ES2805283T3 - Terapia contra el cáncer mediante el uso de anticuerpos dirigidos a la diana cldn6 in vivo - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo que se une a claudina 6 (CLDN6) e induce la inhibición del crecimiento tumoral in vivo tras la unión de CLDN6, dicho anticuerpo producido u obtenido a partir de un clon depositado bajo el número de acceso DSM ACC3059 (GT512muMAB 36A), DSM ACC3058 (GT512muMAB 27A), o DSM ACC3057 (GT512muMAB 5F2D2).

Description

DESCRIPCIÓN

Terapia contra el cáncer mediante el uso de anticuerpos dirigidos a la diana cldn6 in vivo

El cáncer es un problema de salud importante en todo el mundo y aún es una de las principales causas de muerte. Las células cancerosas se diferencian de manera biológica esencialmente de sus células de origen no malignas. Estas diferencias se deben a alteraciones genéticas adquiridas durante el desarrollo del cáncer y resultan, entre otras, también en la formación de estructuras moleculares cualitativa o cuantitativamente alteradas en las células cancerosas. Las estructuras asociadas al cáncer de este tipo son, en particular, productos genéticos cuya expresión se induce o mejora durante el curso de la transformación maligna.

El sistema inmune tiene la capacidad de reconocer y destruir células a través de dos modalidades separadas: inmunidad innata y adaptativa. El componente innato consiste en macrófagos, células asesinas naturales (NK, por sus siglas en inglés), monocitos y granulocitos. Estas células identifican patrones moleculares involucrados en la transformación celular y liberan varias citocinas y mediadores inflamatorios. La respuesta innata carece de la capacidad de memoria para antígenos extraños, una característica presente en la respuesta inmune adaptativa. Este último componente del sistema inmune también presenta especificidad por antígenos extraños, impartida por la presencia de receptores en los linfocitos. Las células presentadoras de antígenos (APC, por sus siglas en inglés) también juegan un papel en la respuesta adaptativa - engloban antígenos extraños y los presentan a los linfocitos en el contexto del complejo de histocompatibilidad mayor. Las células T CD4+ tienen receptores que reconocen los antígenos en el contexto de las moléculas MHC de clase II, lo que les permite liberar citocinas y activar además los linfocitos CD8+ (linfocitos T citotóxicos; CTL) o las células B. Los CTL son parte de la inmunidad mediada por células y son capaces de eliminar las células presentadas en el contexto de las moléculas de MHC de clase I, a través de la apoptosis o la lisis celular mediada por perforina. Es ampliamente aceptado que la inmunidad mediada por células T juega un papel vital en una respuesta antitumoral. Las células B están involucradas en la liberación de inmunoglobulinas y, como tales, son parte del sistema inmune humoral.

Si se apunta y mejora adecuadamente, las funciones inmunes pueden explotarse terapéuticamente para controlar e incluso erradicar las lesiones malignas. Los cambios genéticos y epigenéticos involucrados en la carcinogénesis generan antígenos que son reconocidos por el sistema inmune de manera análoga a los antígenos microbianos.

Los anticuerpos se han introducido con éxito en la clínica para su uso en la terapia del cáncer y en la última década, se han convertido en la terapéutica más prometedora en la oncología. Las terapias basadas en anticuerpos para el cáncer tienen el potencial de una mayor especificidad y un perfil de efectos secundarios inferior en comparación con los fármacos convencionales. La razón es una distinción precisa entre las células normales y neoplásicas por anticuerpos y el hecho de que su modo de acción se basa en mecanismos antitumorales inmunológicos menos tóxicos, tales como la activación del complemento y el reclutamiento de células inmunes citotóxicas.

Las claudinas son proteínas integrales de membrana localizadas dentro de las uniones estrechas de los epitelios y endotelios. Se predice que las claudinas tienen cuatro segmentos transmembrana con dos bucles extracelulares, y N- y C-terminales ubicados en el citoplasma. La familia de proteínas transmembrana claudina (CLDN) desempeña un papel crítico en el mantenimiento de las uniones estrechas epiteliales y endoteliales y pueden desempeñar, además, un papel en el mantenimiento del citoesqueleto y en la señalización celular.

Hemos encontrado que CLDN6 se expresa en tejidos de varios tipos de cáncer, mientras que la expresión en tejidos normales no cancerosos se limita a la placenta. Tales cánceres incluyen cáncer de ovario, en particular, adenocarcinoma de ovario y teratocarcinoma de ovario, cáncer de pulmón, que incluye cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC, por sus siglas en inglés) y cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC, por sus siglas en inglés), en particular, carcinoma de pulmón de células escamosas y adenocarcinoma, cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer hepático, cáncer de páncreas, cáncer de piel, en particular, carcinoma de célula basal y carcinoma de célula escamosa, melanoma maligno, cáncer de cabeza y cuello, en particular, adenoma pleomórfico maligno, sarcoma, en particular, sarcoma sinovial y carcinosarcoma, cáncer de vías biliares, cáncer de la vejiga urinaria, en particular, carcinoma de célula transicional y carcinoma papilar, cáncer de riñón, en particular, carcinoma de células renales que incluye carcinoma de células renales de células claras y carcinoma de células renales papilares, cáncer de colon, cáncer de intestino delgado, que incluye cáncer de íleon, en particular, adenocarcinoma de intestino delgado y adenocarcinoma del íleon, carcinoma embrionario testicular, coriocarcinoma placentario, cáncer cervical, cáncer testicular, en particular, seminoma testicular, teratoma testicular y cáncer testicular embrionario, cáncer uterino, y las formas metastásicas de los mismos. El documento de la técnica anterior WO2009/087978 describe un anticuerpo monoclonal AE49-11 que se une a la CLDN6 humana e induce inhibición del crecimiento tumoral en un modelo de ratón. Sin embargo, dado que este anticuerpo también se une de forma detectable al CDLN4 humano, una claudina que se expresa abundantemente en el cuerpo humano, el uso de este anticuerpo para la terapia humana parece poco realista.

Pudimos producir anticuerpos capaces de unirse a CLDN6 específicamente en la superficie de células intactas que expresan CLDN6. No se observó unión a las células que expresan proteínas claudina que no sean CLDN6, en particular, CLDN3, CLDN4 y CLDN9, o las células que no expresan ninguna de estas proteínas CLDN para estos anticuerpos.

Aquí, extendemos esas observaciones al demostrar que la unión del anticuerpo a CLDN6 en la superficie de las células tumorales es suficiente para conferir una inhibición significativa del crecimiento tumoral. In vivo la evaluación del crecimiento tumoral de células tumorales transfectadas con CLDN6 y xenoinjertos no transfectados mostró la inhibición del crecimiento tumoral específica de células transfectadas con CLDN6 mediada por la unión del anticuerpo a CLDN6. Además, se demostró que la unión del anticuerpo a CLDN6 es suficiente para inhibir el crecimiento tumoral in vivo de células tumorales que expresan CLDN6 de forma endógena. Esto establece la prueba de principio de que la unión del anticuerpo a CLDN6 es efectiva en la inhibición del crecimiento tumoral y proporciona evidencia de que CLDN6 es una diana atractiva para los anticuerpos terapéuticos diseñados para inhibir el crecimiento tumoral al dirigirse a CLDN6.

Además, se demostró que la unión del anticuerpo a CLDN6 es eficaz para inhibir el crecimiento tumoral de una línea celular tumoral de células germinales positivas para CLDN6 humana in vivo lo que demuestra la utilidad de la unión de los anticuerpos a CLDN6 como agentes terapéuticos selectivos para dirigir e inducir la muerte de tumores de células germinales tales como tumores de células germinales testiculares.

Por lo tanto, proporcionamos la primera evidencia directa de que la unión del anticuerpo a CLDN6 en la superficie de las células tumorales in vivo da como resultado la atenuación del crecimiento tumoral y proporciona la demostración de que la unión específica a CLDN6 da como resultado una intervención terapéutica mediante la cual se atenúa el crecimiento tumoral. Además, proporcionamos evidencia de que la unión del anticuerpo a CLDN6 en la superficie de las células tumorales in vivo da como resultado la prolongación de la supervivencia y la extensión de la vida útil de los pacientes con tumor. En consecuencia, la enseñanza se refiere al tratamiento y/o prevención de enfermedades tumorales asociadas con células que expresan CLDN6, en particular cáncer y metástasis de cáncer mediante el uso de anticuerpos que se unen a CLDN6. La presente solicitud demuestra que la unión de anticuerpos a CLDN6 en la superficie de las células tumorales es suficiente para inhibir el crecimiento del tumor y prolongar la supervivencia y extender la vida útil de los pacientes con tumor. Además, la unión de anticuerpos a CLDN6 es eficaz para inhibir el crecimiento de tumores de células germinales positivas para CLDN6 tales como teratocarcinomas o carcinomas embrionarios, en particular tumores de células germinales de los testículos.

Resumen

En un aspecto, la enseñanza se refiere a un anticuerpo que inhibe el crecimiento de un tumor in vivo, en donde las células del tumor expresan claudina 6 (CLDN6) y en donde el anticuerpo es capaz de unirse a CLDN6. En una modalidad, el anticuerpo inhibe el crecimiento del tumor al unirse a CLDN6. En una modalidad, el anticuerpo es específico para CLDN6. En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, quimérico, humano o humanizado, o es un fragmento de un anticuerpo o un anticuerpo sintético. El tumor puede seleccionarse del grupo que consiste en cáncer de ovario, en particular, adenocarcinoma de ovario y teratocarcinoma de ovario, cáncer de pulmón, que incluye cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC, por sus siglas en inglés) y cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC, por sus siglas en inglés), en particular, carcinoma de pulmón de células escamosas y adenocarcinoma, cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer hepático, cáncer de páncreas, cáncer de piel, en particular, carcinoma de célula basal y carcinoma de célula escamosa, melanoma maligno, cáncer de cabeza y cuello, en particular, adenoma pleomórfico maligno, sarcoma, en particular, sarcoma sinovial y carcinosarcoma, cáncer de vías biliares, cáncer de la vejiga urinaria, en particular, carcinoma de célula transicional y carcinoma papilar, cáncer de riñón, en particular, carcinoma de células renales que incluye carcinoma de células renales de células claras y carcinoma de células renales papilares, cáncer de colon, cáncer de intestino delgado, que incluye cáncer de íleon, en particular, adenocarcinoma de intestino delgado y adenocarcinoma del íleon, carcinoma embrionario testicular, coriocarcinoma placentario, cáncer cervical, cáncer testicular, en particular, seminoma testicular, teratoma testicular y cáncer testicular embrionario, cáncer uterino, y las formas metastásicas de los mismos. El tumor puede ser un tumor de células germinales, tal como un teratocarcinoma o un carcinoma embrionario. El tumor de células germinales puede ser un tumor de células germinales de los testículos.

En un aspecto adicional, la enseñanza se refiere a un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en (i) un anticuerpo producido o que puede obtenerse a partir de un clon depositado bajo el número de acceso DSM ACC3059 (GT512muMAB 36A), DSM ACC3058 (GT512muMAB 27A) o DSM ACC3057 (GT512muMAB 5F2D2), (ii) un anticuerpo que es una forma quimerizada o humanizada del anticuerpo en (i)), (iii) un anticuerpo que tiene el especificidad del anticuerpo en (i), y (iv) un anticuerpo que comprende la porción de unión al antígeno o el sitio de unión al antígeno del anticuerpo en (i). La porción de unión al antígeno o el sitio de unión al antígeno del anticuerpo en (i) puede comprender la región variable del anticuerpo en (i).

El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores puede unirse a, al menos, un resto efector terapéutico tal como un radiomarcador, citotoxina o enzima citotóxica.

En un aspecto adicional, la enseñanza se refiere a un hibridoma capaz de producir el anticuerpo de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores.

En un aspecto adicional, la enseñanza se refiere a un hibridoma depositado bajo el número de acceso DSM ACC3059 (GT512muMAB 36A), DSM ACC3058 (GT512muMAB 27A), o DSM ACC3057 (GT512muMAB 5F2D2).

En un aspecto adicional, la enseñanza se refiere a una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores. La composición farmacéutica puede estar en forma de una vacuna terapéutica o profiláctica para tumores. En una modalidad, la composición farmacéutica es para usar en el tratamiento o prevención de una enfermedad tumoral.

En un aspecto adicional, la enseñanza se refiere a un método para tratar a un paciente que tiene una enfermedad tumoral o que está en riesgo de desarrollar una enfermedad tumoral, en donde las células del tumor expresan claudina 6 (CLDN6) y en donde el método comprende la administración de un anticuerpo capaz de unirse a CLDN6. En una modalidad, el anticuerpo cuando se administra al paciente inhibe el crecimiento del tumor en el paciente al unirse a CLDN6. En una modalidad, el anticuerpo está unido a, al menos, un resto efector terapéutico tal como un radiomarcador, citotoxina o enzima citotóxica. El anticuerpo puede ser específico para CLDN6. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, quimérico, humano o humanizado, o un fragmento de un anticuerpo o un anticuerpo sintético. En una modalidad, el método comprende la administración de una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores.

En cualquiera de los aspectos anteriores, la enfermedad tumoral se selecciona del grupo que consiste en cáncer de ovario, en particular, adenocarcinoma de ovario y teratocarcinoma de ovario, cáncer de pulmón, que incluye cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC, por sus siglas en inglés) y cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC, por sus siglas en inglés), en particular, carcinoma de pulmón de células escamosas y adenocarcinoma, cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer hepático, cáncer de páncreas, cáncer de piel, en particular, carcinoma de célula basal y carcinoma de célula escamosa, melanoma maligno, cáncer de cabeza y cuello, en particular, adenoma pleomórfico maligno, sarcoma, en particular, sarcoma sinovial y carcinosarcoma, cáncer de vías biliares, cáncer de la vejiga urinaria, en particular, carcinoma de célula transicional y carcinoma papilar, cáncer de riñón, en particular, carcinoma de células renales que incluye carcinoma de células renales de células claras y carcinoma de células renales papilares, cáncer de colon, cáncer de intestino delgado, que incluye cáncer de íleon, en particular, adenocarcinoma de intestino delgado y adenocarcinoma del íleon, carcinoma embrionario testicular, coriocarcinoma placentario, cáncer cervical, cáncer testicular, en particular, seminoma testicular, teratoma testicular y cáncer testicular embrionario, cáncer uterino, y las formas metastásicas de los mismos.

En cualquiera de los aspectos anteriores, la enfermedad tumoral puede ser una enfermedad de tumor de células germinales tal como una enfermedad caracterizada por un teratocarcinoma o un carcinoma embrionario. La enfermedad de tumor de células germinales puede ser una enfermedad de tumor de células germinales de los testículos.

En cualquiera de los aspectos anteriores, la CLDN6 puede comprender una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de ácidos nucleicos y/o puede comprender la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.

Un anticuerpo descrito en la presente descripción es capaz de unirse a CLDN6 y preferentemente es capaz de unirse a CLDN6 asociado con la superficie de una célula que expresa

CLDN6. Preferentemente, el anticuerpo no es esencialmente capaz de unirse a CLDN3, en particular cuando se asocia con la superficie de una célula que expresa CLDN3, y/o no es esencialmente capaz de unirse a CLDN4, en particular cuando se asocia con la superficie de una célula que expresa CLDN4. Preferentemente, el anticuerpo no es esencialmente capaz de unirse a CLDN9, en particular cuando se asocia con la superficie de una célula que expresa CLDN9. Con la máxima preferencia, el anticuerpo no es esencialmente capaz de unirse a una proteína CLDN distinta de CLDN6, en particular cuando se asocia con la superficie de una célula que expresa dicha proteína CLDN y es específica para CLDN6. Preferentemente, dicha célula que expresa dicha proteína CLDN es una célula intacta, en particular una célula no permeabilizada, y dicha proteína CLDN asociada con la superficie de una célula tiene una conformación nativa, es decir, no desnaturalizada. Preferentemente, el anticuerpo es capaz de unirse a uno o más epítopos de CLDN6 en su conformación nativa.

En modalidades preferidas particulares, un anticuerpo descrito en la presente descripción se une a epítopos nativos de CLDN6 presentes en la superficie de las células vivas tales como las de la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5. En modalidades preferidas adicionales, el anticuerpo es específico para células tumorales que expresan CLDN6 y no se une a células tumorales que no expresan CLDN6. Preferentemente, un anticuerpo descrito en la presente descripción se une específicamente a CLDN6.

En una modalidad, el anticuerpo descrito en la presente descripción es capaz de unirse a un epítopo localizado dentro de una porción extracelular de CLDN6, en donde dicha porción extracelular de CLDN6 comprende preferentemente la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5, con mayor preferencia la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5. Preferentemente, el anticuerpo es capaz de unirse a un epítopo localizado dentro de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5.

En una modalidad, el anticuerpo es obtenible mediante un método que comprende la etapa de inmunizar un animal con un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5, con mayor preferencia la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 o un péptido inmunológicamente equivalente, o un ácido nucleico o célula huésped que expresa dicho péptido.

En diferentes modalidades, la CLDN6 a la que el anticuerpo es capaz de unirse tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6. Se prefiere, particularmente, que el anticuerpo es capaz de unirse a CLDN6 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 y capaz de unirse a CLDN6 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6.

En modalidades preferidas, un anticuerpo descrito en la presente descripción tiene una o más de las actividades siguientes: (i) muerte de una célula que expresa CLDN6, (ii) inhibición de la proliferación de una célula que expresa CLDN6, (iii) inhibición de la formación de colonias de una célula que expresa CLDN6, y (iv) inhibición de la metástasis de una célula que expresa CLDN6. La muerte de células, la inhibición de la proliferación de células y/o la inhibición de la formación de colonias de células se pueden utilizar terapéuticamente para inhibir el crecimiento tumoral, que incluye detener y/o prevenir el crecimiento tumoral, retrasar el crecimiento tumoral y/o reducir el tamaño de un tumor existente y por lo tanto, se puede utilizar terapéuticamente para tratar o prevenir el cáncer, la metástasis del cáncer y/o la diseminación metastásica de las células cancerosas.

Preferentemente, un anticuerpo descrito en la presente descripción media la muerte de las células mediante la inducción de la lisis mediada por la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC, por sus siglas en inglés), lisis mediada por la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés), apoptosis, adhesión homotípica y/o fagocitosis, preferentemente mediante la inducción de la lisis mediada por CDC y/o lisis mediada por ADCC.

Preferentemente, la lisis de las células mediada por ADCC tiene lugar en presencia de células efectoras, que en modalidades particulares se seleccionan del grupo que consiste en monocitos, células mononucleares, células NK y las PMN, y la fagocitosis es por macrófagos.

La actividad de inhibir o reducir la proliferación de las células que expresan CLDN6, preferentemente, las células cancerosas, puede medirse in vitro mediante la determinación de la proliferación de células cancerosas que expresan CLDN6 en un ensayo que usa bromodesoxiuridina (5-bromo-2-desoxiuridina, BrdU). BrdU es un nucleósido sintético que es un análogo de la timidina y puede incorporarse en el ADN recién sintetizado de las células en replicación (durante la fase S del ciclo celular), mediante la sustitución de la timidina durante la replicación del ADN. La detección del químico incorporado mediante el uso, por ejemplo, de anticuerpos específicos para BrdU indica que las células estuvieron activamente replicando su ADN.

La actividad de inhibir o reducir la formación de colonias de células que expresan CLDN6, preferentemente, células cancerosas, puede medirse in vitro en un ensayo clonogénico. Un ensayo clonogénico es una técnica de microbiología para estudiar la efectividad de agentes específicos en la supervivencia y proliferación de las células. Se usa con frecuencia en los laboratorios de investigación del cáncer para determinar el efecto de los fármacos o la radiación sobre las células tumorales en proliferación. El experimento implica tres etapas principales: (i) aplicar un tratamiento a una muestra de células, en particular células cancerosas, (ii) sembrar las células en un recipiente de cultivo tisular y (iii) dejar las células crecer. Las colonias producidas son fijadas, teñidas y contadas. La formación de colonias es importante con respecto a la formación de metástasis si las células tumorales individuales colonizan los órganos. La actividad inhibidora de los anticuerpos indica su potencial para suprimir la formación de metástasis. Los anticuerpos que tienen la actividad de inhibir o reducir la formación de colonias en un ensayo clonogénico son, particularmente, útiles para tratar o prevenir la metástasis y la diseminación metastásica de células cancerosas, en particular, de los tipos de cáncer mencionados en la presente descripción.

En modalidades preferidas, un anticuerpo descrito en la presente descripción exhibe una o más funciones efectoras inmunes contra una célula portadora de CLDN6 en su conformación nativa, en donde la una o más funciones efectoras inmunes se seleccionan preferentemente, del grupo que consiste en citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), inducción de apoptosis e inhibición de la proliferación, preferentemente, las funciones efectoras son ADCC y/o CDC.

