JP2000502261A

JP2000502261A - 毒性タンパク質発現ウイルスおよびプロデューサー細胞株

Info

Publication number: JP2000502261A
Application number: JP09523909A
Authority: JP
Inventors: チャダ，サニル; ジェイ．デポロ，ニコラス; サウター，シビル; ロビンス，ジョアン; ジェイ．ジョリー，ダグラス; シー．マニング，ウィリアム; イー．マーフィー，ジョン; オー．，ザセカンドラルストン，ロバート
Original assignee: カイロンコーポレイション
Priority date: 1995-12-29
Filing date: 1996-12-20
Publication date: 2000-02-29
Also published as: PT870050E; EP0870050B1; EP0870050A2; ES2175184T3; WO1997024452A3; DE69621949T2; DE69621949D1; ATE219521T1; WO1997024452A2; DK0870050T3

Abstract

(57)【要約】融合性タンパク質の発現を指向する厳密に制御可能なプロモーターを有する発現ベクターが提供される。その核酸分子中の１つ以上のシステイン残基がオパール終止コドンに変換されている、毒性タンパク質または融合性タンパク質をコードする核酸分子もまた、提供される。

Description

【発明の詳細な説明】毒性タンパク質発現ウイルスおよびプロデューサー細胞株技術分野本発明は、一般的に組換えウイルスを産生するための組成物および方法、そしてより詳細には、毒性タンパク質または融合性タンパク質（fusogenic protein ）をコードするか、またはそれらを含む組換えウイルスを産生を可能にする、プロデューサー細胞株およびそれらに関連する方法に関する。発明の背景 1940年代のDNAの発見からつい最近まで続いてきた組換えDNA技術により、疾患の経過が、生存する生物の核酸との相互作用により影響され得る可能性を認識するために実質的な研究が行われてきた。最も最近では、遺伝子（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、およびアデノ随伴ウイルスに由来するウイルスベクターを含む）の改変またはこれらに影響を及ぼすことについて、多種多様な方法が記載されている(Jolly，CancerGene Therapy ｌ(1):51-64，1994を参照のこと)。組換えレトロウイルスおよびそれらの種々の使用は、例えば、Mannら（Cell 3 3: 153，1983）、CaneおよびMulligan(Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 81: 6349，198 4)、Millerら，Human Gene Therapy ｌ: 5-14，1990，米国特許第4,405,712号、同第4,861,719号、同第4,980,289号、およびPCT出願WO 89/02,468、同WO 89/05, 349、および同WO 90/02,806を含む多くの参考文献に記載されてきた。簡略には、目的の外来遺伝子が、正常なレトロウイルスRNAのかわりにレトロウイルス内に取り込まれ得る。レトロウイルスがそのRNAを細胞中に注入する場合、外来遺伝子もまた細胞中に導入され、次いでまるでそれがレトロウイルス自身であるかのように宿主の細胞DNA中に組み込まれ得る。宿主内でのこの外来遺伝子の発現は、宿主細胞による外来タンパク質の発現をもたらす。現在のところ、ある種のレトロウイルスベクター（例えば、両種指向性のエンベロープを有するウイルス）は、広範な宿主域を提供するが、VSV-Gタンパク質（Marshおよび有elenius，Advances in Virus Research 36: 107-151，1989）により提供される範囲の宿主域とは比較にならない。手短にいえば、水胞性口内炎ウイルス（VSV）が、筋肉細胞、肝細胞、神経細胞、線維芽細胞、および非複製造血性細胞を含む多様な型の組織に感染することは公知である。VSV-Gは、ヒト、下等霊長類、齧歯類、両生類、魚類、および昆虫類への侵入を可能にする両種指向性エンベロープに匹敵する拡張した指向性を有する。最近の見解では、VSV- G偽型化レトロウイルスベクターは、両種指向性ベクターよりも非常に効率的に、ヒト末梢造血幹細胞／前駆細胞を形質導入し得る（Kerrら、Blood 84(追補 1) :402a,1994）。しかし、VSV-Gタンパク質の強い融合特性のため、安定な細胞株を産生することが非常に困難であった。というのも、培養全体にわたる細胞融合のためである（Yeeら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:9564-9568，1994）。VSV-Gのいくらか発現がマウスC127線維芽細胞（Florkiewiczら、J.of Cell Biol．97:1381-138 8，1983）およびMDCK細胞（Romanら、Experimental Cell Research 175:376-387 ,1988）で報告されているが、細胞表面発現レベルは低い。本発明は、融合性エンベロープ（例えば、VSV-G）を有するか、または細胞に対して毒性の他のタンパク質を発現する組換えウイルス性粒子の産生を可能にする組成物および方法を提供する。本発明はこれら、ならびに関連する他の利点を提供する。発明の要旨手短に言えば、本発明は、毒性タンパク質および／または融合性タンパク質を有する組換えレトロウイルスを産生する組成物および方法を提供する。例えば、本発明の一つの局面によれば、毒性タンパク質および／または融合性タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結されたマウスCMV IEプロモーターを含む発現ベクターが提供される。別の局面では、融合性タンパク質をコードする核酸配列の発現を指向する厳密に制御可能なプロモーターを含む発現ベクターが提供される。代表的な融合性タンパク質の例は、水胞性口内炎ウイルス-Ｇタンパク質および狂犬病ウイルスＧタンパク質を含む。代表的な毒性タンパク質の例は、 γ-IFN、IL-2およびTNF-βを含む。厳密に制御可能なプロモーターの代表的な例は、tTAおよびLAPプロモーター系を含む。関連した局面では、このような発現ベクターはさらに、セレン反応性エレメント、ならびにその核酸配列によってコードされる一つ以上のシステイン残基がオパール終止コドンに変換された上述の核酸配列を含み得る。別の局面では、融合性タンパク質および／または毒性タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターおよびセレン反応性エレメントを含む発現ベクターが提供され、ここで毒性タンパク質および／または融合性タンパク質をコードする配列内の１つ以上のシステイン残基がオパール終止コドンに変換されている。上述の発現ベクターの内の一つを含むレトロウイルスベクター、gag/pol発現カセットおよび上述の発現ベクターを含むパッケージング細胞、ならびにgag/po l発現カセット、上述の発現ベクターおよびレトロウイルス構築物を含むプロデューサー細胞株もまた提供される。本発明の他の局面においては、融合性タンパク質または毒性タンパク質をコードする変異核酸分子が提供され、ここで、核酸分子中の一つ以上のシステイン残基がオパール終止コドンに変換されている。本発明のさらに別の局面では、（a）細胞が対数増殖期に入るのを可能にするのに充分な条件下および時問で、gag/pol発現カセットおよびレトロウイルスベクター構築物を含む10³〜10⁵個の細胞を、225cm²を超える表面積を有する培養物中でインキュベートする工程、ならびに（b）上記の発現ベクターを培養物に導入することにより、レトロベクター粒子が一過的に細胞から産生され得る工程を含む、一過的にレトロベクター粒子を産生するための方法が提供される。発現ベクターを細胞培養物に導入することにより、発現ベクターの細胞への侵入が生じる方法の代表的な例は、リポフェクション、エレクトロポレーション、またはCa⁺⁺ イオン源およびP0₄ ^-源を利用したトランスフェクシヨンを含む。本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照すれば明白となる。さらに、より詳細な特定の手順または組成物（例えば、プラスミドなど）を記載する種々の参考文献が以下に記載され、従って、それぞれが個々に援用のために言及されるように、これらの文献の全体が、参考として援用される。図面の簡単な説明図１は、VSV-G/SRE発現構築物の模式図である。図２は、VSV-G遺伝子中のシステイン残基の分布の模式図である。図３は、CMVのHindＩII「L」フラグメントの模式図である。図4Aは、３つのRM-CMVGの単離物のサザンブロット解析である。図4Bは、図4A で提供される分析に使用されるプローブの模式図である。図5Aおよび図5Bは、RCMVGおよびwt MCMV NIH3T3感染細胞の２枚の写真（200倍）である。図６は、VSV-G発現単離物のウェスタンブロットである図７は、VSV-G発現単離物のウェスタンブロットである。発明の詳細な説明本発明の公布に先行して、以後に使用されるいくつかの用語の定義を示すことは、本発明の理解に有用であり得る。「発現ベクター」および「発現カセット」は、目的の配列または遺伝子の発現を指向させ得る集合体をいう。核酸発現ベクターは、転写される場合に目的の配列または遺伝子ならびにポリアデニル化配列に作動可能に連結されるプロモーターを含まなければならない。本発明の特定の実施態様では、プロモーターおよびポリアデニル化配列の両方は、ヘルパーエレメントであるgag/polおよびenvに対して異種である供給源由来である。本発明の他の実施態様では、本明細書中に記載された発現ベクターはプラスミド構築物内に含まれ得る。「レトロウイルスベクター」、「レトロウイルスベクター構築物」、「RETROV ECT0R CONSTRUCTT^TM」、および一般的に上述の「発現ベクター」の部分集合である「組換えレトロウイルスベクター」は、目的の核酸分子を有し、そして特定の実施態様においてその発現を指向し得る核酸構築物をいう。レトロウイルスベクターは、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサーまたは遺伝子座規定エレメント（locus defininge lement）、あるいは他の手段（オルターナティブスプライシング、核RNAの輸送、メッセンジャーの翻訳後修飾、またはタンパク質の転写後修飾）により遺伝子発現を制御する他のエレメントを含まなければならない。このようなレトロウイルスベクターはまた、パッケージングシグナル、長末端反復（LTR）、またはそれらの部分、ならびに用いられるレトロウイルスに適切なポジティブ鎖およびネガティブ鎖プライマー結合部位（レトロウイルスベクター中に既に存在しない場合）を含まなければならない。随意に、組換えレトロウイルスベクターはまた、ポリアデニル化を指向するシグナル、選択マーカー（例えば、Neo、TK、ハイグロマイシン、フレオマイシン、ヒスチジノール、またはDHFR）、ならびに１つ以上の制限部位および翻訳終結配列を含み得る。例としては、このようなベクターは、代表的には、5'LTR、tRNA結合部位、パッケージングシグナル、第２鎖DNA合成の起点、および3'LTRまたはそれらの部分を含み得る。「組換えレトロウイルス」、「レトロウイルス遺伝子送達ビヒクル」、および「レトロウイルスベクター粒子」は、本発明において利用されるように、少なくとも１つの目的の遺伝子を有するレトロウイルスをいう。レトロウイルスはまた、選択マーカーを含み得る。組換えレトロウイルスは、感染に際して、その遺伝物質をDNAに逆転写し得、そしてこの遺伝物質を宿主細胞のDNAに取り込ませ得る。「パッケージング細胞」は、組換えウイルスベクターに欠けている感染組換えウイルスの産生に必要なこれらのエレメントを含む細胞をいう。代表的には、そのようなパッケージング細胞は、gag、polおよびenvタンパク質をコードするタンパク質を発現し得る一つ以上の発現カセットを含む。「プロデューサー細胞」または「ベクタープロデューサー細胞」は、組換えウイルスベクター粒子の産生のために必要な全てのエレメントをふくむ細胞をいう。「融合性タンパク質（fusogenic protein）」は、培養物内の細胞を多核シンシチウムを融合させる糖タンパク質をいう。融合性タンパク質の代表例はVSV-G および狂犬病Ｇタンパク質を含む。「毒性タンパク質」は、細胞内の細胞毒性または細胞分裂抑制行動を示すタンパク質をいう。本発明の目的について、タンパク質は、増殖培養物において発現する場合、（タンパク質を発現していない同じ培養物と比較して）48時間以内に 20％を超える細胞死が起こるのであれば、細胞毒性であると考える。同様に、タンパク質は、増殖培養物で発現する場合、（タンパク質を発現しない同じ培養物と比較して）48時間以内に20％を超える細胞倍加時間の減少が生じるのであれば、細胞分裂抑制性であると考える。細胞毒性測定に好ましいアッセイは、増殖アッセイ（例えば、Promega Corp.、Madison，WI）において生存細胞数を定量化するための非放射性フォーマットまたは新生DNAへの³H取り込みを使用するMTTアッセイを含む。しかし、他の多くのアッセイフォーマットは、例えば、細胞生存度（染色除外、細胞計数）および細胞代謝（染色減少）を含む、細胞毒性に関連した多様なパラメーターを評価するのに同じように利用され得る（さらなる詳細および方法については、Cell Biology，A laboratory Handbook、J.E．Celis編、A cademic Pressを参照のこと）。毒性タンパク質の代表例はγインターフェロン、インターロイキン-２、TNF αおよびTNF βを含む。「厳密に制御可能な」は、プロモーター（プロモーター系を含む）または遺伝子の転写に関して強力な制限を維持する他のエレメントをいう。より詳細には、本発明に関して使用されるように、厳密に制御可能なプロモーターは目的の遺伝子（例えば、毒性タンパク質または融合性タンパク質をコードする核酸分子）の 10倍を超える誘導を誘導し、そして好ましくは、約50倍〜約100倍を超えるレベルの誘導を誘導すると理解されるべきである。上述のように、本発明は、毒性タンパク質および／または融合性タンパク質をコードする核酸配列の発現を指向する厳密に制御可能なプロモーターを有する発現ベクター、ならびに表面上に融合性タンパク質を含む組換えレトロウイルス粒子を提供する。一般的に、以下により詳細に議論するように、そのようなレトロウイルスベクター粒子は、転写調節機構または翻訳調節機構のいずれかを通じた毒性タンパク質または融合性タンパク質の制御により製造され得、それにより所望のレトロウイルスベクター粒子が多量に産生され得る。 A.組換えレトロウイルスベクター、パッケージング細胞、プロデューサー細胞および組換えレトロウイルスの調製上述のように、本発明は、目的の選択された核酸分子を保持または発現するために構築された組換えレトロウイルスを提供する。