EA020464B1 - Отдельные вариабельные домены антител против сывороточного альбумина - Google Patents

Отдельные вариабельные домены антител против сывороточного альбумина Download PDF

Info

Publication number
EA020464B1
EA020464B1 EA200900955A EA200900955A EA020464B1 EA 020464 B1 EA020464 B1 EA 020464B1 EA 200900955 A EA200900955 A EA 200900955A EA 200900955 A EA200900955 A EA 200900955A EA 020464 B1 EA020464 B1 EA 020464B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
binding
ligand
variable domain
antibody
serum albumin
Prior art date
Application number
EA200900955A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200900955A1 (ru
EA020464B9 (ru
Inventor
Айан Томлинсон
Лорен Джесперс
Джаспер Клуб
Люси Холт
Оливер Шон
Original Assignee
Домантис Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Домантис Лимитед filed Critical Домантис Лимитед
Publication of EA200900955A1 publication Critical patent/EA200900955A1/ru
Publication of EA020464B1 publication Critical patent/EA020464B1/ru
Publication of EA020464B9 publication Critical patent/EA020464B9/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6843—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/624—Disulfide-stabilized antibody (dsFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds
    • C07K2318/20—Antigen-binding scaffold molecules wherein the scaffold is not an immunoglobulin variable region or antibody mimetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Согласно изобретению предложен лиганд с двойной специфичностью, содержащий первый вариабельный домен иммуноглобулина, обладающий первой специфичностью связывания, и комплементарный или некомплементарный вариабельный домен иммуноглобулина, обладающий второй специфичностью связывания.

Description

Настоящее изобретение относится к лигандам с двойной специфичностью. В частности, согласно изобретению предложен способ получения лигандов с двойной специфичностью, содержащих первый отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, связывающий первый антиген или эпитоп, и второй отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, связывающий второй антиген или эпитоп. Более конкретно, изобретение относится к лигандам с двойной специфичностью, где связывание по меньшей мере с одним из первого или второго антигенов или эпитопов увеличивает период полувыведения лиганда ίη νίνο. Описаны лиганды с открытой и закрытой конформацией, включающие более чем одну специфичность связывания.
Введение
Антигенсвязывающий домен антитела содержит две отдельные области: вариабельный домен тяжелой цепи (Ун) и вариабельный домен легкой цепи (Уь, который может представлять собой либо Ук, либо νλ). Собственно антигенсвязывающая область образована шестью полипептидными петлями: три из домена Ун (Н1, Н2 и Н3) и три из домена Уъ (Ь1, Ь2 и Ь3). Разнородный первичный репертуар генов вариабельных доменов (У-генов), кодирующих домены Ун и Уъ, образован комбинационной перестройкой сегментов генов. Ген Ун образован рекомбинацией трех сегментов генов, Ун, Ό и 1н. У людей существует приблизительно 51 функциональный сегмент Ун (Соок апй ТотЪпкоп (1995), 1ттипо1 Тойау, 16: 237), 25 функциональных сегментов Ό (СогЬей е! а1. (1997), 1. Мо1. Вю1., 268: 69) и 6 функциональных сегментов 1н (Кауе1сЬ е! а1. (1981), Се11, 27: 583), в зависимости от гаплотипа. Сегмент Ун кодирует область полипептидной цепи, образующую первую и вторую антигенсвязывающие петли домена Ун (Н1 и Н2), в то время как третья антигенсвязывающая петля домена Ун (н3) образована комбинацией сегментов Ун, Ό и 1н. Ген Уъ образован рекомбинацией только двух сегментов генов, Уъ и Ц. У людей существует приблизительно 40 функциональных сегментов Ук (8сЬаЬ1е апй 2асЬаи (1993), Вю1. СЬет. норре-8еу1ег, 374: 1001), 31 функциональный сегмент νλ (АУПЬатк е! а1. (1996), 1. Мо1. Вю1., 264: 220; КатакаИ е! а1. (1997), Сепоте Кек., 7: 250), 5 функциональных сегментов 1к (Ше!ег е! а1. (1982), 1. Вю1. СЬет., 257: 1516) и 4 функциональных сегмента 1λ (Уак1сек апй Ьейег (1990), 1. Ехр. Мей., 172: 609), в зависимости от гаплотипа. Сегмент Уъ кодирует область полипептидной цепи, образующую первую и вторую антигенсвязывающие петли домена Уъ (Ь1 и Ь2), в то время как третья антигенсвязывающая петля домена Уъ (Ь3) образована комбинацией сегментов Уъ и 1Ь. Полагают, что антитела, выбранные из этого первичного репертуара, обладают достаточным разнообразием для связывания почти всех антигенов, по меньшей мере, с умеренной аффинностью. Высокоаффинные антитела образуются при созревании аффинности перестроенных генов, в которых появляются точковые мутации, и в иммунной системе происходит их селекция на основании улучшенного связывания.
Анализ структур и последовательностей антител показал, что пять из шести антигенсвязывающих петель (Н1, Н2, Ь1, Ь2, Ь3) обладают ограниченным числом конформаций главной цепи или канонических структур (СЬоЙиа апй Ьекк (1987), 1. Мо1. Вю1., 196: 901; СЬоЙиа е! а1. (1989), Ыа!иге, 342: 877). Конформаций главной цепи определяются (1) длиной антигенсвязывающей петли и (2) определенными остатками или типами остатков в определенных ключевых положениях антигенсвязывающей петли и каркасной области антитела. Анализ длин петель и ключевых остатков позволил авторам изобретения предсказать конформации главной цепи Н1, Н2, Ь1, Ь2 и Ь3, кодируемые большинством последовательностей человеческих антител (СЬо!Ыа е! а1. (1992), 1. Мо1. Вю1., 227: 799; ТотЪпкоп е! а1. (1995), ЕМВО 1., 14: 4628; ХУППатк е! а1. (1996), 1. Мо1. Вю1., 264: 220). Хотя область н3 значительно более разнообразна в отношении последовательности, длины и структуры (благодаря использованию сегментов Ό), она также образует ограниченное число конформаций главной цепи для петель короткой длины, что зависит от длины и присутствия определенных остатков, типов остатков в ключевых положениях петли и каркасной области антитела (МагЪп е! а1. (1996), 1. Мо1. Вю1., 263: 800; 8Ьит е! а1. (1996), РЕВ8 Ьейегк, 399: 1).
Биспецифичные антитела, содержащие комплементарные пары областей Ун и Уъ, известны в данной области техники. Эти биспецифичные антитела должны содержать две пары Ун и Уъ, из которых каждая пара Ун/Уъ связывает один антиген или эпитоп. Описанные способы включают гибридные гибридомы (Мйк!еш & Сие11о АС, Ха!иге 305:537-40), мини-тела (ни е! а1. (1996), Сапсег Кек 56:3055-3061), диатела (ноШдег е! а1. (1993), Ргос. ЫаЙ. Асай. 8с1. И8А 90, 6444-6448; \УО 94/13804), хелатообразующие рекомбинантные антитела (СКАЬк; №п е! а1. (1995), 1. Мо1. Вю1. 246, 367-373), ЫксРу (например, А1\\е11
- 1 020464
с) а1. (1996), Мо1. 1ттипо1. 33, 1301-1312), антитела, стабилизированные по механизму кпоЬк ίη йо1е8 (выступы в углубления) (Сайет е! а1. (1997), Рто!еш δει. 6, 781-788). В каждом случае каждый вид антитела содержит две антигенсвязывающие области, каждая из которых образована комплементарной парой доменов νΗ и Уь. Каждое антитело, таким образом, способно связывать два различных антигена или эпитопа одновременно, причем связывание каждого антигена или эпитопа опосредовано νΗ и комплементарным ему доменом Уъ. Каждая из этих методик обладает определенными недостатками; например, в случае гибридных гибридом неактивные пары Ун/Уъ могут значительно уменьшать фракцию биспецифичных 1§О. Более того, большая часть способов получения биспецифичных антител основана на объединении различных пар Ун/Ун или объединении цепей νΗ и у!, для реконструкции двух различных связывающих областей Ун/Уь. Следовательно, соотношение связывающих областей для каждого антигена или эпитопа в объединенной молекуле невозможно проконтролировать, и, таким образом, многие из объединенных молекул будут связывать только один антиген или эпитоп. В некоторых случаях было возможным конструировать тяжелые или легкие цепи на границах субъединиц (Саг)ег е! а1., 1997) с целью увеличения числа молекул, имеющих связывающие области для обоих антигенов или эпитопов, но это никогда не приводит к тому, что все молекулы обладают связыванием с обоими антигенами или эпитопами.
Существуют некоторые данные о том, что две различные специфичности связывания антител могут быть включены в одну и ту же связывающую область, но это обычно относится к двум или более специфичностям, соответствующим структурно родственным антигенам или эпитопам, или к антителам, обладающим широкой перекрестной реактивностью. Например, были описаны перекрестно реактивные антитела, где два антигена обычно являются родственными по последовательности и структуре, как, например, лизоцим белка куриного яйца и лизоцим индейки (МсСайейу е! а1., νθ 92/01047), или к свободному гаптену и гаптену, конъюгированному с носителем (Оййййз Ά.Ό. е! а1. ЕМВО 1. 1994 13:14 3245-60). В другом примере в νθ 02/02773 (ЛЬЬой ЬаЬога!ойе8) описаны молекулы антител с двойной специфичностью. Названные молекулы антител представляют собой антитела, выработанные или выбранные против нескольких антигенов таким образом, что их специфичность охватывает более чем один антиген. Каждая комплементарная пара Ун/Уъ в антителах по νθ 02/02773 характеризует одну специфичность связывания в отношении двух или более структурно родственных антигенов; домены νΗ и таких комплементарных пар не обладают отдельной специфичностью. Антитела, таким образом, имеют одну широкую специфичность, охватывающую два антигена, являющиеся структурно родственными. Кроме того, были описаны природные аутоантитела, являющиеся полиреактивными (СазаИ & №1кш8, Апп. Ксу. 1ттипо1. 7, 515-531), взаимодействующие с по меньшей мере двумя (обычно более) различными антигенами или эпитопами, не являющимися структурно родственными. Также было показано, что селекции случайных пептидных репертуаров с применением технологии фагового дисплея на моноклональное антитело идентифицирует ряд пептидных последовательностей, соответствующих антигенсвязывающей области. Некоторые из последовательностей являются высокородственными, соответствуя консенсусной последовательности, в то время как другие сильно различаются и были названы мимотопами (Ьапе & 8!ерйеп, Ситтеп! Оршюп ш 1ттипо1о§у, 1993, 5, 268-271). Таким образом, ясно, что природное четырехцепочечное антитело, содержащее связанные и комплементарные домены νΗ и Уъ, обладает потенциалом связывания со многими различными антигенами из обширной совокупности известных антигенов. Менее понятно, как создать связывающую область для двух данных антигенов в одном и том же антителе, особенно таких антигенов, которые не обязательно являются структурно родственными.
Были предложены способы конструирования белков, имеющие к этому отношение. Например, было также предложено, что может быть создано каталитическое антитело со связывающей активностью в отношении иона металла через один вариабельный домен и в отношении гаптена (субстрата) через контакты с ионом металла и комплементарный вариабельный домен (ВагЬаз е! а1. 1993, Ргос. Νη)1. Асаб. δοί И8А 90, 6385-6389). Тем не менее, в этом случае предлагают, что связывание и катализ субстрата (первого антигена) требует связывания иона металла (второго антигена). Таким образом, связывание с парой νΗ/ν относится к одному, но многокомпонентному антигену.
Были описаны способы получения биспецифичных антител из отдельных доменов тяжелых цепей антител верблюда, где связывающие контакты для одного антигена создают в одном вариабельном домене, а для второго антигена - в другом вариабельном домене. Тем не менее, вариабельные домены не были комплементарны. Таким образом, первый вариабельный домен тяжелой цепи выбирают против первого антигена, а второй вариабельный домен тяжелой цепи - против второго антигена, затем оба домена связывают друг с другом на одной цепи с образованием фрагмента биспецифичного антитела (Сопга!й е! а1., 1. Вю1. Сйет. 270, 27589-27594). Тем не менее, верблюжьи отдельные домены тяжелой цепи необычны в том смысле, что они имеют происхождение от природных верблюжьих антител, у которых нет легких цепей, и в действительности отдельные домены тяжелой цепи неспособны к объединению с верблюжьими легкими цепями с образованием комплементарных пар νΗ и Уь
Также были описаны отдельные вариабельные домены тяжелой цепи, которые обычно объединены с легкими цепями, имеющие происхождение от природных антител (из моноклональных антител или из репертуаров доменов; см. ЕР-А-0368684). Было показано, что эти вариабельные домены тяжелой цепи
- 2 020464 специфично взаимодействуют с одним или более родственными антигенами, но их не комбинировали с другими вариабельными доменами тяжелой или легкой цепи для образования лиганда со специфичностью в отношении двух или более антигенов. Кроме того, было показано, что эти отдельные домены имеют очень короткий период полувыведения ίη νίνο. Таким образом, такие домены имеют ограниченную терапевтическую ценность.
Было предложено получение биспецифичных фрагментов антител связыванием вместе вариабельных доменов тяжелой цепи с разной специфичностью (как описано выше). Недостатком этого способа является то, что выделенные вариабельные домены антител могут иметь гидрофобную внутреннюю поверхность, которая обычно взаимодействует с легкой цепью, обычно контактирует с растворителем и может быть липкой, позволяя отдельному домену связывать гидрофобные поверхности. Кроме того, в отсутствие легкой цепи-партнера комбинация двух или более различных вариабельных доменов тяжелой цепи и их объединение, возможно, через их гидрофобные внутренние поверхности, может предотвратить их связывание с одним лигандом, если не с обоими лигандами, которые они способны связывать по отдельности. Более того, в этом случае вариабельные домены тяжелой цепи могут объединяться с комплементарными вариабельными доменами легкой цепи и, таким образом, могут быть менее стабильны и легко подвержены анфолдингу (\Уогп & ИисЙЬип, 1998, ВюсЬепщ1гу 37, 13120-7).
Краткое изложение сущности изобретения
Авторы настоящего изобретения описали в их находящейся в процессе одновременного рассмотрения международной заявке на патент νθ 03/002609, а также в находящейся в процессе одновременного рассмотрения неопубликованной заявке на патент Великобритании № 0230203.2, иммуноглобулиновые лиганды с двойной специфичностью, содержащие отдельные вариабельные домены иммуноглобулинов, специфичность которых различна. Домены могут действовать конкурентно в отношении друг друга или независимо со связыванием антигенов или эпитопов на молекулах-мишенях.
В первой форме согласно настоящему изобретению предложено дополнительное усовершенствование лигандов с двойной специфичностью, разработанных авторами настоящего изобретения, где одну специфичность лиганда направляют на белок или полипептид, присутствующий в организме ίη νίνο, связывание с которым может увеличивать период полувыведения лиганда.
Соответственно, в первом аспекте предложен лиганд с двойной специфичностью, содержащий первый отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, имеющий специфичность связывания в отношении первого антигена или эпитопа, и второй комплементарный отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, имеющий связывающую активность в отношении второго антигена или эпитопа, где один или оба указанных антигена или эпитопа действуют для увеличения период полувыведения лиганда ίη νίνο и где в указанных первом и втором доменах нет взаимно комплементарных доменов с той же специфичностью, при условии, что указанный лиганд с войной специфичностью не состоит из домена Ун против ΗδΆ и домена Ук против β-галактозидазы. Предпочтительно ни один из первого или второго вариабельных доменов не связывает человеческий сывороточный альбумин (ΗδΆ).
Антигены или эпитопы, увеличивающие период полувыведения лиганда, как описано здесь, преимущественно присутствуют на белках или полипептидах, обнаруживаемых в организме ίη νίνο. Примеры включают белки внеклеточного матрикса, белки крови и белки, присутствующие в различных тканях в организме. Белки снижают скорость клиренса лиганда из крови, например, действуя как наполнители, или фиксируя лиганд к желаемому месту действия. Примеры антигенов/эпитопов, действующих для увеличения периода полувыведения ίη νίνο, даны в приложении 1 ниже.
Увеличенный период полувыведения полезен при ίη νίνο применениях иммуноглобулинов, конкретно антител и наиболее конкретно фрагментов антител малого размера. Такие фрагменты (Ρν, связанные дисульфидными связями Ρν, РаЬ, δοΡν, доменные антитела (бАЬ)) подвержены быстрому удалению из организма; таким образом, в то время как они способны быстро достигать большинства частей тела, их производство занимает незначительное время и они более просты в использовании, их применения ίη νίνο были ограничены лишь их коротким сохранением ίη νίνο. Согласно изобретению эту проблему решают, обеспечивая увеличенный период полувыведения лигандов ίη νίνο и, вследствие этого, более длительное время сохранения функциональной активности лиганда в организме.
Способы фармакокинетического анализа и определения периода полувыведения лиганда будут знакомы специалистам в данной области техники. Подробности могут быть обнаружены в ^η^ΐΧ А. е1 а1.: СЬетюа1 51аЬННу οί РЬаттасеиДсаН: А Ηαη^οοί ίοτ ΡΙιαπηαοίδΙδ апб ίη Ре1ег5 еΐ а1., РЬа^тасοк^ηеΐс апа1уδίδ: А Ргас11са1 АрргоасЬ (1996). Также сделана ссылка на ΡЬа^тасοк^ηеΐ^сδ, М С1Ьа1б1 & Ό Реггст. риЬЬхЬеб Ьу Магсе1 Эеккег, 2'1 Ве\\ ех ебЬюп (1982), где описаны такие фармакокинетические параметры, как периоды полувыведения ΐ-альфа (ΐα) и ΐ-бета (ΐβ) и площадь под кривой (АИС).
Периоды полувыведения (Н/2альфа и Н/2бета) и АИС могут быть определены по кривой зависимости концентрации лиганда в сыворотке от времени. Пакет программ для расчётов νίηΝοηΗη (доступный от ΡΙιηΓδίβΙιΙ Сюрз., ΜουηΙηίη У1е\у, СА94040, И8А) может быть использован, например, для моделирования кривой. В первой фазе (альфа-фазе) лиганд проходит главным образом распределение в организме пациента с незначительным выведением. Вторая фаза (бета-фаза) является конечной фазой, когда лиганд
- 3 020464 был распределен и концентрация в сыворотке снижается по мере того, как лиганд выводится из организма пациента. Период полувыведения ΐ-альфа является периодом полувыведения первой фазы, а период полувыведения ΐ-бета является периодом полувыведения второй фазы. Таким образом, преимущественно согласно настоящему изобретению предложен лиганд или композиция, содержащая лиганд по изобретению, имеющий период полувыведения ΐα в диапазоне 15 мин или более. В одном воплощении нижняя граница диапазона составляет 30, 45 мин, 1 ч, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11 или 12 ч. В дополнение или альтернативно, лиганд или композиция по изобретению будут иметь период полувыведения ΐα в диапазоне до 12 ч включительно. В одном воплощении верхняя граница диапазона составляет 11, 10, 9, 8, 7, 6 или 5 ч. Пример подходящего диапазона составляет от 1 до 6 ч, от 2 до 5 ч или от 3 до 4 ч.
Преимущественно согласно настоящему изобретению предложен лиганд или композиция, содержащая лиганд по изобретению, имеющий период полувыведения ΐβ в диапазоне 2,5 ч или более. В одном воплощении нижняя граница диапазона составляет 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11 или 12 ч. В дополнение или альтернативно, лиганд или композиция по изобретению имеет период полувыведения ΐβ в диапазоне до 21 дня включительно. В одном воплощении верхняя граница диапазона составляет 12 ч, 24 ч, 2 дня, 3, 5, 10, 15 или 20 дней. Преимущественно лиганд или композиция по изобретению будет иметь период полувыведения ΐβ в диапазоне от 12 до 60 ч. В дополнительном воплощении он будет в диапазоне от 12 до 48 ч. В еще одном дополнительном воплощении он будет в диапазоне от 12 до 26 ч.
В дополнение или альтернативно к вышеописанным критериям, согласно настоящему изобретению предложен лиганд или композиция, содержащая лиганд по изобретению, имеющий значение ЛИС (площадь под кривой) в диапазоне 1 мг/мин/мл или более. В одном воплощении нижняя граница диапазона составляет 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 или 300 мг/мин/мл. В дополнение или альтернативно, лиганд или композиция по изобретению имеет АИС в диапазоне до 600 мг/мин/мл. В одном воплощении верхняя граница диапазона составляет 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 или 50 мг/мин/мл. Преимущественно лиганд по изобретению будет иметь АИС в диапазоне, выбранном, предпочтительно без ограничения, из группы, состоящей из следующего: от 15 до 150, от 15 до 100, от 15 до 75 и от 15 до 50 мг/мин/мл.
В первом воплощении лиганд с двойной специфичностью содержит два комплементарных вариабельных домена, т.е. два вариабельных домена, которые в их природной среде способны действовать совместно как когнатная пара или группа, даже если в контексте настоящего изобретения они связывают их когнатные эпитопы по отдельности. Например, комплементарные вариабельные домены могут представлять собой вариабельные домены тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина (Ун и Уь). Домены νΗ и Уъ преимущественно представлены фрагментами антител 5сРу или РаЬ. Вариабельные домены могут быть связаны друг с другом с образованием мультивалентных лигандов посредством, например, обеспечения присутствия шарнирной области на С-конце каждого вариабельного домена (У-домена) и дисульфидным связыванием цистеинов в шарнирных областях; или обеспечением присутствия в каждом ЙАЬ цистеина на С-конце домена, где цистеины связаны друг с другом дисульфидной связью; или образованием У-СН и У-СЬ с образованием РаЬ-формата; или применением пептидных линкеров (например, линкеров О1у48ет, обсуждаемых в данном изобретении ниже) с образованием димеров, тримеров и других мультимеров.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что применение комплементарных вариабельных доменов делает возможной совместную упаковку поверхностей доменов и их отделение от растворителя. Кроме того, комплементарные домены способны стабилизировать друг друга. Более того, это делает возможным создание 1§О-антител с двойной специфичностью без недостатков, связанных с гибридными гибридомами, которые применяли в предшествующем уровне техники, или необходимости конструирования тяжелых или легких цепей на внутренних поверхностях субъединиц. Лиганды с двойной специфичностью по первому аспекту настоящего изобретения имеют по меньшей мере одну пару Ун/Уъ. Биспецифичный 1§О по данному изобретению будет, таким образом, содержать две такие пары, по одной паре на каждом плече Υ-образной молекулы. Таким образом, в отличие от обычных биспецифичных антител или диател, где соотношение используемых цепей является определяющим для успешного их получения и приводит к практическим трудностям, лиганды с двойной специфичностью по изобретению свободны от проблем баланса цепей. Дисбаланс цепей в обычных биспецифичных антителах является результатом объединения двух различных цепей Уъ с двумя различными цепями Ун, где 1 цепь Уъ совместно с 1 цепью Ун способна связывать 1 антиген или эпитоп, и 2 цепь Уъ совместно со 2 цепью Ун способна связывать 2 антиген или эпитоп, и две правильные пары некоторым образом связаны друг с другом. Таким образом, биспецифичность появляется только тогда, когда 1 цепь Уъ образует пару с 1 цепью Ун и 2 цепь Уъ образует пару со 2 цепью Ун в одной молекуле. Такие биспецифичные молекулы могут быть созданы двумя разными способами. Во-первых, они могут быть созданы объединением двух существующих пар Ун/Уъ, каждая из которых связывает различный антиген или эпитоп (например, в биспецифичном 1дО). В этом случае пары Ун/Уъ должны быть объединены в соотношении 1:1 для образования популяции молекул, каждая из которых является биспецифичной. Этого никогда не происходит (даже когда комплементарный домен СН усилен киоЬк ίηΐο Ьо1е8-конструированием), что приводит к образованию смеси биспецифичных молекул и молекул, способных связывать лишь один антиген или
- 4 020464 эпитоп. Второй способ создания биспецифичного антитела заключается в одновременном объединении двух различных цепей Ун с двумя различными цепями Уъ (например, в биспецифичном диателе). В этом случае, хотя и существует тенденция к преимущественному образованию пар 1 цепи Уъ с 1 цепью Ун и 2 цепи Уъ со 2 цепью Ун (которые могут быть усилены киоЪк ίηΐο Ьо1е8-конструированием доменов Ун и Уъ), никогда не удается достичь такого образования пар во всех молекулах, что ведет к образованию смешанной композиции, где имеют место неправильные пары, неспособные связывать какой-либо из антигенов или эпитопов.
В биспецифичных антителах, полученных способом лиганда с двойной специфичностью по первому аспекту настоящего изобретения, все эти проблемы преодолены, поскольку связывание 1 антигена или эпитопа присуще домену Ун или Уъ и связывание 2 антигена или эпитопа присуще комплементарному домену Ун или Уъ соответственно. Поскольку домены Ун и Уъ образуют пары в соотношении 1:1, все пары Ун/Уъ будут биспецифичными, и, таким образом, все форматы, конструированные с применением этих пар Ун/Уь (Ρν, 8сРу, РаЪ, мини-тела, 1§С и т.п.), будут иметь 100% биспецифичную активность.
В контексте настоящего изобретения первый и второй эпитопы следует понимать как эпитопы, не являющиеся одинаковыми и не связываемые одним моноспецифичным лигандом. В первой форме изобретения они преимущественно расположены на разных антигенах, один из которых увеличивает период полувыведения лиганда ίη νίνο. Подобным образом, первый и второй антигены преимущественно не являются одинаковыми.
Лиганды с двойной специфичностью по изобретению не включают лиганды, как описано в νΟ 02/02773. Таким образом, лиганды по настоящему изобретению не включают комплементарные пары Ун/Уь связывающие один или более антигены или эпитопы кооперативно. Взамен этого, лиганды по первому аспекту изобретения включают комплементарную пару Ун/Уь, где У-домены имеют разные специфичности.
Более того, лиганды по первому аспекту изобретения включают комплементарные пары Ун/Уъ, имеющие различные специфичности в отношении эпитопов или антигенов, не являющихся структурно родственными. Структурно родственные эпитопы или антигены являются эпитопами или антигенами, обладающими достаточным структурным сходством для того, чтобы быть связанными обычной комплементарной парой Ун/Уъ, действующей кооперативным образом для связывания антигена или эпитопа; в случае структурно родственных эпитопов эпитопы достаточно сходны по структуре, так что они подходят к одному и тому же связывающему карману, образованному в антигенсвязывающей области димера Ун/Уь.
Во втором аспекте согласно настоящему изобретению предложен лиганд, содержащий первый вариабельный домен иммуноглобулина, имеющий первую специфичность связывания в отношении антигена или эпитопа, и второй вариабельный домен иммуноглобулина, имеющий вторую специфичность связывания в отношении антигена или эпитопа, где один или оба из указанных первого и второго вариабельных доменов связывают антиген, увеличивающий период полувыведения лиганда ίη νίνο, и вариабельные домены не являются комплементарными по отношению друг к другу.
В одном воплощении связывание с одним вариабельным доменом модулирует связывание лиганда со вторым вариабельным доменом.
В этом воплощении вариабельный домен может представлять собой, например, пары доменов Ун или пары доменов Уь. Связывание антигена в первой области может модулировать, как, например, усиливать или ингибировать, связывание антигена во второй области. Например, связывание в первой области, по меньшей мере, частично ингибирует связывание антигена во второй области. В таком воплощении лиганд может, например, быть сохранен в организме-субъекте ίη νίνο посредством связывания с белком, увеличивающим период полувыведения лиганда, до того времени, пока он не будет связан со вторым антигеном-мишенью и отсоединен от белка, увеличивающего период полувыведения.
Модулирования связывания в изложенном выше контексте достигают вследствие структурной близости антигенсвязывающих областей по отношению друг к другу. Такая структурная близость может быть достигнута ввиду природы структурных компонентов, связывающих две или более антигенсвязывающих области, например, обеспечением лиганда с относительно ригидной структурой, удерживающей антигенсвязывающие области в тесной близости. Преимущественно две или более антигенсвязывающих области находятся в физически тесной близости друг от друга таким образом, что одна область модулирует связывание антигена в другой области в результате процесса, включающего стерическое затруднение и/или конформационные изменения в молекуле иммуноглобулина.
Первый и второй антигенсвязывающие домены могут быть связаны либо ковалентно, либо нековалентно. В случае, когда домены связаны ковалентно, связывание может быть опосредовано, например, дисульфидными связями или полипептидным линкером, таким как (С1у45ег)м. где п=от 1 до 8, например 2, 3, 4, 5 или 7.
Лиганды по изобретению могут быть комбинированы с образованием неиммуноглобулиновых мультилигандных структур для образования мультивалентных комплексов, связывающих молекулымишени с одним и тем же антигеном, обеспечивая посредством этого повышенную авидность, в то время
- 5 020464 как по меньшей мере один вариабельный домен связывает антиген для увеличения периода полувыведения мультимера. Например, природные бактериальные рецепторы, такие как 8рА, были использованы как каркасы для переноса гипервариабельных участков (СЭК) с образованием лигандов, специфично связывающих один или более чем один эпитоп. Подробности этого способа описаны в И8 5831012. Другие подходящие каркасы включают каркасы на основе фибронектина и АТйЪоФек™. Подробности подходящих способов описаны в \УО 98/58965. Другие подходящие каркасы включают липокалин и СТЬА4, как описано в уап беп Веикеп е( а1., 1. Мо1. ΒίοΙ. (2001), 310, 591-601, и такие каркасы, как описанные в \УО 0069907 (Меб1еа1 Кекеагсй Соипей), основанные, например, на кольцевой структуре бактериального СгоЕ1 или других полипептидов-шаперонов.
Белковые каркасы можно комбинировать; например, СОК могут быть перенесены на каркас СТБА4 и использованы совместно с доменами иммуноглобулинов Ун или Уъ с образованием лиганда. Подобным образом можно комбинировать фибронектиновые, липокалиновые и другие каркасы.
В случае, когда вариабельные домены выбраны из репертуаров У-генов, селектрированных, например, с применением технологии фагового дисплея, как описано здесь, эти вариабельные домены могут содержать универсальную каркасную область таким образом, что они могут быть распознаны специфичным лигандом общего типа, как определено здесь. Применение универсальных каркасных областей, лигандов общего типа и т.п. описано в \УО 99/20749. В настоящем изобретении ссылка на фаговый дисплей включает применение фагов и/или фагмид.
Там, где используют репертуары У-генов, разнообразие полипептидной последовательности предпочтительно заключено в структурных петлях вариабельных доменов. Полипептидные последовательности каждого вариабельного домена могут быть изменены перетасовкой ДНК или мутацией с целью усиления взаимодействия каждого вариабельного домена с его комплементарной парой.
В предпочтительном воплощении изобретения лиганд с двойной специфичностью представляет собой одноцепочечный Ρν-фрагмент. В альтернативном воплощении изобретения лиганд с двойной специфичностью состоит из РаЪ-области антитела. Термин РаЪ-область включает РаЪ-подобную область, где использованы два домена Ун или два домена Уь.
Вариабельные домены могут иметь происхождение от антител, направленных против антигеновмишеней или эпитопов-мишеней. Альтернативно, они могут иметь происхождение от репертуара отдельных доменов антител, как, например, экспрессированных на поверхности нитчатого бактериофага. Селекцию можно проводить, как описано ниже.
В третьем аспекте согласно изобретению предложен способ получения лиганда, содержащего первый отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, имеющий первую специфичность связывания, и второй отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, имеющий вторую (другую) специфичность связывания, где одна или обе специфичности связывания специфичны в отношении антигена, увеличивающего период полувыведения лиганда ш νί\Ό, включающий стадии:
а) селекции первого вариабельного домена по его способности связывать первый эпитоп;
б) селекции второго вариабельного домена по его способности связывать второй эпитоп;
в) комбинирования вариабельных доменов;
г) селекции лиганда по его способности связывать указанный первый эпитоп и указанный второй эпитоп.
Лиганд может связывать первый и второй эпитопы либо одновременно, либо там, где связывающие домены связывают эпитопы конкурентно, связывание одного домена может предотвращать связывание другого домена с его штатным эпитопом. В одном воплощении, таким образом, указанная выше стадия (г) требует одновременного связывания как первого, так и второго эпитопа (и, возможно, дополнительных эпитопов); в другом воплощении связывание первого и второго эпитопов не является одновременным.
Эпитопы предпочтительно расположены на отдельных антигенах.
Лиганды преимущественно содержат комбинации вариабельных доменов иммуноглобулинов Ун/Уь или комбинации Ун/Ун или Уь/Уь, как описано выше. Более того, лиганды могут содержать домены Унн представителей семейства верблюдовых, при условии, что домен Унн, специфичный в отношении антигена, увеличивающего период полувыведения лиганда ш νί\Ό. не связывает лизоцим белка куриного яйца (нЕЬ), альфа-амилазу поджелудочной железы свиньи или ЫтС-А; йсд, азокраситель КК6, связанный с бычьим сывороточным альбумином (В8А), или клетки нС982 8. тиТапк, как описано в СопгаТй е( а1. (2001), 1ВС 276:7346-7350 и \УО 99/23221, ни в одной из которых не описано применение специфичности в отношении антигена, увеличивающего период полувыведения, для увеличения периода полувыведения лиганда ш νί\Ό.
В одном воплощении указанный первый вариабельный домен выбран для связывания указанного первого эпитопа в отсутствие комплементарного вариабельного домена. В другом воплощении указанный первый вариабельный домен связывания указанного первого эпитопа/антигена в присутствии третьего вариабельного домена, где указанный третий вариабельный домен отличается от указанного второго вариабельного домена и комплементарен первому домену. Сходным образом, второй домен может быть выбран в отсутствие или в присутствии комплементарного вариабельного домена.
- 6 020464
Антигены или эпитопы, являющиеся мишенями для лигандов по изобретению, увеличивающие период полувыведения лиганда, не ограничены мишенями на сывороточном альбумине. Другие воплощения антигенов или эпитопов, являющихся мишенями для лигандов по изобретению, увеличивающие период полувыведения лиганда ίη νίνο, включают, предпочтительно без ограничения, те антигены и эпитопы, которые перечислены в приложении 1 ниже.
Антигены или эпитопы, являющиеся мишенями для лигандов по изобретению, в дополнение к увеличивающему период полувыведения белку, могут представлять собой любой антиген или эпитоп, но преимущественно представляют собой антиген или эпитоп, направленное воздействие на который сопряжено с терапевтическим эффектом. Согласно изобретению предложены лиганды, включая лиганды с открытой конформацией, закрытой конформацией и лиганды, представляющие собой выделенные мономеры бАЬ, специфичные в отношении любой такой мишени, в частности, тех мишеней, которые дополнительно обозначены здесь. Такие мишени могут представлять собой полипептиды, белки или нуклеиновые кислоты, которые могут быть встречающимися в природе или синтетическими, или быть их частью. В этом отношении, лиганд по изобретению может связывать эпитоп или антиген и действовать как антагонист или агонист (например, агонист рецептора эритропоэтина (ЕРО)). Специалисту в данной области техники будет ясно, что выбор широк и разнообразен. Они могут представлять собой, например, белки человека или животных, цитокины, рецепторы цитокинов, где рецепторы цитокинов включают рецепторы цитокинов, ферментов, кофакторов ферментов или ДНК-связывающих белков. Подходящие цитокины и факторы роста включают, предпочтительно без ограничения, аполипопротеин Е (АроЕ), аполипопротеин БАА (Аро-БАА), нейротрофический фактор головного мозга (ΒΌΝΤ), кардиотрофин-1, эпидермальный фактор роста (ЕСР), рецептор ЕСР, ΕΝΑ-78, эотаксин, эотаксин-2, Ехоби8-2, ЕроК, кислый фактор роста фибробластов (ЕСР), основной ЕСР, фактор роста фибробластов-10, лиганд РЬТЗ, фракталкин (СХЗС), глиальный нейротрофический фактор (СООТ1), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (С-СБЕ), гранулоцитарно-моноцитарный колониестимулирующий фактор (СМ-СБЕ), СЕ-βΙ, инсулин, γ-интерферон (ΙΡΝ-γ), инсулиноподобный фактор роста-1 (ЮЕ-Ι), инсулиноподобный фактор роста2 (1СЕ-11), интерлейкин-1а (1Ь-1а), ΙΕ-1β, 1Ь-2, 1Ь-3, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6, 1Ь-7, 1Ь-8 (72 аминокислоты (а.а.)), Ю-8 (77 а.а.), 1Ь-9, 1Ь-10, 1Ь-11, 1Ь-12, 1Ь-13, 1Ь-15, 1Ь-16, 1Ь-17, 1Ь-18 (ΙΡΝγ-индуцирующий фактор (ЮТЕ)), ингибин α, ингибин β, ΙΡ-10, фактор роста кератиноцитов-2 (КСЕ-2), КСЕ, лептин, лейкемический ингибиторный фактор (ЫЕ), лимфотактин, мюллерову ингибирующую субстанцию, фактор, ингибирующий колонии моноцитов, моноцитарный атрактантный белок, моноцитарный колониеингибирующий фактор М-СБЕ, МЭС (67 а.а.), МЭС (69 а.а.), моноцитарный хемотаксический белок-1 (МСР-1) (моноцитарный хемотаксический и активирующий фактор (МСАЕ)), МСР-2, МСР-3, МСР-4, МЭС (67 а.а.), МЭС (69 а.а.), М1С, макрофагальный воспалительный белок-1а (М1Р-1а), М1Р-1 β, М1Р-3а, М1Р-3в, М1Р4, фактор, ингибирующий миелоидных предшественников, 1 типа (МР1Е-1), нейтрофил-активирующий белок-2 ЩАР-2), неуртурин, фактор роста нервов, фактор роста нервов-β (β-ΝΟΡ), нейротрофин-3 (ΝΤ3), ΝΤ-4, онкостатин М, тромбоцитарный фактор роста АА (РОСЕ-АА), РОСЕ-АВ, РОСЕ-ВВ, тромбоцитарный фактор-4 (РЕ-4), КАЫТЕБ, фактор стромальных клеток-1а (БОЕ1а), Б0Е1 β, фактор стволовых клеток (БСЕ), фактор роста стволовых клеток (БССЕ), фактор стволовых клеток (БСЕ), тимусассоциированные регуляторные хемокины (ТАКС), трансформирующий фактор роста-α (ТСЕ-α), ТСЕ-β, ТСЕХ, ТСЕХ, фактор некроза опухоли (ЮТ), ТИЕ-а, ЮТ-β, рецептор ТОТ1 I типа, рецептор ТОТ1 II типа, Т№Ь-1, ТРО, сосудистый эндотелиальный фактор роста (УЕСЕ), рецептор УЕСЕ 1 типа, рецептор УЕСЕ 2 типа, рецептор УЕСЕ 3 типа, гранулоцитарный хемотактический белок-2 (ССР-2), СКО/МСБА, СКО-β, СКО-γ, НСС1, Ι-309, рецептор человеческого эпидермального фактора роста-1 (НЕК 1), НЕК 2, НЕК 3 и НЕК 4, СЭ4, человеческие рецепторы хемокинов СХСК4 или ССК5, неструктурный белок 3 типа (Ν83) вируса гепатита С, ТХЕ-альфа, !дЕ, ШЫ-гамма, матриксную металлопротеиназу-12 (ММР-12), раковоэмбриональный антиген (СЕА), Н. ру1оп, ТВ, вирус гриппа, вирус гепатита Е, ММР-12, интернализуемые рецепторы, сверхэкспрессируемые на определенных клетках, такие как рецептор эпидермального фактора роста (ЕСЕК), рецептор ЕгВЬ2 на опухолевых клетках, интернализуемый клеточный рецептор, рецептор липопротеинов низкой плотности (ΕΌΕ), рецептор ЕСЕ2, рецептор ЕгВЬ2, рецептор трансферрина, рецептор РОСЕ, рецептор УЕСЕ, РзтАт, белок внеклеточного матрикса, эластин, фибронектин, ламинин, а1-антитрипсин, тканевой фактор, ингибирующий протеазы, РОК1, СБК1, Ваб, каспазу-9, Еогкйеаб, антиген НеПсоЬасЮг ру1оп, антиген МусоЬас1егшт 1иЬегси1о818 и антиген вируса гриппа. Следует понимать, что этот список ни в коем случае не является исчерпывающим.
В одном воплощении изобретения вариабельные домены имеют происхождение от соответствующего антитела, направленного против антигена или эпитопа. В предпочтительном воплощении вариабельные домены имеют происхождение от репертуара отдельных вариабельных доменов антител.
В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложена одна молекула нуклеиновых кислот или более, кодирующая, по меньшей мере, лиганд с двойной специфичностью, как определено здесь. Лиганд с двойной специфичностью может быть кодирован на одной молекуле нуклеиновой кислоты; альтернативно, каждый домен может быть кодирован отдельной молекулой нуклеиновой кислоты. Там, где лиганд кодирован одной молекулой нуклеиновой кислоты, домены могут быть экспрессированы
- 7 020464 в виде слитого полипептида, в форме молекулы ксРу, или могут быть экспрессированы по отдельности и впоследствии соединены друг с другом, например, с использованием химических линкеров. Лиганды, экспрессированные с отдельных нуклеиновых кислот, будут связаны друг с другом подходящими способами.
Нуклеиновая кислота может также кодировать сигнальную последовательность для экспорта полипептидов из клетки-хозяина при экспрессии и может быть слита с поверхностным компонентом частицы нитчатого бактериофага (или другим компонентом дисплейной системы для селекции) при экспрессии.
В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую лиганд с двойной специфичностью по настоящему изобретению.
В еще одном другом аспекте согласно настоящему изобретению предложена клетка-хозяин, трансфицированная вектором, кодирующим лиганд с двойной специфичностью по настоящему изобретению.
Экспрессия с такого вектора может быть изменена для образования, например, на поверхности частицы бактериофага, вариабельных доменов для селекции. Это делает возможным селекцию представленных вариабельных доменов и, таким образом, селекцию лигандов с двойной специфичностью с применением способа по настоящему изобретению.
Согласно настоящему изобретению также предложен набор, содержащий, по меньшей мере, лиганд с двойной специфичностью по настоящему изобретению.
Лиганды с двойной специфичностью по настоящему изобретению предпочтительно содержат комбинации доменов тяжелой и легкой цепи. Например, лиганд с двойной специфичностью может содержать домен νΗ и домен Уь, которые могут быть связаны друг с другом в форме ксРу. В дополнение, лиганды могут содержать один или более чем один домен Сн или Сь Например, лиганды могут содержать домен Сн1, Сн2 или домен Сн3, и/или домен Съ, домены Сц1, Сц2, Сц3 или Сц4, или любую их комбинацию. Также может быть включена шарнирная область. Такие комбинации доменов могут, например, имитировать природные антитела, такие как 1§С или 1дМ, или их фрагменты, такие как молекулы Ру, ксРу, РаЬ или Р(аЬ')2. Предусмотрены другие структуры, такие как отдельное плечо молекулы 1§С, содержащее домены νΗ, ν^ Сн1 и Сь.
В предпочтительном воплощении изобретения вариабельные области выбраны из репертуаров νгенов отдельных доменов. В большинстве случаев репертуар отдельных доменов антител представляют на поверхности нитчатого бактериофага. В предпочтительном воплощении каждый отдельный домен антитела селектируют связыванием фагового репертуара с антигеном.
В предпочтительном воплощении изобретения каждый отдельный вариабельный домен может быть селектирован для связывания его антигена-мишени или эпитопа-мишени в отсутствие комплементарной вариабельной области. В альтернативном воплощении отдельные вариабельные домены могут быть селектированы для связывания их антигена-мишени или эпитопа-мишени в присутствии комплементарной вариабельной области. Таким образом, первый отдельный вариабельный домен может быть селектирован в присутствии третьего комплементарного вариабельного домена, и второй вариабельный домен может быть селектирован в присутствии четвертого комплементарного вариабельного домена. Комплементарный третий или четвертый вариабельный домен может быть естественным когнатным вариабельным доменом, имеющим ту же специфичность, как и исследуемый отдельный домен, или некогнатным комплементарным доменом, таким как модельный вариабельный домен.
Предпочтительно лиганд с двойной специфичностью по изобретению содержит только два вариабельных домена, хотя несколько таких лигандов могут быть включены совместно в один тот же белок, например, два таких лиганда могут быть включены в 1§С или мультимерный иммуноглобулин, как, например, 1дМ. Альтернативно, в другом воплощении множество лигандов с двойной специфичностью комбинируют с образованием мультимера. Например, два различных лиганда с двойной специфичностью комбинируют для создания тетраспецифичной молекулы.
Специалисту в данной области техники будет ясно, что вариабельные домены легкой и тяжелой цепи лиганда с двойной специфичностью, полученного способом по настоящему изобретению, могут быть расположены на одной полипептидной цепи или, альтернативно, на разных полипептидных цепях. В случае, когда вариабельные домены расположены на разных полипептидных цепях, они могут быть связаны линкером, в большинстве случаев гибким линкером (таким как полипептидная цепь), химической связывающей группой или любым другим способом, известным в данной области техники.
В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложена композиция, содержащая лиганд с двойной специфичностью, который можно получить способом по настоящему изобретению, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент.
Более того, согласно настоящему изобретению предложен способ лечения и/или предотвращения заболевания с применением лиганда с двойной специфичностью или композиции по настоящему изобретению.
Во второй форме согласно настоящему изобретению предложены мультиспецифичные лиганды, содержащие по меньшей мере два некомплементарных вариабельных домена. Например, лиганды могут содержать пару доменов или пару доменов ν^ Преимущественно домены имеют происхождение от источника, не являющегося представителем семейства верблюдовых; предпочтительно они являются
- 8 020464 человеческими доменами или содержат человеческие каркасные области (Р^) и одну или более гетерологичные СЭР. СЭР и каркасные области представляют собой области вариабельных доменов иммуноглобулинов, определенные в базе данных КаЬа1 йаШЬа^с о£ Бссщспссх о£ РгоЮнъ о£ 1ттипо1од1са1 БИсгсЧ.
Предпочтительные человеческие каркасные области представляют собой области, кодируемые сегментами генов ΌΡ47 и ΌΡΚ9 эмбрионального типа. Преимущественно Р^1, Р\У2 и Р^3 домена νΗ или V,, имеют последовательность Р\У1. Р\У2 или Р\У3 из ΌΡ47 или ΌΡΚ9. Человеческие каркасные области могут, возможно, содержать мутации, например, в общей сложности до приблизительно 5 аминокислотных замен или до приблизительно 10 аминокислотных замен в человеческих каркасных областях, используемых в лигандах по изобретению.
Вариабельные домены в мультиспецифичных лигандах по второй форме изобретения могут быть расположены в открытой или закрытой конформации; т.е. они могут быть расположены таким образом, что вариабельные домены могут связывать их когнатные лиганды независимо и одновременно, или таким образом, что только один из вариабельных доменов может связывать его когнатный лиганд в определенный момент времени.
Авторам настоящего изобретения было ясно, что при определенных структурных условиях некомплементарные вариабельные домены (например, два вариабельных домена легкой цепи и два вариабельных домена тяжелой цепи) могут присутствовать в лиганде таким образом, что связывание первого эпитопа с первым вариабельным доменом ингибирует связывание второго эпитопа со вторым вариабельным доменом, даже если такие некомплементарные домены не действуют совместно как когнатная пара.
Преимущественно лиганд содержит две или более пары вариабельных доменов; тот есть он содержит по меньшей мере четыре вариабельных домена. Преимущественно четыре вариабельных домена содержат каркасные области человеческого происхождения.
В предпочтительном воплощении человеческие каркасные области идентичны каркасным областям человеческих последовательностей зародышевого типа.
Авторы настоящего изобретения полагают, что такие антитела будут особенно применимы в исследованиях связывания лигандов для терапевтических и других применений.
Таким образом, в первом аспекте второй формы согласно настоящему изобретению предложен способ получения мультиспецифичного лиганда, включающий стадии:
а) селекции первого эпитопсвязывающего домена по его способности связывать первый эпитоп;
б) селекции второго эпитопсвязывающего домена по его способности связывать второй эпитоп;
в) комбинирования эпитопсвязывающих доменов и
г) селекции мультиспецифичного лиганда с закрытой конформацией по его способности связывать указанный первый эпитоп и указанный второй эпитоп.
В другом аспекте второй формы согласно изобретению предложен способ получения мультиспецифичного лиганда с закрытой конформацией, содержащего первый эпитопсвязывающий домен, имеющий специфичность связывания в отношении первого эпитопа, и некомплементарный второй эпитопсвязывающий домен, имеющий специфичность связывания в отношении второго эпитопа, где первая и вторая специфичности связывания конкурируют за связывание эпитопа таким образом, что мультиспецифичный лиганд с закрытой конформацией не может связывать оба эпитопа одновременно, включающий стадии:
а) селекции первого эпитопсвязывающего домена по его способности связывать первый эпитоп;
б) селекции второго эпитопсвязывающего домена по его способности связывать второй эпитоп;
в) комбинирования эпитопсвязывающих доменов таким образом, что домены расположены в закрытой конформации;
г) селекции мультиспецифичного лиганда с закрытой конформацией по его способности связывать указанный первый эпитоп и указанный второй эпитоп, но не оба указанных первый и второй эпитопы одновременно.
Более того, согласно изобретению предложен мультиспецифичный лиганд с закрытой конформацией, содержащий первый эпитопсвязывающий домен, имеющий специфичность связывания в отношении первого эпитопа, и некомплементарный второй эпитопсвязывающий домен, имеющий специфичность связывания в отношении второго эпитопа, где первая и вторая специфичности связывания конкурируют за связывание эпитопа таким образом, что мультиспецифичный лиганд с закрытой конформацией не может связывать оба эпитопа одновременно.
Альтернативное воплощение вышеизложенного аспекта второй формы изобретения, возможно, включает стадию (б1), включающую выбор третьего или дополнительного эпитопсвязывающего домена. Получаемый этим способом мультиспецифичный лиганд с открытой или закрытой конформацией включает специфичность связывания в отношении более чем двух эпитопов. В предпочтительном аспекте второй формы изобретения, где мультиспецифичный лиганд содержит более чем два эпитопсвязывающих домена, по меньшей мере два из указанных доменов расположены в закрытой конформации и конкурируют за связывание; другие домены могут конкурировать за связывание или могут быть способны к независимому объединению с их когнатным эпитопом (эпитопами).
Согласно настоящему изобретению термин мультиспецифичный лиганд относится к лиганду, обладающему специфичностью связывания в отношении более чем одного эпитопа, как определено здесь.
- 9 020464
Как определено здесь, термин закрытая конформация (мультиспецифичного лиганда) означает, что эпитопсвязывающие домены лиганда присоединены или объединены друг с другом, возможно, посредством белкового скелета таким образом, что связывание эпитопа одним эпитопсвязывающим доменом конкурирует со связыванием эпитопа другим эпитопсвязывающим доменом. Т.е. когнатные эпитопы могут быть связаны каждым эпитопсвязывающим доменом по отдельности, но не одновременно. Закрытая конформация лиганда может быть получена с применением способов, описанных здесь.
Открытая конформация обозначает, что эпитопсвязывающие домены лиганда присоединены или объединены друг с другом, возможно, посредством белкового скелета таким образом, что связывание эпитопа одним эпитопсвязывающим доменом не конкурирует со связыванием эпитопа другим эпитопсвязывающим доменом.
Термин конкурирует, как он назван здесь, обозначает, что связывание первого эпитопа с его когнатным эпитопсвязывающим доменом ингибировано, когда второй эпитоп связан с его когнатным эпитопсвязывающим доменом. Например, связывание может быть ингибировано стерически, например, физическим блокированием связывающего домена или изменением структуры или окружения связывающего домена таким образом, что его аффинность или авидность в отношении эпитопа уменьшается.
В другом аспекте второй формы изобретения эпитопы могут вытеснять друг друга при связывании. Например, первый эпитоп может присутствовать на антигене, который, при связывании с его когнатным первым связывающим доменом, вызывает стерическое несоответствие второго связывающего домена или его конформационное изменение, которое вытесняет эпитоп, связанный со вторым связывающим доменом.
Преимущественно связывание уменьшено на 25% или более, преимущественно 40, 50, 60, 70, 80, 90% или более и предпочтительно до 100% или около того таким образом, что связывание полностью ингибировано. Связывание эпитопов может быть измерено обычными исследованиями связывания антигенов, такими как твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЬРЗА), методиками, основанными на флюоресценции, включая резонансный перенос энергии флуоресценции (РКЕТ), или такими методиками, как поверхностный плазмонный резонанс, посредством которого измеряют массу молекул. Специфичное связывание антигенсвязывающего белка с антигеном или эпитопом может быть определено подходящим исследованием, включая, например, анализ Скэтчарда и/или исследования конкурентного связывания, такие как радиоиммуноанализы (К1А), иммуноферментные анализы, такие как ЕЬРЗА и конкурентные сэндвич-анализы, и их различные варианты.
Аффинность связывания предпочтительно определяют с применением поверхностного плазмонного резонанса (8РК) и Ыасоге (Каг188оп е! а1., 1991), с использованием системы Ыасоге (Ирр8а1а, 5>\\е6еп). В системе Ыасоге поверхностный плазмонный резонанс (§РК, \Уе1Гог6 К. 1991, ОрЕ фиапЕ Е1есЕ 23:1; МогЮп апб Му5/ка. 1998, Ме1йоЙ8 ίη Еп/утоКду 295: 268) использован для наблюдения биомолекулярных взаимодействий в реальном времени, и использован поверхностный плазмонный резонанс, посредством которого можно выявлять изменения угла резонанса света на поверхности тонкой золотой пленки на стеклянной основе в результате изменений коэффициента преломления поверхности в радиусе до 300 нм. При анализе Ыасоге легко генерируют константы скорости ассоциации, константы скорости диссоциации, равновесные константы диссоциации и константы аффинности. Аффинность связывания получают посредством оценки констант скорости ассоциации и диссоциации с применением системы поверхностного плазмонного резонанса Ыасоге (Ыасоге, 1пс.). Биосенсорный чип активируют для ковалентного связывания мишени в соответствии с инструкциями изготовителя (Ыасоге). Мишень затем разбавляют и вводят на чип для получения сигнала в единицах ответа иммобилизированного вещества. Поскольку сигнал в резонансных единицах (КИ) пропорционален массе иммобилизированного вещества, он отражает диапазон плотностей иммобилизированной мишени на матрице. Данные о диссоциации согласуют с односайтовой моделью для получения КоГГ +/- 8.6. (стандартное отклонение измерений). Константу скорости псевдопервого порядка (Кз) вычисляют для каждой кривой ассоциации и наносят на график как функцию концентрации белка для получения Коп +/- 8.е. (стандартная ошибка выравнивания). Равновесные константы диссоциации для связывания, Кь вычисляют на основе измерений §РК как КоГГ/КоП.
Как описано РШхлску ап6 Р1е16 в МюгоЪ. Кеу. (1995), 59:114-115, подходящий антиген, такой как Н8А, иммобилизируют на декстрановом полимере и раствор, содержащий лиганд для Н8А, такой как отдельный вариабельный домен, проходит через камеру, контактируя с иммобилизированным Н8А. Отдельный вариабельный домен, задержанный иммобилизированным Н8А, изменяет угол резонанса падающего света, приводя к изменению коэффициента преломления, вызванному увеличенными количествами белка, т.е. отдельного вариабельного домена, вблизи декстранового полимера. Поскольку все белки имеют одинаковый коэффициент преломления и поскольку существует линейная зависимость между изменением угла резонанса и концентрацией белка у поверхности, может быть измерено изменение концентрации белка на поверхности, обусловленное связыванием белок/белок, см. Р1й/юку ап6 Р1е16, 8ирга. Для определения константы связывания увеличение в резонансных единицах (КИ) измеряют как функцию времени, пропуская раствор белка отдельного вариабельного домена мимо иммобилизированного лиганда (Н8А) до стабилизации значений КИ, затем уменьшение в КИ измеряют как функцию времени с использованием буфера без отдельного вариабельного домена. Эту процедуру повторяют при нескольких
- 10 020464 различных концентрациях белка отдельного вариабельного домена. Подробный теоретический предшествующий уровень техники и способы описаны К. КатПкоп, с1 а1. (1991), 1. 1ттипо1 Ме1йоб8, 145, 229.
Программное обеспечение прибора вычисляет равновесную константу диссоциации (КД как описано выше. Равновесную константу диссоциации определяют посредством применения поверхностного плазмонного резонанса, как описано в патенте США № 5573957, на основании таблицы значений бКА/б1 и КА, где К в этом примере представляет собой комплекс Н§А/отдельный вариабельный домен, как измерено Шаеоте в резонансных единицах, и где бК/άΐ представляет собой скорость образования комплексов Н§А/отдельный вариабельный домен, т.е. производную кривой связывания; нанесением на график бКА/б1 против КА для нескольких различных концентраций отдельного вариабельного домена, и затем нанесением на график угловых коэффициентов этих линий против концентрации отдельного вариабельного домена, угловой коэффициент этого второго графика представляет собой константу скорости ассоциации (М-1, с-1). Константа скорости диссоциации или скорость, с которой Н8А и отдельный вариабельный домен отсоединяются друг от друга, может быть определена с использованием кривой диссоциации, построенной на Шаеоге. Константа скорости диссоциации может быть измерена нанесением на график логарифма уменьшения ответа против времени и определением углового коэффициента. Равновесная константа диссоциации Ка=константа скорости диссоциации/константа скорости ассоциации.
В соответствии со способом по настоящему изобретению преимущественно каждый отдельный вариабельный эпитопсвязывающий домен имеет специфичность связывания в отношении эпитопа, отличного от связываемого другими доменами.
В контексте настоящего изобретения под первым и вторым эпитопами понимают эпитопы, не являющиеся одинаковыми и не связываемые одним моноспецифичным лигандом. Они могут быть расположены на разных антигенах или на одном и том же антигене, но разделены расстоянием, достаточным для того, чтобы они не образовывали единого целого, которое может быть связано одной моноспецифичной парой УН/УЪ обычного антитела. Экспериментально, если оба отдельных вариабельных домена в форме одноцепочечных антител (доменных антител или бАЬ) по отдельности конкурируют с моноспецифичным УН/Уъ-лигандом против двух эпитопов, то эти два эпитопа расположены недостаточно далеко друг от друга, для того чтобы рассматривать их как отдельные эпитопы согласно настоящему изобретению.
Мультиспецифичные лиганды с закрытой конформацией по изобретению не включают лиганды, как описано в νΟ 02/02773. Таким образом лиганды по настоящему изобретению не включают комплементарные пары УН/УЪ, связывающие один или более антигены или эпитопы кооперативно. Взамен этого, лиганды по изобретению предпочтительно включают некомплементарные пары УН-УН или Уъ-Уь. Преимущественно каждый домен УН или Уъ в каждой паре УН-УН или Уъ-Уъ имеет специфичность связывания в отношении эпитопа, отличного от связываемого другими доменами, и эпитопсвязывающие области расположены таким образом, что связывание эпитопа в одной области конкурирует со связыванием эпитопа в другой области.
В соответствии с настоящим изобретением преимущественно каждый эпитопсвязывающий домен содержит вариабельный домен иммуноглобулина. Более преимущественно каждый эпитопсвязывающий домен будет представлять собой либо вариабельный домен легкой цепи (УД либо вариабельный домен тяжелой цепи (УН) антитела. Во второй форме настоящего изобретения домены иммуноглобулинов, когда они присутствуют на лиганде по настоящему изобретению, являются некомплементарными, т.е. они не объединяются с образованием антигенсвязывающей области УН/УЪ. Таким образом, мультиспецифичные лиганды, как определено во второй форме изобретения, содержат домены иммуноглобулинов одного и того же подтипа, т.е. либо вариабельные домены легкой цепи (Уъ), либо вариабельные домены тяжелой цепи (УН). Более того, там, где лиганд по изобретению имеет закрытую конформацию, домены иммуноглобулинов могут представлять собой домены типа УНН представителей семейства верблюдовых.
В альтернативном воплощении лиганд (лиганды) по изобретению не содержит домен УНН представителей семейства верблюдовых. Более конкретно, лиганд (лиганды) по изобретению не содержит один или более аминокислотных остатков, специфичных для доменов УНН представителей семейства верблюдовых, по сравнению с человеческими доменами УН.
Преимущественно отдельные вариабельные домены имеют происхождение от антител, выбранных по активности связывания против различных антигенов или эпитопов. Например, вариабельные домены могут быть выделены, по меньшей мере частично, иммунизацией человека. В данной области техники известны альтернативные способы, включая выделение из библиотек человеческих антител и синтез искусственных генов антител.
В выбранных воплощениях отдельный вариабельный домен является встречающимся в природе отдельным вариабельным доменом. В других выбранных воплощениях отдельный вариабельный домен не является встречающимся в природе. Термин встречающийся в природе использован здесь для указания на то, что объект, например белковый домен, например отдельный вариабельный домен или отдельный вариабельный домен антитела, может быть обнаружен в природе. Таким образом, встречающийся в природе белковый домен, такой как вариабельная область (У-область) антитела, существует в белке, например в белке цепи антитела, экспрессируемом в природе, например, у нерекомбинантных видов, например
- 11 020464 млекопитающих, приматов, грызунов, рыб, птиц, рептилий и т.п. Во избежание сомнений, отдельный вариабельный домен, выделенный из репертуара полипептидов, экспрессированных с нуклеиновых кислот, чье разнообразие было внесено ίη νίίτο, не является встречающимся в природе отдельным вариабельным доменом. Во избежание сомнений в будущем, отдельный вариабельный домен антитела, имеющий происхождение от антитела, являющегося результатом иммунизации животного, является встречающимся в природе отдельным вариабельным доменом.
Вариабельные домены преимущественно связывают суперантигены, такие как белок А или белок Ь. Связывание суперантигенов является свойством вариабельных доменов антител, прошедших правильный фолдинг, и делает возможным выделение таких доменов из, например, библиотек рекомбинантных или мутантных доменов.
Эпитопсвязывающие домены по настоящему изобретению содержат белковый каркас и области, взаимодействующие с эпитопами (расположенные преимущественно на поверхности белкового каркаса).
Эпитопсвязывающие домены могут также быть основаны на белковых каркасах или скелетах, отличных от доменов иммуноглобулинов. Например, природные бактериальные рецепторы, такие как δρΑ, были использованы в качестве каркасов для переноса СЭР с образованием лигандов, специфично связывающих один или более эпитопы. Подробности этого способа описаны в υδ 5831012. Другие подходящие каркасы включают основанные на фибронектине и аффителах (ай^Лу). Подробности подходящих способов описаны в νθ 98/58965. Другие подходящие каркасы включают липокалин и СТЬА4, как описано в ναη Леη Βеикеη е! а1., ί. Μο1. Βίο1. (2001), 310, 591-601, и такие каркасы, как описанные в νθ 0069907 (МеЛюа1 Кекеагсй СоинсИ). основанные, например, на кольцевой структуре бактериального ΟτοЕ1 или других полипептидов-шаперонов.
Белковые каркасы можно комбинировать; например, СОК могут быть перенесены на каркас СТЬА4 и использованы совместно с доменами иммуноглобулинов Ун или Уъ с образованием мультивалентного лиганда. Подобным образом можно комбинировать фибронектиновые, липокалиновые и другие каркасы.
Специалисту в данной области техники будет ясно, что эпитопсвязывающие домены мультиспецифичного лиганда с закрытой конформацией, полученного способом по настоящему изобретению, могут быть расположены на одной полипептидной цепи или, альтернативно, на разных полипептидных цепях. В случае, когда вариабельные домены расположены на разных полипептидных цепях, они могут быть связаны линкером, преимущественно гибким линкером (таким как полипептидная цепь), химической связывающей группой или любым другим способом, известным в данной области техники.
Первый и второй эпитопсвязывающие домены могут быть связаны либо ковалентно, либо нековалентно. В случае, когда домены связаны ковалентно, связывание может быть опосредовано, например, дисульфидными связями.
Во второй форме изобретения первый и второй эпитопы являются предпочтительно различными. Они могут представлять собой полипептиды, белки или нуклеиновые кислоты, которые могут быть встречающимися в природе или синтетическими, или являться их частью. В этом отношении, лиганд по изобретению может связывать эпитоп или антиген и действовать как антагонист или агонист (например, агонист рецептора ЕРО). В одном воплощении эпитопсвязывающие домены лиганда имеют специфичность в отношении одного и того же эпитопа и могут, например, одновременно связывать свои эпитопы, когда на одном и том же антигене присутствуют несколько копий эпитопа. В другом воплощении, эти эпитопы представлены на разных антигенах таким образом, что лиганд может связывать эпитопы и соединять антигены. Специалисту в данной области техники будет ясно, что выбор эпитопов и антигенов широк и разнообразен. Они могут представлять собой, например, белки человека или животных, цитокины, рецепторы цитокинов, ферменты, кофакторы ферментов или ДНК-связывающие белки. Подходящие цитокины и факторы роста включают, предпочтительно без ограничения: АроЕ, Αρο-8ΑΑ, ΒΌΝΡ, кардиотрофин-1, ЕОР, рецептор ЕОР, ΕΝΑ-78, эотаксин, эотаксин-2, ЕxοЛиδ-2, ΕροΚ, кислый ΡΟΡ, основной ΡΟΡ, фактор роста фибробластов-10, лиганд РЬТ3, фракталкин (СХ3С), ΟΌΝΡ, О-С8Р, ОМ-С8Р, 0Ρ-β1, инсулин, γ-интерферон (ΙΡΝ-γ), ΙΟΡ-Ι, ΙΟΡ-ΙΙ, интерлейкин-1а (1Ь-1а), 1Ь-1 β, 1Ь-2, 1Ь-3, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6, ГО-7, ГО-8 (72 а.а.), ГО-8 (77 а.а.), ГО-9, ГО-10, ГО-11, ГО-12, ГО-13, ГО-15, ГО-16, ГО-17, ГО-18 (ΙΟΙΡ), ингибин α, ингибин β, ΙΡ-10, фактор роста кератиноцитов-2 (ΚΟΡ-2), КОР, лептин, ЬГО, лимфотактин, мюллерову ингибирующую субстанцию, моноцитарный колониеингибирующий фактор, моноцитарный атрактантный белок, М-С8Р, МПС (67 а.а.), МПС (69 а.а.), МСР-1 (МСАР), МСР-2, МСР-3, МСР-4, МПС (67 а.а.), МПС (69 а.а.), МЮ, МГО-1а, МГО-Щ, МТО-3 а, МГО-3в, МТО-4, фактор, ингибирующий миелоидные предшественники, 1 типа (МРГО-1), ΝΑΡ-2, неуртурин, фактор роста нервов, β-ΝΟΡ, ΝΤ-3, ΝΤ-4, онкостатин М, тромбоцитарный фактор роста АА (ΡΌΟΡ-ΑΑ), ΡΌΟΡ-ΑΒ, ΡΌΟΡ-ΒΒ, тромбоцитарный фактор-4 (ΡΡ-4), ΡΑΝΤΕ8, δΌΡ1α, δΌΡ1β, 8СР, фактор роста стволовых клеток (8СОР), фактор стволовых клеток (8СР), ΤΑΚΟ, ΤΟΡ-α, ΤΟΡ-β, ΤΟΡ-β2, ΤΟΡ-β3, фактор некроза опухоли (ΤΝΡ), ΤΝΡ-α, ΤΝΡ-β, рецептор ΤΝΡ 1 типа, рецептор ΤΝΡ 2 типа, ΤΝΙΡ-1, ΤΡΟ, ΑΡΟΡ, рецептор ΥΕΟΡ 1 типа, рецептор УЕОЕ 2 типа, рецептор УΕΟΡ 3 типа, ΟСΡ-2, ΟΚΟΜΟδΑ, ΟΚΟ-β, ΟΚΟ-γ, НСС1, 1-309, НЕК 1, НЕК 2, НЕК 3 и НЕК 4, область распознавания ТАСЕ, ΤΝΡ ΒΡ-Ι и ΤΝΡ ΒΡ-ΙΙ, СЭ4, человеческие рецепторы хемокинов СХСК4 или ССК5, неструктурный белок 3 типа (Νδ3) вируса гепатита С, ΤΝΡ-альфа, !дЕ, ΙΡΝ-гамма,
- 12 020464
ММР-12, СЕА, Н. ру1оп. ТВ, вирус гриппа, гепатита Е, ММР-12, интернализуемые рецепторы, сверхэкспрессируемые на определенных клетках, такие как рецептор эпидермального фактора роста (БОРК), рецептор ЕгВЬ2 на опухолевых клетках, интернализуемый клеточный рецептор, рецептор БОБ, рецептор РОР2, рецептор ЕгВЬ2, рецептор трансферрина, рецептор ΡΌΟΡ, рецептор УЕОР, РктАт, белок внеклеточного матрикса, эластин, фибронектин, ламинин, а1-антитрипсин, тканевой фактор, ингибирующий протеазы, ΡΌΚ1, О8К1, Вай, каспазу-9, РоткЬеай, антиген неПсоЬас1ег ру1оп, антиген МусоЬас1епит 1иЬегси1о818 и антиген вируса гриппа, а также любую мишень, раскрытую в приложении 2 или приложении 3 к этому документу, либо в комбинации, как изложено в приложениях, либо в другой комбинации, либо по отдельности. Рецепторы цитокинов включают рецепторы вышеизложенных цитокинов, например, рецептор 1Б-1 1 типа (1Б-1 К1); рецептор 1Б-6 (1Б-6К); рецептор 1Б-10 (1Б-10К); рецептор 1Б-18 (1Б-18К), а также рецепторы цитокинов, изложенных в приложении 2 или приложении 3, и также рецепторы, раскрытые в приложении 2 и приложении 3. Следует понимать, что этот список ни в коем случае не является исчерпывающим. Там, где мультиспецифичный лиганд связывает два эпитопа (на одном или разных антигенах), антиген (антигены) может быть выбран из этого списка.
Преимущественно лиганды с двойной специфичностью могут быть использованы для направленного воздействия на цитокины и другие молекулы, синергично взаимодействующие в организме в терапевтических ситуациях. Таким образом, согласно изобретению предложен способ синергичного воздействия на активность двух или более цитокинов, включающий введение лиганда с двойной специфичностью, способного связывать указанные два или более цитокина. В данном аспекте изобретения лиганд с двойной специфичностью представлять собой любой лиганд с двойной специфичностью, включая лиганд, состоящий из комплементарных и/или некомплементарных доменов, лиганд с открытой конформацией и лиганд с закрытой конформацией. Например, данный аспект изобретения относится к комбинациям доменов Ун и доменов Уъ, только доменов Ун или только доменов Уь.
Синергизм в терапевтическом аспекте может быть достигнут несколькими способами. Например, комбинации для направленного воздействия могут быть терапевтически активны, только если обе мишени подвергаются направленному воздействию лигандом, в то время как направленное воздействие на одну мишень саму по себе не является терапевтически эффективным. В другом воплощении одна мишень сама по себе может обеспечить некоторый малый или минимальный терапевтический эффект, но совместно со второй мишенью комбинация обеспечивает синергическое увеличение терапевтического эффекта.
Предпочтительно цитокины, связываемые лигандами с двойной специфичностью по данному аспекту изобретения, выбраны из списка, показанного в приложении 2.
Более того, лиганды с двойной специфичностью могут быть использованы в онкологических применениях, где одна специфичность направлена на СЭ89, экспрессируемый цитотоксичными клетками, и другая специфична в отногшении опухоли. Примеры опухолевых антигенов, которые могут быть мишенями, приведены в приложении 3.
В одном воплощении второй формы изобретения вариабельные домены имеют происхождение от антитела, направленного против первого и/или второго антитела или эпитопа. В предпочтительном воплощении вариабельные домены имеют происхождение от репертуара отдельных вариабельных доменов антител. В одном примере репертуар представляет собой репертуар, не созданный в животном, или синтетический репертуар. В другом примере отдельные вариабельные домены не являются выделенными (по меньшей мере частично) иммунизацией животных. Таким образом, отдельные домены могут быть выделены из интактной библиотеки.
В другом аспекте согласно второй форме изобретения предложен мультиспецифичный лиганд, содержащий первый эпитопсвязывающий домен, имеющий первую специфичность связывания эпитопа, и некомплементраный второй эпитопсвязывающий домен, имеющий вторую специфичность связывания эпитопа. Первая и вторая специфичности связывания могут быть одинаковыми или разными.
В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен мультиспецифичный лиганд с закрытой конформацией, содержащий первый эпитопсвязывающий домен, имеющий специфичность связывания в отношении первого эпитопа, и некомплементарный второй эпитопсвязывающий домен, имеющий специфичность связывания в отношении второго эпитопа, где первая и вторая специфичности связывания способны конкурировать за связывание эпитопа, таким образом, что мультиспецифичный лиганд с закрытой конформацией не может связывать оба эпитопа одновременно.
В еще одном другом аспекте согласно изобретению предложены лиганды с открытой конформацией, содержащие некомплементарные связывающие домены, где домены специфичны в отношении различных эпитопов на одной и той же мишени. Такие лиганды связывают мишени с увеличенной авидностью. Сходным образом, согласно изобретению предложены мультивалентные лиганды, содержащие некомплементарные связывающие домены, специфичные в отношении одного и того же эпитопа и направленные на мишени, содержащие несколько копий указанного эпитопа, такие как, например, 1Б-5, ΡΌΟΡ-ΑΑ, ΡΌΟΡ-ΒΒ, ТОР-β, ΤΟΡ-β2, ΤΟΡ-β3 и ΤΝΡα, а также человеческий рецептор ΤΝΡ 1 типа и человеческий ΤΝΡα.
- 13 020464
В сходном аспекте лиганды по изобретению могут быть изменены для связывания отдельных эпитопов с низкой аффинностью таким образом, что связывание отдельных эпитопов не является терапевтически значимым; но увеличенная авидность, являющаяся результатом связывания двух эпитопов, обеспечивает терапевтический эффект. В конкретном примере мишени могут представлять собой эпитопы, присутствующие по отдельности на нормальных типах клеток, но присутствующие совместно только на аномальных или болезненных клетках, таких как опухолевые клетки. В такой ситуации эффективному направленному воздействию биспецифичными лигандами по изобретению подвержены только аномальные или болезненные клетки.
Лиганды, специфичные в отношении нескольких копий одного и того же эпитопа или расположенных рядом эпитопов на одной и той же мишени (известные как хелатообразующие бАЪ), могут также представлять собой тримерные или полимерные (тетрамерные или более) лиганды, содержащие три, четыре или более некомплементарных связывающих домена. Например, могут быть конструированы лиганды, содержащие три или четыре домена Ун или домена Уъ.
Более того, предложены лиганды, связывающие мишени из нескольких субъединиц, где каждый связывающий домен специфичен в отношении субъединицы указанной мишени. Лиганд может быть димерным, тримерным или полимерным.
Предпочтительно мультиспецифичные лиганды по вышеизложенным аспектам изобретения можно получить способом по первому аспекту изобретения.
Преимущественно по вышеизложенному аспекту второй формы изобретения первый эпитопсвязывающий домен и вторые эпитопсвязывающие домены являются некомплементарными вариабельными доменами иммуноглобулинов, как определено здесь. Т.е. либо вариабельными доменами Ун-Ун, либо вариабельными доменами Уъ-Уь.
Хелатообразующие бАЪ, в частности, могут быть получены по предпочтительному аспекту изобретения, конкретно, с применением якорных бАЪ, где библиотеку димерных, тримерных или мультимерных бАЪ конструируют с использованием вектора, содержащего константное бАЪ у 5'- или 3'-конца линкерной последовательности, и вводя репертуар вторых, третьих и дополнительных бАЪ с другой стороны линкера. Например, якорное или ведущее бАЪ может представлять собой ТАК1-5(Ук), ТАК1-27(Ук), ТАК2й-5(Ун) или ТАК2й-6(Ук).
В альтернативных методиках применения линкера можно избежать, например, применением нековалентного связывания или природной аффинности между связывающими доменами, такими как Ун и Ук. Соответственно, согласно изобретению предложен способ получения хелатообразующего мультимерного лиганда, включающий стадии:
а) предоставления вектора, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую отдельный связывающий домен, специфичный в отношении первого эпитопа на мишени;
б) предоставления вектора, кодирующего репертуар, содержащий вторые связывающие домены, специфичные в отношении второго эпитопа на указанной мишени, который может быть таким же, как первый эпитоп, или отличаться от него и который расположен рядом с указанным первым эпитопом;
в) экспрессии указанных первого и второго связывающих доменов;
г) выделения этих комбинаций первого и второго связывающих доменов, образующих комбинации друг с другом с образованием димера, связывающего мишень.
Первый и второй эпитопы расположены рядом друг с другом таким образом, что мультимерный лиганд способен связывать оба эпитопа одновременно. Это обеспечивает лиганд с преимуществами увеличенной авидности связывания. Там, где эпитопы являются одинаковыми, увеличенную авидность получают присутствием нескольких копий эпитопа на мишени, что делает возможным одновременное связывание по меньшей мере двух копий для получения эффекта увеличенной авидности.
Связывающие домены могут быть объединены несколькими способами, а также с использованием линкеров. Например, связывающие домены могут содержать остатки цистеина, авидиновые или стрептавидиновые группы или другие средства нековалентного соединения после синтеза; будут выделять те комбинации, которые эффективно связывают мишень. Альтернативно, линкер может присутствовать между первым и вторым связывающими доменами, экспрессируемыми в виде одного полипептида с одного вектора, содержащего первый связывающий домен, линкер и репертуар вторых связывающих доменов, например, как описано выше.
В предпочтительном аспекте первый и второй связывающие домены объединяются естественным образом при связывании антигена; например, домены Ун и Уъ (например, Ук) при связывании расположенных рядом эпитопов будут естественным образом объединяться при трехмерном взаимодействии с образованием стабильного димера. Такие объединенные белки могут быть выделены при исследовании связывания мишени. Преимущество данного способа состоит в том, что будут объединяться и, таким образом, будут выделены в результате их увеличенной авидности к мишени только те связывающие домены, которые связывают расположенные в непосредственной близости друг от друга эпитопы в правильной конформации.
В альтернативном воплощении вышеизложенного аспекта второй формы изобретения по меньшей
- 14 020464 мере один эпитопсвязывающий домен содержит неиммуноглобулиновый белковый каркас или белковый скелет, как определено здесь. Подходящие неиммуноглобулиновые белковые каркасы включают, предпочтительно без ограничения, любые из выбранных из группы, состоящей из 8рА, фибронектина, ОтоЕ1 и других шаперонов, липокалина, ССТЬА4 и аффител, как изложено выше.
Преимущественно по вышеизложенному аспекту второй формы изобретения эпитопсвязывающие домены прикреплены к белковому скелету. Преимущественно белковый скелет по изобретению представляет собой иммуноглобулиновый скелет.
Согласно настоящему изобретению термин иммуноглобулиновый скелет относится к белку, включающему по меньшей мере одну характерную для иммуноглобулинов конформацию и действующему в качестве ядра для одного или более эпитопсвязывающих доменов, как определено здесь.
Предпочтительные иммуноглобулиновые скелеты, как определено здесь, включают любой один или более из выбранных из следующего: молекулы иммуноглобулина, содержащей, по меньшей мере, (1) домен Сь антитела (подкласса каппа или лямбда); или (2) домен СН1 тяжелой цепи антитела; молекулы иммуноглобулина, содержащей домены СН1 и СН2 тяжелой цепи антитела; молекулы иммуноглобулина, содержащей домены СН1, СН2 и ΟΗ3 тяжелой цепи антитела; или любого набора (2) в сочетании с доменом С.'[, (подкласса каппа или лямбда) антитела. Также может быть включена шарнирная область. Такие комбинации доменов могут, например, имитировать природные антитела, такие как 1§О или 1дМ, или их фрагменты, такие как молекулы Ρν, 8сРу, РаЬ или Р(аЬ')2. Специалистам в данной области техники будет ясно, что этот список не является исчерпывающим.
Связывание скелета с эпитопсвязывающими доменами, как определено здесь, может быть достигнуто на полипептидном уровне, т.е. после экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей скелет и/или эпитопсвязывающие домены. Альтернативно, стадия связывания может быть проведена на уровне нуклеиновых кислот. Способы связывания белкового скелета по настоящему изобретению с одним или более эпитопсвязывающими доменами включают применение методик химии белков и/или молекулярной биологии, которые будут знакомы специалистам в данной области техники и описаны здесь.
Преимущественно мультиспецифичный лиганд с закрытой конформацией может содержать первый домен, способный связывать молекулу-мишень, и второй домен, способный связывать молекулу или группу, увеличивающую период полувыведения лиганда. Например, молекула или группа может представлять собой крупный агент, такой как Η5Λ или белок клеточного матрикса. При использовании здесь фраза молекула или группа, увеличивающая период полувыведения лиганда относится к молекуле или химической группе, которая, при связывании лигандом с двойной специфичностью, как описано здесь, увеличивает период полувыведения такого лиганда с двойной специфичностью ш νί\Ό при его введении животному относительно лиганда, не связывающего такую молекулу или группу. Примеры молекул или групп, увеличивающих период полувыведения лиганда, описаны в данном патенте ниже. В предпочтительном воплощении мультиспецифичный лиганд с закрытой конформацией может быть способен связывать молекулу-мишень только при вытеснении молекулы или группы, увеличивающей период полувыведения. Таким образом, например, мультиспецифичный лиганд с закрытой конформацией сохраняют в циркулирующей крови субъекта с использованием крупной молекулы, такой как Η5Λ. При встрече с молекулой-мишенью конкуренция между связывающими доменами мультиспецифичного лиганда с закрытой конформацией приводит к вытеснению Η5Λ и связыванию мишени.
Лиганд по любому аспекту настоящего изобретения включает лиганд, имеющий или состоящий из по меньшей мере одного отдельного вариабельного домена в форме отдельного вариабельного доменамономера или в форме нескольких отдельных вариабельных доменов, т.е. мультимера. Лиганд может быть модифицирован для того, чтобы содержать дополнительные группировки, как, например, слитый белок или конъюгат. Такой мультимерный лиганд, например, в форме лиганда с двойной специфичностью, и/или такой лиганд, содержащий или состоящий из отдельного вариабельного домена, т.е. мономера бАЬ, применимый в конструировании такого мультимерного лиганда, может преимущественно диссоциировать от его когнатной мишени (мишеней) с К, 300 нМ или менее, от 300 нМ до 5 пМ (т.е. от 3х10-7 до 5х10-12 М), предпочтительно от 50 нМ до 20 пМ, или от 5 нМ до 200 пМ, или от 1 нМ до 100 пМ, 1х10-7 М или менее, 1х10-8 М или менее, 1х10-9 М или менее, 1х10-10 М или менее, 1х10-11 М или менее; и/или константой скорости Ко££ от 5х10-1 до 1х 10-7 с-1, предпочтительно от 1х 10-2 до 1х 10-6 с-1, или от 5х10-3 до 1 х 10-5 с-1, или 5х10-1 с-1 или менее, или 1 х 10-2 с-1 или менее, или 1 х 10-3 с-1 или менее, или 1 х 10-4 с-1 или менее, или 1х 10-5 с-1 или менее, или 1х 10-6 с-1 или менее, как определено, например, поверхностным плазмонным резонансом. Константу скорости К, определяют как Ко££/Коп. Значение К, более чем 1 М обычно рассматривают как указание на неспецифичное связывание. Предпочтительно отдельный вариабельный домен будет связывать антиген-мишень или эпитоп-мишень с аффинностью менее чем 500 нМ, предпочтительно менее чем 200 нМ и более предпочтительно менее чем 10 нМ, как, например, менее чем 500 пМ.
В частности, согласно изобретению предложен мономер ,АЬ против ΤΝΡα (или лиганд с двойной специфичностью, содержащий такое бАЬ), гомодимерный, гетеродимерный или гомотримерный лиганд, где каждое ,АЬ связывает ΤΝΡα. Лиганд связывает ΤΝΡα с Κ,ι от 300 нМ до 5 пМ (т.е. от 3х10-7 до
- 15 020464
5х10-12 М), предпочтительно от 50 нМ до 20 пМ, более предпочтительно от 5 нМ до 200 пМ и наиболее предпочтительно от 1 нМ до 100 пМ; выражая альтернативным образом, К,| составляет 1х10-7 М или менее, предпочтительно 1 х 10-8 М или менее, более предпочтительно 1 х 10-9 М или менее, преимущественно 1х 10-10 М или менее и наиболее предпочтительно 1х 10-11 М или менее; и/или константой скорости Κοίί от 5х10-1 до 1 х 10-7 с-1, предпочтительно от 1 х 10-2 до 1х 10-6 с-1, более предпочтительно от 5х10-3 до 1 х 10-5 с-1, например, 5х10-1 с-1 или менее, предпочтительно 1х 10-2 с-1 или менее, более предпочтительно 1х 10-3 с-1 или менее, преимущественно 1х 10-4 с-1 или менее, более преимущественно 1х 10-5 с-1 или менее и наиболее предпочтительно 1 х 10-6 с-1 или менее, как определено поверхностным плазмонным резонансом.
Предпочтительно лиганд нейтрализует ΤΝΡα в стандартном исследовании Ь929 с ΝΏ50 от 500 нМ до 50 пМ, предпочтительно от 100 нМ до 50 пМ, преимущественно от 10 нМ до 100 пМ, более предпочтительно от 1 нМ до 100 пМ; например, 50 нМ или менее, предпочтительно 5 нМ или менее, преимущественно 500 пМ или менее, более предпочтительно 200 пМ или менее и наиболее предпочтительно 100 пМ или менее.
Предпочтительно лиганд ингибирует связывание ΤΝΡ-альфа с рецептором ΤΝΡ-альфа 1 типа (рецептором р55) с 1С50 от 500 нМ до 50 пМ, предпочтительно от 100 нМ до 50 пМ, более предпочтительно от 10 нМ до 100 пМ, преимущественно от 1 нМ до 100 пМ; например, 50 нМ или менее, предпочтительно 5 нМ или менее, более предпочтительно 500 пМ или менее, преимущественно 200 пМ или менее и наиболее предпочтительно 100 пМ или менее. Предпочтительно ΤΝΡα представляет собой человеческий ΤΝΡα.
Кроме того, согласно изобретению предложен мономер 1АЬ против рецептора ΤΝΡ 1 типа или лиганд с двойной специфичностью, содержащий такое 1АЬ, связывающее рецептор ΤΝΡ 1 типа с Κ,ι от 300 нМ до 5 пМ (т.е. от 3х10-7 до 5х10-12 М), предпочтительно от 50 нМ до 20 пМ, более предпочтительно от 5 нМ до 200 пМ и наиболее предпочтительно от 1 нМ до 100 пМ, например, 1х 10-7 М или менее, предпочтительно 1х 10-8 М или менее, более предпочтительно 1х 10-9 М или менее, преимущественно 1х 10-10 М или менее и наиболее предпочтительно 1 х 10-11 М или менее; и/или константой скорости Κοίί от 5х10-1 до 1х 10-7 с-1, предпочтительно от 1х 10-2 до 1х 10-6 с-1, более предпочтительно от 5х10-3 до 1х 10-5 с-1, например, 5х10-1 с-1 или менее, предпочтительно 1х 10-2 с-1 или менее, преимущественно 1х 10-3 с-1 или менее, более предпочтительно 1х 10-4 с-1 или менее, еще более предпочтительно 1х 10-5 с-1 или менее и наиболее предпочтительно 1х 10-6 с-1 или менее, предпочтительно как определено поверхностным плазмонным резонансом.
Предпочтительно лиганд, содержащий мономер 1АЬ, нейтрализует ΤΝΡα в стандартном исследовании (например, исследованиях Ь929 или НеЬа, описанных здесь) с ΝΏ50 от 500 нМ до 50 пМ, предпочтительно от 100 нМ до 50 пМ, более предпочтительно от 10 нМ до 100 пМ, преимущественно от 1 нМ до 100 пМ; например, 50 нМ или менее, предпочтительно 5 нМ или менее, более предпочтительно 500 пМ или менее, преимущественно 200 пМ или менее и наиболее предпочтительно 100 пМ или менее.
Предпочтительно мономер 1АЬ или лиганд ингибирует связывание ΤΝΡ-альфа с рецептором ΤΝΡальфа 1 типа (рецептором р55) с 1С50 от 500 нМ до 50 пМ, предпочтительно от 100 нМ до 50 пМ, более предпочтительно от 10 нМ до 100 пМ, преимущественно от 1 нМ до 100 пМ; например 50 нМ или менее, предпочтительно 5 нМ или менее, более предпочтительно 500 пМ или менее, преимущественно 200 пМ или менее и наиболее предпочтительно 100 пМ или менее. Предпочтительно мишенью для рецептора ΤΝΡ 1 типа является человеческий ΤΝΡα.
Кроме того, согласно изобретению предложен мономер 1АЬ (или лиганд с двойной специфичностью, содержащий такое 1АЬ), связывающий сывороточный альбумин (8А) с Κι от 1 нМ до 500 мкМ (т.е. от 1х 10-9 до 5х 10-4), предпочтительно от 100 нМ до 10 мкМ. Предпочтительно для лиганда с двойной специфичностью, содержащего первое 1АЬ против §А и второе 1АЬ против другой мишени, аффинность (например, Κ3 и/или Κοίί, как измерено поверхностным плазмонным резонансом, например, с использованием Вхатоте) второго 1АЬ в отношении его мишени превышает афинность первого 1АЬ в отношении §А в 1-100000 раз (предпочтительно от 100 до 100000, более предпочтительно от 1000 до 100000 или от 10000 до 100000 раз). Например, первое 1АЬ связывает §А с аффинностью приблизительно 10 мкМ, в то время как второе 1АЬ связывает его мишень с аффинностью 100 пМ. Предпочтительно сывороточный альбумин представляет собой человеческий сывороточный альбумин (Н8А).
В одном воплощении первое 1АЬ (или мономер 1АЬ) связывает §А (например, Н8А) с Κ3 приблизительно 50, предпочтительно 70 и наиболее предпочтительно 100, 150 или 200 нМ.
Более того, согласно изобретению предложены димеры, тримеры и полимеры вышеупомянутых мономеров 1АЬ по вышеизложенному аспекту настоящего изобретения.
Лиганды по изобретению, включая мономеры, димеры и тримеры 1АЬ, могут быть связаны с Гсобластью антитела, содержащей один или оба домена Сн2 и Сн3, и, возможно, шарнирную область. Например, для получения таких полипептидов могут быть использованы векторы, кодирующие лиганды, связанные в виде одной нуклеотидной последовательности с Ρс-областью.
В другом аспекте второй формы изобретения согласно настоящему изобретению предложены одна
- 16 020464 или более молекул нуклеиновых кислот, кодирующих, по меньшей мере, мультиспецифичный лиганд, как определено здесь. В одном воплощении мультиспецифичный лиганд представляет собой лиганд с закрытой конформацией. В другом воплощении он представляет собой лиганд с открытой конформацией. Мультиспецифичный лиганд может быть кодирован одной молекулой нуклеиновой кислоты; альтернативно, каждый эпитопсвязывающий домен может быть кодирован отдельной молекулой нуклеиновой кислоты. Там, где мультиспецифичный лиганд кодирован одной молекулой нуклеиновой кислоты, домены могут быть экспрессированы в виде слитого полипептида или могут быть экспрессированы по отдельности и впоследствии соединены друг с другом, например, с использованием химических линкеров. Лиганды, экспрессированные с отдельных нуклеиновых кислот, будут связаны друг с другом подходящими способами.
Нуклеиновая кислота может дополнительно кодировать сигнальную последовательность для экспорта полипептидов из клетки-хозяина при экспрессии и может быть слита с поверхностным компонентом частицы нитчатого бактериофага (или другим компонентом дисплейной системы для селекции) при экспрессии. Лидерные последовательности, которые могут быть использованы при экспрессии у бактерий и/или фаговом или фагмидном дисплее, включают ре1В, МП, отрА, р1юА, Ыа и ре1А.
В другом аспекте второй формы изобретения согласно настоящему изобретению предложен вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению.
В еще одном другом аспекте согласно настоящему изобретению предложена клетка-хозяин, трансфицированная вектором по настоящему изобретению.
Экспрессия такого вектора может быть изменена для образования, например, на поверхности частицы бактериофага, эпитопсвязывающих доменов для селекции. Это делает возможным селекцию представленных вариабельных доменов и, таким образом, селекцию мультиспецифичных лигандов с применением способа по настоящему изобретению.
В предпочтительном воплощении второй формы изобретения эпитопсвязывающие домены представляют собой вариабельные домены иммуноглобулинов и выбраны из репертуаров ν-генов отдельных доменов. В большинстве случаев репертуар отдельных доменов антител представлен на поверхности нитчатого бактериофага. В предпочтительном воплощении каждый отдельный домен антитела выбран связыванием фагового репертуара с антигеном.
Согласно настоящему изобретению также предложен набор, содержащий, по меньшей мере, мультиспецифичный лиганд по настоящему изобретению, который может представлять собой лиганд с открытой конформацией или с закрытой конформацией. Наборы по настоящему изобретению могут представлять собой, например, диагностические наборы, терапевтические наборы, наборы для выявления химических и биологических видов и т.п.
В еще одном другом аспекте второй формы изобретения согласно настоящему изобретению предложен однородный иммунологический анализ с применением лиганда по настоящему изобретению.
В еще одном другом аспекте второй формы изобретения согласно настоящему изобретению предложена композиция, содержащая мультиспецифичный лиганд с закрытой конформацией, который можно получить способом по настоящему изобретению, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент.
Более того, согласно настоящему изобретению предложен способ лечения заболевания с применением мультиспецифичного лиганда с закрытой конформацией или композиции по настоящему изобретению.
В предпочтительном воплощении заболевание представляет собой рак или воспалительное заболевание, например ревматоидный артрит, астму или болезнь Крона.
В другом аспекте второй формы изобретения согласно настоящему изобретению предложен способ диагностики, включающий диагностику заболевания с применением мультиспецифичного лиганда с закрытой конформацией или композиции по настоящему изобретению. Таким образом, в большинстве случаев связывание анализируемого вещества с мультиспецифичным лигандом с закрытой конформацией может быть использовано для вытеснения агента, что приводит к генерированию сигнала на вытеснение. Например, связывание анализируемого вещества (второго антигена) может вытеснять фермент (первый антиген), связанный с антителом, обеспечивая основу для иммунологического анализа, особенно если антитело фиксировало фермент через его активный центр.
Таким образом, в конечном аспекте второй формы согласно настоящему изобретению предложен способ выявления присутствия молекулы-мишени, включающий:
а) предоставление мультиспецифичного лиганда с закрытой конформацией, связанного с агентом, специфичного в отношении молекулы-мишени и агента, где агент, связываемый лигандом, приводит к генерированию детектируемого сигнала в ответ на вытеснение из лиганда;
б) воздействие на мультиспецифичный лиганд с закрытой конформацией молекулой-мишенью;
в) детекцию сигнала, генерируемого в результате вытеснения агента.
По вышеизложенному аспекту второй формы изобретения преимущественно агент представляет собой фермент, неактивный при связывании с мультиспецифичным лигандом с закрытой конформацией. Альтернативно, агент может представлять собой одно или более, выбранное из группы, состоящей из
- 17 020464 следующего: субстрата для фермента и флюоресцентной, люминесцентной или хромогенной молекулы, неактивной или блокируемой при связывании с лигандом.
Последовательности, сходные или гомологичные (например, по меньшей мере 70% идентичность последовательности) последовательностям, раскрытым здесь, также являются частью изобретения. В некоторых воплощениях идентичность последовательности на аминокислотном уровне может составлять приблизительно 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более. На уровне нуклеиновых кислот идентичность последовательности может составлять приблизительно 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95,
96, 97, 98, 99% или более. Альтернативно, существенная идентичность присутствует, когда сегменты нуклеиновых кислот будут гибридизоваться в селективных условиях гибридизации (например, очень строгих условиях гибридизации) с комплементарной цепью. Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в целых клетках, лизате клеток или в частично очищенной или, по существу, чистой форме.
Процент идентичности может относиться к проценту идентичности по всей длине аминокислотной или нуклеотидной последовательности. Если указано, процент идентичности аминокислотной или нуклеотидной последовательности относится к проценту идентичности последовательности (последовательностям) из одной или более отдельных областей эталонной аминокислотной или нуклеотидной последовательности, например, на протяжении одной или более СЭК-областей антитела и/или одной или более вариабельных каркасных областей антитела. Например, идентичность последовательности на аминокислотном уровне одной или более СОК отдельного вариабельного домена тяжелой или легкой цепи антитела может представлять собой приблизительно 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большую идентичность аминокислотной последовательности соответствующих СОК отдельного вариабельного домена тяжелой или легкой цепи антитела соответственно. На уровне нуклеиновых кислот последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей одну или более СОК отдельного вариабельного домена тяжелой или легкой цепи антитела, может иметь по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96,
97, 98, 99% или большую идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей соответствующие СОК отдельного вариабельного домена тяжелой или легкой цепи антитела. На уровне нуклеиновых кислот, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей одну СОК отдельного вариабельного домена тяжелой или легкой цепи антитела, может иметь процент идентичности по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более по сравнению с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей соответствующую СОК отдельного вариабельного домена тяжелой или легкой цепи антитела соответственно. В некоторых воплощениях структурная характеристика процента идентичности сочетается с функциональным аспектом. Например, в некоторых воплощениях последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотная последовательность с менее чем 100% идентичностью эталонной последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности также необходима для отображения по меньшей мере одного функционального аспекта эталонной аминокислотной последовательности или аминокислотной последовательности, кодируемой эталонной нуклеиновой кислотой. В других воплощениях последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотная последовательность с менее чем 100% идентичностью эталонной последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности, соответственно, также необходима для отображения по меньшей мере одного функционального аспекта эталонной аминокислотной последовательности или аминокислотной последовательности, кодируемой эталонной нуклеиновой кислотой, но эта функциональная характеристика может быть незначительно изменена, например, придавать увеличенную аффинность в отношении обозначенного антигена по сравнению с аффинностью эталона.
Вычисления гомологии или идентичности последовательности либо сходства двух последовательностей (термины использованы здесь взаимозаменяемо) проводят следующим образом. Последовательности выравнивают в целях оптимального сравнения (например, могут быть введены разрывы в одну или обе из первой и второй аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты для оптимального выравнивания, и негомологичными последовательностями в целях сравнения можно пренебречь). В предпочтительном воплощении длина эталонной последовательности, выравниваемой в целях сравнения, составляет по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно по меньшей мере 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере 60% и еще более предпочтительно по меньшей мере 70, 80, 90, 100% длины эталонной последовательности. Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих аминокислотных положениях или нуклеотидных положениях. Если положение в первой последовательности занято таким же аминокислотным остатком или нуклеотидом, как в соответствующем положении второй последовательности, то молекулы являются идентичными в этом положении (при использовании здесь гомология аминокислот или нуклеиновых кислот эквивалентна идентичности аминокислот или нуклеиновых кислот). Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией числа идентичных положений в обоих последовательностях, при учете числа разрывов и длины каждого разрыва, который необходимо ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей.