Preferentemente, la inhibición del crecimiento tumoral o funciones efectoras inmunes exhibidas por un anticuerpo descrito en la presente descripción se inducen mediante la unión de dicho anticuerpo a CLDN6, preferentemente, a un epítopo localizado dentro de una porción extracelular de CLDN6, en donde dicha porción extracelular de CLDN6 preferentemente, comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 5, con mayor preferencia la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5.

De acuerdo con la enseñanza, una célula que expresa CLDN6 se caracteriza, preferentemente, por la asociación de CLDN6 con su superficie celular. Una célula que expresa CLDN6 o una célula caracterizada por la asociación de CLDN6 con su superficie celular o que porta CLDN6 en su conformación nativa es preferentemente una célula tumoral, tal como una célula cancerosa, preferentemente una célula cancerosa de un cáncer descrito en la presente descripción.

El anticuerpo descrito en la presente descripción puede unirse a uno o más restos efectores terapéuticos, por ejemplo, radiomarcadores, citotoxinas, enzimas terapéuticas, agentes que inducen apoptosis, para proporcionar citotoxicidad dirigida, es decir, muerte de células tumorales.

En una modalidad, un anticuerpo descrito en la presente descripción (i) se une a células que expresan CLDN6, y (ii) no se une a células que no expresan CLDN6. Un anticuerpo descrito en la presente descripción preferentemente (i) media la muerte y/o inhibe la proliferación de células que expresan CLDN6, y (ii) no media la muerte y/o no inhibe la proliferación de células que no expresan CLDN6.

En una modalidad, un anticuerpo descrito en la presente descripción puede caracterizarse por una o más de las siguientes propiedades:

a) especificidad para CLDN6;

b) una afinidad de unión a CLDN6 de aproximadamente 100 nM o menos, preferentemente, de aproximadamente 5­ 10 nM o menos y, con mayor preferencia, de aproximadamente 1-3 nM o menos;

c) la capacidad de agotar las células tumorales que expresan CLDN6;

d) la capacidad de detener o retardar la proliferación de células tumorales que expresan CLDN6;

e) la capacidad de prolongar la supervivencia de un sujeto que tiene células tumorales que expresan CLDN6.

En una modalidad, un anticuerpo descrito en la presente descripción reduce el crecimiento de las células tumorales y/o induce la muerte de las células tumorales y, por lo tanto, tiene un efecto inhibidor de tumores o destructor de tumores.

Un anticuerpo preferido descrito en la presente descripción es un anticuerpo producido u obtenido a partir de una célula de hibridoma depositada en DSMZ (Inhoffenstr. 7B, 38124 Braunschweig, Alemania) y que tiene una de las siguientes designaciones y números de acceso:

1. GT512muMAB 36A, número de acceso DSM ACC3059, depositado el 13 de abril de 2010;

2. GT512muMAB 27A, número de acceso DSM ACC3058, depositado el 13 de abril de 2010; o

3. GT512muMAB 5F2D2, número de acceso DSM ACC3057, depositado el 13 de abril de 2010.

Los anticuerpos de la enseñanza se designan en la presente descripción mediante la referencia a la designación del anticuerpo y/o mediante la referencia al clon que produce el anticuerpo, por ejemplo, muMAB 36A.

Otros anticuerpos preferidos son los que tienen la especificidad de los anticuerpos producidos y obtenibles a partir de los hibridomas descritos anteriormente y, en particular, los que comprenden una porción de unión al antígeno o sitio de unión al antígeno, en particular, una región variable, idéntica o altamente homóloga al de los anticuerpos producidos y obtenibles a partir de los hibridomas descritos anteriormente. Se contempla que los anticuerpos preferidos son aquellos que tienen las regiones CDR idénticas o altamente homólogas a las regiones de anticuerpos producidos y obtenibles a partir de los hibridomas descritos anteriormente. Por "altamente homólogas" se contempla que de 1 a 5, preferentemente, de 1 a 4, tal como 1 a 3 o 1 o 2 sustituciones pueden hacerse. Los anticuerpos particularmente preferidos son las formas quimerizadas y humanizadas de los anticuerpos producidos y obtenibles a partir de los hibridomas descritos anteriormente.

La presente enseñanza se refiere, además, a una célula tal como una célula de hibridoma que produce un anticuerpo como se describe en la presente descripción.

Las células de hibridoma preferidas son aquellas depositadas en DSMZ (Inhoffenstr. 7B, 38124 Braunschweig, Alemania) y que tienen una de las siguientes designaciones y números de acceso:

1. GT512muMAB 36A, número de acceso Ds M ACC3059, depositado el 13 de abril de 2010;

2. GT512muMAB 27A, número de acceso DSM ACC3058, depositado el 13 de abril de 2010; o

3. GT512muMAB 5F2D2, número de acceso DSM ACC3057, depositado el 13 de abril de 2010.

La presente enseñanza se refiere, además, a los ácidos nucleicos que comprenden los genes o las secuencias de los ácidos nucleicos que codifican anticuerpos o sus partes, por ejemplo, una cadena de anticuerpo, como se describe en la presente descripción. Los ácidos nucleicos pueden comprenderse en un vector, por ejemplo, un plásmido, cósmido, virus, bacteriófago u otro vector usado, por ejemplo, convencionalmente en ingeniería genética. El vector puede comprender otros genes tales como genes marcadores que permiten la selección del vector en una célula huésped adecuada y en condiciones adecuadas. Además, los vectores pueden comprender elementos de control de la expresión que permiten la expresión adecuada de las regiones codificantes en los huéspedes adecuados. Tales elementos de control se conocen por el técnico y pueden incluir un promotor, un casete de empalme y un codón de iniciación de la traducción.

Preferentemente, el ácido nucleico de la enseñanza está unido operativamente a elementos de control de expresión que permiten la expresión en células eucariotas o procariotas. Los elementos de control que aseguran la expresión en las células eucariotas y procariotas se conocen bien por aquellos con experiencia en la materia.

Los métodos para la construcción de las moléculas de ácido nucleico, para la construcción de vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico, para la introducción de los vectores en células huésped apropiadamente seleccionadas, para causar o lograr la expresión de moléculas de ácido nucleico se conocen bien en la técnica.

Un aspecto adicional de la presente enseñanza se refiere a una célula huésped que comprende un ácido nucleico o vector como se describe en la presente descripción.

En un aspecto, la enseñanza proporciona composiciones, por ejemplo, composiciones/estuches farmacéuticos y diagnósticos, que comprenden un anticuerpo o una combinación de anticuerpos descritos en la presente descripción. Una composición farmacéutica de la enseñanza puede comprender un portador farmacéuticamente aceptable y opcionalmente, comprender uno o más adyuvantes, estabilizantes, etc. En una modalidad particular, la composición incluye una combinación de anticuerpos que se unen a epítopos distintos o que poseen características funcionales distintas, tales como inducción de CDC y/o ADCC.

En una modalidad, la composición farmacéutica de la presente enseñanza es una vacuna antitumoral terapéutica o profiláctica.

En un aspecto, la enseñanza proporciona métodos terapéuticos y profilácticos para tratar a un paciente que tiene una enfermedad tumoral o que está en riesgo de desarrollar una enfermedad tumoral. En un aspecto, la enseñanza proporciona métodos para inhibir el crecimiento tumoral. En un aspecto, la enseñanza proporciona métodos para inducir la muerte de la célula tumoral. Estos aspectos pueden implicar la administración de los anticuerpos o composiciones descritos en la presente descripción a un paciente.

La presente enseñanza incluye, además, la administración simultánea o secuencial de dos o más anticuerpos anti-CLDN6, en donde preferentemente al menos uno de dichos anticuerpos es un anticuerpo anti-CLDN6 quimérico y al menos otro anticuerpo es un anticuerpo anti-CLDN6 humano, los anticuerpos se unen a epítopos de CLDN6 similares o diferentes. Preferentemente, un anticuerpo quimérico CLDN6 de la enseñanza se administra primero seguido de la administración de un anticuerpo anti-CLDN6 humano, en donde el anticuerpo anti-CLDN6 humano se administra, preferentemente, durante un período prolongado de tiempo, es decir, como terapia de mantenimiento.

Un anticuerpo o una composición descritos en la presente descripción pueden usarse en una variedad de métodos para inhibir el crecimiento de células tumorales que expresan CLDN6 y/o matar selectivamente células tumorales que expresan CLDN6 y así inhibir el crecimiento tumoral al poner en contacto las células con una cantidad eficaz del anticuerpo o composición, de manera que se inhibe el crecimiento de la célula y/o se muere la célula. En una modalidad, el método incluye la muerte de la célula tumoral que expresa CLDN6, opcionalmente en presencia de las células efectoras, por ejemplo, mediante CDC, apoptosis, ADCC, fagocitosis o mediante una combinación de dos o más de estos mecanismos.

Un anticuerpo o una composición descritos en la presente descripción pueden usarse para tratar y/o prevenir enfermedades tumorales que implican células que expresan CLDN6 al administrar el anticuerpo o composición a pacientes que padecen o están en riesgo de desarrollar tales enfermedades.

La enseñanza puede implicar un tratamiento profiláctico y/o terapéutico de enfermedades tumorales, es decir, para tratar a un paciente que tiene una enfermedad tumoral o que está en riesgo de desarrollar una enfermedad tumoral. En un aspecto, la enseñanza proporciona los métodos para inhibir el crecimiento tumoral que comprende la administración de uno o más de los anticuerpos y composiciones descritas en la presente descripción.

Preferentemente, los anticuerpos y composiciones descritas en la presente descripción se administran de manera que la sustancia terapéuticamente activa, en particular el anticuerpo, no se suministra o no se suministra esencialmente a un tejido u órgano en donde las células cuando el tejido u órgano están libre de tumores expresan CLDN6 tal como el tejido placentario o la placenta. Para este fin, los agentes y composiciones descritos en la presente descripción pueden administrarse localmente.

En un aspecto, la enseñanza proporciona un anticuerpo como se describe en la presente descripción para uso en los métodos de tratamiento descritos en la presente descripción. En una modalidad, la enseñanza proporciona una composición farmacéutica como se describe en la presente descripción para su uso en los métodos de tratamiento descritos en la presente descripción.

Los tratamientos descritos en la presente descripción pueden combinarse con resección quirúrgica y/o radiación y/o quimioterapia tradicional.

Otras características y ventajas de la presente enseñanza serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones.

Descripción detallada

A lo largo de esta descripción y de las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto lo requiera de otra manera, la palabra “comprender”, y variaciones tales como “comprende” y “que comprende”, se entenderá que implican la inclusión de un miembro declarado, entero o etapa o grupo de miembros, enteros o etapas pero no la exclusión de ningún otro miembro, entero o etapa o grupo de miembros, enteros o etapas aunque en algunas modalidades tal otro miembro entero, o etapa o grupo de miembros, enteros o etapas pueden excluirse, es decir, el tema consiste en la inclusión de un miembro declarado, entero o etapa o grupo de miembros, enteros o etapas. Los términos "un" y "una" y "el/la" y referentes similares usados en el contexto para describir la enseñanza (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) deben interpretarse para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique de cualquier otra manera en la presente descripción, o claramente se contradiga por el contexto. La enumeración de los intervalos de valores en la presente descripción pretende servir simplemente como un método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que se encuentra dentro del intervalo. A menos que se indique de cualquier otra manera en la presente descripción, cada valor individual se entiende como si se enumerara individualmente en la presente descripción. Todos los métodos que se describen en la presente descripción pueden llevarse a cabo en cualquier orden adecuado a menos que se indique de otra manera en la presente descripción o que el contexto lo contradiga claramente de otra manera. El uso de cualquiera y de todos los ejemplos, o de lenguaje ilustrativo (por ejemplo, “tal como”) que se proporciona en la presente descripción, sólo tiene la intención de ilustrar mejor la enseñanza y no plantea una limitación en el alcance de la invención a menos que se reivindique de cualquier otra manera. El lenguaje en la descripción no deberá interpretarse como indicación de cualquier elemento no reivindicado esencial para la práctica de la invención.

Las claudinas son una familia de proteínas que son los componentes más importantes de las uniones estrechas, donde establecen la barrera paracelular que controla el flujo de moléculas en el espacio intercelular entre las células de un epitelio. Las claudinas son proteínas transmembranas que se extienden por la membrana 4 veces con el extremo N-terminal y el extremo C-terminal, ambos localizados en el citoplasma. El primer bucle extracelular consiste en promedio de 53 aminoácidos y el segundo de alrededor de 24 aminoácidos. CLDN6 y CLDN9 son los miembros de más similitud en la familia CLDN.

El término "CLDN" como se usa en la presente descripción significa claudina e incluye CLDN6, CLDN9, CLDN4 y CLDN3. Preferentemente, una CLDN es una CLDN humana.

El término "CLDN6" se refiere, preferentemente, a la CLDN6 humana, y, en particular, a una proteína que comprende (i) una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de ácidos nucleicos, y/o (ii) la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 6 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos. El primer bucle extracelular de CLDN6 comprende, preferentemente, los aminoácidos 28 a 80, con mayor preferencia los aminoácidos 28 a 76 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6, tal como la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3. El segundo bucle extracelular de CLDN6 comprende, preferentemente, los aminoácidos 138 a 160, preferentemente, los aminoácidos 141 a 159, con mayor preferencia los aminoácidos 145 a 157 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 6, tal como la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5. Dicho primer y/o segundo bucles extracelulares forman, preferentemente, la porción extracelular de CLDN6.

El término "CLDN9" preferentemente se refiere a CLDN9 humana, y, en particular, a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 7 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos. El primer bucle extracelular de CLDN9 comprende, preferentemente, los aminoácidos 28 a 76 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 7. El segundo bucle extracelular de CLDN9 comprende, preferentemente, los aminoácidos 141 a 159 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 7. Dicho primer y/o segundo bucles extracelulares forman, preferentemente, la porción extracelular de CLDN9.

El término "CLDN4" preferentemente se refiere a CLDN4 humana, y, en particular, a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 8 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos. El primer bucle extracelular de CLDN4 comprende, preferentemente, los aminoácidos 28 a 76 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 8. El segundo bucle extracelular de CLDN4 comprende, preferentemente, los aminoácidos 141 a 159 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 8. Dicho primer y/o segundo bucles extracelulares forman, preferentemente, la porción extracelular de CLDN4.

El término "CLDN3" preferentemente se refiere a CLDN3 humana, y, en particular, a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 9 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos. El primer bucle extracelular de CLDN3 comprende, preferentemente, los aminoácidos 27 a 75 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 9. El segundo bucle extracelular de CLDN3 comprende, preferentemente, los aminoácidos 140 a 158 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 9. Dicho primer y/o segundo bucles extracelulares forman, preferentemente, la porción extracelular de CLDN3.

Las secuencias de CLDN descritas anteriormente incluyen cualquiera de las variantes de dichas secuencias, en particular mutantes, variantes de empalme, conformaciones, isoformas, variantes alélicas, variantes de especies y homólogos de especies, en particular las que se presentan de manera natural. Una variante alélica se refiere a una alteración en la secuencia normal de un gen, cuya relevancia frecuentemente no está clara. La secuenciación génica completa a menudo identifica numerosas variantes alélicas para un gen determinado. Un homólogo de especie es una secuencia de ácido nucleico o aminoácido con una especie de origen diferente de una secuencia determinada de un ácido nucleico o aminoácido. El término "CLDN" abarcará (i) variantes de empalme de CLDN, (ii) variantes modificadas postransduccionalmente de CLDN, que incluyen particularmente variantes con diferente glicosilación tal como estado de N-glucosilación, (iii) variantes de conformación de CLDN, (iv) variantes de CLDN relacionadas con el cáncer y no relacionadas con el cáncer. Preferentemente, una CLDN se presenta en su conformación nativa.

El término "porción" se refiere a una fracción. Con respecto a una estructura particular tal como una secuencia de aminoácidos o proteína, el término "porción" de esta puede designar una fracción continua o discontinua de dicha estructura. Preferentemente, una porción de una secuencia de aminoácidos comprende al menos 1 %, al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, preferentemente al menos 40 %, preferentemente al menos 50 %, más preferentemente al menos 60 %, más preferentemente al menos 70 %, incluso con mayor preferencia al menos 80 %, y con la máxima preferencia al menos 90 % de los aminoácidos de dicha secuencia de aminoácidos. Preferentemente, si la porción es una fracción discontinua, dicha fracción discontinua está compuesta de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más partes de una estructura, siendo cada parte un elemento continuo de la estructura. Por ejemplo, una fracción discontinua de una secuencia de aminoácidos puede conformarse de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más, preferentemente, no más de 4 partes de dicha secuencia de aminoácidos, en donde cada parte comprende, preferentemente, al menos 5 aminoácidos continuos, al menos 10 aminoácidos continuos, preferentemente, al menos 20 aminoácidos continuos, preferentemente al menos 30 aminoácidos continuos de la secuencia de aminoácidos.

Los términos "parte" y "fragmento" se usan indistintamente en la presente descripción y se refieren a un elemento continuo. Por ejemplo, una parte de una estructura tal como una secuencia de aminoácidos o proteína se refiere a un elemento continuo de dicha estructura. Una porción, una parte o un fragmento de una estructura, preferentemente, comprende una o más propiedades funcionales de dicha estructura. Por ejemplo, una porción, una parte o un fragmento de un epítopo o péptido es, preferentemente, equivalente inmunológicamente al epítopo o péptido del que se deriva.

El término "una porción extracelular de una CLDN" en el contexto de la presente enseñanza se refiere a una parte de una CLDN que se enfrenta al espacio extracelular de una célula y que es, preferentemente, accesible desde el exterior de dicha célula, por ejemplo, por anticuerpos localizados externos a la célula. Preferentemente, el término se refiere a uno o más bucles extracelulares o una parte de estos o cualquier otra parte extracelular de una CLDN que es, preferentemente, específico para dicha CLDN. Preferentemente, dicha parte comprende al menos 5, al menos 8, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 30, o al menos 50 aminoácidos o más.

De acuerdo con la enseñanza, una CLDN expresada por una célula se asocia preferentemente con la superficie de dicha célula. El término "CLDN asociada con la superficie de una célula" significa que la CLDN se asocia y localiza en la membrana plasmática de dicha célula, en donde al menos una parte de la CLDN, preferentemente la porción extracelular, se enfrenta al espacio extracelular de dicha célula y es accesible desde el exterior de dicha célula, por ejemplo, por anticuerpos localizados fuera de la célula. La asociación puede ser directa o indirecta. Por ejemplo, la asociación puede ser por uno o más dominios transmembrana, uno o más anclajes lipídicos, y/o por la interacción con cualquier otra proteína, lípido, sacárido u otra estructura que pueda encontrarse en la capa externa de la membrana plasmática de una célula. Por ejemplo, una CLDN asociada con la superficie de una célula puede ser una proteína transmembrana, es decir, una proteína integral de membrana, que tiene una porción extracelular o puede ser una proteína asociada a la superficie de una célula mediante la interacción con otra proteína que es una proteína de transmembrana.

CLDN6 se asocia con la superficie de una célula si se localiza en la superficie de dicha célula y es accesible a la unión con los anticuerpos específicos de CLDN6 adicionados a la célula. Debe entenderse que en el caso donde la CLDN6 se expresa por células, la CLDN6 asociada con la superficie de dichas células puede ser solo una porción de la CLDN6 expresada.

El término "una célula que porta una CLDN" significa, preferentemente, que dicha célula porta una CLDN en su superficie, es decir, que la CLDN se asocia con la superficie de dicha célula.

"Superficie celular" o "superficie de una célula" se usa de acuerdo con su significado normal en la materia, y por lo tanto, incluye el exterior de la célula que es accesible a la unión por las proteínas y otras moléculas.

La expresión "CLDN expresada en la superficie de una célula" significa que la CLDN expresada por una célula se encuentra en asociación con la superficie de dicha célula.

De acuerdo con la enseñanza, la CLDN6 no se expresa esencialmente en una célula y no se asocia esencialmente con una superficie celular si el nivel de expresión y asociación es inferior en comparación con la expresión y asociación en las células de la placenta o tejido placentario. Preferentemente, el nivel de expresión y asociación es inferior al 10 %, preferentemente, inferior al 5 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 % o 0,05 % de la expresión y asociación en las células de la placenta o tejido placentario o incluso inferior. Preferentemente, la CLDN6 no se expresa esencialmente en una célula y no se asocia esencialmente con una superficie celular si el nivel de expresión y asociación excede el nivel de expresión y asociación en el tejido no tumoral, no cancerígeno distinto al tejido placentario en no más de 2 veces, preferentemente, 1,5 veces, y preferentemente, no excede el nivel de expresión y asociación en dicho tejido no tumoral, no cancerígeno. Preferentemente, la CLDN6 no se expresa esencialmente en una célula y no se asocia esencialmente con una superficie celular si el nivel de expresión o asociación está por debajo del límite de detección y/o si el nivel de expresión o asociación es demasiado bajo para permitir la unión con los anticuerpos específicos a CLDN6 adicionados a las células.

