CN104067127A - 用于前列腺癌分析的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于诊断前列腺癌的方法。本发明还提供新颖的抗STEAP-1抗体及其用途。

Description

用于前列腺癌分析的组合物和方法
相关申请
本申请依据35USC119(e)要求2011年11月29日提交的美国临时专利申请No.61/629,886和2012年9月19日提交的美国临时专利申请No.61/703,099的优先权，通过提述将其内容完整收入本文。
发明领域
本发明涉及肿瘤学和癌症诊断领域，更具体地涉及用于前列腺癌筛选，分阶段，治疗监测的组合物和方法。
发明背景
前列腺癌是男性中最流行的癌症之一。虽然大多数早期发作的前列腺癌是没有症状且生长缓慢的，但是某些前列腺癌更具攻击性，疼痛且导致死亡。目前，有两大类非侵入性筛选测试可用于在男性中检测前列腺癌。一种是手指直肠检查(DRE)(其容许医生通过将戴有手套的手指插入直肠并感受前列腺来检测前列腺异常)，而另一种是前列腺表面抗原测试(PSA测试)(其测量血液样品中PSA抗原的水平)。虽然FDA已经批准与DRE一起使用PSA测试来帮助在男性中检测前列腺癌，但是PSA测试在筛选方面是有争议的，因为不清楚该测试是否实际地挽救生命。特别地，基于PSA筛选没有或很小降低前列腺癌死亡率，同时导致引起不必要的疼痛和副作用的治疗或测试的发现，美国预防服务工作组最近反对推荐在健康男性中进行PSA筛选(参见例如R.Chou et al,Ann.Intern.Med.,October7,2011E-375；Djulbegovic et al,BMJ2010,341:c4543)。前列腺癌的最确定性诊断是活检，其中自疑似患者取出的一小块前列腺针对肿瘤细胞的存在情况进行显微镜检查。显然，此类规程相当具有侵入性，不太期望用于早期筛选和检测。
正如在许多其它类型的癌症中，前列腺癌患者中的主要死亡原因不是原发性肿瘤而是转移。一些原发性肿瘤细胞自身能脱离初始组织并进入循环。这些细胞称作循环肿瘤细胞(CTC)。一旦CTC自身播种至身体中的合适部位，它们就可发展成转移性集落，它们难以检测且随着它们进展成继发性肿瘤能危及生命。试图检测CTC。然而，尚未开发出能辨别CTC是否源自前列腺及前列腺癌如何进展的方法。鉴于最近的发现，即PSA筛选未能降低死亡率，仍然存在开发能在前列腺癌的诊断和预后中提供可靠结果的药剂和方法的重大需要。
发明概述
一方面，本公开文本提供用于在测试受试者中诊断前列腺癌的方法，其包括：a)使上皮起源的癌细胞与特异性结合前列腺特异性标志物的抗体接触，其中该癌细胞来自取自测试受试者的血液样品；并b)测定任何癌细胞是否表达前列腺特异性标志物，其中存在表达前列腺特异性标志物的癌细胞指示测试受试者中具有前列腺癌。
在某些实施方案中，该方法进一步包括测定表达前列腺特异性标志物的癌细胞的量，其中此类量指示测试受试者中的前列腺癌的阶段。
在某些实施方案中，该方法进一步包括测定癌细胞上前列腺特异性标志物的表达水平。
在某些实施方案中，该方法进一步包括基于癌细胞的前列腺特异性标志物表达水平对癌细胞分等级，并测定每个等级中的癌细胞的百分比。
在某些实施方案中，该方法进一步包括通过将该等级中的癌细胞的百分比乘以基于前列腺特异性标志物的表达水平指派给该等级的独特等级数为每个等级计算等级得分，并将所有等级得分加和以获得H得分，其中H得分指示测试受试者中的前列腺癌的阶段。
在某些实施方案中，该癌细胞是用包含配体的捕捉组合物自血液样品鉴定的，该配体特异性结合上皮起源的癌细胞。在某些实施方案中，该配体为特异性结合优先在癌细胞上表达的上皮抗原的抗体。在某些实施方案中，该上皮抗原为上皮细胞粘附分子(EpCAM)。
在某些实施方案中，在自血液样品分离的细胞级分中富集鉴定的癌细胞。在某些实施方案中，该细胞级分是在磁场下分离的。在某些实施方案中，该捕捉组合物中的配体是与磁性颗粒偶联的。
在某些实施方案中，该特异性结合前列腺特异性标志物的抗体包含抗STEAP-1抗体。在某些实施方案中，该抗STEAP-1抗体以≤1000nM的KD结合STEAP-1。在某些实施方案中，该抗STEAP-1抗体为鼠单克隆抗体。在某些实施方案中，该抗STEAP-1抗体为15A5，15A5是由具有微生物保藏号PTA-12259的杂交瘤细胞生成的15A5。
在某些实施方案中，该癌细胞是用一种或多种容许检测上皮起源的癌细胞的试剂鉴定的。在某些实施方案中，该试剂包含特异性结合细胞角蛋白的配体，且其中该配体任选是与第二可检测标记物缀合的。在某些实施方案中，该试剂进一步包含区分细胞与非细胞成分的染料。在某些实施方案中，该试剂进一步包含特异性结合白细胞标志物的配体。
在某些实施方案中，该癌细胞是通过基于免疫荧光显微术，流式细胞术，纤维光学扫描细胞术，或激光扫描细胞术的方法检测的。
另一方面，本公开文本提供在测试受试者中预测前列腺癌疗法的功效的方法。
另一方面，本公开文本提供在测试受试者中监测对前列腺癌疗法的响应的方法。
另一方面，本公开文本提供结合与抗体15A5结合的表位基本上相同的表位的抗体，其中抗体15A5是由具有微生物保藏号PTA-12259的杂交瘤细胞生成的。
另一方面，本公开文本提供具有微生物保藏号PTA-12259的杂交瘤细胞系。
另一方面，本公开文本提供用于检测血液样品中表达STEAP-1的前列腺癌细胞的存在情况的测试试剂盒，其包含特异性结合STEAP-1的抗体。在某些实施方案中，该测试试剂盒进一步包含一种或多种选自下组的组合物：与特异性结合上皮起源的癌细胞的第一配体偶联的磁性颗粒，特异性结合上皮标志物的第二配体，特异性结合白细胞标志物的第三配体，和区分细胞与非细胞成分的染料。
附图简述
图1描绘基于抗STEAP-1抗体染色水平的代表性CTC打分标准。
图2描绘不同细胞系在系统上使用绵羊多克隆抗STEAP-1抗体，小鼠单克隆抗STEAP-1抗体37，和家兔多克隆抗STEAP-1抗体测定的STEAP-1表达和H得分：(a)LB50细胞上的表达；(b)PC3细胞上的表达；(c)LB50细胞的H得分；和(d)PC3细胞的H得分。
图3描绘不同掺混(spiked-in)样品在系统上使用绵羊多克隆抗STEAP-1抗体测定的STEAP-1表达和H得分：(a)表达，(b)H得分。
图4描绘11份患者血液样品在系统上用绵羊多克隆抗STEAP-1抗体测定的H得分。
图5描绘10份患者血液样品在系统上使用绵羊多克隆抗STEAP-1抗体测定的H得分(a)，及与来自相同患者的肿瘤组织样品的IHC结果的比较(b-c)。
图6描绘不同掺混样品在系统上使用绵羊多克隆抗STEAP-1抗体(a-b)和小鼠单克隆抗STEAP-1抗体15A5(c-d)测定的STEAP-1表达和H得分。
图7描绘患者样品的重复样品中CTC枚举的再现性(以CTC计数/患者显示)(a)及来自患者样品的重复样品的CTC中STEAP-1生物标志物表达水平的再现性(以H得分/患者显示)(b)。
图8描绘来自基线1和2时采集的血液样品的CTC枚举中的强关联。
图9描绘剂量1-7的剂量放大治疗期间服药前和服药后患者的CTC计数的倍数变化。
图10描绘剂量1-7的剂量放大治疗期间服药前和服药后患者的CTC计数。
图11描绘剂量1-7的剂量放大治疗期间服药前和服药后患者的CTC计数。
发明详述
I.定义
如本文中可互换使用的，术语“肿瘤”或“癌症”指特征在于赘生性或恶性细胞生长，增殖，或转移的任何医学状况，而且包括实体癌症和非实体癌症(诸如白血病)二者。
如本文中使用的，术语“前列腺癌”或“前列腺肿瘤”指源自前列腺组织的癌症或肿瘤。
在疾病(诸如癌症或肿瘤)的语境中，术语“阶段”或“期”指疾病的进展状态，其指示疾病的严重性。
如本文中使用的，术语“分阶段”或“分期”指鉴定疾病进展所处的特定阶段。
术语“诊断”(连同其语法变化形式诸如“诊断性”)指鉴定分子或病理学状态，疾病或状况(诸如鉴定癌症)，或者指鉴定可能受益于特定治疗方案的癌症患者。
术语“预后”(及其语法变化形式诸如“预后性”)指预测受益于治疗(诸如癌症疗法)的可能性。
术语“预测”在本文中用于指患者会有利地或不利地响应特定抗前列腺癌疗法的可能性。在一个实施方案中，预测涉及那些响应的程度。在一个实施方案中，预测涉及患者是否会在治疗(例如使用特定治疗剂的治疗)后存活或改善且某个时间段没有疾病进展和/或患者会在治疗(例如使用特定治疗剂的治疗)后存活或改善且某个时间段没有疾病进展的概率。
术语“好处”以最广义使用，而且指任何期望效果且具体包括本文中定义的临床好处。
“个体”或“受试者”为哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛，绵羊，猫，犬，和马)，灵长动物(例如人和非人灵长动物，诸如猴)，家兔，和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者为人。
术语六次跨膜前列腺上皮抗原1(也称作STEAP-1)指在前列腺组织中优势表达且发现在多种癌细胞系中上调的细胞表面抗原(Hubert et al.(1999),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96(25),14523-8)。一种例示性人STEAP-1具有2007年10月26日提交的US2009/0280056A1中披露的氨基酸序列SEQ ID NO:1，通过提述明确将其完整公开内容收入本文。
