CN117567594A - 一种模拟cd31线性分子抗原性的分支多肽制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于单克隆抗体制备技术领域，具体涉及一种模拟CD31线性分子抗原性的分支多肽制备方法，所述分支多肽制备方法包括以下步骤：步骤1.实验材料准备；步骤2.实验仪器准备；步骤3.氨基酸活化；步骤4.联接氨基酸到树脂上；步骤5.脱去氨基酸的Fmoc保护基；步骤6.裂解肽树脂；步骤7.多肽的分离；步骤8.多肽的分离纯化及分析。该发明分支肽链代替线性肽链制备的单克隆抗体成功，具有生产意义，这种方法降低了成本，加快了制备速度，提高了抗体质量，多肽合成只需短时间，制备的单克隆抗体可用于WB和IHC实验，满足了不同抗原决定簇的需求，总之，分支肽链制备的单克隆抗体具有精确定位、成本低、效率高和多功能性的特点。

Description

一种模拟CD31线性分子抗原性的分支多肽制备方法
技术领域
本发明属于单克隆抗体制备技术领域，具体涉及一种模拟CD31线性分子抗原性的分支多肽制备方法。
背景技术
CD31又称为血小板-内皮细胞粘附分子(Plateletendothelialcelladhesionmolecule-1，PECAM-1/CD31)，分子量为130kDa，其结构属于免疫球蛋白超家族成员，在清除体内老化的中性粒细胞过程中发挥重要作用，CD31存在于血小板、中性粒细胞、单核细胞和某些类型的T细胞表面，以及内皮细胞间紧密连接处，文献表明CD31参与白细胞的迁移、血管生成和整合素的激活，CD-31通常位于血管内皮细胞、血小板、巨噬细胞和枯否氏细胞、粒细胞、T细胞、NK细胞、淋巴细胞、巨核细胞、破骨细胞、嗜中性粒细胞，在某些肿瘤也发现CD31的表达，如上皮样血管内皮瘤、上皮样肉瘤样血管内皮瘤、其他血管肿瘤、组织细胞性恶性肿瘤和浆细胞，而在肉瘤很少发现，如卡波氏肉瘤，在免疫组化中，CD31是主要用于评估肿瘤血管生成，用于证明内皮细胞组织的存在，高度增生的血管意味着肿瘤的恶性程度更高。
CD31蛋白是科学研究的热门靶点，开发优质的抗CD31抗体有巨大的市场需求，然而，市场上CD31抗体质量良莠不齐，存在的问题是：一、流式检测、免疫组化检测和免疫印记检测使用的抗体不能统一，这样同一名称下抗体的型号很多，性能不同，给客户造成巨大的选择困难，二、染色效果不好，表现为，免疫印记检测时，显色条带不单一、条带模糊、位置不正确等问题，免疫组化染色时，抗原细胞内定位不清、前景、背景对比不够明显等诸多缺陷，三、有些抗体结合特异性不好，应该结合CD31的抗体结合其他同源性高的分子，为此，我们计划开发一个特异性高、通用性好、既可用于免疫组化染色，又可用于免疫印记染色的单克隆抗体，而单克隆抗体的开发，抗原多肽的选择，是决定抗体性质的关键因素。
多肽免疫原性弱，使用一个抗原决定簇难以引发有效的引发免疫反应，用过长的多肽，同样又造成免疫表位不清晰的情况，如果采用同一线性表位重复出现的办法，也会形成氨基酸的新组合，形成非特异性的抗体，为克服这一情况，传统的工艺是使用钥孔蛋白或者牛血清白蛋白增强免疫反应，而钥孔蛋白和牛血清白蛋白本身就能引发大量的非特异性结合抗体，降低抗体制备的质量，增加抗体选择的难度，为此我们提出一种模拟CD31线性分子抗原性的分支多肽制备方法来解决上述问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种模拟CD31线性分子抗原性的分支多肽制备方法，能够使用分支肽链代替线性肽链，成功制备了单克隆抗体，抗原表位精确定位，机理清楚更受科研工作者欢迎，降低了成本，短肽由几个氨基酸构成，可以直接用化学法合成，完整或者部分蛋白用合成法的话，由于长度多长，成本高昂，用基因重组法表达同样成本高昂，加快了制备速度，多肽合成只需要很短时间，提高了抗体质量，由于缩短了氨基酸链的长度，可同时用于WB免疫组化染色和流式细胞鉴定:由于采用的是多抗，针对多肽的不同抗原决定簇，可以同时产生几万种抗体，这些抗体中，有些针对线性抗原，有些针对具有二级结构的非线性抗原，所以产生的多抗能够用于WB，也能用于IHC。