De acuerdo con la enseñanza, la CLDN6 se expresa en una célula y se asocia con una superficie celular si el nivel de expresión y asociación excede el nivel de expresión y asociación en el tejido no tumoral, tejido no canceroso distinto del tejido placentario, preferentemente, en más de 2 veces, preferentemente, 10 veces, 100 veces, 1000 veces o 10 000 veces. Preferentemente, la CLDN6 se expresa en una célula y se asocia con una superficie celular si el nivel de expresión y asociación está por encima del límite de detección y/o si el nivel de expresión y asociación es suficientemente alto para permitir la unión con los anticuerpos específicos a CLDN6 adicionados a las células. Preferentemente, la CLDN6 expresada en una célula se expresa o expone en la superficie de dicha célula.

El término "balsa" se refiere a los microdominios de membrana ricos en esfingolípidos y colesterol localizados en el área de la capa exterior de la membrana plasmática de una célula. La capacidad de ciertas proteínas para asociarse dentro de tales dominios y su capacidad para formar "agregados" o "agregados focales" puede afectar la función de la proteína. Por ejemplo, la translocación de moléculas de CLDN6 en tales estructuras, después de unirse a los anticuerpos de la presente enseñanza, crea una alta densidad de complejos de antígeno CLDN6-anticuerpo en las membranas plasmáticas. Tal alta densidad de complejos antígeno CLD6 anticuerpo puede permitir la activación eficiente del sistema del complemento durante la CDC.

El término "anticuerpo" se refiere a una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) que se interconectan por enlaces disulfuro, e incluye cualquier molécula que comprende una porción de unión al antígeno de este. El término "anticuerpo" incluye los anticuerpos monoclonales y fragmentos o derivados de estos, que incluyen, sin limitación, anticuerpos monoclonales humanos, anticuerpos monoclonales humanizados, anticuerpos monoclonales quiméricos, anticuerpos monocatenarios, por ejemplo, fragmentos de anticuerpos de scFv y unidos a antígenos tales como fragmentos Fab y Fab' e incluye, además, todas las formas recombinantes de anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos expresados en procariotas, anticuerpos no glicosilados, y cualquiera de los fragmentos de anticuerpo de unión al antígeno y derivados como se describen en la presente descripción. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente descripción como VH) y una región constante de cadena pesada. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente descripción como VL) y una región constante de cadena ligera. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro Fr , dispuestas desde el extremo amino terminal al extremo carboxilo terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del huésped, que incluyen varias células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y al primer componente (Clq) del sistema clásico del complemento.

El término "anticuerpo humanizado" se refiere a una molécula que tiene un sitio de unión a antígeno que se deriva sustancialmente de una inmunoglobulina de una especie no humana, en donde la estructura remanente de la inmunoglobulina de la molécula se basa en la estructura y/o la secuencia de una inmunoglobulina humana. El sitio de unión a antígeno puede comprender tanto dominios variables completos fusionados a dominios constantes como solo las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) injertadas en las regiones marco apropiadas en los dominios variables. Los sitios de unión a antígeno pueden ser de tipo silvestre o modificados por una o más sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, modificados para parecerse más a las inmunoglobulinas humanas. Algunas formas de anticuerpos humanizados conservan todas las secuencias CDR (por ejemplo, un anticuerpo de ratón humanizado que contiene las seis CDR del anticuerpo de ratón). Otras formas tienen una o más CDR que se alteran con respecto al anticuerpo original.

El término "anticuerpo quimérico" se refiere a aquellos anticuerpos en donde una porción de cada una de las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras es homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase particular, mientras que el segmento remanente de la cadena es homólogo a secuencias correspondientes en otro. Típicamente, la región variable de ambas cadenas ligera y pesada mimetiza las regiones variables de los anticuerpos derivados de una especie de mamíferos, mientras que las porciones constantes son homólogas a las secuencias de anticuerpos derivados de otra. Una clara ventaja de tales formas quiméricas es que la región variable puede derivarse convenientemente de fuentes actualmente conocidas mediante el uso de células B fácilmente disponibles o hibridomas de organismos huéspedes no humanos en combinación con las regiones constantes que se derivan de, por ejemplo, preparaciones de células humanas. Mientras que la región variable tiene la ventaja de ser fácil de preparar y que la fuente no afecta a la especificidad, la región constante que es humana, es menos probable que genere una respuesta inmunitaria de un sujeto humano cuando se inyectan los anticuerpos que si la región constante fuera de una fuente no humana. Sin embargo, la definición no se limita a este ejemplo particular.

El término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de unión") se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno. Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede llevarse a cabo por los fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) fragmentos Fab, fragmentos monovalentes que consisten en los dominios VL, VH, CL y CH; (ii) fragmentos F(ab')², fragmentos bivalentes que comprenden dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra, (iii) fragmentos Fd que consisten en los dominios VH y CH; (iv) fragmentos Fv que consisten en los dominios VL y VH de un brazo único de un anticuerpo, (v) fragmentos dAb (Ward y otros, (1989) Nature 341: 544-546), que consisten en un dominio VH; (vi) regiones aisladas determinantes de la complementariedad (CDR), y (vii) combinaciones de dos o más CDR aisladas que pueden estar opcionalmente unidas por un conector sintético. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y Vh , se codifican por genes separados, ellos pueden unirse, mediante el uso de métodos recombinantes, por un conector sintético que les permite hacerlos como una proteína de cadena única en la que las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena única (scFv); ver por ejemplo, Bird y otros (1988) Science 242: 423-426; y Huston y otros (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). También se pretende que dichos anticuerpos de cadena sencilla se abarquen dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. Un ejemplo adicional son las proteínas de fusión de inmunoglobulina de dominio de unión que comprenden (i) un polipéptido de dominio de unión que se fusiona a un polipéptido de la región bisagra de la inmunoglobulina, (ii) una región constante CH2 de la cadena pesada de la inmunoglobulina que se fusiona a la región bisagra y (iii) una región constante CH3 de la cadena pesada de la inmunoglobulina que se fusiona a la región constante CH2. El polipéptido del dominio de unión puede ser una región variable de la cadena pesada o una región variable de la cadena ligera. Las proteínas de fusión de inmunoglobulina de dominio de unión se describen además en los documentos núms. US 2003/0118592 y US 2003/0133939. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen mediante el uso de técnicas convencionales que conocen los expertos en la técnica, y se seleccionan los fragmentos para la utilidad de la misma manera que a los anticuerpos intactos.

Los anticuerpos descritos en la presente descripción son útiles para la inmunoterapia pasiva antitumoral, y pueden o no estar unidos a restos efectores terapéuticos, por ejemplo, radiomarcadores, quimioterapéuticos como cisplatino, metotrexato, adriamicina, adecuados para la terapia contra el cáncer, citotoxinas, enzimas terapéuticas, agentes que inducen apoptosis, con el fin de proporcionar citotoxicidad dirigida, es decir, la muerte de las células tumorales.

Preferentemente, los anticuerpos descritos en la presente descripción median la muerte de las células mediante la inducción de la lisis mediada por la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), lisis mediada por la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC), apoptosis, adhesión homotípica y/o fagocitosis, preferentemente mediante la inducción de la lisis mediada por CDC y/o lisis mediada por ADCC. Los anticuerpos descritos en la presente descripción interactúan preferentemente con componentes del sistema inmune, preferentemente a través de ADCC o CDC. Por ejemplo, los anticuerpos de la enseñanza pueden ejercer, además, un efecto simplemente de unión a antígenos tumorales en la superficie celular, por lo tanto, por ejemplo, al bloquear la proliferación de las células.

La ADCC describe la capacidad de muerte celular de las células efectoras,como se describe en la presente descripción, en particular linfocitos, que requieren preferentemente, que la célula diana esté marcada por un anticuerpo.

La ADCC ocurre preferentemente cuando los anticuerpos se unen a los antígenos en las células tumorales y los dominios Fc del anticuerpo se enlazan con los receptores Fc (FcR) en la superficie de las células efectoras inmunitarias. Se han identificado varias familias de receptores de Fc, y las poblaciones celulares específicas que expresan de manera característica los receptores definidos de Fc. La ADCC puede verse como un mecanismo para inducir directamente un grado variable de destrucción tumoral inmediata que conduce, además, a la presentación del antígeno y a la inducción de respuestas de células T dirigidas al tumor. Preferentemente, la inducción in vivo de la ADCC conducirá a respuestas de células T dirigidas a los tumores y a respuestas de anticuerpos derivadas del huésped.

La CDC es otro método de destrucción celular que puede ser dirigido por anticuerpos. La IgM es el isotipo más efectivo para la activación del complemento. Además, las IgG1 e IgG3 son ambas muy efectivas para dirigir la CDC a través de la vía clásica de activación del complemento. Preferentemente, en esta cascada, la formación de complejos antígenoanticuerpo resulta en el desbloqueo de múltiples sitios de unión a C1q en estrecha proximidad en los dominios Ch2 de las moléculas de anticuerpos participantes, tales como las moléculas IgG (C1q es uno de los tres subcomponentes del complemento C1). Preferentemente, estos desbloqueo de los sitios de unión a C1q convierten la interacción C1q-IgG, previamente de baja afinidad, en una de alta avidez, que desencadena una cascada de eventos que involucran una serie de otras proteínas del complemento y que conduce a la liberación proteolítica de los agentes quimiotácticos/activadores de las células efectoras, C3a y C5a. Preferentemente, la cascada del complemento termina en la formación de un complejo de ataque a la membrana, que crea poros en la membrana celular que facilitan el paso libre de agua y solutos dentro y fuera de la célula, y pueden conducir a la apoptosis. El término "anticuerpo" incluye "moléculas biespecíficas", es decir, moléculas que tienen dos especificidades de unión diferentes. Por ejemplo, la molécula puede unirse o interactuar con (a) un antígeno de superficie celular, y (b) un receptor de Fc en la superficie de una célula efectora. El término "anticuerpo" también incluye "moléculas multiespecíficas" o "moléculas heteroespecíficas", es decir, moléculas que tienen más de dos especificidades de unión diferentes. Por ejemplo, la molécula puede unirse o interactuar con (a) un antígeno de superficie celular, (b) un receptor de Fc en la superficie de una célula efectora, y (c) al menos otro componente. En consecuencia, la enseñanza incluye, pero no se limita a, moléculas biespecíficas, triespecíficas, tetraespecíficas y otras multiespecíficas que se dirigen a CLDN6, y a otras dianas, tales como receptores de Fc en las células efectoras. El término "anticuerpo" también incluye "anticuerpos biespecíficos" que también incluyen diacuerpos. Los diacuerpos son bivalentes, anticuerpos biespecíficos, en los cuales los dominios VH y VL se expresan en una cadena polipeptídica única, pero mediante el uso de un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, lo que fuerza, de ese modo, a los dominios aparearse con dominios complementarios de otra cadena y crea dos sitios de unión al antígeno (véase, por ejemplo, Holliger, P., y otros (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., y otros (1994) Structure 2: 1121-1123).

El término "anticuerpo" también incluye "heteroanticuerpos" cuyo témino se refiere a dos o más anticuerpos, derivados de los mismos, o regiones de unión al antígeno enlazadas entre sí, al menos dos de las cuales tienen especificidades diferentes. Estas diferentes especificidades incluyen una especificidad de unión por un receptor de Fc en una célula efectora, y una especificidad de unión por un antígeno o epítopo en una célula diana, por ejemplo, una célula tumoral.

"Célula diana" se entenderá cualquier célula indeseable en un sujeto (por ejemplo, un humano o animal) que pueda ser diana de un anticuerpo de la enseñanza. En modalidades preferidas, la célula diana es una célula que expresa CLDN6. Las células que expresan CLDN6 típicamente incluyen las células tumorales.

Como se usa en la presente descripción, el término "célula efectora" se refiere a una célula inmune que está implicada en la fase efectora de una respuesta inmune, a diferencia de las fases cognitiva y de activación de una respuesta inmune. Las células inmunes ilustrativas incluyen células de origen mieloide o linfoide, por ejemplo, linfocitos (por ejemplo, células B y células T que incluyen células T citolíticas (linfocitos T citotóxicos; CTL), células asesinas, células asesinas naturales, macrófagos, monocitos, eosinófilos, neutrófilos, células polimorfonucleares, granulocitos, mastocitos y basófilos. Algunas células efectoras expresan receptores Fc específicos y llevan a cabo funciones inmunes específicas. En modalidades preferidas, una célula efectora es capaz de inducir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), por ejemplo, un neutrófilo capaz de inducir ADCC. Por ejemplo, los monocitos, los macrófagos, que expresan FcR están involucrados en la muerte específica de las células diana y la presentación de antígenos a otros componentes del sistema inmune, o en la unión a las células que presentan antígenos. En otras modalidades, una célula efectora puede fagocitar un antígeno diana, célula diana o microorganismo. La expresión de un FcR particular en una célula efectora puede ser regulada por factores humorales tales como las citocinas. Por ejemplo, se ha encontrado que la expresión de Fc-gammaRI está regulada positivamente por interferón gamma (IFN-y). Esta expresión mejorada aumenta la actividad citotóxica de las células portadoras de Fc-gammaRI contra las dianas. Una célula efectora puede fagocitar o lisar un antígeno diana o una célula diana.

Los anticuerpos descritos en la presente descripción pueden ser anticuerpos humanos. El término "anticuerpo humano", como se usa en la presente descripción, pretende incluir los anticuerpos que tienen regiones variables y constantes que se derivan de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la enseñanza pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o sitio-específica in vitro o por mutación somática in vivo).

Los anticuerpos descritos en la presente descripción pueden ser anticuerpos monoclonales. El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente descripción se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Un anticuerpo monoclonal muestra una única especificidad de unión y afinidad para un epítopo particular. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales se producen mediante un hibridoma que incluye una célula B que se obtiene de un animal no humano, por ejemplo, un ratón, que se fusiona a una célula inmortalizada.

Los anticuerpos descritos en la presente descripción pueden ser anticuerpos recombinantes. El término "anticuerpo recombinante", como se usa en la presente descripción, incluye todos los anticuerpos que se preparan, se expresan, se crean o se aíslan por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos que se aíslan de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico con respecto a los genes de inmunoglobulina o un hibridoma que se prepara a partir de estos, (b) anticuerpos que se aíslan de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo, de un transfectoma, (c) anticuerpos que se aíslan de una biblioteca recombinante, combinatoria, de anticuerpos y (d) anticuerpos que se preparan, se expresan, se crean o se aíslan por cualquier otro medio que involucre el empalme de secuencias génicas de la inmunoglobulina a otras secuencias de ADN.

El término "transfectoma", como se usa en la presente descripción, incluye células huésped eucariotas recombinantes que expresan un anticuerpo, tales como células CHO, células NS/0, células HEK293, células HEK293T, células vegetales, u hongos, que incluyen células de levadura.

Como se usa en la presente descripción, un "anticuerpo heterólogo" se define en relación con un organismo transgénico que produce tal anticuerpo. Este término se refiere a un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácido nucleico codificante que corresponde a la que se encuentra en un organismo que no es el organismo transgénico, y que generalmente se deriva de una especie distinta a la del organismo transgénico.

Como se usa en la presente descripción, un "anticuerpo heterohíbrido" se refiere aun anticuerpo que tiene cadenas ligeras y pesadas de diferentes organismos de origen. Por ejemplo, un anticuerpo que tiene una cadena pesada humana asociada con una cadena ligera murina es un anticuerpo heterohíbrido.

La enseñanza incluye todos los anticuerpos y derivados de anticuerpos como se describen en la presente descripción que, para los fines de la enseñanza, se abarcan por el término "anticuerpo". El término "derivados de anticuerpos" se refiere a cualquier forma modificada de un anticuerpo, por ejemplo, un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo.

Los anticuerpos descritos en la presente descripción son, preferentemente, aislados. Un "anticuerpo aislado", como se usa en la presente descripción, pretende referirse a un anticuerpo que está esencialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a CLDN6, está esencialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de CLDN6). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a un epítopo, isoforma o variante de CLDN6 humana puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, por ejemplo, de otras especies (por ejemplo, homólogos de especies de CLDN6). Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o químicos. En una modalidad de la enseñanza, una combinación de anticuerpos monoclonales "aislados" se refiere a los anticuerpos que tienen especificidades diferentes y que se combinan en una composición bien definida.

De acuerdo con la presente enseñanza, un anticuerpo es capaz de unirse a una diana predeterminada si tiene una afinidad significativa por dicha diana predeterminada y se une a dicha diana predeterminada en ensayos estándar. La "afinidad" o "afinidad de unión" a menudo se mide por la constante de disociación en equilibrio (K^d). Preferentemente, el término "afinidad significativa" se refiere a la unión a una diana predeterminada con una constante de disociación (K^d) of 10^-5 M o inferior, 10^-6 M o inferior, 10^-7 M o inferior, 10^-8 M o inferior, 10^-9 M o inferior, 10^-10 M o inferior, 10^-11 o inferior.

Un anticuerpo no es (esencialmente) capaz de unirse a un objetivo si no tiene una afinidad significativa por dicho objetivo y no se une significativamente a dicho objetivo con ensayos estándar. Preferentemente, un anticuerpo no es (esencialmente) capaz de unirse a un objetivo si no se une de manera detectable a dicho objetivo en un análisis por citometría de flujo (análisis FACS) en donde se determina la unión de dicho anticuerpo a dicho objetivo expresado en la superficie de células intactas. Preferentemente, el anticuerpo no se une de manera detectable a dicha diana si está presente en una concentración de hasta 2, preferentemente 10, con mayor preferencia 20, en particular 50 o 100 pg/ml o superior. Preferentemente, un anticuerpo no tiene afinidad significativa por una diana si se une a dicha diana con una K^d que es al menos 10 veces, 100 veces, 10³-veces, 10⁴-veces, 10⁵-veces, o 10⁶-veces mayor que la K^d para unirse a la diana predeterminada a la cual el anticuerpo es capaz de unirse. Por ejemplo, si la K^d para la unión de un anticuerpo a la diana a la cual el anticuerpo es capaz de unirse es 10^-7 M, la K^d para unirse a una diana para la cual el anticuerpo no tiene afinidad significativa sería de al menos 10^-6 M, 10^-5 M, 10^-4 M, 10^-3 M, 10^-2 M, o 10^-1 M.

Un anticuerpo de acuerdo con la presente enseñanza es preferentemente capaz de unirse específicamente a una diana predeterminada, en particular CLDN6.

Un anticuerpo es específico para una diana predeterminada si es capaz de unirse a dicha diana predeterminada mientras que no es capaz de unirse a otras dianas, es decir, no tiene afinidad significativa por otras dianas y no se une significativamente a otras dianas en ensayos estándar. De acuerdo con la enseñanza, un anticuerpo es específico para CLDN6 si es capaz de unirse a CLDN6 pero no (esencialmente) es capaz de unirse a otras dianas, en particular a proteínas claudina distintas de CLDN6 tales como CLDN9, CLDN4, CLDN3 y CLDN1. Preferentemente, un anticuerpo es específico a CLDN6 si la afinidad y la unión a una proteína claudina distinta a CLDN6 tales como CLDN9, CLDN4, CLDN3 y CLDN1 no excede significativamente la afinidad o unión a proteínas no relacionadas a claudina tales como albúmina sérica bovina (BSA), caseína, albúmina sérica humana (HSA) o proteínas transmembrana que no son claudinas, tales como moléculas de MHC o receptor de transferrina o cualquier otro polipéptido especificado. Preferentemente, un agente es específico para una diana predeterminada si se une a dicha diana con una K^d que es al menos 10 veces, 100 veces, 10³ veces, 10⁴ veces, 10⁵ veces, o 10⁶ veces menor que la K^d de unión a una diana para la que no es específico. Por ejemplo, si la K^d para la unión de un anticuerpo a la diana para la cual es específico es 10^-7 M, la K^d para unirse a una diana para la cual no es específico sería de al menos 10^-6 M, 10^-5 M, 10^-4 M, 10^-3 M, 10^-2 M, o 10^-1 M.

La unión de un anticuerpo a una diana puede determinarse experimentalmente mediante el uso de cualquier método adecuado; ver, por ejemplo, Berzofsky y otros, "Antibody-Antigen Interactions" en Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press Nueva York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman y Company Nueva York, N Y (1992), y los métodos que se describen en la presente descripción. Las afinidades pueden determinarse fácilmente mediante el uso de técnicas convencionales, tales como la diálisis de equilibrio; mediante el uso del instrumento BIAcore 2000, mediante el uso de procedimientos generales delineados por el fabricante; por radioinmunoensayo mediante el uso del antígeno diana radiomarcado; o por otro método conocido por el experto en la materia. Los datos de afinidad pueden analizarse, por ejemplo, mediante el método de Scatchard y otros, Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949). La afinidad que se mide a una interacción particular antígeno anticuerpo puede variar si se mide bajo condiciones diferentes, por ejemplo, concentración de sal, pH. Por lo tanto, las mediciones de la afinidad y otros parámetros de unión al antígeno, por ejemplo, K^d, IC⁵⁰, se llevan a cabo preferentemente, con las soluciones estandarizadas de anticuerpo y antígeno, y un tampón estandarizado.

