JP2024516308A

JP2024516308A - Ｍａｇｅ－ａ４特異性を有するキメラ抗原受容体及びその使用

Info

Publication number: JP2024516308A
Application number: JP2023568054A
Authority: JP
Inventors: ケヴィン・ブレイ; フランク・デルフィーノ; デーヴィッド・ディリロ
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2021-05-04
Filing date: 2022-05-03
Publication date: 2024-04-12
Also published as: KR20240005854A; CO2023016595A2; BR112023023067A2; MX2023013075A; CA3217914A1; EP4333876A1; AU2022271212A1; WO2022235662A1; US20240226163A1; AU2022271212A9; IL308231A

Abstract

ＭＡＧＥ－Ａ４、又は黒色腫関連抗原Ａ４は、Ｘ染色体上の癌精巣抗原（ＣＴＡ）である。本開示は、ＭＡＧＥ－Ａ４特異的キメラ抗原受容体、このようなキメラ抗原受容体を発現する細胞、及びＭＡＧＥ－Ａ４特異的単離抗体を提供する。特定の実施形態では、本開示のキメラ抗原受容体を発現する操作された細胞は、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する腫瘍の成長を阻害することが可能である。本開示の操作された細胞は、上方調節又は誘導されたＭＡＧＥ－Ａ４を標的とする免疫応答が望まれる、及び／又は治療的に有益である、疾患及び障害の治療に有用である。例えば、本開示のＭＡＧＥ－Ａ４特異的キメラ抗原受容体を発現する操作された細胞は、様々な癌の治療に有用である。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２１年５月４日に出願された米国仮出願第６３／１８４，１８３号及び２０２１年８月３１日に出願された同第６３／２３９，２９３号の米国特許法第１１９条（３５ＵＳＣ §１１９（ｅ））に基づく利益を主張するものであり、それぞれ、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

（配列表の参照）
本出願は、２０２２年５月３日に作成され、９５，０５０バイトを含むファイル１０９０１ＷＯ０１－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｔｘｔとしてコンピュータ可読形式で提出された配列表を参照により組み込む。

（発明の分野）
本開示は、黒色腫関連抗原Ａ４（Melanoma-Associated Antigen A4、ＭＡＧＥ－Ａ４）に特異的である、抗体、キメラ抗原受容体（Chimeric Antigen Receptors、ＣＡＲ）、並びにこのような抗体及びＣＡＲを含む操作された細胞、並びにそれらの使用方法を提供する。

ＭＡＧＥ－Ａ４、又は黒色腫関連抗原Ａ４は、Ｘ染色体上の癌精巣抗原（Cancer-Testis Antigen、ＣＴＡ）である。ＭＡＧＥ－Ａ４の機能は不明であるが、細胞周期の進行／調節、転写制御、細胞の生存及び／又はアポトーシスに関与している場合がある。例えば、ＭＡＧＥ－Ａ４の過剰発現は、自発的に形質転換された経口ケラチノサイトの成長を促進し、Ｇ１期の細胞の成長停止を阻害することが示されている。

ＭＡＧＥ－Ａ４は、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌などの肺癌、食道扁平上皮癌、結腸癌、膀胱癌、粘膜及び皮膚黒色腫、卵巣癌、例えば、漿液性癌、及び子宮癌などの異なる組織型の多くの腫瘍によって豊富に発現しているが、正常で健康な成人組織においては、ＭＡＧＥ－Ａ４の発現は精巣に限定されている。

制限された発現パターンと共に免疫応答を誘発するＭＡＧＥ－Ａ４抗原の能力により、ＭＡＧＥ－Ａ４は、癌免疫療法についての優れた候補となっている。

癌などの複雑な疾患に適用される二重標的化抗体戦略もまた、１つの有望な戦略を表し、それによって、多因子調節が治療有効性を改善することを目的とする。ＣＤ３は、Ｔ細胞受容体複合体（T Cell Receptor complex、ＴＣＲ）と共にＴ細胞上に発現されるホモ二量体抗原又はヘテロ二量体抗原であり、Ｔ細胞活性化に必要とされる。機能的ＣＤ３は、４つの異なる鎖：イプシロン、ゼータ、デルタ、及びガンマのうちの２つの二量体対合から形成される。ＭＡＧＥ－Ａ４結合アーム及びＣＤ３結合アームを有する二重特異性抗体は、抗腫瘍活性を増強するのに有用であり得る。

生体外で生成された自己抗原特異的Ｔ細胞の移入を含む養子免疫療法は、ウイルス感染及び癌を治療するための別の有望な戦略である。養子免疫療法に使用されるＴ細胞は、抗原特異的Ｔ細胞の増殖又は遺伝子工学によるＴ細胞の方向転換のいずれかによって生成され得る。

Ｔ細胞における新しい特異性は、遺伝形質転換Ｔ細胞受容体又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の遺伝子導入を介して成功裏に生成されてきた。ＣＡＲは、単一の融合分子における１つ以上のシグナル伝達領域に関連する標的化部分からなる、合成受容体である。一般に、ＣＡＲの結合部分は、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）の抗原結合領域からなり、可撓性リンカによって連結されたモノクローナル抗体の軽鎖可変断片及び重鎖可変断片を含む。第１世代のＣＡＲについてのシグナル伝達領域は、ＣＤ３ゼータの細胞質領域又はＦｃ受容体ガンマ鎖に由来する。第一世代のＣＡＲは、Ｔ細胞の細胞傷害性を成功裏に方向転換することが示されている。しかしながら、それらは、生体内での長期の増殖及び抗腫瘍活性を提供することができなかった。共刺激分子由来のシグナル伝達領域並びに膜貫通領域及びヒンジ領域が追加されて、第２世代及び第３世代のＣＡＲを形成し、ヒトにおける治療試験のいくつかの成功をもたらしている。例えば、Ｂ細胞分化抗原ＣＤ１９に特異的なＣＡＲに方向転換されたＴ細胞は、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療において劇的な効果を示し、Ｔ細胞受容体（T Cell Receptor、ＴＣＲ）に方向転換されたＴ細胞は、固形癌に罹患している患者において有益性を示している。Ｓｔａｕｓｓらは、例えば、抗原特異的エフェクタ機能を増強し、操作されたＴ細胞の毒性を制限する、癌の治療において使用するための治療用ＣＡＲ及びＴＣＲを修飾する戦略を記載している（ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ２０１５，２４：１１３－１１８）。

二重標的化抗体戦略及び／又はＭＡＧＥ－Ａ４抗原に特異的に結合するＣＡＲに基づく新しい標的化剤、並びに治療及び診断の設定においてこのような薬剤を産生及び使用するための方法についての必要性が、満たされていない。

一態様では、本開示は、ＨＬＡ結合黒色腫関連抗原Ａ４（ＭＡＧＥ－Ａ４）に特異的に結合する抗原結合タンパク質であって、当該抗原結合タンパク質が、軽鎖可変領域（Light Chain Variable Region、ＬＣＶＲ）及び重鎖可変領域（Heavy Chain Variable Region、ＨＣＶＲ）を含み、ＬＣＶＲが、配列番号１０又は配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲの相補的決定領域（Complementarity Determining Regions、ＣＤＲ）を含み、ＨＣＶＲが、配列番号２、配列番号８３、又は配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲを含む、抗原結合タンパク質を提供する。

いくつかの実施形態では、ＬＣＶＲは、配列番号１０又は配列番号１１５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣＶＲは、配列番号２、配列番号８３、又は配列番号１０７に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

場合によっては、抗原結合タンパク質は、配列番号３２のアミノ酸２８６～２９４、又はその一部と相互作用する。

一態様では、本開示は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ａ）軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）及び重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗ＭＡＧＥ－Ａ４単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）領域を含む細胞外リガンド結合領域と、（ｂ）ヒンジと、（ｃ）膜貫通領域と、（ｄ）４－１ＢＢ共刺激領域又はＣＤ２８共刺激領域及びＣＤ３ゼータシグナル伝達領域を含む細胞質領域であって、ＬＣＶＲが、配列番号１０又は配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲの相補的決定領域（ＣＤＲ）、及び配列番号２、配列番号８３又は配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲを含む、細胞質領域と、を含む、ＭＡＧＥ－Ａ４特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

いくつかの態様では、ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ａ）細胞外リガンド結合領域と、（ｂ）ヒンジと、（ｃ）膜貫通領域と、（ｄ）共刺激領域及びシグナル伝達領域を含む細胞質領域と、を含む。場合によっては、抗ＭＡＧＥ－Ａ４ｓｃＦｖ領域は、ＬＣＶＲとＨＣＶＲとの間に、第１のリンカを含む。

いくつかの実施形態では、ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲは、細胞外リガンド結合領域とヒンジとの間に、第２のリンカを更に含む。場合によっては、第１のリンカは、配列番号２３～２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、第２のリンカは、配列番号２３～２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。場合によっては、第１のリンカは、配列番号２５のアミノ酸配列を含み、第２のリンカは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む。

ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲの各種実施形態では、ヒンジ、膜貫通領域、又はその両方は、ＣＤ８αポリペプチドに由来する。

ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲの各種実施形態では、共刺激領域は、４－１ＢＢ共刺激領域を含む。

ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲの各種実施形態では、共刺激領域は、ＣＤ２８共刺激領域を含む。

ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲの各種実施形態では、ヒンジ、膜貫通領域、又はその両方は、ＣＤ２８ポリペプチドに由来する。

ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲの各種実施形態では、ヒンジは、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。

ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲの各種実施形態では、膜貫通領域は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む。

ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲの各種実施形態では、４－１ＢＢ共刺激領域は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。

ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲの各種実施形態では、ヒンジは、配列番号３４のアミノ酸配列を含む。

ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲの各種実施形態では、膜貫通領域は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む。

ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲの各種実施形態では、ＣＤ２８共刺激領域は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む。

ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲの各種実施形態では、シグナル伝達領域は、ＣＤ３ゼータシグナル伝達領域を含む。場合によっては、ＣＤ３ゼータシグナル伝達領域は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。

各種実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＭＡＧＥ－Ａ４特異的抗体又はその抗原結合断片である。

場合によっては、上記又は本明細書において考察される抗原結合タンパク質又はＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲは、配列番号２又は配列番号８３に記載のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ内に含有される３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）を含む。場合によっては、ＨＣＤＲ１は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＨＣＶＲは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＨＣＶＲは、配列番号８３に記載のアミノ酸配列を含む。場合によっては、抗原結合タンパク質又はＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲは、配列番号１０７に記載のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ内に含有される３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）を含む。場合によっては、ＨＣＤＲ１は、配列番号１０９に記載のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は、配列番号１１１に記載のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３は、配列番号１１３に記載のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＨＣＶＲは、配列番号１０７に記載のアミノ酸配列を含む。

場合によっては、上記又は本明細書において考察される抗原結合タンパク質又はＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲは、配列番号１０又は配列番号１１５に記載のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ内に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）を含む。場合によっては、ＬＣＤＲ１は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３は、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＬＣＶＲは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＬＣＤＲ１は、配列番号１１７に記載のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３は、配列番号１１９に記載のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＬＣＶＲは、配列番号１１５に記載のアミノ酸配列を含む。

場合によっては、上記又は本明細書において考察される抗原結合タンパク質又はＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ及び配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む。場合によっては、上記又は本明細書において考察される抗原結合タンパク質又はＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲは、配列番号８３に記載のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ及び配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む。場合によっては、上記又は本明細書において考察される抗原結合タンパク質又はＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲは、配列番号１０７に記載のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ及び配列番号１１５に記載のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む。

各種実施形態では、ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲは、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。各種実施形態では、ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲは、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む。各種実施形態では、ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲは、配列番号１２０のアミノ酸配列を含む。各種実施形態では、ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲは、配列番号１２１のアミノ酸配列を含む。

各種実施形態では、上記又は本明細書において考察される抗原結合タンパク質又はＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲは、配列番号３２の２８６～２９４位の１つ以上のアミノ酸に特異的に結合する。各種実施形態では、上記又は本明細書において考察される抗原結合タンパク質又はＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲは、ＨＬＡの１種以上のアミノ酸と相互作用する。場合によっては、ＨＬＡは、ＨＬＡ－Ａ２である。

一態様では、本開示は、上記又は本明細書で考察される抗原結合タンパク質又はＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲをコードする単離された核酸分子を提供する。場合によっては、単離された核酸分子は、配列番号２１のヌクレオチド配列を含む。場合によっては、単離された核酸分子は、配列番号１０４のヌクレオチド配列を含む。

一態様では、本開示は、上記又は本明細書で考察される核酸分子を含むベクターを提供する。場合によっては、ベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はレトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターである。

一態様では、本開示は、上記又は本明細書で考察される核酸分子（複数可）を含む細胞を提供する。場合によっては、細胞は、ヒトＴ細胞である。

一態様では、本開示は、上記又は本明細書で考察される抗原結合タンパク質又はＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲを含む操作された細胞を提供する。場合によっては、操作された細胞は、免疫細胞である。場合によっては、免疫細胞は、免疫エフェクタ細胞である。場合によっては、免疫エフェクタ細胞は、Ｔリンパ球である。場合によっては、Ｔリンパ球は、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球、又はヘルパーＴリンパ球である。場合によっては、操作された細胞は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球である。各種実施形態では、操作された細胞は、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する癌の治療において使用するためのものである。場合によっては、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する癌は、多発性骨髄腫である。場合によっては、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する癌は黒色腫である。

一態様では、本開示は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ａ）軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）及び重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗ＭＡＧＥ－Ａ４単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）領域を含む細胞外リガンド結合領域と、（ｂ）ヒンジと、（ｃ）膜貫通領域と、（ｄ）４－１ＢＢ共刺激領域又はＣＤ２８共刺激領域及びＣＤ３ゼータシグナル伝達領域を含む細胞質領域であって、ＬＣＶＲが、配列番号１０又は配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲの相補的決定領域（ＣＤＲ）、及び配列番号２、配列番号８３又は配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲを含む、細胞質領域と、を含む、キメラ抗原受容体を含む、操作されたヒトＴ細胞を提供する。

操作されたヒトＴ細胞の様々な実施形態では、抗ＭＡＧＥ－Ａ４ｓｃＦｖは、配列番号３２の２８６～２９４位の１つ以上のアミノ酸残基に特異的に結合する。場合によっては、ｓｃＦｖ領域は、配列番号２／１０のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。場合によっては、ｓｃＦｖ領域は、配列番号２／８３のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。場合によっては、ｓｃＦｖ領域は、配列番号１０７／１１５のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣＶＲは、３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）を含み、ＬＣＶＲは、３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）を含み、ＨＣＤＲ１は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３は、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＨＣＶＲは、３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）を含み、ＬＣＶＲは、３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）を含み、ＨＣＤＲ１は、配列番号１０９に記載のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は、配列番号１１１に記載のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３は、配列番号１１３に記載のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号１１７に記載のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３は、配列番号１１９に記載のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ヒンジは、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。場合によっては、膜貫通領域は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む。場合によっては、４－１ＢＢ共刺激領域は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ヒンジは、配列番号３４のアミノ酸配列を含む。場合によっては、膜貫通領域は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＣＤ２８共刺激領域は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＣＤ３ゼータシグナル伝達領域は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。

各種実施形態では、操作されたヒトＴ細胞は、配列番号２２のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む。各種実施形態では、操作されたヒトＴ細胞は、配列番号１０５のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む。各種実施形態では、操作されたヒトＴ細胞は、配列番号１２０のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む。各種実施形態では、操作されたヒトＴ細胞は、配列番号１２１のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む。

一態様では、本開示は、遺伝子修飾ヒトＴ細胞及び薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物を提供し、ここで、遺伝子修飾ヒトＴ細胞は、上記又は本明細書で考察される抗原結合タンパク質又はＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲを含む。場合によっては、医薬組成物は、上記又は本明細書で考察されるような操作された細胞及び薬学的に許容可能なキャリアを含む。場合によっては、医薬組成物は、上記又は本明細書で考察されるような操作されたヒトＴ細胞及び薬学的に許容可能なキャリアを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する癌の治療に使用するためのものである。場合によっては、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する癌は、多発性骨髄腫である。場合によっては、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する癌は黒色腫である。

一態様では、本開示は、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する癌の治療のための薬剤の製造における、上記又は本明細書で考察される抗原結合タンパク質又はＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ、核酸分子、ベクター、細胞、操作された細胞、又は操作されたヒトＴ細胞の使用を提供する。場合によっては、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する癌は、多発性骨髄腫である。場合によっては、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する癌は黒色腫である。

一態様では、本開示は、上記又は本明細書で考察される抗原結合タンパク質又はＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲを含むＴリンパ球を対象に導入することを含む、対象におけるＴリンパ球活性を増強する方法を提供する。

一態様では、本開示は、癌に罹患している対象を治療する方法であって、上記又は本明細書で考察される抗原結合タンパク質又はＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲを含む治療有効量のＴリンパ球を対象に導入することを含む方法を提供する。

一態様では、本開示は、上記又は本明細書で考察される抗原結合タンパク質又はＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲを発現するように遺伝子修飾された有効量の細胞を対象に投与することを含む、対象における標的細胞集団又は組織に対するＴ細胞媒介免疫応答を刺激する方法を提供する。

一態様では、本開示は、対象に抗腫瘍免疫を提供する方法を提供し、本方法は、上記又は本明細書で考察される抗原結合タンパク質又はＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲを発現するように遺伝子修飾された細胞の有効量を対象に投与することを含む。

上記又は本明細書で考察される様々な方法のいずれにおいても、対象は、ヒトであり得る。いくつかの実施形態では、対象は、多発性骨髄腫、滑膜肉腫、食道癌、頭頸部癌、肺癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌、胃癌、子宮頸癌、乳癌、又は黒色腫を有する。いくつかの実施形態では、対象は、多発性骨髄腫を有する。

一態様では、本開示は、上記又は本明細書で考察される抗原結合タンパク質又はＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲを発現するように細胞集団を操作する方法であって、（ａ）上記又は本明細書で考察される抗原結合タンパク質又はＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲをコードする核酸分子を免疫細胞集団に導入することと、（ｂ）当該核酸分子を発現する条件下で、免疫細胞集団を培養することと、（ｃ）細胞表面で当該ＭＡＧＥ－Ａ４特異的抗原結合タンパク質を発現する免疫細胞を単離することと、を含む方法を、提供する。場合によっては、本方法は、核酸分子を導入する前に、対象から免疫細胞集団を取得することを更に含む。

一態様では、本開示は、対象においてＭＡＧＥ－Ａ４を発現する癌を治療する方法であって、（ａ）上記又は本明細書で考察される細胞集団を操作することと、（ｂ）キメラ抗原受容体を発現する細胞集団を対象に再導入することと、を含む方法を、提供する。場合によっては、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する癌は、多発性骨髄腫である。

一態様では、本開示は、単離された抗原結合タンパク質を提供し、抗原結合タンパク質は、ＨＬＡ結合黒色腫関連抗原Ａ４（ＭＡＧＥ－Ａ４）に特異的に結合する第１の抗原結合領域と、ヒトＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合領域と、を含み、第１の抗原結合領域は、重鎖可変領域（Ａ１－ＨＣＶＲ）に含有される３つの重鎖相補的決定領域（ＣＤＲ）（Ａ１－ＨＣＤＲ１、Ａ１－ＨＣＤＲ２、及びＡ１－ＨＣＤＲ３）、及び軽鎖可変領域（Ａ１－ＬＣＶＲ）に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（Ａ１－ＬＣＤＲ１、Ａ１－ＬＣＤＲ２、及びＡ１－ＬＣＤＲ３）を含み、第２の抗原結合領域は、重鎖可変領域（Ａ２－ＨＣＶＲ）に含有される３つの重鎖ＣＤＲ（Ａ２－ＨＣＤＲ１、Ａ２－ＨＣＤＲ２、及びＡ２－ＨＣＤＲ３）、及び軽鎖可変領域（Ａ２－ＬＣＶＲ）に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（Ａ２－ＬＣＤＲ１、Ａ２－ＬＣＤＲ２、及びＡ２－ＬＣＤＲ３）を含み、Ａ１－ＨＣＶＲは配列番号２のアミノ酸配列を含み、Ａ１－ＬＣＶＲは配列番号１０のアミノ酸配列を含み、Ａ２－ＨＣＶＲは配列番号５５のアミノ酸配列を含み、Ａ２－ＬＣＶＲは配列番号１０のアミノ酸配列を含む。

一態様では、本開示は、単離された抗原結合タンパク質を提供し、抗原結合タンパク質は、ＨＬＡ結合黒色腫関連抗原Ａ４（ＭＡＧＥ－Ａ４）に特異的に結合する第１の抗原結合領域と、ヒトＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合領域と、を含み、第１の抗原結合領域は、重鎖可変領域（Ａ１－ＨＣＶＲ）に含有される３つの重鎖相補的決定領域（ＣＤＲ）（Ａ１－ＨＣＤＲ１、Ａ１－ＨＣＤＲ２、及びＡ１－ＨＣＤＲ３）、及び軽鎖可変領域（Ａ１－ＬＣＶＲ）に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（Ａ１－ＬＣＤＲ１、Ａ１－ＬＣＤＲ２、及びＡ１－ＬＣＤＲ３）を含み、第２の抗原結合領域は、重鎖可変領域（Ａ２－ＨＣＶＲ）に含有される３つの重鎖ＣＤＲ（Ａ２－ＨＣＤＲ１、Ａ２－ＨＣＤＲ２、及びＡ２－ＨＣＤＲ３）、及び軽鎖可変領域（Ａ２－ＬＣＶＲ）に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（Ａ２－ＬＣＤＲ１、Ａ２－ＬＣＤＲ２、及びＡ２－ＬＣＤＲ３）を含み、Ａ１－ＨＣＶＲは配列番号２のアミノ酸配列を含み、Ａ１－ＬＣＶＲは配列番号１０のアミノ酸配列を含み、Ａ２－ＨＣＶＲは配列番号７３のアミノ酸配列を含み、Ａ２－ＬＣＶＲは配列番号１０のアミノ酸配列を含む。

上記又は本明細書で考察される単離された抗原結合タンパク質の各種実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号３２のアミノ酸２８６～２９４又はその一部と相互作用する。場合によっては、単離された抗原結合タンパク質は、ＣＡＲである。場合によっては、単離された抗原結合タンパク質は、二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、単離された抗原結合タンパク質は、ＣＤ３と相互作用する。場合によっては、単離された抗原結合タンパク質は、配列番号２又は配列番号８３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む。場合によっては、単離された抗原結合タンパク質は、配列番号５５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む。場合によっては、単離された抗原結合タンパク質は、配列番号７３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む。

一態様では、本開示は、上記又は本明細書で考察される抗原結合タンパク質又はＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲと同じ抗原決定基に結合する単離された抗原結合タンパク質を提供する。一態様では、本開示は、上記又は本明細書で考察される抗原結合タンパク質又はＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲとの結合について競合する、単離された抗原結合タンパク質を提供する。場合によっては、単離された抗原結合タンパク質は、ＣＡＲである。場合によっては、単離された抗原結合タンパク質は、二重特異性抗体である。場合によっては、単離された抗原結合タンパク質は、配列番号３２のアミノ酸２８６～２９４又はその一部と相互作用する。場合によっては、単離された抗原結合タンパク質は、ＣＤ３と相互作用する。いくつかの実施形態では、単離された抗原結合タンパク質は、それぞれ、配列番号４、配列番号６、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む３つの重鎖ＣＤＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、単離された抗原結合タンパク質は、それぞれ、配列番号５７、配列番号５９、及び配列番号６１のアミノ酸配列を含む３つの重鎖ＣＤＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む二重特異性抗体の別のアームに対応するＨＣＶＲを含む。いくつかの実施形態では、単離された抗原結合タンパク質は、それぞれ、配列番号７５、配列番号７７、及び配列番号７９のアミノ酸配列を含む３つの重鎖ＣＤＲを含む二重特異性抗体の別のアームに対応するＨＣＶＲを含む。場合によっては、単離された抗原結合タンパク質は、配列番号１０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、及び／又は配列番号６３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む。

一態様では、本開示は、黒色腫関連抗原Ａ４（ＭＡＧＥ－Ａ４）ポリペプチドに特異的に結合する単離された組換え抗体又はその抗原結合断片を提供し、本抗体は、以下の特徴のうちの１つ以上を有する。（ａ）約２×１０^９Ｍ未満のＥＣ５０で、ＭＡＧＥ－Ａ４ポリペプチドに結合する、（ｂ）ＭＡＧＥ－Ａ４ポリペプチドに特異的に結合しない単離された組換え抗体と比較して、腫瘍細胞の生存率を低下させる能力を示す、及び／又は（ｃ）（ｉ）表１に記載のＨＣＶＲに対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に含有される３つの重鎖相補的決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）と、（ｉｉ）表１に記載のＬＣＶＲに対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）と、を含む。

ＭＡＧＥ－Ａ４ポリペプチドに特異的に結合する単離された組換え抗体又はその抗原結合断片のいくつかの実施形態では、ＭＡＧＥ－Ａ４ポリペプチドは、ＨＬＡ－Ａ２結合ＭＡＧＥ－Ａ４ポリペプチドである。場合によっては、単離された抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２、配列番号８３、又は配列番号１０７のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。場合によっては、単離された抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１０又は配列番号１１５のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。場合によっては、単離された抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２／１０、又は配列番号８３／１０、又は配列番号１０７／１１５の、一対のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列を含む。

一態様では、本開示は、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１領域と、（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２領域と、（ｃ）配列番号８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３領域と、（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１領域と、（ｅ）配列番号１４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２領域と、（ｆ）配列番号１６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３領域と、を含む、単離された抗体又はその抗原結合断片を提供する。

一態様では、本開示は、（ａ）配列番号１０９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１領域と、（ｂ）配列番号１１１のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２領域と、（ｃ）配列番号１１３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３領域と、（ｄ）配列番号１１７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１領域と、（ｅ）配列番号１４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２領域と、（ｆ）配列番号１１９のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３領域と、を含む、単離された抗体又はその抗原結合断片を提供する。

上記又は本明細書で考察される単離抗体又はその抗原結合断片の各種実施形態では、単離抗体又はその抗原結合断片は、ＩｇＧ１抗体又はＩｇＧ４抗体である。場合によっては、単離された抗体又はその抗原結合断片は、二重特異性抗体である。

一態様では、本開示は、黒色腫関連抗原Ａ４（ＭＡＧＥ－Ａ４）ポリペプチドに特異的に結合する第１の抗原結合領域と、ＣＤ３ポリペプチドに特異的に結合する第２の抗原結合領域とを含む、単離された組換え抗体又はその抗原結合断片を提供し、ここで、（ａ）ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する第１の抗原結合領域（Ａ１）は、３つの重鎖相補的決定領域（Ａ１－ＨＣＤＲ１、Ａ１－ＨＣＤＲ２、及びＡ１－ＨＣＤＲ３）及び３つの軽鎖相補的決定領域（Ａ１－ＬＣＤＲ１、Ａ１－ＬＣＤＲ２、及びＡ１－ＬＣＤＲ３）を含み、Ａ１－ＨＣＤＲ１は、配列番号４又は配列番号１０９のアミノ酸配列を含み、Ａ１－ＨＣＤＲ２は、配列番号６又は配列番号１１１のアミノ酸配列を含み、Ａ１－ＨＣＤＲ３は、配列番号８又は配列番号１１３のアミノ酸配列を含み、Ａ１－ＬＣＤＲ１は、配列番号１２、配列番号６５、又は配列番号１１７のアミノ酸配列を含み、Ａ１－ＬＣＤＲ２は、配列番号１４のアミノ酸配列を含み、Ａ１－ＬＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号６７、又は配列番号１１９のアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＣＤ３に結合する第２の抗原結合領域（Ａ２）は、３つの重鎖相補的決定領域（Ａ２－ＨＣＤＲ１、Ａ２－ＨＣＤＲ２、及びＡ２－ＨＣＤＲ３）及び３つの軽鎖相補的決定領域（Ａ２－ＬＣＤＲ１、Ａ２－ＬＣＤＲ２、及びＡ２－ＬＣＤＲ３）を含み、Ａ２－ＨＣＤＲ１は、配列番号５７又は配列番号７５のアミノ酸配列を含み、Ａ２－ＨＣＤＲ２は、配列番号５９又は配列番号７７のアミノ酸配列を含み、Ａ２－ＨＣＤＲ３は、配列番号６１又は配列番号７９のアミノ酸配列を含み、Ａ２－ＬＣＤＲ１は、配列番号１２、配列番号６５、又は配列番号１１７のアミノ酸配列を含み、Ａ２－ＬＣＤＲ２は、配列番号１４のアミノ酸配列を含み、Ａ２－ＬＣＤＲ３は、配列番号１６、配列番号６７、又は配列番号１１９のアミノ酸配列を含む。

一態様では、本開示は、上記又は本明細書で考察される単離された抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容可能なキャリア又は希釈剤と、を含む医薬組成物を、提供する。場合によっては、医薬組成物は、第２の治療薬を更に含む。場合によっては、第２の治療薬は、抗腫瘍剤、ステロイド、及び標的療法からなる群から選択される。

一態様では、本開示は、上記又は本明細書で考察される抗体の１つ以上のＨＣＶＲ及び／又は１つ以上のＬＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子、並びにポリヌクレオチドを含むベクター、並びにベクターを含む細胞を提供する。

一態様では、本開示は、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する癌を治療する方法を提供し、本方法は、上記又は本明細書で考察される抗体若しくは抗原結合断片、あるいは上記又は本明細書で考察される医薬組成物を対象に投与することを含む。場合によっては、医薬組成物は、第２の治療薬と組み合わせて投与される。場合によっては、第２の治療薬は、抗腫瘍剤、ステロイド、及び標的療法からなる群から選択される。

その他の実施形態は、後述の発明を実施するための形態の精査から、明らかとなるであろう。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構成を発現させるための、例示的なヌクレオチド構成を示す。代表的なヌクレオチド構成は、抗ＭＡＧＥ－Ａ４ＶＬ－リンカ－ＶＨｓｃＦｖ、ヒトＣＤ８ヒンジ及び膜貫通領域、４－１ＢＢ共刺激領域、ＣＤ３ゼータシグナル伝達領域、及び任意選択で、ＩＲＥＳ、ＣＡＲ形質導入細胞を追跡するためのｅＧＦＰ配列を含む。本開示の代表的な二重特異性抗体を示す。代表的な二重特異性抗体は、ＭＡＧＥ－Ａ４と相互作用することが可能な１つのＨＣＶＲ（抗ＭＡＧＥ－Ａ４アーム）、及びＣＤ３と相互作用することが可能な別のＨＣＶＲ（抗ＣＤ３アーム）から構成される。代表的な実施例では、ＬＣＶＲは一般的である（例えば、両方とも無差別であるか、又は様々な重鎖アームと効果的に対合することが周知である抗ＣＤ３抗体又は抗体軽鎖に対応する）。

