CN113480474A - 氟啶虫胺腈半抗原及其制备方法、抗原、抗体及其应用 - Google Patents

氟啶虫胺腈半抗原及其制备方法、抗原、抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了氟啶虫胺腈半抗原、制备该半抗原的方法，由该半抗原偶联载体蛋白得到的氟啶虫胺腈抗原、利用该氟啶虫胺腈抗原免疫动物得到的氟啶虫胺腈抗体、上述氟啶虫胺腈半抗原、抗原、抗体在免疫学检测中的应用，由此制备的氟啶虫胺腈胶体金层析检测装置，以及利用上述装置检测样品中氟啶虫胺腈的方法。本发明提供的制备方法，使用的化学试剂容易得到、操作过程简单、反应产率较高、并且检测成本较低。本发明提供的检测装置能够快速、准确地检测出蔬菜或水果中氟啶虫胺腈的残留含量，能满足监管部门、检测机构现场监督执法的需要。本发明的检测方法具有敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、保质期长的优点。

Description

氟啶虫胺腈半抗原及其制备方法、抗原、抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种氟啶虫胺腈半抗原及其制备方法、氟啶虫胺腈抗原、氟啶虫胺腈抗体以及上述半抗原、抗原和抗体在免疫学检测中的应用。
背景技术
氟啶虫胺腈(Sulfoxaflor)，是砜亚胺烟碱类杀虫剂的代表，化学名称：[1-[6-(三氟甲基)吡啶-3-基]乙基]-λ4-巯基氨腈，其是由美国陶氏益农公司最新研发的新烟碱类杀虫剂，主要用于防治棉田盲蝽、叶蝉、蚜虫、飞虱等害虫，也可用于果树、蔬菜、苹果、大白菜等作物的害虫防治上。
我国规定氟啶虫胺腈在芸薹属类蔬菜(甘蓝)、瓜类蔬菜、鳞茎类蔬菜(葱)、叶菜类蔬菜(芹菜)中最高临时残留限量值(MRL)分别为0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.7mg/kg、1.5mg/kg，柑橘类水果(柑橘橙)中最高临时残留限量值(MRL)为2mg/kg。目前，氟啶虫胺腈的检验方法有气相色谱法(GC)、液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)、超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS)，上述检测方法具有精度高、分离效率高、选择性好、假阳性率低、重现性好等优点，但操作复杂、设备昂贵，对操作人员技术要求高，且不能立即显示结果等问题，不适用于快速的在线检测和监控。
免疫学检测分析方法是一种以抗原抗体的特异性识别、可逆性结合反应为基础的分析方法，具有灵敏度高、特异性高、对仪器的要求不高、快速、操作简便、成本低等优点，目前被广泛地用于食品等中的有害物质的检测中。然而，建立免疫学检测分析技术并将其应用于检测氟啶虫胺腈农药残留量的关键技术在于能够获取到特异性强、灵敏度高的抗体，而要实现这一目标，前提条件就是设计并合成出合适的氟啶虫胺腈半抗原。但是，目前尚未有关于氟啶虫胺腈半抗原合成的相关报道。
因此，本领域亟需设计和开发出一种合适的氟啶虫胺腈半抗原，藉此来实现通过免疫学检测分析方法来检测蔬菜或水果中氟啶虫胺腈农药残留。
发明内容
有鉴于此，本发明设计并合成了一种氟啶虫胺腈半抗原、由此提供了相应的抗原、抗体、及其免疫学检测中的应用，以及包括上述抗原和抗体的免疫学检测装置。
根据本发明的第一方面，本发明提供了一种氟啶虫胺腈半抗原，其中，所述氟啶虫胺腈半抗原的结构如式(I)所示：
Figure BDA0003181873790000021
其中，n为1、2、3、4或5。
根据本发明的第二方面，本发明提供了一种制备本发明的第一方面所述的氟啶虫胺腈半抗原的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
1)使6-三氟甲基烟酸发生羧基的还原反应，得到中间体1：
Figure BDA0003181873790000022
2)使中间体1发生卤代反应，得到中间体2：
Figure BDA0003181873790000031
其中，x为卤素原子诸如F、Cl、Br或I；
3)使中间体2与甲硫醇钠发生取代反应，得到中间体3：
Figure BDA0003181873790000032
4)使中间体3与单氰胺上的氨基发生加成反应，得到中间体4：
Figure BDA0003181873790000033
5)在氧化剂的作用下，使中间体4发生氧化反应，得到中间体5：
Figure BDA0003181873790000034
6)使中间体5与卤代酯发生反应，得到中间体6：
Figure BDA0003181873790000035
其中，所述卤代酯为6-卤代己酸甲酯、6-卤代己酸乙酯、6-卤代己酸丙酯、6-卤代己酸叔丁酯、5-卤代戊酸甲酯、5-卤代戊酸乙酯、5-卤代戊酸丙酯、5-卤代戊酸叔丁酯、4-卤代丁酸甲酯、4-卤代丁酸乙酯、4-卤代丁酸丙酯、4-卤代丁酸叔丁酯、3-卤代丙酸甲酯、3-卤代丙酸乙酯、3-卤代丙酸丙酯、3-卤代丙酸叔丁酯、2-卤代乙酸甲酯、2-卤代乙酸乙酯、2-卤代乙酸丙酯或2-卤代乙酸叔丁酯，
其中，n为1、2、3、4或5；以及
7)使中间体6发生碱性水解反应，得到式(I)所示的化合物。
在一个实施方案中，在步骤1)中，所述还原反应在硼烷二甲硫醚络合物的作用下进行；优选地，将6-三氟甲基烟酸与四氢呋喃(THF)混合，加入硼烷二甲硫醚络合物，反应后，得到中间体1；优选地，6-三氟甲基烟酸、THF、硼烷二甲硫醚络合物的摩尔比为1:(15-20):(1-5)。
在一个实施方案中，在步骤2)中，使中间体1与甲磺酰氯发生卤代反应，得到中间体2；优选地，所述卤代反应的溶剂为三乙胺、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、二氯甲烷；优选地，中间体1与甲磺酰氯的摩尔比为1:(1-5)。
在一个实施方案中，在步骤3)中，所述取代反应的溶剂为极性溶剂；优选地，所述取代反应的溶剂为DMSO、DMF、丙酮、乙腈中的一种或多种的组合；优选地，中间体2与甲硫醇钠的摩尔比为1:(1-5)。
在一个实施方案中，在步骤4)中，将中间体3、单氰胺和二氯甲烷混合，再加入碘苯二乙酸，反应后，得到中间体4；优选地，中间体3与单氰胺的摩尔比为1:(1-2)。
