KR20010099807A

KR20010099807A - 감마 인터페론에 대한 인간화 항체

Info

Publication number: KR20010099807A
Application number: KR1020017006675A
Authority: KR
Inventors: 바스케즈맥시밀리아노; 랜돌피니콜라스에프.; 츠루시타나오야; 퀸캐리엘.
Original assignee: 추후제출; 프로테인 디자인 랩스 인코포레이티드
Priority date: 1998-12-01
Filing date: 1999-11-29
Publication date: 2001-11-09
Also published as: EP1135415B1; HK1044159A1; KR100483494B1; EP1135415A4; US20020091240A1; EP1135415A1; JP2002531466A; CA2352572C; DE69942671D1; CN1334821A; US7183390B2; WO2000032634A9; ATE477273T1; US6329511B1; AU2033100A; WO2000032634A1; AU764211B2; MXPA01005515A; CN1214043C; AU764211C

Abstract

본 발명은 γ-인터페론과 결합하여 이를 중화시키는 인간화 면역 글로불린(humanized immunoglobulin)에 관한 것이다. 상기 항체들은 면역계 질환, 특히 자가 면역 질환의 치료에 유용하다.

Description

감마 인터페론에 대한 인간화 항체{HUMANIZED ANTIBODIES TO GAMMA-INTERFERON}

포유 동물의 면역 반응은 외래 물질, 즉 항원과 특이적으로 상호 작용하는 몇가지 유형의 세포들에 의하여 매개된다. 상기 세포 유형들중 하나인, B 세포는 항체 생성에 관여하는 세포이다. 다른 세포 유형으로서, T 세포는 바이러스 감염된 세포들을 파괴하거나 B 세포, 및 T 세포를 포함하는 기타 조혈 세포의 생체내 기능을 조절하는 다양한 종류의 세포 하위세트들을 포함한다. 세번째 세포 유형인, 대식 세포는 주 조직적합성 복합체(MHC) 단백질과 관련된 항원을 가공하고, T 세포에제공하는 세포이다. 상기 유형의 세포들 사이의 소통은 인터루킨 1 ∼ 6 및 γ-IFN 과 같은 림포카인에 의하여 복잡한 방식으로 매개된다[일반적으로, 이와 관련된 부분이 본원에 참고 문헌으로서 인용되어 있는, Paul, W.E.편,Fundamental Immunology, 제3판, Raven Press, New York(1993) 참조].

중요한 림포카인의 하나인, γ-IFN 은 몇몇 T 세포에 의하여 분비된다. 이의 항 바이러스 활성 이외에도, γ-IFN은 천연 킬러 세포(NK Cell) 및 T 헬퍼 1 세포(Th1)를 자극하고, 대식 세포를 활성화시키며, 세포 표면상의 MHC 분자의 발현을 자극한다[Paul, 상동, pp 764-766]. 그러므로 γ-IFN은 일반적으로 면역 기능을 다방면으로 강화시킬 수 있으며, 이러한 강화를 필요로하는 경우, 예를 들어 암 치료에 있어서 치료약으로서 유력한 후보 물질이다. 이와는 반대로, 면역계가 과다 활성인 질병 상태, 예를 들어 자가 면역 질환 및 기관 이식 거부에 있어서, γ-IFN의 길항 물질은 γ-IFN의 자극 효과를 중화시킴으로써 질병을 치료하는데에 유용할 수 있다.

γ-IFN에 결합하여 이를 중화시키는 마우스 단클론 항체에 관하여 보고되어 있다[예를 들어, Van der Meide 등,J. Gen. Virol, 67, 1059(1986) 참조]. 이러한 항 γ-IFN 항체들은 시험관내 및 생체내 조직 이식 마우스 모델에서 거부 현상을 지연시키거나 또는 억제하는 것으로 보고되고 있다 [모두 본원에 참고 문헌으로 인용된, Landolfo 등,Science229, 176(1985) 및 Rosenberg 등,J.Immunol.144, 4648(1990)]. γ-IFN의 단클론 항체에 의하여 유발되는 전신 루프스 홍반증(SLE)과 같은 증상을 나타내는 경향이 있는 마우스의 치료법은 상기 질환의 발병을 지연시키는 것으로 보고되고 있다[Jacob 등,J.Exp.Med.166, 798(1987)]. 뿐만 아니라, 항 γ-IFN 항체는 래트에서의 애쥬반트 관절염(Jacob 등,J.Immunol. 142, 1500(1989)) 및 마우스에서의 대장염(Powrie 등,Immunity 1, 553-562(1994))을 약화시키는 것으로 보고되고 있다. 문헌[Queen 등, WO 92/11018 참조]에서는 γ-IFN에 대한 마우스 AF2 항체, 임의의 인간화 면역 글로불린 및 염증성 질환 치료에 있어서 이들의 용도에 관하여 제시하고 있다.

AF2와 같은 비인간 단클론 항체는 인간 치료, 구체적으로 이하에 설명하는 바와 같은 반복적 치료 요법에 사용하는 경우 몇가지 단점이 있다. 마우스 단클론 항체는 예를 들어, 인간에 있어서 순환 반감기(circulating half-life)가 상대적으로 짧으며, 인간에 사용될 경우 기타 중요한 면역 글로불린의 기능적 특성이 결여되어 있다.

더욱 중요한 사실은, 쥐과 동물의 단클론 항체는 인간 환자에게 주사될 경우 면역원성인 실질적인 아미노산 서열을 포함한다. 다수의 연구 결과, 외래 항체를 주사한 이후, 주사된 항체에 대해 환자에 의해 유발되는 면역 반응은 꽤 강력할 수 있으며, 초기 치료 이후 항체의 치료학적 유용성이 근본적으로 감소된다는 사실을 알아냈다. 더욱이, 마우스 또는 기타 (인간에 대하여) 항원성인 단클론 항체들이 다수의 인간 질병 치료에 사용된다면, 관련성이 없는 마우스 항체를 사용한 후속 치료 자체는 교차 반응성으로 인하여 비효율적이거나 또는 심지어 위험할 수도 있다.

그러므로, 인간에서 실질적으로 비면역원성이고, 치료학적 제형화 및 기타용도에 적합한 방식으로 용이하게 그리고 경제적으로 제조될 수 있는, γ-IFN 항원에 특이적인, 개선된 형태의 인간화 면역 글로불린이 요구되고 있다. 본 발명은 이와 같은 요구 및 다른 목적을 실행하는 것이다.

본 발명은 일반적으로 신규한 생물 물질을 개발하기 위한 재조합 DNA 기술 및 단클론 항체 기술의 조합에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 예를 들어, γ-인터페론(γ-IFN)에 특이적인 비면역원성(인간에 대해서) 면역 글로불린의 제조 방법 및 이들의 시험관내 및 생체내 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 γ-IFN에 대한 인간화 단클론 항체, 상기 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 상기 항체를 제조하는 방법, 활성 성분으로서 상기 항체를 포함하는 약학 조성물, 및 활성 성분으로서 상기 항체를 포함하는, 바람직하지 않은 면역 반응을 억제하는 치료제에 관한 것이다.