Преимущественно для выравнивания последовательностей используют алгоритм ВЬЛ§Т (версии 2.0) с параметрами, установленными на значения по умолчанию. Алгоритм ВЬЛ§Т подробно описан на веб-сайте (тетете) Национального центра биотехнологической информации (Ыайопа1 СсШсг Гот ВюЮсй- 18 020464 по1оду 1пГогтайоп (ЫСВ1)) Национального института здравоохранения (Ыайопа1 1пк!1!и!ек оГ неа1!Ь (N14)) правительства США (доу), в директории /В1ак1/„ в файле Ь1ак!_Ье1р.Ь!т1. Параметры поиска определены следующим образом и преимущественно установлены на определенные параметры по умолчанию.
ВЬА8Т (Вакю Ьоса1 АПдптеп! 8еагсЬ Тоо1) представляет собой эвристический поисковый алгоритм, используемый в программах Ь1ак!р, Ь1ак!п, Ь1ак!х, !Ь1ак!п, апй !Ь1ак!х; в этих программах значимость результатов определяется применением статистических способов КагЬп апй А1!ксЬи1, 1990, Ргос. ИаД Асай. 8с1. И8А 87(6):2264-8 (см. файл Ь1ак!_Ье1р.Ь!т1, как описано выше) с некоторыми усовершенствованиями. Программы ВЬА8Т были написаны для поиска сходства последовательностей, например, для идентификации гомологов запрашиваемой последовательности. Эти программы в большинстве случаев не пригодны для поиска по мотиву/типу. См. обсуждение основных вопросов поиска по сходству в базах данных последовательностей в А1!ксЬи1 е! а1. (1994).
Пять программ ВЬА8Т, доступные на веб-сайте Национального центра биотехнологической информации, выполняют следующие задачи:
Ь1ак!р сравнивает запрашиваемую аминокислотную последовательность с базой данных белковых последовательностей;
Ь1ак!п сравнивает запрашиваемую нуклеотидную последовательность с базой данных нуклеотидных последовательностей;
Ь1ак!х сравнивает умозрительные продукты трансляции в шести рамках считывания запрашиваемой нуклеотидной последовательности (обоих цепей) с базой данных белковых последовательностей;
!Ь1ак!п сравнивает запрашиваемую белковую последовательность с базой данных нуклеотидных последовательностей, динамично транслируемых во всех шести рамках считывания (обоих цепей);
!Ь1ак!х сравнивает трансляции в шести рамках считывания запрашиваемой нуклеотидной последовательности с трансляциями в шести рамках считывания базы данных нуклеотидных последовательностей.
В ВЬА8Т используют следующие параметры поиска.
н18ТОСКАМ отображает гистограмму результатов каждого поиска; по умолчанию да (см. параметр Н в руководстве ВЬА8Т Мапиа1).
ОЕ8СК1РТ1ОИ8 ограничивает число коротких описаний совпадающих последовательностей заданным числом; лимит по умолчанию составляет 100 описаний (см. параметр ν на странице руководства). См. также ЕХРЕСТ и СИТОРР.
АИ1СНМЕМТ8 ограничивает число последовательностей из базы данных с парами сегментов с максимальным сходством (ЫдЬ-ксогшд кедтеп! райк (н8Р)) заданным числом; лимит по умолчанию составляет 50. Если пороговой статистической значимости соответствует больше последовательностей из базы данных (см. ЕХРЕСТ и СИТОРР ниже), будет сообщено только о наиболее статистически значимых совпадениях (см. параметр В в руководстве ВЬА8Т Мапиа1).
ЕХРЕСТ. Пороговая статистическая значимость для сообщения о совпадениях с последовательностями из базы данных; значение по умолчанию составляет 10 таким образом, что ожидают, что 10 совпадений будут обнаружены только случайно, в соответствии со стохастической моделью Кагйп апй А1!ксЬи1 (1990). Если статистическая значимость, определенная для совпадения, превышает пороговое значение ЕХРЕСТ, о совпадении не будет сообщено. Меньшие пороговые значения ЕХРЕСТ являются более строгими, что приводит к сообщению меньшего числа случайных совпадений. Приемлемы дробные величины (см. параметр Е в руководстве ВЬА8Т Мапиа1).
СИТОРР. Пороговое сходство для сообщения о парах сегментов с максимальным сходством. Значение по умолчанию вычисляют на основании значения ЕХРЕСТ (см. выше). О н8Р в последовательности из базы данных сообщается только, если определенная для них статистическая значимость, по меньшей мере, равна той, которая была бы присвоена отдельной н8Р со сходством, равным значению СИТОРР. Большие значения СИТОРР являются более строгими, что приводит к сообщению меньшего числа случайных совпадений (см. параметр 8 в руководстве ВЬА8Т Мапиа1). Обычно, пороговыми значениями значимости можно управлять более интуитивно с использованием ЕХРЕСТ.
МАТК1Х обозначает кососимметрическую матрицу сходства для ВЬА8ТР, ВЬА8ТХ, ТВРА8ТЫ и ТВЬА8ТХ. Матрица по умолчанию представляет собой ВЬО8ИМ62 (ИешкоГГ & ИешкоГЕ 1992, Ргос. Ыа!1. Асай. 8ск И8А 89(22):10915-9). Допустимые альтернативные выборы включают РАМ40, РАМ120, РАМ250 и ГОЕКПТУ. Для ВРА8ТЫ нет доступных кососимметрических матриц сходства; указание МАТК1Х в запросах ВРА8ТЫ приводит к ошибочному ответу.
8ТКАЫЭ ограничивает поиск ТВРА8ТЫ только верхней или только нижней цепью последовательностей из базы данных; или ограничивает поиск ВЕА8ТН ВЬА8ТХ или ТВЬА8ТХ рамками считывания на только верхней или только нижней цепи запрашиваемой последовательности.
Р1ЬТЕК маскирует сегменты запрашиваемой последовательности, имеющие малую структурную сложность, как определено программой 8ЕС ^оойоп & РейегЬеп (1993), Сотри!егк апй СЬетМгу 17:149163, или сегменты, состоящие из внутренних повторов короткой периодичности, как определено программой ХЫи, С1ауег1е & 8!а!ек, 1993, Сотри!егк апй СЬетМгу 17:191-201, или для ВЕА8ТИ програм- 19 020464 мой ΌυδΤ, Тактом апб Ыртап (см. веб-сайт ΝΟΒΙ). Фильтрацией можно удалить из результатов статистически значимые, но биологически неинтересные сообщения (например, совпадения с распространенными кислыми, основными или богатыми пролином областями), оставляя более биологически интересные области запрашиваемой последовательности доступными для специфичного сопоставления с последовательностями из базы данных.
Последовательность малой сложности, обнаруженная программой-фильтром, заменяется буквой Ν в нуклеотидной последовательности (например, Ν, повторяемой 13 раз) и буквой X в белковых последовательностях (например, X, повторяемой 9 раз).
Фильтрацию применяют только к запрашиваемой последовательности (или ее трансляционным продуктам), не к последовательностям из базы данных. Фильтром по умолчанию является ЭЖТ для ΒΕ-Λ8ΤΝ. δΕΟ для других программ.
Нередко δΕΟ, ΧΝυ или обе программы не маскируют ровно ничего при применении к последовательностям в δνΐδδ-РКОТ, поэтому не следует ожидать, что фильтрация всегда эффективна. Кроме того, в некоторых случаях последовательности маскируются полностью, указывая на то, что к статистической достоверности любых совпадений, о которых сообщено для запрашиваемой последовательности без фильтрации, следует относиться с подозрением.
ΝΟΒΙ-§ί показывает в результатах идентификаторы ΝΟΒΙ §ί, в дополнение к зарегистрированному названию и/или названию локуса.
Наиболее предпочтительно сравнение последовательностей проводят с применением простого поискового алгоритма Β^δΈ предоставленного на веб-сайте ΝΕΒΙ, описанном выше, в директории /Β^АδΤ.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 показано разнообразие УН/ЖА в положениях Н50, Н52, Н52а, Н53, Н55, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98 (кодировка ЭУТ или ΝΝΚ соответственно), расположенных в антигенсвязывающей области УН ЖА. Последовательность Ук отличается в положениях Ь50, Ь53.
На фиг. 2 показана библиотека 1: Ук/ОУТ УН эмбрионального типа; библиотека 2: У^/ΝΝΚ УН эмбрионального типа; библиотека 3: УН/ОУТ Ук эмбрионального типа; библиотека 4: УН/ЫЫК Ук эмбрионального типа; в формате фагового дисплея/δοΡν. Эти библиотеки были подвергнуты предварительной селекции на связывание лигандов общего типа, белка А и белка Ь, таким образом, что большинство клонов и селектированных библиотек являются функциональными. Библиотеки селектировали на ЖА (первый раунд) и β-галактозидазу (в-да1) (второй раунд), селекция ЖА β-да!, или на [3-да1 (первый раунд) и ЖА (второй раунд), селекция в-да1 ЖА. Растворимые 8сРу от этих ПЦР (полимеразная цепная реакция)-клонов амплифицируют в последовательности. Для дальнейшей работы был выбран один клон, кодирующий антитело К8 с двойной специфичностью.
На фиг. 3 показано выравнивание цепей УН и цепей Ук.
На фиг. 4 показано описание связывающих свойств антитела К8, связывающие свойства антитела К8 охарактеризованы моноклональным фаговым ЕЬЫА; было обнаружено, что антитело К8 с двойной специфичностью связывало ЖА и [3-да1 и было представлено на поверхности фага с сигналами абсорбции более 1,0. Перекрестной реактивности с другими белками выявлено не было.
На фиг. 5 показан ЕЬЫА растворимого 8сРу, проводимый с использованием известных концентраций фрагмента антитела К8. 96-луночный планшет покрывали 100 мкг ЖА, ΒδА и в-да1 в концентрации 10 мкг/мл и 100 мкг/мл белка А в концентрации 1 мкг/мл. Наносили 50 мкг серийных разведений 8сРу К8 и связанные фрагменты антител выявляли с использованием белка Ь с пероксидазой хрена (белка ЬНКР). Результаты ЕЬЫА подтверждают, что антитело К8 имеет две специфичности.
На фиг. 6 показаны характеристики связывания клона К8Ук/модельный УН, анализируемого с использованием ЕЬЫА растворимого 8сРу. Образование растворимых фрагментов 8сРу было индуцировано изопропилтиогалактозидом (1РТО), как описано Наткоп е1 а1., МеЛобк Ен/уто1. 1996; 267:83-109, и супернатант, содержащий 8сРу, анализировали непосредственно. ЕЬЫА растворимого 8сРу проводили, как описано в примере 1, и связанные 8сРу выявляли с использованием белка Ь-НКР. Результаты ЕЬЫА выявили, что данный клон был все еще способен связывать в-да1, в то время как связывание ΒδΛ было ликвидировано.
На фиг. 7 показана последовательность 1 и 2 векторов вариабельных доменов.
На фиг. 8 представлена карта вектора СН, используемого для конструирования мультиспецифичного лиганда УН1/УН2.
На фиг. 9 представлена карта вектора Ук, используемого для конструирования мультиспецифичного лиганда Ук1/Ук2.
На фиг. 10 показано исследование с рецептором ТОТ1 по сравнению 4 димера ТАК1-5, 4 димера ТАК1-5-19 и мономера ТАК1-5-19.
На фиг. 11 показано исследование с рецептором ТОТ1 по сравнению 1-6 димеров ТАК1-5. Все димеры очищали жидкостной хроматографией быстрого разрешения (РРЬС), и показаны результаты оптимальных димерных разновидностей.
- 20 020464
На фиг. 12 показано исследование с рецептором ТОТ1 гомодимеров ТАК1-5 19 в различных форматах: формате бАЬ-линкер-бАЬ с линкером 3И, 5И или 7И, формате ЕаЬ и формате цистеинового шарнирного линкера.
На фиг. 13 представлена последовательность модельного УН для библиотеки 1. Последовательность каркасной области УН, основанная на последовательности эмбрионального типа ЭР47 - Ш4Ь. Положения, в которых в библиотеке 1 была проведена ММК-рандомизация (^нуклеотиды А, или Т, или С, или С; К=нуклеотиды С или Т), указаны жирным шрифтом с подчеркиванием.
На фиг. 14 представлена последовательность модельного УН для библиотеки 2. Последовательность каркасной области УН, основанная на последовательности эмбрионального типа ЭР47-1Н4Ь. Положения, в которых в библиотеке 2 была проведена ММК-рандомизация (^нуклеотиды А, или Т, или С, или С; К=нуклеотиды С или Т), указаны жирным шрифтом с подчеркиванием.
На фиг. 15 представлена последовательность модельного Ук для библиотеки 3. Последовательность каркасной области Ук, основанная на последовательности эмбрионального типа ЭР,.. 9 - Г1. Положения, в которых в библиотеке 3 была проведена ММК-рандомизация (^нуклеотиды А, или Т, или С, или С; К=нуклеотиды С или Т), указаны жирным шрифтом с подчеркиванием.
На фиг. 16 представлена нуклеотидная и аминокислотная последовательность бАЬ против МБА МБА 16 и МБА 26.
На фиг. 17 представлено В1асоге-ингибирование МБА 16 и 26. Очищенные бАЬ МБА16 и МБА26 анализировали ингибированием В1асоге для определения Кб. Кратко, бАЬ анализировали для определения концентрации бАЬ, необходимой для достижения 200 резонансных единиц (КИ) ответа на чипе В1асоге СМ5, покрытом МБА с высокой плотностью. Когда необходимые концентрации бАЬ были определены, антиген МБА в диапазоне концентраций около ожидаемой Кб предварительно смешивали с бАЬ и инкубировали в течение ночи. Связывание бАЬ с покрытым МБА чипом В1асоге в каждой из предварительных смесей затем измеряли при высокой скорости потока 30 мкл/мин.
На фиг. 18 представлены сывороточные уровни МБА16 после инъекции. Определяли период полувыведения бАЬ МБА16 в сыворотке у мышей. МБА16 дозировали в виде однократных внутривенных (ί.ν.) инъекций в дозе приблизительно 1,5 мг/кг мышам СЭ1. Моделирование с использованием 2компартментной модели показало, что ΐ1/2α МБА16 составлял 0,98 ч и ί1/2β - 36,5 ч, АИС (площадь под кривой) - 913 ч.мг/мл. МБА16 имело существенно увеличенный период полувыведения по сравнению с НЕЬ4 (бАЬ против лизоцима белка куриного яйца), ΐ1/2α которого составлял 0,06 ч и 11/2β - 0,34 ч.
На фиг. 19 представлены ЕЫБА (а) и исследование с рецептором ТОТ1 (в), демонстрирующее ингибирование связывания ТОТ1 ЕаЬ-подобным фрагментом, содержащим МБА26Ск и ТАК1-5-19СН. Добавление МБА с ЕаЬ-подобным фрагментом снижает уровень ингибирования. Планшет для ЕЫБА, покрытый 1 мкг/мл ΊΝΈα, исследовали ЕаЬ-подобным фрагментом Ук СН и Ук Ск с двойной специфичностью и также контрольным бАЬ, связывающим ТХЕа, в концентрации, вычисленной для того, чтобы дать сходный сигнал при ЕЫБА. Как бАЬ с двойной специфичностью, так и контрольное бАЬ использовали для зондирования планшета для ЕЫБА в присутствии и в отсутствие 2 мг/мл МБА. Сигнал в лунках с фрагментами с двойной специфичностью был снижен более чем на 50%, но сигнал в лунках с бАЬ был полностью сохранен (см. фиг. 19а). Такой же белок с двойной специфичностью был подвергнут исследованию с рецептором с и без МБА, и также была показана конкуренция с МБА (см. фиг. 19в). Это демонстрирует, что связывание МБА с фрагментом с двойной специфичностью конкурирует со связыванием с ТОТа.
На фиг. 20 представлено исследование с рецептором ТОТ1, показывающее ингибирование связывания ТОТ1 со связанным дисульфидными связями гетеродимером бАЬ ТАК1-5-19 и бАЬ МБА16. Добавление МБА с димером снижает уровень ингибирования дозозависимым образом. Исследование с рецептором ΊΝΈ1 (фиг. 19 (б)) проводили в присутствии постоянной концентрации гетеродимера (18 нМ) и серийных разведений МБА и НБА. Присутствие НБА в диапазоне концентраций (до 2 мг/мл) не вызывало снижения способности димера ингибировать ТХЕа. Тем не менее, добавление МБА вызывало дозозависимое снижение способности димера ингибировать ТОТа (фиг. 19а). Это демонстрирует, что МБА и ТКЕа конкурируют за связывание со связанным дисульфидными связями димером ТАК1-5-19, МБА16. МБА и НБА сами по себе не оказывали влияния на уровень связывания ТНЕ в исследовании.
На фиг. 21 представлены очищенные рекомбинантные домены человеческого сывороточного альбумина (НБА), дорожки 1-3 содержат домены Ι, ΙΙ и ΙΙΙ НБА соответственно.
На фиг. 22 представлен пример иммунопреципитации, показывающий, что НБА-связывающее бАЬ связывает полноразмерный НБА (дорожка 8) и домен ΙΙ НБА (дорожка 6), но не связывает домены Ι и ΙΙΙ НБА (дорожки 5 и 7 соответственно). бАЬ, не связывающее НБА, не осаждает ни полноразмерный НБА, ни домены Ι, ΙΙ или ΙΙΙ НБА (дорожки 1-4).
На фиг. 23 представлен пример определения связывания домена НБА бАЬ, как определено поверхностным плазмонным резонансом. Исследуемое бАЬ наносили, как описано, на сенсорный чип СМ5 (В1асоге), покрытый человеческим сывороточным альбумином с низкой плотностью. В точке 1 исследуемое бАЬ наносили само по себе в концентрации 1 мкМ. В точке 2 использовали команду одновременного нанесения, нанесение образца переключали на смесь 1 мкМ бАЬ плюс 7 мкМ домена 1, 2 или 3
- 21 020464 н§А, продуцированного в ΡίΟιίη. В точке 3 нанесение останавливали, но сохраняли поток буфера. Результаты для двух различных йАЬ показаны на фиг. 23(а) и 23(б). Когда йАЬ наносят с доменом н§А, который его связывает, он образует комплекс, который не может больше связывать н§А на чипе, поэтому сигнал В1асоге уменьшается в точке 2, со скоростью диссоциации, отражающей 3-компонентное равновесие между йАЬ, растворимым доменом н§А и связанным с чипом н§А. Когда домен не связывает йАЬ, сигнал остается неизменным в точке 2 и начинает уменьшается только в точке 3, где поток переключается на буфер. В обоих случаях йАЬ связывает домен 2 н§А.
На фиг. 24 представлены последовательности антител клонов АЬийАЬ™ (йАЬ, специфично связывающего сывороточный альбумин), идентифицированных фаговой селекцией. Все клоны были выравнены с генами человеческой эмбриональной линии. Остатки, идентичные эмбриональному типу, были обозначены .. В Ун СЭК3, символ - был использован для облегчения выравнивания, но не обозначает остаток. Все клоны были выбраны из библиотек, основанных на одной человеческой каркасной области, содержащей гены тяжелых цепей эмбрионального типа У3-23/^Ρ47 и Ш4Ь для библиотек Ун и гены клегких цепей Ο12/Ο2/ΌΡΚ9 и X 1 для библиотек Ук, с разнообразием боковых цепей, внесенным в положения в антигенсвязывающей области.
На фиг. 25 представлены выравнивания трех доменов человеческого сывороточного альбумина. Консервативность цистеиновых остатков очевидна.
Определения
Комплементарный. Два домена иммуноглобулина комплементарны, когда они принадлежат семействам структур, образующих когнатные пары или группы, или имеют происхождение от таких семейств и сохраняют это свойство. Например, домен Ун и домен Уъ антитела комплементарны; два домена Ун некомплементарны, и два домена Уъ некомплементарны. Комплементарные домены могут быть обнаружены у других членов суперсемейства иммуноглобулинов, как, например, домены Уа и Уβ (или γ и δ) Т-клеточного рецептора. В контексте второй формы настоящего изобретения некомплементарные домены не связывают молекулу-мишень кооперативно, но действуют независимо на разные эпитопымишени, которые могут быть расположены на одной или разных молекулах. Домены, являющиеся искусственными, как, например, домены на основе белковых каркасов, не связывающие эпитопы, если они не конструированы для этого, некомплементарны. Подобным образом, два домена на основе (например) домена иммуноглобулина и домена фибронектина некомплементарны.
Иммуноглобулин. Это относится к семейству полипептидов, сохраняющих конформацию иммуноглобулинов, характерную для молекул антител, которая содержит две β-складчатости и, обычно, консервативную дисульфидную связь. Члены суперсемейства иммуноглобулинов вовлечены во многие аспекты клеточных и неклеточных взаимодействий ίη νί\Ό, включая широко распространенные функции в иммунной системе (например, антитела, молекулы Т-клеточных рецепторов и т.п.), участие в клеточной адгезии (например, молекулы межклеточной адгезии (1САМ)) и межклеточную передачу сигналов (например, рецепторные молекулы, такие как рецептор ΡΌΟΡ). Настоящее изобретение применимо ко всем молекулам суперсемейства иммуноглобулинов, имеющим связывающие домены. Предпочтительно настоящее изобретение относится к антителам.
Объединение. Вариабельные домены по изобретению объединяют с образованием группы доменов; например, могут быть объединены комплементарные домены, как, например, домены Уъ, объединяемые с доменами Ун. Также можно объединять некомплементарные домены. Домены можно объединять несколькими способами, включая связывание доменов ковалентным или нековалентным способом.
Домен. Домен представляет собой складчатую белковую структуру, сохраняющую свою третичную структуру независимо от остальной части белка. В большинстве случаев домены обеспечивают дискретные функциональные свойства белков и во многих случаях могут быть добавлены, удалены или перемещены на другие белки без потери функции оставшейся части белка и/или домена.
При использовании здесь отдельный вариабельный домен представляет собой домен, способный специфично связывать эпитоп, антиген или лиганд независимо, т.е. это не требует кооперативного связывания эпитопа, антигена или лиганда другим связывающим доменом. Такой эпитоп, антиген или лиганд может быть встречающимся в природе или может представлять собой модификацию встречающегося в природе эпитопа, антигена или лиганда, или может быть синтетическим. Вариабельная часть отдельного вариабельного домена определяет главным образом специфичность связывания каждого конкретного отдельного вариабельного домена. Таким образом, термин вариабельный в контексте отдельных вариабельных доменов относится к тому факту, что вариабельность последовательности не распределена равномерно по отдельному вариабельному домену, а распределена главным образом между каркасными или скелетными частями отдельного вариабельного домена. Например, в отдельном вариабельном домене антитела вариабельность сконцентрирована в одном-трех сегментах, обычно известных как гипервариабельные участки (СПК). Один или более СПК могут быть распределены между каркасными областями (РК) легкой цепи или тяжелой цепи антитела с образованием либо отдельного вариабельного домена легкой цепи антитела, либо отдельного вариабельного домена тяжелой цепи антитела, соответственно, каждый из которых специфично связывает эпитоп независимо от другого связывающего домена.
- 22 020464
Сходную структуру имеет отдельный вариабельный домен Т-клеточного рецептора с одним-тремя СЭК, распределенными между каркасными доменами Т-клеточного рецептора (ТСК).
Таким образом, вариабельные части, придающие специфичность связывания отдельным вариабельным доменам, могут значительно отличаться по последовательности от других отдельных вариабельных доменов, имеющих, по существу, такую же остальную каркасную часть, и, соответственно, могут иметь широкий спектр специфичностей связывания. Каркасы отдельных вариабельных доменов включают каркасные области антител, консенсусные каркасные области антител и каркасы, имеющие происхождение и/или полученные из бактериальных белков, например ОгоЕ1, ОгоЕ8, 8рА, 8рО, и из белков эукариот, например СТЬА-4, липокалинов, фибронектина и т.п. Один источник вариабельных частей отдельных вариабельных доменов включает один или более СЭК, которые могут быть перенесены на неиммуноглобулиновые каркасы, а также каркасные области антител с образованием отдельных вариабельных доменов антител. Другим источником разнообразия отдельного вариабельного домена может являться диверсификация выбранных положений в неиммуноглобулиновой каркасной области, такой как фибронектин, для образования отдельных вариабельных доменов с применением молекулярно-биологических методик, таких как ЫМК-разнообразие кодонов. Сходным образом, такой источник разнообразия также применим к отдельному вариабельному домену антитела.
Отдельный вариабельный домен антитела может иметь происхождение от последовательностей, кодируемых и/или генерируемых продуцирующим антитело видом, и включает фрагмент (фрагменты) и/или производные вариабельной области антитела, включая одну или более каркасных областей или консенсусные последовательности каркасных областей, и/или один или более СЭК. Соответственно, отдельный вариабельный домен антитела включает фрагмент (фрагменты) и/или производное (производные) вариабельной области легкой цепи антитела или вариабельной области тяжелой цепи антитела, или области УНН антитела. Например, области УНН антитела включают эндогенные области представителей семейства верблюдовых, например верблюдов и лам, и рецептор нового антигена (ЫЛК) акул-нянек и ковровых акул (Коих е! а1., 1998 РNАδ 95(20): 11804-9) и область УН от пятнистой химеры (Ка8! е! а1., 1998, 1ттиподепейс8 47:234-245). Вариабельные домены легкой цепи антитела и вариабельные домены тяжелой цепи антитела включают эндогенные домены видов животных, включая, предпочтительно без ограничения, человека, мышь, крысу, свинью, обезьян рода Супото1ди8, хомяка, лошадь, корову, козу, собаку, кошку и виды птиц, например, человеческий У-каппа и человеческий УН3 соответственно. Вариабельные области легкой цепи антитела и вариабельные области тяжелой цепи антитела также включают консенсусные каркасные области антител, как описано ниже, включая области из семейств Уобластей, таких как семейство УН3. Отдельный вариабельный домен Т-клеточного рецептора представляет собой отдельный вариабельный домен, имеющий происхождение от цепи (цепей) Т-клеточного рецептора, например, цепей α, β, γ и δ, и связывающий эпитоп или антиген, или лиганд, независимо от другого связывающего домена для этого эпитопа, антигена или лиганда, аналогично отдельным вариабельным доменам антител.
Отдельный вариабельный домен антитела также включает белковый домен, содержащий каркас, не имеющий происхождение от антитела или Т-клеточного рецептора, и который был создан посредством генной инженерии для того, чтобы демонстрировать разнообразие в специфичности связывания по сравнению с его состоянием до конструирования, включением в каркас одного или более из СЭК1, СЭК2 и/или СЭК3, или их производного или фрагмента, или целого У-домена антитела. Отдельный вариабельный домен антитела может также включать как неимуноглобулиновый каркас, так и иммуноглобулиновые каркасы, как проиллюстрировано мультимерами отдельных вариабельных доменов ОгоЕ1, описанными ниже. Предпочтительно СЭК имеют происхождение из У-домена антитела цепи антитела, например УН, Уь и УНН. Цепь антитела может представлять собой цепь, специфично связывающую антиген или эпитоп вместе со второй цепью антитела, или цепь антитела может представлять собой цепь, специфично связывающую антиген или эпитоп независимо от второй цепи антитела, как, например, УНН. Интеграция одного или более СЭК в отдельный вариабельный домен антитела, содержащий неиммуноглобулиновый каркас, должна приводить к способности вариабельного домена с неиммуноглобулиновым каркасом специфично связывать эпитоп или антиген, или лиганд, независимо от другого связывающего домена для этого эпитопа, антигена или лиганда.
Отдельный домен трансформируют в отдельный вариабельный домен внесением разнообразия в область (области), разработанные, чтобы стать связывающими областями, с последующей селекцией желаемых характеристик связывания с применением, например, дисплейных технологий. Разнообразие может быть внесено в определенные области рассматриваемого неиммуноглобулинового каркаса рандомизацией аминокислотной последовательности определенных петель каркаса, например, введением кодонов ΝΝΙ<. Этот механизм генерирования разнообразия с последующей селекцией желаемых характеристик связывания сходен с природной селекцией высокоаффинных антиген-специфичных антител, являющейся результатом генерирования разнообразия в петлях, составляющих связывающую область антител в природе. В идеальном случае, отдельный домен, небольшой и содержащий конформацию, сходную с петлей антитела, трансформируют в отдельный вариабельный домен, варианты отдельного вариабельного домена экспрессируют, и из них могут быть выбраны отдельные вариабельные домены с же- 23 020464 лаемыми специфичностями и характеристиками связывания, из библиотек, содержащих большое число вариантов отдельного вариабельного домена.
Номенклатура отдельных вариабельных доменов: иногда отдельные вариабельные домены обозначают, опуская первую букву б или буквы Эот, например, АЪ7й24 идентичен бАЪ7й24, который идентичен ЭОМ7Н24.
Под отдельным вариабельным доменом антител подразумевают складчатый полипептидный домен, содержащий последовательности, характерные для вариабельных доменов антител. Таким образом, он включает полные вариабельные домены антител и модифицированные вариабельные домены, например, в которых одна или более петли были заменены последовательностями, не характерными для вариабельных доменов антител, или вариабельные домены, которые были процессированы или содержат Ν- или Сконцевые удлинения, а также складчатые фрагменты вариабельных доменов, сохраняющие, по меньшей мере частично, связывающую активность и специфичность полноразмерного домена.
Репертуар. Набор различных вариантов, например полипептидных вариантов, различающихся их первичной последовательностью. Библиотека, используемая в настоящем изобретении, будет включать репертуар полипептидов, содержащий по меньшей мере 1000 членов.
Библиотека. Термин библиотека относится к совокупности гетерогенных полипептидов или нуклеиновых кислот. Библиотека составлена из членов, каждый из которых имеет единственную полипептидную последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты. В этой степени библиотека синонимична репертуару. Различия последовательностей между членами библиотеки обеспечивают разнообразие, присутствующее в библиотеке. Библиотека может принимать форму простой совокупности полипептидов или нуклеиновых кислот или может быть в форме организмов или клеток, например бактерий, вирусов, клеток животных или растительных клеток и т.п., трансформированных в библиотеку нуклеиновых кислот. Предпочтительно каждый отдельный организм или клетка содержит только один или ограниченное число членов библиотеки. Преимущественно нуклеиновые кислоты введены в векторы экспрессии с целью сделать возможной экспрессию полипептидов, кодируемых нуклеиновыми кислотами. В предпочтительном аспекте, таким образом, библиотека может принимать форму популяции организмов-хозяев, каждый из которых содержит одну или более копии вектора экспрессии, содержащего один член библиотеки в форме нуклеиновой кислоты, которая может быть экспрессирована для выработки ее соответствующего полипептидного члена. Таким образом, популяция организмов-хозяев имеет возможность кодировать широкий репертуар генетически различных полипептидных вариантов.
Мультиспецифичный лиганд с закрытой конформацией описывает мультиспецифичный лиганд, как определено здесь, содержащий по меньшей мере два эпитопсвязывающих домена, как определено здесь. Термин закрытая конформация (мультиспецифичного лиганда) обозначает, что эпитопсвязывающие домены лиганда расположены таким образом, что связывание эпитопа одним эпитопсвязывающим доменом конкурирует со связыванием эпитопа другим эпитопсвязывающим доменом. Т.е. штатные эпитопы могут быть связаны каждым эпитопсвязывающим доменом по отдельности, но не одновременно. Закрытая конформация лиганда может быть получена с применением способов, описанных здесь.
Антитело. Антитело (например, 1§О, 1дМ, 1дА, 1§ϋ или 1дЕ) или фрагмент (такой как РаЪ, Р(аЪ')2, Ρν, связанный дисульфидными связями Ρν, 8сΡν, мультиспецифичное антитело с закрытой конформацией, связанный дисульфидными связями δсΡν, диатело), либо имеющие происхождение от любого вида, естественным образом продуцирующего антитело, либо созданные методом рекомбинантных ДНК; либо выделенные из сыворотки, В-клеток, гибридом, трансфектом, дрожжей или бактерий.
Лиганд с двойной специфичностью. Лиганд, содержащий первый отдельный вариабельный домен иммуноглобулина и второй отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, как определено здесь, где вариабельные домены способны связывать два разных антигена или два эпитопа на одном и том же антигене, которые обычно не связывает моноспецифичный иммуноглобулин. Например, два эпитопа могут быть расположены на одном и том же гаптене, но не являются одинаковыми или расположенными достаточно близко друг к другу для связывания одним моноспецифичным лигандом. Лиганды с двойной специфичностью по настоящему изобретению состоят из вариабельных доменов, имеющих разные специфичности, и не содержат пар взаимно комплементарных вариабельных доменов, имеющих одинаковую специфичность. Таким образом, лиганды с двойной специфичностью, которые, как определено здесь, содержат два отдельных вариабельных домена, являются подгруппой мультимерных лигандов, которые, как определено здесь, содержат два или более отдельных вариабельных домена, где по меньшей мере два из отдельных вариабельных доменов способны связывать два разных антигена или два разных эпитопа на одном и том же антигене. Кроме того, лиганд с двойной специфичностью, как определено здесь, также отличен от лиганда, содержащего отдельный вариабельный домен антитела и второй антиген- или эпитопсвязывающий домен, не являющийся отдельным вариабельным доменом. Кроме того, лиганд с двойной специфичностью, как определено здесь, также отличен от лиганда, содержащего первый и второй антиген-/эпитопсвязывающий домен, где ни один антиген-/эпитопсвязывающий домен не является отдельным вариабельным доменом, как определено здесь.
Антиген. Молекула, связываемая лигандом по настоящему изобретению. Обычно антигены связывают лиганды-антитела, и антигены способны вызывать гуморальный иммунный ответ ш νί\Ό. Он мо- 24 020464 жет представлять собой полипептид, белок, нуклеиновую кислоту или другую молекулу. В большинстве случаев лиганды с двойной специфичностью по изобретению выбирают по специфичности в отношении мишени против двух определенных антигенов. В случае обычных антител и их фрагментов связывающая область антитела, определяемая вариабельными петлями (Ь1, Ь2, Ь3 и Н1, Н2, Η3), способна связывать антиген.
Эпитоп. Единица структуры, обычно связываемая иммуноглобулиновой парой νΗ/ν9. Эпитопы определяют минимальную связывающую область для антитела и, таким образом, представляют собой мишень специфичности антитела. В случае отдельного домена антитела эпитоп представляет собой единицу структуры, связываемую вариабельным доменом в выделенном виде. Эпитопсвязывающий домен содержит белковый каркас и области, взаимодействующие с эпитопом (расположенные преимущественно на поверхности белкового каркаса). Эпитопсвязывающий домен может содержать области, взаимодействующие с эпитопом, являющиеся нелинейными, например, когда эпитопсвязывающий домен содержит несколько областей, взаимодействующих с эпитопом, между которыми есть перекрывающиеся области, например, СОР, разделенные РР, или которые расположены на отдельных полипептидных цепях. Альтернативно, эпитопсвязывающий домен может содержать линейную область, взаимодействующую с эпитопом, состоящую из кодируемых рядом друг с другом аминокислотных остатков на одной полипептидной цепи.
Лиганд общего типа. Лиганд, связывающий все члены репертуара. В большинстве случаев он не связан через антигенсвязывающую область, как определено выше. Неограничивающие примеры включают белок А, белок Ь и белок С.
Селекция. Полученный скринингом или полученный способом дарвиновской селекции, где связывающие взаимодействия происходят между доменом и антигеном или эпитопом или между антителом и антигеном или эпитопом. Таким образом, первый вариабельный домен может быть селектирован для связывания антигена или эпитопа в присутствии или в отсутствие комплементарного вариабельного домена.
Универсальная каркасная область. Отдельная последовательность каркасной области антитела, соответствующей областям антитела, сохраняемым в последовательности, как определено КаЬа1 (§есщепсез о£ Гго1е1П5 о£ 1ттипо1ощса1 1п1еге51, И8 ОераПтеШ о£ НеаНЪ апй Нитап Зегуюез), или соответствующей репертуару человеческих иммуноглобулинов эмбрионального типа или структуре, как определено СНоЙна апй Ьезк (1987), ί. Мо1. Вю1. 196:910-917. Согласно изобретению предложено применение отдельной каркасной области или набора таких каркасных областей, которые, как было обнаружено, позволяют получить практически любую специфичность связывания посредством изменения только гипервариабельных областей.
При использовании здесь конъюгат относится к композиции, содержащей антигенсвязывающий фрагмент антитела, связывающий сывороточный альбумин, связанный с лекарственным средством.
При использовании здесь термин малая молекула обозначает соединение с молекулярной массой менее чем 1500 дальтон (Да), предпочтительно менее чем 1000 Да.
Такие конъюгаты включают конъюгаты лекарственных средств, содержащие антигенсвязывающий фрагмент антитела, связывающий сывороточный альбумин, с которым лекарственное средство связано ковалентно, и нековалентные конъюгаты лекарственных средств, содержащие антигенсвязывающий фрагмент антитела, связывающий сывороточный альбумин, с которым лекарственное средство связано нековалентно.
При использовании здесь конъюгат лекарственного средства относится к композиции, содержащей антигенсвязывающий фрагмент антитела, связывающий сывороточный альбумин, с которым лекарственное средство связано ковалентно. Лекарственное средство может быть ковалентно связано с антигенсвязывающим фрагментом непосредственно или косвенно посредством подходящей линкерной группировки. Лекарственное средство может быть связано с антигенсвязывающим фрагментом в любом подходящем положении, таком как Ν-конец, С-конец или через боковые цепи подходящих аминокислот (например, аминогруппу лизина).
Период полувыведения. Время, занимаемое снижением концентрации лиганда в сыворотке на 50% ш У1уо, например, вследствие деградации лиганда и/или клиренса, или секвестрации лиганда естественными механизмами. Лиганды по изобретению стабилизированы ш У1уо, и их период полувыведения увеличен связыванием с молекулами, препятствующими деградации и/или клиренсу, или секвестрации. Типично, такие молекулы представляют собой встречающиеся в природе белки, сами по себе имеющие длительный период полувыведения ш У1уо. Период полувыведения лиганда увеличен, если его функциональная активность сохраняется ш У1уо в течение более длительного периода, чем у сходного лиганда, не являющегося специфичным в отношении молекулы, увеличивающей период полувыведения. Таким образом, лиганд, специфичный в отношении Н8А и молекулы-мишени, сравнивают с таким же лигандом без специфичности в отношении Н8А, не связывающим Н8А, но связывающим другую молекулу. Например, он может связывать второй эпитоп на молекуле-мишени. Типично, период полувыведения увеличен на 10, 20, 30, 40, 50% или более. Возможны увеличения в пределах 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50 или более периодов полувыведения. Альтернативно, или в дополнение, возможны увеличения в пределах до
- 25 020464
30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 периодов полувыведения.
Фраза по существу, одинаковый при использовании для сравнения периода полувыведения Тбета (Тв) лиганда с периодом полувыведения Тв сывороточного альбумина в организме-хозяине означает, что период полувыведения Тв лиганда в организме-хозяине отличается от периода полувыведения Тв сывороточного альбумина самого по себе в том же организме-хозяине, предпочтительно в человеке-хозяине, не более чем на 50%, например период полувыведения Тв такого лиганда не более чем на 50% меньше или не более чем на 50% больше периода полувыведения Тв сывороточного альбумина в указанном организме-хозяине. Предпочтительно применительно к фразе по существу, одинаковый, период полувыведения Тв лиганда в организме-хозяине отличается от периода полувыведения сывороточного альбумина самого по себе не более чем на 10-20% и более предпочтительно отличается от периода полувыведения сывороточного альбумина самого по себе не более чем на 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1%, или менее, или вообще не отличается от периода полувыведения сывороточного альбумина самого по себе.
Альтернативно, фраза по существу, неодинаковый при использовании для сравнения периода полувыведения Тв лиганда с периодом полувыведения Тв сывороточного альбумина в организме-хозяине означает, что период полувыведения Тв лиганда в организме-хозяине отличается от периода полувыведения Тв сывороточного альбумина самого по себе в том же организме-хозяине, предпочтительно в человеке-хозяине, по меньшей мере на 50%, например, период полувыведения Тв лиганда более чем на 50% превышает период полувыведения Тв сывороточного альбумина в указанном организме-хозяине.
Гомогенное иммунологическое исследование. Иммунологическое исследование, где анализируемое вещество выявляют без необходимости в стадии разделения связанных и несвязанных реагентов.
По существу, идентичный или по существу, гомологичный. Первая аминокислотная или нуклеотидная последовательность, содержащая достаточное число идентичных или эквивалентных (например, со сходной боковой цепью, например, консервативные аминокислотные замены) аминокислотных остатков или нуклеотидов по сравнению со второй аминокислотной или нуклеотидной последовательностью таким образом, что первая и вторая аминокислотные или нуклеотидные последовательности обладают одинаковыми активностями. В случае первого и второго антител и/или отдельных вариабельных доменов, описанных здесь, первое антитело или отдельный вариабельный домен имеет ту же специфичность связывания, что и первое, и обладает по меньшей мере 50% или по меньшей мере до 55, 60, 70, 75, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% аффинности первого антитела или отдельного вариабельного домена.
При использовании здесь термины условия низкой строгости, условия средней строгости, условия высокой строгости или условия очень высокой строгости описывают условия гибридизации и промывания нуклеиновых кислот. Руководство по проведению реакций гибридизации может быть найдено в Ситтеп! Рто!осо1§ ш Мо1еси1аг Вю1о§у, 1ойп \νίΓν & §оп8, Ν.Υ. (1989), 6.3.1-6.3.6, что полностью включено сюда посредством ссылки. В этой ссылке описаны водные и неводные способы, любой из которых может быть использован. Названные здесь конкретные условия гибридизации представляют следующие: (1) условия гибридизации низкой строгости в 6Х хлориде натрия/цитрате натрия (§§С) при приблизительно 45°С с двумя последующими промываниями в 0,2Х §§С, 0,1% додецилсульфате натрия (8Ό8) при по меньшей мере 50°С (температура промываний может быть увеличена до 55°С для условий низкой строгости); (2) условия гибридизации средней строгости в 6Х §§С при приблизительно 45°С с последующим одним или более промываниями в 0,2Х §§С, 0,1% δΌδ при 60°С; (3) условия гибридизации высокой строгости в 6Х §§С при приблизительно 45°С с последующим одним или более промываниями в 0,2Х §§С, 0,1% δΌδ при 65°С; предпочтительно (4) условия гибридизации очень высокой строгости представляют собой 0,5 М фосфат натрия, 7% δΌδ при 65°С с последующим одним или более промываниями при 0,2Х §§С, 0,1% δΌδ при 65°С. Условия очень высокой строгости (4) являются предпочтительными условиями, и их следует использовать, если не указано иное.
Поверхностный плазмонный резонанс. Конкурентные исследования могут быть применены для определения того, конкурирует ли определенный антиген или эпитоп, такой как человеческий сывороточный альбумин, с другим антигеном или эпитопом, таким как сывороточный альбумин обезьян рода Супото1ди8, за связывание с лигандом, связывающим сывороточный альбумин, описанным здесь, таким как специфичный ,АЬ. Сходные конкурентные исследования могут быть применены для определения того, конкурирует ли первый лиганд, такой как ,АЬ, со вторым лигандом, таким как ,АЬ, за связывание антигена-мишени или эпитопа-мишени. При использовании здесь термин конкурирует относится к веществу, такому как молекула, соединение, предпочтительно белок, способному в той или иной степени препятствовать специфичному связывающему взаимодействию между двумя или более молекулами. Фраза не оказывает конкурентного ингибирования означает, что вещество, такое как молекула, соединение, предпочтительно белок, не препятствует в какой-либо измеримой или значимой степени специфичному связывающему взаимодействию между двумя или более молекулами. Специфичное связывающее взаимодействие между двумя или более молекулами предпочтительно включает специфичное связывающее взаимодействие между отдельным вариабельным доменом и его когнатным партнером или мишенью. Препятствующая или конкурирующая молекула может представлять собой другой отдельный вариабельный домен, или она может представлять собой молекулу, структурно и/или функционально
- 26 020464 сходную с когнатным партнером или мишенью.
Отдельный вариабельный домен включает отдельный вариабельный домен иммуноглобулина и неиммуноглобулиновый отдельный вариабельный домен, содержащий одну, две, три или более СЭВобласти из вариабельного домена иммуноглобулина, такого как вариабельный домен антитела, включая отдельный вариабельный домен тяжелой или легкой цепи антитела. Отдельный вариабельный домен может иметь происхождение от животного, включая человека, крысу, мышь, свинью, обезьяну, представителей семейства верблюдовых, как, например, вариабельная область (У-область) антитела, или он может иметь происхождение от микроорганизма, такого как Εχο1ΐ, в случае неммуноглобулинового каркаса ОгоЕ1 и ΟτοΕδ. Отдельный варибельный домен может быть частично или полностью искусственным или может быть образован с применением рекомбинантной молекулярно-биологической технологии.
Ιη νίΐτο конкурентные анализы для определения способности отдельного вариабельного домена конкурировать за связывание мишени с другим связывающим мишень доменом, таким как другой отдельный вариабельный домен, а также для определения Κι, хорошо известны в данной области техники. Одним предпочтительным конкурентным исследованием является исследование поверхностного плазмонного резонанса, которое имеет преимущества быстроты, чувствительности и применимости к широкому спектру концентраций белка, и требует небольших количеств исследуемого материала. Предпочтительным конкурентным исследованием поверхностного плазмонного резонанса является конкурентный эксперимент Вхатоте. Конкурентный эксперимент Вхатоте может быть применен для определения, например, того, конкурируют ли сывороточный альбумин яванского макака и человеческий сывороточный альбумин за связывание с лигандом, таким как 1АЬ ЭОМ7Ь-х. Одним экспериментальным протоколом для такого примера является следующий.
Например, после покрытия сенсорного чипа СМ5 катете АВ) при 25°С приблизительно 1000 резонансными единицами (ВИ) человеческого сывороточного альбумина (Н8А), очищенное 1АЬ наносят на антигенную поверхность в одной концентрации (например, 1 мкм) само по себе и в комбинации с серийными разведениями сывороточного альбумина яванского макака (С8А). Серийные разведения Н8А смешивали с постоянной концентрацией (40 нМ) очищенного 1АЬ. Подходящие серийные разведения С8А могут начинаться с 5 мкМ С8А, с шестью двукратными разведениями до 78 нМ С8А. Этим растворам необходимо дать достичь равновесия перед нанесением. После нанесения получали считываемый ответ для измерения полученных ВИ связывания для 1АЬ самого по себе в каждой из нескольких смесей !АЬ/С8А, по данным, использованным в соответствии с программным обеспечением для оценки В1А, строили кривую доза-ответ для каждого случая, когда С8А ингибировал связывание А1Ьи1АЬ™ (1АЬ, специфично связывающего сывороточный альбумин) с чипом, на котором иммобилизирован Н8А. При сравнении связанных ВИ 1АЬ самого по себе со связанными ВИ 1АЬ + С8А будет видно, конкурирует ли С8А с Н8А за связывание 1АЬ. Если он конкурирует, тогда с увеличением концентрации С8А в растворе ВИ 1АЬ, связанного с Н8А, будут уменьшаться. Если конкуренции нет, то добавление С8А не будет влиять на количество 1АЬ, связывающего Н8А.
Специалисту в данной области техники известно как адаптировать этот или другие протоколы для проведения этого конкурентного анализа на множестве различных лигандов, включая несколько лигандов, описанных здесь, связывающих сывороточный альбумин. Множество лигандов включает, без ограничения, мономерные отдельные вариабельные домены, включая отдельные вариабельные домены, содержащие иммуноглобулиновый и/или неиммуноглобулиновый каркас, 1АЬ, лиганды с двойной специфичностью и мультимеры этих лигандов. Специалисту в данной области техники также известно как адаптировать этот протокол для сравнения связывания нескольких разных пар антигенов и/или эпитопов с лигандом с применением этого конкурентного исследования.
В этих экспериментах можно установить числовое значение отсечки, по которому можно будет определить, конкурирует ли антиген или эпитоп с другим антиеном или эпитопом за связывание со специфичным лигандом, предпочтительно 1АЬ. Например, если в описанном выше эксперименте 5 мкМ С8А в растворе приводят к 10% или менее снижению ВИ 1АЬ, связанного с Н8А, тогда признают отсутствие конкуренции за связывание. Соответственно, снижение ВИ связывания 1АЬ с Н8А в присутствии С8А более чем на 10% будет указывать на наличие конкуренции С8А за связывание 1АЬ для связывания Н8А. Снижение ВИ связывания 1АЬ с Н8А менее чем на 10% будет указывать на отсутствие конкуренции С8А за связывание 1АЬ Н8А, где снижения на 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 и 1% являются прогрессивно более строгими требованиями для выявления отсутствия конкуренции. Чем больше снижение ВИ связывания 1АЬ с Н8А, тем больше конкуренция. Таким образом, увеличивающиеся степени конкуренции могут быть расположены в соответствии с процентом снижения ВИ связывания с Н8А, т.е. по меньшей мере 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% или вплоть до 100% снижения.
При использовании здесь фрагмент относится к менее чем 100% последовательности (например, до 99, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10% и т.д.), но содержащей 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более смежных аминокислотных остатков. Фрагмент имеет длину, достаточную для сохранения интересующего связывания сывороточного альбумина с аффинностью 1х 10-6 М или менее. При использовании здесь фрагмент также относится к возможным вставкам, делециям или заменам од- 27 020464 ной или более аминокислот, существенно не меняющим способность измененного полипептида связывать отдельный домен антитела, выработанного против мишени. Число аминокислотных вставок, делеций или замен предпочтительно составляет до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 или 70 аминокислот.
Подробное описание изобретения
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют то же значение, в котором их обычно понимают специалисты в данной области техники (например, в клеточной культуре, молекулярной генетике, химии нуклеиновых кислот, методиках гибридизации и биохимии). Стандартные методики применяют для молекулярных, генетических и биохимических способов (см., в целом, ЗатЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 2й ей. (1989), Со1й 8ртшд нагЬог ЬаЬота!огу Ргекк. Со1й 8ртшд нагЬог, Ν.Υ. и АикиЬе1 е! а1., 8ког1 Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду (1999), 4!к Ей, 1окп \УПеу & Зопк. 1пс., которые включены сюда посредством ссылки), и химических способов. Стандартные методики для исследований поверхностного плазмонного резонанса включают 1ап Теде Апйегкеп е! а1. (2006), Еиг. I. 1ттипо1. 36:304-3051, Радегк1ат (1991), Теск. Рго!ет Скет. 2:65-71, и 1окпккоп е! а1. (1991), Апа1. Вюскет 198:268-277.
Получение мультиспецифичных лигандов на основе иммуноглобулинов
Лиганды с двойной специфичностью по изобретению, с открытой или закрытой конформацией в соответствии с желаемой формой изобретения, могут быть получены по установленным ранее методикам, используемым в области конструирования антител, для получения ксРу, фаговых антител или других конструированных молекул антител. Методики получения антител и, в частности, биспецифичных антител, описаны, например, в следующих обзорах и приведенных там ссылках: ХУиНег & Мйк!еш (1991), №!ите 349:293-299; Р1иеск1кип (1992), 1ттцпо1одюа1 Кеу1етек 130:151-188; \Упдк1 е! а1. (1992), Сп!.. Кеу. 1ттипо1. 12:125-168; ноШдет. Р. & \Ут1ег. С. (1993), Сигг. Ор. Вю!ескп. 4, 446-449; Сайет. е! а1. (1995), I. нета!о!кег. 4. 463-470; Скек!ег. К.А. & натеШпк. К.Е. (1995). Тгепйк Вю!ескп. 13. 294-300; ноодепЬоот. н.К. (1997). №-11иге Вю!ескпо1. 15. 125-126; Реагоп, Ό. (1997). №!ите Вю!ескпо1. 15. 618-619; Р1иск1кип, А. & Раск. Р. (1997). 1ттипо!ескпо1оду 3. 83-105; Сайет. Р. & Мегскап!, А.М. (1997). Сигг. Орш. Вю!ескпо1. 8. 449-454; ноШдет. Р. & \УкИег. С. (1997). Сапсег 1ттипо1. 1ттипо!кег. 45.128-130.
Согласно изобретению предложена селекция вариабельных доменов против двух разных антигенов или эпитопов и последующее комбинирование вариабельных доменов.
В методиках. применяемых для селекции вариабельных доменов антител. используют библиотеки и способы селекции, известные в данной области техники. Естественные библиотеки (Магкк е! а1. (1991). ί. Мо1. Вю1., 222:581; Vаидкаη е! а1. (1996). №!иге Вю!еск.. 14:309). в которых используют перестроенные ν-гены. полученные от человеческих В-клеток. хорошо известны специалистам в данной области техники. Синтетические библиотеки (ноодепЬоот & \Ут1ег (1992). I. Мо1. Вю1.. 227: 381; ВагЬак е! а1. (1992). Ргос. №И. Асай. δοΐ. И8А. 89: 4457; №8ят е! а1. (1994). ЕМВО I.. 13: 692; Спййкк е! а1. (1994). ЕМВО I.. 13: 3245; Эе КгшГ е! а1. (1995). I. Мо1. Вю1.. 248: 97) получают клонированием ν-генов иммуноглобулинов, обычно с применением ПЦР. Ошибки в процессе ПЦР могут привести к высокой степени рандомизации. Библиотеки и/или У[, можно подвергать селекции против антигенов-мишеней или эпитоповмишеней по отдельности, в случае чего связывание отдельного домена селектируют непосредственно, или совместно.
Предпочтительный способ получения лиганда с двойной специфичностью по настоящему изобретению включает применение системы селекции, где репертуар вариабельных доменов подвергают селекции на связывание первого антигена или эпитопа и репертуар вариабельных доменов подвергают селекции на связывание второго антигена или эпитопа. Селектированные первый и второй отдельные вариабельные домены затем комбинируют и лиганд с двойной специфичностью подвергают селекции на связывание как первого. так и второго антигена или эпитопа. Лиганды с закрытой конформацией подвергают селекции на связывание как первого. так и второго антигена или эпитопа по отдельности, но не одновременно.
А. Векторные системы библиотек
В данной области техники известно множество систем селекции, подходящих для использования в настоящем изобретении. Примеры таких систем описаны ниже.
Системы экспрессии бактериофага лямбда могут быть подвергнуты скринингу непосредственно как бактериофагальные бляшки или как колонии лизогенов. в обоих случаях. как описано ранее (нике е! а1. (1989). §с1епсе, 246: 1275; Са!оп и КортотекЫ (1990). Ргос. №!1. Асай. 8с1. И8А. 87; МиШпах е! а1. (1990). Ргос. №!1. Асай. §С1. И8А. 87: 8095; Регккоп е! а1. (1991). Ргос. №Ш. Асай. 8с1. И8А. 88: 2432). и применимы в изобретении. В то время как такие системы экспрессии могут быть использованы для скрининга до 106 различных членов библиотеки, они не являются действительно подходящими для скрининга больших количеств (более чем 106 членов).
Особенно полезными в конструировании библиотек являются дисплейные системы селекции, делающие возможным связывание нуклеиновой кислоты с экспрессируемым ею полипептидом. При использовании здесь дисплейная система селекции представляет собой систему. допускающую селекцию,
- 28 020464 подходящим дисплейным способом, отдельных членов библиотеки связыванием с лигандами общего типа и/или лигандами-мишенями.
Селекционные протоколы для выделения желаемых членов больших библиотек известны в данной области техники, типичными примерами которых являются фаговые дисплейные методики. Такие системы, в которых различные пептидные последовательности представлены на поверхности нитчатого бактериофага (δ^Π и διηΜι (1990), δ^ι^, 249: 386), подтвердили свою полезность для создания библиотек фрагментов антител (и кодирующих их нуклеотидных последовательностей) для ίη νίίτο селекции и амплификации специфичных фрагментов антител, связывающих антиген-мишень (МсСаГГеПу е! а1., νΟ 92/01047). Нуклеотидные последовательности, кодирующие области Ун и Уъ, связаны с фрагментами генов, кодирующими лидерные сигнальные последовательности, направляющие их в периплазматическое пространство Ε^οΗ, и в результате получаемые фрагменты антител представлены на поверхности бактериофага, в большинстве как слитые белки с белками оболочки бактериофага (например, ρΙΙΙ или рУШ). Альтернативно, фрагменты антител представлены снаружи на капсидах фага лямбда (фаготела). Преимущество основанных на фагах дисплейных систем состоит в том, что поскольку они являются биологическими системами, селектируемые члены библиотеки могут быть амплифицированы просто выращиванием фага, содержащего селектируемый член библиотеки, в бактериальных клетках. Кроме того, поскольку фаг или фагмидный вектор содержат на себе нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидный член библиотеки, секвенирование, экспрессия и последующая генетическая манипуляция относительно просты.
Способы конструирования бактериофаговых дисплейных библиотек антител и библиотек экспрессии фага лямбда хорошо известны в данной области техники (МсСаГГеПу е! а1. (1990), Шине, 348: 552; Канд е! а1. (1991), Ρτο^ №П. ΑсаЛ. δ^.. υδΑ, 88: 4363; Сίаскδοη е! а1. (1991), №Циге, 352: 624; Εο\\Ίΐκιη е! а1. (1991), ΒίοΟ^ιηίδΙίΎ, 30: 10832; ΒιιΠοη е! а1. (1991), Ρτο^ №!к ΑсаЛ. δ^ υδΑ, 88: 10134; НοοдеηЪοοт е! а1. (1991), №с1ею ЛаЛз Кее., 19: 4133; СВаид е! а1. (1991), ί. Iттиηο1, 147: 3610; Βκί!ίίη§ е! а1. (1991), Οеηе, 104: 147; Магкз е! а1. (1991), зирга; Βа^Ъаδ е! а1. (1992), зирга; На\\ктз апЛ νίώΌΤ (1992), ί. Iттиηοί, 22: 867; Магкз е! а1., 1992, ί. Βίο1. СЬет., 267: 16007; Ьетет е! а1. (1992), δ^ι^, 258: 1313, включенные сюда посредством ссылки).
Один особенно выгодный подход представлял собой применение фаговых библиотек 8сΡν (НизЮи е! а1., 1988, Ρτο^ №11. ΑсаЛ. δ^ υδΑ, 85: 5879-5883; СЬаиЛЬагу е! а1. (1990), Ρτο^ ЫаЙ. ΑсаЛ. δ^ υδΑ, 87: 1066-1070; МсСаГГеПу е! а1. (1990), зирга; Сίаск8οη е! а1. (1991), №!ите, 352: 624; Магкз е! а1. (1991), ί. Μοί. ΒίοΓ, 222: 581; С1п5\уе11 е! а1. (1992), ^пЛз Βίο^ΗηοΓ, 10: 80; Магкз е! а1. (1992), ί. Βίο1. СЬет., 267). Были описаны различные воплощения библиотек 8сΡν, представленных на белках оболочки бактериофагов. Также известны усовершенствования фаговых дисплейных способов, например, как описано в νΟ 96/06213, νΟ 92/01047 (МеЛюа1 КезеагсЬ СюиисИ е! а1.) и νΟ 97/08320 (Μο^ρЬοδуδ), включенных сюда посредством ссылки.
Другие системы для образования библиотек полипептидов включают применение бесклеточного ферментного оборудования для ίη νί!το синтеза членов библиотеки. В одном способе молекулы РНК селектируют поочередными раундами селекции против мишени и ПЦР-амплификацией (ΤικιΊ< и ΟοΗ (1990), δ^ιη^, 249: 505; ЕШп§Фп и δζοδΕιΚ (1990), №!ите, 346: 818). Похожая методика может быть применена для идентификации последовательностей ДНК, связывающих предопределенный человеческий транскрипционный фактор (ΤЬ^еδеη и ΒасЬ (1990), №.1с1ею 4аЛз Кез., 18: 3203; ΒеаиЛ^у и Шусе (1992), δ^ιη^, 257: 635; νΟ 92/05258 и νΟ 92/14843). Похожим образом, ίη νΠτο трансляция может быть применена для синтеза полипептидов как способ образования больших библиотек. Эти способы, в большинстве случаев включающие стабилизированные полисомные комплексы, описаны, кроме того, в νΟ 88/08453, νΟ 90/05785, νΟ 90/07003, νΟ 91/02076, νΟ 91/05058 и νΟ 92/02536. В альтернативных дисплейных системах, не основанных на фагах, как, например, раскрытых в νΟ 95/22625 и νΟ 95/11922 (ΑГίутаx), используют полисомы для представления полипептидов для селекции.
Еще одна категория методик включает селекцию репертуаров в искусственных компартментах, допускающих связь гена с его генным продуктом. Например, селекционная система, в которой нуклеиновые кислоты, кодирующие желаемые генные продукты, могут быть селектированы в микрокапсулах, сформированных эмульсиями типа вода в масле, описана в νΟ 99/02671, νΟ 00/40712 и Τа\γΠк & ΟτίίΤΗΒδ (1998), №!ите Β^ο!есЬηοί 16(7), 652-6. Генетические элементы, кодирующие генный продукт, имеющий желаемую активность, компартментализуют в микрокапсулах и затем транскрибируют и/или транслируют для образования их соответствующих генных продуктов (РНК или белка) в микрокапсулах. Генетические элементы, вырабатывающие генный продукт, имеющий желаемую активность, впоследствии хранят. В таком способе селектируют интересующие генные продукты выявлением желаемой активности множеством способов.
- 29 020464
Б. Конструирование библиотек
Библиотеки, предназначенные для селекции, могут быть конструированы с применением методик, известных в данной области техники, например, как изложено выше, или могут быть приобретены из коммерческих источников. Библиотеки, полезные в настоящем изобретении, описаны, например, в νθ 99/20749. Когда векторная система выбрана и одна или более последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие интересующие полипептиды, клонированы в вектор библиотеки, можно формировать разнообразие в рамках клонированных молекул, выполняя мутагенез перед экспрессией; альтернативно, кодируемые белки могут быть экспрессированы и селектированы, как описано выше, перед проведением мутагенеза и дополнительных раундов селекции. Мутагенез последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих структурно оптимизированные полипептиды, проводят стандартными молекулярными способами. Особенно полезна полимеразная цепная реакция, или ПЦР (МиШк и Ра1оопа (1987), Мебюбк Еп/уто1, 155: 335, включено здесь посредством ссылки). ПЦР, в которой используют множество циклов репликации ДНК, кактализируемой термостабильной ДНК-зависимой ДНК-полимеразой, для амплификации интересующей последовательности-мишени, хорошо известна в данной области техники. Конструирование различных библиотек антител было обсуждено в νίπΚΓ е! а1. (1994), Апп. Кеу. 1ттипо1оду 12, 433-55, и приведенных там ссылках.
ПЦР проводят с использованием ДНК-матрицы (по меньшей мере 1 фг, более эффективно 1-1000 нг) и по меньшей мере 25 пмоль олигонуклеотидных праймеров; может быть выгодным использование большего количества праймера, когда пул праймера сильно гетерогенен, поскольку каждая последовательность представлена лишь малой фракцией молекул пула, и количества становятся лимитирующими на более поздних циклах амплификации. Типичная реакционная смесь включает: 2 мкл ДНК, 25 пмоль олигонуклеотидного праймера, 2,5 мкл 10Х буфера 1 для ПЦР (Регкш-Е1тег, Рок!ег СНу, СА), 0,4 мкл 1,25 мкМ дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (дНТФ), 0,15 мкл (или 2,5 единицы) Тад-ДНК-полимеразы (Регкш Е1тег, Рок!ег Сбу, СА) и деионизированную воду до общего объема 25 мкл. Накладывают минеральное масло и проводят ПЦР с использованием программируемого термального циклера. Длительность и температуру каждой стадии цикла ПЦР, также как число циклов, адаптируют в соответствии с действующими требованиями строгости. Температуру и время отжига определяют как по предполагаемой эффективности, с которой праймер гибридизуется с матрицей, так и по допустимой степени ошибочного спаривания; очевидно, если молекулы нуклеиновых кислот одновременно амплифицируют и мутагенизируют, ошибочное спаривание обязательно, по меньшей мере, в первом раунде синтеза. Способность оптимизировать строгость условий отжига праймера входит в знания специалиста в данной области техники. Применяют температуру отжига от 30 до 72°С. Начальная денатурация матричных молекул обычно происходит при от 92 до 99°С в течение 4 мин, с последующими 20-40 циклами, состоящими из денатурации (94-99°С в течение от 15 с до 1 мин), отжига (температуру определяют, как обсуждено выше, 1-2 мин) и удлинения (72°С в течение 1-5 мин, в зависимости от длины амплифицируемого продукта). Конечное удлинение в большинстве случаев происходит в течение 4 мин при 72°С, и, возможно, с последующей неопределенной (0-24 ч) стадией при 4°С.
В. Комбинирование отдельных вариабельных доменов
После селекции домены, применимые в изобретении, могут быть комбинированы множеством способов, известных в данной области техники, включая ковалентные и нековалентные способы.
Предпочтительные способы включают применение полипептидных линкеров, как описано, например, в связи с молекулами ксРу (Βίτ6 е! а1. (1988), δ^ι^ 242:423-426). Обсуждение подходящих линкеров предоставлено в Βίτ6 е! а1. δ^ιτ^ 242, 423-426; Нибкоп е! а1., 1оигп;б 1ттипо1 Мебюбк 231 (1999), 177-189; Нибкоп е! а1., Ргос. Ν;·ιΙ. Асаб. δα. ЖА 85, 5879-5883. Линкеры предпочтительно являются гибкими, допускающими взаимодействие двух отдельных доменов. Один пример линкера представляет собой линкер (01у^ег)п, где п=от 1 до 8, например 2, 3, 4, 5 или 7. Также могут быть использованы линкеры, применяемые в диателах, являющиеся менее гибкими (НоШдег е! а1. (1993), Ргос. Ν;·ιΙ. Асаб. δα. ЖА 90:6444-6448).
В одном воплощении используемый линкер не является шарнирной областью иммуноглобулина.
Вариабельные домены могут быть комбинированы с применением способов, отличных от линкеров. Например, использование дисульфидных связей, обеспеченных через естественные или конструированные цистеиновые остатки, может быть применено для стабилизации димеров УН-УН, Уь-Уь или УН-Уь (Кейег е! а1. (1994), Рго!еш Епд. 7:697-704) или, посредством ремоделирования области контакта между вариабельными доменами, для улучшения соответствия и, таким образом, стабильности взаимодействия (Шбдетау е! а1. (1996), Рго!еш Епд. 7:617-621; Ζΐιιι е! а1. (1997), Рго!еш δ^ι^ 6:781-788).
При необходимости могут быть применены другие методики соединения или стабилизации вариабельных доменов иммуноглобулинов и, в частности, доменов УН антител.
Согласно настоящему изобретению лиганды с двойной специфичностью могут быть в закрытых конформациях в растворе. Закрытая конфигурация представляет собой такую конфигурацию, при которой два домена (например, УН и Уъ) присутствуют в объединенной форме, такой как объединенная пара УН-Уь, образующая связывающую область антитела. Например, ксРу может быть в закрытой конформации, в зависимости от расположения линкера, используемого для связывания доменов УН и Уъ. Если он
- 30 020464 достаточно гибок для объединения доменов или жестко удерживает их в объединенном состоянии, домены, вероятно, будут принимать закрытую конформацию.
Сходным образом, пары доменов Ун и пары доменов Уъ могут существовать в закрытой конформации. В большинстве случаев это будет функцией закрытого объединения доменов, как, например, посредством ригидного линкера, в молекуле лиганда. Лиганды в закрытой конформации будут неспособны связывать и молекулу, увеличивающую период полувыведения лиганда, и вторую молекулу-мишень. Таким образом, лиганд будет обычно связывать вторую молекулу-мишень только при диссоциации от молекулы, увеличивающей период полувыведения лиганда.
Более того, конструирование димеров Ун/Ун, Уь/Уь или Ун/Уь без линкеров обеспечивает конкуренцию между доменами.
Более того, лиганды по изобретению могут быть в открытой конформации. В такой конформации лиганды будут способны одновременно связывать и молекулу, увеличивающую период полувыведения лиганда, и вторую молекулу-мишень. Обычно вариабельные домены в открытой конформации (в случае пар Ун-Уь) удерживаются достаточно далеко друг от друга так, что они не взаимодействуют с образованием связывающей области антитела и не конкурируют за связывание их соответствующих эпитопов. В случае димеров Ун/Ун или Уъ/Уъ нет ригидных линкеров, которые удерживали бы домены друг рядом с другом. Естественно, такие пары доменов не будут конкурировать за связывание антигена или образовывать связывающую область антитела.
РаЪ-фрагменты и целые антитела могут существовать, в первую очередь, в закрытой конформации, хотя следует понимать, что открытые и закрытые лиганды с двойной специфичностью, вероятно, существуют во множестве равновесных состояний при различных условиях. Связывание лиганда с мишенью, вероятно, смещает баланс равновесия в сторону открытой конфигурации. Таким образом, определенные лиганды по изобретению могут существовать в двух конформациях в растворе, одна из которых (открытая форма) может связывать два антигена или эпитопа независимо, в то время как альтернативная конформация (закрытая форма) может связывать только один антиген или эпитоп; антигены или эпитопы, таким образом, конкурируют за связывание лиганда в этой конформации.
Хотя открытая форма лиганда с двойной специфичностью может, таким образом, существовать в равновесии с закрытой формой в растворе, предполагают, что равновесие будет способствовать закрытой форме; более того, открытая форма может быть переведена связыванием мишени в закрытую конформацию. Таким образом, предпочтительно определенные лиганды с двойной специфичностью по изобретению присутствуют в равновесии между двумя (открытой и закрытой) конформациями.
Лиганды с двойной специфичностью по изобретению могут быть модифицированы для того, чтобы способствовать открытой или закрытой конформации. Например, стабилизация взаимодействий Ун-Уь дисульфидными связями стабилизирует закрытую конформацию. Более того, линкеры, используемые для соединения доменов, включая пары доменов Ун и доменов Уъ, могут быть конструированы таким образом, чтобы способствовать открытой форме; например, линкеры могут стерически препятствовать объединению доменов, как, например, включением крупных аминокислотных остатков в подходящие положения или разработкой подходящей ригидной структуры, которая будет сохранять домены физически отдаленными друг от друга.
Г. Описание лиганда с двойной специфичностью
Связывание лиганда с двойной специфичностью с его специфичными антигенами или эпитопами можно исследовать способами, которые будут знакомы специалистам в данной области техники и включают ЕЫ8А (твердофазный иммуноферментный анализ). В предпочтительном воплощении изобретения связывание исследуют с применением моноклонального фагового ЕЫ8А.
Фаговый ЕЫ8А может быть проведен в соответствии с любым подходящим способом, типичный протокол изложен ниже.
Популяции фага, полученные на каждом раунде селекции, могут быть подвергнуты скринингу на связывание с выбранным антигеном или эпитопом посредством ЕЫ8А для идентификации поликлональных фаговых антител. Фаг из отдельных инфицированных бактериальных колоний из этих популяций может затем быть подвергнут скринингу посредством ЕЫ8А для идентификации моноклональных фаговых антител. Также желательно провести скрининг растворимых фрагментов антител на связывание с антигеном или эпитопом, и это также может быть проведено посредством ЕЫ8А с использованием реагентов, например, против С- или Ν-концевой метки (см., например, \УиИег е( а1. (1994), Апп. Кет. 1ттипо1оду 12, 433-55 и ссылки, приведенные там).
Разнообразие селектируемых фаговых моноклональных антител может также быть оценено гельэлектрофорезом продуктов ПЦР (Магкк е( а1. 1991, выше; Νίδδίιη е( а1. 1994 выше), зондированием (ТотНпкоп е( а1. (1992), 1. Мо1. Вю1. 227, 776) или секвенированием векторной ДНК.
- 31 020464
Д. Структура лигандов с двойной специфичностью
Как описано выше, антитело определяют здесь как антитело (например, 1дО, 1дМ, 1дА, 1дА, 1дЕ) или фрагмент (РаЬ, Ρν, связанный дисульфидными связями Ρν, 8сРу, диатело), содержащий по меньшей мере один вариабельный домен тяжелой и легкой цепи, по меньшей мере два вариабельных домена тяжелой цепи или по меньшей мере два вариабельных домена легкой цепи. Оно может, по меньшей мере, частично иметь происхождение от любого вида, естественным образом образующего антитело, либо может быть создано рекомбинантной ДНК технологией; либо выделено из сыворотки, В-клеток, гибридом, трансфектом, дрожжей или бактерий.
В предпочтительном воплощении изобретения лиганд с двойной специфичностью содержит по меньшей мере один отдельный вариабельный домен тяжелой цепи антитела и один отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела или два отдельных вариабельных домена тяжелой или легкой цепи. Например, лиганд может содержать пару Ун/Уь, пару доменов Ун или пару доменов Уь.
Первый и второй вариабельные домены такого лиганда могут быть расположены на одной полипептидной цепи. Альтернативно, они могут быть расположены на разных полипептидных цепях. В случае, когда они расположены на одной полипептидной цепи, они могут быть связаны линкером, предпочтительно представляющим собой пептидную последовательность, как описано выше.
Первый и второй вариабельные домены могут быть объединены ковалентно или нековалентно. В случае, когда они объединены ковалентно, ковалентные связи могут представлять собой дисульфидные связи.
В случае если вариабельные домены выбраны из репертуаров У-генов, селектируемых, например, с применением технологии фагового дисплея, как описано здесь, эти вариабельные домены содержат универсальную каркасную область, таким образом, что они могут быть распознаны определенным лигандом общего типа, как определено здесь. Применение универсальных каркасных областей, лигандов общего типа и т.п. описано в \УО 99/20749.
Там, где используют репертуары У-генов, разнообразие полипептидной последовательности предпочтительно локализовано в структурных петлях вариабельных доменов. Полипептидные последовательности каждого домена могут быть изменены перетасовкой ДНК или мутацией с целью усиления взаимодействия каждого вариабельного домена с его комплементарной парой. ДНК-перестановки известны в данной области техники и о них сообщают, например, 81еттег, 1994, №1иге 370: 389-391 и патент США № 6297053, оба из которых включены сюда посредством ссылки. Другие способы мутагенеза хорошо известны специалистам в данной области техники.
В предпочтительном воплощении изобретения лиганд с двойной специфичностью представляет собой одноцепочечный Ρν-фрагмент. В альтернативном воплощении изобретения лиганд с двойной специфичностью состоит из РаЬ-формата.
В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложена нуклеиновая кислота, кодирующая, по меньшей мере, лиганд с двойной специфичностью, как определено здесь.
Специалисту в данной области техники будет ясно, что в зависимости от аспекта изобретения оба антигена или эпитопа могут связывать одну и ту же молекулу антитела одновременно. Альтернативно, они могут конкурировать за связывание одной и той же молекулы антитела. Например, там, где оба эпитопа связаны одновременно, оба вариабельных домена лиганда с двойной специфичностью способны независимо связывать их эпитопы-мишени. Там, где домены конкурируют, один вариабельный домен способен связывать свою мишень, но не в то же самое время, когда другой вариабельный домен связывает свою когнатную мишень; или первый вариабельный домен способен связывать свою мишень, но не в то же самое время, когда второй вариабельный домен связывает свою когнатную мишень.
Вариабельные домены могут иметь происхождение от антител, направленных против антигеновмишеней или эпитопов-мишеней. Альтернативно, они могут иметь происхождение от репертуара отдельных доменов антител, как, например, экспрессированных на поверхности нитчатого бактериофага. Селекцию можно проводить, как описано ниже.
В большинстве случаев молекулы нуклеиновых кислот и векторные конструкции, необходимые для осуществления настоящего изобретения, могут быть конструированы и ими можно манипулировать, как изложено в стандартных лабораторных руководствах, таких как 8атЬгоок еΐ а1. (1989), Мо1еси1аг С1отп§: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, Со1й Зргшд нагЬог, И8А.
Манипулирование нуклеиновыми кислотами, полезными в настоящем изобретении, обычно проводят в рекомбинантных векторах.
Таким образом, в другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую, по меньшей мере, лиганд с двойной специфичностью, как определено здесь.
При использовании здесь, вектор относится к дискретному элементу, используемому для введения гетерологичной ДНК в клетки для ее экспрессии и/или репликации. Способы селектирования или конструирования и впоследствии применения таких векторов хорошо известны специалисту в данной области техники. В свободном доступе находятся множество векторов, включая бактериальные плазмиды, бактериофаг, искусственные хромосомы и эписомные векторы. Такие векторы могут быть использованы для
- 32 020464 простого клонирования и мутагенеза; альтернативно, используют вектор экспрессии гена. Вектор, применимый по изобретению, может быть селектирован для приведения в соответствие последовательности желаемого размера, кодирующей полипептид, обычно от 0,25 тысяч пар оснований (т.п.о.) до 40 т.п.о. или более в длину. Подходящую клетку-хозяина трансформируют с использованием вектора после манипуляций клонирования ш νίϋΌ. Каждый вектор содержит различные функциональные компоненты, которые в большинстве случаев включают сайт клонирования (или полилинкерный сайт), репликатор и по меньшей мере один селектируемый маркерный ген. Если заданный вектор представляет собой вектор экспрессии, он дополнительно обладает одним или более из следующего: энхансерным элементом, промотором, последовательностями терминации транскрипции и сигнальными последовательностями, каждая из которых расположена поблизости от сайта клонирования, таким образом, что они функционально связаны с геном, кодирующим лиганд по изобретению.
Как векторы для клонирования, так и векторы экспрессии в большинстве случаев содержат последовательности нуклеиновых кислот, делающие возможной репликацию вектора в одной или более выбранных клетках-хозяевах. Обычно в векторах для клонирования эта последовательность представляет собой таковую, делающую возможной репликацию вектора независимо от хромосомной ДНК хозяина, и включает репликаторы или автономно реплицируемые последовательности. Такие последовательности хорошо известны для множества бактерий, дрожжей и вирусов. Репликатор из плазмиды рВК322 является подходящим для большинства грамотрицательных бактерий, репликатор 2-мкм плазмиды является подходящей для дрожжей, и различные вирусные репликаторы (например, вируса обезьян 40 (δν 40), аденовирусные) полезны для векторов для клонирования в клетках млекопитающих. В большинстве случаев репликатор не требуется для векторов экспрессии млекопитающих, если их не используют в клетках млекопитающих, способных реплицировать высокие уровни ДНК, таких как клетки СОδ.
Преимущественно вектор для клонирования или вектор экспрессии может содержать селектируемый ген, также называемый селектируемым маркером. Этот ген кодирует белок, необходимый для выживания или роста трансформированных клеток-хозяев, выращиваемых на селективной культуральной среде. Клетки-хозяева, не трансформированные вектором, содержащим селектируемый ген, следовательно, не будут выживать на культуральной среде. Типичные селектируемые гены кодируют белки, придающие устойчивость к антибиотикам и другим токсинам, например ампициллину, неомицину, метотрексату или тетрациклину, ауксотрофные недостаточности системы комплемента, или возмещающие жизненно необходимые питательные вещества, не доступные в питательной среде.
Поскольку репликацию векторов, кодирующих лиганд по настоящему изобретению, наиболее удобно проводить в Е.соН, применяют Е.сой-селектируемый маркер, например, ген в-лактамазы, придающий устойчивость к антибиотику ампициллину. Они могут быть получены из плазмид Е.соН, как, например, рВК322 или плазмида рИС, такая как рИС18 или рИС19.
Векторы экспрессии обычно содержат промотор, распознаваемый организмом-хозяином и функционально связанный с интересующей кодирующей последовательностью. Такой промотор может быть индуцибельным или конститутивным. Термин функционально связанный относится к контактному положению, где описываемые компоненты находятся во взаимоотношениях, допускающих их функционирование предполагаемым для них образом. Контрольная последовательность, функционально связанная с кодирующей последовательностью, лигирована таким образом, что экспрессии кодирующей последовательности достигают в условиях, совместимых с контрольными последовательностями.
Промоторы, подходящие для использования с прокариотическими хозяевами, включают, например, промоторные системы в-лактамазы и лактозы, промоторную систему щелочной фосфатазы, триптофановую (!гр) промоторную систему и гибридные промоторы, такие как промотор !ас. Промоторы для использования в бактериальных системах будут также в большинстве случаев содержать последовательность Шайна-Далгарно, функционально связанную с кодирующей последовательностью.
Предпочтительные векторы представляют собой векторы экспрессии, делающие возможной экспрессию нуклеотидной последовательности, соответствующей члену библиотеки полипептидов. Таким образом, селекция с использованием первого и/или второго антигена или эпитопа может быть проведена отдельным размножением и экспрессией одного клона, экспрессирующего член полипептидной библиотеки, или применением любой селекционной дисплейной системы. Как описано выше, предпочтительная селекционная дисплейная система представляет собой бактериофаговый дисплей. Таким образом, могут быть использованы фаговые или фагмидные векторы, например, р1Т1 или р1Т2. Лидерные последовательности, применимые в изобретении, включают ре1В, 8Ш, отрА, рйоА, Ь1а и ре1А. Один пример представляет собой фагмидные векторы, имеющие репликатор Е.соН (для двуцепочечной репликации) и также фаговый репликатор (для получения одноцепочечной ДНК). Манипуляция такими векторами и их экспрессия хорошо известны в данной области техники (ИоодепНоот апб ^иНег (1992), выше; Νίδδίιη е! а1. (1994), выше). Кратко, вектор содержит ген в-лактамазы для придания селективности фагмиде и промотор 1ас ближе к 5'-концу кассеты экспрессии, состоящей (от Ν- к С-концу) из лидерной последовательности ре1В (направляющей экспресиируемый полипептид в периплазматическое пространство), множественного сайта клонирования (для клонирования нуклеотидной версии члена библиотеки), возможно,
- 33 020464 одной или более пептидной метки (для выявления), возможно, одного или более стоп-кодона ТАС и фагового белка рШ. Таким образом, с использованием различных супрессорных и несупрессорных штаммов Е.соП и с добавлением глюкозы, изопропилтио-β-^-галактозида (ГРТС) или хелперного фага, такого как УСБ М13, вектор способен проходить репликацию, как плазмида, без экспрессии, продуцировать лишь большие количества члена библиотеки полипептидов самого по себе или продуцировать фаг, часть которого содержит по меньшей мере одну копию слитого белка полипептид-рШ на своей поверхности.
В конструировании векторов, кодирующих лиганды по изобретению, применяют обычные методики лигирования. Выделенные векторы или фрагменты ДНК расщепляют, адаптируют и лигируют заново в форме, желаемой для образования требуемого вектора. Если желательно, известным образом может быть проведен анализ для подтверждения присутствия соответствующих последовательностей в конструированном векторе. Подходящие способы конструирования векторов экспрессии, получения ίη νίΙΐΌ транскриптов, введения ДНК в клетки-хозяева и проведения анализов для оценки экспрессии и функции известны специалистам в данной области техники. Присутствие последовательности гена в образце выявляют или его амплификацию и/или экспрессию оценивают количественно обычными способами, такими как саузерн- или нозерн-анализ, вестерн-блоттинг, дот-блоттинг ДНК, РНК или белка, гибридизация ίη 8Йи, иммуноцитохимия или анализ последовательности молекул нуклеиновых кислот или белков. Специалисты в данной области техники легко предусмотрят, как эти способы могут быть модифицированы, если желательно.
Структура мультиспецифичных лигандов с закрытой конформацией
Согласно одному аспекту второй формы настоящего изобретения два или более некомплементарных эпитопсвязывающих домена связаны таким образом, что они имеют закрытую конформацию, как определено здесь. Преимущественно они могут быть дополнительно присоединены к скелету, который может, в качестве альтернативы или в дополнение к линкеру, описанному здесь, способствовать образованию и/или поддержанию закрытой конформации эпитопсвязывающих областей по отношению друг к другу.
(Ι) Скелеты.
Скелеты могут быть основаны на молекулах иммуноглобулинов или могут быть от источника, не являющегося иммуноглобулином, как изложено выше. Предпочтительные иммуноглобулиновые скелеты, как определено здесь, включают любой один или более из выбранных из следующего: молекулы иммуноглобулина, содержащей, по меньшей мере, (1) домен антитела Съ (подкласса каппа или лямбда); или (2) домен СН1 тяжелой цепи антитела; молекулы иммуноглобулина, содержащей домены СН1 и СН2 тяжелой цепи антитела; молекулы иммуноглобулина, содержащей домены СН1, СН2 и СН3 тяжелой цепи антитела; или любого набора (2) в сочетании с доменом антитела Сь (подкласса каппа или лямбда). Также может быть включен домен шарнирной области. Такие комбинации доменов могут, например, имитировать природные антитела, такие как ЦС или ЦМ, или их фрагменты, такие как молекулы 1ν, 8сЕν, ЕаЬ или Е(аЬ')2. Специалистам в данной области техники будет ясно, что этот список не является исчерпывающим.
(ΙΙ) Белковые каркасы.
Каждый эпитопсвязывающий домен содержит белковый каркас и одну или более СОК, вовлеченные в специфичное взаимодействие домена с одним или более эпитопами. Преимущественно эпитопсвязывающий домен по настоящему изобретению содержит три СОК. Подходящие белковые каркасы включают любые из выбранных из группы, состоящей из следующего: каркасов на основе доменов иммуноглобулинов, каркасов на основе фибронектина, каркасов на основе аффител, каркасов на основе СТБА4, каркасов на основе шаперонов, как, например, СгоЕ1, каркасов на основе липокалина и каркасов на основе бактериальных Ес-рецепторов БрА и БрЭ. Специалистам в данной области техники будет ясно, что этот список не является исчерпывающим.
Е. Каркасы для использования в конструировании лигандов с двойной специфичностью
1. Выбор конформации главной цепи.
Все члены суперсемейства иммуноглобулинов имеют сходную конформацию их полипептидной цепи. Например, несмотря на то что антитела сильно отличаются в отношении их первичной последовательности, сравнением последовательностей и кристаллографических структур было выявлено, что, вопреки ожиданиям, пять из шести антигенсвязывающих петель антител (Н1, Н2, Ь1, Ь2, Ь3) принимают ограниченное число конформации главной цепи или канонических структур (СПоППа и Беек (1987), ί. Мо1. Вю1, 196: 901; СПоПиа е1 а1. (1989), №1иге, 342: 877). Анализ длин петель и ключевых остатков сделал, таким образом, возможным предсказание конформации главной цепи Н1, Н2, Ь1, Ь2 и Ь3, обнаруженных в большинстве человеческих антител (СПоППа е1 а1. (1992), ί. Мо1. Вю1, 227: 799; ТотБпзоп е1 а1. (1995), ЕМВО 1., 14: 4628; ХУППатз е1 а1. (1996), 1. Мо1. Вю1, 264: 220). Несмотря на то что область Н3 намного более разнообразна в отношении последовательности, длины и структуры (ввиду использования Ό-сегментов), она также формирует ограниченное число конформации главной цепи для коротких длин петель, которые зависят от длины и присутствия определенных остатков или типов остатка в ключевых положениях в петле и каркасной области антитела (МаЛп е1 а1. (1996), ί. Мо1. Вю1, 263: 800; БЫгщ е1 а1. (1996), ЕЕВБ Ьейегз, 399: 1).
- 34 020464
Лиганды с двойной специфичностью по настоящему изобретению преимущественно состоят из библиотек доменов, таких как библиотеки доменов Ун и/или библиотеки доменов Уъ. Более того, лиганды с двойной специфичностью по изобретению могут сами по себе быть представлены в форме библиотек. В одном аспекте настоящего изобретения разработаны библиотеки лигандов с двойной специфичностью и/или доменов, в которых длины определенных петель и ключевые остатки были выбраны для подтверждения того, что конформация главной цепи членов известна. Преимущественно они представляют собой реально существующие конформации молекул суперсемейства иммуноглобулинов, обнаруженных в природе, для сведения к минимуму шансов, что они нефункциональны, как обсуждено выше. Сегменты У-генов зародышевого типа служат в качестве одной подходящей основной каркасной области для конструирования библиотек антител или Т-клеточных рецепторов; другие последовательности также применимы. Изменения могут происходить с низкой частотой таким образом, что малое число функциональных членов может обладать измененной конформацией главной цепи, что не влияет на ее функцию.
Теорию канонических структур также применяют для оценки числа различных конформации главной цепи, кодируемых лигандами, для предсказания конформации главной цепи на основании последовательностей лигандов и для выбора остатков для внесения разнообразия, которые не влияют на каноническую структуру. Известно, что в человеческом домене Ук петля Ь1 может принимать одну из четырех канонических структур, петля Ь2 имеет одну каноническую структуру и что 90% человеческих доменов Ук принимают одну из четырех или пяти канонических структур для петли Ь3 (Тотйпкоп е! а1. (1995), кирга); таким образом, в домене Ук самом по себе различные канонические структуры могут сочетаться с образованием ряда различных конформаций главной цепи. При условии, что домен νλ кодирует отличный ряд канонических структур для петель Ь1, Ь2 и Ь3 и что домены Ук и νλ могут образовывать пару с любым доменом Ун, который может кодировать несколько канонических структур для петель Н1 и Н2, число комбинаций канонических структур, наблюдаемых для этих пяти петель, очень велико. Это предполагает, что формирование разнообразия в конформации главной цепи может быть необходимо для получения широкого диапазона специфичностей связывания. Тем не менее, конструированием библиотеки антител, основанной на одной известной конформации главной цепи, было обнаружено, вопреки ожиданиям, что разнообразие в конформации главной цепи не является необходимым для формирования достаточного разнообразия для нацеливания на практически все антигены. Даже более удивительно, нет необходимости, чтобы одна конформация главной цепи представляла собой консенсусную структуру, одна встречающаяся в природе конформация может быть использована в качестве основы для всей библиотеки. Таким образом, в предпочтительном аспекте лиганды с двойной специфичностью по изобретению обладают одной известной конформацией главной цепи.
Одна выбранная конформация главной цепи предпочтительно является обычной среди молекул суперсемейства иммуноглобулинов обсуждаемого типа. Конформация является обычной, если, как наблюдают, значительное число встречающихся в природе молекул принимают ее. Соответственно, в предпочтительном аспекте изобретения по отдельности принимают во внимание распространенность в природе различных конформации главной цепи для каждой связывающей петли домена иммуноглобулина и затем выбирают встречающийся в природе вариабельный домен, обладающий желаемой комбинацией конформации главной цепи для различных петель. Если таковые недоступны, может быть выбран ближайший эквивалент. Предпочтительно, что желаемую комбинацию конформации главной цепи для различных петель создают выбором сегментов генов зародышевого типа, кодирующих желаемые конформации главной цепи. Более предпочтительно, что выбранные сегменты генов зародышевого типа часто экспрессированы в природе, и наиболее предпочтительно, что из всех естественных сегментов генов зародышевого типа они экспрессируются чаще всего.
При разработке лигандов с двойной специфичностью или их библиотек встречаемость различных конформации главной цепи для каждой из шести антигенсвязывающих петель может быть рассмотрена отдельно. Для Н1, Н2, Ь1, Ь2 и Ь3 выбирают заданную конформацию, которую принимают от 20 до 100% антигенсвязывающих петель встречающихся в природе молекул. Типично, наблюдаемая распространённость составляет более 35% (т.е. от 35 до 100%) и, в идеальном случае, более 50% или даже более 65%. Поскольку подавляющее большинство петель н3 не имеет канонических структур, предпочтительно выбрать конформацию главной цепи, являющуюся обычной среди тех петель, в которых представлены канонические структуры. Для каждой из петель, следовательно, выбирают конформацию, наиболее часто наблюдаемую в природном репертуаре. В человеческих антителах наиболее распространенные канонические структуры (С8) для каждой петли представляют собой следующие: Н1 - С8 1 (79% экспрессируемого репертуара), Н2 - С8 3 (46%), Ь1 - С8 2 Ук (39%), Ь2 - С8 1 (100%), Ь3 - С8 1 Ук (36%) (при вычислениях предполагали соотношение к:/_ 70:30, ноой е! а1. (1967), Со1й 8ргш§ нагЬог 8утр. Циап!. Вю1., 48: 133). Для петель н3, имеющих канонические структуры, длина СИК3 (КаЬа! е! а1. (1991), 8е4иепсек оГ рго!ешк оГ 1ттипо1одюа1 ш!егек!, Министерство здравоохранения и социальных услуг США (И8 Иераптеп! оГ неа1!Ь апй нитап 8егуюек)) в семь остатков с ионной связью от остатка 94 к остатку 101, по-видимому, является наиболее распространенной. В библиотеке данных ЕМВЬ имеются последовательности по меньшей мере 16 человеческих антител с длиной н3 и ключевыми остатками, необходи- 35 020464 мыми для формирования этой конформации, и по меньшей мере две кристаллографические структуры в белковой базе данных, которые могут быть использованы в качестве основы для моделирования антител (2сдг и 11е1). Наиболее часто экспрессируемые сегменты генов зародышевого типа, кодирующие эту комбинацию канонических структур, представляют собой сегмент УН 3-23 (ЭР-47), сегмент X Ш4Ъ, сегмент Ук 02/012 (ЭРК9) и X, сегмент XX Сегменты УН ЭР45 и ЭР38 также являются подходящими. Эти сегменты, следовательно, могут быть использованы в комбинации в качестве основы для конструирования библиотеки с желаемой одной конформацией главной цепи.
Альтернативно, вместо выбора одной конформации главной цепи на основании распространенности в природе различных конформации главной цепи отдельно для каждой из связывающих петель, распространенность в природе комбинаций конформации главной цепи используют в качестве основания для выбора одной конформации главной цепи. В случае антител, например, может быть определена распространенность в природе комбинаций канонических структур для любых двух, трех, четырех, пяти или для всех шести из антигенсвязывающих петель. Здесь предпочтительно, что выбранная конформация является обычной для встречающихся в природе антител, и наиболее предпочтительно, что ее наблюдают наиболее часто в природном репертуаре. Таким образом, в человеческих антителах, например, когда рассматривают естественные комбинации пяти антигенсвязывающих петель, Н1, Н2, Ь1, Ь2 и Ь3, определяют наиболее распространенную комбинацию канонических структур и затем комбинируют ее с наиболее распространенной конформацией для петли Н3, как основание для выбора одной конформации главной цепи.
2. Внесение разнообразия в каноническую последовательность.
После выбора нескольких известных конформации главной цепи или предпочтительно одной известной конформации главной цепи, можно конструировать лиганды с двойной специфичностью по изобретению или библиотеки для использования в изобретении изменением связывающей области молекулы с целью создания репертуара со структурным и/или функциональным разнообразием. Это означает, что варианты создают таким образом, что они обладают достаточным разнообразием в их структуре и/или в их функции таким образом, что они способны обеспечить ряд активностей.
Желаемое разнообразие обычно создают изменением выбранной молекулы в одном или более положениях. Положения, подлежащие изменению, могут быть избраны случайно или предпочтительно селектированы. Изменение может в таком случае быть достигнуто или рандомизацией, в течение которой резидентную аминокислоту заменяют любой аминокислотой или ее аналогом, природным или синтетическим, с образованием очень большого числа вариантов, или заменой резидентной аминокислоты одной или более аминокислотой из определенной подгруппы аминокислот с образованием более ограниченного числа вариантов.
Было сообщено о различных способах внесения такого разнообразия. Для введения случайных мутаций в гены, кодирующие молекулу, могут быть применены ошибочно-направленная ПЦР (На\укЙ18 е! а1. (1992), 1. Мо1. Бю1., 226: 889), химический мутагенез (Эеп§ е! а1. (1994), 1. Бю1. СЬет., 269: 9533) или бактериальные мутаторные штаммы (Боте е! а1. (1996), ί. Мо1. Бю1., 260: 359). Способы мутирования выбранных положений также хорошо известны в данной области техники и включают использование некомплементарных олигонуклеотидов или вырожденных олигонуклеотидов с или без применения ПЦР. Например, несколько библиотек синтетических антител были созданы нацеливанием мутаций на антигенсвязывающие петли. Область Н3 человеческого РаЪ, связывающего столбнячный анатоксин, была рандомизирована для создания ряда новых специфичностей связывания (ВагЪа8 е! а1. (1992), Ргос. №Ш. Асаб. 8с1. и§А, 89: 4457). Рандомизированные или полурандомизированные области Н3 и Ь3 были присоединены к сегментам У-генов зародышевого типа для создания обширных библиотек с немутированными каркасными областями (НоодепЪоот & ХУййег (1992), 1. Мо1. Вю1, 227: 381; ВагЪа8 е! а1. (1992), Ргос. Ыа!1. Асаб. δοΐ. Ж 89: 4457; №881т е! а1. (1994), ЕМВ0 1., 13: 692; СпЯйЬв е! а1. (1994), ЕМВ0 1., 13: 3245; Эе КгшГ е! а1. (1995), 1. Мо1. Вю1., 248: 97). Такая диверсификация была расширена для включения некоторых из или всех других антигенсвязывающих петель (Статей е! а1. (1996), Ыа!иге Ме6., 2: 100; ГОесЬтапп е! а1. (1995), Вю/ТесЬпо1о§у, 13: 475; МогрЬо8у8, \У0 97/08320, 8ирга).
Поскольку рандомизация петель имеет потенциал для создания приближенно более чем 1015 структур только для Н3 и похожего большого числа вариантов для других пяти петель, создание библиотеки, отражающей все возможные комбинации, неосуществимо с применением современной технологии трансформации или даже применением бесклеточных систем. Например, в одной из наиболее обширных библиотек, конструированных на настоящий момент, были созданы 6х1010 различных антител, что представляет собой лишь часть возможного разнообразия для библиотеки такого плана (ОпГй!Ь8 е! а1. (1994), 8ирга).
В предпочтительном воплощении разнообразие вносят только в те остатки, которые непосредственно вовлечены в создание или модификацию желаемой функции молекулы. Для многих молекул функцией будет связывание мишени и, следовательно, разнообразие следует концентрировать в области связывания мишени, избегая в то же время изменения остатков, имеющих решающее значение для общей упаковки молекулы или для поддержания выбранной конформации главной цепи.
- 36 020464
Внесение разнообразия в каноническую последовательность в применении к доменам антител
В случае лигандов с двойной специфичностью на основе антител связывающая область для мишени наиболее часто представляет собой антигенсвязывающую область. Таким образом, в особо предпочтительном аспекте согласно изобретению предложены библиотеки лигандов с двойной специфичностью на основе антител или библиотеки для сборки лигандов с двойной специфичностью на основе антител, в которых изменяют только те остатки, которые расположены в антигенсвязывающей области. Эти остатки чрезвычайно разнообразны в репертуаре человеческих антител, и известно, что они образуют контакты в комплексах антитело/антиген высокого разрешения. Например, в Ь2 известно, что положения 50 и 53 различаются во встречающихся в природе антителах, и замечено, что они образуют контакт с антигеном. В отличие от этого, обычным способом было бы внесение разнообразия во все остатки в соответствующем гипервариабельном участке (СЭК1), как определено КаЬа1 е1 а1. (1991, зирга), некоторые семь остатков по сравнению с двумя, в которые вносят разнообразие, в библиотеке для использования по изобретению. Это отражает значимое улучшение в отношении функционального разнообразия, необходимого для создания ряда специфичностей связывания антигена.