本发明采取的技术方案具体如下：
一种模拟CD31线性分子抗原性的分支多肽制备方法，所述分支多肽制备方法包括以下步骤：
步骤1.实验材料准备；
步骤2.实验仪器准备；
步骤3.氨基酸活化；
步骤4.联接氨基酸到树脂上；
步骤5.脱去氨基酸的Fmoc保护基；
步骤6.裂解肽树脂；
步骤7.多肽的分离；
步骤8.多肽的分离纯化及分析。
在一种优选方案中，所述实验材料准备包括P-羟甲基苯氧甲基多聚乙烯树脂，Wang树脂、Fmoc-AA、NMP氮甲基吡咯烷酮、DCM二氯甲烷、MeoH甲醇、Piperidine哌啶、DMAP二甲基氨基吡啶、HOBT羟基苯并三唑、DCCN,N'-二环己基碳二亚胺、TFA三氟乙酸、EDT1,2-乙二硫醇、硫代苯甲醚、结晶苯酚、乙腈。
在一种优选方案中，所述实验仪器准备包括多肽自动合成仪、旋转蒸发仪、高效液相色谱仪、冷冻干燥机、真空循环水泵、离心机。
在一种优选方案中，所述氨基酸活化为将化合物羧基末端甘氨酸的羧基以共价键形式同一个不溶性的高分子化合物载体HMP树脂相连接。
在一种优选方案中，所述联接氨基酸到树脂上为在合成完羧基端第二个氨基酸即赖氨酸后将其α-氨基和侧链氨基的保护基同时脱去，暴露两个自由氨基，在偶联上两个相同的赖氨酸。
在一种优选方案中，所述脱去氨基酸的Fmoc保护基为将这两个赖氨酸的α-氨基和侧链氨基的保护基同时脱去，此时就有四个自由氨基，再与过量的活化羧基组份偶联，这样就有四个赖氨酸同时偶联上去，再脱去此四个赖氨酸上的八个氨基保护基，此为八分支赖氨酸骨架，再此骨架上同时接上八个相同的多肽，VMAMVEHSGNYTC-GSK，即得到具有完整的免疫原生物学活性的多肽衍生物：(VMAMVEHSGNYTC-GSK)8(Kys)4-(Lys)2-Lys-Gly。
在一种优选方案中，所述裂解肽树脂为用TFA将多肽从肽树脂上切割下来：用EDT,硫代苯甲醚,H2O作清除剂，在室温下反应3.0小时,除去切割试剂，再用乙醚萃取，得到(VMAMVEHSGNYTC-GSK)8(Kys)4-(Lys)2-Lys-Gly多肽化合物粗品。
在一种优选方案中，所述多肽的分离为用三氟乙酸结合以1,2-乙二硫醇、硫代苯甲醚和水混合的清除剂与所述肽树脂反应，以将所述CD31或对比例多肽片段从肽树脂上分离；反应后过滤掉树脂，并通过减压蒸馏出去所述清除剂；将所述CD31或对比例多肽片段用水溶解后，用乙醚萃取，得到CD31或对比例多肽化合物粗品。
在一种优选方案中，所述多肽的分离纯化及分析为采用高效液相色谱将所述CD31或对比例多肽化合物粗品分离纯化，具体操作条件为：色谱柱：C1825×250mm，色谱仪：Waters600，流动相：A-0.1%TFA、H2O、B-0.1%TFA于60%乙腈，检测波长：214nm，流速：10ml/min，洗脱梯度从20-60%，由此，可以得到纯度>90%的多肽，满足免疫需求。
在一种优选方案中，所述多肽的分离纯化及分析进一步地对分离提纯后的CD31多肽进行高效液相色谱分析，其分析条件为：色谱柱：C184.6×150mm，流动相：A-0.1%TFA、H2O，B-0.1%TFA、乙腈，检测波长：214nm，流速：1ml/min，洗脱梯度从0-60%。
本发明取得的技术效果为：