本発明のレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルは、例えば、Ｂ、Ｃ、およびＤ型のレトロウイルス、ならびにスプマウイルスおよびレンチウイルスを含む、多様なレトロウイルスから容易に構築され得る（RNA Tumor Viruses，第２版，Cold Spring Harbor Laboratory，19 85を参照のこと）。このようなレトロウイルスは、本明細書中で提供された開示および標準的な組換え技術（例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Labor atory Manual，第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989; Kunkle ，PNAS 82:488，1985）があれば、レトロウイルス送達ビヒクルを集合または構築するために容易に利用され得る。本発明に関して利用され得るレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルの代表的な例は、例えば、EP 0,415,731; WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/2 5234; 米国特許第5,219,740号; WO 93/11230; WO 93/10218; VileおよびHart，C ancer Res．53:3860-3864，1993，VileおよびHart，Cancer Res．53:962-967，1 993; Ramら、Cancer Res．53:83-88，1993; Takamiyaら、J．Neurosci.Res．33: 493-503，1992; Babaら、J．Neurosurg．79:729-735，1993(米国特許第4,777,12 7号、GP 2,200,651、EP 0,345,242およびWO 91/02805)において記載されるものを含む。特に好ましい組換えレトロウイルスは、WO 91/02805およびUS 95/05789 に記載されたウイルスを含む。上記に記載のベクター構築物での使用に適切なパッケージング細胞株は、容易に調製され得（WO 92/05266もまた参照のこと）、そして本明細書中で提供される開示があれば、組換えベクター粒子の産生のためのプロデューサー細胞株（ベクター細胞株または「VCL」とも命名される）を生成するために利用され得る。本発明の他の局面において、（a）細胞が対数増殖期に入るのを可能にするのに充分な条件下および時間で、gag/pol発現カセットおよびレトロウイルスベクター構築物を含む10³〜10⁵個の細胞を、225cm²を超える表面積を有する培養物中でインキュベートする工程、および（b）上記発現ベクターを培着物に導入することにより、レトロベクター粒子が一過的に細胞から産生され得る工程を含む、一過的にレトロベクター粒子を産生するための一般的な工程を含む方法が提供される。発現ベクターを細胞培養物に導入することにより、細胞内への発現ベクターの侵入が生じる方法の代表例は、リポフェンクション、エレクトロポレーション、またはCa⁺⁺イオン源およびPO₄ ^-源を利用したトランスフェクションを含む（例えば、CaClおよびHBS，Promega，Madison WI）。特定の実施態様では、培養物の表面積が、約1200cm²よりも広く、またはさらに約6,000cm²よりも広くあり得る。本明細書中で開示される本発明の方法を利用して、10⁶または10⁷cfu/ml（粗上清中）より大きい力価で組換えレトロウイルス粒子を産生するパッケージング細胞株が、容易に得られ得る。加えて、このような力価は、一般的に、マウス3T3 細胞から得られる力価よりも３倍低い力価を生じるHTl080細胞での力価アッセイより得られることを言及すべきである。Ｂ．遺伝子発現の調節上記のように、本発明は、転写制御機構および／または翻訳制御機構を通じて高度に毒性または融合性のタンパク質産生を可能にする、厳密に制御可能なまたは調節された発現ベクター（レトロウイルスベクター、ならびにレトロウイルス粒子を含む）を提供する。このようなベクターは、他の誘導性プロモーター系とは対照的に、多面的な効果を真核生物細胞では示さない。例えば、本発明の一つの局面では、LAP（Lacアクチベータータンパク質；Levi neおよびShenk，Molec．Cell．Biol．10:3343-3356，1990; PNAS 88:5072-5076, 1991）プロモーター系が、上記毒性タンパク質および融合性タンパク質の内の一つをコードする配列に作動可能に連結され、そしてこの配列を発現し得る、発現ベクターが提供される。手短に言えば、LAPは、転写単位の上流または下流のいずれかに位置するlacオペレーター配列を含む、いくつかのプロモーター（SV40 、ワクシニアウイルスプロモーター、T3バクテリオファージ）の強力なアクチベーターである。単一のlacオペレーターはトランス活性化を可能にし、複数のオペレーターは相乗作用的に作用する。lacリプレッサーのオペレーター配列に対する結合親和性および特異性は、結合親和性10^-13Mと非常に高い。LAP融合タンパク質は３つの成分を有する：（１）lacリプレッサー；（２）SV40核局在化シグナル；および（３）VP16（HSVの転写活性化ドメイン）。このような系の代表的な例示は、下記の実施例４に提供される。本発明の別の局面において、上記毒性タンパク質および融合性タンパク質の内の一つに、作動可能に連結され、そしてこれを発現し得る、tet（テトラサイクリン制御）プロモーター系を含む発現ベクターが提供される。手短に言えば、te tプロモーターは、テトラサイクリンの存在によって負に調節される。一つの実施態様において、構成的に発現させたテトラサイクリン制御トランスアクチベーター（tTA）は、tetリプレッサーを単純ヘルペス由来のVP16活性化ドメインと融合することにより生成され得る（GossenおよびBujard、PNAS 89:5547-5551，199 2）。テトラサイクリンの非存在下、このトランスアクチベーターは、プロモーターの上流に位置したtetオペレーター配列もまた含む、最小CMV由来プロモーター配列からの転写を刺激する。tTA-依存性プロモーター下流へのVSV-Gのような融合性タンパク質をコードする配列の組込みは、テトラサイクリン非存在下での VSV-Gの高いレベルの発現を導く。そのようなベクターは、特に、組換えレトロウイルスタンパク質の産生のために有用である。なぜならテトラサイクリンは、パッケージング細胞株および続いてプロデューサー細胞株が作製される間、培地中に維持され得るからである。充分な数のプロデューサー細胞株が増殖した後、次いでテトラサイクリンは培地中から除去され得、それ故、レトロウイルスベクター粒子を含むVSV-Gの産生を可能にする。そのような系の代表的な例示は、下記の実施例３に提供される。本発明中で利用され得る、厳密に制御可能なプロモーターおよびプロモーター系の他の例は、GALI（J．Biotech 32(2):179-89,1994); Gene，156(1):19-25,19 95; P.N.A.S．89(23):11589-93,1992）；デキサメタゾンのようなステロイド類（Biochim Biophys Acta，219(3);653-9,1994; Nawaら.，J．Biol．Chem．261(3 6):16883-16888，1986;J．Vir.，64(10):5132-42．1990）；メタロチオネインのような重金属調節系（J．Vir.，68(9):5602-12，1994;Carc,.14(8):1643-9,1993 ;J Vir．Methods，33(1-2):135-47,1993）;T7/lac（J Biol Chem，269(16); 12106-10，1994; Biochem Biophys Res Comm，188(3);972-81,1992）；Tatおよび／またはtat/rev誘導性レンチウイルスプロモーター系、（例えばHIV-1または HIV-2）（例えば、Leukemia,7 追補 2：S61-5,1993;P.N.A.S．89(1):182-6,1992 を参照のこと）；熱ショック（J．Biol Chem，268(9):6708-13,1993）；NF-KB反応性（Mol Aspects Med，14(3):171-90,1993）；サイクリックAMP（Roeslerら、 J．Biol．Chem．263(19):9063-9066，1988）。上述のように、本発明の他の局面では、翻訳機構で厳密に制御される発現ベクターが提供される。例えば、本発明の一つの局面では、毒性タンパク質および融合性タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーター（例えば、上記で議論されたプロモーターのうちの一つ）、およびセレン反応性エレメントを含む発現ベクターが提供され、ここで核酸分子内の１つ以上のシステイン残基がオパール終止コドンに変換されている。手短に言えば、セレノタンパク質は、原核生物および真核生物ポリペプチドの独特のグループを構成し、その全てが、硫黄様元素であるセレンをセレノシステインとして取り込む。セレノタンパク質は、細菌蟻酸デヒドロゲナーゼ、哺乳動物グルタチオンペルオキシダーゼ(GPx)ファミリー、哺乳動物I型ヨードチロニン 5'脱ヨウ素酵素、および哺乳動物セレノタンパク質Ｐ（Bockら，Trends Biochem ．Sci．16:463,1991）を含む。これらのタンパク質の全ては、セレノシステインをUGAコドン（Bockら、上述）（形式的には「終止」（または、オパール）コドンとして公知）で翻訳と同時に取り込み、そして適切なUGAアンチコドンを含む特異的なセレノシステイン充填（charged）tRNA^SeCysを利用する（Leeら,J Biol .Chem．264:9724-9727,1989）。例えば、本発明の一つの実施態様において、抑制状態で、すなわち、セレン非存在下または正常な増殖培地（例えば、10％FBSを補充したDMEM）に比べて著しく低減したセレンレベルで、毒性遺伝子または融合性遺伝子を有する細胞が増殖される。これは定義された培地（例えばIT（インシュリン、トランスフェリン； Collaborative Bioproducts，Waltham MA））中での増殖に細胞を適応させることにより達成され得る。細胞はセレン欠乏培地で増殖され得、そしてコンフルエントに近くなった場合、培地をFBS含有培地（FBSは通常多量のセレンを含む）に交換するか、または細胞をITS培地（インシュリン、トランスフェリン、セレン；Collaborative Bioproducts，Waltham MA）に移動させる。セレン過多の際には、変異TGAコドンがセレノシステインコドンとして読まれ、そしてセレノシステインが毒性タンパク質または融合性タンパク質に取り込まれる。セレン反応性エレメントが本明細書中において、翻訳調節機構の代表例として提供されるが、本発明はそのように制限されないことが理解されるべきである。特に、他の多様な翻訳調節エレメントが、単独で、または上記の転写エレメントと組み合わせてのいずれかで、所定の配列の発現を制御するために利用され得る。例えば、鉄反応性エレメント（IRE）は、鉄代謝に関わる重要なタンパク質において天然に生じる。それらは、これらのタンパク質の5'または3'非翻訳領域に単一コピーで見出される、約26〜35ヌクレオチドの適度に安定なステムループ構造である（Hentzeら，Science 238:1570-1573，1987)。IREは、IRE結合タンパク質（IRE-BP）と呼ばれるサイトゾルタンパク質に対するmRNA結合部位を提供する（LeiboldおよびMunro、P.N.A.S.85:2171-2175,1988）。このタンパク質は鉄利用能によって調節される（Haileら、PNAS 89:7536-7540,1992）。鉄過剰条件下で、サイトゾルIRE-BPはIREには結合しない。鉄欠乏条件下で、IRE-BPは、IREに対して高い親和性結合（Kd<100pM）を示す。高親和性結合と低親和性結合との間のスイッチはタンパク質合成を必要とせず、そしてIRE-BPの翻訳後修飾を表現する。不活性型タンパク質は、高濃度の鉄キレート剤または還元剤のいずれかの存在下で高親和性でRNAに結合するために活性化され得、それゆえ、２つの結合状態を識別する酸化還元感受性のメルカプトスイッチを有すると思われる。 IREの、融合性タンパク質または毒性タンパク質のような目的の遺伝子（GOI）の5'または3'非翻訳領域への取り込みは、鉄欠乏条件下でのこれらの遺伝予の翻訳を抑制する能力を生じさせ得る。例えば、以下のオリゴヌクレオチド配列または他の非常に関連した配列（およびそれらの相補物）は、毒性遺伝子または融合性遺伝子の5'非翻訳領域（例えば、約-150bpにおけるVSV-G遺伝子）への取り込みのための隣接制限酵素部位（RES）とともに合成され得る。 IRE配列オリゴヌクレオチド３（配列番号１） 5'(RES)-CGT CGG GGT TTC CTG CTT CAA CAG TGC TTG GAC GGA ACC CGG CG-(RES) 3' IRE配列オリゴヌクレオチド４（配列番号２） 5'(RES)-CGC CGG GTT CCG TCC AAG CAC TGT TGA AGC AGG AAA CCC CGT CG-(RES) 3' IRE-VSV-G構築物を含むパッケージング細胞株は、低濃度の鉄、ジチオスレイトール（DTT;例えば、100mM）のような高濃度の還元剤、または50mM〜100mMの鉄キレート剤デスフェリオキサミンを有する培地で維持され得る。鉄源として50mM 〜100mMのヘミンの添加を20時間行うことにより、IRE-BP親和性は低下し、そしてVSV-G翻訳が進行し、タンパク質発現が100倍にまで増加する。それゆえ、これはVSV-G偽型レトロウイルスベクターの高度の産生の調節可能なバーストを可能にする。本発明の別の局面においては、遺伝子発現の調節は、一つの細胞型において複製し得るが、他には不稔感染する（すなわち、生来の種では複製コンピテントであり、他の種では複製コンピテントでない）ウイルスベクターを利用することにより達成される。そのような系は、ウイルスタンパク質の産物が毒性である多くの型のウイルスベクター（例えば、AAVおよびrevタンパク質、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、シンドビスおよび他のアルファウイルス）の産生に使用され得る。例えば、本発明の一つの実施態様では、毒性タンパク質または融合性タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結したマウスCMV IEプロモーターを含む発現ベクターが提供される。簡単には、MCMVは、ヘルペスウイルスのβファミリーのメンバーであるウイルスである。これらのウイルスは、それらのビリオン内に即時初期遺伝子からの転写の開始を担うトランスアクチベータータンパク質を含む。MCMVはヒト細胞に不稔的に感染する。すなわち、ウイルスが標的ヒト細胞に侵入し、いくつかの「初期遺伝子」発現が起こるが、ウイルス粒子は産生されない。