JP2773833B2 - 感染性薬剤の供給系 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は，薬剤供給を生じさせるための組み換え技術
の利用に関する。特に，本発明は，腫瘍壊死因子（TN
F）のような所望の薬剤のための発現系を供給するため
に，集められたウイルス外被の利用に関する。 （従来の技術） 多くの試みが，所望の標的細胞への薬剤の供給を生じ
るべく用いられているので，この分野の調査は，不適当
かつ役に立たなかった。しかしながら，現在使用されて
いる全ての供給系は，実際，対象生物の環境系統への障
壁を透過させるという問題をかかえており，そして，薬
剤の処理に対し標的化される特定の細胞による取り込み
の問題ではなことは注目されるべきである。それゆえ，
これらの障壁の透過を確実にする最も簡単な方式では，
活性成分の溶液の静脈注射（すなわち薬剤供給）は，単
にその活性成分の血液中での循環を生ずるにすぎない。
しかし，この薬剤供給では，細胞の細胞質または核（こ
れは，処理されるかまたは殺されるかと期待される）へ
の経路を見い出すことは確実にするための特別なメカニ
ズムは，何ら用意されていない。他方，特定の細胞は，
例えば，免疫毒素の利用を通じて，標的にされるかもし
れない。しかし，どのような作用機構が細胞それ自体に
よって有効とされるかによって，問題の内部細胞の中に
細胞膜を通じての浸透が生じるか，またはその処理の適
切な部位が細胞外であるかいずれかとなる。 もちろん，ウイルス粒子が，感染の正常の経過におい
て，細胞中に外部の核酸およびタンパクを導入し得るこ
とは確立されている。遺伝子治療の目的のために，標的
となる哺乳動物細胞の中に遺伝材料を運搬するウイルス
粒子の利用が，この技術を発展させるために現在行われ
ている主要な試みであると思われる。例えば,McCormic
k,D.,Bio/Technology（1985）３:689−693を参照せよ。
さらに,Lang,R.A.,ら，Cell（1985）43:531−542ではネ
ズミ科の血液−細胞系列のオートクライン（autocrin
e）増殖を促進するGM−CSFを用いた類似の系が使用され
得た。そのLangの研究では,cDNAをコードするGM−CSF
が，ウイルスの長い末端繰り返しの配列のプロモーター
／エンハンサーの制御下にて，モロニーネズミ科の白血
病の基礎としたベクターに挿入された。そして，感染症
でヘルパーのないウイルスが，Ψ２をパッケージする細
胞系列にトランスフェクトすることにより，生産され
た。この生産されたGMVウイルスは，造血細胞系列でGM
−CSF産物を生じさせ得た。この能力は，しかしなが
ら，今まで完全な生物中で設計されたタンパク薬剤の輸
送に用いられることはなかった。 特にレトロウイルスは，外来の遺伝子挿入のためのベ
クターとして用いられている。そして，この使用の一般
的なパラメーターは，現在全くよく理解されている：レ
トロウイルスは，タンパク外被の内部に閉じ込められた
一本鎖RNAゲノムから成る。５′末端から３′末端に読
むそのゲノム自体は，以下を含む。これらは，キャッ
プ,5′翻訳領域，“Ψ”と命名されたRNA区分すなわち
パッケージ部位（このRNA区分は，タンパク中に包装さ
れ得るRNAに必要である），そしていくつかのタンパク
−−そのレトロウイルスの核タンパク（gag）のための
コード配列:DNAの翻訳（pol）からなる中間段階を促進
する逆転写酵素および頭殻タンパク（env）のウイルス
性外被，およびいくつかの３′非翻訳配列によって行わ
れる全ての領域である。３つのウイルスタンパクは，ウ
イルスゲノムの感染に必要である。このパッケージング
部位は，添加した感染性ウイルスを生産するのに必要で
ある。 レトロウイルスは，そのタンパクをコードするRNA領
域の２重鎖cDNAコピーを含む“プロウイルス”段階を経
験する。しかしながら，この段階では，その転写されな
い３′領域および５′領域は，このタンパクをコードす
るcDNAのいずれかの末端にて，長い末端繰り返し配列
（LTR）を含むべく修飾される。この長い末端繰り返し
配列は,DNAの転写を生じる適当なプロモーター配列およ
びエンハンサー配列だけでなく，このコード部分に関し
て，作動可能な位置にて転写を終了させる配列を供給す
る。 普通の感染では，プロウイルスの２重鎖cDNAは，宿主
細胞のゲノムの中に吸収され得る。そして，これらの効
果から,RNAゲノムを含む追加のウイルス粒子の生産物
は，そのタンパクカプセルにパッケージされた。行われ
るこの手順では，このプロウイルス中にΨパッケージ部
位が，存在することは，重大である。 レトロウイルスのタンパクをコードする配列は，その
修飾されたウイルスが宿主細胞に感染するとき，そのウ
イルスの発現系を使用するように，所望のタンパクに対
する配列と置き換えられることが，他にもあった。例え
ば，米国特許4,405,712号およびLang（前述）を見よ。
しかしながら，これを達成するには，この修飾されたウ
イルスゲノムは，頭殻タンパクを合成し得、かつ外来DN
AのRNA転写をパッケージし得るヘルパーウイルスを必要
とする。 それゆえ，“遺伝子治療”のためには，プロウイルス
DNA形は，適当なベクターの中に挿入され，複写され，
そしてヘルパーウイルスの援助をうけてウイルス外被に
パッケージされる。一般的な総説としては,Anderson,W.
F.Science（1984）226:401−409:Coffin,J.,“Genome S
tructure",in RNA Tumor Viruses, Vol2,Weiss et al,e
ds,2d ed,（1985）,Cold Spring Harbor,NYを参照せ
よ。 遺伝子治療の研究に対して最も一般的に用いられるレ
トロウイルスは，ネズミ科の肉腫ウイルス（MSV）また
はモロニーネズミ科の白血病ウイルス（MoMLV）である
（Mann.R.,ら，Cell（1983）33:153−159）。これらの
レトロウイルスのプロウイルス形は，単離され，そして
増幅のためにほぼ標準的な細胞のクローニングベクター
に挿入される。パッケージ部位に沿ったプロウイルスの
挿入（これは，コントロール配列を含む長い末端繰り返
し配列に隣接するgag,polおよびenvをコードしているmR
NAを含む）は，このタンパクをコードするRNAを含む領
域を所望の外来遺伝子に置き換えるように扱われる。こ
のDNAが，完全なウイルス，またはパッケージ部位のみ
が欠けている欠損ウイルスで感染された宿主細胞にトラ
ンスフェクトされるなら，修飾されたプロウイルスから
合成されるRNAは，そのとき，他の細胞に再感染するた
めのウイルス粒子にパッケージされる。このことによ
り，感染によって，所望の活性成分または薬剤をコード
するDNAを細胞に導入するための作用機構が供給され
る。 これに着手するのに２つの方法がある。一つの方法で
は，修飾されたプロウイルスDNAは，その細胞中に共存
する修飾されていないウイルスからの感染に耐える細胞
にトランスフェクトされる。正常なウイルスベクター
は，パッケージする材料を合成し，そして，修飾された
プロウイルスによって生成するmRNAのいくつかは，正常
なビリオンに類似の方法で，パッケージされる。次い
で，これはタンパクの生産のために，標的細胞に感染さ
せるべく用いられ得る。しかしながら，これらの集めら
れたウイルス外被に加えて，再パッケージされた正常ウ
イルスもある数で存在するだろう。このウイルスは，
“供給物運搬用”ウイルスから分離されないなら，ビリ
オン生産過程の生成物に感染された宿主細胞にて，さら
にウイルス感染を簡単に引き起こすだろう。 もっと有用な方法では，所望の遺伝子を含むプロウイ
ルスのクローニングベクターは，欠損ウイルス外被を生
産するように，遺伝コード的に修飾された細胞をトラン
スフェクトするのに用いられる（この欠損ウイルス外被
は，実際には，空の供給運搬物である）。これらの細胞
は，Ψパッケージ部位を欠いている変異体レトロウイル
スのプロウイルス型の統合によって得られる。そして，
いくつかのこのような細胞系列は，それらを求める全て
の技術に利用できる。Ψ−１またはΨ−２と命名された
これら２つの系列は,Mann.Rら，Cell（1983）33:159−1
59（前述）に、広範囲に記述されている。これは,MoMLV
プロウイルス挿入物を含むプラスミドを用いて，宿主NI
H−3T3繊維芽細胞をトランスフェクトすることにより作
られる。この挿入物からは，Ψパッケージ部位が削除さ
れている。このΨ−２細胞は，一世代の中で固有のウイ
ルスのウイルス外被に相当する細胞あたり，いくらかの
空のウイルス外被を明らかに生産する。これらの細胞
が，外来遺伝子位とパッケージ部位（Ψ）の両方を含ん
でいるプロウイルスのDNAでトランスフェクトされると
き，それらは，修飾されたウイルスを産むように，外来
遺伝子を含むプロウイルスDNAからこれらの空の外被に,
mRNAの転写物をパッケージする。この修飾されたウイル
スは，普通はMoMLVに対する宿主である（この場合では
ネジミ科の動物の）細胞を感染させる、しかしながら，
この組み換え体（修飾されたウイルス）は，それが“感
染させる”細胞中にさらに修飾されたビリオン（または
他の）ビリオンの産生の引き起こし得ない点で欠損があ
ることは注目されるべきである。この組み換え体は，
“感染された”細胞において，この遺伝子がコードする
タンパクの産生を引き起こし得る。しかし，その感染
は，追加のビリオンが全く生産されないので，付加的な
細胞を広げることができない。 現在の発明において，人間に対する薬剤の調製のため
に，Ψ２よりも有用であるのは，Ψ−AM系列である。こ
の系列は,Cone,R.D.,ら，Proc Natl Acad Sci USA（198
4）81:6349−6353から得られる。これらの系列は,NIH−
3T3細胞をトランスフェクトすることによっても得られ
る。しかし,pMAV−Ψ−と命名されるベクターを用いね
ばならない。このベクターも，Ψパッケージング部位を
欠く欠損プロウイルスの挿入物を含む。しかし,pMAV−
Ψ−は,MoMLVのgag−pol配列をコードするハイブリッド
であり，そして外被配列は，両性のウイルス4070Aに由
来する。これらの細胞系列によって生産された空の頭殻
は，偽ウイルスを生産するような共トランスフェクトさ
れ修飾されたプロウイルスDNAのRNA転写物をパッケージ
する。この偽ウイルスは，人間，野ネジミおよびハツカ
ネズミの細胞を認識し感染させる。 それゆえ，この技術は，過去において，遺伝子治療ま
たはオートクライン増殖因子の生成のためだけに使用さ
れてきた感受性細胞に遺伝子を移すための体系を与え
る。これらの方法は，必然的にレトロウイルスのベクタ
ーに標的細胞をエキソ−ビボにさらすことを利用する。
例えば，遺伝子治療では，骨髄細胞が除去されそして処
置され，次いで，注入される。現在の発明では，類似の
系は，高率に終末させてかつ局在化させる“感染”を生
じるような通常の投薬方法を用いて，調合薬を標的細胞
に供給するために集められる。 （発明の要旨） 本発明は，極めて独特の薬剤の組成物およびウイルス
感染を受けやすい生物細胞に活性のある薬剤を供給する
方法を指向する。この標的生物は，通常，脊髄動物であ
る。一実施態様では，この薬剤組成物は，外被タンパク
を含む供給ウイルスから構成される。この外被タンパク
は，薬剤によって処置された対象生物において，細胞の
一過性で複製しない感染を引き起こし得る。これらの薬
剤組成物は，血中への注入により，または腫瘍細胞のよ
うな望ましくない細胞塊への局在的な注入によって投与
される。 本発明のRNAゲノムを含有し薬剤供給に有効なビリオ
ンは，該ゲノムがタンパク薬剤をコードするmRNAを含
み，そして標的対象細胞を感染させ得る外被タンパクに
含まれており，該mRNAがレトロウイルス由来の制御配列
およびパッケージ部位に動作可能に連結されている。 本発明のプロウイルスDNAは，レトロウイルス由来の
制御配列に動作可能に連結した所望のタンパク薬剤をコ
ードする配列を含有し，該DNAがΨパッケージ部位を含
み，かつレトロウイルス由来の長い末端繰り返し配列に
隣接している。 本発明のRNA配列は，レトロウイルスの制御配列に動
作可能に連結した所望の非ウイルスタンパクをコードす
るmRNAを含有する。 本発明のプロビリオンは，レトロウイルス由来の２つ
の長い末端繰り返し配列の間に連結されている所望の非
ウイルスタンパクをコードし，Ψパッケージ部位を含
む。 本発明の細胞系列は，Ψパッケージ部位が欠失したレ
トロウイルスで形質転換された細胞系列であって，該細
胞系列がプロビリオンで形質移入された細胞系列であ
り，該プロビリオンがレトロウイルス由来の２つの長い
末端繰り返し配列の間に連結されている所望の非ウイル
スタンパクをコードし，Ψパッケージ部位を含むプロビ
リオンである。 本発明の薬剤供給ビリオンを調製する方法であって，
