JP2024516308A - Mage-a4特異性を有するキメラ抗原受容体及びその使用 - Google Patents
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Abstract
MAGE-A4、又は黒色腫関連抗原A4は、X染色体上の癌精巣抗原(CTA)である。本開示は、MAGE-A4特異的キメラ抗原受容体、このようなキメラ抗原受容体を発現する細胞、及びMAGE-A4特異的単離抗体を提供する。特定の実施形態では、本開示のキメラ抗原受容体を発現する操作された細胞は、MAGE-A4を発現する腫瘍の成長を阻害することが可能である。本開示の操作された細胞は、上方調節又は誘導されたMAGE-A4を標的とする免疫応答が望まれる、及び/又は治療的に有益である、疾患及び障害の治療に有用である。例えば、本開示のMAGE-A4特異的キメラ抗原受容体を発現する操作された細胞は、様々な癌の治療に有用である。
Description
(関連出願の相互参照)
本出願は、2021年5月4日に出願された米国仮出願第63/184,183号及び2021年8月31日に出願された同第63/239,293号の米国特許法第119条(35 USC §119(e))に基づく利益を主張するものであり、それぞれ、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2021年5月4日に出願された米国仮出願第63/184,183号及び2021年8月31日に出願された同第63/239,293号の米国特許法第119条(35 USC §119(e))に基づく利益を主張するものであり、それぞれ、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
(配列表の参照)
本出願は、2022年5月3日に作成され、95,050バイトを含むファイル10901WO01-Sequence.txtとしてコンピュータ可読形式で提出された配列表を参照により組み込む。
本出願は、2022年5月3日に作成され、95,050バイトを含むファイル10901WO01-Sequence.txtとしてコンピュータ可読形式で提出された配列表を参照により組み込む。
(発明の分野)
本開示は、黒色腫関連抗原A4(Melanoma-Associated Antigen A4、MAGE-A4)に特異的である、抗体、キメラ抗原受容体(Chimeric Antigen Receptors、CAR)、並びにこのような抗体及びCARを含む操作された細胞、並びにそれらの使用方法を提供する。
本開示は、黒色腫関連抗原A4(Melanoma-Associated Antigen A4、MAGE-A4)に特異的である、抗体、キメラ抗原受容体(Chimeric Antigen Receptors、CAR)、並びにこのような抗体及びCARを含む操作された細胞、並びにそれらの使用方法を提供する。
MAGE-A4、又は黒色腫関連抗原A4は、X染色体上の癌精巣抗原(Cancer-Testis Antigen、CTA)である。MAGE-A4の機能は不明であるが、細胞周期の進行/調節、転写制御、細胞の生存及び/又はアポトーシスに関与している場合がある。例えば、MAGE-A4の過剰発現は、自発的に形質転換された経口ケラチノサイトの成長を促進し、G1期の細胞の成長停止を阻害することが示されている。
MAGE-A4は、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌などの肺癌、食道扁平上皮癌、結腸癌、膀胱癌、粘膜及び皮膚黒色腫、卵巣癌、例えば、漿液性癌、及び子宮癌などの異なる組織型の多くの腫瘍によって豊富に発現しているが、正常で健康な成人組織においては、MAGE-A4の発現は精巣に限定されている。
制限された発現パターンと共に免疫応答を誘発するMAGE-A4抗原の能力により、MAGE-A4は、癌免疫療法についての優れた候補となっている。
癌などの複雑な疾患に適用される二重標的化抗体戦略もまた、1つの有望な戦略を表し、それによって、多因子調節が治療有効性を改善することを目的とする。CD3は、T細胞受容体複合体(T Cell Receptor complex、TCR)と共にT細胞上に発現されるホモ二量体抗原又はヘテロ二量体抗原であり、T細胞活性化に必要とされる。機能的CD3は、4つの異なる鎖:イプシロン、ゼータ、デルタ、及びガンマのうちの2つの二量体対合から形成される。MAGE-A4結合アーム及びCD3結合アームを有する二重特異性抗体は、抗腫瘍活性を増強するのに有用であり得る。
生体外で生成された自己抗原特異的T細胞の移入を含む養子免疫療法は、ウイルス感染及び癌を治療するための別の有望な戦略である。養子免疫療法に使用されるT細胞は、抗原特異的T細胞の増殖又は遺伝子工学によるT細胞の方向転換のいずれかによって生成され得る。
T細胞における新しい特異性は、遺伝形質転換T細胞受容体又はキメラ抗原受容体(CAR)の遺伝子導入を介して成功裏に生成されてきた。CARは、単一の融合分子における1つ以上のシグナル伝達領域に関連する標的化部分からなる、合成受容体である。一般に、CARの結合部分は、単鎖抗体(scFv)の抗原結合領域からなり、可撓性リンカによって連結されたモノクローナル抗体の軽鎖可変断片及び重鎖可変断片を含む。第1世代のCARについてのシグナル伝達領域は、CD3ゼータの細胞質領域又はFc受容体ガンマ鎖に由来する。第一世代のCARは、T細胞の細胞傷害性を成功裏に方向転換することが示されている。しかしながら、それらは、生体内での長期の増殖及び抗腫瘍活性を提供することができなかった。共刺激分子由来のシグナル伝達領域並びに膜貫通領域及びヒンジ領域が追加されて、第2世代及び第3世代のCARを形成し、ヒトにおける治療試験のいくつかの成功をもたらしている。例えば、B細胞分化抗原CD19に特異的なCARに方向転換されたT細胞は、B細胞悪性腫瘍の治療において劇的な効果を示し、T細胞受容体(T Cell Receptor、TCR)に方向転換されたT細胞は、固形癌に罹患している患者において有益性を示している。Staussらは、例えば、抗原特異的エフェクタ機能を増強し、操作されたT細胞の毒性を制限する、癌の治療において使用するための治療用CAR及びTCRを修飾する戦略を記載している(Current Opinion in Pharmacology 2015,24:113-118)。
二重標的化抗体戦略及び/又はMAGE-A4抗原に特異的に結合するCARに基づく新しい標的化剤、並びに治療及び診断の設定においてこのような薬剤を産生及び使用するための方法についての必要性が、満たされていない。
一態様では、本開示は、HLA結合黒色腫関連抗原A4(MAGE-A4)に特異的に結合する抗原結合タンパク質であって、当該抗原結合タンパク質が、軽鎖可変領域(Light Chain Variable Region、LCVR)及び重鎖可変領域(Heavy Chain Variable Region、HCVR)を含み、LCVRが、配列番号10又は配列番号115のアミノ酸配列を含むLCVRの相補的決定領域(Complementarity Determining Regions、CDR)を含み、HCVRが、配列番号2、配列番号83、又は配列番号107のアミノ酸配列を含むHCVRのCDRを含む、抗原結合タンパク質を提供する。
いくつかの実施形態では、LCVRは、配列番号10又は配列番号115に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、HCVRは、配列番号2、配列番号83、又は配列番号107に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
場合によっては、抗原結合タンパク質は、配列番号32のアミノ酸286~294、又はその一部と相互作用する。
一態様では、本開示は、N末端からC末端に向かって、(a)軽鎖可変領域(LCVR)及び重鎖可変領域(HCVR)を含む抗MAGE-A4単鎖可変断片(scFv)領域を含む細胞外リガンド結合領域と、(b)ヒンジと、(c)膜貫通領域と、(d)4-1BB共刺激領域又はCD28共刺激領域及びCD3ゼータシグナル伝達領域を含む細胞質領域であって、LCVRが、配列番号10又は配列番号115のアミノ酸配列を含むLCVRの相補的決定領域(CDR)、及び配列番号2、配列番号83又は配列番号107のアミノ酸配列を含むHCVRのCDRを含む、細胞質領域と、を含む、MAGE-A4特異的キメラ抗原受容体(CAR)を提供する。
いくつかの態様では、MAGE-A4特異的CARは、N末端からC末端に向かって、(a)細胞外リガンド結合領域と、(b)ヒンジと、(c)膜貫通領域と、(d)共刺激領域及びシグナル伝達領域を含む細胞質領域と、を含む。場合によっては、抗MAGE-A4 scFv領域は、LCVRとHCVRとの間に、第1のリンカを含む。
いくつかの実施形態では、MAGE-A4特異的CARは、細胞外リガンド結合領域とヒンジとの間に、第2のリンカを更に含む。場合によっては、第1のリンカは、配列番号23~26からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、第2のリンカは、配列番号23~26からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。場合によっては、第1のリンカは、配列番号25のアミノ酸配列を含み、第2のリンカは、配列番号23のアミノ酸配列を含む。
MAGE-A4特異的CARの各種実施形態では、ヒンジ、膜貫通領域、又はその両方は、CD8αポリペプチドに由来する。
MAGE-A4特異的CARの各種実施形態では、共刺激領域は、4-1BB共刺激領域を含む。
MAGE-A4特異的CARの各種実施形態では、共刺激領域は、CD28共刺激領域を含む。
MAGE-A4特異的CARの各種実施形態では、ヒンジ、膜貫通領域、又はその両方は、CD28ポリペプチドに由来する。
MAGE-A4特異的CARの各種実施形態では、ヒンジは、配列番号27のアミノ酸配列を含む。
MAGE-A4特異的CARの各種実施形態では、膜貫通領域は、配列番号28のアミノ酸配列を含む。
MAGE-A4特異的CARの各種実施形態では、4-1BB共刺激領域は、配列番号29のアミノ酸配列を含む。
MAGE-A4特異的CARの各種実施形態では、ヒンジは、配列番号34のアミノ酸配列を含む。
MAGE-A4特異的CARの各種実施形態では、膜貫通領域は、配列番号36のアミノ酸配列を含む。
MAGE-A4特異的CARの各種実施形態では、CD28共刺激領域は、配列番号38のアミノ酸配列を含む。
MAGE-A4特異的CARの各種実施形態では、シグナル伝達領域は、CD3ゼータシグナル伝達領域を含む。場合によっては、CD3ゼータシグナル伝達領域は、配列番号30のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、抗原結合タンパク質は、MAGE-A4特異的抗体又はその抗原結合断片である。
場合によっては、上記又は本明細書において考察される抗原結合タンパク質又はMAGE-A4特異的CARは、配列番号2又は配列番号83に記載のアミノ酸配列を含むHCVR内に含有される3つの重鎖CDR(HCDR1、HCDR2、及びHCDR3)を含む。場合によっては、HCDR1は、配列番号4に記載のアミノ酸配列を含み、HCDR2は、配列番号6に記載のアミノ酸配列を含み、HCDR3は、配列番号8に記載のアミノ酸配列を含む。場合によっては、HCVRは、配列番号2に記載のアミノ酸配列を含む。場合によっては、HCVRは、配列番号83に記載のアミノ酸配列を含む。場合によっては、抗原結合タンパク質又はMAGE-A4特異的CARは、配列番号107に記載のアミノ酸配列を含むHCVR内に含有される3つの重鎖CDR(HCDR1、HCDR2、及びHCDR3)を含む。場合によっては、HCDR1は、配列番号109に記載のアミノ酸配列を含み、HCDR2は、配列番号111に記載のアミノ酸配列を含み、HCDR3は、配列番号113に記載のアミノ酸配列を含む。場合によっては、HCVRは、配列番号107に記載のアミノ酸配列を含む。
場合によっては、上記又は本明細書において考察される抗原結合タンパク質又はMAGE-A4特異的CARは、配列番号10又は配列番号115に記載のアミノ酸配列を含むLCVR内に含有される3つの軽鎖CDR(LCDR1、LCDR2、及びLCDR3)を含む。場合によっては、LCDR1は、配列番号12に記載のアミノ酸配列を含み、LCDR2は、配列番号14に記載のアミノ酸配列を含み、LCDR3は、配列番号16に記載のアミノ酸配列を含む。場合によっては、LCVRは、配列番号10に記載のアミノ酸配列を含む。場合によっては、LCDR1は、配列番号117に記載のアミノ酸配列を含み、LCDR2は、配列番号14に記載のアミノ酸配列を含み、LCDR3は、配列番号119に記載のアミノ酸配列を含む。場合によっては、LCVRは、配列番号115に記載のアミノ酸配列を含む。
場合によっては、上記又は本明細書において考察される抗原結合タンパク質又はMAGE-A4特異的CARは、配列番号2に記載のアミノ酸配列を含むHCVR及び配列番号10に記載のアミノ酸配列を含むLCVRを含む。場合によっては、上記又は本明細書において考察される抗原結合タンパク質又はMAGE-A4特異的CARは、配列番号83に記載のアミノ酸配列を含むHCVR及び配列番号10に記載のアミノ酸配列を含むLCVRを含む。場合によっては、上記又は本明細書において考察される抗原結合タンパク質又はMAGE-A4特異的CARは、配列番号107に記載のアミノ酸配列を含むHCVR及び配列番号115に記載のアミノ酸配列を含むLCVRを含む。
各種実施形態では、MAGE-A4特異的CARは、配列番号22のアミノ酸配列を含む。各種実施形態では、MAGE-A4特異的CARは、配列番号105のアミノ酸配列を含む。各種実施形態では、MAGE-A4特異的CARは、配列番号120のアミノ酸配列を含む。各種実施形態では、MAGE-A4特異的CARは、配列番号121のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、上記又は本明細書において考察される抗原結合タンパク質又はMAGE-A4特異的CARは、配列番号32の286~294位の1つ以上のアミノ酸に特異的に結合する。各種実施形態では、上記又は本明細書において考察される抗原結合タンパク質又はMAGE-A4特異的CARは、HLAの1種以上のアミノ酸と相互作用する。場合によっては、HLAは、HLA-A2である。
一態様では、本開示は、上記又は本明細書で考察される抗原結合タンパク質又はMAGE-A4特異的CARをコードする単離された核酸分子を提供する。場合によっては、単離された核酸分子は、配列番号21のヌクレオチド配列を含む。場合によっては、単離された核酸分子は、配列番号104のヌクレオチド配列を含む。
一態様では、本開示は、上記又は本明細書で考察される核酸分子を含むベクターを提供する。場合によっては、ベクターは、DNAベクター、RNAベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はレトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターである。
一態様では、本開示は、上記又は本明細書で考察される核酸分子(複数可)を含む細胞を提供する。場合によっては、細胞は、ヒトT細胞である。
一態様では、本開示は、上記又は本明細書で考察される抗原結合タンパク質又はMAGE-A4特異的CARを含む操作された細胞を提供する。場合によっては、操作された細胞は、免疫細胞である。場合によっては、免疫細胞は、免疫エフェクタ細胞である。場合によっては、免疫エフェクタ細胞は、Tリンパ球である。場合によっては、Tリンパ球は、炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、調節性Tリンパ球、又はヘルパーTリンパ球である。場合によっては、操作された細胞は、CD8+細胞傷害性Tリンパ球である。各種実施形態では、操作された細胞は、MAGE-A4を発現する癌の治療において使用するためのものである。場合によっては、MAGE-A4を発現する癌は、多発性骨髄腫である。場合によっては、MAGE-A4を発現する癌は黒色腫である。
一態様では、本開示は、N末端からC末端に向かって、(a)軽鎖可変領域(LCVR)及び重鎖可変領域(HCVR)を含む抗MAGE-A4単鎖可変断片(scFv)領域を含む細胞外リガンド結合領域と、(b)ヒンジと、(c)膜貫通領域と、(d)4-1BB共刺激領域又はCD28共刺激領域及びCD3ゼータシグナル伝達領域を含む細胞質領域であって、LCVRが、配列番号10又は配列番号115のアミノ酸配列を含むLCVRの相補的決定領域(CDR)、及び配列番号2、配列番号83又は配列番号107のアミノ酸配列を含むHCVRのCDRを含む、細胞質領域と、を含む、キメラ抗原受容体を含む、操作されたヒトT細胞を提供する。
操作されたヒトT細胞の様々な実施形態では、抗MAGE-A4 scFvは、配列番号32の286~294位の1つ以上のアミノ酸残基に特異的に結合する。場合によっては、scFv領域は、配列番号2/10のアミノ酸配列を含むHCVR/LCVRアミノ酸配列対を含む。場合によっては、scFv領域は、配列番号2/83のアミノ酸配列を含むHCVR/LCVRアミノ酸配列対を含む。場合によっては、scFv領域は、配列番号107/115のアミノ酸配列を含むHCVR/LCVRアミノ酸配列対を含む。いくつかの実施形態では、HCVRは、3つの重鎖CDR(HCDR1、HCDR2、及びHCDR3)を含み、LCVRは、3つの軽鎖CDR(LCDR1、LCDR2、及びLCDR3)を含み、HCDR1は、配列番号4に記載のアミノ酸配列を含み、HCDR2は、配列番号6に記載のアミノ酸配列を含み、HCDR3は、配列番号8に記載のアミノ酸配列を含み、LCDR1は、配列番号12に記載のアミノ酸配列を含み、LCDR2は、配列番号14に記載のアミノ酸配列を含み、LCDR3は、配列番号16に記載のアミノ酸配列を含む。場合によっては、HCVRは、3つの重鎖CDR(HCDR1、HCDR2、及びHCDR3)を含み、LCVRは、3つの軽鎖CDR(LCDR1、LCDR2、及びLCDR3)を含み、HCDR1は、配列番号109に記載のアミノ酸配列を含み、HCDR2は、配列番号111に記載のアミノ酸配列を含み、HCDR3は、配列番号113に記載のアミノ酸配列を含み、LCDR1は、配列番号117に記載のアミノ酸配列を含み、LCDR2は、配列番号14に記載のアミノ酸配列を含み、LCDR3は、配列番号119に記載のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ヒンジは、配列番号27のアミノ酸配列を含む。場合によっては、膜貫通領域は、配列番号28のアミノ酸配列を含む。場合によっては、4-1BB共刺激領域は、配列番号29のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ヒンジは、配列番号34のアミノ酸配列を含む。場合によっては、膜貫通領域は、配列番号36のアミノ酸配列を含む。場合によっては、CD28共刺激領域は、配列番号38のアミノ酸配列を含む。場合によっては、CD3ゼータシグナル伝達領域は、配列番号30のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、操作されたヒトT細胞は、配列番号22のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む。各種実施形態では、操作されたヒトT細胞は、配列番号105のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む。各種実施形態では、操作されたヒトT細胞は、配列番号120のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む。各種実施形態では、操作されたヒトT細胞は、配列番号121のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む。
一態様では、本開示は、遺伝子修飾ヒトT細胞及び薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物を提供し、ここで、遺伝子修飾ヒトT細胞は、上記又は本明細書で考察される抗原結合タンパク質又はMAGE-A4特異的CARを含む。場合によっては、医薬組成物は、上記又は本明細書で考察されるような操作された細胞及び薬学的に許容可能なキャリアを含む。場合によっては、医薬組成物は、上記又は本明細書で考察されるような操作されたヒトT細胞及び薬学的に許容可能なキャリアを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、MAGE-A4を発現する癌の治療に使用するためのものである。場合によっては、MAGE-A4を発現する癌は、多発性骨髄腫である。場合によっては、MAGE-A4を発現する癌は黒色腫である。
一態様では、本開示は、MAGE-A4を発現する癌の治療のための薬剤の製造における、上記又は本明細書で考察される抗原結合タンパク質又はMAGE-A4特異的CAR、核酸分子、ベクター、細胞、操作された細胞、又は操作されたヒトT細胞の使用を提供する。場合によっては、MAGE-A4を発現する癌は、多発性骨髄腫である。場合によっては、MAGE-A4を発現する癌は黒色腫である。
一態様では、本開示は、上記又は本明細書で考察される抗原結合タンパク質又はMAGE-A4特異的CARを含むTリンパ球を対象に導入することを含む、対象におけるTリンパ球活性を増強する方法を提供する。
一態様では、本開示は、癌に罹患している対象を治療する方法であって、上記又は本明細書で考察される抗原結合タンパク質又はMAGE-A4特異的CARを含む治療有効量のTリンパ球を対象に導入することを含む方法を提供する。
一態様では、本開示は、上記又は本明細書で考察される抗原結合タンパク質又はMAGE-A4特異的CARを発現するように遺伝子修飾された有効量の細胞を対象に投与することを含む、対象における標的細胞集団又は組織に対するT細胞媒介免疫応答を刺激する方法を提供する。
一態様では、本開示は、対象に抗腫瘍免疫を提供する方法を提供し、本方法は、上記又は本明細書で考察される抗原結合タンパク質又はMAGE-A4特異的CARを発現するように遺伝子修飾された細胞の有効量を対象に投与することを含む。
上記又は本明細書で考察される様々な方法のいずれにおいても、対象は、ヒトであり得る。いくつかの実施形態では、対象は、多発性骨髄腫、滑膜肉腫、食道癌、頭頸部癌、肺癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌、胃癌、子宮頸癌、乳癌、又は黒色腫を有する。いくつかの実施形態では、対象は、多発性骨髄腫を有する。
一態様では、本開示は、上記又は本明細書で考察される抗原結合タンパク質又はMAGE-A4特異的CARを発現するように細胞集団を操作する方法であって、(a)上記又は本明細書で考察される抗原結合タンパク質又はMAGE-A4特異的CARをコードする核酸分子を免疫細胞集団に導入することと、(b)当該核酸分子を発現する条件下で、免疫細胞集団を培養することと、(c)細胞表面で当該MAGE-A4特異的抗原結合タンパク質を発現する免疫細胞を単離することと、を含む方法を、提供する。場合によっては、本方法は、核酸分子を導入する前に、対象から免疫細胞集団を取得することを更に含む。
一態様では、本開示は、対象においてMAGE-A4を発現する癌を治療する方法であって、(a)上記又は本明細書で考察される細胞集団を操作することと、(b)キメラ抗原受容体を発現する細胞集団を対象に再導入することと、を含む方法を、提供する。場合によっては、MAGE-A4を発現する癌は、多発性骨髄腫である。
一態様では、本開示は、単離された抗原結合タンパク質を提供し、抗原結合タンパク質は、HLA結合黒色腫関連抗原A4(MAGE-A4)に特異的に結合する第1の抗原結合領域と、ヒトCD3に特異的に結合する第2の抗原結合領域と、を含み、第1の抗原結合領域は、重鎖可変領域(A1-HCVR)に含有される3つの重鎖相補的決定領域(CDR)(A1-HCDR1、A1-HCDR2、及びA1-HCDR3)、及び軽鎖可変領域(A1-LCVR)に含有される3つの軽鎖CDR(A1-LCDR1、A1-LCDR2、及びA1-LCDR3)を含み、第2の抗原結合領域は、重鎖可変領域(A2-HCVR)に含有される3つの重鎖CDR(A2-HCDR1、A2-HCDR2、及びA2-HCDR3)、及び軽鎖可変領域(A2-LCVR)に含有される3つの軽鎖CDR(A2-LCDR1、A2-LCDR2、及びA2-LCDR3)を含み、A1-HCVRは配列番号2のアミノ酸配列を含み、A1-LCVRは配列番号10のアミノ酸配列を含み、A2-HCVRは配列番号55のアミノ酸配列を含み、A2-LCVRは配列番号10のアミノ酸配列を含む。
一態様では、本開示は、単離された抗原結合タンパク質を提供し、抗原結合タンパク質は、HLA結合黒色腫関連抗原A4(MAGE-A4)に特異的に結合する第1の抗原結合領域と、ヒトCD3に特異的に結合する第2の抗原結合領域と、を含み、第1の抗原結合領域は、重鎖可変領域(A1-HCVR)に含有される3つの重鎖相補的決定領域(CDR)(A1-HCDR1、A1-HCDR2、及びA1-HCDR3)、及び軽鎖可変領域(A1-LCVR)に含有される3つの軽鎖CDR(A1-LCDR1、A1-LCDR2、及びA1-LCDR3)を含み、第2の抗原結合領域は、重鎖可変領域(A2-HCVR)に含有される3つの重鎖CDR(A2-HCDR1、A2-HCDR2、及びA2-HCDR3)、及び軽鎖可変領域(A2-LCVR)に含有される3つの軽鎖CDR(A2-LCDR1、A2-LCDR2、及びA2-LCDR3)を含み、A1-HCVRは配列番号2のアミノ酸配列を含み、A1-LCVRは配列番号10のアミノ酸配列を含み、A2-HCVRは配列番号73のアミノ酸配列を含み、A2-LCVRは配列番号10のアミノ酸配列を含む。
上記又は本明細書で考察される単離された抗原結合タンパク質の各種実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号32のアミノ酸286~294又はその一部と相互作用する。場合によっては、単離された抗原結合タンパク質は、CARである。場合によっては、単離された抗原結合タンパク質は、二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、単離された抗原結合タンパク質は、CD3と相互作用する。場合によっては、単離された抗原結合タンパク質は、配列番号2又は配列番号83に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(HCVR)を含む。場合によっては、単離された抗原結合タンパク質は、配列番号55に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(HCVR)を含む。場合によっては、単離された抗原結合タンパク質は、配列番号73に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(HCVR)を含む。
一態様では、本開示は、上記又は本明細書で考察される抗原結合タンパク質又はMAGE-A4特異的CARと同じ抗原決定基に結合する単離された抗原結合タンパク質を提供する。一態様では、本開示は、上記又は本明細書で考察される抗原結合タンパク質又はMAGE-A4特異的CARとの結合について競合する、単離された抗原結合タンパク質を提供する。場合によっては、単離された抗原結合タンパク質は、CARである。場合によっては、単離された抗原結合タンパク質は、二重特異性抗体である。場合によっては、単離された抗原結合タンパク質は、配列番号32のアミノ酸286~294又はその一部と相互作用する。場合によっては、単離された抗原結合タンパク質は、CD3と相互作用する。いくつかの実施形態では、単離された抗原結合タンパク質は、それぞれ、配列番号4、配列番号6、及び配列番号8のアミノ酸配列を含む3つの重鎖CDR、HCDR1、HCDR2、及びHCDR3を含む、重鎖可変領域(HCVR)を含む。いくつかの実施形態では、単離された抗原結合タンパク質は、それぞれ、配列番号57、配列番号59、及び配列番号61のアミノ酸配列を含む3つの重鎖CDR、HCDR1、HCDR2、及びHCDR3を含む二重特異性抗体の別のアームに対応するHCVRを含む。いくつかの実施形態では、単離された抗原結合タンパク質は、それぞれ、配列番号75、配列番号77、及び配列番号79のアミノ酸配列を含む3つの重鎖CDRを含む二重特異性抗体の別のアームに対応するHCVRを含む。場合によっては、単離された抗原結合タンパク質は、配列番号10に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(LCVR)、及び/又は配列番号63に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むLCVRを含む。
一態様では、本開示は、黒色腫関連抗原A4(MAGE-A4)ポリペプチドに特異的に結合する単離された組換え抗体又はその抗原結合断片を提供し、本抗体は、以下の特徴のうちの1つ以上を有する。(a)約2×109M未満のEC50で、MAGE-A4ポリペプチドに結合する、(b)MAGE-A4ポリペプチドに特異的に結合しない単離された組換え抗体と比較して、腫瘍細胞の生存率を低下させる能力を示す、及び/又は(c)(i)表1に記載のHCVRに対して少なくとも約90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(HCVR)内に含有される3つの重鎖相補的決定領域(CDR)(HCDR1、HCDR2、及びHCDR3)と、(ii)表1に記載のLCVRに対して少なくとも約90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(LCVR)内に含有される3つの軽鎖CDR(LCDR1、LCDR2、及びLCDR3)と、を含む。
MAGE-A4ポリペプチドに特異的に結合する単離された組換え抗体又はその抗原結合断片のいくつかの実施形態では、MAGE-A4ポリペプチドは、HLA-A2結合MAGE-A4ポリペプチドである。場合によっては、単離された抗体又はその抗原結合断片は、配列番号2、配列番号83、又は配列番号107のアミノ酸配列を有するHCVRを含む。場合によっては、単離された抗体又はその抗原結合断片は、配列番号10又は配列番号115のアミノ酸配列を有するLCVRを含む。場合によっては、単離された抗体又はその抗原結合断片は、配列番号2/10、又は配列番号83/10、又は配列番号107/115の、一対のHCVR/LCVRアミノ酸配列を含む。
一態様では、本開示は、(a)配列番号4のアミノ酸配列を有するHCDR1領域と、(b)配列番号6のアミノ酸配列を有するHCDR2領域と、(c)配列番号8のアミノ酸配列を有するHCDR3領域と、(d)配列番号12のアミノ酸配列を有するLCDR1領域と、(e)配列番号14のアミノ酸配列を有するLCDR2領域と、(f)配列番号16のアミノ酸配列を有するLCDR3領域と、を含む、単離された抗体又はその抗原結合断片を提供する。
一態様では、本開示は、(a)配列番号109のアミノ酸配列を有するHCDR1領域と、(b)配列番号111のアミノ酸配列を有するHCDR2領域と、(c)配列番号113のアミノ酸配列を有するHCDR3領域と、(d)配列番号117のアミノ酸配列を有するLCDR1領域と、(e)配列番号14のアミノ酸配列を有するLCDR2領域と、(f)配列番号119のアミノ酸配列を有するLCDR3領域と、を含む、単離された抗体又はその抗原結合断片を提供する。
上記又は本明細書で考察される単離抗体又はその抗原結合断片の各種実施形態では、単離抗体又はその抗原結合断片は、IgG1抗体又はIgG4抗体である。場合によっては、単離された抗体又はその抗原結合断片は、二重特異性抗体である。
一態様では、本開示は、黒色腫関連抗原A4(MAGE-A4)ポリペプチドに特異的に結合する第1の抗原結合領域と、CD3ポリペプチドに特異的に結合する第2の抗原結合領域とを含む、単離された組換え抗体又はその抗原結合断片を提供し、ここで、(a)MAGE-A4に結合する第1の抗原結合領域(A1)は、3つの重鎖相補的決定領域(A1-HCDR1、A1-HCDR2、及びA1-HCDR3)及び3つの軽鎖相補的決定領域(A1-LCDR1、A1-LCDR2、及びA1-LCDR3)を含み、A1-HCDR1は、配列番号4又は配列番号109のアミノ酸配列を含み、A1-HCDR2は、配列番号6又は配列番号111のアミノ酸配列を含み、A1-HCDR3は、配列番号8又は配列番号113のアミノ酸配列を含み、A1-LCDR1は、配列番号12、配列番号65、又は配列番号117のアミノ酸配列を含み、A1-LCDR2は、配列番号14のアミノ酸配列を含み、A1-LCDR3は、配列番号16、配列番号67、又は配列番号119のアミノ酸配列を含み、(b)CD3に結合する第2の抗原結合領域(A2)は、3つの重鎖相補的決定領域(A2-HCDR1、A2-HCDR2、及びA2-HCDR3)及び3つの軽鎖相補的決定領域(A2-LCDR1、A2-LCDR2、及びA2-LCDR3)を含み、A2-HCDR1は、配列番号57又は配列番号75のアミノ酸配列を含み、A2-HCDR2は、配列番号59又は配列番号77のアミノ酸配列を含み、A2-HCDR3は、配列番号61又は配列番号79のアミノ酸配列を含み、A2-LCDR1は、配列番号12、配列番号65、又は配列番号117のアミノ酸配列を含み、A2-LCDR2は、配列番号14のアミノ酸配列を含み、A2-LCDR3は、配列番号16、配列番号67、又は配列番号119のアミノ酸配列を含む。
一態様では、本開示は、上記又は本明細書で考察される単離された抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容可能なキャリア又は希釈剤と、を含む医薬組成物を、提供する。場合によっては、医薬組成物は、第2の治療薬を更に含む。場合によっては、第2の治療薬は、抗腫瘍剤、ステロイド、及び標的療法からなる群から選択される。
一態様では、本開示は、上記又は本明細書で考察される抗体の1つ以上のHCVR及び/又は1つ以上のLCVRをコードするポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子、並びにポリヌクレオチドを含むベクター、並びにベクターを含む細胞を提供する。
一態様では、本開示は、MAGE-A4を発現する癌を治療する方法を提供し、本方法は、上記又は本明細書で考察される抗体若しくは抗原結合断片、あるいは上記又は本明細書で考察される医薬組成物を対象に投与することを含む。場合によっては、医薬組成物は、第2の治療薬と組み合わせて投与される。場合によっては、第2の治療薬は、抗腫瘍剤、ステロイド、及び標的療法からなる群から選択される。
その他の実施形態は、後述の発明を実施するための形態の精査から、明らかとなるであろう。
本明細書に記載される発明は、記載される特定の方法及び実験条件に限定されず、したがって、方法及び条件は変更され得ることを理解されたい。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではないことも理解されたい。いずれの実施形態又は実施形態の特徴も、互いに組み合わせることができ、このような組み合わせは、本発明の範囲内に明示的に包含される。上記又は本明細書で考察されるいずれの特定の値も、上記又は本明細書で考察される別の関連値と組み合わせられて、それらの値が範囲の上限及び下限を表す範囲を列挙することができ、このような範囲は本開示の範囲内に包含される。
別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特定の列挙された数値に関して使用される場合、その値が列挙された値から1%以下だけ変動し得ることを意味する。例えば、本明細書で使用される場合、「約100」という表現は、99及び101並びにそれらの間の全ての値(例えば、99.1、99.2、99.3、99.4など)を含む。
本明細書に記載されるものと類似の又は同等の任意の方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用し得るが、好ましい方法及び材料を、これから説明する。本明細書において言及される全ての特許、出願及び非特許刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
定義
本明細書で使用される場合、「MAGE-A4」という用語は、黒色腫関連抗原A4を指す。MAGE-A4は、様々な異なる腫瘍細胞によって発現される細胞内タンパク質である。本明細書で使用される場合、「MAGE-A4」とは、非ヒト種(例えば、「マウスMAGE-A4」、「サルMAGE-A4」など)に由来するものとして特定されない限り、ヒトMAGE-A4タンパク質を指す。ヒトMAGE-A4タンパク質は、配列番号32に示されるアミノ酸配列及び配列番号31のポリ核酸配列を有する。MAGE-A4ポリペプチド(例えば、MAGE-A4 286-294)の特定の領域への言及は、配列番号32に関するものである。本明細書で使用される場合、「MAGE-A4 286-294」、「MAGE-A4(286-294)」、及び「MAGEA4286-294」という用語は、互換的に使用され得る。MAGE-A4(286-294)(KVLEHVVRV)のポリペプチド配列は、配列番号33として所与される。
本明細書で使用される場合、「MAGE-A4」という用語は、黒色腫関連抗原A4を指す。MAGE-A4は、様々な異なる腫瘍細胞によって発現される細胞内タンパク質である。本明細書で使用される場合、「MAGE-A4」とは、非ヒト種(例えば、「マウスMAGE-A4」、「サルMAGE-A4」など)に由来するものとして特定されない限り、ヒトMAGE-A4タンパク質を指す。ヒトMAGE-A4タンパク質は、配列番号32に示されるアミノ酸配列及び配列番号31のポリ核酸配列を有する。MAGE-A4ポリペプチド(例えば、MAGE-A4 286-294)の特定の領域への言及は、配列番号32に関するものである。本明細書で使用される場合、「MAGE-A4 286-294」、「MAGE-A4(286-294)」、及び「MAGEA4286-294」という用語は、互換的に使用され得る。MAGE-A4(286-294)(KVLEHVVRV)のポリペプチド配列は、配列番号33として所与される。
