JP2000228982A - 血管内皮増殖因子−ｂのプロモーター配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規な増殖因子ＶＥＧＦ−Ｂのプロモー
ター配列を提供することが本発明の課題である。 【解決手段】 ＶＥＧＦ−ＢゲノムＤＮＡをクローニン
グして、そのプロモーター解析により、ＶＥＧＦ−Ｂの
プロモーターの配列を決定した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、血管内皮増殖因子
−Ｂのプロモーター配列に関する。

【０００２】

【従来の技術】血管新生、すなわち、既存の血管からの
新しい毛細血管の増殖は、組織の正常な成長と発達に必
要な基本的プロセスである。それは、血管の樹枝状分岐
（ｖａｓｃｕｌａｒ ｔｒｅｅ）の発達と分化、およ
び、胚形成、身体の成長、組織および器官の修復と再
生、黄体と子宮内膜の周期的成長、および、神経システ
ムの発達と分化を含む多様な基本的生理学的プロセスに
とっての必須条件である。女性の生殖システムに於い
て、血管新生は、濾胞においてはその発達中に起こり、
黄体においては排卵の後に起こり、胎盤においては妊娠
状態を確立し維持するために起こる。血管新生は、更
に、たとえば、傷や骨折の治癒等の体の修復プロセスの
一部としても起こる。又、血管新生は、腫瘍成長の因子
でもある。というのは、腫瘍は成長するためには、連続
的に新しい毛細血管の成長を刺激しなければならないか
らである。

【０００３】毛細血管は、内皮細胞と、周細胞（ルジェ
ー細胞）とから成る。これら二つの細胞タイプは、管、
分岐、および全毛細血管ネットワークを形成するための
すべての遺伝情報を有している。特定の血管新生分子が
このプロセスを開始させることができる。血管新生の生
理学的重要性に鑑みて、血管新生を刺激することができ
る因子の単離、キャラクタリゼーション、及び精製に多
大な努力がささげられてきた。血管新生を刺激する多数
のポリペプチドが精製され、その分子的、生化学的、お
よび生物学的特性についてのキャラクタライズが行われ
てきた。このような血管新生の調節因子の概観のため
に、クラーグスブルン（Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ）他，"Ｒ
ｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ
“，Ａｎｎ． Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，５３：２１
７−３９（１９９１）とフォークマン（Ｆｏｌｋｍａ
ｎ）他，”Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，“Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１０９３１−９３４（１９９
２）とを参照。最近の結果は、血管システムの確立と維
持に於いて、いくつかの内皮のレセプタ−チロシンキナ
ーゼ（ＲＴＫ）を関連付けている。

【０００４】血管内皮細胞に対する分裂促進因子として
特異性の高い一つのそのような増殖因子は、血管内皮増
殖因子（ＶＥＧＦ）と命名されている。フェッラーラ
（Ｆｅｒｒａｒａ）他，“Ｔｈｅ Ｖａｓｃｕｌａｒ
Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ
Ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，”
Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：２１
１−２１８（１９９１）；コノリー（Ｃｏｎｎｏｌｌ
ｙ），“Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ
Ｆａｃｔｏｒ： Ａ Ｕｎｉｑｕｅ Ｒｅｇｕｌａｔ
ｏｒ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｖｅｓｓｅｌ Ｆｕｎｃｔｉ
ｏｎ，”Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４
７：２１９−２２３（１９９１）を参照。ＶＥＧＦは、
ウシ下垂体濾胞細胞を含む多数の細胞ラインによって調
整された培地中に検出された強力に血管に作用するたん
白質である。ＶＥＧＦは、二つの２４ｋＤサブユニット
から成る、グリコシル化された陽イオン性の４６−４８
ｋＤダイマーである。それは、スルフヒドリル還元剤に
よって不活性化され、酸性ｐＨと加熱とに対する抵抗性
を有し、固定化されたヘパリンに結合する。ＶＥＧＦは
皮内注射後に血管からの液体の漏洩を増加させるため、
時として、血管透過性亢進因子（ＶＰＦ）と称される。
それは、又、ｖａｓｃｕｌｏｔｒｏｐｉｎという名でも
呼ばれる。

【０００５】これまで４つの異なった分子種のＶＥＧＦ
が検出されている。１６５アミノ酸種は、約４６ｋＤの
分子量を有し、正常な細胞と組織に見られる主要な分子
形態である。より数が少なく、位置１１６と１５９との
間で４４個のアミノ酸が欠失した短い形態（ＶＥＧＦ
₁₂₁）と、位置１１６に２４個の高塩基性残基の挿入を
有する長い形態（ＶＥＧＦ₁₈₉）と、ＶＥＧＦ₁₈₉に見ら
れる前記２４アミノ酸挿入を含む、４１個のアミノ酸の
挿入を有するもう一つのより長い形態（ＶＥＧＦ ₂₀₆）
も、知られている。ＶＥＧＦ₁₂₁とＶＥＧＦ₁₆₅とは、可
溶性のたん白質である。 ＶＥＧＦ₁₈₉とＶＥＧＦ₂₀₆と
は、大半が、細胞結合型である。ＶＥＧＦの全てのアイ
ソフォームは、生物学的に活性である。例えば、皮内に
投与された時、これらの種はそれぞれ、エバンスブルー
の血管外遊出を誘発させることができる。

【０００６】前記種々のＶＥＧＦ種は、同じ遺伝子によ
ってコードされ、メッセンジャーＲＮＡの選択的スプラ
イシングから生じる。この結論は、ヒトゲノムＤＮＡの
サザンブロット分析によって支持されており、これは、
ＶＥＧＦ₁₆₅のためのプローブを使用しても、あるい
は、ＶＥＧＦ₂₀₆における挿入を有するプローブを使用
しても、いずれの場合にも、制限パターンが同じである
ことを示している。推定ｍＲＮＡスプライシングの領域
に於けるゲノム・クローンの分析も、選択的スプライシ
ングと矛盾なく一致するイントロン／エキソン構造を示
している。

【０００７】ＶＥＧＦの様々なアイソフォームは、細胞
放出、区画化、バイオアベイラビリティを調節し、更
に、恐らくは、それら増殖因子のシグナリング特性を調
整するであろう異なった化学特性を有している。

【０００８】ＶＥＧＦ遺伝子のヌクレオチド配列の分析
は、ＶＥＧＦが血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）ファミ
リーのメンバーであることを示している。ＶＥＧＦとＰ
１ＧＦとは、二つの内皮のＲＴＫ、ｆｌｔ−１（ＶＥＧ
Ｆレセプター１，ＶＥＧＦＲ１）とｆｌｋ−１／ＫＤＲ
（ＶＥＧＦレセプター２，ＶＥＧＦＲ２）とに対するリ
ガンドである。ＶＥＧＦのアミノ酸配列は、ＰＤＧＦの
ＡおよびＢ鎖の配列に対する約２０％の相同性と、更
に、両方の成熟ＰＤＧＦ鎖に見られる８つのシステイン
残基の完全な保存とを示している。ＶＥＧＦ₁₆₅、ＶＥ
ＧＦ₁₈₉およびＶＥＧＦ₂₀₆は、又、カルボキシ末端領域
内に於いて８つのさらなるシステイン残基をも有してい
る。ＶＥＧＦのアミノ−末端配列の前には、典型的なシ
グナル配列に対応する２６個のアミノ酸がある。成熟た
ん白質は、介在するプロシーケンスなしに、シグナル配
列の切断の後、直接的に生成される。Ａｓｎ⁷⁴に於ける
潜在的グリコシル化部位の存在は、ＶＥＧＦが糖たん白
質であるという他の証拠と一致しているが、前記ポリペ
プチドは、グリコシル化種と非グリコシル化種との両方
の形態で存在することが報告されている。

【０００９】他のサイトカインと同様に、ＶＥＧＦは、
それが見られる特定の生物学的環境(biological contex
t)に依り、様々な作用を有することができる。ＶＥＧＦ
とその高親和性レセプターであるｆｌｔ−１とＫＤＲ／
ｆｌｋ−１とが、血管システムの形成と維持、更に、生
理的および病的血管新生とに必要である。ＶＥＧＦは、
強力な内皮細胞分裂促進因子であり、正常な胚の発達、
傷の治癒、および組織の再生と再編成中に於いて内皮細
胞増殖を促進することに依って、イン・ヴィヴォでの血
管新生の誘発に直接寄与する。ＶＥＧＦは、又、固形腫
瘍の成長と転移、虚血−誘発網膜症等の病的プロセスに
も関係している。ＶＥＧＦの最も顕著な特徴はその特異
性である。それは、毛細血管およびヒト臍帯血管内皮細
胞に対して、１ｎｇ／ｍｌでイン・ヴィトロで分裂促進
性であるが、副腎皮質細胞、角膜又は水晶体上皮細胞、
血管平滑筋細胞、角膜内皮細胞、顆粒膜細胞、ケラチン
生成細胞、ＢＨＫ−２１繊維芽細胞、３Ｔ３細胞、ラッ
ト胚繊維芽細胞、ヒト胎盤繊維芽細胞、およびヒト肉腫
細胞に対してはそうではない。従って、ＶＥＧＦの標的
細胞特異性は、血管内皮細胞に限定される。

【００１０】ＶＥＧＦは、血管新生につながる全ての一
連の事象を引き起こすことができ、イン・ヴィヴォで角
膜に於ける、又、治癒骨移植片モデルに於ける血管新生
を刺激する。それは、小さな血管と大きな血管の両方か
ら単離された内皮細胞の増殖を刺激することができる。
ＶＥＧＦｍＲＮＡの発現は、卵巣の黄体、又は発達中の
脳に於ける毛細血管の生理的増殖に時間的又空間的に、
関連している。ＶＥＧＦ発現は、低酸素症によって引き
起こされるので、内皮細胞増殖と血管新生とは、特に虚
血部位に於いて刺激されるようである。ＶＥＧＦは、
又、単球に対する強力な誘引物質でもある。更に、ＶＥ
ＧＦは、内皮細胞に於いて、プラスミノーゲンアクチベ
ーターと、プラスミノーゲンアクチベータインヒビター
を誘導する。

【００１１】腫瘍細胞はＶＥＧＦ等の血管新生分子を放
出し、ＶＥＧＦに対するモノクローナル抗体は、横紋筋
肉腫等のある種の腫瘍の成長を阻害することが示されて
いる。キム（Ｋｉｍ）他，“Ｉｎｈｉｂｉｔｏｎ ｏｆ
Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏ
ｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ａｎｇｉｏｇ
ｅｎｅｓｉｓ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ｔｕｍｏｒ Ｇ
ｒｏｗｔｈ ｉｎ ｖｉｖｏ，”Ｎａｔｕｒｅ，３６
２：８４１−８４４（１９９３）参照。これは、ＶＥＧ
Ｆの作用を阻止することが、腫瘍一般の治療、特に、高
度に血管が発達した、勢いのある腫瘍の治療に於いて、
潜在的な治療上の重要性を有するものであることを示唆
している。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、内皮
細胞の増殖を促進する特性を有する新規な増殖因子を提
供すること、およびそれによって、その新規な増殖因子
の上流のプロモーター配列を提供することにある。本発
明の別の課題は、内皮細胞の増殖を促進する新規な増殖
因子をコードする単離ＤＮＡ配列を提供することにあ
る。本発明の更に別の課題は、診断および／又は治療用
途に於いて有用な新規な製品を提供することにある。

【００１３】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するた
め、本発明は、配列番号１（配列認識記号：チ）、即ち
図２５に記載の配列を有する核酸分子、または、配列番
号１（配列認識記号：チ）、即ち図２５に記載の配列を
有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズし、プロモーターである核酸分子、からなるプロ
モーター配列を提供する。ここで、核酸分子は、好まし
くは、ＤＮＡ分子である。

【００１４】その他の課題は、本発明に依って、下記の
特徴的なアミノ酸配列（配列認識記号：タ） Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘ
ａａ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙ
ｓ を示し、内皮細胞又は中胚葉細胞の増殖を促進する特性
を有するたん白質をコードする単離ＤＮＡを提供するこ
とによって達成され、そのＤＮＡは、図１および２のＤ
ＮＡ（配列認識記号：ア）と、図３のＤＮＡ（配列認識
記号：エ）と、図５のＤＮＡ（配列認識記号：カ）と、
図７のＤＮＡ（配列認識記号：ク）と、図１０のＤＮＡ
（配列認識記号：コ）と、図１２のＤＮＡ（配列認識記
号：シ）と、図１４のＤＮＡ（配列認識記号：セ）と、
それらＤＮＡ配列の少なくとも一つとストリンジェント
な条件下でハイブリダイズするＤＮＡとから成るグルー
プから選択される。

【００１５】本発明の別の態様に依れば、前記諸課題
は、又、下記の特徴的なアミノ酸配列（配列認識記号：
タ） Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘ
ａａ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙ
ｓ を示し、内皮細胞又は中胚葉細胞の増殖を促進する特性
を有するたん白質を提供することによって達成され、た
ん白質は、図１のアミノ酸配列（配列認識記号：イ）
と、図２のアミノ酸配列（配列認識記号：ウ）と、図４
のアミノ酸配列（配列認識記号：オ）と、図６のアミノ
酸配列（配列認識記号：キ）と、図８のアミノ酸配列
（配列認識記号：ケ）と、図１１のアミノ酸配列（配列
認識記号：サ）と、図１３のアミノ酸配列（配列認識記
号：ス）と、図１５のアミノ酸配列（配列認識記号：
ソ）とから成るグループから選択されるアミノ酸配列に
実質的に対応するアミノ酸配列を含む。

【００１６】本発明の更に別の態様に於いて、前記諸課
題は、そのようなたん白質を含有する医薬調合物を提供
すること、および、そのようなたん白質と反応する、も
しくは、そのようなたん白質を認識する抗体を提供する
ことによって達成される。

【００１７】以後、血管内皮増殖因子Ｂ又はＶＥＧＦ−
Ｂと称する本発明の新規な増殖因子は、ＶＥＧＦと、胎
盤増殖因子（ＰｌＧＦ）とに対して高い構造的類似性を
有する。前記ＶＥＧＦ−Ｂの全ての形態は、前記特徴的
アミノ酸配列（配列認識記号：タ） Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘ
ａａ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙ
ｓ を有し（ここで、Ｘａａは、可変残基を示す）、これ
は、 ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーの増殖因子の特徴
である。この特徴的なアミノ酸配列は、図４，６，８，
１１，１３および１５に於いて、アミノ酸７０から８２
に見られる。

【００１８】本発明の臨床上の使用は、診断用としての
使用、傷の治癒に於ける血管新生の促進、そして血管新
生の阻害を含む。癌の生体組織検査標本に於けるＶＥＧ
Ｆ−Ｂの定量化は、将来の転移のリスクのインジケータ
ーとして有用であろう。慢性的創傷に対するＶＥＧＦ−
Ｂ調合物の局所的適用によって、血管新生と創傷の治癒
を促進することができる。ＶＥＧＦ−Ｂは、ＶＥＧＦと
類似の方法で使用することができる。

【００１９】本発明の更に別の態様に依れば、前記諸課
題は、典型的にはテスト・キットの形態をとる診断／予
知手段を提供することによって達成される。たとえば、
本発明の一具体例に於いて、本発明の新規な増殖因子に
対する抗体と、前記抗体と本発明の新規増殖因子との間
の結合を検出、より好ましくは評価するための手段と、
を有する診断／予知テスト・キットが提供される。本発
明の前記診断／予知手段の一好適具体例に於いて、増殖
因子−抗体相互作用が、抗体と増殖因子との間の結合後
に於いて、基質に結合した標識の量を測定することによ
って確証されるようにするために、抗体又は新規増殖因
子のいずれかが標識化され、そして、抗体又は増殖因子
のいずれかが、基質結合されている。本発明の特に好適
な具体例に於いて、診断／予知手段は、従来式ＥＬＩＳ
Ａキットとして提供することができる。

【００２０】更に別の具体例に於いて、前記診断／予知
手段は、テスト個体のＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子のゲノム配列
構造を確定するためにＰＣＲ手段を含むことができ、そ
して、そのテスト個体の配列構造をなんらかの異常を検
出するために本出願に開示する配列構造と比較すること
ができる。この際、 ＶＥＧＦ−Ｂ発現に於けるなんら
かの異常が所定の病状に関連しているかどうかを確立す
ることを予想している。

【００２１】本発明の更に別の態様は、ＶＥＧＦ−Ｂを
認識し、適当に標識化された抗体に関する。

【００２２】本発明の更に別の態様は、ＶＥＧＦ−Ｂた
ん白質又はそれに対する抗体のいずれかを含有する医薬
組成物の提供に関する。ＶＥＧＦ−Ｂたん白質を含有す
る組成物には、オプションとして、更に、ＶＥＧＦ又は
ヘパリン、あるいはこれらの両方を含ませることができ
る。

【００２３】本発明の更に別の態様に依れば、血管新生
の欠如又は減少によって特徴付けられる状態を治療する
ための、ＶＥＧＦ−Ｂたん白質とヘパリンとを含有する
薬剤の製品が提供される。

