JP2000502261A - 毒性タンパク質発現ウイルスおよびプロデューサー細胞株 - Google Patents
毒性タンパク質発現ウイルスおよびプロデューサー細胞株Info
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Abstract
(57)【要約】
融合性タンパク質の発現を指向する厳密に制御可能なプロモーターを有する発現ベクターが提供される。その核酸分子中の1つ以上のシステイン残基がオパール終止コドンに変換されている、毒性タンパク質または融合性タンパク質をコードする核酸分子もまた、提供される。
Description
【発明の詳細な説明】
毒性タンパク質発現ウイルスおよびプロデューサー細胞株技術分野
本発明は、一般的に組換えウイルスを産生するための組成物および方法、そし
てより詳細には、毒性タンパク質または融合性タンパク質(fusogenic protein
)をコードするか、またはそれらを含む組換えウイルスを産生を可能にする、プ
ロデューサー細胞株およびそれらに関連する方法に関する。発明の背景
1940年代のDNAの発見からつい最近まで続いてきた組換えDNA技術により、疾患
の経過が、生存する生物の核酸との相互作用により影響され得る可能性を認識す
るために実質的な研究が行われてきた。最も最近では、遺伝子(例えば、レトロ
ウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、およびア
デノ随伴ウイルスに由来するウイルスベクターを含む)の改変またはこれらに影
響を及ぼすことについて、多種多様な方法が記載されている(Jolly,CancerGene
Therapy l(1):51-64,1994を参照のこと)。
組換えレトロウイルスおよびそれらの種々の使用は、例えば、Mannら(Cell 3
3: 153,1983)、CaneおよびMulligan(Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 81: 6349,198
4)、Millerら,Human Gene Therapy l: 5-14,1990,米国特許第4,405,712号、
同第4,861,719号、同第4,980,289号、およびPCT出願WO 89/02,468、同WO 89/05,
349、および同WO 90/02,806を含む多くの参考文献に記載されてきた。簡略には
、目的の外来遺伝子が、正常なレトロウイルスRNAのかわりにレトロウイルス内
に取り込まれ得る。レトロウイルスがそのRNAを細胞中に注入する場合、外来遺
伝子もまた細胞中に導入され、次いでまるでそれがレトロウイルス自身であるか
のように宿主の細胞DNA中に組み込まれ得る。宿主内でのこの外来遺伝子の発現
は、宿主細胞による外来タンパク質の発現をもたらす。
現在のところ、ある種のレトロウイルスベクター(例えば、両種指向性のエン
ベロープを有するウイルス)は、広範な宿主域を提供するが、VSV-Gタンパク質
(Marshおよび有elenius,Advances in Virus Research 36: 107-151,1989)に
より提供される範囲の宿主域とは比較にならない。手短にいえば、水胞性口内炎
ウイルス(VSV)が、筋肉細胞、肝細胞、神経細胞、線維芽細胞、および非複製
造血性細胞を含む多様な型の組織に感染することは公知である。VSV-Gは、ヒト
、下等霊長類、齧歯類、両生類、魚類、および昆虫類への侵入を可能にする両種
指向性エンベロープに匹敵する拡張した指向性を有する。最近の見解では、VSV-
G偽型化レトロウイルスベクターは、両種指向性ベクターよりも非常に効率的に
、ヒト末梢造血幹細胞/前駆細胞を形質導入し得る(Kerrら、Blood 84(追補 1)
:402a,1994)。
しかし、VSV-Gタンパク質の強い融合特性のため、安定な細胞株を産生するこ
とが非常に困難であった。というのも、培養全体にわたる細胞融合のためである
(Yeeら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:9564-9568,1994)。VSV-Gのいくら
か発現がマウスC127線維芽細胞(Florkiewiczら、J.of Cell Biol.97:1381-138
8,1983)およびMDCK細胞(Romanら、Experimental Cell Research 175:376-387
,1988)で報告されているが、細胞表面発現レベルは低い。
本発明は、融合性エンベロープ(例えば、VSV-G)を有するか、または細胞に
対して毒性の他のタンパク質を発現する組換えウイルス性粒子の産生を可能にす
る組成物および方法を提供する。本発明はこれら、ならびに関連する他の利点を
提供する。発明の要旨
手短に言えば、本発明は、毒性タンパク質および/または融合性タンパク質を
有する組換えレトロウイルスを産生する組成物および方法を提供する。例えば、
本発明の一つの局面によれば、毒性タンパク質および/または融合性タンパク質
をコードする核酸配列に作動可能に連結されたマウスCMV IEプロモーターを含む
発現ベクターが提供される。別の局面では、融合性タンパク質をコードする核酸
配列の発現を指向する厳密に制御可能なプロモーターを含む発現ベクターが提供
される。代表的な融合性タンパク質の例は、水胞性口内炎ウイルス-Gタンパク
質および狂犬病ウイルスGタンパク質を含む。代表的な毒性タンパク質の例は、
γ-IFN、IL-2およびTNF-βを含む。厳密に制御可能なプロモーターの代表的な例
は、tTAおよびLAPプロモーター系を含む。関連した局面では、このような発現ベ
クターはさらに、セレン反応性エレメント、ならびにその核酸配列によってコー
ドされる一つ以上のシステイン残基がオパール終止コドンに変換された上述の核
酸配列を含み得る。
別の局面では、融合性タンパク質および/または毒性タンパク質をコードする
核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターおよびセレン反応性エレメントを
含む発現ベクターが提供され、ここで毒性タンパク質および/または融合性タン
パク質をコードする配列内の1つ以上のシステイン残基がオパール終止コドンに
変換されている。
上述の発現ベクターの内の一つを含むレトロウイルスベクター、gag/pol発現
カセットおよび上述の発現ベクターを含むパッケージング細胞、ならびにgag/po
l発現カセット、上述の発現ベクターおよびレトロウイルス構築物を含むプロデ
ューサー細胞株もまた提供される。
本発明の他の局面においては、融合性タンパク質または毒性タンパク質をコー
ドする変異核酸分子が提供され、ここで、核酸分子中の一つ以上のシステイン残
基がオパール終止コドンに変換されている。
本発明のさらに別の局面では、(a)細胞が対数増殖期に入るのを可能にする
のに充分な条件下および時問で、gag/pol発現カセットおよびレトロウイルスベ
クター構築物を含む103〜105個の細胞を、225cm2を超える表面積を有する培養物
中でインキュベートする工程、ならびに(b)上記の発現ベクターを培養物に導
入することにより、レトロベクター粒子が一過的に細胞から産生され得る工程を
含む、一過的にレトロベクター粒子を産生するための方法が提供される。発現ベ
クターを細胞培養物に導入することにより、発現ベクターの細胞への侵入が生じ
る方法の代表的な例は、リポフェクション、エレクトロポレーション、またはCa++
イオン源およびP04 -源を利用したトランスフェクシヨンを含む。
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面
を参照すれば明白となる。さらに、より詳細な特定の手順または組成物(例えば
、プラスミドなど)を記載する種々の参考文献が以下に記載され、従って、それ
ぞれが個々に援用のために言及されるように、これらの文献の全体が、参考とし
て援用される。図面の簡単な説明
図1は、VSV-G/SRE発現構築物の模式図である。
図2は、VSV-G遺伝子中のシステイン残基の分布の模式図である。
図3は、CMVのHindIII「L」フラグメントの模式図である。
図4Aは、3つのRM-CMVGの単離物のサザンブロット解析である。図4Bは、図4A
で提供される分析に使用されるプローブの模式図である。
図5Aおよび図5Bは、RCMVGおよびwt MCMV NIH3T3感染細胞の2枚の写真(200倍
)である。
図6は、VSV-G発現単離物のウェスタンブロットである
図7は、VSV-G発現単離物のウェスタンブロットである。発明の詳細な説明
本発明の公布に先行して、以後に使用されるいくつかの用語の定義を示すこと
は、本発明の理解に有用であり得る。
「発現ベクター」および「発現カセット」は、目的の配列または遺伝子の発現
を指向させ得る集合体をいう。核酸発現ベクターは、転写される場合に目的の配
列または遺伝子ならびにポリアデニル化配列に作動可能に連結されるプロモータ
ーを含まなければならない。本発明の特定の実施態様では、プロモーターおよび
ポリアデニル化配列の両方は、ヘルパーエレメントであるgag/polおよびenvに対
して異種である供給源由来である。本発明の他の実施態様では、本明細書中に記
載された発現ベクターはプラスミド構築物内に含まれ得る。
「レトロウイルスベクター」、「レトロウイルスベクター構築物」、「RETROV
ECT0R CONSTRUCTTTM」、および一般的に上述の「発現ベクター」の部分集合であ
る「組換えレトロウイルスベクター」は、目的の核酸分子を有し、そして特定の
実
施態様においてその発現を指向し得る核酸構築物をいう。レトロウイルスベクタ
ーは、少なくとも1つの転写プロモーター/エンハンサーまたは遺伝子座規定エ
レメント(locus defininge lement)、あるいは他の手段(オルターナティブス
プライシング、核RNAの輸送、メッセンジャーの翻訳後修飾、またはタンパク質
の転写後修飾)により遺伝子発現を制御する他のエレメントを含まなければなら
ない。このようなレトロウイルスベクターはまた、パッケージングシグナル、長
末端反復(LTR)、またはそれらの部分、ならびに用いられるレトロウイルスに
適切なポジティブ鎖およびネガティブ鎖プライマー結合部位(レトロウイルスベ
クター中に既に存在しない場合)を含まなければならない。随意に、組換えレト
ロウイルスベクターはまた、ポリアデニル化を指向するシグナル、選択マーカー
(例えば、Neo、TK、ハイグロマイシン、フレオマイシン、ヒスチジノール、ま
たはDHFR)、ならびに1つ以上の制限部位および翻訳終結配列を含み得る。例と
しては、このようなベクターは、代表的には、5'LTR、tRNA結合部位、パッケー
ジングシグナル、第2鎖DNA合成の起点、および3'LTRまたはそれらの部分を含み
得る。
「組換えレトロウイルス」、「レトロウイルス遺伝子送達ビヒクル」、および
「レトロウイルスベクター粒子」は、本発明において利用されるように、少なく
とも1つの目的の遺伝子を有するレトロウイルスをいう。レトロウイルスはまた
、選択マーカーを含み得る。組換えレトロウイルスは、感染に際して、その遺伝
物質をDNAに逆転写し得、そしてこの遺伝物質を宿主細胞のDNAに取り込ませ得る
。
「パッケージング細胞」は、組換えウイルスベクターに欠けている感染組換え
ウイルスの産生に必要なこれらのエレメントを含む細胞をいう。代表的には、そ
のようなパッケージング細胞は、gag、polおよびenvタンパク質をコードするタ
ンパク質を発現し得る一つ以上の発現カセットを含む。
「プロデューサー細胞」または「ベクタープロデューサー細胞」は、組換えウ
イルスベクター粒子の産生のために必要な全てのエレメントをふくむ細胞をいう
。
「融合性タンパク質(fusogenic protein)」は、培養物内の細胞を多核シン
シチウムを融合させる糖タンパク質をいう。融合性タンパク質の代表例はVSV-G
および狂犬病Gタンパク質を含む。
「毒性タンパク質」は、細胞内の細胞毒性または細胞分裂抑制行動を示すタン
パク質をいう。本発明の目的について、タンパク質は、増殖培養物において発現
する場合、(タンパク質を発現していない同じ培養物と比較して)48時間以内に
20%を超える細胞死が起こるのであれば、細胞毒性であると考える。同様に、タ
ンパク質は、増殖培養物で発現する場合、(タンパク質を発現しない同じ培養物
と比較して)48時間以内に20%を超える細胞倍加時間の減少が生じるのであれば
、細胞分裂抑制性であると考える。細胞毒性測定に好ましいアッセイは、増殖ア
ッセイ(例えば、Promega Corp.、Madison,WI)において生存細胞数を定量化す
るための非放射性フォーマットまたは新生DNAへの3H取り込みを使用するMTTアッ
セイを含む。しかし、他の多くのアッセイフォーマットは、例えば、細胞生存度
(染色除外、細胞計数)および細胞代謝(染色減少)を含む、細胞毒性に関連し
た多様なパラメーターを評価するのに同じように利用され得る(さらなる詳細お
よび方法については、Cell Biology,A laboratory Handbook、J.E.Celis編、A
cademic Pressを参照のこと)。毒性タンパク質の代表例はγインターフェロン
、インターロイキン-2、TNF αおよびTNF βを含む。
「厳密に制御可能な」は、プロモーター(プロモーター系を含む)または遺伝
子の転写に関して強力な制限を維持する他のエレメントをいう。より詳細には、
本発明に関して使用されるように、厳密に制御可能なプロモーターは目的の遺伝
子(例えば、毒性タンパク質または融合性タンパク質をコードする核酸分子)の
10倍を超える誘導を誘導し、そして好ましくは、約50倍〜約100倍を超えるレベ
ルの誘導を誘導すると理解されるべきである。
上述のように、本発明は、毒性タンパク質および/または融合性タンパク質を
コードする核酸配列の発現を指向する厳密に制御可能なプロモーターを有する発
現ベクター、ならびに表面上に融合性タンパク質を含む組換えレトロウイルス粒
子を提供する。一般的に、以下により詳細に議論するように、そのようなレトロ
ウイルスベクター粒子は、転写調節機構または翻訳調節機構のいずれかを通じた
毒性タンパク質または融合性タンパク質の制御により製造され得、それにより所
望のレトロウイルスベクター粒子が多量に産生され得る。
A.組換えレトロウイルスベクター、パッケージング細胞、プロデューサー細胞お よび組換えレトロウイルスの調製
上述のように、本発明は、目的の選択された核酸分子を保持または発現するた
めに構築された組換えレトロウイルスを提供する。本発明のレトロウイルス遺伝
子送達ビヒクルは、例えば、B、C、およびD型のレトロウイルス、ならびにス
プマウイルスおよびレンチウイルスを含む、多様なレトロウイルスから容易に構
築され得る(RNA Tumor Viruses,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,19