本明細書で使用される場合、「MAGE-A4に結合する抗体」又は「抗MAGE-A4抗体」は、少なくともMAGE-A4を特異的に認識する抗体及びその抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、MAGE-A4に結合する抗体は、MAGE-A4のアミノ酸286~294と相互作用する。本明細書に開示されるように、「MAGE-A4に結合する抗体」又は「抗MAGE-A4抗体」は更に、その他のMAGE-A4関連ペプチド(例えば、HLA-A2と複合体を形成すると予測されるMAGE-A4関連ペプチド)を特異的に認識することが可能であってもよい。更に、MAGE-A4に結合する抗体は、例えば、二重特異性抗体としてフォーマットされた場合、1つ以上の更なるリガンドに更に結合することが可能である。特定の実施形態では、抗MAGE-A4抗体は、MAGE-A4及びCD3の両方に結合する二重特異性抗体としてフォーマットされてもよい。
「リガンド結合領域」及び「抗原結合領域」という用語は、本明細書では互換的に使用され、所定の抗原(例えば、MAGE-A4)に特異的に結合するキメラ抗原受容体又は対応する抗体の部分を指す。「対応する抗体」への言及は、キメラ抗原受容体又は二重特異性抗体において使用されるCDR又は可変領域(重鎖可変領域(略称HCVR又はVH)及び軽鎖可変領域(略称LCVR又はVL))が由来する抗体を指す。例えば、実施例において考察されるキメラ抗原受容体構成は、抗MAGE-A4抗体に由来する可変領域を有するscFvを含む。この抗MAGE-A4抗体が、それぞれのキメラ抗原受容体に対して「対応する抗体」である。
本発明で使用される場合、「二重特異性抗体」を含む「抗体」という用語は、特定の抗原(例えば、MAGE-A4)に特異的に結合するか又はそれと相互作用する少なくとも1つの相補的決定領域(CDR)を含む、任意の抗原結合分子又は分子複合体を意味する。いくつかの実施形態では、抗体は、HLAが結合したポリペプチドなどのMHCが結合したポリペプチドに結合するか、又はそれと相互作用し得る。本開示の文脈において、抗体は、いくつかの実施形態では、HLA-A2によって提示されるMAGE-A4ポリペプチド(例えば、MAGE-A4 286-294)などのHLA-A2が結合したポリペプチドに結合し得る。「二重特異性抗体」を含む「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互連結された4本のポリペプチド鎖、2本の重(H)鎖、及び2本の軽(L)鎖を含む免疫グロブリン分子、並びにそれらの多量体(例えば、IgM)を含むが、しかしながら、重鎖のみからなる(すなわち、軽鎖を欠く)免疫グロブリン分子もまた、「抗体」という用語の定義内に包含される。「抗体」という用語はまた、ジスルフィド結合によって相互連結された4本のポリペプチド鎖、2本の重(H)鎖、及び2本の軽(L)鎖からなる免疫グロブリン分子を含む。各重鎖(本明細書ではHCと略される)は、重鎖可変領域(本明細書ではHCVR又はVHと略される)及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、3つの領域、CH1、CH2、及びCH3を含む。各軽鎖(本明細書ではLCと略される)は、軽鎖可変領域(本明細書ではLCVR又はVLと略される)及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、1つの領域(CL1)を含む。VH領域及びVL領域は、フレームワーク領域(framework region、FR)と称されるより保存された領域が点在する相補的決定領域(CDR)と称される超可変領域へと、更に細分され得る。各VH及びVLは、3つのCDR及び4つのFRからなり、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で配置されている。本開示の異なる実施形態では、抗MAGE-A4抗体(又はその抗原結合部分)のFRは、ヒト生殖系列配列と同一であり得るか、又は天然若しくは人工的に修飾されてもよい。アミノ酸共通塩基配列は、2つ以上のCDRの並列分析に基づいて定義されてもよい。
本発明の特定の実施形態では、抗体は、二重特異性抗体である。例えば、特定の実施形態では、抗MAGE-A4抗体(例えば、mAbM31339N2)は、高親和性(7195P)CD3アームを利用してbsb6054を生成するか、又は中程度の親和性(7221G)CD3アームを利用してbsAb6043を生成するか、のいずれかで、二重特異性抗体(例えば、抗MAGE-A4×抗CD3)へと再フォーマットされる。
本発明で使用される場合、「抗体」という用語はまた、完全抗体分子の抗原結合断片を含む。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」及び同様の用語は、本明細書で使用される場合、天然の、酵素処理で入手可能な、合成の、又は遺伝子操作された、抗原を特異的に結合して複合体を形成するポリペプチド又は糖タンパク質を含む。本明細書中で使用される場合、「抗原結合部分」又は「抗原結合断片」とは、MAGE-A4(又はMAGE-A4関連ペプチド)及び/又はCD3に特異的に結合する能力を保持する抗体の1つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合断片は、例えば、DNAコード抗体可変領域及び任意選択で定常領域の操作及び発現を包含するタンパク質消化技法又は組換え遺伝子操作技法などの任意の好適な標準的技法を使用した、完全抗体分子に由来してもよい。このようなDNAは、周知である、及び/又は例えば、市販の供給源、DNAライブラリ(例えば、ファージ抗体ライブラリを含む)から容易に入手可能であるか、あるいは合成され得る。DNAは、化学的に、又は分子生物学技法を使用することによって配列決定及び操作されて、例えば、1つ以上の可変領域及び/若しくは定常領域を好適な立体配置に配置するか、又はコドンを導入し、システイン残基を作製し、アミノ酸を修飾、付加、若しくは欠失等させてもよい。
抗原結合断片の非限定的な例としては、(i)Fab断片、(ii)F(ab’)2断片、(iii)Fd断片、(iv)Fv断片、(v)単鎖Fv(scFv)分子、(vi)dAb断片、及び(vii)抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位(例えば、CDR3ペプチドなどの単離された相補的決定領域(CDR))、又は拘束FR3-CDR3-FR4ペプチドが挙げられる。領域特異性抗体、単一領域抗体、領域欠失抗体、キメラ抗体、CDR移植抗体、二特異性抗体、三特異性抗体、四特異性抗体、ミニボディ、ナノボディ(例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど)、小モジュラ免疫薬(small modular immunopharmaceutical、SMIP)、及びサメ可変IgNAR領域などのその他の操作された分子もまた、本明細書で使用されるような「抗原結合断片」の表現内に包含される。
抗体の抗原結合断片は、典型的には、少なくとも1つの可変領域を含む。可変領域は、任意のサイズ又はアミノ酸組成のものであってもよく、一般に、1つ以上のフレームワーク配列に隣接しているか、又はそれとインフレームである少なくとも1つのCDRを含む。VH領域がVL領域に対合した抗原結合断片では、VH領域及びVL領域は、任意の好適な配置で互いに対して位置付けられてもよい。例えば、可変領域は二量体であり、VH-VH、VH-VL、又はVL-VL二量体を含んでもよい。あるいは、抗体の抗原結合断片は、単量体のVH領域又はVL領域を含んでもよい。
特定の実施形態では、抗体の抗原結合断片は、少なくとも1つの定常領域に共有結合された少なくとも1つの可変領域を含んでもよい。本発明の抗体の抗原結合断片内に見出され得る可変及び定常領域の非限定的な例示的な構成としては、(i)VH-CH1、(ii)VH-CH2、(iii)VH-CH3、(iv)VH-CH1-CH2、(v)VH-CH1-CH2-CH3、(vi)VH-CH2-CH3、(vii)VH-CL、(viii)VL-CH1、(ix)VL-CH2、(x)VL-CH3、(xi)VL-CH1-CH2、(xii)VL-CH1-CH2-CH3、(xiii)VL-CH2-CH3、及び(xiv)VL-CLが挙げられる。上に列記される代表的な立体配置のうちのいずれかを含む、可変領域及び定常領域のいずれの立体配置でも、可変領域及び定常領域は、互いに直接連結されているか、又は完全若しくは部分的ヒンジ領域若しくはリンカ領域によって連結されているか、のいずれかであってもよい。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子において隣接する可変領域及び/又は定常領域間の可撓性の連鎖又は半可撓性の連鎖をもたらす少なくとも2つの(例えば、5、10、15、20、40、60以上の)アミノ酸からなってもよい。更に、本発明の抗体の抗原結合断片は、互いとの及び/又は1つ以上の単量体VH若しくはVL領域との(例えば、ジスルフィド結合による)非共有結合において、上に列記される可変領域立体配置及び定常領域立体配置のうちのいずれかのホモ二量体又はヘテロ二量体(又はその他の多量体)を含んでもよい。
特定の実施形態では、抗原結合断片が由来する抗MAGE-A4抗体は、ヒト抗体である。「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含むことが企図される。本開示のヒト抗体は、例えば、CDR、特にCDR3における、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基(例えば、生体外でのランダム変異誘発若しくは部位特異的変異誘発によって又は生体内での体細胞変異によって、導入された変異)を含んでもよい。しかしながら、本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、別の哺乳動物種(例えば、マウス)の生殖系列に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列へと移植された抗体を含むことを意図するものではない。
各種実施形態では、本開示の抗MAGE-A4×抗CD3二重特異性抗体(例えば、BsAb6054及び/又はBsAb6043)は、ヒト抗体である。各種実施形態では、抗MAGE-A4x抗CD3二重特異性抗体は、ヒトIgG抗体である。各種実施形態では、抗MAGE-A4x抗CD3二重特異性抗体は、アイソタイプIgG1、アイソタイプIgG2、アイソタイプIgG3若しくはアイソタイプIgG4、又は混合アイソタイプのヒト抗体である。いくつかの実施形態では、抗MAGE-A4×CD3二重特異性抗体は、ヒトIgG1抗体である(すなわち、抗体は、第1の抗原結合領域及び第2の抗原結合領域のそれぞれのHCVRにそれぞれ付着したヒトIgG1重鎖定常領域を含む)。いくつかの実施形態では、抗MAGE-A4×抗CD3二重特異性抗体は、ヒトIgG4抗体である(すなわち、抗体は、第1の抗原結合領域及び第2の抗原結合領域のそれぞれのHCVRにそれぞれ付着したヒトIgG4重鎖定常領域を含む)。上記又は本明細書で考察される実施形態のうちのいずれかでは、抗MAGE-A4×抗CD3二重特異性抗体は、ヒトカッパ軽鎖を含んでもよい。上記又は本明細書で考察される実施形態のうちのいずれかでは、抗MAGE-A4×抗CD3二重特異性抗体は、ヒトラムダ軽鎖を含んでもよい。
任意の実施形態では、二重特異性抗体は、ホモ二量体不純物からの二重特異性抗体(すなわち、ヘテロ二量体)の精製を容易にするために、一方又は両方の重鎖における修飾を含んでもよい。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、修飾を欠く抗体と比較して、タンパク質Aへの二重特異性抗体の結合を低減させる一方又は他方の重鎖のCH3領域における修飾を除いて、同一(例えば、アイソタイプIgG1又はアイソタイプIgG4の両方)である第1の重鎖及び第2の重鎖(すなわち、抗MAGE-A4結合アームの重鎖、及び抗CD3結合アームの重鎖)を含む。場合によっては、第1の重鎖のCH3領域(例えば、抗MAGE-A4結合アームの)は、タンパク質Aに結合し、第2の重鎖のCH3領域(例えば、抗CD3結合アームの)は、タンパク質A結合を低減又は消失させる変異を含む。場合によっては、変異はH435R修飾である(IMGTエクソン番号付けによる、EU番号付けH95Rによる)。場合によっては、変異はH435R修飾である(IMGTエクソン番号付けによる、EU番号付けH95Rによる)、及びY436F修飾であるIMGTによる、EU番号付けY96F)。第2のCH3領域内に見られ得る更なる修飾としては、IgG1 CH3領域の場合に、EUによるD356E、L358M、N384S、K392N、V397M、及びV422I(IMGTによるD16E、L18M、N44S、K52N、V57M、及びV82I)、並びにIgG4 CH3領域の場合に、EUによるQ355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q、及びV422I(IMGTによるQ15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q、及びV82I)が挙げられる。
任意の実施形態では、二重特異性抗体は、キメラヒンジを含んでもよい。「キメラヒンジ」という用語は、1つのIg分子のヒンジ領域に由来する第1のアミノ酸配列と、Ig分子の異なるクラス又はサブクラスのヒンジ領域に由来する第2のアミノ酸配列と、を含むキメラタンパク質を含むことを、意図している。例えば、キメラヒンジは、一実施形態では、ヒトIgG1ヒンジ領域又はヒトIgG4ヒンジ領域に由来する第1のアミノ酸配列又は「上部ヒンジ」配列と、ヒトIgG2ヒンジ領域に由来する第2のアミノ酸配列又は「下部ヒンジ」配列と、を含む。特定の実施形態では、第1の配列又は「上部ヒンジ」配列は、EU番号付けによる216~227位のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、第2の配列又は「下部ヒンジ」配列は、EU番号付けによる228~236位のアミノ酸残基を含む。
二重特異性抗体、抗MAGE-A4抗原結合断片を生成するために使用されるもの、及び/又はキメラ抗原受容体を含む本開示の抗体は、いくつかの態様では、組換えヒト抗体であってもよい。本明細書で使用される「組換えヒト抗体」という用語は、宿主細胞に形質移入された組換え発現ベクターを使用して発現される抗体などの組換え手段によって調製、発現、作成、又は単離された全てのヒト抗体(更に後述)、組換え組み合わせヒト抗体ライブラリから単離された抗体(更に後述)、ヒト免疫グロブリン遺伝子について遺伝形質転換である動物(例えばマウス)から単離された抗体(例えば、Taylor et al.(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295を参照のこと)、又はヒト免疫グロブリン遺伝子配列のその他のDNA配列へのスプライシングを含む任意のその他の手段によって調製、発現、作成、若しくは単離された抗体を含むように、意図される。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する。しかしながら、特定の実施形態では、このような組換えヒト抗体は、生体外変異誘発(又は、ヒトIg配列に対して遺伝形質転換である動物が使用される際の、生体内体細胞変異誘発)に供され、したがって、組換え抗体のVH領域及びVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列VH配列及びヒト生殖系列VL配列に由来しそれらに関連しているが、生体内でヒト抗体生殖系列レパートリ内に天然に存在し得ない配列である。
ヒト抗体は、ヒンジの不均一性に関連する2つの形態で存在し得る。第1の形態では、免疫グロブリン分子は、二量体が鎖間重鎖ジスルフィド結合によって一緒に保持されているおよそ150~160kDaの安定した四本鎖構築体を含む。第2の形態では、二量体は鎖間ジスルフィド結合によって連結されておらず、共有結合した軽鎖及び重鎖からなる約75~80kDaの分子が形成される(半抗体)。これらの形態は、親和性精製後でさえも分離することが極めて困難とされている。
様々な無傷のIgGアイソタイプにおける第2の形態の出現頻度は、抗体のヒンジ領域アイソタイプに関連する構造上の相違によるが、それに限定されない。ヒトIgG4ヒンジのヒンジ領域における1個のアミノ酸置換により、ヒトIgG1ヒンジを使用して典型的に観察されるレベルにまで第2の形態の出現を有意に減少させ得る(Angal et al.(1993)Molecular Immunology 30:105)。本開示は、ヒンジ、CH2領域又はCH3領域に1つ以上の変異を有する抗体を包含し、例えば、産生において、所望の抗体形態の収率を改善するのに望ましい場合がある。
二重特異性抗体を含む、本明細書に開示される抗体は、単離された抗体であってもよい。「単離された抗体」とは、本明細書で使用される場合、その天然環境の少なくとも1種の成分から同定され、分離及び/又は回収された抗体を意味する。例えば、生物の少なくとも1種の成分から、又は抗体が天然に存在するか若しくは天然に産生される組織又は細胞から分離又は除去された抗体は、本開示の目的のための「単離された抗体」である。単離された抗体はまた、組換え細胞内の原位置の抗体を含む。単離された抗体は、少なくとも1つの精製工程又は単離工程に供された抗体である。したがって、単離された抗体はまた、異なる抗原特異性を有するその他の抗体を実質的に含まない抗体を含む(例えば、ヒトMAGE-A4、又はヒトMAGE-A4及びヒトCD3に特異的に結合する単離された抗体は、ヒトMAGE-A4、又はヒトMAGE-A4及びヒトCD3以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない)。しかしながら、本明細書に開示されるように、ヒトMAGE-A4に特異的に結合するものなどの単離された抗体は、いくつかの実施例では、1種以上のその他のMAGE-A4関連タンパク質又はペプチドに更に特異的に結合する場合がある。特定の実施形態によると、単離された抗体は、その他の細胞性物質及び/又は化学物質を実質的に含まない場合がある。
「特異的に結合する」又は同様の用語は、(二重特異性抗体を含む)抗体又はその抗原結合断片が、生理学的条件下で比較的安定である抗原と複合体を形成することを意味する。特異的結合は、少なくとも約1×10-6M以上の解離定数によって特徴付けられ得る。2つの分子が特異的に結合するかどうかを決定するための方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などを含む。しかしながら、ヒトMAGE-A4、又はヒトMAGE-A4及びヒトCD3に特異的に結合する単離された抗体は、その他の種(定向進化遺伝子(orthologs、オルソログ))由来のMAGE-A4分子及び/又はCD3分子などのその他の抗原に対する交差反応性を有する場合がある。本発明の文脈において、ヒトMAGE-A4並びにMAGE-A4関連ペプチドを含む1つ以上の更なる抗原に結合する単一特異性抗体は、ヒトMAGE-A4に「特異的に結合する」とみなされる。本発明の文脈において、ヒトMAGE-A4及びヒトCD3に結合する多重特異性(例えば、二重特異性)抗体、同様に1つ以上の追加の抗原は、ヒトMAGE-A4及びヒトCD3に「特異的に結合する」とみなされる。
抗MAGE-A4特異的結合領域及び抗CD3特異的結合領域を含む二重特異性抗体を、標準的な方法を使用して構築し、抗MAGE-A4抗原結合領域及び抗CD3抗原結合領域は、それぞれ、共通のLCVRと対をなす異なる別個のHCVRを含んでもよい。例示的な二重特異性抗体では、抗CD3抗体由来の重鎖、抗MAGE-A4抗体由来の重鎖、及び抗MAGE-A4抗体由来の共通軽鎖を利用して、分子を構築した。その他の場合では、二重特異性抗体は、抗CD3抗体由来の重鎖、抗MAGE-A4抗体由来の重鎖、及び抗CD3抗体由来の軽鎖、又は無差別である、あるいは様々な重鎖アームと効果的に対をなすことが周知である抗体軽鎖を利用して構築されてもよい。
本発明の特定の実施形態によれば、抗MAGE-A4×抗CD3二重特異性抗体、又はその抗原結合断片は、ヒトMAGE-A4に特異的に結合する第1の抗原結合領域及びヒトCD3に特異的に結合する第2の抗原結合領域を含み、第1の抗原結合領域は、それぞれ、配列番号4、配列番号6、及び配列番号8のアミノ酸配列を含む重鎖CDRであるA1-HCDR1、A1-HCDR2、及びA1-HCDR3を含み、第2の抗原結合領域は、それぞれ、配列番号57又は配列番号75、配列番号59又は配列番号77、及び配列番号61又は配列番号79のアミノ酸配列を含む重鎖CDRであるA2-HCDR1、A2-HCDR2、及びA2-HCDR3を含む。本発明の特定の実施形態によれば、抗MAGE-A4×抗CD3二重特異性抗体、又はその抗原結合断片は、それぞれ、共通(第1の抗原結合領域及び第2の抗原結合領域の両方に対して)軽鎖相補的決定領域LCDR1-LCDR2-LCDR3を含む。一実施例では、共通軽鎖相補的決定領域は、配列番号12、配列番号14、及び配列番号16のアミノ酸配列を含む。その他の実施例では、共通軽鎖相補的決定領域は、配列番号65、配列番号14、及び配列番号67のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、抗MAGE-A4×抗CD3二重特異性抗体、又はその抗原結合断片は、ヒトMAGE-A4に特異的に結合する第1の抗原結合領域及びヒトCD3に特異的に結合する第2の抗原結合領域を含み、第1の抗原結合領域は、配列番号2、配列番号83、又は配列番号107のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(HCVR)を含み、第2の抗原結合領域は、配列番号55又は配列番号73のアミノ酸配列を含むHCVRを含む。特定の実施形態では、抗MAGE-A4×抗CD3二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、配列番号10、配列番号63、又は配列番号115のアミノ酸配列を含む共通軽鎖可変領域(LCVR)を含む。特定の実施形態では、抗MAGE-A4×抗CD3二重特異性抗体、又はその抗原結合断片は、配列番号2/10のアミノ酸配列を含むHCVR/LCVRアミノ酸配列対を含む第1の抗原結合領域、及び配列番号55/10のアミノ酸配列を含む、又は配列番号73/10のアミノ酸配列を含むHCVR/LCVRアミノ酸配列対を含む第2の抗原結合領域を含む。特定の実施形態では、抗MAGE-A4×抗CD3二重特異性抗体、又はその抗原結合断片は、配列番号83/10のアミノ酸配列を含むHCVR/LCVRアミノ酸配列対を含む第1の抗原結合領域、及び配列番号55/10のアミノ酸配列を含む、又は配列番号73/10のアミノ酸配列を含むHCVR/LCVRアミノ酸配列対を含む第2の抗原結合領域を含む。特定の実施形態では、抗MAGE-A4×抗CD3二重特異性抗体、又はその抗原結合断片は、配列番号107/115のアミノ酸配列を含むHCVR/LCVRアミノ酸配列対を含む第1の抗原結合領域、及び配列番号55/115のアミノ酸配列を含む、又は配列番号73/115のアミノ酸配列を含むHCVR/LCVRアミノ酸配列対を含む第2の抗原結合領域を含む。特定の実施形態では、抗MAGE-A4×抗CD3二重特異性抗体、又はその抗原結合断片は、配列番号2/63のアミノ酸配列を含むHCVR/LCVRアミノ酸配列対を含む第1の抗原結合領域、及び配列番号55/63のアミノ酸配列を含む、又は配列番号73/63のアミノ酸配列を含むHCVR/LCVRアミノ酸配列対を含む第2の抗原結合領域を含む。特定の実施形態では、抗MAGE-A4×抗CD3二重特異性抗体、又はその抗原結合断片は、配列番号83/63のアミノ酸配列を含むHCVR/LCVRアミノ酸配列対を含む第1の抗原結合領域、及び配列番号55/63のアミノ酸配列を含む、又は配列番号73/63のアミノ酸配列を含むHCVR/LCVRアミノ酸配列対を含む第2の抗原結合領域を含む。特定の実施形態では、抗MAGE-A4×抗CD3二重特異性抗体、又はその抗原結合断片は、配列番号107/63のアミノ酸配列を含むHCVR/LCVRアミノ酸配列対を含む第1の抗原結合領域、及び配列番号55/63のアミノ酸配列を含む、又は配列番号73/63のアミノ酸配列を含むHCVR/LCVRアミノ酸配列対を含む第2の抗原結合領域を含む。いくつかの実施形態では、抗MAGE-A4×抗CD3二重特異性抗体は、上記のHCVR/LCVR配列対と、ヒトIgG1重鎖定常領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗MAGE-A4×抗CD3二重特異性抗体は、上記のHCVR/LCVR配列対と、ヒトIgG4重鎖定常領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗MAGE-A4×抗CD3二重特異性抗体は、上記のHCVR/LCVR配列対と、ヒトIgG重鎖定常領域とを含む。いくつかの実施形態では、抗MAGE-A4×抗CD3二重特異性抗体は、上記のHCVR/LCVR配列対と、ヒトIgG1重鎖定常領域又はIgG4重鎖定常領域と、を含む。
本明細書に開示される抗MAGE-A4抗体又はその抗原結合断片は、抗体が由来した対応する生殖系列配列と比較して、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のフレームワーク領域並びに/又はCDR領域において1種以上のアミノ酸置換、挿入、及び/又は欠失を含んでもよい。このような変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば、公共の抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって、容易に確認され得る。本開示は、本明細書に開示されるアミノ酸配列のうちのいずれかに由来する抗体及びその抗原結合断片を含み、1つ以上のフレームワーク及び/若しくはCDR領域内の1種以上のアミノ酸は、抗体が由来した生殖系列配列の対応する残基へ、又は別のヒト生殖系列配列の対応する残基へ、又は対応する生殖系列残基の保存的アミノ酸置換へ変異する(このような配列変化は本明細書でまとめて「生殖系列変異」と称される)。当業者は、本明細書に開示される重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列から出発して、1つ以上の個々の生殖系列変異又はこれらの組み合わせを含む多くの抗体及び抗原結合断片を、容易に産生し得る。特定の実施形態では、VH領域及び/又はVL領域内のフレームワーク及び/又はCDR残基は全て、抗体が由来した元の生殖系列配列において見出される残基へと、再び変異する。その他の実施形態では、特定の残基のみが元の生殖系列配列へと変異し戻され、例えば、変異した残基は、FR1の最初の8つのアミノ酸内に、若しくはFR4の最後の8つのアミノ酸内に見出されるか、又は変異した残基は、CDR1、CDR2、若しくはCDR3内にのみ見出される。その他の実施形態では、フレームワーク及び/又はCDR残基のうちの1つ以上は、異なる生殖系列配列(すなわち、抗体が本来由来した生殖系列配列とは異なる生殖系列配列)の対応する残基へ変異する。更に、本開示の抗体は、フレームワーク及び/又はCDR領域内に2つ以上の生殖系列変異の任意の組み合わせを含有してもよく、例えば、特定の個々の残基は、特定の生殖系列配列の対応する残基へ変異するのに対し、元の生殖系列配列とは異なる特定のその他の残基は、維持されるか、又は異なる生殖系列配列の対応する残基へと変異する。取得されると、1つ以上の生殖系列変異を含む抗体及び抗原結合断片は、結合特異性の改善、結合親和性の増加、拮抗的な(antagonistic)生物学的特性又は反発的な(agonistic)生物学的特性の改善又は増強(場合によって)、免疫原性の低減等の1つ以上の所望の特性について容易に試験され得る。この一般的な様式で取得される抗体及び抗原結合断片は、本開示内に包含される。
抗MAGE-A4抗体は、1以上の保存的置換を有する、本明細書に開示されるHCVR、LCVR、及び/又はCDRアミノ酸配列のうちのいずれかの変異体を含んでもよい。例えば、抗MAGE-A4抗体は、本明細書に記載のHCVR、LCVR、及び/又はCDRアミノ酸配列のうちのいずれかに対して、例えば、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下、2以下、又は1の保存的アミノ酸置換を有するHCVR、LCVR、及び/又はCDRアミノ酸配列を有し得る。
「抗原決定基」という用語は、抗原結合部位(パラトープ、paratope)として周知の抗体分子の可変領域における特異的抗原結合部位と相互作用する、抗原決定基を指す。単一の抗原は、2つ以上の抗原決定基を有してもよい。したがって、異なる抗体は抗原上の異なる領域に結合してもよく、異なる生物学的効果を有してもよい。抗原決定基は、立体配座又は直鎖状のいずれかであってもよい。立体配座抗原決定基は、直鎖状ポリペプチド鎖の異なるセグメント由来の空間的に並置されたアミノ酸によって、産生される。直鎖状抗原決定基は、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基によって産生されるものである。ある特定の状況において、抗原決定基は、抗原上の糖類、ホスホリル基、又はスルホニル基の部分を含んでもよい。
「実質的な同一性(substantial identity)」又は「実質的に同一である(substantially identical)」という用語は、核酸又はその断片を指す場合、別の核酸(又はその相補鎖)との適切なヌクレオチド挿入又は欠失と最適に整列した場合、以下で考察されるように、FASTA、BLAST、又はGapなどの、配列同一性の任意の周知のアルゴリズムによって測定される際に、ヌクレオチド塩基の少なくとも約95%、より好ましくは、少なくとも約96%、97%、98%、99%、99.5%、又は99.9%のヌクレオチド配列同一性があることを示す。基準核酸分子と実質的な同一性を有する核酸分子は、特定の場合では、基準核酸分子によってコードされるポリペプチドと同じ又は実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよい。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号22若しくは配列番号105の配列、又は配列番号22若しくは配列番号105の一部分(例えば、配列番号2、若しくは配列番号83の配列などのHCVR、又は配列番号10の配列などのLCVR、又は配列番号2、配列番号10、配列番号22、若しくは配列番号105に見られるものなどポリペプチド配列のフレームワーク領域)に対して、少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.9%、又は100%同一である配列を含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、このようなポリペプチドをコードするポリ核酸を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号21若しくは配列番号104の配列、又は配列番号21若しくは配列番号104の一部分(例えば、配列番号1の配列などのHCVR、又は配列番号9の配列などのLCVR、又は配列番号1、配列番号9、配列番号21、若しくは配列番号104などのポリヌクレオチド配列のフレームワーク領域)に対して、少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.9%、又は100%同一である配列を含むポリ核酸を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号69の配列、若しくはその一部分(配列番号55など)、又は配列番号71の配列、若しくはその一部分(配列番号63など)、又は配列番号81の配列、若しくはその一部分(配列番号73など)に対して、少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.9%、又は100%同一である配列を含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号68の配列、若しくはその一部分(配列番号54など)、又は配列番号70の配列、若しくはその一部分(配列番号62など)、又は配列番号80の配列、若しくはその一部分(配列番号72など)に対して、少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.9%、又は100%同一である配列を含むポリ核酸を提供する。
ポリペプチドへ適用される場合、「実質的な類似性(substantial similarity)」又は「実質的に類似の(substantially similar)」という用語は、2つのペプチド配列が、既定のギャップ重みを使用してプログラムGAP又はプログラムBESTFITなどによって最適に整列した場合、少なくとも95%の配列同一性、更により好ましくは、少なくとも98%又は99%の配列同一性を共有する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換が異なる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の化学的特性(例えば、電荷又は疎水性)を備えた側鎖(R基)を有する別のアミノ酸残基によって置換されたものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。2つ以上のアミノ酸配列の保存的置換が互いに異なる場合、配列同一性パーセント又は類似性の程度は、置換の保存的性質を補正するために上向きに調整されてもよい。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるPearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331を参照のこと。類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例としては、(1)脂肪族側鎖:グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン、(2)脂肪族ヒドロキシル側鎖:セリン及びトレオニン、(3)アミド含有側鎖:アスパラギン及びグルタミン、(4)芳香族側鎖:フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン、(5)塩基性側鎖:リジン、アルギニン、及びヒスチジン、(6)酸性側鎖:アスパラギン酸及びグルタミン酸、並びに(7)硫黄含有側鎖は、システイン及びメチオニン、が挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リジン-アルギニン、アラニン-バリン、グルタミン酸-アスパラギン酸、及びアスパラギン-グルタミンである。あるいは、保存的置換とは、参照により本明細書に組み込まれるGonnet et al.(1992)Science 256:1443-1445に開示されるPAM250対数尤度マトリックスにおいて正値を有する任意の変化である。「適度に保存的な」置換とは、PAM250対数尤度マトリックスにおいて負以外の値を有する任意の変化である。
ポリペプチドに対する配列類似性は、配列同一性とも称され、典型的には、配列分析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失、及びその他の修飾に割り当てられた類似性の測定値を使用して、類似の配列を一致させる。例えば、GCGソフトウェアは、異なる種の生物由来の相同ポリペプチドなどの密接に関連するポリペプチド間の、又は野生型タンパク質とその変異タンパク質との間の配列相同性又は配列同一性を決定するための既定パラメータと共に使用され得る、Gap及びBestfitなどのプログラムを含む。例えば、GCGバージョン6.1を参照のこと。ポリペプチド配列はまた、GCGバージョン6.1のプログラムである既定パラメータ又は推奨パラメータを用いたFASTAを使用して、比較され得る。FASTA(例えば、FASTA2及びFASTA3)は、問い合わせ配列と検索配列との間の最良重複領域の整列及び配列同一性パーセントを提供する(Pearson(2000)(上記参照))。ギャップオープンペナルティが12、ギャップ拡張ペナルティが2、BLOSUM行列が62でのアフィンギャップ検索を使用したSmith-Waterman相同性検索アルゴリズムを使用して、配列を比較もし得る。本開示の配列を、異なる生物由来の多数の配列を含むデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、既定パラメータを使用するコンピュータプログラムBLAST、特にBLASTP又はTBLASTNである。例えば、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる、Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410、及びAltschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-402を参照のこと。
本明細書で使用される場合、「核酸」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボ核酸(Deoxyribo Nucleic Acid、DNA)又はリボ核酸(Ribo Nucleic Acid、RNA)、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応(Polymerase Chain Reaction、PCR)によって生成される断片、並びに核酸連結、切断、エンドヌクレアーゼ作用、及びエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生成された断片などの、ヌクレオチド及び/又はポリヌクレオチドを指す。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド(DNA及びRNAなど)、若しくは天然に存在するヌクレオチドの類似体(例えば、天然に存在するヌクレオチドのエナンチオマー型)、又はそれらの両方の組み合わせである単量体からなり得る。修飾されたヌクレオチドは、糖部分及び/又はピリミジン塩基部分若しくはプリン塩基部分において変化を有し得る。糖修飾は、例えば、ハロゲンを伴う1つ以上のヒドロキシル基、アルキル基、アミン基、及びアジド基での置換を含む、又は糖は、エーテル若しくはエステルとして官能化され得る。更に、糖部分全体は、アザ糖及び炭素環式糖類似体などの立体化学的及び電子的に類似した構造と置き換えられ得る。塩基部分における修飾の例としては、アルキル化プリン及びピリミジン、アシル化プリン若しくはピリミジン、又はその他の周知の複素環式置換基が挙げられる。核酸単量体は、ホスホジエステル結合又はこのような連鎖の類似体によって連結され得る。核酸は、単鎖又は二本鎖のいずれかであり得る。