В природе разнообразие антител является результатом двух процессов: соматической рекомбинации сегментов генов V, Ό и ί зародышевого типа с образованием интактного первичного репертуара (так называемые гаметное разнообразие и множественность ί-сегментов) и соматической сверхмутации полученных перестроенных ν-генов. Анализ последовательностей человеческих антител показал, что разнообразие в первичном репертуаре сфокусировано в центре антигенсвязывающей области, в то время как соматическая сверхмутация распространяет разнообразие на области на периферии антигенсвязывающей области, высококонсервативной в первичном репертуаре (см. ТотНпзоп е1 а1. (1996), ί. Мо1. Вю1., 256: 813). Эта комплементарность, возможно, эволюционировала как эффективная стратегия поиска пространства последовательностей, и, хотя, вероятно, она присуща только антителам, она может легко быть применена к другим полипептидным репертуарам. Изменяемые остатки представляют собой подгруппу остатков, формирующих область связывания для мишени. В различные (включая перекрывающиеся) подгруппы остатков в области связывания мишени разнообразие вносят на различных стадиях в течение селекции, если желательно.
В случае репертуара антител создают начальный интактный репертуар, где в некоторые, но не во все, остатки в антигенсвязывающей области внесено разнообразие. При использовании здесь в данном контексте термин интактный относится к молекулам антител, не имеющим предопределенной мишени. Эти молекулы имеют сходство с молекулами, кодируемыми генами иммуноглобулинов индивида, не прошедшего иммунную диверсификацию, как в случае с плодами и новорожденными индивидами, иммунная система которых не была еще представлена широкому спектру антигенных стимулов. Этот репертуар затем подвергают селекции против ряда антигенов или эпитопов. Если необходимо, дополнительное разнообразие может затем быть внесено вне области, в которую внесено разнообразие в начальном репертуаре. Этот зрелый репертуар может быть подвергнут селекции для модифицированной функции, специфичности или аффинности.
Согласно изобретению предложены два различных интактных репертуара связывающих доменов для конструирования лигандов с двойной специфичностью, в которых изменены некоторые или все остатки антигенсвязывающей области. Первичная библиотека имитирует естественный первичный репертуар с разнообразием, ограниченным остатками в центре антигенсвязывающей области, различающимися в сегментах ν-генов зародышевого типа (гаметное разнообразие) или диверсифицированными в течение процесса рекомбинации (множественность ί-сегментов). Остатки, в которые внесено разнообразие, включают, предпочтительно без ограничения, Н50, Н52, Н52а, Н53, Н55, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97, Н98, Ь50, Ь53, Ь91, Ь92, Ь93, Ь94 и Ь96. В соматической библиотеке разнообразие ограничено остатками, в которые внесено разнообразие в течение процесса рекомбинации (множественностью ίсегментов), или сильно мутированными соматически. Остатки, в которые внесено разнообразие, включают, предпочтительно без ограничения, Н31, Н33, Н35, Н95, Н96, Н97, Н98, Ь30, Ь31, Ь32, Ь34 и Ь96. Известно, что все остатки, перечисленные выше как подходящие для внесения разнообразия в этих библиотеках, образуют контакты в одном или более комплексе антитело-антиген. Поскольку в обеих библиотеках изменены не все из остатков антигенсвязывающей области, дополнительное разнообразие вносят в течение селекции изменением остальных остатков, если желательно так сделать. Специалисту в данной области техники будет ясно, что любая подгруппа любых из этих остатков (или дополнительных остатков, которые содержит антигенсвязывающий сайт) может быть использована для начального и/или последующего внесения разнообразия в антигенсвязывающую область.
В конструировании библиотек для использования в изобретении внесение разнообразия в выбранные положения обычно осуществляют на уровне нуклеиновой кислоты изменением кодирующей последовательности, задающей последовательность полипептида, таким образом, что несколько возможных аминокислот (все 20 или их подгруппа) могут быть введены в это положение. С применением номенклатуры Международного союза теоретической и прикладной химии (ЮТАС) наиболее изменчивый кодон представляет собой ΝΝΚ, кодирующий все аминокислоты, также как стоп-кодон ТАС. Кодон ΝΝΚ
- 37 020464 предпочтительно используют с целью внесения необходимого разнообразия. Другие кодоны, которыми достигают такой же цели, также полезны, включая кодон МИК, приводящий к образованию дополнительных стоп-кодонов ТОЛ и ТАА.
Свойство разнообразия боковых цепей в антигенсвязывающей области человеческих антител представляет собой резко выраженную склонность, благоприятствующую определенным аминокислотным остаткам. Если суммировать аминокислотный состав десяти наиболее разнообразных положений в каждой из областей νΗ, νκ и νλ, более чем 76% разнообразия боковых цепей исходит от всего семи различных остатков, представляющих собой серин (24%), тирозин (14%), аспарагин (11%), глицин (9%), аланин (7%), аспартат (6%) и треонин (6%). Эта склонность к гидрофильным остаткам и малым остаткам, которые могут обеспечить гибкость главной цепи, возможно, отражает эволюцию поверхностей, предрасположенных к связыванию широкого спектра антигенов или эпитопов, и может помочь в объяснении обязательной разнородности антител первичного репертуара.
Поскольку предпочтительно имитировать это распределение аминокислот, распределение аминокислот в положениях, подлежащих изменению, предпочтительно имитирует наблюдаемое в антигенсвязывающей области антител. Такая склонность при замещении аминокислот, допускающая селекцию определенных полипептидов (не только полипептидов антител) против ряда антигенов-мишеней, легко применима к любому полипептидному репертуару. Существуют множество способов изменения распределения аминокислот в положении, подлежащем изменению (включая применение тринуклеотидного мутагенеза, см. \УО 97/08320), из которых предпочтительным способом, ввиду простоты синтеза, является применение обычных вырожденных кодонов. Сравнением аминокислотного профиля, кодируемого всеми комбинациями вырожденных кодонов (с первичной, вторичной, третичной и четвертичной вырожденностью в равных отношениях в каждом положении), с использованием природных аминокислот можно вычислить наиболее репрезентативный кодон. Кодоны (АОТ)(АОС)Т, (АОТ)(АОС)С и (АОТ)(АОС)(СТ), т.е. ЭУТ. ОУС и ΌνΥ соответственно, с применением номенклатуры ГОРАС, являются ближайшими к желаемому аминокислотному профилю: они кодируют 22% серина и 11% тирозина, аспарагина, глицина, аланина, аспартата, треонина и цистеина. Таким образом, предпочтительно библиотеки конструируют с использованием любого из кодонов ΌνΓ, ^VС или ΌνΥ в каждом из положений, в которых вносят разнообразие.
Ж. Антигены, способные увеличивать период полувыведения лиганда
Лиганды с двойной специфичностью по изобретению, в одной его форме, способны связывать одну или более молекулы, которые могут увеличивать период полувыведения лиганда ίη νίνο. Обычно такие молекулы представляют собой полипептиды, встречающиеся в природе ίη νίνο и препятствующие деградации или удалению эндогенными механизмами, удаляющими нежелательные вещества из организма. Например, молекула, увеличивающая период полувыведения в организме, может быть выбрана из следующего.
Белки внеклеточного матрикса; например, коллагены, ламинины, интегрины и фибронектин. Коллагены являются основными белками внеклеточного матрикса. В настоящее время известно около 15 типов молекул коллагена, обнаруженных в различных частях организма, например, коллаген I типа (составляющий 90% коллагена в организме), обнаруженный в кости, коже, сухожилии, связках, роговице, внутренних органах, или коллаген II типа, обнаруженный в хряще, межпозвоночном диске, хорде и стекловидном теле глаза.
Белки, обнаруженные в крови, включая белки плазмы, такие как фибрин, α-2-макроглобулин, сывороточный альбумин, фибриноген А, фибриноген В, сывороточный амилоидный белок А, гаптоглобин, профилин, убиквитин, утероглобулин и β-2-микроглобулин.
Ферменты и ингибиторы, такие как плазминоген, лизоцим, цистатин С, альфа-1-антитрипсин и ингибитор трипсина поджелудочной железы. Плазминоген является неактивным предшественником трипсиноподобной сериновой протеазы плазмина. В норме его обнаруживают циркулирующим в кровотоке. При активации плазминогена и превращении его в плазмин происходит развертывание мощного ферментативного домена, растворяющего нити фибриногена, удерживающие клетки крови в кровяном сгустке. Это называют фибринолизом.
Белки иммунной системы, такие как 1дЕ, 1дО, 1дМ.
Транспортные белки, такие как ретинолсвязывающий белок, α-1-микроглобулин.
Дефензины, такие как бета-дефензин-1, нейтрофильные дефензины-1, -2 и -3.
Белки, обнаруженные в гематоэнцефалическом барьере или в нервных тканях, такие как рецептор меланокортина, миелин, переносчик аскорбата.
Специфичные в отношении рецептора трансферина слитые белки лиганда-нейрофармацевтического агента (см. И8 5977307).
Рецептор эндотелиальных клеток капилляров головного мозга, трансферрин, рецептор трансферрина, инсулин, рецептор инсулиноподобного фактора роста-1 (1ОР-1), рецептор инсулиноподобного фактора роста-2 (1ОР-2), рецептор инсулина.
Белки, локализованные в почке, такие как полицистин, коллаген ΐν типа, переносчик органических
- 38 020464 анионов Κ1, антиген Хеймана.
Белки, локализованные в печени, например алкогольдегидрогеназа, 0250.
X Фактор свертывания крови. α 1 - Антитрипсин.
Ядерный фактор гепатоцитов-Ш (НМЕ-Ш).
Белки, локализованные в легком, такие как секреторный компонент (связывает 1дА).
Белки, локализованные в сердце, например Н8Р27. Он ассоциирован с дилатационной кардиомиопатией.
Белки, локализованные в коже, например кератин.
Белки, специфичные для костей, такие как морфогенетические белки кости (ВМР), представляющие собой подгруппу суперсемейства трансформирующего фактора роста-β, демонстрирующие остеогенную активность. Примеры включают ВМР-2, -4, -5, -6, -7 (также называемый остеогенным белком-1 (ОР-1)) и -8 (ОР-2).
Белки, специфичные для опухолей, включая человеческий антиген трофобласта, рецептор герцептина, рецептор эстрогенов, катепсины, например катепсин В (обнаруженный в печени и селезенке).
Белки, специфичные для заболеваний, такие как антигены, экспрессируемые только на активированных Т-клетках, включая ЬА0-3 (ген активации лимфоцитов), лиганд остеопротегерина (ОРОЬ) см. №Циге 402, 304-309; 1999, ОХ40 (член семейства рецептора ΤΝΡ, экспрессируемый на активированных Т-клетках и являющийся единственной известной костимуляторной Т-клеточной молекулой, специфично активируемый в клетках, продуцирующих вирус Т-клеточного лейкоза взрослых типа 1 (НГЕУ-1)). См. Iттиηο1. 165 (1):263-70. Металлопротеиназы (ассоциированные с артритом/злокачественным новообразованиями), включая С06512 дрозофилы, человеческий параплегии, человеческий ΡΐδΚ человеческий ΛΡ03Ε2, мышиный йьН; и ангиогенные факторы роста, включая кислый фактор роста фибробластов (Ρ0Ρ-1), основный фактор роста фибробластов (Ρ0Ρ-2), сосудистый эндотелиальный фактор роста/фактор сосудистой проницаемости (νΕΟΡ/νΡΡ), трансформирующий фактор роста-α (Τ0Ρ-α), фактор некроза опухоли-альфа (ΤΝΡ-α), ангиогенин, интерлейкин-3 (1Ь-3), интерлейкин-8 (1Ь-8), тромбоцитарный фактор роста эндотелия (ΡΩ-ΕΟΟΡ), плацентарный фактор роста (ΡΙ0Ρ), мидкайн, тромбоцитарный фактор роста-ВВ (ΡΌ0Ρ), фракталкин.
Белки стрессов (белки теплового шока). Белки теплового шока (Н8Р) обычно обнаруживают внутриклеточно. Если их обнаруживают внеклеточно, это является индикатором того, что клетка погибла или потеряла свое содержимое. Эта незапрограммированная гибель клетки (некроз) происходит только в результате травмы, заболевания или повреждения, и, таким образом, ίη νίνο внеклеточные Н8Р запускают ответ со стороны иммунной системы, который будет бороться с инфекцией и заболеванием. Лиганд с двойной специфичностью, связывающий внеклеточные Н8Р, может быть локализован в месте заболевания.
Белки, вовлеченные в Ρс-транспорт.
Рецептор Брамбелла (ВгатЬе11) (также известный как ΡсВΒ).
Этот Ρс-рецептор имеет две функции, обе из которых потенциально применимы для доставки.
Функции представляют собой:
(1) транспорт 1д0 от матери к плоду через плаценту;
(2) защиту 1д0 от деградации, тем самым продление периода полувыведения 1д0 из сыворотки. Полагают, что рецептор рециклирует 1д0 из эндосом.
См. щи^ет е1 а1., ΝηΙ ВЩесЬш^ 1997, ίιι1; 15(7):632-6.
Лиганды по изобретению могут быть разработаны специфичными в отношении вышеуказанных мишеней без необходимости какого-либо увеличения периода полувыведения ίη νίνο. Например, лиганды по изобретению могут быть специфичны в отношении мишеней, выбранных из описанных выше, являющихся тканеспецифичными, делая таким образом возможным тканеспецифичное направленное воздействие лиганда с двойной специфичностью или мономера 1АЬ, связывающего ткенеспецифичную терапевтически значимую мишень, независимо от какого-либо увеличения периода полувыведения, хотя это может быть результатом. Боле того, там, где лиганд или мономер 1АЬ оказывает направленное воздействие на почку или печень, это может перенаправлять лиганд или мономер 1АЬ на альтернативный путь клиренса ίη νίνο (например, лиганд может быть переправлен с печеночного клиренса на почечный клиренс).
Как описано выше, лиганды, описанные здесь, содержащие отдельный вариабельный домен, как определено здесь, могут быть выбраны специфичными в отношении мишени и предпочтительно могут иметь дополнительное свойство увеличения периода полувыведения мишени ίη νίνο, хотя это не является необходимым. Лиганд с двойной специфичностью может состоять из отдельного вариабельного домена тяжелой цепи антитела, имеющего специфичность связывания в отношении первого эпитопа или антигена, и также из отдельного вариабельного домена легкой цепи антитела, имеющего специфичность связывания в отношении второго эпитопа или антигена, где один или оба антигена могут представлять собой сывороточный альбумин, или один или оба эпитопа представляют собой эпитоп (эпитопы) сыво- 39 020464 роточного альбумина. В одном воплощении оба эпитопа сывороточного альбумина являются одинаковыми, в другом воплощении эпитопы сывороточного альбумина являются разными.
В дополнение к тем лигандам с двойной специфичностью, которые имеют свойство увеличения периода полувыведения мишени ίη νίνο, здесь описаны другие структурные формы лигандов, имеющие или состоящие по меньшей мере из одного отдельного вариабельного домена, как определено здесь, имеющего свойство увеличения периода полувыведения лиганда, связывающего мишень, ίη νίνο, например, связыванием сывороточного альбумина. Например, лиганд может состоять из или содержать мономер отдельного вариабельного домена, как определено здесь, связывающий сывороточный альбумин; или лиганд может быть в форме, содержащей несколько отдельных вариабельных доменов, как определено здесь, т.е. мультимера, где один или более из отдельных вариабельных доменов связывает сывороточный альбумин. Как мультимер, так и мономер, могут содержать другие объекты в дополнение к одному или более отдельному вариабельному домену (доменам), связывающим сывороточный альбумин, например, в форме слитого белка и/или конъюгата. Такой слитый белок предпочтительно представляет собой одну полипептидную цепь и может содержать, например, два или более связанных отдельных вариабельных домена, как определено здесь; связанные отдельные вариабельные домены могут быть идентичными друг другу или могут отличаться друг от друга. Такие объекты включают, например, один или более дополнительные вариабельные домены, как определено здесь, имеющие специфичность в отношении антигена или эпитопа, отличного от сывороточного альбумина, и/или одно или более лекарственные средства, и/или один или более домены, связывающие мишень, имеющие специфичность связывания в отношении антигена или эпитопа, отличного от сывороточного альбумина, и не являющиеся отдельными вариабельными доменами, как определено здесь. Такой мультимер может иметь несколько валентностей в соответствии с его отдельным вариабельным доменом (доменами), например моновалентным, дивалентным, тривалентным, тетравалентным. Такой мультимер может иметь форму структуры 1§О или лиганда с двойной специфичностью, как определено здесь, а также других структур, таких как 1дМ, 1дЕ, 1цГ) или 1дА, и/или их фрагментов, включая, без ограничения, такие фрагменты, как фрагменты δοΕν, ЕаЬ, ЕаЬ' и т.п. Лиганд может быть модифицирован, чтобы содержать дополнительные группировки, как, например, слитый белок или конъюгат.
Отдельный вариабельный домен тяжелой цепи антитела лиганда с двойной специфичностью или мономерного лиганда, или мультимерного лиганда, как описано здесь, может специфично связывать сывороточный альбумин и содержать аминокислотную последовательность отдельного вариабельного домена тяжелой цепи антитела. Такой отдельный вариабельный домен тяжелой цепи антитела может быть выбран, предпочтительно без ограничения, из одного из следующих доменов:
с1АЬ7г20, 0АЬ7г21, с1АЬ7г22, с!АЬ7г23, с1АЬ7г24, 0АЬ7г25, 0АЬ7г26, 0АЬ7г27, с!АЬ7г28, с1АЬ7г29, 0АЬ7гЗО, с1АЬ7г31, с!АЬ7г32, бАЬ7гЗЗ, с!АЬ7Ь21, 0АЬ7Ь22, с1АЬ7Ь23, АЬ7И24, АЬ7Ь25, АЬ7И26, с1АЬ7Ь27, 6АЬ7ИЗО и с1АЬ7Ь31, или домена с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 80% идентичной им, до 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% включительно идентичной им, и специфично связывающего сывороточный альбумин. Альтернативно, лиганд содержит отдельный вариабельный домен антитела, предпочтительно отдельный вариабельный домен тяжелой цепи антитела, конкурирующий за связывание сывороточного альбумина с одним из следующих доменов:
с!АЬ7г20, с!АЬ7г21, 0АЬ7г22, 0АЬ7г23, с!АЬ7г24, άΑ67Γ25, с1АЬ7г26, с1АЬ7г27, бАЬ7г28, с!АЬ7г29, с1АЬ7гЗО, бАЬ7г31, с!АЬ7г32, 0АЬ7гЗЗ, с1АЬ7Ь21, с1АЬ7Ь22, с1АЬ7Ь23, АЬ7М24, АЬ7Ь25, АЬ7К2б, 6АЬ7Ь27, 6АЬ7ЬЗО 6АЬ7К31, 0АЬ7т12, с1АЬ7т16, с!АЬ7т26, с1АЬ7г1, <±АЬ7гЗ, 0АЬ7г4, 0АЬ7г5, 0АЬ7г7, с!АЬ7г8,
0АЬ7г13, 0АЬ7г14, дАЬ7г15, 0АЬ7г16, 0АЬ7г17, с!АЬ7г18, άΑ67ιΊ9, 6АЬ7М,
0АЬ7Ь2, с1АЬ7Ь6, дАЬ7Н7, 0АЬ7К8, с!АЬ7Ь9, дАЬ7М0, с!АЬ7М 1, с!АЬ7М2, с1АЬ7МЗ, с1АЬ7М14, с!АЬ7р1 и с1АЬ7р2, или домена, имеющего аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную им, до 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% включительно идентичную им, и специфично связывающего сывороточный альбумин. Альтернативно, лиганд содержит, в дополнение к отдельному вариабельному домену тяжелой цепи антитела, отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела, который может специфично связывать сывороточный альбумин и содержать аминокислотную последовательность отдельного вариабельного домена легкой цепи антитела. Такой отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела может быть выбран, предпочтительно без ограничения, из одного из следующих доменов:
0АЬ7т12, 0АЬ7т16, 0АЬ7т26, 0АЬ7г1, 0АЬ7гЗ, бАЬ7г4, бАЬ7г5, <ЗАЬ7г7, <1АЬ7г8,
0АЬ7г13, 0АЬ7г14, 0АЬ7г15, с!АЪ7г16, 0АЬ7г17, дАЬ7г18, аАЬ7г19, 0АЬ7М, с)АЬ7Н2,
0АЬ7Ь6, 6АЬ7И7, 0АЬ7Ь8, 0АЬ7Ь9, 0АЬ7М0, с1АЬ7М1, с!АЬ7М2, с1АЬ7МЗ, с1АЬ7М4, с1АЬ7р1 и 0АЬ7р2, или домена с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 80% идентичной им, до 85, 90,
- 40 020464
95, 96, 97, 98, 99% включительно идентичной им, и специфично связывающего сывороточный альбумин. Альтернативно, лиганд содержит отдельный вариабельный домен антитела, предпочтительно отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела, конкурирующий за связывание сывороточного альбумина с доменом, который может быть выбран, предпочтительно без ограничения, из одного из следующих доменов:
с1АЬ7г20, с!АЬ7г21, с1АЬ7г22, бАЬ7г23, 0АЬ7г24, 0АЬ7г25, 0АЬ7г26, 0АЬ7г27,
0АЬ7г28, с!АЬ7г29, с1АЬ7гЗО, 0АЬ7г31, с!АЬ7г32, с!АЬ7гЗЗ, 6АЬ7Н21, с1АЬ7К22,
0АЬ7Ь23, АЬ7Ь24, АЬ7К25, АЬ7Ь26, 0АЬ7Ь27, дАЬ7Ь30 с1АЬ7Н31, 0АЬ7т12,
0АЬ7т16, с!АЬ7пл26, 0АЬ7г1, 0АЬ7гЗ, с!АЬ7г4, 0АЬ7г5, с!АЬ7г7, дАЬ7г8, 0АЬ7г13, с!АЬ7г14, с!АЬ7г15, 0АЬ7г16, 0АЬ7г17, 0АЬ7г18, с1АЬ7г19, с!АЬ7М, 0АЬ7Ь2, άΑ67ή6, дАЬ7Ь7, с!АЬ7Ь8, 0АЬ7Ь9, с!АЬ7М0, (1АЬ7М1, дАЬ7М2, 0АЬ7Н13, 0АЬ7М4, с!АЬ7р1 и с!АЬ7р2, или домена, имеющего аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную им, до 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% включительно идентичную им, и имеющего специфичность связывания в отношении сывороточного альбумина. В одном воплощении лиганд может представлять собой иммуноглобулин 1дО, имеющий любую комбинацию из одного или двух лигандов с двойной специфичностью, приведенных выше. В одном воплощении лиганд может содержать один или более мономеры отдельных вариабельных доменов, перечисленных выше, где, если лиганд содержит более чем один из этих отдельных вариабельных доменов, отдельные вариабельные домены могут быть идентичны друг другу или не идентичны друг другу.
В одном воплощении лиганд может представлять собой лиганд с двойной специфичностью, имеющий первый отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, имеющий первую специфичность связывания антигена или эпитопа, и второй отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, имеющий вторую специфичность связывания антигена или эпитопа, где первый и второй отдельные вариабельные домены иммуноглобулина представляют собой отдельные вариабельные домены тяжелой цепи антитела и где один или оба из первого и второго отдельных вариабельных доменов тяжелой цепи антитела специфично связывают сывороточный альбумин и имеют аминокислотную последовательность отдельного вариабельного домена тяжелой цепи антитела, который может быть выбран, предпочтительно без ограничения, из одного из следующих отдельных вариабельных доменов тяжелой цепи антитела:
0АЬ7г20, 0АЬ7г21, 0АЬ7г22, 0АЬ7г23, 0АЬ7г24, с!АЬ7г25, 0АЬ7г26, 0АЬ7г27, с!АЬ7г28, 0АЬ7г29, с!АЬ7гЗО, с1АЬ7г31, 0АЬ7г32, 0АЬ7гЗЗ, с1АЬ7Ь21, с!АЬ7Ь22,
0АЬ7Ь23, АЬ7Ь24, АЬ7Ь25, АЬ7Ь26, 0АЬ7Ь27, 6АЬ7ЬЗО и с!АЬ7Ь31, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную им, до 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% включительно идентичную им. Одно воплощение такого лиганда представляет собой лиганд с двойной специфичностью, имеющий первый отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, имеющий первую специфичность связывания антигена или эпитопа, и второй отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, имеющий вторую специфичность связывания антигена или эпитопа, где первый и второй отдельные вариабельные домены иммуноглобулина представляют собой отдельные вариабельные домены тяжелой цепи антитела и где один или оба из первого и второго отдельных вариабельных доменов тяжелой цепи антитела специфично связывают сывороточный альбумин и конкурируют за связывание сывороточного альбумина с отдельным вариабельным доменом, имеющим аминокислотную последовательность отдельного вариабельного домена антитела, который может быть выбран, предпочтительно без ограничения, из одного из следующих отдельных вариабельных доменов антитела:
с!АЬ7г20, 0АЬ7г21, с1АЬ7г22, бАЬ7г23, с!АЬ7г24, с1АЬ7г25, бАЬ7г26, с!АЬ7г27,
0АЬ7г28, с!АЬ7г29, бАЬ7гЗО, 0АЬ7г31, 0АЬ7г32, аАЬ7гЗЗ, с1АЬ7Ь21, с!АЬ7Ь22, с!АЬ7Ь23, АЬ7К24, АЬ7М25, АЬ7И26, 0АЬ7К27, дАЬ7пЗО 0АЬ7Ь31, с!АЬ7т12,
0АЬ7т16, бАЬ7т26, с!АЬ7г1, с1АЬ7гЗ, с!АЬ7г4, 0АЬ7г5, с1АЬ7г7, с!АЬ7г8, с!АЬ7г13, с1АЬ7г14, с1АЬ7г15, йАЬ7г16, 0АЬ7г17, с1АЬ7г18, 0АЬ7г19, 0АЬ7Ы, 0АЬ7Н2, 0АЬ7Ь6, с!АЬ7Ь7, с!АЬ7К8, с1АЬ7Ь9, 0АЬ7К10, аАЬ7М1, 0АЬ7М2, 0АЬ7Ь13, 0АЬ7Ы4,
0АЬ7р1 и с1АЬ7р2, или последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную им или до 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% включительно идентичную им. В одном воплощении лиганд может представлять собой иммуноглобулин 1дО, имеющий любую комбинацию из одного или двух лигандов с двойной специфичностью, приведенных выше. В одном воплощении лиганд может содержать один или более мономеры отдельных вариабельных доменов, перечисленных выше, где, если лиганд содержит более чем один из этих отдельных вариабельных доменов, отдельные вариабельные домены могут быть идентичны друг другу или не идентичны друг другу.
В одном воплощении лиганд с двойной специфичностью имеет первый отдельный вариабельный
- 41 020464 домен иммуноглобулина, имеющий первую специфичность связывания антигена или эпитопа, и второй отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, имеющий вторую специфичность связывания антигена или эпитопа, где первый и второй отдельные вариабельные домены иммуноглобулина представляют собой отдельные вариабельные домены легкой цепи антитела и один или оба из первого и второго отдельных вариабельных доменов легкой цепи антитела специфично связывают сывороточный альбумин и имеют аминокислотную последовательность отдельного вариабельного легкой тяжелой цепи антитела, который может быть выбран, предпочтительно без ограничения, из одного из следующих отдельных вариабельных доменов легкой цепи антитела:
0АЬ7т12, 0АЬ7т16, с!АЬ7т26, с!АЬ7г1, с!АЬ7гЗ, 0АЬ7г4, с!АЬ7г5, с!АЬ7г7, 0АЬ7г8,
0АЬ7г13, с1АЬ7г14, с!АЬ7г15, 0АЬ7г16, 0АЬ7г17, 0АЬ7г18, 0АЬ7г19, с1АЬ7М, бАЬ7п2,
0АЬ7К6, с1АЬ7Н7, с!АЬ7п8, 0АЬ7К9, с!АЬ7М0, <1АЬ7М1, с1АЬ7М2, с!АЬ7МЗ, с!АЬ7М4, с1АЬ7р1 и с!АЬ7р2, или последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную им или до 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% включительно идентичную им.
В одном воплощении лиганд может представлять собой лиганд с двойной специфичностью, имеющий первый отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, имеющий первую специфичность связывания антигена или эпитопа, и второй отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, имеющий вторую специфичность связывания антигена или эпитопа, где первый и второй отдельные вариабельные домены иммуноглобулина представляют собой отдельные вариабельные домены легкой цепи антитела и один или оба из первого и второго отдельных вариабельных доменов легкой цепи антитела специфично связывают сывороточный альбумин и конкурируют за связывание сывороточного альбумина с отдельным вариабельным доменом легкой цепи антитела, имеющим аминокислотную последовательность отдельного вариабельного домена антитела, который может быть выбран, предпочтительно без ограничения, из одного из следующих отдельных вариабельных доменов антитела:
с!АЬ7г20, с!АЬ7г21, с!АЬ7г22, 0АЬ7г23, с!АЬ7г24, с!АЬ7г25, с!АЬ7г26, с!АЬ7г27, с!АЬ7г28, <ЗАЬ7г29, с!АЬ7гЗО, бАЬ7г31, с!АЬ7г32, с!АЬ7гЗЗ, с1АЬ7п21, с1АЬ7Ь22, с!АЬ7М23, АЬ7Н24, АЬ7М25, АЬ7К26, с!АЬ7п27, с1АЬ7И30 с!АЬ71э31, 0АЬ7т12, с!АЬ7т16, с!АЬ7т26, 0АЬ7г1, с1АЬ7гЗ, бАЬ7г4, 0АЬ7г5, с1АЬ7г7, бАЬ7г8, 0АЬ7г13,
0АЬ7г14, с!АЬ7г15, с!АЬ7г16, 0АЬ7г17, 0АЬ7г18,0АЬ7г19, с!АЬ7М, с!АЬ7Ь2, 0АЬ7М6,
0АЬ7Н7, 6АЬ7Н8, с1АЬ7Ь9, 6АЬ7МО, 6АЬ7М1, 0АЬ7М2, 0АЬ7МЗ, дАЬ7М4,
0АЬ7р1 и с!АЬ7р2, или последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную им или до 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% включительно идентичную им.
Здесь описан лиганд, имеющий один или более отдельный вариабельный домен тяжелой цепи антитела, где один или более отдельный вариабельный домен тяжелой цепи антитела специфично связывает сывороточный альбумин и имеет аминокислотную последовательность отдельного вариабельного легкой тяжелой цепи антитела, выбранную, предпочтительно без ограничения, из последовательностей:
<ЗАЬ8, 0АЫ0, с!АЬ36, с!АЬ7г20, бАЬ7г21, бАЬ7г22, бАЬ7г23, 0АЬ7г24,
0АЬ7г25, 0АЬ7г26, 0АЬ7г27, 0АЬ7г28, 0АЬ7г29, с1АЬ7гЗО, с1АЬ7г31, 0АЬ7г32, с!АЬ7гЗЗ, 0АЬ7М21, с!АЬ7М22, 0АЬ7К23, АЬ7й24, АЬ7Ь25, АЬ7Ь26, 6АЬ7Ь27,
0АЬ7Ь30, 0АЬ7Н31 и последовательности, по меньшей мере на 80% идентичной им или до 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% включительно идентичной им.
Здесь описан лиганд, имеющий один или более отдельный вариабельный домен тяжелой цепи антитела, где один или более отдельный вариабельный домен тяжелой цепи антитела специфично связывает сывороточный альбумин и конкурирует за связывание сывороточного альбумина с отдельным вариабельным доменом антитела, имеющим аминокислотную последовательность отдельного вариабельного домена антитела, выбранную, предпочтительно без ограничения, из последовательностей одного из следующих:
- 42 020464
6АЬ8, С1АЫ0, бАЬЗб, бАЬ7г20, с1АЬ7г21, 0АЬ7г22, 0АЬ7г23, 0АЬ7г24, 0АЬ7г25,
0АЬ7г26, дАЬ7г27, 0АЬ7г28, с1АЬ7г29, 0АЬ7гЗО, бАЬ7г31, 0АЬ7г32, 0АЬ7гЗЗ,
6АЬ7К21, 6АЬ7Ь22, с1АЬ7К23, АЬ7И24, АЬ7Н25, АЬ7М26, с!АЬ7И27, 0АЬ7И30,
0АЬ7Ь31, с!АЬ2, с!АЬ4, 0АЬ7, с1АЫ1, 0АЫ2, 6АЫЗ, 6АЫ5, с!АЫ6, 6АЫ7, 0АЫ8,
6АЫ9, с!АЬ21, 0АЬ22, с!АЬ23, 6АЬ24, с1АЬ25, дАЬ26, 6АЬ27, с1АЬ30, с1АЬ31, ЦАЬЗЗ, с1АЬ34, с!АЬ35, с!АЬ38, с1АЬ41, с!АЬ46, 0АЬ47, 0АЬ52, 6АЬ53, 6АЬ54, 6АЬ55,
6АЬ56, 0АЬ7т12, 0АЬ7т16, 0АЬ7т26, 0АЬ7г1, с1АЬ7гЗ, с1АЬ7г4, 0АЬ7г5, <ЗАЬ7г7, с1АЬ7г8, 0АЬ7г13, с!АЬ7г14, 0АЬ7г15, бАЬ7г16, 0АЬ7г17, 0АЬ7г18,
0АЬ7г19, 6АЬ7М, 6АЬ7Ь2, 6АЬ7Ь6, 6АЬ7Ь7, 0АЬ7К8, с!АЬ7К9, с1АЬ7М0, с1АЬ7Ы1,
0АЬ7К12, с1АЬ7ЫЗ, 0АЬ7И14, 0АЬ7р1 и с!АЬ7р2.
Здесь описан лиганд, имеющий отдельный вариабельный домен тяжелой цепи антитела, имеющий специфичность связывания в отношении первого антигена или его эпитопа, и отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела, имеющий специфичность связывания в отношении второго антигена или его эпитопа, где один или оба из первого антигена и указанного второго антигена представляют собой сывороточный альбумин и где отдельный вариабельный домен тяжелой цепи антитела специфично связывает сывороточный альбумин и конкурирует за связывание сывороточного альбумина с отдельным вариабельным доменом антитела, имеющим аминокислотную последовательность отдельного вариабельного домена антитела, выбранного, предпочтительно без ограничения, из группы:
с!АЬ8, 6АЫ0, с!АЬ36, с1АЬ7г20, с1АЬ7г21, с1АЬ7г22, 0АЬ7г23, с1АЬ7г24, дАЬ7г25, с!АЬ7г26, 0АЬ7г27, с1АЬ7г28, с1АЬ7г29, с1АЬ7гЗО, с1АЬ7г31, с!АЬ7г32, с!АЬ7гЗЗ, с1АЬ7Ь21, 0АЬ7Ь22, 0АЬ7Ь23, АЬ7Ь24, АЬ7Ь25, АЬ7Р26, 6АЬ7Ь27, 0АЬ7Ь30,
0АЬ7К31, с!АЬ2,0АЬ4, дАЬ7, с1АЫ1, 0АЫ2, 6АЫЗ, с!АЫ5, с!АЫ6, с1АЫ7, с!АЫ8, άΑΜ9, с1АЬ21, с!АЬ22, с1АЬ23, с!АЬ24, с1АЬ25, с1АЬ26, с1АЬ27, с1АЬ30, с1АЬ31, с!АЬЗЗ, с1АЬ34, с!АЬ35, с!АЬ38, с!АЬ41, 0АЬ46, е)АЪ47, с!АЬ52, с!АЬ53, 0АЬ54, с!АЬ55, с!АЬ56, с1АЬ7т12, с1АЬ7т16, с!АЬ7т26, с1АЬ7г1, 0АЬ7гЗ, бАЬ7г4, 0АЬ7г5, с!АЬ7г7,
0АЬ7г8, 0АЬ7г13, 0АЬ7г14, 0АЬ7г15, 0АЬ7г16, е)АЬ7г17, с1АЬ7г18, с1АЬ7г19, 0АЬ7Ь1,
6АЬ7Ь2, аАЬ7К6, 6АЬ7Ь7, дАЬ7Н8, дАЬ7Н9, с1АЬ7М0, с!АЬ7М 1, 0АЬ7К12,
0АЬ7К13, с!АЬ7М4, с1АЬ7р1, 0АЬ7р2, и где отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела специфично связывает сывороточный альбумин и имеет аминокислотную последовательность отдельного вариабельного домена легкой цепи антитела, выбранную, предпочтительно без ограничения, из последовательностей следующего:
с1АЬ2, с!АЬ4, с1АЬ7, <1АМ1,с1АМ2, 0АЫЗ, 6АЫ5, 6АМ6, 6АЫ7,6АЫ8, 6АЫ9, с!АЬ21, с!АЬ22, 0АЬ23, 0АЬ24, 0АЬ25, с1АЬ26, с1АЬ27, дАЬЗО, дАЬ31, бАЬЗЗ, 6АЬ34,
6АЬ35, аАЬ38, 6АЬ41, с!АЬ46, 6АЬ47, с1АЬ52, бАЬбЗ, с1АЬ54, 6АЬ55, с1АЬ56, с!гс1АЬ7т12, с1АЬ7т16, 0АЬ7т26, с1АЬ7г1, 0АЬ7гЗ, дАЬ7г4, с!АЬ7г5, 0АЬ7г7,с!АЬ7г8, с1АЬ7г13, с1АЬ7г14, с1АЬ7г15, аАЬ7г16, аАЬ7г17, бАЬ7г18, с!АЬ7г19, 6АЬ7М,
0АЬ7Ь2, 0АЬ7Ь6, с1АЬ7К7, с!АЬ7Ь8, с!АЬ7Н9, 0АЬ7Ы0, дАЬ7М1, дАЬ7М2, с1АЬ7МЗ,
0АЬ7М4, с1АЬ7р1 и 0АЬ7р2, и последовательности, по меньшей мере на 80% идентичной им или до 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% включительно идентичной им.
Здесь описан лиганд, имеющий отдельный вариабельный домен тяжелой цепи антитела, имеющий специфичность связывания в отношении первого антигена или его эпитопа, и отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела, имеющий специфичность связывания в отношении второго антигена или его эпитопа, где один или оба из указанного первого антигена и указанного второго антигена представляют собой сывороточный альбумин и где отдельный вариабельный домен тяжелой цепи антитела специфично связывает сывороточный альбумин и имеет аминокислотную последовательность отдельного вариабельного домена тяжелой цепи антитела, выбранную, предпочтительно без ограничения, из группы:
0АЬ8, 0АЫ0, бАЬЗб, 0АЬ7г20, с1АЬ7г21, с1АЬ7г22, 0АЬ7г23, дАЬ7г24, с!АЬ7г25, с!АЬ7г26, с1АЬ7г27, 0АЬ7г28, 0АЬ7г29, 0АЬ7гЗО, с1АЬ7г31, с1АЬ7г32, 0АЬ7гЗЗ, с1АЬ7М21, дАЬ7Ь22, аАЬ7Ь23, АЬ7Ь24, АЬ7М25, АЬ7И26, аАЬ7Ь27, с1АЬ7К30, аАЬ7К31, и последовательности, по меньшей мере на 80% идентичной им или до 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% включительно идентичной им, и где отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела специфично связывает сывороточный альбумин и конкурирует за связывание сывороточного альбумина с отдельным вариабельным доменом антитела, содержащим аминокислотную последовательность отдельного вариабельного домена антитела, выбранную, предпочтительно без ограничения, из группы:
- 43 020464 с1АЬ8, аАЫО, бАЬЗб, с1АЬ7г20, с!АЬ7г21, с1АЬ7г22, с!АЬ7г23, с!АЬ7г24, аАЬ7г25, с!АЬ7г26, с!АЬ7г27, с!АЬ7г28, аАЬ7г29, с!АЬ7гЗО, аАЬ7г31, с!АЬ7г32, 0АЬ7гЗЗ, с1АЬ7Ь21, аАЬ7Ь22, 6АЬ7Ь23, с!АЬ7п31, с!АЬ2, аАЬ4, с!АЬ7, с1АЫ1, 0АЫ9, с!АЬ21, с!АЬ22, аАЬ23, с!АЬ24,
АЬ7Ь24, АЬ7Ь25, АЬ7Ь26, аДЬ7Ь27, дАЬ7Ь30, алы 2, адыз, алы 5, алые, ады 7, алые, аАЬ25, аАЬ2б, аАЬ27, адьзо, аАьз1, адьзз, аАЬ34, аАЬ35, аАЬ38, аАЬ41, аАЬ46, аАЬ47, аАЬ52, аАЬ53, аАЬ54, аАЬ55, аАЬ56, аАЬ7т12, аАЬ7т16, аАЬ7т26, <ЗАЬ7г1, аАЬ7гЗ, аАЬ7г4, аАЬ7г5, аАЬ7г7, аАЬ7г8, аАЬ7г13, аАЬ7г14, аАЬ7г15, аАЬ7г16, аАЬ7г17, аАЬ7г18, аАЬ7г19, аАЬ7Ы, аАЬ7Ь2, аАЬ7К6, аАЬ7Ь7, аАЬ7Ь8, аАЬ7К9, аАЬ7М0, аАЬ7М1, аАЬ7М2, аАЬ7Ь13, аАЬ7К14, аАЬ7р1 и аАЬ7р2.
Здесь описан лиганд, имеющий один или более чем один отдельный вариабельный домен тяжелой цепи антитела, имеющий специфичность связывания в отношении первого антигена или его эпитопа, и один или более чем один отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела, имеющий специфичность связывания в отношении второго антигена или его эпитопа, где один или оба из указанного первого антигена и указанного второго антигена представляют собой сывороточный альбумин и где один или более чем один отдельный вариабельный домен тяжелой цепи антитела специфично связывает сывороточный альбумин и конкурирует за связывание сывороточного альбумина с отдельным вариабельным доменом антитела, имеющим аминокислотную последовательность отдельного вариабельного домена антитела, выбранную, предпочтительно без ограничения, из группы:
аАЬ8, аАЫО, аАЬЗб, аАЬ7г20, аАЬ7г21, аАЬ7г22, аАЬ7г23, аАЬ7г24, аАЬ7г25, аАЬ7г26, 0АЬ7г27, аАЬ7г28, аАЬ7г29, аАЬ7гЗО, аАЬ7г31, аАЬ7г32, аАЬ7гЗЗ,
0АЬ7Ь21, аАЬ7Ь22, аАЬ7И23, АЬ7Ь24, АЬ7Ь25, АЬ7Ь26, аАЬ7Ь27, аАЬ7Ь30, адь7ьз1, аАЬ2, аАЬ4, аАЬ7, адьи, адыг, адыз, аАЫ5, адыб, аАЫ7, алые, алы 9, адь21, адьгг, адьгз, адь24, адьгб, адьгб, адь27, адьзо, адьзц адьзз, аАьз4, адьзб, адьзв, аль41, адь4б, аАЬ47, адь52, адьбз, адь54, адьбб, адьбб, аАЬ7т12, аАЬ7т16, аАЬ7т26, аАЬ7г1, аАЬ7гЗ, аАЬ7г4, аАЬ7г5, аАЬ7г7, аАЬ7г8, аАЬ7г13, аАЬ7г14, аАЬ7г15, аАЬ7г16, аАЬ7г17, аАЬ7г18, аАЬ7г19, аАЬ7Ь1, аАЬ7Ь2, аАЬ7Ь6, аАЬ7Ь7, аАЬ7Ь8, аАЬ7Ь9, аАЬ7Ь10, аАЬ7Ь11, аАЬ7Ь12, аАЬ7Ь13, аАЬ7Ь14, аАЬ7р1, аАЬ7р2, и где один или более чем один отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела специфично связывает сывороточный альбумин и содержит аминокислотную последовательность отдельного вариабельного домена легкой цепи антитела, выбранную, предпочтительно без ограничения, из группы:
аль2, адь4, адь7, адьи, адыг, адыз, аАЫ5, адыб, ады?, адыв, адыэ, адь21, адьгг, адьгз, адь24, адьгб, адьгб, адь27, адьзо, адьзц адьзз, адьз4, адьзб, адьз8, адь41, адь4б, адь47, аАЬ52, аАЬ53, аАЬ54, аАЬ55, адьбб, агаАЬ7т12, аАЬ7т16, аАЬ7т2б, аАЬ7г1, аАЬ7гЗ, аАЬ7г4, аАЬ7г5, аАЬ7г7, аАЬ7г8, аАЬ7г13, аАЬ7г14, аАЬ7г15, аАЬ7г16, аАЬ7г17, аАЬ7г18, аАЬ7г19, аАЬ7Ь1, аАЬ7Ь2, аАЬ7Ь6, аАЬ7Ь7, аАЬ7Ь8, аАЬ7Ь9, адь7ыо, адь7Ы1, адь7М2, адь7мз, адь7М4, адь7р1 и адь7р2, и аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 80% идентичной им или до 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% включительно идентичной им.
Здесь описан лиганд, имеющий один или более чем один отдельный вариабельный домен тяжелой цепи антитела, имеющий специфичность связывания в отношении первого антигена или его эпитопа, и один или более чем один отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела, имеющий специфичность связывания в отношении второго антигена или его эпитопа, где один или оба из указанного первого антигена и указанного второго антигена представляют собой сывороточный альбумин и где один или более чем один отдельный вариабельный домен тяжелой цепи антитела специфично связывает сывороточный альбумин и имеет аминокислотную последовательность отдельного вариабельного домена тяжелой цепи антитела, выбранную, предпочтительно без ограничения, из группы:
аАЬ8, адью, адьзб, аАЬ7г20, аАЬ7г21, аАЬ7г22, аАЬ7г23, аАЬ7г24, аАЬ7г25, аАЬ7г26, аАЬ7г27, аАЬ7г28, аАЬ7г29, аАЬ7гЗО, аАЬ7г31, аАЬ7г32, аАЬ7гЗЗ, аАЬ7Ь21, аДЬ7Ь22, аАЬ7Ь23, АЬ7Ь24, АЬ7Ь25, АЬ7Ь26, аАЬ7Ь27, аАЬ7Ь30, адь7ьз1 и последовательности, по меньшей мере на 80% идентичной им или до 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% включительно идентичной им, и где один или более чем один отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела специфично связывает сывороточный альбумин и конкурирует за связывание сывороточ- 44 020464 ного альбумина с отдельным вариабельным доменом антитела, имеющим аминокислотную последовательность отдельного вариабельного домена антитела, выбранную, предпочтительно без ограничения, из группы:
с1АЬ8, 6АЫ0, с1АЬ36, с!АЬ7г20, с1АЬ7г21, бАЬ7г22, 0АЬ7г23, 0АЬ7г24, 0АЬ7г25,
0АЬ7г26, бАЬ7г27, 0АЬ7г28, бАЬ7г29, с!АЬ7гЗО, с1АЬ7г31, с1АЬ7г32, с!АЬ7гЗЗ, дАЬ7Ь21, 0АЬ7Ь22, 0АЬ7Ь23, АЬ7Ь24, АЬ7Ь25, АЬ7Ь26, 0АЬ7К27, 0АЬ7Ь30, с1АЬ7КЗ-|, 0АЬ2, 0АЬ4, 0АЬ7, άΑΜ1, 6АЫ2, <1АМЗ, с!АМ5, 6АЫ6, άΑΜ7, с1АЫ8,
4АЫ9, с1АЬ21, с1АЬ22, с1АЬ23, 0АЬ24, с1АЬ25, с1АЬ26, с1АЬ27, дАЬЗО, 6АЬ31, дАЬЗЗ,
6АЬ34, дАЬ35, 0АЬ38, с1АЬ41, 6АЬ46, с1АЬ47, дАЬ52, 0АЬ53, 0АЬ54, дАЬ55, 0АЬ56, с1АЬ7т12, 0АЬ7т16, 0АЬ7т26, дАЬ7г1, <1АЬ7гЗ, 0АЬ7г4, с!АЬ7г5, дАЬ7г7, дАЬ7г8,
0АЬ7г13, 0АЬ7г14, 0АЬ7г15, с!АЬ7г16, с1АЬ7г17, дАЬ7г18, 0АЬ7г19, с1АЬ7М,
0АЬ7Ь2, с!АЬ7п6, 0АЬ7Ь7, с1АЬ7Ь8, 0АЬ7Ь9, 6АЬ7МО, с1АЬ7М1, с1АЬ7М2, с1АЬ7МЗ, 0АЬ7Ы4, бАЬ7р1 и 0АЬ7р2.
Здесь описан лиганд, имеющий один или более чем один отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела, и где один или более чем один отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела специфично связывает сывороточный альбумин и имеет аминокислотную последовательность отдельного вариабельного домена легкой цепи антитела, выбранную, предпочтительно без ограничения, из группы:
с1АЬ2, с!АЬ4, с1АЬ7, с!АМ1, 6АЫ2,
0АЫЗ, с!АЫ5, 6АЫ6, с!АЫ7, 0АЫ8, с!АМ9, с!АЬ21, 6АЬ22, 6АЬ23, 0АЬ24, с!АЬ25, с!АЬ26, 6АЬ27, йАЬЗО, с1АЬ31, бАЬЗЗ, 0АЬ34, с!АЬ35, с!АЬ38, 0АЬ41, с!АЬ46, 6АЬ47,
0АЬ52, 0АЬ53, с1АЬ54, с1АЬ55, с1АЬ56, бгс1АЬ7т12, бАЬ7т16, с1АЬ7т26, <ЗАЬ7г1, с1АЬ7гЗ, с!АЬ7г4, с1АЬ7г5, с!АЬ7г7, 0АЬ7г8, с!АЬ7г13, с1АЬ7г14, с1АЬ7г15, 0АЬ7г16,
0АЬ7г17, 0АЬ7г18, 0АЬ7г19, 0АЬ7М, 0АЬ7И2, 6АЬ7Ь6, 0АЬ7Ь7, с!АЬ7Ь8, 6АЬ7Ь9, с!АЬ7М0, с1АЬ7Ы1, с!АЬ7Ы2, 0АЬ7Ь13, с!АЬ7М4, 0АЬ7р1, бАЬ7р2 и последовательности, по меньшей мере на 80% идентичной им или до 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% включительно идентичной им.
Здесь описан лиганд, имеющий один или более чем один отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела, и где один или более чем один отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела специфично связывает сывороточный альбумин и конкурирует за связывание сывороточного альбумина с отдельным вариабельным доменом антитела, имеющим аминокислотную последовательность отдельного вариабельного домена антитела, выбранную, предпочтительно без ограничения, из группы:
с!АЬ8, дАЫО, с!АЬ36, с!АЬ7г20, ΰΑ67Γ21, с!АЬ7г22, с!АЬ7г23, 6АЬ7г24, с!АЬ7г25, с1АЬ7г26,
0АЬ7г27, с!АЬ7г28, 0АЬ7г29, бАЬ7гЗО, 0АЬ7г31, 0АЬ7г32, 0АЬ7гЗЗ, с1АЬ7Ь21, с1АЬ7И22, с!АЬ7п23, АЬ7К24, АЬ7Н25, АЬ7И26, с!АЬ7п27, 0АЬ7И30, 0АЬ7Н31, 0АЬ2, с1АЬ4, с!АЬ7, с1АМ1, 6АЫ2, 0АЫЗ, 6АЫ5, 0АЫ6, 0АЫ7, с1АМ8, с1АЫ9, 0АЬ21,
0АЬ22, 0АЬ23, с!АЬ24, 0АЬ25, с1АЬ26, с1АЬ27, РАЬЗО, с1АЬ31, бАЬЗЗ, РАЬ34, с!АЬ35, с!АЬ38, с1АЬ41, с!АЬ46, с!АЬ47, 0АЬ52, с!АЬ53, с!АЬ54, с!АЬ55, с!АЬ56, с!АЬ7т12, бАЬ7т16, с!АЬ7т26, 0АЬ7г1, с!АЬ7гЗ, 0АЬ7г4, с!АЬ7г5, дАЬ7г7, с!АЬ7г8, с1АЬ7г13, с1АЬ7г14, 0АЬ7г15, с1АЬ7г16, с1АЬ7г17, с1АЬ7г18, с1АЬ7г19, с1АЬ7М1, 0АЬ7п2, с!АЬ7И6, с1АЬ7Ь7, 6АЬ7М8, с1АЬ7И9, с)АЬ7М0, с!АЬ7М1, 6АЬ7М2, с1АЬ7МЗ, 0АЬ7К14, с1АЬ7р1 и с!АЬ7р2.
Здесь описан лиганд, имеющий один или более чем один отдельный вариабельный домен, где один или более чем один отдельный вариабельный домен специфично связывает сывороточный альбумин и конкурирует за связывание сывороточного альбумина с отдельным вариабельным доменом антитела, имеющим аминокислотную последовательность отдельного вариабельного домена антитела, выбранную, предпочтительно без ограничения, из группы:
- 45 020464
0АЬ8, с1АЫ 0, с1АЬ36, с1АЬ7г20, с1АЬ7г21, с!АЬ7г22, с!АЬ7г23, с!АЬ7г24, с1АЬ7г25, с1АЬ7г26, 0АЬ7г27, с!АЬ7г28, с1АЬ7г29, с!АЬ7гЗО, с1АЬ7г31, с!АЬ7г32, с1АЬ7гЗЗ, 0АЬ7Н21, с!АЬ7И22, 0АЬ7Ь23, АЬ7К24, АЬ7К25,
АЬ7Н26, с1АЬ7Ь27, с!АЬ7И30, с1АЬ7Н31, 0АЬ2, с!АЬ4, с!АЬ7, 6АЫ1, с!АЫ2, 0АЫЗ,
0АЫ5, с!АЫ6, 0АЫ7, 0АЫ8, с1АЫ9, 0АЬ21, 0АЬ22, 6АЬ23, с!АЬ24, с!АЬ25, 0АЬ26,
0АЬ27, 0АЬ30, с!АЬ31, бАЬЗЗ, 0АЬ34, с!АЬ35, с1АЬ38, с!АЬ41, 6АЬ46, с!АЬ47, 0АЬ52, с!АЬ53, 0АЬ54, е)АЬ55, 0АЬ56, 0АЬ7т12, с1АЬ7т16, с!АЬ7т26, с1АЬ7г1, 0АЬ7гЗ, с!АЬ7г4, с!АЬ7г5, 0АЬ7г7, с!АЬ7г8, 0АЬ7г13, с1АЬ7г14, с1АЬ7г15, с!АЬ7г16, с!АЬ7г17, с!АЬ7г18, с1АЬ7г19, с!АЬ7М, дАЬ7п2, с!АЬ7К6, 0АЬ7Ь7, с!АЬ7Ь8, с1АЬ7К9, с!АЬ7И10, с1АЬ7М1, с!АЬ7М2, с!АЬ7МЗ, с1АЬ7М4, с1АЬ7р1 и 0АЬ7р2.
Предпочтительно один или более чем один отдельный вариабельный домен содержит каркас, выбранный, предпочтительно без ограничения, из группы, состоящей из СТЬА-4, липокалина, 8рА, аффитела, авимера, СгоЕ1 и фибронектина, и конкурирует за связывание сывороточного альбумина с отдельным вариабельным доменом антитела, имеющим аминокислотную последовательность отдельного вариабельного домена антитела, выбранную, предпочтительно без ограничения, из группы:
с1АЬ8, 6АМ0, с1АЬ36, 0АЬ7г20, 0АЬ7г21, 0АЬ7г22, с!АЬ7г23, с!АЬ7г24, 0АЬ7г25, с1АЬ7г26, 0АЬ7г27, с1АЬ7г28, 0АЬ7г29, с1АЬ7гЗО, с!АЬ7г31, с!АЬ7г32, с!АЬ7гЗЗ, с1АЬ7Ь21, 6АЬ7Н22, с!АЬ7п23, АЬ7М24, АЬ7Ь25,
АЬ7И2б, с1АЬ7Н27, дАЬ7Ь30, с!АЬ7И31, 0АЬ2, 0АЬ4, с!АЬ7, 0АЫ1, с!АЫ2, с1АЫЗ, с!АМ5, с1АЫ6, с1АЫ7, с1АМ8, 6АЫ9, дАЬ21, 0АЬ22, <ЗАЬ23, с!АЬ24, 6АЬ25, с1АЬ26, <ЗАЬ27, с!АЬ30, 0АЬ31, дАЬЗЗ, с!АЬ34, с1АЬ35, 0АЬ38, с!АЬ41, 0АЬ46, с1АЬ47, с1АЬ52,
0АЬ53, <±АЬ54, с1АЬ55, 0АЬ56, 0АЬ7т12, 0АЬ7т16, с1АЬ7т26, с1АЬ7г1, 0АЬ7гЗ, с1АЬ7г4, с1АЬ7г5, 0АЬ7г7, 0АЬ7г8, с1АЬ7г13, 0АЬ7г14, с!АЬ7г15, с1АЬ7г16, с1АЬ7г17,
0АЬ7г18, с1АЬ7г19, с1АЬ7Н1, 0АЬ7Ь2, с!АЬ7К6, 0АЬ7И7, с!АЬ7М8, с!АЬ7И9, 6АЬ7МО, дАЬ7И11, 0АЬ7М2, с!АЬ7МЗ, с!АЬ7М4, с!АЬ7р1 и 0АЬ7р2.
Здесь описан лиганд, имеющий первый отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, имеющий первую специфичность связывания антигена или эпитопа, и второй отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, имеющий вторую специфичность связывания антигена или эпитопа, где первый и второй отдельные вариабельные домены иммуноглобулина представляют собой отдельные вариабельные домены тяжелой цепи антитела, где первый отдельный вариабельный домен тяжелой цепи антитела специфично связывает сывороточный альбумин и имеет аминокислотную последовательность отдельного вариабельного домена тяжелой цепи антитела, выбранную, предпочтительно без ограничения, из группы:
6АЬ8, с!АМ0, 0АЬ36, 0АЬ7г20, с!АЬ7г21, 0АЬ7г22, 0АЬ7г23, с1АЬ7г24, 0АЬ7г25, с!АЬ7г26,
0АЬ7г27, 0АЬ7г28, 0АЬ7г29, 0АЬ7гЗО, 0АЬ7г31, с1АЬ7г32, 0АЬ7гЗЗ, с1АЬ7Ь21, с!АЬ7И22, с1АЬ7Н23, АЬ7И24, АЬ7Н25, АЬ7К26, 0АЬ7Н27, 0АЬ7Н30, с!АЬ7М31 и последовательности, по меньшей мере на 80% идентичной им или до 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% включительно идентичной им, и где второй отдельный вариабельный домен тяжелой цепи антитела специфично связывает сывороточный альбумин и конкурирует за связывание сывороточного альбумина с отдельным вариабельным доменом антитела, имеющим аминокислотную последовательность отдельного вариабельного домена антитела, выбранную из группы:
0АЬ8, 0АЫ0, с!АЬ36, бАЬ7г20, 0АЬ7г21, бАЬ7г22, с1АЬ7г23, бАЬ7г24, с1АЬ7г25, 0АЬ7г26, с!АЬ7г27, с1АЬ7г28, с!АЬ7г29, бАЬ7гЗО, с!АЬ7г31, 0АЬ7г32, 0АЬ7гЗЗ, с!АЬ7М21, с!АЬ7К22, с!АЬ7Ь23, АЬ7К24,
АЬ7И25, АЬ7Ь26, 0АЬ7п27, 0АЬ7М30, 0АЬ7Ь31, с1АЬ2, с!АЬ4, дАЬ7, 0АЫ1, 6АЫ2, дАЫЗ, 0АЫ5, 6АЫ6, άΑΜ7, с!АЫ8, άΑΜ9, с!АЬ21, 6АЬ22, 0АЬ23, 0АЬ24, 0АЬ25,
6АЬ26, с1АЬ27, с!АЬ30, 6АЬ31, аАЬЗЗ, 0АЬ34, 6АЬ35, 6АЬ38, с1АЬ41, 0АЬ46, с!АЬ47, с!АЬ52, дАЬ53, дАЬ54, аАЬ55, с!АЬ56, с1АЬ7т12, е)АЬ7т16, с!АЬ7т26, с1АЬ7г1, с1АЬ7гЗ, 0АЬ7г4, 0АЬ7г5, с!АЬ7г7, 0АЬ7г8, с1АЬ7г13, 0АЬ7г14, 0АЬ7г15, с!АЬ7г16,
0АЬ7г17, с!АЬ7г18, дАЬ7г19, с!АЬ7М, 6АЬ7Ь2, 0АЬ7К6, 0АЬ7К7, 0АЬ7К8, с!АЬ7К9, с1АЬ7И10, с1АЬ7И11, с!АЬ7М2, 6АЬ7МЗ, с!АЬ7Ы4, с!АЬ7р1 и с!АЬ7р2.
Здесь описан лиганд, имеющий первый отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, имеющий первую специфичность связывания антигена или эпитопа, и второй отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, имеющий вторую специфичность связывания антигена или эпитопа, где первый и второй отдельные вариабельные домены иммуноглобулина представляют собой отдельные вариабельные домены легкой цепи антитела, где первый отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела специ- 46 020464 фично связывает сывороточный альбумин и имеет аминокислотную последовательность отдельного вариабельного домена легкой цепи антитела, выбранную, предпочтительно без ограничения, из группы:
6АЬ2, 6АЬ4, с!АЬ7, 6АЫ1, 0АЫ2,
6АЫЗ, 6АЫ5, 6АЫ6, 6АМ7, 0АЫ8, С1АМ9, 6АЬ21, 0АЬ22, 0АЬ23, 6АЬ24, 6АЬ25, с1АЬ26, с1АЬ27, бАЬЗО, 6АЬ31, с1АЬЗЗ, 6АЬ34, 6АЬ35, 6АЬ38, с1АЬ41, с1АЬ46, с!АЬ47, с!АЬ52, 6АЬ53, 6АЬ54, 6АЬ55, 6АЬ56, с1г0АЬ7т12, 0АЬ7т16, с!АЬ7т26, 0АЬ7г1, с!АЬ7гЗ, 0АЬ7г4, 0АЬ7г5, с1АЬ7г7, с!АЬ7г8, с!АЬ7г13, с!АЬ7г14, 0АЬ7г15, с!АЬ7г16, с!АЬ7г17, с1АЬ7г18, с1АЬ7г19, с1АЬ7Н1, с!АЬ7Ь2, άΑΡ7ή6, РАЬ767, 0АЬ7К8, 0АЬ7К9, с!АЬ7М0, с!АЬ7М1, дАЬ7М2, 0АЬ7п13, 0АЬ7М4, 0АЬ7р1, с!АЬ7р2 и последовательности, по меньшей мере на 80% идентичной им или до 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% включительно идентичной им, и где второй отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела специфично связывает сывороточный альбумин и конкурирует за связывание сывороточного альбумина с отдельным вариабельным доменом антитела, имеющим аминокислотную последовательность отдельного вариабельного домена антитела, выбранную, предпочтительно без ограничения, из группы:
6АЬ8, ύΑΜΟ, с1АЬ36, с1АЬ7г20, 0АЬ7г21, с!АЬ7г22, с!АЬ7г23, с!АЬ7г24, 0АЬ7г25,
0АЬ7г26, бАЬ7г27, с!АЬ7г28, с!АЬ7г29, с!АЬ7гЗО, с1АЬ7г31, с!АЬ7г32, 0АЬ7гЗЗ, с1АЬ7Ь21, 0АЬ7И22, РАЬ7Ь23, АЬ7И24, АЬ7Ь25, АЬ7Ь26, 6АЬ7Ь27, с!АЬ7Ь30,
0АЬ7Ь31, 6АЬ2, с!АЬ4, с!АЬ7, 6АЫ1, 6АЫ2, с!АЫЗ, 6АЫ5, с!АЫ6, с!АЫ7, (1ΑΜ8, 0АЫ9, с!АЬ21, 0АЬ22, 0АЬ23, 6АЬ24, дАЬ25, с!АЬ26, с!АЬ27, с1АЬ30, с1АЬ31, дАЬЗЗ, 6АЬ34, с1АЬ35, 0АЬ38, с1АЬ41, 6АЬ46, 6АЬ47, с!АЬ52, 6АЬ53, 0АЬ54, с!АЬ55, с!АЬ56, бАЬ7т12, с1АЬ7т16, РАЬ7т26, с1АЬ7г1, 0АЬ7гЗ, 0АЬ7г4, с1АЬ7г5, с1АЬ7г7, с1АЬ7г8, с1АЬ7г13, 0АЬ7г14, РАЬ7г15, 0АЬ7г16, с1АЬ7г17, с1АЬ7г18, с1АЬ7г19, с1АЬ7М1, с!АЬ7К2, с!АЬ7К6, 0АЬ7Ь7, 0АЬ7К8, с1АЬ7К9, с!АЬ7К10, 0АЬ7М1,
6АЬ7М2, 0АЬ7ЫЗ, с!АЬ7Ы4, 0АЬ7р1 и бАЬ7р2.
Воплощения лигандов, описанных выше и здесь, также включают лиганды, имеющие структуру, содержащую 1дО-структуру, имеющую комбинацию из одного или двух описанных выше лигандов с двойной специфичностью и/или отдельных вариабельных доменов, содержащих неиммуноглобулиновые каркасы. Такие иммуноглобулиновые структуры могут иметь различные комбинации отдельных вариабельных доменов антител, включая 1дО-структуру, содержащую четыре отдельных вариабельных домена тяжелой цепи антитела, или 1дО-структуру, содержащую четыре отдельных вариабельных домена тяжелой цепи антитела, а также 1дО-структуру, содержащую две пары цепей, каждая из которых содержит отдельный вариабельный домен тяжелой цепи антитела и отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела. В дополнение к этим 1дО-структурам, лиганды, описанные здесь, могут содержать один или более мономеры отдельного вариабельного домена, включая, предпочтительно без ограничения, отдельные вариабельные домены, перечисленные выше, где, если лиганд содержит более чем один из этих отдельных вариабельных доменов, отдельные вариабельные домены могут быть идентичны друг другу или не идентичны друг другу.
Воплощения лигандов, содержащих один или более отдельные вариабельные домены, включают, предпочтительно без ограничения, бАЬ, описанные здесь, мономеры с двойной специфичностью, содержащие по меньшей мере один отдельный вариабельный домен, молекулы 1дО с двойной специфичностью, содержащие мономеры отдельной цепи антитела, и мультивалентные молекулы 1дО, содержащие мономеры отдельной цепи антитела, как описано здесь. Эти воплощения могут дополнительно включать связывающую область для лиганда общего типа. Лиганд общего типа может включать, предпочтительно без ограничения, белок А, белок Р и белок О. Для таких лигандов с двойной специфичностью, включая лиганды в формате 1дО, мишень (мишени) для каждой второй специфичности связывания антигена или эпитопа включает, предпочтительно без ограничения, специфичность связывания в отношении антигена, который может входить в группу, выбранную из цитокинов, рецепторов цитокинов, ферментов, кофакторов ферментов и ДНК-связывающих белков, и может быть выбран, предпочтительно без ограничения, из рецептора ЕРО, АроЕ, Аро-8АА, ΒΌΝΡ, кардиотрофина-1, ЕОР, рецептора ЕОР, ЕИА-78, эотаксина, эотаксина-2, Еходиз-2, ЕроК, кислого РОР, основного РОР, фактора роста фибробластов-10, лиганда РБТ3, фракталкина (СХ3С), ОВИР, О-С8Р, ОМ-С8Р, ОР-р1, инсулина, γ-интерферона (1РИ-у), 1ОР-1, 1ОР-11, интерлейкина-1а (1Ь-1а), 1Б-13, Ш-2, Ш-3, Ш-4, Ш-5, Ш-6, Ш-7, Ш-8 (72 а.а.), Ш-8 (77 а.а.), Ш-9, Ш-10, Ш-11, Ш-12, 1Ш-13, 1Ш-15, Ш-16, 1Ш-17, 1Ш-18 (1О1Р), ингибина α, ингибина β, 1Р-10, фактора роста кератиноцитов-2 (КОР-2), КОР, лептина, ЫР, лимфотактина, мюллеровой ингибирующей субстанции, моноцитарного колониеингибирующего фактора, моноцитарного атрактантного белка, М-С8Р, МБС (67 а.а.), МБС (69 а.а.), МСР-1 (МСАР), МСР-2, МСР-3, МСР-4, МБС (67 а.а.), МБС (69 а.а.), М1О, М1Р-1а, М1Р1β, М1Р-3а, М1Р-3в, М1Р-4, фактора, ингибирующего миелоидные предшественники, 1 типа (МР1Р-1),
- 47 020464
ΝΆΓ-2. неуртурина. фактора роста нервов. β-ΝΟΡ, ΝΓ-3, ΝΓ-4, онкостатина М. тромбоцитарного фактора роста АА (РПСР-АА). РОСР-АВ. РВСР-ВВ. РР-4, КАЭТЕЗ, 8ΌΡ1α. 8ΌΡ1β. ТСР-β. ТСРф2. ТСР-β. ΊΝΡ-β, рецептора ТОТ1 1 типа. рецептора ТОТ1 2 типа. ТМЫ. ТРО. УЕСР, рецептора УЕСР 1 типа. рецептора УЕСР 2 типа. рецептора УЕСР 3 типа. ССР-2. СКО/МСЗА, СКО-β. СКО-γ. НСС1. 1-309. нЕК 1. нЕК 2. нЕК 3 и нЕК 4. СЭ4. человеческих рецепторов хемокинов СХСК4 или ССК5. неструктурного белка 3 типа (Ν33) вируса гепатита С. ТОТ-альфа. 1дЕ, ΙΡΝ-гамма, ММР-12. СЕА. Н. ру1оп. ТВ. вируса гриппа. гепатита Е. ММР-12. интернализуемых рецепторов, сверхэкспрессируемых на определенных клетках. таких как рецептор эпидермального фактора роста (ЕСРК), рецептор ЕгВЬ2 на опухолевых клетках. интернализуемый клеточный рецептор, рецептор ЬПЬ. рецептор РСР2, рецептор ЕгВЬ2, рецептор трансферрина, рецептор РЭСР. рецептор УЕСР, РктАг. белка внеклеточного матрикса, эластина, фибронектина. ламинина, а1-антитрипсина. тканевого фактора. ингибирующего протеазы, РЭК1. СЗК1. Вай. каспазы-9. Рогккеай. антигена ИеПсоЬасЮг ру1оп. антигена МусоЬас!егшт !иЬегси1о515 и антигена вируса гриппа. В таком лиганде с двойной специфичностью, включая те лиганды с двойной специфичностью, которые представлены в формате 1дС. один или оба отдельных вариабельных домена специфично связывают эпитоп или антиген с константой диссоциации (Кй). которая может быть выбрана. предпочтительно без ограничения, из 1х 10-3 М или менее. 1х 10-4 М или менее. 1х10-5 М или менее. 1х10-6 М или менее. 1х10-7 М или менее. 1 х 10-8 М или менее и 1 х 10-9 М или менее. как определено, например, поверхностным плазмонным резонансом. Такой лиганд с двойной специфичностью, включая те лиганды с двойной специфичностью, которые представлены в формате 1дС. может дополнительно содержать один или более объектов, включая. предпочтительно без ограничения, метку. метку и лекарственное средство. Такой лиганд с двойной специфичностью, включая те лиганды с двойной специфичностью, которые представлены в формате 1дС. а также мультимерный лиганд. содержащий один или более мономеры отдельных вариабельных доменов. перечисленных выше. могут быть представлены в наборе и в композиции, включая фармацевтическую композицию, содержащую лиганд с двойной специфичностью и его носитель.
Сходным образом. для лиганда. содержащего один или более отдельные вариабельные домены. как описано здесь. включая лиганд в мономерной форме и лиганд в мультимерной форме. как определено выше. один или более отдельные вариабельные домены специфично связывают эпитоп или антиген с константой диссоциации (Кй). которая может быть выбрана. предпочтительно без ограничения, из 1 х 10-3 М или менее. 1х 10-4 М или менее. 1х 10-5 М или менее. 1х 10-6 М или менее. 1х 10-7 М или менее. 1х 10-8 М или менее и 1х 10-9 М или менее. как определено, например, поверхностным плазмонным резонансом. Такой лиганд может дополнительно содержать один или более объекты. включая. предпочтительно без ограничения, метку. метку и лекарственное средство. Такой лиганд может быть представлен в наборе. композиции, включая фармацевтическую композицию, содержащую лиганд и его носитель.
При использовании здесь процент идентичности может относиться к проценту идентичности по всей длине аминокислотной или нуклеотидной последовательности. Если указано. процент идентичности аминокислотной последовательности или последовательности нулеиновой кислоты относится к проценту идентичности последовательности (последовательностям) из одной или более отдельных областей эталонной аминокислотной последовательности или последовательности нулеиновой кислоты. например, на протяжении одной или более СЭК-областей антитела и/или одной или более каркасных областей вариабельного домена антитела. Например, идентичность последовательности на аминокислотном уровне в одной или более СОК полипептида может обладать по меньшей мере 80. 85. 90. 91. 92. 93. 94. 95. 96. 97. 98% или 99. или большей идентичностью аминокислотной последовательности соответствующих СОК отдельного вариабельного домена тяжелой или легкой цепи антитела. Сходным образом. идентичность последовательности на аминокислотном уровне в одной или более каркасных областях полипептида может обладать по меньшей мере 80. 85. 90. 91. 92. 93. 94. 95. 96. 97. 98 или 99%. или большей идентичностью аминокислотной последовательности соответствующей каркасной области отдельного вариабельного домена тяжелой или легкой цепи антитела. На уровне нуклеиновых кислот. последовательность нуклеиновой кислоты. кодирующей одну или более СОК полипептида, может иметь по меньшей мере 70. 75. 80. 85. 90. 91. 92. 93. 94. 95. 96. 97. 98 или 99%. или большую идентичность последовательности нуклеиновой кислоты. кодирующей соответствующие СОК отдельного вариабельного домена тяжелой или легкой цепи антитела. На уровне нуклеиновых кислот. последовательность нуклеиновой кислоты. кодирующей одну или более чем одну каркасную область полипептида, может иметь по меньшей мере 70. 75. 80. 85. 90. 91. 92. 93. 94. 95. 96. 97. 98 или 99%. или большую идентичность последовательности нуклеиновой кислоты. кодирующей соответствующие каркасные области отдельного вариабельного домена тяжелой или легкой цепи антитела соответственно. Каркасные области (Р\У) предпочтительно имеют происхождение от каркасной области антитела, как. например, человеческая У3-23[ПР47]Ш4В тяжелой цепи или человеческая ЭРК9/Ж1 легкой цепи каппа. Если каркасная область представляет собой область, обнаруженную в ν-области человеческой тяжелой цепи У3-23[ПР47].Гн4В, процент идентичности может относиться к ее каркасным областям и/или предпочтительно к одной или более чем одной СЭКобласти. как показано на фиг. 24. Если каркасная область представляет собой область. обнаруженную в
- 48 020464
У-области человеческой легкой цепи ОРК9/1К1, процент идентичности может представлять собой процент идентичности по сравнению с ее эталонными каркасными областями и/или предпочтительно с одной или более чем одной СЭК-областью, как показано на фиг. 24.
СОК предпочтительно представляют собой СОК вариабельного домена антитела, предпочтительно без ограничения СОК отдельных вариабельных доменов антитела.
В некоторых воплощениях структурная характеристика процента идентичности сочетается с функциональным аспектом. Например, в некоторых воплощениях последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотная последовательность с менее чем 100% идентичностью эталонной последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности также необходима для отображения по меньшей мере одного функционального аспекта эталонной аминокислотной последовательности или аминокислотной последовательности, кодируемой эталонной нуклеиновой кислотой. В других воплощениях последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотная последовательность с менее чем 100% идентичностью эталонной последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности, соответственно, также необходима для отображения по меньшей мере одного функционального аспекта эталонной аминокислотной последовательности или аминокислотной последовательности, кодируемой эталонной нуклеиновой кислотой, но эта функциональная характеристика может быть незначительно изменена, например, придавать увеличенную аффинность в отношении обозначенного антигена по сравнению с аффинностью эталона.
З. Применение мультиспецифичных лигандов по второй форме изобретения
Мультиспецифичные лиганды в соответствии со способом по второй форме настоящего изобретения могут быть использованы в терапевтических и профилактических применениях ίη νί\Ό, диагностических применениях ίη νίίΐΌ и ίη νί\Ό, применениях в исследованиях и в качестве реагентов ίη νίΙΐΌ и т.п. Например, молекулы антител могут быть использованы в методиках исследований, основанных на антителах, таких как методики ЕЫБА, в соответствии со способами, известными специалистам в данной области техники.
Как упомянуто выше, мультиспецифичные лиганды по изобретению применимы в диагностических, профилактических и терапевтических способах. Мультиспецифичные антитела по изобретению диагностически применимы в ветерн-блот анализе и выявлении белков ίη зПи стандартными иммуногистохимическими способами; для использования в этих применениях лиганды могут быть снабжены метками в соответствии с методиками, известными в данной области техники. В дополнение такие полипептиды-антитела могут быть использованы препаративно в способах аффинной хроматографии в комплексе с хроматографической подложкой, такой как смола. Все такие методики хорошо известны специалисту в данной области техники.
Диагностические применения мультиспецифичных лигандов с закрытой конформацией по изобретению включают гомогенные исследования анализируемых веществ, в которых используют способность мультиспецифичных лигандов с закрытой конформацией связывать две мишени конкурентно таким образом, что две мишени не могут быть связаны одновременно (закрытая конформация), или, альтернативно, их способности связывать две мишени одновременно (открытая конформация).
Производители систем для диагностических и исследовательских анализов, используемых в открытии и разработке лекарственных средств, активно искали формат истинного гомогенного иммунологического исследования. Основные диагностические рынки включают исследования у людей в стационарах, врачебных кабинетах и клиниках, рекомендованных коммерческих лабораториях, станциях переливания крови и на дому, диагностику не у людей (например, исследование пищи, исследование воды, исследование окружающей среды, биологическая защита и ветеринарное исследование) и, в завершение, исследованиях (включая разработку лекарственных средств; фундаментальные исследования и научные исследования).
В настоящее время на всех этих рынках применяют системы иммунологического анализа, построенные на хемилюминесцентных методиках, методиках ЕЫБА, флюоресцентных методиках или, в редких случаях, методиках радиоиммунного анализа. Каждый из этих форматов требует стадии разделения (разделения связанных и несвязанных реагентов). В некоторых случаях необходимы несколько стадий разделения. Добавление этих дополнительных стадий требует добавления реагентов и автоматизации, занимает время и оказывает влияние на конечный результат исследований. В диагностике у человека стадию разделения можно автоматизировать, что маскирует проблему, но не решает ее. Робототехника, дополнительные реагенты, дополнительное время инкубации и т.п. значимо повышают стоимость и сложность. При разработке лекарственных средств, как, например, при высокопроизводительном скрининге, где одновременно исследуют буквально миллионы образцов, добавление дополнительных стадий разделения может сделать проведение скрининга невозможным. Тем не менее, отказ от разделения создает слишком интенсивный шум при считывании данных. Таким образом, существует потребность в истинном гомогенном формате, обеспечивающем чувствительности в диапазоне, получаемом при современных форматах исследований. Преимущественно исследование обладает полностью количественными считываниями данных с широкой чувствительностью и широким динамическим диапазоном. Чувствительность является важным требованием, так как она снижает необходимое количество образца. Оба этих признака явля- 49 020464 ются признаками, предлагаемыми в гомогенной системе. Это очень важно при исследовании в месте наблюдения за пациентом и разработке лекарственных средств, где ценность образцов очень высока. Гетерогенные системы, используемые в данной области техники в настоящее время, требуют больших количеств образца и дорогих реагентов.
Применения для гомогенных исследований включают тесты на злокачественные новообразования, где наиболее крупным исследованием является исследование на простатоспецифический антиген, применяемое в скрининге рака предстательной железы у мужчин. Другие применения включают тесты на бесплодие, представляющие серию тестов для женщин, пытающихся забеременеть, включая исследование на хорионический β-гонадотропин человека (бета-ХГЧ) на беременность. Тесты на инфекционные заболевания, включая гепатит, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), краснуху, и другие вирусы и микроорганизмы, и заболевания, передающиеся половым путем. Тесты применяют на станциях переливания крови, особенно исследования на ВИЧ, гепатит А, В, С, ни А, ни В. Тесты для терапевтического лекарственного мониторинга включают мониторинг уровней принимаемых лекарственных средств у пациентов для оценки эффективности и во избежание токсичности, например дигоксина при аритмии, уровней фенобарбитала в случаях психоза; теофиллина при астме. Более того, диагностические тесты применимы при исследовании на злоупотребление наркотиками, как, например, исследование на кокаин, марихуану и т.п. Метаболические тесты применяют для оценки функций щитовидной железы, анемии и других физиологических расстройств и функций.
Более того, формат гомогенного иммунологического исследования применим в изготовлении стандартных клинико-биохимических исследований. Включение иммунологических исследований и химических исследований в один и тот же прибор обеспечивает большое преимущество при диагностическом исследовании. Подходящие химические исследования включают тесты на глюкозу, холестерин, калий и т.п.
Другим важным применением гомогенных иммунологических исследований является открытие и разработка лекарственных средств: высокопроизводительный скрининг включает исследование комбинаторных химических библиотек против мишеней в очень больших объемах. Сигнал детектируют и положительные группы затем разбивают на меньшие группы, и, в конечном счете, тесты проводят на клетках и затем животных. Гомогенные исследования могут быть использованы во всех этих типах тестов. При разработке лекарственных средств, особенно исследованиях на животных и клинических испытаниях, иммунологические исследования применяют очень активно. Гомогенные исследования значительно ускоряют и упрощают эти способы. Другие применения включают исследование пищи и напитков: исследование мяса и других продуктов на Е.соП, 8а1топе11а и т.п.; исследование воды, включая исследование водоочистных сооружений на все типы загрязнителей, включая Е.соП; и ветеринарное обследование.
В широком воплощении согласно изобретению предложено исследование связывания, включающее детектируемый агент, связываемый мультиспецифичным лигандом с закрытой конформацией по изобретению, и его детектируемые свойства изменяются связыванием анализируемого вещества с указанным мультиспецифичным лигандом с закрытой конформацией. Такое исследование может быть модифицировано несколькими разными способами, в каждом из которых используют вышеописанные свойства мультиспецифичных лигандов с закрытой конформацией.
Исследование основано на непосредственном или косвенном вытеснении агента анализируемым веществом, что приводит к изменению детектируемых свойств агента. Например, там, где агент представляет собой фермент, способный катализировать реакцию, имеющую детектируемую конечную точку, указанный фермент может быть связан лигандом таким образом, что лиганд блокирует его активную область, инактивируя посредством этого фермент. Анализируемое вещество, также связываемое с мультиспецифичным лигандом с закрытой конформацией, вытесняет фермент, придавая ему активность посредством высвобождения активной области. Тогда фермент способен реагировать с субстратом и давать начало детектируемому событию. В альтернативном воплощении лиганд может связывать фермент вне активной области, влияя на конформацию фермента и таким образом изменяя его активность. Например, связывание лиганда может стеснять структуру активной области, или может быть блокировано связывание кофакторов, необходимых для активности.
Физическое воплощение исследования может принимать любую форму, известную в данной области техники. Например, комплекс мультиспецифичный лиганд с закрытой конформацией/фермент может быть представлен на тестовой полоске; субстрат может быть представлен на другой области тестовой полоски, и растворитель, содержащий анализируемое вещество, может проходить через комплекс лиганд/фермент, вытесняя фермент и перенося его к области субстрата с образованием сигнала. Альтернативно, комплекс лиганд/фермент может быть представлен на тестовой палочке или другой твердой фазе, и его можно погружать в раствор анализируемого вещества/субстрата, высвобождая фермент в раствор в ответ на присутствие анализируемого вещества.
Поскольку каждая молекула анализируемого вещества потенциально высвобождает одну молекулу фермента, исследование является количественным, где интенсивность генерируемого в данное время сигнала зависит от концентрации анализируемого вещества в растворе.
Возможны другие формы с применением анализируемого вещества в закрытой конформации. На- 50 020464 пример, мультиспецифичный лиганд с закрытой конформацией может быть изменен, чтобы связывать фермент в аллостерической области, активируя посредством этого фермент. В таком положении фермент активен в отсутствие анализируемого вещества. Добавление анализируемого вещества вытесняет фермент и устраняет аллостерическую активацию, инактивируя таким образом фермент.
В контексте описанных выше воплощений, в которых используют ферментативную активность в качестве меры концентрации анализируемого вещества, активация или инактивация фермента относится к увеличению или уменьшению активности фермента, измеренной как способность фермента катализировать реакцию, генерирующую сигнал. Например, фермент может катализировать превращение недетектируемого субстрата в его детектируемую форму. Например, пероксидазу хрена широко используют в данной области техники совместно с хромогенными или хемилюминесцентными субстратами, имеющимися в продаже. Степень увеличения или уменьшения активности фермента может составлять от 10 до 100%, как, например, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90%; в случае увеличения активности увеличение может превышать 100%, т.е. составлять 200, 300, 500% или более, или может быть неизмерима в процентном отношении, если начальная активность ингибированного фермента не выявляема.
В другой форме мультиспецифичный лиганд с закрытой конформацией может связывать субстрат пары фермент/субстрат активнее, чем фермент. Таким образом, субстрат недоступен для фермента до его высвобождения из мультиспецифичного лиганда с закрытой конформацией посредством связывания анализируемого вещества. Воплощения для этой формы аналогичны воплощениям для форм со связыванием фермента.
Боле того, исследование может быть изменено для связывания флюоресцентной молекулы, такой как флюоресцеин или другой флюорофор, в такой конформации, что флюоресценция блокирована при связывании лиганда. В этом случае связывание анализируемого вещества с лигандом будет вытеснять флюоресцентную молекулу, генерируя таким образом сигнал. Альтернативы флюоресцентным молекулам, применимые в настоящем изобретении, включают люминесцентные агенты, такие как люциферин/люцифераза, и хромогенные агенты, включая агенты, обычно используемые в иммунологических исследованиях, такие как пероксидаза хрена (НВР).
Терапевтические и профилактические применения мультиспецифичных лигандов, полученных в соответствии с изобретением, включают введение лигандов по изобретению млекопитающемуреципиенту, такому как человек. Мультиспецифичность может позволять антителам связывать мультимерный антиген с высокой авидностью. Мультиспецифичные лиганды могут сделать возможным перекрестное связывание двух антигенов, например, при рекрутинге цитотоксических Т-клеток для опосредования цитолиза опухолевых клеточных линий.
По существу, чистые лиганды или их связывающие белки, например мономеры !АЬ, с по меньшей мере 90-95% гомогенностью являются предпочтительными для введения млекопитающему, и с 98-99% или большей гомогенностью наиболее предпочтительны для фармацевтических применений, особенно, когда млекопитающее представляет собой человека. После очистки, частичной или до желаемой гомогенности, лиганды могут быть применены диагностически или терапевтически (включая экстракорпоральное применение), или в разработке и осуществлении способов исследования, иммунофлюоресцентных окрашиваний и т.п. (ΕόΙΓουΠ; ап! Реп-ιίδ (1979 ап! 1981), Iттиηο1οд^са1 МеΐЬο!δ, Уο1итеδ I ап! II, Аса!етю ΡϊΌδδ, ΝΥ).
Лиганды или их связывающие белки, например мономеры !АЬ, по настоящему изобретению будут обычно находить применение в предотвращении, подавлении или лечении воспалительных состояний, аллергической гиперчувствительности, злокачественных новообразований, бактериальной или вирусной инфекции и аутоиммунных расстройств (которые включают, предпочтительно без ограничения, диабет I типа, астму, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, системную красную волчанку, болезнь Крона и злокачественную миастению).
В настоящем изобретении термин предотвращение включает введение защитной композиции до индукции заболевания. Подавление относится к введению композиции после индуцирующего события, но до клинических проявлений заболевания. Лечение включает введение защитной композиции после манифестации симптомов заболевания.
Доступны модельные системы на животных, которые могут быть использованы для скрининга эффективности антител или их связывающих белков в защите от заболевания или его лечении. Способы исследования системной красной волчанки (§ЬЕ) у восприимчивых мышей известны в данной области техники (ΚηίβΙιΙ е1 а1. (1978), ί. Ехр. Ме!., 147: 1653; Ве^ηе^δΐеη е1 а1. (1978), Ν;\υ Епд. ί. Ме!., 299: 515). Злокачественную миастению (МО) исследуют у самок мышей δίΣ/ί, индуцируя заболевание растворимым белком АсЬВ от другого вида (^^η!δΐ^οт е1 а1. (1988), А!у. Iттиηο1., 42: 233). Λ^ιЬ^^ι^δ ίδ ш!исе! ίη а δиδсерί^Ь1е δίηιίη οί писе Ьу т)ес1юп οί Τуре II ^Паде (§1иаг1 е1 а1. (1984), Апп. В;у. Iттиηο1., 42: 233). Была описана модель, посредством которой адъювантный артрит индуцируют у восприимчивых мышей инъекцией микобактериального белка теплового шока (Уап Е!еп е1 а1. (1988), №Циге, 331: 171). Тироидит индуцируют у мышей введением тироглобулина, как описано (Мают е1 а1. (1980), ί. Ехр. Ме!., 152: 1115). Инсулинозависимый сахарный диабет (ГОИМ) встречается в природе или может быть индуцирован у определенных линий мышей, таких как описанные Κапаδаγа е1 а1. (1984), Иха^^^^, 27: 113.
- 51 020464
Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЕАЕ) у мышей и крыс служит моделью рассеянного склероза (М§) у человека. В этой модели демиелинезирующее заболевание индуцируют введением основного миелинового белка (см. Ра!ег8оп (1986), ТеХЪоок оГ 1ттипора1Ьо1о§у, М18сЬег е! а1., е38., Огипе апЗ §!гайоп, Ыете Уогк, р. 179-213; МсРагЕп е! а1. (1973), §с1епсе, 179: 478 апЗ §а!оЬ е! а1. (1987), I 1ттипо1., 138: 179).
Лиганд, содержащий отдельный вариабельных домен, или его композиция, связывающий ν\νΡ, например человеческий ν\νΕ домен А1 ν\νΓ активированного ννΡ или домен А3 ν\νΕ может дополнительно содержать тромболитический агент. Этот тромболитический агент может быть нековалентно или ковалентно присоединен к отдельному вариабельному домену, в частности к отдельному вариабельному домену антитела, посредством ковалентных или нековалентных способов, как известно специалисту в данной области техники. Нековалентные способы включают присоединение посредством белкового взаимодействия, такого как биотин/стрептавидин, или посредством иммуноконъюгата. Альтернативно, тромболитический агент может быть введен одновременно, раздельно или последовательно по отношению к лиганду, состоящему из или содержащему отдельный вариабельный домен, связывающий ν\νΓ или домен ν\νΕ как описано выше, или его композиции. Тромболитические агенты по изобретению могут включать, например, стафилокиназу, тканевой активатор плазминогена, стрептокиназу, одноцепочечную стрептокиназу, урокиназу и ацил-плазминоген-стрептокиназный комплекс.
Также здесь описаны инвазивные медицинские устройства, покрытые отдельным вариабельным доменом или лигандом, содержащим отдельный вариабельный домен, или их композицией, или отдельным вариабельным доменом, являющимся результатом способа скрининга, описанного здесь. Неогранивающие примеры устройств включают хирургические трубки, окклюзионные устройства, протезные устройства. Применения таких устройств включают хирургические способы, требующие модуляции опосредованной тромбоцитами агрегации у места инвазии (например, устройство, покрытое отдельным вариабельным доменом, специфично связывающим ν\νΓ) или модуляции воспаления (например, устройство, покрытое отдельным вариабельным доменом, специфично связывающим ТЫЕ-альфа).
В большинстве случаев лиганды по настоящему изобретению будут использовать в очищенной форме совместно с фармакологически подходящими носителями. Обычно такие носители включают водные или водно-спиртовые растворы, эмульсии или суспензии, любые, включая содержащие физиологический раствор и/или забуференную среду. Парентеральные наполнители включают раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, и лактат Рингера. Подходящие физиологически приемлемые адъюванты, если необходимо поддерживать полипептидный комплекс в суспензии, могут быть выбраны из загустителей, таких как карбоксиметилцеллюлоза, поливинилпирролидон, желатин и альгинаты.
Внутривенные наполнители включают жидкие и питательные наполнители и электролитные наполнители, как, например, наполнители, основанные на декстрозе Рингера. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, такие как противомикробные препараты, антиоксиданты, хелатообразующие агенты и инертные газы (Маск (1982), КеттдГоп'8 РЬагтасеи!юа1 8с1епсе8, 16!Ь ЕЗИюп).
Лиганды по настоящему изобретению могут быть использованы как отдельно вводимые композиции или в сочетании с другими агентами. Они могут включать различные иммунотерапевтические лекарственные средства, такие как циклоспорин, метотрексат, адриамицин или цисплатин, и иммунотоксины. Фармацевтические композиции могут включать смеси цитотоксических или других агентов в сочетании с лигандами по настоящему изобретению или даже комбинации лигандов по настоящему изобретению, имеющих разные специфичности, как, например, лигандов, выбранных с применением различных антигенов-мишеней или эпитопов-мишеней, независимо от того, объединяют ли их перед введением.
Путь введения фармацевтических композиций по изобретению может представлять собой любой из путей введения, обычно известных специалистам в данной области техники. Для лечения, включая, без ограничения, иммунотерапию, выбранные лиганды по изобретению могут быть введены любому пациенту в соответствии со стандартными методиками. Введение может быть осуществлено любым подходящим способом, включая парентеральное, внутривенное, внутримышечное, внутрибрюшинное, трансдермальное, посредством легочного способа введения или также, подходяще, прямой инфузией с использованием катетера. Доза и кратность введения будут зависеть от возраста, пола и состояния пациента, сопутствующего введения других лекарственных средств, противопоказаний и других параметров, которые следует принимать во внимание клиническому врачу.
Лиганды по данному изобретению могут быть лиофилизированы для хранения и восстановлены в подходящем носителе перед применением. Было показано, что эта методика эффективна с использованием обычных иммуноглобулинов и могут быть применены известные в данной области техники методики лиофилизации и восстановления. Специалистам в данной области техники будет ясно, что лиофилизация и восстановление могут привести к различным степеням потери активности антител (например, с использованием обычных иммуноглобулинов, антитела 1дМ проявляют тенденцию к большей потере активности, чем антитела 1дО) и что может быть необходимым адаптировать применяемые титры в сторону повышения для компенсации.
Композиции, содержащие лиганды по настоящему изобретению или их смеси, могут быть введены
- 52 020464 для профилактического и/или терапевтического лечения. В определенных терапевтических применениях адекватное количество для достижения, по меньшей мере, частичного ингибирования, подавления, модуляции, цитолиза или некоторого другого измеряемого параметра популяции выбранных клеток определяют как терапевтически эффективную дозу. Количества, необходимые для достижения этой дозы, будут зависеть от тяжести заболевания и общего состояния иммунной системы пациента, но в большинстве случаев составляют от 0,005 до 5,0 мг лиганда, например антитела, рецептора (например, Тклеточного рецептора) или их связывающего белка, на 1 кг массы тела, при этом чаще всего применяют дозы от 0,05 до 2,0 мг/кг/доза. Для профилактических применений композиции, содержащие лиганды по настоящему изобретению или их смеси, могут также быть введены в сходных или незначительно более низких дозах.
Лечение, проводимое с применением композиций, описанных здесь, признают эффективными при снижении одного или более симптомов (например, на по меньшей мере 10% или по меньшей мере один балл шкалы клинической оценки) по отношению к таким симптомам, присутствовавшим до лечения, или по отношению к таким симптомам у индивида (человека или модельного животного), не пролеченного такой композицией. Симптомы будут очевидно изменяться в зависимости от указанного заболевания или расстройства, но могут быть измерены квалифицированным клиническим врачом или специалистом. Такие симптомы могут быть измерены, например, мониторингом уровня одного или более биохимических индикаторов заболевания или расстройства (например, уровней фермента или метаболита, коррелирующих с заболеванием, количества пораженных клеток и т.п.), мониторингом физикальных проявлений (например, воспаления, размера опухоли и т.п.), или посредством общепринятой шкалы клинической оценки, например, Ехрапйей О|5аЫП1у §1а1и8 8са1е (для рассеянного склероза), 1гуше 1пГ1атта1огу Во\\е1 ЭРеазе ОнеЧюппаие (оценка из 32 пунктов выражает качество жизни в отношении функции кишечника, системных симптомов, социальной функции и эмоционального статуса, сумма баллов составляет от 32 до 224, с более высокими суммами баллов, указывающими на лучшее качество жизни), ОнаШу о£ Ы1с РНеитаЮИ АйНпПз 8са1е или другой общепринятой шкалы клинической оценки, как известно в данной области. Продолжительное (например, один день или более, предпочтительно более длительное) снижение симптомов заболевания или расстройства по меньшей мере на 10% или на один или более балла заданной клинической шкалы указывает на эффективное лечение. Подобным образом, профилактика, проводимая с использованием композиции, как описано здесь, эффективна при задержке, снижении или исчезновении начала или тяжести одного или более симптомов по отношению к таким симптомам у похожего индивида (человека или модельного животного), не пролеченного композицией.
Композиция, содержащая лиганд или их смесь по настоящему изобретению, может быть применена в профилактических и терапевтических наборах для содействия изменению, инактивации, цитолизу или удалению популяции выбранных клеток-мишеней у млекопитающего. В дополнение, выбранные репертуары полипептидов, описанные здесь, могут быть использованы экстракорпорально или ш уПго избирательно для уничтожения, сокращения или же эффективного удаления популяции клеток-мишеней из гетерогенного собрания клеток. Кровь от млекопитающего может быть комбинирована экстракорпорально с лигандами, например антителами, поверхностными клеточными рецепторами или их связывающими белками, посредством чего уничтожают нежелательные клетки или же удаляют их из крови, предназначенной для возврата млекопитающему в соответствии со стандартными методиками.
И. Применение лигандов с двойной специфичностью с увеличенным периодом полувыведения по изобретению
Лиганды с двойной специфичностью в соответствии со способом по настоящему изобретению, а также лиганды, содержащие один или более чем один отдельный вариабельный домен, как определено здесь, могут быть использованы в терапевтических и профилактических применениях ш У1уо, диагностических применениях ш У1уо и т.п.
