CN1895237B - 和厚朴酚脂质体冻干粉制剂及其在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及和厚朴酚脂质体冻干粉制剂及其在制备治疗恶性肿瘤的药物中的新应用，所述恶性肿瘤为肺癌，乳腺癌；本发明和厚朴酚脂质体冻干粉制剂还涉及与放疗和/或化疗药物在制备治疗恶性肿瘤的药物中的新应用，与化疗药物顺铂、紫杉醇和阿霉素联合使用能产生良好的增敏和增效作用；本发明的制剂包含：和厚朴酚20-50份、聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺5-15份、卵磷脂40-60份、胆固醇5-15份，各组分均为重量份。本发明和厚朴酚脂质体冻干粉制剂能充分溶于制备治疗恶性肿瘤的药物的溶剂中，从而改善和厚朴酚在体内的吸收和稳定性、延长在体内循环时间、提高和厚朴酚的药代动力。

Description

和厚朴酚脂质体冻干粉制剂及其在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用 

技术领域

本发明涉及和厚朴酚脂质体冻干粉制剂及其应用，特别涉及在制备治疗恶性肿瘤的药物中的新应用，还涉及与放疗和/或化疗药物在制备治疗恶性肿瘤的药物中的新应用。 

技术背景 

肿瘤是多机制的复杂疾病，威胁着人类的健康，尤其是恶性肿瘤更是威胁人类健康的大敌。目前治疗恶性肿瘤的措施仍采用早期诊断、放疗、化疗等综合手段治疗。但在放射治疗或化学治疗肿瘤过程中，在杀伤肿瘤细胞的同时，也会对骨髓、消化道、肝、肾等某些正常组织和细胞带来损害。如化疗过程可造成从口腔到肠整个消化道黏膜炎症、出血和感染，化疗病人有明显恶心和呕吐，尤其顺铂、氮芥、亚硝基脲类等药物可引起严重恶心呕吐。其次应用阿霉素、5-氟脲嘧啶药物的病人56％发生呕吐，用止吐药对这些病人亦无效。在放射治疗过程中，由于多数实体肿瘤均存在一定比例的乏氧细胞，对低线性能量转移辐射相当抗拒，这是导致放射治疗效果不好的原因之一。这也是制约肿瘤的放疗和化疗治疗的重要因素。近30多年来，在放疗或化疗中对其药物增敏的研究从未间断，从乏氧细胞增敏剂到生物还原药物，新药层出不穷，但至今仍未找到令人满意的增敏剂。 

随着天然药物的开发、研究水平不断提高，从天然来源物质中寻找对放疗、化疗治疗肿瘤具有增强敏感作用的活性化合物或药物组合物，并进一步通过改变剂型以期获得更具有临床价值的在制备预防或治疗恶性肿瘤药物中的新用途成为研究热点。这类药物主要作用于相关的恶性肿瘤细胞上，一方面提高对肿瘤细胞的杀伤力，另一方面减少对正常组织细胞带来的损害，可以帮助肿瘤患者顺利地完成放疗和/或化疗的治疗，从而进一步提高肿瘤患者的生存率。 

和厚朴酚的药理活性的研究已有诸多报道，和厚朴酚(honokiol)是中药厚朴(Magnoliaof ficinalis Rehd et Wils)中分离出来的一种具有生物活性的小分子物质，其结构式为：

诸多研究结果已表明，和厚朴酚具有诱导肿瘤细胞凋亡、抗肿瘤血管形成和抑制肿瘤细胞增殖、提高维甲酸与维生素D₃对细胞分化、阻止肿瘤细胞转移等作用；和厚朴酚还具有对多种肿瘤显示较强的抗肿瘤活性；此外，它还具有对肿瘤细胞的抑制表现出非常高的选择性，能选择性的杀死恶性肿瘤细胞，而对正常造血系统和免疫功能的损伤小，在有效剂量范围内毒副作用小等功能。国内已有和厚朴酚应用于治疗抑制血管生成，应用于在制备治疗抗肿瘤药物中的用途，如申请号200410025653.1，200410025780.1的中国发明专利申请已有公开。 

从植物中提取的和厚朴酚同许多脂溶性天然产物类似，难溶于水及许多药用溶剂，因此，阻碍了和厚朴酚在临床上的广泛应用。目前对和厚朴酚的研究主要采用将和厚朴酚与脂肪乳剂或聚乙二醇等增溶剂，如intralipid制备成乳液，对动物进行腹腔注射(Xianhe Bai，Francesca Cerimele，et al.Honokiol，a Small Molecular Weight Natural Product，Inhibits Angiogenesis in Vitro and Tumor Growth in Vivo.[J]The Juurnal ofbiological chemistry.2003，37(278)：35501-35507.Fei Chen，Tao Wang，Yi-Feng Wu，Ying Gu，Xiao-Li Xu，Shu Zheng，Xun HuHonokiol：A potent chemotherapy candidatefor human colorectal carcinoma.[J]World J Gastroenterol2004；10(23)：3459-3463)，该方法虽然解决了和厚朴酚的水溶性问题，并没有改善含有和厚朴酚的药物组合物的药代动力学，也不能延长和厚朴酚在体内的循环时间，以实现和厚朴酚的靶向治疗。这就迫切需要选择理想的药物载体，一方面改变和厚朴酚的制剂剂型，另一方面选择给药载体既能克服和厚朴酚水溶性和药代动力学差的缺陷，又不会带来过敏反应等副作用。 

