CN101167787B - 抑制血管生成的合欢属植物提取物的组合物及其制备和应用 - Google Patents
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抑制血管生成的合欢属植物提取物的组合物及其制备和应用,属于中药应用技术领域。本发明涉及包含合欢属植物提取物的组合物及其制备方法与新用途。本发明首次发现包含合欢属植物提取物的组合物具有抑制血管生成的活性,因此,它可用于治疗或预防与血管生成相关的疾病,还可用于肿瘤化疗和/或辅助化疗方面的治疗。本发明的合欢属植物提取物的组合物包含一种或多种的抗血管生成的活性成分。本发明巧妙地以血管生成作为治疗疾病的靶点,研究并阐明包含合欢属植物提取物的组合物的药用疗效和机制。这种包含合欢属植物提取物的组合物可用于药物、保健品和/或化妆品等用途。
Description
技术领域
抑制血管生成的合欢属植物提取物的组合物及其制备和应用,属于中药应用技术领域。本发明涉及一种包含合欢属植物为原料制备的提取物、其具有抑制血管生成的活性,阐明了其制备方法及其在医药,食品、化妆品方面的新用途。
背景技术
在人的机体内,只要有器官形成发生就有新血管的形成,或血管的新生成,这对于氧、营养素、代谢产物的输送是必需的。血管形成仅发生在胚胎早期,这些类型的血管形成常受某些因素调控,并且是间断性的,正常人体的血管内皮细胞倍增时间为一年。而持续的和不受调节控制的血管新生成(angiogenesis)则出现于大量病态、肿瘤转移和内皮细胞的异常生长中【1、Tímár J,Dme B,Fazekas K,Janovics A,Paku S.Angiogenesis-dependent diseasesand angiogenesis therapy.Pathol Oncol Res.2001,7(2):85-94.2、Folkman J.Angiogenesis in cancer,rheumatoid and disease.Nat Med.1995,1:27-31.】,这种血管生成速度十分迅速,例如实体瘤组织中血管内皮细胞的倍增时间仅4天。肿瘤的大小超过1~2mm3时,其继续生长、长大依赖于新血管的生成【3、D′Amato RJ,Adamis AP.Angiogenesis inhibition in age-related macular degeneration.Ophthalmology.1995,102(9):1261-1262.4、Arbiser JL.Angiogenesis and the skin:aprimer.J Am Acad Dermatol.1996,34(3):486-497.5、O′Brien KD,McDonald TO,Chait A,Allen MD,Alpers CE.Neovascular expression of E-selectin,intercellularadhesion molecule-1,and vascular cell adhesion molecule-1 in human atherosclerosisand their relation to intimal Leukocyte content.Circulation.1996,93(4):672-82.6、Hanahan D,Folkman J.Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switchduring tumorigenesis.Cell.1996,86(3):353-364.】。这些新生成的血管把还在生长的肿瘤和循环系统直接连接起来,使其供肿瘤生长的物质得以交换。此外,肿瘤还利用新生血管作为转移的方式,通过血液循环将原发癌细胞输送、转移至靶器官【7、Polverini PJ.The pathophysiology of angiogenesis.Crit Rev Oral Biol Med.1995,6(3):230-247.】。因此,血管新生是肿瘤生长、发展的必经之路,与实体瘤的发生、转移有着密切的关系,许多肿瘤仅在新的血管生成出现之后才出现临床症状。目前认为,癌细胞能分泌大量促进血管生长的许多血管生长因子,使肿瘤形成新的血管而快速生长,而血管内皮细胞也可分泌血管生长因子促使血管内皮细胞自身乃至肿瘤细胞的增殖【8、Folkman,Cotran.Relation of vascularproliferation to tumor growth.Int Rev Exp Pathol.1976,16:207-248.9、Veikkola T,Alitalo K.VEGFs,receptors and angiogenesis.Semin Cancer Biol.1999,90:211-220.】