术语“抗STEAP-1抗体”和“结合STEAP-1的抗体”指能够以足够亲和力结合STEAP-1使得该抗体在靶向STEAP-1中作为诊断剂有用的抗体。在一个实施方案中，抗STEAP-1抗体结合无关的非STEAP-1蛋白的程度小于该抗体对STEAP-1的结合的约10％，如例如通过放射免疫测定法(RIA)测量的。在某些实施方案中，结合STEAP-1的抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗STEAP-1抗体结合在来自不同物种的STEAP-1间保守的STEAP-1表位。
“亲和力”指一种分子(例如抗体)的单个结合位点和它的结合配偶(例如抗原)之间全部非共价相互作用的强度之和。除非另有说明，如本文中使用的，“结合亲和力”指内在结合亲和力，其反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对它的配偶Y的亲和力一般可通过解离常数(Kd)来表示。亲和力可通过本领域已知的常用方法来测量，包括本文中描述的那些。下文描述了测量结合亲和力的具体例示性和示例性实施方案。
术语“抗体”在本文中以最广义使用，而且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们展现期望的抗原结合活性。
“抗体片段”指与完整抗体不同，包含完整抗体中结合(完整抗体所结合的)抗原的部分的分子。抗体片段的例子包括但不限于Fv，Fab，Fab'，Fab’-SH，F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和自抗体片段形成的多特异性抗体。
与参照抗体“结合相同表位的抗体”指在竞争测定法中将参照抗体对其抗原的结合阻断50％或更多的抗体，反之，参照抗体在竞争测定法中将该抗体对其抗原的结合阻断50％或更多。本文中提供了一种例示性竞争测定法。
如本文中使用的，术语“抗体15A5”指由具有微生物保藏号PTA-12259的杂交瘤细胞系生成的小鼠单克隆抗STEAP-1抗体。杂交瘤细胞系的微生物保藏信息如下：ATCC保藏物No.：PTA-12259；保藏日：2011年11月17日；和保藏材料：杂交瘤15A5.1.1.1(也称作7284)，其生成抗体15A5。
抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。有5大类抗体：IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM，而且这些中的数种可进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1，和IgA2。与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α，δ，ε，γ，和μ。
术语“全长抗体”，“完整抗体”，和“全抗体”在本文中可互换地用于指具有与天然抗体结构实质性相似的结构或具有含有Fc区的重链的抗体，如本文中定义的。
如本文中使用的，术语“单克隆抗体”指自实质性同质的抗体群体获得的抗体，即除可能的抗体变体(例如含有天然存在突变或单克隆抗体制备物的生产期间产生，此类变体一般以微小量存在)外，构成群体的抗体个体相同和/或结合相同表位。与多克隆抗体制备物(其通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体)形成对比，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此，修饰语“单克隆”指示抗体自实质性同质的抗体群体获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法生成抗体。例如，要依照本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术生成，包括但不限于杂交瘤法，重组DNA法，噬菌体展示法，和利用包含所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了此类方法和用于生成单克隆抗体的其它例示性方法。
“天然抗体”指具有不同结构的天然存在免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体为约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由形成二硫键的两条相同的轻链和两条相同的重链构成。自N至C端，每条重链具有一个可变区(VH)(也称作可变重域或重链可变域)，接着是三个恒定域(CH1，CH2，和CH3)。类似地，自N至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)(也称作可变轻域或轻链可变域)，接着是一个恒定轻域(CL)。抗体的轻链可基于其恒定域的氨基酸序列归于两个型之一，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
如本文中使用的，术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于放射性同位素(例如At211，I131，I125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂或化疗药物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)，阿霉素(adriamicin)，长春花生物碱(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，依托泊苷(etoposide))，多柔比星(doxorubicin)，美法仑(melphalan)，丝裂霉素C(mitomycin C)，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段(诸如溶核酶)；抗生素；和毒素(诸如小分子毒素或细菌，真菌，植物或动物起源的酶活性毒素，包括它们的片段和/或变体)。适合于本发明的细胞毒剂的非限制性例子包括2007年10月26日提交的US2009/0280056A1中记载的那些，通过提述明确将其完整公开内容收入本文。例如，在某些实施方案中，细胞毒剂为单甲基auristatin E(MMAE)。
“分离的”抗体为已经与其天然环境的一种成分分开的抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至超过95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如离子交换或反相HPLC)测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的综述参见例如Flatman et al.,J.Chromatogr.B848:79-87(2007)。
“分离的”核酸指已经与其天然环境的一种成分分开的核酸分子。分离的核酸包括正常情况下包含该核酸分子的细胞中包含的核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置。
“分离的编码抗STEAP-1抗体的核酸”指一种或多种编码抗体重和轻链(或其片段)的核酸分子，包括单一的载体或分开的载体中的此类核酸分子，及存在于宿主细胞中一个或多个位置处的此类核酸分子。
如本文中使用的，术语“载体”指能够扩增与它连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入宿主细胞(其中引入该载体)的基因组的载体。某些载体能够指导与它们可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称作“表达载体”。
术语“宿主细胞”，“宿主细胞系”，和“宿主细胞培养物”可互换使用，而且指其中引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化子”和“转化细胞”，包括原代转化细胞和自它们衍生的后代，不管传代次数。后代在核酸内容方面与亲本细胞可以不是完全相同的，但可包含突变。本文中包括具有在初始转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变后代。
术语“包装插页”用于指治疗性产品的商业包装中通常包括的说明书，它含有关于关注此类治疗性产品使用的适应症，用法，剂量，施用，组合疗法，禁忌症和/或警告的信息。
II.方法
一方面，本公开文本提供使用来自测试受试者的血液样品在测试受试者中进行前列腺癌诊断或分阶段的方法。特别地，本公开文本提供在测试受试者中进行前列腺癌诊断或分阶段的方法，其通过测定循环肿瘤细胞(CTC)是否表达一种或多种前列腺特异性标志物来进行。
在本文中提供的方法中，对CTC分析一种或多种前列腺特异性标志物的表达。在CTC上检测前列腺特异性标志物为前列腺癌诊断和分阶段提供进一步信息。