采用脂质体作为抗肿瘤药物载体，对淋巴系统定向性和对癌细胞的亲和性，可改变药物在组织中的分布，使药物选择性地杀死癌细胞或抑制癌细胞的繁殖，从而提高疗效，减少剂量，降低毒性，减轻变态和免疫反应。BuckeWE等(Vieweg J.Efficient genetransfer with adeno-associated virus based plasmids complexed to cationicliposomes for gene therapy of human prostate cancer[J]CancerRes，1995，55：2366.)，通过在磷脂膜中掺人PEG、Tween80等物质，不仅有效的提高了载药脂质体 的稳定性，而且它在血液中驻留时间长，从而延长药物在体内的循环时间。提高药物的生物利用度。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种和厚朴酚脂质体冻干粉制剂，该制剂是采用脂质体药物载体包裹具有活性成分的和厚朴酚，不仅克服了现有同类药物组合物的缺陷，使和厚朴酚具有很好的稳定性和膜通透性，而且还能使具有活性成分的和厚朴酚易溶于药用的溶剂中，进行静脉滴注，以延长和厚朴酚在体内的循环时间，从而提高和厚朴酚的药代动力。 

本发明的另一目的还涉及和厚朴酚脂质体冻干粉制剂在制备治疗恶性肿瘤的药物中的新应用。 

本发明的又一目的还涉及和厚朴酚脂质体冻干粉制剂与放疗和/或化疗药物在制备治疗恶性肿瘤的药物中的新应用。 

本发明的目的由以下的技术方案来实现的。 

本发明和厚朴酚脂质体冻干粉制剂，该制剂包含：和厚朴酚20-50份、聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺5-15份、卵磷脂40-60份、胆固醇5-15份，其中，卵磷脂与胆固醇的配比为3-12∶1，聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子质量为2000-8000，以上各组分均以重量计。 

本发明的制剂中，所述的聚乙二醇的分子质量为2000时，加入聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的量为5-15份。 

本发明的制剂中，所述的聚乙二醇的分子质量为2000时，加入聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的量为10-15份。 

本发明的制剂中，所述的聚乙二醇的分子质量为4000时，加入聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的量为5-11份。 

本发明的制剂中，所述的聚乙二醇的分子质量为8000时，加入聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的量为8-10份。 

本发明的制剂中，所述的卵磷脂与胆固醇的配比为3∶1。 

本发明和厚朴酚脂质体冻干粉制剂在制备治疗恶性肿瘤的药物中的新应用。 

本发明所述的应用，其中，所述的恶性肿瘤选自肺癌，或乳腺癌。 

本发明和厚朴酚脂质体冻干粉制剂与放疗和/或化疗药物在制备治疗恶性肿瘤的药物中的新应用。 

本发明所述的应用，其中，所说的化疗药物选自顺铂，或紫杉醇，或阿霉素。

本发明和厚朴酚脂质体冻干粉制剂与放疗和/或化疗药物联合用药，能产生良好的增敏和增效作用，能提高放疗、化疗的抑制肿瘤的效率，提高和/或调节机体免疫及抗肿瘤机能，降低放疗和化疗的毒副反应，从而增强放疗和化疗的敏感性，提高治疗效果。 

本发明所述和厚朴酚脂质体冻干粉制剂的制备方法，用不同分子质量的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺掺入磷脂膜中，用脂质体载体包裹具有活性成分的和厚朴酚，溶解于有机溶剂三氯甲烷和甲醇中，用常规超声薄膜法制备，主要包括以下工艺步骤： 

(1)和厚朴酚20-50份，聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺5-15份，卵磷脂40-60份，胆固醇5-15份，冻干赋形剂1-10份，抗氧化剂0.1-1份，其中，卵磷脂与胆固醇的比例为3-12∶1，以上原料均为固态，以克或千克计量，有机溶剂三氯甲烷和甲醇为液态，其体积配比为1-4∶1，以毫升或升计量，加入三氯甲烷和甲醇使制备的药物溶液浓度为1mg/ml-3mg/ml，其中，聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子质量为2000-8000； 

将计量好的和厚朴酚、聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺、卵磷脂、胆固醇溶解于按上述比例配比好的三氯甲烷和甲醇有机溶剂中，置于密闭瓶内，在室温条件下搅拌至完全溶解； 

(2)将上述溶解的溶液转移至烧瓶内，烧瓶与旋转蒸发器连接，烧瓶侵入温度为30℃-50℃的恒温水浴中，然后抽真空旋转蒸发除去有机溶剂，至烧瓶壁上形成一层均匀的薄膜； 

(3)将形成有薄膜的烧瓶放入真空干燥箱中，在室温条件下干燥2小时，进一步除去残留的有机溶剂； 

(4)将灭菌水加入干燥后的烧瓶中，使瓶壁的薄膜完全浸没，用超声破碎仪超声分散，其超声功率为100w-1000w，超声时间为30分钟-3小时，即制得和厚朴酚脂质体溶液； 