Como se usa en la presente descripción, “isotipo” se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o IgG1) codificada por los genes de la región constante de la cadena pesada. Los anticuerpos de acuerdo con la enseñanza incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales e incluyen anticuerpos IgG2a (por ejemplo, IgG2a, k, A), IgG2b (por ejemplo, IgG2b, k, A), IgG3 (por ejemplo, IgG3, k, A) e IgM. Sin embargo, otros isotipos de anticuerpos, que se abarcan, además, por la enseñanza incluyen anticuerpos IgG1, IgA1, IgA2, IgA secretora, IgD e IgE.

Como se usa en la presente descripción, "cambio de isotipo" se refiere al fenómeno por el cual la clase, o isotipo, de un anticuerpo cambia de una clase de Ig a una de las otras clases de Ig.

El término "presente de manera natural" como se usa en la presente descripción como se aplica a un objeto se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de un polipéptido o polinucleótido que está presente en un organismo (incluidos los virus) que puede aislarse a partir de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio, está presente de manera natural.

El término "reordenado" como se usa en la presente descripción se refiere a una configuración de un locus de inmunoglobulina de cadena pesada o cadena ligera en donde un segmento V está ubicado inmediatamente adyacente a un segmento D-J o J en una conformación que codifica esencialmente un dominio completo VH o VL, respectivamente. Un locus del gen de la inmunoglobulina (anticuerpo) reordenado puede identificarse por comparación con el ADN de la línea germinal; un locus reordenado tendrá al menos un elemento de homología de heptámero/nonámero recombinado.

El término "no reordenado" o "configuración de línea germinal" como se usa en la presente descripción en referencia a un segmento V se refiere a la configuración en donde el segmento V no se recombina para estar inmediatamente adyacente a un segmento D o J.

De acuerdo con la enseñanza, los anticuerpos pueden derivarse de especies diferentes, que incluyen, pero no se limitan a, ratón, rata, conejo, cobayo y humano. Los anticuerpos también incluyen moléculas quiméricas en las que una región constante del anticuerpo derivada de una especie, preferentemente humana, se combina con el sitio de unión al antígeno derivado de otra especie. Además, los anticuerpos incluyen moléculas humanizadas en las que los sitios de unión al antígeno de un anticuerpo derivado de una especie no humana se combinan con las regiones constantes y marco de origen humano.

Los anticuerpos pueden producirse mediante una variedad de técnicas, que incluyen la metodología convencional del anticuerpo monoclonal, por ejemplo, la técnica estándar de hibridación de células somáticas de Kohler y Milstein, Nature 256: 495 (1975). Aunque se prefieren los procedimientos de hibridación de células somáticas, en principio, pueden emplearse otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo, la transformación viral u oncogénica de linfocitos B o técnicas de presentación en fagos mediante el uso de bibliotecas de genes de anticuerpos.

El sistema animal que prefiere para la preparación de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales es el sistema murino. La producción de hibridomas en el ratón es un procedimiento muy bien establecido. Los protocolos y técnicas de inmunización para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para la fusión se conocen en la técnica. También se conocen las parejas de fusión (por ejemplo, las células de mieloma murino) y los procedimientos de fusión.

Otros sistemas de animales que se prefieren para la preparación de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales son el sistema de rata y el de conejo (por ejemplo se describen en Spieker-Polet y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

92:9348 (1995), ver también Rossi y otros, Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005)).

Aún en otra modalidad preferida, los anticuerpos monoclonales humanos directamente contra CLDN6 pueden generarse mediante el uso de ratones transgénicos o transcromosómicos que portan partes del sistema inmune humano en lugar del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones conocidos como HuMAb y KM, respectivamente, y se denominan colectivamente en la presente descripción como "ratones transgénicos." La producción de anticuerpos humanos en tales ratones transgénicos puede realizarse como se describe en detalle para CD20 en el documento núm.WO2004 035607

Aún otra estrategia para generar anticuerpos monoclonales es aislar directamente los genes que codifican los anticuerpos de linfocitos que producen anticuerpos de estrategia definida, por ejemplo, véase Babcock y otros, 1996; A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined strategy. Para detalles de ingeniería de anticuerpo recombinante, véase también Welschof y Kraus, Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8 and Benny K.C. Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1.

Para generar anticuerpos contra CLDN6, los ratones pueden inmunizarse con péptidos conjugados con el portador derivados de la secuencia CLDN6, una preparación enriquecida de antígeno CLDN6 expresado de forma recombinante o fragmentos de este y/o células que expresan CLDN6 o fragmentos de estos, como se describe. Alternativamente, los ratones pueden inmunizarse con ADN que codifica la CLDN6 humana de longitud completa o fragmentos de la misma. En el caso de que las inmunizaciones que usan una preparación purificada o enriquecida del antígeno CLDN6 no resulten en anticuerpos, los ratones pueden también inmunizarse con células que expresan CLDN6, por ejemplo, una línea celular, para promover respuestas inmunes.

La respuesta inmunitaria puede monitorearse en el curso del protocolo de inmunización con muestras de plasma y suero que se obtienen por la vena de la cola o sangrados retroorbitales. Los ratones con títulos suficientes de inmunoglobulina anti-CLDN6 pueden usarse para fusiones. Los ratones pueden reforzarse intraperitonealmente o intravenosamente con células que expresan CLDN6, 3-5 días antes del sacrificio y la eliminación del bazo para aumentar la tasa de hibridomas que secretan anticuerpos específicos.

Para generar hibridomas que producen anticuerpos monoclonales a CLDN6, pueden aislarse las células de los ganglios linfáticos, bazos o médula ósea obtenidas de ratones inmunizados y fusionarse a una línea celular inmortalizada apropiada, tal como una línea celular de mieloma de ratón. Los hibridomas resultantes pueden luego tamizarse para la producción de anticuerpos específicos del antígeno. Los pocillos individuales pueden luego tamizarse mediante ELISA para hibridomas que secretan anticuerpos. Por análisis de inmunofluorescencia y FACS mediante el uso de células que expresan CLDN6, pueden identificarse anticuerpos con especificidad para CLDN6. Los hibridomas que secretan el anticuerpo pueden replaquearse, tamizarse de nuevo, y si todavía son positivos para los anticuerpos monoclonales anti-CLDN6 pueden subclonarse por dilución limitante. Los subclones estables pueden después cultivarse in vitro para generar anticuerpos en medio de cultivo tisular para la caracterización.

Los anticuerpos de la enseñanza pueden producirse también en un transfectoma de células huésped mediante el uso, por ejemplo, de una combinación de técnicas de ADN recombinante y métodos de transfección de genes como se conocen bien en la técnica (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).

Por ejemplo, en una modalidad, el o los genes de interés, por ejemplo, genes de anticuerpos, pueden ligarse en un vector de expresión tal como un plásmido de expresión eucariota tal como se usa por el sistema GS de expresión del gen descritos en los documentos núms. WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338 841 u otros sistemas de expresión bien conocidos en la técnica. El plásmido purificado con los genes de anticuerpos clonados puede introducirse en células huésped eucariotas, tales como las células CHO, células NS/0, células HEK293T o células HEK293 o alternativamente otras células eucariotas como células derivadas de plantas, células fúngicas o de levadura. El método que se usa para introducir estos genes puede estar entre los métodos que se describen en la técnica, tales como electroporación, lipofectina, lipofectamina u otros. Después de la introducción de estos genes de anticuerpos en las células huésped, las células que expresan el anticuerpo pueden identificarse y seleccionarse. Estas células representan los transfectomas que luego pueden amplificarse para su nivel de expresión y aumentar su escala de producción de anticuerpos. Los anticuerpos recombinantes pueden aislarse y purificarse a partir de estos sobrenadantes de cultivo y/o células.

Alternativamente, los genes de anticuerpos clonados pueden expresarse en otros sistemas de expresión, que incluyen las células procariotas, tales como microorganismos, por ejemplo, E. coli. Además, los anticuerpos pueden producirse en animales transgénicos no humanos, tales como en la leche de ovejas y conejos o en huevos de gallinas, o en plantas transgénicas; ver por ejemplo Verma, R., y otros (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181; Pollock, y otros (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157; y Fischer, R., y otros (1999) Biol. Chem. 380: 825-839.

Los anticuerpos monoclonales murinos pueden usarse como anticuerpos terapéuticos en humanos cuando se marcan con toxinas o isótopos radiactivos. Los anticuerpos murinos no marcados son altamente inmunogénicos en el hombre cuando se aplican repetidamente lo que conduce a la reducción del efecto terapéutico. La inmunogenicidad principal está mediada por las regiones constantes de la cadena pesada. La inmunogenicidad de los anticuerpos murinos en el hombre puede reducirse o evitarse completamente si los respectivos anticuerpos se quimerizan o humanizan. Los anticuerpos quiméricos son anticuerpos, cuyas diferentes porciones se derivan de diferentes especies de animales, tales como aquellos que tienen una región variable derivada de un anticuerpo murino y una región constante de inmunoglobulina humana. La quimerización de anticuerpos se logra por la unión de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo murino con la región constante de las cadenas pesada y ligera humana (por ejemplo como se describió por Kraus y otros, en Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for cancertherapy ISBN-0-89603-918-8). En una modalidad preferida, los anticuerpos quiméricos se generan mediante la unión de la región constante de la cadena ligera kappa humana a la región variable de la cadena ligera murina. En una modalidad preferida, también los anticuerpos quiméricos pueden generarse mediante la unión de la región constante de la cadena ligera lambda humana a la región variable de la cadena ligera murina. Las regiones constantes de la cadena pesada que se prefieren para la generación de los anticuerpos quiméricos son IgG1, IgG3 e IgG4. Otras regiones constantes de la cadena pesada que se prefieren para la generación de los anticuerpos quiméricos son IgG2, IgA, IgD e IgM.

Los anticuerpos interactúan con los antígenos dianas predominantemente a través de los residuos de aminoácidos que se localizan en las seis regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de las cadenas pesada y ligera. Por esta razón, las secuencias de aminoácidos dentro de las CDR son más diversas entre los anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDR. Debido a que las secuencias de CDR son responsables de la mayoría de las interacciones anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que mimeticen las propiedades de los anticuerpos específicos presentes de manera natural mediante la construcción de vectores de expresión que incluyen secuencias CDR del anticuerpo específico presente de manera natural injertado en las secuencias marco de un anticuerpo diferente con propiedades diferentes (véase, por ejemplo,Riechmann, L. y otros (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. y otros (1986) Nature 321: 522-525; and Queen, C. y otros (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 10029-10033). Tales secuencias marco pueden obtenerse a partir de bases de datos públicas de ADN que incluyen secuencias de genes de anticuerpos de la línea germinal. Estas secuencias de la línea germinal diferirán de las secuencias génicas del anticuerpo maduro porque no incluirán los genes variables completamente ensamblados, que se forman por la unión V (D) J durante la maduración de la célula B. Las secuencias génicas de la línea germinal también diferirán de las secuencias de un anticuerpo de repertorio secundario de alta afinidad a posiciones individuales uniformemente a través de la región variable. Por ejemplo, las mutaciones somáticas son relativamente poco frecuentes en la porción amino terminal de la región marco 1 y en la porción carboxiterminal de la región marco 4. Además, muchas mutaciones somáticas no alteran significativamente las propiedades de unión del anticuerpo. Por esta razón, no es necesario obtener la secuencia de ADN completa de un anticuerpo particular para recrear un anticuerpo recombinante intacto que tenga propiedades de unión similares a las del anticuerpo original (véase el documento núm. WO 99/45962). Las secuencias parciales de cadena pesada y ligera que abarcan las regiones CDR son típicamente suficientes para este propósito. La secuencia parcial se usa para determinar qué variable de línea germinal y qué segmentos de genes de unión contribuyeron a los genes de la variables del anticuerpo recombinado. La secuencia de la línea germinal se usa entonces para completar las porciones faltantes de las regiones variables. Las secuencias líderes de la cadena pesada y ligera se escinden durante la maduración de la proteína y no contribuyen a las propiedades del anticuerpo final. Para agregar secuencias faltantes, las secuencias de ADNc clonadas pueden combinarse con oligonucleótidos sintéticos mediante ligadura o amplificación por PCR. Alternativamente, toda la región variable puede sintetizarse como un conjunto de oligonucleótidos cortos, solapados y combinarse mediante amplificación por PCR para crear un clon de región variable completamente sintético. Este proceso tiene ciertas ventajas, tales como la eliminación o inclusión de sitios de restricción particulares, u optimización de codones particulares.

Las secuencias de nucleótidos de los transcriptos de cadena pesada y ligera de hibridomas se usan para diseñar un conjunto solapado de oligonucleótidos sintéticos para crear secuencias V sintéticas con capacidades de codificación de aminoácidos idénticas a las secuencias naturales. Las secuencias sintéticas de cadena pesada y kappa pueden diferir de las secuencias naturales de tres maneras: cadenas de bases de nucleótidos repetidas se interrumpen para facilitar la síntesis de oligonucleótidos y la amplificación por PCR; los sitios óptimos de iniciación de la traducción se incorporan de acuerdo con las reglas de Kozak (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266: 19867-19870); y los sitios HindIII se modifican genéticamente corriente arriba de los sitios de iniciación de la traducción.

Para las regiones variables de la cadena pesada y ligera, las secuencias de cadenas codificantes optimizadas y las no codificantes correspondientes, se descomponen en 30-50 nucleótidos aproximadamente en el punto medio del oligonucleótido no codificante correspondiente. Por lo tanto, para cada cadena, los oligonucleótidos pueden ensamblarse en conjuntos de doble cadena solapados que abarcan segmentos de 150-400 nucleótidos. Las agrupaciones se usan luego como plantillas para producir productos de amplificación por PCR de 150-400 nucleótidos. Típicamente, un único conjunto de oligonucleótidos de región variable se descompondrá en dos agrupaciones que se amplifican por separado para generar dos productos de PCR solapados. Estos productos solapados se combinan luego por amplificación por PCR para formar la región variable completa. También puede ser conveniente incluir un fragmento solapado de la región constante de la cadena pesada o ligera en la amplificación por PCR para generar fragmentos que puedan clonarse fácilmente en los constructos del vector de expresión.

Las regiones variables de cadena ligera y pesada quimerizadas o humanizadas reconstruidas se combinan luego con el promotor clonado, el líder, el inicio de la traducción, la región constante, las secuencias 3' no traducidas, la poliadenilación y la terminación de la transcripción para formar constructos de vectores de expresión. Los constructos de expresión de la cadena pesada y ligera pueden combinarse en un único vector, cotransfectarse, transfectarse en serie o transfectarse por separado en células huésped que luego se fusionan para formar una célula huésped que expresa ambas cadenas. Se describen plásmidos para su uso en la construcción de vectores de expresión para IgGK humana. Los plásmidos pueden construirse de modo que las secuencias de ADNc de cadena pesada V y ligera V kappa amplificadas por PCR pueden usarse para reconstruir minigenes completos de cadena pesada y ligera. Estos plásmidos pueden usarse para expresar completamente anticuerpos humanos o quiméricos IgG1, Kappa o IgG4, Kappa. Se pueden construir plásmidos similares para la expresión de otros isotipos de cadena pesada, o para la expresión de anticuerpos que comprenden cadenas ligeras lambda.

Por lo tanto, en otro aspecto de la enseñanza, las características estructurales de los anticuerpos anti-CLDN6 descritos en la presente descripción, se usan para crear anticuerpos anti-CLDN6 humanizados estructuralmente relacionados que retienen al menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la enseñanza, tal como unirse a CLDN6. Más específicamente, una o más regiones CDR de anticuerpos monoclonales de ratón pueden combinarse de forma recombinante con regiones marco humanas conocidas y CDRs para crear anticuerpos adicionales anti-CLDN6 humanizados por ingeniería recombinante.

La capacidad del anticuerpo para unirse a CLDN6 puede determinarse mediante el uso de ensayos de unión estándares, tales como los expuestos en los ejemplos (por ejemplo, ELISA, Western Blot, inmunofluorescencia y análisis de citometría de flujo).

El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico en una molécula, es decir, a la parte en una molécula que se reconoce por el sistema inmunitario, por ejemplo, que se reconoce por un anticuerpo. Por ejemplo, los epítopos son los sitios discretos, tridimensionales en un antígeno, que se reconocen por el sistema inmunitario. En el contexto de la presente enseñanza, el epítopo se deriva, preferentemente, de una proteína CLDN. Los epítopos usualmente consisten en agrupaciones de moléculas de superficie químicamente activas tales como los aminoácidos o cadenas laterales de azúcares y tienen usualmente características específicas de estructura tridimensional, así como también características específicas de carga. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen en que la unión al primero pero no al último se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes. Un epítopo de una proteína tal como CLDN comprende, preferentemente, una porción continua o discontinua de dicha proteína y está, preferentemente, entre 5 y 100, preferentemente, entre 5 y 50, con mayor preferencia entre 8 y 30, con preferencia superlativa entre 10 y 25 aminoácidos de longitud, por ejemplo, el epítopo puede tener, preferentemente, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 aminoácidos de longitud.

El término "epítopo discontinuo" como se usa en la presente descripción, significa un epítopo conformacional en un antígeno proteico que se forma a partir de al menos dos regiones separadas de la secuencia primaria de la proteína.

De acuerdo con la descripción, el término "enlazamiento" se relaciona, preferentemente, con un enlazamiento específico. "Enlazamiento específico" significa que un agente tal como un anticuerpo se enlaza más fuertemente a un objetivo tal como un epítopo para el que es específico en comparación con el enlazamiento con otro objetivo. Un agente se une más fuertemente a un primer objetivo en comparación con un segundo objetivo si se une al primer objetivo con una constante de disociación (K^d) que es inferior que la constante de disociación para el segundo objetivo. Preferentemente, la constante de disociación (K^d) para el objetivo al cual se une específicamente el agente es más de 102 veces, 103 veces, 104 veces, 105 veces, 106 veces, 107 veces, 108 veces, 109 veces, o 1010 veces inferior que la constante de disociación (K^d) para el objetivo al cual el agente no se une específicamente.

El término "ácido nucleico", como se usa en la presente descripción, pretende incluir ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN). Los ácidos nucleicos comprenden de acuerdo con la descripción moléculas de ADN genómico, ADNc, ARNm producidas recombinantemente y sintetizadas químicamente. De acuerdo con la enseñanza, un ácido nucleico puede estar presente como una molécula monocatenaria o bicatenaria y lineal o cerradas covalentemente en forma circular.

Los ácidos nucleicos descritos de acuerdo con la descripción, se han aislado, preferentemente. El término "ácido nucleico aislado" significa de acuerdo con la enseñanza que el ácido nucleico (i) se amplificó in vitro, por ejemplo, mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), (ii) se produjo de forma recombinante mediante clonación, (iii) se purificó, por ejemplo, mediante escisión y fraccionamiento electroforético en gel, o (iv) se sintetizó, por ejemplo, mediante síntesis química. Un ácido nucleico aislado es un ácido nucleico que está disponible para su manipulación mediante técnicas de ADN recombinante.

Los ácidos nucleicos pueden, de acuerdo con la enseñanza, presentarse solos o en combinación con otros ácidos nucleicos, que pueden ser homólogos o heterólogos. En modalidades preferidas, un ácido nucleico se une funcionalmente a las secuencias control de la expresión que pueden ser homólogas o heterólogas con respecto a dicho ácido nucleico, donde el término "homólogo" significa que el ácido nucleico se une funcionalmente, además, a la secuencia control de expresión de forma natural y el término "heterólogo" significa que el ácido nucleico no se une funcionalmente a la secuencia control de expresión de forma natural.

Un ácido nucleico, tal como un ácido nucleico que expresa ARN y/o proteína o péptido, y una secuencia control de expresión están "funcionalmente" unidos entre sí, si se unen covalentemente entre sí de tal manera que la expresión o la transcripción de dicho ácido nucleico está bajo el control o bajo la influencia de dicha secuencia control de la expresión. Si el ácido nucleico debe traducirse en una proteína funcional, entonces, con una secuencia control de la expresión funcionalmente unida a una secuencia codificante, la inducción de dicha secuencia control de la expresión resulta en la transcripción de dicho ácido nucleico, sin causar un cambio de marco en la secuencia codificante o que dicha secuencia codificante no sea capaz de traducirse en la proteína o péptido deseado.

