CN111228219B - 以人参皂苷Rg3或其类似物为膜材的空白脂质体、其制备方法及应用 - Google Patents

以人参皂苷Rg3或其类似物为膜材的空白脂质体、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了以人参皂苷Rg3或其类似物为膜材的空白脂质体、其制备方法及应用。本发明的如式I所示的人参皂苷为膜材的空白脂质体，其中，所述的空白脂质体具有膜，所述的膜包含脂类物质和如式I所示的人参皂苷。本发明的空白脂质体具有成膜性、包封率、靶向性、长循环、稳定性、安全性和均一性好特点，用于包封药物、化妆品中的活性物质、生物制剂、多聚核苷酸或寡聚核苷酸，形成负载活性物质的脂质体，并且制备工艺简便。

Description

以人参皂苷Rg3或其类似物为膜材的空白脂质体、其制备方法 及应用
技术领域
本发明涉及一种以人参皂苷Rg3或其类似物为膜材的空白脂质体、其制备方法及应用。
背景技术
脂质体是一种定向药物载体，属于靶向给药系统的一种新剂型。它可以将药物粉末或溶液包埋在直径为纳米级的微粒中，这种微粒类似于生物膜结构的双分子层微小囊泡，进入人体内主要被网状内皮系统吞噬，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在靶向组织中积蓄，从而提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。
CN201210151597.0公开了一种人参皂苷Rg3脂质体及其制备方法，该专利公开了人参皂苷Rg3、磷脂、胆固醇等溶解于正丁醇、乙醇或山梨醇等溶剂中，制备得到Rg3脂质体。CN201610082643.4公开了一种20(R)-人参皂苷Rg3脂质体药物的制备方法，该方法公开了一种将20(R)-人参皂苷Rg3溶解于无水乙醇，然后再装入到磷脂与胆固醇的空白脂质体中，制成20(R)-人参皂苷Rg3脂质体。CN201611059434.4公开了一种人参皂苷Rh2酯脂质体及制备方法和应用，该方法公开了一种将人参皂苷Rh2酯、卵磷脂、胆固醇等溶解于无水乙醇，然后制备得到Rh2酯脂质体。Huan Yu等在International Journal of Pharmaceutics 450(2013)250-258发表的文献所述，公开了一种将蛋黄卵磷脂、人参皂苷Rg3和胆固醇溶解于甲醇，浓缩成膜后水化，可制得人参皂苷Rg3脂质体。该文献表明，该Rg3脂质体中Rg3与磷脂的质量百分比在5-15％之间，当超过15％时，Rg3的包封率仅82％。
上述现有技术公开的脂质体中均以含脂类物质和胆固醇为膜材，将具有药物活性的人参皂苷Rg3负载该膜材上。
中国发明专利CN201610693884.2中公开了以人参皂苷Rg5或Rk1等为代表的两亲性皂苷能作为脂质体膜材。但是这类皂苷应具有亲油端和亲水端，而且亲油端须有两个以上的双健。而以Rg3和Rh2等皂苷作为脂质体膜材包封紫杉醇时，得到的脂质体外观、包封率、粒径和稳定性均较差，尤其是粒径和稳定性，粒径在1μm以上，放置7天有沉淀，包封率≤80％。
另外，长循环脂质体是指普通脂质体经表面修饰后，以达到药物缓释，使血药浓度长时间作用于靶组织，提高治疗效果的一种可体内生物降解的新型脂质体。目前，长循环脂质体的修饰物主要有：聚乙二醇(PEG)修饰的磷脂衍生物、非离子表面活性剂等，如PEG-DSPC,PEG-PE,PEG-DSPE，PEG-PC等。长循环脂质体的专利和文献较多，如CN201711105675.2，CN201710993701.3,CN201611232858.6,CN201611119508.9,CN201610835887.5等。但都未有专利或文献公开报道有关以人参皂苷为膜材的长循环脂质体。
而人参皂苷Rg3和Rh2的亲油段仅含有一个双键，水溶性差，可溶于甲醇、乙醇，不溶于乙醚、氯仿(见国际药学研究杂志，2017年6月，第44卷第6期《人参皂苷Rg3剂型的研究进展》)。
因此，开发一种药效更好，溶血性和安全性都符合要求的，以人参皂苷Rg3和Rh2为膜材，具有良好靶向特性和长循环作用的脂质体，具有重要的应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了提供一种不同于现有技术的以人参皂苷Rg3或其类似物为膜材的空白脂质体、其制备方法及应用。本发明的空白脂质体具有成膜性、包封率、靶向性、长循环、稳定性、安全性和均一性好的特点，并且制备工艺简便。本发明的空白脂质体可用于包封药物、化妆品中的活性物质、生物制剂、多聚核苷酸或寡聚核苷酸，形成负载活性物质的脂质体。所述的载药脂质体一般都具有对肿瘤细胞的靶向作用、抗多药耐药作用、长循环作用、增效减毒和药物协同作用。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明提供了一种以如式I所示的人参皂苷为膜材的空白脂质体，其中，所述空白脂质体具有膜，所述膜包含脂类物质和如式I所示的人参皂苷：
Figure BDA0001885981880000021
其中，“*”表述手性C；R1为H、R10、R11或羟基；
R10为下述基团中的任一种：-O-Glc、-O-Rha、-O-Lyx、-O-Xyl、-O-Ara(p)、-O-Ara(f)、-O-Glc(2→1)Glc(数字表示碳位，→表示连接关系，下同)、-O-Glc(6→1)Glc、-O-Glc(2→1)Rha、-O-Glc(2→1)Xyl、-O-Glc(6→1)Xyl、-O-Glc(6→1)Rha、-O-Glc(2→1)Ara(p)、-O-Glc(6→1)Ara(p)、-O-Glc(2→1)Ara(f)、-O-Glc(6→1)Ara(f)、-O-Glc(2→1)Glc(2→1)Glc、-O-Glc(2→1)Glc(2→1)Xyl、-O-Glc(6→1)Glc(6→1)Xyl、-O-Glc(2→1)Glc(4→1)Xyl、-O-Glc(2→1)Lyx、-O-Glc(6→1)Lyx、-O-Glc(2→1)Glc(2→1)Rha、-O-Glc(2→1)Glc(2→1)Lyx、-O-Glc(2→1)Glc(2→1)Ara(f)、-O-Glc(2→1)Glc(2→1)Ara(p)、-O-Glc(2→1)Glc(6→1)Glc、-O-Glc(2→1)Glc(6→1)Rha、-O-Glc(2→1)Glc(6→1)Xyl、-O-Glc(2→1)Glc(6→1)Lyx、-O-Glc(2→1)Glc(6→1)Ara(f)、-O-Glc(2→1)Glc(6→1)Ara(p)、-O-Glc(6→1)Glc(2→1)Glc、-O-Glc(6→1)Glc(2→1)Rha、-O-Glc(6→1)Glc(2→1)Xyl、-O-Glc(6→1)Glc(2→1)Lyx、-O-Glc(6→1)Glc(2→1)Ara(f)、-O-Glc(6→1)Glc(2→1)Ara(p)、-O-Glc(6→1)Glc(6→1)Glc、-O-Glc(6→1)Glc(6→1)Rha、-O-Glc(6→1)Glc(6→1)Lyx、-O-Glc(6→1)Glc(6→1)Ara(f)或-O-Glc(6→1)Glc(6→1)Ara(p)；其中，Glc为吡喃葡萄糖基，Xyl为吡喃木糖基，Rha为吡喃鼠李糖基，Ara(p)为吡喃阿拉伯糖基，Ara(f)为呋喃阿拉伯糖基，Lyx为来苏糖基；
R11为R10中的一个以上的羟基被R10所取代，每个R10(当存在两个以上时)独立地相同或不同。
所述R1优选羟基或
Figure BDA0001885981880000031
所述如式I所示的人参皂苷的中标记为“*”的C的构型优选S构型。
所述如式I所示的人参皂苷优选
Figure BDA0001885981880000032
其中“*”表述手性C。
所述空白脂质体的平均粒径可为20～500nm，优选50～200nm，更优选80～100nm，最优选80～90nm。
所述空白脂质体中，所述如式I所示的人参皂苷在成膜前，优选，经微粉化处理，制得所述如式I所示的人参皂苷的超微粉。
所述如式I所示的人参皂苷的超微粉的平均粒径可为≤50μm，优选≤20μm，更优选≤10μm。
所述将如式I所示的人参皂苷的超微粉化的处理条件可为本领域常规条件。本发明优选，所述如式I所示的人参皂苷的超微粉的处理的温度为20-30℃。所述如式I所示的人参皂苷的超微粉的处理的时间为20～40分钟。
所述如式I所示的人参皂苷在成膜前，纯度可为≥90％；优选≥95％；更优选≥98％；所述纯度为经高效液相色谱(HPLC)检测，其色谱中，所述如式I所示的人参皂苷的峰面积占总的峰面积的比例。
所述空白脂质体的包封率优选≥90％；更优选≥95％；最优选≥98％。
所述空白脂质体中，所述脂类物质的质量与所述如式I所示的人参皂苷的质量的比值可为0.5-100；优选2-20；更优选3-10，例如5，又例如7。
所述空白脂质体中，所述膜可进一步包含胆固醇。
当所述的空白脂质体中还包含胆固醇时，其中，所述脂质体与所述如式I所示的人参皂苷的质量的比值可为0.5-100；优选2-20；更优选3-10。所述胆固醇的质量与所述如式I所示的人参皂苷的质量的比值可为0.01～100；优选0.1～10；更优选0.5～2，例如0.5。
当所述的空白脂质体中还包含胆固醇时，所述空白脂质体中，所述如式I所示的人参皂苷的质量在所述的膜中的含量可为1～50％；优选3～15％。所述脂类物质在所述的膜中的含量优选为30-90％；优选50～80％。所述胆固醇在所述的膜中的含量优选为0％-50％；优选10～30％；以上百分比(％)均是指各组分的质量占所述空白脂质体的总质量的质量百分比。
所述的空白脂质体中，所述的膜还可进一步包含长循环材料。
当所述的空白脂质体中包含长循环材料时，其中，所述脂类物质与所述如式I所示的人参皂苷的质量的比值可为0.5～100，优选2～20，更优选3～10。所述长循环材料的质量与所述如式I所示的人参皂苷的质量的比值可为0.01～10，优选0.1～5，更优选0.1～1。
优选，所述空白脂质体还可进一步包含冻干保护剂。所述的冻干保护剂在空白脂质体中的含量可为本领域空白脂质体中常规的含量，例如≤95％或≤80％，较佳地为0.5％-70％，更佳地为5％-60％，最佳地为30％-60％；所述百分比(％)是指冻干保护剂的质量占所述空白脂质体总质量的质量百分比。
优选，所述空白脂质体还可进一步包含抗氧化剂。所述的抗氧化剂在所述的空白脂质体中的含量一般小于等于25％，优选为0.001％-15％，更优选为0.01％-10％，进一步优选为0.01％-5％(例如0.7％)；所述的百分比(％)是指所述的抗氧化剂的质量与所述的空白脂质体的总质量的质量百分比。
优选，所述空白脂质体还可进一步包含大豆油和/或油酸钠并封装在膜中。所述大豆油和/或油酸钠的含量可为1％-30％，更优选1％-20％；最优选1％-10％，例如7％，又例如8％；所述的百分比是指大豆油和/或油酸钠的质量占所述的空白脂质体总质量的质量百分比。所述“大豆油和/或油酸钠”和所述脂类中的磷脂的质量比值较佳地为0.1～10；更佳地为0.1～5，例如0.12，又例如0.14。
优选，所述空白脂质体中还可进一步包括其他辅料。所述的其他辅料可为本领域制备脂质体时常规添加的除抗氧化剂和冻干保护剂以外的其他辅料，例如表面活性剂、热敏性辅料、pH敏感物质和离子添加剂中的一种或多种。
在一优选技术方案中，所述空白脂质体包含下列组分：脂类物质和所述如式I所示的人参皂苷；或者脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷和冻干保护剂；或者脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷和胆固醇；或者脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷、胆固醇和冻干保护剂；或者脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷和长循环材料；或者脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷和抗氧化剂；或者脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷、抗氧化剂和冻干保护剂；或者脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷和大豆油和/或油酸钠；或者脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷、胆固醇和长循环材料；或者脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷、胆固醇、长循环材料和冻干保护剂；或者脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷、胆固醇和抗氧化剂；或者脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷、胆固醇、抗氧化剂和冻干保护剂；或者脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷、胆固醇和大豆油和/或油酸钠；或者脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷、胆固醇、长循环材料和冻干保护剂；或者脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷、胆固醇、冻干保护剂和大豆油和/或油酸钠；或者脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷、胆固醇、冻干保护剂、长循环材料和氧化剂；或者脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷、胆固醇、冻干保护剂、长循环材料和大豆油和/或油酸钠；或者脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷、胆固醇、冻干保护剂、长循环材料、氧化剂和大豆油和/或油酸钠。
在另一优选技术方案中，所述的空白脂质体由上述组分组成。
在一优选技术方案中，所述的空白脂质体由下列组分组成：所述如式I所示的人参皂苷、脂类物质和冻干保护剂。
在一优选技术方案中，所述的空白脂质体由下列组分组成：脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷、抗氧化剂和冻干保护剂。
在一优选技术方案中，所述的空白脂质体由下列组分组成：脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷、胆固醇和冻干保护剂。
在一优选技术方案中，所述的空白脂质体由下列组分组成：脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷、胆固醇、大豆油和/或油酸钠和冻干保护剂。
在一优选技术方案中，所述的空白脂质体由下列组分组成：脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷、胆固醇、长循环材料和冻干保护剂。
在一优选技术方案中，所述的空白脂质体由下列组分组成：脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷、胆固醇、抗氧化剂、长循环材料和冻干保护剂。