(5)将上述和厚朴酚脂质体溶液冻干后即得和厚朴酚脂质体冻干粉制剂，存放于4℃-8℃的低温条件下，压盖密封保存备用。 

本发明制备和厚朴酚脂质体冻干粉制剂中，所述的冻干赋形剂为山梨醇，或海藻糖，或甘露醇，或蔗糖，或葡萄糖，或它们的混合物。 

本发明制备和厚朴酚脂质体冻干粉制剂中，所述的抗氧化剂为维生素C，或亚硫化钠。 

本发明制备的和厚朴酚脂质体冻干粉制剂，由于采用不同分子质量的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺掺入到由卵磷脂和胆固醇组成的脂质体表面，由脂质体包裹具有生物活性成分的和厚朴酚制得和厚朴酚脂质体冻干粉，该冻干粉能充分溶解于注射用水中，进行静脉滴注，从而改善和厚朴酚在体内的吸收和稳定性，延长在体内的循环时间，进而提高和厚朴酚的药代动力。

本发明所述的和厚朴酚脂质体冻干粉制剂，可制备成和厚朴酚脂体质粉针制剂，溶解于药用溶剂中，用于静脉注射，也可以制备成注射制剂直接注射。 

本发明和厚朴酚脂质体的包封率检测： 

采用葡聚糖凝胶柱色谱检测，选用安马西亚的葡聚糖凝胶柱SephadexG-75装柱，重蒸馏水洗脱，以294nm监测并收集洗脱峰，由检测出的结果得知本发明制备的和厚朴酚脂质体的包封率为95％。 

1、小鼠的急性毒性试验： 

①静脉给药：取BABL/c健康小鼠20只，6～8周，雌雄各半，分为2组，禁食12小时，正常饮水，采用尾静脉给药的方式，尾静脉给药的剂量为和厚朴酚脂质体中和厚朴酚的浓度为10mg/ml，每只剂量为0.2ml，用药后小鼠并未出现明显的中毒症状及死亡情况，连续观察一周，动物全部存活，活动自如，毛发光滑，饮食正常，一周后解剖动物，肉眼及显微镜观察内脏器官，未出现明显的病理学改变。 

2、药代动力学实验： 

①取BABL/c健康小鼠10只，6～8周，雌雄各半： 

和厚朴酚脂质体中和厚朴酚浓度为2.5mg/ml，每只剂量0.2ml，尾静脉给药一次。 

小鼠给药后3分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、120分钟、240分钟、480分钟取眼球血，采用肝素抗凝，离心取血浆，用HPLC检测小鼠血药不同时间的浓度分布，采用三室模型，测定结果见表1。 

表1小鼠体内和厚朴酚血药浓度的测定结果 

上述结果说明，和厚朴酚脂质体制剂，通过静脉注射研究和厚朴酚脂质体代谢动力学，延长了药物在小鼠体内的循环时间，并且小鼠各器官经检测发现注射和厚朴酚脂质体后，同一时间取血检测在脑、肺的血药浓度最高。 

治疗方法采用： 

用本发明的和厚朴酚脂质体冻干粉针剂中和厚朴酚的剂量为25mg/kg，溶解于药用溶剂，如生理盐水，或灭菌水，或5％葡萄糖溶液，配合放疗治疗小鼠肺癌，每只小鼠注射0.5ml，每天小鼠腹腔注射和厚朴酚脂质体30-40分钟后进行放射治疗，照射5GY，和 厚朴酚脂质体与放疗联合治疗进行5天，然后继续注射和厚朴酚脂质体5天。治疗一共持续10天，每天测肿瘤的大小和体重，统计数据，治疗组中和厚朴酚联合放疗组的治疗效果最明显。 

用本发明的和厚朴酚脂质体冻干粉针剂中和厚朴酚的剂量为25mg/kg，溶解于药用溶剂，如生理盐水，或灭菌水，或5％葡萄糖溶液，每只小鼠注射0.2ml，配合化疗药物4mg/kg的顺铂，治疗人肺癌A549，腹腔给药，每周2次，共4次。顺铂给药4小时后再注射和厚朴酚脂质体，连续给药3周。治疗结果是和厚朴酚脂质体配合顺铂联合治疗人肺癌A549受到显著抑制，使其生存期延长。 

用本发明的和厚朴酚脂质体冻干粉针剂中和厚朴酚的剂量为20mg/kg，溶解于药用溶剂，如生理盐水，或灭菌水，或5％葡萄糖溶液，每只小鼠注射0.1ml，每天腹腔给药，配合化疗药物5mg/kg阿霉素，每周1次，连续2周联合治疗乳腺癌。结果表明联合治疗组同单药治疗组、对照组比较，荷瘤小鼠乳腺癌生长受到明显抑制，小鼠生存期也明显延长，小鼠存活期内未发现明显的毒副作用。 

