CN115252553A - 一种人参皂苷卡巴他赛脂质体、其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人参皂苷卡巴他赛脂质体、其制备方法和应用。本发明提供了一种人参皂苷卡巴他赛脂质体，其包括如下质量分数的组分：8‑25份磷脂、0.5‑3份人参皂苷、1份卡巴他赛及15‑35份冻干保护剂；所述脂质体不含胆固醇、大豆油以及油酸钠中的任一种。本发明中所述的人参皂苷卡巴他赛脂质体具有更好的Glut1的主动靶向性；药效比常规的人参皂苷卡巴他赛脂质体提高2倍以上；毒性比常规的人参皂苷卡巴他赛脂质体降低1.5倍以上，比常规胆固醇卡巴他赛脂质体降低2倍以上。

Description

一种人参皂苷卡巴他赛脂质体、其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种人参皂苷卡巴他赛脂质体、其制备方法和应用；特别是一种高效低毒的注射用人参皂苷卡巴他赛脂质体、其制备方法和应用。
背景技术
脂质体是一种定向载药系统，属于靶向给药系统的一种特殊剂型，它可以将药物包埋在直径为纳米级的微粒中，这种微粒类似于生物膜结构中双分子层微小囊泡，进入人体内主要被网状内皮系统吞噬，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在靶向组织中积蓄，从而提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。
本发明是在CN201610693884.2、CN201811447245.3和CN201811447243.4等中国发明申请专利的基础上进行的技术创新。上述三篇申请专利都公开了以人参皂苷为膜材的脂质体在包载紫杉醇等化疗药物之后，其相关脂质体质量稳定、药效显著等技术优势。
CN201610693884.2公开了一种以人参皂苷Rg5及其衍生物为膜材的空白脂质体和应用，处方中除了包括磷脂、皂苷、药物、冻干保护剂外，还可进一步包括胆固醇、抗氧化剂、大豆油和/或油酸钠等其他辅料。
CN201811447245.3公开了一种以人参皂苷Rh5H及其衍生物为膜材的空白脂质体和应用，该专利在CN201610693884.2基础上，进一步解决了人参皂苷的溶血性问题。同样，处方中除了包括磷脂、皂苷、药物、冻干保护剂外，还可进一步包括胆固醇、抗氧化剂、大豆油和/或油酸钠等其他辅料。
CN201811447243.4公开了一种以人参皂苷Rg3及其衍生物为膜材的空白脂质体和应用。该专利将Rg3、Rh2等皂苷通过超微粉等技术手段，解决了人参皂苷在氯仿中的溶解度问题，从而解决了Rg3和Rh2等人参皂苷必须在氯仿中成膜的难题，制备得到了质量符合标准的Rg3类脂质体。
上述现有技术仍存在一些不足的地方，例如部分方案中脂质体生产均质步骤所需压力较大，滤膜除菌过滤的速度慢，截留率高，产品收率明显较差；需要添加2-6倍量的大豆油。但是由于大豆油的添加，又不利于制剂冻干，影响药物的长期保存。
复方制剂的核心是药物在体内的协同相互作用，并能显著提高药物临床治疗效果。复方制剂各功能组分合理的比例范围是构成复方制剂的核心，尤其是复方脂质体在功能组分发生变化而引起的药物协同、体内药代、体内组织分布、药效等改变，均鲜有人涉及。因此，针对注射用人参皂苷卡巴他赛脂质体(以下简称“Ginposome-CTX”或“Ginposome-CTX”)，在主药“卡巴他赛”已确定，如何选择最合适的“协同作用药物兼辅料”人参皂苷和关键辅料“磷脂”及其相关比例，制备出配伍合理、粒径小、质量稳定、药效和毒性均达到最佳效果，使得本发明的药物和关键辅料特定比例的组合物具有创新性和唯一性，具有十分重要的意义。
处方筛选中，药物、磷脂、皂苷、冻干保护剂和制备工艺等诸多因素中，任何一个因素的变化都将对产品的质量、药效和安全性产生致命的影响。例如增加皂苷与紫杉醇的质量比，能增加复方脂质体的质量稳定性和协同抗肿瘤效果，增加对肿瘤组织的靶向性分布，但也会增加皂苷在人体内的累积毒性并造成不可控器官损伤；合适的皂苷与紫杉醇的质量比，对该类型脂质体的稳定性、主动靶向性、药效学和安全性有非常重要的关联性。同时，选择不同的冻干保护剂，对脂质体冻干过程中脂质双层结构的不受破坏和冻干药物复溶后恢复脂质体的特性有至关重要的作用。例如，在冻干保护剂的选择中，不同冻干保护剂对冻干曲线具有不同影响，尤其是在复方脂质体的共溶点、是否塌陷、脂质体复溶后是否显著改变、一次冻干温度和时间设定、冻干总时间长短等诸多方面具有重要影响。
药品的安全性和有效性是药品的两个基本属性，缺一不可，药品的审批和使用都是基于两者之间的风险收益比来考量，尤其是改良型新药，其核心就是提高有效性和安全性。
在毒理学研究中，制剂学研究起着至关重要的作用，尤其是处方比例和制备工艺的选择对急性毒性、长期毒性和各个功能器官的累积毒性的各个影响，都将直接决定着该复方脂质体是否符合新药申报要求。
可见，上述脂质体处方膜成分中的磷脂、人参皂苷、卡巴他赛和冻干保护剂糖类成分的最佳比例范围对所构成的复方脂质体的良好药学稳定性、体内分布、药效学和毒理学等性质具有重要作用。但是，这个最佳比例，现有技术未给出任何上述组分及比例以及工艺与药理活性、药代及毒理之间的推导关系。由于涉及的变量多，其筛选必须通过大量实验和创造性劳动的付出。
因此，如何选择一个最佳的复方药物配伍，如何制定最佳的制备工艺，以便生产出一种药效更好、毒性更低，质量和其他指标都能符合药品要求的注射用人参皂苷卡巴他赛脂质体，以便符合药品申报要求，需要大量的研究工作和技术攻关。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有卡巴他赛注射剂存在的不足，提供一种(复方)人参皂苷卡巴他赛脂质体、其制备方法和应用；其性质稳定、粒径小、药物包封率高、体内相容性良好、体内释药良好、药效更好、毒性更低、配伍合理；且其具有较好制备工艺，制备条件易于实现，利于产业化；实现了制备工艺与产品性能结合的优化。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明提供了一种(复方)人参皂苷卡巴他赛脂质体(以下简称“Ginposome-CTX”)，其包括如下质量分数的组分：8-25份磷脂、0.5-3份人参皂苷、1份卡巴他赛以及15-35份冻干保护剂；所述人参皂苷卡巴他赛质体不含有胆固醇、大豆油壹以及油酸钠中的任一种；
所述磷脂为天然磷脂和/或氢化磷脂，或者为PEG2000-DSPE与所述天然磷脂和/或氢化磷脂混合得到的混合磷脂；所述PEG2000-DSPE占所述混合磷脂的0.01-10wt％；
所述的人参皂苷选自20(S)-人参皂苷Rg3、人参皂苷伪Rg3、20(S)-人参皂苷Rh2、人参皂苷Rg5、人参皂苷Rk1、人参皂苷Rp1以及人参皂苷伪GQ中的一种或多种。
本发明中所述脂质体的膜相优选包含所述人参皂苷。
本发明中所述的脂质体的D90粒径优选为200nm以下，更优选150nm以下，进一步优选120nm以下。
本发明中所述脂质体的包封率优选80％以上，更优选90以上，进一步优选95％以上。
本发明中所述的天然磷脂可为本领域常规，优选蛋黄卵磷脂、大豆磷脂以及脑磷脂中的一种或多种，例如蛋黄卵磷脂、大豆磷脂或者脑磷脂。
本发明中所述的人身皂苷优选20(S)-人参皂苷Rg3和/或20(S)-人参皂苷Rh2，更优选20(S)-人参皂苷Rg3。