「キメラ抗原受容体」(CAR)という用語は、標的細胞上に存在する成分に対する結合領域、例えば、所望の抗原(例えば、MAGE-A4などの腫瘍抗原)に対する抗体系の特異性をT細胞受容体を活性化する細胞内領域と組み合わせて、特異的な抗標的細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を生成する分子を指す。一般に、CARは、T細胞抗原受容体複合体ゼータ鎖の細胞内シグナル伝達領域に融合した細胞外単鎖抗体結合領域(scFv)からなり、T細胞で発現した場合に、モノクローナル抗体の特異性に基づいて、抗原認識を方向転換する能力を有する。
「HLA」という用語は、ヒト白血球抗原(Human Leukocyte Antigen、HLA)系又は複合体を指し、これは、ヒトにおける主要組織適合遺伝子複合体(Major Histocompatibility Complex、MHC)タンパク質をコードする遺伝子複合体である。これらの細胞表面タンパク質は、ヒトにおける免疫系の調節に関与している。MHCクラスI(A、B、及びC)に対応するHLAは、細胞内からペプチドを提示する。本出願の文脈において、ペプチドは、それがHLA系又は複合体に結合している場合、「HLA結合」であり得る。いくつかの実施形態では、HLA結合ペプチドは、細胞の表面上に存在する。
「HLA-A」という用語は、HLA-A遺伝子座によってコードされるヒト白血球抗原(HLA)の群を指す。HLA-Aは、3つの主要な種類のヒトMHCクラスI細胞表面受容体のうちの1つである。受容体は、ヘテロ二量体であり、重α鎖及び小さなβ鎖からなる。α鎖は、変異体HLA-A遺伝子によってコードされており、β鎖(β2-ミクログロブリン)は、不変のβ2ミクログロブリン分子である。
「HLA-A2」という用語は、HLA-A遺伝子座における1つの特定のクラスI主要組織適合遺伝子複合体(MHC)の対立遺伝子群である。α鎖は、HLA-A*02遺伝子によってコードされ、β鎖は、β2-ミクログロブリン又はB2M遺伝子座によってコードされる。
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、又は染色体、非染色体、半合成核酸若しくは合成核酸からなり得る線状若しくは環状のDNA若しくはRNA分子を含むが、これらに限定されない。場合によっては、ベクターは、自律複製(遺伝子副体ベクター)及び/又はそれらが連結されている核酸の発現(発現ベクター)が可能なものである。多数の好適なベクターが当業者に周知であり、市販されている。ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス(例えば、アデノ随伴ウイルス)、コロナウイルス、オルソミクソウイルス(例えば、インフルエンザウイルス)などのマイナス鎖RNAウイルス、ラブドウイルス(例えば、狂犬病及び水胞性口内炎ウイルス)、パラミクソウイルス(例えば、はしか及びセンダイ)、ピコルナウイルス及びアルファウイルスなどのプラス鎖RNAウイルス、並びにアデノウイルス、ヘルペスウイルス(例えば、単純ヘルペスウイルス1型及び2型、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス)、及びポックスウイルス(例えば、ワクシニア、鶏痘、カナリア痘)を含む二本鎖DNAウイルスが挙げられる。その他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルス、及び肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例としては、トリ白血病肉腫、哺乳動物のC型、B型ウイルス、D型ウイルス、HTLV-BLV群、及びレンチウイルスが挙げられる。
「共刺激領域」又は「共刺激分子」とは、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、これに限定されないが増殖などの細胞による共刺激応答を媒介する、T細胞上の同族の結合パートナを指す。共刺激分子は、MHCクラスI分子、BTLA、及びトール・リガンド受容体(Toll ligand receptor)を含むが、これらに限定されない。共刺激分子の例としては、CD27、CD28、CD8、4-1BB(CD137)(配列番号29)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、及びCD83と特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。共刺激分子は、効率的な免疫応答に必要な抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子である。
「共刺激リガンド」は、T細胞上の同族の共刺激分子に特異的に結合し、それによりシグナルを提供する抗原提示細胞上の分子を指し、そのシグナルは、例えば、ペプチドを担持したMHC分子とのTCR/CD3複合体の結合によって提供される一次的シグナルに加えて、増殖活性化、分化などを含むがこれらに限定されないT細胞応答を媒介する。共刺激リガンドは、CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導性共刺激リガンド(Inducible COStimulatory Ligand、ICOS-L)、細胞間接着分子(Inter Cellular Adhesion Molecule、ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、リンホトキシンベータ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、トール・リガンド受容体に結合するアゴニスト又は抗体、及びB7-H3と特異的に結合するリガンドを含み得るが、これらに限定されない。
「共刺激シグナル」とは、TCR/CD3核酸連結などの一次的シグナルと組み合わせて、T細胞増殖及び/又は重要な分子の上方調節又は下方調節をもたらすシグナルを指す。
本明細書で使用される場合、「細胞外リガンド結合領域」という用語は、リガンド、例えば、細胞表面分子に結合することが可能なオリゴペプチド又はポリペプチドを指す。例えば、細胞外リガンド結合領域は、特定の病状(例えば、癌)に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように、選択されてもよい。リガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例としては、ウイルス、細菌、及び寄生虫の感染、自己免疫疾患、並びに癌細胞に関連するものが挙げられる。細胞外リガンド結合領域は、(例えば、scFvとしてフォーマットされた)LCVR領域及びHCVR領域を含み得、任意選択で、リンカによって連結され得る。
「被検体」又は「患者」という用語は、本明細書で使用される場合、非ヒト霊長類及びヒトを含む動物界の全ての成員を含む。一実施形態では、患者は、癌(例えば、多発性骨髄腫又は黒色腫)を有するヒトである。
本明細書で使用される場合、CARの「シグナル伝達(signal transducing)領域」又は「シグナル伝達(signaling)領域」は、細胞外リガンド結合領域の標的への結合に続く細胞内シグナル伝達に関与し、免疫細胞及び免疫応答の活性化をもたらす。換言すれば、シグナル伝達領域は、CARが発現される免疫細胞の正常なエフェクタ機能のうちの少なくとも1つの活性化に関与する。例えば、T細胞のエフェクタ機能は、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性又はヘルパー活性であり得る。したがって、「シグナル伝達領域」という用語は、エフェクタ機能シグナルを伝達し、細胞に特殊な機能を実施するように指示するタンパク質の部分を指す。CARにおいて使用するためのシグナル伝達領域の例としては、抗原受容体の関与に続いて協調して作用してシグナル伝達を開始する、T細胞受容体及び共受容体の細胞質配列、並びにこれらの配列の任意の誘導体又は変異体及び同じ機能を有する任意の合成配列であり得る。場合によっては、シグナル伝達領域は、抗原依存性の一次的活性化を開始するもの、及び抗原非依存的に作用して二次的シグナル又は共刺激シグナルを提供するものの2つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列を含む。一次的細胞質シグナル伝達配列は、ITAM(Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif)の免疫受容活性化チロシンモチーフとして周知である、シグナル伝達モチーフを含み得る。ITAMは、syk/zap70クラスチロシンキナーゼの結合部位として作用する、様々な受容体の細胞質内尾部に見出される明確なシグナル伝達モチーフである。代表的なITAMとしては、TCRゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、FcRイプシロン、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79b、及びCD66dに由来するものが挙げられる。いくつかの実施形態では、CARのシグナル伝達領域は、CD3ゼータシグナル伝達領域(配列番号30)を含み得る。
キメラ抗原受容体(CAR)
キメラ抗原受容体(CAR)は、T細胞の特異性を、細胞(例えば、癌細胞)の表面上の抗体に認識される抗原が細胞表面で発現しようとも、細胞内で発現し、例えば、HLAによって提示されようとも、それらの抗原に方向転換し得る。
キメラ抗原受容体(CAR)は、T細胞の特異性を、細胞(例えば、癌細胞)の表面上の抗体に認識される抗原が細胞表面で発現しようとも、細胞内で発現し、例えば、HLAによって提示されようとも、それらの抗原に方向転換し得る。
本開示の一態様は、腫瘍細胞などの細胞の表面上に提示されるMAGE-A4抗原に特異的なキメラ抗原受容体(CAR)を含む。この提示は、例えば、HLA-A2などのHLAによるものであり得る。本開示の一実施形態では、本明細書に記載されるCARは、細胞外標的特異的結合領域、膜貫通領域、細胞内シグナル伝達領域(CD3ゼータ又はFcRガンマに由来するシグナル伝達領域など)、及び/又は4-1BBなどであるがこれに限定されない、共刺激分子に由来する1つ以上の共刺激シグナル伝達領域を含む。一実施形態では、CARは、細胞外結合領域と膜貫通領域との間に、CD8アルファヒンジなどのヒンジ又はスペーサー領域を含む。
CARの結合領域又は細胞外領域は、目的の標的抗原に結合する能力をCARに提供する。結合領域(例えば、リガンド結合領域又は抗原結合領域)は、生体分子(例えば、細胞表面受容体又は腫瘍タンパク質、又はそれらの成分)を特異的に認識して結合する能力を有する任意のタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、又はペプチドであり得る。結合領域は、目的の生体分子に対して、天然に存在する、合成の、半合成の、又は組換えにより産生された結合パートナを含む。例えば、本明細書に更に記載されるように、結合領域は、抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域であり得るか、又は軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、単鎖及びいずれかの方向で一緒に連結され得る(例えば、VL-VH又はVH-VL)。ウエスタンブロット、ELISA、フローサイトメトリー、又は表面プラズモン共鳴分析(例えば、BIACORE分析を使用)を含む、特定の標的と特異的に結合する本開示の結合領域を同定するための様々なアッセイが、周知である。標的は、腫瘍の死滅をもたらすエフェクタ免疫応答を誘発することが望ましい、臨床的な目的の抗原であってもよい。一実施形態では、キメラ抗原受容体の結合領域の標的抗原は、腫瘍細胞の表面上のMAGE-A4タンパク質(例えば、HLA-A2に提示されたMAGE-A4タンパク質などのHLAに提示されたMAGE-A4タンパク質)である。
例示的なリガンド結合領域としては、scFv、scTCRなどの抗体の抗原結合断片などの抗原結合タンパク質、受容体の細胞外領域、細胞表面分子/受容体に対するリガンド、又はそれらの受容体結合領域、及び腫瘍結合タンパク質が挙げられる。特定の実施形態では、本開示のCARに含まれる抗原結合領域は、可変領域(Fv)、CDR、Fab、scFv、VH、VL、領域抗体変異体(dAb)、ラクダ抗体(VHH)、フィブロネクチン3領域変異体、アンキリン反復変異体、及びその他のタンパク質骨格に由来するその他の抗原特異的結合領域であり得る。
一実施形態では、CARの結合領域は、抗MAGE-A4単鎖抗体(scFv)であり、マウス、ヒト、又はヒト化scFvであってもよい。単鎖抗体は、所望の標的に特異的なハイブリドーマ(雑種細胞)のV領域遺伝子からクローン化されてもよい。可変領域重鎖(VH)及び可変領域軽鎖(VL)のクローニングのために使用され得る技術は、例えば、Orlandi et al.,PNAS,1989;86:3833-3837に記載されている。したがって、特定の実施形態では、結合領域は、抗体由来の結合領域を含むが、非抗体由来の結合領域であり得る。抗体由来の結合領域は、抗体の断片、又は1つ以上の抗体の断片の遺伝子操作された産物であり得、その断片は、抗原との結合に関与する。
特定の実施形態では、本開示のCARは、分子の適切な間隔及びコンフォメーションのために付加された、様々な領域間のリンカを含んでもよい。例えば、一実施形態では、1~20アミノ酸長であり得る、結合領域VH又はVLの間に、リンカが存在してもよい。その他の実施形態では、キメラ抗原受容体の領域のうちのいずれかの間のリンカは、1~15又は15アミノ酸長であってもよい。これに関して、リンカは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20アミノ酸長であってもよい。更なる実施形態では、リンカは、21、22、23、24、25、26、27、28、29、又は30アミノ酸長であってもよい。本明細書に記載される数を含む範囲もまた、本明細書に含まれるが、例えば、10~30アミノ酸長のリンカである。
特定の実施形態では、本明細書に記載されるCARにおける使用に適したリンカは、可撓性リンカである。好適なリンカは、容易に選択され得、4アミノ酸~10アミノ酸、5アミノ酸~9アミノ酸、6アミノ酸~8アミノ酸、又は7アミノ酸~8アミノ酸を含む、1アミノ酸(例えば、Gly)~20アミノ酸、2アミノ酸~15アミノ酸、3アミノ酸~12アミノ酸などの異なる長さの好適なもののうちのいずれかであり得、1、2、3、4、5、6、又は7アミノ酸であってもよい。
代表的な可撓性リンカとしては、グリシンポリマー(G)n、グリシン-セリンポリマー(式中、nは、少なくとも1つの整数である)、グリシン-アラニンポリマー、アラニン-セリンポリマー、及び当該技術分野において周知のその他の可撓性リンカが挙げられる。グリシンポリマー及びグリシン-セリンポリマーは比較的構築化されておらず、したがって、本明細書に記載されるCARなどの融合タンパク質の領域間の中性テザーとして機能することができる場合がある。グリシンは、アラニンよりもはるかに多くのファイ(phi)-プサイ(psi)空間にアクセスし、より長い側鎖を有する残基よりもはるかに制限が少なくなる(Scheraga,Rev.Computational Chem.11173-142(1992)を参照のこと)。通常、当業者は、リンカが、可撓性リンカ及び所望のCAR構造について提供するためのより可撓性の低い構造を与える1つ以上の部分を含み得るように、CARの設計が、全て又は部分的に可撓性であるリンカを含み得ることを認識するであろう。特定のリンカは、配列番号23~25に示されるように、(G4S)nリンカを含み、式中、n=1~3である。別の代表的なリンカは、配列番号26として提供される。リンカは、CARのLCVR領域とHCVR領域との間に、可変領域(HCVRなど)とヒンジ領域(CD8αヒンジなど)との間に、又はそれらの両方に、存在し得る。例えば、本開示は、LCVRとHCVRとの間の(G4S)3リンカ、及びHCVRとCD8αヒンジとの間の(G4S)1リンカを含むCARを提供する。
CARの結合領域の後には、「スペーサー」又は「ヒンジ」が続いてもよく、これは、抗原結合領域をエフェクタ細胞表面から遠ざけて、適切な細胞/細胞接触、抗原結合、及び活性化を可能にする領域を指す(Patel et al.,Gene Therapy,1999;6:412-419)。CARのヒンジ領域は、一般に、膜貫通(transmembrane、TM)と結合領域との間にある。特定の実施形態では、ヒンジ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域であり、野生型免疫グロブリンヒンジ領域又は変性された野生型免疫グロブリンヒンジ領域であってもよい。本明細書に記載されるCARにおいて使用されるその他の代表的なヒンジ領域としては、CD8アルファ、CD4、CD28、及びCD7などの1型膜タンパク質の細胞外領域に由来するヒンジ領域が挙げられるが、これらは、これらの分子からの野生型ヒンジ領域であってもよいか、又は変性されてもよい。一実施形態では、ヒンジ領域は、CD8アルファヒンジ(配列番号27)を含む。
「膜貫通」領域(region)又は領域(domain)は、細胞外結合部分を免疫エフェクタ細胞の原形質膜に固定し、結合領域の標的抗原への結合を促進するCARの部分である。膜貫通領域はCD3ゼータ膜貫通領域であってもよいが、採用され得るその他の膜貫通領域は、CD8アルファ、CD4、CD28、CD45、CD9、CD16、CD22、CD33、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、及びCD154から取得されたものを含む。一実施形態では、膜貫通領域は、CD137の膜貫通領域である。いくつかの実施形態では、膜貫通領域は、配列番号28のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、膜貫通領域は合成であり、その場合、それは、ロイシン及びバリンなどの主に疎水性の残基を含むであろう。
「細胞内シグナル伝達領域」又は「シグナル伝達領域」とは、キメラ抗原受容体タンパク質の一部を指し、それは標的抗原に結合する効果的なCARのメッセージを免疫エフェクタ細胞の内部に伝達して、エフェクタ細胞機能、例えば、活性化、サイトカイン産生、増殖、及び細胞傷害性因子のCARが結合した標的細胞への放出を含む細胞傷害性活性、又は細胞外CAR領域への抗原結合で誘発されるその他の細胞応答を誘発することに関与する。「エフェクタ機能」という用語は、細胞の特殊な機能を指す。T細胞のエフェクタ機能は、例えば、細胞溶解活性又はサイトカインの分泌を含む補助又は活性であってもよい。したがって、本明細書で互換的に使用される「細胞内シグナル伝達領域」又は「シグナル伝達領域」という用語は、エフェクタ機能シグナルを伝達し、細胞に特殊な機能を実施するように指示するタンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達領域全体を採用することができるが、多くの場合、領域全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達領域の短縮部分が使用される範囲で、エフェクタ機能シグナルを伝達する限り、領域全体の代わりにこのような短縮部分を使用してもよい。細胞内シグナル伝達領域という用語は、エフェクタ機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達領域の任意の短縮部分を含むことを、意味する。細胞内シグナル伝達領域は「シグナル伝達領域」としても周知であり、典型的には、ヒトCD3又はFcRy鎖の部分に由来する。
T細胞受容体のみを介して生成されるシグナルは、T細胞の完全な活性化には不十分であり、二次的シグナル又は共刺激シグナルも必要であることが周知である。したがって、T細胞の活性化は、2つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列、すなわち、T細胞受容体を介して抗原依存性の一次的活性化を開始するもの(一次的細胞質シグナル伝達配列)、及び抗原非依存的に作用して二次的シグナル又は共刺激シグナルを提供するもの(二次細胞質シグナル伝達配列)によって媒介されると言うことができる。共刺激的に作用する細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又はITAMとして周知のシグナル伝達モチーフを含んでもよい。
本開示において特に有用である一次的細胞質シグナル伝達配列を含むITAMの例としては、TCRゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79b及びCD66dに由来するものが挙げられる。1つの特定の実施形態では、本明細書に記載される抗MAGE-A4 CARの細胞内シグナル伝達領域は、CD3ゼータに由来する。いくつかの実施形態では、シグナル伝達領域は、配列番号30のアミノ酸配列を含む。
本明細書で使用される場合、「共刺激シグナル伝達領域」又は「共刺激領域」という用語は、共刺激分子の細胞内領域を含むCARの部分を指す。共刺激分子は、抗原受容体又はFc受容体以外の細胞表面分子であり、抗原に結合する際に、Tリンパ球の効率的な活性化及び機能に必要な第2のシグナルを提供する。このような共刺激分子の例としては、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、CD30、CD40、PD-1、ICOS(CD278)、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKD2C、B7-H2、及びCD83に特異的に結合するリガンドが挙げられる。したがって、本開示は、CD3ゼータ及び4-1BBに由来する代表的な共刺激領域を提供するが、一方で、その他の共刺激領域は、本明細書に記載されるCARでの使用が企図される。1つ以上の共刺激シグナル伝達領域を含むことによって、CAR受容体を発現するT細胞の有効性及び増殖が増強される場合がある。細胞内シグナル伝達及び共刺激シグナル伝達領域は、膜貫通領域のカルボキシル末端に直列で任意の順序で連結されてもよい。いくつかの実施形態では、共刺激領域は、配列番号29のアミノ酸配列を含む。
CD3又はFcRガンマ由来のシグナル伝達領域を含むように操作されたscFv系のCARは、T細胞の活性化及びエフェクタ機能についての強力なシグナルを伝達することが示されているが、それらは、付随する共刺激シグナルの非存在下においては、T細胞の生存及び増殖を促進するシグナルを誘発するのに十分ではない。1つ以上の共刺激シグナル伝達領域(例えば、CD28、CD137、CD134、及びCD278に由来する細胞内共刺激領域)と共に、結合領域、ヒンジ、膜貫通、及びCD3ゼータ又はFcRガンマに由来するシグナル伝達領域を含むその他のCARは、生体外のCARを発現するT細胞において、並びに動物モデル及び癌患者において、抗腫瘍活性並びにサイトカイン分泌、溶解活性、生存及び増殖の増加をより効果的に指示し得る(Milone et al.,Molecular Therapy,2009;17:1453-1464;Zhong et al.,Molecular Therapy,2010;Zhong et al.,Molecular Therapy,2010;18:413-420;Carpenito et al.,PNAS,2009;106:3360-3365)。
各種実施形態では、本開示の抗MAGE-A4 CARは、(a)結合領域として抗MAGE-A4 scFv(例えば、表1において同定された抗MAGE-A4抗体由来の結合領域(例えば、CDR又は可変領域)を有するscFv)、(b)ヒトCD8アルファに由来するヒンジ領域、(c)ヒトCD8アルファ膜貫通領域、及び(d)ヒトT細胞受容体CD3ゼータ鎖(CD3)細胞内シグナル伝達領域、及び任意選択で、1つ以上の共刺激シグナル伝達領域、例えば、4-1BBを含む。一実施形態では、様々なタンパク質領域は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、結合領域、ヒンジ領域、及び膜貫通領域の順序で配置される。細胞内シグナル伝達領域及び所望による共刺激シグナル伝達領域は、膜貫通のカルボキシ末端に任意の順序で直列に連結されて、単鎖キメラポリペプチドを形成する。一実施形態では、抗MAGE-A4 CARをコードする核酸構成は、様々なコード配列、例えば、(5’から3’へ)ヒト抗MAGE-A4 scFv、ヒトCD8アルファヒンジ、ヒトCD8アルファ膜貫通領域、及びCD3ゼータ細胞内シグナル伝達領域のコード配列を含む核酸分子を含むキメラ核酸分子である。別の実施形態では、抗MAGE-A4 CARをコードする核酸構成は、様々なコード配列、例えば、(5’から3’へ)ヒト抗MAGE-A4 scFv、ヒトCD8アルファヒンジ、ヒトCD8アルファ膜貫通領域、4-1BB共刺激領域、及びCD3ゼータ共刺激領域のコード配列を含む核酸分子を含むキメラ核酸分子である。
特定の実施形態では、本明細書に記載されるCARをコードするポリヌクレオチドは、ベクターに挿入される。ベクターは、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを共有結合で挿入して、そのタンパク質の発現及び/又はポリヌクレオチドのクローニングについてもたらすことができる媒体である。このようなベクターは、「発現ベクター」と称される場合もある。単離されたポリヌクレオチドは、当該技術分野で周知の任意の好適な方法を使用してベクターに挿入されてもよく、例えば、限定するものではないが、ベクターを適切な制限酵素を使用して消化し、次に、一致する制限末端を有する単離ポリヌクレオチドと核酸連結する場合がある。発現ベクターは、細胞内で転写されることが可能な遺伝子産物の少なくとも一部についてコードする異種又は修飾された核酸配列を組み込んで発現する能力を、有し得る。ほとんどの場合、RNA分子は、タンパク質に翻訳される。発現ベクターは、様々な制御配列を含み得るが、これは、特定の宿主生物において作動可能に連結されたコード配列の転写、及び場合によっては翻訳のために必要な、核酸配列を指す。転写及び翻訳を調節する制御配列に加えて、ベクター及び発現ベクターは、同様に他に機能も果たす核酸配列を含む場合があり、以下で考察される。発現ベクターは、追加の要素を含んでもよく、例えば、発現ベクターは、2つの複製システムを有してもよく、したがって、それを2つの生物、例えば、発現のためのヒト細胞並びにクローニング及び増幅のための原核生物宿主において維持されることを可能にする。
発現ベクターは、CMV、PGK及びEF1アルファプロモータなどのプロモータ配列、リボソーム認識及び結合TATAボックス、及びそれぞれの宿主細胞における効率的な遺伝子転写及び翻訳のための3’UTR AAUAAA転写終結配列などの、必要な5’上流調節要素及び3’下流調節要素を有してもよい。その他の好適なプロモータとしては、シミアンウイルス40(Simian Virus 40、SV40)初期プロモータ、マウス乳腺腫瘍ウイルス(Mouse Mammary Tumor Virus、MMTV)、HIV LTRプロモータ、MoMuLVプロモータ、トリ白血病ウイルスプロモータ、EBV即時初期プロモータ、及びラウス肉腫ウイルスプロモータの構成的プロモータを含む。アクチンプロモータ、ミオシンプロモータ、ヘモグロビンプロモータ、及びクレアチンキナーゼプロモータを含むがこれらに限定されない、ヒト遺伝子プロモータもまた使用されてもよい。特定の実施形態では、誘導性プロモータもまた、キメラ抗原受容体を発現するベクターの一部として企図される。これは、目的のポリヌクレオチド配列の発現をオンにするか、又は発現をオフにすることが可能な分子スイッチを提供する。誘導性プロモータの例としては、メタロチオニンプロモータ、グルココルチコイドプロモータ、プロゲステロンプロモータ、又はテトラサイクリンプロモータが挙げられるが、これらに限定されない。
発現ベクターは、発現されたCARに組み込まれる6x-ヒスチジン、c-Myc、及びFLAGタグなどの追加の配列を有してもよい。したがって、発現ベクターは、5’及び3’の非翻訳調節配列を含むように操作されてもよいが、これは、発現ベクター上で運ばれる目的の核酸の効率的な転写を促進又は増強し得るエンハンサ配列、プロモータ領域及び/又はターミネーター配列として機能し得る。発現ベクターはまた、特定の細胞型、細胞位置、又は組織型における複製及び/又は発現機能性(例えば、転写及び翻訳)のために、操作されてもよい。発現ベクターは、宿主又は受容細胞におけるベクターの維持のための選択可能なマーカーを含んでもよい。
各種実施形態では、ベクターは、プラスミド、自律的に複製する配列、及び転位要素である。追加の代表的なベクターとしては、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体(Yeast Artificial Chromosome、YAC)、細菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome、BAC)、又はP1由来人工染色体(P1-derived Artificial Chromosome、PAC)などの人工染色体、ラムダファージ又はM13ファージなどのバクテリオファージ、及び動物ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターとして有用な動物ウイルスのカテゴリーの例としては、レトロウイルス(レンチウイルスを含む)、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス(例えば、単純ヘルペスウイルス)、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、及びパポーバウイルス(例えば、SV40)が挙げられるが、これらに限定されない。発現ベクターの例は、哺乳動物細胞における発現のための、Lenti-X(商標)Bicistronic Expression System(Neo)ベクター(Clontrch社製)、PClneoベクター(Promega社製)、哺乳動物細胞におけるレンチウイルス媒介遺伝子移入及び発現のための、pLenti4/V5-DEST(商標)、pLenti6/V5-DEST(商標)、及びpLenti6.2N5-GW/lacZ(Invitrogen社製)である。本明細書に開示されるCARのコード配列は、哺乳動物細胞におけるキメラタンパク質の発現のために、このような発現ベクターに核酸連結され得る。
特定の実施形態では、本開示のCARをコードする核酸は、ウイルスベクターにおいて提供される。ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、又は泡沫状ウイルスに由来するものであり得る。本明細書で使用される場合、「ウイルスベクター」という用語は、少なくとも1つのウイルス起源の要素を含み、ウイルスベクター粒子にパッケージ化される能力を有する核酸ベクター構成を指す。ウイルスベクターは、非必須ウイルス遺伝子の代わりに、本明細書に記載される様々なキメラタンパク質についてのコード配列を含み得る。生体外又は生体内のいずれかでDNA、RNA、又はその他の核酸を細胞に移入させる目的で、ベクター及び/又は粒子が利用され得る。ウイルスベクターの多くの形態が、当該技術分野において周知である。
特定の実施形態では、本明細書に記載されるCARのコード配列を含むウイルスベクターは、レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである。「レトロウイルスベクター」という用語は、主にレトロウイルスに由来する構造的遺伝子要素及び機能的遺伝子要素を含むベクターを指す。「レンチウイルスベクター」という用語は、主にレンチウイルスに由来する、LTRの外側の構造的遺伝子要素及び機能的遺伝子要素を含むベクターを指す。
本明細書で使用するレトロウイルスベクターは、任意の周知のレトロウイルス(例えば、モロニーマウス肉腫ウイルス(Moloney Murine Sarcoma Virus、MoMSV)、ハーベイマウス肉腫ウイルス(Harvey Murine Sarcoma Virus、HaMuSV)、マウス乳腺腫瘍ウイルス(Murine Mammary Tumor Virus、MuMTV)、テナガザル白血病ウイルス(Gibbon ape Leukemia Virus、GaLV)、ネコ白血病ウイルス(Feline Leukemia Virus、FLV)、スプマウイルス、フレンド、マウス幹細胞ウイルス(Murine Stem Cell Virus、MSCV)及びラウス肉腫ウイルス(Rous Sarcoma Virus、RSV)などのc型レトロウイルス)に由来し得る。本開示の「レトロウイルス」はまた、ヒトT細胞白血病ウイルス、HTLV-1及びHTLV-2、並びにヒト免疫不全ウイルス、HIV-1、HIV-2、サル免疫不全ウイルス(Simian Immunodeficiency Virus、SIV)、ネコ免疫不全ウイルス(Feline Immunodeficiency Virus、FIV)、ウマ免疫不全ウイルス(Equine Immnodeficiency Virus、EIV)及びそのその他のクラスのレトロウイルスなどレトロウイルスのレンチウイルスファミリーを含む。
本明細書で使用するレンチウイルスベクターは、ゆっくりと進行する疾患を引き起こすレトロウイルスの群(又は属)であるレンチウイルスに由来するベクターを指す。この群に含まれるウイルスとしては、HIV(Human Immunodeficiency Virus、ヒト免疫不全ウイルス、HIV1型及びHIV2型を含む)、ビスナ-マエディ(visna-maedi)、ヤギ関節炎脳炎ウイルス(caprine arthritis-encephalitis virus)、ウマ伝染性貧血ウイルス(equine infectious anemia virus)、ネコ免疫不全ウイルス(Feline Immunodeficiency Virus、FIV)、ウシ免疫不全ウイルス(Bovine Immune deficiency Vvirus、BIV)、及びサル免疫不全ウイルス(Simian Immunodeficiency Virus、SIV)が挙げられる。組換えレンチウイルスの調製は、Dullら及びZuffereyらによる方法を使用して達成され得る(Dull et al.,J.Virol.,1998;72:8463-8471、及びZufferey et al.,J.Virol.1998;72:9873-9880)。
本開示における使用のためのレトロウイルスベクター(すなわち、レンチウイルス及び非レンチウイルスの両方)は、本明細書に記載される順序及び配向で、所望のDNA配列を組み合わせることによって、標準的なクローニング技術を使用して形成され得る(Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel,F.M.et al.(eds.)Greene Publishing Associates,(1989),Sections 9.10-9.14及びその他の標準的な実験室マニュアル,Eglitis,et al.(1985)Science 230:1395-1398;Danos and Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6460-6464,Wilson et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:3014-3018,Armentano et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6141-6145,Huber et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8039-8043,Ferry et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8377-8381,Chowdhury et al.(1991)Science 254:1802-1805;van Beusechem et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7640-7644;Kay et al.(1992)Human Gene Therapy 3:641-647;Dai et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10892-10895,Hwu et al.(1993)J.Immunol 150:4104-4115;米国特許第4,868,116号、同第4,980,286号、PCT国際公開特許第89/07136号、同第89/02468号、同第89/05345号、及び同第92/07573号)。
ベクターの形成において使用するためのレトロウイルス(すなわち、レンチウイルス及び非レンチウイルスの両方)配列を取得するための好適な供給源は、例えば、Type Culture Collection(アメリカンタイプカルチャーコレクション、American Type Culture Collection(ATCC))、ロックビル、メリーランド州、を含む市販の供給源から入手可能な、ゲノムRNA及びcDNAを含む。配列はまた、化学的に合成され得る。