85を参照のこと)。このようなレトロウイルスは、本明細書中で提供された開示
および標準的な組換え技術(例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Labor
atory Manual,第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989; Kunkle
,PNAS 82:488,1985)があれば、レトロウイルス送達ビヒクルを集合または構
築するために容易に利用され得る。
本発明に関して利用され得るレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルの代表的な例
は、例えば、EP 0,415,731; WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/2
5234; 米国特許第5,219,740号; WO 93/11230; WO 93/10218; VileおよびHart,C
ancer Res.53:3860-3864,1993,VileおよびHart,Cancer Res.53:962-967,1
993; Ramら、Cancer Res.53:83-88,1993; Takamiyaら、J.Neurosci.Res.33:
493-503,1992; Babaら、J.Neurosurg.79:729-735,1993(米国特許第4,777,12
7号、GP 2,200,651、EP 0,345,242およびWO 91/02805)において記載されるもの
を含む。特に好ましい組換えレトロウイルスは、WO 91/02805およびUS 95/05789
に記載されたウイルスを含む。
上記に記載のベクター構築物での使用に適切なパッケージング細胞株は、容易
に調製され得(WO 92/05266もまた参照のこと)、そして本明細書中で提供され
る開示があれば、組換えベクター粒子の産生のためのプロデューサー細胞株(ベ
クター細胞株または「VCL」とも命名される)を生成するために利用され得る。
本発明の他の局面において、(a)細胞が対数増殖期に入るのを可能にするの
に充分な条件下および時間で、gag/pol発現カセットおよびレトロウイルスベク
ター構築物を含む103〜105個の細胞を、225cm2を超える表面積を有する培養物中
でインキュベートする工程、および(b)上記発現ベクターを培着物に導入する
ことにより、レトロベクター粒子が一過的に細胞から産生され得る工程を含む、
一過的にレトロベクター粒子を産生するための一般的な工程を含む方法が提供さ
れる。発現ベクターを細胞培養物に導入することにより、細胞内への発現ベクタ
ーの侵入が生じる方法の代表例は、リポフェンクション、エレクトロポレーショ
ン、またはCa++イオン源およびPO4 -源を利用したトランスフェクションを含む(
例えば、CaClおよびHBS,Promega,Madison WI)。特定の実施態様では、培養物
の表面積が、約1200cm2よりも広く、またはさらに約6,000cm2よりも広くあり得
る。
本明細書中で開示される本発明の方法を利用して、106または107cfu/ml(粗上
清中)より大きい力価で組換えレトロウイルス粒子を産生するパッケージング細
胞株が、容易に得られ得る。加えて、このような力価は、一般的に、マウス3T3
細胞から得られる力価よりも3倍低い力価を生じるHTl080細胞での力価アッセイ
より得られることを言及すべきである。
B.遺伝子発現の調節
上記のように、本発明は、転写制御機構および/または翻訳制御機構を通じて
高度に毒性または融合性のタンパク質産生を可能にする、厳密に制御可能なまた
は調節された発現ベクター(レトロウイルスベクター、ならびにレトロウイルス
粒子を含む)を提供する。このようなベクターは、他の誘導性プロモーター系と
は対照的に、多面的な効果を真核生物細胞では示さない。
例えば、本発明の一つの局面では、LAP(Lacアクチベータータンパク質;Levi
neおよびShenk,Molec.Cell.Biol.10:3343-3356,1990; PNAS 88:5072-5076,
1991)プロモーター系が、上記毒性タンパク質および融合性タンパク質の内の一
つをコードする配列に作動可能に連結され、そしてこの配列を発現し得る、発現
ベクターが提供される。手短に言えば、LAPは、転写単位の上流または下流のい
ずれかに位置するlacオペレーター配列を含む、いくつかのプロモーター(SV40
、ワクシニアウイルスプロモーター、T3バクテリオファージ)の強力なアクチベ
ーターである。単一のlacオペレーターはトランス活性化を可能にし、複数のオ
ペレーターは相乗作用的に作用する。lacリプレッサーのオペレーター配列に
対する結合親和性および特異性は、結合親和性10-13Mと非常に高い。LAP融合タ
ンパク質は3つの成分を有する:(1)lacリプレッサー;(2)SV40核局在化
シグナル;および(3)VP16(HSVの転写活性化ドメイン)。このような系の代
表的な例示は、下記の実施例4に提供される。
本発明の別の局面において、上記毒性タンパク質および融合性タンパク質の内
の一つに、作動可能に連結され、そしてこれを発現し得る、tet(テトラサイク
リン制御)プロモーター系を含む発現ベクターが提供される。手短に言えば、te
tプロモーターは、テトラサイクリンの存在によって負に調節される。一つの実
施態様において、構成的に発現させたテトラサイクリン制御トランスアクチベー
ター(tTA)は、tetリプレッサーを単純ヘルペス由来のVP16活性化ドメインと融
合することにより生成され得る(GossenおよびBujard、PNAS 89:5547-5551,199
2)。テトラサイクリンの非存在下、このトランスアクチベーターは、プロモー
ターの上流に位置したtetオペレーター配列もまた含む、最小CMV由来プロモータ
ー配列からの転写を刺激する。tTA-依存性プロモーター下流へのVSV-Gのような
融合性タンパク質をコードする配列の組込みは、テトラサイクリン非存在下での
VSV-Gの高いレベルの発現を導く。そのようなベクターは、特に、組換えレトロ
ウイルスタンパク質の産生のために有用である。なぜならテトラサイクリンは、
パッケージング細胞株および続いてプロデューサー細胞株が作製される間、培地
中に維持され得るからである。充分な数のプロデューサー細胞株が増殖した後、
次いでテトラサイクリンは培地中から除去され得、それ故、レトロウイルスベク
ター粒子を含むVSV-Gの産生を可能にする。そのような系の代表的な例示は、下
記の実施例3に提供される。
本発明中で利用され得る、厳密に制御可能なプロモーターおよびプロモーター
系の他の例は、GALI(J.Biotech 32(2):179-89,1994); Gene,156(1):19-25,19
95; P.N.A.S.89(23):11589-93,1992);デキサメタゾンのようなステロイド類
(Biochim Biophys Acta,219(3);653-9,1994; Nawaら.,J.Biol.Chem.261(3
6):16883-16888,1986;J.Vir.,64(10):5132-42.1990);メタロチオネインの
ような重金属調節系(J.Vir.,68(9):5602-12,1994;Carc,.14(8):1643-9,1993
;J Vir.Methods,33(1-2):135-47,1993);T7/lac(J Biol Chem,269(16);
12106-10,1994; Biochem Biophys Res Comm,188(3);972-81,1992);Tatおよ
び/またはtat/rev誘導性レンチウイルスプロモーター系、(例えばHIV-1または
HIV-2)(例えば、Leukemia,7 追補 2:S61-5,1993;P.N.A.S.89(1):182-6,1992
を参照のこと);熱ショック(J.Biol Chem,268(9):6708-13,1993);NF-KB反
応性(Mol Aspects Med,14(3):171-90,1993);サイクリックAMP(Roeslerら、
J.Biol.Chem.263(19):9063-9066,1988)。
上述のように、本発明の他の局面では、翻訳機構で厳密に制御される発現ベク
ターが提供される。例えば、本発明の一つの局面では、毒性タンパク質および融
合性タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーター(例えば
、上記で議論されたプロモーターのうちの一つ)、およびセレン反応性エレメン
トを含む発現ベクターが提供され、ここで核酸分子内の1つ以上のシステイン残
基がオパール終止コドンに変換されている。
手短に言えば、セレノタンパク質は、原核生物および真核生物ポリペプチドの
独特のグループを構成し、その全てが、硫黄様元素であるセレンをセレノシステ
インとして取り込む。セレノタンパク質は、細菌蟻酸デヒドロゲナーゼ、哺乳動
物グルタチオンペルオキシダーゼ(GPx)ファミリー、哺乳動物I型ヨードチロニン
5'脱ヨウ素酵素、および哺乳動物セレノタンパク質P(Bockら,Trends Biochem
.Sci.16:463,1991)を含む。これらのタンパク質の全ては、セレノシステイン
をUGAコドン(Bockら、上述)(形式的には「終止」(または、オパール)コド
ンとして公知)で翻訳と同時に取り込み、そして適切なUGAアンチコドンを含む
特異的なセレノシステイン充填(charged)tRNASeCysを利用する(Leeら,J Biol
.Chem.264:9724-9727,1989)。
例えば、本発明の一つの実施態様において、抑制状態で、すなわち、セレン非
存在下または正常な増殖培地(例えば、10%FBSを補充したDMEM)に比べて著し
く低減したセレンレベルで、毒性遺伝子または融合性遺伝子を有する細胞が増殖
される。これは定義された培地(例えばIT(インシュリン、トランスフェリン;
Collaborative Bioproducts,Waltham MA))中での増殖に細胞を適応させるこ
とにより達成され得る。細胞はセレン欠乏培地で増殖され得、そしてコンフルエ
ントに近くなった場合、培地をFBS含有培地(FBSは通常多量のセレンを含む)に
交換するか、または細胞をITS培地(インシュリン、トランスフェリン、セレン
;Collaborative Bioproducts,Waltham MA)に移動させる。セレン過多の際に
は、変異TGAコドンがセレノシステインコドンとして読まれ、そしてセレノシス
テインが毒性タンパク質または融合性タンパク質に取り込まれる。
セレン反応性エレメントが本明細書中において、翻訳調節機構の代表例として
提供されるが、本発明はそのように制限されないことが理解されるべきである。
特に、他の多様な翻訳調節エレメントが、単独で、または上記の転写エレメント
と組み合わせてのいずれかで、所定の配列の発現を制御するために利用され得る
。例えば、鉄反応性エレメント(IRE)は、鉄代謝に関わる重要なタンパク質に
おいて天然に生じる。それらは、これらのタンパク質の5'または3'非翻訳領域に
単一コピーで見出される、約26〜35ヌクレオチドの適度に安定なステムループ構
造である(Hentzeら,Science 238:1570-1573,1987)。IREは、IRE結合タンパク
質(IRE-BP)と呼ばれるサイトゾルタンパク質に対するmRNA結合部位を提供する
(LeiboldおよびMunro、P.N.A.S.85:2171-2175,1988)。このタンパク質は鉄利
用能によって調節される(Haileら、PNAS 89:7536-7540,1992)。鉄過剰条件下
で、サイトゾルIRE-BPはIREには結合しない。鉄欠乏条件下で、IRE-BPは、IREに
対して高い親和性結合(Kd<100pM)を示す。高親和性結合と低親和性結合との間
のスイッチはタンパク質合成を必要とせず、そしてIRE-BPの翻訳後修飾を表現す
る。不活性型タンパク質は、高濃度の鉄キレート剤または還元剤のいずれかの存
在下で高親和性でRNAに結合するために活性化され得、それゆえ、2つの結合状
態を識別する酸化還元感受性のメルカプトスイッチを有すると思われる。
IREの、融合性タンパク質または毒性タンパク質のような目的の遺伝子(GOI)
の5'または3'非翻訳領域への取り込みは、鉄欠乏条件下でのこれらの遺伝予の翻
訳を抑制する能力を生じさせ得る。例えば、以下のオリゴヌクレオチド配列また
は他の非常に関連した配列(およびそれらの相補物)は、毒性遺伝子または融合
性遺伝子の5'非翻訳領域(例えば、約-150bpにおけるVSV-G遺伝子)への取り込
みのための隣接制限酵素部位(RES)とともに合成され得る。
IRE配列オリゴヌクレオチド3(配列番号1)
5'(RES)-CGT CGG GGT TTC CTG CTT CAA CAG TGC TTG GAC GGA ACC CGG CG-(RES)
3'
IRE配列オリゴヌクレオチド4(配列番号2)
5'(RES)-CGC CGG GTT CCG TCC AAG CAC TGT TGA AGC AGG AAA CCC CGT CG-(RES)
3'
IRE-VSV-G構築物を含むパッケージング細胞株は、低濃度の鉄、ジチオスレイ
トール(DTT;例えば、100mM)のような高濃度の還元剤、または50mM〜100mMの鉄
キレート剤デスフェリオキサミンを有する培地で維持され得る。鉄源として50mM
〜100mMのヘミンの添加を20時間行うことにより、IRE-BP親和性は低下し、そし
てVSV-G翻訳が進行し、タンパク質発現が100倍にまで増加する。それゆえ、これ
はVSV-G偽型レトロウイルスベクターの高度の産生の調節可能なバーストを可能
にする。
本発明の別の局面においては、遺伝子発現の調節は、一つの細胞型において複
製し得るが、他には不稔感染する(すなわち、生来の種では複製コンピテントで
あり、他の種では複製コンピテントでない)ウイルスベクターを利用することに
より達成される。そのような系は、ウイルスタンパク質の産物が毒性である多く
の型のウイルスベクター(例えば、AAVおよびrevタンパク質、アデノウイルスベ
クター、ヘルペスウイルスベクター、シンドビスおよび他のアルファウイルス)
の産生に使用され得る。
例えば、本発明の一つの実施態様では、毒性タンパク質または融合性タンパク
質をコードする核酸配列に作動可能に連結したマウスCMV IEプロモーターを含む
発現ベクターが提供される。簡単には、MCMVは、ヘルペスウイルスのβファミリ
ーのメンバーであるウイルスである。これらのウイルスは、それらのビリオン内
に即時初期遺伝子からの転写の開始を担うトランスアクチベータータンパク質を
含む。MCMVはヒト細胞に不稔的に感染する。すなわち、ウイルスが標的ヒト細胞
に侵入し、いくつかの「初期遺伝子」発現が起こるが、ウイルス粒子は産生され
ない。これは、ヒト細胞において「バースト」様式で、そうでなければ、毒性な