Терапевтические и профилактические применения лигандов с двойной специфичностью, полученных в соответствии с изобретением, а также лигандов, содержащих один или более отдельные вариабельные домены, как определено здесь, включают введение лигандов по изобретению млекопитающемуреципиенту, такому как человек. Антитела с двойной специфичностью по изобретению, а также лиганды, содержащие один или более отдельные вариабельные домены, как определено здесь, включают по меньшей мере одну специфичность в отношении молекулы, увеличивающей период полувыведения; одна или более чем одна другая специфичность может быть направлена против молекул-мишеней. Например, 1дС с двойной специфичностью может быть специфичен в отношении четырех эпитопов, один из которых расположен на молекуле, увеличивающей период полувыведения. Двойная специфичность, а также тройная специфичность, а также высокие валентности могут позволять лигандам, содержащим по меньшей мере один отдельный вариабельный домен, связывать мультимерный антиген с высокой авидностью. Антитела с двойной специфичностью могут сделать возможным перекрестное связывание двух антигенов, например, при рекрутинге цитотоксических Т-клеток для опосредования цитолиза опухолевых клеточных линий.
По существу, чистые лиганды с двойной специфичностью в соответствии со способом по настоящему изобретению, а также лиганды, содержащие один или более чем один отдельный вариабельный
- 53 020464 домен, как определено здесь, или их связывающие белки, такие как мономеры отдельных вариабельных доменов (т.е. мономеры бАЬ), с по меньшей мере 90-95% гомогенностью являются предпочтительными для введения млекопитающему, и с 98-99% или большей гомогенностью наиболее предпочтительны для фармацевтических применений, особенно, когда млекопитающее представляет собой человека. После очистки, частичной или до желаемой гомогенности, лиганды могут быть применены диагностически или терапевтически (включая экстракорпоральное применение), или в разработке и осуществлении способов исследования, иммунофлюоресцентных окрашиваний и т.п. (ЬеГкоуПе апб Регшз (1979 апб 1981), Iттипо1о§1са1 МеШобз, Уо1итез Ι апб ΙΙ, Асабетк Ргезз, ΝΥ).
Лиганды с двойной специфичностью в соответствии со способом по настоящему изобретению, а также лиганды, содержащие один или более чем один отдельный вариабельный домен, как определено здесь, будут обычно находить применение в предотвращении, подавлении или лечении воспалительных состояний, аллергической гиперчувствительности, злокачественных новообразований, бактериальной или вирусной инфекции и аутоиммунных расстройств (которые включают, предпочтительно без ограничения, диабет Ι типа, астму, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, системную красную волчанку, болезнь Крона и злокачественную миастению).
В настоящем изобретении термин предотвращение включает введение защитной композиции до индукции заболевания. Подавление относится к введению композиции после индуцирующего события, но до клинических проявлений заболевания. Лечение включает введение защитной композиции после манифестации симптомов заболевания.
Доступны модельные системы на животных, которые могут быть использованы для скрининга эффективности антител или их связывающих белков в защите от заболевания или его лечении. Способы исследования системной красной волчанки (БЬЕ) у восприимчивых мышей известны в данной области техники (КшдЫ е1 а1. (1978), 1. Ехр. Меб., 147: 1653; Кетегз1еп е1 а1. (1978), №ν Епд. 1. Меб., 299: 515). Злокачественную миастению (МС) исследуют у самок мышей Б1Ь71, индуцируя заболевание растворимым белком Ас1К от другого вида (Ьшбзйош е1 а1. (1988), Αбν. Iттиηο1., 42: 233). АцНпПз 1з шбисеб ίη а зизсерЦЫе зйат оГ тке Ьу шксПоп оГ Туре ΙΙ со11адеп (Б1иаг1 е1 а1. (1984), Апп. Ке\'. Iттиηο1., 42: 233). Была описана модель, посредством которой адъювантный артрит индуцируют у восприимчивых мышей инъекцией микобактериального белка теплового шока (Уап Ебеп е1 а1. (1988), Ν-Φιό, 331: 171). Тироидит индуцируют у мышей введением тироглобулина, как описано (Магоп е1 а1. (1980), ί. Ехр. Меб., 152: 1115). Инсулинозависимый сахарный диабет (ГОЭМ) встречается в природе или может быть индуцирован у определенных линий мышей, таких как описанные Капаза\уа е1 а1. (1984), П1аЬе1о1од1а, 27: 113. ЕАЕ у мышей и крыс служит моделью рассеянного склероза (МБ) у человека. В этой модели демиелинезирующее заболевание индуцируют введением основного миелинового белка (см. Ракгзоп (1986), Техкоок оГ IттиηοраΐЬο1ο§у, М|зсПег е1 а1., ебз., Сгипе апб БЦаПоп, №ν Уогк, р. 179-213; МсЕагБп е1 а1. (1973), Бскпсе, 179: 478: апб Ба1оП е1 а1. (1987), 1. Iттиηο1., 138: 179).
Лиганды с двойной специфичностью по изобретению и мономеры бАЬ, способные связывать внеклеточные мишени, вовлеченные в эндоцитоз (например, клатрин), делают возможным эндоцитоз лигандов с двойной специфичностью, позволяя другой специфичности, способной связывать внутриклеточную мишень, быть доставленной во внутриклеточную среду. Для этой стратегии необходим лиганд с двойной специфичностью с физическими свойствами, позволяющими ему оставаться функциональным внутри клетки. Альтернативно, если внутриклеточный компартмент конечного назначения обладает оксидазной активностью, в лиганде с правильной конформацией не должно быть дисульфидных связей.
В большинстве случаев лиганды по настоящему изобретению будут использовать в очищенной форме совместно с фармакологически подходящими носителями. Обычно такие носители включают водные или водно-спиртовые растворы, эмульсии или суспензии, любые, включая содержащие физиологический раствор и/или забуференную среду. Парентеральные наполнители включают раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, лактат Рингера. Подходящие физиологически приемлемые адъюванты, если необходимо поддерживать полипептидный комплекс в суспензии, могут быть выбраны из загустителей, таких как карбоксиметилцеллюлоза, поливинилпирролидон, желатин и альгинаты.
Внутривенные наполнители включают жидкие и питательные наполнители, и электролитные наполнители, как, например, наполнители, основанные на декстрозе Рингера. Также могут быть представлены консерванты и другие добавки, такие как противомикробные препараты, антиоксиданты, хелатообразующие агенты и инертные газы (Маск (1982), Кеттдкп'з РБагтасеи1ка1 Бскпсез, 1611 Ебкоп).
Лиганды по настоящему изобретению могут быть использованы как отдельно вводимые композиции или в сочетании с другими агентами. Они могут включать различные иммунотерапевтические лекарственные средства, такие как циклоспорин, метотрексат, адриамицин или цисплатин, и иммунотоксины. Фармацевтические композиции могут включать смеси цитотоксических или других агентов в сочетании с лигандами по настоящему изобретению.
Путь введения фармацевтических композиций по изобретению может представлять собой любой из путей введения, обычно известных специалистам в данной области техники. Для лечения, включая, без ограничения, иммунотерапию, лиганды по изобретению могут быть введены любому пациенту в соот- 54 020464 ветствии со стандартными методиками. Введение может быть осуществлено любым подходящим способом, включая парентеральное, внутривенное, внутримышечное, внутрибрюшинное, трансдермальное, посредством легочного способа введения или также, подходяще, прямой инфузией с использованием катетера. Доза и кратность введения будут зависеть от возраста, пола и состояния пациента, сопутствующего введения других лекарственных средств, противопоказаний и других параметров, которые следует принимать во внимание клиническому врачу.
Лиганды по данному изобретению могут быть лиофилизированы для хранения и восстановлены в подходящем носителе перед применением. Было показано, что эта методика эффективна с использованием обычных иммуноглобулинов и могут быть применены известные в данной области техники методики лиофилизации и восстановления. Специалистам в данной области техники будет ясно, что лиофилизация и восстановление могут привести к различным степеням потери активности антител (например, с использованием обычных иммуноглобулинов, антитела ^М проявляют тенденцию к большей потере активности, чем антитела !дО) и что может быть необходимым адаптировать применяемые титры в сторону повышения для компенсации.
Композиции, содержащие лиганды по настоящему изобретению или их смесь, могут быть введены для профилактического и/или терапевтического лечения. В определенных терапевтических применениях адекватное количество для достижения, по меньшей мере, частичного ингибирования, подавления, модуляции, цитолиза или некоторого другого измеряемого параметра популяции выбранных клеток определяют как терапевтически эффективную дозу. Количества, необходимые для достижения этой дозы, будут зависеть от тяжести заболевания и общего состояния иммунной системы пациента, но в большинстве случаев составляют от 0,005 до 5,0 мг лиганда на 1 кг массы тела, при этом чаще всего применяют дозы от 0,05 до 2,0 мг/кг/доза. Для профилактических применений композиции, содержащие лиганды по настоящему изобретению или их смеси, могут также быть введены в сходных или незначительно более низких дозах.
Композиция, содержащая лиганд по настоящему изобретению, может быть применена в профилактических и терапевтических условиях для содействия изменению, инактивации, цитолизу или удалению популяции выбранных клеток-мишеней у млекопитающего.
В дополнение, селектированные репертуары полипептидов, описанные здесь, могут быть использованы экстракорпорально или ίη νίΐτο избирательно для селективного уничтожения, сокращения или же эффективного удаления популяции клеток-мишеней из гетерогенной совокупности клеток. Кровь от млекопитающего может быть комбинирована экстракорпорально с лигандами, например антителами, поверхностными клеточными рецепторами или их связывающими белками, посредством чего уничтожают нежелательные клетки или же удаляют их из крови, предназначенной для возврата млекопитающему в соответствии со стандартными методиками.
Выбор и описание лигандов, содержащих отдельный вариабельный домен для связывания сывороточного альбумина, имеющего происхождение от ряда видов
Лиганд может содержать один или более отдельные вариабельные домены, например отдельные вариабельные домены иммуноглобулина и/или неиммуноглобулиновые отдельные вариабельные домены, где по меньшей мере один из отдельных вариабельных доменов специфично связывает сывороточный альбумин, имеющий происхождение от человека или вида, не являющегося человеком. В одном воплощении отдельный вариабельный домен специфично связывает сывороточный альбумин, эндогенный для человека. В другом воплощении отдельный вариабельный домен специфично связывает сывороточный альбумин от вида, не являющегося человеком. Альтернативно, отдельный вариабельный домен специфично связывает как сывороточный альбумин, эндогенный для человека, так и сывороточный альбумин, эндогенный для одного или более видов, не являющихся человеком. В качестве неограничивающего примера, такой отдельный вариабельный домен может специфично связывать сывороточный альбумин, эндогенный как для человека, так и для яванского макака, или сывороточный альбумин, эндогенный как для человека, так и для крысы, или сывороточный альбумин, эндогенный как для человека, так и для мыши, или сывороточный альбумин, эндогенный как для человека, так и для свиньи. Альтернативно, отдельный вариабельный домен специфично связывает два или более сывороточных альбумина от двух или более видов, не являющихся человеком. При использовании здесь сывороточный альбумин может быть экспрессирован геном, эндогенным для вида, т.е. природный сывороточный альбумин, или его рекомбинантным эквивалентом. В одном воплощении сывороточный альбумин включает фрагменты, аналоги и производные природного и рекомбинантного сывороточного альбумина. Такие фрагменты сывороточного альбумина включают фрагменты, содержащие I домен, II домен и/или III домен, или комбинации двух или более из каждого из I, II и III доменов сывороточного альбумина, преимущественно человеческого сывороточного альбумина. II домен сывороточного альбумина предпочтителен в качестве мишени для отдельного вариабельного домена, как определено здесь. Другие предпочтительные комбинации представляют собой I домен и II домен; I домен и III домен; II домен и III домен; I домен сам по себе; II домен сам по себе; и III домен сам по себе; и I домен и II домен, и III домен. В одном воплощении сывороточный альбумин представляет собой рекомбинантный сывороточный альбумин, экзогенно экспрессированный в хозяине, не являющемся человеком, таком как животное-хозяин или одноклеточный хозя- 55 020464 ин, как, например, дрожжи или бактерии.
Виды, для которых сывороточный альбумин является эндогенным, включают любой вид, экспрессирующий эндогенный сывороточный альбумин, включая, предпочтительно без ограничения, виды человека, мыши, мышиные виды, крысы, яванского макака, свиньи, собаки, кошки, лошади, козы и хомяка. В некоторых случаях сывороточный альбумин, эндогенный для верблюда или ламы, исключен.
Отдельный вариабельный домен может представлять собой отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, включая, предпочтительно без ограничения, отдельный вариабельный домен тяжелой цепи антитела, отдельный вариабельный домен Унн тяжелой цепи антитела, человеческий отдельный вариабельный домен тяжелой цепи антитела, человеческий отдельный вариабельный домен Ун3 тяжелой цепи отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела, человеческий отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела, человеческий отдельный вариабельный домен легкой цепи каппа антитела и/или человеческий отдельный вариабельный домен легкой цепи лямбда антитела.
Отдельный вариабельный домен, специфично связывающий сывороточный альбумин, может представлять собой отдельный вариабельный домен, содержащий иммуноглобулиновый каркас или неиммуноглобулиновый каркас. Отдельный вариабельный домен, связывающий сывороточный альбумин, может содержать одну, или две, или три из СЭК1, СЭК2 и СЭК3 из вариабельного домена антитела, предпочтительно от отдельного вариабельного домена, где СЭК-область (СЭК-области) представлена на неиммуноглобулиновом каркасе, таком как каркас СТЬА-4, липокалиновый каркас, каркас стафилококкового белка Α (δρΑ), ΟτοΕΙ и фибронектиновый каркас, трансферриновый каркас (имеющийся в продаже от Βίοτθχίδ), каркас Аушет™ и АРйЬобу™. Альтернативно, неиммуноглобулиновый отдельный вариабельный домен, связывающий сывороточный альбумин, может не содержать ни СЭК-области (СЭКобластей) антитела, ни целого связывающего домена антитела. Альтернативно, отдельный вариабельный домен (домены), связывающий сывороточный альбумин, может представлять собой отдельные вариабельные домены, содержащие одну, или две, или три из любых из СЭК1. СЭК2 и СЭК3 из вариабельного домена антитела, предпочтительно отдельного вариабельного домена; эти СЭК-области могут быть представлены на каркасной области тяжелой или легкой цепи антитела. Каркасные области включают, например, каркасные области Ун, такие как Ун3 (включая ΌΡ47, ΌΡ38 и ΌΡ45) и каркасные области Унн, описанные выше, а также каркасные области УЪ, включая каркасные области У-каппа (как, например, ΌΡΚ9) и У-лямбда. В некоторых воплощениях вариабельный домен содержит по меньшей мере одну человеческую каркасную область, имеющую аминокислотную последовательность, кодируемую человеческим сегментом гена антитела зародышевого типа, или аминокислотную последовательность, содержащую до 5 аминокислотных различий по отношению к аминокислотной последовательности, кодируемой человеческим сегментом гена антитела зародышевого типа. В других воплощениях вариабельный домен содержит четыре человеческие каркасные области, Р^1, Р^2, Р\У2 и Р^4, имеющие аминокислотные последовательности, кодируемые человеческим сегментом гена антитела зародышевого типа, или аминокислотные последовательности Р^1, Р^2, Р\У2 и Р^4, содержащие в общей сложности до 10 аминокислотных различий по отношению к аминокислотным последовательностям, кодируемым человеческим сегментом гена антитела зародышевого типа. В одном воплощении все три СЭК-области представлены либо на иммуноглобулиновом каркасе (например, каркасе тяжелой цепи или легкой цепи антитела), либо на неиммуноглобулиновом каркасе, как определено здесь, любой из которых может быть от источника, не являющегося человеком, синтетическим, полусинтетическим. Альтернативно, любая комбинация из одной, двух или трех из СЭК1-, СЭК2- и/или СЭК3-областей представлена либо на иммуноглобулиновом каркасе, либо на неиммуноглобулиновом каркасе, например, либо СОК3-область сама по себе, либо СОК2- и СЭК3-области совместно, либо СЭК1 и СЭК2 представлены либо на иммуноглобулиновом каркасе, либо на неиммуноглобулиновом каркасе. Подходящие каркасы и методики такого СЭК-переноса будут ясны специалисту в данной области техники и хорошо известны в данной области техники, см., например, заявку на патент США 07/180370, \УО 01/27160, ЕР 0605522, ЕР 0460167, заявку на патент США 07/054297, №са1§е е! а1., ΡΐΌ^ίη 8аеисе (2004), 13:1882-1891; Е\\ег1 е! а1., Мейюйк 2004 Ос!; 34(2): 184-199; КеШеЬотоидй е! а1., Ρ^ο!е^и Еид. 1991 Ос!; 4(7): 773-783; О'Впеи апб 1опе8, Ме!йоЙ8 Мо1. Вю1. 2003: 207: 81-100; и 8кетта, I. Мо1. Кесодпй. 2000: 13: 167-187, и 8аетеп8 е! а1., I. Мо1. Вю1. 2005 8ер 23; 352(3): 597-607, и другие ссылки, приведенные там.
Лиганды могут содержать один или более таких отдельных вариабельных доменов, специфично связывающих сывороточный альбумин, предпочтительно включающих по меньшей мере один отдельный вариабельный домен, специфично связывающий как сывороточный альбумин, эндогенный для людей, так и по меньшей мере один дополнительный сывороточный альбумин, эндогенный для вида, не являющегося человеком. В одном воплощении этот отдельный вариабельный домен специфично связывает сывороточный альбумин, эндогенный для человека, со значением Ка, не более чем в 10 раз превышающим значение Ка, с которым он специфично связывает (т.е. перекрестно взаимодействует с) по меньшей мере один сывороточный альбумин, эндогенный для вида, не являющегося человеком. Альтернативно, этот отдельный вариабельный домен специфично связывает сывороточный альбумин, эндогенный для человека, со значением Κι, не более чем в 15, 20, 25, 30, 50 или до приблизительно 100 раз превышающим значение Ка, с которым он специфично связывает (т.е. перекрестно взаимодействует с) по
- 56 020464 меньшей мере один сывороточный альбумин, эндогенный для вида, не являющегося человеком. В некоторых воплощениях К, может составлять от 300 нМ до приблизительно 5 пМ. В других воплощениях отдельный вариабельный домен специфично связывает сывороточный альбумин с Ко££ по меньшей мере 5х10-1 с-1, 5х10-2 с-1, 5х10-3 с-1, 5х10-4 с-1, 5х10-5 с-1, 5х10-6 с-1, 5х10-7 с-1, 5х10-8 с-1, 5х10-9 с-1, 5х10-10 с-1 или менее, предпочтительно с Ко££ от 1 х 10-6 до 1х 10-8 с-1.
В одном воплощении этот отдельный вариабельный домен специфично связывает сывороточный альбумин, эндогенный для первого вида, не являющегося человеком, со значением К,, не более чем в 10 раз превышающим значение К,, с которым он специфично связывает (т.е. перекрестно взаимодействует с) по меньшей мере один сывороточный альбумин, эндогенный для второго вида, не являющегося человеком. Альтернативно, этот отдельный вариабельный домен специфично связывает сывороточный альбумин, эндогенный для первого вида, не являющегося человеком, со значением К,, не более чем в 15, 20, 25, 30, 50 или до приблизительно 100 раз превышающим значение К,, с которым он специфично связывает (т.е. перекрестно взаимодействует с) по меньшей мере один сывороточный альбумин, эндогенный для второго вида, не являющегося человеком. В некоторых воплощениях К, может составлять от 300 нМ до приблизительно 5 пМ. В других воплощениях отдельный вариабельный домен специфично связывает сывороточный альбумин с Ко££ по меньшей мере 5х10-1 с-1, 5х10-2 с-1, 5х10-3 с-1, 5х10-4 с-1, 5х10-5 с-1, 5х10-6 с-1, 5х10-7 с-1, 5х10-8 с-1, 5х10-9 с-1, 5х10-10 с-1 или менее, предпочтительно с Ко££ от 1 х 10-6 до 1х 10-8 с-1.
Например, такой лиганд может содержать отдельный варибельный домен иммуноглобулина, где отдельный вариабельный домен иммуноглобулина специфично связывает человеческий сывороточный альбумин и мышиный сывороточный альбумин и где период полувыведения Тв лиганда и период полувыведения Тв мышиного сывороточного альбумина в мыши-хозяине, по существу, одинаковы. В одной версии такого лиганда эпитопсвязывающий домен содержит неиммуноглобулиновый каркас, специфично связывающий человеческий сывороточный альбумин и мышиный сывороточный альбумин, и где период полувыведения Тв лиганда и период полувыведения Тв мышиного сывороточного альбумина в мыши-хозяине, по существу, одинаковы. Фраза по существу, одинаковый означает, что лиганд имеет период полувыведения Тв в мыши-хозяине, составляющий по меньшей мере 50% от периода полувыведения Тв мышиного сывороточного альбумина в мыши-хозяине, т.е. по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 105, 110, 125 и до 150% от периода полувыведения Тв мышиного сывороточного альбумина в мыши-хозяине. Неиммуноглобулиновый каркас может, возможно, содержать фрагменты отдельного вариабельного домена антитела, такие как одна или более СЭКобластей вариабельного домена антитела, включая отдельный вариабельный домен антитела, имеющий период полувыведения Тв в человеке-хозяине, составляющий по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 105, 110, 125 или до 150% от периода полувыведения Тв человеческого сывороточного альбумина в человеке-хозяине.
Например, одно воплощение представляет собой отдельный вариабельный домен, где отдельный вариабельный домен специфично связывает человеческий сывороточный альбумин и крысиный сывороточный альбумин и где период полувыведения Тв лиганда и период полувыведения Тв крысиного сывороточного альбумина в крысе-хозяине, по существу, одинаковы. В одной версии такого лиганда отдельный вариабельный связывающий домен содержит неиммуноглобулиновый каркас, специфично связывающий человеческий сывороточный альбумин и крысиный сывороточный альбумин, и где период полувыведения Тв лиганда и период полувыведения Тв крысиного сывороточного альбумина в крысехозяине, по существу, одинаковы. Фраза по существу, одинаковый означает, что лиганд имеет период полувыведения Тв в крысе-хозяине, составляющий по меньшей мере 50% от периода полувыведения Тв крысиного сывороточного альбумина в крысе-хозяине, т.е. до 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 105, 110, 125 до 150% от периода полувыведения Тв крысиного сывороточного альбумина в крысе-хозяине. Неиммуноглобулиновый каркас может, возможно, содержать фрагменты отдельного вариабельного домена антитела, такие как одна или более СГОК-области вариабельного домена антитела.
Например, лиганд может содержать отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, где отдельный вариабельный домен иммуноглобулина специфично связывает человеческий сывороточный альбумин и свиной сывороточный альбумин и где период полувыведения Тв лиганда и период полувыведения Тв свиного сывороточного альбумина в свинье-хозяине, по существу, одинаковы. В одной версии лиганда эпитопсвязывающий домен содержит неиммуноглобулиновый каркас, специфично связывающий человеческий сывороточный альбумин и свиной сывороточный альбумин, и где период полувыведения Тв лиганда и период полувыведения Тв свиного сывороточного альбумина в свинье-хозяине, по существу, одинаковы. Фраза по существу, одинаковый означает, что лиганд имеет период полувыведения Тв в свинье-хозяине, составляющий по меньшей мере 50% от периода полувыведения Тв свиного сывороточного альбумина в свинье-хозяине, т.е. до 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 105, 110, 125 до 150% от периода полувыведения Тв свиного сывороточного альбумина в свиньехозяине. Неиммуноглобулиновый каркас может, возможно, содержать фрагменты отдельного вариабель- 57 020464 ного домена антитела, такие как одна или более СЭК-области вариабельного домена антитела, включая отдельный вариабельный домен антитела.
Например, лиганд может содержать отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, где отдельный вариабельный домен иммуноглобулина специфично связывает человеческий сывороточный альбумин и сывороточный альбумин яванского макака и где период полувыведения Тв лиганда и период полувыведения Тв сывороточного альбумина яванского макака в яванском макаке-хозяине, по существу, одинаковы. В одной версии лиганда домен, связывающий сывороточный альбумин, содержит неиммуноглобулиновый каркас, специфично связывающий человеческий сывороточный альбумин и сывороточный альбумин яванского макака, и где период полувыведения Тв лиганда и период полувыведения Тв сывороточного альбумина яванского макака в яванском макаке-хозяине, по существу, одинаковы. Фраза по существу, одинаковый означает, что лиганд имеет период полувыведения Тв в яванском макакехозяине, составляющий по меньшей мере 50% от периода полувыведения Тв сывороточного альбумина яванского макака в яванском макаке-хозяине, т.е. до 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 105, 110, 125 или до 150% от периода полувыведения Тв сывороточного альбумина яванского макака в яванском макаке-хозяине.
Неиммуноглобулиновый каркас может, возможно, содержать фрагменты отдельного вариабельного домена антитела, такие как одна или более СЭК-области вариабельного домена антитела.
В одном воплощении лиганд и/или лиганд с двойной специфичностью содержит отдельный вариабельный домен, специфично связывающий сывороточный альбумин, эндогенный для человека, имеющий период полувыведения Тв в человеке-хозяине, составляющий по меньшей мере 50% от периода полувыведения Тв человеческого сывороточного альбумина в человеке-хозяине, до 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 105, 110, 125 или до 150% от периода полувыведения Тв человеческого сывороточного альбумина в человеке-хозяине. В предпочтительном воплощении отдельный вариабельный домен, специфично связывающий сывороточный альбумин, эндогенный для вида, не являющегося человеком, имеет период полувыведения Тв в его соответствующем хозяине, не являющемся человеком, составляющий по меньшей мере 50% от периода полувыведения Тв сывороточного альбумина от источника, не являющегося человеком, в его соответствующем хозяине, не являющемся человеком, до 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 105, 110, 125 или до 150% от периода полувыведения Тв сывороточного альбумина от источника, не являющегося человеком, в его соответствующем хозяине, не являющемся человеком. В предпочтительном воплощении отдельный вариабельный домен, специфично связывающий сывороточный альбумин, эндогенный для человека, и также специфично связывающий сывороточный альбумин от по меньшей мере одного вида, не являющегося человеком, имеет период полувыведения Тв в человеке-хозяине, составляющий до 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 105, 110, 125 или до 150% от человеческого сывороточного альбумина в человеке-хозяине, и период полувыведения Тв в хозяине, не являющемся человеком, составляющий до 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 105, 110, 125 или до 150% от сывороточного альбумина от источника, не являющегося человеком, в его соответствующем хозяине, не являющемся человеком. В некоторых воплощениях период полувыведения Тв отдельного вариабельного домена, специфично связывающего сывороточный альбумин, может составлять от 2 до 3 ч, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 18, 20, 22 ч, 1 сутки, 2, 3, 4, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 суток включительно, вплоть до 21 суток или более. В человеке-хозяине, а также в хозяине, не являющемся человеком, как, например, свинье-хозяине, яванском макаке-хозяине, крысе-хозяине, мышином хозяине, мыши-хозяине, период полувыведения Тв отдельного вариабельного домена, специфично связывающего сывороточный альбумин, может составлять от 2 до 3 ч, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 18, 20, 22 ч, 1 сутки, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 суток включительно, вплоть до 21 суток или более. Другие предпочтительные периоды полувыведения Тв лиганда, содержащего отдельный вариабельный домен, специфично связывающий сывороточный альбумин, включают в обезьяне-хозяине от приблизительно 3 до приблизительно 5, 6, 7 или 8 суток, включая от 2 до 3 ч, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 18, 20, 22 ч, 1 сутки, 2, 3, 4, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 суток включительно, вплоть до 21 суток. В крысе-хозяине или мыши-хозяине период полувыведения Тв отдельного вариабельного домена, специфично связывающего сывороточный альбумин, может составлять от 40 до приблизительно 75 ч и включает от 2 до 3 ч, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 18, 20, 22 ч, 1 сутки, 2, 3, 4, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 суток включительно, вплоть до 21 суток.
Отдельный вариабельный домен, специфично связывающий сывороточный альбумин, включает отдельные вариабельные домены У-каппа, выбранные, предпочтительно без ограничения, из Э0М7Н-9 Э0М7Ь-1, Э0М7Ь-8, Э0М7Ь-9, Э0М7Ь-11, Э0М7Ь-12, Э0М7Ь-13 и Э0М7Ь-14, Э0М7г-3 и Э0М7г-16, и/или те домены, которые конкурируют за связывание сывороточного альбумина, предпочтительно человеческого сывороточного альбумина, с отдельными вариабельными доменами, выбранными, предпочтительно без ограничения, из ЗАЪ7г20, ЗАЪ7г21, ЗАЪ7г22, ЗАЪ7г23, ЗАЪ7г24, ЗАЪ7г25, ЗАЪ7г26, ЗАЪ7г27, ЗАЪ7г28, ЗАЪ7г29, ЗАЪ7г30, ЗАЪ7г31, ЗАЪ7г32, ЗАЪ7г33, ЗАЪ7Ь21, ЗАЪ7Ь22, ЗАЪ7Ь23, АЪ7Ь24, АЪ7Ь25, АЪ7Ь26, 6АЪ7Ь27, ЗАЪ7Ь30 ЗАЪ7Ь31, 6АЪ7т12, 6АЪ7т16, 6АЪ7т26, ЗАЪ7г1, ЗАЪ7г3, ЗАЪ7г4, ЗАЪ7г5,
- 58 020464 йАЬ7г7, йАЬ7г8, йАЬ7г13, йАЬ7г14, йАЬ7г15, йАЬ7г16, йАЬ7г17, йАЬ7г18, йАЬ7г19, ЙАЬ7Б1, ЙАЬ7Б2, ЙАЬ7Б6, ЙАЬ7Б7, ЙАЬ7Б8, ЙАЬ7Б9, йАЬ7Б10, ЙАЬ7Б11, ЙАЬ7Б12, ЙАЬ7Б13, ЙАЬ7Б14, йАЬ7р1 и йАЬ7р2. Отдельный вариабельный домен, специфично связывающий сывороточный альбумин, может представлять собой отдельный вариабельный домен тяжелой цепи антитела, в частности, человеческий νΗ3 или νΗΗ· Упомянутый выше отдельный вариабельный домен может также дополнительно специфично связывать человеческий сывороточный альбумин с по меньшей мере 5х10-1 с-1, 5х10-2 с-1, 5х10-3 с-1, 5х10-4 с-1, 5х10-5 с-1, 5х10-6 с-1, 5х10-7 с-1, 5х10-8 с-1, 5х10-9 с-1, 5х10-10 с-1 или менее, предпочтительно с Κοίϊ от 1 х 10-6 с-1 до 1х 10-8 с-1. Отдельные вариабельные домены, специфично связывающие человеческий сывороточный альбумин и сывороточный альбумин, эндогенный для вида, не являющегося человеком, могут дополнительно связывать сывороточный альбумин, эндогенный для третьего, четвертого, пятого, шестого, седьмого, восьмого, девятого или десятого вида, не являющегося человеком. В одном неограничивающем воплощении отдельный вариабельный домен, специфично связывающий человеческий сывороточный альбумин и крысиный сывороточный альбумин, дополнительно специфично связывает сывороточный альбумин яванского макака. В другом неограничивающем воплощении отдельный вариабельный домен, специфично связывающий человеческий сывороточный альбумин и мышиный сывороточный альбумин, дополнительно специфично связывает сывороточный альбумин яванского макака.
Как описано здесь, лиганд, содержащий один отдельный вариабельный домен (мономер) или более чем один отдельный вариабельный домен (мультимер, слитый белок, конъюгат и лиганд с двойной специфичностью, как определено здесь), специфично связывающий сывороточный альбумин, может дополнительно содержать один или более объекты, выбранные, предпочтительно без ограничения, из метки, метки, дополнительного отдельного вариабельного домена, бАЬ. антитела, фрагмента антитела, маркера и лекарственного средства. Один или более из этих объектов могут быть расположены либо на С-конце, либо на Ν-конце, либо как на Ν-конце, так и на С-конце лиганда, содержащего отдельный вариабельный домен (либо отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, либо неиммуноглобулиновый отдельный вариабельный домен). Один или более из этих объектов могут быть расположены на либо С-конце, либо на Ν-конце, либо как на Ν-конце, так и на С-конце отдельного вариабельного домена, специфично связывающего сывороточный альбумин, лиганда, содержащего один отдельный вариабельный домен (мономер) или более чем один отдельный вариабельный домен (мультимер, слитый белок, конъюгат, лиганд с двойной специфичностью, как определено здесь). Неограничивающие примеры меток, которые могут быть расположены на одном или обоих из этих концов, включают НА-, Нй- или туе-метку. Объекты, включающие одну или более метки, метки и лекарственные средства могут быть связаны с лигандом, содержащим один отдельный вариабельный домен (мономер) или более чем один отдельный вариабельный домен (мультимер, слитый белок, конъюгат, лиганд с двойной специфичностью, как определено здесь), специфично связывающим сывороточный альбумин, либо непосредственно, либо через линкеры, как описано в отдельном разделе ниже.
Лиганд, содержащий один отдельный вариабельный домен (мономер) или более чем один отдельный вариабельный домен (мультимер, слитый белок, конъюгат, лиганд с двойной специфичностью, как определено здесь), специфично связывающий сывороточный альбумин или специфично связывающий как человеческий сывороточный альбумин, так и по меньшей мере один сывороточный альбумин от источника, не являющегося человеком, может специфично связывать один или более из I домена и/или II домена, и/или III домена человеческого сывороточного альбумина, как описано далее ниже. В дополнение к тому, что он содержит один или более отдельных вариабельных доменов (например, отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, связывающий сывороточный альбумин, или неиммуноглобулиновый отдельный вариабельный домен, связывающий сывороточный альбумин), специфично связывающие сывороточный альбумин, такой как человеческий сывороточный альбумин, или специфично связывающие как человеческий сывороточный альбумин, так и по меньшей мере один сывороточный альбумин от источника, не являющегося человеком, лиганд может содержать один или более дополнительные домены, способные специфично связывать антиген и/или эпитоп, отличный от сывороточного альбумина, антиген и эпитоп, выбранный из группы, состоящей из любого животного белка, включая цитокины и/или антигены, имеющие происхождение от микроорганизмов, патогенов, внутриклеточных организмов, насекомых, вирусов, водорослей и растений. Этот один или более дополнительный домен (домены), связывающий группировку, отличную от сывороточного альбумина, может представлять собой неиммуноглобулиновый связывающий домен, неиммуноглобулиновый отдельный вариабельный домен и/или отдельный вариабельный домен иммуноглобулина.
В некоторых воплощениях лиганд с двойной специфичностью, содержащий один или более отдельных вариабельных доменов (либо отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, либо неиммуноглобулиновый отдельный вариабельный домен), специфично связывающие сывороточный альбумин, такой как человеческий сывороточный альбумин, или специфично связывающие как человеческий сывороточный альбумин, так и по меньшей мере один сывороточный альбумин от источника, не являющегося человеком, может состоять из (а) отдельного вариабельного домена, специфично связывающего сывороточный альбумин, и отдельного вариабельного домена, специфично связывающего лиганд, отличный от
- 59 020464 сывороточного альбумина, где оба отдельных вариабельных домена представляют собой отдельный вариабельный домен тяжелой цепи; или (б) отдельного вариабельного домена, специфично связывающего сывороточный альбумин, и отдельного вариабельного домена, специфично связывающего лиганд, отличный от сывороточного альбумина, где оба отдельных вариабельных домена представляют собой отдельный вариабельный домен легкой цепи; или (в) отдельный вариабельный домен, специфично связывающий сывороточный альбумин, представляет собой отдельный вариабельный домен тяжелой цепи, и отдельный вариабельный домен, специфично связывающий антиген, отличный от сывороточного альбумина, представляет собой отдельный вариабельный домен легкой цепи; или (г) отдельный вариабельный домен, специфично связывающий сывороточный альбумин, представляет собой отдельный вариабельный домен легкой цепи, и отдельный вариабельный домен, специфично связывающий антиген, отличный от сывороточного альбумина, представляет собой отдельный вариабельный домен тяжелой цепи.
Также сюда включена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая любой из лигандов, описанных здесь, например лиганд, содержащий один отдельный вариабельный домен (мономер) или более чем один отдельный вариабельный домен (мультимер, слитый белок, конъюгат, лиганд с двойной специфичностью, как определено здесь), специфично связывающий сывороточный альбумин или специфично связывающий как человеческий сывороточный альбумин, так и по меньшей мере один сывороточный альбумин от источника, не являющегося человеком, или их функционально активные фрагменты. Также сюда включен его вектор и/или вектор экспрессии, клетка-хозяин, содержащая вектор, например растительная или животная клетка, и/или клеточная линия, трансформированная вектором, способ экспрессии и/или получения одного или более лигандов, содержащих один отдельный вариабельный домен (мономеров) или более чем один отдельный вариабельный домен (мультимеров, слитых белков, конъюгатов, лигандов с двойной специфичностью, как определено здесь), специфично связывающих сывороточный альбумин, или их фрагмента (фрагментов), кодируемого указанными векторами, включающий, в некоторых случаях, культивирование клеток-хозяев таким образом, что один или более лиганда или их фрагмента экспрессированы, и, возможно, получение лиганда, содержащего один отдельный вариабельный домен (мономера) или более чем один отдельный вариабельный домен (мультимера, слитого белка, конъюгата, лиганда с двойной специфичностью, как описано здесь), специфично связывающего сывороточный альбумин, из культуральной среды клеток-хозяев. Также включены способы приведения лиганда, описанного здесь, в контакт с сывороточным альбумином, включая сывороточный альбумин и/или сывороточный альбумин (альбумины) от источника, не являющегося человеком, и/или одной или более мишенями, отличными от сывороточного альбумина, где мишени включают биологически активные молекулы и включают животные белки, цитокины, как перечислено выше, и включены способы, где приведение в контакт осуществляют ш νίΙΐΌ, а также в форме введения любого из лигандов, описанных здесь, отдельному животному-хозяину или в клетку, ш νί\Ό и/или ех νί\Ό. Предпочтительно введение лигандов, описанных здесь, содержащих отдельный вариабельный домен (иммуноглобулина или неиммуноглобулиновый), направленный против сывороточного альбумина и/или сывороточного альбумина (альбуминов) от источника, не являющегося человеком, и один или более домена, направленных против одной или более мишеней, отличных от сывороточного альбумина, будет увеличивать период полувыведения, включая период полувыведения Т(К лиганда против мишени. Здесь описаны молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие лиганды, содержащие отдельные домены или их фрагменты, включая их функциональные фрагменты. Здесь описаны векторы, кодирующие молекулы нуклеиновых кислот, включая, предпочтительно без ограничения, векторы экспрессии, а также клетки-хозяева из клеточной линии или организма, содержащие один или более из этих векторов экспрессии. Также описаны способы получения любых лигандов, содержащих отдельные домены, включающие, предпочтительно без ограничения, любые из упомянутых выше нуклеиновых кислот, векторов и клеток-хозяев.
Картирование эпитопов сывороточного альбумина
Сывороточные альбумины от видов млекопитающих имеют сходную структуру, содержащую три основных домена со сходным характером свертывания и дисульфидных связей, как подчеркнуто на фиг. 25. Полагают, что белок произошел от двух тандемных дупликаций и последующей диферсификации остатков.
Структура человеческого сывороточного альбумина была выяснена рентгеновской кристаллографией с или без множества связанных лигандов.
АЮиис кТгисТиге аиб сйет1кТгу оГ йитап кегит а1Ъитт. не Х.М., Сайег Э.С.
№-11иге. 1992; 358: 209-15. ЕггаТит ш: №-11иге 1993; 364: 362.
А1опис кйнсТиге апб сйетЫгу оГ йитап кегит а1Ъитт. не Х.М., Сайег Э.С.; 1. Мо1. Вю1. 2001; 314:955-60.
Сгук1а1 кТгисТигек оГ йитап кегит а1Ъитт сотр1ехеб \\ЙН топоипкаТигаТеб апб ро1уипкаТигаТеб Гайу ас1бк. РеТйрак I., Огипе Т., Вйайасйагуа А.А., Сипу 8.; 1. Вю1. Сйет. 2001; 276: 22804-9.
Было показано, что человеческий сывороточный альбумин представляет собой сердцевидную молекулу. Отдельные домены, называемые I, II и III, являются преимущественно спиральными, и каждый из них состоит из двух субдоменов, называемых ΣΆ, ГВ, ПА, 2В, ША и ШВ. Они связаны гибкими случайными спиралями.
- 60 020464
Здесь описан лиганд. содержащий один или более отдельные вариабельные домены. специфично связывающие ΙΙ домен человеческого сывороточного альбумина. Отдельный вариабельный домен может представлять собой отдельный вариабельный домен Ун антитела. Отдельный вариабельный домен может представлять собой отдельный вариабельный домен Унн антитела. Отдельный вариабельный домен Ун может представлять собой отдельный вариабельный домен Ун3. Отдельный вариабельный домен Ун3 может представлять собой человеческий отдельный вариабельный домен Ун3. Лиганд может. альтернативно или дополнительно, содержать отдельный вариабельный домен. представляющий собой отдельный вариабельный домен антитела ν-каппа. включая один из следующих: ООМ7Н-1. ЭОМ711-8. ЭОМ7й9. ЭОМ711-11. ЭОМ711-12. ЭОМ711-13. ЭОМ711-14. ЭОМ7г-3 и ЭОМ7г-16. или отдельный вариабельный домен антитела ν-каппа. имеющий домен. имеющий аминокислотную последовательность, приблизительно на 80. 85. 90. 91. 92. 93. 94. 95. 96. 97. 98. 99% или более идентичную им.
Отдельный вариабельный домен антитела может включать набор из четырех каркасных областей (РК) КаЬа!. кодируемых сегментами генов каркасных областей Ун. предпочтительно Ун3, антител зародышевого типа. Каркасная область Ун3 выбрана из группы. состоящей из ЭР47. ЭР38 и ЭР45. Отдельный вариабельный домен антитела может включать набор из четырех каркасных областей (РК) КаЬа!. кодируемых сегментами генов каркасных областей Уй. предпочтительно ν-каппа. антител зародышевого типа. Предпочтительно каркасная область ν-каппа представляет собой ЭРК9.
Лиганд. содержащий один или более отдельные вариабельные домены. специфично связывающие II домен человеческого сывороточного альбумина, может дополнительно содержать один или более доменов, способных специфично связывать группировку, отличную от сывороточного альбумина, и может дополнительно содержать один объект или более. включая одно или более из метки. метки и лекарственного средства. Один или более домены. способные специфично связывать группировку, отличную от сывороточного альбумина, могут представлять собой отдельный вариабельный домен иммуноглобулина. Также здесь описан лиганд. содержащий один или более отдельные вариабельные домены. специфично связывающие II домен человеческого сывороточного альбумина, содержащие неиммуноглобулиновый каркас и СОК1-. СЭК2- и/или СОК3-области. или где по меньшей мере одна из СЭК1-. СЭК2- и/или СОК3-областей имеет происхождение из отдельного вариабельного домена отдельного вариабельного домена антитела, связывающего II домен человеческого сывороточного альбумина. Неиммуноглобулиновые каркасы включают, преимущественно без ограничения, СТЬА-4. липокалин. стафилококковый белок А (ЗРА). АГйЬойу™. Ауйнег™. СгоЕ1 и фибронектин.
Лиганд. содержащий один или более отдельных вариабельных доменов. специфично связывающие II домен человеческого сывороточного альбумина, содержит те домены. которые специфично связывают человеческий сывороточный альбумин с Кй менее или равной 300 нМ. Лиганд. содержащий один или более отдельные вариабельные домены. специфично связывающий II домен человеческого сывороточного альбумина, может дополнительно содержать один или более объекты. включая одно или более из метки. метки и лекарственного средства. Метка может включать одну или более из С-концевых НА- или тус-меток или Ν-концевых НА- или тус-меток.
Лиганд. содержащий один или более отдельных вариабельных доменов. специфично связывающий II домен человеческого сывороточного альбумина, и который может дополнительно содержать один или более домены. способные специфично связывать группировку, отличную от сывороточного альбумина, и который может дополнительно содержать один или более объекты. включая одно или более из метки. метки и лекарственного средства, может связывать через по меньшей мере один из его отдельных вариабельных доменов антиген. включая. предпочтительно без ограничения, рецептор цитокинов, рецептор ЕРО. АроЕ. Аро-ЗАА. βΩΝ'. кардиотрофин-1. ЕСР. рецептор ЕСР. ΕNА-78, эотаксин. эотаксин-2. Ехойик-2. ЕроК. кислый РСР. основной РСР. фактор роста фибробластов-10. лиганд РЬТ3. фракталкин (СХ3С). С-СЗР. СМ-СЗР. СР-в1, инсулин. ^Ν-γ. ЮРЧ. ЮР-й, ГО-1а. ГО-^. ГО-2. ГО-3. ГО-4, ГО-5.
ГО-6. ГО-7. ГО-8 (72 а.а.). ГО-8 (77 а.а.). ГО-9. ГО-10. ГО-11. ГО-12. ГО-13. ГО-15. ГО-16. ГО-17. ГО-18 (ЮГО). ингибин α. ингибин β. ГР-10. фактор роста кератиноцитов-2 (КСР-2). КСР, лептин. ЬГР. лимфотактин. мюллерову ингибирующую субстанцию, моноцитарный колониеингибирующий фактор. моноцитарный атрактантный белок. М-СЗР. МЭС (67 а.а.). МЭС (69 а.а.). МСР-1 (МСАГ). МСР-2. МСР-3. МСР-4. МЭС (67 а.а.). МЭС (69 а.а.). МЮ. МЬР-1а. МГО-ЦР МГО-3а. МГО^. МГО-4, фактор. ингибирующий миелоидных предшественников, 1 типа (МРГО-1). NΆР-2, неуртурин. фактор роста нервов. β-ΝΟΡ, ЭТ-3. ЭТ-4, онкостатин М. РВСГ-АА. РВСГ-АВ. РВСВ-ВВ. РР-4, КАЭТЕЗ, 3ΌΡ1α. 3ΌΡ1β. ЗСР. ЗССР. фактор стволовых клеток (ЗСР). ТАКС. ТСР-α. ТСР-β. ТСР^, ТСР^, фактор некроза опухоли (ТОТ) ТОТ-а, ТОТ'ф, рецептор ТОТ1 1 типа. рецептор ТОТ1 2 типа. Т№Ь-1. ТРО. УЕСР, рецептор УЕСР 1 типа. рецептор УЕСР 2 типа. рецептор УЕСР 3 типа. ССР-2. СКО/МСЗА, СКО-β. СКО-γ. нСС1. Ь309, нЕК 1. нЕК
2. нЕК 3 и нЕК 4. СЭ4. человеческие рецепторы хемокинов СХСК4 или ССК5. неструктурный белок 3 типа (Ν83) вируса гепатита С. Т№-альфа. IдΕ, ГО№гамма. ММР-12. СЕА. Н. ру1оп. ТВ. вирус гриппа. гепатита Е. ММР-12. интернализуемые рецепторы, сверхэкспрессируемые на определенных клетках. такие как рецептор эпидермального фактора роста (ЕСРК), рецептор ЕгВЬ2 на опухолевых клетках. интернализуемый клеточный рецептор, рецептор ЬПЬ. рецептор РСР2, рецептор ЕгВЬ2, рецептор трансферри- 61 020464 на, рецептор ΡΌΟΡ, рецептор УЕОР, ΡδтΑ^, белок внеклеточного матрикса, эластин, фибронектин, ламинин, а1-антитрипсин, тканевой фактор, ингибирующий протеазы, ΡΌΚ1, О8К1, Вай, каспазу-9, Рогккеай, антиген неПсоЬасЮг ру1оп, антиген МусоЬайегшт (иЬегсЫохХ и антиген вируса гриппа.
Лиганд, содержащий один или более отдельных вариабельных доменов, специфично связывающий II домен человеческого сывороточного альбумина, и который может дополнительно содержать один или более домены, способные специфично связывать группировку, отличную от сывороточного альбумина, представляет собой, по меньшей мере, лиганд с двойной специфичностью, который может иметь одну из следующих структур: (а) каждый указанный отдельный вариабельный домен, специфично связывающий
II домен сывороточного альбумина, и указанный отдельный вариабельный домен, специфично связывающий группировку, отличную от сывороточного альбумина, представляет собой отдельный вариабельный домен тяжелой цепи антитела; или (б) каждый указанный отдельный вариабельный домен, специфично связывающий II домен сывороточного альбумина, и указанный отдельный вариабельный домен, специфично связывающий группировку, отличную от сывороточного альбумина, представляет собой отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела; или (в) указанный отдельный вариабельный домен, специфично связывающий II домен сывороточного альбумина, представляет собой отдельный вариабельный домен тяжелой цепи антитела, и указанный отдельный вариабельный домен, специфично связывающий антиген, отличный от сывороточного альбумина, представляет собой отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела; или (г) указанный отдельный вариабельный домен, специфично связывающий II домен сывороточного альбумина, представляет собой отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела, и указанный отдельный вариабельный домен, специфично связывающий антиген, отличный от сывороточного альбумина, представляет собой отдельный вариабельный домен тяжелой цепи антитела. Включены молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие любые лиганды или их фрагменты, включая их функциональные фрагменты, описанные здесь, векторы, включая, предпочтительно без ограничения, векторы экспрессии, и клетки-хозяева любого типа клеточной линии или организма, содержащие один или более из этих векторов экспрессии и/или способы получения любых лигандов, включающие, предпочтительно без ограничения, любые из упомянутых выше нуклеиновых кислот, векторов и клеток-хозяев.
Сывороточный альбумин имеет длительный период полувыведения в сыворотке по сравнению с другими белками сыворотки вместе с прямой зависимостью между концентрацией в сыворотке и фракционной интенсивностью катаболизма (т.е. чем выше концентрация сывороточного альбумина (8А), тем большее количество деградирует), общее свойство с ЦО. Недавно было выяснено, что как у ЦО, так и у сывороточного альбумина одинаковый механизм рециклинга, опосредованный неонатальным Рсрецептором РсКп. РсКп является членом семейства молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС) I типа, состоящим из гетеродимера мембранно заякоренной цепи Εί','ΚΟΤ и не являющегося мембранно связанным бета-2-микроглобулина. Мышиные нокаутные мутанты либо по РсКп, либо по бета-2микроглобулину не экспрессируют функциональных РсКп и демонстрируют увеличенную интенсивность биосинтеза сывороточного альбумина (увеличение приблизительно на 20%) и повышенный катаболизм сывороточного альбумина, приводящий к 40% снижению уровня сывороточного альбумина с более коротким периодом полувыведения (СЬаийЬгу еΐ а1. 2005). Было показано, что у людей мутации бета-2-микроглобулина приводят к сильному снижению уровней функционального РсКп и, в конечном счете, к недостаточности ЦО и гипоальбуминемии, характеризующейся уменьшенным периодом полувыведения н8А в сыворотке (\Уаш еΐ а1. 2006, ΡNΑ8).
Без желания быть связанными теорией, предложенный механизм реутилизации, опосредованной РсКп, является следующим.
1. Белки плазмы подвергаются пиноцитозу клетками эндотелия, выстилающими все кровеносные сосуды и, возможно, клетками с пиноцитарной активностью из внесосудистого компартмента. Эта стадия является неспецифической и происходит поглощение всех циркулирующих белков. РсКп имеет очень низкую аффинность к альбумину (и (дО) при сывороточном рН, приблизительно при рН 7,4.
2. После пиноцитоза в везикулах происходит закисление до рН 5,0. В кислых условиях РсКп имеет более высокую аффинность к альбумину и связывает альбумин и также ЦО. Таким образом, альбумин и ЦО связываются с рецептором РсКп. РсКп связывает человеческий сывороточный альбумин в области в
III домене через область, отличную от области, связывающей ЦО.
3. Происходит сортировка, посредством которой большинство белков, не связанных с рецепторами, подвергаются сортировке в эндосому, где большинство белков будут направлены на деградацию. Связанные с рецептором альбумин и ЦО подвергаются сортировке в везикулу, направляемую к поверхности клетки и, таким образом, сберегаемую от деградации.
4. Везикула, направленная к клеточной поверхности, затем либо сливается с клеточной поверхностью, либо, кратко, сливается с клеточной мембраной. В этих условиях рН эндосомы увеличивается до приблизительно рН 7,4, аффинность РсКп к альбумину снижается, и альбумин высвобождается обратно в циркуляцию.
Таким образом, авторы изобретения могут определить четкий набор желаемых параметров для любого белка, связывающего 8А, для того, чтобы он имел максимальный период полувыведения. Эти пара- 62 020464 метры могут быть ясно проиллюстрированы с использованием реутилизационного рецептора сывороточного альбумина РсРп в качестве модели, хотя будут использованы также другие рецепторы, опосредующие длительный период полувыведения:
аффинность связывания сывороточного альбумина будет предпочтительно такой, что белок, связывающий §А, не диссоциирует от сывороточного альбумина при прохождении клубочковой фильтрации в почке, минимизируя, таким образом, потери с мочой, и/или связывание 8А не будет предпочтительно оказывать отрицательное воздействие на связывание сывороточного альбумина с любыми рецепторами, обусловливающими поддержание уровней сывороточного альбумина в циркуляции, поскольку это будет ингибировать рециклинг и, таким образом, снижать период полувыведения как сывороточного альбумина, так и белка, связывающего δΛ; таким образом, йАЬ, связывающие 8А, предпочтительно связывают эпитоп, отличный от эпитопа, связываемого РсРп на III домене Н8А, и комплекс δΛ/йАЬ предпочтительно также способен связывать РсРп, и/или связывание с δΛ будет предпочтительно сохраняться при условиях, при которых рецептор и комплекс связанный δΛ/белок, связывающий §А, подвергается сортировке и рециклингу; было показано, что эндосомальный рН приближается к рН 5,0, следовательно, желательно стабильное связывание йАЬ с сывороточным альбумином как при рН 7,4, так и при рН 5,0.
Как показано в примере 15 ниже, большинство йАЬ связывают 2 домен Н8А, и, следовательно, ожидают, что они не будут конкурировать со связыванием человеческого сывороточного альбумина с РсРп. Два йАЬ (ΌΘΜ7Π-27 и ΌΘΜ7Π-30) связывают III домен.
йАЬ против §А, сохраняющее достаточную аффинность к §А в диапазоне рН от 7,4 до 5,0
В дополнение к аффинности к 8А, а также в отсутствие конкуренции с образованием комплексов §А:РсРи, специфичные в отношении сывороточного альбумина йАЬ будут предпочтительно сохранять аффинность к §А в диапазоне рН от рН 7,4 в сыворотке до рН 5,0 в эндосоме для получения полного преимущества РсРп-опосредованного пути реутилизации.
В этом диапазоне рН только гистидиновые остатки и боковые цепи аминокислот с отклоненной рКа, вероятно, изменят свое состояние протонирования. Если боковые цепи аминокислот вносят существенный вклад в энергию связывания комплекса, можно ожидать, что изменение рН от одной крайней точки до другой крайней точки диапазона может приводить к снижению аффинности связывания комплекса. Без желания быть связанными теорией это будет, в свою очередь, приводить к увеличению вероятности того, что йАЬ, специфичное в отношении §А, скорее пойдет по пути деградации, чем будет вызволено посредством РсРп-опосредованного пути реутилизации.
Таким образом, для связывающего 8А А1ЬийАЬ™ (йАЬ, специфично связывающего сывороточный альбумин) желательно выбрать такое, у которого характеристики связывания сывороточного альбумина значимо не изменяются при изменении рН (в диапазоне от 5,0 до 7,4). Непосредственным способом подтверждения этого будет анализ аминокислотных последовательностей йАЬ против §А на отсутствие гистидиновых остатков в СОР. Как показано ниже, для такого свойства могут быть предусмотрены несколько способов селекции.
Например, первый раунд селекции проводят с интактным фаговым репертуаром йАЬ с использованием иммобилизированного человеческого сывороточного альбумина в условиях, где рН буфера представляет собой рН 7,4 (например, забуференный фосфатом физиологический раствор (ΡΒδ)). Выделенную и амплифицированную фаговую популяцию затем подвергают второму раунду селекции, где рН инкубационного буфера составляет 5,0. Смену буферов и рН, возможно, повторяют в других раундах для поддержания селекционного давления для связывания йАЬ с Н$А при обоих рН.
Во втором примере все раунды селекции проводят с интактным фаговым репертуаром йАЬ с использованием иммобилизированного человеческого сывороточного альбумина в условиях, где рН буфера представляет собой рН 7,4 (например, ΡΒδ). Тем не менее, сразу после промывания несвязанного фага с использованием ΡΒδ (или ΡΒδ, дополненного Т\\ееп) и перед элюированием связанного фага добавляют дополнительную стадию промывки/инкубации при рН 5,0 в течение длительного периода времени (например, до 4 ч). В течение этого времени фаг, на котором представлены йАЬ, не способные связывать δА при рН 5,0 (но способные связывать при рН 7,4), отделяют от иммобилизированного δА. После второй серии стадий промывки (при рН 5,0 с (без) Т\\ееп) связанный фаг выделяют и анализируют.
В третьем примере все раунды селекции проводят с интактным фаговым репертуаром йАЬ с использованием иммобилизированного человеческого сывороточного альбумина в условиях, где рН буфера представляет собой рН 7,4 (например, ΡΒδ). Наилучшие йАЬ-кандидаты (т.е. способные к связыванию при рН 7,4 и рН 5,0) затем устанавливают посредством скрининга. Обычно гены, кодирующие йАЬ, выделяют от пула селектируемого фага, субклонируют в вектор экспрессии, направляющий растворимое йАЬ в супернатант культур Е.соП. Отдельные клоны собирают, выращивают по отдельности в лунках титрационного микропланшета и индуцируют для экспрессии. Супернатанты (или очищенные йАЬз) затем непосредственно наносят на чип Βϊηοθγο для определения тех йАЬ, которые демонстрируют аффинность к иммобилизированному сывороточному альбумину. Каждый супернатант подвергают скринингу на связывание (главным образом по кривой скорости диссоциации на сенсограмме) с ЖА в условиях,
- 63 020464 где рН буфера для проведения эксперимента составляет либо 7,4, либо 5,0. Следует отметить, что скрининг связывания !АЬ на Взатоге может также быть использован как предпочтительный способ для идентификации лучших !АЬ из двух вышеописанных примеров.
Здесь описан лиганд, содержащий отдельный вариабельный домен, как определено здесь, где отдельный вариабельный домен специфично связывает сывороточный альбумин как при естественном рН сыворотки, так и при рН внутриклеточной везикулы. Естественный рН сыворотки составляет приблизительно 7 (например, 7,4), и указанный рН внутриклеточной везикулы может варьировать от приблизительно 4,8 до 5,2, или может представлять собой рН приблизительно 5. В одном воплощении отдельный вариабельный домен может специфично связывать сывороточный альбумин в диапазоне рН приблизительно от 7 до 5 или при рН 7,4. Без желания быть связанными теорией, дополнительная характеристика этого лиганда состоит в том, что его отдельный вариабельный домен, специфично связывающий сывороточный альбумин, по существу, не диссоциирует от сывороточного альбумина при прохождении клубочковой фильтрации в почке. Без желания быть связанными теорией, дополнительная характеристика этого лиганда состоит в том, что его отдельный вариабельный домен, специфично связывающий сывороточный альбумин, по существу, не препятствует связыванию ΡсВη с сывороточным альбумином. Этот отдельный вариабельный домен может представлять собой отдельный вариабельный домен антитела; отдельный вариабельный домен антитела может представлять собой домен УН3 и/или отдельный вариабельный домен антитела может представлять собой домен У-каппа. Этот отдельный вариабельный домен может содержать неиммуноглобулиновый каркас, например каркасы СТЬА-4, липокалиновые каркасы, каркасы §рА, Λίί^Ьο!у™, ОгоЕ1, Аухп;!™ или фибронектиновые каркасы, и может содержать одну или более из СИВ1, СИВ2 и/или СИВ3 из отдельного вариабельного домена антитела, предпочтительно, но не обязательно, специфично связывающего сывороточный альбумин. Отдельный вариабельный домен (домены) этого лиганда может специфично связывать человеческий сывороточный альбумин и/или, включая сывороточный альбумин от одного или более видов, например, человека, крысы, обезьяны, свиньи, кролика, хомяка, мыши или козы. Внутриклеточный компартмент может представлять собой любой внутриклеточный компартмент любой клетки любого животного, включая эндосомальный компартмент или внутриклеточную везикулу, либо отпочковывающуюся везикулу. Эндосомальный компартмент может иметь рН приблизительно 5 или 5,0. Лиганды, описанные здесь, могут содержать один или более отдельные вариабельные домены, включая домены иммуноглобулинов и/или неиммуноглобулиновые домены, где связывание сывороточного альбумина с отдельным вариабельным доменом, по существу, не оказывает конкурентного ингибирования на связывание ΡсВη с сывороточным альбумином. Эти один или более отдельные вариабельные домены могут предпочтительно специфично связывать сывороточный альбумин с равновесной константой диссоциации (Κ!), меньшей или равной 300 нМ.
Здесь описан способ селекции лиганда, содержащего отдельный вариабельный домен, содержащего один отдельный вариабельный домен (мономера) или более чем один отдельный вариабельный домен (мультимера, слитого белка, конъюгата, лиганда с двойной специфичностью, как определено здесь), специфично связывающего, сывороточный альбумин, где отдельный вариабельный домен специфично связывает человеческий сывороточный альбумин при естественном рН сыворотки, где отдельный вариабельный домен не оказывает конкурентного ингибирования на связывание человеческого сывороточного альбумина с ΡсВη и где отдельный вариабельный домен специфично связывает человеческий сывороточный альбумин при рН внутриклеточного компартмента, включающий стадии: (а) селекции лигандов, содержащих отдельный вариабельный домен, не связывающий области человеческого сывороточного альбумина, связывающие ΡсВη; (б) селекции, из лигандов, селектированных на стадии (а), лигандов, содержащих отдельный вариабельный домен, связывающий сывороточный альбумин при указанном естественном рН сыворотки; (в) селекции лигандов, селектированных на стадии (б), на лиганды, содержащие отдельный вариабельный домен, связывающий сывороточный альбумин при рН указанного внутриклеточного компартмента. Альтернативно, стадии (а) и (б) можно поменять местами следующим образом: (а) селекция лигандов, содержащих отдельный вариабельный домен, связывающий человеческий сывороточный альбумин при указанном естественном рН сыворотки; (б) селекция, из лигандов, селектированных на стадии (а), лигандов, содержащих отдельный вариабельный домен, связывающий человеческий сывороточный альбумин вне областей Н8А, связывающих ΡсВη; и (в) селекция, из лигандов, селектированных на стадии (б), лигандов, связывающих сывороточный альбумин при указанном рН указанного внутриклеточного компартмента. Также описан способ селекции лиганда, содержащего отдельный вариабельный домен, где отдельный вариабельный домен специфично связывает человеческий сывороточный альбумин при естественном рН сыворотки, где отдельный вариабельный домен не оказывает конкурентного ингибирования на связывание человеческого сывороточного альбумина с ΡсВη и где отдельный вариабельный домен специфично связывает человеческий сывороточный альбумин при рН внутриклеточного компартмента, включающий стадии: (а) селекции лигандов, содержащих отдельный вариабельный домен, не связывающий области человеческого сывороточного альбумина, связывающие ΡсВη; (б) селекции, из лигандов, селектированных на стадии (а), лигандов, содержащих отдельный вариабельный домен, связывающий сывороточный альбумин при указанном естественном рН сыворотки; и (в) генетической модификации отдельного вариабельного домена стадии (б) таким образом, чтобы он
- 64 020464 связывал сывороточный альбумин при указанном рΗ указанного внутриклеточного компартмента. Альтернативно, стадии (а) и (б) можно поменять местами следующим образом: (а) селекция лигандов, содержащих отдельный вариабельный домен, связывающий сывороточный альбумин при указанном естественном рΗ сыворотки; (б) селекция, из лигандов, селектированных на стадии (а), лигандов, содержащих отдельный вариабельный домен, не связывающий области человеческого сывороточного альбумина, связывающие РсКп; и (в) генетическая модификация отдельного вариабельного домена стадии (б) таким образом, чтобы он связывал сывороточный альбумин при указанном рΗ указанного внутриклеточного компартмента.
Исследование для определения того, что отдельный вариабельный домен не оказывает конкурентного ингибирования на связывание человеческого сывороточного альбумина с РсКп. Конкурентный эксперимент В1асоте может быть использован для определения того, оказывает ли отдельный вариабельный домен конкурентное ингибирование на связывание сывороточного альбумина с РсКп. Один экспериментальный протокол для такого примера представляет собой следующий. После покрытия сенсорного чипа СМ5 (В1асоте АВ) при 25°С приблизительно 1100 резонансными единицами (КИ) очищенного РсКп при рΗ 7,4, человеческий сывороточный альбумин (ЖА) наносят на антигенную поверхность в одной концентрации (например, 1 мкМ) сам по себе и в комбинации с серийными разведениями смесей, каждая из которых содержит ЖА и возрастающие количества рассматриваемого отдельного вариабельного домена. Получаемые КИ связывания определяют для ЖА самого по себе и каждой из смесей ЖА/отельный вариабельный домен. При сравнении связанных КИ ЖА самого по себе со связанными КИ ЖА + отдельный вариабельный домен можно будет видеть, конкурирует ли РсКп с отдельным вариабельным доменом за связывание ЖА. Если он конкурирует, то с увеличением концентрации отдельного вариабельного домена в растворе КИ ЖА, связанного с РсКп, будут уменьшаться. Если конкуренции нет, то добавление отдельного вариабельного домена не будет оказывать влияния на то, какое количество ЖА связывается с РсКп. Это конкурентное исследование может, возможно, быть повторено при рΗ 5,0 для отдельного вариабельного домена, связывающего ΗАδ при рΗ 5,0, для определения того, оказывает ли отдельный вариабельный домен конкурентное ингибирование на связывание сывороточного альбумина с РсКп при рΗ 5,0.
Эти лиганды, имеющие отдельный вариабельный домен, содержащий один отдельный вариабельный домен (мономер) или более чем один отдельный вариабельный домен (мультимер, слитый белок, конъюгат, лиганд с двойной специфичностью, как определено здесь), специфично связывающий сывороточный альбумин, где отдельный вариабельный домен специфично связывает сывороточный альбумин как при естественном рΗ сыворотки, так и при рΗ внутриклеточной везикулы, могут дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный отдельный вариабельный домен, где каждый дополнительный отдельный вариабельный домен специфично связывает антиген, отличный от сывороточного альбумина, при естественном рΗ сыворотки, но не связывает антиген при рΗ внутриклеточной везикулы. Естественный рΗ сыворотки составляет приблизительно 7,4, и рΗ указанной внутриклеточной везикулы варьирует от приблизительно 4,8 до 5,2, и в некоторых воплощениях рΗ указанной внутриклеточной везикулы составляет приблизительно 5.
Способ, основанный на изложенных выше замыслах, включает применение биспецифичного связывающего агента с аффинностью к сывороточному альбумину для увеличения периода полувыведения и аффинностью к желаемому антигену-мишени, как описано выше, для направления связанного антигена на деградацию или рециклинг. Как описано выше, группировку, связывающую сывороточный альбумин, селектируют таким образом, что аффинность связывания высока при рΗ 5,0 таким образом, что молекула будет отсортирована, чтобы не быть направленной на деградацию в эндосоме посредством РсКпопосредованного процесса. Группировку, связывающую желаемый антиген-мишень, затем селектируют с применением сходной методики, как описано выше, за исключением того, что вместо селекции на высокую аффинность связывания при рΗ 7,4 и рΗ 5, как описано выше, проводят селекцию на высокую аффинность связывания при рΗ 7,4 и низкую или нулевую аффинность к антигену-мишени при рΗ 5. Одним способом достижения этого является селекция группировок с гистидинами на контактной поверхности. Слитый белок из 2 молекул затем получают обычными молекулярно-биологическими методиками, либо химической дериватизацией и перекрестным сшиванием, либо генетическим слиянием. Результатом является увеличение активности данного А1ЬибАЬ™ (,АЬ, специфично связывающего сывороточный альбумин) 1п νί\Ό, разработкой δА-связывающего ,АЬ, связывающего δА при рΗ 5, имеющего в то же время бАЬ-партнера, связывающего лиганд, имеющего низкую или нулевую аффинность при рΗ
5. Без желания быть связанными теорией, после эндосомального рециклинга молекула-мишень будет высвобождена и направлена в эндосому для деградации и разрушена, в то время как АЬибАЬ™ (,АЬ, специфично связывающее сывороточный альбумин) рециклирует со связыванием свежего лиганда посредством РсКп-опосредованного рециклинга. В этом способе предложено ключевое преимущество над связанными с полиэтиленгликолем (ПЭГилированными) молекулами или другими технологиями увеличения периода полувыведения, где этот метаболический путь недоступен для регенерации. Предположительно, в этих случаях связанный лиганд просто расположен на ПЭГилированной группировке и занима- 65 020464 ет ее.
Здесь описан способ направления антигена на деградацию, включающий введение лиганда, имеющего по меньшей мере один отдельный вариабельный домен, где отдельный вариабельный домен специфично связывает сывороточный альбумин как при естественном рН сыворотки, так и при рН внутриклеточной везикулы, и дополнительно имеющий по меньшей мере один дополнительный отдельный вариабельный домен, где отдельный вариабельный домен связывает антиген, отличный от сывороточного альбумина, при естественном рН сыворотки, но не связывает антиген при рН внутриклеточной везикулы, направляя, таким образом, антиген, отличный от сывороточного альбумина, на деградацию. Также здесь описан лиганд, дополнительно содержащий по меньшей мере один дополнительный отдельный вариабельный домен, где указанный отдельный вариабельный домен специфично связывает антиген, отличный от сывороточного альбумина, при естественном рН сыворотки, но не связывает указанный антиген при рН внутриклеточной везикулы.
Селекция бАЬ ίη νίίΐΌ в присутствии метаболитов
Лиганды, описанные здесь, включают лиганд, содержащий отдельный вариабельный домен, содержащий один отдельный вариабельный домен (мономер) или более чем один отдельный вариабельный домен (например, мультимер, слитый белок, конъюгат и лиганд с двойной специфичностью, как определено здесь), специфично связывающий сывороточный альбумин, где отдельный вариабельный домен специфично связывает человеческий сывороточный альбумин и где связывание лекарственных средств и/или метаболитов, и/или малых молекул с одной или более областями сывороточного альбумина существенно не блокирует специфичное связывание сывороточного альбумина отдельным вариабельным доменом. Одна или более области человеческого сывороточного альбумина включают область Биб1оу 1 и область Биб1о\у 2. Одна или более области могут быть расположены на любой комбинации одного или более доменов человеческого сывороточного альбумина, выбранных из группы, состоящей из Ι домена, ΙΙ домена и ΙΙΙ домена.
Лиганды, описанные здесь, включают лиганд, содержащий отдельный вариабельный домен, содержащий один отдельный вариабельный домен (мономер) или более чем один отдельный вариабельный домен (например, мультимер, слитый белок, конъюгат и лиганд с двойной специфичностью, как определено здесь), специфично связывающий сывороточный альбумин, где отдельный вариабельный домен специфично связывает человеческий сывороточный альбумин и где специфичное связывание сывороточного альбумина указанным отдельным вариабельным доменом не изменяет характеристики связывания сывороточного альбумина для лекарственных средств и/или метаболитов, и/или малых молекул, связываемых с БА. В одном воплощении отдельный вариабельный домен лиганда связывает сывороточный альбумин как в присутствии, так и в отсутствие лекарственного средства, метаболита или другой малой молекулы. И в другом воплощении специфичное связывание сывороточного альбумина указанным отдельным вариабельным доменом, по существу, не изменяет характеристики связывания сывороточного альбумина для лекарственных средств и/или метаболитов, и/или малых молекул, связываемых с БА в природе ίη νί\Ό, включая, предпочтительно без ограничения, те лекарственные средства и/или метаболиты, и/или малые молекулы, описанные в Еазапо е1 а1. (2005), 57(12):787-96. Т1е ехЦаогбтагу Пдапб Ьтбтд ргорегйез оГ 1штап зегит а1Ьит1п, и ВеПисск С. е1 а1. (2002), 9(15): 1463-81, Ксуегзкк апб сονа1еηΐ Ьтбтд оГ бгидз Ю 1штап зегит а1Ьитт: те11юбо1одка1 арргоасБез апб рБузю1одюа1 гс1еуапсе.
Лекарственные средства, и/или метаболиты, и/или малые молекулы, связываемые с БА, могут перекрываться или могут не перекрываться с лекарственными средствами, и/или метаболитами, и/или малыми молекулами, по существу, не ингибирующими или не конкурирующими с сывороточным альбумином за связывание с отдельным вариабельным доменом. Лекарственные средства и/или метаболиты включают, предпочтительно без ограничения, варфарин, ибупрофен, витамин В6, тета-билирубин, гемин, тироксин, жирные кислоты, ацетальдегид, метаболиты жирных кислот, ацилглюкуронид, метаболиты билирубина, галотан, салицилат, бензодиазепины и 1-О-гемифиброзил-В-Э-глюкуронид. Это ингибирование или конкуренция малых молекул с сывороточным альбумином за связывание с отдельным вариабельным доменом может происходить как посредством прямого вытеснения, так и посредством аллостерических эффектов, как описано для изменений связывания одних малых молекул, индуцированных связыванием другой малой молекулы, см. Азсеп/ί е1 а1. (2006), М1т Ксу. Меб. С1ет. 6(4):483-9. А11оз1епс тоби1аЬоп оГ бгид Ьтбтд Ю Ьитап зегит а1Ьит1п, и СЬитап ί. е1 а1. (2005), ί. Мо1. Вю1. 353(1):38-52 Б1гис1ига1 Ьаз1з оГ Не бгид-Ьшбшд Ю Ьитап зегит а1Ьитт. В одном воплощении малая молекула, либо сама по себе, либо совместно с одной или более другими малыми молекулами и/или метаболитами, и/или белками, и/или лекарственными средствами, связывает сывороточный альбумин. В другом воплощении малая молекула, либо сама по себе, либо совместно с одной или более другими малыми молекулами и/или метаболитами, и/или белками, и/или лекарственными средствами, по существу, не ингибирует или не конкурирует с сывороточным альбумином за связывание с отдельным вариабельным доменом. В другом воплощении малая молекула, либо сама по себе, либо совместно с одной или более другими малыми молекулами и/или метаболитами, и/или белками, и/или лекарственными средствами, существенно ингибирует или конкурирует с сывороточным альбумином за связывание с отдельным вариабельным доменом.
Отдельный вариабельный домен может представлять собой отдельный вариабельный домен анти- 66 020464 тела. Отдельный вариабельный домен антитела может представлять собой домен Ун3. Отдельный вариабельный домен антитела может представлять собой домен У-каппа. Отдельный вариабельный домен может содержать один или более неиммуноглобулиновые каркасы. Неиммуноглобулиновый каркас может включать одно или более из, предпочтительно без ограничения, СТЬА-4, липокалина, δρΑ, СгоЕ1 и фибронектина и включает АГПЬойу'™ и Ауипег™.
Здесь описан способ селекции отдельного вариабельного домена, связывающего сывороточный альбумин, включающий селекцию первого отдельного вариабельного домена по его способности связывать сывороточный альбумин в присутствии одного или более метаболитов и/или лекарственных средств, где селекцию проводят в присутствии одного или более метаболитов и/или лекарственных средств. Также здесь описан способ получения лиганда с двойной специфичностью, содержащего первый отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, имеющий первую специфичность связывания в отношении сывороточного альбумина в присутствии одного метаболита и/или лекарственного средства, и второй отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, имеющий вторую специфичность связывания, включающий стадии: а) селекции первого вариабельного домена по его способности связывать первый эпитоп в присутствии одного или более метаболитов и/или лекарственных средств; б) селекции второго вариабельного домена по его способности связывать второй эпитоп; в) комбинирования вариабельных доменов и г) селекции лиганда по его способности связывать сывороточный альбумин в присутствии указанных одного или более метаболитов и/или лигандов и способности связывать указанные вторые эпитопы. Этот способ может также включать стадию, где первый вариабельный домен селектируют для связывания указанного первого эпитопа в отсутствие комплементарного вариабельного домена и/или где первый вариабельный домен селектируют для связывания указанного первого эпитопа в присутствии третьего комплементарного вариабельного домена, где указанный третий вариабельный домен отличается от указанного второго вариабельного домена. Эти стадии селекции могут быть проведены в присутствии смеси метаболитов и/или лекарственных средств, и/или белков, и/или малых молекул. Стадии селекции могут также быть проведены следующим образом: (а) селекция отдельных вариабельных доменов, связывающих сывороточный альбумин в присутствии первого метаболита и/или лекарственного средства, и/или малой молекулы; и (б) из доменов, селектированных на стадии (а) селектируют домен в присутствии второго метаболита и/или лекарственного средства, и/или малой молекулы. Также включен способ получения лиганда с двойной специфичностью, имеющего первый отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, имеющий первую специфичность связывания в отношении сывороточного альбумина в присутствии одного метаболита и/или лекарственного средства, и/или малой молекулы, и второй отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, имеющий вторую специфичность связывания, включающий стадии: а) селекции первых вариабельных доменов по их способности связывать сывороточный альбумин в присутствии одного или более метаболитов и/или лекарственных средств, и/или малых молекул; б) селекции вторых вариабельных доменов по их способности связывать эпитоп; в) комбинирования вариабельных доменов для предоставления лигандов, содержащих первый и второй отдельный вариабельный домен; и г) селекции, из лигандов предоставленных на стадии (в), лиганда по его способности связывать сывороточный альбумин в присутствии одного или более метаболитов и/или лекарственных средств и его способности связывать указанные эпитопы, с получением посредством этого лиганда с двойной специфичностью. В одном воплощении первый вариабельный домен селектируют для связывания сывороточного альбумина в отсутствие комплементарного вариабельного домена. В другом воплощении первый вариабельный домен селектируют для связывания первого эпитопа в присутствии комплементарного вариабельного домена, где комплементарный вариабельный домен отличается от второго вариабельного домена.
Здесь описан лиганд, содержащий отдельный вариабельный домен, где отдельный вариабельный домен специфично связывает сывороточный альбумин ίη νίϋΌ как при рн 7, так и при рн внутриклеточного компартмента, и где отдельный вариабельный домен представляет собой отдельный вариабельный домен, не встречающийся в природе. Также здесь описан лиганд, содержащий отдельный вариабельный домен антитела, где отдельный вариабельный домен антитела специфично связывает сывороточный альбумин ίη У1!го как при рн 7, так и при рн внутриклеточного компартмента. В одном воплощении рн внутриклеточного компартмента составляет от 4,8 до 5,2. В другом воплощении связывание сывороточного альбумина с отдельным вариабельным доменом антитела, по существу, не ингибирует связывание РсКи с сывороточным альбумином, как определено в ίη уйго конкурентном исследовании поверхностного плазмонного резонанса. В другом воплощении отдельный вариабельный домен антитела представляет собой отдельный вариабельный домен тяжелой цепи антитела. В дополнительных воплощениях отдельный вариабельный домен тяжелой цепи антитела может представлять собой отдельный вариабельный домен Ун3, и отдельный вариабельный домен Ун3 может представлять собой человеческий отдельный вариабельный домен Ун3. В другом воплощении отдельный вариабельный домен антитела представляет собой отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела. В одном воплощении отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела представляет собой отдельный вариабельный домен У-каппа, и в другом воплощении представляет собой отдельный вариабельный домен У-лямбда.
В другом воплощении отдельный вариабельный домен содержит одну или более из СЭК-областей
- 67 020464 антитела, выбранных из группы, состоящей из СОЕ1, СЭЕ2 и СЭЕ3. В другом воплощении отдельный вариабельный домен содержит каркас, выбранный из группы, состоящей из СТЬА-4, липокалина, стафилококкового белка А (8рА), СгоЕ1, СгоЕк, трансферрина и фибронектина. В одном воплощении связывание сывороточного альбумина с отдельным вариабельным доменом, по существу, не конкурирует со связыванием ЕсЕп с сывороточным альбумином, и в другом воплощении отдельный вариабельный домен антитела специфично связывает сывороточный альбумин с равновесной константой диссоциации (Кб) менее или равной 300 нМ.
В другом воплощении отдельный вариабельный домен антитела дополнительно включает по меньшей мере один дополнительный отдельный вариабельный домен антитела, где дополнительный отдельный вариабельный домен антитела специфично связывает антиген, отличный от сывороточного альбумина, при рН 7, но не связывает антиген при рН внутриклеточного компартмента. Также здесь описан способ направления антигена на деградацию у индивида, включающий введение индивиду лиганда, содержащего отдельный вариабельный домен, такой как отдельный вариабельный домен антитела, специфично связывающий сывороточный альбумин ίη νίΐτο как при рН 7, так и при рН внутриклеточного компартмента, и дополнительно содержащего по меньшей мере один дополнительный отдельный вариабельный домен антитела, включающий отдельный вариабельный домен, например отдельный вариабельный домен антитела, где антиген, отличный от сывороточного альбумина, направляется на деградацию.
В одном воплощении лигандов по изобретению связывание предопределенного лекарственного средства и/или метаболита и/или малой молекулы с одной или более областями человеческого сывороточного альбумина не блокирует специфичное связывание человеческого сывороточного альбумина с отдельным вариабельным доменом антитела. В этих воплощениях дополнительный отдельный вариабельный домен антитела может представлять собой отдельный вариабельный домен тяжелой цепи антитела или отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела, содержащий одну или более СЭЕ антитела, выбранные из группы, состоящей из СЭЕ1, СЭЕ2 и/или СЭЕ3. Отдельный вариабельные домены могут содержать каркас, выбранный из группы, состоящей из СТЬА-4, липокалина, стафилококкового белка А (8рА), СгоЕ1, СгоЕ$, трансферрина и фибронектина.
Другое воплощение лиганда, описанного здесь, представляет собой лиганд, содержащий отдельный вариабельный домен, где отдельный вариабельный домен представляет собой отдельный вариабельный домен, не встречающийся в природе, где отдельный вариабельный домен специфично связывает сывороточный альбумин ίη νίΐτο как при рН 7, так и при рН внутриклеточного компартмента, где связывание предопределенного лекарственного средства и/или метаболита и/или малой молекулы с одной или более областями человеческого сывороточного альбумина не блокирует специфичное связывание человеческого сывороточного альбумина отдельным вариабельным доменом антитела, где одна или более области человеческого сывороточного альбумина включают область 8πά1ογ· 1 и область διι<ΐ1ο\γ 2 или одна или более области расположены на одном или более доменах человеческого сывороточного альбумина, выбранных из группы, состоящей из I домена, II домена и III домена.
Линкеры
Соединение А1Ьи0АЬ™ (бАЬ, специфично связывающего сывороточный альбумин) (доменного антитела или отдельного вариабельного домена против сывороточного альбумина) с другой биологически активной группировкой может быть осуществлено методиками рекомбинантного конструирования. В большинстве случаев гены, кодирующие оба интересующих белка, слиты в одной рамке считывания. Можно рассматривать несколько форматов, где доменное антитело против сывороточного альбумина расположено либо на Ν-конце слитого белка (т.е. А1Ьи0АЬ™-У, где Υ представляет собой биологически активный полипептид), либо на С-конце слитого белка (т.е. 2-А1ЬийАЬ™, где Υ представляет собой биологически активный пептид). В некоторых случаях можно рассматривать слияние более чем одного биологически активного полипептида с А1ЬийАЪ™ (бАЬ, специфично связывающим сывороточный альбумин), что делает возможным несколько конструкций слитого белка. Например, слитый белок может представлять собой следующее: Ζ-Υ-А1ЪиάАЪ™, 2-А1ЪиάАЪ™-Υ или АЪийАЬ™^^
Во всех этих слитых молекулах два полипептида ковалентно связаны друг с другом через по меньшей мере одну пептидную связь. В наиболее простом способе АШибЛЬ™ (бАЬ, специфично связывающее сывороточный альбумин) и биологический полипептид (полипептиды) связаны непосредственно. Таким образом, соединение между Ай^АЬ™ (бАЬ, специфично связывающим сывороточный альбумин) и полипептидом будет следующим:
а) для Ай^АЬ™ (бАЬ, специфично связывающего сывороточный альбумин) на С-конце, где Ай^АЬ™ представляет собой νκ:хххОЩ хххАЩ хххАЩ χχχνπν хххОШ
- 68 020464 хххИУУ хххЕ^ хххЕ^ где МЬи!АЬ™ (!АЬ, специфично связывающее сывороточный альбумин) представляет собой УХ:хххР§У хххР§А ххх8УЕ ххх88Е ххх8УУ хххЬРУ хххОРУ хххОЬУ хххОАУ хххМЕМ xxx^ΤУ хххОАО где МЬи!АЬ™ (!АЬ, специфично связывающее сывороточный альбумин) представляет собой УН (например, человеческий УН):хххОУС) хххРМр хххЕУО хххОП хххРУГ хххОЕ-О где МЬи!АЬ™ (!АЬ, специфично связывающее сывороточный альбумин) представляет собой УНН (например, вариабельный домен тяжелой цепи представителя семейства верблюдовых):хххЕУО хххОУС) хххИУР хххОУ1<
ххх.АУС)
б) для А1Ьи!АЬ™ (!АЬ, специфично связывающего сывороточный альбумин) на Ν-конце, где МЬи!АЬ™ (!АЬ, специфично связывающее сывороточный альбумин) представляет собой Ук:ΚУΕIΚxxx
1<ЕЕП<ххх
1<УОП<ххх
ВЬЕЖххх
ЕКВххх где МЬи!АЬ™ (!АЬ, специфично связывающее сывороточный альбумин) представляет собой УХ:1<УОУЕххх
Κ^^У^xxx рЬПУЪххх где МЬи!АЬ™ (!АЬ, специфично связывающее сывороточный альбумин) представляет собой УН (например, человеческий УН):УГУ§§ххх где МЬи!АЬ™ (!АЬ, специфично связывающее сывороточный альбумин) представляет собой УНН (например, вариабельный домен тяжелой цепи представителя семейства Верблюдовых):УГУ§§ххх ххх представляет собой первые или последние три аминокислоты (первого) биологически активного полипептида, слитого с А1Ьи!АЬ™ (!АЬ, специфично связывающим сывороточный альбумин).
Тем не менее, возможны случаи, когда получение рекомбинантного слитого белка, сохраняющего функциональные активности обоих полипептидов, может быть облегчено соединением кодирующих генов мостиковым сегментом ДНК, кодирующим пептидный линкер, сплайсированный между полипептидами, соединенными в тандеме. Оптимальную длину линкера обычно определяют эмпирически: она может быть небольшой, как одна аминокислота, или увеличиваться до 50 аминокислот. Были предложены линкеры различных конструкций, и они хорошо известны в данной области техники. Следующие примеры призваны представить обширный, но не исчерпывающий, список возможных линкерных способов.
1. Гибкие линкеры.
Г ибкие линкеры разработаны для придания стабильной вторичной структуры при соединении двух полипептидных группировок, таким образом, делая возможным ряд конформаций слитого белка. Эти линкеры по своей природе предпочтительно гидрофильны для предотвращения их взаимодействия с од- 69 020464 ним или обоими слитыми полипептидами. Обычно в этих линкерах преобладают малые полярные остатки, такие как глицин и серин, для увеличения гибких и гидрофильных свойств пептидного каркаса соответственно. Длина этих линкеров различна, и ее лучше всего определять либо эмпирически, либо с помощью компьютерных 30-способов. В большинстве случаев предпочтительная длина линкера будет наименьшей совместимой с хорошей экспрессией, хорошей растворимостью и полным восстановлением интересующих нативных функций и структур. Ввиду их гибких свойств гибкие линкеры могут составлять хорошие субстраты для эндогенных протеаз. В большинстве случаев, если это не является желаемым свойством, гибкие линкеры лишены таких аминокислот, как заряженные аминокислоты или крупные гидрофобные/ароматические аминокислоты, легко распознаваемые эндогенными протеазами с широкой субстратной специфичностью. В дополнение, предпочтительно избегают цистеиновых остатков, поскольку свободные цистеины могут взаимодействовать друг с другом с образованием цистеинов, приводя посредством этого к (1) связыванию двух слитых белков через линкеры и/или (2) неправильной экспрессии/фолдингу слитого белка, если один или более биоактивные полипептиды содержат один или более цистеиновый остаток (цистеиновое запутывание).
Примерами гибких линкеров являются: (1) линкеры, богатые глицином, на основе повторения мотива (ОООО8)у, где у составляет по меньшей мере 1, хотя у может составлять 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9 или более (см. международные публикации РСТ № ЕР 0753551, И8 5258498, ЕР 0623679), (2) линкеры, богатые серином, на основе повторения мотива (8888О)у, где у составляет по меньшей мере 1, хотя у может составлять 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9 или более (см. международные публикации РСТ № ЕР 0573551, И8 5525491).
2. Ригидные линкеры.
Ригидные линкеры разработаны для придания стабильной вторичной структуры при соединении двух полипептидных группировок, ограничивая, таким образом, ряд конформаций слитого белка. Такие линкеры обычно придают спиральную структуру с несколькими изгибами. Снова, длина этих линкеров различна, и ее лучше всего определять либо эмпирически, либо с помощью компьютерных способов. Основной причиной выбора ригидных линкеров является поддержание наибольшего расстояния между полипептидами слитого белка. Это особенно уместно, когда оба полипептида имеют тенденцию к образованию гетероагрегатов. В силу их структуры ригидные линкеры могут также быть более устойчивы к протеолитической деградации, предлагая посредством этого преимущество при введении ш νί\Ό.
Примеры ригидных линкеров приведены в международных публикациях РСТ № \УО 00/24884 (например, 888А8А88А, О8РО8РО или АТТТО88РОРТ), И8 6132992 (например, спиральные пептидные линкеры).
3. Природные линкеры.
Природные линкеры представляют собой полипептидные последовательности (различной длины), которые, напротив, не являются синтетическими, т.е. полипептидные последовательности, составляющие линкеры, обнаруживают в природе. Природные линкеры могут быть либо гибкими, либо ригидными, и могут быть очень разнообразны по аминокислотной последовательности и составу. Степень их устойчивости к протеолизу зависит от белков, от которых они имеют происхождение, и биологической среды, в которой эти белки существуют в природе (внеклеточной, внутриклеточной, прокариотической, эукариотической и т.п.). Один класс линкеров особенно важен для разработки биологических лекарственных средств у человека: линкеры на основе пептидов, обнаруживаемых в человеческих белках. В самом деле, такие линкеры по природе неиммуногенны или очень слабо иммуногенны, и, таким образом, потенциально безопаснее для терапии у человека.
Примерами природных линкеров являются: (1) КЕ8О8У88ЕрЬАррК8ЬО (см. Вйб еТ а1. (1988), 8с1епсе, 242, 423-426), (2) последовательности, соответствующие шарнирному домену иммуноглобулинов, лишенных легких цепей (см. натегк-СакТегтап еТ а1. (1993), №йиге, 363, 446-448 апб РСТ йиегпаВопа1 РиЪНсаТюп №: \УО 096/34103). Примерами линкеров для использования с доменными антителами против альбумина (например, человеческими, гуманизированными, человеческими камелизированными (сатеП/еб) доменными антителами или доменными антителами на основе Унн представителей семейства верблюдовых) являются ЕКчПЧЙЧ/РКРОРОРОРОРкРОРкРНРНСТСРкСР и ОТЖУСКСРКСР. Другие линкеры, имеющие происхождение от человеческих шарнирных областей или шарнирных областей представителей семейства верблюдовых, раскрыты в ЕР 0656946, включенной сюда посредством ссылки. Линкеры, имеющие происхождение от шарнирных областей, могут иметь различную длину, например от 0 до приблизительно 50 аминокислот, включая 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 или 49 аминокислот.
При использовании здесь лекарственное средство относится к любому соединению (например, малой органической молекуле, нуклеиновой кислоте, полипептиду), которое может быть введено индивиду для оказания полезного, терапевтического или диагностического эффекта посредством связывания и/или изменения функции биологической молекулы-мишени у индивида. Молекула-мишень может представлять собой эндогенную молекулу-мишень, кодируемую геномом индивида (например, фермент, рецептор, фактор роста, цитокин, кодируемый геномом индивида) или экзогенную молекулу-мишень, ко- 70 020464 дируемую геномом патогенна (например, фермент, кодируемый геномом вируса, бактерии, гриба, нематоды или другого патогена).
Лекарственная композиция может представлять собой конъюгат, в котором лекарственное средство ковалентно или нековалентно связано с полипептидной связывающей группировкой. Лекарственное средство может быть ковалентно или нековалентно связано с полипептидной связывающей группировкой непосредственно или косвенно (например, посредством подходящего линкера и/или нековалентного связывания комплементарных партнеров по связыванию (например, биотина и авидина)). При использовании комплементарных партнеров по связыванию один из партнеров по связыванию может быть ковалентно связан с лекарственным средством непосредственно или через подходящую линкерную группировку, и ковалентный партнер по связыванию может быть ковалентно связан с полипептидной связывающей группировкой непосредственно или через подходящую линкерную группировку. Когда лекарственное средство представляет собой полипептид или пептид, лекарственная композиция может представлять собой слитый белок, где полипептид или пептид, лекарственное средство и полипептидная связывающая группировка являются отдельными частями (группировками) непрерывной полипептидной цепи. Как описано здесь, полипептидные связывающие группировки и полипептидные лекарственные группировки могут быть непосредственно связаны друг с другом через пептидную связь или связаны через подходящую аминокислоту, или пептидный или полипептидный линкер.
Сниженная иммуногенность
Здесь описан способ снижения иммуногенности фармацевтического агента, включающий модификацию указанного агента таким образом, что агент дополнительно содержит область отдельного вариабельного домена, где отдельный вариабельный домен специфично связывает сывороточный альбумин ш νί\Ό и/или ех νί\Ό, и где агент может включать лекарственное средство, метаболит, лиганд, антиген и белок. Сывороточный альбумин может представлять собой человеческий сывороточный альбумин. Отдельный вариабельный домен может представлять собой отдельный вариабельный домен иммуноглобулина. Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина может представлять собой отдельный вариабельный домен антитела Ун. Отдельный вариабельный домен Ун может представлять собой отдельный вариабельный домен Ун3. Отдельный вариабельный домен Ун3 может представлять собой человеческий отдельный вариабельный домен Ун3. Отдельный вариабельный домен антитела может представлять собой отдельный вариабельный домен антитела У-каппа или У-лямбда. Отдельный вариабельный домен антитела может включать набор из четырех каркасных областей (РК) КаЬай кодируемых сегментами генов каркасных областей Ун3 антител зародышевого типа. Каркасная область Ун3 выбрана из группы, состоящей из ΌΡ47, ΌΡ38 и ΌΡ45. Отдельный вариабельный домен антитела может включать набор из четырех каркасных областей (РК) КаЬай кодируемых сегментами генов каркасных областей У-каппа антител зародышевого типа. Неограничивающим примером каркасной области каппа является ΌΡΚ9. Отдельный вариабельный домен может содержать иммуноглобулиновый или неиммуноглобулиновый каркас, содержащий СОК1-, СЭК2- и/или СОК3-области, где по меньшей мере одна из СОК1-, СЭК2- и СЭК3 -областей имеет происхождение из отдельного вариабельного домена антитела, связывающего сывороточный альбумин. Неиммуноглобулиновый каркас может включать, предпочтительно без ограничения, СТЬА-4, липокалин, 8рА, АТйЬойу™, ОгоЕ1, Ауипег™ и фибронектин. Сывороточный альбумин может представлять собой человеческий сывороточный альбумин. Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина и/или неиммуноглобулиновый отдельный вариабельный домен может специфично связывать человеческий сывороточный альбумин с Κ,ι менее 300 нМ. Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина и/или неиммуноглобулиновый отдельный вариабельный домен может специфично связывать как человеческий сывороточный альбумин, так и один или более сывороточных альбумина от источника, не являющегося человеком, со значениями Щ, отличающимися друг от друга не более чем в 10 раз. Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина и/или неиммуноглобулиновый отдельный вариабельный домен может специфично связывать как человеческий сывороточный альбумин, так и один или более сывороточных альбумина от источника, не являющегося человеком, и где период полувыведения Тβ лиганда и период полувыведения Тβ человеческого сывороточного альбумина у человекахозяина, по существу, одинаковы. Кроме того, отдельный вариабельный домен иммуноглобулина и/или неиммуноглобулиновый отдельный вариабельный домен может специфично связывать II домен человеческого сывороточного альбумина. Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина и/или неиммуноглобулиновый отдельный вариабельный домен может дополнительно специфично связывать сывороточный альбумин как при естественном рн сыворотки, так и при рн внутриклеточной везикулы. Связывание лекарственных средств и/или метаболитов с одной или более областями сывороточного альбумина, по существу, не блокирует специфичное связывание сывороточного альбумина отдельным вариабельным доменом иммуноглобулина и/или неиммуноглобулиновым отдельным вариабельным доменом. В одном воплощении специфичное связывание сывороточного альбумина отдельным вариабельным доменом не изменяет характеристики связывания сывороточного альбумина для лекарственных средств и/или метаболитов, и/или малых молекул, связываемых с 8А. В одном воплощении способ модификации агента приводит к образованию модифицированного агента, имеющего формулу включая: а-(Х)п1-Ь- 71 020464 (У)п2-с-(2)п3-й или а-^)п3-Ь-^)п2-с-(Х)п-й, где X представляет собой полипептидное лекарственное средство, имеющее специфичность связывания в отношении первой мишени; Υ представляет собой отдельный вариабельный домен, например отдельный вариабельный домен антитела, специфично связывающий сывороточный альбумин ш У1уо и/или ех У1уо; Ζ представляет собой полипептидное лекарственное средство, имеющее специфичность связывания в отношении второй мишени; а, Ь, с и й независимо представляют собой полипептид, содержащий от одной до нескольких аминокислот, или отсутствуют; п1 представляет собой от 1 до приблизительно 10; п2 представляет собой от 1 до приблизительно 10; п3 представляет собой от 0 до приблизительно 10. В другом воплощении, где п1 и п2 представляют собой 1 и п3 представляет собой 0, X не включает цепь антитела или фрагмент цепи антитела.
