ES2353273T3 - Anticuerpos anti-cd28. - Google Patents
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Abstract
Proteína capaz de unirse específicamente al receptor linfocitario CD28 y bloquear la interacción CD28/B7, caracterizada porque comprende al menos las CDR de la cadena pesada y de la cadena ligera de la inmunoglobulina CD28.3 producida por el hibridoma CNCM I-2582, y porque se elige de entre: a) el anticuerpo CD28.3 producido por el hibridoma CNCM I-2582; b) los fragmentos Fv, Fab o scFv del anticuerpo CD28.3; c) los anticuerpos quiméricos o humanizados obtenidos a partir de las regiones variables de CD28.3; d) los fragmentos Fv, Fab o scFv de un anticuerpo quimérico o humanizado c); e) las proteínas recombinantes que incluyen un fragmento b) o d) y un polipéptido heterólogo.
Description
La invención se refiere a anticuerpos dirigidos contra el receptor linfocitario CD28, a sus fragmentos, así como a sus utilizaciones terapéuticas, en particular en el marco de la regulación de la activación de las células T.
En la patogénesis de numerosas enfermedades autoinmunes, así como en fenómenos de rechazo de injertos, provocando el desarrollo de una respuesta inmune dirigida contra el injerto, aparece una activación anormal de las células T.
La activación de los linfocitos T necesita una señal activadora inducida por el reconocimiento, por los receptores T (TCR), del antígeno asociado al complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) de clase II y presentado por las células presentadoras del antígeno (CPAg). Sin embargo, esta activación sólo provoca la proliferación de células T y la secreción de citoquinas inmunomoduladoras específicas (tales como interleucina 2, interferón gamma o interleucina 4), cuando se activan también otros sistemas de coestímulo T.
Uno de los sistemas más importantes de regulación de la activación de los linfocitos T es el sistema molecular B7/CD28/CTLA4. Este sistema desempeña, por ejemplo, un papel esencial en los mecanismos de rechazo de injertos [WOODWARD y col., Transplantation, 66, 14-20, (1998)]. Las moléculas B7.1 (CD80) y B7.2 (CD86), llevadas por las CPAg, pueden activar el receptor CD28 y el receptor CTLA4 de los linfocitos T. La activación del CD28 suministra al linfocito T una señal positiva que estimula la célula; en cambio, la activación del CTLA4 suministra una señal negativa que conduce a una no respuesta (anergia) [FALLARINO y col., J. Exp. Med., 188, 205-210, (1998)].
Los linfocitos T en reposo expresan una cantidad importante de CD28 y muy poca de CTLA4. En un primer contacto cognitivo entre una CPAg y un linfocito T, prevalece la interacción CD28/B7, lo que activa la célula. Sólo varias horas después de la iniciación de la activación, debido al incremento de la expresión membranaria de CTLA4, cuya afinidad con B7 es 5 a 10 veces superior a la del CD28, la interacción B7/CD28 se desplaza a beneficio de una interacción B7/CTLA4.
Actualmente, para bloquear la activación de los linfocitos T, en particular en el marco de los transplantes de órganos, se utiliza principalmente la ciclosporina. A pesar de la eficacia de este medicamento, la protección que confiere no es absoluta. Además, actúa bloqueando todas las vías de activación celulares dependientes del calcio y, por tanto, posee una actividad biológica que no es estrictamente específica de los linfocitos T y provoca muchos efectos secundarios. Por ello, es deseable desarrollar nuevos inmunosupresores con un mecanismo de acción definido y de mayor especificidad.
Se ha postulado que la inhibición selectiva de la señal agonista proporcionada a la célula T por el CD28 dejando intacto el sistema antagonista constituido por la pareja CTLA4/B7 mediante un bloqueo específico de la interacción CD28/B7 permitiría prevenir la activación de los linfocitos T. Dicho bloqueo específico de la interacción CD28/B7 puede obtenerse gracias a un anticuerpo dirigido contra CD28.
Son conocidos anticuerpos anti-CD28 capaces de impedir la unión de CD28 con B7. Sin embargo, cuando se utilizan en su forma nativa divalente, presentan el inconveniente de provocar la dimerización y activación de CD28 por su unión a este receptor. Sin embargo, fragmentos monovalentes procedentes de estos anticuerpos son capaces de bloquear, sin activarlo, el receptor CD28 [DAMLE y col., J. Immunol., 140, 1753-1761, (1988); NUNES y col., Int. Immunol., 5, 311-315, (1993); PAGES y col., J. Biol. Chem., 271, 9403, (1996)].
Así, se ha reportado [PERRIN y col., J. Immunol. 163, 1704-1710, (1999)] que fragmentos Fab procedentes de un anticuerpo anti-CD28 podían detener los síntomas clínicos de la encefalitis experimental autoinmune inducida en el ratón por la administración de mielina o por la transferencia de células T de un animal afectado.
Fragmentos monovalentes Fab o scFv derivados de un anticuerpo antiCD28 se pueden utilizar potencialmente para prevenir la activación de los linfocitos T por medio de un bloqueo específico de la interacción CD28/B7.
Los fragmentos Fab resultan de la acción de la papaína sobre una molécula de inmunoglobulina y contienen cada uno una cadena ligera y la primera mitad de una cadena pesada; los fragmentos scFv están constituidos por porciones variables de las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo unidas entre sí por intermediación de un ligante flexible [CLACKSON y col., Nature, 352, 624-628, (1991)], formando así una proteína de cadena simple.
