DE3751682T2

DE3751682T2 - Infektiöses System zur Arzneimittelabgabe

Info

Publication number: DE3751682T2
Application number: DE3751682T
Authority: DE
Inventors: Michael Kriegler; Francis P Mccormick
Original assignee: Institute of Cancer Research; Cetus Oncology Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1986-04-24
Filing date: 1987-04-24
Publication date: 1996-09-12
Anticipated expiration: 2007-04-25
Also published as: JP2843318B2; ES2083353T3; DE3751682D1; ATE133449T1; US5652130A; JPH10287590A; HK38497A; EP0243204A2; JP2773833B2; US5635399A; EP0243204B1; JPS63157985A; EP0243204A3; GR3019460T3; CA1310924C

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung der rekombinanten Technik, um eine Wirkstoffabgabe zu bewirken. Insbesondere betrifft sie die Verwendung von eingefangenen ("commandeered") Virushüllen zur Abgabe von Expressionssystemen für einen gewünschten Wirkstoff, wie den Tumornekrosefaktor (TNF).
Es wurden so viele Versuche unternommen, um die Abgabe von Wirkstoffen an gewunschte Zielzellen zu bewirken, daß ein Überblick auf diesem Gebiet sowohl unangebracht als auch nicht hilfreich sein würde. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß in der Tat alle Abgabesysteme, die gegenwärtig verwendet werden, das Problem der Durchdringung von Barrieren zum Kreislaufsystem des Organismus betreffen und nicht das Problem der Aufnahme durch spezielle Zellen, die das Ziel der Behandlung mit dem Wirkstoff sind. So führt in der einfachsten Form der Gewährleistung einer Durchdringung dieser Barrieren, der intravenösen Injektion einer Wirkstofflösung, die Wirkstoffabgabe nur dazu, daß der Wirkstoff im Blut kreist, aber ohne daß irgendein spezieller Mechanismus bereitgestellt wird, der gewährleistet, daß der Wirkstoff seinen Weg in das Cytoplasma oder den Kern einer Zelle findet, die entweder damit behandelt oder abgetötet werden soll. Während eine spezifische Zelle zielgerecht angegangen werden kann, z.B. durch die Verwendung von Immuntoxinen, wird entweder die Durchdringung von zellulären Membranen in die inneren Zellen von Interesse durch irgendeinen Mechanismus bewirkt, der von den Zellen selbst zur Verfügung gestellt wird, oder die geeignete Behandlungsstelle liegt extrazellulär.
Es steht natürlich fest, daß virale Teilchen fremde Nucleinsäuren und Proteine in Zellen im normalen Verlauf einer Infektion einschleusen können. Die Verwendung von viralen Teilchen, um genetisches Material in Zielzellen eines Säugers zum Zwecke der Gentherapie zu transportieren, scheint der hauptsächliche Ansatz zu sein, der gegenwärtig zur Entwicklung dieser Technik verfolgt wird. Vgl. z.B. McCormick, D., Bioltechnology (1985), 3:669-693. Zusätzlich konnten Lang, R.A., et al., Cell (1985) 43:531-542, ein ähnliches System mit GM-CSF verwenden, um autokrines Wachstum in einer murinen Blutzellinie zu induzieren. In der Arbeit von Lang wurde eine GM-CSF-codierende cDNA in einen Vektor auf der Basis des Moloney-Maus-Leukämievirus unter der Kontrolle des Promotors/Enhancers der viralen langen terminalen Wiederholung inseriert, und das infektiöse helferfreie Virus wurde durch Transfektion in die Ψ2-Verpackungszellinie produziert. Das so gebildete GMV-Virus konnte eine GM- CSF-Produktion in einer hämopoetischen Zellinie bewirken. Diese Fähigkeit wurde bisher jedoch nicht verwendet, um bestimmte Proteinwirkstoffe in einen intakten Organismus zu transportieren.
Insbesondere Retroviren wurden als Vektor zur Insertion eines Fremdgens verwendet, und die allgemeinen Parameter dieser Verwendung sind gegenwärtig recht gut verstanden: Retroviren bestehen aus einem einzelsträngigen RNA-Genom, das in eine Proteinhülle eingekapselt ist. Das Genom als solches, das vom 5'- zum 3'-Ende gelesen wird, enthält ein "Cap"(-Nucleotid), einen nicht-translatierten 5'-Bereich, ein RNA-Segment mit der Bezeichnung "Ψ", das für die Verpackung der RNA in das Protein notwendig ist - d.h. eine Verpackungsstelle, und dann die codierenden Sequenzen für mehrere Proteine - das retrovirale Core-Protein (gag); reverse Transkriptase zur erleichterten Bildung einer Zwischenstufe, bestehend aus einem DNA-Transkript (pol) und der Virushülle oder dem Capsidprotein (env), wobei auf alle diese Bestandteile einige nicht-translatierte 3'-Sequenzen folgen. Die drei viralen Proteine werden für die Infektiosität des viralen Genoms benötigt. Die Verpackungsstelle wird benötigt, um weitere infektiöse Viren zu produzieren.
Retroviren erfahren ein "provirales" Stadium, das eine doppelsträngige cDNA-Kopie des Protein-codierenden Bereiches der RNA enthält. Jedoch sind in diesem Stadium die nicht-translatierten 3'- und 5'-Bereiche so modifiziert, daß an jedem der beiden Enden dieser Protein-codierenden cDNA eine lange terminale Wiederholung (LTR) erhalten wird, die die geeigneten Promotor- und Enhancer-Sequenzen für eine DNA-Transkription sowie Transkriptions-Terminations-Sequenzen in funktionellen Positionen bezüglich der codierenden Anteile bereitstellt.
Bei einer üblichen Infektion kann die provirale doppelsträngige cDNA in das Wirtszellgenom integriert werden und von da aus die Produktion weiterer Virusteilchen, die das RNA-Genom verpackt in ihrer Proteinkapsel enthalten, bewirken. Damit dieses Verfahren stattfindet, ist es wichtig, daß die Ψ-Verpackungsstelle in dem Provirus vorhanden ist. Andere hatten die Idee, die Protein-codierenden Sequenzen der Retroviren durch diejenigen für ein gewünschtes Protein zu ersetzen, so daß die Expressionssysteme des Virus verwendet werden, wenn das modifizierte Virus Wirtszellen infiziert. Vgl. z.B. US-Patent 4 405 712 und Lang (a.a.O.). Um dies zu erzielen, benötigt das modifizierte virale Genom jedoch ein Helfervirus, das die Capsidproteine synthetisieren und die RNA-Transkripte der Fremd-DNA verpacken kann.
So wird für die "Gentherapie" die provirale DNA-Form in einen geeigneten Vektor inseriert, repliziert und in virale Hüllen mit Hilfe eines Helfervirus verpackt. Bezüglich einer allgemeinen Übersicht vgl. Anderson, W.F., Science (1984) 226:401-409; Coffin, J., "Genome Structure", in RNA Tumor Viruses, Bd. 2, Weiss et al., Hrsg., 2. Aufl. (1985), Cold Spring Harbor, N.Y.
Die am häufigsten verwendeten Retroviren zur Untersuchung der Gentherapie waren entweder das Maus-Sarcomvirus (MSV) oder das Molony-Maus- Leukämievirus (MoMLV) (Mann, R., et al., Cell (1983) 33:153-159). Die provirale Form dieser Retroviren wird isoliert und in mehr oder weniger übliche bakterielle clonierungsvektoren zur Amplifikation inseriert. Die provirale Insertion, die die gag-, pol- und env-codierende mRNA, flankiert von langen terminalen Wiederholungen, die die Kontrollsequenzen zusammen mit einer Verpackungsstelle enthalten, enthält, wird dann so verändert, daß der Bereich, der die Protein-codierende RNA enthält, durch das gewünschte Fremdgen ersetzt wird. Wenn Wirtszellen, die mit dem vollständigen Virus oder mit einem defekten Virus, dem nur die Verpackungsstelle fehlt, infiziert wurden, mit dieser DNA transfiziert werden, dann wird die RNA, die von dem modifizierten Provirus synthetisiert wird, in Virionen verpackt, um eine andere Zelle zu reinfizieren. Dies stellt einen Mechanismus zur Einschleusung der DNA, die den gewünschten Wirkstoff oder das gewünschte Arzneimittel codiert, in die Zelle durch Infektion bereit.