本明細書に記載される発明は、記載される特定の方法及び実験条件に限定されず、したがって、方法及び条件は変更され得ることを理解されたい。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではないことも理解されたい。いずれの実施形態又は実施形態の特徴も、互いに組み合わせることができ、このような組み合わせは、本発明の範囲内に明示的に包含される。上記又は本明細書で考察されるいずれの特定の値も、上記又は本明細書で考察される別の関連値と組み合わせられて、それらの値が範囲の上限及び下限を表す範囲を列挙することができ、このような範囲は本開示の範囲内に包含される。

別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特定の列挙された数値に関して使用される場合、その値が列挙された値から１％以下だけ変動し得ることを意味する。例えば、本明細書で使用される場合、「約１００」という表現は、９９及び１０１並びにそれらの間の全ての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。

本明細書に記載されるものと類似の又は同等の任意の方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用し得るが、好ましい方法及び材料を、これから説明する。本明細書において言及される全ての特許、出願及び非特許刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

定義
本明細書で使用される場合、「ＭＡＧＥ－Ａ４」という用語は、黒色腫関連抗原Ａ４を指す。ＭＡＧＥ－Ａ４は、様々な異なる腫瘍細胞によって発現される細胞内タンパク質である。本明細書で使用される場合、「ＭＡＧＥ－Ａ４」とは、非ヒト種（例えば、「マウスＭＡＧＥ－Ａ４」、「サルＭＡＧＥ－Ａ４」など）に由来するものとして特定されない限り、ヒトＭＡＧＥ－Ａ４タンパク質を指す。ヒトＭＡＧＥ－Ａ４タンパク質は、配列番号３２に示されるアミノ酸配列及び配列番号３１のポリ核酸配列を有する。ＭＡＧＥ－Ａ４ポリペプチド（例えば、ＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４）の特定の領域への言及は、配列番号３２に関するものである。本明細書で使用される場合、「ＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４」、「ＭＡＧＥ－Ａ４（２８６－２９４）」、及び「ＭＡＧＥＡ４_{２８６－２９４}」という用語は、互換的に使用され得る。ＭＡＧＥ－Ａ４（２８６－２９４）（ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ）のポリペプチド配列は、配列番号３３として所与される。

本明細書で使用される場合、「ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗体」又は「抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体」は、少なくともＭＡＧＥ－Ａ４を特異的に認識する抗体及びその抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗体は、ＭＡＧＥ－Ａ４のアミノ酸２８６～２９４と相互作用する。本明細書に開示されるように、「ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗体」又は「抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体」は更に、その他のＭＡＧＥ－Ａ４関連ペプチド（例えば、ＨＬＡ－Ａ２と複合体を形成すると予測されるＭＡＧＥ－Ａ４関連ペプチド）を特異的に認識することが可能であってもよい。更に、ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗体は、例えば、二重特異性抗体としてフォーマットされた場合、１つ以上の更なるリガンドに更に結合することが可能である。特定の実施形態では、抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体は、ＭＡＧＥ－Ａ４及びＣＤ３の両方に結合する二重特異性抗体としてフォーマットされてもよい。

「リガンド結合領域」及び「抗原結合領域」という用語は、本明細書では互換的に使用され、所定の抗原（例えば、ＭＡＧＥ－Ａ４）に特異的に結合するキメラ抗原受容体又は対応する抗体の部分を指す。「対応する抗体」への言及は、キメラ抗原受容体又は二重特異性抗体において使用されるＣＤＲ又は可変領域（重鎖可変領域（略称ＨＣＶＲ又はＶＨ）及び軽鎖可変領域（略称ＬＣＶＲ又はＶＬ））が由来する抗体を指す。例えば、実施例において考察されるキメラ抗原受容体構成は、抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体に由来する可変領域を有するｓｃＦｖを含む。この抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体が、それぞれのキメラ抗原受容体に対して「対応する抗体」である。

本発明で使用される場合、「二重特異性抗体」を含む「抗体」という用語は、特定の抗原（例えば、ＭＡＧＥ－Ａ４）に特異的に結合するか又はそれと相互作用する少なくとも１つの相補的決定領域（ＣＤＲ）を含む、任意の抗原結合分子又は分子複合体を意味する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＨＬＡが結合したポリペプチドなどのＭＨＣが結合したポリペプチドに結合するか、又はそれと相互作用し得る。本開示の文脈において、抗体は、いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ２によって提示されるＭＡＧＥ－Ａ４ポリペプチド（例えば、ＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４）などのＨＬＡ－Ａ２が結合したポリペプチドに結合し得る。「二重特異性抗体」を含む「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互連結された４本のポリペプチド鎖、２本の重（Ｈ）鎖、及び２本の軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子、並びにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を含むが、しかしながら、重鎖のみからなる（すなわち、軽鎖を欠く）免疫グロブリン分子もまた、「抗体」という用語の定義内に包含される。「抗体」という用語はまた、ジスルフィド結合によって相互連結された４本のポリペプチド鎖、２本の重（Ｈ）鎖、及び２本の軽（Ｌ）鎖からなる免疫グロブリン分子を含む。各重鎖（本明細書ではＨＣと略される）は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶ_Ｈと略される）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つの領域、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、及びＣ_Ｈ３を含む。各軽鎖（本明細書ではＬＣと略される）は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶ_Ｌと略される）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つの領域（Ｃ_Ｌ１）を含む。Ｖ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域は、フレームワーク領域（framework region、ＦＲ）と称されるより保存された領域が点在する相補的決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域へと、更に細分され得る。各Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置されている。本開示の異なる実施形態では、抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体（又はその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であり得るか、又は天然若しくは人工的に修飾されてもよい。アミノ酸共通塩基配列は、２つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義されてもよい。

本発明の特定の実施形態では、抗体は、二重特異性抗体である。例えば、特定の実施形態では、抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体（例えば、ｍＡｂＭ３１３３９Ｎ２）は、高親和性（７１９５Ｐ）ＣＤ３アームを利用してｂｓｂ６０５４を生成するか、又は中程度の親和性（７２２１Ｇ）ＣＤ３アームを利用してｂｓＡｂ６０４３を生成するか、のいずれかで、二重特異性抗体（例えば、抗ＭＡＧＥ－Ａ４×抗ＣＤ３）へと再フォーマットされる。

本発明で使用される場合、「抗体」という用語はまた、完全抗体分子の抗原結合断片を含む。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」及び同様の用語は、本明細書で使用される場合、天然の、酵素処理で入手可能な、合成の、又は遺伝子操作された、抗原を特異的に結合して複合体を形成するポリペプチド又は糖タンパク質を含む。本明細書中で使用される場合、「抗原結合部分」又は「抗原結合断片」とは、ＭＡＧＥ－Ａ４（又はＭＡＧＥ－Ａ４関連ペプチド）及び／又はＣＤ３に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合断片は、例えば、ＤＮＡコード抗体可変領域及び任意選択で定常領域の操作及び発現を包含するタンパク質消化技法又は組換え遺伝子操作技法などの任意の好適な標準的技法を使用した、完全抗体分子に由来してもよい。このようなＤＮＡは、周知である、及び／又は例えば、市販の供給源、ＤＮＡライブラリ（例えば、ファージ抗体ライブラリを含む）から容易に入手可能であるか、あるいは合成され得る。ＤＮＡは、化学的に、又は分子生物学技法を使用することによって配列決定及び操作されて、例えば、１つ以上の可変領域及び／若しくは定常領域を好適な立体配置に配置するか、又はコドンを導入し、システイン残基を作製し、アミノ酸を修飾、付加、若しくは欠失等させてもよい。

抗原結合断片の非限定的な例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）Ｆｄ断片、（ｉｖ）Ｆｖ断片、（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂ断片、及び（ｖｉｉ）抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補的決定領域（ＣＤＲ））、又は拘束ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチドが挙げられる。領域特異性抗体、単一領域抗体、領域欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、二特異性抗体、三特異性抗体、四特異性抗体、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小モジュラ免疫薬（small modular immunopharmaceutical、ＳＭＩＰ）、及びサメ可変ＩｇＮＡＲ領域などのその他の操作された分子もまた、本明細書で使用されるような「抗原結合断片」の表現内に包含される。

抗体の抗原結合断片は、典型的には、少なくとも１つの可変領域を含む。可変領域は、任意のサイズ又はアミノ酸組成のものであってもよく、一般に、１つ以上のフレームワーク配列に隣接しているか、又はそれとインフレームである少なくとも１つのＣＤＲを含む。Ｖ_Ｈ領域がＶ_Ｌ領域に対合した抗原結合断片では、Ｖ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域は、任意の好適な配置で互いに対して位置付けられてもよい。例えば、可変領域は二量体であり、Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ、又はＶ_Ｌ－Ｖ_Ｌ二量体を含んでもよい。あるいは、抗体の抗原結合断片は、単量体のＶ_Ｈ領域又はＶ_Ｌ領域を含んでもよい。

特定の実施形態では、抗体の抗原結合断片は、少なくとも１つの定常領域に共有結合された少なくとも１つの可変領域を含んでもよい。本発明の抗体の抗原結合断片内に見出され得る可変及び定常領域の非限定的な例示的な構成としては、（ｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１、（ｉｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ２、（ｉｉｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ３、（ｉｖ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２、（ｖ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３、（ｖｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３、（ｖｉｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｌ、（ｖｉｉｉ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ１、（ｉｘ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ２、（ｘ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ３、（ｘｉ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２、（ｘｉｉ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３、（ｘｉｉｉ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３、及び（ｘｉｖ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｌが挙げられる。上に列記される代表的な立体配置のうちのいずれかを含む、可変領域及び定常領域のいずれの立体配置でも、可変領域及び定常領域は、互いに直接連結されているか、又は完全若しくは部分的ヒンジ領域若しくはリンカ領域によって連結されているか、のいずれかであってもよい。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子において隣接する可変領域及び／又は定常領域間の可撓性の連鎖又は半可撓性の連鎖をもたらす少なくとも２つの（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０以上の）アミノ酸からなってもよい。更に、本発明の抗体の抗原結合断片は、互いとの及び／又は１つ以上の単量体Ｖ_Ｈ若しくはＶ_Ｌ領域との（例えば、ジスルフィド結合による）非共有結合において、上に列記される可変領域立体配置及び定常領域立体配置のうちのいずれかのホモ二量体又はヘテロ二量体（又はその他の多量体）を含んでもよい。

特定の実施形態では、抗原結合断片が由来する抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体は、ヒト抗体である。「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含むことが企図される。本開示のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３における、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、生体外でのランダム変異誘発若しくは部位特異的変異誘発によって又は生体内での体細胞変異によって、導入された変異）を含んでもよい。しかしながら、本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列へと移植された抗体を含むことを意図するものではない。

各種実施形態では、本開示の抗ＭＡＧＥ－Ａ４×抗ＣＤ３二重特異性抗体（例えば、ＢｓＡｂ６０５４及び／又はＢｓＡｂ６０４３）は、ヒト抗体である。各種実施形態では、抗ＭＡＧＥ－Ａ４ｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ヒトＩｇＧ抗体である。各種実施形態では、抗ＭＡＧＥ－Ａ４ｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体は、アイソタイプＩｇＧ１、アイソタイプＩｇＧ２、アイソタイプＩｇＧ３若しくはアイソタイプＩｇＧ４、又は混合アイソタイプのヒト抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＭＡＧＥ－Ａ４×ＣＤ３二重特異性抗体は、ヒトＩｇＧ１抗体である（すなわち、抗体は、第１の抗原結合領域及び第２の抗原結合領域のそれぞれのＨＣＶＲにそれぞれ付着したヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含む）。いくつかの実施形態では、抗ＭＡＧＥ－Ａ４×抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ヒトＩｇＧ４抗体である（すなわち、抗体は、第１の抗原結合領域及び第２の抗原結合領域のそれぞれのＨＣＶＲにそれぞれ付着したヒトＩｇＧ４重鎖定常領域を含む）。上記又は本明細書で考察される実施形態のうちのいずれかでは、抗ＭＡＧＥ－Ａ４×抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ヒトカッパ軽鎖を含んでもよい。上記又は本明細書で考察される実施形態のうちのいずれかでは、抗ＭＡＧＥ－Ａ４×抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ヒトラムダ軽鎖を含んでもよい。

任意の実施形態では、二重特異性抗体は、ホモ二量体不純物からの二重特異性抗体（すなわち、ヘテロ二量体）の精製を容易にするために、一方又は両方の重鎖における修飾を含んでもよい。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、修飾を欠く抗体と比較して、タンパク質Ａへの二重特異性抗体の結合を低減させる一方又は他方の重鎖のＣＨ３領域における修飾を除いて、同一（例えば、アイソタイプＩｇＧ１又はアイソタイプＩｇＧ４の両方）である第１の重鎖及び第２の重鎖（すなわち、抗ＭＡＧＥ－Ａ４結合アームの重鎖、及び抗ＣＤ３結合アームの重鎖）を含む。場合によっては、第１の重鎖のＣＨ３領域（例えば、抗ＭＡＧＥ－Ａ４結合アームの）は、タンパク質Ａに結合し、第２の重鎖のＣＨ３領域（例えば、抗ＣＤ３結合アームの）は、タンパク質Ａ結合を低減又は消失させる変異を含む。場合によっては、変異はＨ４３５Ｒ修飾である（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる、ＥＵ番号付けＨ９５Ｒによる）。場合によっては、変異はＨ４３５Ｒ修飾である（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる、ＥＵ番号付けＨ９５Ｒによる）、及びＹ４３６Ｆ修飾であるＩＭＧＴによる、ＥＵ番号付けＹ９６Ｆ）。第２のＣＨ３領域内に見られ得る更なる修飾としては、ＩｇＧ１ＣＨ３領域の場合に、ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、及びＶ４２２Ｉ（ＩＭＧＴによるＤ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、及びＶ８２Ｉ）、並びにＩｇＧ４ＣＨ３領域の場合に、ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、及びＶ４２２Ｉ（ＩＭＧＴによるＱ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、及びＶ８２Ｉ）が挙げられる。

任意の実施形態では、二重特異性抗体は、キメラヒンジを含んでもよい。「キメラヒンジ」という用語は、１つのＩｇ分子のヒンジ領域に由来する第１のアミノ酸配列と、Ｉｇ分子の異なるクラス又はサブクラスのヒンジ領域に由来する第２のアミノ酸配列と、を含むキメラタンパク質を含むことを、意図している。例えば、キメラヒンジは、一実施形態では、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域又はヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する第１のアミノ酸配列又は「上部ヒンジ」配列と、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域に由来する第２のアミノ酸配列又は「下部ヒンジ」配列と、を含む。特定の実施形態では、第１の配列又は「上部ヒンジ」配列は、ＥＵ番号付けによる２１６～２２７位のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、第２の配列又は「下部ヒンジ」配列は、ＥＵ番号付けによる２２８～２３６位のアミノ酸残基を含む。

二重特異性抗体、抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗原結合断片を生成するために使用されるもの、及び／又はキメラ抗原受容体を含む本開示の抗体は、いくつかの態様では、組換えヒト抗体であってもよい。本明細書で使用される「組換えヒト抗体」という用語は、宿主細胞に形質移入された組換え発現ベクターを使用して発現される抗体などの組換え手段によって調製、発現、作成、又は単離された全てのヒト抗体（更に後述）、組換え組み合わせヒト抗体ライブラリから単離された抗体（更に後述）、ヒト免疫グロブリン遺伝子について遺伝形質転換である動物（例えばマウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒｅｔａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０：６２８７－６２９５を参照のこと）、又はヒト免疫グロブリン遺伝子配列のその他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意のその他の手段によって調製、発現、作成、若しくは単離された抗体を含むように、意図される。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する。しかしながら、特定の実施形態では、このような組換えヒト抗体は、生体外変異誘発（又は、ヒトＩｇ配列に対して遺伝形質転換である動物が使用される際の、生体内体細胞変異誘発）に供され、したがって、組換え抗体のＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列Ｖ_Ｈ配列及びヒト生殖系列Ｖ_Ｌ配列に由来しそれらに関連しているが、生体内でヒト抗体生殖系列レパートリ内に天然に存在し得ない配列である。

ヒト抗体は、ヒンジの不均一性に関連する２つの形態で存在し得る。第１の形態では、免疫グロブリン分子は、二量体が鎖間重鎖ジスルフィド結合によって一緒に保持されているおよそ１５０～１６０ｋＤａの安定した四本鎖構築体を含む。第２の形態では、二量体は鎖間ジスルフィド結合によって連結されておらず、共有結合した軽鎖及び重鎖からなる約７５～８０ｋＤａの分子が形成される（半抗体）。これらの形態は、親和性精製後でさえも分離することが極めて困難とされている。

様々な無傷のＩｇＧアイソタイプにおける第２の形態の出現頻度は、抗体のヒンジ領域アイソタイプに関連する構造上の相違によるが、それに限定されない。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における１個のアミノ酸置換により、ヒトＩｇＧ１ヒンジを使用して典型的に観察されるレベルにまで第２の形態の出現を有意に減少させ得る（Ａｎｇａｌｅｔａｌ．（１９９３）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ３０：１０５）。本開示は、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２領域又はＣ_Ｈ３領域に１つ以上の変異を有する抗体を包含し、例えば、産生において、所望の抗体形態の収率を改善するのに望ましい場合がある。

二重特異性抗体を含む、本明細書に開示される抗体は、単離された抗体であってもよい。「単離された抗体」とは、本明細書で使用される場合、その天然環境の少なくとも１種の成分から同定され、分離及び／又は回収された抗体を意味する。例えば、生物の少なくとも１種の成分から、又は抗体が天然に存在するか若しくは天然に産生される組織又は細胞から分離又は除去された抗体は、本開示の目的のための「単離された抗体」である。単離された抗体はまた、組換え細胞内の原位置の抗体を含む。単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程又は単離工程に供された抗体である。したがって、単離された抗体はまた、異なる抗原特異性を有するその他の抗体を実質的に含まない抗体を含む（例えば、ヒトＭＡＧＥ－Ａ４、又はヒトＭＡＧＥ－Ａ４及びヒトＣＤ３に特異的に結合する単離された抗体は、ヒトＭＡＧＥ－Ａ４、又はヒトＭＡＧＥ－Ａ４及びヒトＣＤ３以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、本明細書に開示されるように、ヒトＭＡＧＥ－Ａ４に特異的に結合するものなどの単離された抗体は、いくつかの実施例では、１種以上のその他のＭＡＧＥ－Ａ４関連タンパク質又はペプチドに更に特異的に結合する場合がある。特定の実施形態によると、単離された抗体は、その他の細胞性物質及び／又は化学物質を実質的に含まない場合がある。

「特異的に結合する」又は同様の用語は、（二重特異性抗体を含む）抗体又はその抗原結合断片が、生理学的条件下で比較的安定である抗原と複合体を形成することを意味する。特異的結合は、少なくとも約１×１０^－６Ｍ以上の解離定数によって特徴付けられ得る。２つの分子が特異的に結合するかどうかを決定するための方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などを含む。しかしながら、ヒトＭＡＧＥ－Ａ４、又はヒトＭＡＧＥ－Ａ４及びヒトＣＤ３に特異的に結合する単離された抗体は、その他の種（定向進化遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ、オルソログ））由来のＭＡＧＥ－Ａ４分子及び／又はＣＤ３分子などのその他の抗原に対する交差反応性を有する場合がある。本発明の文脈において、ヒトＭＡＧＥ－Ａ４並びにＭＡＧＥ－Ａ４関連ペプチドを含む１つ以上の更なる抗原に結合する単一特異性抗体は、ヒトＭＡＧＥ－Ａ４に「特異的に結合する」とみなされる。本発明の文脈において、ヒトＭＡＧＥ－Ａ４及びヒトＣＤ３に結合する多重特異性（例えば、二重特異性）抗体、同様に１つ以上の追加の抗原は、ヒトＭＡＧＥ－Ａ４及びヒトＣＤ３に「特異的に結合する」とみなされる。

抗ＭＡＧＥ－Ａ４特異的結合領域及び抗ＣＤ３特異的結合領域を含む二重特異性抗体を、標準的な方法を使用して構築し、抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗原結合領域及び抗ＣＤ３抗原結合領域は、それぞれ、共通のＬＣＶＲと対をなす異なる別個のＨＣＶＲを含んでもよい。例示的な二重特異性抗体では、抗ＣＤ３抗体由来の重鎖、抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体由来の重鎖、及び抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体由来の共通軽鎖を利用して、分子を構築した。その他の場合では、二重特異性抗体は、抗ＣＤ３抗体由来の重鎖、抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体由来の重鎖、及び抗ＣＤ３抗体由来の軽鎖、又は無差別である、あるいは様々な重鎖アームと効果的に対をなすことが周知である抗体軽鎖を利用して構築されてもよい。

本発明の特定の実施形態によれば、抗ＭＡＧＥ－Ａ４×抗ＣＤ３二重特異性抗体、又はその抗原結合断片は、ヒトＭＡＧＥ－Ａ４に特異的に結合する第１の抗原結合領域及びヒトＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合領域を含み、第１の抗原結合領域は、それぞれ、配列番号４、配列番号６、及び配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲであるＡ１－ＨＣＤＲ１、Ａ１－ＨＣＤＲ２、及びＡ１－ＨＣＤＲ３を含み、第２の抗原結合領域は、それぞれ、配列番号５７又は配列番号７５、配列番号５９又は配列番号７７、及び配列番号６１又は配列番号７９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲであるＡ２－ＨＣＤＲ１、Ａ２－ＨＣＤＲ２、及びＡ２－ＨＣＤＲ３を含む。本発明の特定の実施形態によれば、抗ＭＡＧＥ－Ａ４×抗ＣＤ３二重特異性抗体、又はその抗原結合断片は、それぞれ、共通（第１の抗原結合領域及び第２の抗原結合領域の両方に対して）軽鎖相補的決定領域ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３を含む。一実施例では、共通軽鎖相補的決定領域は、配列番号１２、配列番号１４、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む。その他の実施例では、共通軽鎖相補的決定領域は、配列番号６５、配列番号１４、及び配列番号６７のアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態では、抗ＭＡＧＥ－Ａ４×抗ＣＤ３二重特異性抗体、又はその抗原結合断片は、ヒトＭＡＧＥ－Ａ４に特異的に結合する第１の抗原結合領域及びヒトＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合領域を含み、第１の抗原結合領域は、配列番号２、配列番号８３、又は配列番号１０７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、第２の抗原結合領域は、配列番号５５又は配列番号７３のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲを含む。特定の実施形態では、抗ＭＡＧＥ－Ａ４×抗ＣＤ３二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１０、配列番号６３、又は配列番号１１５のアミノ酸配列を含む共通軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。特定の実施形態では、抗ＭＡＧＥ－Ａ４×抗ＣＤ３二重特異性抗体、又はその抗原結合断片は、配列番号２／１０のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む第１の抗原結合領域、及び配列番号５５／１０のアミノ酸配列を含む、又は配列番号７３／１０のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む第２の抗原結合領域を含む。特定の実施形態では、抗ＭＡＧＥ－Ａ４×抗ＣＤ３二重特異性抗体、又はその抗原結合断片は、配列番号８３／１０のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む第１の抗原結合領域、及び配列番号５５／１０のアミノ酸配列を含む、又は配列番号７３／１０のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む第２の抗原結合領域を含む。特定の実施形態では、抗ＭＡＧＥ－Ａ４×抗ＣＤ３二重特異性抗体、又はその抗原結合断片は、配列番号１０７／１１５のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む第１の抗原結合領域、及び配列番号５５／１１５のアミノ酸配列を含む、又は配列番号７３／１１５のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む第２の抗原結合領域を含む。特定の実施形態では、抗ＭＡＧＥ－Ａ４×抗ＣＤ３二重特異性抗体、又はその抗原結合断片は、配列番号２／６３のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む第１の抗原結合領域、及び配列番号５５／６３のアミノ酸配列を含む、又は配列番号７３／６３のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む第２の抗原結合領域を含む。特定の実施形態では、抗ＭＡＧＥ－Ａ４×抗ＣＤ３二重特異性抗体、又はその抗原結合断片は、配列番号８３／６３のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む第１の抗原結合領域、及び配列番号５５／６３のアミノ酸配列を含む、又は配列番号７３／６３のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む第２の抗原結合領域を含む。特定の実施形態では、抗ＭＡＧＥ－Ａ４×抗ＣＤ３二重特異性抗体、又はその抗原結合断片は、配列番号１０７／６３のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む第１の抗原結合領域、及び配列番号５５／６３のアミノ酸配列を含む、又は配列番号７３／６３のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む第２の抗原結合領域を含む。いくつかの実施形態では、抗ＭＡＧＥ－Ａ４×抗ＣＤ３二重特異性抗体は、上記のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対と、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＭＡＧＥ－Ａ４×抗ＣＤ３二重特異性抗体は、上記のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対と、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＭＡＧＥ－Ａ４×抗ＣＤ３二重特異性抗体は、上記のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対と、ヒトＩｇＧ重鎖定常領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗ＭＡＧＥ－Ａ４×抗ＣＤ３二重特異性抗体は、上記のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対と、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域又はＩｇＧ４重鎖定常領域と、を含む。

本明細書に開示される抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体又はその抗原結合断片は、抗体が由来した対応する生殖系列配列と比較して、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のフレームワーク領域並びに／又はＣＤＲ領域において１種以上のアミノ酸置換、挿入、及び／又は欠失を含んでもよい。このような変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば、公共の抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって、容易に確認され得る。本開示は、本明細書に開示されるアミノ酸配列のうちのいずれかに由来する抗体及びその抗原結合断片を含み、１つ以上のフレームワーク及び／若しくはＣＤＲ領域内の１種以上のアミノ酸は、抗体が由来した生殖系列配列の対応する残基へ、又は別のヒト生殖系列配列の対応する残基へ、又は対応する生殖系列残基の保存的アミノ酸置換へ変異する（このような配列変化は本明細書でまとめて「生殖系列変異」と称される）。当業者は、本明細書に開示される重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列から出発して、１つ以上の個々の生殖系列変異又はこれらの組み合わせを含む多くの抗体及び抗原結合断片を、容易に産生し得る。特定の実施形態では、Ｖ_Ｈ領域及び／又はＶ_Ｌ領域内のフレームワーク及び／又はＣＤＲ残基は全て、抗体が由来した元の生殖系列配列において見出される残基へと、再び変異する。その他の実施形態では、特定の残基のみが元の生殖系列配列へと変異し戻され、例えば、変異した残基は、ＦＲ１の最初の８つのアミノ酸内に、若しくはＦＲ４の最後の８つのアミノ酸内に見出されるか、又は変異した残基は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、若しくはＣＤＲ３内にのみ見出される。その他の実施形態では、フレームワーク及び／又はＣＤＲ残基のうちの１つ以上は、異なる生殖系列配列（すなわち、抗体が本来由来した生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基へ変異する。更に、本開示の抗体は、フレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内に２つ以上の生殖系列変異の任意の組み合わせを含有してもよく、例えば、特定の個々の残基は、特定の生殖系列配列の対応する残基へ変異するのに対し、元の生殖系列配列とは異なる特定のその他の残基は、維持されるか、又は異なる生殖系列配列の対応する残基へと変異する。取得されると、１つ以上の生殖系列変異を含む抗体及び抗原結合断片は、結合特異性の改善、結合親和性の増加、拮抗的な（antagonistic）生物学的特性又は反発的な（agonistic）生物学的特性の改善又は増強（場合によって）、免疫原性の低減等の１つ以上の所望の特性について容易に試験され得る。この一般的な様式で取得される抗体及び抗原結合断片は、本開示内に包含される。

抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体は、１以上の保存的置換を有する、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれかの変異体を含んでもよい。例えば、抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体は、本明細書に記載のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれかに対して、例えば、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下、又は１の保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列を有し得る。

「抗原決定基」という用語は、抗原結合部位（パラトープ、paratope）として周知の抗体分子の可変領域における特異的抗原結合部位と相互作用する、抗原決定基を指す。単一の抗原は、２つ以上の抗原決定基を有してもよい。したがって、異なる抗体は抗原上の異なる領域に結合してもよく、異なる生物学的効果を有してもよい。抗原決定基は、立体配座又は直鎖状のいずれかであってもよい。立体配座抗原決定基は、直鎖状ポリペプチド鎖の異なるセグメント由来の空間的に並置されたアミノ酸によって、産生される。直鎖状抗原決定基は、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基によって産生されるものである。ある特定の状況において、抗原決定基は、抗原上の糖類、ホスホリル基、又はスルホニル基の部分を含んでもよい。

「実質的な同一性（substantial identity）」又は「実質的に同一である（substantially identical）」という用語は、核酸又はその断片を指す場合、別の核酸（又はその相補鎖）との適切なヌクレオチド挿入又は欠失と最適に整列した場合、以下で考察されるように、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、又はＧａｐなどの、配列同一性の任意の周知のアルゴリズムによって測定される際に、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９５％、より好ましくは、少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％のヌクレオチド配列同一性があることを示す。基準核酸分子と実質的な同一性を有する核酸分子は、特定の場合では、基準核酸分子によってコードされるポリペプチドと同じ又は実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよい。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号２２若しくは配列番号１０５の配列、又は配列番号２２若しくは配列番号１０５の一部分（例えば、配列番号２、若しくは配列番号８３の配列などのＨＣＶＲ、又は配列番号１０の配列などのＬＣＶＲ、又は配列番号２、配列番号１０、配列番号２２、若しくは配列番号１０５に見られるものなどポリペプチド配列のフレームワーク領域）に対して、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、又は１００％同一である配列を含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、このようなポリペプチドをコードするポリ核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号２１若しくは配列番号１０４の配列、又は配列番号２１若しくは配列番号１０４の一部分（例えば、配列番号１の配列などのＨＣＶＲ、又は配列番号９の配列などのＬＣＶＲ、又は配列番号１、配列番号９、配列番号２１、若しくは配列番号１０４などのポリヌクレオチド配列のフレームワーク領域）に対して、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、又は１００％同一である配列を含むポリ核酸を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号６９の配列、若しくはその一部分（配列番号５５など）、又は配列番号７１の配列、若しくはその一部分（配列番号６３など）、又は配列番号８１の配列、若しくはその一部分（配列番号７３など）に対して、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、又は１００％同一である配列を含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号６８の配列、若しくはその一部分（配列番号５４など）、又は配列番号７０の配列、若しくはその一部分（配列番号６２など）、又は配列番号８０の配列、若しくはその一部分（配列番号７２など）に対して、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、又は１００％同一である配列を含むポリ核酸を提供する。