タンパク質を発現し、次いでMCMVのさらなる産生および夾雑なく産物を採集する
ためのMCMVの使用を可能にする。それゆえ、毒性または融合性タンパク質を取り
込んでいる産物が採集され得、そして顕著なMCMV毒性なく標的細胞または組織に
使用され得る。
このトランス活性化現象は、少なくとも以下の2つの異なった方法で、VSV-G
遺伝子のような広範囲の種々の毒性タンパク質および/または融合性遺伝子を発
現を調節するために使用され得る:
a)VSV-G遺伝子は、IE遺伝子由来のプロモーター領域をVSV-G遺伝子に融合す
ることにより、ielまたはie3のようなMCMV即時初期(IE)遺伝子の制御下に置か
れ得る。次いで、修飾されたVSV-G遺伝子は、相同組換えにより、MCMVゲノムに
再導入される。VSVgタンパク質は即座には毒性ではなく、そしてマウス細胞にお
けるMCMVの生活環が2日または3日であり、MCMVのストックが従来の力価(107
〜109pfu/ml)で産生され得る。組換えウイルスストックは、連続回のプラーク
精製によって得られ、そしてヒトプレプロデューサー細胞(レトロウイルスベク
ターを含むがエンベロープタンパク質を欠く細胞)に感染させるために使用され
得る。MCMVが、ヒト細胞において不稔感染を引き起こすため、VSV-G偽型レトロ
ウイルスベクターがMCMVの汚染なく感染細胞から放出される。
b)VSV-G遺伝子は、MCMV由来のie遺伝子調節配列の制御下に置かれ得る。この
構築物はプレプロデューサー細胞株(上述)にトランスフェクトされ得る。ieト
ランスアクチベーターの非存在下で、MCMV IEプロモーターからの構成的転写は
非常に低く、毒性VSV-G遺伝子タンパク質の最少発現をもたらす。プレプロデュ
ーサー細胞が野生型MSMVに感染した場合、トランスアクチベーターは、非常に速
やかで強いVSV-G遺伝子の発現を引き起こし、VSV-G偽型レトロウイルスベクター
の分泌を導く。MCMVがヒト細胞において不稔感染を引き起こすので、VSV-G偽型
レトロウイルスベクターはMCMVによる汚染なく感染細胞から放出される。低いレ
ベルのMCMV複製がヒトプレプロデューサー細胞において生じる事象において、後
期MCMVタンパク質合成を防止するため、MCMV感染培養物はガンシクロビルで処理
され得る。
あるいは、MCMVのトランス活性化は、複製能という意味では機能的である必要
はなく、そして、初期遺伝子または後期遺伝子、あるいはその両方を欠く組換え
MSMVが操作され得る。そのような組換えMSMVは、トランス相補、そしてMCMVウイ
ルス形成を許容するために、欠失遺伝子(すなわち初期または後期)の単一コピ
ーを安定に含む細胞内で増殖され得る。
MCMVは本明細書中で例として提供されるが、本発明はそのように制限されない
ことが理解されるべきである。特に、それらの生来の種では複製コンピテントで
あり、他の種では複製コンピテントでない多様な他のウイルスが、同様に、本発
明で利用され得る。代表的な例は、マウス適合性インフルエンザウイルスおよび
アカゲザルロタウイルス、ならびに下記表1に示された他のウイルスのような動
物ウイルスを含む。
表1
ウイルス 許容宿主 不稔感染
mCMV マウス ヒト
鶏痘 鳥 ヒト
豚痘 ブタ ヒト
仮性狂犬病 ブタ、ウシ、家畜 ヒト
ポリオーマ マウス ヒト
SV40 アフリカミドリザル ヒト
全種の温度感受性 許容温度(通常32℃) 非許容温度(通常37〜3
ウイルス での細胞 7℃)での細胞
C.毒性タンパク質および融合性タンパク質
上記で議論したように、広範な種々の天然に生じるかまたは合成的に生成され
た毒性または融合性タンパク質のいずれかが、本発明の発現ベクターおよび/ま
たはウイルスベクターにより発現され得る。融合性タンパク質(融合性状態を媒
介する)の代表例は、VSV-G(Lazariniら、J.Vir.45:773-781,1983)、狂犬
病ウイルス-G(Gaudinら、J.Virol.67:1365-1372,1993)、セムリキ森林ウイ
ルス、シンドビスおよびE1およびE2糖タンパク質を有する他のアルファウイルス
(Whitt,M.ら.,Virol.185:681,1991)を含む。
本発明の他の局面では、活性を変化されたこれらの糖タンパク質の合成キメラ
が産生され得る。例えば、狂犬病細胞外ドメインをVSV-G膜貫通ドメインおよび
細胞質ドメインに融合させた合成キメラが産生され得、これは逆説的に感染性を
保持するが、融合活性を欠く(Whitt,Mら、Virol.185:681,1991)。加えて、
細胞外-膜貫通ドメインのみの糖タンパク構築物は、偽型化に有用であり得る。
このようにして偽型化され得るウイルスの代表例は、HIV(Virology 209(2):696
-700,1995;J Vir.69(3):1984-9,1995; AIDS Res Hum Retroviruses 8(9):166
9-77,1992);SIV(J.Med.Primatol 21(2-3):69-73,1992);HTLV(Int.J.C
ancer 60(4):567-70,1995; Int.J.Cancer 59(5)655-60,1994; Int.J.Canc
er 59(3)416-21,1994; Int.J.Cancer 56(1):100-5,1994; J.Vir.65(1)162
-9,1991; Virology 180(1):420-4,1991);MuLV(J.Vir.67(8);4712-21,1993
; J.Vir.66(3):1468-75,1992);FIV(J.Vir 67(7):4142-53,1993; P.N.A.S
.89(18):8457-61,1992);RSV(J.Gen.Vir.73(Pt11):2995-7,1992);AKV(Viro
logy 186(1):161-6,1992);Cocal(J.Vir Methods44(2-3):287-304,1993);VSV-G
(Virology 178(2):373-83,1990;J.Vir.5(3):1202-7,1991);HSV(Vaccine 1
1(6):675-8,1993);およびLDV(J.Vir.69(7);4237-44,1995)を含む。
本発明はまた、毒性タンパク質を発現する組換えウイルスの産生においても有
用である。細胞に毒性であるタンパク質の代表例は、γ-インターフェロン、IL-
2およびTNF-β、ならびに組換えウイルスによって発現され得る他の毒性分子(
以下より詳細に議論)(例えば、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒
素、抗ウイルスタンパク質、トリチン、赤痢毒素およびプソイドモナスコレラ外
毒素Aを含む)を含む。
D.他の異種核酸分子
広範囲の核酸分子は、本発明の発現ベクターまたは組換えレトロウイルスによ
り保持および/または発現され得る。一般的に、本明細書中で記載した核酸分子
は、それを保持する発現ベクターまたは組換えレトロウイルスにおいて天然に生
じず、そしていくつかの所望の利益、典型的には、疾患、あるいは他の病原体、
または病原状態と戦う能力を提供する。
本明細書中に記載の核酸分子によってコードされ得る物質は、タンパク質(例
えば、単一鎖分子を含む抗体)、免疫剌激分子(例えば抗原)、免疫抑制分子、
遮断剤、緩和剤(例えば、毒素、アンチセンスリボ核酸、リボザイム、酵素、お
よび病原体の機能を阻害し得る他の物質)、サイトカイン、多様なポリペプチド
またはペプチドホルモン、それらのアゴニストまたはアンタゴニストを含み、こ
こでこれらのホルモンは、下垂体、海馬、腎臓、内皮細胞、肝臓、膵臓、骨、造
血骨髄および副腎のような組織から得られ得る。このようなポリペプチドは、増
殖の誘導、組織後退、免疫応答の抑制、アポトーシス、遺伝子発現、レセプター
−リガンド相互作用遮断、免疫応答のために使用され得、そして特定の貧血、糖
尿病、感染、高血圧、異常な血液化学(例えば、高血液コレステロール、血液凝
固因子の欠乏、低HDKを伴う高LDL)、アルツハイマー関連アミロイドタンパク質
のレベル、骨侵食/カルシウム沈着の処置、ならびにステロイドホルモン、プリ
ン、およびピリミジンのような多様な代謝物のレベルを調節するために使用され
得る。
本発明の一つの局面においては、緩和剤の発現を指向する発現ベクターまたは
組換えレトロウイルスの投与のための方法が提供される。細胞の増殖を阻害する
ために直接作用する緩和剤の代表的な例は、リシンのような毒素を含む(Lambら
.,Eur.J.Biochem 148:265-270,1985)。
本発明の別の局面においては、発現ベクターまたは組替えレトロウイルスは、
他の不活性前駆体を、病原体の活性インヒビターに活性化し得る物質、または病
原状態を発現する細胞に対して毒性の緩和剤である条件的毒性緩和剤の発現を指
向する。本明細書中で提供された開示があれば明らかなように、広範な不活性前
駆体は、病原体の活性インヒビターに変換され得る。したがって、例えば、遺伝
子産物(例えば、タンパク質)(例えば、抗ウイルスヌクレオシドアナログのそ
れらの活性形態への代謝を補助する単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HS
VTK)またはVaricella Zosterウイルスチミジンキナーゼ(VZVTK))の発現を指
向する発現ベクターまたは組換えレトロウイルスは、ヌクレオシドアナログ前駆
体(例えば、AZTまたはddC)を活性形態に活性化することに有用である。それに
より、AZTまたはddI治療は、より効果的で、低用量を可能にし、より少ない毒性
を生じ、そして生産的感染に対してより高い効力を有する。さらなるヌクレオシ
ドアナログ(それらのヌクレオチド三リン酸形態がレトロウイルス逆転写酵素に
ついて選択性を示すが、細胞性ヌクレオシドおよびヌクレオチドキナーゼの基質
特異性の結果としてリン酸化されない)は、より効果的になる。
さらに別の局面として、病原機能に対応するRNA分子を切断して、それにより
不活性化する一つ以上のリボザイム(RNA酵素)(HaseloffおよびGerlach,Natu
re 334:585,1989)をコードすることにより治療効果を有する、発現ベクターお
よび組換えレトロウイルスが提供される(FosterおよびSymons,Cell 48:211-22
0,1987;HaseloffおよびGerlach,Nature 328:596-600,1988;Ruffnerら,Bioch
em 29:10,695-10,702,1990;米国特許第5,254,678号および同第4,987,071号、PC
T公報第 WO 93/23569号もまた、参照のこと)。別の局面では、アンチセンス配
列(アンチセンス配列はまた、核酸配列によりコードされ得、次いで転写により
宿主細胞内に産生され得る)である生物学的に活性な核酸分子を含む、発現ベク
ターおよび組み換えレトロウイルスが提供される。好ましい実施態様では、アン
チセンス配列が、インフルエンザウイルス、HIV、HSV、HPV、CMVおよびHBVをコ
ードする配列からなる群から選択される。アンチセンス配列はまた、病原性に必
要なRNA配列に相補的なアンチセンスRNAでもあり得る。あるいは、生物学的に活
性な核酸分子は、病原性に必要なRNA配列に相補的なセンスRNA(またはDNA)で
あり得る。
本発明のなおさらなる局面は、免疫剌激能力のある組換えレトロウイルスに関
する。手短に言えば、外来性病原体を認識し、そしてそれに対して防御する能力
は、免疫系の機能に必須である。特に、免疫系は、「自己」と「非自己」(すな
わち外来性)とを区別し得なければならず、それゆえ、宿主の防御機構が宿主組
織に対する代わりに侵入物にむけて指向される。代表的には、細胞溶解性Tリン
パ球(CTL)が、MHCクラスIまたはII細胞表面タンパク質と関連して、プロセス
された病原特異的ペプチドのような細胞表面認識構造の提示により誘導されるか
、
または剌激される。
一つの実施態様において、本発明は、感受性標的細胞において抗原およびそれ
らの改変形態の発現を指向する発現ベクターまたは組換えレトロウイルスを使用
することにより、特異的な免疫応答を剌激し、そしてウイルス拡散を阻害する方
法が提供される。ここで、この抗原は(1)ウイルス抗原に対する免疫応答を開
始し得るか、または(2)ウイルス相互作用に必要な細胞性レセプターを占有す
ることによりウイルス拡散を防ぎ得るかのいずれかである。
本発明の別の局面では、本発明の発現ベクターまたは組換えレトロウイルスは
「免疫調節因子」を発現するように構築され得る。免疫調節因子は、免疫応答に
関連する1つ以上の細胞によって製造された場合、または細胞に外因的に添加さ
れた場合、因子の非存在下に生じるものとは質または効力が異なる免疫応答を生
じる、因子をいう。応答の質または効力は、例えば、細胞増殖を測定するインビ
トロアッセイ(例えば、3Hチミジン取り込み)およびインビトロ細胞毒性アッセ
イ(例えば51Cr放出を測定する)(Warnerら、AIDS Res.およびHuman Retroviru
ses 7:645-655,1991を参照のこと)を含む当該業者に公知の種々のアッセイによ
り測定され得る。免疫調節因子はインビボおよびエクスビボの両方で活性であり
得る。
そのような免疫調節因子の代表例は、サイトカインまたはリンパ球、インター
フェロン(例えば、γ-IFN)、腫瘍壊死因子(TNF)(Jayaramanら)J.Immutol
ogy 144:942-951,1990)、CD3(Krissanenら、Immunogenetics 26:258-266,1987)
、ICAM-1(Altmanら,Nature 338:512-514,1989;Simmonsら、Nature 331:624-62
7,1988)、ICAM-2、LFA-1、LFA-3(Wallnerら、J.Exp.Med.166(4):923-932,19
87)、MHCクラスI分予、MHCクラスII分予、B7.1-.3、β2-ミクログロブリン(Par
nesら、PNAS 78:2253-2257,1981)、カルネキシンのようなシャペロンおよびMHC
連結輸送体タンパク質またはそのアナログ(Powisら、Nature 354:528-531,1991
)を含む。
本発明はまた、例えば、ウイルス、細菌、または寄生虫抗原を含む所望の抗原
の免疫原性部分をコードする発現べクターおよび組換えレトロウイルスを包含す
る。代表例は、肝炎Band Cウイルス抗原(例えば、WO 93/15207)、ネコ白血病
ウイルスおよび/または免疫不全ウイルス抗原(例えば、WO 94/06921)。さら
に他の例は、ras(ras*)遺伝子およびp53遺伝子(WO 93/10814を参照のこと)
のような非腫瘍形成性、変換遺伝子の発現を指向する発現ベクターまたは組換え
レトロウイルスを包含する。
E.細胞培養濃度および組換えレトロウイルス粒子の精製
上述のように、本発明は、ヒトおよび他の温血動物への投与に適した組換えレ
