CN115137702A - 人参皂苷高三尖杉酯碱脂质体、其制备方法和应用 - Google Patents

人参皂苷高三尖杉酯碱脂质体、其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人参皂苷高三尖杉酯碱脂质体、其制备方法和应用。本发明的脂质体的原料包括如下重量份计的组分：10‑20份磷脂、0.5‑3.0份人参皂苷和1份高三尖杉酯碱；所述的脂质体不含有胆固醇、大豆油或油酸钠。该脂质体具有良好的制剂学特征、靶向性和药效，具有良好的成药前景。

Description

人参皂苷高三尖杉酯碱脂质体、其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种人参皂苷高三尖杉酯碱脂质体、其制备方法和应用。
背景技术
脂质体是一种定向载药系统，属于靶向给药系统的一种特殊剂型，它可以将药物包埋在直径为纳米级的微粒中，这种微粒类似于生物膜结构中双分子层微小囊泡，进入人体内主要被网状内皮系统吞噬，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在靶向组织中积蓄，从而提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。
本发明是在CN201610693884.2、CN201811447245.3和CN201811447243.4等中国发明申请专利的基础上进行的技术创新。上述三篇申请专利都公开了以人参皂苷为膜材的脂质体在包载紫杉醇等化疗药物之后，其相关脂质体质量稳定、药效显著等技术优势。
CN201610693884.2公开了一种以人参皂苷Rg5及其衍生物为膜材的空白脂质体和应用，处方中除了包括磷脂、皂苷、药物、冻干保护剂外，还可进一步包括胆固醇、抗氧化剂、大豆油和/或油酸钠等其他辅料。
CN201811447245.3公开了一种以人参皂苷Rh5H及其衍生物为膜材的空白脂质体和应用，该专利在CN201610693884.2基础上，进一步解决了人参皂苷的溶血性问题。同样，处方中除了包括磷脂、皂苷、药物、冻干保护剂外，还可进一步包括胆固醇、抗氧化剂、大豆油和/或油酸钠等其他辅料。
CN201811447243.4公开了一种以人参皂苷Rg3及其衍生物为膜材的空白脂质体和应用。该专利将Rg3、Rh2等皂苷通过超微粉等技术手段，解决了人参皂苷在氯仿中的溶解度问题，从而解决了Rg3和Rh2等人参皂苷必须在氯仿中成膜的难题，制备得到了质量符合标准的Rg3类脂质体。
上述现有技术仍存在一些不足的地方，例如部分方案中脂质体生产均质步骤所需压力较大，滤膜除菌过滤的速度慢，截留率高，产品收率明显较差；另外还需要添加2-6倍量的大豆油。但是由于大豆油的添加，又不利于制剂冻干，进而影响药物的长期保存。
药品的安全性和有效性是药品的两个基本属性，缺一不可，药品的审批和使用都是基于两者之间的风险收益比来考量，尤其是改良型新药，其核心就是提高有效性和安全性。
在毒理学研究中，制剂学研究起着至关重要的作用，尤其是处方比例和制备工艺的选择对急性毒性、长期毒性和各个功能器官的累积毒性的各个影响，都将直接决定着该复方脂质体是否符合新药申报要求。
因此，如何选择一个最佳的复方药物配伍，如何制定最佳的制备工艺，以便生产出一种药效更好、毒性更低，质量和其他指标都能符合药品要求的注射用复方人参皂苷高三尖杉酯碱脂质体，以便符合药品申报要求，需要大量的研究工作和技术攻关。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中高三尖杉酯碱种类较少的缺陷，为此，提供一种人参皂苷高三尖杉酯碱脂质体、其制备方法和应用。本发明的人参皂苷高三尖杉酯碱脂质体具有良好的制剂学特征(例如稳定性好、粒径小、药物包封率高)和靶向性，并且部分人参皂苷高三尖杉酯碱脂质体还具有药效好和毒性低的优点；本发明的脂质体本发明的制备工艺制得的产品收率高、且制备过程中无需高压均质，可见本发明的制备工艺条件温和，利于产业化，进而可以实现制备工艺与产品性能结合的优化。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明提供了一种脂质体(以下简称“Ginposome-HHT”)，其原料包括如下重量份计的组分：10-20份磷脂、0.5-3.0份人参皂苷和1份高三尖杉酯碱；所述的脂质体不含有胆固醇、大豆油或油酸钠；
所述的磷脂为蛋黄卵磷脂(EPC)、大豆磷脂(SPC)、脑磷脂(PE)、甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE)和甲氧基聚乙二醇2000-二油酰基磷脂酰乙醇胺(mPEG-DOPE)中的一种或多种，或混合氢化磷脂；
所述的混合氢化磷脂为含有0.1-10％二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000的氢化磷脂。
在本发明的某一方案中，所述的脂质体的膜相包含人参皂苷。
在本发明的某一方案中，所述的脂质体的D90粒径≤200nm，优选≤150nm，更优选为≤120nm，例如≤100nm。
在本发明的某一方案中，所述的脂质体的包封率≥90％，优选≥90％，更优选≥95％。
在本发明的某一方案中，所述的磷脂为蛋黄卵磷脂、脑磷脂或二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000的蛋黄卵磷脂。
在本发明的某一方案中，当所述的磷脂为蛋黄卵磷脂、大豆磷脂、脑磷脂、甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE)、甲氧基聚乙二醇2000-二油酰基磷脂酰乙醇胺(mPEGDOPE)中的一种或多种时，所述的磷脂的份数为10-15份，例如10份、12份或15份。
在本发明的某一方案中，当所述的磷脂为混合氢化磷脂时，所述的磷脂的份数为15-22份，例如15.1份、15.3份、15.5份、16份、16.5份、18.1份、18.3份、18.5份、20份、20.1份、20.3份、20.5份、21份、21.5份或22份。
在本发明的某一方案中，所述的磷脂为10份蛋黄卵磷脂、12份蛋黄卵磷脂、15份蛋黄卵磷脂、20份蛋黄卵磷脂、12份大豆磷脂、12份脑磷脂、12份甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE)、12份甲氧基聚乙二醇2000-二油酰基磷脂酰乙醇胺(mPEG-DOPE)、12份含有4.7％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE)的蛋黄卵磷脂、18份含有3％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE)的氢化磷脂、15.1份含有0.6％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂、15.3份含有2.0％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂、15.5份含有3.2％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂、16份含有6.3％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂、16.5份含有9.1％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂、18.1份含有0.6％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂、18.3份含有1.6％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂、18.5份含有2.7％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂、19份含有5.3％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂、19.5份含有7.7％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂、20份含有10.0％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂、20.1份含有0.5％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂、20.3份含有1.4％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂、20.5份含有2.4％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂、21份含有4.7％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂、21.5份含有6.98％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂22份或含有9.09％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂，
优选10份蛋黄卵磷脂、12份蛋黄卵磷脂、12份脑磷脂或12份含有4.7％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的蛋黄卵磷脂、18.1份含有0.6％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂、18.3份含有1.6％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂或18.5份含有2.7％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂。
在本发明的某一方案中，所述的人参皂苷为20(S)-人参皂苷Rg3、人参皂苷伪Rg3、20(S)-人参皂苷Rh2、人参皂苷Rg5、人参皂苷Rk1、人参皂苷Rp1或人参皂苷伪GQ，优选20(S)-人参皂苷Rg3、1.5份人参皂苷伪Rg3、20(S)-人参皂苷Rh2、人参皂苷Rg5、人参皂苷Rk1或人参皂苷Rp1。
在本发明的某一方案中，所述的人参皂苷的份数为1.0-2.5份，优选1.0-1.5份，例如1份或1.5份。
在本发明的某一方案中，所述的人参皂苷为1.0份20(S)-人参皂苷Rg3、1.5份20(S)-人参皂苷Rg3、2.5份20(S)-人参皂苷Rg3、3.0份20(S)-人参皂苷Rg3、1.0份20(S)-人参皂苷Rh2、1.5份20(S)-人参皂苷Rh2、2.0份20(S)-人参皂苷Rh2、2.5份20(S)-人参皂苷Rh2、3.0份20(S)-人参皂苷Rh2、1.5份人参皂苷伪Rg3、1.5份人参皂苷Rg5、1.5份人参皂苷Rk1或1.5份人参皂苷Rp1，
优选1.0份20(S)-人参皂苷Rg3、1.5份20(S)-人参皂苷Rg3、1.0份20(S)-人参皂苷Rh2或1.5份20(S)-人参皂苷Rh2。
在本发明的某一方案中，所述的脂质体，其原料包括如下重量份计的组分：10-15份磷脂、0.5-3.0份人参皂苷和1份高三尖杉酯碱；
所述的磷脂为蛋黄卵磷脂、大豆磷脂、脑磷脂、甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺和甲氧基聚乙二醇2000-二油酰基磷脂酰乙醇胺中的一种或多种。
在本发明的某一方案中，所述的脂质体，其原料包括如下重量份计的组分：10-15份磷脂、1.0-2.0份人参皂苷和1份高三尖杉酯碱；
所述的磷脂为蛋黄卵磷脂或脑磷脂；
所述的人参皂苷为20(S)-人参皂苷Rg3、1.5份人参皂苷伪Rg3、20(S)-人参皂苷Rh2、人参皂苷Rg5、人参皂苷Rk1或人参皂苷Rp1；
所述的脂质体的D90粒径≤120nm，包封率≥90％。
在本发明的某一方案中，所述的脂质体，其原料包括如下重量份计的组分：磷脂、0.5-3.0份人参皂苷和1份高三尖杉酯碱；
所述的磷脂为15-22份含有0.1-10％二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000的氢化磷脂。
在本发明的某一方案中，所述的脂质体，其原料包括如下重量份计的组分：18.1-18.5份磷脂、1.0-2.0份人参皂苷和1份高三尖杉酯碱；
所述的磷脂为含有0.6-2.7％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂；
所述的人参皂苷为20(S)-人参皂苷Rg3、人参皂苷伪Rg3、20(S)-人参皂苷Rh2、人参皂苷Rg5、人参皂苷Rk1或人参皂苷Rp1；
所述的脂质体的D90粒径≤120nm。
在本发明的某一方案中，所述的脂质体，其原料包括如下重量份计的组分：12份蛋黄卵磷脂、1.0-3.0份人参皂苷和1份高三尖杉酯碱；
所述的人参皂苷为20(S)-人参皂苷Rg3或20(S)-人参皂苷Rh2；
所述的脂质体的D90粒径≤120nm。
在本发明的某一方案中，所述的脂质体，其原料包括如下重量份计的组分：12份蛋黄卵磷脂、1.0-1.5份人参皂苷和1份高三尖杉酯碱；
所述的人参皂苷为20(S)-人参皂苷Rg3或20(S)-人参皂苷Rh2；
所述的脂质体的D90粒径≤120nm。
在本发明的某一方案中，所述的脂质体，其原料由如下重量份计的组分组成：上述的磷脂、上述的人参皂苷和1份高三尖杉酯碱。
脂质体是由脂质双分子组成，当脂质体的内部为含水的闭合囊泡时，脂质体是包含水的。因此，即使本发明的脂质体的原料没有限定水，本领域技术人员应当理解，当脂质体的内部为含水的闭合囊泡时，本发明的脂质体是含有水。
本发明还提供了一种脂质体的制备方法，其包括如下步骤；
步骤1、将以重量份计的10-20份磷脂、以重量份计的0.5-3.0份人参皂苷和以重量份计的1份高三尖杉酯碱与有机溶剂进行混合得到的混合溶液A1，将混合溶液A1浓缩成膜；其中，所述的磷脂和所述的人参皂苷均同上所述；
步骤2、将步骤1得到的膜在水中进行水化，得到溶液A2；
步骤3、将步骤2得到的溶液A2采用高压均质法的方法或者高速剪切-挤出法得到溶液A3；将所述的溶液A3过滤和浓缩，得到所述的脂质体；
所述的脂质体的制备方法中的条件和操作可以为本领域常规活性药物脂质体的制备方法的条件和操作，本发明特别优选如下条件和操作：
步骤1中，所述的有机溶剂可为醇类溶剂(例如甲醇、乙醇)和/或卤代烃类溶剂(例如氯仿、二氯甲烷)，进一步优选为乙醇和氯仿(例如乙醇和氯仿的体积比为1:1)。所述的有机溶剂的用量可不做具体限定，以能溶解高三尖杉酯碱、人参皂苷和磷脂即可。例如所述的有机溶剂与所述的高三尖杉酯碱的体积质量比为90-250ml/g，例如200ml/g。
步骤1中，所述的混合的顺序可以将所述的人参皂苷和所述的磷脂加入到所述的高三尖杉酯碱与所述的有机溶剂形成的溶液中。例如，将所述的人参皂苷、所述的磷脂加入到高三尖杉酯碱与所述的有机溶剂的溶液中，加热溶解得到混合溶液；所述的加热可为水浴加热，所述的加热温度可以为35-65℃，例如40-45℃，或55-60℃。
