CN103524427A - 一种三甲氧苄氨嘧啶半抗原制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种三甲氧苄氨嘧啶半抗原，相应的人工抗原和单克隆抗体，同时本发明也公开了所述三甲氧苄氨嘧啶半抗原，相应的人工抗原和单克隆抗体的制备方法及其应用。本发明提供的单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC NO.6065的细胞株D-3-2分泌产生的。本发明提供的三甲氧苄氨嘧啶半抗原与载体蛋白连接可以得到三甲氧苄氨嘧啶抗原。本发明的三甲氧苄氨嘧啶人工抗原，通过免疫动物可产生针对三甲氧苄氨嘧啶的特异性抗体，可用于制备检测食品中三甲氧苄氨嘧啶残留的胶体金试纸条，具有简单、快速、处理样品量大、灵敏度高、特异性强等诸多优点。

Description

一种三甲氧苄氨嘧啶半抗原制备方法及其应用
技术领域
本发明属于食品安全技术领域，具体涉及一种三甲氧苄氨嘧啶半抗原、抗原、单克隆抗体制备方法，并应用于对牛奶中三甲氧苄氨嘧啶的快速测定。 
背景技术
三甲氧苄氨嘧啶：别名磺胺增效剂，抗菌增效剂，甲氧苄胺嘧啶，三甲氧苄二氨嘧啶，英文名Trimethoprim(Synaprim，TMP)。化学名称为5-[(3，4，5-三甲氧基苯基)-甲基]-2，4-嘧啶二胺[5-(3,4,5-trimetoxybenzene)methy-2,4-pyrimidine diamine]，属于二氨嘧啶类(亦即苄氨嘧啶类)化合物。 
本品由Hitc1ings·G·H等于1959年合成，国内于1972年开始生产，主要由关键中间体3,4,5-三甲氧基苯甲醛（TMB）经缩合、环合反应而得，目前国内已有许多药厂生产。磺胺增效剂为白色或类白色结晶性粉末，无臭、味苦。在氯仿中略溶，在乙醇或丙酮中微溶，在水中几乎不溶，在冰醋酸中易溶。本品的熔点为199～203℃。磺胺增效剂属抑菌剂，亲脂性弱碱，临床上其注射剂为微黄色或者无色。 
它是一种抗菌增效剂，磺胺类药物单独使用，会使细菌很易产生耐药性，与磺胺类药物组成复方制剂，可使细菌的叶酸代谢受到双重阻断，使抗菌谱扩大、抗菌活性增强，从抑菌作用变为杀菌作用，对多数革兰氏阳性菌和阴性菌有效，在兽医临床上应用十分广泛。用于治疗尿路感染、呼吸道感染、菌莉和肠炎等一般用作磺胺类药物的增效剂，广泛用于各类磺胺制剂中，最近的研究表明，磺胺增效剂对青霉素类、氨基糖苷类等其它抗生素和合成抗生素均有一定的增效作用，故又称为广谱抗菌增效剂。因其水溶性差，现一般仅与磺胺类药联用作为口服制剂应用于临床，也因而大大限制了其在临床的应用范围和其它给药途径。 
磺胺增效剂可发生瘙痒、皮疹，临床也有发现服用头孢羟氨苄/TMP致过敏性休克的报道，也有发生恶心、呕吐、腹泻等胃肠道反应。磺胺增效剂对小白鼠的半数致死量(LD50)为2500毫克/千克体重。大剂量使用时，可影响叶酸代谢和作用，可致白细胞减少和血小板减少，故长期使用时必须注意。 
为了保护人类健康，各国对动物源性食品中甲氧苄氨嘧啶残留量的检测很重视，均制定了严格的限量要求。例如：欧盟、香港政府规定牛、猪和家禽组织中残留限量为0.05mg/kg。我国农业行业标准《无公害食品水产品中渔药残留限量》(NY 5070-2002)中规定了以磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑4种药物按总量计最大残留限量为100μg/kg，甲氧苄啶最大残留限量为50μg/kg。 
目前磺胺类及其增效剂残留的测定方法有高效液相色谱法配合紫外检测器、荧光检测器和质谱检测器，但大多采用国外产的净化小柱处理样品，增加了测定成本。目前尚无关于磺胺类药物增效剂的系统检测方法，该方法的建立为监控动物源性食品中磺胺类药物增效剂残留提供了技术支持。 
发明内容
本发明的目的是提供一种三甲氧苄氨嘧啶半抗原、抗原制备方法及其应用。 
本发明提供的三甲氧苄氨嘧啶半抗原，是式(1)所示化合物： 
Figure BDA0000184588521
式1。 
本发明还公开式(1)所示化合物的制备方法，包括如下步骤： 
取0.58 g三甲氧苄氨嘧啶、0.40 g马来酸酐和1 mL吡啶溶解于10 mL二甲基亚砜（DMSO）中，在40℃下搅拌反应12小时，蒸除溶剂，柱层析后在乙醇-水体系中重结晶得到三甲氧苄氨嘧啶单马来酸酰胺， 即为式(1)所示化合物。 
