KR100548167B1 - 베로톡신 ⅱ를 인식하는 인체 적응된 항체 및 그것을 생산하는 세포주 - Google Patents

Abstract

본 발명은 베로톡신 Ⅱ(VT2)에 특이적으로 결합하고, 바람직하게는 중화시키는 인체 적응된 항체를 제공한다. 항체는 베로톡신의 독성효과로 고통 또는 위험에 처한 환자를 치료하는데 유용하다.

Description

베로톡신 Ⅱ를 인식하는 인체 적응된 항체 및 그것을 생산하는 세포주{HUMANIZED ANTIBODIES THAT RECOGNIZE VEROTOXIN Ⅱ AND CELL LINE PRODUCING SAME}

본 발명은 일반적으로 새로운 생물제제(biologics)를 발달시키기 위한 재조합 DNA 및 단일클론성 항체(monoclonal antibody) 기술의 조합, 더욱 상세히는, 예컨대, 베로톡신 Ⅱ(VT2) 항원 및 베로톡신 Ⅱ 변종 항원(VT2V)에 특이적인 비-면역성(인간에서) 면역글로불린(immunoglobulin)의 생산과 시험관내 및 생체내에서 그들의 이용에 관한 것이다. 본 발명은, 또한, 더욱 상세히는, VT2 및 VT2V를 중화시킬 수 있는 VT2에 대한 인체 적응된 단일클론성 항체, 그 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(polynucleotide sequence), 항체 생산 방법, 유효 성분으로 항체를 포함하는 약제 조성물, 베로톡신 생산 E. coli(Verotoxin Producing E.coli; VTEC) 감염 및 용혈성 요독 증후군(Hemolytic Uremic Syndrome; HUS)을 치료하기 위해 유효 성분으로 항체를 함유하는 치료제 및 그러한 질환의 치료 방법에 관한 것이다.

종래 시가양 독소(Shiga-like toxin; SLT)로 알려진 베로톡신(VT)은 혈성 설사(bloody diarrhea) 및 베로톡신 생산 E.coli(VTEC) 감염에서 용혈성 요독 증후군(HUS)의 발달을 야기하는 것으로 알려져 있다. VTEC 감염의 병인학적 약제 중 하나는 독성 E.coli 0157이다. VT는, 또한, 사람에서 독성 중후군을 일으키는 VTEC 감염을 야기하는 것 외에 박테리아에 의해 생산된다. 아이들 또는 저하된 면역 반응을 갖는 노인들에서, 장에서 성장하는 박테리아에 의해 생산된 VT는 장 표피 세포를 붕괴시키면서 혈류로 들어간다. 이는 신성장애(renal dysfunction) 및 때때로 뇌 손상으로 특징지어지는 용혈성 요독 증후군(HUS)을 야기한다(see, e.g., Karmali, M. et al., The Lancet, 1, 619-620(1983); Siegler, R., The Journal of Pediatrics, 125, 511-518(1994)). 현재까지, 이들 독성 증후군에 대한 효과적인 약제는 존재하지 않는다. 항생제는 독성 증후군의 진행을 억제하기 위한 증명된 효과를 가지고 있지 않다(see, e.g., Carter, A. et al., The New England Journal of Medicine, 316, 1496-1500(1987); Griffen, P. et al., Annals of Internal Medicine, 109, 705-712(1988)). 이는 항생제에 의해 제거된 박테리아로부터 VT의 방출 및 VT에 대한 항생제의 무효 때문이다.

베로톡신(또는 시가양 독소)에는 베로톡신 Ⅰ(VT1 또는 SLT-1) 및 베로톡신Ⅱ(VT2 또는 SLT-2)의 두 가지 형태가 있다(see, O'Brien et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 180, 65-94.(1992)). VT2 생산 E.coli는 VTEC 감염 환자로부터 분리할 수 있다(see, Russmann et al., J. Med. Microbiol., 40(5), 338-343(1994)). Ostroff et al., J. Infect. Dis. 160, 994-998(1989) and Kleanthous et al., Arch. Dis. child. 65, 722-727(1990)은 VT1은 아닌 VT2만이 함유된 E.coli 0157 균주가 HUS와 더 많이 관련되어 있다는 것을 보고했다. 또한 임상적으 로 분리된 추가 VT2 변종(VT2V)이 있다(see, e. g.., Microb. Pathog., 8, 47-60(1990); FEBS Lett., 79, 27-30(1991); Microb. Pathog., 5, 419-426(1988); and J. Bacteriol., 170, 4223-4230(1988)). Armstrong et al., J. Infect. Dis., 171(4), 1042-1045(1995)는 임상적 시도로 VT 흡수제를 시험했으나, 이는 단지 장에서만 작용하고, 혈류에 도달한 VT를 흡수하지는 못했다.

Y-글로불린 제제는 VT1에 비교하여 VT2에 대하여 매우 낮은 중화 활성을 나타내었다(Ashkenazi, S. et al., The Journal of Pediatrics, 113, 1008-1014(1988); Morooka, T. et al., Acta Paediatrica Japonica, 38, 294-295(1996)). VT2를 중화시키는 마우스 단일클론성 항체가 보고되었다. 그러나, 이 항체는 VT2V에 대해 다소 낮은 결합 친화성(binding affinity)을 나타내었다(see, Schmitt, C. et al., Infection and Immunity, 59, 1065-1073 (1991)).

또한, 상기 기술된 바와 같은 뮤린 단일클론성 항체의 사용은 사람 치료, 특히, 하기 설명된 바와 같은 반복된 치료 양생법에서는 문제점이 있었다. 마우수 단일클론성 항체는, 예컨대, 사람에서 짧은 반감기를 갖고, 사람에 사용했을 때 다른 중요한 면역글로불린 기능적 특징이 부족한 경향이 있다.

게다가, 뮤린 단일클론성 항체는 사람 환자에 주입시, 면역원성인 실질적인 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 연구는 외부 항체의 주입 후, 주입된 항체에 대하여 환자에 의해 유도된 면역 반응이 초기 치료 후에, 실질적으로 항체의 치료 용도를 제거할 정도로 상당히 강하다는 것을 나타냈다. 게다가, 마우스 또는 다른 항원성(사람에게) 단일클론성 항체가 다양한 사람 질환을 치료하도록 사용되면, 관련 없는 마우스 항체로의 연이은 치료가 교차-반응성 때문에 그들 자체에 비효과적 또는 위험할 수 있다.

이른바 "키메라 항체(chimeric antibodies)"(예컨대, 사람의 불변부위(constant region)에 마우스의 가변부위(variable region)가 결합된)가 다소 성공적이라는 것이 증명된 반면, 중요한 면역원성 문제가 남아 있다. 일반적으로, 많은 항원에 높은 친화성을 갖는 VT2 항원에 반응성인 사람 면역글로불린의 생산은 전형적인 사람 단일클론성 항체 생산 기술을 사용하여서는 상당히 어렵다.

이렇게 해서, 실질적으로 사람에게 비-면역원성이고, 치료 제형 및 다른 용도에 적합한 방식으로 생산된 용이하고 경제적인 VT2 항원에 특이적인 인체 적응된 면역글로불린의 개선된 형태에 대한 요구가 있다. 본 발명은 이들 및 다른 요구들을 충족시킨다.

본 발명은 VT2 및/또는 VT2 변종에 특이적으로 결합하는 인체 적응된 항체를 제공한다. 그러한 항체들은 VT2의 B 서브유니트 및/또는 VT2 변종의 B 서브유니트에 특이적으로 결합한다. 그러한 항체들은 VT2 및/또는 VT2 변종을 중화시킨다. 바람직한 항체들은 VT2 또는 VT2 변종의 10 LD₅₀으로 제기된 마우스 또는 다른 포유류에 대해 적어도 50%, 75% 95% 또는 100% 보호를 제공하기 위해 VT2 및/또는 VT2 변종을 중화시킨다.

다소의 인체 적응된 항체들은 도1b에서 도시된 경쇄 가변부위(light chain variable region) 및 도1a에 도시된 중쇄 가변부위(heavy chain variable region) 로 특징지어지는 마우스 항체 VTm1-1의 인체 적응된 형이다.

본 발명은, 또한, VT2 및/또는 VT2 변종에 특이적 결합을 위해 마우스 항체 VTm1-1과 경쟁하는 항체를 제공한다.

상기 기술된 바와 같은 인체 적응된 항체들 중 약간은 L49, H29, H30, H49 및 H98로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 한 위치가 마우스 VTm1-1 항체 중쇄 또는 경쇄 가변부위 구조의 동등한 위치에 존재하는 아미노산에 의해 차지되는 마우스 VTm1-1 항체 중쇄 및 경쇄 가변부위 골격(franework)과 사람 GF4 항체 중쇄 및 경쇄 구조로부터 상보성 결정 부위(complementarity determining regions; CDRs)를 포함한다. 그러한 인체 적응된 항체는 10⁷ M^-1과 마우스 VTm1-1 항체의 3, 5 또는 10배 친화성 사이의 친화성 상수를 갖고, 베로톡신 Ⅱ에 특이적으로 결합한다.

상기 단락에서 기술된 인체 적응된 항체에서, L49, H29, H30, H49 및 H98로 구성된 그룹으로부터 선택된 각 위치는 마우스 VTm1-1 항체 중쇄 또는 경쇄 가변부위 골격의 동등한 위치에 존재하는 아미노산으로 차지된다.

상기 인체 적응된 항체 중에서, L3, L4, L19, L76, L79, L85, H1, H4, H5, H79, H89 및 H93으로부터 선택된 적어도 한 위치는 사람 항체 중쇄 또는 경쇄 동일 서열(consensus sequence)의 동등한 위치에 존재하는 아미노산으로 차지된다. 다소의 인체 적응된 항체에서, 그룹 L3, L4, L19, L76, L79, L85, H1, H4, H5, H79, H89 및 H93으로부터 선택된 각 위치는 사람 항체 중쇄 또는 경쇄 동일 서열의 동등한 위치에 존재하는 아미노산에 의해 차지된다.

다소의 인체 적응된 항체는 L49, H29, H30, H49, H98, L3, L4, L19, L76, L79, L85, H1, H4, H5, H79, H89 및 H93으로 구성된 그룹으로부터 선택된 한 개 이상의 위치가 표2 및 3에서 나타낸 바와 같이 치환될 수 있는 도2a에 도시된 중쇄 가변부위 및 도2b에 도시된 경쇄 가변부위를 포함한다.

다소의 인체 적응된 항체는 도2a에 도시된 중쇄 가변부위 및 도2b에 도시된 경쇄 가변부위를 포함한다.