在某些实施方案中，本公开文本提供在测试受试者中进行前列腺癌诊断或分阶段的方法，其包括：a)使上皮起源的癌细胞与特异性结合前列腺特异性标志物的抗体接触，其中该癌细胞来自取自测试受试者的血液样品；并b)测定任何癌细胞是否表达前列腺特异性标志物，其中存在表达前列腺特异性标志物的癌细胞指示测试受试者中具有前列腺癌。
术语“上皮起源的癌细胞”指表达至少一种上皮标志物的癌细胞。如本文中使用的，术语“标志物”指在特定类型的细胞上优先表达且帮助区分那些细胞与其它类型的细胞的抗原分子。例如，上皮标志物可以是在上皮细胞上普遍表达但正常情况下在白细胞上找不到的抗原分子。上皮起源的癌细胞还可表达肿瘤标志物，例如在肿瘤细胞上优先找到但在正常细胞上不太频繁找到的抗原分子。在某些实施方案中，上皮起源的癌细胞包括CTC。
在某些实施方案中，上皮起源的癌细胞表达至少一种也在癌细胞中优先找到的上皮标志物。检测到此类上皮标志物指示上皮起源的癌细胞。在某些实施方案中，此类上皮标志物为上皮细胞粘附分子(EpCAM)。
上皮起源的癌细胞来自得自测试受试者的血液样品。血液样品可以是任何自人血液衍生的样品，例如血浆样品，血清样品，全血，或已经用某些药剂(诸如抗凝剂)处理过的血液。可以直接自测试受试者获得血液样品，或者可以从自测试受试者收集样品的机构获得血液样品。
在某些实施方案中，用捕捉组合物自血液样品鉴定癌细胞。在某些实施方案中，捕捉组合物包含特异性结合上皮起源的癌细胞的配体。在某些实施方案中，配体为特异性结合在癌细胞上优先表达的上皮抗原的抗体。在某些实施方案中，上皮抗原为EpCAM。
如本文中使用的，术语“鉴定”指实质性区分上皮起源的癌细胞与血液样品中的其余成分。例如，可以由捕捉组合物结合或捕捉上皮起源的癌细胞，而其余成分没有得到结合或捕捉。
可以将所鉴定的癌细胞与血液样品中的其余成分分开或不分开。在某些实施方案中，没有将所鉴定的癌细胞与样品中的其它成分分开，或者自样品中的其它成分富集所鉴定的癌细胞。例如，可以将血液样品(例如血清样品)加载至载玻片，可以用捕捉组合物鉴定血液样品(例如血清样品)，而且可以在没有任何分离或富集操作的情况下，使样品与其它试剂进一步接触。
在某些实施方案中，在自血液样品分离的细胞级分中富集所鉴定的癌细胞。如本文中使用的，术语“富集”指细胞级分中所鉴定的癌细胞的密度比血液样品中的要高。可使用任何合适技术来分离细胞级分。本领域常用的技术包括但不限于重力分离，磁力分离或亲和力分离，例如在癌细胞与容许分离癌细胞的捕捉组合物形成复合物之后。对于重力分离，可以将捕捉组合物与能旋转下来以容许富集所鉴定的癌细胞的颗粒或珠偶联。对于磁力分离，可以将捕捉组合物与能在合适的磁场中分离的磁性颗粒偶联。对于亲和力分离，可以在装置(诸如载玻片)上固定化捕捉组合物，并容许捕捉所鉴定的细胞。
在某些实施方案中，在磁场下分离细胞级分。在某些实施方案中，捕捉组合物中的配体是与磁性颗粒偶联的。
可以使用本领域已知的方法(参见例如美国专利No.5,597,531，No.5,698,271，和No.6,365,362)，还有Liberti et al,In Fine Particles Science andTechnology,777-90,E.Pelizzetti(ed.)(1996)中记载的规程来制备适合于本文中公开的方法的磁性颗粒。简言之，磁性颗粒包含用聚合物或蛋白质(例如牛血清清蛋白和酪蛋白)包被的磁核(例如铁氧化物)。可以控制磁性颗粒的磁质和尺寸使得磁性颗粒是响应磁的但对细胞分析技术(诸如免疫荧光检测)是基本上不可见的。磁性颗粒的合适尺寸可以是小于200nm，优选具有合适的尺寸分布范围，例如在90-150nm内。颗粒的磁质可以介于70-90％之间。
在某些实施方案中，磁性颗粒是胶状的。此类胶状磁性颗粒在溶液中在延长的时段里是基本上稳定的，而且在重力下或在不应用磁场的情况下不趋于聚集。在某些实施方案中，磁性颗粒为胶状纳米颗粒。
可以使用本领域已知的任何合适方法将捕捉组合物中的配体与磁性颗粒偶联。例如，可以使用异双功能接头(诸如琥珀酰亚氨基丙基-二硫代吡啶(SPDP)和磺基琥珀酰亚氨基-4-[马来酰亚氨基甲基]环己烷-1-羧酸酯(SMCC))将捕捉组合物与磁性颗粒直接偶联。又例如，可以将包含生物素化抗体的捕捉组合物与缀合有链霉亲合素的磁性颗粒偶联。也可以用能引起偶联的其它偶联对(例如亲合素-生物素，蛋白A-抗体Fc，受体-配体，和凝集素-碳水化合物)引入捕捉组合物和磁性颗粒。
在某些实施方案中，捕捉组合物包含与磁性胶状纳米颗粒偶联的EpCAM抗体。在某些实施方案中，可使用系统(Veridex，NewJersey)来分离富集了所鉴定的细胞的细胞级分。
使上皮起源的癌细胞与特异性结合前列腺特异性标志物的抗体接触。如本文中使用的，术语“前列腺特异性”指示标志物优先见于前列腺组织，而且实质性区分前列腺组织或细胞与其它组织或细胞。在某些实施方案中，前列腺特异性标志物为前列腺细胞的表面或膜标志物。在某些实施方案中，前列腺特异性标志物选自下组：六次跨膜前列腺上皮抗原(STEAP-1)(参见例如Hubert et al.,(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96,14523-14528)，前列腺特异性膜抗原(PSM)(参见例如Israeli,R.S.et al.,(1993)Cancer Res.53,227-230)，前列腺癌肿瘤抗原(PCTA-1)(参见例如Su,Z.Z.et al.,(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93,7252-7257)，和前列腺干细胞抗原(PSCA)(参见例如Reiter,R.E.et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci USA95,1735-1740)。一种例示性人STEAP-1具有2007年10月26日提交的US2009/0280056A1中披露的氨基酸序列SEQ ID NO:1，通过提述明确将其完整公开内容收入本文。
在某些实施方案中，特异性结合前列腺特异性标志物的抗体包含抗STEAP-1抗体。在某些实施方案中，抗STEAP-1抗体以≤1000nM的KD结合STEAP-1。抗STEAP-1抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，而且可以是任何合适物种的，诸如例如绵羊抗体，家兔抗体，或鼠抗体。
在某些实施方案中，抗STEAP-1抗体为鼠单克隆抗体。在某些实施方案中，抗STEAP-1抗体为15A5，15A5是由具有微生物保藏号PTA-12259的杂交瘤细胞生成的。在某些实施方案中，抗STEAP-1抗体为结合与抗体15A5结合的表位基本上相同的表位的抗体。
在某些实施方案中，抗STEAP-1抗体是与第一可检测标记物缀合的。可使用任何合适的可检测标记物。在某些实施方案中，可检测标记物为荧光标记物，诸如例如荧光团AF-488，花青染料的衍生物，荧光素，罗丹明，德克萨斯红，氨基甲基香豆素(AMCA)，藻红蛋白，异硫氰酸荧光素(FITC)，等等。缀合抗体与可检测标记物的方法是本领域公知的，参见例如Hermanson,G.T.,Bioconjugate techniques,Academic Press,2008。
在某些实施方案中，抗STEAP-1抗体不是缀合的。可以用与可检测标记物(例如第一可检测标记物)缀合的二抗来检测未缀合的抗STEAP-1抗体。此类二抗可以是在与抗STEAP-1抗体不同的物种中生成的，而且识别抗STEAP-1抗体恒定区的任何抗体，正如本领域通常采用的。
在某些实施方案中，用一种或多种容许检测上皮起源的癌细胞的试剂鉴定癌细胞。
在某些实施方案中，试剂包含特异性结合上皮标志物的配体。在某些实施方案中，上皮标志物不是EpCAM。在某些实施方案中，上皮标志物为细胞角蛋白。细胞角蛋白是一组通常在上皮细胞中表达的蛋白质，而且形成上皮组织的细胞骨架中的含角蛋白丝体。
在某些实施方案中，特异性结合上皮标志物的配体为抗细胞角蛋白抗体，任选与第二可检测标记物缀合。可使用任何合适的可检测标记物，例如荧光标记物，诸如藻红蛋白。
在某些实施方案中，试剂进一步包含区分细胞与非细胞成分的细胞特异性染料。例如，可使用对细胞核染色的染料。在某些实施方案中，染料为4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)。
在某些实施方案中，试剂进一步包含特异性结合白细胞标志物的配体。可以选择白细胞标志物为在白细胞上普遍表达但在非白细胞上通常不表达，例如，CD45可以是合适的白细胞标志物。在某些实施方案中，特异性结合白细胞标志物的配体是与第三可检测标记物缀合的。例如，配体可以是与别藻蓝蛋白缀合的抗CD45抗体。抗CD45抗体对所鉴定的细胞的染色可帮助自上皮起源的CTC排除白细胞。
在一项测试中使用超过一种可检测标记物(包括染料)的情况中，优选选择可检测标记物使得能独立检测每种标记物，对样品中存在的任何其它可检测信号没有实质性干扰。例如，可检测标记物(包括染料)可以是在检测条件下显示不同颜色的不同荧光分子。
可通过任何合适方法来进行检测，例如基于免疫荧光显微术，流式细胞术，纤维光学扫描细胞术，或激光扫描细胞术的那些。