Es gibt zwei Wege zu diesem Ziel. Bei einem Weg wird die modifizierte provirale DNA in Zellen transfiziert, die eine Infektion durch das nicht-modifizierte Virus tragen, das in der Zelle gleichzeitig vorhanden ist. Die normalen Virusvektoren synthetisieren dann die Verpackungsmaterialien, und ein Teil der durch das modifizierte Provirus produzierten mRNA wird analog dem normalen Virion verpackt und kann dann zur Infektion von Zielzellen zur Produktion des Proteins verwendet werden. Unter diesen eingefangenen ("commandeered") Virushüllen befindet sich jedoch eine bestimmte Anzahl von ebenfalls verpackten normalen Viren, die, sofern sie von den "Lieferwagen"-Viren nicht abgetrennt werden, einfach eine zusätzliche Virusinfektion in mit den gebildeten Produkten dieses Virion-Produktionscyclus infizierten Wirtszellen bewirken.
In einem nützlicheren Ansatz wird der Provirus-Clonierungsvektor, der das gewünschte Gen enthält, zur Transfektion einer Zelle verwendet, die genetisch modifiziert wurde, so daß sie defekte Virushüllen produziert, die keine virale genomische RNA enthalten - in der Tat "leere Lieferwagen". Diese Zellen werden durch Integration der proviralen Form eines mutierten Retrovirus ohne die Ψ-Verpackungsstelle erhalten, und mehrere derartige Zellinien sind auf dem Fachgebiet für alle, die sie verlangen, verfügbar. Zwei dieser Zellinien mit der Bezeichnung Ψ-1 oder Ψ-2 sind ausführlich in Mann, R., et al., Cell (1983) 33:153-159 (a.a.O.) beschrieben und werden durch Transfektion von NIH-3T3-Wirtsfibroblastenzellen mit einem Plasmid, das provirale MoMLV-Insertionen enthält, von denen die Ψ-Verpackungsstelle deletiert worden war, hergestellt. Die Ψ-2-Zellen produzieren offensichtlich einige leere Virushüllen pro Zelle im Verlauf einer Generation, die der Virushülle des nativen Virus entsprechen. Wenn diese Zellen mit der proviralen DNA, die sowohl ein Fremdgen als auch die Verpackungsstelle Ψ enthalten, transfiziert werden, verpacken sie das mRNA-Transkript der proviralen, das Fremdgen enthaltenden DNA, in diese leeren Hüllen, wobei modifizierte Viren erzeugt werden, die beliebige Zellen (Maus in diesem Fall) infizieren können, die normalerweise Wirte für MoMLV sind. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß dieses rekombinante modifizierte Virus dahingehend einen Defekt besitzt, daß es die Produktion zusätzlicher modifizierter (oder anderer) Virionen in der Zelle, die es "infiziert", nicht verursachen kann. Es kann die Produktion des Proteins, das das Gen in der "infizierten" Zelle codiert, verursachen, aber die Infektion kann sich nicht auf weitere Zellen ausbreiten, weil keine zusätzlichen Virionen produziert werden.
Nützlicher als Ψ2 für die Herstellung von Medikamenten für Menschen gemäß der Erfindung sind die Ψ-AM-Linien, die von Cone, R.D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81:6349-6353, erhältlich sind. Diese Linien werden auch durch Transfektion von NIH-3T3-Zellen erhalten, allerdings mit einem Vektor mit der Bezeichnung -pMAV-Ψ&supmin;. Dieser Vektor enthält auch eine Insertion eines defekten Provirus, dem die Ψ-Verpackungsstelle fehlt. Jedoch ist pMAV-Ψ&supmin; ein Hybrid, das die gag-pol-Sequenzen von MoMLV und die von dem amphitropen Virus 4070A stammenden Hüllsequenzen codiert. Die durch diese Zellinien produzierten leeren Capside verpacken RNA-Transkripte von co-transfizierter modifizierter proviraler DNA, wodurch Pseudoviren produziert werden, die Zellen des Menschen, der Ratte und der Maus erkennen und infizieren.
So stellt der Stand der Technik ein System zur Bewegung von Genen in empfängliche Zellen bereit, das in der Vergangenheit nur zur Gentherapie oder zur Erzeugung von autokrinen Wachstumsfaktoren verwendet wurde. Diese Verfahren verwenden zwangsläufig eine ex-vivo-Exponierung der Zielzellen gegenüber dem retroviralen Vektor: beispielsweise werden in der Gentherapie Knochenmarkszellen entnommen und behandelt und dann reimplantiert. Erfindungsgemäß wird ein analoges System verwendet, um Arzneimittel an Zielzellen abzugeben, wobei herkömmliche Verabreichungsverfahren verwendet werden, um eine lokale Sackgassen ("dead-end")-"Infektion" zu bilden.
Die Erfindung betrifft in hohem Maße unübliche Arzneimittel und Verfahren zur Abgabe von Wirkstoffen an Zellen von Organismen, die für eine virale Infektion empfänglich sind. Die Zielorganismen sind üblicherweise Vertebraten. In einer Ausführungsform besteht das Arzneimittel aus Abgabeviren, die Hüllproteine enthalten, die eine transiente und nicht-replikative Infektion der Zellen in dem Organismus, der mit dem Wirkstoff behandelt werden soll, hervorrufen können. Diese Arzneimittel werden durch Injektion in den Blutstrom oder durch lokale Injektion in Ansammlungen unerwünschter Zellen, wie Tumorzellen, verabreicht.
So betrifft die Erfindung gemäß einem Gesichtspunkt ein Wirkstoffabgabesystem, das ein Abgabe-Retrovirus umfaßt. Das Retrovirus besitzt ein "Genom", umfassend eine RNA, die den gewünschten Proteinwirkstoff codiert, in funktioneller Verknüpfung mit Kontrollsequenzen, die von einem Retrovirus stammen, und mit einer Ψ-Verpackungsstelle, und ein Hüllprotein, das die Infektion der Wirtszielzelle durch das Virion bewirken kann, so daß die Wirtszielzelle allein "infiziert" wird, aber diese Infektion nicht an weitere Zellen weitergeben kann.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Verabreichung eines Proteinwirkstoffs an einen einzelnen Vertebratenwirt, bei dem dieses Wirkstoffabgabesystem entweder lokal oder systemisch verabreicht wird.
Gemäß noch weiteren Gesichtspunkten betrifft die Erfindung Materialien und Verfahren, die zur Herstellung des vorstehend beschriebenen Wirkstoffabgabesystems wichtig sind. Diese umfassen eine provirale DNA, umfassend eine DNA-Sequenz, die einen gewünschten Proteinwirkstoff codiert, in funktioneller Verknüpfung mit von einem Retrovirus stammenden Kontrollsequenzen einschließlich einer Verpackungsstelle, flankiert von von einem Retrovirus stammenden LTRs, sowie Ψ&supmin;-Zellen, die mit dieser proviralen DNA transfiziert sind.
In einer weiteren Ausführungsform kann das allgemeine Verfahren der Erfindung auch durch Implantieren von mit der proviralen DNA des vorstehenden Absatzes transfizierten Ψ&supmin;-Zellen oder von mit den Pseudovirionen infizierten Zellen, die sie produzieren, durchgeführt werden, um eine in situ-Produktion des gewünschten Proteins zu bewirken. Folglich ergeben die co-transfizierten Ψ&supmin;-Zellen und die mit den modifizierten Viren infizierten, sie produzierende Zellen Arzneimittel, die auch Gesichtspunkte der Erfindung sind.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Zusammensetzungen davon, das die Isolierung von Abgabevirionen, die durch die vorstehenden Ψ&supmin;-Verpackungszellen produziert wurden, umfaßt.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt eine Autoradiographie von mit ³&sup5;S-Methionin markiertem TNF in Lysaten von Ψ-AM (Verpackungs)-Zellen, die mit pFVX-TNF transfiziert sind.
Fig. 2 zeigt eine Autoradiographie von mit S-Cystein markiertem TNF in Lysaten von Ψ-AM (Verpackungs)-Zellen, die mit pFVX-TNF transfiziert sind.
Fig. 3 zeigt eine Autoradiographie von mit S-Cystein markiertem TNF in Überständen und Lysaten von mit TNF-Abgabevirionen infizierten Testerzellen.