다소의 인체 적응된 항체는 L49, H29, H30, H49 및 H98로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 한 위치가 마우스 VTm1-1 항체 중쇄 또는 경쇄 가변부위 골격의 동등한 위치에 존재하는 아미노산에 의해 차지되는 도2a에 도시된 인체 적응된 중쇄와 적어도 85% 일치를 갖는 인체 적응된 중쇄 및 도2b에 도시된 인체 적응된 경쇄와 적어도 85% 서열 일치를 갖는 인체 적응된 경쇄를 포함한다.

상기 기술된 인체 적응된 항체 중 약간은 경/중쇄 다이머의 두 쌍을 포함하고, 여기서 각 체인은 가변부위 및 불변부위를 포함한다.

상기 기술된 인체 적응된 항체 중 약간은 Fab 단편(fragment) 또는 F(ab')₂이다.

추가로, 상기 기술된 인체 적응된 항체는 정제된(purified) 형태로 제공된다.

상기 기술된 다소의 인체 적응된 항체는 IgG₁ 면역글로불린 동종형(isotype)을 갖는다.

본 발명은, 또한, 인체 적응된 VTm1-1 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 그러한 방법은 상기 기술된 항체들 중의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하여 인체 적응된 항체가 발현되는 세포주를 배양하고, 세포주에 의해 발현된 인체 적응된 항체를 리커버링(recovering)하는 것을 포함한다. 또한, 그러한 방법들은 항체를 약제학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하여 약제 조성물을 생산하는 것을 포함한다.

본 발명은, 또한, 상기 기술된 항체들 중 어느 것과 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제 조성물을 제공한다. 그러한 목표의 조성물은 도2a에 도시된 중쇄 가변부위 및 도2b에 도시된 경쇄 가변부위를 포함하는 인체 적응된 항체를 포함한다. 본 발명은, 또한, 베로톡신의 독성 효과로 고통 또는 위험에 처해 있는 환자의 치료를 위한 약제의 제조에서 상기 기술된 항체들 중 어느 것의 사용을 제공한다.

본 발명은, 또한, 베로톡신 Ⅱ 및/또는 베로톡신 Ⅱ 변종에 특이적으로 결합하는 사람 또는 인체 적응된 항체의 유효선량(effective dosage)을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 베로톡신의 독성 효과로 고통 또는 위험에 처해 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 그러한 방법에서, 항체는 베로톡신 Ⅱ 또는 베로톡신 Ⅱ 변종에 특이적으로 결합하기 위해 마우스 항체 VTm1-1과 경쟁한다. 그러한 방법에서, 인체 적응된 항체는 VT2 및/또는 VT2 변종에 특이적으로 결합한다. 그러한 방법에서, 인체 적응된 항체는 VT2 및/또는 VT2 변종의 B 서브유니트에 특이적으로 결합한다. 그러한 방법에서, 인체 적응된 항체는 VT2 및/또는 VT2 변종에 특이적으로 결합하고, VT2 및/또는 VT2 변종을 중화시킨다. 그러한 방법에서, 인체 적응된 항체는 VT2의 B 서브유니트 및/또는 VT2 변종의 B 서브유니트에 특이적으로 결합하고, VT2 및/또는 VT2 변종을 중화시킨다. 그러한 방법에서, 항체는 인체 적응된 항체이고, 이것은 마우스 VTm1-1 항체의 인체 적응된 형태이다. 그러한 방법에서, 항체는 도2a에 도시된 중쇄 가변부위 및 도2b에 도시된 경쇄 가변부위를 포함하는 인체 적응된 항체이다. 그러한 방법에서, 환자는 베로톡신 생산 E.coli에 감염되고, 항체는 치료용으로 투여된다. 그러한 방법에서, 환자는 베로톡신 생산 E.coli에 의한 감염의 위험에 있고, 항체는 예방용으로 투여된다. 그러한 방법은, 또한, 베로톡신 Ⅱ 또는 베로톡신 Ⅱ 변종의 독성 효과로부터 회복에 대한 환자의 모니터링(monitoring)을 포함한다.

다른 면에서, 본 발명은 상기 기술된 항체들 중 어느 것을 생산하는 세포주를 제공한다.

본 발명은, 예컨대, 베로톡신 생산 E.coli(VTEC) 감염 및 용혈성 요독 증후군(HUS)의 치료에서, 유용한 새로운 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 VT2 항원의 B 서브유니트에 특이적으로 결합하고, VT2 및 VT2 변종을 중화시킬 수 있는 인체 적응된 면역글로불린을 포함한다. 면역글로불린은 적어도 한 체인이 사람 골격부(framework region) 세그멘트에 기능적으로 연결된 한 개 이상의 마우스 상보성 결정 부위를 포함하는 경/중쇄 복합체의 두 쌍을 가질 수 있다. 예컨대, 추가로 마우스 아미노산 잔기에 자연적으로 연관되거나 되지 않는 마우스 상보성 결정 부위는 약 10⁷ M^-1 보다 큰 친화성으로 항원에 결합할 수 있는 인체 적응된 면역글로불린을 생산하는 사람 골격부로 도입될 수 있다. 이들 인체 적응된 면역글로불린 은, 또한, VT2에 CDR-부여 마우스 단일클론성 항체의 결합을 억제할 수 있다.

결합 단편 및 그것의 다른 유도체를 포함하는 본 발명의 면역글로불린은 다양한 재조합 DNA 기술, 감염 세포에서 최대 발현, 바람직하게는, 골수종(myeloma) 또는 하이브리도마 세포 같은 무한 증식 진핵세포(immortalize eukaryotic cell)로 용이하게 생산될 수 있다. 인체 적응된 면역글로불린 골격부를 코딩하는 제1서열 및 목표의 면역글로불린 상보성 결정 부위를 코딩하는 제2서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 합성 또는 적당한 cDNA 및 유전자 DNA 세그멘트를 조합하여 생산될 수 있다.

인체 적응된 면역글로불린은 베로톡신 생산 E.coli(VTEC) 감염 및 용혈성 요독 증후군(HUS) 동안 생산된 것과 같은 VT2 또는 VT2V로부터의 독성 효과를 잠재적으로 치료하는 실질적으로 정제 형태로 사용될 수 있다. 인체 적응된 면역글로불린 또는 그들의 복합체는 투여 방식에 따라 다양한 약제학적으로 허용 가능한 제형으로 제제될 수 있다.

도1은 마우스 VTm1.1 항체(MuVTm1.1)의 중쇄(A) 및 경쇄(B) 가변부위의 cDNA 및 해독된 아미노산 서열을 도시한다. 상보성 결정 부위(CDRs)는 밑줄 그어 있고, 머츄어 체인(mature chain)의 제1아미노산은 두 줄로 그어 있다.

도2는 인체 적응된 VTm1.1 항체(HuVTm1.1)의 중쇄(A) 및 경쇄(B) 가변부위의 cDNA 및 해독된 아미노산 서열을 도시한다. 상보성 결정 부위(CDRs)는 밑줄 그어 있고, 머츄어 체인의 제1아미노산은 두 줄로 그어 있다.

도3은 인체 적응된 항체 가변부위 cDNA의 합성을 위한 도식이다.

도4는 MuVTm1.1 및 HuVTm1.1 항체의 E.coli 베로톡신 Ⅱ(VT2)에 대한 경쟁적인 결합을 도시한다. 경쟁 항체의 농도를 증가시키는 것은 바이오티닐레이티드 트레이서(biotinylated tracer) MuVtm1.1의 존재에서 코팅된 VT2로 배양된다.

흡광도는 표지되지 않은 경재 항체의 농도에 대해 측정되고, 플롯된다.

도5는 시험관내에서 HuVTm1.1 vs. MuVTm1.1의 중화 활성을 도시한다.

도6은 HuVTm1.1의 인지된 항원(VT2의 B 서브유니트)의 동정을 도시한다.

도7은 VT2 및 VT2 변종에 대한 MuVTm1.1의 중화 활성을 도시한다.

(정의)

두 개 핵산 또는 폴리펩티드(예컨대, DNAs는 인체 적응된 면역글로불린 또는 인체 적응된 면역글로불린의 아미노산 서열을 코딩하는)의 문맥에서, "실질적으로 동일한(substantially identical)" 이란 구는 최대 대응을 위한 비교 및 정렬시, 따르는 서열 비교 방법 및/또는 시각적 검사를 사용하여 측정된 것과 같은 적어도 약 80%, 더욱 바람직하게는 85%, 90-95% 또는 높은 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 일치성을 갖는 두 개 이상의 서열 또는 아서열(subsequence)을 의미한다. 그러한 "실질적으로 동일한" 서열은 전형적으로 동일한 것으로 여겨진다. 바람직하게는, "실질적 동일성"은 적어도 길이에 있어서 약 50 잔기의 서열 부위가 존재하고, 더욱 바람직하게는 적어도 약 100 잔기 이상의 부위, 가장 바람직하게는 서열이 적어도 150 잔기가 실질적으로 동일하거나 비교될 두 개 서열의 전체 길이가 동일한 것이다. 하기 기술된 바와 같이, 두 개 항체 서열 중 어느 것은, Kabat의 넘버링 시스템(numbering system)을 사용하여 한 방식으로 배열될 수 있다. 그러므로, 항체들에 대한, 퍼센트 동일성은 독특하고 잘-정의된 의미를 갖는다.

면역글로불린의 머츄어 중쇄 및 경쇄의 가변부위로부터의 아미노산 서열은 각각 Hx 및 Lx로 제안되고, 여기서 X는 Kabat(Sequence of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda MD, 1987 and 1991)의 도식에 따라 아미노산의 위치를 제안하는 수이다. Kabat은 각 서브그룹을 위한 항체에 대한 많은 아미노산 서열 리스트를 작성하고, 동일한 서열을 산출하기 위해 서브그룹에서 각 잔기 위치에 대해 발생하는 가장 일반적인 아미노산을 작성했다. Kabat은 각 작성된 서열에서 각 아미노산에 대한 잔기 수를 할당하는 방법을 사용하고, 자기 수들을 할당하기 위한 이 방법은 이 분야에서 기본적인 것이 되었다. Kabat의 도식은 보존된 아미노산을 참조로 Kabat에서 동일한 서열 중 하나에 관한 문제에서, 항체를 배열하는 것에 의한 그의 개론에 포함되지 않는 다른 항체에 대해서도 연장된다. 예컨대, 사람 항체의 L50위치에서 아미노산은 마우스 항체의 L50위치에서 아미노산에 동등한 위치를 차지한다.

보존적 아미노산 치환은 유사한 사이드 체인을 갖는 잔기의 교환력을 의미한다. 예컨대, 지방성 사이드 체인을 갖는 아미노산의 그룹은 글라이신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신, 지방성-수산기 사이드 체인을 갖는 아미노산의 그룹은 세린 및 트레오닌, 아미드-함유 사이드 체인을 갖는 아미노산의 그룹은 아스파라긴 및 글루타민, 방향성 사이드 체인을 갖는 아미노산의 그룹은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판, 염기성 사이드 체인을 갖는 아미노산의 그룹은 리신, 아르기닌 및 히스티딘 및 황-함유 사이드 체인을 갖는 아미노산의 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적인 아미노산 치환 그룹은 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린 및 아스파라긴-글루타민이다.