도1A 및 도1B는 마우스 항체 AF2 가변 영역의 경쇄(A)(서열 1 및 서열 2) 및 중쇄(B)(서열 3 및 서열 4)의 cDNA 서열 및 번역된 아미노산 서열을 나타내는 것이다. Kabat CDR 서열에 밑줄을 그었다.

도2A 및 도2B는 인간화 항체 HuZAF의 경쇄 및 중쇄의 성숙한 가변 영역의 cDNA(서열 5 및 서열 7) 및 아미노산(서열 6 및 서열 8) 서열을 나타내는 것이다. Kabat CDR 서열에 밑줄을 그었다.

도3은 마우스 AF2, 인간화 면역 글로불린 HuZAF 및 인간화 면역 글로불린 haf25 및 HuXAF 각각의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 비교한 것이다.

도4는 γ-IFN에 대한 마우스 AF2 및 인간화 항체 haf25, HuXAF 및 HuZAF의 중화 활성을 나타내는 것이다.

본 발명의 목적 및 개요

본 발명의 목적은 γ-IFN 에 대한 인간화 단클론 항체 ; 상기 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열 ; 상기 항체의 제조 방법 ; 활성 성분으로서 상기 항체를 포함하는 약학 조성물 ; 질환, 특히 자가 면역 질환 치료용 치료제, 및 활성 성분으로서 상기 항체를 포함하는 면역계 억제용 치료제 ; 및 이러한 질환의 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 마우스 AF2 면역 글로불린의 인간화된 형태인 인간화 면역 글로불린을 제공한다. 상기 마우스 AF2 면역 글로불린은 서열 2의 경쇄 가변 영역과 서열 4의 중쇄 가변 영역으로 특징지워 진다. 본 발명의 인간화 면역 글로불린은 인간화 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 상기 인간화 중쇄 가변 영역 구조틀의 11번 위치에는 마우스 AF2 중쇄 가변 영역 구조틀과 대등한 위치에 존재하는 아미노산이 존재한다. 본 발명의 바람직한 인간화 면역 글로불린은 서열 6의 인간화 경쇄 가변 영역과 서열 8의 인간화 중쇄 가변 영역을 포함한다.

인간화 면역 글로불린은 γ-IFN 항원에 특이적으로 결합하여 γ-IFN을 중화시킨다. 상기 인간화 면역 글로불린은 또한 γ-IFN에 대한 CDR 공여 마우스 단클론 항체의 결합을 차단할 수 있다. 바람직한 인간화 면역 글로불린은 2쌍의 경쇄/중쇄의 복합체로서, 이들 중 1 이상의 마우스 상보성 결정 영역(CDRs)을 포함하는 1이상의 사슬은 인간 구조틀 영역 분절에 기능적으로 결합된다. 예를 들어, 자연적으로 관련된 마우스의 추가의 아미노산 잔기를 보유하거나 또는 보유하지 않는 마우스 CDR은 인간 구조틀 영역으로 도입되어 약 10⁷M^-1보다 높은 친화성 수준으로 항원과 결합할 수 있는 인간화 면역 글로불린을 제조할 수 있다.

결합 단편 및 기타 이들의 유도체를 포함하는 본 발명의 면역 글로불린은 이것이 형질 감염된 세포, 바람직하게는 골수종 세포 또는 하이브리도마 세포와 같은 불멸화 진핵 세포에서 상기 면역 글로불린을 궁극적으로 발현시키는, 다수의 재조합 DNA 기술에 의하여 용이하게 제조할 수 있다. 인간화 면역 글로불린 구조틀 영역을 암호화하는 제1 서열 및 바람직한 면역 글로불린 CDR을 암호화하는 제2 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 합성하거나 또는 적합한 cDNA 및 게놈 DNA 절편을 조합하여 제조할 수 있다.

인간화 면역 글로불린은 실질적으로 순수한 형태로 사용될 수 있으며, 투여 방식에 따라서 약학적으로 허용 가능한, 상이한 투여 형태로 제조될 수 있다.

정의

2개의 핵산 또는 폴리펩타이드(예를 들어, 인간화 면역 글로불린을 암호화하는 DNA 또는 인간화 면역 글로불린의 아미노산 서열)에 있어서 "실질적으로 동일한(substantially identical)"이란 의미는, 다음과 같은 서열 비교법 및/또는 육안 관찰법으로 측정되는, 최대 부합율(maximum correspondence)에 대하여 비교 및 정렬하였을때, 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 동일성이 약 80% 이상, 가장 바람직하게는 90∼95% 이상인 2 이상의 서열 또는 하부 서열을 의미한다. 이러한 "실질적으로 동일한" 서열들은 통상적으로 상동성인 것으로 간주된다. 상기 "실질적인 동일성"은, 바람직하게는 길이 약 50 잔기 이상인 서열의 영역에 걸쳐서 존재하는 경우를 의미하며, 더욱 바람직하게는 약 100 잔기 이상의 영역, 및 가장 바람직하게는 약 150 잔기 이상의 영역이 실질적으로 동일하거나, 또는 비교하고자 하는 2개의 서열의 전체가 실질적으로 동일한 서열을 의미한다. 이하에 기술되는 바와 같이, 임의의 2개의 항체 서열은 Kabat의 번호 부여법을 사용하여, 하나의 방향으로 정렬될 수만 있다. 따라서, 항체에 있어서, 동일성(%)은 특이적이며 널리 정의된 의미를 갖는다.

면역 글로불린의 성숙한 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로부터 얻은 아미노산은 각각 Hx 및 Lx 라고 표시하는데, 여기서 x는Sequences of Proteins of Immunological Interest(미국 매릴랜드 베데스다 소재, 국립보건원, 1987 및 1991)의 Kabat 스킴에 따라 아미노산의 위치를 지정하는 번호이다. Kabat은 각각의 하위군에 대한 항체의 다수의 아미노산 서열 및 상기 하위군의 각 잔기에 대하여 가장 일반적으로 발생하는 아미노산을 나열하여 공통 서열(consensus sequence)을 형성한다. Kabat은 나열된 서열의 각 아미노산 잔기에 번호를 부여하는 방법을 사용하는데, 이와 같이 잔기 번호를 부여하는 방법은 당 업계의 표준이 되었다. Kabat 스킴은 보존적 아미노산을 참고로 하여 Kabat의 공통 서열중의 하나와 미지의 항체를 정렬시킴으로써, 상기 목록에 포함되지 않은 기타의 항체로 신장시킬 수 있다. Kabat 번호 부여 시스템을 사용하면 상이한 항체의 대등 위치의 아미노산을 용이하게 동정할 수 있다. 예를 들어, 인간 항체의 150번 위치에 있는 아미노산은 마우스 항체의 L50 위치의 아미노산과 대등한 위치에 존재한다.

