JP2003530818A - セリン／トレオニンプロテインキナーゼＡｋｔによる血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の導入 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、治療的血管形成のための方法および組成物に関する。より詳細には、本発明は、セリン／トレオニン蛋白質キナーゼＡＫＴによる、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）発現の誘発を対象とする。本発明による組成物および方法は、ＡＫＴをエンコードする核酸と、その投与を含むことが好ましい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の分野】

本発明は、治療的血管形成のための方法および組成物に関する。より詳細には
本発明は、セリン／トレオニンプロテインキナーゼＡｋｔによる血管由来蛋白血
管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の発現の誘導を対象とする。本発明による組成物お
よび方法は、Ａｋｔをエンコードする核酸とその投与を含むことが好ましい。

【０００２】

【発明の背景】

血管形成 血管形成は、新しい血管の発生をもたらす生物学的なプロセスである。このプ
ロセスは、細胞−細胞、細胞−基質、および細胞−サイトカイン間の様々な相互
作用を含む（Melillo他 1997、Cardiovascular Research 35 : 480〜489 ; Lew
is他 1997、Cardiovascular Research 35 : 490〜497）。新しい血管網の形成
は、通常、成体ではめったに行われない。しかし新しい血管系は、虚血、炎症、
創傷治癒、腫瘍成長、糖尿病性網膜症、リウマチ様関節炎、乾癬、および慢性の
創傷を含めた様々な病的な条件下で生じる可能性がある。

【０００３】 治療的血管形成では、適切な血管由来成長因子を使用して新しい血管発生にゆ
っくりと刺激を与える。したがって治療的血管形成は、様々な虚血状態を治療す
るために、または創傷治癒に刺激を与えるために使用することができる。虚血状
態は、心臓、下肢、皮膚弁、抹消神経、骨、または移植片に影響を及ぼす可能性
がある。虚血状態には、脳血管虚血、腎虚血、肺虚血、四肢虚血、抹消動脈疾患
、間欠性跛行、虚心形心筋症、および心筋虚血症が含まれる（WO97／14307）。

【０００４】 様々な因子が血管由来活性を有することが実証されてきた。これらの因子の中
には、塩基性および酸性の線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦおよびａＦＧＦ）、Ｆ
ＧＦ−５（米国特許第5,661,133号）、内皮細胞成長因子（Pu他 1993、Circula
tion 88 : 208〜2156）、アンギオポイエチン、ＶＥＧＦ（総説についてはMelil
lo他 1997およびLewis他 1997参照）がある。

【０００５】 血管形成は、充実性腫瘍の成長および残存とその転移に非常に重要であること
も示唆されてきた（米国特許第5,854,205号）。血管形成に刺激を与えるために
、腫瘍は、ＶＥＧＦを含む様々な血管由来因子の産生を上方調節する。

【０００６】 ＶＥＧＦ 血管内皮細胞成長因子は、蛋白質の血小板由来成長因子ファミリーのメンバー
である血管由来ポリペプチドの群である。これらの蛋白質は、分子量が約４６〜
４８kDaであるグリコシル化したカチオン性ダイマーである。他の血管由来因子
とは異なり、ＶＥＧＦの前には、無傷の細胞からのその分泌を可能にするシグナ
ル配列がある。ＶＥＧＦの代替の名称としては、血管透過因子（ＶＰＦ）および
ｃ−ｆｏｓ誘導成長因子（ＦＩＧＦ）がある。

【０００７】 ＶＥＧＦ₁₂₁（米国特許第5,219,739号）、ＶＥＧＦ₁₆₅（米国特許第5,332,672
号）、ＶＥＧＦ₁₈₉（米国特許第5,240,848号）、ＶＥＧＦ₂₀₆、ＶＥＧＦ−２（W
O95／24473 ; WO96／39515）、ＶＥＧＦ−Ｂ（米国特許第5,607,918号および第5
,840,693号）、およびＶＦＧＦ−Ｄ（WO97／12972）を含む、いくつかの形のＶ
ＥＧＦが確認されている。様々な形のＶＥＧＦは、血管内皮細胞に対して分裂促
進性を有し、虚血組織での側副血管形成および血流を高めることが示されてきた
。 ＣｏＣｌ₂などの遷移金属イオンはＶＥＧＦ遺伝子の発現を高め、血管新生を
刺激することが示されている（米国特許第5,480,975号）。

【０００８】 Ａｋｔ ＡＫＴ蛋白質は、アポプトシス（プログラム細胞死）に影響を与えるセリン／
トレオニンプロテインキナーゼである。最近、細胞生存／死の調節に関与する２
つの細胞内シグナル経路について研究が行われた。アポプトシス刺激キナーゼ１
（ＡＳＫ１）の活性化により様々な細胞タイプでアポプトシスが生じ（Ichijo他 1997）、一方、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）およびＡｋｔに関
与する経路は細胞保護につながる。ＡＳＫ１の活性は、腫瘍壊死因子−α（ＴＮ
Ｆａ）処理またはＦａｓ連結反応によって誘発されることが実証された（Ichijo
他 1997、Chang他 1998）。ＡＳＫ１優性ネガティブ変異体の過発現により、
ＴＮＦａまたはＦａｓ連結反応によって誘発されたアポプトシスが阻害されるが
、これは、ＡＳＫ１が、ＴＮＦａまたはＦａｓ連結反応により誘導されたアポプ
トシス細胞死の期間中に重要な役割を果たすことを示している。ＡＳＫ１がアポ
プトシスを誘発する分子メカニズムは明らかではない。ＡＳＫ１の異所性発現に
より、ＭＫＫ４／ＪＮＫやＭＫＫ６／ｐ３８経路などの様々なストレス活性化シ
グナル経路の活性化が生じ、これがＡＳＫ−１誘導アポプトシスを仲介する可能
性があることが示された（Ichijo他 1997）。

【０００９】 ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路も細胞生存／死の調節に重要と考えられる（Kulik他 F
ranke他 1997、Kauffmann−Zeh他 Hemmings、1997、Dedek他 1997）。血小板
由来成長因子（ＰＤＧＦ）や神経成長因子（ＮＧＦ）、インスリン様成長因子−
１（ＩＧＦ−１）などの生存因子は、ＰＩ３Ｋの活性を誘発することによって様
々な条件下で細胞生存を促進させる（Kulik他 1997、Hemmings 1997）。活性化
したＰＩ３Ｋによって、ホスファチジルイノシトール(３,４,５)−三リン酸(Ｐ
ｔｄｌｎｓ(３,４,５)−Ｐ３)の産生が生じ、これがＡＨ／ＰＨ−ドメイン含有
セリン／トレオニンキナーゼ、Ａｋｔに結合してその活性を誘発する（Franke他 1995、Hemmings 1997b、Downward 1998、Allesi他 1996）。ＰＩ３Ｋまたは
優性ネガティブＡｋｔ変異体の特異的阻害剤は、これらの成長因子またはサイト
カインの生存促進活性をなくす。さらに、構成上活性なＰＩ３ＫまたはＡｋｔ変
異体の導入により、通常なら細胞がアポプトシス細胞死に至る条件下で細胞生存
を促進させる（Kulik他 1997、Dudek他 1997）。これらの観察によれば、ＰＩ
３Ｋ／Ａｋｔ経路が細胞生存またはアポプトシスに重要な役割を果たすことが実
証される。

【００１０】 ヒトＡｋｔプロテインキナーゼの２つのアイソフォーム、Ａｋｔ１およびＡｋ
ｔ２が文献で明らかにされている（Staal 1987）。米国仮出願第60／125,108号
には、Ａｋｔ３で示されるヒトＡｋｔの第３の形が記載されている。さらに別の
ＡｋｔのアイソフォームがNakatani他、1999（Biochem. Biophys. Res. Comm. 2
57、906〜910）に記載されている。ラットＡｋｔ配列も明らかにされている（Ko
nishi他 1995）。

【００１１】 ヒトＡｋｔ１のＣ末端にあるセリン−４７３は、その調節に非常に重要である
ことが示された（Stokeo他 1997；Stephens他 1998）。成長因子の刺激により
、ＰＩ３Ｋが活性化する。ＰＩ３Ｋの産物、Ｐｔｄｌｎｓ（３.４.５）−ＰはＡ
ｋｔ１に結合し、Ａｋｔ１は細胞質から内細胞質膜近位に転座し、残基Ｔｈｒ３
０８およびＳｅｒ４７３でリン酸化する（Downward、1998）。これらの残基のリ
ン酸化はＡｋｔ１の活性化に非常に重要である。最近確認されたプロテインキナ
ーゼ、ＰＤＫ１は、Ｔｈｒ３０８のリン酸化の原因になることが示されたが、Ｓ
ｅｒ４７３をリン酸化するキナーゼはまだ確認されていない（Stokeo他 1997、
Stephens他 1998）。

【００１２】 遺伝子療法 遺伝子療法では、患者の冒された細胞や器官など、患者に遺伝子情報を導入す
ることによって、欠陥または異常（突然変異や異所発現など）の矯正が行われる
。この遺伝子情報は、細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏ導入した後にこの変性した細胞を
体内に再び導入することができ、または、適切な部位に直接ｉｎ ｖｉｖｏ導入
することができる。この点について、細胞トランスフェクションと遺伝子移入の
種々の技法が文献（Roemer and Friedman 、Eur. J. Biochem. 208（1992）211
参照）に記載されており、これには、「裸のＤＮＡ」のトランスフェクションと
、ＤＮＡおよびＤＥＡＥ−デキストランの複合体（Pagano他、J. Virol.1（1967
）891）、ＤＮＡおよび核蛋白質の複合体（Kaneda他、Science243（1989）375）
、ＤＮＡおよび脂質の複合体（Felgner他、PNAS84（1987）7413）、リポソーム
の用法（Fraley他、J. Biol. Chem. 255（1980）10431）などに関する様々な技
法が含まれる。より最近になって、物理的トランスフェクション技法の有望な代
替例として、遺伝子移入の際にウイルスをベクターとして使用することが浮かび
上がってきた。この点について、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随
伴ウイルス、およびアデノウイルスを含む種々のウイルスに関し、ある特定の細
胞集団に対する感染能力が試験された。

【００１３】 血管形成に対する遺伝子療法、特にＶＥＧＦをエンコードする配列を使用する
療法が提案されている（Melillo他、1997；Lewis他、1997）。ＶＥＧＦ₁₆₃に関
するｃＤＮＡを含むプラスミドの動脈内および筋内投与によって、虚血性ウサギ
後脚モデルでの側副血流が増大する（Tsurumi他、1996、Circulation 94 : 3281
〜3290 ; Takeshita他、1996、Biochem. Biophys. Res. Commun. 227 : 628〜63
5）。ヒトＶＥＧＦ₁₂₁、ＶＥＧＦ₁₆₅、およびＶＥＧＦ₁₈₉のｃＤＮＡを含むプラ
スミドは、このモデルで血管由来活性を有することも示された（Takeshita他、1
996、Lab Invest. 75 :487〜501 ; WO97／14307）。同様に、ＶＥＧＦ₁₆₅コード
配列を含む複製欠陥アデノウイルスは、マウスの血管新生を誘発する（Muhlhaus
er他、1995、Circ. Res. 77 : 1077〜1086）。ヒトの患者では、ＶＥＧＦ₁₆₅に
関する配列を含むプラスミドが、虚血四肢に血管形成を誘発し（Isner他、1996
、lancet 348 : 370〜374）、心臓に血管形成を誘発することが示された（Time
magazine、1999年1月11日、p. 68〜73参照）。

【００１４】 本発明は、ＶＥＧＦコード配列の直接投与によらずに血管形成を刺激する代替
方法に関する。より詳細には、本出願人は、ＶＥＧＦ産生が蛋白質Ａｋｔによっ
て誘発されることを予期せずに発見した。したがって本発明は、細胞にＡｋｔ蛋
白質を導入することにより細胞内でのＶＥＧＦの発現を刺激することを対象とす
る。細胞は、虚血状態に罹っている患者に存在することが好ましく、その結果、
患者に有益な側副血管が形成される。 本明細書のどの参考文献の引用も、そのような参考文献が本出願に対する「従
来技術」として利用可能であると認めるものと解釈するべきではない。

【００１５】

【発明の概要】 本発明は、細胞内でのＶＥＧＦの発現を刺激する方法および組成物に関する。
より詳細には、本出願人は、Ａｋｔ蛋白質がＶＥＧＦ発現を刺激することができ
ることを予期せずに発見した。最も好ましい態様では、細胞は虚血状態に罹って
いる患者に存在し、その結果、患者に有益な側副血管が形成される。

【００１６】 したがって本発明の第１の主題は、Ａｋｔ蛋白質を細胞に投与することによっ
て細胞内でのＶＥＧＦの発現を誘発する方法に関する。この蛋白質はどのＡｋｔ
蛋白質でもよい。Ａｋｔ蛋白質は、ヒトＡｋｔ蛋白質であることが好ましい。Ａ
ｋｔ蛋白質は、ヒトＡｋｔ１、Ａｋｔ２、またはＡＫｔ３であることがより好ま
しい。

【００１７】 Ａｋｔ蛋白質の投与によって産生したＶＥＧＦは、血管形成を刺激することが
できる任意の形のＶＥＧＦでよい。ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ₁₂₁、ＶＥＧＦ₁₆₅、Ｖ
ＥＧＦ₁₈₉、ＶＥＧＦ₂₀₆、ＶＥＧＦ−２、ＶＥＧＦ−Ｂ、またはＶＥＧＦ−Ｄで
あることが好ましい。

【００１８】 一態様では、細胞にＡｋｔ蛋白質を投与する。好ましい実施形態では、Ａｋｔ
蛋白質をエンコードし発現制御配列に動作可能に関連付けられた核酸を、細胞に
投与する。核酸は、プラスミドまたはウイルスベクターの一部にすることができ
る。好ましいウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随
伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびワクシニアウイルスである。

【００１９】 Ａｋｔ蛋白質、またはＡｋｔ蛋白質をエンコードする核酸は、単独で、あるい
は遷移金属イオンおよび／または血管拡張剤と組み合わせて投与することができ
る。Ａｋｔ蛋白質、またはＡｋｔ蛋白質をエンコードする核酸は、発現制御配列
に動作可能に関連付けられた第２の血管由来因子をエンコードする核酸と共に投
与することもできる。好ましい血管由来因子には、ＶＥＧＦ、酸性線維芽細胞成
長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、内皮細胞成長因子、またはアンギオポイエ
チンが含まれる。別の態様では、２つ以上の形のＡｋｔ蛋白質を細胞に投与する
ことができる。

【００２０】 本発明は、Ａｋｔ蛋白質を患者に投与することによって虚血状態に罹っている
患者の細胞内でのＶＥＧＦの発現を誘発する方法にも関する。虚血状態は、脳血
管虚血、腎虚血、肺虚血、四肢虚血、心筋虚血、あるいは虚血性、特発性、また
は肥大性心筋症でよい。蛋白質は、任意のＡｋｔ蛋白質でよい。Ａｋｔ蛋白質は
、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、またはＡｋｔ３であることが好ましい。

【００２１】 Ａｋｔ蛋白質の投与によって産生したＶＥＧＦは、血管形成を刺激することが
できる任意の形のＶＥＧＦでよい。ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ₁₂₁、ＶＥＧＦ₁₆₅、Ｖ
ＥＧＦ₁₈₉、ＶＥＧＦ₂₀₆、ＶＥＧＦ−２、ＶＥＧＦ−Ｂ、またはＶＥＧＦ−Ｄで
あることが好ましい。

【００２２】 一態様では、患者にＡｋｔ蛋白質を投与する。好ましい実施形態では、Ａｋｔ
蛋白質をエンコードし発現制御配列に動作可能に関連付けられた核酸を、患者に
投与する。核酸は、プラスミドまたはウイルスベクターの一部にすることができ
る。好ましいウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随
伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびワクシニアウイルスである。最も好まし
い実施形態では、Ａｋｔ蛋白質をエンコードする核酸を、経心外膜外科的投与に
よってまたはカテーテルを使用した経皮送達によって、直接心臓組織に投与する
。

【００２３】 Ａｋｔ蛋白質、またはＡｋｔ蛋白質をエンコードする核酸は、単独で、あるい
は遷移金属イオンおよび／または血管拡張剤と組み合わせて投与することができ
る。Ａｋｔ蛋白質、またはＡｋｔ蛋白質をエンコードする核酸は、発現制御配列
に動作可能に関連付けられた第２の血管由来因子をエンコードする核酸と共に、
患者に投与することもできる。好ましい血管由来因子には、ＶＥＧＦ、酸性線維
芽細胞成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、内皮細胞成長因子、またはアンギ
オポイエチンが含まれる。別の態様では、２つ以上の形のＡｋｔ蛋白質を患者に
投与することができる。

【００２４】 本発明は、Ａｋｔ蛋白質をエンコードする核酸、遷移金属および／または血管
拡張剤、医薬品として許容される賦形剤を含む医薬品組成物にも関する。核酸は
、プラスミドまたはウイルスベクターの一部にすることができる。好ましいウイ
ルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘル
ペスウイルス、およびワクシニアウイルスである。

【００２５】 別の態様では、本発明は、患者のＡｋｔ活性レベルを抑制することによって腫
瘍に罹っている患者の血管形成を阻害し、それによってＶＥＧＦの産生を阻害す
る方法に関する。Ａｋｔのレベルは、患者の細胞にＡｋｔアンチセンス核酸を導
入することによって低下させることができるが、これは、アンチセンス核酸が細
胞内条件下でハイブリダイズしてＡｋｔｍＲＮＡになる条件下で行われる。Ａｋ
ｔのレベルは、一本鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）などの細胞内結合蛋白質を導入する
ことによって低下させることもでき、この蛋白質が、Ａｋｔに結合しかつＡｋｔ
を活性化するのに十分なレベルでＡｋｔを患者の細胞に特異的に結合させる。別
の実施形態では、優性ネガティブ形のＡｋｔをエンコードする核酸を投与するこ
とによって、Ａｋｔ活性を低下させることができる。アンチセンス核酸、細胞内
結合蛋白質またはそれをエンコードする核酸、あるいは優性ネガティブを腫瘍細
胞に直接投与することが好ましい。

【００２６】 添付図面において； 図１：活性化Ａｋｔ３変異体の構成。 図１Ａ：活性化Ａｋｔ３の概略図：ヒトＡｋｔ３の完全長コード配列を、Ｎ末
端でヒトＳｒｃ遺伝子からのミリスチル化シグナル（Ｍｙｒ）とフレーム内で融
合させ、Ｃ末端でＨＡタッグ（ＨＡ）とフレーム内で融合させた（実施例参照）
。

【００２７】 図１Ｂ：ＨＥＫ２９３細胞における活性化Ａｋｔ３の異所発現。ＨＥＫ２９３
細胞に、ＣＭＶ６−ＭｙｒＡｋｔ３ＨＡまたは発現プラスミド（ＣＭＶ６）のみ
をトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、細胞溶解産
物を調製してＨＡ抗体による免疫ブロット法にかけた。

【００２８】 図１Ｃ：活性化Ａｋｔ３はＡｋｔ活性を有する。ＨＥＫ２９３細胞に、活性Ａ
ｋｔ３に関する発現プラスミド（ＭｙｒＡｋｔ３ＨＡ）または発現ベクター（Ｃ
ＭＶ６）のみをトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後
、細胞溶解産物を調製して抗ＨＡ抗体による免疫ブロット法にかけた。ＧＳＫ３
から誘導した基質ペプチドを使って免疫ペレットのＡｋｔ３キナーゼ活性を測定
した。Ｂｋｇｄ：トランスフェクションされていない細胞のバックグラウンドレ
ベル；ＣＭＶ６：ＣＭＶ６をトランスフェクションした細胞；Ａｋｔ３ｃａｋ：
構成上活性なＡｋｔ３に関する発現プラスミドをトランスフェクションした細胞
（ＣＭＶ６−ＭｙｒＡｋｔ３ＨＡ）（実施例参照）。