步骤1中，所述的浓缩可为减压浓缩。所述的减压浓缩的真空度可以为-0.04mpa--0.1mpa，例如-0.04--0.1Mpa。所述的浓缩的状态以所述的混合溶液中的溶剂挥发完全为止。所述的浓缩的时间较佳地为≥4小时。
步骤1中，所述的浓缩可在旋蒸瓶中进行，转速可为40～60rp/min，例如50rp/min。
步骤2中，所述的溶液A2优选还含有冻干保护剂。
所述的冻干保护剂保护以重量份计的份数优选为10-30份，优选为12-15份；其中，所述的冻干保护剂的以重量份计的份数是以步骤1中以高三尖杉酯碱的重量为基准计得的份数。
所述的冻干保护剂优选为葡萄糖、海藻糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、甘露醇和木糖醇中的一种或多种，优选为葡萄糖、海藻糖或蔗糖。
所述的冻干保护剂的浓度优选为10-60mg/ml。
步骤2中，所述的水可为注射用水。
步骤2中，所述的冻干保护剂的浓度可为10-60mg/ml，例如50mg/mL。
步骤2中，所述的水化的温度可为35-65℃，例如45-50℃。
步骤2中，所述的水化可在旋蒸瓶中进行，转速可为40-70rp/min，例如50rp/min或65rp/min。
步骤2中，所述的水化的状态以溶液均一即可。所述的水化的时间例如2-4小时。
步骤2中，所述的水与所述的高三尖杉酯碱的体积质量比可为100-300ml/g，例如240ml/g。
步骤3中，所述的高压均质法可以为本领域常规的高压均质法，本发明特别优选以下操作和条件：
所述的高压均质法包括以下步骤：将步骤2得到的所述的溶液A2进行高压均质，控制粒径D90在100nm以下，得到溶液A3。
所述的高压均质的压力优选800-1400bar，例如1200bar。所述的高压均质的次数优选3或4次，例如4次。
步骤3中，所述的高速剪切-挤出法可以为本领域常规的方法，本发明特别优选以下操作和条件：
所述的高速剪切-挤出法包括以下步骤：将步骤2得到的所述的溶液A2进行剪切后，分别通过400nm、200nm和100nm孔径挤出板挤出，控制粒径D90在100nm以下，得到溶液A3。
所述的高速剪切-挤出法中，所述的高速剪切优选在室温下进行。
所述的高速剪切-挤出法中，所述的高速剪切的转速优选1500-2200rp/min；例如2000rp/min。
所述的高速剪切-挤出法中，所述的高速剪切的时间优选5-10min；例如5min。所述的挤出的温度优选35-45℃，例如40℃。
所述的高速剪切-挤出法中，所述的挤出的压力优选600-800psi；例如800psi。所述挤出的次数优选3或4次，例如4次。
在本发明的某一方案中，步骤1中，将所述的人参皂苷和所述的磷脂加入到所述的高三尖杉酯碱与所述的有机溶剂形成的溶液中，所述的有机溶剂为乙醇和氯仿；
步骤2中，所述的冻干保护剂的浓度为10-60mg/ml，所述的水化的温度可为35-65℃；
步骤3中，所述的高压均质法包括以下步骤：将步骤2得到的溶液A2进行高压均质，控制粒径D90在100nm以下，得到溶液A3；
所述的高速剪切-挤出法包括以下步骤：将步骤2得到的所述的脂质体溶液A2进行剪切后，分别通过400nm、200nm、100nm孔径挤出板挤出，控制粒径D90在100nm以下，得到脂质体溶液A3。
在本发明的某一方案中，步骤中1，将所述的人参皂苷和所述的磷脂加入到所述的高三尖杉酯碱与所述的有机溶剂形成的溶液中，所述的有机溶剂为体积比为1:1乙醇和氯仿；所述的浓缩为减压浓缩，所述的减压浓缩的真空度为-0.04～-0.1Mpa；
步骤2中，所述的水化的温度为35-65℃；
步骤3中，所述的高压均质法包括以下步骤：将步骤2得到的所述的溶液A2进行高压均质，控制粒径D90在100nm以下，得到溶液A3；所述的高压均质的压力为800-1400bar；所述的高压均质的次数为3或4次；
所述的高速剪切-挤出法包括以下步骤：将步骤2得到的所述的溶液A2进行剪切后，分别依次通过400nm、200nm和100nm孔径挤出板挤出，控制粒径D90在100nm以下，得到溶液A3；所述的高速剪切的转速为1500-2200rp/min；所述的高速剪切的时间为5-10min；所述的挤出的温度为35-45℃。
本发明还提供了一种脂质体，其按照上述的脂质体的制备方法制得。
本发明还提供了一种注射用脂质体的制备方法，其包括如下步骤；
步骤a、b和c同上述的脂质体的制备方法中的步骤1-3，得到的溶液A3；
步骤d、将所述的步骤c得到的溶液A3进行除菌过滤、分装装于西林瓶中，得到的溶液A4；
步骤e、将所述的步骤d得到的溶液A4进行冷冻干燥，得到注射用脂质体。
所述的注射用脂质体的制备方法中，所述的除菌过滤、冷冻干燥的条件和操作可为本领域该类工艺中常规的条件和操作；本发明中优选如下：
步骤d中，所述的除菌过滤的滤膜优选为0.22um滤膜。
步骤d中，所述的分装的体积优选为0.2-0.4ml。
步骤d中，所述的分装的西林瓶可为本领域常规的西林瓶，例如1mL或2mL西林瓶。
步骤e中，所述的冷冻干燥优选在-40℃--50℃温度预冻、-20℃--30℃范围内一次干燥和-5℃-5℃二次干燥。根据设定冻干曲线的程序控温，在48～72小时内将产品冷冻干燥至合格。
所述的注射用脂质体的制备方法还可进一步包括后处理，所述的后处理的条件和操作可为本领域该类工艺中常规的条件和操作；例如，所述的后处理包括如下步骤：将所述的注射用注射用脂质体保温结束后，全压塞、出箱、轧盖和包装。
本发明还提供了一种注射用脂质体，其按照上述注射用脂质体的制备方法制得。
在本发明的某一方案中，所述的注射用脂质体的粒径D90≤200nm，优选D90≤150nm。
在本发明的某一方案中，所述的注射用脂质体的包封率≥90％，优选≥95％。
本发明还提供了一种脂质体组合物，其包括上述的脂质体和辅料。
在本发明的某一方案中，所述的辅料优选为冻干保护剂和/或注射用水。
所述的冻干保护剂的以重量份计的份数优选为10-30份，更优选为12-15份；其中，所述的冻干保护剂的份数是以上述的脂质体原料中的高三尖杉酯碱的重量为基准计得的份数。
所述的冻干保护剂优选为葡萄糖、海藻糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、甘露醇和木糖醇中的一种或多种，更优选为葡萄糖、海藻糖或蔗糖。
所述的冻干保护剂进一步优选为5份葡萄糖、10份葡萄糖、12份葡萄糖、15份葡萄糖、20份葡萄糖、30份葡萄糖、5份海藻糖、10份海藻糖、15份海藻糖、20份海藻糖、30份海藻糖、5份蔗糖、10份蔗糖、15份蔗糖、20份蔗糖、30份蔗糖、5份乳糖、10份乳糖、15份乳糖、20份乳糖、30份乳糖、5份半乳糖、10份半乳糖、15份半乳糖、20份半乳糖、30份半乳糖、5份甘露醇、10份甘露醇、15份甘露醇、20份甘露醇、30份甘露醇、5份木糖醇、10份木糖醇、15份木糖醇、20份木糖醇或30份木糖醇，
更优选12份葡萄糖、15份葡萄糖、15份海藻糖或15份蔗糖。
本发明还提供了一种物质A在制备用于治疗和/或预防癌症药物中的应用，所述的物质A为上述的脂质体或上述的脂质体组合物。
所述的癌症可为急性非淋巴细胞白血病。
术语“辅料”是指生产药品和调配处方时使用的赋形剂和附加剂；是除活性成分或前体以外，在安全性方面已进行了合理的评估，并且包含在药物制剂中的物质。
术语“粒径D90”是指一个样品的累计粒度分布百分数达到90％时所对应的粒径。它的物理意义是粒径小于它的颗粒占90％。
本发明的处方缩写解释如下所示：
Figure BDA0003002234740000071
Figure BDA0003002234740000081