該方法は細胞を培養し，生産される供給ビリオンを回収
することを包含する方法であり，該細胞がΨパッケージ
部位が欠失したレトロウイルスで形質転換された細胞系
列に属する細胞であり，該細胞系列がプロビリオンで形
質移入された細胞系列であり，該プロビリオンがレトロ
ウイルス由来の２つの長い末端繰り返し配列の間に連結
されている所望の非ウイルスタンパクをコードし，Ψパ
ッケージ部位を含むプロビリオンである。 本発明の薬剤組成物は，薬剤供給ビリオンを含有し，
野生型ビリオンを含まず，該薬剤供給ビリオンがRNAゲ
ノムを含有する，薬剤供給に有効なビリオンであり，該
ゲノムがタンパク薬剤をコードするmRNAを含み，そして
標的対象細胞を感染させ得る外被タンパクに含まれてお
り，該mRNAがレトロウイルス由来の制御配列およびパッ
ケージ部位に動作可能に連結されている。 それゆえ，ある局面では，本発明は，供給レトロウイ
ルスを含む薬剤供給系に関する。このレトロウイルス
は,RNAおよび外被タンパクを含む“ゲノム”を有する。
このRNAは，制御配列（これはレトロウイルスに由来し
ていた）およびΨパッケージ部位と動作可能に連結され
る所望の感染タンパク成分をコードする。この外被タン
パクは，ビリオンを有する標的宿主細胞を感染させ得
る。その結果，この標的宿主細胞のみが“感染される”
が，この感染を付加的な細胞にまで進行させ得ない。 もう１つの局面では，本発明は，活性タンパク成分を
対象の脊椎動物宿主に投与する方法に関する。この方法
は，局部的または体系的のいずれかで，この薬剤供給系
を投与することを包含する。 さらに他の局面では，本発明は，上記薬剤供給系を調
製する際に重要な材料および過程に関する。これらは，
プロウイルスDNAを含んでいる。このプロウイルスDNA
は，所望の活性タンパク成分をコードするDNA配列から
構成される。この活性タンパク成分は，以下の制御配列
と動作可能に連結されている。この制御配列は，レトロ
ウイルス由来で，パッケージ部位を含み，そしてレトロ
ウイルス由来のLTRだけでなくΨ−−細胞（これはこの
プロウイルスとトランスフェクトされている）によって
隣接されている。 もう１つの実施態様では，本発明の一般的な方法は，
前の段階のプロウイルスDNAでトランスフェクトされた
Ψ−細胞，または所望のタンパクの生産物をものと位置
で生じるように生成する偽ウイルス粒子と感染される細
胞を注入することによっても，実施され得る。従って，
共トランスフェクトされたΨ−細胞，およびそれらが生
産する修飾されたウイルスで感染される細胞も，本発明
の局面である薬剤組成物を提供する。 また，本発明の局面は，それらの組成物を調製する過
程である。この過程は，前述のΨ−パッケージ細胞によ
って生じた供給ウイルスを単離することを包含する。 発明の実施要領 A.定義 ここで用いられているように，“薬剤供給ビリオン”
とは，“活性成分”タンパクのコード配列に動作可能な
ように連結したレトロウイルスの核酸由来の制御配列を
含むRNAをゲノムとする修飾レロウイルスを指して言
う。このゲノムは，そのタンパクで治療しようとする対
象物（患者）に適合し，そしてその中に含まれる遺伝子
で“感染”を引き起こし得るタンパク外被にパッケージ
される。この場合の感染の範囲，所望のRNAを細胞に移
入し，タンパクを生産させることに限られ，付加的な感
染性のビリオンは，生産されない。 このように，“終末”感染は，ウイルス外被が修飾ウ
イルスの細胞質への移入を促進し，そして，含まれてい
るゲノムは発現されるが，新しいビリオンは生産されな
いような，改変された形の感染のことを述べている。 “制御配列”とは，例えば，プロモーター，そしてし
ばしばエンハンサーを含む核酸配列を言う。このプロモ
ーターおよびエンハンサーは，該制御配列に動作可能な
ように連結したコード配列の発現による所望の活性タン
パク成分の生産に必要で，かつ充分なものである。 本発明の薬剤放出レトロウイルスの場合は,RNAゲノム
およびそのプロウイルスの相対物もまた，Ψパッケージ
ング部位を含む。 “核酸配列”という用語は，ここでは時々,DNAおよび
RNA断片の両者を意味する遺伝学用語として採用され
る。核発明の材料は，レトロウイルスのゲノムおよびそ
のプロウイルスの相対物を含むので，ここで述べられる
特定の機能性配列は,RNAおよびDNAの両方の形態で生じ
る。相当する遺伝子座は,DNAおよびRNA両方におけるそ
の発生が，相互変換可能なように述べられる。なぜな
ら，感染の普通の過程においては，そのような機能性
は，もちろん，相互変換可能であると理解されるからで
ある。例えば，そのΨパッケージング部位は，パッケー
ジされるべきRNAゲノム中で，明らかに動作可能であ
る。しかし，相当する配列がプロウイルスDNA中に生じ
る。同様に，プロモーター，エンハンサーおよびターミ
ネーター配列も，少々異なる形ではあるが，ゲノムRNA
およびプロウイルスDNAの両方の形態で，生じる。ウイ
ルスの生活環の種々の段階におけるこれらの機能性の相
互変換能力は，当該分野において理解されている。従っ
て,DNAまたはRNAの状態に関するむしろルーズな命名が
これらについて述べるのにしばしば用いられている。特
に，塩基の配列決定により特定される配列は，これらの
特異的な配列およびその相補鎖を,DNAおよびRNA両方の
形において，含むと考えられるべきである。 本発明の薬剤組成物には，トランスフェクトされた中
間細胞により生産される薬剤放出ビリオンが含まれる。
この中間細胞は，Ψ−ヘルパープロウイルスで形質転換
され，従って空の外殻を生産する。この組成物の調製に
用いる細胞について述べる場合には，簡単のため，これ
らの細胞を“パッケージング”細胞と言う。 得られる供給ビリオンは，野生型細胞をインビトロで
感染させるのにも使用され得る。例えば，標的宿主中
で，所望のタンパクの生産を引き起こす薬剤供給ビリオ
ンの能力のモデルとして使用され得る。これらの感染細
胞は，ここでは，“テスター”細胞と言う。 B.発明の概要 本発明の組成物の調製における重要な中間体は，投与
すべきタンパク薬剤のコード配列を含むプロウイルスDN
Aベクターである。そのような活性タンパク成分をコー
ドするDNAは，どのような手近な供給源からも得ること
ができる。そして，選択したタンパクに依存して，該DN
Aは，化学的に合成,cDNAライブラリーから回収，ゲノム
DNAから単離，または，そうでなければ当該分野での既
知の方法により得ることができる。 本発明の方法により投与されるべきタンパクは，処理
（治療）されるべき対象（患者）の感染細胞に対し，所
望の効果を与えるいずれのタンパクをも包含する。本発
明の薬剤供給系の利点は，特に，標的細胞の細胞質内で
該タンパクが作用するときに経験される。例えば，腫瘍
壊死因子（TNF）は，選択的に腫瘍細胞を殺すことがで
きるが，その効力を発揮するためには，細胞膜を通過す
る必要がある。リボトキシンおよび種々のコロニー刺激
因子のような他のタンパクもまた，細胞内で作用する。 本発明の系はまた，標的細胞の外側で機能する物質ま
たは細胞表面のレセプターに結合することにより機能す
る物質に対しても適用され得る。しかし，このような場
合には，薬剤供給ビリオンは，感染したパッケージング
細胞または，薬剤供給ビリオンに感染したテスター細胞
の移植片として，間接的に投与される。例えば組織プラ
スミノーゲンアクチベーターまたはウロキナーゼ（これ
らは血液中の可溶性酵素に対し，それ自信が血流中で直
接的に働く）は，これらの移植細胞により，その場で生
産され得る。 前述のタンパクをコードするDNAは，当該分野におい
て入手可能である。そして，所望であれば，取り扱いを
便利にするため，リンカー配列ではさまれたものを得る
ことができる。該供給系の特徴は，ゲノムDNAおよびcDN
A配列の両方を使用し得ることである。これは，プロウ
イルスによってトランスフェクトされた環境下で，イン
トロンがプロセッシングされ得るためである。このタン
パク薬剤は，所望タンパクのいずれの形（例えば，活性
型．成熟型，融合タンパク，プレタンパクまたはプレプ
ロタンパク）をも特定するように供給ビリオン中にコー
ドされ得る。後術の実施例では,TNFをコードするcDNAク
ローンをコード配列の源として用いるが，これは，明ら
かに例証にすぎず，他のどのような所望のコード配列を
も採用し得る。 プロウイルス輸送ベクターは，レトロウイルスの適当
なプロウイルス型を単離することによって得られる。こ
のレトロウイルスには，例えば，通常使用されるマウス
肉腫ウイルス（MSV），モロニーマウス白血病ウイルス
（MoMLV），ハーベイ肉腫ウイルス（HaSV），または種
々の他のレトロウイルスがある。ビリオン自身と関連す
るタンパクは，この建築物中では欠損しているので，肝
炎,HTLVIおよびLAVIのようなヒトに病気を引き起こす感
染性レトロウイルスでさえも使用され得る。しかし，治
療を受ける患者の間に当然心理的な抵抗をもたせる可能
性があるような材料は，使う必要もないであろう。 組織培養でウイルスを増殖させ，プロウイルスDNAを
単離し，このプロウイルスDNAをγファージクローニン
グベクターにクローニングし，そして，フォージベクタ
ーが統合されるような感受性宿主バクテリア中で組み換
えベクターを増殖させることによって，選択したレトロ
ウイルスのプロウイルス型が得られる。このプロウイル
スDNAは切り出され，再分離される。次に，そのプロビ
リオンには適当なリンカーが与えられ，増幅のためバク
テリアのクローニングベクターに挿入される。適当なバ
クテリアのクローニングベクターには,pBR322,pMLまた
はpUCシリーズのベクターが包含される。制限部位を除
去または変化させるなどして，これらを修飾する必要が
あり得る。これは，当業者には公知である。該クローニ
ングベクターは制限処理され，次に，リンカーをつけた
プロビリオンが挿入される。 もとのプロビリオン挿入物は，長い末端繰り返し（LT
R）配列に隣接するウイルスタンパクコード配列を含
み，そして，そのLTRの１つに隣接したパッケージング
部位を含む。このパッケージング部位と他方のLTRとの
間のこれらのタンパクコード配列は，次に，適当な制限
酵素による分解および／またはエキソネクレアーゼ分解
によって除去され，リンカーまたはポリリンカー配列に
より置換される。その適当な部位は，既に介在領域中か
ら得ることができ，もしそうでなければ，これらを位置
特異的変異法（当該分野において既知である）により得
ることができる。 増幅の後，修飾プロビリオンを含むベクターを適当な
制限酵素で開裂させ，所望のコード配列を挿入するため
にベクターを開環させる。パッケージング部位を除く制
限配列は，長い末端繰り返し配列の中にあるので，所望
のタンパクコード薬剤の配列のリンカーへの挿入は，制
御配列と動作可能なように連結させて行なわれる。得ら
れる修飾ビリオンは，ビリオンタンパクの代わりに所望
のタンパクの発現系となる。そして，該修飾ビリオンは
修飾したウイルスゲノムを感染性にすることの可能なパ
ッケージング部位を，なお保持している。 これらの薬剤供給プロビリオンDNAは，既知の手法を
用いて増幅および単離され，Ψ−パッケージング細胞の
トランスフェクティングDNA源が供給される。 所望であれば，修飾ビリオン中の挿入コード配列もま
た，マーカー配列を含み得る。しかし，マーカー配列が
挿入物の３′位に置かれると，挿入配列の発現が有意に
減少するのが認められる。これは，Ψ−パッケージング
細胞のトランスフェクションが適当なマーカー（最も適
切なのは,G418耐性マーカー）を有するベクターによる
形質転換と，同時になされれば，避けられ得る。もちろ
ん，適当ないずれのマーカーも使用され得，そのような
マーカーとしては，例えば，ミコフェノール酸耐性を与
えるエコプト，およびメトトレキセート耐性を与えるDH
FR配列が包含される。 修飾されたプロビリオンは，マーカープラスミドとと
もに，もし必要であれば，リン酸カルシウム沈澱法のよ
うな標準的なトランスフェクション法で，受容体パッケ
ージング細胞にトランスフェクトされる。その形質転換
体をそれらの特有な細胞型に適切な培地で生育させる
（後述のΨ-3T3細胞は，野生型の3T3細胞に，一般に用
いられる条件下で培養する）。もちろん，生成した形質
転換体を選抜するためには，培地中に適量の選択成分
（例えばG418）が加えられる。 形質転換されたパッケージング細胞が，修飾ビリオン
中の挿入コード配列によりコードされたタンパクをうま
く生産していることは，培地中または細胞ライゼート中
のタンパク濃度が適切なものであることにより示され得
る。 パッケージング組み換えビリオンを得るために，たと
えば,0.45μフィルターを用い，パッケージング細胞の
上澄液を該細胞から分離する。濾液からウイルスを，例
えば，高速遠心分離して濾液からウイルス粒子を採取
し，または濾液自身が使用される。次に，濃縮したウイ