本发明中所述冻干保护剂可为本领域常规，优选海藻糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖和半乳糖中的一种或多种，更优选葡萄糖。
当本发明所述磷脂为天然磷脂时，其用量优选8-20份，例如10-16份。
当所述磷脂为混合磷脂时，所述混合磷脂的用量为15-20份；所述混合磷脂优选为将所述氢化磷脂与所述二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000(PEG2000-DSPE)混合得到的混合氢化磷脂，即：所述的磷脂为含有0.1-10％的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000(PEG2000-DSPE)的氢化磷脂(以下简称：混合氢化磷脂)。
本发明中所述冻干保护剂的用量优选20-25份。
本发明中所述人参皂苷的用量优选1-1.5份。即：所述的卡巴他赛与所述的人参皂苷的质量比可为1:1或1:1.5。
在本发明的某一实施方案中，所述人参皂苷卡巴他赛脂质体，其由如下质量分数的组分组成:12-18份磷脂、1-1.5份人参皂苷、1份卡巴他赛及25-35份冻干保护剂。
在本发明的某一实施方案中，所述的卡巴他赛与所述的磷脂的质量比可为1:12-18，例如1:15；例如，所述的卡巴他赛与蛋黄卵磷脂的质量比为1:15。
在本发明的某一实施方案中，所述的卡巴他赛与所述的混合氢化磷脂的质量比可为 1:18-25，例如20；例如，所述的卡巴他赛与含有1.67wt％PEG2000-DSPE的氢化磷脂的质量比为1:20。
在本发明的某一实施方案中，所述的卡巴他赛与所述的20(S)-人参皂苷Rg3的质量比为1:1；或，所述的卡巴他赛与所述的20(S)-人参皂苷Rg3的质量比为1:1.5；或，所述的卡巴他赛与所述的20(S)-人参皂苷Rh2的质量比为1:1；或，所述的卡巴他赛与所述的 20(S)-人参皂苷Rh2的质量比为1:1.5。
在本发明的某一实施方案中，所述的人参皂苷卡巴他赛脂质体粒径D90≤150nm，包封率≥98％。
在本发明的某一实施方案中，所述人参皂苷的HPLC纯度≥99％。
在本发明的某一实施方案中，所述磷脂为8-20份蛋黄卵磷脂；具体地，可为8份、10份、12份、14份、16份、18份或者20份蛋黄卵磷脂。
在本发明的某一实施方案中，所述磷脂为10份蛋黄卵磷脂以及0.5-3份二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000；具体地，可为10份蛋黄卵磷脂以及0.5份、1份、 1.5份、2份或者3份二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000。
在本发明的某一实施方案中，所述磷脂为15-20份氢化磷脂以及0.1-1份二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000；具体地，可为15份氢化磷脂及0.1、0.3、0.5、1份二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000，或者18份氢化磷脂及0.1、0.3、0.5、 1份二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000，20份氢化磷脂及0.1、0.3、0.5、1 份二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000。
在本发明的某一实施方案中，所述的人参皂苷为：0.5-1.5份人参皂苷Rp1、人参皂苷Rk1、20(S)-人参皂苷Rg3或者20(S)-人参皂苷Rh2；具体可为：1份20(S)-人参皂苷 Rg3、1.5份20(S)-人参皂苷Rg3、1份20(S)-人参皂苷Rh2，或者1.5份20(S)-人参皂苷 Rh2。
在本发明的某一实施方案中，所述的人参皂苷卡巴他赛脂质体包括如下质量分数的组分：12份磷脂、1份或1.5份人参皂苷、1份卡巴他赛及18份冻干保护剂。
在本发明的某一实施方案中，所述脂质体可包括如下质量分数的组分：
12份磷脂、1份20(S)-Rg3、1份卡巴他赛及18份冻干保护剂；
或，12份磷脂、1.5份20(S)-Rg3、1份卡巴他赛及18份冻干保护剂；
或，18份混合氢化磷脂、1份20(S)-Rg3、1份卡巴他赛及30份冻干保护剂；
或，18份混合氢化磷脂、1.5份20(S)-Rg3、1份卡巴他赛及30份冻干保护剂；
或，12份磷脂、1.5份20(S)-Rh2、1份卡巴他赛及18份冻干保护剂；
或，12份磷脂、1.5份20(S)-Rh2、1份卡巴他赛及18份冻干保护剂；
或，18份混合氢化磷脂、1份20(S)-Rh2、1份卡巴他赛及30份冻干保护剂；
或，18份混合氢化磷脂、1.5份20(S)-Rh2、1份卡巴他赛及30份冻干保护剂。
在本发明的某一实施方案中，所述的脂质体包含：12份天然磷脂、1份20(S)-人参皂苷Rg3、1份卡巴他赛及18份冻干保护剂。
在本发明的某一实施方案中，所述的脂质体包含：12份天然磷脂、1.5份20(S)-人参皂苷Rg3、1份卡巴他赛及18份冻干保护剂。
在本发明的某一实施方案中，所述的脂质体包含：18份混合磷脂、1份20(S)-人参皂苷Rg3、1份卡巴他赛及30份冻干保护剂。
在本发明的某一实施方案中，所述的脂质体包含：18份混合磷脂、1.5份20(S)-人参皂苷Rg3、1份卡巴他赛及30份冻干保护剂。
在本发明的某一实施方案中，所述的脂质体包含：12份天然磷脂、1.5份20(S)-人参皂苷Rh2、1份卡巴他赛及18份冻干保护剂。
在本发明的某一实施方案中，所述的脂质体包含：18份混合磷脂、1份20(S)-人参皂苷Rh2、1份卡巴他赛及30份冻干保护剂。
在本发明的某一实施方案中，所述的脂质体包含：18份混合磷脂、1.5份20(S)-人参皂苷Rh2、1份卡巴他赛及30份冻干保护剂。
在本发明的某一实施方案中，10份天然磷脂、1.5份20(S)-人参皂苷Rh2、1份卡巴他赛及30份冻干保护剂。
在本发明的某一实施方案中，10份天然磷脂、1.5份20(S)-人参皂苷Rh2、1份卡巴他赛及18份冻干保护剂。
在本发明的某一实施方案中，10份天然磷脂、1份20(S)-人参皂苷Rh2、1份卡巴他赛及18份冻干保护剂。
在本发明的某一实施方案中，10份天然磷脂、1份20(S)-人参皂苷Rh2、1份卡巴他赛及30份冻干保护剂。
在本发明的某一实施方案中，10份天然磷脂、1.5份20(S)-人参皂苷Rg3、1份卡巴他赛及30份冻干保护剂。
在本发明的某一实施方案中，10份天然磷脂、1.5份20(S)-人参皂苷Rg3、1份卡巴他赛及18份冻干保护剂。
在本发明的某一实施方案中，10份天然磷脂、1份20(S)-人参皂苷Rg3、1份卡巴他赛及18份冻干保护剂。
在本发明的某一实施方案中，10份天然磷脂、1份20(S)-人参皂苷Rg3、1份卡巴他赛及30份冻干保护剂。
以上：所述的天然磷脂优选蛋黄卵磷脂；
所述混合磷脂优选含有1.67wt％PEG2000-DSPE的氢化磷脂；
所述冻干保护剂优选葡萄糖。
在本发明的某一方案中，所述人参皂苷卡巴他赛脂质体可包括如下质量分数的组分:
12份蛋黄卵磷脂、1份20(S)-人参皂苷Rg3、1份卡巴他赛及18份葡萄糖；
或，12份蛋黄卵磷脂、1.5份20(S)-人参皂苷Rg3、1份卡巴他赛及18份葡萄糖。
或，18份含有1.67wt％PEG2000-DSPE的氢化磷脂、1份20(S)-Rg3、1份卡巴他赛及30份葡萄糖；
或，18份含有1.67wt％PEG2000-DSPE的氢化磷脂、1.5份20(S)-Rg3、1份卡巴他赛及30份葡萄糖；
或，18份含有1.67wt％PEG2000-DSPE的氢化磷脂、1.5份20(S)-Rg3、1份卡巴他赛；
或，12份蛋黄卵磷脂、1份20(S)-Rh2、1份卡巴他赛及18份葡萄糖；
或，12份蛋黄卵磷脂、1.5份20(S)-Rh2、1份卡巴他赛及18份葡萄糖；
或，18份含有1.67wt％PEG2000-DSPE的氢化磷脂、1份20(S)-Rh2、1份卡巴他赛及30份葡萄糖；
或，18份含有1.67wt％PEG2000-DSPE的氢化磷脂、1.5份20(S)-Rh2、1份卡巴他赛及30份葡萄糖。
或，18份含有1.67wt％PEG2000-DSPE的氢化磷脂、1.5份20(S)-Rh2、1份卡巴他赛。
本发明还提供了一种人参皂苷卡巴他赛脂质体的制备方法，其包括如下步骤；
步骤1、将卡巴他赛、人参皂苷、磷脂与有机溶剂的溶液A1，进行浓缩成膜；
步骤2、将步骤1得到的膜在水中保温水化后，与冻干保护剂溶液混合均匀，得到脂质体溶液A2；
步骤3、其为方案1或方案2；
方案1(高压均质法)包括如下步骤：
将步骤2得到的所述的脂质体溶液A2进行高压均质，控制粒径D90小于100nm，得到脂质体溶液A3a。
方案2(高速剪切+挤出法)包括如下步骤：
将步骤2得到的所述的脂质体溶液A2进行剪切后，分别通过400nm、200nm、100nm孔径挤出板挤出，控制粒径D90在100nm以下，得到脂质体溶液A3b；
其中，卡巴他赛、人参皂苷、磷脂以及冻干保护剂溶液的定义同如上所述(复方)人参皂苷卡巴他赛脂质体中所述。
在本发明的某一方案中，所述的步骤1中，所述的有机溶剂可为甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷中的一种或多种，优选甲醇和/或乙醇与氯仿和/或二氯甲烷的混合溶剂；例如乙醇:氯仿＝1:1或1:3(体积比)的混合溶剂。所述的有机溶剂的用量可不做具体限定，以能溶解卡巴他赛、人参皂苷、磷脂即可。例如卡巴他赛与所述的有机溶剂的质量体积比为 1g/90-250ml，例如1g/100mL或1g/200ml。
在本发明的某一方案中，所述的步骤1中，所述的溶液A1较佳地为将卡巴他赛、所述的人参皂苷、所述的磷脂等加热溶解于有机溶剂中得到；例如，将所述的人参皂苷、所述的磷脂加入到卡巴他赛与所述的有机溶剂的溶液中，加热溶解得到；所述的加热可为水浴加热至35-65℃，例如40-45℃，或55-60℃。
在本发明的某一方案中，所述的步骤1中，所述的浓缩可为减压浓缩；所述的减压浓缩可为真空＝-0.1mpa～-0.04mpa，例如-0.1～-0.04MPa；所述的浓缩至溶剂全部挥发完全即可；总浓缩时间较佳地为低于4小时。
在本发明的某一方案中，所述的步骤1中，所述的浓缩可为在旋蒸瓶中进行，转速可为40～60rp/min，例如50rp/min。
在本发明的某一方案中，所述的步骤2中，所述的水可为注射用水。
在本发明的某一方案中，所述的步骤2中，所述的冻干保护剂溶液的浓度可为0.15- 0.35mg/ml，例如0.18mg/mL或0.30mg/mL。
在本发明的某一方案中，所述的步骤2中，所述的水化的温度可为35-65℃，优选40- 45℃。
在本发明的某一方案中，所述的步骤2中，所述的水化为在旋蒸瓶中进行，转速为40-70rp/min，例如50rp/min或65rp/min。
在本发明的某一方案中，所述的步骤2中，所述的水化以溶液均一即可，例如2-4小时。
在本发明的某一方案中，所述的步骤2中，所述的卡巴他赛:冻干保护剂溶液＝1g:100- 300mL。
在本发明的某一方案中，所述的步骤2中，所述的冻干保护剂溶液的体积与所述的水的体积相同或不同。
在本发明的某一方案中，所述的步骤3的方案1中，所述的高压均质为在均质机中使用0～10℃冷冻水冷切循环；较佳地，确保脂质体溶液的温度在5-10℃。
在本发明的某一方案中，所述的步骤3的方案1中，所述的高压均质的压力在800-1400bar之间，例如1200bar。
在本发明的某一方案中，所述的步骤3的方案1中，所述的高压均质的次数可为3-4次，例如4次。
在本发明的某一方案中，所述的步骤3的方案2中，所述的剪切可在室温下进行。
在本发明的某一方案中，所述的步骤3的方案2中，所述的剪切的转速为1500-2200rp/min；例如2000rp/min。
在本发明的某一方案中，所述的步骤3的方案2中，所述的剪切的时间为5-10min；例如5min。
在本发明的某一方案中，所述的步骤3的方案2中，所述挤出的温度为35-45℃，例如40℃。
在本发明的某一方案中，所述的步骤3的方案2中，所述挤出板的孔径为150nm。
在本发明的某一方案中，所述的步骤3的方案2中，所述挤出的压力为600-800psi；例如800psi。
在本发明的某一方案中，所述的步骤3的方案2中，所述挤出的次数可为3-4次，例如4次。
本发明还提供了一种注射用人参皂苷卡巴他赛脂质体的制备方法，其包括如下步骤；
步骤1-1、如上所述的人参皂苷卡巴他赛脂质体的制备方法中的步骤1-3，得到脂质体溶液A3a或A3b；
步骤2-1、将所述的脂质体溶液A3a或A3b除菌过滤，得到脂质体溶液A4；
步骤3-1、将所述的脂质体溶液A4进行冷冻干燥，得到注射用人参皂苷卡巴他赛脂质体。
所述的制备方法中，所述的除菌过滤、冷冻干燥的条件和操作可为本领域该类工艺中常规的条件和操作；本发明中优选如下：
本发明的某一方案中，所述的步骤2-1中，所述的除菌过滤可采用0.22μm滤膜。
本发明的某一方案中，所述的步骤3-1中，所述的冷冻干燥可在西林瓶中进行，所述西林瓶可为本领域常规的西林瓶，例如20ml或30mL西林瓶。
本发明的某一方案中，所述的步骤5中，所述的冷冻干燥可为:在-50℃～-40℃温度范围内预冻，-30℃～-20℃范围内一次干燥，-5℃～5℃二次干燥，根据设定冻干曲线的程序控温，在48～72小时内将产品冷冻干燥至合格；
本发明的某一方案中，所述的制备方法还可进一步包括后处理，所述的后处理的条件和操作可为本领域该类工艺中常规的条件和操作；例如，所述的后处理包括如下步骤:步骤c中所述的保温结束后，全压塞，出箱；轧盖和包装，即可。
本发明还提供了一种注射用人参皂苷卡巴他赛脂质体，其由如上所述的注射用人参皂苷卡巴他赛脂质体的制备方法制备得到。
在本发明的某一方案中，所述的注射用人参皂苷卡巴他赛脂质体的粒径D90≤150nm，包封率≥98％。在本发明的某一方案中，所述人参皂苷的纯度≥99％。
本发明还提供了一种如上所述的人参皂苷卡巴他赛脂质体、或如上所述的注射用人参皂苷卡巴他赛脂质体在制备治疗和/或预防癌症药物中的应用。
所述的癌症可为前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、头颈癌和食管癌。
术语“粒径D90”是指一个样品的累计粒度分布百分数达到90％时所对应的粒径。它的物理意义是粒径小于它的颗粒占90％。
