CN101167778B - 一种用于抑制血管生成的王不留行提取物及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

一种用于抑制血管生成的王不留行提取物及其制备和应用，属于中药应用技术领域。本发明提供一种王不留行提取物的制备方法，用水、或有机溶剂、或含水有机溶剂来提取王不留行的干燥种子，并将提取液过滤、浓缩、干燥而成。本发明首次发现王不留行提取物具有抑制血管生成的活性，可用于治疗或预防与血管生成相关的疾病，还可用于肿瘤化疗和/或辅助化疗方面的治疗。本发明巧妙地以血管生成作为治疗疾病的靶点，研究并阐明王不留行提取物的药用疗效和机制，为其新用途开发和发现药物作用新的靶点提供科学依据和重要信息，是中医药理论新的发展方向。这种王不留行提取物可用于药物、保健品和/或化妆品等用途。

Description

一种用于抑制血管生成的王不留行提取物及其制备和应用

技术领域

一种用于抑制血管生成的王不留行提取物及其制备和应用，属于中药应用技术领域。本发明涉及一种以王不留行为原料制备的提取物、其具有抑制血管生成的活性，阐明了其制备方法及其在医药，食品、化妆品方面的新用途。

背景技术

在人的机体内，只要有器官形成发生就有新血管的形成，或血管的新生成，这对于氧、营养素、代谢产物的输送是必需的。血管形成仅发生在胚胎早期，这些类型的血管形成常受某些因素调控，并且是间断性的，正常人体的血管内皮细胞倍增时间为一年。而持续的和不受调节控制的血管生成(angiogenesis)则出现于大量病态、肿瘤转移和内皮细胞的异常生长中【1、Tímár J，D

me B，Fazekas K，Janovics A，Paku S.Angiogenesis-dependent diseases and angiogenesistherapy.Pathol Oncol Res.2001，7(2)：85-94.2、Folkman J.Angiogenesis in cancer，rheumatoid and disease.Nat Med.1995，1：27-31.】，这种血管生成速度十分迅速，例如实体瘤组织中血管内皮细胞的倍增时间仅4天。肿瘤的大小超过1～2mm³时，其继续生长、长大依赖于新血管的生成【3、D′Amato RJ，Adamis AP.Angiogenesisinhibition in age-related macular degeneration.Ophthalmology.1995，102(9)：1261-1262.4、Arbiser JL.Angiogenesis and the skin：a primer.J AmAcad Dermatol.1996，34(3)：486-497.5、O′Brien KD，McDonald TO，Chait A，AllenMD，Alpers CE.Neovascular expression of E-selectin，intercellular adhesionmolecule-1，and vascular cell adhesion molecule-1 in human atherosclerosis and theirrelation to intimal leukocyte content.Circulation.1996，93(4)：672-82.6、Hanahan D，Folkman J.Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch duringtumorigenesis.Cell.1996，86(3)：353-364.】。这些新生成的血管把还在生长的肿瘤和循环系统直接连接起来，使其供肿瘤生长的物质得以交换。此外，肿瘤还利用新生血管作为转移的方式，通过血液循环将原发癌细胞输送、转移至靶器官【7、Polverini PJ.The pathophysiology of angiogenesis.Crit Rev Oral Biol Med.1995，6(3)：230-247.】。因此，血管新生是肿瘤生长、发展的必经之路，与实体瘤的发生、转移有着密切的关系，许多肿瘤仅在新的血管生成出现之后才出现临床症状。目前认为，癌细胞能分泌大量促进血管生长的许多血管生长因子，使肿瘤形成新的血管而快速生长，而血管内皮细胞也可分泌血管生长因子促使血管内皮细胞自身乃至肿瘤细胞的增殖【8、Folkman，Cotran.Relation of vascularproliferation to tumor growth.Int Rev Exp Pathol.1976，16：207-248.9、Veikkola T，Alitalo K.VEGFs，receptors and angiogenesis.Semin Cancer Biol.1999，90：211-220.】。由此可得出这样的结论，毛细血管如果没有血管生长因子诱导不会同肿瘤连接，肿瘤如果没有血管生长和得不到源源不断的血液供应就只能处于休眠状态【10、Kim KJ，Li B，Winer J.Inhibition of vascular endothelial growthfactor-induced angiogenesis suppresses tumor growth in vivo.Nature.1993，362：841-844.】。所以，利用血管生成抑制剂特异性地抑制肿瘤血管内皮细胞的增殖和活性，可抑制肿瘤的生长和转移而不影响其他正常细胞。

