PT1345969E - Anticorpos anti-cd28 - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO ANTICORPOS ANTI-CD28 A presente invenção tem por objecto anticorpos dirigidos contra o receptor linfocitário CD28 e os seus fragmentos e as suas utilizações terapêuticas, nomeadamente no quadro da regulação da activação das células T.

Uma activação anormal das células T intervém na patogénese de numerosas doenças auto-imunes, assim como nos fenómenos de rejeição de enxertos onde provoca o desenvolvimento de uma resposta imunitária dirigida contra o enxerto. A activação dos linfócitos T necessita de um sinal activador induzido pelo reconhecimento pelos receptores T (TCR) do antigénio associado ao complexo principal de histocompatibilidade (CPH) de classe II e presente nas células portadoras do antigénio (CPAg). Esta activação, contudo, não leva à proliferação das células T nem à secreção de citocinas imunomoduladoras especificas (tal como a interleucina 2, o interferão gama ou a interleucina 4), a menos que outros sistemas de co-estimulação de T sejam igualmente activados.

Um dos sistemas mais importantes de regulação da activação dos linfócitos T é o sistema molecular B7/CD28/CTLA4. Este sistema desempenha um papel essencial, por exemplo, nos mecanismos de rejeição de enxertos [WOODWARD et al., Transplantation, 66, 14-20, (1998)]. As moléculas B7.1 (CD80) e B7.2 (CD86) existentes nas CPAgs podem activar o receptor CD28 assim como o receptor CTLA4 dos linfócitos T. A activação de CD28 emite, para os 1 linfócitos T, um sinal positivo que estimula a célula; pelo contrário, a activação de CTLA4 emite um sinal negativo que leva a uma não resposta (anergia) [FALLARINO et al., J. Exp. Med., 188, 205-210, (1998)].

Os linfócitos T, em repouso, expressam uma quantidade importante de CD28 e muito pouco de CTLA4. Quando há um primeiro contacto cognitivo entre uma CPAg e um linfócito T, a interacção CD28/B7 é privilegiada, o que activa a célula. Apenas várias horas após o início da activação, em virtude do aumento da expressão de CTLA4 das membranas, cuja afinidade para B7 é 5 a 10 vezes superior à de CD28, é que a interacção de B7/CD28 se desloca em benefício de uma interacção de B7/CTLA4.

Actualmente, para bloquear a activação dos linfócitos T, nomeadamente no quadro dos transplantes de órgãos, utiliza-se principalmente ciclosporina. Apesar da eficácia deste medicamento, a protecção que confere, contudo, não é absoluta. Por outro lado, age bloqueando todas as vias de activação celulares dependentes do cálcio e possui portanto uma actividade biológica que não é estritamente específica dos linfócitos T e causa um número importante de efeitos secundários. Portanto, é desejável desenvolver novos imunossupressores com um modo de acção específico e com uma especificidade maior. Já foi documentado que a inibição selectiva do sinal agonista, emitido para a célula T por CD28, deixando intacto o sistema antagonista constituído pelo par CTLA4/B7, por intermédio de um bloqueio específico da interacção CD28/B7, permitiria prevenir a activação dos linfócitos T. Um tal bloqueio específico da interacção 2 CD28/B7 pode ser obtido com a ajuda de um anticorpo dirigido contra CD28.

Conhecem-se anticorpos anti-CD28 capazes de impedir a ligação de CD28 com B7. Contudo, apresentam o inconveniente, quando são utilizados sob a forma bivalente natural, de levar à dimerização e à activação de CD28 por meio da sua ligação ao receptor. Contudo, os fragmentos monovalentes provenientes destes anticorpos são capazes de bloquear sem activar o receptor CD28 [DAMLE et al., J. Immunol., 140, 1753-1761, (1988); NUNES et al., Int. Immunol., 5, 311-315, (1993); PAGES et al., J. Biol. Chem., 271, 9403, (1996)].

Foi assim relatado [PERRIN et al., J. Immunol. 163, 1704-1710, (1999)] que os fragmentos Fac (Fab em inglês), provenientes de um anticorpo anti-CD28, podiam bloquear os sintomas clinicos de encefalite experimental auto-imune induzida em murganhos pela administração de mielina ou pela transferência de células T de um animal atingido.

Os fragmentos monovalentes, Fac ou scFv, derivados de um anticorpo anti-CD28 são potencialmente utilizáveis para prevenir a activação dos linfócitos T por intermédio de um bloqueio especifico da interacção CD28/B7.

Os fragmentos Fac resultam da acção de papaina numa molécula de imunoglobulina e contêm, cada um, uma cadeia leve e a primeira metade de uma cadeia pesada; os fragmentos scFv são constituídos por porções variáveis das cadeias pesadas e leves de um anticorpo, ligadas entre si por intermédio de uma ligação flexível [CLACKSON et al., Nature, 352, 624-628, (1991)], formando assim uma proteína de cadeia simples. 3

Estes fragmentos monovalentes apresentam frequentemente uma afinidade para o antigénio menos importante que a dos anticorpos naturais, o que pode limitar as suas possibilidades de utilização em aplicações de diagnóstico ou terapêuticas.

Os requerentes decidiram seleccionar, entre os diferentes anticorpos que reconhecem o antigénio CD28, um anticorpo capaz de bloquear a interacção CD28/B7 e portanto os fragmentos monovalentes apresentam uma afinidade para o antigénio suficiente para serem utilizáveis, in vitro ou in vivo, para bloquear o receptor CD28 sem activação deste receptor.

Este anticorpo, denominado CD28.3, é produzido pelo hibridoma depositado, de acordo com os termos do tratado de Budapeste, em 28 de Novembro de 2000, na CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15) com o número 1-2582. A presente invenção tem por objecto uma proteína capaz de se ligar especificamente ao receptor de linfócitos CD28 e de bloquear a interacção de CD28/B7, caracterizada pelo facto de compreender pelo menos as RDCs (regiões de determinação de complementaridade) da cadeia pesada e da cadeia leve da imunoglobulina CD28.3 e que se selecciona entre: a) o anticorpo CD28.3 produzido pelo hibridoma CNCM I-2582; b) os fragmentos Fv, Fac ou scFv do anticorpo CD28.3; c) os anticorpos quiméricos ou humanizados obtidos a partir das regiões variáveis de CD28.3; 4 d) os fragmentos monovalentes, Fv, Fac ou scFv dos anticorpos c) anteriores, compreendendo as RDCs do anticorpo CD28.3; e) as proteínas recombinantes compreendendo um fragmento b) ou d) e um polipéptido heterólogo.

As RDCs (regiões de determinação de complementaridade) são as porções das regiões variáveis de uma imunoglobulina implicadas na especificidade do reconhecimento do antigénio.