Con frecuencia, estos fragmentos monovalentes presentan una afinidad por el antígeno menos importante que la de los anticuerpos nativos, lo que puede limitar sus posibilidades de utilización en aplicaciones diagnósticas o terapéuticas.
Los inventores han logrado seleccionar, de entre distintos anticuerpos que reconocen el antígeno CD28, un anticuerpo capaz de bloquear la interacción CD28/B7, cuyos fragmentos monovalentes presentan una afinidad suficiente por el antígeno como para que sean útiles, in vitro o in vivo, en el bloqueo del receptor CD28, sin que se produzca la activación de este receptor.
Este anticuerpo, llamado CD28.3, es producido por el hibridoma depositado según los términos del tratado de Budapest, a 28 de noviembre de 2000, en la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15) bajo el número I-2582.
La presente invención tiene por objeto una proteína capaz de unirse específicamente al receptor linfocitario CD28 y bloquear la interacción CD28/B7, caracterizada porque comprende al menos las CDR de la cadena pesada y de la cadena ligera de la inmunoglobulina CD28.3, y que se seleccionan de entre:
a) el anticuerpo CD28.3 producido por el hibridoma CNCM I-2582;
b) los fragmentos Fv, Fab o scFv del anticuerpo CD28.3;
c) los anticuerpos quiméricos o humanizados obtenidos a partir de las regiones variables de CD28.3;
d) los fragmentos monovalentes Fv, Fab o scFv de los anticuerpos c) mencionados más arriba que comprenden las CDR del anticuerpo CD28.3;
e) las proteínas recombinantes que incluyen un fragmento b) o d) y un polipéptido heterólogo.
Las CDR (regiones que determinan la complementariedad) son aquellas porciones de las regiones variables de una inmunoglobulina implicadas en la especificidad de reconocimiento del antígeno.
Así, las proteínas según la invención abarcan en particular:
proteínas que asocian al menos un fragmento de anticuerpo, que comprende las CDR del anticuerpo CD28.3, a al menos un fragmento de anticuerpo que incluye las CDR de un anticuerpo de diferente especificidad; a modo de ejemplo, se mencionan inmunoglobulinas biespecíficas, conjugados de un fragmento Fv o Fab que contienen las CDR de CD28.3 con un fragmento Fv o Fab de un anticuerpo de diferente especificidad, “diacuerpos biespecíficos” que resultan de la asociación de un fragmento scFv que contiene las CDR de CD28.3 a un fragmento Fv o Fab de un anticuerpo de diferente especificidad;
proteínas que asocian al menos un fragmento de anticuerpo que comprende las CDR del anticuerpo CD28.3 a una molécula provista de actividad farmacológica (por ejemplo una toxina) o de propiedades efectoras (por ejemplo un fragmento Fc);
proteínas que asocian al menos un fragmento de anticuerpo que comprende las CDR del anticuerpo CD28.3 a una molécula que permite prolongar su vida media plasmática durante su administración in vivo; por ejemplo, se puede asociar dicho fragmento de anticuerpo a un polipéptido hidrosoluble de masa molecular suficiente para que la masa molecular del polipéptido de fusión así obtenido sea superior al umbral de filtración renal. En este caso, se elegirá un polipéptido que, contrariamente a los fragmentos Fc, no pueda asociarse en dímeros y que no posea actividad efectora propia susceptible de provocar efectos secundarios inoportunos. Se pueden obtener ventajosamente polipéptidos que poseen estas propiedades a partir de proteínas séricas hidrosolubles, a saber: en particular seroalbúmina, haptoglobulina, ITIH2 (inhibidor inter-alfa (globulina), polipéptido H2), transferrina, CBG (proteína ligante de corticosteroides), α-1 antitripsina, ITIH4 (inhibidor inter-alfa (globulina), polipéptido H4), AACT (alfa-1 antiquimotripsina), TBG (globulina ligante de tiroxina), fibrinógeno y protrombina, para preparar proteínas de fusión con fragmentos scFv derivados de anticuerpos anti-CD28. También se puede conjugar una proteína de acuerdo con la invención con un poliol, por ejemplo polietilenglicol, tal como se describe por ejemplo en la patente US 4.179.337.
Se ilustra en la Figura 1 un ejemplo de proteína de acuerdo con la invención, que representa un fragmento scFv derivado del anticuerpo CD28.3. Las secuencias de las CDR del anticuerpo CD28.3 están enmarcadas en la secuencia representada en la Figura 1.
La secuencia nucleotídica que codifica para este fragmento scFv viene representada en la lista de secuencias adjuntas bajo el número SEQ ID NO:1 y la secuencia peptídica correspondiente se representa bajo el número SEQ ID NO:2.
Se pueden obtener fragmentos Fv o Fab de acuerdo con la invención mediante técnicas convencionales de digestión enzimática a partir del anticuerpo CD28.3.
Un plásmido que contiene un polinucleótido que codifica para un fragmento scFv de CD28.3, fusionado a un polinucleótido que codifica para los aminoácidos 53 a 425 de la α-1 antitripsina ha sido depositado, según los términos del tratado de Budapest, a 11 de diciembre de 2001, en la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75124 PARIS CEDEX 15), bajo el número I-2762.
Se pueden obtener proteínas de acuerdo con la invención, tales como anticuerpos quiméricos o recombinantes, fragmentos scFv y sus derivados, etc. mediante técnicas convencionales de ingeniería genética, tales como las descritas en SAMBROOK y col., [MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)].