これは、ヒト細胞において「バースト」様式で、そうでなければ、毒性なタンパク質を発現し、次いでMCMVのさらなる産生および夾雑なく産物を採集するためのMCMVの使用を可能にする。それゆえ、毒性または融合性タンパク質を取り込んでいる産物が採集され得、そして顕著なMCMV毒性なく標的細胞または組織に使用され得る。このトランス活性化現象は、少なくとも以下の２つの異なった方法で、VSV-G 遺伝子のような広範囲の種々の毒性タンパク質および／または融合性遺伝子を発現を調節するために使用され得る： a）VSV-G遺伝子は、IE遺伝子由来のプロモーター領域をVSV-G遺伝子に融合することにより、ielまたはie3のようなMCMV即時初期（IE）遺伝子の制御下に置かれ得る。次いで、修飾されたVSV-G遺伝子は、相同組換えにより、MCMVゲノムに再導入される。VSVgタンパク質は即座には毒性ではなく、そしてマウス細胞におけるMCMVの生活環が２日または３日であり、MCMVのストックが従来の力価（10⁷ 〜10⁹pfu/ml）で産生され得る。組換えウイルスストックは、連続回のプラーク精製によって得られ、そしてヒトプレプロデューサー細胞（レトロウイルスベクターを含むがエンベロープタンパク質を欠く細胞）に感染させるために使用され得る。MCMVが、ヒト細胞において不稔感染を引き起こすため、VSV-G偽型レトロウイルスベクターがMCMVの汚染なく感染細胞から放出される。 b）VSV-G遺伝子は、MCMV由来のie遺伝子調節配列の制御下に置かれ得る。この構築物はプレプロデューサー細胞株（上述）にトランスフェクトされ得る。ieトランスアクチベーターの非存在下で、MCMV IEプロモーターからの構成的転写は非常に低く、毒性VSV-G遺伝子タンパク質の最少発現をもたらす。プレプロデューサー細胞が野生型MSMVに感染した場合、トランスアクチベーターは、非常に速やかで強いVSV-G遺伝子の発現を引き起こし、VSV-G偽型レトロウイルスベクターの分泌を導く。MCMVがヒト細胞において不稔感染を引き起こすので、VSV-G偽型レトロウイルスベクターはMCMVによる汚染なく感染細胞から放出される。低いレベルのMCMV複製がヒトプレプロデューサー細胞において生じる事象において、後期MCMVタンパク質合成を防止するため、MCMV感染培養物はガンシクロビルで処理され得る。あるいは、MCMVのトランス活性化は、複製能という意味では機能的である必要はなく、そして、初期遺伝子または後期遺伝子、あるいはその両方を欠く組換え MSMVが操作され得る。そのような組換えMSMVは、トランス相補、そしてMCMVウイルス形成を許容するために、欠失遺伝子（すなわち初期または後期）の単一コピーを安定に含む細胞内で増殖され得る。 MCMVは本明細書中で例として提供されるが、本発明はそのように制限されないことが理解されるべきである。特に、それらの生来の種では複製コンピテントであり、他の種では複製コンピテントでない多様な他のウイルスが、同様に、本発明で利用され得る。代表的な例は、マウス適合性インフルエンザウイルスおよびアカゲザルロタウイルス、ならびに下記表１に示された他のウイルスのような動物ウイルスを含む。表１ウイルス許容宿主不稔感染 mCMV マウスヒト鶏痘鳥ヒト豚痘ブタヒト仮性狂犬病ブタ、ウシ、家畜ヒトポリオーママウスヒト SV40 アフリカミドリザルヒト全種の温度感受性許容温度（通常32℃）非許容温度（通常37〜3 ウイルスでの細胞 7℃）での細胞Ｃ．毒性タンパク質および融合性タンパク質上記で議論したように、広範な種々の天然に生じるかまたは合成的に生成された毒性または融合性タンパク質のいずれかが、本発明の発現ベクターおよび／またはウイルスベクターにより発現され得る。融合性タンパク質（融合性状態を媒介する）の代表例は、VSV-G（Lazariniら、J．Vir．45:773-781，1983）、狂犬病ウイルス-G（Gaudinら、J．Virol．67:1365-1372，1993）、セムリキ森林ウイルス、シンドビスおよびE1およびE2糖タンパク質を有する他のアルファウイルス（Whitt，M.ら.，Virol．185:681，1991）を含む。本発明の他の局面では、活性を変化されたこれらの糖タンパク質の合成キメラが産生され得る。例えば、狂犬病細胞外ドメインをVSV-G膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに融合させた合成キメラが産生され得、これは逆説的に感染性を保持するが、融合活性を欠く（Whitt，Mら、Virol．185:681，1991）。加えて、細胞外-膜貫通ドメインのみの糖タンパク構築物は、偽型化に有用であり得る。このようにして偽型化され得るウイルスの代表例は、HIV（Virology 209(2):696 -700，1995;J Vir．69(3):1984-9，1995; AIDS Res Hum Retroviruses 8(9):166 9-77，1992）；SIV（J．Med．Primatol 21(2-3):69-73，1992）;HTLV（Int．J.C ancer 60(4):567-70，1995; Int．J．Cancer 59(5)655-60，1994; Int．J．Canc er 59(3)416-21，1994; Int．J．Cancer 56(1):100-5，1994; J．Vir．65(1)162 -9，1991; Virology 180(1):420-4，1991）;MuLV（J．Vir．67(8);4712-21,1993 ; J．Vir．66(3):1468-75，1992）;FIV（J．Vir 67(7):4142-53，1993; P.N.A.S ．89(18):8457-61，1992);RSV(J．Gen．Vir．73(Pt11):2995-7，1992);AKV(Viro logy 186(1):161-6,1992);Cocal(J.Vir Methods44(2-3):287-304,1993);VSV-G （Virology 178(2):373-83,1990;J．Vir．5(3):1202-7，1991）;HSV（Vaccine 1 1(6):675-8,1993）；およびLDV（J．Vir．69(7);4237-44,1995）を含む。本発明はまた、毒性タンパク質を発現する組換えウイルスの産生においても有用である。細胞に毒性であるタンパク質の代表例は、γ-インターフェロン、IL- 2およびTNF-β、ならびに組換えウイルスによって発現され得る他の毒性分子（以下より詳細に議論）（例えば、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、抗ウイルスタンパク質、トリチン、赤痢毒素およびプソイドモナスコレラ外毒素Aを含む）を含む。Ｄ．他の異種核酸分子広範囲の核酸分子は、本発明の発現ベクターまたは組換えレトロウイルスにより保持および／または発現され得る。一般的に、本明細書中で記載した核酸分子は、それを保持する発現ベクターまたは組換えレトロウイルスにおいて天然に生じず、そしていくつかの所望の利益、典型的には、疾患、あるいは他の病原体、または病原状態と戦う能力を提供する。本明細書中に記載の核酸分子によってコードされ得る物質は、タンパク質（例えば、単一鎖分子を含む抗体）、免疫剌激分子（例えば抗原）、免疫抑制分子、遮断剤、緩和剤（例えば、毒素、アンチセンスリボ核酸、リボザイム、酵素、および病原体の機能を阻害し得る他の物質）、サイトカイン、多様なポリペプチドまたはペプチドホルモン、それらのアゴニストまたはアンタゴニストを含み、ここでこれらのホルモンは、下垂体、海馬、腎臓、内皮細胞、肝臓、膵臓、骨、造血骨髄および副腎のような組織から得られ得る。このようなポリペプチドは、増殖の誘導、組織後退、免疫応答の抑制、アポトーシス、遺伝子発現、レセプター −リガンド相互作用遮断、免疫応答のために使用され得、そして特定の貧血、糖尿病、感染、高血圧、異常な血液化学（例えば、高血液コレステロール、血液凝固因子の欠乏、低HDKを伴う高LDL）、アルツハイマー関連アミロイドタンパク質のレベル、骨侵食／カルシウム沈着の処置、ならびにステロイドホルモン、プリン、およびピリミジンのような多様な代謝物のレベルを調節するために使用され得る。本発明の一つの局面においては、緩和剤の発現を指向する発現ベクターまたは組換えレトロウイルスの投与のための方法が提供される。細胞の増殖を阻害するために直接作用する緩和剤の代表的な例は、リシンのような毒素を含む（Lambら .，Eur．J．Biochem 148:265-270，1985）。本発明の別の局面においては、発現ベクターまたは組替えレトロウイルスは、他の不活性前駆体を、病原体の活性インヒビターに活性化し得る物質、または病原状態を発現する細胞に対して毒性の緩和剤である条件的毒性緩和剤の発現を指向する。本明細書中で提供された開示があれば明らかなように、広範な不活性前駆体は、病原体の活性インヒビターに変換され得る。したがって、例えば、遺伝子産物（例えば、タンパク質）（例えば、抗ウイルスヌクレオシドアナログのそれらの活性形態への代謝を補助する単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HS VTK）またはVaricella Zosterウイルスチミジンキナーゼ(VZVTK)）の発現を指向する発現ベクターまたは組換えレトロウイルスは、ヌクレオシドアナログ前駆体（例えば、AZTまたはddC）を活性形態に活性化することに有用である。それにより、AZTまたはddI治療は、より効果的で、低用量を可能にし、より少ない毒性を生じ、そして生産的感染に対してより高い効力を有する。さらなるヌクレオシドアナログ（それらのヌクレオチド三リン酸形態がレトロウイルス逆転写酵素について選択性を示すが、細胞性ヌクレオシドおよびヌクレオチドキナーゼの基質特異性の結果としてリン酸化されない）は、より効果的になる。さらに別の局面として、病原機能に対応するRNA分子を切断して、それにより不活性化する一つ以上のリボザイム（RNA酵素）（HaseloffおよびGerlach，Natu re 334:585,1989）をコードすることにより治療効果を有する、発現ベクターおよび組換えレトロウイルスが提供される（FosterおよびSymons，Cell 48:211-22 0，1987;HaseloffおよびGerlach，Nature 328:596-600，1988;Ruffnerら，Bioch em 29:10,695-10,702,1990；米国特許第5,254,678号および同第4,987,071号、PC T公報第 WO 93/23569号もまた、参照のこと）。別の局面では、アンチセンス配列（アンチセンス配列はまた、核酸配列によりコードされ得、次いで転写により宿主細胞内に産生され得る）である生物学的に活性な核酸分子を含む、発現ベクターおよび組み換えレトロウイルスが提供される。好ましい実施態様では、アンチセンス配列が、インフルエンザウイルス、HIV、HSV、HPV、CMVおよびHBVをコードする配列からなる群から選択される。アンチセンス配列はまた、病原性に必要なRNA配列に相補的なアンチセンスRNAでもあり得る。あるいは、生物学的に活性な核酸分子は、病原性に必要なRNA配列に相補的なセンスRNA（またはDNA）であり得る。本発明のなおさらなる局面は、免疫剌激能力のある組換えレトロウイルスに関する。手短に言えば、外来性病原体を認識し、そしてそれに対して防御する能力は、免疫系の機能に必須である。特に、免疫系は、「自己」と「非自己」（すなわち外来性）とを区別し得なければならず、それゆえ、宿主の防御機構が宿主組織に対する代わりに侵入物にむけて指向される。代表的には、細胞溶解性Tリンパ球（CTL）が、MHCクラスIまたはII細胞表面タンパク質と関連して、プロセスされた病原特異的ペプチドのような細胞表面認識構造の提示により誘導されるか、または剌激される。一つの実施態様において、本発明は、感受性標的細胞において抗原およびそれらの改変形態の発現を指向する発現ベクターまたは組換えレトロウイルスを使用することにより、特異的な免疫応答を剌激し、そしてウイルス拡散を阻害する方法が提供される。ここで、この抗原は（１）ウイルス抗原に対する免疫応答を開始し得るか、または（２）ウイルス相互作用に必要な細胞性レセプターを占有することによりウイルス拡散を防ぎ得るかのいずれかである。本発明の別の局面では、本発明の発現ベクターまたは組換えレトロウイルスは「免疫調節因子」を発現するように構築され得る。免疫調節因子は、免疫応答に関連する１つ以上の細胞によって製造された場合、または細胞に外因的に添加された場合、因子の非存在下に生じるものとは質または効力が異なる免疫応答を生じる、因子をいう。応答の質または効力は、例えば、細胞増殖を測定するインビトロアッセイ（例えば、³Hチミジン取り込み）およびインビトロ細胞毒性アッセイ（例えば⁵¹Cr放出を測定する）（Warnerら、AIDS Res.およびHuman Retroviru ses 7:645-655,1991を参照のこと）を含む当該業者に公知の種々のアッセイにより測定され得る。免疫調節因子はインビボおよびエクスビボの両方で活性であり得る。そのような免疫調節因子の代表例は、サイトカインまたはリンパ球、インターフェロン（例えば、γ-IFN）、腫瘍壊死因子（TNF）（Jayaramanら）J．Immutol ogy 144:942-951,1990）、CD3(Krissanenら、Immunogenetics 26:258-266,1987) 、ICAM-1（Altmanら,Nature 338:512-514,1989；Simmonsら、Nature 331:624-62 7,1988）、ICAM-2、LFA-1、LFA-3(Wallnerら、J．Exp．Med．166(4):923-932,19 87)、MHCクラスI分予、MHCクラスII分予、B7.1-.3、β₂-ミクログロブリン（Par nesら、PNAS 78:2253-2257,1981）、カルネキシンのようなシャペロンおよびMHC 連結輸送体タンパク質またはそのアナログ（Powisら、Nature 354:528-531,1991 ）を含む。本発明はまた、例えば、ウイルス、細菌、または寄生虫抗原を含む所望の抗原の免疫原性部分をコードする発現べクターおよび組換えレトロウイルスを包含する。代表例は、肝炎Band Cウイルス抗原（例えば、WO 93/15207）、ネコ白血病ウイルスおよび／または免疫不全ウイルス抗原（例えば、WO 94/06921）。さらに他の例は、ras（ras^*）遺伝子およびp53遺伝子（WO 93/10814を参照のこと）のような非腫瘍形成性、変換遺伝子の発現を指向する発現ベクターまたは組換えレトロウイルスを包含する。Ｅ．細胞培養濃度および組換えレトロウイルス粒子の精製上述のように、本発明は、ヒトおよび他の温血動物への投与に適した組換えレトロウイルス調製物を提供する。特に、例えば、発酵槽またはバイオリアクターの使用、回転瓶、細胞ホテルまたは細胞工場、および中空繊維培養を含む、投与に適した組換えレトロウイルスを産生するための広範囲の方法が利用され得る。手短に言えば、バイオリアクターまたは発酵槽については、細胞は、好ましくは、マイクロキャリア（すなわち、CytodexｌまたはCytodex 2;Pharmacia，Pisc ataway，N.J.）