예시된 항체 서열의 유사물은 예컨대, Cesareni, FEBS Lett 307:66-70(1992); Swimmer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3756-60(1992); Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-80)1992); Clackson et al., Nature 352:624-8(1991); Scott & Smith, Science 249:386-90(1990) Garrard et al., Bio/Techniques 9:1373-1377(1991)에 의해 기술된 것과 같은 파지 디스플레이(phage display) 방법을 사용하여 결합 활성의 잔류에 대해 스크린되었고, 이들은 모든 의도에 대하여 그들의 전체에서 참고문헌으로 포함되었다.

"실질적으로 순수한(substantially pure)"이란 것은 대상 종이 우세한 종으로 존재하는 것이고(즉, 분자적 기초에서, 조성물에서 어떤 다른 개개 종 보다 더 풍부한), 바람직하게는, 실질적으로 정제된 단편은 대상 종이 존재하는 모든 거대분자 종 중에 적어도 약 50%를 포함하는 조성물이다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 조성물은 존재하는 모든 거대분자 종의 조성물에서 약 80 내지 90% 이상을 포함하는 것이다. 더욱 바람직하게는, 대상 종은 실질적으로 균일하게 정제되고(오염된 종은 종래 감지 방법에 의해 조성물에서 감지될 수 없다), 여기서 조성물은 실질적으로 단일의 거대분자 종으로 구성된다.

항체들 간의 경쟁은 시험 하에서 면역글로불린이 항원 결정기에 대한 대조 항체의 특이적 결합을 억제하는 분석에 의해 결정된다. 경쟁적 결합 분석의 다양한 형태는 종래 공지된, 예컨대, 고체상(solid phase) 직접 또는 간접 방사선 면역측정법(radioimmunoassay; RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역측정법(enzyme immunoassay: EIA), 샌드위치 경쟁 측정법(see Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253(1983)); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA(see Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619(1986)); 고체상 직접 표지측정법, 고체상 직접 표지 샌드위치측정법(see Harlow and Lane, "Antibodies, A. Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Press(1988)); I-125 표지를 사용한 고체상 직접 표지 RIA(see Morel et al., Molec. Immunol. 25(1):7-15(1988)); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA(Cheung et al., Virology 176:546-552(1990)); 및 직접 표지 RIA(Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82(1990))가 있다. 일반적으로 검사 면역글로불린은 과도한 양으로 존재한다. 경쟁 분석에 의해 확인된 항체(경쟁 항체)는 대조 항체와 같은 동일한 항원결정기(epitope)에 결합하는 항체 및 공간적 방해를 일으키기 위해 대조 항체에 의해 결합된 항원결정기에 충분히 근접한 인접 항원결정기에 결합하는 항체를 포함한다.

일반적으로, 경쟁 항체는 과도하게 존재시, 적어도 50 또는 75%에 의해 제안된 항원 타깃에 대조 항체의 특이적 결합을 억제할 것이다.

본 발명에 따라, VT2의 B 서브유니트와 특이적으로 반응하는 인체 적응된 면역글로불린을 제공한다. VT2의 B 서브유니트에 약 10⁷ M^-2 내지 10¹⁰ M ^-1, 더욱 바람 직하게는 10⁸ M^-1 내지 10¹⁰ M^-2 또는 그 보다 큰 결합 친화성을 갖는 이들 면역글로불린은 예컨대, VT2 및 VT2V(VT2 항원)의 독성을 중화시킬 수 있다. 인체 적응된 면역글로불린은 사람 골격을 갖고, VT2와 특이적으로 반응하는 면역글로불린, 전형적인 마우스 면역글로불린으로부터 한 개 이상의 상보성 결정 부위(CDRs)를 갖는다. 바람직한 실시형태에서, CDR's 중 한 개 이상은 MuVTm1.1 항체로부터 기인한다. 이렇게 해서, 경제적으로 대량 생산될 수 있는 본 발명의 면역글로불린은, 예컨대, 다양한 기술을 이용하여 베로톡신 생산 E.coli(VTEC) 감염 및 용혈성 요독 증후군(HUS) 환자에서의 독성을 치료할 수 있다.

기본 항체 구조적 단위는 테트라머(tetramer)를 포함하는 것으로 알려져 있다. 각 테트라머는 "경쇄"(약 25 kD) 및 "중쇄"(50-70 kD)의 폴리펩티드 체인 두개의 동일한 쌍으로 구성된다. 각 체인의 아미노-말단 부분은 약 100 내지 110 또는 그 이상의 주로 항원을 인식하는 아미노산의 가변부위를 포함한다. 각 체인의 카르복시-말단 부분은 주로 작동 기능을 하는 불변부위를 한정한다.

경쇄는 카파(kappa) 또는 람다(lambda)로 분류된다. 중쇄는 감마(gamma), 뮤(mu), 알파(alpha), 델타(delta) 또는 입실론(epsilon)으로 분류되고, 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 항체의 동종형을 한정한다. 경쇄 및 중쇄에서, 가변 및 불변부위가 "D" 영역 또는 약 10개 이상의 아미노산을 포함하는 중쇄와 "J" 영역과 약 12개 이상의 아미노산에 의해 연결된다(see, generally, Fundamental Immunology, Paul, W., Ed., Chapter 7, pgs. 131-166, Raven Press, N. Y.(1984), 본원에 참고문헌으로 포함된다).

각 경/중쇄 쌍의 가변부위는 항체 결합부위를 형성한다. 체인들은 모두 3개의 과가변부위(hypervariable region), 이른바, 상보성 결정 부위 또는 CDR's에 의해 연결된 다소 보존된 골격부의 동일한 일반적인 구조를 나타낸다(see, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services,(1987); and Chothia and Le나, J. Mol. Biol., 196, 901-917(1987), 본원에 참고문헌으로 포함된다). 각 쌍의 두 개 체인으로부터의 CDR's는 골격 부위에 의해 정렬되고, 특정 항원결정기에 결합할 수 있다.

기술된 바와 같이, "면역글로불린"이라는 용어는 실질적으로 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩되는 한 개 이상의 폴리펩티드로 구성된 단백질을 의미하는 것이다. 인지된 면역글로불린 유전자는 무수한 면역글로불린 가변부위 유전자뿐만 아니라 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 입실론 및 뮤 불변부위 유전자를 포함한다. 면역글로불린은, 예컨대, 이작용성 하이브리드 항체뿐만 아니라 Fv, Fab 및 F(ab')₂(e.g., Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105(1987)) 및 단일 체인에서 항체(e.g., Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 5879-5883(1998) and Bird et al., Science 242, 423-426(1998), 본원에 참고문헌으로 포함된다)에 부가하는 다양한 형태로 존재한다(see, generally, Hood et al., Immunology, Benjamin, N.Y., 2^nd ed, (1984), Harlow and Lane, Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1998) and Hunkapiller and Hood, Nature, 323, 15-16(1986), 본원에 참고문헌으로 포함된다).

키메라 항체는 그것의 경쇄 및 중쇄 유전자가 다른 종에 속하는 면역글로불린 유전자 세그멘트로부터 유전공학에 의해 일반적으로 만들어지는 항체이다. 예컨대, 마우스 단일클론성 항체로부터의 유전자의 가변(V) 세그멘트는 Y1 및 Y3 같은 사람 불변(C) 세그멘트에 결합될 수 있다. 일반적으로 치료용 키메라 항체는 이렇게 해서, 다른 포유류 종이 사용될 지라도, 마우스 항체로부터의 V 또는 항원-결합 도메인 및 사람 항체로부터 C 또는 작동기 도메인으로 구성된다.

여기서 사용된 바와 같이, "골격부"는 Kabat et al., op. cit.에 의해 한정된 단일 종의 다른 면역글로불린 사이에서 다소 보존된(즉, CDR's 외) 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변부위의 그 부분들을 언급한다. 여기에서 사용된 바와 같이, "사람 골격부"는 자연적으로 발생하는 사람 항체의 골격부에 실질적으로 동일한(약 85% 이상) 골격부이다.

여기서 사용된 바와 같이, "인체 적응된 면역글로불린"은 사람 골격부, 비-사람 항체로부터의 적어도 한 개의 CDR 및 어떤 존재하는 불변부위가 사람 면역글로불린 불변부위와 적어도 약 85 내지 90%, 바람직하게는 적어도 95%로 실질적으로 동일한 것을 포함한다. 그러므로, 가능한 CDR's를 제외하고 인체 적응된 면역글로불린의 모든 부분은 실질적으로 한 개 이상의 자연의 사람 면역글로불린 서열의 상응하는 부분에 동일하다. 예컨대, 인체 적응된 면역글로불린은 키메라 마우스 가변부위/사람 불변부위 항체를 포함하지 않는다.

인체 적응된 항체는 사람 치료를 위한 목적의 키메라 항체의 경우에서, 마우 스 보다 적어도 3가지의 잠재적 이점을 갖는다.

작용기 부분이 사람이기 때문에, 사람 면역체계의 다른 부분과 상호작용할 수 있다(예컨대, 보체-종속 세포독성(CDC) 또는 항체-종속 세포성 세포독성(ADCC) 에 의해 더욱 효과적으로 타깃 세포를 파괴).

사람 면역체계는 인체 적응된 항체의 골격 또는 C 영역을 이물질로 인식하지 않고, 그러므로, 주입된 항체 같은 것에 대한 반응은 전체적으로 이물질 마우스 항체 또는 부분적으로 이물질인 키메라 항체에 대한 것 보다 작다.

주입된 마우스 항체는 정상 항체의 반감기 보다 짧은 사람 순환에서의 반감기를 갖는 것으로 보고되었다(Shaw, D. et al., J. Immunol, 138, 4534-4538(1987)). 주입된 인체 적응된 항체는 자연적으로 발생하는 사람 항체와 실질적으로 동일한 반감기를 갖고, 이는 더 적은 양과 짧은 빈도의 투여를 가능하게 한다.