在一个实施方案中，在步骤5)中，所述氧化剂为间氯过氧苯甲酸(mCPBA)、双氧水或过氧苯甲酸；优选地，将乙醇、间氯过氧苯甲酸(mCPBA)和碳酸钾水溶液在-5℃～5℃混合，然后加入中间体4的乙醇溶液，后升温至室温，加入饱和亚硫酸氢钠溶液，反应后，得到中间体5；优选地，中间体4与所述氧化剂的摩尔比为1:(2-5)。
在一个实施方案中，在步骤6)中，将中间体5和THF混合，加入六甲基磷酰三胺(HMPA)，将反应温度降至-80℃～-75℃，然后加入双(三甲基硅烷基)氨基钾，搅拌后加入4-卤代丁酸甲酯，反应后，得到中间体6；优选地，中间体5与所述卤代酯的摩尔比为1:(1-2)。
在一个实施方案中，在步骤7)中，所述碱性水解反应在氢氧化锂的作用下进行；优选地，中间体6与氢氧化锂的摩尔比为1:(1-2)。
根据本发明的第三方面，本发明提供了一种氟啶虫胺腈抗原，其中，所述氟啶虫胺腈抗原包含：本发明的第一方面所述的氟啶虫胺腈半抗原，以及与所述氟啶虫胺腈半抗原偶联的载体蛋白。
根据本发明的第四方面，本发明提供了一种氟啶虫胺腈抗体，其中，所述氟啶虫胺腈抗体为特异性针对本发明的第三方面所述的氟啶虫胺腈抗原的抗体。
根据本发明的第五方面，本发明提供了本发明的第一方面所述的氟啶虫胺腈半抗原、本发明的第三方面所述的氟啶虫胺腈抗原、和/或本发明的第四方面所述的氟啶虫胺腈抗体在免疫学检测中的应用。
根据本发明的第六方面，本发明提供了一种氟啶虫胺腈胶体金层析检测装置，包括试纸条和反应杯，其中，所述试纸条包括反应膜，所述反应膜上有检测区和质控区，并且其中，所述检测区包被有本发明的第三方面所述的氟啶虫胺腈抗原，并且其中，所述反应杯中含有胶体金标记的本发明的第四方面所述的氟啶虫胺腈抗体。
根据本发明的第七方面，本发明提供了一种检测样品中氟啶虫胺腈的方法，所述方法包括：使用本发明的第六方面所述的胶体金层析检测装置对样品中的氟啶虫胺腈进行检测。
本发明提供的氟啶虫胺腈半抗原的制备方法，使用的化学试剂容易得到、操作过程简单、反应产率较高、并且检测成本较低。
本发明利用层析式免疫胶体金原理，通过试纸条中检测线与质控线之间的比色来半定量检测中蔬菜或水果中氟啶虫胺腈的残留含量，该检测装置能够快速、准确地检测出蔬菜或水果中氟啶虫胺腈的残留含量，能满足监管部门、检测机构现场监督执法的需要。
与现有技术相比，本发明提供的免疫学检测方法具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、保质期长等优点。本发明可应用于需要进行氟啶虫胺腈农药残留的快速检测的各个领域中。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的实施方案。
图1是根据本发明的实施方案的胶体金层析检测装置中的试纸条的剖面结构示意图。
图2是根据本发明的实施方案的胶体金层析检测装置中的微孔反应杯的示意图。
图3是根据本发明的实施方案的采用本发明提供的方法检测氟啶虫胺腈的判定结果。
图4是根据本发明的实施方案的氟啶虫胺腈半抗原的质谱图。
图5-1是根据本发明的实施方案的载体蛋白BSA、氟啶虫胺腈半抗原、相应的氟啶虫胺腈抗原的吸收曲线。
图5-2是根据本发明的实施方案的载体蛋白OVA、氟啶虫胺腈半抗原、相应的氟啶虫胺腈抗原的吸收曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施方案和附图，对本发明进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施方案仅仅是本发明的一部分实施方案，而不是全部的实施方案。基于本发明中的实施方案，本领域普通技术人员可以获得的所有其他实施方案，都属于本发明保护的范围。
免疫学检测分析方法是一种利用抗原抗体特异性结合反应来检测各种物质(药物、激素、蛋白质、微生物等)的分析方法，建立小分子化合物的免疫学检测分析方法的关键是能够生产出对小分子化合物具有高亲和力和高特异性的抗体，而生产这样的抗体的关键在于人工抗原或者人工半抗原的设计和合成。具体到本发明，建立氟啶虫胺腈的免疫学检测分析方法的关键步骤就是要设计并合成出合适的氟啶虫胺腈半抗原。
因此，根据本发明的第一方面，本发明提供了一种氟啶虫胺腈半抗原，其中，所述氟啶虫胺腈半抗原的结构如式(I)所示：
Figure BDA0003181873790000071
其中，n为1、2、3、4或5。
如本领域技术人员所理解的，所谓半抗原，是指这样的一类小分子物质：其单独存在时并不能诱导免疫应答，即不具备免疫原性，但当其与大分子蛋白质或非抗原性的多聚赖氨酸等载体交联或结合后可获得免疫原性，从而诱导免疫应答。这类小分子物质可与应答效应产物结合，具备抗原性，即免疫反应性，但是不具有免疫原性。
具体到本发明，容易理解，氟啶虫胺腈半抗原针对氟啶虫胺腈抗体(单抗隆抗体或多克隆抗体均可)具有免疫反应性，但是不具备免疫原性。换言之，氟啶虫胺腈半抗原可以与其相对应的氟啶虫胺腈抗体结合发生抗原-抗体反应；然而，在将该氟啶虫胺腈半抗原接种到动物体内进行免疫时，不能单独刺激动物产生相应的抗体。
然而，由于氟啶虫胺腈小分子(如下式(Ⅱ)所示，CAS号：188425-85-6)上没有可以直接与载体偶联的活性基团，因此需先在氟啶虫胺腈小分子上的适当位置进行适当的化学修饰，以引入合适的连接臂和与载体蛋白偶联的活性基团。但是需要注意的是，该修饰应尽可能地少，并且尽可能多地保留能与抗体结合的位点，并且不同结构的连接臂、不同的偶联方法或连接臂的引入位置，都影响后续建立的免疫学方法检测的灵敏度和特异性。目前，尚未有关于制备氟啶虫胺腈半抗原的相关报道。
Figure BDA0003181873790000081
因此，根据本发明的第二方面，本发明还提供了一种制备本发明第一方面提供的氟啶虫胺腈半抗原的方法，所述方法包括如下步骤：
1)使6-三氟甲基烟酸发生羧基的还原反应，得到中间体1；
2)使中间体1发生卤代反应，得到中间体2；
3)使中间体2与甲硫醇钠发生取代反应，得到中间体3；
4)使中间体3与单氰胺上的氨基发生加成反应，得到中间体4；
5)在氧化剂的作用下，使中间体4发生氧化反应，得到中间体5；
6)使中间体5与卤代酯发生反应，得到中间体6；以及
7)使中间体6发生碱性水解反应，得到式(I)所示的化合物。