在某些实施方案中，在用细胞特异性染料和差异标记的，针对上皮标志物，前列腺特异性标志物和白细胞标志物的抗体或配体染色之后在荧光显微术下显现癌细胞。将细胞特异性染料，上皮标志物和前列腺特异性标志物呈阳性但白细胞标志物呈阴性的细胞归类为表达前列腺特异性标志物的，上皮起源的癌细胞。也可以使用流式细胞术来分析此类细胞，参见例如Cruz,I.,etal.,Am J Clin Pathol,Vol.123:66-74(2005)。
或者，也可以将癌细胞沉积在玻璃载玻片的表面上，并扫描细胞特异性染料，上皮标志物和前列腺特异性标志物呈阳性但白细胞标志物呈阴性的细胞(参见例如Marrinucci,D.et al.,Human Pathology,Vol.38,No.3,514-519(2007))。类似地，也可以使用激光扫描技术分析沉积在玻璃载玻片上的所鉴定的细胞(参见例如Pachmann,K.et al.,Breast Cancer Research,Vol.7,No.6,R975-R979(2005))。
在某些实施方案中，该方法进一步包括测定表达前列腺特异性标志物的癌细胞的量，其中此类量指示测试受试者中的前列腺癌的阶段。已经做出假设要关联肿瘤的尺寸和/或攻击性与外周血中肿瘤细胞的数目。例如，有报告说具有1mm直径肿瘤的患者可能具有每100ml血液约6个肿瘤细胞的外周血中肿瘤细胞频率(参见例如美国专利No.6,365,362)。假设肿瘤尺寸的增大可能与此频率成比例，那么可以建立标准来指示测试受试者中的癌症的阶段。在某些实施方案中，可使用来自诊断有早期阶段或转移性前列腺癌的患者的临床血液样品来测定那些患者的外周血中癌细胞的统计水平，由此为将来的检测和分析提供标准。
在某些实施方案中，该方法进一步包括测定癌细胞上的前列腺特异性标志物的表达水平。一些前列腺特异性标志物为其表达水平因癌症的肿瘤生长，转移和/或晚期阶段而上调的抗原。此类前列腺特异性标志物可包括但不限于STEAP-1，PSMA，PCTA-1，和PSCA。可通过任何合适方法来测定癌细胞上的前列腺特异性标志物的表达水平，例如通过测定与前列腺特异性标志物对应的荧光信号的强度。
在某些实施方案中，该方法进一步包括基于癌细胞的前列腺特异性标志物的表达水平对癌细胞分等级，并测定每个等级中的癌细胞的百分比。在某些实施方案中，分别对表达高水平，中等水平和低水平的前列腺特异性标志物的癌细胞分等级。可以例如使用已建立的具有已知标志物表达水平的细胞系来测定“高水平”，“中等水平”，和“低水平”的标准。例如，已知LB50细胞系表达高水平的STEAP-1，已知LnCAPner细胞系表达中等水平的STEAP-1，且已知PC3细胞系表达低水平的STEAP-1。因此，检测为具有与LB50细胞系相当或比LB50细胞系要高的STEAP-1表达水平的癌细胞可以分等级为“高水平”。类似地，“中等水平”可指派给其STEAP-1表达水平与LnCAPner细胞系相当或比LnCAPner细胞系要高但比LB50细胞系要低的癌细胞。那些具有与PC3细胞系相当或比PC3细胞系要低的STEAP-1表达水平的可以分等级为“低水平”。
可进一步测定每个等级中的癌细胞的数目。在某些实施方案中，可计算每个等级中的癌细胞的百分比。更高百分比的高水平等级中的癌细胞可指示更加晚期阶段的前列腺癌。类似地，处于早期阶段的前列腺癌可显示更低百分比的较高水平等级中的癌细胞和/或更高百分比的较低水平等级中的癌细胞。
在某些实施方案中，该方法进一步包括通过将该等级中的癌细胞的百分比乘以基于前列腺特异性标志物的表达水平指派给该等级的独特等级数，并将所有等级得分加和以获得H得分为每个等级计算等级得分，其中H得分指示测试受试者中的前列腺癌的阶段。例如，等级数3可指派给较高水平等级，2指派给中等水平等级，而1指派给较低水平等级，这限定了H得分的范围在0至300以内。更高的H得分指示更多的细胞处于较高水平等级，即更加晚期阶段的前列腺癌，而更低的H得分指示更多的细胞处于较低水平等级，即相对较早阶段的前列腺癌。
在一些实施方案中，该方法进一步包括测定标志物的存在情况和/或标志物的存在频率。在一些实施方案中，通过免疫组织化学(“IHC”)，Western印迹分析，免疫沉淀，分子结合测定法，ELISA，ELIFA，荧光激活细胞分选(“FACS”)，MassARRAY，蛋白质组学，基于血液的定量测定法(如例如血清ELISA)，生化酶活性测定法，原位杂交，Northern分析，聚合酶链式反应(“PCR”)包括定量实时PCR(“qRT-PCR”)和其它扩增型检测方法，诸如例如分支DNA，SISBA，TMA等等)，RNA-Seq，FISH，微阵列分析，基因表达概况分析，和/或基因表达连续分析(“SAGE”)，以及极其多种可通过蛋白质，基因，和/或组织阵列分析实施的测定法任一来测定标志物的存在情况。在一些实施方案中，通过荧光原位杂交(FISH)来测定标志物的存在情况。在一些实施方案中，标志物为PTEN。在一些实施方案中，CTC是三倍体。在一些实施方案中，CTC是具有PTEN损失的三倍体。在一些实施方案中，CTC通过CEP10FISH测定为三倍体。在一些实施方案中，CTC通过PTEN FISH测定为包含PTEN损失。
另一方面，本公开文本还提供在测试受试者中预测前列腺癌疗法的功效的方法，其包括：a)使上皮起源的癌细胞与特异性结合前列腺特异性标志物的抗体接触，其中该癌细胞来自取自测试受试者的血液样品；并b)测定任何癌细胞是否表达前列腺特异性标志物，其中存在表达前列腺特异性标志物的癌细胞指示测试受试者中前列腺癌疗法的功效。
某些前列腺特异性标志物还可以是前列腺癌治疗的治疗性靶物。因此，CTC上此类标志物的表达水平及此类水平的变化可预示靶向此类标志物的疗法的功效。
在某些实施方案中，该方法进一步包括测定表达前列腺特异性标志物的癌细胞的量，和/或测定癌细胞上前列腺特异性标志物的表达水平。例如，可以关联来自早期临床试验中基线治疗前样品的癌细胞上前列腺特异性标志物(例如STEAP-1)的表达水平与临床终点(诸如无进展存活，PSA变化，患者报告的骨痛，总体存活，或其它)以确定某个阈值以上的前列腺特异性标志物表达是否指示前列腺癌疗法(例如基于STEAP-1抗体-药物缀合物(ADC)的疗法)的临床活性。还可以关联癌细胞中前列腺特异性标志物(例如STEAP-1)表达水平的动态变化(即治疗后样品中的下调)与临床结局度量以确定此类变化是否指示治疗活性。可使用此类方法作为检验该测定法作为可用于为前列腺癌疗法(例如基于STEAP-1ADC的疗法)选择患者的候选预测性生物标志物中的第一步，接着是确认性III研究中的前瞻性验证。
另一方面，本公开文本还提供在测试受试者中监测对前列腺癌疗法的响应的方法，其包括：a)使第一组上皮起源的癌细胞与特异性结合前列腺特异性标志物的抗体接触，其中第一组癌细胞来自取自测试受试者的第一血液样品；b)测定第一组中表达前列腺特异性标志物的癌细胞的量和/或癌细胞中前列腺特异性标志物的表达水平；c)使第二组上皮起源的癌细胞与特异性结合前列腺特异性标志物的抗体接触，其中第二组癌细胞来自在前列腺癌疗法的测试时段之后取自测试受试者的第二血液样品；d)测定第二组中表达前列腺特异性标志物的癌细胞的量和/或癌细胞中前列腺特异性标志物的表达水平；并e)将b)中测定得到的表达前列腺特异性标志物的癌细胞的量和/或前列腺特异性标志物表达水平与步骤d)中的比较，其中表达前列腺特异性标志物的癌细胞的量变化和/或癌细胞中前列腺特异性标志物表达水平升高指示测试受试者中对前列腺癌疗法的响应。在某些实施方案中，前列腺特异性标志物为STEAP-1。
III.抗体
另一方面，本公开文本提供结合与抗体15A5结合的表位基本上相同的表位的抗体，其中抗体15A5是由具有微生物保藏号PTA-12259的杂交瘤细胞生成的。
在某些实施方案中，本文中提供的抗体与15A5抗体竞争对STEAP-1的结合。可使用竞争测定法来鉴定与抗STEAP-1抗体15A5竞争对STEAP-1的结合的抗体。
在一种例示性竞争测定法中，在包含结合STEAP-1的第一经标记抗体(例如15A5)和第二未标记抗体(要测试它与第一抗体竞争对STEAP-1的结合的能力)的溶液中温育固定化的STEAP-1。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，在包含第一经标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中温育固定化的STEAP-1。在允许第一抗体结合STEAP-1的条件下温育后，去除过量的未结合抗体，并测量与固定化STEAP-1缔合的标记物的量。如果测试样品中与固定化STEAP-1缔合的标记物的量相对于对照样品实质性减少，那么这指示第二抗体与第一抗体竞争对STEAP-1的结合。参见Harlow andLane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
在某些实施方案中，本文中提供的抗体具有≤1000nM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的对STEAP-1的解离常数(Kd)。