使用分支肽链代替线性肽链，成功制备了单克隆抗体，抗原表位精确定位，机理清楚更受科研工作者欢迎，降低了成本，短肽由几个氨基酸构成，可以直接用化学法合成，完整或者部分蛋白用合成法的话，由于长度太长，成本高昂，用基因重组法表达同样需要表达体系，也造成成本高昂。多肽合成只需要很短时间，加快了制备速度，提高了抗体质量，由于缩短了氨基酸链的长度，可同时用于WB免疫组化染色和流式细胞鉴定: 由于采用的是免疫原性更好的分支抗原，产生的抗体亲和力高、特异性好，经验证可用于WB，也可用于IHC。
附图说明
图1是本发明的一种模拟CD31线性分子抗原性的分支多肽制备方法的示意图；
图2是本发明的一种模拟CD31线性分子抗原性的分支多肽制备方法的联接氨基酸到树脂上的示意图；
图3是本发明的一种模拟CD31线性分子抗原性的分支多肽制备方法的脱去氨基酸的Fmoc保护基的示意图；
图4是本发明的一种模拟CD31线性分子抗原性的分支多肽制备方法的氨基酸活化的示意图；
图5是本发明的一种模拟CD31线性分子抗原性的分支多肽制备方法的氨基酸偶联的示意图；
图6是本发明的一种模拟CD31线性分子抗原性的分支多肽制备方法的氨基酸分枝结构示意图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
实施例一
请参阅图1-6所示，本发明提供了一种模拟CD31线性分子抗原性的分支多肽制备方法，分支多肽制备方法包括以下步骤：
步骤1.实验材料准备；
步骤2.实验仪器准备；
步骤3.氨基酸活化；
步骤4.联接氨基酸到树脂上；
步骤5.脱去氨基酸的Fmoc保护基；
步骤6.裂解肽树脂；
步骤7.多肽的分离；
步骤8.多肽的分离纯化及分析。
实验材料准备包括P-羟甲基苯氧甲基多聚乙烯树脂，Wang树脂、Fmoc-AA、NMP氮甲基吡咯烷酮、DCM二氯甲烷、MeoH甲醇、Piperidine哌啶、DMAP二甲基氨基吡啶、HOBT羟基苯并三唑、DCCN,N'-二环己基碳二亚胺、TFA三氟乙酸、EDT1,2-乙二硫醇、硫代苯甲醚、结晶苯酚、乙腈；
实验仪器准备包括多肽自动合成仪、旋转蒸发仪、高效液相色谱仪、冷冻干燥机、真空循环水泵、离心机，氨基酸活化为将化合物羧基末端甘氨酸的羧基以共价键形式同一个不溶性的高分子化合物载体HMP树脂相连接，联接氨基酸到树脂上为在合成完羧基端第二个氨基酸即赖氨酸后将其α-氨基和侧链氨基的保护基同时脱去，暴露两个自由氨基，在偶联上两个相同的赖氨酸；
脱去氨基酸的Fmoc保护基为将这两个赖氨酸的α-氨基和侧链氨基的保护基同时脱去，此时就有四个自由氨基，再与过量的活化羧基组份偶联，这样就有四个赖氨酸同时偶联上去，再脱去此四个赖氨酸上的八个氨基保护基，此为八分支赖氨酸骨架，再此骨架上同时接上八个相同的多肽，VMAMVEHSGNYTC-GSK，即得到具有完整的免疫原生物学活性的多肽衍生物：(VMAMVEHSGNYTC-GSK)8(Kys)4-(Lys)2-Lys-Gly；
裂解肽树脂为用TFA将多肽从肽树脂上切割下来：用EDT,硫代苯甲醚,H2O作清除剂，在室温下反应3.0小时,除去切割试剂，再用乙醚萃取，得到(VMAMVEHSGNYTC-GSK)8(Kys)4-(Lys)2-Lys-Gly多肽化合物粗品；
多肽的分离为用三氟乙酸结合以1,2-乙二硫醇、硫代苯甲醚和水混合的清除剂与肽树脂反应，以将CD31或对比例多肽片段从肽树脂上分离；反应后过滤掉树脂，并通过减压蒸馏出去清除剂；将CD31或对比例多肽片段用水溶解后，用乙醚萃取，得到CD31或对比例多肽化合物粗品；