在上述制备方法中，具体的反应过程如下所示：
Figure BDA0003181873790000082
其中，n为1、2、3、4或5，x为卤素原子诸如F、Cl、Br或I。
在一个实施方案中，在步骤1)中，在四氢呋喃(THF)溶液中，在硼烷二甲硫醚络合物的作用下，使6-三氟甲基烟酸发生羧基的还原反应，得到中间体1。在一个实施方案中，将6-三氟甲基烟酸与四氢呋喃(THF)混合，加入硼烷二甲硫醚络合物，反应后，得到中间体1。在一个实施方案中，6-三氟甲基烟酸为6-三氟甲基烟酸。更具体地，将6-三氟甲基烟酸与THF搅拌，滴加硼烷二甲硫醚络合物，减压蒸馏至干，得白色固体，再用二氯甲烷和纯化水，室温搅拌，分液，取有机层，水层用二氯甲烷萃取，合并有机层，干燥，过滤，滤液柱层析，得到中间体1。在一个优选的实施方案中，6-三氟甲基烟酸、THF、硼烷二甲硫醚络合物的摩尔比为1:(15-20):(1-5)。
在一个实施方案中，在步骤2)中，在三乙胺、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、二氯甲烷中，使中间体1与甲磺酰氯发生卤代反应，得到中间体2。在一个具体的实施方案中，将中间体1、三乙胺、DMAP、二氯甲烷搅拌，加入甲磺酰氯，使之发生氯代反应，得到中间体2。在一个优选的实施方案中，中间体1与甲磺酰氯的摩尔比为1:(1-5)。
在一个实施方案中，在步骤3)中，在极性溶剂中，使中间体3与甲硫醇钠发生取代反应，得到中间体3。优选地，所述取代反应的溶剂为DMSO、DMF、丙酮、乙腈中的一种或多种的组合。在一个具体的实施方案中，将中间体2和DMSO室温搅拌(溶清)，然后加入甲硫醇钠继续搅拌，往反应液中加入乙酸乙酯和纯化水，室温搅拌,取有机层,水层再用乙酸乙酯萃取，合并有机层，干燥，过滤，滤液柱层析，得到中间体3。在一个优选的实施方案中，中间体2与甲硫醇钠的摩尔比为1:(1-5)。
在一个实施方案中，在步骤4)中，将中间体3、单氰胺和二氯甲烷混合，再加入碘苯二乙酸，反应后，得到中间体4。在一个具体的实施方案中，将中间体3、单氰胺和二氯甲烷搅拌，再加入碘苯二乙酸，室温搅拌，分液，取有机层，水层依次用二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，合并有机层，干燥，过滤，滤液柱层析，分出有机相，蒸干，得到中间体4。在一个优选的实施方案中，中间体3与单氰胺的摩尔比为1:(1-2)。
在一个实施方案中，在步骤5)中，在氧化剂的作用下，使中间体4发生氧化反应，得到中间体5。在一个实施方案中，所述氧化剂为间氯过氧苯甲酸(mCPBA)、双氧水或过氧苯甲酸。在一个实施方案中，将乙醇、间氯过氧苯甲酸(mCPBA)和碳酸钾水溶液在-5℃～5℃混合，然后加入中间体4的乙醇溶液，后升温至室温，加入饱和亚硫酸氢钠溶液，反应后，得到中间体5。更具体地，将乙醇、间氯过氧苯甲酸和碳酸钾水溶液在0℃左右搅拌，再加入中间体4乙醇溶液(7.6g溶于240ml无水乙醇中)继续搅拌，后升温至室温搅拌。往反应液中加入饱和亚硫酸氢钠溶液,室温搅拌，减压蒸馏，除去部分溶剂(乙醇)，剩余物中依次用乙酸乙酯、二氯甲烷萃取，合并有机层，干燥，过滤，滤液直接柱层析，分出目标液，蒸干，得黄色固体(较杂乱)，加入二氯甲烷，室温搅拌30min，再冰浴下搅拌1h，过滤，滤饼用冷二氯甲烷洗涤，抽干，室温晾干，得到中间体5。在一个优选的实施方案中，中间体4与所述氧化剂的摩尔比为1:(2-5)。
在一个实施方案中，在步骤6)中，使中间体5与卤代酯发生反应，得到中间体6，其中，所述卤代酯为6-卤代己酸甲酯、6-卤代己酸乙酯、6-卤代己酸丙酯、6-卤代己酸叔丁酯、5-卤代戊酸甲酯、5-卤代戊酸乙酯、5-卤代戊酸丙酯、5-卤代戊酸叔丁酯、4-卤代丁酸甲酯、4-卤代丁酸乙酯、4-卤代丁酸丙酯、4-卤代丁酸叔丁酯、3-卤代丙酸甲酯、3-卤代丙酸乙酯、3-卤代丙酸丙酯、3-卤代丙酸叔丁酯、2-卤代乙酸甲酯、2-卤代乙酸乙酯、2-卤代乙酸丙酯或2-卤代乙酸叔丁酯。在一个具体的实施方案中，将中间体5和THF混合，加入六甲基磷酰三胺(HMPA)，将反应温度降至-80℃～-75℃，然后加入双(三甲基硅烷基)氨基钾，搅拌后加入4-卤代丁酸甲酯，反应后，得到中间体6。在一个实施方案中，4-卤代丁酸甲酯为4-溴丁酸甲酯。在一个具体的实施方案中，往干净三口瓶中加入中间体5和THF，室温搅拌(溶清)，加入六甲基磷酰三胺(HMPA)，室温搅拌，降反应浴温度至-78℃，在5～10min滴入双(三甲基硅烷基)氨基钾，滴完后搅拌，在5～10min滴入4-溴丁酸甲酯液，滴完后继续搅拌，升温至室温搅拌。往反应液中加入纯化水，减压蒸馏除去部分溶剂(THF)，剩余物中加入纯化水，并用乙酸乙酯萃取,合并有机层,干燥,过滤,滤液柱层析，分得目标液，蒸干，得到中间体6。在一个优选的实施方案中，中间体5与所述卤代酯的摩尔比为1:(1-2)。
如本领域技术人员所理解的，本发明所提及的“卤代”是指氢原子被卤素原子诸如F、Cl、Br、I取代。具体地，“4-卤代丁酸甲酯”是指丁酸甲酯的4位上的氢原子被卤素原子诸如F、Cl、Br或I取代后得到的化合物。
在一个实施方案中，在步骤7)中，在氢氧化锂的作用下，使中间体6发生碱性水解反应，得到式(I)所示的化合物。在一个实施方案中，在步骤7)中，往干净单口瓶中依次加入中间体6和甲醇，室温搅拌(溶清)，加入氢氧化锂溶液，室温搅拌。将反应液40℃减压蒸馏除去部分溶剂(甲醇)，剩余物中加入纯化水，用乙酸乙酯洗涤，取水层，用6N盐酸液调节pH值至4～5，用乙酸乙酯萃取，合并有机层，干燥，过滤，滤液蒸馏至干，得无色透明油状物，柱层析，分出目标液，蒸馏至干，得到式(I)所示的化合物，即氟啶虫胺腈半抗原。在一个优选的实施方案中，中间体6与氢氧化锂的摩尔比为1:(1-2)。
在一个实施方案中，氟啶虫胺腈半抗原的制备方法包括如下步骤：
1)将6-三氟甲基烟酸与THF搅拌，滴加硼烷二甲硫醚络合物，减压蒸馏至干，得白色固体，再用二氯甲烷和纯化水，室温搅拌，分液，取有机层，水层用二氯甲烷萃取，合并有机层，干燥，过滤，滤液柱层析，得到中间体1。
2)将中间体1、三乙胺、DMAP、二氯甲烷搅拌，加入甲磺酰氯，使之发生氯代反应，得到中间体2。