用本发明的和厚朴酚脂质体冻干粉针剂中和厚朴酚的剂量为25mg/kg，溶解于药用溶剂，如生理盐水，或灭菌水，或5％葡萄糖溶液，每只小鼠注射0.3ml，每天腹腔给药，先用化疗药物10mg/kg紫杉醇腹腔注射，注射紫杉醇2.5小时后注射和厚朴酚脂质体，连续2周，每周5次治疗肺癌。结果表明和厚朴酚脂质体有抑制小鼠Lewis肺癌生长的作用，和厚朴酚脂质体联合紫杉醇治疗小鼠Lewis肺癌较和厚朴酚和紫杉醇单药分别治疗小鼠Lewis肺癌抑瘤效果更好，肿瘤生长较小，荷瘤小鼠生存期延长，和厚朴酚脂质体治疗组没有发现明显的毒副反应，和厚朴酚脂质体和紫杉醇联合治疗小鼠Lewis肺癌较紫杉醇单药治疗的副反应没有增加。 

从以上结果，可以得出本发明的优点在于： 

1、本发明对已具有活性成分的和厚朴酚用脂质体包裹后的和厚朴酚脂质体冻干粉，能充分溶解于进行静脉滴注的药用溶剂中，如5％的葡萄糖溶液，或生理盐水，或灭菌水及注射用水。 

2、本发明和厚朴酚脂质体冻干粉的制备工艺简单，并可以制做成口服剂型、注射剂型、片剂型等。 

3、本发明和厚朴酚脂质体冻干粉毒性低，与放疗和/或化疗药物联合用药，具有更良好的增敏作用和增效作用，能明显的增强抗肿瘤的治疗效果。 

4、本发明和厚朴酚脂质体冻干粉与化疗药物顺铂，或紫杉醇，或阿霉素联合用药， 对人或小鼠肺癌，或乳腺癌的治疗具有明显的效果。 

5、本发明和厚朴酚脂质体冻干粉作为放疗和/或化疗药物增敏剂和在抗肿瘤药物的治疗中具有很好的临床抗肿瘤治疗的应用前景。 

附图说明

图1本发明各单纯对照组、单纯和厚朴酚脂质体治疗组及联合放疗诱导肺癌细胞凋亡的情况。 

图2本发明各单纯对照组、单纯和厚朴酚脂质体治疗组及联合放疗治疗小鼠lewis肺癌的肿瘤生长体积曲线图。 

图3本发明各单纯对照组、单纯和厚朴酚脂质体治疗组及联合放疗治疗小鼠lewis肺癌的肿瘤生存曲线图。 

图4本发明和厚朴酚脂质体治疗人肺癌A547的肿瘤生存曲线图，以存活率(％)为纵坐标，观察天数T为横坐标。 

图5本发明和厚朴酚脂质体治疗人肺癌A547中对照组与各治疗组的肿瘤生长曲线图，以肿瘤体积比(Vmm3)为纵坐标，观察天数T为横坐标。 

图6本发明和厚朴酚脂质体联合阿霉素治疗乳腺癌中对照组与各治疗组的肿瘤生长曲线图，以肿瘤体积比(Vmm3)为纵坐标，观察天数T为横坐标。 

图7本发明和厚朴酚脂质体联合阿霉素治疗乳腺癌中对照组与各治疗组的小鼠肿瘤生存曲线图，以存活率(％)为纵坐标，观察天数T为横坐标。 

图8本发明和厚朴酚脂质体联合放疗治疗肺癌的不同组肿瘤组织情况图。 

图9本发明和厚朴酚脂质体联合放疗治疗肺癌免疫组化显示不同组肿瘤组织中的血管生成情况图。 

图10本发明和厚朴酚脂质体治疗肺癌A547的肿瘤组织的HE染色图。 

图11本发明和厚朴酚脂质体治疗肺癌A547的肿瘤组织的免疫组化图。 

图12本发明和厚朴酚脂质体联合阿霉素治疗乳腺癌组织的HE染色图。 

图13本发明和厚朴酚脂质体联合阿霉素治疗乳腺癌组织的免疫组化图。 

图14.本发明和厚朴酚联合紫杉醇治疗小鼠lewis肺癌体积增长曲线图 

图15.本发明和厚朴酚联合紫杉醇治疗小鼠lewis肺癌生存曲线图 

图16本发明和厚朴酚脂质体联合紫杉醇治疗小鼠lewis肺癌各组HE染色组织图片 

图17本发明和厚朴酚脂质体联合紫杉醇治疗小鼠lewis肺癌各组肿瘤组织微血管图 

图1-3和图8中，A生理盐水对照组；B脂质体对照组；C单纯和厚朴酚脂质体治疗 组；D单纯放疗组；E和厚朴酚脂质体联合放疗治疗组。 

图4-5和图9中，A生理盐水对照组(NS)；B单纯脂质体对照组；C低剂量和厚朴酚脂质体治疗组；D单纯顺铂治疗组；E高剂量和厚朴酚脂质体治疗组；F高剂量和厚朴酚脂质体与顺铂联合治疗组。 

图6-7和图10-11中，A低剂量和厚朴酚脂质体治疗组；B中剂量和厚朴酚脂质体治疗组；C高剂量和厚朴酚脂质体治疗组；D中剂量和厚朴酚脂质体与阿霉素配合联合治疗组；E单独阿霉素化疗组；F脂质体对照组；G生理盐水对照组(NS)。 