【００２９】 図２：ＡｋｔはＨｅＬａ細胞からのＶＥＧＦ−１６５の分泌を増大させる。 ＨｅＬａ細胞に、活性化マウスＡｋｔ１（Ａｋｔ１）、活性化ヒトＡｋｔ３（
Ａｋｔ３）、またはＣＭＶ６ベクターのみに関する発現プラスミドをトランスフ
ェクションした。トランスフェクションの１日後、細胞は低マイトジェン培地に
替わった（ＤＭＥＭ−０.５％ＦＢＳ）。１６時間後、ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡア
ッセイ用に培養培地を収集した。レーンＡ：０.４μgのＣＭＶ６ベクターＤＮＡ
をトランスフェクションした細胞（６ウェル組織培養皿）；レーンＡｋｔ１：０
.４μgのＣＭＶ６−ｍＡｋｔ１ｃａｋ発現プラスミドをトランスフェクションし
た細胞（６ウェル組織培養皿）；レーンＡｋｔ３：活性ヒトＡｋｔ３（Ａｋｔ３
）に関する発現プラスミドをトランスフェクションした細胞（６ウェル組織培養
皿）。

【００３０】 図３：Ａｋｔはヒト冠状平滑筋細胞およびヒト骨格筋細胞でのＶＥＧＦ−１６
５の発現を増大させる。 図３Ａ：ヒト骨格筋細胞（ＨＳＫＭＣ）に、緑色蛍光蛋白質に関する組換えア
デノウイルス（ＡＶ−ＧＦＰ）、構成上活性なマウスＡｋｔ１に関する組換えア
デノウイルス（ＡＶ−ｍＡｋｔ１ｃａｋ）、または構成上活性なヒトＡｋｔ３に
関する組換えアデノウイルス（ＡＶ−ｈＡｋｔ３ｃａｋ）を、３×１０⁸ＶＰ／m
lの濃度で一晩感染させた（ＶＰ：ウイルス粒子）。感染させた１日後、培地を
収集し、培地のＶＥＧＦレベルをＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。 図３Ｂ：ヒト冠動脈平滑筋細胞（ＨＣＡＳＭＣ）に、ＡＶ−ＧＦＰ、ＡＶ−ｍ
Ａｋｔ１ｃａｋ、ＡＶ−ｈＡｋｔ３ｃａｋを、３×１０⁸VP／mlの濃度で一晩感
染させた。感染させた１日後、培地を収集し、ヒトＶＥＧＦに関し、培地のＶＥ
ＧＦレベルをＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。 図３Ｃ：ＨＣＡＳＭＣに示されるウイルスを、３×１０⁸VP／mlの濃度で一晩
感染させた。対照として、感染していない細胞を低酸素状態に切り替えた。１日
後、全ＲＮＡをこれらの細胞から分離し、ノーザンブロット分析によってＶＥＧ
Ｆ発現を検出した。

【００３１】 図４：Ａｋｔはラット心筋細胞でのＶＥＧＦ発現を誘発する。 新生子心筋細胞に、緑色蛍光蛋白質に関する組換えアデノウイルス（ＡＶ−Ｇ
ＦＰ）、構成上活性なマウスＡｋｔ１に関する組換えアデノウイルス（ＡＶ−ｍ
Ａｋｔ１ｃａｋ）、または構成上活性なヒトＡｋｔ３に関する組換えアデノウイ
ルス（ＡＶ−ｈＡｋｔ３ｃａｋ）を、３×１０⁷VP／mlの濃度で一晩感染させた
。対照として、感染していない細胞を低酸素状態に２４時間曝した。１日後、全
ＲＮＡを分離し、Northernブロット分析によってＶＥＧＦ発現を検出した。

【００３２】

【発明の詳述】

本発明は、細胞内のＶＥＧＦの発現を刺激する方法および組成物を提供するこ
とが有利である。したがって本発明は、虚血組織での側副血管形成を刺激する手
段および方法を提供することによって、患者の虚血性疾患の治療を可能にする。
より詳細には、Ａｋｔ蛋白質は本明細書において、血管由来蛋白質ＶＥＧＦの発
現を刺激することが示される。したがって本発明の第１の主題は、細胞にＡｋｔ
蛋白質を導入することによって、細胞内でのＶＥＧＦ発現を刺激することに関す
る。好ましい態様では、Ａｋｔをエンコードする核酸が細胞に投与される。

【００３３】 本発明は、Ａｋｔ蛋白質を患者に投与することによって、虚血状態に罹った患
者を治療することにも関する。Ａｋｔ蛋白質をエンコードする核酸を患者に投与
することが好ましく、その結果、患者の虚血組織に有益な側副血管形成が生じる
。

【００３４】 本発明の様々な態様について、以下のセクションでさらに詳細に述べる。様々
なセクションに編成されたこの構成は、本発明の理解を容易にしようとするもの
であり、決して本発明を限定しようとするものではない。

【００３５】 定義 以下の定義された用語は、本明細書全体を通して使用され、本発明の範囲およ
び実施について理解する助けとなるべきである。 特定の実施形態において、「約」または「およそ」という用語は、所与の値ま
たは範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内を意味
する。

【００３６】 「核酸」は、ヌクレオチドと呼ばれるサブユニットが共有結合したものからな
るポリマー化合物である。核酸にはポリリボ核酸（ＲＮＡ）およびポリデオキシ
リボ核酸（ＤＮＡ）が含まれ、そのいずれも一本鎖または二本鎖である。ＤＮＡ
にはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、および半合成ＤＮＡが含まれる。 「遺伝子」は、ポリペプチドをエンコードするヌクレオチドのアセンブリを指
し、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ核酸を含む。 「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作が行われたＤＮＡ分子である。

【００３７】 「ベクター」は、核酸を宿主細胞に移入する任意の手段である。ベクターは、
別のＤＮＡセグメントを結合することができるレプリコンでよく、結合したセグ
メントの複製を引き起こすようなものである。「レプリコン」は、ｉｎ ｖｉｖ
ｏ状態でのＤＮＡ複製の自律単位として機能する、すなわちそれ自体の制御下で
複製が可能な任意の遺伝要素（例えばプラスミド、ファージ、コスミド、染色体
、ウイルス）である。「ベクター」という用語は、核酸を細胞にｉｎ ｖｉｔｒ
ｏで、ｅｘ ｖｉｖｏで、またはｉｎ ｖｉｖｏで導入するためのウイルス性ま
たは非ウイルス性の手段を含む。ウイルスベクターは、以下にさらに詳細に示す
ように、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックス、バキュロウイルス、
ワクシニア、単純ヘルペス、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ（エプスタイン−バー）
およびアデノウイルスベクターが含まれる。非ウイルスベクターには、プラスミ
ド、リポソーム、帯電した脂質（サイトフェクチン）、ＤＮＡ蛋白質複合体、お
よびバイオポリマーが含まれる。核酸の他、ベクターは、１つまたは複数の調節
領域を含み、かつ／または選択、測定、および核酸移入結果（その組織への移入
、発現期間など）のモニタリングに有用な選択可能なマーカーも含むことができ
る）。

【００３８】 「クローニングベクター」は、別のＤＮＡセグメントを結合することができて
その結合したセグメントの複製が生じるような、プラスミドやファージ、コスミ
ドなどのレプリコンである。クローニングベクターは、１つの細胞タイプで複製
することができ、別の細胞タイプで発現することができる（「シャトルベクター
」）。

【００３９】 「カセット」は、特定の制限部位でベクターに挿入することができるＤＮＡの
セグメントを指す。ＤＮＡのセグメントは問題のポリペプチドをエンコードし、
カセットおよび制限部位は、転写および翻訳のためにカセットが適正なリーディ
ングフレームに確実に挿入されるように設計される。

【００４０】 細胞は、外因性または異種のＤＮＡを細胞内に導入するとき、そのようなＤＮ
Ａによって「トランスフェクション」された。細胞は、トランスフェクションさ
れたＤＮＡが表現変化を引き起こすとき、外因性または異種のＤＮＡによって「
形質転換」された。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに
（共有結合で）組み込むことができる。

【００４１】 「核酸分子」は、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン、ま
たはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシア
デノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはデオキシシジジン；
「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルポリマー形、あるいはホスホロチオエートや
チオエステルなど、これらの任意のホスホエステル類似体であって、一本鎖形ま
たは二重らせん状のものを指す。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、およ
びＲＮＡ−ＲＮＡらせんが可能である。核酸分子、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子
という用語は、分子の一次構造および二次構造のみを指し、任意の特定の三次形
態に限定されるものではない。したがってこの用語は、特に線形または環状ＤＮ
Ａ分子であることが見出された二本鎖ＤＮＡ（制限断片）、プラスミド、および
染色体を含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造について論じる際、本明細書では
、配列を、ＤＮＡの転写されていない鎖（すなわちｍＲＮＡと相同の配列を有す
る鎖）に沿って５′から３′の方向にのみ配列を与えるという通常の決まりに従
って記述することができる。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作がなさ
れたＤＮＡ分子である。

【００４２】 核酸分子は、温度および溶液のイオン強度の適切な条件下で一本鎖形の核酸分
子がアニールされて他の核酸分子になることができるとき、ｃＤＮＡやゲノムＤ
ＮＡ、ＲＮＡなどの別の核酸分子と「ハイブリダイズ可能」である（前掲のSamb
rook他参照）。温度およびイオン強度の条件により、ハイブリダイゼーションの
「ストリンジェンシー」が決まる。相同核酸の予備スクリーニングのため、Ｔm
５５°に対応する低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を使用す
ることができ、例えば５×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ、０.２５％乳、ホルムアミド
なし；または３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳである）。中程
度のストリンジェンシーであるハイブリダイゼーション条件は、より高いＴmに
対応し、例えば４０％ホルムアミドで５×または６×ＳＣＣである。高ストリン
ジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、最も高いＴmに対応し、例えば５
０％ホルムアミド、５×または６×ＳＣＣである。ハイブリダイゼーションは２
つの核酸が相補的配列を含むことを必要とし、ハイブリダイゼーションのストリ
ンジェンシーに左右されるが、塩基同士のミス対合が起こり得る。核酸をハイブ
リダイズするための適切なストリンジェンシーは核酸の長さおよび相補の程度に
依存し、これらの変数は当技術分野で周知である。２つのヌクレオチド配列同士
の類似性または相同性の程度が高くなるほど、これらの配列を有する核酸のハイ
ブリッドのためのＴmの値は大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的
な安定性（より高いＴmに対応する）は、以下の順で低下する。ＲＮＡ：ＲＮＡ
、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さがヌクレオチド１００個よりも長いハ
イブリッドでは、Ｔmを算出するための方程式が導かれた（前掲のSambrook他、
９.５０〜０.５１参照）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドとのハイ
ブリダイゼーションでは、ミス対合の位置がより重要になり、オリゴヌクレオチ
ドの長さがその特異性を決定する（前掲のSambrook他、１１.７〜１１.８参照）
。ハイブリダイズ可能な核酸の最短の長さは少なくともヌクレオチドが約１０個
の長さであることが好ましく、少なくともヌクレオチドが約１５個の長さである
ことが好ましく、その長さは少なくともヌクレオチドが約２０個の長さであるこ
とが好ましい。

【００４３】 特定の実施形態で、「標準ハイブリダイゼーション条件」という用語はＴmが
５５℃であることを指し、上述の条件を利用する。好ましい実施形態ではＴmが
６０℃であり、より好ましい実施形態ではＴ_mが６５℃である。

【００４４】 本明細書で使用する「オリゴヌクレオチド」という用語は、一般にヌクレオチ
ドが少なくとも１８個の核酸を指し、これは、ＡｋｔをエンコードするゲノムＤ
ＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子とハイブリダイズ可能なものであ
る。オリゴヌクレオチドは、例えば³²Ｐ−ヌクレオチドやビオチンなどの標識を
共有結合させることができるヌクレオチドで標識することができる。一実施形態
では、Ａｋｔをエンコードする核酸の存在を検出するために、標識されたオリゴ
ヌクレオチドをプローブとして使用することができる。さらに別の実施形態で、
オリゴヌクレオチド（その一方または両方を標識することができる）は、Ａｋｔ
の完全長または断片をクローニングするためのＰＣＲプライマーとして使用する
ことができ、あるいはＡｋｔをエンコードする核酸の存在を検出するために使用
することができる。別の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドはＡｋｔ
ＤＮＡ分子と共に三重らせんを形成することができる。一般に、オリゴヌクレオ
チドは合成によって調製され、好ましくは核酸合成装置で調製する。したがって
オリゴヌクレオチドは、チオエステル結合など、天然ではないホスホエステル類
似体結合により調製することができる。

【００４５】 ＤＮＡ「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれたとき、ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ状態で細胞内のポリペプチドに転写され翻訳され
る二本鎖ＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５′（アミノ）末端の開始コ
ドンと３′（カルボキシル）末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード
配列には、原核配列、真核ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核（例えば哺乳動物）Ｄ
ＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列も含めることができるが、
それだけには限定されない。コード配列が真核細胞内での発現を意図するもので
ある場合、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、通常、コード配列に
対し３′に位置付けられている。

【００４６】 転写および翻訳制御配列は、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターな
どのＤＮＡ調節配列であり、宿主細胞でのコード配列の発現をもたらすものであ
る。真核細胞では、ポリアデニル化信号は制御配列である。

【００４７】 「プロモーター配列」は、細胞内でＲＮＡポリメラーゼを結合することができ
、下流（３′方向）コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域で
ある。本発明を明確にするため、プロモーター配列を転写開始部位によってその
３′末端に結合し、上流（５′方向）に伸ばして、バックグラウンドよりも高い
検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基または要素が含まれ
るようにする。プロモーター配列内には、転写開始部位（例えばヌクレアーゼＳ
１を用いてマッピングすることにより都合よく画定される）、ならびにＲＮＡポ
リメラーゼの結合の原因となる蛋白質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出
される。

【００４８】 コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写するときに
細胞内で転写および翻訳制御配列の「制御下」にあり、次いでトランス−ＲＮＡ
でスプライスされ（コード配列がイントロンを含む場合）、コード配列によりエ
ンコードされた蛋白質に翻訳される。

【００４９】 本明細書で使用する「相同的」という用語は、その用語の文法的な形および綴
りの全ての変形例において、「共通の進化の起源を」有する蛋白質同士の関係を
指し、上科（例えば免疫グロブリン上科）からの蛋白質と、異なる種（例えばミ
オシンＬ鎖）からの相同蛋白質が含まれる（Reeck他、1987、Cell 50：667）。
このような蛋白質（およびそのエンコード遺伝子）は、その高度な配列類似性に
反映されるように、配列相同性を有する。

【００５０】 したがって「配列類似性」という用語は、その文法上の全ての形において、共
通の進化の起源を共有する可能性がありまたはその可能性がない蛋白質の核酸配
列またはアミノ酸配列同士の同一性または一致の程度を指す（上記Reeck他参照
）。しかし一般的な用法で、また本出願で、「相同的」という用語は、「非常に
」などの副詞で修飾された場合に配列類似性を指し、共通の進化の起源を指さな
いと考えられる。

【００５１】 特定の実施形態で、２つのＤＮＡ配列は、ヌクレオチドの少なくとも約５０％
（好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０％または９
５％）がＤＮＡ配列の明確にされた長さ全体を通して一致するとき、「実質上相
同的」でありまたは「実質上類似」している。実質上相同的な配列は、配列デー
タバンクまたはSouthern（サザン）ハイブリダイゼーション実験で利用可能な標
準のソフトウェアを使用して、例えばその特定のシステムに向けて明確に定めら
れたストリンジェントな条件下で、配列を比較することによって同定することが
できる。適切なハイブリダイゼーション条件を明確に定めることは当業者の範囲
内である。例えば、上記Maniatis他；上記 DNA Cloning、Vols. I & II；上記 N
ucleic Acid Hybridization を参照されたい。

【００５２】 「アンチセンス核酸」は、センス配列に相補的なヌクレオチドの配列である。
アンチセンス核酸は、センス鎖によりエンコードされたポリペプチドの発現を、
下方調節またはブロックするのに使用することができる。

【００５３】 転写および翻訳制御配列は、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターな
どのＤＮＡ調節配列であり、これが宿主細胞内でコード配列の発現をもたらす。
真核細胞では、ポリアデニル化シグナルは追加のタイプの制御配列である。

【００５４】 「シグナル配列」は、細胞の表面に発現するように、蛋白質のコード配列の最
初に含まれる。この配列は、シグナルペプチド、すなわち成熟ポリペプチドのＮ
末端をエンコードし、宿主細胞によってポリペプチドに転座が生じる。「転座シ
グナル配列」という用語は、本明細書ではこの種のシグナル配列を指すために使
用する。転座シグナル配列は、真核生物および原核生物由来の様々な蛋白質に関
連付けられた状態で見出すことができ、しばしば両方のタイプの生物体で機能的
である。

【００５５】 「調節領域」は、第２の核酸配列の発現を調節する核酸配列を意味する。調節
領域は、特定の核酸発現の当然の原因となる配列を含むことができ（相同領域）
、あるいは異なる蛋白質または合成蛋白質をも発現させる原因である異なる起源
の配列を含むことができる（異種領域）。特に、この配列は、真核遺伝子または
ウイルス遺伝子の配列でよく、あるいは、特異的または非特異的な手法、誘導的
または非誘導的な手法で誘導された、遺伝子の転写を刺激しまたは抑制する配列
でよい。調節領域には、複製の起点、ＲＮＡスプライス部位、プロモーター、エ
ンハンサー、転写終結配列、ポリペプチドを標的細胞の分泌経路に向けるシグナ
ル配列、およびプロモーターが含まれる。

【００５６】 「異種源」からの調節領域は、発現した核酸に自然には関連付けられていない
調節領域である。異種調節領域の中には、異なる種からの調節領域、異なる遺伝
子からの調節領域、ハイブリッド調節配列、および天然に存在せず当業者によっ
て設計された調節配列が含まれる。

【００５７】 「異種」ＤＮＡは、細胞内または細胞の染色体部位にもともと位置付けられて
いないＤＮＡを指す。異種ＤＮＡは、細胞に無関係な遺伝子を含むことが好まし
い。

【００５８】 「相同組換え」は、外来ＤＮＡ配列を別のＤＮＡ分子に挿入すること、例えば
染色体へのベクターの挿入を指す。ベクターは、相同組換えのため、特異的染色
体部位を標的とすることが好ましい。特異的相同組換えでは、ベクターが、染色
体の配列に対して十分に長い相同領域を含むことになり、それによってベクター
の相補的結合と染色体への取込みが可能になる。より長い相同領域とより高度な
配列類似性により、相同組換えの効率を高めることができる。

【００５９】 「ポリペプチド」は、共有結合したアミノ酸残基からなるポリマー化合物であ
る。アミノ酸は以下の一般構造を有する。

【化１】 アミノ酸は、側鎖Ｒに基づいて７つのグループに分類される：(１)脂肪族側鎖、
（２）水酸(ＯＨ)基を含む側鎖、（３）イオウ原子を含む側鎖、（４）酸性基ま
たはアミド基を含む側鎖、（５）塩基性基を含む側鎖、（６）芳香環を含む側鎖
、および（７）プロリン、すなわち側鎖がアミノ基に融合しているイミノ酸であ
る。本発明のポリペプチドは、少なくとも約１４個のアミノ酸を含むことが好ま
しい。