トロウイルス調製物を提供する。特に、例えば、発酵槽またはバイオリアクター
の使用、回転瓶、細胞ホテルまたは細胞工場、および中空繊維培養を含む、投与
に適した組換えレトロウイルスを産生するための広範囲の方法が利用され得る。
手短に言えば、バイオリアクターまたは発酵槽については、細胞は、好ましく
は、マイクロキャリア(すなわち、CytodexlまたはCytodex 2;Pharmacia,Pisc
ataway,N.J.)で、3g/L−15g/Lマイクロキャリアの範囲の濃度で増殖させる。
回転瓶については、適切な条件は、マイクロキャリアビーズは一般的に好ましく
ないことを除いて、バイオリアクターに関して上記に記載した方法を含む。その
ような方法の代表例、ならびに細胞ホールドまたは細胞工場および中空リンカー
(hollow linker)培養のような他の方法は、WO 96/0926に記載される。
培養に続いて、例えば、組換えレトロウイルスの硫酸アンモニウム沈澱、ポリ
エチレングリコール(「PEG」)濃縮、遠心分離による濃縮(PERCOLLのような勾
配、またはショ糖のような「クッション(cushion)」を伴うか、伴わないかの
いずれか)、濃縮フィルター(例えば、Amicon濾過)の使用、および2相分離を
含む広範囲の方法が、ウイルス濃度および純度を増加させるために利用され得る
。組換えレトロウイルス粒子の濃縮および精製の代表例はWO 96/0926に記載され
る。
F.投与
上述のように、本発明の高力価の組換えレトロウイルス粒子は、例えば、脳脊
髄液、骨髄、関節、動脈内皮細胞、直腸、頬/舌下、膣、リンパ系のような部位
、または肺、肝臓、牌臓、皮膚、血液、および脳からなる群から選択される器官
に、または腫瘍および間質空間からなる群から選択される部位を含む広範囲の位
置に
投与され得る。他の実施態様において、組換えレトロウイルスは、眼内的、鼻孔
内的、舌下的、経口的、局所的、膀胱内的、クモ膜下腔内的、局所的、静脈内的
、腹腔内的、頭蓋内的、筋肉内的、または皮下的に、投与され得る。投与経路の
他の代表的な経路は、胃内視鏡、ECRP、および結腸鏡を含み、これらは、手術手
順の全ておよび入院は必要としないが、医学的人物の存在を必要とし得る。
以下の実施例が、例示のために提示されるが、これは制限のために提示するも
のではない。
実施例 実施例1
レトロウイルスベクター骨格の調製
本発明での使用に適切なレトロウイルス骨格を、当業者は容易に調製し得る。
このような骨格の典型的な例(例えば、KT-1およびKT-3)は、WO 91/02805およ
ひWO 95/05789に記載される。
実施例2
プラスミドMLP-GからのVSV-G遺伝子の回収
VSV-G遺伝子(Lazariniら,J.Vir.45:773-781,1983;配列番号1および2も
また参照のこと)を、VSV-Gを含むプラスミド(例えば、pMLP-G、これは、アデ
ノウイルス主要後期プロモーターおよびトリパータイト(tri-partite)リーダ
ー配列(Kaufman,P.N.A.S.82:689-693,1985; Ballayら,Hepadna Viruses,W.R
obinson,K.KoikeおよびH.Will(編),173-187頁,Liss,New York,1987; WO 92
/05266もまた参照のこと)を有する)から、プライマー#5および#2(これらはま
た、それぞれ、5'末端にSacII部位および3'末端にEcoRI部位を導入する)を用い
て、1.6kb PCR産物として単離する。
プライマー-2:(配列番号3)
5'-GCC GAA TTC AAT TGA GGC CTC TTT G-3’(25マー)
プライマー-5:(配列番号4)
5'-GAT CCG CGG AGA ATC GAT CTG TTT CCT TGA CAC TAT GAA GTG
CCT TTT G-3'(49マー)
PCR産物を、TAクローニングベクターpCRTMII(INVITR0GEN C0RP.,San Diego,
CA)中にクロ−ニングし、そして部分的な配列決定およびVSV-G遺伝子の正確な
方向付けを介して正確な配列について調べる。次いで、VSV-G遺伝子を、TAクロ
ーニングベクターから回収し、そして真核生物発現ベクターpcDNAIII(INVITR0G
EN)中に連結する。次いで、PCRクローンを、PR0MEGAからのプロフェクチン(pr
ofectin)キットを用いて、1:1の比のVSV-G発現pcDNAIIIおよびpCB/β-galで
の293(2-3)細胞の同時トランスフェクションにより、機能性について調べる。ポ
ジティブコントロールとして、pMLP-Gを、平行してpCB/β-galプラスミドと同時
トランスフェクトする。同時トランスフェクションの後、新鮮な培地を細胞に添
加し、上清を収集し、そして24時間後に滅菌濾過(0.45mm)する。次いで、HT10
80標的細胞を、以下のような種々の希釈で両方の上清を用いて形質導入する。
1日目に、6ウェルプレートのうち3ウェルに、2mlの培地(10% FBS、非必
須アミノ酸、およびピルビン酸ナトリウムを有するDMEM高グルコース)中に2×
105個のHT1080を各ウェルに播種する。翌日の形質導入の前に、細胞を、37℃お
よび10% C02にて24時間インキュベートする。
2日目に、培地を取り除き、そして8μgポリブレン/ml最終を含有する培地
の1mlを各ウェルに添加する。細胞を、37℃および10% C02にて30分間インキュ
ベートする。上清を、ベクター含有培地の穏やかなピペッティングにより約5 c
fu/mlの濃度まで希釈する。希釈した上清の5、20、および50μlを、それぞれウ
ェル1〜3に添加し、培地をかき回し、そして37℃および10%C02にて24時間イ
ンキュベートする。
3日目に、1mlの培地を各ウェルに添加し、そして細胞を、37℃および10% C
O2にて24時間インキュベートする。
4日目に、形質導入した細胞にX-gal染色手順を行なう。青色細胞の総数を各
ウェルで計数し、そして力価を決定する。簡略には、培地を排出し、そして0.5m
lの固定溶液(2%(v/v)ホルムアルデヒドおよび0.2%(v/v)グルタルアルデヒ
ドを有するPBS)を各ウェルに添加する。細胞を、5分間室温にてインキュベー
トし、固定溶液を排出し、そして細胞を1ウェルあたり2mlのPBSで洗浄する。
ウェルを排出し、そして0.5mlの新たに混合したX-gal染料(5mMフェロシアン化
カリウム、5mMフェリシアン化カリウム、2mM MgCl2、および1mg/ml X-galを有
するPBS)を、各ウェルに添加する。細胞を、37℃で2時間から一晩インキュベ
ートし、そして青色細胞を計数する。
pMLP-Gと、発現ベクター中のPCRに基づくVSV-G遺伝予産物との間の力価が匹敵
する場合、PCRに基づくVSV-G遺伝子を、Lark Sequencing Technologiesにより配
列決定し、そしてpMLP-G中のVSV-G配列に対して比較する。力価が、PCRにより回
収されたVSV-G遺伝子ではずっと小さいかまたは0である場合、PCR IIに連結さ
れたVSV-Gを有する他のプラスミドクローンをスクリーニングする。
機能的VSV-G遺伝子を、原核生物TAクローニングベクターpCRTMIIまたは真核生
物発現ベクターpcDNAIIIのいずれかから回収し得る。
実施例3
安定なVSV-G発現パッケージング細胞株を生成するための
テトラサイクリン誘導性プロモーター系の使用
A.導入
以下でより詳細に記載するように、テトラサイクリントランスアクチベーター
(tTA)を、293(2-3)PCLに導入し、そして構成的に発現させる。293(2-3)tTA細
胞株の2回目のトランスフェクションでは、tetオペレーター配列を、tetオペレ
ーター配列の後ろに融合したVSV-G遺伝子とともに導入する。
B.プラスミド調製
以下のプラスミドの各々のプラスミド調製を、QIAGENプラスミドキット(QIAG
EN Inc.,Chatsworth,CA)を本質的に製造者により記載されるように用いて行
なう。簡略には、プラスミドを、E.coli DH 12S(Life Technologies,Inc.,Gai
thersburg,MD)中にエレクトロポレーションし、そして培養物を、pMLP-G(こ
れは、テトラサイクリンを5μg/mlの最終濃度で必要とする)を除く全てのプラ
スミドについて100μg/mlの最終濃度でアンピシリンを補充したLBブロス中で増
殖させる。エレクトロポレーションされた細菌を、それぞれの抗生物質を含有す
るLB寒天プレート上にシングルコロニーとしてプレートする。シングルコロニー
を選択し、微量プラスミド調製を行ない、そして特徴的な制限酵素消化を行って
各プラスミドの同一性を確認する。一旦シングルコロニーが同定されたら、グリ
セロール培養物(40%グリセロールと細菌懸濁液との1:1希釈)を−80℃にて
保存する。以下の表は、利用可能なプラスミドを列挙し、コード領域およびプラ
スミドの供給源を記載する。
安定なテトラサイクリン誘導性VSV-G PCLの生成のためのプラスミド 名称 コード領域 参考文献
pUHD 15-20 HSV-Tkプロモーターの下のtTA 例えば、米国特許第5,464,758
号を参照のこと
pUHD 15-1 hCMVプロモーター/エンハンサ 米国特許第5,464,758号;
ーの下のtTA Gossen M.およびBujard H.,PN
AS 89: 5547-5551 (1992)
pUHD 10-3 上記の参考文献に記載のように GossenおよびBujard,PNAS89:
ヘプタマー化した上流のtetオ 5547-5551 (1992)
ペレーターそれに続く多数のク
ローニング部位を有するhCMVプ
ロモーター/エンハンサー名称 コード領域 参考文献
pMLP-G MLPプロモーターの下のVSV-G遺 Lazzariniら,J.Virol.45: 77
伝子 3-781 (1983)
pT3/T7-Luc ルシフェラーゼ発現ベクター Clontech(Clontech Inc.,Palo
Alto,CA)
pUT 507 フレオマイシン(phleomycin) Tirabyら,Somatic Cell and M
/ゼオシン(zeocin)耐性プラ olecular Genetics 14: 243-25
スミド 2(1988)
pHIS ヒスチジノールマーカープラス (以下を参照のこと)
ミド
pCB/β-gal β-galコードプラスミド Irwinら,J.Vjr.68(8): 5036- 5044,1994
真核生物発現ベクターpREP8(Invitrogen,San Diego,CA)(これは、ヒスチ
ジノール耐性遺伝子を含む)ならびにEpstein Barrウイルス複製起点およびEBNA
を、EcoRIで消化し、そして5.8Kbフラグメントを単離し、再連結し、そしてE.co
li中にトランスフェクトする。このベクターpHISは、プラスミド複製起点、アン
ピシリン耐性遺伝子、ならびにSV40プロモーターおよびポリアデニル化配列を有
するヒスチジノール耐性遺伝子のみを含む。
C.ルシフェラーゼレポータープラスミドpUHD 10-3/lucの構築
テトラサイクリントランスアクチベーター機能を、tTA制御ルシフェラーゼレ
ポーターユニットを用いる一過性トランスフェクションアッセイにおいて最初に
調べる。両方のレギュレータープラスミド(pUHD 15-20ならびにpUHD 15-1)を、
一過性アッセイにおいて分析し、どのプラスミドが、テトラサイクリンの使用中
止後の活性化の漏出およびレベルに関して良好な系を与えるかを決定する。同時
トランスフェクション実験を、293(2-3)細胞およびD-17 gag/pol細胞ならびにポ
ジティブコントロールとしてのHeLa細胞において行なう。
1.pUHD10-3へのルシシフェラーゼ道伝子のクローニング。
プラスミドpUHD 10-3を、EcoRI (New England Biolabs,Inc.,Beverly,MA)で
線状化し、5'突出を、制限酵素緩衝液中でヌクレオチドおよびKlenowフラグメン
トでフィルインする。次いで、ベクターを、PCI(フェノール:クロロホルム:
イソアミルアルコール,Amresco Inc.,Solon,Ohio)で処理してタンパク質を
除去し、そしてエタノール沈澱する。HindIIIリンカーをプラスミドに連結
し、プラスミドをHindIIIで制限処理し、そしてCIP(仔ウシ腸ホスファターゼ)
で脱リン酸化する。脱リン酸化後、ベクターを、PCI抽出し、そしてQiagenから
のQiaexゲル精製キットを本質的に製造者の手順に従って用いてゲル精製する。
ルシフェラーゼ遺伝子を、HindIII消化(New England Biolabs)の後、pT3/T7
-Luc(Clontech)から1.9kbのフラグメントとして切り離し、2つのフラグメン
トをアガロースゲルで精製して3.15kbベクターから1.9kbルシフェラーゼコード
フラグメントを分離し、そしてルシフェラーゼ遺伝子を、HindIIIで制限処理し
たpUHD 10-3ベクターに連結してpUHD 10-3/lucを生成する。
連結物のアリコートを、E.coli DH 12S(Life Technologies)中にエレクトロ
ポレーションし、培養物をLBブロス中で37℃にて1時間増殖させ、アリコートを
、100μg/mlの最終濃度でアンピシリンを補充したLB寒天プレートにプレートし
、そして37℃にて一晩インキュベートする。シングルコロニーを選択し、100μg
/mlの最終濃度でアンピシリンを補充した2mL LBブロス中で一晩増殖させ、そし
てプラスミド微量調製を、Qiagenミニプレップキット(Qiagen Inc.,Chatsworth
,CA)を製造者の指示に従って用いて行なう。
ルシフェラーゼ遺伝子を有するクローンを同定するために、SalIおよびSacI(
New England Laboratories)での制限酵素二重消化またはHindIII(New England
Laboratories)での単一消化を行なう。1%分析用アガロースゲルでの消化物
の電気泳動は、3.15kbの線状化ベクターおよびルシフェラーゼ遺伝子についての
1.9kbフラグメントを示す。両方のフラグメントを有するクローンを、ベクター
中のルシフェラーゼ遺伝子の方向に関してさらに分析する。XbaI消化(New Engl
and Laboratories)を行ない、そして電気泳動したフラグメントを1%アガロー
スゲルで調べる。正確な方向についてのフラグメントのパターンは、0.14、1.76
、および3.15kbであり、そして逆の方向については、0.14および5.0kbである。
正確なルシフェラーゼ方向を有するクローン(pUHD 10-3/luc)のプラスミド
調製を、Qiagenプラスミドキットを用いて行なう。
2.293(2-3)、D-17 gag/pol.およびHeLa細胞におけるルシフェラーゼの一過
性発現。
293(2-3)およびD-17パッケージング細胞(WO 92/05266)(ならびにポジティ