ルス粒子，または濾液は薬剤組成物として処方される。 さらに，このピリオン調製物は，テスター細胞系列を
用いて標的細胞への薬剤供給に効果をもたらす能力が評
価され得る。テスター細胞系列は，例えば，パッケージ
ング細胞系列の野生型の相対物であり空のウイルス外被
を生産しないもの，または，ウイルスによる感染に感受
性であり，好ましくは，組み換えビリオンの生産するタ
ンパクにも感受性であるいずれの細胞系列をも指してい
う。このテスター細胞の生産する所望のタンパクの量は
評価され得，そして，適当な細胞である場合には，この
評価は，タンパクの細胞への直接の影響によりなされ得
る。 パッケージングおよびテスター細胞の両者とも，それ
自身タンパク薬剤の供給源を与える移植物としても使用
され得る。 C.有用性および投与 本発明の薬剤供給系は，タンパク物質が，それらが効
果を示す得る細胞内へ入っていくという最終的な結果の
点で，まさに有効である。この移入は，ウイルスの感染
によっておこるので，薬剤供給ビリオンを標的細胞と併
置させることのみが必要とされる。例えば，もし標的細
胞が実質腫瘍中に局在すれば，本発明の組成物は実質腫
瘍中に直接注入され得る。しかし，細胞が広く分布して
いる場合（白血病または，例えば，赤血球または，骨髄
細胞を標的にする必要がある場合）には，全身的な静脈
注射が必要とされる。 このビリオンは，注射（薬剤を投与するための典型的
な方法である）用に調製される。つまり，等張食塩水に
懸濁し，または，当該分野で既知の他の薬学的に適切な
媒体による懸濁液として調製される。 パッケージングまたは，テスター細胞の移入は，生理
食塩水のような適切な併用物と合わせた処方物とし，所
望の部位に直接注射することにより，行われる。その細
胞は，また，カプセル化の手法を用いて処方され得る
（例えば，米国特許第4,391,909号参照）。 D.標準的方法 使用する宿主細胞に依存して，そのような細胞に適切
な標準的方法を用いて形質転換が行われる。Cohen,S.
N.,Proc Natl Acad Sci（USA）（1972）69:2110,に記載
された塩化カルシウムを用いたカルシウム処理法，また
は,Maniatisら，Molecular Cloning:A laboratory Manu
al（1982）Cold Spring Harbor Press,p.254に記載され
たRbCl2法が，原核生物または，実質的な細胞壁障壁を
有する他の細胞に対して用いられる。そのような細胞壁
を持たない哺乳類動物には,Graham and van der Eb,Vir
ology（1978）52:546に記載のリン酸カルシウム沈澱法
が好ましい。 所望のコード配列および制御配列を含む適当なベクタ
ーの構築には，当該分野でよく知られた標準的なライゲ
ーションおよび制限技術が採用される。単離されたプラ
スミド,DNA配列，または合成オリゴヌクレオチドを開裂
させ，適当に仕立て，所望の形に再ライゲーションす
る。 位置特異的DNAの切断は，適当な制限酵素の１種もし
くはそれ以上により，当該分野で一般的に知られる条件
下，および商業的に入手できる制限酵素の生産者により
特定された特定の条件下（例えば,New England Biolabs
製品カタログ参照）において行われる。一般に，プラス
ミドまたは,DNA配列約１μｇは，約20μの緩衝液中で
１単位の酵素により切断される。ここでの実施例におい
ては，典型的には,DNA基質の完全な分解を確実にするた
め，過剰の制限酵素が用いられる。変更も可能である
が。約37℃〜約１〜２時間のインキュベーションの時間
が適当である。各インキューベーションを行った後，フ
ェノール／クロロホルム抽出により，タンパクの除去が
行われる。そして，その後のエーテル抽出が行われ得
る。そして，エタノールでの沈澱および10mM Tris 1mM
EDTA,pH7.5への再懸濁により水層から核酸が回収され
る。もし所望であれば，切断した断片のサイズ分離が，
標的な手法を用いたポリアクリルアミドゲルまたはアガ
ロースゲル電気泳動により行われ得る。サイズ分離の一
般的な記述は,Methods in Enzymology（1980）65:499−
560に記載されている。 制限切断断片は,4つのデオキシヌクレオチドトリフォ
スフェート（dNTP）の存在下で，E.coli DNAポリメラー
ゼＩの大断片（クレノー）による処理で平滑末端にされ
得る。この反応の条件には,50mM Tris pH7.6,50mM NaC
l,6mM MgCl2,6mM DTTおよび５〜10μM dNTP中で,20〜25
℃にて15〜25分のインキュベート時間が採用される。そ
のクレノー断片は,5′粘性末端を埋めるが,4つのdNTPが
存在しても，突き出した３′一本鎖を埋めない。もし所
望であれば，粘性末端の性質により決まる制限内で,dNT
Pの１種のみ，または選択したdNTPを供給することによ
って選択的修復がなされ得る。クレノーでの処理後，そ
の混合物はフェノール／クロロホルムで抽出され，エタ
ノール沈澱が行われ，その後、セファデックスG50スピ
ンカラムにかけられる。S1ヌクレアーゼによる適当な条
件下での処理で，すべての一本鎖部分が加水分解され
る。 合成オリゴヌクレオチドは,Matteucciら（JAm Chem S
oc（1981）103:3185）のトリエステル法により，また
は，市販のオリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いて
調製される。アニーリングに先立つ，または標識化のた
めの一本鎖のキナーゼ処理は，過剰量（例えば,50mM Tr
is,pH7.6,10mM MgCl2,57mMジチオスレイトール,1〜2mM
ATP,1.7pmoles γ32P−ATP（2.9mCi/mmole）,0.1mMスペ
ルミジン,0.1mM EDTAの存在下で,0.1nmoleの基質に対し
約10単位のポリヌクレオチドキナーゼ）を用いて行われ
る。 ライゲーションは,15〜30μの容積で，以下の標準
的条件と温度とで行われる:20mM Tris−Cl pH7.5,10mM
MgCl2,10mM DTT,33μg/ml BSA,10mM〜50mM NaCl,および
40μM ATP,0.01〜0.02（Weiss）単位T4 DNAリガーゼ，
（０℃にて）（“粘性末端”ライゲーション用）また
は,1mM ATP,0.3〜0.6（Weiss）単位T4−DNAリガーゼ（1
4℃にて）（“平滑末端”ライゲーション用）。分子間
“粘性末端”ライゲーションは，通常，全DNAの濃度が,
33〜100μg/ml（全末端濃度５〜100mM）で行われる。分
子間平滑末端タイゲーション（通常,10〜30倍過剰モル
のリンカーが用いられる）は，全末端濃度１μＭが行わ
れる。 “ベクター断片”を用いたベクターの構築では，該ベ
クターの５′リン酸塩を除去し，再タイゲーションを防
止するため，通常，ベクター断片はバクテリアアルカリ
ホスファターゼ（BAP）で処理される。BAP分解は,pH8,
約150mM Tris中でNa+,およびMg+2の存在下において,1μ
ｇのベクターあたり,1単位のBAPを使い,60℃にて約１時
間行われる。核酸断片を回収するため，この調製物をフ
ェノール／クロロホルムで抽出し，エタノール沈澱を行
い，セファデックスG50スピンカラムにかけ，脱塩が行
われる。または，不必要な断片をさらに制限酵素で分解
することにより２重分解されたベクターで再ライゲーシ
ョンが防止され得る。 ベクターの配列の修飾を必要とするcDNAまたはゲノム
DNA由来の部分には，位置特異的プライマー変異操作法
が使用される。これは，限定されたミスマッチを除き，
変異をおこすべき一本鎖ファージDNAに相補的な合成オ
リゴヌクレオチドプライマーを用いて行われ，その結果
所望の変異が発現される。簡単に述べれば，合成オリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして用い，そのファージに
相補的な鎖を直接合成し，そして，生じた二本鎖DNAで
ファージ補助バクテリア宿主を形質転換する。形質転換
されたバクテリア培養物をトップアガー中でプレートに
まき，ファージを保持する単一細胞からブラークを形成
させる。 理論的には，新しいプラークの50％が（一本鎖とし
て）変異した形のファージを有しており;50％はもとの
配列を有している。生じたプラークは，正確に一致する
ハイブリダイゼーションを許容する温度下で，キナーゼ
処理した合成プライマーとハイブリダイズする。しか
し，もとの鎖とミスマッチしてハイブリダイゼーション
が避けられるような温度であれば充分である。次に，プ
ローブとハイブリダイズするプラークを採取し，培養
し，そして,DNAを回収する。位置特異的変異方法の詳細
は，後述の特定の実施例に示す。 プラスミド構築のためのライゲーションが正しく行わ
れているか否かは，まず，E.coli Genetic Stock Cente
r,CGSC＃6135より得たE.coli MM294株，または，その他
の適当な宿主をライゲーション混合物で形質転換するこ
とにより確認される。所望の形質転換体は，アンピシリ
ン，テトラサイクリンまたは他の抗生物質耐性あるい
は，当該分野で公知のごとく，プラスミドの構築の様式
に依存した他のマーカーにより選択される。形質転換体
からプラスミドが,Clewell,D.B.ら,Proc Natl Acad Sci
（USA）（1969）62:1159,の方法で，調製される。この
方法では，必要に応じて，クロラムフェニコール増幅
（Clewell,D.B.,J Bacteriol（1972）110:667）が行わ
れる。単離されたDNAは，制限酵素処理法および／また
は塩基配列決定法により分析される。塩基配列決定法と
しては,Sanger,F.,ら，Proc Natl Acad Sci（USA）（19
77）74:5463（これは，さらにMessingら，Nucleic Acid
Res（1981）９:309に記述されている）のジデオキシ
法，または,Maxmaら，Methods in Enzymology（1980）6
5:499の方法がある。 ここでクローニングおよび発現に用いる宿主株は，次
のとおりである： クローニングおよび塩基配列決定には，E.coliHB101
株を宿主として用いた。 M13ファージ組み換え体には，E.coli K12株DG98のよ
うな，ファージ感染に感受性のE.coliの株が採用され
る。このDG98株は,ATCCに1984年７月13日に寄託され，
受託番号1965を有する。 （実施例） 以下の実施例は本発明を例証することを意図したもの
であって，本発明を制限することを意図したものではな
い。 実施例１ TNFを含む修飾プロビリオンの調製 ヒトTNFのコード配列は，クローンpE4すなわち米国特
許出願第760,661号（1983年７月30日提出；同一譲受人
に譲渡され，参照文献としてここに述べられている）に
広範囲にわたって記述されているcDNAクローンから得ら
れた。このクローンはまた,ATCC（1984年10月15日寄託;
ATCC＃39894）に寄託されている。 プラスミドpAW711（上記特許に記述;1984年11月８日
寄託;ATCC＃39918）もTNF配列の源として使用され得
る。 パッケージ部位とともにプロウイルス型のレトロウイ
ルス制御系を有するベクターは,pEVXの誘導体である;pE
VXは,pMLのEcoR I部位に挿入されたMoMLV由来のLTRおよ
びΨ部位を有する（Kreigler,M.J.,ら，Cell（1984）3
8:483−491）。pEVXを修飾し,Sma I/Bal I分節をハーベ
イ肉腫ウイルス（HaSV）由来の978bp Sam I/Sma I断片
で置換することによってスプライスドナー部位を除去し
た。このSam I/Sma I断片は,5′LTRの３′部分およびHa
SVゲノムの５′部分を有する。得られた構築物はSst II
で完全にBgl IIで部分的に切断され，本質的でないHaSV
領域を含まない669bp断片を欠失させた。この669bp断片
を含まないベクターをゲル精製し,Sst II末端およびBal
II末端を充填し，ライゲートすることによってこのDNA
を環状にした。得られたベクターpFVX−Ｍは,MoMLV由来
のLTR断片間のポリリンカーを有し，このウイルス由来
のパッケージ部位を含むが，上流側LTRにおけるスプラ
イスドナー部位は含まない。 pFVXMベクターを大腸菌HB101株内で増幅し，プラスミ
ドDNAを単離した。pE4を大腸菌HB101株内で同様に増幅
し，プラスミドDNAとして再び単離した。両方のプラス
ミドDNA調製物をPst Iで処理した（この処理はpE4からT
NFをコードする領域を切除し，ポリリンカー領域におけ
るpFXVMを切開するためのものである）。断片のライゲ
ーションは，標準的な条件とアンピシリン耐性という性