图12-15中，A生理盐水对照组(空白组)；B和厚朴酚治疗组；C紫杉醇治疗组；D和厚朴酚联合紫杉醇治疗组。 

具体实施方式

下面将描述本发明的几个实施例，但本发明的内容完全不局限于此。 

一、和厚朴酚脂质体冻干粉的制备 

实施例1 

称量和厚朴酚20mg、卵磷脂60mg、胆固醇8mg、聚乙二醇的分子质量2000的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺12mg，山梨醇1mg、维生素C0.1mg； 

将上述称量好的卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺及和厚朴酚，溶解于按比例配制好的三氯甲烷和甲醇为100ml的有机溶剂中，其中三氯甲烷为75ml，甲醇为25ml，在密闭的瓶中搅拌至完全溶解，将完全溶解的溶液置于250ml的烧瓶中，将烧瓶与旋转蒸发器连接，烧瓶侵入40℃的恒温水浴中，抽真空旋转蒸发除去有机溶剂，这时在烧瓶壁上形成一层均匀的磷脂薄膜，再将其放入真空干燥箱中，在室温条件下干燥2小时，加入100ml的灭菌水，用功率200W超声破碎仪进行超声分散，超声时间1小时；再将山梨醇和维生素C溶解在和厚朴酚脂质体溶液中，置于冻干机中经冷冻干燥，即制得白色粉状的和厚朴酚脂质体冻干粉；将其抽真空密封，置于温度为4℃-8℃条件下保存备用。 

实施例2 

称量和厚朴酚35mg、卵磷脂45mg、胆固醇12mg、聚乙二醇的分子质量为4000聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺8mg、山梨醇0.5mg、维生素C0.5mg； 

按照实施例1的使用条件和操作步骤制得和厚朴酚脂质体冻干粉，将其抽真空或充入惰性气体密封，置于温度为4℃-8℃条件下保存备用。 

实施例3 

称量和厚朴酚50mg、卵磷脂40mg、胆固醇5mg、聚乙二醇的分子质量为8000聚乙二 醇-磷脂酰乙醇胺5mg、葡萄糖4mg、维生素C0.1mg； 

按照实施例1的使用条件和操作步骤制得和厚朴酚脂质体冻干粉，将其抽真空或充入惰性气体密封，置于温度为4℃-8℃条件下保存备用。 

实施例4 

称量和厚朴酚30mg、卵磷脂50mg、胆固醇10mg、聚乙二醇的分子量为2000的聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺10mg、蔗糖5mg、亚硫酸钠0.1mg； 

按照实施例1的使用条件和操作步骤制得和厚朴酚脂质体冻干粉，将其抽真空或充入惰性气体密封，置于温度为4℃-8℃条件下保存备用。 

实施例5 

和厚朴酚脂质体粉针剂与放疗联合治疗小鼠肺癌 

细胞株：小鼠肺癌细胞LLC来源于美国Amercian Type Culture Collection(ATCC)公司。 

细胞培养：小鼠肺癌细胞LLC为单层贴壁生长的细胞，培养在10％小牛血清的DMEM培养基，37℃温度，5％CO₂孵箱中，取指数生长期细胞进行试验。 

取C57健康小鼠40只，6～8周，雌性，在小鼠左腿外侧皮下种植5×10⁵个肺癌细胞株，接种后肿瘤体积达到500mm³时，随机分为5组，每组8只。 

第一组：生理盐水对照A组，每天给0.5ml生理盐水，连续注射10天。 

第二组：单纯脂质体对照B组，脂质体浓度为1mg/ml，每只剂量0.5ml，每天小鼠腹腔注射给药，剂量为37.5mg/kg，连续注射10天。 

第三组：单纯放疗治疗对照C组，每天照射5GY，连续照射5天。 

第四组：单纯和厚朴酚脂质体治疗D组，和厚朴酚脂质体中和厚朴酚浓度为0.5mg/ml，25mg/kg，每只剂量0.5ml，每天小鼠腹腔注射给药，连续治疗10天。 

第五组：和厚朴酚脂质体联合放射治疗E组，于小鼠腹腔注射和厚朴酚30-40分钟后进行放射治疗，持续治疗5天后停止放射治疗，再继续给予和厚朴酚腹腔注射5天，合计治疗时间为10天，和厚朴酚脂质体中和厚朴酚剂量为25mg/kg。 