Verfahren zur Durchführung der Erfindung

A. Definitionen

Der hier verwendete Ausdruck "Wirkstoffabgabevirion" bezeichnet ein modifiziertes Retrovirus, bei dem das Genom eine RNA ist, die von retroviralen Nucleinsäuren stammende Kontrollsequenzen in funktioneller Verknüpfung mit den codierenden Sequenzen für einen "Proteinwirkstoff" enthalten. Das Genom wird in ein Hüllprotein verpackt, das mit dem mit dem Protein zu behandelnden Patienten kompatibel ist und die "Infektion" mit dem darin enthaltenen Genom bei diesem hervorrufen kann. In diesem Fall erstreckt sich die Infektion nur auf den Eintritt der gewünschten RNA in die Zelle und die Produktion des Proteins; keine weiteren infektiösen Virionen werden gebildet.
So beschreibt "Sackgassen" ("dead end")-Infektion eine modifizierte Form einer Infektion, bei der die virale Umhüllung den Eintritt des modifizierten Virus in das Cytoplasma erleichtert und das enthaltene Genom exprimiert wird, aber keine neuen Virionen produziert werden.
"Kontrollsequenzen" bezeichnet solche Nucleinsäuresequenzen, die beispielsweise Promotoren und oft Enhancer enthalten, die zur Produktion des gewünschten Proteinwirkstoffs durch Expression der codierenden Sequenz notwendig und ausreichend sind, und mit diesen funktionell verknüpft sind.
Im Falle der erfindungsgemäßen Wirkstoffabgabe-Retrovirionen schließen das RNA-Genom und dessen provirales Gegenstück auch die Ψ-Verpackungsstelle ein.
"Nucleinsäuresequenzen" werden manchmal hier als allgemeiner Ausdruck verwendet, der sowohl DNA- als auch RNA-Fragmente abdeckt. Da die erfindungsgemäßen Substanzen retrovirale Genome und ihre proviralen Gegenstücke umfassen, treten spezielle funktionelle Sequenzen, auf die Bezug genommen wird, sowohl in der RNA- als auch in der DNA-Form auf. Die entsprechenden Loci werden bezüglich ihres Vorkommens sowohl in DNA als auch RNA austauschbar bezeichnet, weil klar ist, daß im üblichen Verlauf einer Infektion solche Funktionalitäten in der Tat austauschbar sind. Beispielsweise ist die Ψ-Verpackungsstelle offensichtlich in dem zu verpackenden RNA-Genom funktionell; jedoch kommen die entsprechenden Sequenzen in der proviralen DNA vor. Auf ähnliche Weise kommen Promotor-, Enhancer- und Terminator-Sequenzen - obwohl in geringfügig unterschiedlichen Formen - sowohl in der genomischen RNA- als auch in proviralen DNA-Formen vor. Die Austauschbarkeit dieser Funktionalitäten in verschiedenen Phasen des viralen Lebenszyklus ist einem Fachmann klar, und folglich wird eine ziemlich lockere Terminologie bezüglich des DNA- oder RNA-Status bei Bezugnahme auf diese oft verwendet. Genau gesagt, Sequenzen, die durch eine Aneinanderreihung von Basen spezifiziert werden, sind so zu verstehen, daß sie diese spezifischen Sequenzen und ihre Gegenstücke sowohl in DNA- als auch RNA-Formen umfassen.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel umfassen die Wirkstoffabgabe-Virionen, die durch die transfizierten intermediären Zellen produziert werden, die mit dem Ψ&supmin;-Helferprovirus transformiert wurden und somit leere Hüllen produzieren. Diese Zellen, die zur Herstellung dieses Präparats verwendet werden, werden der Einfachheit halber, was die Bezeichnung anbetrifft, als "Verpackungs"-Zellen bezeichnet.
Die erhaltenen Abgabevirionen können auch zur Infektion von Wildtypzellen in vitro, beispielsweise als Modelle für ihre Fähigkeit, die Produktion des gewünschten Proteins in dem Zielwirt, zu verursachen, verwendet werden. Diese infizierten Zellen werden hier als "Tester"-Zellen bezeichnet.