Se pueden obtener polinucleótidos que codifican regiones variables del anticuerpo anti-CD28.3 por ejemplo mediante clonación de dichas regiones variables a partir de un banco de ADNc del hibridoma CD28.3, o a partir del plásmido CNCM I-2762. Se pueden preparar también total o parcialmente mediante síntesis de ácidos nucleicos, a partir de las secuencias nucleotídicas de dichas regiones variables. Por ejemplo, se pueden sintetizar polinucleótidos que codifican las CDR de CD28.3 e incorporarlos en las regiones marco (FR por “framework regions”) de otro anticuerpo, en particular de un anticuerpo de origen humano, mediante técnicas conocidas en sí de injerto de CDRs, tales como las descritas en ROUTLEDGE y col., [“Reshaping antibodies for therapy”, en PROTEIN ENGINEERING OF ANTIBODY MOLECULES FOR PROPHYLACTIC AND THERAPEUTIC APPLICATIONS IN MAN, 13-44, Academic Titles, Nottingham, Inglaterra (1993)] o ROGUSKA y col., Protein Engineering, 9(10), 895-904, 81996)].
La presente invención tiene igualmente por objeto toda molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de acuerdo con la invención que comprende las CDR del anticuerpo CD28.3, así como todo vector recombinante, en particular todo vector de expresión, que comprende dicha molécula de ácido nucleico.
La presente invención también tiene por objeto toda célula que expresa una proteína de acuerdo con la invención, que comprende las CDR del anticuerpo CD28.3. Ello abarca en particular el hibridoma CNCM I-2582, así como las células huésped transformadas por una molécula de ácido nucleico según la invención.
Las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención pueden comprender ventajosamente, además de una secuencia que codifica una proteína según la invención, una secuencia que codifica un péptido señal que permite la secreción de dicha proteína; pueden incluir asimismo una o varias secuencias que codifican uno o varios péptidos marcadores, permitiendo la detección y/o facilitando la purificación de dicha proteína.
Los vectores de expresión de acuerdo con la invención comprenden al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína según la invención, asociada a elementos de control de la transcripción y de la traducción activos en la célula huésped elegida. Son conocidos de por sí vectores a utilizar para la construcción de vectores de expresión según la invención y se seleccionarán en particular en función de la célula huésped que se desee utilizar.
Las células huésped a utilizar en el marco de la presente invención pueden ser células procariotas o eucariotas. Entre las células eucariotas a utilizar se mencionarán en particular células vegetales, células de levaduras, tales como Saccharomyces, células de insecto, tales como células de Drosophila o de Spodoptera, y células de mamíferos, tales como células HeLa, CHO, 3T3, C127, BHK, COS, etc.
La construcción de vectores de expresión de acuerdo con la invención y la transformación de las células huésped pueden llevarse a cabo mediante técnicas convencionales de biología molecular.
La invención tiene asimismo por objeto un proceso de producción de una proteína de acuerdo con la invención, caracterizado porque comprende el cultivo de al menos una célula según la invención y la recuperación de dicha proteína a partir de dicho cultivo.
Cuando la proteína se secreta puede ser recuperada directamente desde el medio de cultivo; de otro modo, se procederá previamente a la lisis de las células.
Entonces, la proteína puede ser purificada a partir del medio de cultivo o del lisado celular mediante procesos convencionales bien conocidos por el especialista en la técnica, por ejemplo por precipitación fraccionada, en particular por precipitación con sulfato de amonio, electroforesis, filtración en gel, cromatografía de afinidad, etc.
Las proteínas según la invención se pueden utilizar in vitro para estudiar la respuesta proliferativa o la diferenciación de linfocitos T como respuesta a un estímulo antigénico, viral, alogénico o xenogénico. Se pueden utilizar también in vitro para inducir la diferenciación de linfocitos T extraídos de un paciente, por ejemplo la inducción de tolerancia con un antígeno o un aloantígeno, destinados a ser re-administrados in vivo posteriormente.
Se pueden utilizar también para la obtención de medicamentos o de reactivos de diagnóstico.
Las proteínas según la invención monovalentes, es decir presentando un único sitio de unión al receptor CD28, se pueden utilizar en todos aquellos casos en los que se desea bloquear selectivamente este receptor, sin activarlo, con el fin de inducir una inmunosupresión.
En particular, se puede emplear una proteína de acuerdo con la invención que comprende un fragmento monovalente derivado de un anticuerpo anti-CD28 para la obtención de un medicamento inmunosupresor, bloqueando selectivamente los fenómenos de activación de las células T que implican el receptor CD28 y sin presentar los inconvenientes de los inmunosupresores conocidos, por ejemplo de la ciclosporina.
La inmunosupresión T por bloqueo selectivo del CD28 por una proteína de acuerdo con la invención tiene aplicaciones en todas las patologías dependientes de los linfocitos T.
Se trata esencialmente del rechazo de injerto, enfermedad injerto contra huésped, enfermedades autoinmunes mediadas por linfocitos T tales como la diabetes de tipo I o la esclerosis en placas e hipersensibilidad de tipo IV, que interviene en los fenómenos alérgicos, así como en la patogénesis de enfermedades inflamatorias crónicas después de una infección por un agente patógeno (en particular lepra, tuberculosis, leishmaniasis, listeriosis, etc.).
Se entenderá mejor la presente invención por medio del complemento de la descripción siguiente, el cual se refiere a ejemplos no limitativos de preparación y utilización de los anticuerpos de acuerdo con la invención.