在一优选技术方案中，所述的空白脂质体由下列组分组成：脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷、胆固醇、抗氧化剂、大豆油和/或油酸钠和冻干保护剂。
本发明中，所述的脂类物质可为本领域常规的脂类物质，通常是指磷脂，优选天然磷脂、半合成磷脂和全合成磷脂中的一种或多种。
本发明中，所述的天然磷脂一般是来源于大豆、蛋黄、动物脑或脏器中的天然磷脂，优选天然卵磷脂、鞘磷脂、甘油磷脂、大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂和脑磷脂中的一种或多种。
本发明中，所述的半合成或全合成磷脂可为本领域常规的半合成或全合成磷脂，较佳地为磷脂酰胆碱类的磷脂、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺类的磷脂、磷脂酰甘油(DSPG)、二鲸蜡磷酸酯(DCP)、PEG修饰的磷脂、琥珀酸胆固醇酯(CHS)和2-油酰-1-棕榈锡甘油-3-磷酸胆碱(16:0-18:1PC，其中16:0-18:1是指PC的碳链)中的一种或多种。由于二棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰胆碱等半合成或全合成的磷脂本身具有热敏性，可同时作为热敏性辅料使用。
本发明中，所述的磷脂酰胆碱类的磷脂可为本领域常规的磷脂酰胆碱类的磷脂，较佳地为氢化大豆卵磷脂(HSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、磷脂酰胆碱(SPC)、单棕榈酰磷脂酰胆碱(MPPC)和甘油磷脂酰胆碱(GPC)中的一种或多种。
本发明中，所述的磷脂酰乙醇胺类的磷脂可为本领常规的磷脂酰乙醇胺类的磷脂，较佳地为1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺(DLPE)、二芥酰基磷脂酰乙醇胺(DEPE)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)和二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)中的一种或多种。
本发明中，所述的脂类物质优选蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂或大豆卵磷脂S100。
本发明中，所述长循环材料可为本领域常规的PEG修饰的磷脂，较佳地为磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DMPE-PEG)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DPPE-PEG)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)、二油酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DOPE-PEG)、C8神经酰胺-聚乙二醇(C8Ceramide-PEG)、C16神经酰胺-聚乙二醇(C16Ceramide-PEG)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-琥珀酰(DSPE-PEG Succinyl)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基(DSPE-PEG)Carboxylic Acid)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺基(DSPE-PEG Maleimide)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-丙酰胺双巯基吡啶(DSPE-PEGPDP)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-三聚氯氰(DSPE-PEGCyanur)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基(DSPE-PEGAmine)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-生物素(DSPE-PEGBiotin)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸(DSPE-PEGFolate)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸(DSPE-PEGFolate)、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DLPE-PEG)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-活性酯(DSPE-PEG-NHS)、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-活性酯(DMPE-PEG-NHS)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-活性酯(DPPE-PEG-NHS)、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-活性酯(DLPE-PEG-NHS)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺基(DSPE-PEG-Maleimide)、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺基(DMPE-PEG-Maleimide)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺基(DPPE-PEG-Maleimide)、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺基(DLPE-PEG-Maleimide)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-生物素(DSPE-PEG-Biotin)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-荧光素(DSPE-PEG-FITC)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羟基(DSPE-PEG-OH)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基(DSPE-PEG-NH2)、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基(DMPE-PEG-NH2)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基(DPPE-PEG-NH2)、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基(DLPE-PEG-NH2)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基(DSPE-PEG-COOH)、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基(DMPE-PEG-COOH)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基(DPPE-PEG-COOH)、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基(DLPE-PEG-COOH)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-硫基(DSPE-PEG-SH)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-硅烷(DSPE-PEG-Silane)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叠氮(DSPE-PEG-N3)、胆固醇-聚乙二醇(CholesterolPEG)、甲氧基-聚乙二醇-胆固醇(mPEG-CLS)、胆固醇-聚乙二醇-活性酯(Cholesterol PEGNHS ester)、胆固醇-聚乙二醇-马来酰亚胺(CLS-PEG-Mal)、胆固醇-聚乙二醇-生物素(Cholesterol PEG Biotin)、胆固醇-聚乙二醇-荧光素(Cholesterol PEG fluorescein)、胆固醇-聚乙二醇-羧基(Cholesterol PEG COOH)、胆固醇-聚乙二醇-氨基(CholesterolPEG NH2)和胆固醇-聚乙二醇-硫基(Cholesterol PEG SH)中的一种或多种。其中，所述的聚乙二醇的相对分子量优选300-50000，更佳地为500-10000，例如300、350、500、550、1000、2000、3400、5000、10000、20000、30000、40000或50000。
本发明中，所述的DMPE-PEG的数均分子量较佳地为350、550、750、1000、2000、3000或5000。所述的DPPE-PEG的数均分子量较佳地为350、550、750、1000、2000、3000或5000。所述的DSPE-PEG的数均分子量较佳地为350、550、750、1000、2000、3000、5000、10000、20000、30000或40000。所述的DOPE-PEG的数均分子量较佳地为350、550、750、1000、2000、3000或5000。所述的C8Ceramide-PEG的数均分子量较佳地为750、2000或5000。所述的C16Ceramide-PEG的数均分子量较佳地为750、2000或5000。所述的DLPE-PEG的数均分子量较佳地为2000或5000。所述的DSPE-PEG-NHS的数均分子量较佳地为1000、2000、5000、10000、20000、30000或40000。所述的DMPE-PEG-NHS的数均分子量较佳地为3400或5000。所述的DPPE-PEG-NHS的数均分子量较佳地为3400或5000。所述的DLPE-PEG-NHS的数均分子量较佳地为3400或5000。所述的DSPE-PEG-Maleimide的数均分子量较佳地为1000、2000、3400、5000或10000。所述的DMPE-PEG-Maleimide的数均分子量较佳地为1000、2000、3400、5000或10000。、所述的DPPE-PEG-Maleimide的数均分子量较佳地为1000、2000、3400、5000或10000。所述的DLPE-PEG-Maleimid的数均分子量较佳地为1000、2000、3400、5000或10000。所述的DSPE-PEG-Biotin的数均分子量较佳地为1000、2000、3400、5000或10000。所述的DSPE-PEG-FITC的数均分子量较佳地为1000、2000、3400、5000或10000。所述的DSPE-PEG-OH的数均分子量较佳地为2000、3400或5000。所述的DSPE-PEG-NH2的数均分子量较佳地为2000、3400或5000。所述的DMPE-PEG-NH2的数均分子量较佳地为2000、3400或5000。所述的DPPE-PEG-NH2的数均分子量较佳地为2000、3400或5000。所述的DLPE-PEG-NH2的数均分子量较佳地为2000、3400或5000。所述的DSPE-PEG-COOH的数均分子量较佳地为2000、3400或5000。所述的DMPE-PEG-COOH的数均分子量较佳地为2000、3400或5000。所述的DPPE-PEG-COOH的数均分子量较佳地为2000、3400或5000。所述的DLPE-PEG-COOH的数均分子量较佳地为2000、3400或5000。所述的DSPE-PEG-SH的数均分子量较佳地为5000。所述的DSPE-PEG-Silane的数均分子量较佳地为3400。所述的DSPE-PEG-N3的数均分子量较佳地为2000、3400或5000。所述的mPEG-CLS的数均分子量较佳地为1000、2000、5000、10000或20000。所述的Cholesterol PEG NHS ester的数均分子量较佳地为1000、2000、3400、5000或10000。所述的CLS-PEG-Mal的数均分子量较佳地为2000、3400、5000或10000。所述的CLS-PEG-Biotin的数均分子量较佳地为2000、3400或5000。所述的CLS-PEG-FITC的数均分子量较佳地为2000、3400或5000。所述的Cholesterol PEG COOH的数均分子量较佳地为3400。所述的Cholesterol PEG amine的数均分子量较佳地为3400。所述的Cholesterol PEG Thiol/Sulfhydril的数均分子量较佳地为3400。
本发明中，所述长循环材料优选PEG2000-DSPE。
本发明中，所述的抗氧化剂可为本领域常规的抗氧化剂，较佳地为焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、没食子酸丙酯、α-生育酚、α-羟基酸、黄酮类化合物、苯丙素酚类化合物、维生素E、维生素C、反丁烯二酸、半胱氨酸、蛋氨酸、丁羟基茴香醚(BHA)、二丁羟基甲苯(BHT)、硫代二丙酸、亚硫酸盐(如亚硫酸钠)、亚硫酸氢盐(如亚硫酸氢钠)、二硫代氨基苯甲酸类化合物、枸橼酸、苹果酸、山梨醇、甘油、丙二醇、氢醌、羟基香豆素、乙醇胺、磷酸和亚磷酸中的一种或多种。
所述抗氧化剂优选为维生素E、维生素C、硫代硫酸钠或亚硫酸钠。
本发明中，所述的冻干保护剂可为本领域常规的冻干保护剂，一般为糖、多元醇、氨基酸和缓冲剂中的一种或多种。其中，所述的糖较佳地为单糖、双糖和多糖中的一种或多种。所述的单糖较佳地为葡萄糖、甘露醇、木糖醇和山梨醇中的一种或多种。所述的双糖较佳地为蔗糖、乳糖、半乳糖和麦芽糖中的一种或多种。所述的多糖较佳地为海藻糖。所述的多元醇较佳地为丙二醇和/或丙三醇。所述的氨基酸较佳地为α-氨基酸，例如苏氨酸、甘氨酸、谷氨酸、精氨酸和组氨酸中的一种或多种。所述的缓冲剂一般是指缓冲溶液。所述的缓冲溶液可为本领域常规的缓冲溶液，较佳地其pH值在3-10之间，更佳地在5-7之间。所述的缓冲溶液较佳地为硫酸铵水溶液、乙醇-醋酸缓冲溶液、三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液、巴比妥缓冲溶液、甲酸钠缓冲溶液、邻苯二甲酸盐缓冲溶液、枸橼酸盐缓冲溶液、枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲溶液、氨-氯化铵缓冲溶液、硼砂-氯化钙缓冲溶液、醋酸盐缓冲溶液、醋酸-锂盐缓冲溶液、醋酸-醋酸钠缓冲溶液、醋酸-醋酸铵缓冲溶液、磷酸-三乙胺缓冲溶液或磷酸盐缓冲溶液(PBS)。
本发明中，所述的冻干保护剂优选海藻糖、葡萄糖、蔗糖、丙二醇、丙三醇、木糖醇或硫酸铵水溶液。