因此，肿瘤的血管系统已成为一个崭新的、有希望的抗肿瘤治疗靶点。通过开发和研究能破坏或抑制血管生成，有效地阻止肿瘤生长和转移的药物是非常有前途的一种方法，有望发展成为一种新型的癌症疗法。这种抗血管生成疗法——“饿死疗法”可以对肿瘤细胞进行干预，从而防止肿瘤分泌血管生长因子，阻止发出诱导血管生成的分子信号，而且有助于阻止癌细胞的转移。【11、Kong HL，Crystal RG.Gene therapy strategies for tumor antiangiogenesis.JNatl Cancer Inst.1998，90(4)：273-286.12、Pluda JM.Tumor-associatedangiogenesis：Mechanisms，clinical implications，and therapeutic strategies.Semin Oncol，1997，24(2)：203-218.13、Pepper MS.Manipulatingangiogenesis.From basic science to the bedside.Arterioscler Thromb VascBi.1997，17(4)：605-619.14、Liekens S，de Clercq E，Neyts J.Angiogenesis：Regulators and clinical applications.Biochem Pharmacol.2001，61(3)：253-270.】世界各国以肿瘤血管生成作为靶点经过广泛研究，目前开发出许多血管生成抑制剂在进行I～III期临床试验研究，例如血管生成抑素(Angiostatin)、内皮抑素(Endostatin)、烟曲霉素类似物及金属蛋白酶抑制因子和尿激酶、白介素-12、血小板因子、Bufotanine等20多种。上述血管生成抑制剂，具有特异性强，作用快，剂量小，疗效高，副作用小，不易产生耐药性等优点。此类药物不但可用于大多数实体肿瘤的治疗，还可用于癌的预防和血液系统恶性肿瘤的治疗，同时对其他与血管生成有关的疾病如：糖尿病视网膜病变、风湿性关节炎、银屑病、血管瘤、动脉粥样硬化等的预防与治疗，都具有重要的理论及现实意义。而我国的传统中药在血管生成抑制方面的研究刚刚起步，还属于一个新的十分活跃的领域，从中我们已经看到了希望。

王不留行系石竹科麦蓝菜(Vaccaria segetalis(Neck)Garche.)的种子，为传统常用中药，性苦、平，入肝、胃经，对行血通经、催生下乳、消肿敛疮、妇女闭经、乳汁不通、难产、血淋、痈肿、金疮出血等有良好的功效，临床疗效显著，主要治疗多种妇科疾病。其植物资源丰富，尤以河北产量最大。王不留行中主要含有三萜皂甙、黄酮甙、环肽、类脂和脂肪酸、单糖等【15、SangShengmin，Lao Aina，Wang Hongcheng，et al.A Phenylpropanoid Glycoside fromVaccaria segetalis.Phytochemistry.1998，48(3)：569-574.16、Sang Shengmin，LaoAina，Wang Hongcheng，et al.Triterpenoid Saponins from Vaccaria segetalis.J AsiNat Prod Res，1999，1(3)：199-211.17、Mazza G，et al.Compositional andmorphological characteri stics of cow cockle(Saponaria vaccaria)seed，apotential alternative crop.J Agric Food Chem，1992，40(9)：1520-1533.18、桑圣民，夏增华，毛士龙，劳爱娜，陈仲良.中药王不留行中黄酮甙类成分的研究.中国中药杂志，2000，25(4)：221-222.】。经过调研，未见我国学者对王不留行抑制血管生成作用的相关文献报道(自CNKI、维普中国期刊网)，因此王不留行在抑制血管生成的药理、药效等研究领域尚处于空白阶段。