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明的人参皂苷高三尖杉酯碱脂质体具有良好的制剂学特征(例如D90粒径≤200nm，包封率≥90％)、对肿瘤细胞具有良好的靶向作用。以实施例中注射用复方人参皂苷Rg3高三尖杉酯碱脂质体为例，相比于胆固醇脂质体；本发明的人参皂苷Rg3高三尖杉酯碱脂质体中具有更好的药效或者靶向等多种作用，具体地：
(1)药效显著提高：尤其是HHT-Rg3(1.0)/Lp、HHT-Rg3(1.5)/Lp和HHT-Rh2(1.5)/Lp组药效最优，其中HHT剂量(125μg/kg)的癌细胞抑制率(≥95％)均达到或超过了非本发明处方(皂苷比例不在1.0-1.5)脂质体组高剂量(250μg/kg)的癌细胞抑制率，所以，抑瘤效果提高了2倍以上；
(2)Glut1靶向性显著提高：在荷瘤鼠的Glut1靶向性实验中，所述的人参皂苷脂质体的Glut1靶向性都是比普通胆固醇脂质体的靶向性提高了2倍以上，而普通非优选的人参皂苷脂质体的Glut1靶向性都是比普通胆固醇脂质体的靶向性提高了2倍。
(3)毒副作用显著降低：按本发明的处方制备的脂质体，HHT-Rg3(1.0)/Lp组、HHT-Rg3(1.5)/Lp和HHT-Rh2(1.5)/Lp组的急性毒性(高剂量组HHT＝4.5mg/kg)未出现动物死亡；而HHT-C/Lp组、HHT-GQ/Lp组(磷脂:伪GQ:HHT＝8:4:1)、HHT-Rg5/Lp组(磷脂:Rg5:HHT＝4:3:1)、HHT-Rg3/Lp组(磷脂:Rg3:HHT:大豆油＝10:2:1:4)的高剂量组动物死亡严重，中剂量组(HHT＝3mg/kg)也出现了动物死亡；HHT-Rg3(2.0)/Lp组的高剂量组(HHT＝4.5mg/kg)动物死亡1只。因此，本发明处方(皂苷比例1.0-1.5)比非本发明处方(皂苷比例不在1.0-1.5)和胆固醇脂质体的急性毒性降低了2倍以上。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实验药物和器材
实验药物：20(S)-人参皂苷Rg3(简称：Rg3)、人参皂苷伪Rg3(简称：伪Rg3)、人参皂苷Rp1(简称：Rp1)、人参皂苷伪GQ(简称：伪GQ)、人参皂苷Rk1(简称：Rk1)、人参皂苷Rg5(简称：Rg5)、20(S)-人参皂苷Rh2(简称：Rh2)、人参皂苷Rk2(简称：Rk2)、20(S)-人参皂苷Rg2(简称：Rg2)、20(S)-人参皂苷Rh1(简称：Rh1)、20(S)-原人参二醇(简称：PPD)、20(S)-原人参三醇(简称PPT)、高三尖杉酯碱等为本领域常规市售可得，例如上海本素医药科技有限公司、上海源叶生物科技有限公司等。
本发明所述的人参皂苷分子结构式如下：
Figure BDA0003002234740000082
Figure BDA0003002234740000091
Figure BDA0003002234740000101
试验仪器：下述实施例中所使用的仪器为上海本素医药科技有限公司、复旦大学药学院自有仪器设备，其设备型号和来源信息如下：
安捷伦液相色谱：安捷伦1100一套，奥泰3300ELSD，安捷伦科技(中国)有限公司；
旋蒸蒸发仪：ZX98-1 5L，上海鲁伊工贸有限公司；
超声波清洗机(SB3200DT，宁波新芝生物科技股份有限公司)；
氮吹仪(HGC-12A，天津市恒奥科技发展有限公司)；
探头超声仪(JYD-650，上海智信仪器有限公司，中国)；
高压均质机(B15，加拿大AVESTIN)；
微型挤出器(Mini-extruder，Avanti Polar Lipids Inc)；
激光粒度分析仪(Nano ZS,英国马尔文公司)；
马尔文粒度仪Malvern Nanosizer ZS90(英国马尔文公司)；
酶标仪(Thermo Scientific，Waltham，MA，USA)；
酶标仪(Infinitie 200，瑞士Tecan Trading Co.，Ltd)；
流式细胞仪(BD Biosciences，USA)；
流式细胞仪(CytoFlex S，Beckman Coulter，Inc.，USA)；
倒置荧光显微镜(Leica，DMI 4000D，Germany)；
荧光显微镜观察(Zeiss LSM 710，Oberkochen，Germany)；
激光共聚焦显微镜(Leica，DMI 4000D，Germany)；
共聚焦活体显微镜(Confocal intravital microscopy,IVM)；
正置双光子显微镜(DM5500 Q；Nikon)；
小动物活体光学成像系统(in vivo imaging system,IVIS)(PerkinElmer，USA)；
生物大分子相互作用仪BiaCore T 200仪器(GE，USA)；
洁净工作台(SW-CJ-1FD，苏州安泰空气技术有限公司)；
20L旋转蒸发仪：R5002K，上海夏丰实业有限公司；
冷冻干燥机：FD-1D-80，上海比朗仪器制造有限公司；
冷冻干燥机：PDFD GLZ-1B，上海浦东冷冻干燥设备有限公司；
电子天平：CPA2250(精度0.00001g)，赛多利斯(上海)贸易有限公司；
电子天平：JY3003(精度0.001g)，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；
光电显微镜(XDS-1B，重庆光电仪器有限公司)；
细胞培养箱(CCL-170B-8，新加坡ESCO)。
动物和细胞株动物：BALB/c裸小鼠，鼠龄3-4周，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
肿瘤细胞株：
4T1人乳腺癌细胞
K562人白血病细胞
购自江苏凯基生物技术股份有限公司。
实施例1注射用复方人参皂苷Rg3高三尖杉酯碱脂质体的制备
1.处方：蛋黄卵磷脂12g，人参皂苷Rg3 1.0g，高三尖杉酯碱1g，葡萄糖12g，无水乙醇50ml，氯仿150ml，注射用水240ml。
2.成膜：配置处方量的无水乙醇和氯仿(1:1)混合溶剂备用。
将处方量的高三尖杉酯碱加入混合溶剂溶解备用，再将处方量的人参皂苷Rg3和蛋黄卵磷脂加入混合溶剂中，加热溶解，转移入1L旋蒸瓶中，减压浓缩，水浴温度55℃，转速50转/min，真空度-0.04～-0.05MPa，旋蒸至溶剂全部挥发完全。
3.水化：配置葡萄糖溶液：将12g无水葡萄糖加入到240ml注射用水，搅拌溶解后配置成葡萄糖水溶液，40℃水浴加热备用。
将240ml葡萄糖溶液加入到成膜后的旋蒸瓶中，水浴温度40-45℃，转速50转/min，水化并完全溶解，时间约2h。备用。
4.高压均质：水化后的溶液转移至均质机，均质机使用0～10℃冷冻水冷切循环，均质压力设置1200bar，循环均质3--4次，至D90小于100nm。
5.除菌过滤：将均质后的溶液过0.22um滤膜除菌过滤。
6.分装：将除菌过滤后的溶液按装设定量0.2～0.4ml分装进1ml或2ml西林瓶中。
7.冷冻干燥：产品进箱后，在-40℃～-50℃温度范围内预冻2h，-20℃～-30℃范围内一次干燥15h，-5℃～5℃二次干燥10h，升温至25℃，保温8h，全压塞，出箱。
8.轧盖和包装：将上述脂质体轧盖和包装，即得注射用复方人参皂苷Rg3高三尖杉酯碱脂质体。
实施例2注射用复方人参皂苷Rg3高三尖杉酯碱脂质体的制备
1.处方：蛋黄卵磷脂12g，人参皂苷Rg3 1.5g，高三尖杉酯碱1g，葡萄糖12g，无水乙醇50ml，氯仿150ml，注射用水240ml。
2.成膜：同实施例1的成膜法。
3.水化：同实施例1的水化法。
4.高速剪切和挤出：将上述脂质体溶液，室温下，在2000rp/min快速剪切5min。
将脂质体溶液温度控制在35-45℃，连接挤出装置，分别通过400nm、200nm、100nm孔径挤出板，在800psi压力下挤出。
5.后续步骤同实施例1的各个步骤，制备得到注射用复方人参皂苷Rg3高三尖杉酯碱脂质体。