本发明中，所述的表面活性剂较佳地为聚乙二醇和/或聚山梨醇酯。其中，所述的聚乙二醇的数均分子量较佳地为200-8000。所述的聚山梨醇酯较佳地为聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇三油酸酯、聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)、聚赖氨酸-聚丙交酯乙交酯、聚醚酰亚胺-聚乳酸、聚乙二醇-聚己内酯(PEG-PCL)、聚乙二醇-聚乙交酯丙交酯(PEG-PLGA)、聚乙二醇-聚十六烷基氰基丙烯酸酯(PEG-PHDCA)、泊洛沙姆188(Pluroic F68)、聚氧乙烯脂肪酸酯类(Mrij)、聚氧乙烯脂肪酸醚(Brij)和聚氧乙烯甲基蓖麻油醚(Cremophor)中的一种或多种。
本发明中，所述的热敏性辅料一般是指可使脂质体具有热敏性的聚合物和/或表面活性剂中的一种或多种。其中，所述的聚合物较佳地为聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚磷酸酯和聚磷脂酰胺共聚物中的一种或多种。所述的表面活性剂较佳地为吐温类表面活性剂(例如吐温80)和/或苄泽类表面活性剂。
本发明中，所述的离子添加剂较佳地为阳离子添加剂(例如十八胺)和/或阴离子添加剂(例如磷脂酸和/或磷脂酰丝氨酸)。
本发明中，上述其他辅料的用量可按照本领域含有该类辅料的普通脂质体中的用量进行选择。例如，当所述的空白脂质体中包含表面活性剂时，其含量为0％-50％，但不为0％；当所述的空白脂质体中包含离子添加剂时，其含量为0％-10％，但不为0％。
本发明还提供了一种如式I所示的人参皂苷为膜材的空白脂质体的制备方法。
所述制备方法可为本领域常规的脂质体制备方法制备得到，一般地，可采用注入法、逆向蒸发法、冻融法、复乳法、主动包封法、前体脂质体制备法、薄膜分散法、冷冻干燥法、硫酸铵梯度法或pH梯度法以及以上任意两种方法结合使用的方法。本发明优选下述方法：
步骤一：在有机溶剂中，将所述脂类物质和所述如式I所示的人参皂苷混合，可选地加入胆固醇、长循环材料、脂溶性抗氧化剂、大豆油和/或油酸钠、脂溶性表面活性剂、脂溶性热敏性辅料、脂溶性pH敏感物质和脂溶性离子添加剂中的一种或多种，得到一澄清溶液；其中，所述有机溶剂为醇类溶剂、卤代烃类和腈类溶剂中的一种或多种；所述如式I所示的人参皂苷经微粉化处理得到超微粉，所述超微粉的平均粒径≤50μm；
步骤二：除去步骤一中所得澄清溶液的有机溶剂，成膜，然后可选地与冻干保护剂的水溶液混合，可选地加入水溶性抗氧化剂、水溶性表面活性剂、水溶性热敏性辅料、水溶性pH敏感物质和水溶性离子添加剂中的一种或多种，超声、高压均质或挤推过膜后，过滤，得一含有如式I所示的人参皂苷脂质体的水溶液，干燥，即得所述空白脂质体。
所述的脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷、所述胆固醇、所述长循环材料、所述脂溶性抗氧化剂、所述大豆油和/或油酸钠、所述脂溶性表面活性剂、所述脂溶性热敏性辅料、所述脂溶性pH敏感物质和所述脂溶性离子的定义和所述如式I所示的人参皂苷微粉化处理的条件均同前所述。
步骤一中，所述卤代烃溶剂可为C1～4卤代烃类溶剂，优选C1～2卤代烃类溶剂，进一步优选氯仿、二氯甲烷和二氯乙烷中的一种或多种；更进一步优选二氯甲烷和/氯仿。所述的醇类溶剂可为C1～4醇类溶剂，优选C1～3醇类溶剂，进一步优选甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇和正丁醇中的一种或多种；更进一步优选甲醇、乙醇或异丙醇。所述腈类溶剂可为乙腈。当所述卤代烃类溶剂与所述醇类溶剂的混合溶剂时，所述卤代烃类溶剂与所述醇类溶剂的体积的比值可为5～100，优选5～10。当所述有机溶剂为所述卤代烃类溶剂与所述腈类溶剂的混合溶剂时，所述所述卤代烃类溶剂与所述腈类溶剂的体积的比值可为5～100，优选5～10。所述的溶剂的用量可为本领域脂质体制备方法中常规的用量，可不作具体限定，一般要求溶剂和所有组分混合后能够得到澄清溶液即可，较佳地，所述的有机溶剂与方法中步骤(1)中的所有组分的体积质量比为5-200mL/g。
步骤一中，所述超微粉的平均粒径可为≤20μm，优选≤10μm。
步骤一中，所述的混合的温度可为本领域常规的温度，一般为0-80℃，优选20-80℃，更优选为40-65℃。根据本领域常识，在一些情况下，为使混合温度达到80℃，需要在加热条件下进行；又或者当除冻干保护剂的所有原料组分中有对温度敏感的物质例如蛋白质类物质，一般选择在0℃下混合。
步骤二中，所述除去步骤(1)中澄清溶液的有机溶剂的操作可为本领域常规操作，一般使用旋转蒸发器或者膜蒸发器除去有机溶剂。其中，所述的除去有机溶剂的温度根据需要除去的有机溶剂进行常规选择，一般为40-65℃。
步骤二中，所述的超声、高压均质或挤推过膜的操作可为本领域常规的操作。所述的超声、高压均质或挤推过膜的操作结束后，所述脂质体颗粒的平均粒径一般在0.05～0.3μm，优选0.05～0.2μm。
步骤二中，所述的过滤的操作可为本领域脂质体制备方法中常规的操作，其目的是除去细菌、固体颗粒、特别大的脂质体(在负载活性物质的脂质体的制备方法中，也可除去未包封的游离药物)等。本发明中，所述过滤较佳地为微孔滤膜过滤。所述微孔滤膜的孔径较佳地为0.22微米。
步骤二中，所述冻干保护剂的水溶液是指所述的冻干保护剂与水混合形成的水溶液。其中，所述冻干保护剂的水溶液较佳地为5％-10％的冻干保护剂的水溶液，所述的百分比是指冻干保护剂的质量占冻干保护剂水溶液总质量的百分比。所述的冻干保护剂的水溶液的用量可不作具体限定，只要不影响空白脂质体的形成即可。
步骤二中，所述干燥的操作可为本领域常规的操作，较佳地为冷冻干燥，一般采用冷冻干燥机进行真空冷冻干燥。所述的冷冻干燥的温度和时间为本领域常规的温度和时间，可不作具体限定。
为方便贮存，将步骤二制得的含有所述空白脂质体的水溶液分装于西林瓶中，干燥，通入保护性气体(氩气或氮气)，密封保存即可。
本发明还提供了一种如上述如式I所示的人参皂苷为膜材的空白脂质体的制备方法制得的空白脂质体。
本发明还提供了一种负载活性物质的脂质体，其包括上述如式I所示的人参皂苷空白脂质体和活性物质。
所述的负载活性物质的脂质体的平均粒径可为本领域常规的平均粒径，优选30-500nm，更优选30-300nm，最优选50-200nm。
所述的负载活性物质的脂质体中，包封率可为80％以上，优选为90％以上，更优选为95％以上。
当所述的负载活性物质的脂质体中所述的活性物质为药物时，所述的负载活性物质的脂质体的给药途径可为本领域常规的给药途径，较佳地为注射给药、口服给药或透皮给药，用于疾病的治疗和/或医疗保健。因此，所述的负载活性物质的脂质体通常制备成注射剂、冻干注射剂、口服固体制剂、口服液、搽剂、膏剂、酊剂或气雾剂的形式。其中所述的注射给药的方式较佳地为静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射。一般地，将所述的负载活性物质的脂质体加入到生理盐水、磷酸盐缓冲溶液或5％的葡萄糖水溶液配置成注射液，用于注射给药。
所述的负载活性物质的脂质体中，当所述的活性物质为抗肿瘤药物时，所述的负载活性物质的脂质体一般具有长循环作用。所述负载活性物质的脂质体中，所述活性物质与所述如式I所示的人参皂苷质量的比值可为0.1～10，优选0.5～2(例如0.5，又例如1)。
所述活性物质中，所述药物可为本领域常规的药物，优选为抗肿瘤药物中的一种或多种。
所述的活性物质中，所述的抗肿瘤药物可为本领域常规的抗恶性肿瘤的药物，较佳地为紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛、替司他赛(Tesetaxel)、奥他他赛(Ortataxel)、拉洛他赛(Larotaxel)、司莫他赛(Simotaxel)、盐酸伊立替康、羟基喜树碱、氨基喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱、顺铂、卡铂、奥沙利铂、三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱、雷公藤甲素、阿糖胞苷、磷酸依托泊甙、去氧鬼臼毒素、石杉碱甲、酒石酸长春瑞滨、硫酸长春新碱、硫酸长春碱、埃博霉素A、埃博霉素B、埃博霉素C、埃博霉素D、埃博霉素E、埃博霉素F、地西他滨、三氧化二砷、全反式维甲酸、阿奇霉素、盐酸表柔比星、盐酸多柔比星(阿霉素)、盐酸氨柔比星中的一种或多种。
在一优选技术方案中，所述的活性物质为紫杉醇、多西他赛、伊立替康、阿霉素或顺铂。
本发明还提供了一种所述负载活性物质的脂质体的制备方法，其包括以下步骤：
步骤一：在有机溶剂中，将所述脂类物质和所述如式I所示的人参皂苷混合，可选地加入胆固醇、长循环材料、脂溶性抗氧化剂、大豆油和/或油酸钠、脂溶性表面活性剂、脂溶性热敏性辅料、脂溶性pH敏感物质和脂溶性离子添加剂中的一种或多种，得到一澄清溶液；其中，所述有机溶剂为醇类溶剂、卤代烃类和腈类溶剂中的一种或多种；所述如式I所示的人参皂苷经微粉化处理得到超微粉，所述超微粉的平均粒径≤50μm；
步骤二：除去步骤一中所得澄清溶液的有机溶剂，成膜，然后可选地与冻干保护剂的水溶液混合，可选地加入水溶性抗氧化剂、水溶性表面活性剂、水溶性热敏性辅料、水溶性pH敏感物质和水溶性离子添加剂中的一种或多种，超声、高压均质或挤推过膜后，得一空白脂质体溶液，过滤，然后与所述的活性物质混合，得一含有负载活性物质的脂质体的水溶液，干燥，即得所述的负载活性物质的脂质体。
所述如式I所示的人参皂苷的负载活性物质的脂质体的制备方法中步骤一的条件和参数参照所述的空白脂质体的制备方法中的方法中步骤一的条件和参数。
步骤二中，所述冻干保护剂还可在制得一含负载活性物质的脂质体的水溶液之后加入。
所述的负载活性物质的脂质体的制备方法中，所述的活性物质的用量可为本领域常规的用量，所述的活性物质与所述如式I所示的人参皂苷质量的比值可为0.1～10，优选为0.5～2(例如0.5，又例如1)。
本发明还提供了一种由上述负载活性物质的脂质体的制备方法制得的负载活性物质的脂质体。
本发明中，“包封率”为百分包封率(Encapsulation percentage,EN％)，是指被包裹物质(如某药物)的质量在脂质体中占药物总质量的质量百分；其计算公式为：EN％＝(1－Cf/Ct)×100％，式中Cf为游离药物的质量，Ct为脂质体中药物的总质量；“包封率”的测定方法可为本领域中常规的测定方法。
本发明中：“S构型”是用来对手型C命名中R-S系统命名法的术语。R-S系统具体命名法如下：当连接到中心碳原子上的a、b、c、d是不同基团时，分子是手性的。假设分子中四个取代基按CIP顺序规则以a>b>c>d顺序排列，如果将最小d基团置于离观察者最远的位置，按a-b-c的先后顺序观察其他三个基团，观察到a→b→c是顺时针方向，则这个碳中心的构型被定义为R(拉丁文rectus)；否则就认定为S(拉丁文sinister)。
本发明中，室温是指10-30℃。
本发明中，所述的冻干保护剂的水溶液或者所述的活性物质的水溶液的密度按照1g/mL计算(即水的密度)，因此，所述的冻干保护剂的水溶液或者所述的活性物质的水溶液的总质量m＝ρ*V。
本发明中，所述的活性物质的有机溶液的密度按照有机溶剂的种类计算，例如当有机溶剂为DMSO时，所述的活性物质的有机溶液的密度为1.1g/mL。
本发明中，“水溶性抗氧化剂”是指能溶解于水的一些抗氧化物质，突出的作用是对催化氧化离子的掩蔽，并兼顾对果蔬食物的护色及防褐变等作用，同时对添加在含水油脂或乳化食物中的脂溶性抗氧化剂具有辅助和加强的作用。常用的水溶性抗氧化剂有抗坏血酸类、异抗坏血酸及其盐、植酸、氨基酸类等。所述水溶性抗氧化剂包括在上述抗氧化剂的范围内。
本发明中，“水溶性表面活性剂”是指有一定亲水能力的表面活性剂。例如聚山梨醇酯。所述水溶性表面活性剂包括在上述表面活性剂的范围内。
本发明中，“水溶性热敏性辅料”是指有一定亲水能力并具有一定热敏性的表面活性剂。例如吐温类表面活性剂。所述水溶性热敏性辅料包括在上述热敏性辅料的范围内。
本发明中，“水溶性pH敏感物质”是指有一定亲水能力并具有一定pH敏感性的表面活性剂。所述水溶性pH敏感物质包括在上述pH敏感物质的范围内。
本发明中，“水溶性离子添加剂”是指此类离子添加剂中的离子为亲水型的离子。所述水溶性离子添加剂包括在上述离子添加剂的范围内。
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明的人参皂苷Rg3或Rh2，活性好，能够作为脂质体膜材，且用其制备得到的脂质体溶血性、成膜性和稳定性符合要求，具有重要的应用价值。本发明的空白脂质体具有高效、安全、稳定、长循环、均一性好、质量稳定和可靠、制备工艺简便的优点。本发明的空白脂质体可通过将活性物质包裹于所述的膜中用于制备负载活性物质的脂质体。当所述的活性物质为抗肿瘤药物时，所述的负载活性物质的脂质体一般都具有长循环作用、药效更强。
附图说明
图1为紫杉醇胆固醇脂质体的粒径分布曲线图，其中A为紫杉醇胆固醇脂质体的粒径的电镜检测图。
图2为紫杉醇Rg3脂质体的粒径分布曲线图，其中B为紫杉醇胆固醇脂质体的粒径的电镜检测图。
图3为紫杉醇胆固醇脂质体(PTX-Cho-Lipo)和紫杉醇Rg3脂质体(PTX-Rg3-Gipo)中紫杉醇泄露实验结果图。
图4为胆固醇空白脂质体(Cho空)、mPEG-DSPE胆固醇空白脂质体(PEG空)、Rg5空白脂质体(Rg5空)、Rg3空白脂质体(Rg3空)以及Rh2空白脂质体(Rh2空)的长循环效果图。
图5为对照组、Rg5-Gipo、Rg3-Gipoh和Rh2-Gipo于2、4、8、12和24h用活体成像仪记录DIR荧光的体内分布图；其中，图5-A1～5分别为对照组在2、4、8、12和24h用活体成像仪记录IR783荧光的体内分布图；图5-S是指荧光标尺，按荧光强弱，依次是红黄绿蓝，红色表示荧光最强，蓝色表示微弱荧光；图5-B1～5、图5-C1～5、图5-D1～5为实验组在2、4、8、12和24h用活体成像仪记录IR783荧光的体内分布图；图5-B1～5分别为Rg5空白脂质体(Rg5-Gipo)实验组；图5-C1～5分别为Rh2空白脂质体(Rh2-Gipo)实验组；图5-D1～5分别为Rg3空白脂质体(Rg3-Gipo)实验组。
图6为对照组和各脂质体在注射入小鼠24h后的离体器官荧光分布图；其中图6-S是指荧光标尺，按荧光强弱，依次是红黄绿蓝，红色表示荧光最强，蓝色表示微弱荧光；图6-A、图6-B、图6-C和图6-D分别为对照组、Rg5-Gipo组、Rg3-Gipo组合Rh2-Gipo组。
图7为对照组、Rh2-Gipo、Rg3-Gipo和Rg5-Gipo组小鼠肿瘤的荧光数值的统计图。
图8为游离Rh2组(Rh2)、Rh2空白脂质体组(Rh2空)、游离紫杉醇组(PTX)、紫杉醇胆固醇脂质体组(PTX-Cho-Lipo)、紫杉醇Rh2脂质体组(PTX-Rh2-Gipo)对乳腺癌细胞(4T1)的细胞存活率曲线图。
图9为Control组(PBS)、游离Rh2组(Rh2)、Rh2空白脂质体组(Rh2空)、力扑素组(PTX-Cho-Lipo)、紫杉醇Rh2脂质体组(PTX-Rh2-Gipo)对乳腺癌细胞(4T1)的抑瘤曲线图。
图10为游离多西他赛组(DTX)、多西他赛胆固醇脂质体组(DTX-Cho-Lipo)、多西他赛Rg3脂质体组(DTX-Rg3-Gipo)对乳腺癌细胞(4T1)的细胞存活率曲线图。
图11为Control组(PBS)、Taxotere组、Nanoxel-PM、载多西他赛Rg5脂质体组(DTX-Rg5-Gipo)、多西他赛Rg3脂质体组(DTX-Rg3-Gipo)对乳腺癌细胞(4T1)的抑瘤曲线图。