本发明提供的三甲氧苄氨嘧啶抗原，是将式(1)所示化合物和载体蛋白偶联得到的偶联物。 
所述三甲氧苄氨嘧啶抗原的结构示意图见图3。 
本发明还公开所述三甲氧苄氨嘧啶抗原的制备方法，包括如下步骤： 
（1）取8.5mg三甲氧苄氨嘧啶半抗原，溶解于1mL二甲基甲酰胺（DMF）中； 
（2）取15mg碳化二亚胺（EDC）用0.2mL去离子水充分溶解后加入半抗原溶解液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A； 
（3）称取载体蛋白30~40mg，使之充分溶解在2.8mL pH为7.2的PBS中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h； 
（4）用0.01mol/L PBS在4℃透析3d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质； 
（5）分装，于-20℃保存备用。 
常用载体蛋白均可采用，如牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)，人血清白蛋白（HSA），鼠血清白蛋白（MSA），甲状腺蛋白（TG）或血蓝蛋白（KLH）等。 
所述三甲氧苄氨嘧啶免疫抗原可以作为免疫原制备三甲氧苄氨嘧啶特异性抗体。 
本发明公开保藏编号为CGMCC N0.6065的杂交瘤细胞株D-3-2（磺胺增效剂单克隆抗体杂交瘤细胞株D-3-2）。 
杂交瘤细胞株D-3-2已于2012年05月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏登记号为CGMCC No.6065。 
应用三甲氧苄氨嘧啶抗原制备得到的抗体也属于本发明的公开范围。是由保藏编号为CGMCC N0.6065的杂交瘤细胞株D-3-2分泌产生的。 
所述抗体具体可为单克隆抗体。 
式(1)所示化合物、所述三甲氧苄氨嘧啶抗原、所述抗体均可应用于检测三甲氧苄氨嘧啶。 
应用三甲氧苄氨嘧啶抗原和三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体制备得到的微孔式检测试纸条也属于本发明的公开范围。 
所述微孔式检测试纸条，是由胶体金微孔试剂条和检测试纸条组成，试纸条由PVC底板、附着在底板上依次紧密相连的样本吸收垫、反应膜和吸水垫。其中反应膜上包被有三甲氧苄氨嘧啶-载体蛋白偶联物构成的检测线(T)和包被羊抗鼠IgG构成的质控线(C)。胶体金微孔试剂条由8个微孔构成，每个微孔中均冻干有可与三甲氧苄氨嘧啶特异性反应的单克隆抗体。 
本发明依靠免疫学、免疫化学基本原理和残留分析技术手段，设计、合成小分子目标分析物半抗原，并与载体蛋白偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备针对小分子分析物的特异性抗体。利用抗原抗体的特异性免疫学反应，定性的检测样本中微量小分子目标分析物，具有特异、灵敏、准确、快速、方便、廉价等特点。本发明制备方法简便可行、成本较低，半抗原产率较高。本发明克服了现有检测技术中对三甲氧苄氨嘧啶样品预处理复杂、耗时、且需要大量有机溶剂萃取，以及在检测过程中要用到精密昂贵的检测仪器而不适于推广使用等缺点。本发明的三甲氧苄氨嘧啶人工抗原，通过免疫动物可产生了针对三甲氧苄氨嘧啶的特异性抗体，用于快速检测食品中的三甲氧苄氨嘧啶残留，具有简单、快速、处理样品量大、灵敏度高、特异性强等诸多优点。 
附图说明
图1为三甲氧苄氨嘧啶半抗原合成路线图。 
图2为三甲氧苄氨嘧啶半抗原核磁图谱。 
图3为三甲氧苄氨嘧啶抗原的结构示意图。 
图4为本发明纯化后三甲氧苄氨嘧啶抗体SDS-PAGE电泳图谱。 
图5为本发明单克隆抗体与三甲氧苄氨嘧啶标准品的反应曲线示图。 
图6为本发明胶体金试纸条的检测效果示图。 
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明， 均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。 
产率=实际得到的产物的质量/理论上得到产物的质量×100%。 