3)将中间体2和DMSO室温搅拌(溶清)，然后加入甲硫醇钠继续搅拌，往反应液中加入乙酸乙酯和纯化水，室温搅拌,取有机层,水层再用乙酸乙酯萃取，合并有机层，干燥，过滤，滤液柱层析，得到中间体3。
4)将中间体3、单氰胺和二氯甲烷搅拌，再加入碘苯二乙酸，室温搅拌，分液，取有机层。水层依次用二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，合并有机层，干燥，过滤，滤液柱层析，分出疑似液，蒸干，得到中间体4。
5)将乙醇、间氯过氧苯甲酸(mCPBA)和碳酸钾水溶液在0℃左右搅拌，再加入中间体4乙醇溶液(7.6g溶于240ml无水乙醇中)继续搅拌，后升温至室温搅拌。往反应液中加入饱和亚硫酸氢钠溶液，室温搅拌，减压蒸馏，除去部分溶剂(乙醇)，剩余物中依次用乙酸乙酯、二氯甲烷萃取，合并有机层，干燥，过滤，滤液直接柱层析，分出目标液，蒸干，得黄色固体(较杂乱)，加入二氯甲烷，室温搅拌30min，再冰浴下搅拌1h，过滤，滤饼用冷二氯甲烷洗涤，抽干，室温晾干，得到中间体5。
6)往干净三口瓶中加入中间体5和THF，室温搅拌(溶清)，加入六甲基磷酰三胺(HMPA)，室温搅拌，降反应浴温度至-78℃，在5～10min滴入双(三甲基硅烷基)氨基钾，滴完后搅拌，在5～10min滴入4-溴丁酸甲酯液，滴完后继续搅拌，升温至室温搅拌。往反应液中加入纯化水，减压蒸馏除去部分溶剂(THF)，剩余物中加入纯化水，并用乙酸乙酯萃取，合并有机层，干燥，过滤，滤液柱层析，分得目标液，蒸干，得到中间体6。
7)往干净单口瓶中依次加入中间体6和甲醇，室温搅拌(溶清)，加入氢氧化锂溶液，室温搅拌。将反应液40℃减压蒸馏除去部分溶剂(甲醇)，剩余物中加入纯化水，用乙酸乙酯洗涤,取水层，用6N盐酸液调节pH值至4～5，用乙酸乙酯萃取，合并有机层，干燥，过滤，滤液蒸馏至干，得无色透明油状物，柱层析，分出目标液，蒸馏至干，得到氟啶虫胺腈半抗原。
在上述制备方法中，具体的反应过程如下所示：
Figure BDA0003181873790000131
本发明所制备的氟啶虫胺腈半抗原在保留氟啶虫胺腈基本结构的基础上引入连接臂结构和用于偶联大分子的活性基团，这样既有利于其与大分子偶联，又可以在偶联后充分暴露本身分子结构和分子量较小的氟啶虫胺腈基本结构，避免了其被大分子掩蔽而影响动物机体的识别。
在制备氟啶虫胺腈半抗原的方法中，通过多步合成来制备氟啶虫胺腈半抗原，所制备的氟啶虫胺腈半抗原最大程度地保留了氟啶虫胺腈分子的特征结构，增强了氟啶虫胺腈半抗原的免疫性，并且同时通过进行适当的化学修饰引入了与载体蛋白偶联的活性基团-羧基，将合成的半抗原与载体蛋白偶联制备人工抗原，利用人工抗原免疫动物获得抗体，为后续建立氟啶虫胺腈的各种免疫分析方法提供原材料。
如上所述，氟啶虫胺腈半抗原仅具有免疫反应性，而不具有免疫原性，并不能单独地刺激动物产生相应的抗体。因此，为了赋予氟啶虫胺腈半抗原以免疫原性，需要将氟啶虫胺腈半抗原与大分子蛋白质等载体偶联、结合或者交联在一起，由此产生既具有免疫反应性又具有免疫原性的氟啶虫胺腈偶联抗原。半抗原与载体分子之间的偶联、结合或者交联方法是本领域已知的。
因此，根据本发明的第三方面，本发明提供了一种氟啶虫胺腈抗原，包含本发明第一方面提供的氟啶虫胺腈半抗原，以及与所述氟啶虫胺腈半抗原偶联的载体蛋白。
本发明所提及的术语“载体蛋白”是任何能够与半抗原偶联、结合或者交联并由此产生既具有免疫原性又具有免疫反应性的物质，包括例如大分子蛋白质或者非抗原性的多聚赖氨酸等。作为示例，可以使用的载体蛋白包括，但不限于，大分子蛋白质，例如牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、鸡卵清白蛋白(OVA)、血蓝蛋白(KLH)。
抗原在进入机体后，刺激B细胞，诱导细胞的增殖和分化，继而产生特异性抗体。具体到本发明，利用本发明氟啶虫胺腈半抗原与载体蛋白偶联后得到的氟啶虫胺腈抗原去免疫动物，刺激动物免疫应答，从而可以产生特异性更强、灵敏度更高的抗体。
因此，根据本发明的第四方面，提供了一种氟啶虫胺腈抗体，该氟啶虫胺腈抗体为特异性针对本发明第三方面提供的氟啶虫胺腈抗原的抗体。
氟啶虫胺腈抗体可以为单克隆抗体或者多克隆抗体。另外，可以采用本领域普通技术人员已知的方法来制备氟啶虫胺腈抗体。例如，在氟啶虫胺腈抗体为多克隆抗体的情况下，可以通过采用氟啶虫胺腈抗原免疫接种哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、灵长类动物(不包括人类)等，随后分离血清获得。在氟啶虫胺腈抗体为单克隆抗体的情况下，可以通过制造和培养杂交瘤细胞并收集培养基获得单克隆抗体，或者可以将由此制备获得的杂交瘤细胞通过腹腔注射接种到哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、灵长类动物(不包括人类)等的体内，在被接种动物的腹部明显膨大时收集腹水，由此获得单克隆抗体。
如本领域技术人员所能理解的，对于氟啶虫胺腈抗体的来源，并没有特别的限制，其可以来源于任何哺乳动物，包括例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、灵长类动物(不包括人类)等，但不限于此。在一个具体的实施方案中，氟啶虫胺腈抗体为来源于小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、灵长类动物(不包括人类)的多克隆或者单克隆抗体。
基于免疫学检测的需要，发明人将本发明的第一方面所述的氟啶虫胺腈半抗原、本发明的第三方面所述的氟啶虫胺腈抗原、本发明的第四方面所述的氟啶虫胺腈抗体应用于免疫学检测中，以检测氟啶虫胺腈农药残留量。
因此，根据本发明的第五方面，提供了本发明的第一方面所述的氟啶虫胺腈半抗原、本发明的第三方面所述的氟啶虫胺腈抗原、和/或本发明的第四方面所述的氟啶虫胺腈抗体在免疫学检测中的应用。
根据本发明的第六方面，提供了一种氟啶虫胺腈胶体金层析检测装置，包括试纸条和反应杯，其中，试纸条包括反应膜，反应膜上有检测区和质控区，均呈与所述试纸条的长相垂直的条带状，检测区位于近于有MAX标记的一端，质控区位于远离有MAX标记的一端。在发明中，检测区包被有本发明的第三方面所述的氟啶虫胺腈抗原，并且其中，反应杯中含有胶体金标记的本发明的第四方面所述的氟啶虫胺腈抗体(简称“金标抗体”)。在一个实施方案中，氟啶虫胺腈胶体金层析检测装置为氟啶虫胺腈胶体金层析检测试纸盒。