【００６０】 「蛋白質」は、生きている細胞で構造的または機能的な役割を果すポリペプチ
ドである。 ポリペプチドまたは蛋白質の「変形例」は、ポリペプチドまたは蛋白質から誘
導され、ポリペプチドまたは蛋白質の少なくとも１つの生物学的性質を保つ、任
意の類似体、断片、誘導体、または変異体である。ポリペプチドまたは蛋白質の
種々の変形例が天然に存在する。これらの変形例は、蛋白質をコードする構造遺
伝子のヌクレオチド配列の相違を特徴とする対立遺伝子変形例でよく、または種
々のスプライシングまたは翻訳後修飾を含んでよい。当業者なら、１つまたは複
数のアミノ酸の置換、欠失、付加、または交換を有する変形例を産生することが
できる。これらの変形例には、特に、（ａ）１つまたは複数のアミノ酸残基が保
存的または非保存的なアミノ酸で置換された変形例、（ｂ）１つまたは複数のア
ミノ酸がポリペプチドまたは蛋白質に付加された変形例、（ｃ）アミノ酸の１つ
または複数が置換基を含む変形例、および（ｄ）ポリペプチドまたは蛋白質が血
清アルブミンなどの別のポリペプチドに融合した変形例を含めることができる。
これらの変形例を得るための技法は、遺伝子による技法（抑制、欠失、変異など
）、化学的技法、および酵素による技法も含めて当業者に知られている。

【００６１】 そのような、代替のｍＲＮＡスプライシングの形および代替翻訳後修飾の形を
含む対立遺伝子変形例、類似体、断片、誘導体、変異体、および修飾によって、
ポリペプチドの生物学的性質を保つポリペプチドの誘導体が得られる場合、それ
らは本発明の範囲内に含まれるものとする。

【００６２】 「異種蛋白質」は、細胞内では自然には産生されない蛋白質を指す。 ２つのアミノ酸配列は、アミノ酸の約４０％よりも高い割合で同一であるとき
、または６０％よりも高い割合で類似しているとき（機能的に同一である）、「
実質上相同」でありまたは「実質上類似」である。類似または相同配列は、例え
ばＧＣＧ（Genetics Computer Group、Program Manual for the GCG Package、V
ersion7、Madison、Wisconsin）パイルアッププログラムを使用してアライメン
トを行うことにより、確認することが好ましい。

【００６３】 本明細書で「〜に対応する」という用語は、正確な位置が、類似性または相同
性が測定される分子と一致していようとまたは異なっていようと、類似配列また
は相同配列を指すために使用する。核酸配列またはアミノ酸配列のアライメント
はスペースを含むことができる。したがって、「〜に対応する」という用語は配
列の類似性を指し、アミノ酸残基またはヌクレオチド塩基のナンバリングを指す
ものではない。

【００６４】 Ａｋｔ蛋白質をエンコードする遺伝子 本発明は、細胞内でのＶＥＧＦの発現を刺激するために、Ａｋｔ蛋白質または
ポリペプチド、あるいはＡｋｔ蛋白質またはポリペプチドをエンコードする核酸
を使用することを企図するものである。Ａｋｔは、ＶＥＧＦの発現を刺激するこ
とが可能な、Ａｋｔの完全長または天然に存在する形あるいはその任意の断片を
含めたヒトＡｋｔ３蛋白質またはポリペプチドであることが好ましい。本明細書
で使用する「Ａｋｔ」はＡｋｔポリペプチドを指し、「ａｋｔ」はＡｋｔポリペ
プチドをエンコードする遺伝子を指す。

【００６５】 様々なマウスおよびヒトＡｋｔ配列が、当技術分野で知られている（Coffer他
、1991、Eur. J. Biochem. 201：475〜481；Jones他、1991、Proc. Natl. Acad. Sci. 88：4171〜4175；Bellacosa他、1993、Oncogene、8：745〜754；GenBank
Accession No. M63167、X61037、およびX65687；および米国仮出願第60／125,10
8参照）。Ａｋｔは、ヒトＡｋｔ１（配列番号１１）、Ａｋｔ２（配列番号１２
）、またはＡｋｔ３（配列番号２）であることが好ましい。本発明による好まし
いＡｋｔは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む。本発明による好ましい
核酸は、配列番号２、配列番号１１、または配列番号１２に示されるアミノ酸配
列をエンコードする。核酸は、配列番号１で示す配列を含むことがより好ましい
。Ａｋｔは、ヒト以外の供給源から誘導することもできる。

【００６６】 本発明によれば、当業者の範囲内である従来の分子生物学、微生物学、および
組換えＤＮＡ技法を使用することができる。そのような技法は、文献で十分に記
載されている。例えば、Sambrook、Fritsch & Maniatis 、Molecular Cloning：
A Laboratory Manual、第２版（1989）Cold Spring Harbor Laboratory Press、
Cold Spring Harbor、New York（以下「Sambrook他、1989」とする）；DNA Clon
ing：A Practical Approach、第IおよびII巻（D.N.G. Glover編 1985）；Oligo
nucleotide Synthesis（M. J. Gait編 1984）；Nucleic Acid Hybidization［B
. D. Hames & S. J. Higgins編（1985）］；Transcripsion And Translation［B
. D. Hames & S. J. Higgin編（1984）］；Animal Cell Culture［R. I. Freshn
ey編（1986）］；Immobilized Cells And Enzymes［IRL Press、（1986）］；B.
Perbal、A Practical Guide To Molecular Cloning（1984）；F. M. Ausubel他
（編）、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons,Inc.（
1994）を参照されたい。

【００６７】 Ａｋｔをエンコードする遺伝子は、ゲノムＤＮＡであろうとｃＤＮＡであろう
と、任意の供給源、特にヒトｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーから分離するこ
とができる。上述のように、ａｋｔ遺伝子を得るための一般的な方法は当技術分
野で周知である（例えば前掲のSambrook他、1989参照）。

【００６８】 したがって、どの動物の細胞も、ａｋｔ遺伝子の分子クローニングのための核
酸源としての働きをすることができる可能性がある。ＤＮＡは、当技術分野で知
られている標準的な手順によってクローンＤＮＡ（例えばＤＮＡ「ライブラリー
」）から得ることができ、好ましくは、化学合成によって、ｃＤＮＡクローニン
グによって、またはゲノムＤＮＡのクローニングによって、またはその断片によ
って、所望の細胞から精製された蛋白質の発現レベルが高い組織（例えば心臓、
膵臓、骨格筋ｃＤＮＡ）から得られる（例えば、前掲のSambrook他、1989；Glov
er, D. M.（編）、1985、DNA Cloning：A Practcal Approach、MRL Press, Ltd.
、Oxford、U. K. Vol. I、II参照）。ゲノムＤＮＡから誘導されたクローンは、
コード領域の他に調節領域およびイントロンＤＮＡ領域を含むことができ、ｃＤ
ＮＡから得られたクローンは、イントロン配列を含まない。供給源が何であろう
と、遺伝子は、遺伝子の増殖のため、適切なベクターに分子上クローニングされ
るべきである。

【００６９】 ＤＮＡ断片が発生すると、所望のａｋｔ遺伝子を含む特定のＤＮＡ断片の同定
をいくつかの方法で行うことができる。例えばＤＮＡ断片は、核酸のハイブリダ
イゼーションによりスクリーニングを行って、標識プローブにすることができる
（Benton および Davis、1977、Science 196：180；Grunstein および Hogness
、1975、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72：3961）。プローブに対して十分に
相同性のあるこれらのＤＮＡ断片はハイブリダイズされる。上述のように、相同
性の程度が高いほど、よりストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を使
用することができる。特定の実施形態では、Northernハイブリダイゼーション条
件を使用して、ａｋｔ遺伝子のｍＲＮＡスプライシング変形例について同定する
。

【００７０】 例えば遺伝子が、等電点電気泳動アミノ酸組成物を有しまたは本明細書に開示
したＡｋｔ蛋白質の部分アミノ酸配列を有する蛋白質産物をエンコードする場合
、遺伝子の性質に基づいてほかの選択をすることができる。したがって遺伝子の
存在は、その発現産物の物理的、化学的、または免疫学的な性質をベースとした
アッセイにより検出することができる。例えば、ｃＤＮＡクローン、または適正
なｍＰＮＡをハイブリッド選択するＤＮＡクローンは、例えば類似または同一の
電気泳動移動度や、等電点電気泳動または非平衡ｐＨゲル電気泳動挙動、蛋白質
消化マップ、Ａｋｔに関して知られている抗原としての性質を有するタンパク質
を産生するものを選択することができる。特定の実施形態で、発現した蛋白質は
、ヒトＡｋｔに特異的なエピトープに対して発生したポリクローナル抗体によっ
て確認することができる。

【００７１】 本発明は、ＶＥＧＦの発現を刺激する能力を有するＡｋｔの対立遺伝子変形例
、スプライシング変形例、類似体、および誘導体をエンコードする遺伝子（例え
ばｃＤＮＡ）の使用にも関する。Ａｋｔ誘導体および類似体の産生および使用は
、本発明の範囲内である。このような変形例、類似体、誘導体、および相同体は
、ＶＥＧＦの発現を刺激する能力を保持するべきである。

【００７２】 Ａｋｔ誘導体は、機能的に等価な分子が提供されるように、置換、付加、また
は欠失によってエンコード核酸配列を変更することにより、作製することができ
る。天然のＡｋｔよりも機能的な活性が高くまたは増大した誘導体を作製するこ
とが好ましい。

【００７３】 ヌクレオチドコード配列の縮重により、ａｋｔ遺伝子と実質上同じアミノ酸配
列をエンコードする他のＤＮＡ配列を、単一のアミノ酸変形例を含むアミノ酸配
列も含め、本発明の実施の際に使用することができる。これらには、対立遺伝子
、他の種からの相同遺伝子、配列内の同じアミノ酸残基をエンコードし、したが
って目に見えない変化を生じる、異なるコドンでの置換によって変更されたａｋ
ｔ遺伝子の全てまたは一部を含むヌクレオチド配列が含まれるが、それだけには
限定されない。同様に本発明のＡｋｔ誘導体には、一次アミノ酸配列として、配
列内の残基に代えて機能的に等価なアミノ酸残基が使用され、それによって保存
的アミノ酸置換が生じる、変更された配列を含めて、Ａｋｔ蛋白質のアミノ酸配
列の全てまたは一部を含むものが含まれるが、一次アミノ酸配列はそれだけには
限定されない。例えば、配列内の１つまたは複数のアミノ酸残基を、機能的に等
価なものとして働き、目に見えない変化を生じる、同様の極性の別のアミノ酸で
置換することができる。配列内のアミノ酸に対する置換基は、アミノ酸が属する
クラスの他のメンバーから選択することができる。例えば非極性（疎水性）アミ
ノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルア
ラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれる。芳香環構造を含むアミ
ノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンである。極性が中
性のアミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、ア
スパラギン、およびグルタミンが含まれる。正に帯電した（塩基性）アミノ酸に
は、アルギニン、リシン、およびヒスチジンが含まれる。負に帯電した（酸性）
アミノ酸には、アスパラギン酸、およびグルタミン酸が含まれる。このような変
形例は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または等電点によって決定されたよう
に、見掛けの分子量に影響を及ぼさないことが予想される。

【００７４】 特に好ましい置換基は、 正の電荷を維持することができるように、Ａｒｇに対してはＬｙｓでありまた
その逆であり、 負の電荷を維持することができるように、Ａｓｐに対してはＧｌｕでありまた
その逆であり、 遊離−ＯＨを維持することができるように、Ｔｈｒに対してはＳｅｒであり、 遊離ＣＯＮＨ₂を維持することができるように、Ａｓｎに対してはＧｌｎであ
る。

【００７５】 アミノ酸置換基は、アミノ酸を特に好ましい性質に代えるために導入すること
もできる。例えばＣｙｓは、別のＣｙｓとのジスルフィド架橋が可能な部位を付
加するために導入することができる。Ｈｉｓは、特定の「触媒」部位として導入
することができる（すなわちＨｉｓは、酸または塩基として働くことができ、生
化学触媒の中で最も一般的なアミノ酸である）。Ｐｒｏは、その特に平面的な構
造により導入することができ、蛋白質の構造にβターンを引き起こす。

【００７６】 本発明のＡｋｔ誘導体および類似体をエンコードする遺伝子は、当技術分野で
知られている様々な方法によって産生することができる。その産生をもたらす操
作は、遺伝子または蛋白質レベルで行うことができる。例えば、クローンＡｋｔ
遺伝子配列は、当技術分野で知られている数多くの戦略のいずれかによって変更
することができる（上記Sambrook他、1989）。配列は、適切な部位で制限エンド
ヌクレアーゼにより切断することができ、その後、望むならさらに酵素修飾され
、分離され、ｉｎ ｖｉｔｒｏで連結される。Ａｋｔの誘導体または類似体をエ
ンコードする遺伝子の産生では、所望の活性がエンコードされる遺伝子領域内で
、翻訳停止シグナルによって中断されることのない状態で、変性遺伝子が同じ翻
訳リーディングフレーム内にＡｋｔ遺伝子として確実に残るようにするために注
意を払うべきである。

【００７７】 さらに、Ａｋｔエンコード核酸配列は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖ
ｏで変異して翻訳、開始、および／または終止配列を生成しかつ／または破壊す
ることができ、あるいはコード領域に変形例を生成しかつ／または新しい制限エ
ンドヌクレアーゼ部位を形成しまたは先に存在しているものを破壊することがで
き、その結果、さらにｉｎ ｖｉｔｒｏ変性を促進させることができる。このよ
うな変異では、変異したＡｋｔ遺伝子産物の機能的活性が向上することが好まし
い。当技術分野で知られている変異誘発のための任意の技法、すなわちｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ部位特異的突然変異誘発（Hutchinson, C. 他、1978、J.Biol. Chem. 2
53：6551；Zoller および Smith、1984、DNA 3：479〜488；Oliphant他、1986、
Gene 44：177；Hutchinson他、1986、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83：710
）、ＴＡＢ（登録商標）リンカー（Pharmacia）の使用などを含むがそれだけに
限定されない任意の技法を使用することができる。ＰＣＲ技法は、部位特異的突
然変異誘発に好ましい（PCR TechnologyのHiguchi、1989、「Using PCR to Engi
neer DNA」：Principles and Applications for DNA Amplification、H. Erlich
編、Stockton Press、Chapter 6、p.61〜70参照）。

【００７８】 次いで同定され分離された遺伝子を適切なクローニングベクターに挿入するこ
とができる。当技術分野で知られている多数のベクター−宿主系を使用すること
ができる。可能なベクターにはプラスミドまたは変性ウイルスが含まれるがこれ
らに限定されるものではなく、しかしベクター系は、使用される宿主細胞に適合
するものでなければならない。ベクターの例には、E. coli、λ誘導体などのバ
クテリオファージ、またはｐＢＲ３２２誘導体やｐＵＣプラスミド誘導体などの
プラスミドが含まれ、例えばｐＧＥＸベクターやｐｍａｌ−ｃ、ｐＦＬＡＧなど
があるが、これらに限定されない。クローニングベクターへの挿入は、例えば相
補的粘着末端を有するクローニングベクターにＤＮＡ断片を連結することによっ
て、行うことができる。しかし、ＤＮＡ断片に使用される相補的制限部位がクロ
ーニングベクターに存在しない場合、ＤＮＡ分子の末端を酵素修飾することがで
きる。あるいは、所望の任意の部位は、ヌクレオチド配列（リンカー）をＤＮＡ
末端に連結することによって生成することができ、これらの連結されたリンカー
は、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をエンコードする特定の化学的に合成され
たオリゴヌクレオチドを含むことができる。組換え分子は、形質転換、トランス
フェクション、感染、エレクトロポレーションなどによって宿主細胞に導入する
ことができ、したがって、多くの遺伝子配列のコピーが発生する。クローン遺伝
子はシャトルベクタープラスミド上に含まれることが好ましく、そうすると、ク
ローニング細胞、例えばE. coliでの膨張ならびに、望むなら後で行われる適切
な発現細胞系への挿入のための容易な精製がもたらされる。例えば、２種以上の
タイプの生物体で複製可能なベクターであるシャトルベクターは、E. coliプラ
スミドからの配列と酵母２μプラスミドからの配列を結合することによって、E.
coli と Saccharomyces cerevisiae の両方で複製を行うために調製することが
できる。

【００７９】 Ａｋｔポリペプチドの発現 Ａｋｔ、あるいはその抗原断片、誘導体、または類似体、あるいは機能的に活
性な誘導体であってそのキメラ蛋白質を含めた誘導体をコードするヌクレオチド
配列は、適切な発現ベクター、すなわち挿入された蛋白質コード配列の転写およ
び翻訳に必要な要素を含むベクターに挿入することができる。そのような要素を
本明細書では「プロモーター」と呼ぶ。したがって本発明の核酸は、本発明の発
現ベクターのプロモーターに動作可能に関連付けられている。ｃＤＮＡおよびゲ
ノム配列は、共に、そのような調節配列の制御下でクローニングし発現すること
ができる。発現ベクターは、複製起点を含むことも好ましい。

【００８０】 必要な転写および翻訳シグナルは、組換え発現ベクター上に提供することがで
き、またはこのシグナルは、Ａｋｔをエンコードする天然の遺伝子および／また
はその両側にある領域から供給することができる。１つの好ましい実施形態では
、Ａｋｔの発現は、心臓に特異的なプロモーターおよび／または心臓細胞に特異
的な親和性を有するベクターを使用し、心筋細胞に制限される。

【００８１】 可能性ある宿主−ベクター系には、ウイルス（例えばワクシニアウイルスやア
デノウイルスなど）に感染した哺乳類の細胞系；ウイルス（例えばバキュロウイ
ルス）に感染した昆虫の細胞系；酵母ベクターを含む酵母などの微生物；または
バクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡで形質
転換された細菌が含まれるがこれらに限定されない。ベクターの発現要素は、そ
の強度および特異性が様々である。利用される宿主−ベクター系に応じて、いく
つかの適切な転写および翻訳要素のいずれか１つを使用することができる。

【００８２】 組換えＡｋｔ蛋白質、あるいはその機能的断片、誘導体、キメラ構成、または
類似体は、組換えによるコード配列の取込み後、染色体によって発現することが
できる。この点で、いくつかの増幅系のいずれかを使用して、高レベルの安定な
遺伝子発現を実現することができる（前掲のSambrook他、1989参照）。

【００８３】 Ａｋｔをエンコードする核酸を含む組換えベクターを含んだ細胞は、細胞によ
るＡｋｔ発現をもたらす条件下、適切な細胞培養培地で培養することができる。
クローニングベクターにＤＮＡ断片を挿入するための前述の方法のいずれかを使
用して、適切な転写／翻訳制御シグナルと蛋白質コード配列からなる遺伝子を含
む発現ベクターを構成することができる。これらの方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組
換えＤＮＡおよび合成技法とｉｎ ｖｉｖｏ組換え（遺伝子組換え）を含むこと
ができる。

【００８４】 Ａｋｔポリペプチドをエンコードする核酸は、調節領域、すなわち当技術分野
で知られているプロモーター／エンハンサー要素によって動作可能に結合し制御
することができるが、これらの調節要素は、発現のために選択された宿主標的腫
瘍で機能的でなければならない。調節領域は、宿主細胞内での機能的転写のため
のプロモーター領域、ならびに問題の遺伝子の３′に位置する領域を含むことが
でき、これが転写の終結のシグナルとポリアデニル化部位を指定する。これらの
要素全てが発現カセットを構成する。

【００８５】 本発明で使用することができるプロモーターには、構成プロモーターおよび調
節（誘導）プロモーターが含まれる。プロモーターは、当然ながら核酸の発現の
原因となる可能性がある。プロモーターは異種の供給源からのものでよい。特に
、真核遺伝子またはウイルス遺伝子のプロモーター配列でよい。例えば、感染す
ることが望まれる細胞のゲノムから得られたプロモーター配列でよい。同様に、
アデノウイルス（Ｅ１ＡおよびＭＬＰ）やシトメガロウイルス、Rous Sarcoma V
irus（ラウス肉腫ウイルス）などのウイルスのゲノムから得られたプロモーター
配列でよい。さらに、プロモーターは、活性化または調節配列あるいは組織特異
的または優先的な発現が可能な配列を付加することによって、変性することがで
きる（エノラーゼおよびＧＦＡＰプロモーターなど）。さらに、核酸がプロモー
ター配列を含まないとき、挿入することができる。