B. Allgemeine Beschreibung

Das wichtige Zwischenprodukt bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Arzneimittel ist ein proviraler DNA-Vektor, der die codierende Sequenz für den zu verabreichenden Proteinwirkstoff enthält. Die DNA, die einen solchen Proteinwirkstoff codiert, kann aus jeder herkömmlichen Quelle erhalten werden und kann in Abhängigkeit von dem gewählten Protein chemisch synthetisiert, aus einer cDNA-Bank gewonnen, aus genomischer DNA isoliert oder sonstwie durch auf dem Fachgebiet bekannte Mittel erhalten werden.
Die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zu verabreichenden Proteine umfassen jedes beliebige Protein, das eine gewünschte Wirkung auf eine infizierte Zelle in einem zu behandelnden Individuum besitzt. Vorteile des erfindungsgemäßen Wirkstoffabgabesystems werden besonders dann erfahren, wenn das Protein im Cytoplasma einer Zielzelle seine Wirkung ausübt. Beispielsweise kann der Tumornekrosefaktor (TNF) selektiv Tumorzellen abtöten, aber muß für diese Wirkung die Zellmembran durchdringen. Andere Proteine, wie Ribotoxine und die verschiedenen koloniestimulilerenden Faktoren, wirken ebenfalls intrazellulär.
Das erfindungsgemäße System kann auch bei Substanzen angewendet werden, deren Funktion außerhalb der Zielzellen ausgeführt wird, oder deren Funktion durch Bindung an Rezeptoren auf der Zelloberfläche erfolgt. In diesem Fall werden jedoch die Wirkstoffabgabe-Virionen indirekt als ein Implantat von transfizierten Verpackungszellen oder von Testerzellen, die mit den Wirkstoffabgabe-Virionen infiziert wurden, verabreicht. Beispielsweise könnte der Gewebeplasminogenaktivator oder Urokinase, die im Blutstrom selbst direkt auf lösliche Enzyme im Blut ein wirken, in situ durch diese implantierten Zellen produziert werden.
DNAs, die die vorstehenden Proteine codieren, sind auf dem Fachgebiet verfügbar und können, gegebenenfalls umgeben von Linkersequenzen für die einfache Handhabung, erhalten werden. Die Natur des Abgabesystems ist derart, daß sowohl genomische als auch cDNA-Sequenzen verwendet werden können, da Introns in der durch das Provirus transfizierten Umgebung prozessiert werden können. Der Proteinwirkstoff kann in dem Abgabevirion codiert werden, so daß jede beliebige Form des gewünschten Proteins spezifiziert wird - beispielsweise eine aktive Form, eine reife Form, ein Fusionsprotein, ein Präprotein oder ein Präproprotein. In dem nachstehenden Beispiel wird ein cDNA-Clon, der den TNF codiert, als Quelle für die codierende Sequenz verwendet; jedoch ist dies nur eine Erläuterung, und beliebige andere gewünschte codierende Sequenzen können ebenfalls verwendet werden.
Der provirale Transfervektor wird durch Isolieren einer geeigneten proviralen Form eines Retrovirus, wie des üblicherweise verwendeten Maus-Sarcomvirus (MSV), Molony-Maus-Leukämievirus (MoMLV), Harvey-Sarcomvirus (HaSV) oder einer Vielzahl anderer Retroviren erhalten. Da die mit dem Virion per se assoziierten Proteine bei der Konstruktion deletiert werden, könnten selbst infektiöse Retroviren, die beim Menschen Erkrankungen verursachen, wie Hepatitis, HTLVI und LAVI, auch verwendet werden, obwohl es nicht notwendig ist, solche Materialien zu verwenden, die natürlich ein Potential für eine psychologische Ablehnung unter den zu behandelnden Patienten in sich tragen.
Die provirale Form des ausgewählten Retrovirus wird durch Vermehren des Virus in einer Gewebekultur, Isolieren der proviralen DNA, Clonieren dieser proviralen DNA in einen γ-Phagen-Clonierungsvektor und Vermehren des rekombinanten Vektors in einem empfänglichen bakteriellen Wirt, in den der Phagenvektor integriert wird, erhalten. Die provirale DNA wird herausgeschnitten und nochmals isoliert. Das Provirion wird dann mit geeigneten Linkern versehen und in einen bakteriellen Clonierungsvektor zur Amplifikation insertiert. Geeignete bakterielle Clonierungsvektoren umfassen pBR322, pML oder Vektoren der pUC-Reihe. Diese müssen gegebenenfalls modifiziert werden, um Restriktionsspaltstellen zu beseitigen oder zu verändern usw., wie es dem Fachmann klar ist. Die Clonierungsvektoren werden mit Restriktionsenzymen behandelt und dann mit Insertionen der von einem Linker umrahmten Provirionen versehen.
Die nativen Provirioninsertionen enthalten die das virale Protein codierenden Sequenzen, flankiert von langen terminalen Wiederholungssequenzen (LTR) und enthalten die Verpackungsstelle in Nachbarschaft zu einer der LTRs. Diese Proteincodierenden Sequenzen zwischen der Verpackungsstelle und der anderen LTR werden dann durch geeignete Restriktionsspaltung und/oder Spaltung mit einer Exonudease entfernt und durch Linker- oder Polylinkersequenzen ersetzt. Die geeigneten Stellen können bereits in der dazwischenliegenden Region vorhanden sein oder sie können, sofern dies nicht der Fall ist, unter Verwendung ortsspezifischer Mutagenese erhalten werden, wie es auf dem Fachgebiet bekannt ist.
Nach der Amplifikation werden die Vektoren, die die modifizierten Provirionen enthalten, mit geeigneten Restriktionsenzymen gespalten, um die Vektoren für die Insertion der gewünschten codierenden Sequenz zu öffnen. Da sich die Kontrollsequenzen mit Ausnahme der Verpackungsstelle in den langen terminalen Wiederholungen befinden, bringt die Insertion einer einen gewünschten Proteinwirkstoff codierenden Sequenz in die Linkersequenz diese in funktionelle Verknüpfung mit den Kontrollsequenzen. Das so erhaltene modifizierte Virion wird zu einem Expressionssystem für das gewünschte Protein anstatt für die viralen Proteine und behält noch eine Verpackungsstelle, die die Infektion des modifizierten viralen Genoms erlauben.
Diese Wirkstoffabgabe-Provirion-DNAS werden unter Verwendung bekannter Techniken amplifiziert und isoliert, wodurch eine Quelle für transfizierende DNA für die Ψ-Verpackungszellen erhalten wird.
Gegebenenfalls kann die insertierte codierende Sequenz in dem modifizierten Virion auch eine Markersequenz umfassen. Jedoch wird eine signifikante Abnahme der Expression der insertierten Sequenz beobachtet, wenn die Markersequenz 3' der Insertion vorhanden ist. Dies kann vermieden werden, da die Transfektion der Ψ&supmin;-Verpackungszellen mit der Transformation mit Vektoren, die einen geeigneten Marker, am geeignetsten den G418-Resistenzmarker, enthalten, zusammenfallen kann. Jeder beliebige geeignete Marker kann natürlich verwendet werden, und solche Marker umfassen beispielsweise Ecogpt, das Resistenz gegenüber Mycophenolsäure verleiht, und DHFR-Sequenzen, die Methotrexat-Resistenz verleihen.
Das modifizierte Provirion wird gegebenenfalls zusammen mit einem Markerplasmid, in die Empfängerverpackungszellen unter Verwendung von Transfektions-Standardtechniken, wie Calciumphosphatfällung, transfiziert. Die Transformanten werden in einer Kultur gezüchtet, die für ihren speziellen Zelltyp geeignet ist. Die nachstehend erläuterten Ψ&supmin;- 3T3-Zellen werden unter Bedingungen gezüchtet, die im allgemeinen für Wildtyp-3T3-Zellen verwendet werden. Natürlich ist auch eine geeignete Menge einer selektiven Komponente des Mediums, wie G418 zur Selektion auf nützliche Transformanten eingeschlossen.
Es kann gezeigt werden, daß die transformierten Verpackungszellen die durch die insertierten codierenden Sequenzen in dem modifizierten Virion codierten Proteine erfolgreich produzieren, indem die Proteinkonzentration in dem Medium oder Zellysat, sofern geeignet, bestimmt wird.
Zum Erhalt verpackter rekombinanter Virionen, wird der Überstand der Verpackungszellen von den Zellen getrennt, beispielsweise unter Verwendung eines 0,45 µm-Filters. Das Virus wird aus dem Filtrat, beispielsweise durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation, isoliert, um die viralen Teilchen zu gewinnen, oder das Filtrat wird als solches verwendet. Die konzentrierten viralen Teilchen oder das Filtrat werden dann als Arzneimittel formuliert.
Zusätzlich kann das Virionpräparat bezüglich seiner Fähigkeit, eine Wirkstoffabgabe an Zielzellen zu bewirken, bewertet werden, indem eine Testerzellinie verwendet wird, beispielsweise das Wildtyp-Gegenstück der Verpackungszellinie, die keine leeren viralen Capside produziert, oder eine beliebige Zellinie, die gegenüber einer Infektion durch das Virus und bevorzugt auch gegenüber dem durch das rekombinante Virion produzierten Protein empfänglich ist. Die Menge an durch diese Testerzelle produziertem gewünschtem Protein kann bestimmt werden, und im Falle geeigneter Zellen kann diese Bestimmung durch die direkte Wirkung des Proteins auf die Zellen erfolgen.
Sowohl die Verpackungs- als auch die Testerzellen können als Implantate verwendet werden, um eine in situ-Quelle für den Proteinwirkstoff bereitzustellen.