기본적 항체 구조 단위(basic antibody structural unit)는 사량체를 포함하는 것으로 알려져 있다. 각 사량체는 2개의 동일한 폴리펩타이드 사슬 쌍으로 이루어져 있는데, 각 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25kDa) 및 하나의 "중쇄"(약 50 ∼ 70kDa)를 보유한다. 각 사슬의 아미노 말단부는 주로 항원 인지에 관여하는, 약 100 ∼ 110 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각 사슬의 카복시 말단부는 주로 효과기 기능을 갖는 불변 영역을 한정한다. 각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 항체 결합 위치를 형성한다. 그러므로, 원형의 항체는 2개의 결합 위치를 보유한다.

경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되며, 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로, 항체의 이소타입을 정의한다. 경쇄 및 중쇄내에서, 가변 영역과 불변 영역은 약 12 개 이상의 아미노산으로 이루어진 "J" 영역에 의하여 약 10 개 이상의 아미노산으로 이루어진 "D" 영역을 포함하는 중쇄와 연결된다[일반적으로,Fundamental Immunology, Paul, W. 편저, 제3판, Raven Press, NY, 1993, SH.9 (본원에 참고용으로 인용됨)].

N-말단에서 C-말단까지, 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 모두 택일적 구조틀과 상보성 결정 영역(CDRs)을 포함한다 : FR, CDR.FR, CDR.FR, CDR 및 FR. Kabat(1987 및 1991), 상동 및/또는 Chothia & Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987) ; Chothia 등,Nature342:878-883(1989)의 정의에 따라서 각 영역에 아미노산을 할당한다.

구체화된 인간화 면역 글로불린의 유사체는 보존적 아미노산 치환에 의하여 구체화된 면역 글로불린과 상이한 것이 바람직하다. 보존적인 아미노산 또는 비보존적인 아미노산과 같이 아미노산을 분류하기 위하여, 아미노산은 다음과 같은 군으로 나눌 수 있다 : Ⅰ군(소수성 측쇄) : met, ala, val, leu, ile ; Ⅱ군(중성 친수성 측쇄) : cys, ser, thr ; Ⅲ군(산성 측쇄) : asp, glu ; Ⅳ군(염기성 측쇄) : asn, gln, his, lys, arg ; Ⅴ군(사슬 배향에 영향을 미치는 잔기) : gly, pro ; 및 Ⅵ군(방향족 측쇄) : trp, tyr, phe. 보존적 치환에는 동일 부류내 아미노산 사이의 치환을 포함한다. 비보존적 치환은 이들 부류들 중 하나가 다른 구성원과 교환된 것을 포함한다.

에피토프라는 용어는 면역 글로불린에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정기를 포함한다. 에피토프 결정기는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은, 분자의 화학 활성인 표면 군집으로 이루어져 있으며, 일반적으로 특이적인 3차원적 구조 특성 및 특이적 하전 특성을 보유한다.

본원에 사용된 바와 같은, "면역 글로불린"이란 용어는 사량체인 항체 및 항체 이외의 다양한 형태를 의미하는 것으로서, 예를 들어, Fv, Fab 및 F(ab')₂및 이기능성 하이브리드 항체(예를 들어, Lanzavecchia 등,Eur.J.Immunol.17, 105(1987)) 및 단일쇄(예를 들어, Huston 등,Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 85, 5879-5883(1988) 및 Bird 등,Science242, 423-426(1988), 본원에 참고 문헌으로 인용됨)를 포함한다. 일반적으로 Hood 등,Immunology, Benjamin, NY, 제2판(1984), Harlow 및 Lane,Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988) 및 Hunkapiller 및 Hood,Nature, 323, 15-16(1986) (본원에 참고 문헌으로 인용됨)을 참조하시오.

본원에 사용된, "구조틀 영역(framework region)"이란, Kabat 등(상동)에 의하여 정의된 바와 같이, 단일종 중 상이한 면역 글로불린 사이에서 상대적으로 보존된(즉, CDR 보다 더욱 보존된) 면역 글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 일부를 의미한다. 본원에 사용된 "인간 구조틀 영역(human framework region)"이란, 자연 발생적 인간 항체의 구조틀 영역과 실질적으로 동일한(약 85% 이상) 구조틀 영역을 의미한다.

본원에 사용된, "인간화 면역 글로불린(humanized immunoglobulin)"이란, 인간 구조틀, 즉 비인간 항체로부터 얻은 1 이상의 CDR을 포함하는 면역 글로불린을 의미하며, 여기서 존재하는 임의의 불변 영역은 인간 면역 글로불린 불변 영역과 실질적으로 동일한데, 즉 동일성이 약 85∼90%, 바람직하게는 95% 이상이다. 그러므로, 가능한 CDR을 제외한 인간화 면역 글로불린의 모든 부분들은 1 이상의 자연 발생적 인간 면역 글로불린 서열에 해당하는 부분과 실질적으로 동일하다. 예를 들어, 인간화 면역 글로불린은 키메라 마우스 가변 영역/인간 불변 영역 항체를 포함하지 않는다.

본원에 사용된 용어 "환자"에는, 인간 및 척추 동물들을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "실질적으로 순수한(substantially pure)" 또는 "분리된(isolated)"이란, 우세하게 존재하는 개체종(즉, 몰 농도를 기준으로 조성물내 다른 임의의 개체 종보다 다량으로 존재하는 종)을 의미하는 것으로서, 실질적으로 정제된 분획은 상기 개체종이 존재하는 모든 거대 분자종을 약 50% 이상(몰 농도 기준) 포함하는 조성물인 것이 바람직하다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물내 존재하는 모든 거대 분자종을 약 80, 90, 95 또는 99중량% 이상 포함한다. 개체 종은 상기 조성물이 본질적으로 단일 거대 분자종으로 구성되는, 본질적인 균질성(오염물 종(contaminant species)이 통상의 검출 방법으로 조성물내에서 검출될 수 없는)으로 정제되는 것이 가장 바람직하다.

상세한 설명

본 발명은 γ-IFN에 특이적으로 결합하는 인간화 면역 글로불린, 및 이를 이용하여 바람직하지 않은 면역 반응을 억제하는 방법을 제공한다.

Ⅰ. γ-IFN에 특이적인 인간화 항체

본 발명의 인간화 면역 글로불린은 실질적으로 인간의 면역 글로불린(수용체 면역 글로불린이라 칭함)으로부터 얻은 가변성 구조틀 영역을 보유하며, 인간 수용체 항체 EU 및 실질적으로 AF2라 칭하는 마우스 면역 글로불린(공여체 면역 글로불린이라 칭함)으로부터 얻은 CDR을 보유하는 것이 바람직하다. 불변 영역(들)이 존재하는 경우, 이(들)은 또한 실질적으로 인간 면역 글로불린으로부터 얻을 수도 있다. 인간화 항체는 γ-IFN에 대한 특이적 결합 친화성이 10⁷, 10⁸, 10⁹또는 10¹⁰M^-1이상이다. 일반적으로 인간 γ-IFN에 대한 인간화 항체의 결합 친화성의 상한은 AF2의 결합 친화성의 3, 4, 5 또는 10 배 이내이다. 종종 결합 친화성의 하한은 또한 AF2 의 3, 4, 5 또는 10 인자 이내이다. 바람직한 인간화 면역 글로불린은 γ-IFN에의 결합에 대해 AF2와 경쟁하며, γ-IFN이 결합하는 것을 방지함으로써 γ-IFN 수용체를 통한 반응을 변환시킨다. 인간화 항체는 1배, 2배, 5배, 10배, 20배, 50배 또는 100배 과량의 몰 농도에서 γ-IFN의 80%, 90%, 95% 또는 99% 중화시키는 것이 바람직하다.