で、3g/L−15g/Lマイクロキャリアの範囲の濃度で増殖させる。回転瓶については、適切な条件は、マイクロキャリアビーズは一般的に好ましくないことを除いて、バイオリアクターに関して上記に記載した方法を含む。そのような方法の代表例、ならびに細胞ホールドまたは細胞工場および中空リンカー（hollow linker）培養のような他の方法は、WO 96/0926に記載される。培養に続いて、例えば、組換えレトロウイルスの硫酸アンモニウム沈澱、ポリエチレングリコール（「PEG」）濃縮、遠心分離による濃縮（PERCOLLのような勾配、またはショ糖のような「クッション（cushion）」を伴うか、伴わないかのいずれか）、濃縮フィルター（例えば、Amicon濾過）の使用、および２相分離を含む広範囲の方法が、ウイルス濃度および純度を増加させるために利用され得る。組換えレトロウイルス粒子の濃縮および精製の代表例はWO 96/0926に記載される。Ｆ．投与上述のように、本発明の高力価の組換えレトロウイルス粒子は、例えば、脳脊髄液、骨髄、関節、動脈内皮細胞、直腸、頬／舌下、膣、リンパ系のような部位、または肺、肝臓、牌臓、皮膚、血液、および脳からなる群から選択される器官に、または腫瘍および間質空間からなる群から選択される部位を含む広範囲の位置に投与され得る。他の実施態様において、組換えレトロウイルスは、眼内的、鼻孔内的、舌下的、経口的、局所的、膀胱内的、クモ膜下腔内的、局所的、静脈内的、腹腔内的、頭蓋内的、筋肉内的、または皮下的に、投与され得る。投与経路の他の代表的な経路は、胃内視鏡、ECRP、および結腸鏡を含み、これらは、手術手順の全ておよび入院は必要としないが、医学的人物の存在を必要とし得る。以下の実施例が、例示のために提示されるが、これは制限のために提示するものではない。実施例実施例１レトロウイルスベクター骨格の調製本発明での使用に適切なレトロウイルス骨格を、当業者は容易に調製し得る。このような骨格の典型的な例（例えば、KT-1およびKT-3）は、WO 91/02805およひWO 95/05789に記載される。実施例２プラスミドMLP-GからのVSV-G遺伝子の回収 VSV-G遺伝子（Lazariniら，J．Vir．45:773-781，1983;配列番号１および２もまた参照のこと）を、VSV-Gを含むプラスミド（例えば、pMLP-G、これは、アデノウイルス主要後期プロモーターおよびトリパータイト（tri-partite）リーダー配列（Kaufman,P.N.A.S．82:689-693，1985; Ballayら，Hepadna Viruses,W.R obinson，K.KoikeおよびH.Will(編)，173-187頁，Liss，New York，1987; WO 92 /05266もまた参照のこと）を有する）から、プライマー#5および#2（これらはまた、それぞれ、5'末端にSacII部位および3'末端にEcoRI部位を導入する）を用いて、1.6kb PCR産物として単離する。プライマー-２：（配列番号３） 5'-GCC GAA TTC AAT TGA GGC CTC TTT G-3’（25マー）プライマー-５：（配列番号４） 5'-GAT CCG CGG AGA ATC GAT CTG TTT CCT TGA CAC TAT GAA GTG CCT TTT G-3'（49マー） PCR産物を、TAクローニングベクターpCR^TMII（INVITR0GEN C0RP.，San Diego, CA）中にクロ−ニングし、そして部分的な配列決定およびVSV-G遺伝子の正確な方向付けを介して正確な配列について調べる。次いで、VSV-G遺伝子を、TAクローニングベクターから回収し、そして真核生物発現ベクターpcDNAIII（INVITR0G EN）中に連結する。次いで、PCRクローンを、PR0MEGAからのプロフェクチン（pr ofectin）キットを用いて、１：１の比のVSV-G発現pcDNAIIIおよびpCB/β-galでの293(2-3)細胞の同時トランスフェクションにより、機能性について調べる。ポジティブコントロールとして、pMLP-Gを、平行してpCB/β-galプラスミドと同時トランスフェクトする。同時トランスフェクションの後、新鮮な培地を細胞に添加し、上清を収集し、そして24時間後に滅菌濾過（0.45mm）する。次いで、HT10 80標的細胞を、以下のような種々の希釈で両方の上清を用いて形質導入する。１日目に、６ウェルプレートのうち３ウェルに、２mlの培地（10％ FBS、非必須アミノ酸、およびピルビン酸ナトリウムを有するDMEM高グルコース）中に２× 10⁵個のHT1080を各ウェルに播種する。翌日の形質導入の前に、細胞を、37℃および10％ C0₂にて24時間インキュベートする。２日目に、培地を取り除き、そして８μgポリブレン／ml最終を含有する培地の1mlを各ウェルに添加する。細胞を、37℃および10％ C0₂にて30分間インキュベートする。上清を、ベクター含有培地の穏やかなピペッティングにより約５ c fu/mlの濃度まで希釈する。希釈した上清の５、20、および50μlを、それぞれウェル１〜３に添加し、培地をかき回し、そして37℃および10％C0₂にて24時間インキュベートする。３日目に、１mlの培地を各ウェルに添加し、そして細胞を、37℃および10％ C O₂にて24時間インキュベートする。４日目に、形質導入した細胞にX-gal染色手順を行なう。青色細胞の総数を各ウェルで計数し、そして力価を決定する。簡略には、培地を排出し、そして0.5m lの固定溶液（２％(v/v)ホルムアルデヒドおよび0.2％（v/v）グルタルアルデヒドを有するPBS）を各ウェルに添加する。細胞を、５分間室温にてインキュベートし、固定溶液を排出し、そして細胞を１ウェルあたり２mlのPBSで洗浄する。ウェルを排出し、そして0.5mlの新たに混合したX-gal染料（５mMフェロシアン化カリウム、５mMフェリシアン化カリウム、２mM MgCl₂、および1mg/ml X-galを有するPBS）を、各ウェルに添加する。細胞を、37℃で２時間から一晩インキュベートし、そして青色細胞を計数する。 pMLP-Gと、発現ベクター中のPCRに基づくVSV-G遺伝予産物との間の力価が匹敵する場合、PCRに基づくVSV-G遺伝子を、Lark Sequencing Technologiesにより配列決定し、そしてpMLP-G中のVSV-G配列に対して比較する。力価が、PCRにより回収されたVSV-G遺伝子ではずっと小さいかまたは０である場合、PCR IIに連結されたVSV-Gを有する他のプラスミドクローンをスクリーニングする。機能的VSV-G遺伝子を、原核生物TAクローニングベクターpCR^TMIIまたは真核生物発現ベクターpcDNAIIIのいずれかから回収し得る。実施例３安定なVSV-G発現パッケージング細胞株を生成するためのテトラサイクリン誘導性プロモーター系の使用Ａ．導入以下でより詳細に記載するように、テトラサイクリントランスアクチベーター（tTA）を、293(2-3)PCLに導入し、そして構成的に発現させる。293(2-3)tTA細胞株の２回目のトランスフェクションでは、tetオペレーター配列を、tetオペレーター配列の後ろに融合したVSV-G遺伝子とともに導入する。Ｂ．プラスミド調製以下のプラスミドの各々のプラスミド調製を、QIAGENプラスミドキット（QIAG EN Inc.，Chatsworth，CA）を本質的に製造者により記載されるように用いて行なう。簡略には、プラスミドを、E.coli DH 12S（Life Technologies，Inc.,Gai thersburg，MD）中にエレクトロポレーションし、そして培養物を、pMLP-G（これは、テトラサイクリンを５μg/mlの最終濃度で必要とする）を除く全てのプラスミドについて100μg/mlの最終濃度でアンピシリンを補充したLBブロス中で増殖させる。エレクトロポレーションされた細菌を、それぞれの抗生物質を含有するLB寒天プレート上にシングルコロニーとしてプレートする。シングルコロニーを選択し、微量プラスミド調製を行ない、そして特徴的な制限酵素消化を行って各プラスミドの同一性を確認する。一旦シングルコロニーが同定されたら、グリセロール培養物（40％グリセロールと細菌懸濁液との１：１希釈）を−80℃にて保存する。以下の表は、利用可能なプラスミドを列挙し、コード領域およびプラスミドの供給源を記載する。安定なテトラサイクリン誘導性VSV-G PCLの生成のためのプラスミド名称コード領域参考文献 pUHD 15-20 HSV-Tkプロモーターの下のtTA 例えば、米国特許第5,464,758 号を参照のこと pUHD 15-1 hCMVプロモーター／エンハンサ米国特許第5,464,758号; ーの下のtTA Gossen M.およびBujard H.，PN AS 89: 5547-5551 (1992) pUHD 10-3 上記の参考文献に記載のように GossenおよびBujard，PNAS89: ヘプタマー化した上流のtetオ 5547-5551 (1992) ペレーターそれに続く多数のクローニング部位を有するhCMVプロモーター／エンハンサー名称コード領域参考文献 pMLP-G MLPプロモーターの下のVSV-G遺 Lazzariniら，J.Virol．45: 77 伝子 3-781 (1983) pT3/T7-Luc ルシフェラーゼ発現ベクター Clontech(Clontech Inc.,Palo Alto，CA) pUT 507 フレオマイシン（phleomycin） Tirabyら，Somatic Cell and M ／ゼオシン（zeocin）耐性プラ olecular Genetics 14: 243-25 スミド 2(1988) pHIS ヒスチジノールマーカープラス（以下を参照のこと）ミド pCB/β-gal β-galコードプラスミド Irwinら，J.Vjr．68(8): 5036- 5044，1994 真核生物発現ベクターpREP8（Invitrogen，San Diego，CA）（これは、ヒスチジノール耐性遺伝子を含む）ならびにEpstein Barrウイルス複製起点およびEBNA を、EcoRIで消化し、そして5.8Kbフラグメントを単離し、再連結し、そしてE.co li中にトランスフェクトする。このベクターpHISは、プラスミド複製起点、アンピシリン耐性遺伝子、ならびにSV40プロモーターおよびポリアデニル化配列を有するヒスチジノール耐性遺伝子のみを含む。Ｃ．ルシフェラーゼレポータープラスミドpUHD 10-3/lucの構築テトラサイクリントランスアクチベーター機能を、tTA制御ルシフェラーゼレポーターユニットを用いる一過性トランスフェクションアッセイにおいて最初に調べる。両方のレギュレータープラスミド(pUHD 15-20ならびにpUHD 15-1)を、一過性アッセイにおいて分析し、どのプラスミドが、テトラサイクリンの使用中止後の活性化の漏出およびレベルに関して良好な系を与えるかを決定する。同時トランスフェクション実験を、293(2-3)細胞およびD-17 gag/pol細胞ならびにポジティブコントロールとしてのHeLa細胞において行なう。１．pUHD10-3へのルシシフェラーゼ道伝子のクローニング。プラスミドpUHD 10-3を、EcoRI (New England Biolabs，Inc.,Beverly，MA)で線状化し、5'突出を、制限酵素緩衝液中でヌクレオチドおよびKlenowフラグメントでフィルインする。次いで、ベクターを、PCI（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール，Amresco Inc.，Solon，Ohio）で処理してタンパク質を除去し、そしてエタノール沈澱する。HindIIIリンカーをプラスミドに連結し、プラスミドをHindIIIで制限処理し、そしてCIP（仔ウシ腸ホスファターゼ）で脱リン酸化する。脱リン酸化後、ベクターを、PCI抽出し、そしてQiagenからのQiaexゲル精製キットを本質的に製造者の手順に従って用いてゲル精製する。ルシフェラーゼ遺伝子を、HindIII消化（New England Biolabs）の後、pT3/T7 -Luc（Clontech）から1.9kbのフラグメントとして切り離し、２つのフラグメントをアガロースゲルで精製して3.15kbベクターから1.9kbルシフェラーゼコードフラグメントを分離し、そしてルシフェラーゼ遺伝子を、HindIIIで制限処理したpUHD 10-3ベクターに連結してpUHD 10-3/lucを生成する。連結物のアリコートを、E.coli DH 12S（Life Technologies）中にエレクトロポレーションし、培養物をLBブロス中で37℃にて１時間増殖させ、アリコートを、100μg/mlの最終濃度でアンピシリンを補充したLB寒天プレートにプレートし、そして37℃にて一晩インキュベートする。シングルコロニーを選択し、100μg /mlの最終濃度でアンピシリンを補充した2mL LBブロス中で一晩増殖させ、そしてプラスミド微量調製を、Qiagenミニプレップキット（Qiagen Inc.,Chatsworth ,CA）を製造者の指示に従って用いて行なう。ルシフェラーゼ遺伝子を有するクローンを同定するために、SalIおよびSacI（ New England Laboratories）での制限酵素二重消化またはHindIII（New England Laboratories）での単一消化を行なう。１％分析用アガロースゲルでの消化物の電気泳動は、3.15kbの線状化ベクターおよびルシフェラーゼ遺伝子についての 1.9kbフラグメントを示す。両方のフラグメントを有するクローンを、ベクター中のルシフェラーゼ遺伝子の方向に関してさらに分析する。XbaI消化（New Engl and Laboratories）を行ない、そして電気泳動したフラグメントを１％アガロースゲルで調べる。正確な方向についてのフラグメントのパターンは、0.14、1.76 、および3.15kbであり、そして逆の方向については、0.14および5.0kbである。正確なルシフェラーゼ方向を有するクローン（pUHD 10-3/luc）のプラスミド調製を、Qiagenプラスミドキットを用いて行なう。２．293(2-3)、D-17 gag/pol．およびHeLa細胞におけるルシフェラーゼの一過性発現。 293(2-3)およびD-17パッケージング細胞（WO 92/05266）（ならびにポジティブコントロールとしてのHeLa細胞）を、1:20、1:50、および1:100の比で、pUHD1 0-3/lucと、pUHD 15-20またはpUHD 15-1のいずれかとで同時トランスフェクトする。プラスミドを、Promega（Promega Corp.，Madison，WI）からのプロフェクションキットを製造者により推奨されるように用いて、リン酸カルシウム沈澱を介して導入する。プラスミド、比、および細胞株の種々の組み合わせについて各々２つの組織培養皿を用意する。テトラサイクリン、無水サイクリン、またはデオキシサイクリンを、一方の皿に添加するが、他方の皿には添加しない。テトラサイクリンの一種を、同時トランスフェクションの数時間前に１μg/ml の最終濃度で添加する。