As proteínas de acordo com a presente invenção englobam assim, nomeadamente: proteínas que associam pelo menos um fragmento de anticorpo que compreende as RDCs do anticorpo CD28.3, com pelo menos um fragmento de anticorpos que compreende as RDCs de um anticorpo de especificidade diferente; pode-se citar, a título de exemplo, imunoglobulinas bi-específicas, conjugados de um fragmento Fv ou Fac, contendo as RDCs de CD28.3, com um fragmento Fv ou Fac de anticorpos de especificidade diferente, «diacorpos bi-específicos» resultando da associação de um fragmento scFv contendo as RDCs de CD28.3 com um fragmento Fv ou Fac de um anticorpo de especificidade diferente, proteínas que associam pelo menos um fragmento de anticorpos que compreende as RDCs do anticorpo CD28.3, com uma molécula dotada de actividade farmacológica (por exemplo uma toxina) ou propriedades efectoras (por exemplo um fragmento Fc) . proteínas que associam pelo menos um fragmento de anticorpo que compreende as RDCs do anticorpo CD28.3, com uma molécula que permite prolongar a semi-vida plasmática aquando da sua administração in vivo; pode- 5 se, por exemplo, associar o referido fragmento de anticorpo com um polipéptido solúvel em água de massa molecular suficiente para que a massa molecular do polipéptido de fusão assim obtido seja superior ao limite de filtração renal. Neste caso, escolher-se-á um polipéptido que, contrariamente aos fragmentos Fc, não se poderá associar em dimeros e que não possui actividade efectora própria capaz de originar efeitos secundários inoportunos. Os polipétidos que possuem estas propriedades podem ser obtidos, com vantagem, a partir de proteínas séricas solúveis em água, a saber, nomeadamente, a albumina sérica, a haptoglobulina, o ITIH2 (inibidor inter-alfa (globulina), polipéptido H2), a transferrina, a CBG (proteína que liga os corticosteróides), a al antitripsina, ο ITIH4 (inibidor inter-alfa (globulina), polipéptido H4), a AACT (alfa-1-antiquimotripsina), a GLT (globulina ligante da tiroxina), o fibrinogénio e a protrombina, para preparar proteínas de fusão com fragmentos scFv derivados de anticorpos anti-CD28. Pode-se igualmente conjugar uma proteína, de acordo com a presente invenção, com um poliol, por exemplo, o polietileno-glicol, como descrito, por exemplo, na patente norte-americana 4.179.337.

Um exemplo duma proteína, de acordo com a presente invenção, está ilustrado na figura 1, que representa um fragmento scFv derivado do anticorpo CD28.3. As sequências das RDCs do anticorpo CD28.3 estão enquadradas na sequência representada na figura 1. A sequência nucleotídica que codifica para este fragmento scFv está representada na lista de sequências em 6 anexo, com o número SEQ ID NO: 1 e a sequência peptídica correspondente está representada com o número SEQ ID NO: 2.

Os fragmentos Fv ou Fac, de acordo com a presente invenção, podem ser obtidos pelas técnicas clássicas de digestão enzimática, a partir do anticorpo CD28.3.

Um plasmido contendo um polinucleótido codificando para um fragmento scFv de CD 28.3, fundido com um polinucleótido que codifica para os aminoácidos 53 a 425 da al antitripsina foi depositado, de acordo com os termos do tratado de Budapest, em 11 de Dezembro de 2001, na CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15), com o numero I-2762.

As proteínas, de acordo com a presente invenção, tal como anticorpos quiméricos ou recombinantes, fragmentos scFv e os seus derivados, etc. podem ser obtidos pelas técnicas clássicas de engenharia genética, tal como as descritas por SAMBROOK et al., [MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)].

Os polinucleótidos que codificam as regiões variáveis do anticorpo anti-CD28.3 podem ser obtidos, por exemplo, por clonagem das referidas regiões variáveis, a partir de um banco de ADNc do hibridoma CD28.3 ou a partir do plasmido CNCM 1-2762. Podem igualmente ser preparados totalmente ou parcialmente, por síntese de ácidos nucleicos, a partir das sequências nucleotídicas das referidas regiões variáveis. Pode-se sintetizar, por exemplo, polinucleótidos que codificam RDCs de CD28.3 e incorporá-los nas regiões da estrutura (FR para «framework 7 regions») de um outro anticorpo, nomeadamente de um anticorpo de origem humana, por técnicas conhecidas, elas próprias, de enxerto de RDCs tal como as descritas por ROUTLEDGE et al., ["Reshaping antibodies for therapy", em PROTEIN ENGINEERING OF ANTIBODY MOLECULES FOR PROPHYLATIC AND THERAPEUTIC APPLICATIONS IN MAN, 13-44, Academic Titles, Nottingham, England (1993)] ou por ROGUSKA et al., Protein Engineering, 9 (10), 895-904, (1996)]. A presente invenção tem igualmente por objecto qualquer molécula de ácido nucleico que codifique uma proteína de acordo com a presente invenção compreendendo as RDCs do anticorpo CD28.3, assim como qualquer vector recombinante, nomeadamente qualquer vector de expressão, compreendendo a referida molécula de ácido nucleico. A presente invenção tem igualmente por objecto qualquer célula que expresse uma proteína de acordo com a presente invenção compreendendo as RDCs do anticorpo CD28.3. Isto engloba, nomeadamente, o hibridoma CNCM I-2582, assim como as células hospedeiras transformadas por uma molécula de ácido nucleico, de acordo com a presente invenção.

As moléculas de ácido nucleico, de acordo com a presente invenção, podem compreender, com vantagem, para além de uma sequência que codifica uma proteína de acordo com a presente invenção, uma sequência que codifica um péptido de sinal que permite a secreção da referida proteína; podem também compreender uma ou várias sequências que codificam um ou vários péptidos marcadores que permitem a detecção e/ou facilitam a purificação da referida proteína. 8

Os vectores de expressão, de acordo com a presente invenção, compreendem pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína, de acordo com a presente invenção, associada a elementos de controlo da transcrição e da tradução, activos na célula hospedeira escolhida. Os vectores que se podem utilizar para a preparação de vectores de expressão, de acordo com a presente invenção, são conhecidos por eles mesmos e serão escolhidos, nomeadamente, em função da célula hospedeira que se deseje utilizar.

As células hospedeiras que se podem utilizar, no quadro da presente invenção, podem ser células procarióticas ou eucarióticas. Entre as células eucarióticas que se podem utilizar, pode-se citar, em particular, células vegetais, células de levedura, tal como Saccharomyces, células de insectos, tal como as células de Drosophila ou de Spodoptera e células de mamíferos tal como as células HeLa, OHC, 3T3, C127, BHK, COS, etc. A preparação de vectores de expressão, de acordo com a presente invenção e a transformação das células hospedeiras podem ser efectuadas por técnicas clássicas de biologia molecular. A presente invenção tem igualmente por objecto um processo de produção de uma proteína, de acordo com a presente invenção, caracterizada pelo facto de compreender a cultura de pelo menos uma célula de acordo com a presente invenção e a recuperação da referida proteína a partir da referida cultura. 9

Se a proteína for segregada, pode ser recuperada directamente a partir do meio de cultura; caso contrário, procede-se previamente à lise das células. A proteína pode em seguida ser purificada a partir do meio de cultura ou do lisado celular, por processos clássicos, conhecidos dos especialistas na matéria, por exemplo, por precipitação fraccionada, nomeadamente precipitação com sulfato de amónio, electroforese, filtração em gel, cromatografia de afinidade, etc.

As proteínas, de acordo com a presente invenção, podem ser utilizadas in vitro para se estudar a resposta proliferativa ou a diferenciação de linfócitos T que respondem a uma estimulação antigénica, virai, alogénica ou xenogénica. Podem igualmente ser utilizadas in vitro para induzir a diferenciação dos linfócitos T recolhidos de um paciente, por exemplo, a indução de uma tolerância face a um antigénio ou a um aloantigénio, destinados a serem em seguida novamente administrados in vivo.

Podem igualmente ser utilizadas para a obtenção de medicamentos ou de reagentes de diagnóstico.

As proteínas, de acordo com a presente invenção, monovalentes, quer dizer, que possuem um único sítio de ligação ao receptor CD28,podem ser utilizadas em todos os casos em que se deseja bloquear selectivamente este receptor sem o activar, a fim de induzir uma imunossupressão.

Uma proteína, de acordo com a presente invenção, que compreende um fragmento monovalente derivado de um anticorpo anti-CD28 pode nomeadamente ser utilizado para a 10 obtenção de um medicamento imunossupressor, bloqueando selectivamente os fenómenos de activação das células T que implicam o receptor CD28 e não apresentam os inconvenientes dos imunossupressores conhecidos, tal como a ciclosporina. A imunossupressão de T pelo bloqueio selectivo de CD28 por uma proteína de acordo com a presente invenção encontra aplicações em todas as patologias dependentes dos linfócitos T.

