CN100575955C - 密蛋白的未表达作为肿瘤转移的标记物 - Google Patents

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Abstract

一种治疗哺乳动物中癌症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的试剂，所述试剂诱导癌细胞中一个或多个密蛋白的表达。优选地，所述密蛋白是密蛋白-3，密蛋白-4，或密蛋白-9。在一个优选的方法中，将编码密蛋白的核酸在其中核酸被转染到癌细胞中并且所述密蛋白在细胞中产生的条件下施用给哺乳动物。还公开了一种诊断癌症的方法，所述方法包含确定密蛋白3，4或9在正常表达蛋白质的细胞中的存在。如果所述细胞没有表达密蛋白，那么其是癌性的。

Description

密蛋白的未表达作为肿瘤转移的标记物
发明背景
癌症形成自细胞的不受控制的增殖。所有的癌症都是威胁生命的。即使当癌症没有导致死亡时，不仅对于患者，还对于家庭、朋友和同事它是使人衰弱的。而且，太频繁地，癌症证明是致命的。个人和公众从导致所有过早死亡的显著部分的该类疾病中受到的损失是难以估计的。
尽管在一些病例中已经开发了有效的治疗形式，但许多癌症对于现有的治疗来说仍是难以控制的。特别难治的是转移性癌症。这些癌症给患者造成了最高的风险，并且对于最佳预后，经常必须通过侵入性方法进行治疗，所述侵入性方法存在有害副作用的增加风险。因此，存在对于将那些可能转移的肿瘤与不可能转移的那些精确区分的方法的极大需求。而且，治疗转移性癌症的方法经常是不充分的，并且还有对于改进的抗转移药剂和治疗转移性癌症的方法的明显需要。
转移性癌症起源自原发肿瘤。原发肿瘤的转移产生了继发瘤和播散性癌。众所周知的是原发和继发肿瘤流出大量细胞。这些流出的细胞可扩散到全身。例如，原发肿瘤可损伤周围淋巴或循环导管，使流出的细胞进入淋巴或循环系统，并加速它们在体内的传播。而且，通过癌性肿瘤的细胞的流出在外科手术和放疗过程中增加。
大多数流出的细胞不形成新的肿瘤。为此，这些细胞必须克服一系列身体和生理障碍。事实上，对于转移的发生必须发生一系列的独特事件。原发肿瘤在身体上必须侵犯初生组织的胞间隙。特别地，其必须渗透组织的基膜。对于大多数转移来说，肿瘤必须损伤淋巴管或脉管壁血管的内皮细胞壁以提供针对流出细胞的通道。进入淋巴或血液的细胞必须经受得住血液动力学压力和在循环中的宿主的防御，而且，细胞必须沉积在循环系统中的新位点，一种明显包括聚集的血小板的过程。然后，细胞必须渗出导管到胞间隙。最终，其必须侵犯次级器官的胞间隙并在新的位点增殖。尽管转移的过程在生理上是复杂的，转移的总的模式对于许多类型的癌症来说是通用的。
转移的过程还清楚地包括复杂的细胞内机制，其改变癌细胞以及它们与周围细胞和组织的相互作用。例如，癌细胞的特征在于粘着蛋白的异常表达，降解基质成分的酶，自分泌因子，配体反应性受体，血管发生因子和前列腺素，仅举几个例子(to name a few)。具体而言，起始肿瘤细胞移动的信号途径在侵入和转移的了解最少的方面中。目前，认为许多癌细胞的增殖取决于特异配体-受体相互作用。然而，迄今，使用这种范例，或转移的潜在机制的其它概念来开发预防或有效抑制转移性癌的转移的治疗是不可能的。
该过程的复杂性涉及转移，并且对潜在分子机制的了解的缺乏，在一些病例中，使区分可能转移的肿瘤和不可能转移的那些特别困难。不能辨别肿瘤的转移潜能妨碍精确的预后并不可避免地导致太具攻击性或攻击性不足的治疗干预。临床上，在决定是否施用化学疗法还是将治疗限制在肿瘤的外科手术摘除中，确定肿瘤是否是转移性的也是重要的。而且，迄今对于所有类型的癌症来说，开发抑制或预防转移性肿瘤的传播的治疗仍是困难的或不可能的。显而易见地，对于精确确定肿瘤的转移潜能的方法和有效的抗转移组合物和方法仍存在着巨大需求。
发明内容
本发明通过提供抑制肿瘤细胞转移的方法来满足该需要，所述方法包括促进如下称为密蛋白-3(SEQ ID NOs：1和2)，密蛋白-4(SEQ ID NOs：3和4)和密蛋白-9(SEQ ID NOs：5和6)的密蛋白蛋白质一个或多个的表达。通过检查密蛋白在正常和转化的细胞系中的表达的研究得到的令人惊讶的发现导致了本发明。所述结果显示了在来自正常和转化的细胞系的组织的密蛋白-3、密蛋白-4、密蛋白-9的表达中的清晰明确的差异。密蛋白3，4和9在正常组织中表达，但在转化的、癌细胞中不表达。
因此，在一方面本发明提供诊断瘤形成的方法，其方法包括分析密蛋白-3、密蛋白-4、密蛋白-9的表达。如果这些基因是未表达的(under-expressed)，这说明转化的/癌细胞是转移细胞。方法包括检测密蛋白存在的核酸杂交技术，其包括RT-PCR方法和试剂盒。还要求诊断试剂盒，所述试剂盒是第一个容器和第二个容器的体外PCR分析试剂盒，所述第一个容器包括扩增所述密蛋白转录物或从那里产生的cDNA的PCR引物，所述第二个容器包括核酸标记物。
还要求的是检测转移性癌症的抗体方法和试剂盒。所述试剂盒包括与哺乳动物的密蛋白-3、密蛋白-4或密蛋白-9多肽特异性结合的多肽、蛋白质、抗体或抗体片段。包括酶联的免疫吸附测定法，放射免疫测定和荧光免疫测定。
瘤形成的诊断可以指瘤形成组织的起始检测或其可是区别转移性和非转移性瘤的步骤。用于本文时，涉及的术语“诊断”据此理解。
所述方法是可特别适用于固体瘤，特别是恶性肿瘤，例如癌的诊断。进行测定的样品优选地是体组织或体液，并且不是体外培养的细胞。所述样品可是来自固体肿瘤的小片的组织或细胞的精细针状吸出物(FNA)。或者，其可以是血液或尿或另外的体液的样品，刮擦子宫颈或非侵入性获得的样品诸如唾液、尿液或大便。
可通过应用一个或多个标记的特异性寡核苷酸探针来检测cDNA，对所述探针进行选择从而使其能够与扩增的cDNA序列的部分复性。或者可使用标记的寡核苷酸引物和/或标记的单核苷酸。存在许多可被应用的合适的可检测的标记，包括放射性标记。
密蛋白-3、密蛋白-4和密蛋白-9的基因表达的水平可通过RT-PCR，或通过使用与密蛋白-3、密蛋白-4或密蛋白-9结合的标记的抗体来进行确定。例如，可用与密蛋白-3、密蛋白-4或密蛋白-9结合的标记的抗体对表达蛋白质的组织进行染色。如果组织正常地表达密蛋白，但是如通过缺乏产生所需染色剂或其它标记的所指示的，针对密蛋白的抗体没有与组织的表面结合，这说明组织没有表达密蛋白并且所述组织是癌性的并且是转移的。
本发明还涉及治疗转移性癌症的方法，所述方法诱导密蛋白-3、密蛋白-4或密蛋白-9的表达。优选的实施方案包括用编码密蛋白-3(SEQ IDNOs：5和6)，密蛋白-4(SEQ ID NOs：7和8)或密蛋白-9(SEQ ID NOs：17和18)的核酸转染癌细胞。优选地，核酸是包含在合适的载体诸如腺病毒载体(见美国专利号5,547,932)，腺病毒关联的病毒载体(见美国专利号6,541,258；美国专利号5,658,776和美国专利号6,346,415)或合适的反转录病毒载体(见美国专利号5,736,387)中的DNA。
癌症是用于指各种类型的恶性肿瘤的任一个的通用术语，所述恶性肿瘤大多数侵犯周围组织，它们可转移到一些位点，可能在被尝试去除后复发并导致患者死亡，除非被充分治疗。癌症包括肉瘤和癌。
转移性癌是可传播到身体其它部分的癌症。
人密蛋白-3是多肽并具有如下的220个氨基酸残基：
MSMGLEITGTALAVLGWLGTIVCCALPMWRVSAFIGSNIITSQNIWEGLWMNCVVQS TGQMQCKVYDSLLALPQDLQAARALIVVAILLAAFGLLVALVGAQCTNCVQDDTAKAKITIVAGVLFLLAALLTLVPVSWSANTIIRDFYNPVVPEAQKREMGAGLYVGWAAAALQLLGGALLCCSCPPREKKYTATKVVYSAPRSTGPGASLGTGYDRKDYV(SEQ ID NO：2)
，其下划线部分是胞外结构域。
人密蛋白-4是209个氨基酸的多肽。
MASMGLQVMGIALAVLGWLAVMLCCALPMWRVTAFIGSNIVTSQTIWEGLWMNCV VQSTGQMQCKVYDSLLALPQDLQAARALVIISIIVAALGVLLSVVGGKCTNCLEDESAKAKTMIVAGVVFLLAGLMVIVPVSWTAHNIIQDFYNPLVASG QKREMGASLYVGWAASGLLLLGGGLLCCNCPPRTDKPYSAKYSAARSAAASNYV (SEQ ID NO：4)
。氨基酸序列的胞外结构域用下划线表示。
人密蛋白-9是217个氨基酸的多肽。
MASTGLELLGMTLAVLGWLGTLVSCALPLWKVTAFIGNSIVVAQVVWEGLWMSCVV QSTGQMQCKVYDSLLALPQDLQAARALCVLALLLALLGLLVAITGAQCTTCVEDEGAKARIVLTAGVILLLAGILVLIPVCWTAHAIIQDFYNPLVAEALKRELGASLYLGWAAAALLMLGGGLLCCTCPPPQVERPRGPRLGYSIPSRSGASGLDKRDYV (SEQ ID NO：6)
。氨基酸序列的胞外结构域用下划线表示。
上皮和内皮细胞的紧密连接(TJ)是特别重要的细胞-细胞连接，其调节细胞旁(paracellular)途径的渗透性，并还将细胞表面分成顶端和基底外侧(basolateral)部分。紧密连接形成介于上皮细胞之间的连续的纤维胞间接触并产生针对水、溶质和免疫细胞的细胞旁运动的被调节的屏障。它们还提供第二种类型的屏障，其通过限制膜脂质在顶端和基底外侧的膜结构域之间的交换有利于细胞的极性。
认为紧密连接通过产生胞间密封从而产生针对溶质通过细胞旁途径的扩散的主要屏障，和通过充当介于顶端和基底外侧血浆膜结构域之间的界面从而分别产生和维持细胞的极性而涉及上皮细胞的屏障和防御功能。紧密连接还涉及白细胞到达炎性位点的变移。响应于化学引诱物，白细胞通过穿越内皮从血液中渗出并在粘膜感染的病例中，越过发炎的上皮细胞。变移主要沿细胞旁路径发生并似乎以高度协调和可逆方式开放和关闭紧密连接被调节。在超薄切片电子显微照片上，TJ作为包括邻近细胞的血浆膜的外小叶的一组明显融合的分离位点出现。在大多数上皮细胞的冷冻-断口电子显微照片上，TJ作为在一组在原生质面(P-面)中的连续的网结的膜内颗粒链(TJ链)出现，所述原生质面(P-面)具有在胞外(E)-面中的互补的沟。