根据本发明的一些实施方案，试纸条还可以包括诸如底板、样品吸收垫、吸水垫等的其他组件。如图1所示，所述试纸条由底板、样品吸收垫、反应膜、吸水垫组成。在这种情况下，在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、反应膜和吸水垫，样品吸收垫的末端与反应膜相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐。如图3所示，所述试纸条在检测端印有MAX字样。
在本发明中，样品吸收垫可以为玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜、聚醋膜或吸滤纸。反应膜可以为硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜。吸水垫可以为吸水滤纸或滤油纸。底板可以为不吸水的韧性材料例如硬质塑胶条如PVC底板或不吸水硬纸条或其它硬质不吸水材料。
在本发明中，反应膜包含检测区和质控区。通常情况下，将检测区设置在靠近样品吸收垫一侧。检测区由氟啶虫胺腈抗原(在本发明中即氟啶虫胺腈半抗原-载体蛋白偶联物)在反应膜上进行线性点样制得。质控区可以通过将抗原或者抗体在反应膜上进行线性点样获得。在一个具体的实施方案中，本发明的反应膜上的检测区包被有氟啶虫胺腈半抗原-卵清白蛋白的偶联物，质控区包被有羊抗鼠抗抗体。
将具有包被氟啶虫胺腈抗原的检测区和包被羊抗鼠抗抗体的质控区的反应膜、上述样品吸收垫、吸水垫、底板组装成用于氟啶虫胺腈胶体金层析检测装置的试纸条。
在本发明的一个实施方案中，质控区由本发明提供的氟啶虫胺腈抗体的第二抗体点样获得。在胶体金标记的氟啶虫胺腈抗体移动至质控区时，其会与形成该质控区的第二抗体发生结合反应，由此显现颜色。
如果质控区显色，则指示该检测系统成立，检测结果可用。相反，如果质控区不显色，则指示该检测系统不成立，检测结果不可用。
如上所述，反应杯中含有胶体金标记的本发明第四方面提供的氟啶虫胺腈抗体，所述氟啶虫胺腈抗体特异性地针对本发明第三方面的氟啶虫胺腈抗原。在一个具体的实施方案中，微孔反应杯上冻干有氟啶虫胺腈单克隆抗体-胶体金标记物，所述微孔反应杯具有微孔塞。
氟啶虫胺腈抗体只要能够与氟啶虫胺腈抗原发生抗原-抗体结合反应即可，而不管它是单克隆抗体还是多克隆抗体。然而，正如本领域技术人员可以理解的那样，从需要更高特异性的角度上考虑，单克隆抗体是更合适的。因此在本发明中，氟啶虫胺腈抗体优选地为单克隆抗体。
在本发明中，质控区的点样制备可以根据胶体金标记的氟啶虫胺腈抗体的类型来进行。具体地，若胶体金标记的氟啶虫胺腈抗体为氟啶虫胺腈单克隆抗体，则该质控区可以采用羊抗鼠抗抗体进行线性点样制得，若胶体金标记的氟啶虫胺腈抗体为氟啶虫胺腈多克隆抗体时，则该质控区可以采用羊抗兔抗抗体进行线性点样制得。
在本发明的一个实施方案中，本发明提供了一种氟啶虫胺腈胶体金层析检测装置，包括试纸条和反应杯，试纸条如图1所示，包含底板以及在其上按顺序粘贴的样品吸收垫、反应膜和吸水垫，该反应膜在样品吸收垫至吸水垫方向上包括检测区和质控区，检测区由氟啶虫胺腈抗原制备获得；反应杯如图2所示，包含胶体金标记的氟啶虫胺腈抗体，氟啶虫胺腈抗体为特异性地针对氟啶虫胺腈抗原的鼠源单克隆抗体，并且质控区为针对该氟啶虫胺腈抗体的羊抗鼠抗抗体。
在本发明的一个实施方案中，可以通过下述制备方法来制备本发明的氟啶虫胺腈胶体金层析检测装置：制备反应膜，采用本发明的氟啶虫胺腈抗原在反应膜上进行线性点样制备检测区，并采用针对氟啶虫胺腈抗体的羊抗鼠抗抗体通过线性点样制备质控区；在底板上沿同一方向依次搭接粘贴样品吸收垫、反应膜和吸水垫，由此组装成试纸条；将本发明的胶体金标记的氟啶虫胺腈抗体加入微孔反应杯、冻干后，将微孔反应杯加上微孔塞。该制备方法中使用到的各成分或者组件如上文针对本发明的氟啶虫胺腈胶体金层析检测装置所描述。
在一个具体的实施方案中，将上述组装好的试纸条、微孔反应杯组装成氟啶虫胺腈胶体金层析检测装置，在2-30℃环境中保存，有效期24个月。
本发明提供的氟啶虫胺腈胶体金层析检测装置利用层析式免疫胶体金原理，通过试纸条中检测区与质控区之间的比色来半定量检测诸如水果或蔬菜等中的氟啶虫胺腈农药残留。该检测装置能够短时间内快速、准确地检测出诸如水果或蔬菜等中的氟啶虫胺腈，以确定氟啶虫胺腈是否超标。
根据本发明的第七方面，本发明提供了一种检测样品中氟啶虫胺腈的方法，该方法使用本发明的第六方面提供的氟啶虫胺腈胶体金层析检测装置进行检测。
在本发明中，该样品可以为任何疑似氟啶虫胺腈残留量超标的样品，其可以是蔬菜或水果等。
根据本发明的一些实施方案，在采用本发明的方法检测样品中的氟啶虫胺腈之前，可以根据样品的不同对其进行前处理，处理方法为本领域已知的用于检测的样品处理的一般方法，在此不对其进行特别限定。
在进一步的方案中，在对样品进行预处理之后，将其滴加至微孔反应杯中，混匀后，将试纸条插入微孔反应杯，待检样品溶液与微孔中的金标抗体结合后一起向反应膜扩散，若观察到质控区显现出紫红色条带，则指示该检测系统成立、可用。图3示出了根据本发明的一些实施例的采用本发明提供的方法检测氟啶虫胺腈的判定结果，判断方法如下：
(1)若检测区(T线)不显色，或者与质控区(C线)相比显色更浅，则表明样品中含有氟啶虫胺腈。因为待检样品液中含有氟啶虫胺腈时，扩散过程中待检样品液中的氟啶虫胺腈可与金标抗体相结合，进而完全封闭金标抗体上氟啶虫胺腈的抗原结合点，阻止金标抗体与反应膜上的氟啶虫胺腈抗原结合，T线不显色或T线颜色比C线颜色更浅，而抗抗体则可与金标抗体结合，C线显色。
(2)若检测区同质控区一样显现出紫红色条带，并且检测区的颜色深度与质控区的颜色深度相当或者更深，则表明样品不含氟啶虫胺腈。因为待检样品液中不含氟啶虫胺腈时，金标抗体上的抗原结合位点不能被封闭，进而金标抗体会与反应膜上的氟啶虫胺腈抗原偶联结合，T线显色，同时抗抗体也可与金标抗体结合，C线亦显色，此时，T线颜色比C线颜色深或颜色相同。
(3)若反应膜上T线和C线均未显色，则试纸条失效。
下面结合附图和实施例对本发明进行更为具体和详细的描述，实施例仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明。若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。