Trata-se essencialmente da rejeição de um enxerto, da doença do enxerto contra o hospedeiro, das doenças auto-imunes mediadas por linfócitos T, tal como a diabetes do tipo I ou a esclerose em placas e a hipersensibilidade do tipo IV, que intervêm em fenómenos alérgicos, assim como a patogénese de doenças inflamatórias crónicas no seguimento de uma infecção por um agente patogénico (nomeadamente lepra, tuberculose, leishmaniose, listeriose, etc.). A presente invenção sé melhor compreendida com a ajuda do complemento de descrição que se segue, que se refere a exemplos não limitativos de preparação e de utilização de anticorpos de acordo com a presente invenção. EXEMPLO 1: ESCOLHA DE UM ANTICORPO QUE PRODUZ FRAGMENTOS MONOVALENTES; PROPRIEDADES DOS FRAGMENTOS MONOVALENTES Fac COM ORIGEM EM CD28.3.

Algumas das propriedades dos vários anticorpos anti-CD28 (CD28.1, CD28.2, CD28.3, CD28.4, CD28.5 e CD28.6) estão descritas na publicação de NUNES et al. [Int. Immunol., 5, 311, (1993)]. Estes diferentes anticorpos, que não estão acessíveis ao público, foram fornecidos pelo laboratório de Daniel OLIVE (INSERM). Compararam-se as 11 propriedades de ligação ao antigénio dos fragmentos monovalentes Fac destes diferentes anticorpos.

Preparou-se 5 mg de fragmentos Fac de cada um destes anticorpos por digestão com papaina (relação molar papaina/anticorpos = 1/100) durante 24 horas, a 37 °C, seguido da inactivação da enzima por meio de iodoacetamida 0,03 M e de diálise contra SBF, para eliminar a iodoacetamida. 1) Ligação dos fragmentos Fac a células T de Jurkat CD28+:

Fez-se a incubação de 100 000 células de Jurkat CD28+ em 100 μΐ em SBF-ASB a 1 % - NaN3 a 0,1 % a 4°C durante 30 minutos, com concentrações crescentes de anticorpos anti-CD28 ou os seus fragmentos Fac. Após lavagem, fez-se a incubação das células, de uma maneira semelhante, com um anticorpo de cabra anti-IgG de murganho, conjugado com ITCF (isotiocianato de fluoresceina, FITC em inglês), lavaram-se e analisaram-se por citofluorometria.

Os resultados estão ilustrados na figura 2:

Legenda da figura 2:

Eixo das abcissas: Concentração de anticorpos ou de fragmentos Fac

Eixo das ordenadas: Intensidade média da fluorescência (IMF) -0-: F1 = Fragmentos Fac do anticorpo CD28.1 F2 = Fragmentos Fac do anticorpo CD28.2 -Δ-: F3 = Fragmentos Fac do anticorpo CD28.3 12 -Χ-: F5 = Fragmentos Fac do anticorpo CD28.5 -0-: F6 = Fragmentos Fac do anticorpo CD28.6 W1 = anticorpo inteiro CD28.1 W2 = anticorpo inteiro CD28.2 : W3 = anticorpo inteiro CD28.3 : W5 = anticorpo inteiro CD28.5 W6 = anticorpo inteiro CD28.6 -À-: Mara-1 = controlo negativo (IgGl de murganho).

Estes resultados mostram que entre os fragmentos Fac, apenas os que têm origem em CD28.3 são capazes de se ligar de maneira significativa às células de Jurkat CD28+, em concentrações inferiores a 10 pg/ml. 2) Efeito dos fragmentos Fac na adesão das células T de Jurkat CD28+ às células L de murinos transfectadas, que expressam a molécula B7-1:

Fez-se a incubação de 4 x 105 células T humanas (Jurkatt, positivas a CD28) marcadas com 51Cr, durante 2 horas, numa placa de microtitulação na qual se semearam, 24 horas antes, 105 células aderentes LTK" ou LB7+ (fibroblastos de murinos transfectados com B7.1 humano [PAGES et al., J. Biol. Chem., 271, 9403, (1996)]. Estas incubações são realizadas na presença dos fragmentos Fac originários dos anticorpos CD28.1 a CD28.6 ou do anticorpo CD28.3, diluídos com diferentes diluições num tampão de SBF sem Ca2+ nem Mg2+. As células aderentes, após a lavagem, são quantificadas por leitura da radioactividade residual, com um contador beta (PACKARD TOPCOUNT).

Os resultados estão ilustrados na figura 3:

Legenda da figura 3: 13

Eixo das abcissas: percentagem de células aderentes Eixo das ordenadas: concentração de anticorpos F1 = Fragmentos Fac do anticorpo CD28.1 F2 = Fragmentos Fac do anticorpo CD28.2 -A-: F3 = Fragmentos Fac do anticorpo CD28.5 -X-: F5 = Fragmentos Fac do anticorpo CD28.5 . F6 = Fragmentos Fac do anticorpo CD28.6 : Anticorpo inteiro CD28.3 0: Sem anticorpos.

Estes resultados mostram que os fragmentos Fac, com origem em CD28.3, são os mais eficazes para inibir as interacções CD28/B7. Inibem a adesão a 90 %, a uma concentração de 3 yg/ml e com uma eficácia comparável à do anticorpo CD28.3 inteiro, enquanto a esta concentração, os fragmentos Fac com origem noutros anticorpos não inibem a adesão a mais de 50 %. 3) Efeito dos fragmentos Fac na proliferação em reacção linfocitária mista:

Mistura-se 105 células mononucleadas de sangue periférico com 105 células mononucleadas alogénicas irradiadas a 35 Gy, na presença de concentrações variáveis dos anticorpos CD28.1 a CD28.6 ou fragmentos Fac com origem nesses anticorpos. A resposta proliferativa nestas culturas é avaliada 3 dias depois, por incorporação de (3H)timidina, durante 16 horas.

Os resultados estão ilustrados na figura 4:

Legenda da figura 4: 14

Eixo das abcissas: concentração de anticorpos Eixo das ordenadas: resposta proliferativa (cpm) Nível básico de proliferação = 6500 cpm. : 28.1 = anticorpo CD28.1 : 28.2 = anticorpo CD28.2 -A-: 28.3 = anticorpo CD28.3 -X-: 28.5 = anticorpo CD28.5 . : 28 .6 = anticorpo CD28.6 -·-; Facl = Fragmentos Fac do anticorpo CD28.1

Fac2 = Fragmentos Fac do anticorpo CD28.2 : Fac3 = Fragmentos Fac do anticorpo CD28.3 : Fac5 = Fragmentos Fac do anticorpo CD28.5 -0-: Fac6 = Fragmentos Fac do anticorpo CD28.6.

Estes resultados mostram que os fragmentos Fac, com origem em CD28.3 ou CD28.6, são os mais eficazes para inibir a proliferação das células mononucleadas. Os anticorpos inteiros CD28.1 a CD28.6, ensaiados em paralelo, não têm qualquer efeito inibidor ou então estimulam a proliferação por causa da acção estimuladora de CD28.

Efeito dos fragmentos Fac, originários de CD28.3, na proliferação induzida por um super-antigénio.

Para esta experiência, misturaram-se células T CD4+ reactivas com CMSP (células mononucleares de sangue periférico, PBMC em inglês) isogénicas, irradiadas, na presença de 50 ng/ml de toxina-1 da síndrome de choque tóxico (TSST-1) que estimula especificamente as células Τνβ2+, quer na ausência de anticorpos, quer na presença de anti-B7-l (1 yg/ml), de anti-B7-2 (0,5 yg/ml), de CTLA4Ig 15 (10 yg/ml) ou de fragmentos Fac com origem em CD28.3 (10 yg/mi). A resposta proliferativa nestas culturas é avaliada 1, 3, 6 e 8 dias depois, por incorporação de (3H) timidina, durante 16 horas.