【００２４】更に別の態様に於いて、本発明は、ＶＥＧ
Ｆ−Ｂたん白質を含むたん白質ダイマー、特に、ジスル
フィド結合ダイマーに関する。本発明のたん白質ダイマ
ーは、ＶＥＧＦ−Ｂたん白質のホモダイマーと、ＶＥＧ
Ｆ−ＢとＶＥＧＦとのヘテロダイマーとの両方を含む。

【００２５】本発明の更に別の態様に依れば、細胞から
のＶＥＧＦおよび／又はＶＥＧＦ−Ｂの放出を容易にす
るための方法であって、前述した増殖因子の一方又は両
方を発現する細胞をヘパリンに対して露出させる工程を
有する方法が提供される。

【００２６】本発明の更に別の態様は、内皮細胞の増殖
を促進する本発明の新規な増殖因子をコードする、ここ
に開示されるＤＮＡ配列の少なくとも一部に対して相補
的なアンチ・センスヌクレオチド配列を有するベクター
の提供に関する。本発明の更に別の態様に依れば、アン
チ・センス配列を有するそのようなベクターは、ＶＥＧ
Ｆ−Ｂ発現を阻害するか、あるいは少なくともそれを弱
めるために使用することができる。ＶＥＧＦ−Ｂ発現を
阻害するためのこのタイプのベクターの使用は、ＶＥＧ
Ｆ−Ｂ発現が、腫瘍が、血管新生の準備ためにＶＥＧＦ
−Ｂを産生する場合等の疾患に関連している場合に、好
適である。このような腫瘍細胞を、アンチ・センスヌク
レオチド配列を有するベクターでトランスフォーメーシ
ョンすることによって、血管新生が抑制、又は、遅延さ
れ、腫瘍の成長も阻害又は遅延されるであろう。

【００２７】

【発明の実施の形態】従って、本発明は、ＶＥＧＦの血
管新生およびその他の特性を共有するが、組織において
はＶＥＧＦと異なる分布と発現を示す、以後ＶＥＧＦ−
Ｂ増殖因子と称する新規な血管新生内皮増殖因子、およ
びそのプロモーター配列に関する。

【００２８】ＶＥＧＦ−Ｂ増殖因子は、血小板由来増殖
因子のファミリーのメンバーであり、血管新生内皮細胞
および／又は中胚葉細胞の有糸分裂と増殖とを促進する
増殖因子である。それらは、図１および２（配列認識記
号：ア）、図３（配列認識記号：エ）、図５（配列認識
記号：カ）、図７（配列認識記号：ク）、図１０（配列
認識記号：コ）、図１２（配列認識記号：シ）、又は図
１４（配列認識記号：セ）に示すＤＮＡ配列のいずれか
一つに対応、又は、それとストリンジェントな条件下に
於いてハイブリダイズ可能なＤＮＡ配列の発現によって
産生される。本発明の範囲には、上記ＤＮＡ配列のいず
れか一つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するＤＮＡ配列によってコードされるすべての血管新生
たん白質が含まれると意図される。適当なハイブリダイ
ゼーション条件には、たとえば、５０％ホルムアミド、
５ｘＳＳＰＥ緩衝液、５ｘデンハルト溶液、０．５％Ｓ
ＤＳそして、１００μｇ／ｍｌの鮭精子ＤＮＡで４２℃
で一晩、その後、５５℃で２ｘＳＳＣ中で２ｘ３０分間
の洗浄、という条件が含まれる。本発明は、又、上記Ｄ
ＮＡ配列のいずれか一つと対応、又は、それとストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズする単離および／又
は精製ＤＮＡにも関する。

【００２９】ＶＥＧＦ−Ｂプロモーター配列は、図２５
（配列番号１、配列認識記号チ）に示す配列に対応する
ヌクレオチド配列からなる核酸分子、または、配列番号
１のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズする核酸分子からなる。このプロモーター
配列は、本発明によって単離されたヒトＶＥＧＦ−Ｂゲ
ノムＤＮＡのプロモーター解析によって明らかになった
配列である。ストリンジェントな条件とは、上記したよ
うな条件を指す。

【００３０】別の態様に於いて、本発明は、ＶＥＧＦ−
Ｂ増殖因子の抗体、特に、モノクローナル抗体に関す
る。

【００３１】ＶＥＧＦ−Ｂたん白質は、たん白質チロシ
ンキナーゼ増殖因子レセプターと相互作用するものであ
ると考えられている。このようなレセプターの詳細は当
該技術に於いて公知である。［たとえば、ウィルクス，
エイ，エフ（Ｗｉｌｋｓ，Ａ．Ｆ．），“Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ ＧｒｏｗｔｈＦ
ａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ
Ｌｉｇａｎｄｓｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｄｉ
ｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｃａｎｃｅ
ｒ，”Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６０：４３−
７３（１９９３）参照］。

【００３２】様々な成体マウス組織が、ＶＥＧＦ−Ｂに
対応する転写産物の発現について、ノザンブロッティン
グによってテストされた。ｍＲＮＡのサイズは、１．３
−１．４ｋｂであった。マウスの多組織ノザンブロット
（ＭＴＮ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、上述したｐＰＣ６７
酵母発現ベクター由来の≒０．９ｋｂ ＳａｌＩ／Ｎｏ
ｔＩフラグメントでプローブした。前記プローブは、ラ
ンダムプライミングを使用して、³²Ｐ−ｄＣＴＰによっ
て標識化した（比活性１０⁸−１０⁹ｃｐｍ／μｇＤＮ
Ａ）。前記ブロットを、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳ
ＰＥ緩衝液、２％ＳＤＳ、１０ｘデンハルト溶液、１０
０μｇ／ｍｌの鮭精子ＤＮＡ、そして１ｘ１０⁶ｃｐｍ
の前記標識化プローブ／ｍｌを使用して、４２℃で一晩
ハイブリダイゼーションした。前記ブロットを、０．０
５％ＳＤＳを含有する２ｘＳＳＣ中で、室温で２ｘ３０
分間、その後、０．１％ＳＤＳを含有する０．１ｘＳＳ
Ｃ中で、５２℃で２ｘ２０分間洗浄した。前記ブロット
を、その後、強化スクリーンを使用して３日間、−７０
℃で露出した。コダック社製ＸＡＲフィルムを使用し
た。前記フィルムの視覚検査よって測定した相対発現レ
ベルを以下の表にリストする。

【００３３】

【表１】

【００３４】Ｃｌｏｎｔｅｃｈからのヒトの多組織ノザ
ンブロット（ＭＮＴ）を、マウスの部分的ｃＤＮＡを用
いて、プローブして、様々なヒト組織に於ける相対ＶＥ
ＧＦ−Ｂ発現レベルを測定した。転写産物のサイズは、
１．３−１．４ｋｂであった。条件は、上述したマウス
のノザンブロットに使用したものと同じであった。ヒト
のノザンブロットの相対的ＶＥＧＦ−Ｂ転写産物レベル
を、次の表２にリストする。比較の目的のために、表２
は、文献からの様々な哺乳類システムに於けるＶＥＧＦ
の相対的発現レベルデータもリストしている。

【００３５】

【表２】

【００３６】表１と表２の比較から、ＶＥＧＦ−Ｂ転写
産物のマウスとヒトの組織発現レベルは、比較的類似し
ており、最高の発現レベルが、心臓と骨格筋とに見られ
ることが理解される。脳と腎臓組織においては、かなり
の相違が見られる。又、そこから最も一般的なヒトの腫
瘍のいくつかが発生する、前立腺、膵臓および腸等の、
筋細胞と上皮細胞との両方を大きな比率で含有する組織
は、比較的高いレベルでＶＥＧＦ−Ｂを発現することも
銘記されるべきである。

【００３７】ヒトの組織に於けるＶＥＧＦとＶＥＧＦ−
Ｂの相対的発現レベルの比較は、いくつかの顕著な相違
を示している。ＶＥＧＦは、ヒトの心臓組織によっては
やや弱く発現されるが、ＶＥＧＦ−Ｂは、同組織によっ
て非常に強く発現される。他方、ＶＥＧＦはヒトの肺組
織によって強く発現されるが、ＶＥＧＦ−Ｂはヒトの肺
組織によって弱く発現されるだけである。同様に、ヒト
の肝臓組織は、ＶＥＧＦを中レベルで発現するが、ＶＥ
ＧＦ−Ｂは非常に弱く発現されるだけである。これらの
データは、その全体的類似にも拘わらず、ＶＥＧＦとＶ
ＥＧＦ−Ｂの作用が、完全に同一ではないことを証明し
ている。

【００３８】ＶＥＧＦ−Ｂ転写産物の発現を、マウスと
ヒトの組織に於いて、ノザンブロッティングによって更
に分析し、ＶＥＧＦ転写産物の発現と比較した。マウス
とヒトの多組織ノザン（ＭＴＮ）ブロット（Ｃｌｏｎｔ
ｅｃｈ）を、³²Ｐ−標識化マウスＶＥＧＦ−Ｂプローブ
（クローンｐｃｉｆ２の≒０．９ｋｂ ＳａｌＩ／Ｎｏ
ｔＩインサート）でハイブリタイズさせた。ＶＥＧＦ発
現は³²Ｐ標識化ＶＥＧＦ₁₆₅ｃＤＮＡをプローブとして
用いて分析した。ハイブリダイゼーションを、５０％脱
イオン化ホルムアミド、５ｘＳＳＣ ｐＨ７．０，１％
ＳＤＳ，５ｘデンハルト溶液、および１００μｇ／ｍｌ
の変性鮭精子ＤＮＡ中で、４２℃で行った。フィルター
を、０．５％ＳＤＳを含む２ｘＳＳＣ中で、５２℃で２
ｘ３０分間洗浄し、補力スクリーンを使用して、−７０
℃で２−５日間、コダック社製ＸＡＲフィルムに露出し
た。ＣＢＡマウスからの成体マウス組織と、ＣＢＡとＮ
ＭＲＩマウスとの交配から得た胚のインサイチュハイブ
リダイゼーション分析を、過去に於いてコルホーネン
（Ｋｏｒｈｏｎｅｎ）他，Ｂｌｏｏｄ，８０，２５４８
−５５（１９９２）によって記載されているものと実質
的に同様に行った。ＲＮＡプローブ（３８３ｂｐアンチ
センスプローブと、１６９ｂｐセンスプローブ）を、ｐ
ｃｉｆ２ｃＤＮＡクローンから得た４４０ｂｐ Ｓａｌ
Ｉ／ＳａｃＩフラグメントを含む線状化プラスミドか
ら作成した。放射性標識化ＲＮＡを、Ｔ７およびＳＰ６
ＲＮＡポリメラーゼと、［³⁵Ｓ］ＵＴＰ（Ａｍｅｒｓ
ｈａｍＩｎｃ．）を使用して合成した。プローブのアル
カリ加水分解は省略した。ヘマトキシリンを対比染色に
使用した。センスストランドと、ＲＮＡｓｅＡ−処理済
みセクションによるコントロールハイブリダイゼーショ
ンでは、バックグランド以上のシグナルは検出されなか
った。

【００３９】マウス組織に於いては、１．４ｋｂ ＶＥ
ＧＦ−Ｂ転写産物の最も多量の発現が、心臓、脳、骨格
筋および腎臓において検出された。主要な３．７ｋｂの
ＶＥＧＦ転写産物が、心臓、脳、肺、骨格筋、および腎
臓において発現された。ヒトの組織に於いては、１．４
ｋｂ ＶＥＧＦ−Ｂ転写産物と、主要な３．７と４．５
ｋｂのＶＥＧＦ転写産物との最も多量の発現が、心臓、
骨格筋、膵臓、および前立腺において検出された。従っ
て、明白な量的相違が存在するものの、ＶＥＧＦ−Ｂと
ＶＥＧＦとは、多くのヒトとマウスの組織において同時
発現されるようである。

【００４０】ＶＥＧＦ−Ｂ転写産物の発現を、更に、成
体マウス心臓および骨格筋からのセクションと、初期
（Ｅ１０）マウス胚からのセクションに於けるインサイ
チュハイブリダイゼーションによって調べた。成体心臓
に於いて、ＶＥＧＦ−Ｂ転写産物は、心筋において顕著
に発現されるのに対して、動脈平滑筋においてはなんら
特異的なシグナルは検出されない。成体横紋筋では、Ｖ
ＥＧＦ−Ｂ転写産物は、いくつかの筋原繊維によって発
現されるが、それ以外で前記転写産物が欠如しているよ
うである。Ｅ１０マウス胚では、ＶＥＧＦ−Ｂ転写産物
は、主として成長中の心臓に於いて検出される。成体マ
ウス心臓の心筋は、顕著なシグナルを有する。横紋筋に
於いては、ＶＥＧＦ−Ｂ発現は、筋原繊維の部分集団に
おいて見られる。

【００４１】Ｅ１０マウス胚の成長中の心臓に於いて
も、強いシグナルが得られた。他の胚組織は、より低い
レベル、もしくは検出不能なレベルのＶＥＧＦ−Ｂ転写
産物を発現した。総括すると、これらのテストは、ＶＥ
ＧＦ−Ｂ転写産物が主として筋肉組織に於いて発現され
ることを示している。ＶＥＧＦ−Ｂは、特に、心臓と骨
格筋とに於いて豊富であり、これらの組織とその他の組
織とに於いてＶＥＧＦと同時発現する。トランスフェク
ション細胞に於いては、ＶＥＧＦ−Ｂは、細胞表面に結
合したジスルフィド結合ホモダイマーを形成し、ＶＥＧ
Ｆと同時発現される時には、ＶＥＧＦとヘテロダイマー
を形成する。ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆アイソフォーム特異的プ
ローブを使用したいくつかのマウスとヒトの組織に於け
るＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆転写産物の発現のノザンブロット分
析を図２１に示す。

【００４２】ＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子の染色体位置を、サザ
ンブロッティングと、体細胞雑種のポリメラーゼ連鎖反
応による分析と、中期染色体の蛍光インサイチュハイブ
リダイゼーション（ＦＩＳＨ）とによって評価した。前
記ＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子は、染色体１１ｑ１３上の、サイ
クリンＤ１遺伝子の近傍に見つかった。興味深いこと
に、サイクリンＤ１遺伝子は、多数のヒトの癌腫におい
て増幅されるが、ＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子は、増幅されたサ
イクリンＤ１を含有するいくつかの乳がん細胞ラインに
於いては増幅されなかった。しかしながら、ＶＥＧＦ−
Ｂ遺伝子に於ける突然変異は、血管の奇形および／又は
心血管疾病に関連しているかもしれない。

【００４３】特に銘記のない限り、下記の例では、オー
スベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）他，（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）に記載されている標準的
分子生物学技術および手順を使用した。

【００４４】

【実施例】以下の記載は、本発明の、ＶＥＧＦ−Ｂプロ
モーター配列を得るための一連の方法を記載するもので
あるが、その他の方法によって得られたＶＥＧＦ−Ｂプ
ロモーター配列も、本発明の枠内に含まれる。

【００４５】［例１：二つのリーディングフレームを有
する部分的ｃＤＮＡクローン］マウスＶＥＧＦ−Ｂをコ
ードする部分的ｃＤＮＡクローンを次のようにして同定
した。１４．５日齢のマウス胚から単離されたポリＡ＋
ｍＲＮＡから得られたｃＤＮＡライブラリー（Ｅ１４．
５）［シェヴレイ，ピー（Ｃｈｅｖｒａｙ Ｐ．)および
ネイサンズ，ディ（Ｎａｔｈａｎｓ Ｄ．），“Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ
ｉｎ ｙｅａｓｔ： Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｈａ
ｔ ｒｅａｃｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｌｅｕｃｉｎｅ
ｚｉｐｐｅｒ ｏｆＪｕｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５７８９−９３（１９
９２）］から、ジュリス，ジェイ（Ｇｙｕｒｉｓ
Ｊ．），ゴレミス，イー（Ｇｏｌｅｍｉｓ Ｅ．），チ
ェルトコフ，エイチ（Ｃｈｅｒｔｋｏｖ Ｈ．）および
ブレント，アール（Ｂｒｅｎｔ Ｒ．），“Ｃｄｉ１，
ａ Ｈｕｍａｎ Ｇｌａｎｄ Ｓ Ｐｈａｓｅ Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｔｈａｔ Ａｓｓ
ｏｃｉａｔｅｓ ｗｉｔｈ Ｃｄｋ２，”Ｃｅｌｌ，７
５：７９１−８０３（１９９３）に記載されている酵母
ツーハリブリッド相互作用トラップ・スクリーニング技
術を使用して、細胞質レチノイン酸−結合たん白質タイ
プ１（ＣＲＡＢＰ−Ｉ）と相互作用する可能性のある細
胞質たん白質をスクリーニングした。このスクリーニン
グ技術は、結合ドメインを有し、転写的に不活性である
ことが知られている融合たん白質（“ｂａｉｔ”）と、
基礎転写を示さず、かつ、前記ｂａｉｔによって結合さ
れるレポーター遺伝子と、キメラとして発現され、その
アミノ末端が、活性化ドメインと、他の有用な部分を有
するたん白質（“ｐｒｅｙ”）をコードする、発現ライ
ブラリー、とを含む。スクリーニングされたライブラリ
ーは、Ｄｒ．Ｐｉｅｒｒｅ Ｃｈｅｖｒａｙ ｏｆ ｔ
ｈｅ Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７２５
Ｎｏｒｔｈ Ｗｏｌｆｅ Ｓｔ．，Ｂａｌｔｉｍｏｒ
ｅ，ＭＤ ２１２０５から入手した酵母発現ベクターｐ
ＰＣ６７中の１４．５日齢マウス胚プラスミドライブラ
リーであった。