ブコントロールとしてのHeLa細胞)を、1:20、1:50、および1:100の比で、pUHD1
0-3/lucと、pUHD 15-20またはpUHD 15-1のいずれかとで同時トランスフェクトす
る。プラスミドを、Promega(Promega Corp.,Madison,WI)からのプロフェク
ションキットを製造者により推奨されるように用いて、リン酸カルシウム沈澱を
介して導入する。プラスミド、比、および細胞株の種々の組み合わせについて各
々2つの組織培養皿を用意する。テトラサイクリン、無水サイクリン、またはデ
オキシサイクリンを、一方の皿に添加するが、他方の皿には添加しない。
テトラサイクリンの一種を、同時トランスフェクションの数時間前に1μg/ml
の最終濃度で添加する。1組み合わせあたりの両方の皿の細胞を、トランスフェ
クションの24時間後にルシフェラーゼ活性について分析する。
3.ルシフェラーゼ活性の分祈。
ルシフェラーゼアッセイを、製造者(Promega)の指示に従って行なう。最低
の基底活性およびテトラサイクリンを含まない培養下で最高の程度のルシフェラ
ーゼ活性化を与えるtTAレギュレータープラスミド(pUHD 15-20またはpUHD 15-1
)を、安定なVSV-G産生293(2-3)およびまたはD-17細胞株を樹立するために利用
する。
4.安定な293(2-3)tTAおよびD-17 gag/pol tTA細胞株の構築
293(2-3)およびD-17 gag/pol細胞における調節系を、2段階で樹立する。第1
に、293(2-3)およびD-17 gag/pol細胞を、10:1の比で、tTAレギュレータープラ
スミドおよびpUT 507で同時トランスフェクトする。プラスミドを、PR0MEGAから
のプロフェクションキットを用いてリン酸カルシウム沈澱を介して導入する。同
時トランスフェクションを、製造者により推奨されるように行なう。同時トラン
スフェクションの2日後、細胞を、全ての非耐性細胞が死ぬまで10日間、ゼオシ
ンで選択する。次いで、細胞の選択を止め、そしてウェルの3分の1が増殖を示
すようにいくつかの96ウェルプレートにおいて限界希釈を行なう。各クローンを
、pUHD 10-3/lucで一過性にトランスフェクトし、そしてルシフェラーゼ活性に
つ
いてスクリーニングする。pUHD 10-3にクローニングしたVSV-G遺伝子を導入する
ために、高レベルのルシフェラーゼ活性およびテトラサイクリンの存在下で低い
基底レベルを有するクローンを用いる。次いで、細胞の選択を止め、そしてウェ
ルの3分の1が増殖を示すようにいくつかの96ウェルプレートにおいて限界希釈
を行なう。各クローンを、pUHD 10-3/lucで一過的にトランスフェクトし、そし
てルシフェラーゼ活性についてスクリーニングする。pUHD 10-3にクローニング
したVSV-G遺伝子を導入するために、高レベルのルシフェラーゼ活性およびテト
ラサイクリンの存在下で低い基底レベルを有するクローンを用いる。
D.VSV-G 発現プラスミドpUHD 10-3/VSV-Gの構築
VSV-G遺伝子を、Eco-RI-SacII二重消化でpCRTMII TAクローニングベクターか
ら回収する。1.6kbのVSV-G遺伝子を単離し、そして上記のようにQIAEXキットを
用いる1%アガロースゲルでの電気泳動により精製する。プラスミドpUHD 10-3
を、SacIIおよびEcoRIで制限処理し、そしてVSV-G遺伝子を骨格に連結する。
連結物のアリコートを、E.colI DH 12S(LifeTechnologies)中にエレクトロ
ポレーションし、培養物を、LBブロス中で37℃にて1時間増殖させ、アリコート
を、100μg/mlの最終濃度にアンピシリンを補充したLB寒天プレート上にプレー
トし、そして37℃にて一晩インキュベートする。シングルコロニーを拾い、100
μg/mlの最終濃度にアンピシリンを補充した2ml LBブロス中で一晩増殖させ、
そしてプラスミドの微量調製を上記のように行なう。
VSV-G遺伝子を有するクローンを同定するために、SacIIおよびXbaI(New Engl
andLaboratories)での制限酵素二重消化を行なう。1%分析用アガロースゲル
での消化物の電気泳動は、3.15kbの線状化ベクターおよびVSV-G遺伝子について
の1.6kbフラグメントを示す。
正確なVSV-G方向を有するクローン(pUHD 10-3/VSV-G)のプラスミド調製を、
Qiagenプラスミドキットを用いて行なう。
E.安定な293(2-3)tTA/VSV-Gおよび/またはD-17 gag/pol tTA/VSV-G細胞株の 構築
VSV-G遺伝子を、pUHD 10-3/VSV-GおよびpUT 507の同時トランスフェクション
により、293(2-3)tTAおよび/またはD-17 tTA-VSV-Gクローン中に導入し、次い
でフレオマイシンまたはゼオシンで選択する。
両方のプラスミドを、Promegaからのプロフェクションキットを製造者により
推奨されるように用いるリン酸カルシウム沈澱を介して、293(2-3)tTAおよびD-1
7-gag/pol細胞中に、10:1の比で導入する。同時トランスフェクションの時から
、細胞をテトラサイクリン含有培地(1μg/ml最終濃度)中に保つ。同時トラン
スフェクションの2日後、細胞を、全ての非耐性細胞が死ぬまで10日間、ヒスチ
ジノールで選択する。次いで、細胞の選択を止め、そしてウェルの3分の1が増
殖を示すようにいくつかの96ウェルプレートにおいて限界希釈を行なう。各クロ
ーンを、2つの組織培養皿に分ける(一つの皿はVSV-Gの産生を誘導するために
テトラサイクリンを含まない培地を含む)。1日後、テトラサイクリンを含まな
い培地における細胞を、PCLクローンの各々のタイタリング能(titering potent
ial)を決定するために、リン酸カルシウムトランスフェクションを介して、β-
gal遺伝子(pCB/β-galから)を用いてトランスフェクトする。トランスフェク
ションの2日後、上清を収集し、そしてHT1080標的細胞を、β-gal遺伝子を有す
るウイルス粒子で以下のように形質導入する。
1日目に、1上清あたり6ウェルプレートの3ウェルに、2mlの培地(10% F
BS、非必須アミノ酸、およびピルビン酸ナトリウムを有するDMEM高グルコース)
中の2×105個のHT1080細胞を、各ウェルに播種する。細胞を、翌日の形質導入
の前に、37℃および10%C02にて正確に24時間インキュベートする。
2日目に、培地を除去し、そして8mgポリブレン/mlを含有する培地1mlを各
ウェルに添加する。細胞を、37℃および10% C02にて30分間インキュベートする
。培地中での穏やかなピペッティングにより、上清を約5 CFU/mlの濃度まで希
釈する。希釈した上清の5、20、および50mlを、それぞれウェル1〜3に添加し
、培地をかき回し、そして37℃および10% C02にて24時間インキュベートする。
3日目に、1mlの培地を各ウェルに添加し、そして細胞を、37℃および10% C
02にて24時間インキュベートする。
4日目に、形質導入した細胞でのX-gal染色手順を行なう。青色細胞の総数を
各ウェルで計数し、そして力価を決定する。
X-gal染色のために、培地を排出し、0.5mlの固定溶液(2%(v/v)のホルムア
ルデヒドおよび0.2%(v/v)のグルタルアルデヒドを有するPBS)を12ウェルプレ
ートの各ウェルに添加し、細胞を室温にて5分間インキュベートし、固定溶液を
排出し、細胞を1ウェルあたり2mlのPBSで洗浄し、そして0.5mlの新たに混合し
たX-gal染料(5mM フェロシアン化カリウム、5mM フェリシアン化カリウム、
2mM MgCl2、および1mg/ml X-galを有するPBS)を各ウェルに添加し、細胞を37
℃にて2時間から一晩インキュベートし、そして青色細胞を計数する。
一旦、タイタリング能が決定されたら、感染性ウイルス粒子を産生する最大の
能力を有する4つのクローンを、VSV-G発現の基底レベルを決定するために、テ
トラサイクリンを含有する培地中で数週間培養し続ける。VSV-G毒性の影響を示
さないコロニーのみが、安定なVSV-GPCLとして有用である。
実施例4
安定なVSV-G発現パッケージング細胞株を産生するための
IPTG/温度誘導性LAPプロモーター系の使用
以下でより詳細に記載のように、強力なプロモーターにより駆動されるLAPの
各々を、293(2-3)パッケージング細胞株中に導入し、そして構成的に発現させる
。293(2-3)LAP細胞株の2回目のトランスフェクションは、弱いプロモーターに
より駆動されるLAP結合ドメイン(lacオペレーター配列)を、lacオペレーター
配列の後ろに融合したVSV-G遺伝子とともに導入する。
A.LAP267 およびLAP348プロモーター系の説明
LAP348:このプロモーター系は、IPTGによりネガティブに調節される。それゆ
え、VSV-Gエンベロープの発現は、IPTGの添加後に抑制される。
LAP267:対照的に、LAP267は、IPTGの添加および/または32℃への温度の下降
シフトの後にVSV-Gエンベロープの発現を可能にする。LAP267は、lacリプレッサ
ータンパク質のインデューサー結合および二量体化ドメイン内にHSV VP 16の転
写活性化ドメインの挿入(これは、LAP267タンパク質を温度感受性にする)を含
む。
IPTGは、LAP267活性には、許容温度(32℃)では何の影響も有さない。LAP267活
性は、39.5℃でIPTGによりレスキューされる。
B.プラスミド調製
以下のプラスミドの各々のプラスミド調製を、Qiagenプラスミドキット(Qiag
en Inc.,Chatsworth,CA)を製造者の示唆に従って用いて行なう。簡略には、
プラスミドを、E.coli DH 12S(Life Technologies,Inc.,Gaithersburg,MD)
中にエレクトロポレーションし、培養物を、pMLP-G(これは、テトラサイクリン
を5μg/mlの最終濃度で必要とする)を除く全てのプラスミドについて100μg/m
lの最終濃度でアンピシリンを補充したLBブロス中で増殖させる。エレクトロポ
レーションされた細菌を、それぞれの抗生物質を含有するLB寒天プレート上にシ
ングルコロニーとしてプレートし、シングルコロニーを拾い、微量プラスミド調
製を行ない、そして特徴的な制限酵素消化を行って各プラスミドの同一性を確認
する。一旦シングルコロニーが同定されたら、グリセロール培養物(40%グリセ
ロールと細菌懸濁液との1:1希釈)を−80℃にて保存する。以下の表は、利用
可能なプラスミドを列挙し、コード領域およびプラスミドの供給源を記載する。
安定なIPTG誘導性VSV-GPCLの生成のためのプラスミド名称 コード領域 参考文献
pCMV267 最小CMVプロモーターの下のLAP PNAS 88:5072-5076,1991
267
pHCMVLAP348 最小CMVプロモーターの下のLAP Molec.Cell.Biol.10:3343-3
348 356,1990
pL7CAT SV40プロモーターおよびCAT遺 Molec.Cell.Biol.10:3343-3
伝子が続く1セットのタンデム 356,1990
AおよびB lacオペレーター反
復
pL14CAT SV40プロモーターおよびCAT遺 Molec.Cell.Biol.10:3343-3
伝子が続く2セットのタンデム 356,1990
AおよびB lacオペレーター反
復
pMLP-G MLPプロモーターの下のVSV-G遺 J.Vir.45:773-781,1983
伝子
pT3/T7-Luc ルシフェラーゼ発現ベクター Clontech(Clontech Inc.,Palo
Alto,Ca)
pUT507 フレオマイシン/ゼオシン耐性 Somatic Cell and Molecular G
プラスミド enetjcs 14:243-252,1988
pHIS ヒスチジノールマーカープラス (上を参照のこと)
ミド
pCB/β-gal β-galコードプラスミド Irwinら,J.Vir.68(8):5036-5 044,1994
C.ルシフェラーゼレポータープラスミドpL7/lucおよびpL14/lucの構築
LAP機能を、LAP267またはLAP348に制御されるルシフェラーゼレポーターユニ
ットを用いる一過性トランスフェクションアッセイにおいて最初に調べる。2つ
のレポータープラスミドpL7/lucおよびpL14/lucのいずれかと一緒の両方のレギ
ュレータープラスミドpCMV267およびpHCMVLAP348の組み合わせを、一過性アッセ
イにおいて分析し、どのプラスミドの組み合わせが、IPTG/温度誘導の後の漏出
および活性化のレベルに関して良好な系を与えるかを決定する。同時トランスフ
ェクション実験を、293(2-3)およびD-17gag/pol細胞ならびにポジティブコント
ロールとしてのHeLa細胞において行なう。
D.pL7CAT およびpL14CAT中へのルシフェラーゼ遺伝子のクローニング
CAT遺伝子をコードするpL7CATおよびpL14CATからのStuI-BalIフラグメントを
、2つのレポータープラスミドの各々の、StuIおよびBalIでの二重消化を用いて
欠失させる。各々のプラスミドについての2つの得られた平滑末端フラグメント
を、1%アガロースゲル中で分離し、そしてpL7およびpL14骨格を切断し、Qiage
nか
らのQiaexゲル精製キットを製造者の手順に従って用いてゲル精製する。この工
程は、CAT遺伝子をpL7CATおよびpL14CATプラスミドから除去する。HindIIIリン
カーを、各々の骨格に連結し、骨格をHindIIIで制限処理し、そして仔ウシ腸ホ
スフアターゼで処理して再連結の可能性を減少させる。ルシフェラーゼ遺伝子を
、pT3/T7-Lucプラスミドから、HindIII消化により切り離し、1.9kbのルシフェラ
ーゼ遺伝子を、上記のように1%アガロースゲルで単離および精製し、そしてル
シフェラーゼフラグメントを、各々のプラスミド骨格のHindIII部位中に連結す
る。
連結物のアリコートを、E.coli DH 12S(Life Technologies)中にエレクトロ
ポレーションし、培養物をLBブロス中で37℃にて1時間増殖させ、アリコートを
、100μg/mlの最終濃度でアンピシリンを補充したLB寒天プレート上にプレート
し、そして37℃にて一晩インキュベートする。シングルコロニーを拾い、100μg
/mlの最終濃度でアンピシリンを補充した2ml LBブロス中で一晩増殖させ、そし
てプラスミド微量調製を、Qiagenミニプレップキット(Qiagen Inc.,Chatsworth
,CA)を製造者の指示に従って用いて行なう。
ルシフェラーゼ遺伝子を有するクローンを同定するために、分析用制限酵素消
化を行なう。正確なルシフェラーゼの方向を有する各1つのクローン(pL7/luc
およびpL14/luc)のプラスミド調製を、Qiagenプラスミドキットを用いて行なう
。