。由此可得出这样的结论,毛细血管如果没有血管生长因子诱导不会同肿瘤连接,肿瘤如果没有血管生长和得不到源源不断的血液供应就只能处于休眠状态【10、Kim KJ,Li B,Winer J.Inhibition of vascular endothelia growthfactor-induced angiogenesis suppresses tumor growth in vivo.Nature.1993,362:841-844.】。所以,利用血管生成抑制剂特异性地抑制肿瘤血管内皮细胞的增殖和活性,可抑制肿瘤的生长和转移而不影响其他正常细胞。
因此,肿瘤的血管系统已成为一个崭新的、有希望的抗肿瘤治疗靶点。通过开发和研究能破坏或抑制血管生成,有效地阻止肿瘤生长和转移的药物是非常有前途的一种方法,有望发展成为一种新型的癌症疗法。这种抗血管生成疗法——“饿死疗法”可以对肿瘤细胞进行干预,从而防止肿瘤分泌血管生长因子,阻止发出诱导血管生成的分子信号,而且有助于阻止癌细胞的转移。【11、Kong HL,Crystal RG.Gene therapy strategies for tumor antiangiogenesis.JNatl Cancer Inst.1998,90(4):273-286.12、Pluda JM.Tumor-associatedangiogenesis:Mechanisms,clinical implications,and therapeutic strategies.Semin Oncol,1997,24(2):203-218.13、Pepper MS.Manipulatingangiogenesis.From basic science to the bedside.Arterioscler Thromb VascBi.1997,17(4):605-619.14、Liekens S,de Clercq E,Neyts J.Angiogenesis:Regulators and clinical applications.Biochem Pharmacol.2001,61(3):253-270.】世界各国以肿瘤血管生成作为靶点经过广泛研究,目前开发出许多血管生成抑制剂在进行I~III期临床试验研究,例如血管生成抑素(Angiostatin)、内皮抑素(Endostatin)、烟曲霉素类似物及金属蛋白酶抑制因子和尿激酶、白介素-12、血小板因子、Bufotanine等20多种。上述血管生成抑制剂,具有特异性强,作用快,剂量小,疗效高,副作用小,不易产生耐药性等优点。此类药物不但可用于大多数实体肿瘤的治疗,还可用于癌的预防和血液系统恶性肿瘤的治疗,同时对其他与血管生成有关的疾病如:糖尿病视网膜病变、风湿性关节炎、银屑病、血管瘤、动脉粥样硬化等的预防与治疗,都具有重要的理论及现实意义。而我国的传统中药在血管生成抑制方面的研究刚刚起步,还属于一个新的十分活跃的领域,从中我们已经看到了希望。
合欢属Albizzia系豆科含羞草亚科植物,广泛分布于世界各地。我国有16种,大部分产于南部和西南部,其中最常见的有合欢Albizzia Julibrissin Durazz,楹树Albizzia chinensis(Osb.)Merr.,大叶合欢Albizzia Lebbeck(L.)Benth和白格Albizzia Procera(L.)Benth等。合欢属植物树皮、茎皮、叶、花、种子的主要的化学成分有三萜及其苷类化合物、黄酮及其苷类化合物、生物碱、有机酸、甾醇类化合物、木脂素、鞣质及挥发性成分等。现代药理实验表明,合欢属植物具有广泛的抗癌、镇静、抗生育、PAF受体拮抗和抗炎等作用。例如,被中国药典一部收录的合欢属植物中的合欢皮是一味常用中药,为豆科植物合欢Albizia julibrissin Durazz.的干燥树皮,具有解郁安神,活血消肿的功能,用于心神不安,忧郁失眠,肺痈疮肿,跌扑伤痛等症。合欢皮提取物具有广泛的体内、体外抑制肿瘤细胞增殖的活性,但由于其抗癌作用机制还不明确,限制了其抗癌作用的临床应用【15、Tsuyoshi Ikeda,Tetsuya Kajimoto,Toshihiro Nohara,Jun-eiKino,Chi-Huey Wong. Preparation of a neoglycolipid carrying the oligosaccharidecomponent of saponin from Albizzia julibr
