CN1979170A

CN1979170A - 麻痹性贝毒竞争酶联免疫定量检测试剂盒及其制备和应用

Info

Publication number: CN1979170A
Application number: CN 200510125681
Authority: CN
Inventors: 曹际娟; 周卫东
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2005-12-05
Filing date: 2005-12-05
Publication date: 2007-06-13

Abstract

本发明涉及麻痹性贝毒竞争酶联免疫定量检测试剂盒，其特征在于它含有：由麻痹性贝毒单克隆抗体包被的酶标板、麻痹性贝毒标准抗原液、包被液、封闭液、辣根过氧化物酶标记抗原结合物、底物、反应停止液和洗涤液。其制备主要包括由麻痹性贝毒单克隆抗体包被的酶标板的制备。它应用于样品中麻痹性贝类毒素的检测，具有灵敏度高，特异性好，重复性高和检测准确快速的优点。满足了国际上越来越严格的允许限量标准要求，以及食品安全监控中快速检测的要求。并且减少了检测费用，扩大了监测样本数量，使我国食品中生物毒素危害得到有效控制。并在毒物的快速鉴定、检测，及病人的应急救治方面有着重要作用。

Description

麻痹性贝毒竞争酶联免疫定量检测试剂盒及其制备和应用

技术领域

本发明涉及麻痹性贝毒竞争酶联免疫定量检测试剂盒及其制备和应用，具体的说是涉及一种用竞争酶免疫分析法(Enzyme LinkedImmunosorbent Assay，ELISA)定量检测贝类产品中的麻痹性贝类毒素的试剂盒及其制备和应用。

技术背景

麻痹性贝毒(PSP)是在多种水藻产生的潜在的神经毒素，通过食物链累积在贝类中。麻痹性贝毒(PSP)引起呼吸麻痹，导致8％的病例死亡，阻滞神经和肌肉隔膜的钠离子通道。致死量是1-3mg，在食入0.5-1.0ug的麻痹性贝毒(PSP)临床表现麻木和呼吸障碍。PSP是由石房蛤毒素(STX)及其天然衍生物组成，是一种非蛋白质的毒素，是带胍基的三环化合物，PSP的结构如下所示：

现在检测贝类毒素的方法是小鼠活体实验和化学仪器分析技术，前一种方法目前被许多国家接受和采用，我国目前也采用该方法对贝毒实施检测，但该方法存在着很多不足和缺陷，如：仅能指出毒性的大小，无法确定毒素的组成和含量；所测得的毒性和小鼠的品系有关，可比性较差，必须进行标准毒素的校准才有可能相比；毒性测定结果的重复性差；毒性测试所需时间长；需要受过专门训练的操作人员；小鼠维持费用较高等。因此人们极希望能有另外一些操作简便，可比性强，费用较低的生物检测手段来取代小白鼠生物试验法。

化学仪器分析技术检测贝毒也有许多不足之处，如化学检测的仪器采用的柱后衍生荧光检测技术，必须严格控制条件才能获得理想的结果。近些年来，贝毒的分析领域不断涌现出一些新的技术，例如应用液相色谱-质谱联用技术，毛细管电泳技术等。然而相对于传统的液相色谱技术，这些方法还有待于进一步完善。由于食品(动物组织)的背景基底非常复杂，样品间差异又相当大，采用LC-MS(MS/MS)技术测定食品中贝类毒素的关键部分是样品的前处理。目前国外文献方法多采用固相萃取法进行纯化与浓缩，最常用的固相萃取柱是C₁₈烷基键合硅胶，还有CN基键合硅胶或离子交换剂，非键合硅胶也有很好的纯化和萃取效果。此外还有各种溶剂提取方法，液相色谱制备法和超临界流体萃取法等。食品(水产品)中的贝类毒素残留量甚微，一般为μg/kg水平，而且基质复杂，在此混合物中分析某种痕量成分并加以鉴别，常常是对分析化学家的挑战。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有高灵敏度、高特异性和相对较低的交叉反应的商品化的分析快速准确的麻痹性贝毒竞争酶联免疫定量检测试剂盒及其制备和应用。