在一个实施方案中，通过如下述测定法所述用Fab型式的感兴趣抗体及其抗原实施的放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量Kd。通过在存在未标记抗原的滴定系列的情况中用最小浓度的(125I)标记抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(参见例如Chen et al.,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为了建立测定法的条件，将多孔板(Thermo Scientific)用50mM碳酸钠(pH9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)包被过夜，随后用PBS中的2％(w/v)牛血清清蛋白于室温(大约23℃)封闭2-5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与连续稀释的感兴趣Fab混合(例如与Presta etal.,Cancer Res.57:4593-4599(1997)中抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致)。然后将感兴趣的Fab温育过夜；然而，温育可持续更长时段(例如约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板，于室温温育(例如1小时)。然后去除溶液，并用PBS中的0.1％聚山梨酯20洗板8次。板干燥后，添加150μl/孔闪烁液(MICROSCINT-20TM；Packard)，并在TOPCOUNTTM伽马计数器(Packard)上对板计数10分钟。选择每种Fab给出小于或等于最大结合之20％的浓度用于竞争性结合测定法。
依照另一个实施方案，使用表面等离振子共振测定法使用或(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)于25℃用固定化抗原CM5芯片以～10个响应单位(RU)测量Kd。简言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIAcore,Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠pH4.8稀释至5μg/ml(～0.2μM)，之后以5μl/min的流速注射以实现大约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注射抗原之后，注射1M乙醇胺以封闭未反应基团。对于动力学测量，于25℃以大约25μl/min的流速注射在含0.05％聚山梨酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(Evaluation Software version3.2)通过同时拟合结合和解离传感图来计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。以比率koff/kon计算平衡解离常数(Kd)。参见例如Chen et al.,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过上述表面等离振子共振测定法，结合速率超过106M-1s-1，那么可使用荧光淬灭技术来测定结合速率，即根据分光计，诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在浓度渐增的抗原存在下，测量PBS，pH7.2中20nM抗抗原抗体(Fab形式)于25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。
也可在Octet Red仪器(ForteBio，Menlo Park，CA，USA)上实施动力学结合测量。例如，在Octet缓冲液(0.2％十二烷基麦芽糖苷或DDM，--PBS)中实施所有清洗，稀释和测量，以1000rpm摇动板。将链霉亲合素生物传感器在Octet缓冲液中平衡10分钟，然后加载生物素化STEAP-1(来自1％DDM中的病毒裂解物，在Octet缓冲液中1:8稀释)5分钟，并清洗10分钟。对于结合阶段，将配体包被的链霉亲合素尖头在抗STEAP-1抗体片段中浸泡10分钟(8次连续2倍稀释，始于500或50nM)。可在仅装有Octet缓冲液的孔中对抗体-STEAP-1复合物的解离测量600秒。用Octet评估软件v6.3使用1:1结合模型及全局拟合来测定KD，Ka和Kd。
在某些实施方案中，本文中提供的抗体包括但不限于鼠抗体，绵羊抗体和家兔抗体。在某些实施方案中，抗体为鼠单克隆抗体。
在某些实施方案中，本文中提供的抗体包含抗体15A5的至少一个CDR区。可使用本领域已知的方法来测定抗体的CDR区。例示性CDR(CDR-L1，CDR-L2，CDR-L3，CDR-H1，CDR-H2，和CDR-H3)存在于氨基酸残基24-34(L1)，50-56(L2)，89-97(L3)，31-35B(H1)，50-65(H2)，和95-102(H3)(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。重链可变区中的CDR1除外，CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，它们是接触抗原的残基。SDR包含在CDR中称作短缩-CDR或a-CDR的区域内。例示性a-CDR(a-CDR-L1，a-CDR-L2，a-CDR-L3，a-CDR-H1，a-CDR-H2，和a-CDR-H3)存在于氨基酸残基31-34(L1)，50-55(L2)，89-96(L3)，31-35B(H1)，50-58(H2)，和95-102(H3)(参见Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))。除非另有说明，CDR残基和可变域中的其它残基(例如FR残基)在本文中是依照Kabat et al.，supra编号的。
在某些实施方案中，本文中提供的抗体包含抗体15A5的至少一个重链可变区，或抗体15A5的至少一个轻链可变区。
术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中涉及抗体结合抗原的结构域。天然抗体的重链和轻链可变域(分别为VH和VL)一般具有相似的结构，每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)(参见例如Kindtet al.Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,page91(2007))。单个VH或VL域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可分别使用来自结合抗原的抗体的VH或VL域筛选互补VL或VH域的文库来分离结合特定抗原的抗体。参见例如Portolano et al.,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson et al.,Nature352:624-628(1991)。
本公开文本还涵盖本文中提供的抗体的抗体片段。在某些实施方案中，本文中提供的抗体为抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2，Fv，和scFv片段，及下文描述的其它片段。关于某些抗体片段的综述参见Hudson et al.Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述参见例如Pluckthün,in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,(Springer-Verlag,New York),pp.269-315(1994)；还可参见WO93/16185；美国专利No.5,571,894和No.5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论参见美国专利No.5,869,046。
双抗体指具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。参见例如EP404,097；WO1993/01161；Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)；Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)。
单域抗体指包含抗体的整个或部分重链可变域或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体为人单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利No.6,248,516B1)。
可以通过各种技术生成抗体片段，包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)生成，如本文中描述的。