Здесь описан способ снижения иммуногенности фармацевтического агента, включающий модификацию агента таким образом, что агент дополнительно содержит отдельный вариабельный домен, где отдельный вариабельный домен специфично связывает сывороточный альбумин, где отдельный вариабельный домен представляет собой отдельный вариабельный домен, не встречающийся в природе, и где агент выбран из группы, состоящей из лекарственного средства, метаболита, лиганда, антигена и белка. Также здесь описан способ снижения иммуногенности фармацевтического агента, включающий модификацию агента таким образом, что агент дополнительно содержит отдельный вариабельный домен антитела, где отдельный вариабельный домен антитела специфично связывает сывороточный альбумин и где агент выбран из группы, состоящей из лекарственного средства, метаболита, лиганда, антигена и белка. В одном воплощении отдельный вариабельный домен антитела представляет собой отдельный вариабельный домен тяжелой цепи антитела, например отдельный вариабельный домен νφ3 антитела или человеческий отдельный вариабельный домен антитела. В другом воплощении отдельный вариабельный домен антитела представляет собой отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела, например отдельный вариабельный домен ν-каппа или ν-лямбда антитела. В одном воплощении отдельный вариабельный домен содержит СЭР1-, СЭР2- и СОР3-области, где по меньшей мере одна из СЭР1-, СЭР2- и СЭР3-областей имеет происхождение из вариабельного домена антитела, специфично связывающего сывороточный альбумин, и возможно, дополнительно содержит каркас, выбранный из группы, состоящей из СТЬА-4, липокалина, стафилококкового белка А ^рА), СгоЕ1, СгоЕз, трансферрина и фибронектина. В другом воплощении этих способов отдельный вариабельный домен, например отдельный вариабельный домен антитела, специфично связывает человеческий сывороточный альбумин с Кй менее 300 нМ, и в другом воплощении этих способов отдельный вариабельный домен, например отдельный вариабельный домен антитела, специфично связывает человеческий сывороточный альбумин и один или более сывороточные альбумины от источника, не являющегося человеком, со значениями Кй, отличающимися друг от друга не более чем в 10 раз. В другом воплощении этих способов отдельный вариабельный домен, например отдельный вариабельный домен антитела, специфично связывает человеческий сывороточный альбумин и сывороточный альбумин от источника, не являющегося человеком, и период полувыведения Тв лиганда и период полувыведения Тв человеческого сывороточного альбумина у человека-хозяина, по существу, одинаковы. В другом воплощении этих способов отдельный вариабельный домен, например отдельный вариабельный домен антитела, специфично связывает II домен человеческого сывороточного альбумина. В другом воплощении этих способов отдельный вариабельный домен, например отдельный вариабельный домен антитела, специфично связывает сывороточный альбумин как при рН 7, так и при рН внутриклеточного компаИрзтомбернеттае.ние дополнительно описано, лишь с целью иллюстрации, в следующих примерах. При использовании здесь в целях номенклатуры йАЬ человеческий ΤΝΡα называют ТАР1 и рецептор человеческого ΤΝΡα 1 типа (рецептор р55) называют ТАР2.
Пример 1. Селекция зсРу антитела с двойной специфичностью (К8), направленного против человеческого сывороточного альбумина (ЖА) и β-галактозидазы (в-да1).
В этом примере раскрыт способ получения антитела с двойной специфичностью, направленного против в-да1 и ЖА, в котором репертуар вариабельных доменов νκ, связанных с доменом (модельным доменом) зародышевого типа, селектируют для связывания в-да1, и репертуар вариабельных доменов У^ связанных с доменом (модельным доменом) зародышевого типа, селектируют для связывания ЖА. Селектированные вариабельные домены ЖА и νκ в-да1 затем комбинируют и антитела селектируют для связывания в-да1 и ЖА. ЖА является белком, увеличивающим период полувыведения, обнаруженным в крови людей.
В этом эксперименте использовали четыре фаговые библиотеки человеческих антител.
Библиотека 1 Библиотека 2 Библиотека 3 Библиотека 4 νκ зародышевой линии/ОУТ \/н νκ зародышевой линии/ΝΝΚ \/н νΗ зародышевой линииЮ\/Т Ун \/н зародышевой линии/ΝΝΚ Ун
8,46x107 9,64x107 1,47x10® 1,45x10®
Все библиотеки основаны на одной человеческой каркасной области для (ν3-23/ΌΡ47 и 1Н4Ь) и νκ (Θ12/Θ2/ΏΡΚ9 и ίκ 1) с разнообразием боковых цепей, заключенным в областях, определяющих ком- 72 020464 плементарность (СЭК2 и СЭК3).
Библиотека 1 и библиотека 2 содержат последовательность модельного Ук, в то время как в последовательности УН разнообразие заключено в положениях Н50, Н52, Н52а, Н53, Н55, Н56, Н58, Н95, Н96, Н97 и Н98 (кодированных ЭУТ или ΝΝΡ соответственно) (фиг. 1). Библиотека 3 и библиотека 4 содержат последовательность модельного УН, в то время как в последовательности Ук разнообразие заключено в положениях Ь50, Ь53, Ь91, Ь92, Ь93, Ь94 и Ь96 (кодированных ЭУТ или ΝΝΟ соответственно) (фиг. 1). Библиотеки представлены в формате фагмиды ρ1Т2/§сΡν (фиг. 2) и были предварительно селектированы для связывания лигандов общего типа, белка А и белка Ь, таким образом, что большинство клонов в неселектированных библиотеках являются функциональными. Размеры библиотек, показанные выше, соответствуют размерам после предварительной селекции. Библиотека 1 и библиотека 2 были смешаны перед селекциями на антигене для образования библиотеки отдельных УН/модельных Ук, и библиотека 3 и библиотека 4 были смешаны для образования библиотеки отдельных Ук/модельных УН.
Проводили три раунда селекции на в-да1 с использованием библиотеки Ук/модельных УН и проводили три раунда селекции на Н8А с использованием библиотеки УН/модельных Ук. В случае в-да1 фаговые титры увеличивались с 1,1 х 106 в первом раунде до 2,0х108 в третьем раунде. В случае Н8А фаговые титры увеличивались с 2х104 в первом раунде до 1,4х109 в третьем раунде. Селекции проводили, как описано Огйй!Ь е! а1. (1993), за исключением того, что использовали хелперный фаг КМ13 (содержащий белок р111 с протеазным сайтом расщепления между доменами Ό2 и Ό3) и фаг элюировали с использованием 1 мг/мл трипсина в РВ§. Добавление трипсина приводит к расщеплению белков р111, имеющих происхождение от хелперного фага (но не тех, которые имеют происхождение от фагмиды), и элюированию связанных слитых белков 8сΡν-фаг посредством расщепления в метке с-тус (фиг. 2), обеспечивая посредством этого дальнейшее обогащение для фагов, экспрессирующих функциональные 8сΡν, и соответствующее уменьшение фона (КЙ8!еп8еп & ^ш!ег, Ро13шд & Эе81дп 3: 321-328, Χι1 9, 1998). Селекции проводили с использованием иммунологических пробирок, покрытых либо Н8А, либо в-да1 в концентрации 100 мкг/мл.
Для проверки связывания 24 колонии от третьего раунда каждой селекции подвергали скринингу моноклональным фаговым ЕЬ1§А. Фаговые частицы получали, как описано Нат8оп е! а1., Ме!Ьоб8 Еп/уто1. 1996; 267:83-109. 96-луночные планшеты для ЕЬ1§А покрывали 100 мкл Н8А или в-да1 в концентрации 10 мкг/мл в РВ§ на ночь при 4°С. Следовали стандартному протоколу ЕЬ1§А (НоодепЪоот е! а1., 1991) с использованием выявления связанного фага конъюгатом анти-М13-НКР. Селекция клонов давала ЕЬРЗА-сигналы, превышающие 1,0 с использованием 50 мкл супернатанта.
Затем готовили образцы ДНК от библиотеки УН/модельных Ук, селектированной на Н8А, и от библиотеки Ук/модельных УН, селектированной в-да1, с использованием набора Ц1Аргер 8рш Мииргер (Οίадеп). Для оценки большей части разнообразия образцы ДНК готовили от каждого из трех раундов селекции и затем объединяли друг с другом для каждого из антигенов. Затем образцы ДНК расщепляли 8а11/№!1 в течение ночи при 37°С. После гель-очистки фрагменты цепи Ук из библиотеки Ук/модельных УН, селектированной на в-да1, лигировали вместо цепей модельных Ук библиотеки УН/модельных Ук, селектированной на Н8А, с образованием библиотеки из 3,3х109 клонов.
Эту библиотеку затем либо селектировали на Н8А (первый раунд) и в-да1 (второй раунд), селекция Н§А/в-да1, либо на в-да1 (первый раунд) и Н8А (второй раунд), селекция в-да1/Н§А. Селекции проводили, как описано выше. В каждом случае после второго раунда 48 клонов тестировали на связывание Н8А и в-да1 моноклональным фаговым ЕЬ1§А (как описано выше) и ЕЬ1§А растворимых фрагментов 8сΡν. Растворимые фрагменты антител получали, как описано Нат8оп е! а1. (1996), и следовали стандартному протоколу ЕЬ1§А, НоодепЪоот е! а1. (1991), №с1ею Аш38 Ке8., 19: 4133, за исключением того, что в качестве блокирующего буфера использовали 2% Тетееи/РВЗ и связанные 8сΡν выявляли белком Ь-НКР. Три клона (Е4, Е5 и Е8) от селекции селекции Н§А/в-да1 и два клона (К8 и К10) от селекции в-да1/Н§А были способны связывать оба антигена. 8сΡν от этих клонов амплифицировали с использованием ПЦР и секвенировали, как описано 1дпаГошсЬ е! а1. (1999), 1. Мо1 Вю1 1999 №)ν 26; 294(2):457-65, с использованием праймеров ЬМВ3 и рНЕ№ес|. При анализе последовательностей было выявлено, что все клоны были идентичны. Таким образом, для дальнейшей работы был выбран только клон, кодирующий антитело с двойной специфичностью (К8) (фиг. 3).
- 73 020464
Пример 2. Описание связывающих свойств антитела К8.
Во-первых, связывающие свойства антитела К8 были охарактеризованы моноклональным фаговым ЕЫЗА. 96-луночный планшет покрывали 100 мкл ΗδΑ и β-β;ιΙ наряду с щелочной фосфатазой (ΑΡδ), бычьим сывороточным альбумином (ВЗА), арахисовым агглютинином, лизоцимом и цитохромом с (для проверки на перекрестную реактивность) в концентрации 10 мкг/мл в РВЗ на ночь при 4°С. Фагмиду от клона К8 извлекали с использованием КМ13, как описано Наткой е! а1. (1996), и супернатант (50 мкл), содержащий фаг, анализировани непосредственно. Следовали стандартному протоколу ЕЫЗА (Ноо§еиЬоош е! а1., 1991) с использованием выявления связанного фага конъюгатом анти-М13-НКР. Было обнаружено, что антитело с двойной специфичностью К8 связывало ΗδΑ и β-β;ιΙ при их представлении на поверхности фага с сигналами абсорбции, превышающими 1,0 (фиг. 4). Также наблюдали сильное связывание с ΒδΑ (фиг. 4). Поскольку НЗА и ВЗА на 76% гомологичны на аминокислотном уровне, не удивительно, что антитело К8 распознавало оба этих структурно родственных белка. Перекрестной реактивности с другими белками выявлено не было (фиг. 4).
Во-вторых, связывающие свойства антитела К8 тестировали в ЕЫЗА растворимого κεΡν. Образование растворимого фрагмента 5сР\ индуцировали ΙΡΤΟ, как описано Наткой е! а1. (1996). Для определения уровней экспрессии κεΡν К8 растворимые фрагменты антител очищали из супернатанта 50 мл индукций с использованием колонок белок А-сефароза, как описано Наг1о\\ апб Ьапе, АпбЬоб1ек: а ЬаЬотаЮгу Мапиа1 (1988), Со1б δρήη§ НатЬот. Затем измеряли оптическую плотность при 280 нм (00280) и вычисляли концентрацию белка, как описано ЗашЬтоок е! а1. (1989). δεΡν К8 получали в супернатанте в концентрации 19 мг/л.
Затем проводили ЕЫЗА растворимого κοΡν с использованием известных концентраций фрагмента антитела К8. 96-луночный планшет покрывали 100 мкл ΗδΑ, ΒδΑ и β-βίΐ! в концентрации 10 мкг/мл и 100 мкл белка А в концентрации 1 мкг/мл. Наносили 50 мкл серийных разведений κεΡν К8 и связанные фрагменты антитела выявляли белком Ь-НКР. Результаты ЕЫЗА подтвердили двойную специфичность антитела К8 (фиг. 5).
Для подтверждения того, что связывание β-βίΐΐ определяет домен Ук, а связывание НЗА/ВЗА - домен νΗ κεΡν антитела К8, домен Ук выделяли из ДНК κεΡν К8 расщеплением ЗаИ/ΝοΐΙ и лигировали в расщепленный ЗаИ/ΝοΐΙ вектор р1Т2, содержащий цепь модельного Ун (фиг. 1 и 2). Характеристики связывания полученного клона К8УК/модельный Ун анализировали посредством ЕЫЗА растворимого κοΡν. Образование растворимого фрагмента κεΡν индуцировали ΙΡΤΟ, как описано Наткой е! а1. (1996), и супернатант (50 мкл), содержащий ксРу, анализировали непосредственно. ЕЫЗА растворимого κοΡν проводили, как описано в примере 1, и связанные κεΡν выявляли белком Ь-НРР. Результаты ЕЫЗА показали, что этот клон был еще способен связывать β-βίΐΙ. в то время как связывания с ВЗА не было (фиг. 6).
Пример 3. Селекция антител из одного домена Ун, направленных против антигенов А и В, и антител из одного домена Ук, направленных против антигенов СиО.
В этом примере описан способ получения антител из одного домена Ун, направленных против антигенов А и В, и антител из одного домена Ук, направленных против антигенов СиО, селекцией репертуаров интактных отдельных вариабельных доменов антител для связывания этих антигенов в отсутствие комплементарных вариабельных доменов.
Селекции и описания связывающих клонов проводят, как описано ранее (см. пример 5, РСТ/СВ 02/003014). Для дальнейшей работы выбраны четыре клона:
УН1 - Ун против А;
Ун2 - Ун против В;
УК1 - Ук против С;
Ук2 - Ук против ϋ.
Способы, описанные выше в примерах 1-3, могут быть применены так, как они описаны, для образования димерных молекул, содержащих комбинации доменов Ун (т.е. лиганды Ун-Ун) и комбинации доменов Уь (лиганды Уь-Уь).
Пример 4. Образование и описание антител ЗсРу с двойной специфичностью (Ун1/Ун2, направленных против антигенов А и В, и Ук1/Ук2, направленных против антигенов С и ϋ).
В этом примере показано, что антитела ЗсР\ с двойной специфичностью (Ун1/Ун2, направленные против антигенов А и В, и Ук1/Ук2, направленные против антигенов СиО) могут быть образованы комбинированием отдельных доменов Ук и Ун, селектированных против соответствующих антигенов в векторе ЗсРу.
Для образования антитела с двойной специфичностью Ун1/Ун2, отдельный домен УН1 выделяют из 1 вектора вариабельного домена (фиг. 7) расщеплением ΝοοΙ/ΧΙιοΙ и лигируют в расщепленный ΝοοΙ/ΧΙιοΙ 2 вектор вариабельного домена (фиг. 7) для образования Ун1/2 вектор вариабельного домена. Отдельный домен Ун2 амплифицируют с использованием ПЦР из 1 вектора вариабельного домена с использованием праймеров для введения сайта рестрикции ЗаИ в 5'-конец и сайта рестрикции ΝοΐΙ в 3'конец. ПЦР-продукт затем расщепляют ЗаИ/ΝοίΙ и лигируют в расщепленный ЗаИ/ΝοΐΙ Ун 1/2 вектор вариабельного домена для образования Ун1/Ун2/2 вектор вариабельного домена.
-74020464
Ук1/Ук2/2 вектор вариабельного домена создают сходным образом. Двойную специфичность образованных §сРу Ун1/Ун2 и §сРу Ук1/Ук2 проверяют в ЕЫ§А растворимого 8сРу, как описано ранее (см. пример 6, ΡΟΓ/ΟΒ 02/003014). Конкурентный ЕЫ§А проводят, как описано ранее (см. пример 8, ΡΟΓ/ΟΒ 02/003014).
Возможные результаты:
8сРу Ун1/Ун2 способно связывать антигены А и В одновременно;
8сРу Ук1/Ук2 способно связывать антигены С и Ό одновременно;
связывание §сРу Ун1/Ун2 конкурентно (во время связывания антигена А, §сРу Ун1/Ун2 не способно связывать антиген В);
связывание §сРу Ук1/Ук2 конкурентно (во время связывания антигена С, §сРу Ук1/Ук2 не способно связывать антиген Ό).
Пример 5. Конструирование РаЬ Ун1/Ун2 и РаЬ Ук1/Ук2 с двойной специфичностью и анализ их связывающих свойств.
Для образования РаЬ Ун1/Ун2, отдельный домен Ун1 лигируют в расщепленный Ысо1/ХЪо1 вектор СН (фиг. 8) для образования Ун1/Сн и отдельный домен Ун2 лигируют в расщепленный ЗаЦ/ЫоИ вектор СК (фиг. 9) для образования Ун2/СК. Плазмидную ДНК от Ун1/Сн и Ун2/СК используют для сотрансформации компетентных клеток Е.соН, как описано ранее (см. пример 8, ΡСТ/ΟΒ02/003014).
Клон, содержащий плазмиды Ун1/Сн и Ун2/СК, затем индуцируют ΙΡΤΟ для образования растворимого РаЬ Ун1/Ун2, как описано ранее (см. пример 8, ΡСΤ/ΟΒ 02/003014).
РаЬ Ук1/Ук2 получают сходным образом.
Связывающие свойства образованных РаЬ исследуют конкурентным ЕЫ§А, как описано ранее (см. пример 8, ΡΓΤ/ΟΒ 02/003014).
Возможные результаты:
РаЬ Ун1/Ун2 способен связывать антигены А и В одновременно;
РаЬ Ук1/Ук2 способен связывать антигены С и Ό одновременно;
связывание РаЬ Ун1/Ун2 конкурентно (во время связывания антигена А, РаЬ Ун1/Ун2 не способен связывать антиген В);
связывание РаЬ Ук1/Ук2 конкурентно (во время связывания антигена С, РаЬ Ук1/Ук2 не способен связывать антиген Ό).
Пример 6. Хелатообразующие димеры бАЬ.
Краткое изложение.
Гомодимеры Ун и Ук создают в формате бАЬ-линкер-бАЬ с использованием гибких полипептидных линкеров. Векторы создавали в формате бАЬ линкер-бАЬ, содержащем глицин-сериновые линкеры разной длины, 3и:(О1у48ет)3, 5и:(О1у48ет)5, 7и:(О1у48ет)7. Библиотеки димеров создавали с использованием ведущих бАЬ ближе к 5'-концу линкера: ТАК1-5(Ук), ТАК1-27(Ук), ТАК2-5(Ун) или ТАК2-6(Ук), и библиотеки соответствующих вторых бАЬк после линкера. С применением этого способа селектировали новые димерные бАЬ. Эффект димеризации на связывание антигена определяли посредством ЕЫ8А и исследований Βίη^ΐΌ и в исследованиях нейтрализации клеток и связывания рецепторов. Димеризация как ТАК1-5, так и ТАК1-27, приводила к значимому улучшению аффинности связывания и уровней нейтрализации.
1.0. Методы.
1.1. Образование библиотек.
1.1.1. Векторы.
Векторы рЕЭА3и, рЕЭА5и и рЕЭА7и разрабатывали для введения различных длин линкеров, совместимых с форматом бАЬ-линкер-бАЬ. Для рЕЭА3и смысловые и антисмысловые олиголинкеры из 73 пар оснований отжигали с применением программы медленного отжига (95°С - 5 мин, 80°С -10 мин, 70°С - 15 мин, 56°С - 15 мин, 42°С до использования) в буфере, содержащем 0,1 М ЫаС1, 10 мМ триснС1, рн 7,4, и клонирновали с использованием сайтов рестрикции Х1о1 и Ыо!1. Линкеры включали 3 единицы (О1у48ет) и лишнюю область (МиГГсг тедюи), расположенную между сайтами клонирования §а11 и Ыо!1 (схема 1). Для уменьшения возможности селекции мономерных бАЬ фаговым дисплеем лишняя область была разработана содержащей 3 стоп-кодона, сайт рестрикции §ас1 и мутацию со сдвигом рамки считывания, чтобы вывести область из рамки считывания при отсутствии второго бАЬ. Для рЕЭА5и и 7и, ввиду необходимой длины линкеров, для каждого вектора были разработаны перекрывающиеся олиголинкеры и проведены их отжиг и элонгация с применением К1еиоте. Затем фрагмент очищали и расщепляли с использованием подходящих ферментов перед клонированием с использованием сайтов рестрикции Х1о1 и Ыо!1.
- 75 020464
1.1.2. Образование библиотек.
Ν-концевой У-ген, соответствующий ведущему ЛΑЪ, клонировали ближе к 5'-концу вектора с использованием сайтов рестрикции Νοο 1 и Х1ю 1. Г ены Ун имеют существующие совместимые сайты, хотя для клонирования генов Ук было необходимо введение подходящих сайтов рестрикции. Это было осуществлено с использованием модифицирующих ПЦР-праймеров (ΥΚ-ΌΡΙΒΡ: 5' сддсса!ддсд!саасддаса!; УКХ^Ш: 5' а!д!дсдс!сдадсдШда!!1 3') в 30 циклах ПЦР-амплификации с использованием смеси 2:1 δυре^ад (НΤΒ^ο!есЬηοίοду Ь!Л) и рГи Ιιιώο (δ!^а!адеηе). Это сохраняло сайт №ο1 на 5'-конце, разрушая в то же время близлежащий сайт δа11, и вводило сайт Х1ю1 в 3'-конец. 5 ведущих ЛΑЪ клонировали в каждый из 3 димерных векторов: ΤΑΚ1-5(Уκ), ΤΛΚ1-27(Уκ), ΤЛΚ2-5(УН), ΤЛΚ2-6(Уκ) и ΤΑΚ2-7(Уκ). Все конструкции подтверждали секвенированием.
После клонирования ведущих ЛΑЪ ближе к 5'-концу линкера в каждый из векторов (ρΕ^Α3υ, 5υ и 7υ): ΤЛΚ1-5(Уκ), ΤЛΚ1-27(Уκ), ΤЛΚ2-5(УН) или ΤΑΚ2-6(Уκ) после линкера клонировали библиотеку вторых ЛΑЪ. Для осуществления этого библиотеки комплементарных ЛΑЪ ПЦР-амплифицировали из фага, полученного из селекции 1 раунда либо библиотеки Ук против человеческого ΤΝΡα (при разнообразии приблизительно 1х106 после 1 раунда), когда ΤΑΡ1-5 или ΤΑΡ1-27 являются ведущими ЛΑЪ, либо библиотеки Ун или Ук против человеческого рецептора ΤΝΡ р55 (каждой при разнообразии приблизительно 1х105 после 1 раунда), когда ΤΑΡ2-5 или ΤΑΡ2-6 соответственно являются ведущими ЛΑЪ. Для библиотек Ук проводили ПЦР-амплификацию с использованием праймеров в 30 циклах ПЦРамплификации с использованием смеси 2:1 δиρе^Τа^ и рГи ΙιιΛο. Библиотеки Ун ПЦР-амплифицировали с использованием праймеров с целью введения сайта рестрикции δа11 в 5'-конец гена. Продукты ПЦР библиотек ЛΑЪ расщепляли подходящими рестриктазами, лигировали в соответствующие векторы ближе к 3'-концу линкера с использованием сайтов рестрикции δа11/Nο!1 и подвергали электоропорации в свежеприготовленные компетентные клетки ΤΟ1.
Титры, полученные для каждой библиотеки, были следующими:
ТАК 1-5: рЕОАЗи =4x10®, ρΕϋΑδυ = 8 х 107, ρΕϋΑ7υ = 1x10®;
ТАК1-27: ρΕϋΑ31Ι = 6,2 х 10е, ρΕϋΑδυ = 1 х 108. рЕ0А711 = 1 х 109;
ТАР2М-5: рЕОАЗи = 4 х 107, ρΕϋΑδυ = 2x10®, ρΕϋΑ71Ι = 8 х 107;
ТАР2И-6: рЕОАЗи = 7,4 х 10®, ρΕϋΑδΙΙ = 1,2 х 10®, рЕЭА7и = 2,2 х 10®.
1.2. Селекции.
1.2.1. ΤΝΡα.
Селекции проводили с использованием человеческого ΤΝΡα, пассивно нанесенного на иммунологические пробирки. Кратко, иммунологические пробирки покрывали на ночь 1-4 мл необходимого антигена. Иммунологические пробирки затем промывали 3 раза ΡΒδ и блокировали 2% молочным порошком в ΡΒδ в течение 1-2 ч и промывали еще 3 раза ΡΒδ. Раствор фага разводили в 2% молочном порошке в ΡΒδ и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Пробирки затем промывали ΡΒδ и фаг элюировали 1 мг/мг трипсином-ΡΒδ. Для библиотек димеров ΤΑΡ1-5 исследовали три стратегии селекции. Селекции первого раунда проводили в иммунологических пробирках с использованием человеческого ΤΝΡα, нанесенного в концентрации 1 мкг/мл или 20 мкг/мл с 20 промываниями в ΡΒδ 0.1%Τ\γееη. Клетки ΤΟ1 инфицировали элюированным фагом и определяли титры (например, Магкз е! а1. ί. Μοί Βίο1. 1991 Иес 5; 222(3):581-97, Κ^сЬтаηη е! а1. Β^οсЬет^5!^у. 1993 Α^ 31; 32(34):8848-55).
Полученные титры составляли:
рЕИАЗВ = 2,8 х 107 (1 мкг/мл ΤΝΡ) 1,5 х 10® (20 мкг/мл ΤΝΡ); ρΕϋΑδυ = 1,8 х 107 (1 мкг/мл ΤΝΡ), 1,6 х 10® (20 мкг/мл ΤΝΡ);
ρΕϋΑ7υ = 8 х 10® (1 мкг/мл ΤΝΡ), 7 х 107 (20 мкг/мл ΤΝΡ).
Селекции второго раунда проводили с применением 3 различных способов.
1. В иммунологических пробирках, 20 промываний с инкубацией в течение ночи с последующими дополнительными 10 промываниями.
2. В иммунологических пробирках 20 промываний с последующей инкубацией в течение 1 ч при комнатной температуре (КГ) в буфере для промывания с (1 мкг/мл ΤΝΡα) и дополнительными 10 промываниями.
3. Селекция на стрептавидиновых гранулах с использованием 33 пмоль биотинилированного чело- 76 020464 веческого ТЫРа (Непбепкх е! а1., 2002, δе1есί^оп о£ апбЬоб1ек адатк! Ыобпу1а1еб апбдепк. АпбЬобу РЬаде И1кр1ау: Мебюбк апб рго!осо1к, Еб. О'Бпеп апб Λιк^н. Нитапа Ргекк). Отдельные клоны от селекции 2 раунда отбирали в 96-луночные планшеты и образцы необработанного супернатанта приготавливали в формате 2 мл 96-луночного планшета.
1 раунд Концентрация человеческого ΤΝΡα, покрывающего иммунологические пробирки Селекция 2 раунда, 1 способ Селекция раунда, способ 2 2 Селекция 2 раунда, 3 способ
рЕОАЗи 1 мкг/мл 1 х 109 1,8 х 10“ 2,4 х 10,и
рЕОАЗи 20 мкг/мл 6х 109 1,8 х 101и 8,5х Юга
ρΕϋΑ5υ 1 мкг/мл 9х 10“ 1,4 х 109 2,8 х 1О’и
ρΕϋΑδυ 20 мкг/мл 9,5 хЮ9 8,5 х 109 2,8 х 1О’и
ρΕϋΑ7υ 1 мкг/мл 7,8 х 10“ 1,6 х 10“ 4х 10™
рЕЭА7и 20 мкг/мл 1 х 101и 8x10’ 1,5 х 10™
Для ТАК1-27 селекции проводили, как описано ранее, со следующими изменениями. Селекции первого раунда проводили в иммунологических пробирках с использованием человеческого ΊΝΕα, нанесенного в концентрации 1 мкг/мл или 20 мкг/мл с 20 промываниями в РΒδ 0,1% Тетееп. Селекции второго раунда проводили в иммунологических пробирках с использованием 20 промываний с инкубацией в течение ночи с последующими дополнительными 20 промываниями. Отдельные клоны от селекции 2 раунда отбирали в 96-луночные планшеты и образцы необработанного супернатанта приготавливали в формате 2 мл 96-луночного планшета.
Титры ТАК1-27 являются следующими.
Концентрация человеческого ΤΝΡα, покрывающего иммунологические пробирки 1 раунд 2 раунд
рЕОАЗи 1 мкг/мл 4 х 109 '6x111'
рЕОАЗи 20 мкг/мл 5x10’ 4,4 х 101и
ρΕϋΑδυ 1 мкг/мл 1,5x105 1,9 х 10™
ρΕϋΑδυ 20 мкг/мл 3,4x109 3,5x1010
ρΕϋΑ7υ 1 мкг/мл 2,6x109 5х 109
рЕРА7и 20 мкг/мл 7х 109 1,4x10™
1.2.2. Рецептор ТИР 1 (рецептор р55; ТАК2).
Селекции проводили, как описано ранее только для библиотек ТАК2Ь-5. Три раунда селекции проводили в иммунологических пробирках с использованием либо 1 мкг/мл человеческого рецептора ТОТ1 р55, либо 10 мкг/мл человеческого рецептора ТОТ1 р55 с 20 промываниями в РΒδ 0,1%Т\уееп с инкубацией в течение ночи с последующими дополнительными 20 промываниями. Отдельные клоны от селекции 2 и 3 раунда отбирали в 96-луночные планшеты и образцы необработанного супернатанта приготавливали в формате 2 мл 96-луночного планшета.
Титры ТАК2Ь-5 являются следующими.
Концентрация человеческого рецептора ΤΝΡ р55, покрывающего иммунологические пробирки в 1 раунде 1 раунд 2 раунд 3 раунд
рЕОАЗи 1 мкг/мл 2,4 х 10“ 1,2x10' 1,9 хЮ9
рЕОАЗи 10 мкг/мл 3,1 х 107 7 хЮ7 1 хЮ9
ρΕϋΑ51Ι 1 мкг/мл 2,5 х 10“ 1,1x10' 5,7x10“
ρΕϋΑδΙΙ 10 мкг/мл 3,7 х 10' 2,3 х 10“ Э.ЭхЮ9
ρΕϋΑ7υ 1 мкг/мл ТзхЭо* Ί,3 х 10' 1,4 хЮ9
ρΕϋΑ7υ 10 мкг/мл 1,6x10' 1,9x10' 3x10™
- 77 020464
1.3. Скрининг.
По необходимости отдельные клоны от селекции 2 или 3 раунда отбирали от каждой из библиотек 3и, 5и и 7и от разных способов селекции. Клоны выращивали в 2.\ΤΥ со 100 мкг/мл ампициллина и 1% глюкозы в течение ночи при 37°С. Разведения этой культуры 1/100 засевали в 2 мл 2хГУ со 100 мкг/мл ампициллина и 1% глюкозы в формате 2 мл 96-луночных планшетов и выращивали при 37°С, встряхивая до оптической плотности при 600 нм (ΟΌ600) приблизительно 0,9. Культуру затем индуцировали 1 мМ ΓΡΤ0 в течение ночи при 30°С. Супернататны осветляли центрифугированием при 4000 оборотов в минуту (об/мин) в течение 15 мин в центрифуге для планшетов. Образцы супернатанта использовали для начального скрининга.
1.3.1. ЕЫ§А.
Связывающую активность димерных рекомбинантных белков сравнивали с мономером посредством ЕЫ8А с белком А/Ь или посредством ЕЫ8А с антигеном. Кратко, 96-луночный планшет покрывают антигеном или белком А/Ь в течение ночи при 4°С. Планшет промывают 0,05% Τγееη-РΒδ, блокирую в течение 2 ч 2% Τγееη-РΒδ. Образец добавляют на планшет и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшет промывают и инкубируют с вторичным реагентом в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшет промывают и проявляют субстратом ТМВ. В качестве вторичного реагента использовали белок А/Ь-НВР или ШИа-НВР. Для ЕЫ8А с антигеном концентрации антигена составляли 1 мкг/мл в РВ§ для человеческого ΤΝΡα и рецептора человеческого ΊΉΡ 1 типа. Ввиду присутствия ведущего !АЬ в большинстве случаев димеры давали положительный сигнал при ЕЫЗА, таким образом, определение уровня отсечки проводили посредством Вхатоте.
1.3.2. Вхатоте.
Анализ Вхатоте проводили для клонов ΤΛВ1-5 и ΤΛВ2Ь-5. Для скрининга человеческий ΤΝΡα наносили на чип СМ5 с высокой плотностью (приблизительно 10000 ВИ). 50 мкл человеческого ΤΝΡα (50 мкг/мл) наносили на чип со скоростью 5 мкл/мин в ацетатном буфере - рН 5,5. Регенерация чипа после анализа с применением стандартных способов невозможна ввиду нестабильности человеческого ΤΝΡα, таким образом, после анализа каждого образца чип промывали буфером в течение 10 мин.
Для клонов ΤΛВ1-5 проводили скрининг супернантантов от селекции 2 раунда посредством Вхатоте.
Проводили скрининг 48 клонов от каждой из библиотек 3И, 5И и 7И, полученных с применением следующих способов селекции.
В1: иммунологическая пробирка с 1 мкг/мл человеческого ΤΝΡα; В2: иммунологическая пробирка с 1 мкг/мл человеческого ΤΝΡα, промывание в течение ночи.
В1: иммунологическая пробирка с 20 мкг/мл человеческого ΤΝΡα; В2: иммунологическая пробирка с 20 мкг/мл человеческого ΤΝΡα, промывание в течение ночи.
В1: иммунологическая пробирка с 1 мкг/мл человеческого ΤΝΡα; В2: 33 пмоль биотинилированного человеческого ΤΝΡα на зернах.
В1: иммунологическая пробирка с 20 мкг/мл человеческого ΤΝΡα; В2: 33 пмоль биотинилированного человеческого ΤΝΡα на зернах.
Для скрининга человеческий рецептор ΤΝΡ р55 наносили на чип СМ5 с высокой плотностью (приблизительно 4000 ВИ). 100 мкл человеческого рецептора ΤΝΡ р55 (10 мкг/мл) наносили на чип со скоростью 5 мкл/мин в ацетатном буфере - рН 5,5. Использовали стандартные условия регенерации (глицин, рН 2 или рН 3), но в каждом случае антиген удаляли с поверхности чипа, таким образом, аналогично ΤΝΡα, по этой причине после анализа каждого образца чип промывали буфером в течение 10 мин.
Для клонов ΤΛВ2-5 проводили скрининг супернантантов от селекции 2 раунда.
Проводили скрининг 48 клонов от каждой из библиотек 3И, 5И и 7И, с применением следующих способов селекции.
В1: иммунологическая пробирка с 1 мкг/мл человеческого рецептора ΤΝΡ р55; В2: иммунологическая пробирка с 1 мкг/мл человеческого рецептора ΤΝΡ р55, промывание в течение ночи.
В1: иммунологическая пробирка с 10 мкг/мл человеческого рецептора ΤΝΡ р55; В2: иммунологическая пробирка с 10 мкг/мл человеческого рецептора ΤΝΡ р55, промывание в течение ночи.
1.3.3. Исследования на клетках и рецепторах.
Способность димеров к нейтрализации в исследовании на рецепторах проводили следующим образом.
Связывание рецепторов !АЬ против ΤΝΡ исследовали на способность ингибировать связывание ΤΝΡ с рекомбинантным рецептором ΤΝΡ 1 типа (р55). Кратко, планшеты Ма\^δο^р инкубировали в течение ночи с 30 мг/мл мышиного моноклонального антитела против человеческого Ρс (Ууте!, δαη Ρ^аηс^δсο. И8А). Лунки промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором (РΒδ), содержащим 0,05% Τγ;;η-20, и затем блокировали 1% ΒδА в РΒδ перед инкубацией со 100 нг/мл слитого белка рецептора ΤΝΡ 1 типа и Ρс (В&Э δуδΐетδ, М^ηηеарοί^δ, ЩА). !АЬ против ΤΝΡ смешивали с ΤΝΡ, который добавляли в промытые лунки в конечной концентрации 10 нг/мл. Связывание ΤΝΡ выявляли с использованием 0,2 мг/мл биотинилиро- 78 020464 ванного антитела против ТИР (НуСиИ Ыо1есйпо1о§у, ИЬеп, Ие1Ьег1апЙ8) с последующим разведением 1 к 500 стрептавидина, меченного пероксидазой хрена (Атетзйат Вюзшепсез, ИК), и затем инкубацией с субстратом ТМВ (КРЬ, ОаИЬетзЬшд, И8А). Реакцию останавливали добавлением НС1 и считывали поглощение при 450 нм. Активность ЙАЬ против ТИР приводила к уменьшению связывания ТИР, и, следовательно, к уменьшению поглощения по сравнению с контролем ТИР самим по себе.
Исследование цитотоксичности на клетках Ь929
ЙАЬ против ТИР исследовали на способность нейтрализовать цитотоксическую активность ТИР на мышиных фибробластах Ь929 (Еνаηδ, Т. (2000), Мо1еси1аг Вю1есйпо1о§у 15, 243-248). Кратко, клетки Ь929, высеянные на титрационный микропланшет инкубировали в течение ночи с ЙАЬ против ТИР, 100 пг/мл ТИР и 1 мг/мл актиномицина Ό (81дта, Роо1е, ИК). Жизнеспособность клеток оценивали считыванием поглощения при 490 нм с последующей инкубацией с [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолием (Рготеда, МаФзоп, И8А). Активность ЙАЬ против ТИР приводила к уменьшению цитотоксичности ТИР и, следовательно, к увеличению поглощения по сравнению с контролем ТИР самим по себе.
При начальном скрининге супернатанты, приготовленные для анализа В1асоге, описанного выше, использовали также для исследования на рецепторах. Дальнейший анализ выбранных димеров также проводили в исследованиях на клетках и рецепторах с использованием очищенных белков.
Исследование на клетках НеЬа 1Ь-8
ЙАЬ против ТИРК1 или против ТИР-альфа исследовали на способность нейтрализовать индукцию секреции 1Ь-8 посредством ТИР в клетках НеЬа (способ представляет собой адаптированный способ Акезоп, Ь. е! а1. (1996), 1оигпа1 о! Вю1одюа1 Сйет181гу 271, 30517-30523, описывающих индукцию 1Ь-8 посредством 1Ь-1 в НИАРС; здесь авторы изобретения наблюдают индукцию человеческим ТИР-альфа и используют клетки НеЬа вместо клеточной линии НИАРС). Кратко, клетки НеЬа, высеянные на титрационные микропланшеты инкубировали в течение ночи с ЙАЬ и 300 пг/мл ТИР. После инкубации супернатант аспирировали от клеток и измеряли концентрацию 1Ь-8 посредством сэндвич-ЕР18А (Κ&Ό 8уз!етз). Активность ЙАЬ против ТИРК1 приводила к уменьшению секреции 1Ь-8 в супернатант по сравнению с контролем ТИР самим по себе.
Исследование на клетках Ь929 применяют в последующих экспериментах; тем не менее, применение исследования 1Ь-8 на клетках НеЬа предпочтительно для оценки лигандов против рецептора ТИР 1 типа (р55); присутствие мышиного р55 в исследовании на клетках Ь929 накладывает определенные ограничения на его применение.
1.4. Секвенирование.
Проводили секвенирование димеров, интересующие свойства которых были подтверждены в исследованиях на рецепторах и В1асоте. Последовательности подробно изложены в перечне последовательностей.
1.5. Форматирование.
1.5.1. Димеры ТАР1-5-19.
Димеры ТАК1-5, для которых были показаны хорошие нейтрализующие свойства, форматировали повторно и анализировали в исследованиях на клетках и рецепторах. Ведущее ЙАЬ ТАК1-5 было заменено клоном ТАК1-5-19 с созревшей аффинностью. Для осуществления этого ТАК1-5 клонировали из отдельной димерной пары и заменяли на ТАК1-5-19, амплифицированный посредством ПЦР. В дополнение, также конструировали гомодимеры ТАК1-5-19 в векторах 3И, 5И и 7ϋ. И-концевую копию гена амплифицировали посредством ПЦР и клонировали, как описано выше, и С-концевой фрагмент гена клонировали с использованием существующих сайтов рестрикции 8а11 и Ио!1.
1.5.2. Мутагенез.
Амбер-стоп-кодон, присутствующий в ЙАЬ2, одном из С-концевых ЙАЬ в димерных парах ТАК1-5, заменяли на глутамин сайт-направленным мутагенезом.
1.5.3. РаЬ.
Димеры, содержащие ТАК1-5 или ТАК1-5-19, повторно форматировали в векторы экспрессии РаЬ. ЙАЬ клонировали в векторы экспрессии, содержащие гены либо СК, либо СН, с использованием сайтов рестрикции 8й1 и Ио!1 и верифицировали секвенированием. Вектор СК имеет происхождение от основанного на рИС устойчивого к ампициллину вектора, и вектор СН от вектора рАСΥС, устойчивого к хлорамфениколу. Для экспрессии РаЬ клетки НВ2151 со-трансформировали конструкциями ЙАЬ-СН и ЙАЬ-СК и выращивали в 2xТΥ, содержащем 0,1% глюкозы, 100 мкг/мл ампициллина и 10 мкг/мл хлорамфеникола.
1.5.4. Димеризация через шарнирную область.
ЙАЬ димеризовали образованием цистеиновых связей. На С-концевой области ЙАЬ конструировали короткую аминокислотную последовательность ЕРК8ОИКТНТСРРСР, модифицированную форму шарнирной области человеческого 1дОС1. Олигонуклеотидный линкер, кодирующий эту последовательность синтезировали и отжигали, как описано ранее. Линкер клонировали в вектор рЕИА, содержащий ТАК15-19, с использованием сайтов рестрикции Хйо1 и Ио!1. Димеризация происходит ш 8Йи в периплазме.
- 79 020464
1.6. Экспрессия и очистка.
1.6.1. Экспрессия.
Супернатанты приготавливали в формате 2 мл 96-луночных планшетов для начального скрининга, как описано ранее. После начального скрининга проводили дальнейший анализ выбранных димеров. Димерные конструкции экспрессировали в клетках ТОР10Р' или НВ2151 в виде супернатантов. Кратко. отдельную колонию из свежезасеянного планшета выращивали в течение ночи при 37°С в 2xТΥ со 100 мкг/мл ампициллина и 1% глюкозы. Разведение 1/100 этой культуры засевали в 2xТΥ со 100 мкг/мл ампициллина и 0.1% глюкозы и выращивали при 37°С. встряхивая до ОЭ600 приблизительно 0.9. Культуру затем индуцировали 1 мМ ГОТС в течение ночи при 30°С. Клетки удаляли центрифугированием и супернатант очищали с использованием агарозы с белком А или Ь.
РаЬ и цистеиновые димеры шарнирных областей экспрессировали как периплазматические белки в клетках НВ2152. Разведение 1/100 культуры, инкубированной в течение ночи. засевали в 2xТΥ с 0.1% глюкозы и подходящими антибиотиками и выращивали при 30°С. встряхивая до ОЭ600 приблизительно 0.9. Культуру затем индуцировали 1 мМ ГОТС в течение 3-4 ч при 25°С. Клетки собирали центрифугированием и осадок ресуспендировали в буфере препарата периплазмы (30 мМ трис-нС1. рН 8.0. 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЕЭТА). 20% сахарозы). После центрифугирования супернатант сохраняли и осадок ресуспендировали в 5 мМ МдЗО4. Супернатант вновь собирали центрифугированием, объединяли и очищали.
1.6.2. Очистка с использованием белка А/Ь.
Использовали оптимизацию очистки димерных белков от агарозы с белком Ь (АГГНеск. №ттеау) или агарозы с белком А (З1дта. ИК). Белок элюировали серией или в колонке с использованием перистальтического насоса. Использовали три буфера. 0.1 М фосфатно-цитратный буфер рн 2.6. 0.2 М глицин рн 2.5 и 0.1 М глицин рн 2.5. Было определено, что оптимальным условием было нахождение под действием перистальтического насоса с использованием 0.1 М глицина. рн 2.5. более10 объемов колонки. Очистку от белка А проводили под действием перистальтического насоса с использованием 0.1 М глицина. рН 2.5.
1.6.3. Очистка жидкостной хроматографией быстрого разрешения (РРЬС-очистка).
Дальнейшую очистку проводили посредством РРЬС-анализа на системе АКТА Ехр1огег 100 (Атегккат Вюкшепсек Ь!й). Димеры ТАК1-5 и ТАК1-5-19 фракционировали катионообменной хроматографией (1 мл Кекоигсе З -Атегккат Вюкшепсек Ь!й) и элюировали с использованием градиента 0-1 М №С1 в 50 мМ ацетатном буфере. рн 4. Димеры шарнирных областей очищали ионообменной хроматографией (1 мл Кекоигсе О Атегккат Вюкшепсек Ь!й) и элюировали с использованием градиента 0-1 М №С1 в 25 мМ трис-нС1 рн 8.0. РаЬ очищали гель-хроматографией с использованием колонки с суперозой 12 (Атегккат Вюкшепсек Ь!й) при скорости потока 0.5 мл/мин в РВЗ с 0.05% !теееп. После очистки образцы концентрировали с использованием концентраторов утакрш 5К (Ууакшепсе Ь!й).
2.0. Результаты.
2.1. Димеры ТАК1-5.
6х96 клонов были отобраны от селекции 2 раунда. включая все библиотеки и условия селекции. Образцы супернатантов приготавливали и анализировали посредством ЕЫЗА с антигеном и белком Ь. исследований В1асоте и исследований связывания рецепторов. При ЕЫЗА определяли положительные связывающие клоны от каждого способа селекции и распределяли их между библиотеками 3И. 5И и 7ϋ. Тем не менее. ввиду постоянного присутствия ведущего йАЬ не представлялось возможным разделить клоны с высокой и низкой аффинностью связывания этим способом, по этой причине проводили анализ В1асоте.
Анализ В1асоте проводили с использованием 2 мл супернатантов. Анализ В1асоте выявил. что значения КоГГ димеров были значительно лучше по сравнению с мономерным ТАК1-5. Значение КоГГ мономера составляло более 10-1 М. для сравнения, значения КоГГ димеров составляли 10-3-10-4 М. Были выбраны шестнадцать клонов. которые. по-видимому. имели очень низкие скорости диссоциации, они имели происхождение от библиотек 3И. 5И и 7И и были отсеквенированы. В дополнение, супернатанты анализировали на способность нейтрализовать человеческий ТОТа в исследовании на рецепторах.
наиболее удачных клонов (й1-й6 ниже). нейтрализовавшие в этих исследованиях, были отсеквенированы. Результаты показали, что из 6 полученных клонов было только 3 разных вторых йАЬ (йАЬ1. йАЬ2 и йАЬ3); тем не менее. там. где второе йАЬ обнаруживают более одного раза. они связаны линкерами разной длины.
ТАК1-5й1: 3и линкер. второе йАЬ=йАЬ1 - иммунологическая пробирка с 1 мкг/мл антигена, промывание в течение ночи.
ТАК1-5й2: 3И линкер. второе йАЬ=йАЬ2 - иммунологическая пробирка с 1 мкг/мл антигена, промывание в течение ночи.
ТАК1-5й3: 5и линкер. второе йАЬ=йАЬ2 - иммунологическая пробирка с 1 мкг/мл антигена, промывание в течение ночи.
ТАК1-5й4: 5И линкер. второе йАЬ=йАЬ3 - иммунологическая пробирка с 20 мкг/мл антигена, про- 80 020464 мывание в течение ночи.
ТАК1-5б5: 5И линкер, второе бАЬ=бАЬ1 - иммунологическая пробирка с 20 мкг/мл антигена, промывание в течение ночи.
ТАК1-5б6:7и линкер, второе бАЬ=бАЬ1 - К1: иммунологическая пробирка с 1 мкг/мл антигена, промывание в течение ночи, К2: гранулы.
Шесть наиболее удачных клонов исследовали далее. Белок получали из периплазмы и супернантанта, очищали агарозой с белком Ь и исследовали в анализах на клетках и рецепторах. Уровни нейтрализации были различны (Таблица 1). Определяли оптимальные условия приготовления белка. Белок получали из клеток НВ2151, поскольку супернатанты давали наибольший выход (приблизительно 10 мг/л культуры). Супернатаны инкубировали с агарозой с белком Ь в течение 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4°С. Гранулы промывали РВБ/№С1 и вносили в колонку для ЕРЬС с использованием перистальтического насоса. Гранулы промывали 10 объемами колонки РВБ/№С1 и элюировали 0,1 М глицином, рН 2,5. В большинстве случаев димерный белок элюируют после мономера.
Димеры ТАК1-5б1-6 очищали посредством ЕРЬС. ЕРЬС-очисткой получали три разновидности и идентифицировали их посредством электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (БОБ РАСЕ). Одна разновидность соответствует мономеру, и две разновидности соответствуют димерам различных размеров. Присутствие большей из двух разновидностей, возможно, обусловлено присутствием С-концевых меток. Эти белки исследовали в анализе на рецепторах. Данные, представленные в табл. 1, отражают оптимальные результаты, полученные от двух димерных разновидностей (фиг. 11).
Три вторых бАЬ из димерных пар (т.е. бАЬ1, бАЬ2 и бАЬ3) клонировали в виде мономеров и исследовали посредством ЕЫБА и в исследованиях на клетках и рецепторах. Все три бАЬ специфично связывают ТОТ1 при ЕЫБА с антигеном и не демонстрируют перекрестного взаимодействия с пластиком или ВБА. В виде мономеров ни одно из бАЬ не является нейтрализующим в исследованиях на клетках или рецепторах.
2.1.2. Димеры ТАК1-5-19.
ТАК1-5-19 был заменен на ТАК1-5 в шести наиболее удачных клонах. Анализ всех димеров ТАК15-19 в исследованиях на клетках и рецепторах проводили с использованием всего белка (очищенного только белком Ь), если не указано иное (табл. 2). ТАК1-5-19б4 и ТАК1-5-19б3 имели наилучшие ΝΌ50 (приблизительно 5 нМ) в исследовании на клетках, это согласуется с результатами исследования на рецепторах и является улучшением по сравнению с мономером ТАК1-5-19 (ΝΌ50 приблизительно 30 нМ). Несмотря на то что очищенные димеры ТАК1-5 дают различные результаты в исследованиях на клетках и рецепторах, димеры ТАК1-5-19 более непротиворечивы. Вариабельность была продемонстрирована при использовании различных элюирующих буферов в процессе очистки белка. Элюирование с использованием 0,1 М фосфатно-цитратного буфера, рН 2,6, или 0,2 М глицина, рН 2,5, хотя и удаляло весь белок из агарозы с белком Ь, в большинстве случаев приводило к уменьшению его функциональности.
ТАК1-5-19б4 экспрессировали в ферментере и очищали катионо-обменной ЕРЬС для получения полностью очищенного димера. Как с ТАК1-5б4, ЕРЬС-очисткой были получены три разновидности, соответствующие мономерной и двум димерным разновидностям. Определяли аминокислотную последовательность этого димера. Мономер ТАК1-5-19 и ТАК1-5-19б4 затем исследовали в анализах на рецепторах, и полученная Ιί'.'50 для мономера составляла 30 нМ и для димера составляла 8 нМ. Результаты исследования на рецепторах для сравнения мономера ТАК1-5-19, ТАК1-5-19б4 и ТАК1-5б4 показаны на фиг. 10.
Гомодимеры ТАК1-5-19 изготавливали в векторах 3И, 5И и 7И, экспрессировали и очищали с использованием белка Ь. Белки исследовали в анализах на клетках и рецепторах, и определяли получаемые ЮТо (для исследования на рецепторах) и ΝΌ50 (для исследования на клетках) (табл. 3, фиг. 12).
2.2. ЕаЬ.
Димеры ТАК1-5 и ТАК1-5-19 также клонировали в формат ЕаЬ, экспрессировали и очищали с использованием агарозы с белком Ь. ЕаЬ оценивали в анализах связывания рецепторов (табл. 4). Результаты показали, что для обоих димеров ТАК1-5-19 и ТАК1-5 уровни нейтрализации были сходны с исходными димерами с линкером С1у4Бег, от которых они имели происхождение. ТАК1-5-19 ЕаЬ, где ТАК1-519 был представлен как на СН, так и на СК, экспрессировали, очищали с использованием белка Ь и оценивали в исследовании на рецепторах. Полученная Ιί'.'50 составляла приблизительно 1 нМ.
2.3. Димеры ТАК1-27.
3x96 клонов отбирали от селекции 2 раунда, включая все библиотеки и условия селекции. 2-мл образцы супернантана приготавливали для анализа в ЕЫБА и биологических исследованиях. В ЕЫБА с антигеном был получен 71 положительный клон. В исследовании неочищенных супернатантов на рецепторах были получены 42 положительных клона с ингибиторными свойствами (связывание ТХЕ 0-60%). В большинстве случаев ингибиторные свойства коррелировали с интенсивным сигналом при ЕЫБА. 42 клона были отсеквенированы, 39 из них имели уникальные последовательности второго бАЬ. Далее анализировали 12 димеров с наилучшими ингибиторными свойствами.
нейтрализующих клонов экспрессировали в виде 200-мл образцов супернатанта и очищали с использованием белка Ь. Их оценивали посредством ЕЫБА с белком Ь и с антигеном, В1асоге и в исследо- 81 020464 вании на рецепторах. Во всех случаях были получены интенсивные сигналы при ЕЫ8А. Анализ В1асоге выявил, что все клоны имели высокие скорости ассоциации и диссоциации. Скорости ассоциации были улучшены по сравнению с мономерным ΤΑК1-27, тем не менее, скорость диссоциации димеров ΤΑК1-27 была больше (Κ^ составляет приблизительно от 10-1 до 10-2 М) больше, чем димеров ΤΑК1-5, исследованных ранее (Κ^ составляет приблизительно 10-3-10-4 М). Стабильность очищенных димеров вызывала сомнения и, таким образом, для улучшения стабильности в очистку димеров ΤΑК1-27 (й2 и й16) включали добавление 5% глицерина, 0,5% Τή^ Х100 или 0,5% ΝΡ40 (81дта). Добавление ΝΡ40 или Τή^ Х100™ увеличивало выход очищенного продукта приблизительно в 2 раза. Оба димера оценивали в исследовании на рецепторах. Для ΤΑК1-27й2 была получена Κ.'50 приблизительно 30 нМ при всех условиях очистки. Для ΤΑК1-27й16 было показано отсутствие нейтрализующего эффекта при очистке без применения стабилизаторов, но для него была получена Κ.'50 приблизительно 50 нМ при очистке в стабилизирующих условиях. Других анализов проведено не было.
2.4. Димеры ΤΑК2-5.
3x96 клонов отбирали от селекции второго раунда, включая все библиотеки и условия селекции. 2мл образцы супернантана приготавливали для анализа. ЕЫ8А с белком А и антигеном проводили для каждого планшета. Посредством В1асоте были идентифицированы 30 интересующих клонов с хорошими скоростями диссоциации (Κ^ варьирует от 10-2 до 10-3 М). Клоны секвенировали, и 13 уникальных димеров были идентифицированы посредством анализа последовательностей.
Таблица 1
Димеры ΤΑК1-5
Димер Тип клеток Очистка Белковая фракция Условия элюирования Исследование на клетках/исследование на рецепторах
ТАР1- 5ά1 НВ2151 Белок Ь + РРЬС Малая димерная разновидность 0,1 М глицин рН 2,5 РА приблизительно 30 нМ
ТАР1- 562 НВ2151 Белок ί + РРЮ Малая димерная разновидность 0,1 М глицин рН 2,5 РА приблизительно 50 нМ
ТАР1- 503 НВ2151 Белок ί + РРЮ Большая димерная разновидность 0,1 М глицин рН 2,5 РА приблизительно 300 нМ
ТАР1- 504 НВ2151 Белок I- + РР1.С Малая димерная 0,1 М глицин рН 2,5 РА приблизительно 3 нМ
разновидность
ТАР1- 565 НВ2151 Белок 1 + РРЬС Большая димерная разновидность 0,1 М глицин рН 2,5 РА приблизительно 200 нМ
ТАР1- 506 НВ2151 Белок ί + РРЬС Большая димерная разновидность 0,1 М глицин рН 2,5 РА приблизительно 100 нМ
* Следует отметить, что 2 димер и 3 димер имеют одинаковое второе йАЬ (называемое йАЬ2), тем не менее, они имеют разные длины линкеров (й2=(О1у48ег)3, й3=(О1у48ег)3). йАЬ1 является йАЬпартнером для 1, 5 и 6 димеров. йАЬ3 является йАЬ-партнером для 4 димера. Ни один из йАЬ-партнеров не проявляет нейтрализующей активности сам по себе. ΡΡ^С-очистка является катионообменной, если не указано иное. Оптимальные димерные разновидности для каждого димера, полученные посредством ΡΡΕΟ были определены в этих исследованиях.
- 82 020464
Димеры ТАК 1-5-19
Таблица 2
Димер Тип ( клеток Очистка Белковая фракция Условия элюирования Исследование на клетках/исследование на рецепторах
ТАР1- 5-19 61 ТОРЮР’ Белок Ь Общий белок 0,1 М глицин рН 2,0 РА приблизительно 15 нМ
ТАР1- 5-19 (12 ТОРЮР' Белок ί Общий белок 0,1 М глицин рН 2,0 + 0,05% ΝΡ40 РА приблизительно 2 нМ
ТАР1- 563 ТОПОР’ Белок ί Общий белок 0,1 М глицин рН 2,0 + 0.05% ΝΡ40 РА приблизительно 8 нМ
ТАР1- 5-1964 ТОРЮР’ Белок 1. + РРЮ РРЬС- очищенная фракция 0,1 М глицин рН 2,0 РА приблизительно 2-5 нМ СА приблизительно 12 нМ
ТАР1- 5-1965 ТОРЮР' Белок ί Общий белок 0,1 М глицин рН 2,0 + ΝΡ40 РА приблизительно 8 нМ СА приблизительно 10 нМ
ТАР1- 5-19 66 ТОРЮР' Белок С Общий белок 0,1 М глицин рН 2,0 РА приблизительно 10 нМ
Таблица 3
Гомодимеры ТАК1-5-19
Димер Тип клеток Очистка Белковая фракция Условия элюирования Исследование на клетках/исследование на рецепторах
Гомодимер ТАР1-5-19 зи НВ2151 Белок ί Общий белок 0,1 М глицин рН 2,5 РА приблизительно 20 нМ СА приблизительно 30 нМ
Гомодимер ТАК1-5-19 5ϋ НВ2151 Белок ί Общий белок 0,1 М глицин рН 2,5 РА приблизительно 2 нМ СА приблизительно 3 нМ
Гомодимер ΤΑΡ1-5-19 7и НВ2151 Белок ί Общий белок 0,1 М глицин рН 2,5 РА приблизительно 10 нМ СА приблизительно 15 нМ
ТАР1-5-19 с дисульфидно связанной шарнирной областью НВ2151 Белок Ь + РРЬС РРЬС- очищенная фракция 0,1 М глицин рН 2,5 РА приблизительно 2 нМ
ΤΑΡ1-5- 19СН/ТАР1- 5-19СК НВ2151 Белок Общий белок 0,1 М глицин рН 2,5 РА приблизительно 1 нМ
- 83 020464
Таблица 4
ЕаЬ ТЛΚ1-5/ТЛΚ1-5-19
Димер Тип клеток Очистка Белковая фракция Условия элюирования Исследование на клетка х/исследование на рецепторах
ТАР1- 5СН/ 6АМ СК НВ2151 Белок Б Общий белок 0,1 М цитрат рН 2,6 РА приблизительно 90 нМ
ТАР1- 5СН/ 6АЬ2 СК НВ2151 Белок Б Общий белок 0,1 М глицин рН 2,5 РА приблизительно 30 нМ СА приблизительно 60 нМ
ДАЬЗСН/ ТАР1-5СК НВ2151 Белок ί Общий белок 0,1 М цитрат рН 2,6 РА приблизительно 100 нМ
ТАР 1-5- 19СН/ άΑΜ СК НВ2151 Белок 1 Общий белок 0,1 М глицин рН 2,0 РА приблизительно 6 нМ
άΑΜ СН/ ТАР1-5- 19СК НВ2151 Белок ί 0,1М глицин рН 2,0 Мус/Яад РА приблизительно 6 нМ
ТАР 1-5- 19СН/ <ЗАЬ2 СК НВ2151 Белок Б Общий белок 0,1 М глицин рН 2,0 РА приблизительно 8 нМ СА приблизительно 12 нМ
ТАК 1-5- 19СН/ с!АЬЗСК НВ2151 Белок Б Общий белок 0,1 М глицин рН 2,0 РА приблизительно 3 нМ
Пример 7. Димеризация бАЬ связыванием концевых цистеинов.
Краткое изложение
Для димеризации бАЬ на С-конце белка конструировали свободный цистеин. При экспрессии белок образует димер, который может быть очищен двухстадийным способом очистки.
ПЦР-конструирование димера ΤЛΚ1-5-19СΥδ
См. пример 8, где описан тример бАЬ. При выполнении протокола тримера образуется смесь мономера, димера и тримера.
Экспрессия и очистка димера ΤЛΚ1-5-19СΥδ
Димер очищали из супернатанта культуры захватом на агарозе с белком Ь, как описано в примере 8. Отделение мономера ΤЛΚ1-5-19СΥδ от димера ΤЛΚ1-5-19СΥδ
Перед катионообменным разделением в смешанном образце мономера/димера заменяли буфер в буфере с 50 мМ ацетатом натрия, рН 4,0, с использованием колонки ΡΌ-10 (АтегкБат РБагтаиа), следуя руководствам изготовителя. Образец затем наносили на 1 мл Ееюнгсе δ колонку для катионообменной хроматографии (АтегкНат РБагтааа), которую предварительно уравновешивали с использованием 50 мМ ацетата натрия, рН 4,0. Мономер и димер разделяли с использованием следующего солевого градиента в 50 мМ ацетате натрия рН 4,0:
150-200 мМ хлорида натрия - 15 объемов колонки;
200-450 мМ хлорида натрия - 10 объемов колонки;
450-1000 мМ хлорида натрия - 15 объемов колонки.
Фракции, содержащие только димер, устанавливали с применением δΌδ-РАСЕ, затем объединяли и рН увеличивали до 8 добавлением 1/5 объема 1 М трис, рН 8,0.
Функциональное исследование связывания ίη νίΐτο: исследование на рецепторах ΤΝΕ и исследование на клетках
Аффинность димера в отношении человеческого ΤΝΕα определяли с применением исследования на рецепторах ΤΝΕ и исследования на клетках. Κ.'50 в исследовании на рецепторах составляла приблизительно 0,3-0,8 нМ; ΝΏ50 в исследовании на клетках составляла приблизительно 3-8 нМ.
Другие возможные форматы димеров ΤЛΚ1-5-19СΥδ ПЭГ-димеры и специально изготовленные синтетические малеимидные димеры №1<1аг (ЬНеапгаЮг) предлагают спектр бималеимидных полиэтиленгликолей (ПЭГ, РЕС) [тРЕС2(МАЬ)2 или тРЕСДМАЩ], которые могут делать возможным придание мономеру формата димера с небольшим линкером, разделяющим бАЬ, оба из которых связаны с ПЭГ, размер которого составляет от
- 84 020464 до 40 кДа. Было показано, что ιηΡΕ^(ΜΛΕ)2 массой 5 кДа (т.е. [ТАР1-5-19]-цис-малеимид-РЕСх2, где малеимиды связаны друг с другом в димер) имеет афинность в исследовании связывания рецепторов ΤΝΡ приблизительно 1-3 нМ. Также димер может также быть изготовлен с использованием ТМЕА (трис[2-мелеимидоэтил]амина) (Легсе Β^оΐесЬио1о§у) или других бифункциональных линкеров.
Также возможно изготовление дисульфидного димера с применением способа химического сочетания с использованием 2,2'-дитиопиридина Лдта А1йпсй) и восстановленного мономера.
Присоединение полипептидного линкера или шарнирной области к С-концу йАЬ Между йАЬ и концевым цистеиновым остатком может быть конструирован небольшой линкер, любой из (С1у^ег)п, где п=от 1 до 10, например 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7, иммуноглобулиновый линкер (например, шарнирная область ЦС, либо случайная пептидная последовательность (например, выбранная из библиотеки случайных полипептидных последовательностей). Затем он может быть использован для изготовления димеров, как описано выше.
Пример 8. Тримеризация йАЬ.
Краткое изложение
Для тримеризации йАЬ необходим свободный цистеин на С-конце белка. Цистеиновый остаток, восстановленный с образованием свободного тиола, может затем быть использован для специфичного сочетания белка с тримерной молекулой малеимида, например ТМЕА (трис[2-мелеимидоэтил]амина).
ПЦР-конструирование ΤΛР1-5-19СΥδ
Следующие олигонуклеотиды были использованы для специфичного ПЦР ТАР1-5-19 с сайтами δη1! и ΒатΗI для клонирования и также для введения С-концевого цистеинового остатка.
ССА САС ССТ СТС АСС АТС АСТ ТСС ССС ССА АСТ САС АСС АТТ САТ АСТ ТАТ ТТА САТ ТСС
ССТ СТС ССА САС ТСС ТАС ТСА АСС ССС ССТ ТСА СТС ТСС ТАД СТА ТСА АТА ААТ СТА АСС
Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е Туг Зег Д1а Зег С1и Ьеи С1п
121 ТАС САС САС ААД ССА ССС ААА ССС ССТ ААС СТС СТС АТС ТАТ АСТ ССА ТСС САС ТТС САА
АТС СТС СТС ТТТ ССТ ССС ТТТ ССС ССА ТТС САС САС ТАС АТА ТСА ССТ АСС СТС ААС СТТ
Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не
131 АСТ ССС СТС ССА ТСА ССТ ТТС АСТ ССС АСТ ССА ТСТ ССС АСА САТ ТТС АСТ СТС АСС АТС
ТСА ССС САС ССТ АСТ ССА ААС ТСА ССС ТСА ССТ АСА ССС ТСТ СТА ААС ТСА САС ТСС ТАС
Зег Зег Ьеи С1п Рго С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз 61п С1п Уа1 Уа1 Тгр Агд Рго
241 АСС АСТ СТС САА ССТ САА САТ ТТТ ССТ АСС ТАС ТАС ТСТ САА САС СТТ СТС ТСС ССТ ССТ
ТСС ТСА САС СТТ ССА СТТ СТА ААА ССА ТСС АТС АТС АСА СТТ СТС САА САС АСС ССА ССА
ВашН!
301
РЬе ТЫ РЬе С1у ст С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз Агд Суз + ♦ * ★ + С1у Зег 61 у
ТТТ АСС ТТС ССС САА ссс АСС ААС СТС САА АТС ААА ССС ТСС ТАА ТАА ССА ТСС ССС
ААА ТСС ААС ссс СТТ ссс тсс ТТС САС СТТ ТАС ТТТ ССС АСС АТТ АТТ ССТ АСС ссс
(* начало последовательности ΤΛР1-5-19СΥδ)
Прямой праймер:
5'-ТССАСССССТССАСССАСАТССАСАТСАСССАСТСТССА-3.'
Обратный праймер:
5'-ТТАССАСССССАТССТТАТТАССАСССТТТСАТТТССАС-3'.
ПЦР-реакцию (объем 50 мкл) ставили следующим образом: 200 мкМ дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (άΝΤΡ), 0,4 мкМ каждого праймера, 5 мкл десятикратного буфера ЕГиТигЬо ЛгаШдепе), 100 нг матричной плазмиды (кодирующей ТАР1-5-19), 1 мкл фермента ЕГиТигЬо ЛгаШдепе), и объем доводили до 50 мкл стерильной водой. Использовали следующие условия ПЦР: начальная стадия денатурации
- 85 020464
94°С в течение 2 мин, затем 25 циклов 94°С в течение 30 с, 64°С течение 30 с и 72°С течение 30 с. Также включали конечную стадию удлинения при 72°С в течение 5 мин. Продукт ПЦР очищали и расщепляли с использованием δ;·ι1Ι и ВатН1 и лигировали в вектор, который также расщепляли теми же рестриктазами. Правильные клоны верифицировали секвенированием ДНК.
Экспрессия и очистка ТЛК1-5-19СУ8
Вектором ТЛК1-5-19СУ8 трансформировали химически компетентные клетки ВЬ21 (ΌΕ3) рЬу8§ (Ыоуадеп), следуя протоколу изготовителя. Клетки, несущие плазмиду ДЛЬ. селектировали для использования 100 мкг/мл карбенициллина и 37 мкг/мл хлорамфеникола. Культуры содержали в 2-л рифленых колбах, содержащих 500 мл Тегпйс Вго1Ь (Ыдта-АИпсЬ), 100 мкг/мл карбенициллина и 37 мкг/мл хлорамфеникола. Культуры выращивали при 30°С при 200 об/мин до оптической плотности при 600 нм (Θ.Ό.600) 1-1,5 и затем индуцировали 1 мМ 1РТС (изопропил-бета-Э-тиогалактопиранозид, от МеИогД ЬаЬогаЮпек). Экспрессию ДАЬ продолжали в течение 12-16 ч при 30°С. Было обнаружено, что большая часть ДЛЬ присутствовала в культуральной среде. По этой причине клетки отделяли от среды центрифугированием (8000 д в течение 30 мин) и супернатант использовали для очистки ДЛЬ. На литр супернатанта добавляли 30 мл агарозы с белком Ь (АГГйесЬ) и связывание ДЛЬ продолжали течение 2 ч. Затем смоле давали осесть под действием силы тяжести в течение еще 1 ч, перед тем как откачивали супернатант. Агарозу затем помещали в колонку ХК 50 (АтегкЬат РЬагтааа) и промывали 10 объемами колонки РВ§. Связанное ДЛЬ элюировали 100 мМ глицином, рН 2,0, и фракции, содержащие белок, нейтрализовали добавлением 1/5 объема 1 М трис рН 8,0. На 1 л супернатанта культуры выделяли 20 мг чистого белка, которые содержали соотношение мономера и димера 50:50.
Тримеризация ТЛР1-5-19СУЗ
2,5 мл 100 мкМ ТЛК1-5-19СУ8 восстанавливали 5 мМ дитиотриетола и оставляли при комнатной температуре на 20 мин. Затем в образце заменяли буфер с использованием колонки ΡΌ-10 (АтегкЬат РЬагтааа). Колонку предварительно уравновешивали с использованием 5 мМ ЕЭТА, 50 мМ фосфата натрия, рН 6,5, и образец наносили и элюировали, следуя руководствам изготовителя. Образец замораживали до использования. ТМЕА (трис[2-малеимидоэтил]амин) приобретали от Р1егсе В|о1есЬпо1оду. 20 мМ исходный раствор ТМЕА приготавливали в 100% ΌΜδΘ (диметилсульфоксиде). Было обнаружено, что концентрация ТМЕА более 3:1 (молярное соотношение ДАЬ:ТМЕА) вызывала быстрое осаждение и перекрестное сшивание белка. Также интенсивность осаждения и перекрестного сшивания увеличивалась с повышением рН. Таким образом, с использованием 100 мМ восстановленного ТАК1-5-19СΥδ, добавляли 25 мкМ ТМЕА для тримеризации белка и реакции давали идти при комнатной температуре в течение 2 ч. Было обнаружено, что добавление добавок, таких как глицерин или этиленгликоль, до 20% (объемное отношение (ν/ν)) значимо уменьшало осаждение тримера по мере прохождения реакции сочетания. После сочетания анализом δΌδ-РАОЕ было показано присутствие в растворе мономера, димера и тримера.
Очистка тримерного ТАК1-5-19СΥδ мкл 40% ледяной уксусной кислоты добавляли на 1 мл реакции ТМЕА-ТАК1-5-19сук для снижения рН до приблизительно 4. Образец затем наносили на 1 мл Кекоигсе δ колонку для катионообменной хроматографии (АтегкЬат РЬагтааа), которую предварительно уравновешивали с использованием 50 мМ ацетата натрия рН 4,0. Димер и тример частично разделяли с использованием солевого градиента 340-450 мМ хлорида натрия, 50 мМ ацетата натрия, рН 4,0, 30 объемов колонки. Фракции, содержащие только тример, устанавливали с применением δΌδ-РАОЕ и затем объединяли, и рН увеличивали до 8 добавлением 1/5 объема 1 М трис рН 8,0. Для предупреждения осаждения тримера в течение стадий концентрации (с применением концентраторов УАа крш с отсечкой 5К; УКакаепсе), к образцу добавляли 10% глицерин.
Функциональное исследование связывания ίη У'Нго: исследование на рецепторах ТЫР и исследование на клетках
Аффинность тримера в отношении человеческого ТЫРа определяли с применением исследования на рецепторах ТЫР и исследования на клетках. 1С50 в исследовании связывания рецепторов составляла приблизительно 0,3 нМ; ΝΏ50 в исследовании на клетках составляла от 3 до 10 нМ (например, 3 нМ).
Другие возможные форматы тримеров ТАК1-5-19СΥδ
ТАК1-5-19СΥδ можно также придать формат тримера с использованием следующих реагентов.
ПЭГ -тримеры и специально изготовленные синтетические малеимидные димеры
Ыек1аг (ЪЬеапуаКг) предлагают спектр разветвленных ПЭГ, которые могут быть химически модифицированы на конце ПЭГ. Таким образом, использование ПЭГ-тримера с малеимидной функциональной группой на конце каждой цепи может сделать возможной тримеризацию ДАЬ сходным образом с тем, как описано выше с применением ТМЕА. ПЭГ может также иметь преимущество увеличенной растворимости тримера, предупреждая, таким образом, проблему агрегации. Таким образом, можно получить тример ДАЬ, где каждое ДАЬ имеет С-концевой цистеин, связанный с малеимидной функциональной группой, где малеимидные функциональные группы связаны с ПЭГ-тримером.
- 86 020464
Присоединение полипептидного линкера или шарнирной области к С-концу бАЬ
Между бАЬ и концевым цистеиновым остатком может быть конструирован небольшой линкер, любой из (О1у48ег)и, где и=от 1 до 10, например 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7, иммуноглобулиновый линкер (например, шарнирная область 1дО, либо случайная пептидная последовательность (например, выбранная из библиотеки случайных полипептидных последовательностей). Кроме того, при использовании для изготовления мультимеров (например, димеров или тримеров), это может приводить к большей степени гибкости и большему расстоянию между отдельными мономерами, что может улучшить характеристики связывания мишени, например мишени из нескольких субъединиц, такой как человеческий ТОТа.
Пример 9. Селекция набора отдельных доменных антител (бАЬ), направленных против человеческого сывороточного альбумина (н§А) и мышиного сывороточного альбумина (М8А).
В этом примере пояснен способ изготовления отдельного доменного антитела (бАЬ), направленного против сывороточного альбумина. Описана селекция бАЬ как против мышиного сывороточного альбумина (М8А), так и против человеческого сывороточного альбумина (н§А). В этом эксперименте использовали три библиотеки человеческих антител для фагового дисплея, каждая из которых основана на отдельной человеческой каркасной области для Ун (см. фиг. 13: последовательность модельного Ун, основанного на Υ3-23/ΌΡ47 и Ш4Ь) или Ук (см. фиг. 15: последовательность модельного Ук, основанного на ο12/ο2/^ΡΚ9 и Лк1), с разнообразием боковой цепи, кодируемым кодонами ΝΝΙ<, введенным в области, определяющие комплементарность (СЭК1, СЭК2 и СЭК3).
Библиотека 1 (Ун)
Разнообразие в положениях: н30, Н31, н33, Н35, Н50, Н52, Н52а, Н53, Н55, Н56, Н58, Н95, Н97,
Н98.
Размер библиотеки: 6,2х109.
Библиотека 2 (Ун)
Разнообразие в положениях: н30, Н31, н33, Н35, Н50, Н52, Н52а, Н53, Н55, Н56, Н58, Н95, Н97, Н98, Н99, Н100, Н100а, н100Ь.
Размер библиотеки: 4,3 х109.
Библиотека 3 (Ук)
Разнообразие в положениях: Ь30, Ь31, Ь32, Ь34, Ь50, Ь53, Ь91, Ь92, Ь93, Ь94, Ь96.
Размер библиотеки: 2х109.
В библиотеках Ун и Ук проводили предварительную селекцию для связывания лигандов общего типа, белка А и белка Ь, соответственно, таким образом, что большинство клонов в неселектированных библиотеках являются функциональными. Размеры библиотек, показанные выше, соответствуют размерам после предварительной селекции.
Два раунда селекции проводили на сывороточном альбумине с использованием каждой из библиотек по отдельности. Для каждой селекции антиген использовали для покрытия иммунологической пробирки (Νιιικ) в 4 мл ΡΒδ в концентрации 100 мкг/мл. В первом раунде селекции каждую из трех библиотек сортировали по отдельности против И$А (δίβΐηη) и МδΑ (δίβΐηη). Во втором раунде селекции фаг от каждой из шести селекции первого раунда сортировали против (1) того же антигена повторно (например, 1-й раунд МδΑ, 2-й раунд МδΑ) и (2) против реципрокного антигена (например, 1-й раунд МδΑ, 2-й раунд н$А), получая в результате двенадцать селекции 2-го раунда. В каждом случае после второго раунда селекции 48 клонов исследовали на связывание И$А и МδΑ. Растворимые фрагменты бАЬ получали, как описано для ксРу-фрагментов наткои е! а1., МеШобк Еи/уток 1996; 267:83-109, и следовали стандартному протоколу ЕЬКА (ноодеиЬоот е! а1. (1991), №с1ею Асйк Кек., 19: 4133), за исключением того, что в качестве блокирующего буфера использовали 2% Шееи ΡΒδ и связанные бАЬ выявляли либо белком ЬИКГ (δίβΐηη) (для Ук), либо белком А-ЖГ (Атегкйат ΡЬа^тас^а Β^ο!есЬ) (для Ун).
бАЬ, от которых получали сигнал интенсивнее фона, что указывало на связывание МδΑ, ЖА или и того, и другого, исследовали в ЕМБА нерастворимой формы на связывание пластика самого по себе, но все были специфичны в отношении сывороточного альбумина. Клоны затем секвенировали (см. табл. 5), и при этом было выявлено, что была идентифицирована 21 уникальная последовательность бАЬ. Минимальное сходство (на аминокислотном уровне) между селектированными клонами Ук бАЬ составляло 86,25% ((69/80)х 100; результат, когда все диверсифицированные остатки различны, например 24 и 34 клоны). Минимальное сходство между селектированными клонами Ун бАЬ составляло 94% (127/136)х100).
Затем, бАЬ, связывающие сывороточный альбумин, исследовали на их способность к захвату биотинилированного антигена из раствора. Следовали протоколу ЕМБА (как описано выше), за исключением того, что планшет для ЕМБА покрывали 1 мкг/мл белка Ь (для клонов Ук) и 1 мкг/мл белка А (для клонов Ун). Растворимый бАЬ захватывали из раствора, как описано в протоколе, и выявление проводили с использованием биотинилированного МδΑ или ЖА и стрептавидина-ΗКΡ. Биотинилированный МδΑ и ЖА готовили в соответствии с инструкциями изготовителя с целью получения в среднем 2 биотинов на молекулу сывороточного альбумина. Были идентифицированы двадцать четыре клона, которые захватывали биотинилированный МδΑ из раствора при ЕЬКА, табл. 5. Два из них (2 и 38 клоны ниже)
- 87 020464 также захватывали биотинилированный ЖА. Затем, !АЬ исследовали на их способность связывать МδА, нанесенный на чип СМ5 Вхатоте. Были обнаружены восемь клонов, которые связывали МδА на
Таблица 5
бАЬ (все
захватыва Свя- Свя-
ют зывает зывает
биотинили Н М5А биотини-
рованный или в лирован-
М8А) к СОР1 СОК2 сэкз В|асоге ный НЗА
Библиотекк хххъх ХА5ХЫ25 ООХХХХРХТ
а νκ матрицы (модели) ζ все 4 связыва-
2, 4, 7,41, к 58ΥΙ,Ν КА8РЬ25 ООТУЗУРРТ ЮТ
38,54 к 33ΥΙ.Ν ВАЗРЬОЗ ΟΟΤΥΕΙΡΡΤ оба связыва- ют
46, 47, 52,
56 К РКЗЬК ИАЗУЬОЗ οςννΥΜΡντ
13, 15 к УУНЬК КАЗТЬОЗ οονκκνρκτ
30, 35 к ККУЬК <2Α3νΐχ5 <2<2СЬУРР1Т
19, к ΥΝΒΙ,Κ КАЗЗЬОЗ ΟΟΝννίΡΕΤ
22, к ьиньв НАЗЬЬОЗ ΏΟ3ΑνΥΡΚΤ
23, к ΓΚΥΙ,Α НАЗНЬОЗ ООКЬЬУРКТ
24, к ГТ'НЬА РАЗКЬОЗ 00ЕАЕИРЕТ
31, к ΙΚΗΙ,Ν КАЗЕЫ23 ΟΟνΑΚνΡΚΤ
зз. к ΥΚΥΙ,Κ КАЗЗЬОЗ ООУУСУРЕТ
34, к ЪКУЬК ΝΑ5ΗΙ,<23 ΟΟΤΤΥΥΡΙΤ
53, к ΙΚΥΙΚ КАЗИЬОЗ ΟΟνί,ΥΥΡΟΤ
11, к ькзьк ААЗКЬОЗ ΟΟννΥΜΡΑΤ ✓
12, к гкньк ААЗКЬСЗ ΟΟνΑΕΥΡΚΤ ✓
17, к ККУЬК ТАЗЗЬОЗ ΩβΝΙΓΜΡΕΤ ζ
18, к ΚΚΥΙ.Ν ААЗЗЬОЗ ООМЬГУРКТ ζ
16, 21 к 1КНЬК САЗКЬОЗ ООСАКИРОТ Ζ
25, 26 к ΥΥΗΤΚ ΚΑ3ΊΊ,ζ>3 ΟΩνΚΚνρΕΤ ✓
27, к УКНЬК НАЗНЬОЗ <22ν6ΚΥΡΚΤ ζ
55, к ГКЗЬК ΝΑΞΥΓ03 ΟΟννΥΜΡνΤ ζ
1 (и 2)
библио- ΧΙΧΧΧ2ΧΧΤΧΥΑ05νΚ
тека УнН ΧΧΥΧΧΧ С ΧΧΧΧ(ΧΧΧΧ) ΕΈΥ
матрица
(модель) 315АГСАКТЬУА057К
8,10 Η «νγςΜϋ 0 ΕΞ6ΚΓ0Υ
5Ι55Ρε35ΤΙ,ΥΑ05νΚ
36, Η ИЗУ2МТ С 6Κ0ΗΝΥ5Ι,ΕΌΥ
- 88 020464
Во всех случаях каркасные области были идентичны каркасным областям в соответствующей модельной последовательности с разнообразием в СОК, как указано в табл. 5.
Из восьми клонов, связывавших М8А на В1асоге, два клона, интенсивно экспрессируемых в Е.соП (клоны М8А16 и М8А26), были выбраны для дальнейшего исследования (см. пример 10). Полные нуклеотидные и аминокислотные последовательности М8А16 и 26 даны на фиг. 16.
Пример 10. Определение аффинности и периода полувыведения М8А-связывающих йАЬ, М8А16 и М8А26, в сыворотке у мышей.
Как описано в И8 20060251644, одним из обычных способов определения аффинности связывания является оценка констант скорости ассоциации и диссоциации с применением системы поверхностного плазмоннного резонанса В1асоге™ (Ыасоге, 1пс.). Биосенсорный чип активируют для ковалентного связывания мишени в соответствии с инструкциями изготовителя (В1асоге). Мишень затем разводят и наносят на чип для получения сигнала в единицах резонанса (КИ) иммобилизированного вещества. Поскольку сигнал в КИ пропорционален массе иммобилизированного вещества, он отражает спектр плотностей иммобилизированной мишени на матрице. Данные о диссоциации согласуют с односайтовой моделью для получения КоГГ +/- к.й. (стандартное отклонение измерений). Константы скорости псевдопервого порядка (Кй) вычисляют для каждой кривой ассоциации, и наносят на график как функцию концентрации белка для получения Коп +/- к.е. (стандартная ошибка выравнивания). Равновесные константы диссоциации для связывания, Кй вычисляют на основе вычислений 8РК как КоГГ/Коп.
йАЬ М8А16 и М8А26 экспрессировали в периплазме Е.соП и очищали с использованием пакетной абсорбции на смоле для аффинной хроматографии с агарозой с белком Ь (АГГйесЬ, Ыогоау) с последующим элюированием глицином при рн 2,2. Очищенные йАЬ затем анализировали ингибированием В1асоге для определения Кй. Кратко, очищенные М8А16 и М8А26 исследовали для определения концентрации йАЬ, необходимой для достижения ответа в 200 КИ на чипе В1асоге СМ5, покрытом М8А с большой плотностью. После определения необходимых концентраций йАЬ, антиген М8А в ряде концентраций, близких ожидаемой Кй, предварительно смешивали с йАЬ и инкубировали в течение ночи. Связывание йАЬ с покрытым М8А чипом В1асоге в каждой предварительной смеси затем измеряли при высокой скорости потока 30 мкл/мин. Аффинности определяют с применением поверхностного плазмонного резонанса (8РК) и В1асоге (Каг1ккоп е! а1., 1991). Система В1асоге (Иррка1а, 8\\ейеп) является предпочтительным способом определения аффинности связывания. В системе В1асоге поверхностный плазмонный резонанс (8РК, ХУеИогй К. 1991, Ор!. Циап!. Е1ес!. 23:1; Мойоп апй Мук/ка, 1998, Ме!Ьойк ш Еп/уто1оду 295: 268) использован для наблюдения биомолекулярных взаимодействий в реальном времени. При анализе В1асоге легко генерируют константы скорости ассоциации, константы скорости диссоциации, равновесные константы диссоциации и константы аффинности. Получаемые кривые используют для создания графиков К1о1/ (К1о1/, 1.М. (1982), 8аепсе 217:1247-1249 и К1о1/, 1.М. (1983), 1. Тгепйк ш РЬагтасоЕ 8с1. 4:253-255), которые дают расчетную Кй 200 нМ для М8А16 и 70 нМ для М8А26 (фиг. 17А и В).
Затем, клоны М8А16 и М8А26 клонировали в вектор экспрессии с НА-меткой (последовательность нуклеиновой кислоты: ТАТССТТАТСАТСТТССТСАТТАТССА, и аминокислотная последовательность: УРУОУРЭУА) и количества 2-10 мг экспрессировали в Е.соП и очищали из супернатанта с использованием аффинной смолы с агарозой с белком Ь (АГй!есЬ, Ыогтау) и элюировали глицином при рн 2,2. Определяли период полувыведения йАЬ в сыворотке у мышей. М8А26 и М8А16 вводили как однократные внутривенные инъекции в дозе приблизительно 1,5 мг/кг мышам СЭЕ Анализ сывороточных концентраций проводили с использованием ловушки с козьими антителами против НА (АЬеат, ИК) и выявлением посредством ЕЫ8А с белком Ь-нКР (1пуйгодеп), который блокировали 4% Магуе1. Для промывания использовали 0,05% Гетееп РВ8. Стандартные кривые известных концентраций йАЬ строили в присутствии 1х мышиной сыворотки для подтверждения сопоставимости с исследуемыми образцами. Моделирование с применением 2-компартментной модели показало, что М8А-26 имел !1/2а 0,16 ч, !1/2β 14,5 ч и площадь под кривой (ЛИС) 465 чхмг/мл (данные не показаны), и М8А-16 имел !1/2а 0,98 ч, а !1/2β 36,5 ч и АИС 913 чхмг/мл (фиг. 18). Оба клона М8А имели существенно продленный период полувыведения по сравнению с нЕЬ4 (йАЬ против белого лизоцима куриного яйца), который имел !1/2а 0,06 ч и !1/2β 0,34 ч.
Пример 11. Создание РаЬ-подобных фрагментов Ун-Ун и Ук-Ук с двойной специфичностью.
В этом примере описан способ изготовления Ун-Ун и Ук-Ук с двойной специфичностью как РаЬподобных фрагментов. Перед конструированием каждого из описанных РаЬ-подобных фрагментов, йАЬ, связывающие выбранные мишени, селектировали из библиотек йАЬ, сходных с описанными в примере 9. Выделяли Ун йАЬ, нЕЬ4, связывающее лизоцим куриного яйца (81дта), и также выделяли второе Ун йАЬ (ТАК2Ь-5), связывающее рецептор ТЫРа (К апй Ό кук!етк). Их последовательности приведены в перечне последовательностей. Ук йАЬ, связывающее ТЫРа (ТЛКЕ-5-19), выделяли селекцией и созреванием аффинности, и последовательность также изложена в перечне последовательностей. В этих экспериментах было использовано второе Ук йАЬ (М8А 26), описанное в примере 9, последовательность которого представлена на фиг. 17б.
ДНК от векторов экспрессии, содержащих четыре йАЬ, описанных выше, расщепляли ферментами
- 89 020464
За11 и №)1 для выделения ДНК, кодирующей бАЬ. Полоску ожидаемого размера (300-400 пар оснований (Ьр)) очищали расщеплением на агарозном геле и выделением полоски с последующей очисткой из геля с использованием набора для очистки из геля р1адеп де1 рипПсаИоп кН (Р1адеп, ИК). ДНК, кодирующую бАЬ, затем вводили либо в векторы Сн, либо в векторы Ск (фиг. 8 и 9), как указано в табл. 6.
Таблица 6
адь Антиген-мишень адь νΗ или адьук Введение в вектор Метка (С- конец) Антибиотико- резистент- ность
ΗΕΙ.4 Лизоцим куриного яйца νΗ Сн туе Хлорамфе- никол
ТАК2-5 Рецептор ΤΝΡ Ск Над Ампициллин
ТАК1-5- 19 ΤΝΡα νκ Сн туе Хлорамфе- никол
М5А26 Мышиный сывороточный альбумин νκ Ск Над Ампициллин
Конструкциями νΗ Сн и νΗ Ск котрансформировали клетки НВ2151. Отдельно, конструкциями νκ Сн и νκ Ск котрансформировали клетки НВ2151. Культуры каждой из ^трансформированных клеточных линий выращивали в течение ночи (в 2хТу, содержащем 5% глюкозы, 10 мкг/мл хлорамфеникола и 100 мкг/мл ампициллина для поддержания селекции антибиотиками как для плазмид Сн, так и для плазмид Ск). Культуры, выращиваемые в течение ночи, затем использовали для засева в свежую среду (2хТу, 10 мкг/мл хлорамфеникола и 100 мкг/мл ампициллина) и выращивали до ΘΌ 0,7-0,9 перед индукцией добавлением 1РТС для экспрессии их конструкций Сн и Ск. Экспрессированный РаЬ-подобный фрагмент затем очищали из периплазмы посредством очистки с использованием белка А (для котрансформированных Ун Сн и νι ι Ск) и очисткой на смоле с МЗА для аффинной хроматографии (для котрансформированных νκ Сн и νκ Ск).
Ун-Ун с двойной специфичностью
Экспрессию Ун Сн и Ун Ск с двойной специфичностью исследовали электрофорезм белков на геле. Гель подвергали блоттингу и полоску ожидаемого размера для РаЬ-фрагмента можно было выявить при вестерн-блоттинге посредством как тус-метки, так и йад-метки, что указывало на присутствие как Ун Сн, так и Ун Ск частей РаЬ-подобного фрагмента. Затем, с целью определения присутствия двух половин лиганда с двойной специфичностью в одном и том же РаЬ-подобном фрагменте на планшет для ЕЫЗА в течение ночи при 4°С наносили 100 мкл на лунку лизоцима куриного яйца (нЕЬ) в концентрации 3 мг/мл в буфере с бикарбонатом натрия. Планшет затем блокировали (как описано в примере 1) 2% Т\уееп РВЗ с последующей инкубацией с РаЬ-подобным фрагментом Ун Сн/Ун Ск с двойной специфичностью. Выявление связывания лиганда с двойной специфичностью с нЕЬ проводили посредством некогнатной цепи с использованием 9е10 (моноклонального антитела, связывающего тус-метку, КосЬе) и антитела против мышиного 1дС-ИКР (АтегкЬат РЬагташа Вю!есЬ). Сигнал РаЬ-подобного фрагмента Ун Сн/Ун Ск с двойной специфичностью составлял 0,154 по сравнению с фоновым сигналом 0,069 для цепи Ун Ск, экспрессированной самой по себе. Это демонстрирует, что РаЬ-подобный фрагмент имеет специфичность связывания в отношении антигена-мишени.
Ук-Ук с двойной специфичностью
После очистки ^трансформированного РаЬ-подобного фрагмента Ук Сн и Ук Ск с двойной специфичностью на смоле с МЗА для аффинной хроматографии получаемый белок использовали для зондирования планшета для ЕЫЗА, покрытого 1 мкг/мл ТЫРа, и планшета для ЕЫЗА, покрытого 10 мкг/мл МЗА. Как предсказывали, при выявлении белком Ь-ИКР сигнал обоих планшетов для ЕЫЗА превышал фоновый (данные не показаны). Это указывало на то, что фракция белка, способного связывать МЗА (и, таким образом, очищаемая на колонке с МЗА для аффинной хроматографии), была также способна связывать ТОТа в последующем ЕЫЗА, подтверждая двойную специфичность фрагмента антитела. Эту фракцию белка затем использовали для двух последующих экспериментов. Во-первых, планшет для ЕЫЗА, покрытый 1 мкг/мл ТОТа, зондировали РаЬ-подобным фрагментом Ук Сн и Ук Ск с двойной специфичностью и также контрольным бАЬ, связывающим ТОТа, в концентрации, которая, согласно вычислениям, дает сходный сигнал при ЕЫЗА. Как лиганды с двойной специфичностью, так и контрольное бАЬ, использовали для зондирования планшета для ЕЫЗА в присутствии и в отсутствие 2 мг/мл МЗА. Сигнал от лунки с лигандом с двойной специфичностью был снижен более чем на 50%, но сигнал от лунки с бАЬ не был снижен вообще (см. фиг. 19а). Тот же белок подвергали исследованию на рецепторах с и без МЗА, и также была показана конкуренция с МЗА (см. фиг. 19в). Это показывает, что связывание
- 90 020464
М8А с лигандом с двойной специфичностью конкурирует со связыванием ТЫРа.
Пример 12. Создание связанных дисульфидными связями лигандов Ук-Ук с двойной специфичностью, специфичных в отношении мышиного сывороточного альбумина и ТЫРа.
В этом примере описан способ изготовления фрагмента антитела с двойной специфичностью, специфичного как в отношении мышиного сывороточного альбумина, так и ТЫРа, посредством химического связывания через дисульфидную связь. Как 6АЪ М8А16 (из примера 1), так и 6АЪ ТАКМ-РТ повторно клонировали в вектор на основе рЕТ с С-концевым цистеином и без меток. Два 6АЪ8 экспрессировали на уровне 4-10 мг и очищали из супернатанта с использованием аффинной смолы с агарозой с белком Ь (ЛГГ^!^есЬ, Ыог\\цу). Меченные цистеином 6АЪ затем восстанавливали дитиотреитолом. 6АЪ ТАК1-5-19 затем связывали с дитиопиридином для блокирования повторного образования дисульфидных связей, приводящего к образованию гомодимеров РЕР 1-5-19. Два разных 6АЪ затем смешивали при рН 6,5 для стимулирования образования дисульфидной связи и формирования дисульфидно связанных гетеродимеров ТАК1-5-19 и М8А16. Этот способ получения конъюгатов двух разных белков был изначально описан Кшд е! а1. (Кшд ТР, Ы Υ КосЬоит1ап Ь ВюсЬет18йу. 1978 νо1 17:1499-506 Ргерагайоп оГ рго!еш сон)ида!е8 νίη т!егто1еси1аг 318и1й3е ЬопЗ Гогтайоп). Гетеродимеры отделяли от мономерных разновидностей катионообменной хроматографией. Разделение подтверждали по присутствию полоски ожидаемого размера на геле с додецилсульфатом натрия (δΌδ). Получаемые гетеродимерные разновидности исследовали в анализе на рецепторах ТЫР, и было обнаружено, что они имеют 1С50 нейтрализации ТЫР приблизительно 18 нМ. Затем, исследования на рецепторах повторяли с постоянной концентрацией гетеродимера (18 нМ) и серией разведений М8А и Н8А. Присутствие Н8А в ряде концентраций (до 2 мг/мл) не вызывало снижения способности димера ингибировать ТЫРа. Тем не менее, добавление М8А вызывало дозозависимое снижение способности димера ингибировать ТЫРа (фиг. 20). Это показывает, что М8А и ТЫРа конкурируют за связывание связанного дисульфидными связями димера ТАК1-5-19 и М8А16.
Краткое изложение данных
Краткое изложение данных, полученных в экспериментах, изложенных в предыдущих примерах, приведено в приложении 4.
Пример 13. Селекция и описание 6АЪ для связывания сывороточного альбумина от ряда видов.
6АЪ против человеческого сывороточного альбумина, мышиного сывороточного альбумина и свиного сывороточного альбумина селектировали, как описано ранее для 6АЪ против М8А, за исключением следующих изменений протокола. Фаговые библиотеки синтетических доменов УН представляли собой библиотеки 4О и 6О, которые основаны на человеческом УН3, содержащем ген зародышевого типа ЭР47 и сегмент 1Н4, для УН и человеческом Ук1 содержащем ген зародышевого типа ЭРК9 и сегмент ХЕ для Ук. Библиотеки содержат 1х1010 отдельных клонов. Субпопуляцию из библиотек УН и Ук подвергали предварительной селекции для связывания лигандов общего типа, белка А и белка Ь, соответственно, таким образом, что большинство клонов в неселектированных библиотеках являлись функциональными. Размеры библиотек, показанные выше, соответствуют размерам после предварительной селекции.
Проводили два или три раунда селекции на мышином, свином и человеческом сывороточном альбумине с использованием субпопуляций из библиотек УН и Ук по отдельности. Для каждой селекции антиген был либо (1) нанесен на иммунологическую пробирку (Ыипс) в 4 мл РВ§ в концентрации 100 мкг/мл, либо (2) биотинилирован и затем использован для селекции в растворе с последующим захватом на стрептавидиновые гранулы или нейтравидиновые гранулы. В каждом случае после второго или третьего раунда селекции, селектированную ДНК клонировали в вектор экспрессии для получения растворимого 6АЪ и собирали отдельные колонии. Растворимые фрагменты 6АЪ получали, как описано для 8сРνфрагментов Нат8оп е! а1. (Ме!Ьоб8 Еп/уто1. 1996; 267:83-109), и для каждой селекции 96 растворимых клонов исследовали на связывание ряда сывороточных альбуминов.
Скрининг клонов на связывание сывороточного альбумина от ряда видов проводили с использованием аппарата для поверхностного плазмонного резонанса В1асоге (В1асоге АВ). Чип СМ-5 В1асоге покрывали сывороточным альбумином от разных видов с высокой плотностью в каждой из 2-4 проточных ячеек. 6АЪ, демонстрировавшие связывание с одним или более рассматриваемыми сывороточными альбуминами, секвенировали и экспрессировали в объеме 50 мл, очищали с использованием белка Ь и затем подвергали скринингу в известной концентрации для связывания набора сывороточных альбуминов на чипе СМ-5 В1асоге, покрытом сывороточным альбумином с низкой плотностью во 2-4 проточных ячейках. Было обнаружено несколько 6АЪ, связывавших сывороточный альбумин от ряда различных видов, и предпочтительные кандидаты, вместе с их профилями связывания, перечислены в табл. 7.