마우스 AF2 항체는 Queen 등, WO 92/11018에 기술되어 있으며, 이는 서열 2 및 서열 4인 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 보유한다. 상기 마우스 항체는 IgG2b 이소타입과 카파 경쇄를 보유한다. 바람직한 인간 수용체 항체 EU의 중쇄 및 경쇄 가변 영역과 기타 가능한 인간 수용체 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 관하여는 Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(미국 매릴랜드 베데스다소재, 국립 보건원, 1987 및 1991)에 기술되어 있다. 인간 수용체 항체는 이의 가변 영역이 마우스 AF2 항체의 가변 영역과 서열 동일성이 높은 것으로 선택된다. 중쇄 및 경쇄 가변 구조틀 영역은 동일하거나 또는 상이한 인간 항체 서열로부터 얻어질 수 있다. 인간 항체 서열은 자연 발생적 인간 항체 서열일 수 있거나 또는 몇몇 인간 항체의 공통 서열일 수 있다.

인간화 면역 글로불린은 다음과 같이 구성할 수 있다. 아미노산이 하기 범주에 속하는 경우, 인간 면역 글로불린(수용체 면역 글로불린)의 아미노산 구조틀은 CDR 제공 비인간 면역 글로불린(공여체 면역 글로불린)으로부터 얻은 아미노산 구조틀로 대체된 것을 사용한다.

(a) 수용체 면역 글로불린의 인간 구조틀 영역의 아미노산은 해당 위치의 인간 면역 글로불린에 특이적인 반면에, 공여체 면역 글로불린의 해당 아미노산은 해당 위치의 인간 면역 글로불린에 통상적인 경우 ;

(b) 아미노산 위치가 CDR중의 하나와 바로 인접하여 있는 경우 ; 또는

(c) 아미노산이 CDR과 상호 작용할 수 있는 경우[참조 : Queen 등의 문헌(상동) 및 Co 등의 문헌,Proc. Natl. Acad. SCi. USA 88, 2869(1991)(상기 각 문헌은 본원에 참고 문헌으로서 인용됨)]. 인간화 면역 글로불린 제조에 대한 상세한 설명은, Queen 등의 문헌(상동) 및 Co 등의 문헌(상동)을 참조하시오.

Queen 등의 문헌, WO 92/11018에는 임의의 위치들이 치환된, AF2로부터 얻은 CDR 영역 및 EU로부터 얻은 가변 영역 구조틀을 포함하는 AF2의 임의의 인간화 형태에 관하여 개시되어 있다. 본 발명의 인간화 면역 글로불린은 Queen 등의 문헌(상동)에 기술되어 있는 것과 동일한 치환을 포함하는 것이 바람직하다. 그러나, 부가적인 치환도 존재할 수 있다. 특히, H11 위치는 마우스 AF2 중쇄에서의 대등 위치를 점유하고 있는 아미노산으로 치환된다.

H11 위치는 상기 치환에 대한 기준을 충족시키지는 않지만, 그럼에도 불구하고 상기 치환을 포함하는 인간화 면역 글로불린의 활성을 중화시키는데에 중요한 역할을 한다. 상기 위치에서 치환이 어느 정도 바람직한다는 키메라 AF2 항체(즉, 마우스 가변 도메인과 인간 불변 영역을 보유하는 항체)의 다양한 위치를 인간 EU 항체의 대등 위치의 아미노산과 치환시킴으로써 결정된다. H11 위치에서의 치환은 γ-IFN에 대한 키메라 항체의 중화 활성을 상당히 감소시킨다.

일반적으로 인간화 항체내 CDR 영역은 실질적으로 동일하며, 더욱 일반적으로는 이들이 얻어진 마우스 항체의 해당 CDR 영역과 동일하다. 일반적으로 바람직한 경우는 아니지만, 때때로 생성된 인간화 면역 글로불린의 결합 친화성에 영향을 미치지 않고, CDR 잔기에 1 이상의 아미노산을 보존적으로 치환시킬 수도 있다. 경우에 따라서, CDR 영역의 치환은 결합 친화성을 강화시킬 수 있다.

전술한 특이적 아미노산 치환 이외에, 인간화 면역 글로불린의 구조틀 영역은 실질적으로 동일한 것이 일반적이며, 이들이 유래된 인간 항체의 구조틀 영역과 동일한 것이 더욱 일반적이다. 물론, 상기 구조틀 영역내의 다수의 아미노산들은 항체의 특이성 또는 친화성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 전혀 영향을 미치지 않는다. 그러므로, 구조틀 잔기의 다수의 개별적인 보존적 치환은 생성된 인간화 면역 글로불린의 특이성 또는 친화성에 대한 감지할 수 있을 정도의 변화 없이 용인될 수 있다.

HuZAF의 유사체는 HuZAF와 실질적인 아미노산 서열 동일성을 나타낸다. 유사체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 엄격한 조건하에서, HuZAF의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산과 혼성화되는 핵산 서열, 또는 이들의 축퇴성 형태에 의하여 암호화된다. 파아지 디스플레이 기술은 결합 친화성 및 특이성을 보유하는 HuZAF의 유사체를 선택하는 유용한 기술을 제공한다[참조 : 예를 들어, Dower 등, WO 91/17271 ; McCafferty 등, WO 92/01047 ; 및 Huse, WO 92/06204 (상기 각 문헌은 본원에 참고 문헌으로 인용됨)].

전술한 바와 같이 제조된 인간화 항체의 가변성 절편은 통상적으로 면역 글로불린의 불변 영역(Fc), 일반적으로 인간 면역 글로불린의 불변 영역중 적어도 일부분에 결합된다. 인간 불변 영역 DNA 서열은 널리 공지된 방법에 의하여 다양한 인간 세포, 바람직하게는 무한 증식성 B-세포로부터 분리될 수 있다[참조 : Kabat 등 (상동) 및 WO 87/02671]. 보통, 항체는 경쇄 및 중쇄 불변 영역을 모두 포함한다. 상기 중쇄 불변 영역은 일반적으로 CH1, 힌지, CH2, CH3를 포함하며, 때때로 CH4 영역을 포함하는 경우도 있다.