已经鉴定了许多与TJ关联的蛋白质，包括完整的和外周血浆膜蛋白。目前对这些蛋白质的复合结构和相互功能的了解仍是有限的。在许多与上皮连接有关的蛋白质中，已经鉴定了一些种类的跨上皮膜的蛋白质，其可能在上皮连接的生理调节中发挥功能。这些包括许多“连接黏附分子”(JAMs)和其它被称为闭合蛋白、密蛋白和连蛋白的TJ-关联的分子。JAMs、闭合蛋白和密蛋白延伸到细胞旁空间，并且已特别意欲将这些蛋白质作为产生在邻近的上皮细胞之间的上皮屏障和通过上皮细胞层的可调节的通道的候选物。在一个模型中，已经建议将闭合蛋白、密蛋白和JAM作为嗜同性结合的模式相互作用以产生针对水、溶质和免疫细胞在上皮细胞之间的细胞旁运动的调节的屏障。本发明的机制基于发现转移性癌细胞已经失去了它们与其它细胞之间形成紧密连接的能力，并因此细胞对于在遍及身体的转移是自由的。
编码用在本发明过程中的密蛋白的DNA应该编码至少人密蛋白-3，密蛋白-4，或密蛋白-9的胞外结构域，和能与细胞膜或跨膜结构域结合的结构域，特别是密蛋白3，密蛋白-4和密蛋白-9的那些。认为由这些密蛋白表达的蛋白质抑制癌细胞的转移。如果密蛋白-3，密蛋白-4和密蛋白-9然后被诱导进行表达，癌细胞可被诱导以分化成正常细胞或至少可再次形成紧密连接，因此丢失它们转移的能力的细胞。
本发明提供一种逆转癌细胞的癌表型的方法，其包括在允许基因表达的条件下将包含密蛋白基因的核酸引入细胞中从而逆转细胞的癌表型。
本发明还提供一种在受试者中逆转癌细胞的癌表型的方法，其包括将包括密蛋白基因的核酸分子在允许基因在受试者的细胞中表达的条件下引入受试者的癌细胞从而由此逆转细胞的癌表型。
将核酸分子引入细胞的方法已经成为本领域众所周知的。可通过直接转化将裸核酸分子引入细胞。或者，可将核酸分子包埋在脂质体中。因此，本发明提供上述方法，其中通过裸DNA技术、腺病毒载体、腺病毒关联病毒载体、EB病毒载体、疱疹病毒载体、减弱的HIV载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、脂质体、抗体包被的脂质体、机械或电子方法来将核酸引入细胞。上述列举的方法仅充当将核酸引入细胞的可行方式的实例。还可将其它已知方法用在本发明中。
在上述方法的一个实施方案中，将密蛋白基因与调节元件连接从而使其在调控元件的控制下进行表达。在另一个实施方案中，调节元件是可诱导的或组成型的。可诱导的调节元件如可诱导的启动子是本领域已知的。调节元件如可指导组成型表达的启动子，也是本领域已知的。在一个单独的实施方案中，调节元件是组织特异性调节元件。然后，密蛋白基因的表达将是组织-特异性的。本发明还提供药物组合物，其包括有效逆转癌细胞的癌表型的量的包含密蛋白基因的核酸和药用载体。
因此，在本发明的另一个实施方案中，可将编码本发明的密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9的核酸插入载体中并将其用作基因治疗载体。在一个实施方案中，基因治疗载体是病毒载体，例如复制缺陷逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒，其中编码光敏感性蛋白质的核酸分子与病毒基因组连接。包括慢病毒载体、逆转录病毒载体和腺伴随病毒载体的病毒载体，是通常了解的对于外源基因转移到体内，特别是到人体内的选择的基因疗法载体。慢病毒载体的实例包括，但不限于，HIV、FIV、BIV、EIAV和SIV。病毒载体提供有效的到细胞内的基因传递，并将转移的核酸稳定的整合到宿主的染色体DNA中。通过在病毒颗粒表面上表达将与独特于目标细胞的受体相互作用的细胞特异性蛋白质可使病毒载体的感染性是细胞特异性的。以该方法，可将病毒载体靶向到视网膜神经节细胞。通过应用组织或细胞特异性的控制基因表达的转录调节序列来进一步增加表达。见，Anderson et al.，美国专利号5,399,346；Mann et al.，Cell，33：153(1983)；Temin et al.，美国专利号4,650,764；Temin et al.，美国专利号4,980,289；Markowitz et al.，J.Virol.，62：1120(1988)；Temin et al.，美国专利号5,124,263；由Dougherty等1995年3月16日公开的国际专利公开号WO95/07358；和Blood，82：845(1993)。
或者，可将载体通过使用脂质体的体内脂质转染法引入。可将合成的阳离子脂质用于制备脂质体以进行编码标记的基因的体内转染[Felgner etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84：7413-7417(1987)；见Mackey et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：8027-8031(1988)]。应用脂质转染法将外源基因引入体内特定器官具有确定的实际优势。脂质体到特异细胞的分子靶向代表益处的一个范围。清楚的是到具体细胞的定向转染代表益处的一个范围。清楚的是到具体细胞类型的定向转染将在具有细胞异质性的组织，诸如胰腺、肝、肾和脑中特别有利。出于靶向的目的，脂质可以与其它分子进行化学偶联。靶向的肽，例如激素或神经递质，和蛋白质诸如抗体，或非肽分子可与脂质体化学偶联。
使用常规技术，诸如标准细胞培养生长技术可进行促进传染性的病毒颗粒在细胞中的产生的步骤。收集传染性病毒颗粒的步骤还可通过使用常规技术进行。例如，传染性的颗粒可通过如本领域已知的细胞裂解，或收集细胞培养物的上清液来进行收集。任选地，如果需要，可纯化收集的病毒颗粒。合适的纯化技术是本领域那些技术人员所众所周知的。或者，使用本领域众所周知的标准转染技术可将本发明的病毒载体在活体外(exvivo)或体外施用给细胞或组织。
其它涉及在基因治疗中的病毒载体的应用的方法可见于例如，Kay，M.A.，Chest 111(6 Supp.)：138S-142S(1997)；Ferry，N.and Heard，J.M.，Hum.Gene Ther.9：1975-81(1998)；Shiratory，Y.et al.，Liver 19：265-74(1999)；Oka，K.et al.，Curr.Opin.Lipidol 11：179-86(2000)；Thule，P.M.and Liu，J.M.，Gene Ther.7：1744-52(2000)；Yang，N.S.，Crit.Rev.Biotechnol.12：335-56(1992)；Alt，M.，J.Hepatol.23：746-58(1995)；Brody，S.L.andCrystal，R.G.，Ann.N.Y.Acad.Sci.716：90-101(1994)；Strayer，D.S.，ExpertOpin.Investig.Drugs 8：2159-2172(1999)，Smith-Arica，J.R.and Bartlett，J.S.Curr.Cardiol.Rep.3：43-49(2001)；Lee，H.C.et al，Nature 408：483-8(2000).，美国专利号6,365,150，美国专利号6,596,270，美国专利号6,573,092，美国专利号6,475,757，美国专利号6,465,253，美国专利号5,965,541美国专利号.6,635,476，美国专利号6,348,352，美国专利号6,312,681，美国专利号5,994,134，美国专利号5,932,210，美国专利号5,837,520，美国专利号6,689,600，美国专利号6,531,456，美国专利号6,416,992，美国专利号6,211,163，和美国专利号6,207,457。
通过例如，静脉内注射、局部施用(见美国专利号5,328,470)或通过立体定位技术注射(见，例如，Chen et al，Proc.Natl.Acad.Sci USA91：3054-3057(1994))可将基因治疗载体传递到受试者，哺乳动物，优选地人中。基因治疗载体的药用制剂可包括在可接受的稀释剂中的基因治疗载体，或可包括其中埋入基因传递赋形剂的缓慢释放基质。或者，其中完整的基因传递载体可完整地产自重组细胞，例如逆转录病毒载体，所述药物制剂可包括一个或多个产生基因传递系统的细胞。
本发明还提供包括有效逆转癌细胞的癌表型的量的密蛋白基因的关联基因的基因产物和药用载体。在上述方法的另一个实施方案中，癌细胞包括，但不限于，乳腺、子宫颈、结肠、前列腺、鼻咽、肺结缔组织和神经系统细胞。所述癌细胞还包括来自多形性成胶质细胞瘤，淋巴瘤和白血病的细胞。
通常将包含编码密蛋白-3、密蛋白-4或密蛋白-9的核酸的核酸或载体在可生理接受的缓冲溶液中进行施用，所述缓冲溶液可包含一个或多个促进无菌、稳定性和/或活性的成分。可以使用任何便于将核酸/载体制备物引入身体需要的位点的方式，包括，例如通过静脉内或局部注射，通过从导管进行输注，鼻内传递或气溶胶传递来进行。
包含编码密蛋白3，密蛋白-4或密蛋白-9的核酸的核酸或载体以足以促进密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9在肿瘤细胞中表达的治疗有效量进行施用，所述表达导致细胞形成紧密连接从而抑制肿瘤的转移。治疗有效量指以在剂量上并对于必需的时间周期有效获得所需治疗效果的量。治疗有效量可对于癌症，个体的年龄、性别、或体重的不同形式而有所不同。诊断转移性癌症的存在