在某些实施方案中，本文中提供的抗体为抗体15A5或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是与可检测标记物进一步缀合的。合适的标记物包括但不限于直接检测的标记物或模块(诸如荧光，发色，电子致密，化学发光，和放射性标记物)，以及(例如经由酶促反应或分子相互作用)间接检测的模块(诸如酶或配体)。例示性的标记物包括但不限于放射性同位素32P，14C，125I，3H，和131I，荧光团诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰，伞形酮，萤光素酶例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利No.4,737,456)，萤光素，2,3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖类氧化酶例如葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶(其与采用过氧化氢氧化染料前体的酶诸如HRP偶联)，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶，生物素/亲合素，自旋标记物，噬菌体标记物，稳定的自由基，等等。
IV.核酸和宿主细胞
可以使用重组方法和组合物生成抗体，例如如美国专利No.4,816,567中记载的。在一个实施方案中，提供分离的编码本文中描述的抗STEAP-1抗体的核酸。此类核酸可编码包含/构成抗体VL的氨基酸序列和/或包含/构成VH的氨基酸序列(例如抗体的轻和/或重链)。在又一个实施方案中，提供一种或多种包含此类核酸的载体(例如表达载体)。在又一个实施方案中，提供包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如转化有)：(1)包含编码包含/构成抗体VL的氨基酸序列和包含/构成抗体VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码包含/构成抗体VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码包含/构成抗体VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0，NS0，Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供生成抗STEAP-1抗体的方法，其中该方法包括在适合于表达抗体的条件下培养上文提供的包含编码抗体的核酸的宿主细胞，并任选自宿主细胞(或宿主细胞培养液)回收抗体。
为了重组生成抗STEAP-1抗体，分离编码抗体的核酸(例如上文描述的)，并插入一种或多种载体，供宿主细胞中的进一步克隆和/或表达使用。可使用常规规程(例如通过使用能够特异性结合编码抗体重和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易对此类核酸进行分离和测序。
对于克隆或表达抗体编码载体合适的宿主细胞包括本文中描述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中生成抗体，特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时。关于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如美国专利No.5,648,237，No.5,789,199，和No.5,840,523(还可参见Charlton,Methods inMolecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ,2003),pp.245-254，其记载在大肠杆菌中表达抗体片段)。在表达之后，可以在可溶性级分中自细菌细胞糊分离抗体，并且可以进一步纯化。
在原核生物以外，真核微生物(诸如丝状真菌或酵母)对于抗体编码载体也是合适的克隆或表达宿主，包括糖基化途径已经“人源化”，导致抗体生成具有部分或完全人糖基化样式的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)；Li et al.,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
对于表达糖基化抗体合适的宿主细胞还衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了众多可以与昆虫细胞联合使用的杆状病毒株，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
还可利用植物细胞培养物作为宿主。参见例如美国专利No.5,959,177，No.6,040,498，No.6,420,548，No.7,125,978，和No.6,417,429(记载用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
也可使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适应悬浮生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子有经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，如记载于例如Graham et al.,J.Gen Virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利(Sertoli)细胞(TM4细胞，如记载于例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL3A))；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562)；TRI细胞，如记载于例如Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)；MRC5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系，诸如Y0，NS0和Sp2/0。关于适合于抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如Yazaki and Wu,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。
本文中还提供杂交瘤细胞系，其具有微生物保藏号PTA-12259。该杂交瘤细胞系生成抗体15A5。
V.抗体的用途
本文中提供的抗体可用于制造前列腺癌的诊断试剂。抗体可以与适合于诊断目的的可检测标记物进一步缀合，而且可以以合适形式呈现，诸如冻干粉或合适溶液形式。
VI.测试试剂盒
本公开文本的另一方面，提供测试试剂盒，其包含可用于前列腺癌诊断或预后的组合物。
本公开文本进一步提供用于在血液样品中检测表达STEAP-1的前列腺癌细胞的存在情况的测试试剂盒，其包含特异性结合STEAP-1的抗体。
在某些实施方案中，抗体是与第一可检测标记物缀合的。可使用任何合适的可检测标记物，诸如荧光标记物。
在某些实施方案中，抗体为本文中提供的抗STEAP-1抗体。在某些实施方案中，抗体为抗体15A5。
在某些实施方案中，测试试剂盒进一步包含一种或多种选自下组的组合物：与特异性结合上皮起源的癌细胞的第一配体偶联的磁性颗粒，特异性结合上皮标志物的第二配体，特异性结合白细胞标志物的第三配体，和区分细胞与非细胞成分的染料。
在某些实施方案中，第二配体是与第二可检测标记物缀合的，和/或第三配体是与第三可检测标记物缀合的。在某些实施方案中，当测试试剂盒包含超过一种可检测标记物(包括染料)时，优选选择可检测标记物(包括染料)使得能独立检测每种标记物，对样品中存在的任何其它可检测信号没有实质性干扰。
在某些实施方案中，第一配体，第二配体和/或第三配体包括抗体。在某些实施方案中，第一配体包括抗EpCAM抗体。在某些实施方案中，第二配体包括抗角蛋白抗体。在某些实施方案中，第三配体包括抗CD45抗体。
测试试剂盒可进一步包含容器和容器上或与容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶，管形瓶，注射器，IV溶液袋，等。容器可以是自各种材料制成的，诸如玻璃或塑料。容器装有自身或与另一种组合物组合时有效诊断状况的组合物。组合物中的至少一种试剂是本发明的抗体。标签或包装插页指示组合物可用于选定状况的体外诊断。
实施例
下面是本发明的方法和组合物的实施例。要理解，鉴于上文提供的一般描述，可实施各种其它实施方案。
实施例1：检测不同细胞系上的STEAP-1