E.293(2-3) 、D-17 gag/pol.およびHela細胞におけるルシフェラーゼの一過性 発現
293(2-3)、D-17 gag/pol.およびポジティブコントロールとしてのHeLa細胞を
、1:20、1:50、および1:100の比で、pL7/lucまたはpL14/lucのいずれか、および
pCMV267またはpHCMVLAP348のいずれかで同時トランスフェクトする。プラスミド
を、Promega(Promega Corp.,Madison,WI)からのプロフェクションキットを製
造者により推奨されるように用いて、リン酸カルシウム沈澱を介して導入する。
プラスミド、比、および細胞株の種々の組み合わせについて各々2つの組織培養
皿を用意する。2皿のうち一方は、LAP267を含む組み合わせについては5mMでの
IPTGおよび/または温度シフトを用いて誘導し、そしてLAP348を含む組み合わせ
についてはIPTGを使用中止する。
細胞を、同時トランスフェクションの数時間前に誘導する。1つの組み合わせ
あたりの両方の皿の細胞を、トランスフェクションの24時間後に、ルシフェラー
ゼ活性について分析する。
F.ルシフェラーゼ活性の分析
ルシフェラーゼアッセイを、製造者(Promega)の指示に従って行なう。
最低の基底活性および非誘導培養条件下でルシフェラーゼの最大の活性化程度
を与えるLAPレギュレータープラスミド(pCMV267またはpHCMVLAP348)を、安定
なVSV-G産生293(2-3)および/またはD-17 gag/pol細胞株を樹立するために利用
する。
G.安定な293(2-3)LAP267、D-17 gag/pol LAP267、D-17 gag/pol LAP348、およ び/または293(2-3)LAP348細胞株の構築
293(2-3)およびD-17 gag/pol細胞における調節系を、2工程で樹立する。第1
に、293(2-3)およびD-17 gag/pol細胞を、10:1の比で、LAP調節プラスミドおよ
びpUT507で同時トランスフェクトする。プラスミドを、Promegaからのプロフェ
クションキットを本質的に製造者の指示に従って用いて、リン酸カルシウム沈澱
を介して導入する。同時トランスフェクションを、製造者により推奨されるよう
に行なう。同時トランスフェクションの2日後、細胞を、全ての非耐性細胞が死
ぬまで10日間、0.8mg/mlでG418で選択する。次いで、細胞の選択を止め、そして
ウェルの3分の1が増殖を示すようにいくつかの96ウェルプレートにおいて限界
希釈を行なう。各クローンを、pL7/lucまたはpL14/lucで一過的にトランスフェ
クトし、そしてルシフェラーゼ活性についてスクリーニングする。pL7またはpL1
4中にクローニングされたVSV-G遺伝子を導入するために、非誘導培養条件下で高
レベルのルシフェラーゼ活性および低い基底レベルを有するクローンを用いる。
H.VSV-G 発現プラスミドpL7/VSV-GおよびpL14/VSV-Gの構築
VSV-G遺伝子を、pCRTMII TAクローニングベクターからEcoRI消化を用いて回収
する。1.6kbのVSV-G遺伝子を、上記のようにQIAEXキットを用いる1%アガロー
スゲルでの電気泳動により単離および精製する。
プラスミドpL7CATおよびpL14CATを、CAT遺伝子を欠失する、StuIおよびBalIで
消化する。EcoRIリンカーを平滑末端に連結し、骨格をEcoRIで制限処理し、そし
て仔ウシ腸ホスファターゼで処理する。次いで、1.6kbのVSV-Gを、pL7およびpL1
4骨格中に連結する。
連結物のアリコートを、E.coli DH 12S(LLFE TECHN0L0GIES)中にエレクトロ
ポレーションし、培養物をLBブロス中で37℃にて1時間増殖させ、アリコートを
、100μg/mlの最終濃度でアンピシリンを補充したLB寒天プレート上にプレート
し、そして37℃にて一晩インキュベートする。シングルコロニーを拾い、100μg
/mlの最終濃度までアンピシリンを補充した2ml LBブロス中で一晩増殖させ、そ
してプラスミド微量調製を、上記のように行なう。
分析用制限酵素消化を、連結物の各々のいくつかのクローンについて、正確な
連結を確認するために行なう。正確なVSV-G方向を有する各々の連結物について
のクローンのプラスミド調製(pL7/VSV-GおよびpL14/VSV-G)を、Qiagenプラス
ミドキットを用いて行なう。
I.安定な293(2-3)LAP267/VSV-G D-17 gag/pol LAP267/VSrGおよび/または293 (2-3)LAP348/VSV-G、D-17 gag/pol LAP 348/VSV-G細胞株の構築
VSV-G遺伝子を、pL7/VSV-GまたはpL14/VSV-Gと、ヒスチジノールでの選択のた
めのpHISとの同時トランスフェクションにおいて、293(2-3)LAPおよびD-17 ag/p
ol LAPクローン中に導入する。
両方のプラスミドを、PR0MEGAからのプロフェクションキットを製造者により
推奨されるように用いて、リン酸カルシウム沈澱を介して、293(2-3)LAPおよびD
-17 gag/pol LAP細胞中に10:1の比(VSV-G:選択マーカー)で導入する。同時ト
ランスフェクションの時から、細胞を、非誘導培地中で保持する。同時トランス
フェクションの2日後、細胞を、全ての非耐性細胞が死ぬまで10日間、ヒスチジ
ノールで選択する。次いで、細胞の選択を止め、そしてウェルの3分の1が増殖
を示すようにいくつかの96ウェルプレートにおいて限界希釈を行なう。各クロー
ンを、2つの組織培養皿に分け、一方の皿を、VSV-G誘導条件下で培養し、そし
て一方の皿をVSV-G抑制条件下で培養する。1日後、誘導された細胞を、PCLクロ
ーンの各々のタイタリング能を決定するために、リン酸カルシウムトランスフェ
クションを介して、β-gal遺伝子(pCB/β-galから)でトランスフェクトする。
VSV-G発現の漏出を分析するために、非誘導細胞を、β-gal遺伝子で同様にトラ
ンスフェクトする。トランスフェクションの2日後、上清を収集し、そしてHT10
80標的細胞を、以下のようにβ-gal遺伝子を有するウイルス粒子で形質導入する
。
1日目、1上清あたり6ウェルプレートの3つのウェルに、2mlの培地(10%
FBS、非必須アミノ酸、およびピルビン酸ナトリウムを有するDMEM高グルコース
)中の2×105個のHT1080を、各ウェルに播種する。細胞を、翌日の形質導入の
前に、37℃および10% C02にて正確に24時間インキュベートする。
2日目に、培地を除去し、そして8μgポリブレン/mlを含有する培地1mlを各
ウェルに添加する。細胞を、37℃および10% C02にて30分間インキュベートする
。培地中での穏やかなピペッティングにより、上清を5 CFU/μlの近似濃度まで
希釈する。希釈した上清の5、20、および50mlを、それぞれウェル1〜3に添加
し、培地をかき回し、そして37℃および10% C02にて24時間インキュベートする
。
3日目に、1mlの培地を各ウェルに添加し、そして細胞を、37℃および10% C
O2にて24時間インキュベートする。
4日目に、形質導入した細胞でのX-gal染色手順を行なう。
簡略には、培地を排出し、そして0.5mlの固定溶液(2%(v/v)のホルムアルデ
ヒドおよび0.2%(v/v)のグルタルアルデヒドを有するPBS)を12ウェルプレート
の各ウェルに添加する。細胞を、室温にて5分間インキュベートし、固定溶液を
排出し、そして細胞を1ウェルあたり2mlのPBSで洗浄する。次いで、ウェルを
排出し、そして0.5mlの新たに混合したX-gal染料(5mMフェロシアン化カリウム
、5mMフェリシアン化カリウム、2mM MgCl2、および1mg/ml X-galを有するPBS
)を各ウェルに添加する。細胞を37℃にて2時間から一晩インキュベートし、そ
して青色細胞を計数する。
一旦タイタリング能が決定されたら、感染性ウイルス粒子を産生する最大の能
力を有する4つのクローンを、VSV-G発現の基底レベルを決定するために、非誘
導培地中で数週間培養し続ける。VSV-G毒性の影響を示さないクローンのみが、
安定なVSV-GPCLとして有用である。実施例5
安定な偽型化細胞の生成のための代替糖タンパク質代謝
上記のように、本発明はまた、変化または変異したグリコシル化経路を有する
細胞株を提供する。これは、別の毒性のグリコシル化タンパク質または紡錘形生
成(fusogenic)タンパク質の発現を指向する発現ベクターを有するかまたは含
む。
例えば、LecL 1、2、および8細胞(ATCC CRL 1735、1736、1737)(これ
は、変化したグリコシル化表現型を有することが公知である)を、本質的にpMLP
-Gでのトランスフェクションによりスクリーニングし、そして適切な選択マーカ
ーでの抗生物質耐性について選択し得る。単離されたコロニーを、VSV-Gに対す
るモノクローナル抗体(例えば、Sigma Chemical Corp.,St.Louis,MOから)
を用いてフローサイトメトリーにより分析する。適切な細胞クローンを、パッケ
ージング細胞株の生成のために用いる。
実施例6
狂犬病Gタンパク質パッケージング細胞株
弱毒化狂犬病ウイルスSAD B19株のGタンパク質を含むプラスミドベクター(pS
AD61 EMBL/GenBank Acc.No..M31046,Conzelmann,FRCVDA Tubingen,D)を、レ
トロウイルスベクターを偽型化する際の使用のために、Gタンパク質配列をPCR
増幅するためのテンプレートとして使用する。
簡単には、Gタンパク質をコードする配列を、以下に示すプライマーセットを
利用して、製造者の指示(Perkin Elmer)に従って増幅する:
配列番号5
5'-3' GTC AAG CTT AAC ATC CCT CAA AAG ACT CAA GGA AAG ATG G
このプライマーは、5'末端のHindIII部位と共にATG開始部位を含むGタンパク
質のセンス配列である。
配列番号6
5'-3' GAT ATC TCG AGC TTA CAG TCT GGT CTC ACC CCC ACT CTT
このプライマーは、5i末端にXhoI部位を伴う、タンパク質末端のGタンパク質
のアンチ七ンス配列である。
5'および3'プライマーの両方は、pcDNA3(Invitrogen SD,CA)のマルチクローニ
ング部位の5'HindIII部位および3'XhoI部位と適合する制限部位を有する。
得られるPCR産物を単離し、HindIIIおよびXhoIで消化し、そしてHindIIIおよ
びXhoIで消化したpcDNA3に連結して、pcDNA3/Rab-Gプラスミドを作製する。Gag/
polプレパッケージング株を、pcDNA3/Rab-Gでトランスフェクトし、そしてNeor
耐性について選択する。安定な細胞株を適切な薬物を用いて選択し、そしてプー
ルをサブクローニングする。
実施例7
アルファウイルスコア、E1、E2パッケージング細胞株
シンドビスウイルスのようなアルファウイルスにおけるVSV-Gタンパク質等価
物は、3つのタンパク質:コア、E1およびE2のヘテロタンパク質である。以下で
より詳細に記載するように、シンドビスDNA(ATCC 75891)を含むプラスミドベ
クターを、レトロウイルスベクターを偽型化する際の使用のために、コアおよび
E1およびE2糖タンパク質を増幅するためのテンプレートとして利用し得る。
簡単には、実施例6において上述されたことと同様に、コア、E1およびE2タン
パク質を、以下のプライマーを利用して、製造者の指示(Perkin Elmer)に従って
増幅する:
配列番号7
5'-3' GTC AAG CTT GCT AGC TAC AAC ACC ACC ACC ATG AAT ACA G
このプライマーは、5'末端のHindIII部位と共にATG開始部位を含むコアタンパ
ク質のセンス配列である。
配列番号8
5'-3' GAT ATC TCG AGC GGC CGC TCA TCT TCG TGT GCT AGT CAG
このプライマーは、5i末端にXhoI部位を伴う、タンパク質末端のE2タンパク質
のアンチセンス配列である。
5'および3'プライマーの両方は、pcDNA3(Invitrogen SD,CA)のマルチクロー
ニング部位の5'HindIII部位および3'XhoI部位に適合する制限部位を有する。
得られるPCR産物を単離し、HindIIIおよびXhoIで消化し、そしてHindIIIおよ
びXhoIで消化したpcDNA3に連結して、pcDNA3/コアE1E2Gプラスミドを作製する。
Gag/polプレパッケージング株を、pcDNA3/コアE1E2Gでトランスフェクトし、そ
してNeor耐性について選択する。安定な細胞株を適切な薬物を用いて選択し、そ
してプールをサブクロ−ニングする。実施例8
合成Gタンパク質パッケージング細胞株
合成Gタンパク質の例は、膜貫通領域の細胞質末端のアンカー残基で端を切ら
れた、狂犬病Gの外部ドメイン(ectodomain)である。この端の切断を、以下の3'
プライマーを使用することを除いて、実施例5からの試薬を用いて行なう:
配列番号9
5'-3' GAT ATC TCG AGT TAG ACT CTT CTA CAA CAT GTC ATC AGG
このプライマーは、5i末端にXhoI部位を伴う、タンパク質のアンカー領域での
Gタンパク質のアンチセンス配列である。
得られるPCR産物を単離し、HindIIIおよびXhoIで消化し、そしてHindIIIおよ
びXhoIで消化したpcDNA3に連結して、pcDNA3/ΔGプラスミドを作製した。Gag/po
lプレパッケージング株を、pcDNA3/ΔGでトランスフェクトし、そしてNeor耐性
について選択する。安定な細胞株を適切な薬物を用いて選択し、そしてプールを
サブクローニングする。
実施例9
オパール変異したセレン調節性VSV-G発現ベクターの作製
上記のように、選択されたシステインコドンがセレノシステインアイソアク
セプターTGAに変換された、VSV-G遺伝子変異を作製し得る。以下でより詳細に記
載するように、1、2、4、またはそれより多くの変異誘発システインコドンを
含む構築物を、GPX1 SREを含む3'非翻訳領域へオパール変異体コーディング領域
を融合することにより作製し得る(構築物の模式的な実例については図1を参照
のこと)。従って、セレンの非存在下で、UGA(オパール)コドンは終結をもたら
す;しかし、セレン補給の際には、セレノシステイン残基はポリペプチド中に取
り込まれる。VSV-Gタンパク質について、構造的に重要なシステイン残基は、セ
レノシステインが正常な構造を維持するように置換するために特に好ましいが、
セレン欠乏細胞におけるサプレッサーtRNAによる任意の読み過しが、不安定化ア
ミノ酸置換をもたらすだろう。しかし、より重要には、変異誘発は三量体化ドメ
インにおいて避けられるべきである:セレンが化学的には硫黄とほぼ同一であっ