实施例1：氟啶虫胺腈半抗原的制备与鉴定
制备：在步骤1)中，将6-三氟甲基烟酸与THF搅拌，滴加硼烷二甲硫醚络合物，减压蒸馏至干，得白色固体，再用二氯甲烷和纯化水，室温搅拌，分液，取有机层，水层用二氯甲烷萃取，合并有机层，干燥，过滤，滤液柱层析，得到中间体1，其中，6-三氟甲基烟酸、THF、硼烷二甲硫醚络合物的摩尔比为1:(15-20):(1-5)。
在步骤2)中，将中间体1、三乙胺、DMAP、二氯甲烷搅拌，加入甲磺酰氯，使之发生氯代反应，得到中间体2，其中，中间体1与甲磺酰氯的摩尔比为1:(1-5)。
在步骤3)中，将中间体2和DMSO室温搅拌(溶清)，然后加入甲硫醇钠继续搅拌，往反应液中加入乙酸乙酯和纯化水，室温搅拌,取有机层,水层再用乙酸乙酯萃取，合并有机层，干燥，过滤，滤液柱层析，得到中间体3，其中，中间体2与甲硫醇钠的摩尔比为1:(1-5)。
在步骤4)中，将中间体3、单氰胺和二氯甲烷搅拌，再加入碘苯二乙酸，室温搅拌，分液，取有机层。水层依次用二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，合并有机层，干燥，过滤，滤液柱层析，分出疑似液，蒸干，得到中间体4，其中，中间体3与单氰胺的摩尔比为1:(1-2)。
在步骤5)中，将乙醇、间氯过氧苯甲酸和碳酸钾水溶液在0℃左右搅拌，再加入中间体4乙醇溶液(7.6g溶于240ml无水乙醇中)继续搅拌，后升温至室温搅拌。往反应液中加入饱和亚硫酸氢钠溶液,室温搅拌,减压蒸馏,除去部分溶剂(乙醇)，剩余物中依次用乙酸乙酯、二氯甲烷萃取，合并有机层，干燥，过滤，滤液直接柱层析，分出目标液，蒸干，得黄色固体(较杂乱)，加入二氯甲烷，室温搅拌30min，再冰浴下搅拌1h，过滤，滤饼用冷二氯甲烷洗涤，抽干，室温晾干，得到中间体5，其中，中间体4与间氯过氧苯甲酸的摩尔比为1:(2-5)。
在步骤6)中，往干净三口瓶中加入中间体5和THF，室温搅拌(溶清)，加入六甲基磷酰三胺(HMPA)，室温搅拌，降反应浴温度至-78℃，在5～10min滴入双(三甲基硅烷基)氨基钾，滴完后搅拌，在5～10min滴入4-溴丁酸甲酯液，滴完后继续搅拌，升温至室温搅拌。往反应液中加入纯化水，减压蒸馏除去部分溶剂(THF)，剩余物中加入纯化水，并用乙酸乙酯萃取，合并有机层，干燥，过滤，滤液柱层析，分得目标液，蒸干，得到中间体6，其中，中间体5与4-溴丁酸甲酯的摩尔比为1:(1-2)。
在步骤7)中，往干净单口瓶中依次加入中间体6和甲醇，室温搅拌(溶清)，加入氢氧化锂溶液，室温搅拌。将反应液40℃减压蒸馏除去部分溶剂(甲醇)，剩余物中加入纯化水，用乙酸乙酯洗涤，取水层，用6N盐酸液调节pH值至4～5，用乙酸乙酯萃取，合并有机层，干燥，过滤，滤液蒸馏至干，得无色透明油状物，柱层析，分出目标液，蒸馏至干，得到氟啶虫胺腈半抗原，如下式所示，其中，中间体6与氢氧化锂的摩尔比为1:(1-2)，
Figure BDA0003181873790000201
鉴定：采用质谱法来鉴定氟啶虫胺腈半抗原，所得到的质谱图如图4所示。从质谱图可以看出，半抗原的分子离子峰为m/z(697.5)[2M-1]-，且为最高峰，其与该氟啶虫胺腈半抗原的分子量(349.3)相符，表明成功合成了上式所示的氟啶虫胺腈半抗原。
实施例2：氟啶虫胺腈免疫原、包被原的制备与鉴定
制备：
(1)氟啶虫胺腈免疫原的制备：取12mg氟啶虫胺腈半抗原用0.8mL DMF溶解，冷却至10℃，得到溶液I；取氯甲酸异丁酯10μL加入溶液I中，10℃搅拌反应10min得到溶液II；取40mg牛血清白蛋白(BSA)，用3.2ml 50mmol/L Na2CO3溶解，与溶液II于10℃反应4h，然后4℃过夜；用0.01mol/L PBS 4℃透析3d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，得到氟啶虫胺腈半抗原-BSA偶联物，即为氟啶虫胺腈免疫原；分装，于-20℃保存备用。
(2)包被原1的制备：取12mg氟啶虫胺腈半抗原，加甲醇1mL溶解，得到A液，取牛血清白蛋白(BSA)50mg，加0.05M碳酸钠缓冲液4ml溶解，得到B液，将A液缓慢滴加到B液中，室温反应8h，加硼氢化钠3mg，继续搅拌2h，0.01M PB缓冲液透析纯化3天，每天换液3次，离心、分装，得到氟啶虫胺腈半抗原-BSA偶联物，即为包被原1，-20℃保存备用。
(3)包被原2的制备：取8mg丙醛-氟啶虫胺腈半抗原，加甲醇1mL溶解，得至液，取卵血清白蛋白(OVA)50mg，加0.05M碳酸钠缓冲液4ml溶解，得到B液，将A液缓慢滴加到B液中，室温反应8h，加硼氢化钠3mg，继续搅拌2h，0.02M PB缓冲液透析纯化3天，每天换液3次，离心、分装，得到氟啶虫胺腈半抗原-OVA偶联物，即为包被原2，-20℃保存备用。
鉴定：将载体蛋白、氟啶虫胺腈半抗原、氟啶虫胺腈半抗原-BSA偶联物、氟啶虫胺腈半抗原-OVA偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/mL的溶液，以0.01moL/L pH7.4PBS调零，用紫外分光光度计在波长200～800nm范围内扫描，得到载体蛋白、氟啶虫胺腈半抗原、氟啶虫胺腈半抗原-BSA偶联物、氟啶虫胺腈半抗原-OVA偶联物的吸收曲线，如图5-1和图5-2所示。
从图5-1可以看出，免疫原的吸收曲线与氟啶虫胺腈半抗原、BSA明显不同，是一种BSA与啶酰菌胺半抗原的累加吸收特征，这表明啶酰菌胺半抗原与载体蛋白BSA偶联成功。
从图5-2可以看出，免疫原的吸收曲线与氟啶虫胺腈半抗原、OVA明显不同，是一种OVA与啶酰菌胺半抗原的累加吸收特征，这表明啶酰菌胺半抗原与载体蛋白OVA偶联成功。
实施例3：氟啶虫胺腈单克隆抗体的制备
⑴动物免疫
将实施例2中得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。
(2)细胞融合和克隆化
取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按8：1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选得到稳定分泌氟啶虫胺腈单克隆抗体的氟啶虫胺腈单克隆杂交瘤细胞株。