Ejemplo 1:
Selección de un anticuerpo que produce fragmentos monovalentes, propiedades de los fragmentos monovalentes Fab procedentes de CD28.3
Algunas de las propiedades de diversos anticuerpos anti-CD28 (CD28.1, CD28.2, CD28.3, CD28.4, CD28.5 y CD28.6) se describen en la publicación de NUNES y col., [Int. Immunol., 5, 311, (1993)]. Estos distintos anticuerpos, que no son accesibles al público, han sido suministrados por el laboratorio de Daniel OLIVE (INSERM). Se compararon las propiedades de unión al antígeno de los fragmentos monovalentes Fab de estos diferentes anticuerpos.
5 mg de fragmentos Fab de cada uno de estos anticuerpos se prepararon por digestión con papaína (relación molar papaína/anticuerpo = 1/100) durante 24 horas a 37ºC, seguida de inactivación de la enzima por yodoacetamida 0,03M y de diálisis contra PBS para eliminar la yodoacetamida.
100.000 células Jurkat CD28+ en 100 μl se incuban en PBS-BSA al 1%NaN3 al 0,1% a 4ºC durante 30 minutos con concentraciones crecientes de anticuerpos anti-CD28 o de sus fragmentos. Después de su lavado, se incuban las células de forma similar con un anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado con el FITC, se lavan y se analizan por citofluorometría.
Se ilustran los resultados en la Figura 2.
Leyenda de la Figura 2:
Eje de abscisas: concentración en anticuerpos o fragmentos Fab Eje de ordenadas: intensidad media de fluorescencia (IMF)
-◊-: F1 = Fragmentos Fab del anticuerpo CD28.1
-■-: F2 = Fragmentos Fab del anticuerpo CD28.2
-Δ-: F3 = Fragmentos Fab del anticuerpo CD28.3 -Χ-: F5 = Fragmentos Fab del anticuerpo CD28.5 -Ο-: F6 = Fragmentos Fab del anticuerpo CD28.6 ..●..: W1 = anticuerpos enteros CD28.1 5 ..-..: W2 = anticuerpos enteros CD28.2
proceden de CD28.3 son capaces de unirse de manera significativa a las células Jurkat CD28+ a concentraciones inferiores a 10 μg/ml.
4 x 105 células T humanas (Jurkat, CD28-positivas) marcadas con 51Cr se incuban durante 2 horas en una placa de microtitulación en la que se habían sembrado 24 horas antes 105 células adherentes LTK-o LB7+ (fibroblastos
20 murinos transfectados con B7.1 humano [PAGES y col., J. Biol. Chem., 271, 9403, (1996)]. Estas incubaciones se realizan en presencia de fragmentos Fab procedentes de los anticuerpos CD28.1 a CD28.6 o del anticuerpo CD28.3, diluidos a distintas diluciones en tampón PBS sin Ca2+ ni Mg2+. Después de los lavados, se cuantifican las células adherentes mediante lectura de la
25 radioactividad residual en un contador beta (PACKARD TOPCOUNT).
Se ilustran los resultados en la Figura 3.
Leyenda de la Figura 3:
Eje de abscisas: porcentaje de células adherentes Eje de ordenadas: concentración en anticuerpos
-♦-: F1 = Fragmentos Fab del anticuerpo CD28.1
-■-: F2 = Fragmentos Fab del anticuerpo CD28.2
-▲-: F3 = Fragmentos Fab del anticuerpo CD28.3
-Χ-: F5 = Fragmentos Fab del anticuerpo CD28.5
5 imagen1
: F6 = Fragmentos Fab del anticuerpo CD28.6
..●..: Anticuerpo entero CD28.3
○: Ningún anticuerpo.
Estos resultados muestran que los fragmentos Fab procedentes de CD28.3 son los más eficaces para inhibir las interacciones CD28/B7. Inhiben la
10 adhesión al 90% a una concentración de 3 μg/ml y con una eficacia comparable a la del anticuerpo CD28.3 entero, mientras que, con esta concentración, los fragmentos Fab procedentes de los demás anticuerpos no inhiben la adhesión en más de un 50%.
Se mezclan 105 células mononucleadas de sangre periférica con 105 células mononucleadas alogénicas irradiadas a 35 Gy, en presencia de concentraciones variables de los anticuerpos CD28.1 a CD28.6 o de fragmentos Fab procedentes de estos anticuerpos. La respuesta proliferativa en estos
20 cultivos se evalúa a los 3 días mediante incorporación de (3H)-timidina durante 16 horas.
Se ilustran los resultados en la Figura 4.
Leyenda de la Figura 4:
Eje de abscisas: concentración en anticuerpos
25 Eje de ordenadas: respuesta proliferativa (cpm) Nivel basal de proliferación = 6.500 cpm
-♦-: 28.1 = anticuerpo CD28.1
-■-: 28.2 = anticuerpo CD28.2
-▲-: 28.3 = anticuerpo CD28.3
-Χ-: 28.5 = anticuerpo CD28.5
5 -_-: Fab. 3 = fragmentos Fab del anticuerpo CD28.3 -+-: Fab. 5 = fragmentos Fab del anticuerpo CD28.5. -◊-: Fab. 6 = fragmentos Fab del anticuerpo CD28.6. Estos resultados muestran que los fragmentos Fab procedentes de
CD28.3 o de CD28.6 son los más eficaces para inhibir la proliferación de las
10 células mononucleadas. Los anticuerpos enteros CD28.1 a CD28.6, probados en paralelo, no tienen ningún efecto inhibidor o estimulan la proliferación por su acción estimuladora sobre CD28.