按照本发明，可通过确定密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9是否在正常表达这些蛋白质的组织类型中表达来诊断转移性肿瘤。存在许多确定此的途径，包括应用抗体以检测蛋白质的胞外部分的存在或通过确定在细胞的细胞质中的编码密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9的mRNA的存在和量。
本发明的诊断癌症组织的方法优选地使用人癌症患者肿瘤样品进行，最优选地，使用保存在，例如石蜡中并被制备以进行组织学和免疫组织化学分析的样品进行。
出于本发明的目的，术语“肿瘤样品”倾向于包括被切除的固体肿瘤、活组织检查材料、病理样品，骨髓吸出物和血液样品，它们包含造血起源，以及良性肿瘤，特别是确定组织诸如脑和中枢神经系统的肿瘤的肿瘤细胞。普通技术人员将理解的是来自固体肿瘤的样品将需要物理和化学/酶促解聚作用的结合从而从基质细胞和渗透的造血细胞中分离肿瘤细胞，同时将获得作为在血液、血清或血浆中的混和细胞群的包括白血病和淋巴瘤的造血肿瘤样品，并将需要从其非肿瘤成分，特别是从红细胞中和从其它有核细胞中分离，其中分离通过差速分离和本领域已知的其它方法来完成，所述红细胞可通过用低渗溶液进行处理而溶解。
应用免疫学试剂来检测密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9的表达
出于本发明的目的，术语“免疫学试剂”意欲包括抗血清和抗体，特别是单克隆抗体，及其与密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋自-9结合的片段(包括F(ab)，F(ab)2.，F(ab)′和Fv片段)。还包括在免疫学试剂的定义中的是嵌合抗体，人源化抗体，和重组产生的抗体及其片段，以及适体(即，能够与靶分子诸如肽相互作用的寡核苷酸)。在与本发明的试剂结合应用的免疫学方法包括直接和间接(例如，夹层方法-类型)标记技术，免疫亲和柱，免疫磁性珠，荧光激活细胞分选仪(FACS)，酶联免疫吸附测定(ELISA)，和放射免疫测定法(RIA)，最优选FACS。对于在这些测定中的应用，可特别使用荧光、抗原、放射性同位素或生物素标记物来对肿瘤的免疫学试剂进行标记，或可使用标记的二级或三级免疫学检测试剂以检测用于检测密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9的存在的肿瘤免疫学试剂的结合(即，在二级抗体(夹层方法)测定)。有效用在本发明实践中的免疫学试剂的实例包括识别密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9的抗体，最优选单克隆抗体。
本发明的免疫学试剂优选地是被可检测地标记的，最优选使用适合于使用商购的设备诸如和最优选地荧光激活细胞分选仪进行检测的具有激发和发射波长的荧光标记物。有效用在本发明的实践中的荧光标记物的实例包括藻红素(PE)、异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明(RH)、德克萨斯红(TX)、Cy3、Hoechst 33258和4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)。使用标准技术[Maino et al.，Cytometry 20：127-133(1995)]，可将这些标记与免疫学试剂诸如抗体，最优选单克隆抗体结合。
使用核酸杂交技术检测密蛋白-3，密蛋白-4和密蛋白-9
可使用核酸和相关杂交方法来确定密蛋白-3，密蛋白-4和密蛋白-9的表达从而检测mRNA在目标细胞中的存在。例如，可对在严格条件下与密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9的部分的mRNA互补并杂交的核酸进行可检测地标记。这些可检测地标记的核酸分子可与细胞或细胞的提取物接触从而检测编码密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9的mRNA的存在和量。编码密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9的核酸的量与密蛋白在细胞中的表达较好地相关。可通过研究SEQ ID NOs：1，3和5的核酸序列并确定合适的长度来选择用作探针的合适的核酸分子。应确定在严格条件下与密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9的mRNA选择性杂交的独特的序列。
用于本文时，术语“严格条件”指本领域熟悉的参数。核酸杂交参数可见于汇编这些方法的参考文献，例如Molecular Cloning：A LaboratoryManual，J.Sambrook，et al.，eds.，Second Edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989，或Current Protocols inMolecular Biology，F.M.Ausubel，et al.，eds.，John Wiley & Sons，Inc.，New York中。更具体地，用于本文时，严格条件指，例如在杂交缓冲液(3.5倍SSC，0.02％菲可(Ficoll)，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％牛血清白蛋白，2.5mM NaH2PO4(pH7)，0.5％SDS，2mM EDTA)中于65℃进行杂交。SSC是0.15M氯化钠/0.015M柠檬酸钠，pH7；SDS是十二烷基硫酸钠；并且EDTA是乙二胺四乙酸。杂交后，例如以2倍SSC于室温，然后以0.1-0.5倍SSC/0.1倍SDS于高达68℃的温度，洗涤DNA转移在上面的膜。
有许多导致相似严格程度的可应用的其它条件，试剂等。技术人员将熟悉这些条件，因此在此没有给出它们。然而，将理解的是，本领域技术人员将能够以容许清楚鉴定本发明的癌症相关抗原核酸的同源物和等位基因的方式(例如，通过使用低级严格条件)来操作这些条件。技术人员也熟悉筛选表达这些分子的细胞和库的方法，然后常规分离所述细胞和库，随后分离相关核酸分子并进行测序。
在来自细胞的遗传材料中检测密蛋白转录物的优选的方法应用聚合酶链式反应(PCR)技术。PCR技术由本领域技术人员常规操作并且其在诊断中的应用是众所周知的并被接受的。进行PCR技术的方法公开于“PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications”，Innis，M.A.，et al.Eds.Academic Pres，Inc.San Diego，CA(1990)中。PCR技术的应用公开于描述进行PCT的方法的“Polymerase Chain Reaction”Erlich，H.A.，etal.，Eds.Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989).美国专利号4,683,202，美国专利号4,683,195，美国专利号4,965,188和美国专利号5,075,216中。使用Perkin Elmer Cetus GENE AMP RNA PCR试剂盒，Part No.N808-0017来常规进行PCR。
PCR技术通过提供与RNA或DNA分子中出现的序列杂交的5′和3′引物和另外提供游离核苷酸，和用游离核苷酸将互补碱基填充到引物之间的核苷酸序列的酶，来产生DNA的互补链而快速产生多拷贝的DNA序列。酶将填充邻近引物的互补序列。如果5′引物和3′引物与在核酸的相同小片段的核苷酸序列杂交，特异双链大小的产物的指数扩增产生。如果仅有单一引物与核酸片段杂交，线性扩增产生不同长度的单链产物。
使用序列信息，具有本领域普通技术的那些人员可常规设计PCR引物。密蛋白-3，密蛋白-4和密蛋白-9转录物的核苷酸序列分别以SEQ IDNOs：1，3和5表示。为了进行该方法，将RNA从样品的细胞中提取出来并进行测试或使用众所周知的方法和容易获得的起始材料来制备cDNA。那些本领域技术人员可容易地制备PCR引物。一组引物通常包含两个引物。当在产生于此的被提取的mRNA或cDNA上进行PCR时，如果产生于此的密蛋白转录物或cDNA存在，多拷贝的mRNA或cDNA将被制备。如果其不存在，PCR将不产生分离的可检测产物。引物通常是8-50个核苷酸，优选约15-35个核苷酸，更优选18-28个核苷酸，其与产生于此的密蛋白转录物或cDNA相同或互补从而与它们杂交。在优选的实施方案中，引物每个是15-35个核苷酸，更优选地是SEQ ID NOs：1，3或9的18-28个核苷酸片段。所述引物必须与待扩增的序列杂交。典型引物具有18-28个核苷酸的长度并且通常具有500-60％的G+C组成。整个引物优选地与其必须杂交的序列互补。优选地，引物产生100bp-2000bp的PCR产物。然而，产生50-高达10kb和更长的产物是可能的。如果将mRNA用作模板，所述引物必须与mRNA序列杂交。如果将cDNA用作模板，引物必须与cDNA序列杂交。
mRNA或cDNA按照标准PCR方法与引物、游离核苷酸和酶结合。所述混合物经过一系列温度变化。如果产生于此的密蛋白转录物或cDNA存在，即，如果引物都与相同分子上的序列杂交，包含所述引物的和插入互补序列的分子将被指数扩增。扩增的DNA可通过多种众所周知的方法容易地进行检测。如果产生于此的密蛋白转录物或cDNA不存在，没有PCR产物被指数扩增。PCR技术因此提供非常容易、直接和可靠的检测样品中密蛋白转录物的方法。
可通过一些众所周知的方式来检测PCR产物。检测扩增的DNA的存在的优选的方法是通过凝胶电泳分离PCR反应材料并用溴化乙锭来对凝胶进行染色从而在扩增的DNA存在时观察它。将预期大小的被扩增的DNA的大小标准物优选地作为对照在凝胶上移动。
在一些情况中，诸如当回收显著小量RNA时，和仅有小量cDNA产生于此时，理想的或必须的是在第一个PCR产物上进行PCR反应。即，如果检测通过第一个反应产生的扩增DNA的量是困难的，可以进行第二个PCR从而制备第一个扩增DNA的DNA序列的多个拷贝。将嵌套组的引物用在第二个PCR反应中。将与5′引物下游和3′引物上游的序列杂交的嵌套组的引物用在第一个反应中。