本发明的目的是这样实现的：

麻痹性贝毒竞争酶联免疫定量检测试剂盒，其特征在于它含有：

(1)由麻痹性贝毒单克隆抗体包被的酶标板；

(2)麻痹性贝毒(PSP)标准抗原液；

(3)包被液：PH9.6，0.05M碳酸盐缓冲液(CBS)；

(4)封闭液：1％BSA的磷酸盐缓冲液(PBS)；

(5)辣根过氧化物酶标记抗原结合物；

(6)底物：过氧化尿素和四甲基联苯胺；

(7)反应停止液：2M硫酸溶液；

和(8)洗涤液：磷酸盐缓冲液(PBS)。

麻痹性贝毒竞争酶联免疫定量检测试剂盒的制备，主要包括由麻痹性贝毒单克隆抗体包被的酶标板的制备，其特征在于：

(1)样品抗原的制备：称取样品清洗、匀浆，10％盐酸煮沸，离心，取上清；

(2)将PSP贝毒(STX)溶于的二甲基亚砜(DMSO)中，将牛血清白蛋白(BSA)、碳化二亚胺(EDC)，N-羟基磺基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)分别溶于pH7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中。按1∶3∶1∶1的比例将上述4种物质混和在一起，4℃搅拌过夜。次日，将反应液移入超滤管中，4℃条件下以离心，用PBS溶液冲洗并收集超滤膜上的STX-BSA偶联物，分装后-20℃冻存备用，此偶联物作为免疫原。以所获抗原免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，培养，筛选克隆；将特异性性的抗STX单克隆细胞株小鼠腹腔注射，收取腹水，采用辛酸-饱和硫酸铵改进方法进行单克隆抗体的纯化；

(3)单克隆抗体包被的酶标板的制作：将所纯化的单克隆抗体用包被液碳酸盐缓冲液按1∶800浓度包被，加入酶标板，37℃孵育3h，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤液洗涤酶标板，再用封闭液，1％BSA的磷酸盐缓冲液(PBS)37℃封闭2h，洗涤酶标板。甩干，吹干。

麻痹性贝毒竞争酶联免疫定量检测试剂盒做为检测样品中的麻痹性贝类毒素试剂盒的应用。

本发明的测定基础是竞争性酶联免疫反应。酶标板包被有针对麻痹性贝毒抗体，当加入游离麻痹性贝毒(标准或样品溶液)及麻痹性贝毒标准抗原酶标记物，游离的麻痹性贝毒与麻痹性贝毒标准抗原酶标记物竞争麻痹性贝毒抗体。没有被结合的标准抗原酶标记物在洗涤步骤中被除去。将酶底物(过氧化尿素和四甲基联苯胺)加入到孔中并且孵育。结合的标准抗原酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液2M硫酸后使颜色由蓝转变为黄色。在450nm波长的酶标仪测量酶标板溶液的吸光度值，样品中的麻痹性贝毒溶液与吸光度值成反比，按绘制的校正曲线定量计算。

本发明与现有技术相比，它以竞争酶联免疫反应为测定基础，具有灵敏度高，特异性好，重复性高和检测准确快速的优点。满足了国际上越来越严格的允许限量标准要求，以及食品安全监控中快速检测的要求。并且减少了检测费用，扩大了监测样本数量，可以用于定量检测贝类产品中的麻痹性贝类毒素，使我国食品中生物毒素危害得到有效控制。并在毒物的快速鉴定、检测，及病人的应急救治方面有着重要作用。可以强化基层卫生医疗部门的毒物检测手段，完善我国急性中毒救治体系。

具体实施方式

以下结合实施例进一步说明本发明

实施例1：样品抗原的制备：称取样品清洗、匀浆，10％盐酸煮沸，离心，取上清。

实施例2：单克隆抗体的制备及单抗性质检测

1.将25μg PSP贝毒(STX)溶于25μL的二甲基亚砜(DMSO)中，将牛血清白蛋白(BSA)、碳化二亚胺(EDC)，N-羟基磺基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)分别溶于pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中。按1∶3∶1∶1的比例将上述4种物质混和在一起，4℃搅拌过夜。次日，将反应液移入超滤管中，4℃条件下以6000rpm离心80min，用PBS溶液冲洗并收集超滤膜上的STX-BSA偶联物，分装后-20℃冻存备用，此偶联物作为免疫原。