El término "secuencia control de la expresión" o "elemento de control de la expresión" comprende, de acuerdo con la enseñanza, promotores, sitios de unión a ribosomas, potenciadores y otros elementos de control que regulan la transcripción de un gen o la traducción de un ARNm. En modalidades particulares de la descripción, pueden regularse las secuencias de control de la expresión. La estructura exacta de las secuencias control de la expresión puede variar en función de las especies o tipo de célula, pero generalmente comprende las secuencias 5'-sin transcribirse y 5'- y 3'-sin traducirse que están involucradas en el inicio de la transcripción y traducción, respectivamente, tales como caja TATA, secuencia de capucha y secuencia CAAT. Más específicamente, las secuencias control de expresión 5'-sin transcribirse comprenden una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional del ácido nucleico unido funcionalmente. Las secuencias control de la expresión pueden comprender, además, las secuencias potenciadoras o secuencias activadoras corriente arriba.

De acuerdo con la enseñanza, el término "promotor" o "región promotora" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que se encuentra ubicada corriente arriba (5') de la secuencia de ácidos nucleicos que se expresa y controla la expresión de la secuencia lo que proporciona un reconocimiento y sitio de unión para la ARN polimerasa. La "región promotora" puede incluir sitios de reconocimiento y unión adicionales para otros factores que están implicados en la regulación de la transcripción de un gen. Un promotor puede controlar la transcripción de un gen procariótico o eucariótico. Además, un promotor puede ser "inducible" y puede iniciar la transcripción en respuesta aun agente inductor o puede ser "constitutivo" si la transcripción no está controlada por un agente inductor. Un gen que está bajo el control de un promotor inducible no se expresa o se expresa solo en pequeña medida si está ausente un agente inductor. En presencia del agente inductor, el gen se enciende o se aumenta el nivel de transcripción. Esto está mediado, en general, por la unión de un factor de transcripción específico.

Los promotores que se prefieren, de acuerdo con la enseñanza, incluyen promotores para SP6, T3 y T7 polimerasa, promotor de ARN U6 humano, promotor de CMV y promotores híbridos artificiales de los mismos (por ejemplo, CMV) donde una parte o partes están fusionadas a una parte o partes de promotores de genes de otras proteínas celulares tales como, por ejemplo, GAPDH humana (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa) e incluyen o no un o unos intrón(es) adicional(es).

De acuerdo con la enseñanza, el término "expresión" se usa en su significado más general y comprende la producción de ARN o de ARN y proteína/péptido. Comprende también la expresión parcial de ácidos nucleicos. Además, la expresión puede llevarse a cabo de forma transitoria o estable. De acuerdo con la enseñanza, el término expresión incluye, además, una "expresión aberrante" o "expresión anormal".

"Expresión aberrante" o "expresión anormal" significan, de acuerdo con la enseñanza, que la expresión está alterada, preferentemente aumentada, en comparación con una referencia, preferentemente, en comparación con el estado en una célula normal no tumorigénica o un individuo sano. Un aumento en la expresión se refiere a un aumento de al menos 10 %, en particular al menos 20 %, al menos 50 %, al menos 100 %, al menos 200 %, al menos 500 %, al menos 1000 %, al menos 10000 % o incluso más. En una modalidad, la expresión solo se encuentra en un tejido enfermo, mientras que la expresión en un tejido sano se reprime.

En una modalidad preferida, una molécula de ácido nucleico, de acuerdo con la presente enseñanza, se presenta en un vector, donde sea apropiado con un promotor, que controla la expresión del ácido nucleico. El término "vector" se usa en la presente en su significado más general y comprende cualquier vehículo intermediario para un ácido nucleico que permite que dicho ácido nucleico, por ejemplo, se introduzca en células procariotas y/o eucariotas y, cuando sea apropiado, se integre en un genoma. Preferentemente, los vectores de este tipo se replican y/o se expresan en las células. Los vectores comprenden plásmidos, fagémidos, bacteriófagos o genomas virales. El término "plásmido", como se usa en la presente descripción, se refiere en general a un constructo de material genético extracromosómico, generalmente, un ADN dúplex circular, que puede replicarse independientemente del ADN cromosómico.

Como vector para la expresión de un anticuerpo, puede usarse ya sea un vector en el que están presentes la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo en diferentes vectores o un tipo de vector en el que la cadena pesada y la cadena ligera están presentes en el mismo vector.

La enseñanza dada en la presente descripción con respecto a secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos específicos, por ejemplo, los que se muestran en el listado de secuencias, deben interpretarse que se refieren, además, a modificaciones de dichas secuencias específicas que resultan en secuencias que son funcionalmente equivalentes a dichas secuencias específicas, por ejemplo, secuencias de aminoácidos que exhiben propiedades idénticas o similares a las de las secuencias de aminoácidos específicas y secuencias de ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos que exhiben propiedades idénticas o similares a las de las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de ácidos nucleicos específicas.

De manera similar, la enseñanza dada en la presente descripción con respecto a anticuerpos específicos o hibridomas que producen anticuerpos específicos debe interpretarse de manera que se refiere, además, a anticuerpos caracterizados por una secuencia de aminoácidos y/o una secuencia de ácidos nucleicos que se modifican en comparación con la secuencia de aminoácidos y/o secuencia de ácidos nucleicos de los anticuerpos específicos pero son funcionalmente equivalente. Una propiedad importante es retener la unión de un anticuerpo a su diana o mantener las funciones efectoras de un anticuerpo. Preferentemente, una secuencia modificada con respecto a una secuencia específica, cuando reemplaza la secuencia específica en un anticuerpo, conserva la unión de dicho anticuerpo a la diana y preferentemente las funciones de dicho anticuerpo como se describe en la presente descripción, por ejemplo, lisis mediada por CDC o lisis mediada por ADCC.

Los expertos en la técnica apreciarán que en particular las secuencias de los CDR, las regiones hipervariables y variables pueden modificarse sin perder la capacidad de unirse a una diana. Por ejemplo, las regiones CDR serán idénticas o altamente homólogas a las regiones de anticuerpos especificadas en la presente descripción. Por "altamente homóloga" se contempla que de 1 a 5, preferentemente, de 1 a 4, tal como 1 a 3 o 1 o 2 sustituciones pueden hacerse en las CDR. Además, las regiones hipervariables y variables pueden modificarse de manera que muestren homología sustancial con las regiones de anticuerpos específicamente descritos en la presente descripción.

Debe entenderse que los ácidos nucleicos específicos descritos en la presente descripción también incluyen ácidos nucleicos modificados en aras de optimizar el uso de codones en una célula huésped u organismo particular. Las diferencias en el uso de codones entre organismos pueden conducir a una variedad de problemas relacionados con la expresión de genes heterólogos. La optimización de codones al cambiar uno o más nucleótidos de la secuencia original puede resultar en una optimización de la expresión de un ácido nucleico, en particular, en la optimización de la eficacia de la traducción, en un huésped homólogo o heterólogo en el que se expresará dicho ácido nucleico. Por ejemplo, si los ácidos nucleicos derivados de humanos y que codifican regiones constantes y/o regiones marco de anticuerpos deben usarse de acuerdo con la presente enseñanza, por ejemplo, para preparar anticuerpos quiméricos o humanizados, puede preferirse modificar dichos ácidos nucleicos en aras de la optimización del uso de codones, en particular si dichos ácidos nucleicos, opcionalmente fusionados con ácidos nucleicos heterólogos, tales como ácidos nucleicos derivados de otros organismos como se describe en la presente descripción, deben expresarse en células de un organismo diferente al humano, tal como el ratón o el hámster. Por ejemplo, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican regiones constantes de cadena ligera y pesada humana pueden modificarse para incluir una o más, preferentemente, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 y preferentemente hasta 10, 15, 20, 25, 30, 50, 70 o 100 o más reemplazos de nucleótidos que resultan en un uso optimizado de codones. Tales reemplazos de nucleótidos preferentemente se refieren a reemplazos de nucleótidos que no resultan en un cambio en la secuencia de aminoácidos codificada o se se refieren a reemplazos correspondientes en las posiciones correspondientes en otras secuencias de ácidos nucleicos que codifican regiones constantes de cadena ligera y pesada humanas, respectivamente.

Preferentemente, el grado de identidad entre una secuencia de ácidos nucleicos específica y una secuencia de ácidos nucleicos que se modifica con respecto a o que es una variante de dicha secuencia de ácidos nucleicos específica será al menos 70 %, preferentemente al menos 75 %, con mayor preferencia al menos 80 %, aún con mayor preferencia al menos 90 % o con la máxima preferencia al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %. Con respecto a las variantes de ácido nucleico de CLDN6, el grado de identidad está dado, preferentemente, para una región de al menos aproximadamente 300, al menos aproximadamente 400, al menos aproximadamente 450, al menos aproximadamente 500, al menos aproximadamente 550, al menos aproximadamente 600 o al menos aproximadamente 630 nucleótidos. En modalidades preferidas, el grado de identidad está dado por la longitud completa de la secuencia de ácidos nucleicos de referencia, tal como las secuencias de ácidos nucleicos dadas en el listado de secuencias. Preferentemente, las dos secuencias son capaces de hibridar y de formar un dúplex estable entre sí, con la hibridización, preferentemente, se lleva a cabo bajo condiciones que permiten la hibridización específica entre polinucleótidos (condiciones rigurosas). Las condiciones rigurosas se describen, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook y otros., Editores, 2da Edición, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 o Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel y otros, Editores, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York y se refieren, por ejemplo, a la hibridación a 65 °C en un tampón de hibridación (3,5 x SSC, Ficoll al 0,02 %, polivinilpirrolidona al 0,02 %, albúmina de suero bovino al 0,02 %, NaH²PO⁴2,5 mM (pH 7), SDS al 0,5 %, EDTA 2 mM). SSC es cloruro de sodio 0,15 M/citrato de sodio 0,15 M, pH 7. Después de la hibridación, se lava la membrana a la que se ha transferido el ADN, por ejemplo, en 2 x SSC a temperatura ambiente y después en 0,1-0,5 x SSC/0,1 x SDS a temperaturas de hasta 68 °C.

El término "variante" con respecto a, por ejemplo, secuencias de ácido nucleico o aminoácidos, de acuerdo con la enseñanza, incluye cualesquiera variantes, en particular, mutantes, variantes de empalme, conformaciones, isoformas, variantes alélicas, variantes de especies y homólogos de especies, en particular aquellos que son de origen natural. Una variante alélica se refiere a una alteración en la secuencia normal de un gen, cuya relevancia frecuentemente no está clara. La secuenciación génica completa a menudo identifica numerosas variantes alélicas para un gen determinado. Un homólogo de especie es una secuencia de ácido nucleico o aminoácido con una especie de origen diferente de una secuencia determinada de un ácido nucleico o aminoácido.

Con respecto a las moléculas de ácido nucleico, el término "variante" incluye secuencias de ácido nucleico degeneradas, en donde un ácido nucleico degenerado de acuerdo con la enseñanza es un ácido nucleico que difiere de un ácido nucleico de referencia en la secuencia de codones debido a la degeneración del código genético.

Además, una "variante" de una secuencia de ácido nucleico específica de acuerdo con la enseñanza incluye secuencias de ácido nucleico que comprenden una o múltiples sustituciones, deleciones y/o adiciones de nucleótidos tales como al menos 2, al menos 4, o al menos 6 y, preferentemente, hasta 3, hasta 4, hasta 5, hasta 6, hasta 10, hasta 15, o hasta 20.

Para los propósitos de la presente enseñanza, las "variantes" de una secuencia de aminoácidos comprenden variantes de inserción de aminoácidos, variantes de adición de aminoácidos, variantes de deleción de aminoácidos y/o variantes de sustitución de aminoácidos.

En el caso de las variantes de secuencias de aminoácidos que tienen una inserción, se insertan uno o más residuos de aminoácidos en un sitio particular en una secuencia de aminoácidos, aunque es posible también una inserción aleatoria con el tamizaje apropiado del producto resultante.

Las variantes de deleción de aminoácidos se caracterizan por la eliminación de uno o más aminoácidos de la secuencia.

Las variantes de sustitución de aminoácidos se caracterizan por la eliminación de al menos un residuo en la secuencia y la inserción de otro residuo en su lugar. La preferencia está dada a las modificaciones que están en las posiciones de la secuencia de aminoácidos que no se conservan entre las proteínas o péptidos homólogos y/o al reemplazo de aminoácidos con otros que tienen propiedades similares.

Preferentemente, los cambios de aminoácidos en las variantes de proteína son cambios conservadores de aminoácidos, es decir, sustituciones de aminoácidos cargados o no cargados de manera similar.

Preferentemente, el grado de similitud, preferentemente identidad entre una secuencia de aminoácidos específica y una secuencia de aminoácidos que se modifica con respecto a o que es una variante de dicha secuencia de aminoácidos específica, tal como entre secuencias de aminoácidos que muestran una homología sustancial, será al menos 70 %, preferentemente al menos 80 %, aún con mayor preferencia al menos 90 % o con la máxima preferencia al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %. Con respecto a las variantes de polipéptidos de CLDN6, el grado de similitud o de identidad está dado, preferentemente, para una región de al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 120, al menos aproximadamente 140, al menos aproximadamente 160, al menos aproximadamente 180, al menos aproximadamente 200, al menos aproximadamente 210 aminoácidos. En modalidades preferidas, el grado de similitud o identidad está dado por la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de referencia, tal como las secuencias de aminoácidos dadas en el listado de secuencias.

"Similitud de secuencia" indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos o que representan sustituciones conservadoras de aminoácidos. "Identidad de secuencia" entre dos secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos indica el porcentaje de aminoácidos o nucleótidos que son idénticos entre las secuencias.

Con el término "porcentaje de identidad" se pretende indicar un porcentaje de nucleótidos o de residuos de aminoácidos que son idénticos entre las dos secuencias que se van a comparar, obtenido después de la mejor alineación, este porcentaje es puramente estadístico y las diferencias entre las dos secuencias se distribuyen en forma aleatoria y en toda su longitud. Las comparaciones de secuencias entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos se llevan a cabo convencionalmente mediante la comparación de estas secuencias después de haberlas alineado de forma óptima, dicha comparación se lleva a cabo por segmento o por "ventana de comparación" para identificar y comparar las regiones locales con similitud de la secuencia. El alineamiento óptimo de las secuencias para la comparación puede producirse, además de manualmente, por medio del algoritmo de homología local de Smith y Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, por medio del algoritmo de homología local de Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, por medio del método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. EE.UU. 85, 2444, o por medio de programas de ordenador que usan estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).

El porcentaje de identidad se calcula mediante la determinación del número de posiciones idénticas entre las dos secuencias que se comparan, se divide este número entre el número de posiciones comparadas, y se multiplica el resultado obtenido por 100 de forma que se obtiene el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias.

"Sustituciones conservativas" pueden realizarse, por ejemplo, sobre la base de similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y/o la naturaleza anfipática de los residuos implicados. Por ejemplo: (a) los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano, y metionina; (b) los aminoácidos polares neutros incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, y glutamina; (c) los aminoácidos positivamente cargados (básicos) incluyen arginina, lisina, e histidina; y (d) los aminoácidos negativamente cargados (acídicos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Las sustituciones típicamente pueden realizarse dentro de los grupos (a)-(d). Adicionalmente, glicina y prolina se pueden sustituir una por otra basado en su capacidad de alterar a-hélices. Se pueden hacer algunas sustituciones preferidas entre los siguientes grupos: (i) S y T; (ii) P y G; y (iii) A, V, L y I. Dado el código genético conocido, y las técnicas de ADN recombinante y sintético, el científico experto puede construir fácilmente los ADN que codifican las variantes de aminoácidos conservadoras.

La enseñanza incluye derivados de las secuencias de ácidos nucleicos, secuencias de aminoácidos, péptidos o proteínas, en particular anticuerpos, descritos en la presente descripción.

El término "derivado" comprende la formación de un derivado químico de un ácido nucleico en una base nucleótida, en el azúcar o en el fosfato. El término "derivado" comprende, además, ácidos nucleicos que contienen nucleótidos y análogos de nucleótidos que no son de origen natural. Preferentemente, la formación de un derivado de un ácido nucleico aumenta su estabilidad.

De acuerdo con la enseñanza, los "derivados" de proteínas y péptidos son formas modificadas de proteínas y péptidos. Tales modificaciones incluyen cualquier modificación química y comprenden sustituciones, deleciones y/o adiciones, simples o múltiples, de cualquiera de las moléculas asociadas con la proteína o péptido, tales como carbohidratos, lípidos y/o proteínas o péptidos. El término "derivado" se extiende, además, a todos los equivalentes químicos funcionales de dichas proteínas y péptidos. Preferentemente, un péptido modificado tiene estabilidad aumentada y/o inmunogenicidad aumentada.

De acuerdo con la enseñanza, una variante, derivado, forma modificada, fragmento, parte o porción de una secuencia de ácidos nucleicos, secuencia de aminoácidos, péptido o proteína, tiene preferentemente, una propiedad funcional de la secuencia de ácidos nucleicos, secuencia de aminoácidos, péptido o proteína, respectivamente, de la cual se ha derivado. Dichas propiedades funcionales comprenden la interacción con péptidos o proteínas, tales como anticuerpos o anticuerpo que se dirigen, en particular, contra CLDN6, la unión selectiva de ácidos nucleicos y una actividad enzimática. En una modalidad, una variante, derivado, forma modificada, fragmento, parte o porción de una secuencia de ácidos nucleicos, secuencia de aminoácidos, péptido o proteína es inmunológicamente equivalente a la secuencia de ácidos nucleicos, secuencia de aminoácidos, péptido o proteína, respectivamente, de la cual se ha derivado. En una modalidad, la propiedad funcional es una propiedad inmunológica.

De acuerdo con la enseñanza, una célula, preferentemente, es una célula intacta, es decir, una célula con una membrana intacta que no libera sus componentes intracelulares normales tales como enzimas, organelos, o material genético. Una célula intacta, preferentemente, es una célula viable, es decir, una célula viva capaz de llevar a cabo sus funciones metabólicas normales. Preferentemente, una célula es una célula humana.

Una "célula" puede ser una "célula huésped" que, como se usa en la presente descripción, pretende referirse a una célula en la que se ha introducido un ácido nucleico recombinante.

Los términos "animal transgénico" se refieren a un animal que tiene un genoma que comprende uno o más transgenes, preferentemente transgenes de cadena pesada y/o ligera, o transcromosomas (ya sea integrados o no integrados en el ADN genómico natural del animal) y que es preferentemente capaz de expresar los transgenes. Por ejemplo, un ratón transgénico puede tener un transgén de cadena ligera humana y un transgén de cadena pesada humana o un transcromosoma de cadena pesada humana, de manera que el ratón produce anticuerpos humanos anti-CLDN6 cuando se inmuniza con antígeno CLDN6 y/o células que expresan CLDN6. El transgén de la cadena pesada humana puede integrarse en el ADN cromosómico del ratón, como es el caso de los ratones transgénicos, por ejemplo, los ratones HuMAb, tales como los ratones HCo7 o HCol2, o el transgén de la cadena pesada humana puede mantenerse extracromosómicamente, como el caso para ratones transcromosómicos (por ejemplo, KM) como se describe en el documento núm. WO 02/43478. Tales ratones transgénicos y transcromosómicos pueden ser capaces de producir múltiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos para CLDN6 (por ejemplo, IgG, IgA y/o IgE) al someterse a recombinación V-D-J y cambio de isotipo.

De acuerdo con la enseñanza, el término "resto efector terapéutico" significa cualquier molécula que pueda ejercer un efecto terapéutico. De acuerdo con la enseñanza, una molécula efectora terapéutica, preferentemente, se guía selectivamente a una célula que expresa CLDN6 e incluye agentes anticancerígenos, radioisótopos, toxinas, fármacos citostáticos o citolíticos, etc. Los agentes contra el cáncer comprenden, por ejemplo, aminoglutetimida, azatioprina, sulfato de bleomicina, busulfano, carmustina, clorambucilo, cisplatino, ciclofosfamida, ciclosporina, citarabidina, dacarbacina, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, taxol, etopósido, fluorouracilo, interferon-a, lomustina, mercaptopurina, metotrexato, mitotano, procarbacina HCl, tioguanina, sulfato de vinblastina y sulfato de vincristina. Otros agentes contra el cáncer se describen, por ejemplo, en Goodman y Gilman, “The Pharmacological Basis of Therapeutics”, 8a edición, 1990, McGraw-Hill Inc., en particular el Capítulo 52 (Antineoplastic Agents (Paul Calabresi y Bruce A. Chabner). Las toxinas pueden ser proteínas como la proteína antiviral de la hierba carmín, la toxina del cólera, la toxina pertussis, la ricina, la gelonina, la abrina, la exotoxina diftérica o exotoxina de Pseudomonas. Los residuos de toxinas también pueden ser radionúclidos emisores de gran energía como el cobalto-60.

Como se usa en la presente descripción "reducir" o "inhibir" significan la capacidad para causar una disminución global, preferentemente de 5 % o mayor, 10 % o mayor, 20 % o mayor, con mayor preferencia de 50 % o mayor, y con la máxima preferencia de 75 % o mayor en el nivel, por ejemplo, en el nivel de proliferación de las células. El término "inhibir" o frases similares incluye una inhibición completa o esencialmente completa, es decir, una reducción a cero o esencialmente a cero.