１組み合わせあたりの両方の皿の細胞を、トランスフェクションの24時間後にルシフェラーゼ活性について分析する。３．ルシフェラーゼ活性の分祈。ルシフェラーゼアッセイを、製造者（Promega）の指示に従って行なう。最低の基底活性およびテトラサイクリンを含まない培養下で最高の程度のルシフェラーゼ活性化を与えるtTAレギュレータープラスミド（pUHD 15-20またはpUHD 15-1 ）を、安定なVSV-G産生293(2-3)およびまたはD-17細胞株を樹立するために利用する。４．安定な293(2-3)tTAおよびD-17 gag/poｌ tTA細胞株の構築 293(2-3)およびD-17 gag/pol細胞における調節系を、２段階で樹立する。第１に、293(2-3)およびD-17 gag/pol細胞を、10:1の比で、tTAレギュレータープラスミドおよびpUT 507で同時トランスフェクトする。プラスミドを、PR0MEGAからのプロフェクションキットを用いてリン酸カルシウム沈澱を介して導入する。同時トランスフェクションを、製造者により推奨されるように行なう。同時トランスフェクションの２日後、細胞を、全ての非耐性細胞が死ぬまで10日間、ゼオシンで選択する。次いで、細胞の選択を止め、そしてウェルの３分の１が増殖を示すようにいくつかの96ウェルプレートにおいて限界希釈を行なう。各クローンを、pUHD 10-3/lucで一過性にトランスフェクトし、そしてルシフェラーゼ活性についてスクリーニングする。pUHD 10-3にクローニングしたVSV-G遺伝子を導入するために、高レベルのルシフェラーゼ活性およびテトラサイクリンの存在下で低い基底レベルを有するクローンを用いる。次いで、細胞の選択を止め、そしてウェルの３分の１が増殖を示すようにいくつかの96ウェルプレートにおいて限界希釈を行なう。各クローンを、pUHD 10-3/lucで一過的にトランスフェクトし、そしてルシフェラーゼ活性についてスクリーニングする。pUHD 10-3にクローニングしたVSV-G遺伝子を導入するために、高レベルのルシフェラーゼ活性およびテトラサイクリンの存在下で低い基底レベルを有するクローンを用いる。Ｄ．VSV-G 発現プラスミドpUHD 10-3/VSV-Gの構築 VSV-G遺伝子を、Eco-RI-SacII二重消化でpCR^TMII TAクローニングベクターから回収する。1.6kbのVSV-G遺伝子を単離し、そして上記のようにQIAEXキットを用いる１％アガロースゲルでの電気泳動により精製する。プラスミドpUHD 10-3 を、SacIIおよびEcoRIで制限処理し、そしてVSV-G遺伝子を骨格に連結する。連結物のアリコートを、E.colI DH 12S（LifeTechnologies）中にエレクトロポレーションし、培養物を、LBブロス中で37℃にて１時間増殖させ、アリコートを、100μg/mlの最終濃度にアンピシリンを補充したLB寒天プレート上にプレートし、そして37℃にて一晩インキュベートする。シングルコロニーを拾い、100 μg/mlの最終濃度にアンピシリンを補充した２ml LBブロス中で一晩増殖させ、そしてプラスミドの微量調製を上記のように行なう。 VSV-G遺伝子を有するクローンを同定するために、SacIIおよびXbaI（New Engl andLaboratories）での制限酵素二重消化を行なう。１％分析用アガロースゲルでの消化物の電気泳動は、3.15kbの線状化ベクターおよびVSV-G遺伝子についての1.6kbフラグメントを示す。正確なVSV-G方向を有するクローン（pUHD 10-3/VSV-G）のプラスミド調製を、 Qiagenプラスミドキットを用いて行なう。Ｅ．安定な293(2-3)tTA/VSV-Gおよび／またはD-17 gag/pol tTA/VSV-G細胞株の構築 VSV-G遺伝子を、pUHD 10-3/VSV-GおよびpUT 507の同時トランスフェクションにより、293(2-3)tTAおよび／またはD-17 tTA-VSV-Gクローン中に導入し、次いでフレオマイシンまたはゼオシンで選択する。両方のプラスミドを、Promegaからのプロフェクションキットを製造者により推奨されるように用いるリン酸カルシウム沈澱を介して、293(2-3)tTAおよびD-1 7-gag/pol細胞中に、10:1の比で導入する。同時トランスフェクションの時から、細胞をテトラサイクリン含有培地（１μg/ml最終濃度）中に保つ。同時トランスフェクションの２日後、細胞を、全ての非耐性細胞が死ぬまで10日間、ヒスチジノールで選択する。次いで、細胞の選択を止め、そしてウェルの３分の１が増殖を示すようにいくつかの96ウェルプレートにおいて限界希釈を行なう。各クローンを、２つの組織培養皿に分ける（一つの皿はVSV-Gの産生を誘導するためにテトラサイクリンを含まない培地を含む）。１日後、テトラサイクリンを含まない培地における細胞を、PCLクローンの各々のタイタリング能（titering potent ial）を決定するために、リン酸カルシウムトランスフェクションを介して、β- gal遺伝子（pCB/β-galから）を用いてトランスフェクトする。トランスフェクションの２日後、上清を収集し、そしてHT1080標的細胞を、β-gal遺伝子を有するウイルス粒子で以下のように形質導入する。１日目に、１上清あたり６ウェルプレートの３ウェルに、２mlの培地（10％ F BS、非必須アミノ酸、およびピルビン酸ナトリウムを有するDMEM高グルコース）中の２×10⁵個のHT1080細胞を、各ウェルに播種する。細胞を、翌日の形質導入の前に、37℃および10％C0₂にて正確に24時間インキュベートする。２日目に、培地を除去し、そして８mgポリブレン/mlを含有する培地１mlを各ウェルに添加する。細胞を、37℃および10％ C0₂にて30分間インキュベートする。培地中での穏やかなピペッティングにより、上清を約５ CFU/mlの濃度まで希釈する。希釈した上清の５、20、および50mlを、それぞれウェル１〜３に添加し、培地をかき回し、そして37℃および10％ C0₂にて24時間インキュベートする。３日目に、１mlの培地を各ウェルに添加し、そして細胞を、37℃および10％ C 0₂にて24時間インキュベートする。４日目に、形質導入した細胞でのX-gal染色手順を行なう。青色細胞の総数を各ウェルで計数し、そして力価を決定する。 X-gal染色のために、培地を排出し、0.5mlの固定溶液（２％(v/v)のホルムアルデヒドおよび0.2％(v/v)のグルタルアルデヒドを有するPBS）を12ウェルプレートの各ウェルに添加し、細胞を室温にて５分間インキュベートし、固定溶液を排出し、細胞を１ウェルあたり２mlのPBSで洗浄し、そして0.5mlの新たに混合したX-gal染料（５mM フェロシアン化カリウム、５mM フェリシアン化カリウム、２mM MgCl₂、および1mg/ml X-galを有するPBS）を各ウェルに添加し、細胞を37 ℃にて２時間から一晩インキュベートし、そして青色細胞を計数する。一旦、タイタリング能が決定されたら、感染性ウイルス粒子を産生する最大の能力を有する４つのクローンを、VSV-G発現の基底レベルを決定するために、テトラサイクリンを含有する培地中で数週間培養し続ける。VSV-G毒性の影響を示さないコロニーのみが、安定なVSV-GPCLとして有用である。実施例４安定なVSV-G発現パッケージング細胞株を産生するための IPTG/温度誘導性LAPプロモーター系の使用以下でより詳細に記載のように、強力なプロモーターにより駆動されるLAPの各々を、293(2-3)パッケージング細胞株中に導入し、そして構成的に発現させる。293(2-3)LAP細胞株の２回目のトランスフェクションは、弱いプロモーターにより駆動されるLAP結合ドメイン（lacオペレーター配列）を、lacオペレーター配列の後ろに融合したVSV-G遺伝子とともに導入する。Ａ．LAP267 およびLAP348プロモーター系の説明 LAP348：このプロモーター系は、IPTGによりネガティブに調節される。それゆえ、VSV-Gエンベロープの発現は、IPTGの添加後に抑制される。 LAP267:対照的に、LAP267は、IPTGの添加および／または32℃への温度の下降シフトの後にVSV-Gエンベロープの発現を可能にする。LAP267は、lacリプレッサータンパク質のインデューサー結合および二量体化ドメイン内にHSV VP 16の転写活性化ドメインの挿入（これは、LAP267タンパク質を温度感受性にする）を含む。 IPTGは、LAP267活性には、許容温度（32℃）では何の影響も有さない。LAP267活性は、39.5℃でIPTGによりレスキューされる。Ｂ．プラスミド調製以下のプラスミドの各々のプラスミド調製を、Qiagenプラスミドキット（Qiag en Inc.，Chatsworth，CA）を製造者の示唆に従って用いて行なう。簡略には、プラスミドを、E.coli DH 12S（Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD）中にエレクトロポレーションし、培養物を、pMLP-G（これは、テトラサイクリンを５μg/mlの最終濃度で必要とする）を除く全てのプラスミドについて100μg/m lの最終濃度でアンピシリンを補充したLBブロス中で増殖させる。エレクトロポレーションされた細菌を、それぞれの抗生物質を含有するLB寒天プレート上にシングルコロニーとしてプレートし、シングルコロニーを拾い、微量プラスミド調製を行ない、そして特徴的な制限酵素消化を行って各プラスミドの同一性を確認する。一旦シングルコロニーが同定されたら、グリセロール培養物（40％グリセロールと細菌懸濁液との１：１希釈）を−80℃にて保存する。以下の表は、利用可能なプラスミドを列挙し、コード領域およびプラスミドの供給源を記載する。安定なIPTG誘導性VSV-GPCLの生成のためのプラスミド名称コード領域参考文献 pCMV267 最小CMVプロモーターの下のLAP PNAS 88:5072-5076，1991 267 pHCMVLAP348 最小CMVプロモーターの下のLAP Molec．Cell．Biol．10:3343-3 348 356，1990 pL7CAT SV40プロモーターおよびCAT遺 Molec．Cell．Biol．10:3343-3 伝子が続く１セットのタンデム 356，1990 ＡおよびＢ lacオペレーター反復 pL14CAT SV40プロモーターおよびCAT遺 Molec．Cell．Biol．10:3343-3 伝子が続く2セットのタンデム 356，1990 ＡおよびＢ lacオペレーター反復 pMLP-G MLPプロモーターの下のVSV-G遺 J.Vir．45:773-781，1983 伝子 pT3/T7-Luc ルシフェラーゼ発現ベクター Clontech（Clontech Inc.,Palo Alto，Ca） pUT507 フレオマイシン／ゼオシン耐性 Somatic Cell and Molecular G プラスミド enetjcs 14:243-252，1988 pHIS ヒスチジノールマーカープラス（上を参照のこと）ミド pCB/β-gal β-galコードプラスミド Irwinら，J.Vir．68(8):5036-5 044，1994 Ｃ．ルシフェラーゼレポータープラスミドpL7/lucおよびpL14/lucの構築 LAP機能を、LAP267またはLAP348に制御されるルシフェラーゼレポーターユニットを用いる一過性トランスフェクションアッセイにおいて最初に調べる。２つのレポータープラスミドpL7/lucおよびpL14/lucのいずれかと一緒の両方のレギュレータープラスミドpCMV267およびpHCMVLAP348の組み合わせを、一過性アッセイにおいて分析し、どのプラスミドの組み合わせが、IPTG/温度誘導の後の漏出および活性化のレベルに関して良好な系を与えるかを決定する。同時トランスフェクション実験を、293(2-3)およびD-17gag/pol細胞ならびにポジティブコントロールとしてのHeLa細胞において行なう。Ｄ．pL7CAT およびpL14CAT中へのルシフェラーゼ遺伝子のクローニング CAT遺伝子をコードするpL7CATおよびpL14CATからのStuI-BalIフラグメントを、２つのレポータープラスミドの各々の、StuIおよびBalIでの二重消化を用いて欠失させる。各々のプラスミドについての２つの得られた平滑末端フラグメントを、１％アガロースゲル中で分離し、そしてpL7およびpL14骨格を切断し、Qiage nからのQiaexゲル精製キットを製造者の手順に従って用いてゲル精製する。この工程は、CAT遺伝子をpL7CATおよびpL14CATプラスミドから除去する。HindIIIリンカーを、各々の骨格に連結し、骨格をHindIIIで制限処理し、そして仔ウシ腸ホスフアターゼで処理して再連結の可能性を減少させる。ルシフェラーゼ遺伝子を、pT3/T7-Lucプラスミドから、HindIII消化により切り離し、1.9kbのルシフェラーゼ遺伝子を、上記のように１％アガロースゲルで単離および精製し、そしてルシフェラーゼフラグメントを、各々のプラスミド骨格のHindIII部位中に連結する。連結物のアリコートを、E.coli DH 12S（Life Technologies）中にエレクトロポレーションし、培養物をLBブロス中で37℃にて１時間増殖させ、アリコートを、100μg/mlの最終濃度でアンピシリンを補充したLB寒天プレート上にプレートし、そして37℃にて一晩インキュベートする。シングルコロニーを拾い、100μg /mlの最終濃度でアンピシリンを補充した２ml LBブロス中で一晩増殖させ、そしてプラスミド微量調製を、Qiagenミニプレップキット（Qiagen Inc.,Chatsworth ,CA）を製造者の指示に従って用いて行なう。ルシフェラーゼ遺伝子を有するクローンを同定するために、分析用制限酵素消化を行なう。正確なルシフェラーゼの方向を有する各１つのクローン（pL7/luc およびpL14/luc）のプラスミド調製を、Qiagenプラスミドキットを用いて行なう。Ｅ．293(2-3) 、D-17 gag/pol．およびHela細胞におけるルシフェラーゼの一過性発現 293(2-3)、D-17 gag/pol．およびポジティブコントロールとしてのHeLa細胞を、1:20、1:50、および1:100の比で、pL7/lucまたはpL14/lucのいずれか、および pCMV267またはpHCMVLAP348のいずれかで同時トランスフェクトする。プラスミドを、Promega（Promega Corp.,Madison，WI）からのプロフェクションキットを製造者により推奨されるように用いて、リン酸カルシウム沈澱を介して導入する。プラスミド、比、および細胞株の種々の組み合わせについて各々２つの組織培養皿を用意する。２皿のうち一方は、LAP267を含む組み合わせについては５mMでの IPTGおよび／または温度シフトを用いて誘導し、そしてLAP348を含む組み合わせについてはIPTGを使用中止する。細胞を、同時トランスフェクションの数時間前に誘導する。１つの組み合わせあたりの両方の皿の細胞を、トランスフェクションの24時間後に、ルシフェラーゼ活性について分析する。Ｆ．ルシフェラーゼ活性の分析ルシフェラーゼアッセイを、製造者（Promega）の指示に従って行なう。