2.选用8周龄雌性Balb/c小鼠3只，体重18～22g，将分装好的600μL(1mg/mL)抗原用生理盐水稀释至1.5mL。加等体积弗氏完全佐剂，用注射器在安培瓶中反复抽吸搅拌直至乳化药液在水中呈不溶液滴(水包油状态)。在小鼠颈部，背部多点注射进行初次免疫，每只小鼠0.5mL；间隔10d后，抗原量减半用弗氏不完全佐剂混合，进行第二次免疫，再过10d后，进行第三次免疫，方法同上。10d后采血，再次加强免疫直至效价大于10⁴，可以用来进行细胞融合。

(1)准备骨髓瘤细胞：将骨髓瘤细胞SP2/0从液氮中取出，立即放入37-40℃水浴中，待完全融化后，1,000rpm离心5min，弃上清，将沉淀细胞用5％DMEM完全培养液悬浮，移入细胞培养瓶，置37℃，CO₂浓度为5％的二氧化碳培养箱中培养，次日换液。(2)免疫脾细胞的获取：将免疫Balb/c小鼠，摘除眼球放血，收集免疫个体的血液制备阳性血清。在无菌条件下，取出脾脏，置于不锈钢网上，用不完全培养液洗涤2次，并剥去周围的结缔组织，用玻璃注射器柄轻轻碾压，收集钢网下的脾细胞于50mL离心管，离心后取悬液，加台盼兰染液做活细胞计数。(3)饲养细胞准备：将幼龄Balb/c小鼠摘除眼球放血，并分离血清供阴性对照用。拉颈脱臼处死小鼠，在无菌条件下，剥离胸骨两侧白色的胸腺置于钢网上，加IMDM培养基，用玻璃注射器柄轻碾，吸取液体反复洗二次，然后1,000rpm离心5min，弃去上清液，计数后将细胞稀释到所需浓度。(4)细胞融合①将骨髓瘤细胞和脾细胞悬液以1∶10的比例混合，1,000rpm离心5min，弃去上清液，在台面上轻轻敲打试管底部，使沉淀细胞均匀松散成糊状。②吸取0.8mL(50％)PEG，加入到上述细胞中，1min内加完，静止90s。③加IMDM 25mL于上述试管中，轻吹混匀。300rpm离心3min。④离心后的细胞加1mL IMDM，3mL胸腺细胞，1mL HAT溶液，10mL胎牛血清，轻摇，混匀。⑤加入25mL甲基纤维素半固体培养基，边加入边轻摇搅拌混匀。⑥吸取1.5-2.0mL上述混合液于小培养皿中，在细胞培养箱中培养，并观察记录。

3.混合细胞在半固体培养基中生长10d左右，在显微镜下观察，有成团生长的活细胞，肉眼观察呈灰白色，此即为杂交瘤细胞群落。在解剖镜下，用200μL移液枪将其吸出。放在已铺好饲养细胞的96孔培养板中，同时加200μLHT培养基，常规培养。

4.待96孔培养板中细胞长满至2/3时，用间接ELISA法测定其阳性(步骤同阳性血清检测)。并将阳性细胞依次扩增到24孔板、6孔板和培养瓶中，每次扩增均测定其阳性。选择能稳定分泌抗体的细胞株，一部分液氮冻存，一部分注入动物体内诱导产生大量抗体。

5.选用20-24g雌性Balb/c小鼠10只，每只腹腔注射石蜡油0.5mL；2周后，将培养的杂交瘤细胞从培养瓶中吹打下来，1,000rpm离心5min，弃去上清液，加生理盐水将沉淀细胞混匀，并调节细胞至5×10⁶个/mL，每只小鼠注射0.5mL。1周后观察小鼠腹部的肿大情况，待有明显膨大时，收取腹水，5,000rpm离心10min，收集上清液，分装，即得单克隆抗体粗品。-20℃保存备用。

6.取单克隆抗体粗品2,500rpm离心15min。将1mL上清夜缓慢加入到4mL醋酸缓冲溶液(0.06mol/L，pH4.8)中。将预先已与少量醋酸缓冲液混合的辛酸滴加到上述混合液中，边加边轻柔搅拌，使辛酸最终浓度为33μL/mL，加完后继续搅拌30min。12,000rpm室温离心30min，取上清液，弃去沉淀。将上清液与0.1mol/L的PBS按10∶1比例混合，然后用浓氨水调节至pH 7.2-7.4。4℃下滴加饱和硫酸铵至终浓度为45％，继续搅拌30min，4℃静止2h。取12,000rpm4℃离心30min，弃去上清液，保留沉淀。沉淀用少量PBS溶液溶解，PBS溶液4℃透析过夜。收集透析液，测OD₂₆₀和OD₂₈₀值，分装，即为改进辛酸-饱和硫酸铵法纯化的单克隆抗体。保存于-20℃。