实施例3注射用复方人参皂苷Rg3高三尖杉酯碱脂质体的制备(非冻干注射剂)
1.处方：氢化磷脂(HSPC)18g，mPEG2000-DSPE 0.3g，人参皂苷Rg3 1.5g，高三尖杉酯碱1g，无水乙醇25ml，氯仿75ml，注射用水240ml。
2.成膜：配置处方量的无水乙醇和氯仿(1:3)混合溶剂备用。
将处方量的高三尖杉酯碱加入混合溶剂溶解备用，再将处方量的Rg3、HSPC和mPEG2000-DSPE加入混合溶剂中，加热溶解，转移入1L旋蒸瓶中，减压浓缩，水浴温度65℃，转速60-70转/min，真空度-0.02～-0.04MPa，旋蒸至溶剂全部挥发完全。
3.水化：将240ml注射用水水浴预热至45℃，然后加入到成膜后的旋蒸瓶中，水浴温度45-50℃，转速50转/min，水化并完全溶解，时间约2h。
4.高压均质：水化后的溶液转移至均质机，均质机使用0～10℃冷冻水冷切循环，均质压力设置1600bar，循环均质3-4次，至D90小于100nm。
5.除菌过滤：将均质后的溶液过0.22um滤膜除菌过滤。
6.分装：将除菌过滤后的溶液按装设定量0.1～0.4ml分装进1ml或2ml西林瓶中。
7.轧盖和包装：将上述脂质体轧盖和包装，即得复方人参皂苷Rg3高三尖杉酯碱脂质体。
实施例4注射用复方人参皂苷Rg3高三尖杉酯碱脂质体的制备
将实施例1中的人参皂苷Rg3的1.0g更换为2.0g，其他同实施例1，制备得到注射用复方人参皂苷Rg3高三尖杉酯碱脂质体。
实施例5注射用复方人参皂苷Rg3高三尖杉酯碱脂质体的制备
将实施例3中的mPEG2000-DSPE更换为PEG2000-DSPE，其他同实施例3，制备得到注射用复方人参皂苷Rg3高三尖杉酯碱脂质体。
实施例6注射用复方人参皂苷Rh2高三尖杉酯碱脂质体的制备
将实施例1中的人参皂苷Rg3变更为人参皂苷Rh2 1.0g，其他同实施例1，制备得到注射用复方人参皂苷Rh2高三尖杉酯碱脂质体。
实施例7注射用复方人参皂苷Rh2高三尖杉酯碱脂质体的制备
将实施例1中的人参皂苷Rg3变更为人参皂苷Rh2 1.5g，其他同实施例1，制备得到注射用复方人参皂苷Rh2高三尖杉酯碱脂质体。
实施例8注射用复方人参皂苷Rh2高三尖杉酯碱脂质体的制备
将实施例1中的人参皂苷Rg3变更为人参皂苷Rh2 2.0g，其他同实施例1，制备得到注射用复方人参皂苷伪Rg3高三尖杉酯碱脂质体。
实施例9注射用复方人参皂苷伪Rg3高三尖杉酯碱脂质体的制备
将实施例1中的人参皂苷Rg3变更为人参皂苷伪Rg3 1.5g，其他同实施例1，制备得到注射用复方人参皂苷伪Rg3高三尖杉酯碱脂质体。
实施例10注射用复方人参皂苷Rg5高三尖杉酯碱脂质体的制备
将实施例1中的人参皂苷Rg3变更为人参皂苷Rg5 1.5g，其他同实施例1，制备得到注射用复方人参皂苷Rg5高三尖杉酯碱脂质体。
实施例11注射用复方人参皂苷Rk1高三尖杉酯碱脂质体的制备
将实施例1中的人参皂苷Rg3变更为人参皂苷Rk1 1.5g，其他同实施例1，制备得到注射用复方人参皂苷Rk1高三尖杉酯碱脂质体。
实施例12注射用复方人参皂苷Rp1高三尖杉酯碱脂质体的制备
将实施例1中的人参皂苷Rg3变更为人参皂苷Rp1 1.5g，其他同实施例1，制备得到注射用复方人参皂苷Rp1高三尖杉酯碱脂质体。
组分种类和含量的筛选
(a)人参皂苷的种类
根据下表1处方，按实施例1相同方法和冻干保护剂制备高三尖杉酯碱脂质体，其结果如下表1所示：
表1
Figure BDA0003002234740000141
上述系列实验证明，在不添加大豆油或胆固醇等其他辅料情况下，含有上述人参皂苷的脂质体粒径D90≤200nm，与对比例中的粒径相当甚至效果更佳，例如：Rg3、伪Rg3、Rh2、Rg5、Rk1和Rp1的脂质体的粒径D90≤120nm，Ginposome-HHT具有较好制备工艺，例如均质压力小和收率高，制备条件易于实现，更利于产业化的。
(b)磷脂
根据下表2处方，按实施例1相同方法和冻干保护剂制备高三尖杉酯碱脂质体，其结果如下表2所示：
表2
Figure BDA0003002234740000151
Figure BDA0003002234740000161
备注：蛋黄卵磷脂(EPC)、大豆磷脂(SPC)、脑磷脂(PE)、鞘磷脂(SM)、氢化磷脂(HSPC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基卵磷脂(DOPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE)、聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)、甲氧基聚乙二醇2000-二油酰基磷脂酰乙醇胺(mPEG-DOPE)。
上述实验证明：
(1)脂质体中磷酸的份数为10-20份，脂质体的粒径D90≤200nm，而且包封率均在90％以上。而脂质体中磷酸为6份时，脂质体的粒径D90≤200nm，包封率在80％以下。
(2)脂质体中磷酸的种类为蛋黄卵磷脂、大豆磷脂、脑磷脂、mPEG-DOPE、mPEG-DSPE、PEG-DSPE和混合氢化磷脂、在不添加大豆油或胆固醇等其他辅料情况下，能良好包裹高三尖杉酯碱，并且制备工艺较易实现的。
上述实验说明：在成膜性方面，脂质体中含有10-15份的蛋黄卵磷脂、大豆磷脂、脑磷脂、mPEG-DOPE、mPEG-DOPE、PEG-DSPE或混合氢化磷脂时，脂质体的D90≤150nm，包封率≥90％，效果更佳。
(c)人参皂苷的含量
根据下表3处方，按实施例1相同方法和冻干保护剂制备高三尖杉酯碱脂质体，其结果如下表3所示：
表3
Figure BDA0003002234740000171
上述实验证明，在不添加大豆油或胆固醇等其他辅料情况下，含有0.5-3.份的人参皂苷的脂质体的粒径D90≤150nm，具有较好的制剂学特征。
(d)混合氢化磷脂
根据下表4处方，按实施例1相同方法制备高三尖杉酯碱脂质体，其结果如下表5所示：
表4
Figure BDA0003002234740000172
Figure BDA0003002234740000181
Figure BDA0003002234740000191
Figure BDA0003002234740000201
综上所述，在选用混合氢化磷脂时时，在处方HSPC：mPEG2000-DSPE：皂苷：HHT＝15-20：0.1-0.5：1.0-2.0：1的处方范围时，在均质压力达到1600bar以上时，D90≤150nm，也具有良好的成膜性。尤其在HSPC：mPEG2000-DSPE：皂苷：HHT＝18：0.1-0.5：1.5：1时，D90≤100nm，效果最优。
稳定性
根据下表5处方，按实施例1相同方法制备高三尖杉酯碱脂质体，其结果如下表5所示：
表5
Figure BDA0003002234740000211
Figure BDA0003002234740000221
Figure BDA0003002234740000231
通过上述实验，脂质体中的冻干保护剂为葡萄糖、海藻糖、蔗糖、乳糖、半乳糖甘露醇或木糖醇时，脂质体的冻干复溶后，粒径变化较小，粒径D90≤150nm，包封率≥90％，稳定性好。高三尖杉酯碱与冻干保护剂的比例为：冻干保护剂/高三尖杉酯碱＝10-30倍量，一般选择10-15倍量。
应用实施例1：Glut1的细胞摄取实验
1)实验目的：通过添加葡萄糖抑制剂等证明Glut1靶向机制；通过Glut1靶向验证本发明的人参皂苷种类和比例、磷脂种类和比例。