最低の基底活性および非誘導培養条件下でルシフェラーゼの最大の活性化程度を与えるLAPレギュレータープラスミド（pCMV267またはpHCMVLAP348）を、安定なVSV-G産生293(2-3)および／またはD-17 gag/pol細胞株を樹立するために利用する。Ｇ．安定な293(2-3)LAP267、D-17 gag/pol LAP267、D-17 gag/pol LAP348、および／または293(2-3)LAP348細胞株の構築 293(2-3)およびD-17 gag/pol細胞における調節系を、２工程で樹立する。第１に、293(2-3)およびD-17 gag/pol細胞を、10:1の比で、LAP調節プラスミドおよびpUT507で同時トランスフェクトする。プラスミドを、Promegaからのプロフェクションキットを本質的に製造者の指示に従って用いて、リン酸カルシウム沈澱を介して導入する。同時トランスフェクションを、製造者により推奨されるように行なう。同時トランスフェクションの２日後、細胞を、全ての非耐性細胞が死ぬまで10日間、0.8mg/mlでG418で選択する。次いで、細胞の選択を止め、そしてウェルの３分の１が増殖を示すようにいくつかの96ウェルプレートにおいて限界希釈を行なう。各クローンを、pL7/lucまたはpL14/lucで一過的にトランスフェクトし、そしてルシフェラーゼ活性についてスクリーニングする。pL7またはpL1 4中にクローニングされたVSV-G遺伝子を導入するために、非誘導培養条件下で高レベルのルシフェラーゼ活性および低い基底レベルを有するクローンを用いる。Ｈ．VSV-G 発現プラスミドpL7/VSV-GおよびpL14/VSV-Gの構築 VSV-G遺伝子を、pCR^TMII TAクローニングベクターからEcoRI消化を用いて回収する。1.6kbのVSV-G遺伝子を、上記のようにQIAEXキットを用いる１％アガロースゲルでの電気泳動により単離および精製する。プラスミドpL7CATおよびpL14CATを、CAT遺伝子を欠失する、StuIおよびBalIで消化する。EcoRIリンカーを平滑末端に連結し、骨格をEcoRIで制限処理し、そして仔ウシ腸ホスファターゼで処理する。次いで、1.6kbのVSV-Gを、pL7およびpL1 4骨格中に連結する。連結物のアリコートを、E.coli DH 12S（LLFE TECHN0L0GIES）中にエレクトロポレーションし、培養物をLBブロス中で37℃にて１時間増殖させ、アリコートを、100μg/mlの最終濃度でアンピシリンを補充したLB寒天プレート上にプレートし、そして37℃にて一晩インキュベートする。シングルコロニーを拾い、100μg /mlの最終濃度までアンピシリンを補充した２ml LBブロス中で一晩増殖させ、そしてプラスミド微量調製を、上記のように行なう。分析用制限酵素消化を、連結物の各々のいくつかのクローンについて、正確な連結を確認するために行なう。正確なVSV-G方向を有する各々の連結物についてのクローンのプラスミド調製（pL7/VSV-GおよびpL14/VSV-G）を、Qiagenプラスミドキットを用いて行なう。Ｉ．安定な293(2-3)LAP267/VSV-G D-17 gag/pol LAP267/VSrGおよび／または293 (2-3)LAP348/VSV-G、D-17 gag/pol LAP 348/VSV-G細胞株の構築 VSV-G遺伝子を、pL7/VSV-GまたはpL14/VSV-Gと、ヒスチジノールでの選択のためのpHISとの同時トランスフェクションにおいて、293(2-3)LAPおよびD-17 ag/p ol LAPクローン中に導入する。両方のプラスミドを、PR0MEGAからのプロフェクションキットを製造者により推奨されるように用いて、リン酸カルシウム沈澱を介して、293(2-3)LAPおよびD -17 gag/pol LAP細胞中に10:1の比（VSV-G:選択マーカー）で導入する。同時トランスフェクションの時から、細胞を、非誘導培地中で保持する。同時トランスフェクションの２日後、細胞を、全ての非耐性細胞が死ぬまで10日間、ヒスチジノールで選択する。次いで、細胞の選択を止め、そしてウェルの３分の１が増殖を示すようにいくつかの96ウェルプレートにおいて限界希釈を行なう。各クローンを、２つの組織培養皿に分け、一方の皿を、VSV-G誘導条件下で培養し、そして一方の皿をVSV-G抑制条件下で培養する。１日後、誘導された細胞を、PCLクローンの各々のタイタリング能を決定するために、リン酸カルシウムトランスフェクションを介して、β-gal遺伝子（pCB/β-galから）でトランスフェクトする。 VSV-G発現の漏出を分析するために、非誘導細胞を、β-gal遺伝子で同様にトランスフェクトする。トランスフェクションの２日後、上清を収集し、そしてHT10 80標的細胞を、以下のようにβ-gal遺伝子を有するウイルス粒子で形質導入する。１日目、１上清あたり６ウェルプレートの３つのウェルに、２mlの培地（10％ FBS、非必須アミノ酸、およびピルビン酸ナトリウムを有するDMEM高グルコース）中の２×10⁵個のHT1080を、各ウェルに播種する。細胞を、翌日の形質導入の前に、37℃および10％ C0₂にて正確に24時間インキュベートする。２日目に、培地を除去し、そして８μgポリブレン/mlを含有する培地１mlを各ウェルに添加する。細胞を、37℃および10％ C0₂にて30分間インキュベートする。培地中での穏やかなピペッティングにより、上清を５ CFU/μlの近似濃度まで希釈する。希釈した上清の５、20、および50mlを、それぞれウェル１〜３に添加し、培地をかき回し、そして37℃および10％ C0₂にて24時間インキュベートする。３日目に、１mlの培地を各ウェルに添加し、そして細胞を、37℃および10％ C O₂にて24時間インキュベートする。４日目に、形質導入した細胞でのX-gal染色手順を行なう。簡略には、培地を排出し、そして0.5mlの固定溶液（２％(v/v)のホルムアルデヒドおよび0.2％(v/v)のグルタルアルデヒドを有するPBS）を12ウェルプレートの各ウェルに添加する。細胞を、室温にて５分間インキュベートし、固定溶液を排出し、そして細胞を１ウェルあたり２mlのPBSで洗浄する。次いで、ウェルを排出し、そして0.5mlの新たに混合したX-gal染料（５mMフェロシアン化カリウム、５mMフェリシアン化カリウム、２mM MgCl₂、および１mg/ml X-galを有するPBS ）を各ウェルに添加する。細胞を37℃にて２時間から一晩インキュベートし、そして青色細胞を計数する。一旦タイタリング能が決定されたら、感染性ウイルス粒子を産生する最大の能力を有する４つのクローンを、VSV-G発現の基底レベルを決定するために、非誘導培地中で数週間培養し続ける。VSV-G毒性の影響を示さないクローンのみが、安定なVSV-GPCLとして有用である。実施例５安定な偽型化細胞の生成のための代替糖タンパク質代謝上記のように、本発明はまた、変化または変異したグリコシル化経路を有する細胞株を提供する。これは、別の毒性のグリコシル化タンパク質または紡錘形生成（fusogenic）タンパク質の発現を指向する発現ベクターを有するかまたは含む。例えば、LecＬ１、２、および８細胞（ATCC CRL 1735、1736、1737）（これは、変化したグリコシル化表現型を有することが公知である）を、本質的にpMLP -Gでのトランスフェクションによりスクリーニングし、そして適切な選択マーカーでの抗生物質耐性について選択し得る。単離されたコロニーを、VSV-Gに対するモノクローナル抗体（例えば、Sigma Chemical Corp.，St．Louis，MOから）を用いてフローサイトメトリーにより分析する。適切な細胞クローンを、パッケージング細胞株の生成のために用いる。実施例６狂犬病Ｇタンパク質パッケージング細胞株弱毒化狂犬病ウイルスSAD B19株のＧタンパク質を含むプラスミドベクター(pS AD61 EMBL/GenBank Acc．No..M31046，Conzelmann，FRCVDA Tubingen，D)を、レトロウイルスベクターを偽型化する際の使用のために、Ｇタンパク質配列をPCR 増幅するためのテンプレートとして使用する。簡単には、Ｇタンパク質をコードする配列を、以下に示すプライマーセットを利用して、製造者の指示（Perkin Elmer）に従って増幅する：配列番号５ 5'-3' GTC AAG CTT AAC ATC CCT CAA AAG ACT CAA GGA AAG ATG G このプライマーは、5'末端のHindIII部位と共にATG開始部位を含むＧタンパク質のセンス配列である。配列番号６ 5'-3' GAT ATC TCG AGC TTA CAG TCT GGT CTC ACC CCC ACT CTT このプライマーは、5i末端にXhoI部位を伴う、タンパク質末端のＧタンパク質のアンチ七ンス配列である。 5'および3'プライマーの両方は、pcDNA3(Invitrogen SD，CA)のマルチクローニング部位の5'HindIII部位および3'XhoI部位と適合する制限部位を有する。得られるPCR産物を単離し、HindIIIおよびXhoIで消化し、そしてHindIIIおよびXhoIで消化したpcDNA3に連結して、pcDNA3/Rab-Gプラスミドを作製する。Gag/ polプレパッケージング株を、pcDNA3/Rab-Gでトランスフェクトし、そしてNeo^r 耐性について選択する。安定な細胞株を適切な薬物を用いて選択し、そしてプールをサブクローニングする。実施例７アルファウイルスコア、E1、E2パッケージング細胞株シンドビスウイルスのようなアルファウイルスにおけるVSV-Gタンパク質等価物は、３つのタンパク質：コア、E1およびE2のヘテロタンパク質である。以下でより詳細に記載するように、シンドビスDNA（ATCC 75891）を含むプラスミドベクターを、レトロウイルスベクターを偽型化する際の使用のために、コアおよび E1およびE2糖タンパク質を増幅するためのテンプレートとして利用し得る。簡単には、実施例６において上述されたことと同様に、コア、E1およびE2タンパク質を、以下のプライマーを利用して、製造者の指示(Perkin Elmer)に従って増幅する：配列番号７ 5'-3' GTC AAG CTT GCT AGC TAC AAC ACC ACC ACC ATG AAT ACA G このプライマーは、5'末端のHindIII部位と共にATG開始部位を含むコアタンパク質のセンス配列である。配列番号８ 5'-3' GAT ATC TCG AGC GGC CGC TCA TCT TCG TGT GCT AGT CAG このプライマーは、5i末端にXhoI部位を伴う、タンパク質末端のE2タンパク質のアンチセンス配列である。 5'および3'プライマーの両方は、pcDNA3(Invitrogen SD，CA)のマルチクローニング部位の5'HindIII部位および3'XhoI部位に適合する制限部位を有する。得られるPCR産物を単離し、HindIIIおよびXhoIで消化し、そしてHindIIIおよびXhoIで消化したpcDNA3に連結して、pcDNA3/コアE1E2Gプラスミドを作製する。 Gag/polプレパッケージング株を、pcDNA3/コアE1E2Gでトランスフェクトし、そしてNeo^r耐性について選択する。安定な細胞株を適切な薬物を用いて選択し、そしてプールをサブクロ−ニングする。実施例８合成Ｇタンパク質パッケージング細胞株合成Ｇタンパク質の例は、膜貫通領域の細胞質末端のアンカー残基で端を切られた、狂犬病Ｇの外部ドメイン(ectodomain)である。この端の切断を、以下の3' プライマーを使用することを除いて、実施例５からの試薬を用いて行なう：配列番号９ 5'-3' GAT ATC TCG AGT TAG ACT CTT CTA CAA CAT GTC ATC AGG このプライマーは、5i末端にXhoI部位を伴う、タンパク質のアンカー領域でのＧタンパク質のアンチセンス配列である。得られるPCR産物を単離し、HindIIIおよびXhoIで消化し、そしてHindIIIおよびXhoIで消化したpcDNA3に連結して、pcDNA3/ΔGプラスミドを作製した。Gag/po lプレパッケージング株を、pcDNA3/ΔGでトランスフェクトし、そしてNeo^r耐性について選択する。安定な細胞株を適切な薬物を用いて選択し、そしてプールをサブクローニングする。実施例９オパール変異したセレン調節性VSV-G発現ベクターの作製上記のように、選択されたシステインコドンがセレノシステインアイソアクセプターTGAに変換された、VSV-G遺伝子変異を作製し得る。以下でより詳細に記載するように、１、２、４、またはそれより多くの変異誘発システインコドンを含む構築物を、GPX1 SREを含む3'非翻訳領域へオパール変異体コーディング領域を融合することにより作製し得る（構築物の模式的な実例については図１を参照のこと）。従って、セレンの非存在下で、UGA(オパール)コドンは終結をもたらす；しかし、セレン補給の際には、セレノシステイン残基はポリペプチド中に取り込まれる。VSV-Gタンパク質について、構造的に重要なシステイン残基は、セレノシステインが正常な構造を維持するように置換するために特に好ましいが、セレン欠乏細胞におけるサプレッサーtRNAによる任意の読み過しが、不安定化アミノ酸置換をもたらすだろう。しかし、より重要には、変異誘発は三量体化ドメインにおいて避けられるべきである：セレンが化学的には硫黄とほぼ同一であっても、この領域における変異の回避は、変異が三量体化能を変化させ、従って操作されたVSV-Gタンパク質の機能を変化させ得るといういずれの可能性をも最小にする。Ａ．VSV-G 遺伝子の変異誘発 VSV-G cDNAの配列分析は、15個のシステイン残基がコーディング配列のアミノ末端部分に集中し（図２を参照のこと）、このうち11個のシステインはUGCによりコードされ、そして４個のシステインはUGUコドンによりコードされることを証明する(Rose，J.Virol．39: 519-528，1981)。２個のシステインは、細胞表面へのVSV-Gタンパク質輸送の間に切断されるNH₂末端シグナル配列（16アミノ酸）に含まれるので、約67kDの成熟タンパク質は13個のみのシステインを含む。タンパク質は、細胞表面上に非共有結合したホモ三量体として存在する。 VSV-Gのコーディング領域の分析は、PCRに基づく変異誘発のための基質として使用され得る４つの制限フラグメントの単離を可能にするための便利な制限部位が存在することを示す。制限フラグメントは以下の通りである：フラグメントサイズシステインの数 ClaI-NdeI 540bp ８ NdeI-StyI 120bp ２ StyI-PstI 150bp ２ PstI-KpnI 220bp ２ 30未満のヌクレオチドにより隔てられ、そしてオパールターミネーターコドンに対する対として変異誘発され得る、３対のシステイン残基が同定されている。PC Rに基づく変異誘発を、VSV-Gコーディング配列の個々の制限フラグメントで行い得、そして一過性系においてVSV-G発現への１、２、または４個のオパール変異の影響を試験し得る。ClaI-StyIフラグメント（660bp）は10個のシステインを含み、それによりネスティッドプライマーを用いる２対のシステインの変異誘発を同時に可能にする。