Efecto de los fragmentos Fab procedentes de CD28.3 sobre la proliferación inducida por un súper-antígeno
15 Para este experimento se mezclaron células T CD4+ respondedoras con PBMC isogénicas irradiadas en presencia de 50 ng/ml de toxina-1 del síndrome de choque tóxico (TSST-1), que estimula específicamente las células TVβ2+, ya sea en ausencia de anticuerpos o en presencia de anti-B7-1 (1 μg/ml), anti-B7-2 (0,5 μg/ml), CTLA-4 Ig (10 μg/ml) o de fragmentos Fab procedentes de CD28.3
20 (10 μg/ml).
Se evalúa la respuesta proliferativa en estas células después de 1, 3, 6 y 8 días mediante la incorporación de (3H)-timidina durante 16 horas.
Se ilustran los resultados en la Figura 5.
Leyenda de la Figura 5:
25 Eje de abscisas: tiempo de cultivo Eje de ordenadas: índice de proliferación = IP
cpmreacción mista linfocitaria -cpmcélulasestimuladorasirradiadassolasIP
cpmcélulas respondedoras no estimuladas
-♦-: Fab anti-CD28.3
-X-: anti B7-2
-■-: CTLA-4 Ig
5 -▲-: anti-B7-1
-○-: ningún anticuerpo
TSST-1 induce una proliferación importante de las células T CD4+. Se observa, en presencia de anti-B7, CTLA-4 Ig o de los fragmentos Fab de CD28.3, una inhibición de esta proliferación del 70% después de 6 días.
10 Efecto de los fragmentos Fab procedentes de CD28.3 sobre la producción de citoquinas
Con el fin de determinar si los fragmentos Fab procedentes de CD28.4 podían inducir una desviación inmune in vitro, se realizó una reacción linfocitaria mixta (PBMC procedentes de un donante A / PBMC irradiadas procedentes de
15 un donante B) en presencia de fragmentos Fab procedentes de CD28.3. Se mezclan 105 células mononucleadas de sangre periférica de un donante con 105 células mononucleadas alogénicas irradiadas a 35 Gy y se cultivan durante 5 días en presencia o ausencia de 10 μg/ml de Fab procedentes del anticuerpo CD28.3.
20 Se extrajo el ARN de las células respondedoras y la cantidad de ARNm de citoquinas se evaluó mediante medida cuantitativa del número de transcritos, relacionada con la cantidad de HPRT por medio de un TaqMan (Perkin Helmer).
Se observa, en presencia de fragmentos Fab procedentes de CD28.3, una reducción de la producción de IFNy y de IL2 y un incremento de la
25 producción de IL10. Esta desviación de la respuesta inmune sugiere una orientación hacia una respuesta de tipo Th2. Este resultado es inesperado en la medida en que se ha reportado que el compromiso de CTLA4 (que se supone interviene durante el bloqueo de CD28 solo) conduce a una respuesta de tipo Th1.
30 Tratamiento in vitro del anticuerpo CD28.3 y de los fragmentos Fab procedentes del mismo por las células T humanas
Se investigó una eventual internalización de los fragmentos Fab del anticuerpo CD28.3 en las células T humanas en comparación con el anticuerpo entero CD28.3.
Se incubaron células T Jurkat en medio de cultivo con 100 μg/ml de anticuerpo CD28.3, a 37ºC ó a 0ºC. En tiempos diferentes, se lavaron las células con tampón PBS frío que contenía un 0,1% de seroalbúmina bovina y NaN3, para bloquear la motilidad membranaria. Los anticuerpos ligados se revelaron con un anticuerpo secundario de cabra anti-ratón marcado con fluoresceína. Se montaron las células en MOVIOL y se analizaron mediante microscopía confocal.
Se observa así que los anticuerpos CD28.3 enteros que se unen a las células T Jurkat son capturados y desaparecen de la superficie celular a 37ºC pero no a 0ºC. Por el contrario, los fragmentos Fab se quedan fijados en la superficie de la célula. Ello indica que la fijación de los anticuerpos divalentes CD28.3 provoca la dimerización de CD28, lo que conduce a su penetración en la célula, mientras que los fragmentos monovalentes Fab, que no inducen esta dimerización, se quedan en la superficie.
Ejemplo 2:
Propiedades de un fragmento scFv derivado del anticuerpo CD28.3
La Figura 1 representa la secuencia nucleotídica y la secuencia polipeptídica deducida de un fragmento scFv derivado del anticuerpo CD28.3. Las porciones de esta secuencia que corresponden al fragmento variable de la cadena pesada y de la cadena ligera se representan con letras mayúsculas. La secuencia que corresponde al fragmento variable de la cadena ligera además se subraya. La secuencia del ligante se representa con letras minúsculas. Las secuencias de las CDR de la cadena pesada y de la cadena ligera están encuadradas.
La secuencia nucleotídica que codifica este fragmento scFv viene representada también en la lista de secuencias adjunta, bajo el número SEQ ID NO:1.