C. Nützlichkeit und Verabreichung

Das erfindungsgemäße Wirkstoffabgabesystem ist bezüglich des Nettoergebnisses der Übertragung von Proteinmaterialien in Zellen effektiv, in denen sie ihre Wirkungen ausüben können. Die Übertragung erfolgt aufgrund der viralen Infektion, so daß es nur notwendig ist, die Wirkstoffabgabe-Virionen in die Nähe der Zielzellen zu bringen. Wenn die Zielzellen beispielsweise in einem festen Tumor lokalisiert sind, kann das erfindungsgemäße Arzneimittel direkt in den festen Tumor injiziert werden. Wenn die Zellen jedoch weit verbreitet sind, wie bei einer Leukämie, oder wenn beispielsweise Erythrocyten oder Knochenmarkszellen zielgerecht angegangen werden müssen, ist eine systemische intravenöse Injektion notwendig.
Virionen werden zur Injektion in typischer Weise, die für die Verabreichung von Arzneistoffen geeignet ist, durch Suspension in isotoner Kochsalzlösung oder einem anderen geeigneten pharmazeutischen Exzipient, wie auf dem Fachgebiet bekannt ist, hergestellt.
Die Implantation von Verpackungs- oder Testerzellen wird durch ihre Formulierung in geeignete kompatible Formulierungen, wie physiologische Kochsalzlösung, und ihre direkte Injektion an den gewünschten Ort durchgeführt. Die Zellen können auch unter Verwendung von Einkapselungstechniken formuliert werden. (Vgl. z.B. US-Patent 4 391 909.)

D. Standardverfahren

In Abhängigkeit von der verwendeten Wirtszelle wird die Transformation unter Verwendung von Standardtechniken, die für solche Zellen geeignet sind, durchgeführt. Die Calciumbehandlung, bei der Calciumchlorid verwendet wird, wie von Cohen, S.N., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1972) 69:2110, beschrieben ist, oder das in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982), Cold Spring Habor Press, S. 254, beschriebene RbCl&sub2;-Verfahren wurde für Prokaryonten oder andere Zellen, die wesentliche Zellwandbarrieren enthalten, verwendet. Für Säugerzellen ohne solche Zellwände wird das Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren nach Graham und van der Eb, Viriology (1978) 52:546 bevorzugt.
Zur Konstruktion geeigneter Vektoren, die die gewünschten codierenden und Kontroll-Sequenzen enthalten, werden Standardtechniken zur Ligierung und Restriktion verwendet, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. Isolierte Plasmide, DNA-Sequenzen oder synthetisierte Oligonucleotide werden gespalten, "maßgeschneidert" und in der gewünschten Form religiert.
Die ortsspezifische DNA-Spaltung wird durch Behandlung mit dem (den) geeigneten Restriktionsenzym (oder -enzymen) unter Bedingungen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, durchgeführt, und die Einzelheiten davon sind vom Hersteller dieser im Handel erhältlichen Restriktionsenzyme angegeben. Vgl. z.B. New England Biolabs, Produktkatalog. Im allgemeinen wird etwa 1 µg Plasmid oder DNA-Sequenz durch eine Enzymeinheit in etwa 20 µl Pufferlösung gespalten; in den hier angegebenen Beispielen wird typischerweise ein Überschuß an Restriktionsenzym verwendet, um eine vollständige Spaltung des DNA-Substrats zu gewährleisten. Inkubationszeiten von etwa 1 h bis 2 h bei etwa 37ºC sind durchführbar, obwohl Variationen toleriert werden können. Nach jeder Inkubation wird das Protein durch Extraktion mit Phenol/Chloroform entfernt, es kann sich eine Etherextraktion anschließen, und die aus den wäßrigen Fraktionen durch Ethanolfällung gewonnene Nucleinsäure wird in 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5, resuspendiert. Gegebenenfalls kann eine Größentrennung der gespaltenen Fragmente durch Polyacrylamidgel- oder Agarosegel-Elektrophorese unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt werden. Eine allgemeine Beschreibung für Größenauftrennungen findet sich in Methods in Enzymology (1980) 65:499-560.
Die restriktionsgespaltenen Fragmente können durch Behandlung mit dem großen Fragment der E. coli-DNA-Polymerase I (Klenow) in Gegenwart der vier Desoxynucleotidtriphosphate (dNTPs) unter Verwendung von Inkubationszeiten von etwa 15 bis 25 min bei 20 bis 25ºC in 50 mM Tris, pH 7,6, 50 mM NaCl, 6 mM MgCl&sub2;, 6 mM DTT und 5 bis 10 µM dNTPs mit glatten Enden hergestellt werden. Das Klenow-Fragment füllt die klebrigen 5'-Enden auf, aber spaltet überstehende 3'-Einzelstränge ab, selbst wenn die vier dTPS vorhanden sind. Gegebenenfalls kann eine selektive Reparatur durch Bereitstellen nur eines oder ausgewählter DNTPs innerhalb der durch die Natur der klebrigen Enden vorgegebenen Grenzen durchgeführt werden. Nach der Behandlung mit Klenow wird das Gemisch mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt und anschließend über eine Sephadex-G-50-Spin-Säule laufengelassen. Die Behandlung mit S1-Nuclease unter geeigneten Bedingungen führt zur Hydrolyse aller einzelsträngigen Anteile.
Die synthetischen Oligonudeotide werden nach dem Triesterverfahren von Matteucci et al. (J. Am. Chem. Soc. (1981) 103:3185) oder unter Verwendung von im Handel erhältlichen automatisierten Geräten zur Oligonucleotidsynthese hergestellt. Die Kinasebehandlung der Einzelstränge vor der Anelierung oder für die Markierung wird unter Verwendung eines Überschusses, beispielsweise etwa 10 Einheiten Polynucleotidkinase zu 0,1 nmol Substrat in Gegenwart von 50 mM Tris, pH 7,6, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM Dithiothreit, 1 bis 2 mM ATP, 1,7 pmol γ³²P-ATP (2,9 mCi/mmol), 0,1 mM Spermidin und 0,1 mM EDTA durchgeführt.
Die Ligierungen werden in 10 bis 30 µl Volumina unter den folgenden Standardbedingungen und Temperaturen durchgeführt: 20 mM Tris-Cl, pH 7,5, 10,M MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 33 µg/ml BSA, 10 mM bis 50 mM NaCl und entweder 40 µM ATP, 0,01 bis 0,02 (Weiss) Einheiten T4-DNA-Ligase bei 0ºC (für die Ligierung "klebriger Enden") oder 1 mM ATP, 0,3 bis 0,6 (Weiss) Einheiten T4-DNA-Ligase bei 14ºC (für die Ligierung "glatter Enden"). Intermolekulare Ligierungen "klebriger Enden" werden üblicherweise bei 33 bis 100 µg/ml Gesamt-DNA-Konzentrationen (5 bis 100 nM Gesamt-Endkonzentration) durchgeführt. Intermolekulare Ligierungen glatter Enden (üblicherweise unter Verwendung eines 10- bis 30fachen molaren Überschusses an Linkem) werden bei einer Gesamt-Endkonzentration von 1 µM durchgeführt.
Bei der Konstruktion des Vektors, bei dem "Vektorfragmente" verwendet werden, wird das Vektorfragment üblicherweise mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP) behandelt, um das 5'-Phosphat zu entfernen und die Religierung des Vektors zu verhindern. BAP-Spaltungen werden bei einem pH-Wert von 8 in etwa 150 mM Tris in Gegenwart von Na und Mg unter Verwendung von etwa 1 Einheit BAP pro µg Vektor bei 60ºC etwa 1 h durchgeführt. Zur Isolierung der Nucleinsäurefragmente wird das Präparat mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt und durch Aufbringen auf eine Sephadex G-50-Spin-Säule entsalzt. Alternativ kann die Restriktionsenzymabspaltung der unerwünschten Fragmente doppelt gespalten worden waren.
Für die von cDNA oder genomischer DNA stammenden Vektoranteile, die Sequenzmodifikationen benötigen, wird eine ortsspezifische Primer-gerichtete Mutagenese verwendet. Diese wird unter Verwendung eines synthetischen Primer-Oligonucleotids durchgeführt, das zu einer zu mutierenden, einzelsträngigen Phagen-DNA komplementär ist, ausgenommen einer beschränkten Anzahl an Fehlpaarungen, die die gewünschte Mutation darstellen. In Kürze, das synthetische Oligonucleotid wird als Primer zur Steuerung der Synthese eines zu dem Phagen komplementären Strangs verwendet, und mit der so erhaltenen doppelsträngigen DNA wird ein Phagentragendes Wirtsbakterium transformiert. Kulturen der transformierten Bakterien werden auf Topagar plattiert, der die Plaquebildung aus Einzelzellen, die den Phagen beherbergen, erlaubt.
Theoretisch enthalten 50 % der neuen Plaques den Phagen, der als Einzelstrang die mutierte Form enthält. 50 % besitzen die Ursprungssequenz. Die so erhaltenen Plaques werden mit einem Kinase-behandelten, synthetischen Primer bei einer Temperatur hybridisiert, die die Hybridisierung einer exakten Paarung erlaubt, aber bei der die Fehlpaarungen mit dem ursprünglichen Strang ausreichen, um die Hybridisierung zu verhindern. Plaques, die mit der Sonde hybridisieren, werden dann entnommen, gezüchtet, und die DNA wird isoliert. Einzelheiten der ortsspezifischen Mutationsverfahren sind nachstehend in spezifischen Beispielen beschrieben.
Korrekte Ligierungen zur Konstruktion des Plasmids werden dadurch bestätigt, daß zuerst der von dem E. coli-Genetic Stock Center, CGSC #6135, erhaltene E. coli-Stamm MM294 oder ein anderer geeigneter Wirt mit dem Ligierungsgemisch transformiert wird. Auf erfolgreiche Transformanten wird durch Ampicillin-, Tetracyclin- oder eine andere Antibiotika-Resistenz oder unter Verwendung anderer Marker in Abhängigkeit von der Plasmidkonstruktion selektiert, wie auf dem Fachgebiet bekannt ist. Plasmide aus den Transformanten werden dann nach dem Verfahren von Clewell, D.B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1969) 62:1159, gegebenenfalls nach Chloramphenicol-Amplifikation (Clewell, D.B., J. Bacteriol. (1972) 110:667) hergestellt. Die isolierte DNA wird durch Restriktionsspaltung analysiert und/oder nach dem Didesoxyverfahren von Sanger, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1977) 74:5463, wie weiter von Messing et al., Nucleic Acids Res. (1981) 9:309, beschrieben, oder nach dem Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology (1980) 65:499, sequenziert.
Wirtsstämme, die bei der Clonierung und Expression hier verwendet werden, sind die folgenden:
Für die Clonierung und Sequenzierung wurde der E. coli-Stamm HB101 als Wirt verwendet.
Für die Rekombinanten mit dem Phagen M13 werden E. coli-Stämme, die gegenüber einer Phageninfektion empfänglich sind, wie der E. coli K12- Stamm DG98, verwendet. Der Stamm DG98 wurde bei der ATCC am 13. Juli 1984 hinterlegt und besitzt die Hinterlegungs-Nr. 1965.