変異誘発スキームは、好ましくは、制限フラグメントにおける個々のまたは複数のシステインの変異誘発を可能にする変異誘発プライマーの異なる組合せを用いて行われる。この方法は、野生型および変異誘発フラグメントの「ライブラリー」を提供し、これは組合せ様式で容易に再結合されて、異なるオパール変異を含む完全長VSV-G遺伝子を作製し得る。次いで、PCR産物を、クローニングし、そして変異誘発の忠実度をチェックするために配列決定する。次いで、フラグメントを最初に再結合して、１、２、または４以上のcys-＞オパール変異を含む完全長VSV-G変異体を作製する。Ｂ．変異VSV-G遺伝子のセレン応答エレメント(SRE)への融合変異誘発したVSV-G遺伝子を、Shenら(J.Biol.Chem．268: 11463-11469，1993) に記載されるのと同様の様式で、ヒトGPX1遺伝子からの3'非翻訳領域に融合し得る。より詳細には、VSV-G遺伝子を、pcDNA3(Invitrogen，San Diego，CA)のポリリンカーに挿入し、そしてGPX1からのSRE（cDNAヌクレオチド920〜1070）を、VS V-G遺伝子の3'側に挿入し得る。さらに、ネオマイシン選択マーカーは、ハイグロマイシン耐性マーカーを置換し得る。実施例10 プレプロデューサー細胞株の作製Ａ．プレプロデューサー細胞株の作製プレプロデューサー細胞株は、gag/pol遺伝子およびレトロウイルスベクターを含むが、エンベロープ遺伝子を欠いている細胞である。このような細胞株を、本質的に以下のように生成し得る。簡単には、N2βgalを使用して、293 2-3細胞（これは、gag/pol発現カセットのみを含む）を形質導入し、そしてG418耐性コロニーを単離する。次いで、クローンをβgal発現について試験し、そして安定なポジティブクローンを単離する。Ｂ．セレン欠乏培地における増殖についてのプレプロデューサー細胞株の試験 293 2-3/βgalプレプロデューサー細胞をDMEM-10％FBS中で解凍し、そしてセレン欠乏培地（例えば、インシュリン/トランスフェリンを補充したDMEM（IT，C ollaborative Resaerch））（一般的には、Speierら、上記を参照のこと）に計画的に適応させた。このプロトコルは、FBS含有培地における最初の増殖、およびIT含有培地における同時増加を伴う培地からのFBSの連続枯渇を含む。セレン欠乏状態への適応手順は通常２〜３週間以内に完了し、そして適応した細胞はしばしばセレン欠乏状態で３ケ月を超えて維持され得る。実施例11 VSV-Gタンパク質のセレン調節性発現のためのプロデューサー細胞株の作製および試験Ａ．VSV-G/SRE により安定にトランスフェクトされた293 2-3/β-gal細胞の作製 VSV-G/SRE発現構築物を、エレクトロポレーションまたはCaPO₄手順のいずれかを用いて293 2-3/β-gal細胞中にトランスフェクトする。全てのトランスフェクションおよび希釈クローニング手順を、セレン欠乏培地で行う。VSV-G/SREでトランスフェクトした293 2-3/β-gal細胞をハイグロマイシン中で選択し、そして耐性細胞を、限界希釈によりクローニングして単一細胞のクローンを作製する。Ｂ．セレン調節性VSV-G発現についての最初のスクリーニング単一細胞のクローンの拡大の間に、細胞の抗生物質耐性プールを、VSV-G/SRE のセレン調節性発現についての予備スクリーニングに供する。細胞を、30％コンフルエンシーまで増殖させ（コンフルエンスが達成されるまで約３日かかる）、そしてセレンを、生物利用可能な形態である亜セレン酸ナトリウムとして25ng/m lで培地に添加する。VSV-Gタンパク質は迅速に出現し、そして細胞は、セレン過多に応答して48時間以内に融合を開始する。実施例12 超大規模一過性トランスフェクションによるレトロウイルスベクターの産生Ａ．導入細胞株からの新たに導入されたタンパク質の高レベル発現が、しばしば（すなわち、レトロウイルスベクターパッケージング細胞株においてgag-polまたはエンベロープタンパク質を発現するために）所望される。しかし、いくつかの場合において、VSV Gのような毒性タンパク質の細胞変性効果または細胞分裂抑制性効果は、安定にトランスフェクトされそして安定に発現する細胞株におけるそれらの有用性を厳しく制限または排除するために、それらの最大の安定な発現レベルを厳しく制限し得る。安定な発現に対する有用な代替物は、発現プラスミドの一過性トランスフェクションの後の一過性発現である。このようなトランスフェクションは、DEAE Dextran、エレクトロポレーション、リポソーム、またはCaPO₄ 沈澱のいずれかを利用して達成され得る（代表的なプロトコルについては、Cur rent Protocols in Molecular Biology またはMolecular Cloning，a Laborator y Manualを参照のこと）。一過性トランスフェクションの後に、ある割合の細胞が吸収し(take up)、そして少なくとも数日間、たとえ毒性遺伝子でも適度に高レベルで発現する。レトロウイルスベクターの産生のために、CaPO₄での一過性トランスフェクションは、単純さ、１細胞あたりの高DNAコピー数および発現、ならびに最も重要には高力価のベクター産生を含む理由のために最もよく選択される一過性トランスフェクション方法であった。それは、いずれかの代表的なレトロウイルスエンベロープタンパク質を用いる小規模ベクター産生のために（Fi nerら、Blood 83: 43-50，1994; Pearら、PNAS USA 90: 8392，1993)、またはVS V Gタンパク質での偽型化のために（Burnsら、PNAS USA 90: 8033-8037，1993）使用されている。この方法論は、種々の異なるベクターの少量または試験量を作製するためによく適応されるが、中規模または大規模の産生にはほとんど適さない。例えば、CaPO₄トランスフェクション効率は、溶液の正確なpHおよび十分に理解されていない多くの他のパラメーターに依存して広範に変化することが知られている。一般的に、10cm以下のプレートにおける細胞のトランスフェクションを明記する、公表されたプロトコル(すなわち、Current Protocols in Molecula r BiologyまたはMolecular Cloning，a Laboratory Manual)からの小さなプロトコルの変動を超えると寛容でないと考えられる。従って、CaPO₄トランスフェクションの公表された説明は、代表的には、自由な気体交換およびC0₂平衡のために10cm以下のプレートを特定する。次いで、任意の規模拡大が、例えば、J.Yee ら（Yeeら、「高力価の汎親和性レトロウイルスベクターの作製のための一般的な方法:初代肝細胞の高効率感染」、PNAS USA 91: 9564-9568，1994)による最近の論文のように、多数のこれらのプレートを取り扱うことによりなされる。小プレートトランスフェクションの規模拡大能力は、明らかに制限される。以下でより詳細に記載するように、培養工場（各1200〜6,000cm²）を利用して、伝統的な小プレートにおけるトランスフェクションで得られる粗力価と同等かまたはそれより大きな粗力価を有するレトロウイルスベクターを産生し得る。このプロトコルは単純であり、通常の安価な試薬を使用して所望のプラスミドをトランスフェクトし、そしてこれは、以前に報告された一過性トランスフェクション方法での実際的な量よりもずっと多量のレトロウイルスベクターの産生を非常に容易にする。表１は、G偽型N2β-galレトロウイルスベクターを産生するための、２層の1200cm²細胞工場における293 2-3細胞の１回の感染の結果を示す。本明細書中に記載される単純なプロトコルは、細胞を覆う培地へのCaPO₄沈澱DNAの添加、および24時間後の新鮮な培地の交換しか必要とせず、従って、多数の細胞工場を容易に計れる。これは、数十リットルまたは数百リットルの高力価G偽型ベクターの産生を可能にする。細胞株293 2-3は、ヒト胚性腎臓293細胞に由来するMLV gag-pol発現クローンである。プラスミドpMLP-Gは、アデノウイルスMLPプロモーターからVSV Gを発現する。試験レトロウイルスベクターpN2 B-gal neoを含むプラスミドを、pMLP-Gプラスミドと共に同時トランスフェクトする。同様の力価を、この同時トランスフェクション方法、または293 2-3/B-gal細胞株（B-galベクターで形質導入された 293 2-3クローン）へのpMLP-G単独のトランスフェクションのいずれかを利用して得ることができる。Ｂ．CaPO₄ バルクトランスフェクションによるG偽型レトロウイルスベクターの産生１．トランスフェクションのための細胞の調製 293 2-3と呼ばれる、MLV gag-polを発現する293細胞(ATCC CRL1573)を、約120 0cm²細胞培養領域の２層細胞工場(Nunc)へのトランスフェクション日前に継代する。細胞株293のこのgag pol発現クローンを、他の場所で記載されているような標準的な方法により作製する。４〜48時間、好ましくは18〜24時間後に、好ましくは30％〜90％、最も好ましくは60％〜80％のコンフルエンスのレベルに達した細胞をトランスフェクションのために使用する。２．DNA CaPO₄沈殿物の調製２つのプラスミドを、１つの沈殿物に同時トランスフェクションする。プラスミドMLP-Gは、VSV G遺伝子を発現し、そしてプラスミドpCBβ-galは、β-galおよびネオマイシン耐性遺伝子を発現するレトロウイルスベクターを含む。100cm² の培養領域毎に対して、10〜40μgの各プラスミド、好ましくは約20μgを使用する。プラスミドは、Quiagenキット標準方法により調製する。必要に応じて、それらを、エタノール沈澱またはクロロホルム抽出によりトランスフェクション前に滅菌する。細胞工場に対して、TE(10mM Tris(pH7.4)、１mM EDTA)中の約240μ gの各プラスミドを、50mlポリプロピレンコニカルチューブ(CorningまたはFalco n)中で混合し、次いでTrisの最終濃度が２mM以下になるように、水およびTE(1/1 0TE)で10.8ml(0.9ml/100cm²)に希釈する。次いで、1.2ml(0.1ml/100cm²)の2.5M CaCl₂を混合する。別々の50mlチューブに、12mlのHepes緩衝化生理食塩水(２×H eBS)(pH約7.08)を添加する（以下の溶液処方を参照のこと）。滅菌組織培養フードにおいて、DNA混合物が、約30秒の期間にわたってピペットからゆっくりした滴下添加により添加される間、２×HeBSを断続的にボルテックスする。得られた沈殿物を室温で15分間放置する。３．トランスフェクション標準的な増殖培地を細胞から取り出し、DNA沈殿物をそれに添加し、そして培地およびDNAを細胞工場に穏やかに戻す。４〜24時間、好ましくは16〜24時間後、培地を取り除き、そして細胞を約50mlのPBSで２回リンスする。次いで、新鮮な培地を、培地を一日一回の割合で所望の採集日数の間置換するが、少なくとも２日（トランスフェクション後の２日目および３日目）は、常に、最良の力価のための典型的に最適な日として収集される。４．溶液 2.5M CaCl₂：１リットルあたり367.4gのCaCl₂二水和物(dihydride)をフィルター滅菌する。２×HeBS:0.21g Na₂HPO₄、16.4g NaCl、11.9g HEPES酸、約800ml H₂O。1ON Na OHでpHを7.08に調節し、そしてH₂Oで１リットルに調節する。フィルター滅菌し、そしてアリコートで-20℃で貯蔵する。実施例13 プロデューサー細胞におけるシンシチウムの誘導を妨げるVSV-G融合タンパク質Ａ．背景以下により詳細に記載するように、VSV-GのＣ末端の最後の49アミノ酸（膜貫通ドメイン(TM)を含む）は、MoML Venvの最後の54アミノ酸と置換され得る。このキメラタンパク質は、いくつかのMLV成分：膜貫通ドメイン、両親媒性ループ、およびRペプチドを含む。同様に作製され得る他のキメラタンパク質は、TMドメイン内のまたは外側の２つのエンベロープタンパク質の融合を含み、例えば、全VSV-GTMドメインまたはV SV-GTMドメインの一部はＣ末端内のMLV配列と融合される。本明細書中で利用されるように、エンベロープタンパク質および２つのタンパク質配列の融合物由来の配列組合せは、得られるキメラの弱毒化フューゾジェニシティー(fusogenicit y)を導くことが理解されるべきである。Ｂ．VSV-G 融合タンパク質の構築例示のために、VSV-GのＣ末端の最後の49アミノ酸の、等価なMLVのＣ末端54アミノ酸での置換を以下に記載する。得られたアミノ酸配列を以下に示す。接合部を(::)で示す: (VSV-G Indiana)...GWFSSWK::IMGPLIVLLLFGP...-(Ampho env-4070A)... １．材料： SV40ポリAを含むMoMLV 4070A Amphoエンベロープ発現ベクターpEnvAm-Dra。VS V(Indiana株)エンベロープタンパク質Ｇは、pMLP-Gに由来する。pSC6は、CMVプロモーター発現カセットである（WO 91/02805を参照のこと）。キメラタンパク質の構築は、重複PCR法および以下のプライマーを利用する：プライマーI：（VSV-G:803〜825bp;PstI部位を含む）（配列番号10） PstI 5'GG ATC TCT TTG CTG CAG CCA GAT プライマーII：（接合配列：Gの1398〜1415およびAmphoの7616〜7634）（配列番号11） 5'TGG TTC AGT AGT TGG AAA/ATC ATG GGA CCT CTA ATA G プライマーIII：（プライマーIIと相補的）（配列番号12） 5'C TAT TAG AGG TCC CAT GAT/TTT CCA ACT ACT GAA CCA プライマーIV：（pEnvAm-Dra由来のSV40ポリA;161〜185bp；BamHI部位;ネガティブ鎖）（配列番号13） BamHI 5'C ATG TCT GGA TCC CCA GGA AGC TCC ２．発現ベクターの構築：プライマー（IおよびIIならびにIIIおよびIV）の２セットを用いたPCR増幅DNA をアニールし、そしてプライマーIおよびIVを用いてPCR増幅する。得られたDNA を、制限酵素PstIおよびBamHIで消化する。得られたハイブリッドG/Aの約900bp のフラグメントを、VSV-G DNAのClaI（平滑化）からPstI(800bp)と共にpSC6（Ec oRVおよびBamHI消化）にクローニングする。このプラスミドはpG/Aと命名する。３．細胞培養/力価アッセイ（ａ）ハイブリッドenvプラスミドDNA(pG/A)を、上記のようにCaPO₄沈澱法を用いてgag-pol発現293/2-3細胞にトランスフェクトする。シンシチウムの形成を、１、２、および３日後に視覚的に評価する。（ｂ）並行して、pG/Aを、pKT-1と共に293/2-3およびSCV21またはDA gag-pol細胞に同時トランスフェクトして、一過性力価およびエンベロープ機能性を評価する。この一過性（48時間）発現方法は上述される。