发明内容

本发明的目的是提供一种以王不留行为原料制备的中药提取物，其中含有多种具有抑制血管生成作用的活性成分。

本发明的技术方案：一种用于抑制血管生成的王不留行提取物。

所述王不留行提取物的制备方法，是用水、或有机溶剂、或含水有机溶剂来提取王不留行的干燥种子，并将提取液过滤、浓缩、干燥而成。

所述王不留行提取物在制备抑制血管生成药物中的应用，是该抑制血管生成药物含有有效剂量的王不留行提取物及常规药用载体和/或赋形剂。

所述的应用，所述提取物被制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、膏剂、霜剂或乳剂。

所述的应用，所述提取物是用于预防和/或治疗至少一种选自下述之一的疾病：癌症和/或癌症转移，血管瘤，血管纤维瘤，新生血管性青光眼，糖尿病视网膜病变，早熟视网膜病及视网膜静脉闭塞，视网膜变性，晶体后纤维组织增生，颗粒性结膜炎，血管生成引起的角膜疾病，更年期黄斑和黄斑变性，牛皮癣，老年盘状斑变性及风湿性关节炎，银屑病，毛细管扩张，脓性肉芽肿，伤口愈合中抑制斑痕形成，动脉粥样硬化，脂溢性皮炎和痤疮。

所述的应用，是该提取物有抗肿瘤血管生成及其他与血管生成有关疾病治疗、预防的用途。

所述的应用，是该提取物还有用于肿瘤化疗和/或辅助化疗的用途。

所述的提取物在制备抑制血管生成保健食品中的应用，是所述提取物是用于抑制血管生成的保健食品。

所述的提取物在制备抑制血管生成化妆品中的应用，是所述提取物是用于抑制血管生成的化妆品。

本发明中王不留行提取物可用常规方法制备。在实际需要的时候，在王不留行提取物中可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂，赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、乳化剂、渗透压调节剂，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。

本发明中王不留行提取物可以按常规的制剂工艺，单独使用或与其它药物配合制备成在临床上可以使用的各种不同剂型的药物，例如注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、膏剂、霜剂或乳剂等多种形式。

本发明中王不留行提取物可以应用于抗肿瘤血管生成及其他与血管生成有关疾病治疗、预防，还可以用于肿瘤化疗和/或辅助化疗。更具体地，本发明提供了一种用于药物、食品、化妆品的抑制血管生成的提取物。

本发明的有益效果：本发明首次发现王不留行提取物具有抑制血管生成的活性，可用于治疗或预防与血管生成相关的疾病，还可用于肿瘤化疗和/或辅助化疗方面的治疗。本发明巧妙地以血管生成作为治疗疾病的靶点，研究并阐明王不留行提取物的药用疗效和机制，为其新用途开发和发现药物作用新的靶点提供科学依据和重要信息，是中医药理论新的发展方向。这种王不留行提取物可用于药物、保健品和/或化妆品等用途。

附图说明

图1王不留行提取物对HMEC细胞体外增殖的抑制作用

图2王不留行提取物抑制鸡胚尿囊膜血管生成(CAM实验)

图3王不留行提取物对体内Matrigel plug法血管的抑制作用

图4王不留行提取物对血管内皮细胞中CD31分子表达的抑制作用图5王不留行提取物对体内肿瘤的抑制作用

具体实施方式

本发明提供的王不留行提取物的制备工艺如下：首先用水、或有机溶剂、或含水有机溶剂来提取王不留行的干燥种子，煎煮提取两遍，将提取液离心、合并后减压回收成浸膏，经冷冻干燥后得到王不留行提取物。

实施例1：王不留行提取物对人血管内皮细胞增殖的抑制作用。

将人血管内皮细胞(HMEC，法国国家卫生医学研究所惠赠)置于含1mmol谷氨酰胺，1μg/mL氢化可的松，10ng/mL表皮生长因子(EGF)和15％小牛血清的MCDB-131培养液中培养(37℃、5％CO₂、95％湿度)。取对数生长期细胞，以10⁵cell/mL细胞接种于96孔板，100μL/孔，每组设4个平行孔，放置于37℃、5％湿化CO₂的培养箱过夜。加不同浓度(10-100μg/mL)王不留行提取物，以水为空白对照，培养48小时后，去掉上清液，每孔轻轻地加入10％三氯醋酸100μL固定，静置5min后移到4℃冰箱放置1h后倒掉固定液，用去离子水洗5次，空气干燥。每孔加入0.4％磺酰罗丹明B(SRB)100μL 37℃培养箱放置30min，用1％醋酸液洗5次，空气干燥。加100μL 10mM Tris碱液(pH10.5)溶解，自动分光光度仪在531nm波长处测定每个小孔的吸光度值(A)。上述实验重复3次。抑制率(％)计算如下：