简称:蛋黄卵磷脂(EPC)，大豆磷脂(SPC)，胆固醇(Cho)，氢化磷脂(HSPC)，卡巴他赛 (CTX)
本发明的处方缩写解释如下所示:
Figure BDA0003050526140000091
Figure BDA0003050526140000101
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于:本发明提供的复方人参皂苷卡巴他赛脂质体具有对肿瘤细胞的靶向作用、抗多药耐药作用、增效减毒和药物协同作用。以实施例中注射用人参皂苷Rg3卡巴他赛脂质体为例，药效显著优于不在本发明请求保护的范围内的技术方案；说明了Rg3在注射用人参皂苷Rg3卡巴他赛脂质体中起到了更好的“药物、辅料、膜材、靶头”等多种作用，起到了良好的药物协同作用。具体地:
(1)药效显著提高。尤其是CTX-Rg3(1.0)/Lp组、CTX-Rg3(1.5)/Lp组、CTX- Rh2(1.0)/Lp组、CTX-Rh2(1.5)/Lp组的药效最佳，在第21天肿瘤完全消失。四组的中剂量(卡巴他赛＝2.5mg/kg)的抑瘤率优于Jevtana组、CTX-C/Lp组、CTX-Rg3(0.5)/Lp、CTX- Rh2(0.5)/Lp组、CTX-C-Rg3(1.8)/Lp组和CTX-C-Rh2(2.0)/Lp组的高剂量组(卡巴他赛＝5mg/kg)的抑瘤率。即:抑瘤效果比非本发明组提高了约2倍以上；
(2)Glut1靶向性显著提高。在荷瘤鼠的Glut1靶向性实验中，所述的人参皂苷脂质体的Glut1靶向性都是比普通胆固醇脂质体的靶向性提高了4倍以上，而普通非优选的人参皂苷脂质体的Glut1靶向性都是比普通胆固醇脂质体的靶向性提高了2倍以下。
(3)毒副作用显著降低。相对胆固醇脂质体组(CTX-C/Lp)和卡巴他赛注射剂(Jevtana) 的5mg/kg剂量组大鼠死亡率1/6，与CTX-Rg3(1.0)/Lp组、CTX-Rg3(1.5)/Lp组、CTX- Rh2(1.0)/Lp组和CTX-Rh2(1.5)/Lp组10mg/kg未见死亡，毒性普遍降低2倍以上；相对CTX-C-Rg3(1.8)/Lp组和CTX-C-Rh2(2.0)/Lp组10mg/kg大鼠死亡3/6，而CTX-Rg3(1.0)/Lp组、CTX-Rg3(1.5)/Lp组、CTX-Rh2(1.0)/Lp组和CTX-Rh2(1.5)/Lp组15mg/kg大鼠死亡率低于3/6，说明毒性显著降低1.5倍以上；相对皂苷比例(2.0和2.5)的10mg/kg组大鼠死亡率超过3/6，而皂苷比例(1.0和1.5组)的15mg/kg大鼠死亡率低于3/6，说明毒性显著降低1.5倍以上。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实验药物和器材
实验药物：20(S)-人参皂苷Rg3(简称：Rg3)、人参皂苷伪Rg3(简称：伪Rg3)、人参皂苷Rp1(简称：Rp1)、人参皂苷伪GQ(简称：伪GQ)、人参皂苷Rk1(简称：Rk1)、人参皂苷Rg5(简称：Rg5)、20(S)-人参皂苷Rh2(简称：Rh2)、人参皂苷Rk2(简称：Rk2)、20(S)- 人参皂苷Rg2(简称：Rg2)、20(S)-人参皂苷Rh1(简称：Rh1)、20(S)-原人参二醇(简称： PPD)、20(S)-原人参三醇(简称PPT)等为本领域常规市售可得，例如上海本素医药科技有限公司、上海源叶生物科技有限公司等。
卡巴他赛注射剂:Jevtana，简称厂家:法国Sanofi Aventis公司，采购自中国香港SPG PHARMA COMPANY公司。
本发明所述的人参皂苷分子结构式如下:
Figure BDA0003050526140000111
Figure BDA0003050526140000121
Figure BDA0003050526140000131
试验仪器:下述实施例中所使用的仪器为上海本素医药科技有限公司、复旦大学药学院自有仪器设备，其设备型号和来源信息如下:
安捷伦液相色谱:安捷伦1100一套，奥泰3300ELSD，安捷伦科技(中国)有限公司；
旋蒸蒸发仪:ZX98-1 5L，上海鲁伊工贸有限公司；
超声波清洗机(SB3200DT，宁波新芝生物科技股份有限公司)；
氮吹仪(HGC-12A，天津市恒奥科技发展有限公司)；
探头超声仪(JYD-650，上海智信仪器有限公司，中国)；
高压均质机(B15，加拿大AVESTIN)；
微型挤出器(Mini-extruder，Avanti Polar Lipids Inc)；
激光粒度分析仪(Nano ZS,英国马尔文公司)；
马尔文粒度仪Malvern Nanosizer ZS90(英国马尔文公司)；
酶标仪(Thermo Scientific，Waltham，MA，USA)；
酶标仪(Infinitie 200，瑞士Tecan Trading Co.，Ltd)；
流式细胞仪(BD Biosciences，USA)；
流式细胞仪(CytoFlex S，Beckman Coulter，Inc.，USA)；
倒置荧光显微镜(Leica，DMI 4000D，Germany)；
荧光显微镜观察(Zeiss LSM 710，Oberkochen，Germany)；
激光共聚焦显微镜(Leica，DMI 4000D，Germany)；
共聚焦活体显微镜(Confocal intravital microscopy,IVM)；
正置双光子显微镜(DM5500 Q；Nikon)；
小动物活体光学成像系统(in vivo imaging system,IVIS)(PerkinElmer，USA)；
生物大分子相互作用仪BiaCore T 200仪器(GE，USA)；
洁净工作台(SW-CJ-1FD，苏州安泰空气技术有限公司)；
20L旋转蒸发仪:R5002K，上海夏丰实业有限公司；
冷冻干燥机:FD-1D-80，上海比朗仪器制造有限公司；
冷冻干燥机:PDFD GLZ-1B，上海浦东冷冻干燥设备有限公司；
电子天平:CPA2250(精度0.00001g)，赛多利斯(上海)贸易有限公司；
电子天平:JY3003(精度0.001g)，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；
光电显微镜(XDS-1B，重庆光电仪器有限公司)；
细胞培养箱(CCL-170B-8，新加坡ESCO)。
动物和细胞株
动物:BALB/c裸小鼠，鼠龄3-4周，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
肿瘤细胞株：
DU145人前列腺癌细胞、HCT-8人结肠癌细胞、4T1人乳腺癌细胞、A549人肺癌细胞、A549/Taxol人肺癌紫杉醇耐药细胞、MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞、MCF-7人乳腺癌细胞、PANC-1人胰腺癌细胞、A2780人卵巢癌细胞、SNU-5人胃癌细胞、OE19人食管癌细胞、OE33人食管癌细胞、A172人脑胶质母细胞瘤细胞均购自江苏凯基生物技术股份有限公司。
实施例1注射用人参皂苷Rg3卡巴他赛脂质体的制备
1.处方：蛋黄卵磷脂12g，人参皂苷Rg3 1g，卡巴他赛1g，葡萄糖18g，无水乙醇50ml，氯仿50ml，注射用水240ml。