質を用いて実施した。プラスミドDNAを再び単離し，正
しい挿入方向は制限酵素分析によって確証した。TNFを
コードする配列が正しい方向である組み換えプラスミド
をpFVX−TNFと呼び，以下に記述するように適当なパッ
ケージ細胞を形質移入するために用いた。 同様の方法により，例えばpFVXMをPst Iで切断し，リ
シンＡトキシン,CSF−１およびウロキナーゼ，そして必
要に応じて適当なPst Iリンカーを与えられたこれらの
各々をコードするDNA配列にライゲートし得る。得られ
たベクターは，それぞれpFVX−RA,pFVX−CSFおよびpFVX
−UKと呼ぶ。 実施例２ 薬剤供給レトロビリオンの生産 実施例１で調製したpFVX−TNF（10μｇ）を１μｇのp
SV2−NEO（Southernら，J Mol Appl Gen（1982）１:237
−341）と混合した。このpSV2−NEOは，抗生物質G418耐
性を付与するマーカー配列を有する。１μg/mlのDNA混
合物を,10％のウシ胎児血清を含有するDMEM培地に添加
し，この溶液に30μg/mlのポリブレン（polybrene）を
添加した。得られた溶液を60mmペトリプレート上の８×
105Ψ−AM細胞（Mannら，上記）に注ぎ，このプレート
を37℃にて６時間,CO2インキュベーターでインキュベー
トした。初期成長の期間の後,400μg/mlのG418を含有す
る選択培地上でこの細胞を成長させ，耐性コロニーを選
び,TNF生産試験を行うために24穴の組織培養皿に移し
た。 細胞タンパクを35S−システインまた35S−メチオニン
で標識化した。この細胞をシステインまたはメチオニン
欠乏するためにシステインまたはメチオニンは含まない
が,5％の透析されたウシ胎児血清を含むDMEN上で37℃に
て30分間培養した。約400Ci/mmolの比活性を有する35S
−システインまたは35S−メチオニンを100μCi添加し，
この細胞をさらに37℃にて２時間培養した。上澄液を移
し，保存した。細胞を溶解緩衝液で溶解，この溶解産物
の上澄液を遠心分離によって回収した。洗浄した溶解産
物および内容液の上澄におけるTNFの存在を以下のよう
にして試験した。 ウサギについて調製したTNFに対するポリクローナル
抗血清を遠心管中の各試験材料に添加し,4℃にて１時間
振盪しながらインキュベートした。この後，セファロー
スCL4Bに結合したプロテインＡの50％（v/v）懸濁液を
添加し，次いで４℃にて30分間インキュベートした。 ビーズを微量遠心によってペレット状にし，そして洗
浄した。SDS内で煮沸することにより沈澱物をビーズか
ら除去した。可溶化されたTNFを含む溶液を電気泳動用
の12.5％ポリアクリルアミドゲル上に載せた。このタン
パクはオートラジオグラフによって読み取られるだけで
なく固定され，そして染色された。この結果は第１図お
よび第２図に示す。 第１図は35S−メチオニンを用いた標識化の結果を表
す。標識は溶解産物中の26kd未処理型タンパクの主配列
内にのみ見られる；成熟した17kdの（メチオニン残基を
含まない）分泌型には標識は存在しない。 第２図は35S−システイン標識化の結果を表す；未処
理型および成熟型は，その両方が予想通り標識化され
る。 細胞上澄液をさらに下記のＬ−929分析を用いてTNFを
定量した。この上澄液位のTNF活性を示す能力は，ウサ
ギ抗TNF血清と共にプレインキュベートすることにより
完全に消失した。 実施例３ 薬剤供給ビリオンの回収 培地中にTNFを分泌する，実施例２の細胞の上澄液を
0.45μのミリポアフィルターで濾過し，細胞の混入がな
いことを確認した。濾過した上澄液は,TNF−Ｖと呼ばれ
る組み換えビリオンを含有する。 実施例４ テスター細胞の終末感染 実施例２において調製したTNF−Ｖを用いて１×105の
NIH 3T3細胞またはRAT2細胞をCO2インキュベーター中で
一晩,37℃にてインキュベートすることにより感染させ
た。実施例２の記述と全く同様に35S−システインによ
る標識化，イムノプレシピテーションおよびラジオオー
トグラフィーを用い，細胞上澄液および溶解産物のTNF
生産について分析した。感染した細胞に対する結果を第
３図に示した。TNFの17kd型および26kd型はどちらも標
識を含んでいた。Ｌ−929細胞毒性分析を行ったとこ
ろ，これらの細胞からの上澄液もまたTNF活性を示し，
この活性はウサギ抗TNF血清と共にインキュベートする
ことによって除去された。 TNF活性の分析 TNFの生物学的活性を分析するために,L−929分析シス
テムをさらに使用した。Ｌ−929細胞をマイクロタイタ
ープレート上で単層になるように一晩調製した。試験試
料をこのプレート上で２倍に希釈し,UV照射し，次いで
調製された細胞単層の上に添加した。組織培養皿の穴に
ある倍地に１μg/mlのアクチノマイシンＤを添加した。
このプレートを37℃にて18時間インキュベートし，顕微
鏡により視覚的に記録した。各穴に25,50,75あるいは10
0％の評価を与えた。これらの評価は各穴における細胞
死滅の割合を表している。TNF活性１単位とは,50％の死
滅をもたらす希釈率の逆数であると定義する。 さらに，試験試料およびアクチノマイシンＤで処理す
る場合，予め標識化された細胞から35S標識化ペプチド
の放出をモニターすることにより，この分析をより高感
度な方法とした。この分析方法は効果の定量，例えば材
料を翻訳する卵母細胞の相対的効果を評価するために用
いられ得る。簡単に言えば,2％の透析されたウシ胎児血
清を補った，メチオニンを含まない倍地中で，活性を有
して成育しているＬ−929培養物を35S−メチオニン（20
0μCi/ml）によって３時間標識化した。次いで，この細
胞を洗浄し,96穴プレート上に載せ，一晩インキュベー
トし，そして翌日試験試料および１μg/mlのアクチノマ
イシンＤの２倍希釈液で処理した。さらにこの培養物を
37℃にて18時間インキュベートした。次いで各穴から10
0μの上澄液を別の96穴プレートに移し，酸（TCA）で
沈澱させ，そしてガラスファイバーフィルターに採集す
る。このフィルターを95％エタノールで洗浄し，乾燥
し，そして計数する。NP40洗浄剤による対照を，細胞か
らの放射能の最大放出量を測定するためにすべての分析
に含めた。次いで35Sの放出率（％）を，処理した細胞
と処理していない対照間の計数差と,NP40で処理した細
胞とNP40で処理していない対照間の計数差の比，すなわ
ち によって計算した。TNF能力が高いほどこの比の値が大
きくなった。 以下のプラスミドは，特許手続きの目的およびその規
則に対する微生物寄託の国際的承認に基づくブタペスト
条約の項目によってアメリカンタイプカルチャーコレク
ション（ATCC;ロックビル,MD,USA）に寄託されている。
従って。これらのプラスミドはブタペスト条約の項目に
したがって維持されており，利用が可能である。このよ
うな株の利用可能性は，いかなる政府の権威の下であっ
ても，特許法に従って承認された権利に違反して本発明
を実施するための許可として解釈されるべきものはな
い。 上述の明細は，当業者が本発明を実施し得るほど十分
のものであると考えられる。ここに記載された材料の寄
託は，ここに包含される記述が，その最良の様式を含む
本発明のいかなる様相を実施するにも不適当であるとい
うことを容認するものではなく，また特許請求の範囲
を，寄託された材料について表した特定の例証に限定す
るものであると解釈されるべきものでもない。 （発明の要約） 本発明の薬剤供給ビリオンは，レトロウイルスに由来
し，外被にパッケージされた所望のタンパク活性成分に
対する発現系を含むビリオンであって，その機能を果た
すために細胞膜を通過する必要がある物質を投与する際
に特に有用である。
の利用に関する。特に，本発明は，腫瘍壊死因子（TN
F）のような所望の薬剤のための発現系を供給するため
に，集められたウイルス外被の利用に関する。 （従来の技術） 多くの試みが，所望の標的細胞への薬剤の供給を生じ
るべく用いられているので，この分野の調査は，不適当
かつ役に立たなかった。しかしながら，現在使用されて
いる全ての供給系は，実際，対象生物の環境系統への障
壁を透過させるという問題をかかえており，そして，薬
剤の処理に対し標的化される特定の細胞による取り込み
の問題ではなことは注目されるべきである。それゆえ，
これらの障壁の透過を確実にする最も簡単な方式では，
活性成分の溶液の静脈注射（すなわち薬剤供給）は，単
にその活性成分の血液中での循環を生ずるにすぎない。
しかし，この薬剤供給では，細胞の細胞質または核（こ
れは，処理されるかまたは殺されるかと期待される）へ
の経路を見い出すことは確実にするための特別なメカニ
ズムは，何ら用意されていない。他方，特定の細胞は，
例えば，免疫毒素の利用を通じて，標的にされるかもし
れない。しかし，どのような作用機構が細胞それ自体に
よって有効とされるかによって，問題の内部細胞の中に
細胞膜を通じての浸透が生じるか，またはその処理の適
切な部位が細胞外であるかいずれかとなる。 もちろん，ウイルス粒子が，感染の正常の経過におい
て，細胞中に外部の核酸およびタンパクを導入し得るこ
とは確立されている。遺伝子治療の目的のために，標的
となる哺乳動物細胞の中に遺伝材料を運搬するウイルス
粒子の利用が，この技術を発展させるために現在行われ
ている主要な試みであると思われる。例えば,McCormic
k,D.,Bio/Technology（1985）３:689−693を参照せよ。
さらに,Lang,R.A.,ら，Cell（1985）43:531−542ではネ
ズミ科の血液−細胞系列のオートクライン（autocrin
e）増殖を促進するGM−CSFを用いた類似の系が使用され
得た。そのLangの研究では,cDNAをコードするGM−CSF
が，ウイルスの長い末端繰り返しの配列のプロモーター
／エンハンサーの制御下にて，モロニーネズミ科の白血
病の基礎としたベクターに挿入された。そして，感染症
でヘルパーのないウイルスが，Ψ２をパッケージする細
胞系列にトランスフェクトすることにより，生産され
た。この生産されたGMVウイルスは，造血細胞系列でGM
−CSF産物を生じさせ得た。この能力は，しかしなが
ら，今まで完全な生物中で設計されたタンパク薬剤の輸
送に用いられることはなかった。 特にレトロウイルスは，外来の遺伝子挿入のためのベ
クターとして用いられている。そして，この使用の一般
的なパラメーターは，現在全くよく理解されている：レ
トロウイルスは，タンパク外被の内部に閉じ込められた
一本鎖RNAゲノムから成る。５′末端から３′末端に読
むそのゲノム自体は，以下を含む。これらは，キャッ
プ,5′翻訳領域，“Ψ”と命名されたRNA区分すなわち
パッケージ部位（このRNA区分は，タンパク中に包装さ
れ得るRNAに必要である），そしていくつかのタンパク
−−そのレトロウイルスの核タンパク（gag）のための
コード配列:DNAの翻訳（pol）からなる中間段階を促進
する逆転写酵素および頭殻タンパク（env）のウイルス
性外被，およびいくつかの３′非翻訳配列によって行わ
れる全ての領域である。３つのウイルスタンパクは，ウ
イルスゲノムの感染に必要である。このパッケージング
部位は，添加した感染性ウイルスを生産するのに必要で
ある。 レトロウイルスは，そのタンパクをコードするRNA領
域の２重鎖cDNAコピーを含む“プロウイルス”段階を経
験する。しかしながら，この段階では，その転写されな
い３′領域および５′領域は，このタンパクをコードす
るcDNAのいずれかの末端にて，長い末端繰り返し配列
（LTR）を含むべく修飾される。この長い末端繰り返し
配列は,DNAの転写を生じる適当なプロモーター配列およ
びエンハンサー配列だけでなく，このコード部分に関し
て，作動可能な位置にて転写を終了させる配列を供給す
る。 普通の感染では，プロウイルスの２重鎖cDNAは，宿主
細胞のゲノムの中に吸収され得る。そして，これらの効
果から,RNAゲノムを含む追加のウイルス粒子の生産物
は，そのタンパクカプセルにパッケージされた。行われ
るこの手順では，このプロウイルス中にΨパッケージ部
位が，存在することは，重大である。 レトロウイルスのタンパクをコードする配列は，その
修飾されたウイルスが宿主細胞に感染するとき，そのウ
イルスの発現系を使用するように，所望のタンパクに対
する配列と置き換えられることが，他にもあった。例え
ば，米国特許4,405,712号およびLang（前述）を見よ。
しかしながら，これを達成するには，この修飾されたウ
イルスゲノムは，頭殻タンパクを合成し得、かつ外来DN
AのRNA転写をパッケージし得るヘルパーウイルスを必要
とする。 それゆえ，“遺伝子治療”のためには，プロウイルス
DNA形は，適当なベクターの中に挿入され，複写され，
そしてヘルパーウイルスの援助をうけてウイルス外被に
パッケージされる。一般的な総説としては,Anderson,W.