ポリペプチドへ適用される場合、「実質的な類似性（substantial similarity）」又は「実質的に類似の（substantially similar）」という用語は、２つのペプチド配列が、既定のギャップ重みを使用してプログラムＧＡＰ又はプログラムＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列した場合、少なくとも９５％の配列同一性、更により好ましくは、少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換が異なる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）を備えた側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されたものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列の保存的置換が互いに異なる場合、配列同一性パーセント又は類似性の程度は、置換の保存的性質を補正するために上向きに調整されてもよい。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰｅａｒｓｏｎ（１９９４）ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３３１を参照のこと。類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン、（２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリン及びトレオニン、（３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン、（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン、（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、及びヒスチジン、（６）酸性側鎖：アスパラギン酸及びグルタミン酸、並びに（７）硫黄含有側鎖は、システイン及びメチオニン、が挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタミン酸－アスパラギン酸、及びアスパラギン－グルタミンである。あるいは、保存的置換とは、参照により本明細書に組み込まれるＧｏｎｎｅｔｅｔａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：１４４３－１４４５に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて正値を有する任意の変化である。「適度に保存的な」置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負以外の値を有する任意の変化である。

ポリペプチドに対する配列類似性は、配列同一性とも称され、典型的には、配列分析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失、及びその他の修飾に割り当てられた類似性の測定値を使用して、類似の配列を一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、異なる種の生物由来の相同ポリペプチドなどの密接に関連するポリペプチド間の、又は野生型タンパク質とその変異タンパク質との間の配列相同性又は配列同一性を決定するための既定パラメータと共に使用され得る、Ｇａｐ及びＢｅｓｔｆｉｔなどのプログラムを含む。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照のこと。ポリペプチド配列はまた、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムである既定パラメータ又は推奨パラメータを用いたＦＡＳＴＡを使用して、比較され得る。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、問い合わせ配列と検索配列との間の最良重複領域の整列及び配列同一性パーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）（上記参照））。ギャップオープンペナルティが１２、ギャップ拡張ペナルティが２、ＢＬＯＳＵＭ行列が６２でのアフィンギャップ検索を使用したＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを使用して、配列を比較もし得る。本開示の配列を、異なる生物由来の多数の配列を含むデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、既定パラメータを使用するコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰ又はＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、及びＡｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．（１９９７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９－４０２を参照のこと。

本明細書で使用される場合、「核酸」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボ核酸（Deoxyribo Nucleic Acid、ＤＮＡ）又はリボ核酸（Ribo Nucleic Acid、ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction、ＰＣＲ）によって生成される断片、並びに核酸連結、切断、エンドヌクレアーゼ作用、及びエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生成された断片などの、ヌクレオチド及び／又はポリヌクレオチドを指す。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド（ＤＮＡ及びＲＮＡなど）、若しくは天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチドのエナンチオマー型）、又はそれらの両方の組み合わせである単量体からなり得る。修飾されたヌクレオチドは、糖部分及び／又はピリミジン塩基部分若しくはプリン塩基部分において変化を有し得る。糖修飾は、例えば、ハロゲンを伴う１つ以上のヒドロキシル基、アルキル基、アミン基、及びアジド基での置換を含む、又は糖は、エーテル若しくはエステルとして官能化され得る。更に、糖部分全体は、アザ糖及び炭素環式糖類似体などの立体化学的及び電子的に類似した構造と置き換えられ得る。塩基部分における修飾の例としては、アルキル化プリン及びピリミジン、アシル化プリン若しくはピリミジン、又はその他の周知の複素環式置換基が挙げられる。核酸単量体は、ホスホジエステル結合又はこのような連鎖の類似体によって連結され得る。核酸は、単鎖又は二本鎖のいずれかであり得る。

「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）という用語は、標的細胞上に存在する成分に対する結合領域、例えば、所望の抗原（例えば、ＭＡＧＥ－Ａ４などの腫瘍抗原）に対する抗体系の特異性をＴ細胞受容体を活性化する細胞内領域と組み合わせて、特異的な抗標的細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を生成する分子を指す。一般に、ＣＡＲは、Ｔ細胞抗原受容体複合体ゼータ鎖の細胞内シグナル伝達領域に融合した細胞外単鎖抗体結合領域（ｓｃＦｖ）からなり、Ｔ細胞で発現した場合に、モノクローナル抗体の特異性に基づいて、抗原認識を方向転換する能力を有する。

「ＨＬＡ」という用語は、ヒト白血球抗原（Human Leukocyte Antigen、ＨＬＡ）系又は複合体を指し、これは、ヒトにおける主要組織適合遺伝子複合体（Major Histocompatibility Complex、ＭＨＣ）タンパク質をコードする遺伝子複合体である。これらの細胞表面タンパク質は、ヒトにおける免疫系の調節に関与している。ＭＨＣクラスＩ（Ａ、Ｂ、及びＣ）に対応するＨＬＡは、細胞内からペプチドを提示する。本出願の文脈において、ペプチドは、それがＨＬＡ系又は複合体に結合している場合、「ＨＬＡ結合」であり得る。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ結合ペプチドは、細胞の表面上に存在する。

「ＨＬＡ－Ａ」という用語は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座によってコードされるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の群を指す。ＨＬＡ－Ａは、３つの主要な種類のヒトＭＨＣクラスＩ細胞表面受容体のうちの１つである。受容体は、ヘテロ二量体であり、重α鎖及び小さなβ鎖からなる。α鎖は、変異体ＨＬＡ－Ａ遺伝子によってコードされており、β鎖（β２－ミクログロブリン）は、不変のβ２ミクログロブリン分子である。

「ＨＬＡ－Ａ２」という用語は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座における１つの特定のクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の対立遺伝子群である。α鎖は、ＨＬＡ－Ａ^＊０２遺伝子によってコードされ、β鎖は、β２－ミクログロブリン又はＢ２Ｍ遺伝子座によってコードされる。

本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、ウイルスベクター、プラスミド、ＲＮＡベクター、又は染色体、非染色体、半合成核酸若しくは合成核酸からなり得る線状若しくは環状のＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子を含むが、これらに限定されない。場合によっては、ベクターは、自律複製（遺伝子副体ベクター）及び／又はそれらが連結されている核酸の発現（発現ベクター）が可能なものである。多数の好適なベクターが当業者に周知であり、市販されている。ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）などのマイナス鎖ＲＮＡウイルス、ラブドウイルス（例えば、狂犬病及び水胞性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、はしか及びセンダイ）、ピコルナウイルス及びアルファウイルスなどのプラス鎖ＲＮＡウイルス、並びにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型及び２型、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス）、及びポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘、カナリア痘）を含む二本鎖ＤＮＡウイルスが挙げられる。その他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルス、及び肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例としては、トリ白血病肉腫、哺乳動物のＣ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ－ＢＬＶ群、及びレンチウイルスが挙げられる。

「共刺激領域」又は「共刺激分子」とは、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、これに限定されないが増殖などの細胞による共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞上の同族の結合パートナを指す。共刺激分子は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ、及びトール・リガンド受容体（Toll ligand receptor）を含むが、これらに限定されない。共刺激分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）（配列番号２９）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。共刺激分子は、効率的な免疫応答に必要な抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子である。

「共刺激リガンド」は、Ｔ細胞上の同族の共刺激分子に特異的に結合し、それによりシグナルを提供する抗原提示細胞上の分子を指し、そのシグナルは、例えば、ペプチドを担持したＭＨＣ分子とのＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によって提供される一次的シグナルに加えて、増殖活性化、分化などを含むがこれらに限定されないＴ細胞応答を媒介する。共刺激リガンドは、ＣＤ７、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（Inducible COStimulatory Ligand、ＩＣＯＳ－Ｌ）、細胞間接着分子（Inter Cellular Adhesion Molecule、ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ－Ｇ、ＭＩＣＡ、Ｍ１ＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンベータ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、トール・リガンド受容体に結合するアゴニスト又は抗体、及びＢ７－Ｈ３と特異的に結合するリガンドを含み得るが、これらに限定されない。

「共刺激シグナル」とは、ＴＣＲ／ＣＤ３核酸連結などの一次的シグナルと組み合わせて、Ｔ細胞増殖及び／又は重要な分子の上方調節又は下方調節をもたらすシグナルを指す。

本明細書で使用される場合、「細胞外リガンド結合領域」という用語は、リガンド、例えば、細胞表面分子に結合することが可能なオリゴペプチド又はポリペプチドを指す。例えば、細胞外リガンド結合領域は、特定の病状（例えば、癌）に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように、選択されてもよい。リガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例としては、ウイルス、細菌、及び寄生虫の感染、自己免疫疾患、並びに癌細胞に関連するものが挙げられる。細胞外リガンド結合領域は、（例えば、ｓｃＦｖとしてフォーマットされた）ＬＣＶＲ領域及びＨＣＶＲ領域を含み得、任意選択で、リンカによって連結され得る。

「被検体」又は「患者」という用語は、本明細書で使用される場合、非ヒト霊長類及びヒトを含む動物界の全ての成員を含む。一実施形態では、患者は、癌（例えば、多発性骨髄腫又は黒色腫）を有するヒトである。

本明細書で使用される場合、ＣＡＲの「シグナル伝達（signal transducing）領域」又は「シグナル伝達（signaling）領域」は、細胞外リガンド結合領域の標的への結合に続く細胞内シグナル伝達に関与し、免疫細胞及び免疫応答の活性化をもたらす。換言すれば、シグナル伝達領域は、ＣＡＲが発現される免疫細胞の正常なエフェクタ機能のうちの少なくとも１つの活性化に関与する。例えば、Ｔ細胞のエフェクタ機能は、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性又はヘルパー活性であり得る。したがって、「シグナル伝達領域」という用語は、エフェクタ機能シグナルを伝達し、細胞に特殊な機能を実施するように指示するタンパク質の部分を指す。ＣＡＲにおいて使用するためのシグナル伝達領域の例としては、抗原受容体の関与に続いて協調して作用してシグナル伝達を開始する、Ｔ細胞受容体及び共受容体の細胞質配列、並びにこれらの配列の任意の誘導体又は変異体及び同じ機能を有する任意の合成配列であり得る。場合によっては、シグナル伝達領域は、抗原依存性の一次的活性化を開始するもの、及び抗原非依存的に作用して二次的シグナル又は共刺激シグナルを提供するものの２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列を含む。一次的細胞質シグナル伝達配列は、ＩＴＡＭ（Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif）の免疫受容活性化チロシンモチーフとして周知である、シグナル伝達モチーフを含み得る。ＩＴＡＭは、ｓｙｋ／ｚａｐ７０クラスチロシンキナーゼの結合部位として作用する、様々な受容体の細胞質内尾部に見出される明確なシグナル伝達モチーフである。代表的なＩＴＡＭとしては、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＦｃＲイプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達領域は、ＣＤ３ゼータシグナル伝達領域（配列番号３０）を含み得る。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、Ｔ細胞の特異性を、細胞（例えば、癌細胞）の表面上の抗体に認識される抗原が細胞表面で発現しようとも、細胞内で発現し、例えば、ＨＬＡによって提示されようとも、それらの抗原に方向転換し得る。

本開示の一態様は、腫瘍細胞などの細胞の表面上に提示されるＭＡＧＥ－Ａ４抗原に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。この提示は、例えば、ＨＬＡ－Ａ２などのＨＬＡによるものであり得る。本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、細胞外標的特異的結合領域、膜貫通領域、細胞内シグナル伝達領域（ＣＤ３ゼータ又はＦｃＲガンマに由来するシグナル伝達領域など）、及び／又は４－１ＢＢなどであるがこれに限定されない、共刺激分子に由来する１つ以上の共刺激シグナル伝達領域を含む。一実施形態では、ＣＡＲは、細胞外結合領域と膜貫通領域との間に、ＣＤ８アルファヒンジなどのヒンジ又はスペーサー領域を含む。

ＣＡＲの結合領域又は細胞外領域は、目的の標的抗原に結合する能力をＣＡＲに提供する。結合領域（例えば、リガンド結合領域又は抗原結合領域）は、生体分子（例えば、細胞表面受容体又は腫瘍タンパク質、又はそれらの成分）を特異的に認識して結合する能力を有する任意のタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、又はペプチドであり得る。結合領域は、目的の生体分子に対して、天然に存在する、合成の、半合成の、又は組換えにより産生された結合パートナを含む。例えば、本明細書に更に記載されるように、結合領域は、抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域であり得るか、又は軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、単鎖及びいずれかの方向で一緒に連結され得る（例えば、ＶＬ－ＶＨ又はＶＨ－ＶＬ）。ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、又は表面プラズモン共鳴分析（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ分析を使用）を含む、特定の標的と特異的に結合する本開示の結合領域を同定するための様々なアッセイが、周知である。標的は、腫瘍の死滅をもたらすエフェクタ免疫応答を誘発することが望ましい、臨床的な目的の抗原であってもよい。一実施形態では、キメラ抗原受容体の結合領域の標的抗原は、腫瘍細胞の表面上のＭＡＧＥ－Ａ４タンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ａ２に提示されたＭＡＧＥ－Ａ４タンパク質などのＨＬＡに提示されたＭＡＧＥ－Ａ４タンパク質）である。

例示的なリガンド結合領域としては、ｓｃＦｖ、ｓｃＴＣＲなどの抗体の抗原結合断片などの抗原結合タンパク質、受容体の細胞外領域、細胞表面分子／受容体に対するリガンド、又はそれらの受容体結合領域、及び腫瘍結合タンパク質が挙げられる。特定の実施形態では、本開示のＣＡＲに含まれる抗原結合領域は、可変領域（Ｆｖ）、ＣＤＲ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ、領域抗体変異体（ｄＡｂ）、ラクダ抗体（ＶＨＨ）、フィブロネクチン３領域変異体、アンキリン反復変異体、及びその他のタンパク質骨格に由来するその他の抗原特異的結合領域であり得る。

一実施形態では、ＣＡＲの結合領域は、抗ＭＡＧＥ－Ａ４単鎖抗体（ｓｃＦｖ）であり、マウス、ヒト、又はヒト化ｓｃＦｖであってもよい。単鎖抗体は、所望の標的に特異的なハイブリドーマ（雑種細胞）のＶ領域遺伝子からクローン化されてもよい。可変領域重鎖（ＶＨ）及び可変領域軽鎖（ＶＬ）のクローニングのために使用され得る技術は、例えば、Ｏｒｌａｎｄｉｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ，１９８９；８６：３８３３－３８３７に記載されている。したがって、特定の実施形態では、結合領域は、抗体由来の結合領域を含むが、非抗体由来の結合領域であり得る。抗体由来の結合領域は、抗体の断片、又は１つ以上の抗体の断片の遺伝子操作された産物であり得、その断片は、抗原との結合に関与する。

特定の実施形態では、本開示のＣＡＲは、分子の適切な間隔及びコンフォメーションのために付加された、様々な領域間のリンカを含んでもよい。例えば、一実施形態では、１～２０アミノ酸長であり得る、結合領域ＶＨ又はＶＬの間に、リンカが存在してもよい。その他の実施形態では、キメラ抗原受容体の領域のうちのいずれかの間のリンカは、１～１５又は１５アミノ酸長であってもよい。これに関して、リンカは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０アミノ酸長であってもよい。更なる実施形態では、リンカは、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０アミノ酸長であってもよい。本明細書に記載される数を含む範囲もまた、本明細書に含まれるが、例えば、１０～３０アミノ酸長のリンカである。

特定の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲにおける使用に適したリンカは、可撓性リンカである。好適なリンカは、容易に選択され得、４アミノ酸～１０アミノ酸、５アミノ酸～９アミノ酸、６アミノ酸～８アミノ酸、又は７アミノ酸～８アミノ酸を含む、１アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）～２０アミノ酸、２アミノ酸～１５アミノ酸、３アミノ酸～１２アミノ酸などの異なる長さの好適なもののうちのいずれかであり得、１、２、３、４、５、６、又は７アミノ酸であってもよい。

代表的な可撓性リンカとしては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン－セリンポリマー（式中、ｎは、少なくとも１つの整数である）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、及び当該技術分野において周知のその他の可撓性リンカが挙げられる。グリシンポリマー及びグリシン－セリンポリマーは比較的構築化されておらず、したがって、本明細書に記載されるＣＡＲなどの融合タンパク質の領域間の中性テザーとして機能することができる場合がある。グリシンは、アラニンよりもはるかに多くのファイ（ｐｈｉ）－プサイ（ｐｓｉ）空間にアクセスし、より長い側鎖を有する残基よりもはるかに制限が少なくなる（Ｓｃｈｅｒａｇａ，Ｒｅｖ．ＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌＣｈｅｍ．１１１７３－１４２（１９９２）を参照のこと）。通常、当業者は、リンカが、可撓性リンカ及び所望のＣＡＲ構造について提供するためのより可撓性の低い構造を与える１つ以上の部分を含み得るように、ＣＡＲの設計が、全て又は部分的に可撓性であるリンカを含み得ることを認識するであろう。特定のリンカは、配列番号２３～２５に示されるように、（Ｇ４Ｓ）_ｎリンカを含み、式中、ｎ＝１～３である。別の代表的なリンカは、配列番号２６として提供される。リンカは、ＣＡＲのＬＣＶＲ領域とＨＣＶＲ領域との間に、可変領域（ＨＣＶＲなど）とヒンジ領域（ＣＤ８αヒンジなど）との間に、又はそれらの両方に、存在し得る。例えば、本開示は、ＬＣＶＲとＨＣＶＲとの間の（Ｇ４Ｓ）３リンカ、及びＨＣＶＲとＣＤ８αヒンジとの間の（Ｇ４Ｓ）１リンカを含むＣＡＲを提供する。

ＣＡＲの結合領域の後には、「スペーサー」又は「ヒンジ」が続いてもよく、これは、抗原結合領域をエフェクタ細胞表面から遠ざけて、適切な細胞／細胞接触、抗原結合、及び活性化を可能にする領域を指す（Ｐａｔｅｌｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，１９９９；６：４１２－４１９）。ＣＡＲのヒンジ領域は、一般に、膜貫通（transmembrane、ＴＭ）と結合領域との間にある。特定の実施形態では、ヒンジ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域であり、野生型免疫グロブリンヒンジ領域又は変性された野生型免疫グロブリンヒンジ領域であってもよい。本明細書に記載されるＣＡＲにおいて使用されるその他の代表的なヒンジ領域としては、ＣＤ８アルファ、ＣＤ４、ＣＤ２８、及びＣＤ７などの１型膜タンパク質の細胞外領域に由来するヒンジ領域が挙げられるが、これらは、これらの分子からの野生型ヒンジ領域であってもよいか、又は変性されてもよい。一実施形態では、ヒンジ領域は、ＣＤ８アルファヒンジ（配列番号２７）を含む。

「膜貫通」領域（region）又は領域（domain）は、細胞外結合部分を免疫エフェクタ細胞の原形質膜に固定し、結合領域の標的抗原への結合を促進するＣＡＲの部分である。膜貫通領域はＣＤ３ゼータ膜貫通領域であってもよいが、採用され得るその他の膜貫通領域は、ＣＤ８アルファ、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ１５４から取得されたものを含む。一実施形態では、膜貫通領域は、ＣＤ１３７の膜貫通領域である。いくつかの実施形態では、膜貫通領域は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、膜貫通領域は合成であり、その場合、それは、ロイシン及びバリンなどの主に疎水性の残基を含むであろう。

「細胞内シグナル伝達領域」又は「シグナル伝達領域」とは、キメラ抗原受容体タンパク質の一部を指し、それは標的抗原に結合する効果的なＣＡＲのメッセージを免疫エフェクタ細胞の内部に伝達して、エフェクタ細胞機能、例えば、活性化、サイトカイン産生、増殖、及び細胞傷害性因子のＣＡＲが結合した標的細胞への放出を含む細胞傷害性活性、又は細胞外ＣＡＲ領域への抗原結合で誘発されるその他の細胞応答を誘発することに関与する。「エフェクタ機能」という用語は、細胞の特殊な機能を指す。Ｔ細胞のエフェクタ機能は、例えば、細胞溶解活性又はサイトカインの分泌を含む補助又は活性であってもよい。したがって、本明細書で互換的に使用される「細胞内シグナル伝達領域」又は「シグナル伝達領域」という用語は、エフェクタ機能シグナルを伝達し、細胞に特殊な機能を実施するように指示するタンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達領域全体を採用することができるが、多くの場合、領域全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達領域の短縮部分が使用される範囲で、エフェクタ機能シグナルを伝達する限り、領域全体の代わりにこのような短縮部分を使用してもよい。細胞内シグナル伝達領域という用語は、エフェクタ機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達領域の任意の短縮部分を含むことを、意味する。細胞内シグナル伝達領域は「シグナル伝達領域」としても周知であり、典型的には、ヒトＣＤ３又はＦｃＲｙ鎖の部分に由来する。

Ｔ細胞受容体のみを介して生成されるシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であり、二次的シグナル又は共刺激シグナルも必要であることが周知である。したがって、Ｔ細胞の活性化は、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列、すなわち、Ｔ細胞受容体を介して抗原依存性の一次的活性化を開始するもの（一次的細胞質シグナル伝達配列）、及び抗原非依存的に作用して二次的シグナル又は共刺激シグナルを提供するもの（二次細胞質シグナル伝達配列）によって媒介されると言うことができる。共刺激的に作用する細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又はＩＴＡＭとして周知のシグナル伝達モチーフを含んでもよい。

本開示において特に有用である一次的細胞質シグナル伝達配列を含むＩＴＡＭの例としては、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。１つの特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＭＡＧＥ－Ａ４ＣＡＲの細胞内シグナル伝達領域は、ＣＤ３ゼータに由来する。いくつかの実施形態では、シグナル伝達領域は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。

本明細書で使用される場合、「共刺激シグナル伝達領域」又は「共刺激領域」という用語は、共刺激分子の細胞内領域を含むＣＡＲの部分を指す。共刺激分子は、抗原受容体又はＦｃ受容体以外の細胞表面分子であり、抗原に結合する際に、Ｔリンパ球の効率的な活性化及び機能に必要な第２のシグナルを提供する。このような共刺激分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＤ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ２、及びＣＤ８３に特異的に結合するリガンドが挙げられる。したがって、本開示は、ＣＤ３ゼータ及び４－１ＢＢに由来する代表的な共刺激領域を提供するが、一方で、その他の共刺激領域は、本明細書に記載されるＣＡＲでの使用が企図される。１つ以上の共刺激シグナル伝達領域を含むことによって、ＣＡＲ受容体を発現するＴ細胞の有効性及び増殖が増強される場合がある。細胞内シグナル伝達及び共刺激シグナル伝達領域は、膜貫通領域のカルボキシル末端に直列で任意の順序で連結されてもよい。いくつかの実施形態では、共刺激領域は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。

ＣＤ３又はＦｃＲガンマ由来のシグナル伝達領域を含むように操作されたｓｃＦｖ系のＣＡＲは、Ｔ細胞の活性化及びエフェクタ機能についての強力なシグナルを伝達することが示されているが、それらは、付随する共刺激シグナルの非存在下においては、Ｔ細胞の生存及び増殖を促進するシグナルを誘発するのに十分ではない。１つ以上の共刺激シグナル伝達領域（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、及びＣＤ２７８に由来する細胞内共刺激領域）と共に、結合領域、ヒンジ、膜貫通、及びＣＤ３ゼータ又はＦｃＲガンマに由来するシグナル伝達領域を含むその他のＣＡＲは、生体外のＣＡＲを発現するＴ細胞において、並びに動物モデル及び癌患者において、抗腫瘍活性並びにサイトカイン分泌、溶解活性、生存及び増殖の増加をより効果的に指示し得る（Ｍｉｌｏｎｅｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ，２００９；１７：１４５３－１４６４；Ｚｈｏｎｇｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ，２０１０；Ｚｈｏｎｇｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ，２０１０；１８：４１３－４２０；Ｃａｒｐｅｎｉｔｏｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ，２００９；１０６：３３６０－３３６５）。

各種実施形態では、本開示の抗ＭＡＧＥ－Ａ４ＣＡＲは、（ａ）結合領域として抗ＭＡＧＥ－Ａ４ｓｃＦｖ（例えば、表１において同定された抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体由来の結合領域（例えば、ＣＤＲ又は可変領域）を有するｓｃＦｖ）、（ｂ）ヒトＣＤ８アルファに由来するヒンジ領域、（ｃ）ヒトＣＤ８アルファ膜貫通領域、及び（ｄ）ヒトＴ細胞受容体ＣＤ３ゼータ鎖（ＣＤ３）細胞内シグナル伝達領域、及び任意選択で、１つ以上の共刺激シグナル伝達領域、例えば、４－１ＢＢを含む。一実施形態では、様々なタンパク質領域は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、結合領域、ヒンジ領域、及び膜貫通領域の順序で配置される。細胞内シグナル伝達領域及び所望による共刺激シグナル伝達領域は、膜貫通のカルボキシ末端に任意の順序で直列に連結されて、単鎖キメラポリペプチドを形成する。一実施形態では、抗ＭＡＧＥ－Ａ４ＣＡＲをコードする核酸構成は、様々なコード配列、例えば、（５’から３’へ）ヒト抗ＭＡＧＥ－Ａ４ｓｃＦｖ、ヒトＣＤ８アルファヒンジ、ヒトＣＤ８アルファ膜貫通領域、及びＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達領域のコード配列を含む核酸分子を含むキメラ核酸分子である。別の実施形態では、抗ＭＡＧＥ－Ａ４ＣＡＲをコードする核酸構成は、様々なコード配列、例えば、（５’から３’へ）ヒト抗ＭＡＧＥ－Ａ４ｓｃＦｖ、ヒトＣＤ８アルファヒンジ、ヒトＣＤ８アルファ膜貫通領域、４－１ＢＢ共刺激領域、及びＣＤ３ゼータ共刺激領域のコード配列を含む核酸分子を含むキメラ核酸分子である。

特定の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、ベクターに挿入される。ベクターは、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを共有結合で挿入して、そのタンパク質の発現及び／又はポリヌクレオチドのクローニングについてもたらすことができる媒体である。このようなベクターは、「発現ベクター」と称される場合もある。単離されたポリヌクレオチドは、当該技術分野で周知の任意の好適な方法を使用してベクターに挿入されてもよく、例えば、限定するものではないが、ベクターを適切な制限酵素を使用して消化し、次に、一致する制限末端を有する単離ポリヌクレオチドと核酸連結する場合がある。発現ベクターは、細胞内で転写されることが可能な遺伝子産物の少なくとも一部についてコードする異種又は修飾された核酸配列を組み込んで発現する能力を、有し得る。ほとんどの場合、ＲＮＡ分子は、タンパク質に翻訳される。発現ベクターは、様々な制御配列を含み得るが、これは、特定の宿主生物において作動可能に連結されたコード配列の転写、及び場合によっては翻訳のために必要な、核酸配列を指す。転写及び翻訳を調節する制御配列に加えて、ベクター及び発現ベクターは、同様に他に機能も果たす核酸配列を含む場合があり、以下で考察される。発現ベクターは、追加の要素を含んでもよく、例えば、発現ベクターは、２つの複製システムを有してもよく、したがって、それを２つの生物、例えば、発現のためのヒト細胞並びにクローニング及び増幅のための原核生物宿主において維持されることを可能にする。

発現ベクターは、ＣＭＶ、ＰＧＫ及びＥＦ１アルファプロモータなどのプロモータ配列、リボソーム認識及び結合ＴＡＴＡボックス、及びそれぞれの宿主細胞における効率的な遺伝子転写及び翻訳のための３’ＵＴＲＡＡＵＡＡＡ転写終結配列などの、必要な５’上流調節要素及び３’下流調節要素を有してもよい。その他の好適なプロモータとしては、シミアンウイルス４０（Simian Virus 40、ＳＶ４０）初期プロモータ、マウス乳腺腫瘍ウイルス（Mouse Mammary Tumor Virus、ＭＭＴＶ）、ＨＩＶＬＴＲプロモータ、ＭｏＭｕＬＶプロモータ、トリ白血病ウイルスプロモータ、ＥＢＶ即時初期プロモータ、及びラウス肉腫ウイルスプロモータの構成的プロモータを含む。アクチンプロモータ、ミオシンプロモータ、ヘモグロビンプロモータ、及びクレアチンキナーゼプロモータを含むがこれらに限定されない、ヒト遺伝子プロモータもまた使用されてもよい。特定の実施形態では、誘導性プロモータもまた、キメラ抗原受容体を発現するベクターの一部として企図される。これは、目的のポリヌクレオチド配列の発現をオンにするか、又は発現をオフにすることが可能な分子スイッチを提供する。誘導性プロモータの例としては、メタロチオニンプロモータ、グルココルチコイドプロモータ、プロゲステロンプロモータ、又はテトラサイクリンプロモータが挙げられるが、これらに限定されない。

発現ベクターは、発現されたＣＡＲに組み込まれる６ｘ－ヒスチジン、ｃ－Ｍｙｃ、及びＦＬＡＧタグなどの追加の配列を有してもよい。したがって、発現ベクターは、５’及び３’の非翻訳調節配列を含むように操作されてもよいが、これは、発現ベクター上で運ばれる目的の核酸の効率的な転写を促進又は増強し得るエンハンサ配列、プロモータ領域及び／又はターミネーター配列として機能し得る。発現ベクターはまた、特定の細胞型、細胞位置、又は組織型における複製及び／又は発現機能性（例えば、転写及び翻訳）のために、操作されてもよい。発現ベクターは、宿主又は受容細胞におけるベクターの維持のための選択可能なマーカーを含んでもよい。