抗MAGE-A4 CARの発現のために、ベクターを宿主細胞に導入して、宿主細胞内でのポリペプチドの発現を可能にしてもよい。発現ベクターは、プロモータ配列、転写開始配列、エンハンサ配列、選択可能なマーカー、及びシグナル配列を含むがこれらに限定されない、発現を制御するための様々な要素を含有してもよい。これらの要素は、本明細書に記載されるように、当業者によって適切に選択されてもよい。例えば、プロモータ配列は、ベクターにおけるポリヌクレオチドの転写を促進するように選択されてもよい。好適なプロモータ配列は、T7プロモータ、T3プロモータ、SP6プロモータ、ベータアクチンプロモータ、EF1aプロモータ、CMVプロモータ、及びSV40プロモータを含むが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドの転写を増強するために、エンハンサ配列を選択してもよい。ベクターが挿入された宿主細胞をそうでないものから選択できるように、選択可能なマーカーを選択してもよく、例えば、選択可能なマーカーは、抗生物質耐性を付与する遺伝子であってもよい。シグナル配列は、発現されたポリペプチドが宿主細胞の外に輸送されることを可能にするように選択されてもよい。
ポリヌクレオチドのクローニングのために、ベクターを宿主細胞(単離された宿主細胞)に導入して、ベクター自体の複製を可能にし、それにより、そこに含まれるポリヌクレオチドのコピーを増幅してもよい。クローニングベクターは、一般に、複製起点、プロモータ配列、転写開始配列、エンハンサ配列、及び選択可能なマーカーを含むがこれらに限定されない配列成分を含有してもよい。これらの要素は、当業者によって適切に選択されてもよい。例えば、複製起点は、宿主細胞におけるベクターの自律複製を促進するように選択されてもよい。
特定の実施形態では、本開示は、本明細書で提供されるベクターを含む単離された宿主細胞を提供する。ベクターを含む宿主細胞は、ベクター中に含まれるポリヌクレオチドの発現又はクローニングにおいて、有用である場合がある。好適な宿主細胞は、原核細胞、真菌細胞、酵母細胞、又は哺乳動物細胞などの高等真核細胞を含み得るが、これらに限定されない。この目的に好適な原核生物細胞としては、グラム陰性生物又はグラム陽性生物などの真正細菌、例えば、大腸菌(Escherichia)などの腸内細菌(Enterobactehaceae)、例えば、E.coli、エンテロバクター属(Enterobacter)、エルウィニア族(Erwinia)、クレブシエラ属(Klebsiella)、プロテウス属(Proteus)、サルモネラ属(Salmonella)、例えばサルモネラ菌(Salmonella typhimurium)、セラシア属(Serratia)、例えば、セラチア・マルセッセンス(Serratia marcescans)及び志賀菌属(Shigella)、並びに、枯草菌(B.subtilis)及びバチルス・リケニフォルミス(B.licheniformis)などの桿菌(Bacilli)、緑膿菌(P.aeruginosa)などのシュードモナス菌(Pseudomonas)、並びにストレプトマイセス属(Streptomyces)が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示のCARは、当該技術分野で周知の形質移入技術及び/又は形質導入技術を使用して、宿主細胞に導入され得る。本明細書で使用される場合、「形質移入」及び「形質導入」という用語は、外因性核酸配列が宿主細胞に導入されるプロセスを指す。核酸は、宿主細胞のDNAに組み込まれてもよいか、又は染色体外で維持されてもよい。核酸は一過性に維持されてもよいか、又は安定した導入であってもよい。形質移入は、リン酸カルシウム-DNA共沈、DEAE-デキストラン媒介形質移入、ポリブレン媒介形質移入、電気穿孔法、微量注射法、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、及びバイオリスティック法を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で周知の様々な手段によって達成されてもよい。形質導入は、形質移入によってではなく、ウイルス感染によるウイルス又はレトロウイルスベクターを使用した遺伝子の送達を指す。特定の実施形態では、レトロウイルスベクターは、細胞と接触する前にベクターをウイルス粒子にパッケージングすることによって、形質導入される。例えば、レトロウイルスベクターによって運ばれる抗MAGE-A4 CARをコードする核酸は、感染及びプロウイルスの組み込みを介して、細胞に形質導入され得る。
本明細書で使用される場合、「遺伝子操作された」又は「遺伝子修飾された」という用語は、細胞内の全遺伝物質への、DNA又はRNAの形態の余分な遺伝物質の添加を指す。「遺伝子修飾細胞」、「修飾細胞」、及び「方向転換された細胞」という用語は、互換的に使用される。
特に、本開示のCARは、それらの特異性を、目的の標的抗原、例えば、HLA-A2と共にMAGE-A4を提示する悪性細胞などの悪性のMAGE-A4を発現する細胞に方向転換するように、免疫エフェクタ細胞に導入及び発現される。
本開示は、本明細書に記載されるCARを発現する免疫エフェクタ細胞を作製するための方法を提供する。一実施形態では、方法は、免疫エフェクタ細胞が本明細書に記載される1つ以上のCARを発現するように、MAGE-A4を発現する腫瘍細胞を有する対象などの対象から単離された免疫エフェクタ細胞に、形質移入又は形質導入することを含む。特定の実施形態では、免疫エフェクタ細胞は、個体から単離され、生体外で更に操作することなく遺伝子修飾される。次に、このような細胞は、個体に直接再投与され得る。更なる実施形態では、免疫エフェクタ細胞は、CARを発現するように遺伝子修飾される前に、生体外で最初に活性化及び刺激されて増殖する。これに関して、免疫エフェクタ細胞は、遺伝子修飾される(すなわち、本明細書に記載されるように、CARを発現するように形質導入又は形質移入される)前又は後に培養されてもよい。
本明細書に記載される免疫エフェクタ細胞の生体外操作又は遺伝子修飾の前に、細胞の供給源を対象から取得してもよい。特に、本明細書に記載されるCARと共に使用するための免疫エフェクタ細胞は、T細胞を含む。T細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺の問題、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、腫瘍など、多くの供給源から取得され得る。特定の実施形態では、T細胞は、FICOLL(フィコール)分離などの当業者に周知の任意の数の技術を使用して、対象から収集された一単位の血液から取得され得る。一実施形態では、個体の循環血液由来の細胞は、アフェレーシスによって取得され得る。アフェレーシス産物は、典型的には、T細胞、単球、顆粒球、B細胞、そのその他の有核白血球、赤血球、血小板を含むリンパ球を含む。一実施形態では、アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、その後の処理のために細胞を適切な緩衝液又は培地に入れてもよい。本開示の一実施形態では、細胞をPBSで洗浄する。代替の実施形態では、洗浄された溶液はカルシウムを欠き、マグネシウムを欠くか、又は全てではないにしても多くの二価カチオンを欠く可能性がある。当業者によって理解されるように、洗浄工程は、半自動フロースルー遠心分離機を使用することなど、当業者に周知の方法によって達成されてもよい。洗浄後、細胞を様々な生体適合性緩衝液、又は緩衝液の有無にかかわらずその他の生理食塩水溶液に、再懸濁させてもよい。特定の実施形態では、アフェレーシス試料の望ましくない成分は、細胞が直接再懸濁された培養培地において除去されてもよい。
特定の実施形態では、T細胞は、例えば、PERCOLL(商標)勾配を介した遠心分離によって、赤血球を溶解し、単球を枯渇させることによって、末梢血単核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells、PBMC)から単離される。CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+、及びCD45RO+T細胞などのT細胞の特定の亜集団を、陽性選択技術又は陰性選択技術によって、更に単離し得る。例えば、陰性選択によるT細胞集団の濃縮は、陰性選択された細胞に特有の表面マーカーに向けられた抗体の組み合わせで、達成され得る。本明細書で使用するための一方法は、陰性選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに向けられたモノクローナル抗体のカクテルを使用する陰性磁気免疫接着、又はフローサイトメトリーによる細胞選別及び/若しくは選択である。例えば、陰性選択によってCD4+細胞について濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、及びCD8に対する抗体を含む。フローサイトメトリー及び細胞選別もまた、本開示において使用するための目的の細胞集団を単離するために、使用されてもよい。
PBMCは、本明細書に記載される方法を使用して、CARでの遺伝子組換えに直接使用されてもよい。特定の実施形態では、PBMCの単離後、Tリンパ球が更に単離され、特定の実施形態では、細胞傷害性及びヘルパーTリンパ球の両方を、遺伝子組換え及び/又は増殖の前又は後のいずれかで、ナイーブ、メモリ、及びエフェクタT細胞亜集団に選別し得る。標準的な方法を使用することによって、CD8+細胞を取得し得る。いくつかの実施形態では、CD8+細胞は、これらの種類のCD8+細胞のそれぞれに関連する細胞表面抗原を同定することによって、ナイーブ、中央メモリ、及びエフェクタ細胞に更に選別される。実施形態では、メモリT細胞は、CD8+末梢血リンパ球のCD62L+及びCD62L-サブセットの両方に存在する。PBMCは、抗CD8及び抗CD62L抗体で染色した後、CD62L-CD8+及びCD62L+CD8+画分に選別される。いくつかの実施形態では、中央メモリTCMの表現型マーカーの発現は、CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3、及びCD127を含み、グランザイムBに対して陰性である。いくつかの実施形態では、中央メモリT細胞は、CD45RO+、CD62L+、CD8+T細胞である。いくつかの実施形態では、エフェクタT細胞は、CD62L、CCR7、CD28、及びCD127に対して陰性であり、グランザイムB及びパーフォリンに対して陽性である。いくつかの実施形態では、ナイーブCD8+Tリンパ球は、CD62L、CCR7、CD28、CD3、CD127、及びCD45RAを含むナイーブT細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられる。
特定の実施形態では、CD4+T細胞は、更に亜集団に選別される。例えば、CD4+Tヘルパー細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を同定することにより、ナイーブ、中央メモリ、エフェクタ細胞に選別され得る。標準的な方法によって、CD4+リンパ球を取得し得る。いくつかの実施形態では、ナイーブCD4+Tリンパ球は、CD45RO-、CD45RA+、CD62L+CD4+T細胞である。いくつかの実施形態では、中央メモリCD4+細胞は、CD62L陽性及びCD45RO陽性である。いくつかの実施形態では、エフェクタCD4+細胞は、CD62L陰性及びCD45RO陰性である。
T細胞などの免疫エフェクタ細胞は、周知の方法を使用して単離の後に遺伝子修飾され得るか、又は免疫エフェクタ細胞は、遺伝子修飾される前に生体外で活性化及び増殖(又は前駆細胞の場合は分化)し得る。別の実施形態では、T細胞などの免疫エフェクタ細胞は、本明細書に記載されるキメラ抗原受容体で遺伝子修飾され(例えば、CARをコードする核酸を含むウイルスベクターで形質導入される)、次に、生体外で活性化及び増殖する。T細胞を活性化及び拡大するための方法は当該技術分野において周知であり、例えば、米国特許第6,905,874号、同第6、867,041号、同第6、797,514号、PCT国際公開特許第2012079000号に記載されている。一般に、このような方法は、PBMC又は単離されたT細胞を、IL-2などの適切なサイトカインを含む培地において、一般に、ビーズ又はその他の表面に結合した抗CD3抗体及び抗CD28抗体などの刺激剤及び共刺激剤と接触させることを含む。同じビーズに結合した抗CD3抗体及び抗CD28抗体は、「代理」抗原提示細胞(Antigen Presenting Cell、APC)として機能する。その他の実施形態では、T細胞は、米国特許第6,040,177号、同第5,827,642号、及びPCT国際公開特許第2012129514号に記載されているものなどの方法を使用して、フィーダー細胞及び適切な抗体及びサイトカインと共に活性化及び刺激されて、増殖してもよい。
本開示は、MAGE-A4を発現する腫瘍、例えば、多発性骨髄腫又は黒色腫によって引き起こされる悪性腫瘍を有する患者の治療のための修飾された免疫エフェクタ細胞の集団を提供し、修飾された免疫エフェクタ細胞は、本明細書に開示される抗MAGE-A4 CARを含む。
本明細書に記載されるように調製されたCARを発現する免疫エフェクタ細胞は、周知の技術、又は本開示に基づいて当業者に明らかであろうその変形形態による養子免疫療法のための方法及び組成物において、利用され得る。例えば、Gruenbergらの米国特許出願公開第2003/0170238号を参照のこと。Rosenbergの米国特許第4,690,915号もまた参照のこと。
いくつかの実施形態では、細胞は、最初にそれらの培養培地からそれらを採取し、次に、治療有効量での投与に適した培地及び容器系(「薬学的に許容される」キャリア)において、細胞を洗浄及び濃縮することによって、配合される。好適な注入培地は、任意の等張培地製剤、典型的には、通常の生理食塩水、Normosol R(Abbott社製)又はPlasma-Lyte A(Baxter社製)であり得るが、水中5%のデキストロース又はリンガー乳酸も利用され得る。注入培地には、ヒト血清アルブミンが補充され得る。
組成物中の治療有効量の細胞は、少なくとも2つの細胞(例えば、少なくとも1つのCD8+中央メモリT細胞及び少なくとも1つのCD4+ヘルパーT細胞のサブセット)であるか、又はより典型的には、102細胞超である、最大106までである、最大108細胞又は109細胞までである又はそれらを含む、及び1010細胞超であり得る。細胞の数は、その中に含まれる細胞の種類と同様に、組成物が意図される最終的な用途に依存するであろう。
細胞は、療法を受けている患者に対して、自家又は異種であってもよい。必要に応じて、処置は、免疫応答の誘導を増強するために本明細書に記載されるマイトジェン(例えば、PHA)又はリンホカイン、サイトカイン、及び/若しくはケモカイン(例えば、IFN-γ、IL-2、IL-12、TNF-α、IL-18、及びTNF-β、GM-CSF、IL-4、IL-13、Flt3-L、RANTES、MIP1αなど)の投与もまた含んでもよい。
本開示のCARを発現する免疫エフェクタ細胞集団は、単独で、又は、希釈剤及び/若しくはIL-2若しくはその他のサイトカイン若しくは細胞集団などのその他の成分との組み合わせで、医薬組成物として投与され得る。簡単に言えば、本開示の医薬組成物は、1種以上の薬学的又は生理学的に許容されるキャリア、希釈剤又は賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載されるT細胞などのCARを発現する免疫エフェクタ細胞集団を含んでもよい。このような組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等の緩衝液と、グルコース、マンノース、スクロース、又はデキストラン、マンニトールなどの炭水化物と、タンパク質と、ポリペプチド又はアミノ酸、例えばグリシンと、抗酸化剤と、EDTA又はグルタチオンなどのキレート剤と、補助剤(例えば、水酸化アルミニウム)と、防腐剤と、を含んでもよい。本開示の組成物は、好ましくは、静脈内投与用に製剤化される。
本明細書に記載される方法又は当該技術分野において周知のその他の方法を使用して本明細書に記載されるCARを発現するT細胞を投与することによって、対象において誘導される抗腫瘍免疫応答は、感染した細胞を死滅させることが可能な細胞傷害性T細胞、調節性T細胞、及びヘルパーT細胞応答によって媒介される細胞性免疫応答を含んでもよい。B細胞を活性化して抗体産生をもたらすことが可能なヘルパーT細胞によって主に媒介される液性免疫応答もまた、誘導されてもよい。本開示の組成物によって誘導される免疫応答の種類を分析するために、様々な技術を使用してもよく、これらは、Current Protocols in Immunology,Edited by:John E.Coligan,Ada M.Kruisbeek,David H.Margulies,Ethan M.Shevach,Warren Strober(2001)John Wiley & Sons,NY,N.Y.など、当該技術分野で十分に説明されている。
したがって、本開示は、癌細胞(例えば、MAGE-A4を発現する固形腫瘍細胞)によるMAGE-A4の発現によって少なくとも部分的に特徴付けられる悪性腫瘍と診断されるか、又はそれを有する疑いがあるか、又はそれを発症するリスクがある個体を治療する方法を提供し、本明細書に記載される治療有効量のCARを発現する免疫エフェクタ細胞を、個体に投与することを含む。
一実施形態では、本開示は、MAGE-A4を発現する癌と診断された対象を治療する方法を提供し、MAGE-A4を発現する癌と診断された対象由来の免疫エフェクタ細胞を除去すること、該免疫エフェクタ細胞を、本開示のキメラ抗原受容体をコードする核酸を含むベクターで遺伝子修飾すること、それによって、修飾された免疫エフェクタ細胞集団を産生すること、及び修飾された免疫エフェクタ細胞集団を同じ対象に投与すること、を含む。一実施形態では、免疫エフェクタ細胞は、T細胞を含む。
本明細書に記載される細胞組成物を投与するための方法は、生体外遺伝子修飾された免疫エフェクタ細胞の再導入をもたらすのに有効な任意の方法を含むが、これは、対象において本開示のCARを直接発現するか、又は対象に導入されるとCARを発現する成熟免疫エフェクタ細胞に分化する免疫エフェクタ細胞の遺伝子修飾された前駆細胞の再導入の、いずれかである。1つの方法は、生体外で本開示による核酸構成を末梢血T細胞に形質導入し、形質導入された細胞を対象に戻すことを含む。
キメラ抗原受容体及び対応する抗体の結合特性
本明細書で使用される場合、「結合」という用語は、キメラ抗原受容体又は対応する抗体(又は二重特異性抗体)の、例えば、細胞表面タンパク質又はその断片などの所定の抗原への(あるいはHLA分子などの細胞表面タンパク質に結合した抗原への)結合という文脈において、考察される。結合とは、典型的には、抗原結合領域:抗原相互作用などの、最低限の2つの存在物又は分子構造間の相互作用又は関連性を指す。
本明細書で使用される場合、「結合」という用語は、キメラ抗原受容体又は対応する抗体(又は二重特異性抗体)の、例えば、細胞表面タンパク質又はその断片などの所定の抗原への(あるいはHLA分子などの細胞表面タンパク質に結合した抗原への)結合という文脈において、考察される。結合とは、典型的には、抗原結合領域:抗原相互作用などの、最低限の2つの存在物又は分子構造間の相互作用又は関連性を指す。
例えば、結合親和性は、例えば、リガンドとして抗原を、分析物(又は抗リガンド)として抗体又はキメラ抗原受容体を使用したBIAcore 3000機器での表面プラズモン共鳴(SPR)技術により決定される場合、典型的には、約10-8M以下など、約10-9M以下などの、約10-7M以下のKD値に対応する。蛍光活性化セルソーティング(FACS)結合アッセイなどの細胞系の結合戦略もまた日常的に使用されており、FACSデータは、放射性リガンド競合結合法及びSPRなどのその他の方法と、良好に相関する(Benedict,CA,J Immunol Methods.1997,201(2):223-31,Geuijen,CA,et al.J Immunol Methods.2005,302(1-2):68-77)。
したがって、本開示のキメラ抗原受容体又は対応する抗体(又は二重特異性抗体)は、非特異的抗原(例えば、BSA、カゼイン)へ結合するその親和性よりも少なくとも10倍低いKD値に対応する親和性を有する、所定の抗原又は細胞表面分子(受容体)に結合する。本明細書に記載されるように、本開示のキメラ抗原受容体又は対応する抗体は、HLAに提示されたMAGE-A4抗原、例えば、HLA-A2に提示されたMAGE-A4抗原に結合し得る。本開示によれば、非特異的抗原と同等かそれより10倍未満で低いKD値を有するキメラ抗原受容体又は対応する抗体の親和性は、検出不可能な結合とみなされる場合がある。
「KD」(M)という用語は、特定の抗原結合領域の解離平衡定数:抗原相互作用、又は抗原に対する対応する抗体の解離平衡定数を指す。KDと結合親和性との間には逆の関係があり、したがって、KD値が小さいほど、親和性は高い、すなわち、より強い。したがって、「より高い親和性」又は「より強い親和性」という用語は、相互作用を形成するより高い能力、つまりより小さいKD値に関し、逆に「より低い親和性」又は「より弱い親和性」という用語は、相互作用を形成するより低い能力、つまりより大きなKD値に関する。状況によっては、特定の分子(例えば、キメラ抗原受容体又は対応する抗体)のその相互作用パートナ分子(例えば抗原X)に対する結合親和性(又はKD)が、分子(例えば、キメラ抗原受容体又は対応する抗体)の別の相互作用パートナ分子(例えば、抗原Y)に対する結合親和性と比較して、より高いことは、より大きなKD値(より低い、又はより弱い親和性)をより小さなKD(より高い、又はより強い親和性)で割ることによって決定される結合比として、例えば、場合によって5倍又は10倍高い結合親和性として、表されてもよい。
「kd」(秒-1又は1/秒)という用語は、特定の抗原結合領域の解離速度定数:抗原相互作用、又はキメラ抗原受容体若しくは対応する抗体の解離速度定数を指す。その値は、koff値とも称される。
「ka」(M-1×秒-1又は1/M)という用語は、特定の抗原結合領域の対合速度定数:抗原相互作用、又はキメラ抗原受容体若しくは対応する抗体の対合速度定数を指す。
「KA」(M-1又は1/M)という用語は、特定の抗原結合領域の対合平衡定数:抗原相互作用、又はキメラ抗原受容体若しくは対応する抗体の対合平衡定数を指す。対合平衡定数は、kaをkdで割ることによって得られる。
「EC50」又は「EC50」という用語は、最大半量の有効濃度を指し、指定された曝露時間後にベースラインと最大値との間の中間で応答を誘導する抗体又はキメラ抗原受容体の濃度を含む。EC50は本質的に、その最大効果の50%が観察されるキメラ抗原受容体又は抗体(例えば、二重特異性抗体)の濃度を表す。特定の実施形態では、EC50値は、例えばFACS結合アッセイ及び/又はT細胞レポータ/抗原提示細胞(APC)生物学的検定によって決定された場合に、抗原(例えば、MAGE-A4などの腫瘍関連抗原)を発現する細胞への最大半量の結合を与える本開示のキメラ抗原受容体又は対応する抗体の濃度に等しい。したがって、低減した結合又は弱い結合は、EC50の増加、又は最大半量の有効濃度で観察される。
一実施形態では、結合の減少は、最大半量の標的細胞への結合を可能にするEC50二重特異性抗体濃度、抗原結合断片濃度、キメラ抗原受容体濃度、又は対応する抗体濃度の増加として、定義され得る。
抗体及びキメラ抗原受容体の配列変異体
本開示の抗体、抗原結合断片、及びキメラ抗原受容体は、対応する抗体の個々の抗原結合領域が由来する対応する生殖系列配列と比較して、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のフレームワーク領域(FR)及び/又は相補的決定領域(CDR)領域において、1つ以上のアミノ酸置換、挿入及び/又は欠失を含んでもよい。このような変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば、公共の抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって、容易に確認され得る。本開示の抗体、抗原結合断片、及びキメラ抗原受容体は、本明細書に開示される代表的なCDR又は可変領域アミノ酸配列のうちのいずれかに由来する抗原結合領域を含んでもよく、1つ以上のフレームワーク及び/又はCDR領域内の1つ以上のアミノ酸は、対応する抗体が由来する生殖系列配列の対応する残基(複数可)へ、又は別のヒト生殖系列配列の対応する残基(複数可)へ、又は対応する生殖系列残基(複数可)の保存的アミノ酸置換へ変異する(このような配列変化は本明細書ではまとめて、「生殖系列変異」と称される)。当業者は、本明細書に開示される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域配列から出発して、1つ以上の個々の生殖系列変異又はこれらの組み合わせを含む多くの抗体を、容易に産生し得る。特定の実施形態では、VH領域及び/又はVL領域内のフレームワーク及び/又はCDR残基は全て、抗原結合領域が本来由来した元の生殖系列配列に認められる残基へと、変異して戻る。その他の実施形態では、特定の残基のみが元の生殖系列配列へと変異し戻され、例えば、変異した残基は、FR1の最初の8つのアミノ酸内に、若しくはFR4の最後の8つのアミノ酸内に見出されるか、又は変異した残基は、CDR1、CDR2、若しくはCDR3内にのみ見出される。その他の実施形態では、フレームワーク及び/又はCDR残基(複数可)の1つ以上は、異なる生殖系列配列(すなわち、抗原結合領域が本来由来した生殖系列配列とは異なる生殖系列配列)の対応する残基(複数可)へと変異する。更に、抗原結合領域は、フレームワーク及び/又はCDR領域内に2つ以上の生殖系列変異の任意の組み合わせを含んでもよく、例えば、特定の個々の残基が、特定の生殖系列配列の対応する残基へと変異するのに対し、元の生殖系列配列とは異なる特定のその他の残基が維持されるか、又は異なる生殖系列配列の対応する残基へと変異する。
本開示の抗体、抗原結合断片、及びキメラ抗原受容体は、対応する抗体の個々の抗原結合領域が由来する対応する生殖系列配列と比較して、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のフレームワーク領域(FR)及び/又は相補的決定領域(CDR)領域において、1つ以上のアミノ酸置換、挿入及び/又は欠失を含んでもよい。このような変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば、公共の抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって、容易に確認され得る。本開示の抗体、抗原結合断片、及びキメラ抗原受容体は、本明細書に開示される代表的なCDR又は可変領域アミノ酸配列のうちのいずれかに由来する抗原結合領域を含んでもよく、1つ以上のフレームワーク及び/又はCDR領域内の1つ以上のアミノ酸は、対応する抗体が由来する生殖系列配列の対応する残基(複数可)へ、又は別のヒト生殖系列配列の対応する残基(複数可)へ、又は対応する生殖系列残基(複数可)の保存的アミノ酸置換へ変異する(このような配列変化は本明細書ではまとめて、「生殖系列変異」と称される)。当業者は、本明細書に開示される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域配列から出発して、1つ以上の個々の生殖系列変異又はこれらの組み合わせを含む多くの抗体を、容易に産生し得る。特定の実施形態では、VH領域及び/又はVL領域内のフレームワーク及び/又はCDR残基は全て、抗原結合領域が本来由来した元の生殖系列配列に認められる残基へと、変異して戻る。その他の実施形態では、特定の残基のみが元の生殖系列配列へと変異し戻され、例えば、変異した残基は、FR1の最初の8つのアミノ酸内に、若しくはFR4の最後の8つのアミノ酸内に見出されるか、又は変異した残基は、CDR1、CDR2、若しくはCDR3内にのみ見出される。その他の実施形態では、フレームワーク及び/又はCDR残基(複数可)の1つ以上は、異なる生殖系列配列(すなわち、抗原結合領域が本来由来した生殖系列配列とは異なる生殖系列配列)の対応する残基(複数可)へと変異する。更に、抗原結合領域は、フレームワーク及び/又はCDR領域内に2つ以上の生殖系列変異の任意の組み合わせを含んでもよく、例えば、特定の個々の残基が、特定の生殖系列配列の対応する残基へと変異するのに対し、元の生殖系列配列とは異なる特定のその他の残基が維持されるか、又は異なる生殖系列配列の対応する残基へと変異する。
キメラ抗原受容体及び対応する抗体の生物学的特徴
本開示は、ヒトMAGE-A4又はヒトMAGE-A4及びCD3に結合する抗体に由来する抗原結合領域を有する抗体(二重特異性抗体を含む)、抗原結合断片、及びキメラ抗原受容体(CAR)を提供する。本明細書に記載されるように、二重特異性抗体を使用して、二重特異性抗体と同様の特性を有するCARを生成し得る。したがって、本明細書に記載され、二重特異性抗体に起因する特性は、同様にCARに適用される。例えば、本開示は、実施例2に関して以下に記載されるフローサイトメトリー系のペプチドパルスアッセイによって評価されるように、2nM未満のEC50値及び1900超のS/N比でヒトMAGE-A4に結合する、抗MAGE-A4抗体を含む。別の実施例として、本開示は、実施例2のフローサイトメトリー系のペプチドパルスアッセイによって評価され、実施例3に詳述されるように、約5~300超の範囲のS/N比で1つ以上のMAGE-A4関連ペプチドに結合する、抗MAGE-A4抗体を提供する。別の実施例として、本開示は、実施例2のフローサイトメトリー系のペプチドパルスアッセイによって評価され、実施例3に詳述されるように、約5~240超の範囲のS/N比で1つ以上のMAGE-A4関連ペプチドに結合する、抗MAGE-A4×抗CD3二重特異性抗体を提供する。
本開示は、ヒトMAGE-A4又はヒトMAGE-A4及びCD3に結合する抗体に由来する抗原結合領域を有する抗体(二重特異性抗体を含む)、抗原結合断片、及びキメラ抗原受容体(CAR)を提供する。本明細書に記載されるように、二重特異性抗体を使用して、二重特異性抗体と同様の特性を有するCARを生成し得る。したがって、本明細書に記載され、二重特異性抗体に起因する特性は、同様にCARに適用される。例えば、本開示は、実施例2に関して以下に記載されるフローサイトメトリー系のペプチドパルスアッセイによって評価されるように、2nM未満のEC50値及び1900超のS/N比でヒトMAGE-A4に結合する、抗MAGE-A4抗体を含む。別の実施例として、本開示は、実施例2のフローサイトメトリー系のペプチドパルスアッセイによって評価され、実施例3に詳述されるように、約5~300超の範囲のS/N比で1つ以上のMAGE-A4関連ペプチドに結合する、抗MAGE-A4抗体を提供する。別の実施例として、本開示は、実施例2のフローサイトメトリー系のペプチドパルスアッセイによって評価され、実施例3に詳述されるように、約5~240超の範囲のS/N比で1つ以上のMAGE-A4関連ペプチドに結合する、抗MAGE-A4×抗CD3二重特異性抗体を提供する。
本開示はまた、以下の実施例4に詳述されるように、T細胞レポータ/抗原提示細胞(APC)生物学的検定において実質的な活性を示す、抗MAGE-A4×抗CD3二重特異性抗体を提供する。具体的には、本開示の抗MAGE-A4×抗CD3二重特異性抗体は、MAGE-A4及びHLA-A2を発現するAPC(例えば、IM9細胞及びU266B1細胞)の存在下で、ルシフェラーゼ発現によって測定されるように、NF-κB依存性T細胞(例えば、ジャーカット細胞)遺伝子転写/翻訳を、3.2nM未満(U266B1細胞)又は0.75nM未満のEC50値で活性化し得る。T細胞レポータ/APC生物学的検定における抗CD28抗体の包含は、以下の実施例4に詳述されるように、CD80及びCD86の内因性レベルの関数として、抗MAGE-A4×抗CD3二重特異性抗体の活性を調節し得る。
本開示はまた、以下の実施例5に詳述されるように、1つ以上のMAGE-A4関連ペプチドを用いた上記のT細胞レポータ/抗原提示細胞(APC)生物学的検定において実質的な活性を示す、抗MAGE-A4×抗CD3二重特異性抗体を提供する。具体的には、抗MAGE-A4×抗CD3二重特異性抗体は、ルシフェラーゼレポータを有するT細胞及びAOX1795-803でパルスされたT2細胞の存在下で培養された場合に、刺激されたレポータ活性に関して、ナノモル以下のEC50値(例えば、高親和性CD3アームを有する二重特異性抗体について2.10E-11M、及び中親和性CD3アームを有する二重特異性抗体について3.30E-10M)を示す。更に、抗MAGE-A4×抗CD3二重特異性抗体は、ルシフェラーゼレポータを有するT細胞及びSHTN1198-206でパルスされたT2細胞の存在下で培養された場合に、刺激されたレポータ活性に関して、ナノモルのEC50値(例えば、高親和性CD3アームを有する二重特異性抗体について1.30E-9M、及び中親和性CD3アームを有する二重特異性抗体について3.5E-9M)を示し得る。
本開示はまた、以下の実施例6に詳述されるように、腫瘍細胞(例えば、HLA-A2陽性IM9細胞を提示するMAGE-A4286-294抗原)に対して応答するT細胞(例えば、ヒトPBMCから単離されたCD8+T細胞)の方向付けを可能にする、イメージング系の多重化一次的T細胞殺滅アッセイによって評価されるような、MAGE-A4x抗CD3二重特異性抗体を提供する。具体的には、本開示の特定の抗MAGE-A4×抗CD3二重特異性抗体は、10nM未満(例えば、6.6nM)の濃度で、抗体依存性T細胞媒介性応答に起因する腫瘍細胞生存率を、50%未満(例えば、38%)まで低下させることが可能である。この生存率の低下は、腫瘍細胞がCD80及びCD86を内因的に発現する状況下で、抗MAGE-A4×抗CD3二重特異性抗体を抗CD28抗体と共培養することによって、少なくとも部分的に阻止し得るが、これは、抗CD28抗体が、CD28と、CD80及びCD86と、の相互作用を阻止することに、少なくとも部分的に起因する場合がある。
本開示はまた、以下の実施例7で詳述するように、腫瘍細胞(例えば、HLA-A2陽性IM9細胞を提示するMAGE-A4286-294抗原)の存在下で培養した場合に、サイトカイン放出を刺激することが可能な、抗MAGE-A4×抗CD3二重特異性抗体、及びT細胞(例えば、ヒトPBMCから単離されたCD8+T細胞)を提供する。具体的には、本開示は、腫瘍及びT細胞が抗MAGE-A4×抗CD3二重特異性抗体を欠く条件下でのサイトカイン放出と比較して、2倍を超えてサイトカイン放出(例えば、IL2、IFN-γ)を刺激することが可能な、抗MAGE-A4×抗CD3二重特異性抗体を提供する。
本開示はまた、FACS結合アッセイによって決定される場合、内因性MAGE-A4を発現するヒト細胞株に特異的に結合する対応する抗体に由来する抗原結合領域を有する、キメラ抗原受容体を提供する。
本開示はまた、(i)MAGE-A4を発現する細胞によって活性化される(実施例8を参照のこと)、及び/又は(ii)ヒト多発性骨髄腫又は黒色腫の異種移植片を有する免疫無防備状態のマウスにおいて腫瘍の成長の阻害を示す、MAGE-A4特異的キメラ抗原受容体を発現する、操作された細胞を提供する。
抗原結合領域の調製
特定の抗原(例えば、MAGE-A4)に特異的である、本開示の抗体(二重特異性抗体を含む)及びキメラ抗原受容体の抗原結合領域は、当該技術分野で周知の任意の抗体生成技術によって調製され得る。特定の実施形態では、本開示の対応する抗体の個々の成分(例えば、重鎖及び軽鎖)のうちの1つ以上は、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体に由来する。このような抗体を作製するための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、重鎖及び/又は軽鎖のうちの1つ以上は、VELOCIMMUNE(商標)技術を使用して調製され得る。VELOCIMMUNE(商標)技術(又は任意のその他のヒト抗体生成技術)を使用して、特定の抗原(例えば、MAGE-A4)に対する高親和性キメラ抗体が、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有して最初に単離される。抗体は、親和性、中和性、選択性、抗原決定基等を含む望ましい特徴について特徴付けられ、選択される。本明細書で考察されるように、次に、これらのヒト可変領域(又はCDR)は、キメラ抗原受容体の抗原結合領域へと組み込まれ得る。その他の実施例では、2つの異なる抗原(例えば、抗MAGE-A4及び抗CD3)を互いに対して適切に配置して、本開示の二重特異性抗原結合分子(例えば、抗体、CAR、又はいずれかの抗原結合断片)を日常的な方法によって生成し得る。特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗原結合分子の1つ以上の個々の構成要素(例えば、重鎖及び軽鎖)は、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト化抗体に由来する。
特定の抗原(例えば、MAGE-A4)に特異的である、本開示の抗体(二重特異性抗体を含む)及びキメラ抗原受容体の抗原結合領域は、当該技術分野で周知の任意の抗体生成技術によって調製され得る。特定の実施形態では、本開示の対応する抗体の個々の成分(例えば、重鎖及び軽鎖)のうちの1つ以上は、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体に由来する。このような抗体を作製するための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、重鎖及び/又は軽鎖のうちの1つ以上は、VELOCIMMUNE(商標)技術を使用して調製され得る。VELOCIMMUNE(商標)技術(又は任意のその他のヒト抗体生成技術)を使用して、特定の抗原(例えば、MAGE-A4)に対する高親和性キメラ抗体が、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有して最初に単離される。抗体は、親和性、中和性、選択性、抗原決定基等を含む望ましい特徴について特徴付けられ、選択される。本明細書で考察されるように、次に、これらのヒト可変領域(又はCDR)は、キメラ抗原受容体の抗原結合領域へと組み込まれ得る。その他の実施例では、2つの異なる抗原(例えば、抗MAGE-A4及び抗CD3)を互いに対して適切に配置して、本開示の二重特異性抗原結合分子(例えば、抗体、CAR、又はいずれかの抗原結合断片)を日常的な方法によって生成し得る。特定の実施形態では、本開示の多重特異性抗原結合分子の1つ以上の個々の構成要素(例えば、重鎖及び軽鎖)は、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト化抗体に由来する。