【００８６】 本発明の実施に有用ないくつかのプロモーターは、偏在プロモーター（ubiqui
tous promoters）（例えば、ＨＰＲＴやビメンチン、アクチン、チューブリン）
、中間径フィラメントプロモーター（例えばデスミンや神経フィラメント、ケラ
チン、ＧＦＡＰ）、治療用遺伝子プロモーター（例えばＭＤＲタイプやＣＦＴＲ
、第VIII因子）、組織特異的プロモーター（例えば平滑筋細胞内のアクチンプロ
モーター）、細胞の分割の際に優先的に活性化するプロモーター、刺激に応答す
るプロモーター（例えばステロイドホルモン受容体やレチノイン酸受容体）、テ
トラサイクリン調節型転写モジュレーター、極初期シトメガロウイルス（ＣＭＶ
）、レトロウイルスＬＴＲ、メタロチオネイン、ＳＶ−４０、アデノウイルスＥ
１ａ、およびアデノウイルス主要後期（ＭＬＰ）プロモーターである。テトラサ
イクリン調節型転写モジュレーターおよびＣＭＶプロモーターはWO96／01313、U
S5,168,062、および5,385,839に記載されており、その内容を参照により本明細
書に組み込む。

【００８７】 より詳細には、Ａｋｔ蛋白質の発現は、当技術分野で知られている任意のプロ
モーター／エンハンサー要素によって制御することができるが、これらの調節要
素は、発現のために選択された宿主内で機能しなければならない。遺伝子発現の
制御に使用することができるプロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター領域
（Benoist および Chambon、1981、nature 290：304〜310）、Ｒｏｕｓ肉腫ウイ
ルスの３′ＬＴＰ（ロングターミナルリピート）に含まれるプロモーター（Yama
moto他、1980、Cell 22：787〜797）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター
（Wagner他、1981、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78：1441〜1445）、メタロ
チオネイン遺伝子の調節配列（Brinster他、1982、Nature 296：39〜42）；β−
ラクタマーゼプロモーターなどの原核発現ベクター（Villa−Kamaroff他、1978
、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75：3727〜3731）、またはｔａｃプロモータ
ー（DeBoer他、1983、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80：21〜25）；Scientif
ic American、1980、242：74〜94の「Useful proteins from recombinant bacte
ria」も参照；Ｇａｌ４プロモーターなど、酵母または他の菌類からのプロモー
ター要素、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホス
フォグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリ性ホスファターゼプロモー
ター；および組織特異性を示し形質転換された動物に利用される動物転写制御領
域：膵臓腺房細胞で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Swift他、1984、Cel
l 38：639〜646；Ornitz他、1986、Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50
：399〜409；MacDonald、1987、Hepatology 7：425〜515）；膵臓β細胞で活性
なインスリン遺伝子制御領域（Hanahan、1985、Nature 315：115〜122）、リン
パ系細胞で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Grosschedl他、1984、Cell 3
8：647〜658；Adames他、1985、Nature 318：533〜538；Alexander他、1987、Mo
l. Cell. Biol. 7：1436〜1444）、精巣、胸部、リンパ系、およびマスト細胞で
活性なマウス乳房腫瘍ウイルス制御領域（Leder他、1986、Cell 45：485〜495）
、肝臓で活性なアルブミン遺伝子制御領域（Pinkert他、1987、Genes and Devel
. 1：268〜276）、肝臓で活性なαフェトプロテイン遺伝子制御領域（Krumlauf
他、1985、Mol. Cell. Biol. 5：1639〜1648；Hammer他、1987、Science 235：5
3〜58）、肝臓で活性なα１アンチトリプシン遺伝子制御領域（Kelsey他、1987
、Genes and Devel. 1：161〜171）、骨髄細胞で活性なβグロブリン遺伝子制御
領域（Mogram他、1985、Nature 315：338〜340；Kollias他、1986、Cell 46：89
〜94）、脳のオリゴデンドログリア細胞で活性なミエリン塩基性蛋白質遺伝子制
御領域（Readhead他、1987、Cell 48：703〜712）、骨格筋で活性なミオシン軽
鎖２遺伝子制御領域（Sani、1985、Natuer 314：283〜286）、および視床下部で
活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Mason他、1986、Science
234：1372〜1378）が含まれるが、それだけには限定されない。

【００８８】 Ａｋｔの発現は、心臓に特異的なプロモーター、または心臓に特異的な親和性
を有するベクターを使用して、心筋細胞に限定することが好ましい。

【００８９】 Ａｋｔ蛋白質をエンコードする核酸含む発現ベクターは、５種類の一般的な手
法、すなわち（ａ）所望のプラスミドＤＮＡまたは特定のｍＲＮＡのＰＣＲ増幅
、（ｂ）核酸ハイブリダイゼーション、（ｃ）選択マーカー遺伝子機能が存在す
ることまたは存在しないこと、（ｄ）適切な制限エンドヌクレアーゼによる分析
、および（ｅ）挿入した配列の発現によって同定することができる。第１の手法
では、核酸をＰＣＲによって増幅することができ、その結果、増幅された産物の
検出が可能になる。第２の手法では、発現ベクターに挿入された外来遺伝子の存
在が、挿入されたマーカー遺伝子と相同な配列を含んだプローブを使用する核酸
ハイブリダイゼーションによって検出することができる。第３の手法では、ベク
ターへの外来遺伝子の挿入によって引き起こされた、ある特定の「選択マーカー
」遺伝子機能（例えばβ−ガラクトシダーゼ活性やチミジンキナーゼ活性、抗生
物質に対する耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスの密着体（occlusion bo
dy）形成など）が存在しているか存在していないかに基づいて、組換えベクター
／宿主系を同定し選択することができる。別の例では、Ａｋｔをエンコードする
核酸がベクターの「選択マーカー」遺伝子配列内に挿入された場合、Ａｋｔイン
サートを含む組換え体は、遺伝子機能が存在しないことによって同定することが
できる。第４の手法では、適切な制限酵素による消化によって、組換え発現ベク
ターを同定することができる。第５の手法では、組換え発現ベクターは、組換え
によって発現した遺伝子産物の活性、生化学的、または免疫学的な特性に関して
アッセイを行うことによって同定することができるが、この場合、発現した蛋白
質は機能的に活性なコンフォメーションであると想定する。

【００９０】 ＡｋｔＤＮＡ配列の発現には、広く様々な宿主／発現ベクターの組合せを使用
することができる。有用な発現ベクターは、例えば、染色体、非染色体、合成Ｄ
ＮＡの配列のセグメントからなるものでよい。適切なベクターには、ＳＶ４０の
誘導体と既知の細菌プラスミドが含まれ、例えば、E. coliプラスミドcol E1、
ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａ１−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ（Smith他、1988
、Gene 67：31〜40）、ｐＭＢ９およびその誘導体、ＲＰ４などのプラスミド；
ファージＤＮＡＳ、例えばファージ１の多数の誘導体、例えばＮＭ９８９、およ
び他のファージＤＮＡ、例えばＭ１３および線状一本鎖ファージＤＮＡ；２ｍプ
ラスミドやその誘導体などの酵母プラスミド；昆虫または哺乳類の細胞に有用な
ベクターなど、真核細胞に有用なベクター；ファージＤＮＡまたは他の発現制御
配列をを使用するために変性されたプラスミドなど、プラスミドとファージＤＮ
Ａの組合せから得られるベクターなどがある。

【００９１】 例えばバキュロウイルス発現系では、ｐＶＬ９４１（ＢａｍＨ１クローニング
部位；Summers）やｐＶＬ１３９３（ＢａｍＨ１、ＳｍａＩ、ＸｂａＩ、Ｅｃｏ
Ｒ１、ＮｏｔＩ、ＸｍａIII、ＢｇｌII、およびＰｓｔＩクローニング部位；Inv
itrogen）、ｐＶＬ１３９２（ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ、ＮｏｔＩ、ＸｍａIII、Ｅ
ｃｏＲＩ、ＸｂａＩ、ＳｍａＩ、およびＢａｍＨ１クローニング部位；Summers
および Invitrogen）、ｐＢｌｕｅＢａｃIII（ＢａｍＨ１、ＢｇｌII、ＰｓｔＩ
、ＮｃｏＩ、およびＨｉｎｄIIIクローニング部位、青／白組換えスクリーニン
グが可能；Invitrogen）などであるがこれらに限定されない非融合トランスファ
ーベクターと、ｐＡｃ７００（ＢａｍＨ１およびＫｐｎＩクローニング部位、Ｂ
ａｍＨ１認識部位が開始コドンで始まる；Summers）やｐＡｃ７０１およびｐＡ
ｃ７０２（ｐＡｃ７００と同じでありリーディングフレームが異なる）、ｐＡｃ
３６０（ＢａｍＨ１クローニング部位３６塩基対 ポリヘドリン開始コドンの下
流；Invitrogen (195)）、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（３つの異なるリ
ーディングフレーム、ＢａｍＨ１、ＢｇｌII、ＰｓｔＩ、ＮｃｏＩ、およびＨｉ
ｎｄIIIクローニング部位、ＰｒｏＢｏｎｄ精製用Ｎ末端ペプチド、およびプラ
ークの青／白組換えスクリーニング；invitrogen (220)）などであるがこれらに
限定されない融合トランスファーベクターの、両方を使用することができる。

【００９２】 本発明での使用が企図される哺乳類発現ベクターには、ジヒドロ葉酸レダクタ
ーゼ（ＤＨＦＲ）プロモーターなどの誘導的プロモーターを有するベクターが含
まれ、例えば、ＤＨＦＲ発現ベクターを有する任意の発現ベクターや、ＤＨＦＲ
／メトトレキセート同時増幅ベクターなどであって、例えばｐＥＤ（ＰｓｔＩ、
ＳａｌＩ、ＳｂａＩ、ＳｍａＩ、およびＥｃｏＲＩクローニング部位、クローン
遺伝子とＤＨＦＲの両方を発現するベクターを有する；Kaufman、Current Proto
cols in Molecular Biology、16.12 (1991)）などがある。あるいは、ｐＥＥ１
４などのグルタミン合成酵素／メチオニンスルホキシミン同時増幅ベクターであ
る（ＨｉｎｄIII、ＸｂａＩ、ＳｍａＩ、ＳｂａＩ、ＥｃｏＲＩ、およびＢｃｌ
Ｉクローニング部位、ベクターがグルタミン合成酵素およびクローン遺伝子を発
現させる；Celltech）。別の実施形態では、Epstein Barr Virus（ＥＢＶ）の制
御下でエピソーム発現を行うベクターを使用することができ、ｐＲＥＰ４（Ｂａ
ｍＨ１、ＳｆｉＩ、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄIII、ＮｈｅＩ、
ＰｖｕII、およびＫｐｎＩクローニング部位、構成ラウス肉腫ウイルスロングタ
ーミナルリピート（ＲＳＶ−ＬＴＲ）プロモーター、ヒグロマイシン選択性マー
カー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）や、ｐＣＥＰ４（ＢａｍＨＩ、ＳｆｉＩ、Ｘｈｏ
Ｉ、ＮｏｔＩ、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄIII、ＮｈｅＩ、ＰｖｕII、およびＫｐｎＩ
クローニング部位、構成ヒトシトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）極初期遺伝子、ヒ
グロマイシン選択性マーカー；Invitrogen）、ｐＭＥＰ４（ＫｐｎＩ、ＰｖｕＩ
、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄIII、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＳｆｉＩ、ＢａｍＨ１クロー
ニング部位、誘導的メタロチオネインIIａ遺伝子プロモーター、ヒグロマイシン
選択性マーカー；Invirtogen）、ｐＲＥＰ８（ＢａｍＨｉ、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ
、ＨｉｎｄIII、ＮｈｅＩ、およびＫｐｎＩクローニング部位、ＲＳＶ−ＬＴＲ
プロモーター、ヒスチジノール選択性マーカー；Invitrogen）、ｐＲＥＰ９（Ｋ
ｐｎＩ、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄIII、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＳｆｉＩ、およびＢａ
ｍＨＩクローニング部位、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、Ｇ４１８選択性マーカ
ー；Invitrogen）、ｐＥＢＶＨｉｓ（ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ヒグロマイ
シン選択性マーカー、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂を介して精製可能でありエンテロキナ
ーゼによって切断されたＮ末端ペプチド；Invitrogen）などがある。本発明での
使用に際して選択可能な哺乳類発現ベクターには、ｐＲｃ／ＣＭＶ（ＨｉｎｄII
I、ＢｓｔＸＩ、ＮｏｔＩ、ＳｂａＩ、およびＡｐａＩクローニング部位、Ｇ４
１８選択；Invitrogen）、ｐＲｃ／ＲＳＶ（ＨｉｎｄIII、ＳｐｅＩ、ＢｓｔＸ
Ｉ、ＮｏｔＩ、ＸｂａＩクローニング部位、Ｇ４１８選択；Invitrogen）、およ
びその他のものが含まれる。本発明により使用されるワクシニアウイルス哺乳類
発現ベクター（上記Kaufman、1991参照）には、ｐＳＣ１１（ＳｍａＩクローニ
ング部位、ＴＫ−およびβ−ｇａｌ選択）、ｐＭＪ６０１（ＳａｌＩ、ＳｍａＩ
、ＡｆｌＩ、ＮａｒＩ、ＢｓｐＭＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＡｐａＩ、ＮｈｅＩ、Ｓａ
ｃＩＩ、ＫｐｎＩ、およびＨｉｎｄIIIクローニング部位；ＴＫ−およびβ−ｇ
ａｌ選択）、およびｐＴＫｇｐｔＦ１Ｓ（ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、Ａ
ｃｃＩ、ＨｉｎｄII、ＳｂａＩ、ＢａｍＨＩ、およびＨｐａクローニング部位、
ＴＫまたはＸＰＲＴ選択）が含まれるがこれらに限定されない。

【００９３】 本発明によれば、Ａｋｔ蛋白質を発現させるために酵母発現系を使用すること
もできる。例えば本発明によれば、２種類だけ挙げると、非融合ｐＹＥＳ２ベク
ター（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＧｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｂ
ｓｔＸＩ、ＢａｍＨ１、ＳａｃＩ、Ｋｐｎ１、およびＨｉｎｄIIIクローニング
部位；Invitrogen）、または融合ｐＹＥＳＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（ＸｂａＩ、Ｓｐｈ
Ｉ、ＳｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨ１、ＳａｃＩ、Ｋ
ｐｎ１、およびＨｉｎｄIIIクローニング部位、ＰｒｏＢａｎｄ樹脂で精製され
エンテロキナーゼで切断されたＮ末端ペプチド；Invitrogen）を使用することが
できる。

【００９４】 特定の組換えＤＮＡ分子を同定し分離した後、当技術分野で知られているいく
つかの方法を使用してその分子を増殖することができる。適切な宿主系および成
長条件を確立すると、組換え発現ベクターを多量に増殖し調製することができる
。先に述べたように、使用することができる発現ベクターには、２〜３種類挙げ
ると、以下のベクターまたはその誘導体が含まれ、すなわちワクシニアウイルス
やアデノウイルスなどのヒトウイルスまたは動物ウイルス；バキュロウイルスな
どの昆虫ウイルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えばλ）、
およびプラスミドおよびコスミウドＤＮＡベクターが含まれるが、これらに限定
されない。

【００９５】 さらに、挿入された配列を発現をモジュレートし、または所望の特定の手法で
遺伝子産物を変性し処理することができる宿主細胞株を選択することができる。
種々の宿主細胞は、蛋白質の翻訳および翻訳後の処理および修飾のための特徴お
よび特定のメカニズムを有する。適切な細胞系または宿主系を選択して、発現し
た外来蛋白質の所望の修飾および処理が確実に行われるようにすることができる
。酵母内での発現は、生物学的に活性な産物を産生することができる。真核細胞
での発現は、「自然」フォールディングの可能性を高めることができる。さらに
、哺乳類細胞での発現は、Ａｋｔ活性を再構成しまたは構成するための道具をも
たらすことができる。さらに、種々のベクター／宿主発現系は、蛋白質切断など
の処理反応に種々の程度で影響を及ぼす可能性がある。

【００９６】 ベクターは、当技術分野で知られている方法によって所望の宿主細胞に導入す
ることができ、例えばトランスフェクションやエレクトロポレーション、マイク
ロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カル
シウム沈降法、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子ガンの使用、また
はＤＮＡベクタートランスポーターがある（例えばWu他、1992、J. Biol. Chem.
267：963〜967；WuおよびWu、1988、J. Biol. Chem. 263：14621〜14624；Hart
mut他、1990年3月15日出願のカナダ特許出願第2,012,311号参照）。

【００９７】 可溶性の形の蛋白質は、培養流体を収集することによって、または封入体を可
溶化することによって、例えば界面活性剤の処理によって、また望むなら音波処
理または上述のその他の機械的プロセスによって、得ることができる。可溶化し
た、または可溶性の蛋白質は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）や
等電点電気泳動、二次元ゲル電気泳動、クロマトグラフィ（例えばイオン交換や
親和性、免疫親和性、サイズカラムクロマトグラフィ）、遠心分離、示差溶解度
、免疫沈降法、あるいは蛋白質を精製するための任意のその他の標準的な技法な
ど、様々な技法を使用して分離することができる。

【００９８】 遺伝子療法およびトランスジェニックベクター 上記論じたように、本発明は、ＶＥＧＦ、すなわち血管形成を誘発する蛋白質
の発現を刺激するＡｋｔ蛋白質の能力に関する。したがって本発明は、Ａｋｔ蛋
白質をエンコードする核酸を虚血状態に罹っている患者に投与するという遺伝子
療法を含む。虚血状態には、脳血管虚血、腎虚血、肺虚血、四肢虚血、抹消動脈
疾患、間欠性跛行、心筋虚血症、あるいは虚血性、特発性、または肥大性の心筋
症を含めることができる。

【００９９】 核酸エンコードＡｋｔ、すなわち適切にベクターに取り込まれたものと、それ
らを含有する医薬品組成物は、虚血組織の治療に使用することができる。これら
は遺伝子を任意のタイプの虚血組織、特に心臓の組織にｉｎ ｖｉｖｏで移入し
発現させるのに使用することができる。さらにこの治療は、治療すべき病状に従
って目標を定めることができる（特定の組織への移入は、特にベクターの選択に
よって決定することができ、発現は特定のプロモーターの選択による）。本発明
の核酸またはベクターは、ＶＥＧＦ蛋白質の発現を刺激することが可能なＡｋｔ
蛋白質を、ヒトまたは動物でｉｎ ｖｉｖｏ状態でかつ細胞内で産生するのに使
用することが有利である。したがって本発明によれば、虚血を特異的に局所的に
かつ効果的に治療することが可能になる。

【０１００】 Ａｋｔをエンコードする核酸は、単独で、または血管由来因子をエンコードす
る核酸と組み合せて投与することができる。既知の血管由来因子には、塩基性お
よび酸性の線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦおよびａＦＧＦ）、ＦＧＦ−５（米国
特許第5,661,133号）、内皮細胞成長因子（Pu他、1993、Circulation 88：208〜
2156）、アンギオポイエチンおよびＶＥＧＦ（総説についてはMelillo他、1997
およびLewis他、1997参照）が含まれる。ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ₁₂₁（米国特許第
5,219,739号）、ＶＥＧＦ₁₆₅（米国特許第5,332,672号）、ＶＥＧＦ₁₈₉（米国特
許第5,240,848号）、ＶＥＧＦ₂₀₆、ＶＥＧＦ−２（WO95／24473；WO96／39515）
、ＶＥＧＦ−Ｂ（米国特許第5,607,918号および第5,840,693号）、およびＶＦＧ
Ｆ−Ｄ（WO97／12972）を含む、いくつかの形のものが確認されている。Ａｋｔ
蛋白質をエンコードする核酸は、ＣｏＣｌ₂などの遷移金属イオンと組み合せて
投与することもでき、それによってＶＥＧＦの発現が高められ、血管新生を刺激
することが示された（米国特許第5,480,975号）。