各種実施形態では、ベクターは、プラスミド、自律的に複製する配列、及び転位要素である。追加の代表的なベクターとしては、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（Yeast Artificial Chromosome、ＹＡＣ）、細菌人工染色体（Bacterial Artificial Chromosome、ＢＡＣ）、又はＰ１由来人工染色体（P1-derived Artificial Chromosome、ＰＡＣ）などの人工染色体、ラムダファージ又はＭ１３ファージなどのバクテリオファージ、及び動物ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターとして有用な動物ウイルスのカテゴリーの例としては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、及びパポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられるが、これらに限定されない。発現ベクターの例は、哺乳動物細胞における発現のための、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ（商標）ＢｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（Ｎｅｏ）ベクター（Ｃｌｏｎｔｒｃｈ社製）、ＰＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、哺乳動物細胞におけるレンチウイルス媒介遺伝子移入及び発現のための、ｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５－ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５－ＤＥＳＴ（商標）、及びｐＬｅｎｔｉ６．２Ｎ５－ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）である。本明細書に開示されるＣＡＲのコード配列は、哺乳動物細胞におけるキメラタンパク質の発現のために、このような発現ベクターに核酸連結され得る。

特定の実施形態では、本開示のＣＡＲをコードする核酸は、ウイルスベクターにおいて提供される。ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、又は泡沫状ウイルスに由来するものであり得る。本明細書で使用される場合、「ウイルスベクター」という用語は、少なくとも１つのウイルス起源の要素を含み、ウイルスベクター粒子にパッケージ化される能力を有する核酸ベクター構成を指す。ウイルスベクターは、非必須ウイルス遺伝子の代わりに、本明細書に記載される様々なキメラタンパク質についてのコード配列を含み得る。生体外又は生体内のいずれかでＤＮＡ、ＲＮＡ、又はその他の核酸を細胞に移入させる目的で、ベクター及び／又は粒子が利用され得る。ウイルスベクターの多くの形態が、当該技術分野において周知である。

特定の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲのコード配列を含むウイルスベクターは、レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである。「レトロウイルスベクター」という用語は、主にレトロウイルスに由来する構造的遺伝子要素及び機能的遺伝子要素を含むベクターを指す。「レンチウイルスベクター」という用語は、主にレンチウイルスに由来する、ＬＴＲの外側の構造的遺伝子要素及び機能的遺伝子要素を含むベクターを指す。

本明細書で使用するレトロウイルスベクターは、任意の周知のレトロウイルス（例えば、モロニーマウス肉腫ウイルス（Moloney Murine Sarcoma Virus、ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（Harvey Murine Sarcoma Virus、ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（Murine Mammary Tumor Virus、ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（Gibbon ape Leukemia Virus、ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（Feline Leukemia Virus、ＦＬＶ）、スプマウイルス、フレンド、マウス幹細胞ウイルス（Murine Stem Cell Virus、ＭＳＣＶ）及びラウス肉腫ウイルス（Rous Sarcoma Virus、ＲＳＶ）などのｃ型レトロウイルス）に由来し得る。本開示の「レトロウイルス」はまた、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ＨＴＬＶ－１及びＨＴＬＶ－２、並びにヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、サル免疫不全ウイルス（Simian Immunodeficiency Virus、ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（Feline Immunodeficiency Virus、ＦＩＶ）、ウマ免疫不全ウイルス（Equine Immnodeficiency Virus、ＥＩＶ）及びそのその他のクラスのレトロウイルスなどレトロウイルスのレンチウイルスファミリーを含む。

本明細書で使用するレンチウイルスベクターは、ゆっくりと進行する疾患を引き起こすレトロウイルスの群（又は属）であるレンチウイルスに由来するベクターを指す。この群に含まれるウイルスとしては、ＨＩＶ（ＨｕｍａｎＩｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙＶｉｒｕｓ、ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ１型及びＨＩＶ２型を含む）、ビスナ－マエディ（visna-maedi）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（caprine arthritis-encephalitis virus）、ウマ伝染性貧血ウイルス（equine infectious anemia virus）、ネコ免疫不全ウイルス（Feline Immunodeficiency Virus、ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（Bovine Immune deficiency Vvirus、ＢＩＶ）、及びサル免疫不全ウイルス（Simian Immunodeficiency Virus、ＳＩＶ）が挙げられる。組換えレンチウイルスの調製は、Ｄｕｌｌら及びＺｕｆｆｅｒｅｙらによる方法を使用して達成され得る（Ｄｕｌｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９８；７２：８４６３－８４７１、及びＺｕｆｆｅｒｅｙｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９８；７２：９８７３－９８８０）。

本開示における使用のためのレトロウイルスベクター（すなわち、レンチウイルス及び非レンチウイルスの両方）は、本明細書に記載される順序及び配向で、所望のＤＮＡ配列を組み合わせることによって、標準的なクローニング技術を使用して形成され得る（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔａｌ．（ｅｄｓ．）ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９），Ｓｅｃｔｉｏｎｓ９．１０－９．１４及びその他の標準的な実験室マニュアル，Ｅｇｌｉｔｉｓ，ｅｔａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０：１３９５－１３９８；ＤａｎｏｓａｎｄＭｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：６４６０－６４６４，Ｗｉｌｓｏｎｅｔａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：３０１４－３０１８，Ａｒｍｅｎｔａｎｏｅｔａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：６１４１－６１４５，Ｈｕｂｅｒｅｔａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：８０３９－８０４３，Ｆｅｒｒｙｅｔａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：８３７７－８３８１，Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙｅｔａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１８０２－１８０５；ｖａｎＢｅｕｓｅｃｈｅｍｅｔａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：７６４０－７６４４；Ｋａｙｅｔａｌ．（１９９２）ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ３：６４１－６４７；Ｄａｉｅｔａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０８９２－１０８９５，Ｈｗｕｅｔａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１５０：４１０４－４１１５；米国特許第４，８６８，１１６号、同第４，９８０，２８６号、ＰＣＴ国際公開特許第８９／０７１３６号、同第８９／０２４６８号、同第８９／０５３４５号、及び同第９２／０７５７３号）。

ベクターの形成において使用するためのレトロウイルス（すなわち、レンチウイルス及び非レンチウイルスの両方）配列を取得するための好適な供給源は、例えば、ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（アメリカンタイプカルチャーコレクション、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））、ロックビル、メリーランド州、を含む市販の供給源から入手可能な、ゲノムＲＮＡ及びｃＤＮＡを含む。配列はまた、化学的に合成され得る。

抗ＭＡＧＥ－Ａ４ＣＡＲの発現のために、ベクターを宿主細胞に導入して、宿主細胞内でのポリペプチドの発現を可能にしてもよい。発現ベクターは、プロモータ配列、転写開始配列、エンハンサ配列、選択可能なマーカー、及びシグナル配列を含むがこれらに限定されない、発現を制御するための様々な要素を含有してもよい。これらの要素は、本明細書に記載されるように、当業者によって適切に選択されてもよい。例えば、プロモータ配列は、ベクターにおけるポリヌクレオチドの転写を促進するように選択されてもよい。好適なプロモータ配列は、Ｔ７プロモータ、Ｔ３プロモータ、ＳＰ６プロモータ、ベータアクチンプロモータ、ＥＦ１ａプロモータ、ＣＭＶプロモータ、及びＳＶ４０プロモータを含むが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドの転写を増強するために、エンハンサ配列を選択してもよい。ベクターが挿入された宿主細胞をそうでないものから選択できるように、選択可能なマーカーを選択してもよく、例えば、選択可能なマーカーは、抗生物質耐性を付与する遺伝子であってもよい。シグナル配列は、発現されたポリペプチドが宿主細胞の外に輸送されることを可能にするように選択されてもよい。

ポリヌクレオチドのクローニングのために、ベクターを宿主細胞（単離された宿主細胞）に導入して、ベクター自体の複製を可能にし、それにより、そこに含まれるポリヌクレオチドのコピーを増幅してもよい。クローニングベクターは、一般に、複製起点、プロモータ配列、転写開始配列、エンハンサ配列、及び選択可能なマーカーを含むがこれらに限定されない配列成分を含有してもよい。これらの要素は、当業者によって適切に選択されてもよい。例えば、複製起点は、宿主細胞におけるベクターの自律複製を促進するように選択されてもよい。

特定の実施形態では、本開示は、本明細書で提供されるベクターを含む単離された宿主細胞を提供する。ベクターを含む宿主細胞は、ベクター中に含まれるポリヌクレオチドの発現又はクローニングにおいて、有用である場合がある。好適な宿主細胞は、原核細胞、真菌細胞、酵母細胞、又は哺乳動物細胞などの高等真核細胞を含み得るが、これらに限定されない。この目的に好適な原核生物細胞としては、グラム陰性生物又はグラム陽性生物などの真正細菌、例えば、大腸菌（Escherichia）などの腸内細菌（Enterobactehaceae）、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、エンテロバクター属（Enterobacter）、エルウィニア族（Erwinia）、クレブシエラ属（Klebsiella）、プロテウス属（Proteus）、サルモネラ属（Salmonella）、例えばサルモネラ菌（Salmonella typhimurium）、セラシア属（Serratia）、例えば、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescans）及び志賀菌属（Shigella）、並びに、枯草菌（B.subtilis）及びバチルス・リケニフォルミス（B.licheniformis）などの桿菌（Bacilli）、緑膿菌（P.aeruginosa）などのシュードモナス菌（Pseudomonas）、並びにストレプトマイセス属（Streptomyces）が挙げられるが、これらに限定されない。

本開示のＣＡＲは、当該技術分野で周知の形質移入技術及び／又は形質導入技術を使用して、宿主細胞に導入され得る。本明細書で使用される場合、「形質移入」及び「形質導入」という用語は、外因性核酸配列が宿主細胞に導入されるプロセスを指す。核酸は、宿主細胞のＤＮＡに組み込まれてもよいか、又は染色体外で維持されてもよい。核酸は一過性に維持されてもよいか、又は安定した導入であってもよい。形質移入は、リン酸カルシウム－ＤＮＡ共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介形質移入、ポリブレン媒介形質移入、電気穿孔法、微量注射法、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、及びバイオリスティック法を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で周知の様々な手段によって達成されてもよい。形質導入は、形質移入によってではなく、ウイルス感染によるウイルス又はレトロウイルスベクターを使用した遺伝子の送達を指す。特定の実施形態では、レトロウイルスベクターは、細胞と接触する前にベクターをウイルス粒子にパッケージングすることによって、形質導入される。例えば、レトロウイルスベクターによって運ばれる抗ＭＡＧＥ－Ａ４ＣＡＲをコードする核酸は、感染及びプロウイルスの組み込みを介して、細胞に形質導入され得る。

本明細書で使用される場合、「遺伝子操作された」又は「遺伝子修飾された」という用語は、細胞内の全遺伝物質への、ＤＮＡ又はＲＮＡの形態の余分な遺伝物質の添加を指す。「遺伝子修飾細胞」、「修飾細胞」、及び「方向転換された細胞」という用語は、互換的に使用される。

特に、本開示のＣＡＲは、それらの特異性を、目的の標的抗原、例えば、ＨＬＡ－Ａ２と共にＭＡＧＥ－Ａ４を提示する悪性細胞などの悪性のＭＡＧＥ－Ａ４を発現する細胞に方向転換するように、免疫エフェクタ細胞に導入及び発現される。

本開示は、本明細書に記載されるＣＡＲを発現する免疫エフェクタ細胞を作製するための方法を提供する。一実施形態では、方法は、免疫エフェクタ細胞が本明細書に記載される１つ以上のＣＡＲを発現するように、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する腫瘍細胞を有する対象などの対象から単離された免疫エフェクタ細胞に、形質移入又は形質導入することを含む。特定の実施形態では、免疫エフェクタ細胞は、個体から単離され、生体外で更に操作することなく遺伝子修飾される。次に、このような細胞は、個体に直接再投与され得る。更なる実施形態では、免疫エフェクタ細胞は、ＣＡＲを発現するように遺伝子修飾される前に、生体外で最初に活性化及び刺激されて増殖する。これに関して、免疫エフェクタ細胞は、遺伝子修飾される（すなわち、本明細書に記載されるように、ＣＡＲを発現するように形質導入又は形質移入される）前又は後に培養されてもよい。

本明細書に記載される免疫エフェクタ細胞の生体外操作又は遺伝子修飾の前に、細胞の供給源を対象から取得してもよい。特に、本明細書に記載されるＣＡＲと共に使用するための免疫エフェクタ細胞は、Ｔ細胞を含む。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺の問題、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、腫瘍など、多くの供給源から取得され得る。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＦＩＣＯＬＬ（フィコール）分離などの当業者に周知の任意の数の技術を使用して、対象から収集された一単位の血液から取得され得る。一実施形態では、個体の循環血液由来の細胞は、アフェレーシスによって取得され得る。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、そのその他の有核白血球、赤血球、血小板を含むリンパ球を含む。一実施形態では、アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、その後の処理のために細胞を適切な緩衝液又は培地に入れてもよい。本開示の一実施形態では、細胞をＰＢＳで洗浄する。代替の実施形態では、洗浄された溶液はカルシウムを欠き、マグネシウムを欠くか、又は全てではないにしても多くの二価カチオンを欠く可能性がある。当業者によって理解されるように、洗浄工程は、半自動フロースルー遠心分離機を使用することなど、当業者に周知の方法によって達成されてもよい。洗浄後、細胞を様々な生体適合性緩衝液、又は緩衝液の有無にかかわらずその他の生理食塩水溶液に、再懸濁させてもよい。特定の実施形態では、アフェレーシス試料の望ましくない成分は、細胞が直接再懸濁された培養培地において除去されてもよい。

特定の実施形態では、Ｔ細胞は、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を介した遠心分離によって、赤血球を溶解し、単球を枯渇させることによって、末梢血単核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells、ＰＢＭＣ）から単離される。ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、及びＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞などのＴ細胞の特定の亜集団を、陽性選択技術又は陰性選択技術によって、更に単離し得る。例えば、陰性選択によるＴ細胞集団の濃縮は、陰性選択された細胞に特有の表面マーカーに向けられた抗体の組み合わせで、達成され得る。本明細書で使用するための一方法は、陰性選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに向けられたモノクローナル抗体のカクテルを使用する陰性磁気免疫接着、又はフローサイトメトリーによる細胞選別及び／若しくは選択である。例えば、陰性選択によってＣＤ４＋細胞について濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＣＤ８に対する抗体を含む。フローサイトメトリー及び細胞選別もまた、本開示において使用するための目的の細胞集団を単離するために、使用されてもよい。

ＰＢＭＣは、本明細書に記載される方法を使用して、ＣＡＲでの遺伝子組換えに直接使用されてもよい。特定の実施形態では、ＰＢＭＣの単離後、Ｔリンパ球が更に単離され、特定の実施形態では、細胞傷害性及びヘルパーＴリンパ球の両方を、遺伝子組換え及び／又は増殖の前又は後のいずれかで、ナイーブ、メモリ、及びエフェクタＴ細胞亜集団に選別し得る。標準的な方法を使用することによって、ＣＤ８＋細胞を取得し得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋細胞は、これらの種類のＣＤ８＋細胞のそれぞれに関連する細胞表面抗原を同定することによって、ナイーブ、中央メモリ、及びエフェクタ細胞に更に選別される。実施形態では、メモリＴ細胞は、ＣＤ８＋末梢血リンパ球のＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ６２Ｌ－サブセットの両方に存在する。ＰＢＭＣは、抗ＣＤ８及び抗ＣＤ６２Ｌ抗体で染色した後、ＣＤ６２Ｌ－ＣＤ８＋及びＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ８＋画分に選別される。いくつかの実施形態では、中央メモリＴＣＭの表現型マーカーの発現は、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、及びＣＤ１２７を含み、グランザイムＢに対して陰性である。いくつかの実施形態では、中央メモリＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、エフェクタＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、及びＣＤ１２７に対して陰性であり、グランザイムＢ及びパーフォリンに対して陽性である。いくつかの実施形態では、ナイーブＣＤ８＋Ｔリンパ球は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ１２７、及びＣＤ４５ＲＡを含むナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられる。

特定の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、更に亜集団に選別される。例えば、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を同定することにより、ナイーブ、中央メモリ、エフェクタ細胞に選別され得る。標準的な方法によって、ＣＤ４＋リンパ球を取得し得る。いくつかの実施形態では、ナイーブＣＤ４＋Ｔリンパ球は、ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、中央メモリＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ陽性及びＣＤ４５ＲＯ陽性である。いくつかの実施形態では、エフェクタＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ陰性及びＣＤ４５ＲＯ陰性である。

Ｔ細胞などの免疫エフェクタ細胞は、周知の方法を使用して単離の後に遺伝子修飾され得るか、又は免疫エフェクタ細胞は、遺伝子修飾される前に生体外で活性化及び増殖（又は前駆細胞の場合は分化）し得る。別の実施形態では、Ｔ細胞などの免疫エフェクタ細胞は、本明細書に記載されるキメラ抗原受容体で遺伝子修飾され（例えば、ＣＡＲをコードする核酸を含むウイルスベクターで形質導入される）、次に、生体外で活性化及び増殖する。Ｔ細胞を活性化及び拡大するための方法は当該技術分野において周知であり、例えば、米国特許第６，９０５，８７４号、同第６、８６７，０４１号、同第６、７９７，５１４号、ＰＣＴ国際公開特許第２０１２０７９０００号に記載されている。一般に、このような方法は、ＰＢＭＣ又は単離されたＴ細胞を、ＩＬ－２などの適切なサイトカインを含む培地において、一般に、ビーズ又はその他の表面に結合した抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体などの刺激剤及び共刺激剤と接触させることを含む。同じビーズに結合した抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体は、「代理」抗原提示細胞（Antigen Presenting Cell、ＡＰＣ）として機能する。その他の実施形態では、Ｔ細胞は、米国特許第６，０４０，１７７号、同第５，８２７，６４２号、及びＰＣＴ国際公開特許第２０１２１２９５１４号に記載されているものなどの方法を使用して、フィーダー細胞及び適切な抗体及びサイトカインと共に活性化及び刺激されて、増殖してもよい。

本開示は、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する腫瘍、例えば、多発性骨髄腫又は黒色腫によって引き起こされる悪性腫瘍を有する患者の治療のための修飾された免疫エフェクタ細胞の集団を提供し、修飾された免疫エフェクタ細胞は、本明細書に開示される抗ＭＡＧＥ－Ａ４ＣＡＲを含む。

本明細書に記載されるように調製されたＣＡＲを発現する免疫エフェクタ細胞は、周知の技術、又は本開示に基づいて当業者に明らかであろうその変形形態による養子免疫療法のための方法及び組成物において、利用され得る。例えば、Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇらの米国特許出願公開第２００３／０１７０２３８号を参照のこと。Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇの米国特許第４，６９０，９１５号もまた参照のこと。

いくつかの実施形態では、細胞は、最初にそれらの培養培地からそれらを採取し、次に、治療有効量での投与に適した培地及び容器系（「薬学的に許容される」キャリア）において、細胞を洗浄及び濃縮することによって、配合される。好適な注入培地は、任意の等張培地製剤、典型的には、通常の生理食塩水、ＮｏｒｍｏｓｏｌＲ（Ａｂｂｏｔｔ社製）又はＰｌａｓｍａ－ＬｙｔｅＡ（Ｂａｘｔｅｒ社製）であり得るが、水中５％のデキストロース又はリンガー乳酸も利用され得る。注入培地には、ヒト血清アルブミンが補充され得る。

組成物中の治療有効量の細胞は、少なくとも２つの細胞（例えば、少なくとも１つのＣＤ８＋中央メモリＴ細胞及び少なくとも１つのＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞のサブセット）であるか、又はより典型的には、１０^２細胞超である、最大１０^６までである、最大１０^８細胞又は１０^９細胞までである又はそれらを含む、及び１０^１０細胞超であり得る。細胞の数は、その中に含まれる細胞の種類と同様に、組成物が意図される最終的な用途に依存するであろう。

細胞は、療法を受けている患者に対して、自家又は異種であってもよい。必要に応じて、処置は、免疫応答の誘導を増強するために本明細書に記載されるマイトジェン（例えば、ＰＨＡ）又はリンホカイン、サイトカイン、及び／若しくはケモカイン（例えば、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１８、及びＴＮＦ－β、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、Ｆｌｔ３－Ｌ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１αなど）の投与もまた含んでもよい。

本開示のＣＡＲを発現する免疫エフェクタ細胞集団は、単独で、又は、希釈剤及び／若しくはＩＬ－２若しくはその他のサイトカイン若しくは細胞集団などのその他の成分との組み合わせで、医薬組成物として投与され得る。簡単に言えば、本開示の医薬組成物は、１種以上の薬学的又は生理学的に許容されるキャリア、希釈剤又は賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載されるＴ細胞などのＣＡＲを発現する免疫エフェクタ細胞集団を含んでもよい。このような組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等の緩衝液と、グルコース、マンノース、スクロース、又はデキストラン、マンニトールなどの炭水化物と、タンパク質と、ポリペプチド又はアミノ酸、例えばグリシンと、抗酸化剤と、ＥＤＴＡ又はグルタチオンなどのキレート剤と、補助剤（例えば、水酸化アルミニウム）と、防腐剤と、を含んでもよい。本開示の組成物は、好ましくは、静脈内投与用に製剤化される。

本明細書に記載される方法又は当該技術分野において周知のその他の方法を使用して本明細書に記載されるＣＡＲを発現するＴ細胞を投与することによって、対象において誘導される抗腫瘍免疫応答は、感染した細胞を死滅させることが可能な細胞傷害性Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、及びヘルパーＴ細胞応答によって媒介される細胞性免疫応答を含んでもよい。Ｂ細胞を活性化して抗体産生をもたらすことが可能なヘルパーＴ細胞によって主に媒介される液性免疫応答もまた、誘導されてもよい。本開示の組成物によって誘導される免疫応答の種類を分析するために、様々な技術を使用してもよく、これらは、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄｉｔｅｄｂｙ：ＪｏｈｎＥ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ＡｄａＭ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，ＤａｖｉｄＨ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，ＥｔｈａｎＭ．Ｓｈｅｖａｃｈ，ＷａｒｒｅｎＳｔｒｏｂｅｒ（２００１）ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．など、当該技術分野で十分に説明されている。

したがって、本開示は、癌細胞（例えば、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する固形腫瘍細胞）によるＭＡＧＥ－Ａ４の発現によって少なくとも部分的に特徴付けられる悪性腫瘍と診断されるか、又はそれを有する疑いがあるか、又はそれを発症するリスクがある個体を治療する方法を提供し、本明細書に記載される治療有効量のＣＡＲを発現する免疫エフェクタ細胞を、個体に投与することを含む。

一実施形態では、本開示は、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する癌と診断された対象を治療する方法を提供し、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する癌と診断された対象由来の免疫エフェクタ細胞を除去すること、該免疫エフェクタ細胞を、本開示のキメラ抗原受容体をコードする核酸を含むベクターで遺伝子修飾すること、それによって、修飾された免疫エフェクタ細胞集団を産生すること、及び修飾された免疫エフェクタ細胞集団を同じ対象に投与すること、を含む。一実施形態では、免疫エフェクタ細胞は、Ｔ細胞を含む。

本明細書に記載される細胞組成物を投与するための方法は、生体外遺伝子修飾された免疫エフェクタ細胞の再導入をもたらすのに有効な任意の方法を含むが、これは、対象において本開示のＣＡＲを直接発現するか、又は対象に導入されるとＣＡＲを発現する成熟免疫エフェクタ細胞に分化する免疫エフェクタ細胞の遺伝子修飾された前駆細胞の再導入の、いずれかである。１つの方法は、生体外で本開示による核酸構成を末梢血Ｔ細胞に形質導入し、形質導入された細胞を対象に戻すことを含む。

キメラ抗原受容体及び対応する抗体の結合特性
本明細書で使用される場合、「結合」という用語は、キメラ抗原受容体又は対応する抗体（又は二重特異性抗体）の、例えば、細胞表面タンパク質又はその断片などの所定の抗原への（あるいはＨＬＡ分子などの細胞表面タンパク質に結合した抗原への）結合という文脈において、考察される。結合とは、典型的には、抗原結合領域：抗原相互作用などの、最低限の２つの存在物又は分子構造間の相互作用又は関連性を指す。

例えば、結合親和性は、例えば、リガンドとして抗原を、分析物（又は抗リガンド）として抗体又はキメラ抗原受容体を使用したＢＩＡｃｏｒｅ３０００機器での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術により決定される場合、典型的には、約１０^－８Ｍ以下など、約１０^－９Ｍ以下などの、約１０^－７Ｍ以下のＫ_Ｄ値に対応する。蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）結合アッセイなどの細胞系の結合戦略もまた日常的に使用されており、ＦＡＣＳデータは、放射性リガンド競合結合法及びＳＰＲなどのその他の方法と、良好に相関する（Ｂｅｎｅｄｉｃｔ，ＣＡ，ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ．１９９７，２０１（２）：２２３－３１，Ｇｅｕｉｊｅｎ，ＣＡ，ｅｔａｌ．ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ．２００５，３０２（１－２）：６８－７７）。

したがって、本開示のキメラ抗原受容体又は対応する抗体（又は二重特異性抗体）は、非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）へ結合するその親和性よりも少なくとも１０倍低いＫ_Ｄ値に対応する親和性を有する、所定の抗原又は細胞表面分子（受容体）に結合する。本明細書に記載されるように、本開示のキメラ抗原受容体又は対応する抗体は、ＨＬＡに提示されたＭＡＧＥ－Ａ４抗原、例えば、ＨＬＡ－Ａ２に提示されたＭＡＧＥ－Ａ４抗原に結合し得る。本開示によれば、非特異的抗原と同等かそれより１０倍未満で低いＫ_Ｄ値を有するキメラ抗原受容体又は対応する抗体の親和性は、検出不可能な結合とみなされる場合がある。

「Ｋ_Ｄ」（Ｍ）という用語は、特定の抗原結合領域の解離平衡定数：抗原相互作用、又は抗原に対する対応する抗体の解離平衡定数を指す。Ｋ_Ｄと結合親和性との間には逆の関係があり、したがって、Ｋ_Ｄ値が小さいほど、親和性は高い、すなわち、より強い。したがって、「より高い親和性」又は「より強い親和性」という用語は、相互作用を形成するより高い能力、つまりより小さいＫ_Ｄ値に関し、逆に「より低い親和性」又は「より弱い親和性」という用語は、相互作用を形成するより低い能力、つまりより大きなＫ_Ｄ値に関する。状況によっては、特定の分子（例えば、キメラ抗原受容体又は対応する抗体）のその相互作用パートナ分子（例えば抗原Ｘ）に対する結合親和性（又はＫ_Ｄ）が、分子（例えば、キメラ抗原受容体又は対応する抗体）の別の相互作用パートナ分子（例えば、抗原Ｙ）に対する結合親和性と比較して、より高いことは、より大きなＫ_Ｄ値（より低い、又はより弱い親和性）をより小さなＫ_Ｄ（より高い、又はより強い親和性）で割ることによって決定される結合比として、例えば、場合によって５倍又は１０倍高い結合親和性として、表されてもよい。

「ｋ_ｄ」（秒－１又は１／秒）という用語は、特定の抗原結合領域の解離速度定数：抗原相互作用、又はキメラ抗原受容体若しくは対応する抗体の解離速度定数を指す。その値は、ｋ_ｏｆｆ値とも称される。

「ｋ_ａ」（Ｍ－１×秒－１又は１／Ｍ）という用語は、特定の抗原結合領域の対合速度定数：抗原相互作用、又はキメラ抗原受容体若しくは対応する抗体の対合速度定数を指す。

「Ｋ_Ａ」（Ｍ－１又は１／Ｍ）という用語は、特定の抗原結合領域の対合平衡定数：抗原相互作用、又はキメラ抗原受容体若しくは対応する抗体の対合平衡定数を指す。対合平衡定数は、ｋ_ａをｋ_ｄで割ることによって得られる。

「ＥＣ５０」又は「ＥＣ_５０」という用語は、最大半量の有効濃度を指し、指定された曝露時間後にベースラインと最大値との間の中間で応答を誘導する抗体又はキメラ抗原受容体の濃度を含む。ＥＣ_５０は本質的に、その最大効果の５０％が観察されるキメラ抗原受容体又は抗体（例えば、二重特異性抗体）の濃度を表す。特定の実施形態では、ＥＣ_５０値は、例えばＦＡＣＳ結合アッセイ及び／又はＴ細胞レポータ／抗原提示細胞（ＡＰＣ）生物学的検定によって決定された場合に、抗原（例えば、ＭＡＧＥ－Ａ４などの腫瘍関連抗原）を発現する細胞への最大半量の結合を与える本開示のキメラ抗原受容体又は対応する抗体の濃度に等しい。したがって、低減した結合又は弱い結合は、ＥＣ_５０の増加、又は最大半量の有効濃度で観察される。

一実施形態では、結合の減少は、最大半量の標的細胞への結合を可能にするＥＣ_５０二重特異性抗体濃度、抗原結合断片濃度、キメラ抗原受容体濃度、又は対応する抗体濃度の増加として、定義され得る。

抗体及びキメラ抗原受容体の配列変異体
本開示の抗体、抗原結合断片、及びキメラ抗原受容体は、対応する抗体の個々の抗原結合領域が由来する対応する生殖系列配列と比較して、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のフレームワーク領域（ＦＲ）及び／又は相補的決定領域（ＣＤＲ）領域において、１つ以上のアミノ酸置換、挿入及び／又は欠失を含んでもよい。このような変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば、公共の抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって、容易に確認され得る。本開示の抗体、抗原結合断片、及びキメラ抗原受容体は、本明細書に開示される代表的なＣＤＲ又は可変領域アミノ酸配列のうちのいずれかに由来する抗原結合領域を含んでもよく、１つ以上のフレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸は、対応する抗体が由来する生殖系列配列の対応する残基（複数可）へ、又は別のヒト生殖系列配列の対応する残基（複数可）へ、又は対応する生殖系列残基（複数可）の保存的アミノ酸置換へ変異する（このような配列変化は本明細書ではまとめて、「生殖系列変異」と称される）。当業者は、本明細書に開示される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域配列から出発して、１つ以上の個々の生殖系列変異又はこれらの組み合わせを含む多くの抗体を、容易に産生し得る。特定の実施形態では、Ｖ_Ｈ領域及び／又はＶ_Ｌ領域内のフレームワーク及び／又はＣＤＲ残基は全て、抗原結合領域が本来由来した元の生殖系列配列に認められる残基へと、変異して戻る。その他の実施形態では、特定の残基のみが元の生殖系列配列へと変異し戻され、例えば、変異した残基は、ＦＲ１の最初の８つのアミノ酸内に、若しくはＦＲ４の最後の８つのアミノ酸内に見出されるか、又は変異した残基は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、若しくはＣＤＲ３内にのみ見出される。その他の実施形態では、フレームワーク及び／又はＣＤＲ残基（複数可）の１つ以上は、異なる生殖系列配列（すなわち、抗原結合領域が本来由来した生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基（複数可）へと変異する。更に、抗原結合領域は、フレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内に２つ以上の生殖系列変異の任意の組み合わせを含んでもよく、例えば、特定の個々の残基が、特定の生殖系列配列の対応する残基へと変異するのに対し、元の生殖系列配列とは異なる特定のその他の残基が維持されるか、又は異なる生殖系列配列の対応する残基へと変異する。