实验结果：小鼠皮下接种肺癌细胞，治疗一共持续10天，每天测肿瘤的大小和体重，对小鼠肿瘤组织的石蜡切片采用原位末端标记(TUNEL)的方法检测肿瘤组织中细胞凋亡的情况。用上述方法检测结果显示联合治疗E组可见肿瘤组织明显坏死，同时可以看到肿瘤细胞发生了明显的凋亡，生理盐水对照A组和脂质体对照B组的肿瘤细胞只发生了极为少量的细胞凋亡。单用和厚朴酚脂质体治疗C组和单用放射治疗D组的细胞也发生了明显 凋亡。但是和厚朴酚脂质体与放射治疗的联合治疗E组肿瘤组织中荧光标记的凋亡细胞明显高于各个单独治疗组见图1所示。从图2中可以看出从治疗后第6天起肿瘤体积曲线有分离，经过统计学分析得知：联合治疗E组相对于两个对照组有明显的肿瘤生长抑制(P<0.05)，相对于单独和厚朴酚C和单独放疗D组也体现了更强的肿瘤抑制作用(P<0.05)。单独和厚朴酚治疗C组和单独放疗D组相对于对照组也可见肿瘤生长的抑制(P<0.05)见图3所示。联合治疗E组的病理切片上可见肿瘤组织坏死明显，甚至出现大片凝固性坏死区域，此外可以看到少量免疫细胞浸润的现象。和厚朴酚治疗C组与单独放疗D组的切片中肿瘤组织也有大量坏死，但坏死面积少于联合治疗E组。生理盐水对照A组和脂质体对照B组的肿瘤组织不但坏死和凋亡极少，而且还可以看到肿瘤细胞的增殖依然较为活跃见图8所示。采用CD31作肿瘤组织血管内皮细胞免疫组化染色，可以检测肿瘤组织内微血管密度(MVD)。小鼠Lewis肺癌经不同的治疗后各组肿瘤组织微血管密度(MVD)的结果显示CD31染色，细胞膜着棕黄色，和厚朴酚治疗C组，放疗D组的肿瘤组织内新生血管明显少于其他两个对照组，而联合治疗E组肿瘤组织内新生血管又明显少于两个单独治疗组见图9所示。 

在治疗过程中观察小鼠的体重、毛发、行动和喂食，和厚朴酚脂质体与放疗联合治疗组治疗效果明显好，而且将联合治疗组小鼠的肝、肺、肾、脑、心组织进行检测，都没有病变反应。 

实施例6 

和厚朴酚脂质体粉针剂与顺铂联合治疗人肺癌A549 

患者A549肺癌株：来自美国典型物培养中心(American Type Culture Collection，ATCC)，由四川大学华西肿瘤药物实验室保存。 

化疗药物：顺铂(CISPLATIN)，购于山东省齐鲁制药厂。 

试验动物：30只BALB/c裸鼠(SPF级)，雌性，鼠龄6-8周，体重约20-22克，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。 

在6-8周龄雌性裸鼠中建立A549肺癌模型。接种肿瘤细胞1×10⁷/0.2ml后，将荷瘤小鼠随机分为6组，每组5只，从接种7天后成瘤开始治疗。 

具体操作如下： 

第一组生理盐水对照A组，生理盐水0.2ml/只，每日腹腔给药，连续给药3周。 

第二组脂质体对照B组，脂质体37.5mg/kg，溶于0.2ml生理盐水中，每日腹腔给药，连续给药3周。

第三组低剂量和厚朴酚脂质体C组，厚朴酚脂质体中和厚朴酚剂量为5mg/kg，溶于0.2ml生理盐水中，载药量为40％，每日腹腔给药，连续给药3周。 

第四组单纯顺铂D组，剂量为4mg/kg，腹腔给药，每周2次，共4次。 

第五组高剂量和厚朴酚脂质体E组，厚朴酚脂质体中和厚朴酚剂量为25mg/kg，溶于0.2ml生理盐水中，载药量为40％，每日腹腔给药，连续给药3周。 

第六组高剂量和厚朴酚脂质体与顺铂联合治疗F组，即为第四组和第五组的联合治疗组，厚朴酚脂质体中和厚朴酚剂量为25mg/kg，溶于0.2ml生理盐水中，载药量为40％，每日腹腔给药，连续给药3周；顺铂剂量为4mg/kg，腹腔给药，每周2次，共4次；顺铂给药后4小时，再注射和厚朴酚脂质体。 

实验结果：在完成了上述治疗过程后观察到，生理盐水对照A组、脂质体对照B组和低剂量和厚朴酚脂质体C组比较无明显疗效；单纯顺铂D组则表现为化疗过程中肿瘤缩小但未完全消退，待化疗结束后缩小的肿瘤逐渐长大直至肿瘤负荷过大导致小鼠死亡；高剂量和厚朴酚E组与单独化疗D组相比，表现为早期肿瘤生长较快，但随着化疗的结束，其肿瘤的生长速度减慢，肿瘤缩小及生存期延长，治疗效果优于单独化疗组(P<0.05)，见图4所示；第五组小鼠肿瘤受到显著抑制(与各组比较，P<0.05)，并且生存率高于各组，见图5所示；肿瘤组织HE染色，结果发现对照A组和低剂量C组以及单纯脂质体B组肿瘤细胞异型性明显，几乎没有或者极少肿瘤组织坏死；单独顺铂治疗D组和高剂量和厚朴酚E组中可见成片的肿瘤细胞坏死；联合治疗F组肿瘤组织中出现大片坏死区域，部分肿瘤细胞表现为胞核致密固缩，胞浆红染，和少量的淋巴细胞浸润，见图10所示。免疫组化的结果观察到，相对于生理盐水对照组和顺铂单独用药组，联合用药治疗组中新生血管显著减少。进行微血管密度(MVD)定量分析结果显示，在生理盐水A组中肿瘤组织微血管染色非常明显，MVD达到38.20±1.68；低剂量C组、脂质体B组的微血管染色也非常明显(p>0.05)；高剂量和厚朴酚脂质体E组和顺铂D组肿瘤组织微血管染色有一定程度减少，分别为25.60±1.53和24.60±1.50；而联合用药治疗F组的微血管染色明显减少仅为15.40±1.69，差异有统计学意义(p<0.05)，见图11所示。 