Los términos tales como "aumentar" o "potenciar", preferentemente, se refieren a un aumento o potenciación de aproximadamente en al menos un 10 %, preferentemente al menos 20 %, preferentemente al menos 30 %, con mayor preferencia al menos 40 %, con mayor preferencia al menos 50 %, aún con mayor preferencia al menos 80 %, y con la máxima preferencia al menos 100 %.

El término "inmunológicamente equivalente" significa que la molécula inmunológicamente equivalente tal como una secuencia de aminoácidos inmunológicamente equivalente exhibe las mismas o esencialmente las mismas propiedades inmunológicas y/o ejerce los mismos o esencialmente los mismos efectos inmunológicos, por ejemplo, con respecto al tipo de efecto inmunológico tal como la inducción de una respuesta inmune humoral y/o celular, la resistencia y/o duración de la reacción inmune inducida, o la especificidad de la reacción inmune inducida. En el contexto de la presente enseñanza, el término "inmunológicamente equivalente" se usa preferentemente con respecto a los efectos inmunológicos o propiedades de un péptido o variante de péptido usada para inmunización o un anticuerpo. Una propiedad inmunológica particular es la capacidad de unirse a anticuerpos y, cuando sea apropiado, generar una respuesta inmunitaria, preferentemente, por estimular la generación de anticuerpos. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos es inmunológicamente equivalente a una secuencia de aminoácidos de referencia si dicha secuencia de aminoácidos, cuando se expone al sistema inmune de un sujeto, induce una reacción inmune, preferentemente de anticuerpos, que tienen una especificidad de reacción con la secuencia de aminoácidos de referencia, tal como la secuencia de aminoácidos de referencia que forma parte de CLDN6.

El término "funciones efectoras inmunitarias" en el contexto de la presente invención incluye cualquier función mediada por los componentes del sistema inmunitario que resulta en la inhibición del crecimiento tumoral y/o la inhibición del desarrollo tumoral, que incluye la inhibición de la diseminación tumoral y las metástasis. Preferentemente, las funciones efectoras inmunitarias resultan en la destrucción de células tumorales. Preferentemente, las funciones efectoras inmunitarias en el contexto de la presente invención son funciones efectoras mediadas por anticuerpos. Tales funciones comprenden la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), la inducción de apoptosis en las células que portan el antígeno asociado a tumor, por ejemplo, CLDN6, por ejemplo, mediante la unión del anticuerpo al antígeno superficial, y/o la inhibición de la proliferación de las células que portan el antígeno asociado a tumor, preferentemente ADCc y/o CDC. Por lo tanto, los anticuerpos que son capaces de mediar una o más funciones efectoras inmunitarias son, preferentemente, capaces de mediar la destrucción de las células mediante la inducción de lisis mediada por la CDC, lisis mediada por la ADCC, apoptosis, adhesión homotípica y/o fagocitosis, preferentemente, mediante la inducción de lisis mediada por la CDC y/o lisis mediada por la ADCC. Además, los anticuerpos pueden ejercer un efecto simplemente mediante la unión a los antígenos asociados a tumor en la superficie de una célula tumoral. Por ejemplo, los anticuerpos pueden bloquear la función del antígeno asociado a tumor o inducir la apoptosis simplemente mediante la unión al antígeno asociado a tumor en la superficie de una célula tumoral.

Los anticuerpos, composiciones y métodos descritos en la presente descripción pueden usarse para tratar a un sujeto con una enfermedad tumoral, por ejemplo, una enfermedad caracterizada por la presencia de células tumorales que expresan CLDN6. Los ejemplos de enfermedades tumorales que se pueden tratar y/o prevenir abarcan todos los cánceres que expresan CLDN6 y las entidades tumorales, incluidas las descritas en la presente descripción.

Los anticuerpos, composiciones y métodos descritos en la presente descripción pueden usarse, además, para la inmunización o vacunación para prevenir una enfermedad descrita en la presente descripción.

De acuerdo con la enseñanza, el término "enfermedad" se refiere a cualquier estado patológico, que incluye cáncer, en particular, las formas de cáncer que se describen en la presente descripción.

"Enfermedades que implican células que expresan CLDN6" significa de acuerdo con la enseñanza que la expresión de CLDN6 en células de un tejido u órgano enfermo aumenta, preferentemente, en comparación con el estado en un tejido u órgano sano. Un aumento se refiere a un aumento de al menos 10 %, en particular al menos 20 %, al menos 50 %, al menos 100 %, al menos 200 %, al menos 500 %, al menos 1000 %, al menos 10000 % o aún más. En una modalidad, la expresión solo se encuentra en un tejido enfermo, mientras que la expresión en un tejido sano se reprime. De acuerdo con la enseñanza, las enfermedades que implican o se asocian con células que expresan CLDN6 incluyen enfermedades tumorales tales como enfermedades de cáncer. Además, de acuerdo con la enseñanza, las enfermedades tumorales tales como las enfermedades de cáncer son, preferentemente, aquellas en donde las células tumorales o células cancerosas expresan CLDN6.

De acuerdo con la invención, el término "tumor" o "enfermedad tumoral" se refiere a una hinchazón o lesión que se forma por un crecimiento anormal de células (llamadas células neoplásicas o células tumorales). Por"célula tumoral" se entiende una célula anormal que crece mediante una proliferación celular rápida y descontrolada y continúa su crecimiento después de que cesa el estímulo que inició el nuevo crecimiento. Los tumores muestran una pérdida parcial o completa de organización estructural y coordinación funcional con el tejido normal, y generalmente forman una masa distinta de tejido, que puede ser ya sea benigna, premaligna o maligna.

Un tumor benigno es un tumor que carece de las tres propiedades malignas de un cáncer. Por lo tanto, por definición, un tumor benigno no crece de manera ilimitada y agresiva, no invade los tejidos circundantes y no se propaga a los tejidos no adyacentes (hace metástasis). Los ejemplos comunes de tumores benignos incluyen lunares y fibromas uterinos.

El término "benigno" implica una enfermedad leve y no progresiva, y de hecho, muchos tipos de tumores benignos son inofensivos para la salud. Sin embargo, algunas neoplasias que se definen como "tumores benignos" porque carecen de las propiedades invasivas de un cáncer, aún pueden producir efectos negativos para la salud. Ejemplos de esto incluyen tumores que producen un "efecto de masa" (compresión de órganos vitales tales como vasos sanguíneos) o tumores "funcionales" de tejidos endocrinos, que pueden producir en exceso ciertas hormonas (los ejemplos incluyen adenomas tiroideos, adenomas adrenocorticales y adenomas pituitarios).

Los tumores benignos típicamente están rodeados por una superficie exterior que inhibe su capacidad de comportarse de manera maligna. En algunos casos, ciertos tumores "benignos" pueden más tarde, dar lugar a cánceres malignos, que resultan de cambios genéticos adicionales en una subpoblación de las células neoplásicas del tumor. Un ejemplo destacado de este fenómeno es el adenoma tubular, un tipo común de pólipo de colon que es un precursor importante del cáncer de colon. Las células en los adenomas tubulares, como la mayoría de los tumores que con frecuencia progresan a cáncer, muestran ciertas anormalidades de maduración y apariencia celular conocidas colectivamente como displasia. Estas anormalidades celulares no se ven en tumores benignos que rara vez o nunca se vuelven cancerosos, pero se ven en otras anormalidades de tejido precanceroso que no forman masas discretas, tales como las lesiones precancerosas del cuello uterino. Algunas autoridades prefieren referirse a los tumores displásicos como "premalignos" y reservan el término "benigno" para los tumores que rara vez o nunca dan lugar al cáncer.

El neoplasma es una masa anormal de tejido como resultado de la neoplasia. La neoplasia (nuevo crecimiento en griego) es la proliferación anormal de células. El crecimiento de las células excede, y no está coordinado con el de los tejidos normales a su alrededor. El crecimiento persiste de la misma manera excesiva incluso después del cese de los estímulos. Generalmente causa un bulto o tumor. Las neoplasias pueden ser benignas, premalignas o malignas.

El "crecimiento de un tumor" o el "crecimiento tumoral" de acuerdo con la enseñanza se refiere a la tendencia de un tumor a aumentar su tamaño y/o a la tendencia de las células tumorales a proliferar.

Preferentemente, una "enfermedad tumoral", de acuerdo con la enseñanza, es una enfermedad cancerosa, es decir, una enfermedad maligna y una célula tumoral es una célula cancerosa. Preferentemente, una "enfermedad tumoral" se caracteriza por células que expresan CLDN6 y una célula tumoral expresa CLDN6. El cáncer (término médico: neoplasia maligna) es una clase de enfermedades en las que un grupo de células muestra un crecimiento incontrolado (división más allá de los límites normales), invasión (intrusión y destrucción de tejidos adyacentes) y, a veces, metástasis (propagación a otras ubicaciones en el cuerpo a través de la linfa o la sangre). Estas tres propiedades malignas de los cánceres los diferencian de los tumores benignos, que son autolimitados y no invaden ni hacen metástasis. La mayoría de los cánceres forman un tumor, pero algunos, como la leucemia, no.

Una célula que expresa CLDN6, preferentemente, es una célula tumoral o célula cancerosa, preferentemente, de los tumores y cánceres descritos en la presente descripción. Preferentemente, tal célula es una célula distinta de una célula placentaria.

Los cánceres se clasifican por el tipo de célula que se asemeja al tumor y, por lo tanto, al tejido que se supone que es el origen del tumor. Estas son la histología y la ubicación, respectivamente.

El término "cáncer" de acuerdo con la enseñanza, comprende leucemias, seminomas, melanomas, teratomas, linfomas, neuroblastomas, gliomas, cáncer rectal, cáncer de endometrio, cáncer de riñón, cáncer adrenal, cáncer de tiroides, cáncer de la sangre, cáncer de piel, cáncer de cerebro, cáncer cervical, cáncer intestinal, cáncer de hígado, cáncer de colon, cáncer de estómago, cáncer intestinal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer gastrointestinal, cáncer de ganglios linfáticos, cáncer de esófago, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de garganta, nariz, y oídos (ENT, por sus siglas en inglés), cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de útero, cáncer de ovario, y cáncer de pulmón y las metástasis de los mismos. Los ejemplos de estos son carcinomas de pulmón, carcinomas de mama, carcinomas de próstata, carcinomas de colon, carcinomas de células renales, carcinomas cervicales, o metástasis de los tipos de cáncer o tumores descritos anteriormente. El término cáncer de acuerdo con la presente enseñanza, comprende además, las metástasis del cáncer.

Las enfermedades tumorales o cánceres preferidos de acuerdo con la enseñanza se seleccionan del grupo que consiste en cáncer de ovario, en particular, adenocarcinoma de ovario y teratocarcinoma de ovario, cáncer de pulmón, que incluye cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC, por sus siglas en inglés) y cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC, por sus siglas en inglés), en particular, carcinoma de pulmón de células escamosas y adenocarcinoma, cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer hepático, cáncer de páncreas, cáncer de piel, en particular, carcinoma de célula basal y carcinoma de célula escamosa, melanoma maligno, cáncer de cabeza y cuello, en particular, adenoma pleomórfico maligno, sarcoma, en particular, sarcoma sinovial y carcinosarcoma, cáncer de vías biliares, cáncer de la vejiga urinaria, en particular, carcinoma de célula transicional y carcinoma papilar, cáncer de riñón, en particular, carcinoma de células renales que incluye carcinoma de células renales de células claras y carcinoma de células renales papilares, cáncer de colon, cáncer de intestino delgado, que incluye cáncer de íleon, en particular, adenocarcinoma de intestino delgado y adenocarcinoma del íleon, carcinoma embrionario testicular, coriocarcinoma placentario, cáncer cervical, cáncertesticular, en particular, seminoma testicular, teratoma testicular y cáncer testicular embrionario, cáncer uterino, y las formas metastásicas de los mismos.

Particularmente, las enfermedades tumorales o cánceres preferidos de acuerdo con la enseñanza se seleccionan del grupo que consiste en cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de ovario metastásico y cáncer de pulmón metastásico. Preferentemente, el cáncer de ovario es un carcinoma de ovario o un adenocarcinoma de ovario. Preferentemente, el cáncer de pulmón es un carcinoma o un adenocarcinoma, y preferentemente, es un cáncer bronquiolar tal como un carcinoma bronquiolar o un adenocarcinoma bronquiolar. En una modalidad, la célula tumoral es una célula de dicho cáncer. Los cánceres de ovario metastásicos incluyen carcinomas de ovario metastásicos y adenocarcinomas de ovario metastásicos, y los cánceres de pulmón metastásicos incluyen carcinomas de pulmón metastásicos, adenocarcinomas de pulmón metastásicos, carcinomas bronquiolares metastásicos y adenocarcinomas bronquiolares metastásicos.

Los principales tipos de cáncer de pulmón son el carcinoma de pulmón de células pequeñas (SCLC) y el carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Hay tres subtipos principales de carcinomas de pulmón de células no pequeñas: carcinoma de pulmón de células escamosas, adenocarcinoma y carcinoma de pulmón de células grandes. Los adenocarcinomas representan aproximadamente el 10 % de los cánceres de pulmón. Generalmente, este cáncer se observa periféricamente en los pulmones, a diferencia del cáncer de pulmón de células pequeñas y cáncer de pulmón de células escamosas, que tienden a tener una localización más central.

El cáncer de piel es un crecimiento maligno en la piel. Los cánceres de piel más comunes son el cáncer de células basales, el cáncer de células escamosas y el melanoma. El melanoma maligno es un tipo grave de cáncer de piel. Se debe al crecimiento incontrolado de células pigmentarias, llamadas melanocitos.

De acuerdo con la enseñanza, un "carcinoma" es un tumor maligno derivado de las células epiteliales. Este grupo representa los cánceres más comunes, que incluye las formas comunes de cáncer de mama, próstata, pulmón y colon.

"Carcinoma bronquiolar" es un carcinoma de pulmón, que se cree que se deriva del epitelio de los bronquiolos terminales, en el cual el tejido neoplásico se extiende a lo largo de las paredes alveolares y crece en pequeñas masas dentro de los alvéolos. La mucina puede demostrarse en algunas de las células y en el material en los alvéolos, que incluye, además, las células desprovistas.

"Adenocarcinoma" es un cáncer que se origina en el tejido glandular. Este tejido es parte, además, de una categoría de tejido más grande conocido como tejido epitelial. El tejido epitelial incluye piel, glándulas y una variedad de otros tejidos que recubren las cavidades y los órganos del cuerpo. El epitelio se deriva embriológicamente a partir de ectodermo, endodermo y mesodermo. Para clasificarse como adenocarcinoma, las células no necesitan necesariamente formar parte de una glándula, siempre que tengan propiedades secretoras. Esta forma de carcinoma puede ocurrir en algunos mamíferos superiores, incluyendo los seres humanos. Los adenocarcinomas bien diferenciados tienden a parecerse al tejido glandular del que se derivan, mientras que los pobremente diferenciados pueden no serlo. Al teñir las células de una biopsia, un patólogo determinará si el tumor es un adenocarcinoma o algún otro tipo de cáncer. Los adenocarcinomas pueden surgir en muchos tejidos del cuerpo debido a la naturaleza ubicua de las glándulas dentro del cuerpo. Mientras que cada glándula puede no secretar la misma sustancia, siempre que exista una función exocrina para la célula, se considera glandular y su forma maligna se denomina, por lo tanto, adenocarcinoma. Los adenocarcinomas malignos invaden otros tejidos y, frecuentemente, con tiempo suficiente hacen metástasis. El adenocarcinoma de ovario es el tipo más común de carcinoma de ovario. Incluye los adenocarcinomas serosos y mucinosos, el adenocarcinoma de células claras y el adenocarcinoma endometrial.

"Cistoadenocarcinoma" es una forma maligna de un tumor epitelial estromal superficial, un tipo de cáncer de ovario.

Los tumores estromales epiteliales superficiales son una clase de neoplasmas ováricos que se creen derivados del epitelio superficial ovárico (peritoneo modificado) o del tejido endometrial ectópico o del tubo de Falopio (tubárico). Este grupo de tumores representa la mayoría de todos los tumores de ovario.

El "coriocarcinoma" es un cáncer maligno, trofoblástico y agresivo, usualmente de la placenta. Se caracteriza por una diseminación hematógena temprana a los pulmones.

El carcinoma de células renales, conocido también como cáncer de células renales o adenocarcinoma de células renales es un cáncer de riñón que se origina en el revestimiento del túbulo contorneado proximal, los tubos muy pequeños en el riñón que filtran la sangre y eliminan los productos de desecho. El carcinoma de células renales es, con mucho, el tipo más común de cáncer de riñón en adultos y el más letal de todos los tumores genitourinarios. Los distintos subtipos de carcinoma de células renales son el carcinoma de células renales de células claras y el carcinoma de células renales papilares. El carcinoma de células renales de células claras es la forma más común del carcinoma de células renales. Cuando se observan bajo un microscopio, las células que componen el carcinoma de células renales de células claras aparecen muy pálidas o claras. El carcinoma de células renales papilares es el segundo subtipo más común. Estos cánceres forman pequeñas proyecciones en forma de dedos (denominadas papilas) en algunos, si no en la mayoría, de los tumores.

Un sarcoma es un tumor maligno derivado del tejido conectivo o células mesenquimales. Esto está en contraste con los carcinomas, que son de origen epitelial. Un sarcoma sinovial es una forma rara de cáncer que generalmente ocurre cerca de las articulaciones del brazo o la pierna. Es uno de los sarcomas de tejidos blandos.

Un tumor de células germinales es una neoplasia derivada de células germinales. Los tumores de células germinales pueden ser tumores cancerosos o no cancerosos. Las células germinales, normalmente, se encuentran dentro de las gónadas (ovario y testículo). Los tumores de células germinales que se originan fuera de las gónadas (por ejemplo, en la cabeza, dentro de la boca, cuello, pelvis, en fetos, bebés y niños pequeños que la mayoría se encuentran frecuentemente en la línea media del cuerpo, particularmente en la punta del cóccix) pueden ser defectos de nacimiento que resultan de errores durante el desarrollo del embrión.

Las dos clases principales de tumores de células germinales son los seminomas y los no seminomas, en donde los no seminomas incluyen: teratocarcinoma, carcinoma embrionario, tumores del saco vitelino, coriocarcinoma y teratoma diferenciado. La mayoría de las líneas celulares de los no seminomas son equivalentes a los carcinomas embrionarios, es decir, están compuestos casi en su totalidad por células madre que no se diferencian en condiciones basales, aunque algunas pueden responder a inductores de diferenciación tal como el ácido retinoico.

El teratocarcinoma se refiere aun tumor de células germinales que es una mezcla de teratoma con carcinoma embrionario, o con coriocarcinoma, o con ambos. Este tipo de tumor de células germinales mixto puede conocerse simplemente como un teratoma con elementos de carcinoma embrionario o coriocarcinoma, o simplemente ignorar el componente teratoma y referirse solo a su componente maligno: carcinoma embrionario y/o coriocarcinoma.

El linfoma y la leucemia son tumores malignos derivados de células hematopoyéticas (formadoras de sangre).

El tumor blástico o blastoma es un tumor (generalmente maligno) que se asemeja a un tejido inmaduro o embrionario. Muchos de estos tumores son más comunes en niños.

Por "metástasis" se entiende la propagación de las células cancerosas desde su sitio original a otra parte del cuerpo. La formación de metástasis es un proceso muy complejo y depende del desprendimiento de las células malignas del tumor primario, la invasión de la matriz extracelular, la penetración de las membranas basales del endotelio para entrar en la cavidad y en los vasos del cuerpo, y después, tras haberse transportado por la sangre, la infiltración en los órganos objetivo. Finalmente, el crecimiento de un nuevo tumor, es decir, un tumor secundario o metastásico, en el sitio diana depende de la angiogénesis. A menudo la metástasis del tumor ocurre incluso después de la remoción del tumor primario porque las células o componentes tumorales pueden permanecer y desarrollar un potencial metastásico. En una modalidad, el término "metástasis" de acuerdo con la descripción se refiere a "metástasis distante" que se relaciona con una metástasis que se halla remota del tumor primario y del sistema de nódulos linfáticos regional.

Las células de un tumor secundario o metastásico son como las del tumor original. Esto significa, por ejemplo, que si el cáncer de ovario hace metástasis en el hígado, el tumor secundario se forma por células ováricas anormales, no por células hepáticas anormales. El tumor en el hígado entonces se denomina cáncer de ovario metastásico, no cáncer de hígado.