E. Beispiele

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1

Herstellung eines TNF enthaltenden modifizierten Provirions

Die codierenden Sequenzen für menschlichen TNF wurden von dem Clon pE4 erhalten, einem cDNA-Clon, der ausführlich in der USSNR. 760 661, angemeldet am 30. Juli 1984, des gleichen Anmelders, auf die hiermit Bezug genommen wird, beschrieben ist. Dieser Clon ist auch bei der ATCC unter der ATCC-Nr. 39894, hinterlegt am 15. Oktober 1984, hinterlegt.
Das Plasmid pAW711, das hier auch beschrieben ist und am 8. November 1984 unter der ATCC-Nr. 39918 hinterlegt wurde, kann auch als Quelle für TNF-Sequenzen verwendet werden.
Der Vektor, der das retrovirale Kontrollsystem in der proviralen Form zusammen mit der Verpackungsstelle enthält, ist ein Derivat von pEVX; pEVX enthält die LTRs und die Ψ-Stelle aus MoMLV als Insertion in die EcoRI-Spaltstelle von pML (Kreigler, M.J., et al., Cell (1984) 38:483-491). pEVX wurde zur Entfernung einer Spleißdonorstelle durch Ersetzen eines SmaI/BalI-Segments durch ein 978 bp-SamI/SamI-Fragment aus dem Harvey-Sarcomvirus (HaSV), das den 3'-Anteil des 5'-LTR und den 5'- Anteil des HaSV-Genoms enthält, modifiziert. Die so erhaltene Konstruktion wurde vollständig mit SstII und teilweise mit BglII gespalten, wodurch ein 669 bp-Fragment, dem nicht-wesentliche HaSV-Regionen fehlen, deletiert wurde. Der Vektor, dem dieses 669 bp-Fragment fehlt, wurde unter Verwendung eines Gels gereinigt, die SstII- und BglII-Enden aufgefüllt, und die DNA wurde durch Ligierung zirkularisiert. Der so erhaltene Vektor pFVX-M enthält einen Polylinker zwischen den von MoMLV stammenden LTR-Fragmenten und umfaßt die Verpackungsstelle aus diesem Virus, aber ihm fehlt die Spleißdonorstelle in dem stromaufwärts gelegenen LTR.
Der pFVX-M-Vektor wird in dem E. coli-Stamm HB101 amplifiziert, und die Plasmid-DNA wird isoliert. pe4 wird auf gleiche Weise in E. coli HB101 amplifiziert und als Plasmid-DNA reisoliert. Beide Plasmid-DNA- Präparationen werden mit PstI behandelt (um den TNF-codierenden Bereich aus pE4 und um pFXV-M in der Polylinkerregion zu öffnen). Die Ligierung der Fragmente wird unter Verwendung von Standardbedingungen und AmpR durchgeführt. Die Plasmid-DNA wurde erneut isoliert, und die korrekte Orientierung der Insertion wurde durch Restriktionsanalyse ermittelt. Die rekombinanten Plasmide mit der korrekten Orientierung der TNF-codierenden Sequenzen werden als pFVX-TNF bezeichnet und zur Transfektion geeigneter Verpackungszellen, wie nachstehend beschrieben, verwendet.
Auf ähnliche Weise kann beispielsweise pFVX-M mit PstI gespalten werden und mit DNA-Sequenzen, die Ricin-A-Toxin, CSF-1 und Urokinase, die gegebenenfalls jeweils mit geeigneten PstI-Linkern versehen sind, ligiert werden. Die so erhaltenen Vektoren werden als pFVS-RA, pFVX-CSF bzw. pFVX-UK bezeichnet.