- 91 020464
Таблица 7
Н5А ГС5А МЗА Сывороточный
(аффинность. (аффинность, (аффинность, альбумин
если ее если ее если ее яванского
измеряли) измеряли) измеряли) макака (аффинность, если ее измеряли)
ООМ7Н-9 связывает 200 нМ связывает связывает связывает
ООМ7МО связывает ΝΟ ΝΟ Νϋ
ООМ7Р-11 связывает связывает связывает связывает
ООМ7Н-12 связывает ΝΟ связывает связывает
ООМ7Н-13 связывает связывает связывает
ϋΟΜ7Ιι-14 связывает 33 нМ связывает связывает 27 нМ связывает 123 нМ
Таким образом, в этом эксперименте авторы изобретения выделили ЛΑЪ, связывающие ΗδΑ и альбумин от одного или более из ряда видов, не являющихся людьми. Например, авторы изобретения обнаружили ЛΑЪ, связывающие (1) человеческий и мышиный альбумин, (2) человеческий альбумин и альбумин яванского макака, (3) человеческий и крысиный альбумин и (4) человеческий, мышиный, крысиный альбумин и альбумин яванского макака.
Пример 14. Определение периода полувыведения слитых белков ЛΑЪ/НΑ-метка-эпитоп или ЛΑЪ/тус-метка-эпитоп, связывающих сывороточный альбумин, в сыворотке у крысы и яванского макака, и определение периода полувыведения в сыворотке.
ЛΑЪ против сывороточного альбумина яванского макака экспрессировали с С-концевыми НА- или тус-метками в периплазме Εχο1ί и очищали с использованием пакетной абсорбции на смоле для аффинной хроматографии с агарозой с белком Ь (ΛГй!есЬ, Νογυήυ) для Ук ЛΑЪ и пакетной абсорбции на смоле для аффинной хроматографии с агарозой с белком А для Ун ЛΑЪ, с последующим элюированием глицином при рН 2,0. Для определения периода полувыведения в сыворотке группам из 3 яванских макаков однократно внутривенно вводили 2,5 мг/кг ^ΟΜ7Ь-9, ^ΟΜ7Ь-11 или ^ΟΜ7Ь-14. Образцы крови получали серией заборов крови из бедренной вены или артерии в течение периода из 21 дня и из каждого образца приготавливали сыворотку. Образцы сыворотки анализировали посредством сэндвич-Ε^IδΑ с применением козьих антител против НА ^^ат, СатЪпЛде ϋΚ) или козьих антител против тус ^Ъеат, СатЪпЛде υΚ), нанесенных на планшет для ΞυδΑ, с последующим выявлением белком Ь-ИКК. Стандартные кривые известных концентраций ЛΑЪ строили в присутствии сыворотки яванского макака в такой же концентрации, как для экспериментальных образцов, для подтверждения сопоставимости исследуемых образцов. Согласование двойного экспоненциального моделирования с 2-хкомпартментной моделью (с использованием программного обеспечения Κ;·ιΕΗο8Γ;φ1ι (δγικτβγ 5οΠ\υ;πό, ΡΑ, υδΑ)) использовали для вычисления !1/2β, см. табл. 8.
ЛΑЪ против крысиного сывороточного альбумина экспрессировали с С-концевыми НА- или тусметками в периплазме Εχο1ΐ и очищали с использованием пакетной абсорбции на смоле для аффинной хроматографии с агарозой с белком Ь (ΑГй!есЬ, Νογυήυ) с последующим элюированием глицином при рН 2,0. ЛΑЪ затем метили 3Н с применением следующего способа. На каждый белок готовили один флакон: 300 мкл ΝδΡ распределяли по флакону и растворитель удаляли в мягком потоке азота при <30°С. Остаток затем ресуспендировали в диметилсульфоксиде (^ΜδΟ) (100 мкл). Аликвоту раствора белка (2,5 мл) добавляли к ^ΜδΟ-раствору и смесь инкубировали в течение 6 мин при комнатной температуре. Ровно 2,5 мл раствора затем помещали на предварительно уравновешенную колонку ΡΌ10 (предварительно уравновешенную 25 мл забуференного фосфатом физиологического раствора, ΡΒδ) и элюат удаляли. Будут добавлять забуференный фосфатом физиологический раствор (ΡΒδ, 3,5 мл) и собирать элюат. Таким образом получали раствор меченного белка в концентрации приблизительно 2 мг/мл. Определяли специфичную активность вещества и в зависимости от эффективного мечения раствор использовали немедленно или хранили при -20°С до востребования.
Для определения периода полувыведения в сыворотке группам из 4 крыс однократно внутривенно вводили 2,5 мг/кг ^ΟΜ7Ь-9, ^ΟΜ7Ь-11, ^ΟΜ7Ь-13 или ^ΟΜ7Ь-14. Образцы крови получали их хвостовой вены или артерии в течение периода из 7 дней и приготавливали сыворотку. Уровни 3Н определяли жидкостно-сцинтилляционным измерением активности и концентрацию меченного белка в каждом образце вычисляли в соответствии с известной специфичной активностью белка, введенного в начале эксперимента. Согласование двойного экспоненциального моделирования с 2-хкомпартментной моделью (с использованием программного обеспечения Κаίе^Лοд^аρЬ ^умегду 8οйγа^е, ΡΑ, υδΑ)) использовали для
- 92 020464 вычисления !1/2β, см. табл. 8.
Таблица 8
Агент Каркас Ι1/2β (у яванского макака) 11/2р (у крысы)
ЦОМ7Н-9 V, 3,8 суток 66 часов
ООМ7Н-11 νκ 5,2 суток 61 час
ϋΟΜ7Η-13 Ук не исследовано 73 часа
ООМ7Н-14 νκ 6,8 суток 56 часов
ϋΟΜ7Γ-3 Ук 53 часа
ϋΟΜ7Γ-16 Ук 43 часа
Агент Каркас 11 /2β (у яванского макака) 11/2β (у крысы)
ϋΟΜ7ή-9 Ук 3,8 суток 66 часов
ϋΟΜ7Κ-11 Ук 5,2 суток 61 час
ΟΟΜ7Η-13 Ук не исследовано 73 часа
ООМ76-14 Ук 6,8 суток 56 часов
ООМ7Г-3 Ук 53 часа
ΟΟΜ7Γ-16 Ук 43 часа
Период полувыведения альбумина у крысы и яванского макака составляет 53 ч (определено экспериментально) и 7-8 дней (согласно оценкам) соответственно. Из табл. 8 можно видеть, что период полувыведения ЙАЬ ЭОМ7г-3, ООМ7Н-9, ООМ7Н-11, ЭОМ7Н-13 и ЭОМ7Н-14 у крысы близок или, по существу, одинаков с периодом полувыведения альбумина у крысы. Также можно видеть, что период полувыведения ЙАЬ ЭОМ7Н-11 и ЭОМ7Н-14 у яванского макака близок или, по существу, одинаков с периодом полувыведения альбумина у яванского макака. ЙАЬ ЭОМ7Н-14 имеет период полувыведения как у крысы, так и у яванского макака, по существу, одинаковый с периодом полувыведения альбумина у обоих видов.
Пример 15. Картирование эпитопов.
Три домена человеческого сывороточного альбумина были ранее экспрессированы в РюЫа разЮпз (Эоска1 Сайег апй Кикег (1999), 1. Вю1. СНет. 2000 РеЬ 4; 275(5):3042-50). Авторы изобретения эккспрессировали те же домены с использованием вектора рР1С2аА для РюЫа разЮпз и там, где необходимо, очищали их до гомогенности на матрице МипеОс В1ие 8А (поставщик: РтотеНс Вюзшепсез), фиг. 21. Идентификацию домена сывороточного альбумина, связываемого ЙАЬ, оценивали одним из дух способов, иммунопреципитации доменных антител и конкурентного исследования В1асоге. Результаты показаны ниже на фиг. 22 и 23.
Для исследования иммунопреципитации 1 мл супернатанта Рю1йа разЮпз, экспрессирующих какойлибо из I, II или III доменов Н8А адаптировали к рН 7,4, и смешивали с 1 мкг ЙАЬ, и 10 мкл агарозы с белком А или белком Ь (для Ун или νκ ЙАЬ соответственно). Смесь перемешивали перевертыванием в течение 1 ч, чтобы сделать возможным образование комплекса, затем комплекс, связанный с агарозой, выделяли центрифугированием при 13000 д в течение 10 мин, супернатант фильтровали и осадочный материал промывали один раз с использованием РВ8, и выделяли центрифугированием. Гранулы затем ресуспендировали в буфере для введения образцов при 8Э8-РАОЕ, содержащем дитиотреитол (ОТТ), нагретом до 70°С, в течение 10 мин, затем проводили электрофорез в 4-12% гелях ИиРАОЕ для 8Ό8РАОЕ (поставщик: ^Нтодеп), и окрашивали 81тр1уВ1ие заГезЕтп
Для конкурентного исследования В1асоте очищенные ЙАЬ готовили в концентрации до 1 мкМ в НВ8-ЕР при рН 7,4, или 1 мкМ в 50 мМ цитратно-фосфатном буфере, 150 мМ ИаС1, рН 5,0, и там, где необходимо, с 7 мкМ очищенного домена Н8А. Исследования В1асоте при скорости потока 30 мкл/мин на поверхности чипа СМ5, покрытого 500-1000 КИ человеческого сывороточного альбумина, и чистой эталонной ячейке, использованной для субтракции исходного уровня.
В табл. 9 представлен список НАЬ, специфичных в отношении человеческого сывороточного альбумина и домена (доменов) человеческого сывороточного альбумина, которым они соответствуют при картировании (как определено посредством иммунопреципитации и/или Вгасоте).
- 93 020464
Таблица 9
Клон Κ/Κ Картированный домен Η8Α
ООМ7И-1 Κ II домен
ООМ7К-2 Κ Νά
ЮОМ7Ь-6 Κ N6
ООМ7К-7 Κ N6
ООМ7К-8 Κ II домен
ООМ7К-9 Κ ,1 домен
ООМ7И-Ю Κ N6
ООМ7К-11 Κ II домен
ООМ7Н-12 κ II домен
ϋΟΜ7Ιι-13 κ II домен
ΟΟΜ7Η-14 κ II домен
ϋΟΜ7Ιι-21 Η N6
ΟΟΜ7Μ-22 Η Ι+ΙΙΙ домены
ΟΟΜ7Κ-23 Η N6
ϋΟΜ7Κ-24 Η N6
ϋΟΜ7Ιι-25 Η N6
ϋΟΜ71ι-26 Η Νό
ООМ7П-27 Н III домен
ООМ7К-30 Н III домен
ООМ7К-31 Н Νά
Ν± не определено.
В заключение, большинство йАЬ связывают 2-й домен н8А, и, таким образом, ожидают, что они не конкурируют со связыванием человеческого сывороточного альбумина с РсКп. Два йАЬ (ΌΟΜ7Η-27 и ΌΟΜ7Η-30) связывают III домен.
ЙАЬ Связываемый домен Η8Α ΡΙΙ связывания НЗА при 1 мкМ, рН 7,4 КЫ связывания Н8А при 1 мкМ, рН 5,0 ΗΪ5 в СОК
ООМ7И-1 II 300с 150 нет
ϋΟΜ7ίι-3 ΝΙ 0 0
ϋΟΜ71ι-4 ΝΙ 0 0
ϋΟΜ7Ιι-8 II 1000 250 нет
ЭОМ711-9 II 150 0 СОК1
ϋΟΜ7ή-11 II 250 0 сокз
ϋΟΜ7Μ2 На 55 0 нет
ΟΟΜ7Κ-13 II 300 40 2 в СОКЗ
ϋΟΜ7Ιι-14 II 20 0 нет
ΟΟΜ7Κ-22 I + ШЬ 100с 0 СЦК2
ООМ7И-27 III 50 0 нет
ϋΟΜ7ή-30 III 320 35 нет
Краткое изложение результатов картирования эпитопов А1ЬийАЬ™ (йАЬ, специфично связывающих сывороточный альбумин), связывающих н8А, и данных В1асоге при рн 7,4 и 5,0.
Пример 16. Селекция йАЬ ш У11го в присутствии метаболитов.
Молекулы альбумина аккумулируют эффекты воздействия других соединений в сыворотке в течение времени их жизни, составляющего приблизительно 19 дней. Эти эффекты включают связывание множества молекул, имеющих аффинность в отношении альбумина, включая, предпочтительно без ограничения, цистеин и глутатион как смешанные дисульфиды, витамин В6, δ-билирубин, гемин, тироксин, длинноцепочечные и среднецепочечные жирные кислоты и глюкозу на ε-аминогруппах. Также, метаболиты, такие как ацетальдегид (продукт метаболизма этанола в печени), метаболиты жирных кислот, ацилглюкуронид и метаболиты билирубина. В дополнение, многие лекарственные средства, такие как
- 94 020464 варфарин. галотан. салициловая кислота. бензодиазепины и другие (см. обзор в Ракапо е! а1. 2005. ШВМВ ЫГе). и также1-О-гемфиброзил-β-^-глюкуронид, связывают сывороточный альбумин.
Соединения, которые. как обнаружено, связывают сывороточный альбумин, имеют тенденцию к связыванию определенных областей на молекуле альбумина, потенциально блокируя посредством этого эти области для связывания других молекул. таких как А1ЬийАЬ™ (йАЬ. специфично связывающих сывороточный альбумин). Для многих лигандов были идентифицированы области связывания, основные и наиболее полно охарактеризованные области связывания называют область Зий1оте 1 и область Зий1оте 2. Согласно этой номенклатуре 1 область расположена в субдомене НА и связывает варфарин и другие лекарственные средства, которые обычно представляют собой крупные гетероциклические анионные молекулы. 2 область расположена в субдомене ША и связывает ароматические карбоновые кислоты с растянутой конформацией, с отрицательным зарядом у одного конца молекулы, такие как стереотипичная 2 область лиганда. ибупрофен. Второстепенные области связывания как для варфарина. так и для ибупрофена, были идентифицированы на I и II доменах соответственно. Также существуют другие области связывания и их подобласти, что означает, что в циркуляции сывороточный альбумин существует в сложной смеси связанных лигандов с аффинностями, варьирующими от 1 х 10-2 М до 1 х 10-8 М. Олеиновая кислота. например, связывает до 7 областей на ЗА (I. Мо1 Вю1. 2001. 314:955-60).
Человеческий сывороточный альбумин был в кристаллизованном комплексе с жирными кислотами (РеШрак I.. Сгипе Т.. ВкаНаскагуа А.А.. Сиггу З. №и. З!гис! Вю1. (1998). 5:827-35). Области связывания для этих молекул расположены в гидрофобных углублениях у поверхности ЗА и распределены асимметрично, несмотря на почти трехмерную симметрию молекулы нЗА. Позднее. использование различных рекомбинантных фрагментов сывороточного альбумина помогло более точно установить роль доменов в образовании областей связывания (например, Рто!еш Зс1 (2000). 9:1455-65; I. Вю1 Скет. (1999). 274:29303-10). Вытеснение связанных лигандов из ЗА играет важную роль во взаимодействии лекарственных средств. например, период полувыведения варфарина уменьшается при его вытеснении из ЗА этанолом (I. Вю1 Скет. (2000). 275:38731-8). Аффинность других лекарственных средств в отношении ЗА изменяется присутствием других лекарственных средств в других областях связывания. Например, связывание диазепама со 2 областью увеличивает аффинность 1 области к теноксикаму в результате конформационных изменений при связывании. Это значимо влияет на фармакокинетические свойства (Рипйат С1т Ркагтасо1. (1989). 3:267-79).
Таким образом. для А1ЬийАЬ™ (йАЬ. специфично связывающего сывороточный альбумин) является желательным выбрать такое. которое не изменяет характеристики связывания сывороточного альбумина для лекарственных средств. связываемых ЗА. В дополнение, там. где было показано, что связывание лекарственного средства изменяет конформацию ЗА. желательно иметь А1ЬийАЬ™ (йАЬ. специфично связывающее сывороточный альбумин), связывающее ЗА как в присутствии, так и в отсутствие лекарственного средства. Эти способы означают, что будет возможным идентифицировать такое А1ЬийАЬ™ (йАЬ. специфично связывающего сывороточный альбумин), у которого не будет значимых положительных или отрицательных лекарственных взаимодействий с ключевыми лекарственными средствами. Таким образом. в этом примере описана селекция фага для идентификации йАЬ. связывающих сывороточный альбумин в присутствии соединений и метаболитов, которые. вероятно, присутствуют, связанные с альбумином, ш У1уо. Селекции фагов проводят в присутствии одного или нескольких метаболитов или соединений, о которых известно, что они взаимодействуют с сывороточным альбумином ш У1уо. В этих селекциях идентифицируют А1ЬийАЬ™ (йАЬ. специфично связывающие сывороточный альбумин), которые будут связывать сывороточный альбумин таким образом. что. вероятно, этому связыванию не будет мешать присутствие метаболитов или других соединений.
Фаговые библиотеки, описанные в примере 1. используют, как описано в примере 1. для селекции против альбумина от одного или более из ряда видов. включая человека, яванского макака. крысу и мышь. Альбумин, использумый в качестве антигена, отличается от описанного в примере 1 тем. что его будут предварительно инкубировать с метаболитом или соединением в концентрации в 10-100 раз большей, чем концентрация самого альбумина. Это может быть проведено либо с одним соединением или метаболитом, либо с более чем одним соединением или метаболитом. В частности, это может быть проведено в присутствии соединений, занимающих I область альбумина или II область альбумина, или обе области. Эта концентрация метаболита также присутствует в буфере. используемом для покрытия иммунологических пробирок антигеном, и в буферах. используемых в течение ключевых стадий селекции. Стадии с присутствием метаболитов включают блокирующий буфер МРВЗ. используемый для блокирования иммунологических пробирок, покрытых антигеном, или биотинилированного антигена (для селекции в растворе), и также буфер. в котором блокируют фаговую библиотеку. В этом способе при добавлении блокированного фага в иммунологическую пробирку или к биотинилированному антигену концентрацию метаболита сохраняют. Таким образом. в течение этапов селекции, на которых селектируют фаг. связывающий альбумин, также присутствуют метаболиты, способные блокировать определенные области молекулы альбумина ш у1уо, конкурируя с фагом за связывание и направляя селекцию в пользу тех йАЬ. которые связывают области альбумина, отличающиеся от блокируемых метаболитами.
- 95 020464
В другой группе селекции проводят чередующиеся раунды селекции против сывороточного альбумина в присутствии и отсутствии связанных соединений или метаболитов. Это подтверждает селекцию тех бАЬ, которые могут связывать сывороточный альбумин как в присутствии, так и в отсутствие связанных соединений. В обеих схемах селекции возможна селекция бАЬ, способных вытеснять лекарственное средство, связанное с сывороточным альбумином, и на это проводят скрининг посредством измерения способности АШибАЬ™ (бАЬ, специфично связывающего сывороточный альбумин) вытеснять связанное с δΛ лекарственное средство. Такие исследования хорошо обоснованы для лекарственных средств с малым размером молекул, и их легко адаптировать для этой цели. Для определения способности А1ЬибАЬ™ (бАЬ, специфично связывающего сывороточный альбумин) вытеснять связанные с δΛ лекарственные средства может быть использовано множество способов, хорошо известных в данной области техники. Они включают равновесный диализ, хроматографические способы на иммобилизированных лигандах или сывороточном альбумине, анализ ядерного магнитного резонанса (ЯМР). В следующем примере описано применение наиболее простого способа равновесного диализа. Другие технически более сложные способы позволят получить по существу ту же информацию.
Раствор сывороточного альбумина готовят в определенной концентрации в физиологическом буфере, например буфере с 20 мМ фосфатом натрия, 150 мМ №С1, рН 7,4. Лекарственное средство готовят в сходном буфере и оно синтезировано таким образом, что оно сохраняет свой исходные фармакологические свойства, но имеет радиоактивную метку, например тритий или 14С. Фрагмент антитела, связывающий сывороточный альбумин, готовят в определенной концентрации в сходном буфере.
В серию пробирок помещают раствор сывороточного альбумина и добавляют возрастающее количество А1ЬибАЬ™ (бАЬ, специфично связывающего сывороточный альбумин) таким образом, что концентрация сывороточного альбумина в каждой пробирке является фиксированной (например, 1% (процентное соотношение массы и объёма (ет/ν)), приблизительно 150 мкМ), в то время как концентрация (бАЬ, специфично связывающего сывороточный альбумин)™ варьирует от 0 до 150 мкМ в серии пробирок. Это включает один экспериментальный набор.
Для каждого набора к пробирке добавляют пробирку или контейнер для диализа, содержащий фиксированную концентрацию лиганда с радиоактивной меткой. Диапазон концентраций от 0,2 до 10 мМ может быть подходящим, в зависимости от используемого лиганда, его аффинности и растворимости.
Размер молекул, способных проникать через мембрану, используемую для диализа должен быть таким, чтобы сывороточный альбумин и А1ЬибАЬ™ (бАЬ, специфично связывающее сывороточный альбумин) не диффундировали через нее, но лиганд с радиоактивной меткой диффундировал бы через нее свободно. Для этой цели достаточен пороговый размер 3,5 кДа.
Смесь перемешивают при фиксированной температуре, например 37°С, в течение фиксированного периода времени для того, чтобы сделать возможным равновесие лекарственного средства с радиоактивной меткой в обоих компартментах, например, в течение 5 ч. После этого времени должно быть достигнуто равновесие, на что влияет способность А1ЬибАЬ™ (бАЬ, специфично связывающего сывороточный альбумин), связывающего сывороточной альбумин, ингибировать связывание лекарственного средства.
Из обоих компартментов берут образцы и вычисляют радиоактивность с использованием сцинтилляционного счетчика. Концентрация лиганда, связанного с альбумином, может быть определена по различию вычислений между двумя компартментами. Стехиометрическая константа связывания К' может быть вычислена на основании равновесной концентрации связанного лиганда, Ь, свободного лиганда, с, и альбумина, р, в соответствии с уравнением К'=Ь/с(р-Ь). Это предполагает связывание 1 молекулы лиганда с одной молекулой сывороточного альбумина.
Данные связывания могут затем быть вычислены с использованием графика δса!сЬа^б в соответствии с уравнением г/с=пк-гк, где г представляет собой долю альбумина, с которой связан лиганд (т.е. Ь/р), и п представляет собой число областей связывания на молекулу альбумина, и к представляет собой константу ассоциации для областей. Значения п и к могут быть определены из графиков г/с против г.
Там, где связывание А1ЬибАЬ™ (бАЬ, специфично связывающего сывороточный альбумин) блокирует связывание радиоактивно меченного лиганда, это будет влиять как на стехиометрическую константу связывания лиганда, так и на вероятное число областей связывания для лиганда. Можно предположить, что поскольку связывание А1ЬибАЬ™ (бАЬ, специфично связывающего сывороточный альбумин) будет происходить в одной определенной области на поверхности сывороточного альбумина, и некоторые лиганды имеют более чем одну область связывания на сывороточном альбумине, не все области связывания будут заблокированы. В случае, когда А1ЬибАЬ™ (бАЬ, специфично связывающее сывороточный альбумин) специфично связывает сывороточный альбумин в комплексе с лекарственным средством и вытесняет лекарственное средство, имеющее низкий терапевтический индекс и связываемое сывороткой, пороговое значение аффинности для различения между А1ЬибАЬ™ (бАЬ, специфично связывающим сывороточный альбумин), способным вытеснять лекарственное средство из связи с сывороточным альбумином, и А1ЬибАЬ™ (бАЬ, специфично связывающим сывороточный альбумин), не способным вытеснять лекарственное средство из связи с сывороточным альбумином, будет варьировать от 10 нМ до 100 нМ. Пример этого способа приведен в следующей публикации: Ьшекеу апб Ьипб БюсНет 1. 204(1): 265- 96 020464
272 БОйи-щ оГ ЬгапсПей-сПат 2-охо ашйз Ю Ьоуше зегит а1Ьитт.
Пример 17. Образование лиганда с двойной специфичностью, содержащего неиммуноглобулиновый каркас СТЬА-4, связывающий сывороточный альбумин, посредством СЭР-переноса.
Домены СОР йАЬ7П14 используют для конструирования полипептида с неиммуноглобулиновым каркасом антигена, ассоциированного с цитотоксическими Т-лимфоцитами, 4 типа (СТЬА-4), связывающего человеческий сывороточный альбумин, следующим образом.
Последовательности С1)Р1 (1^('ЖКЛС)1Л; δΕΟ ГО ΝΟ.:__), С1)Р2 (\\ΉδδΙΓ)δ; δΕΟ ГО ΝΟ.:_) и СГОР3 (А^САΛ^ΡРΤ; δΕΟ ГО ΝΟ.:_) йАЬ7П14 переносят в растворимый процессированный мутант СТЬА-4, содержащий ν-подобный домен СТЬА-4 (как описано в \О 99/45110; возможно, конструированный из СТЬА-4, например, где удалены домены А2 и А3) взамен аминокислотных остатков нативного
СТЬА-4, соответствующих СГОР1 (δΡ^ΑΓΕ; δΕΟ ГО ΝΟ.:_) в пределах петли δ1-δ2 (петля ВС), СГОР2 (ΥΜΜΟΝΕΕΊΈ; δΕΟ ГО ΝΟ.._) и СОР3 (ΕΜΥΡΡΡΥΥΕ; δΕΟ ГО ΝΟ.:_) в пределах петли δ5-δ6 соответственно (подробности состава и/или структуры каркаса СТЬА-4 см. в \Ο 00/60070; \Ο 99/45110; Ме1/1ег е1 а1. δΙπ.ιΜ. Бю1. 4: 527-53; и №Ша11 е1 а1. Ггсаетз δΙπ.ιΜ. РипсР Сепе!. 36:217-27, все полностью включенные сюда посредством ссылки). Проводят экспрессию этого полипептида, имеющего происхождение от СЬТА-4, в системе экспрессии, основанной на рСС, рΡΟ\V. или другой принятой в данной области техники системе экспрессии, с ожидаемым получением преимущественно мономерного растворимого белка. Исследуют белковую растворимость этого полипептида, имеющего происхождение от СТЬА-4, и ожидают, что она превышает растворимость нативного внеклеточного полипептида СТЬА-4. Ε^IδА-анализ применяют для изучения специфичного связывания человеческого сывороточного альбумина очищенным мономерным полипептидом по сравнению с неспецифичными антигенами и по сравнению с полипептидами, имеющими происхождение от внеклеточного СТЬА-4, с перенесенными на них неспецифичными полипептидами (например, соматостатином, замещенным в пределах петлевой структуры СГОР1). Анализ связывания в реальном времени посредством Б|асоге проводят для оценки специфичного связывания человеческого сывороточного альбумина с иммобилизированным полипептидом, имеющим происхождение от СТЬА-4, содержащим домены СОР йАЬ7П14 против человеческого сывороточного альбумина (специалисту в данной области техники будет ясно, что аффинность связывания может быть оценена с применением любого подходящего способа, включая, например, преципитацию меченного человеческого сывороточного альбумина, конкурентное исследование Βϊηοθγο и т.п.). Возможно, экспрессию полипептида СТЬА-4 против человеческого сывороточного альбумина усиливают, адаптируя кодирующую последовательность с применением зрйсе оует1ар ПЦР для включения кодонов, предпочтительных для экспрессии в Е.соП. При выявлении низкой аффинности в отношении человеческого сывороточного альбумина (например, значения Кй в мкМ-диапазоне или выше) или ее отсутствия, по меньшей мере одну из нескольких стратегий используют для улучшения свойств связывания человеческого сывороточного альбумина полипептида СТЬА-4 с перенесенными СОР, включая любой из следующих способов, способствующих аффинности связывания.
Связывание человеческого сывороточного альбумина полипептидом (полипептидами) СТЬА-4 с перенесенными СОР, представляющим СОР йАЬ7П14, оптимизируют посредством мутагенеза, возможно, в комбинации со способами параллельной и/или повторной селекции, как описано ниже, и/или, в противном случае, как известно в данной области техники. Полипептидные домены каркаса СТЬА-4, окружающие полипептидные последовательности перенесенных СОР йАЬ7П14, подвергают случайному и/или ΝΝΚ-мутагенезу, проводимому, как описано ниже. Такой мутагенез проводят в пределах последовательности СТЬА-4 в отношении аминокислотных остатков вне СОР с целью разработки новых или улучшенных полипептидов, связывающих человеческий сывороточный альбумин. Возможно, полипептидные домены СОР йАЬ7П14, представленные в полипептиде СТЬА-4 с перенесенными СОР, подвергают мутагенезу посредством, например, случайного мутагенеза, ΝΝΚ-мутагенеза, 1оок-рЬгоидП мутагенеза и/или другого способа, принятого в данной области техники. Возможно, для проведения таких способов мутагенеза используют ПЦР, что приводит к появлению разнообразия последовательностей в целевых последовательностях в полипептидах СТЬА-4 с перенесенными СОР. Такие способы сходны с описанными ниже для образования библиотек йАЬ. В дополнение к случайному и/или 1оок-!ПгоидП способам мутагенеза используют направленный мутагенез целевых аминокислотных остатков, где по структурной информации установлено, что определенные аминокислотные остатки имеют критическое значение для связывания человеческого сывороточного альбумина.
Полипептиды СТЬА-4, содержащие последовательности перенесенных СОР йАЬ7П14, конструированные, как описано выше, подвергают способам параллельной и/или повторной селекции для идентификации тех полипептидов СТЬА-4, которые оптимизированы для связывания человеческого сывороточного альбумина. Например, после получения библиотеки последовательностей полипептидов СТЬА-4 с перенесенными СОР йАЬ7П14, эту библиотеку таких полипептидов подвергают фаговому дисплею и нескольким раундам селекции, требующим связывания сывороточного альбумина и/или пролиферации, как описано ниже для селекции йАЬ, связывающих сывороточный альбумин, из библиотек йАЬ. Возможно, селекцию проводят против сывороточного альбумина, иммобилизированного на иммунологических пробирках или против биотинилированного сывороточного альбумина в растворе. Возможно, аффин- 97 020464 ность связывания определяют с применением поверхностного плазмонного резонанса (БРК) и В1асоге (Каг1ззоп е1 а1., 1991), с применением системы В1асоге (Иррза1а, Буебеп), где для полностью оптимизированных полипептидов, имеющих происхождение от СТЬА-4, в идеальном случае достигают значений Кб аффинности связывания с человеческим сывороточным альбумином в нМ-диапазоне или менее.
После идентификации полипептидов, имеющих происхождение от СТЬА-4, связывающих человеческий сывороточный альбумин, такие полипептиды затем используют для образования композиций лигандов с двойной специфичностью любым из способов, описанных ниже.
Пример 18. Образование лиганда с двойной специфичностью, содержащего неиммуноглобулиновый каркас СТЬА-4, связывающий сывороточный альбумин, посредством селекции группировок, связывающих сывороточный альбумин.
Растворимый процессированный мутант СТЬА-4, содержащий У-подобный домен нативного СТЬА-4 (как описано в \УО 99/45110; возможно, конструированный из СТЬА-4, например, где удалены домены А2 и А3) и который был конструирован, чтобы содержать вариабельную область (области), представляют в библиотеке и подвергают методикам селекции и, возможно, созревания аффинности с целью получения молекул с неиммуноглобулиновоым каркасом СТЬА-4, связывающих человеческий сывороточный альбумин, для использования в лигандах по изобретению.
Проводят экспрессию этого полипептида, имеющего происхождение от СЬТА-4, в системе экспрессии, основанной на рСС, рРОУ, или другой принятой в данной области техники системе экспрессии. Исследуют белковую растворимость этого полипептида, имеющего происхождение от СТЬА-4, и проводят мутагенез для увеличения растворимости полипептида (полипептидов), имеющего происхождение от СТЬА-4, относительно растворимости нативного внеклеточного полипептида СТЬА-4.
ЕЫБА-анализ применяют для изучения возможного специфичного связывания человеческого сывороточного альбумина очищенным мономерным полипептидом по сравнению с неспецифичными отдельными варибельными доменами, содержащими каркас, имеющий происхождение от СТЬА-4, и по сравнению с полипептидами, имеющими происхождение от внеклеточного СТЬА-4, с перенесенными на них неспецифичными полипептидами (например, полипептидом СТЬА-4 с соматостатином, замещенным в пределах петлевой структуры СЭЮ). Анализ связывания в реальном времени посредством В1асоге проводят для оценки специфичного связывания человеческого сывороточного альбумина с иммобилизированным полипептидом, имеющим происхождение от СТЬА-4. Возможно, экспрессию полипептида СТЬА-4 против человеческого сывороточного альбумина усиливают, адаптируя кодирующую последовательность с применением зрЬсе о\'ег1ар ПЦР для включения кодонов, предпочтительных для экспрессии в Е.соП. После выявления низкой аффинности связывания полипептида СТЬА-4 в отношении человеческого сывороточного альбумина (например, значения Кб в мкМ-диапазоне или выше) или ее отсутствия, по меньшей мере одну из нескольких стратегий используют для придания свойств связывания человеческого сывороточного альбумина полипептиду СТЬА-4, включая один или более из следующих способов, способствующих аффинности связывания.
Связывание человеческого сывороточного альбумина полипептидом (полипептидами) с каркасом СТЬА-4 достигают и оптимизируют посредством способов мутагенеза, возможно, в комбинации со способами параллельной и/или повторной селекции, как описано ниже, и/или, в противном случае, как известно в данной области техники. Полипептидные домены СТЬА-4 подвергают случайному и/или ΝΝΙ<мутагенезу, проводимому, как описано ниже. Такой мутагенез проводят в отношении всего полипептида СТЬА-4 или в отношении определенных последовательностей в пределах полипептида СТЬА-4, возможно, с направленным воздействием на аминокислоты, соответствующие СОК (например, последовательности СЭК1 и/или СЭК3 рандомизируют и полученные полипептиды подвергают селекции, например, как описано в примере 6 \УО 99/45110). Возможно, мутагенез направлен на определенные аминокислотные остатки, в отношении которых определено или предсказано, что они являются структурно важными для представления СЭК-подобной петли. Мутагенез, в особенности, случайный мутагенез, проводят с целью разработки новых или улучшенных полипептидов, связывающих человеческий сывороточный альбумин. Возможно, для проведения таких способов мутагенеза используют ПЦР, что приводит к появлению разнообразия последовательностей в целевых последовательностях в полипептидах СТЬА-4. (Такие способы сходны с описанными ниже для образования библиотек бАЬ.) В дополнение к случайным способам мутагенеза используют направленный мутагенез целевых аминокислотных остатков, где по структурной информации установлено, что определенные аминокислотные остатки полипептидов СТЬА4 имеют критическое значение для связывания человеческого сывороточного альбумина.
Полипептиды СТЬА-4, конструированные, как описано выше, подвергают способам параллельной и/или повторной селекции для идентификации тех полипептидов СТЬА-4, которые оптимизированы для связывания человеческого сывороточного альбумина. Например, после получения библиотеки последовательностей мутированных полипептидов СТЬА-4 указанные библиотеки полипептидов подвергают фаговому дисплею и нескольким раундам селекции, требующим связывания сывороточного альбумина и/или пролиферации, как описано ниже для селекции бАЬ, связывающих сывороточный альбумин, из библиотек бАЬ. Возможно, селекцию проводят против сывороточного альбумина, иммобилизированного на иммунологических пробирках, или против биотинилированного сывороточного альбумина в растворе.
- 98 020464
Возможно, аффинность связывания определяют с применением поверхностного плазмонного резонанса (8РК) и В1асоге (Каг1ккоп еТ а1., 1991), с применением системы В1асоге (Иррка1а, 8^ебеп), где для полностью оптимизированых полипептидов, имеющих происхождение от СТЬА-4, в идеальном случае достигают значений Кб аффинности связывания с человеческим сывороточным альбумином в нМ-диапазоне или менее.
После идентификации полипептидов СТЬА-4, связывающих человеческий сывороточный альбумин, такие полипептиды затем используют для образования композиций лигандов с двойной специфичностью любым из способов, описанных ниже.
У-подобные домены СТЬА-4
СТЬА-4 является примером неиммуноглобулинового лиганда, связывающего специфичный партнер по связыванию, и также содержит У-подобные домены. Эти У-подобные домены отличаются от Удоменов антител или Т-клеточных рецепторов, поскольку у них нет склонности к объединению друг с другом в молекулы Ρν-типа. Такой неиммуноглобулиновый лиганд предоставляет альтернативную каркасную область для для разработки новых связывающих группировок с высокими аффинностями в отношении молекул-мишеней. Таким образом, желательны растворимые однодоменные У-подобные связывающие молекулы, имеющие происхождение от СТЬА-4.
Антиген 4 типа, ассоциированный с цитотоксическими Т-лимфоцитами, (СТЬА-4) вовлечен в Тклеточную регуляцию в течение иммунного ответа. СТЬА-4 представляет собой гомодимер массой 44 кДа, экспрессируемый первоначально и кратковременно на поверхности активированных Т-клеток, где он взаимодействует с поверхностными антигенами СЭ80 и СЭ86 на антиген-представляющих клетках, влияя на регуляцию иммунного ответа (^аТегйоике еТ а1. 1996 Iттиηο1 Кеу 153: 183-207, νап бег Мег\\е еТ а1. 1997 I. Ехр Меб 185: 393-403). Каждая мономерная единица СТЬА-4 состоит из Ν-концевого внеклеточного домена, трансмембранной области и С-концевого внутриклеточного домена. Внеклеточный домен содержит Ν-концевой У-подобный домен (УЬЭ; с предсказываемой молекулярной массой приблизительно 14 кДа по гомологии с суперсемейством иммуноглобулинов) и стебелек из приблизительно 10 остатков, соединяющий УЬЭ с трансмембранной областью. УЬЭ содержит поверхностные петли, соответствующие СЭК-1, СЭК-2 и СЭК-3 У-домена антитела (Ме1/1ег еТ а1. 1997 ΝηΙ 8ТгисТ Вю1 4: 527-531). Недавние структурные и мутационные исследования СТЬА-4 указывают, что связывание СЭ80 и СЭ86 происходит через поверхность УЬЭ, образованную У-подобными бета-цепями А'ОРСС' и также высококонсенвативной последовательностью МУРРРУ в СЭК3-подобной поверхностной петле (Реасй еТ а1. 1994 I. Ехр Меб 180: 2049-2058; Мойоп еТ а1. 1996 I. ^типоЕ 156: 1047-1054; Ме1/1ег еТ а1. 1997 ΝηΙ 8ТгисТ Вю1 4: 527-531). Димеризация мономеров СТЬА-4 происходит через дисульфидную связь между цистеиновыми остатками (СУ8120) в двух стеблях, что приводит к связыванию двух внеклеточных доменов, но, вероятно, без непосредственного объединения У-подобных доменов (Ме1/1ег еТ а1. 1997 ΝηΙ 8ТгисТ Вю1 4: 527-531).
Ранее было показано, что замещение петлевых структур СЭК в пределах УЬЭ приводит к образованию мономерных, правильно свернутых молекул с измененными специфичностями связывания и улучшенной растворимостью. Соответственно, в определенных воплощениях образуют связывающую группировку, содержащую по меньшей мере один мономерный У-подобный домен (УЬЭ), имеющий происхождение СТЬА-4, где по меньшей мере один мономерный У-домен характеризуется тем, что по меньшей мере одна петлевая структура СЭК или ее часть модифицирована или заменена таким образом, что растворимость модифицированного УЬЭ улучшена по сравнению с немодифицированным УЬЭ.
В определенных воплощениях по меньшей мере одна петлевая структура СЭК или ее часть модифицирована или заменена таким образом, что (1) размер петлевой структуры СЭК увеличен по сравнению с соответствующей петлевой структурой СЭК в немодифицированном УЬЭ; и/или (2) модификация или замещение приводит к образованию дисульфидной связи в пределах или между одной или более петлевыми структурами СЭК.
В определенных воплощениях согласно настоящему изобретению предложена связывающая группировка, содержащая по меньшей мере один мономерный У-подобный домен (УЬЭ), имеющий происхождение от СТЬА-4, характеризующиеся тем, что по меньшей мере одна петлевая структура СЭК или ее часть модифицирована или заменена таким образом, что (1) размер петлевой структуры СЭК изменен по сравнению с соответствующей петлевой структурой СЭК в немодифицированном УЬЭ; и/или (2) модификация или замещение приводит к образованию дисульфидной связи в пределах или между одной или более петлевыми структурами СЭК.
В определенных воплощениях размер петлевой структуры СЭК увеличивают по меньшей мере на два, более предпочтительно по меньшей мере на три, более предпочтительно по меньшей мере на шесть и более предпочтительно по меньшей мере на девять аминокислотных остатков. В других воплощениях модифицированная связывающая группировка по изобретению также демонстрирует измененную аффинность или специфичность связывания при сравнении с немодифицированной связывающей группировкой. Предпочтительно эффект замены или модификации петлевой структуры СЭК состоит в снижении или устранении аффинности УЬЭ в отношении одного или более природных лигандов немодифицированного УЬЭ. Предпочтительно эффект замены или модификации петлевой структуры СЭК также
- 99 020464 состоит в изменении специфичности связывания УЕО (например, в образовании композиции, связывающей человеческий сывороточный альбумин). Таким образом, предпочтительно, что лиганд связывает специфичный партнер по связыванию (например, человеческий сывороточный альбумин), отличный от партнера по связыванию немодифицированного УЬО.
Подразумевают, что фраза УЬЭ относится к домену, имеющему сходные структурные характеристики с вариабельным доменом тяжелой цепи (Ун) или вариабельным доменом легкой цепи (УЬ) антитела. Эти сходные структурные характеристики включают петлевые структуры СЭЕ.
При использовании здесь термин петлевые структуры СОК относится к поверхностным полипептидным петлевым структурам или областям, сходным с областями, определяющими комплементарность, в ν-доменах антител.
Будет ясно, что связывающие группировки, имеющие происхождение от СТЬА-4, по настоящему изобретению могут быть соединены друг с другом, либо химически, либо генетически, для образования мультивалентных или мультифункциональных реагентов. Например, присоединение С-концевых хвостов, как, например, в нативном СТЬА-4 с Сук'20, будет приводить к образованию димера. Связывающие группировки по настоящему изобретению могут также быть соединены с другими молекулами для различных композиций, включая содержащие лиганды с двойной специфичностью. Например, УЬЭ СТЬА-4 могут содержать С-концевой хвост или могут быть соединены со стрептавидином или биотином. УЬЭ СТЬА-4 могут также быть соединены с радиоактивными изотопами, маркерами-красителями или другими реагентами для визуализации для ίη νίνο выявления и/или локализации злокачественных опухолей, сгустков крови и т.п. νΤΟ СТЬА-4 могут также быть иммобилизированы соединением с нерастворимыми устройствами и платформами для диагностических и биосенсорных применений.
В определенных воплощениях настоящего изобретения используют ν-подобный домен внеклеточного СТЬА-4. Одну или более поверхностные петли ν-подобного домена СТЬА-4 и предпочтительно петлевые структуры СОЕ1, СЭЕ2 и СЭЕ3 заменяют полипептидом, имеющим аффинность связывания в отношении сывороточного альбумина (например, доменами СЭЕ ЙАЬ7Ы4 и последовательностями, имеющими происхождение от них, примеры которых приведены ниже). Будет ясно, что эти УЬЭ СТЬА4 могут быть полиспецифичными и иметь аффинности, регулируемые как их природными поверхностями, так и модифицированными полипептидными петлями.
Одна или более петлевые структуры СОЕ УБЭ СТЬА-4 могут быть заменены одной или более петлевыми структурами СОЕ, имеющими происхождение от антитела. Антитело может иметь происхождение от любого вида. В предпочтительном воплощении антитело имеет происхождение от человека, крысы, мыши, верблюда, ламы или акулы. Петлевые структуры СЭЕ1 и СЭЕ3 могут принимать неканонические конформации, крайне гетерогенные по длине. ν-подобный домен может также обладать дисульфидной связью, соединяющей петлевые структуры СЭЕ1 и СЭЕ3 (как обнаружено в некоторых верблюжьих антителах Унн) или петлевые структуры СЭЕ2 и СЭЕ3 (как обнаружено в некоторых антителах Унн ламы).
Для применений ίη νίνο предпочтительно, чтобы УБЭ были гомологичны субъекту, у которого проводят лечение или диагностику, и чтобы все возможные чужеродные антигены были удалены. Соответственно, предпочтительно, чтобы молекулы УБЭ для применения в клинических применениях были, по существу, гомологичны встречающимся в природе членам суперсемейства иммуноглобулинов человека.
Связывание сывороточного альбумина полипептидами СТЬА-4 (например, УЬЭ, имеющими происхождение от СТЬА-4) может быть оптимизировано посредством селекции связывающей группировки с аффинностью в отношении сывороточного альбумина, например, включающей скрининг библиотеки полинуклеотидов для экспрессии связывающей группировки с аффинностью в отношении сывороточного альбумина, где полинуклеотиды подвергают мутагенезу, приводящему к модификации или замене по меньшей мере одной петлевой структуры СОЕ в по меньшей мере одном УБЭ, и где растворимость выделенного модифицированного УЬЭ улучшена по сравнению с выделенным немодифицированным УБЭ.
Специалистам в данной области техники будет ясно, что в контексте такого способа скрининга афинности для введения модификаций в У-подобные домены может быть применен любой способ случайного или направленного мутагенеза. В предпочтительном воплощении мутагенез представляет собой направленный мутагенез. Возможно, направленный мутагенез включает замену по меньшей мере одной последовательности в пределах по меньшей мере одной петлевой структуры СОЕ с применением, например, $рПсе ονηΤ-ηι или другой ПЦР-технологии.
Специалистам в данной области техники также будет ясно, что библиотека полинуклеотидов может содержать последовательности, кодирующие УЕО, содержащие петлевые структуры СЭЕ, по существу, идентичные петлевым структурам СЭЕ, обнаруживаемым во встречающихся в природе иммуноглобулинах, и/или последовательности, кодирующие УБЭ, содержащие петлевые структуры СЭЕ, не встречающиеся в природе. Возможно, способ скрининга включает представление модифицированных У-доменов в виде слитых конструкций с белком III на поверхности частиц бактериофага.
Библиотека может содержать бактериофагальные векторы, такие как рНЕА, ίά-ΐδΐ-άο^ или рЕАВ.5с, содержащие полинуклеотиды, кодирующие У-подобные домены. Способ скрининга может также включать представление модифицированных У-подобных доменов в рибосомальной дисплейной системе се- 100 020464 лекции.
Предпочтительные молекулы по изобретению, связывающие сывороточный альбумин, имеющие происхождение от СТЬА-4, представляют следующие преимущества: (1) применение нативного человеческого белка устраняет необходимость последующей гуманизации рекомбинантной молекулы, стадии, часто необходимой для защиты от ответа иммунной системы при применении для лечения человека; (2) домен является мономерным по своему характеру, как описано выше (включение остатка Сук120 в Сконцевой хвост приводит к образованию димерной молекулы); и (3) структурные модификации привели к улучшенным уровням экспрессии в Е.соН.
Изначальное определение структуры нативного СТЬА-4 сделало возможным моделирование и предсказание областей, соответствующих СИК1-, 2- и 3-областям антитела. Была выдвинута гипотеза, что такие области будуп чувствительны к мутации или замене без существенного эффекта на каркасную область молекулы и, таким образом, сделают возможной экспрессию правильно свернутой молекулы. Опубликованная структура СТЬА-4 (Ме1/1ег е! а1. 1997, ΝηΙ δίπια ΒΦ1 4: 527-531) продемонстрировала точность этих предсказаний, за исключением неожиданного отделения СИК1 от лигандсвязывающей области и протяженного изгиба СИК3 с образованием плоской поверхности, расположенной рядом с лигандсвязывающей плоскостью.
У-подобные домены предоставляют основную каркасную область для конструирования растворимых однодоменных молекул, где специфичность связывания молекулы может быть изменена модификацией петлевых структур СИК. Остатки основной каркасной области У-подобного домена могут быть модифицированы в соответствии со структурными характеристиками антител представителей семейства верблюдовых. Верблюжьи иммуноглобулины из тяжелых цепей отличаются от структур обычных антител тем, что они состоят из цепей Унн (натегк-Сак!егтаи е! а1. 1993 Иа!иге 363: 446-448). Антитела представителей семейства верблюдовых состоят из двух тяжелых цепей, каждая из которых содержит домен Унн. Несколько уникальных свойств позволяют этим антителам преодолевать двойные проблемы растворимости и неспособности предоставить достаточно обширную антигенсвязывающую поверхность.
Во-первых, несколько необычных замен (преимущественно гидрофобных аминокислот на полярные по своему характеру) в подверженных воздействию остатках каркасных областей сокращают гидрофобную поверхность, сохраняя в то же время внутреннюю бета-складчатую структуру каркасной области (Иекту!ег е! а1. 1996 ΝηΙ δίπια ΒΦ1 3:803-811). Кроме того, в пределах трех петель СИК несколько структурных характеристик компенсируют потерю антигенсвязывающей поверхности, обычно предоставляемой доменом УЬ. В то время как петля СИК2 существенно не отличается от других доменов Ун, петли СИК1 и СИК3 принимают неканонические конформации, крайне гетерогенные по длине. Например, петля Н1 может содержать любое число остатков от 2 до 8 по сравнению с обычными пятью в молекулах 1д. Тем не менее, наибольшее разнообразие демонстрирует петля СИК3: у 17 описанных последовательностей верблюжьих антител длина этой области варьирует от 7 до 21 остатка (Миу1бегтаик е! а1. 1994 Ριό!ет Еид 7: 1129-1135). В-третьих, многие домены Унн представителей семейства верблюдовых обладают дисульфидной связью, соединяющей СИК1 и СИК3 в случае верблюдов и соединяющей СИК1 и СИК2 в случае лам (Уи е! а1. 1997 Мо1ес. 1ттиио1. 34: 1121-113). Функция этого структурного свойства, повидимому, состоит в поддержании стабильности петель и обеспечении более контурированной, как отличной от плоской, конформации петель, которая как делает возможным связывание карманов в пределах антигена, так и дает увеличенную площадь поверхности. Тем не менее, не все антитела представителей семейства верблюдовых обладают этой дисульфидной связью, что указывает на то, что это не является абсолютным структурным требованием.
Настоящее изобретение также относится к способу образования и селекции отдельных молекул УЬИ с новыми аффинностями связывания в отношении молекул-мишеней (например, человеческого сывороточного альбумина). Этот способ включает применение хорошо известных методик молекулярной эволюции к полипептидам, имеющим происхождение от СТЬА-4. Способ может включать получение фаговых или рибосомальных дисплейных библиотек для скрининга большого числа мутированных полипептидов, имеющих происхождение от СТЬА-4.
Геномы нитчатого Гб-бактериофага конструируют таким образом, что фаг представляет, на его поверхности, такие белки, как ^-подобные белки (ксРу, РаЬ), кодируемые ДНК, которую содержит фаг ^тНН, 1985 δ^οχο 228: 1315-1317; нике е! а1. 1989 δΧι^ 246: 1275-81; МсСаГГейу е! а1., 1990 Ыа!иге 348: 552-4; ноодеиЬоот е! а1., 1991 Ыис1ею Аабк Кек. 19: 4133-4137). Молекулы белка могут быть представлены на поверхности Рб-бактериофага, ковалентно связанные с белками оболочки фага, кодируемыми геном III или, реже, геном УШ. Введение генов антител в ген белка оболочки III приводит к экспрессии 3-5 молекул рекомбинантного белка на фаг, расположенных на концах. Наоборот, введение генов антител в ген УШ дает возможность представить приблизительно 2000 копий рекомбинантного белка на фаговую частицу, тем не менее, это мультивалентная система, способная маскировать аффинность отдельного представленного белка. Также используют Рб-фагмидные векторы, поскольку они могут быть легко переключены с представления функциональных ^-подобных фрагментов на поверхности Гббактериофага на секрецию растворимых ^-подобных фрагментов в Е.соН. Представленные на фаге рекомбинантные слитые белки с Ν-концом гена III белка оболочки делают возможными посредством тер- 101 020464 минирующего кодона, занимающего стратегическое положение между двумя генами белков. В штаммах Е.соН с амбер-супрессором получаемые слитые белки домен 1дО-ген III оказываются заякоренными в оболочке фага.
Способ селекции, основанный на аффинности белков, может быть применен к любым реагентам с высокой аффинностью связывания, таким как антитела, антигены, рецепторы и лиганды (см., например, ХУиНег апД МДк!е1п, 1991 Ыа!иге 349: 293-299, полное содержание которой включено сюда посредством ссылки). Таким образом, селекцию белка с самой высокой афииностью, представленного на бактериофаге, сочетают с получением гена кодирующего этот белок. Фаг, на котором представлен иммуноглобулиновый или неиммуноглобулиновый каркас, может быть селектирован по аффинности посредством связывания когнатных партнеров по связыванию, ковалентно связанных с гранулами или адсорбированных на пластиковые поверхности, способом, сходным с ЕЬКА или твердофазными радиоиммунными анализами. В то же время как почти любая пластиковая поверхность будет адсорбировать белковые антигены, некоторые коммерческие продукты специально изготовлены для этой цели, как, например, Ыипс 1ттипо!иЬек.
Рибосомные дисплейные библиотеки включают полипептиды, синтезированные Де ηоνо в трансляционных системах, свободных от клеток, и представленные на поверхности рибосом в целях селекции (Напек апД Р1иск1Ьип, 1997, Ргос. Ыа!1. АсаД. δ^.. υδΑ. 94: 4937- 4942; Не апД Таикк1д, 1997, Ыис1. АсМк Кек. 25: 5132-5134). Трансляционная система, свободная от клеток рибосомы, растворимые ферменты, необходимые для синтеза белка (обычно из той же клетки, что и рибосомы), транспортные РНК, аденозинтрифосфат, гуанозинтрифосфат, систему регенерации рибонуклеозидтрифосфатов (такую как фосфоенолпируват и пируваткиназа) и соли, и буфер, необходимые для синтеза белка, кодируемого экзогенной матричной РНК (мРНК). Можно сделать так, что трансляция полипептидов будет происходить в условиях, сохраняющих интактные полисомы, т.е. где рибосомы, молекула мРНК и транслируемые полипептиды объединены в единый комплекс. Это в сущности приводит к рибосомальному дисплею транслируемого полипептида. Для селекции, транслируемые полипептиды, объединенные с соответствующим рибосомным комплексом, находятся в смеси с молекулой-мишенью (например, сывороточным альбумином), которая связана с матрицей (например, ЭупаЬеаДк). Рибосомы, на которых представлены транслируемые полипептиды, будут связывать молекулу-мишень, и эти комплексы будут селектировать, и мРНК будут реамплифицировать с применением ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).
Хотя существует несколько альтернативных способов модификации связывающих молекул, общий способ для всех представляемых белков соответствует модели, в которой отдельные связывающие реагенты селектируют из дисплейных библиотек по аффинности к их когнатному лиганду и/или рецептору. Гены, кодирующие эти реагенты, модифицируют любой одной или комбинацией из нескольких ш νί\Ό и ш νίΐго стратегий мутации и конструируют в виде нового пула генов для представления и селекции связывающих молекул с наиболее высокой аффинностью.
Оценка аффинностей связывания
В определенных воплощениях лиганды с двойной специфичностью по настоящему изобретению, включая их молекулы-компоненты (например, неиммуноглобулиновые молекулы, связывающие человеческий сывороточный альбумин), оценивают на аффинность связывания в отношении белка-мишени (например, человеческого сывороточного альбумина). Связывание эпитопов белка-мишени может быть измерено обычными исследованиями связывания антигена, такими как ΕΠδΑ, методиками, основанными на флюоресценции, включая резонансный перенос энергии флуоресценции (РКЕТ), или такими методиками, как поверхностный плазмонный резонанс, посредством которых измеряют большое количество молекул. Специфичное связывание антигенсвязывающего белка с антигеном или эпитопом может быть определено подходящим исследованием, включая, например, анализ δса!сЬа^Д и/или исследования конкурентного связывания, такие как радиоиммунные анализы (К1А), ферментные иммунологические исследования, такие как ΕΠδΑ и сэндвич конкурентные исследования, и их различные варианты.
Аффинность связывания предпочтительно определяют с применением поверхностного плазмонного резонанса ^РК) и В1асоге (Каг1ккоп е! а1., 1991), с использованием системы В1асоге (иррка1а, δ\\ι^π). В системе В1асоге поверхностный плазмонный резонанс (ЪРК \Уе1ГогД К. 1991, Ор!. Циап!. Е1ес!. 23: 1; Мойоп апД Мук/ка, 1998, Ме!ЬоДк ш Еп/уто1оду 295: 268) использован для наблюдения биомолекулярных взаимодействий в реальном времени, и использован поверхностный плазмонный резонанс, посредством которого можно выявлять изменение угла резонанса света на поверхности тонкой золотой пленки на стеклянной основе в результате изменений коэффициента преломления поверхности в радиусе до 300 нм. При анализе В1асоге легко генерируют константы скорости ассоциации, константы скорости диссоциации, равновесные константы диссоциации и константы аффинности. Аффинность связывания получают посредством оценки констант скорости ассоциации и диссоциации с применением системы поверхностного плазмонного резонанса В1асоге (В1асоге, 1пс.). Биосенсорный чип активируют для ковалентного связывания мишени в соответствии с инструкциями изготовителя (В1асоге). Мишень затем разбавляют и вводят на чип для получения сигнала в единицах ответа (Ки) иммобилизированного вещества. Поскольку сигнал в Ки пропорционален массе иммобилизированного вещества, он отражает диапазон плотностей иммобилизированной мишени на матрице. Данные о диссоциации согласуют с односайтовой моде- 102 020464 лью для получения Ко££ +/- к.б. (стандартное отклонение измерений). Константу скорости псевдопервого порядка (К,) вычисляют для каждой кривой ассоциации, и наносят на график как функцию концентрации белка для получения Коп +/- 8.е. (стандартная ошибка выравнивания). Равновесные константы диссоциации для связывания, К,, вычисляют на основе вычислений ЗРК как Ко££/Коп.
Как описано Р1й/юку апб Р1е1б в МкгоЬ. Кеу. (1995), 59:114-115, подходящий антиген, такой как нЗА, иммобилизируют на декстрановом полимере и раствор, содержащий лиганд для нЗА, такой как отдельный вариабельный домен, проходит через камеру, контактируя с иммобилизированным нЗА. Отдельный вариабельный домен, задержанный иммобилизированным нЗА, изменяет угол резонанса падающего света, приводя к изменению коэффициента преломления, вызванному увеличенными количествами белка, т.е. отдельного вариабельного домена, вблизи декстранового полимера. Поскольку все белки имеют одинаковый коэффициент преломления и поскольку существует линейная зависимость между изменением угла резонанса и концентрацией белка у поверхности, могут быть измерены изменения концентрации белка на поверхности, обусловленные связыванием белок/белок, см. РЫ/юку апб Р1е1б, 8ирга. Для определения константы связывания увеличение в единицах резонанса (КИ) измеряют как функцию времени, пропуская раствор белка отдельного вариабельного домена мимо иммобилизированного лиганда (нЗА) до стабилизации значений КИ, затем уменьшение в КИ измеряют как функцию времени с использованием буфера без отдельного вариабельного домена. Эту процедуру повторяют при нескольких различных концентрациях белка отдельного вариабельного домена. Подробный теоретический предшествующий уровень техники и способы описаны К. КагНкоп, е! а1. (991) 1. 1ттипо1 МеШобк, 145, 229.
Программное обеспечение прибора вычисляет равновесную константу диссоциации (Кб), как описано выше. Равновесную константу диссоциации определяют применением поверхностного плазмонного резонанса (ЗРК), как описано в патенте США № 5573957, на основании таблицы значений бКА/б! и КА, где К в этом примере представляет собой комплекс нЗА/отдельный вариабельный домен, как измерено В1асоге в резонансных единицах, и где бК/б! представляет собой скорость образования комплексов нЗА/отдельный вариабельный домен, т.е. производную кривой связывания; при нанесении на график бКА/б! против КА для нескольких различных концентраций отдельного вариабельного домена, и затем нанесении на график угловых коэффициентов этих линий против концентрации отдельного вариабельного домена, угловой коэффициент этого второго графика представляет собой константу скорости ассоциации (М-1, с-1). Константа скорости диссоциации или скорость, с которой нЗА и отдельный вариабельный домен отсоединяются друг от друга, может быть определена с использованием кривой диссоциации, построенной на В1асоге. Константа скорости диссоциации может быть измерена нанесением на график логарифма уменьшения ответа против времени и определением углового коэффициента. Равновесная константа диссоциации Кб=константа скорости диссоциации/константа скорости ассоциации.
Лиганд по любому аспекту настоящего изобретения включает лиганд имеющий или состоящий из по меньшей мере одного отдельного вариабельного домена в форме отдельного вариабельного доменамономера или в форме нескольких отдельных вариабельных доменов, т.е. мультимера. Лиганд может быть модифицирован для того, чтобы содержать дополнительные группировки, как, например, слитый белок или конъюгат. Такой мультимерный лиганд, например, в форме лиганда с двойной специфичностью, и/или такой лиганд, содержащий или состоящий из отдельного вариабельного домена, т.е. мономера бАЬ, применимый в конструировании такого мультимерного лиганда, могут преимущественно диссоциировать от их когнатной мишени (мишеней) с Кб 300 нМ или менее, от 300 нМ до 5 пМ (т.е. от 3х10-7 до 5х10-12 М), предпочтительно от 50 нМ до 20 пМ или от 5 нМ до 200 пМ, или от 1 нМ до 100 пМ, 1х 10-7 М или менее, 1х 10-8 М или менее, 1х 10-9 М или менее, 1х 10-10 М или менее, 1х 10-11 М или менее; и/или константой скорости Ко££ от 5х10-1 до 1х 10-7 с-1, предпочтительно от 1 х 10-6 до 1 х 10-8 с-1, предпочтительно от 1 х 10-2 до 1 х 10-6 с-1, или от 5х10-3 до 1х 10-5 с-1, или 5х10-1 с-1 или менее, или 1 х 10-2 с-1 или менее, или 1 х 10-3 с-1 или менее, или 1 х 10-4 с-1 или менее, или 1 х 10-5 с-1 или менее, или 1 х 10-6 с-1 или менее, как определено, например, поверхностным плазмонным резонансом. Константу скорости Кб определяют как Ко££/Коп. Предпочтительно отдельный вариабельный домен будет специфично связывать антиген-мишень или эпитоп-мишень с аффинностью менее чем 500 нМ, предпочтительно менее чем 200 нМ и более предпочтительно менее чем 10 нМ, как, например, менее чем 500 пМ.
Липокалины
Пример 19. Образование лиганда с двойной специфичностью, содержащего неиммуноглобулиновый липокалиновый каркас, связывающий сывороточный альбумин посредством селекции группировок, связывающих сывороточный альбумин.
Билинсвязывающий белок (ВВР), липокалин, имеющий происхождение от Р1еп5 Ьга881сае, может быть реконструирован посредством конструирования гибридного белка, таким образом, что он распознает человеческий сывороточный альбумин. С этой целью нативный ВВР подвергают селекции из библиотеки и, возможно, созреванию аффинности, для получения молекул ВВР, связывающих человеческий сывороточный альбумин, для использования в лигандах с двойной специфичностью по изобретению.
Способность нативного ВВР связывать человеческий сывороточный альбумин изначально выявляют исследованием В1асоге, как описано ниже для полипептидов, имеющих происхождение от СТЬА-4
- 103 020464 (специалисту в данной области техники будет ясно, что аффинность связывания может быть оценена любым подходящим способом, включая, например, осаждение меченного человеческого сывороточного альбумина, конкурентное исследование В1асоге и т.п.). При выявлении низкой аффинности ВВР в отношении человеческого сывороточного альбумина (например, значения Кй в мкМ-диапазоне или выше) или ее отсутствия по меньшей мере одну из нескольких стратегий используют для придания ВВР свойств связывания человеческого сывороточного альбумина, включая любой из следующих способов, способствующих аффинности связывания.
Связывания человеческого сывороточного альбумина ВВР или полипептидом, имеющим происхождение от ВВР, достигают и оптимизируют посредством способов мутагенеза, возможно, в комбинации со способами параллельной и/или повторной селекции, как описано ниже, и/или, в противном случае, как известно в данной области техники. Полипептидные домены ВВР подвергают случайному и/или ΝΝΙ<мутагенезу, проводимому, как описано ниже. Такой мутагенез проводят в отношении всего полипептида ВВР (или имеющего происхождение от ВВР) и/или проводят в отношении определенных последовательностей в пределах полипептида ВВР, включая 16 остатков, которые, как установлено, расположены в центре связывающей области нативного ВВР, образованной четырьмя петлями на верхушке бетабочонка, состоящего из восьми цепей (Век!е е! а1. 1999 Ргос. Ыа!1. Асай. 8ск И8А 96: 1898-903). Возможно, такие способы мутагенеза рандомизированы для разработки новых или улучшенных полипептидов, связывающих человеческий сывороточный альбумин; и множество раундов мутагенеза могут быть проведены в процессе создания ВВР, оптимально связывающего человеческий сывороточный альбумин. Возможно, для проведения таких способов мутагенеза используют ПЦР, что приводит к формированию разнообразия последовательностей в целевых последовательностях в полипептидах ВВР (или имеющих происхождение от ВВР). (Такие способы сходны с описанными ниже для образования библиотек йАЬ.) В дополнение к случайным способам мутагенеза используют направленный мутагенез целевых аминокислотных остатков, где по структурной информации установлено, что определенные аминокислотные остатки полипептидов ВВР (или имеющих происхождение от ВВР) имеют критическое значение для связывания человеческого сывороточного альбумина.
Полипептиды ВВР или имеющие происхождение от ВВР, конструированные, как описано выше, подвергают способам параллельной и/или повторной селекции для идентификации тех полипептидов ВВР, которые оптимизированы для связывания человеческого сывороточного альбумина. Например, после получения библиотеки последовательностей мутированных полипептидов ВВР, указанную библиотеку полипептидов представляют на фаге и подвергают нескольким раундам селекции, требующим связывания человеческого сывороточного альбумина и/или пролиферации, как описано ниже для селекции йАЬ, связывающих сывороточный альбумин, из библиотек йАЬ. Возможно, селекцию проводят против сывороточного альбумина, иммобилизированного на иммунологических пробирках или против биотинилированного сывороточного альбумина в растворе. Возможно, аффинность связывания определяют с применением поверхностного плазмонного резонанса (8РК) и В1асоге (Каг1ккоп е! а1., 1991), с применением системы В1асоге (Иррка1а, 8'гейеп), где для полностью оптимизированных полипептидов, имеющих происхождение от ВВР, в идеальном случае достигают значений Кй аффинности связывания с человеческим сывороточным альбумином в нМ-диапазоне или менее.
После идентификации полипептидов ВВР, связывающих человеческий сывороточный альбумин, такие полипептиды затем используют для образования композиций лигандов с двойной специфичностью любым из способов, описанных ниже.
Белки с липокалиновым каркасом
Липокалины (Регуц/ апй Вге\у, РА8ЕВ ί. 1 (1987), 209-214) представляют собой семейство малых, часто мономерных, секреторных белков, которые были выделены от различных организмов, и чья физиологическая роль состоит в хранении или транспорте различных лигандов, а также в более сложных биологических функциях (Р1о^ег, ВюсЬет. ί. 318 (1996), 1-14). Липокалины демонстрируют относительно малое взаимное сходство последовательностей, и их принадлежность к одному структурному семейству белков была впервые выяснена рентгеноструктурным анализом (8а\\уег е! а1., Ыа!иге 327 (1987), 659).
Первым липокалином с выясненной пространственной структурой был ретинолсвязывающий белок, КЬр, который осуществляет транспорт нерастворимого в воде витамина А в сыворотке крови (Ысетсотег е! а1., ЕМВО ί. 3 (1984), 1451-1454). Через некоторое время была определена третичная структура билинсвязывающего белка, ВЬр, от бабочки Р1епк Ьгаккюае (ниЬег е! а1., ί. Мо1. Вю1. 195 (1987), 423-434). Существенные структурные признаки этого класса белков описаны на примере пространственной структуры этого липокалина. Центральным элементом свернутой структуры липокалинов является цилиндрическая β-складчатая структура, так называемый β-бочонок, состоящая из восьми почти циркулярно расположенных антипараллельных β-цепей.
Этот элемент супервторичной структуры можно также рассматривать как сэндвич-образное расположение двух четырехцепочечных β-складчатых структур. Другими структурными элементами являются протяженный сегмент на Ν-конце полипептидной цепи и а-спираль вблизи С-конца, за которой, в
- 104 020464 свою очередь, следует протяженный сегмент. Эти дополнительные признаки, тем не менее, не обязательно были выявлены у всех липокалинов. Например, существенная часть Ы-концевого сегмента отсутствует в белке придатка яичка, связывающем ретиноевую кислоту (Ые\усотег, §!гис!иге (1993), 1: 7-18). Также известны дополнительные характерные структурные элементы, такие как, например, мембранные якорные структуры (В18Ьор апЗ ^ешег, ТгепЗ8 ВюсЬет. §ск (1996), 21: 127), присутствующие только в определенных липокалинах.
в-бочонок закрыт на одном конце плотным расположением аминокислот, а также петлевыми сегментами. На другом конце в-бочонок образует связывающий карман, где образуется комплекс липокалина и соответствующего лиганда. Восемь расположенных рядом антипараллельных в-цепей соединены попарно соответствующим образом шпильковыми изгибами полипептидной цепи, которые, совместно с близлежащими аминокислотами, все еще частично расположены в области цилиндрической Рскладчатой структуры, и каждая из которых образует петлевой элемент. Связывающий карман для лигандов, в целом, образован в общей сложности этими четырьмя петлями. В случае ВЪр, образование комплекса с биливердином ΙΧγ происходит в этом связывающем кармане. Другим типичным лиандом для липокалинов является витамин А в случае КЪр, а также в-лактоглобулина (Рар|/ е! а1., Ыа!иге 324(1986), 383-385).
Как описано, например, в публикации патента США № 20060058510, члены липокалинового семейства полипептидов могут быть использованы для получения класса молекул, называемых антикалинами, разработанных для распознавания новых лигандов посредством мутации аминокислот, расположенных в области четырех пептидных петель и на конце цилиндрической в-складчатой структуры, и которые характеризуются тем, что они связывают данные лиганды (например, человеческий сывороточный альбумин) с определяемой аффинностью.
Лигандсвязывающие области липокалинов имеют более простое строение, чем соответствующие области иммуноглобулинов. Липокалиновые полипептиды содержат только одно кольцо из 8 антипараллельных в-цепей: в-бочонок. Циклическая в-складчатая структура консервативна в белковой конформации липокалинов. Связывающая область образована в области входа в в-бочонок четырьмя пептидными петлями, каждая из которых соединяет две расположенные рядом в-цепи друг с другом. Эти пептидные петли могут существенно различаться по своей структуре между отдельными членами семейства липокалинов.
Для использования липокалинового полипептида в качестве неиммуноглобулинового каркаса одну или более из четырех пептидных петель, образующих лигандсвязывающую область липокалина, подвергают мутагенезу с последующим выбором, т.е. селекцией тех белковых вариантов (мутеинов), которые демонстрируют желаемую связывающую активность в отношении данного лиганда. Липокалиновые мутеины, полученные таким образом были названы антикалины.
Четыре пептидные петли липокалинов, последовательность которых модифицируют мутагенезом в процессе получения антикалинов, характеризуются теми сегментами в линейной полипептидной последовательности ВВР, которые включают аминокислотные положения ВЪр с 28 по 45, с 58 по 69, с 86 по 99 и с 114 до 129. Каждый из этих сегментов последовательности начинается перед С-концом одной из консервативных в-цепей на открытой стороне в-бочонка, включает существующую пептидную шпильку и заканчивается после Ы-конца аналогично консервативной в-цепи, следующей за последовательностью.
Выравнивания последовательностей или структурные суперпозиции позволяет приписать положения последовательности, характерные для ВЗр, другим липокалинам. Например, при выравниваниях последовательностей, соответствующих опубликованному выравниванию РеП8сЬ апЗ Води8к1 (Ыете Вю1од18! 2 (1990), 197-206), выявлено, что четыре пептидные петли АроЭ включают аминокислотные положения с 28 по 44, с 59 по 70, с 85 по 98 и с 113 по 127. Тем же способом также возможно идентифицировать соответствующие пептидные петли в новых липокалинах, подходящих для мутагенеза.
Оказалось, что в некоторых случаях относительно малая гомология последовательностей липокалинов может являться проблемой при определении консервативных в-цепей. Таким образом, крайне важно, чтобы полипептидная последовательность была способна формировать циклическую вскладчатую структуру, состоящую из 8 антипараллельных 3-цепей. Это может быть определено с применением способов структурного анализа, таких как кристаллография белков или многомерная ядерная магнитно-резонансная спектроскопия.
В липокалинах, не являющихся ВЗр, таких как, например, АроЭ или КЪр, сегменты последовательности, подходящие для мутагенеза, могут, несомненно, быть длиннее или короче соответствующих сегментов последовательности ВЗр на основании индивидуальной изменчивости структуры пептидных петель. Модификация длины сегментов последовательности посредством делеции или вставки одной или более аминокислот может даже быть предпочтительной. В определенных воплощениях мутагенезу подвергают те аминокислотные положения, которые соответствуют положениям последовательности ВЗр с 34 по 37, 58, 60, 69, 88, 90, 93, 95, 97, 114, 116, 125 и 127. Соответственно, в случае АроЭ, положения последовательности с 34 по 37, 59, 61, 70, 87, 89, 92, 94, 96, 113, 115, 123 и 125 предпочтительны для мутагенеза. Тем не менее, для получения антикалинов нет необходимости подвергать мутагенезу все поло- 105 020464 жения последовательности, перечисленные выше.
Другие липокалины также применимы в качестве первичной структуры для получения антикалинов. Предпочтительно используют липокалины ВЬр, ВЬр или Арο^, которые к настоящему времени были исчерпывающе биохимически изучены. Применение липокалинов человеческого происхождения являются особенно предпочтительным для получения антикалинов. Это особенно применимо к тем случаям, когда предполагают применение получаемого антикалина (антикалинов) у человека, поскольку, например, в диагностических или терапевтических применениях ίη νίνο ожидают минимальный иммуногенный эффект по сравнению с липокалинами от других организмов. Тем не менее, другие липокалины, а также липокалины, которые, возможно, еще предстоит открыть, могут оказаться особенно преимущественными для получения антикалинов. Также могут быть использованы искусственные белки с элементом конформации, структурно эквивалентным β-бочонку липокалинов.
Предпочтительно молекулы антикалинов по изобретению должны быть способны связывать желаемый лиганд (например, человеческий сывороточный альбумин) с определяемой активностью, т.е. с константой аффинности по меньшей мере 105 М-1. Аффинности меньше этой в большинстве случаев не могут быть определены точно обычными способами и, таким образом, имеют второстепенное значение для практических применений. Особенно предпочтительны антикалины, связывающие желаемый лиганд с аффинностью по меньшей мере 106 М-1, соответствующей константе диссоциации для комплекса 1 мкМ. Специалист в данной области техники может измерить аффинность связывания антикалина в отношении желаемого лиганда множеством способов, например флюоресцентным титрованием, конкурентным ЕЬКА или методикой поверхностного плазмонного резонанса.
Липокалиновая кДНК, которая может быть получена и клонирована специалистом в данной области техники известными способами, может служить начальной точкой для мутагенеза пептидной петли, как это было, например, описано для ВЬр (8сЬтИ: αη! δίαιτα, Еиг. ί. ВюсНет. 219 (1994), 855-863). Альтернативно, геномная ДНК может также быть использована для синтеза генов, или может быть осуществлена комбинация этих способов. Для мутагенеза аминокислотных остатков четырех пептидных петель специалист в данной области техники имеет в своем распоряжении различные известные способы сайтнаправленного мутагенеза посредством полимеразной цепной реакции. Способ мутагенеза может, например, характеризоваться тем, что для введения мутаций могут быть использованы смеси синтетических олигодезоксинуклеотидов, имеющими в своем составе вырожденные основания в желаемых положениях. Применение нуклеотидных составных блоков со сниженной специфичностью в отношении пар оснований, таких как, например, инозин, является также возможным вариантом для введения мутаций в выбранный сегмент последовательности или аминокислотные положения. Способ мутагенеза лигандсвязывающих областей упрощен по сравнению с антителами, поскольку в случае липокалинов с этой целью необходимо манипулировать только четырьмя сегментами последовательности, соответствующими упомянутыми выше четырем пептидным петлям, вместо шести.
В способах сайт-направленного случайного мутагенеза, включающих синтетические олигодезоксинуклеотиды, соответствующие аминокислотные положения в структуре липокалина, подлежащие мутации, могут быть определены предварительно. Идеальная селекция аминокислотных положений, подлежащих мутации, может зависеть, с одной стороны, от используемого липокалина и, с другой стороны, от желаемого лиганда (например, человеческого сывороточного альбумина). Возможно, может быть полезным поддерживать общее число мутированных аминокислотных положений в одном эксперименте достаточно небольшим таким образом, что совокупность вариантов, полученных мутагенезом, т.е. так называемая библиотека, может, полностью или по меньшей мере в виде ее репрезентативной выборки, быть реализована с максимально возможной комбинационной сложностью не только на уровне кодирующих нуклеиновых кислот, но также на уровне продуктов генов.
Аминокислотные положения, подлежащие мутации, могут быть выбраны осмысленным способом, особенно когда имеется структурная информация, относящаяся к самому используемому липокалину, как в случае с ВВР и ВЬр или по меньшей мере относящаяся к липокалину со сходной структурой, как, например, в случае Арο^. Набор выбранных аминокислотных положений может также зависеть от характеристик желаемого лиганда. Также может быть преимущественным исключить из мутагенеза отдельные аминокислотные положения в области лигандсвязывающего кармана, если будет выяснено, что они, например, являются необходимыми для эффективного фолдинга или стабильной конформации белка. Описаны способы мутагенеза липокалинов, основанные на специфичных олигонуклеотидах, например, в публикации патента США № 20060058510, полное содержание которой включено сюда посредством ссылки.
После экспрессии последовательностей нуклеиновых кислот, подверженных мутагенезу, клоны, несущие генетическую информацию об антикалинах, связывающих данный лиганд (например, человеческий сывороточный альбумин), могут быть селектированы из различных клонов полученной библиотеки. Для селекции этих клонов могут быть применены известные стратегии экспрессии и стратегии селекции. Такие способы были описаны в контексте получения или конструирования рекомбинантных фрагментов антител, как, например, методика фагового дисплея или способы скрининга колоний ^кетга е1 а1., АпяТ ВюсНет. 196 (1991), 151-155).
- 106 020464
Методики фагового дисплея описаны, например, в Ноекк, Сигг. Орт. δίπια. Еюк 3 (1993), 572579; Vе11к апб Ьотетап, Сигг. Орт. δίπια. ЕЫ. 2 (1992), 597-604; апб Кау е! а1., РНаде И1кр1ау о£ РерНбек апб РгоЮтк-А ЬаЬога!огу Мапиа1 (1996), Асабет1с Ргекк. Кратко, в типичном воплощении получают плазмиды, экспрессирующие мутированный структурный ген липокалина в виде слитого белка с сигнальной последовательностью на Ν-конце, предпочтительно сигнальной последовательностью ОтрА, и с белком оболочки р111 фага М13 (Мобе1 апб Кикке1, ш ТНе Βас!е^^орΗадек, Уо1. 2 (1988), Р1епит Ргекк, №\у Уогк, 375-456) или фрагментами этого белка оболочки, которые включены в оболочку фага, на Сконце. Предпочтительно для получения слитых белков используют С-концевой фрагмент АрШ белка оболочки фага, содержащий только аминокислоты с 217 по 406 природного белка оболочки рШ. Особенно предпочтителен С-концевой фрагмент р111, где цистеиновый остаток в положении 201 отсутствует или заменен на другую аминокислоту. Дополнительное описание способов фагового дисплея, способов селекции и т.п., которые могут быть применены к липокалинам при получении антикалинов, обладающих свойствами специфичного связывания, подробно изложены, например, в публикации заявки на патент США № 20060058510, полное содержание которой включено сюда посредством ссылки.
Антикалины могут быть идентифицированы и получены, например, с применением описанных выше способов, для того, чтобы они обладали высокой аффинностью в отношении данного лиганда (например, человеческого сывороточного альбумина). Для антикалинов могут быть достигнуты константы связывания лиганда, превышающие 106 М-1, даже в случае, когда новый лиганд не имеет никакого структурного родства с биливердином ΙΧγ, исходным лигандом ΒЬр (см. публикацию заявки на патент США № 20060058510). Такие аффинности в отношении новых лигандов, достижимые с использованием антикалинов, сравнимы с аффинностями, известными для антител от вторичного иммунного ответа. Кроме того, дополнительно существует возможность подвергнуть полученные антикалины дополнительному, возможно, частично случайному мутагенезу для селекции вариантов с еще более высокой аффинностью из библиотеки, полученной таким образом. Соответствующие способы были уже описаны для случая рекомбинантных фрагментов антител с целью созревания аффинности (Ьоте е! а1., 1. Мо1. ЕюР 260 (1996), 359-368; ЕагЬак апб ΒυτίΌ^ Тгепбк ЬюГесНпоН 14 (1996), 230-234), и специалист в данной области техники может, соответствующим образом, применить их также к антикалинам.
Стафилококковый белок А ^РАуАффитело
Пример 20. Образование лиганда с двойной специфичностью, содержащего неиммуноглобулиновый каркас аффитела (стафилококкового белка А ^РА)), связывающий сывороточный альбумин, посредством селекции группировок, связывающих сывороточный альбумин.
Домен Ζ стафилококкового белка А ^РА) подвергают методикам селекции в библиотеке и, возможно, созревания аффинности для получения молекул с неиммуноглобулиновым каркасом, имеющим происхождение от δРΛ (называемых аффителами), связывающих человеческий сывороточный альбумин, для использования в лигандах с двойной специфичностью по изобретению.
Исследования связывания в реальном времени посредством Е|асоге проводят для оценки специфичного связывания человеческого сывороточного альбумина с иммобилизированным полипептидом δРΛ (специалисту в данной области техники будет ясно, что аффинность связывания может быть оценена любым подходящим способом, включая, например, осаждение меченного человеческого сывороточного альбумина, конкурентное исследование Е|асоге и т.п.). После выявления низкой аффинности неизмененного полипептида δРΛ в отношении человеческого сывороточного альбумина (например, значения Кб в мкМ-диапазоне или выше) или ее отсутствия по меньшей мере одну из нескольких стратегий используют для придания полипептиду δРΛ свойств связывания человеческого сывороточного альбумина, включая один или более из следующих способов, разработанных для придания и/или усиления аффинности связывания молекулы в отношении антигена-мишени.
Связывания человеческого сывороточного альбумина полипептидом (полипептидами), имеющим каркас δРΛ, достигают и оптимизируют способами мутагенеза, возможно, в комбинации со способами параллельной и/или повторной селекции, как описано ниже, и/или, в противном случае, как известно в данной области техники. Полипептидные домены каркаса δРΛ подвергают случайному и/или ΝΝΙ<мутагенезу, проводимому, как описано ниже. Такой мутагенез проводят в отношении всего домена Ζ полипептида δРΛ или в отношении определенных последовательностей в пределах полипептида δРΛ, например, в отношении 13 поверхностных остатков домена Ζ, контактирующих с растворителем, как установлено в №гб е! а1. (1997 №Ц. ЕюЮсНпоР 15: 772-77), и, возможно, рандомизируют для разработки новых или улучшенных полипептидов, связывающих человеческий сывороточный альбумин. Возможно, для проведения таких способов мутагенеза используют ПЦР, что приводит к формированию разнообразия последовательностей в целевых последовательностях в полипептидах δРΛ. (Такие способы сходны с описанными ниже для образования библиотек бАЬ.) В дополнение к случайным способам мутагенеза используют направленный мутагенез целевых аминокислотных остатков, где по структурной информации установлено, что определенные аминокислотные остатки полипептидов δРΛ имеют критическое значение для связывания человеческого сывороточного альбумина. В определенных воплощениях репертуары мутантных генов домена Ζ объединяют и вводят в фагмидный вектор, адаптированный для моновалентного фагового дисплея. Библиотеки, содержащие, например, миллионы трансформантов, конст- 107 020464 руируют с применением для мутагенеза, например, вырожденности ΝΝ(Ο/Τ) или, альтернативно, (€/Α/Ο)ΝΝ.
Полипептиды δΡΑ, конструированные, как описано выше, подвергают способам параллельной и/или повторной селекции для идентификации тех полипептидов δΡΑ, которые оптимизированы для связывания человеческого сывороточного альбумина. Например, после получения библиотеки последовательностей мутированных полипептидов δΡΑ, указанную библиотеку полипептидов представляют на фаге и подвергают нескольким раундам селекции, требующим связывания сывороточного альбумина и/или пролиферации, как описано ниже для селекции ЛΑЪ, связывающих сывороточный альбумин, из библиотек ЛΑЪ. Биопаннинг против белка-мишени человеческого сывороточного альбумина используют для достижения значимого обогащения для молекул δΡΑ, связывающих сывороточный альбумин. Селектированные клоны затем экспрессируют в ΕχοΗ и анализируют посредством δΟδ-ΡΑΟΗ, спектроскопии кругового дихроизма и исследований связывания с человеческим сывороточным альбумином посредством анализа биоспецифичного взаимодействия. Ожидают, что молекулы δΡΑ (аффитела), связывающие человеческий сывороточный альбумин будут иметь вторичную структуру, сходную с нативным доменом Ζ, и будут иметь микромолярные константы диссоциации (КЛ) в отношении их соответствующих мишеней в мкМ-диапазоне или менее (например, нМ или пМ).
Возможно, селекцию проводят против сывороточного альбумина, иммобилизированного на иммунологических пробирках или против биотинилированного сывороточного альбумина в растворе. Возможно, аффинность связывания определяют с применением поверхностного плазмонного резонанса (δΡ^ и Β^асο^е (ΙΚ·ιγ155οπ е! а1., 1991), с применением системы (^рзаШ, δ\\ι^η), где для полностью оптимизированных полипептидов, имеющих происхождение от δΡΑ, в идеальном случае достигают значений КЛ аффинности связывания с человеческим сывороточным альбумином в нМ-диапазоне или менее.
После идентификации полипептидов δΡΑ, связывающих человеческий сывороточный альбумин, такие полипептиды затем используют для образования композиций лигандов с двойной специфичностью любым из способов, описанных ниже.
Полипептиды аффител стафилококкового белка Α (δΡΑ)
Контактирующие с растворителем поверхности бактериальных рецепторов могут быть мишенью для направленного мутагенеза с последующей фенотипической селекцией для придания таким рецепторным молекулам, например, аффинности связывания в отношении сывороточного альбумина. Такие белки могут быть необычно стабильными, что делает их подходящими для различных применений е! а1. (1992), бюсЬенизЦу 31: 3597-3603). В частности, для бактериальных рецепторов, содержащих спиральные пучковые структуры, можно ожидать, что конформация будет устойчива к изменениям в боковых цепях остатков, не вовлеченных во взаимодействия при укладке спирали. Примерами таких молекул являются относительно небольшой (58 остатков) IдΟ-связывающий домен В стафилококкового белка Α (δΡΑ) и синтетический аналог домена В, обозначенный как домен Ζ (Νί^οη е! а1. (1987), ΡΐΌΚίη Еп§1ΐ'^πηβ 1: 107-113).
Домен Ζ, имеющий происхождение от δΡΑ, является основным доменом δΡΑ, используемым в качестве каркаса с целью конструирования вариантов доменов с новыми связывающими свойствами (см., например, νΟ 00/63243 и νΟ 95/19374, полностью включенные сюда посредством ссылки). Домен Ζ δΡΑ представляет собой свободный от цистеина трехспиральный пучковый домен из 58 аминокислотных остатков, используемый в качестве каркаса для конструирования комбинаторных фагмидных библиотек, из которых селектируют варианты, направленные на желаемые молекулы (например, человеческий сывороточный альбумин) с применением технологии фагового дисплея (Νί^οη е! а1. 1987 ΡΐΌΚίη Еп§. 1: 107-113; Νοιύ е! а1. (1997), Ыа!. Βίο^^οΕ 15: 772-777; Νοιύ е! а1. (2000), ί. Βίο^^οΕ 80: 45-54; Наи8зοη е! а1. 1999 Iттиηο!есЬиοίο§у 4: 237-252; ЕЕЕтЛ е! а1. (2002), Ρίο^ίπδ 48: 454-462; ^штагк е! а1. 2002 Еиг. ί. бюсЬет. 269: 2647-2655). Такие мишеньсвязывающие варианты, называемые молекулами аффител, селектируют как связывающие агенты для белков-мишеней посредством фагового дисплея комбинаторных библиотек, в которых обычно 13 боковых цепей на поверхности 1 и 2 спиралей (09, 010, Ν11, Ρ13, Υ14, Ь17, Н18, Е24, Е25, К27, Ν28, 032 и К35) в домене Ζ были рандомизированы (ЕеиЛе1 е! а1. (2006), ί. Μοί. ΒίοΕ 359: 1293-304). Простая устойчивая структура таких молекул аффител совместно с малой молекулярной массой (7 кДа) делает их подходящими для широкого спектра применений. Доказанная эффективность была продемонстрирована при биоразделениях в масштабах биопроцессов и в лабораторных масштабах (ΝοΜ е! а1. (2000), ί. Βΐο^αΙηοΕ 80: 45-54; ΝοΜ е! а1. (2001), Еиг. ί. бюсЬет. 268: 4269-4277; ΟπΜιιι^ е! а1. (2002), ί. ΒίοΚΟιηοΕ 99: 41-50), и перспективные результаты были получены при оценке аффител-лигандов в качестве реагентов для выявления (Кайз!гот апЛ Νυ8γ;π 2001 ΑιτιΕ ΒίοсЬет. 295: 22-30; ^штагк е! а1. 2002, ί. Iттиηοί. МеЛюЛз 261: 199-211), для конструирования аденовирусного тропизма (Неттд е! а1. 2002, Нит. Ο;η; Пег. 13: 1427-1439) и для ингибирования рецепторных взаимодействий ^а^з^цт е! а1. 2003, ΡΐΌΚίη Еп§. 16: 691-697). Таким образом, конструированные аффитела-лиганды, например, связывающие человеческий сывороточный альбумин, являются желательными компонентами определенных композиций с лигандов с двойной специфичностью по настоящему изобретению.
- 108 020464
Библиотеки полипептидов, имеющие происхождение от домена Ζ стафилококкового белка А, могут быть получены любым способом мутагенеза, как известно в данной области техники и/или описано ниже. После создания таких полипептидных библиотек варианты, способные связывать желаемые молекулы-мишени (например, человеческий сывороточный альбумин) можно эффективно селектировать и идентифицировать с применением, например, технологий селекции ш у|1го, таких как фаговый дисплей (ТОнпп 1996; 8ιηί11ι апй Ρаΐ^епкο 1997; ноодепЬоот е1 а1. 1998), рибосомальный дисплей (напек апй Ρ1ϋθ^ 11шп 1997; не апй Τηιΐδδίβ 1997), пептиды на плазмидах (8сНа1/ 1993) или бактериальный дисплей (Оеогдюи е1 а1. 1997). Для таких селекции была теоретически обоснована (Теге1коп апй Οкΐе^ 1979) и экспериментально продемонстрирована (ОпГГйНк е1 а1. 1994; Уаидйап е1 а1. 1996; Афате е1 а1. 1997) корреляция между размером библиотеки (сложностью) и вероятностью выделения связывающих агентов с высокими аффинностями (ΚΌ=10-8 М или менее).
Аффитела имеют несколько преимуществ перед традиционными антителами, например, (1) меньшую стоимость изготовления; (2) меньший размер; (3) увеличенную стабильность и устойчивость; (4) возможность рекомбинантного получения в бактериальном хозяине или посредством химического синтеза, что устраняет риск вирусной контаминации.
Аффитело представляет собой полипептид, являющийся производным домена стафилококкового белка А (8ΡΑ), представляющего собой домен В или Ζ, где несколько аминокислотных остатков были замещены другими аминокислотными остатками, без существенной потери основной структуры и стабильности указанного домена 8ΡΑ, что привело к возможности взаимодействия указанного полипептида с по меньшей мере одним доменом антигена-мишени (например, человеческого сывороточного альбумина). Число замещенных аминокислотных остатков может составлять от 1 до приблизительно 30 или от 1 до приблизительно 13. Другие возможные диапазоны включают от 4 до приблизительно 30; от 4 до приблизительно 13; от 5 до приблизительно 20 или от 5 до приблизительно 13 аминокислотных остатков. Специалисту в данной области техники будет ясно, например, из Шгй е1 а1. 1997, №1. Вю1есйпо1. 15: 772777, что преимущественно могут быть замещены аминокислотные остатки, расположенные на поверхности домена Ζ, в то время как середину пучка необходимо поддерживать неизменной для сохранения структурных свойств молекулы.
Способ изготовления аффитела изложен, например, в νΟ 00/63243, и в целях настоящего изобретения может включать, например, следующие стадии:
(1) представление, посредством, например, фагового дисплея (см. обзор, например, в 1<ау, Κ. е1 а1. (ейк.) ΡЬаде О1кр1ау оГ Ρерΐ^йек апй Ρ^οΐе^пк: А ЬаЬота1огу Мапиа1, Асайетю Ριόκκ, 8ап О|едо, I8ΒN 0-124023 80-0), рибосомального дисплея (см. обзор, например, в напек, I. е1 а1. (1998), ΡΐΌα №ύ. Асай. 8а. И8А 95: 14130-14135) или клеточного дисплея (см. обзор, например, в ПаидйеПу, Ρ.8. е! а1. (1998), Ρ^οΐе^η Епд. 11: 825-832), полипептидных вариантов из белковой библиотеки, включающей репертуар полипептидных вариантов, имеющих происхождение от домена В или Ζ 8ΡΑ;
(2) селекцию клонов, экспрессирующих полипептиды, связывающие человеческий сывороточный альбумин; и (3) получение полипептидов рекомбинантной экспрессией селектированных клонов или химическим синтезом.
Авимер
Пример 21. Образование лиганда с двойной специфичностью, содержащего авимер, связывающий сывороточный альбумин, посредством СЭК-переноса.
Домены СОК йАЬ7114 используют для конструирования полипептида авимера, связывающего человеческий сывороточный альбумин, следующим образом. Последовательности СГОК1 (КΑ8^VIΟ8^^8; 8ЕС) ГО ΝΟ.:__), СГОК2 (ГОК88ЕС)8; 8ЕО ГО ΝΟ.:_) и СГОК (Α^ΟΑΑ^ΡКΤ; 8ЕО ГО ΝΟ.:_) йАЬ7114 переносят в мономер С2 (описанный в публикации патента США № 2005/0221384, полностью включенной сюда посредством ссылки) в 17-28, 49-53 и 78-85 остатки, соответственно, составляющими 1, 2 и 3 петлевые области мономера С2 соответственно. Проводят анализ связывания в реальном времени посредством В1асоте для оценки специфичного связывания человеческого сывороточного альбумина и иммобилизированного полипептида, имеющего происхождение от мономера С2, содержащего С'ГОК-домены йАЬ7114 против человеческого сывороточного альбумина (специалисту в данной области техники будет ясно, что аффинность связывания может быть оценена с применением любого подходящего способа, включая, например, осаждение меченного человеческого сывороточного альбумина, конкурентное исследование В1асоте и т.п.). При выявлении низкой аффинности в отношении человеческого сывороточного альбумина (например, значения Κ в мкМ-диапазоне или выше) или ее отсутствия, по меньшей мере одну из нескольких стратегий используют для улучшения свойств связывания человеческого сывороточного альбумина мономера С2 с перенесенными СОК (и/или димеров, тримеров авимеров и других композиций с повторениями более высокого порядка), включая любой из следующих способов, способствующих аффинности связывания.
Длину (длины) С'ГОК-перенесенных областей йАЬ7114 исходного полипептида мономера С2 (и/или полипептидов димеров, тримеров авимера и т.п., полученных повторением), соответствующих контактирующим с растворителем петлевым областям в пределах нативного мономера С2 (и/или других нативных мономеров, используемых в композициях авимеров) адаптируют применением линкерных полипепти- 109 020464 дов. Например, девять аминокислотных остатков последовательности пептида СОК бАЬ7114 могут быть увеличены по длине до 13 аминокислотных остатков с применением аминокислотных линкеров, состоящих из, например, от нуля до четырех остатков по длине, расположенных на Ν- или С-концевых частях полипептидной последовательности СЭК3 бАЬ7114, достигая посредством этого общей длины перенесенной пептидной последовательности в 13 аминокислот в пределах домена с перенесенной СОК3, соответствующего 3 петли полипептида мономера С2. Такое применение линкерного полипептида (полипептидов), возможно, комбинируют с мутагенезом линкерных последовательностей, последовательностей СЭК и/или полипептидных последовательностей мономера С2, не являющихся последовательностями СОК, (например, с применением мутагенных способов оптимизации, как описано ниже) для улучшения способности полипептида (полипептидов) мономера С2 с перенесенными СОК связывать человеческий сывороточный альбумин (например, посредством оптимизации полипептидных последовательностей как СОК, так и мономера С2, в пределах полипептидов мономера С2 с перенесенными СОК). Полипептидные линкеры, используемые с этой целью, либо обладают предопределенной последовательностью, либо, возможно, их селектируют из совокупности случайных полипептидных линкерных последовательностей посредством оценки способностей содержащих линкер полипептидов мономера С2 с перенесенными СЭК связывать человеческий сывороточный альбумин. Способы оптимизации проводят параллельно и/или повторно. В способах как параллельной, так и повторной оптимизации (например, созревание аффинности) применяют способы селекции, применимые для оптимизации связывающих свойств полипептидов, как описано ниже и/или известно в данной области техники.