한 관점에서 보면, 본 발명은 단일클론성 항체 MuVTm1.1 같은 VT2의 B 서브유니트에 결합할 수 있는 면역글로불린으로부터 중쇄 및/또는 경쇄 CDR's를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 목표로 한다. 3개 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 적당한 사람 골격부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 결합될 것이다. 사람 골격부에 대하여, CDR-제공 비-사람 면역글로불린의 골격 또는 가변부위 아미노산 서열은 사람 면역글로불린 서열 수집에서의 상응하는 서열과 비교되고, 높은 상동성을 갖는 서열이 선택된다. 발현에 있서, 단일클론성 항체 MuVTm1.1의 중쇄 및 경쇄 CDR's를 포함하는 폴리펩티드 체인을 코딩하는 예시적 폴리뉴클레 오티드가 도1에 도시된다. 코돈 퇴화 및 중요하지 않은 아미노산 치환으로, 다른 폴리뉴클레오티드 서열이 하기 기술된 바와 같이, 용이하게 그 서열 대신에 치환될 수 있다. 인체 적응된 면역글로불린의 제작은 다음과 같이 실행되었다. 아미노산이 다음의 카테고리를 거칠 때, 사용된 사람 면역글로불린(수용체 면역글로불린)의 골격 아미노산이 CDR-제공 비-사람 면역글로불린(공여체 면역글로불린)의 골격 아미노산에 의해 치환된다.

수용체 면역글로불린의 사람 골격부의 아미노산은 그 위치에서 사람 면역글로불린에 대해 드물고, 반면, 공여체 면역글로불린의 상응하는 아미노산은 그 위치에서 사람 면역글로불린에 대해 일반적이다;

아미노산의 위치는 CDR's 중 하나에 바로 인접하거나,

아미노산은 3차 구조 면역글로불린 모델에서 CDR의 약 3 Å내이다(see, Queen et al., op. cit., and Co et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2869(1991), 본원에 참고문헌으로 포함된다).

수용체 면역글로불린의 사람 골격부의 아미노산 각각 및 공여체 면역글로불린의 상응하는 아미노산은 그 위치에서 사람 면역글로불린에 대해 드물고, 그러한 아미노산은 그 위치에서 사람 면역글로불린에 대해 일반적인 아미노산으로 치환된다.

인체 적응된 면역글로불린의 생산에 대한 상세한 기술은 Queen et al., op. cit., and Co et al., op. cit.에 나타나 있다.

폴리뉴클레오티드는, 또한, 일반적으로, 자연적으로-연관된 또는 이종 유래 의 프로모터 영역을 포함하는 인체 적응된 면역글로불린 코딩 서열에 연관된 발현 제어 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

바람직하게는, 발현 제어 서열은 진핵 숙주세포를 형질전환 또는 감염할 수 있는 벡터(vector)의 진핵 프로모터 시스템일 것이나, 원핵 숙주를 위한 제어 서열 또한 사용될 수 있다. 벡터가 적당한 숙주로 들어가면, 숙주는 뉴클레오티드 서열, 경쇄, 중쇄, 경/중쇄 다이머 또는 완전한 항체의 높은 수준 발현을 위한 적당한 조건 하에서 유지될 수 있고, 단편 또는 다른 면역글로불린 형태에 결합은 다음에 따른다.

바람직한 인체 적응된 항체를 최대로 발현할 수 있는 본 발명의 핵산 서열은 다양한 다른 기술에 의해서 뿐만 아니라 다양한 다른 폴리뉴클레오티드(유전자 또는 cDNA, RNA, 합성 올리고뉴클레오티드 등) 및 성분(예컨대, V, J, D, 및 C 영역)으로부터 형성될 수 있다.

적당한 유전자와 합성 서열을 결합하는 것은 생산의 가장 일반적이 방법이나, cDNA 서열이 또한 사용될 수 있다(see, European Patent Publication No. 0239400 and Riechmann, L. et al., Nature, 332, 323-327(1988), 모두, 본원에 참고문헌으로 포함된다).

사람 불변부위 DNA 서열은 다양한 사람 세포, 바람직하게는 무한증식 B-세포, 로부터 종래 공지된 가정으로 분리될 수 있다(see, Kabat op. cit. and WP 87/02671). 본 발명의 면역글로불린을 생산하기 위한 CDR's는 VT2 항원에 결합할 수 있는 단일클론성 항체로부터 유사하게 유도될 수 있고, 종래 공지된 방법에 의 해 항체를 생산할 수 있는 마우스, 쥐, 토끼 또는 다른 척추동물을 포함하는 어떤 편리한 포유류 근원에서도 생산될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열을 위한 적당한 근원세포와 면역글로불린 발현 및 분비를 위한 숙주세포는 Americal Type Culture Collection(Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, Fifth edition(1985) Rockville, Maryland, U.S.A., 본원에 참고문헌으로 포함된다) 같은 다양한 곳으로부터 얻어질 수 있다.

여기서, 특이적으로, 기술된 인체 적응된 면역글로불린에 부가하여, 다른 "실질적으로 상동"으로 변형된 면역글로불린이 종래 공지된 다양한 재조합 DNA 기술을 이용하여 용이하게 제작 및 제조될 수 있다. 예컨대, 골격부는 다양한 아미노산 치환, 말단 및 중간 추가 및 결실 등과 같은 1차 구조 수준에서 자연 서열로부터 다양해질 수 있다. 게다가, 다양한 다른 사람 골격부는 본 발명의 인체 적응된 면역글로불린을 기초로 단일 또는 조합하여 사용될 수 있다. 일반적으로, 유전자의 변형은 위치-유도 돌연변이(site-directed mutagenesis)(see, Gillman and Smith, Gene 8, 81-97(1979) and Roberts S. et al., Nature 328, 731-734(1987)) 같은 종래 공지된 다양한 기술에 의해 용이하게 이루어질 수 있다.

또한, 1차 항체 구조의 단지 부분을 포함하는 폴리펩티드 단편이 생산될 수 있고, 그 단편은 한 개 이상의 면역글로불린 활성(예컨대, 보체 고정 활성)을 갖는다. 이 폴리펩티드 단편들은 종래 공지된 방법으로 완전한 항체의 단백질 분해성 절단 또는 CH1 다음에 Fab 단편 또는 경첩부(hinge region) 다음에 F(ab')₂를 생산하는 것 같은 위치-유도 돌연변이를 사용하는 벡터에서 바람직한 위치에서 정지 코 돈을 삽입하는 것으로 생산될 수 있다. 단일 체인 항체는 DNA 링커(linker)와 VL 및 VH를 연결하여 생산될 수 있다(see Huston et al., op. cit., and Bird et al., op. cit.). 또한, 많은 유전자 때문에, 면역글로불린-관련된 유전자들은 각각 한 개 이상의 독특한 생물학적 활성을 갖는 독립된 기능 부위를 포함하고, 유전자들은 다른 유전자로부터 기능적 부위에 융합되어 새로운 성질을 갖는 융합 단백질을 생산한다.

상기 기술된 바와 같이, 폴리뉴클레오티드는 서열이 실시 가능하게 발현 제어 서열에 연결된(즉, 그 기능을 확실하게 하기 위해 위치된) 후에 숙주에서 발현될 것이다. 이 발현 벡터는 일반적으로 에피솜(episome) 또는 숙주 염색체 DNA의 완전체로서 숙주 생물에서 복제할 수 있다. 일반적으로, 발현 벡터는 선택 표지, 즉, 테트라사이클린 또는 네오마이신을 포함하여 바람직한 DNA 서열로 감염된 세포들의 감지를 가능하게 한다(see, e.g., U.S. Patent 4,704,362, 본원에 참고문헌으로 포함된다).

E.coli는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 클로닝하는데 특히 유용한 진핵 숙주이다. 다른 적합한 미생물 숙주로는 Bacillus subtilus 같은 bacilli, Salmonella, Serratia 같은 enterobacteriacea 및 다른 Pseudomonas 종이 있다. 이들 진핵 숙주에서, 또한, 발현 벡터를 만들 수 있고, 이는 일반적으로 숙주 세포(예컨대, 복제의 오리진(origin))에 양립할 수 있는 발현 제어 서열을 포함한다. 게다가, 락토오스 프로모터 시스템, 트립토판(TRP) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템 또는 파지 람다의 프로모터 시스템 같은 종래 공지된 다양한 시스 템이 존재한다. 프로모터는 일반적으로 부가적으로 작동 서열을 가져서 발현을 제어하고, 전사 및 해독을 개시하고 완성하기 위한 리보솜(ribosome) 결합부위 서열 등과 같은 것을 갖는다.

효모 같은 다른 미생물이 또한 발현을 위해 사용될 수 있다. Saccharomyces는 3-포스포글리세레이트키나아제 또는 다른 글리코라이틱 효소 및 복제의 오리진, 바람직하게는 종결 서열 등을 포함하는 프로모터 같은 발현 제어 서열 갖는 적당한 벡터를 갖는 바람직한 숙주이다.

미생물에 부가하여, 포유류 조직세포 배양은, 또한, 본 발명의 폴리펩티드를 발현하고 생산하는데 사용될 수 있다(see, Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y.(1987), 본원에 참고문헌으로 포함된다). 진핵세포는 자연의 면역글로불린을 분비할 수 있는 CHO 세포주, 다양한 COS 세포주, HeLa 세포, 바람직하게는, 골수종 세포주를 포함하는 다양한 적합한 숙주 세포주가 종래 공지되어 있기 때문에 실제로 바람직하다. 이 세포들을 위한 발현 벡터는 복제의 오리진, 프로모터 및 인핸서(enhancer) 같은 발현 제어 서열(Queen et al., Immunol. Rev. 89, 46-68(1986), 본원에 참고문헌으로 포함된다) 및 리보솜 결합부위, RNA 스플라이싱 부위, 폴리아데닐레이션(polyadenylation) 부위 및 전사 종결 서열 같은 필수적인 처리 정보 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 발현 제어 서열은 면역글로불린 유전자, SV40, 아데노바이러스, 보바인 파필로마 바이러스, 사이토메갈로바이러스 등과 같은 것으로부터 기원한 프로모터이다.

관심의 폴리뉴클레오티드 서열(예컨대, 중쇄 및 경쇄 인코딩 서열 및 발현 제어 서열)을 포함하는 벡터는 종래 공지된 방법으로 숙주세포에 전이될 수 있고, 이들은 세포 숙주의 형태에 따라 다양하다. 예컨대, 칼슘클로라이드 감염은 일반적으로 진핵세포에 이용되는 반면, 칼슘포스페이트 처리 또는 일렉트로포레이션(electroporation)은 다른 세포 숙주에 사용될 수 있다(see, generally Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press(1982), 본원에 참고문헌으로 포함된다).