Beispiel 2

Produktion von Wirkstoffabgabe-Retrovirionen

10 µg des in Beispiel 1 hergestellten pFVX-TNF werden mit 1 µg pSV2-NEO (Southern et al., J. Mol. Appl. Gen. (1982) 1:327-341) vermischt, das die Markersequenzen enthält, die Resistenz gegenüber dem Antibiotikum G418 verleihen. Das DNA-Gemisch wurde in einer Konzentration von 1 µg/ml zu DMEM-Medium, das 10 % fötales Kälberserum enthält, gegeben, und die Lösung wurde zu 30 µg/ml Polybrene gegeben. Die so erhaltene Lösung wurde auf 8 x 10&sup5; Ψ-AM-Zellen (Mann et al., a.a.O.) in einer 60 mm-Petri-Schale gegossen, und die Platte wurde bei 37ºC in einem CO&sub2;-Inkubator 6 h inkubiert. Nach einer anfänglichen Wachstumsperiode wurden die Zellen auf einem Selektivmedium, das 400 µg/ml G418 enthielt, gezüchtet, und resistente Kolonien wurden entnommen und in Gewebekulturschalen mit 24 Vertiefungen zum Test auf TNF-Produktion überführt.
Die zellulären Proteine wurden mit entweder ³&sup5;S-Cystein oder ³&sup5;S- Methionin markiert. Die Zellen wurden zuerst auf DMEM ohne Cystein oder Methionin, aber mit 5 % dialysiertem fötalem Kälberserum 30 min bei 37ºC gezüchtet, um eine Cystein- oder Methioninaushungerung zu bewirken. 100 µCi ³&sup5;S-Cystein oder ³&sup5;S-Methionin mit einer spezifischen Aktivität von etwa 400 Ci/mmol wurden zugesetzt, und die Zellen wurden weitere 2 h bei 37ºC inkubiert. Der Überstand wurde entfernt und aufbewahrt. Die Zellen wurden mit Lysepuffer lysiert, und auch der Lysatüberstand wurde durch Zentrifugation gewonnen. Sowohl das geklärte Lysat als auch der Kulturüberstand wurden auf die Anwesenheit von TNF wie folgt getestet:
Polyclonale Antiseren gegen TNF, die in Kaninchen hergestellt worden waren, wurden zu jedem Testmaterial in einem Zentrifugenröhrchen gegeben und bei 4ºC unter Schütteln 1 h inkubiert. Darauf folgte die Zugabe einer 50%igen Suspension (Vol./Vol.) von Protein A in Bindung an Sepharose CL4B und anschließend eine 30minütige Inkubation bei 4ºC.
Die Kügelchen wurden in einer Mikrozentrifuge pelletiert und gewaschen. Das präzipitierte Material wurde von den Kügelchen durch Sieden in SDS entfernt. Die Lösungen, die solubilisierten TNF enthielten, wurden auf ein 12,5%iges Polyacrylamidgel für die Elektrophorese geladen, und die Proteine wurden fixiert und gefärbt und auch autoradiographisch gelesen. Die Ergebnisse sind in den Fig. 1 und 2 dargestellt.
Fig. 1 zeigt die Ergebnisse der Markierung mit 5-Methionin. Der Marker erscheint nur in der Leader-Sequenz des nicht-prozessierten 26 kD-Proteins in dem Lysat; kein Marker ist in der reifen 17 kD-Sekretionsform vorhanden (die keine Methioninreste enthält).
Fig. 2 zeigt die Ergebnisse der ³&sup5;S-Cysteinmarkierung; sowohl die nicht-prozessierten als auch die reifen Formen sind, wie erwartet, markiert.
Die Zellüberstände wurden auch auf TNF unter Verwendung des nachstehenden L-929-Tests getestet. Die Fähigkeit dieser Überstände, TNF-Aktivität zu zeigen, wurde durch Präinkubation mit Kaninchen-Anti-TNF- Antiseren vollständig zerstört.

Beispiel 3

Gewinnung von Wirkstoffabgabe-Virionen

Die Überstände von den Zellen von Beispiel 2, die TNF in das Medium sezernierten, wurden durch ein 0,45 µm-Millipore-Filter filtriert, um zu gewährleisten, daß keine Zellen übertragen wurden. Der filtrierte Überstand enthält das rekombinante Virion mit der Bezeichnung TNF-V.

Beispiel 4

Sackgassen ("Dead-End")-Infektion der Testerzellen ohne Vermehrung

Das in Beispiel 2 hergestellte TNF-V wurde zur Infektion von 1 x10&sup5; NIH 3T3- oder RAT2-Zellen durch Inkubation bei 37ºC über Nacht in einem CO&sub2;-Inkubator verwendet. Die Zellüberstände und -lysate wurden auf TNF- Produktion unter Verwendung einer ³&sup5;S-Cysteinmarkierung, Immunpräzipitation und Autoradiographie, genau wie im vorstehenden Beispiel 2 beschrieben, analysiert. Die Ergebnisse für die infizierten Zellen sind in Fig. 3 gezeigt. Sowohl die 17 kD- als auch die 26 kD-Formen von TNF enthalten den Marker.
Der Überstand von diesen Zellen zeigte bei Verwendung des L-929-Cytotoxizitäts-Tests ebenfalls eine TNF-Aktivität, die durch Inkubation mit Kaninchen-Anti-TNF-Antisera beseitigt wurde.