キメラ抗原受容体及び対応する抗体の生物学的特徴
本開示は、ヒトＭＡＧＥ－Ａ４又はヒトＭＡＧＥ－Ａ４及びＣＤ３に結合する抗体に由来する抗原結合領域を有する抗体（二重特異性抗体を含む）、抗原結合断片、及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。本明細書に記載されるように、二重特異性抗体を使用して、二重特異性抗体と同様の特性を有するＣＡＲを生成し得る。したがって、本明細書に記載され、二重特異性抗体に起因する特性は、同様にＣＡＲに適用される。例えば、本開示は、実施例２に関して以下に記載されるフローサイトメトリー系のペプチドパルスアッセイによって評価されるように、２ｎＭ未満のＥＣ_５０値及び１９００超のＳ／Ｎ比でヒトＭＡＧＥ－Ａ４に結合する、抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体を含む。別の実施例として、本開示は、実施例２のフローサイトメトリー系のペプチドパルスアッセイによって評価され、実施例３に詳述されるように、約５～３００超の範囲のＳ／Ｎ比で１つ以上のＭＡＧＥ－Ａ４関連ペプチドに結合する、抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体を提供する。別の実施例として、本開示は、実施例２のフローサイトメトリー系のペプチドパルスアッセイによって評価され、実施例３に詳述されるように、約５～２４０超の範囲のＳ／Ｎ比で１つ以上のＭＡＧＥ－Ａ４関連ペプチドに結合する、抗ＭＡＧＥ－Ａ４×抗ＣＤ３二重特異性抗体を提供する。

本開示はまた、以下の実施例４に詳述されるように、Ｔ細胞レポータ／抗原提示細胞（ＡＰＣ）生物学的検定において実質的な活性を示す、抗ＭＡＧＥ－Ａ４×抗ＣＤ３二重特異性抗体を提供する。具体的には、本開示の抗ＭＡＧＥ－Ａ４×抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＭＡＧＥ－Ａ４及びＨＬＡ－Ａ２を発現するＡＰＣ（例えば、ＩＭ９細胞及びＵ２６６Ｂ１細胞）の存在下で、ルシフェラーゼ発現によって測定されるように、ＮＦ－κＢ依存性Ｔ細胞（例えば、ジャーカット細胞）遺伝子転写／翻訳を、３．２ｎＭ未満（Ｕ２６６Ｂ１細胞）又は０．７５ｎＭ未満のＥＣ_５０値で活性化し得る。Ｔ細胞レポータ／ＡＰＣ生物学的検定における抗ＣＤ２８抗体の包含は、以下の実施例４に詳述されるように、ＣＤ８０及びＣＤ８６の内因性レベルの関数として、抗ＭＡＧＥ－Ａ４×抗ＣＤ３二重特異性抗体の活性を調節し得る。

本開示はまた、以下の実施例５に詳述されるように、１つ以上のＭＡＧＥ－Ａ４関連ペプチドを用いた上記のＴ細胞レポータ／抗原提示細胞（ＡＰＣ）生物学的検定において実質的な活性を示す、抗ＭＡＧＥ－Ａ４×抗ＣＤ３二重特異性抗体を提供する。具体的には、抗ＭＡＧＥ－Ａ４×抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ルシフェラーゼレポータを有するＴ細胞及びＡＯＸ１_{７９５－８０３}でパルスされたＴ２細胞の存在下で培養された場合に、刺激されたレポータ活性に関して、ナノモル以下のＥＣ_５０値（例えば、高親和性ＣＤ３アームを有する二重特異性抗体について２．１０Ｅ－１１Ｍ、及び中親和性ＣＤ３アームを有する二重特異性抗体について３．３０Ｅ－１０Ｍ）を示す。更に、抗ＭＡＧＥ－Ａ４×抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ルシフェラーゼレポータを有するＴ細胞及びＳＨＴＮ１_{１９８－２０６}でパルスされたＴ２細胞の存在下で培養された場合に、刺激されたレポータ活性に関して、ナノモルのＥＣ_５０値（例えば、高親和性ＣＤ３アームを有する二重特異性抗体について１．３０Ｅ－９Ｍ、及び中親和性ＣＤ３アームを有する二重特異性抗体について３．５Ｅ－９Ｍ）を示し得る。

本開示はまた、以下の実施例６に詳述されるように、腫瘍細胞（例えば、ＨＬＡ－Ａ２陽性ＩＭ９細胞を提示するＭＡＧＥ－Ａ４_{２８６－２９４}抗原）に対して応答するＴ細胞（例えば、ヒトＰＢＭＣから単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞）の方向付けを可能にする、イメージング系の多重化一次的Ｔ細胞殺滅アッセイによって評価されるような、ＭＡＧＥ－Ａ４ｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体を提供する。具体的には、本開示の特定の抗ＭＡＧＥ－Ａ４×抗ＣＤ３二重特異性抗体は、１０ｎＭ未満（例えば、６．６ｎＭ）の濃度で、抗体依存性Ｔ細胞媒介性応答に起因する腫瘍細胞生存率を、５０％未満（例えば、３８％）まで低下させることが可能である。この生存率の低下は、腫瘍細胞がＣＤ８０及びＣＤ８６を内因的に発現する状況下で、抗ＭＡＧＥ－Ａ４×抗ＣＤ３二重特異性抗体を抗ＣＤ２８抗体と共培養することによって、少なくとも部分的に阻止し得るが、これは、抗ＣＤ２８抗体が、ＣＤ２８と、ＣＤ８０及びＣＤ８６と、の相互作用を阻止することに、少なくとも部分的に起因する場合がある。

本開示はまた、以下の実施例７で詳述するように、腫瘍細胞（例えば、ＨＬＡ－Ａ２陽性ＩＭ９細胞を提示するＭＡＧＥ－Ａ４_{２８６－２９４}抗原）の存在下で培養した場合に、サイトカイン放出を刺激することが可能な、抗ＭＡＧＥ－Ａ４×抗ＣＤ３二重特異性抗体、及びＴ細胞（例えば、ヒトＰＢＭＣから単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞）を提供する。具体的には、本開示は、腫瘍及びＴ細胞が抗ＭＡＧＥ－Ａ４×抗ＣＤ３二重特異性抗体を欠く条件下でのサイトカイン放出と比較して、２倍を超えてサイトカイン放出（例えば、ＩＬ２、ＩＦＮ－γ）を刺激することが可能な、抗ＭＡＧＥ－Ａ４×抗ＣＤ３二重特異性抗体を提供する。

本開示はまた、ＦＡＣＳ結合アッセイによって決定される場合、内因性ＭＡＧＥ－Ａ４を発現するヒト細胞株に特異的に結合する対応する抗体に由来する抗原結合領域を有する、キメラ抗原受容体を提供する。

本開示はまた、（ｉ）ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する細胞によって活性化される（実施例８を参照のこと）、及び／又は（ｉｉ）ヒト多発性骨髄腫又は黒色腫の異種移植片を有する免疫無防備状態のマウスにおいて腫瘍の成長の阻害を示す、ＭＡＧＥ－Ａ４特異的キメラ抗原受容体を発現する、操作された細胞を提供する。

抗原結合領域の調製
特定の抗原（例えば、ＭＡＧＥ－Ａ４）に特異的である、本開示の抗体（二重特異性抗体を含む）及びキメラ抗原受容体の抗原結合領域は、当該技術分野で周知の任意の抗体生成技術によって調製され得る。特定の実施形態では、本開示の対応する抗体の個々の成分（例えば、重鎖及び軽鎖）のうちの１つ以上は、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体に由来する。このような抗体を作製するための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、重鎖及び／又は軽鎖のうちの１つ以上は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術を使用して調製され得る。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術（又は任意のその他のヒト抗体生成技術）を使用して、特定の抗原（例えば、ＭＡＧＥ－Ａ４）に対する高親和性キメラ抗体が、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有して最初に単離される。抗体は、親和性、中和性、選択性、抗原決定基等を含む望ましい特徴について特徴付けられ、選択される。本明細書で考察されるように、次に、これらのヒト可変領域（又はＣＤＲ）は、キメラ抗原受容体の抗原結合領域へと組み込まれ得る。その他の実施例では、２つの異なる抗原（例えば、抗ＭＡＧＥ－Ａ４及び抗ＣＤ３）を互いに対して適切に配置して、本開示の二重特異性抗原結合分子（例えば、抗体、ＣＡＲ、又はいずれかの抗原結合断片）を日常的な方法によって生成し得る。特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗原結合分子の１つ以上の個々の構成要素（例えば、重鎖及び軽鎖）は、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト化抗体に由来する。

ポリヌクレオチド及びベクター
本開示はまた、本明細書で考察される抗体（又はその部分）及びキメラ抗原受容体をコードする、ポリヌクレオチド及びベクターを提供する。

各種実施形態では、ポリヌクレオチドは、発現カセット又は発現ベクター（例えば、細菌宿主細胞に導入するためのプラスミド、又は昆虫宿主細胞の形質移入のためのバキュロウイルスベクターなどのウイルスベクター、又は哺乳動物宿主細胞の形質移入のためのレンチウイルス又はアデノ関連ウイルスなどのプラスミド又はウイルスベクター）を含んでもよい。

各種実施形態では、ポリヌクレオチド及び／又はベクターは、配列番号２１のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むか、又は配列番号２２のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。その他の実施形態では、ポリヌクレオチド及び／又はベクターは、配列番号１０４のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むか、又は配列番号１０５のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。各種実施形態では、ポリヌクレオチド及び／又はベクターは、配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むか、又は配列番号２若しくは配列番号８３のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。各種実施形態では、ポリヌクレオチド及び／又はベクターは、配列番号９のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むか、又は配列番号１０のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。各種実施形態では、ポリヌクレオチド及び／又はベクターは、配列番号１７のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むか、又は配列番号１８のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。各種実施形態では、ポリヌクレオチド及び／又はベクターは、配列番号１９のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むか、又は配列番号２０のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。各種実施形態では、ポリヌクレオチド及び／又はベクターは、配列番号５４のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むか、又は配列番号５５のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。各種実施形態では、ポリヌクレオチド及び／又はベクターは、配列番号６２のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むか、又は配列番号６３のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。各種実施形態では、ポリヌクレオチド及び／又はベクターは、配列番号６８のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むか、又は配列番号６９のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。各種実施形態では、ポリヌクレオチド及び／又はベクターは、配列番号７０のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むか、又は配列番号７１のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。各種実施形態では、ポリヌクレオチド及び／又はベクターは、配列番号７２のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むか、又は配列番号７３のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。各種実施形態では、ポリヌクレオチド及び／又はベクターは、配列番号８０のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むか、又は配列番号８１のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。上記の配列番号に関して、ポリヌクレオチド及び／又はベクターが、１つ以上のＨＣＤＲ、ＬＣＤＲ等の任意のその部分配列を包含することは、本開示の範囲内である。各種実施形態では、ポリヌクレオチド及び／又はベクターは、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、又は配列番号３０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。

キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞を操作する方法
本開示は、免疫療法のための免疫細胞を調製する方法を提供し、生体外で、このような免疫細胞に、本明細書に記載されるＭＡＧＥ－Ａ４特異的キメラ抗原受容体のうちの１つをコードするポリヌクレオチド又はベクターを導入することを含む。このような免疫細胞は、自己由来又は同種異系であり得る。

本開示は、本明細書で考察されるＭＡＧＥ－Ａ４特異的キメラ抗原受容体のうちの１つをコードするポリヌクレオチド又はレンチウイルスベクターを含む、免疫細胞を提供する。いくつかの実施形態では、これらの免疫細胞は、免疫療法（例えば、癌の治療）のために使用される。

本開示は、免疫細胞を同種異系移植により適したものにするために、それらを遺伝子修飾する方法を提供する。第１の態様によれば、例えば、ＰＣＴ国際公開特許第２０１３／１７６９１５号に記載されているように、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の１つ以上の成分を発現する少なくとも１つの遺伝子を不活性化することによって免疫細胞を同種異系にし得るが、これは、ＨＬＡ又はβ２ｍタンパク質の発現をコード又は調節する遺伝子の不活化と組み合わされ得る。したがって、移植片対宿主症候群及び移植片拒絶のリスクは、顕著に減少する。本開示の更なる態様によれば、免疫細胞を更に操作して、ＰＤ１又はＣＴＬＡ－４などのＴ細胞活性化の調節因子として作用する「免疫チェックポイント」として作用するタンパク質をコードする遺伝子を不活性化することによって、それらをより活性にするか、又は消耗を制限し得る。

操作された免疫細胞
本開示はまた、本明細書に記載されるキメラ抗原受容体を含む免疫細胞（例えば、操作された免疫細胞）を提供する。場合によっては、免疫細胞は、免疫エフェクタ細胞である。場合によっては、免疫細胞は、Ｔ細胞である。場合によっては、免疫細胞は、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球、又はヘルパーＴリンパ球から選択されるＴリンパ球である。場合によっては、免疫細胞は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球である。

いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ａ）軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）及び重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗ＭＡＧＥ－Ａ４単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）領域を含む細胞外リガンド結合領域と、（ｂ）ヒンジと、（ｃ）膜貫通領域と、（ｄ）共刺激領域及びシグナル伝達領域を含む細胞質領域と、を含む、キメラ抗原受容体を含む、ヒトＴ細胞である。

いくつかの実施形態では、操作されたヒトＴ細胞のｓｃＦｖ領域は、配列番号２／１０のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。場合によっては、ヒンジは、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。場合によっては、膜貫通領域は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む。場合によっては、共刺激領域は、４－１ＢＢ共刺激領域である。場合によっては、４－１ＢＢ共刺激領域は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。場合によっては、シグナル伝達領域は、ＣＤ３ゼータシグナル伝達領域である。場合によっては、ＣＤ３ゼータシグナル伝達領域は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。

各種実施形態では、操作されたヒトＴ細胞は、配列番号２２のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む。各種実施形態では、操作されたヒトＴ細胞は、配列番号１０５のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む。

生物学的等価物
本開示は、抗体及びキメラ抗原受容体、並びにキメラ抗原受容体を発現する操作された細胞を提供し、それらは、本明細書に開示される代表的な分子のものとは異なるが、ＭＡＧＥ－Ａ４（及び二重特異性抗体の場合はＣＤ３）に結合する能力を保持するか、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する細胞の存在下でキメラ抗原受容体を発現する免疫細胞を活性化するか、又はＭＡＧＥ－Ａ４を発現する腫瘍細胞の成長又は増殖を抑制する、アミノ酸配列を有する。このような変異体分子は、親配列と比較した場合、１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、又は置換を含んでもよいが、記載された抗原結合分子の生物学的活性と本質的に同等である生物学的活性を示す。

一実施形態では、本開示のキメラ抗原受容体を発現する２つの操作された免疫細胞、又は本開示の２種の抗原結合タンパク質は、それらの安全性、純度、及び効力に臨床的に意味のある差異がない場合、生物学的に等価である。

一実施形態では、２つの操作された免疫細胞又は２種の抗原結合タンパク質は、免疫原性の臨床的に有意な変化又は有効性の減退を含む有害作用のリスクの予測される上昇なしで基準生成物と生物学的生成物との間での切り替えなしで持続される療法と比較して、患者が１回以上切り替えられ得る場合に、生物学的に等価である。

一実施形態では、２つの操作された免疫細胞、又は２種の抗原結合タンパク質は、これらが両方とも、条件又は使用条件についての共通の機序又は作用機序によって、このような機序が周知である程度まで作用する場合、生物学的に等価である。

一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質、又は抗体は、例えば、それらが類似の実験条件下で単回用量又は複数回用量のいずれかで同じモル用量で投与された場合に、吸収速度及び吸収の程度が有意差を示さない医薬的等価物又は医薬的選択肢である場合、生物学的等価物とみなされる。これらの吸収の程度は等価であるが吸収速度は等価ではなく、吸収速度におけるこのような差が意図的で、かつ標識に反映されており、例えば長期使用に及ぼす有効な身体薬剤濃度の達成に必須ではなく、試験した特定の薬剤製品にとって医学的に有意ではないとみなされるため、生物学的に等価とみなされ得る場合、いくつかの抗原結合タンパク質は、等価物又は薬学的選択肢とみなされるであろう。

生物学的等価性は、生体内及び生体外の方法によって実証されてもよい。生物学的等価性尺度には、例えば、（ａ）操作された細胞の濃度が、血液、血漿、血清、又はその他の生物学的流体において時間の関数として測定される、ヒト又はその他の哺乳動物における生体内試験、（ｂ）ヒト生体内生物学的利用能データと相関しており、かつ合理的に予測的な生体外試験、（ｃ）操作された細胞（又はその標的）の適切な急性薬理効果を時間の関数として測定する、ヒト又はその他の哺乳動物における生体内試験、及び（ｄ）操作された細胞の安全性、有効性、又は生物学的利用能若しくは生物学的等価性を確立する十分に制御された臨床試験が含まれる。

本明細書に記載の代表的な操作された細胞の生物学的に等価な変異体は、例えば、残基若しくは配列の様々な置換を生じること、又は生物活性に必要とされない末端若しくは内部の残基若しくは配列を欠失することによって構築されてもよい。

本明細書に示す代表的な二重特異性抗原結合分子の生物学的に等価な変異体は、例えば、残基若しくは配列の様々な置換を生じること、又は生物活性に必要とされない末端若しくは内部の残基若しくは配列を欠失することによって、構築されてもよい。例えば、生物学的活性にとって必須ではないシステイン残基は、再生の際の不必要又は不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するために、欠失又はその他のアミノ酸で置換され得る。その他の文脈において、生物学的に等価な抗原結合タンパク質は、分子のグリコシル化特性を修飾するアミノ酸変化、例えば、グリコシル化を排除又は除去する変異を含む、本明細書に記載される代表的な二重特異性抗原結合分子の変異体を含んでもよい。

種の選択性及び種の交差反応性
本開示の特定の実施形態によれば、ヒトＭＡＧＥ－Ａ４に結合するがその他の種由来のＭＡＧＥ－Ａ４には結合しない抗原結合領域が提供される。また、ヒトＡＯＸ１には結合するが、その他の種由来のＡＯＸ１には結合しない、抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗原結合領域も提供される。また、ヒトＳＨＴＮ１には結合するが、その他の種由来のＳＨＴＮ１には結合しない、抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗原結合領域も提供される。本開示はまた、ヒトＭＡＧＥ－Ａ４及び１つ以上の非ヒト種由来のＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗原結合領域を提供する。本開示はまた、ヒトＡＯＸ１及び１つ以上の非ヒト種由来のＡＯＸ１に結合する抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗原結合領域を提供する。本開示はまた、ヒトＳＨＴＮ１及びその他の種由来のＳＨＴＮ１に結合する抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗原結合領域を提供する。いくつかの実施形態では、本開示の抗原結合領域は、ＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４、並びにＡＯＸ１７９５－８０３、及び／又はＳＨＴＮ１１９８－２０６に結合する。いくつかの実施形態では、抗原結合領域が結合するＭＡＧＥ－Ａ４及び／又はＡＯＸ１及び／又はＳＨＴＮ１（例えば、ＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４又はＡＯＸ１７９５－８０３又はＳＨＴＮ１１９８－２０６）は、ＨＬＡ、例えば、ＨＬＡ－Ａ２によって細胞の表面上に提示される。

本開示の特定の代表的な実施形態によると、ヒトＭＡＧＥ－Ａ４及び／又はＭＡＧＥ－Ａ４関連ペプチドに結合し、場合によっては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザル若しくはチンパンジーＭＡＧＥ－Ａ４及び／又はＭＡＧＥ－Ａ４関連ペプチドのうちの１つ以上に結合し得るか、又は結合し得ない抗原結合領域が提供される。更に、ＭＡＧＥ－Ａ４及び／又はＭＡＧＥ－Ａ４関連ペプチドへの結合は、ＨＬＡ提示ＭＡＧＥ－Ａ４などのＭＨＣ提示ＭＡＧＥ－Ａ４（又はＭＡＧＥ－Ａ４関連ペプチド）との関連であり得る。代表的なＨＬＡに提示されたＭＡＧＥ－Ａ４は、ＨＬＡ－Ａ２が結合したヒトＭＡＧＥ－Ａ４である。

操作された免疫細胞の活性化及び増殖
操作された細胞（例えば、Ｔ細胞）の遺伝子修飾の前であろうと後であろうと、本開示の遺伝子修飾された免疫細胞が活性化され、抗原結合メカニズムとは無関係に増殖する場合でも、免疫細胞、特に本開示のＴ細胞を、一般に、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、同第６，５３４，０５５号、同第６，９０５，６８０号、同第６，６９２，９６４号、同第５，８５８，３５８号、同第６，８８７，４６６号、同第６，９０５，６８１号、同第７，１４４，５７５号、同第７，０６７，３１８号、同第７，１７２，８６９号、同第７，２３２，５６６号、同第７，１７５，８４３号、同第５，８８３，２２３号、同第６，９０５，８７４号、同第６，７９７，５１４号、同第６，８６７，０４１号、及び米国特許出願公開第２００６／０１２１００５号に記載の方法を使用して、更に活性化及び増殖させ得る。生体外又は生体内で、Ｔ細胞を増殖させ得る。

一般に、本開示のＴ細胞は、ＣＤ３ＴＣＲ複合体及びＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤との接触によって増殖し、Ｔ細胞の活性化シグナルを生成し得る。例えば、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（Phorbol12-Myristate13-Aacetate、ＰＭＡ）、又は有糸分裂レクチン様フィトヘマグルチニン（phytohemagglutinin、ＰＨＡ）などの化学物質を使用して、Ｔ細胞の活性化シグナルを生成し得る。

非限定的な実施例として、Ｔ細胞集団は、抗ＣＤ３抗体若しくはその抗原結合断片、又は表面に固定化された抗ＣＤ２抗体との接触によって、又はカルシウムイオノフォアと組み合わせたプロテインキナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）との接触によってなど、生体外で刺激されてもよい。Ｔ細胞の表面のアクセサリ分子の共刺激については、アクセサリ分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞集団を、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触させ得る。Ｔ細胞培養に適した条件には、血清（例えば、ウシ胎児又はヒト血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－ｇ、１Ｌ－４、１Ｌ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－２、１Ｌ－１５、ＴＧＦｐ、及びＴＮＦ－αを含む増殖及び生存に必要な因子、又は当業者に周知の細胞の成長のための任意のその他の添加剤を含み得る適切な培地（例えば、最小必須培地又はＲＰＭＩ培地１６４０、又はＸ－ｖｉｖｏ５、（Ｌｏｎｚａ））を含む。細胞の成長のためのその他の添加剤は、界面活性剤、プラスマネート、並びにＮ－アセチル－システイン及び２－メルカプトエタノールなどの還元剤を含むが、これらに限定されない。培地は、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、及びビタミンが添加され、無血清で、又は、適切な量の血清（若しくは血漿）若しくは定義されたホルモンのセット、及び／若しくはＴ細胞の成長及び増殖に十分な量のサイトカインを補充した、ＲＰＭＩ１６４０、Ａ１Ｍ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ１、Ｘ－Ｖｉｖｏ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを含み得る。ペニシリン及びストレプトマイシンなどの抗生物質は、実験培養においてのみ含まれ、対象に注入される細胞の培養には含まれない。標的細胞は、成長を支持するのに必要な条件下、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）及び雰囲気（例えば、空気に加えて５％Ｏ_２）で維持される。様々な刺激時間に曝露されたＴ細胞は、様々な特徴を示す可能性がある。

いくつかの実施形態では、組織又は細胞と共培養することによって、細胞を増殖させ得る。細胞はまた、例えば、該細胞を対象に投与した後、対象の血液中で生体内で増殖され得る。

治療製剤及び投与
本明細書で使用される場合、「有効量」及び「治療有効量」という用語は、毒性、刺激、又はアレルギー反応などの過度の有害な副作用を伴わずに所望の治療応答をもたらすのに十分な活性治療薬の量を指す。具体的な「有効量」は、明らかに、治療される特定の状態、患者の身体的状態、治療される動物の種類、治療の期間、併用療法（もしあれば）の性質、並びに用いられる具体的な製剤及び化合物又はその誘導体の構造などの因子によって、変化する。この場合、ある量は、限定されないが、以下のうちの１つ以上をもたらした場合、治療的に有効であると考えられる：（ａ）腫瘍増殖（例えば、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する癌）の阻害、（ｂ）ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する癌の拮抗又は安定化。

患者に投与される抗原結合分子の用量は、患者の年齢及び大きさ、標的疾患、病態、投与経路などに応じて変動する場合がある。好ましい用量は、典型的には、体重又は体表面積に従って計算される。本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子が成人患者の治療目的に使用される場合、本発明の二重特異性抗原結合分子を通常約０．０１～約２０ｍｇ／ｋｇ体重の単回投与で、より好ましくは約０．０２～約７、約０．０３～約５、又は約０．０５～約３ｍｇ／ｋｇ体重の単回投与で静脈内投与することが有利である場合がある。容態の重篤度に応じて、治療の頻度及び期間を調整し得る。二重特異性抗原結合分子を投与するための有効投薬量及びスケジュールは、経験的に決定されてもよい。例えば、患者の進行は、定期的な評価によってモニタリングされ得、それに応じて用量が調整される。更に、投与量の種間スケーリングは、当該技術分野において周知の方法を用いて実施され得る（例えば、ＭＭｏｒｄｅｎｔｉｅｔａｌ．，１９９１，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．８：１３５１）。

種々の送達系が既知であり、本発明の医薬組成物を投与するために使用することができ、例えば、リポソーム封入、マイクロパーティクル、マイクロカプセル、変異ウイルスを発現することができる組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシスである（例えば、Ｗｕｅｔａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９－４４３２を参照のこと）。導入方法には、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路及び経口経路が含まれるが、これらに限定されない。組成物は、例えば、注入若しくはボーラス注射による、上皮又は粘膜皮膚の内層（lining）（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）を介した吸収による任意の好都合な経路によって投与されてもよく、その他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与されてもよい。投与は、全身又は局所であり得る。

本発明の薬学的組成物は、標準的な針及び注射器を用いて、皮下に又は静脈内に送達され得る。なお、皮下送達に関して、ペン型送達デバイスは、本発明の薬学的組成物を送達する際の適用を容易にする。このようなペン型送達デバイスは、再利用可能又は使い捨て可能であり得る。再利用可能なペン型送達デバイスは、一般に、薬学的組成物を含む交換可能なカートリッジを利用する。一度、カートリッジ内の薬学的組成物が全て投与され、カートリッジが空になると、この空のカートリッジは容易に廃棄することができ、薬学的組成物を含む新しいカートリッジと容易に交換することができる。次に、ペン型送達デバイスは再利用することができる。使い捨てのペン型送達デバイスにおいて、交換可能なカートリッジは存在しない。むしろ、使い捨てペン型送達デバイスは、このデバイス内の貯蔵器の中に保持された薬学的組成物が事前に充填されている。貯蔵器から薬学的組成物が空になると、デバイス全体が廃棄される。

数多くの再利用可能なペン型送達デバイス及び自動注射送達デバイスは、本発明の薬学的組成物の皮下送達の用途を有する。例としては、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（オーウェン・マンフォード社製，ウッドストック，イギリス）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（ＤｉｓｅｔｒｏｎｉｃＭｅｄｉｃａｌＳｙｓｔｅｍｓ社製，バーグドルフ，スイス）、ＨＵＭＡＬＯＧＭＩＸ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ７０／３０（商標）ペン（イーライリリー・アンド・カンパニー社製，インディアナポリス，インディアナ州）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ（ノボ・ノルディスク社製，コペンハーゲン，デンマーク）、ＮＯＶＯＰＥＮＪＵＮＩＯＲ（商標）（ノボ・ノルディスク社製，コペンハーゲン，デンマーク）、ＢＤ（商標）ペン（ベクトン・ディッキンソン社製，フランクリン・レイクス，ニュージャージー州）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、及びＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（サノフィ・アベンティス社製，フランクフルト，ドイツ）が挙げられるが、これらに限定されず、ほんの数種類しか挙げていない。本発明の薬学的組成物の皮下送達での用途を有する使い捨て可能なペン型送達デバイスの例としては、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（サノフィ・アベンティス社製）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（ノボ・ノルディスク社製）、及びＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（イーライリリー社製）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）自動注射器（アムジェン社製，サウザンドオークス，カリフォルニア州）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（ハーゼルマイヤー社製，シュトゥットガルト，ドイツ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ，Ｌ．Ｐ．社製）及びＨＵＭＩＲＡ（商標）ペン（アボット・ラボラトリーズ社製，アボット・パークＩｌｌ）が挙げられるが、これらに限定されない。

ある特定の状況において、薬学的組成物は、徐放系で送達され得る。一実施形態では、ポンプを使用してもよい（Ｌａｎｇｅｒ、上記、Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣＣｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１を参照のこと）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用し得る。ＭｅｄｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒａｎｄＷｉｓｅ（ｅｄｓ．），１９７４，ＣＲＣＰｒｅｓ．，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，Ｆｌａ．を参照のこと。更に別の実施形態では、徐放系を組成物の標的の近傍に配置し得、それによって、全身用量のほんの一部のみが必要となる（例えば、ＧＧｏｏｄｓｏｎ，１９８４，ｉｎＭｅｄｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ，ｓｕｐｒａ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５－１３８を参照のこと）。その他の徐放系は、Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７－１５３３による総説で考察されている。

注射可能な調製物には、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、及び筋肉内注射、点滴注入などのための剤形が含まれてもよい。これらの注射可能な調製物は、周知の方法によって調製されてもよい。

有益なことに、上記に記載される経口又は非経口での使用のための薬学的組成物は、有効成分の用量に適合するために好適な単位用量の剤形へと調製される。このような単位用量の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤等が挙げられる。含有される上記抗体の量は、一般に、単位用量の剤形当たり約５～約５００ｍｇであり、特に注射剤の形態では、抗体は、約５～約１００ｍｇ、その他の剤形では、約１０～約２５０ｍｇ含有されることが好ましい。