多肽的分离纯化及分析为采用高效液相色谱将CD31或对比例多肽化合物粗品分离纯化，具体操作条件为：色谱柱：C1825×250mm，色谱仪：Waters600，流动相：A-0.1%TFA、H2O、B-0.1%TFA于60%乙腈，检测波长：214nm，流速：10ml/min，洗脱梯度从20-60%，由此，可以得到纯度>90%的多肽，满足免疫需求，多肽的分离纯化及分析进一步地对分离提纯后的CD31多肽进行高效液相色谱分析，其分析条件为：色谱柱：C184.6×150mm，流动相：A-0.1%TFA、H2O，B-0.1%TFA、乙腈，检测波长：214nm，流速：1ml/min，洗脱梯度从0-60%；
氨基酸分枝结构中每条分枝的序列如下：丝氨酸-亮氨酸-赖氨酸-天门冬氨酸-色氨酸-苏氨酸-缬氨酸-赖氨酸，氨基酸分枝结构中每条分枝的序列如下：以赖氨酸结尾，在第5位以酸性氨基酸构建，氨基酸序列：天冬酰胺-丝氨酸-精氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺-天冬酰胺-苯丙氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-亮氨酸-赖氨酸，1,4,6位密集使用天冬酰胺调节分枝肽的每一条肽链，增强抗原性，氨基酸序列：组氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-天冬酰胺-丝氨酸-天门冬氨酸-缬氨酸-谷氨酰胺-络氨酸-苏氨酸-赖氨酸，以碱性氨基酸开头，结合4,6两位使用天门冬酰胺，增强抗原性。
实施例二
CD31单克隆抗体的制备及检测
免疫动物
取8～12周龄与骨髓瘤细胞同种系的Balb/c小鼠，以含分支多肽的抗原与等量福氏完全佐剂充分乳化，注入小鼠腹腔内，间隔2～4周用福氏不完全佐剂乳化抗原，多采用皮下多点注射。第二次免疫后约一周，尾静脉采血，检测抗体效价，对符合要求的小鼠，再以20μg/100μL的抗原溶液进行脾内直接注射，加强免疫，3天后取脾脏用于细胞融合。
1．骨髓瘤细胞复苏
将冷冻的骨髓瘤细胞从液氮罐内取出，立即放入37℃水浴中，融化后1000r/min离心5min。将沉淀细胞移入细胞培养瓶中，加DMEM完全培养液，置CO2培养箱内培养。
2．骨髓瘤细胞培养
将骨髓瘤细胞（Sp2/0）培养在含10%～15%小牛血清的完全培养液中，每3～4天进行一次传代或扩大培养，然后选处于旺盛生长、形态良好的对数生长期细胞供融合使用。
3.饲养细胞的培养
取Balb/c小鼠3～4只，颈椎脱位法处死后，浸泡在75%乙醇中消毒。小鼠固定于蜡盘上，腹部朝上，用无菌剪刀在其腹部皮肤剪一小口，暴露腹肌，用灭菌注射器将DMEM培养液5mL注入小鼠腹腔内，轻轻按摩其腹部约1～2min。用注射器抽取腹腔内液体，置于预冷的50mL离心管中。1000rpm离心10min，弃上清，将细胞悬于20mLHAT培养液中，混匀后将细胞悬液滴加于96孔培养板的小孔中，每孔100μL，放置5%～7%CO2，37℃，饱和湿度的培养箱中培养。
4杂交瘤细胞的选择培养：
在细胞融合后第一天，每孔分别滴加100μLHAT培养液，每2～3天换一半HAT培养液。7～10天停止使用HAT培养液，改用HT培养液。吸取培养液进行特异性抗体检测，确定哪个孔中有分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。
5特异性抗体的检测
将稀释至适当浓度的抗原滴入96孔板的每个小孔内，每孔100μL，置4℃吸附过夜。次日甩去孔中的抗原液，用PBST洗涤液洗三次。每孔加入200μL含10%牛血清白蛋白的0.01MpH7.2磷酸盐缓冲液，置37℃1h，以封闭孔壁上的空隙，并防止非特异性结合。再用磷酸盐缓冲液洗2～3次。每孔加入100μL待测上清，置湿盒内于37℃作用1h，同时设阴性、阳性对照。用洗涤液洗三次后，每孔加入100μL用稀释液适度稀释的HRP标记的抗小鼠IgG二抗，置湿盒内于37℃1h。甩掉多余的酶标二抗，用洗涤液洗五次，然后用蒸馏水洗两次。每孔加入100μL新配制的底物TMB，置室温暗处作用5～30min，当阳性对照孔变蓝色时，加入100μL2mol/L硫酸，终止反应。置酶标读数仪测定结果。