Test auf TNF-Aktivität

Zum Überprüfen der biologischen Aktivität des TNF wurde ebenfalls das L-929-Testsystem verwendet. Die L-929-Zellen wurden über Nacht als einzellige Schichten in Mikrotiterplatten hergestellt. Die Testproben wurden 2fach auf der Platte verdünnt, mit UV bestrahlt und dann auf die vorbereiteten einzelligen Zellschichten gegeben. Die Kulturmedien in den Vertiefungen wurden auf 1 µg/ml Actinomycin D eingestellt. Man ließ die Platten 18 h bei 37ºC inkubieren und beurteilte sie dann visuell unter dem Mikroskop. Jeder Vertiefung wird eine 25, 50, 75 oder 100 %-Marke zugeordnet, die das Ausmaß des Zelltods in der Vertiefung bezeichnet. Eine Einheit TNF-Aktivität ist als der reziproke Wert der Verdünnung, bei der eine 50%ige Abtötung eintritt, definiert.
Zusätzlich wurde eine empfindlichere Version dieses Tests entwickelt, die die Freisetzung der ³&sup5;S-markierten Peptide aus vormarkierten Zellen bei Behandlung mit der Testprobe und Actinomycin D kontrolliert. Diese Version des Tests kann zur quantitativen Bestimmung der Wirksamkeit verwendet werden, d.h. zur Bewertung der relativen Wirksamkeit von in Oocyten translatiertem Material. In Kürze, aktiv wachsende L-929-Kulturen wurden mit ³&sup5;S-Methionin (200 µCi/ml) 3 h in methioninfreiem Medium, das mit 2 % dialysiertem fötalem Kälberserum supplementiert ist, markiert. Die Zellen wurden dann gewaschen und in Platten mit 96 Vertiefungen plattiert, über Nacht inkubiert und am nächsten Tag mit 2fachen Verdünnungen der Testproben und 1 µg/ml Actinomycin D behandelt. Die Kulturen wurden dann 18 h bei 37ºC inkubiert. 100 µl Überstand-Aliquote aus jeder Vertiefung wurden dann in eine andere Platte mit 96 Vertiefungen überführt, mit Säure (TCA) gefällt und auf Glasfaserfiltern geerntet. Die Filter wurden mit 95%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und ausgezählt. Ein NP&sub4;&sub0;-Detergens ist als Kontrolle in jeden Test aufgenommen, um die maximale Freisetzung der Radioaktivität aus den Zellen zu messen. Die prozentuale ³&sup5;S-Freisetzung wird dann als Verhältnis der Differenz im Zählimpuls zwischen behandelten Zellen und unbehandelten Kontrollen, geteilt durch die Differenz zwischen NP&sub4;&sub0;-behandelten Zellen und unbehandelten Kontrollen, d.h. als Verhältnis:
% Freisetzung = Probe - Zellkontrolle/NP&sub4;&sub0;-Zellkontrolle x 100
berechnet.
Höhere TNF-Wirksamkeit führt zu höheren Werten dieses Verhältnisses.
Die folgenden Plasmide wurden bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC) gemäß dem Budapester Vertrag, basierend auf der Internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für Patentzwecke und den entsprechenden Bestimmungen (Budapester Vertrag), hinterlegt und werden so aufrechterhalten und gemäß dem Budapester Vertrag verfügbar gemacht. Die Verfügbarkeit solcher Stämme soll nicht als eine Befugnis zur Ausführung der Erfindung bei Verstoß gegen die Rechte verstanden werden, die unter jeder Regierung nach dem Patentgesetz gewährleistet werden.
Den hinterlegten Plasmiden wurden die angegebenen ATCC-Hinterlegungs-Nrn. zugeteilt. Die Plasmide wurden auch bei der Master Culture Collection (CMCC) of Cetus Corporation, Emeryville, CA, USA, dem Anmelder der vorliegenden Anmeldung hinterlegt und erhielten die angegebenen CMCC-Hinterlegungs-Nrn.: Plasmid oder Zellinie CMCC-Hinterlegungs Datum der ATCC-Hinterlegung 24. April 1986
Die vorstehende schriftliche Beschreibung gilt als ausreichend, um einem Fachmann auf dem Gebiet die Durchführung der Erfindung zu ermöglichen. Die Hinterlegung von Materialen hier stellt kein Eingeständnis dahingehend dar, daß die hier enthaltene schriftliche Beschreibung nicht angemessen ist, um die Ausführung irgendeines Gesichtspunkts der Erfindung einschließlich der besten Ausführungsform davon zu ermöglichen, noch sollte diese Hinterlegung als Beschränkung des Umfangs der Patentansprüche auf die spezifischen Beispiele, die die hinterlegten Materialien darstellen, verstanden werden.

Claims

1. Arzneimittel, das ein ein RNA-Genom umfassendes Virion zur Wirkstoffabgabe enthält, wobei das Genom eine mRNA umfaßt, die einen Proteinwirkstoff Codiert, dessen Wirkung außerhalb der Zielzelle eintritt oder durch Bindung an Rezeptoren an der Zielzellenoberfläche, und wobei die mRNA funktionell verknüpft ist mit Kontrollsequenzen und einer Verpackungsstelle, die Von einem Retrovirus stammen, wobei das Genom in einem Hüllprotein enthalten ist, das eine Zielzelle infizieren kann, wobei das Mittel frei von Wildtyp-Virionen ist.

2. Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei die Kontrollsequenzen und die Verpackungsstelle des Virions vom Moloney- Maus-Leukämievirus (MoMLV) stammen, wobei die Kontrollsequenzen durch Ersetzen der MoMLV-Spleißdonorstelle mit einer Sequenz geändert sind, die einen Teil der langen terminalen Wiederholung vom Harvey-Sarcomvirus (HaSV) umfaßt, und wobei das Hüllprotein die Infektion einer menschlichen Zelle bewirken kann.

3. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, wobei der codierte Proteinwirkstoff Tumornecrosefaktor (TNF) ist.

4. Verwendung

(a) einer proviralen DNA, umfassend eine einen Proteinwirkstoff codierende Sequenz, funktionell verknüpft mit Kontrollsequenzen, die von einem Retrovirus stammen, wobei die DNA eine Ψ-Verpackungsstelle enthält, und flankiert von langen terminalen Wiederholungen, die von einem Retrovirus stammen; oder

(b) einer RNA-Sequenz, die einen Proteinwirkstoff codierende mRNA umfaßt, funktionell verknüpft mit retroviralen Kontrollsequenzen; oder

(c) eines Provirions, das einen Proteinwirkstoff Codiert, ligiert zwischen zwei langen terminalen Wiederholungen, die vom Retrovirus stammen, und eine Ψ- Verpackungsstelle enthält;

wobei in jedem Fall die Wirkung des Proteinwirkstoffes außerhalb der Zielzelle eintritt oder durch Bindung an Rezeptoren auf der Zielzellenoberfläche; zur Herstellung eines Medikaments.

5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei der Proteinwirkstoff TNF ist.

6. Verfahren zur Bereitstellung eines Wirkstoffabgabe Systems für therapeutische Zwecke, umfassend (a) Bereitstellung eines Genoms, das eine einen Proteinwirkstoff codierende mRNA umfaßt, wobei die mRNA funktionell verknüpft ist mit Kontrollsequenzen und einer Verpackungsstelle, die von einem Retrovirus stammen; wobei der Proteinwirkstoff ein Wirkstoff ist, dessen Wirkung außerhalb der Zielzelle eintritt, oder durch Bindung an Rezeptoren auf der Zielzellenoberfläche; und (b) Verpacken des Genoms in ein Hüllprotein, das die Zielzelle infizieren kann.

7. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, umfassend: (a) Bereitstellung eines Genoms, das eine einen Proteinwirkstoff codierende mRNA umfaßt, wobei die mRNA funktionell verknüpft ist mit Kontrollsequenzen und einer Verpackungsstelle, die von einem Retrovirus stammen, wobei der Proteinwirkstoff ein Wirkstoff ist, dessen Wirkung außerhalb der Zielzelle eintritt oder durch Bindung an Rezeptoren auf der Zielzellenoberfläche; und

(b) Verpacken des Genoms in ein Hüllprotein, das die Zielzelle infizieren kann, zur Vermeidung von Wildtyp Virionen durch Transfektion einer retroviralen transformierten Zelle ohne Ψ-Verpackungsstelle mit einem Provirion, das den Wirkstoff codiert, ligiert zwischen zwei langen terminalen Wiederholungen, die von einem Retrovirus stammen, und eine Ψ-Verpackungsstelle enthält.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei der Proteinwirkstoff TNF ist.