F.Science（1984）226:401−409:Coffin,J.,“Genome S
tructure",in RNA Tumor Viruses, Vol2,Weiss et al,e
ds,2d ed,（1985）,Cold Spring Harbor,NYを参照せ
よ。 遺伝子治療の研究に対して最も一般的に用いられるレ
トロウイルスは，ネズミ科の肉腫ウイルス（MSV）また
はモロニーネズミ科の白血病ウイルス（MoMLV）である
（Mann.R.,ら，Cell（1983）33:153−159）。これらの
レトロウイルスのプロウイルス形は，単離され，そして
増幅のためにほぼ標準的な細胞のクローニングベクター
に挿入される。パッケージ部位に沿ったプロウイルスの
挿入（これは，コントロール配列を含む長い末端繰り返
し配列に隣接するgag,polおよびenvをコードしているmR
NAを含む）は，このタンパクをコードするRNAを含む領
域を所望の外来遺伝子に置き換えるように扱われる。こ
のDNAが，完全なウイルス，またはパッケージ部位のみ
が欠けている欠損ウイルスで感染された宿主細胞にトラ
ンスフェクトされるなら，修飾されたプロウイルスから
合成されるRNAは，そのとき，他の細胞に再感染するた
めのウイルス粒子にパッケージされる。このことによ
り，感染によって，所望の活性成分または薬剤をコード
するDNAを細胞に導入するための作用機構が供給され
る。 これに着手するのに２つの方法がある。一つの方法で
は，修飾されたプロウイルスDNAは，その細胞中に共存
する修飾されていないウイルスからの感染に耐える細胞
にトランスフェクトされる。正常なウイルスベクター
は，パッケージする材料を合成し，そして，修飾された
プロウイルスによって生成するmRNAのいくつかは，正常
なビリオンに類似の方法で，パッケージされる。次い
で，これはタンパクの生産のために，標的細胞に感染さ
せるべく用いられ得る。しかしながら，これらの集めら
れたウイルス外被に加えて，再パッケージされた正常ウ
イルスもある数で存在するだろう。このウイルスは，
“供給物運搬用”ウイルスから分離されないなら，ビリ
オン生産過程の生成物に感染された宿主細胞にて，さら
にウイルス感染を簡単に引き起こすだろう。 もっと有用な方法では，所望の遺伝子を含むプロウイ
ルスのクローニングベクターは，欠損ウイルス外被を生
産するように，遺伝コード的に修飾された細胞をトラン
スフェクトするのに用いられる（この欠損ウイルス外被
は，実際には，空の供給運搬物である）。これらの細胞
は，Ψパッケージ部位を欠いている変異体レトロウイル
スのプロウイルス型の統合によって得られる。そして，
いくつかのこのような細胞系列は，それらを求める全て
の技術に利用できる。Ψ−１またはΨ−２と命名された
これら２つの系列は,Mann.Rら，Cell（1983）33:159−1
59（前述）に、広範囲に記述されている。これは,MoMLV
プロウイルス挿入物を含むプラスミドを用いて，宿主NI
H−3T3繊維芽細胞をトランスフェクトすることにより作
られる。この挿入物からは，Ψパッケージ部位が削除さ
れている。このΨ−２細胞は，一世代の中で固有のウイ
ルスのウイルス外被に相当する細胞あたり，いくらかの
空のウイルス外被を明らかに生産する。これらの細胞
が，外来遺伝子位とパッケージ部位（Ψ）の両方を含ん
でいるプロウイルスのDNAでトランスフェクトされると
き，それらは，修飾されたウイルスを産むように，外来
遺伝子を含むプロウイルスDNAからこれらの空の外被に,
mRNAの転写物をパッケージする。この修飾されたウイル
スは，普通はMoMLVに対する宿主である（この場合では
ネジミ科の動物の）細胞を感染させる、しかしながら，
この組み換え体（修飾されたウイルス）は，それが“感
染させる”細胞中にさらに修飾されたビリオン（または
他の）ビリオンの産生の引き起こし得ない点で欠損があ
ることは注目されるべきである。この組み換え体は，
“感染された”細胞において，この遺伝子がコードする
タンパクの産生を引き起こし得る。しかし，その感染
は，追加のビリオンが全く生産されないので，付加的な
細胞を広げることができない。 現在の発明において，人間に対する薬剤の調製のため
に，Ψ２よりも有用であるのは，Ψ−AM系列である。こ
の系列は,Cone,R.D.,ら，Proc Natl Acad Sci USA（198
4）81:6349−6353から得られる。これらの系列は,NIH−
3T3細胞をトランスフェクトすることによっても得られ
る。しかし,pMAV−Ψ−と命名されるベクターを用いね
ばならない。このベクターも，Ψパッケージング部位を
欠く欠損プロウイルスの挿入物を含む。しかし,pMAV−
Ψ−は,MoMLVのgag−pol配列をコードするハイブリッド
であり，そして外被配列は，両性のウイルス4070Aに由
来する。これらの細胞系列によって生産された空の頭殻
は，偽ウイルスを生産するような共トランスフェクトさ
れ修飾されたプロウイルスDNAのRNA転写物をパッケージ
する。この偽ウイルスは，人間，野ネジミおよびハツカ
ネズミの細胞を認識し感染させる。 それゆえ，この技術は，過去において，遺伝子治療ま
たはオートクライン増殖因子の生成のためだけに使用さ
れてきた感受性細胞に遺伝子を移すための体系を与え
る。これらの方法は，必然的にレトロウイルスのベクタ
ーに標的細胞をエキソ−ビボにさらすことを利用する。
例えば，遺伝子治療では，骨髄細胞が除去されそして処
置され，次いで，注入される。現在の発明では，類似の
系は，高率に終末させてかつ局在化させる“感染”を生
じるような通常の投薬方法を用いて，調合薬を標的細胞
に供給するために集められる。 （発明の要旨） 本発明は，極めて独特の薬剤の組成物およびウイルス
感染を受けやすい生物細胞に活性のある薬剤を供給する
方法を指向する。この標的生物は，通常，脊髄動物であ
る。一実施態様では，この薬剤組成物は，外被タンパク
を含む供給ウイルスから構成される。この外被タンパク
は，薬剤によって処置された対象生物において，細胞の
一過性で複製しない感染を引き起こし得る。これらの薬
剤組成物は，血中への注入により，または腫瘍細胞のよ
うな望ましくない細胞塊への局在的な注入によって投与
される。 本発明のRNAゲノムを含有し薬剤供給に有効なビリオ
ンは，該ゲノムがタンパク薬剤をコードするmRNAを含
み，そして標的対象細胞を感染させ得る外被タンパクに
含まれており，該mRNAがレトロウイルス由来の制御配列
およびパッケージ部位に動作可能に連結されている。 本発明のプロウイルスDNAは，レトロウイルス由来の
制御配列に動作可能に連結した所望のタンパク薬剤をコ
ードする配列を含有し，該DNAがΨパッケージ部位を含
み，かつレトロウイルス由来の長い末端繰り返し配列に
隣接している。 本発明のRNA配列は，レトロウイルスの制御配列に動
作可能に連結した所望の非ウイルスタンパクをコードす
るmRNAを含有する。 本発明のプロビリオンは，レトロウイルス由来の２つ
の長い末端繰り返し配列の間に連結されている所望の非
ウイルスタンパクをコードし，Ψパッケージ部位を含
む。 本発明の細胞系列は，Ψパッケージ部位が欠失したレ
トロウイルスで形質転換された細胞系列であって，該細
胞系列がプロビリオンで形質移入された細胞系列であ
り，該プロビリオンがレトロウイルス由来の２つの長い
末端繰り返し配列の間に連結されている所望の非ウイル
スタンパクをコードし，Ψパッケージ部位を含むプロビ
リオンである。 本発明の薬剤供給ビリオンを調製する方法であって，
該方法は細胞を培養し，生産される供給ビリオンを回収
することを包含する方法であり，該細胞がΨパッケージ
部位が欠失したレトロウイルスで形質転換された細胞系
列に属する細胞であり，該細胞系列がプロビリオンで形
質移入された細胞系列であり，該プロビリオンがレトロ
ウイルス由来の２つの長い末端繰り返し配列の間に連結
されている所望の非ウイルスタンパクをコードし，Ψパ
ッケージ部位を含むプロビリオンである。 本発明の薬剤組成物は，薬剤供給ビリオンを含有し，
野生型ビリオンを含まず，該薬剤供給ビリオンがRNAゲ
ノムを含有する，薬剤供給に有効なビリオンであり，該
ゲノムがタンパク薬剤をコードするmRNAを含み，そして
標的対象細胞を感染させ得る外被タンパクに含まれてお
り，該mRNAがレトロウイルス由来の制御配列およびパッ
ケージ部位に動作可能に連結されている。 それゆえ，ある局面では，本発明は，供給レトロウイ
ルスを含む薬剤供給系に関する。このレトロウイルス
は,RNAおよび外被タンパクを含む“ゲノム”を有する。
このRNAは，制御配列（これはレトロウイルスに由来し
ていた）およびΨパッケージ部位と動作可能に連結され
る所望の感染タンパク成分をコードする。この外被タン
パクは，ビリオンを有する標的宿主細胞を感染させ得
る。その結果，この標的宿主細胞のみが“感染される”
が，この感染を付加的な細胞にまで進行させ得ない。 もう１つの局面では，本発明は，活性タンパク成分を
対象の脊椎動物宿主に投与する方法に関する。この方法
は，局部的または体系的のいずれかで，この薬剤供給系
を投与することを包含する。 さらに他の局面では，本発明は，上記薬剤供給系を調
製する際に重要な材料および過程に関する。これらは，
プロウイルスDNAを含んでいる。このプロウイルスDNA
は，所望の活性タンパク成分をコードするDNA配列から
構成される。この活性タンパク成分は，以下の制御配列
と動作可能に連結されている。この制御配列は，レトロ
ウイルス由来で，パッケージ部位を含み，そしてレトロ
ウイルス由来のLTRだけでなくΨ−−細胞（これはこの
プロウイルスとトランスフェクトされている）によって
隣接されている。 もう１つの実施態様では，本発明の一般的な方法は，
前の段階のプロウイルスDNAでトランスフェクトされた
Ψ−細胞，または所望のタンパクの生産物をものと位置
で生じるように生成する偽ウイルス粒子と感染される細
胞を注入することによっても，実施され得る。従って，
共トランスフェクトされたΨ−細胞，およびそれらが生
産する修飾されたウイルスで感染される細胞も，本発明
の局面である薬剤組成物を提供する。 また，本発明の局面は，それらの組成物を調製する過
程である。この過程は，前述のΨ−パッケージ細胞によ
って生じた供給ウイルスを単離することを包含する。 発明の実施要領 A.定義 ここで用いられているように，“薬剤供給ビリオン”
とは，“活性成分”タンパクのコード配列に動作可能な
ように連結したレトロウイルスの核酸由来の制御配列を
含むRNAをゲノムとする修飾レロウイルスを指して言
う。このゲノムは，そのタンパクで治療しようとする対
象物（患者）に適合し，そしてその中に含まれる遺伝子
で“感染”を引き起こし得るタンパク外被にパッケージ
される。この場合の感染の範囲，所望のRNAを細胞に移
入し，タンパクを生産させることに限られ，付加的な感
染性のビリオンは，生産されない。 このように，“終末”感染は，ウイルス外被が修飾ウ
イルスの細胞質への移入を促進し，そして，含まれてい
るゲノムは発現されるが，新しいビリオンは生産されな
いような，改変された形の感染のことを述べている。 “制御配列”とは，例えば，プロモーター，そしてし