【００４６】一つの陽性のｃＤＮＡクローン（ｐｃｉｆ
−２）がスクリーニングから回収された。その陽性クロ
ーンを、周知の、従来技術を使用してシークエンシング
したところ、ＶＥＧＦと、ＰＤＧＦファミリーの増殖因
子の他のメンバーとに対して相同性の高いたん白質をコ
ードすることが分かった。前記プラスミドｐＰＣ６７中
の≒０．９ｋｂＳａｌＩ／ＮｏｔＩインサートを、ｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングし、Ｔ７，Ｔ３ベク
タープライマーを内部プライマーと共に使用して、完全
にシークエンシングした。プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ．，ＬａＪｏ
ｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから市販されている。前
記ｃＤＮＡインサートは、８８６塩基対長で、異なるリ
ーディングフレームにおいて、２つのポリペプチドをコ
ードし、それらはそれぞれＶＥＧＦのＮ−末端とＣ−末
端とに相向性があることがわかった。この新規な増殖因
子を、以後、ＶＥＧＦ−Ｂと称する。前記クローンは、
部分的であり、アミノ末端領域と、全シグナル配列とに
おいていくつかのアミノ酸が欠如している。

【００４７】図１は、このＶＥＧＦ−Ｂの部分的ｃＤＮ
Ａクローンのヌクレオチド配列（配列認識記号：ア）
と、その第１リーディングフレームにおいてコードされ
るアミノ酸配列（配列認識記号：イ）とを示している。
図１のＤＮＡ配列は、前記酵母発現ベクターｐＰＣ６７
中のクローン（ｐｃｉｆ−２）を従来式にシークエンシ
ングすることによって得た。そのクローンは、８８６の
塩基対を有し、マウスＶＥＧＦ−Ｂの一部をコードして
いた。

【００４８】前記単離ｃＤＮＡ配列は、ＶＥＧＦ−Ｂを
含有する、たとえばマウス又はヒトの、哺乳類ゲノムＤ
ＮＡ、とハイブリダイズするであろう。コード配列の他
に、ゲノムＤＮＡは、単数又は複数の特定の組織に於い
てＶＥＧＦ−Ｂの発現を引き起こし、誘導する単数又は
複数のプロモーター配列を有するであろう。従って、Ｖ
ＥＧＦ−Ｂのコード配列は、ある種の筋繊維に対して特
異的な筋肉−特異的プロモーターエレメントにつながっ
ているかもしれない。

【００４９】前記ヌクレオチド配列は、二つの異なるリ
ーディングフレームに於いて、二つの異なるアミノ酸配
列に翻訳される。コード配列内の塩基対３０９−３１１
において一つの停止コドン（ＴＧＡ）が存在する。従っ
て、ＶＥＧＦ−Ｂには、複数のスプライシング・バリア
ントがある。クローニングされたｃＤＮＡ配列の５‘末
端は、ＶＥＧＦ，ＰｌＧＦおよびＰＤＧＦ ＡおよびＢ
のＮ−末端ドメインに対してかなりの相同性を有する１
０２アミノ酸長のたん白質をコードする。特に、多数の
システイン残基が、このグループのたん白質中おいてに
完全に保存されている。前記ヌクレオチド配列（配列認
識記号：ア）の他に、図１は、更に、この第１たん白質
の推定アミノ酸配列（配列認識記号：イ）を示してい
る。

【００５０】異なったリーディングフレームで前記ｃＤ
ＮＡのＣ−末端（塩基対３１１−４７５）が翻訳される
と、ＶＥＧＦ₁₆₅，ＶＥＧＦ₁₈₉，ＶＥＧＦ₂₀₆のＣ−末
端部分に対して相同性の高いたん白質が生成される。図
２も、図１のヌクレオチド配列（配列認識記号：ア）を
示しているが、ここでは、第２リーディングフレームに
コードされ、５５アミノ酸長である第２のたん白質の推
定アミノ酸配列（配列認識記号：ウ）が示されている。
従って、ＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子は、一次転写産物の選択的
スプライシングを使用して、異なったたん白質をコード
するようである。前記第２ペプチドをコードする前記ク
ローンの最後の部分は、ＶＥＧＦ−Ｂの他のスプライシ
ング・バリアントに於いて機能的たん白質として発現さ
れるかもしれない。

【００５１】上述したたん白質は、約５ないし１０個の
アミノ酸からなる付加的なＮ−末端配列と、更に、約２
１ないし２８個のアミノ酸のリーダー配列と結合して存
在するかもしれない。従って、そのように結合されたア
ミノ酸配列は、内皮細胞の増殖を促進する特性を示し、
そのように結合されたペプチド配列をコードするＤＮＡ
配列は、図１および２のＤＮＡ配列と、ストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズし、そのようなアミノ酸配
列と、それらをコードするＤＮＡとが、本発明の範囲に
含まれると明らかに理解される。

【００５２】［例２： マウスＶＥＧＦ−Ｂの全長ｃＤ
ＮＡのクローニング］前述の例１で同定されたｃＤＮＡ
クローンの約０．９ｋｂのＳａｌＩ／ＮｏｔＩｃＤＮＡ
インサートをプローブとして使用して、Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ Ｉｎｃ．，ｏｆ Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉ
ｆｏｒｎｉａから入手した成体マウス心臓ラムダＺＡＰ
−ＩＩｃＤＮＡライブラリーを、標準式技術を使用して
スクリーニングした。前記ライブラリーを、指示に従っ
て、滴定し、プレーティングして、フィルターを作成し
た。５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＰＥ，５ｘデンハル
ト溶液、１％ＳＤＳおよび１００μｇの鮭精子ＤＮＡ／
ｍｌ中での４２℃でのプレハイブリダイゼーションの
後、前記フィルターを、同じ温度で、かつ、変性放射性
標識化プローブを含有する同じ溶液中で１０⁶ｃｐｍ／
ｍｌのハイブリダイゼーション溶液を使用して、ハイブ
リダイゼーションした。前記プローブは、ランダムプラ
イミングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して標識化
した。１６時間後、前記フィルターを、０．５％ＳＤＳ
含有の２ｘＳＳＣ中で、２ｘ３０分間、５２℃で洗浄し
た。前記フィルターを、−７０℃で一晩、補力スクリー
ンを使用して露出した。プレート上のすべてのプラーク
が陽性になるまで、陽性クローンを２回再スクリーニン
グした。いくつかの陽性クローンからのインサートを、
供給業者によって指示されているように、イン・ヴィヴ
ォエキサイションによって、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔ ＳＫ＋にサブクローニングした。

【００５３】いくつかのクローンを、制限酵素分析によ
ってマッピングしたところ、ＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩの制
限フラグメントの長さによって特徴付けられる二つの異
なるグループに分類されることが分かった。これらのグ
ループの第１のものは、それぞれが、２４０ｂｐ Ｓｐ
ｅＩ／ＢａｍＨＩ制限フラグメントを有する、前記制限
マッピングされたクローンの内の三つを有していた。も
う一つののグループは、３４０ｂｐ ＳｐｅＩ／Ｂａｍ
ＨＩフラグメントを有するクローンであった。このフラ
グメントの分析は、例５に記載する。

【００５４】２４０ｂｐ ＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩ制限フ
ラグメントを示した三つのクローンを、完全、又は部分
的にシークエンシング（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ２．０，
Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、そして、これら
のクローンの特徴を次のように要約する。

【００５５】ヌクレオチド配列分析は、前記ｃＤＮＡク
ローンの内の二つは、長さに於いて異なり、一方が突然
変異を有していたものの、実質的に同じであることを示
した。前記クローンの内の一方は、全長であり、最初の
２１個のアミノ酸が切断可能なシグナル配列である１８
８のアミノ酸残基をコードするオープンリーディングフ
レームを含有していた。これら実質的に同一の二つのク
ローンの内の他方は、開始コドンのＧの位置が末端とな
っていた。別のクローンの配列分析により、前記Ｇの前
の配列は、ＡＣＣＡＴであると推定できた。これらのク
ローンの両方は、図３に示す同じコード領域ヌクレオチ
ド配列（配列認識記号：エ）を有していることが分かっ
た。図面に於いて、前記単離クローンには存在していな
かった開始コドン（ＡＴＧ）の最初のチミンとアデニン
とは省略されている。これら二つのｃＤＮＡクローンの
両方のコード領域のオープンリーディングフレームの推
定アミノ酸配列が図４に示されている（配列認識記号：
オ）。この配列によってコードされたん白質を、以後Ｖ
ＥＧＦ−Ｂ₁₆₇と称する。ここに使用されるたん白質名
のそれぞれに於いて、その下付き数字は、シグナル配列
を除いた成熟たん白質に於けるアミノ酸の数を示す。

【００５６】予想されたように、これらの二つのクロー
ンによってコードされるアミノ酸配列と、例１のｃＤＮ
Ａクローンから推定された部分的アミノ酸配列との比較
は、顕著な類似性を示した。しかし、それぞれがＶＥＧ
Ｆの異なった部分に対する相同性を有するアミノ酸配列
をコードする、例１のクローンにおける二つのオープン
リーディングフレームは、両方共に、例２に依る上述の
二つのクローンのそれぞれにおける同じリーディングフ
レーム中に存在している。例１のクローンのフレームシ
フトは、二つの追加アデニン単位の挿入によって引き起
こされ、その結果、例１のクローンのＣ−末端部分はフ
レーム外にずれることになる。この理由は、現在ではわ
からないが、クローニングにおけるアーティファクトに
依るものであるかもしれない。

【００５７】前述の３つのクローンのうち第３のクロー
ンのコード領域は、２１ｂｐの挿入を有することを除い
て、前の二つのクローンのそれらと同一のヌクレオチド
配列を有していた。図５は、この第３クローンのヌクレ
オチド配列（配列認識記号：カ）を示している。確認を
容易にするために、前記２１の追加塩基は、図中に於い
て下線を引かれている。この挿入によって、成熟たん白
質中に於いて７つの追加のアミノ酸残基が生じる。従っ
て、このより長いｃＤＮＡによってコードされるたん白
質を、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₇₄と称する。図５のｃＤＮＡによ
ってコードされるたん白質のアミノ酸配列が、図６に示
されている（配列認識記号：キ）。この図に於いても、
確認を容易にするために、前記７つの追加アミノ酸には
下線が引かれている。これらの追加アミノ酸は、スプラ
イス部位に於いて前記配列中に挿入されており、マウス
ゲノムＤＮＡクローンのシークエンシングは、これら追
加アミノ酸が、実際に選択的スプライシングの結果であ
ることを示している。更に、ＰＤＧＦのレセプター結合
部位位置に関して今日知られていることに基づくと、前
記挿入は、恐らくレセプター結合部位の一部であるたん
白質中の位置において起こる。従って、前記挿入は、恐
らく、レセプター結合に影響を与え、アンタゴニストお
よび／又は異なるレセプター特異性に対する影響に於い
て、機能的重要性を持つものであるかもしれない。

【００５８】［例３： ハイブリッドｃＤＮＡクロー
ン］既に指摘したように、例１のこの元のｃＤＮＡクロ
ーンは、全長ではなく、アーティファクトを含んでいる
ものである可能性がある。しかし、もしもＶＥＧＦ−Ｂ
₁₆₇および／又はＶＥＧＦ−Ｂ₁₇₄をコードする前述のク
ローンの末端５‘ヌクレオチド配列を追加すると、例１
のこのオープンリーディングフレームは、１３３個のア
ミノ酸のたん白質をコードし、１１２アミノ酸長で、従
って、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₁₂と称される成熟たん白質を生成
することになる。ＶＥＧＦ−Ｂ₁₁₂をコードするこのハ
イブリッドｃＤＮＡ配列（配列認識記号：ク）が、図７
に示され、対応するたん白質のアミノ酸配列（配列認識
記号：ケ）が図８に示されている。

【００５９】図９は、マウス血管内皮増殖因子Ｂの１６
７アミノ酸バリアント（ｍＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇）と、マウ
ス血管内皮増殖因子（ｍＶＥＧＦ₁₆₄）と、ヒト胎盤増
殖因子（ｈＰｌＧＦ）と、マウス血小板由来増殖因子Ａ
（ｍＰＤＧＦ Ａ）と、マウス血小板由来増殖因子Ｂ
（ｍＰＤＧＦ Ｂ）とを比較する目的の、複数のアミノ
酸配列のアラインメントを示している。マウスＶＥＧＦ
−Ｂ₁₆₇と同一のアミノ酸残基は、箱内に示されてい
る。これら配列の相同関係は、明らかであり、図は、Ｐ
ＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーの増殖因子に属する増殖因
子の保存された構造を示し、ＶＥＧＦ−Ｂが、このグル
ープの他の増殖因子の構造的ホモローグであることをは
っきりと示している。これらアミノ酸配列の対比較は、
マウスＶＥＧＦ−Ｂが、マウスＶＥＧＦ₁₆₄に対して約
４３％同一であり、ヒトＰｌＧＦに対して約３０％同一
であり、更に、マウスＰＤＧＦ ＡおよびＢに対して約
２０％同一であることを示している。保存されたシステ
イン残基が特に注目に値する。前記５つの増殖因子のＮ
−末端ドメイン（すなわち、ＰＤＧＦ様ドメイン）に於
ける最初の８つのシステイン残基がこのファミリーのす
べてのメンバーによって共有されていることが理解さ
れ、従って、分子内および分子間ジスルフィド結合に関
係しているこれら８つのシステイン残基が、これらの増
殖因子間に於いて不変であることが明らかである。更
に、マウスＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇とＶＥＧＦ₁₆₄のＣ−末端ド
メインは、又、８つのさらなる保存システイン残基とい
くらかの領域にわたる塩基性アミノ酸に対して重要な類
似性をも示している。

【００６０】［例４： ヒトＶＥＧＦ−Ｂ ｃＤＮＡの
クローニング］λｇｔｌｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中のヒ
ト繊維肉腫ｃＤＮＡライブラリーＨＴ１０８０の１０⁶
λ−クローンを、標準式手順に従って、前記マウスＶＥ
ＧＦ−Ｂクローンｐｃｉｆ２の≒０．９ｋｂインサート
を用いてスクリーニングした。いくつかの陽性クローン
の中の、一つの、Ｈ．１と命名したものをより詳しく分
析し、そのヌクレオチド配列を決定した。そのヌクレオ
チド配列は、ヒトＶＥＧＦ−Ｂの２０７アミノ酸アイソ
フォームがコードされていることを示した。このアイソ
フォームの分析は、例６に於いて後述する。前記Ｈ．１
配列に基づき、マウスＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇アイソフォーム
に対応する推定ヒトｃＤＮＡの全コード領域を増幅する
二つのオリゴヌクレオチドをデザインした。 ５‘−ＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＣＣＴＣＴＧＣＴＣＣ−
３’（正方向）（配列認識記号：ツ） ５‘−ＧＣＣＡＴＧＴＧＴＣＡＣＣＴＴＣＧＣＡＧ−
３’（逆方向）（配列認識記号：テ）

【００６１】これらのオリゴヌクレオチドを利用して、
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、オリゴ−ｄ
Ｔプライムドヒト赤白血病細胞（ＨＥＬ）ＲＮＡからの
ヒトＶＥＧＦ−Ｂの全コード領域を増幅した。この増幅
産物を、ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ）のｐＣＲ−ＩＩ−ベクターにクローニングし、標準
式技術を使用してシークエンシングした。ヒトＶＥＧＦ
−ＢｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を図１０に示
し（配列認識記号：コ）、ヒトＶＥＧＦ−Ｂ_{16 7}の推定
アミノ酸配列を、図１１に示す（配列認識記号：サ）。

【００６２】例２の全長マウスｃＤＮＡクローンと、例
４の全長ヒトｃＤＮＡクローンとは、それぞれ、Ｎ−末
端疎水性推定シグナル配列を含有する１８８個のアミノ
酸のポリペプチドをコードする。ＶＥＧＦとの類推に依
り、シグナルペプチダーゼ切断部位は、Ａｌａ２１とＰ
ｒｏ２２との間に位置するものと考えられる。シグナル
ペプチダーゼの推定切断部位を、図１６に於いて矢印に
よって示す。従って、これら二つのクローンのプロセッ
シングされたＶＥＧＦ−Ｂポリペプチドは、それぞれ１
６７個のアミノ酸を有している。