图12为游离Rg3组(Rg3)、Rg3空白脂质体组(Rg3空)、游离紫杉醇组(PTX)组、游离紫杉醇+Rg3组(PTX+Rg3)、力扑素组(PTX-Cho-Lipo)、紫杉醇Rg3脂质体组(PTX-Rg3-Gipo)组对大鼠脑胶质瘤细胞(C6)的细胞存活率曲线图。
图13为Control组(PBS)、游离紫杉醇组(PTX)、游离Rg3组(Rg3)、Rg3空白脂质体组(Rg3空)、游离紫杉醇+Rg3组(PTX+Rg3)、力扑素组(PTX-Cho-Lipo)、紫杉醇Rg3脂质体组(PTX-Rg3-Gipo)对原位脑胶质瘤模型(C6细胞)的生存曲线及中位生存期结果。
图14为游离Rg5组(Rg5)、游离Rg3组(Rg3)、游离Rh2组(Rh3)、Rg5空白脂质体组(Rg5空)、Rg3空白脂质体组(Rg3空)、Rh2空白脂质体组(Rh2空)、游离紫杉醇组(PTX)、力扑素组(PTX-Cho-Lipo)、紫杉醇Rg5脂质体组(PTX-Rg5-Gipo)、紫杉醇Rg3脂质体组(PTX-Rg3-Gipo)和紫杉醇Rh2脂质体组(PTX-Rh2-Gipo)对人源胃癌细胞(BGC-823)的细胞存活率曲线图。
图15为Control组(PBS)、游离Rg3组(Rg3)、Rg3空白脂质体组(Rg3空)、力扑素组(PTX-Cho-Lipo)、Abraxane组(Abraxane)、紫杉醇Rg5脂质体组(PTX-Rg5-Gipo)、紫杉醇Rg3脂质体组(PTX-Rg3-Gipo)和紫杉醇Rh2脂质体组(PTX-Rh2-Gipo)对人源胃癌细胞(BGC-823)的抑瘤曲线图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
1、实验药物：20(S)-人参皂苷Rg3、20(R)-人参皂苷Rg3、20(S)-人参皂苷Rh2、20(R)-人参皂苷Rh2为本领域常规市售可得，例如上海本素医药科技有限公司、苏州星海金森生物医药有限公司、上海源叶生物科技有限公司等。
2、试验仪器：下述实施例中所使用的仪器为上海本素医药科技有限公司自有仪器设备，其设备型号和来源信息如下：
超微粉碎机：ZD-10S一套，上海绿翊机械制造有限公司；
安捷伦液相色谱：安捷伦1100一套，奥泰3300ELSD，安捷伦科技(中国)有限公司；
旋蒸蒸发仪：ZX98-1 5L，上海鲁伊工贸有限公司；
20L旋转蒸发仪：R5002K，上海夏丰实业有限公司；
冷冻干燥机：FD-1D-80，上海比朗仪器制造有限公司；
冷冻干燥机：PDFD GLZ-1B，上海浦东冷冻干燥设备有限公司；
电子天平：CPA2250(精度0.00001g)，赛多利斯(上海)贸易有限公司；
电子天平：JY3003(精度0.001g)，上海舜宇恒平科学仪器有限公司。
3、下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。对于操作温度和压力，如未作特别说明，一般是指室温和常压。其中，室温是指10-30℃；常压是指一个标准大气压。回流温度，如未作特别说明，是指溶剂回流温度。
超微粉处理
取500g干燥好(水份含量≤1％)的人参皂苷Rg3，投入到ZD-10S超微粉碎机中，密闭后，开启冷却循环水控制粉碎腔体温度在20-30℃，开启电机粉碎30分钟，即得超微粉人参皂苷Rg3，经电镜检测90％粒度≤10μm。
脂质体的制备
实施例1 普通Rg3脂质体的制备
将1g蛋黄卵磷脂、0.1g胆固醇、0.1g人参皂苷20(S)-Rg3(未经超微粉化处理)、加入20mL的无水乙醇中，在室温下，搅拌形成澄清溶液，在40-50℃的恒温水浴中，旋转蒸发除去有机溶剂，成膜，加入20mL 5％海藻糖水溶液(所述的百分比是指海藻糖的质量占海藻糖水溶液总质量的百分比)，超声至脂质体颗粒在0.1-0.3微米，通过0.22微米的微孔滤膜，得一含人参皂苷Rg3脂质体的水溶液，然后将溶液装于西林瓶中。将上述水溶液放入冷冻干燥机中冷冻干燥72小时，通入保护性气体(氩气或氮气)，密封，即得所述的普通人参皂苷Rg3脂质体。经检测，该脂质体的D10为75nm，D50为118nm，D90为131nm。
实施例2 Rg3空白脂质体的制备
将1g蛋黄卵磷脂、0.1g超微粉人参皂苷20(S)-Rg3、加入200mL的氯仿中，在室温下，搅拌形成澄清溶液，在40-50℃的恒温水浴中，旋转蒸发除去有机溶剂，成膜，加入20mL5％海藻糖水溶液(所述的百分比是指海藻糖的质量占海藻糖水溶液总质量的百分比)，超声至脂质体颗粒在0.1-0.3微米，通过0.22微米的微孔滤膜，得一含人参皂苷Rg3的空白脂质体的水溶液，然后将溶液分装于西林瓶中。将上述水溶液放入冷冻干燥机中冷冻干燥72小时，通入保护性气体(氩气或氮气)，密封，即得所述人参皂苷Rg3空白脂质体。经检测，该脂质体的D10为66nm，D50为90nm，D90为105nmnm。
实施例3 Rg5空白脂质体的制备
按实施例2相同的方法，将Rg3换成Rg5，制得Rg5空白脂质体。经检测，该脂质体的D10为70nm，D50为96nm，D90为111nmnm。
实施例4 Rg3空白脂质体的制备
将0.5g蛋黄卵磷脂、0.1g超微粉人参皂苷20(R)-Rg3、0.1g维生素E、加入200mL的二氯甲烷中，在室温下，搅拌形成澄清溶液，在40-50℃的恒温水浴中，旋转蒸发除去有机溶剂，成膜，加入20mL的5％葡萄糖水溶液(所述的百分比是指葡萄糖的质量占葡萄糖水溶液总质量的百分比)，超声至脂质体颗粒在0.1-0.3微米，通过0.22微米的微孔滤膜，得空白脂质体的水溶液，然后将溶液分装于西林瓶中。将上述水溶液放入冷冻干燥机中冷冻干燥72小时，通入保护性气体(氩气或氮气)，密封，即得所述人参皂苷Rg3空白脂质体。经检测，该脂质体的D10为88nm，D50为116nm，D90为153nmnm。
实施例5 Rg3空白脂质体的制备
将0.6g大豆卵磷脂、0.2g超微粉人参皂苷20(S)-Rg3、加入200mL的氯仿：甲醇＝1：1(体积比)混合溶剂中，在室温下，搅拌形成澄清溶液，在50-60℃的恒温水浴中，旋转蒸发除去有机溶剂，成膜，加入20mL的5％蔗糖水溶液(所述的百分比是指蔗糖的质量占蔗糖水溶液总质量的百分比)，超声至脂质体颗粒在0.1-0.3微米，通过0.22微米的微孔滤膜，得空白脂质体的水溶液，然后将溶液分装于西林瓶中。将上述水溶液放入冷冻干燥机中冷冻干燥72小时，通入保护性气体(氩气或氮气)，密封，即得所述人参皂苷Rg3空白脂质体。经检测，该脂质体的D10为60nm，D50为84nm，D90为102nm。
实施例6 Rh2空白脂质体的制备
将0.7g氢化大豆卵磷脂(HSPC)、0.1g超微粉人参皂苷20(S)-Rh2、0.2g胆固醇、加入200mL的氯仿中，在室温下，搅拌形成澄清溶液，在60-65℃的恒温水浴中，旋转蒸发除去有机溶剂，成膜，加入20mL的5％甘露醇水溶液(所述的百分比是指甘露醇的质量占甘露醇水溶液总质量的百分比)，超声至脂质体颗粒在0.1-0.3微米，得空白脂质体的水溶液，然后将溶液分装于西林瓶中。将上述水溶液放入冷冻干燥机中冷冻干燥72小时，通入保护性气体(氩气或氮气)，密封，即得所述人参皂苷Rh2空白脂质体。经检测，该脂质体的D10为94nm，D50为120nm，D90为133nm。
实施例7 Rh2空白脂质体的制备
将0.4g蛋黄卵磷脂、0.1g超微粉人参皂苷20(R)-Rh2、0.2g大豆油、0.1g维生素C、加入200mL的氯仿：异丙醇＝9：1(体积比)混合溶剂中，在室温下，搅拌形成澄清溶液，在60-65℃的恒温水浴中，旋转蒸发除去有机溶剂，成膜，加入20mL的5％丙二醇水溶液(所述的百分比是指丙二醇的质量占丙二醇水溶液总质量的百分比)，超声至脂质体颗粒在0.1-0.3微米，通过0.22微米的微孔滤膜，得空白脂质体的水溶液，然后将溶液分装于西林瓶中。将上述水溶液放入冷冻干燥机中冷冻干燥72小时，通入保护性气体(氩气或氮气)，密封，即得所述人参皂苷Rh2空白脂质体。经检测，该脂质体的D10为124nm，D50为157nm，D90为189nm。
实施例8 Rg3空白脂质体的制备
将0.9g蛋黄卵磷脂、0.2g超微粉人参皂苷20(S)-Rg3、0.05g PEG2000-DSPE、加入200mL的氯仿：甲醇＝1：1(体积比)混合溶剂中，在室温下，搅拌形成澄清溶液，在55-65℃的恒温水浴中，旋转蒸发除去有机溶剂，成膜，加入20mL的5％丙三醇水溶液(所述的百分比是指丙三醇的质量占丙三醇水溶液总质量的百分比)，超声至脂质体颗粒在0.1-0.3微米，通过0.45微米的微孔滤膜，得空白脂质体的水溶液，然后将溶液分装于西林瓶中。将上述水溶液放入冷冻干燥机中冷冻干燥72小时，通入保护性气体(氩气或氮气)，密封，即得所述人参皂苷Rg3空白脂质体。经检测，该脂质体的D10为62nm，D50为71nm，D90为85nm。
实施例9 Rg3空白脂质体的制备
将0.9g大豆卵磷脂S100、0.2g超微粉人参皂苷20(S)-Rg3、0.01g VE、0.1g胆固醇、0.05g mPEG2000-DSPE、加入20mL的氯仿：丙酮＝1：1(体积比)混合溶剂中，在室温下，搅拌形成澄清溶液，在45-55℃的恒温水浴中，旋转蒸发除去有机溶剂，成膜，加入20mL的5％半乳糖水溶液(所述的百分比是指半乳糖的质量占半乳糖水溶液总质量的百分比)，超声至脂质体颗粒在0.1-0.3微米，通过1微米的微孔滤膜，得空白脂质体的水溶液，然后将溶液分装于西林瓶中。将上述水溶液放入冷冻干燥机中冷冻干燥72小时，通入保护性气体(氩气或氮气)，密封，即得所述人参皂苷Rg3空白脂质体。经检测，该脂质体的D10为65nm，D50为130nm，D90为143nm。
实施例10 Rg3紫杉醇脂质体的制备
将0.8g蛋黄卵磷脂、0.2g超微粉人参皂苷20(S)-Rg3、0.1g紫杉醇，加入200mL的氯仿中，在室温下，搅拌形成澄清溶液，在40-50℃的恒温水浴中，旋转蒸发除去有机溶剂，成膜，加入20mL的5％海藻糖水溶液(所述的百分比是指海藻糖的质量占海藻糖水溶液总质量的百分比)，超声至脂质体颗粒在0.1-0.3微米，得紫杉醇脂质体的水溶液。然后将溶液分装于西林瓶中，使每瓶含紫杉醇30mg。将上述水溶液放入冷冻干燥机中冷冻干燥72小时，通入保护性气体(氩气或氮气)，密封，即得所述人参皂苷Rg3紫杉醇脂质体。经检测，该脂质体的D10为76nm，D50为90nm，D90为105nm，包封率≥95％。
实施例11 Rg5紫杉醇脂质体的制备
按实施例9相同方法，将Rg3换成Rg5后，制得人参皂苷Rg5紫杉醇脂质体。经检测，该脂质体的D10为92nm，D50为128nm，D90为158nm，包封率≥95％。
实施例12 Rh2紫杉醇脂质体的制备
将0.7g大豆卵磷脂、0.2g超微粉人参皂苷20(S)-Rh2、0.1g紫杉醇、0.1g胆固醇、0.1g大豆油、0.1g维生素C、加入200mL的氯仿：乙腈＝1：1(体积比)混合溶剂中，在室温下，搅拌形成澄清溶液，在50-60℃的恒温水浴中，旋转蒸发除去有机溶剂，成膜，加入20mL的10％海藻糖水溶液(所述的百分比是指葡萄糖的质量占葡萄糖水溶液总质量的百分比)，超声至脂质体颗粒在0.1-0.3微米，得紫杉醇脂质体的水溶液。然后将溶液分装于西林瓶中，使每瓶含紫杉醇30mg。将上述水溶液放入冷冻干燥机中冷冻干燥72小时，通入保护性气体(氩气或氮气)，密封，即得所述人参皂苷Rh2紫杉醇脂质体。经检测，该脂质体的D10为79nm，D50为118nm，D90为130nm，包封率≥95％。
实施例13 Rg3多西他赛脂质体的制备
将0.9g蛋黄卵磷脂、0.18g超微粉人参皂苷20(S)-Rg3、0.1g多西他赛、0.225g胆固醇，加入200mL的氯仿：甲醇＝1：1(体积比)混合溶剂中，在40-50℃下，搅拌形成澄清溶液，在50-60℃下，使用膜蒸发器蒸发除去有机溶剂，成膜，加入20mL为5％的蔗糖水溶液(所述的百分比是指蔗糖的质量占蔗糖水溶液总质量的百分比)，高压均质机均质至脂质体颗粒在0.1-0.3微米，通过0.22微米的微孔滤膜，得多西他赛脂质体的水溶液，然后分装于西林瓶中，使每瓶含多西他赛20mg。将上述水溶液放入冷冻干燥机中冷冻干燥72小时，通入保护性气体(氩气或氮气)，密封，即得所述人参皂苷Rg3多西他赛脂质体。经检测，该脂质体的D10为70nm，D50为109nm，D90为122nm，包封率≥95％。
实施例14 Rg5多西他赛脂质体的制备
将0.9g蛋黄卵磷脂、0.18g人参皂苷Rg5、0.1g多西他赛、0.225g胆固醇，加入20mL的氯仿：甲醇＝1：1(体积比)混合溶剂中，在40-50℃下，搅拌形成澄清溶液，在50-60℃下，使用膜蒸发器蒸发除去有机溶剂，成膜，加入20mL为5％的蔗糖水溶液(所述的百分比是指蔗糖的质量占蔗糖水溶液总质量的百分比)，高压均质机均质至脂质体颗粒在0.1-0.3微米，通过0.22微米的微孔滤膜，得多西他赛脂质体的水溶液，然后分装于西林瓶中，使每瓶含多西他赛20mg。将上述水溶液放入冷冻干燥机中冷冻干燥72小时，通入保护性气体(氩气或氮气)，密封，即得所述人参皂苷Rg5多西他赛脂质体。经检测，该脂质体的D10为73nm，D50为101nm，D90为118nm，包封率≥95％。
实施例15 Rh2多西他赛脂质体的制备
将300mg大豆卵磷脂、60mg超微粉人参皂苷20(S)-Rh2、30mg多西他赛、75mg胆固醇，10mgmPEG2000-DSPE，加入200mL的体积比为氯仿：甲醇＝1：1混合溶剂中，在40-50℃下，搅拌形成澄清溶液，在50-60℃下，使用膜蒸发器蒸发除去有机溶剂，成膜，加入20mL为5％的蔗糖水溶液(所述的百分比是指蔗糖的质量占蔗糖水溶液总质量的百分比)，高压均质机均质至脂质体颗粒在0.1-0.3微米，通过0.22微米的微孔滤膜，得人参皂苷Rh2多西他赛脂质体的水溶液，然后分装于西林瓶中，使每瓶含多西他赛20mg。将上述水溶液放入冷冻干燥机中冷冻干燥72小时，通入保护性气体(氩气或氮气)，密封，即得所述人参皂苷Rh2多西他赛脂质体。经检测，该脂质体的D10为81nm，D50为129nm，D90为148nm，包封率≥95％。
实施例16 Rg3伊立替康脂质体的制备
将0.9g蛋黄卵磷脂、0.3g超微粉人参皂苷20(S)-Rg3、0.1g胆固醇，加入200mL的二氯甲烷：乙醇1：1(体积比)混合溶剂中，在室温下，搅拌形成澄清溶液，在50-60℃温度下，使用旋转蒸发器除去有机溶剂，成膜。加入20mL 6.6％硫酸铵水溶液(所述的百分比是指硫酸铵的质量占硫酸铵水溶液总质量的百分比)，超声至空白脂质体颗粒在0.1-0.3微米，得一空白脂质体溶液，然后将空白脂质体溶液在0.15M(0.15mol/L)的葡萄糖溶液中透析12h后，根据透析后空白脂质体溶液的体积加入相应质量的海藻糖，使得海藻糖在所述的空白脂质体溶液的质量分数达到10％，所述的百分比是指海藻糖的质量占空白脂质体溶液总质量的质量百分比。加入1mL质量分数为20％盐酸伊立替康水溶液(盐酸伊立替康0.2g)，在37℃水浴保温30min，得伊立替康脂质体的水溶液，然后分装于西林瓶中，使每瓶含盐酸伊立替康40mg。将上述水溶液放入冷冻干燥机中冷冻干燥72小时，通入保护性气体(氩气或氮气)，密封，即得所述人参皂苷Rg3伊立替康脂质体。经检测，该脂质体的D10为92nm，D50为139nm，D90为165nm，包封率≥95％。
实施例17 Rg3顺铂脂质体的制备