发明内容
本发明的目的是提供一种用于抑制血管生成的含有合欢属植物提取物的组合物,其中含有多种具有抑制血管生成作用的活性成分。
本发明的技术方案:一种用于抑制血管生成的含有合欢属植物提取物的组合物。
所述组合物选自下述一种或几种物质的成分:合欢Albizzia JulibrissinDurazz,楹树Albizzia chinensis(Osb.)Merr.,大叶合欢Albizzia Lebbeck(L.)Benth,白格Albizzia Procera(L.)Benth,白花合欢Albizia crassiramea Lace,光叶合欢Albizia Lucidior(Steud.)Nielsen,山合欢Albizia Kalkora(Roxb.)Prain,亮叶合欢Albizia Lucida,驱虫合欢Albizia anthelminitica,西非合欢Albizia zygia,金合欢Acacia farnesiana(Linn.)Willd.,光叶金合欢Acacia delavayi Franch,胜利金合欢Acacia victoriae(Benth.),灰金合欢Acacia glauca(Linn.)Moench,藤金合欢Acacia sinuata(Lour.)Merr.。
所述组合物的制备方法,采用有机溶剂、含水有机溶剂或水来提取植物的干燥树皮、茎皮、叶、花、种子、豆荚或根,并将提取液过滤、浓缩而成。
所述组合物在制备抑制血管生成药物中的应用,是该抑制血管生成药物中含有有效剂量的合欢属植物提取物的组合物及常规药用载体和/或赋形剂。
所述的应用,为所述组合物被制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、膏剂、霜剂或乳剂。
所述的应用,为所述组合物是用于预防和/或治疗至少一种选自下述之一的疾病:癌症和/或癌症转移,血管瘤,血管纤维瘤,新生血管性青光眼,糖尿病视网膜病变,早熟视网膜病及视网膜静脉闭塞,视网膜变性,晶体后纤维组织增生,颗粒性结膜炎,血管生成引起的角膜疾病,更年期黄斑和黄斑变性,牛皮癣,老年盘状斑变性及风湿性关节炎,银屑病,毛细管扩张,脓性肉芽肿,伤口愈合中抑制斑痕形成,动脉粥样硬化,脂溢性皮炎和痤疮。
所述的应用,为该组合物有抗肿瘤血管生成及其他与血管生成有关疾病治疗、预防的用途。
所述的应用,为该组合物还有用于肿瘤化疗和/或辅助化疗的用途。
所述组合物在制备抑制血管生成的保健食品中的应用,是该组合物用于抑制血管生成的保健食品组合物。
所述组合物在制备抑制血管生成的化妆品中的应用,是该组合物用于抑制血管生成的化妆品组合物。
包含合欢属植物提取物的组合物可用常规方法制备。在实际需要的时候,在包含合欢属植物提取物的组合物中可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂,赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、乳化剂、渗透压调节剂,必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。
本发明中包含合欢属植物提取物的组合物可以按常规的制剂工艺,单独使用或与其它药物配合制备成在临床上可以使用的各种不同剂型的药物,例如注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、膏剂、霜剂或乳剂等多种形式。
本发明中包含合欢属植物提取物的组合物可以应用于抗肿瘤血管生成及其他与血管生成有关疾病治疗、预防,还可以用于肿瘤化疗和/或辅助化疗。更具体地,本发明提供了一种用于药物、食品、化妆品的抑制血管生成的组合物。
本发明的有益效果:本发明巧妙地以血管生成作为治疗疾病的靶点,首次提出包含合欢属植物提取物的组合物具有抑制血管生成的作用,并将其作为用于肿瘤血管生成及其他与血管生成有关的疾病预防、治疗的药物,其特点是剂量小,疗效高,副作用小,特异性好,不易产生耐药性。本发明以血管生成理论为研究背景,为今后阐述中药有效部位的作用机制,发展中医药理论新的方向,发现新的药物作用靶点提供重要的科学依据。
附图说明
图1合欢属植物提取物对HMEC细胞体外增殖的抑制作用
图2合欢属植物提取物抑制鸡胚尿囊膜血管生成(CAM实验)
图3合欢属植物提取物对体内Matrigel plug法血管的抑制作用
图4合欢属植物提取物对血管内皮细胞中CD31分子表达的抑制作用
图5合欢属植物提取物对体内肿瘤的抑制作用
图6合欢属植物提取物对人血管内皮细胞迁移能力的抑制作用
具体实施方式