【００６３】［例５］例２に於いて単離された３４０ｂ
ｐ ＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを示したクロー
ンを分析したところ、その大部分は、２４０ｂｐ Ｓｐ
ｅＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを示した例２の最初の二
つのクローンと同一であることが分かった。その相違
は、配列のＣ−末端部分に於いて挿入が存在することに
依るものである。

【００６４】この３４０ｂｐ ＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩ
ＤＮＡフラグメントは、２０７個のアミノ酸を含むマウ
スＶＥＧＦ−Ｂの別のアイソフォームをコードする。こ
のたん白質をコードするＤＮＡのコード領域（配列認識
記号：シ）が図１２に示され、それが翻訳れたアミノ酸
配列（配列認識記号：ス）は、図１３に示されている。
２１アミノ酸のリーダー配列の切断後、成熟たん白質
は、１８６個のアミノ酸を有し、これをｍＶＥＧＦ−Ｂ
₁₈₆と称する。このアイソフォームは、明らかに、図１
７を参照して後述するように、選択的ＤＮＡスプライシ
ングの結果、生じるものである。

【００６５】［例６]例４に記載したようにして単離さ
れた前記Ｈ．１クローンは、ヒトＶＥＧＦ−Ｂの２０７
アミノ酸のアイソフォームをコードすることが分かっ
た。このたん白質をコードするＤＮＡのコード領域（配
列認識記号：セ）が図１４に示され、それが翻訳された
アミノ酸配列（配列認識記号：ソ）が、図１５に示され
ている。ここでも、ｈＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆と命名する、こ
のアイソフォームは、選択的スプライシングの産生物で
あるようである。

【００６６】例５のｍＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆と、例６のｈＶ
ＥＧＦ−Ｂ₁₈₆との両方が、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇のコード配
列のヌクレオチド４１４と４１５との間に１０１の塩基
対の挿入部を有している。この挿入部の後、これらｃＤ
ＮＡクローンのヌクレオチド配列は、対応するＶＥＧＦ
−Ｂ₁₆₇の配列と同一であった。その１０１塩基対挿入
部の位置は、ＶＥＧＦ中のエキソン５−エキソン６接続
部に対応している。この挿入によって、フレームシフト
が生じ、これによって、二つのＶＥＧＦ−Ｂアイソフォ
ームのＣ−末端ドメインは、互いに全く異なったものに
なっている。

【００６７】二つの主要なＶＥＧＦ−Ｂアイソフォー
ム、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇とＶＥＧＦ−Ｂ_{1 86}とに対応する、
配列認識記号：サとソとに於けるアミノ酸１１６から始
まるＣ−末端アミノ酸配列の相違は、これら二つのアイ
ソフォームの互いに異なる生化学的特徴によって反映さ
れている。ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇のＣ−末端ドメインは、強
塩基性（正味のチャージ＋１３）であり、ヘパリンに結
合する。ＶＥＧＦ−Ｂ_{18 6}のＣ−末端ドメインは、弱塩
基性（正味のチャージ＋５）であり、そのＣ−末端に疎
水性アミノ酸残基が長い領域にわたって存在している。
ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆の疎水性末端が、膜貫通ドメインとし
て振る舞う可能性は低い、というのは、このＶＥＧＦ−
Ｂのバリアントは、細胞から分泌されるからである。従
って、Ｎ−末端ドメインが同一であるにもかかわらず、
これらの二つの主要なＶＥＧＦ−Ｂのアイソフォーム
は、互いに非常に異なる生化学的特徴を有している。Ｖ
ＥＧＦ−Ｂ₁₈₆には高塩基性ヘパリン−結合ドメインが
ないことにより、前記たん白質は、細胞から自由に分泌
されることが可能となる。しかしながら、ＶＥＧＦ−Ｂ
₁₈₆の分泌は、非常に低速であり、トランスフェクショ
ン細胞を使用したパルス・チェイス実験では、ＶＥＧＦ
−Ｂ₁₈₆ホモダイマーは、１時間以内では培地中に見つ
からなかった。これに対して、ＶＥＧＦホモダイマーと
ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆・ＶＥＧＦダイマーとは、３０分以内
に培地中に出現した。

【００６８】図１６は、マウスおよびヒトＶＥＧＦ−Ｂ
₁₆₇およびＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆のアミノ酸配列（配列認識記
号：オ，サ，スおよびソ）のアラインメントを１文字コ
ードで示している。同一の残基は、箱内に示され、これ
に対して、マウスおよびヒトＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇およびＶ
ＥＧＦ−Ｂ₁₈₆アイソフォーム間で異なるアミノ酸残基
は、箱の外側に示されている。マウスおよびヒトＶＥＧ
Ｆ−Ｂは、約８８％のアミノ酸配列同一性を示し、特に
そのＣ−末端領域に於いて、高塩基性である。マウスと
ヒトのＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆のＣ−末端ドメインは、アミノ
酸レベルに於いて約８５％同一である。マウスとヒトの
ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇のＣ−末端ドメインはアミノ酸レベル
において約８４％同一である。両方のポリペプチドは、
Ｎ−結合グリコシレート化のコンセンサス配列（Ｎ−Ｘ
−Ｔ／Ｓ）を欠如している。矢印は、Ａｌａ²¹とＰｒｏ
²²との間のシグナルペプチダーゼのための推定切断サイ
トを示している。シグナル配列を除くと、マウスとヒト
のＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇アミノ酸配列は、高度に相同であ
り、１６７の残基において２０の置換があるにすぎな
い。これらの置換部は、Ｎ−末端、アミノ酸６０と１４
５との周囲の二つの領域、に集中している。両方のＶＥ
ＧＦ−Ｂ₁₆₇たん白質のすべてのシステイン残基は不変
であるが、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇のＣ−末端の８つのシステ
イン残基は、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆アイソフォームに於いて
は保存されていない。マウスおよびヒト配列は、残基６
６と１２９との間の領域に於いて、一つの進化的に保存
された置換（Ｑ１０５Ｒ）を除いて同一であることが注
目される。これは、レセプター結合部位がたん白質のこ
の部分に見られるため（ＰＤＧＦ構造と比較して）、重
要である。このことから、マウスとヒトのＶＥＧＦ−Ｂ
が、レセプターレベルで交差反応結合を示し、従って、
同一又は類似の生物学的活性を示す可能性がある、と結
論される。

【００６９】［例７： マウスとヒトのＶＥＧＦ−Ｂ遺
伝子のエキソンイントロン構造］ヒトＶＥＧＦ−Ｂ遺伝
子の構造を、ヒトゲノムＤＮＡをテンプレートとして使
用したＰＣＲ反応から得た、クローン化ＰＣＲフラグメ
ントの制限マッピングとヌクレオチド配列分析とによっ
て調べた。この際、ゲノムλクローンから同定された、
第１エキソンとイントロンについては除いた。マウス遺
伝子の構造を、異なる組み合わせのプライマーを使用し
て増幅されたクローン化ＰＣＲフラグメントの制限マッ
ピングとヌクレオチド配列分析とによって調べた。これ
らのＰＣＲ増幅に於けるテンプレートとして、全長マウ
スＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子を含有する単離ゲノムλクローン
を使用した。

【００７０】手順 前記マウスＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子のいくつかのλクローン
を、供給業者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ．）によ
る指示に従って、１２９／Ｓｗ λＦＩＸゲノムライブ
ラリーから単離した。ＶＥＧＦ−Ｂの、前述のｐｃｉｆ
２ｃＤＮＡの≒０．９ｋｂ ＳａｌＩ／ＮｏｔＩインサ
ート（配列認識記号：ア）を、プローブとして使用し
た。いくつかの陽性クローンからのλＤＮＡを、プレー
ト溶解物から単離した。前記陽性λ−クローンの一つ
（クローン１０）を、ＢａｍＨＩフラグメントとしてｐ
Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
Ｉｎｃ．）にサブクローニングした。この同じクローン
からの単離ＤＮＡも、ＰＣＲ反応のテンプレートとして
使用し（１００ｎｇのλＤＮＡ／反応）、マウスＶＥＧ
Ｆ−Ｂ遺伝子のコード領域を、異なった組み合わせのプ
ライマーを使用して増幅した。これらのプライマーのヌ
クレオチド配列は、マウスＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇とマウスＶ
ＥＧＦ−Ｂ₁₈₆とをコードするｃＤＮＡクローンから得
た。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／反応）を
使用した。生成されたＰＣＲフラグメントを、ＴＡ−ク
ローニングベクターｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
Ｉｎｃ．）に直接にクローニングした。マウスＶＥＧ
Ｆ−Ｂ遺伝子のエキソンイントロン構造を、サブクロー
ニングされたＢａｍＨＩゲノムフラグメントと、クロー
ニングされたＰＣＲ生成物とのヌクレオチド配列分析に
よって確定した。

【００７１】ヒトゲノムλ−クローンを、 ＥＭＢＬ−
３ ＳＰ６／Ｔ７（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中のヒトのゲノ
ムライブラリーの１ｘ１０⁶クローンをスクリーニング
することによって単離した。その際、プローブとしてヒ
トＶＥＧＦ−ＢｃＤＮＡの５‘配列にわたる９０ｂｐの
ＰＣＲ−フラグメントを使用し、高度にストリンジェン
トな条件を用いた。洗浄条件は、１ｘＳＳＣ、室温で３
０分間での１回の洗浄と、１ｘＳＳＣ、６５℃で３０分
間の２回の洗浄、であった。前記ＰＣＲのプライマー
は、５‘−ＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＣＣＴＣＴＧＣＴＣＣ
−３’（正方向）（配列認識記号：ツ）と、５‘−ＧＧ
ＧＣＡＴＣＡＧＧＣＴＧＧＧＡＧＡＣＡＧ−３’（逆方
向）（配列認識記号：ト）とであった。

【００７２】陽性λ−クローンを、Ｓａｃ Ｉフラグメ
ントとしてｐＧＥＭ ３Ｚベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）
にサブクローニングしたところ、遺伝子の５‘−領域を
坦持していることが分かった。ヒトＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子
の残りの部分を、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使
用したＰＣＲによって増幅した。ヒトｃＤＮＡ配列から
得た異なった組み合わせのプライマーを使用した。Ｄｙ
ｎａｚｙｍｅ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／反応、
Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を使用した。増幅されたＰＣＲフ
ラグメントを、ＴＡ−クローニングベクターｐＣＲ Ｉ
Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）に直接にクロー
ニングした。マウスとヒトのＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子の短い
イントロンのエキソン−イントロン境界と、長さとを、
ベクター特異的プライマー又は、ｃＤＮＡ配列から得た
適当なプライマーを使用したヌクレオチド配列分析によ
って判定した。長いイントロンの長さは、アガロース・
ゲル電気泳動によって分析した時の増幅ＰＣＲフラグメ
ントの長さに基づいて計算した。

【００７３】結果 その結果は、マウスとヒトのＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子のコー
ド化部分は、ＤＮＡの約４ｋｂに渡っており、両方の遺
伝子が長さが１９ｂｐ（Ｅ７）から２３６ｂｐ（Ｅ６）
の範囲である７つのコードエキソンに分割されることを
示した。図１７は、マウスとヒトのＶＥＧＦ−Ｂの遺伝
子の構造の略図である。塩基対としてのエキソンのサイ
ズは、箱内に示され、イントロンのサイズは、箱の間に
示されている。イントロンは、一定縮尺では示されてい
ない。マウスとヒトのＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子の非翻訳化隣
接領域の構造は、確定されず、グレーのボックスで示さ
れている。両方の遺伝子のエキソン−イントロン接続部
を、次の表３に示す。

【００７４】

【表３】

【００７５】前述したように、エキソン６は、遺伝子が
異なる２つのＶＥＧＦ−Ｂアイソフォームの転写産物を
生成することを可能にする選択的スプライス受容部位を
有している。ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇は、エキソン１−５、エ
キソン６の最後の部分、そしてエキソン７（ＴＧＡ）を
用いてなる。ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆は、エキソン１ないし
５、エキソン６の最初の部分を用いてなり、エキソン６
の最後の部分中（ＴＡＧ）において終止している。エキ
ソン６の最初の部分の挿入が、フレームシフトを導入
し、エキソン６の最後の部分に於いて終止コドンを生成
するため、エキソン７は、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆に於いて翻
訳されない。ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆の終止コドン（ＴＡＧ）
の位置は、エキソン６Ｂにおいて示され、 ＶＥＧＦ−
Ｂ₁₆₇の終止コドン（ＴＧＡ）の位置は、エキソン７に
おいて示されている。

【００７６】両方の遺伝子に於けるイントロンは、１６
１ｂｐから約２．６ｋｂの範囲である。各エキソンの長
さと、二つの遺伝子に於けるスプライス接続部の位置と
は、同一であった。そして、すべてのスプライス供与、
及び受容部位は、規範的なＧＴ／ＡＧ則に従っている、
パジェット（Ｐａｄｇｅｔｔ）他，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅ
ｖ． ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５５：１１１
９−５０（１９８６）。マウスとヒトの遺伝子の間の唯
一の特筆すべき相違は、イントロン１，４および６の長
さであり、それらはマウスの遺伝子に於いてのほうが長
いということである。すべてのエキソンイントロン境界
が、ＶＥＧＦ−ＢとＶＥＧＦとの間で保存されているこ
とが分かったが、ＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子に於けるイントロ
ンは、一般的に、ＶＥＧＦ遺伝子に於けるよりも小さか
った。

【００７７】ＶＥＧＦ−Ｂのエキソン５の後の３００ｂ
ｐ−イントロンは、ＶＥＧＦにおける対応のものとは異
なっている。ＶＥＧＦにおけるものは、長さが３ｋｂで
あり、ＶＥＧＦ₁₈₉とＶＥＧＦ₂₀₆との転写産物に見られ
る選択的スプライシングされたエキソンを有し、それは
多数の塩基性アミノ酸残基をコードする。このＶＥＧＦ
−Ｂにおけるイントロンをより詳しく調べたが、ＶＥＧ
Ｆの第６番目のエキソンに対応するエキソンは見つから
なかった。その代わり、このイントロンの３‘末端とそ
れに続くエキソンとは、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆をコードする
ｃＤＮＡクローンの対応する配列と同一であることが分
かった。これは、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆のｍＲＮＡが、ｍＲ
ＮＡスプライシング中における、選択的スプライス受容
部位の使用によって形成され、その結果、これらのｍＲ
ＮＡ中に１０１ｂｐイントロン配列の挿入が起こるとい
う事実によって説明可能である。

【００７８】図１８は、マウスＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇とＶＥ
ＧＦ−Ｂ₁₈₆の比較親水性分析を示している。これらの
プロファイルは、９つの残基の枠を使用するキール（Ｋ
ｙｌｅ）およびドゥーリトル（Ｄｏｌｉｔｔｌｅ）に従
って作成された。予想されるように、親水性／疎水性の
パターンは、アミノ酸１からアミノ酸１１５まで本質的
に同一である。アミノ酸１１５の後に於いて、親水性／
疎水性パターンは、エキソン６の最初の部分によって引
き起こされるフレームシフトに依り、変化する。従っ
て、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇とＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆とは、類似と非
類似の両方の活性を示すものと予期される。

【００７９】図１９は、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦファミリー
の増殖因子の５つのメンバーのアミノ酸配列の系統発生
的関係を示す系統樹である。置換又は代替の数は、図の
左側から右側にかけて減少している。ＶＥＧＦ−Ｂは、
ＶＥＧＦと血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）グループの
間に位置していることが分かる。

【００８０】図９および１６の複数のアミノ酸配列アラ
インメントと、図１９の系統発生分析は、ＰＡＭ２５０
ディスタンステーブルを使用して、ヘリン（Ｈｅｉ
ｎ），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，
Ｖｏｌ．１８３，ｐｐ．６２６−４５，Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９
９０）に従って行った。

【００８１】［例８： 抗体の産生］ ａ．マウスＶＥＧＦ−Ｂに対する抗血清 マウスＶＥＧＦ−Ｂに対する抗血清を、ラビットを、プ
ロセッシングされたＶＥＧＦ−ＢのＮ−末端領域を有
し、キーホールリンペットヘモシニアンと結合させた１
８−ｍｅｒ オリゴペプチドで免疫化することによって
産生させた。前記ペプチドがキャリアたん白質に結合で
きるようにするため、 ＳＰＤＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）を用いて、システイン残基をＮ−末端およびＣ−末
端アミノ酸残基として導入した。前記オリゴペプチドの
配列は、Ｃ−Ｐ−Ｖ−Ｓ−Ｑ−Ｆ−Ｄ−Ｇ−Ｐ−Ｓ−Ｈ
−Ｑ−Ｋ−Ｋ−Ｖ−Ｖ−Ｐ−Ｃ（配列認識記号：ナ）で
あった。各ラビットには、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕ
ｎｄｓ Ａｄｊｖａｎｔ中で懸濁させたペプチド結合体
の３００μｇの皮下注射を行った。Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔ
ｅ Ｆｒｅｕｎｄｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ中で懸濁させた
同量の抗原を用いて、皮下追加抗原刺激（ｂｏｏｓｔｅ
ｒ）注射を与えた。第２回目の追加抗原刺激注射後に血
清が得られた。