本開示による細胞又は細胞集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸液、埋め込み、又は移植を含む、任意の便利な様式で実施されてもよい。本明細書に記載される組成物は、患者に、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内若しくはリンパ内注射によって、又は腹腔内に投与されてもよい。一実施形態では、本開示の細胞組成物は、好ましくは、静脈内注射によって投与される。

細胞又は細胞集団の投与は、体重ｋｇ当たり１０^４～１０^９細胞、好ましくは、１０^５～１０^６細胞／ｋｇ体重の投与からなり得、これらの範囲内の細胞数の全ての整数値を含む。細胞又は細胞集団は、１つ以上の用量で投与され得る。いくつかの実施形態では、有効量の細胞は、単回投与として投与される。いくつかの実施形態では、有効量の細胞は、ある期間にわたって２回以上の用量として投与される。投与のタイミングは、主治医の判断の範囲内であり、患者の臨床状態に依存する。細胞又は細胞集団は、血液バンク又はドナーなどの任意の供給源から得られてもよい。個々のニーズは異なるが、特定の疾患又は状態についての所与の細胞型の有効量の範囲の決定は、当業者の範囲内である。有効量は、治療的又は予防的利益をもたらす量を意味する。投与される投薬量は、受容者の年齢、健康及び体重、同時治療の種類、もしあれば、治療の頻度、及び望まれる効果の性質に依存するであろう。

一実施形態では、有効量の細胞又はそれらの細胞を含む組成物は、非経口で投与される。この投与は、静脈内投与であり得る。場合によっては、投与は、腫瘍内への注射によって直接行われ得る。

本開示の特定の実施形態では、細胞は、抗ウイルス療法、シドフォビル及びインターロイキン－２、シタラビン（ＡＲＡ－Ｃとしても知られる）、又はＭＳ患者に対するナタリズマブ治療、又は乾癬患者に対するエファリズチマブ治療、又はＰＭＬ患者に対するその他の治療などの薬剤での治療を含むがこれらに限定されない、任意の数の関連する治療法と併せて（例えば、前に、同時に又は後に）患者に投与される。更なる実施形態では、本開示のＴ細胞は、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノーレート、及びＦＫ５０６などの免疫抑制剤、抗体、又はＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体などのその他の免疫除去剤、又はその他の抗体療法、サイトキシン、フルダリビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、及び照射と組み合わせて使用されてもよい。

更なる実施形態では、本開示の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法剤、外部ビーム放射線療法（external-beam radiation therapy、ＸＲＴ）、シクロホスファミド、又はＯＫＴ３若しくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体のいずれかを使用したＴ細胞除去療法と併せて（例えば、前に、同時に又は後に）患者に投与される。別の実施形態では、本開示の細胞組成物は、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えばＲｉｔｕｘａｎなどのＢ細胞除去療法の後に投与される。例えば、一実施形態では、対象は、高用量化学療法とそれに続く末梢血幹細胞移植による標準的な治療を受けてもよい。特定の実施形態では、移植に続いて、対象は、本開示の増殖された免疫細胞の注入を受ける。追加の実施形態では、増殖した細胞は、手術の前又は後に投与される。特定の実施形態では、任意の手段（例えば、外科手術、化学療法、又は放射線療法）を使用して、本開示の増殖された免疫細胞の投与前に腫瘍負荷を減少させる場合がある。一実施形態では、本開示の操作された細胞の投与前に腫瘍負荷を低減することにより、ＣＡＲＴ細胞療法に関連し得る副作用であるサイトカイン放出症候群又はサイトカインストームの可能性を減少又はそれらを防止し得る。

治療への応用
本開示は、本開示のキメラ抗原受容体を発現する操作された細胞（例えば、Ｔ細胞）及び薬学的に許容される媒体を含む組成物を提供する。本開示はまた、抗体又はその抗原結合断片、及び薬学的に許容される媒体を含む組成物を提供する。場合によっては、操作された細胞、抗体、又は抗原結合断片は、特に免疫療法用の薬剤を形成する。場合によっては、操作された細胞、抗体、又は抗原結合断片は、癌（例えば、多発性骨髄腫又は黒色腫）の治療に使用される。場合によっては、操作された細胞、抗体、又は抗原結合断片は、免疫療法及び／又は癌（例えば、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する癌）の治療用の薬剤の製造に使用される。

本開示は、抗体（例えば、二重特異性抗体）、若しくはその抗原結合断片、及び／又はキメラ抗原受容体を発現する本明細書で考察される操作された細胞（例えば、Ｔ細胞）を含む治療用組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を、提供する。治療用組成物は、本明細書に開示される任意のキメラ抗原受容体を発現する細胞と、薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤又は媒体と、を含み得る。追加的又は代替的な実施例では、治療用組成物は、本明細書で考察される抗体及び／又は抗原結合性断片を含む。本明細書で使用される場合、「それを必要とする対象」という表現は、癌の１つ以上の症状又は徴候を示すヒト又は非ヒト動物（例えば、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する腫瘍を有する対象又は本明細書に記載される癌のうちのいずれかに罹患している対象）、又はそうでなければＭＡＧＥ－Ａ４活性の阻害若しくは減少若しくはＭＡＧＥ－Ａ４＋細胞の枯渇から利益を得るであろう者を意味する。

本開示の操作された細胞、並びに／又は抗体、及び抗原結合断片は、とりわけ、免疫応答の刺激、活性化、及び／又は標的化が有益である任意の疾患若しくは障害を治療するために、有用であり得る。特に、本開示の操作された細胞、並びに／又は抗体、及び抗原結合断片は、ＭＡＧＥ－Ａ４の発現若しくは活性、又はＭＡＧＥ－Ａ４＋細胞の増殖に関連するか又はそれによって媒介される任意の疾患又は障害の治療、予防、及び／又は改善のために使用されてもよい。本開示の操作された細胞、並びに／又は抗体、及び抗原結合断片を使用して阻害又は死滅させ得るＭＡＧＥ－Ａ４を発現する細胞は、例えば、多発性骨髄腫細胞、黒色腫細胞、又はその他の固形腫瘍細胞を含む。

本開示の操作された細胞、並びに／又は抗体、及び抗原結合断片は、例えば、多発性骨髄腫、滑膜肉腫、食道癌、頭頸部癌、肺癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌、胃癌、子宮頸癌、乳癌、及び黒色腫を含むがこれらに限定されない癌を含む、ＭＡＧＥ－Ａ４発現に関連する疾患又は障害を治療するために、使用されてもよい。本開示の操作された細胞、並びに／又は抗体、及び抗原結合断片は、一般に、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する腫瘍を治療するために使用されてもよい。本開示のその他の関連する実施形態によれば、本明細書に開示される操作された細胞、並びに／又は抗体、及び抗原結合断片を、上記の癌からの腫瘍を含む、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する腫瘍に罹患している患者に投与することを含む方法が、提供される。腫瘍スキャニングなどの当該技術分野において周知の分析的方法／診断的方法を使用して、患者がこのような腫瘍、疾患、又は状態を抱えているかどうかを確認してもよい。

本開示はまた、対象における残存癌を治療するための方法を提供する。本明細書で使用される場合、「残存癌」という用語は、抗癌療法による治療後の対象における１つ以上の癌性細胞の存在又は持続を意味する。

特定の態様によれば、本開示は、対象が疾患又は傷害を有すると決定された後、本明細書の他所に記載の操作された細胞集団、並びに／又は抗体、及び抗原結合断片を対象に投与することを含む、ＭＡＧＥ－Ａ４発現に関連する疾患又は障害（例えば、癌）を治療するための方法を提供する。例えば、本開示は、対象がその他の免疫療法又は化学療法を受けてから１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、又は４週間、２カ月、４カ月、６カ月、８カ月、１年、又はそれ以上後に、操作された免疫細胞を患者に投与することを含む、疾患又は障害を治療するための方法を提供する。

本明細書で考察される治療は、改善、治癒、又は予防的であり得る。治療は、自家免疫療法の一部又は同種異系免疫療法の一部のいずれかであってもよい。自家によるとは、患者の治療のために使用される細胞、細胞株、又は細胞集団が、患者又はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合ドナーに由来することを意味する。同種異系によるとは、患者の治療のために使用される細胞、細胞株、又は細胞集団が、患者ではなくドナーに由来することを意味する。

開示された方法で使用され得る細胞は、本明細書に記載されている。治療は、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する細胞、特にＭＡＧＥ－Ａ４を発現する細胞の過剰によって特徴付けられる前悪性又は悪性の癌状態と診断された患者を治療するために使用され得る。このような状態は、癌において見出され得る。

本開示の操作された細胞、抗体、及び抗原結合断片で治療される癌の種類は、多発性骨髄腫、滑膜肉腫、食道癌、頭頸部癌、肺癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌、胃癌、子宮頸癌、乳癌、及び黒色腫を含むが、これらに限定されない。

本開示の組成物及び方法は、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する細胞又は組織を有すると特徴付けられた、又はＭＡＧＥ－Ａ４を発現する細胞又は組織を有することが疑われる対象を治療するために使用されてもよい。例えば、本開示による治療から利益を得る対象は、多発性骨髄腫、滑膜肉腫、食道癌、頭頸部癌、肺癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌、胃癌、子宮頸癌、乳癌、又は黒色腫を有する対象を含む。

併用療法
本開示は、１種以上の追加の治療薬と組み合わせて、抗体及び／又は抗原結合断片（例えば、二重特異性抗体）、及び／又は本明細書に記載されるキメラ抗原受容体のうちのいずれかを含む操作された細胞若しくは細胞の集団を投与することを含む方法を、提供する。本開示の抗体／抗原結合断片細胞、及び／又は細胞若しくは細胞集団と組み合わせてもよい、又は組み合わせて投与されてもよい代表的な追加の治療薬は、例えば、抗腫瘍剤（例えば、メルファラン、ビンクリスチン（オンコビン）、シクロホスファミド（シトキサン）、エトポシド（ＶＰ－１６）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、リポソームドキソルビシン（ドキシル）、オベンダムスチン（トレアンダ）を含む化学療法剤、又は対象における形質細胞腫瘍の治療に有効であることが周知である任意のその他のもの）を含む。いくつかの実施形態では、第２の治療薬は、ステロイドを含む。いくつかの実施形態では、第２の治療薬は、サリドマイド、レナリドミド、及びボルテゾミブを含む標的療法を含むが、これらは、新たに診断された患者を治療するために承認された療法である。例えば、レナリドミド、ポマリドミド、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、パノビノスタット、イキサゾミブ、エロツズマブ、及びダラツムマブは、再発性骨髄腫を治療するために有効な第２の治療薬の例である。特定の実施形態では、第２の治療薬は、放射線療法又は幹細胞移植を含むレジメンである。特定の実施形態では、第２の治療薬は、免疫調節剤であってもよい。特定の実施形態では、第２の治療薬は、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標））、カルフィルゾミブ（Ｋｙｐｒｏｌｉｓ（登録商標））、イキサゾミブ（Ｎｉｎｌａｒｏ（登録商標））を含むプロテアソーム阻害剤であってもよい。特定の実施形態では、第２の治療薬は、パノビノスタット（Ｆａｒｙｄａｋ（登録商標））などのヒストンデアセチラーゼ阻害剤であってもよい。特定の実施形態では、第２の治療薬は、モノクローナル抗体、抗体薬物共役体、抗腫瘍剤に共役し得るか又は共役し得ない二重特異性抗体、チェックポイント阻害剤、又はそれらの組み合わせであってもよい。本開示の抗原結合分子と組み合わせて有益に投与され得るその他の薬剤は、小分子サイトカイン阻害剤及びＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８などのサイトカイン、又はそれらのそれぞれの受容体に結合する抗体を含むサイトカイン阻害剤を含む。本開示の医薬組成物（例えば、本明細書に開示される操作された細胞又は細胞集団を含む医薬組成物）はまた、形質細胞表面上の異なる抗原と相互作用し得る本明細書に記載されるもの以外のモノクローナル抗体、腫瘍細胞表面上の抗原に結合する一方のアーム及びＴ細胞上の抗原に結合する他方のアームを有する二重特異性抗体、抗体薬物コンジュゲート、抗腫瘍剤と共役した二重特異性抗体、チェックポイント阻害剤、例えば、ＰＤ－１又はＣＴＬＡ－４を標的とするもの、又はそれらの組み合わせ、から選択される１つ以上の治療的組み合わせを含む治療レジメンの一部として投与されてもよい。特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））、又はセミプリマブ（Ｌｉｂｔａｙｏ（登録商標））などのＰＤ－１阻害剤から選択されてもよい。特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標））、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ（登録商標））、又はデュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ（登録商標））などのＰＤ－Ｌ１阻害剤から選択されてもよい。特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））などのＣＴＬＡ－４阻害剤から選択されてもよい。

本開示はまた、本明細書に記載される抗体／抗原結合断片、及び／又は操作された細胞若しくは細胞集団のうちのいずれかと、ＶＥＧＦ、Ａｎｇ２、ＤＬＬ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｃＭｅｔ、ＩＧＦ１Ｒ、Ｂ－ｒａｆ、ＰＤＧＦＲ－α、ＰＤＧＦＲ－β、ＦＯＬＨ１（ＰＳＭＡ）、ＰＲＬＲ、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＭＳＬＮ、ＣＡ９、ウロプラキンのうちの１種以上の阻害剤、又は前述のサイトカインのうちのいずれかと、を含む治療的組み合わせを含み、阻害剤は、アプタマー、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ペプチボディ、ナノボディ又は抗体断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ断片、又はその他の操作された分子、例えば、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ及び最小認識単位）である。いくつかの実施形態では、本開示の抗体／抗原結合断片、及び／又は操作された細胞若しくは細胞集団はまた、放射線治療及び／又は従来の化学療法も含む治療レジメンの一部として投与されてもよい。

追加の治療活性成分（複数可）は、本開示の操作された細胞の投与の直前、投与と同時、又は投与直後に投与されてもよい（本開示の目的上、このような投与計画は、追加の治療活性成分と「組み合わせて」遺伝子操作された細胞を投与するものとみなされる）。

本開示は、本開示の操作された細胞又は細胞集団が、本明細書の他所に記載の追加の治療活性成分のうちの１種以上と同時製剤化された、医薬組成物を提供する。

投与レジメン
本開示の特定の実施形態によれば、複数の用量の抗体／抗原結合断片、及び／又は操作された細胞が、定義された時間経過にわたって対象に投与されてもよい。本態様による方法は、対象に、複数の用量の抗原結合分子及び／又は細胞を連続的に投与することを含む。本明細書で使用される場合、「連続的に投与すること」は、各用量が、異なる時点、例えば、所定の間隔（例えば、数時間、数日、数週間、又は数か月）よって分けられた異なる日に、対象へ投与されることを意味する。本開示は、患者へ単回の一次的用量、それに続く１回以上の二次的用量、及び任意選択でそれに続く１回以上の三次的用量を連続的に投与することを含む方法を提供する。

「一次的用量」、「二次的用量」、及び「三次的用量」という用語は、本開示の抗原結合分子及び／又は操作された細胞の投与の時系列を指す。したがって、「初期用量」は、治療レジメンの開始時に投与される用量（「ベースライン用量」とも称される）である。「二次用量」は、初期投与後に投与される用量であり、「三次用量」は、二次用量後に投与される用量である。一次的用量、二次的用量、及び三次的用量は全て、抗原結合分子及び／又は操作された細胞の同じ量を含んでもよいが、一般に、投与頻度に関して互いに異なる場合がある。しかしながら、特定の実施形態では、一次的用量、二次的用量、及び／又は三次的用量に含有される抗原結合分子及び／又は操作された細胞の量は、治療経過の間、互いに異なる（例えば、適宜上下に調整される）。特定の実施形態では、２回以上（例えば、２回、３回、４回、又は５回）の用量が治療レジメンの開始時において「負荷用量（loading dose）」として投与され、続いてより低い頻度に基づいて投与される後続用量（例えば、「維持用量」）が投与される。

本開示の一代表的実施形態では、各二次用量及び／又は三次用量は、直前の用量の１～２６（例えば、１、１^１／_２、２、２^１／_２、３、３^１／_２、４、４^１／_２、５、５^１／_２、６、６^１／_２、７、７^１／_２、８、８^１／_２、９、９^１／_２、１０、１０^１／_２、１１、１１^１／_２、１２、１２^１／_２、１３、１３^１／_２、１４、１４^１／_２、１５、１５^１／_２、１６、１６^１／_２、１７、１７^１／_２、１８、１８^１／_２、１９、１９^１／_２、２０、２０^１／_２、２１、２１^１／_２、２２、２２^１／_２、２３、２３^１／_２、２４、２４^１／_２、２５、２５^１／_２、２６、２６^１／_２以上）週間後に投与される。「直前の用量」という語句は、本明細書で使用される場合、一連の複数回の投与において、介入用量のない順序の次の用量の投与の前に患者へ投与される用量を意味する。

本発明の本態様による方法は、患者に、任意の数の二次及び／又は三次用量を投与することを含んでもよい。例えば、特定の実施形態では、単回の二次用量のみが患者に投与される。その他の実施形態では、２回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回以上）の二次用量が患者に投与される。同様に、特定の実施形態では、単回の三次用量のみが患者に投与される。その他の実施形態では、２回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回以上）の三次用量が患者に投与される。

複数回の二次用量を伴う実施形態では、各二次用量は、その他の二次用量と同じ頻度で投与されてもよい。例えば、各二次用量は、直前の用量の１～２週間後に患者に投与されてもよい。同様に、複数の三次用量を伴う実施形態では、各三次用量は、その他の三次用量と同じ頻度で投与されてもよい。例えば、各三次用量は、直前の用量の２～４週間後に患者に投与されてもよい。あるいは、二次用量及び／又は三次用量が患者へ投与される頻度は、治療レジメンの経過にわたって変動し得る。投与頻度はまた、臨床検査後の個々の患者の必要性に応じて、医師によって治療経過中に調整されてもよい。

以下の実施例は、本開示の方法及び組成物を作製及び使用する方法の完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示されており、本発明者らが本発明とみなすことの範囲を限定することを企図するものではない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力はなされたが、ある程度の実験上の誤差及び偏差が考慮されるべきである。別段示されない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧又はそれに近い圧力である。

実施例１：抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体の生成
抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体を、遺伝子組換えマウス（例えば、ヒト免疫グロブリン重鎖及びカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む操作されたマウス）をヒトＭＡＧＥ－Ａ４抗原（例えば、ｍＡｂ３１３３９Ｎ２に関してはｈＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４）、及びＨＬＡ－Ａ２（ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１）で免疫付与することにより得た。より詳細には、遺伝的に修飾されたマウスのゲノムは、遺伝的に修飾されたマウスがヒトＨＬＡ－Ａ２を発現するように、ヒトＨＬＡ－Ａ２をコードするヌクレオチド配列（並びにヒト免疫グロブリン重鎖可変領域及びカッパ軽鎖可変領域をコードする配列）を有したが、ここで、このマウスは、ＭＡＧＥ－Ａ４抗原及びＨＬＡ－Ａ２で免疫された場合に特異的Ｂ細胞応答を生じるように、ヒトＨＬＡ－Ａ２に対して寛容化されていた。

免疫後、脾細胞を各マウスから採取し、（１）マウス骨髄腫細胞と融合させてそれらの生存率を保存し、ハイブリドーマ細胞を形成し、ＭＡＧＥ－Ａ４特異性についてスクリーニングし、又は（２）反応性抗体（抗原陽性Ｂ細胞）に結合して同定する選別試薬としてヒトＭＡＧＥ－Ａ４断片を使用して、Ｂ細胞を選別した（米国特許公開第２００７／０２８０９４５（Ａ１）号に記載のとおり）。

ヒト可変領域及びマウス定常領域を有するＭＡＧＥ－Ａ４に対するキメラ抗体が、最初に単離された。抗体を、親和性、選択性などを含む望ましい特徴について特徴付けし選択する。例えば、マウス定常領域を所望のヒト定常領域、例えば野生型又は改変されたＩｇＧ１又はＩｇＧ４定常領域と置き換えて、完全ヒト型抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体を生成した（例えば、ｍＡｂＭ３１３３９Ｎ２（マウス定常領域を含む）を使用して、ｍＡｂＨ３１３３９Ｎ２（ヒト定常領域を含む）を生成した）。選択される定常領域は特異的用途に応じて変化する場合があるが、高親和性抗原結合特徴及び標的特異性特徴は、可変領域に存在する。

ｍＡｂＭ３１３３９Ｎ２はまた、高親和性（７１９５Ｐ）ＣＤ３アームを使用して、ｂｓＡｂ６０５４（ｍＡｂ３１３３９からのＨＣＶＲ１、ＬＣＶＲ１、及びＬＣＶＲ２、並びに７１９５ＰからのＨＣＶＲ２）を生成するか、又は中親和性（７２２１Ｇ）ＣＤ３アームを使用して、ｂｓＡｂ６０４３（ｍＡｂ３１３３９からのＨＣＶＲ１、ＬＣＶＲ１、及びＬＣＶＲ２、並びに７２２１ＧからのＨＣＶＲ２）を生成するか、のいずれかを使用して、二重特異性抗体に再フォーマットした。

抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸及び核酸配列：表１は、本開示の選択された抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域並びにＣＤＲのアミノ酸配列識別子を記載する。表１のｍＡｂ３１３３９Ｎ及びｍＡｂ３１３３９Ｎ２配列は、ＨＣＶＲフレームワーク領域３における１つのアミノ酸の違いを除いて、同一である。しかし、ＣＤＲは、ｍＡｂ３１３３９Ｎ及びｍＡｂ３１３３９Ｎ２の両方について、同じである。対応する核酸配列識別子を、表２に示す。本明細書に含まれる全ての配列の要約を、表１５に提供する。

ＣＤ３及びＭＡＧＥ－Ａ４に結合する二重特異性抗体の生成：抗ＣＤ３特異的結合領域及び抗ＭＡＧＥ－Ａ４特異的結合領域を含む二重特異性抗体を、抗ＣＤ３抗体由来の重鎖を抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体由来の重鎖及び同族軽鎖と組み合わせる方法論を使用して、表３及び表４に列挙される配列を用いて構築した。

したがって、本実施例に従って作成された二重特異性抗体は、２つの別個の抗原結合領域（すなわち、結合アーム）を含む。第１の抗原結合領域は、抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体（「ＭＡＧＥ－Ａ４－ＶＬ」）に由来する同族軽鎖可変領域と対になった抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体（「ＭＡＧＥ－Ａ４－ＶＨ」）に由来する重鎖可変領域を含み、第２の抗原結合領域は、ＭＡＧＥ－Ａ４－ＶＬと対になった抗ＣＤ３抗体（「ＣＤ３－ＶＨ」）に由来する重鎖可変領域を含む。原則として、抗ＣＤ３抗体（「ＣＤ３－ＶＬ」）由来の同族軽鎖可変領域を、抗体の両方のアームに共通の軽鎖可変領域として使用することもまた可能である。本実施例で作成した全ての二重特異性抗体において、同じＭＡＧＥ－Ａ４－ＶＨを使用した。ｂｓＡｂ６０５４抗体は、配列番号２／１０のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲを含むＭＡＧＥ－Ａ４結合アームと、配列番号７３／１０のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲを含むＣＤ３結合アームと、を含む。ｂｓＡｂ６０４３抗体は、配列番号２／１０のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲを含むＭＡＧＥ－Ａ４結合アームと、配列番号５５／１０のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲを含むＣＤ３結合アームと、を含む。

抗ＣＤ３抗原結合アーム及び抗ＭＡＧＥ－Ａ４結合アームを構築するために使用される、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域並びにＣＤＲのアミノ酸配列識別子を、表３に記載する。対応する核酸配列識別子を、表４に示す。抗ＭＡＧＥ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を、中親和性ＣＤ３抗体（抗ＣＤ３－Ａ、本明細書においてＨ４ｓＨ７２２１Ｇ又は７２２１Ｇと称される）、又は高親和性ＣＤ３抗体（抗ＣＤ３－Ｂ、本明細書においてＨｐＨ４ｓＨ７１９５Ｐ又は７１９５Ｐと称される）のいずれかから生成した。第１の抗原結合領域及び第２の抗原結合領域は、本明細書において、二重特異性抗体の「アーム」と称される。実施例では、一方のアームは、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲと、を含み、一方で、他方のアームは、配列番号５５、又は配列番号７３のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲを含み、ＬＣＶＲは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。

実施例２：抗ＨＬＡ－Ａ２の結合：フローサイトメトリーを介してＭＡＧＥ－Ａ４（２８６－２９４）でパルスされたＴ２細胞に対するＭＡＧＥ－Ａ４（２８６－２９４）抗体
抗ＨＬＡ－Ａ２：ＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４抗体（ｍＡｂＭ３１３３９Ｎ）の、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１陽性Ｔ２（１７４ＣＥＭ．Ｔ２）細胞への細胞表面結合を、フローサイトメトリー系のペプチドパルスアッセイにおいて評価した。パルスするために、１×１０^６のＴ２細胞を、１ｍｌのＡＩＭＶ培養液（ジブコ社製，カタログ番号３１０３５－０２５）中で１６時間、３７℃で、１０μｇ／ｍｌのヒト（ｈ）Ｂ２Ｍ（ＥＭＤミリポア社製，カタログ番号４７５８２８）及び１００μｇ／ｍｌのＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４ペプチドで培養した。細胞を、染色緩衝液（カルシウム及びマグネシウムを含まないＰＢＳ（コーニング社製，参照番号２１－０３１－ＣＶ）＋２％のＦＢＳ（セラダイム社製，ロット番号２３８Ｂ１５））中で洗浄し、細胞解離緩衝液（ミリポア社製，カタログ番号Ｓ－００４－Ｃ）を使用して回収し、染色緩衝液中に再懸濁した。パルスした細胞（２００，０００個）を、９６ウェルＶ底プレート（アキシジェン社製，カタログ番号Ｐ－９６－４５０Ｖ－Ｃ－Ｓ）に播種し、ｍＡｂＭ３１３３９Ｎの３倍連続希釈（１．７ｐＭ～１００ｎＭ）で、又は非結合対照抗体（ｍＡｂ１０９７）で、４℃で３０分間、染色した。次に、細胞を、染色緩衝液で１回洗浄し、５ｕｇ／ｍｌのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７共役Ｆａｂ’２抗マウスＦｃ特異的二次的抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製，カタログ番号１１５－６０６－０７１）で、４℃で３０分間、培養した。最後に、細胞を、１：１０００の濃度の緑色蛍光生存色素（５０μｌのＤＭＳＯ中で再構築した、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ社製，カタログ番号Ｌ－３４９７０）で、染色した。次に、細胞を洗浄し、ＰＢＳで希釈したＢＤＣｙｔｏｆｉｘ（ＢＤ社製，カタログ番号５５４６５５）の５０％の溶液を使用して、固定した。試料を、ＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔｉＱｕｅフローサイトメーター（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ社製）にかけ、Ｆｏｒｅｃｙｔｅ分析ソフトウェア（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔｅ）を使用して結果を分析して、生細胞のゲーティング後の平均蛍光強度（Mean Fluorescent Intensity、ＭＦＩ）を計算した。ＥＣ_５０値を計算するために、１２ポイントの応答曲線上で４パラメータロジスティック方程式を使用して、ＭＦＩ値をＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍにプロットした。各用量応答曲線の二次抗体のみ（つまり、一次抗体なし）もまた、３倍連続希釈の継続として分析に含まれ、最低用量として表される。用量応答曲線上の最高のＭＦＩと二次的単独ウェルにおけるＭＦＩとの比を取ることによって、シグナル対雑音（Ｓ／Ｎ）が決定された。ＥＣ_５０値（Ｍ）及び最大Ｓ／Ｎを、表５に示す。ｍＡｂＭ３１３３９Ｎは１．７ｎＭのＥＣ５０及び１９３３の最大Ｓ／Ｎで結合したが、対照抗体（ｍＡｂ１０９７）の結合は検出されず、ｍＡｂ３１３３９ＮがＭＡＧＥ－Ａ４（２８６－２９４）に対して強い結合親和性を有することを示した。表５を参照すると、ＮＤは、試験した抗体濃度範囲内で結合が飽和に達しなかったために正確に決定され得なかったＥＣ５０値を指す。

実施例３：抗ＨＬＡ－Ａ２の結合：ＭＡＧＥ－Ａ４関連ペプチドでパルスされたＴ２細胞に対するＭＡＧＥ－Ａ４抗体及びＭＡＧＥ－Ａ４×ＣＤ３二重特異性抗体。
インシリコ計算戦略（ＤｈａｎｉｋＡｅｔ．ａｌ．ＢＭＣＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２０１６）により、ＭＡＧＥ－Ａ４に関連するいくつかのペプチドが同定されたが、これらのペプチドは、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１と複合体を形成すると予測された。同定されたペプチドを、表６に要約する。

親抗体（ｍＡｂＨ３１３３９Ｎ２）、ＭＡＧＥ－Ａ４×ＣＤ３（７２２１Ｇ）二重特異性抗体（ｂｓＡｂ６０４３）、及び非結合アイソタイプ対照抗体（ｍＡｂ４２４１）の、表６に示されるこれらの関連ペプチドへの結合を、上記のＴ２パルスアッセイにおいて評価した。実施例１において上述したように、ｂｓＡｂ６０４３抗体は、配列番号２／１０のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲを含むＭＡＧＥ－Ａ４結合アームと、配列番号５５／１０のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲを含むＣＤ３結合アームと、を含む。表７に要約したように、両抗体は、ｍＡｂＨ３１３３９Ｎ２については３１０、ｂｓＡｂ６０４３については２４４のＳ／Ｎ値でＭＡＧＥ－Ａ４ペプチドに結合し、実質的にベースライン（ペプチドなし）を上回った。試験した抗体は、ｍＡｂＨ３１３３９Ｎ２については１３１のＳ／Ｎ値で、ｂｓＡｂ６０４３については１１０のＳ／Ｎ値で、ＡＯＸ１に対してより低い結合を示し、両方の抗体については、５のＳ／Ｎ値でＳＨＴＮ１に対してより低い結合を示した。残りのペプチドへの検出可能な結合は観察されず、対照抗体結合は、全ての試験ペプチドについて≦３であった。