Связывание человеческого сывороточного альбумина полипептидом (полипептидами) мономера С2 с перенесенными СОК (и/или димеров, тримеров авимера и т.п., композиций более высокого порядка, полученных повторением, или отдельных входящих в них дополнительных мономеров), представляющих СОК бАЬ7114, оптимизируют посредством способов мутагенеза, возможно, в комбинации со способами параллельной и/или повторной селекции, как описано ниже, и/или, в противном случае, как известно в данной области техники. Для типичного полипептида с каркасом мономера С2 домены, окружающие перенесенные последовательности СОК бАЬ7114, подвергают случайному и/или NNК-мутагенезу, проводимому, как описано ниже. Такой мутагенез, возможно, проводят в отношении выбранных аминокислотных остатков в пределах полипептидной последовательности мономера С2, как изложено, например, в публикации патента США № 2005/0221384, или, возможно проводят в отношении всех аминокислотных остатков, не входящих в СОК, и, возможно, рандомизируют для разработки новых или улучшенных полипептидов, связывающих человеческий сывороточный альбумин. Возможно, полипептидные домены СОК бАЬ7114, представленные в полипептиде мономера С2 с перенесенными СОК, подвергают мутагенезу посредством, например, случайного мутагенеза, ММК-мутагенеза, 1оок (НгондН мутагенеза и/или другого принятого в данной области техники способа. Возможно, для проведения таких способов мутагенеза используют ПЦР, что приводит к формированию разнообразия последовательностей в целевых последовательностях в полипептидах мономера С2 с перенесенными СОК. Такие способы сходны с описанными ниже для образования библиотек бАЬ. В дополнение к случайным и/или 1оок (НгондН способам мутагенеза используют направленный мутагенез целевых аминокислотных остатков, где по структурной информации установлено, что определенные аминокислотные остатки имеют критическое значение для связывания человеческого сывороточного альбумина.
Полипептиды мономера С2 (и/или композиции авимеров, полученные повторением, содержащие отдельные мономеры), содержащие перенесенные последовательности СОК бАЬ7114, конструированные, как описано выше, подвергают способам параллельной и/или повторной селекции для идентификации тех полипептидов мономеров С2 (и композиций авимеров), которые оптимизированы для связывания человеческого сывороточного альбумина. Например, после получения библиотеки последовательностей полипептидов мономера С2 с перенесенными СОК бАЬ7114, эту библиотеку таких полипептидов представляют на фаге и подвергают нескольким раундам селекции, требующим связывания сывороточного альбумина и/или пролиферации, как описано ниже для селекции бАЬ, связывающих сывороточный альбумин, из библиотек бАЬ. Возможно, селекцию проводят против сывороточного альбумина, иммобилизированного на иммунологических пробирках или против биотинилированного сывороточного альбумина в растворе. Возможно, аффинность связывания определяют с применением поверхностного плазмонного резонанса (БРК) и В1асоге (Каг1ззоп е1 а1., 1991), с применением системы В1асоге (Иррза1а, Буебеп), где для полностью оптимизированных авимеров, содержащих мономеры, имеющие происхождение от С2, в идеальном случае достигают значений Кб аффинности связывания с человеческим сывороточным альбумином в нМ-диапазоне или менее.
После идентификации полипептидов, имеющих происхождение от мономера С2, связывающих человеческий сывороточный альбумин, свойства связывания человеческого альбумина таких исходных мономеров могут быть дополнительно усилены посредством комбинирования таких мономеров с другими мономерами, с последующим дополнительным мутагенезом и/или селекцией, с образованием посредством этого композиции авимера, обладающей специфичной аффинностью в отношении человеческого сывороточного альбумина. После идентификации композиции авимера, обладающей аффинностью в отношении человеческого сывороточного альбумина, такие полипептиды авимеров затем используют для
- 110 020464 образования композиций лигандов с двойной специфичностью любым из способов, описанных ниже.
Пример 22. Образование лиганда с двойной специфичностью, содержащего неиммуноглобулиновый каркас авимера. связывающего сывороточный альбумин, посредством селекции группировок, связывающих сыворточный альбумин.
Описанный полипептид нативного мономера С2 подвергают методикам селекции в библиотеке и. возможно, созревания аффинности, затем комбинируют с дополнительным мономером (например, фибронектиновым мономером, для которого, возможно, параллельно может быть оптимизирована аффинность в отношении человеческого сывороточного альбумина) и. возможно, повторно подвергают методикам селекции в библиотеке и. возможно, созревания аффинности для получения молекулы с неиммуноглобулиновым каркасом авимера. связывающей человеческий сывороточный альбумин, для использования в лигандах с двойной специфичностью по изобретению.
Проводят анализ связывания в реальном времени посредством В1асоге для оценки специфичного связывания человеческого сывороточного альбумина и иммобилизированного полипептида мономера С2 (и/или молекулы авимера. полученной повторением). После выявлении низкой аффинности полипептида мономера С2 в отношении человеческого сывороточного альбумина (например, значения Кй в мкМдиапазоне или выше) или ее отсутствия, по меньшей мере одну из нескольких стратегий используют для придания свойств связывания человеческого сывороточного альбумина полипептиду мономера С2. включая один или более из следующих способов, способствующих аффинности связывания.
Связывание человеческого сывороточного альбумина полипептидом (полипептидами) мономера С2 (и/или димером. тримером авимера и т.п. молекулами, полученными повторением) оптимизируют посредством способов мутагенеза, возможно, в комбинации со способами параллельной и/или повторной селекции, как описано ниже. и/или. в противном случае. как известно в данной области техники. Домены полипептида мономера С2 подвергают случайному и/или NNК-мутагенезу, проводимому, как описано ниже. Такой мутагенез проводят в отношении всего полипептида мономера С2 или в отношении определенных последовательностей в пределах полипептида мономера С2. в отношении выбранных аминокислотных остатков, как изложено, например, в публикации патента США № 2005/0221384. и. возможно, рандомизируют для разработки новых или улучшенных полипептидов, связывающих человеческий сывороточный альбумин. Возможно, для проведения таких способов мутагенеза используют ПЦР. что приводит к формированию разнообразия последовательностей в целевых последовательностях в полипептидах мономера С2 и/или молекулах авимеров. (Такие способы сходны с описанными ниже для образования библиотек йАЬ.) В дополнение к случайным способам мутагенеза используют направленный мутагенез целевых аминокислотных остатков, где по структурной информации установлено, что определенные аминокислотные остатки мономера С2 имеют критическое значение для связывания человеческого сывороточного альбумина.
Полипептиды мономера С2. конструированные, как описано выше. подвергают способам параллельной и/или повторной селекции для идентификации тех полипептидов мономера С2 и/или молекул авимеров. которые оптимизированы для связывания человеческого сывороточного альбумина. Например, после получения библиотеки мутированных последовательностей полипептидов мономера С2. указанную библиотеку полипептидов представляют на фаге и подвергают нескольким раундам селекции, требующим связывания сывороточного альбумина и/или пролиферации, как описано ниже для селекции йАЬ. связывающих сывороточный альбумин, из библиотек йАЬ. Возможно, раунды селекции могут включать повторения, при которых добавляют дополнительные мономерные субъединицы для образования новой молекулы авимера. Возможно, селекцию проводят против сывороточного альбумина, иммобилизированного на иммунологических пробирках или против биотинилированного сывороточного альбумина в растворе. Возможно, аффинность связывания определяют с применением поверхностного плазмонного резонанса (ЗРК) и В1асоте (Каг1ккоп е! а1.. 1991). с применением системы В1асоте (Иррка1а. Зтеейеп). где для полностью оптимизированных авимеров. содержащих полипептиды мономеров, имеющих происхождение от С2. в идеальном случае достигают значений Кй аффинности связывания с человеческим сывороточным альбумином в нМ-диапазоне или менее.
После идентификации полипептидов, имеющих происхождение от мономера С2. связывающих человеческий сывороточный альбумин, свойства связывания человеческой сыворотки таких исходных мономеров могут быть дополнительно усилены посредством комбинирования таких мономеров с другими мономерами, с последующим дополнительным мутагенезом и/или селекцией, с образованием посредством этого композиции авимера. обладающей специфичной аффинностью в отношении человеческого сывороточного альбумина. После идентификации композиции авимера. обладающей аффинностью в отношении человеческого сывороточного альбумина, такие полипептиды авимеров затем используют для образования композиций лигандов с двойной специфичностью любым из способов, описанных ниже.
- 111 020464
Получение и применение полипептидов авимеров
Авимеры получают из большого семейства человеческих внеклеточных рецепторных доменов ш νί1го перетасовкой экзонов и фаговым дисплеем, образуя многодоменные белки со связывающими и/или ингибирующими свойствами. Связывание нескольких независимых связывающих доменов (селектированных, например, повторно для связывания белка-мишени, например, человеческого сывороточного альбумина) создает авидность и приводит к улучшенной аффинности и специфичности по сравнению с обычными белками, связывающими один эпитоп. Другие возможные преимущества включают простоту и эффективность получения молекул, специфичных в отношении нескольких мишеней, в Е.соП, улучшенную термостабильность и устойчивость к протеазам. Возможно получение авимеров, обладающих субнаномолярными аффинностями против белка-мишени. Например, был получен авимер, ингибирующий интерлейкин-6 с КА, 0,8 пМ в исследованиях, основанных на клетках, и он был охарактеризован как биологически активный (8Пуегтап е! а1. 2005 Иа!иге Вю!есЬпо1оду 23: 1556-1561; также см., например, публикации патентов США № 2005/0221384, 2005/0164301, 2005/0053973 и 2005/0089932, 2005/0048512, и 2004/0175756, каждая из которых полностью включена сюда посредством ссылки).
Синтез авимеров включает фаговый дисплей библиотек, имеющих происхождение от человеческого репертуара доменов А. Синтетическую рекомбинацию используют для создания пула мономеров с большим разнообразием, как описано в 8Пуегтап е! а1. (2005 Иа!иге Вю!есЬпо1оду 23: 1556-1561). После образования пула мономеров, пул подвергают скринингу против белка-мишени (например, человеческого сывороточного альбумина). Устанавливают исходных кандидатов и присоединяют дополнительный мономер, и получаемую библиотеку димеров подвергают скринингу против белка-мишени для установления димеров-кандидатов, связывающих мишень. Способ затем повторяют для получения тримера с очень высокой аффинностью связывания в отношении белка-мишени, и, возможно, его можно дополнительно повторять для установления комплексов-кандидатов более высокого порядка. Комплексыкандидаты, которые, как установлено, связывают белки-мишени с высокой аффинностью и специфичностью, называют авимерами (как авидные мультимеры).
Мономерные домены авимеров могут представлять собой полипептидные цепи любого размера. Например, мономерные домены могут иметь от приблизительно 25 до приблизительно 500, от приблизительно 30 до приблизительно 200, от приблизительно 30 до приблизительно 100, от приблизительно 90 до приблизительно 200, от приблизительно 30 до приблизительно 250, от приблизительно 30 до приблизительно 60, от приблизительно 9 до приблизительно 150, от приблизительно 100 до приблизительно 150, от приблизительно 25 до приблизительно 50 или от приблизительно 30 до приблизительно 150 аминокислот. Сходным образом, мономерный домен авимера может содержать, например, от приблизительно 30 до приблизительно 200 аминокислот; от приблизительно 25 до приблизительно 180 аминокислот; от приблизительно 40 до приблизительно 150 аминокислот; от приблизительно 50 до приблизительно 130 аминокислот; или от приблизительно 75 до приблизительно 125 аминокислот. Мономерные домены и иммунные домены могут обычно сохранять стабильную конформацию в растворе. Иногда мономерные домены авимеров и иммунные доменоы могут независимо принимать сиабильную конформацию. Стабильную конформацию могут стабилизировать ионы металлов. Стабильная конформация может, возможно, включать дисульфидные связи (например, по меньшей мере одну, две или три, или более дисульфидных связей). Дисульфидные связи могут, возможно, быть образованы между двумя цистеиновыми остатками.
Публикации, в которых описаны мономерные домены и белки-мозаики, и ссылки, приведенные там, включают следующее: Не§у1, Н. апй Вогк, Р. 1997 1. Рго!еш СЬет., 16: 545-551; Вагоп е! а1. 1991 Тгепйз ВюсЬет. 8сЕ 16: 13-17; Ропйпд е! а1. 2000 Λύν. Рго!ет СЬет. 54: 185-244; ЭооПШе 1995 Аппи. Кеу. ВюсЬет 64: 287-314; ОооЬйе апй Вогк 1993 8аепййс Атепсап 269: 50-6; апй Вогк 1991 РЕВ8 1ейегз 286: 47-54. Мономерные домены, используемые в авимерах, могут также включать домены, обнаруживаемые в базе данных РГат и базе данных 8МАКТ. См. 8с1ш11/ е! а1. 2000 Иис1ею АсМ Кез. 28: 231-34.
Мономерные домены, особенно подходящие для применения в композициях авимеров, представляют собой: (1) домены с β-сэндвичем; (2) домены с β-бочонком; или (3) домены, богатые цистеином, содержащие дисульфидные связи. Домены, богатые цистеином, используемые в авимерах, обычно не образуют α-спиральных, β-складчатых структур или структур в виде β-бочонка. Обычно дисульфидные связи стимулируют фолдинг домена с образованием тримерной структуры. Обычно домены, богатые цистеином, имеют по меньшей мере две дисульфидные связи, более типично, по меньшей мере три дисульфидные связи.
Мономерные домены авимеров могут иметь любое число характеристик. Например, домены могут не иметь иммуногенности у животного (например, человека) или иметь низкую иммуногенность. Домены могут иметь небольшой размер, например, домены могут быть достаточно малыми для проникновения через кожу или другие ткани. Домены могут обладать несколькими периодами полувыведения ш νί\Ό или стабильностями.
Типичные мономерные домены, подходящие для использования в авимерных композициях, включают, например, ЕОР-подобный домен, Кйп§1е-подобный домен, фибронектиновый домен I типа, фиб- 112 020464 ронектиновый домен II типа, фибронектиновый домен III типа, домен РАЫ, домен О1а, домен δКСК, домен КипШ/домен, ингибирующий бычий панкреатический трипсин, домен типа Ка/а1, ингибирующий сериновые протеазы, домен ТгеГоП (Р-типа), домен фактора фон Виллебранда типа С, анафилотоксиноподобный домен, домен СиВ, тироглобулиновый повтор I типа, домен рецептора ЬОЬ класса А, домен διι^ύ, домен Ппк, тромбоспондиновый домен I типа, мономерный домен тироглобулина, иммуноглобулиноподобный домен, домен лектина С-типа, домен МАМ, домен фактора фон Виллебранда типа А, домен соматомедина В, центральный домен \УАР-типа с четырьмя дисульфидными связями, домен Р5/8 типа С, гемопексиновый домен, домен δΜ, домен δΟΙ, ЕОР-подобный домен ламининового типа, домен С2 и другие подобные домены, известные специалистам в данной области техники, а также их производные и/или варианты. В публикации патента США № 20050221384 представлены схематические диаграммы различных типичных форм мономерных доменов, обнаруженных в молекулах семейства рецептора ЬПЬ.
Подходящие мономерные домены (например, домены, способные к независимому фолдингу или фолдингу при некотором ограниченном содействии) могут быть селектированы из семейств белковых доменов, содержащих трехмерные структуры в виде β-сэндвича или β-бочонка, как определено такими компьютеризированными средствами анализа последовательностей, как δίι^ι^ МоДи1аг Агсй!ес!иге КекеагсЬ Тоо1 ^МАКТ; см. δΐηιΐΐζ е! а1. 2000 Ыис1ею АщДк КекеагсЬ 28: 231-234) или САТН (см. Реаг1 е! а1. 2000 Ыис1ею АщДк КекеагсЬ 28: 277-282). Типичные мономерные домены авимеров также включают фибронектиновые домены III типа, антикалиновые домены и ^-подобные домены из СТЬА-4. Некоторые аспекты этих доменов описаны в \УО 01/64942 Ыроукек е! а1., \УО 99/16873 Век!е е! а1. и \УО 00/60070 Эекте! е! а1., содержание которых полностью включено сюда посредством ссылки.
Мономерные домены авимеров, возможно, богаты цистеином. Подходящие богатые цистеином мономерные домены включают, например, домен рецептора ЬПЬ класса А (А-домен) или ЕСР-подобный домен. Мономерные домены могут также иметь группу отрицательно заряженных остатков. Возможно, мономерные домены содержат повторяющуюся последовательность, такую как УХУТЭ, обнаруженная в β-пропеллерном домене. Друним типичным мономерным доменом, подходящим для использования в авимерах, является домен С2. Типичные последовательности домена А и домена С2 и консенсусные последовательности, применимые в получении авимеров, включая типичные выборки аминокислотных остатков (например, остатков расположенных на поверхности петель), наиболее желательные для направленного мутагенеза, представлены в публикации патента США № 2005/0221384.
Полинуклеотиды (также называемые нуклеиновыми кислотами), кодирующие мономерные домены, обычно используют для изготовления мономерных доменов посредством экспрессии. Нуклеиновые кислоты, кодирующие мономерные домены, могут иметь происхождение из множества различных источников. Библиотеки мономерных доменов могут быть получены экспрессией множества различных нуклеиновых кислот, кодирующих встречающиеся в природе мономерные домены, измененные мономерные домены (например, варианты мономерных доменов) или их комбинации.
Определяют мономерные домены, связывающие выбранный или желаемый лиганд (например, человеческий сывороточный альбумин) или смесь лигандов, возможно, в качестве начальной стадии получения авимеров. В некоторых воплощениях мономерные домены и/или иммунные домены идентифицируют или селектируют на желаемое свойство (например, аффинность связывания в отношении человеческого сывороточного альбумина) и затем из мономерных доменов и/или иммунных доменов образуют мультимеры. Для этих воплощений может быть применен любой способ, приводящий к селекции доменов с желаемым свойством (например, связыванием человеческого сывороточного альбумина). Например, способы могут включать представление множества различных нуклеиновых кислот, каждая из которых кодирует мономерный домен; трансляцию множества различных нуклеиновых кислот, представляя посредством этого множество различных мономерных доменов; скрининг множества различных мономерных доменов на связывание желаемого лиганда или смеси лигандов; и идентификацию членов множества различных мономерных доменов, связывающих желаемый лиганд или смесь лигандов.
Мономерные домены для получения авимеров могут быть встречающимися в природе или модифицированными (искусственными вариантами). Термин встречающийся в природе использован здесь для обозначения того, что объект может быть обнаружен в природе. Например, природные мономерные домены могут включать человеческие мономерные домены или, возможно, домены, имеющие происхождение от разных видов или источников, например, млекопитающих, приматов, грызунов, рыб, птиц, рептилий, растений и т.п. Встречающиеся в природе мономерные домены могут быть получены несколькими способами, например, ПЦР-амплификацией геномной ДНК или кДНК. При использовании здесь термин нативный использован в отношении нуклеиновой кислоты и/или полипептида, который не был модифицирован посредством мутагенеза или, в противном случае, посредством проведения любого из способов, описанных ниже.
Мономерные домены авимеров могут представлять собой встречающиеся в природе домены или не встречающиеся в природе варианты. Библиотеки мономерных доменов, используемые в синтезе авимеров, могут содержать встречающийся в природе мономерный домен, не встречающиеся природе вариан- 113 020464 ты мономерного домена или их комбинацию.
Множество описанных дисплейных векторов или систем могут быть использованы для экспрессии нуклеиновых кислот, кодирующих мономерные домены и авимеры, и для исследования на желаемую активность (например, связывание человеческого сывороточного альбумина). Например, система фагового дисплея представляет собой систему, в которой мономерные домены экспрессируют в виде слитых белков на поверхности фага (Лк-птаЛа, МПтаикее \1з.). Фаговый дисплей может включать представление полипептидной последовательности, кодирующей мономерные домены и/или иммунные домены, на поверхности нитчатого бактериофага, обычно в виде слитых белков с белком оболочки бактериофага. Типичные способы увеличения аффинности и фаговый дисплей изложены, например, в патентных публикациях РСТ № 91/17271, 91/18980, 91/19818 и 93/08278, полностью включенных сюда посредством ссылки.
Примеры других дисплейных систем включают рибосомальные дисплеи, нуклеотид-связанный дисплей (см., например, патенты США № 6281344; 6194550, 6207446, 6214553 и 6258558), дисплеи на поверхности клеток и т.п. Дисплеи на поверхности клеток включают множество клеток, например, клетки Е.соП, дрожжей и/или млекопитающих. При использовании клетки в качестве дисплея нуклеиновые кислоты, например, полученные ПЦР-амплификацией после расщепления, вводят в клетку и транслируют. Возможно, в клетку могут быть введены, например, инъекцией, полипептиды, кодирующие мономерные домены или авимеры.
Как описано ниже и в данной области техники, авимеры представляют собой мультимерные структуры. В типичных воплощениях мультимеры содержат по меньшей мере два мономерных домена и/или иммунных домена. Например, мультимеры по изобретению могут содержать от 2 до приблизительно 10 мономерных доменов и/или иммунных доменов, от 2 до приблизительно 8 мономерных доменов и/или иммунных доменов, от 3 до приблизительно 10 мономерных доменов и/или иммунных доменов, приблизительно 7 мономерных доменов и/или иммунных доменов, приблизительно 6 мономерных доменов и/или иммунных доменов, приблизительно 5 мономерных доменов и/или иммунных доменов или приблизительно 4 мономерных домена и/или иммунных домена. В некоторых воплощениях мультимер содержит по меньшей мере 3 мономерных домена и/или иммунных домена. Обычно мономерные домены были предварительно селектированы для связывания интересующей молекулы-мишени (например, человеческого сывороточного альбумина).
В авимере каждый мономерный домен может специфично связывать одну молекулу-мишень (например, человеческий сывороточный альбумин). Возможно, каждый мономер связывает различные положения (аналогичные эпитопу) на молекуле-мишени. Несколько мономерных доменов и/или иммунных доменов, связывающих одну и ту же молекулу-мишень, могут приводить к эффекту авидности, примводящему к улучшенной авидности мультимерного авимера по отношению к молекуле-мишени по сравнению с каждым отдельным мономером. Возможно, мультимер может обладать авидностью, по меньшей мере в 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50 или 100 раз превышающей авидность мономерного домена самого по себе в отношении белка-мишени (например, человеческого сывороточного альбумина).
Выбранные мономерные домены могут быть соединены линкером с образованием мультимера (авимера). Например, в мультимере между каждым отдельным отличным мономерным доменом расположен линкер. Обычно иммунные домены также связаны друг с другом или с мономерными доменами посредством линкерной группировки. Линкерные группировки, которые без труда могут быть использованы для связывания вариантов иммунных доменов, являются такими же, как описанные для мультимеров вариантов мономерных доменов. Здесь описаны типичные линкерные группировки, подходящие для связывания вариантов иммунных доменов с другими доменами с образованием мультимеров.
Связывание выбранных мономерных доменов посредством линкера с образованием авимера может быть осуществлено с применением множества методик, известных в данной области техники. Например, комбинационное объединение полинуклеотидов, кодирующих выбранные мономерные домены, может быть достигнуто лигированием ДНК, или, возможно, основанными на ПЦР самозапускающимися реакциями перекрывания. Линкер может быть присоединен к мономеру до установления способности мономера связывать мультимер-мишень или после селекции мономера на способность связывать мультимермишень.
- 114 020464
Как упомянуто выше, полипептид (полипептиды), содержащий авимеры, может быть модифицирован. Описания множества способов внесения разнообразия для образования модифицированных или измененных последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих эти полипептиды, изложены выше и далее в следующих публикациях и приведенных там ссылках:
Зоопд, Ν. βί ак, Мо1еси1аг Ьгеебтд οί νΐηΐδθδ, (2000) №ί Сепе1 25(4):436-439:
5{еттег, е1 а!., Мо1еси1аг ЬгеесПпд οί мгизез ίοΓ 1агдейпд апс! ойпег сПпюа! ргорегйев, (1999) Титог ТагдеЛпд 4:1-4; Ыезз βί ак, ϋΝΑ ЗЬийНпд οί зиЬдепотю зеяиепсез οί зиЬйНзт, (1999) ΝβΙυΓβ Вю1есИпо1оду 17:893-896; СЬапд βί ак,
ΕνοΙυίϊοη οί а суйэкте изтд ϋΝΑ ίθΓηΐΙγ зЬиЯНпд, (1999) Майке Вю1есЬпо1оду 17:793-797; М|пзЬиП апс! 51еттег, ΡγοΙθϊπ βνοίιιίΐοη Ьу то1еси1аг ЬгеесПпд, (1999)
Сиггеп1 Ορϊηΐοη ΐη СЬет1са1 Вю1оду 3:284-290; СЬпзйапз βί ак, ϋΪΓβοίβά βνοίιιίΐοη οί {ЬуткПпе ктазе ίοΓ ΑΖΤ рЬозрЬогу1айоп из1пд ϋΝΑ ίθΓηΐΙγ зЬийНпд, (1999) №1иге В|о1есЬпо1оду 17:259-264; Сгатеп βί ак, ϋΝΑ зЬийНпд οί а ίθΓηΐΙγ οί депез ίΓΟΠΊ άΐνθΓδβ δρβοϊβδ ассе1ега1еб 6ΐΓβοίβ6 θνοίυίϊοη, (1998) Ыа1иге 391:288-291;
Сгатеп е1 ак, Мо1еси1аг βνοίυίΐοη οί ап агеепа1е άβίοχϊίϊθ3ίϊοη раФмау Ьу ϋΝΑ зЬийПпд, (1997) Ыа1иге Вю1есЬпо1оду 15:436-438; гЬапд βί ак, ϋΪΓβοίβ6 еуо!ийоп οί ап βίίβοίΐνβ Йюо51базе йот а да1ас1оз1базе Ьу ϋΝΑ зЬийНпд апб бсгеептд (1997) Ргос. Ыа11. Асаб. δοί. υδΑ 94:4504-4509; Райеп βί ак, АррПсаНопз οί ϋΝΑ ЗЬийНпд ίο РЬагтасеиЛса1з апб \/асс'тез, (1997) Сиггеп! Ор'т'юп ΐη В'ю1есЬпо1оду 8:724-733; Сгатеп βί ак, Сопзйисйоп апб βνοίιιίΐοη οί апЛЬобу-рЬаде НЬгапез Ьу ΩΝΑ зЬийНпд, (1996) Ыа1иге Мебюте 2:100-103; Сгатеп βί ак, 1тргсп/еб дгееп Лиогезсеп1 ρΐΌίβΐη Ьу то!еси1аг βνοΐιιΐΐοη из!пд ϋΝΑ зЬийНпд, (1996) №1иге Вю1есЬпо1оду 14:315-319; Са1ез βί ак, Αίίΐηίίγ δβΐβοίΐνβ ΐδοΙθίΐοη οί Пдапбб йот рерЛбе НЬгапез ЙяоидЬ б1зр1ау оп а 1ас гергеззог ’Ьеабр1есе б1тег', (1996) боигпа! οί Мо1еси1аг Вю1оду 255:373-386; 51еттег, 5ехиа1 РСР апб АззетЫу РСР, (1996) Ιη: ТЬе Епсус1ореб1а οί Мо1еси1аг Вюкэду. \/СН РиЬНзЬегз, Νβνν Уогк. рр.
447-457; Сгатеп апб 81еттег, СотЬтайта! ти1Пр1е саззейе гтйадепез15 сгеа1ез аН 1Ье реггтйайопз οί ти1ап{ апб ννΐΙ6ίγρβ саззейез, (1995) ВюТесЬтдиез 18:194-195; 31еттег βί ак, Зтд1е-з1ер аззетЫу οί а депе апб епПге р1азт1б ίοπτι 1агде пиплЬегз οί оПдобеоху-пЬопис1еоЛбез, (1995) Сепе, 164:49-53; 31еттег, ТЬе ΕνοΙυίϊοη οί Мо1еси1аг Сотри1аЛоп, (1995) δοΐβηοβ 270:1510; 3ίβΓηιτιβΓ. ЗеагсЫпд Зеяиепсе Зрасе, (1995) Вю/ТесЬпо1оду 13:549-553; 51еттег, Рар|б βνοίιιίΐοη οίβ ρΓοίβΐη ΐη νΐίΓΟ Ьу ϋΝΑ зЬийНпд, (1994) Ыайге 370:389-391; апб δίβιτίΓηβΓ, ϋΝΑ зЬийНпд Ьу гапбот йадтеп1аЛоп апб геаззетЫу: Ιη νΐίΓΟ гесотЬтаПоп ίοΓ то!еси1аг βνοίιιίΐοη, (1994) Ргос. ЫаП. Асаб. δοί. иЗА 91:10747-10751.
- 115 020464
Мутационные способы внесения разнообразия включают, например, сайт-направленный мутагенез (1-1пд е1 ак, АрргоасЬез ίο ϋΝΑ гтйадепез1з: ап ονβπ/ίβνν, (1997) Апа1 ВюсЬет. 254(2): 157-178; 0а1е е1 ак, ОНдопис1еоЬбеάϊΓβοίβά гапбот тЩадепез1з изтд 1Ье ρήοδρήοΓοίήίοβίβ те1Ьоб, (1996) МеИюбв ΜοΙ. ΒΐοΙ. 57:369-374; ЗтИЬ, Ιη νίΐτο ти1адепез13, (1985) Апп. Ρβν. Сепек 19:423462; Βοίδίβΐη & ЗЬогИе, 3{га1ед1ез апб аррНсайопз οί ίη νίΐτο ти1адепез1з, (1985) Заепсе 229:1193-1201; Сабег, ЗЛе-бшесбеб пли1адепез13, (1986) ВюсЬет. б. 237:1-7; апб Кипке!, ТЬе е№с'1епсу οί оГ|допис1ео1|бе б1гес1еб ти1адепез13, (1987) ίη ΝιιοΙβίο Аобз & Мо1еси1аг Вю1оду (Ескз1е1п, Р. апб ЫПеу, ϋ. М. б. ебз., Зрппдег \/ег1ад, ВегПп)); мутагенез с применением урацил-содержащих матриц (Кипке1, Рар|б апб βίίίοίβηί δίίβ-δρβοίίίο тЩадепез13 ννίίΐιοιιί рНепо1урю зе1есГюп, (1985) Ргос. №ίΙ. Асад. Зек ΙΙ5Α 82:488-492; Кипке! βί ак, Рар1б апб βίίίοίβηί δίίβ-δρβοίίίο тЩадепез13 ννίίΚοιιί рЬепо1урю зе1есйоп, (1987) Μβίίιοάδ ίη Епгуток 154, 367382; апб Вазз βί ак, Μιιίβηί Тгр гергеззотз ννίίΚ ηβνν ОМА-ЫпсПпд зресйюШез, (1988) Зрелее 242:240-245); олигонуклеотид-направленный мутагенез ((1983) МеИтобз ίη Епгуток 100: 468-500; (1987) Μβίήοάδ ίη Епгуток 154: 329-350; ΖοΙΙβΓ & ЗтИЬ, Ο^οηιιοΙβοίίόβ-όίΓβοίβό ти1адепез13 изтд М13-бет/еб νβοίοτδ: ап βίίίοίβηί апб депега! ргосебиге ίοτ 1Ье ргобиейоп οί ροίηί ти1айопз ίη апу ϋΝΑ Йадтеп1, (1982) Νιόβιο Ас!бз Рез. 10:6487-6500; ΖοΙΙβΓ & ЗтИЬ, О1|допис1еойбеб1гес1еб ти1адепез13 οί ϋΝΑ ^адтеп1з с1опеб ίηίο М13 νβοίοτδ, (1983) МеНюбз ίη Епгуток 100:468-500; апб ΖοΙΙβΓ & ЗтИЬ, О1|допис1еойбе-б1гес1еб тЩадепез!з: а δϊτηρΙβ те1Ьоб изтд ίννο оПдопис1еойбе рптегз апб а 31пд1е-з1гапбеб ϋΝΑ 1етр1а1е, (1987) Ме1Ьобз ίη Епгуток 154:329-350); мутагенез ДНК, модифицированной фосфоротиоатом (Тау1ог е1 ак, ТЬе изе οί рЬозрЬого1Ь1оа1етобйеб ϋΝΑ ίη Γβδίποίίοη епгуте геаейопз ίο ргераге пюкеб ϋΝΑ, (1985) №ск Αοί6δ Рез. 13: 8749-8764; Тау1ог е1 ак, ТЬе гар|'б депегайоп οί оНдопис1еоЬ'беб1гес1еб гтийайопз а! ЫдЬ ^едиепсу изтд рЬозрЬого1Ь1оа1е-тоб|Леб ϋΝΑ, (1985) ΝιιοΙ. Αοί6δ Рез. 13: 8765-8787; №катауе & Ескз1е1п, Ιηήίόίίίοη οί Γβδίποίίοη епбопис1еазе Νοί I с1еауаде Ьу ρΚοδρΚοΓοίΚίοθίβ дгоирз апб Из аррКсайоп ίο о1|допис1еойбе-б1гес1еб ти1адепез13, (1986) ΝιιοΙ. Аабз Рез. 14: 9679-9698; Зауегз βί ак, Υ-Т Ехопис1еазез ίη рЬозрЬопЯЬюа1е-Ьазеб о1|допис1ео11с!е-б|гес1еб т1йадепез'15, (1988) ΝιιοΙ. Αοϊ6δ Рез. 16:791-802; апб Зауегз е1 ак, 31гапб зресИю с1еауаде οί рЬозрЬого1Ыоа1е-соп1а1П1пд ϋΝΑ Ьу геаейоп \л/ЛЬ Γβδίποίίοη епбопис1еазез ίη ίήβ ргезепсе οί βίίιί6ίιΐΓη Ьгоггибе, (1988) ΝιιοΙ. Ас1'бз Рез. 16: 803-814); мутагенез с применением двойной спирали ДНК с разрывами (Кгатег βί ак, ТЬе дарреб бир!ех ϋΝΑ арргоасЬ ίο ο^οηιιοΙβοίί6β-6ΪΓβοίβ6 гтиЛайоп οοηδίηιοίίοη, (1984) №ск Αοί6δ Рез. 12: 9441-9456; Кгатег & Επίζ ОПдопис1еойбе6ίτβοίβ6 οοηδίηιοίίοη οί ти1айопз νίβ дарреб бир1ех ϋΝΑ, (1987) Ме1Ьобз ίη Епгуток 154:350-367; Кгатег βί ак, 1тргоуеб епгутайс ίη νίΐτο геаейопз ίη 1Ье дарреб бир1ех ϋΝΑ арргоасЬ ίο оНдопис1еойбе-б'1гес1еб οοηδίηιοίίοη οί ти1айопз, (1988) ΝιιοΙ. Αοί6δ Рез. 16: 7207; апб Επίζ е1 ак, О1|'допис1еойбе-б1гес1еб οοηδίηιοίίοη οί гтИайопз: а дарреб бир1ех ϋΝΑ ргосебиге ννίΐΓτοιιΐ епгутайс геаейопз ίη νίίτο, (1988) ΝιιοΙ. Αοί6δ Рез. 16: 6987-6999).
- 116 020464
Дополнительные подходящие способы включают точечную репарацию ошибочно спаренных оснований (Кгатег βί ак, Ροΐηί М1эта1сК ВераИ, (1984) СеП 38:879-887), мутагенез с применением штаммов-хозяев, дефектных по репарации (Саг1ег βί ак, 1тргоуеб о1|допис1еоЛс1е 3ΐίβ-6ΐΓβοίβ6 тЫадепез1з из1пд М13 νβοΐΟΓδ, (1985) ΝιιοΙ. Αοΐ6δ Вез. 13: 4431-4443; апб Сабег, ΙιτιρΓονβό оНдопис1еойбе-б1гес1еб ти1адепез'13 изтд М13 νβοίΟΓβ, (1987) Мебюбз ίη Епгуток 154: 382-403), делеционный мутагенез (ЕдЫебаггабеЬ & Четкой, 1)зе οί оНдопис1еойбез ίο депега!е 1агде άβΙβίϊοηδ, (1986) ΝιιοΙ. Αοΐάδ Вез. 14: 5115), рестрикционную селекцию и рестрикционную очистку (\Л/еНз βί ак, 1тробапсе οί Ьубгодеп-Ьопб ίοπτίθίϊοη ίη з1аЫНг!пд ίίιβ {гапзИюп βίβΐβ οί δΐώίΐΐϊδΐη, (1986) ΡΝΙ.
Тгапз. В. 8ос. Ьопб. А 317: 415-423), мутагенез посредством синтеза всего гена (ИатЫаг βί ак, То1а1 зуп1Ьез15 апб с1оп1пд οί а депе собюд ίοτ 1Ье пЬопис1еазе 5 ρΓΟίβΐη, (1984) 8с1епсе 223: 1299-1301; Закатаг апб КЬогапа, То1а1 зуп1Ьез15 апб ехргезз'юп οί а депе ίοτ ίίιβ а-зиЬипН οί όονϊηβ гоб ои!ег зедтеп! диапте пис1еойбе-Ыпб1пд ρΓοίβίη Дгапвбист), (1988) ΝιιοΙ. Ас1бз Вез. 14: 6361-6372;
\Л/еНз βί ак, СаззеМе тЫадепез1з: ап βίίΐοϊβηί ηιβίήοά ίοτ депегайоп οί ти1йр1е ти1а1юпз а! беГтеб зИез, (1985) Сепе 34:315-323; апб бгипбзкот е1 ак, ОНдопис1еоИбе-б1гес1еб тЩадепез1з Ьу тюгозса1е 'зЬо1-дип' депе зуп1Ьез1з, (1985) ΝιιοΙ. Ас'|бз Вез. 13: 3305-3316), репарацию двуцепочечных разрывов (Мапбескк ОНдопис1еойбе-б1гес1еб боиЫе-зкапб Ьгеак гераИ ϊη р1азт1бз οί ЕзсЬепсЫа соП: а теИтоб ίοΓ зИе-зресШс ти1адепез1з, (1986) Ргос. ΝβίΙ. Асаб. Зек ΙΙ5Α, 83:7177-7181; апб Агпо1б, ΡΓοίβίη епдюееппд ίοΓ ипизиа! етлгоптеЫз, (1993) Сиггеп1 Ορϊηίοη ϊη Вю1есЬпо1оду 4:450-455).
Дополнительные подробности о многих из указанных выше способов могут быть обнаружены в Ме!Ьобз т Нп/уто1оуу Уо1. 154, где также описаны применимые контроли для выявления и устранения неполадок с различными способами мутагенеза.
Дополнительные подробности, касающиеся различных способов внесения разнообразия, могут быть обнаружены в следующих патентах США, публикациях и заявках РСТ и публикациях ЕРО:
патенте США № 5605793, принадлежащем 31еттег (РеЬ. 25, 1997),
МеМзобз ίοΓ Ιη \/Иго ВесотЫпаМоп; патенте США № 5811238, принадлежащем 81еттег е! ак (Зер. 22, 1998) Ме1Ьобз ίοτ СепегаГтд Ро1упис1еойбез Ьау1пд Оезкеб СЬагас1епзИсз Ьу ИегаНуе Зе1есИоп алб ВесотЫпаМоп; патенте США № 5830721, принадлежащем
31еттег е1 а1. (Νον. 3, 1998), ’ΌΝΑ Ми1адепез1з Ьу Вапбот РгадтеЫайоп апб ВеаззетЫу; патенте США №5834252, принадлежащем 31еттег, βί а1. (Νον. 10,
1998) Епб-Сотр1етеЫагу Ро1утегазе ВеасМоп; патенте США №5837458, принадлежащем М|ПзЬиИ, βί ак (Νον. 17, 1998), МеЯзобз апб СотрозИюпз ίοΓ СеПи1аг апб Ме1аЬоНс Епд1пееппд; )Л/О 95/22625, 81еттег апб Сгатеп,
Ми1адепез1з Ьу Вапбот РгадтеЫаИоп апб ВеаззетЫу; МО 96/33207, поданной 51еттег апб υρβοίιιιίζ Епб Сотр1етеЫагу Ро1утегазе СЬа1п ВеасИоп; \Л/О 97/20078, поданной 51еттег апб Сгатеп МеМтобз ίοΓ СепегаЬпд Ро1упис1еойбез Ьаутд ОезИеб СЬагас1епзИсз Ьу ΙίβΓβίίνβ 8е1есйоп апб ВесотЫпайоп; \Л/О 97/35966, поданной МтзЬиН апб 51еттег, МеМзобз апб СотрозИюпз ίοΓ Се11и1аг апб Ме1аЬо11с Епд1пееппд; \Л/О 99/41402, поданной Риппопеп е1 ак ТагдеМпд οί ОепеМс Уассте Уес1огз;МО 99/41383, поданной Риппопеп βί ак АпМдеп ЫЬгагу 1ттип12аМоп;МО 99/41369, поданной Риппопеп βί ак СепеИс Уассте νβοίοΓ Епд1пееппд; МО 99/41368, поданной Риппопеп βί
- 117 020464 а1. ΟρίίιτιίζβΙΐοη οί 1ттипотоби1а1огу Ргорегйез οί Οθηθίίο Уасс1пез; ЕР 752008, поданной 81еттег апс1 Сгатеп, 'ΌΝΑ Ми1адепез15 Ьу Рапдот РгадтепГаГюп апб РеаззетЫу; ЕР 0932670, поданной 31еттег ЕуоМпд Се11и1аг ϋΝΑ 11р1аке,
Ресигз'ще Зедиепсе РесотЫпаГюп; МО 99/23107 поданной, 51еттег е! ак,
ΜοάϊίϊοβΙϊοη οί \/1гиз Тгор1зт апб Ηθ3ί Рапде Ьу \/1га1 Сепоте ЗЬийНпд; \ΝΟ 99/21979, Αρί βί ак, Нитап РарШотаукиз Уес1огз;МО 98/31837, поданной бе1 Сагбауге е1 а1. ΈνοΙιιίΐοη οί \Л/Но1е СеПз апб Огдап1зтз Ьу Ресигзп/е Зедиепсе РесотЫпайоп; \ΝΟ 98/27230, поданной Райеп апб 31еттег, Ме1Ьобз апб СотрозИюпз 1ог Ро1урерйбе Епд1пееппд; МО 98/27230, поданной 51еттег θί а1.,
Мейтобз 1ог ΟρίΪΓηίζθίιοη οί Сепе ТЬегару Ьу Ресигзме Зедиепсе ЗЬиГСГтд апб Зе1есйоп, \Л/О 00/00632, МеЙтобз ίοΓ Сепегайпд ШдЫу Омегзе иЬгапез, МО 00/09679, МеЙюбз ίοΓ ОЫа1П1пд ϊη νίίΓΟ РесотЫпеб Ро1упис1еойбе Зедиепсе Вапкз апб Рези1йпд Зедиепсез; \ΝΟ 98/42832, поданной ΑιτιοΙά еГ ак, РесотЫпайоп οί Ро1упис1еойбе Зедиепсез из1пд Рапбот ог ϋβίϊηβό Рптегз;
МО 99/29902, поданной Агпо1б βί ак, Ме1Ьоб ίοΓ Сгеайпд Ро1упис1еойбе апб Ро1урерйбе Зедиепсез, МО 98/41653, поданной νίη6, Ап ϊη Уйго Ме1Ьоб ίοΓ Сопзйисйоп οί а ϋΝΑ иЬгагу; \ΝΟ 98/41622, поданной ВогсЬеб βί ак, МеГЬоб ίοΓ Сопзйисйпд а ЫЬгагу из!пд ϋΝΑ ЗЬиЙПпд; и \ΝΟ 98/42727, поданной Рай апб гагНпд, Зедиепсе АКегайопз изтд Ното1одоиз РесотЫпайоп; \ΝΟ 00/18906, поданной Райеп βί ак, ЗЬиГСНпд οί Собоп-АИегеб Оепез; \ΝΟ 00/04190, поданной бе! Сагбауге еГ ак ΈνοΙυίϊοη οί Мйо1е СеНз апб Огдап1зтз Ьу Ресигзше РесотЫпайоп; МО 00/42561, поданной Сгатеп е! ак, ОНдопис1еойбе Меб1а1еб ΝυοΙβϊο Αοϊ6 РесотЫпайоп; МО 00/42559, поданной 3βΙϊίοηον апб 81еттег Ме^Ьобз οί Рори1айпд Оа1а ЗГгисГигез ίοΓ изе ϊη Еуо1ийопагу 3|'ти1айопз; \ΝΟ 00/42560, поданной 3βΙϊίοηον е1 ак, Мейтобз Ьг Мак1пд СЬагас1ег ЗМпдз,
Ро1упис1еойбез & Ро1урерйбез Наутд Оезкеб СЬагас1епзйсз; МО 01/23401, поданной Ме1сЬ е! ак, изе οί Собоп-\/апеб ОНдопис1еойбе Зуп1Ьез13 ίοΓ Зупйаейс ЗЬиЯНпд; и РСТ/1)301/06775, 3|пд1е-3капбеб ΝυοΙβϊο Αοϊ6 Тетр1а1еМеб1а1еб РесотЫпайоп апб ΝυοΙβϊο Αοϊ6 РгадтепГ 1зо1айоп, поданной АййоИег.
Полипептиды (например, авимеры), используемые в настоящем изобретении, возможно, экспрессируют в клетках. Домены мультимера могут быть синтезированы в виде одного белка с применением систем экспрессии, хорошо известных в данной области техники. В дополнение ко многим руководствам, упомянутым выше, общие руководства, в которых описаны молекулярно-биологические методики, применимые здесь, включая применение векторов, промоторов и многие другие темы, относящиеся к экспрессии нуклеиновых кислот, таких как мономерные домены, селектированные мономерные домены, мультимеры и/или селектированные мультимеры, включают Вегдег апб К1тте1, Ошбе То Мо1еси1аг С1оптд Тесйшдиек, МеТйобк т 1'л/уто1оду νο1ите 152 Асабетю Ргекк, Ес., 8ап Эгедо, СайГ. (Вегдег); 8атЪгоок еТ а1., Мо1еси1аг С1отпд-А ЙаЪогаТогу Мапиа1 (2пб Еб.), Уо1. 1-3, Со1б 8рппд нагЪог ЬаЪогаТогу, Со1б 8рппд нагЪог, Ν.Υ., 1989 (8атЪгоок) и СиггепТ РгоТосо1к т Мо1еси1аг Вю1оду, Ρ. М. АикиЪе1 еТ а1., ебк., СиггепТ РгоТосо1к, а )о1'п1 гепПи'е ЪеТ^ееп Огеепе РиЪйкйтд АккоЫаТек, Шс. апб .1ойп УПеу & 8опк, Ес., (кирр1етепТеб Тйгоидй 1999) (АикиЪе1)). Примеры методик, достаточных для проведения специалистами в данной области техники способов амплификации ш νίΐΐΌ, применимые в идентификации, выделении и клонировании нуклеиновых кислот, кодирующих мономерные домены и мультимеры, включая полимеразную цепную реакцию (ПЦР), лигазную цепную реакцию (ЙСК), амплификацию с О-репииказой и другие методики с использованием РНК-полимеразы (например, амплификацию, основанную на последовательности нуклеиновых кислот (Х.А8В.А)), приведены в Вегдег, 8атЪгоок и АикиЪе1, а также МиШк еТ а1. (1987), патент США № 4683202; РСК РгоТосо1к А Ошбе То МеТйобк апб Аррйсайопк Цпшк еТ а1. ебк) Асабетю Ргекк Ес. 8ап Эгедо, СайГ. (1990), (Хппхк); Апйе1т & ^еν^пкοп (ОсТ. 1, 1990) С&ЕN 36-47; Тйе 1оигпа1 ОГ ΝΜ Кекеагсй (1991), 3, 81-94; (К^ой еТ а1. (1989), Ргос. №Т1. Асаб. 8с£ и8А 86, 1173; ОиаТеШ еТ а1. (1990), Ргос. №Т1. Асаб. 8сХ. и8А 87, 1874; Йоте11 еТ а1. (1989), I. Сйп. Сйет 35, 1826; йапбедгеп еТ а1. (1988), 8Ыепсе 241, 1077-1080; Уап ВгипТ (1990), ВюТесйпо1оду 8, 291-294; Уи апб Уа11асе (1989), Оепе 4, 560; Ватпдег еТ а1. (1990), Оепе 89, 117, апб 8оокпапап апб Ма1ек (1995), ВюТесйпо1оду 13: 563-564. Усовершенствованные способы клонирования ш νίΐΐΌ амиплифицированных нуклеиновых кислот описаны в
- 118 020464 \Уа11асе е1 а1., патент США № 5426039. Краткое изложение усовершенствованных способов амплификации больших нуклеиновых кислот посредством ПЦР, где могут быть получены ПЦР-ампликоны размером до 40 тысяч пар оснований (Ьр), приведено в СТеид е1 а1. (1994), ΝαΙιιτ; 369: 684-685 и представленных там ссылках. Специалисту в данной области техники будет ясно, что, по существу, любая РНК может быть превращена в двуцепочечную ДНК, подходящую для расщепления рестриктазами, ПЦРамиплификации и секвенирования, с применением обратной транскриптазы и полимеразы.
Векторы, кодирующие, например, мономерные домены и/или авимеры, могут быть введены в клетки-хозяева, полученные и/или селектированные рекомбинантными методиками. Клетки-хозяева обычно конструируют (т.е. трансдуцируют, трансформируют или трансфицируют) такими векторами, которые могут представлять, собой, например, вектор клонирования или вектор экспрессии. Вектор может быть, например, в форме плазмиды, вирусной частицы, фага и т.п. Конструированные клетки-хозяева можно культивировать в обычной питательной среде, модифицированной, по необходимости, для активации промоторов, селекции трансформантов или амплификации интересующего гена (генов) мономерных доменов, селектированных мономерных доменов, мультимеров и/или селектированных мультимеров. Условия культивирования, такие как температура, рН и т.п., представляют собой условия, использованные ранее с клеткой-хозяином, выбранной для экспрессии, и будут очевидны специалистам в данной области техники и в приведенных здесь ссылках, включая, например, ΡΐΌ5ΐιη;ν (1994), Си11иге οί Атта1 СеНз, а Маηиаί οί Вамс ΤесЬη^^ие. ΐΗίτ! ;!ίΙίοη, ^Пеу-Ы88, Ν;\ν ΥοιΓ и приведенные там ссылки.
Полипептиды по изобретению могут также быть получены в клетках, не являющихся клетками животных, таких как клетки растений, дрожжей, грибов, бактерий и т.п. Действительно, как указано здесь, фаговый дисплей является особенно подходящей методикой получения таких полипептидов. В дополнение к δαπιόΐΌοΚ Вегдег и Аи8иЬе1, подробности, относящиеся к культурам клеток, могут быть обнаружены в Рауне е1 а1. (1992), Ρ1αηΙ Се11 αη! Τίδδΐι; Си11иге ίη Ысцн! δу8ΐет8 ίοΐιη \УПеу & δοηδ, Жс. ΥοιΓ, Ν.Υ.; ΟαπιόοΓβ αη! РЫШрз (е!з) (1995), Р1аШ Се11, Τίδδΐι; αη! Отдан СиНите; Ти^ашей^ Ме11ю!5 δр^^ηде^ ЬаЬ Маша1, δр^^ηде^-Vе^ίад (Вепш Не1!е1Ьегд Υοτ1<), и АДаз αη! Рагкз (е!з) Τΐι; Ηаη!Ьοοк οί МюгоЬю^дюЛ Ме!1а (1993), СВС Ргезз, Βοса ΡαΙοη, Ρ1α.
Авимеры могут также обладать модификациями мономерных доменов, иммунных доменов и/или мультимеров, улучшающими фармакологические свойства, снижающими иммуногенность или усиливающими транспорт мультимера и/или мономерного домена в клетку или ткань (например, через гематоэнцефалический барьер или через кожу). Эти типы модификаций включают множество модификаций (например, присоединение углеводных групп или гликозилирование), присоединение ПЭГ, присоединение белковых доменов, связывающих определенный белок (например, ЖА или другой сывороточный белок), присоединение белков, фрагментов или последовательностей, являющихся сигналами для перемещения или транспорта в, из и через клетку. Дополнительные компоненты могут также быть присоединены к мультимеру и/или мономерному домену для воздействия на свойства мультимера и/или мономерного домена. Также может быть добавлено множество компонентов, включая, например, домен, связывающий известный рецептор (например, белковый домен Тс-области, связывающий Тс-рецептор), токсин (токсины) или часть токсина, продомен, который может, возможно, быть расщеплен для активации мультимера или мономерного домена, репотерную молекулу (например, зеленый флюоресцентный белок), компонент, связывающий репортерную молекулу (как, например, радионуклид для лучевой терапии, биотин или авидин) или комбинацию модификаций.
При использовании здесь термин направленная эволюция относится к способу, посредством которого образуют и экспрессируют полинуклеотидные варианты и проводят их скрининг на активность (например, полипептид со связывающей активностью в отношении белка-мишени, человеческого сывороточного альбумина) в рекурсивном способе. При скрининге выбирают один или более кандидатов и способ затем повторяют с использованием полинуклеотидов, кодирующих выбранные кандидаты, для образования новых вариантов. Направленная эволюция включает по меньшей мере два раунда внесения разнообразия и может включать 3, 4, 5, 10, 20 или более раундов внесения разнообразия и селекции. Разнообразие может быть внесено любым способом, известным специалистам в данной области техники, включая, например, ошибочно-направленную ПЦР, перетасовку генов, химический мутагенез и т.п.
Термин перетасовка использован здесь для обозначения рекомбинации между неидентичными последовательностями. В некоторых воплощениях перетасовка может включать кроссинговер посредством гомологичной рекомбинации или посредством негомологичной рекомбинации, как, например, посредством систем сте/кх и/или Г1р/Гг1. Перетасовка может быть проведена с использованием множества различных форматов, включая, например, ίη νίΐτο и ίη νίνο форматы перетасовки, ίη βΗκο форматы перетасовки, форматы перетасовки с использованием либо двуцепочечных, либо одноцепочечных матриц, форматы перетасовки на основе праймеров, форматы перетасовки на основе фрагментации нуклеиновых кислот, форматы перетасовки с использованием олигонуклеотидов, все из которых основаны на эпизодах рекомбинации между неидентичными последовательностями и описаны более подробно в данном изобретении ниже, либо ссылки на них приведены в данном изобретении ниже, а также сходные форматы на основе рекомбинации.
При использовании здесь термин случайный относится к полинуклеотидной последовательности
- 119 020464 или аминокислотной последовательности, состоящей из двух или более аминокислот и конструированной вероятностным или случайным способом. Случайная полинуклеотидная последовательность или аминокислотная последовательность может включать мотивы каркасных областей или каркасов, которые могут содержать инвариантные последовательности.
СгоЕ1 и СгоЕк
Пример 24. Образование лиганда с двойной специфичностью, содержащего неиммуноглобулиновый каркас срп10 (СгоЕк), связывающий сывороточный альбумин, посредством СЭК-переноса.
Домен СЭК3 йАЬ7Ь14 используют следующим образом для конструирования полипептида с неиммуноглобулиновым каркасом срп10 (СгоЕк), связывающего человеческий сывороточный альбумин.
Последовательность СЭК3 (АЦСААРРКТ; 8ЕЦ ГО ЫО.:_) йАЬ7Ь14 переносят в полипептид срп10 взамен нативных аминокислотных остатков срп10 в положениях 19-27 (остатки подвижных петель). Проводят анализ связывания в реальном времени посредством В1асоге для оценки специфичного связывания человеческого сывороточного альбумина и иммобилизированного полипептида, имеющего происхождение от срп10, содержащего домен СГОК3 йАЬ7Ь14 против человеческого сывороточного альбумина (специалисту в данной области техники будет ясно, что аффинность связывания может быть оценена с применением любого подходящего способа, включая, например, осаждение меченного человеческого сывороточного альбумина, конкурентное исследование В1асоге и т.п.). При выявлении низкой аффинности в отношении человеческого сывороточного альбумина (например, значения Кй в мкМ-диапазоне или выше) или ее отсутствия, по меньшей мере одну из нескольких стратегий используют для улучшения свойств связывания человеческого сывороточного альбумина полипептида срп10 с перенесенной СГОК3, включая любой из следующих способов, способствующих аффинности связывания.
Длину перенесенной СГОК3-области йАЬ7Ь14 полипептида срп10, соответствующей подвижной петлевой области в нативном полипептиде срп10, адаптируют удалением аминокислотных остатков и/или применением линкерных полипептидов. Например, девять аминокислотных остатков пептидной последовательности СГОК3 йАЬ7Ь14 увеличивают по длине до 16 аминокислотных остатков с применением аминокислотных линкеров, состоящих из, например, от нуля до семи остатков по длине, расположенных на Ν- или С-концевых частях полипептидной последовательности СГОК3 йАЬ7Ь14, достигая посредством этого общей длины перенесенной пептидной последовательности в 16 аминокислот в пределах домена перенесенной СГОК3, соответствующего подвижной петле в последовательности нативного срп10. Такое применение линкерного полипептида (полипептидов), возможно, комбинируют с мутагенезом линкерных последовательностей, последовательности (последовательностей) СГОК3 и/или последовательностей срп10, не являющихся последовательностями СОК, (например, с применением мутагенных способов оптимизации, как описано ниже) для улучшения способности полипептидов срп10 с перенесенной СГОК3 связывать человеческий сывороточный альбумин (например, посредством оптимизации как последовательностей СОК, так и фибронектиновых последовательностей в пределах полипептидов срп10 с перенесенной СГОК3). Полипептидные линкеры, используемые с этой целью, либо обладают предопределенной последовательностью, либо, возможно, их селектируют из совокупности случайных полипептидных линкерных последовательностей посредством оценки способности содержащих линкер полипептидов срп10 с перенесенной СГОК3 связывать человеческий сывороточный альбумин. Способы оптимизации проводят параллельно и/или повторно. В способах как параллельной, так и повторной оптимизации (например, созревания аффинности) применяют способы селекции, применимые для оптимизации связывающих свойств полипептидов, как описано ниже и/или как известно в данной области техники.
Связывание человеческого сывороточного альбумина полипептидом (полипептидами) срп10 с перенесенными СОК, представляющего СГОК3 йАЬ7Ь14, оптимизируют посредством способов мутагенеза, возможно, в комбинации со способами параллельной и/или повторной селекции, как описано ниже, и/или, в противном случае, как известно в данной области техники. Полипептидные домены каркаса срп10, окружающие перенесенную полипептидную последовательность СГОК3 йАЬ7Ь14, подвергают случайному и/или ЫЫК-мутагенезу, проводимому, как описано ниже. Такой мутагенез проводят пределах полипептидной последовательности срп10 в отношении не перенесенных аминокислотных остатков и, возможно, рандомизируют для разработки новых или улучшенных полипептидов, связывающих человеческий сывороточный альбумин. Возможно, полипептидный домен СГОК3 йАЬ7Ь14, представленный в полипептиде срп10 с перенесенной СЭК3, подвергают мутагенезу, посредством, например, случайного мутагенеза, ЫЫК-мутагенеза, 1оок !ЬгоидЬ мутагенеза и/или другого принятого в данной области техники способа. Возможно, для проведения таких способов мутагенеза используют ПЦР, что приводит к формированию разнообразия последовательностей в целевых последовательностях в полипептидах срп10 с перенесенной СГОК3. Такие способы сходны с описанными ниже для образования библиотек йАЬ. В дополнение к случайным и/или 1оок !ЬгоидЬ способам мутагенеза используют направленный мутагенез целевых аминокислотных остатков, где по структурной информации установлено, что определенные аминокислотные остатки имеют критическое значение для связывания человеческого сывороточного альбумина.
Полипептиды срп10, содержащие перенесенную последовательность СГОК3 йАЬ7Ь14, конструиро- 120 020464 ванные, как описано выше, подвергают способам параллельной и/или повторной селекции для идентификации тех полипептидов срп10, которые оптимизированы для связывания человеческого сывороточного альбумина. Например, после получения библиотеки последовательностей полипептидов срп10 с перенесенной СЭК3 ЗАЪ7Ь14, эту библиотеку таких полипептидов представляют на фаге и подвергают нескольким раундам селекции, требующим связывания сывороточного альбумина и/или пролиферации, как описано ниже для селекции ЗАЪ, связывающих сывороточный альбумин, из библиотек ЗАЪ. Возможно, селекцию проводят против сывороточного альбумина, иммобилизированного на иммунологических пробирках или против биотинилированного сывороточного альбумина в растворе. Возможно, аффинность связывания определяют с применением поверхностного плазмонного резонанса (8РК) и В1асоге (Каг188оп е! а1., 1991), с применением системы В1асоге (Ирр8а1а, ЕлуеЗеп), где для полностью оптимизированных мономерных и/или олигомерных полипептидов, имеющих происхождение от срп10, в идеальном случае достигают значений КЗ аффинности связывания с человеческим сывороточным альбумином в нМдиапазоне или менее.
После идентификации мономерных полипептидов, имеющих происхождение от срп10, связывающих человеческий сывороточный альбумин, свойства связывания человеческого альбумина таких исходных мономеров могут быть дополнительно усилены посредством комбинирования таких мономеров с другими мономерами, с последующим дополнительным мутагенезом и/или селекцией, образуя посредством этого композицию олигомерного срп10/ОгоЕ8, обладающую специфичной аффинностью в отношении человеческого сывороточного альбумина. После идентификации композиции олигомерного срп10/ОгоЕ8, обладающей аффинностью в отношении человеческого сывороточного альбумина, такие полипептиды затем используют для образования композиций лигандов с двойной специфичностью любым из способов, описанных ниже.
Пример 25. Образование лиганда с двойной специфичностью, содержащего неиммуноглобулиновый каркас срп10, связывающий сывороточный альбумин, посредством селекции группировок, связывающих человеческий сывороточный альбумин.
Нативный полипептид срп10 подвергают методикам селекции в библиотеке и, возможно, созревания аффинности, для получения молекул с неиммуноглобулиновым каркасом срп10, связывающих человеческий сывороточный альбумин, для использования в лигандах с двойной специфичностью по изобретению.
Способность нативного полипептида срп10 связывать человеческий сывороточный альбумин изначально оценивают исследованием В1асоге, как описано выше. После выявлении низкой аффинности полипептида срп10 в отношении человеческого сывороточного альбумина (например, значения КЗ в мкМдиапазоне или выше) или ее отсутствия, по меньшей мере одну из нескольких стратегий используют для придания свойств связывания человеческого сывороточного альбумина полипептиду срп10, включая один или более из следующих способов, способствующих аффинности связывания.
Связывания человеческого сывороточного альбумина полипептидом (полипептидами) с каркасом срп10 достигают и оптимизируют посредством способов мутагенеза, возможно, в комбинации со способами параллельной и/или повторной селекции, как описано ниже, и/или, в противном случае, как известно в данной области техники. Домены полипептида с каркасом срп10 подвергают случайному и/или ЫЫК-мутагенезу, проводимому, как описано ниже. Такой мутагенез проводят в отношении всего полипептида срп10 или в отношении определенных последовательностей в пределах полипептида срп10, включая аминокислотные остатки подвижных петель в положениях 19-27, и, возможно, рандомизируют для разработки новых или улучшенных полипептидов, связывающих человеческий сывороточный альбумин. Возможно, для проведения таких способов мутагенеза используют ПЦР, что приводит к формированию разнообразия последовательностей в целевых последовательностях в полипептидах срп10. (Такие способы сходны с описанными ниже для образования библиотек ЗАЪ.) В дополнение к случайным способам мутагенеза используют направленный мутагенез целевых аминокислотных остатков, где по структурной информации установлено, что определенные аминокислотные остатки полипептидов срп10 имеют критическое значение для связывания человеческого сывороточного альбумина.
Полипептиды срп10, конструированные, как описано выше, подвергают способам параллельной и/или повторной селекции для идентификации тех полипептидов срп10, которые оптимизированы для связывания человеческого сывороточного альбумина. Например, после получения библиотеки мутированных последовательностей полипептидов срп10, указанную библиотеку полипептидов представляют на фаге и подвергают нескольким раундам селекции, требующим связывания сывороточного альбумина и/или пролиферации, как описано ниже для селекции ЗАЪ, связывающих сывороточный альбумин, из библиотек ЗАЪ. Возможно, селекцию проводят против сывороточного альбумина, иммобилизированного на иммунологических пробирках или против биотинилированного сывороточного альбумина в растворе. Возможно, аффинность связывания определяют с применением поверхностного плазмонного резонанса (8РК) и В1асоге (Каг188оп е! а1., 1991), с применением системы В1асоге (Ирр8а1а, 5>\уеЗеп), где для полностью оптимизированных мономерных и/или олигомерных полипептидов, имеющих происхождение от срп10, в идеальном случае достигают значений КЗ аффинности связывания с человеческим сывороточным альбумином в нМ-диапазоне или менее.
- 121 020464
После идентификации мономерных полипептидов, имеющих происхождение от срп10, связывающих человеческий сывороточный альбумин, свойства связывания человеческого альбумина таких исходных мономеров могут быть дополнительно усилены посредством комбинирования таких мономеров с другими мономерами, с последующим дополнительным мутагенезом и/или селекцией, образуя посредством этого композицию олигомерного српЮ/СгоРз, обладающую специфичной аффинностью в отношении человеческого сывороточного альбумина. После идентификации композиции олигомерного срη10/С^оΕз. обладающей аффинностью в отношении человеческого сывороточного альбумина, такие полипептиды затем используют для образования композиций лигандов с двойной специфичностью любым из способов, описанных ниже.
Полипептиды СгоИ
ΟγθΕ1 является ключевым молекулярным шапероном у Е.соП, состоящим из 14 субъединиц, каждая из которых имеет молекулярную массу приблизительно 57,5 кДа, расположенных в двух семичленных кольцах (Βπιίβ е! а1. 1994 йгос. №!1. Асай. δα. 90: 3978-3982). В кольцевой системе СгоИ имеется большая полость, и широко распространено мнение о том, что полость необходима для эффективного фолдинга белков. Для оптимальной активности необходим кошаперон, ΟιυΕδ, состоящий из семичленного кольца из субъединиц, массой 10 кДа (Нип! е! а1. 1996 №1иге 379: 37-45). В каждой субъединице СгсЬз использована подвижная петля с консервативным гидрофобным трипептидом для взаимодействия с СгоΕ1 (Ьапйгу е! а1. 1993 №Циге 364: 255-258). Подвижные петли в большинстве случаев имеют длину менее 16 аминокислот и проходят превращение из неупорядоченных петель в β-шпильки одновременно со связыванием апикальных доменов ΟγόΕ1 (ЪПехутакег е! а1. 2001 ί. Ею1. СПет. 276: 31257-31264). Для активности комплекса С^оΕ1/С^оΕз необходим аденозинтрифосфат (АТФ). СгоИ и СгсЬз широко распространены у всех организмов, и их часто называют молекулами-шаперонинами (срп), срп10 и срп10 соответственно.
ΟγθΕ1 является аллостерическим белком. Аллостерические белки являются особым классом олигомерных белков, которые сменяют две или более различные трехмерные структуры в процессе связывания лигандов и субстратов. Аллостерические белки часто вовлечены в контрольные процессы в биологии или там, где происходит взаимное превращение механической и физико-химической энергии. Роль АТФ состоит в стимуляции этого аллостерического изменения, что вызывает переход ΟγόΕ1 из состояния, прочно связывающего денатурированные белки, в состояние, слабо связывающее денатурированные белки. Ко-шаперон, ΟγθΕ8, содействует этому процессу, способствуя состоянию слабого связывания. Он может также действовать в качестве кэпа, блокируя полость СгоИ. Кроме того, его связывание с СгоИ, вероятно, непосредственно конкурирует со связыванием денатурированных субстратов. Конечный результат состоит в том, что связывание С^оΕз и АТФ с СгоИ со связанным субстратом в его денатурированной форме приводит к высвобождению денатурированного субстрата либо в полость, либо в раствор, где он может пройти рефолдинг.
СгсЫ и С^оΕз представляют собой полипептидные каркасы, которые могут быть использованы для мультимеризации мономерных полипептидов или белковых доменов с образованием мультимерных белков с любой желаемой характеристикой. Как также описано ниже, например, для композиций авимеров, мультимеризация полипептидных мономеров часто является желательной.
Для многих белков необходимо содействие молекулярных шаперонов при их фолдинге ш У1уо или рефолдинге ш уйго с высоким выходом. Молекулярные шапероны являются белками, которые часто имеют большие размеры и для их функционирования необходим источник энергии, такой как АТФ. Ключевым молекулярным шапероном у Е.соП является ΟγόΕ1, состоящий из 14 субъединиц, каждая из которых имеет молекулярную массу приблизительно 57,5 кДа, расположенных в двух семичленных кольцах. В кольцевой системе ΟγόΕ1 имеется большая полость, и широко распространено мнение о том, что полость необходима для для эффективного фолдинга белков. Для оптимальной активности необходим кошаперон, СгоВз, состоящий из семичленного кольца из субъединиц, массой 10 кДа. Для активности комплекса &όΕ1/&όΕ3 необходим источник энергии, АТФ.
Минишапероны были подробно описаны в других публикациях (см. международную заявку на патент \Ο 99/05163, описание которой полностью включено сюда посредством ссылки). Полипептидыминишапероны обладают активностью шаперонов в мономерной форме и не требуют энергии в форме АТФ. Определенные фрагменты апикального домена СгоБ1 длиной приблизительно 143-186 аминокислотных остатков, обладают активностью молекулярных шаперонов в отношении белков либо в растворе в мономерных условиях, либо в монодисперсной форме и прикрепленные к подложке.
Каркасы СгоБ1 и СгоВз делают возможной олигомеризацию полипептидов с образованием функциональных белковых олигомеров, обладающих активностями, превышающими активности рекомбинантных мономерных полипептидов. Срп10 является широко распространенным компонентом шаперониновой системы срп10/срп10. Примеры срп10 включают бактериальный СгоВз и Ср31 бактериофага Т4 и также перечислены ниже. Другие члены семейства срп10 будут известны специалистам в данной области техники.
Субъединицы белкового каркаса объединяются с образованием белкового каркаса. Такой каркас может иметь любую форму и содержать любое число субъединиц. Для определенных воплощений ΟγόΕ1
- 122 020464 и ОгоЕк каркас содержит от 2 до 20 субъединиц, от 5 до 15 субъединиц или приблизительно 10 субъединиц. Структура встречающихся в природе каркасов членов семейства срп10 содержит семь субъединиц в форме семичленного кольца или цикла. Таким образом, в определенных воплощениях каркас представляет собой семичленное кольцо.
Гетерологичная аминокислотная последовательность, которая может представлять собой, например, домен СИК3, имеющий происхождение от антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, обладающий аффинностью в отношении белка-мишени (например, человеческого сывороточного альбумина), или, возможно, которая может представлять собой отдельный остаток, такой как цистеин, делающий возможным связывание с каркасом дополнительных групп или молекул, может быть введена в последовательность олигомеризуемой субъединицы белкового каркаса таким образом, что как Ν-, так и С-конец полипептидного мономера образованы последовательностью олигомеризуемой субъединицы белкового каркаса. Таким образом, гетерологичный полипептид включают в последовательность субъединицы каркаса, например, замещением одной или более его аминокислот.
Известно, что субъединицы срп10 обладают подвижной петлей в их структуре. Подвижная петля расположена между 15 и 34 аминокислотами, предпочтительно между 16 и 33 аминокислотами, в последовательности ОгоЕк Е.соН и в эквивалентных положениях других членов семейства срп10. Подвижная петля Ор31 Т4 расположена между 22 и 45, предпочтительно 23 и 44 остатками. Возможно, гетерологичный полипептид может быть введен замещением всей подвижной петли полипептида семейства срп10 или ее части. Там, где субъединица каркаса представляет собой полипептид семейства срп10, гетерологичная последовательность может, сверх того, быть включена в его Ν- или С-конец или в положения, эквивалентные β-шпильке свода полипептидов семейства срп10. Это положение расположено между 54 и 67, предпочтительно 55 и 66, и предпочтительно 59 и 61, положениями Ор31 бактериофага Т4 или между 43 и 63, предпочтительно 44 и 62, преимущественно 50 и 53, положениями ОгоЕк Е.соН.
Возможно, полипептид может быть введен в Ν- или С-конец субъединицы каркаса совместно с циклической перестановкой самой субъединицы. Циклическая перестановка описана в ОгаТ апб δсΗасΗтап, РNΛδ(υδΛ) 1996, 93: 11591. По существу, полипептид циркуляризуют слиянием существующих Νи С-концов и расщеплением полипептидной цепи в другом месте с образованием новых Ν- и С-концов. В предпочтительном воплощении изобретения геторологичный полипептид может быть включен в Νи/или С-конец, образованные после циклической перестановки. Место образования новых концов может быть выбрано в соответствии с желаемыми свойствами и может включать подвижную петлю и/или βшпильку свода.
Преимущественно гетерологичные последовательности, которые могут быть одинаковыми или разными, могут быть введены в более чем одно из положений и/или в положения, отличающиеся от определенных выше положений в пределах субъединицы белкового каркаса. Таким образом, каждая субъединица может содержать два или более гетерологичных полипептида, представляемые на каркасе при их объединении. Гетерологичные полипептиды могут быть представлены на субъединице каркаса в свободной или ограниченной форме, в зависимости от степени свободы, предоставляемой местом введения в последовательность каркаса. Например, изменение длины последовательностей, окружающих подвижную петлю или петлю β-шпильки в каркасе, будет модулировать степень ограничения любого введенного туда гетерологичного полипептида.
Композиции ОгоЕ1 и/или ОгоЕк могут также содержать полипептидный олигомер, включающий два или более мономера. Олигомер может иметь конфигурацию гетероолигомера, содержащего две или более различные аминокислотные последовательности, введенные в каркас, или гомоолигоиера, где введенные в каркас последовательности одинаковы.
Мономеры, составляющие олигомер, могут быть ковалентно перекрестно связаны друг с другом. Перекрестное связывание может быть осуществлено рекомбинантными способами таким образом, что мономеры с самого начала экспрессируют в виде олигомера; альтернативно, перекрестное связывание может быть проведено в Сук остатках каркаса. Например, для перекрестного связывания субъединиц каркаса могут быть использованы уникальные Сук остатки, введенные между 50 и 53 положениями каркаса ОгоЕк, или эквивалентные положения других членов семейства срп10.
Природа гетерологичного полипептида, введенного в субъединицу каркаса, может быть выбрана по желанию. В определенных воплощениях синтезируют каркасные белки, представляющие антитела или их фрагменты, такие как ксР\', природные или камелизированные домены УН или фрагменты СИК3 УН.
В типичном воплощении полипептидный мономер, способный к олигомеризации, может быть изготовлен, как описано выше и/или как изложено в \УО 00/69907, полностью включенной сюда посредством ссылки. Способ такого изготовления может включать введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный полипептид, в последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую субъединицу олигомеризуемого белкового каркаса, включение полученной нуклеиновой кислоты в вектор экспрессии и экспрессию нуклеиновой кислоты с получением полипептидных мономеров. Возможно, полипептидный олигомер может затем быть получен способом, включающим возможность объединения полипептидных мономеров, полученных, как описано выше, с образованием олигомера. В опреде- 123 020464 ленных воплощениях мономеры перекрестно связаны с образованием олигомера.
В определенных воплощениях каркасный полипептид основан на членах семейства срп10/нкр10.
таких как СгоЕк или его аналог. Особенно предпочтительным аналогам является полипептид Ср31 Т4. Аналоги СгоЕк, включая Ср31. обладают подвижной петлей (нип!. Ι.Ρ.. е! а1. (1997). Се11 90. 361-371; Ьапбгу. З.1.. е! а1. (1996). Ргос. Ν!1. Асай. Зс1. иЗА 93. 11622-11627). которая может быть включена или замещена для слияния гетерологичного полипептида с каркасом.
Гомологи срп10 широко распространены среди животных, растений и бактерий. Например, поиск в СепВапк указывает на то. что гомологи срп10 известны у следующих видов:
АсНпоЬасШиз асНпотусе1етсотНапз;
р1еигорпеитогнае; Аеготопаз за1тот'ск1а;
АсНпоЬасШиз
АдгоЬас1епит
1ите/ас1епз; АНосЬготаНит у/позит; АтоеЬа ргсйеиз зутЫоНс Ьаскзпит; Αηυί/βχ аеоНсиз; АгаЫс1орз18 1ЬаНапа; ВасШиз зр; ВасШиз з1еаго1ЬегторЫ1из; ВасШиз зиЫШз; ВапопеНа Ьепзе1ае; Вогс1е(е11а рег1изз1з; ВоггеПа ЬигдЬог/еп; ВгисеНа аЬопиз; ВисЬпега арЫсНсо1а; ВигкЬо1с1епа серас/а; ВигкЬоМепа У1е1пат1епз1з; Сатру1оЬас1ег]е/ип1; Саи1оЬас1ег сгезсепП/з; СЫатусНа тигМагит; СЫатусНа ПъсЬотаНз; СЫатуЬорЬНа рпеитоп/ае; С1оз1псНит асе&ЬЫуНсит; С1оз1псНит регМпдепз; С1озМсНит 1Ьегтосе11ит; соНрЬаде Т- Сошдпа гиттапНит; СуапеНе СуапорЬога рагадоха; ЕЫИсЫа сат'з; ЕЫИсЫа сЬаЯеепз/з; ЕЬгНсЫа еда/; ЕЫИсЫа рЬадосуПэрЬНа; ЕЫИсЫа пзНсН; ЕЬгНсЫа зеппе1зи; ЕЬгНсЫа зр 'НСЕ адеп1;
ЕЫегоЬас1ег аегодепез; ЕЫегоЬас1ег адд1отегапз; Еп1егоЬас1ег атЫдепиз;
ЕЫегоЬаЫег азЬипае; ЕЫегоЬас1ег дегдоу/ае; ЕЫегоЬаЫег кНегтесНиз; ЕплПЫа арЫсНсо1а; ЕпмЫа саго1оуога; ЕпмЫа ЬегЫсо1а; ЕзсЬепсЫа соН; Ргапс/зеНа 1и1агепз1з; 61усте тах; НаеторЬНиз дисгеу1; НаеторЬНиз /пПиетае Рд;
НеНсоЬас1ег ру1оп; Но1озрога оЫиза; Ното зар/епз; К1еЬз/е11а огпНЫпо1уНса;
К1еЬз/е11а оху{оса; К1еЬз/е11а р1апНсо1а; К1еЬз/е11а рпеитоЫае; Ьас1оЬасН1из Ье1уеНсНз; Ьас(оЬасШиЗ 7еае; Ьас1ососсиз 1асНз; ЬашзоЫа /п1гасе11и1апз;
Ьер1озр/га /Ыеггодапз; Ме1Ьу1оуогиз зр з1га/'п 33; МусоЬас1епит ау/ит;
МусоЬас1епит ау/ит зиЬзр аи/'ит; МусоЬас1епит ау/ит зиЬзр рага1иЬегси1о8/5;
МусоЬас1епит 1ергае; МусоЬаЫепит ЫЬегси/оз/з; Мусор1азта депПаНит;
Мусор1азта рпеитоЫае; Мугиз регз/сае рптагу епдозутЫоЫ; Ме/ззепа допоггЬоеае; ОзсШак/па зр ΝΚΒΟ,- РаЫоеа апапаз; Раз1еиге11а тиНос/да;
РогрЬуготопаз д/пд/уаНз; Рзеидотопаз аегидтоза; Рзеис1отопаз аегид'тоза;
Рзеидотопаз риНда; РаНиз поп/ед/сиз; РаНиз поп/ед/сиз; РЫгоЫит 1едиттозагит; РЬодоЬаЫег сарзи1а(из; РЬодоЬаЫег зрЬаего/дез; РЬодо1Ьегтиз таппиз; Р/скеНз/а ргои/агекП; Р/скеНз/а пскеНзН; ЗассЬаготусез сегеу/з/ае;
ЗеггаНа Псапа; ЗеггаНа тагсезсепз; ЗеггаНа гиЫдаеа; ЗтогЫгоЫит теШоН;
ЗНорЬНиз огугае ргтс/ра! епдозутЫоЫ; 31епо1горЬотопаз таПорЫНа;
ЗПеркзсоссиз рпеитогиае; 31гер1отусез а1Ьиз; ЗНерк/тусез соеНсо1ог;
ЗНерк/тусез соеНсо1ог; 31гер1отусез Ну/дапз; ЗупесЬососсиз зр; ЗупесЬососсиз уи1сапиз; ЗупесЬосузНз зр; ТЬегтоапаегоЬас(ег ЬгоскП; ТЬегтокэда тап'Нта;
ТЬегтиз адиаНсиз; Тгеропета раШс!ит; \Л/о1ЬасЫа зр; Хутотопаз тоЫНз.
Преимущество субъединиц семейства срп10 состоит в том. что они обладают подвижной петлей, обеспечивающей активность природного шаперонина по фолдингу белков. которая может быть удалена. не затрагивая каркас. Срп10 с удаленной подвижной петлей не имеет биологической активности, что делает его преимущественно инертным каркасом, минимизируя, таким образом. любые потенциально вредные эффекты.
Введение подходящего биологически активного полипептида может придать биологическую активность (например, связывание человеческого сывороточного альбумина) новому полипептиду, образованному таким образом. Действительно, биологическая активность введенного полипептида может быть улучшена введением биологически активного полипептида в каркас. в особенности, например, при применении мутагенеза и основанных на аффинности способов скрининга, как описано здесь. для оптимизации связывания белка-мишени полипептидом, представленным на каркасе.
- 124 020464
Возможны альтернативные места для введения пептидов. Преимущественным вариантом является введение в положение, эквивалентное β-шпильке свода СгоЕз. Это включает замещение С1и- в Ср31 желаемым полипептидом. Аминокислотная последовательность представляет собой Рго (59)-С1и(60)С1у(61). На уровне ДНК ее подходящим образом превращают в сайт Бта1 (ССС:ССС), кодирующий РгоС1у, оставляя сайт рестрикции с тупыми концами для введения пептида в виде фрагмента ДНК. Сходным образом, введение может быть осуществлено между 50 и 53 положениями последовательности СгоЕз и в эквивалентных положениях других членов семейства срп10. Альтернативно, может быть применена инвертированная ПЦР для представления пептида на противоположной стороне каркаса.
Члены семейства молекул шаперонинов срп60/Нзр60 могут также быть использованы в качестве каркасов. Например, может быть использован тетрадекамерный бактериальный шаперонин СгоЕ1. В определенных воплощениях гетерологичные полипептиды будут вводить между 191 и 376 положениями, в частности, между 197 и 333 положениями (представленными конструированным сайтом БасП и уникальным сайтом С1а Ι) для сохранения интактной шарнирной области между экваториальным и апикальным доменами для придания подвижности введенному полипептиду. Выбор каркаса может зависеть от предполагаемого применения олигомера (или лиганда с двойной специфичностью, включающего такой олигомер и/или имеющего происхождение от такого олигомера): например, если олигомер предназначен для целей вакцинации, то применение иммуногенного каркаса, такого как имеющие происхождение от МусоЬас1егшт 1иЬегси1оз1з, особенно преимущественно и придает адъювантный эффект.
Также могут быть использованы мутанты молекул срп60. Например, однокольцевой мутант СгоЕ1 (СгоЕ1БК1) содержит четыре точковые мутации, затрагивающими главное соединение между двумя кольцами СгоЕ1 (К452Е, Е461А, Б463А и У464А) и не имеет функциональной активности ίη νίΙΐΌ, поскольку он свободно связывает СгоЕз. СгоЕ1БК2 имеет дополнительную мутацию С1и191-С1у, которая восстанавливает активность, снижая аффинность в отношении СгоЕз. Оба эти мутанта образуют кольцевые структуры и будут подходящими для использования в качестве каркасов.
Определенные встречающиеся в природе каркасные молекулы являются продуктами бактериофагов: по этой причине антитела к таким каркасам редко встречаются в природе. Это улучшает применение каркасных слитых белков в качестве вакцинных агентов. Ср31 Т4 с удаленной петлей не имеет биологической активности (за исключением доминантно-негативной или внутриклеточной вакцины против бактериофага Т4), минимизируя, таким образом, вредные эффекты на хозяина. Тем не менее, введение подходящих последовательностей, кодирующих полипептиды, может придавать биологическую активность новым белкам. Действительно, биологическая активность может быть улучшена введением в каркасный белок.
Аффинность антител или фрагментов антител в отношении антигенов (например, человеческого сывороточного альбумина) может быть увеличена олигомеризацией по настоящему изобретению. Фрагменты антител могут представлять собой такие фрагменты, как фрагменты Еу, ЕаЬ и Е(аЬ')2 или любые их производные, такие как одноцепочечные фрагменты Еу. Антитела или фрагменты антител могут быть нерекомбинантными, рекомбинантными или гуманизированными. Антитело может быть любого изотипа иммуноглобулинов, например ЦС, ЦМ и т.п.
В определенных воплощениях фрагменты антител могут представлять собой камелизированные домены УН. Известно, что основные межмолекулярные взаимодействия между антителами и их когнатными антигенами опосредованы через УН СЭК3.
Применение каркасных молекул СгоЕ1 и/или СгоЕз (срп10), как описано ниже и как известно в данной области техники, предусматривает олигомеризацию доменов УН или доменов УН СЭК3 с образованием олигомера с высокой аффинностью. В такой олигомер могут быть включены два или более олигомера; в олигомер на основании каркаса срп10 могут быть включены до 7 доменов с образованием гептамерной олигомерной молекулы (гептатела), связывающей белок-мишень (например, человеческий сывороточный альбумин).
С целью придания и/или оптимизации аффинности определенных каркасных полипептидов/олигомеров в отношении белка-мишени (например, человеческого сывороточного альбумина) в гетерологичные полипептиды, введенные в каркасные полипептиды, может быть внесено разнообразие таким образом, что специфичность и/или аффинность таких полипептидов/олигомеров в отношении их лигандов/субстратов может быть исследована и/или картирована. Могут быть получены варианты одной и той же петли, или разработан набор разных стандартных петель для быстрой оценки аффинности нового полипептида в отношении белка-мишени (например, человеческого сывороточного альбумина). Варианты могут быть получены рандомизацией последовательностей в соответствии с известными методиками, такими как ПЦР. Перед введением в белковые каркасы они могут быть подвергнуты селекции по протоколу скрининга, такого как фаговый дисплей.
Олигомеризуемый каркас, как он назван здесь, представляет собой полипептид, способный к олигомеризации, или который может быть олигомеризован, с образованием каркаса, и с которым может быть слит гетерологичный полипептид, предпочтительно ковалентно, без устранения способностей к олигомеризации. Таким образом, он представляет каркас, применением которого полипептиды могут быть упорядочены в виде мультимеров по настоящему изобретению. Возможно, части полипептида ди- 125 020464 кого типа, от которого каркас имеет происхождение, могут быть удалены, например, замещением гетерологичным полипептидом, который должен быть представлен на каркасе.
Мономеры представляют собой полипептиды, обладающие потенциалом к олигомеризации или к тому, чтобы быть олигомеризованными. Олигомеризация может быть обусловлена включением в полипептид субъединицы олигомеризуемого каркаса, которая, при комбинировании с другими субъединицами каркаса, будет олигомеризоваться с ними. Возможно, олигомеризация может быть обусловлена применением принятых в данной области техники линкеров с целью соединения мономеров друг с другом.
При использовании здесь олигомер является синонимом полимера и мультимера и использован для обозначения того, что рассматриваемый объект не является мономерным. Таким образом, олигомерные полипептиды содержат по меньшей мере две мономерные единицы, соединенные друг с другом ковалентно или нековалентно. Число используемых мономерных единиц будет зависеть от предполагаемого применения олигомера, и может составлять от 2 до 20 или более. Возможно, оно составляет от 5 до 10 и предпочтительно приблизительно 7.
Фаговый дисплей
Технология фагового дисплея оказалась крайне полезной в биологических исследованиях. Она делает возможной селекцию лигандов из больших библиотек молекул. В каркасной технологии возможности фагового дисплея могут быть использованы особенно преимущественным образом. Молекулы срп10 могут быть представлены в виде мономеров на бактериофагах Гй, по аналогии с дисплеем одноцепочечных молекул Ρν. Библиотеки вставок (на место высокоподвижной петли, например, с использованием полипептидов СЭК3, имеющих происхождение от антител, связывающих человеческий сывороточный альбумин) конструируют стандартными способами и проводят скрининг полученных библиотек на интересующие молекулы. Такая селекция основана на аффинности. После идентификации молекул, обладающих аффинностью в отношении белка-мишени (например, человеческого сывороточного альбумина), возможно, посредством одного или более повторений мутагенеза, экспрессии (белки ОгоЕ1, -57,5 кДа ОгоЕ1 и -10 кДа ОгоЕк могут быть экспрессированы и очищены, как описано ранее (СЬа!еШег е1 а1. 1998, Ργόο. №й1. Асай. 8с1. И8А 95: 9861-9866; Согга1ек апй РегкЫ, 1996, 1: 265-273), или любым способом, принятым в данной области техники) и скрининга аффинности, могут быть олигомеризованы, используя посредством этого преимущество авидности таких молекул. Возможно, определенные селектированные мономеры будут способны к перекрестному связыванию или олигомеризации их партнеров по связыванию.
Фибронектин
Пример 26. Образование лиганда с двойной специфичностью, содержащего неиммуноглобулиновый фибронектиновый каркас, связывающий сывороточный альбумин, посредством СЭК-переноса.
Домены СОК йАЬ7114 используют для конструирования полипептида с неиммуноглобулиновым фибронектиновым каркасом, связывающего человеческий сывороточный альбумин, следующим образом. Последовательности СГОК1 (НА8ОГО!О8ОЕ8; 8ЕО ГО ΝΟ.:__), СГОК2 (ГОК88ЕС)8; 8ЕО ГО ΝΟ.:_) и СГОК3 (АООААЕ-ΡΕΤ; 8ЕЦ ГО ΝΟ.:_) йАЬ7114 переносят в 10Рп3 вместо аминокислотных остатков нативного 10Рп3 в положениях 21-31 (петля ВС), 51-56 (петля ЭЕ) и 76-88 (петля РО) соответственно. Проводят анализ связывания в реальном времени посредством В1асоте для оценки специфичного связывания человеческого сывороточного альбумина и иммобилизированного полипептида, имеющего происхождение от фибронектина, содержащего СГОК-домены йАЬ7114 против человеческого сывороточного альбумина (специалисту в данной области техники будет ясно, что аффинность связывания может быть оценена с применением любого подходящего способа, включая, например, осаждение меченного человеческого сывороточного альбумина, конкурентное исследование В1асоте и т.п.). При выявлении низкой аффинности в отношении человеческого сывороточного альбумина (например, значения Κ в мкМ-диапазоне или выше) или ее отсутствия, по меньшей мере одну из нескольких стратегий используют для улучшения свойств связывания человеческого сывороточного альбумина фибронектинового полипептида с перенесенными СОК, включая любой из следующих способов, способствующих аффинности связывания.
Длину (длины) СГОК-перенесенных областей фибронектинового полипептида, контактирующим с растворителем петлевым областям в полипептиде нативного фибронектина, адаптируют применением линкерных полипептидов. Например, девять аминокислотных остатков пептидной последовательности СОК йАЬ7114 увеличивают по длине до 13 аминокислотных остатков с применением аминокислотных линкеров, состоящих из, например, от нуля до четырех остатков по длине, расположенных на одной из Ν- или С-концевых частей последовательности полипептида СГОК3 йАЬ7114 или на обеих концевых частях, достигая посредством этого общей длины перенесенной пептидной последовательности в 13 аминокислот в пределах СГОК3-перенесенного домена, соответствующего петле РО последовательности нативного фибронектина. Такое применение линкерного полипептида (полипептидов), возможно, комбинируют с мутагенезом линкерных последовательностей, последовательностей СОК и/или полипептидных последовательностей фибронектина, не являющихся последовательностями СОК (например, с применением способов мутагенной оптимизации, как описано ниже), для улучшения способности фибронектиновых полипептидов с перенесенными СОК связывать человеческий сывороточный альбумин (например, посредством оптимизации как последовательностей СОК, так и фибронектиновых последовательностей,
- 126 020464 в пределах фибронектиновых полипептидов с перенесенными СОК). Полипептидные линкеры, используемые с этой целью либо обладают предопределенной последовательностью, либо, возможно, их селектируют из совокупности случайных полипептидных линкерных последовательностей посредством оценки способности содержащих линкер фибронектиновых полипептидов с перенесенными СОК связывать человеческий сывороточный альбумин. Способы оптимизации проводят параллельно и/или повторно. В способах как параллельной, так и повторной оптимизации (например, созревания аффинности) применяют способы селекции, как описано ниже и/или как известно в данной области техники, применимые для оптимизации связывающих свойств полипептидов.
Связывание человеческого сывороточного альбумина фибронектиновым полипептидом (полипептидами) с перенесенными СОК, представляющих СОК ЛΑЪ7Ь14, оптимизируют посредством мутагенеза, возможно, в комбинации со способами параллельной и/или повторной селекции, как описано ниже, и/или, в противном случае, как известно в данной области техники. Полипептидные домены каркаса 10Ρη3, окружающие перенесенные полипептидные последовательности СОК ЛΑЪ7Ь14, подвергают случайному и/или МИК-мутагенезу, проводимому, как описано ниже. Такой мутагенез проводят в пределах полипептидной последовательности 10Ρη3 в отношении 1-9, 44-50, 61-54, 82-94 аминокислот (края бетаскладчатостей); 19, 21, 30-46 (четных), 79-65 (нечетных) аминокислот (контактирующие с растворителем поверхности обеих бета-складчатостей); и 14-16 и 36-45 аминокислот (не-СЭК-подобные контактирующие с растворителем петли и бета-изгибы); и, возможно, рандомизируют для разработки новых или улучшенных полипептидов, связывающих человеческий сывороточный альбумин. Возможно, полипептидные домены СОК ЛΑЪ7Ь14, представленные в фибронектиновом полипептиде с перенесенными СОК, подвергают мутагенезу посредством, например, случайного мутагенеза, NNΚ-мутагенеза, 1οο1< !ЬгоидЬ мутагенеза и/или другого принятого в данной области техники способа. Возможно, для проведения таких способов мутагенеза используют ПЦР, что приводит к формированию разнообразия последовательностей в целевых последовательностях в фибронектиновых полипептидах с перенесенными СОК. Такие способы сходны с описанными ниже для образования библиотек ЛΑЪ. В дополнение к случайным и/или 1οο1< !ЬгоидЬ способам мутагенеза используют направленный мутагенез целевых аминокислотных остатков, где по структурной информации установлено, что определенные аминокислотные остатки имеют критическое значение для связывания человеческого сывороточного альбумина.
Фибронектиновые полипептиды, содержащие перенесенные последовательности СОК ЛΑЪ7Ь14, конструированные, как описано выше, подвергают способам параллельной и/или повторной селекции для идентификации тех фибронектиновых полипептидов, которые оптимизированы для связывания человеческого сывороточного альбумина. Например, после получения библиотеки последовательностей фибронектиновых полипептидов с перенесенными СОК, эту библиотеку таких полипептидов представляют на фаге и подвергают нескольким раундам селекции, требующим связывания сывороточного альбумина и/или пролиферации, как описано ниже для селекции ЛΑЪ, связывающих сывороточный альбумин, из библиотек ЛΑЪ. Возможно, селекцию проводят против сывороточного альбумина, иммобилизированного на иммунологических пробирках, или против биотинилированного сывороточного альбумина в растворе. Возможно, аффинность связывания определяют с применением поверхностного плазмонного резонанса (δΡ^) и Β^асο^е (Κа^ίззοη е! а1., 1991), с применением системы Β^асο^е (^рзаШ, δγеЛеη). где для полностью оптимизированных полипептидов, имеющих происхождение от фибронектина, в идеальном случае достигают значений КЛ аффинности связывания с человеческим сывороточным альбумином в нМ-диапазоне или менее. После идентификации полипептидов, имеющих происхождение от фибронектина, связывающих человеческий сывороточный альбумин, такие полипептиды затем используют для образования композиций лигандов с двойной специфичностью любым из способов, описанных ниже.
Пример 27. Образование лиганда с двойной специфичностью, содержащего неиммуноглобулиновый фибронектиновый каркас, связывающий сывороточный альбумин, посредством селекции группировок, связывающих сывороточный альбумин.
Белок нативного фибронектина, конкретно, полипептид фибронектина 10Ρη3, подвергают методикам селекции в библиотеке и, возможно, созревания аффинности для получения молекул с неиммуноглобулиновым фибронектиновым каркасом, связывающих человеческий сывороточный альбумин, для использования в лигандах с двойной специфичностью по изобретению.
Проводят анализ связывания в реальном времени посредством Β^асο^е для оценки специфичного связывания человеческого сывороточного альбумина и иммобилизированного нативного фибронектина и/или полипептида, имеющего происхождение от фибронектина. После выявления низкой аффинности фибронектинового полипептида в отношении человеческого сывороточного альбумина (например, значения КЛ в мкМ-диапазоне или выше) или ее отсутствия, по меньшей мере одну из нескольких стратегий используют для придания фибронектиновому полипептиду свойств связывания человеческого сывороточного альбумина, включая один или более из следующих способов, способствующих аффинности связывания.
Связывания человеческого сывороточного альбумина полипептидом (полипептидами) с фибронектиновым каркасом достигают и оптимизируют посредством способов мутагенеза, возможно, в комбинации со способами параллельной и/или повторной селекции, как описано ниже, и/или, в противном слу- 127 020464 чае, как известно в данной области техники. Полипептидные домены каркаса 10Рп3 подвергают случайному и/или ЫЫК-мутагенезу, проводимому, как описано ниже. Такой мутагенез проводят в отношении всего полипептида 10Рп3 или в отношении определенных последовательностей в пределах полипептида 10Рп3, включая 1-9, 44-50, 61-54, 82-94 аминокислоты (края бета-складчатостей); 19, 21, 30-46 (четные), 79-65 (нечетные) аминокислоты (контактирующие с растворителем поверхности обеих бетаскладчатостей); 21-31, 51-56, 76-88 аминокислоты (СЭК-подобные контактирующие с растворителем петли); и 14-16 и 36-45 аминокислоты (другие контактирующие с растворителем петли и бета-изгибы); и, возможно, рандомизируют для разработки новых или улучшенных полипептидов, связывающих человеческий сывороточный альбумин. Возможно, для проведения таких способов мутагенеза используют ПЦР, что приводит к формированию разнообразия последовательностей в целевых последовательностях в фибронектиновых полипептидах. (Такие способы сходны с описанными ниже для образования библиотек ДАЬ.) В дополнение к случайным способам мутагенеза используют направленный мутагенез целевых аминокислотных остатков, где по структурной информации установлено, что определенные аминокислотные остатки фибронектиновых полипептидов имеют критическое значение для связывания человеческого сывороточного альбумина.
Фибронектиновые полипептиды, конструированные, как описано выше, подвергают способам параллельной и/или повторной селекции для идентификации тех фибронектиновых полипептидов, которые оптимизированы для связывания человеческого сывороточного альбумина. Например, после получения библиотеки мутированных последовательностей фибронектиновых полипептидов, указанную библиотеку полипептидов представляют на фаге и подвергают нескольким раундам селекции, требующим связывания сывороточного альбумина и/или пролиферации, как описано ниже для селекции ДАЬ, связывающих сывороточный альбумин, из библиотек ДАЬ. Возможно, селекцию проводят против сывороточного альбумина, иммобилизированного на иммунологических пробирках, или против биотинилированного сывороточного альбумина в растворе. Возможно, аффинность связывания определяют с применением поверхностного плазмонного резонанса ^РК) и В1асоге (Каг1ккоп е! а1., 1991), с применением системы В1асоге (иррка1а, δ\γеДеη). где для полностью оптимизированных полипептидов, имеющих происхождение от фибронектина, в идеальном случае достигают значений КД аффинности связывания с человеческим сывороточным альбумином в нМ-диапазоне или менее.