【００８２】ｂ．ヒトＶＥＧＦ−Ｂに対する抗血清 ヒトＶＥＧＦ−Ｂに対する抗ペプチド抗血清を、ラビッ
トを、下記のＮ−末端領域アミノ酸残基配列（配列認識
記号：ニ）を有する派生（ｂｒａｎｃｈｅｄ）２３−ｍ
ｅｒオリゴペプチドで免疫化することによって産生させ
た。 Ｓ−Ｑ−Ｐ−Ｄ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｈ−Ｑ−Ｒ−Ｋ−Ｖ−Ｖ
−Ｓ−Ｗ−Ｉ−Ｄ−Ｖ−Ｙ−Ｔ−Ｒ−Ａ−Ｔ。

【００８３】前記派生２３−ｍｅｒオリゴペプチドは、
タム（Ｔａｍ），“Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄ
ｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ： ｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｓａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｈｉｇ
ｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｎｔｉｇｅ
ｎｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｓｔｅｍ”，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８５，
ｐａｇｅｓ ５４０９−４１３（１９８８）に従って合
成した。第１回目の免疫化に於いて、ラビットに、Ｃｏ
ｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ中で
懸濁された５００μｇの前記派生ペプチドを皮下注射し
た。引き続いての追加抗原刺激に於いては、Ｉｎｃｏｍ
ｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ中で懸
濁された２００μｇの前記抗原を注射した。第２回目と
第３回目の追加抗原刺激の後、従来技術によって抗血清
を採集した。

【００８４】［例９： ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇の生化学的特
徴、ホモダイマー化およびＶＥＧＦとのヘテロダイマー
化］ヒトＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇の生化学的特徴を、トランス
フェクションされたヒト胚腎臓２９３ＥＢＮＡ細胞（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）中において調べた。ヒ
トＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇とヒトＶＥＧＦ₁₆₅とをコードするｃ
ＤＮＡインサート［ケック（Ｋｅｃｋ）他，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，Ｖｏｌ．２４６，ｐａｇｅｓ１３０９−３１２
（１９８９）参照］を、個々に、ｐＲＥＰ７発現ベクタ
ー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）にクローニング
した。ヒト胚腎臓２９３ＥＢＮＡ細胞（エプスタイン・
バーウィルス核抗原−１を発現する）を、燐酸カルシウ
ム沈殿法を使用して、それぞれの発現プラスミドによる
トランジェントなトランスフェクションによってトラン
スフェクションし、これらの細胞を、４８時間インキュ
ベートした。コントロールとして、細胞を、ＶＥＧＦ−
Ｂ₁₆₇ｃＤＮＡを反対方向で含有する発現ベクターによ
ってもトランスフェクションした。細胞の単層を、メチ
オニン非含有およびシステイン非含有培地中で、３０分
間インキュベートし、その後、同じ培地中で、２時間、
１００μＣｉ／ｍｌ［³⁵Ｓ］メチオニンおよび［³⁵Ｓ］
システイン（Ｐｒｏｍｉｘ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎ
ｃ．）で標識化した。標識化培地を、血清を含まない通
常の培地と置き換え、標識化されたたん白質を、６時間
チェイスした。指示されている場合、チェイス中にはヘ
パリンが含まれていた（１００μｇ／ｍｌ）。前記チェ
イス時間後に、培地を採集し、細胞を１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ ｐＨ７．５，５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．５％デオキ
シコール酸ナトリウム，０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−
４０，０．１％ ＳＤＳおよび０．１Ｕ／ｍｌ ａｐｒ
ｏｔｉｎｉｎ中で溶解した。

【００８５】ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇は、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇ＤＮ
Ａを含有するプラスミドでトランスフェクションされた
細胞中で発現された。ヘパリンで処理された、あるい
は、処理されていない細胞からの培地上清のアリコット
と、洗浄剤可溶化細胞溶解物を、例８に記載したように
して得たＶＥＧＦ−Ｂに対する特異的抗ペプチド抗血清
で免疫沈降させ、特に指示されている場合を除き、還元
条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。そのデー
タは、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇ホモダイマーとＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇
−ＶＥＧＦ₁₆₅ヘテロダイマーとがヘパリンによって細
胞から放出されることを示している。ヘパリン処理（１
−１００μｇ／ｍｌ）又は１．２Ｍ ＮａＣｌによっ
て、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇が細胞から放出され、上清中に見
つかった。細胞がヘパリンによって処理されなかった場
合には、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇は、細胞結合状態にとどま
り、培養培地中には放出されなかった。同じ条件下で、
ＶＥＧＦ ₁₆₅ホモダイマーは、細胞から分泌され、ヘパ
リン処理無しで培養上清中に見つかる。

【００８６】還元条件下に於いて、ヒトＶＥＧＦ−Ｂ
₁₆₇は、２１ｋＤａの分子量（Ｍｒ）として移動する。
非還元条件下での培養上清の分析は、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇
が、分子量４２ｋＤａ種として移動し、ダイマー構造を
示すことを示した。これらの結果は、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇
が、恐らくは細胞外ヘパラン硫酸プロテオグリカンとの
イオン性相互作用によって、細胞表面に結合したジスル
フィド結合ダイマーを形成することを示唆している。細
胞表面への結合は、ＶＥＧＦのより長いスプライスバリ
アントに於いて観察されるように、Ｃ−末端塩基性ドメ
インによって仲介される可能性がある。

【００８７】ＶＥＧＦがＰｌＧＦとヘテロダイマーを形
成することが示されたので、ＶＥＧＦ₁₆₅も、ＶＥＧＦ
−Ｂ₁₆₇とヘテロダイマーを形成できるか否かをテスト
することにした。この目的のために、２９３ＥＢＮＡ細
胞を、ヒトＶＥＧＦ₁₆₅とヒトＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇との両方
をコードする発現ベクターで、コトランスフェクション
したところ、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇は、ＶＥＧＦ₁₆₅と組み合
わされて発現された。代謝標識化したたん白質を、ヘパ
リンの存在下でチェイスし、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇又はＶＥ
ＧＦ₁₆₅のいずれかに対する抗血清で免疫沈降法を行っ
た。ヒトＶＥＧＦに対する抗血清は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔ
ｅｍｓからのものであった。非還元条件下に於いて、Ｖ
ＥＧＦ−Ｂ₁₆₇・ＶＥＧＦ₁₆₅ヘテロダイマーは、分子量
４２−４６ｋＤａ種として移動した。その結果は、ＶＥ
ＧＦ−Ｂは、ＶＥＧＦとジスルフィド結合ヘテロダイマ
ーを形成することが出来、これは、ヘパリンの不在下で
は細胞結合状態にとどまる、ということを示している。
ＶＥＧＦ₁₆₅のホモダイマーは、培地中に効率的に分泌
されるので、ＶＥＧＦ−Ｂが、前記ヘテロダイマーの分
泌を決定するようである。

【００８８】ＶＥＧＦ−Ｂは、正常には、続いておこる
輸送の為にソース細胞の小胞体中に於いて合成される。
組換えＶＥＧＦ−Ｂは、ＶＥＧＦ−Ｂたん白質をコード
するＤＮＡ配列を、適当な操作可能にリンクされたプロ
モーターと、コントロール配列とともに、周知のプラス
ミドｐＢＲ３２２やその誘導体のような適当なベクター
に挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉやＣｏｓ細胞等の適当な宿主細
胞を、その結果得られる当該技術に於いて周知のベクタ
ー又は他のシステムによってトランスフォーメーション
又はトランスフェクションし、その結果得られるトラン
スフォーマント又はトランスフェクタントをＶＥＧＦ−
Ｂ発現についてスクリーニングし、次に、ＶＥＧＦ−Ｂ
の発現に関して陽性の細胞ライン又はバクテリア細胞ス
トックを培養することによって生産することができる。
トランスフェクション又はトランスフォーメーションさ
れるべき細胞のタイプに応じて、真核ベクター又は原核
ベクターのいずれかが使用される。組換えＶＥＧＦ−Ｂ
の生産のための特に好適なシステムは、組換えたん白質
の産出量が極めて優れていることが証明されているバキ
ュロウィルス−昆虫細胞システムである。

【００８９】［例１０： バキュロウィルスシステムを
使用したＶＥＧＦ−Ｂ発現］ １０．１ それ自身のシグナルペプチドを有するＶＥＧ
Ｆ−Ｂ ａ）クローニングとトランスフェクション 完全ヒトＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇遺伝子を、市販されているプ
ラスミドｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒ
ｐ．）に挿入した。その結果得られるプラスミドｐＣＲ
ＩＩ−ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇からのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｘｂａ
Ｉフラグメントと３‘−５’−接続部の両方をシークエ
ンシングした。前記フラグメントはＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇の
全オープンリーディングフレームをコードしており、次
にｐＦＡＳＴＢＡＣｌにクローニングされた。Ｂａｃｍ
ｉｄ−ＤＮＡを、“Ｂａｃ−Ｔｏ−Ｂａｃ（商標名）Ｂ
ａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓ
ｔｅｍ”（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．）のための製造業者の指示に従って作成し、Ｓｆ９
００ＩＩ−ａｄａｐｔｅｄ Ｓｆ９細胞（Ｄｒ．Ｃｈｒ
ｉｓｔｉａｎ Ｏｋｅｒ−Ｂｌｏｍから得た）にリポフ
ェクションした。Ｓｆ９細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅ
ｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ，Ｒ
ｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７１
１）からのものである。トランスフェクションされた細
胞を、次に、２５ｃｍ²の培養皿中で標準ＴＭＮ−ＦＨ
培地上で培養した。

【００９０】ｂ）たん白質発現のアッセイ トランスフェクションの約７２時間後に、前記細胞を溶
解し、１ｍｌの培養上清と細胞溶解物とを、例９に記載
した免疫沈降法とウェスタンブロッティングとで、発現
されたＶＥＧＦ−Ｂについてアッセイした。４つの個別
にトランスフェクションされた細胞培養物の内の三つか
らの溶解物が、ウェスタンブロッティングでのシグナル
の強度が異なるものの、ＶＥＧＦ−Ｂについて陽性であ
ることが分かった。各ケースの発現されたＶＥＧＦ−Ｂ
ポリペプチドは、例９の哺乳類細胞に於いて発現された
たん白質にサイズに於いて、対応していることが分かっ
た。ウェスタンブロッティングに於いて最も強いシグナ
ルを提示した細胞からのウィルスストックを、細胞を感
染させて培地から新たなウィルスを収集することによっ
て２ラウンド増幅した。その結果得られた上清を分析し
た。非感染細胞も、ネガティブコントロールとして分析
した。経時分析は、感染後４８時間と７２時間の間に収
集された細胞が、最も多量のＶＥＧＦ−Ｂを含有してい
ることを示した。感染の９６時間後、ウィルスによって
誘発された細胞溶解の結果として、ＶＥＧＦ−Ｂは、免
疫沈降法とウェスタンブロッティングとによって培養上
清中でも検出することができた。組換えＶＥＧＦ−Ｂ
は、２０％と４０％の間の（ＮＨ ₄）₂ＳＯ₄によって溶
解物から沈殿させることができた。

【００９１】１０．２ メリチンシグナルペプチドを有
するＶＥＧＦ−Ｂ（ｐＶＴＢａｃ） ａ）クローニングおよびトランスフェクション ヌクレオチド位置６８−１４１からのポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）フラグメントを使用して、例１０．１の
プラスミドｐＣＲＩＩ−ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇中のシグナル
切断部位の直後にＢａｍＨＩ制限部位を導入した。この
修飾ｐＣＲＩＩ−ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇コンストラクトから
のＢａｍＨＩフラグメントを、ＢａｍＨＩ開裂ｐＶＴＢ
ａｃにクローニングした［テッシール（Ｔｅｓｓｉｅ
ｒ）他，“Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｆ
ｒｏｍ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓｏｆ ａ ｆｏｒｅ
ｉｇｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｓｅｄ ｔｏ ｔｈｅ
ｈｏｎｅｙｂｅｅ ｍｅｌｌｉｔｉｎ ｓｉｇｎａｌ
ｐｅｐｔｉｄｅ"，Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．９８，ｐａｇｅ
１７７（１９９１）］。３‘−と５’−接続部の両方
を、シークエンシングした。Ｓｆ９細胞を、ヒトＶＧＥ
Ｆ−Ｂ₁₆₇遺伝子を含む前述したｐＶＴＢａｃベクター
と、線状化したバキュロウィルスＤＮＡ（Ｉｎｓｅｃｔ
ｉｎ（商標名），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）
とでコトランスフェクションした。これらトランスフェ
クション細胞を、次に、ＴＭＮ−ＦＨ培地中で培養し
た。

【００９２】ｂ）たん白質発現のアッセイ トランスフェクションの４８時間後、上清を採集し、こ
れを、免疫沈降法によって一次スクリーニングした。４
つの陽性のプラークが単離された。

【００９３】１０．３マウスＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆をコード
するｃＤＮＡインサート（マウスＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆ｃＤ
ＮＡ（配列認識記号：シ）クローン由来のＥｃｏＲＩ切
断ｃＤＮＡフラグメント）を、ｐＦＡＳＴＢＡＣ１にク
ローニングした。マウスＶＥＧＦ−Ｂ ₁₆₇（配列認識記
号：エ）由来のＥｃｏＲＩ切断ｃＤＮＡフラグメントも
ｐＦＡＳＴＢＡＣ１にクローニングした。その結果得ら
れたプラスミドを、前述の１０．１に記載されたように
してバクテリアにトランスフォーメーションし、組換え
プラスミドを単離し、Ｓｆ９およびＳｆ２１細胞にリポ
フェクションした。組換えバキュロウィルスを含む上清
を、Ｓｆ２１細胞に複数ラウンド再感染させることによ
って増幅した。前記バキュロウィルスストックの最終タ
イターを、プラーク滴定によって測定したところ、１ミ
リリットルのストック上清に対して、４ｘ１０⁸ないし
２ｘ１０⁹の範囲のバキュロウイルス粒子が見出され
た。

【００９４】［例１１： 組換えＶＥＧＦ−Ｂの大量生
産］Ｓｆ２１細胞［ヴォーン（Ｖａｕｇｈｎ）他，Ｉｎ
Ｖｉｔｒｏ，１３：２１３−１７（１９７７）参照］
に、１細胞当たり１０のウィルス粒子の複数の感染によ
って、例１０のバキュロウィルスストックを感染させ
た。これらの感染Ｓｆ２１細胞を、無血清培地（Ｓｆ９
００ＩＩ，Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）１ｍｌ当たり２ｘ１０
⁶の細胞の密度で接種し、９６時間ローラーフラスコ内
で増殖させた。次に、培養培地と細胞とを回収した。細
胞溶解物と培地とのアリコットを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに
よって分析した。全たん白質パターンを、ゲルをＣｏｏ
ｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅで染色す
ることによって可視化し、発現されたＶＥＧＦ−Ｂアイ
ソフォームの存在を、例８に記載したように、ヒトおよ
びマウスＶＥＧＦ−Ｂに対する特異的抗ペプチド抗体を
使用したイムノブロッティングによって可視化した。分
析に依れば、ヒトとマウスとの両方のＶＥＧＦ−Ｂ ₁₆₇
ポリペプチドは２１．５ｋＤａの予想されたサイズであ
った。両方のたん白質は前記感染細胞中で細胞内に保持
され、培地中には放出されていなかった。これに対し
て、マウスＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆は、ダイマー形態として培
地中に容易に分泌された。ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆ホモダイマ
ーは、５２−５４ｋＤａ種として移動し、これは、昆虫
細胞産生たん白質が、トランスフェクションＣｏｓ−１
細胞から分泌されたＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆にみられるものと
同じ共有結合修飾を受けなかったことを示唆した。

【００９５】［例１２： ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆を発現する
Ｃｏｓ−１細胞のトランスフェクションと分析］マウス
ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆とヒトＶＥＧＦ₁₆₅をコードするｃＤＮ
Ａインサートを、ｐＳＧ５発現ベクター［グリーン（Ｇ
ｒｅｅｎ）他，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，
１６：３６９（１９８８）］にクローニングした。Ｃｏ
ｓ−１細胞を、１０％胎児ウシ血清、２ｍＭグルタミ
ン、および適当な抗生物質を含む最小必須培地（ＭＥ
Ｍ）中に維持した。トランスフェクションのために、前
記細胞を、９０ｍｍペトリ皿に再びプレーティングし
た。燐酸カルシウム沈殿法を使用して、別々又は組み合
わせて、前記発現ベクターでこれらの細胞をトランスフ
ェクションさせ、３６−４８時間インキュベートした。
細胞の単層を、メチオニンとシステインとを含まない培
地中で、３０分間インキュベートし、次に、１００μＣ
ｉ／ｍｌの［³⁵Ｓ］−メチオニンおよび［³⁵Ｓ］−シス
テインを含む同じ培地中で２時間インキュベートした
（Ｐｒｏｍｉｘ Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｃ.）。