使用免疫组织化学(IHC)测定法使用3种抗STEAP-1抗体检测3种前列腺癌细胞系上的STEAP-1表达。使用293LB50作为高STEAP-1表达细胞系；使用LnCAPner作为中等STEAP-1表达细胞系；且使用PC3作为低至阴性STEAP-1表达细胞系。测试的抗STEAP-1抗体为：抗体-37，它是一种小鼠单克隆抗STEAP-1抗体；一种绵羊多克隆抗STEAP-1抗体；和sc-25514，它是一种家兔多克隆抗STEAP-1抗体。将3种抗体与荧光团AF-488缀合。
分别将抗体与3种细胞系一起温育。在针对AF-488信号的荧光显微术下显现抗体-抗原结合。结果显示所有3种抗体给出预期的相对于3种细胞系的表达水平的信号强度，即抗体显示293LB50细胞上的最强染色，LnCAPner细胞上的中等染色，和PC3细胞上的低至阴性染色。
实施例2：在系统上使用抗STEAP-1抗体检测前列腺癌细胞中的STEAP-1表达
在系统上对3种抗体(小鼠抗体-37，绵羊多克隆抗体，和家兔sc-25514)分别测试它们检测LB50细胞和PC3细胞上的STEAP-1表达的能力。
如下实施掺混(spike-in)测定法。在T75烧瓶中培养LB50细胞和PC3细胞。当细胞达到80％汇合时，用10ml PBS清洗细胞，然后用3ml胰蛋白酶处理。将7ml培养基添加至脱离的细胞，并将全部悬浮液转移入Falcon管，接着以13000rpm离心5分钟。取出上清液，并在10ml PBS中重悬浮团粒。将0.5ml每份细胞悬浮液转移入Vicell管，并使用使用Beckman Coulter计数器计数。在10ml培养基中将细胞悬浮液稀释至5000个细胞/ml溶液。将合适量的细胞掺混入10ml血液，其中7.5ml血液将用于CellSearch方法。为了掺混入100个细胞，将26.6ul细胞悬浮液添加至10ml血液。将掺混有细胞的血液旋转20分钟。
为了确保有大约100个细胞掺混入血液，重复将5ul每份细胞悬浮液添加到聚L-赖氨酸格栅的载玻片(电子显微术科学)上达5次。5ul细胞悬浮液大约等于25个细胞。对每张载玻片上的细胞计数，并使用细胞数通过计数CellSearch上捕捉的“CTC”(即掺混细胞)的数目/载玻片上计数的实际细胞数来计算细胞回收率。
在彻底混合掺混有细胞的血液之后，在CellSearch上分别用3种抗STEAP-1抗体遵循CellSearch CTC方案运行血液样品。简言之，将每份测试样品与缀合有磁性胶状纳米颗粒的抗EpCAM抗体混合，然后置于磁场以容许分离富集样品中EpCAM阳性上皮细胞的细胞级分。然后将细胞级分与缀合有藻红蛋白的抗细胞角蛋白抗体，缀合有别藻蓝蛋白的抗CD45抗体，DAPI，和3种缀合有AF-488的抗STEAP-1抗体之一混合，用于第4滤器。将缀合的抗STEAP-1抗体在PBS中稀释至1:50。在CellSearch上运行样品，并在CellTracks分析仪上对CTC打分。细胞角蛋白和DAPI染色呈阳性但CD45呈阴性的细胞确定为CTC。选择在CellSearch自动制备系统上显示STEAP-1染色的CTC，并对指示STEAP-1表达水平的抗STEAP-1抗体荧光强度进一步定量。
基于染色强度(即STEAP-1的表达水平)对具有STEAP-1表达的CTC打分。对具有高STEAP-1表达(展现为强染色强度和最小限度至无背景)的CTC给予得分3，对具有一些背景的中等染色强度给予得分2，而对具有相对较高背景的低染色强度给予得分1。图1显示了一个代表例。
如图2(a)中显示的，所有3种测试抗体均检测出掺混入血液的STEAP-1高表达者LB50细胞，尽管动态范围不同。如图2(b)中显示的，绵羊多克隆抗体和家兔sc-25514还检测出掺混入血液的STEAP-1低表达者PC3细胞。
自(1x弱阳性染色细胞的百分比)+(2x中等阳性染色细胞的百分比)+(3x强阳性染色细胞的百分比)的和，对具有STEAP-1表达的CTC计算H得分，最大得分为300(McCall et al.(2008)British Journal of Cancer98(6):1094-1101)。
如图2(c)-(d)中显示的，绵羊多克隆抗体展现最好的动态范围，因此选择绵羊多克隆抗体用于临床样品的进一步测试。
实施例3：在系统上使用绵羊多克隆抗体分析掺混样品中的STEAP-1表达细胞
使用抗STEAP-1绵羊多克隆抗体测定掺混入血液样品的细胞上的STEAP-1表达。以与实施例2中的描述相似的规程实施掺混测定法。分别将3种细胞系(293LB50，LnCAPner和PC3)掺混入血液样品，并彻底混合。将绵羊多克隆抗体在PBS中稀释至1:50，并添加至CellSearch上的第4滤器中的血液样品。在CellSearch上运行样品，并在CellTracks分析仪上对CTC打分。细胞角蛋白和DAPI染色呈阳性但CD45呈阴性的细胞确定为CTC。选择在CellSearch自动制备系统上显示STEAP-1染色的CTC，并对指示STEAP-1表达水平的抗STEAP-1抗体荧光强度进一步定量。还依照与实施例2中的描述相同的方法计算H得分。
如3(a)-(b)中显示的，绵羊多克隆抗体在测试的所有3种细胞系上检测出STEAP-1表达，而且具有较好的动态范围。如通过绵羊多克隆抗体检测的，掺混有293LB50细胞的样品中超过60％的CTC具有高强度水平，而且H得分测定为200以上；掺混有LnCAPner细胞的样品具有约100的H得分；而掺混有PC3细胞的样品具有100以下的H得分。
实施例4：在系统上使用抗STEAP-1抗体检测前列腺癌患者的CTC中的STEAP-1表达
来自11名前列腺癌患者的血液样品是自一家诊所获得的。在系统上使用抗STEAP-1绵羊多克隆抗体分析血液样品。将绵羊多克隆抗体在PBS中稀释至1:50，并添加至CellSearch上的第4滤器中的血液样品。在CellSearch上运行样品，并在CellTracks分析仪上对CTC打分。细胞角蛋白和DAPI染色呈阳性但CD45呈阴性的细胞确定为CTC。选择在CellSearch自动制备系统上显示STEAP-1染色的CTC，并对指示STEAP-1表达水平的抗STEAP-1抗体荧光强度进一步定量。对于每份样品对CTC数计数，并还如实施例2所述计算H得分。结果显示于图4。
实施例5：关联CTC测定法与免疫组织化学(IHC)测定法
在一项I期临床试验中自10名前列腺癌患者收集了血液样品和肿瘤组织样品。
在系统上使用抗STEAP-1绵羊多克隆抗体分析血液样品。对于每份样品对CTC数计数，并还如实施例2所述计算H得分。结果显示于图5(a)。
使用常规IHC方法测试肿瘤组织样品，并以总体得分(1+，2+和3+)显示组织中STEAP-1的表达水平。数字越大指示STEAP-1表达水平越高。
图5(b)-(c)中显示并比较结果和IHC结果。结果显示较好的与IHC结果的关联，指示使用绵羊多克隆抗体的方法有效检测血液样品中的STEAP-1表达CTC。
实施例6：比较绵羊多克隆抗体与小鼠单克隆抗体15A5
在系统上使用掺混测定法测试小鼠单克隆抗体15A5，并与绵羊多克隆抗体比较。如实施例2所述，分别将293LB50细胞(高表达者)，LnCAPner细胞(中等表达者)，和PC3细胞(低表达者)掺混入血液样品。在系统上分别使用绵羊多克隆抗体和小鼠单克隆抗体15A5分析血液样品。还计算H得分。规程和方法与实施例2中的描述相似。
如图6(a)-(d)中显示的，两种抗体对每份样品在强度水平方面和在H得分方面显示相当的结果。小鼠单克隆抗体15A5在该测定法中也显示较好的动态范围。
使用单克隆抗体15A5相对于多克隆抗体有优势。例如，与多克隆抗体相比，单克隆抗体会显示较小的批间变异，较小的背景，和更大的实验间再现性。
实施例7：在系统上使用小鼠单克隆抗体15A5分析患者样品中的STEAP-1表达细胞
自前列腺癌患者收集血液样品，并在系统上使用抗STEAP-1单克隆抗体15A5进行分析。将抗体15A5在PBS中稀释至例如1:50，并添加至血液样品。在CellSearch上运行样品，并在CellTracks分析仪上对CTC打分。细胞角蛋白和DAPI染色呈阳性但CD45呈阴性的细胞确定为CTC。选择在CellSearch自动制备系统上显示STEAP-1染色的CTC，并对代表STEAP-1表达水平的抗STEAP-1抗体荧光强度进一步定量。对于每份样品对CTC数计数，并还如实施例2所述计算H得分。
此外，关联在临床试验中自“基线”(即治疗前)患者收集的血液样品中的CTC上的STEAP-1表达水平与临床终点(诸如无进展存活，PSA变化，患者报告的骨痛，总体存活，或其它)以确定某个阈值以上的前列腺特异性标志物表达是否指示前列腺癌疗法(例如基于抗STEAP-1抗体-药物偶联物(ADC)的疗法)的临床活性。关联癌细胞中前列腺特异性标志物(例如STEAP-1)表达水平的动态变化(即治疗后样品中的下调)与临床结局度量以确定此类变化是否指示治疗活性。可使用此类方法作为检验该测定法作为可用于为前列腺癌疗法(例如基于抗STEAP-1ADC的疗法)选择患者的候选预测性生物标志物中的第一步，接着是确认性III期研究中的前瞻性验证。
实施例8：枚举患者样品中的CTC
在启动疗法之前自前列腺癌患者采集血液样品的两份重复样品(基线样品)。如上所述，在系统上分析样品，并在CellTracks分析仪上对CTC枚举打分。简言之，细胞角蛋白和DAPI染色呈阳性但CD45呈阴性的细胞打分为CTC。为每对重复样品计算均值CTC计数和标准偏差，并在柱状图中绘制误差(+-标准偏差)。如图7A中显示的，这些患者中的均值CTC枚举有较大的动态范围，样品的重复样品之间有紧密的计数(小误差棒)，证明使用这种系统时CTC枚举的高再现性。