本发明包括有效用作进行PCR方法的引物以扩增产生于此的密蛋白转录物或cDNA的寡核苷酸。
按照本发明，可以装配有效用作进行检测产生于非结肠直肠样品中的密蛋白转录物或cDNA的存在的方法的诊断试剂盒。这些诊断试剂盒包括有效用作进行PCR方法的引物的寡核苷酸。优选的是，按照本发明的诊断试剂盒包含一种容器，所述容器包含用于检测被扩增DNA的存在的作为标准物在凝胶上移动的大小标记物。在产生于此的密蛋白转录物或cDNA存在时，大小标记物与由所述引物产生的DNA大小相同。在一些试剂盒中的另外的组分是进行所述测定的说明书。另外，试剂盒可任选地包含代表出现阳性和阴性结果的描述或照片。
PCR测定在检测均化的组织样品和体液样品的细胞中的密蛋白转录物是有用的。意欲可将在液体样品的血浆部分上的PCR用于检测密蛋白转录物。
确定样品是否包含表达密蛋白的细胞的另一个方法是提取自样品的mRNA的支链寡核苷酸杂交分析。支链寡核苷酸的杂交可如在美国专利号5,597,909，美国专利号5,437,977和美国专利号5,430,138中描述的进行，将其每个都并入作为参考。可按照那些专利教导和密蛋白转录物的序列设计试剂。
确定样品是否包含表达密蛋白的细胞的另一个方法通过提取自非结肠直肠样品的mRNA的RNA印迹分析进行。进行RNA印迹分析的技术是本领域那些技术人员众所周知的并描述于Sambrook，J.et al.，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.中。mRNA的提取，mRNA的电泳分离、印迹、探针制备和杂交是众所周知的技术，其可使用容易获得的起始材料常规进行。
使用聚dT柱提取mRNA并通过凝胶电泳分离材料，并将其，例如转移到硝酸纤维纸上。可将制备自分离的特异一个或多个片段的标记的探针用于显现固定在纸上的互补片段的存在。在RNA印迹中有效用于鉴定mRNA的探针具有与密蛋白转录物互补的核苷酸序列。那些本领域技术人员可使用SEQ ID NOs：1，3或5中的序列信息以设计这些探针或分离和克隆产生于此的密蛋白转录物或cDNA从而将其用作探针。这些探针至少是15个核苷酸，优选30-200个，更优选40-100个核苷酸片段并可是整个的密蛋白转录物。
按照本发明，可以组装诊断试剂盒，所述试剂盒在进行通过RNA印迹在非结肠直肠样品中分析检测密蛋白转录物的存在的方法中是有效的。这些诊断试剂盒包含有效用作与所述mRNA杂交的探针的寡核苷酸。所述探针可是放射性标记的。优选的是按照本发明的诊断试剂盒包含一种容器，所述容器包含作为标准在凝胶上移动的大小标记物。优选的是按照本发明的诊断试剂盒包含一种容器，所述容器包含将与探针杂交的阳性对照。在一些试剂盒中的另外的组分包括进行测定的说明书。另外，所述试剂盒可任选地包含代表阳性和阴性结果出现的描述或照片。
RNA印迹分析对于检测在均化的组织样品和体液样品的细胞中的密蛋白转录物是有用的。意欲可将在液体样品的血浆部分上的PCR用于检测密蛋白转录物。
检测密蛋白转录物存在的另一个方法是通过寡核苷酸杂交技术。寡核苷酸杂交技术是本领域技术人员众所周知的。简言之，包含将与密蛋白转录物的核苷酸序列杂交的具体核苷酸序列的可检测的探针。通常将制备自样品RNA的RNA或cDNA固定到滤纸或类似物上。在仅当探针充分互补被固定的遗传材料时容许杂交的条件下加入和维持探针。所述条件足够严格从而洗脱其中仅有部分探针与被固定的材料杂交的探针。在洗脱滤器上检测探针显示互补序列。
有效用在寡核苷酸测定中的探针是互补DNA的至少18个核苷酸，并可与密蛋白转录物的完整互补序列一些大。在一些优选的实施方案中，本发明的探针是30-200个核苷酸，优选40-100个核苷酸。
本领域技术人员，使用公开在SEQ ID NOs：1，3或5中的序列信息可设计与密蛋白转录物充分互补的探针。可常规优化杂交条件以通过非充分地互补杂交使背景信号最小化。在一些优选的实施方案中，探针是全长克隆。探针至少是15个核苷酸，优选30-200个核苷酸，更优选40-100个核苷酸片段并可是完整的密蛋白转录物。
本发明包括有效作为进行寡核苷酸杂交的探针的标记的寡核苷酸。即，它们与密蛋白转录物充分互补。例如，所述mRNA序列包括由不同外显子编码的部分。本发明的标记的探针是用放射性标记的核苷酸标记的或可通过容易获得的非放射性的检测系统进行检测。
按照本发明，可以组装用于本发明的寡核苷酸杂交方法的诊断试剂盒。这些诊断试剂盒包括编码密蛋白转录物的部分的标记的寡核苷酸。优选的是用放射性核苷酸标记的按照本发明的寡核苷酸诊断试剂盒的标记的探针。所述按照本发明的基于寡核苷酸杂交的诊断试剂盒优选地包含代表阳性和阴性对照的DNA样品。阳性对照DNA样品是包含具有与试剂盒的探针充分互补的核苷酸序列的核酸分子从而使探针将在测定条件下与所述分子杂交的样品。阴性对照DNA样品是包含至少一个核酸分子的样品，其核苷酸序列与试剂盒的探针的序列部分互补。在测定条件下，所述探针将不与阴性对照DNA样品杂交。在一些试剂盒中的另外组分包括进行所述测定的说明书。另外，所述试剂盒可任选地包含代表阳性和阴性结果出现的说明或照片。
寡核苷酸杂交技术有效用于检测在均化的组织样品和体液样品的细胞中的密蛋白转录物。意欲可将在液体样品的血浆部分上的PCR用于检测密蛋白转录物。
本发明涉及评价组织样品以确定转移的水平的体外试剂盒以及有效用于进行相同确定的试剂和组合物。
这些确定多肽的mRNA的存在的技术已导致多种微阵列、生物阵列、生物芯片和生物芯片阵列的产生。用于本文时，术语“微阵列”、“生物阵列”、“生物芯片”和“生物芯片阵列”指排列在固体支持基底上的被固定的生物分子探针的规则的空间排列。优选地，生物分子探针被固定于与聚合珠接触的第二个接头部分上，其中将聚合珠固定于与固体支持基底接触的第一个接头部分上。用于本领域时，生物芯片涵盖包含生物分子的阵列或微阵列，优选地有规则的阵列和最优选地规则的，可寻址的阵列，所述生物分子包含生物结合对的一个成员。典型地，这些阵列是包含与编码密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9的核酸的至少一个序列互补的核苷酸序列的寡核苷酸阵列。
或者，并优选地，可将蛋白质，肽或其它小分子排列在这些生物芯片中，以特别进行免疫学分析(其中被排列的分子是抗原)或分析生物受体(其中被排列的分子是所述受体的配体、激动剂或拮抗剂)。有效用于检测差异基因表达的微阵列特别描述于授权给Lockhart et al的美国专利号6,040,138(从Affymetrix，Inc.，Santa Clara，Calif.商购)和授权给Wang的美国专利号6,004,755(商购自Incyte Inc.，Palo Alto，Calif.)并还特别商购自Research Genetics(Huntsville，Ala.)。
进行基因表达分析以检测在肿瘤、转移性细胞和正常细胞的群体之间的基因表达的不同以确定密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9是否被表达。基因表达微阵列的杂交产生密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9的基因表达的图谱。通过比较基因表达图谱可建立基因和在这些细胞中基因差异表达图谱的鉴定，所述基因表达图谱是通过与正常组织的相比较，对来自肿瘤细胞的cDNA进行微阵列杂交分析而获得。
本发明将从随后的实验细节中更好的得以了解。然而，本领域技术人员将容易地理解所讨论的具体方法和结果仅是对于本发明的描述，本发明如在其后的权利要求中更充分地进行描述。
实施例1
在呼吸性上皮中的紧密连接基因表达：
密蛋白、闭合蛋白、连蛋白和JAM的差异mRNA表达
密蛋白、连接黏附分子(JAM)和连蛋白是多基因超家族蛋白质和紧密连接(TJ)的组分。它们在所有的上皮细胞中表达和在极化细胞中协助TJ并起障碍作用。对这些蛋白质在组成中的作用和来自呼吸上皮组织的TJ的功能的发现对于研究TJ的治疗剂的组织渗透性是关键的。在此，我们报道得自我们通过RT-PCR在正常和被固定的呼吸上皮中的TJ基因表达分析的结果。使用引物3程序，对数个密蛋白(CLDN 1-12和14-20)的每个的特异性引物进行设计。从分化的和未分化的原初上皮细胞(primaryepithelial cell)(EpiAirway，MatTek Inc.)中提取mRNA并进行半定量RT-PCR。SEQ ID NOs：7和8是用于扩增编码密蛋白-3的cDNA的引物。SEQ ID NOs：9和10是用于扩增编码密蛋白-4的cDNA的引物。SEQ IDNOs：11和12是用于扩增编码密蛋白-9的cDNA的引物。通过EtBr-染色的琼脂糖凝胶电泳和光密度分析法来分析这些反应的产物。在正常的上皮中，CLDN 1，3，4，9，12和20显示高水平的RNA表达，而CLDN5，7，10，11，14和16是在更低的水平上。其它密蛋白的mRNA水平是不可检测的。在高水平密蛋白表达组中，CLDN 1，12和20见于分化和未分化的组织中。然而，仅CLDN 3，4和9在分化的组织中表达。其它TJ转录物(JAM-1，闭合蛋白，ZO-1，ZO-2和ZO-3)的水平没有显示差异表达。我们还报道在原初呼吸细胞(16HBE14o-)和RPMI 2650，一种没有显示TJs的细胞系中的表达图谱。这些结果显示在呼吸道上皮细胞中TJs蛋白的差异表达图谱并协助集中力量以产生作为药物靶向的TJ调节子以促进细胞旁的药物传递。
序列表
<110>纳斯泰克制药公司
S·C·夸伊
崔坤元
<120>诊断和治疗癌症的方法
<130>03-07PCT
<150>60/466,905
<151>2003-04-30
<160>12
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>1294