ばしばエンハンサーを含む核酸配列を言う。このプロモ
ーターおよびエンハンサーは，該制御配列に動作可能な
ように連結したコード配列の発現による所望の活性タン
パク成分の生産に必要で，かつ充分なものである。 本発明の薬剤放出レトロウイルスの場合は,RNAゲノム
およびそのプロウイルスの相対物もまた，Ψパッケージ
ング部位を含む。 “核酸配列”という用語は，ここでは時々,DNAおよび
RNA断片の両者を意味する遺伝学用語として採用され
る。核発明の材料は，レトロウイルスのゲノムおよびそ
のプロウイルスの相対物を含むので，ここで述べられる
特定の機能性配列は,RNAおよびDNAの両方の形態で生じ
る。相当する遺伝子座は,DNAおよびRNA両方におけるそ
の発生が，相互変換可能なように述べられる。なぜな
ら，感染の普通の過程においては，そのような機能性
は，もちろん，相互変換可能であると理解されるからで
ある。例えば，そのΨパッケージング部位は，パッケー
ジされるべきRNAゲノム中で，明らかに動作可能であ
る。しかし，相当する配列がプロウイルスDNA中に生じ
る。同様に，プロモーター，エンハンサーおよびターミ
ネーター配列も，少々異なる形ではあるが，ゲノムRNA
およびプロウイルスDNAの両方の形態で，生じる。ウイ
ルスの生活環の種々の段階におけるこれらの機能性の相
互変換能力は，当該分野において理解されている。従っ
て,DNAまたはRNAの状態に関するむしろルーズな命名が
これらについて述べるのにしばしば用いられている。特
に，塩基の配列決定により特定される配列は，これらの
特異的な配列およびその相補鎖を,DNAおよびRNA両方の
形において，含むと考えられるべきである。 本発明の薬剤組成物には，トランスフェクトされた中
間細胞により生産される薬剤放出ビリオンが含まれる。
この中間細胞は，Ψ−ヘルパープロウイルスで形質転換
され，従って空の外殻を生産する。この組成物の調製に
用いる細胞について述べる場合には，簡単のため，これ
らの細胞を“パッケージング”細胞と言う。 得られる供給ビリオンは，野生型細胞をインビトロで
感染させるのにも使用され得る。例えば，標的宿主中
で，所望のタンパクの生産を引き起こす薬剤供給ビリオ
ンの能力のモデルとして使用され得る。これらの感染細
胞は，ここでは，“テスター”細胞と言う。 B.発明の概要 本発明の組成物の調製における重要な中間体は，投与
すべきタンパク薬剤のコード配列を含むプロウイルスDN
Aベクターである。そのような活性タンパク成分をコー
ドするDNAは，どのような手近な供給源からも得ること
ができる。そして，選択したタンパクに依存して，該DN
Aは，化学的に合成,cDNAライブラリーから回収，ゲノム
DNAから単離，または，そうでなければ当該分野での既
知の方法により得ることができる。 本発明の方法により投与されるべきタンパクは，処理
（治療）されるべき対象（患者）の感染細胞に対し，所
望の効果を与えるいずれのタンパクをも包含する。本発
明の薬剤供給系の利点は，特に，標的細胞の細胞質内で
該タンパクが作用するときに経験される。例えば，腫瘍
壊死因子（TNF）は，選択的に腫瘍細胞を殺すことがで
きるが，その効力を発揮するためには，細胞膜を通過す
る必要がある。リボトキシンおよび種々のコロニー刺激
因子のような他のタンパクもまた，細胞内で作用する。 本発明の系はまた，標的細胞の外側で機能する物質ま
たは細胞表面のレセプターに結合することにより機能す
る物質に対しても適用され得る。しかし，このような場
合には，薬剤供給ビリオンは，感染したパッケージング
細胞または，薬剤供給ビリオンに感染したテスター細胞
の移植片として，間接的に投与される。例えば組織プラ
スミノーゲンアクチベーターまたはウロキナーゼ（これ
らは血液中の可溶性酵素に対し，それ自信が血流中で直
接的に働く）は，これらの移植細胞により，その場で生
産され得る。 前述のタンパクをコードするDNAは，当該分野におい
て入手可能である。そして，所望であれば，取り扱いを
便利にするため，リンカー配列ではさまれたものを得る
ことができる。該供給系の特徴は，ゲノムDNAおよびcDN
A配列の両方を使用し得ることである。これは，プロウ
イルスによってトランスフェクトされた環境下で，イン
トロンがプロセッシングされ得るためである。このタン
パク薬剤は，所望タンパクのいずれの形（例えば，活性
型．成熟型，融合タンパク，プレタンパクまたはプレプ
ロタンパク）をも特定するように供給ビリオン中にコー
ドされ得る。後術の実施例では,TNFをコードするcDNAク
ローンをコード配列の源として用いるが，これは，明ら
かに例証にすぎず，他のどのような所望のコード配列を
も採用し得る。 プロウイルス輸送ベクターは，レトロウイルスの適当
なプロウイルス型を単離することによって得られる。こ
のレトロウイルスには，例えば，通常使用されるマウス
肉腫ウイルス（MSV），モロニーマウス白血病ウイルス
（MoMLV），ハーベイ肉腫ウイルス（HaSV），または種
々の他のレトロウイルスがある。ビリオン自身と関連す
るタンパクは，この建築物中では欠損しているので，肝
炎,HTLVIおよびLAVIのようなヒトに病気を引き起こす感
染性レトロウイルスでさえも使用され得る。しかし，治
療を受ける患者の間に当然心理的な抵抗をもたせる可能
性があるような材料は，使う必要もないであろう。 組織培養でウイルスを増殖させ，プロウイルスDNAを
単離し，このプロウイルスDNAをγファージクローニン
グベクターにクローニングし，そして，フォージベクタ
ーが統合されるような感受性宿主バクテリア中で組み換
えベクターを増殖させることによって，選択したレトロ
ウイルスのプロウイルス型が得られる。このプロウイル
スDNAは切り出され，再分離される。次に，そのプロビ
リオンには適当なリンカーが与えられ，増幅のためバク
テリアのクローニングベクターに挿入される。適当なバ
クテリアのクローニングベクターには,pBR322,pMLまた
はpUCシリーズのベクターが包含される。制限部位を除
去または変化させるなどして，これらを修飾する必要が
あり得る。これは，当業者には公知である。該クローニ
ングベクターは制限処理され，次に，リンカーをつけた
プロビリオンが挿入される。 もとのプロビリオン挿入物は，長い末端繰り返し（LT
R）配列に隣接するウイルスタンパクコード配列を含
み，そして，そのLTRの１つに隣接したパッケージング
部位を含む。このパッケージング部位と他方のLTRとの
間のこれらのタンパクコード配列は，次に，適当な制限
酵素による分解および／またはエキソネクレアーゼ分解
によって除去され，リンカーまたはポリリンカー配列に
より置換される。その適当な部位は，既に介在領域中か
ら得ることができ，もしそうでなければ，これらを位置
特異的変異法（当該分野において既知である）により得
ることができる。 増幅の後，修飾プロビリオンを含むベクターを適当な
制限酵素で開裂させ，所望のコード配列を挿入するため
にベクターを開環させる。パッケージング部位を除く制
限配列は，長い末端繰り返し配列の中にあるので，所望
のタンパクコード薬剤の配列のリンカーへの挿入は，制
御配列と動作可能なように連結させて行なわれる。得ら
れる修飾ビリオンは，ビリオンタンパクの代わりに所望
のタンパクの発現系となる。そして，該修飾ビリオンは
修飾したウイルスゲノムを感染性にすることの可能なパ
ッケージング部位を，なお保持している。 これらの薬剤供給プロビリオンDNAは，既知の手法を
用いて増幅および単離され，Ψ−パッケージング細胞の
トランスフェクティングDNA源が供給される。 所望であれば，修飾ビリオン中の挿入コード配列もま
た，マーカー配列を含み得る。しかし，マーカー配列が
挿入物の３′位に置かれると，挿入配列の発現が有意に
減少するのが認められる。これは，Ψ−パッケージング
細胞のトランスフェクションが適当なマーカー（最も適
切なのは,G418耐性マーカー）を有するベクターによる
形質転換と，同時になされれば，避けられ得る。もちろ
ん，適当ないずれのマーカーも使用され得，そのような
マーカーとしては，例えば，ミコフェノール酸耐性を与
えるエコプト，およびメトトレキセート耐性を与えるDH
FR配列が包含される。 修飾されたプロビリオンは，マーカープラスミドとと
もに，もし必要であれば，リン酸カルシウム沈澱法のよ
うな標準的なトランスフェクション法で，受容体パッケ
ージング細胞にトランスフェクトされる。その形質転換
体をそれらの特有な細胞型に適切な培地で生育させる
（後述のΨ-3T3細胞は，野生型の3T3細胞に，一般に用
いられる条件下で培養する）。もちろん，生成した形質
転換体を選抜するためには，培地中に適量の選択成分
（例えばG418）が加えられる。 形質転換されたパッケージング細胞が，修飾ビリオン
中の挿入コード配列によりコードされたタンパクをうま
く生産していることは，培地中または細胞ライゼート中
のタンパク濃度が適切なものであることにより示され得
る。 パッケージング組み換えビリオンを得るために，たと
えば,0.45μフィルターを用い，パッケージング細胞の
上澄液を該細胞から分離する。濾液からウイルスを，例
えば，高速遠心分離して濾液からウイルス粒子を採取
し，または濾液自身が使用される。次に，濃縮したウイ
ルス粒子，または濾液は薬剤組成物として処方される。 さらに，このピリオン調製物は，テスター細胞系列を
用いて標的細胞への薬剤供給に効果をもたらす能力が評
価され得る。テスター細胞系列は，例えば，パッケージ
ング細胞系列の野生型の相対物であり空のウイルス外被
を生産しないもの，または，ウイルスによる感染に感受
性であり，好ましくは，組み換えビリオンの生産するタ
ンパクにも感受性であるいずれの細胞系列をも指してい
う。このテスター細胞の生産する所望のタンパクの量は
評価され得，そして，適当な細胞である場合には，この
評価は，タンパクの細胞への直接の影響によりなされ得
る。 パッケージングおよびテスター細胞の両者とも，それ
自身タンパク薬剤の供給源を与える移植物としても使用
され得る。 C.有用性および投与 本発明の薬剤供給系は，タンパク物質が，それらが効
果を示す得る細胞内へ入っていくという最終的な結果の
点で，まさに有効である。この移入は，ウイルスの感染
によっておこるので，薬剤供給ビリオンを標的細胞と併
置させることのみが必要とされる。例えば，もし標的細
胞が実質腫瘍中に局在すれば，本発明の組成物は実質腫
瘍中に直接注入され得る。しかし，細胞が広く分布して
いる場合（白血病または，例えば，赤血球または，骨髄
細胞を標的にする必要がある場合）には，全身的な静脈
注射が必要とされる。 このビリオンは，注射（薬剤を投与するための典型的
な方法である）用に調製される。つまり，等張食塩水に
懸濁し，または，当該分野で既知の他の薬学的に適切な
媒体による懸濁液として調製される。 パッケージングまたは，テスター細胞の移入は，生理
食塩水のような適切な併用物と合わせた処方物とし，所
望の部位に直接注射することにより，行われる。その細
胞は，また，カプセル化の手法を用いて処方され得る
（例えば，米国特許第4,391,909号参照）。 D.標準的方法 使用する宿主細胞に依存して，そのような細胞に適切
な標準的方法を用いて形質転換が行われる。Cohen,S.