将0.8g蛋黄卵磷脂、0.2g超微粉人参皂苷20(S)-Rg3、0.1g顺铂、0.1g大豆油、加入200mL的氯仿：甲醇＝9：1(体积比)混合溶剂中，在室温下，搅拌形成澄清溶液，在40-50℃的恒温水浴中，旋转蒸发除去有机溶剂，成膜，加入20mL的5％乳糖水溶液(所述的百分比是指乳糖的质量占乳糖水溶液总质量的百分比)，超声至脂质体颗粒在0.1-0.3微米，通过1微米的微孔滤膜，得顺铂脂质体的水溶液。然后将溶液分装于西林瓶中，使每瓶含顺铂10mg。将上述水溶液放入冷冻干燥机中冷冻干燥72小时，通入保护性气体(氩气或氮气)，密封，即得所述顺铂脂质体。经检测，该脂质体的D10为69nm，D50为109nm，D90为126nm，包封率≥95％。
实施例18 Rg3阿霉素脂质体的制备
将0.9g大豆卵磷脂S100、0.3g超微粉人参皂苷20(S)-Rg3、0.1g维生素E，加入200mL的氯仿：甲醇＝9：1(体积比)混合溶剂中，在40-50℃下，搅拌形成澄清溶液，在50-55℃下，使用膜蒸发器蒸发除去有机溶剂，成膜。加入20mL为磷酸缓冲盐溶液(PBS)，旋转水化，完全溶解后，高压均质机均质至脂质体颗粒在0.1-0.3微米，得空白脂质体的水溶液，加入1mL质量分数为20％的阿霉素水溶液(盐酸多柔比星0.2g)及6mL质量分数为7.1％磷酸氢二钠水溶液，加纯水使外水相pH值为7.30，在60℃水浴保温30min，得阿霉素脂质体的水溶液。然后将溶液分装于西林瓶中，使每瓶含阿霉素20mg。将上述水溶液放入冷冻干燥机中冷冻干燥72小时，通入保护性气体(氩气或氮气)，密封，即得所述人参皂苷Rg3阿霉素脂质体。经检测，该脂质体的D10为76nm，D50为101nm，D90为125nm，包封率≥95％。
应用实施例
1、实验药物
人参皂苷20(S)-Rg3(简称Rg3)、紫杉醇、多西他赛、盐酸伊立替康、阿霉素、顺铂为本领域常规市售可得。
如未作特别说明，普通Rg3脂质体按实施例1的方法制备，Rg3或Rh2空白脂质体按实施例2的方法制备，Rg5空白脂质体按实施例3的方法制备，Rg3紫杉醇脂质体按实施例10的方法制备，Rg5紫杉醇脂质体按实施例11的方法制备，Rg3多西他赛脂质体按实施例13的方法制备，Rg5多西他赛脂质体按实施例14的方法制备。
各人参皂苷空白脂质体的制备方法见上述脂质体制备部分，或者参照脂质体的制备中的实施例1，根据实际需要，做出相应的调制得目标物即可。
2、仪器
下述应用实施例中所使用的仪器为复旦大学药学院自有仪器设备，其设备型号和来源信息如下：
高效液相色谱仪(Agilent 1100)；
电子天平(TB-215，美国Denver Instrument)；
超声波清洗机(SB3200DT，宁波新芝生物科技股份有限公司)；
氮吹仪(HGC-12A，天津市恒奥科技发展有限公司)；
旋转蒸发器(RE-2000A，上海亚荣生化仪器厂)；
超纯水制造系统(ULUP-IV-10T，四川优普超纯科技有限公司)；
恒温振荡器(SHA-C，常州澳华仪器有限公司)；
超声波细胞粉碎机(JY92-II，宁波新芝生物科技股份有限公司)；
高压均质机(B15，加拿大AVESTIN)；
激光粒度分析仪(Nano ZS,英国马尔文仪器公司)；
微型挤出器(Mini-extruder，Avanti Polar Lipids Inc)；
光电显微镜(XDS-1B，重庆光电仪器有限公司)；
洁净工作台(SW-CJ-1FD，苏州安泰空气技术有限公司)；
细胞培养箱(CCL-170B-8，新加坡ESCO)；
荧光倒置显微镜(IX-73，日本奥林巴斯)；
马尔文Mastersizer 2000激光粒度仪。
3、实验细胞株
4T1人乳腺癌(南京凯基生物)；A549人肺癌细胞(南京凯基生物)。
4、溶血检测
2％红细胞混悬液的制备：取健康家兔血液，放入含玻璃珠的锥形瓶中振摇10分钟，或用玻璃棒搅动血液，以除去纤维蛋白原，使成脱纤血液。加入0.9％氯化钠溶液约10倍量，摇匀，每分钟1000～1500转离心15分钟，除去上清液，沉淀的红细胞再用0.9％氯化钠溶液按上述方法洗涤2～3次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用0.9％氯化钠溶液制成2％的混悬液，供试验用。
检查法：取洁净玻璃试管5只，编号1、2号管为供试品管，3号管为阴性对照管，4号管为阳性对照管，5号管为供试品对照管。按下表所示依次加入2％红细胞悬液、0.9％氯化钠溶液、纯化水，混匀后，立即置37±0.5℃的恒温箱中进行温育。3小时后观察溶血和凝聚反应。
表5
试管编号 1 2 3 4 5
2％红细胞悬液/mL 2.5 2.5 2.5 2.5 /
0.9％氯化钠溶液/mL 2.2 2.2 2.5 / 4.7
纯化水/mL / / / 2.5 /
供试品溶液/mL 0.3 0.3 / / 0.3
如试管中的溶液呈澄明红色，管底无细胞残留，表明有溶血发生；如红细胞全部下沉，上清液无色透明，或上清液虽有色澄明，但1、2号管和5号管肉眼观察无明显差异，则表明无溶血发生。
若溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀，轻轻倒转3次扔不分散，表明可能有红细胞凝聚发生，应进一步置显微镜下观察，如可见红细胞聚集为凝聚。
结果判断：当阴性对照管无溶血或凝聚发生，阳性对照管有溶血发生，若2支供试品管中的溶液在3小时内均不发生溶血和凝聚，判定供试品符合规定；若有1支供试品管的溶液在3小时内发生溶血和(或)凝聚，应设4支供试品管进行复试，其供试品管的溶液在3小时内均不得发生溶血和(或)凝聚，否则判定供试品不符合规定。
具体实验中，供试品(人参皂苷)浓度可根据实际调节。
5、实验动物
昆明小鼠(或称正常小鼠)，购自第三军医大学动物中心。
BALB/C-nu/nu小鼠(或称裸小鼠)，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
6、细胞培养方法
将涉及的细胞株置于含5％CO2的37℃培养箱中，用DMEM或RPMI1640完全培养基(含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素)培养，0.25％胰酶-EDTA消化传代，每周传代2-3次。
7、给药
对于每次实验，设置空白对照组(生理盐水组)、阳性对照组、载药人参皂苷脂质体组。设置3-6个以上浓度梯度、倍半或五倍稀释，每个浓度三复孔。
8、肿瘤细胞抑制浓度IC50实验方法
将对数生长期的肿瘤细胞用胰酶消化后配制成一定浓度的细胞液，按5000个/孔接种于96孔板，每孔加100μL。次日加入含不同浓度样品及相应溶剂对照的新鲜培养基，每孔加100μL(DMSO终浓度<0.5％)，每样品设10个剂量组，每组设三个平行孔，于37℃培养箱继续培养72h后，弃上清液，每孔加100μL的PBS及10μL的CCK-8，用微型振荡器震荡混匀，继续培养3h，用酶标仪在参考波长630nm，检测波长450nm条件下测定光密度值(OD)，以溶剂对照处理的肿瘤细胞为对照组，按中效方程计算IC50。
9、体外细胞实验方法
收集对数生长期的肿瘤细胞，将细胞重悬至DMEM完全培养基(含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素)中，终浓度为4×104个/mL。在96孔细胞培养板中，每孔加入200μL上述细胞悬液(8×103个细胞/孔)，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱内培养48h，将DMEM完全培养基分别换成200μL含不同浓度的抗肿瘤药物，使药物的最终浓度设置为6组以上，以DMEM完全培养基为阴性对照组，每个浓度设4个复孔，实验重复3次。细胞在37℃、5％CO2的细胞培养箱内培养72h后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μl，置细胞培养箱内继续培养4h后，弃上清液，每孔加入150μl DMSO，震荡10min后，用连续光谱多功能酶标仪(Tecaninfinite M 200,TECAN，瑞士)测定在490nm处的OD值，按下式计算细胞存活率：(细胞存活率(％)＝OD药物/OD对照×100％)。
细胞存活率(％)＝OD490(样品)/OD490(对照)×100％；
其中，OD490(样品)为实验组的OD值，OD490(对照)为空白对照组的OD值。
10、小动物活体成像
如实施例。
11、体内药效实验方法
取1×107-10×107个/mL对数生长期的肿瘤细胞，用1mL注射器缓慢注射至18-20g的裸小鼠右侧腋下皮下，每只裸小鼠注射100μL，观察瘤块生长，直至瘤块体积长至约100mm3。将动物随机分组开始给药。每隔两天称重并测定肿瘤体积，并用游标卡尺测量肿瘤最长直径和最短直径，处死裸小鼠，测定瘤块体积，计算相对肿瘤体积(RTV)、相对肿瘤增殖率(T/C)和肿瘤抑制百分率，做统计学分析。
肿瘤体积计算公式：V＝abh/2。其中，a为肿瘤直径，b为肿瘤横径，h为肿瘤高度。
相对肿瘤体积RTV计算公式：RTV＝Vt/V0。其中Vt为某一时间的肿瘤体积，V0为开始给药时的肿瘤体积。
相对肿瘤增殖率的计算公式：T/C(％)＝TRTV/CRTV×100％。其中TRTV为治疗组RTV，CRTV为溶剂对照组RTV。
肿瘤抑制百分率的计算公式：肿瘤抑制百分率＝(溶剂对照组瘤重-给药组瘤重)/溶剂对照组瘤重×100％。
疗效评价标准：T/C(％)>60为无效；T/C(％)≦60，并且与溶剂对照组比较，瘤体积经统计学处理P<0.05为有效。
下述应用实施例中C(μM)是指浓度，其中，Taxol+Rg3的浓度是指紫杉醇长循环脂质体中，紫杉醇的浓度和人参皂苷Rg3的浓度，例如5+30是指紫杉醇长循环脂质体中紫杉醇的浓度为5μM，人参皂苷Rg3的浓度为30μM；Time(d)是指时间(天)。
12、紫杉醇检测方法
根据USP 34中的紫杉醇检测法。
应用实施例
应用实施例1溶血性研究
实验结果具体地见表1。
表1
编号 名称 溶血性(HD50)
实施例1 Rg3-Cho-Lipo 人参皂苷Rg3胆固醇脂质体 20-50μg/mL
实施例2 Rg3空 人参皂苷Rg3空白脂质体 650-700μg/mL
实施例3 Rg5空 人参皂苷Rg5空白脂质体 450-500μg/mL
实施例7 Rh2空 人参皂苷Rh2空白脂质体 400-500μg/mL
实施例10 PTX-Rg3-Gipo 紫杉醇人参皂苷Rg3脂质体 650-700μg/mL
实施例11 PTX-Rg5-Gipo 紫杉醇人参皂苷Rg5脂质体 450-500μg/mL
实施例12 PTX-Rh2-Gipo 紫杉醇人参皂苷Rh2脂质体 400-500μg/mL
实施例13 DTX-Rg3-Gipo 多西他赛人参皂苷Rg3脂质体 650-700μg/mL
实施例14 DTX-Rg5-Gipo 多西他赛人参皂苷Rg5脂质体 450-500μg/mL
实施例15 DTX-Rh2-Gipo 多西他赛人参皂苷Rh2脂质体 400-500μg/mL
由表1中的数据可知，Rg3胆固醇脂质体的溶血性最严重；本发明的Rg3空白脂质体、Rh2空白脂质体、紫杉醇人参皂苷Rg3脂质体、紫杉醇人参皂苷Rh2脂质体、多西他赛人参皂苷Rg3脂质体和多西他赛人参皂苷Rh2脂质体，与Rg5空白脂质体、紫杉醇人参皂苷Rg5脂质体和多西他赛人参皂苷Rg5脂质体的溶血性基本一致，均在400-700μg/mL之间，均能满足药用的安全性标准。
另外，人参皂苷Rg3胆固醇脂质体溶血可达20-50μg/mL。主要原因为Rg3胆固醇脂质体包封率不高，至少Rg3泄漏，故影响其药物效果。而本发明实施例2、实施例3、实施例7、实施例10、实施例12～13和实施例15制得的脂质体，与Rg5空白脂质体、紫杉醇人参皂苷Rg5脂质体和多西他赛人参皂苷Rg5脂质体包封率相当，包封量大，除了包封人参皂苷Rg3或人参皂苷Rh2以外，还进一步包封紫杉醇等药物，从而证明Rg3在本发明的脂质体中充当了膜材作用。
应用实施例2人参皂苷比例高低对脂质体平均粒径影响的研究
冻干前样品的检测法：取20ml待检测溶液，室温下，加入到900ml纯化水中搅拌分散，搅拌转速为1700转/分，搅拌1分钟后，开启仪器测定，并记录检测结果。
冻干后的样品的检测法：取样品1瓶，加20ml纯化水，摇匀，完全溶解后，加入到900ml纯化水中搅拌分散，搅拌转速为1700转/分，搅拌1分钟后，开启仪器测定，并记录检测结果。
实验结果具体地见表2。
表2人参皂苷比例高低对脂质体平均粒径影响
Figure BDA0001885981880000241
由表2可知，Rg3胆固醇脂质体，随着Rg3比例的上升，粒径越来越大，包封率越来越低。现有技术(Huan Yu,etc.International Journal of Pharmaceutics 450(2013)250-258)公开的Rg3胆固醇脂质体，实质上为普通的空白脂质体负载上了药物活性物质。Rg3胆固醇脂质体中，Rg3是作为药物用途，随着Rg3用量的加大，包封率随之降低，粒径随之增大；而本发明的Rg3膜材空白脂质体和紫杉醇Rg3脂质体，随着Rg3用量的加大，在一定程度上改善了粒径，包封率均在95％以上，从而说明本发明的Rg3在脂质体中充当了膜材的作用，脂质体的性质随膜材比例的变化而产生相应的变化。
应用实施例3紫杉醇胆固醇脂质体和紫杉醇Rg3脂质体的粒径、分散系数及电镜检测
将紫杉醇胆固醇脂质体和紫杉醇Rg3脂质体稀释10倍后，吸取1mL置于激光粒度仪样品池中，采用激光粒度仪测定脂质体粒径及分散系数。
取紫杉醇胆固醇脂质体和紫杉醇Rg3脂质体150μL，加入5mL纯水稀释，分别滴在带有支持膜的铜网上10min后吸干水分，滴上2％醋酸钠染色30分钟，吸干染色液。采用透射电镜观察脂质体形态并拍摄图像。
实验结果具体地见表3。
表3为紫杉醇胆固醇脂质体(PTX-Cho-Lipo)和紫杉醇Rg3脂质体(PTX-Rg3-Gipo)的粒径
Figure BDA0001885981880000251
由图1和图2可知，图2呈现显良好的正态分布图。由表3可知，在相同条件下，本发明的紫杉醇Rg3脂质体比紫杉醇胆固醇脂质体的粒径分散系数更优、粒径更小，本发明的紫杉醇Rg3脂质体质量更好。
应用实施例4紫杉醇胆固醇脂质体(PTX-Cho-Lipo)和紫杉醇Rg3脂质体(PTX-Rg3-Gipo)的紫杉醇泄漏实验
取新制备的紫杉醇胆固醇脂质体和紫杉醇Rg3脂质体，经0.22μm滤膜过滤，测定包封率，视为百分之百。然后移取3mL，放置于4℃条件下，每天测定脂质体中紫杉醇的包封率，测定7天，记录结果并绘制图表。
实验结果具体地见图3和表4。
表4 PTX-Cho-Lipo)和PTX-Rg3-Gipo中的紫杉醇的包封率
Figure BDA0001885981880000252
由图3可知紫杉醇胆固醇脂质体的包封率从开始到第三天急剧下降；而紫杉醇Rg3脂质体包封率在七天内变化较小。
由表4可知，在相同条件下，本发明的紫杉醇Rg3脂质体(PTX-Rg3-Gipo)包封率均大于紫杉醇胆固醇脂质体(PTX-Cho-Lipo)的包封率，从而说明紫杉醇Rg3脂质体在溶液中的更加稳定，泄漏更少。Rg3脂质体质量更优，从而Rg3作为膜材比胆固醇作为膜材更好。
应用例5脂质体长循环效果实验
取ICR小鼠18-22g 30只，随机分成5组，分别给予包载荧光染料DID的胆固醇空白脂质体(Cho空)、包载荧光染料DID的mPEG-DSPE胆固醇空白脂质体(PEG空)、包载荧光染料DID的Rg5空白脂质体(Rg5空)、包载荧光染料DID的Rg3空白脂质体(Rg3空)以及包载荧光染料DID的Rh2空白脂质体(Rh2空)，以0.3mg/kg剂量经小鼠尾静脉推注，分别于给药后2min,5min,15min,30min,1,3,6,12,24h,脸部静脉丛取血0.2ml于肝素化离心管中，分别取0.1ml各时间点血液样品，酶标仪检测样品中DID荧光强度，以2分钟时间点荧光值作为荧光最高点即100％，其余时间点以此为基准计算体内剩余DID含量。