6、将杂交瘤细胞接种于同系小鼠或裸鼠腹腔具体步骤：
（1）在接种杂交瘤细胞前，先给小鼠（Balb/c小鼠）腹腔注射0.5mL降植烷。
（2）然后每只小鼠腹腔注射5×105～106个杂交瘤细胞。
（3）接种杂交瘤细胞约7～10天后，小鼠腹部明显涨大，用75%乙醇消毒其腹部，将灭菌的注射针头（7号）刺入小鼠下腹部，让腹水滴入试管内，取腹水2～3次。
（4）腹水以1500rpm离心10min，吸取上清液，加入0.02%叠氮钠，分装保存于-20℃。
本发明中，使用分支肽链代替线性肽链，成功制备了单克隆抗体，抗原表位精确定位，机理清楚更受科研工作者欢迎，降低了成本，短肽由几个氨基酸构成，可以直接用化学法合成，完整或者部分蛋白用合成法的话，由于长度多长，成本高昂，用基因重组法表达同样成本高昂，加快了制备速度，多肽合成只需要很短时间，提高了抗体质量，由于缩短了氨基酸链的长度，可同时用于WB免疫组化染色和流式细胞鉴定:由于采用的是多抗，针对多肽的不同抗原决定簇，可以同时产生几万种抗体，这些抗体中，有些针对线性抗原，有些针对具有二级结构的非线性抗原，所以产生的多抗能够用于WB，也能用于IHC。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本发明中未具体描述和解释说明的结构、装置以及操作方法，如无特别说明和限定，均按照本领域的常规手段进行实施。

Claims (16)

1.一种模拟CD31线性分子抗原性的分支多肽制备方法，其特征在于：所述分支多肽制备方法包括以下步骤：
步骤1.实验材料准备；
步骤2.实验仪器准备；
步骤3.氨基酸活化；
步骤4.联接氨基酸到树脂上；
步骤5.脱去氨基酸的Fmoc保护基；
步骤6.裂解肽树脂；
步骤7.多肽的分离；
步骤8.多肽的分离纯化及分析。
2.根据权利要求1所述的一种模拟CD31线性分子抗原性的分支多肽制备方法，其特征在于：所述实验材料准备包括P-羟甲基苯氧甲基多聚乙烯树脂，Wang树脂、Fmoc-AA、NMP氮甲基吡咯烷酮、DCM二氯甲烷、MeoH甲醇、Piperidine哌啶、DMAP二甲基氨基吡啶、HOBT羟基苯并三唑、DCCN,N'-二环己基碳二亚胺、TFA三氟乙酸、EDT1,2-乙二硫醇、硫代苯甲醚、结晶苯酚、乙腈。
3.根据权利要求1所述的一种模拟CD31线性分子抗原性的分支多肽制备方法，其特征在于：所述实验仪器准备包括多肽自动合成仪、旋转蒸发仪、高效液相色谱仪、冷冻干燥机、真空循环水泵、离心机。
4.根据权利要求1所述的一种模拟CD31线性分子抗原性的分支多肽制备方法，其特征在于：所述氨基酸活化为将化合物羧基末端甘氨酸的羧基以共价键形式同一个不溶性的高分子化合物载体HMP树脂相连接。
5.根据权利要求1所述的一种模拟CD31线性分子抗原性的分支多肽制备方法，其特征在于：所述联接氨基酸到树脂上为在合成完羧基端第二个氨基酸即赖氨酸后将其α-氨基和侧链氨基的保护基同时脱去，暴露两个自由氨基，在偶联上两个相同的赖氨酸。
6.根据权利要求1所述的一种模拟CD31线性分子抗原性的分支多肽制备方法，其特征在于：所述脱去氨基酸的Fmoc保护基为将这两个赖氨酸的α-氨基和侧链氨基的保护基同时脱去，此时就有四个自由氨基，再与过量的活化羧基组份偶联，这样就有四个赖氨酸同时偶联上去，再脱去此四个赖氨酸上的八个氨基保护基，此为八分支赖氨酸骨架，再此骨架上同时接上八个相同的多肽，VMAMVEHSGNYTC-GSK，即得到具有完整的免疫原生物学活性的多肽衍生物：(VMAMVEHSGNYTC-GSK)8(Kys)4-(Lys)2-Lys-Gly。