实施例1、三甲氧苄氨嘧啶半抗原的制备和鉴定 
一、三甲氧苄氨嘧啶半抗原的制备 
取0.58 g三甲氧苄氨嘧啶、0.40 g马来酸酐和1 mL吡啶溶解于10 mL二甲基亚砜（DMSO）中，在40℃下搅拌反应12小时，蒸除溶剂，柱层析后在乙醇-水体系中重结晶得到三甲氧苄氨嘧啶单马来酸酰胺，即为式(1)所示化合物。产率为66%。 
二、三甲氧苄氨嘧啶半抗原的鉴定 
将制备得到的三甲氧苄氨嘧啶半抗原进行核磁鉴定。 
核磁图见图2。图谱显示新增加的12.0左右的羧基信号峰以及6~7之间的烯烃信号峰说明半抗原合成成功。 
实施例2、三甲氧苄氨嘧啶人工抗原的制备和鉴定 
一、三甲氧苄氨嘧啶免疫抗原（TMP-BSA）的合成 
（1）取8.5mg三甲氧苄氨嘧啶半抗原，溶解于1mL二甲基甲酰胺（DMF）中； 
（2）取15mg碳化二亚胺（EDC）用0.2mL水充分溶解后于加入半抗原溶解液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A； 
（3）称取牛血清白蛋白40mg，使之充分溶解在2.8mL PH为7.2的PBS中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h； 
（4）用0.01mol/LPBS在4℃透析3d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质； 
（5）分装，于-20℃保存备用。 
二、三甲氧苄氨嘧啶包被抗原（TMP-OVA）的合成 
（1）取8.5mg三甲氧苄氨嘧啶半抗原，溶解于1mL二甲基甲酰胺（DMF）中； 
（2）取15mg碳化二亚胺（EDC）用0.2mL水充分溶解后于加入半抗原溶解液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A； 
（3）称取卵清蛋白30mg，使之充分溶解在2.8mL PH为7.2的PBS中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h； 
（4）用0.01mol/LPBS在4℃透析3d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质； 
（5）分装，于-20℃保存备用。 
三、三甲氧苄氨嘧啶人工抗原的鉴定 
按合成三甲氧苄氨嘧啶人工抗原反应所用的半抗原、载体蛋白与偶联产物的比例，分别进行紫外(200~400nm)扫描鉴定，并通过比较三者在同一波长下的吸光值计算其结合比。产物的紫外光谱图与载体蛋白相比发生了变化，说明半抗原已经与载体蛋白成功偶联制得三甲氧苄氨嘧啶人工抗原。经计算，三甲氧苄氨嘧啶半抗原分子与BSA分子的结合比为13.7:1，三甲氧苄氨嘧啶半抗原分子与OVA分子的结合比为16.2:1。 
实施例3、单抗的制备和鉴定 
一、三甲氧苄氨嘧啶单抗的制备 
1、用上述制备出的免疫抗原(TMP-BSA)按100μg/只，以生理盐水溶解免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6~8周龄Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，分别追加免疫一次，融合前3天以免疫复合物100μg/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次。 
2、按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)混合，然后在45秒内缓慢加入预热的融合剂(PEG4000)进行融合，用HAT培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37℃，5％CO2培养箱中培养，5天后用HT培养基半换液，9天时进行全换液。 