実施例４：Ｔ細胞レポータ／抗原提示細胞（ＡＰＣ）生物学的検定における、ＭＡＧＥ－Ａ４×ＣＤ３二重特異性抗体の活性の評価。
ＭＡＧＥ－Ａ４×ＣＤ３二重特異性抗体の活性を、Ｔ細胞レポータ／抗原提示細胞（ＡＰＣ）生物学的検定において評価した。アッセイ細胞株を作製するために、Ｊｕｒｋａｔ細胞にＮＦ－ＫＢ依存性κＢＬｕｃルシフェラーゼレンチウイルスレポータベクター（キアゲン社製）を形質導入し、単細胞を高いルシフェラーゼ活性について選別して、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦ－κＢＬｕｃアッセイ細胞株を生成した。ＭＡＧＥ－Ａ４及びＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１を内因的に発現する骨髄腫細胞株であるＩＭ９細胞及びＵ２６６Ｂ１細胞を、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として利用した。更に、ＭＡＧＥ－Ａ４及びＨＬＡ－Ａ２陰性であるＲａｊｉ細胞を、対照として使用した。簡単に言えば、２５，０００個のＪｕｒｋａｔ／ＮＦ－κＢＬｕｃ細胞を、２５μｌのアッセイ培地（１０％のＦＢＳ及び１％のＰ／Ｓ／Ｇを含むＲＰＭＩ培地）中で、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｎｕｎｃ９６ウェル白色プレート（サーモ・サイエンティフィック社製，カタログ番号１３６１０１）に添加し、続いて、２５μｌのアッセイ培地中に２５，０００個のＡＰＣを添加した。２７．４ｐＭ～２０ｎＭの抗体の３倍連続希釈物を、５０μｌのアッセイ培地中のプレートに添加した。細胞混合物を、３７℃、５％のＣＯ_２で、加湿インキュベータ内で５時間培養した。製造者取扱説明書に従って、ＰｒｏｍｅｇａＯｎｅ－Ｇｌｏ（カタログ番号Ｅ６１３０）及びＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダを使用して、ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼ活性を測定した。相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）を生成し、８点用量応答曲線（ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ）にわたる４パラメータロジスティック方程式を使用して、ＥＣ５０値を決定した。各用量応答曲線の一次的抗体ゼロ条件（二次的抗体単独）もまた、３倍連続希釈の継続として分析に含まれ、最低用量として表される。最大活性は、曲線上の最高ＲＬＵと最低ＲＬＵとの比を取得することによって決定され、シグナル：雑音（Ｓ／Ｎ）として表される。ＥＣ５０値及びＳ／Ｎを、表８に要約する。表８に関して、ＮＤは、試験した抗体濃度範囲内で結合が飽和に達しなかったために正確に決定され得なかったＥＣ５０値に対応する。

実施例１に記載のように、ｂｓＡｂ６０５４抗体は、配列番号２／１０のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲを含むＭＡＧＥ－Ａ４結合アームと、配列番号７３／１０のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲを含むＣＤ３結合アームと、を含み、ｂｓＡｂ６０４３抗体は、配列番号２／１０のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲを含むＭＡＧＥ－Ａ４結合アームと、配列番号５５／１０のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲを含むＣＤ３結合アームと、を含む。ｂｓＡｂ４２４１抗体及びｂｓＡｂ３９０５抗体は、それぞれ、ｂｓＡｂ６０４３及びｂｓＡｂ６０５４と同じ抗ＣＤ３ＨＣＶＲを含む抗ＣＤ３結合アームを有する（ＭＡＧＥ－Ａ４に対する）非結合対照であり、それぞれの抗体の非ＭＡＧＥ－Ａ４結合アームに由来する同族の軽鎖可変領域と対合する。

表８に示すように、ＭＡＧＥ－Ａ４×ＣＤ３中親和性二重特異性抗体（ｂｓＡｂ６０４３）は、ＩＭ９細胞、Ｕ２６６Ｂ１細胞、又はＲＡＪＩ細胞の存在下で、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦ－κＢＬｕｃ生物学的検定において活性を有さなかった。対照的に、ＭＡＧＥ－Ａ４×ＣＤ３高親和性二重特異性抗体（ｂｓＡｂ６０５４）は、ＩＭ９細胞及びＵ２６６Ｂ１細胞に対して、それぞれ、７．４Ｅ～１０Ｍ及び３．１Ｅ～０９ＭのＥＣ５０値、並びに４１．９及び６．３のＳ／Ｎ値を有した。中親和性ＣＤ３アーム（ｍＡｂ４２４１）又は高親和性ＣＤ３アーム（ｍＡｂ３９０５）のいずれかを有する非結合対照二重特異性抗体は、≦２．２のＳ／Ｎ値で最小限に活性であった。更に、ＲＡＪＩ細胞に対するいずれの抗体の活性もなかった。

同様の生物学的検定を実施したが、今回は、一定量の抗ＣＤ２８抗体を添加した。ここで、ＣＤ２８の添加は、ＩＭ９細胞に対するｂｓＡｂ６０５４の活性を部分的に遮断したが（ＥＣ５０２．１Ｅ０９Ｍ、Ｓ／Ｎ２８．７）、Ｕ２６６Ｂ１細胞に対する活性をわずかに増加させた（ＥＣ５０６．１Ｅ－０９Ｍ、Ｓ／Ｎ８．６）。これは、これらの細胞株上で内因的に発現されるＣＤ８０及びＣＤ８６共刺激分子のレベルに起因する可能性が高い。ＩＭ９は、高レベルのＣＤ８０及びＣＤ８６を、内因的に有する。従って、生物学的検定におけるＣＤ２８抗体の添加は、Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ２８とそのリガンドＣＤ８０及びＣＤ８６との天然の相互作用を遮断し、したがって、活性を低下させる。Ｕ２６６Ｂ１は、低レベルのＣＤ８０及びＣＤ８６を有する。ここで、ＣＤ２８の添加は、Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ２８シグナル伝達を刺激し、活性を増加させる（表９）。

表８に関連して上記で考察された抗体に加えて、ｍＡｂ５７０５は、配列番号８５のＨＣＶＲ及び配列番号９３のＬＣＶＲを含む抗ＣＤ２８抗体である。

実施例５：Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦ－κＢ－Ｌｕｃ／ＡＰＣレポータ生物学的検定におけるペプチド特異性
操作されたＴ細胞／ＡＰＣ機能的Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦ－κＢＬｕｃレポータ／ＡＰＣ生物学的検定もまた利用して、ＭＡＧＥ－Ａ４×ＣＤ３二重特異性抗体が、表７に同定された関連ペプチドよりもＭＡＧＥ－Ａ４ペプチドに対する選択性を保持しているかどうかを評価した。本アッセイでは、Ｔ２細胞を、前述の通り、標的ペプチドＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４又は配列関連オフ標的ペプチド（表７）でパルスした。表１０に要約したように、ＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４ペプチドでパルスしたＴ２細胞と共に培養した場合に、ｂｓＡｂ６０４３（ＭＡＧＥ－Ａ４×ＣＤ３中親和性）及びｂｓＡｂ６０５４（ＭＡＧＥ－Ａ４×ＣＤ３高親和性）二重特異性抗体の両方が、ＮＦ－κＢ依存性レポータ活性を刺激した。オフ標的ペプチドＡＯＸ１７９５－８０３及びＳＨＴＮ１１９８－２０６でパルスしたＴ２細胞と共に培養した場合にもまた、活性が検出された。要約すると、ｂｓＡｂ６０４３は、ＭＡＧＥ－Ａ４２９３－２９４、ＡＯＸ１７９５－８０３、及びＳＨＴＮ１１９８－２０６ペプチドについて、それぞれ、３．０Ｅ－１０Ｍ、３．３Ｅ－１０Ｍ、及び３．５Ｅ－０９ＭのＥＣ５０値、並びに７５．２、４０．４及び７５．３のＳ／Ｎ値でレポータ活性を刺激した。ｂｓＡｂ６０５４は、ＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４、ＡＯＸ１７９５－８０３、及びＳＨＴＮ１１９８－２０６ペプチドについて、それぞれ、２．０Ｅ－１２Ｍ、２．１Ｅ－１１Ｍ、及び１．３Ｅ－０９ＭのＥＣ５０値、並びに７８．７、３６、及び８１．１のＳ／Ｎ値でレポータ活性を刺激した。中親和性ＣＤ３アーム（ｍＡｂ４２４１）又は高親和性ＣＤ３アーム（ｍＡｂ３９０５）のいずれかを有する非結合対照二重特異性抗体は、≦２．９のＳ／Ｎ値で最小限に活性であった。

実施例６：一次的画像系の死滅アッセイ
ＭＡＧＥ－Ａ４×ＣＤ３二重特異性抗体が癌細胞に対するＴ細胞応答を方向転換する能力を評価するために、イメージング系の多重化一次的Ｔ細胞死滅アッセイを実施した。簡単に言えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、製造業者のプロトコルに従って、磁気ビーズ分離（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ社製，カタログ番号１３０－０４５－２０１）を用いてヒト末梢血単核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells、ＰＢＭＣ）から単離し、ＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４抗原提示ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１陽性ＩＭ９細胞株を、製造者取扱説明書に従って、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ（サーモ・フィッシャー社製、Ｃ３４５５７）で予め標識した。９６ウェルイメージングプレート（パーキンエルマー社製，カタログ番号６０５５３０８）中の１００ｕｌの刺激培地（ＸＶｉｖｏ１５＋１０％のＦＢＳ＋１％のＨＥＰＥＳ＋１％のＮａＰｙｒ＋１％のＮＥＡＡ＋０．０１ｍＭのＢＭＥ）中で、ＩＭ９多発性骨髄腫細胞（１０，０００）を、ＣＤ８＋Ｔ細胞（２５，０００）と合わせた。２０ｎＭ～２７．４ｐＭの範囲の抗体の３倍連続希釈物を、更なる１００μｌの刺激培地中の細胞に添加した。７２時間の培養後、５０μｌの上清をサイトカイン放出アッセイ（下記を参照のこと）のために取り出し、核色素ＤＲＡＱ５（サーモフィッシャー社製，カタログ番号６２２５２）の１：１０００希釈物（ＰＢＳ中）１５μｌを、細胞に添加した。ＤＲＡＱ５標識核及びＣｅｌｌ－Ｔｒａｃｅバイオレット標識ＡＰＣの画像を、ＯｐｅｒａＰｈｅｎｉｘ（パーキンエルマー社製）上に収集し、全ての条件（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）バイオレット及びＤＲＡＱ５の両方で標識された集団）における生存ＩＭ９細胞の数を、Ｈａｒｍｏｎｙ解析ソフトウェア（パーキンエルマー社製）を使用して計算した。ＥＣ５０値は、得られた非シグモイド曲線から生成することができなかったので、生存ＩＭ９（抗体なしの条件に対して正規化された）細胞の％を、６．６ｎＭ用量（非結合対照が不活性であった最高試験用量）について報告した。表１１に要約されるように、ｂｓＡｂ６０４３（ＭＡＧＥ－Ａ４×ＣＤ３（７２２１Ｇ）中親和性二重特異性抗体）は、生存ＩＭ９細胞集団の％に対して正の影響を有さなかったが、ｂｓＡｂ６０５４（ＭＡＧＥ－Ａ４×ＣＤ３高親和性二重特異性抗体）は、ＩＭ９集団を３８％に減少させた。２ｎＭの抗ＣＤ２８アゴニスト抗体の添加は、生存細胞の数を倍増させた（８０％）（表９）。これは、ｍＡｂ５７０５がＣＤ２８を遮断し、それによって、ＩＭ９細胞上で内因的に発現されるＣＤ８０及びＣＤ８６との相互作用を阻害する能力に起因し得る。非結合対照×ＣＤ３二重特異性抗体ｍＡｂ４２４１（中ＣＤ親和性）及びｍＡｂ３９０５（高ＣＤ３親和性）は、アッセイにおいて活性を有さなかった。

実施例７：一次的サイトカイン放出アッセイ
ＩＬ２及びＩＦＮ－γ放出はまた、上記の画像系の殺傷アッセイにおいて利用される６．６ｎＭの処置用量からサンプリングされた細胞培養上清において評価された。サイトカインレベルを、ＡｌｐｈａＬｉｓａ（パーキンエルマー社製，カタログ番号ＡＬ２２１Ｆ、ＡＬ２１７Ｆ）により、製造者取扱説明書に従って決定し、ＲＬＵ値を未処理ウェルに対して正規化して、Ｓ／Ｎ値を決定した。表１２に要約されるように、ｂｓＡｂ６０４３（ＭＡＧＥ－Ａ４×ＣＤ３（７２２１Ｇ）中親和性二重特異性抗体）は、いずれのＩＬ２又はＩＦＮ－γも放出しなかったが、より高い親和性のＭＡＧＥ－Ａ４×ＣＤ３二重特異性抗体ｂｓＡｂ６０５４は、それぞれ２．１及び２．４のＳ／Ｎ値で、ＩＬ２及びＩＦＮ－γの中程度の産生を誘導した。ＣＤ２８抗体（ｍＡｂ５７０５）の添加は、サイトカイン産生に有意に影響を及ぼさなかった（表１２）。

実施例８：ＭＡＧＥ－Ａ４特異的キメラ抗原受容体の生成
表１の抗ＭＡＧＥ－Ａ４３１３３９Ｎ２抗体は、ＶＬ－ＶＨ単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）に再形式化され、それぞれ、配列番号１及び配列番号９に対応する抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体のＨＣＶＲ及びＬＣＶＲヌクレオチド配列を使用して、ＣＤ８αヒンジ及び膜貫通領域、４－１ＢＢ共刺激領域、並びにＣＤ３ゼータ刺激領域、又はＣＤ２８ヒンジ、膜貫通、及びシグナル伝達領域を使用するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構成に入れられた。対応する抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体（ｍＡｂＨ３１３３９Ｎ２）の全長核酸及びポリペプチド重鎖配列は、それぞれ、配列番号１７及び配列番号１８に対応する。対応する抗ＭＡＧＥ－Ａ４抗体（ｍＡｂＨ３１３３９Ｎ２）の全長核酸及びポリペプチド軽鎖配列は、それぞれ、配列番号１９及び配列番号２０に対応する。全長核酸及びポリペプチドＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４_{２８６－２９４}を標的とするＣＡＲ配列は、それぞれ、配列番号２１及び配列番号２２に対応する。非結合対照として、無関係なｓｃＦｖのヌクレオチド配列を使用して同様のＣＡＲを設計した。ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲをレンチウイルス発現ベクター（Ｌｅｎｔｉ－Ｘ（商標）バイシストロン性発現システム（Ｎｅｏ）、クロンテック社製、カタログ番号６３２１８１）にクローン化し、レンチウイルス粒子をＬｅｎｔｉ－Ｘパッケージングシングルショット（ＶＳＶ－Ｇ）システム（クロンテック社製，カタログ番号６３１２７６）を介して、製造元のプロトコルに従って生成した。次に、ＮＦＫＢ－ルシフェラーゼレポータを発現するように操作されたＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ／ＮＫＦＢＬｕｃｃｌ１Ｃ１１）に、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）ＰｒｅｃｏａｔｅｄＤｉｓｈｅｓ（クロンテック社製，カタログ番号Ｔ１１０ａ）を使用して、製造元のプロトコルに従ってＣＡＲ構成を形質導入した。５００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ジブコ社製，カタログ番号１１８１１－０９８）で少なくとも２週間について選択後、以下のＣＡＲＴ細胞株を生成した。Ｊｕｒｋａｔ／ＮＫＦＢＬｕｃｃ１１Ｃ１１／ＭＡＧＥ－Ａ４（２８６－２９４）３１３３９ＶＬ－ＶＨＣＡＲＴ。非結合対照として、無関係なｓｃＦｖのヌクレオチド配列を使用して、同様のＣＡＲを設計した。このＣＡＲＴ細胞株を、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する細胞への応答において、細胞表面発現及び機能的活性について評価した。

実施例９：Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＭＡＧＥ－Ａ４ＣＡＲ構築の細胞表面発現、及びＭＡＧＥ－Ａ４ＣＡＲＴ細胞の活性化
Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦ－κＢ－Ｌｕｃ細胞におけるＭＡＧＥ－Ａ４ＣＡＲ構築の細胞表面発現の相対レベルを、フローサイトメトリーによって評価した。染色するために、細胞をカルシウム及びマグネシウムを含まないＰＢＳの染色緩衝液（Ｉｒｖｉｎｇ９２４０）、及び２％のＢＳＡ（シグマーアルドリッチ社製，カタログ番号Ａ８５７７）中で、９６ウェルＶ底プレートのウェル当たり２００，０００細胞の密度で播種し、１０μｇ／ｍｌのタンパク質Ｌ（ジェンスクリプト社製，ビオチンタンパク質Ｌ、カタログ番号Ｍ０００９７）で、４℃で３０分間染色した。培養後、細胞を、染色緩衝液で１回洗浄し、０．５μｇ／ｍｌのストレプトアビジンＡｌｅｘａ－６４７二次的抗体（バイオレジェンド社製，カタログ番号４０５２３７）で、４℃で３０分間染色した。最後に、細胞を、１：１０００の濃度の緑色蛍光生存色素（５０μｌのＤＭＳＯ中で再構築した、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ社製，カタログ番号Ｌ－３４９７０）で、染色した。次に、細胞を洗浄し、ＰＢＳで希釈したＢＤＣｙｔｏｆｉｘ（ベクトン・ディッキンソン社製，カタログ番号５５４６５５）の５０％の溶液を使用して、固定した。試料を、ＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔｉＱｕｅフローサイトメーターで実行し、生存細胞を得た後に、ＦｌｏｗＪｏ１０．２で分析して、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を計算した。タンパク質Ｌ陽性細胞のパーセントは、タンパク質Ｌ陽性細胞の数を取得し、細胞の総数で割ることによって計算された。表１３は、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦ－κＢ－Ｌｕｃ／ＭＡＧＥ－Ａ４３１３３９Ｎ２ＶＬ－ＶＨＣＡＲ－Ｔ細胞株が、タンパク質Ｌ染色パーセントによって測定した際に、３３．８％のＣＡＲ陽性であったことを示す。非標的化対照ＣＡＲは、細胞の６７．２％で発現された。

ＣＡＲＴ細胞株の活性は、ＣＡＲＴ／ＡＰＣ（抗原提示細胞）生物学的検定で評価された。生物学的検定を実施するために、５０μｌのアッセイ培地（１０％のＦＢＳ及び１％のＰ／Ｓ／Ｇを含むＲＰＭＩ培地）中の５０，０００個のＣＡＲＴ細胞を、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｎｕｎｃ９６ウェル白色プレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製，カタログ番号１３６１０１）に添加し、続いて、５０μｌのアッセイ培地中のＡＰＣの３倍連続希釈（５００，０００細胞～６８５細胞）を添加した。以下のＡＰＣを利用した：ＩＭ９（ＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４ペプチドを内因的に発現し、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１陽性である）、及びＨＥＫ２９３（ＭＡＧＥ－Ａ４２８６－２９４陰性であるが、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１陽性である）。細胞混合物を、３７℃、５％のＣＯ_２で、加湿インキュベータ内で５時間培養した。ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼ活性を、ＰｒｏｍｅｇａＯｎｅ－Ｇｌｏ（カタログ番号Ｅ６１３０）及びパーキンエルマー社製のＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダを使用して、決定した。相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）を生成し、８点用量応答曲線にわたる４パラメータロジスティック方程式を使用してＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍにプロットして、ＥＣ５０値（ＡＰＣの数）を生成した。各用量応答曲線についてのゼロＡＰＣ条件も、３倍連続希釈の継続として分析に含まれ、最低用量として表された。ＥＣ５０（ＡＰＣの数）として報告し、曲線上の最高ＲＬＵと最低ＲＬＵとの比をとることによって、ＣＡＲ－Ｔ活性を決定し、シグナル：雑音（Ｓ：Ｎ）として、表１４に表される。３１３３９Ｎ２ＣＡＲ－Ｔは、ＩＭ９細胞との培養時に活性化され、ＥＣ５０は１４、６６９個の細胞及びＳ／Ｎは３７．４であったが、非標的化対照ＣＡＲ－Ｔは４．９倍しか活性化されなかった。ＨＥＫ２９３細胞（ＭＡＧＥ－Ａ４陰性であるが、ＨＬＡ－Ａ２陽性である）では、活性化は観察されなかった。

実施例１０：抗ＨＬＡ－Ａ２の結合：ＭＡＧＥ－Ａ４２３０－２３９及び関連オフ標的ペプチドでパルスされたＴ２細胞に対するフローサイトメトリーによるＭＡＧＥ－Ａ４２３０－２３９抗体
抗ＨＬＡ－Ａ２：ＭＡＧＥ－Ａ４２３０－２３９抗体（ｍＡｂＭ３４８５２Ｎ）の、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１陽性Ｔ２（１７４ＣＥＭ．Ｔ２）細胞への細胞表面結合を、フローサイトメトリー系のペプチドパルスアッセイにおいて、評価した。パルスするために、１×１０^６のＴ２細胞を、１ｍｌのＡＩＭＶ培養液（ジブコ社製，カタログ番号３１０３５－０２５）中で１６時間、３７℃で、１０μｇ／ｍｌのヒト（ｈ）Ｂ２Ｍ（ＥＭＤミリポア社製，カタログ番号４７５８２８）及び１００μｇ／ｍｌのＭＡＧＥ－Ａ４２３０－２３９ペプチドで、培養した。細胞を、染色緩衝液（カルシウム及びマグネシウムを含まないＰＢＳ（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製，カタログ番号９３１９）＋２％のＦＢＳ（セラダイム社製，ロット番号２３８Ｂ１５））中で洗浄し、細胞解離緩衝液（ミリポア社製，カタログ番号Ｓ－００４－Ｃ）を使用して回収し、染色緩衝液中に再懸濁した。パルスした細胞（２００，０００個）を、９６ウェルＶ底プレート（アキシジェン社製，カタログ番号Ｐ－９６－４５０Ｖ－Ｃ－Ｓ）に播種し、ｍＡｂＭ３４８５２Ｎの３倍連続希釈（１．７ｐＭ～１００ｎＭ）で、又は非結合対照抗体（ｍＡｂ１０９７）で、４℃で３０分間、染色した。次に、細胞を、染色緩衝液で１回洗浄し、５ｕｇ／ｍｌのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７共役Ｆａｂ’２抗マウスＦｃ特異的二次的抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製，カタログ番号１１５－６０６－０７１）で、４℃で３０分間、培養した。最後に、細胞を、１：１０００の濃度の緑色蛍光生存色素（５０μｌのＤＭＳＯ中で再構築した、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ社製，カタログ番号Ｌ－３４９７０）で、染色した。次に、細胞を洗浄し、ＰＢＳで希釈したＢＤＣｙｔｏｆｉｘ（ＢＤ社製，カタログ番号５５４６５５）の５０％の溶液を使用して、固定した。試料を、ＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔｉＱｕｅフローサイトメーター（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ社製）にかけ、Ｆｏｒｅｃｙｔｅ分析ソフトウェア（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）を使用して結果を分析して、生細胞のゲーティング後の平均蛍光強度（Mean Fluorescent Intensity、ＭＦＩ）を計算した。ＥＣ_５０値を計算するために、１２ポイントの応答曲線上で４パラメータロジスティック方程式を使用して、ＭＦＩ値をＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍにプロットした。各用量応答曲線の二次抗体のみ（つまり、一次抗体なし）もまた、３倍連続希釈の継続として分析に含まれ、最低用量として表された。用量応答曲線上の最高のＭＦＩと二次的単独ウェルにおけるＭＦＩとの比を取ることによって、シグナル対雑音（Ｓ／Ｎ）が決定された。ＥＣ_５０値（Ｍ）及び最大Ｓ／Ｎを表１５に示す。ｍＡｂＭ３４８５２Ｎは、４．７ｎＭのＥＣ_５０及び２４３．３の最大Ｓ／Ｎで結合したが、対照抗体（ｍＡｂ１０９７）の結合は、弱くしか検出されなかった。

ＮＤ＝ＥＣ５０値は、結合が試験抗体濃度範囲内で飽和に達しなかったので、正確に決定することができなかった。

インシリコ計算戦略により、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１と複合体を形成すると予測されるいくつかのＭＡＧＥ－Ａ４関連ペプチドが同定された。同定されたペプチドを、表１６に要約する。これらの関連ペプチドへのＨＬＡ－Ａ２：ＭＡＧＥ－Ａ４２３０－２３９抗体（ｍＡｂＭ３４８５２Ｎ）及び非結合アイソタイプ対照抗体（ｍＡｂ１０９７）の結合を、上記のＴ２パルシングアッセイにおいて、１００ｎＭの単一濃度で評価した。ここでの結合は、非パルス細胞への結合で割ったペプチドパルス細胞への結合のＭＦＩ比として表１７に示される。ｍＡｂＭ３４８５２Ｎは、５１２．９の結合比でＭＡＧＥ－Ａ４ペプチドに結合したが、アイソタイプ対照ｍＡｂ１０９７は、４．３の結合比でそれに結合した。ｍＡｂＭ３４８５２Ｎは、８７０．２の結合比でＭＡＧＥ－Ａ８（２３２－２４１）ペプチドに対して同様の結合を有した。しかしながら、残りのペプチドへの検出可能な結合は観察されず、対照抗体結合は全ての試験ペプチドについて＜４．３であり、ｍＡｂＭ３４８５２ＮがＭＡＧＥ－Ａ４に対する治療薬としての可能性を有することを示した。

ＭＡＧＥ－Ａ４（２３０－２３９）配列からの変化を、下線で示す。

実施例１１：ＨＬＡ－Ａ２：ＭＡＧＥ－Ａ４（２３０－２３９）アラニン走査
抗ＨＬＡ－Ａ２：ＭＡＧＥ－Ａ４２３０－２３９抗体（ｍＡｂＭ３４８５２Ｎ）の、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１陽性Ｔ２（１７４ＣＥＭ．Ｔ２）細胞への細胞表面結合を、フローサイトメトリー系のペプチドパルスアッセイにおいて、評価した。パルスするために、１×１０^６のＴ２細胞を、１０ｇμｇ／ｍｌのヒト（ｈ）Ｂ２Ｍ（ＥＭＤミリポア社製，カタログ番号４７５８２８）、及び１ｍｌのＡＩＭＶ培地中のｇ／ｍｌの１００μｇ／ｍｌのＭＡＧＥ－Ａ４２３０－２３９ペプチド（ジブコ社製，カタログ３１０３５－０２５）で、３７℃で１６時間培養した。細胞を、染色緩衝液（カルシウム及びマグネシウムを含まないＰＢＳ（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製，カタログ番号９３１９）＋２％のＦＢＳ（セラダイム社製，ＬｏｔＮｏ．２３８Ｂ１５）で洗浄し、細胞分離緩衝液（ミリポア社製，カタログ番号Ｓ－００４－Ｃ）を使用して回収し、染色緩衝液に再懸濁した。パルスした細胞（２００，０００）を、９６ウェルＶ底プレート（アキシジェン社製，カタログ番号Ｐ－９６－４５０Ｖ－Ｃ－Ｓ）に播種し、ｍＡｂＭ３４８５２Ｎ又は非結合アイソタイプ対照抗体の３倍連続希釈物（１．７ｐＭ－１００ｎＭ）で、４℃で３０分間染色した。次に、細胞を、染色緩衝液で１回洗浄し、５ｕｇ／ｍｌのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７共役Ｆａｂ’２抗マウスＦｃ特異的二次的抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製，カタログ番号１１５－６０６－０７１）で、４℃で３０分間、培養した。最後に、細胞を、緑色蛍光生存色素（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ社製，カタログ番号Ｌ－３４９７０）で染色し、５０μｌのＤＭＳＯ中で、１：１０００の濃度で再構成した。次に、細胞を洗浄し、ＰＢＳで希釈したＢＤＣｙｔｏｆｉｘ（ＢＤ社製，カタログ番号５５４６５５）の５０％の溶液を使用して固定した。試料を、ＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔｉＱｕｅフローサイトメーター（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ社製）にかけ、Ｆｏｒｅｃｙｔｅ分析ソフトウェア（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）を使用して結果を分析して、生細胞のゲーティング後の平均蛍光強度（Mean Fluorescent Intensity、ＭＦＩ）を計算した。ＥＣ_５０値を計算するために、１２ポイントの応答曲線上で４パラメータロジスティック方程式を使用して、ＭＦＩ値をＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍにプロットした。各用量応答曲線の二次抗体のみ（つまり、一次抗体なし）もまた、３倍連続希釈の継続として分析に含まれ、最低用量として表された。用量応答曲線上の最高のＭＦＩと二次的単独ウェルにおけるＭＦＩとの比を取ることによって、シグナル対雑音（Ｓ／Ｎ）が決定された。ＥＣ_５０値（Ｍ）及び最大Ｓ／Ｎを表１９に示す。ｍＡｂＭ３４８５２Ｎは、４．７ｎＭのＥＣ_５０及び２４３．３の最大Ｓ／Ｎで結合したが、対照抗体の結合は、弱くしか検出されなかった。アラニン走査アッセイからの結果は、ｍＡｂＭ３４８５２がＭＡＧＥ－Ａ４（２３０－２３９）ペプチドにわたる結合を示したことを示す。

配列の説明

注釈付き配列
以下の注釈付き配列において、下線なしのセクションと下線付きのセクションとを交互に配置することで部分を識別する。部分の順序は、各配列の下に列挙されている順序に対応する（すなわち、最初の下線なしのセクションはＶＬであり、次の下線付きのセクションは（Ｇ４Ｓ）３であり、次の下線なしのセクションはＶＨなどである）。
ＭＡＧＥ－Ａ４（２８６－２９４）３１３３９Ｎ２ＶＬ－ＶＨＢＢｚＣＡＲ（配列番号２２）

ＶＬ
（Ｇ４Ｓ）３
ＶＨ
Ｇ４Ｓ
ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ
４－１ＢＢ共刺激領域
ＣＤ３Ｚ
ＭＡＧＥ－Ａ４（２８６－２９４）３１３３９Ｎ２ＶＬ－ＶＨＢＢｚＣＡＲ（配列番号１２０）

ＶＬ
（Ｇ４Ｓ）３
ＶＨ
Ｇ４Ｓ
ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ
４－１ＢＢ共刺激領域
ＣＤ３Ｚ
ＭＡＧＥ－Ａ４（２８６－２９４）３１３３９Ｎ２ＶＬ－ＶＨＣＤ２８ヒンジ／ＴＭ／ｃｙｔｏＣＤ３ｚＣＡＲ（配列番号１０５）