Os resultados estão ilustrados na figura 5:

Legenda da figura 5:

Eixo das abcissas: tempos de cultura

Eixo das ordenadas: indice de proliferação = IP IP = cpm da reacçào mista linfocitária - cpm das células estimuladoras irradiadas isoladamente cpm das células não estimuladas que respondem : Fac anti-CD28.3 -X-: anti B7-2 CTLA-4 Ig anti-B7-l+2 -A-: anti B7-1 -O-: sem anticorpos. TSST-1 induziu uma proliferação importante das células T CD4+. Na presença de anti-B7, de CTLA4Ig ou dos fragmentos Fac de CD28.3, observa-se uma inibição desta proliferação da ordem de 70 %, passados 6 dias.

Efeito dos fragmentos Fac com origem em CD28.3 na produção de citocinas.

Para determinar se os fragmentos Fac, com origem em CD28.3, podiam induzir um desvio imunitário, in vitro, efectuou-se uma reacção linfocitária mista (CMSP com origem 16 num dador A/CMSP irradiadas com origem num dador B) , na presença de fragmentos Fac com origem em CD28.3. Misturou-se 105 células mononucleadas de sangue periférico de um dador com 105 células mononucleadas alogénicas irradiadas a 35 Gy e puseram-se em cultura durante 5 dias, na presença ou na ausência de 10 yg/ml de Fac com origem no anticorpo CD28.3.

Extraiu-se o ARN das células que respondem e avaliou-se a quantidade de ARNm de citocinas, medindo a quantidade do número de transcritos, em relação à quantidade de HPRT, com a ajuda de um TaqMan (Perkin Elmer).

Observa-se, na presença de fragmentos Fac com origem em CD28.3, uma redução da produção de IFNy e de IL2 e um aumento da produção de IL10. Este desvio da resposta imunitária sugere uma orientação para uma resposta do tipo Th2. Este resultado é inesperado na medida em que já foi relatado que o envolvimento de CTLA4 (que se supões que intervém apenas no bloqueio de CD28) leva a uma resposta do tipo Thl.

Tratamento, in vitro, do anticorpo CD28.3 e dos fragmentos Fac com origem nele, por meio de células T humanas.

Tem-se pesquisado uma eventual internalização dos fragmentos Fac do anticorpo CD28.3 em células T humanas, em comparação com o anticorpo inteiro CD28.3.

Incubaram-se células T de Jurkatt em meio de cultura com 100 yg/ml do anticorpo CD28.3, a 37 °C ou a 0 "C. Em momentos diferentes, lavaram-se as células com tampão de SBF frio contendo 0,1 % de albumina de soro bovino e NaN3, para bloquear a motilidade da membrana. Os anticorpos 17 ligados foram revelados com um anticorpo secundário de cabra anti-murganho, marcado com fluorescência. As células foram montadas em MOVIOL e analisadas por meio de um microscópio confocal.

Observou-se assim que os anticorpos CD28.3 inteiros que se ligam às células T de Jurkatt são capturados e desaparecem da superfície celular, a 37 °C, mas não a 0 °C. Pelo contrário, os fragmentos Fac permanecem fixados na superfície da célula. Isto indica que a fixação dos anticorpos bivalentes CD28.3 leva à dimerização de CD28, o que leva à sua entrada na célula, enquanto os fragmentos monovalentes Fac, que não induzem esta dimerização, permanecem na superfície. EXEMPLO 2: PROPRIEDADES DE UM FRAGMENTO scFv DERIVADO DO ANTICORPO CD28.3. A figura 1 representa a sequência nucleotídica e a sequência polipeptídica deduzida de um fragmento scFv derivado do anticorpo CD28.3. As porções desta sequência que correspondem ao fragmento variável de cadeia pesada e de cadeia leve estão representadas em letras maiusculas. A sequência correspondente ao fragmento variável de cadeia leve está, além disso, sublinhada. A sequência do ligante está representada em letras minúsculas. As sequências das RDCs de cadeia pesada e de cadeia leve estão enquadradas. A sequência nucleotídica que codifica para este fragmento scFv está igualmente representada na lista de sequências em anexo, como o número SEQ ID NO: 1 0 ADNc que codifica este fragmento scFv foi inserido no vector pIG6 (Biochemisches Institut, Universitát 18

Zurich). Este vector compreende, nomeadamente, um marcador de resistência à ampicilina e uma cassete de expressão que compreende um promotor lac inductível, sob o qual são colocados sob controlo: uma sequência que codifica um péptido de sinal ompA, uma sequência que codifica um péptido marcador de sequência (código 1 letra) DYKD, uma sequência que codifica um péptido marcador c-myc e uma sequência que codifica um marcador de poli-histidina-5. 0 ADNc que codifica o fragmento scFv descrito antes foi introduzido entre os sítios EcoRI e EcoRV de pIG6, a jusante da sequência que codifica o péptido DYKD e a montante da sequência que codifica o marcador c-myc. A estrutura obtida foi designada por pIg6-28.3. Produção em células procarióticas 0 vector pIg6-28.3 foi utilizado para transformar as células JM83 de E.coli. As células foram postas em cultura a 25 °C, até a uma D055o de 0,5. Após a indução por IPTG, o fragmento scFv foi produzido sob a forma solúvel no periplasma. Apareceu após a electroforese e transferência de Western, sob a forma de uma banda de cerca de 30 kDa.

Purificou-se a partir dos extractos periplásmicos de bactérias, obtidos após choque osmótico em Tris-Cl 50 mM e ultracentrifugação do material insolúvel, por cromatografia numa matriz de NI-NTA e permuta de iões em DEAE-sefarose. A ligação dos fragmentos scFv, presentes no produto eluído da coluna de NiNTA, a células de Jurkat CD28+ é comparável à obtida com os fragmentos Fac obtidos a partir do anticorpo CD28.3 por digestão com papaína. 19

Produção em células eucarióticas 0 vector pSec-28.3 foi utilizado para transfectar células Cos. Põe-se as células em cultura a 37 °C durante 3 dias. 0 fragmento scFv é produzido sob a forma solúvel no sobrenadante. Este sobrenadante inibe a reacção mista linfocitária: mistura-se 105 células mononucleadas de sangue periférico de um dador são com 105 células mononucleadas de sangue periférico de um outro dador são alogénico. A resposta proliferativa nestas culturas é avaliada 5 dias depois, por incorporação de (3H)timidina, durante 16 horas. Observa-se uma inibição importante da incorporação, dependente da diluição do sobrenadante utilizado. Um sobrenadante de controlo não apresenta actividade inibidora da proliferação. EXEMPLO 3: OBTENÇÃO DE UMA PROTEÍNA DE FUSÃO COMPREENDENDO UM FRAGMENTO SCFv DE CD28.3. A sequência nucleotidica que codifica o fragmento scFv descrito no exemplo 2 foi ligada à extremidade 5' de uma porção do ADNc da αΐ-antitripsina humana (número de acesso no GENBANK K01396) correspondendo aos aminoácidos 53 a 425, por intermédio de um péptido charneira, de sequência VAAPS. A sequência resultante está representada na lista de sequências em anexo com o número SEQ ID NO: 3 e o polipéptido correspondente com o número SEQ ID NO: 4. EXEMPLO 4: PREPARAÇÃO DE VECTORES DE EXPRESSÃO QUE COMPREENDEM A SEQUÊNCIA QUE CODIFICA PARA A a-1 ANTITRIPSINA E PERMITEM A INTRODUÇÃO DE UMA SEQUÊNCIA QUE CODIFICA UM FRAGMENTO scFv 20

Vector de expressão procariótico:

Utilizou-se o vector pIG6 (Biochemisches Institut, Universitát Zurich). Este vector compreende, nomeadamente, um marcador de resistência à ampicilina e uma cassete de expressão que compreende um promotor lac indutivel, sob o qual são colocados sob controlo: uma sequência que codifica um péptido de sinal ompA, uma sequência que codifica um péptido marcador de sequência (códiqo de 1 letra) DYKD, uma sequência que codifica um péptido marcador c-myc e uma sequência que codifica um marcador de poli-histidina-5. 0 ADNc que codifica um fraqmento de al-antitripsina correspondente aos aminoácidos 53 a 425 foi introduzido entre os sítios EcoRI e EcoRV de pIG6, a jusante da sequência que codifica o péptido DYKD e a montante da sequência que codifica o marcador c-myc. A figura 1 esquematiza a estrutura obtida, denominada pIg6-Haat.