结果如图1所示，王不留行提取物对人血管内皮细胞增殖有抑制作用，其半数抑制量为50μg/mL。

实施例2：王不留行提取物对血管形成能力的抑制作用。

2.1王不留行提取物抑制鸡胚尿囊膜血管生成(CAM实验)

白皮种蛋，参考张树成的方法【19、张树成，吴志奎，王蕾，等.研究中药血管生成活性和作用的鸡胚绒毛尿囊膜试验模型的应用.中国中医基础医学杂志，1999，5：16-19.】制备鸡胚尿囊膜。用打孔器制备直径为6mm的微孔滤膜圆片，湿热高压消毒。设王不留行提取物给药组(10μL、1g生药/mL)和生理盐水阴性对照组。将药物滴于滤纸上，制成药膜，吹干备用。鸡胚培养3d后分组，将药膜贴于CAM的部位。加药48h后，观察药膜周围的血管数，并摄影记录。

结果如图2所示，生理盐水阴性对照组CAM血管生成非常明显，整体呈鲜红色，血管在药膜下呈放射状生长，血管粗大，血液充盈，血管分支较多，毛细血管密度大。王不留行提取物给药组则明显抑制了血管生成，放射状生长的血管数目大为减少，血管主要以零星、杂乱、叶脉样等表现形式存在，血管细小，稀疏，血管分支少，血管色淡浅黄，在药膜片下及周围局部鲜有血管区，或者血管断裂或消失。

2.2体内Matrigel plug法血管抑制试验

换【20、Passaniti A，Taylor RM，Pili R，GuoY，Long PV，Haney JA，Pauly RR，Grant DS，Martin GR.A simple，quantitative method for assessing angiogenesis andantiangiogenic agents using reconstituted basement membrane，heparin，andfibroblast growth factor.Lab Invest.1992，67：519-528.】方法，取4℃下液态Matrigel200μL按不同实验分组，分别与不同药物混合，分别注射入BALB/c小鼠的腋部皮下，4只小鼠为一组。7天后处死小鼠，取出Matrigel小包，10％中性福尔马林固定，包埋，切片，HE染色后，显微镜下摄片(×200)。实验药物分组为：纯Matrigel(空白组)，Matrigel+bFGF(碱性成纤维细胞生长因子，0.1μg)(对照组)，Matrigel+bFGF+甘草提取物(100μL、1g生药/mL)(阴性对照组)，Matrigel+bFGF+王不留行提取物(100μL、1g生药/mL)(实验组)。

结果如图3所示，bFGF能够明显诱导形成丰富的微血管，甘草提取物对此种血管生成没有丝毫作用。而王不留行提取物能明显抑制Matrigel种植体内的微血管生成，可明显减少侵入Matrigel小包的内皮细胞数量。与对照组相比，差异有显著性(P＜0.001)。

2.3体内荷瘤模型小鼠分析王不留行提取物对血管内皮细胞中CD31分子表达的影响

人类结肠癌细胞系C51colon细胞，用PBS制成细胞悬液，以200万cell/200μL接种至8周大BALB/cAnN-nu裸鼠的右股部皮下。待瘤体生长至5mm×5mm大小时，随机分成三组：生理盐水对照组，甘草提取物阴性对照组，王不留行提取物用药组(0.4mL、1g生药/mL)，每组5只。连续灌胃给药60天，每天记录瘤体的长径和短径。用药期间，小鼠未出现不良反应。处死小鼠后，取出肿瘤并制成冰冻切片，应用SABC法对上述冰冻切片进行CD31免疫组织化学染色，显微镜下观察(×200)。