实施例7： 

和厚朴酚脂质体与阿霉素联合治疗乳腺癌 

1.细胞培养：37℃，5％CO₂培养小鼠乳腺癌细胞株4T1，收集对数生长期的肿瘤细胞，计数细胞数后再调整细胞密度为1×10⁵/ml肿瘤细胞悬液备用。 

2.构建动物模型：将4T1细胞接种于6～8周龄，体重20g左右雌性BALB/C小鼠右 侧乳腺处，小鼠共56，每只接种0.1ml(1×10⁴个细胞)。待肿瘤长至直径约2mm时将小鼠随机分为7组，每组8只。 

3.动物分组： 

第一组单独低剂量和厚朴酚脂质体治疗A组，厚朴酚脂质体中和厚朴酚剂量为5mg/kg，每日给药1次，腹腔给药，连续2周； 

第二组单独中剂量和厚朴酚脂质体治疗B组，厚朴酚脂质体中和厚朴酚剂量为20mg/kg，每日给药1次，腹腔给药，连续2周； 

第三组单独高剂量和厚朴酚脂质体治疗C组，厚朴酚脂质体中和厚朴酚剂量为50mg/kg，每日给药1次，腹腔给药，连续2周； 

第四组中剂量和厚朴酚脂质体与阿霉素配合联合治疗D组，厚朴酚脂质体中和厚朴酚剂量为20mg/kg，阿霉素剂量为5mg/kg，和厚朴酚脂质体药物给药每日1次，连续2周，阿霉素每周给药1次，腹腔给药，连续2周； 

第五组单独阿霉素化疗E组，阿霉素剂量为ADR5mg/kg，每周给药1次，腹腔给药，连续2周； 

第六组脂质体对照F组，脂质体剂量为30mg/kg，每日给药1次，腹腔给药，连续2周； 

第七组生理盐水对照G组，每日给药1次，腹腔给药，连续2周。 

自接种肿瘤细胞2天后起，每3天用游标卡尺测量肿瘤的最长径与最短径，用下列公式计算肿瘤体积，即肿瘤体积(Vmm³)＝(长×宽²)÷2。记录小鼠皮毛色泽变化、食欲情况、活动规律、体重变化及死亡时间。 

实验结果分析： 

通过实验首先证实了和厚朴酚脂质体单独治疗小鼠乳腺肿瘤可以使肿瘤生长减缓，并且通过低、中、高三个不同剂量组抗肿瘤作用之间的比较，发现中剂量组(20mg/kg)是最佳治疗浓度。进一步通过对肿瘤组织进行CD31免疫组化染色和TUNEL法检测细胞凋亡，发现和厚朴酚脂质体治疗组和对照组比较，能明显抑制新生血管生成、增加肿瘤细胞的凋亡，从而证实抑制新生血管生长和诱导肿瘤细胞凋亡是和厚朴酚脂质体发挥抗肿瘤作用的主要原因。 

和厚朴酚脂质体与阿霉素配合，联合治疗小鼠乳腺癌肿瘤，观察两者联合治疗是否可增强抗肿瘤作用，是否产生明显的毒副作用。实验中和厚朴酚脂质体采用20mg/kg，化疗药物阿霉素采用5mg/kg(小鼠最大耐受量的1/3)，结果表明联合治疗组同单药治疗组、对 照组比较，荷瘤小鼠肿瘤生长受到明显抑制，见图6所示；小鼠生存期也明显延长，见图7所示；小鼠存活期内未发现明显的毒副作用，取其它正常组织做HE染色，在光学显微镜下观察，没有发现明显的异常；肿瘤组织HE染色发现，联合治疗D组出现大片固缩性坏死区域，并且伴有少量的淋巴细胞浸润，见图12所示；肿瘤组织切片CD31免疫组化分析显示，联合治疗D组肿瘤组织微血管密度较单纯和厚朴酚脂质体A组、C治疗组、对照G组较低，见图13所示。肿瘤组织TUNEL分析显示联合治疗组肿瘤细胞凋亡较单药治疗组、对照组明显增多。 

以上实验结果证实了和厚朴酚脂质体和阿霉素配合联合治疗恶性肿瘤有较强的抗肿瘤效应，二者在抑制新生血管生长、诱导肿瘤细胞凋亡方面都发挥了协同增敏和/或增效作用；同时又不产生明显的毒副作用。 