일단 발현되면, 본 발명의 전체 항체, 그들의 다이머, 개개 경쇄 및 중쇄 또는 다른 면역글로불린 형태가 암모늄설페이트 침전, 분별 컬럼, 컬럼 크로마토그라피, 겔 전기 영동 등과 같은 종래 기술에 따라 정제될 수 있다(see, Scopes, R., Protein Purification, Spring-Verlag, N. Y.(1982), 본원에 참고문헌으로 포함된다). 약제 용도로, 적어도 약 90 내지 95% 동질성의 실질적으로 순수한 면역글로불린이 바람직하고, 98 내지 99% 또는 그 이상의 동질성이 더욱 바람직하다. 일단 부분적으로 또는 바람직하게는 동질로 정제되면, 폴리펩티드는 치료용(체외를 포함하는) 또는 면역형광 염색법 등과 같은 분석 방법을 발달시키고 수행하는데 사용될 수 있다(see, generally Immunological Methods, Vols. Ⅰ and Ⅱ, Lefkovoits and Pernis, eds., Academic Press, New York, N. Y.(1979 and 1981).

본 발명의 면역글로불린은 일반적으로 베로톡신 생산 E.coli(VTEC) 감염 및 용혈성 요독 증후군(HUS)의 독성 효과 치료 및/또는 VT2 항원을 중화시키는데 사용될 것이다. 볼 발명을 제한하지 않는 예로, 치료를 위해 적합한 다소의 일반적인 질환 상태는 장에서 국부적 출혈성 대장염, 신성 기능장애 및 뇌 손상을 포함한다.

본 발명에 따른 인체 적응된 면역글로불린 및 그것의 약제 조성물은 특히, 장관외 투여, 즉, 피하, 근육내 또는 정맥내 투여에 유용하다. 장관외 투여를 위한 조성물은 일반적으로 면역글로불린의 용액 또는 허용 가능한 담체, 바람직하게는 허용성 담체에 용해된 그혼합물을 포함한다. 예컨대, 물, 완충수, 0.4% 식염수, 0.3% 글라이신, 5% 글루코오스, 사람 알부민 용액 등과 같은 다양한 허용성 담체가 사용될 수 있다. 이 용액들은 멸균하여 일반적으로 입자가 없는 상태이다. 이들 조성물은 종래의 공지된 멸균 기술로 멸균될 수 있다. 조성물은 pH 조정 및 완충제, 토니서티제(tonicity), 독성 조정제 등과 같은, 예컨대, 소듐아세테이트, 소듐클로라이드, 포타슘클로라이드, 칼슘클로라이드, 소듐락테이트, 소듐시트레이트 등의 적당한 생리적 조건에 요구된 약제학적으로 허용 가능한 보조 물질을 포함한다. 이 제형에서 면역글로불린의 농도는 약 0.5% 보다 작은 것부터, 일반적으로 적어도 1%, 많게는 15 또는 20 중량%로 매우 다양하고, 특정 투여 방식에 따라 액체 부피, 점성 등에 따라 선택된다.

이렇게 해서, 주입용의 일반적인 약제 조성물은 1 ml의 멸균 완충액 및 1 ∼ 10 mg의 면역글로불린을 포함하는 것으로 구성된다. 정맥내 주입을 위한 일반적인 조성물은 250 ml의 멸균 링거액 및 150 mg의 면역글로불린을 포함하는 것으로 제조될 수 있다.

장관외 투여 조성물 준비를 위한 실제 방법은 종래 기술된 방법으로, 예컨대, Remington's Pharmaceutical Science, 15^th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania(1980)에 상세히 기술되어 있고, 본원에 참고문헌으로 포함된 다.

본 발명의 면역글로불린은 저장을 위해 냉동 또는 동결건조되고, 사용 전에 적합한 담체에서 복원될 수 있다. 이 기술은 통상적인 면역글로불린에 효과적임이 알려져 있다. 동결건조 및 복원 기술은 면역글로불린 활성 손실을 가변적인 정도로 유도할 수 있고(예컨대, 종래 면역글로불린에서, IgM 항체는 IgG 항체 보다 더 큰 활성 손실을 갖는 경향이 있다), 그 사용 수준은 보충되도록 조절된다.

본 발명의 면역글로불린 또는 그 혼합물을 포함하는 조성물은 치료적 또는 예방적 치료를 위해 투여될 수 있다. 치료적 투여에 있어서, 조성물은 베로톡신 생산 E.coli(VTEC) 감염 및 용혈성 요독 증후군(HUS) 또는 VT2 항원으로부터의 독성 징후의 환자에 적어도 부분적으로 독성 증후군 및 그것의 합병증을 치료할 수 있을 정도의 충분한 양으로 투여된다. 이를 이룰 수 있는 적합한 양을 "치료적 유효선량"으로 정의한다. 예방적 투여에 있어서, 조성물은 VT2에 의한 감염 및/또는 독성 징후 같은 것을 억제 또는 감지 방해할 수 있는 정도의 충분한 양으로 감염의 위험에 있는 환자에 투여된다. 여기서 유효한 양은 병의 심각성 및 환자 자신의 면역체계의 일반적인 상태에 의존하나 일반적으로 환자 당 약 0.1 내지 5 mg/kg의 범위가 일반적으로 사용된다. 본 발명의 물질은 일반적으로 심각한 질환, 즉, 생명을 위협하거나 잠재적으로 생명 위협 상태에서 사용되는 것을 명심해야 한다. 그러한 경우에서, 외부 물질의 최소화 및 본 발명의 인체 적응된 면역글로불린에 의해 이루어진 "이물질(foreign substance)" 제거의 더 낮은 가능성의 관점에서, 치료 의사에 의해 이 면역글로불린의 실질적으로 과도한 양을 투여하는 것이 가능하고, 바람직 하다.

조성물의 일회 투여 또는 다중 투여는 치료 의사에 의해 선택된 투여량 및 방식으로 수행된다. 어떤 경우라도, 약제학적 제제는 효과적으로 환자를 치료하기에 충분한 본 발명의 면역글로불린 양을 함유해야 한다.

특히, 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 인체 적응된 면역글로불린을 포함하는 조성물은 베로톡신 생산 감염 E.coli(VTEC) 감염 및 용혈성 요독 증후군(HUS) 및/또는 다른 VT2 또는 VT2V를 감염하는 VT2 항원을 감지하는데 사용될 수 있다. 이렇게 해서, MuVTm1.1 항체에 의해 확인된 항원 결정기에 결합하는 인체 적응된 면역글로불린 같은 본 발명의 인체 적응된 면역글로불린은 표지되고, VT2 또는 VT2V의 상당한 농도를 함유하는 해부학적 부위를 확인하는데 사용될 수 있다. 제한하지 않는 예로, 한 개 이상의 표지 모이어티(moiety)가 인체 적응된 면역글로불린에 부착될 수 있다. 제한하지 않는 예로 표지 모이어티는 방사선비투과성(radiopaques) 염료, 방사선 조영제(radiocontrast agents), 형광 분자, 스핀-표지 분자, 또는, 특히, 방사선 또는 전자기 공명 이미징 기술에서 다른 진단 값의 표지 모이어티를 포함한다.

본 발명의 인체 적응된 면역글로불린은 또한 시험관내에서 다양한 용도로 이용될 수 있다. 예로, 면역글로불린은 VT2 항원 등의 감지를 위해 이용될 수 있다.

진단을 목적으로, 면역글로불린은 표지 또는 비표지될 수 있다. 비표지된 면역글로불린은 사람 면역글로불린 불변부위에 특이적인 항체 같은 인체 적응된 면역글로불린과 반응하는 다른 표지된 항체(제2항체)와 조합하여 사용될 수 있다. 또 한, 면역글로불린은 직접적으로 표지될 수 있다. 방사선핵종(radionuclides), 형광(fluors), 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 억제제, 리간드(특히, 헵텐) 등과 같은 다양한 표지가 사용될 수 있다. 다양한 형태의 면역측정법이 가능하고, 종래 공지되어 있다.

키트가 선택된 항원의 존재 또는 세포 활성에 대한 보호 또는 감지에서 대상 면역글로불린과 이용을 위해 제공될 수 있다. 이렇게 해서, 본 발명의 대상 면역글로불린 조성물이 용기에 동결건조된 형, 단독 또는 목적하는 세포 형태에 특이적인 부가 항체와 결합하여 제공될 수 있다. 표지 또는 독소에 결합되거나 결합되지 않은 면역글로불린이 트리스, 포스페이트, 카보네이트 등과 같은 완충액, 안정화제, 방부제, 생물치사제, 예컨대, 혈청 알부민 같은 불활성 단백질 및 사용 설명서와 키트에 포함될 수 있다. 일반적으로, 이 물질들은 유효 면역글로불린을 기준으로 약 5 중량% 미만으로 존재하고, 면역글로불린 농도를 기준으로 적어도 약 0.001 중량%의 총 양으로 존재한다. 흔히, 유효 성분을 희석하기 위해 증량제(extender) 또는 부형제를 함유하는 것이 바람직하고, 여기서 부형제는 전체 조성물의 약 1 내지 99 중량%로 존재할 수 있다.

면역글로불린에 결합할 수 있는 제2차 항체가 분석에 사용될 시, 이는 별도의 병에 제공된다. 제2차 항체는 일반적으로 표지에 결합되고, 상기 기술된 면역글로불린 제형과 유사한 방식으로 제형화된다.

사람 항체

본 발명의 다른 관점에서, 베로톡신 Ⅱ 또는 베로톡신 Ⅱ 변종에 결합하는 마우스 VTm1-1과 경쟁하는 사람 항체가 제공된다.

a. 트리오마(trioma) 방법론

여기서 사용하기 위한 기본적 접근 및 예가 되는 세포 융합 파트너, SPAZ-4는 Oestberg et al., Hybridoma 2:361-367(1983); Oestberg, U.S. Patent No. 4,634,664; and Engleman et al., US Patent 4,634,666(본원에 참고문헌으로 포함된다)에 의해 기술되었다. 이 방법에 의해 얻어진 항체-생산 세포주는 그들이 3개의 세포-두개의 사람 및 한 개의 마우스로부터 기인하기 때문에 트리오마라고 불린다. 초기에, 마우스 골수종이 사람 B-림프구와 융합하여 Oestberg, supra에 의해 기술된 SPAZ-4 세포주와 같은 비-항체-생산 이종의 잡종 세포(non-antibody-producing xenogenic hybrid cell)를 얻는다. 이종 세포(xenogenic cell)는 면역된 사람 B-림프구와 융합되어 항체-생산 트리오마 세포주를 얻는다. 트리오마는 사람 세포로부터 만들어진 일반적인 하이브리도마 보다 더 안정하게 항체를 생산하는 것이 확인되었다.

B-림프구는 혈액, 비장, 림프절 또는 사람 공여체의 골수에서 얻어진다. 베로톡신 Ⅱ 또는 베로톡신 Ⅱ 변종을 갖는 살아있는 사람의 생체내 면역조치는 해로운 반응을 시작하는 위험 때문에 일반적으로 바람직하지 않다. 이렇게 해서, B-림프구는 일반적으로 이런 항원들 또는 이것의 항원성 단편 또는 이들을 함유하는 세포로 시험관내에서 면역된다. B-림프구는 일반적으로 10% 사람 혈청이 보강된 RPMI-1640(see, Engleman, supra) 같은 배지에서 7 내지 14일 동안 항원에 노출된다.