【０１０１】 上記論じたように、「ベクター」は、本発明による核酸を宿主細胞に移入する
ための任意の手段である。好ましいベクターは、レトロウイルスやヘルペスウイ
ルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクターである。し
たがって、Ａｋｔ蛋白質またはポリペプチドをエンコードする遺伝子は、ｉｎ
ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで、ウイルスベクターを使
用して導入され、あるいはＤＮＡの直接導入によって導入される。標的組織での
発現は、ウイルスベクターや受容体配位子などを用いてトランスジェニックベク
ターを特定の細胞に向けることによって行うことができ、または組織特異性プロ
モーターを使用することによって行うことができ、あるいはその両方によって行
うことができる。

【０１０２】 ｉｎ ｖｉｖｏターゲッティングおよび治療手順に一般に使用されるウイルス
ベクターは、ＤＮＡベースのベクターおよびレトロウイルスベクターである。ウ
イルスベクターを構成し使用するための方法は、当技術分野で知られている［例
えばMillerおよびRosman、BioTechniques 7：980〜990（1992）参照］。ウイル
スベクターは、複製欠陥があることが好ましく、すなわちウイルスベクターは、
標的細胞内で自律的に複製することができないことが好ましい。一般に、本発明
の範囲内で使用される複製欠陥ウイルスベクターのゲノムは、感染した細胞内で
ウイルスの複製に必要な少なくとも１つの領域が欠けている。これらの領域は、
なくすことができ（全体的にまたは部分的に）、あるいは当業者に知られている
任意の技法によって非機能的にすることができる。これらの技法には、全体的な
除去、置換（他の配列で、特に挿入された核酸で）、部分欠失、または本質的な
（複製に）領域への１つまたは複数の塩基の付加が含まれる。このような技法は
、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（分離されたＤＮＡ上）でまたはｉｎ ｓｉｔｕで、遺伝子
操作の技法を使用して、または突然変異誘発剤を用いた治療によって行うことが
できる。複製欠陥ウイルスは、そのゲノムの配列、すなわちウイルス粒子を封入
するのに必要な配列を保持することが好ましい。

【０１０３】 ＤＮＡウイルスベクターには、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）や乳頭腫ウイ
ルス、Epstein Barrウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス
（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルスなどであるがこれらに限定されない弱毒または
欠陥ＤＮＡウイルスが含まれる。全体またはほぼ全体にウイルス遺伝子のない欠
陥ウイルスが好ましい。欠陥ウイルスは、細胞内への導入後に複製を行う能力が
なく、したがってウイルス感染に至らない。欠陥ウイルスベクターでは、このベ
クターによって他の細胞が感染するという心配がなく、特定の局所的な領域の細
胞への投与が可能になる。したがって、特定の組織を特に標的とすることができ
る。特定のベクターの例には、欠陥ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）ベクター［
Kaplitt他、Molec. Cell. Neurosci. 2：320〜330（1991）］、糖蛋白質Ｌ遺伝
子がない欠陥ヘルペスウイルスベクター［特許公報RD371005A］、または他の欠
陥ヘルペスウイルスベクター［国際特許公開No. WO94／21807、1994年9月29日公
開；国際特許公開No. WO92／05263、1994年4月2日公開］；Stradford−Perricau
det他により記述されているベクターなどの弱毒アデノウイルスベクター［J. Cl
in. Invest. 90：626〜630（1992）；La Salle他、Science 259：988〜990（199
3）も参照］；および欠陥アデノ随伴ウイルスベクター［Samulski他、J. Virol.
61：3096〜3101（1987）；Samulski他、J. Virol. 63：3822〜3828（1989）；L
ebkowski他、Mol. Cell. Biol. 8：3988〜3996（1988）］が含まれるがこれらに
限定されない。

【０１０４】 ｉｎ ｖｉｖｏ投与では、ウイルスベクターおよびトランスフェクションされ
た細胞の免疫失活を避けるため、適切な免疫抑制治療を、ウイルスベクター、例
えばアデノウイルスベクターと共に使用することが好ましい。例えば、インター
ロイキン−１２（ＩＬ−１２）やインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、抗ＣＤ
４抗体などの免疫抑制サイトカインを投与して、ウイルスベクターに対する体液
性または細胞性の免疫応答をブロックすることができる［例えばWilson、Nature
Medicine（1995）参照］。さらに、最小限の数の抗原を発現するように設計さ
れたウイルスベクターを使用することが有利である。

【０１０５】 当然ながら本発明は、遺伝子治療の適用分野に関して治療上有効な量のＡｋｔ
を発現するベクターの送達を企図するものである。「治療上有効な量」という言
いまわしは、本明細書では、臨床上非常に重い宿主の虚血状態を改善するのに十
分な量、という意味を表すために使用する。

【０１０６】 アデノウイルスベクター 好ましい実施形態では、ベクターはアデノウイルスベクターである。アデノウ
イルスは、本発明の核酸が様々な細胞タイプに効果的に送達されるように変性す
ることができる、真核ＤＮＡウイルスである。様々な血清型のアデノウイルスが
存在する。これらの血清型の中で、本発明の範囲に含まれるものとして好ましい
ものは、タイプ２またはタイプ５のヒトアデノウイルス（Ａｄ２またはＡｄ５）
、あるいは動物由来のアデノウイルスの使用である（WO94／26914参照）。本発
明の範囲内で使用することができる動物由来のこれらのアデノウイルスには、イ
ヌ、ウシ、マウス（例：Mav1、Beard他、Virology 75（1990）81）、ヒツジ、ブ
タ、トリ、およびサル（例：ＳＡＶ）由来のアデノウイスが含まれる。動物由来
のアデノウイルスはイヌアデノウイルスが好ましく、ＣＡＶ２アデノウイルス（
例えばManhattanまたはＡ２６／６１株（ＡＴＣＣ ＶＲ−８００）など）がよ
り好ましい。

【０１０７】 本発明の複製欠陥アデノウイルスベクターは、ＩＴＲ、エンキャプシド配列、
および、問題の核酸を含むことが好ましい。アデノウイルスベクターノ少なくと
もＥ１領域は非機能的であることがさらに好ましい。Ｅ１領域の欠失は、Ａｄ５
アデノウイルスの配列のヌクレオチド４５５から３３２９まで（ＰｖｕII−Ｂｇ
１II断片）、または３８２から３４４６まで（ＨｉｎｆII−Ｓａｕ３Ａ断片）延
びていることが好ましい。他の領域、特にＥ３領域（WO95／02697）、Ｅ２領域
（WO94／28928）、Ｅ４領域（WO94／28152、WO94／12649、およびWO95／02697）
、または後期遺伝子Ｌ１〜Ｌ５のいずれかを変性させることもできる。

【０１０８】 好ましい実施形態で、アデノウイルスベクターはＥ１領域に欠失部分を有する
（Ａｄ１.０）。Ｅ１欠失アデノウイルスの例はEP185,573に開示されており、そ
の内容を参照により本明細書に取り込む。別の好ましい実施形態では、アデノウ
イルスベクターはＥ１領域およびＥ４領域に欠失部分を有する（Ａｄ３.０）。
Ｅ１／Ｅ４欠失アデノウイルスの例がWO95／02697およびWO96／22378に開示され
ており、その内容を参照により本明細書に組み込む。さらに別の実施形態では、
アデノウイルスベクターはＥ１領域に欠失部分を有し、その領域内にはＥ４領域
および核酸配列が挿入されている（FR94 13355参照、その内容を参照により本明
細書に取り込む）。

【０１０９】 本発明による複製欠陥組換えアデノウイルスは、当業者に知られている任意の
技法によって調製することができる（Levrero他、Gene 101（1991）195、EP1855
73；Graham、EMBO J. 3（1984）2917）。特にこのウイルスは、アデノウイスル
と、特に問題のＤＮＡ配列を保持するプラスミドとの相同的組換えによって調製
することができる。相同的組換えは、アデノウイルスおよびプラスミドを適切な
細胞株にコトランスフェクションした後に行われる。使用される細胞株は、好ま
しくは（ｉ）前記要素によって形質転換が可能であるべきであり、（ii）複製欠
陥アデノウイルスのゲノムの一部を相補することが可能な配列を含むべきであっ
て、好ましくは組換えのリスクを回避するために一体化した形で含むべきである
。使用することができる細胞株の例は、そのゲノムと一体化したＡｄ５アデノウ
イルス（１２％）のゲノムの左側部分を含むヒト胚腎臓細胞株２９３（Grahamｍ
他、J. Gen. Virol. 36（1977）59）と、Ｅ１およびＥ４機能を相補することが
可能な細胞株であって、出願WO94／26914およびWO95／02697に記載されているも
のである。組換えアデノウイルスは、当業者に周知の標準的な分子生物学的技法
を使用して回収され精製される。

【０１１０】 アデノ随伴ウイルスベクター アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、安定で部位特異的な手法により、感染させ
る細胞のゲノムと一体化させることが可能な比較的小さいサイズのＤＮＡウイル
スである。細胞の成長、形態、または分化にいかなる影響ももたらすことなく、
広い範囲の細胞をこのウイルスに感染させることができ、したがってこのウイル
スはヒトの病状に関与しないと考えられる。ＡＡＶゲノムはクローニングされ、
配列決定され、特徴付けられる。このゲノムは約４７００個の塩基を包含し、各
端部で約１４５個の塩基の逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域を含み、これがウイル
スに関する複製の起点としての役割を果たす。ゲノムの残りは、封入機能を保持
する２つの非常に重要な領域、すなわちウイルス複製およびウイルス遺伝子の発
現に関わるｒｅｐ遺伝子を含んだゲノムの左側部分と、ウイルスのキャプシド蛋
白質をエンコードするｃａｐ遺伝子を含んだゲノムの右側部分に分割される。

【０１１１】 遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏで移入するためにＡＡＶから得ら
れたベクターを使用することが記述されている（WO91／18088；WO93／09239；US
4,797,368、US5,139,941、EP488528参照）。これらの公報は、ｒｅｐおよび／ま
たはｃａｐ遺伝子が欠失して問題の遺伝子で置換されている様々なＡＡＶ由来構
成と、問題の前記遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏで（培養細胞に）またはｉｎ ｖｉ
ｖｏで（生物体に直接）移入するためにこれらの構成を使用することについて記
述している。本発明による複製欠陥組換えＡＡＶは、２つのＡＡＶ逆方向末端反
復（ＩＴＲ）領域が両側にある問題の核酸配列を含んだプラスミドと、ＡＡＶ封
入遺伝子（ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子）を保持するプラスミドとを、ヒト
ヘルパーウイルス（例えばアデノウイルス）に感染した細胞株にコトランスフェ
クションすることによって調製することができる。次いで生じたＡＡＶ組換え体
を標準的な技法によって精製する。

【０１１２】 したがって本発明は、ＡＡＶ由来組換えウイルスであって、そのゲノムが、Ａ
ＡＶＩＴＲが両側にあるＡｋｔ３をエンコードする核酸をエンコードする配列を
包含するウイルスにも関する。本発明は、ＡＡＶからの２つのＩＴＲが両側にあ
るＡｋｔ３をエンコードする核酸をエンコードする配列を包含するプラスミドに
も関する。このようなプラスミドは、核酸配列の移入の際にそのまま使用するこ
とができ、適切な場合にはこのプラスミドはリポソームベクター（偽性ウイルス
）に取り込まれる。

【０１１３】 レトロウイルスベクター 別の実施形態では、例えばAnderson他、米国特許第5,399,346号；Mann他、198
3、Cell 33：153；Temin他、米国特許第4,650,764号；Temin他、米国特許第4,98
0,289号；Markowitz他、1988、J. Virol. 62：1120；Temin他、米国特許第5,124
,263号；EP453242、EP178220；Bermsteom他 Genet. Eng. 7（1985）235；McCor
mick、BioTechnology 3（1985）689；Dougherty他による1995年3月16日公開の国
際特許公開No. WO95／07358；およびKuo他、1993、Blood 82：845に記載されて
いるように、遺伝子をレトロウイルスベクターに導入することができる。レトロ
ウイルスベクターは、分割細胞に感染する組込み型ウイルスである。レトロウイ
ルスゲノムは、２つのＬＴＲ、封入配列、および３つのコード領域（ｇａｇ、ｐ
ｏｌ、およびｅｎｖ）を含む。組換えレトロウイルスベクターでは、一般に、ｇ
ａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｅｎｖ遺伝子が全体的にまたは部分的に欠失
しており、問題の相同核酸配列で置換されている。これらのベクターは、ＨＩＶ
やＭｏＭｕＬＶ（「マウスMoloney（モロニー）白血病ウイルス」）、ＭＳＶ（
「マウスモロニー肉腫ウイルス」）、ＨａＳＶ（「Harvey（ハーベイ）肉腫ウイ
ルス」）、ＳＮＶ（「脾臓壊死ウイルス」）、ＲＳＶ（「Rous（ラウス）肉腫ウ
イルス」）、Friend（フレンド）ウイルスなど、種々のタイプのレトロウイルス
から構成することができる。欠陥レトロウイルスベクターはWO95／02697に開示
されている。

【０１１４】 一般に、核酸配列を含む組換えレトロウイルスを構成するために、ＬＴＲ、封
入配列、およびコード配列を含むプラスミドを構成する。この構成はパッケージ
ング細胞株のトランスフェクションに使用され、この細胞株は、プラスミドに欠
けているレトロウイルス機能をトランス形で供給することができるものである。
このようにパッケージング細胞株は、一般にｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およ
びｅｎｖ遺伝子を発現することができる。このようなパッケージング細胞株は従
来技術に記載されており、特に、細胞株ＰＡ３１７（US1,861,719）、ＰｓｉＣ
ＲＩＰ細胞株（WO90／02806）、およびＧＰ⁺ｅｎｖＡｍ^-１２細胞株（WO89／071
50）がある。さらに、組換えレトロウイルスベクターは、転写活性を抑制するた
めにＬＴＲ内に変異部分を含むことができ、同様に、ｇａｇ遺伝子の一部を含む
ことが可能な広範囲に及ぶ封入配列を含むこともできる（Bender他、J. Virol.
61（1987）1639）。組換えレトロウイルスベクターは、当業者に知られている標
準的な技法によって精製される。

【０１１５】 レトロウイルスベクターは、感染粒子として機能するように、またはトランス
フェクションが１回行われるように構成することができる。前者の場合、ウイル
スは、腫瘍形質転換の性質の原因となる遺伝子を除いてその遺伝子の全てを保つ
ように、かつ相同遺伝子を発現するように、変性する。非感染性ウイルスベクタ
ーは、ウイルスパッケージングシグナルを破壊するために、しかし相同遺伝子と
パッケージングシグナルを含むように設計された同時導入型ウイルスをパッケー
ジングするのに必要とされる構造遺伝子を保持するために調製される。したがっ
て、生成されるウイルス粒子は追加のウイルスを産生することができない。 標的遺伝子送達は、1995年10月に公開された国際特許公開WO95／28494に記載
されている。

【０１１６】 非ウイルスベクター 別法として、ベクターは、リポフェクションによりｉｎ ｖｉｖｏ状態で導入
することができる。核酸をｉｎ ｖｉｖｏで封入しトランスフェクションするた
めに、過去１０年間でリポソームの使用が増加してきた。リポソーム媒介トラン
スフェクションが直面する困難および危険が抑えられるように設計された合成カ
チオン脂質を使用して、マーカーをエンコードする遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏトラ
ンスフェクション用リポソームを調製することができる［Felgner他、Proc. Nat
l. Acad. Sci. U.S.A. 84：7413〜7414（1987）；Mackey他、Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 85：8027〜8031（1988）参照；Ulmer他、Science 259：1745〜174
8（1993）］。カチオン脂質を使用することにより、負に帯電した核酸の封入を
促進させることができ、負に帯電した細胞膜との融合も促進させることができる
［FelgnerおよびRingold、Science 337：387〜388（1989）］。核酸の移入に特
に有用な脂質化合物および組成物は、国際特許公開WO95／18863およびWO96／178
23と、米国特許第5,459,127号に記載されている。特定の器官に外因性遺伝子を
ｉｎ ｖｉｖｏ導入する際のリポフェクションの使用には、ある実用的な利点が
ある。特定の細胞に対するリポソームの分子標的は、ある領域の利益を表してい
る。トランスフェクションを特定の細胞タイプに向けることは、膵臓や肝臓、腎
臓、脳などの細胞異種性を有する組織において、特に有利になることが明らかで
ある。脂質は、標的のために他の分子に化学的に結合することができる［上記Ma
ckey他参照］。標的ペプチド、例えばホルモンや神経伝達物質と、抗体などの蛋
白質、または非ペプチド分子は、リポソームに化学的に結合することができる。

【０１１７】 核酸のｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクションを容易にするには、カチオンオリ
ゴペプチド（例えば国際特許公開WO95／21931）、ＤＮＡ結合蛋白質から得られ
たペプチド（例えば国際特許公開WO96／25508）、カチオンポリマー（例えば国
際特許公開WO95／21931）などの、他の分子も有用である。

【０１１８】 ベクターを、裸のＤＮＡプラスミドとしてｉｎ ｖｉｖｏで導入することも可
能である（米国特許第5,693,622号、第5,589,466号、および第5,580,859号参照
）。遺伝子療法のための裸のＤＮＡベクターは、当技術分野で知られている方法
、例えばトランスフェクションやエレクトロポレーション、マイクロインジェク
ション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈降法
、遺伝子ガンの使用、またはＤＮＡベクタートランスポーターなどによって、所
望の宿主細胞に導入することができる［例えばWu他、J. Biol. Chem. 267：963
〜967（1992）；WuおよびWu、J. Biol. Chem. 263：14621〜14624（1988）；Har
tmut他、1990年3月15日出願のカナダ特許出願第2,012,311号；Williams他、Proc
. Natl. Acad. Sci. USA 88：2726〜2730（1991）参照］。受容体媒介型ＤＮＡ
送達手法も使用することができる［Curiel他、Hum. Gene Ther. 3：147〜154（1
992）；WuおよびWu、J. Biol. Chem. 262：4429〜4432（1987）］。好ましい裸
のＤＮＡベクターには、条件付き複製起点を有するｐＣＯＲプラスミド（WO97／
10343参照）と、複製起点およびマーカー遺伝子がないミニサークルプラスミド
（WO96／26270参照）が含まれる。

【０１１９】 医薬品組成物および送達 本発明は、医薬品組成物にも関する。このような組成物は、上述のＡｋｔ蛋白
質またはポリペプチドあるいはＡｋｔ蛋白質またはポリペプチドをエンコードす
る核酸と、医薬品として許容される担体または賦形剤を含むことができる。本発
明の組成物は、遺伝子療法のための生物学的材料の形成に特に適している。した
がって好ましい実施形態では、組成物が、ヒトＡｋｔ蛋白質またはペプチドをエ
ンコードする核酸を含んでいる。