Vector de expressão eucariótico:

Utilizou-se o vector pSECTagB (Invitrogen, De Schelp, Holanda). Este vector compreende, nomeadamente, um marcador de resistência à ampicilina, um marcador de resistência à zeocina e uma cassete de expressão que compreende um promotor CMV sob o qual são colocados sob controlo: uma sequência que codifica um péptido de sinal de cadeia leve de IgG Kapa, uma sequência que codifica um péptido marcador c-myc e uma sequência que codifica um péptido marcador de poli-histidina-6. 21

Introduziu-se o ADNc que codifica um fragmento de al-antitripsina humana correspondente aos aminoácidos 53 a425, entre os sítios BamHI e EcoRI do vector marcador PSEC B, a montante da sequência que codifica o marcador c-myc. A figura 2 esquematiza a estrutura obtida, denominada pSecHaat.

EXEMPLO 5: PREPARAÇÃO DE VECTORES DE EXPRESSÃO QUE INTEGRAM A SEQUÊNCIA DE CODIFICAÇÃO DA PROTEÍNA DE FUSÃO scFv CD28.3/al-ANTITRIPSINA

Vector de expressão procariótico: 0 ADNc que codifica a proteína de fusão scFv CD28.3/al-antitripsina, descrita antes no exemplo 3 anterior, foi introduzido entre os sítios EcoRI e Xhol de pIG6, a jusante da sequência que codifica o péptido DYKD e a montante da sequência que codifica o marcador c-myc. A figura 3 esquematiza a estrutura obtida, denominada pIg6-28.3Haat.

Vector de expressão eucariótico:

Introduziu-se o ADNc que codifica a proteína de fusão ScFv CD28.3/al-antitripsina, descrita antes no exemplo 3, entre os sítios BamHI e Xhol do vector marcador PSEC B, a montante da sequência que codifica o marcador c-myc. A figura 4 esquematiza a estrutura obtida, denominada pSec-28.3Haat. 22

Este vector, alojado em DH5a de E.coli, foi depositado, em 11 de Dezembro de 2001, na CNCM, com o número 1-2762. EXEMPLO 6: EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS DE FUSÃO Em células procarióticas: O vector pIg6-28.3Haat foi utilizado para transformar células JM83 de E.coli. As células são postas em cultura a 25 °C, até a uma DO550 de 0,5. Após a indução por IPTG, a proteína é produzida sob a forma solúvel no periplasma. Aparece após a electroforese e transferência de Western, sob a forma de uma banda de cerca de 74 kDa.

Pode ser purificada a partir de extractos periplásmicos utilizando uma matriz de cromatografia de afinidade NI-NTA e/ou uma matriz de cromatografia de afinidade anti-c-myc. Pode igualmente ser purificada a partir de uma coluna de afinidade anti-al-antitripsina.

Em células eucarióticas: O vector pSec-28.3Haat foi utilizado para transfectar células OHC por lipofecção. Fez-se uma cultura das células na presença de 200 yg/ml de zeocina em meio MEM contendo 10 % de soro bovino fetal. A proteína é segregada no meio de cultura.

Após separação por electroforese, transferência de Western e revelação por meio de um anticorpo anti-c-myc aparece sob a forma de uma banda a cerca de 80 kDa. 23

EXEMPLO 7: ENSAIOS DE ACTIVIDADE DE DMA PROTEÍNA DE FUSÃO scFv/al-ANTITRIPSINA A actividade anti-CD28 da proteína de fusão scFv CD28.3/al-antitripsina, obtida no exemplo 6 anterior, é avaliada pela sua ligação à molécula CD28 ou a células que expressam CD28 na sua membrana e pela ausência de ligação a células que não expressam CD28. A actividade imunossupressora da proteína de fusão scFvCD28.3/al-antitripsina, obtida no exemplo 6 anterior, é avaliada pela inibição da adesão a B7 e a inibição da activação induzida do linfócito T.

Estas actividades anti-CD28 e imunossupressoras foram medidas pelos ensaios que se seguem:

Actividade anti CD28

Medição, com um biossensor, dos parâmetros de ligação a CD28:

Imobilizou-se CD28 humana recombinante no detector do biossensor (BIACORE). Pôs-se em contacto uma proteína de fusão scFv CD28.3/al-antitripsina, obtida como se descreveu no exemplo 6 anterior, com o detector. Os parâmetros de ligação são: KA (1/M)2,86e9; KD (M) : 3,49e-10. Em comparação, estes parâmetros medidos para o fragmento Fac do anticorpo CD28.3 são: KA (1/M) : 9,6 9e 8; KD (Μ): 1,0 3e— 9 . A afinidade para CD28 do fragmento Fac do anticorpo CD28.3 e da proteína de fusão são assim comparáveis.

Ensaio de reconhecimento específico de CD28 por citofluorometria: 24

Faz-se a incubação de 105 células de Jurkat (CD28+) e U937 (CD28-) em SBF-ASB a 1 %-NaN3 a 0,1 %, a 4 °C, durante 1 hora, com concentrações crescentes da proteína de fusão scFvCD28.3/al-antitripsina. Após lavagem, faz-se a incubação das células com um anticorpo de coelho anti-alfa-1-antitripsina, depois com um anticorpo de cabra anti-coelho conjugado com FITC, lava-se e analisa-se por citofluorometria. Observa-se uma ligação, dependente da dose, nas células de Jurkat (CD28+) e não se observa ligação nas células U937 (CD28-) . Isto mostra a especificidade da proteína de fusão para a molécula CD28 e a ausência de reactividade face a outras moléculas expressas por células hematopoiéticas humanas.

Actividade imunossupressora

Ensaio de adesão dependente de CD28/B7:

Fez-se a incubação de 4 x 105 células humanas T (Jurkatt, positivas a CD28) marcadas com 51Cr, durante 2 horas, numa placa de microtitulação na qual se semearam, 24 horas antes, 105 células aderentes LTK~ ou LB7+ (fibroblastos de murinos transfectados com B7.1 humano [PAGES et al., J. Biol. Chem., 271, 9403, (1996)]. Estas incubações são realizadas na ausência ou na presença da proteína de fusão scFv CD28.3/al-antitripsina, diluída a diferentes concentrações no tampão de SBF sem Ca2+ nem Mg2+. As células aderentes, após a lavagem, são quantificadas por leitura da radioactividade residual, com um contador beta (PACKARD TOPCOUNT). Observa-se uma inibição da adesão na presença da proteína de fusão scFv CD28.3/al-antitripsina, inibição directamente dependente da dose de proteína de fusão utilizada. 25

Inibição da activação:

Faz-se a estimulação de 5 x 101 2 3 4 células T (policlonais humanas, com uma redução das células CDllb) com 1 x 104 células de hibridoma OKT3 (anti-CD3) irradiadas ou com células B CD28‘ alogénicas (com uma redução das células CD28+) na ausência ou na presença de quantidades variáveis da proteína de fusão scFv CD28.3/al-antitripsina. A resposta proliferativa em culturas é avaliada após 3 dias de se efectuar a estimulação por meio de anti-CD3 ou após 7 dias quando a estimulação é efectuada por células alogénicas, por incorporação de (3H)timidina durante 16 horas. Observa-se uma inibição importante da incorporação na presença da proteína de fusão scFv CD28.3/al-antitripsina, inibição directamente dependente da dose de proteína de fusão utilizada.