【００９６】パルスチェイス実験のために、前記細胞
を、３０分間標識化し、通常の培地で２回洗浄し、次
に、胎児ウシ血清を含まないＭＥＭ培地中で６時間まで
インキュベートした。チェイス時間後に培地を回収し、
細胞を、５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．５％デオキシコール
酸塩、０．５％ ｎｏｎｉｄｅｔＰ−４０および０．１
％ＳＤＳを含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．
５中で可溶化した。培地と細胞溶解物のアリコットに対
して、例８ａからのマウスＶＥＧＦ−Ｂに対する特異的
抗血清と、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから市販されている
ヒトＶＥＧＦ特異的抗血清とを使用した免疫沈降法を行
った。沈降物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。

【００９７】［例１３： トランスフェクションＣｏｓ
−１細胞に発現されたＶＥＧＦ−Ｂ_{18 6}の生化学的特
性］マウスＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆の生化学的特性を、適当な
発現ベクターで例１２に記載したようにトランジェント
にトランスフェクションしたＣｏｓ−１細胞で調べた。
これら細胞を、代謝標識化し、これらの標識化細胞から
のたん白質を、ＶＥＧＦ−Ｂに対する抗ペプチド抗体を
使用して免疫沈降させた。沈降物を、還元条件下でＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ分析した。細胞培養培地（Ｍ）と洗浄剤可
溶化細胞溶解物（Ｌ）との両方を、分析した。その結果
を図２２に示す。細胞結合型ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆が、還元
条件下で分子量約２４，０００のポリペプチドとして移
動したことが判る。これに対して、トランスフェクショ
ン細胞の培地中に存在するＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆は、分子量
３２，０００種として移動し、これは、たん白質が、そ
の細胞内輸送および分泌中に於いて共有結合的に修飾さ
れたことを示唆している。対応する分子は、コントロー
ルとして使用した模擬（ｍｏｃｋ）トランスフェクショ
ンＣｏｓ−１細胞からの細胞溶解物や培地には検出され
なかった。

【００９８】非還元条件下での培地の免疫沈降法とＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ分析は、分子量約６０，０００種を示し、
これは、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆がジスルフィド結合ホモダイ
マーを形成したことを示唆した。標識化中に１００μｇ
／ｍｌのヘパリンを含有させても、トランスフェクショ
ン細胞からのＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆ホモダイマーの分泌又は
放出には影響がなかった。

【００９９】［例１４： ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆ホモダイマ
ーの生合成］ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆ホモダイマーの生合成
を、パルスチェイス実験によって調べた。トランスフェ
クションＣｏｓ−１細胞を、３０分間代謝標識化し、次
に、４時間までチェイスした。洗浄剤可溶化細胞溶解物
と培地との免疫沈降法とＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析とは、細
胞結合型の分子量約２４，０００種がチェイス時間全体
を通じて溶解物中に容易に検出されることを示した。こ
の分子種の強度の減少は、培地中に存在する分子量３
２，０００たん白質の増加と関連していた。分子量３
２，０００種は、１時間のチェイス後に培地中に現れ
た。４時間のチェイス時間後に、最高レベルの分泌ＶＥ
ＧＦ−Ｂ₁₈₆が得られた。細胞溶解物中には、中間体は
検出されなかったが、分泌された分子量３２，０００た
ん白質は、わずかに不均一であるようであった。前記修
飾の性質は現在まだ未知であるが、Ｎ−結合グリコシル
化は、この修飾のためのコンセンサス部位が不在である
ため除外することができる。

【０１００】［例１５： ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆によるヘテ
ロダイマーの形成］上述したように、ＶＥＧＦ−ＢとＶ
ＥＧＦとは、多くの組織に於いて同時発現され、ＶＥＧ
Ｆ−Ｂ₁₆₇・ＶＥＧＦ₁₆₅ヘテロダイマーは、トランスフ
ェクション細胞内で同時発現された時に容易に形成され
る。ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆もＶＥＧＦ₁₆₅とヘテロダイマーを
形成することができるか否かを調べるために、Ｃｏｓ−
１細胞を、適当な発現ベクターによって、単独又は組み
合わせて、上述したようにして、トランスフェクション
した。これらトランスフェクション細胞からの培地中に
存在する代謝標識化たん白質について、ＶＥＧＦ−Ｂと
ＶＥＧＦとに対する抗血清を使用した免疫沈降法を行っ
た。図２３Ａは、それぞれＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆とＶＥＧＦ
とを別々に発現するトランジェントにトランスフェクシ
ョンされたＣｏｓ−１細胞の細胞培養培地からの免疫沈
降物の還元条件下に於けるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果
を示している。前記抗血清が、検出可能な交叉反応性無
く、ＶＥＧＦ−ＢとＶＥＧＦとに対してそれぞれ特異的
であることが判る。

【０１０１】Ｃｏｓ−１細胞を、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆とＶ
ＥＧＦ₁₆₅のための発現ベクターでコトランスフェクシ
ョンした。その結果得られたＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆とＶＥＧ
Ｆ₁₆₅とを同時発現する細胞からの細胞培養培地（Ｍ）
と洗浄剤可溶化溶解物（Ｌ）とについて、還元条件下で
免疫沈降法とＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析とを行った。その結
果を図２３Ｂに示す。このテストは、マウスＶＥＧＦ−
Ｂ₁₈₆とヒトＶＥＧＦ₁₆₅が細胞内及び分泌型ヘテロダイ
マーを形成することを示した。

【０１０２】マウスＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆とヒトＶＥＧＦ₁₆₅
を別々に又は組み合わせて、発現する細胞からの培養培
地に対して、ＶＥＧＦ−ＢとＶＥＧＦに対する抗体を使
用した免疫沈降法と、非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ分析とを行った。コントロールとして、模擬トランス
フェクション細胞からの細胞培養培地を、分析した。そ
の結果を図２３Ｃに示す。ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆が、分泌ジ
スルフィド結合ホモダイマーを形成し、ＶＥＧＦ−Ｂ
₁₈₆とＶＥＧＦ₁₆₅とが、分泌ジルスフィド結合ヘテロダ
イマーを形成することが分かった。

【０１０３】ＶＥＧＦとのヘテロダイマー形成がＶＥＧ
Ｆ−Ｂ₁₈₆の分泌と放出とに影響を与えたか否かを調べ
るために、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆とＶＥＧＦ₁₆₅との発現ベク
ターでトランジェントにトランスフェクションされたＣ
ｏｓ−１細胞を使用して、パルスチェイス実験を行っ
た。３０分間の標識化時間後、細胞結合型ジスルフィド
結合ヘテロダイマーを回収することができ、分泌された
ヘテロダイマーが、３０分間のチェイス時間後に既に培
地から回収された。分泌されたヘテロダイマーは、標識
化後の２時間までの間に培地中に蓄積した。４時間のチ
ェイス時点で、恐らくは複合体の分解に依る、培地中の
ヘテロダイマーの量の減少があった。いくらかのＶＥＧ
Ｆ−Ｂ₁₈₆・ＶＥＧＦヘテロダイマーが、チェイス時間
を通じて細胞結合状態のままであった。これらの結果
は、ＶＥＧＦとのヘテロダイマー形成が、ＶＥＧＦ−Ｂ
₁₈₆ホモダイマーの分泌と比較して、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆の
分泌を促進するものであることを示唆した。更に、３０
分間の標識化時間後に於いて既にヘテロダイマーが存在
していたことは、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆ホモダイマーのゆっ
くりとした放出が、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆がダイマー化する
能力の欠陥に依るものではないことを示唆した。

【０１０４】［例１６： 分泌されたＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆
ホモダイマーの精製］分泌されたＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆ホモ
ダイマーを、次のようにして、バキュロウィルス感染Ｓ
ｆ２１細胞の無血清培養培地から単離した。

【０１０５】ａ．最初の分離 培養培地中の主要なコンタミナントたん白質は、バキュ
ロウィルス感染細胞によって分泌される酸性たん白質で
ある、バキュロウィルスたん白質ｇｐ６４／６７であ
る。このたん白質を除去するために、培養培地を、限外
濾過で２０倍に濃縮し、次に、２０ｍＭのＮａＣｌを含
有する２０ｍＭの燐酸緩衝液ｐＨ６．５中で平衡化させ
たＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムを通過させた。次
に、溶出したたん白質を、同じ緩衝液中で平衡化させた
ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）イオ
ン交換カラムを通過させた。このカラムを、未結合のた
ん白質を除去するために、燐酸緩衝液で洗浄し、結合し
たたん白質を、溶出緩衝液のＮａＣｌ濃度を段階的に増
加させることによって溶出させた。主要なｇｐ６４／６
７バキュロウィルスコードたん白質は、それらの条件下
に於いて前記イオン交換カラムに結合しなかったのに対
して、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆ホモダイマーは、９０ｍＭのＮ
ａＣｌ濃度で溶出した。溶出フラクションのＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ分析によって判断すると、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆ホモ
ダイマーは、この手順によって５−１５％の純度になっ
ていた。

【０１０６】ｂ．均質状態への精製 前記ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆ホモダイマーを、ＦＬＰＣシステ
ム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合させたＭｏｎｏＳカラ
ムで均質状態にまで精製した。結合したたん白質を、２
０ｍＭの燐酸緩衝液ｐＨ６．５中でのＮａＣｌのリニア
グラジェントで溶出した。

【０１０７】［例１７］前記二つのＶＥＧＦ−Ｂスプラ
イスアイソフォームが、異なった組織分布を示すか否か
と、さらに別のアイソフォームが存在するか否かとを調
べるために、マウスの脳、心臓、肝臓および腎臓、そし
てヒトの胚心臓と骨格筋とから抽出された全ＲＮＡを使
用して、ＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。その転写産物を、
マウスとヒトＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子のエキソン４ないし７
と、エキソン３ないし７とをそれぞれカバーする４対の
特異的プライマーを使用したＰＣＲによって分析した。

【０１０８】手順 マウスおよびヒト組織からの全ＲＮＡを、チャーグウィ
ン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ）他，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ，１８：５２９４−９９（１９７９）によって開示さ
れている標準式手順を使用して、単離した。反応当たり
２ないし５μｇの全ＲＮＡを、トリｍｙｅｌｏｓｔｏｓ
ｉｓウィルス逆転写酵素（２０Ｕ／反応）を使用したフ
ァーストストランドｃＤＮＡ合成用に使用した。反応
は、オリゴ−（ｄＴ）₁₈を用いて始めた。これらの反応
のアリコットを、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５
Ｕ／反応）を使用したＰＣＲ反応におけるテンプレート
として使用した。マウスｃＤＮＡを増幅するために、二
対のプライマーを使用した。これらの対は、エキソン４
に位置する共通の５‘−プライマー、５‘−ＣＡＣＡＧ
ＣＣＡＡＴＧＴＧＡＡＴＧＣＡ（正方向）（配列認識記
号：ヌ）を、それぞれエキソン６Ｂと７とに位置する二
つの異なった３’−プライマー、５‘−ＧＣＴＣＴＡＡ
ＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＴＧＧＣＡＡＴＧＧＡＧＧＡＡ
（逆方向）（配列認識記号：ネ）、５’−ＡＣＧＴＡＧ
ＡＴＣＴＴＣＡＣＴＴＴＣＧＣＧＧＣＴＴＣＣＧ（逆方
向）（配列認識記号：ノ）（この最後のプライマーは、
Ｂｇｌ ＩＩ部位と、５‘末端に４つの追加の塩基を有
する）とを組み合わせることによって得た。アガロース
ゲル電気泳動による分析後、増幅されたバンドを、ナイ
ロンフィルター（Ｇｅｎｅｓｃｒｅｅｎ Ｐｌｕｓ）に
トランスファーし、続いてエキソン６Ａと６Ｂとに対し
て特異的なオリゴヌクレオチドプローブでハイブリダイ
ゼーションした。前記オリゴヌクレオチドプローブは、
５’−ＣＴＣＴＧＴＴＣＣＧＧＧＣＴＧＧＧＡＣＴＣＴ
Ａ（エキソン６Ａ）（配列認識記号：ハ）と、５‘−Ｔ
ＣＡＧＧＧＣＧＴＴＧＡＣＧＧＣＧＣＴＧＧＧＴＧＣＡ
Ａ（エキソン６Ｂ）（配列認識記号：ヒ）とであった。
このオリゴヌクレオチドプローブを、高特異性活性とな
るようなターミナルトランスフェラーゼを使用して［³²
Ｐ］ｄＣＴＰで標識化した。毎ｍｌの溶液当たり１ｘ１
０⁶ｃｐｍの標識化プローブを使用して、５ｘデンハル
ト溶液と、０．５％ＳＤＳと、１００μｇ／ｍｌの鮭精
子ＤＮＡとを含有する、６ｘＳＳＣ中で、３７℃でハイ
ブリダイゼーションを行った。フィルターを、２ｘ１５
分間、０．５％ＳＤＳを含有する６ｘＳＳＣ中で、同じ
温度で洗浄し、フィルムに露出した。

【０１０９】ヒトｃＤＮＡの増幅に使用する二対のプラ
イマーは、二つの異なった５‘−プライマー、すなわ
ち、エキソン３に位置する ５’−ＣＣＴＧＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＴ
（正方向）（配列認識記号：フ）と、エキソン４に位置
する ５‘−ＴＧＴＣＣＣＴＧＧＡＡＧＡＡＣＡＣＡＧＣＣ
（正方向）（配列認識記号：ヘ）とを用いてエキソン７
に位置する、共通の３’−プライマー、 ５‘−ＧＣＣＡＴＧＴＧＴＣＡＣＣＴＴＣＧＣＡＧ（逆
方向）（配列認識記号：テ）と組み合わせたものであ
る。増幅産生物のアリコットを、アガロースゲル電気泳
動によって分析した。前記アリコットを、ＴＡ−クロー
ニングベクターｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉ
ｎｃ．）中に直接にクローニングし、生成されたプラス
ミドを、ヌクレオチドシークエンシングによって分析し
た。ＧＡＰＤＨの増幅はコントロールとして用いた。

【０１１０】結果 増幅されたＰＣＲ産生物のアガロースゲル電気泳動に依
る分析は、それぞれ２１５と３１６ｂｐの二つの主要な
バンドを示した。これらのサイズは、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇
とＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆とに対応する二つのｍＲＮＡと一致
する。これら二つのバンドは、同じ強度であり、これ
は、前記二つのアイソフォームが、調べたすべてのマウ
スおよびヒト組織中に於いて大体同じレベルで発現され
たことを示唆するものであった。

【０１１１】マウス組織からの増幅産生物の正体を確か
めるために、ＰＣＲ−増幅ＤＮＡを、フィルターにトラ
ンスファーし、それぞれエキソン６Ａと６Ｂとに対する
特異的オリゴヌクレオチドプローブでプローブした。オ
ートラジオグラムは、エキソン６−特異的プローブは前
記３１６ｂｐバンドとハイブリダイズするのに対して、
エキソン６Ｂ特異的プローブは前記２１５ｂｐと３１６
ｂｐとの両方の増幅バンドとハイブリダイズすることを
示した。これらの結果は、二つのＶＥＧＦ−Ｂのアイソ
フォームを作り出すためのエキソン６における受容部位
の選択的利用と一致するものであり、従って、すべての
増幅産物がＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇とＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆アイソフ
ォームの配列から予想されたものと一致した。

【０１１２】ヒト胚心臓および筋から単離された全ＲＮ
ＡのＰＣＲ分析の産生物のアガロースゲル電気泳動によ
って３２９ｂｐと４３０ｂｐの二つの主要な増幅バンド
が可視化された。

【０１１３】総合すると、これらのデータは、ＶＥＧＦ
−Ｂ₁₆₇とＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆とが組織に於ける二つの主要
なＶＥＧＦ−Ｂのアイソフォームであることを示してい
る。ＰＣＲの産生物のパターンと、プライマーの位置と
は、もしもＶＥＧＦ−Ｂのより長いスプライスアイソフ
ォームが存在するとすれば、そのような転写産物は、Ｖ
ＥＧＦ−Ｂ₁₈₆の場合よりも、わずかに５‘側に位置す
るスプライス受容部位を使用するものであることを示し
ている。更に、ヘパリン結合ドメイン、すなわち、ＶＥ
ＧＦ−Ｂのエキソン６に対応する配列を欠如した、ＶＥ
ＧＦ₁₂₁に対応するＰＣＲ産物は、検出されなかった。
しかしながら、エキソン５をエキソン７にスプライシン
グすることによって、ＶＥＧＦ₁₂₁に対応するＶＥＧＦ
−Ｂのアイソフォームをコードする転写産物が作り出さ
れるかもしれず、このＶＥＧＦ−Ｂの推定アイソフォー
ムは、この例に於いて分析されたもの以外の組織に於い
て発現されるかもしれない。