在启动疗法之前自前列腺癌患者采集血液样品的两份重复样品(基线样品)。在系统上在A488通道中以20ug/ml使用抗STEAP-1单克隆抗体15A5分析样品。如实施例2所述在CellTracks分析仪上对CTC枚举和STEAP-1表达打分。简言之，选择在CellSearch自动制备系统上显示STEAP-1染色的CTC，并使用加权强度打分系统(H得分，见实施例2)对抗STEAP-1抗体荧光强度进一步定量。为每对重复样品计算均值H得分和标准偏差，并绘制误差(+-标准偏差)。如图7B中显示的，患者群体中的STEAP-1表达水平有较大的动态范围，而且进一步指示样品的重复样品之间紧密的H得分，证明使用CellSearch系统时靶物表达水平定量的高再现性。
在启动疗法之前相隔约2-4周在2个不同时间点自前列腺癌患者采集血液样品(基线1和基线2)。如上所述，在系统上分析血液样品，并在CellTracks分析仪上对CTC枚举打分。为了评估CTC枚举的生物学变异性，在每名患者的2份基线样品之间比较CTC计数。
在图8中，每个点代表1名患者，基线1时计数的CTC在X轴上，而基线2时计数的CTC在Y轴上。图包括来自14名患者的数据，而且显示不同时间点时采集的CTC枚举之间的强关联，提示启动治疗之前CTC枚举的低生物学变异性。使用这些数据计算CTC计数的正常变异性，作为治疗前CTC计数分布的95％置信区间来计算。
使用置信区间确定在治疗期间观察到的CTC变化的显著性。使用超出计算置信区间的CTC计数减少评估剂量效应和药物活性证据。在抗STEAP-1ADC疗法服药前和抗STEAP-1ADC疗法服药后的2个不同时间点自前列腺癌患者采集血液样品。如上所述，在系统上分析样品，并在CellTracks分析仪上对CTC枚举和STEAP-1表达打分。如图9-11中显示的，同样基于服药后和服药前CTC的倍数变化在最高剂量观察到显著的CTC计数减少，即有利的CTC预后转变。而且，在治疗后具有显著CTC减少的患者中观察到更高的STEAP-1靶物表达(数据未显示)。

Claims (46)

1.一种用于在测试受试者中诊断前列腺癌的方法，其包括：
a)使上皮起源的癌细胞与特异性结合前列腺特异性标志物的抗体接触，其中该癌细胞来自取自测试受试者的血液样品；并
b)测定任何癌细胞是否表达前列腺特异性标志物，
其中存在表达前列腺特异性标志物的癌细胞指示测试受试者中具有前列腺癌。
2.权利要求1的方法，其进一步包括测定表达前列腺特异性标志物的癌细胞的量，其中此类量指示测试受试者中的前列腺癌的阶段。
3.权利要求1-2任一项的方法，其进一步包括测定癌细胞上前列腺特异性标志物的表达水平。
4.权利要求1-3任一项的方法，其进一步包括基于癌细胞的前列腺特异性标志物表达水平对癌细胞分等级，并测定每个等级中的癌细胞的百分比。
5.权利要求1-4任一项的方法，其进一步包括通过将所述等级中的癌细胞的百分比乘以代表所述等级中前列腺特异性标志物表达水平的独特等级数为每个等级计算等级得分，并将所有等级得分加和以获得H得分，其中H得分指示测试受试者中的前列腺癌的阶段。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中该癌细胞是用包含配体的捕捉组合物自血液样品鉴定的，该配体特异性结合上皮起源的癌细胞。
7.权利要求6的方法，其中该配体为特异性结合优先在癌细胞上表达的上皮抗原的抗体。
8.权利要求7的方法，其中该上皮抗原为上皮细胞粘附分子(EpCAM)。
9.权利要求6-8任一项的方法，其中在自血液样品分离的细胞级分中富集鉴定的癌细胞。
10.权利要求9的方法，其中该细胞级分是在磁场下分离的。
11.权利要求10的方法，其中该捕捉组合物中的配体是与磁性颗粒(例如胶状磁性颗粒，例如胶状磁性纳米颗粒)偶联的。
12.权利要求11的方法，其中该配体包含EpCAM抗体。
13.权利要求1-12任一项的方法，其中该前列腺特异性标志物选自下组：六次跨膜前列腺上皮抗原(STEAP)，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，前列腺癌肿瘤抗原(PCTA-1)，和前列腺干细胞抗原(PSCA)。
14.权利要求1-13任一项的方法，其中该特异性结合前列腺特异性标志物的抗体包含抗STEAP-1抗体。
15.权利要求14的方法，其中该抗STEAP-1抗体以≤1000nM的KD结合STEAP-1。
16.权利要求14-15任一项的方法，其中该抗STEAP-1抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
17.权利要求16的方法，其中该抗STEAP-1抗体为鼠单克隆抗体。
18.权利要求17的方法，其中该抗STEAP-1抗体为15A5，15A5是由具有微生物保藏号PTA-12259的杂交瘤细胞生成的。
19.权利要求14-18任一项的方法，其中该抗STEAP-1抗体是与第一可检测标记物缀合的。
20.权利要求1-19任一项的方法，其中该癌细胞是用一种或多种容许检测上皮起源的癌细胞的试剂鉴定的。
21.权利要求20的方法，其中该试剂包含特异性结合细胞角蛋白的配体，且其中该配体任选是与第二可检测标记物缀合的。
22.权利要求20-21任一项的方法，其中该试剂进一步包含区分细胞与非细胞成分的染料。
23.权利要求22的方法，其中该染料为4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)。
24.权利要求20-23任一项的方法，其中该试剂进一步包含特异性结合白细胞标志物的配体，且其中该配体任选是与第三可检测标记物缀合的。
25.权利要求24的方法，其中该针对白细胞标志物的配体为CD45抗体。
26.权利要求1-25任一项的方法，其中该测定是通过基于免疫荧光显微术，流式细胞术，纤维光学扫描细胞术，或激光扫描细胞术的方法进行的。
27.一种在测试受试者中预测前列腺癌疗法的功效的方法，其包括：
a)使上皮起源的癌细胞与特异性结合前列腺特异性标志物的抗体接触，其中该癌细胞来自取自测试受试者的血液样品；并
b)测定任何癌细胞是否表达前列腺特异性标志物，
其中存在表达前列腺特异性标志物的癌细胞指示测试受试者中前列腺癌疗法的功效。
28.一种在测试受试者中监测对前列腺癌疗法的响应的方法，其包括：
a)使第一组上皮起源的癌细胞与特异性结合前列腺特异性标志物的抗体接触，其中该第一组癌细胞来自取自测试受试者的第一血液样品；
b)测定第一组中表达前列腺特异性标志物的癌细胞的量和/或癌细胞中前列腺特异性标志物的表达水平；
c)使第二组上皮起源的癌细胞与特异性结合前列腺特异性标志物的抗体接触，其中该第二组癌细胞来自在前列腺癌疗法的测试时段之后取自测试受试者的第二血液样品；
d)测定第二组中表达前列腺特异性标志物的癌细胞的量和/或癌细胞中前列腺特异性标志物的表达水平；并
e)将b)中测定得到的表达前列腺特异性标志物的癌细胞的量和/或前列腺特异性标志物的表达水平与d)中的比较，其中表达前列腺特异性标志物的癌细胞的量减少和/或癌细胞中前列腺特异性标志物的表达水平降低指示测试受试者中对前列腺癌疗法的响应。
29.权利要求27-28任一项的方法，其中该前列腺癌疗法包含结合前列腺特异性标志物的抗体或抗体-药物缀合物(ADC)。
30.权利要求29的方法，其中该前列腺特异性标志物为STEAP-1。
31.权利要求27-30任一项的方法，其中该ADC包含共价附着至细胞毒剂的抗STEAP-1抗体。
32.权利要求31的方法，其中该细胞毒剂选自：毒素，化疗剂，药物模块，单甲基auristatin E(MMAE)，抗生素，放射性同位素，和溶核酶。
33.一种抗体，其结合与抗体15A5结合的表位基本上相同的表位，其中抗体15A5是由具有微生物保藏号PTA-12259的杂交瘤细胞生成的。
34.权利要求33的抗体，其包含抗体15A5的至少一个CDR区。
35.权利要求34的抗体，其包含抗体15A5的六个CDR区。
36.权利要求33-35任一项的抗体，其包含抗体15A5的重链可变区。
37.权利要求33-36任一项的抗体，其包含抗体15A5的轻链可变区。
38.权利要求33-37任一项的抗体，其为抗体15A5或其抗原结合片段。
39.权利要求33-38任一项的抗体，其进一步与可检测标记物缀合。
40.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求33-39任一项的抗体。
41.一种宿主细胞，其包含权利要求40的多核苷酸。
42.一种杂交瘤细胞系，其具有微生物保藏号PTA-12259。
43.权利要求33-39任一项的抗体或其抗原结合片段在制备用于前列腺癌的诊断剂中的用途。
44.一种用于检测血液样品中表达STEAP-1的前列腺癌细胞的存在情况的测试试剂盒，其包含特异性结合STEAP-1的抗体。
45.权利要求44的测试试剂盒，其中该抗体是与可检测标记物缀合的。
46.权利要求44或45的测试试剂盒，其中该抗体为权利要求33-39任一项的抗体。
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