(3)细胞冻存和复苏
将杂交瘤细胞用冻存液制成5X 106个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
(4)单克隆抗体的制备与纯化
增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，20℃保存。
所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％(质量百分含量)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2％(质量百分含量)；所述细胞培养基的pH为7.4。
实施例4：羊抗鼠抗抗体的制备
以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。
实施例5：氟啶虫胺腈试纸盒的制备
5.1胶体金的制备
用双蒸去离子水将1％氯金酸(购于sigma公司)稀释成0.01％(质量百分含量)，取100ml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2.5ml1％柠檬酸三钠(购于广州化学试剂厂)，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。
5.2氟啶虫胺腈单克隆抗体-胶体金标记物的制备
在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾调胶体金的pH值至7.2，按每毫升胶体金溶液中加入30～50μg抗体的标准向胶体金溶液中加入上述氟啶虫胺腈单克隆抗体，继续搅拌混匀10min，加入10％牛血清白蛋白(BSA)使其在胶体金溶液中的终浓度为1％(体积百分含量)，静置10min。12000rpm，4℃离心35min，弃上清液，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用。
复溶缓冲液：含牛血清白蛋白0.3％～0.5％(体积百分含量)、吐温-20 0.1％～0.2％(质量百分含量)、海藻糖3％-8％(质量百分含量)、pH 7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。
5.3微孔反应杯的制备
向微孔反应杯微孔板中加入100μL氟啶虫胺腈单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，在冷阱温度为50℃条件下，预冻3h后，再真空干燥6h，即可取出，得到冻干有氟啶虫胺腈单克隆抗体-胶体金标记物的微孔反应杯，密封保存，氟啶虫胺腈单克隆抗体-胶体金标记物冻干量0.20～0.25μg/mL。
5.4样品吸收垫的制备
将样品吸收垫置于含牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在缓冲液中的终浓度为0.5％(体积百分含量))、pH7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡2h，50℃烘干2h备用。
5.5反应膜的制备
包被过程：用磷酸缓冲液将氟啶虫胺腈半抗原-卵清白蛋白偶联物稀释到10mg/mL，用金标喷金点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测区(T)，包被浓度为1.0mg/mL；用0.01mol/L、pH 7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释到10mg/mL，用金标喷金点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控区(C)，包被浓度为1.0mg/mL。将包被好的反应膜置于50℃条件下干燥6h，备用。
5.6氟啶虫胺腈试纸盒的制备
(1)试纸条的组装
将所述样品吸收垫、反应膜、吸水垫依次按顺序粘贴在所述底板上，其中，所述底板为PVC底板，所述样品吸收垫为吸滤纸，所述吸水垫为吸水滤纸，所述反应膜为硝酸纤维素膜。样品吸收垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐。
(2)氟啶虫胺腈试纸盒的组装
将上述步骤1得到的试纸条与微孔反应杯组装成试纸盒，在2-8℃的环境中贮存，有效期24个月。
实施例6：蔬菜或水果中氟啶虫胺腈的检测方法的建立
1.样品前处理
称取5.0g±0.05g均质的样本至50mL聚苯乙稀离心管中,加入样本提取液(0.2mol/L磷酸盐缓冲液，0.3％-0.5％T-20,1％-3％甲醇)10mL，混匀，3000g以上，室温(20-25℃)离心1min。上清液即为待测液。
2.用试剂盒检测样品
从原包装中取出试剂桶(若低温存放需要预先平衡至室温)，打开后取出所需数目的微孔反应杯和试纸条，并做好标记；用微量移液器吸取100μL复溶的样本液，缓慢抽吸且充分与微孔中试剂混匀，将标记好的试纸条插入微孔中一一印有“MAX”线端朝下，使之充分浸入溶液中；室温(20℃-25℃)孵育5min后，取出试纸条，判定结果。
3.检测结果分析
阳性：当质控区(C)显示出条带，检测区(T)不显色，判为阳性，用“+”表示；阴性：当质控区和检测区均显示出条带，判为阴性，用“-”表示；无效：当质控区(C)不显示条带，试纸失效，具体如图3所示。
实施例7：样品检测实例
1、检测限试验
取具有代表性的阴性蔬菜或水果：苹果、猕猴桃、梨、黄瓜、大白菜、油麦菜样本，分别在其中分别添加氟啶虫胺腈至终浓度为0.5、1、2、4μg/kg，取试纸条进行检测，每个样本重复测定三次。
用试纸条检测上述1)中样本时，当其中氟啶虫胺腈添加浓度为0.5μg/kg时，结果显示为阴性；当其中氟啶虫胺腈添加浓度为1、2、4μg/kg时，结果显示为阳性，结果见表1，这表明试纸条的检测线为1μg/kg。
表1：检测限试验结果
Figure BDA0003181873790000251
2、假阳性率、假阴性率试验
取已知氟啶虫胺腈含量大于1μg/kg的苹果、猕猴桃、梨、黄瓜、大白菜、油麦菜阳性样本各30份和含量小于0.5μg/kg的苹果、猕猴桃、梨、黄瓜、大白菜、油麦菜阴性样本各30份，用三批试纸条进行检测，计算其阴阳性率，结果见表2、表3。