ＶＬ
（Ｇ４Ｓ）３
ＶＨ
Ｇ４Ｓ
ＣＤ２８ヒンジ
ＣＤ２８ＴＭ
ＣＤ２８共刺激領域
ＣＤ３Ｚ
ＭＡＧＥ－Ａ４（２８６－２９４）３１３３９Ｎ２ＶＬ－ＶＨＣＤ２８ヒンジ／ＴＭ／ｃｙｔｏＣＤ３ｚＣＡＲ（配列番号１２１）

ＶＬ
（Ｇ４Ｓ）３
ＶＨ
Ｇ４Ｓ
ＣＤ２８ヒンジ
ＣＤ２８ＴＭ
ＣＤ２８共刺激領域
ＣＤ３Ｚ

本発明は、本明細書に記載される具体的な実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されるものに加えて本発明の様々な変更が、前述の記載から当業者には明らかとなるであろう。このような変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図されている。

Claims

ＨＬＡ結合黒色腫関連抗原Ａ４（ＭＡＧＥ－Ａ４）に特異的に結合する抗原結合タンパク質であって、前記抗原結合タンパク質が、軽鎖可変領域（Light Chain Variable Region、ＬＣＶＲ）及び重鎖可変領域（Heavy Chain Variable Region、ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが、配列番号１０又は配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲの相補的決定領域（Complementarity Determining Regions、ＣＤＲ）を含み、前記ＨＣＶＲが、配列番号２、配列番号８３、又は配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲを含む、抗原結合タンパク質。
前記ＬＣＶＲが、配列番号１０又は配列番号１１５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
前記ＨＣＶＲが、配列番号２、配列番号８３、又は配列番号１０７に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の抗原結合タンパク質。
前記ＭＡＧＥ－Ａ４特異的抗原結合タンパク質が、配列番号３２のアミノ酸２８６～２９４又はその一部と相互作用する、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
ＭＡＧＥ－Ａ４特異的キメラ抗原受容体（Chimeric Antigen Receptor、ＣＡＲ）であって、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ａ）軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）及び重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗ＭＡＧＥ－Ａ４単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）領域を含む、細胞外リガンド結合領域と、（ｂ）ヒンジと、（ｃ）膜貫通領域と、（ｄ）４－１ＢＢ共刺激領域又はＣＤ２８共刺激領域及びＣＤ３ゼータシグナル伝達領域を含む細胞質領域であって、前記ＬＣＶＲが、配列番号１０又は配列番号１１５の前記アミノ酸配列を含むＬＣＶＲの相補的決定領域（ＣＤＲ）、及び配列番号２、配列番号８３、又は配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲを含む、細胞質領域と、を含む、ＭＡＧＥ－Ａ４特異的キメラ抗原受容体。
前記ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲが、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ａ）前記細胞外リガンド結合領域と、（ｂ）ヒンジと、（ｃ）膜貫通領域と、（ｄ）共刺激領域及びシグナル伝達領域を含む細胞質領域と、を含む、請求項５に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
前記抗ＭＡＧＥ－Ａ４ｓｃＦｖ領域が、前記ＬＣＶＲと前記ＨＣＶＲとの間に第１のリンカを含む、請求項５に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
前記細胞外リガンド結合領域と前記ヒンジとの間に、第２のリンカを更に含む、請求項５～７のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
前記第１のリンカが、配列番号２３～２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記第２のリンカが、配列番号２３～２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
前記第１のリンカが、配列番号２５の前記アミノ酸配列を含み、前記第２のリンカが、配列番号２３の前記アミノ酸配列を含む、請求項９に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
前記ヒンジ、前記膜貫通領域、又はそれらの両方が、ＣＤ８αポリペプチド由来である、請求項５～１０のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
前記共刺激領域が、４－１ＢＢ共刺激領域を含む、請求項５～１１のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
前記共刺激領域が、ＣＤ２８共刺激領域を含む、請求項５～１１のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
前記ヒンジ、前記膜貫通領域、又はそれらの両方が、ＣＤ２８ポリペプチド由来である、請求項５～１０、１２及び１３のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
前記ヒンジが、配列番号２７の前記アミノ酸配列を含む、請求項５～１２のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
前記膜貫通領域が、配列番号２８の前記アミノ酸配列を含む、請求項５～１２のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
前記４－１ＢＢ共刺激領域が、配列番号２９の前記アミノ酸配列を含む、請求項５～１２のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
前記ヒンジが、配列番号３４の前記アミノ酸配列を含む、請求項５～１０及び１２～１４のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
前記膜貫通領域が、配列番号３６の前記アミノ酸配列を含む、請求項５～１０、１２～１４、及び１８のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
前記ＣＤ２８共刺激領域が、配列番号３８の前記アミノ酸配列を含む、請求項５～１０、及び１２～１４、１８及び１９のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
前記シグナル伝達領域が、ＣＤ３ゼータシグナル伝達領域を含む、請求項５～２０のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
前記ＣＤ３ゼータシグナル伝達領域が、配列番号３０の前記アミノ酸配列を含む、請求項２１に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
前記抗原結合タンパク質が、ＭＡＧＥ－Ａ４特異的抗体、又はその抗原結合断片である、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
前記抗原結合タンパク質又は前記ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲが、配列番号２又は配列番号８３に記載の前記アミノ酸配列を含むＨＣＶＲ内に含有される３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）を含む、請求項１～４及び２３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質又は請求項５～２２のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
ＨＣＤＲ１が、配列番号４に記載の前記アミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が、配列番号６に記載の前記アミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が、配列番号８に記載の前記アミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の抗原結合タンパク質又はＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
前記ＨＣＶＲが、配列番号２に記載の前記アミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の抗原結合タンパク質又はＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
前記ＨＣＶＲが、配列番号８３に記載の前記アミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の抗原結合タンパク質又はＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
前記抗原結合タンパク質又は前記ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲが、配列番号１０７に記載の前記アミノ酸配列を含むＨＣＶＲ内に含有される３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）を含む、請求項１～４及び２３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質又は請求項５～２２のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
ＨＣＤＲ１が、配列番号１０９に記載の前記アミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が、配列番号１１１に記載の前記アミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が、配列番号１１３に記載の前記アミノ酸配列を含む、請求項２８に記載の抗原結合タンパク質又はＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
前記ＨＣＶＲが、配列番号１０７に記載の前記アミノ酸配列を含む、請求項２８に記載の抗原結合タンパク質又はＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
前記抗原結合タンパク質又は前記ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲが、配列番号１０又は配列番号１１５に記載の前記アミノ酸配列を含むＬＣＶＲ内に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）を含む、請求項１～４及び２３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項５～２２のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ、又は請求項２４～２９のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質若しくはＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
ＬＣＤＲ１が、配列番号１２に記載の前記アミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が、配列番号１４に記載の前記アミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３が、配列番号１６に記載の前記アミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の抗原結合タンパク質又はＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
前記ＬＣＶＲが、配列番号１０に記載の前記アミノ酸配列を含む、請求項３１に記載の抗原結合タンパク質又はＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
ＬＣＤＲ１が、配列番号１１７に記載の前記アミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が、配列番号１４に記載の前記アミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３が、配列番号１１９に記載の前記アミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の抗原結合タンパク質又はＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
前記ＬＣＶＲが、配列番号１１５に記載の前記アミノ酸配列を含む、請求項３３に記載の抗原結合タンパク質又はＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
前記抗原結合タンパク質又は前記ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲが、配列番号２に記載の前記アミノ酸配列を含むＨＣＶＲ及び配列番号１０に記載の前記アミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む、請求項１～４及び２３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質又は請求項５～２２のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
前記抗原結合タンパク質又は前記ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲが、配列番号８３に記載の前記アミノ酸配列を含むＨＣＶＲ及び配列番号１０に記載の前記アミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む、請求項１～４及び２３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質又は請求項５～２２のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
前記抗原結合タンパク質又は前記ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲが、配列番号１０７に記載の前記アミノ酸配列を含むＨＣＶＲ及び配列番号１１５に記載の前記アミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む、請求項１～４及び２３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質又は請求項５～２２のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
配列番号２２の前記アミノ酸配列を含む、請求項５に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
配列番号１０５の前記アミノ酸配列を含む、請求項５に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
配列番号１２０の前記アミノ酸配列を含む、請求項５に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
配列番号１２１の前記アミノ酸配列を含む、請求項５に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
前記抗原結合タンパク質又は前記ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲが、配列番号３２の２８６～２９４位の１種以上のアミノ酸に特異的に結合する、請求項１～４及び２３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項５～２２及び３８～４１のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ、又は請求項２４～３７のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質若しくはＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
前記抗原結合タンパク質又は前記ＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲが、前記ＨＬＡの１種以上のアミノ酸と相互作用する、請求項１～４及び２３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項５～２２及び３８～４１のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ、又は請求項２４～３７及び４２のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質若しくはＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
前記ＨＬＡがＨＬＡ－Ａ２である、請求項１～４及び２３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項５～２２及び３８～４１のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ、又は請求項２４～３７、４２及び４３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質若しくはＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ。
請求項１～４及び２３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項５～２２及び３８～４１のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ、又は請求項２４～３７及び４２～４４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質若しくはＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲをコードする、単離された核酸分子。
配列番号２１のヌクレオチド配列を含む、請求項４５に記載の単離された核酸分子。
配列番号１０４のヌクレオチド配列を含む、請求項４５に記載の単離された核酸分子。
請求項４５～４７のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
前記ベクターが、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はレトロウイルスベクターである、請求項４８に記載のベクター。
前記ベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項４９に記載のベクター。
請求項４５～４７のいずれか一項に記載の核酸分子、又は請求項４８～５０のいずれか一項に記載のベクターを含む、細胞。
前記細胞が、ヒトＴ細胞である、請求項５１に記載の細胞。
請求項１～４及び２３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項５～２２及び３８～４１のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ、又は請求項２４～３７及び４２～４４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質若しくはＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲを含む、操作された細胞。
免疫細胞である、請求項５３に記載の操作された細胞。
前記免疫細胞が、免疫エフェクタ細胞である、請求項５４に記載の操作された細胞。
前記免疫エフェクタ細胞が、Ｔリンパ球である、請求項５５に記載の操作された細胞。
前記Ｔリンパ球が、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球、又はヘルパーＴリンパ球である、請求項５６に記載の操作された細胞。
ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球である、請求項５７に記載の操作された細胞。
ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する癌の治療において使用するための、請求項５３～５８のいずれか一項に記載の操作された細胞。
前記ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する癌が、多発性骨髄腫である、請求項５９に記載の操作された細胞。
前記ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する癌が、黒色腫である、請求項５９に記載の操作された細胞。
操作されたヒトＴ細胞であって、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ａ）軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）及び重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗ＭＡＧＥ－Ａ４単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）領域を含む細胞外リガンド結合領域と、（ｂ）ヒンジと、（ｃ）膜貫通領域と、（ｄ）４－１ＢＢ共刺激領域又はＣＤ２８共刺激領域及びＣＤ３ゼータシグナル伝達領域を含む細胞質領域であって、前記ＬＣＶＲが、配列番号１０又は配列番号１１５の前記アミノ酸配列を含むＬＣＶＲの相補的決定領域（ＣＤＲ）、及び配列番号２、配列番号８３、又は配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲを含む、細胞質領域と、を含む、キメラ抗原受容体を含む、操作されたヒトＴ細胞。
前記抗ＭＡＧＥ－Ａ４ｓｃＦｖが、配列番号３２の２８６～２９４位の１つ以上のアミノ酸残基に特異的に結合する、請求項６２に記載の操作されたヒトＴ細胞。
前記ｓｃＦｖ領域が、配列番号２／１０の前記アミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項６２又は６３に記載の操作されたヒトＴ細胞。
前記ｓｃＦｖ領域が、配列番号２／８３の前記アミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項６２又は６３に記載の操作されたヒトＴ細胞。
前記ｓｃＦｖ領域が、配列番号１０７／１１５の前記アミノ酸配列を含むＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項６２又は６３に記載の操作されたヒトＴ細胞。
前記ＨＣＶＲが、３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）を含み、前記ＬＣＶＲが、３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）を含み、ＨＣＤＲ１が、配列番号４に記載の前記アミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が、配列番号６に記載の前記アミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が、配列番号８に記載の前記アミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が、配列番号１２に記載の前記アミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が、配列番号１４に記載の前記アミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３が、配列番号１６に記載の前記アミノ酸配列を含む、請求項６４又は６５に記載の操作されたヒトＴ細胞。
前記ＨＣＶＲが、３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）を含み、前記ＬＣＶＲが、３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）を含み、ＨＣＤＲ１が、配列番号１０９に記載の前記アミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が、配列番号１１１に記載の前記アミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が、配列番号１１３に記載の前記アミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が、配列番号１１７に記載の前記アミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が、配列番号１４に記載の前記アミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３が、配列番号１１９に記載の前記アミノ酸配列を含む、請求項６６に記載の操作されたヒトＴ細胞。
前記ヒンジが、配列番号２７の前記アミノ酸配列を含む、請求項６２～６８のいずれか一項に記載の操作されたヒトＴ細胞。
前記膜貫通領域が、配列番号２８の前記アミノ酸配列を含む、請求項６２～６９のいずれか一項に記載の操作されたヒトＴ細胞。
前記４－１ＢＢ共刺激領域が、配列番号２９の前記アミノ酸配列を含む、請求項６２～７０のいずれか一項に記載の操作されたヒトＴ細胞。
前記ヒンジが、配列番号３４の前記アミノ酸配列を含む、請求項６２～６８のいずれか一項に記載の操作されたヒトＴ細胞。
前記膜貫通領域が、配列番号３６の前記アミノ酸配列を含む、請求項６２～６８及び７２のいずれか一項に記載の操作されたヒトＴ細胞。
前記ＣＤ２８共刺激領域が、配列番号３８の前記アミノ酸配列を含む、請求項６２～６８、７２及び７３のいずれか一項に記載の操作されたヒトＴ細胞。
前記ＣＤ３ゼータシグナル伝達領域が、配列番号３０の前記アミノ酸配列を含む、請求項６２～７４のいずれか一項に記載の操作されたヒトＴ細胞。
配列番号２２の前記アミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む、請求項６２に記載の操作されたヒトＴ細胞。
配列番号１０５の前記アミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む、請求項６２に記載の操作されたヒトＴ細胞。
配列番号１２０の前記アミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む、請求項６２に記載の操作されたヒトＴ細胞。
配列番号１２１の前記アミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む、請求項６２に記載の操作されたヒトＴ細胞。
遺伝子修飾ヒトＴ細胞及び薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物であって、前記遺伝子修飾ヒトＴ細胞が、請求項１～４及び２３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項５～２２及び３８～４１のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ、又は請求項２４～３７及び４２～４４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質若しくはＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲを含む、医薬組成物。
請求項５３～５８のいずれか一項に記載の操作された細胞及び薬学的に許容可能なキャリアを含む、医薬組成物。
請求項６２～７９のいずれか一項に記載の操作されたヒトＴ細胞及び薬学的に許容可能なキャリアを含む、医薬組成物。
ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する癌の前記治療において使用するための、請求項８０～８２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する癌が、多発性骨髄腫である、請求項８３に記載の医薬組成物。
前記ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する癌が、黒色腫である、請求項８３に記載の医薬組成物。
ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する癌の前記治療のための薬剤の製造における、請求項１～４及び２３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質の使用、請求項５～２２及び３８～４１のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲの使用、又は請求項２４～３７及び４２～４４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質若しくはＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲの使用、請求項４５～４７のいずれか一項に記載の核酸の使用、請求項４８～５０のいずれか一項に記載のベクターの使用、請求項５１又は５２に記載の細胞の使用、請求項５３～５８のいずれか一項に記載の操作された細胞の使用、又は請求項６２～７９のいずれか一項に記載の操作されたヒトＴ細胞の使用。
前記ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する癌が、多発性骨髄腫である、請求項８６に記載の使用。
前記ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する癌が、黒色腫である、請求項８６に記載の使用。
対象においてＴリンパ球活性を増強する方法であって、請求項１～４及び２３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項５～２２及び３８～４１のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ、又は請求項２４～３７及び４２～４４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質若しくはＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ、を含むＴリンパ球を、前記対象に導入することを含む、方法。
癌に罹患している対象を治療する方法であって、請求項１～４及び２３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項５～２２及び３８～４１のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ、又は請求項２４～３７及び４２～４４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質若しくはＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ、を含む治療有効量のＴリンパ球を、前記対象に導入することを含む、方法。
対象における標的細胞集団又は組織に対するＴ細胞媒介性免疫応答を刺激する方法であって、請求項１～４及び２３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項５～２２及び３８～４１のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ、又は請求項２４～３７及び４２～４４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質若しくはＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲを発現するように遺伝子修飾された細胞の有効量を、前記対象に投与することを含む、方法。
対象において抗腫瘍免疫を提供する方法であって、前記方法が、請求項１～４及び２３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項５～２２及び３８～４１のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ、又は請求項２４～３７及び４２～４４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質若しくはＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲを発現するように遺伝子修飾された細胞の有効量を、前記対象に投与することを含む、方法。
前記対象がヒトである、請求項８９～９２のいずれか一項に記載の方法。
前記対象が、多発性骨髄腫、滑膜肉腫、食道癌、頭頸部癌、肺癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌、胃癌、子宮頸癌、乳癌、又は黒色腫を有する、請求項８９～９３のいずれか一項に記載の方法。
前記対象が、多発性骨髄腫を有する、請求項９４に記載の方法。
ＨＬＡ結合ＭＡＧＥ－Ａ４又はＭＡＧＥ－Ａ４特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に特異的に結合する抗原結合タンパク質を発現するように細胞集団を操作する方法であって、
（ａ）請求項１～４及び２３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項５～２２及び３８～４１のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ、又は請求項２４～３７及び４２～４４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質若しくはＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲをコードする核酸分子を、免疫細胞集団に導入することと、
（ｂ）前記核酸分子を発現する条件下で、前記免疫細胞集団を培養することと、
（ｃ）前記細胞の表面で、前記ＭＡＧＥ－Ａ４特異的抗原結合タンパク質を発現する前記免疫細胞を単離することと、を含む、方法。
前記核酸分子を導入する前に、対象から前記免疫細胞集団を取得することを更に含む、請求項９６に記載の方法。
対象において、ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する癌を治療する方法であって、
（ａ）請求項９６又は９７に従って、細胞集団を操作することと、
（ｂ）前記キメラ抗原受容体を発現する前記細胞集団を、前記対象に再導入することと、を含む、方法。
前記ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する癌が、多発性骨髄腫である、請求項９８に記載の方法。
単離された抗原結合タンパク質であって、前記抗原結合タンパク質が、ＨＬＡ結合黒色腫関連抗原Ａ４（ＭＡＧＥ－Ａ４）に特異的に結合する第１の抗原結合領域と、ヒトＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合領域と、を含み、前記第１の抗原結合領域が、重鎖可変領域（Ａ１－ＨＣＶＲ）に含有される３つの重鎖相補的決定領域（ＣＤＲ）（Ａ１－ＨＣＤＲ１、Ａ１－ＨＣＤＲ２、及びＡ１－ＨＣＤＲ３）と、軽鎖可変領域（Ａ１－ＬＣＶＲ）に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（Ａ１－ＬＣＤＲ１、Ａ１－ＬＣＤＲ２、及びＡ１－ＬＣＤＲ３）と、を含み、前記第２の抗原結合領域が、重鎖可変領域（Ａ２－ＨＣＶＲ）に含有される３つの重鎖ＣＤＲ（Ａ２－ＨＣＤＲ１、Ａ２－ＨＣＤＲ２、及びＡ２－ＨＣＤＲ３）と、軽鎖可変領域（Ａ２－ＬＣＶＲ）に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（Ａ２－ＬＣＤＲ１、Ａ２－ＬＣＤＲ２、及びＡ２－ＬＣＤＲ３）と、を含み、Ａ１－ＨＣＶＲが、配列番号２の前記アミノ酸配列を含み、Ａ１－ＬＣＶＲが、配列番号１０の前記アミノ酸配列を含み、Ａ２－ＨＣＶＲが、配列番号５５の前記アミノ酸配列を含み、Ａ２－ＬＣＶＲが、配列番号１０の前記アミノ酸配列を含む、抗原結合タンパク質。
単離された抗原結合タンパク質であって、前記抗原結合タンパク質が、ＨＬＡ結合黒色腫関連抗原Ａ４（ＭＡＧＥ－Ａ４）に特異的に結合する第１の抗原結合領域と、ヒトＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合領域と、を含み、前記第１の抗原結合領域が、重鎖可変領域（Ａ１－ＨＣＶＲ）に含有される３つの重鎖相補的決定領域（ＣＤＲ）（Ａ１－ＨＣＤＲ１、Ａ１－ＨＣＤＲ２、及びＡ１－ＨＣＤＲ３）と、軽鎖可変領域（Ａ１－ＬＣＶＲ）に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（Ａ１－ＬＣＤＲ１、Ａ１－ＬＣＤＲ２、及びＡ１－ＬＣＤＲ３）と、を含み、前記第２の抗原結合領域が、重鎖可変領域（Ａ２－ＨＣＶＲ）に含有される３つの重鎖ＣＤＲ（Ａ２－ＨＣＤＲ１、Ａ２－ＨＣＤＲ２、及びＡ２－ＨＣＤＲ３）と、軽鎖可変領域（Ａ２－ＬＣＶＲ）に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（Ａ２－ＬＣＤＲ１、Ａ２－ＬＣＤＲ２、及びＡ２－ＬＣＤＲ３）と、を含み、Ａ１－ＨＣＶＲが、配列番号２の前記アミノ酸配列を含み、Ａ１－ＬＣＶＲが、配列番号１０の前記アミノ酸配列を含み、Ａ２－ＨＣＶＲが、配列番号７３の前記アミノ酸配列を含み、Ａ２－ＬＣＶＲが、配列番号１０の前記アミノ酸配列を含む、抗原結合タンパク質。
前記抗原結合タンパク質が、配列番号３２のアミノ酸２８６～２９４又はその一部と相互作用する、請求項１００又は１０１に記載の単離された抗原結合タンパク質。
前記単離された抗原結合タンパク質が、ＣＡＲである、請求項１００又は１０１に記載の単離された抗原結合タンパク質。
前記単離された抗原結合タンパク質が、二重特異性抗体である、請求項１００又は１０１に記載の単離された抗原結合タンパク質。
前記単離された抗原結合タンパク質が、配列番号３２のアミノ酸２８６～２９４又はその一部と相互作用する、請求項１００～１０４のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
前記単離された抗原結合タンパク質が、ＣＤ３と相互作用する、請求項１００～１０５のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
前記単離された抗原結合タンパク質が、配列番号２又は配列番号８３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む、請求項１００又は１０２～１０６のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
前記単離された抗原結合タンパク質が、配列番号５５と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む、請求項１００又は１０２～１０６のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
前記単離された抗原結合タンパク質が、配列番号７３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む、請求項１０１～１０６のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
請求項１～４及び２３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項５～２２及び３８～４１のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ、又は請求項２４～３７及び４２～４４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質若しくはＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲと同じ抗原決定基に結合する、単離された抗原結合タンパク質。
請求項１～４及び２３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項５～２２及び３８～４１のいずれか一項に記載のＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲ、又は請求項２４～３７及び４２～４４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質若しくはＭＡＧＥ－Ａ４特異的ＣＡＲと結合について競合する、単離された抗原結合タンパク質。
前記単離された抗原結合タンパク質が、ＣＡＲである、請求項１１０又は１１１に記載の単離された抗原結合タンパク質。
前記単離された抗原結合タンパク質が、二重特異性抗体である、請求項１１０又は１１１に記載の単離された抗原結合タンパク質。
前記単離された抗原結合タンパク質が、配列番号３２のアミノ酸２８６～２９４又はその一部と相互作用する、請求項１１１～１１３のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
前記単離された抗原結合タンパク質が、ＣＤ３と相互作用する、請求項１１３又は１１４に記載の単離された抗原結合タンパク質。
前記単離された抗原結合タンパク質が、それぞれ、配列番号４、６及び８の前記アミノ酸配列を含む３つの重鎖ＣＤＲである、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む、請求項１００～１１５のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
前記単離された抗原結合タンパク質が、それぞれ、配列番号５７、５９及び６１の前記アミノ酸配列を含む３つの重鎖ＣＤＲである、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む前記二重特異性抗体の別のアームに対応するＨＣＶＲを含む、請求項１００又は１０２～１１６のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
前記単離された抗原結合タンパク質が、それぞれ、配列番号７５、７７及び７９の前記アミノ酸配列を含む３つの重鎖ＣＤＲを含む前記二重特異性抗体の別のアームに対応するＨＣＶＲを含む、請求項１０１～１１６のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
前記単離された抗原結合タンパク質が、配列番号１０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）及び／又は配列番号６３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む、請求項１００～１１８のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
黒色腫関連抗原Ａ４（ＭＡＧＥ－Ａ４）ポリペプチドに特異的に結合する、単離された組換え抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体が、以下の特徴、
（ａ）約２ｘ１０^－９Ｍ未満のＥＣ５０で、前記ＭＡＧＥ－Ａ４ポリペプチドに結合すること、
（ｂ）前記ＭＡＧＥ－Ａ４ポリペプチドに特異的に結合しない単離された組換え抗体と比較して、腫瘍細胞生存率を低下させる能力を示すこと、及び／又は
（ｃ）（ｉ）表１に記載のＨＣＶＲに対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に含有される３つの重鎖相補的決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）、並びに（ｉｉ）表１に記載のＬＣＶＲに対して少なくとも約９０％の配列同一性を有する前記アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）を含むこと、のうちの１つ以上を有する、単離された組換え抗体又はその抗原結合断片。
前記ＭＡＧＥ－Ａ４ポリペプチドが、ＨＬＡ－Ａ２結合ＭＡＧＥ－Ａ４ポリペプチドである、請求項１２０に記載の抗体又は抗原結合断片。
配列番号２、配列番号８３、又は配列番号１０７のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む、請求項１２０又は１２１に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
配列番号１０又は配列番号１１５のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む、請求項１２０～１２２のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
配列番号２／１０、配列番号８３／１０、又は配列番号１０７／１１５のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項１２０～１２３のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１領域、
（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２領域、
（ｃ）配列番号８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３領域、
（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１領域、
（ｅ）配列番号１４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２領域、及び
（ｆ）配列番号１６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３領域、を含む、請求項１２０～１２４のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
（ａ）配列番号１０９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１領域、
（ｂ）配列番号１１１のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２領域、
（ｃ）配列番号１１３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３領域、
（ｄ）配列番号１１７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１領域、
（ｅ）配列番号１４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２領域、及び
（ｆ）配列番号１１９のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３領域、を含む、請求項１２０～１２４のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
ＩｇＧ１抗体である、請求項１２０～１２６のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
ＩｇＧ４抗体である、請求項１２０～１２６のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
二重特異性抗体である、請求項１２０～１２８のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
黒色腫関連抗原Ａ４（ＭＡＧＥ－Ａ４）ポリペプチドに特異的に結合する第１の抗原結合領域と、ＣＤ３ポリペプチドに特異的に結合する第２の抗原結合領域と、を含む、単離された組換え抗体又はその抗原結合断片であって、
（ａ）ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する前記第１の抗原結合領域（Ａ１）が、３つの重鎖相補的決定領域（Ａ１－ＨＣＤＲ１、Ａ１－ＨＣＤＲ２、及びＡ１－ＨＣＤＲ３）、及び３つの軽鎖相補的決定領域（Ａ１－ＬＣＤＲ１、Ａ１－ＬＣＤＲ２、及びＡ１－ＬＣＤＲ３）を含み、
Ａ１－ＨＣＤＲ１が、配列番号４又は配列番号１０９の前記アミノ酸配列を含み、
Ａ１－ＨＣＤＲ２が、配列番号６又は配列番号１１１の前記アミノ酸配列を含み、
Ａ１－ＨＣＤＲ３が、配列番号８又は配列番号１１３の前記アミノ酸配列を含み、
Ａ１－ＬＣＤＲ１が、配列番号１２、配列番号６５、又は配列番号１１７の前記アミノ酸配列を含み、
Ａ１－ＬＣＤＲ２が、配列番号１４の前記アミノ酸配列を含み、
Ａ１－ＬＣＤＲ３が、配列番号１６、配列番号６７又は配列番号１１９の前記アミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＣＤ３に結合する前記第２の抗原結合領域（Ａ２）が、３つの重鎖相補的決定領域（Ａ２－ＨＣＤＲ１、Ａ２－ＨＣＤＲ２、及びＡ２－ＨＣＤＲ３）、及び３つの軽鎖相補的決定領域（Ａ２－ＬＣＤＲ１、Ａ２－ＬＣＤＲ２、及びＡ２－ＬＣＤＲ３）を含み、
Ａ２－ＨＣＤＲ１が、配列番号５７又は配列番号７５の前記アミノ酸配列を含み、
Ａ２－ＨＣＤＲ２が、配列番号５９又は配列番号７７の前記アミノ酸配列を含み、
Ａ２－ＨＣＤＲ３が、配列番号６１又は配列番号７９の前記アミノ酸配列を含み、
Ａ２－ＬＣＤＲ１が、配列番号１２、配列番号６５、又は配列番号１１７の前記アミノ酸配列を含み、
Ａ２－ＬＣＤＲ２が、配列番号１４の前記アミノ酸配列を含み、
Ａ２－ＬＣＤＲ３が、配列番号１６、配列番号６７、又は配列番号１１９の前記アミノ酸配列を含む、単離された組換え抗体又はその抗原結合断片。
請求項１２０～１３０のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容可能なキャリア又は希釈剤と、を含む、医薬組成物。
前記医薬組成物が、第２の治療薬を更に含む、請求項１３１に記載の医薬組成物。
前記第２の治療薬が、抗腫瘍剤、ステロイド、及び標的療法からなる群から選択される、請求項１３２に記載の医薬組成物。
請求項１２０～１３３のいずれか一項に記載の抗体の１つ以上のＨＣＶＲ及び／又は１つ以上のＬＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド分子。
請求項１３４に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
請求項１３５に記載のベクターを含む、細胞。
ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する癌を治療する方法であって、請求項１２０～１３０のいずれか一項に記載の抗体若しくは抗原結合断片、又は請求項１３１～１３３のいずれか一項に記載の医薬組成物を、対象に投与することを含む、方法。
前記医薬組成物が、第２の治療薬と組み合わせて投与される、請求項１３７に記載の方法。
前記第２の治療薬が、抗腫瘍剤、ステロイド、及び標的療法からなる群から選択される、請求項１３８に記載の方法。