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(198)...(860)
<400>1
caaagccaca ggcaggtgca ggcgcagccg cggcgagagc gtatggagcc gagccgttag 60
cgcgcgccgt cggtgagtca gtccgtccgt ccgtccgtcc gtcggggcgc cgcagctccc 120
gccaggccca gcggccccgg cccctcgtct ccccgcaccc ggagccaccc ggtggagcgg 180
gccttgccgc ggcagcc atg tcc atg ggc ctg gag atc acg ggc acc gcg    230
                   Met Ser Met Gly Leu Glu Ile Thr Gly Thr Ala
                    1               5                   10
ctg gcc gtg ctg ggc tgg ctg ggc acc atc gtg tgc tgc gcg ttg ccc   278
Leu Ala Val Leu Gly Trp Leu Gly Thr Ile Val Cys Cys Ala Leu Pro
             15                  20                  25
atg tgg cgc gtg tcg gcc ttc atc ggc agc aac atc atc acg tcg cag   326
Met Trp Arg Val Ser Ala Phe Ile Gly Ser Asn Ile Ile Thr Ser Gln
         30                  35                  40
aac atc tgg gag ggc ctg tgg atg aac tgc gtg gtg cag agc acc ggc   374
Asn Ile Trp Glu Gly Leu Trp Met Asn Cys Val Val Gln Ser Thr Gly
     45                  50                  55
cag atg cag tgc aag gtg tac gac tcg ctg ctg gca ctg cca cag gac   422
Gln Met Gln Cys Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp
 60                  65                  70                  75
ctt cag gcg gcc cgc gcc ctc atc gtg gtg gcc atc ctg ctg gcc gcc   470
Leu Gln Ala Ala Arg Ala Leu Ile Val Val Ala Ile Leu Leu Ala Ala
                 80                  85                  90
ttc ggg ctg cta gtg gcg ctg gtg ggc gcc cag tgc acc aac tgc gtg   518
Phe Gly Leu Leu Val Ala Leu Val Gly Ala Gln Cys Thr Asn Cys Val
             95                 100                 105
cag gac gac acg gcc aag gcc aag atc acc atc gtg gca ggc gtg ctg   566
Gln Asp Asp Thr Ala Lys Ala Lys Ile Thr Ile Val Ala Gly Val Leu
        110                 115                 120
ttc ctt ctc gcc gcc ctg ctc acc ctc gtg ccg gtg tcc tgg tcg gcc    614
Phe Leu Leu Ala Ala Leu Leu Thr Leu Val Pro Val Ser Trp Ser Ala
    125                 130                 135
aac acc att atc cgg gac ttc tac aac ccc gtg gtg ccc gag gcg cag    662
Asn Thr Ile Ile Arg Asp Phe Tyr Asn Pro Val Val Pro Glu Ala Gln
140                 145                 150                 155
aag cgc gag atg ggc gcg ggc ctg tac gtg ggc tgg gcg gcc gcg gcg    710
Lys Arg Glu Met Gly Ala Gly Leu Tyr Val Gly Trp Ala Ala Ala Ala
                160                 165                 170
ctg cag ctg ctg ggg ggc gcg ctg ctc tgc tgc tcg tgt ccc cca cgc    758
Leu Gln Leu Leu Gly Gly Ala Leu Leu Cys Cys Ser Cys Pro Pro Arg
            175                 180                 185
gag aag aag tac acg gcc acc aag gtc gtc tac tcc gcg ccg cgc tcc    806
Glu Lys Lys Tyr Thr Ala Thr Lys Val Val Tyr Ser Ala Pro Arg Ser
        190                 195                 200
acc ggc ccg gga gcc agc ctg ggc aca ggc tac gac cgc aag gac tac    854
Thr Gly Pro Gly Ala Ser Leu Gly Thr Gly Tyr Asp Arg Lys Asp Tyr
    205                 210                 215
gtc taa gggacagacg cagggagacc ccaccaccac caccaccacc aacaccacca     910
Val  ＊
220
ccaccaccgc gagctggagc gcgcaccagg ccatccagcg tgcagccttg cctcggaggc 970
cagcccaccc ccagaagcca ggaagccccc gcgctggact ggggcagctt ccccagcagc 1030
cacggctttg cgggccgggc agtcgacttc ggggcccagg gaccaacctg catggactgt 1090
gaaacctcac ccttctggag cacggggcct gggtgaccgc caatacttga ccaccccgtc 1150
gagccccatc gggccgctgc ccccatgctc gcgctgggca gggaccggca gccctggaag 1210
gggcacttga tatttttcaa taaaagcctt tcgttttgca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1270
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa                                        1294
<210>2
<211>220
<212>PRT
<213>人
<400>2
Met Ser Met Gly Leu Glu Ile Thr Gly Thr Ala Leu Ala Val Leu Gly
 1               5                  10                  15
Trp Leu Gly Thr Ile Val Cys Cys Ala Leu Pro Met Trp Arg Val Ser
            20                  25                  30
Ala Phe Ile Gly Ser Asn Ile Ile Thr Ser Gln Asn Ile Trp Glu Gly
        35                  40                  45
Leu Trp Met Asn Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys Lys
    50                  55                  60
Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala Arg
65                  70                  75                  80
Ala Leu Ile Val Val Ala Ile Leu Leu Ala Ala Phe Gly Leu Leu Val