El ADNc que codifica este fragmento scFv ha sido insertado en el vector pIG6 (Biochemisches Institut, Universität Zurich). En particular, este vector comprende un marcador de resistencia a la ampicilina y un cassette de expresión que incluye un promotor lac inducible, bajo el control del cual se encuentran: una secuencia que codifica un péptido señal ompA, una secuencia que codifica un péptido marcador de secuencia (código de 1 letra) DYKD, una secuencia que codifica un péptido marcador c-myc y una secuencia que codifica un marcador polihistidina-5.
El ADNc que codifica el fragmento scFv descrito más arriba se ha introducido entre los sitios EcoRI y EcoRV de pIG6, aguas abajo de la secuencia que codifica el péptido DYKD y aguas arriba de la secuencia que codifica el marcador c-myc.
El constructo obtenido se llama pIg6-28.3.
Se utiliza el vector pIg6-28.3 para transformar células E. coli JM83. Se cultivan las células a 25ºC, hasta una DO550 de 0,5. Tras la inducción por el IPTG, se produce el fragmento scFv en forma soluble en el periplasma. Aparece, después de electroforesis y transferencia Western, en forma de una banda de aproximadamente 30 kDa.
Se purifica a partir de los extractos periplásmicos de las bacterias, obtenidos después del choque osmótico en 50 mM de Tris-Cl y ultracentrifugación del material insoluble, mediante cromatografía sobre matriz de Ni-NTA e intercambio iónico sobre DEAE-sefarosa.
La unión de los fragmentos scFv presentes en el eluato de la columna de NiNTA a células Jurkat CD28+ es comparable con la que se obtiene con los fragmentos Fab obtenidos a partir del anticuerpo CD28.3 mediante digestión con papaína.
Se utiliza el vector pSec-28.3 para transfectar células Cos. Se cultivan las células a 37ºC durante 3 días. Se produce el fragmento scFv en forma soluble en el sobrenadante. Este sobrenadante inhibe la reacción mixta linfocitaria: 105 células mononucleadas de sangre periférica de un donante sano se mezclan con 105 células mononucleadas de sangre periférica de otro donante sano alogénico. La respuesta proliferativa en estos cultivos se evalúa a los 5 días mediante la incorporación de (3H)-Timidina durante 16 horas. Se observa una importante inhibición que depende de la dilución del sobrenadante utilizada. Un sobrenadante de control no presenta actividad inhibidora de la proliferación.
Ejemplo 3:
Obtención de una proteína de fusión que comprende un fragmento scFv de CD28.3
La secuencia nucleotídica que codifica el fragmento scFc descrito en el Ejemplo 2 ha sido unida al extremo 5’ de una porción del ADNc de la α-1 antitripsina humana (número de acceso GENBANK K01396) correspondiente a los aminoácidos 53 a 425, por medio de un péptido bisagra de secuencia VAAPS. La secuencia resultante viene representada en la lista de secuencias adjunta bajo el número SEQ ID NO: 3 y el polipéptido correspondiente bajo el número SEQ ID NO:4.
Ejemplo 4:
Construcción de vectores de expresión que comprenden la secuencia que codifica para la α-1 antitripsina y que permite la introducción de una secuencia que codifica un fragmento scFv
Vector de expresión procariota
Se utiliza el vector pIG6 (Biochemisches Institut, Universität Zurich). Este vector comprende en particular un marcador de resistencia a la ampicilina y un cassette de expresión que incluye un promotor lac inducible, bajo el control del cual se encuentran: una secuencia que codifica un péptido señal ompA, una secuencia que codifica un péptido marcador de secuencia (código de 1 letra) DYKD, una secuencia que codifica un péptido marcador c-myc y una secuencia que codifica un marcador polihistidina-5.
El ADNc que codifica un fragmento de α-1 antitripsina humana correspondiente a los aminoácidos 53 a 425 se introduce entre los sitios EcoRI y EcoRV de pIG6, aguas abajo de la secuencia que codifica el péptido DYKD y aguas arriba de la secuencia que codifica el marcador c-myc.
La Figura 1 esquematiza el constructo obtenido, llamado pIg6-Haat.
Vector de expresión eucariota
Se utiliza el vector pSECTagB (Invitrogen, De Schelp, Países Bajos). Este vector comprende en particular un marcador de resistencia a la ampicilina, un marcador de resistencia a la zeocina y un cassette de expresión que incluye un promotor CMV, bajo el control del cual se encuentran: una secuencia que codifica un péptido señal de la cadena ligera IgG Kappa, una secuencia que codifica un péptido marcador c-myc y una secuencia que codifica un marcador polihistidina-6.
El ADNc que codifica un fragmento de α-1 antitripsina humana correspondiente a los aminoácidos 53 a 425 se introduce entre los sitios BamHI y EcoRI del vector PSEC B Tag, aguas arriba de la secuencia que codifica el marcador c-myc.
La Figura 2 esquematiza el constructo obtenido, llamado pSecHaat.
Ejemplo 5:
Construcción de vectores de expresión que integran la secuencia que codifica la proteína de fusión scFv CD28.3 / α-1 antitripsina
Vector de expresión procariota
El ADNc que codifica la proteína de fusión scFv CD28.3 / α-1 antitripsina descrita en el Ejemplo 3 más arriba se introduce entre los sitios EcoRI y Xhol de pIG6, aguas abajo de la secuencia que codifica el péptido DYKD y aguas arriba de la secuencia que codifica el marcador c-myc.
La Figura 3 esquematiza el constructo obtenido, llamado pIg6-28.3Haat.