3、细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初选采用间接ELISA方法，以包被抗原(预先用方正法常规滴定其最佳包被浓度和阳性血清稀释度)包被酶标板，加入被 测孔培养上清，孵育，清洗后加入羊抗鼠IgG-HRP和IgM-HRP，OPD进行显色反应。筛选出的阳性孔再用间接竞争ELISA方法筛选，先将细胞上清与100μg/mL的三甲氧苄氨嘧啶等体积混合，37℃水浴作用30min，再加入到包被好的酶标板中。同时用PBS取代三甲氧苄氨嘧啶作对照，其余步骤同上。若经三甲氧苄氨嘧啶阻断后的OD450nm值下降到对照孔的50％以下，则判为阳性，经2~3次检测都为阳性的孔，立即用有限稀释法进行亚克隆化。 
4、将2~3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液用间接ELISA测定效价，冻存；并取8~10周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5mL/只，7~10日后腹腔注射杂交瘤细胞1~2×106/只，7~10日后抽取小鼠腹水，离心取上清，测定效价，并冻存备用。 
5、最后获得稳定分泌抗三聚氰胺单克隆抗体细胞株D-3-2，该细胞株已于2012年05月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏登记号为CGMCC No. 6065。 
二、三甲氧苄氨嘧啶单抗鉴定 
1、抗体敏感性 
采用间接竞争ELISA法测定纯化的抗体的阻断率。用PBS溶解三甲氧苄氨嘧啶标准品，再稀释成一系列浓度梯度（81.0、27.0、9.0、3.0、1.0、0μg/L)，加入到包被TMP-OVA的酶标板中，每个浓度标准品50μL/孔，然后分别加入工作浓度单克隆抗体50μL/孔，同时设置0标准孔和空白对照孔，25℃温箱中反应30min后洗涤拍干，加入1:2000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，50μL/孔，25℃温箱中反应30min后洗涤拍干，加底物显色液50μL/孔，25℃温箱中避光反应15min，最后，每孔加入50μL 2mo1/L的硫酸终止反应后，读取OD450值，得出三甲氧苄氨嘧啶各浓度标准品溶液的吸光度值(B)，以吸光度值(B)除以零标准品吸光度值(B0)再乘以100%，得到百分吸光度值，以三甲氧苄氨嘧啶标准品浓度对数值(lgC)为x轴，百分吸光率为Y轴，绘制标准曲线，得出本发明中抗体的50%的抑制率浓度(IC50)为2.0μg/L，回归方程为y = -37.229x+71.212，R2为0.9554，结果见图2。 
2、抗体特异性 
采用间接竞争性ELISA法进行测定，参试物为磺胺类药物、氯霉素、氨基糖苷类药物、氟喹诺酮类药物、四环素类药物，以单抗对三甲氧苄氨嘧啶的IC50与对竞争物的IC50之比的百分数为其交叉反应率(CR)。单克隆抗体与所选参试物交叉反应率均小于1%，结果见表1。 
表1 单克隆抗体特异性检测结果 
竞争物 IC50(μg/L) 交叉反应率（%）
三甲氧苄氨嘧啶 2.0 100
磺胺类药物 2351 <0.1
氯霉素 2612 <0.1
氨基糖苷类药物 2348 <0.1
氟喹诺酮类药物 2217 <0.1
四环素类药物 2109 <0.1
实施例4、三甲氧苄氨嘧啶的试纸及其制备与应用 
一、试纸的结构 
1）试纸条： 
样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜依次按顺序黏贴在所述底板上，样品吸收垫的末端与反应膜始端相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐，试纸样品吸收垫端黏贴有保护膜，保护膜覆盖在样品吸收垫的检测端，在检测端保护膜上印有MAX标记线，检测线包被有TMP-OVA偶联物，质控线包被有羊抗鼠抗抗体。 
底板为PVC底板，样品吸收垫为吸滤纸，反应膜为硝酸纤维素膜，吸水垫为吸水纸，保护膜为PE材质保护膜。 
2）微孔试剂条 
微孔试剂条具有胶塞，微孔中冻干有三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体-胶体金标记物。 
3）将试纸条和微孔试剂条装入具有密封盖的塑料试剂桶，将塑料试剂桶放置于试剂盒盒体内的固定用具中。 
二、检测试剂的制备 
1）胶体金的制备 