2)实验方法：为了比较4T1对各实验组的摄取，探讨复方制剂的摄取机制，将4T1细胞按2×105的细胞密度接种于12孔板中，对于实验组+葡萄糖、实验组+根皮苷和实验组+槲皮素组，12小时后分别用20mM的葡萄糖溶液、根皮苷溶液和槲皮素溶液代替培养基。这三种溶质应在无葡萄糖培养基中溶解，孵育1小时后，加入各实验组药物(紫外荧光显色剂的浓度为100ng/ml)，孵育4小时后，消化，用新鲜PBS溶液洗涤，采用流式细胞仪进行分析。
为了研究Rg3脂质体的摄取机制，将底物(葡萄糖)，Glut1竞争性抑制剂根皮苷和槲皮素预先孵育1小时将Glut1先饱和后，再加入制剂，Rg3-Lp/C6的荧光强度分别降低了30％，35％和68％。由此可见Glut1底物和抑制剂的加入，阻止了Rg3-Lp/C6的细胞摄取，证明人参皂苷Rg3脂质体可通过与Glut1相互作用增强其摄取效率。
3)实验组制备方法：按本发明实施例1方法制备(药物改为香豆素，不需要冻干步骤)，因应用实施例4体急性毒性实验结果，下述实验未开展人参皂苷/高三尖杉酯碱超过2.0的处方的实验，处方见表6。
实验组：
表6
Figure BDA0003002234740000232
Figure BDA0003002234740000241
实验结果如下表7：
表7
Figure BDA0003002234740000242
Figure BDA0003002234740000251
实验结论：
1、相同处方下，添加胆固醇后，其Glut1靶向性大幅度降低。
2、相同处方下，添加随着添加mPEG-DSPE数量的加大，其Glut1靶向性随之降低。
3、本发明处方的靶向性相对胆固醇脂质体提高了4倍以上，非优选处方的人参皂苷脂质体的靶向性相对胆固醇脂质体提高了约2倍。
加入底物和Glut1竞争性抑制剂后的实验结果如下表8：
表8
Figure BDA0003002234740000252
由上述结果可见，随着Glut1底物和抑制剂的加入，C6-C/Lp的荧光强度无显著改变(荧光强度分别降低了4％，6％和10％)，但阻止了C6-Rg3/Lp的细胞摄取(荧光强度分别降低了30％，35％和68％)，C6-C-Rg3/Lp的荧光强度(分别降低了9％，12％和17％)和C6-C/Lp组没有显著性差别，证明人参皂苷Rg3脂质体通过与Glut1相互作用增强其摄取效率，从而证明Rg3位于脂质体的膜上，Rg3的葡萄糖基(Glc)裸露在脂质体表面。
应用实施例2：对人白血病细胞K562的抑制实验
1、验证本发明的人参皂苷种类和比例、磷脂种类和比例对白血病细胞K562的抑制。
2、实验方法：将处于对数生长期的K562白血病细胞按1×104的细胞密度接种于96孔板，每孔加100μl，在含5％二氧化碳的培养箱中培养24h。加入10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml不同浓度样品及空白组和市售对照组新鲜培养基，每孔加100μl，每组设三个平行孔，于37℃培养箱继续培养36h后，弃上清液，每孔加100μl的PBS及10μl的CCK-8，用微型振荡器震荡混匀，继续培养3h，用酶标仪在参考波长630nm，检测波长450nm条件下测定光密度值(OD)，以空白对照处理的肿瘤细胞为对照组计算存活率。
存活率(％)＝OD450(样品)/OD450(对照)×100％；
其中，OD450(样品)为实验组的OD值，OD450(对照)为空白对照组的OD值。
备注：HHT+Rg3＝3μg/ml+4.5μg/ml，表示药物浓度，下同。
HHT-C/Lp组：根据实施例1的方法，将人参皂苷Rg3更换为等量胆固醇制备得到的常规胆固醇高三尖杉酯碱脂质体。
HHT:Rg3＝1:0.5组和HHT:Rg3＝1:2.5组：根据实施例1的方法，将人参皂苷Rg3的质量分别更换0.5g和2.5g。
表9
Figure BDA0003002234740000261
有上表可知：脂质体中的人参皂苷的份数为1-2.5份对K562细胞具有较好的抑制率。
应用实施例3：K562白血病细胞体内药效学研究
1)试验方法：将处于对数生长期的K562白血病细胞液，离心洗涤去除牛血清，用BMEM基础培养基，配制成1×106的细胞密度的混悬细胞液，然后想NOD/SCID小鼠的尾静脉注射上述细胞液0.5ml，以流式技术检测外周血的CD13的表达，以确定建模是否成功，建模成功，配制20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml不同浓度样品及空白组和市售对照组，尾静脉注射0.5ml(低、中、高给药剂量分别为：0.5mg/kg，0.75mg/kg，1mg/kg)，分别在0,5,10,15,20天注射给药，眼眶静脉取血；分别观察小鼠体重变化、生存时间、白细胞数量及CD13表达，21天处死小鼠。
用酶标仪在参考波长630nm，检测波长450nm条件下测定光密度值(OD)，以空白对照处理的肿瘤细胞为对照组计算存活率。
细胞存活率(％)＝OD450(样品)/OD450(对照)×100％；
其中，OD490(样品)为实验组的OD值，OD490(对照)为空白对照组的OD值。
备注：HHT+Rg3＝1mg/kg+1mg/kg，表示药物给药剂量，下同。
HHT-C/Lp组：根据实施例1的方法，将人参皂苷Rg3更换为等量胆固醇制备得到的常规胆固醇高三尖杉酯碱脂质体。
对比例1-3的脂质体根据实施例1的方法制备的脂质体。
2)试验结果如下表10：
表10
Figure BDA0003002234740000271
Figure BDA0003002234740000281
结论：
(1)HHT-Rg3(1.0)/Lp、HHT-Rg3(1.5)/Lp和HHT-Rh2(1.5)/Lp组的药效最佳，在第20天肿瘤细胞完全消失。二组的中剂量的癌细胞抑制率与3组对比例的高剂量组的癌细胞抑制率基本一致。即：抑瘤效果比非本发明组提高了约2倍左右。
(2)高三尖杉酯碱HHT-C/Lp组出现了动物死亡，表明毒性作用大。
(3)药效高低与人参皂苷的比例高低不具有线性关系，根据本处方，人参皂苷Rg3/高三尖杉酯碱的比例在1.0-1.5时，药效最佳。
应用实施例4：急性毒性实验和药代动力学实验
1)实验方法：大鼠160～260g，6～9周龄，每组6只，给药方式：缓慢静推(约1mL/min)，给药频率：单次。
本试验供试品高三尖杉酯碱剂量设置为1.5、3、4.5mg/kg/天，供试品中高三尖杉酯碱和人参皂苷Rg3的质量比在1:1.5时。同时设置溶媒对照组(5％葡萄糖注射液)、HHT普通胆固醇脂质体对照组，缓慢静推，配置相应浓度的脂质体溶液，注射量0.5ml，尾静脉注射。中剂量组于0/0.5/1/2/4/8/16/32/48监测血药浓度。
2)实验分组：共计6组，5％葡萄糖组、HHT-C/Lp组、HHT-Rg3(1.0)/Lp组、HHT-Rg3(1.5)/Lp组、HHT-Rg3(2.0)/Lp组、HHT-Rh2(1.5)/Lp组，组别名称如下述表格所示。
3)实验组制备方法：根据表11中处方要求，按照实施例1方法制备。
表11
Figure BDA0003002234740000282
Figure BDA0003002234740000291
4)急性毒性实验结果如下表12：
表12
Figure BDA0003002234740000292
5)药代动力学实验结果(中剂量组)
表13
Figure BDA0003002234740000293
Figure BDA0003002234740000301
通过以上实验显示：
(1)HHT-C/Lp组、HHT-GQ/Lp组(磷脂:伪GQ:HHT＝8:4:1)、HHT-Rg5/Lp组(磷脂:Rg5:HHT＝4:3:1)、HHT-Rg3/Lp组(磷脂:Rg3:HHT:大豆油＝10:2:1:4)等4组的3mg/kg、4.5mg/kg出现了动物死亡，HHT-Rg3(2.0)/Lp组的4.5mg/kg出现动物死亡；而HHT-Rg3(1.0)/Lp组、HHT-Rg3(1.5)/Lp组、HHT-Rh2(1.5)/Lp组的高中低三个剂量组未出现动物死亡。说明在药物：皂苷＝1：1.0-1.5的范围内，具有较好的制剂学特征，从而具有较好的降低毒性的作用。