【０１２０】 組成物は、Ａｋｔ蛋白質、またはＡｋｔ蛋白質をエンコードする核酸を含むこ
とができる。組成物は、さらに、血管由来因子をエンコードする核酸を含むこと
ができる。既知の血管由来因子には、塩基性および酸性の線維芽細胞成長因子（
ｂＦＧＦおよびａＦＧＦ）、ＦＧＦ−５（米国特許第5,661,133号）、内皮細胞
成長因子（Pu他 1993、Circulation 88：208〜2156）、アンギオポイエチン、お
よびＶＥＧＦ（総説についてはMelillo他 1997およびLewis他 1997参照）が含ま
れる。ＶＥＧＦ₁₂₁（米国特許第5,219,739号）、ＶＥＧＦ₁₆₅（米国特許第5,332
,672号）、ＶＥＧＦ₁₈₉（米国特許第5,240,848号）、ＶＥＧＦ₂₀₆、ＶＥＧＦ−
２（WO95／24473；WO96／39515）、ＶＥＧＦ−Ｂ（米国特許第5,607,918号およ
び第5,840,693号）、およびＶＦＧＦ−Ｄ（WO97／12972）を含む、いくつかの形
のＶＥＧＦをエンコードする核酸が確認されている。組成物は、ＶＥＧＦ遺伝子
の発現を高めて血管新生を刺激することが示されるＣｏＣｌ₂などの遷移金属イ
オンも含むことができる（米国特許第5,480,975号）。Ａｋｔ蛋白質、またはＡ
ｋｔ蛋白質をエンコードする核酸も、血管拡張剤と共に投与することができる。
血管拡張剤の例には、ニトロ血管拡張剤（例えばニトロプルシドやニトログリセ
リン）、非特異的血管拡張剤（例えばヒルドラリジンやパパベリン）、アデノシ
ン受容体作動薬、カルシウム拮抗薬、α−遮断剤（例えばプラゾシン）、内因性
血管拡張剤ペプチドまたは関連するペプチド類似体（例えばサブスタンスＰ、Ｃ
ＧＲＰ）、Ｋチャネル賦活物質、ＡＣＥ阻害剤またはアンギオテンシン受容体遮
断剤、エンドセリン受容体遮断剤またはＥＣＥ阻害剤、および血管拡張剤プロス
タグランジンが含まれる。

【０１２１】 ウイルス性または非ウイルス性である本発明のどのベクターも、医薬品として
許容される賦形剤または担体にｉｎ ｖｉｖｏ導入されることが好ましい。「医
薬品として許容される」という言いまわしは、生理学的に耐えることができると
ともに、ヒトに投与したときに一般にアレルギーや異常亢進、眩暈などの同様の
有害反応を引き起こさない、分子そのものおよび組成物を指す。本明細書で使用
する「医薬品として許容される」という用語は、動物に使用するため、より具体
的にはヒトに使用するために、連邦政府または州政府の監督官庁によって承認さ
れ、あるいは米国薬局方または他の一般的に認可されている薬局方のリストに記
載されたことを意味することが好ましい。「担体」という用語は、希釈液、アジ
ュバント、医薬品添加物、または賦形剤であって、これらと共に組成物が投与さ
れるものを指す。このような医薬品担体は水や油などの無菌の液体にすることが
でき、石油、動物や植物由来の油、合成した油などであって、落花生油や大豆油
、鉱油、ゴマ油などが含まれる。担体として、特に注射可能な溶液とするために
、水または水溶液、食塩水とデキストロースおよびグリセロールの水溶液を使用
することが好ましい。適切な医薬品担体は、E. W. Martinにより「Remingon's P
harmaceutical Sciences」に記載されている。

【０１２２】 本発明の医薬品組成物は、局所投与、経口投与、非経口投与、鼻腔内投与、静
脈投与、筋肉投与、皮下投与、眼内投与などを目的に処方することができる。

【０１２３】 医薬品組成物は、注射可能な処方のため、医薬品として許容される賦形剤を含
むことが好ましい。これらは特に、無菌の等張食塩水液（一ナトリウムリン酸塩
または二ナトリウムリン酸塩、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム
、または塩化マグネシウムなど、あるいはこのような塩の混合物）、あるいは乾
燥組成物、特に凍結乾燥した組成物であって、無菌水または生理食塩水を適宜添
加することによって注射可能な溶液を形成することができるものでよい。

【０１２４】 組成物は、特に、等張性で無菌の食塩水（一ナトリウムリン酸塩または二ナト
リウムリン酸塩、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、または塩化
マグネシウムなど、あるいはこのような塩の混合物）、あるいは乾燥組成物、特
に凍結乾燥した組成物であって、無菌水または生理食塩水を場合に応じて添加す
ることによって注射可能な溶液を構成することができるものでよい。

【０１２５】 好ましい無菌の注射可能な製剤は、非毒性の非経口的に許容される溶媒または
希釈液に溶かした溶液または懸濁液にすることができる。医薬品として許容され
る担体または賦形剤の例は、食塩水、緩衝食塩水、等張食塩水（例えば一ナトリ
ウムリン酸塩または二ナトリウムリン酸塩、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩
化カルシウム、または塩化マグネシウムなど、あるいはこのような塩の混合物）
、Ringer（リンガー）溶液、デキストロース、水、無菌水、グリセロール、エタ
ノール、およびこれらの組合せである。１,３−ブタンジオールおよび無菌固定
油が、溶媒または懸濁媒質として都合良く使用される。合成モノグリセリドまた
は合成ジグリセリドを含めた任意の無刺激性の固定油を使用することができる。
オレイン酸などの脂肪酸も、注射可能な調剤として使用できることがわかってい
る。

【０１２６】 投与の際に単独でまたはベクターに組み入れた状態でに使用される本発明の核
酸の用量は、種々のパラメータに従って調整することができ、特に、使用される
投与形態、問題の病状、発現する遺伝子、または所望の治療期間に従って調整す
ることができる。概して本発明による組換えウイルスの場合、このウイルスは、
用量が１０⁴ｐｆｕから１０¹⁴ｐｆｕの間の形に処方され投与され、好ましくは
１０⁶〜１０¹⁰ｐｆｕである。ｐｆｕ（プラーク形成単位）という用語はウイル
スの溶液の感染力に該当し、適切な細胞培養の感染と、一般に４８時間後に行わ
れる感染した細胞のプラーク数の測定によって決定される。ウイルス溶液のｐｆ
ｕ力価の決定技法は、文献で十分に示されている。

【０１２７】 本発明の組成物は、非経口的にまたは経粘膜的に、例えば経口的に、鼻腔を通
して、直腸を通して、あるいは経皮的に導入することができる。投与は、非経口
的に、例えば静脈注射によって行われることが好ましく、小動脈内投与、筋肉内
投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、心室内投与、および頭蓋内投与も含む
が、これらに限定されない。組成物の投与は、治療するべき部位、特に心臓に、
直接注射することによって導入することができる。

【０１２８】 心臓への好ましい投与経路は、心臓内への直接的な注射によるものである（米
国特許第5,693,622号または第5,661,133号）。心臓は、磁気共鳴画像法やコンピ
ュータ支援断層撮影法など、当技術分野で利用可能な技法のいずれかを使用して
画像化することができ、治療用組成物は、例えば心筋層の虚血領域に定位固定注
射をすることによって投与することができる。

【０１２９】 Ａｋｔの発現は、心臓特異性プロモーター、または心臓細胞に特異的な親和性
を有するベクターを使用して、心筋細胞に制限されることが好ましい。 心臓への投与は、カテーテルを使用して行うこともできる。様々な多孔性バル
ーン、二連バルーン、およびヒドロゲルカテーテルが、米国特許第5,851,521号
、第5,652,225号、第5,328,470号、第5,698,531号、第5,707,969号、第5,830,87
9号、および第5,564,192号に記載されている。

【０１３０】 さらに別の実施形態では、Ａｋｔポリペプチド、またはこのポリペプチドをエ
ンコードする核酸を含む組成物を、制御放出システムで送達することができる。
例えば、核酸やポリペプチドは、静脈内注入、埋め込み型浸透圧ポンプ、経皮パ
ッチ、リポソーム、またはその他の形態の投与を使用して投与することができる
。一実施形態ではポンプを使用することができる［上記Langer；Sefton、CRC Cr
it. Ref. Biomed. Eng. 14：201（1987）；Buchwald他、Surgery 88：507（1980
）；Saudek他、N. Engl J. Med. 321：574（1989）参照］。別の実施形態では、
ポリマー材料を使用することができる［Medical Applications of Controlled R
elease、LangerおよびWise（編）、CRC Press：Boca Raton、Florida（1974）；
Controlled Drug Biovailability、Drug Product Design and Performance、Smo
lenおよびBall（編）、Willey：New York（1984）；RangerおよびPeppas、J. Ma
cromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23：61（1983）参照；Levy他、Science 22
8：190（1985）；During他、Ann. Neurol. 25：351（1989）；Howard他、J.Neur
osurg. 71：105（1989）も参照］。さらに別の実施形態では、制御放出システム
を、治療標的、すなわち心臓の近くに配置することができ、したがって全身用量
の一部しか必要としない［例えばGoodsonの前掲書Medical Applications of Con
trolled Release、vol. 2、p. 115〜138（1984）参照］。その他の制御放出シス
テムが、Langerによる総説［Sciende 24：1527〜1533（1990）］で論じられてい
る。

【０１３１】 したがって本発明の組成物は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、または皮下
経路の投与によって送達することができる。別法として、適正に処方された組成
物は、鼻腔または経口投与によって投与することができる。生物学的材料の一定
の供給は、治療上有効な用量（すなわち被験者に代謝変化をもたらすのに有効な
用量）を必要な間隔で、例えば毎日供給したり１２時間毎に供給することによっ
て、確実に行うことができる。これらのパラメータは、治療すべき病状の重さ、
実施される食事の変更などのその他の作用、被験者の体重、年齢、および性別、
当業者によって標準的な良好な医療行為に従い容易に決定することができるその
他の基準に依存する。

【０１３２】 本発明は、患者のＡｋｔ活性レベルを抑制することによって、腫瘍に罹ってい
る患者の血管形成を阻害する方法にも関し、そのようにすることによってＶＥＧ
Ｆの産生が阻害される。Ａｋｔのレベルは、アンチセンス核酸が細胞内条件下で
ハイブリダイズしてＡｋｔｍＲＮＡになる条件下、患者の細胞にＡｋｔアンチセ
ンス核酸を導入することによって低下させることができる。Ａｋｔのレベルは、
一本鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦＶ）などの細胞内結合蛋白質を導入することによって低
下させることもでき、それによって、Ａｋｔに結合しかつＡｋｔを不活性化する
のに十分なレベルで患者の細胞にＡｋｔを特異的に結合させる。別の実施形態で
は、優性ネガティブ形のＡｋｔをエンコードする核酸を投与することによって、
Ａｋｔ活性を低下させることができる。アンチセンス核酸、細胞内結合蛋白質ま
たはそれをエンコードする核酸、あるいは優性ネガティブは、腫瘍細胞に直接投
与することが好ましい。

【０１３３】 本発明によるアンチセンス配列は、Ａｋｔ蛋白質をエンコードする配列に相補
的であり、Ａｋｔ蛋白質の発現を下方調節またはブロックする。好ましい実施形
態は、アンチセンスポリヌクレオチド分子を含む。アンチセンスポリヌクレオチ
ドの調製および使用、アンチセンスＲＮＡ分子をエンコードするＤＮＡ、オリゴ
および遺伝子アンチセンスの使用が、WO92／15680に開示されており、その内容
全体を参照により本明細書に組み込む。

【０１３４】 本発明のアンチセンス核酸は、Ａｋｔ蛋白質をエンコードするＤＮＡ配列の全
てまたは一部と特異的にハイブリダイズすることが可能なＲＮＡ、またはそれに
対応するメッセンジャーＲＮＡであることが好ましい。本発明のアンチセンス配
列は、細胞内でのそ発現によってヒトＡｋｔｍＲＮＡの全てまたは一部と相補的
なＲＮＡが産生される、ＤＮＡ配列から得ることができる。これらのアンチセン
ス配列は、反対の向きにあるＡｋｔ蛋白質をエンコードする配列の全てまたは一
部の発現によって、調製することができる（EP140308）。アンチセンスは、Ａｋ
ｔの発現の下方調節またはブロックが可能である限り、どのような長さであって
も本発明の実施に適している。アンチセンス配列は、少なくともヌクレオチド２
０個の長さであることが好ましい。

【０１３５】 この好ましい実施形態の別の態様では、核酸がアンチセンスＲＮＡ分子をエン
コードする。この実施形態で、核酸は、核酸配列の発現が可能なシグナルに動作
可能に結合しており、好ましくは組換えベクター構成を利用して細胞に導入され
、それによって、ベクターが細胞内に導入されるとアンチセンス核酸が発現する
ことになる。適切なベクターの例には、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随
伴ウイルス、レトロウイルス、およびヘルペスウイルスが含まれる。

【０１３６】 Ａｋｔ活性の阻害によって血管形成を特異的に阻害する本発明の方法の第２の
実施形態は、トランスフェクションされた細胞内でＡｋｔと選択的に相互に作用
することが可能な細胞内結合蛋白質をエンコードする核酸配列の発現を含む。そ
の内容全体が参照により本明細書に組み込まれるWO94／29446およびWO94／02610
は、細胞内結合蛋白質をエンコードする遺伝子による細胞トランスフェクション
について開示している。細胞内結合蛋白質には、細胞内で発現したＡｋｔと選択
的に相互に作用し結合することができ、結合したＡｋｔ蛋白質の機能を中立させ
る任意の蛋白質が含まれる。細胞内結合蛋白質は、抗体または抗体の断片である
ことが好ましい。

【０１３７】 WO94／02610は、抗体の調製、および特定の抗体をエンコードする核酸の同定
について開示している。Ａｋｔ蛋白質またはその断片を使用して、その蛋白質に
特異的なモノクローナル抗体を、当業者に知られている技法に従って調製する。
細胞内結合蛋白質またはその一部をエンコードする核酸を含み、宿主細胞内での
発現が可能なベクターを、本発明の方法で使用するために続けて調製する。Ａｋ
ｔを含む細胞に細胞内結合蛋白質をエンコードする核酸を送達する適切なベクタ
ーおよび方法には、上記論じたものが含まれる。Ａｋｔ細胞内結合蛋白質をエン
コードする核酸配列は、細胞内結合蛋白質の目標をＡｋｔの細胞位置に定めるた
めの局在化シグナルをエンコードする配列、および／または形質膜への細胞内結
合蛋白質の挿入が可能な配列を、さらに含むことができる。局在化シグナルまた
は挿入配列は、Ａｋｔ蛋白質への結合が妨げられない限り、細胞内結合蛋白質の
どの場所にも位置付けることができる。局在化シグナルの例が、WO94／02610に
開示されている。

【０１３８】 別の実施形態では、優性ネガティブ形のＡｋｔをエンコードする核酸を投与す
ることによって、Ａｋｔ活性を低下させることができる。優性ネガティブ形のＡ
ｋｔの例は、Fujio他、1999（J. Biol. Chem. 274．（23）：16349〜16354）、W
ang他、1999（Mol. Cell Biol. 19（6）：4008〜4018）、Jiang他、1999（Proc.
Natl. Acad. Sci. 96（5）：2077〜2081）、およびGerber他、1998（J. Biol.
Chem. 273（46）：30336〜30343）に記載されている。

【０１３９】 本発明の範囲に含まれる生物学的材料の投与が行われる生物体は、ヒトである
ことが好ましいが、どの動物でもよい。したがって当業者なら容易に理解できる
ように、本発明の方法および医薬品組成物は、任意の動物、特に哺乳類と、ネコ
類やイヌ類の被験動物など家庭で飼う動物、ウシ類やウマ類、ヤギ類、ヒツジ類
、ブタ類の被験動物などであるがこれらに限定されない家畜、野生動物（野生環
境にあるか動物園にいるかに関わらず）、マウスやラット、ウサギ、ヤギ、ヒツ
ジ、ブタ、イヌ、ネコなどの研究用の動物、ニワトリや七面鳥、鳴禽類などの鳥
類の種が含まれるがそれだけには限定されない任意の動物への投与に特に適して
おり、すなわち獣医学に属する医療に用いるのに特に適している。 本発明は、本発明の例示として提供された以下の非限定的な実施例を参照する
ことによって、より容易に理解できるであろう。

【０１４０】

【実施例】 一般的な分子生物学的技法 プラスミドＤＮＡの調製抽出、塩化セシウム勾配でのプラスミドＤＮＡの遠心
分離、アガロースおよびアクリルアミドゲル電気泳動、電気溶出によるＤＮＡ断
片の精製、フェノールまたはフェノール／クロロホルムによる蛋白質の抽出、食
塩水媒質中でのＤＮＡのエタノールまたはイソプロパノール沈殿、Escherichia
coli（大腸菌）での形質転換など、分子生物学で従来から使用されている方法は
当業者に周知であり、文献に十分に記述されている［Maniatis T他、「Molecula
r Cloning、a Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Sp
ring Harbor、N.Y.、1982；（第2版 1989）；Ausubel F.M. 他（編）、「Curren
t Protocols in Molecular Biology」、John Wiley & Sons、New York、1987］
。 従来のクローニング媒体には、ｐＢＲ３２２およびｐＵＣタイプのプラスミド
と、Ｍ１３シリーズのファージが含まれる。これらは市販されている（Bethesda
Research Laboratories）。

【０１４１】 連結反応では、ＤＮＡ断片を、そのサイズに従ってアガロースまたはアクリル
アミドゲル電気泳動によって分離し、フェノールで、またはフェノール／クロロ
ホルム混合物で抽出し、エタノールで沈殿させ、次いでファージＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼ（Biolabs）の存在下、その供給元のアドバイスに従ってインキュベート
することができる。

【０１４２】 ５′突出末端の埋め込みは、E. Coli DNAポリメラーゼＩのKlenow（クレノウ
）断片（Biolabs）を用い、その供給元の仕様に従って行うことができる。３′
突出末端の破壊は、製造元のアドバイスに従って使用されるファージＴ４ ＤＮ
Ａポリメラーゼ（Biolabs）の存在下で行われる。５′突出末端の破壊は、Ｓ１
ヌクレアーゼで制御された処理によって行われる。

【０１４３】 合成オリゴデオキシヌクレオチドによってｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導された突然
変異誘発は、Taylor他によって開発された方法［Nucleic Acids Res. 13（1985
）8749〜8764］に従って、Amershamから販売されているキットを使用して行うこ
とができる。

【０１４４】 ＰＣＲ［Polymerase−catalyzed Chain Reaction、Saiki R.K. 他、Science 2
30（1985）1350〜1354；Mullis K.B. およびFaloona F.A.、Meth. Enzym. 155（
1987）335〜350］技法によるＤＮＡ断片の酵素増幅は、「ＤＮＡ熱サイクラ」（
Perkin Elmer Cetus）を使用し、その製造元の仕様に従って行うことができる。

【０１４５】 ヌクレオチド配列の確認は、Sanger他が開発した方法［Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA、74（1977）5463〜5467］により、Amershamから販売されているキットを
使用して行うことができる。 プラスミドＤＮＡは、Qiagen Plasmid Purification System（Quiagenプラス
ミド精製システム）によって、その製造元の指示に従って精製することができる
。

【０１４６】 実施例１：ヒトＡｋｔ３のクローニング この実施例では、Ａｋｔ３蛋白質をエンコードする核酸のクローニングについ
て述べる。 実施例１.１：Ａｋｔ３のためのｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング データベース検索によれば、１つのヒトｃＤＮＡクローンは、ヒトＡｋｔ１お
よびＡｋｔ２に相同であるが異なっている一連のヒトｃＤＮＡ配列を含有するこ
とが、明らかにされた。以前は知られていなかったこのヒトＡｋｔアイソフォー
ム（本明細書ではヒトＡｋｔ３と呼ぶ）の完全長コード配列を分離するため、ヒ
ト心臓ｃＤＮＡライブラリーを、５′−ＵＴＲおよびヒトＡｋｔ３のＮ末端に関
するコード領域に対応するｃＤＮＡプローブでスクリーニングした。