Inibição da reacção linfocitária mista: 26 1

Mistura-se 105 células mononucleadas de sangue 2 periférico de um dador são com 105 células mononucleadas de 3

sangue periférico de um outro dador são alogénico. A 4 resposta proliferativa nestas culturas é avaliada passados 5 dias, por incorporação de (3H)timidina, durante 16 horas. Observa-se uma inibição importante da incorporação na presença da proteína de fusão scFv CD28.3/al-antitripsina, inibição directamente dependente da dose de proteína de fusão utilizada. LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> INSERM IMTIXT SANGSTAT LAFLAMME, Geneviève VANHOVE, Bernard <120> ANTICORPOS ANTI-CD28 <130> MJPcb598-48 <140> <141> <150> 00 17025 <151> 2000-12-26 <160> 4 <170> Patentin Ver. 2.1

<210> 1 <211> 732 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: fragmento scFv <220> <221> CDS <222> (1)..(732) 27 <220> <221> características várias <222> (1)..(360) <223> cadeia leve <220> <221> caracteristicas várias <222> (406) .. (732) <223> cadeia pesada <220> <221> caracteristicas várias <222> (361) .. (405) <223> ligante <220> <221> caracteristicas várias <222> (85) . . (96) <223> RDCl <220> <221> caracteristicas várias <222> (139) .. (189) <223> RDC2 < 2 2 0 > <221> caracteristicas várias <222> (286) .. (324) <223> RDC3 28 < 2 2 Ο > <221> características várias <222> (496) .. (522) <223> RDC1 <220> <221> características várias <222> (553) .. (576) <223> RDC2 <220> <221> características várias <222> (673) . . (681) <223> RDC3 <400> 1 29 43 gtc ctg cag cag tça gga gct gag ctg gtg aaa cec ggg gcg tcg Vai Lys Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Vai Lys Fro Gly Ala Ser 1 5 10 15 gtg agg ctg tcc tgc aag gcg tct ggt tac acc ttc act gaa tât att Vai Arg Leu, Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr GlU Tyr Ile 20 25 30 ata cac t m ata aag ctg agg tct gg« cag ggt ctt gag tgg att ggg n» His T rp Ue Lys Leu Arg Ser Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie Gly 35 40 45 tag ttt lac cct gga agt aat gat ata cag tac aat gcg aaa ttc aag TÍp Phe Tyr Fro Gly Ser Asn Asp lie Gin Tyr Asn Ala Lys Phe Lys 50 55 60 ggc aag gec aca ttg act gcg gac aaa tcc tcc âgc acc gtc tat atg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp lys Ser Ser Ser Thr Vai Tyr Met 65 70 75 80 gaa ctt act gga ttg aca tct gag gac tct gcg gtc tat ttc tgt gea Glu Leu Thr Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Phe Cys Ais 85 90 95 aga egc gac gat ttc tct ggt tac gac gee ctt cct tac tgg ggc caa Arg Arg Asp Asp Phe Ser Gly Tyr Asp Ala Leu Fro Tyr Trp Gly Gin 100 105 110 ggg acc atg gtc acc gtc tcc tca ggt gga ggc ggt tca ggc gga ggt Gly Thr Met Vai Thr Vai Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1.15 120 125 ggc tCt ggc ggt ggc gga tcg gac ate cag atg acc cag tct cca gee Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gin Het Thr Gin Ser Pro Ala no 135 140 fcce cta tct gtt tct gtg gga gaa act gtc acc ate acg tgc cga aca Ser Leu Ser Vai Ser Vai Gly Glu Thr Vai Thr lie Thr Cys Arg Thr 96 144 192 240 288 336 384 432 480 145 ISO 155 160 30 526 aat gea att tac agt aat tta gcâ tgg tat cag cag aaa cag gga Asn Glu Asn He Tyr 165 Ser Asn Leu Ala Trp Tyr 170 bi.fi Gin Lys Gin 175 Giy aaa tct ect cag etc etg ate tat gct gea âcs caç tta gta qaq ggt Lys Ser Pro Gin Leu Leu He Tyr Ai a Ai 8 Thr His Leu Vai Glu Gly 180 185 160 gtg cca tea agg ttc agt ggc agt gga tea ggc SCâ cag tat tcc ctc vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Giy Ser Giy Thr Gin Tyr Ser Leu 195 200 205 aag ate aec age ctg cag tct gaa gat ttt gçg &S L tat tac tgt caa Lys He Thr Ser Leu Gin Ser Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gin 210 215 220 cac ttt tgg ggfc etCt çcg tçc aeg ttc gga ggg ggg acc eag etg gaa His Phe Trp Gr y Thr Pro Cys Thr Phe Gly Gly Giy Thr Lys Leu Glu 225 230 235 240 576 624 672 720 BKõ âoíi CÇÇ âct He Lys Arg Thr 732

<210> 2 <211> 244 < 212 > PRT <213> Sequência artificial <223> Descrição da sequência artificial: fragmento scFv <400> 2 31

Vai 1 Lys Leu Gin Gin 5 Vai Arg Leu Ser Cys 20 Ile his Trp 35 Xle Lys Trp Phe 50 Tyr Pro Gly Gly Lys Ala Thr Leu 65 Glu Leu Thr Gly Leu 85 Arg Arg Asp Asp Phe iOO Gly Thr Met ns Vai The Gly Ser Gly Gly Gly 130 Ser 145 Liâ U Ser Vai Ser Asn Qiu Asn lie Tyr 165 Lys Ser Pro Gin Leu 180 Vai Pro Ser 195 Arg Phe Lys U* 210 Thr Ser Leu His Phe Trp Gly Thr 225 Ile Lys Arg Thr Ser Gly Ala Glu Leu Vai 10 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 25 Leu Arg 5ér Gly Gin Gly 40 Ser Asn Asp lie Gir. Tyr 55 Thr Ala Asp Lys Ser Ser 70 75 Thr Ser Glu Asp Ser Ala 90 Ser Gly Tyr Asp Ala Leu 105 Vai Ser Ser Gly Gly Gly 120 Gly Ser Asp Xle Gin Met 135 Vai Gly Glu Thr Vai Thr 150 155 Ser Asa Leu Ala Trp Tyr 170 leu He Tyr Ala Ala Thr 185 Ser Gly Ser Gly Ser Gly 200 Gin Ser Glu Asp Fhe Gly 215 Fr© Cys Thr Phe Gly Gly 230 235

Lys Pr© Gly Ala Ser 15

Phe Thr Glu Tyr lie 30

Leu Glu Trp 11« Gly 45

Asn Ala Lys Phe Lys 00

Ser Thr Vai Tyr Met 80

Vai Tyr Phe Cys Ala 95

Pro Tyr Trp Gly Gin 110

Gly Ser Gly Gly Gly 125

Thr Gin Ser Prc Ala 140

Xle Thr Cys Arg Thr 160

Gin Gin Lys Gin Gly 175 f-iis leu Vai Glu Gly 190

Thr Gin Tyr Ser Leu 205

Asn Tyr Tyr Cys Gin 220

Glv Thr Lys Leu Glu 240 <210> 3 <211> 2013

<212> ADN <213> Sequência artificial 32 <220> <223> Descrição da sequência artificial: fusão scFv anti-CD28/alfa-l antitripsina <220> <221> CDS <222> (1) .. (2013) <220> <221> vários sinais <222> (1) . . (57)