인간화 항체는, IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE 를 포함하는 모든 유형의 불변 영역을 보유하는 항체와, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 이소타입 을 포함한다. 인간화 항체가 세포 독소 활성을 나타내는 것이 바람직한데, 여기서 상기 불변 도메인은 일반적으로 보체 고정 불변 도메인(complement-fixing constant domain)로서, 통상적으로 IgG1이다. 이러한 세포 독소 활성이 바람직하지않은 경우, 불변 도메인은 IgG2 부류일 수 있다. 인간화 항체는 1 이상의 부류 또는 이소타입으로부터 얻은 서열들을 포함할 수 있다.

인간화 면역 글로불린의 CDR 및 구조틀 성분들은 개념적으로 선택되므로, 여러가지 방법을 이용하여 이러한 면역 글로불린을 제조할 수 있다. 유전 암호의 축퇴성으로 인하여, 다양한 핵산 서열들이 각각의 면역 글로불린 아미노산 서열을 암호화한다. 바람직한 핵산 서열은 신규한 고체상 DNA 합성법 또는 바람직한 폴리뉴클레오타이드의 초기 제조 변이체의 PCR 돌연 변이 유발법으로 제조할 수 있다. 본원에 기술된 항체들을 암호화하는 모든 핵산들은 본 발명에 명백히 포함되는 것이다.

일단 발현되면, 본 발명의 전체 항체, 이의 이량체, 개별적인 경쇄 및 중쇄, 또는 기타 면역 글로불린 형태는 암모늄 셀페이트 침전법, 친화성 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함하는, 당 업계의 표준적인 방법으로 정제할 수 있다[참조 : Scopes, R.,Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y.(1982)(본원에 참고 문헌으로 인용됨)]. 약학적 용도에서 실질적으로 순수한 면역 글로불린의 상동성은 약 90∼95% 이상인 것이 바람직하고, 98∼99% 이상인 면역 글로불린이 가장 바람직하다. 일단 부분적으로 또는 필요로 하는 정도의 상동성으로 정제되면, 폴리펩타이드는 치료학적으로(외용의 경우 포함) 사용하거나, 또는 면역 형광 염색법등과 같은 분석 방법을 개발 및 수행하는데 사용할 수 있다[참조 :Immunological Methods, Vol.I 및 II, Lefkovits 및 Pernis 편저, Academic Press, New York, NY(1979 및 1981)].

Ⅱ. 치료 방법

본 발명의 면역 글로불린을 포함하는 약학 조성물은 피하, 근육내 및 특히 정맥내 투여 방법과 같은 비경구 투여에 유용하다. 비경구 투여용 조성물은 일반적으로 항체 용액 또는 허용가능한 담체, 바람직하게는 수성 담체에 용해된 이의 혼합 용액(cocktail)을 포함한다. 예를 들어 물, 완충수, 0.4% 염수, 0.3% 글리신등과 같은 다양한 수성 담체를 사용할 수 있다. 상기 용액은 멸균된 것이며, 일반적으로 미립자는 포함되어 있지 않다. 상기 조성물은 필요에 따라 pH 조절제 및 완충제, 독성 조절제 등과 같이, 생리적 조건을 맞추는 데에 필요한 약학적으로 허용 가능한 보조 물질 예를 들어, 나트륨 아세테이트, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘, 나트륨 락테이트, 히스티딘 및 아르기닌을 함유할 수 있다. 이들 제제내의 면역 글로불린의 농도는 약 0.01 중량% 미만, 일반적으로 약 0.1 중량% 이상 내지 5 중량%이며, 주로 용액 부피 및 선택된 특정 투여 방법에 따른 용해도를 기준으로 선택된다.

그러므로, 통상적인 주사용 약학 조성물은 1㎖의 멸균 완충수와 1∼100㎎의 면역 글로불린을 함유하도록 구성할 수 있다. 통상적인 정맥내 주입용 조성물은 250㎖의 멸균 링거 용액과 10㎎의 면역 글로불린을 함유하도록 구성할 수 있다. 비경구적으로 투여가능한 조성물을 제조하는 실질적인 방법은 공지되어 있거나 또는 당업자에게 명백하며, 예를 들어Remington's Pharmaceutical Science(제15판, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1980 ; 본원에 참고 문헌으로 인용함)에 더욱 상세히 기술되어 있다.

본 발명의 면역 글로불린은 저장을 위하여 냉동 또는 동결 건조할 수 있으며, 사용전 적합한 담체내에서 재구성할 수 있다. 상기 기법은 종래의 면역 글로불에도 효과적인 것으로 확인되었으며, 기존의 동결 건조 및 재구성 기법을 사용할 수 있다. 동결 건조 및 재구성법은 다양한 정도로 면역 글로불린 활성을 손상시킬 수 있으므로(예를 들어, 종래의 면역 글로불린에 있어서, IgM 항체는 IgG 항체의 경우보다 활성 손실량이 더욱 많은 경향이 있음), 사용량을 조정하여 이를 보상하여야 한다.

상기 조성물은 예방적 처치 및/또는 치료적 처치를 위해 투여할 수 있다. 치료적 용도에 있어서, 상기 조성물은 질환과 합병증을 치유하거나 적어도 부분적으로 지연시키는데에 충분한 양으로, 바람직하지 않은 면역 반응이 이미 발병한 환자에 투여한다. 이를 수행하는데에 적합한 양을 "치료적 유효량"이라고 정의한다. 이러한 용도에 효과적인 양은 질환의 심각성 및 환자 자신의 면역계의 전반적인 상태에 의존하지만, 1회 투여당 항체 약 0.01 ∼ 약 100㎎의 범위인 것이 일반적이며, 환자 1인당 0.1 ∼ 50㎎ 및 1 ∼ 10㎎인 것이 더욱 일반적이다. 일간, 주간 또는 월간 계획으로 치료의에 의하여 선택되는 투여량 수준과 패턴으로 1회 또는 수회 투여될 수 있다. 본 발명의 물질은 일반적으로 중증 질환 상태, 즉 생명을 위협하거나 또는 생명을 위협할 가능성이 있는 상태에 사용할 수 있다. 이러한 경우, 본 발명의 인간화 면역 글로불린에 의하여 얻어지는 외인성 물질의 최소화 및 "외래 물질" 거부에 대한 더욱 낮은 가능성의 관점에서, 치료의에 의하여 바람직하다고 생각될 수 있는, 실질적으로 과량인 면역 글로불린을 투여할 수 있다.

예방적 용도에 있어서, 조성물은 바람직하지 않은 면역 반응을 억제시키기에 충분한 양으로, 상기 면역 반응이 유발될 위험성이 있는 환자에게 투여한다. 이러한 양을 "예방적 유효량"이라 정의한다. 이러한 용도에서, 정확한 양은 또한 환자의 건강 상태 및 면역성의 일반적인 수준에 의존하지만, 일반적으로는 1회 투여량당 0.1 ∼ 100 ㎎, 특히, 환자 1인당 1 ∼ 10 ㎎의 범위이다.