实施例3：单克隆抗体分子量的确定

在Bio-Rad电泳槽中，灌入12％分离胶，并加入微量水，使凝胶凝固后边缘呈水平状态。滤纸吸除水分，灌入电极缓冲液，恒流(I＝12mA)电泳10min。吸出电极缓冲液后，槽中灌入3％浓缩胶。胶凝后，每个样品孔加入10μl纯化后的单克隆抗体和标准蛋白样品。样品在浓缩胶中恒流(I＝20mA)浓缩20min，然后在分离胶中分离2.5h。分离完毕后，分离胶经固定、染色、脱色和干胶(分子克隆试验指南第二版，1999)。SDS-PAGE不连续电泳中，每种蛋白质的相对迁移率Mr(蛋白质从原点迁移的距离与原点到参考点距离的比值)与标准蛋白质分子量有如下关系1gMW＝-K×Mr+b，通过工作曲线求得单抗的相对分子量126,600道尔顿，其中重链为43,000道尔顿，轻链为20,300道尔顿。

实施例4：单克隆抗体的交叉反应，特异性实验

将PSP和Decarbamoyl PSP和Neo PSP作为抗原包被酶标板，将单克隆抗体不同梯度稀释作为一抗，用已建立的间接ELISA法测定抗体的特异性(以OD₄₅₀值大于等于其阴性值的2倍判定为阳性)。PSP抗体检测其它抗原时表现为阴性(OD₄₅₀指大于或等于阴性对照2倍，即判为阳性)，结果分别是100％；18％；10％。表明该抗体非特异性很低。

实施例5：单克隆抗体包被的酶标板的制作：

将所纯化的单克隆抗体用包被液碳酸盐缓冲液按体积比稀释1000倍包被，100μl加入酶标板，37℃孵育3h，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤液洗涤酶标板，再用封闭液，1％BSA的磷酸盐缓冲液(PBS)37℃封闭2h，洗涤酶标板。甩干，吹干。

实施例6：制备麻痹性贝毒竞争酶联免疫定量检测试剂盒

(1)样品抗原的制备：同实施例1。

(2)单克隆抗体的制备：同实施例2。

(3)单克隆抗体包被的酶标板的制作：同实施例5。

(4)试剂的配制：

麻痹性贝毒(PSP)标准抗原液0ppb；2.5ppb；5ppb；10ppb；20ppb；40ppb；

包被液，PH9.6，0.05M碳酸盐缓冲液(CBS)(市售)，

封闭液，1％BSA的磷酸盐缓冲液(PBS)(市售)，

辣根过氧化物酶标记抗原结合物(市售)，按体积比稀释100倍

底物过氧化尿素和四甲基联苯胺(市售)，两者按体积比1∶100混合

反应停止液，2M硫酸溶液(市售)，

洗涤液磷酸盐缓冲液(PBS)(市售)。

实施例7：应用麻痹性贝毒竞争酶联免疫定量检测试剂盒检测样品中的麻痹性贝毒的方法检测

(1)样品处理：除去贝壳，用双蒸水洗净贝肉后均质器均质；称取10g均质后的样品加10mL 0.1M的HCl，煮沸并搅拌5min；4℃，3500g离心10min，离心后控制PH值，用5N的盐酸调节到4.0以下；取100μL上清液，用样品稀释缓冲液(1∶10)稀释(1+9)；取50μL用试剂盒进行分析，此时的稀释倍数是20；

(2)包被抗原：用包被液CBS(pH9.6，0.05mol/L)将单克隆抗体800倍稀释，每孔100μL加入酶标板，37℃孵育3h，用洗涤液洗涤3次，拍干；

(3)封闭：每孔加200μL封闭液(1％BSA，PBS稀释)，37℃孵育2h，洗涤3次，拍干；

(4)加样：

①待测样品：每孔加入样品50μL，稀释后的酶标抗原50μL；

②标准曲线：分别加入10ppb和100ppb的标准抗原50μL，两孔再加稀释后的酶标抗原50μL，37℃孵育反应0.5h。孵育完成后，用洗涤液洗涤5次，每次3min，拍干；