<223> sinal Omp A <220> <221> caracteristicas várias <222> (64) . . (75) <223> Marcador < 2 2 0 > <221> caracteristicas várias <222> (109) .. (810) <223> scFv 28.3 <220> <221> caracteristicas várias <222> (826) . . (1992) <223> alfa-1 antitripsina <220> <221> caracteristicas várias <222> (1993) . . (2007) <223> marcador His <400> 3 33 atg a a a St* <3 a ca gct ate gcg att gea gtg gea ctg gct ggt ttc gct 48 M3t lys Lys Thr Ala Jle Ala lie Ala Vai Ala Leu Ala Giy The Ala 1 5 10 15 acc gta gcg cag gee gac tac aaa gat citC gtc aag ctg cag cag tea 96 Thr Vai Ais Gin Ala Asp Tyr Lys Asp Ile Vai Lys Leu Gin Gin Ser 2Q 25 30 90e gct gag ctg gtg aas ccc ggç gcg tcg gtg agg ctg tcc tge aag 144 Giy Ala Glu Leu Vâi Lys Pro G.ly Ais Ser vai Arg Leu Ser Cys Lys 35 40 45 gcg tct ggt tac acc ttc act gaa tat att ata cac tgg ata aag ctg 192 Ala. Ser C-ly Tyr Thr The Thr Glu Tyr Ile Ile His Trp He Lys Leu 50 55 60 agg tct gga cag ggt ctt gsg tgg att gçg tgg ttt tac cct gga agt 240 Arg Ser Giy Gin Giy Leu Glu Trp Ile Giy Trp Phe Tyr Pro Giy Ssr 65 7Q g 4 5 30 aat gat ata cag tãC aat gcg aaa ttc aag gçc aag gee aca ttg act 288 Asn Asp Ha Gin Tyr Asn Ala Lys Phe Lys Giy Lys Ala Thr Leu Thr 85 90 95 gcg gac ãàã tcc tcc age acc gtc tat sfcg gaa ctt act gga ttg aca 336 Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Vai Tyr Met Glu Leu Thr Giy Leu Thr 100 105 110 tct gag gac tct gcg gtc tâfc ttc tgt gea aga ege gac gat ttc tct 384 Ser Glu Ase Ser Ala Vai Tyr The Cys Àla Arg Arg Asp Asp Phe Ser 115 120 125 ggt tac gac gee ctt cct tac tgg ggc câs ggg acc atg gtc acc gtc 4 32 Giy Tyr Asp Ala Leu Pro Tyr Trp Giy Gin Giy Thr Met Vai Thr Vâi 130 135 140 tcc tea ggt gga gg= ggt tea gçc gga ggt ggc tct gçc ggt ggc gga 480 Ser Ser GIv Giy Giy Giy Ser Giy Giy Giy Giy Ser Giy Giy Giy Giy 145 150 155 160 tcg gac ate cag atg acc cag tct CCS gee tcc et a tct gtc tct gtg 528 Ser ASp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Vai Ser Vâi 165 170 175 gga gaa act gtc acc acc acg tgt cgs aca aat gaa aat att tac agt 576 Giy Glu Thr Vai Thr Ile Thr Cys Arg Thr Asn Glu Asn Ile Tyr Ser 180 IBS 190 aat r.t& ges tgg tat cag cag aaa cag gga aaa tct cct cag ctc ctg 624 Asn Leu Ale Trp Tyr Gin Gin Lys Gin Giy Lys Ser Pro Gin Leu Leu 195 200 205 ate tafc gct gea ecs c&c tte gta gag ggt gtg ÇÇ ã tea agg ttc age 672 11« Tyr Ala Ala Thr His Leu Vai Glu Giy Vftl Pro Ser Arg Phe Ser 210 215 220 çgc agt gga tea ggc aca cag tãt tcc ctc aag ate acc age ctg cag 720 Giy Ser Giy Ser Glv Thr Gin Tyr Ser Leu Lys He Thr Ser Leu Gin 2 2 D 230 235 240 34 tct gaa gat ttt «99 aat tat tac cgt caa cac ttt tqg ggt act ccg 7 66 Ser Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gin. His Phe Trp Gly Thr Pro 245 250 255 tgc a cg ttc gga 999 999 acc aag ctg aca aaa egg act gtg gct 816 Cys Thr Phs Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu I le. Lys Arg Thr Val Ala 260 265 270 gc a cca tct gaa ttc. esc aag ate acc ccc aac ctg CfCt gag ttc gee 864 Ale Pro Ser Glu Phe Asn Lys Xle Thr Pro Asn Leu Ala Glu Phe Ala 275 280 285 etc age cta tac ege cag ctg CdC cag tec SâC age acc aat ate 912 Pha Ser Leu Tyr Arg Gin Leu Ala His Gin Ser Asn Ser Thr Asn Ile 290 295 300 ttc ttc fccc cca gtg age ate gct aca gee ttt gea atg ctc tcc ctg 960 Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu Ser Leu 305 310 315 320 âec aag gct gac act cac gat gaa ate ctg gag ggc ctg aat. ttc 1006 Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu 11© Leu Glu Gly Leu Asn Phe 325 330 335 aae ctc a cg gag ate ccg gag gct cag ate eat gaa ggc ttc cag gaa 1056 Asn Leu Thr Glu Xle Pro Glu Ala Gin He His Glu Gly Phe Gin Glu 340 345 350 ctc ctc cgt SCO etc a&c cag cca gac age cag ctc cag ctg acc. acc 1104 Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gin Pro Asp Ser. Gin Leu Gin Leu Thr Thr 355 360 365 ggc aat ggc ctg ttc ctc age gag ggc ctg aag cta gtg gat aag ttt 1152 Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp Lys Phe 370 375 360 ttg gag gat gtt aaa aag ttg tac cac tea gaa gee ttc act gtc aac 1200 Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr Val Asn 385 390 3SS 400 ttc ggg gac acc gaa S*g qcc aag aaa cag ate aac gat tac gtg gag 1248 Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gin Xle Asn Asp Tyr Vai Glu 405 410 415 aag ggt act caa 999 aaa att gtg gat ttg gtc aag g»9 ctt gac aga 1296 Lys Glv Thr Gin Gly Lys lie Val Asp Leu Val Lys Glu Leu Asp Arg 420 425 430 gac aca gtt ttt gct ctg gtg aat tac ate ttc ttt aaa ggc aaa tçç 1344 Asp Thr Vai Phe AU Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly Lys Trp 435 440 445 gag aga coe ttt gaa gtc aag gac acc gag gaa gag gac ttc cac gtg 1392 Glu Arg Pro Phe Gru Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe His Val 450 4 55 460 gsc cag gtg acc acc 9tg aag gtg cct atg ãtg aag cgt tta ggc atg 1440 Asp Gin Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu Gly Met 465 470 475 480 35 1488 tfct aac ate cag çac tçt Phe As n Ile 61 ft Hís Cys 485 ctâ& tae ctg ggc aat gee Lys Tyr Lau Gly Asn Ala 500 o ta cag CâC ctg gaa Lys Leu Gin His Léu Glu 515 ttc ctg gaa aat çaa gac Phe Leu Glu Asn Glu Asp 530 ctg tcc att act gga âCC Léu Ser Ile Thr Gly Thr 545 550 ggc ate act aag gtc ttc Gly Ile Thr Lys vai Fhè 565 gaç gag gea ccc Ctg aag Glu Glu Ala p£0 Leu Lys 580 acc ate gac gag aaa 999 Thr Ile Asp Glu Lys Gly 595 gcc ata ccc atg tet ate Ala Ile Pro Met Ser lie 610 gtc ttc tta atg att gaa Vai Phe Leu Met lie Glu 625 630 asa gtg gtq aat ccc acc Lys Vai Vai Asn Pre 645 Thr ctg ate tet gaa gsa gac Leu lie Ser Glu Glu Asp 660 aag aaç ctg tcc age tgg Lys Lys Leu Ser Ser Trp 490 aee gee ate ttc ttc ctg Thr Ala Ile Phe Phe Leu 505 aat gaa ccc acc cac gat Asn Glu Leu Thr His Asp 520 aga agg tet gee age tta ftrg Arg Ser Ala Ser Leu 535 540 tafc gat ctg aag age gtc Tyr Asp Lsu Lys Ser Vai 555 age aat 999 gct gsc ctc Ser Asn Gly Ala Asp Leu 570 ctc tcc sag gee gtg cat Leu Ser Lys Ala Vai His 585 act gaa gct gct 999 gee Thr Glu Ala Ala Gly Ala 600 ccc ccc gag gtc «ag ttc ?ro Pro Glu Vai Lys Phe 615 620 ca a aat ace aag tet ccc Gin Asn Thr Lys Se.r Pro 635 caa aaa ctc gag gga gaa Gin Lys Leu Glu Gly Glu 650 ctg aac cac cac cac cac Leu Asn Mis His his His 665 gtg ctg etg atg Vai Léu Leu Met 495 cet gat Oro Asp çag ggç Glu Gly 1536 510 ate ate Ile Ile acc aag Thr Lvs 1584 S25 cat tta His Leu ccc aaa Pro Lys 1632 ctg ggt Leu Gly caa ctg Gin Leu 560 1680 tcc ggg Ser Gly gtc aca Vai Thr 575 1728 aaç gct Lys Ala gtg ctg Va.1 Leu 1776 SSO atg tet Met Phe tta gaç Leu Glu 1824 605 aac aaa Asn Lys ccc ttt Pro Phe 1872 Ctc ttc Leu Phe atg gga Met Gly 640 1920 ttc: gaa Phe Glu cag aaa Gin Lys 65 S 1968 cac tga taa 2013 His 670