ポリヌクレオチド及びベクター
本開示はまた、本明細書で考察される抗体(又はその部分)及びキメラ抗原受容体をコードする、ポリヌクレオチド及びベクターを提供する。
本開示はまた、本明細書で考察される抗体(又はその部分)及びキメラ抗原受容体をコードする、ポリヌクレオチド及びベクターを提供する。
各種実施形態では、ポリヌクレオチドは、発現カセット又は発現ベクター(例えば、細菌宿主細胞に導入するためのプラスミド、又は昆虫宿主細胞の形質移入のためのバキュロウイルスベクターなどのウイルスベクター、又は哺乳動物宿主細胞の形質移入のためのレンチウイルス又はアデノ関連ウイルスなどのプラスミド又はウイルスベクター)を含んでもよい。
各種実施形態では、ポリヌクレオチド及び/又はベクターは、配列番号21のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むか、又は配列番号22のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。その他の実施形態では、ポリヌクレオチド及び/又はベクターは、配列番号104のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むか、又は配列番号105のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。各種実施形態では、ポリヌクレオチド及び/又はベクターは、配列番号1のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むか、又は配列番号2若しくは配列番号83のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。各種実施形態では、ポリヌクレオチド及び/又はベクターは、配列番号9のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むか、又は配列番号10のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。各種実施形態では、ポリヌクレオチド及び/又はベクターは、配列番号17のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むか、又は配列番号18のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。各種実施形態では、ポリヌクレオチド及び/又はベクターは、配列番号19のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むか、又は配列番号20のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。各種実施形態では、ポリヌクレオチド及び/又はベクターは、配列番号54のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むか、又は配列番号55のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。各種実施形態では、ポリヌクレオチド及び/又はベクターは、配列番号62のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むか、又は配列番号63のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。各種実施形態では、ポリヌクレオチド及び/又はベクターは、配列番号68のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むか、又は配列番号69のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。各種実施形態では、ポリヌクレオチド及び/又はベクターは、配列番号70のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むか、又は配列番号71のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。各種実施形態では、ポリヌクレオチド及び/又はベクターは、配列番号72のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むか、又は配列番号73のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。各種実施形態では、ポリヌクレオチド及び/又はベクターは、配列番号80のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むか、又は配列番号81のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。上記の配列番号に関して、ポリヌクレオチド及び/又はベクターが、1つ以上のHCDR、LCDR等の任意のその部分配列を包含することは、本開示の範囲内である。各種実施形態では、ポリヌクレオチド及び/又はベクターは、配列番号27、配列番号28、配列番号29、又は配列番号30のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞を操作する方法
本開示は、免疫療法のための免疫細胞を調製する方法を提供し、生体外で、このような免疫細胞に、本明細書に記載されるMAGE-A4特異的キメラ抗原受容体のうちの1つをコードするポリヌクレオチド又はベクターを導入することを含む。このような免疫細胞は、自己由来又は同種異系であり得る。
本開示は、免疫療法のための免疫細胞を調製する方法を提供し、生体外で、このような免疫細胞に、本明細書に記載されるMAGE-A4特異的キメラ抗原受容体のうちの1つをコードするポリヌクレオチド又はベクターを導入することを含む。このような免疫細胞は、自己由来又は同種異系であり得る。
本開示は、本明細書で考察されるMAGE-A4特異的キメラ抗原受容体のうちの1つをコードするポリヌクレオチド又はレンチウイルスベクターを含む、免疫細胞を提供する。いくつかの実施形態では、これらの免疫細胞は、免疫療法(例えば、癌の治療)のために使用される。
本開示は、免疫細胞を同種異系移植により適したものにするために、それらを遺伝子修飾する方法を提供する。第1の態様によれば、例えば、PCT国際公開特許第2013/176915号に記載されているように、T細胞受容体(TCR)の1つ以上の成分を発現する少なくとも1つの遺伝子を不活性化することによって免疫細胞を同種異系にし得るが、これは、HLA又はβ2mタンパク質の発現をコード又は調節する遺伝子の不活化と組み合わされ得る。したがって、移植片対宿主症候群及び移植片拒絶のリスクは、顕著に減少する。本開示の更なる態様によれば、免疫細胞を更に操作して、PD1又はCTLA-4などのT細胞活性化の調節因子として作用する「免疫チェックポイント」として作用するタンパク質をコードする遺伝子を不活性化することによって、それらをより活性にするか、又は消耗を制限し得る。
操作された免疫細胞
本開示はまた、本明細書に記載されるキメラ抗原受容体を含む免疫細胞(例えば、操作された免疫細胞)を提供する。場合によっては、免疫細胞は、免疫エフェクタ細胞である。場合によっては、免疫細胞は、T細胞である。場合によっては、免疫細胞は、炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、調節性Tリンパ球、又はヘルパーTリンパ球から選択されるTリンパ球である。場合によっては、免疫細胞は、CD8+細胞傷害性Tリンパ球である。
本開示はまた、本明細書に記載されるキメラ抗原受容体を含む免疫細胞(例えば、操作された免疫細胞)を提供する。場合によっては、免疫細胞は、免疫エフェクタ細胞である。場合によっては、免疫細胞は、T細胞である。場合によっては、免疫細胞は、炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、調節性Tリンパ球、又はヘルパーTリンパ球から選択されるTリンパ球である。場合によっては、免疫細胞は、CD8+細胞傷害性Tリンパ球である。
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、N末端からC末端に向かって、(a)軽鎖可変領域(LCVR)及び重鎖可変領域(HCVR)を含む抗MAGE-A4単鎖可変断片(scFv)領域を含む細胞外リガンド結合領域と、(b)ヒンジと、(c)膜貫通領域と、(d)共刺激領域及びシグナル伝達領域を含む細胞質領域と、を含む、キメラ抗原受容体を含む、ヒトT細胞である。
いくつかの実施形態では、操作されたヒトT細胞のscFv領域は、配列番号2/10のアミノ酸配列を含むHCVR/LCVRアミノ酸配列対を含む。場合によっては、ヒンジは、配列番号27のアミノ酸配列を含む。場合によっては、膜貫通領域は、配列番号28のアミノ酸配列を含む。場合によっては、共刺激領域は、4-1BB共刺激領域である。場合によっては、4-1BB共刺激領域は、配列番号29のアミノ酸配列を含む。場合によっては、シグナル伝達領域は、CD3ゼータシグナル伝達領域である。場合によっては、CD3ゼータシグナル伝達領域は、配列番号30のアミノ酸配列を含む。
各種実施形態では、操作されたヒトT細胞は、配列番号22のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む。各種実施形態では、操作されたヒトT細胞は、配列番号105のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む。
生物学的等価物
本開示は、抗体及びキメラ抗原受容体、並びにキメラ抗原受容体を発現する操作された細胞を提供し、それらは、本明細書に開示される代表的な分子のものとは異なるが、MAGE-A4(及び二重特異性抗体の場合はCD3)に結合する能力を保持するか、MAGE-A4を発現する細胞の存在下でキメラ抗原受容体を発現する免疫細胞を活性化するか、又はMAGE-A4を発現する腫瘍細胞の成長又は増殖を抑制する、アミノ酸配列を有する。このような変異体分子は、親配列と比較した場合、1つ以上のアミノ酸の付加、欠失、又は置換を含んでもよいが、記載された抗原結合分子の生物学的活性と本質的に同等である生物学的活性を示す。
本開示は、抗体及びキメラ抗原受容体、並びにキメラ抗原受容体を発現する操作された細胞を提供し、それらは、本明細書に開示される代表的な分子のものとは異なるが、MAGE-A4(及び二重特異性抗体の場合はCD3)に結合する能力を保持するか、MAGE-A4を発現する細胞の存在下でキメラ抗原受容体を発現する免疫細胞を活性化するか、又はMAGE-A4を発現する腫瘍細胞の成長又は増殖を抑制する、アミノ酸配列を有する。このような変異体分子は、親配列と比較した場合、1つ以上のアミノ酸の付加、欠失、又は置換を含んでもよいが、記載された抗原結合分子の生物学的活性と本質的に同等である生物学的活性を示す。
一実施形態では、本開示のキメラ抗原受容体を発現する2つの操作された免疫細胞、又は本開示の2種の抗原結合タンパク質は、それらの安全性、純度、及び効力に臨床的に意味のある差異がない場合、生物学的に等価である。
一実施形態では、2つの操作された免疫細胞又は2種の抗原結合タンパク質は、免疫原性の臨床的に有意な変化又は有効性の減退を含む有害作用のリスクの予測される上昇なしで基準生成物と生物学的生成物との間での切り替えなしで持続される療法と比較して、患者が1回以上切り替えられ得る場合に、生物学的に等価である。
一実施形態では、2つの操作された免疫細胞、又は2種の抗原結合タンパク質は、これらが両方とも、条件又は使用条件についての共通の機序又は作用機序によって、このような機序が周知である程度まで作用する場合、生物学的に等価である。
一実施形態では、2つの抗原結合タンパク質、又は抗体は、例えば、それらが類似の実験条件下で単回用量又は複数回用量のいずれかで同じモル用量で投与された場合に、吸収速度及び吸収の程度が有意差を示さない医薬的等価物又は医薬的選択肢である場合、生物学的等価物とみなされる。これらの吸収の程度は等価であるが吸収速度は等価ではなく、吸収速度におけるこのような差が意図的で、かつ標識に反映されており、例えば長期使用に及ぼす有効な身体薬剤濃度の達成に必須ではなく、試験した特定の薬剤製品にとって医学的に有意ではないとみなされるため、生物学的に等価とみなされ得る場合、いくつかの抗原結合タンパク質は、等価物又は薬学的選択肢とみなされるであろう。
生物学的等価性は、生体内及び生体外の方法によって実証されてもよい。生物学的等価性尺度には、例えば、(a)操作された細胞の濃度が、血液、血漿、血清、又はその他の生物学的流体において時間の関数として測定される、ヒト又はその他の哺乳動物における生体内試験、(b)ヒト生体内生物学的利用能データと相関しており、かつ合理的に予測的な生体外試験、(c)操作された細胞(又はその標的)の適切な急性薬理効果を時間の関数として測定する、ヒト又はその他の哺乳動物における生体内試験、及び(d)操作された細胞の安全性、有効性、又は生物学的利用能若しくは生物学的等価性を確立する十分に制御された臨床試験が含まれる。
本明細書に記載の代表的な操作された細胞の生物学的に等価な変異体は、例えば、残基若しくは配列の様々な置換を生じること、又は生物活性に必要とされない末端若しくは内部の残基若しくは配列を欠失することによって構築されてもよい。
本明細書に示す代表的な二重特異性抗原結合分子の生物学的に等価な変異体は、例えば、残基若しくは配列の様々な置換を生じること、又は生物活性に必要とされない末端若しくは内部の残基若しくは配列を欠失することによって、構築されてもよい。例えば、生物学的活性にとって必須ではないシステイン残基は、再生の際の不必要又は不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するために、欠失又はその他のアミノ酸で置換され得る。その他の文脈において、生物学的に等価な抗原結合タンパク質は、分子のグリコシル化特性を修飾するアミノ酸変化、例えば、グリコシル化を排除又は除去する変異を含む、本明細書に記載される代表的な二重特異性抗原結合分子の変異体を含んでもよい。
種の選択性及び種の交差反応性
本開示の特定の実施形態によれば、ヒトMAGE-A4に結合するがその他の種由来のMAGE-A4には結合しない抗原結合領域が提供される。また、ヒトAOX1には結合するが、その他の種由来のAOX1には結合しない、抗MAGE-A4抗原結合領域も提供される。また、ヒトSHTN1には結合するが、その他の種由来のSHTN1には結合しない、抗MAGE-A4抗原結合領域も提供される。本開示はまた、ヒトMAGE-A4及び1つ以上の非ヒト種由来のMAGE-A4に結合する抗原結合領域を提供する。本開示はまた、ヒトAOX1及び1つ以上の非ヒト種由来のAOX1に結合する抗MAGE-A4抗原結合領域を提供する。本開示はまた、ヒトSHTN1及びその他の種由来のSHTN1に結合する抗MAGE-A4抗原結合領域を提供する。いくつかの実施形態では、本開示の抗原結合領域は、MAGE-A4 286-294、並びにAOX1 795-803、及び/又はSHTN1 198-206に結合する。いくつかの実施形態では、抗原結合領域が結合するMAGE-A4及び/又はAOX1及び/又はSHTN1(例えば、MAGE-A4 286-294又はAOX1795-803又はSHTN1 198-206)は、HLA、例えば、HLA-A2によって細胞の表面上に提示される。
本開示の特定の実施形態によれば、ヒトMAGE-A4に結合するがその他の種由来のMAGE-A4には結合しない抗原結合領域が提供される。また、ヒトAOX1には結合するが、その他の種由来のAOX1には結合しない、抗MAGE-A4抗原結合領域も提供される。また、ヒトSHTN1には結合するが、その他の種由来のSHTN1には結合しない、抗MAGE-A4抗原結合領域も提供される。本開示はまた、ヒトMAGE-A4及び1つ以上の非ヒト種由来のMAGE-A4に結合する抗原結合領域を提供する。本開示はまた、ヒトAOX1及び1つ以上の非ヒト種由来のAOX1に結合する抗MAGE-A4抗原結合領域を提供する。本開示はまた、ヒトSHTN1及びその他の種由来のSHTN1に結合する抗MAGE-A4抗原結合領域を提供する。いくつかの実施形態では、本開示の抗原結合領域は、MAGE-A4 286-294、並びにAOX1 795-803、及び/又はSHTN1 198-206に結合する。いくつかの実施形態では、抗原結合領域が結合するMAGE-A4及び/又はAOX1及び/又はSHTN1(例えば、MAGE-A4 286-294又はAOX1795-803又はSHTN1 198-206)は、HLA、例えば、HLA-A2によって細胞の表面上に提示される。
本開示の特定の代表的な実施形態によると、ヒトMAGE-A4及び/又はMAGE-A4関連ペプチドに結合し、場合によっては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザル若しくはチンパンジーMAGE-A4及び/又はMAGE-A4関連ペプチドのうちの1つ以上に結合し得るか、又は結合し得ない抗原結合領域が提供される。更に、MAGE-A4及び/又はMAGE-A4関連ペプチドへの結合は、HLA提示MAGE-A4などのMHC提示MAGE-A4(又はMAGE-A4関連ペプチド)との関連であり得る。代表的なHLAに提示されたMAGE-A4は、HLA-A2が結合したヒトMAGE-A4である。
操作された免疫細胞の活性化及び増殖
操作された細胞(例えば、T細胞)の遺伝子修飾の前であろうと後であろうと、本開示の遺伝子修飾された免疫細胞が活性化され、抗原結合メカニズムとは無関係に増殖する場合でも、免疫細胞、特に本開示のT細胞を、一般に、例えば、米国特許第6,352,694号、同第6,534,055号、同第6,905,680号、同第6,692,964号、同第5,858,358号、同第6,887,466号、同第6,905,681号、同第7,144,575号、同第7,067,318号、同第7,172,869号、同第7,232,566号、同第7,175,843号、同第5,883,223号、同第6,905,874号、同第6,797,514号、同第6,867,041号、及び米国特許出願公開第2006/0121005号に記載の方法を使用して、更に活性化及び増殖させ得る。生体外又は生体内で、T細胞を増殖させ得る。
操作された細胞(例えば、T細胞)の遺伝子修飾の前であろうと後であろうと、本開示の遺伝子修飾された免疫細胞が活性化され、抗原結合メカニズムとは無関係に増殖する場合でも、免疫細胞、特に本開示のT細胞を、一般に、例えば、米国特許第6,352,694号、同第6,534,055号、同第6,905,680号、同第6,692,964号、同第5,858,358号、同第6,887,466号、同第6,905,681号、同第7,144,575号、同第7,067,318号、同第7,172,869号、同第7,232,566号、同第7,175,843号、同第5,883,223号、同第6,905,874号、同第6,797,514号、同第6,867,041号、及び米国特許出願公開第2006/0121005号に記載の方法を使用して、更に活性化及び増殖させ得る。生体外又は生体内で、T細胞を増殖させ得る。
一般に、本開示のT細胞は、CD3 TCR複合体及びT細胞の表面上の共刺激分子を刺激する薬剤との接触によって増殖し、T細胞の活性化シグナルを生成し得る。例えば、カルシウムイオノフォアA23187、ホルボール12-ミリステート13-アセテート(Phorbol12-Myristate13-Aacetate、PMA)、又は有糸分裂レクチン様フィトヘマグルチニン(phytohemagglutinin、PHA)などの化学物質を使用して、T細胞の活性化シグナルを生成し得る。
非限定的な実施例として、T細胞集団は、抗CD3抗体若しくはその抗原結合断片、又は表面に固定化された抗CD2抗体との接触によって、又はカルシウムイオノフォアと組み合わせたプロテインキナーゼC活性化因子(例えば、ブリオスタチン)との接触によってなど、生体外で刺激されてもよい。T細胞の表面のアクセサリ分子の共刺激については、アクセサリ分子に結合するリガンドが使用される。例えば、T細胞集団を、T細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で、抗CD3抗体及び抗CD28抗体と接触させ得る。T細胞培養に適した条件には、血清(例えば、ウシ胎児又はヒト血清)、インターロイキン-2(IL-2)、インスリン、IFN-g、1L-4、1L-7、GM-CSF、IL-10、IL-2、1L-15、TGFp、及びTNF-αを含む増殖及び生存に必要な因子、又は当業者に周知の細胞の成長のための任意のその他の添加剤を含み得る適切な培地(例えば、最小必須培地又はRPMI培地1640、又はX-vivo5、(Lonza))を含む。細胞の成長のためのその他の添加剤は、界面活性剤、プラスマネート、並びにN-アセチル-システイン及び2-メルカプトエタノールなどの還元剤を含むが、これらに限定されない。培地は、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、及びビタミンが添加され、無血清で、又は、適切な量の血清(若しくは血漿)若しくは定義されたホルモンのセット、及び/若しくはT細胞の成長及び増殖に十分な量のサイトカインを補充した、RPMI1640、A1M-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo1、X-Vivo20、Optimizerを含み得る。ペニシリン及びストレプトマイシンなどの抗生物質は、実験培養においてのみ含まれ、対象に注入される細胞の培養には含まれない。標的細胞は、成長を支持するのに必要な条件下、例えば、適切な温度(例えば、37℃)及び雰囲気(例えば、空気に加えて5%O2)で維持される。様々な刺激時間に曝露されたT細胞は、様々な特徴を示す可能性がある。
いくつかの実施形態では、組織又は細胞と共培養することによって、細胞を増殖させ得る。細胞はまた、例えば、該細胞を対象に投与した後、対象の血液中で生体内で増殖され得る。
治療製剤及び投与
本明細書で使用される場合、「有効量」及び「治療有効量」という用語は、毒性、刺激、又はアレルギー反応などの過度の有害な副作用を伴わずに所望の治療応答をもたらすのに十分な活性治療薬の量を指す。具体的な「有効量」は、明らかに、治療される特定の状態、患者の身体的状態、治療される動物の種類、治療の期間、併用療法(もしあれば)の性質、並びに用いられる具体的な製剤及び化合物又はその誘導体の構造などの因子によって、変化する。この場合、ある量は、限定されないが、以下のうちの1つ以上をもたらした場合、治療的に有効であると考えられる:(a)腫瘍増殖(例えば、MAGE-A4を発現する癌)の阻害、(b)MAGE-A4を発現する癌の拮抗又は安定化。
本明細書で使用される場合、「有効量」及び「治療有効量」という用語は、毒性、刺激、又はアレルギー反応などの過度の有害な副作用を伴わずに所望の治療応答をもたらすのに十分な活性治療薬の量を指す。具体的な「有効量」は、明らかに、治療される特定の状態、患者の身体的状態、治療される動物の種類、治療の期間、併用療法(もしあれば)の性質、並びに用いられる具体的な製剤及び化合物又はその誘導体の構造などの因子によって、変化する。この場合、ある量は、限定されないが、以下のうちの1つ以上をもたらした場合、治療的に有効であると考えられる:(a)腫瘍増殖(例えば、MAGE-A4を発現する癌)の阻害、(b)MAGE-A4を発現する癌の拮抗又は安定化。
患者に投与される抗原結合分子の用量は、患者の年齢及び大きさ、標的疾患、病態、投与経路などに応じて変動する場合がある。好ましい用量は、典型的には、体重又は体表面積に従って計算される。本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子が成人患者の治療目的に使用される場合、本発明の二重特異性抗原結合分子を通常約0.01~約20mg/kg体重の単回投与で、より好ましくは約0.02~約7、約0.03~約5、又は約0.05~約3mg/kg体重の単回投与で静脈内投与することが有利である場合がある。容態の重篤度に応じて、治療の頻度及び期間を調整し得る。二重特異性抗原結合分子を投与するための有効投薬量及びスケジュールは、経験的に決定されてもよい。例えば、患者の進行は、定期的な評価によってモニタリングされ得、それに応じて用量が調整される。更に、投与量の種間スケーリングは、当該技術分野において周知の方法を用いて実施され得る(例えば、MMordenti et al.,1991,Pharmaceut.Res.8:1351)。
種々の送達系が既知であり、本発明の医薬組成物を投与するために使用することができ、例えば、リポソーム封入、マイクロパーティクル、マイクロカプセル、変異ウイルスを発現することができる組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシスである(例えば、Wu et al.,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432を参照のこと)。導入方法には、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路及び経口経路が含まれるが、これらに限定されない。組成物は、例えば、注入若しくはボーラス注射による、上皮又は粘膜皮膚の内層(lining)(例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など)を介した吸収による任意の好都合な経路によって投与されてもよく、その他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与されてもよい。投与は、全身又は局所であり得る。
本発明の薬学的組成物は、標準的な針及び注射器を用いて、皮下に又は静脈内に送達され得る。なお、皮下送達に関して、ペン型送達デバイスは、本発明の薬学的組成物を送達する際の適用を容易にする。このようなペン型送達デバイスは、再利用可能又は使い捨て可能であり得る。再利用可能なペン型送達デバイスは、一般に、薬学的組成物を含む交換可能なカートリッジを利用する。一度、カートリッジ内の薬学的組成物が全て投与され、カートリッジが空になると、この空のカートリッジは容易に廃棄することができ、薬学的組成物を含む新しいカートリッジと容易に交換することができる。次に、ペン型送達デバイスは再利用することができる。使い捨てのペン型送達デバイスにおいて、交換可能なカートリッジは存在しない。むしろ、使い捨てペン型送達デバイスは、このデバイス内の貯蔵器の中に保持された薬学的組成物が事前に充填されている。貯蔵器から薬学的組成物が空になると、デバイス全体が廃棄される。
数多くの再利用可能なペン型送達デバイス及び自動注射送達デバイスは、本発明の薬学的組成物の皮下送達の用途を有する。例としては、AUTOPEN(商標)(オーウェン・マンフォード社製,ウッドストック,イギリス)、DISETRONIC(商標)ペン(Disetronic Medical Systems社製,バーグドルフ,スイス)、HUMALOG MIX 75/25(商標)ペン、HUMALOG(商標)ペン、HUMALIN 70/30(商標)ペン(イーライリリー・アンド・カンパニー社製,インディアナポリス,インディアナ州)、NOVOPEN(商標)I、II及びIII(ノボ・ノルディスク社製,コペンハーゲン,デンマーク)、NOVOPEN JUNIOR(商標)(ノボ・ノルディスク社製,コペンハーゲン,デンマーク)、BD(商標)ペン(ベクトン・ディッキンソン社製,フランクリン・レイクス,ニュージャージー州)、OPTIPEN(商標)、OPTIPEN PRO(商標)、OPTIPEN STARLET(商標)、及びOPTICLIK(商標)(サノフィ・アベンティス社製,フランクフルト,ドイツ)が挙げられるが、これらに限定されず、ほんの数種類しか挙げていない。本発明の薬学的組成物の皮下送達での用途を有する使い捨て可能なペン型送達デバイスの例としては、SOLOSTAR(商標)ペン(サノフィ・アベンティス社製)、FLEXPEN(商標)(ノボ・ノルディスク社製)、及びKWIKPEN(商標)(イーライリリー社製)、SURECLICK(商標)自動注射器(アムジェン社製,サウザンドオークス,カリフォルニア州)、PENLET(商標)(ハーゼルマイヤー社製,シュトゥットガルト,ドイツ)、EPIPEN(Dey,L.P.社製)及びHUMIRA(商標)ペン(アボット・ラボラトリーズ社製,アボット・パーク Ill)が挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の状況において、薬学的組成物は、徐放系で送達され得る。一実施形態では、ポンプを使用してもよい(Langer、上記、Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201を参照のこと)。別の実施形態では、ポリマー材料を使用し得る。Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(eds.),1974,CRC Pres.,Boca Raton,Fla.を参照のこと。更に別の実施形態では、徐放系を組成物の標的の近傍に配置し得、それによって、全身用量のほんの一部のみが必要となる(例えば、GGoodson,1984,in Medical Applications of Controlled Release,supra,vol.2,pp.115-138を参照のこと)。その他の徐放系は、Langer,1990,Science249:1527-1533による総説で考察されている。
注射可能な調製物には、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、及び筋肉内注射、点滴注入などのための剤形が含まれてもよい。これらの注射可能な調製物は、周知の方法によって調製されてもよい。
有益なことに、上記に記載される経口又は非経口での使用のための薬学的組成物は、有効成分の用量に適合するために好適な単位用量の剤形へと調製される。このような単位用量の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤(アンプル)、坐剤等が挙げられる。含有される上記抗体の量は、一般に、単位用量の剤形当たり約5~約500mgであり、特に注射剤の形態では、抗体は、約5~約100mg、その他の剤形では、約10~約250mg含有されることが好ましい。
本開示による細胞又は細胞集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸液、埋め込み、又は移植を含む、任意の便利な様式で実施されてもよい。本明細書に記載される組成物は、患者に、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内若しくはリンパ内注射によって、又は腹腔内に投与されてもよい。一実施形態では、本開示の細胞組成物は、好ましくは、静脈内注射によって投与される。
細胞又は細胞集団の投与は、体重kg当たり104~109細胞、好ましくは、105~106細胞/kg体重の投与からなり得、これらの範囲内の細胞数の全ての整数値を含む。細胞又は細胞集団は、1つ以上の用量で投与され得る。いくつかの実施形態では、有効量の細胞は、単回投与として投与される。いくつかの実施形態では、有効量の細胞は、ある期間にわたって2回以上の用量として投与される。投与のタイミングは、主治医の判断の範囲内であり、患者の臨床状態に依存する。細胞又は細胞集団は、血液バンク又はドナーなどの任意の供給源から得られてもよい。個々のニーズは異なるが、特定の疾患又は状態についての所与の細胞型の有効量の範囲の決定は、当業者の範囲内である。有効量は、治療的又は予防的利益をもたらす量を意味する。投与される投薬量は、受容者の年齢、健康及び体重、同時治療の種類、もしあれば、治療の頻度、及び望まれる効果の性質に依存するであろう。
一実施形態では、有効量の細胞又はそれらの細胞を含む組成物は、非経口で投与される。この投与は、静脈内投与であり得る。場合によっては、投与は、腫瘍内への注射によって直接行われ得る。
本開示の特定の実施形態では、細胞は、抗ウイルス療法、シドフォビル及びインターロイキン-2、シタラビン(ARA-Cとしても知られる)、又はMS患者に対するナタリズマブ治療、又は乾癬患者に対するエファリズチマブ治療、又はPML患者に対するその他の治療などの薬剤での治療を含むがこれらに限定されない、任意の数の関連する治療法と併せて(例えば、前に、同時に又は後に)患者に投与される。更なる実施形態では、本開示のT細胞は、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノーレート、及びFK506などの免疫抑制剤、抗体、又はCAMPATH、抗CD3抗体などのその他の免疫除去剤、又はその他の抗体療法、サイトキシン、フルダリビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、サイトカイン、及び照射と組み合わせて使用されてもよい。
更なる実施形態では、本開示の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法剤、外部ビーム放射線療法(external-beam radiation therapy、XRT)、シクロホスファミド、又はOKT3若しくはCAMPATHなどの抗体のいずれかを使用したT細胞除去療法と併せて(例えば、前に、同時に又は後に)患者に投与される。別の実施形態では、本開示の細胞組成物は、CD20と反応する薬剤、例えばRituxanなどのB細胞除去療法の後に投与される。例えば、一実施形態では、対象は、高用量化学療法とそれに続く末梢血幹細胞移植による標準的な治療を受けてもよい。特定の実施形態では、移植に続いて、対象は、本開示の増殖された免疫細胞の注入を受ける。追加の実施形態では、増殖した細胞は、手術の前又は後に投与される。特定の実施形態では、任意の手段(例えば、外科手術、化学療法、又は放射線療法)を使用して、本開示の増殖された免疫細胞の投与前に腫瘍負荷を減少させる場合がある。一実施形態では、本開示の操作された細胞の投与前に腫瘍負荷を低減することにより、CAR T細胞療法に関連し得る副作用であるサイトカイン放出症候群又はサイトカインストームの可能性を減少又はそれらを防止し得る。
治療への応用
本開示は、本開示のキメラ抗原受容体を発現する操作された細胞(例えば、T細胞)及び薬学的に許容される媒体を含む組成物を提供する。本開示はまた、抗体又はその抗原結合断片、及び薬学的に許容される媒体を含む組成物を提供する。場合によっては、操作された細胞、抗体、又は抗原結合断片は、特に免疫療法用の薬剤を形成する。場合によっては、操作された細胞、抗体、又は抗原結合断片は、癌(例えば、多発性骨髄腫又は黒色腫)の治療に使用される。場合によっては、操作された細胞、抗体、又は抗原結合断片は、免疫療法及び/又は癌(例えば、MAGE-A4を発現する癌)の治療用の薬剤の製造に使用される。
本開示は、本開示のキメラ抗原受容体を発現する操作された細胞(例えば、T細胞)及び薬学的に許容される媒体を含む組成物を提供する。本開示はまた、抗体又はその抗原結合断片、及び薬学的に許容される媒体を含む組成物を提供する。場合によっては、操作された細胞、抗体、又は抗原結合断片は、特に免疫療法用の薬剤を形成する。場合によっては、操作された細胞、抗体、又は抗原結合断片は、癌(例えば、多発性骨髄腫又は黒色腫)の治療に使用される。場合によっては、操作された細胞、抗体、又は抗原結合断片は、免疫療法及び/又は癌(例えば、MAGE-A4を発現する癌)の治療用の薬剤の製造に使用される。
本開示は、抗体(例えば、二重特異性抗体)、若しくはその抗原結合断片、及び/又はキメラ抗原受容体を発現する本明細書で考察される操作された細胞(例えば、T細胞)を含む治療用組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を、提供する。治療用組成物は、本明細書に開示される任意のキメラ抗原受容体を発現する細胞と、薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤又は媒体と、を含み得る。追加的又は代替的な実施例では、治療用組成物は、本明細書で考察される抗体及び/又は抗原結合性断片を含む。本明細書で使用される場合、「それを必要とする対象」という表現は、癌の1つ以上の症状又は徴候を示すヒト又は非ヒト動物(例えば、MAGE-A4を発現する腫瘍を有する対象又は本明細書に記載される癌のうちのいずれかに罹患している対象)、又はそうでなければMAGE-A4活性の阻害若しくは減少若しくはMAGE-A4+細胞の枯渇から利益を得るであろう者を意味する。
本開示の操作された細胞、並びに/又は抗体、及び抗原結合断片は、とりわけ、免疫応答の刺激、活性化、及び/又は標的化が有益である任意の疾患若しくは障害を治療するために、有用であり得る。特に、本開示の操作された細胞、並びに/又は抗体、及び抗原結合断片は、MAGE-A4の発現若しくは活性、又はMAGE-A4+細胞の増殖に関連するか又はそれによって媒介される任意の疾患又は障害の治療、予防、及び/又は改善のために使用されてもよい。本開示の操作された細胞、並びに/又は抗体、及び抗原結合断片を使用して阻害又は死滅させ得るMAGE-A4を発現する細胞は、例えば、多発性骨髄腫細胞、黒色腫細胞、又はその他の固形腫瘍細胞を含む。