【０１１４】［例１８：細胞増殖の刺激］ＶＥＧＦ−Ｂ
₁₆₇が内皮細胞増殖を刺激する能力を、ヒト臍帯血管内
皮細胞（ＨＵＶＥＣ）と、ウシ毛細血管内皮（ＢＣＥ）
細胞への［³Ｈ］チミジン導入の分析を通じて確認し
た。

【０１１５】２９３ＥＢＮＡ細胞に、１μｇ／ｍｌヘパ
リンの存在下で、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇、ＶＥＧＦ₁₆₅にのた
めの発現ベクター、又はエンプティベクター（模擬）を
上述した要領でトランスフェクションした。これらの細
胞から調整された培地を、それぞれの培地中で希釈し、
ヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）と、ウシ毛細血管
内皮（ＢＣＥ）細胞とに投与し、［³Ｈ］チミジンの取
り込みを測定した。ポジティブコントロールとして、組
換えｂＦＧＦを、ＢＣＥ細胞に添加した。

【０１１６】詳述すると、ヒトＶＥＧＦ−ＢとヒトＶＥ
ＧＦ₁₆₅とを含有する調整された培地を、ヘパリン（１
μｇ／ｍｌ）の存在下で、適当な発現ベクター又は、エ
ンプティーベクター（模擬）でトランスフェクションさ
れた２９３ＥＢＮＡ細胞から、トランスフェクションの
４８時間後に収集した。第２パッセージ（ｓｅｃｏｎｎ
ｄ ｐａｓｓａｇｅ）ＨＵＶＥＣを、１０％ウシ胎児血
清を添加したＭ−１９９培地中で、９６−ウェルプレー
ト（４ｘ１０³細胞／ウェル）にプレーティングし、２
４時間インキュベートした。調整された培地を、増殖培
地によって希釈し、細胞を４８時間刺激した。１０μＣ
ｉ／ｍｌの［³Ｈ］チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎ
ｃ．）を含有する新たな調整された培地を前記細胞に添
加し、刺激を更に４８時間継続した。細胞を、ＰＢＳで
洗浄し、トリプシン処理し、取り込まれた放射能を、液
体シンチレーション計数によって測定した。ＢＣＥ細胞
を、２４−ウェルプレートに接種し、１０％胎児ウシ血
清を添加した最小必須培地（ＭＥＭ）中で集密するまで
増殖させた。細胞を、３％の胎児ウシ血清を添加したＭ
ＥＭ中で７２時間飢餓させ、その後、無血清培地に希釈
した調整された培地を、前記細胞に添加し、これらの細
胞を２４時間刺激した。［³Ｈ］チミジンは、刺激期間
の最後の４時間にわたって含ませた（１μＣｉ／ｍ
ｌ）。ｂＦＧＦによる刺激を、６ｎｇ／ｍｌの組換えｂ
ＦＧＦ（Ｓｙｎｅｒｇｅｎ Ｉｎｃ．）を使用して、上
述したように行った。細胞を、ＰＢＳで洗浄し、ＮａＯ
Ｈで溶解し、取り込まれた放射能を、液体シンチレーシ
ョン計数によって測定した。

【０１１７】図２０は、前記模擬トランスフェクション
細胞から調整された培地によって誘発された基礎活性と
の比較に於ける、ヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）
と、ウシ毛細血管内皮（ＢＣＥ）細胞におけるＶＥＧＦ
−Ｂ₁₆₇に依る［³Ｈ］チミジン取り込みの誘発の倍率を
示す棒グラフである。比較の目的のために、ＶＥＧＦ
₁₆₅とｂＦＧＦとに依る誘発も示されている。棒は並列
したサンプルの平均±標準偏差を示している。いくつか
の他の独立した実験に於いても類似の結果が得られた。
これらのテスト結果は、ＶＥＧＦ−ＢがＨＵＶＥＣとＢ
ＣＥとの両方の細胞に於いて［³Ｈ］チミジン取り込み
明らかにを誘発し、イン・ヴィトロでの内皮細胞の増殖
を刺激したことを示しており、これによって、ＶＥＧＦ
−Ｂが内皮増殖因子であることが示される。

【０１１８】［例１９： ヒトＶＥＧＦ−Ｂプロモータ
ーＤＮＡクローンの同定と活性］バクテリオファージλ
ＥＭＢＬ中のヒトゲノムＤＮＡライブラリーを、ＶＥＧ
Ｆ−Ｂ第１および第２エキソンからの配列を含む５‘Ｐ
ＣＲフラグメントをプローブとして使用して、スクリー
ニングした。二つの陽性クローンが得られ、これらの内
の一つを、Ｓａｃ ＩフラグメントとしてＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔ ＳＫＩＩプラスミドにサブクローニングし
た。１．４ｋｂのフラグメントが得られ、これは、ｃＤ
ＮＡ中に存在するＮｃｏＩ部位（ＡＴＧ翻訳開始部位の
１００ｂｐ以内の上流側に位置する）から上流側に約
０．４ｋｂの配列を含んでいた。

【０１１９】更に、他方のλクローンからの約６ｋｂの
ＸｈｏＩフラグメントを、ｐＧＥＭＥＸプラスミドにサ
ブクローニングした。このサブクローンは、ＮｃｏＩ部
位から上流側に約１．５ｋｂの配列を有していた。Ｓａ
ｃＩ／ＮｃｏＩフラグメントとＥｃｏＲＩ（ポリリンカ
ー）−ＮｃｏＩフラグメントを、それぞれの転写方向
で、ｐＧＬ３ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に
サブクローニングした。これらのサブクローンのＤＮＡ
と、ＳＶ４０プロモーターを有するｐＧＬ３コントロー
ルベクターからのＤＮＡを、燐酸カルシウム沈殿法を使
用して、ＨｅＬａ細胞にトランスフェクションした。ト
ランスフェクションの２日後、トランスフェクション細
胞の溶解物から、ルシフェラーゼ活性を測定した。その
結果は、４００ｐｂ ＳａｃＩ／ＮｃｏＩフラグメント
がｐＧＬ３コントロールベクターの活性の約３０％に等
しいプロモーター活性を有しているのに対して、１．５
ｋｂフラグメントはバックグランド活性を与えるに過ぎ
ないことを示した。より強い、あるいはより活性度の高
いプロモーター、たとえば、ＣＭＶプロモーターや延長
因子１−アルファプロモーター、を使用すれば、恐ら
く、ヒトの細胞および組織に於いてより高い活性が得ら
れるであろう。クローニングされたフラグメントの構造
を図２４に示す。

【０１２０】前記ＮｃｏＩ部位の上流側の１．５ｋｂフ
ラグメントをシークエンシングした。その結果得られた
配列（配列番号１、配列認識記号：チ）を図２５に示
す。得られた配列は、ヌクレオチド１６６−１８７間の
２つの８−塩基対部分（図中箱内）から成る推定サイレ
ンサーエレメント［ワイスマン（Ｗｅｉｓｓｍａｎ）お
よびシンガー（Ｓｉｎｇｅｒ），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１：４
２２８−２３４（１９９１）］を明らかにした。このサ
イレンサーが、１．５ｋｂフラグメントの活性の相対的
欠如の原因であるのかもしれない。

【０１２１】［例２０：ＲＴ−ＰＣＲに依る、メラノー
マ、正常皮膚および筋肉中のＶＥＧＦ−ＢｍＲＮＡの分
析］正常な皮膚とメラノーマ組織とを、ｔｈｅ Ｄｅｐ
ａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ ａ
ｎｄ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｈｅｌｓｉｎｋｉ Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌにか
かっている患者から得た。４つの転移性メラノーマ標本
を、外科切除後に新規な状態で得て、すぐに、Ｔｉｓｓ
ｕｅ−ｔｅｋ（Ｍｉｌｅｓ）中に埋め込み、液体窒素中
で凍結した。正常皮膚のサンプルは、乳がんの外科手術
および皮膚斑点の摘出を受けているボランティア患者か
ら得た。すべての標本は、その診断を確認するために病
理学者によって検査された。

【０１２２】全ＲＮＡを、グアニジウム・イソチオアネ
ート法［チョムジンスキー（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ）
他，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５
９（１９８７）］によって単離した。ｃＤＮＡを、０．
２μｇのランダム・ヘキサデオキシヌクレオチド・プラ
イマーと、５ユニットのマウス逆転写酵素と、テンプレ
ートとしての５μｇの全ＲＮＡと、ファーストストラン
ドｃＤＮＡ合成キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用し
て合成した。３７℃での１時間のインキュベーション
後、その反応混合物を、−７０℃で保存した。ＰＣＲ増
幅のためのネガティブコントロールサンプルを、類似の
方法で作成したが、但しここでは逆転写酵素は添加しな
かった。β−アクチンも、それが構成的に高レベルで発
現され、その発現は、様々な細胞に於いて大きな違いを
示さないので、内部標準としてテストした。

【０１２３】ＰＣＲ増幅のために、次に示すようにプラ
イマー配列を、ＶＥＧＦ−Ｂおよびβ−アクチン遺伝子
から選択した。 ＶＥＧＦ−Ｂセンス：５‘−ＧＣＣＡＴＧＴＧＴＣＡＣ
ＣＴＴＣＧＣＡＧ−３’（配列認識記号：テ）、 ＶＥＧＦ−Ｂアンチセンス：５‘−ＴＧＴＣＣＣＴＧＧ
ＡＡＧＡＡＣＡＣＡＧＣＣ−３’（配列認識記号：
ヘ）、 β−アクチン センス：５‘−ＣＧＧＧＡＡＡＴＣＧＴ
ＧＣＧＴＧＡＣＡＴ−３’（配列認識記号：ホ）、 β−アクチン アンチセンス：５‘−ＧＧＡＧＴＴＧＡ
ＡＧＧＴＡＧＴＴＴＣＧＴＧ−３’（配列認識記号：
マ） ［β−アクチン配列は、ウング（Ｎｇ）他，Ｍｏｌ．Ｃ
ｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：２７２０−７３２（１９８５）
からのヌクレオチド２１０５−２１２５と２４１１−２
４３２からなる］。前記ｃＤＮＡ反応産物からの４μｌ
のアリコットを、５分間、９４℃で加熱し、ＰＣＲＩ増
幅のためのテンプレートとして使用した。ＰＣＲは、２
０ｐｍｏｌのプライマーと、１０ｘＰＣＲ緩衝液と、１
μｌの２０ｍＭ ｄＮＴＰと、２．５ＵのＴａｑ ポリ
メラーゼと用いて行った。最終容積を、ＤＥＰＣ処理水
によって、１００μｌに調節した。９５℃で１分間の変
性と、６２℃で４５秒間のアニーリングと、７２℃で５
０秒間のポリマー化とを、ＶＥＧＦ−Ｂに対しては合計
３５サイクル、そしてβ−アクチンに対しては合計２５
サイクル行った。各５サイクル後に、１５μｌのアリコ
ットを分析のために採取した。

【０１２４】５μｌの前記ＰＣＲ反応混合物の電気泳動
を、エチジウムブロマイドを含む２％アガロースゲル中
で行った。サイズマーカーＤＮＡフラグメントの長さ
は、２４から７２６塩基対の範囲であった（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡからの ΦＸ１
７４ ＤＮＡ／Ｈｉｎｆ Ｉマーカー）。従って、テス
トされたサンプルは、４つの転移性メラノーマ、筋肉、
正常皮膚、ネガティブコントロール（逆転写酵素無し）
そして前記ΦＸ１７４ ＤＮＡ／Ｈｉｎｆ Ｉサイズ・
マーカー、を含んでいた。ＶＥＧＦ−Ｂ（ＰＣＲ産物の
長さ：３２３および２３４ｂｐ）と、β−アクチンとに
対するＲＴ−ＰＣＲ分析の結果は、ＶＥＧＦ−Ｂが、調
べられたすべてのメラノーマに於いて、筋肉組織に於け
る発現とほぼ同様のレベルで、高レベルで発現されるこ
とを示している。他方、正常皮膚は、非常にわずかなＶ
ＥＧＦ−Ｂ ＲＮＡしか有していない。ノザン・ブロッ
ティングおよびハイブリダイゼーション分析からも類似
の結論を導くことができる。

【０１２５】

【発明の効果】本発明により、ＶＥＧＦ−Ｂのプロモー
ター配列を提供することができた。

【０１２６】上記実施例の結果は、ＶＥＧＦ−Ｂが、血
管新生、特に筋肉の血管新生に於いて役割を有する、内
皮細胞に対する新規な増殖因子であることを示してい
る。虚血心臓又は四肢の側枝動脈増殖は、タケシタ（Ｔ
ａｋｅｓｈｉｔａ）他，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１
４７：１６４９−６０（１９９５）に記載された技術を
利用してＶＥＧＦ−Ｂ巨丸剤（ｂｏｌｕｓ）を動脈投与
することによって促進させることができる。ＶＥＧＦ−
Ｂの細胞結合は、血管新生と内皮細胞増殖の調節にいく
つかの関係を持っているかもしれない。発育中の胚と、
収縮性組織とに於いて、細胞結合型ＶＥＧＦ−Ｂは、血
管樹枝状組織の確立と維持との間に於ける過剰増殖内皮
細胞に対する空間的指示（ｓｐａｔｉａｌ ｃｕｅｓ）
を提供するのかもしれない。それは、又、その細胞結合
を通じて、成人血管に於ける損傷を受けた内皮の再生を
支持することができるかもしれない。動脈損傷の再内皮
化は、アサハラ（Ａｓａｈａｒａ）他，Ｃｉｒｃｕｌａ
ｔｉｏｎ，９１（１１）：２７９３−８０２（１９９
５）によって記載された技術を使用してＶＥＧＦ−Ｂを
直接的に適用することによって促進させることができる
であろう。ＶＥＧＦ−Ｂが、ヘテロダイマーの形成によ
ってＶＥＧＦの分泌を調整することができる能力は、Ｖ
ＥＧＦシグナリングに於いてＶＥＧＦ−Ｂが間接的な役
割を果たし、これによって、ポトジェンス（Ｐｏｔｇｅ
ｎｓ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９（５
２）：３２８７９−８５（１９９４）に記載されている
ように、レセプター結合および／又は活性化を調節する
こと、を示唆している。これらの増殖因子の複数のヘテ
ロダイマー複合体の形成は、内皮細胞のための多様な調
節シグナルのための基礎を提供することができるかもし
れない。

【０１２７】ＶＥＧＦ−Ｂは、イン・ヴィトロで、内皮
細胞の集団に対する増殖因子として使用可能である。Ｖ
ＥＧＦ−Ｂは、望ましい血管新生、すなわち、新たな血
管および毛細血管の形成を促進するために使用可能であ
る。タケシタ（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ）他，前述、参照。
たとえば、妊娠を開始および／又は維持するための補助
剤として、黄体や、子宮内膜の発達を促進するのに有用
であろう。又、その内皮細胞に対する作用に依り、骨の
修復にも有用であろう。ＶＥＧＦ−Ｂの投与は、又、胚
形成、更に、体の成長と血管の発達と分化とを支持する
のにも有用であろう。傷に対してＶＥＧＦ−Ｂを局所的
に適用することは、傷の治癒を促進するのに有用であろ
うし、ＶＥＧＦ−Ｂを経口投与することは、胃および／
又は十二指腸潰瘍の治癒を促進するのに有用であろう。
ＶＥＧＦ−Ｂの、ヘテロダイマーの形成によってＶＥＧ
Ｆの分泌を調節する能力は、 ＶＥＧＦアゴニストが有
用であるような疾病に於いて、ＶＥＧＦ−Ｂの治療的な
役割を提供する可能性がある。前述のポトジェンス（Ｐ
ｏｔｇｅｎｓ）他，参照。

【０１２８】ＶＥＧＦ−Ｂは、中胚葉細胞に対して、直
接的、又は、血液供給に於ける改善を通じて、増殖効果
を提供することができる。

【０１２９】ＶＥＧＦ−Ｂは、メラノーマ等の腫瘍に於
いて過剰に発現されることが判っている。従って、ＶＥ
ＧＦ−Ｂの発現のアッセイは、腫瘍の診断に於ける手段
として使用することができ、たとえば、モノクローナル
抗体を使用した、ＶＥＧＦ−Ｂ発現の抑制は、腫瘍の成
長を遅延させるために有用であろう。