(2)药代动力学实验结果显示，HHT-Rg3(1.0)/Lp组、HHT-Rg3(1.5)/Lp组、HHT-Rg3(2.0)/Lp组、HHT-Rh2(1.5)/Lp组相对普通胆固醇脂质体和3组对照组，实验组具有较好的长循环效果。
综上实验，当人参皂苷的份数为1-1.5份时，得到的脂质体的具有优秀的制剂学特征和药效、以及交底的毒性，该范围为本发明优选的处方范围。

Claims (13)

1.一种脂质体，其原料包括如下重量份计的组分：10-20份磷脂、0.5-3.0份人参皂苷和1份高三尖杉酯碱；所述的脂质体不含有胆固醇、大豆油或油酸钠；
所述的磷脂为蛋黄卵磷脂、大豆磷脂、脑磷脂、甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺和甲氧基聚乙二醇2000-二油酰基磷脂酰乙醇胺中的一种或多种，或混合氢化磷脂；
所述的混合氢化磷脂为含有0.1-10％二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000的氢化磷脂。
2.如权利要求1所述的脂质体，其特征在于，所述的脂质体的膜相包含人参皂苷；
和/或，所述的脂质体的D90粒径≤200nm，优选≤150nm，更优选为≤120nm；
和/或，所述的脂质体的包封率≥80％，优选≥90％，更优选≥95％；
和/或，所述的磷脂为蛋黄卵磷脂、脑磷脂或二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000的蛋黄卵磷脂；
和/或，当所述的磷脂为蛋黄卵磷脂、大豆磷脂、脑磷脂、甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺和甲氧基聚乙二醇2000-二油酰基磷脂酰乙醇胺中的一种或多种时，所述的磷脂的份数为10-15份；
和/或，当所述的磷脂为混合氢化磷脂时，所述的磷脂的份数为15-22份；
和/或，所述的人参皂苷为20(S)-人参皂苷Rg3、人参皂苷伪Rg3、20(S)-人参皂苷Rh2、人参皂苷Rg5、人参皂苷Rk1、人参皂苷Rp1或人参皂苷伪GQ，优选20(S)-人参皂苷Rg3、1.5份人参皂苷伪Rg3、20(S)-人参皂苷Rh2、人参皂苷Rg5、人参皂苷Rk1或人参皂苷Rp1；
和/或，所述的人参皂苷的份数为1.0-2.5份，优选1.0-1.5份。
3.如权利要求1所述的脂质体，其特征在于，所述的磷脂为10份蛋黄卵磷脂、12份蛋黄卵磷脂、15份蛋黄卵磷脂、20份蛋黄卵磷脂、12份大豆磷脂、12份脑磷脂、12份甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺、12份甲氧基聚乙二醇2000-二油酰基磷脂酰乙醇胺、12份含有4.7％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的蛋黄卵磷脂、18份含有3％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂、15.1份含有0.6％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂、15.3份含有2.0％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂、15.5份含有3.2％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂、16份含有6.3％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂、16.5份含有9.1％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂、18.1份含有0.6％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂、18.3份含有1.6％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂、18.5份含有2.7％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂、19份含有5.3％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂、19.5份含有7.7％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂、20份含有10.0％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂、20.1份含有0.5％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂、20.3份含有1.4％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂、20.5份含有2.4％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂、21份含有4.7％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂、21.5份含有6.98％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂或22份含有9.09％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂，优选10份蛋黄卵磷脂、12份蛋黄卵磷脂、12份脑磷脂或12份含有4.7％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的蛋黄卵磷脂、18.1份含有0.6％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂、18.3份含有1.6％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂或18.5份含有2.7％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂；
和/或，所述的人参皂苷为1.0份20(S)-人参皂苷Rg3、1.5份20(S)-人参皂苷Rg3、2.5份20(S)-人参皂苷Rg3、3.0份20(S)-人参皂苷Rg3、1.0份20(S)-人参皂苷Rh2、1.5份20(S)-人参皂苷Rh2、2.0份20(S)-人参皂苷Rh2、2.5份20(S)-人参皂苷Rh2、3.0份20(S)-人参皂苷Rh2、1.5份人参皂苷伪Rg3、1.5份人参皂苷Rg5、1.5份人参皂苷Rk1或1.5份人参皂苷Rp1，优选1.0份20(S)-人参皂苷Rg3、1.5份20(S)-人参皂苷Rg3、1.0份20(S)-人参皂苷Rh2或1.5份20(S)-人参皂苷Rh2。
4.如权利要求1所述的脂质体，其特征在于，所述的脂质体为如下任一方案：
方案1：
所述的脂质体，其原料包括如下重量份计的组分：10-15份磷脂、0.5-3.0份人参皂苷和1份高三尖杉酯碱；
所述的磷脂为蛋黄卵磷脂、大豆磷脂、脑磷脂、甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺和甲氧基聚乙二醇2000-二油酰基磷脂酰乙醇胺中的一种或多种；
方案2：