<210> 4 <211> 669 <212> PRT <213> Sequência artificial <223> Descrição da sequência artificial: fusão scFv anti-CD28/alfa-l antitripsina <400> 4 36

Met Lis Lis Tre Ala Ile Ala Vai Ala Leu Ala Gli Fen Ala 1 5 10 15

Thr Vai Ala Gin Ala Asp Tyr Lys Asp Ile Vai Lys Leu Gin Gin Ser 20 25 30 Gly Ala Glu Leu Vai Lys Pro Gly Ala Ser val Arg Leu Ser Cys Lys 35 40 45 Ais Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Ile His Trp Ile Lys Leu 50 55 60 Arg Ser Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Ser 65 70 75 80 Asn Asp Ile Gin Tyr Asn Ala Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr 85 90 95 Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Thr Gly Leu Thr 100 105 110 Ser Gi U Asp Ser Ala Vai Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Asp Asp Phe Ser 115 120 125 Gly Tyr Asp Ala Leu Pro Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ket Val Thr Val 130 135 140 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val 165 170 175 Gly Glu Thr Vai Thr Ile Thr Cys Arg Thr Asn Glu Asn lie Tyr Ser 180 195 190 Asn JLíSU Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Gin Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu 195 200 205 Ile Tyr Ar a Ala Thr His Leu Val Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 210 215 220 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gin Tyr Ser Leu Lys lie Thr Ser Leu Gin 225 230 235 240 Ser Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gin His Phe Trp Gly Thr Pro 245 250 255 Cys Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 260 265 270 Ala Pro Ser Glu Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu Phe Ala 275 280 285 Phe Ssr Leu Tyr Arg Gin Leu Ala His Gin Ser Asn Ser Thr Asn lie 290 295 300 Phe Fft© ser Pro Val $er Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu Ser Leu 305 310 315 320 Gly Thr Lys Ale Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu Asn Phe 325 330 335 Asn Leu rhr Glu Ue Pro Glu Ala Gin Ile His Glu Gly Phe Gin Glu 340 345 350 Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gin Pro Asp Ser Gin Leu Gin Leu Thr Thr 355 360 365 Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu uiy Leu Lys Leu Val Asp Lys Phe 370 3?5 380 Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr Val Asn 385 390 395 400 Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gin lie Asn Asp Tyr Val Glu 405 410 415 Lys Gly Thr Gin Gly Lys Ile Val Asp Leu Vai Lys Glu Leu Asp Arg 420 425 430 Asp Thr Vai Phe Ala Leu Vai Asn Tyr lie Phe Phe Lys Gly Lys Trp 4 35 440 445 Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe His Val 450 455 4 60 Asp Gin Vai Thr Thr Val Lys Val Pto Met Ket Lys Arg Leu Gly Met 465 470 475 480 Ph e Asn Ile Gin HÍS Cys Lys Lys Leu Ser Ser Trp Vai Leu Leu Met 485 450 455 37

Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp Glu Gly 500 505 510 Lys Leu Gin HiS Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp lie ile Thr Lys 515 520 525 Phe Leu Glu Asn Glu ASp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu pro Lys 530 535 540 Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu G1 y Gin Leu 545 550 5SS 560 Gly lie The· Lys Val Phe Ser Asn GX y Ala Asp Leu Ser Gly Val Thr 565 570 575 Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala Val Leu 580 585 590 Thr He Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe Leu Glu 595 600 605 Ala He Pro Me t Ser n« Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe 610 615 620 vai Phe Leu Met Ile Glu Gin Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe Met Gly 625 630 635 640 Lys vai Val Asn Pro Thr Gin Lys Leu Glu Gly Glu Phe Glu Gin Lys 645 650 655 Leu lie Ser Glu Glu Asp Leu Asn His His His His His 660 665

Lisboa, 10 de Novembro de 2010. 38

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Proteína capaz de se ligar especificamente ao receptor de linfócitos CD28 e de bloquear a interacçâo de CD28/B7, caracterizada pelo facto de compreender pelo menos as RDCs de cadeias pesada e de cadeia leve da imunoglobulina CD28.3, produzida pelo hibridoma CNCM 1-2582 e, pelo facto de se seleccionar entre: a) o anticorpo CD28.3 produzido pelo hibridoma CNCM 1-2582; b) os fragmentos Fv, Fac ou scFv do anticorpo CD28.3; c) os anticorpos quiméricos ou humanizados obtidos a partir das regiões variáveis de CD28.3; d) os fragmentos Fv, Fac ou scFv de um anticorpo quimérico ou humanizado c) ; e) as proteínas recombinantes compreendendo um fragmento b) ou d) e um polipéotido heterólogo.
2. 2. Proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de se tratar de uma proteína recombinante que compreende: - um fragmento scFv do anticorpo CD28.3 e - um polipéptido heterólogo obtido a partir da al-antitripsina.
3. 3. Molécula de ácido nucleico caracterizada pelo facto de codificar uma proteína de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 2.
4. 4. Vector de expressão, caracterizado pelo facto de compreender uma molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 3. 1
5. 5. Vector de expressão, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de se tratar do plasmido CNCM 1-2762.
6. 6. Célula caracterizada pelo facto de expressar uma proteína de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 2.
7. 7. Célula, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo facto de se tratar do hibridoma CNCM 1-2582.
8. 8. Célula, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo facto de se tratar de uma célula transformada por uma molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 3.
9. 9. Processo para a preparação de uma proteína, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de compreender a cultura de pelo menos uma célula, de acordo com uma qualquer das reivindicações 6 a 8 e a recuperação da referida proteína a partir da referida a cultura.
10. 10. Utilização de uma proteína, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo facto de se destinar a obter um medicamento.
11. 11. Utilização, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo facto de a referida proteína ter um único sítio de ligação ao receptor CD28 e pelo facto de o referido medicamento ser um imunossupressor que bloqueia selectivamente a activação das células T por meio do receptor CD-28. 2
12. 12. Utilização, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo facto de o referido medicamento se destinar ao tratamento de uma patologia seleccionada enxerto contra mediadas por e as doenças entre a rejeição do enxerto, a doença do o hospedeiro, as doenças auto-imunes linfócitos T, os fenómenos alérgicos inflamatórias crónicas. Lisboa, 10 de Novembro de 2010. 3