상기 방법들은 HLA 부류Ⅱ 항원 및/또는 Th1 세포에 의하여 매개되는 바람직하지 않은 면역 반응과 관련된 여러가지 질환에 효과적이다. 이러한 질환들로서는 예를 들어, 심장, 폐, 신장 및 간과 같은 기관 이식을 수행한 환자에 있어서 이식편 대 숙주 사이의 질환 및 이식 거부 현상, 및 Ⅰ형 당뇨병, 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 전신 루프스 홍반증, 하시모토 갑상선염, 건선, 1차 담석증 및 예를 들어, 크론병과 같은 염증성 대장 질환을 포함한다.

인간화 면역 글로불린은 실질적으로 순수한 형태, 즉 단독으로 사용하거나, 또는 비스테로이드성 항염증제, 코르티코스테로이드 또는 면역 억제제와 같은 화학 치료제와 병용할 수 있다. 상기 제제는 비스테로이드성 항염증제(예를 들어, 아스피린, 이부프로펜), 스테로이드(예를 들어, 프레드니손) 및 면역 억제제(예를 들어, 시클로스포린 A, 메토트렉세이트 시톡산)를 포함할 수 있다.

본 발명의 인간화 면역 글로불린은 또한 기타 항체, 특히 다른 림포카인 또는 림포카인 수용체와 반응성인 인간화 항체와 병용할 수 있다. 예를 들어, 인간화 면역 글로불린 혼합 용액과 반응할 수 있는 적합한 항원으로는 인터루킨 1 ∼ 18 및 IL-2 수용체의 p55 및 p75 사슬을 포함한다[참조 : Waldmann,Annu. Rev,Biochem.58, 875(1989) 및 Queen 등,Proc. Natl. Acad. Sci.USA 86, 10029(1989) ; 본원에 참고 문헌으로 인용함]. 기타 항원으로는 질환에 관여하는 세포상의 항원, 예를 들어 소위 "분화 클러스터(Cluster of differentiation)"를 포함한다[참조 :Leucocyte Typing Ⅲ, A.J.McMichael 편저, Oxford University Press (1987) ; 본원에 참고 문헌으로 인용함].

진단 방법

또한, 인간화 항 γ-IFN 항체는 진단 방법에도 유용하다. 인간화 항 γ-IFN 항체는 γ-IFN 발현 및 후속 면역 반응을 측정하는데에 유용하다. 진단 방법은 환자로부터 얻은 세포 시료(예를 들어, 혈액 시료, 림프절 생검편 또는 조직)를 사용하여 시험관내에서 수행하거나 또는 생체내 이미지 형성법으로 수행할 수 있다. 인간화 항 γ-IFN 항체는 또한 인간 γ-IFN을 정제하는데에 유용하다.

특정 구체예에서, 본 발명의 인간화 면역 글로불린을 포함하는 조성물은 예를 들어 방사성 면역 분석법 또는, ELISA에 의해 γ-IFN을 검출하는데에 사용될 수 있다. 그러므로, AF2 항체에 의하여 동정되는 항원 결정기에 결합하는 인간화 면역 글로불린과 같은 본 발명의 인간화 면역 글로불린은 표지화되어 상당한 농도의 γ-IFN을 함유하는 해부학적 위치를 동정하는데에 사용될 수 있다. 1이상의 표지화 부분이 인간화 면역 글로불린에 부착될 수 있으나, 이는 예시적인 것에 불과할 뿐, 본 발명을 한정하는 것은 아니다. 대표적인 표지화 부분으로는 구체적으로 방사성 또는 자기 공명 영상화 기법에 있어서 방사선 불투과성 염료, 방사선 콘트라스트 제제, 형광 분자, 스핀 표지화 분자, 효소 또는 기타 진단용 표지화 부분을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하의 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것일뿐, 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아니다. 실시예가 인간화 AF2 항체에 포함된다 하더라도, γ-IFN에 대한 결합 친화성이 높은 인간화 항체를 제조하는 방법 또한 γ-IFN의 에피토프와 결합하는 다른 단클론 항체로부터 얻은 CDR을 사용하는 것으로 추측할 수 있다는 사실을 이해할 수 있을 것이다.

본원에 언급된 모든 공개 공보들은 예를 들어, 구성물 및 본원에 기술된 발명과 관련하여 사용될 수 있는 공개 공보에 기술된 방법들을 기술 및 개시하기 위하여 본원에 참고 문헌으로서 인용하였다. 전술한 공보들 및 명세서에 전반적으로 기술되어 있는 공보들은 본원의 출원일 이전의 공개용으로서만 제공된다. 선행 발명에 의하여 공지된 사실에 앞서는 것으로서 발명자들이 인정받지 못할 수 있는 사실은 본원에 존재하지 않는다.

1. 인간화 면역 글로불린 클로닝 수행 방법 및 마우스 AF2 가변 영역 cDNA의 시퀀싱

마우스 AF2 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역을 암호화하는 cDNA 서열의 클로닝에 관하여는 Queen 등, WO 92/11018에 기술되어 있다. 이들 cDNA의 서열들은 도1에 나타내었다.

인간의 불변 영역에 결합된 마우스 AF2 항체의 가변 도메인을 포함하는 키메라 항체를 구성 및 발현시키기 위하여 2개의 플라스미드 벡터들을 제조하였다. 플라스미드 pVg1-dhfr(Queen등, 상동)은 인간 사이토메갈로바이러스 IE1 프로모터 및 인핸서(M.Boshart 등, Cell 41,521(1985)), 선행 인트론의 일부를 포함하는 인간 게놈형 Cg1 분절, 및 선별을 위한 디히드로폴레이트 환원 효소(dhfr) 유전자(참조 : Simonsen 등,Proc. Natl. Acad. Sci.USA 80, 2495(1984), 본원에 참고 문헌으로 인용함)를 포함한다. 플라스미드 pVk(Queen 등, 상동)은 pVg1-dhfr과 유사하지만, 인간 게놈 Ck 분절과 gpt 유전자를 포함한다. AF2 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 유도체들은 중합효소 연쇄 반응에 의하여 cDNA로부터 제조하였다. 5' 프라이머는 ATG 코돈에서 개시되는 V 영역에 혼성화되며, XbaI 위치를 포함하고 ; 3' 프라이머는 J 영역의 마지막 15 뉴클레오타이드에 혼성화되며 스플라이스 공여체 시그널 및 XbaI 위치를 포함한다[참조 : Queen 등,Proc. Natl. Acad. Sci.USA 86, 10029(1989); 본원에 참고 문헌으로 인용함]. 변형된 V 영역을 각 플라스미드의 CMV 프로모터와 불변 영역의 일부 인트론 사이에 있는 XbaI 위치로 클로닝하였다.