7.根据权利要求1所述的一种模拟CD31线性分子抗原性的分支多肽制备方法，其特征在于：所述裂解肽树脂为用TFA将多肽从肽树脂上切割下来：用EDT,硫代苯甲醚,H2O作清除剂，在室温下反应3.0小时,除去切割试剂，再用乙醚萃取，得到(VMAMVEHSGNYTC-GSK)8(Kys)4-(Lys)2-Lys-Gly多肽化合物粗品。
8.根据权利要求1所述的一种模拟CD31线性分子抗原性的分支多肽制备方法，其特征在于：所述多肽的分离为用三氟乙酸结合以1,2-乙二硫醇、硫代苯甲醚和水混合的清除剂与所述肽树脂反应，以将所述CD31或对比例多肽片段从肽树脂上分离；反应后过滤掉树脂，并通过减压蒸馏出去所述清除剂；将所述CD31或对比例多肽片段用水溶解后，用乙醚萃取，得到CD31或对比例多肽化合物粗品。
9.根据权利要求1所述的一种模拟CD31线性分子抗原性的分支多肽制备方法，其特征在于：所述多肽的分离纯化及分析为采用高效液相色谱将所述CD31或对比例多肽化合物粗品分离纯化，具体操作条件为：色谱柱：C1825×250mm，色谱仪：Waters600，流动相：A-0.1%TFA、H2O、B-0.1%TFA于60%乙腈，检测波长：214nm，流速：10ml/min，洗脱梯度从20-60%，由此，可以得到纯度>90%的多肽，满足免疫需求。
10.根据权利要求9所述的一种模拟CD31线性分子抗原性的分支多肽制备方法，其特征在于：所述多肽的分离纯化及分析进一步地对分离提纯后的CD31多肽进行高效液相色谱分析，其分析条件为：色谱柱：C184.6×150mm，流动相：A-0.1%TFA、H2O，B-0.1%TFA、乙腈，检测波长：214nm，流速：1ml/min，洗脱梯度从0-60%。
11.根据权利要求1所述的一种模拟CD31线性分子抗原性的分支多肽制备方法，其特征在于：所述氨基酸分枝结构中每条分枝的序列如下：丝氨酸-亮氨酸-赖氨酸-天门冬氨酸-色氨酸-苏氨酸-缬氨酸-赖氨酸。
12.根据权利要求1所述的一种模拟CD31线性分子抗原性的分支多肽制备方法，其特征在于：所述氨基酸分枝结构中每条分枝的序列如下：以赖氨酸结尾，在第5位以酸性氨基酸构建。
13.根据权利要求1所述的一种模拟CD31线性分子抗原性的分支多肽制备方法，其特征在于：所述氨基酸序列：天冬酰胺-丝氨酸-精氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺-天冬酰胺-苯丙氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-亮氨酸-赖氨酸。
14.根据权利要求1所述的一种模拟CD31线性分子抗原性的分支多肽制备方法，其特征在于：所述1,4,6位密集使用天冬酰胺调节分枝肽的每一条肽链，增强抗原性。
15.根据权利要求1所述的一种模拟CD31线性分子抗原性的分支多肽制备方法，其特征在于：所述氨基酸序列：组氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-天冬酰胺-丝氨酸-天门冬氨酸-缬氨酸-谷氨酰胺-络氨酸-苏氨酸-赖氨酸。
16.根据权利要求15所述的一种模拟CD31线性分子抗原性的分支多肽制备方法，其特征在于：所述以组氨酸开头，结合4,6两位使用天门冬酰胺，增强抗原性。
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