N.,Proc Natl Acad Sci（USA）（1972）69:2110,に記載
された塩化カルシウムを用いたカルシウム処理法，また
は,Maniatisら，Molecular Cloning:A laboratory Manu
al（1982）Cold Spring Harbor Press,p.254に記載され
たRbCl2法が，原核生物または，実質的な細胞壁障壁を
有する他の細胞に対して用いられる。そのような細胞壁
を持たない哺乳類動物には,Graham and van der Eb,Vir
ology（1978）52:546に記載のリン酸カルシウム沈澱法
が好ましい。 所望のコード配列および制御配列を含む適当なベクタ
ーの構築には，当該分野でよく知られた標準的なライゲ
ーションおよび制限技術が採用される。単離されたプラ
スミド,DNA配列，または合成オリゴヌクレオチドを開裂
させ，適当に仕立て，所望の形に再ライゲーションす
る。 位置特異的DNAの切断は，適当な制限酵素の１種もし
くはそれ以上により，当該分野で一般的に知られる条件
下，および商業的に入手できる制限酵素の生産者により
特定された特定の条件下（例えば,New England Biolabs
製品カタログ参照）において行われる。一般に，プラス
ミドまたは,DNA配列約１μｇは，約20μの緩衝液中で
１単位の酵素により切断される。ここでの実施例におい
ては，典型的には,DNA基質の完全な分解を確実にするた
め，過剰の制限酵素が用いられる。変更も可能である
が。約37℃〜約１〜２時間のインキュベーションの時間
が適当である。各インキューベーションを行った後，フ
ェノール／クロロホルム抽出により，タンパクの除去が
行われる。そして，その後のエーテル抽出が行われ得
る。そして，エタノールでの沈澱および10mM Tris 1mM
EDTA,pH7.5への再懸濁により水層から核酸が回収され
る。もし所望であれば，切断した断片のサイズ分離が，
標的な手法を用いたポリアクリルアミドゲルまたはアガ
ロースゲル電気泳動により行われ得る。サイズ分離の一
般的な記述は,Methods in Enzymology（1980）65:499−
560に記載されている。 制限切断断片は,4つのデオキシヌクレオチドトリフォ
スフェート（dNTP）の存在下で，E.coli DNAポリメラー
ゼＩの大断片（クレノー）による処理で平滑末端にされ
得る。この反応の条件には,50mM Tris pH7.6,50mM NaC
l,6mM MgCl2,6mM DTTおよび５〜10μM dNTP中で,20〜25
℃にて15〜25分のインキュベート時間が採用される。そ
のクレノー断片は,5′粘性末端を埋めるが,4つのdNTPが
存在しても，突き出した３′一本鎖を埋めない。もし所
望であれば，粘性末端の性質により決まる制限内で,dNT
Pの１種のみ，または選択したdNTPを供給することによ
って選択的修復がなされ得る。クレノーでの処理後，そ
の混合物はフェノール／クロロホルムで抽出され，エタ
ノール沈澱が行われ，その後、セファデックスG50スピ
ンカラムにかけられる。S1ヌクレアーゼによる適当な条
件下での処理で，すべての一本鎖部分が加水分解され
る。 合成オリゴヌクレオチドは,Matteucciら（JAm Chem S
oc（1981）103:3185）のトリエステル法により，また
は，市販のオリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いて
調製される。アニーリングに先立つ，または標識化のた
めの一本鎖のキナーゼ処理は，過剰量（例えば,50mM Tr
is,pH7.6,10mM MgCl2,57mMジチオスレイトール,1〜2mM
ATP,1.7pmoles γ32P−ATP（2.9mCi/mmole）,0.1mMスペ
ルミジン,0.1mM EDTAの存在下で,0.1nmoleの基質に対し
約10単位のポリヌクレオチドキナーゼ）を用いて行われ
る。 ライゲーションは,15〜30μの容積で，以下の標準
的条件と温度とで行われる:20mM Tris−Cl pH7.5,10mM
MgCl2,10mM DTT,33μg/ml BSA,10mM〜50mM NaCl,および
40μM ATP,0.01〜0.02（Weiss）単位T4 DNAリガーゼ，
（０℃にて）（“粘性末端”ライゲーション用）また
は,1mM ATP,0.3〜0.6（Weiss）単位T4−DNAリガーゼ（1
4℃にて）（“平滑末端”ライゲーション用）。分子間
“粘性末端”ライゲーションは，通常，全DNAの濃度が,
33〜100μg/ml（全末端濃度５〜100mM）で行われる。分
子間平滑末端タイゲーション（通常,10〜30倍過剰モル
のリンカーが用いられる）は，全末端濃度１μＭが行わ
れる。 “ベクター断片”を用いたベクターの構築では，該ベ
クターの５′リン酸塩を除去し，再タイゲーションを防
止するため，通常，ベクター断片はバクテリアアルカリ
ホスファターゼ（BAP）で処理される。BAP分解は,pH8,
約150mM Tris中でNa+,およびMg+2の存在下において,1μ
ｇのベクターあたり,1単位のBAPを使い,60℃にて約１時
間行われる。核酸断片を回収するため，この調製物をフ
ェノール／クロロホルムで抽出し，エタノール沈澱を行
い，セファデックスG50スピンカラムにかけ，脱塩が行
われる。または，不必要な断片をさらに制限酵素で分解
することにより２重分解されたベクターで再ライゲーシ
ョンが防止され得る。 ベクターの配列の修飾を必要とするcDNAまたはゲノム
DNA由来の部分には，位置特異的プライマー変異操作法
が使用される。これは，限定されたミスマッチを除き，
変異をおこすべき一本鎖ファージDNAに相補的な合成オ
リゴヌクレオチドプライマーを用いて行われ，その結果
所望の変異が発現される。簡単に述べれば，合成オリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして用い，そのファージに
相補的な鎖を直接合成し，そして，生じた二本鎖DNAで
ファージ補助バクテリア宿主を形質転換する。形質転換
されたバクテリア培養物をトップアガー中でプレートに
まき，ファージを保持する単一細胞からブラークを形成
させる。 理論的には，新しいプラークの50％が（一本鎖とし
て）変異した形のファージを有しており;50％はもとの
配列を有している。生じたプラークは，正確に一致する
ハイブリダイゼーションを許容する温度下で，キナーゼ
処理した合成プライマーとハイブリダイズする。しか
し，もとの鎖とミスマッチしてハイブリダイゼーション
が避けられるような温度であれば充分である。次に，プ
ローブとハイブリダイズするプラークを採取し，培養
し，そして,DNAを回収する。位置特異的変異方法の詳細
は，後述の特定の実施例に示す。 プラスミド構築のためのライゲーションが正しく行わ
れているか否かは，まず，E.coli Genetic Stock Cente
r,CGSC＃6135より得たE.coli MM294株，または，その他
の適当な宿主をライゲーション混合物で形質転換するこ
とにより確認される。所望の形質転換体は，アンピシリ
ン，テトラサイクリンまたは他の抗生物質耐性あるい
は，当該分野で公知のごとく，プラスミドの構築の様式
に依存した他のマーカーにより選択される。形質転換体
からプラスミドが,Clewell,D.B.ら,Proc Natl Acad Sci
（USA）（1969）62:1159,の方法で，調製される。この
方法では，必要に応じて，クロラムフェニコール増幅
（Clewell,D.B.,J Bacteriol（1972）110:667）が行わ
れる。単離されたDNAは，制限酵素処理法および／また
は塩基配列決定法により分析される。塩基配列決定法と
しては,Sanger,F.,ら，Proc Natl Acad Sci（USA）（19
77）74:5463（これは，さらにMessingら，Nucleic Acid
Res（1981）９:309に記述されている）のジデオキシ
法，または,Maxmaら，Methods in Enzymology（1980）6
5:499の方法がある。 ここでクローニングおよび発現に用いる宿主株は，次
のとおりである： クローニングおよび塩基配列決定には，E.coliHB101
株を宿主として用いた。 M13ファージ組み換え体には，E.coli K12株DG98のよ
うな，ファージ感染に感受性のE.coliの株が採用され
る。このDG98株は,ATCCに1984年７月13日に寄託され，
受託番号1965を有する。 （実施例） 以下の実施例は本発明を例証することを意図したもの
であって，本発明を制限することを意図したものではな
い。 実施例１ TNFを含む修飾プロビリオンの調製 ヒトTNFのコード配列は，クローンpE4すなわち米国特
許出願第760,661号（1983年７月30日提出；同一譲受人
に譲渡され，参照文献としてここに述べられている）に
広範囲にわたって記述されているcDNAクローンから得ら
れた。このクローンはまた,ATCC（1984年10月15日寄託;
ATCC＃39894）に寄託されている。 プラスミドpAW711（上記特許に記述;1984年11月８日
寄託;ATCC＃39918）もTNF配列の源として使用され得
る。 パッケージ部位とともにプロウイルス型のレトロウイ
ルス制御系を有するベクターは,pEVXの誘導体である;pE
VXは,pMLのEcoR I部位に挿入されたMoMLV由来のLTRおよ
びΨ部位を有する（Kreigler,M.J.,ら，Cell（1984）3
8:483−491）。pEVXを修飾し,Sma I/Bal I分節をハーベ
イ肉腫ウイルス（HaSV）由来の978bp Sam I/Sma I断片
で置換することによってスプライスドナー部位を除去し
た。このSam I/Sma I断片は,5′LTRの３′部分およびHa
SVゲノムの５′部分を有する。得られた構築物はSst II
で完全にBgl IIで部分的に切断され，本質的でないHaSV
領域を含まない669bp断片を欠失させた。この669bp断片
を含まないベクターをゲル精製し,Sst II末端およびBal
II末端を充填し，ライゲートすることによってこのDNA
を環状にした。得られたベクターpFVX−Ｍは,MoMLV由来
のLTR断片間のポリリンカーを有し，このウイルス由来
のパッケージ部位を含むが，上流側LTRにおけるスプラ
イスドナー部位は含まない。 pFVXMベクターを大腸菌HB101株内で増幅し，プラスミ
ドDNAを単離した。pE4を大腸菌HB101株内で同様に増幅
し，プラスミドDNAとして再び単離した。両方のプラス
ミドDNA調製物をPst Iで処理した（この処理はpE4からT
NFをコードする領域を切除し，ポリリンカー領域におけ
るpFXVMを切開するためのものである）。断片のライゲ
ーションは，標準的な条件とアンピシリン耐性という性
質を用いて実施した。プラスミドDNAを再び単離し，正
しい挿入方向は制限酵素分析によって確証した。TNFを
コードする配列が正しい方向である組み換えプラスミド
をpFVX−TNFと呼び，以下に記述するように適当なパッ
ケージ細胞を形質移入するために用いた。 同様の方法により，例えばpFVXMをPst Iで切断し，リ
シンＡトキシン,CSF−１およびウロキナーゼ，そして必