(5)加底物过氧化尿素和四甲基联苯胺混合液50μL，室温放置10min；

(6)终止反应：加2mol/L硫酸溶液50μL，终止反应；

(7)读数：在450nm波长下用酶标仪测定OD值；

(8)结果计算：①计算每个标准样，待测样和参照样的OD₄₅₀值；②以每个标准样品的平均吸光度的1g值为X轴，以抑制率为Y轴作图，此图为线性图，其中，抑制率＝(参照OD₄₅₀-待测OD₄₅₀或标准样OD₄₅₀)×100/参照孔OD₄₅₀；③利用标准曲线计算出待检测样品中的抗原量。

1.重复性实验：用变异系数表示。结果显示，该试剂盒检测样品的板内和板间变异系数分别为2.6％和3.5％。批内和批间变异系数分别为5.3％和8.6％。

2.灵敏度试验

检测灵敏度为2.5ppb(μg/kg)。试剂盒对PSP的最低检测水平为50ppb(μg/kg)。

3.回收实验，准确性实验

应用试剂盒对添加不同剂量PSP的样品进行检测，本实验采用经气相色谱未检出PSP的样品中分别添加不同浓度PSP标准溶液，依次为0.05mg/kg，0.28mg/kg，0.93mg/kg，所用样品有扇贝、牡蛎、蛤及贻贝，经检测后确定回收率。表1结果显示回收率如下：牡蛎样品平均回收率92％，蛤样品平均回收率91％，贻贝样品平均回收率93％，扇贝样品平均回收率89％。

表1：回收率的测定

样品编号	添加量(μg/kg)	ELLSA测定值(μg/kg)	回收率％	平均回收率％
样品编号	添加量(μg/kg)	ELLSA测定值(μg/kg)	回收率％	平均回收率％	牡蛎样品	1.00	0.94	94	92
牡蛎样品	5.60	4.98	89		牡蛎样品	1.00	0.94	94
牡蛎样品	5.60	4.98	89	牡蛎样品	18.60	17.30	93
杂色蛤样品	1.00	0.85	85	牡蛎样品	18.60	17.30	93	91
杂色蛤样品	1.00	0.85	85	杂色蛤样品	5.60	4.82	86
杂色蛤样品	18.60	18.97	102	杂色蛤样品	5.60	4.82	86
杂色蛤样品	18.60	18.97	102	贻贝样品	1.00	0.93	93		93
贻贝样品	5.60	5.10	91	贻贝样品	1.00	0.93	93
贻贝样品	5.60	5.10	91	贻贝样品	18.60	17.67	95
扇贝样品	1.00	0.86	87	贻贝样品	18.60	17.67	95	89
扇贝样品	1.00	0.86	87	扇贝样品	5.60	5.10	91
扇贝样品	18.60	16.55	89	扇贝样品	5.60	5.10	91

实施例8：麻痹性贝毒竞争酶联免疫定量检测试剂盒的应用

1试剂：同实施例6

2其他辅助材料和试剂：

酶标仪(450nm)定量分析用

离心机

均质器

磁搅拌器

刻度移液管

50μL，100μL，500μL微量加样器

3样品处理：除去贝壳，用双蒸水洗净贝肉后均质器均质；称取10g均质后的样品加入10mL 0.1M的HCl，煮沸并搅拌5min；4℃，3500g离心10min，离心后控制PH值，用5N的盐酸调节到4.0以下；取100μL上清液，用样品稀释缓冲液(1∶10)稀释(1+9)；取50μL用试剂盒进行分析，此时的稀释倍数是20；

麻痹性贝毒测定程序(在20-25℃条件下操作)：

(1)将6个孔条插入酶标板架，标准及样品做平行，并记录标准及样品的位置。

(2)加入50μL的标准或处理好的样品到各自的微孔中，每个标准和样品必须使用新的吸头。

(3)加入50μL稀释的辣根过氧化物酶标记抗原结合物到微孔底部，充分混合。

(4)22℃~25℃黑暗避光处孵育10min。

(5)倒出孔中的液体，将酶标板架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去微孔中的液体。用洗瓶或多通道移液器将250μL洗涤液加入孔中。再次倒出孔中的液体，完全除去孔中的液体，再重复操作洗涤步骤四次。