实施例8： 

和厚朴酚脂质体与紫杉醇联合治疗小鼠肺癌 

1、细胞培养 

(1)细胞复苏培养 

从液氮中取出冻存保种的细胞，迅速置于37℃水浴复温融化，在超净工作台内用培养基洗涤1次。然后用完全培养基于37℃，5％CO₂培养箱培养。 

(2)细胞传代 

贴壁生长细胞的传代：从培养箱中取出培养瓶，吸掉培养基后，用无血清培养基洗涤2次，加入0.25％的胰酶，显微镜下观察细胞收缩变圆后，加入完全培养基终止胰酶作用，并吹打使细胞分散脱落，收集液体，2000rpm，3min，细胞沉淀用完全培养基重悬，吹打均匀后分瓶培养。一般3～4天传代1次。 

2、C57BL/6小鼠接种肿瘤及分组 

6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠60只，体重约20克左右，每只小鼠均右腋下接种Lewis肺癌LLC细胞1×10⁶个，第8天小鼠右腋下肿瘤直径约0.2cm时随机分为4组，每组15只，具体分组如下： 

第一组：生理盐水对照A组，生理盐水0.3ml/只，腹腔内注射，每天一次，连续14天； 

第二组：和厚朴酚脂质体治疗B组，和厚朴酚的剂量为25mg/kg，腹腔内注射，每天一次，连续14天； 

第三组：紫杉醇治疗C组，紫杉醇剂量为10mg/Kg，腹腔内注射，连续2周，每周5次；

第四组：和厚朴酚脂质体联合紫杉醇治疗D组，为腹腔注射，每天一次，连续14天，和厚朴酚脂质体中和厚朴酚的剂量为25mg/kg，紫杉醇剂量为10mg/Kg，注射紫杉醇2.5小时后注射和厚朴酚脂质体。 

结果分析：对四组C57BL/6小鼠Lewis肺癌进行治疗，观察四组C57BL/6小鼠Lewis肺癌生长情况并做出肿瘤生长曲线。从图14中可以看到；第22天时，联合治疗组Lewis肺癌肿瘤生长减慢，平均肿瘤体积为321.802±13.739mm³，紫杉醇单药治疗组肿瘤体积为473.227±29.922mm3，和厚朴酚治疗组为847.922±27.839mm3，而生理盐水对照组C57BL/6小鼠肿瘤体积达1639.186±47.838mm³(p<0.05)。显示出单药治疗有一定的抗肿瘤活性，但联合治疗较二组单药治疗有更强的抗肿瘤活性。联合治疗组小鼠生存情况明显优于其它三组。如图显示，第32天时，生理盐水对照组小鼠开始死亡，在第48天时，生理盐水对照组小鼠存活率为10％，而紫杉醇或和厚朴酚单药治疗组小鼠分别有70％和40％存活，联合治疗组90％存活(p<0.05)见图15所示。从HE染色组织图片看出，未处理组瘤组织边界不清，细胞密集排列，异形性较为明显，联合治疗组伴有炎细胞侵润，纤维组织增生并形成包裹，细胞间距稍增宽。紫杉醇组可见少许灶性坏死组织，少量炎细胞，边界较清。和厚朴酚组组织边界不清，细胞密集排列，异形性较为明显，肿瘤组织周围有炎症细胞，癌细胞团侵润肌层，见图16所示。生理盐水A组微血管密度(MC)为35.8±3.114/视野(×200)，紫杉醇治疗C组为(MC)15.2±2.28视野(×200)，联合治疗D组为(MC)14±2.739/视野(×200)，和厚朴酚B组(MC)为16±1.581/视野(×200)。统计分析结果表明B、C、D组每一组对于A组均有显著性差异(p<0.05)。但B、C、D组之间比较无显著性差异(p>0.05)见图17所示。在治疗后处死小鼠，取各组小鼠的脑、肺、心、肝、脾、肾等脏器，进行肉眼观察，并制成病理切片，HE染色后在光学显微镜下观察，没有发现明显的异常。

Claims (10)

1.一种和厚朴酚脂质体冻干粉制剂，其特征在于，该制剂包含：和厚朴酚20-50份、聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺5-15份、卵磷脂40-60份、胆固醇5-15份，其中，卵磷脂与胆固醇的配比为3-12∶1，聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子质量为2000-8000，以上各组分均以重量计。

2.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述聚乙二醇的分子质量为2000时，加入聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的量为5-15份。

3.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述聚乙二醇的分子质量为2000时，加入聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的量为10-15份。

4.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述聚乙二醇的分子质量为4000时，加入聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的量为5-11份。

5.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述聚乙二醇的分子质量为8000时，加入聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺的量为8-10份。

6.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述卵磷脂与胆固醇的配比为3∶1。

7.权利要求1-6中任一所述的和厚朴酚脂质体冻干粉制剂在制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所制备的药物为和厚朴酚脂质体冻干粉制剂与放疗和/或化疗联合使用药物。

8.根据权利要求7所述的和厚朴酚脂质体冻干粉制剂在制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述的恶性肿瘤选自肺癌，或乳腺癌。

9.根据权利要求7或8所述的和厚朴酚脂质体冻干粉制剂在制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述和厚朴酚脂质体冻干粉制剂还作为放疗和/或化疗药物的增敏剂。

10.根据权利要求7所述的和厚朴酚脂质体冻干粉制剂在制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述的化疗药物选自顺铂，或紫杉醇，或阿霉素。

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