要に応じて適当なPst Iリンカーを与えられたこれらの
各々をコードするDNA配列にライゲートし得る。得られ
たベクターは，それぞれpFVX−RA,pFVX−CSFおよびpFVX
−UKと呼ぶ。 実施例２ 薬剤供給レトロビリオンの生産 実施例１で調製したpFVX−TNF（10μｇ）を１μｇのp
SV2−NEO（Southernら，J Mol Appl Gen（1982）１:237
−341）と混合した。このpSV2−NEOは，抗生物質G418耐
性を付与するマーカー配列を有する。１μg/mlのDNA混
合物を,10％のウシ胎児血清を含有するDMEM培地に添加
し，この溶液に30μg/mlのポリブレン（polybrene）を
添加した。得られた溶液を60mmペトリプレート上の８×
105Ψ−AM細胞（Mannら，上記）に注ぎ，このプレート
を37℃にて６時間,CO2インキュベーターでインキュベー
トした。初期成長の期間の後,400μg/mlのG418を含有す
る選択培地上でこの細胞を成長させ，耐性コロニーを選
び,TNF生産試験を行うために24穴の組織培養皿に移し
た。 細胞タンパクを35S−システインまた35S−メチオニン
で標識化した。この細胞をシステインまたはメチオニン
欠乏するためにシステインまたはメチオニンは含まない
が,5％の透析されたウシ胎児血清を含むDMEN上で37℃に
て30分間培養した。約400Ci/mmolの比活性を有する35S
−システインまたは35S−メチオニンを100μCi添加し，
この細胞をさらに37℃にて２時間培養した。上澄液を移
し，保存した。細胞を溶解緩衝液で溶解，この溶解産物
の上澄液を遠心分離によって回収した。洗浄した溶解産
物および内容液の上澄におけるTNFの存在を以下のよう
にして試験した。 ウサギについて調製したTNFに対するポリクローナル
抗血清を遠心管中の各試験材料に添加し,4℃にて１時間
振盪しながらインキュベートした。この後，セファロー
スCL4Bに結合したプロテインＡの50％（v/v）懸濁液を
添加し，次いで４℃にて30分間インキュベートした。 ビーズを微量遠心によってペレット状にし，そして洗
浄した。SDS内で煮沸することにより沈澱物をビーズか
ら除去した。可溶化されたTNFを含む溶液を電気泳動用
の12.5％ポリアクリルアミドゲル上に載せた。このタン
パクはオートラジオグラフによって読み取られるだけで
なく固定され，そして染色された。この結果は第１図お
よび第２図に示す。 第１図は35S−メチオニンを用いた標識化の結果を表
す。標識は溶解産物中の26kd未処理型タンパクの主配列
内にのみ見られる；成熟した17kdの（メチオニン残基を
含まない）分泌型には標識は存在しない。 第２図は35S−システイン標識化の結果を表す；未処
理型および成熟型は，その両方が予想通り標識化され
る。 細胞上澄液をさらに下記のＬ−929分析を用いてTNFを
定量した。この上澄液位のTNF活性を示す能力は，ウサ
ギ抗TNF血清と共にプレインキュベートすることにより
完全に消失した。 実施例３ 薬剤供給ビリオンの回収 培地中にTNFを分泌する，実施例２の細胞の上澄液を
0.45μのミリポアフィルターで濾過し，細胞の混入がな
いことを確認した。濾過した上澄液は,TNF−Ｖと呼ばれ
る組み換えビリオンを含有する。 実施例４ テスター細胞の終末感染 実施例２において調製したTNF−Ｖを用いて１×105の
NIH 3T3細胞またはRAT2細胞をCO2インキュベーター中で
一晩,37℃にてインキュベートすることにより感染させ
た。実施例２の記述と全く同様に35S−システインによ
る標識化，イムノプレシピテーションおよびラジオオー
トグラフィーを用い，細胞上澄液および溶解産物のTNF
生産について分析した。感染した細胞に対する結果を第
３図に示した。TNFの17kd型および26kd型はどちらも標
識を含んでいた。Ｌ−929細胞毒性分析を行ったとこ
ろ，これらの細胞からの上澄液もまたTNF活性を示し，
この活性はウサギ抗TNF血清と共にインキュベートする
ことによって除去された。 TNF活性の分析 TNFの生物学的活性を分析するために,L−929分析シス
テムをさらに使用した。Ｌ−929細胞をマイクロタイタ
ープレート上で単層になるように一晩調製した。試験試
料をこのプレート上で２倍に希釈し,UV照射し，次いで
調製された細胞単層の上に添加した。組織培養皿の穴に
ある倍地に１μg/mlのアクチノマイシンＤを添加した。
このプレートを37℃にて18時間インキュベートし，顕微
鏡により視覚的に記録した。各穴に25,50,75あるいは10
0％の評価を与えた。これらの評価は各穴における細胞
死滅の割合を表している。TNF活性１単位とは,50％の死
滅をもたらす希釈率の逆数であると定義する。 さらに，試験試料およびアクチノマイシンＤで処理す
る場合，予め標識化された細胞から35S標識化ペプチド
の放出をモニターすることにより，この分析をより高感
度な方法とした。この分析方法は効果の定量，例えば材
料を翻訳する卵母細胞の相対的効果を評価するために用
いられ得る。簡単に言えば,2％の透析されたウシ胎児血
清を補った，メチオニンを含まない倍地中で，活性を有
して成育しているＬ−929培養物を35S−メチオニン（20
0μCi/ml）によって３時間標識化した。次いで，この細
胞を洗浄し,96穴プレート上に載せ，一晩インキュベー
トし，そして翌日試験試料および１μg/mlのアクチノマ
イシンＤの２倍希釈液で処理した。さらにこの培養物を
37℃にて18時間インキュベートした。次いで各穴から10
0μの上澄液を別の96穴プレートに移し，酸（TCA）で
沈澱させ，そしてガラスファイバーフィルターに採集す
る。このフィルターを95％エタノールで洗浄し，乾燥
し，そして計数する。NP40洗浄剤による対照を，細胞か
らの放射能の最大放出量を測定するためにすべての分析
に含めた。次いで35Sの放出率（％）を，処理した細胞
と処理していない対照間の計数差と,NP40で処理した細
胞とNP40で処理していない対照間の計数差の比，すなわ
ち によって計算した。TNF能力が高いほどこの比の値が大
きくなった。 以下のプラスミドは，特許手続きの目的およびその規
則に対する微生物寄託の国際的承認に基づくブタペスト
条約の項目によってアメリカンタイプカルチャーコレク
ション（ATCC;ロックビル,MD,USA）に寄託されている。
従って。これらのプラスミドはブタペスト条約の項目に
したがって維持されており，利用が可能である。このよ
うな株の利用可能性は，いかなる政府の権威の下であっ
ても，特許法に従って承認された権利に違反して本発明
を実施するための許可として解釈されるべきものはな
い。 上述の明細は，当業者が本発明を実施し得るほど十分
のものであると考えられる。ここに記載された材料の寄
託は，ここに包含される記述が，その最良の様式を含む
本発明のいかなる様相を実施するにも不適当であるとい
うことを容認するものではなく，また特許請求の範囲
を，寄託された材料について表した特定の例証に限定す
るものであると解釈されるべきものでもない。 （発明の要約） 本発明の薬剤供給ビリオンは，レトロウイルスに由来
し，外被にパッケージされた所望のタンパク活性成分に
対する発現系を含むビリオンであって，その機能を果た
すために細胞膜を通過する必要がある物質を投与する際
に特に有用である。
【図面の簡単な説明】
第１図は,pFVX−TNFでトランスフェクトされたΨ−AM
（パッケージしている）細胞のライゼートにおいて,35S
−メチオニンでラベルされたTNFのラジオオートグラフ
を示す。 第２図は,pFVX−TNFでトランスフェクトされたΨ−AM
（パッケージしている）細胞のライゼートにおいて,35S
−システインでラベルされたTNFのラジオオートグラフ
で示す。 第３図は,TNF供給ビリオンで感染したテスター細胞の上
澄液およびライゼートにおいて,35S−システインでラベ
ルされたTNFのラジオオートグラフを示す。
（パッケージしている）細胞のライゼートにおいて,35S
−メチオニンでラベルされたTNFのラジオオートグラフ
を示す。 第２図は,pFVX−TNFでトランスフェクトされたΨ−AM
（パッケージしている）細胞のライゼートにおいて,35S
−システインでラベルされたTNFのラジオオートグラフ
で示す。 第３図は,TNF供給ビリオンで感染したテスター細胞の上
澄液およびライゼートにおいて,35S−システインでラベ
ルされたTNFのラジオオートグラフを示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 フランシス ピー．マコーミック
アメリカ合衆国 カリフォルニア
94706 アルバニー，ラモナ アベニュ
ー 921
(72)発明者 ミカエル クリーグラー
アメリカ合衆国 ペンシルベニア
19002 アンブラー，ロカルッシュ ア
ベニュー 615
(56)参考文献 国際公開85／5692（ＷＯ，Ａ１)
国際公開86／922（ＷＯ，Ａ１)
欧州公開178220（ＥＰ，Ａ１)
Ｃｅｌｌ （1985），43，Ｐ．531−
542
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ．，（1986）．83，Ｐ．409
−413
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ．，（1984）．81，Ｐ．6349
−6353
Ｎａｔｕｒｅ，（1986），320，Ｐ.
275−277
Ｓｃｉｅｎｃｅ，（1985），228，Ｐ.
149−154
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．ヒト細胞に感染し得る複製欠損レトロウイルス粒子
であって、該レトロウイルス粒子が、ヒトタンパクをコ
ードするRNA配列を含み、該RNA配列が、プロモーターに
動作可能に連結され、かつ該ヒト細胞中で発現可能であ
り、該タンパクがサイトカインまたは組織プラスミノー
ゲンアクチベーターである、レトロウイルス粒子。 ２．前記タンパクが細胞内で作用し得る、請求項１に記
載のレトロウイルス粒子。 ３．前記サイトカインがコロニー刺激因子である、請求
項２に記載のレトロウイルス粒子。 ４．前記コロニー刺激因子がCSF−１である、請求項３
に記載のレトロウイルス粒子。 ５．前記タンパクが分泌可能であり、かつ細胞外で作用
し得る、請求項１に記載のレトロウイルス粒子。 ６．前記タンパクが、サイトカインであるTNF、または
組織プラスミノーゲンアクチベーターである、請求項５
に記載のレトロウイルス粒子。 ７．前記タンパクがTNFである、請求項６に記載のレト
ロウイルス粒子。 ８．前記レトロウイルス粒子がMoMLV由来である、請求
項１に記載のレトロウイルス粒子。 ９．Ψパッケージ部位が欠失したレトロウイルスで形質
転換された細胞系列であって、該細胞系列が、請求項１
に記載の複製欠損組換えレトロウイルスで形質移入され
ている、細胞系列。 １０．薬剤供給ビリオンを調製するための方法であっ
て、細胞を培養し、そして生産される供給ビリオンを回
収する工程を包含し、ここで該細胞が、請求項１に記載
の複製欠損組換えレトロウイルス粒子で形質移入されて
いる、Ψパッケージ部位が欠失したレトロウイルスで形
質転換された細胞系列である、方法。
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