【０１４７】 ヒトｃＤＮＡクローン（ID#479072）を購入した（Genome System Inc.）。ヒ
トＡｋｔ３の５′−ＵＴＲ（翻訳されていない領域）の部分および５'−コード
配列の部分を覆うこのＤＮＡの１つの断片を、以下のプライマーを使用してポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。ＡＫＴ３−５′ＵＴＲ−Ｆ３（５
′ＴＣＣ ＡＡＡ ＣＣＣ ＴＡＡ ＡＧＣ ＴＧＡ ＴＡＴ ＣＡＣ３'；配
列番号３）およびＡＫＴ３−Ｃ−Ｒ１（５′ＣＣＴ ＧＧＡ ＴＡＧ ＣＴＴ
ＣＴＧ ＴＣＣ ＡＴＴ Ｃ３′；配列番号４）。ｃＤＮＡプローブは、Random
Primer DNA標識キット（Boerhinger Mannheim）を使用してその製造元の指示に
従って［α−ｐ３２］ｄＣＴＰで標識した。プローブは、Ｂｉｏ−Ｒａｄクロマ
トグラフィスピンカラムを使用し、その製造元の指示に従って精製した。

【０１４８】 ｃＤＮＡファージライブラリーをスクリーニングするため、初めに１００万個
を超えるファージクローンを使用した（Clonetech、Cat#（カタログ番号） HL5
027t）。ＬＢ培地（２０mg／mlのテトラサイクリン、０.２％マルトース、およ
び１０mMＭｇＣｌ₂が補われた）で、宿主細胞ＸＬ１−Ｂに３７℃で一晩接種し
た。Maniatis、1989に記述されるように、ファージ感染および膜リフティングを
行った。膜を変性させ、復元し、ベークし、次いでハイブリダイゼーション溶液
を用いて６５℃で４時間プレハイブリダイズした。変性した形のｐ３２−標識プ
ローブ（１０分間熱変性させた）を膜に添加し、ハイブリダイゼーションを一晩
行った。ハイブリダイゼーション後、膜を、２×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳ、１×
ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳ、および０.５×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳで、６５℃で順
次洗浄した。膜を風乾し、Kodak Ｘ線フィルムに曝した。この一次スクリーニン
グの後、ポジティブクローンを選択して、二次および三次スクリーニングにかけ
る。得られたポジティブファージを精製し、ＢＭ２５.８−２５宿主細胞を使用
して、その製造元（Boerhinger Mannheim）の指示に従ってファージＤＮＡをプ
ラスミドＤＮＡに変換した。

【０１４９】 ２つのポジティブクローンを選択して、配列決定および別の特徴付けを終了さ
せた。これらのクローンの一方（クローン＃９）は、ヒトＡｋｔ３の５'−ＵＴ
Ｒの部分およびＮ末端コード配列（ａａ１〜１２７）を含む。第２のクローン（
クローン＃１）は、ヒトＡｋｔ３配列（ａａ１５〜Ｃ末端）のほとんどと、３'
−ＵＴＲを含む。完全長ｃＤＮＡ配列は、これら２つの部分配列の融合によって
形成した。ヒトＡｋｔ３をエンコードする完全な配列を、配列番号１に示す。対
応するアミノ酸配列を、配列番号２に示す。Ａｋｔ３は、Ａｋｔ１およびＡｋｔ
２よりも短く、分子のＣ末端において、Ａｋｔ３とＡｋｔ１またはＡｋｔ２との
間に大きな相同性はない。特に、ヒトＡｋｔ３のＣ末端部分の最後の１４個のア
ミノ酸は、ヒトＡｋｔ１およびＡｋｔ２に存在するものとは異なっている。

【０１５０】 実施例２：Ａｋｔ発現プラスミドの構成 この実施例では、活性化Ａｋｔ３に関する発現プラスミドの構成について述べ
る。初めに２つの部分ｃＤＮＡクローン（上述のクローン＃１およびクローン＃
９）を融合して、完全長ＡＫＴ３コード配列を得た。ヒトＳｒｃミリスチル化配
列を含むＤＮＡを、完全長Ａｋｔ３配列のＮ末端に融合させた。ＨＡタグ配列を
、完全長Ａｋｔ３配列のＣ末端に融合させた（発現の検出のため）。このキメラ
ＭｙｒＡｋｔ３ＨＡに関する配列を、ＣＭＶプロモーターの制御下で配置した。
この完全な構成を、ＣＭＶ６−ＭｙｒＡｋｔ３ＨＡと呼ぶ（図１Ａ）。

【０１５１】 実施例２.１：ＣＭＶ６−ＭｙｒＡｋｔＨＡ この実施例では、Ａｋｔ３と、構成上活性な形のヒトＡｋｔ３を発現すること
が可能なプラスミドの構成について述べる。完全長Ａｋｔ３コード配列は、以下
のプライマーを使用したクローン＃１のＰＣＲ増幅によって得た。 Ａｋｔ３の最初の２４個のアミノ酸のコード配列を含む、ｈＡＫＴ３ｃｌ９−
ＰＣＲ５(Ｆ)：(５′−ＡＴＧ ＡＧＣ ＧＡＴ ＧＴＴ ＡＣＣ ＡＴＴ Ｇ
ＴＧ ＡＡＡ ＧＡＡ ＧＧＴ ＴＧＧ ＧＴＴ ＣＡＧ ＡＡＧ ＡＧＧ Ｇ
ＧＡ ＧＡＡ ＴＡＴ ＡＴＡ ＡＡＡ ＡＡＣ ＴＧＧ ＡＧＧ ＣＣＡ Ａ
Ｇ−３′；配列番号５)、および ｈＡＫＴ３ｃｌｌ−ＰＣＲ３(登録商標)：(５′−ＴＴＡ ＴＴＴ ＴＴＴ
ＣＣＡ ＧＧＴ ＡＣＣ ＣＡＧ ＣＡＴ ＧＣＣ−３′；配列番号６)。

【０１５２】 構成上活性なＡｋｔ３の形を作製するため、完全長Ａｋｔ３のコード配列を、
以下のプライマーを使用してＰＣＲ増幅した：Ｋｏｚａｋ配列（ＣＣＡＣＣ）、
ヒトｓｒｃからのミリスチル化配列（下線部分）、およびヒトＡｋｔ３の最初の
８個のアミノ酸（太字）を含む、 および、ＨＡタグのコード配列（太字）を含む、 ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲ１／Ａｐａ１で消化し、ｐＣＤＮＡ３−Ｍｙｒ−Ａｋ
ｔ−ＨＡを産生するｐＣＤＮＡ３.１のＥｃｏＲ１／Ａｐａ１部位にサブクロー
ニングした。ＭｙｒＡｋｔＨＡのコード配列も、ＰＣＲ増幅し、ベクターＣＭＶ
６のＫｐｎ１／ＥｃｏＲ１にサブクローニングした。ＰＣＲ反応に使用されるプ
ライマーは、 ＣＭＶ６−ＡＫＴ３ｃａｔ−Ｆ（５′−ＣＧＧ ＧＧＴ ＡＣＣ ＡＣＣ Ａ
ＴＧ ＧＧＴ ＡＧＣ ＡＡＣ ＡＡＧ ＡＧＣ ＡＡＧ ＣＣＣ ＡＡＧ Ｇ
ＡＴ ＧＣＣ ＡＧＣ ＣＡＧ−３′；配列番号９）、および ＣＭＶ６−ＡＫＴ３ｃａｔ−Ｒ（５′−ＣＣＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＴＴＡ Ｇ
ＧＣ ＧＴＡ ＧＴＣ ＧＧＧ ＧＡＣ ＧＴＣ−３′；配列番号１０） であった。プラスミドを、配列決定によって確認した。

【０１５３】 実施例２.２：ヒトＡＫＴ３の発現 この実施例では、組織培養でのヒトＡＫＴ３の発現について述べる。ＨＥＫ２
９３およびＣＯＳ−７細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が補われたＤＭＥ
培地中に維持した。細胞を、５％ＣＯ₂インキュベータ内で３７℃で増殖させた
。

【０１５４】 プラスミドＣＭＶ６−[ＭｙｒＡｋｔ３ＨＡ]を、ＨＥＫ２９３細胞に一時的に
トランスフェクションした。対照として、ＨＥＫ２９３細胞にＣＭＶ６ベクター
をトランスフェクションした。それぞれのトランスフェクションの１日前に、細
胞を分けて０.２×１０⁶／cm²の密度にした。トランスフェクションは、Lipofec
tAmine（Gibco BRL）を使用して、その製造元の指示に従って行った。簡単に、
ＤＮＡをＤＭＥ培地に混合した（血清も抗生物質もない状態で）。LipofectAmin
eを添加した（DNA：LipofectAmine＝１mg：４ml）。短時間混合した後、ＤＮＡ
／LipofectAmine混合物を室温で３０分間保った。細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、
ＤＮＡ／LipofectAmine混合物に３時間曝した。トランスフェクション後、細胞
を１×ＰＢＳで２回洗浄し、ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ培地に交換した。

【０１５５】 トランスフェクションの２４時間後、細胞が溶解した。溶解産物を抗ＨＡ抗体
で免疫沈降させ、免疫ペレットのキナーゼ活性を、ＧＳＫ−３から誘導したペプ
チド、Ａｋｔ１の下流標的を使用して決定した（Cross他、1995）。トランスフ
ェクション後２４時間で、Ａｋｔに関するｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを
Cross他（Cross他、1995）に従って行った。細胞を１×ＰＢＳ溶液で２回洗浄し
、溶解緩衝液（５０mM Tris／ＨＣｌ、pＨ７.４、１mMＥＤＴＡ、１mMＥＧＴＡ
、０.５mMＮａ₃ＶＯ₄、０.１％β−メルカプトエタノール、１％Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００、５０mM ＮａＦ、５mMピロリン酸ナトリウム、１０mMグリセロリン
酸ナトリウム、０.５mM ＰＭＳＦ、２ug／mlアプロチニン、２mg／mlロイペプ
チン、および１mMミクロシスチン）に溶解した。遠心分離を４℃で１５分間行う
ことによって、不溶性材料を除いた。ポリクローナル抗ＨＡ抗体（ＢＡＢＣＯ）
を用い、プラットフォームを回転させながら、細胞溶解産物を４℃で１時間イン
キュベートした。溶解産物に、蛋白質Ａ−アガロースビーズを１時間添加した。
免疫沈降後、ペレットを、洗浄溶液Ａ（０.５Ｍ ＮａＣｌが補われた溶解緩衝液
）で３回、洗浄溶液Ｂ（５０mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、pＨ７.４、０.０３％ Ｂｒ
ｉｊ３５、０.１mMＥＧＴＡ、および０.１％β−メルカプトエタノール）で３回
、キナーゼ緩衝液（２０mMＭＯＰＳ、pＨ７.２、２５mMβ−グリセロリン酸ナト
リウムpＨ７.０、１mMＮａ₃ＶＯ₄、１mM ＤＴＴ）で３回洗浄した。洗浄後、ペ
レットを４０μlのキナーゼ反応混合物［１００mMＡＴＰ、０.１mg／ml Crossti
de基質ペプチド（ＵＢＩ）、２０mM ＭｇＣｌ₂、１０mM 蛋白質キナーゼＡ阻
害剤／ＰＫＩ（ＵＢＩ）、および１０ｍＣｉ（ｇ−３２Ｐ）−ＡＴＰ］に再懸濁
した。反応を、３０℃で３０分間行った。反応終了後、混合物を短時間遠心分離
し、上澄み３０μｌをｐ８１の円形のニトロセルロース紙上に流し込んだ（Ｇｉ
ｂｃｏ ＢＲＬ）。ニトロセルロース紙を、１８０mMリン酸で３回洗浄し（洗浄
時間は１回につき１０分）、アセトンで２回洗浄した（洗浄時間は１回につき２
分）。この紙の放射能を、Scintillation Counting Machine（シンチレーション
計数器）で監視した。ＣＭＶ６［ＭｙｒＡｋｔ３ＨＡ］がトランスフェクション
されたサンプル中に存在するキナーゼ活性は、このアッセイのために観察された
バックグラウンドレベルと同様の、対照ベクターＣＭＶ６がトランスフェクショ
ンされた細胞に存在するキナーゼ活性よりも、２０倍高かった（図１Ｂ）。

【０１５６】 トランスフェクションされた細胞でのＭｙｒＡｋｔ３ＨＡの発現を試験するた
め、トランスフェクションされた細胞から調製された溶解産物を、抗ＨＡ抗体に
よる免疫ブロット法にかけた。細胞溶解産物は上述のように調製し、ＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル上で電気泳動にかけた。蛋白質をニトロセルロース膜にトラ
ンスフェクションし、次いでこれを遮断溶液（１×ＰＢＳ、０.２％Ｔｗｅｅｎ
２０、５％脱脂粉乳、）で、４℃で一晩処理した。膜を、マウスのモノクローナ
ル抗ＨＡ抗体（遮断溶液で１：５００に希釈）で３時間、室温でインキュベート
した。遮断溶液で３回洗浄した後（それぞれ１５分）、膜をＨＲＰ共役ウサギ抗
マウスＩｇＧ抗体（遮断溶液で１：１０００に希釈）で、室温で１時間インキュ
ベートした。遮断溶液で３回洗浄し（それぞれ１０分）、０.２％Ｔｗｅｅｎ２
０が補われた１×ＰＢＳで３回洗浄した後、製造元の指示に従って膜をＥＣＬ（
PIERCE）で形成し、Kodak Ｘ線フィルムに曝した。図１Ｃに見られるように、Ｃ
ＭＶ６−［ＭｙｒＡｋｔ３ＨＡ］がトランスフェクションされたサンプルには強
度の約６０KDのバンド（ＭｙｒＡｋｔ１ＨＡのサイズと同様、データは図示せず
）が存在するが、ＣＭＶ６がトランスフェクションされたサンプル（負の対照）
には存在しない。総合すると、これらのデータは、ＣＭＶ６−［ＭｙｒＡｋｔ３
ＨＡ］のトランスフェクションによって機能的なＡｋｔ活性が得られることを実
証している。

【０１５７】 実施例３：ＶＥＧＦ発現の刺激 実施例３.１：細胞培養 ＨｅＬａ（ヒーラ）細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が補
われたＤＭＥ培地に維持した。細胞を、５％ＣＯ₂インキュベータ内で、３７℃
で増殖させた。ヒト骨格筋細胞（ＨＳＫＭＣ）およびヒト冠状平滑筋細胞（ＨＣ
ＳＭＣ）をClinetics Corporationから購入した。

【０１５８】 新生ラットの心筋細胞を、Myocyte Isolation System（Worthigton Biochemic
al Co.）を使用して分離した。簡単に、生後１〜３日のラットから採取した心臓
を細分し、トリプシン（最終濃度５０μg／ml）で一晩４℃で消化し、その後、
コラゲナーゼを用いて３７℃で４５分間消化した。すり潰した後、混合物を細胞
ストレーナによりろ過した。短時間遠心分離を行った後、細胞を、平板培地（Ｄ
ＭＥＭ：Ｍ１９９＝４：１、１０％心臓不活性化ウマ血清、５％ウシ胎児血清、
１×インスリン−トランスフェリン−セレンサプリメント（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ
）、および１×ゲンタマイシン、１００μg／mlＢｒｄＵ）に再懸濁し、密度を
０.３×１０⁶細胞／ｍｌにした。２４時間後、細胞は、低マイトジェン培地（Ｄ
ＭＥＭ：Ｍ１９９＝４：１、１×ゲンタマイシン）に切り替えた。

【０１５９】 実施例３.２：トランスフェクション トランスフェクションの１日前、細胞を分けて、密度を０.２×１０⁶細胞／cm² にした。トランスフェクションは、リポフェクトアミン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）
を使用し、その製造元の指示に従って行った。簡単に、示されるＤＮＡをＤＭＥ
培地（血清も抗生物質もない）に入れて混合し、リポフェクトアミンを添加した
（ＤＮＡ：ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ＝１μg：４μl）。短時間撹拌した後、
ＤＮＡ／リポフェクトアミン混合物を、３０分間室温に保った。次いで細胞を１
×ＰＢＳで洗浄し、ＤＮＡ／リポフェクトアミン混合物に３時間曝した。トラン
スフェクション後、細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、ＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ培
地に切り替えた。

【０１６０】 ３．３組換えアデノウイルス構成 構成上活性なヒトＡｋｔ３（ｈＡｋｔ３ｃａｋ）含む組換えアデノウイルスを
、Crouzet他（1997）に記載されているように構成した（Proc. Natl. Acad. Sci
. USA. Vol. 94、1414〜1419）。構成上活性なヒトＡｋｔ３ｃ（Ｎ末端のｃ−ｓ
ｒｃからのミリスチル化配列を含む）に関するｃＤＮＡをサブクローニングして
ｐＸＬ２９９６にした（このプラスミドをｐＸＬ２９９６−ｈＡｋｔ３ｃａｋと
呼ぶ）。ｐＸＬ２９９６−ｈＡｋｔ３ｃａｋからのｈＡｋｔ３ｃａｋに関する発
現カセットをサブクローニングしてシャトルベクターｐＸＬ３４７４にした。ｈ
Ａｋｔ３ｃａｋに関するこのシャトルプラスミドと、アデノウイルス−ｂｇａｌ
に関するプラスミドＤＮＡ（ｐＸＬ３２１５）を、エレクトロポレーションによ
って細菌ＪＭ８３細胞に導入した。二重に相同的組換えを行った後、アデノウイ
ルス−ｈＡｋｔ３ｃａｋに関するプラスミドＤＮＡをＣｓＣｌにより精製した。
このＤＮＡを、制限酵素ＰａｃＩで消化することにより線状にし、リポフェクト
アミンを使用して２９３個の細胞にトランスフェクションした。トランスフェク
ションの３週間後、ｈＡｋｔ３ｃａｋを含む組換えアデノウイルス（ＡＶ−ｈＡ
ＫＴ３ｃａｋ）を収集し、２９３個の細胞内で増幅させた。細胞質毒性アッセイ
（ＣＰＡ）を使用して、ウイルス力価を決定した。

【０１６１】 構成上活性なマウスａｋｔ１を含む組換えアデノウイルス（ＡＶ−ｍＡｋｔ１
ｃａｋ）を標準的な方法（上記に論じた）を使用して調製し、これはKenneth Wa
lsh博士（Boston、Ma）から提供された。

【０１６２】 ウイルス感染の前に、ウイルスを組織培養培地に入れて希釈し、３×１０⁷／m
lにした。ウイルス含有培地１mlを、６ウェル組織培養プレートの各ウェルに添
加し、ウイルス含有培地８mlを、１００mm培養皿のそれぞれに添加した。一晩感
染させた後、培地中の過剰なウイルスを１×ＰＢＳで洗浄除去し、細胞を通常の
培地に替えた。

【０１６３】 実施例３.４：ＥＬＩＳＡアッセイ ＶＥＧＦ−１６５ ＥＬＩＳＡ検出キット（R & D Systems Inc. 、ｃcat.DVE
00から購入）を使用して、ヒトＶＥＧＦ Ｅｌｉｓａアッセイを行った。培養培
地を収集し、短時間遠心分離にかけて澄ませた。アッセイ希釈剤ＲＤ１Ｗを添加
した後、サンプルを適切な各ウェルに添加した。次いでプレートにより、室温で
２時間インキュベートした。次いで各ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄した。この
後、各ウェルを、提供された共役抗ＶＥＧＦで、室温で２時間処理した。この時
点で、前述と同様の洗浄ステップを繰り返した。基質を添加し、室温で２０分間
インキュベートした。４５０nmに設定したマイクロプレートリーダにより光学密
度を決定し、波長補正は５４０nmに設定した。

【０１６４】 実施例３.５：ＲＮＡ分離およびノーザンブロット法： 全ＲＮＡを、Ultraspec RNA Isolation試薬（Biotecx）使用して分離した。簡
単に、Ultraspec溶液１mlを、１００mm組織培養プレートの細胞に添加した。細
胞をプレートからかき出し、ＲＮアーゼを含まないＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（エッペ
ンドルフ）管内に移した。クロロホルム２００μlを添加した後、混合物を撹拌
し、４℃で遠心分離にかけた。水溶液（上層）を収集し、ＲＮＡを等体積のイソ
プロパノールで沈澱させた。７０％エタノールで洗浄し乾燥した後、ＲＮＡを、
ＤＥＰＣで処理した水に溶解した。全ＲＮＡ２０μgを１％アガロースゲル上に
分離した。電気泳動および移入後、ブロットを紫外線架橋した。