pMLP-GおよびN2βgalの上記の細胞への同時トランスフェクションを、この実験のコントロールとして使用する。（ｃ）プロデューサー細胞におけるハイブリッドエンベロープの安定な発現を評価するために：トランスフェクションの48時間後に、細胞（上記の（ｂ）由来）をG418選択に10日間供し、そして安定なプールをベクター産生、感染性、およびシンシチウムを形成するいずれかの傾向について試験する。実施例14 レトロウイルスベクターを偽型化するための、水泡性口内炎ウイルスＧタンパク質を発現する組換えサイトメガロウイルスの使用Ａ．材料および方法１．ウイルスおよび細胞株野生型MCMV（Smith株K181＋）、RM427、およびRMCMVGを増殖させ、そしてMann ingら、J.Vir．66: 3794-3802，1992；Stoddart，J.Vir．68(10):6243-6253，19 94に記載されるようにNIH3T3細胞で力価測定した。NIH3T3、HeLa、293、および2 93 gag/pol（gagおよびpolを含むがenv遺伝子を欠く293細胞株）の細胞を、10％ウシ胎児血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地中で増殖させた。２．プラスミドおよび組換えウイルスの調製プラスミドクローニングは、標準的な技術(Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第２版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)によるものである。pON401は、MCMVのHindIIILフラグメントを含む（Manningら、V ir．66:3794-3802，1992)。pCMV-Gは、HCMV ielプロモーター-エンハンサーの転写制御下のVSV-Gタンパク質を含む。pON401CMVGを構築するために、VSV-Gを含む pCMV-Gの2665bp Hinc IIフラグメントを、pON401のHpaI部位の間にクローニングする（図３）。これは、pON401における79bpのHpaIフラグメントの欠失をもたらす。pMLP-Gは、アデノウイルス主要後期プロモーターの転写制御下のVSVGタンパク質を含む。組換えMCMVの産生および単離のためのプロトコルは記載されている(Manningら、Vir．167:477-484，1988)。簡単には、15μgの線状pON401CMVGを、リン酸カルシウム沈澱を用いてRM427ウイルスDNAと共に同時トランスフェクションする。トランスフェクションにおいて用いるRM427 DNAの量を、各ウイルスDNA調製物について経験的に決定する。同時トランスフェクション物を、細胞変性効果(cpe)が完了した時（トランスフェクションの約５日後）に採集する。 β-gal組換え体を単離するために、限界希釈アッセイを行う。簡単には、NIH3 T3細胞（10⁴細胞/ウェル）を、96ウェル組織培養プレートに播種する。同時トランスフェクションから生じた組換えウイルスプールを力価測定し、次いでこれを使用して、96ウェルプレート当たり約75プラーク形成単位(pfu)を含む希釈で96 ウェルプレートを感染させた。細胞変性効果(cpe)が明らかになるとき（感染の約７日後）、メチルウンベリフェテロン(methyl umberryliferone)(MUG)を、150 μg/mlの最終濃度で全てのウェルに添加する。種々の時点（３〜24時間）で、プレートをUVライトボックス上に置き、そして写真を撮る。親β-gal＋ウイルス (RM427)を含むウェルは蛍光を発する。非感染ウェル、またはβ-gal組み換え体により感染されたウェルは、蛍光を発しない。cpeを有しそして蛍光を有さないウェル由来のウイルスを増殖させ、そしてDNAブロット分析により分析する。３．DNA分析ウイルスDNAを、精製ビリオンから調製し(Vieiraら、J.Virol．68: 4837-4846 ，1994)、そして以前に記載されたように(Manningら、Vir．167:477-484，1988) 、DNAブロット分析に供する。４．感染細胞タンパク質の単離およびイムノブロッティング総細胞タンパク質を調製するために、細胞を、10の感染多重度(MOI)でウイルスに感染させる。適切な時点で、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水でリンスし、次いでアプロチニン(２μg/ml)、ペプスタチン(１μg/ml)、ロイペプチン(２μg/m l)、およびPeflabloc SC(１mg/ml)を補充したNP40溶解緩衝液（100mM NaCl,20mM Tris(pH7.5)，1mM EDTA，0.5％NP40，0.5％デオキシコール酸塩）中に溶解する。全てのプロテアーゼインヒビターをBoehringer Mannheimから購入する。プレートを氷上で５分間インキュベートする。細胞を引っかくことにより採集し、1. 5mlの微小遠心チューブに入れ、そして４℃で10分間、微小遠心において高速でスピンする。上清を収集し、そして分析するまで−80℃で貯蔵する。感染細胞タンパク質を、10％SDSポリアクリルアミドゲル(Novex)で分離し、ニトロセルロースに移し、そしてウェスタンブロット分析に供する。一次抗体は、１：100,000の希釈で使用される、VSV-G糖タンパク質に対するマウスモノクローナル(Sigma ImmunoChemicals)である。ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス(Boeh ringer Mannheim)を、１：30,000の希釈で二次抗体として使用する。ブロットを、製造者の指示に従ってECL(Amersham)を用いて発色させる。５．プロデューサー細胞、レトロウイルスベクター産生、および力価測定偽型ベクターの産生における使用のための細胞株を作製するために、293gag/p ol細胞をN2 β-gal、VSV-G偽型レトロウイルスベクターで感染させる。N2 βgal は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(neor)およびβ-ガラクトシダーゼ( β-gal)の遺伝子を含む。G418耐性クローンを選択する。得られた細胞株のBluo gal(GIBCO BRL)での染色は、全ての細胞が青色であることを示す。VSV-G偽型レトロウイルスを産生するために、293gag/pol(N2 β-gal)細胞の10cmプレートを、2mlの総容量中で所望のMOIでRMCMVGを用いて感染する。感染の２時間後、細胞を２回洗浄し、次いで採集するまで２mlの培地中でインキュベートする。感染の 24時間または48時間後、上清を濾過し(0.45μm孔)、そして力価測定まで−80℃ で貯蔵する。上清をHeLa細胞で力価測定する。感染日前に、10cmプレートに２× 10⁶細胞で播種する。１日目に、プレートを、ポリブレン（Sigma;８μg/ml）を含む２mlの培地中の100μlの上清で感染させる。２時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、そして新鮮な培地で一晩インキュベートする。２日目に、RMCMVG感染細胞由来の上清で感染したプレートを、1:10および1:100で分割する(split)。モックまたは野生型MCMV感染上清由来のものを、1:2で分割する。３日目に、G418(Sigma; 1mg/ml)を培地に添加する。10日〜14日後に、コロニーを染色し、そして計数する。Ｂ．結果１．RMCMVGの構築 RMCMVGを、NIH3T3細胞のRM427 DNAおよびpON401-CMVGでの同時トランスフェクションに従って単離する（図３）。β-gal組み換え体についての８つの96ウェルプレートをスクリーニングした後、β-galウイルスを含んだ６つのウェルを同定する。これらのうちの３つを増殖させ、そしてプラークをさらに精製する。これらは、２つの独立した同時トランスフェクションから生じる組換え体を示す。ウイルスDNAを、これらの３つの単離物から調製し、そしてDNAブロット分析に供する。図４に示すように、全てのこれらの組換えウイルスは、VSV-G組換え体について予想される5.7kbpおよび4.3kbpのHindIIIバンドを含む。単離物D9を増殖させ、そして約１×10⁸のプラーク形成単位(PFU)/mlのストック力価を得る。これは、VSV-G発現が細胞培養でのMCMV複製に対して毒性ではないことを示す、野生型MCMVのストック力価と同一である。野生型MCMVとは対照的に、RMCMVGプラークは、著しいシンシチウム表現型を証明した（図5A）。２．RMCMVGは、許容細胞および非許容細胞においてVSV G糖タンパク質を発現する。 NIH3T3細胞を、RMCMVGの３つの単離物で感染させ、そしてウェスタンブロット分析に供する。図６において証明するように、３つ全ての単離物で感染したNIH3 T3細胞は、感染の24時間後に大量のＧタンパク質を発現した。RM427で感染した細胞は、VSV-G発現を示さなかった。ポジティブコントロールとして、293細胞の pMLP-Gでのトランスフェクション後に産生されたＧ糖タンパク質を含むレーンを含める。RMCMVGがＧタンパク質を非許容細胞で発現するかどうかを決定するために、293細胞をRMCMVGで感染させ、そしてタンパク質を感染の６、24、および48 時間後に採集する。図７に示すように、VSV-Gタンパク質発現は、感染の６時間後に早くにも検出されるが、感染の24時間後にピークに達する。３．RMCMVG感染を使用して、レトロウイルスベクターを偽型化し得る。 RMCMVGのレトロウイルスベクターを偽型化する能力を調べるために、293gag/p ol(N2 β-gal)細胞を、野生型MCMVまたはRMCMVGのいずれかで感染させる。上清を、感染の24時間および48時間後の細胞から収集し、そして力価測定する。表１に示すように、10または20のM0IでのRMCMVGによる感染の24時間後の細胞上清において、１×10⁴コロニー形成単位(CFU)/mlのピークneo力価を見出す。モック感染細胞または野生型MCMV感染細胞の上清において、レトロウイルス力価を見出さない。表１ RMCMVG または野生型MCMVでの感染後の293gag/pol(N2 β-gal)細胞からのVSV-G偽型ベクター産生 293細胞は、MCMV複製に対して許容的ではないので、上清中のRMCMVGは存在しないはずである。上清をRMCMVGについて力価測定した場合、200プラーク形成単位(PFU)/mlの力価が見出される（データは示さず）。この少量のMCMVは、恐らく、最初の感染から残存するウイルスである。レトロウイルスベクターと比較して大きなサイズのMCMV(300nm)は、この残存MCMVの上清からの単純な除去を可能にするはずである。前述から、本発明の特定の実施態様が例示の目的のために本明細書中に記載されているが、種々の改変が本発明の精神および範囲を逸脱することなくなされ得ることが理解される。従って、本発明は、添付の請求の範囲を除いては限定されない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者サウター，シビルアメリカ合衆国カリフォルニア 92014, デルマー，ストラトフォードコートナンバー17 639 (72)発明者ロビンス，ジョアンアメリカ合衆国カリフォルニア 92109, サンディエゴ，チャルセドニーストリート 2160 (72)発明者ジョリー，ダグラスジェイ. アメリカ合衆国カリフォルニア 92924, リューカディア，ヒルクレストドライブ 277 (72)発明者マニング，ウィリアムシー. アメリカ合衆国カリフォルニア 94061, レッドウッドシティー，カントリークラブドライブ 3660 (72)発明者マーフィー，ジョンイー. アメリカ合衆国カリフォルニア 94618, オークランド，ハーバードコート 49 (72)発明者ラルストン，ロバートオー．，ザセカンドアメリカ合衆国テキサス 77381―6317, ザウッドランズ，レイクリーフプレイス６

Claims

【特許請求の範囲】１．毒性タンパク質または融合性タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結されたマウスCMV IEプロモーターを含む、発現ベクター。２．融合性タンパク質をコードする核酸配列の発現を指向する厳密に制御可能なプロモーターを含む、発現ベクター。３．前記融合性タンパク質が水胞性口内炎ウイルスGタンパク質である、請求項１または２に記載の発現ベクター。４．前記厳密に制御可能なプロモーターがtTAプロモーター系である、請求項２に記載の発現ベクター。５．前記厳密に制御可能なプロモーターがLAPプロモーター系である、請求項２に記載の発現ベクター。６．セレン反応性エレメントをさらに含む、請求項１または２に記載の発現ベクター。７．融合性タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター、およびセレン反応性エレメントを含む発現ベクターであって、ここで該融合性タンパク質をコードする配列内の１つ以上のシステイン残基がオパール終止コドンに変換されている、発現ベクター。８．細胞に対して毒性のタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター、およびセレン反応性エレメントを含む発現ベクターであって、ここで該毒性タンパク質をコードする配列によりコードされる１つ以上のシステイン残基がオパール終止コドンに変換されている、発現ベクター。９．請求項１〜８のいずれか１つに記載の発現ベクターを含む、レトロウイルスベクター。１０．gag/pol発現カセットおよび請求項１〜８のいずれか１つに記載の発現ベクターを含む、パッケージング細胞株。１１．gag/pol発現カセット、請求項１〜７のいずれか１つに記載の発現ベクター、およびレトロウイルスベクター構築物を含む、プロデューサー細胞株。１２．融合性タンパク質をコードする変異核酸分子であって、該核酸分子内の１つ以上のシステイン残基がオパール終止コドンに変換されている、変異核酸分子。１３．細胞に毒性のタンパク質をコードする変異核酸分子であって、該核酸分子内の１つ以上のシステイン残基がオパール終止コドンに変換されている、変異核酸分子。１４．一過的にレトロベクター粒子を産生する方法であって、該方法は以下の工程： (a) gag/pol発現カセットおよびレトロウイルスベクター構築物を含む10³〜10⁵ 個の細胞を、該細胞が対数増殖期に入るのを可能にするのに充分な条件下および時間で、225cm²を超える表面積を有する培養物中でインキュベートする工程；および (b) 請求項１〜８のいずれか１つに記載の発現ベクターを該培養物に導入することにより、該レトロベクター粒子が一過的に該細胞から生産され得る工程、を包含する、方法。１５．毒性タンパク質または融合性タンパク質の発現を指向させ、生来の種において複製コンピテントであり、他の種において複製コンピテントでない、組換えウイルス。１６．グリコシル化された毒性タンパク質または融合性タンパク質の発現を指向する発現ベクターを保持する、変換または変異されたグリコシル化経路を有する細胞株。