2.成膜：配制处方量的无水乙醇和氯仿(1:1)混合溶剂备用。
将处方量的卡巴他赛加入混合溶剂溶解备用，再将处方量的人参皂苷Rg3和蛋黄卵磷脂加入混合溶剂中，加热溶解，转移入1L旋蒸瓶中，减压浓缩，水浴温度55℃，转速50转/min，真空度-0.09～-0.04MPa，旋蒸至溶剂全部挥发完全。
3.水化：配制葡萄糖溶液:将18g无水葡萄糖加入到100ml注射用水，搅拌溶解后配制成0.18mg/ml的葡萄糖水溶液，40℃水浴加热备用。
将140ml注射用水加入到成膜后的旋蒸瓶中，水浴温度40-45℃，转速50转/min，水化并完全溶解，时间约2h。
然后再加入100ml的葡萄糖水溶液，搅拌均匀，备用。
4.高压均质：水化后的溶液转移至均质机，均质机使用0～10℃冷冻水冷切循环，均质压力设置1200bar，循环均质3-4次，至D90小于100nm。
5.除菌过滤：将均质后的溶液过0.22μm滤膜除菌过滤。
6.分装：将除菌过滤后的溶液按装设定量4～5ml分装进30ml西林瓶中。
7.冷冻干燥：产品进箱后，在-40℃～-55℃温度范围内预冻2h，-20℃～-30℃范围内一次干燥15h，-5℃～+5℃二次干燥10h，升温至25℃，保温8h，全压塞，出箱。
8.轧盖和包装:将上述脂质体轧盖和包装，即得注射用人参皂苷Rg3卡巴他赛脂质体。
实施例2注射用人参皂苷Rg3卡巴他赛脂质体的制备
1.处方：蛋黄卵磷脂12g，人参皂苷Rg3 1.5g，卡巴他赛1g，葡萄糖18g，无水乙醇50ml，氯仿50ml，注射用水240ml。
2.成膜：同实施例1的成膜法。
3.水化：同实施例1的水化法。
4.高速剪切和挤出:将上述脂质体溶液，室温下，在2000rp/min快速剪切5min。
将脂质体溶液温度控制在35-45℃，连接挤出装置，分别通过400nm、200nm、100nm孔径挤出板，在800psi压力下分别反复4-10次挤出。
5.后续步骤同实施例1的各个步骤，制备得到注射用人参皂苷Rg卡巴他赛脂质体。
实施例3注射用人参皂苷Rg3卡巴他赛脂质体的制备
1.处方：氢化磷脂(HSPC)18g，PEG2000-DSPE 0.3g，人参皂苷Rg3 1.5g，卡巴他赛1g，葡萄糖30g，无水乙醇50ml，氯仿150ml，注射用水360ml。
2.成膜：配制处方量的无水乙醇和氯仿(1:3)混合溶剂备用。
将处方量的卡巴他赛加入混合溶剂溶解备用，再将处方量的Rg3、HSPC和PEG2000-DSPE加入混合溶剂中，加热溶解，转移入1L旋蒸瓶中，减压浓缩，水浴温度65℃，转速60-70转/min，真空度-0.04～-0.02MPa，旋蒸至溶剂全部挥发完全。
3.水化：配制葡萄糖溶液:将30g无水葡萄糖加入到100ml注射用水，搅拌溶解后配制成0.30mg/ml的葡萄糖水溶液，40℃水浴加热备用。
将260ml注射用水加入到成膜后的旋蒸瓶中，水浴温度45-50℃，转速50转/min，水化并完全溶解，时间约2h。
然后再加入100ml的葡萄糖水溶液，搅拌均匀，备用。
4.高压均质：水化后的溶液转移至均质机，均质机使用0～10℃冷冻水冷切循环，均质压力设置1600bar，循环均质3-4次，至D90小于100nm。
5.除菌过滤：将均质后的溶液过0.22um滤膜除菌过滤。
6.分装：将除菌过滤后的溶液按装设定量7～8ml分装进30ml西林瓶中。
7.冷冻干燥：产品进箱后，在-55℃～-40℃温度范围内预冻2h，-30℃～-20℃范围内一次干燥15h，-5℃～+5℃二次干燥10h，升温至25℃，保温8h，全压塞，出箱。
8.轧盖和包装：将上述脂质体轧盖和包装，即得注射用人参皂苷Rg3卡巴他赛脂质体。
实施例4人参皂苷Rg3卡巴他赛脂质体注射液的制备
1.处方：氢化磷脂(HSPC)18g，PEG2000-DSPE 0.9g，人参皂苷Rg3 1.5g，卡巴他赛1g，5％葡萄糖注射液适量，无水乙醇50ml，氯仿150ml，注射用水360ml。
2.成膜：配制处方量的无水乙醇和氯仿(1:3)混合溶剂备用。
将处方量的卡巴他赛加入混合溶剂溶解备用，再将处方量的Rg3和HSPC加入混合溶剂中，加热溶解，转移入1L旋蒸瓶中，减压浓缩，水浴温度65℃，转速60-70转/min，真空度-0.04～-0.02MPa，旋蒸至溶剂全部挥发完全。
3.水化：加入180mL的5％葡萄糖水溶液，水化10分钟。然后再加入20mL的PEG-DSPE溶液(将0.9g PEG-DSPE溶解于20mL的5％葡萄糖注射液中)。
4.高压均质：水化后的溶液转移至均质机，均质机使用0～10℃冷冻水冷切循环，均质压力设置1600bar，循环均质3-4次，至D90小于100nm。
5.除菌过滤：将均质后的溶液过0.22um滤膜除菌过滤。
6.分装：将除菌过滤后的溶液按装设定量7～8ml分装进30ml西林瓶中。
7.轧盖和包装：将上述脂质体轧盖和包装，即得Rg3卡巴他赛脂质体注射液。
实施例5注射用人参皂苷Rh2卡巴他赛脂质体的制备
将实施例1中的人参皂苷Rg3变更为人参皂苷Rh2 1.0g，其他同实施例1，制备得到注射用人参皂苷Rh2卡巴他赛脂质体。
实施例6注射用人参皂苷Rh2卡巴他赛脂质体的制备
将实施例1中的人参皂苷Rg3变更为人参皂苷Rh2 1.5g，其他同实施例1，制备得到注射用人参皂苷Rh2卡巴他赛脂质体。
实施例7注射用人参皂苷伪Rg3卡巴他赛脂质体的制备
将实施例1中的人参皂苷Rg3变更为人参皂苷伪Rg3 1.5g，其他同实施例1，制备得到注射用人参皂苷伪Rg3卡巴他赛脂质体。
实施例8注射用人参皂苷Rg5卡巴他赛脂质体的制备
将实施例1中的人参皂苷Rg3变更为人参皂苷Rg5 1.5g，其他同实施例1，制备得到注射用人参皂苷Rg5卡巴他赛脂质体。
实施例9注射用人参皂苷Rk1卡巴他赛脂质体的制备
将实施例1中的人参皂苷Rg3变更为人参皂苷Rk1 1.5g，其他同实施例1，制备得到注射用人参皂苷Rk1卡巴他赛脂质体。
实施例10注射用人参皂苷Rp1卡巴他赛脂质体的制备
将实施例1中的人参皂苷Rg3变更为人参皂苷Rp1 1.5g，其他同实施例1，制备得到注射用人参皂苷Rp1卡巴他赛脂质体。
实施例11注射用人参皂苷伪GQ卡巴他赛脂质体的制备
将实施例1中的人参皂苷Rg3变更为人参皂苷伪GQ 1.5g，其他同实施例1，制备得到注射用人参皂苷伪GQ卡巴他赛脂质体。
效果实施例1
(a)根据下表处方，并按实施例1相同方法(不需要冻干步骤)，对人参皂苷的种类比较结果如下表1：
表1
Figure BDA0003050526140000171
Figure BDA0003050526140000181
上述系列实验证明，在不添加大豆油或胆固醇等其他辅料情况下，本发明中的人参皂苷为：Rg3、伪Rg3、Rh2、伪GQ、Rg5、Rk1和Rp1等7个时，Ginposome-CTX具有较好制备工艺，制备条件易于实现，利于产业化的。人参皂苷为Rk2、Rg2、Rh1、PPD 和PPT时，需要添加其他辅料，并且制备条件比较苛刻的。
同时，针对卡巴他赛，对比例1-4的粒径偏大，截留率高，产品得率低，其原因为卡巴他赛的化学性质与紫杉醇和多西他赛具有较大差别，其对比例的原有处方不符合卡巴他赛脂质体的化学特性。
(b)对磷脂的种类和比例进行了比较:
备注:蛋黄卵磷脂(EPC)、大豆磷脂(SPC)、脑磷脂(PE)、鞘磷脂(SM)、氢化磷脂(HSPC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基卵磷脂(DOPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱 (DMPC)、聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)、聚乙二醇2000-二油酰基磷脂酰乙醇胺(mPEG-DOPE)。
按实施例1相同方法(不需要冻干步骤)，对磷脂种类和比例的比较结果如下表2：
表2
Figure BDA0003050526140000191
Figure BDA0003050526140000201
上述实验证明，在不添加大豆油或胆固醇等其他辅料情况下，能良好包裹卡巴他赛，制备工艺较易实现的磷脂为蛋黄卵磷脂、大豆磷脂、脑磷脂和混合磷脂(上述4个磷脂中含有0.01-10％PEG-DSPE)。其他磷脂与Rg3无法良好包裹卡巴他赛，添加4-6倍量大豆油等其他辅料，并且提高均质压力和均质次数，依然无法制备合格的脂质体。上述实验同时说明：在成膜性方面，本发明中的磷脂:卡巴他赛＝8-16:1时，效果较佳，优选为10- 16:1。
按实施例1相同方法(不需要冻干步骤)，对氢化磷脂脂质体的条件筛选如下：
表3
Figure BDA0003050526140000202
Figure BDA0003050526140000211
Figure BDA0003050526140000221
综上所述，在选用氢化磷脂时，在处方HSPC:PEG2000-DSPE:皂苷:CTX＝15-20:0.1- 0.5:0.5:1的处方范围时，在均质压力达到1600bar以上时，也具有良好的粒径范围和包封率。
综上所述，对磷脂的选择中，最佳处方如下：
天然磷脂(蛋黄卵磷脂、大豆磷脂、脑磷脂等)：最佳处方比例为磷脂:药物＝8-16:1；
混合氢化磷脂(含有0.1-10％的PEG2000-DSPE的氢化磷脂)：最佳处方比例为磷脂: 药物＝15-20:1。
(c)按实施例1相同方法(不需要冻干步骤)，对人参皂苷的最佳比例进行了比较：
表4
Figure BDA0003050526140000231
上述实验证明，在不添加大豆油或胆固醇等其他辅料情况下，本发明中皂苷:卡巴他赛＝1-3:1的比例范围时，效果较佳。但由于本发明应用实施例2急性毒性实验和应用实施例3体外药效学研究的实验结果，本发明只选择了皂苷:卡巴他赛＝1-1.5:1的比例范围。
(d)按实施例1相同方法，对冻干保护剂进行了比较：
表5
Figure BDA0003050526140000241
Figure BDA0003050526140000251
在冻干保护剂的选择中，不同冻干保护剂对产品复溶后脂质体的包封率，粒径分布有显著影响，对冻干曲线的经济性也存在较大影响。通过上述实验，在不添加大豆油等其他辅料情况下，本发明中的冻干保护剂为葡萄糖、海藻糖、蔗糖、乳糖和半乳糖中的一种或多种，在使用蛋黄卵磷脂时卡巴他赛与冻干保护剂的比例为:冻干保护剂/卡巴他赛＝15-30倍量，例如20倍量葡萄糖时，与卡巴他赛脂质体具有良好匹配性；在使用混合氢化磷脂时卡巴他赛与冻干保护剂的比例为：冻干保护剂/卡巴他赛＝25-30倍量，例如25或 30倍量葡萄糖时，与卡巴他赛脂质体具有良好匹配性。因综合考虑制剂学的经验数据，本发明确定的卡巴他赛与冻干保护剂的比例为:冻干保护剂/卡巴他赛＝15-30倍量。
应用实施例1:Glut1的细胞摄取实验
1)实验目的:通过添加葡萄糖抑制剂等证明Glut1靶向机制；通过Glut1靶向验证本发明的人参皂苷种类和比例、磷脂种类和比例。
2)实验方法:为了比较4T1对各实验组的摄取，探讨复方制剂的摄取机制，将4T1细胞按2×105的细胞密度接种于12孔板中，对于实验组+葡萄糖、实验组+根皮苷和实验组+槲皮素组，12小时后分别用20mM的葡萄糖溶液、根皮苷溶液和槲皮素溶液代替培养基。这三种溶质应在无葡萄糖培养基中溶解，孵育1小时后，加入各实验组药物(紫外荧光显色剂的浓度为100ng/ml)，孵育4小时后，消化，用新鲜PBS溶液洗涤，采用流式细胞仪进行分析。
为了研究Rg3脂质体的摄取机制，将底物(葡萄糖)，Glut1竞争性抑制剂根皮苷和槲皮素预先孵育1小时将Glut1先饱和后，再加入制剂，Rg3-Lp/C6的荧光强度分别降低了30％，35％和68％。由此可见Glut1底物和抑制剂的加入，阻止了Rg3-Lp/C6的细胞摄取，证明人参皂苷Rg3脂质体可通过与Glut1相互作用增强其摄取效率。
3)实验组制备方法:按本发明实施例1方法制备(卡巴他赛改为香豆素，不需要冻干步骤)。
因应用实施例2急性毒性和应用实施例3体外药效学的实验结果，下述实验未开展人参皂苷/卡巴他赛超过2.0的处方的实验。
实验组:
表6
Figure BDA0003050526140000261
Figure BDA0003050526140000271
实验结果如下：
表7
Figure BDA0003050526140000272
Figure BDA0003050526140000281
实验结论：
1)相同处方下，添加胆固醇后，其Glut1靶向性大幅度降低。
2)相同处方下，添加随着添加PEG-DSPE数量的加大，其Glut1靶向性随之降低。
3)本发明处方的靶向性相对胆固醇脂质体提高了4倍以上，非优选处方的人参皂苷脂质体的靶向性相对胆固醇脂质体提高了约2倍。
加入底物和Glut1竞争性抑制剂后的实验结果如下表8：
表8
Figure BDA0003050526140000282
Figure BDA0003050526140000291
由上述结果可见，随着Glut1底物和抑制剂的加入，C6-C/Lp的荧光强度无显著改变(荧光强度分别降低了4％，6％和10％)，但阻止了C6-Rg3/Lp的细胞摄取(荧光强度分别降低了30％，35％和68％)，C6-C-Rg3/Lp的荧光强度(分别降低了9％，12％和17％)和 C6-C/Lp组没有显著性差别，证明人参皂苷Rg3脂质体通过与Glut1相互作用增强其摄取效率，从而证明Rg3位于脂质体的膜上，Rg3的葡萄糖基(Glc)裸露在脂质体表面。
应用实施例2:急性毒性研究
1)实验方法：大鼠160～260g，6～9周龄，每组6只，给药方式:缓慢静推(约1mL/min)，给药频率:3次/天。
本试验供试品卡巴他赛剂量设置为2.5，5，10和15mg/kg/天，供试品中含Rg3分别3.75，7.5，15和22.5mg/kg/天。同时设置溶媒对照组(5％葡萄糖注射液)、市售阳性对照组(Jevtana组)和CTX-C-Rg3/Lp组，缓慢静推(约1mL/min)，3次/天，每次给药间隔至少4h。
2)实验分组：共计13组，5％葡萄糖组、CTX-C/Lp、CTX-C-Rg3(1.8)/Lp组、CTX- C-Rh2(2.0)/Lp组和药效学的实验分组一致，其他组别名称如下述表格所示。
3)实验组制备方法:根据处方要求，依实施例1方法制备。
表9
Figure BDA0003050526140000292
Figure BDA0003050526140000301
3)实验结果如下表：
表10
Figure BDA0003050526140000302
通过以上实验显示，