本開示の操作された細胞、並びに/又は抗体、及び抗原結合断片は、例えば、多発性骨髄腫、滑膜肉腫、食道癌、頭頸部癌、肺癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌、胃癌、子宮頸癌、乳癌、及び黒色腫を含むがこれらに限定されない癌を含む、MAGE-A4発現に関連する疾患又は障害を治療するために、使用されてもよい。本開示の操作された細胞、並びに/又は抗体、及び抗原結合断片は、一般に、MAGE-A4を発現する腫瘍を治療するために使用されてもよい。本開示のその他の関連する実施形態によれば、本明細書に開示される操作された細胞、並びに/又は抗体、及び抗原結合断片を、上記の癌からの腫瘍を含む、MAGE-A4を発現する腫瘍に罹患している患者に投与することを含む方法が、提供される。腫瘍スキャニングなどの当該技術分野において周知の分析的方法/診断的方法を使用して、患者がこのような腫瘍、疾患、又は状態を抱えているかどうかを確認してもよい。
本開示はまた、対象における残存癌を治療するための方法を提供する。本明細書で使用される場合、「残存癌」という用語は、抗癌療法による治療後の対象における1つ以上の癌性細胞の存在又は持続を意味する。
特定の態様によれば、本開示は、対象が疾患又は傷害を有すると決定された後、本明細書の他所に記載の操作された細胞集団、並びに/又は抗体、及び抗原結合断片を対象に投与することを含む、MAGE-A4発現に関連する疾患又は障害(例えば、癌)を治療するための方法を提供する。例えば、本開示は、対象がその他の免疫療法又は化学療法を受けてから1日、2日、3日、4日、5日、6日、1週間、2週間、3週間、又は4週間、2カ月、4カ月、6カ月、8カ月、1年、又はそれ以上後に、操作された免疫細胞を患者に投与することを含む、疾患又は障害を治療するための方法を提供する。
本明細書で考察される治療は、改善、治癒、又は予防的であり得る。治療は、自家免疫療法の一部又は同種異系免疫療法の一部のいずれかであってもよい。自家によるとは、患者の治療のために使用される細胞、細胞株、又は細胞集団が、患者又はヒト白血球抗原(HLA)適合ドナーに由来することを意味する。同種異系によるとは、患者の治療のために使用される細胞、細胞株、又は細胞集団が、患者ではなくドナーに由来することを意味する。
開示された方法で使用され得る細胞は、本明細書に記載されている。治療は、MAGE-A4を発現する細胞、特にMAGE-A4を発現する細胞の過剰によって特徴付けられる前悪性又は悪性の癌状態と診断された患者を治療するために使用され得る。このような状態は、癌において見出され得る。
本開示の操作された細胞、抗体、及び抗原結合断片で治療される癌の種類は、多発性骨髄腫、滑膜肉腫、食道癌、頭頸部癌、肺癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌、胃癌、子宮頸癌、乳癌、及び黒色腫を含むが、これらに限定されない。
本開示の組成物及び方法は、MAGE-A4を発現する細胞又は組織を有すると特徴付けられた、又はMAGE-A4を発現する細胞又は組織を有することが疑われる対象を治療するために使用されてもよい。例えば、本開示による治療から利益を得る対象は、多発性骨髄腫、滑膜肉腫、食道癌、頭頸部癌、肺癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌、胃癌、子宮頸癌、乳癌、又は黒色腫を有する対象を含む。
併用療法
本開示は、1種以上の追加の治療薬と組み合わせて、抗体及び/又は抗原結合断片(例えば、二重特異性抗体)、及び/又は本明細書に記載されるキメラ抗原受容体のうちのいずれかを含む操作された細胞若しくは細胞の集団を投与することを含む方法を、提供する。本開示の抗体/抗原結合断片細胞、及び/又は細胞若しくは細胞集団と組み合わせてもよい、又は組み合わせて投与されてもよい代表的な追加の治療薬は、例えば、抗腫瘍剤(例えば、メルファラン、ビンクリスチン(オンコビン)、シクロホスファミド(シトキサン)、エトポシド(VP-16)、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、リポソームドキソルビシン(ドキシル)、オベンダムスチン(トレアンダ)を含む化学療法剤、又は対象における形質細胞腫瘍の治療に有効であることが周知である任意のその他のもの)を含む。いくつかの実施形態では、第2の治療薬は、ステロイドを含む。いくつかの実施形態では、第2の治療薬は、サリドマイド、レナリドミド、及びボルテゾミブを含む標的療法を含むが、これらは、新たに診断された患者を治療するために承認された療法である。例えば、レナリドミド、ポマリドミド、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、パノビノスタット、イキサゾミブ、エロツズマブ、及びダラツムマブは、再発性骨髄腫を治療するために有効な第2の治療薬の例である。特定の実施形態では、第2の治療薬は、放射線療法又は幹細胞移植を含むレジメンである。特定の実施形態では、第2の治療薬は、免疫調節剤であってもよい。特定の実施形態では、第2の治療薬は、ボルテゾミブ(Velcade(登録商標))、カルフィルゾミブ(Kyprolis(登録商標))、イキサゾミブ(Ninlaro(登録商標))を含むプロテアソーム阻害剤であってもよい。特定の実施形態では、第2の治療薬は、パノビノスタット(Farydak(登録商標))などのヒストンデアセチラーゼ阻害剤であってもよい。特定の実施形態では、第2の治療薬は、モノクローナル抗体、抗体薬物共役体、抗腫瘍剤に共役し得るか又は共役し得ない二重特異性抗体、チェックポイント阻害剤、又はそれらの組み合わせであってもよい。本開示の抗原結合分子と組み合わせて有益に投与され得るその他の薬剤は、小分子サイトカイン阻害剤及びIL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18などのサイトカイン、又はそれらのそれぞれの受容体に結合する抗体を含むサイトカイン阻害剤を含む。本開示の医薬組成物(例えば、本明細書に開示される操作された細胞又は細胞集団を含む医薬組成物)はまた、形質細胞表面上の異なる抗原と相互作用し得る本明細書に記載されるもの以外のモノクローナル抗体、腫瘍細胞表面上の抗原に結合する一方のアーム及びT細胞上の抗原に結合する他方のアームを有する二重特異性抗体、抗体薬物コンジュゲート、抗腫瘍剤と共役した二重特異性抗体、チェックポイント阻害剤、例えば、PD-1又はCTLA-4を標的とするもの、又はそれらの組み合わせ、から選択される1つ以上の治療的組み合わせを含む治療レジメンの一部として投与されてもよい。特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ペムブロリズマブ(Keytruda(登録商標))、ニボルマブ(Opdivo(登録商標))、又はセミプリマブ(Libtayo(登録商標))などのPD-1阻害剤から選択されてもよい。特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ(Tecentriq(登録商標))、アベルマブ(Bavencio(登録商標))、又はデュルバルマブ(Imfinzi(登録商標))などのPD-L1阻害剤から選択されてもよい。特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、イピリムマブ(Yervoy(登録商標))などのCTLA-4阻害剤から選択されてもよい。
本開示は、1種以上の追加の治療薬と組み合わせて、抗体及び/又は抗原結合断片(例えば、二重特異性抗体)、及び/又は本明細書に記載されるキメラ抗原受容体のうちのいずれかを含む操作された細胞若しくは細胞の集団を投与することを含む方法を、提供する。本開示の抗体/抗原結合断片細胞、及び/又は細胞若しくは細胞集団と組み合わせてもよい、又は組み合わせて投与されてもよい代表的な追加の治療薬は、例えば、抗腫瘍剤(例えば、メルファラン、ビンクリスチン(オンコビン)、シクロホスファミド(シトキサン)、エトポシド(VP-16)、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、リポソームドキソルビシン(ドキシル)、オベンダムスチン(トレアンダ)を含む化学療法剤、又は対象における形質細胞腫瘍の治療に有効であることが周知である任意のその他のもの)を含む。いくつかの実施形態では、第2の治療薬は、ステロイドを含む。いくつかの実施形態では、第2の治療薬は、サリドマイド、レナリドミド、及びボルテゾミブを含む標的療法を含むが、これらは、新たに診断された患者を治療するために承認された療法である。例えば、レナリドミド、ポマリドミド、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、パノビノスタット、イキサゾミブ、エロツズマブ、及びダラツムマブは、再発性骨髄腫を治療するために有効な第2の治療薬の例である。特定の実施形態では、第2の治療薬は、放射線療法又は幹細胞移植を含むレジメンである。特定の実施形態では、第2の治療薬は、免疫調節剤であってもよい。特定の実施形態では、第2の治療薬は、ボルテゾミブ(Velcade(登録商標))、カルフィルゾミブ(Kyprolis(登録商標))、イキサゾミブ(Ninlaro(登録商標))を含むプロテアソーム阻害剤であってもよい。特定の実施形態では、第2の治療薬は、パノビノスタット(Farydak(登録商標))などのヒストンデアセチラーゼ阻害剤であってもよい。特定の実施形態では、第2の治療薬は、モノクローナル抗体、抗体薬物共役体、抗腫瘍剤に共役し得るか又は共役し得ない二重特異性抗体、チェックポイント阻害剤、又はそれらの組み合わせであってもよい。本開示の抗原結合分子と組み合わせて有益に投与され得るその他の薬剤は、小分子サイトカイン阻害剤及びIL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18などのサイトカイン、又はそれらのそれぞれの受容体に結合する抗体を含むサイトカイン阻害剤を含む。本開示の医薬組成物(例えば、本明細書に開示される操作された細胞又は細胞集団を含む医薬組成物)はまた、形質細胞表面上の異なる抗原と相互作用し得る本明細書に記載されるもの以外のモノクローナル抗体、腫瘍細胞表面上の抗原に結合する一方のアーム及びT細胞上の抗原に結合する他方のアームを有する二重特異性抗体、抗体薬物コンジュゲート、抗腫瘍剤と共役した二重特異性抗体、チェックポイント阻害剤、例えば、PD-1又はCTLA-4を標的とするもの、又はそれらの組み合わせ、から選択される1つ以上の治療的組み合わせを含む治療レジメンの一部として投与されてもよい。特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ペムブロリズマブ(Keytruda(登録商標))、ニボルマブ(Opdivo(登録商標))、又はセミプリマブ(Libtayo(登録商標))などのPD-1阻害剤から選択されてもよい。特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ(Tecentriq(登録商標))、アベルマブ(Bavencio(登録商標))、又はデュルバルマブ(Imfinzi(登録商標))などのPD-L1阻害剤から選択されてもよい。特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、イピリムマブ(Yervoy(登録商標))などのCTLA-4阻害剤から選択されてもよい。
本開示はまた、本明細書に記載される抗体/抗原結合断片、及び/又は操作された細胞若しくは細胞集団のうちのいずれかと、VEGF、Ang2、DLL4、EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、EGFRvIII、cMet、IGF1R、B-raf、PDGFR-α、PDGFR-β、FOLH1(PSMA)、PRLR、STEAP1、STEAP2、TMPRSS2、MSLN、CA9、ウロプラキンのうちの1種以上の阻害剤、又は前述のサイトカインのうちのいずれかと、を含む治療的組み合わせを含み、阻害剤は、アプタマー、アンチセンス分子、リボザイム、siRNA、ペプチボディ、ナノボディ又は抗体断片(例えば、Fab断片、F(ab’)2断片、Fd断片、Fv断片、scFv、dAb断片、又はその他の操作された分子、例えば、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ及び最小認識単位)である。いくつかの実施形態では、本開示の抗体/抗原結合断片、及び/又は操作された細胞若しくは細胞集団はまた、放射線治療及び/又は従来の化学療法も含む治療レジメンの一部として投与されてもよい。
追加の治療活性成分(複数可)は、本開示の操作された細胞の投与の直前、投与と同時、又は投与直後に投与されてもよい(本開示の目的上、このような投与計画は、追加の治療活性成分と「組み合わせて」遺伝子操作された細胞を投与するものとみなされる)。
本開示は、本開示の操作された細胞又は細胞集団が、本明細書の他所に記載の追加の治療活性成分のうちの1種以上と同時製剤化された、医薬組成物を提供する。
投与レジメン
本開示の特定の実施形態によれば、複数の用量の抗体/抗原結合断片、及び/又は操作された細胞が、定義された時間経過にわたって対象に投与されてもよい。本態様による方法は、対象に、複数の用量の抗原結合分子及び/又は細胞を連続的に投与することを含む。本明細書で使用される場合、「連続的に投与すること」は、各用量が、異なる時点、例えば、所定の間隔(例えば、数時間、数日、数週間、又は数か月)よって分けられた異なる日に、対象へ投与されることを意味する。本開示は、患者へ単回の一次的用量、それに続く1回以上の二次的用量、及び任意選択でそれに続く1回以上の三次的用量を連続的に投与することを含む方法を提供する。
本開示の特定の実施形態によれば、複数の用量の抗体/抗原結合断片、及び/又は操作された細胞が、定義された時間経過にわたって対象に投与されてもよい。本態様による方法は、対象に、複数の用量の抗原結合分子及び/又は細胞を連続的に投与することを含む。本明細書で使用される場合、「連続的に投与すること」は、各用量が、異なる時点、例えば、所定の間隔(例えば、数時間、数日、数週間、又は数か月)よって分けられた異なる日に、対象へ投与されることを意味する。本開示は、患者へ単回の一次的用量、それに続く1回以上の二次的用量、及び任意選択でそれに続く1回以上の三次的用量を連続的に投与することを含む方法を提供する。
「一次的用量」、「二次的用量」、及び「三次的用量」という用語は、本開示の抗原結合分子及び/又は操作された細胞の投与の時系列を指す。したがって、「初期用量」は、治療レジメンの開始時に投与される用量(「ベースライン用量」とも称される)である。「二次用量」は、初期投与後に投与される用量であり、「三次用量」は、二次用量後に投与される用量である。一次的用量、二次的用量、及び三次的用量は全て、抗原結合分子及び/又は操作された細胞の同じ量を含んでもよいが、一般に、投与頻度に関して互いに異なる場合がある。しかしながら、特定の実施形態では、一次的用量、二次的用量、及び/又は三次的用量に含有される抗原結合分子及び/又は操作された細胞の量は、治療経過の間、互いに異なる(例えば、適宜上下に調整される)。特定の実施形態では、2回以上(例えば、2回、3回、4回、又は5回)の用量が治療レジメンの開始時において「負荷用量(loading dose)」として投与され、続いてより低い頻度に基づいて投与される後続用量(例えば、「維持用量」)が投与される。
本開示の一代表的実施形態では、各二次用量及び/又は三次用量は、直前の用量の1~26(例えば、1、11/2、2、21/2、3、31/2、4、41/2、5、51/2、6、61/2、7、71/2、8、81/2、9、91/2、10、101/2、11、111/2、12、121/2、13、131/2、14、141/2、15、151/2、16、161/2、17、171/2、18、181/2、19、191/2、20、201/2、21、211/2、22、221/2、23、231/2、24、241/2、25、251/2、26、261/2以上)週間後に投与される。「直前の用量」という語句は、本明細書で使用される場合、一連の複数回の投与において、介入用量のない順序の次の用量の投与の前に患者へ投与される用量を意味する。
本発明の本態様による方法は、患者に、任意の数の二次及び/又は三次用量を投与することを含んでもよい。例えば、特定の実施形態では、単回の二次用量のみが患者に投与される。その他の実施形態では、2回以上(例えば、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回以上)の二次用量が患者に投与される。同様に、特定の実施形態では、単回の三次用量のみが患者に投与される。その他の実施形態では、2回以上(例えば、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回以上)の三次用量が患者に投与される。
複数回の二次用量を伴う実施形態では、各二次用量は、その他の二次用量と同じ頻度で投与されてもよい。例えば、各二次用量は、直前の用量の1~2週間後に患者に投与されてもよい。同様に、複数の三次用量を伴う実施形態では、各三次用量は、その他の三次用量と同じ頻度で投与されてもよい。例えば、各三次用量は、直前の用量の2~4週間後に患者に投与されてもよい。あるいは、二次用量及び/又は三次用量が患者へ投与される頻度は、治療レジメンの経過にわたって変動し得る。投与頻度はまた、臨床検査後の個々の患者の必要性に応じて、医師によって治療経過中に調整されてもよい。
以下の実施例は、本開示の方法及び組成物を作製及び使用する方法の完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示されており、本発明者らが本発明とみなすことの範囲を限定することを企図するものではない。使用される数値(例えば、量、温度など)に関して正確性を確保するための努力はなされたが、ある程度の実験上の誤差及び偏差が考慮されるべきである。別段示されない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧又はそれに近い圧力である。
実施例1:抗MAGE-A4抗体の生成
抗MAGE-A4抗体を、遺伝子組換えマウス(例えば、ヒト免疫グロブリン重鎖及びカッパ軽鎖可変領域をコードするDNAを含む操作されたマウス)をヒトMAGE-A4抗原(例えば、mAb31339N2に関してはhMAGE-A4 286-294)、及びHLA-A2(HLA-A*02:01)で免疫付与することにより得た。より詳細には、遺伝的に修飾されたマウスのゲノムは、遺伝的に修飾されたマウスがヒトHLA-A2を発現するように、ヒトHLA-A2をコードするヌクレオチド配列(並びにヒト免疫グロブリン重鎖可変領域及びカッパ軽鎖可変領域をコードする配列)を有したが、ここで、このマウスは、MAGE-A4抗原及びHLA-A2で免疫された場合に特異的B細胞応答を生じるように、ヒトHLA-A2に対して寛容化されていた。
抗MAGE-A4抗体を、遺伝子組換えマウス(例えば、ヒト免疫グロブリン重鎖及びカッパ軽鎖可変領域をコードするDNAを含む操作されたマウス)をヒトMAGE-A4抗原(例えば、mAb31339N2に関してはhMAGE-A4 286-294)、及びHLA-A2(HLA-A*02:01)で免疫付与することにより得た。より詳細には、遺伝的に修飾されたマウスのゲノムは、遺伝的に修飾されたマウスがヒトHLA-A2を発現するように、ヒトHLA-A2をコードするヌクレオチド配列(並びにヒト免疫グロブリン重鎖可変領域及びカッパ軽鎖可変領域をコードする配列)を有したが、ここで、このマウスは、MAGE-A4抗原及びHLA-A2で免疫された場合に特異的B細胞応答を生じるように、ヒトHLA-A2に対して寛容化されていた。
免疫後、脾細胞を各マウスから採取し、(1)マウス骨髄腫細胞と融合させてそれらの生存率を保存し、ハイブリドーマ細胞を形成し、MAGE-A4特異性についてスクリーニングし、又は(2)反応性抗体(抗原陽性B細胞)に結合して同定する選別試薬としてヒトMAGE-A4断片を使用して、B細胞を選別した(米国特許公開第2007/0280945(A1)号に記載のとおり)。
ヒト可変領域及びマウス定常領域を有するMAGE-A4に対するキメラ抗体が、最初に単離された。抗体を、親和性、選択性などを含む望ましい特徴について特徴付けし選択する。例えば、マウス定常領域を所望のヒト定常領域、例えば野生型又は改変されたIgG1又はIgG4定常領域と置き換えて、完全ヒト型抗MAGE-A4抗体を生成した(例えば、mAbM31339N2(マウス定常領域を含む)を使用して、mAbH31339N2(ヒト定常領域を含む)を生成した)。選択される定常領域は特異的用途に応じて変化する場合があるが、高親和性抗原結合特徴及び標的特異性特徴は、可変領域に存在する。
mAbM31339N2はまた、高親和性(7195P)CD3アームを使用して、bsAb6054(mAb31339からのHCVR1、LCVR1、及びLCVR2、並びに7195PからのHCVR2)を生成するか、又は中親和性(7221G)CD3アームを使用して、bsAb6043(mAb31339からのHCVR1、LCVR1、及びLCVR2、並びに7221GからのHCVR2)を生成するか、のいずれかを使用して、二重特異性抗体に再フォーマットした。
抗MAGE-A4抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸及び核酸配列:表1は、本開示の選択された抗MAGE-A4抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域並びにCDRのアミノ酸配列識別子を記載する。表1のmAb31339N及びmAb31339N2配列は、HCVRフレームワーク領域3における1つのアミノ酸の違いを除いて、同一である。しかし、CDRは、mAb31339N及びmAb31339N2の両方について、同じである。対応する核酸配列識別子を、表2に示す。本明細書に含まれる全ての配列の要約を、表15に提供する。
CD3及びMAGE-A4に結合する二重特異性抗体の生成:抗CD3特異的結合領域及び抗MAGE-A4特異的結合領域を含む二重特異性抗体を、抗CD3抗体由来の重鎖を抗MAGE-A4抗体由来の重鎖及び同族軽鎖と組み合わせる方法論を使用して、表3及び表4に列挙される配列を用いて構築した。
したがって、本実施例に従って作成された二重特異性抗体は、2つの別個の抗原結合領域(すなわち、結合アーム)を含む。第1の抗原結合領域は、抗MAGE-A4抗体(「MAGE-A4-VL」)に由来する同族軽鎖可変領域と対になった抗MAGE-A4抗体(「MAGE-A4-VH」)に由来する重鎖可変領域を含み、第2の抗原結合領域は、MAGE-A4-VLと対になった抗CD3抗体(「CD3-VH」)に由来する重鎖可変領域を含む。原則として、抗CD3抗体(「CD3-VL」)由来の同族軽鎖可変領域を、抗体の両方のアームに共通の軽鎖可変領域として使用することもまた可能である。本実施例で作成した全ての二重特異性抗体において、同じMAGE-A4-VHを使用した。bsAb6054抗体は、配列番号2/10のHCVR/LCVRを含むMAGE-A4結合アームと、配列番号73/10のHCVR/LCVRを含むCD3結合アームと、を含む。bsAb6043抗体は、配列番号2/10のHCVR/LCVRを含むMAGE-A4結合アームと、配列番号55/10のHCVR/LCVRを含むCD3結合アームと、を含む。
抗CD3抗原結合アーム及び抗MAGE-A4結合アームを構築するために使用される、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域並びにCDRのアミノ酸配列識別子を、表3に記載する。対応する核酸配列識別子を、表4に示す。抗MAGE/抗CD3二重特異性抗体を、中親和性CD3抗体(抗CD3-A、本明細書においてH4sH7221G又は7221Gと称される)、又は高親和性CD3抗体(抗CD3-B、本明細書においてHpH4sH7195P又は7195Pと称される)のいずれかから生成した。第1の抗原結合領域及び第2の抗原結合領域は、本明細書において、二重特異性抗体の「アーム」と称される。実施例では、一方のアームは、配列番号2のアミノ酸配列を含むHCVRと、配列番号10のアミノ酸配列を含むLCVRと、を含み、一方で、他方のアームは、配列番号55、又は配列番号73のアミノ酸配列を含むHCVRを含み、LCVRは、配列番号10のアミノ酸配列を含む。
実施例2:抗HLA-A2の結合:フローサイトメトリーを介してMAGE-A4(286-294)でパルスされたT2細胞に対するMAGE-A4(286-294)抗体
抗HLA-A 2:MAGE-A4 286-294抗体(mAbM31339N)の、HLA-A*02:01陽性T2(174CEM.T2)細胞への細胞表面結合を、フローサイトメトリー系のペプチドパルスアッセイにおいて評価した。パルスするために、1×106のT2細胞を、1mlのAIM V培養液(ジブコ社製,カタログ番号31035-025)中で16時間、37℃で、10μg/mlのヒト(h)B2M(EMDミリポア社製,カタログ番号475828)及び100μg/mlのMAGE-A4 286-294ペプチドで培養した。細胞を、染色緩衝液(カルシウム及びマグネシウムを含まないPBS(コーニング社製,参照番号21-031-CV)+2%のFBS(セラダイム社製,ロット番号238B15))中で洗浄し、細胞解離緩衝液(ミリポア社製,カタログ番号S-004-C)を使用して回収し、染色緩衝液中に再懸濁した。パルスした細胞(200,000個)を、96ウェルV底プレート(アキシジェン社製,カタログ番号P-96-450V-C-S)に播種し、mAbM31339Nの3倍連続希釈(1.7pM~100nM)で、又は非結合対照抗体(mAb1097)で、4℃で30分間、染色した。次に、細胞を、染色緩衝液で1回洗浄し、5ug/mlのAlexa Fluor647共役Fab’2抗マウスFc特異的二次的抗体(Jackson ImmunoResearch社製,カタログ番号115-606-071)で、4℃で30分間、培養した。最後に、細胞を、1:1000の濃度の緑色蛍光生存色素(50μlのDMSO中で再構築した、Molecular Probes社製,カタログ番号L-34970)で、染色した。次に、細胞を洗浄し、PBSで希釈したBD Cytofix(BD社製,カタログ番号554655)の50%の溶液を使用して、固定した。試料を、Intellicyt iQueフローサイトメーター(Intellicyt社製)にかけ、Forecyte分析ソフトウェア(Intellicyte)を使用して結果を分析して、生細胞のゲーティング後の平均蛍光強度(Mean Fluorescent Intensity、MFI)を計算した。EC50値を計算するために、12ポイントの応答曲線上で4パラメータロジスティック方程式を使用して、MFI値をGraphPad Prismにプロットした。各用量応答曲線の二次抗体のみ(つまり、一次抗体なし)もまた、3倍連続希釈の継続として分析に含まれ、最低用量として表される。用量応答曲線上の最高のMFIと二次的単独ウェルにおけるMFIとの比を取ることによって、シグナル対雑音(S/N)が決定された。EC50値(M)及び最大S/Nを、表5に示す。mAbM31339Nは1.7nMのEC50及び1933の最大S/Nで結合したが、対照抗体(mAb1097)の結合は検出されず、mAb31339NがMAGE-A4(286-294)に対して強い結合親和性を有することを示した。表5を参照すると、NDは、試験した抗体濃度範囲内で結合が飽和に達しなかったために正確に決定され得なかったEC50値を指す。
抗HLA-A 2:MAGE-A4 286-294抗体(mAbM31339N)の、HLA-A*02:01陽性T2(174CEM.T2)細胞への細胞表面結合を、フローサイトメトリー系のペプチドパルスアッセイにおいて評価した。パルスするために、1×106のT2細胞を、1mlのAIM V培養液(ジブコ社製,カタログ番号31035-025)中で16時間、37℃で、10μg/mlのヒト(h)B2M(EMDミリポア社製,カタログ番号475828)及び100μg/mlのMAGE-A4 286-294ペプチドで培養した。細胞を、染色緩衝液(カルシウム及びマグネシウムを含まないPBS(コーニング社製,参照番号21-031-CV)+2%のFBS(セラダイム社製,ロット番号238B15))中で洗浄し、細胞解離緩衝液(ミリポア社製,カタログ番号S-004-C)を使用して回収し、染色緩衝液中に再懸濁した。パルスした細胞(200,000個)を、96ウェルV底プレート(アキシジェン社製,カタログ番号P-96-450V-C-S)に播種し、mAbM31339Nの3倍連続希釈(1.7pM~100nM)で、又は非結合対照抗体(mAb1097)で、4℃で30分間、染色した。次に、細胞を、染色緩衝液で1回洗浄し、5ug/mlのAlexa Fluor647共役Fab’2抗マウスFc特異的二次的抗体(Jackson ImmunoResearch社製,カタログ番号115-606-071)で、4℃で30分間、培養した。最後に、細胞を、1:1000の濃度の緑色蛍光生存色素(50μlのDMSO中で再構築した、Molecular Probes社製,カタログ番号L-34970)で、染色した。次に、細胞を洗浄し、PBSで希釈したBD Cytofix(BD社製,カタログ番号554655)の50%の溶液を使用して、固定した。試料を、Intellicyt iQueフローサイトメーター(Intellicyt社製)にかけ、Forecyte分析ソフトウェア(Intellicyte)を使用して結果を分析して、生細胞のゲーティング後の平均蛍光強度(Mean Fluorescent Intensity、MFI)を計算した。EC50値を計算するために、12ポイントの応答曲線上で4パラメータロジスティック方程式を使用して、MFI値をGraphPad Prismにプロットした。各用量応答曲線の二次抗体のみ(つまり、一次抗体なし)もまた、3倍連続希釈の継続として分析に含まれ、最低用量として表される。用量応答曲線上の最高のMFIと二次的単独ウェルにおけるMFIとの比を取ることによって、シグナル対雑音(S/N)が決定された。EC50値(M)及び最大S/Nを、表5に示す。mAbM31339Nは1.7nMのEC50及び1933の最大S/Nで結合したが、対照抗体(mAb1097)の結合は検出されず、mAb31339NがMAGE-A4(286-294)に対して強い結合親和性を有することを示した。表5を参照すると、NDは、試験した抗体濃度範囲内で結合が飽和に達しなかったために正確に決定され得なかったEC50値を指す。
実施例3:抗HLA-A2の結合:MAGE-A4関連ペプチドでパルスされたT2細胞に対するMAGE-A4抗体及びMAGE-A4×CD3二重特異性抗体。
インシリコ計算戦略(Dhanik A et.al.BMC Bioinformatics 2016)により、MAGE-A4に関連するいくつかのペプチドが同定されたが、これらのペプチドは、HLA-A*02:01と複合体を形成すると予測された。同定されたペプチドを、表6に要約する。
インシリコ計算戦略(Dhanik A et.al.BMC Bioinformatics 2016)により、MAGE-A4に関連するいくつかのペプチドが同定されたが、これらのペプチドは、HLA-A*02:01と複合体を形成すると予測された。同定されたペプチドを、表6に要約する。
親抗体(mAbH31339N2)、MAGE-A4×CD3(7221G)二重特異性抗体(bsAb6043)、及び非結合アイソタイプ対照抗体(mAb4241)の、表6に示されるこれらの関連ペプチドへの結合を、上記のT2パルスアッセイにおいて評価した。実施例1において上述したように、bsAb6043抗体は、配列番号2/10のHCVR/LCVRを含むMAGE-A4結合アームと、配列番号55/10のHCVR/LCVRを含むCD3結合アームと、を含む。表7に要約したように、両抗体は、mAbH31339N2については310、bsAb6043については244のS/N値でMAGE-A4ペプチドに結合し、実質的にベースライン(ペプチドなし)を上回った。試験した抗体は、mAbH31339N2については131のS/N値で、bsAb6043については110のS/N値で、AOX1に対してより低い結合を示し、両方の抗体については、5のS/N値でSHTN1に対してより低い結合を示した。残りのペプチドへの検出可能な結合は観察されず、対照抗体結合は、全ての試験ペプチドについて≦3であった。
実施例4:T細胞レポータ/抗原提示細胞(APC)生物学的検定における、MAGE-A4×CD3二重特異性抗体の活性の評価。
MAGE-A4×CD3二重特異性抗体の活性を、T細胞レポータ/抗原提示細胞(APC)生物学的検定において評価した。アッセイ細胞株を作製するために、Jurkat細胞にNF-KB依存性κBLucルシフェラーゼレンチウイルスレポータベクター(キアゲン社製)を形質導入し、単細胞を高いルシフェラーゼ活性について選別して、Jurkat/NF-κBLucアッセイ細胞株を生成した。MAGE-A4及びHLA-A*02:01を内因的に発現する骨髄腫細胞株であるIM9細胞及びU266B1細胞を、抗原提示細胞(APC)として利用した。更に、MAGE-A4及びHLA-A2陰性であるRaji細胞を、対照として使用した。簡単に言えば、25,000個のJurkat/NF-κBLuc細胞を、25μlのアッセイ培地(10%のFBS及び1%のP/S/Gを含むRPMI培地)中で、Thermo-Nunc96ウェル白色プレート(サーモ・サイエンティフィック社製,カタログ番号136101)に添加し、続いて、25μlのアッセイ培地中に25,000個のAPCを添加した。27.4pM~20nMの抗体の3倍連続希釈物を、50μlのアッセイ培地中のプレートに添加した。細胞混合物を、37℃、5%のCO2で、加湿インキュベータ内で5時間培養した。製造者取扱説明書に従って、Promega One-Glo(カタログ番号E6130)及びPerkin Elmer Envisionプレートリーダを使用して、NF-κB-ルシフェラーゼ活性を測定した。相対ルシフェラーゼ単位(RLU)を生成し、8点用量応答曲線(GraphPad Prism)にわたる4パラメータロジスティック方程式を使用して、EC50値を決定した。各用量応答曲線の一次的抗体ゼロ条件(二次的抗体単独)もまた、3倍連続希釈の継続として分析に含まれ、最低用量として表される。最大活性は、曲線上の最高RLUと最低RLUとの比を取得することによって決定され、シグナル:雑音(S/N)として表される。EC50値及びS/Nを、表8に要約する。表8に関して、NDは、試験した抗体濃度範囲内で結合が飽和に達しなかったために正確に決定され得なかったEC50値に対応する。
MAGE-A4×CD3二重特異性抗体の活性を、T細胞レポータ/抗原提示細胞(APC)生物学的検定において評価した。アッセイ細胞株を作製するために、Jurkat細胞にNF-KB依存性κBLucルシフェラーゼレンチウイルスレポータベクター(キアゲン社製)を形質導入し、単細胞を高いルシフェラーゼ活性について選別して、Jurkat/NF-κBLucアッセイ細胞株を生成した。MAGE-A4及びHLA-A*02:01を内因的に発現する骨髄腫細胞株であるIM9細胞及びU266B1細胞を、抗原提示細胞(APC)として利用した。更に、MAGE-A4及びHLA-A2陰性であるRaji細胞を、対照として使用した。簡単に言えば、25,000個のJurkat/NF-κBLuc細胞を、25μlのアッセイ培地(10%のFBS及び1%のP/S/Gを含むRPMI培地)中で、Thermo-Nunc96ウェル白色プレート(サーモ・サイエンティフィック社製,カタログ番号136101)に添加し、続いて、25μlのアッセイ培地中に25,000個のAPCを添加した。27.4pM~20nMの抗体の3倍連続希釈物を、50μlのアッセイ培地中のプレートに添加した。細胞混合物を、37℃、5%のCO2で、加湿インキュベータ内で5時間培養した。製造者取扱説明書に従って、Promega One-Glo(カタログ番号E6130)及びPerkin Elmer Envisionプレートリーダを使用して、NF-κB-ルシフェラーゼ活性を測定した。相対ルシフェラーゼ単位(RLU)を生成し、8点用量応答曲線(GraphPad Prism)にわたる4パラメータロジスティック方程式を使用して、EC50値を決定した。各用量応答曲線の一次的抗体ゼロ条件(二次的抗体単独)もまた、3倍連続希釈の継続として分析に含まれ、最低用量として表される。最大活性は、曲線上の最高RLUと最低RLUとの比を取得することによって決定され、シグナル:雑音(S/N)として表される。EC50値及びS/Nを、表8に要約する。表8に関して、NDは、試験した抗体濃度範囲内で結合が飽和に達しなかったために正確に決定され得なかったEC50値に対応する。
実施例1に記載のように、bsAb6054抗体は、配列番号2/10のHCVR/LCVRを含むMAGE-A4結合アームと、配列番号73/10のHCVR/LCVRを含むCD3結合アームと、を含み、bsAb6043抗体は、配列番号2/10のHCVR/LCVRを含むMAGE-A4結合アームと、配列番号55/10のHCVR/LCVRを含むCD3結合アームと、を含む。bsAb4241抗体及びbsAb3905抗体は、それぞれ、bsAb6043及びbsAb6054と同じ抗CD3 HCVRを含む抗CD3結合アームを有する(MAGE-A4に対する)非結合対照であり、それぞれの抗体の非MAGE-A4結合アームに由来する同族の軽鎖可変領域と対合する。
表8に示すように、MAGE-A4×CD3中親和性二重特異性抗体(bsAb6043)は、IM9細胞、U266B1細胞、又はRAJI細胞の存在下で、Jurkat/NF-κBLuc生物学的検定において活性を有さなかった。対照的に、MAGE-A4×CD3高親和性二重特異性抗体(bsAb6054)は、IM9細胞及びU266B1細胞に対して、それぞれ、7.4E~10M及び3.1E~09MのEC50値、並びに41.9及び6.3のS/N値を有した。中親和性CD3アーム(mAb4241)又は高親和性CD3アーム(mAb3905)のいずれかを有する非結合対照二重特異性抗体は、≦2.2のS/N値で最小限に活性であった。更に、RAJI細胞に対するいずれの抗体の活性もなかった。
同様の生物学的検定を実施したが、今回は、一定量の抗CD28抗体を添加した。ここで、CD28の添加は、IM9細胞に対するbsAb6054の活性を部分的に遮断したが(EC50 2.1E09M、S/N28.7)、U266B1細胞に対する活性をわずかに増加させた(EC50 6.1E-09M、S/N8.6)。これは、これらの細胞株上で内因的に発現されるCD80及びCD86共刺激分子のレベルに起因する可能性が高い。IM9は、高レベルのCD80及びCD86を、内因的に有する。従って、生物学的検定におけるCD28抗体の添加は、Jurkat細胞上のCD28とそのリガンドCD80及びCD86との天然の相互作用を遮断し、したがって、活性を低下させる。U266B1は、低レベルのCD80及びCD86を有する。ここで、CD28の添加は、Jurkat細胞上のCD28シグナル伝達を刺激し、活性を増加させる(表9)。