表2:阳性样本的检测结果
Figure BDA0003181873790000261
表3：阴性样本的检测结果
Figure BDA0003181873790000262
结果表明：用3个批次生产的试纸条检测阳性苹果、猕猴桃、梨、黄瓜、大白菜、油麦菜阳性样本各30样本时，结果全为阳性，可知阳性样本符合率为100％，假阴性率为0；检测30份阴性苹果、猕猴桃、梨、黄瓜、大白菜、油麦菜的阴性样本各30样本时，结果全为阴性，可知符合率为100％，假阳性率为0。
上述结果表明本发明的检测氟啶虫胺腈的试纸盒具有良好的特异性，能够准确地检测出样品中的氟啶虫胺腈，因此可以对蔬菜或水果中氟啶虫胺腈残留进行快速检测。
实施例8：氟啶虫胺腈胶体金层析检测装置的保质期测定
用三批常规生产的产品分别做保质期实验，放置于室内室温环境保持，间隔1个月取12个装置，用质控样本检测，分别做阴性，1μg/kg，2μg/kg和4μg/kg样品，重复三次，观察产品显色变化，考察保质期时间。
阴性显色从13个月开始下降，这表明在1年时间内产品的品质无明显变化，因此确定保质期为1年。
以上仅为本发明的较佳实施方案而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种氟啶虫胺腈半抗原，其中，所述氟啶虫胺腈半抗原的结构如式(I)所示：
Figure FDA0003181873780000011
其中，n为1、2、3、4或5。
2.一种制备权利要求1所述的氟啶虫胺腈半抗原的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
1)使6-三氟甲基烟酸发生羧基的还原反应，得到中间体1：
Figure FDA0003181873780000012
优选地，所述还原反应在硼烷二甲硫醚络合物的作用下进行；
优选地，将6-三氟甲基烟酸与四氢呋喃(THF)混合，加入硼烷二甲硫醚络合物，反应后，得到中间体1；
优选地，6-三氟甲基烟酸、THF、硼烷二甲硫醚络合物的摩尔比为1:(15-20):(1-5)；
2)使中间体1发生卤代反应，得到中间体2：
Figure FDA0003181873780000013
其中，x为卤素原子诸如F、Cl、Br或I；
优选地，使中间体1与甲磺酰氯发生卤代反应，得到中间体2；
优选地，所述卤代反应的溶剂为三乙胺、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、二氯甲烷；
优选地，中间体1与甲磺酰氯的摩尔比为1:(1-5)；
3)使中间体2与甲硫醇钠发生取代反应，得到中间体3：
Figure FDA0003181873780000021
优选地，所述取代反应的溶剂为极性溶剂；
优选地，所述取代反应的溶剂为DMSO、DMF、丙酮、乙腈中的一种或多种的组合；
优选地，中间体2与甲硫醇钠的摩尔比为1:(1-5)；
4)使中间体3与单氰胺上的氨基发生加成反应，得到中间体4：
Figure FDA0003181873780000022
优选地，将中间体3、单氰胺和二氯甲烷混合，再加入碘苯二乙酸，反应后，得到中间体4；
优选地，中间体3与单氰胺的摩尔比为1:(1-2)；
5)在氧化剂的作用下，使中间体4发生氧化反应，得到中间体5：
Figure FDA0003181873780000023
优选地，所述氧化剂为间氯过氧苯甲酸(mCPBA)、双氧水或过氧苯甲酸；
优选地，将乙醇、间氯过氧苯甲酸(mCPBA)和碳酸钾水溶液在-5℃～5℃混合，然后加入中间体4的乙醇溶液，后升温至室温，加入饱和亚硫酸氢钠溶液，反应后，得到中间体5；
优选地，中间体4与所述氧化剂的摩尔比为1:(2-5)；
6)使中间体5与卤代酯发生反应，得到中间体6：
Figure FDA0003181873780000024
其中，所述卤代酯为6-卤代己酸甲酯、6-卤代己酸乙酯、6-卤代己酸丙酯、6-卤代己酸叔丁酯、5-卤代戊酸甲酯、5-卤代戊酸乙酯、5-卤代戊酸丙酯、5-卤代戊酸叔丁酯、4-卤代丁酸甲酯、4-卤代丁酸乙酯、4-卤代丁酸丙酯、4-卤代丁酸叔丁酯、3-卤代丙酸甲酯、3-卤代丙酸乙酯、3-卤代丙酸丙酯、3-卤代丙酸叔丁酯、2-卤代乙酸甲酯、2-卤代乙酸乙酯、2-卤代乙酸丙酯或2-卤代乙酸叔丁酯，
其中，n为1、2、3、4或5；
优选地，将中间体5和THF混合，加入六甲基磷酰三胺(HMPA)，将反应温度降至-80℃～-75℃，然后加入双(三甲基硅烷基)氨基钾，搅拌后加入4-卤代丁酸甲酯，反应后，得到中间体6；
优选地，中间体5与所述卤代酯的摩尔比为1:(1-2)；
7)使中间体6发生碱性水解反应，得到式(I)所示的化合物；
优选地，所述碱性水解反应在氢氧化锂的作用下进行；
优选地，中间体6与氢氧化锂的摩尔比为1:(1-2)。
3.一种氟啶虫胺腈抗原，其中，所述氟啶虫胺腈抗原包含：权利要求1所述的氟啶虫胺腈半抗原，以及与所述氟啶虫胺腈半抗原偶联的载体蛋白。
4.根据权利要求3所述的氟啶虫胺腈抗原，其中，所述载体蛋白包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。
5.一种氟啶虫胺腈抗体，其中，所述氟啶虫胺腈抗体为特异性针对权利要求3或4所述的氟啶虫胺腈抗原的抗体。
6.根据权利要求5所述的氟啶虫胺腈抗体，其中，所述氟啶虫胺腈抗体为氟啶虫胺腈单克隆抗体或氟啶虫胺腈多克隆抗体。
7.权利要求1所述的氟啶虫胺腈半抗原、权利要求3或4所述的氟啶虫胺腈抗原、和/或权利要求5或6所述的氟啶虫胺腈抗体在免疫学检测中的应用。
8.一种氟啶虫胺腈胶体金层析检测装置，包括试纸条和反应杯，其中，所述试纸条包括反应膜，所述反应膜上有检测区和质控区，并且其中，所述检测区包被有权利要求3或4所述的氟啶虫胺腈抗原，并且其中，所述反应杯中含有胶体金标记的权利要求5或6所述的氟啶虫胺腈抗体。
9.根据权利要求8所述的氟啶虫胺腈胶体金层析检测装置，其中，所述质控区包被有特异性针对所述氟啶虫胺腈抗体的第二抗体。
10.一种检测样品中氟啶虫胺腈的方法，所述方法包括：使用权利要求8至9任一项所述的胶体金层析检测装置对样品中的氟啶虫胺腈进行检测。
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