数据处理：用药动学处理软件3p97计算各脂质体的药物动力学参数包括：血药浓度-时间曲线下面积(AUC)、分布相半衰期(t1/2α、t1/2β)、消除半衰期(t1/2γ)等。
实验结果如图4和表5所示。
表5脂质体长循环效果表征
参数 Cho空 PEG空 Rg5空 Rg3空 Rh2空
t1/2α/h 0.03 0.016 0.017 0.67 0.245
t1/2β/h 0.798 0.917 0.47 1.603 1.892
t1/2γ/h 9.049 24.647 12.999 27.243 24.844
AUC(0-t)/mg·L·h 401.352 808.472 450.461 753.111 760.584
AUC(0-∞)/mg·L·h 455.227 1163.13 613.035 827.905 916.252
由表5可知，本发明的Rg3和Rh2空白脂质体与mPEG-DSPE胆固醇空白脂质体在血药浓度-时间曲线下面积(AUC)、分布相半衰期(t1/2α、t1/2β)、消除半衰期(t1/2γ)方面效果相当；都具有长循环效果，并且长循环效果与mPEG-DSPE胆固醇空白脂质体的长循环效果相当；而Rg5脂质体相比于mPEG-DSPE胆固醇空白脂质体具有较弱的长循环效果，仅比普通胆固醇脂质体强。
应用例6动物体内靶向性实验
取右后肢皮下肿瘤大小为100mm3左右(红色圈出部位为肿瘤部位)，大小均一，无出血坏死的裸鼠，分别尾静脉注射载近红外荧光探针(DIR)的脂质体(以下简称实验组，即用实验用空白脂质体包封近红外荧光探针(DIR)得到，具体可参照实施例10，将紫杉醇替换为近红外荧光探针(DIR)即可)和载近红外荧光探针(DIR)普通脂质体(以下简称对照组，即用普通空白脂质体包封近红外荧光探针(DIR)得到，制备方法为本领域常规的载近红外荧光探针(DIR)脂质体的制备方法)，后于2、4、8、12和24h用活体成像仪记录DIR荧光的体内分布，具体见图5。
其中，图5-A1～5分别为对照组在2、4、8、12和24h用活体成像仪记录IR783荧光的体内分布图；图5-S是指荧光标尺，按荧光强弱，依次是红黄绿蓝，红色表示荧光最强，蓝色表示微弱荧光。图5-B1～5、图5-C1～5、图5-D1～5为实验组在2、4、8、12和24h用活体成像仪记录IR783荧光的体内分布图。其中，图5-B1～5分别为Rg5空白脂质体(Rg5-Gipo)实验组；图5-C1～5分别为Rh2空白脂质体(Rh2-Gipo)实验组；图5-D1～5分别为Rg3空白脂质体(Rg3-Gipo)实验组。
由图5可知，对照组小鼠右前肢无荧光，而实验组小鼠右前肢荧光很强，说明人参皂苷空白脂质体对肿瘤细胞的靶向性很强。
图6-A为对照组，图6-B、图6-C和图6-D为实验组小鼠离体肿瘤的荧光图，即活体成像实验结束后，将实验组和对照组小鼠的肿瘤取出，再进行离体的荧光检测；图6-S是指荧光标尺，按荧光强弱，依次是红黄绿蓝，红色表示荧光最强，蓝色表示微弱荧光。图6-B、图6-C和图6-D实验组Rg5-Gipo、Rg3-Gipo、Rh2-Gipo肿瘤荧光很强，说明人参皂苷空白脂质体对肿瘤细胞具有较强的靶向性。
图7为对照组和实验组小鼠肿瘤的荧光数值的统计比较结果，实验组Rg5-Gipo、Rg3-Gipo、Rh2-Gipo均显著高于对照组。而人参皂苷Rg3空白脂质体(Rg3-Gipo)和Rh2空白脂质体(Rh2-Gipo)对BGC-823胃癌的靶向性显著强于Rg5空白脂质体(Rg5-Gipo)。
综上实验结果可知：人参皂苷Rg5白脂质体、人参皂苷Rg3白脂质体、人参皂苷Rh2空白脂质体的靶向性明显高于胆固醇空白脂质体；而且人参皂苷Rg3白脂质体、人参皂苷Rh2空白脂质体的靶向性明显强于人参皂苷Rg5空白脂质体。
应用例7体外细胞实验与体内动物实验
1、体外细胞实验
根据体外细胞实验方法，测定游离Rh2组(Rh2)、人参皂苷Rh2空白脂质体(Rh2空)、游离紫杉醇组(PTX)、紫杉醇胆固醇脂质体(PTX-Cho-Lipo)、紫杉醇人参皂苷Rh2脂质体(PTX-Rh2-Gipo)分别对乳腺癌细胞(4T1)的存活率，设置表6中的8个药物浓度，具体实验数据见表6以及图8。
表6脂质体对乳腺癌细胞(4T1)的浓度和细胞活性
Figure BDA0001885981880000271
Figure BDA0001885981880000281
由表6和图8可知：游离Rh2和人参皂苷Rh2空白脂质体对乳腺癌细胞(4T1)的活性较弱。在低浓度下，紫杉醇胆固醇脂质体(PTX-Cho-Lipo)对乳腺癌细胞(4T1)的细胞活性比游离紫杉醇更低。而无论浓度高低，本发明的紫杉醇Rh2脂质体(PTX-Rh2-Gipo)对乳腺癌细胞(4T1)的抑制活性比游离紫杉醇更强。
7.2、体内药效实验
根据体内药效实验方法，将45只皮下荷瘤裸鼠随机分为5组(每组9只)，分别设为空白对照组(Control组，PBS溶液)、游离Rh2组(Rh2)、人参皂苷Rh2空白脂质体组(Rh2空)、力扑素组(PTX-Cho-Lipo)、紫杉醇Rh2脂质体组(PTX-Rh2-Gipo)。将相应制剂经尾静脉注射(按照30mg·kg-1的剂量给药)。每隔两天记录每组小鼠的体重变化，并用游标卡尺测量肿瘤最长直径和最短直径，瘤体积由以下公式计算：V＝(dmax×dmin2)/2，其中dmin和dmax分别为肿瘤的短径和长径(mm)；根据测量的结果计算相对肿瘤体积(relative tumorvolume，RTV)，计算公式为：RTV＝Vt/V0。其中V0为给药时测量的肿瘤体积，Vt为每隔两天测量的肿瘤体积。
表7各组对乳腺癌细胞4T1抑瘤作用
Figure BDA0001885981880000282
由表7和图9可知：相同时间下，PBS和游离Rh2组的肿瘤体积最大，而PTX-Rh2-Gipo组最小，其次为力扑素组和Rh2空白组；进而说明本发明的PTX-Rh2-Gipo组对肿瘤具有较好的抑制性，药效好。
3、体外细胞实验
根据体外细胞实验方法，测定游离DTX组，普通载多西他赛胆固醇脂质体组(DTX-Cho-Lipo)、载多西他赛人参皂苷Rg3脂质体(DTX-Rg3-Gipo)和上市多西他赛胶束(Nanoxel-PM)分别对乳腺癌细胞(4T1)的存活率，设置表8中的9个药物浓度，具体实验数据见表8以及图10。
表8各组对乳腺癌细胞4T1抑瘤作用
Figure BDA0001885981880000291
由表8和图10可知：相同时间下，DTX-Rg3-Gipo组对乳腺癌细胞(4T1)的体内药效的整体趋势比DTX-Cho-Lipo组得到大幅度提高，尤其是低浓度给药时。
4、体内药效实验
根据体内药效实验方法，将45只皮下荷瘤裸鼠随机分为5组(每组9只)，分别设为空白对照组(Control组，PBS)、Taxotere组、Nanoxel-PM组、多西他赛+Rg5脂质体组(DTX-Rg5-Gipo)、多西他赛Rg3脂质体组(DTX-Rg3-Gipo)。将相应制剂经尾静脉注射(按照10mg·kg-1的剂量给药)。每隔两天记录每组小鼠的体重变化，并用游标卡尺测量肿瘤最长直径和最短直径，瘤体积由以下公式计算：V＝(dmax×dmin2)/2，其中dmin和dmax分别为肿瘤的短径和长径(mm)；根据测量的结果计算相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为：RTV＝Vt/V0。其中V0为给药时测量的肿瘤体积，Vt为每隔两天测量的肿瘤体积。
表9各组对乳腺癌细胞4T1抑瘤作用
Figure BDA0001885981880000292
Figure BDA0001885981880000301
由表9和图11可知：相同时间下，Control组的肿瘤体积最大，而DTX-Rg3-Gipo组最小，其次为DTX-Rg5-Gipo组和Nanoxel-PM组；DTX-Rg5-Gipo组和Nanoxel-PM组基本等效。进而说明Rg3-Gipo对肿瘤具有较好的抑制性，药效好。
应用实施例8体外细胞实验与体内动物实验
8.1、体外药效实验方法
根据体外细胞实验方法，设置表10中的10个浓度，具体存活率数据和曲线图见表11和图12。
表10脂质体对大鼠脑胶质瘤细胞(C6)的浓度
Figure BDA0001885981880000302
表11脂质体对大鼠脑胶质瘤细胞(C6)存活率
Figure BDA0001885981880000303
Figure BDA0001885981880000311
由表11和图12可知：本发明的紫杉醇Rg3脂质体组(PTX-Rg3-Gipo)组对大鼠脑胶质瘤细胞(C6)表现出的活性比力扑素组(PTX-Cho-Lipo)和游离的Rg3+紫杉醇更强(PTX+Rg3)，说明本发明的紫杉醇Rg3脂质体的活性得到了大幅度提高。
8.2、生存曲线及中位生存期
将63只皮下荷瘤裸鼠随机分为7组(每组9只)，分别设为空白对照组(Control组，PBS)、游离Rg3组(Rg3)、Rg3空白脂质体组(Rg3空)、游离紫杉醇组(PTX)、游离紫杉醇+Rg3组(PTX+Rg3)、力扑素组(PTX-Cho-Lipo)、紫杉醇Rg3脂质体组(PTX-Rg3-Gipo)。从第12天起，将相应制剂经尾静脉注射(按照10mg·kg-1的剂量给药)。每天记录裸鼠的存活数量，直至所有裸鼠均死亡。以GraphPad Prism 5软件绘制各组裸鼠生存曲线图，计算中位生存期。
表12相应时间各组给药后原位脑胶质瘤(C6细胞)小鼠存活数量
Figure BDA0001885981880000312
Figure BDA0001885981880000321
表13各组给药后原位脑胶质瘤(C6细胞)小鼠存活天数
Figure BDA0001885981880000322
由表12和13，和图13可知：PTX-Rg3-Gipo组的的小鼠中位生存期比PTX-Cho-Lipo组和PTX+Rg3组都显著延长。
应用例9体外细胞实验与体内动物实验
1、体外细胞实验
根据体外细胞实验方法，测定游离Rg5组(Rg5)、游离Rg3组(Rg3)、游离Rh2组(Rh3)、Rg5空白脂质体组(Rg5空)、Rg3空白脂质体组(Rg3空)、Rh2空白脂质体组(Rh2空)、游离紫杉醇组(PTX)、力扑素组(PTX-Cho-Lipo)、紫杉醇Rg5脂质体组(PTX-Rg5-Gipo)、紫杉醇Rg3脂质体组(PTX-Rg3-Gipo)和紫杉醇Rh2脂质体组(PTX-Rh2-Gipo)分别对人源胃癌细胞(BGC-823)的存活率，设置表12中的9个药物浓度，具体实验数据见表14。
表14各组对人源胃癌细胞(BGC-823)的浓度
Figure BDA0001885981880000323
Figure BDA0001885981880000331
表15脂质体对人源胃癌细胞(BGC-823)的细胞活性
Figure BDA0001885981880000332
由表15和图14可知：紫杉醇Rg5脂质体、紫杉醇Rh2脂质体、紫杉醇Rg3脂质体的细胞活性最强。其次为PTX-Cho-Lipo组和PTX组。
2、体内药效实验
根据体内药效实验方法，将72只皮下荷瘤裸鼠随机分为8组(每组9只)，分别设为Control组(PBS)、游离Rg3组(Rg3)、Rg3空白脂质体组(Rg3空)、力扑素组(PTX-Cho-Lipo)、Abraxane组(Abraxane)、紫杉醇Rg5脂质体组(PTX-Rg5-Gipo)、紫杉醇Rg3脂质体组(PTX-Rg3-Gipo)和紫杉醇Rh2脂质体组(PTX-Rh2-Gipo)。将相应制剂经尾静脉注射(按照10mg·kg-1的剂量给药，隔两天给一次药)。每隔两天记录每组小鼠的体重变化，并用游标卡尺测量肿瘤最长直径和最短直径，瘤体积由以下公式计算：V＝(dmax×dmin2)/2，其中dmin和dmax分别为肿瘤的短径和长径(mm)；根据测量的结果计算相对肿瘤体积(Relative tumorvolume，RTV)，计算公式为：RTV＝Vt/V0。其中V0为给药时测量的肿瘤体积，Vt为每隔两天测量的肿瘤体积。
具体实验数据和结果见表16和图15。
表16各组对人源胃癌细胞(BGC-823)抑瘤作用
Figure BDA0001885981880000333
Figure BDA0001885981880000341
由表16和图15可知：相同时间下，Control组(PBS)的肿瘤体积最大，而PTX-Rg3-Gipo组和PTX-Rh2-Gipo组最小，其次为PTX-Rg5-Gipo组，再其次为Abraxane组和PTX-Cho-Lipo组。可见PTX-Rg3-Gipo和PTX-Rh2-Gipo对肿瘤抑制作用显著。

Claims (29)

1.一种以如式I所示的人参皂苷为膜材的空白脂质体，其中，所述的空白脂质体具有膜，所述的膜包含脂类物质和如式I所示的人参皂苷：
Figure 52334DEST_PATH_IMAGE001
其中，“*”表述手性C；R1为-O-Glc或羟基；
其中，Glc为吡喃葡萄糖基；
所述如式I所示的人参皂苷中标记为“*”的C的构型为S构型。
2.如权利要求1所述空白脂质体，其特征在于，R1为羟基；
和/或，所述空白脂质体的平均粒径为20～500nm；
和/或，所述如式I所示的人参皂苷在成膜前，经微粉化处理，制得所述如式I所示的人参皂苷的超微粉；
和/或，所述如式I所示的人参皂苷在成膜前，纯度为≥90％，所述纯度为经高效液相色谱检测，其色谱中，所述如式I所示的人参皂苷的峰面积占总的峰面积的比例；
和/或，所述空白脂质体的包封率为≥90％；
和/或，所述空白脂质体中，所述脂类物质的质量与所述如式I所示的人参皂苷的质量的比值为0.5-100。
3.如权利要求2所述空白脂质体，其特征在于，
所述空白脂质体的平均粒径为50～200nm；
和/或，所述如式I所示的人参皂苷在成膜前，纯度为≥95％；
和/或，所述空白脂质体的包封率为≥95％；
和/或，所述空白脂质体中，所述脂类物质的质量与所述如式I所示的人参皂苷的质量的比值为2-20。
4.如权利要求3所述空白脂质体，其特征在于，
所述空白脂质体的平均粒径为80～100nm；
和/或，所述如式I所示的人参皂苷在成膜前，纯度为≥98％；
和/或，所述空白脂质体的包封率为≥98％；
和/或，所述空白脂质体中，所述脂类物质的质量与所述如式I所示的人参皂苷的质量的比值为3-10。
5.如权利要求4所述空白脂质体，其特征在于，
所述空白脂质体的平均粒径为80～90nm。
6.如权利要求1所述空白脂质体，其特征在于，所述空白脂质体中，所述膜还进一步包含胆固醇；
所述脂质体与所述如式I所示的人参皂苷的质量的比值为0.5-100；所述胆固醇的质量与所述如式I所示的人参皂苷的质量的比值为0.01～100；
所述如式I所示的人参皂苷的质量在所述的膜中的含量为1～50％；所述脂类物质的质量在所述的膜中的含量为30-90％；所述胆固醇的质量在所述的膜中的含量为0％-50％；
和/或，所述的空白脂质体中，所述的膜还进一步包含长循环材料；
所述脂类物质与所述如式I所示的人参皂苷的质量的比值为0.5～100；所述长循环材料的质量与所述如式I所示的人参皂苷的质量的比值为0.01～10。
7.如权利要求6所述空白脂质体，其特征在于，所述脂质体与所述如式I所示的人参皂苷的质量的比值为2-20；所述胆固醇的质量与所述如式I所示的人参皂苷的质量的比值为0.1～10；
所述如式I所示的人参皂苷的质量在所述的膜中的含量为3～15％；所述脂类物质的质量在所述的膜中的含量为50～80％；所述胆固醇的质量在所述的膜中的含量为10～30％；