表8に関連して上記で考察された抗体に加えて、mAb5705は、配列番号85のHCVR及び配列番号93のLCVRを含む抗CD28抗体である。
実施例5:Jurkat/NF-κB-Luc/APCレポータ生物学的検定におけるペプチド特異性
操作されたT細胞/APC機能的Jurkat/NF-κBLucレポータ/APC生物学的検定もまた利用して、MAGE-A4×CD3二重特異性抗体が、表7に同定された関連ペプチドよりもMAGE-A4ペプチドに対する選択性を保持しているかどうかを評価した。本アッセイでは、T2細胞を、前述の通り、標的ペプチドMAGE-A4 286-294又は配列関連オフ標的ペプチド(表7)でパルスした。表10に要約したように、MAGE-A4 286-294ペプチドでパルスしたT2細胞と共に培養した場合に、bsAb6043(MAGE-A4×CD3中親和性)及びbsAb6054(MAGE-A4×CD3高親和性)二重特異性抗体の両方が、NF-κB依存性レポータ活性を刺激した。オフ標的ペプチドAOX1795-803及びSHTN1198-206でパルスしたT2細胞と共に培養した場合にもまた、活性が検出された。要約すると、bsAb6043は、MAGE-A4 293-294、AOX1 795-803、及びSHTN1 198-206ペプチドについて、それぞれ、3.0E-10M、3.3E-10M、及び3.5E-09MのEC50値、並びに75.2、40.4及び75.3のS/N値でレポータ活性を刺激した。bsAb6054は、MAGE-A4 286-294、AOX1 795-803、及びSHTN1 198-206ペプチドについて、それぞれ、2.0E-12M、2.1E-11M、及び1.3E-09MのEC50値、並びに78.7、36、及び81.1のS/N値でレポータ活性を刺激した。中親和性CD3アーム(mAb4241)又は高親和性CD3アーム(mAb3905)のいずれかを有する非結合対照二重特異性抗体は、≦2.9のS/N値で最小限に活性であった。
操作されたT細胞/APC機能的Jurkat/NF-κBLucレポータ/APC生物学的検定もまた利用して、MAGE-A4×CD3二重特異性抗体が、表7に同定された関連ペプチドよりもMAGE-A4ペプチドに対する選択性を保持しているかどうかを評価した。本アッセイでは、T2細胞を、前述の通り、標的ペプチドMAGE-A4 286-294又は配列関連オフ標的ペプチド(表7)でパルスした。表10に要約したように、MAGE-A4 286-294ペプチドでパルスしたT2細胞と共に培養した場合に、bsAb6043(MAGE-A4×CD3中親和性)及びbsAb6054(MAGE-A4×CD3高親和性)二重特異性抗体の両方が、NF-κB依存性レポータ活性を刺激した。オフ標的ペプチドAOX1795-803及びSHTN1198-206でパルスしたT2細胞と共に培養した場合にもまた、活性が検出された。要約すると、bsAb6043は、MAGE-A4 293-294、AOX1 795-803、及びSHTN1 198-206ペプチドについて、それぞれ、3.0E-10M、3.3E-10M、及び3.5E-09MのEC50値、並びに75.2、40.4及び75.3のS/N値でレポータ活性を刺激した。bsAb6054は、MAGE-A4 286-294、AOX1 795-803、及びSHTN1 198-206ペプチドについて、それぞれ、2.0E-12M、2.1E-11M、及び1.3E-09MのEC50値、並びに78.7、36、及び81.1のS/N値でレポータ活性を刺激した。中親和性CD3アーム(mAb4241)又は高親和性CD3アーム(mAb3905)のいずれかを有する非結合対照二重特異性抗体は、≦2.9のS/N値で最小限に活性であった。
実施例6:一次的画像系の死滅アッセイ
MAGE-A4×CD3二重特異性抗体が癌細胞に対するT細胞応答を方向転換する能力を評価するために、イメージング系の多重化一次的T細胞死滅アッセイを実施した。簡単に言えば、CD8+T細胞を、製造業者のプロトコルに従って、磁気ビーズ分離(Miltenyi Biotec社製,カタログ番号130-045-201)を用いてヒト末梢血単核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells、PBMC)から単離し、MAGE-A4 286-294抗原提示HLA-A*02:01陽性IM9細胞株を、製造者取扱説明書に従って、CellTrace(商標)Violet(サーモ・フィッシャー社製、C34557)で予め標識した。96ウェルイメージングプレート(パーキンエルマー社製,カタログ番号6055308)中の100ulの刺激培地(X Vivo 15+10%のFBS+1%のHEPES+1%のNaPyr+1%のNEAA+0.01mMのBME)中で、IM9多発性骨髄腫細胞(10,000)を、CD8+T細胞(25,000)と合わせた。20nM~27.4pMの範囲の抗体の3倍連続希釈物を、更なる100μlの刺激培地中の細胞に添加した。72時間の培養後、50μlの上清をサイトカイン放出アッセイ(下記を参照のこと)のために取り出し、核色素DRAQ5(サーモフィッシャー社製,カタログ番号62252)の1:1000希釈物(PBS中)15μlを、細胞に添加した。DRAQ5標識核及びCell-Traceバイオレット標識APCの画像を、Opera Phenix(パーキンエルマー社製)上に収集し、全ての条件(CellTrace(商標)バイオレット及びDRAQ5の両方で標識された集団)における生存IM9細胞の数を、Harmony解析ソフトウェア(パーキンエルマー社製)を使用して計算した。EC50値は、得られた非シグモイド曲線から生成することができなかったので、生存IM9(抗体なしの条件に対して正規化された)細胞の%を、6.6nM用量(非結合対照が不活性であった最高試験用量)について報告した。表11に要約されるように、bsAb6043(MAGE-A4×CD3(7221G)中親和性二重特異性抗体)は、生存IM9細胞集団の%に対して正の影響を有さなかったが、bsAb6054(MAGE-A4×CD3高親和性二重特異性抗体)は、IM9集団を38%に減少させた。2nMの抗CD28アゴニスト抗体の添加は、生存細胞の数を倍増させた(80%)(表9)。これは、mAb5705がCD28を遮断し、それによって、IM9細胞上で内因的に発現されるCD80及びCD86との相互作用を阻害する能力に起因し得る。非結合対照×CD3二重特異性抗体mAb4241(中CD親和性)及びmAb3905(高CD3親和性)は、アッセイにおいて活性を有さなかった。
MAGE-A4×CD3二重特異性抗体が癌細胞に対するT細胞応答を方向転換する能力を評価するために、イメージング系の多重化一次的T細胞死滅アッセイを実施した。簡単に言えば、CD8+T細胞を、製造業者のプロトコルに従って、磁気ビーズ分離(Miltenyi Biotec社製,カタログ番号130-045-201)を用いてヒト末梢血単核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells、PBMC)から単離し、MAGE-A4 286-294抗原提示HLA-A*02:01陽性IM9細胞株を、製造者取扱説明書に従って、CellTrace(商標)Violet(サーモ・フィッシャー社製、C34557)で予め標識した。96ウェルイメージングプレート(パーキンエルマー社製,カタログ番号6055308)中の100ulの刺激培地(X Vivo 15+10%のFBS+1%のHEPES+1%のNaPyr+1%のNEAA+0.01mMのBME)中で、IM9多発性骨髄腫細胞(10,000)を、CD8+T細胞(25,000)と合わせた。20nM~27.4pMの範囲の抗体の3倍連続希釈物を、更なる100μlの刺激培地中の細胞に添加した。72時間の培養後、50μlの上清をサイトカイン放出アッセイ(下記を参照のこと)のために取り出し、核色素DRAQ5(サーモフィッシャー社製,カタログ番号62252)の1:1000希釈物(PBS中)15μlを、細胞に添加した。DRAQ5標識核及びCell-Traceバイオレット標識APCの画像を、Opera Phenix(パーキンエルマー社製)上に収集し、全ての条件(CellTrace(商標)バイオレット及びDRAQ5の両方で標識された集団)における生存IM9細胞の数を、Harmony解析ソフトウェア(パーキンエルマー社製)を使用して計算した。EC50値は、得られた非シグモイド曲線から生成することができなかったので、生存IM9(抗体なしの条件に対して正規化された)細胞の%を、6.6nM用量(非結合対照が不活性であった最高試験用量)について報告した。表11に要約されるように、bsAb6043(MAGE-A4×CD3(7221G)中親和性二重特異性抗体)は、生存IM9細胞集団の%に対して正の影響を有さなかったが、bsAb6054(MAGE-A4×CD3高親和性二重特異性抗体)は、IM9集団を38%に減少させた。2nMの抗CD28アゴニスト抗体の添加は、生存細胞の数を倍増させた(80%)(表9)。これは、mAb5705がCD28を遮断し、それによって、IM9細胞上で内因的に発現されるCD80及びCD86との相互作用を阻害する能力に起因し得る。非結合対照×CD3二重特異性抗体mAb4241(中CD親和性)及びmAb3905(高CD3親和性)は、アッセイにおいて活性を有さなかった。
実施例7:一次的サイトカイン放出アッセイ
IL2及びIFN-γ放出はまた、上記の画像系の殺傷アッセイにおいて利用される6.6nMの処置用量からサンプリングされた細胞培養上清において評価された。サイトカインレベルを、AlphaLisa(パーキンエルマー社製,カタログ番号AL221F、AL217F)により、製造者取扱説明書に従って決定し、RLU値を未処理ウェルに対して正規化して、S/N値を決定した。表12に要約されるように、bsAb6043(MAGE-A4×CD3(7221G)中親和性二重特異性抗体)は、いずれのIL2又はIFN-γも放出しなかったが、より高い親和性のMAGE-A4×CD3二重特異性抗体bsAb6054は、それぞれ2.1及び2.4のS/N値で、IL2及びIFN-γの中程度の産生を誘導した。CD28抗体(mAb5705)の添加は、サイトカイン産生に有意に影響を及ぼさなかった(表12)。
IL2及びIFN-γ放出はまた、上記の画像系の殺傷アッセイにおいて利用される6.6nMの処置用量からサンプリングされた細胞培養上清において評価された。サイトカインレベルを、AlphaLisa(パーキンエルマー社製,カタログ番号AL221F、AL217F)により、製造者取扱説明書に従って決定し、RLU値を未処理ウェルに対して正規化して、S/N値を決定した。表12に要約されるように、bsAb6043(MAGE-A4×CD3(7221G)中親和性二重特異性抗体)は、いずれのIL2又はIFN-γも放出しなかったが、より高い親和性のMAGE-A4×CD3二重特異性抗体bsAb6054は、それぞれ2.1及び2.4のS/N値で、IL2及びIFN-γの中程度の産生を誘導した。CD28抗体(mAb5705)の添加は、サイトカイン産生に有意に影響を及ぼさなかった(表12)。
実施例8:MAGE-A4特異的キメラ抗原受容体の生成
表1の抗MAGE-A4 31339N2抗体は、VL-VH単鎖可変断片(ScFv)に再形式化され、それぞれ、配列番号1及び配列番号9に対応する抗MAGE-A4抗体のHCVR及びLCVRヌクレオチド配列を使用して、CD8αヒンジ及び膜貫通領域、4-1BB共刺激領域、並びにCD3ゼータ刺激領域、又はCD28ヒンジ、膜貫通、及びシグナル伝達領域を使用するキメラ抗原受容体(CAR)構成に入れられた。対応する抗MAGE-A4抗体(mAbH31339N2)の全長核酸及びポリペプチド重鎖配列は、それぞれ、配列番号17及び配列番号18に対応する。対応する抗MAGE-A4抗体(mAbH31339N2)の全長核酸及びポリペプチド軽鎖配列は、それぞれ、配列番号19及び配列番号20に対応する。全長核酸及びポリペプチドHLA-A2/MAGE-A4286-294を標的とするCAR配列は、それぞれ、配列番号21及び配列番号22に対応する。非結合対照として、無関係なscFvのヌクレオチド配列を使用して同様のCARを設計した。MAGE-A4特異的CARをレンチウイルス発現ベクター(Lenti-X(商標)バイシストロン性発現システム(Neo)、クロンテック社製、カタログ番号632181)にクローン化し、レンチウイルス粒子をLenti-Xパッケージングシングルショット(VSV-G)システム(クロンテック社製,カタログ番号631276)を介して、製造元のプロトコルに従って生成した。次に、NFKB-ルシフェラーゼレポータを発現するように操作されたJurkat細胞(Jurkat/NKFBLuc cl 1C11)に、RetroNectin(登録商標)Precoated Dishes(クロンテック社製,カタログ番号T110a)を使用して、製造元のプロトコルに従ってCAR構成を形質導入した。500μg/mlのG418(ジブコ社製,カタログ番号11811-098)で少なくとも2週間について選択後、以下のCAR T細胞株を生成した。Jurkat/NKFBLuc c 11 C 11/MAGE-A4(286-294)31339 VL-VH CART。非結合対照として、無関係なscFvのヌクレオチド配列を使用して、同様のCARを設計した。このCAR T細胞株を、MAGE-A4を発現する細胞への応答において、細胞表面発現及び機能的活性について評価した。
表1の抗MAGE-A4 31339N2抗体は、VL-VH単鎖可変断片(ScFv)に再形式化され、それぞれ、配列番号1及び配列番号9に対応する抗MAGE-A4抗体のHCVR及びLCVRヌクレオチド配列を使用して、CD8αヒンジ及び膜貫通領域、4-1BB共刺激領域、並びにCD3ゼータ刺激領域、又はCD28ヒンジ、膜貫通、及びシグナル伝達領域を使用するキメラ抗原受容体(CAR)構成に入れられた。対応する抗MAGE-A4抗体(mAbH31339N2)の全長核酸及びポリペプチド重鎖配列は、それぞれ、配列番号17及び配列番号18に対応する。対応する抗MAGE-A4抗体(mAbH31339N2)の全長核酸及びポリペプチド軽鎖配列は、それぞれ、配列番号19及び配列番号20に対応する。全長核酸及びポリペプチドHLA-A2/MAGE-A4286-294を標的とするCAR配列は、それぞれ、配列番号21及び配列番号22に対応する。非結合対照として、無関係なscFvのヌクレオチド配列を使用して同様のCARを設計した。MAGE-A4特異的CARをレンチウイルス発現ベクター(Lenti-X(商標)バイシストロン性発現システム(Neo)、クロンテック社製、カタログ番号632181)にクローン化し、レンチウイルス粒子をLenti-Xパッケージングシングルショット(VSV-G)システム(クロンテック社製,カタログ番号631276)を介して、製造元のプロトコルに従って生成した。次に、NFKB-ルシフェラーゼレポータを発現するように操作されたJurkat細胞(Jurkat/NKFBLuc cl 1C11)に、RetroNectin(登録商標)Precoated Dishes(クロンテック社製,カタログ番号T110a)を使用して、製造元のプロトコルに従ってCAR構成を形質導入した。500μg/mlのG418(ジブコ社製,カタログ番号11811-098)で少なくとも2週間について選択後、以下のCAR T細胞株を生成した。Jurkat/NKFBLuc c 11 C 11/MAGE-A4(286-294)31339 VL-VH CART。非結合対照として、無関係なscFvのヌクレオチド配列を使用して、同様のCARを設計した。このCAR T細胞株を、MAGE-A4を発現する細胞への応答において、細胞表面発現及び機能的活性について評価した。
実施例9:Jurkat細胞におけるMAGE-A4 CAR構築の細胞表面発現、及びMAGE-A4 CAR T細胞の活性化
Jurkat/NF-κB-Luc細胞におけるMAGE-A4 CAR構築の細胞表面発現の相対レベルを、フローサイトメトリーによって評価した。染色するために、細胞をカルシウム及びマグネシウムを含まないPBSの染色緩衝液(Irving9240)、及び2%のBSA(シグマーアルドリッチ社製,カタログ番号A8577)中で、96ウェルV底プレートのウェル当たり200,000細胞の密度で播種し、10μg/mlのタンパク質L(ジェンスクリプト社製,ビオチンタンパク質L、カタログ番号M00097)で、4℃で30分間染色した。培養後、細胞を、染色緩衝液で1回洗浄し、0.5μg/mlのストレプトアビジンAlexa-647二次的抗体(バイオレジェンド社製,カタログ番号405237)で、4℃で30分間染色した。最後に、細胞を、1:1000の濃度の緑色蛍光生存色素(50μlのDMSO中で再構築した、Molecular Probes社製,カタログ番号L-34970)で、染色した。次に、細胞を洗浄し、PBSで希釈したBD Cytofix(ベクトン・ディッキンソン社製,カタログ番号554655)の50%の溶液を使用して、固定した。試料を、Intellicyt iQueフローサイトメーターで実行し、生存細胞を得た後に、FlowJo 10.2で分析して、平均蛍光強度(MFI)を計算した。タンパク質L陽性細胞のパーセントは、タンパク質L陽性細胞の数を取得し、細胞の総数で割ることによって計算された。表13は、Jurkat/NF-κB-Luc/MAGE-A4 31339N2 VL-VH CAR-T細胞株が、タンパク質L染色パーセントによって測定した際に、33.8%のCAR陽性であったことを示す。非標的化対照CARは、細胞の67.2%で発現された。
Jurkat/NF-κB-Luc細胞におけるMAGE-A4 CAR構築の細胞表面発現の相対レベルを、フローサイトメトリーによって評価した。染色するために、細胞をカルシウム及びマグネシウムを含まないPBSの染色緩衝液(Irving9240)、及び2%のBSA(シグマーアルドリッチ社製,カタログ番号A8577)中で、96ウェルV底プレートのウェル当たり200,000細胞の密度で播種し、10μg/mlのタンパク質L(ジェンスクリプト社製,ビオチンタンパク質L、カタログ番号M00097)で、4℃で30分間染色した。培養後、細胞を、染色緩衝液で1回洗浄し、0.5μg/mlのストレプトアビジンAlexa-647二次的抗体(バイオレジェンド社製,カタログ番号405237)で、4℃で30分間染色した。最後に、細胞を、1:1000の濃度の緑色蛍光生存色素(50μlのDMSO中で再構築した、Molecular Probes社製,カタログ番号L-34970)で、染色した。次に、細胞を洗浄し、PBSで希釈したBD Cytofix(ベクトン・ディッキンソン社製,カタログ番号554655)の50%の溶液を使用して、固定した。試料を、Intellicyt iQueフローサイトメーターで実行し、生存細胞を得た後に、FlowJo 10.2で分析して、平均蛍光強度(MFI)を計算した。タンパク質L陽性細胞のパーセントは、タンパク質L陽性細胞の数を取得し、細胞の総数で割ることによって計算された。表13は、Jurkat/NF-κB-Luc/MAGE-A4 31339N2 VL-VH CAR-T細胞株が、タンパク質L染色パーセントによって測定した際に、33.8%のCAR陽性であったことを示す。非標的化対照CARは、細胞の67.2%で発現された。
CAR T細胞株の活性は、CAR T/APC(抗原提示細胞)生物学的検定で評価された。生物学的検定を実施するために、50μlのアッセイ培地(10%のFBS及び1%のP/S/Gを含むRPMI培地)中の50,000個のCAR T細胞を、Thermo-Nunc 96ウェル白色プレート(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製,カタログ番号136101)に添加し、続いて、50μlのアッセイ培地中のAPCの3倍連続希釈(500,000細胞~685細胞)を添加した。以下のAPCを利用した:IM9(MAGE-A4 286-294ペプチドを内因的に発現し、HLA-A*02:01陽性である)、及びHEK293(MAGE-A4 286-294陰性であるが、HLA-A*02:01陽性である)。細胞混合物を、37℃、5%のCO2で、加湿インキュベータ内で5時間培養した。NF-κB-ルシフェラーゼ活性を、Promega One-Glo(カタログ番号E6130)及びパーキンエルマー社製のEnvisionプレートリーダを使用して、決定した。相対ルシフェラーゼ単位(RLU)を生成し、8点用量応答曲線にわたる4パラメータロジスティック方程式を使用してGraphPad Prismにプロットして、EC50値(APCの数)を生成した。各用量応答曲線についてのゼロAPC条件も、3倍連続希釈の継続として分析に含まれ、最低用量として表された。EC50(APCの数)として報告し、曲線上の最高RLUと最低RLUとの比をとることによって、CAR-T活性を決定し、シグナル:雑音(S:N)として、表14に表される。31339N2 CAR-Tは、IM9細胞との培養時に活性化され、EC50は14、669個の細胞及びS/Nは37.4であったが、非標的化対照CAR-Tは4.9倍しか活性化されなかった。HEK293細胞(MAGE-A4陰性であるが、HLA-A2陽性である)では、活性化は観察されなかった。
実施例10:抗HLA-A 2の結合:MAGE-A4 230-239及び関連オフ標的ペプチドでパルスされたT2細胞に対するフローサイトメトリーによるMAGE-A4 230-239抗体
抗HLA-A 2:MAGE-A4 230-239抗体(mAbM34852N)の、HLA-A*02:01陽性T2(174CEM.T2)細胞への細胞表面結合を、フローサイトメトリー系のペプチドパルスアッセイにおいて、評価した。パルスするために、1×106のT2細胞を、1mlのAIM V培養液(ジブコ社製,カタログ番号31035-025)中で16時間、37℃で、10μg/mlのヒト(h)B2M(EMDミリポア社製,カタログ番号475828)及び100μg/mlのMAGE-A4 230-239ペプチドで、培養した。細胞を、染色緩衝液(カルシウム及びマグネシウムを含まないPBS(Irvine Scientific社製,カタログ番号9319)+2%のFBS(セラダイム社製,ロット番号238B15))中で洗浄し、細胞解離緩衝液(ミリポア社製,カタログ番号S-004-C)を使用して回収し、染色緩衝液中に再懸濁した。パルスした細胞(200,000個)を、96ウェルV底プレート(アキシジェン社製,カタログ番号P-96-450V-C-S)に播種し、mAbM34852Nの3倍連続希釈(1.7pM~100nM)で、又は非結合対照抗体(mAb1097)で、4℃で30分間、染色した。次に、細胞を、染色緩衝液で1回洗浄し、5ug/mlのAlexa Fluor647共役Fab’2抗マウスFc特異的二次的抗体(Jackson ImmunoResearch社製,カタログ番号115-606-071)で、4℃で30分間、培養した。最後に、細胞を、1:1000の濃度の緑色蛍光生存色素(50μlのDMSO中で再構築した、Molecular Probes社製,カタログ番号L-34970)で、染色した。次に、細胞を洗浄し、PBSで希釈したBD Cytofix(BD社製,カタログ番号554655)の50%の溶液を使用して、固定した。試料を、Intellicyt iQueフローサイトメーター(Intellicyt社製)にかけ、Forecyte分析ソフトウェア(Intellicyt)を使用して結果を分析して、生細胞のゲーティング後の平均蛍光強度(Mean Fluorescent Intensity、MFI)を計算した。EC50値を計算するために、12ポイントの応答曲線上で4パラメータロジスティック方程式を使用して、MFI値をGraphPad Prismにプロットした。各用量応答曲線の二次抗体のみ(つまり、一次抗体なし)もまた、3倍連続希釈の継続として分析に含まれ、最低用量として表された。用量応答曲線上の最高のMFIと二次的単独ウェルにおけるMFIとの比を取ることによって、シグナル対雑音(S/N)が決定された。EC50値(M)及び最大S/Nを表15に示す。mAbM34852Nは、4.7nMのEC50及び243.3の最大S/Nで結合したが、対照抗体(mAb1097)の結合は、弱くしか検出されなかった。
抗HLA-A 2:MAGE-A4 230-239抗体(mAbM34852N)の、HLA-A*02:01陽性T2(174CEM.T2)細胞への細胞表面結合を、フローサイトメトリー系のペプチドパルスアッセイにおいて、評価した。パルスするために、1×106のT2細胞を、1mlのAIM V培養液(ジブコ社製,カタログ番号31035-025)中で16時間、37℃で、10μg/mlのヒト(h)B2M(EMDミリポア社製,カタログ番号475828)及び100μg/mlのMAGE-A4 230-239ペプチドで、培養した。細胞を、染色緩衝液(カルシウム及びマグネシウムを含まないPBS(Irvine Scientific社製,カタログ番号9319)+2%のFBS(セラダイム社製,ロット番号238B15))中で洗浄し、細胞解離緩衝液(ミリポア社製,カタログ番号S-004-C)を使用して回収し、染色緩衝液中に再懸濁した。パルスした細胞(200,000個)を、96ウェルV底プレート(アキシジェン社製,カタログ番号P-96-450V-C-S)に播種し、mAbM34852Nの3倍連続希釈(1.7pM~100nM)で、又は非結合対照抗体(mAb1097)で、4℃で30分間、染色した。次に、細胞を、染色緩衝液で1回洗浄し、5ug/mlのAlexa Fluor647共役Fab’2抗マウスFc特異的二次的抗体(Jackson ImmunoResearch社製,カタログ番号115-606-071)で、4℃で30分間、培養した。最後に、細胞を、1:1000の濃度の緑色蛍光生存色素(50μlのDMSO中で再構築した、Molecular Probes社製,カタログ番号L-34970)で、染色した。次に、細胞を洗浄し、PBSで希釈したBD Cytofix(BD社製,カタログ番号554655)の50%の溶液を使用して、固定した。試料を、Intellicyt iQueフローサイトメーター(Intellicyt社製)にかけ、Forecyte分析ソフトウェア(Intellicyt)を使用して結果を分析して、生細胞のゲーティング後の平均蛍光強度(Mean Fluorescent Intensity、MFI)を計算した。EC50値を計算するために、12ポイントの応答曲線上で4パラメータロジスティック方程式を使用して、MFI値をGraphPad Prismにプロットした。各用量応答曲線の二次抗体のみ(つまり、一次抗体なし)もまた、3倍連続希釈の継続として分析に含まれ、最低用量として表された。用量応答曲線上の最高のMFIと二次的単独ウェルにおけるMFIとの比を取ることによって、シグナル対雑音(S/N)が決定された。EC50値(M)及び最大S/Nを表15に示す。mAbM34852Nは、4.7nMのEC50及び243.3の最大S/Nで結合したが、対照抗体(mAb1097)の結合は、弱くしか検出されなかった。
インシリコ計算戦略により、HLA-A*02:01と複合体を形成すると予測されるいくつかのMAGE-A4関連ペプチドが同定された。同定されたペプチドを、表16に要約する。これらの関連ペプチドへのHLA-A2:MAGE-A4 230-239抗体(mAbM34852N)及び非結合アイソタイプ対照抗体(mAb1097)の結合を、上記のT2パルシングアッセイにおいて、100nMの単一濃度で評価した。ここでの結合は、非パルス細胞への結合で割ったペプチドパルス細胞への結合のMFI比として表17に示される。mAbM34852Nは、512.9の結合比でMAGE-A4ペプチドに結合したが、アイソタイプ対照mAb1097は、4.3の結合比でそれに結合した。mAbM34852Nは、870.2の結合比でMAGE-A8(232-241)ペプチドに対して同様の結合を有した。しかしながら、残りのペプチドへの検出可能な結合は観察されず、対照抗体結合は全ての試験ペプチドについて<4.3であり、mAbM34852NがMAGE-A4に対する治療薬としての可能性を有することを示した。
実施例11:HLA-A2:MAGE-A4(230-239)アラニン走査
抗HLA-A 2:MAGE-A4 230-239抗体(mAbM34852N)の、HLA-A*02:01陽性T2(174CEM.T2)細胞への細胞表面結合を、フローサイトメトリー系のペプチドパルスアッセイにおいて、評価した。パルスするために、1×106のT2細胞を、10gμg/mlのヒト(h)B2M(EMDミリポア社製,カタログ番号475828)、及び1mlのAIM V培地中のg/mlの100μg/mlのMAGE-A4 230-239ペプチド(ジブコ社製,カタログ31035-025)で、37℃で16時間培養した。細胞を、染色緩衝液(カルシウム及びマグネシウムを含まないPBS(Irvine Scientific社製,カタログ番号9319)+2%のFBS(セラダイム社製,Lot No.238B15)で洗浄し、細胞分離緩衝液(ミリポア社製,カタログ番号S-004-C)を使用して回収し、染色緩衝液に再懸濁した。パルスした細胞(200,000)を、96ウェルV底プレート(アキシジェン社製,カタログ番号P-96-450V-C-S)に播種し、mAbM34852N又は非結合アイソタイプ対照抗体の3倍連続希釈物(1.7pM-100nM)で、4℃で30分間染色した。次に、細胞を、染色緩衝液で1回洗浄し、5ug/mlのAlexa Fluor647共役Fab’2抗マウスFc特異的二次的抗体(Jackson ImmunoResearch社製,カタログ番号115-606-071)で、4℃で30分間、培養した。最後に、細胞を、緑色蛍光生存色素(Molecular Probes社製,カタログ番号L-34970)で染色し、50μlのDMSO中で、1:1000の濃度で再構成した。次に、細胞を洗浄し、PBSで希釈したBD Cytofix(BD社製,カタログ番号554655)の50%の溶液を使用して固定した。試料を、Intellicyt iQueフローサイトメーター(Intellicyt社製)にかけ、Forecyte分析ソフトウェア(Intellicyt)を使用して結果を分析して、生細胞のゲーティング後の平均蛍光強度(Mean Fluorescent Intensity、MFI)を計算した。EC50値を計算するために、12ポイントの応答曲線上で4パラメータロジスティック方程式を使用して、MFI値をGraphPad Prismにプロットした。各用量応答曲線の二次抗体のみ(つまり、一次抗体なし)もまた、3倍連続希釈の継続として分析に含まれ、最低用量として表された。用量応答曲線上の最高のMFIと二次的単独ウェルにおけるMFIとの比を取ることによって、シグナル対雑音(S/N)が決定された。EC50値(M)及び最大S/Nを表19に示す。mAbM34852Nは、4.7nMのEC50及び243.3の最大S/Nで結合したが、対照抗体の結合は、弱くしか検出されなかった。アラニン走査アッセイからの結果は、mAbM34852がMAGE-A4(230-239)ペプチドにわたる結合を示したことを示す。
抗HLA-A 2:MAGE-A4 230-239抗体(mAbM34852N)の、HLA-A*02:01陽性T2(174CEM.T2)細胞への細胞表面結合を、フローサイトメトリー系のペプチドパルスアッセイにおいて、評価した。パルスするために、1×106のT2細胞を、10gμg/mlのヒト(h)B2M(EMDミリポア社製,カタログ番号475828)、及び1mlのAIM V培地中のg/mlの100μg/mlのMAGE-A4 230-239ペプチド(ジブコ社製,カタログ31035-025)で、37℃で16時間培養した。細胞を、染色緩衝液(カルシウム及びマグネシウムを含まないPBS(Irvine Scientific社製,カタログ番号9319)+2%のFBS(セラダイム社製,Lot No.238B15)で洗浄し、細胞分離緩衝液(ミリポア社製,カタログ番号S-004-C)を使用して回収し、染色緩衝液に再懸濁した。パルスした細胞(200,000)を、96ウェルV底プレート(アキシジェン社製,カタログ番号P-96-450V-C-S)に播種し、mAbM34852N又は非結合アイソタイプ対照抗体の3倍連続希釈物(1.7pM-100nM)で、4℃で30分間染色した。次に、細胞を、染色緩衝液で1回洗浄し、5ug/mlのAlexa Fluor647共役Fab’2抗マウスFc特異的二次的抗体(Jackson ImmunoResearch社製,カタログ番号115-606-071)で、4℃で30分間、培養した。最後に、細胞を、緑色蛍光生存色素(Molecular Probes社製,カタログ番号L-34970)で染色し、50μlのDMSO中で、1:1000の濃度で再構成した。次に、細胞を洗浄し、PBSで希釈したBD Cytofix(BD社製,カタログ番号554655)の50%の溶液を使用して固定した。試料を、Intellicyt iQueフローサイトメーター(Intellicyt社製)にかけ、Forecyte分析ソフトウェア(Intellicyt)を使用して結果を分析して、生細胞のゲーティング後の平均蛍光強度(Mean Fluorescent Intensity、MFI)を計算した。EC50値を計算するために、12ポイントの応答曲線上で4パラメータロジスティック方程式を使用して、MFI値をGraphPad Prismにプロットした。各用量応答曲線の二次抗体のみ(つまり、一次抗体なし)もまた、3倍連続希釈の継続として分析に含まれ、最低用量として表された。用量応答曲線上の最高のMFIと二次的単独ウェルにおけるMFIとの比を取ることによって、シグナル対雑音(S/N)が決定された。EC50値(M)及び最大S/Nを表19に示す。mAbM34852Nは、4.7nMのEC50及び243.3の最大S/Nで結合したが、対照抗体の結合は、弱くしか検出されなかった。アラニン走査アッセイからの結果は、mAbM34852がMAGE-A4(230-239)ペプチドにわたる結合を示したことを示す。
配列の説明
注釈付き配列
以下の注釈付き配列において、下線なしのセクションと下線付きのセクションとを交互に配置することで部分を識別する。部分の順序は、各配列の下に列挙されている順序に対応する(すなわち、最初の下線なしのセクションはVLであり、次の下線付きのセクションは(G4S)3であり、次の下線なしのセクションはVHなどである)。
MAGE-A4(286-294)31339N2 VL-VH BBz CAR(配列番号22)
以下の注釈付き配列において、下線なしのセクションと下線付きのセクションとを交互に配置することで部分を識別する。部分の順序は、各配列の下に列挙されている順序に対応する(すなわち、最初の下線なしのセクションはVLであり、次の下線付きのセクションは(G4S)3であり、次の下線なしのセクションはVHなどである)。
MAGE-A4(286-294)31339N2 VL-VH BBz CAR(配列番号22)
(G4S)3
VH
G4S
CD8ヒンジ/TM
4-1BB共刺激領域
CD3Z
MAGE-A4(286-294)31339N2 VL-VH CD28ヒンジ/TM/cytoCD3z CAR(配列番号105)
(G4S)3
VH
G4S
CD28ヒンジ
CD28 TM
CD28共刺激領域
CD3Z
MAGE-A4(286-294)31339N2 VL-VH CD28ヒンジ/TM/cytoCD3z CAR(配列番号121)
本発明は、本明細書に記載される具体的な実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されるものに加えて本発明の様々な変更が、前述の記載から当業者には明らかとなるであろう。このような変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図されている。
Claims (140)
- HLA結合黒色腫関連抗原A4(MAGE-A4)に特異的に結合する抗原結合タンパク質であって、前記抗原結合タンパク質が、軽鎖可変領域(Light Chain Variable Region、LCVR)及び重鎖可変領域(Heavy Chain Variable Region、HCVR)を含み、前記LCVRが、配列番号10又は配列番号115のアミノ酸配列を含むLCVRの相補的決定領域(Complementarity Determining Regions、CDR)を含み、前記HCVRが、配列番号2、配列番号83、又は配列番号107のアミノ酸配列を含むHCVRのCDRを含む、抗原結合タンパク質。
- 前記LCVRが、配列番号10又は配列番号115に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の抗原結合タンパク質。
- 前記HCVRが、配列番号2、配列番号83、又は配列番号107に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1又は2に記載の抗原結合タンパク質。
- 前記MAGE-A4特異的抗原結合タンパク質が、配列番号32のアミノ酸286~294又はその一部と相互作用する、請求項1~3のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
- MAGE-A4特異的キメラ抗原受容体(Chimeric Antigen Receptor、CAR)であって、N末端からC末端に向かって、(a)軽鎖可変領域(LCVR)及び重鎖可変領域(HCVR)を含む抗MAGE-A4単鎖可変断片(scFv)領域を含む、細胞外リガンド結合領域と、(b)ヒンジと、(c)膜貫通領域と、(d)4-1BB共刺激領域又はCD28共刺激領域及びCD3ゼータシグナル伝達領域を含む細胞質領域であって、前記LCVRが、配列番号10又は配列番号115の前記アミノ酸配列を含むLCVRの相補的決定領域(CDR)、及び配列番号2、配列番号83、又は配列番号107のアミノ酸配列を含むHCVRのCDRを含む、細胞質領域と、を含む、MAGE-A4特異的キメラ抗原受容体。
- 前記MAGE-A4特異的CARが、N末端からC末端に向かって、(a)前記細胞外リガンド結合領域と、(b)ヒンジと、(c)膜貫通領域と、(d)共刺激領域及びシグナル伝達領域を含む細胞質領域と、を含む、請求項5に記載のMAGE-A4特異的CAR。