(6)加入50μL底物至每个微孔中，轻拍混匀，22℃~25℃黑暗避光处孵育6min。

(7)加入50μL反应停止液到微孔中，(注意此操作步骤要快，如果实验所用孔数量多，请用多通道移液器加液。)迅速混匀后在450nm处测量吸光度值，以空气为空白调零，必须在加入停止液后10min内读取吸光度值。

结果：

计算百分比吸光度值：

计算麻痹性贝毒标准液和样液的平均吸光度值，按公式分别求得每个麻痹性贝毒标准液和样液的百分比吸光度值：

绘制校正曲线：

以百分比吸光度值(算术级)为纵坐标，以麻痹性贝毒溶液(μg/kg)(对数级)为横坐标，绘制出麻痹性贝毒标准液百分比吸光度值与麻痹性贝毒溶液的校正曲线。每次试验均应重新绘制校正曲线。

结果的计算：

任何麻痹性贝毒含量值大于0.2μg/100g的样品即被认为是有害的，对人类食用不安全。

在绘制的校正曲线上读取样液百分比吸光度值所对应的麻痹性贝毒浓度即为试样中麻痹性贝毒的含量(μg/kg)。

当测定值＜0.2μg/100g时，麻痹性贝毒为阴性；当测定值≥0.2μg/100g时，麻痹性贝毒为阳性。

请注意：为了获得样品中的麻痹性贝毒的实际浓度(μg/kg)，从校正曲线上读出的浓度值必须乘以相对应的稀释系数。

检出限：检测范围为10~100μg/kg。检测下限为10μg/kg。

回收率：添加回收实验：约90％。

完成实验的关键注意点：

(1)按要求将所有试剂回升至室温22-25℃，测量实验台面的温度为22-25℃。

(2)将锡箔袋回至室温后，沿横向边压封线外侧剪开，取出需用数量的酶标板及框架，将不用的酶标板立即放回原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2-8℃。

(3)如果用移液器洗酶标板时，移液器管尖千万不要进入酶标板孔中，不要接触到放进孔中的液体，避免污染洗涤液造成洗板不彻底。

(4)实验完毕后，如果容器再次使用，请认真洗净容器，不要造成容器的交叉污染，特别是不要将盛装过标准溶液的容器与其它容器同时洗涤(最好丢弃)。

(5)所有吸头应该一次性使用，要使用高品质的吸头。

Claims

1、麻痹性贝毒竞争酶联免疫定量检测试剂盒，其特征在于它含有：(1)由麻痹性贝毒单克隆抗体包被的酶标板；

(2)麻痹性贝毒标准抗原液；

(3)包被液：PH9.6，0.05M碳酸盐缓冲液；

(4)封闭液：1％BSA的磷酸盐缓冲液；

(5)辣根过氧化物酶标记抗原结合物；

(6)底物：过氧化尿素和四甲基联苯胺；

(7)反应停止液：2M硫酸溶液；

和(8)洗涤液：磷酸盐缓冲液。

2、麻痹性贝毒竞争酶联免疫定量检测试剂盒的制备，主要包括由麻痹性贝毒单克隆抗体包被的酶标板的制备，其特征在于：

(2)将麻痹性贝毒溶于二甲基亚砜中，将牛血清白蛋白、碳化二亚胺，N-羟基磺基琥珀酰亚胺分别溶于pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，按1∶3∶1∶1的比例将上述4种物质混和在一起，4℃搅拌过夜，次日，将反应液移入超滤管中，4℃条件下离心，用磷酸盐缓冲溶液冲洗并收集超滤膜上的偶联物，分装后-20℃冻存备用，此偶联物作为免疫原。以所获抗原免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，培养，筛选克隆；将特异性性的抗STX单克隆细胞株小鼠腹腔注射，收取腹水，采用辛酸-饱和硫酸铵改进方法进行单克隆抗体的纯化；

(3)单克隆抗体包被的酶标板的制作：将所纯化的单克隆抗体用包被液碳酸盐缓冲液按1∶800浓度包被，加入酶标板，37℃孵育3h，洗涤液洗涤酶标板，再用封闭液37℃封闭2h，洗涤酶标板，甩干，吹干。

3、麻痹性贝毒竞争酶联免疫定量检测试剂盒做为检测样品中的腹泻性贝类毒素的试剂的应用。