本发明提供的合欢属植物提取物的制备工艺如下:首先将合欢属植物用75%乙醇回流提取,将提取液减压回收乙醇,浓缩干燥后得到合欢属植物提取物。
实施例1:合欢属植物提取物对人血管内皮细胞增殖的抑制作用。
将人血管内皮细胞(HMEC,法国国家卫生医学研究所惠赠)置于含1mmol谷氨酰胺,1μg/mL氢化可的松,10ng/mL表皮生长因子(EGF)和15%小牛血清的MCDB-131培养液中培养(37℃、5%CO2、95%湿度)。取对数生长期细胞,以105cell/mL细胞接种于96孔板,100μL/孔,每组设4个平行孔,放置于37℃、5%湿化CO2的培养箱过夜。加不同浓度(10-100μg/mL)合欢属植物提取物,以水为阴性对照,培养48小时后,去掉上清液,每孔轻轻地加入10%三氯醋酸100μL固定,静置5min后移到4℃放置1h后倒掉固定液,用去离子水洗5次,空气干燥。每孔加入0.4%磺酰罗丹明B(SRB)100μL 37℃培养箱放置30min,用1%醋酸液洗5次,空气干燥。加100μL 10Mm Tris碱液(pH10.5)溶解,自动分光光度仪在531nm波长处测定每个小孔的吸光度值(A)。上述实验重复3次。抑制率(%)计算如下:
结果如图1所示,合欢属植物提取物对人血管内皮细胞增殖有抑制作用,其半数抑制量为30μg/mL。
实施例2:合欢属植物提取物对血管形成能力的抑制作用。
2.1合欢属植物提取物抑制鸡胚尿囊膜血管生成(CAM实验)
白皮种蛋,参考张树成的方法【19、张树成,吴志奎,王蕾,等.研究中药血管生成活性和作用的鸡胚绒毛尿囊膜试验模型的应用.中国中医基础医学杂志,1999,5:16-19.】制备鸡胚尿囊膜。用打孔器制备直径为6mm的微孔滤膜圆片,湿热高压消毒。设合欢属植物提取物给药组(10μL、1g生药/mL)和生理盐水阴性对照组。将药物滴于滤纸上,制成药膜,吹干备用。鸡胚培养3d后分组,将药膜贴于CAM的部位。加药48h后,观察药膜周围的血管数,并摄影记录。
结果如图2所示,生理盐水阴性对照组CAM血管生成非常明显,整体呈鲜红色,血管在药膜下呈放射状生长,血管粗大,血液充盈,血管分支较多,毛细血管密度大。合欢属植物提取物给药组则明显抑制了血管生成,放射状生长的血管数目大为减少,血管主要以零星、杂乱、叶脉样等表现形式存在,血管细小,稀疏,血管分支少,血管色淡浅黄,在药膜片下及周围局部鲜有血管区,或者血管断裂或消失。
2.2体内Matrigel plug法血管抑制试验
按【20、Passaniti A,Taylor RM,Pili R,Guo Y,Long PV,Haney JA,Pauly RR,Grant DS,Martin GR.A simple,quantitative method for assessing angiogenesis andantiangiogenic agents using reconstituted basement membrane,heparin,andfibroblast growth factor.Lab Invest.1992,67:519-528.】方法,取4℃下液态Matrigel200μL按不同实验分组,分别与不同药物混合,分别注射入BALB/c小鼠的腋部皮下,4只小鼠为一组。7天后处死小鼠,取出Matrigel小包,10%中性福尔马林固定,包埋,切片,HE染色后,显微镜下摄片(×200)。实验药物分组为:纯Matrigel(空白组),Matrige+bFGF(碱性成纤维细胞生长因子,0.1μg)(对照组),Matrigel+bFGF+甘草提取物(100μL、1g生药/mL)(阴性对照组),Matrigel+bFGF+合欢属植物提取物(100μL、1g生药/mL)(实验组)。
结果如图3所示,bFGF能够明显诱导形成丰富的微血管,甘草提取物对此种血管生成没有丝毫作用。而合欢属植物提取物能明显抑制Matrigel种植体内的微血管生成,可明显减少侵入Matrigel小包的内皮细胞数量。与对照组相比,差异有显著性(P<0.001)。
2.3体内荷瘤模型小鼠分析合欢属植物提取物对血管内皮细胞中CD31分子表达的影响
人类结肠癌细胞系C51colon细胞,用PBS制成细胞悬液,以200万cell/200μL接种至8周大BALB/cAnN-nu裸鼠的右股部皮下。待瘤体生长至5mm×5mm大小时,随机分成三组:生理盐水对照组,甘草提取物阴性对照组(0.4mL、1g生药/mL),合欢属植物提取物用药组(0.4mL、1g生药/mL),每组5只。连续灌胃给药60天,每天记录瘤体的长径和短径。用药期间,小鼠未出现不良反应。处死小鼠后,取出肿瘤并制成冰冻切片,应用SABC法对上述冰冻切片进行CD31免疫组织化学染色,显微镜下观察(×200)。