면역된 B-림프구는 종래 공지된 방법으로 SPAZ-4 같은 이종 잡종 세포에 융합된다. 예컨대, 세포는 약 37도에서 약 5 내지 10분 동안 분자량 1000 ∼ 4000의 40 내지 50% 폴리에틸렌글리콜로 처리된다.

세포는 융합 혼합물로부터 분리되고, 소정의 하이브리드를 위한 선택적 배지(예컨대, HAT 또는 AH)에 증식된다.

요구된 결합 특이성을 갖는 클론 분비 항체는 베로톡신 Ⅱ 또는 베로톡신 Ⅱ 변종에 결합하는 능력에 대한 트리오마 배양 배지를 분석하여 확인되었다. 소정의 특이성을 갖는 트리오마 생산 사람 항체는 즉, 한계 희석법(limiting dilution technique)에 의해 서브클론되고, 배양 배지의 시험관내에서 배양된다.

트리오마가 유전적으로 높은 수준으로 항체를 생산할 수 없을 지라도, 발현 수준은 트리오마로부터의 클로닝 항체 유전자를 한개 이상의 발현 백터에 넣고, 백터를 재조합 또는 인체 적응된 면역글로불린의 발현을 위해 논의된 세포주, infra 같은 세포주로 형질전환되는 것에 의해 증가될 수 있다.

b. 트랜스재닉 비-사람 포유류

베로톡신 Ⅱ 및/또는 베로톡신 Ⅱ 독소와 반응하는 사람 항체는, 또한, 사람 면역글로불린 로커스(locus)의 적어도 한 세그멘트를 인코딩하는 트랜스 유전자를 갖는 비-사람 트랜스제닉 포유류로부터 생산될 수 있다. 일반적으로, 그러한 트랜스제닉 포유류의 내생적 면역글로불린 로커스는 기능적으로 불활성된다. 바람직하게는, 사람 면역글로불린 로커스의 세그멘트는 중쇄 및 경쇄 성분의 재배열되지 않은 서열을 포함한다. 내생적 면역글로불린 유전자의 불활성 및 외생적 면역글로불 린의 도입은 목표가 된 상동의 재조합 또는 YAC 염색체의 도입에 의해 이루어질 수 있다. 이 과정으로부터의 트랜스제닉 포유류는 기능적으로 면역글로불린 성분 서열을 재배열하고, 내생적 면역글로불린 유전자의 발현없이 사람 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩된 다양한 동종형 항체의 레퍼토리를 발현할 수 있다. 3가지 성질을 갖는 포유류의 생산 및 성질은 예컨대, Lonberg et al., WO93/12227(1993); Kucherlapati, WO 91/10741(1991, 본원에 참고문헌으로 포함된다)에 의해 상세히 기술되었다.

트랜스제닉 마우스는 특히 적합하다. 항체는 Lonberg 또는 Kucherlapati, supra.에 의해 기술된 것과 같은 트랜스제닉 비-사람 포유류에 의해 얻어진다. 단일클론성 항체는 예컨대, 종래의 Kohler-Milstein 기술을 사용하여 적합한 골수종 세포주에 그러한 포유류로부터 B-세포를 융합하는 것에 의해 준비되었다.

다음은 예시적인 목적으로 제공되는 것이며 본 발명을 제한하지 않는다. HuVTm1.1 항체에 속하는 예가 VT2 항원의 B 서브유니트에 대한 높은 결합 친화성을 갖는 인체 적응된 항체를 생산할지라도, VT2의 항원 결정기에 결합하는 다른 단일클론성 항체로부터 CDR's를 사용하는 것이 고려된다.

(실험)

예1: VT2 톡소이드(toxoid)로 마우스의 면역

VT2는 Oku et al., Microb. Pathog., 1989, 6(2), 113-122에 의해 기술된 바와 같이 준비되었다. VT2 톡소이드는 0.1 M 포스페이트 완충액 중의 0.4% 포름알데히드와 37℃에서 7일 동안 정제된 VT2 1 mg을 pH 7.6으로 처리하여 준비되었다.

Balb/c 마우스(Nippon Charles River)를 복강내(i.p.) 주사로 Freund's Complete Adjuvant(Gibco BRL)와 혼합된 VT2 톡소이드(0.5 ㎍)으로 면역시켰다. 약 4주 후에, 마우스에 i.p. 주사로 Freund's Complete Adjuvant와 혼합된 VT2 톡소이드(1 ㎍)를 주입했다. 그리고 나서, 마우스에 이어서 1 내지 5주의 간격으로 i.p. 주사로 Freund's Complete Adjuvant와 혼합된 VT2 톡소이드(1 ㎍ 두 번, 4 ㎍ 두 번, 5 ㎍ 한번)를 주입하였다.

마우스 꼬리 동맥을 잘라서 혈액을 얻고, 30분 동안, 37℃에서 혈액을 배양하고, 10분 동안 3000 rpm에서 원심분리하여 혈청을 수집하였다. VT2에 대한 혈청 적정 농도(titer)는 ELISA에 의해 다음과 같이 측정된다:

96웰의 평평한 바닥의 플레이트(Falcon 3912, Becton Dickinson)의 각 웰은 0.01 M 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 희석된 1 ㎍/ml의 50 ㎕로 코팅하고, 1시간 동안 실온에서 배양된다.

각 웰은 PBS- 0.05% Tween 20으로 3번 세척된다.

각 웰은 1시간 동안 실온에서, PBS-3% BSA로 억제된다.

각 웰은 PBS- 0.05% Tween 20으로 3번 세척된다.

PBS로 연속 희석된 혈청 50 ㎕를 각 웰에 가하고 1시간 동안 실온에서 배양된다.

각 웰은 PBS- 0.05% Tween 20으로 3번 세척된다.

각 웰에 PBS- 3% BSA로 희석된(× 1000) 염소 항-마우스 IgG(ZYMED) 결합된 알카라인 포스파타제 50 ㎕이 추가되고, 1시간 동안 실온에서 배양된다.

각 웰은 PBS- 0.05% Tween 20으로 3번 세척된다.

각 웰에 p-니트로페닐포스페이트(PNPP: Wako Chemicals)를 가하고, 1시간 동안 실온에서 배양된다.

405 nm에서 흡광도가 측정되고, 각 웰에 기록된다.

예2: 세포 융합 방법에 의한 하이브리도마의 제작

VT2에 대해 반응하는 항체가 함유된 혈청을 갖는 마우스가 선택되고, 비장 절제된다. 5 × 10⁷ 비장 세포 및 5 × 10⁶ P3 × 63 Ag8U.1(P3U1) 마우스 골수종 세포가 결합되고, RPMI 1640 배지로 한 번 세척되고, 5분 동안 1500 rpm에서 원심분리된다. 세포 펠렛(pellet)을 부드럽게 분산시켜서 폴리에틸렌글리콜(PEG) 용액(RPMI 1640 배지 5.75 ml + PEG 3.5 ml + 디메틸술폭사이드 0.75 ml 함유)의 1 ml에 재부유시키고, 2분 동안 부드럽게 회전시킨다. 그리고 나서, RPMI 배지 1 ml이 추가되고 2분 동안 회전시킨다. 그 후, RPMI 배지 2 ml이 추가되고, 2분 동안 회전시킨다. GIT-HAT 배지(95 μM 하이포크산틴, 0.4 μM 아미노프테린, 1.6 μM 티미딘, 5% FCS) 4 ml이 추가되고, 2분 동안 회전시킨다. 그리고, GIT-HAT 배지 8 ml이 추가되고, 2분 동안 회전시킨다. 37℃에서 배양한 30분 후, 세포 현탁액이 10⁴ 마우스 복막 마크로파지(macrophage)/웰로 접종된 96웰의 평평한 바닥의 각 플레이트의 각 웰에 배달되었다. 그 플레이트는 5% CO₂ - 95% 공기 배양기에서 일주일 동안 37℃에서 배양되었다. 각 웰의 배지의 반은 새로운 GIT-HT(아미노페린이 없는 GIT-HAT 배지)로 대치되고, 플레이트는 약 1주일 동안 배양되어 하이브리도마 세포 로 자란다.

예3: VT2에 대한 항체를 분비하는 마우스 하이브리도마 세포의 스크리닝

스크리닝은 VT2에 결합하여 VT2를 중화시키는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포를 선택하여 실행된다. 하이브리도마 상층액이 스크리닝을 위해 사용된다. 결합 활성은 예1에 기술된 ELISA 방법에 의해 측정된다. VT2 중화 활성은 다음의 방법으로 측정된다.

96웰 플레이트의 각 웰에 하이브리도마 상층액 30 ㎕ 및 10% FCS-MEM 중의 200 pg/ml VT2의 30 ㎕가 추가된다.

플레이트는 1시간 동안 37℃에서 배양된다.

상기 용액의 50 ㎕가 Vero 세포(ATCC)가 접종된(4 × 10⁴ 세포/웰) 96웰의 평평한 바닥의 플레이트의 각 웰에 추가된다.

플레이트는 5% CO₂ - 95% 공기 배양기에서 4일 동안 37℃에서 배양된다.

0.014%의 뉴트럴레드(neutral red) 용액 100 ㎕가 각 웰에 추가된다.

플레이트는 살아 있는 세포를 염색하기 위해 1시간 동안 37℃에서 배양된다.

PBS로 각 웰을 세척한 후, 1% 아세트산용액을 함유하는 50% 에탄올 용액(ETOH-AcOH)의 100 ㎕가 각 웰에 추가된다.

550 nm에서 흡광도가 측정되고, 각 웰에 대해 기록된다.

예4: 하이브리도마 세포의 글로닝

하이브리도마 세포의 클로닝은 한계희석법에 의해 실행된다. 1 내지 2개의 하이브리도마 세포는 피더(feeder) 세포로서 10⁴ 마우스 복막 마크로파지로 접종된 96웰의 평평한 바닥의 플레이트의 각 웰에 추가된다. 약 2주 후에, 상층액이 예1에 기술된 바와 같이 VT2에 대한 결합 및 중화에 대해 측정된다. 상기 기술된 바와 같이 이 클로닝 과정을 다수 반복하여, 하이브리도마 세포 클론이 단일클론성 항체(MuVTm1.1)을 분비하고, 이것이 VT2를 중화시키도록 하였다.