Vector de expresión eucariota
El ADNc que codifica la proteína de fusión scFv CD28.3 / α-1 antitripsina descrita en el Ejemplo 3 más arriba se introduce entre los sitios BamHI y Xhol del vector PSEC B Tag, aguas arriba de la secuencia que codifica el marcador c-myc.
La Figura 4 esquematiza el constructo obtenido, llamado pSec-28.3Haat.
Este vector, alojado en E. coli DH5α, fue depositado a 11 de diciembre 2001 en la CNCM, bajo el número I-2762. Ejemplo 6: Expresión y purificación de las proteínas de fusión
En células procariotas
Se utiliza el vector pIg6-28.3Haat para transformar células E. coli JM83. Se cultivan las células a 25ºC, hasta una DO550 de 0,5. Tras la inducción por IPTG, se produce la proteína en forma soluble en el periplasma. Aparece, después de electroforesis y transferencia Western, en forma de una banda de aproximadamente 74 kDa.
Se puede purificar a partir de los extractos periplásmicos por medio de una matriz de cromatografía de afinidad Ni-NTA y/o una matriz de cromatografía de afinidad anti-c-myc. Se puede purificar también a partir de una columna de afinidad anti-α1-antitripsina.
En células eucariotas
Se utiliza el vector pSec-28.3Haat para transfectar células CHO mediante lipofección. Se cultivan las células en presencia de 200 μg/ml de zeocina en medio MEM que contiene un 10% de suero de ternera fetal.
La proteína se secreta en el medio de cultivo
Después de separación por electroforesis, transferencia Western y revelación por un anticuerpo anti-c-myc, aparece en forma de una banda de aproximadamente 80 kDa. Ejemplo 7: Ensayos de actividad de una proteína de fusión scFv / α-1 antitripsina
La actividad anti-CD28 de la proteína de fusión scFv CD28.3 / α-1 antitripsina obtenida en el Ejemplo 6 anterior se evalúa por su unión a la molécula CD28 o a células que expresan CD28 en su membrana y su no unión a células que no expresan CD28.
La actividad inmunosupresora de la proteína de fusión scFv CD28.3 / α-1 antitripsina obtenida en el Ejemplo 6 anterior se evalúa mediante la inhibición de la adhesión a B7 y la inhibición de la activación inducida del linfocito T.
Estas actividades anti-CD28 e inmunosupresivas se midieron mediante de los siguientes ensayos:
Actividad anti-CD28
Medición con biosensor de los parámetros de unión a CD28
Se inmovilizó CD28 humano recombinante sobre el detector del biosensor (BIACORE). Se puso en contacto una proteína de fusión scFv CD28.3 / α-1 antitripsina obtenida tal como se describe en el Ejemplo 6 anterior con el detector. Los parámetros de unión son: KA (1/M) 2,86·109; KD (M): 3,49·10-10 . Para comparación, estos parámetros medidos para el fragmento Fab del anticuerpo CD28.3 son: KA (1/M): 9,69·108; KD (M): 1,03·10-9. Por tanto, se pueden comparar la afinidad para CD28 del fragmento Fab del anticuerpo CD28.3 y de la proteína de fusión.
Prueba de reconocimiento específico de CD28 por citofluorometría
Se incuban 105 células Jurkat (CD28+) y U937 (CD28-) en PBS-BSA al 1% - NaN3 al 0,1% a 4ºC durante 1 hora con concentraciones crecientes de la proteína de fusión scFv CD28.3 / α-1 antitripsina. Después de su lavado, se incuban las células con un anticuerpo de conejo anti-alfa-1-antitripsina, luego con un anticuerpo de cabra anti-conejo conjugado con el FITC, se lavan y se analizan por citofluorometría. Se observa una unión dependiente de la dosis en las células Jurkat (CD28+) y ninguna unión en las células U937 (CD28-). Ello muestra la especificidad de la proteína de fusión por la molécula CD28 y su ausencia de reactividad con otras moléculas expresadas por células hematopoyéticas humanas.
Actividad inmunosupresora
Prueba de adhesión CD28/B7-dependiente
4 x 105 células humanas T (Jurkat, CD28-positivas) marcadas con 51Cr se incuban durante 2 horas en una placa de microtitulación en la que se habían sembrado 24 horas antes 105 células adherentes LTK-o LB7+ (fibroblastos murinos transfectados con B7.1 humano [PAGES y col., J. Biol. Chem., 271, 9403 (1996)]. Estas incubaciones se realizan en ausencia o en presencia de la proteína de fusión scFv CD28.3 / α-1 antitripsina, diluida a distintas concentraciones en tampón PBS sin Ca2+ ni Mg2+. Las células adherentes, después de los lavados, se cuantifican mediante lectura de la radioactividad residual en un contador beta (PACKARD TOPCOUNT). Se observa una inhibición de la adhesión en presencia de la proteína de fusión scFv CD28.3 / α1 antitripsina, inhibición directamente dependiente de la dosis de proteína de fusión utilizada.
Inhibición de la activación
5 x 104 células T (policlonales humanas, depletadas en células CD11b) son estimuladas con 1 x 104 células de hidridoma OKT3 (anti-CD3) irradiadas o con células B CD28 alogénicas (depletadas en células CD28+) en ausencia o en presencia de cantidades variables de la proteína de fusión scFv CD28.3 / α-1
5 antitripsina. La respuesta proliferativa en estas células se evalúa a los 3 días cuando el estímulo es realizado por anti-CD3 o a los 7 días cuando el estímulo es realizado por células alogénicas, mediante la incorporación de (3H)-Timidina durante 16 horas. Se observa una importante inhibición de la incorporación en presencia de la proteína de fusión scFv CD28.3 / α-1 antitripsina, inhibición
10 directamente dependiente de la dosis de proteína de fusión utilizada.