ても、この領域における変異の回避は、変異が三量体化能を変化させ、従って操
作されたVSV-Gタンパク質の機能を変化させ得るといういずれの可能性をも最小
にする。
A.VSV-G 遺伝子の変異誘発
VSV-G cDNAの配列分析は、15個のシステイン残基がコーディング配列のアミノ
末端部分に集中し(図2を参照のこと)、このうち11個のシステインはUGCによ
りコードされ、そして4個のシステインはUGUコドンによりコードされることを
証明する(Rose,J.Virol.39: 519-528,1981)。2個のシステインは、細胞表面
へのVSV-Gタンパク質輸送の間に切断されるNH2末端シグナル配列(16アミノ酸)
に含まれるので、約67kDの成熟タンパク質は13個のみのシステインを含む。タン
パク質は、細胞表面上に非共有結合したホモ三量体として存在する。
VSV-Gのコーディング領域の分析は、PCRに基づく変異誘発のための基質として
使用され得る4つの制限フラグメントの単離を可能にするための便利な制限部位
が存在することを示す。制限フラグメントは以下の通りである:
フラグメント サイズ システインの数
ClaI-NdeI 540bp 8
NdeI-StyI 120bp 2
StyI-PstI 150bp 2
PstI-KpnI 220bp 2
30未満のヌクレオチドにより隔てられ、そしてオパールターミネーターコドンに
対する対として変異誘発され得る、3対のシステイン残基が同定されている。PC
Rに基づく変異誘発を、VSV-Gコーディング配列の個々の制限フラグメントで行い
得、そして一過性系においてVSV-G発現への1、2、または4個のオパール変異
の影響を試験し得る。ClaI-StyIフラグメント(660bp)は10個のシステインを含
み、それによりネスティッドプライマーを用いる2対のシステインの変異誘発を
同時に可能にする。変異誘発スキームは、好ましくは、制限フラグメントにおけ
る個々のまたは複数のシステインの変異誘発を可能にする変異誘発プライマーの
異なる組合せを用いて行われる。この方法は、野生型および変異誘発フラグメン
トの「ライブラリー」を提供し、これは組合せ様式で容易に再結合されて、異な
るオパール変異を含む完全長VSV-G遺伝子を作製し得る。次いで、PCR産物を、ク
ローニングし、そして変異誘発の忠実度をチェックするために配列決定する。次
いで、フラグメントを最初に再結合して、1、2、または4以上のcys->オパー
ル変異を含む完全長VSV-G変異体を作製する。
B.変異VSV-G遺伝子のセレン応答エレメント(SRE)への融合
変異誘発したVSV-G遺伝子を、Shenら(J.Biol.Chem.268: 11463-11469,1993)
に記載されるのと同様の様式で、ヒトGPX1遺伝子からの3'非翻訳領域に融合し得
る。より詳細には、VSV-G遺伝子を、pcDNA3(Invitrogen,San Diego,CA)のポリ
リンカーに挿入し、そしてGPX1からのSRE(cDNAヌクレオチド920〜1070)を、VS
V-G遺伝子の3'側に挿入し得る。さらに、ネオマイシン選択マーカーは、ハイグ
ロマイシン耐性マーカーを置換し得る。
実施例10
プレプロデューサー細胞株の作製
A.プレプロデューサー細胞株の作製
プレプロデューサー細胞株は、gag/pol遺伝子およびレトロウイルスベクター
を含むが、エンベロープ遺伝子を欠いている細胞である。このような細胞株を、
本質的に以下のように生成し得る。簡単には、N2βgalを使用して、293 2-3細胞
(これは、gag/pol発現カセットのみを含む)を形質導入し、そしてG418耐性コ
ロニーを単離する。次いで、クローンをβgal発現について試験し、そして安定
なポジティブクローンを単離する。
B.セレン欠乏培地における増殖についてのプレプロデューサー細胞株の試験
293 2-3/βgalプレプロデューサー細胞をDMEM-10%FBS中で解凍し、そしてセ
レン欠乏培地(例えば、インシュリン/トランスフェリンを補充したDMEM(IT,C
ollaborative Resaerch))(一般的には、Speierら、上記を参照のこと)に計
画的に適応させた。このプロトコルは、FBS含有培地における最初の増殖、およ
びIT含有培地における同時増加を伴う培地からのFBSの連続枯渇を含む。セレン
欠乏状態への適応手順は通常2〜3週間以内に完了し、そして適応した細胞はし
ばしばセレン欠乏状態で3ケ月を超えて維持され得る。
実施例11
VSV-Gタンパク質のセレン調節性発現のための
プロデューサー細胞株の作製および試験
A.VSV-G/SRE により安定にトランスフェクトされた293 2-3/β-gal細胞の作製
VSV-G/SRE発現構築物を、エレクトロポレーションまたはCaPO4手順のいずれか
を用いて293 2-3/β-gal細胞中にトランスフェクトする。全てのトランスフェク
ションおよび希釈クローニング手順を、セレン欠乏培地で行う。VSV-G/SREでト
ランスフェクトした293 2-3/β-gal細胞をハイグロマイシン中で選択し、そして
耐性細胞を、限界希釈によりクローニングして単一細胞のクローンを作製する。
B.セレン調節性VSV-G発現についての最初のスクリーニング
単一細胞のクローンの拡大の間に、細胞の抗生物質耐性プールを、VSV-G/SRE
のセレン調節性発現についての予備スクリーニングに供する。細胞を、30%コン
フルエンシーまで増殖させ(コンフルエンスが達成されるまで約3日かかる)、
そしてセレンを、生物利用可能な形態である亜セレン酸ナトリウムとして25ng/m
lで培地に添加する。VSV-Gタンパク質は迅速に出現し、そして細胞は、セレン過
多に応答して48時間以内に融合を開始する。
実施例12
超大規模一過性トランスフェクションによるレトロウイルスベクターの産生
A.導入
細胞株からの新たに導入されたタンパク質の高レベル発現が、しばしば(すな
わち、レトロウイルスベクターパッケージング細胞株においてgag-polまたはエ
ンベロープタンパク質を発現するために)所望される。しかし、いくつかの場合
において、VSV Gのような毒性タンパク質の細胞変性効果または細胞分裂抑制性
効果は、安定にトランスフェクトされそして安定に発現する細胞株におけるそれ
らの有用性を厳しく制限または排除するために、それらの最大の安定な発現レベ
ルを厳しく制限し得る。安定な発現に対する有用な代替物は、発現プラスミドの
一過性トランスフェクションの後の一過性発現である。このようなトランスフェ
クションは、DEAE Dextran、エレクトロポレーション、リポソーム、またはCaPO4
沈澱のいずれかを利用して達成され得る(代表的なプロトコルについては、Cur
rent Protocols in Molecular Biology またはMolecular Cloning,a Laborator
y Manualを参照のこと)。一過性トランスフェクションの後に、ある割合の細胞
が吸収し(take up)、そして少なくとも数日間、たとえ毒性遺伝子でも適度に高
レベルで発現する。レトロウイルスベクターの産生のために、CaPO4での一過性
トランスフェクションは、単純さ、1細胞あたりの高DNAコピー数および発現、
ならびに最も重要には高力価のベクター産生を含む理由のために最もよく選択さ
れる一過性トランスフェクション方法であった。それは、いずれかの代表的なレ
トロウイルスエンベロープタンパク質を用いる小規模ベクター産生のために(Fi
nerら、Blood 83: 43-50,1994; Pearら、PNAS USA 90: 8392,1993)、またはVS
V Gタンパク質での偽型化のために(Burnsら、PNAS USA 90: 8033-8037,1993)
使用されている。この方法論は、種々の異なるベクターの少量または試験量を作
製するためによく適応されるが、中規模または大規模の産生にはほとんど適さな
い。例えば、CaPO4トランスフェクション効率は、溶液の正確なpHおよび十分に
理解されていない多くの他のパラメーターに依存して広範に変化することが知ら
れている。一般的に、10cm以下のプレートにおける細胞のトランスフェクション
を明記する、公表されたプロトコル(すなわち、Current Protocols in Molecula
r BiologyまたはMolecular Cloning,a Laboratory Manual)からの小さなプロト
コルの変動を超えると寛容でないと考えられる。従って、CaPO4トランスフェク
ションの公表された説明は、代表的には、自由な気体交換およびC02平衡のため
に10cm以下のプレートを特定する。次いで、任意の規模拡大が、例えば、J.Yee
ら(Yeeら、「高力価の汎親和性レトロウイルスベクターの作製のための一般的
な方法:初代肝細胞の高効率感染」、PNAS USA 91: 9564-9568,1994)による最近
の論文のように、多数のこれらのプレートを取り扱うことによりなされる。小プ
レートトランスフェクションの規模拡大能力は、明らかに制限される。
以下でより詳細に記載するように、培養工場(各1200〜6,000cm2)を利用して
、伝統的な小プレートにおけるトランスフェクションで得られる粗力価と同等か
またはそれより大きな粗力価を有するレトロウイルスベクターを産生し得る。こ
のプロトコルは単純であり、通常の安価な試薬を使用して所望のプラスミドをト
ランスフェクトし、そしてこれは、以前に報告された一過性トランスフェクショ
ン方法での実際的な量よりもずっと多量のレトロウイルスベクターの産生を非常
に容易にする。表1は、G偽型N2β-galレトロウイルスベクターを産生するため
の、2層の1200cm2細胞工場における293 2-3細胞の1回の感染の結果を示す。本
明細書中に記載される単純なプロトコルは、細胞を覆う培地へのCaPO4沈澱DNAの
添加、および24時間後の新鮮な培地の交換しか必要とせず、従って、多数の細胞
工場を容易に計れる。これは、数十リットルまたは数百リットルの高力価G偽型
ベクターの産生を可能にする。
細胞株293 2-3は、ヒト胚性腎臓293細胞に由来するMLV gag-pol発現クローンで
ある。プラスミドpMLP-Gは、アデノウイルスMLPプロモーターからVSV Gを発現す
る。試験レトロウイルスベクターpN2 B-gal neoを含むプラスミドを、pMLP-Gプ
ラスミドと共に同時トランスフェクトする。同様の力価を、この同時トランスフ
ェクション方法、または293 2-3/B-gal細胞株(B-galベクターで形質導入された
293 2-3クローン)へのpMLP-G単独のトランスフェクションのいずれかを利用し
て得ることができる。
B.CaPO4 バルクトランスフェクションによるG偽型レトロウイルスベクターの産 生
1.トランスフェクションのための細胞の調製
293 2-3と呼ばれる、MLV gag-polを発現する293細胞(ATCC CRL1573)を、約120
0cm2細胞培養領域の2層細胞工場(Nunc)へのトランスフェクション日前に継代す
る。細胞株293のこのgag pol発現クローンを、他の場所で記載されているような
標準的な方法により作製する。4〜48時間、好ましくは18〜24時間後に、好まし
くは30%〜90%、最も好ましくは60%〜80%のコンフルエンスのレベルに達した
細胞をトランスフェクションのために使用する。
2.DNA CaPO4沈殿物の調製
2つのプラスミドを、1つの沈殿物に同時トランスフェクションする。プラス
ミドMLP-Gは、VSV G遺伝子を発現し、そしてプラスミドpCBβ-galは、β-galお
よびネオマイシン耐性遺伝子を発現するレトロウイルスベクターを含む。100cm2
の培養領域毎に対して、10〜40μgの各プラスミド、好ましくは約20μgを使用す
る。プラスミドは、Quiagenキット標準方法により調製する。必要に応じて、そ
れらを、エタノール沈澱またはクロロホルム抽出によりトランスフェクション前
に滅菌する。細胞工場に対して、TE(10mM Tris(pH7.4)、1mM EDTA)中の約240μ
gの各プラスミドを、50mlポリプロピレンコニカルチューブ(CorningまたはFalco
n)中で混合し、次いでTrisの最終濃度が2mM以下になるように、水およびTE(1/1
0TE)で10.8ml(0.9ml/100cm2)に希釈する。次いで、1.2ml(0.1ml/100cm2)の2.5M
CaCl2を混合する。別々の50mlチューブに、12mlのHepes緩衝化生理食塩水(2×H
eBS)(pH約7.08)を添加する(以下の溶液処方を参照のこと)。滅菌組織培養フー
ドにおいて、DNA混合物が、約30秒の期間にわたってピペットからゆっくりした
滴下添加により添加される間、2×HeBSを断続的にボルテックスする。得られた
沈殿物を室温で15分間放置する。
3.トランスフェクション
標準的な増殖培地を細胞から取り出し、DNA沈殿物をそれに添加し、そして培
地およびDNAを細胞工場に穏やかに戻す。4〜24時間、好ましくは16〜24時間後
、培地を取り除き、そして細胞を約50mlのPBSで2回リンスする。次いで、新鮮
な培地を、培地を一日一回の割合で所望の採集日数の間置換するが、少なくとも
2日(トランスフェクション後の2日目および3日目)は、常に、最良の力価の
ための典型的に最適な日として収集される。
4.溶液
2.5M CaCl2:1リットルあたり367.4gのCaCl2二水和物(dihydride)をフィルタ
ー滅菌する。
2×HeBS:0.21g Na2HPO4、16.4g NaCl、11.9g HEPES酸、約800ml H2O。1ON Na
OHでpHを7.08に調節し、そしてH2Oで1リットルに調節する。フィルター滅菌し
、そしてアリコートで-20℃で貯蔵する。
実施例13
プロデューサー細胞におけるシンシチウムの誘導を妨げるVSV-G融合タンパク質
A.背景
以下により詳細に記載するように、VSV-GのC末端の最後の49アミノ酸(膜貫
通ドメイン(TM)を含む)は、MoML Venvの最後の54アミノ酸と置換され得る。こ
のキメラタンパク質は、いくつかのMLV成分:膜貫通ドメイン、両親媒性ループ
、およびRペプチドを含む。
同様に作製され得る他のキメラタンパク質は、TMドメイン内のまたは外側の2
つのエンベロープタンパク質の融合を含み、例えば、全VSV-GTMドメインまたはV
SV-GTMドメインの一部はC末端内のMLV配列と融合される。本明細書中で利用さ
れるように、エンベロープタンパク質および2つのタンパク質配列の融合物由来
の配列組合せは、得られるキメラの弱毒化フューゾジェニシティー(fusogenicit
y)を導くことが理解されるべきである。
B.VSV-G 融合タンパク質の構築
例示のために、VSV-GのC末端の最後の49アミノ酸の、等価なMLVのC末端54ア
ミノ酸での置換を以下に記載する。得られたアミノ酸配列を以下に示す。接合部
を(::)で示す:
(VSV-G Indiana)...GWFSSWK::IMGPLIVLLLFGP...-(Ampho env-4070A)...