1)相对胆固醇脂质体组(CTX-C/Lp)和卡巴他赛注射剂(Jevtana)的5mg/kg剂量组大鼠死亡率1/6，与CTX-Rg3(1.0)/Lp组、CTX-Rg3(1.5)/Lp组、CTX-Rh2(1.0)/Lp组和CTX-Rh2(1.5)/Lp组10mg/kg未见死亡，毒性普遍降低2倍以上；
2)相对CTX-C-Rg3(1.8)/Lp组和CTX-C-Rh2(2.0)/Lp组10mg/kg大鼠死亡3/6，而CTX-Rg3(1.0)/Lp组、CTX-Rg3(1.5)/Lp组、CTX-Rh2(1.0)/Lp组和CTX-Rh2(1.5)/Lp 组15mg/kg大鼠死亡率低于3/6，说明毒性显著降低1.5倍以上；
3)相对皂苷比例(2.0和2.5)的10mg/kg组大鼠死亡率超过3/6，而皂苷比例(1.0和1.5组)的15mg/kg大鼠死亡率低于3/6，说明毒性显著降低1.5倍以上。
综上实验结果，本发明优选处方为:药物:皂苷＝1:1.0-1.5。
应用实施例3:体外药效学研究
1)肿瘤细胞抑制浓度IC50实验方法:处于对数生长期的细胞按相应浓度接种至96孔培养板，每孔100μL完全培养基培养过夜。加入不同浓度的化合物，每个浓度设三复孔，并设置无化合物作用的阳性对照孔及无细胞阴性对照孔。细胞在37℃、5％CO2条件下培养72h。药物作用结束后，每孔加入10μL CCK-8试剂，置于37℃培养箱中放置2-4 小时后，用全波长式微孔板酶标仪SpectraMax 190测定450nm处的OD值。化合物对细胞增殖的抑制率由以下公式计算:
抑制率(％)＝[1-(OD给药孔-OD阴性对照孔)/(OD阳性对照孔-OD阴性对照孔)]×100％
IC50值用四参数法计算得出。每组实验独立重复三次，每次每个浓度设三个复孔。结果展示以Mean±SD表示。
备注:脂质体制备方法依据实施例1方法。
表11
Figure BDA0003050526140000311
Figure BDA0003050526140000321
通过以上实验显示:
1)相对Jevtana组，CTX:Rg3＝1.0和1.5实验组的体外药效学具有显著性优势，药效学提高了1.19-7.31倍；CTX-C/Lp组提高了0.93-1.14倍；CTX:Rg3＝1:2.0组提高了0.93-1.65倍；CTX:Rg3＝1:2.5组提高了0.95-1.50倍。
2)CTX:Rg3＝1.0和1.5实验组，相对其他实验组，具有显著性优势。
综上实验结果，本发明优选处方为：药物:皂苷＝1:1.0-1.5。
应用实施例4:前列腺癌(DU145)体内药效学研究
1)试验方法:将肿瘤细胞株(DU145)注入小鼠皮下，建立皮下肿瘤模型。当肿瘤体积达到100mm3(接种后7d)时，将小鼠随机分组(n＝8每组)治疗，每组尾静脉注射空白溶剂(5％葡萄糖，Blank)、Jevtana组、CTX-C/Lp组、CTX-Rg3(0.5)/Lp组、CTX-Rg3(1.0)/Lp 组、CTX-Rg3(1.5)/Lp组、CTX-Rh2(0.5)/Lp组、CTX-Rh2(1.0)/Lp组、CTX-Rh2(1.5)/Lp 组、CTX-C-Rg3(1.8)/Lp组(蛋黄卵磷脂:Rg3:胆固醇:卡巴他赛＝9:1.8:2.25:1)、CTX-C- Rh2(2.0)/Lp组(大豆磷脂:Rh2:胆固醇:卡巴他赛＝10:1:2.25:1)，剂量按卡巴他赛计高中低三组(5mg、2.5mg、1.25mg)，每7天给一次药，持续到第28天，给药的同时测量肿瘤的长度、宽度和记录体重。计算肿瘤体积(V)的公式为:V＝(W2×L)/2。长度(L)为实体瘤的最长直径，宽度(W)是垂直于长度的最短直径。在第28天实验结束，所有动物均处死，取出肿瘤进行影像学和组织学检测。
备注：卡巴他赛+Rg3＝5mg/kg+7.5mg/kg，表示药物浓度，下同。
因应用实施例2急性毒性和应用实施例3体外药效学的实验结果，本实施例未开展药物:皂苷≥2.0组的研究。
2)试验结果如下：
表12
Figure BDA0003050526140000331
Figure BDA0003050526140000341
结论：
1)CTX-Rg3(1.0)/Lp组、CTX-Rg3(1.5)/Lp组、CTX-Rh2(1.0)/Lp组、CTX- Rh2(1.5)/Lp组的药效最佳，在第21天肿瘤完全消失。四组的中剂量(卡巴他赛＝2.5mg/kg)的抑瘤率优于Jevtana组、CTX-C/Lp组、CTX-Rg3(0.5)/Lp、CTX- Rh2(0.5)/Lp组、CTX-C-Rg3(1.8)/Lp组和CTX-C-Rh2(2.0)/Lp组的高剂量组(卡巴他赛＝5mg/kg)的抑瘤率。即:抑瘤效果比非本发明组提高了约2倍以上。
2)药效高低与人参皂苷的比例高低不具有线性关系，根据本处方，人参皂苷Rg3或Rh2/卡巴他赛的比例在1.0～1.5时，药效最佳。
应用实施例5:注射用人参皂苷卡巴他赛脂质体对三阴性乳腺癌(MDA-MB-231)体内研究
动物：BALB/c裸小鼠，鼠龄3-4周，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
肿瘤细胞株：三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞株
移植瘤模型：用上述各细胞株接种于裸小鼠右侧腋窝皮下，细胞接种量为5×106/只，形成移植瘤后再在裸小鼠体内传1代后使用。
实验方法：将肿瘤细胞株注入小鼠皮下，建立皮下肿瘤模型。当肿瘤体积达到100mm3 (接种后7d)时，将小鼠随机分为4组(n＝8每组)治疗，每组尾静脉注射空白溶剂(5％葡萄糖)、Jevtana组、CTX-Rg3/Lp组(5mg/kg卡巴他赛计，7.5mg/kg人参皂苷Rg3计)、CTX- Rh2/Lp组(5mg/kg卡巴他赛计，7.5mg/kg人参皂苷Rh2计)，每7天给一次药，持续到第28天，给药的同时测量肿瘤的长度、宽度和记录体重。计算肿瘤体积(V)的公式为：V＝ (W2×L)/2。长度(L)为实体瘤的最长直径，宽度(W)是垂直于长度的最短直径。在第28天实验结束，所有动物均处死，取出肿瘤进行影像学和组织学检测。
三阴性乳腺癌MDA-MB-231：根据体内药效学实验方法，针对三阴性乳腺癌MDA-MB-231体内药效学的研究数据如下。
表13
Figure BDA0003050526140000351
结果显示：针对三阴性乳腺癌MDA-MB-231荷瘤鼠，同等剂量下，Jevtana组抑瘤效果一般(抑瘤率62％)，CTX-Rg3/Lp组和CTX-Rh2/Lp组效果最佳。该实验结果表明：复方制剂药效显著，具有显著的药物协同作用。
人结肠癌细胞(HCT-8):根据体内药效学实验方法，针对人结肠癌细胞体内药效学的研究数据如下。
表14
Figure BDA0003050526140000352
结果显示：针对人结肠癌细胞荷瘤鼠，同等剂量下，CTX-C/Lp组抑瘤效果一般(抑瘤率45％)，CTX-Rg3/Lp组和CTX-Rh2/Lp组效果最佳，在第28天肿瘤都已完全消失。该实验结果表明：复方制剂药效显著，具有显著的药物协同作用。
人肺癌紫杉醇耐药细胞(A549/Taxol)：根据体内药效学实验方法，针对人肺癌紫杉醇耐药细胞体内药效学的研究数据如下。
表15
Figure BDA0003050526140000361