                85                  90                  95
Ala Leu Val Gly Ala Gln Cys Thr Asn Cys Val Gln Asp Asp Thr Ala
            100                 105                 110
Lys Ala Lys Ile Thr Ile Val Ala Gly Val Leu Phe Leu Leu Ala Ala
        115                 120                 125
Leu Leu Thr Leu Val Pro Val Ser Trp Ser Ala Asn Thr Ile Ile Arg
    130                 135                 140
Asp Phe Tyr Asn Pro Val Val Pro Glu Ala Gln Lys Arg Glu Met Gly
145                 150                 155                 160
Ala Gly Leu Tyr Val Gly Trp Ala Ala Ala Ala Leu Gln Leu Leu Gly
                165                 170                 175
Gly Ala Leu Leu Cys Cys Ser Cys Pro Pro Arg Glu Lys Lys Tyr Thr
            180                 185                 190
Ala Thr Lys Val Val Tyr Ser Ala Pro Arg Ser Thr Gly Pro Gly Ala
        195                 200                 205
Ser Leu Gly Thr Gly Tyr Asp Arg Lys Asp Tyr Val
    210                 215                 220
<210>3
<211>1712
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(206)...(835)
<400>3
ggcacgaggg gcagctgtcg gctggaagga actggtctgc tcacacttgc tggcttgcgc 60
atcaggactg gctttatctc ctgactcacg gtgcaaaggt gcactctgcg aacgttaagt 120
ccgtccccag cgcttggaat cctacggccc ccacagccgg atcccctcag ccttccaggt 180
cctcaactcc cgcggacgct gaaca atg gcc tcc atg ggg cta cag gta atg   232
                            Met Ala Ser Met Gly Leu Gln Val Met
                             1               5
ggc atc gcg ctg gcc gtc ctg ggc tgg ctg gcc gtc atg ctg tgc tgc   280
Gly Ile Ala Leu Ala Val Leu Gly Trp Leu Ala Val Met Leu Cys Cys
 10                  15                  20                  25
gcg ctg ccc atg tgg cgc gtg acg gcc ttc atc ggc agc aac att gtc   328
Ala Leu Pro Met Trp Arg Val Thr Ala Phe Ile Gly Ser Asn Ile Val
                 30                  35                  40
acc tcg cag acc atc tgg gag ggc cta tgg atg aac tgc gtg gtg cag   376
Thr Ser Gln Thr Ile Trp Glu Gly Leu Trp Met Asn Cys Val Val Gln
             45                  50                  55
agc acc ggc cag atg cag tgc aag gtg tac gac tcg ctg ctg gca ctg   424
Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu
         60                  65                  70
ccg cag gac ctg cag gcg gcc cgc gcc ctc gtc atc atc agc atc atc   472
Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala Arg Ala Leu Val Ile Ile Ser Ile Ile
     75                  80                  85
gtg gct gct ctg ggc gtg ctg ctg tcc gtg gtg ggg ggc aag tgt acc   520
Val Ala Ala Leu Gly Val Leu Leu Ser Val Val Gly Gly Lys Cys Thr
 90                  95                 100                 105
aac tgc ctg gag gat gaa agc gcc aag gcc aag acc atg atc gtg gcg   568
Asn Cys Leu Glu Asp Glu Ser Ala Lys Ala Lys Thr Met Ile Val Ala
                110                 115                 120
ggc gtg gtg ttc ctg ttg gcc ggc ctt atg gtg ata gtg ccg gtg tcc   616
Gly Val Val Phe Leu Leu Ala Gly Leu Met Val Ile Val Pro Val Ser
            125                 130                 135
tgg acg gcc cac aac atc atc caa gac ttc tac aat ccg ctg gtg gcc   664
Trp Thr Ala His Asn Ile Ile Gln Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala
        140                 145                 150
tcc ggg cag aag cgg gag atg ggt gcc tcg ctc tac gtc ggc tgg gcc    712
Ser Gly Gln Lys Arg Glu Met Gly Ala Ser Leu Tyr Val Gly Trp Ala
    155                 160                 165
gcc tcc ggc ctg ctg ctc ctt ggc ggg ggg ctg ctt tgc tgc aac tgt    760
Ala Ser Gly Leu Leu Leu Leu Gly Gly Gly Leu Leu Cys Cys Asn Cys
170                 175                 180                 185
cca ccc cgc aca gac aag cct tac tcc gcc aag tat tct gct gcc cgc    808
Pro Pro Arg Thr Asp Lys Pro Tyr Ser Ala Lys TyT Ser Ala Ala Arg
                190                 195                 200
tct gct gct gcc agc aac tac gtg taa ggtgccacgg ctccactctg          855
Ser Ala Ala Ala Ser Asn Tyr Val  ＊
            205
ttcctctctg ctttgttctt ccctggactg agctcagcgc aggctgtgac cccaggaggg 915
ccctgccacg ggccactggc tgctggggac tggggactgg gcagagactg agccaggcag 975
gaaggcagca gccttcagcc tctctggccc actcggacaa cttcccaagg ccgcctcctg 1035
ctagcaagaa cagagtccac cctcctctgg atattgggga gggacggaag tgacagggtg 1095
tggtggtgga gtggggagct ggcttctgct ggccaggatg gcttaaccct gactttggga 1155