CD31为血小板内皮细胞黏附分子-1(PECAM-1),由于在发育和成熟个体的所有血管内皮细胞都有高度表达CD31,因此常常被用来作为血管内皮细胞的标志物【21、高媛,高建恩,孙启鸿.血小板内皮细胞黏附分子-1(PECAM-1)的研究进展.细胞与分子免疫学杂志,2005,21:40-42.】。内皮细胞相互间的黏附是血管生成的基本过程,CD31是介导内皮细胞黏附的重要分子。体内外实验表明,用抗CD31的抗体作用于鼠的内皮细胞,可以阻断由鼠的毛细血管内皮细胞参与的新生血管形成【22、Delisser HM,Christofidou-Solomidou M,Strieter RM,et al.Involvement of endothelial PECAM-1/CD31 in angiogenesis.Am J Pathol,1997,151:671-677】。结果如图4所示,生理盐水对照组的肿瘤微血管呈棕褐条索状分布,血管密集。合欢属植物提取物用药组的肿瘤呈棕褐色条索状微血管明显稀少,几乎观察不到,说明合欢属植物提取物能明显抑制肿瘤细胞中CD31的表达,具有抑制新生血管形成的作用。甘草提取物对新生血管形成没有抑制作用。
实施例3:Lewis肺癌转移模型小鼠分析合欢属植物提取物对体内肿瘤的抑制作用
选取体重为14-18g的雄性近交系C57BL/6小鼠15只,将制备好的Lewis肺癌细胞悬液以0.2mL/只接种于小鼠右腋皮下(约含活细胞数1×106个)。随机分为3组,每组5只:生理盐水对照组,甘草提取物阴性对照组(0.4mL、1g生药/mL),合欢属植物提取物用药组(0.4mL、1g生药/mL)。在接种Lewis肺癌细胞后4天后,每天灌胃给药1次,共治疗4周。第28天将所有小鼠断颈处死,将肿瘤完整取下,取部分肿瘤组织,常规石蜡切片或冰冻切片,HE染色,光镜下观察(×100)。
结果如图5所示,生理盐水组的肿瘤细胞大小不等,病灶大,移行性明显,核分裂相多见,可见瘤巨细胞,间质血管丰富。甘草提取物组肿瘤细胞形态与生理盐水组无明显差异。合欢属植物提取物给药组能够明显改善和稳定病灶,核分裂大为减少,移行性不明显,间质血管明显减少。
实施例4:合欢属植物提取物对人血管内皮细胞迁移能力的抑制作用
将24孔板呈60°倾斜,在每孔底部的1/2处加1%的琼脂糖,待凝固后用培养基洗涤,没有琼脂糖的一侧加HMEC细胞,每孔105个细胞。细胞贴壁后分别加生理盐水阴性对照组和不同浓度(10~60μg/mL)的合欢属植物提取物,72h后用倒置显微镜记录每一组内皮细胞向另一半迁移的数量。
结果如图6所示,阴性对照组细胞的迁移数量较高,而加入合欢属植物提取物加以干预后,细胞迁移数明显减少且呈浓度依赖关系。说明合欢属植物提取物可能通过抑制血管内皮细胞的迁移而抑制新生血管的生成。
本发明是结合最佳实施例进行描述的,然而在阅读了本发明的上述内容后,本领域技术人员能领会在公开的实施例中作许多改变也可获得相同或类似的结果,而不超出本发明的构思、精神和范围。更具体地说,显然有些化学和生理性的相关试剂可替代本文所公开的试剂而得到相同或类似的结果。所有类似的取代和修饰对本领域技术人员来说,显然都认为是本发明的精神、范围和构思及权利要求范围内的,即所有上述这些等价形式都同样落于本发明的权利要求书所限定的范围。
Claims (6)
1.一种含有合欢属植物提取物的组合物在制备抑制血管生成药物中的应用,其特征是该抑制血管生成药物中含有有效剂量的合欢属植物提取物的组合物及常规药用载体和/或赋形剂。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述组合物被制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、膏剂、霜剂或乳剂。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述组合物是用于预防和/或治疗至少一种选自下述之一的疾病:血管瘤,血管纤维瘤。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征是该组合物在制备抗血管生成及其他与血管生成有关疾病治疗、预防药物的用途。
5.一种含有合欢属植物提取物的组合物在制备抑制血管生成的保健食品中的应用,其特征是该组合物用于抑制血管生成的保健食品组合物。
6.一种含有合欢属植物提取物的组合物在制备抑制血管生成的化妆品中的应用,其特征是该组合物用于抑制血管生成的化妆品组合物。
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