结果显示：同等剂量下，CTX-Rg3/Lp组和CTX-Rh2/Lp组在各给药时间点肿瘤的抑制效果均显著优于CTX-C/Lp组。CTX-C/Lp组无法抑制人肺癌紫杉醇耐药肿瘤，而CTX- Rg3/Lp组和CTX-Rh2/Lp组达到了有效抑制。该实验结果表明：Rg3和Rh2在复方脂质体中起到了良好的药物协同作用。
人食管癌细胞(OE19)：根据体内药效学实验方法，针对人食管癌细胞体内药效学的研究数据如下。
表16
Figure BDA0003050526140000362
结果显示：同等剂量下，CTX-Rg3/Lp组和CTX-Rh2/Lp组在各给药时间点肿瘤的抑制效果均显著优于CTX-C/Lp组。该实验结果表明：Rg3和Rh2在复方脂质体中起到了良好的药物协同作用。

Claims (10)

1.一种人参皂苷卡巴他赛脂质体，其原料包含如下重量份计的组分：8-25份磷脂、0.5-3份人参皂苷、1份卡巴他赛及15-35份冻干保护剂；所述脂质体不含胆固醇、大豆油以及油酸钠中的任一种；
所述磷脂为天然磷脂和/或氢化磷脂，或者为PEG2000-DSPE与所述天然磷脂和/或氢化磷脂混合得到的混合磷脂；所述PEG2000-DSPE占所述混合磷脂的0.01-10wt％；
所述的人参皂苷选自20(S)-人参皂苷Rg3、人参皂苷伪Rg3、20(S)-人参皂苷Rh2、人参皂苷Rg5、人参皂苷Rk1、人参皂苷Rp1以及人参皂苷伪GQ中的一种或多种。
2.如权利要求1所述的脂质体，所述的脂质体的膜相包含所述人参皂苷；
和/或，所述的脂质体的D90粒径≤200nm，优选≤150nm，更优选≤120nm；
和/或，所述的脂质体的包封率≥80％，优选≥90％，更优选≥95％。
3.如权利要求1所述的脂质体，其特征在于，所述天然磷脂为蛋黄卵磷脂、大豆磷脂以及脑磷脂中的一种或多种，例如蛋黄卵磷脂、大豆磷脂或者脑磷脂；
和/或，所述人参皂苷为20(S)-人参皂苷Rg3和/或20(S)-人参皂苷Rh2，优选20(S)-人参皂苷Rg3；
和/或，所述冻干保护剂为海藻糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖和半乳糖中的一种或多种，优选葡萄糖；
和/或，当所述磷脂为天然磷脂时，所述天然磷脂的用量为8-20份，例如10-16份；当所述磷脂为混合磷脂时，所述混合磷脂的用量为15-20份；
和/或，所述冻干保护剂的用量为20-25份；
和/或，所述人参皂苷的用量为1-1.5份。
4.如权利要求3所述的脂质体，其特征在于，所述磷脂为8-20份蛋黄卵磷脂；
或者，所述磷脂为10份蛋黄卵磷脂以及0.5-3份PEG2000-DSPE；
或者，所述磷脂为15-20份氢化磷脂以及0.1-1份PEG2000-DSPE；
较佳地：
所述的磷脂为：8份、10份、12份、14份、16份、18份或者20份蛋黄卵磷脂，或者10份蛋黄卵磷脂以及0.5份、1份、1.5份、2份或者3份PEG2000-DSPE，或者15份氢化磷脂及0.1、0.3、0.5、1份PEG2000-DSPE，或者18份氢化磷脂及0.1、0.3、0.5、1份PEG2000-DSPE，20份氢化磷脂及0.1、0.3、0.5、1份PEG2000-DSPE。
5.如权利要求3所述的脂质体，其特征在于，所述的人参皂苷为：1份20(S)-人参皂苷Rg3、1.5份20(S)-人参皂苷Rg3、1份20(S)-人参皂苷Rh2，或者1.5份20(S)-人参皂苷Rh2。
6.如权利要求3所述的脂质体，其特征在于，所述的脂质体包含：
12份天然磷脂、1份20(S)-人参皂苷Rg3、1份卡巴他赛及18份冻干保护剂；
或，12份天然磷脂、1.5份20(S)-人参皂苷Rg3、1份卡巴他赛及18份冻干保护剂；
或，18份混合磷脂、1份20(S)-人参皂苷Rg3、1份卡巴他赛及30份冻干保护剂；
或，18份混合磷脂、1.5份20(S)-人参皂苷Rg3、1份卡巴他赛及30份冻干保护剂；
或，12份天然磷脂、1.5份20(S)-人参皂苷Rh2、1份卡巴他赛及18份冻干保护剂；
或，18份混合磷脂、1份20(S)-人参皂苷Rh2、1份卡巴他赛及30份冻干保护剂；
或，18份混合磷脂、1.5份20(S)-人参皂苷Rh2、1份卡巴他赛及30份冻干保护剂；
或，10份天然磷脂、1.5份20(S)-人参皂苷Rh2、1份卡巴他赛及30份冻干保护剂；
或，10份天然磷脂、1.5份20(S)-人参皂苷Rh2、1份卡巴他赛及18份冻干保护剂；
或，10份天然磷脂、1份20(S)-人参皂苷Rh2、1份卡巴他赛及18份冻干保护剂；
或，10份天然磷脂、1份20(S)-人参皂苷Rh2、1份卡巴他赛及30份冻干保护剂；
或，10份天然磷脂、1.5份20(S)-人参皂苷Rg3、1份卡巴他赛及30份冻干保护剂；
或，10份天然磷脂、1.5份20(S)-人参皂苷Rg3、1份卡巴他赛及18份冻干保护剂；
或，10份天然磷脂、1份20(S)-人参皂苷Rg3、1份卡巴他赛及18份冻干保护剂；
或，10份天然磷脂、1份20(S)-人参皂苷Rg3、1份卡巴他赛及30份冻干保护剂；
其中：
所述天然磷脂优选蛋黄卵磷脂；
所述混合磷脂优选含有1.67wt％PEG2000-DSPE的氢化磷脂；
所述冻干保护剂优选葡萄糖。
7.如权利要求1-6任一项所述的脂质体，其特征在于，其制备方法包括如下步骤：
(1)成膜：将所述卡巴他赛、所述人参皂苷以及所述磷脂溶解于无水乙醇和氯仿混合溶剂中、溶解后除去溶剂，得成膜后产物；
(2)水化：溶解步骤(1)所得成膜后产物，然后与冻干保护剂的水溶液均匀混合，得水化后产物；
(3)将步骤(2)所得水化后产物制成合适粒径的脂质体。
8.如权利要求7所述的脂质体，其特征在于，步骤(1)中，所述无水乙醇和所述氯仿的用量比为1:(1-3)(v/v)，优选1:1或者1:3；较佳地，所述卡巴他赛与所述混合溶剂的用量比为1g:(100-300)ml，优选1g:100ml或者1g:200ml；
和/或，步骤(2)中使用注射用水进行所述溶解，所述冻干保护剂的溶剂为注射用水；所述冻干保护剂与所述溶剂的体积比优选(15-35)g:100ml，更优选(18-30)g:100ml；
和/或，步骤(3)中所用方法为高压均质或者挤出法。
9.如权利要求8所述的脂质体，其特征在于，步骤(3)中所述高压均质包括如下步骤：将步骤(2)所得水化后产物进行高压均质，控制粒径D90在目标范围内，例如200nm以下、150nm以下或者120nm以下；所述高压均质的压力优选800-1600bar，例如1200-1400bar；
或者，步骤(3)中所述挤出法包括：
将步骤(2)所得水化后产物进行剪切，然后通过挤出板挤出，所述挤出板的孔径例如为400nm、200nm或者100nm；
所述挤出的压力优选600-800psi。
10.一种人参皂苷卡巴他赛脂质体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)成膜：将1份卡巴他赛、0.5-3份人参皂苷以及8-25份磷脂溶解于无水乙醇和氯仿混合溶剂中、溶解后除去溶剂，得成膜后产物；
(2)水化：溶解步骤(1)所得成膜后产物，然后与15-35份冻干保护剂的水溶液均匀混合，得水化后产物；
(3)将步骤(2)所得水化后产物制成合适粒径的脂质体；
所述人参皂苷卡巴他赛脂质体较佳地如权利要求2～6任一项所定义；
所述步骤(1)～步骤(3)较佳地如权利要求8或9所定义。
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