用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0.01%（质量百分含量），置磁力加热棒搅拌器上搅拌煮沸，每100mL 0.01%氯金酸加入2.5 mL 1%柠檬酸三钠，继续搅拌加热反应至液体呈红色时停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。 
2）三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体-胶体金标记物的制备 
在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾调胶体金的pH值至7.0，按50~100μg抗体/mL胶体金的标准向胶体金溶液中加入上述三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体，继续搅拌混匀30min，加入10%BSA至BSA在胶体金溶液中的终浓度为1%（体积百分含量），静置30min。12000rpm、4℃离心30min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/20的复溶缓冲液将沉淀重悬，得到的三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体-胶体金标记物溶液的浓度为50μg单抗/mL溶液，置4℃备用。 
复溶缓冲液：含酪蛋白、吐温-80的0.02mol/L、pH7.2的磷酸盐溶液，其中酪蛋白在复溶缓冲液中的终浓度为0.05~0.1％（体积百分含量），吐温-80在复溶缓冲液中的终浓度为0.05~0.15％（质量百分含量）。 
3）将三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体-胶体金标记物冻干到微孔试剂上 
向微孔试剂微孔板中加入100μL三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，冷阱温度为-70℃条件下，预冻4h后，再冻干14h，即可取出，得到冻干有三甲氧苄氨嘧啶单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂； 
4）样品吸收垫的准备：将样品吸收垫置于含牛血清白蛋白（牛血清白蛋白在缓冲液中的终浓度为0.5%（体积百分含量））、pH为7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃烘2h备用； 
5）反应膜的制备 
包被过程：用磷酸缓冲液将TMP-OVA偶联物稀释到10mg/mL，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测区，包被量为1.0μg/cm2；用0.01M、pH为7.4的PBS缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释到200μg/mL，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控区，包被量为1.0μg/cm2。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用。 
三、试纸条检测试验 
1) 牛奶样品前处理及检测 
（1）实验前请先仔细阅读操作说明书。使用前将本试纸条和待检奶样恢复至室温。 
注：牛奶样品必须为均匀液体，不能有结块、发酸和沉淀。 
（2）从原包装中取出试剂桶，打开后取出所需数目的微孔试剂和试纸条，并做好标记。请在60min内尽快使用。检测试剂取出后，请立即盖好试剂桶盖。 
（3）用微量移液器吸取200μL待检牛奶样品溶液于微孔中，缓慢抽吸且充分与微孔中试剂混匀。 
（4）室温（20~25℃）孵育5min后，将标记好的试纸条插入微孔中——印有“MAX”线端朝下，使之充分浸入溶液中。 
（5）再次室温（20~25℃）孵育5min后，取出试纸条并根据示意图判定结果，其他时间判定无效。 
2)结果判断 
阴性（-） ：C线显色，T线显色，无论颜色深浅，均表示牛奶样品中三甲氧苄氨嘧啶浓度低于检测限。 
阳性（+） ：C线显色，T线不显色，表示牛奶样品中三甲氧苄氨嘧啶浓度高于检测限。 