CD31为血小板内皮细胞黏附分子-1(PECAM-1)，由于在发育和成熟个体的所有血管内皮细胞都有高度表达CD31，因此常常被用来作为血管内皮细胞的标志物【21、高媛，高建恩，孙启鸿.血小板内皮细胞黏附分子-1(PECAM-1)的研究进展.细胞与分子免疫学杂志，2005，21：40-42.】。内皮细胞相互间的黏附是血管生成的基本过程，CD31是介导内皮细胞黏附的重要分子。体内外实验表明，用抗CD31的抗体作用于鼠的内皮细胞，可以阻断由鼠的毛细血管内皮细胞参与的新生血管形成【22、Delisser HM，Christofidou-Solomidou M，Strieter RM，et al.Involvement of endothelial PECAM-1/CD31 in angiogenesis.AmJ Pathol，1997，151：671-677】。本发明结果如图4(CD31 staining×200)所示，生理盐水对照组的肿瘤微血管呈棕褐条索状分布，血管密集。王不留行提取物用药组的肿瘤呈棕褐色条索状微血管明显稀少，几乎观察不到，说明王不留行提取物能明显抑制肿瘤细胞中CD31的表达，具有抑制新生血管形成的作用。甘草提取物对新生血管形成无抑制作用。

实施例3：Lewis肺癌转移模型小鼠分析王不留行提取物对体内肿瘤的抑制作用

选取体重为14-18g的雄性近交系C57BL/6小鼠15只，将制备好的Lewis肺癌细胞悬液以0.2mL/只接种于小鼠右腋皮下(约含活细胞数1×10⁶个)。随机分为3组，每组5只：生理盐水对照组(0.4mL)，甘草提取物阴性对照组(0.4mL、1g生药/mL)，王不留行提取物用药组(0.4mL、1g生药/mL)。在接种Lewis肺癌细胞4天后，每天灌胃给药1次，共治疗4周。第28天将所有小鼠断颈处死，将肿瘤完整取下，取部分肿瘤组织，常规石蜡切片或冰冻切片，HE染色，光镜下观察(×100)。

结果如图5所示，生理盐水组的肿瘤细胞大小不等，病灶大，移行性明显，核分裂相多见，可见瘤巨细胞，间质血管丰富。甘草提取物组肿瘤细胞形态与生理盐水组组无明显差异。王不留行提取物组能够明显改善和稳定病灶，核分裂大为减少，移行性不明显，间质血管明显减少。

本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员能领会在公开的实施例中作许多改变也可获得相同或类似的结果，而不超出本发明的构思、精神和范围。更具体地说，显然有些化学和生理性的相关试剂可替代本文所公开的试剂而得到相同或类似的结果。所有类似的取代和修饰对本领域技术人员来说，显然都认为是本发明的精神、范围和构思及权利要求范围内的，即所有上述这些等价形式都同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (5)

1.一种王不留行提取物在制备药物中的应用，其特征在于：用于制备抑制血管生成药物；

所述王不留行提取物的制备方法是，用水、或有机溶剂、或含水有机溶剂提取王不留行的干燥种子，并将提取液过滤、浓缩、干燥而成。

2.根据权利要求1所述王不留行提取物在制备药物中的应用，其特征在于：用于制备抑制血管生成药物，其中含有有效剂量的王不留行提取物及常规药用载体和/或赋形剂。

3.根据权利要求2所述的在制备药物中应用，其特征在于：所述王不留行提取物被制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、膏剂、霜剂或乳剂。

4.一种王不留行提取物在制备保健食品中的应用，其特征在于：王不留行提取物用于制备抑制血管生成的保健食品；

所述王不留行提取物的制备方法是，用水、或有机溶剂、或含水有机溶剂提取王不留行的干燥种子，并将提取液过滤、浓缩、干燥而成。

5.一种王不留行提取物在制备化妆品中的应用，其特征在于：王不留行提取物用于制备抑制血管生成的化妆品；

所述王不留行提取物的制备方法是，用水、或有机溶剂、或含水有机溶剂提取王不留行的干燥种子，并将提取液过滤、浓缩、干燥而成。

Images