예5: MuVTm1.1의 정제

MuVTm1.1을 분비하는 하이브리도마 세포는 인슐린, 트랜스페린, 에탄올아민 및 셀레나이트를 함유하는 eRDF 기저 혈청 프리 배지에 적합시킨다. 배양 상층액을 단백질 G 세파로즈 컬럼(Pharmacia)에 통과시키고, 표준 방법을 사용하여 항체를 분리한다. 항체의 순수도는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)에 의해 증명되고, 그것의 농도는 SRID에 의해 측정된다. 정제된 MuVTm1.1은 예3에 기술된 바와 같이 VT2 변종을 중화시키는 능력이 시험되었다. 그 결과는 하기 표1 및 도7에 나타나 있다.

예6: 마우스 VTm1.1 가변부위 cDNAs의 클로닝 및 서열화

마우스 VTm1.1(MuVTm1.1) 중쇄 및 경쇄 가변부위 cDNAs는 앵커드(anchored) PCR을 사용하여 하이브리도마 세포로부터 분리된 mRNA로부터 클로닝되었다(Co et al., J. Immunol. 148: 1149(1992)). 폴리-dG 테일(tail)에 어닐링하기 위해 사용된 5'프라이머가 cDNA에 추가되고, 불변부위에 3'프라이머가 추가된다. 증폭된 유전자 단편은 플라스미드 pUC18에 삽입된다. 뉴클레오티드 서열은 V_L과 V_H cDNA 양쪽에 다수의 독립적인 클론으로부터 결정된다. 중쇄에 대해, 단일, 독특한 서열이 마우스 중쇄 가변부위의 전형적인 것으로 확인되었다. 경쇄에 대해, 단일, 독특한 서열이 마우스 중쇄 가변부위에 전형적인 것으로 확인되었다. 그러나, V-J 결합에서 프레임 시프트(frame shift)를 야기한 손실 뉴클레오티드 때문에 한 서열은 기능이 없고, 비-생산성 대립 유전자로 확인되었다. 그 다른 서열은 기능성 마우스 카파 체인 가변부위였다. 중쇄 및 기능성 경쇄의 가변부위 cDNA 서열과 해독된 아미노산 서열은 도1에 도시된다. 마우스 V_K 서열은 Kabat's 마우스 카파 체인 서브그룹 V에 속한다. 마우스 V_H는 Kabat's 중쇄 서브그룹 Ⅲ(D)에 속한다.

예7: 인체 적응된 VTm1.1 가변부위의 제작

인체 적응된 항체에서 마우스 항체의 결합 친화성을 보유하기 위해, Queen et al.의 일반적인 과정이 따른다(Queen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029(1989) and U. S. patent Nos. 5,585,089 and 5,693,762). 골격 잔기의 선택은 높은 결합 친화성을 보유하는데 중요하다. 주로, 사람 항체로부터의 골격 서열은 CDR 이식을 위한 주형으로 제공될 수 있으나, 그러한 골격으로의 직접적인 CDR 치환은 항원에 대한 결합 친화성의 상당한 손실을 유도할 수 있다는 것이 증명되었다(Glaser et al., J. Immunol. 149:2606(1992); Tempest et al., Biotechnology 9:226(1992); Shalaby et al., J. Exp. Med. 17:217(1992)). 사람 항체가 최초의 마우스 항체에 더욱 동일할 수록, 사람 골격이 친화성을 감소시키는 마우스 CDRs로 왜곡되는 것은 줄어들 것이다. Kabat 데이타베이스에 대한 서열 동일성 조사를 근거로(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., U. S. Department of Health and Human Services, 1991), 사람 항체 GF4가 MuVTm1.1 항체에 동일한 골격을 제공하도록 선택된다. 다른 높은 동일한 사람 항체 체인은 또한 인체 적응된 항체 골격, 특히 Kabat에 의해 정의된 사람 서브그룹Ⅲ로부터의 카파 경쇄 및 중쇄를 제공하는데 적합하다.

컴퓨터 프로그램 ABMOD와 ENCAD(Levitt et al., J. Mol. Biol.168:595(1983))은 VTm1.1 가변 도메인의 분자적 모델을 구성하는데 사용되었고, 이는 그들과 잠재적으로 상호작용 할 수 있도록 CDRs에 충분히 인접한 VTm1.1 골격에서 아미노산을 위치시키는데 사용되었다. 인체 적응된 VTm1.1 중쇄 및 경쇄 가변부위를 제작하기 위해, 마우스 VTm1.1 항체로부터 CDRs가 사람 GF4 항체의 골격 부위로 이식되었다. 컴퓨터 모델이 제안하는 골격 위치에서 CDRs와 접촉하고, 마우스 항체로부터의 아미노산은 최초의 사람 골격 아미노산에 대해 치환된다. 인체 적응된 VTm1.1에 대해, 이는 중쇄의 잔기 29, 30, 49 및 98과 경쇄의 잔기 49에서 수행된다. 게다가, 사람 항체 데이타베이스의 드문 위치에서 발생하는 골격 잔기는 그들의 위치에서 사람의 동일 아미노산으로 치환된다. 인체 적응된 VTm1.1에 대해, 이는 중쇄의 잔기 1, 4, 5, 79, 89 및 93과 경쇄의 잔기 3, 4, 19, 76, 79 및 85에서 수행된다.

개시 코돈과 신호 펩티드 서열을 포함하는 인체 적응된 VTm1.1 항체 중쇄 및 경쇄 가변부위의 서열이 도2에 도시된다. 그러나, 잠재적 CDR-접촉 잔기의 대부분은 항원에 실질적인 친화성을 보유하는 항체를 가능하게 하는 다른 아미노산의 치환에 순응한다. 다음의 표는 적합한 치환 아미노산의 골격에서의 위치를 나열한다(LC = 경쇄(light chain), HC = 중쇄(heavy chain)).

마찬가지로, 인체 적응된 VTm1.1 중쇄 및 경쇄와 접촉하지 않는 골격 잔기의 대부분은 인체 적응된 항체의 비-면역원성 또는 친화성의 상당한 손실 없이 사람 GF4 항체의 상응하는 위치, 다른 사람 항체, 마우스 VTm1.1 항체 또는 다른 마우스 항체로부터의 아미노산의 치환에 적용할 수 있다.

다음의 표는 적합한 치환 아미노산의 골격에서의 부가적 위치를 나열한다

다양한 치환 아미노산의 선택은 친화성, 특이성, 비-면역원성, 제작의 용이함 및 다른 바람직한 성질의 다양한 조합을 갖는 인체 적응된 VTm1.1의 형태를 생 산하는데 사용될 수 있다. 이렇게 해서, 상기 표의 예들은 기술의 방법으로, 본 발명을 제한하지 않는다.

예8: 인체 적응된 VTm1.1의 제작

일단 인체 적응된 가변부위 아미노산 서열이 상기 기술된 바와 같이 제작되면, 유전자는 신호 펩티드, 스플라이스 공여 신호 및 적당한 제한 부위를 포함하는 것을 인코딩하도록 제작된다(도2). 경쇄 및 중쇄 가변부위 유전자는 도3에 도시된 바와 같이 대략 65 내지 80 베이스의 길이로 8개의 오버래핑(overlapping) 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 구조되고 증폭된다(see He et al. J. Immunol. 160:1029(1998)). 올리고는 한 쌍 방향으로 어닐링되고, DNA 폴리머라제Ⅰ의 클레노우(Klenow) 단편으로 연장되어 4가닥의 이중가닥의 단편을 만든다. 생성 단편은 분리되고, 어닐링되고 클레노우로 연장되어 두개의 단편을 만든다. 이 단편들은 분리되고, 두 방향으로 어닐링되어 다시 한 번 연장되어 전체-길이의 유전자(full-length gene)를 생산한다. 생성물은 Taq 폴리머라제를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR)에 의해 증폭되고, 겔-정제, XbaⅠ 제한효소 처리, 다시 겔-정제되고, pVk 또는 pVg1 발현 벡터의 XbaⅠ 부위로 서브클론된다. 각각의 경쇄 및 중쇄 발현을 위한 pVk 및 pVg1 벡터는 종래 기술되어 있다(see Co et al., J. Immunol. 148:1149(1992)).

최종 플라스미드의 구조는 뉴클레오티드 서열화 및 제한효소 지도화(restriction mapping)로 증명되었다. 모든 DNA 조작은 기본적인 종래 공지된 방법으로 수행된다.

인체 적응된 VTm1.1을 생산하는 세포주를 만들기 위해, 중쇄 및 경쇄 플라스미드를 마우스 골수종 세포주 Sp2/0-Ag14(ATCC CRL 1581)에 형질감염하였다. 형질감염 전에, 중쇄 및 경쇄-함유 플라스미드는 FspⅠ을 사용하여 선형이 되었다. 각 플라스미드의 대략 20 ㎍을 PBS의 1 × 10⁷ 세포에 형질감염되었다. 제작자의 지시에 따라 360 V 및 25 μFD 정전용량에서 Gene Pulser 장치(BioRad)를 사용하여 일렉트로포레이션에 의해 형질감염되었다. 각 형질감염으로부터의 세포는 4개의 96웰 조직 배양 플레이트에 플레이트되고, 2일 후에, 선택 배지(DMEM, 10% FCS, 1 × HT 보강물(Sigma), 0.25 mg/ml 크산틴, 1 ㎍/ml 미코페놀산)가 추가되었다.

대략 2주 후에, 나타난 클론은 ELISA로 항체 제조를 위해 스크린되었다. 높은-생산 클론으로부터의 항체는 보통의 배지(10% FCS를 함유하는 DMEM)에서 컨플루언시(confluency)로 세포를 생장시키고, 그 배지를 혈청-프리 배지(Hybridoma SMF; Gibco)로 치환하고, 최대 항체 적정 농도가 될 때까지 배양하여 제조된다. 배양 상층액은 단백질 A-세파로즈 컬럼(Pharmacia)을 통하고, 항체는 0.1 M 글라이신, 100 mM NaCl, pH3로 분리, 중화되고, 이어서, 인산염-완충 식염수(PBS)로 교환된다. 항체의 순도는 아크릴아미드겔 분석으로 증명되고, 그 농도는 OD₂₈₀ 읽기에 의해 측정되고, 항체 단백질 1.0 mg은 1.4의 OD₂₈₀ 읽기로 가정한다.

예9: 인체 적응된 VTm1.1의 성질

친화성 측정

베로톡신 Ⅱ(VT2)에 대한 MuNTm1.1과 HuVTm1.1 항체의 친화성은 바이오티닐 레이티드(biotinylated) MuVTm1.1 항체와의 경쟁적 결합에 의해 결정된다. 실험의 과정은 다음과 같다:

Dynatech Laboratiries Immulon 2 96웰 플레이트(part #0110103455)를 웰 당 50 ㎕ VT2 용액(PBS 중의 0.2 ㎍/ml)으로 코팅한다. 부드럽게 흔들어 주면서 37℃에서 2시간 동안 배양한다.