【０１６５】 Rondom Primer DNA標識キット（Boehringer Mannheim）を使用して生成したｐ
３２標識ＤＮＡプローブを用い、ハイブリダイゼーションを行った。６５℃でハ
イブリダイゼーションを行った後、ブロトを、２×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳおよ
び０.１×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳで順次洗浄し、Ｋｏｄａｋ Ｘ線フィルムに一
晩曝した。

【０１６６】 実施例３.６：Ａｋｔはトランスフェクションされた細胞からのＶＥＧＦの発現
を増大させる ＨｅＬａ（ヒーラ）細胞に、活性化マウスＡｋｔ１（ＣＭＶ６−ｍＡｋｔ１ｃ
ａｋ）、活性化ヒトＡｋｔ３（ＣＭＶ６−ｈＡＫｔ３）、またはＣＭＶ６ベクタ
ー（対照として）に関する発現プラスミドをトランスフェクションした。トラン
スフェクション後、細胞は低マイトジェン培地（０.５％ウシ胎児血清が補われ
たＤＭＥＭ）に切り替えた。１６時間後、トランスフェクションされた細胞から
の培地を収集し、ヒトＶＥＧＦ−１６５のためのＥＬＩＳＡにかけた。図２に示
すように、Ａｋｔ１またはＡｋｔ３トランスフェクション細胞の培地のＶＥＧＦ
レベルは、ベクターＣＭＶ６をトランスフェクションした細胞の培地（対照）で
示されるレベルよりも著しく高い。これらのデータによれば、構成上活性なＡｋ
ｔ１またはＡＫｔ３によって、ＨＥＬＡ細胞にＶＥＧＦ−１６５発現が引き起こ
されることが実証された。

【０１６７】 実施例３．７：ＡＶ−ｍＡｋｔ１ｃａｋおよびＡＶ−ｈＡｋｔ３ｃａｋはヒト骨
格筋細胞およびヒト平滑筋細胞でＶＥＧＦ発現を誘発する ヒト骨格筋細胞（ＨＳＫＭＣ）およびヒト冠状平滑筋細胞（ＨＣＡＳＭＣ）に
、活性マウスＡｋｔ１（ＡＶ−ｍＡｋｔ１ｃａｋ）または構成上活性なヒトＡｋ
ｔ３（ＡＶ−ｈＡＫＴ３ｃａｋ）を発現する組換えアデノウイルスを感染させた
。対照として、細胞に、緑色蛍光蛋白質の発現を誘発するＡＶ−ＧＦＰを感染さ
せた。感染した１日後、培養培地を収集し、培地のＶＥＧＦレベルをＥＬＩＳＡ
によって測定した。図３Ａに示すように、ＡＶ−ｍＡＫＴ１ｃａｋおよびＡＶ−
ｈＡＫＴ３ｃａｋは共に、ＨＳＫＭＣでのＶＥＧＦ−１６５発現を著しく増大さ
せるが、ＡＶ−ＧＦＰ感染ではほとんどまたは全く影響がなかった。さらに、図
３Ｂに示すように、ＡＶ−ｍＡｋｔ１およびＡＶ−ｈＡｋｔ３ｃａｋは、ヒト冠
状動脈平滑筋細胞（ＨＣＡＳＭＣ）からＶＥＧＦ−１６５を誘発する。

【０１６８】 ＡｋｔがＶＥＧＦメッセンジャーＲＮＡに及ぼす影響を評価するため、ＨＣＡ
ＳＭＣに、ｍＡｋｔ１ｃａｋ、ｈＡｋｔ３ｃａｋ、またはＧＦＰを発現するアデ
ノウイルスを感染させた。正の対照として、細胞を、２４時間低酸素状態に切り
替えた。全ＲＮＡを分離し、ＶＥＧＦ用のノーザンブロット分析にかけた。図３
Ｃに示すように、低酸素処理によって、発現ＶＥＧＦが劇的に誘発される。さら
に、ＡＶ−ＧＦＰではなくＡＶ−ｍＡｋｔ１ｃａｋおよびＡＶ−ｈＡｋｔ３ｃａ
ｋが、ＶＥＧＦのｍＲＮＡレベルを著しく増大させる。これらのデータは、Ａｋ
ｔが、ｍＲＮＡのレベルを高めることによってＶＥＧＦ発現を増大させることを
示している。

【０１６９】 実施例３.８：ＡＶ−ｍＡＫＴ１ｃａｋおよびＡＶ−ｈＡＫｔ３ｃａｋは心筋細
胞内でＶＥＧＦ発現を誘発する 新生ラット心筋細胞に、ｍＡｋｔ１ｃａｋ（ＡＶ−ｍＡｋｔ１ｃａｋ）、マウ
ス野生型Ａｋｔ１（ＡＶ−ｍＡｋｔ１ｗｔ）、ｈＡｋｔ３ｃａｋ（ＡＶ−ｈＡｋ
ｔ３ｃａｋ）、またはＡＶ−ＧＦＰ（対照として）をエンコードするアデノウイ
ルスを感染させた。正の対照として、感染していない細胞を、低酸素状態で２４
時間インキュベートした。感染の１日後、これらの細胞からのＲＮＡを分離し、
ノーザンブロット分析によってＶＥＧＦ発現を検出した。図３に示すように、Ａ
Ｖ−ｍＡＫｔ１ｃａｋまたはＡＶ−ｈＡｋｔ３ｃａｋは心筋細胞でのＶＥＧＦの
発現を著しく増大させるが、ＡＶ−ＧＦＰまたはＡＶ−ｍＡｋｔ１ｗｔは、ＶＥ
ＧＦ−１６５発現にほとんどまたは全く影響を及ぼさない。

【０１７０】 本発明は、本明細書に記述した特定の実施形態によって範囲を限定するもので
はない。実際に、前述の説明および添付図面から、本明細書に記述した実施形態
に加えて本発明の様々な変形例が当業者に明らかになるであろう。そのような変
形例は、上述の特許請求の範囲内に含まれるものとする。

【０１７１】 さらに、核酸またはポリペプチドに与えられた、全ての塩基サイズまたはアミ
ノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量値は、およその値であり、記述
するために与えられたものであることが、さらに理解される。 様々な文献を本明細書で引用したが、その開示の全体を参照により組み込む。

【０１７２】 Aams JM. et al. 1998. The Bcl-2 portein family: arbiters of cell survi
val. Science. Vol281 (5381): 1322-1326. Alessi DR. et al. 1996. Mechanism of activation of protein kinase B by
insulin and IGF-1. EMBO J. Vol15 (23): 6541-6551. Barinaga M. 1998a. Is apotosis key in Alzheimer's disease? Science Vol
281: 1303-1304. Barinaga M. 1998b. Stroke-damaged neurons may commit cellular sucide.
Science Vol281: 1302-1303. Chang HY et al. 1998. Activation of apoptosis signal-regulating kinase
(ASK1) by the adapter protein DAXX. Science. Vol281 (5384): 1860-1863.

【０１７３】 Cross DA. et al. 1995. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 by ins
ulin mediated by protein kinase B. Nature Vol378 (6559): 785-789. Downward J. 1998. Mechanisms and consequences of activation of protein
kinase B/Akt. Curr. Opin. Cell Biol. Vol10 (2): 262-267. Dudek H. et al. 1997. Regulation of neuronal survival by the serine-th
reonine protein kinase Akt. Science Vol275 (5300): 661-665. Franke TF. et al. 1995. The protein kinase encoded by the Akt proto-on
cogene is a target of PDGF-activated phosphatidylinositol 3-kinase. Cell
Vol81 (5): 727-736. Franke TF. et al. 1997. PI3K: downstream AKTion blocks apoptosis. Cell
Vol88 (4): 435-437.

【０１７４】 Hemmings BA. 1997a. Akt signalling: linking membrane events to life an
d death decisions. Science Vol275 (5300): 628-630. Hemmings BA. 1997b. PtdIns (3.4.5) P3 gets its message across. Science
Vol277: 534. Ichijo H. et al. 1997. Induction of apoptosis by ASK1, a mammalian MAP
KKK that activates SAPK/JNK and p38 signaling pathways. Science. Vol 275
: 90-94. Kauffmann-Zeh A. et al. 1997. Suppression of c-Myc-induced apoptosis b
y Ras signaling through PI (3) K and PKB. Nature Vol385 (6616): 544-548.

【０１７５】 Klippel A. et al. 1997. A specific product of phosphatidylinositol 3-k
inase directly activates the protein kinase Akt through its pleckstrin h
omology domain. Mol. Cell Biol. Vol17 (1): 338-344. Konishi H. et al. 1995. Molecular cloning and characterization of a ne
w member of the RAC protein kinase family: association of the pleckstrin
homology domain of three types of RAC protein kinase with protein kinas
e Csubspecies and beta gamma subunits of G proteins. Biochem. Biophys. R
es. Comm. Vol. 216 (2): 526-534. Kulik G. et al. 1997. Antiapoptotic signalling by the insulin-like gro
wth factor I receptor, phosphatidylinositol 3-kinase, and Akt. Mol. Cell
Biol. Vol17 (3): 1595-1606.

【０１７６】 MacLellan WR. et al. 1998. Death by design: programmed cell death in c
ardiovascular biology and diseases. Circ. Res. Vol81 (2): 137-144. Okubo Y. et al. 1998. Insulin-like growth factor-1 inhibits the stress
-activated protein kinase/c-Jun N-terminal kinase. J Biol. Chem. Vol273:
25961-25966. Pullen N. et al. 1998. Phosphorylation and activation of p70S6K by PDK
1. Science Vol279: 707-710. Sambrook J., Fritsch EF. & Maniatis T. 1989. Molecular Cloning (2^nd ed
ition).

【０１７７】 Staal SP. 1987. Molecular cloning of the Akt oncogene and its human ho
mologues AKT1 and AKT2: amplification of AKT1 in a primary human gastric adenocarcinoma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol84 (14): 5034-5037. Stephens L. et al. 1998. Protein kinase B kinases that mediated phosph
atidylinositol 3,4,5-triphosphate-dependent activation of protein kinase
B. Science Vol279: 710-714.

【０１７８】 Stokoe D. et al. 1997. Dual role of phosphatidylinositol-3,4,5-triphos
phate in the activation of protein kinase B. Science Vol277: 567-570. Thornberry NA. et al. 1998. Caspases: enemies within. Science Vol281:
1312-1316.

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 活性化Ａｋｔの概略図である。

【図１Ｂ】 ＨＥＫ２９３細胞における活性化Ａｋｔ３の異所発現を示す。

【図１Ｃ】 活性化Ａｋｔ３のＡｋｔ活性を示す。

【図２】 ＡｋｔのＨｅＬａ細胞からのＶＥＧＦ−１６５の分泌を示す。

【図３Ａ】 Ａｋｔのヒト骨格筋細胞（ＨＳＫＭＣ）でのＶＥＧＦの発現を示す。

【図３Ｂ】 Ａｋｔのヒト冠動脈平滑筋細胞（ＨＣＡＳＭＣ）からのＶＥＧＦ産生を示す。

【図３Ｃ】 ＡｋｔのＨＣＡＳＭＣでのＶＥＧＦ発現を示す。

【図４】 Ａｋｔのラット心筋細胞でのＶＥＧＦ発現を示す。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/22 Ａ６１Ｋ 48/00 38/46 Ａ６１Ｐ 9/10 39/395 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 45/06 Ａ６１Ｋ 37/54 48/00 37/24 Ａ６１Ｐ 9/10 37/43 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ケネス・クラーク アメリカ合衆国ペンシルベニア州19525． ギルバーツビル．ロバーツロード1235 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 DA02 EA02 EA04 HA17 4C084 AA02 AA13 AA17 AA19 BA44 CA18 CA53 DB52 DB54 DB57 DB70 DC22 MA02 NA14 ZA36 ZB26 ZC03 4C085 AA13 BB07 BB31 CC21 CC31 DD62 EE01 EE03 4C086 AA01 AA02 EA16 HA10 HA24 MA01 MA02 MA03 MA04 NA14 ZA36 ZB26 ZC03 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 NA14 ZA36 ZB26 ZC03

Claims (42)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 細胞にＡＫｔ蛋白質を投与することを包含する、細胞内でＶ
   ＥＧＦの発現を誘発する方法。
2. 【請求項２】 Ａｋｔ蛋白質が、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、およびＡｋｔ３から
   なる群から選択される請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 Ａｋｔ蛋白質がＡｋｔ３である請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 ＶＥＧＦが、ＶＥＧＦ₁₂₁、ＶＥＧＦ₁₆₅、ＶＥＧＦ₁₈₉、Ｖ
   ＥＧＦ₂₀₆、ＶＥＧＦ−２、ＶＥＧＦ−Ｂ、およびＶＥＧＦ−Ｄからなる群から
   選択される請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 投与が、発現制御配列に動作可能に関連付けられたＡｋｔ蛋
   白質をエンコードする核酸を細胞内に導入することを包含する、請求項１に記載
   の方法。
6. 【請求項６】 核酸がプラスミドまたはウイルスベクターの一部である請求
   項５に記載の方法。
7. 【請求項７】 核酸がプラスミドの一部である請求項６に記載の方法。
8. 【請求項８】 ウイルスベクターが、レトロウイルス、アデノウイルス、ア
   デノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびワクシニアウイルスからなる群か
   ら選択される請求項６に記載の方法。
9. 【請求項９】 Ａｋｔが、細胞内で構成上発現する請求項５に記載の方法。
10. 【請求項１０】 遷移金属イオンおよび／または血管拡張剤の投与をさらに
    包含する請求項１に記載の方法。
11. 【請求項１１】 発現制御配列に動作可能に関連付けられた第２の血管由来
    因子をエンコードする核酸を投与することをさらに包含する、請求項５に記載の
    方法。
12. 【請求項１２】 第２の血管由来因子が、ＶＥＧＦ、酸性線維芽細胞成長因
    子、塩基性線維芽細胞成長因子、内皮細胞成長因子、およびアンギオポイエチン
    からなる群から選択される請求項１１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 ＶＥＧＦが、ＶＥＧＦ₁₂₁、ＶＥＧＦ₁₆₅、ＶＥＧＦ₁₈₉、
    ＶＥＧＦ₂₀₆、ＶＥＧＦ−２、ＶＥＧＦ−Ｂ、およびＶＥＧＦ−Ｄからなる群か
    ら選択される請求項１２に記載の方法。
14. 【請求項１４】 第２の血管由来因子が内皮細胞成長因子である請求項１２
    に記載の方法。
15. 【請求項１５】 少なくとも２つの形のＡｋｔ蛋白質が細胞に投与される請
    求項２に記載の方法。
16. 【請求項１６】 細胞が、虚血状態に罹っている患者の内部にある請求項１
    に記載の方法。
17. 【請求項１７】 虚血状態が、脳血管虚血、腎虚血、肺虚血、四肢虚血、心
    筋虚血、あるいは、虚血性、特発性、または肥大性の心筋症である請求項１６に
    記載の方法。
18. 【請求項１８】 患者にＡｋｔ蛋白質を投与することを包含する虚血状態に
    罹っている患者の細胞内でＶＥＧＦの発現を誘発する方法。
19. 【請求項１９】 Ａｋｔ蛋白質が、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、およびＡｋｔ３か
    らなる群から選択される請求項１８に記載の方法。
20. 【請求項２０】 Ａｋｔ蛋白質がＡｋｔ３である請求項１９に記載の方法。
21. 【請求項２１】 ＶＥＧＦが、ＶＥＧＦ₁₂₁、ＶＥＧＦ₁₆₅、ＶＥＧＦ₁₈₉、
    ＶＥＧＦ₂₀₆、ＶＥＧＦ−２、ＶＥＧＦ−Ｂ、およびＶＥＧＦ−Ｄからなる群か
    ら選択される請求項１８に記載の方法。
22. 【請求項２２】 発現制御配列に動作可能に関連付けられているＡｋｔ蛋白
    質をエンコードする核酸を患者に投与する請求項１８に記載の方法。
23. 【請求項２３】 核酸がプラスミドまたはウイルスベクターの一部である請
    求項２２に記載の方法。
24. 【請求項２４】 核酸がプラスミドの一部である請求項２３に記載の方法。
25. 【請求項２５】 ウイルスベクターが、レトロウイルス、アデノウイルス、
    アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびワクシニアウイルスからなる群
    から選択される請求項２３に記載の方法。
26. 【請求項２６】 Ａｋｔが、細胞内で構成上発現する請求項２２に記載の方
    法。
27. 【請求項２７】 遷移金属イオンおよび／または血管拡張剤を患者に投与す
    ることをさらに包含する請求項１８に記載の方法。
28. 【請求項２８】 虚血状態が、脳血管虚血、腎虚血、肺虚血、四肢虚血、心
    筋虚血、あるいは、虚血性、特発性、または肥大性の心筋症である請求項１８に
    記載の方法。
29. 【請求項２９】 発現制御配列に動作可能に関連付けられた第２の血管由来
    因子をエンコードする核酸を投与することをさらに包含する請求項２２に記載の
    方法。
30. 【請求項３０】 第２の血管由来因子が、ＶＥＧＦ、酸性線維芽細胞成長因
    子、塩基性線維芽細胞成長因子、内皮細胞成長因子、およびアンギオポイエチン
    からなる群から選択される請求項２９に記載の方法。
31. 【請求項３１】 ＶＥＧＦが、ＶＥＧＦ₁₂₁、ＶＥＧＦ₁₆₅、ＶＥＧＦ₁₈₉、
    ＶＥＧＦ₂₀₆、ＶＥＧＦ−２、ＶＥＧＦ−Ｂ、およびＶＥＧＦ−Ｄからなる群か
    ら選択される請求項３０に記載の方法。
32. 【請求項３２】 第２の血管由来因子が内皮細胞成長因子である請求項３０
    に記載の方法。
33. 【請求項３３】 少なくとも２つの形のＡｋｔ蛋白質が患者に投与される請
    求項１６に記載の方法。
34. 【請求項３４】 Ａｋｔ蛋白質をエンコードする核酸と、遷移金属および／
    または血管拡張剤と、医薬品として許容される賦形剤とを含む医薬品組成物。
35. 【請求項３５】 核酸が、プラスミドまたはウイルスベクターの一部である
    請求項３４に記載の組成物。
36. 【請求項３６】 核酸がプラスミドの一部である請求項３５に記載の組成物
    。
37. 【請求項３７】 ウイルスベクターが、レトロウイルス、アデノウイルス、
    アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびワクシニアウイルスからなる群
    から選択される請求項３５に記載の組成物。
38. 【請求項３８】 腫瘍に罹っている患者の血管形成を抑制する方法であって
    、患者のＡｋｔ活性レベルを抑制することを含み、それによってＶＥＧＦの産生
    を抑制する方法。
39. 【請求項３９】 アンチセンス核酸が細胞内条件下でＡｋｔのｍＲＮＡにハ
    イブリダイズする条件下、Ａｋｔアンチセンス核酸を患者の細胞内に導入するこ
    とを含む請求項３８に記載の方法。
40. 【請求項４０】 Ａｋｔに特異的に結合する細胞内結合蛋白質を、Ａｋｔに
    結合しかつＡｋｔを不活性化するのに十分なレベルで患者の細胞内に導入するこ
    とを含む、請求項３８に記載の方法。
41. 【請求項４１】 細胞内結合蛋白質は一本鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）である請
    求項４０に記載の方法。
42. 【請求項４２】 優性ネガティブ形のＡｋｔをエンコードする核酸を導入す
    ることを含む請求項３８に記載の方法。