- 前記抗MAGE-A4 scFv領域が、前記LCVRと前記HCVRとの間に第1のリンカを含む、請求項5に記載のMAGE-A4特異的CAR。
- 前記細胞外リガンド結合領域と前記ヒンジとの間に、第2のリンカを更に含む、請求項5~7のいずれか一項に記載のMAGE-A4特異的CAR。
- 前記第1のリンカが、配列番号23~26からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記第2のリンカが、配列番号23~26からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項8に記載のMAGE-A4特異的CAR。
- 前記第1のリンカが、配列番号25の前記アミノ酸配列を含み、前記第2のリンカが、配列番号23の前記アミノ酸配列を含む、請求項9に記載のMAGE-A4特異的CAR。
- 前記ヒンジ、前記膜貫通領域、又はそれらの両方が、CD8αポリペプチド由来である、請求項5~10のいずれか一項に記載のMAGE-A4特異的CAR。
- 前記共刺激領域が、4-1BB共刺激領域を含む、請求項5~11のいずれか一項に記載のMAGE-A4特異的CAR。
- 前記共刺激領域が、CD28共刺激領域を含む、請求項5~11のいずれか一項に記載のMAGE-A4特異的CAR。
- 前記ヒンジ、前記膜貫通領域、又はそれらの両方が、CD28ポリペプチド由来である、請求項5~10、12及び13のいずれか一項に記載のMAGE-A4特異的CAR。
- 前記ヒンジが、配列番号27の前記アミノ酸配列を含む、請求項5~12のいずれか一項に記載のMAGE-A4特異的CAR。
- 前記膜貫通領域が、配列番号28の前記アミノ酸配列を含む、請求項5~12のいずれか一項に記載のMAGE-A4特異的CAR。
- 前記4-1BB共刺激領域が、配列番号29の前記アミノ酸配列を含む、請求項5~12のいずれか一項に記載のMAGE-A4特異的CAR。
- 前記ヒンジが、配列番号34の前記アミノ酸配列を含む、請求項5~10及び12~14のいずれか一項に記載のMAGE-A4特異的CAR。
- 前記膜貫通領域が、配列番号36の前記アミノ酸配列を含む、請求項5~10、12~14、及び18のいずれか一項に記載のMAGE-A4特異的CAR。
- 前記CD28共刺激領域が、配列番号38の前記アミノ酸配列を含む、請求項5~10、及び12~14、18及び19のいずれか一項に記載のMAGE-A4特異的CAR。
- 前記シグナル伝達領域が、CD3ゼータシグナル伝達領域を含む、請求項5~20のいずれか一項に記載のMAGE-A4特異的CAR。
- 前記CD3ゼータシグナル伝達領域が、配列番号30の前記アミノ酸配列を含む、請求項21に記載のMAGE-A4特異的CAR。
- 前記抗原結合タンパク質が、MAGE-A4特異的抗体、又はその抗原結合断片である、請求項1~4のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
- 前記抗原結合タンパク質又は前記MAGE-A4特異的CARが、配列番号2又は配列番号83に記載の前記アミノ酸配列を含むHCVR内に含有される3つの重鎖CDR(HCDR1、HCDR2、及びHCDR3)を含む、請求項1~4及び23のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質又は請求項5~22のいずれか一項に記載のMAGE-A4特異的CAR。
- HCDR1が、配列番号4に記載の前記アミノ酸配列を含み、HCDR2が、配列番号6に記載の前記アミノ酸配列を含み、HCDR3が、配列番号8に記載の前記アミノ酸配列を含む、請求項24に記載の抗原結合タンパク質又はMAGE-A4特異的CAR。
- 前記HCVRが、配列番号2に記載の前記アミノ酸配列を含む、請求項25に記載の抗原結合タンパク質又はMAGE-A4特異的CAR。
- 前記HCVRが、配列番号83に記載の前記アミノ酸配列を含む、請求項25に記載の抗原結合タンパク質又はMAGE-A4特異的CAR。
- 前記抗原結合タンパク質又は前記MAGE-A4特異的CARが、配列番号107に記載の前記アミノ酸配列を含むHCVR内に含有される3つの重鎖CDR(HCDR1、HCDR2、及びHCDR3)を含む、請求項1~4及び23のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質又は請求項5~22のいずれか一項に記載のMAGE-A4特異的CAR。
- HCDR1が、配列番号109に記載の前記アミノ酸配列を含み、HCDR2が、配列番号111に記載の前記アミノ酸配列を含み、HCDR3が、配列番号113に記載の前記アミノ酸配列を含む、請求項28に記載の抗原結合タンパク質又はMAGE-A4特異的CAR。
- 前記HCVRが、配列番号107に記載の前記アミノ酸配列を含む、請求項28に記載の抗原結合タンパク質又はMAGE-A4特異的CAR。
- 前記抗原結合タンパク質又は前記MAGE-A4特異的CARが、配列番号10又は配列番号115に記載の前記アミノ酸配列を含むLCVR内に含有される3つの軽鎖CDR(LCDR1、LCDR2、及びLCDR3)を含む、請求項1~4及び23のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項5~22のいずれか一項に記載のMAGE-A4特異的CAR、又は請求項24~29のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質若しくはMAGE-A4特異的CAR。
- LCDR1が、配列番号12に記載の前記アミノ酸配列を含み、LCDR2が、配列番号14に記載の前記アミノ酸配列を含み、LCDR3が、配列番号16に記載の前記アミノ酸配列を含む、請求項30に記載の抗原結合タンパク質又はMAGE-A4特異的CAR。
- 前記LCVRが、配列番号10に記載の前記アミノ酸配列を含む、請求項31に記載の抗原結合タンパク質又はMAGE-A4特異的CAR。
- LCDR1が、配列番号117に記載の前記アミノ酸配列を含み、LCDR2が、配列番号14に記載の前記アミノ酸配列を含み、LCDR3が、配列番号119に記載の前記アミノ酸配列を含む、請求項30に記載の抗原結合タンパク質又はMAGE-A4特異的CAR。
- 前記LCVRが、配列番号115に記載の前記アミノ酸配列を含む、請求項33に記載の抗原結合タンパク質又はMAGE-A4特異的CAR。
- 前記抗原結合タンパク質又は前記MAGE-A4特異的CARが、配列番号2に記載の前記アミノ酸配列を含むHCVR及び配列番号10に記載の前記アミノ酸配列を含むLCVRを含む、請求項1~4及び23のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質又は請求項5~22のいずれか一項に記載のMAGE-A4特異的CAR。
- 前記抗原結合タンパク質又は前記MAGE-A4特異的CARが、配列番号83に記載の前記アミノ酸配列を含むHCVR及び配列番号10に記載の前記アミノ酸配列を含むLCVRを含む、請求項1~4及び23のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質又は請求項5~22のいずれか一項に記載のMAGE-A4特異的CAR。
- 前記抗原結合タンパク質又は前記MAGE-A4特異的CARが、配列番号107に記載の前記アミノ酸配列を含むHCVR及び配列番号115に記載の前記アミノ酸配列を含むLCVRを含む、請求項1~4及び23のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質又は請求項5~22のいずれか一項に記載のMAGE-A4特異的CAR。
- 配列番号22の前記アミノ酸配列を含む、請求項5に記載のMAGE-A4特異的CAR。
- 配列番号105の前記アミノ酸配列を含む、請求項5に記載のMAGE-A4特異的CAR。
- 配列番号120の前記アミノ酸配列を含む、請求項5に記載のMAGE-A4特異的CAR。
- 配列番号121の前記アミノ酸配列を含む、請求項5に記載のMAGE-A4特異的CAR。
- 前記抗原結合タンパク質又は前記MAGE-A4特異的CARが、配列番号32の286~294位の1種以上のアミノ酸に特異的に結合する、請求項1~4及び23のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項5~22及び38~41のいずれか一項に記載のMAGE-A4特異的CAR、又は請求項24~37のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質若しくはMAGE-A4特異的CAR。
- 前記抗原結合タンパク質又は前記MAGE-A4特異的CARが、前記HLAの1種以上のアミノ酸と相互作用する、請求項1~4及び23のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項5~22及び38~41のいずれか一項に記載のMAGE-A4特異的CAR、又は請求項24~37及び42のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質若しくはMAGE-A4特異的CAR。
- 前記HLAがHLA-A2である、請求項1~4及び23のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項5~22及び38~41のいずれか一項に記載のMAGE-A4特異的CAR、又は請求項24~37、42及び43のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質若しくはMAGE-A4特異的CAR。
- 請求項1~4及び23のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項5~22及び38~41のいずれか一項に記載のMAGE-A4特異的CAR、又は請求項24~37及び42~44のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質若しくはMAGE-A4特異的CARをコードする、単離された核酸分子。
- 配列番号21のヌクレオチド配列を含む、請求項45に記載の単離された核酸分子。
- 配列番号104のヌクレオチド配列を含む、請求項45に記載の単離された核酸分子。
- 請求項45~47のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
- 前記ベクターが、DNAベクター、RNAベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はレトロウイルスベクターである、請求項48に記載のベクター。
- 前記ベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項49に記載のベクター。
- 請求項45~47のいずれか一項に記載の核酸分子、又は請求項48~50のいずれか一項に記載のベクターを含む、細胞。
- 前記細胞が、ヒトT細胞である、請求項51に記載の細胞。
- 請求項1~4及び23のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項5~22及び38~41のいずれか一項に記載のMAGE-A4特異的CAR、又は請求項24~37及び42~44のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質若しくはMAGE-A4特異的CARを含む、操作された細胞。
- 免疫細胞である、請求項53に記載の操作された細胞。
- 前記免疫細胞が、免疫エフェクタ細胞である、請求項54に記載の操作された細胞。
- 前記免疫エフェクタ細胞が、Tリンパ球である、請求項55に記載の操作された細胞。
- 前記Tリンパ球が、炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、調節性Tリンパ球、又はヘルパーTリンパ球である、請求項56に記載の操作された細胞。
- CD8+細胞傷害性Tリンパ球である、請求項57に記載の操作された細胞。
- MAGE-A4を発現する癌の治療において使用するための、請求項53~58のいずれか一項に記載の操作された細胞。
- 前記MAGE-A4を発現する癌が、多発性骨髄腫である、請求項59に記載の操作された細胞。
- 前記MAGE-A4を発現する癌が、黒色腫である、請求項59に記載の操作された細胞。
- 操作されたヒトT細胞であって、N末端からC末端に向かって、(a)軽鎖可変領域(LCVR)及び重鎖可変領域(HCVR)を含む抗MAGE-A4単鎖可変断片(scFv)領域を含む細胞外リガンド結合領域と、(b)ヒンジと、(c)膜貫通領域と、(d)4-1BB共刺激領域又はCD28共刺激領域及びCD3ゼータシグナル伝達領域を含む細胞質領域であって、前記LCVRが、配列番号10又は配列番号115の前記アミノ酸配列を含むLCVRの相補的決定領域(CDR)、及び配列番号2、配列番号83、又は配列番号107のアミノ酸配列を含むHCVRのCDRを含む、細胞質領域と、を含む、キメラ抗原受容体を含む、操作されたヒトT細胞。
- 前記抗MAGE-A4 scFvが、配列番号32の286~294位の1つ以上のアミノ酸残基に特異的に結合する、請求項62に記載の操作されたヒトT細胞。
- 前記scFv領域が、配列番号2/10の前記アミノ酸配列を含むHCVR/LCVRアミノ酸配列対を含む、請求項62又は63に記載の操作されたヒトT細胞。
- 前記scFv領域が、配列番号2/83の前記アミノ酸配列を含むHCVR/LCVRアミノ酸配列対を含む、請求項62又は63に記載の操作されたヒトT細胞。
- 前記scFv領域が、配列番号107/115の前記アミノ酸配列を含むHCVR/LCVRアミノ酸配列対を含む、請求項62又は63に記載の操作されたヒトT細胞。
- 前記HCVRが、3つの重鎖CDR(HCDR1、HCDR2、及びHCDR3)を含み、前記LCVRが、3つの軽鎖CDR(LCDR1、LCDR2、及びLCDR3)を含み、HCDR1が、配列番号4に記載の前記アミノ酸配列を含み、HCDR2が、配列番号6に記載の前記アミノ酸配列を含み、HCDR3が、配列番号8に記載の前記アミノ酸配列を含み、LCDR1が、配列番号12に記載の前記アミノ酸配列を含み、LCDR2が、配列番号14に記載の前記アミノ酸配列を含み、LCDR3が、配列番号16に記載の前記アミノ酸配列を含む、請求項64又は65に記載の操作されたヒトT細胞。
- 前記HCVRが、3つの重鎖CDR(HCDR1、HCDR2、及びHCDR3)を含み、前記LCVRが、3つの軽鎖CDR(LCDR1、LCDR2、及びLCDR3)を含み、HCDR1が、配列番号109に記載の前記アミノ酸配列を含み、HCDR2が、配列番号111に記載の前記アミノ酸配列を含み、HCDR3が、配列番号113に記載の前記アミノ酸配列を含み、LCDR1が、配列番号117に記載の前記アミノ酸配列を含み、LCDR2が、配列番号14に記載の前記アミノ酸配列を含み、LCDR3が、配列番号119に記載の前記アミノ酸配列を含む、請求項66に記載の操作されたヒトT細胞。
- 前記ヒンジが、配列番号27の前記アミノ酸配列を含む、請求項62~68のいずれか一項に記載の操作されたヒトT細胞。
- 前記膜貫通領域が、配列番号28の前記アミノ酸配列を含む、請求項62~69のいずれか一項に記載の操作されたヒトT細胞。
- 前記4-1BB共刺激領域が、配列番号29の前記アミノ酸配列を含む、請求項62~70のいずれか一項に記載の操作されたヒトT細胞。
- 前記ヒンジが、配列番号34の前記アミノ酸配列を含む、請求項62~68のいずれか一項に記載の操作されたヒトT細胞。
- 前記膜貫通領域が、配列番号36の前記アミノ酸配列を含む、請求項62~68及び72のいずれか一項に記載の操作されたヒトT細胞。
- 前記CD28共刺激領域が、配列番号38の前記アミノ酸配列を含む、請求項62~68、72及び73のいずれか一項に記載の操作されたヒトT細胞。
- 前記CD3ゼータシグナル伝達領域が、配列番号30の前記アミノ酸配列を含む、請求項62~74のいずれか一項に記載の操作されたヒトT細胞。
- 配列番号22の前記アミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む、請求項62に記載の操作されたヒトT細胞。
- 配列番号105の前記アミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む、請求項62に記載の操作されたヒトT細胞。
- 配列番号120の前記アミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む、請求項62に記載の操作されたヒトT細胞。
- 配列番号121の前記アミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む、請求項62に記載の操作されたヒトT細胞。
- 遺伝子修飾ヒトT細胞及び薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物であって、前記遺伝子修飾ヒトT細胞が、請求項1~4及び23のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項5~22及び38~41のいずれか一項に記載のMAGE-A4特異的CAR、又は請求項24~37及び42~44のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質若しくはMAGE-A4特異的CARを含む、医薬組成物。
- 請求項53~58のいずれか一項に記載の操作された細胞及び薬学的に許容可能なキャリアを含む、医薬組成物。
- 請求項62~79のいずれか一項に記載の操作されたヒトT細胞及び薬学的に許容可能なキャリアを含む、医薬組成物。
- MAGE-A4を発現する癌の前記治療において使用するための、請求項80~82のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記MAGE-A4を発現する癌が、多発性骨髄腫である、請求項83に記載の医薬組成物。
- 前記MAGE-A4を発現する癌が、黒色腫である、請求項83に記載の医薬組成物。
- MAGE-A4を発現する癌の前記治療のための薬剤の製造における、請求項1~4及び23のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質の使用、請求項5~22及び38~41のいずれか一項に記載のMAGE-A4特異的CARの使用、又は請求項24~37及び42~44のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質若しくはMAGE-A4特異的CARの使用、請求項45~47のいずれか一項に記載の核酸の使用、請求項48~50のいずれか一項に記載のベクターの使用、請求項51又は52に記載の細胞の使用、請求項53~58のいずれか一項に記載の操作された細胞の使用、又は請求項62~79のいずれか一項に記載の操作されたヒトT細胞の使用。
- 前記MAGE-A4を発現する癌が、多発性骨髄腫である、請求項86に記載の使用。
- 前記MAGE-A4を発現する癌が、黒色腫である、請求項86に記載の使用。
- 対象においてTリンパ球活性を増強する方法であって、請求項1~4及び23のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項5~22及び38~41のいずれか一項に記載のMAGE-A4特異的CAR、又は請求項24~37及び42~44のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質若しくはMAGE-A4特異的CAR、を含むTリンパ球を、前記対象に導入することを含む、方法。
- 癌に罹患している対象を治療する方法であって、請求項1~4及び23のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項5~22及び38~41のいずれか一項に記載のMAGE-A4特異的CAR、又は請求項24~37及び42~44のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質若しくはMAGE-A4特異的CAR、を含む治療有効量のTリンパ球を、前記対象に導入することを含む、方法。
- 対象における標的細胞集団又は組織に対するT細胞媒介性免疫応答を刺激する方法であって、請求項1~4及び23のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項5~22及び38~41のいずれか一項に記載のMAGE-A4特異的CAR、又は請求項24~37及び42~44のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質若しくはMAGE-A4特異的CARを発現するように遺伝子修飾された細胞の有効量を、前記対象に投与することを含む、方法。
- 対象において抗腫瘍免疫を提供する方法であって、前記方法が、請求項1~4及び23のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項5~22及び38~41のいずれか一項に記載のMAGE-A4特異的CAR、又は請求項24~37及び42~44のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質若しくはMAGE-A4特異的CARを発現するように遺伝子修飾された細胞の有効量を、前記対象に投与することを含む、方法。
- 前記対象がヒトである、請求項89~92のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が、多発性骨髄腫、滑膜肉腫、食道癌、頭頸部癌、肺癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌、胃癌、子宮頸癌、乳癌、又は黒色腫を有する、請求項89~93のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が、多発性骨髄腫を有する、請求項94に記載の方法。
- HLA結合MAGE-A4又はMAGE-A4特異的キメラ抗原受容体(CAR)に特異的に結合する抗原結合タンパク質を発現するように細胞集団を操作する方法であって、
(a)請求項1~4及び23のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項5~22及び38~41のいずれか一項に記載のMAGE-A4特異的CAR、又は請求項24~37及び42~44のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質若しくはMAGE-A4特異的CARをコードする核酸分子を、免疫細胞集団に導入することと、
(b)前記核酸分子を発現する条件下で、前記免疫細胞集団を培養することと、
(c)前記細胞の表面で、前記MAGE-A4特異的抗原結合タンパク質を発現する前記免疫細胞を単離することと、を含む、方法。 - 前記核酸分子を導入する前に、対象から前記免疫細胞集団を取得することを更に含む、請求項96に記載の方法。
- 対象において、MAGE-A4を発現する癌を治療する方法であって、
(a)請求項96又は97に従って、細胞集団を操作することと、
(b)前記キメラ抗原受容体を発現する前記細胞集団を、前記対象に再導入することと、を含む、方法。 - 前記MAGE-A4を発現する癌が、多発性骨髄腫である、請求項98に記載の方法。
- 単離された抗原結合タンパク質であって、前記抗原結合タンパク質が、HLA結合黒色腫関連抗原A4(MAGE-A4)に特異的に結合する第1の抗原結合領域と、ヒトCD3に特異的に結合する第2の抗原結合領域と、を含み、前記第1の抗原結合領域が、重鎖可変領域(A1-HCVR)に含有される3つの重鎖相補的決定領域(CDR)(A1-HCDR1、A1-HCDR2、及びA1-HCDR3)と、軽鎖可変領域(A1-LCVR)に含有される3つの軽鎖CDR(A1-LCDR1、A1-LCDR2、及びA1-LCDR3)と、を含み、前記第2の抗原結合領域が、重鎖可変領域(A2-HCVR)に含有される3つの重鎖CDR(A2-HCDR1、A2-HCDR2、及びA2-HCDR3)と、軽鎖可変領域(A2-LCVR)に含有される3つの軽鎖CDR(A2-LCDR1、A2-LCDR2、及びA2-LCDR3)と、を含み、A1-HCVRが、配列番号2の前記アミノ酸配列を含み、A1-LCVRが、配列番号10の前記アミノ酸配列を含み、A2-HCVRが、配列番号55の前記アミノ酸配列を含み、A2-LCVRが、配列番号10の前記アミノ酸配列を含む、抗原結合タンパク質。
- 単離された抗原結合タンパク質であって、前記抗原結合タンパク質が、HLA結合黒色腫関連抗原A4(MAGE-A4)に特異的に結合する第1の抗原結合領域と、ヒトCD3に特異的に結合する第2の抗原結合領域と、を含み、前記第1の抗原結合領域が、重鎖可変領域(A1-HCVR)に含有される3つの重鎖相補的決定領域(CDR)(A1-HCDR1、A1-HCDR2、及びA1-HCDR3)と、軽鎖可変領域(A1-LCVR)に含有される3つの軽鎖CDR(A1-LCDR1、A1-LCDR2、及びA1-LCDR3)と、を含み、前記第2の抗原結合領域が、重鎖可変領域(A2-HCVR)に含有される3つの重鎖CDR(A2-HCDR1、A2-HCDR2、及びA2-HCDR3)と、軽鎖可変領域(A2-LCVR)に含有される3つの軽鎖CDR(A2-LCDR1、A2-LCDR2、及びA2-LCDR3)と、を含み、A1-HCVRが、配列番号2の前記アミノ酸配列を含み、A1-LCVRが、配列番号10の前記アミノ酸配列を含み、A2-HCVRが、配列番号73の前記アミノ酸配列を含み、A2-LCVRが、配列番号10の前記アミノ酸配列を含む、抗原結合タンパク質。
- 前記抗原結合タンパク質が、配列番号32のアミノ酸286~294又はその一部と相互作用する、請求項100又は101に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- 前記単離された抗原結合タンパク質が、CARである、請求項100又は101に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- 前記単離された抗原結合タンパク質が、二重特異性抗体である、請求項100又は101に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- 前記単離された抗原結合タンパク質が、配列番号32のアミノ酸286~294又はその一部と相互作用する、請求項100~104のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- 前記単離された抗原結合タンパク質が、CD3と相互作用する、請求項100~105のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- 前記単離された抗原結合タンパク質が、配列番号2又は配列番号83に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(HCVR)を含む、請求項100又は102~106のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- 前記単離された抗原結合タンパク質が、配列番号55と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(HCVR)を含む、請求項100又は102~106のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- 前記単離された抗原結合タンパク質が、配列番号73に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(HCVR)を含む、請求項101~106のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- 請求項1~4及び23のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項5~22及び38~41のいずれか一項に記載のMAGE-A4特異的CAR、又は請求項24~37及び42~44のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質若しくはMAGE-A4特異的CARと同じ抗原決定基に結合する、単離された抗原結合タンパク質。
- 請求項1~4及び23のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項5~22及び38~41のいずれか一項に記載のMAGE-A4特異的CAR、又は請求項24~37及び42~44のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質若しくはMAGE-A4特異的CARと結合について競合する、単離された抗原結合タンパク質。
- 前記単離された抗原結合タンパク質が、CARである、請求項110又は111に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- 前記単離された抗原結合タンパク質が、二重特異性抗体である、請求項110又は111に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- 前記単離された抗原結合タンパク質が、配列番号32のアミノ酸286~294又はその一部と相互作用する、請求項111~113のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- 前記単離された抗原結合タンパク質が、CD3と相互作用する、請求項113又は114に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- 前記単離された抗原結合タンパク質が、それぞれ、配列番号4、6及び8の前記アミノ酸配列を含む3つの重鎖CDRである、HCDR1、HCDR2、及びHCDR3を含む重鎖可変領域(HCVR)を含む、請求項100~115のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- 前記単離された抗原結合タンパク質が、それぞれ、配列番号57、59及び61の前記アミノ酸配列を含む3つの重鎖CDRである、HCDR1、HCDR2、及びHCDR3を含む前記二重特異性抗体の別のアームに対応するHCVRを含む、請求項100又は102~116のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- 前記単離された抗原結合タンパク質が、それぞれ、配列番号75、77及び79の前記アミノ酸配列を含む3つの重鎖CDRを含む前記二重特異性抗体の別のアームに対応するHCVRを含む、請求項101~116のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- 前記単離された抗原結合タンパク質が、配列番号10に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(LCVR)及び/又は配列番号63に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むLCVRを含む、請求項100~118のいずれか一項に記載の単離された抗原結合タンパク質。
- 黒色腫関連抗原A4(MAGE-A4)ポリペプチドに特異的に結合する、単離された組換え抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体が、以下の特徴、
(a)約2x10-9M未満のEC50で、前記MAGE-A4ポリペプチドに結合すること、
(b)前記MAGE-A4ポリペプチドに特異的に結合しない単離された組換え抗体と比較して、腫瘍細胞生存率を低下させる能力を示すこと、及び/又は
(c)(i)表1に記載のHCVRに対して少なくとも約90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(HCVR)内に含有される3つの重鎖相補的決定領域(CDR)(HCDR1、HCDR2、及びHCDR3)、並びに(ii)表1に記載のLCVRに対して少なくとも約90%の配列同一性を有する前記アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(LCVR)内に含有される3つの軽鎖CDR(LCDR1、LCDR2、及びLCDR3)を含むこと、のうちの1つ以上を有する、単離された組換え抗体又はその抗原結合断片。 - 前記MAGE-A4ポリペプチドが、HLA-A2結合MAGE-A4ポリペプチドである、請求項120に記載の抗体又は抗原結合断片。
- 配列番号2、配列番号83、又は配列番号107のアミノ酸配列を有するHCVRを含む、請求項120又は121に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
- 配列番号10又は配列番号115のアミノ酸配列を有するLCVRを含む、請求項120~122のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
- 配列番号2/10、配列番号83/10、又は配列番号107/115のHCVR/LCVRアミノ酸配列対を含む、請求項120~123のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
- (a)配列番号4のアミノ酸配列を有するHCDR1領域、
(b)配列番号6のアミノ酸配列を有するHCDR2領域、
(c)配列番号8のアミノ酸配列を有するHCDR3領域、
(d)配列番号12のアミノ酸配列を有するLCDR1領域、
(e)配列番号14のアミノ酸配列を有するLCDR2領域、及び
(f)配列番号16のアミノ酸配列を有するLCDR3領域、を含む、請求項120~124のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。 - (a)配列番号109のアミノ酸配列を有するHCDR1領域、
(b)配列番号111のアミノ酸配列を有するHCDR2領域、
(c)配列番号113のアミノ酸配列を有するHCDR3領域、
(d)配列番号117のアミノ酸配列を有するLCDR1領域、
(e)配列番号14のアミノ酸配列を有するLCDR2領域、及び
(f)配列番号119のアミノ酸配列を有するLCDR3領域、を含む、請求項120~124のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。 - IgG1抗体である、請求項120~126のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
- IgG4抗体である、請求項120~126のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
- 二重特異性抗体である、請求項120~128のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片。
- 黒色腫関連抗原A4(MAGE-A4)ポリペプチドに特異的に結合する第1の抗原結合領域と、CD3ポリペプチドに特異的に結合する第2の抗原結合領域と、を含む、単離された組換え抗体又はその抗原結合断片であって、
(a)MAGE-A4に結合する前記第1の抗原結合領域(A1)が、3つの重鎖相補的決定領域(A1-HCDR1、A1-HCDR2、及びA1-HCDR3)、及び3つの軽鎖相補的決定領域(A1-LCDR1、A1-LCDR2、及びA1-LCDR3)を含み、
A1-HCDR1が、配列番号4又は配列番号109の前記アミノ酸配列を含み、
A1-HCDR2が、配列番号6又は配列番号111の前記アミノ酸配列を含み、
A1-HCDR3が、配列番号8又は配列番号113の前記アミノ酸配列を含み、
A1-LCDR1が、配列番号12、配列番号65、又は配列番号117の前記アミノ酸配列を含み、
A1-LCDR2が、配列番号14の前記アミノ酸配列を含み、
A1-LCDR3が、配列番号16、配列番号67又は配列番号119の前記アミノ酸配列を含み、
(b)CD3に結合する前記第2の抗原結合領域(A2)が、3つの重鎖相補的決定領域(A2-HCDR1、A2-HCDR2、及びA2-HCDR3)、及び3つの軽鎖相補的決定領域(A2-LCDR1、A2-LCDR2、及びA2-LCDR3)を含み、
A2-HCDR1が、配列番号57又は配列番号75の前記アミノ酸配列を含み、
A2-HCDR2が、配列番号59又は配列番号77の前記アミノ酸配列を含み、
A2-HCDR3が、配列番号61又は配列番号79の前記アミノ酸配列を含み、
A2-LCDR1が、配列番号12、配列番号65、又は配列番号117の前記アミノ酸配列を含み、
A2-LCDR2が、配列番号14の前記アミノ酸配列を含み、
A2-LCDR3が、配列番号16、配列番号67、又は配列番号119の前記アミノ酸配列を含む、単離された組換え抗体又はその抗原結合断片。 - 請求項120~130のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容可能なキャリア又は希釈剤と、を含む、医薬組成物。
- 前記医薬組成物が、第2の治療薬を更に含む、請求項131に記載の医薬組成物。
- 前記第2の治療薬が、抗腫瘍剤、ステロイド、及び標的療法からなる群から選択される、請求項132に記載の医薬組成物。
- 請求項120~133のいずれか一項に記載の抗体の1つ以上のHCVR及び/又は1つ以上のLCVRをコードするポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド分子。
- 請求項134に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 請求項135に記載のベクターを含む、細胞。
- MAGE-A4を発現する癌を治療する方法であって、請求項120~130のいずれか一項に記載の抗体若しくは抗原結合断片、又は請求項131~133のいずれか一項に記載の医薬組成物を、対象に投与することを含む、方法。
- 前記医薬組成物が、第2の治療薬と組み合わせて投与される、請求項137に記載の方法。
- 前記第2の治療薬が、抗腫瘍剤、ステロイド、及び標的療法からなる群から選択される、請求項138に記載の方法。
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