tctgcctgca tcggtgttgg ccactgtccc catttacatt ttccccactc tgtctgcctg 1215
catctcctct gttgcgggta ggccttgata tcacctctgg gactgtgcct tgctcaccga 1275
aacccgcgcc caggagtatg gctgaggcct tgcccaccca cctgcctggg aagtgcagag 1335
tggatggacg ggtttagagg ggaggggcga aggtgctgta aacaggtttg ggcagtggtg 1395
ggggaggggg ccagagaggc ggctcaggtt gcccagctct gtggcctcag gactctctgc 1455
ctcacccgct tcagcccagg gcccctggag actgatcccc tctgagtcct ctgccccttc 1515
caaggacact aatgagcctg ggagggtggc agggaggagg ggacagcttc acccttggaa 1575
gtcctggggt ttttcctctt ccttctttgt ggtttctgtt ttgtaattta agaagagcta 1635
ttcatcactg taattattat tattttctac aataaatggg acctgtgcac aggaaaaaaa 1695
aaaaaaaaaa aaaaaaa                                                1712
<210>4
<211>209
<212>PRT
<213>人
<400>4
Met Ala Ser Met Gly Leu Gln Val Met Gly Ile Ala Leu Ala Val Leu
 1               5                  10                  15
Gly Trp Leu Ala Val Met Leu Cys Cys Ala Leu Pro Met Trp Arg Val
            20                  25                  30
Thr Ala Phe Ile Gly Ser Asn Ile Val Thr Ser Gln Thr Ile Trp Glu
        35                  40                  45
Gly Leu Trp Met Asn Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys
    50                  55                  60
Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala
65                  70                  75                  80
Arg Ala Leu Val Ile Ile Ser Ile Ile Val Ala Ala Leu Gly Val Leu
                85                  90                  95
Leu Ser Val Val Gly Gly Lys Cys Thr Asn Cys Leu Glu Asp Glu Ser
            100                 105                 110
Ala Lys Ala Lys Thr Met Ile Val Ala Gly Val Val Phe Leu Leu Ala
        115                 120                 125
Gly Leu Met Val Ile Val Pro Val Ser Trp Thr Ala His Asn Ile Ile
    130                 135                 140
Gln Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Ser Gly Gln Lys Arg Glu Met
145                 150                 155                 160
Gly Ala Ser Leu Tyr Val Gly Trp Ala Ala Ser Gly Leu Leu Leu Leu
                165                 170                 175
Gly Gly Gly Leu Leu Cys Cys Asn Cys Pro Pro Arg Thr Asp Lys Pro
            180                 185                 190
Tyr Ser Ala Lys Tyr Ser Ala Ala Arg Ser Ala Ala Ala Ser Asn Tyr
        195                 200                 205
Val
<210>5
<211>1167
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(32)...(685)
<400>5
tggggctgag aagacctaac cgaggggcca g atg gct tcg acc ggc tta gaa     52
                                   Met Ala Ser Thr Gly Leu Glu
                                    1               5
ctg ctg ggc atg acc ctg gct gtg ctg ggc tgg ctg ggg acc ctg gtg    100
Leu Leu Gly Met Thr Leu Ala Val Leu Gly Trp Leu Gly Thr Leu Val
         10                  15                  20
tcc tgc gcc ctg ccc ctg tgg aag gtg acc gcc ttc atc ggc aac agc    148
Ser Cys Ala Leu Pro Leu Trp Lys Val Thr Ala Phe Ile Gly Asn Ser
     25                  30                  35
atc gtg gtg gcc cag gtg gtg tgg gag ggc ctg tgg atg tcc tgc gtg    196
Ile Val Val Ala Gln Val Val Trp Glu Gly Leu Trp Met Ser Cys Val
 40                  45                  50                  55
gtg cag agc acg ggc cag atg cag tgc aag gtg tac gac tca ctg ctg    244
Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu
                 60                  65                  70
gct ctg ccg cag gac ctg cag gcc gca cgt gcc ctc tgt gtc att gcc    292
Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala Arg Ala Leu Cys Val Ile Ala
             75                  80                  85
ctc ctg ctg gcc ctg ctt ggc ctc ctg gtg gcc atc aca ggt gcc cag    340
Leu Leu Leu Ala Leu Leu Gly Leu Leu Val Ala Ile Thr Gly Ala Gln
         90                  95                 100
tgt acc acg tgt gtg gag gac gaa ggt gcc aag gcc cgt atc gtg ctc    388
Cys Thr Thr Cys Val Glu Asp Glu Gly Ala Lys Ala Arg Ile Val Leu
    105                 110                 115
acc gcg ggg gtc atc ctc ctc ctc gcc ggc atc ctg gtg ctc atc cct    436
Thr Ala Gly Val Ile Leu Leu Leu Ala Gly Ile Leu Val Leu Ile Pro
120                 125                 130                 135
gtg tgc tgg acg gcg cac gcc atc atc cag gac ttc tac aac ccc ctg    484
Val Cys Trp Thr Ala His Ala Ile Ile Gln Asp Phe Tyr Asn Pro Leu
                140                 145                 150