所述的脂质体，其原料包括如下重量份计的组分：10-15份磷脂、1.0-2.0份人参皂苷和1份高三尖杉酯碱；
所述的磷脂为蛋黄卵磷脂或脑磷脂；
所述的人参皂苷为20(S)-人参皂苷Rg3、1.5份人参皂苷伪Rg3、20(S)-人参皂苷Rh2、人参皂苷Rg5、人参皂苷Rk1或人参皂苷Rp1；
所述的脂质体的D90粒径≤120nm；
方案3：
所述的脂质体，其原料包括如下重量份计的组分：15-22份磷脂、0.5-3.0份人参皂苷和1份高三尖杉酯碱；
所述的磷脂为含有0.1-10％二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000的氢化磷脂；
方案4：
所述的脂质体，其原料包括如下重量份计的组分：18.1-18.5份磷脂、1.0-2.0份人参皂苷和1份高三尖杉酯碱；
所述的磷脂为含有0.6-2.7％甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺的氢化磷脂；
所述的人参皂苷为20(S)-人参皂苷Rg3、人参皂苷伪Rg3、20(S)-人参皂苷Rh2、人参皂苷Rg5、人参皂苷Rk1或人参皂苷Rp1；
所述的脂质体的D90粒径≤120nm；
方案5：
所述的脂质体，其原料包括如下重量份计的组分：12份蛋黄卵磷脂、1.0-3.0份人参皂苷和1份高三尖杉酯碱；
所述的人参皂苷为20(S)-人参皂苷Rg3或20(S)-人参皂苷Rh2；
所述的脂质体的D90粒径≤120nm；
方案6：
所述的脂质体，其原料包括如下重量份计的组分：12份蛋黄卵磷脂、1.0-1.5份人参皂苷和1份高三尖杉酯碱；
所述的人参皂苷为20(S)-人参皂苷Rg3或20(S)-人参皂苷Rh2；
所述的脂质体的D90粒径≤120nm。
5.如权利要求1-4中任一项所述的脂质体，其特征在于，其原料由如下重量份计的组分组成：如权利要求1-4中任一项所述的磷脂、如权利要求1-4中任一项所述的人参皂苷和1份高三尖杉酯碱。
6.一种脂质体的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤；
步骤1、将以重量份计的10-20份磷脂、以重量份计的0.5-3.0份人参皂苷和以重量份计的1份高三尖杉酯碱与有机溶剂进行混合得到的混合溶液A1，将混合溶液A1浓缩成膜；其中，所述的磷脂和所述的人参皂苷均如权利要求1-4中任一项所述；
步骤2、将步骤1得到的膜在水中进行水化得到溶液A2；
步骤3、将步骤2得到的溶液A2采用高压均质法的方法或者高速剪切-挤出法得到溶液A3；将所述的溶液A3过滤和浓缩，得到所述的脂质体。
7.如权利要求6所述的脂质体的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述的有机溶剂为醇类溶剂和/或卤代烃类溶剂，进一步优选为乙醇和氯仿；
和/或，步骤1中，所述的有机溶剂与所述的高三尖杉酯碱的体积质量比为90-250ml/g；
和/或，步骤1中，所述的混合的顺序为将所述的人参皂苷和所述的磷脂加入到所述的高三尖杉酯碱与所述的有机溶剂形成的溶液中；例如，将所述的人参皂苷、所述的磷脂加入到高三尖杉酯碱与所述的有机溶剂的形成的溶液中，加热溶解得到混合液；所述的加热可为水浴加热，所述的加热温度可以为35-65℃，例如40-45℃，或55-60℃
和/或，步骤1中，所述的浓缩为减压浓缩；所述的减压浓缩的真空度可以为-0.04--0.1mpa，例如-0.04--0.1Mpa；
和/或，步骤1中，所述的浓缩在旋蒸瓶中进行，转速为40-60rp/min，例如50rp/min；
和/或，步骤2中，所述的溶液A2还含有冻干保护剂；
所述的冻干保护剂优选为葡萄糖、海藻糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、甘露醇和木糖醇中的一种或多种，更优选为葡萄糖、海藻糖或蔗糖；所述的冻干保护剂以重量份计的份数优选为10-30份，更优选为12-15份；
所述的冻干保护剂的浓度优选为10-60mg/ml；
和/或，步骤2中，所述的水为注射用水；
和/或，步骤2中，所述的冻干保护剂的浓度为10-60mg/ml，例如50mg/mL；
和/或，步骤2中，所述的水化的温度为35-65℃，例如45-50℃；
和/或，步骤2中，所述的水化在旋蒸瓶中进行，转速为40-70rp/min，例如50rp/min或65rp/min；
和/或，步骤2中，所述的水化的状态以溶液均一即可，所述的水化的时间例如2-4小时；
和/或，步骤2中，所述的水与所述的高三尖杉酯碱的体积质量比为100-300ml/g，例如240ml/g；
和/或，步骤3中，所述的高压均质法包括以下步骤：将步骤2得到的所述的溶液A2进行高压均质，控制粒径D90在100nm以下，得到溶液A3；
所述的高压均质的压力优选800-1400bar，例如1200bar；所述的高压均质的次数优选3或4次，例如4次；
和/或，步骤3中，所述的高速剪切-挤出法包括以下步骤：将步骤2得到的所述的溶液A2进行剪切后，分别通过400nm、200nm和100nm孔径挤出板挤出，控制粒径D90在100nm以下，得到溶液A3；
所述的高速剪切优选在室温下进行；所述的高速剪切的转速优选1500-2200rp/min；所述的高速剪切的时间优选5-10min；所述的挤出的温度优选35-45℃；所述的挤出的压力优选600-800psi；所述挤出的次数优选3或4次。
8.如权利要求6所述的脂质体的制备方法，其特征在于，步骤中1，将所述的人参皂苷和所述的磷脂加入到所述的高三尖杉酯碱与所述的有机溶剂形成的溶液中，所述的有机溶剂为体积比为1:1乙醇和氯仿；所述的浓缩为减压浓缩，所述的减压浓缩的真空度为-0.04-0.1Mpa；
步骤2中，所述的水化的温度为35-65℃；
步骤3中，所述的高压均质法包括以下步骤：将步骤2得到的所述的溶液A2进行高压均质，控制粒径D90在100nm以下，得到溶液A3；所述的高压均质的压力为800-1400bar；所述的高压均质的次数为3或4次；
所述的高速剪切-挤出法包括以下步骤：将步骤2得到的所述的溶液A2进行剪切后，分别依次通过400nm、200nm和100nm孔径挤出板挤出，控制粒径D90在100nm以下，得到溶液A3；所述的高速剪切的转速为1500-2200rp/min；所述的高速剪切的时间为5-10min；所述的挤出的温度为35-45℃。
9.一种脂质体，其按照如权利要求6-8中任一项所述的脂质体的制备方法制得。
10.一种注射用脂质体的制备方法，其包括如下步骤；
步骤a、b和c如权利要求6-8中任一项所述的脂质体的制备方法中的步骤1-3，得到的溶液A3；
步骤d、将所述的步骤c得到的溶液A3进行除菌过滤、分装装于西林瓶中，得到的溶液A4；
步骤e、将所述的步骤d得到的溶液A4进行冷冻干燥，得到注射用脂质体。
11.一种脂质体，其按照如权利要求10所述的注射用脂质体的制备方法制得。
12.一种脂质体组合物，其包括如权利要求1-5、9和11中任一项所述的脂质体和辅料；
所述的辅料优选为冻干保护剂和/或注射用水；
所述的冻干保护剂以重量份计的份数优选为10-30份，更优选为12-15份；
所述的冻干保护剂优选为葡萄糖、海藻糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、甘露醇和木糖醇中的一种或多种，更优选为葡萄糖、海藻糖或蔗糖。
13.一种物质A在制备用于治疗或预防癌症药物中的应用，所述的物质A为如权利要求1-5、9和11中任一项所述的脂质体或如权利要求9所述的脂质体组合物；
所述的癌症优选急性非淋巴细胞白血病。
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