无   效  ：未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸条已变质失效。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试纸条重新测试。 
四、试纸条质量检测 
3)试纸条的灵敏度和特异性 
向阴性牛奶样品中添加终浓度为0、25、50、100μg/L三甲氧苄氨嘧啶标准品溶液和500μg/L的磺胺类、氯霉素类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类和四环素类溶液。用微量移液器吸取200μL添加牛奶样品溶液于微孔中，缓慢抽吸且充分与微孔中试剂混匀。室温（20~25℃）孵育5min后，将标记好的试纸条插入微孔中—印有“MAX”线端朝下，使之充分浸入溶液中。再次室温（20~25℃）孵育5min后，取出试纸条并根据示意图判定结果，每个浓度重复5次。结果显示，胶体金免疫层析试验对添加三甲氧苄氨嘧啶标准品浓度为0、25μg/L的牛奶溶液检测为阴性，对添加三甲氧苄氨嘧啶标准品浓度为50、100μg/L及以上的牛奶溶液检测为阳性，500μg/L的磺胺类、氯霉素类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类和四环素类溶液检测均为阴性，表明胶体金免疫层析检测试纸条具有良好的敏感性和特异性。 
4)试纸条的批内和批间重复实验 
将同批和不同批次的试纸条分别检测添加三甲氧苄氨嘧啶标准品浓度为0、25、50、100μg/L的牛奶溶液，每个浓度添加样品5份，每份样品重复测试5次，共使用3个批次试纸条进行检测，观察其重复性。经三个批次试纸条验证，三甲氧苄氨嘧啶快速检测试纸条的批内和批间重复性为100%，假阳性率和假阴性率均为0。 
5）试纸条稳定实验 
将包装好的试纸条分别保存于2~8℃和37℃，观察其稳定性。保存于2~8℃的试纸条每隔1个月取出12条，分别检测添加三甲氧苄氨嘧啶标准品浓度为0、25、50、100μg/L的系列牛奶溶液，每个浓度3个重复。保存于37℃的试纸条每7天取出12条，分别检测添加三甲氧苄氨嘧啶标准品浓度为0、25、50、100μg/L的系列牛奶溶液，每个浓度3个重复。2~8℃保存的试纸条在每隔1个月的检验中，13个月以前，显色程度无明显改变。而37℃保存的试纸条在第98天检测时出现样液迁移时间减慢、金标垫释放金标抗体不完全、灵敏度降低等现象。稳定性试验结果表明，本试纸条在2~8℃条件下阴凉干燥处可保存1年。 

Claims (7)

1.一种三甲氧苄氨嘧啶半抗原，为式(1)所示化合物：
Figure FDA0000184588511
式1。
2.式(1)所示化合物的制备方法，包括如下步骤：
取0.58 g三甲氧苄氨嘧啶、0.40 g马来酸酐和1 mL吡啶溶解于10mL DMSO中，在40℃下搅拌反应12小时，蒸除溶剂，柱层析后在乙醇-水体系中重结晶得到三甲氧苄氨嘧啶单马来酸酰胺，即为式(1)所示化合物。
3.一种三甲氧苄氨嘧啶抗原，是将式(1)所示化合物和载体蛋白偶联得到的偶联物。
4.权利要求3所述三甲氧苄氨嘧啶抗原的制备方法，包括如下步骤：
（1）取8.5mg三甲氧苄氨嘧啶半抗原，溶解于1mL DMF中；
（2）取15mg EDC用0.2mL水充分溶解后加入半抗原溶解液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；
（3）称取载体蛋白30~40mg，使之充分溶解在2.8mL pH为7.2的PBS中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h；
（4）用0.01mol/L的PBS在4℃透析3d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；
（5）分装，于-20℃保存备用。
5.权利要求3所述三甲氧苄氨嘧啶抗原在制备三甲氧苄氨嘧啶特异性抗体中的应用。
6.应用权利要求3所述三甲氧苄氨嘧啶抗原制备得到的特异性抗体。
7.权利要求1所述化合物、权利要求3所述三甲氧苄氨嘧啶抗原、权利要求6所述抗体在检测三甲氧苄氨嘧啶中的应用。
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