gtg gct gag gcc ctc aag cgg gag ctg ggg gcc tcc ctc tac ctg ggc    532
Val Ala Glu Ala Leu Lys Arg Glu Leu Gly Ala Ser Leu Tyr Leu Gly
            155                 160                 165
tgg gcg gcg gct gca ctg ctt atg ctg ggc ggg ggg ctc ctc tgc tgc    580
Trp Ala Ala Ala Ala Leu Leu Met Leu Gly Gly Gly Leu Leu Cys Cys
        170                 175                 180
acg tgc ccc ccg ccc cag gtc gag cgg ccc cgc gga cct cgg ctg ggc    628
Thr Cys Pro Pro Pro Gln Val Glu Arg Pro Arg Gly Pro Arg Leu Gly
    185                 190                 195
tac tcc atc ccc tcc cgc tcg ggt gca tct gga ctg gac aag agg gac    676
Tyr Ser Ile Pro Ser Arg Ser Gly Ala Ser Gly Leu Asp Lys Arg Asp
200                 205                 210                 215
tac gtg tga ggcggaggtt tcccctggga gcccactgct ccccactgcc            725
Tyr Val  ＊
ccgccctttc gaccttggcc tgatgaccag atgccctgct ccatcacaac ctccttcccc  785
aggaaaaccc actttccaaa agcccaagct acacctggct gcagggctgg gtcagctggc  845
ctggctgagc tcttctcagt ggggtcccct ttgatgttct cccccaagtt gggcagccta  905
gaggtgttgg gaaccctggc ctgcccccac ctccccagta attgtttcct tccgttgccc  965
aggacactgg ctggccttcc ttctcttctg agccctcccc tgccccagga accctggcct  1025
caccaaaaca gcagcagctc gttggctcca aaaccaggga gcagaccatg ccctcccaac  1085
cctggagttg tcagggaggg cctgcccatc acctccctct ccccaacatc cccaccctcg  1145
agttggaaat aaagagcatt tg                                           1167
<210>6
<211>217
<212>PRT
<213>人
<400>6
Met Ala Ser Thr Gly Leu Glu Leu Leu Gly Met Thr Leu Ala Val Leu
 1               5                  10                  15
Gly Trp Leu Gly Thr Leu Val Ser Cys Ala Leu Pro Leu Trp Lys Val
            20                  25                  30
Thr Ala Phe Ile Gly Asn Ser Ile Val Val Ala Gln Val Val Trp Glu
        35                  40                  45
Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys
    50                  55                  60
Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala
65                  70                  75                  80
Arg Ala Leu Cys Val Ile Ala Leu Leu Leu Ala Leu Leu Gly Leu Leu
                85                  90                  95
Val Ala Ile Thr Gly Ala Gln Cys Thr Thr Cys Val Glu Asp Glu Gly
            100                 105                 110
Ala Lys Ala Arg Ile Val Leu Thr Ala Gly Val Ile Leu Leu Leu Ala
        115                 120                 125
Gly Ile Leu Val Leu Ile Pro Val Cys Trp Thr Ala His Ala Ile Ile
    130                 135                 140
Gln Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Glu Ala Leu Lys Arg Glu Leu
145                 150                 155                 160
Gly Ala Ser Leu Tyr Leu Gly Trp Ala Ala Ala Ala Leu Leu Met Leu
                165                 170                 175
Gly Gly Gly Leu Leu Cys Cys Thr Cys Pro Pro Pro Gln Val Glu Arg
            180                 185                 190
Pro Arg Gly Pro Arg Leu Gly Tyr Ser Ile Pro Ser Arg Ser Gly Ala
        195                 200                 205
Ser Gly Leu Asp Lys Arg Asp Tyr Val
    210                 215
<210>7
<211>19
<212>DNA
<213>人
<400>7
aaggtgtacg actcgctgc         19
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人
<400>8
agtcccggat aatggtgttg        20
<210>9
<211>19
<212>DNA
<213>人
<400>9
gacttctaca atccgctgg         19
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人
<400>10
agcagagagg aacagagtgg        20
<210>11
<211>23
<212>DNA
<213>人
<400>11
catcatccag gacttctaca acc    23
<210>12
<211>22
<212>DNA
<213>人
<400>12
acgtagtccc tcttgtccag tc     22

Claims (10)

1.一种试剂在制备用于治疗哺乳动物中癌症的药物中的应用，其中所述试剂诱导密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9在癌细胞中的表达。
2.权利要求1的应用，其中所述试剂是编码密蛋白的核酸，其中可将所述核酸在其中所述核酸被转染到癌细胞和在所述细胞中产生密蛋白的条件下施用给哺乳动物。
3.权利要求2的应用，其中将所述核酸包含在病毒载体中。
4.权利要求3的应用，其中所述病毒载体选自由腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺病毒相关病毒载体组成的组中。
5.权利要求1的应用，其中所述哺乳动物是人。
6.治疗有效量的试剂在制备用于抑制癌组织转移的药物中的应用，其中所述试剂诱导癌组织中的密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9的表达。
7.权利要求6的应用，其中将一种或多种编码密蛋白-3，密蛋白-4或密蛋白-9的核酸在其中所述核酸被转染到癌细胞并且在所述细胞中产生密蛋白的条件下施用给哺乳动物。
8.权利要求7的应用，其中所述核酸包含在病毒载体中。
9.权利要求6的应用，其中所述病毒载体选自由腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒和腺病毒相关病毒载体组成的组中。
10.权利要求6的应用，其中所述哺乳动物是人。
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