Inhibición de la reacción mixta linfocitaria
Se mezclan 105 células mononucleadas de sangre periférica de un donante sano con 105 células mononucleadas de sangre periférica de otro donante sano alogénico. Se evalúa la respuesta proliferativa en estas células a
15 los 5 días mediante la incorporación de (3H)-Timidina durante 16 horas. Se observa una importante inhibición de la incorporación en presencia de la proteína de fusión scFv CD28.3 / α-1 antitripsina, inhibición directamente dependiente de la dosis de proteína de fusión utilizada.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110>INSERM IMTIXT SANGSTAT LAFLAMME, Geneviève VANHOVE, Bernard
<120>ANTICUERPOS ANTI-CD28
<130>MJPcb598-48
<140>
<141>
<150>00 17025 <151>26-12-2000 <160>4
<170>Patentln Ver. 2.1
<210>1 <211>732
<212>ADN
<213>Secuencia artificial
<220>
<223>Descripción de la secuencia artificial: fragmento scFv
- <220>
- <221>CDS <222>(1)..(732)
- <220>
- <221>misc_feature <222>(1)..(360) <223>cadena ligera
- <220>
- <221>misc_feature <222>(406)..(732)
<223>cadena pesada
- <220>
- <221>misc_feature <222>(361)..(405) <223>ligante
- <220>
- <221>misc_feature <222>(85)..(96) <223>CDR1
- <220>
- <221>misc_feature <222>(139)..(189) <223>CDR2
- <220>
- <221>misc_feature <222>(286)..(324) <223>CDR3
- <220>
- <221>misc_feature <222>(496)..(522) <223>CDR1
- <220>
- <221>misc_feature <222>(553)..(576) <223>CDR2
- <220>
- <221>misc_feature <222>(673)..(681)
<223>CDR3 <400>1
<210>2
<211>244
<212>PRT
<213>Secuencia artificial
<223>Descripción de la secuencia artificial: fragmento scFv
<400>2
- 5
- <210>3 <211>2013 <212>ADN <213>Secuencia artificial
- 10
- <220> <223>Descripción antitripsina de la secuencia artificial: fusión scFv anti-CD28/alfa-1
- <220> <221>CDS <222>(1)..(2013)
- 15
- <220> <221>misc_señal <222>(1)..(57) <223>señal Omp A
- 20
- <220> <221>misc_feature <222>(64)..(75)
<223>Flag Tag
<220> <221>misc_feature
5 <222>(109)..(810)
<223>scFv 28.3
<220> <221>misc_feature
10 <222>(826)..(1992) <223>alfa-1 antitripsina
<220>
<221>misc_feature 15 <222>(1993)..(2007)
<223>His Tag
<400>3
- 5
- <210>4 <211>669 <212>PRT <213>Secuencia artificial <223>Descripción de la antitripsina secuencia artificial: fusión scFv anti-CD28/alfa-1
- 10
- <400>
Claims (11)
1. Proteína capaz de unirse específicamente al receptor linfocitario CD28 y bloquear la interacción CD28/B7, caracterizada porque comprende al menos las CDR de la cadena pesada y de la cadena ligera de la inmunoglobulina CD28.3 producida por el hibridoma CNCM I-2582, y porque se elige de entre:
a) el anticuerpo CD28.3 producido por el hibridoma CNCM I-2582;
b) los fragmentos Fv, Fab o scFv del anticuerpo CD28.3;
c) los anticuerpos quiméricos o humanizados obtenidos a partir de las regiones variables de CD28.3;
d) los fragmentos Fv, Fab o scFv de un anticuerpo quimérico o humanizado c);
e) las proteínas recombinantes que incluyen un fragmento b) o d) y un polipéptido heterólogo.
2. Proteína según la reivindicación 1, caracterizada porque se trata de una proteína recombinante que comprende:
- un fragmento scFv del anticuerpo CD28.3, y
- un polipéptido heterólogo obtenido a partir de la α1-antitripsina.
- 3.
- Molécula de ácido nucleico que codifica una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.
- 4.
- Vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 3.
- 5.
- Vector de expresión según la reivindicación 4, caracterizado porque se trata del plásmido CNCM I-2762.
- 6.
- Célula que expresa una proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.
- 7.
- Célula según la reivindicación 6, caracterizada porque se trata del hibridoma CNCM I-2582.
- 8.
- Célula según la reivindicación 6, caracterizada porque se trata de una célula transformada por una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 3.
- 9.
- Proceso de preparación de una proteína según cualquiera de las
5 reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque comprende el cultivo de al menos una célula según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, así como la recuperación de dicha proteína a partir de dicho cultivo.
10. Utilización de una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, para la obtención de un medicamento.
10 11. Utilización según la reivindicación 10, caracterizada porque dicha proteína posee un único sitio de unión al receptor CD28 y porque dicho medicamento es un inmunosupresor que bloquea selectivamente la activación de las células T por medio del receptor CD-28.
12. Utilización según la reivindicación 11, caracterizada porque dicho
15 medicamento está destinado al tratamiento de una patología seleccionada de entre rechazo de injerto, enfermedad injerto contra huésped, enfermedades autoinmunes mediadas por linfocitos T, fenómenos alérgicos, así como enfermedades inflamatorias crónicas.
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