En el cáncer de ovario, la metástasis puede ocurrir de las siguientes maneras: por contacto directo o extensión, puede invadir tejidos u órganos cercanos ubicados cerca o alrededor del ovario, como las trompas de Falopio, el útero, la vejiga, el recto, etc.; al sembrarse o desprenderse en la cavidad abdominal, que es la manera más común de propagación del cáncer de ovario. Las células cancerosas se desprenden de la superficie de la masa ovárica y "caen" en otras estructuras del abdomen, como el hígado, el estómago, el colon o el diafragma; al desprenderse de la masa ovárica, invadir los vasos linfáticos y luego viajar a otras áreas del cuerpo u órganos distantes tales como el pulmón o el hígado; al desprenderse de la masa ovárica, invadir el sistema sanguíneo y viajar a otras áreas del cuerpo u órganos distantes.

De acuerdo con la enseñanza, el cáncer de ovario metastásico incluye cáncer en las trompas de Falopio, cáncer en los órganos del abdomen, tales como cáncer en el intestino, cáncer en el útero, cáncer en la vejiga, cáncer en el recto, cáncer en el hígado, cáncer en el estómago, cáncer en el colon, cáncer en el diafragma, cáncer en los pulmones, cáncer en el revestimiento del abdomen o la pelvis (peritoneo) y cáncer en el cerebro. De manera similar, el cáncer de pulmón metastásico se refiere al cáncer que se ha diseminado desde los pulmones a sitios distantes y/o variados en el cuerpo e incluye cáncer en el hígado, cáncer en las glándulas suprarrenales, cáncer en los huesos y cáncer en el cerebro.

Una recaída o recurrencia se produce cuando una persona se ve afectada nuevamente por una afección que la afectó en el pasado. Por ejemplo, si un paciente ha sufrido una enfermedad tumoral, ha recibido un tratamiento exitoso de dicha enfermedad y desarrolla nuevamente dicha enfermedad, dicha enfermedad recientemente desarrollada puede considerarse una recaída o recurrencia. Sin embargo, de acuerdo con la enseñanza, una recaída o recurrencia de una enfermedad tumoral puede, pero no necesariamente, producirse en el sitio de la enfermedad tumoral original. Así, por ejemplo, si una paciente ha sufrido un tumor ovárico y ha recibido un tratamiento exitoso, una recaída o recurrencia puede ser la aparición de un tumor ovárico o la aparición de un tumor en un sitio diferente al ovario. Una recaída o recurrencia de un tumor incluye, además, situaciones en donde un tumor se produce en un sitio diferente al sitio del tumor original, así como también en el sitio del tumor original. Preferentemente, el tumor original para el que el paciente ha recibido un tratamiento es un tumor primario y el tumor en un sitio diferente al sitio del tumor original es un tumor secundario o metastásico.

Por "tratar" se entiende administrar un compuesto o composición como se describe en la presente descripción a un sujeto para: prevenir o eliminar un tumor o reducir el tamaño de un tumor o el número de tumores en un sujeto; detener o retrasar el crecimiento de un tumor en un sujeto; inhibir o retrasar el desarrollo de un nuevo tumor o metástasis tumoral en un sujeto; disminuir la frecuencia o severidad de los síntomas y/o recurrencias en un sujeto que actualmente tiene o que previamente ha tenido cáncer; y/o prolongar, es decir, aumentar la vida útil del sujeto.

En particular, el término "tratamiento de una enfermedad" incluye curar, acortar la duración, mejorar, prevenir, retrasar o inhibir la progresión o el empeoramiento, o prevenir o demorar la aparición de una enfermedad o los síntomas de esta.

Por "está en riesgo" se entiende un sujeto, es decir, un paciente, que se identifica que tiene una posibilidad mayor de la normal de desarrollar una enfermedad tumoral, en particular cáncer, en comparación con la población general. Además, un sujeto que ha tenido, o que tiene recientemente, una enfermedad tumoral, en particular cáncer, es un sujeto que tiene un mayor riesgo de desarrollar cáncer, ya que dicho sujeto puede continuar con el desarrollo de cáncer. Los sujetos que recientemente tienen o han tenido un cáncer tienen, además, un riesgo aumentado de metástasis de tumor.

El término "inmunoterapia" se refiere a un tratamiento que involucra una reacción inmune específica. En el contexto de la presente enseñanza, los términos tales como "proteger", "prevenir", "profiláctico", "preventivo" o "protector" se refieren a la prevención o al tratamiento, o ambos, de la aparición y/o propagación de un tumor en un individuo y, en particular, minimizar la posibilidad que el sujeto desarrollará un tumor o retardar el desarrollo de un tumor. Por ejemplo, una persona en riesgo de un tumor, como se describió anteriormente, sería un candidato para la terapia para prevenir un tumor.

Una administración profiláctica de una inmunoterapia, por ejemplo, una administración profiláctica de la composición inmunogénica de la enseñanza, preferentemente, protege al receptor del desarrollo del crecimiento tumoral. Una administración terapéutica de una inmunoterapia, por ejemplo, una administración terapéutica de la composición de la enseñanza, puede conducir a la inhibición del progreso/crecimiento del tumor. Esto comprende la desaceleración del progreso/crecimiento del tumor, en particular una interrupción de la progresión del tumor, que conduce, preferentemente, a la eliminación del tumor.

El término "in vivo" se refiere a la situación en un sujeto.

Los términos "sujeto", "individuo", o "paciente" se usan indistintamente y se refieren a vertebrados, preferentemente, mamíferos. Por ejemplo, los mamíferos en el contexto de la presente invención son seres humanos, primates no humanos, animales domesticados tales como perros, gatos, ovejas, vacuno, cabras, cerdos, caballos, etc., animales de laboratorio tales como ratones, ratas, conejos, conejillos de indias, etc., así como también animales en cautiverio, tal como animales de zoológicos. El término "animal" como se usa en la presente descripción incluye, además, a los seres humanos. El término "sujeto" puede incluir, además, un paciente, es decir, un animal, preferentemente, un ser humano que tiene una enfermedad, preferentemente, una enfermedad asociada con la expresión de CLDN6, preferentemente una enfermedad tumoral tal como un cáncer.

Como parte de la composición para una inmunización o vacunación, preferentemente, se administran uno o más agentes como se describe en la presente descripción conjuntamente con uno o más adyuvantes para inducir una respuesta inmune o para aumentar una respuesta inmune. El término "adyuvante" se refiere a los compuestos que prolongan o potencian o aceleran una respuesta inmunitaria. La composición de la presente enseñanza, preferentemente, ejerce su efecto sin la adición de adyuvantes. Aun así, la composición de la presente descripción puede contener cualquier adyuvante conocido. Los adyuvantes comprenden un grupo heterogéneo de compuestos tales como emulsiones de aceite (por ejemplo, adyuvantes de Freund), compuestos minerales (tal como alumbre), productos bacterianos (tal como toxina de Bordetella pertussis), liposomas, y complejos inmunoestimulantes. Los ejemplos de adyuvantes son monofosforil lípido A (MPL SmithKline Beecham). Saponinas tales como QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; el documento núm. WO 96/33739), QS7, QS17, QS18, y QS-L1 (So y otros, 1997, Mol. Cells 7: 178-186), adyuvantes incompletos de Freund, adyuvantes completos de Freund, vitamina E, montanide, alumbre, oligonucleótidos CpG (Krieg y otros, 1995, Nature 374: 546-549), y diversas emulsiones de agua en aceite que se preparan a partir de aceites biológicamente degradables tales como escualeno y/o tocoferol.

De acuerdo con la presente enseñanza, una "muestra" puede ser cualquier muestra útil de acuerdo con la presente enseñanza, en particular una muestra biológica tal como muestra de tejido, que incluye fluidos corporales, y/o una muestra celular y puede obtenerse de manera convencional tal como mediante biopsia de tejido, que incluye biopsia por punción, y mediante toma de sangre, aspirado bronquial, esputo, orina, heces fecales u otros fluidos corporales. De acuerdo con la enseñanza, el término "muestra" incluye, además, muestras procesadas tales como fracciones o aislados de muestras biológicas, por ejemplo, aislados de ácidos nucleicos y péptidos/proteínas.

Pueden administrarse, además, otras sustancias que estimulan una respuesta inmunitaria del paciente. Es posible, por ejemplo, usar citocinas en una vacunación, debido a sus propiedades reguladoras sobre los linfocitos. Dichas citocinas comprenden, por ejemplo, interleucina-12 (IL-12) que ha demostrado que aumenta las acciones protectoras de las vacunas (Hall (1995) Science 268: 1432-1434), GM-CSF e IL-18.

Existe una cantidad de compuestos que aumentan la respuesta inmunitaria y que, por consiguiente, pueden usarse en una vacunación. Dichos compuestos comprenden moléculas coestimuladoras proporcionadas en la forma de proteínas o ácidos nucleicos tales como B7-1 y B7-2 (CD80 y CD86, respectivamente).

Los compuestos activos terapéuticamente pueden administrarse mediante una de las vías convencionales, lo que incluye la inyección o la infusión. La administración puede llevarse a cabo, por ejemplo, oralmente, intravenosamente, intraperitonealmente, intramuscularmente, subcutáneamente o transdérmicamente. Preferentemente, los anticuerpos se administran terapéuticamente por medio de un aerosol pulmonar.

En una modalidad adicional, los anticuerpos de la enseñanza pueden formularse para prevenir o reducir su transporte a través de la placenta. Esto puede hacerse mediante métodos conocidos en la materia, por ejemplo, mediante la PEGilación de los anticuerpos o por medio del uso de fragmentos F(ab)2'. Se pueden hacer más referencias a "Cunningham-Rundles C, Zhuo Z, Griffith B, Keenan J. (1992) Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulin conjugates. Resistance to enzymatic degradation. J. Immunol. Methods, 152: 177-190; y en "Landor M. (1995) Maternalfetal transfer of immunoglobulins, Ann. Allergy Asthma Immunol. 74: 279-283.

Las composiciones descritas en la descripción se administran en cantidades eficaces. Una "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad que logra una reacción deseada o un efecto deseado solo o junto con dosis adicionales. En el caso del tratamiento de una enfermedad particular o de una afección particular, la reacción deseada se relaciona, preferentemente, con la inhibición del curso de la enfermedad. Esto comprende ralentizar el progreso de la enfermedad y, en particular, interrumpir o revertir el progreso de la enfermedad. La reacción deseada en un tratamiento de una enfermedad o de una afección puede ser también un retraso en la aparición o una prevención de la aparición de dicha enfermedad o de dicha afección.

Una cantidad eficaz de una composición de la enseñanza dependerá de la condición a tratar, la gravedad de la enfermedad, los parámetros individuales del paciente, lo que incluye la edad, la condición fisiológica, el tamaño y el peso, la duración del tratamiento, el tipo de la terapia de acompañamiento (si está presente), la vía específica de administración y factores similares. En consecuencia, las dosis de las composiciones administradas de la enseñanza pueden depender de varios de tales parámetros. En el caso que una reacción en un paciente sea insuficiente con una dosis inicial pueden usarse dosis más altas (o dosis eficazmente mayores alcanzadas por una vía de administración diferente, más localizada).

Las composiciones farmacéuticas de la descripción son, preferentemente, estériles y contienen una cantidad eficaz de la sustancia activa terapéuticamente para generar la reacción deseada o el efecto deseado.

Las composiciones farmacéuticas de la enseñanza se administran generalmente en cantidades compatibles farmacéuticamente y en preparación compatible farmacéuticamente. El término "compatible farmacéuticamente" se refiere a un material no tóxico que no interactúa con la acción del componente activo de la composición farmacéutica. Las preparaciones de este tipo pueden contener usualmente sales, sustancias tampón, conservantes, portadores, lo que complementa las sustancias que potencian la inmunidad tales como los adyuvantes, por ejemplo, oligonucleótidos CpG, citocinas, quimiocinas, saponinas, GM-CSF y/o ARN y, donde sea apropiado, otros compuestos terapéuticamente activos. Cuando se usan en medicina, las sales deberían ser compatibles farmacéuticamente. Sin embargo, las sales que no son compatibles farmacéuticamente pueden usarse para preparar sales compatibles farmacéuticamente y se incluyen en la descripción. Las sales compatibles farmacológicamente y farmacéuticamente de este tipo comprenden de manera no limitativa, aquellas preparadas a partir de los ácidos siguientes: ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, cítrico, fórmico, malónico, y succínico. Las sales compatibles farmacéuticamente pueden prepararse, además, como sales de metales alcalinos o sales de metales alcalinotérreos, tales como sales de sodio, sales de potasio o sales de calcio.

Una composición farmacéutica de la enseñanza puede comprender un portador compatible farmacéuticamente. El término "portador" se refiere a un componente orgánico o inorgánico, de naturaleza natural o sintética, en el que el componente activo se combina con el fin de facilitar la aplicación. De acuerdo con la enseñanza, el término "portador compatible farmacéuticamente" incluye, uno o más rellenos sólidos o líquidos, diluyentes o sustancias de encapsulación, que son adecuadas para la administración a un paciente. Los componentes de la composición farmacéutica de la descripción son usualmente tales que no se produce interacción que perjudique sustancialmente la eficacia farmacéutica deseada.

Las composiciones farmacéuticas de la descripción pueden contener sustancias tampón adecuadas tales como ácido acético en una sal, ácido cítrico en una sal, ácido bórico en una sal y ácido fosfórico en una sal.

Las composiciones farmacéuticas pueden contener, además, cuando sea apropiado, conservantes adecuados tales como cloruro de benzalconio, clorobutanol, parabeno y tiomersal.

Las composiciones farmacéuticas se proporcionan usualmente en una forma de dosificación uniforme y pueden prepararse de una forma conocida per se. Las composiciones farmacéuticas de la descripción pueden estar, por ejemplo, en forma de cápsulas, comprimidos, tabletas, soluciones, suspensiones, jarabes, elíxires o, en la forma de una emulsión.

Las composiciones adecuadas para la administración parenteral comprenden usualmente una preparación acuosa o no acuosa estéril del componente activo, que es, preferentemente, isotónica para la sangre del receptor. Ejemplos de portadores y disolventes compatibles son la solución de Ringer y la solución de cloruro de sodio isotónica. Adicionalmente, se usan aceites fijados, usualmente estériles, como solución o medio de suspensión.

La presente invención se describe en detalle mediante las figuras y los ejemplos más abajo, que se usan solamente para propósitos ilustrativos y no pretenden ser limitativos. Debido a la descripción y los ejemplos, las modalidades adicionales que se incluyen del mismo modo en la invención son asequibles para el trabajador experto.

Figuras:

Figura 1:

Especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales murinos anti-CLDN6 muMAB 5F2D2, 27Ay 36A.

Los anticuerpos MuMAB 5F2D2, 27A y 36A se unen fuertemente a las células que expresan CLDN6, mientras que no se unen a las células que expresan CLDN3 o CLDN4.

Figura 2:

Titulación de la unión de muMAB 5F2D2 a células HEK293T transfectadas transitoriamente con CLDN6, 3, 4 o 9, respectivamente.

El MuMAB 5F2D2 muestra una fuerte unión a la CLDN6 humana y una unión débil a la CLDN9 humana. El anticuerpo no interactúa con CLDN3 o 4 humanos.

Figura 3:

Titulación de la unión de muMAB 27A a células HEK293T transfectadas transitoriamente con CLDN6, 3, 4 o 9, respectivamente.

El MuMAB 27A muestra una fuerte unión a la CLDN6 humana y una unión muy débil a la CLDN9 humana. El anticuerpo no interactúa con CLDN3 o 4 humanos.

Figura 4:

Titulación de la unión de muMAB 36A a células HEK293T transfectadas transitoriamente con CLDN6, 3, 4 o 9, respectivamente.

El MuMAB 36A muestra una fuerte unión a la CLDN6 humana y prácticamente ninguna unión a la CLDN9 humana. El anticuerpo no interactúa con CLDN3 o 4 humanos.

Figura 5:

Afinidades relativas de los anticuerpos monoclonales murinos anti-CLDN6 muMAB 5F2D2, 27Ay 36A.

Los MuMAB 5F2D2 y 27A exhiben valores de CE50 de 350-450 ng/mL y la saturación de la unión se logra a bajas concentraciones, mientras que muMAB 36A no muestra saturación de la unión incluso a la concentración más alta. Figura 6:

Actividad de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo monoclonal murino anti-CLDN6 muMAB 5F2D2.

El MuMAB 5F2D2 muestra actividad de CDC de una manera dependiente de la dosis.

Figura 7:

Actividad de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) de los anticuerpos monoclonales murinos anti-CLDN6 muMAB 27A y 36A.

El MuMAB 27A exhibe actividad de CDC dependiente de la dosis, mientras que muMAB 36A no es capaz de inducir CDC in vitro.

Figura 8:

Inducción de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) por el anticuerpo anti-CLDN6 quimérico chimAB 5F2D2 en NEC8 y NEC8 LVTS2 54 que expresan CLDN6 de forma endógena (desactivación de CLDN6).

El anticuerpo anti-CLDN6 quimérico chimAB 5F2D2 induce ADCC en células NEC8 con células efectoras de dos donantes diferentes de una manera dependiente de la dosis. La eficiencia para inducir ADCC en las células NEC8 LVTS2 54 (desactivación de CLDN6) disminuye fuertemente con chimAB 5F2D2.

Figura 9:

Efecto terapéutico de muMAB 5F2D2 en un modelo de xenoinjerto de tratamiento temprano.

El MuMAB 5F2D2 muestra una inhibición específica y fuerte del crecimiento tumoral en ratones injertados con células HEK293 que expresan establemente CLDN6 humana.

Figura 10:

Efecto terapéutico de muMAB 5F2D2 en un modelo de xenoinjerto de tratamiento temprano.

Los volúmenes tumorales se reducen significativamente en el día 28 (y posteriormente) después del tratamiento con muMAB 5F2D2 en una prueba de Kruskal-Wallis.

Figura 11:

Efecto terapéutico de muMAB 5F2D2 en un modelo de xenoinjerto de tratamiento temprano.

Los ratones tratados con el anticuerpo monoclonal murino anti-CLDN6 muMAB 5F2D2 muestran una supervivencia prolongada en comparación con los grupos control de PBS.

Figura 12:

Efecto terapéutico de muMAB 27A en un modelo de xenoinjerto de tratamiento temprano.

El MuMAB 27A muestra una inhibición específica y fuerte del crecimiento tumoral en ratones injertados con células HEK293 que expresan establemente CLDN6 humana.

Figura 13:

Efecto terapéutico de muMAB 36A en un modelo de xenoinjerto de tratamiento temprano.

El MuMAB 36A muestra una inhibición específica y fuerte del crecimiento tumoral en ratones injertados con células HEK293 que expresan establemente CLDN6 humana.

Figura 14:

Efecto terapéutico de muMAB 27A y 36A en un modelo de xenoinjerto de tratamiento temprano.

Los ratones tratados con los anticuerpos monoclonales murinos anti-CLDN6 muMAB 27A y 36A muestran una supervivencia prolongada.

Figura 15:

Análisis de inmonoblot de la expresión de CLDN3, 4, 6 y 9 humanas, en células NEC8.

La línea celular NEC8 de tumor de células germinales testiculares solo muestra la expresión de CLDN6 (A) pero no de CLDN3, 4 o 9, respectivamente (B).

Figura 16:

Análisis de la expresión superficial de CLDN6 en células NEC8 mediante el uso de citometría de flujo.

La CLDN6 se expresa en células NEC8.

Figura 17:

Efecto terapéutico de muMAB 5F2D2 en un modelo de xenoinjerto de tratamiento temprano mediante el uso de ratones injertados con la línea celular tumoral NEC8.

En comparación con el grupo control de solución salina, el muMAB 5F2D2 mostró inhibición específica y fuerte del crecimiento tumoral en ratones injertados con células NEC8 que expresan CLDN6 humana de forma endógena.

Figura 18:

Efecto terapéutico de muMAB 5F2D2 en un modelo de xenoinjerto de tratamiento temprano mediante el uso de ratones injertados con la línea celular tumoral NEC8.

La prueba de Kruskal-Wallis muestra que los volúmenes tumorales se reducen a los días 21 y 42 después del tratamiento con muMAB 5F2D2.

EJEMPLOS

Las técnicas y métodos usados en la presente descripción se llevan a cabo de la forma conocida per se y como se describen, por ejemplo, en Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da Edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York. Todos los métodos, incluido el uso de kits y reactivos, se llevan a cabo de acuerdo con la información del fabricante a menos que se indique específicamente.

Ejemplo 1: Materiales y Métodos

A. Generación de anticuerpos murinos contra CLDN6

a. Generación de vectores de expresión que codifican CLDN6 de longitud completa y fragmentos de CLDN6 Se preparó por síntesis química (GENEART AG, Alemania) una secuencia de ADN no natural, optimizada por codón (SEQ ID NO: 10) que codifica la Cl Dn 6 de longitud completa (SEQ ID NO: 2) y se clonó en el vector pcDNA3.1/myc-His (Invitrogen, EE.UU.) lo que produjo el vector p3953. La inserción de un codón de parada permitió la expresión de la proteína CLDN6 sin fusionarse con el vector codificado por la etiqueta myc-His. La expresión de CLDN6 se probó mediante análisis por Western blot, citometría de flujo e inmunofluorescencia mediante el uso de anticuerpos anti-CLDN6 disponibles comercialmente (ARP, 01-8865; R&D Systems, MAB3656).