【０１３０】ＶＥＧＦ−Ｂの腫瘍アッセイは、転移リス
クのインジケーターとして有用であろう。たとえば、新
血管新生と増殖とを定量化するための、タカハシ（Ｔａ
ｋａｈａｓｈｉ）他，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５５：
３９６４−６８（１９９５）によって記載されている手
順に類似するＶＥＧＦ−Ｂ抗体の使用は、大腸癌からの
転移リスクのインジケータとして使用できるであろう。
組織化学による体液又は腫瘍自体におけるＶＥＧＦ−Ｂ
のアッセイは腫瘍予知因子として有用であろう。コンド
ウ（Ｋｏｎｄｏ）他， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ
Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１２２１（２）：２
１１−１４（１９９４）によって記載されている手法に
類似のＥＬＩＳＡは、腫瘍スクリーニングとしてＶＥＧ
Ｆ−Ｂアップレギュレーションを検出するのに有用であ
ろう。ブーコック（Ｂｏｏｃｏｃｋ）他，Ｊ．Ｎａｔ
ｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，８７：５０６−１６
（１９９５）によって記載されている技術を使用した、
ＶＥＧＦ−Ｂ発現の固相酵素免疫検定法は、卵巣がんの
診断指標として有用であろう。ウェインデル（Ｗｅｉｎ
ｄｅｌ）他，Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，３５：４３９
−４８（１９９４）によって記載されているＶＥＧＦア
ッセイに類似のＶＥＧＦ−Ｂ発現のアッセイは、脳腫瘍
における悪性腫瘍のインジケーターとして有用であろ
う。

【０１３１】更に、腫瘍の成長には、血管新生が必要で
あることから、ＶＥＧＦ−Ｂの投与は、抗腫瘍形成剤を
テストするために、実験動物に於いて腫瘍の成長を促進
するのにも有用であろう。ＶＥＧＦ−Ｂは、又、腫瘍の
低酸素症領域の微小血管質を増加させ、それらを放射
線、放射線増感剤等に対してより敏感にさせるのに有用
であろう。

【０１３２】ＶＥＧＦ−Ｂの血管新生作用は、虚血状態
を治療するのに有用であろう。ボータース（Ｂａｕｔｅ
ｒｓ）他，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２６７（４ Ｐｔ２）：Ｈ１２
６３−７／（１９９４）に記載されている技術によっ
て、ＶＥＧＦ−Ｂの動脈内巨丸剤（ｂｏｌｕｓ）を投与
することは、下肢虚血の治療と、四肢に於ける潅流を増
加させるのに有用であろう。メスリ（Ｍｅｓｒｉ）他，
Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７６：１
６１−６７（１９９５）によって記載されている手順を
使用して、組織虚血（たとえば、心筋虚血）を治療する
ために、ＶＥＧＦ−Ｂを発現するウィルスを形質導入し
た繊維芽細胞を注射した組織中で、血管新生反応を作り
出すことができるであろう。ＶＥＧＦ−Ｂ又はアゴニス
トは、たとえば、心筋梗塞、虚血四肢、深静脈血栓症、
および／又は分娩後の血管障害等の、動脈および／又は
静脈閉塞に於ける側枝循環の発達を刺激するために利用
できるであろう。前出のタケシタ（Ｔａｋｅｓｈｉｔ
ａ）他を参照。

【０１３３】ＶＥＧＦ−Ｂ／ＶＥＧＦ−Ｂレセプターシ
ステムは、新しい薬品としての、開発のために、アゴニ
スト／アンタゴニストとして小さな分子を検出するため
のアッセイシステムとして使用可能である。検出可能な
小分子の具体例としては、これらに限定されるものでは
ないが、有機化学薬品、ペプチド、およびＲＮＡ分子が
ある。

【０１３４】薬剤的有効量のＶＥＧＦ−Ｂたん白質を、
水、ミネラルオイル、ポリエチレングリコール、スター
チ、タルカム、ラクトース、増粘剤（ｔｈｉｃｋｅｎｅ
ｒ）、安定剤、懸濁剤、等の単数又は複数の適当なキャ
リア又はアジュバントと混合することによって、医薬組
成物を作ることができる。このような組成物は、溶液、
懸濁液、錠剤、カプセル、クリーム、膏薬、軟膏、その
他の従来形状の形態とすることができる。

【０１３５】例７に示したように、ＶＥＧＦ−Ｂたん白
質は、抗体を生産するのにも使用することができる。一
般に、従来式抗体生産技術を使用して、ＶＥＧＦ−Ｂ抗
体を生産することができる。たとえば、特異的モノクロ
ーナル抗体を、組換えＤＮＡ発現によって得られた融合
たん白質の免疫化を通じて生産することができる。

【０１３６】標識化モノクローナル抗体は、特に、体内
での異常なレベルのＶＥＧＦ−Ｂに関連する状態をスク
リーニングするのに有用であろう。たとえば、ファヴァ
（Ｆａｖａ）他，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉ
ｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１８０：３４１−４
６（１９９４）によって記載されている手法に類似の免
疫蛍光測定技術による滑液および／又は関節組織のＶＥ
ＧＦ−Ｂのアッセイは、慢性関節リウマチの診断インジ
ケーターとして有用であろう。アイロ（Ａｉｅｌｌｏ）
他，ｉｎ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３３１（２２）：１４８０−
８７（１９９４）によって記載されている技術を使用し
た眼液（ｏｃｃｕｌａｒ ｆｌｕｉｄ）におけるＶＥＧ
Ｆ−Ｂの放射線免疫検定法は、糖尿病性網膜症、虹彩又
は網膜血管閉塞の新血管新生の診断インジケーターとし
て有用であろう。血液、尿、又はその他の体液中のＶＥ
ＧＦ−Ｂレベルのイムノアッセイは、腫瘍マーカーとし
ても有用であろう。前出のコンドウ（Ｋｏｎｄｏ）他，
参照。ＶＥＧＦ−Ｂに対するこれらのモノクローナル抗
体は、又、体内での高いレベルのＶＥＧＦ−Ｂに関連す
る血管新生の阻害において有用であり、たとえば、哺乳
類に於ける急速に増殖する血管新生依存性腫瘍において
は、この血管新生阻害によって、そのような腫瘍の成長
を遅延させることができるであろう。キム（Ｋｉｍ）
他，ｉｎ Ｎａｔｕｒｅ，３６２（６２４３）：８４１
−４４（１９９３）によって記載されているものに類似
の技術を使用した、ＶＥＧＦ−Ｂに対して特異的なモノ
クローナル抗体による治療は、イン・ヴィヴォでの腫瘍
の成長を阻害又は抑制するために有用であろう。アサノ
（Ａｓａｎｏ）他，ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ，５５：５２９６−５３０１（１９９５）に記載さ
れているような手順を使用した、ＶＥＧＦ−Ｂに対する
モノクローナル抗体の静脈および／又は皮下注射は、新
血管新生と、固形腫瘍の一次および転移成長とを阻害す
るのに有用であろう。ヒトの治療のためには、そのよう
なモノクローナル抗体のｃｈｉａｓｅｒｉｚａｔｉｏｎ
又はｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎが好ましい。治療は、例
えば１０ないし５００μｇ、好ましくは、５０−１００
μｇのモノクローナル抗体を、週二回、腹膜内注射する
ことによって行うことができる。

【０１３７】抗体等のＶＥＧＦ−Ｂアンタゴニストは、
又、糖尿病性網膜症、乾癬関節症および／又は血管腫等
の血管腫瘍における新しい血管を阻害するのにも有用で
あろう。アイロ（Ａｉｅｌｌｏ）他，前出、参照。

【０１３８】以上の記載および例は、単に本発明を説明
するために記載されたものであって、限定することを意
図したものではない。当業者に於いては、本発明の精神
および内容を具体化している開示した実施例の改変があ
りうるであろうから、本発明は、付随のクレームとその
均等物の範囲内に於けるすべてを含むものであると理解
されるべきである。

【配列表】 ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ <110> LUDWIG INSTITUTE FOR CANCER RESEARCH ; HELSINKI UNIVERSITY LICENCI NG LTD., OY <120> PROMOTER SEQUENCE OF VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR-B <130> 41979PCT <150> US 08/397,651 <151> 1995-03-01 <150> US 08/469,427 <151> 1995-06-06 <150> US 08/569,063 <151> 1995-12-06 <160> 1 <210> 1 <211> 1550 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> unsure <222> 638, 820, 1488 <223> n = not determined <400> 1 ctcgagatct gtttgttgtc ttggaacaat acggtttaga ggtgactggc gggtgacgag 60 aacatatgcg agttcaccta agagaaaagc tgaatgaggc aatgcctctt cctgaccata 120 tctcttactc agataactat agaatttatt gtccagtaaa gggtatatta aaaaatcata 180 ttaaaagtca tacagtgaag ttgtccaggg aaatcaagac ttaacagtct cactctgaca 240 ataatgaaca gggggattcc ctcaagatag actaggacat gaccccacac tggcaggtag 300 tagtaccaga aaagaacgca tggaaaatct ttaccttatg cttgaggtag ggaccaggct 360 aaagtgaagg ccagacctaa aattctatct aaaataaatc cacaatcgaa gaaaatatgt 420 ggtgtacagg tatagaatgt ctttactgga tcattgaaat agtaagataa attcaacttt 480 ttacattgtt ttcttttcct ccagttaggg cttgagacct tcgtctctgg agagtgactg 540 tcaattggag ccctgctttc tgggtttctg gccagggggg ttgtggatgc ttaacatgtg 600 cctttcacag gacacttcct taccccagca gtggccangt gtgcatccca cgaccaggcc 660 tccctctcac ggaacatctg ttgagactag gagatgcctg gtgactgttg cctgacctgt 720 gtcctgtgta tttctgacaa gagccactct caaagaccct ggccaggagg agagttaggt 780 tccagtgtag gtcagctcag acagatggag gccacagaan caaacatggg aaatcacaga 840 agtaggttta ttactcacag atccctatcc caaccaccca ggtgccctct cctccagggc 900 caacagaggc atccttcagc aggagcgaca acggctaggg cagcggcaag ccgccaccat 960 ccgagccaac ccaggccccg agatcgtgcc ccggggcgcc ggcccctgag gggctcacct 1020 ggatggggcc tgcatgcgtt cccgctttgc ttccttccct ggacggcccg ctcccccgaa 1080 acgcgccgcc aataaagtga ttcgcagagc tcgtgtgcgg ctccctcctt aaggcccgac 1140 gcccccggcc ccggcctcgc caagggcagc gccccggcct ccgggtagtg gcggccggcg 1200 actggggagc ccagcctcct gggcggtgcg tccccttccc cctgccgcgg cgggaggcgg 1260 gagggggtgt gtggaggagg cgggccccgc cgacggcctc gcccccccac cccgccgccc 1320 cgcccccgcc ccacgggccc ggtggggagc gcgtgtctgg gtcacatgag ccgcctgccc 1380 gccagcccgg gcccagcccc ccgccgcccc cgccgtcccc gccgccgctg cccgccgcca 1440 ccggccgccc gcccgcccgg ctcctccggc cgccttcgct gcgctgcntg cgctgcctgc 1500 acccagggct cgggaggggg ccgcggagga gccgcccccc gcgcccggcc 1550

【図面の簡単な説明】

【図１】ＶＥＧＦ−Ｂの（部分的）ｃＤＮＡクローンの
ヌクレオチド配列（配列認識記号：ア）と、ｃＤＮＡの
第１リーディングフレームによってコードされるたん白
質セグメントのアミノ酸配列（配列認識記号：イ）

【図２】ＶＥＧＦ−Ｂの（部分的）ｃＤＮＡクローンの
ヌクレオチド配列（配列認識記号：ア）と、ｃＤＮＡの
第２リーディングフレームによってコードされるたん白
質セグメントのアミノ酸配列（配列認識記号：ウ）

【図３】マウスＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇の全長ｃＤＮＡクロー
ンのコード領域のヌクレオチド配列（配列認識記号：
エ）

【図４】マウスＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇のアミノ酸配列（配列
認識記号：オ）

【図５】ＶＥＧＦ−Ｂ₁₇₄のｃＤＮＡクローンのコード
領域のヌクレオチド配列（配列認識記号：カ）

【図６】ＶＥＧＦ−Ｂ₁₇₄のアミノ酸配列（配列認識記
号：キ）

【図７】ＶＥＧＦ−Ｂ₁₁₂のｃＤＮＡクローンのヌクレ
オチド配列（配列認識記号：ク）

【図８】ＶＥＧＦ−Ｂ₁₁₂のアミノ酸配列（配列認識記
号：ケ）

【図９】ｍＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇，ｍＶＥＧＦ₁₆₄，ｈＰｌＧ
Ｆ，ｍＰＤＧＦ ＡおよびｍＰＤＧＦ Ｂのアミノ酸配
列の比較

【図１０】ヒトＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇のクローンのヌクレオ
チド配列（配列認識記号：コ）

【図１１】ヒトＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇のアミノ酸配列（配列
認識記号：サ）

【図１２】マウスＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆のヌクレオチド配列
（配列認識記号：シ）

【図１３】マウスＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆のアミノ酸配列（配
列認識記号：ス）

【図１４】ヒトＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆のヌクレオチド配列
（配列認識記号：セ）

【図１５】ヒトＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆のアミノ酸配列（配列
認識記号：ソ）

【図１６】マウスおよびヒトＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇およびＶ
ＥＧＦ−Ｂ₁₈₆アイソフォームのアミノ酸配列（配列認
識記号：オ，サ，ス＆ソ）比較

【図１７】ＶＥＧＦ−Ｂのマウスおよびヒトの遺伝子の
概略構造

【図１８】マウスＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇とＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆ア
イソフォームの親水性分析

【図１９】ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦファミリーの増殖因子の
系統発生分析を示す図

【図２０】ヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）とウシ
の毛細血管内皮（ＢＣＥ）細胞の、ＶＥＧＦ−Ｂ，ＶＥ
ＧＦおよびｂＦＧＦによる、［³Ｈ］チミジン取り込み
の誘導を示すグラフ

【図２１】いくつかのマウスとヒトの組織に於けるＶＥ
ＧＦ−Ｂ₁₈₆転写産物の発現のノザンブロット分析

【図２２】トランジェントにマウスＶＥＧＦ−Ｂ ｃＤ
ＮＡをトランスフェクションしたＣｏｓ−１細胞からの
細胞培養培地および洗浄剤可溶化細胞溶解物の免疫沈降
法とＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果

【図２３】Ａ；マウスＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆とヒトＶＥＧＦ
₁₆₅とを別々に発現するトランスフェクションＣｏｓ−
１細胞からの細胞培養培地の免疫沈降法とＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ分析の結果、Ｂ；マウスＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆とヒトＶ
ＥＧＦ₁₆₅とを同時に発現するＣｏｓ−１細胞の細胞培
養培地（Ｍ）と洗浄剤可溶化細胞溶解物（Ｌ）の免疫沈
降法とＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、Ｃ；マウスＶＥＧ
Ｆ−Ｂ₁₈₆とヒトＶＥＧＦとを別々に又は、組み合わせ
て発現するＣｏｓ−１細胞及び、模擬(mock)トランスフ
ェクションコントロール細胞からの細胞培養培地の免疫
沈降法およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果

【図２４】ＶＥＧＦ−Ｂプロモーター−レポータークロ
ーンの導出の略図

【図２５】１．５５ｋｂヒトＶＥＧＦ−Ｂプロモーター
フラグメントのヌクレオチド配列、即ち配列番号１（配
列認識記号：チ）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (71)出願人 594011992 605 ＴＨＩＲＤ ＡＶＥＮＵＥ，ＮＥＷ ＹＯＲＫ，ＮＥＷ ＹＯＲＫ 10158, ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭ ＥＲＩＣＡ (71)出願人 500044722 ヘルシンキ・ユニバーシティ・ライセンシ ング・リミテッド・オイ ＨＥＬＳＩＮＫＩ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＬＩＣＥＮＳＩＮＧ ＬＴＤ．， ＯＹ フィンランド国 エフアイエヌ‐00014 ヘルシンキ ピー・オー・ボックス 26 Ｐ．Ｏ． ＢＯＸ 26， ＦＩＮ‐00014 ＨＥＬＳＩＮＫＩ， ＦＩＮＬＡＮＤ (72)発明者 エリクソン，ウルフ スウェーデン国 エス‐746 34 バルス タ ハーガーヴァーゲン 27 (72)発明者 オロフソン，ビルギッタ スウェーデン国 エス‐117 26 ストッ クホルム クリング ホルンスガタン 106 ３ ティアール (72)発明者 アリターロ，カリ フィンランド国 エフアイエヌ‐02100 エスポー ニーリキンティエ ４ エイ (72)発明者 パジュソラ，カトリ フィンランド国 エフアイエヌ‐00900 ヘルシンキ カステホルマンティエ ４ エイ ８

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（ａ）または（ｂ）の核酸分子か
   らなるプロモーター配列： （ａ）図２５（配列番号１）の配列に対応するヌクレオ
   チド配列を有する核酸分子、 （ｂ）図２５（配列番号１）の配列に対応するヌクレオ
   チド配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下
   でハイブリダイズし、プロモーターである核酸分子。