1.材料:
SV40ポリAを含むMoMLV 4070A Amphoエンベロープ発現ベクターpEnvAm-Dra。VS
V(Indiana株)エンベロープタンパク質Gは、pMLP-Gに由来する。pSC6は、CMVプ
ロモーター発現カセットである(WO 91/02805を参照のこと)。
キメラタンパク質の構築は、重複PCR法および以下のプライマーを利用する:
プライマーI:(VSV-G:803〜825bp;PstI部位を含む)(配列番号10)
PstI
5'GG ATC TCT TTG CTG CAG CCA GAT
プライマーII:(接合配列:Gの1398〜1415およびAmphoの7616〜7634)(配列番
号11)
5'TGG TTC AGT AGT TGG AAA/ATC ATG GGA CCT CTA ATA G
プライマーIII:(プライマーIIと相補的)(配列番号12)
5'C TAT TAG AGG TCC CAT GAT/TTT CCA ACT ACT GAA CCA
プライマーIV:(pEnvAm-Dra由来のSV40ポリA;161〜185bp;BamHI部位;ネガテ
ィブ鎖)(配列番号13)
BamHI
5'C ATG TCT GGA TCC CCA GGA AGC TCC
2.発現ベクターの構築:
プライマー(IおよびIIならびにIIIおよびIV)の2セットを用いたPCR増幅DNA
をアニールし、そしてプライマーIおよびIVを用いてPCR増幅する。得られたDNA
を、制限酵素PstIおよびBamHIで消化する。得られたハイブリッドG/Aの約900bp
のフラグメントを、VSV-G DNAのClaI(平滑化)からPstI(800bp)と共にpSC6(Ec
oRVおよびBamHI消化)にクローニングする。このプラスミドはpG/Aと命名する。
3.細胞培養/力価アッセイ
(a)ハイブリッドenvプラスミドDNA(pG/A)を、上記のようにCaPO4沈澱法を用
いてgag-pol発現293/2-3細胞にトランスフェクトする。シンシチウムの形成を、
1、2、および3日後に視覚的に評価する。
(b)並行して、pG/Aを、pKT-1と共に293/2-3およびSCV21またはDA gag-pol細
胞に同時トランスフェクトして、一過性力価およびエンベロープ機能性を評価す
る。この一過性(48時間)発現方法は上述される。pMLP-GおよびN2βgalの上記
の細胞への同時トランスフェクションを、この実験のコントロールとして使用す
る。
(c)プロデューサー細胞におけるハイブリッドエンベロープの安定な発現を評
価するために:トランスフェクションの48時間後に、細胞(上記の(b)由来)
をG418選択に10日間供し、そして安定なプールをベクター産生、感染性、および
シンシチウムを形成するいずれかの傾向について試験する。
実施例14
レトロウイルスベクターを偽型化するための、水泡性口内炎ウイルスGタンパク
質を発現する組換えサイトメガロウイルスの使用
A.材料および方法
1.ウイルスおよび細胞株
野生型MCMV(Smith株K181+)、RM427、およびRMCMVGを増殖させ、そしてMann
ingら、J.Vir.66: 3794-3802,1992;Stoddart,J.Vir.68(10):6243-6253,19
94に記載されるようにNIH3T3細胞で力価測定した。NIH3T3、HeLa、293、および2
93 gag/pol(gagおよびpolを含むがenv遺伝子を欠く293細胞株)の細胞を、10%
ウシ胎児血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地中で増殖させた。
2.プラスミドおよび組換えウイルスの調製
プラスミドクローニングは、標準的な技術(Sambrookら、Molecular Cloning:A
Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)に
よるものである。pON401は、MCMVのHindIIILフラグメントを含む(Manningら、V
ir.66:3794-3802,1992)。pCMV-Gは、HCMV ielプロモーター-エンハンサーの転
写制御下のVSV-Gタンパク質を含む。pON401CMVGを構築するために、VSV-Gを含む
pCMV-Gの2665bp Hinc IIフラグメントを、pON401のHpaI部位の間にクローニング
する(図3)。これは、pON401における79bpのHpaIフラグメントの欠失をもたら
す。pMLP-Gは、アデノウイルス主要後期プロモーターの転写制御下のVSVGタンパ
ク質を含む。
組換えMCMVの産生および単離のためのプロトコルは記載されている(Manningら
、Vir.167:477-484,1988)。簡単には、15μgの線状pON401CMVGを、リン酸カル
シウム沈澱を用いてRM427ウイルスDNAと共に同時トランスフェクションする。ト
ランスフェクションにおいて用いるRM427 DNAの量を、各ウイルスDNA調製物につ
いて経験的に決定する。同時トランスフェクション物を、細胞変性効果(cpe)が
完了した時(トランスフェクションの約5日後)に採集する。
β-gal組換え体を単離するために、限界希釈アッセイを行う。簡単には、NIH3
T3細胞(104細胞/ウェル)を、96ウェル組織培養プレートに播種する。同時トラ
ンスフェクションから生じた組換えウイルスプールを力価測定し、次いでこれを
使用して、96ウェルプレート当たり約75プラーク形成単位(pfu)を含む希釈で96
ウェルプレートを感染させた。細胞変性効果(cpe)が明らかになるとき(感染の
約7日後)、メチルウンベリフェテロン(methyl umberryliferone)(MUG)を、150
μg/mlの最終濃度で全てのウェルに添加する。種々の時点(3〜24時間)で、
プレートをUVライトボックス上に置き、そして写真を撮る。親β-gal+ウイルス
(RM427)を含むウェルは蛍光を発する。非感染ウェル、またはβ-gal組み換え体
により感染されたウェルは、蛍光を発しない。cpeを有しそして蛍光を有さない
ウェル由来のウイルスを増殖させ、そしてDNAブロット分析により分析する。
3.DNA分析
ウイルスDNAを、精製ビリオンから調製し(Vieiraら、J.Virol.68: 4837-4846
,1994)、そして以前に記載されたように(Manningら、Vir.167:477-484,1988)
、DNAブロット分析に供する。
4.感染細胞タンパク質の単離およびイムノブロッティング
総細胞タンパク質を調製するために、細胞を、10の感染多重度(MOI)でウイル
スに感染させる。適切な時点で、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水でリンスし、次
いでアプロチニン(2μg/ml)、ペプスタチン(1μg/ml)、ロイペプチン(2μg/m
l)、およびPeflabloc SC(1mg/ml)を補充したNP40溶解緩衝液(100mM NaCl,20mM
Tris(pH7.5),1mM EDTA,0.5%NP40,0.5%デオキシコール酸塩)中に溶解する
。全てのプロテアーゼインヒビターをBoehringer Mannheimから購入する。プレ
ートを氷上で5分間インキュベートする。細胞を引っかくことにより採集し、1.
5mlの微小遠心チューブに入れ、そして4℃で10分間、微小遠心において高速で
スピンする。上清を収集し、そして分析するまで−80℃で貯蔵する。
感染細胞タンパク質を、10%SDSポリアクリルアミドゲル(Novex)で分離し、ニ
トロセルロースに移し、そしてウェスタンブロット分析に供する。一次抗体は、
1:100,000の希釈で使用される、VSV-G糖タンパク質に対するマウスモノクロー
ナル(Sigma ImmunoChemicals)である。ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス(Boeh
ringer Mannheim)を、1:30,000の希釈で二次抗体として使用する。ブロットを
、製造者の指示に従ってECL(Amersham)を用いて発色させる。
5.プロデューサー細胞、レトロウイルスベクター産生、および力価測定
偽型ベクターの産生における使用のための細胞株を作製するために、293gag/p
ol細胞をN2 β-gal、VSV-G偽型レトロウイルスベクターで感染させる。N2 βgal
は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(neor)およびβ-ガラクトシダーゼ(
β-gal)の遺伝子を含む。G418耐性クローンを選択する。得られた細胞株のBluo
gal(GIBCO BRL)での染色は、全ての細胞が青色であることを示す。VSV-G偽型レ
トロウイルスを産生するために、293gag/pol(N2 β-gal)細胞の10cmプレートを
、2mlの総容量中で所望のMOIでRMCMVGを用いて感染する。感染の2時間後、細胞
を2回洗浄し、次いで採集するまで2mlの培地中でインキュベートする。感染の
24時間または48時間後、上清を濾過し(0.45μm孔)、そして力価測定まで−80℃
で貯蔵する。上清をHeLa細胞で力価測定する。感染日前に、10cmプレートに2×
106細胞で播種する。1日目に、プレートを、ポリブレン(Sigma;8μg/ml)を
含む2mlの培地中の100μlの上清で感染させる。2時間のインキュベーションの
後、プレートを洗浄し、そして新鮮な培地で一晩インキュベートする。2日目に
、RMCMVG感染細胞由来の上清で感染したプレートを、1:10および1:100で分割す
る(split)。モックまたは野生型MCMV感染上清由来のものを、1:2で分割する。3
日目に、G418(Sigma; 1mg/ml)を培地に添加する。10日〜14日後に、コロニーを
染色し、そして計数する。
B.結果
1.RMCMVGの構築
RMCMVGを、NIH3T3細胞のRM427 DNAおよびpON401-CMVGでの同時トランスフェク
ションに従って単離する(図3)。β-gal組み換え体についての8つの96ウェル
プレートをスクリーニングした後、β-galウイルスを含んだ6つのウェルを同定
する。これらのうちの3つを増殖させ、そしてプラークをさらに精製する。これ
らは、2つの独立した同時トランスフェクションから生じる組換え体を示す。ウ
イルスDNAを、これらの3つの単離物から調製し、そしてDNAブロット分析に供す
る。図4に示すように、全てのこれらの組換えウイルスは、VSV-G組換え体につ
いて予想される5.7kbpおよび4.3kbpのHindIIIバンドを含む。単離物D9を増殖さ
せ、そして約1×108のプラーク形成単位(PFU)/mlのストック力価を得る。これ
は、VSV-G発現が細胞培養でのMCMV複製に対して毒性ではないことを示す、野生
型MCMVのストック力価と同一である。野生型MCMVとは対照的に、RMCMVGプラーク
は、著しいシンシチウム表現型を証明した(図5A)。
2.RMCMVGは、許容細胞および非許容細胞においてVSV G糖タンパク質を発現す
る。
NIH3T3細胞を、RMCMVGの3つの単離物で感染させ、そしてウェスタンブロット
分析に供する。図6において証明するように、3つ全ての単離物で感染したNIH3
T3細胞は、感染の24時間後に大量のGタンパク質を発現した。RM427で感染した
細胞は、VSV-G発現を示さなかった。ポジティブコントロールとして、293細胞の
pMLP-Gでのトランスフェクション後に産生されたG糖タンパク質を含むレーンを
含める。RMCMVGがGタンパク質を非許容細胞で発現するかどうかを決定するため
に、293細胞をRMCMVGで感染させ、そしてタンパク質を感染の6、24、および48
時間後に採集する。図7に示すように、VSV-Gタンパク質発現は、感染の6時間
後に早くにも検出されるが、感染の24時間後にピークに達する。
3.RMCMVG感染を使用して、レトロウイルスベクターを偽型化し得る。
RMCMVGのレトロウイルスベクターを偽型化する能力を調べるために、293gag/p
ol(N2 β-gal)細胞を、野生型MCMVまたはRMCMVGのいずれかで感染させる。上清
を、感染の24時間および48時間後の細胞から収集し、そして力価測定する。表1
に示すように、10または20のM0IでのRMCMVGによる感染の24時間後の細胞上清に
おいて、1×104コロニー形成単位(CFU)/mlのピークneo力価を見出す。モック感
染細胞または野生型MCMV感染細胞の上清において、レトロウイルス力価を見出さ
ない。
表1 RMCMVG または野生型MCMVでの感染後の293gag/pol(N2 β-gal)細胞からのVSV-G偽 型ベクター産生 293細胞は、MCMV複製に対して許容的ではないので、上清中のRMCMVGは存在し
ないはずである。上清をRMCMVGについて力価測定した場合、200プラーク形成単
位(PFU)/mlの力価が見出される(データは示さず)。この少量のMCMVは、恐らく
、最初の感染から残存するウイルスである。レトロウイルスベクターと比較して
大きなサイズのMCMV(300nm)は、この残存MCMVの上清からの単純な除去を可能に
するはずである。
前述から、本発明の特定の実施態様が例示の目的のために本明細書中に記載さ
れているが、種々の改変が本発明の精神および範囲を逸脱することなくなされ得
ることが理解される。従って、本発明は、添付の請求の範囲を除いては限定され
ない。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),CA,JP
(72)発明者 サウター,シビル
アメリカ合衆国 カリフォルニア 92014,
デルマー,ストラトフォード コート ナ
ンバー17 639
(72)発明者 ロビンス,ジョアン
アメリカ合衆国 カリフォルニア 92109,
サンディエゴ,チャルセドニー ストリー
ト 2160
(72)発明者 ジョリー,ダグラス ジェイ.
アメリカ合衆国 カリフォルニア 92924,
リューカディア,ヒルクレスト ドライブ
277
(72)発明者 マニング,ウィリアム シー.
アメリカ合衆国 カリフォルニア 94061,
レッドウッド シティー,カントリー ク
ラブ ドライブ 3660
(72)発明者 マーフィー,ジョン イー.
アメリカ合衆国 カリフォルニア 94618,
オークランド,ハーバード コート 49
(72)発明者 ラルストン,ロバート オー.,ザ セカ
ンド
アメリカ合衆国 テキサス 77381―6317,
ザ ウッドランズ,レイク リーフ プレ
イス 6
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.毒性タンパク質または融合性タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に 連結されたマウスCMV IEプロモーターを含む、発現ベクター。 2.融合性タンパク質をコードする核酸配列の発現を指向する厳密に制御可能な プロモーターを含む、発現ベクター。 3.前記融合性タンパク質が水胞性口内炎ウイルスGタンパク質である、請求項 1または2に記載の発現ベクター。 4.前記厳密に制御可能なプロモーターがtTAプロモーター系である、請求項2 に記載の発現ベクター。 5.前記厳密に制御可能なプロモーターがLAPプロモーター系である、請求項2 に記載の発現ベクター。 6.セレン反応性エレメントをさらに含む、請求項1または2に記載の発現ベク ター。 7.融合性タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモータ ー、およびセレン反応性エレメントを含む発現ベクターであって、ここで該融合 性タンパク質をコードする配列内の1つ以上のシステイン残基がオパール終止コ ドンに変換されている、発現ベクター。 8.細胞に対して毒性のタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結され たプロモーター、およびセレン反応性エレメントを含む発現ベクターであって、 ここで該毒性タンパク質をコードする配列によりコードされる1つ以上のシステ イン残基がオパール終止コドンに変換されている、発現ベクター。 9.請求項1〜8のいずれか1つに記載の発現ベクターを含む、レトロウイルス ベクター。 10.gag/pol発現カセットおよび請求項1〜8のいずれか1つに記載の発現ベ クターを含む、パッケージング細胞株。 11.gag/pol発現カセット、請求項1〜7のいずれか1つに記載の発現ベクタ ー、およびレトロウイルスベクター構築物を含む、プロデューサー細胞株。 12.融合性タンパク質をコードする変異核酸分子であって、該核酸分子内の1 つ以上のシステイン残基がオパール終止コドンに変換されている、変異核酸分子 。 13.細胞に毒性のタンパク質をコードする変異核酸分子であって、該核酸分子 内の1つ以上のシステイン残基がオパール終止コドンに変換されている、変異核 酸分子。 14.一過的にレトロベクター粒子を産生する方法であって、該方法は以下の工 程: (a) gag/pol発現カセットおよびレトロウイルスベクター構築物を含む103〜105 個の細胞を、該細胞が対数増殖期に入るのを可能にするのに充分な条件下およ び時間で、225cm2を超える表面積を有する培養物中でインキュベートする工程; および (b) 請求項1〜8のいずれか1つに記載の発現ベクターを該培養物に導入する ことにより、該レトロベクター粒子が一過的に該細胞から生産され得る工程、 を包含する、方法。 15.毒性タンパク質または融合性タンパク質の発現を指向させ、生来の種にお いて複製コンピテントであり、他の種において複製コンピテントでない、組換え ウイルス。 16.グリコシル化された毒性タンパク質または融合性タンパク質の発現を指向 する発現ベクターを保持する、変換または変異されたグリコシル化経路を有する 細胞株。
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