Además, se preparó una secuencia de ADN optimizada por codones (SEQ ID NO: 11) que codifica para el fragmento putativo del dominio extracelular 2 (EC2) de CLDN6 (SEQ ID NO: 5) como una fusión con un péptido señal derivado de la guía de un N-terminal de Ig kappa seguido por 4 aminoácidos adicionales para asegurar un correcto sitio de escisión de peptidasa señal (SEQ ID NO: 12) y se clonó en el vector pcDNA3.1/myc-His lo que produjo el vector p3974. Antes de la inmunización, la expresión del fragmento EC2 se confirmó mediante microscopía de inmunofluorescencia en células CHO-K1 transfectadas transitoriamente y fijadas con paraformaldehído (PFA) mediante el uso de un anticuerpo anti-myc disponible comercialmente (Cell Signaling, MAB 2276).

b. Generación de líneas celulares que expresan establemente CLDN6

Las líneas celulares HEK293 y P3X63Ag8U.1 que expresan establemente CLDN6 se generaron mediante técnicas estándar por medio del uso del vector p3953.

c. Inmunizaciones

MuMAB 5F2D2: Los ratones Balb/c se inmunizaron con 25 |jg de ADN plasmídico p3974 junto con 4 jL de PEI-manosa (PEI-Man; in vivo-jetPEI™-Man de PolyPlus Transfection) (PEI-Man 150 mM en H²O con glucosa al 5 %) mediante inyección intraperitoneal en los días 0, 16 y 36. En los días 48 y 62 se inmunizaron ratones mediante inyección intraperitoneal con 2 x 107 células de mieloma P3X63Ag8U.1 transfectadas con el vector p3953 para expresar de manera estable la CLDN6. Las células administradas el día 62 se irradiaron con 3000 rad antes de la inyección.

MuMAB 27A: Se inmunizaron ratones Balb/c mediante inyección intraperitoneal con 2 x 107 células de mieloma P3X63Ag8U.1 transfectadas con el vector p3953 para expresar de manera estable la CLDN6 en los días 0 y 13. Los ratones que desarrollaron tumores se reforzaron mediante inyección intraperitonal con 2 x 107 de células HEK293 transfectadas de manera estable con el vector p3953 en el día 21. Después de tres días, se sacrificaron los ratones y se prepararon los esplenocitos. 5 x 107 esplenocitos se trasplantaron a otro ratón Balb/c mediante inyección intravenosa. En los días 35, 49, 67 y 104 los ratones trasplantados se inmunizaron por inyección intraperitoneal con 2 x 107 células de mieloma P3X63Ag8u.1 transfectadas con el vector p3953 junto con oligodesoxinucleótidos CpG modificados con fosforotioato purificados por HPLC (PTO-CpG-ODN) (50 |jg; 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT; Eurofins MWG Operon, Alemania). Antes de la administración, las células se trataron con mitomicina-C (5 jg/mL, Sigma-Aldrich, M4287).

Los ratones MuMAB 36A:C57BL/6 se inmunizaron con 25 jg de ADN plasmídico p3974 junto con 4 jL de PEI-manosa (PEI-Man; in vivo-jetPEI™-Man de PolyPlus Transfection) (PEI-Man 150 mM en H²O con glucosa al 5 %) mediante inyección intraperitoneal en los días 0, 16 y 36. En los días 55, 69 y 85 se inmunizaron ratones mediante inyección intraperitoneal con 2 x 107 células de mieloma P3X63Ag8U.1 transfectadas con el vector p3953 para expresar de manera estable la CLDN6. El día 85 se administraron células junto con PTO-CpG-ODN purificado por Hp LC (50 jg en PBS; 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT; Eurofins MWG Operon, Alemania).

La presencia de anticuerpos dirigidos contra CLDN6 en sueros de ratones se monitoreó mediante microscopía de inmunofluorescencia mediante el uso de células CHO-K1 cotransfectadas con ácidos nucleicos que codifican para CLDN6 y GFP. Con esta finalidad, 24 h después de la transfección, las células fijadas o no fijadas con PFA se incubaron con una dilución 1:100 de sueros de ratones inmunizados durante 45 min a temperatura ambiente (RT). Las células se lavaron, incubaron con un anticuerpo anti Ig de ratón marcado con Alexa555 (Molecular Probes) y se sometieron a microscopía de fluorescencia.

Para la generación de anticuerpos monoclonales, los ratones con respuestas inmunes anti-CLDN6 detectables se reforzaron cuatro días antes de la esplenectomía mediante inyección intraperitoneal de 2 x 107 células de HEK293 establemente transfectadas con el vector p3953.

d. Generación de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales murinos contra CLDN6

6 x 107 esplenocitos aislados de un ratón inmunizado se fusionaron con 3 x 107 células de la línea celular de mieloma de ratón P3X63Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) mediante el uso de PEG 1500 (Roche, CRL 10783641001). Las células se sembraron a aproximadamente 5 x 104 células por pocillo en placas de microtitulación de fondo plano y se cultivaron durante aproximadamente dos semanas en medio selectivo RPMI que contiene suero fetal bovino al 10 % inactivado por calor, suplemento de fusión y clonación de hibridoma al 1 % (HFCS, Roche, CRL 11363735), HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM, glucosa al 4,5 %, 2-mercaptoetanol 0,1 mM, penicilina/estreptomicina 1 x y suplemento HAT 1 x (Invitrogen, CRL 21060). Después de 10 a 14 días, los pocillos individuales se tamizaron por citometría de flujo para anticuerpos monoclonales anti-CLDN6. Los hibridomas que secretan anticuerpos se subclonaron mediante dilución limitante y se probaron de nuevo para los anticuerpos monoclonales anti-CLDN6. Los subclones estables se cultivaron para generar pequeñas cantidades de anticuerpo en un medio de cultivo tisular para su caracterización. Se seleccionó al menos un clon de cada hibridoma que retuvo la reactividad de las células parentales (probado por citometría de flujo). Se generaron bancos de células de nueve viales para cada clon y se almacenaron en nitrógeno líquido.

B. Citometría de flujo

Para probar la unión de los anticuerpos monoclonales a CLDN6 y otras claudinas, las células HEK293T, se transfectaron transitoriamente con el correspondiente plásmido que codifica la claudina y la expresión se analizó por citometría de flujo. Para diferenciar entre las células transfectadas y no transfectadas, se cotransfectaron las células HEK293T con un marcador de fluorescencia como reportero. 24 h después de la transfección, las células se cosecharon con tripsina/EDTA al 0,05 %, se lavaron con tampón FACS (PBS que contiene FCS al 2 % y azida sódica al 0,1 %) y se resuspendieron en tampón FACS a una concentración de 2 x 106 células/mL. Se incubaron 100 pL de la suspensión celular con el anticuerpo apropiado a las concentraciones indicadas durante 30 minutos a 4 °C. Los anticuerpos anti-claudina de ratón comercialmente disponibles anti-CLDN6 (R&D, CRL MAB3656), anti-CLDN3 (R&D, MAB4620) y anti-CLDN4 (R&D, MAB4219) sirvieron como controles positivos, mientras que los IgG2b de ratón (Sigma, CRL M8894) sirvieron como control de isotipo. Las células se lavaron tres veces con tampón FACS y se incubaron con un anticuerpo secundario específico a IgG 1+2a+2b+3a anti-ratón conjugado con aloficocianina (APC) (Dianova, CRL 115-135-164) durante 30 min a 4 °C. Las células se lavaron dos veces y se resuspendieron en tampón FACS. La unión se analizó mediante citometría de flujo por medio del uso de una matriz Bd FACS. La expresión del marcador de fluorescencia se trazó en el eje horizontal contra la unión del anticuerpo en el eje vertical.

La unión de anticuerpos monoclonales a líneas celulares que expresan CLDN6 de forma endógena se analizó de manera similar.

C. Análisis de inmunoblot

Las células NEC8 se analizaron para la expresión de CLDN6, 3, 4 y 9 por análisis de inmunoblot. Como control positivo, las células HEK293T se transfectaron transitoriamente con CLDN6, 3, 4, 9 o un plásmido simulado como control negativo. Las células se cosecharon en tampón Laemmli, se lisaron y se sometieron a s DS-PAGE. El gel se secó y se tiñó con un anticuerpo anti-CLDN3 (Invitrogen, 34-1700), anti-CLDN4 (Invitrogen, 32-9400), anti-CDLN6 (ARP, 01-8865) o anti-CLDN9 (Santa Cruz, sc- 17672), respectivamente. Después de la incubación con un anticuerpo secundario marcado con peroxidasa, la transferencia se desarrolló con el reactivo ECL y se visualizó mediante el uso del generador de imágenes LAS-3000 (Fuji).

D. Análisis de la CDC

La citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) se determinó al medir el contenido de ATP intracelular en las células no lisadas después de la adición del complemento humano a las células dianas incubadas con los anticuerpos anti-CLDN6. Como un método analítico muy sensible, la reacción bioluminiscente de la luciferasa se usó para medir el ATP.

Las células CHO-K1 establemente transfectadas con CLDN6 (CHO-K1-CLDN6) se cosecharon con tripsina/EDTA al 0,05 %, se lavaron dos veces con medio X-Vivo 15 (Lonza, BE04-418Q) y se suspendieron a una concentración de 1 x 107 células/mL en medio X-Vivo 15. Se transfirieron 250 pl de la suspensión celular a una cubeta de electroporación de 0,4 cm y se mezclaron in vitro con 7 pg de ARN transcrito que codifica para la luciferasa (ARN de la luciferasa IVT). Las células se electroporaron a 200 V y 300 pF por medio del uso de un Gene Pulser Xcell (Bio Rad). Después de la electroporación, las células se suspendieron en 2,4 mL de D-MEM/F12 precalentado (1:1) con medio GlutaMax-I (Invitrogen, 31331-093) que contiene FCS al 10 % (v/v), penicilina/estreptomicina al 1 % (v/v) y 1,5 mg/mL de G418. Se sembraron 50 pL de la suspensión celular por pozo en una placa de 96 pocillos blanca y se incubaron a 37 °C y 7,5 % de CO².24 h después de la electroporación, 50 pL de anticuerpos monoclonales murinos anti-CLDN6 en RPMI al 60 % (que contiene HEPES 20 mM) y suero humano al 40 % (mezcla de suero obtenido de seis donantes sanos) se añadieron a las células a las concentraciones indicadas. Se añadieron 10 pL por pocillo de Triton X-100 al 8 % (v/v) en PBS a los controles de lisis total, mientras que se añadieron 10 pL de PBS por pocillo a los controles con el máximo de células viables y a las muestras reales. Después de una incubación de 80 minutos a 37 °C y 7,5 % de CO², se adicionaron por pocillo 50 pL de la mezcla de luciferina (3,84 mg/mL de D-luciferina, 0,64 U/mL de ATPasa y HEPES 160 mM en ddH²O). La placa se incubó en la oscuridad durante 45 minutos a temperatura ambiente. La bioluminiscencia se midió mediante el uso de un luminómetro (Infinite M200, TECAN). Los resultados se dan como unidades de luz relativa digital integrada (RLU).

La lisis específica se calcula como sigue:

(m u e s tra - lis ís to tal)

Lisis específica [%] = 100 —L —m a áximo de células v iab le s-lis is to ta l) x 100

máximo de células viables: 10 pl PBS, sin anticuerpo

lisis total: 10 pl de Triton X-100 al 8 % (v/v) en PBS, sin anticuerpo

E. Análisis de la ADCC

Los anticuerpos monoclonales quimerizados anti-CLDN6 se analizaron por su capacidad para inducir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) contra células NEC8 que expresan CLDN6 de forma endógena y células NEC8 con desactivación de CLDN6 (NEC8 LVTS254) en un sistema de ensayo basado en luciferasa.

Las células dianas NEC8 o NEC8 LVTS254 se cosecharon con tripsina/EDTA al 0,05 %, se lavaron dos veces con medio X-Vivo 15 y 2,5 x 106 células se sometieron a electroporación con 7 |jg de ARN de luciferasa IVT (200 V, 400 jF ) mediante el uso de un Gene PulserXcell (Bio Rad). Después de la electroporación, las células se suspendieron en 2,4 mL de RPMI precalentado que contiene 10 % de FCS. Se sembraron 50 jL de la suspensión celular (5 x 104 células) por pozo en una placa de 96 pocillos blanca y se incubaron a 37 °C y 5 % de CO² durante 6 h. Las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs, por sus siglas en inglés) se enriquecieron a partir de la sangre de donantes sanos mediante el uso de Ficoll (Ficoll-Paque TM Plus, GE Healthcare, 17-1440-03). Las PBMCs se suspendieron en X-Vivo 15 (Lonza, BE04-418Q) suplementado con 5 % de suero humano inactivado por calor y se incubaron a 37 °C y 5 % de CO². Después de la incubación durante 2-4 h, el sobrenadante se enriqueció con células asesinas naturales (NK). Se añadieron 25 pL de anticuerpos diluidos en PBS a las concentraciones indicadas a las células NEC8. Se añadieron las células Nk enriquecidas en una relación de 20:1 (efector para células dianas) y las muestras se incubaron durante 24 h a 37 °C y 5 % de CO². La lisis de las células se determinó al medir el contenido de ATP intracelular con luciferasa como se describe en "CDC".

F. Ensayo de tratamiento temprano

Para los tratamientos tempranos con anticuerpos, 5 x 106 células HEK293-CLDN6 (células HEK293 que expresan establemente CLDN6) en 200 pL de PBS se inocularon subcutáneamente en el costado de ratones atímicos Nude-Foxn1nu. Se usaron células simuladas HEK293 como controles negativos. Cada grupo experimental consistió en ratones hembras de 6 - 8 semanas de edad. (En el caso de ratones injertados con células HEK293-CLDN6 o células simuladas, respectivamente, los grupos control de solución salina consistieron en diez ratones). Tres días después de la inoculación, se aplicaron 200 jg de los anticuerpos monoclonales murinos purificados muMAB 5F2D2, 27A y 36A durante 46 días al alternar inyecciones intravenosas e intraperitoneales dos veces por semana. Los grupos experimentales tratados con PBS sirvieron como controles negativos. El volumen tumoral (TV = (longitud x ancho2)/2) se controló dos veces por semana. TV se expresa en mm3, lo que permite la construcción de curvas de crecimiento tumoral en el tiempo. Cuando el tumor alcanzó un volumen superior a 1500 mm3, se sacrificaron los ratones.

Ejemplo 2: Unión de anticuerpos obtenidos de acuerdo con la invención a claudinas

La unión de los anticuerpos monoclonales murinos muMAB 5F2D2, 27A y 36A a CLDN6, 3, 4 y 9 humanas, se analizó por citometría de flujo mediante el uso de células HEK293T que expresan transitoriamente la claudina humana correspondiente. Las HEK293T se cotransfectaron con un marcador de fluorescencia para distinguir entre las células no transfectadas (población Q3) y transfectadas (población Q4). La concentración de anticuerpo usada fue la concentración que saturó la unión a CLDN6 (25 pg/ml). La expresión de CLDN6, 3, 4, 9 humanas se confirmó con anticuerpos monoclonales disponibles comercialmente contra la claudina-6 humana (R&D Systems, MAB3656), claudina-3 humana (R&D Systems, MAB4620) y claudina-4 humana (R&D Systems, MAB 4219).

Los anticuerpos MuMAB 5F2D2, 27A y 36A mostraron una fuerte unión a las células que expresan CLDN6, mientras que no se unieron a las células que expresan CLDN3 o CLDN4; véase figura 1.

Los anticuerpos MuMAB 5F2D2, 27A y 36A se incubaron a diferentes concentraciones (0,01; 0,1; 1, 10, 100, 1000, 10 000 y 25000 ng/mL) con células HEK293T que expresan transitoriamente CLDN6, CLDN³ , CLDN4 o CLDN9 humanas. La unión se detectó por citometría de flujo; véase figuras 2, 3 y 4. El eje y representa el porcentaje de células unidas por el anticuerpo (población Q2) mientras que el eje x representa la concentración de anticuerpo usado.

El MuMAB 5F2D2 mostró una fuerte unión a la CLDN6 humana y una débil unión a la CLDN9 humana. El MuMAB 27A mostró una fuerte unión a la CLDN6 humana y una unión muy débil a la CLDN9 humana. El MuMAB 36A mostró una fuerte unión a la CLDN6 humana y prácticamente ninguna unión a la CLDN9 humana. Ninguno de los anticuerpos interactuó con CLDN3 o 4 humanas.

Para determinar las afinidades relativas, la unión de anticuerpos anti-CLDN6 a CLDN6 humana expresada establemente en la superficie de las células HEK293 se analizó mediante citometría de flujo. En el experimento de unión por saturación, la concentración de los anticuerpos se graficó frente a las señales FACS (mediana de la intensidad de fluorescencia); véase figura 5. La EC50 (concentración de anticuerpo que se une a la mitad de los sitios de unión en equilibrio) se calculó mediante regresión no lineal. Los resultados muestran que los anticuerpos tienen patrones de unión característicos. Los MuMAB 5F2D2 y 27A exhibieron valores bajos de CE50 (CE50 350-450 ng/mL) y la saturación de la unión se logró a bajas concentraciones, mientras que el muMAB 36A no mostró saturación de unión incluso a la concentración más alta.

Ejemplo 3: Funciones efectoras de anticuerpos obtenidas de acuerdo con la invención

La actividad de CDC de anticuerpos anti-CLDN6 se analizó mediante el uso de un ensayo dependiente de luciferasa para detectar ATP endógeno dentro de células no lisadas. Con este fin, las células CHO-K1 que expresan establemente CLDN6

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo que se une a claudina 6 (CLDN6) e induce la inhibición del crecimiento tumoral in vivo tras la unión de CLDN6, dicho anticuerpo producido u obtenido a partir de un clon depositado bajo el número de acceso DSM ACC3059 (GT512muMAB 36A), DSM ACC3058 (GT512muMAB 27A), o DSM ACC3057 (GT512muMAB 5F2D2).

2. El anticuerpo la reivindicación 1 unido al menos a un resto efector terapéutico, en donde el resto efector terapéutico es preferentemente un radiomarcador, citotoxina o enzima citotóxica.

3. Un hibridoma seleccionado del grupo que consiste en:

(i) un hibridoma que produce el anticuerpo de la reivindicación 1, y

(ii) un hibridoma depositado bajo el número de acceso DSM ACC3059 (GT512muMAB 36A), DSM ACC3058 (GT512muMAB 27A), o DSM ACC3057 (GT512muMAB 5F2D2).

4. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la reivindicación 1 o 2, en donde la composición farmacéutica preferentemente tiene forma de una vacuna terapéutica o profiláctica para tumores.

5. La composición farmacéutica de la reivindicación 4 para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad tumoral.

6. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 para su uso en un método de tratamiento de un paciente que tiene una enfermedad tumoral o que está en riesgo de desarrollar una enfermedad tumoral, en donde las células del tumor expresan claudina 6 (CLDN6).

7. El anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el anticuerpo cuando se administra al paciente inhibe el crecimiento del tumor en el paciente al unirse a CLDN6.

8. El anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, en donde el anticuerpo se une al menos a un resto efector terapéutico, en donde el resto efector terapéutico es preferentemente un radiomarcador, citotoxina o enzima citotóxica.

9. El anticuerpo para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

10. El anticuerpo para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en donde el método comprende la administración de una composición farmacéutica de la reivindicación 4.

11. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 5 o el anticuerpo para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en donde la enfermedad tumoral se selecciona del grupo que consiste en cáncer de ovario, en particular adenocarcinoma de ovario y teratocarcinoma de ovario, cáncer de pulmón, que incluye cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) y cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), en particular carcinoma de pulmón de células escamosas y adenocarcinoma, cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer hepático, cáncer de páncreas, cáncer de piel, en particular carcinoma de células basales y carcinoma de células escamosas, melanoma maligno, cáncer de cabeza y cuello, en particular adenoma pleomórfico maligno, sarcoma, en particular, sarcoma sinovial y carcinosarcoma, cáncer de vías biliares, cáncer de la vejiga urinaria, en particular carcinoma de células transicionales y carcinoma papilar, cáncer de riñón, en particular carcinoma de células renales que incluye carcinoma de células renales de células claras y carcinoma de células renales papilares, cáncer de colon, cáncer de intestino delgado, que incluye cáncer de íleon, en particular, adenocarcinoma de intestino delgado y adenocarcinoma del íleon, carcinoma embrionario testicular, coriocarcinoma placentario, cáncer cervical, cáncer testicular, en particular seminoma testicular, teratoma testicular y cáncer testicular embrionario, cáncer uterino, una enfermedad de tumor de células germinales, en particular un teratocarcinoma o un carcinoma embrionario, preferentemente una enfermedad de tumor de células germinales de los testículos, y las formas metastásicas de las mismas.