所述脂类物质与所述如式I所示的人参皂苷的质量的比值为2～20；所述长循环材料的质量与所述如式I所示的人参皂苷的质量的比值为0.1～5。
8.如权利要求7所述空白脂质体，其特征在于，
所述脂质体与所述如式I所示的人参皂苷的质量的比值为3-10；所述胆固醇的质量与所述如式I所示的人参皂苷的质量的比值为0.5～2；
所述脂类物质与所述如式I所示的人参皂苷的质量的比值为3～10；所述长循环材料的质量与所述如式I所示的人参皂苷的质量的比值为0.1～1。
9.如权利要求1～8任一项所述空白脂质体，其特征在于，所述空白脂质体还进一步包含冻干保护剂；所述冻干保护剂在空白脂质体中的含量为0.5％-70％；所述百分比是指冻干保护剂的质量占所述空白脂质体总质量的质量百分比；
和/或，所述空白脂质体还进一步包含抗氧化剂；所述的抗氧化剂在所述的空白脂质体中的含量为0.001％-15％；所述百分比是指所述的抗氧化剂的质量与所述的空白脂质体的总质量的质量百分比；
和/或，所述空白脂质体还进一步包含大豆油和/或油酸钠并封装在膜中；所述大豆油和/或油酸钠的含量为1％-30％，所述的百分比是指大豆油和/或油酸钠的质量占所述的空白脂质体总质量的质量百分比；所述脂类物质包括磷脂，所述大豆油和/或油酸钠和所述脂类物质中的磷脂的质量比值为0.1～10；
和/或，所述空白脂质体中还进一步包括其他辅料；所述的其他辅料为表面活性剂、热敏性辅料、pH敏感物质和离子添加剂中的一种或多种。
10.如权利要求9所述空白脂质体，其特征在于，所述冻干保护剂在空白脂质体中的含量为5％-60％；所述百分比是指冻干保护剂的质量占所述空白脂质体总质量的质量百分比；
和/或，所述的抗氧化剂在所述的空白脂质体中的含量为0.01％-10％；所述百分比是指所述的抗氧化剂的质量与所述的空白脂质体的总质量的质量百分比；
和/或，所述大豆油和/或油酸钠的含量为1％-20％，所述的百分比是指大豆油和/或油酸钠的质量占所述的空白脂质体总质量的质量百分比；所述脂类物质包括磷脂，所述大豆油和/或油酸钠和所述脂类物质中的磷脂的质量比值为0.1～5。
11.如权利要求10所述空白脂质体，其特征在于，所述冻干保护剂在空白脂质体中的含量为30％-60％；所述百分比是指冻干保护剂的质量占所述空白脂质体总质量的质量百分比；
和/或，所述的抗氧化剂在所述的空白脂质体中的含量为0.01％-5％；所述百分比是指所述的抗氧化剂的质量与所述的空白脂质体的总质量的质量百分比；
和/或，所述大豆油和/或油酸钠的含量为1％-10％，所述的百分比是指大豆油和/或油酸钠的质量占所述的空白脂质体总质量的质量百分比。
12.如权利要求1～8任一项所述空白脂质体，其特征在于，其包含下列组分：脂类物质和所述如式I所示的人参皂苷；或者脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷和冻干保护剂；或者脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷和胆固醇；或者脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷、胆固醇和冻干保护剂；或者脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷和长循环材料；或者脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷和抗氧化剂；或者脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷、抗氧化剂和冻干保护剂；或者脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷和大豆油和/或油酸钠；或者脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷、胆固醇和长循环材料；或者脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷、胆固醇、长循环材料和冻干保护剂；或者脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷、胆固醇和抗氧化剂；或者脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷、胆固醇、抗氧化剂和冻干保护剂；或者脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷、胆固醇和大豆油和/或油酸钠；或者脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷、胆固醇、长循环材料和冻干保护剂；或者脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷、胆固醇、冻干保护剂和大豆油和/或油酸钠；或者脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷、胆固醇、冻干保护剂、长循环材料和氧化剂；或者脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷、胆固醇、冻干保护剂、长循环材料和大豆油和/或油酸钠；或者脂类物质、所述如式I所示的人参皂苷、胆固醇、冻干保护剂、长循环材料、氧化剂和大豆油和/或油酸钠。
13.如权利要求1～8任一项所述空白脂质体，其特征在于，所述的脂类物质为磷脂和/或，所述长循环材料为磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二油酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、C8神经酰胺-聚乙二醇、C16神经酰胺-聚乙二醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-琥珀酰、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺基、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-丙酰胺双巯基吡啶、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-三聚氯氰、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-生物素、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-活性酯、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-活性酯、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-活性酯、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-活性酯、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺基、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺基、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺基、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺基、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-生物素、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-荧光素、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羟基、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-硫基、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-硅烷、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叠氮、胆固醇-聚乙二醇、甲氧基-聚乙二醇-胆固醇、胆固醇-聚乙二醇-活性酯、胆固醇-聚乙二醇-马来酰亚胺、胆固醇-聚乙二醇-生物素、胆固醇-聚乙二醇-荧光素、胆固醇-聚乙二醇-羧基、胆固醇-聚乙二醇-氨基和胆固醇-聚乙二醇-硫基中的一种或多种，其中，所述的聚乙二醇的相对分子量为300-50000；所述的DMPE-PEG的数均分子量为350、550、750、1000、2000、3000或5000；所述的DPPE-PEG的数均分子量为350、550、750、1000、2000、3000或5000；所述的DSPE-PEG的数均分子量为350、550、750、1000、2000、3000、5000、10000、20000、30000或40000；所述的DOPE-PEG的数均分子量为350、550、750、1000、2000、3000或5000；所述的C8Ceramide-PEG的数均分子量为750、2000或5000；所述的C16Ceramide-PEG的数均分子量为750、2000或5000；所述的DLPE-PEG的数均分子量为2000或5000；所述的DSPE-PEG-NHS的数均分子量为1000、2000、5000、10000、20000、30000或40000；所述的DMPE-PEG-NHS的数均分子量为3400或5000；所述的的数均分子量为3400或5000；所述的DLPE-PEG-NHS的数均分子量为3400或5000；所述的DSPE-PEG-Maleimide的数均分子量为1000、2000、3400、5000或10000；所述的DMPE-PEG-Maleimide的数均分子量为1000、2000、3400、5000或10000；所述的DPPE-PEG-Maleimide的数均分子量为1000、2000、3400、5000或10000；所述的DLPE-PEG-Maleimid的数均分子量为1000、2000、3400、5000或10000；所述的DSPE-PEG-Biotin的数均分子量为1000、2000、3400、5000或10000；所述的DSPE-PEG-FITC的数均分子量为1000、2000、3400、5000或10000；所述的DSPE-PEG-OH的数均分子量为2000、3400或5000；所述的DSPE-PEG-NH2的数均分子量为2000、3400或5000；所述的DMPE-PEG-NH2的数均分子量为2000、3400或5000；所述的DPPE-PEG-NH2的数均分子量为2000、3400或5000；所述的DLPE-PEG-NH2的数均分子量为2000、3400或5000；
所述的DSPE-PEG-COOH的数均分子量为2000、3400或5000；所述的DMPE-PEG-COOH的数均分子量为2000、3400或5000；
所述的DPPE-PEG-COOH的数均分子量为2000、3400或5000；所述的DLPE-PEG-COOH的数均分子量为2000、3400或5000；
所述的DSPE-PEG-SH的数均分子量为5000；所述的DSPE-PEG-Silane的数均分子量为3400；所述的DSPE-PEG-N3的数均分子量为2000、3400或5000；所述的mPEG-CLS的数均分子量为1000、2000、5000、10000或20000；所述的Cholesterol PEG NHSester的数均分子量为1000、2000、3400、5000或10000；所述的CLS-PEG-Mal的数均分子量为2000、3400、5000或10000；所述的CLS-PEG-Biotin的数均分子量为2000、3400或5000；所述的CLS-PEG-FITC的数均分子量为2000、3400或5000；所述的Cholesterol PEG COOH的数均分子量为3400；所述的Cholesterol PEG amine的数均分子量为3400；所述的Cholesterol PEG Thiol/Sulfhydril的数均分子量为3400；
和/或，所述的抗氧化剂为焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、没食子酸丙酯、α-生育酚、α-羟基酸、黄酮类化合物、苯丙素酚类化合物、维生素E、维生素C、反丁烯二酸、半胱氨酸、蛋氨酸、丁羟基茴香醚、二丁羟基甲苯、硫代二丙酸、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、二硫代氨基苯甲酸类化合物、枸橼酸、苹果酸、山梨醇、甘油、丙二醇、氢醌、羟基香豆素、乙醇胺、磷酸和亚磷酸中的一种或多种；
和/或，所述的冻干保护剂为糖、多元醇、氨基酸和缓冲剂中的一种或多种；所述的糖为单糖、双糖和多糖中的一种或多种；
其中，所述的单糖为葡萄糖、甘露醇、木糖醇和山梨醇中的一种或多种；所述的双糖为蔗糖、乳糖、半乳糖和麦芽糖中的一种或多种；所述的多糖为海藻糖；所述的多元醇为丙二醇和/或丙三醇；所述的氨基酸为α-氨基酸，选自苏氨酸、甘氨酸、谷氨酸、精氨酸和组氨酸中的一种或多种；所述的缓冲剂的pH值在3-10之间；所述的缓冲剂为硫酸铵水溶液、乙醇-醋酸缓冲溶液、三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液、巴比妥缓冲溶液、甲酸钠缓冲溶液、邻苯二甲酸盐缓冲溶液、枸橼酸盐缓冲溶液、枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲溶液、氨-氯化铵缓冲溶液、硼砂-氯化钙缓冲溶液、醋酸盐缓冲溶液、醋酸-锂盐缓冲溶液、醋酸-醋酸钠缓冲溶液、醋酸-醋酸铵缓冲溶液、磷酸-三乙胺缓冲溶液或磷酸盐缓冲溶液；
和/或，所述的表面活性剂为聚乙二醇和/或聚山梨醇酯；
其中，所述的聚乙二醇的数均分子量为200-8000；
所述的聚山梨醇酯为聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇三油酸酯、聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-聚乳酸、聚赖氨酸-聚丙交酯乙交酯、聚醚酰亚胺-聚乳酸、聚乙二醇-聚己内酯、聚乙二醇-聚乙交酯丙交酯、聚乙二醇-聚十六烷基氰基丙烯酸酯、泊洛沙姆188、聚氧乙烯脂肪酸酯类、聚氧乙烯脂肪酸醚和聚氧乙烯甲基蓖麻油醚中的一种或多种；
所述的热敏性辅料是指可使脂质体具有热敏性的聚合物和/或表面活性剂中的一种或多种；
其中，所述的聚合物为聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚磷酸酯和聚磷脂酰胺共聚物中的一种或多种；所述的表面活性剂为吐温类表面活性剂和/或苄泽类表面活性剂；
所述的离子添加剂为阳离子添加剂和/或阴离子添加剂。
14.如权利要求13所述空白脂质体，其特征在于，所述的脂类物质为天然磷脂、半合成磷脂和全合成磷脂中的一种或多种；
其中，所述天然磷脂为天然卵磷脂、鞘磷脂、甘油磷脂、大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂和脑磷脂中的一种或多种；