키메라 항체의 발현을 위하여, 중쇄 및 카파 사슬 플라스미드를 전기천공법 (electroporation)으로 Sp2/0 마우스 골수종 세포로 형질 감염시킨후 gpt 발현 여부에 대해 세포들을 선별하였다. 완전한 항체를 가장 많이 분비하는 클론을 ELISA로 검출하였다. 키메라 AF2 항체가 인간 γ-IFN에 결합하였음을 ELISA를 통하여 알 수 있었다.

인간화 AF2 가변 영역의 구성

인간화 항체에서 마우스 항체의 결합 친화성을 유지시키기 위하여, Queen 등의 일반적인 방법을 수행하였다[참조 : Queen 등.Proc. Natl. Acad. Sci.USA86:10029(1989) 및 미국 특허 제5,585,089호 및 동 제5,693,762호]. 구조틀 잔기의 선택이 높은 결합 친화성을 유지시키는데에 결정적일 수 있다. 원칙적으로, 임의의 인간 항체로부터 얻은 구조틀 서열은 CDR 이식에 있어서 주형으로서 사용될 수 있지만, 이러한 구조틀에 CDR이 직접 치환되어 도입되는 경우 항원에 대한 결합 친화성이 상당히 상실될 수 있다[참조 : Tempest 등,Biotechnology9:266(1992) ; Shalaby 등,J.Exp.Med.17:217(1992)]. 인간 항체와 쥐과 동물 유래의 항체와의 상동성이 높을수록, 마우스 CDR 내에 인간 구조틀이 왜곡 도입되어 친화성이 감소될 가능성은 낮아진다. 항체 서열 데이터베이스에 대한 서열 상동성 조사를 기초로 하여, 마우스 AF2 항체와 구조틀 상동성이 양호한 인간 항체 Eu를 선택하였다. 기타의 상동성이 높은 인간 항체 사슬은 또한 인간화 항체 구조틀, 특히 인간 하위군Ⅰ로부터 얻은 카파 경쇄 및 중쇄(Kabat 등,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, U.S. Department of Health and Human Services, (1991) 에서 정의함)를 제공하는데에 적합할 것이다.

컴퓨터 프로그램 ABMOD 및 ENCAD[참조 : Levitt 등,J.Mol.Biol.168:595 (1983)]를 사용하여, CDR과 상호 작용할 수 있을만큼 충분히 가까이 위치한 AF2 구조틀내 아미노산을 확인하는데에 사용되는 AF2 가변 도메인의 분자 모델을 구성하였다. 인간화 HuZAF 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 구성하기 위하여, 마우스 AF2 항체로부터 얻은 CDR을 인간 Eu 항체의 구조틀 영역내로 이식하였다. 컴퓨터 모델이 CDR과 상당량 접촉할 것으로 제시한 구조틀 위치에서, 마우스 항체로부터 얻은 아미노산을 인간 구조틀 근원 아미노산과 치환하였다. HuZAF로 나타낸 AP2의 인간화형태에 있어서, 상기 치환은 중쇄의 27, 28(코티아 CHR H1 내), 30, 38, 48, 67, 68, 70, 72, 74, 98 및 107번 잔기에서, 그리고 경쇄의 48, 63 및 70번 잔기에서 수행하였다. 더욱이, 인간 항체 데이터베이스내 위치에는 거의 존재하지 않는 구조틀 잔기들은, 상기 위치에 존재하는 인간 공통 서열 아미노산 또는 해당 마우스 항체의 아미노산으로 치환시켰다. HuZAF에 있어서는 중쇄의 93, 95, 98, 107, 108, 109 및 111번 잔기 및 경쇄의 48, 63 및 70번 잔기에서 치환시켰다.

더욱이, HuZAF의 H11 위치를 마우스 항체 AF2의 중쇄 중 대등 위치를 차지하고 있는 아미노산으로 치환시켰다. 키메라 AF2 항체내 다수의 위치(즉, 치환 위치 이외의 마우스 가변 도메인을 보유하는 위치)를 인간 EU 항체내 대등 위치에서 얻은 아미노산과 치환시켜 치환용 후보 변이체로 만든후, 상기 각 변이체를 중화 활성이 감소되었는지 여부에 대하여 시험하여 H11을 동정하였다. 상기 치환 모두를 포함하는 HuZAF 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 최종 서열을 도2A 및 도2B에 나타내었다.

또한, 마우스 AF2 CDR 영역 및 인간 EU 가변 영역을 포함하지만, 상기와 같이 치환된 여러가지 하위세트를 포함하는 다른 인간화 면역 글로불린도 구성하였다(도3 참조). Haf25는 H11 및 H38 위치에서 치환이 일어나지 않았다는 점을 제외하고는 HuZAF와 동일한 항체이다. HuXAF는 H38 위치에서 치환이 일어나지 않았다는 점을 제외하고는 HuZAF와 동일한 항체이다.

그러나, 치환되기 용이하며 항원에 대한 항체의 실질적 친화성을 유지시킬 수 있는 다수의 잠재적 CDR 접촉 잔기가 존재한다. 예를 들어, 인간화 AF2 경쇄의처음 4개의 N-말단 아미노산 잔기는, CDR과 접촉하기 때문에 쥐과 동물 항체로부터 얻은 서열로 선택적으로 치환할 수도 있다.

이와 유사하게, 인간화 항 γ-IFN 중쇄 및 경쇄내 CDR과 접촉하지 않는 다수의 구조틀 잔기는 인간화 항체의 친화성 또는 비면역원성을 상당한 정도로 상실시키지 않고, 인간 EU 항체의 해당 위치, 기타 인간 항체, 마우스 AF2 항체 또는 기타 마우스 항체로부터 얻은 아미노산을 치환시킬 수 있다.

다수의 선택적 아미노산을 선택하여 친화성, 특이성, 비면역원성, 제조 용이성 및 기타 바람직한 특성의 다양한 조합 특성을 보유하는 인간화 항 γ-IFN을 제조할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 실시예들은 본 발명을 예시하는 것일뿐, 제한하는 것은 아니다.

인간화 항체에 대한 유전자를 구성하기 위해, 인간화 중쇄 및 경쇄의 단백질 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과, 일반적으로 마우스 서열에서 발견되는 코돈을 사용하는 통상의 면역 글로불린 시그널 서열을 선택하였다. 몇몇 축퇴성 코돈을 변경시켜 제한 위치를 형성하거나 또는 바람직하지 않은 제한 위치를 제거하였다. 상기 뉴클레오타이드 서열은 또한 키메라 유전자에 사용되는 것과 동일한 스플라이스 공여체 시그널과 이의 각 말단부에 XbaI 위치를 포함하였다. 4개의 중첩 합성 올리고뉴클레오타이드로부터 임의의 유전자들을 구성하였다. 각 가변 도메인 유전자에 있어서, 선택적 사슬에 존재하는 2쌍의 중첩 올리고뉴클레오타이드를 합성하여 전체 암호 서열과 시그널 펩타이드 및 스플라이스 공여체 시그널을 포함시켰다. 이후 Applied Biosystems 380B DNA 합성기에서 상기 올리고뉴클레오타이드를합성하였다. 약 15 염기가 중첩된 각 올리고뉴클레오타이드의 길이는 약 110∼140 염기이었다. 각 쌍의 올리고뉴클레오타이드로부터 얻은 2본쇄 DNA 단편을 클리나우 중합효소(Klenow polymerase)로 합성한후, 이를 제한 효소로 절단하고, pUC18 벡터에 결찰시킨후 시퀀싱하였다. 이후 각각 수정된 반쪽 서열을 보유하는 2개의 단편들을 pVg1-dhfr 또는 pVk 발현 벡터의 XbaI 위치에 적당한 방향으로 결찰시켜 완전한 중쇄 및 경쇄 유전자를 제조하였다. PCR 돌연변이 유발법에 의하여 인간화 AF2 변이체에 대한 임의의 유전자들을 기존 유전자로부터 합성하였다.