VT2 용액을 아스피레이션한다. 각 웰을 세척 완충액 400 ㎕(PBS 중의 0.1 % Tween 20)로 4번 세척한다.

PBS 중의 Pierce SuperBlock Blocking Buffer(cat #37515)의 400 ㎕로 각 웰을 실온에서 30분 동안 억제한다.

억제 용액을 아스피레이션한다. 각 웰을 세척 완충액 400 ㎕로 4번 세척한다.

각 웰에서 추가된 20 ng의 바이오티닐레이티드 MuVTm1.1 항체를 결합 완충액(1% BSA, PBS 중의 0.1% Tween 20)에 100 ㎕의 전체 부피로 비표지된 마우스 또는 Hu VTm1.1 항체의 다양한 농도와 혼합한다.

부드럽게 흔들어주면서 4℃에서 밤새 배양한다. 항체 용액을 아스피레이션하다.

각 웰을 세척 완충액 400 ㎕로 4번 세척한다.

페록시다제-결합된 스트레프아비딘(strepavidin)(Bioscource cat #5NN2004)의 100 ㎕(결합 완충액 중의 1:500 희석)를 각 웰에 추가한다. 부드럽게 흔들어주면서 37℃에서 1시간 동안 배양한다.

스트레프아비딘 용액을 아스피레이션한다. 각 웰을 세척 완충액 400 ㎕로 6번 세척한다.

100 ㎕/웰 페록시다제 기질(BioRad #172-1064)를 추가한다. 발색될 때까지 실온으로 배양한다. 415 nm에서 Molecular Devices ELISA plate reader로 플레이트를 읽는다.

도4에 도시된 결과는 인체 적응된 VTm1.1 항체가 경쟁적 ELISA 분석에서 바이오티닐레이티드 마우스 항체에 대해, 마우스 항체에 비교시 2개의 요인 내에서, 경쟁하는 것을 증명한다.

HuVTm1.1 과 MuVTm1.1의 친화성은 또한 BIAcore 방법을 사용하여 계산된다. HuVTm1.1에 대해 계산된 K_D는 표에 나타난 바와 같이 Mu VTm1.1에 대해 대략 3.6 × 10^-9 M vs. 1.9 × 10^-9 M이다.

예10: HuVTm1.1의 시험관내 중화 활성

HuVTm1.1의 중화 활성은 또한 하기 기술된 시험관내 분석에서 마우스 MuVTm1.1에 비교하여 측정된다.

사람 신장 기원 세포주(ACHN)가 1 × 10⁴ 세포/웰로 96웰 플레이트에 접종되 고, 24시간 동안 37℃에서 배양된다.

배지가 아스피레이션되고, 540 pg/ml VT2 용액 30 ㎕의 혼합된 용액의 50 ㎕가 10% FCS-MEM으로 희석되고, 37℃에서 1시간 동안 배양된 10% FCS-MEM(마우스 또는 인체 적응된 VTm1.1)으로 연속적으로 희석된 시험 항체 30 ㎕가각 웰에 추가되고, 37℃에서 4일 동안 배양된다.

배지 중의 0.028% 뉴트럴레드 100 ㎕가 각 웰에 추가되고, 37℃에서 1시간 동안 배양된다(Mullbacher, A. et al., 1984, Journal of Immunological Methods, 68, 205-215).

용액은 아스피레이션된다. 각 웰은 PBS 150 ㎕로 두 번 세척된다.

50% EtOH/1% AcOH의 100 ㎕가 각 웰에 추가되고, 실온에서 5 내지 10분 동안 배양된다.

550 nm에서 흡광도 값은 Molecular Devices ELISA plate reader를 사용하여 각 웰에 대해 기록된다.

중화 활성은 다음의 식에 따라 계산된다.

MuVTm1.1에 비교된 HuVTm1.1의 중화 활성은 도5에 도시된다. HuVTm1.1의 ED₅₀은 MuVTm1.1에 대해 0.33 ㎍/ml vs. 0.2 ㎍/ml 이다. VT2 변종에 대한 HuVTm1.1의 중화 활성은 하기에 나타낸다.

예11: 인식된 VT2 항원의 분석

VT2는 감소되고, A와 B 서브유니트는 SDS를 함유하는 폴리아크릴아미드겔에 의해 분리되고, 웨스턴 블로팅 방법에 의해 니트로셀룰로오스막(BioRad)에 전이된다. 니트로셀룰로오스막은 PBS 중의 3% BSA에서 밤새 억제되고, 실온에서 1시간 동안 PBS 중의 3% BSA로 희석된 토끼 항-VT2 혈청 또는 HuVTm1.1 10 ㎍/ml과 반응한다. 막은 1% BSA-PBS로 6번 세척되고, 실온에서 1시간 동안 PBS 중의 3% BSA로 희석된 25 ㎍/ml의 알카라인 포스파타제 결합된 염소 항-사람 IgG(TAGO) 또는 알카라인 포스파타제 결합된 항-토끼 IgG(TAGO)과 반응한다. 막은 PBS 중의 1% BSA로 6번 세척되고, NBT(Nitro-Blue Tetrazolium Chloride)-BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3'-Indolyephosphate p-Toluidine salt) 용액 [PIERCE]과 실온에서 10분 동안 반응한다. 도6에 도시된 결과는 HuVTm1.1이 주로 VT2의 B 서브유니트에 결합하는 것을 나타낸다.

예12: VT2에 대한 HuVTm1.1의 생체내 활성

DdY 마우스(Nippon SLC)에 정맥을 통하여 멸균된 HuVTm1.1, MuVTm1.1 또는 PBS 4.8 ㎍이 주입된다. 1시간 후, 마우스에 VT2의 46 ng(10 LD₅₀에 상응하는)을 복강내(i.p.) 루트를 통하여 주입된다.

일주 후, 마우스의 생존력이 측정된다.

다음의 표는 결과를 나타낸다. HuVTm1.1은 VT2에 의해 야기된 죽음으로부터 마우스를 완전히 보호한다.

상기로부터, 본 발명의 인체 적응된 면역글로불린이 다른 항 VT 특이적 항체 이상의 다양한 이점을 제공하는 것으로 생각된다. 마우스 단일클론성 항체에 비교하여, 본 발명의 인체 적응된 면역글로불린은 실질적으로 더 적은 비-사람 및 잠재적인 면역원성 아미노산 서열을 포함한다. 사람 환자에 주입 후, 항원성의 감소된 가능성이 상당한 치료 개선을 나타낸다.

상기 인용된 모든 출판물 및 특허 출원은 각 출판물 또는 특허 출원이 특이적 및 개별적으로 참고문헌으로 포함된 것이면 동일한 범위로 참고문헌으로 포함된다. 볼 발명은 명확성과 이해를 목적으로 기술 및 예를 통하여 상세히 기술되었으나 이에 제한되지 않고, 어떤 변화 및 변형이 첨부된 청구항의 관점내에서 실행될 수 있다.

Claims (33)

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7. 마우스 VTm1-1 항체로부터의 상보성 결정 부위와 L49, H29, H30, H49 및 H98로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 한 위치가 마우스 VTm1-1 항체 중쇄 또는 경쇄 가변부위 골격의 위치와 동등한 위치에 존재하는 아미노산에 의해 차지된 사람 GF4 항체 중쇄 및 경쇄 골격부로부터의 중쇄 및 경쇄 가변부위 골격을 포함하고, 상기 항체의 머츄어 중쇄 및 경쇄의 가변부위의 아미노산 서열은 Hx 및 Lx로 지정되고, 여기에서 상기 x는 Kabat 도식에 따른 아미노산의 위치를 지정하는 숫자이고, 10⁷ M^-1과 마우스 VTm1-1의 친화도의 10배의 친화도 사이의 친화도 상수를 갖는, 베로톡신 Ⅱ에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 인체 적응된 항체.
8. 제7항에 있어서, L49, H29, H30, H49 및 H98로 구성된 그룹으로부터 선택된 각 위치가 마우스 VTm1-1 항체 중쇄 또는 경쇄 가변부위 골격의 동등한 위치에 존재하는 아미노산에 의해 차지되는 것을 특징으로 하는 인체 적응된 항체.
9. 제8항에 있어서, 그룹 L3, L4, L19, L76, L79, L85, H1, H4, H5, H79, H89 및 H93으로부터 선택된 적어도 한 위치는 사람 항체 중쇄 또는 경쇄 동일 서열의 동등한 위치에 존재하는 아미노산에 의해 차지되는 것을 특징으로 하는 인체 적응된 항체.
10. 제9항에 있어서, 그룹 L3, L4, L19, L76, L79, L85, H1, H4, H5, H79, H89 및 H93으로부터 선택된 각 위치는 사람 항체 중쇄 또는 경쇄 동일 서열의 동등한 위치에 존재하는 아미노산에 의해 차지되는 것을 특징으로 하는 인체 적응된 항체.
11. 제7항에 있어서, L49, H29, H30, H49, H98, L3, L4, L19, L76, L79, L85, H1, H4, H5, H79, H89 및 H93으로 구성된 그룹으로부터 선택된 한 개 이상의 위치가 표2 및 3에 나타낸 바와 같이 치환될 수 있는 도2a에 도시된 중쇄 가변부위 및 도2b에 도시된 경쇄 가변부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 인체 적응된 항체.
12. 제7항에 있어서, 도2a에 도시된 중쇄 가변부위 및 도2b에 도시된 경쇄 가변부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 인체 적응된 항체.
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14. 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 경/중쇄 다이머의 두 쌍을 포함하고, 각 체인은 가변부위 및 불변부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 인체 적응된 항체.
15. 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, Fab 단편 또는 F(ab')₂인 것을 특징으로 하는 인체 적응된 항체.
16. 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 형태인 것을 특징으로 하는 인체 적응된 항체.
17. 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, IgG₁ 면역글로불린 동종형을 갖는 것을 특징으로 하는 인체 적응된 항체.
18. 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항 기재의 인체 적응된 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 세포주를 배양하고, 이에 의해 인체 적응된 항체가 발현되고, 세포주에 의해 발현된 인체 적응된 항체를 리커버링하는 것을 포함하는 인체 적응된 VTm1-1 항체의 제조 방법.
19. 약제학적으로 허용가능한 담체와, 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항 기재의 인체적응된 항체를 혼합하는 것을 포함하는 베로톡신의 독성효과 치료용 또는 예방용 약제학적 조성물의 제조 방법.
20. 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항 기재의 인체 적응된 항체와 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 베로톡신의 독성효과 치료용 또는 예방용 약제학적 조성물.
21. 제12항 기재의 인체 적응된 항체와 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 베로톡신의 독성효과 치료용 또는 예방용 약제학적 조성물.
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33. 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항 기재의 항체를 생산하는 것을 특징으로 하는 무한증식(immortalized) 진핵세포주.

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