所述的半合成或全合成磷脂为磷脂酰胆碱类的磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺类的磷脂、磷脂酰甘油、二鲸蜡磷酸酯、PEG修饰的磷脂、琥珀酸胆固醇酯中的一种或多种；
所述的磷脂酰胆碱类的磷脂为氢化大豆卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、磷脂酰胆碱、单棕榈酰磷脂酰胆碱和甘油磷脂酰胆碱中的一种或多种；
所述的磷脂酰乙醇胺类的磷脂为1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺、二芥酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺和二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺中的一种或多种；
和/或，所述长循环材料为EG2000-DSPE；
所述的聚乙二醇的相对分子量为500-10000；
和/或，所述的抗氧化剂为维生素E、维生素C、硫代硫酸钠或亚硫酸钠；
和/或，所述的冻干保护剂为海藻糖、葡萄糖、蔗糖、丙二醇、丙三醇、木糖醇或硫酸铵水溶液；
和/或，所述的冻干保护剂为缓冲剂，所述的缓冲剂其pH值在5-7之间。
15.如权利要求14所述空白脂质体，其特征在于，所述的脂类物质为蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂或大豆卵磷脂S100；
所述的聚乙二醇的相对分子量为300、350、500、550、1000、2000、3400、5000、10000、20000、30000、40000或50000。
16.一种如权利要求1～15任一项所述如式I所示的人参皂苷为膜材的空白脂质体的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：
步骤一：在有机溶剂中，将所述脂类物质和所述如式I所示的人参皂苷混合，可选地加入胆固醇、长循环材料、脂溶性抗氧化剂、大豆油和/或油酸钠、脂溶性表面活性剂、脂溶性热敏性辅料、脂溶性pH敏感物质和脂溶性离子添加剂中的一种或多种，得到一澄清溶液；其中，所述有机溶剂为醇类溶剂、卤代烃类和腈类溶剂中的一种或多种；所述如式I所示的人参皂苷经微粉化处理得到超微粉，所述超微粉的平均粒径≤50μm；
步骤二：除去步骤一中所得澄清溶液的有机溶剂，成膜，然后可选地与冻干保护剂的水溶液混合，可选地加入水溶性抗氧化剂、水溶性表面活性剂、水溶性热敏性辅料、水溶性pH敏感物质和水溶性离子添加剂中的一种或多种，超声、高压均质或挤推过膜后，过滤，得一含有如式I所示的人参皂苷脂质体的水溶液，干燥，即得所述空白脂质体。
17.如权利要求16所述制备方法，其特征在于，
步骤一中，所述卤代烃类溶剂为C1～4卤代烃类溶剂；
和/或，步骤一中，所述的醇类溶剂为C1～4醇类溶剂；
和/或，所述腈类溶剂为乙腈；
和/或，所述有机溶剂为所述卤代烃类溶剂与所述醇类溶剂的混合溶剂，所述卤代烃类溶剂与所述醇类溶剂的体积的比值为5～100；
和/或，所述有机溶剂为所述卤代烃类溶剂与所述腈类溶剂的混合溶剂，所述所述卤代烃类溶剂与所述腈类溶剂的体积的比值为5～100；
和/或，步骤一中，所述如式I所示的人参皂苷的超微粉的粒度粒径为≤20μm；
和/或，步骤一中，所述的混合的温度为0-80℃；
和/或，步骤二中，所述除去步骤(1)中澄清溶液的有机溶剂为使用旋转蒸发器或者膜蒸发器除去有机溶剂；所述除去有机溶剂的温度为40-65℃；
和/或，步骤二中，所述的超声、高压均质或挤推过膜的操作结束后，所述脂质体颗粒的平均粒径为0.05～0.3μm；
和/或，步骤二中，所述过滤为微孔滤膜过滤；所述的微孔滤膜的孔径为0.22微米；
和/或，步骤二中，所述冻干保护剂的水溶液为5％-10％的冻干保护剂的水溶液，所述的百分比是指冻干保护剂的质量占冻干保护剂水溶液总质量的百分比；
和/或，步骤二中，所述干燥的操作为冷冻干燥，所述冷冻干燥采用冷冻干燥机进行真空冷冻干燥；
和/或，将步骤二得到的含有使用空白脂质体的水溶液分装于西林瓶中，干燥，通入保护性气体，密封保存即可。
18.如权利要求17所述制备方法，其特征在于，
步骤一中，所述卤代烃类溶剂为C1～2卤代烃类溶剂；
和/或，步骤一中，所述的醇类溶剂为C1～3醇类溶剂；
和/或，所述有机溶剂为卤代烃类溶剂与所述醇类溶剂的混合溶剂，所述卤代烃类溶剂与所述醇类溶剂的体积的比值为5～10；
和/或，所述有机溶剂为所述卤代烃类溶剂与所述腈类溶剂的混合溶剂，所述所述卤代烃类溶剂与所述腈类溶剂的体积的比值为5～10；
和/或，步骤一中，所述如式I所示的人参皂苷的超微粉的粒度粒径为≤10μm；
和/或，步骤一中，所述的混合的温度为20-80℃；
和/或，步骤二中，所述的超声、高压均质或挤推过膜的操作结束后，所述脂质体颗粒的平均粒径为0.05～0.2μm。
19.如权利要求18所述制备方法，其特征在于，
步骤一中，所述卤代烃类溶剂为氯仿、二氯甲烷和二氯乙烷中的一种或多种；
和/或，步骤一中，所述的醇类溶剂为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇和正丁醇中的一种或多种；
和/或，步骤一中，所述的混合的温度为40-65℃。
20.如权利要求19所述制备方法，其特征在于，
步骤一中，所述卤代烃类溶剂为二氯甲烷和/或氯仿；
和/或，步骤一中，所述的醇类溶剂为甲醇、乙醇或异丙醇。
21.一种空白脂质体，其按照如权利要求16~20任一项所述如式I所示的人参皂苷为膜材的空白脂质体的制备方法制得。
22.一种负载活性物质的脂质体，其包括如式I所示的人参皂苷空白脂质体和活性物质；所述如式I所示的人参皂苷空白脂质体如权利要求1～15任一项如式I所示的人参皂苷空白脂质体，或权利要求21所述空白脂质体。
23.如权利要求22所述负载活性物质的脂质体，其特征在于，
所述的负载活性物质的脂质体的平均粒径为30-500nm；
和/或，所述的负载活性物质的脂质体的包封率为80％以上；
和/或，所述的活性物质为抗肿瘤药物，所述的负载活性物质的脂质体具有长循环作用；
和/或，所述的活性物质为抗肿瘤药物，所述活性物质与所述如式I所示的人参皂苷质量的比值为0.1～10；
和/或，所述活性物质为抗肿瘤药物中的一种或多种；所述的抗肿瘤药物为紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛、替司他赛、奥他他赛、拉洛他赛、司莫他赛、盐酸伊立替康、羟基喜树碱、氨基喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱、顺铂、卡铂、奥沙利铂、三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱、雷公藤甲素、阿糖胞苷、磷酸依托泊甙、去氧鬼臼毒素、石杉碱甲、酒石酸长春瑞滨、硫酸长春新碱、硫酸长春碱、埃博霉素A、埃博霉素B、埃博霉素C、埃博霉素D、埃博霉素E、埃博霉素F、地西他滨、三氧化二砷、全反式维甲酸、阿奇霉素、盐酸表柔比星、盐酸多柔比星、盐酸氨柔比星中的一种或多种。
24.如权利要求23所述负载活性物质的脂质体，其特征在于，
所述的负载活性物质的脂质体的平均粒径为30-300nm；
和/或，所述的负载活性物质的脂质体的包封率为90％以上；
和/或，所述的活性物质为抗肿瘤药物，所述活性物质与所述如式I所示的人参皂苷质量的比值为0.5～2；
和/或，所述活性物质为抗肿瘤药物中的一种或多种；所述的抗肿瘤药物为紫杉醇、多西他赛、伊立替康、阿霉素或顺铂。
25.如权利要求24所述负载活性物质的脂质体，其特征在于，
所述的负载活性物质的脂质体的平均粒径为50-200nm；
和/或，所述的负载活性物质的脂质体的包封率为95％以上。
26.如权利要求22~25任一项所述负载活性物质的脂质体的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：步骤一：在有机溶剂中，将所述脂类物质和所述如式I所示的人参皂苷混合，可选地加入胆固醇、长循环材料、脂溶性抗氧化剂、大豆油和/或油酸钠、脂溶性表面活性剂、脂溶性热敏性辅料、脂溶性pH敏感物质和脂溶性离子添加剂中的一种或多种，得到一澄清溶液；其中，所述有机溶剂为醇类溶剂、卤代烃类和腈类溶剂中的一种或多种；所述如式I所示的人参皂苷经微粉化处理得到超微粉，所述超微粉的平均粒径≤50μm；
步骤二：除去步骤一中所得澄清溶液的有机溶剂，成膜，然后可选地与冻干保护剂的水溶液混合，可选地加入水溶性抗氧化剂、水溶性表面活性剂、水溶性热敏性辅料、水溶性pH敏感物质和水溶性离子添加剂中的一种或多种，超声、高压均质或挤推过膜后，得一空白脂质体溶液，过滤，然后与所述的活性物质混合，得一含有负载活性物质的脂质体的水溶液，干燥，即得所述的负载活性物质的脂质体。
27.如权利要求26所述负载活性物质的脂质体的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述有机溶剂、所述脂类物质和所述如式I所示的人参皂苷的超微粉均如权利要求17~21任一项所述；
步骤二中，所述冻干保护剂还可在制得一含负载活性物质的脂质体的水溶液之后加入；
和/或，所述的活性物质与所述如式I所示的人参皂苷质量的比值为0.1～10。
28.如权利要求27所述负载活性物质的脂质体的制备方法，其特征在于，所述的活性物质与所述如式I所示的人参皂苷质量的比值为0.5～2。
29.一种按照如权利要求26~28任一项所述负载活性物质的脂质体的制备方法制得的负载活性物质的脂质体。
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Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112362863B (zh) * 2020-11-02 2024-02-13 上海市农业科学院 一种巯基功能化脂质体纳米材料及其制备方法和应用
CN114432245B (zh) * 2020-11-06 2023-10-03 上海参素药物技术有限公司 一种人参皂苷紫杉醇脂质体、其制备方法和应用
CN114712309B (zh) * 2020-12-22 2023-11-28 上海参素药物技术有限公司 一种人参皂苷多西他赛脂质体、其制备方法和应用
CN112641642A (zh) * 2020-12-31 2021-04-13 茵素科技(广州)有限公司 基于人参皂苷次生苷的脂质体及其应用
CN113058027A (zh) * 2021-03-10 2021-07-02 浙江工业大学 一种大豆凝集素和单宁酸表面修饰紫杉醇微粒的制备方法
CN115444822B (zh) * 2021-06-09 2024-02-27 厦门本素药业有限公司 一种人参皂苷表阿霉素脂质体、其制备方法和应用
CN115444821B (zh) * 2021-06-09 2024-02-27 厦门本素药业有限公司 一种人参皂苷长春新碱脂质体、其制备方法和应用
CN115487147A (zh) * 2021-06-17 2022-12-20 厦门本素药业有限公司 一种人参皂苷阿霉素脂质体、其制备方法和应用
CN115487148A (zh) * 2021-06-18 2022-12-20 厦门本素药业有限公司 一种人参皂苷米托蒽醌脂质体、其制备方法和应用
CN113425689B (zh) * 2021-08-06 2022-10-14 江西杏林白马药业股份有限公司 一种猴耳环提取物纳米制剂及其制备方法
CN113577132B (zh) * 2021-08-06 2022-11-01 江西杏林白马药业股份有限公司 一种抑菌消炎、止血镇痛的中药组合物的制备方法
CN113827487B (zh) * 2021-09-23 2022-10-14 茵素科技(广州)有限公司 一种壳材、纳米载体及其用途
CN114053225B (zh) * 2021-10-20 2023-03-28 浙江大学 一种高效低毒且稳定性良好的用于基因递送的阳离子脂质体及其应用
CN114276404B (zh) * 2021-12-24 2023-07-25 五邑大学 甘草次酸类甘油磷脂化合物、其分泌型磷脂酶a2敏感性脂质体及其应用
CN114983943A (zh) * 2022-06-16 2022-09-02 苏州卫生职业技术学院 一种青蒿琥酯纳米靶向制剂及其制备方法与应用
CN115429759B (zh) * 2022-08-24 2023-07-21 中国人民解放军空军军医大学 以重楼皂苷活性提取物为膜材的脂质体的制备方法及应用
CN115486539A (zh) * 2022-09-14 2022-12-20 厦门遇见今生生物科技有限公司 具有抗衰老及端粒延长的草药提取物仿生膜及其制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101091714A (zh) * 2007-07-02 2007-12-26 中国药科大学 含人参皂甙Rh2的前体脂质体及其制备方法
CN103417479A (zh) * 2012-05-16 2013-12-04 吉林大学 一种人参皂苷Rg3脂质体及其制备方法
CN106466299A (zh) * 2015-08-19 2017-03-01 上海本素医药科技有限公司 以人参皂苷为膜材的空白脂质体、其制备方法及应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017095138A1 (en) * 2015-11-30 2017-06-08 Gil Medical Center Curcumin-containing lipid nanoparticle complex comprising ginsenosides
CN105708801A (zh) * 2016-02-04 2016-06-29 大连民族大学 一种20(R)-人参皂苷Rg3/大豆卵磷脂/胆固醇/叶酸脂质体药物制备方法和应用
CN106511274A (zh) * 2016-11-28 2017-03-22 南昌大学 一种人参皂苷Rh2酯脂质体及制备方法和应用
WO2019105408A1 (en) * 2017-11-29 2019-06-06 Xiamen Ginposome Pharmaceutical Co., Ltd. Novel liposomes with ginsenoside derivative as membrane material and preparations thereof
CN108420793B (zh) 2017-12-26 2021-09-24 厦门本素药业有限公司 一种空白混合胶束及其制备方法和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101091714A (zh) * 2007-07-02 2007-12-26 中国药科大学 含人参皂甙Rh2的前体脂质体及其制备方法
CN103417479A (zh) * 2012-05-16 2013-12-04 吉林大学 一种人参皂苷Rg3脂质体及其制备方法
CN106466299A (zh) * 2015-08-19 2017-03-01 上海本素医药科技有限公司 以人参皂苷为膜材的空白脂质体、其制备方法及应用

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