중쇄 및 경쇄 플라스미드들을 전기 천공법에 의하여 Sp2/0 마우스 골수종 세포에 형질 감염시키고 gpt 발현 여부에 대해 세포들을 선별하였다. ELISA에 의하여 배양 상등액에 인간 항체가 생성되었는지 여부를 검정하여 클론을 스크리닝하였으며, 생산성이 가장 높은 세포로부터 항체를 정제하였다. 스타필로코커스 단백질 A -세파로즈 CL-4B(파마시아) 컬럼으로 조직 배양 상등액을 통과시켜 항체를 정제하였다. 결합된 항체는 pH 3.0의 0.2M 글리신-HCl로 용출시켰으며, 여기에 1M 트리스(pH 8.0)을 첨가하여 중화시켰다. 이후 PD10 컬럼(파마시아)을 통과시키거나 또는 투석법에 의하여 완충액을 PBS로 교환하였다.

2. γ-IFN에 대한 중화 활성 분석법

γ-IFN은 반응성 세포주상 MHC 분자의 발현 수준을 증가시켰다. Hs294T는 γ-IFN과 함께 48∼72 시간 동안 항온 처리될 경우 표면상에 발현되는 MHC 부류 Ⅱ 분자의 양을 상향 조절하는 인간 흑색종 세포주이다[참조 : Zarniecki 등,J.Immunology, 140, 4217∼4223(1988)]. 상향 조절된 분자에 특이적인 단클론 항체및 간접 면역 형광법 및 유동 혈구 계측법을 사용하여 이러한 증가 현상을 검출할 수 있었다. 상기 세포주상 MHC 부류 Ⅱ 분자의 상향 조절 현상을 상기 항체가 억제하였는지 여부를 측정하여 상기 항체의 γ-IFN 중화 활성을 분석하였다. 상기 분석법에 사용되는 γ-IFN는 미국 미네소타 55413, 미네아폴리스, N.E., 맥킨리 플레이스 614 소재, R&D Systems으로부터 구입하였다.

이미 HS294T 세포상 MHC 부류 Ⅱ 분자의 수준을 상향 조절하는 것으로 밝혀진바 있는 일정량의 γ-IFN에 농도를 증가시키면서 항체를 첨가하였다. 상기 세포들을 항체 γ-IFN 혼합물과 함께 48∼72 시간 동안 항온 처리한 후, 인간 MHC 부류 Ⅱ 분자에 특이적인 마우스 단클론 항체를 사용하는 간접 면역 형광법으로 MHC 부류 Ⅱ 분자의 수준을 측정하였다. 유동 혈구 계측법에 의하여 분석한 결과를 세포 군집의 평균 형광 강도를 측정한후, 항체 농도에 대하여 그래프로 표시하여 상기 항체의 중화 능력을 나타내었다.

도4에 나타낸 바와 같이, HuZAF는 haf25의 경우보다 중화 활성이 상당히 높아졌는데, 이는 H11 및 H38 위치에서의 치환이 중화 활성을 개선시켰음을 나타내는 것이다. HuXAF 또한 haf25의 경우보다 중화 활성이 상당히 높았는데, 이는 곧 H11에만 치환이 일어나면 중화 활성에 중요한 영향을 미친다는 사실을 시사하는 것이다.

Claims

서열 2의 경쇄 가변 영역과 서열 4의 중쇄 가변 영역을 보유하는 마우스 AF2 면역 글로불린의 인간화 형태인 인간화 면역 글로불린으로서, 인간화 중쇄 및 경쇄를 포함하되 단, 인간화 중쇄 가변 영역 구조틀의 11번 위치의 아미노산이 마우스 AF2 중쇄 가변 영역 구조틀의 대등한 위치에 존재하는 아미노산인 인간화 면역 글로불린.
제1항에 있어서, 마우스 AF2 면역 글로불린으로부터 얻은 CDR 및 인간 EU 면역 글로불린으로부터 얻은 중쇄 및 경쇄 가변 영역 구조틀을 포함하는 인간화 면역 글로불린.
제2항에 있어서, 추가로 H38 위치의 아미노산이 마우스 AF2 중쇄 가변 영역 구조틀의 대등한 위치에 존재하는 아미노산인 인간화 면역 글로불린.
제2항에 있어서, 추가로 H11, H27, H28, H30, H38, H48, H67, H68, H70, H72, H74, H93, H95, H98, H107, H108, H109, H111 위치의 아미노산이 마우스 AF2 중쇄의 대등한 위치에 존재하는 아미노산이고, L48 및 L70 위치의 아미노산이 마우스 AF2 경쇄의 대등한 위치에 존재하는 아미노산이고, L63 위치의 아미노산이 인간 면역 글로불린 경쇄 공통 서열의 대등한 위치에 존재하는 아미노산인 인간화 면역글로불린.
제1항에 있어서, 상기 면역 글로불린이 친화성 상수가 마우스 AF2 항체의 친화성의 4배 이하인 인간 γ-IFN에 특이적으로 결합하는 인간화 면역 글로불린.
제1항에 있어서, 서열 6의 성숙 경쇄와 90% 이상의 서열 동일성을 나타내는 인간화 성숙 경쇄 및 서열 8의 성숙 중쇄와 90% 이상의 서열 동일성을 나타내는 인간화 성숙 중쇄를 포함하는 γ-IFN에 특이적으로 결합하는 인간화 면역 글로불린.
제1항에 있어서, 상기 면역 글로불린이 2개의 경쇄/중쇄 이량체를 포함하는 인간화 면역 글로불린.
제1항에 있어서, 상기 면역 글로불린이 IgG1 이소타입인 인간화 면역 글로불린.
제1항에 있어서, 상기 면역 글로불린이 95% 이상의 상동성으로 정제되는 인간화 면역 글로불린.
서열 6의 성숙 중쇄 가변 영역 및 서열 8의 성숙 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간화 면역 글로불린.
제1항 또는 제10항의 인간화 면역 글로불린 및 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물.
제1항 또는 제10항의 약학 조성물을 치료학적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 유해한 면역 반응이 발생한 환자를 치료하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 환자가 자가 면역 질환 환자인 방법.