После идентификации фибронектиновых полипептидов, связывающих человеческий сывороточный альбумин, такие полипептиды затем используют для образования композиций лигандов с двойной специфичностью любым из способов, описанных ниже.
Фибронектиновые неиммуноглобулиновые каркасы
В определенных воплощениях изобретения для связывания человеческого сывороточного альбумина конструируют неиммуноглобулиновый каркас, содержащий фибронектин или его функциональную группировку и/или фрагмент. Используют неиммуноглобулиновую каркасную структуру, имеющую происхождение от модуля фибронектина III типа (Рп3). Модуль фибронектина III типа является распространенным домен, обнаруженным в крови и структурных белках млекопитающих, который встречается более 400 раз в базе данных белковых последовательностей и, согласно оценкам, встречается в 2% всех белков, секвенированных на настоящий момент. Белки, содержащие последовательность модуля Рп3 включают фибронектины, тенасцин, внутриклеточные белки цитоскелета и прокариотические ферменты (Вогк апД ЭооиШе, Ргос. Ыа!1. АсаД. δ^. ^А 89:8990, 1992; Вогк е! а1., Ыа!иге Вю!есЬ. 15:553, 1997; Мешке е! а1., I. Вас!епо1. 175:1910, 1993; \Уа1апаЬе е! а1., I. Вю1. СЬет. 265:15659, 1990). Конкретный неиммуноглобулиновый каркас фибронектина представляет собой десятый модуль человеческого Рп3 (10Рп3), содержащий 94 аминокислотных остатка. Общая конформация этого домена очень сходна с конформацией наименьшего функционального фрагмента антитела, вариабельной области тяжелой цепи, содержащей целую антиген-распознающую единицу в ЦС верблюда и ламы. Основные различия между доменами верблюда и ламы и доменом 10Рп3 состоят в том, что (1) 10Рп3 имеет меньшее количество бетацепей (семь против девяти) и (2) две бета-складчатости, расположенные друг напротив друга, связаны дисульфидной связью в доменах верблюда и дамы, но не в 10Рп3.
Три петли 10Рп3, соответствующие антигенсвязывающим петлям тяжелой цепи ЦС, расположены между 21-31 (ВС), 51-56 (ЭЕ) и 76-88 (РС) аминокислотными остатками (см. фиг. 3 патента США № 7115396, полное содержание которого включено сюда посредством ссылки). Длины петель ВС и ЭЕ, 11 и 6 остатков соответственно, расположены в узком диапазоне соответствующих антиген-распознающих петель, обнаруженных в тяжелых цепях антител, составляющем 7-10 и 4-8 остатков соответственно. Соответственно, стратегия переноса СИК может легко быть применена для введения последовательностей СИК тяжелой цепи в эти домены. Дополнительно и/или альтернативно, в эти две петли может быть внесено генетическое разнообразие любым принятым в данной области техники способом (например, способом сайт-направленного, 1оок !ЬгоидЬ мутагенеза, или другим способом мутагенеза, рандомизацией и т.п.), и, возможно, полученный полипептид может быть подвергнут селекции на высокую аффинность в отношении антигена (Альтернативно, внесение генетического разнообразия и/или способы селекции могут быть применены для идентификации композиций со сниженной аффинностью связывания и/или для оптимизации таких свойств, как стабильность, токсичность и т.п.). С применением таких способов петли
- 128 020464
ВС и ΌΕ фибронектина могут быть конструированы для образования контактов с антигенами, эквивалентных контактам соответствующих доменов СЭК1 и СЭК2 в антителах.
В отличие от петель ВС и ΌΕ петля РО 10Рп3 имеет длину 12 аминокислотных остатков, в то время как соответствующая петля в тяжелых цепях антитела имеет длину от 4 до 28 остатков. Соответственно, для оптимизации связывания антигенов может быть изменена длина петли РО 10Рп3 (например, применением рандомизации и/или применением полипептидных линкерных последовательностей (которые также могут быть рандомизированы)), а также ее последовательности с покрытием диапазона длины СЭК3 в 4-28 остатков для получения наибольшей возможной гибкости и аффинности при связывании антигена. Действительно, для обоих этих способов, в которых СОК непосредственно переносят в фибронектиновый каркас, и способов, в которых нативный фибронектиновый каркас селектируют и/или оптимизируют для связывания сывороточного альбумина (или другого антигена-мишени), длины, а также последовательности, СЭК-подобных петель имитаторов антител могут быть рандомизированы в процессе ш \йго или ш νί\Ό созревания аффинности (как описано более подробно ниже).
Десятый домен человеческого фибронектина III типа, 10Рп3, быстро проходит рефолдинг, даже при низкой температуре; конформация его остова была восстановлена за 1 с при 5°С. Термодинамическая стабильность 10Рп3 высока (ДОц=24 кДж/моль=5,7 ккал/моль), что коррелирует с его высокой температурой плавления, составляющей 110°С.
Одна из физиологических функций 10Рп3 состоит в том, что он является субъединицей фибронектина, гликопротеина, существующего в растворимой форме в биологических жидкостях и в нерастворимой форме во внеклеточном матриксе (Эюктзоп е! а1., 1. Мо1. Вю1. 236:1079, 1994). Мономер фибронектина массой 220-250 кДа содержит 12 модулей I типа, два модуля II типа и 17 модулей фибронектина III типа (Ройз апй СатрЬе11, Сигг. Орш. Се11 Вю1. 6:648, 1994). Различные модули III типа вовлечены в связывание фибронектина с интегринами, гепарином и хондроитинсульфатом. Было обнаружено, что 10Рп3 опосредует клеточную адгезию через интегринсвязывающий мотив Агд-Ой-Азр (КОЭ) на одной из его доступных петель. Было показано, что сходные мотивы КОЭ вовлечены в связывание интегринов другими белками, такими как фибриноген, фактор фон Виллебранда и витронектин (Нупез е! а1., Се11 69:11, 1992). Для 10Рп3 не было описано других функций по связыванию клеток или матрикса.
Наблюдение того, что 10Рп3 имеет лишь незначительно большую адгезивную активность, чем короткий пептид, содержащий КОЭ, согласуется с заключение о том, что активность 10Рп3 по связыванию клеток скорее сосредоточена в пептиде КОЭ, чем распределена по всей структуре 10Рп3 (Вагоп е! а1., ВюсЬет1з!ту 31:2068, 1992). Тот факт, что 10Рп3 без КЭО-мотива, скорее всего, не будет связывать другие белки плазмы или внеклеточного матрикса, делает 10Рп3 полезным каркасом для замены антител. В дополнение присутствие 10Рп3 в природном фибриногене в кровотоке указывает на то, что 10Рп3 сам по себе, скорее всего, не будет иммуногенным в организме, из которого он происходит.
В дополнение, было показано, что каркас 10Рп3 имеет доступные петлевые структуры, устойчивые к рандомизации, что облегчает образование разнородных пулов имитаторов антител. Это обнаружение было сделано при исследовании гибкости последовательности 10Рп3. В частности, последовательность человеческого 10Рп3 выравнивали с последовательностями фибронектинов из других источников, а также с последовательностями родственных белков, и результаты этого выравнивания наносили на трехмерную структуру домена человеческого 10Рп3. Это выравнивание показало, что большинство консервативных остатков были обнаружены в сердцевине сэндвича бета-складчатости, в то время как высоковариабельные остатки были расположены по краям бета-складчатостей, включая И- и С-концы, на контактирующих с растворителем поверхностях обеих бета-складчатостей и на трех контактирующих с растворителем петлях, выполняющих функцию гипервариабельных петель для созревания аффинности имитаторов антител. В свете этих результатов было установлено, что рандомизация этих трех петель, скорее всего, не будет оказывать вредного эффекта на общую конформацию или стабильность каркаса 10Рп3 самого по себе.
Для последовательности человеческого 10Рп3 этот анализ указывает на то, что как минимум 1-9, 4450, 61-54, 82-94 аминокислоты (края бета-складчатостей); 19, 21, 30-46 (четные), 79-65 (нечетные) аминокислоты (контактирующие с растворителем поверхности обеих бета-складчатостей); 21-31, 51-56, 7688 аминокислоты (СОК подобные контактирующие с растворителем петли); и 14-16 и 36-45 аминокислоты (другие контактирующие с растворителем петли и бета-изгибы) могут быть рандомизированы для разработки новых или улучшенных белков, связывающих соединения. В дополнение, как обсуждено выше, изменения в длине одной или более контактирующих с растворителем петель могут также быть включены в такие способы направленной эволюции.
Альтернативно, изменения в последовательностях β-складчатостей могут также быть использованы для разработки новых белков. Эти мутации изменяют каркас и посредством этого косвенно изменяют структуру (структуры) петель. При применении этого способа не следует насыщать последовательность мутациями, скорее следует ввести небольшое число мутаций. Предпочтительно согласно этому способу в последовательности β-складчатостей следует вводить не более чем 3-20 изменений.
Разнообразие последовательностей может быть внесено любой методикой, включая, например, му- 129 020464 тагенез Тад-полимеразой (Тшба11 апб Кипке1, Β^осЬет^κ!^у 27:6008 (1988)), рекомбинацию фрагментов или их комбинацию. Сходным образом, для введения дополнительных усовершенствований в неиммуноглобулиновые каркасы может быть использовано увеличение структурного разнообразия библиотек, например, изменением длины, а также последовательности, СИК-представляющих и/или СИК-подобных петель, или структурной перестройкой на основании преимущественных мутаций каркасной области, обнаруженных в селектированных пулах.
Слитые белки, содержащие фибронектиновые каркасные полипептиды
Фибронектиновые каркасные полипептиды, описанные здесь, могут быть слиты с другими белковыми доменами. Например, фибронектиновые каркасные полипептиды, которые, как установлено, связывают человеческий сывороточный альбумин, могут быть слиты с отдельными вариабельными доменами тяжелой цепи или их антигенсвязывающим фрагментами для образования лиганда с двойной специфичностью по изобретению, содержащего группировку на основе фибронектина, связывающую сывороточный альбумин. В дополнение, фибронектиновые каркасные полипептиды могут быть интегрированы в иммунный ответ у человека слиянием константной области 1дО (Рс) с фибронектиновым каркасным полипептидом, таким как модуль 10Рп3, предпочтительно через С-конец 10Рп3. Рс в такой слитой молекуле 10Рп3-Рс активирует комплементный компонент иммунного ответа и может служить для повышения терапевтической ценности конструированного фибронектинового полипептида. Сходным образом, слитый белок между фибронектиновым каркасным полипептидом, таким как 10Рп3, и белком комплемента, таким как С1д, может быть использован для направленного воздействия на клетки, и слитый белок между фибронектиновым каркасным полипептидом, таким как 10Рп3, и токсином может быть использован для специфичного уничтожения клеток, несущих определенный антиген. Любой из этих слитых белков может быть образован стандартными методиками, например, экспрессией слитого белка из рекомбинантного слитого гена, конструированного с применением общедоступных последовательностей генов и/или, в противном случае, как описано ниже.
Каркасные мультимеры
В дополнение к мономерам любые фибронектиновые каркасные конструкции, описанные здесь, могут быть образованы в виде димеров или мультимеров каркасов в качестве средства увеличения валентности и, таким образом, авидности связывания антигена (например, сывороточного альбумина). Такие мультимеры могут быть образованы ковалентным связыванием. Например, отдельные модули 101п3 могут быть связаны, имитируя природное связывание 8Рп3-9Рп3-10Рп3 от С-конца к Ν-концу или имитируя димеры антител, удерживаемые друг с другом через их константные области. Конструкция 10Рп3-Рс может быть использована для образования димеров с общей схемой 10Рп3-Рс::Рс-10Рп3. Связи, конструированные в формате 1с::1с могут быть ковалентными или нековалентными. В дополнение, партнеры по димеризации или мультимеризации, отличные от 1с, как, например, другие неиммуноглобулиновые каркасные группировки и/или антигенсвязывающие группировки на основе иммуноглобулинов, могут быть использованы в гибридах, таких как гибриды 10Рп3, для создания подобных структур более высокого порядка. Другие примеры мультимеров включают отдельные вариабельные домены, описанные здесь.
В определенных примерах ковалентно связанные мультимеры могут быть образованы конструированием слитых генов, кодирующих мультимер, или, альтернативно, конструированием кодонов для цистеиновых остатков в последовательностях мономеров, и делая возможным образование дисульфидных связей между продуктами экспрессии. Нековалентно связанные мультимеры могут также быть образованы множеством методик. Они включают введение в последовательности мономеров кодонов, соответствующих положительно и/или отрицательно заряженным остаткам и возможность взаимодействия между этими остатками в продуктах экспрессии (и, таким образом, между мономерами). Этот способ может быть упрощен использованием преимущества заряженных остатков, присутствующих в мономерной субъединице естественным образом, например, отрицательно заряженных остатков фибронектина. Другие способы создания нековалентно связанных композиций, содержащих фибронектиновые каркасные полипептиды, состоит во введении в ген мономера (например, Ν- или С-концы) кодирующих последовательностей белков или белковых доменов, о которых известно, что они взаимодействуют друг с другом. Такие белки или белковые домены включают мотивы спираль-спираль, мотивы лейциновая застежкамолния или любые из множества белковых субъединиц (или их фрагментов), о которых известно, что они управляют образованием димеров или мультимеров более высокого порядка.
Фибронектиноподобные молекулы
Хотя 101п3 является предпочтительным каркасом для образования имитаторов антител, в молекулах, описанных здесь, 101п3 может быть заменен другими молекулами. Они включают, без ограничения, модули человеческого фибронектина 1Рп3-9Рп3 и 11Рп3-17Рп3, а также родственные модули Рп3 от животных, не являющихся людьми, и прокариот. В дополнение, могут также быть использованы модули 1п3 от других белков с последовательностями, гомологичными последовательности 10Рп3, таких как тенасцины и ундулины. Другие типичные каркасы, имеющие иммуноглобулиноподобные конформации (но с последовательностями, неродственными домену УН), включают Ν-кадгерин, 1САМ-2, титин, рецептор ΟСδР, цитокиновый рецептор, ингибитор гликозидазы, Е-кадгерин и антибиотик-хромопротеин. Другие домены с родственными структурами могут иметь происхождение от миелиновой мембранной молекулы ад- 130 020464 гезии Р0, СЭ8, СЭ4, СЭ2, МНС I класса, рецептора Т-клеточного антигена, СЭ1, С2 и домены 1-8е! УСАМ-1, иммуноглобулинового домена 1-8е! миозинсвязывающего белка С, иммуноглобулинового домена 1-8е! миозинсвязывающего белка Н, иммуноглобулинового домена 1-8е! телокина, ЫСАМ, твитчина, нейроглиана, рецептора гормона роста, рецептора эритропоэтина, рецептора пролактина, рецептора ОС8Р, рецептор гамма-интерферона, в-галактозидазы/глюкуронидазы, в-глюкуронидазы и трансглутаминазы. Альтернативно, может быть использован любой другой белок, содержащий одну или более иммуноглобулиноподобные конформации. Такие белки могут быть идентифицированы, например, с применением программы 8С0Р (Мигап е! а1., I. Мо1. Вю1. 247:536 (1995); Ьо Соп!е е! а1., Ыис1ею Ас1З8 Ке8. 25:257 (2000)).
В целом, любая молекула, демонстрирующая структурное родство с доменом УН (как определено, например, с применением компьютерной программы 8С0Р, указанной выше), может быть использована в качестве неиммуноглобулинового каркаса. Такие молекулы могут, подобно фибронектину, содержать три петли на Ы-концевом полюсе молекулы и три петли на С-концевом полюсе, каждая из которых может быть рандомизирована для создания разнородных библиотек; альтернативно, могут быть использованы более крупные домены, имеющие большее число петель, при условии, что несколько таких поверхностных рандомизируемых петель расположены достаточно близко в пространстве таким образом, что они могут участвовать в связывании антигена. Примеры полипептидов, обладающих более чем тремя петлями, расположенными близко друг к другу, включают рецептор Т-клеточного антигена и супероксиддисмутазу, каждый из которых имеет четыре петли, которые могут быть рандомизированы; и димер Рп3, домены тканевого фактора и домены рецептора цитокинов, каждый из которых имеет три группы из двух сходных доменов, где три рандомизируемые петли являются частью двух доменов (что дает в общей сложности шесть петель).
В еще одной другой альтернативе любой белок, имеющий вариабельные петли, расположенные достаточно близко в пространстве может быть использован для получения связывающего белка-кандидата. Например, могут быть использованы крупные белки, имеющие пространственно взаимосвязанные контактирующие с растворителем петли, даже если они не являются структурно родственными иммуноглобулиноподобной конформации. Типичные белки включают, без ограничения, цитохром Р, зеленый флюоресцентный белок, ОгоЕ1 и тауматин. Петли, представленные на этих белках, могут быть рандомизированы и белки с наилучшим связыванием могут быть селектированы из рандомизированной библиотеки, как описано здесь, например, в примере 1. Ввиду их размера могут быть получены молекулы, демонстрирующие антигенсвязывающую поверхность, значительно большую чем обнаруживаемая при взаимодействии антитело-антиген. Другие применимые каркасы такого типа могут также быть идентифицированы с применением программы 8С0Р (Митп е! а1., I. Мо!. Вю1. 247: 536 (1995)) для просмотра белковкандидатов, имеющих несколько петель, в частности, петель, расположенных среди параллельных бетаскладчатостей или нескольких альфа-спиралей.
Модули от различных организмов и исходных белков могут быть наиболее подходящими для различных применений. Например, при разработке фибронектинового каркасного полипептида по изобретению может быть наиболее желательным образовать такой белок из фибронектина или фибронектиноподобной молекулы, естественной для организма, для которого предназначено лекарственное средство. Наоборот, организм, являющийся источником происхождения, имеет меньшее значение или вовсе не имеет значения для фибронектиновых каркасов, предназначенных для использования в ш νίΙΐΌ применениях, как, например, в качестве диагностических средств или в качестве реагентов для исследований.
Для любых из этих молекул могут быть образованы и использованы библиотеки для селекции связывающих белков любым из способов, описанных здесь.
Направленная эволюция связывающих белков на основе каркасов
Неиммуноглобулиновые каркасы, описанные здесь, могут быть использованы в любой методике образования новых или улучшенных связывающих белков. В одном конкретном примере мишень для связывания (например, сывороточный альбумин) иммобилизируют на твердой подложке, такой как смола колонки или лунка титрационного микропланшета, и мишень приводят в контакт с библиотекой связывающих белков-кандидатов на основе неиммуноглобулиновых каркасов. Такая библиотека может состоять из клонов с фибронектиновым каркасом, таких как клоны 10Рп3, конструированные из каркаса нативного 10Рп3 (10Рп3 дикого типа) посредством рандомизации последовательности и/или длины СЭКподобных петель 10Рп3. Если желательно, эта библиотека может представлять собой слитую РНКбелковую библиотеку, образованную, например, методиками, описанными в 5>/о81ак е! а1., И8 8ег. Ыо. 09/007005 и §ег. Ыо. 09/247190; 5>/о81ак е! а1., ν0 98/31700; и КоЪей8 & 5>/о81ак, Ргос. Ыа!1. АсаЗ. 8ск И8А (1997), νо1. 94, р. 12297-12302. Альтернативно, она может представлять собой ДНК-белковую библиотеку (например, как описано в ЬоГОе, ПЫА-Рго!еш Ри8юп8 апЗ И8е8 ТНегеоГ, υδ 8ег. Ыо. 60/110549, И8 8ег. Ыо. 09/459190, \ν0 00/32823). Слитую библиотеку инкубируют с иммобилизированной мишенью, подложку промывают для удаления неспецифичных связывающих агентов и агентов с наиболее прочным связыванием элюируют в очень строгих условиях и подвергают ПЦР для получения информации о последовательности или для создания новой библиотеки связывающих агентов, которая может быть использована для повторения способа селекции, с или без дополнительного мутагенеза последова- 131 020464 тельности. Несколько раундов селекции могут быть проведены до получения связывающих агентов с достаточной аффинностью в отношении антигена (например, сывороточного альбумина).
В одном конкретном примере каркас 10Рп3 может быть использован как мишень для селекции. Например, если необходим белок, связывающий определенную пептидную последовательность (например, сывороточный альбумин), представленную в петле из десяти остатков, конструируют отдельный клон 10Рп3, в котором длина одной из петель составляет десять остатков и последовательность соответствует желаемой последовательности. Новый клон экспрессируют ш νί\Ό и очищают, и затем иммобилизируют на твердой подложке. Затем создают условия для взаимодействия слитой РНК-белковой библиотеки на основе подходящего каркаса с подложкой, которую затем промывают и желаемые молекулы элюируют и повторно селектируют, как описано выше.
Сходным образом, каркасы, описанные здесь, например, каркас 10Рп3, могут быть использованы для поиска природных белков, взаимодействующих с пептидной последовательностью, представленной на каркасе, например, в петле 10Рп3. Каркасный белок, такой как белок 10Рп3, иммобилизируют, как описано выше, проводят скрининг слитой РНК-белковой библиотеки на агенты, связывающие представленную петлю. Связывающие агенты улучшают посредством нескольких раундов селекции и идентифицируют посредством секвенирования ДНК.
В дополнение, в описанных выше способах РНК-белковые библиотеки хотя и являются типичными библиотеками для направленной эволюции, любой тип библиотеки на основе каркаса может быть использован в способах селекции по изобретению.
Применение фибронектиновых каркасных полипептидов
Фибронектиновые каркасные полипептиды, описанные здесь, могут быть разработаны для связывания сывороточного альбумина или любого интересующего антигена. Такие белки с фибронектиновым каркасом имеют термодинамические свойства, превосходящие термодинамические свойства природных антител, и могут быть быстро разработаны ш νί!ΐΌ. Соответственно, эти фибронектиновые каркасные полипептиды могут быть использованы для получения связывающих доменов для применения в областях исследований, лечения и диагностики.
Мутагенное созревание аффинности
Селекции, описанные здесь, можно также комбинировать с мутагенезом после всех или части стадий селекции для дополнительного увеличения разнообразия в библиотеке. В способах созревания аффинности может быть применена, например, ошибочно направленная ПЦР (Сай\\е11 апй 1оусе, РСК Ме!Пойк Арр1 2:28 (1992)) или альтернативные формы случайного мутагенеза, ЫЫК-мутагенез, как описано ниже, 1оок !йгоидП мутагенез (где фибронектиновые каркасные полипептиды с перенесенными СОК конструируют для оптимизации связывания антигена использованием встречающегося в природе разнообразия СОК, см, например, \УО 06/023144, включенную сюда посредством ссылки) и/или другой принятый в данной области техники способ мутагенеза для создания разнообразия полипептидов, который комбинируют с одним или более раундами селекции на аффинность связывания антигена.
Любые из каркасных белков, описанных ниже, можно комбинировать друг с другом для использования, например, в композициях лигандов с двойной специфичностью по настоящему изобретению. Например, СОК могут быть перенесены на каркас СТЬА-4 и использованы совместно с доменами Ун или У[, антитела для образования мультивалентного лиганда. Сходным образом можно комбинировать фибронектиновые, липокалиновые каркасы, каркасы аффител и другие каркасы.
Все публикации, упомянутые в настоящем описании, и ссылки, приведенные в указанных публикациях, включены сюда посредством ссылки. Различные модификации и вариации описанных способов и систем по изобретению будут очевидны специалистам в данной области техники без выхода за рамки объема и сущности изобретения. Несмотря на то что изобретение было описано в связи с конкретными предпочтительными воплощениями, следует понимать, что заявленное изобретение не следует чрезмерно ограничивать такими конкретными воплощениями. Действительно, подразумевают, что различные модификации описанных способов воплощения изобретения, очевидные специалистам в молекулярной биологии или родственных областях, входят в объем следующей формулы изобретения.
- 132 020464
Приложение 1.
Полипептиды, увеличивающие период полувыведения ΐη νΐνο Альфа-1-гликопротеин (орозомукоид) (ААС).
Альфа-1-антихимотрипсин (АСТ).
Альфа-1-антитрипсин (ААТ).
Альфа-1-микроглобулин (белок НС) (АШ).
Альфа-2-макроглобулин (А2М).
Антиромбин III (АТ III).
Аполипопротеин А-1 (АроА-1).
Аполипопротеин В (Аро В).
Бета-2-микроглобулин (В2М).
Церулоплазмин (Ср).
Компонент комплемента (С3).
Компонент комплемента (С4).
Ингибитор эстераз С1 (С1 [ΝΜ).
С-реактивный белок (СРГ).
Цистатин С (Суз С).
Ферритин (ΡΕР).
Фибриноген (РГО).
Фибронектин (ΤΝ).
Гаптоглобин (Нр).
Гемопексин (НРХ).
Иммуноглобулин А ДдА).
Иммуноглобулин Ό (!дО).
Иммуноглобулин Е ΟβΕ).
Иммуноглобулин С (ЩС).
Иммуноглобулин М (!дМ).
Легкие цепи иммуноглобулинов (каппа/лямбда).
Липопротеин (а) [Ьр(а)].
Маннозасвязывающий белок (МВР).
Миоглобин (Муо).
Плазминоген (ΡδΜ).
Преальбумин (транстиретин) (ΡΛ^).
Ретинолсвязывающий белок (РΒΡ).
Ревматоидный фактор (РР).
Сывороточный амилоид А ^АА).
Растворимый рецептор трансферрина (зТГР).
Трансферрин (ТГ).
- 133 020464
Приложение 2.
Образование пары Терапевтически значимые ссылки
ТИР-альфа/ТОР-р При введении в коленный сустав в модели коллаген- индуцированногто артрита ΤΘΡ-Ь и ΤΝΡ существенно усиливали воспаление сустава. У мышей, не иммунизированных коллагеном, не оказывали эффекта.
ТМР-альфа//Ь-1 • ΤΝΡ и И-1 синергисты при увеите. • ΤΝΡ и И-1 синергисты при малярии (гипогликемия, N0). • ΤΝΡ и 1Ь1 синергисты при индукции миграции полиморфноядерных (ΡΜΝ) клеток при воспалении. • 1Ы и ΤΝΡ синергисты при индукции инфильтрации ΡΜΝ в брюшину. • 1Ь-1 и ΤΝΡ синергисты при индукции секреции 1Ь-1 эндотелиальными клетками. Важно при воспалении . • 1И или ΤΝΡ сами по себе индуцируют некоторую клеточную инфильтрацию в синовиальной оболочке коленного сустава. 11_-1 индуцирует ΡΜΝ, ΤΝΡ - моноциты. Вместе они индуцирую более тяжелое воспаление за счет увеличения ΡΜΝ. • Циркулирующая депрессорная миокардиальная субстанция (присутствует при сепсисе) представляет собой незначительное количество 1И и ΤΝΡ, действующих синергично.
ΤΝΡ-ал ьфа/11-2 • В наибольшей степени относится к синергичной активации Т-клеток-киллеров.
ΤΝΡ-альфа /1Ь-3 • Синергизм интерлейкина-3 и фактора некроза олухолиальфа в стимуляции клонального роста бластов при остром миелобластном лейкозе является результатом индукции синтеза вторичных гематопоэтических цитокинов фактором некроза опухоли-альфа. • Сапсег Кев. 1992 Арг 15;52(8):2197-201.
ΤΝΡ-альфа /11.-4 • 1Ь-4 и ΤΝΡ синергично действуют на клетки эндотелия для индукции экспрессии \/САМ. Полагают, что они играют роль при астме. Аналогично для синовиальной оболочки - вовлечены в ревматоидный артрит (КА). • ΤΝΡ и И-4 синергично действуют для индукции экспрессии И-6 в кератиноцитах. • 5ив1а1пес1 βίβνθίβό ΙβνβΙδ οί УСАМ-1 ίη сиКигед ЛЬгоЫав1-Пке вупомосуШ сап Ье асГиеуеб Ьу ТЖ-а1рЬа ίη сотЫпайоп
- 134 020464
и/ЛЬ еЛЬег И-4 ог И-13 кгоидЬ 1псгеазеб γπΚΝΑ з!аЫ1Лу. Ат б РаНю1. 1999 Арг;154(4):1149-58.
ΤΝΡ-альфа /11_-5 • Ре1айопз1йр Ьейл/ееп (Ье 1итог ηθΟΓΟδίδ £ас1ог зуз1ет апб (Не зегит 1п1ег1еик1п-4, 1П1ег1еикгп-5, 1п(ег1еик1п-8, βοδίησρΚίΙ сайолгс ρΓοίβΐη, апб йптипод1оЬиНп Ε ΙβνβΙδ ίη (Ье ЬгопсЬга! Ьуреггеас(м(у οί абиКз апб (Ьек сЬИбгеп. АИегду АзЮта Рте. 2003 Маг-Арг;24(2):111-8.
ΤΝΡ-альфа /11.-6 • ΤΝΡ апб ΙΙ.-6 аге ро(еп( дгоук (ас(огз Тог ОН-2, а ηονβΙ Ьитап туе1ота се11 Ιίηβ. Еиг4 Наета(о1. 1994 би1;53(1):31-7.
ΤΝΡ-альфа /11.-8 • ΤΝΡ и И-8 синергично действовали на ΡΜΝ с активацией тромбоцитов. Вовлечены в острый респираторный дистресс-синдром. • См. Ιί-5/ΤΝΡ (астма). 5упегд1вт ЬеЪлгееп 1п(ебеик1П-8 апб 1итог песгоб15 1ас(ог-а1рЬа (ог пеи(горЬй-теб1а(еб р1а(е1е( асЙУабоп. Еиг Су(ок)пе Νβ(\ν. 1994 Зер-Ос(;5(5):455-60. (респираторный дистресс-синдром взрослых (АРОЗ)).
ΤΝΡ-альфа /П_-9
ΤΝΡ-альфа /11.-10 • П.-10 индуцирует и синергично действует с ΤΝΡ при индукции экспрессии ВИЧ в хронически инфицированных Т- клетках.
ΤΝΡ-альфа/11.-11 • Су1ок1пез зупегд1б11са1!у шбисе оз(еос!аз( бЛ(егеп(1а1юп: зирроб Ьу 1ттоба11геб ог погта! сакапа! се11з. Ат 4 РЬузю! Се11 РЬузю!. 2002 Зер;283(3):С679-87. (Разрушение костей.)
ΤΝΡ-альфа /11.-12
ΤΝΡ-альфа /|1_-13 • Зиз1а1пеб е1еуа(еб ΙβνβΙδ οί Х/САМ-1 ίη сиЛигеб 8ЬгоЫаз1-Нке зупоуюсу(ез сап Ье аскеуеб Ьу ΤΝΡ-афЬа ίη сотЫпайоп ννίίίι еЛЬег И-4 ог ΙΙ.-13 (ЬгоидЬ тсгеазеб ιτιΡΝΑ з(аЬШ1у. Ат б Ра(Ьо1.1999 Арг;154(4):1149-58. • 1п1ег1еик1Л-13 апб (итоиг песгоз151ас(ог-а1рЬа зупегд1зйсаНу 1пбисе ео1ахю ргобиейоп ίη Ьитап паза! ЯЬгоЫаз(з. СИп Ехр АИегду. 2000 Маг;30(3):348-55. • 1п1ег1еик1П-13 апб (итоиг песгоз!з (ас!ог-а1рЬа зупегд1з(1са11у 1пбисе βοΙθχίη ргобиейоп ίη Ьитап паза! ЯЬгоЫаз(з. СНп Ехр
- 135 020464
АНегду. 2000 Маг;30(3):348-55 (аллергическое воспаление) • 1тр||са1юпз οί зегит ΤΝΡ-όβΙβ апс! Ш-13 ίη Ше ЬгеаЬпегЛ гезролзе οί сКЛбНооб перНгойс зупбготе. Су(оМпа. 2003 РеЬ 7;21 (3):155-9.
ΤΝΡ-альфа /Ш-14 * Ейес1з οί 1пЬа1еб1итоиг песгоз18 1ас1ог а1рЬа ίη зиЬ)ес1з ννίίή тЛб азШта. Погах. 2002 5ер;57(9):774-8.
ΤΝΡ-альфа ЛИ 5 • Είίβοίδ οί нФа1еб 1итоиг песгоз131ас1ог а1рЬа ίη зиЬ)ес1з ννίΐίι тПб азШта. Погах. 2002 Зер;57(9):774-8.
ΤΝΡ-альфа /Ш-16 • Титог песгоз131ас1ог-а1рЬа-юбисеб зупШеыз οί И1ег1еикт- 16 ίη а1пгау βρίίίιβΙίθΙ сеНз: рпттд ίοΓ зегоФпт зйти!а1юп. Ат 4 Разр1г Се11 Мо1 ВЫ. 2003 Маг;28(3):354-62. (Воспаление дыхательных путей) • Согге1айоп οί С1гси1айпд (п1ег1еикт 16 ν/ίΦ рго(п11атта1огу суГоктез ίη райеп1з \мШ Шеитаклб агШпйз. РЬеитаЫоду (ΟχίοΓά). 2001 Арг;40(4):474-5. Краткое изложение недоступно. • 1п1ег1еик(п 16 Ϊ3 ир-геди!а(еб ίη СгоЬп’з сНзеазе апб рагйара1ез ίη ΤΝΒ3 соййз ίη ηηίοβ. Оаз1гоеп(его1оду. 2000 Ос(;119(4):972-82.
ΤΝΡ-альфа /Ш-17 • ΙηΐΊΦίΙίοη οί 1п1ег1еик1п-17 ргечеп1з Ше беуе1ортеп1 οί агШпйз ίη уасста(еб тгсе сЪаИепдеб ννίίίι ВоггеНа ЬигдбоПеп. 1пГес( 1ттип. 2003 бип;71(6):3437-42. • 1п1ег1еик1п 17 зупегд1зез ννίΐίι 1итоиг песгоыз 1ас1ог а1рЬа 1о Ибисе саППаде безкисйоп /л νϋω. Апп РЬвит ΟΪ8. 2002 Ос1,61(10):870-6. • А го!е οί СМ-СЗР ίη Ше ассити!айоп οί пеикорЬПз ίη Ше а)г\мауз саизеб Ьу Ш-17 апб ΤΝΡ-θΙρΙιβ. Еиг Резр1Г 4. 2003 Маг;21 (3):387-93. (Воспаление дыхательных путей) • АЬз1гас( 1п1ег1еик1Л-1, (итог песгоз(з 1ас(ог а!рЬа, апб И1ег1еикИ-17 5упегд1з(юаНу ир-геди!а!е пйпс οχί6θ апб ргоз1ад1апбт Е2 ргобисйоп ίη ехр1ап1з οί Нитап оз(еоагШпйс кпее тетзск АгЫШз РЬеит. 2001 Зер;44(9):2078-83.
ΤΝΡ-альфа /Ш-18 • Аззос1айоп οί Н1ег1еикИ-18 ехргеззюп νι/ίίΗ епНапсеб ΙβνβΙβ
- 136 020464
οί Ьо1Ь 1п{ег1еик1п-1 Ье1а апй Ютог песгоз1з1ас1ог а1рИа ϊπ клее зупсма! Йззие οί райеп!з м/ϊΐή гЬеита1оИ агЮпйз, ААЬпИз КЬеит. 2003 РеЬ;48(2):339-47. • АЬз1гас1 Е1еуа1еб ΙβνβΙβ οί ю1ег1еик1П-18 апб Ютог песгоз!'з 1ас1ог-а1рЬа ίη зегит οί райеп!з ννϊίίι 1уре 2 б1аЬе(ез теНИиз: ге1айопз111р ννϊίίι ФаЬеОс перКгораОпу. Ме1аЬоНзт. 2003 Мау;52(5):605-8.
ΤΝΡ-альфа/11.-19 • АЬз1гас11Ы9юбисез ргобисйоп οί Ιί-6 апб ΤΝΡ-афпа апб гезиИз ϊη се11 арор1оз13 Югоидп ТМР-а1рЬа. 71ттипо1. 2002 Ос115:169(8):4288-97.
ΤΝΡ-альфа /IЬ-20 • АЬз(гас1 Су1ок1пез: ΙΙ.-20 - а ηβνν еЯес1ог ϊη зкю 1п0аттайоп. Сигг ΒίοΙ. 2001 ϋίΐΐ 10;11(13):К531-4
ΤΝΡ-альфа /Сотр1етеп1 * (пОаттайоп апб соадфайоп: 1тр1юаЙопз Юг 1Ке зерйс раОепТ СПп ίηί&οΐ ΰί$. 2003 Мау 15;36(10):1259-65. ЕриЬ 2003 Мау 08. Обзор .
ΤΝΡ-альфа /ΙΡΝ-0 • Индукция МНС в мозге. • Синергизм при противовирусном ответе/индукция ΙΡΝ-γ. • Активация нейтрофилов/респираторный взрыв. • Активация эндотелиальных клеток. • Токсичности, упомянутые при лечении пациентов ΤΝΡ/ΙΡΝ- γ в качестве противовирусной терапии. • Экспрессия фракталкина человеческими астроцитами. • Много публикаций о воспалительных ответах - то есть, 1.Р5, также активация макрофагов. • Антитела против ΤΝΡ и против ΙΡΝ-γ синергично защищают мышей от летальной эндотоксемии.
ΤΟΡ-β/Ιί-Ι • Синтез простагландинов остеобластами. • Образование Н_-6 эпителиальными клетками кишечника (модель воспаления). • Стимулирует И-11 и Ы-6 в фибробластах легких (модель воспаления). • Образование ΙΙ_-Θ и И-8 в сетчатке.
- 137 020464
тер- β /ιι-б * Пролиферация хондросаркомы.
1Ь-1/И-2 • Активация В-клеток. • Активация ЬАК-клеток, • Активация Т-клеток. • 11_-1 зупегду ννίφ П_-2 ίη Фе депегайоп οΐ 1утрЬок1пе асйуа1ей к|Пег сеНз ίδ теФаФй Ьу ТМР-а1рЬа апй Ье1а (1утрЬо1ох1п). Су1ок1пе. 1992 Νον;4(6):479-87.
Ιί-1/11-3
П--1/И-4 • Активация В-клеток. • П_-4 индуцирует экспрессию П.-1 при активации эндотелиальных клеток.
ΙΙ_-1/ΙΙ_-5
И-1/И-6 • Активация В-клеток, • Активация Т-клеток (может замещать вспомогательные клетки). • 1Ь-1 индуцирует экспрессию И-6. • Экспрессия СЗ и сывороточного амилоида (ответ острой фазы). • Экспрессия ВИЧ. • Распад коллагена хряща.
1Ы/И.-7 • Ιί-7 ίδ ΓβηιιίδϊΙβ ϊογ 1Ы-1ПЙисей Фуглосу1е рго1Негайол. ΙηνοΙνβιηβηί οί Ιί-7 ίη Фе $упегд15йс ейес1з οί дгапи1осу1етасгорЬаде со1опу-зйти1айпд 1ас(ог ог {итог песго5151ас1ог ννίΦ 1Ь-1. Лттипо/. 1992 йап 1;148(1):99-105.
И-1/И-8
ΙΙ_-1/|[_-10
И-1/11-11 • Суйэктез зупегд13йсаПу Фйисе оз1еос1аз! сййегепйайоп: зиррой Ьу ίΓΠΓηοΓΟΙίζβά ог погта! са1уапа1 се11з. Ат й РЬузю! Се11 РЬузю!. 2002 5ер;283(3):С679-87. (Разрушение кости)
И-1/Ш16 • Согге1аЙоп οί С1гси1айпд 1п1ег1еик|'п 16 ννϊΦ рго1ПЙатта(огу су!ок!пез ίη райеп1з адф ФеитаЮгс! агФлЙз. Р!юита1о1оду (ОхФгй). 2001 Арг;40(4):474-5. Краткое изложение недоступно.
11-1/И-17 • 1пЬгЬ|'йоп οί 1п{ег1еик|'п-17 ргеуеп(з Фе йеуе1ортеп( о1агФпйз ίη
- 138 020464
уасс1па1еД пже сКаПепдеД ννϊίή ВоггеКа ЬигдДоДел. !п/ес( 1ттип. 2003 Дип;71(6):3437-42. • СогйпЬийоп οί Нег1еикю 17 ίο Китап сагМаде ДедгаДайоп апД зупоу|а1 юйаттайоп ίη оз1еоаЛКпйз. Оз/еоэДЛлйз СагЫаде. 2002 Ос1; 10(10):799-807. • АЬз1гас11п1ег1еик1п-1,1итог песгаз15 ТасЮг а1рКа, апД 1п1ег1еикт17 зупегд1зйсаПу ир-геди1а1е ηίίπο охйе апД ргоз(ад1апДт Е2 ргоДисйоп ίη ехр1ап1з οί Китап оз1еоаДКлйс кпее ΓΠβηίεοί. АЫпИз РЬеит. 2001 5ер;44(9):2078-83.
1ЫЛЫ8 • Аззос1а1юп οί 1п1ег1еик1п-18 ехргеззюп ννίίΚ епКапсеД ΙβνβΙδ οί Ьо1К 1п1ег1еик1п-1Ье1а апД {итог песгоз131ас1ог а1рКа ίη кпее зупома! йззие οί райеп1з ννίίΚ гКеитакйД аДКгЖз. ΑίΟιήϋε РЬеит. 2003 РеЬ;48(2):339-47.
ΙΙ-ΙΛΡΝ-д
Ιί.-2/И-З • Пролиферация Т-клеток. Пролиферация В-клеток.
И-2/И-4 • Пролиферация Т-клеток. • Пролиферация В-клеток. • (зе1ес(ше1у 1пДис1пд асйуайоп οί СЭ8 апД ΝΚ 1утрНосу1ез)И--2К Ье(а адотз! Р1-30 ас1з ϊη зупегду ννίίΚ 1Ь-2, И-4, И_-9, апД И-15: Ь'ю1од1са1 апД то1еси)аг еЯес1з. Д 1ттипо1. 2000 Ос1 15:165(8): 4312-8.
ΙΙ_-2/ΙΙ_-5 • Пролиферация В-клеток/секрецию 1д • Ιί-5 индуцирует рецепторы 1Ь-2 на В-клетках
11-2/И-8 • Развитие цитотоксических Т-кпеток
И-2/1Б7
И-2/И-9 • См. И_-2/П_-4 (ΝΚ-клетки)
И-2/1И0 • Активация В-клеток
Н.-2ЛЫ2 • 1Ь-12 зупегд12ез ννίίΚ И-2 ίο тДиое 1утрКок1пе-ас1п/а1еД су1о1ох1сЦу апД реДопп апД дгапгуте депе ехргеззюп ίη ЬезК Китап ΝΚ се11з. Се» 1ттипо1. 1995 Ос1 1;165(1):33-43. (активация Т-клеток)
И-2ЛЫ5 • См. 1Ь-2ЛЬ-4 (ΝΚ-клетки)
- 139 020464
• <Т се11 асйуайоп апс! ргоИ/егайоп) ΪΙ--15 апс! ΙΙ--2: а таНег οί 1Ие апб с!еа1ЬУогТ се!1б ΐη и/νο. Νβΐ Мед. 2001 Лап;7( 1):114-8.
Н.-2/1Ы6 • Зупегд1зНс ас1ма(юп οί СЭ4+ Т се11з Ьу 11.-16 апб И-2. б 1ттипо1. 1998 Маг 1;160(5):2115-20,
И-2/1Ы7 • Ενίάβποβ Тог Ше еаг!у ίηνοίνβιτιβηί οί 1п1ег1еикю 17 ίη Ьитап апб ехрептеп1а1 гепа! аНодгаб ге)ес1юп. б Ра№ю1. 2002 би1;197(3):322- 32.
Н.-2ЛЫ8 • 1п1ег1еик1П 18 (Ιί-18) ίη зупегду ууНЬ ΙΙ_-2 юбисез 1е1Ьа11иг>д нуигу ίη гтсе: а ро1епйа! го1е !ог су1ок1пез, сЬетокюез, апб па1ига! кб1ег сеНэ ίη (Ье ра1Ьодепез15 οί ίηΙβΓβίίΙίβΙ рпеитота. В1оод. 2002 РеЬ 15:99(4):1289-98.
И-2/ΤΟΡ-β • Соп1го1 οί С04 βίίβοίΟΓ !а(е: капзГопгнпд дгоуЛЬ (ас(ог Ье(а 1 апб 1п1ебеик1п 2 зупегд12е Ιο ρΓβνβηί арор!оз13 апб рготоГе ейес1ог ехрапзюп. б Ехр Мед. 1995 Зер 1;182(3):699-709.
ΙΗ2/ΙΡΝ-Ι.Ί * Секреция ,д В-клетками • И-2 индуцирует экспрессию ΙΡΝ-γ Т-клетками
Ιί-2/ΙΡΝ-α/β •Нет
ΙΙ_-3/ΙΙ_-4 • Синергизм при росте тучных клеток • ЗупефзНс ейес1з οί Ιί-4 апб ейЬег ОМ-СЗР ог ΙΙ.-3 оп 1Ье юбисНоп οί СО23 ехргеззюп Ьу Ьитап топосуГез: геди!а(огу е#ес!з οί 1РИ-а1рЬа апб ΙΡΝ-датта. СуЬэк/пе. 1994 би!;б(4):407- 13.
К-З/И-б
И-З/И-6
Ιί-3/ΙΡΝ-γ • И-4 апб ΙΡΝ-датта зупегд1зНсаНу юсгеазе (о1а) ро1утепс 1дА гесер!ог ΙβνβΙβ ίη Ьитап 1п1езНпа1 ерЛЬеЛа! се11з. Ро1е οί ρΓοίβΐη (угозте к1пазез. Лттипо/. 1996 бип 15;156(12):4807-14.
И-З/ОМ- • ΟίίίβΓβηίίθί геди1абоп οί Ьитап θοδίηορΝΙ И-З, Ιί-5, апб ОМ-СЗР
СЭР гесер(ог а1рЬа-сЬа1П ехргеззюп Ьу су1ок1пез: 1Ь-3, 1Ь-5, апб ОМ- СЗР бо«т-геди1а1е И-5 гесер1ог а1рЬа ехргеззюп νν№ 1озз οί 11-5 гезропзмепезз, Ьи1 ир-геди1а!е 11_-3 гесерГог а1рЬа ехргеззюп. б /ттипо/. 2003 бип 1;170(11):5359-66. (аллергическое воспаление)
- 140 020464
И-4/И-2 • Ιί-4 зупегд1з1гса11у епЬапсез Ьо1Ь И_-2- апР П_-12-тРисеР 1ΡΝ- {датта} ехргеззюп ίη типпе ΝΚ сеНз. В1оод. 2003 Маг 13 [ЕриЬ аНеаР οί ρπηί]
11.-4/11.-5 • ЕпЬапсеР таз! сеН Ь1з1атюе βίο. зесгеЬоп ίη гезропзе 1о 1дЕ А ТЬ2-Нке су1ок(пе гезропзе ίβ ίηνοΙνβΡ ίη ЬиНоиз ретрЫдо!р.1Ье го1е οί Ιί-4 апР И-5 ΐπ 1Ке раЙюдепезгз οί 1Ье сйзеазе. Ιηί 2 1ттипора1Ьо1 РЬагтасо!. 1999 Мау-Аид;12(2):55-61.
И-4/И-6
И-4/1Ы0
Ιί-4/11.-11 • Зупегд|$1ю ю1егас1юпз ЬеЬлгееп т1ег1еикт-11 апР 1п1ег1еик1п-4 ίη зиррой οί ρΓοΙίίθΓθίίοη οί ρπιτιίΐίνβ Нета1оро1еПс ргодепйогз οί т!се. 6/ооР. 1991 5ер 15;78(6): 1448-51.
И-4/И-12 • Зупегд13Йс еЯес1з οί Ιί-4 апР 11-18 оп 1Ь-12-РерепРеп1 ΙΡΝ- датта ргоРисйоп Ьу РепРпйс сеНз. / 1ттипо1. 2000 Лап 1 ,Ί 64(1):64-71. (увелимение ТМ/ТЬ2-дифференцировки) • Ιί-4 зупегд1зйса11у еппапсез Ьо1К ΙΙ.-2- апс1 1Ь-12-1пРисеР ΙΡΝ- {датта} ехргеззюп ίη толпе ΝΚ сеИз. В1оод. 2003 Маг 13 [ЕриЬ аЬеаР οί ρπηί]
11.-4/11.-13 » АЬз1гас1 1п1ег1еик1п-4 апс1 1п1ег1еикт-13 э<дпаНпд соппесйопз тарз. Зс/епсе. 2003 Лип 6;300(5625): 1527-8. (аПегду, азФта) • ΙηίιίΡίίίοη οί 1Ье И-4/И-13 гесер1ог зуз1ет ргеуеп1з аНегдю зепз^гайоп улИтои! айесЬпд ез1аЬВзЬеР аПегду ίη а тоизе торе! 1ог аНегдю аз!Ьта. Л АПегду СНп 1ттипо1. 2003 Лип;111(6):1361- 1369.
1Ь-4/И-16 • (астма) 1п1ег1еик1п (11_)-4/11_-9 апР еходепоиз И-16 тРисе 11-16 ргоРисВоп Ьу ВЕА5-2В сеНз, а ЬгопсЫа! ерНЬеВа! сеН Ппе. СвН 1ттипо1. 2001 РеЬ 1:207(2):75-80
П.-4/П.-17 • 1п1ег1еик1п (П_)-4 апР И-17 зупегд15Йса11у зйти!а!е П.-6 зесгеВоп ίη Ьитап οοΙοηίο туоЛЬгоЫаз1з. Ιηί Л Мо1 Мед. 2002 Νον;10(5):631-4. (Ои1 |'п11атта1юп)
Ιί-4/Ιί-24 • ΙΙ.-24 13 ехргеззеР Ьу га1 апР Ьитап тасгорЬадез. 1ттипоЫо1оду. 2002 Ли1;205(3):321-34.
П.-4/П.-25 • АЬз1гас1 Νθνν Ιί-17 1атНу тетЬегз рготоТе ТЫ ог ТЬ2
- 141 020464
гезропзез ίη 1Не 1ипд: ίη νίνο ίυηοίίοη οί Ше ηονβΙ су!ок1пе И-25. Й ΙηνηυηοΙ. 2002 3и11,169(1):443-53. (аПегдю 1пЛатта1юп) • АЬз1гас1 Маз1 се11з ргойисе 1п1ег1еик!п-25 ироп РсерзНоп ΚΙтей'и1ей ас1к/айоп. ΒΙοοά. 2003 Мау 1;101(9):3594-6. ЕриЬ 2003 Йап 02. (аПегдю 1пЯатта1юп)
И-4/ΙΡΝ-γ • АЬз1гас1 1п*ег!еикю 4 тйисез >п*ег1еик1п 6 ргойископ Ьу епйо№е1|а1 се11з: зупегду ννίΙΗ ю1ейегоп-датта. Еиг Й !ттипо1. 1991 Йап;21 (1):97-101.
И-4/ЗСР • Кеди1аЙоп οί Нитап 1п1ез11па1 таз1 се11з Ьу з1ет се11 1ас1ог апй Ιί-4.1ттипо1 Ρβν. 2001 РеЬ; 179:57-60. Κβνίβνν.
Ιί-5/И-З • ОИТегепйа! геди!а(юп οί Нитап βοΒϊηορΗίί Ιί-3, Ιί-5, апй 6М-С5Р гесер(ог а1рНа-сНа1п ехргеБзюп Ьу сукМпез: 1Ь-3, И-5, апй СМ- СЗР Йоу/п-геди1а)е 1Ь-5 гесер(ог а1рНа ехргеззюп ννίΐΗ 1озз οί 11,-5 гезропзкепезз, Ьи( ир-геди1а1е 1Ь-3 гесер1ог а1рНа ехргеззюп. 7 1ттипо1. 2003 Йип 1;170(11):5359-66. (Аллергическое воспаление, см. краткое изложение)
1Ι_-5/Ι1_-6
И-5/И-13 • ΙηΗίΜίοη οί аПегдю а1п»ауз тЯаттайоп апй а1пл/ау Нуреггезропзкепезз ίη пьсе Ьу йехатеШазопе: го1е οί еозторННз, ΙΕ-5, ео(ах(п, апй 11_-13. ϋ АНегду СНп 1ттипо1. 2003 Мау;111 (5):1049-61.
ΙΙ_-5/ΙΙ_-17 • 1п1ег1еик1п-17 огсНез1га!ез 1Не дгапи1осу{е ίηίΐυχ ίηΐο а1пл/ауз аКег аНегдеп тНа1акоп ίη а тоизе тойе! οί аПегдю азШта. Ат 7 Яезр/г Се// Мо1 ВЫ. 2003 йап;28(1 ):42-50.
Ιί-5/Ιί-25 • АЬзкас/ Νβνν П_-17 /атНу тетЬегз ргото(е ТН1 ог ТН2 гезропзез ίη 1Не 1ипд: ίη νίνο /ипскоп οί 1Не ηονβΙ су!ок1пе ΙΕ-25. Й 1ттипо1. 2002 3и11;169(1):443-53. (аллергическое воспаление) • АЬзкас1 Маз! се11з ргойисе 1п)ег1еик1п-25 ироп РсерзНоп ЫтесЛа(ей асШакоп. ΒΙοοά. 2003 Мау 1,101(9):3594-6. ЕриЬ 2003 Лап 02. (аллергическое воспаление)
И-5/ΙΡΝ-γ
И-5/СМ- • О|йегепка! геди!акоп οί Нитап βοείηορΗίΙ 1Ь-3, И.-5, апй СМ-СЗР
С8Р гесер!ог а!рНа-сНат ехргеззюп Ьу суЮктез: 1Ь-3, 1Б-5, апй СМ-
- 142 020464
СВР боууп-геди1а1е 1Ь-5 гесер1ог а!рЬа ехргеззюп ννίίΚ 1озз οί 1Ь-5 гезропзмепезз, Ьи1 ир-геди1а1е Ιί,-З гесерЮг а1р1эа ехргеззюп. б 1ттипо1. 2003 Лип 1;170(11):5359-66. (Аллергическое воспаление)
И-6/11-10
Н.-6/Н.-11
Ц-6/1Ы6 • 1п1ег1еик1п-16 зйти1а1ез 1Ье ехргеззюп апб ргобисйоп οί рго- 1пТ1атта1огу суФкюез Ьу питал топосу1ез. 1ттипо1оду. 2000 Мау;100(1):63-9.
11.-6/11.-17 • 8йти1айоп οί анууау тисю депе ехргеззюп Ьу 1п1ег1еик1п (11.)-17 ЙкоидЬ И-6 рагасппе/аи!осппе 1оор. б ΒϊοΙ СЬет. 2003 Мау 9;278(19):17036-43. ЕриЬ 2003 Маг 06. (воспаление дыхательных путей, астма)
Н.-6ЛЫ9 • АЬз1гас1 И-19 юбисез ргобисйоп οί Ιί-6 апб ТИР-а|рЬа апб гезиИз ΐη сеН арор1оз13 1ЬгоидЬ ТЫР-а1рЬа. б 1ттипо1. 2002 Ос1 15; 169(8):4288-97.
Ιί-θ/ΙΡΝ-д
11.-7/11.-2 • 1п(ег1еик1п 7 ууогзепз дгаЙ-уегзиз-Ьоз! б!зеазе. ΒΙοοά. 2002 Ос( 1;100(7):2642-9.
Ιί-7/Ιί-12 • 8упегд1з(1с е(Тес!з οί 11_-7 апб 11_-12 оп Ьитап Т сеН асйуайоп. б 1ттипо1. 1995 Мау 15:154(10):5093-102.
И-7/1Ы5 • 1п1ег|еик1п-7 апб ю(ег1еи1бп-15 геди1а1е 1Ье ехргеззюп οί 1Ье Ьс12 апб с-туЬ депез ίη си(апеоиз Т-се11 1утрКота сеНз. ΒΙοοά. 2001 Νον 1:98(9):2778-83. (фактор роста)
Ιί-8/И-Н • АЬпогта! ргобисйоп οί 1п1ебеик1п (11.)-11 апб И-8 ίη ро1усу1Ьает1а уега. Су(ок/пв. 2002 Νον 21;20(4):178-83.
И-8/1Ы7 • ТЬе Ро1е οί И-17 ίη ϋοίηί Оез1гисйоп. Огод Λ/βνν$ Регзрес!. 2002 иап;15(1):17-23. (артрит) • АЬз(гас( 1п(ег1еик1п-17 зйти1а1ез №е ехргеззюп οί 1п(ег1еикю-8, дгоуу!Ь-ге1а1еб опсодепе-а1рЬа, апб дгапи1осу1е-со1опу-зйти1айпд 1ас1ог Ьу Ьитап а1п/уау ерНЬеПа! сеНз. Ат б Резр1г СеН ΜοΙ ΒίοΙ. 2002 3ип;2б(6):748-53. (воспаление дыхательных путей)
И-8/С5Р • 1п1ебеик1П-8: ап аиЮсппе/рагасппе дгоиЛЬ 1ас1ог /ог Ьитап
- 143 020464
Ьета1оро1ейс ргодепИогз асйпд ίη зупегду ννίίή со1опу з1)ти1айпд (ас1ог-1 Ю ргото(е топосу(е-тасгорИаде дго<МЬ апй сНГГегепйайоп. Ехр Нета1о1.1999 Эап;27(1 ):28-36.
Ιί-δΛ/СЕР • 1п1гасауйагу \/ЕСР, ЬРСР, 11-8, 11_-12 ΙβνβΙδ ίη рптагу апс! гесшгеп! таНдпап! дНота. 7 Ыеигоопсо/. 2003 Мау;62(3):297- 303.
И-9/И-4 • Ап1нп1ег1еик'т-9 апВЬоРу 1геа1теп1 ίηήίϋίίε а1плгау 1пЯаттайоп апс) Ьурелгеас1М1у ίη тоизе аз1Ита тос!е1. Ат Л Кезр/г Сп'( Саге Мед. 2002 Аид 1;166(3):409-16.
И-9/И-5 • Ри1топагу оуегехргеззюп οί И_-Э тбисез ТЬ2 суЮкте ехргеззюп, 1еасПпд ίο ттипе ра1Ьо1оду. 4 СИп 1тез(. 2002 Зап;109(1):29-39. • ТЬ2 су!ок(пез апб аз1Ьта. 1п1ег1еик1п-9 аз а (Ьегареийс 1агде( (ог аз(Ьта. Кезр/гРез. 2001;2(2):80-4. ЕриЬ2001 РеЬ 15. Ρβνίβνν. АЬз1га<Л 1п(ег1еик1П-9 епЬапсез 1п1ег1еик!п-5 гесер!ог ехргеззюп, <Жегепйа(юп, апс) зитуа! οί Ьитап βοείηορίιίΐε. В1оод. 2000 Зер 15;96(6):2163-71 (астма)
ΙΙ_-9/ΙΙ_-13 • Ап1нп1ег1еик1п-9 апйЬойу (геа(теп( ίηίιίόίίβ а1гшау т(1атта(юп апб Ьуреггеас1м(у ίπ тоизе аз!Ьта тоРе1. Ат 4 Еезр/г СгИ Саге Мед. 2002 Аид 1,166(3):409-16. • ϋίΓβοί ейес1з οί 1п1ег1еик1п-13 оп ерМеКа! сеНз саизе а1гу/ау Ьуреггеас4м1у апс1 тисиз оуегргоРисИоп ίη аз1Ьта. Л/а? Мед. 2002 Аид;8(8):885-9.
И-9/11-16 • См. И-4/1Ы6.
ΙΙ_-10/ΙΙ_-2 • ТЬе 1п1егр1ау οί |Шег1еик1п-10 (11-10) апс! |'п(ег1еик(п-2 (И-2) ίη Ьитога! 1ттипе гезропзез: И-10 зупегд!2ез ννίίΚ И-2 ίο епКапсе гезропзез οί Ьитап В 1утрЬосу1ез ίη а тесЬатзт ννήίοΜ Ϊ3 άίίίβΓβηί кот иргеди1а1юп οί СО25 ехргеззюп. СеН 1ттипо1. 1994 5ер;157(2):478-88.
И-10/1Ы2
и-юяер-β • ΙΙ.-10 апс) ТСР-Ье1а соорега!е ίη 1Ье геди1а1огу Т сеН гезропзе ίο тисоза) аПегдепз ίη погта! 1ттиш(у апб зресФс 1ттипо1Ьегару. Еиг 41ттипо1. 2003 Мау;33(5):1205-14.
- 144 020464
И-10/ΙΡΝ-γ
ΙΙ_-11/ΙΙ.-6 * 1п1ег1еик1П-6 апб 1п1ег!еик1п-11 зиррог! Ьитап ов1еос1аз1 ГогтаИоп Ьу а КАМКЫпберепбеп! тесЬагивт. Вопе. 2003 бап;32(1):1-7. (резорбция кости при воспалении)
И-11/И-17 • Ро1алгеб ιη νίνο ехргеззюп οί )Ы1 апб ΙΙ--17 ЬеЬлгееп аси1е апб сЬгопю вк1П Ιβδίοηδ. 4 АПегду СНп 1ттипо1. 2003 Арг;111(4):87581. (аллергический дерматит) • ΙΙ.-17 ргото1ев Ьопе егозюп ΐη типпе со(1адеп-1пбисеб агНтпйз ИггоидЬ 1озв οί Пае гесер1ог асйуа1ог οί ΝΡ-карра В ||дапб/оз1еорго1едепп Ьа1апсе. 4 1ттипо1. 2003 Маг 1;170(5):2655-62.
Ιί-11/ΤΟΡ-β • Ро1апгеб ϊη νίνο ехргеввюп οί И-11 апб ΙΙ_-17 ЬеЪл/ееп аси!е апб сЬгопю вк1П 1евюпв. 4 АПегду СНп 1ттипо1. 2003 Арг;111 (4):875- 81. (аллергический дерматит)
11-12/1ЫЗ • Ре1а11опвЬ|р οί 1п(ег1еикт-12 апб 1п1ег(еик1п-13 1тЬа1апсе νι/ίΐή с1азз-зресйю гЬеита1оИ ίθοίοτδ апб апЬсагбюНрт апйЬосйез ΐη вуз1етю 1ириз егу1Ьета1озиз. СНп РЬеита1о1. 2003 Мау;22{2): 107-11.
11.-12/11.-17 • иргеди!айоп οί (п1ег1еикгп-12 апб -17 ίη ас!йе 1пйатта1огу Войте! скзеаве. Зсапс! 4 Саз1гоеп[его1. 2003 РеЬ;38(2):180-5.
И.-12/И.-18 • 5упегд1зйс рго!Иегайоп апб асйуайоп οί па1ига1 кШег се11з Ьу 1п(ег1еик1п 12 апс! 1л1ег1еик<п 18. Су1ок1пе. 1999 Νον;11(11):822- 30. • 1пЯатта1огу Ι_ΐνβΓ 31еа(оз15 Саизеб Ьу И-12 апб 1Ы8. 4 Ιηίβι/егоп Су(ок1'пе Рез. 2003 Маг;23(3): 155-62.
И-12/И-23 • п1ег1еик'т-23 гайпег 1Ьап 1п4ег1еикт-12 ΐε №е спйса! суМбпе ίοτ аикнттипе юйаттайоп οί 1Ье Ьга1п. ΝβίυΓβ. 2003 РеЬ 13;421 (6924):744-8. • АЬз(гас1 Α υηίςυβ го1е ίοτ 1(--23 ίη рготойпд се11и1аг 1ттипЙу. 4 Ьеикос Βϊοί. 2003 бап;73(1 ):49-56. Обзор.
И-12/И-27 • АЬз1гас1 И-27, а Ье1егоб1тепс су1ок|пе сотрозеб οί ΕΒΙ3 апб р28 рго1ет, тбисез ргоМегайоп οί паюе СЭ4(+) Т се11з. 1ттипНу. 2002 бип;16(6):779-90.
- 145 020464
И-12/ΙΡΝ-γ • И-12 индуцирует экспрессию ΙΡΝ-γ В- и Т-клетками как часть иммунной стимуляции.
11-13/11-5 •См. И-5/И-13.
11.-13/11.-25 • АЬз1гас1 Νβν/ 1Ы7 ТатЯу тетЬегз рготоХе ТЫ ог ТЬ2 гезропзез ίη 1Ье 1ипд: ίη νίνο ίυηοΐίοη οί 1Ье ηονβΙ су1оМпе )1.-25. 7 1ттипо1. 2002 Эи11 ;169(1):443-53. (аллергическое воспаление) • АЬз(гас( Маз! се11з ргойисе 1п1еПеик1п-25 ироп РсерзЛоп ΡΙтей1а1ей асйуайоп. В/оой. 2003 Мау 1;101 (9):3594-6, ЕриЬ 2003 Зап 02. (аллергическое воспаление)
)1.-15/11.-13 • ОНТегепКа! ехргеззюп οί 1п(ег1еик1пз (11)-13 апй И-15 ίη βσίορίο апс! βιΛορίο епйоте1пит οί ν/отеп ν/ИЬ епйоте!поз1з апй погта! ίβιΐίίβ ν/отеп. Ат 4 Ееркх) 1ттипо1. 2003 РеЬ;49(2):75-83.
11.-15/11.-16 • И-15 апй 1И6 оуегехргеззюп ίη сиГапеоиз Т-се11 1утр1ютаз: з1аде-йерепйеп( юсгеазе ίη тусоз15 /ипдойез ргодгеззюп. Ехр Оегта1о1. 2000 Аид;9(4):248-51.
Ιί-15/11.-17 • АЬз1гас1 Н_-17, ргойисей Ьу 1утрЬосу1ез апс! пеи1горЫ1з, 13 песеззагу ίοτ Проро1узассЬапйе-1пйисей а1пд/ау пеШгорЫНа: 11.-15 аз а розз1Ые 1пддег. 3 1ттипо1, 2003 РеЬ 15;170(4):2106-12. (воспаление дыхательных путей)
И-15/И-21 • И-21 ίη Зупегду ννίΐΚ Ιί-15 ог ΙΙ.-18 ЕпЬапсез ΙΡΝ-датта Ргойисйоп ίη Нитап ΝΚ апс) Т СеПз. 7 1ттипо1. 2003 Зип 1 ;170(11):5464-9.
ΙΙ.-17/ΙΙ.-23 • 1п1ег1еик1п-23 ргото!ез а Й1зйпс1 СО4 Т се11 асйуайоп з(а(е сЬагас(епгей Ьу 1Ье ргойисйоп οί 1п4ег1еикт-17. 4 ΒΐοΙ СРет. 2003 Зап 17,278(3):1910-4. ЕриЬ 2002 Νον 03
Ι1_-17/ΓΘΡ-β • Ро)апгей ίη νίνο ехргеззюп οί Ιί-11 апй 11-17 ЬеЬл/ееп аси1е апб спгопю зкт 1езюпз. 3 АНегду СНп 1ттипо1. 2003 Арг;111(4):875- 81. (аллергический дерматит)
1Ы8/1Ы2 • Зупегд^зйс ргой/егайоп апй асйуайоп οί па1ига! кШег се11з Ьу 1п1ег1еик1п 12 апй 1п1ег1еик1п 18. Су1оМпе. 1999 Νον; 11 (11 ):822- 30. • АЬз1гас11пЫЫйоп οί ίη νίΐτο 1ттцпод1оЬц(1п ргойисйоп Ьу И-12 ίη типпе сЬгопю дгай-уз.-Ьоз! сйзеазе: зулегд1зт νν№ Ιί-18. Еиг 4
ΙιππκιηοΙ. 1998 Зип;28(6):2017-24.
И.-18/П.-21 • 1Ь-21 ίη Зупегду ν/ίΐίι 11-15 ог 11.-18 ЕпЬапсез ΙΡΝ-датта Ргойисйоп ίη Нитап ΝΚ апй Т СеПз. 4 1ттипо1. 2003 Зип 1,-170(11):5464-9.
И.-18/ГСР-0 • 1п1ег1еикгп 18 апй Бапз/оптйпд дгоМЬ Тас1ог Ье1а1 ίη 1Ье зегит οί райеп1з м(Ь Огауез' орМЬа1тора1Ьу 1геа1ей ίλ/ϊΙΙί согйсоз1его1йз. Ιηί 1ттипорЬаггпасо1. 2003 Арг;3(4):549-52.
Н.-18/ΙΡΝ-Ο
Αηίί-ΤΝΡ Синергичный терапевтический эффект на мышей СВА/1 с
ΑίΡΗΑ/апй- артритом.
Οϋ4
- 146 020464
Приложение 3.
Онкологические комбинации
Мишень Заболевание Образует пару с
СО89* Используют как рекрутера цитотоксических клеток Все
СО19 В-кпеточные лимфомы Н1.А-ОР Οϋδ
ΗΙΑ-ΌΗ В-клеточные лимфомы Οϋ89 Οϋ19 Οϋ5
СО38 Множественная миелома СО138 Οϋ56 ΗΙΑ-ϋΡ
СО138 Множественная миелома СО38 СО56 ΗίΑ-ϋΡ
СО138 Рак легкого СО56 СЕА
СОЗЗ Острая миелобластная лимфома СО34 ΗίΑ-ΟΡ
Οϋ56 Рак легкого С0138
- 147 020464
СЕА
СЕА Рак поджелудочной железы Рецептор МЕТ
νεορ Рак поджелудочной железы Рецептор Μετ
Рецептор νεορ Рак поджелудочной железы Рецептор МЕТ
И-13 Астма/воспаление легких И-4 И-5 Эотаксин (эотаксин ы) МЭС ТАКС ΤΝΡα Ιί-9 ΕΘΡΚ С 0401- Ιί-25 МСР-1 тсрр
И-4 Астма ΙΙ.-13 Ιί-5 Ео(ах1П(в) МОС ТАКС ΤΝΡα Ιί-9 ЕСРР СО40Ь Н_-25 МСР-1 ТСР0
Эотаксин Астма Н_-5 Ео4ах1П-2 Ео1ах1п-3
- 148 020464
ЕСРР Злокачественные новообразования НЕР2/пеи НЕРЗ НЕР4
НЕР2 Злокачественные новообразования НЕРЗ НЕР4
ΤΝΡΡ1 РАУболезиь Крона 1Ь-1Р 1Ь-6Р ΙΙ.-18Ρ
ΤΝΡβ РА/болезнь Крона 1Ь-1а/р 1Ь-6 И-18 1САМ-1 ΙΙ.-15 11_-17
И-1Р РА/болезнь Крона Ιί-6Ρ И-18Р
1И8Р РА/болезнь Крона 11.-6Р
Приложение 4.
Краткое изложение данных
МИШЕНЬ ель Равновесная константа диссоциации (К8 = Κοίί/Κοη) ΚοίΓ 1С50 для исследования с лигандом N050 для основанного на кл етках и сел ед о вания нейтрализации
ТАР1 Мономеры ТАР1 от 300 нМ до 5 пМ (то есть, от 3 х 10'7до 5 х 10'12), предпочтительно от 50 нМ до 20 пМ от 5 х 10’11о 1 х 10’' от 500нМ до ЮОпМ от 500 нМ до 50 пМ
Димеры ТАР1 Как для мономера ТАР1 Как для мономера ТАР1 Как для мономера ТАР1 Как для мономера ТАР1
Т римеры ТАР1 Как для мономера ΤΑΡ1 Как для мономера ΤΑΡ1 Как для мономера ТАР1 Как для мономера ТАР1
ТАК1-5
ТАР 1-27
Мономер ТАР 1-5-19 30 нМ
Гомодимер ТАК1-5-19 С линкером (С1у,8ег)3 = 20 нм С линкером (С1743ег)я = 2 нм =30 нМ
- 149 020464
С линкером (О1у43ег)7 = 10 нм В Формате РаЬ = 1нМ =ЗнМ =15 нМ
Гетеродиме ры ТАК1-5- 19 С линкером (С1у43ег)„ ТАРП-5-19 62 = 2 нМ ТАРП-5-19 63 = 8 нМ ТАК1-5-19 64 = 2-5 нМ = 12 нМ = 10 нМ
ТАК1-5-19 65 = 8 нМ В формате РаЬ ТАК1-5-19СН 61СК = 6 нМ ТАК1-5-19СК 61 СН = 6 нМ ТАК1-5-19СН 62СК = 8 нМ ТАК1-5-19СН 63СК = 3 нМ
= 12 нМ
Гетеродиме ры ТАК1-5 С линкером (С1у43ег)„ ТАЕ1-561 = 30 нМ ТАР 1-562 = 50 нМ ТАР 1-563 = 300 нМ ТАР1-564 = 3 нМ
ТАК1-565 = 200 нМ ТАР1-566 = 100 нМ В формате РаЬ ТАР1-5СН 62СК = 30 НМ = 60нМ
ТАР1-5СК63СН = 100 нМ
Гомотример ТАК1-5-19 0,3 нМ 3-10 нМ (например, 3 нМ)
ТАК2 Мономеры ТАР2 Как мономер ТАР1 Как мономер ТАР1 от 500 нМ до 100 пМ от 500 нМ до 50 пМ
ТАК2-10
ТАН2-5
Сывороточ ный альбумин Мономеры против ЗА от 1 нМдо 500 мкМ, предпочтительно 100 нМдо ЮмкМ от 1 нМ до 500 мкМ, предпочтительно 100 нМ до ЮмкМ
В формате с двойной специфичностью аффинность к мишени В формате с двойной сп е цифи чн ость ю аффинность к мишени
составляет от 1 до 100000 аффинности ЗА 6АЬ аффинности, например, 1мкМ аффинность к ЗА составляет от 1 до 100000 аффинности ЗА 6АЬ аффинности, например, 1 мкМ аффинность к ЗА
МЗА-16 200 нМ
МЗА-26 70 нМ
- 150 020464
Перечень последовательностей <110> Клуб, Джаспер
Джеспере, Лорен Томлинсон, Айан Холт, Люси Шон, Оливер <120> Отдельные вариабельные домены антител против сывороточного альбумина <130» 208039-2145 <140» 11/704,832 <141» 2007-02-08 <150» РСТ/СВ05/002163 <151» 2005-05-31 <150» 11/023,959 <151» 2004-12-28 <150» 60/632,361 <151» 2004-12-02 <150» 60/576,271 <151» 2004-06-01 <150» РСТ/СВОЗ/002804 <151» 2003-06-30 <150» СВ 0230202.4 <151» 2002-12-27 <150» РСТ/СВ02/03014 <151» 2002-06-28 <160» 263 <170» РаСепЫп νβΓ3ίοη 3.3 <210» 1 <211» 5 <212» ПРТ <213» Искусственная последовательность <220» <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400» 1 <31у 61у С1у 61у Зег
5 <210» 2 <211» 40 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220» <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <220»
- 151 020464 <221? ΜΟΏ_ΕΕΞ <222? (6),.(40) <223> Может присутствовать или может не присутствовать <220?
<22 3> Подробное описание замен и предпочтительных воплощений смотри в описании изобретения <400? 2 <31у С1у С1у <31у Зег С1у С1у С1у СТу Зег 61у С1у С1у С1у Зег СТу
10 15
С1у С1у С1у 5ег С1у СТу С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у 20 25 30
С1у С1у Зег СТу С1у С1у С1у Зег 35 40 <210? 3 <211? В <212? ПРТ <213? Искусственная последовательность <220?
<223? Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <220?
<221? МСФЕЕЗ <222? (6)..(8) <223? Вариабельная аминокислота <400? 3
Ьуз 7а1 С1и Не Ьуз Хаа Хаа Хаа
5 <210? 4 <211? 8 <212? ПРТ <213? Искусственная последовательность <220?
<22 3> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <220?
<221? ΜΟϋ_ΕΕ3 <222? (6)..(6) <223? Вариабельная аминокислота <400? 4
Ьуз Ьеи 61и Не Ьуз Хаа Хаа Хаа
5 <210? 5 <211? е <212? ПРТ <213? Искусственная последовательность <220?
<223? Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
- 152 020464 <220?
<221? МОЬ_Р.ЕЗ <222? (6),.(8) <223? Вариабельная аминокислота <400? 5
Ьуз 7а1 Азр Не Ьуз Хаа Хаа Хаа 1 5 <210? 6 <211? 8 <212? ПРТ <213? Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <220?
<221? МОБ_КЕЗ <222? (6) . . (8) <223? Вариабельная аминокислота <400? б
Агд Ьеи С1и 11е Ьуз Хаа Хаа Хаа
5 <210? 7 <211? 7 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: пептид <220?
<221? МОЭ_КЕЗ <222? (6)..(8) <223> Вариабельная аминокислота <400? 7
О1и Не Ьуз Агд Хаа Хаа Хаа 1 5 <210? 8 <211? 8 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223? Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический
Синтетический <220?
<221? МОО_Р.ЕЗ <222? (6)..(8) <22 3> Вариабельная аминокислота <400? 8
Ьуз 1/а1 Азр Уа1 Ьеи Хаа Хаа Хаа
- 153 020464 е21С> 9 <211? 8 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: пептид <220?
<221> МСГОКЕЗ <222? (6) . . (8) <223> Вариабельная аминокислота <400? 9
Ьуз Ьеи Азр Уа1 Ьеи Хаа Хаа Хаа <210? 10 <211? 8 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<22 3> Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический
Синтетический <220?
<221? МОЬ_КЕЙ <222? (6)..(8} <223> Вариабельная аминокислота <400? 10
С1п Ьеи Азр Уа1 Ьеи Хаа Хаа Хаа <210? 11 <211? 3 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <220?
<221? МОЬ_КЕЙ <222? (6)..(8) <22 3> Вариабельная аминокислота <400? 11
Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег Хаа Хаа Хаа <210? 12 <211? 45 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 154 020464 <220» <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <220» <221» МСГО_КЕ£ <222» (6).,(45) <223> Может присутствовать или может не присутствовать <220» <223> Подробное описание замен и предпочтительных воплощений смотри в описании изобретения <400» 12
С1у С1у С1у 1 С1у бег 5 С1у С1у С1у <31у Зег С1у С1у С31у О1у Зег С1у
10 15
О1у С1у С1у Зег О1у С1у О1у е1у Зег 01у С1у С1у <31у Зег С1у С1у
20 25 30
О1у <31у Зег С1у С1у С1у О1у Зег 61у 61у С1у О1у Зег
35 40 45
<210» 13
<211» 45
<212» ПРТ
<213» Искусственная последовательность
<220» <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <220» <221» МОЕ_ЕЕ5 <222» (6)..(45) <223> Может присутствовать или может не присутствовать <220» <223> Подробное описание замен и предпочтительных воплощений смотри в описании изобретения <400» 13
Зег Зег Зег 1 Зег <31у 5 Зег Зег Зег Зег О1у 10 Зег Зег Зег Зег С1у 15 Зег
Зег Зег Зег 01у 20 Зег Зег Зег Зег <31у 25 Зег Зег Зег Зег С1у 30 Зег Зег
Зег Зег С1у 35 Зег Зег Зег Зег С1у 40 Зег Зег Зег Зег С1у 45
<210> 14 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
<220»
- 155 020464 <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 14
Зег Зег Зег А1а Зег А1а Зег Зег А1а
5 <210? 15 <211? 7 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 15
С1у Зег Рго О1у Зег Рго <31у 1 5 <210? 16 <211? 11 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 16
А1а ТЬг ТНг ТНг С1у Зег Зег Рго Е1у Рго ТНг
10 <210? 17 <211? 18 <212? ПРТ <213? Неизвестный организм <220?
<223> Описание неизвестного организма: Природный пептидный линкер <400? 17
Ьуз С1и Зег О1у Зег Уа1 Зег Зег С1и С1п Ьеи А1а С1п РНе Агд Зег
10 15
Ьеи Азр <210? 18 <211? 35 <212? ПРТ <213? Сате1из бготедагтиз <400? 18
51и Рго Ьуз Не Рго <31п Рго (31п Рго Ьуз Рго О1п Рго ΰΐη рго О1п 15 10 15
Рго 61п Рго Ьуз Рго С1п Рго Ьуз Рго О1и Рго С1и Суз ТНг Суз Рго
156 020464
Ьуз Суз Рго 35 <210? 19 <211? 12 <212? ПРТ <213? Сате1из бготебагтиз <400? 19
01у ТЬг Азп С1и Уа1 Суз Ьуз Суз Рго Ьуз Суз Рго 15 10 <210? 20 <211? 15 <212? ПРТ <213? Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 20
С1у С1у <31у <31у Бег С1у С1у С1у С1у Бег <31у С1у С1у С1у Бег 15 10 15 <210? 21 <211? 25 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 21
С1у С1у С1у С1у Бег С1у С1у О1у С1у Бег С1у 01у С1у С1у Бег С1у 15 10 15
С1у О1у О1у Бег О1у <31у <31у С1у Бег 20 25 <210? 22 <211? 35 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 22
С1у С1у О1у С1у Бег С1у 01у 01у С1у Бег 01у 01у С1у С1у Бег С1у 15 10 15
С1у С1у <31у Бед 01у С1у С1у С1у Бег С1у С1у С1у С1у Бег С1у С51у
- 157 020464
С1у (31у Зег 35 <210> 23 <211? 22 <212? ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 23 сддссаГддс дСсаасддас ас
Синтетический <210? 24 <211? 23 <212? ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223? Описание искусственной последовательности; Синтетический праймер <400? 24 аСдСдсдсСс дадсдСССда ССС <210? 25 <211? 15 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220=· <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 25
61и Рго Дув Зег С1у Азр Дув тАг Ηϊξ ТАг Сув Рго Рго Суз Рго 15 10 15 <210? 26 <211? 50 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический <220?
<221? МОП_НЕЗ <222? (61,.(50) <223> Может присутствовать или может не присутствовать <220?
<223> Подробное описание замен изобретения предпочтительных воплощении смотри описании
- 158 020464 <400? 26
О1у О1у С1у 61у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у 61у С1у Зег <31у 15 10 15
С1у С1у С1у Зег С1у <31у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у 20 25 30
С1у <31у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у 35 40 45
О1у Зег 50 <210? 27 <211? 357 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <220?
<221? СИЗ <222? (1)..(342) <400? 27
Едд аде дед А1а Есд асд да с Азр аЕС Не сад аЕд асе сад С1п ЕсЕ Зег сса Рго Есс Зег ЕСЕ Зег 15 сЕд Ьеи 48
Тгр 1 Зег Зег ТЬг 5 С1п МеЕ ТЬг 10
ЕСЕ дса ЕсЕ дЕа дда да с сдЕ дЕс асе аЕс асЕ Еде едд дса адЕ сад 96
Зег А1а Зег ν«1 С1у Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а зег «1п
20 25 30
аде аЕЕ даЕ адЕ ЕаЕ ЕЕа саЕ едд Еае сад сад ааа сса ддд ааа дсс 144
Зег Не Азр Зег Туг Ьеи Шз Тгр Туг С1п □ 1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а
35 40 45
ССЕ аад сЕс сЕд аЕс ЕаЕ адЕ дса Есс дад ЕЕд саа адЕ ддд дЕс сса 192
Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не Туг Зег А1а Зег С1и Ьеи С1п зет С1у Уа1 Рго
50 55 60
Ееа сдЕ ЕЕс адЕ дде адЕ дда ЕсЕ ддд аса даЕ ЕЕС асЕ сЕс асе аЕс 240
Зег Агд РЬе Зег 61у Зег О1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не
65 70 75 80
аде адЕ сЕд саа ССЕ даа даЕ ЕЕЕ дсЕ асд Еае Еае ЕдЕ саа сад дЕЕ 288
Зег Зег Ьеи С1п Рго С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Уа1
85 90 95
дкд едд сдЕ ССЕ ЕЕЕ асд ЕЕс дде саа ддд асе аад дЕд даа аЕс ааа 336
Уа1 Тгр Агд РГО РЬе ТЬг РЬе <31у αΐη О1у ТЬг Ьуз Уа1 О1и Не Ьуз
100 105 но
едд Еде ЕааЕааддаЕ ссддс 357
Агд Суз
- 159 020464 <210? 28 <211? 114 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 26 ТЬг Азр Не <31п 5 МеС ТЬг 10 С1п Зег Рго Зег Зег 15 ьеи
Тгр 1 зег А1а Зег
Зег А1а Зег Уа1 <31у Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг суз Агд А1а Зег О1п
20 25 30
Зег Не Азр Зег Туг Ьеи Ηίθ Тгр Туг С1п αΐη Ьуз Рго <31у Ьуз А1а
35 40 45
Рго Дуя Ьеи Ьеи Не Туг Зег А1а Зег 61и Ьеи О1п Зег С1у Уа1 Рго
50 55 60
Зег Агд РЬе Зег С1у Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не
65 70 75 80
Зег Зег Ьеи С1п Рго С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз σΐη Θΐη Уа1
85 90 95
Уа1 Тгр Агд Рго РЬе ТЬг РЬе С1у С1ь С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз
100 105 110
Агд Суз
<210 > 29
<211? 39
<212 > ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер <400? 29
ЪддадсдсдД сдасддасаЬ ссадаЬдасс садЬсДсса 39 <210? 30 <211? 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический праймер
- 160 020464 <400? 30 геадсадссд даДссбЪаЬЬ адсассдддд даъьиссас <210? 31 <211? 5 <212> ПРТ <213? Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический <400? 31
Зег Зег Туг Ьеи Азп <210? 32 <211? 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 32
РЬе Ьуз Зег Ьеи Ьуз <210? 33 <211? 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<22 3> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 33
Туг Туг Нтз Ьеи Ьуз <210? 34 <211? 5 <212? ПРТ <213? Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 34
Агд Агд Туг Ьеи Ьуз <210? 35 <211? 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 161 020464 <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 35
Туг Азп Тгр Ьеи Ьуз
5 <210? 36 <211? 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 36
Ьеи Тгр Ηί.8 Ьеи Агд
5 <210? 37 <211? 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 37
РЬе Агд Туг Ьеи А1а
5 <210? 33 <211? 5 <212? ПРТ <213? Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 38
РЬе Туг Нтз Ьеи А1а
5 <210? 39 <211? 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 39
11е Тгр Нтз ьеи Азп
5
- 162 020464 <210> 40 <211? 5 <212> ΠΡΤ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид <400> 40
Туг Агд Туг Ьеи Агд 1 5 <210> 41 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический
Синтетический <400> 41
Ьеи Ьув Туг Ьеи Ьуз 1 5 <210> 42 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 42
Ьеи Агд Туг Ьеи Агд <210> 43 <211? 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 43
Ьеи Агд Зег Ьеи Ьуз <210? 44 <211? 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
- 163 020464 <223> Описание искусственной последовательности; Синтетический пептид <400> 44
РЬе Агд ΗίΒ Ьеи Ьуэ
5 <210> 45 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 45
Агд Ьуз Туг Ьеи Агд
5 <210> 46 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 46
Агд Агд Туг Ьеи Азп
5 <210? 47 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 47
Не Ьуз ГИз Ьеи Ьуз
5 <210> 48 <211> 5 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 48
Туг Ьуз Нтз Ьеи Ьуз 1 5
- 164 020464 <210> 49 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <2205 <223> Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический <2205· <221> МОО_К.Е5 <222> (1),.(1) <223> Вариабельная аминокислота <220>
<221> МОЬКЕЗ <222> (4) . . (4) <223> Вариабельная аминокислота <400> 49 _
Хаа А1а Зег Хаа Ьеи С1п Зег <2105 50 <2115 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <2205 <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <4005 50
Агд А1а Зег Рго Ьеи С1п Зег <210> 51 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400ь 51
Азп А1а Зег Туг Ьеи С1п Зег <2105 52 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <2205 <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <4005 52
Ьуе А1а Зег ТЬг Ьеи С31п Зег 1 5
- 165 020464 <210> 53 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 53 <31п А1а Зег ν&1 Ьеи <31п Зег
5 <210? 54 <211? 7 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 54
Агд А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег
5 <210? 55 <211? 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 55
Нтз А1а Зег Ьеи ьеи С31п Зег
5 <210? 56 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 56
Н13 А1а Зег Нтз Ьеи 51п Зег 1 5 <210? 57 <211? 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
- 166 020464 <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 57
Рго А1а Зег Ьуз Ьеи С1п Зег
5 <210? 58 <211? 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<22 3> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 53
Агд А1а Зег Агд Ьеи С1п Зег
5 <210? 59 <211? 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 59
Ьуз А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег
5 <210? 50 <211> 7 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 60
Азп А1а Зег ΗΪ3 Ьеи С1п Зег
5 <210? 61 <211? 7 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 61 '
Ьуз А1а Зег Тгр Ьеи С1п Зег
5
- 167 020464 <210? 62 <211? 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223? Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 62
А1а А1а Зег Агд Ьеи О1п Зег <210? 63 <211? 7 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 63
ТЬг А1а Зег Зег Ьеи О1п Зег <210? 64 <211? 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический <400? 64
А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег <210? 65 <211?
<212?
ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности:
пептид
Синтетический <400? 65
С1у АТа Зег Агд Ьеи С1п Зег <210? 66 <211? 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический
- 168 020464 <220?
<221? МОЕЕЕЙ <222> (3)..(6) <223> Вариабельная аминокислота <220?
<221? МОЕ_КЕЗ <222? (8).,(8) <223> Вариабельная аминокислота <400? 66 с1п С1п Хаа Хаа Хаа Хаа Рго Хаа ТЬг 1 5 <210? 67 <211? 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 67
О1п С1п ТЬг Туг Зег Уа1 Рго Рго ТЬг
5 <210? 68 <211? 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 68
С1п С1п ТЬг Туг Агд Не Рго Рго ТЬг
5 <210? 69 <211? 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 69
О1п σΐη Уа1 Уа! Туг Тгр Рго Уа1 ТЬг
5 <210? 70 <211? 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
- 169 020464 <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400» 70
С1п С1п 37а1 Агд Ьуе Уа1 Рго Агд ТКг
5 <210» 71 <211» 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220» <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400» 71
О1п С1п О1у Ьеи Туг Рго Рго Не ТЬг <210» 72 <211» 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220» <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400» 72
С1п С1п Азп Уа1 Уа1 11е Рго Агд ТЬг
5 <210» 73 <211» 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220» <223> Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический <400» 73
С1п О1п Зег А1а Уа1 Туг Рго Ьуз ТЬг <210» 74 <211» 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220» <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400» 74
С1п ΰΐη Агд Ьеи Ьеи Туг Рго Ьуз ТЬг
5
- 170 020464 <210> 75 <211? 9 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 75
С1п В1п Агд А1а Агд Тгр Рго Агд ТЬг <210? 76 <211? 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 76
С1п С1п 7а1 А1а Агд Уа1 Рго Агд ТЬг <210? 77 <211? 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<22 3> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 77
С1п 51п Туг Т/а1 С1у Туг Рго Адд ТЬг
5 <210? 78 <211? 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 78
С1п Οίη ТЬг ТЬг Туг Туг Рго Не ТЬг <210? 79 <211? 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
- 171 020464 <400? 79
О1п 01η Уа1 Ьеи Туг Туг Рго Οίη ТЬг 1 5 <210? 80 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический <400? 80
С1п О1п Уа1 Уа1 Туг Тгр Рго А1а ТЬг 1 5 <210? 81 <211? 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 81
С1п О1п Уа1 А1а Ьеи Туг Рго Ьуз ТЬг
5 <210? 82 <211? 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический <400? 82
Οίη Οίη Азп Ьеи РЬе Тгр Рго Агд ТЬг <210? 83 <211? 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: пептид
Синтетический <400? 83
01η С1п МеЬ Ьеи РЬе Туг Рго Ьуз ТЬг 1 5 <210? 84 <211? 9
- 172 020464 <212> ПРТ <213? Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 84
С1п С1п С1у А1а Агд Тгр Рго С1п ТЬг <210? 85 <211> 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 85
С1п О1г. Уа1 С1у Агд Туг Рго Ьуа ТИг
5 <210? 86 <211? 6 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 86
Тгр Уа1 Туг С1п МеЕ Азр <210? 87 <211? 6 <212> ПРТ <213? Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 87 тгр Зег Туг С1П мес тНг <210? 88 <211? 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <220?
- 173 020464
<210-- 90 <211> 17 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 90
Зег Не Зег Зег РЬе С1у Зег Зег ТЬг Ьеи Туг А1а Азр Зег 7а1 Ьуе 15 10 15
С1у
- 174 020464 <210> 91 <211> 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 91
Ьеи Зег С1у Ьуе РЬе Азр Туг <210> 92 <211> 11 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 92
С1у Агд Азр Ηϊβ Азп Туг 5ег Ьеи РЬе Азр Туг
10 <2105 93 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический олигонуклеотид <4005 93 сассоссасд асдссоссда осаодса <2105 94 <2115 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 94
Туг Рго Туг Азр Уа1 Рго Азр Туг А1а <210> 95 <2115 11 <212> ПРТ <21 3> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
- 175 020464 <400? 95
Агд А1а Зег С1п Тгр Не С1у Зег С1п Ьеи Зег
10 <210? 96 <211? 7 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 96
Тгр Агд Зег Зег Ьеи С31п Зег <210? 97 <211? 9 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400? 97
А1а Οίη С1у А1а А1а Ьеи Рго Агд ТЬг <210? 93 <211? 7 <212> ПРТ <213? Ното заргепз <400? 98
Зег Рго О1у Ьуз А1а ТЬг О1и 1 5 <210? 99 <211? 9 <212> ПРТ <213? Ното заргепз <400? 99
Туг МеД МеД О1у Азп С1и Ьеи ТЬг РЬе 1 5 <210? 100 <211? 9 <212> ПРТ <213? ното заргепз <400? 100
Ьеи МеД Туг Рго Рго Рго Туг Туг Ьеи 1 5 <210? 101
- 176 020464 <211? 6 <212> ПРТ <213? Ношо заргепз <400? 101
Мер Туг Рго Рго Рго Туг 1 5 <210? 102 <211? 4 <212> ПРТ <213> Неизвестный организм <220?
<223? Описание неизвестного организма: Пептид <400? 102
Туг Тгр ТЬг Авр <210? 103 <211? 360 <212? ДНК <213? Ношо заргепз <220?
<221? СОЗ <222? (1)..(360) <400? 103
дад дСд сад С1п сСд Ьеи ССд дад СсС ддд дда ддс О1у 10 ССд Ьеи дСа Уа1 сад <31п ссС Рго ддд С1у 15 ддд <31у 48
С1и 1 Уа1 Ьеи 5 С1и Зег С1у <31у
Ссс сед сдС сес Ссс Сдс деа дсс Ссс дда ССС адд асе аде даС дад 96
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе Агд Х1е Зег Азр О1и
20 25 30
дае аед ддс едд дСс сдс сад дсС сса ддд аад дде сса дад едд деа 144
Азр мес С1у Тгр Уа1 Агд εΐη А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и тгр Уа1
35 40 45
Сса аде аес сас ддс ссе аде дде аде аса Сас Сас деа дас есс дед 192
Зег Зег Не туг <31у Рго Зег <31у Зег ТЬг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
аад ддс едд еес асе аСс Ссс сдС дас ааС Ссс аад аас асд сСд еае 240
Ьуз О1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
сОд саа аСд аас аде сСд сде дсс дад дас асе дед дСа СаС СаС Сдс 288
Ьеи С1п МеС Аеп Зег Ьеи Агд А1а О1и Авр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
дед адС дсС ССд дад ссд сее Ссд дад ссс сСд ддс сес едд дде сад 336
А1а Зег А1а Ьеи 61и Рго Ьеи Зег С1и Рго Ьеи 51у РЬе тгр С1у С1п
100 105 но
дда асе ссд дсс асе дсс Ссд аде 360
Е1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120
- 177 020464 <210? 104 <211? 120 <212> ПРТ <213? Ното варЬепз <400? 104
С1и 1 УаЬ СЬп ьеи ьеи СЬи 5 Зег СЬу СЬу СЬу 10 Ьеи 1/аЬ СЬп Рго СЬу 15 СЬу
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег СЬу РЬе Агд Не Зег Азр СЬи
20 25 30
Азр Мес СЬу Тгр УаЬ Агд СЬп А1а Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи СЬи Тгр А/аЬ
35 40 45
Зег Зег Не Туг С1у Рго Зег СЬу Зег ТЬг Туг Туг АЬа Азр Зег УаЬ
50 55 60
Ьуз СЬу Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи СЬп мес Азп зег Ьеи Агд А1а СЬи Азр ТЬг А1а УаЬ Туг Туг Суз
35 90 95
А1а Зег А1а Ьеи СЬи Рго Ьеи Зег СЬи РГО Ьеи СЬу РЬе Тгр СЬу СЬп
100 105 110
СЬу ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг УаЬ Зег Зег
115 120 <210? 105 <211? 348 <212? ДНК
<213? ното . зар1епз
<220? <221? СПЗ <222? (1) . . (348)
<400? 105 дад дСд сад сЬд РРд дад РсР 999 дда ддс РРд дра сад ССР ддд 999 48
СЬи УаЬ СЬп Ьеи Ьеи СЬи Зег СЬу СЬу СЬу Ьеи УаЬ СЬп Рго СЬу сьу
1 5 10 15
есс сед сде сРс есс сдс дса дсс РСС дда РРС асе РРР дар ерр РаР 96
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз АЬа АЬа Зег СЬу РЬе ТЬг РЬе Азр Ьеи Туг
20 25 30
ааР асд СЬС ^99 дрс сдс сад дсь сса 999 а ад ддр сра дад рдд дрс 144
Азп МеС РЬе Тгр УаЬ Агд СЬп АЬа Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи СЬи Тгр УаЬ
35 40 45
Сса РРР аРР аде сад аср ддь адд Срр аса ьдд Рас дса да с Рсс дрд 192
Зег РЬе ЬЬе зег СЬп ТЬг СЬу Агд Ьеи ТЬг тгр Туг АЬа Азр Зег УаЬ
- 178
50 55 60
аад ддс едд ССс асе аСс Ссс сдс да с ааС Ссс аад аас асд сСд СаС 240
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Аар Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи туг
65 70 75 80
сед саа асд аас аде сСд сдс дсс дад да с асе дед дса сас Сас сдс 288
Ьеи С1п Мес Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
дед ааа асд сСд дад даС ССС да с Сас Сдд ддс сад дда асе сСд дСс 336
А1а Ьуз ТЬг Ьеи О1и Азр РЬе Азр Туг Тгр С1у С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1
100 105 110
асе дСс Сед аде 348
ТЬг Уа1 Зег Зег
115 <210> 105 <211> 116 <212> ПРТ <213> ното зар!епз <400> 106
С1и 1 Уа1 С1п Ьеи Ьеи 5 <31и Зег С1у С1у С1у 10 Ьеи Уа1 αΐη Рго С1у 15 С1у
Зег Ьеи Агд Ьеи 20 Зег Су 8 А1а А1а Зег 25 С1у РЬе ТЬг РЬе Азр 30 Ьеи туг
АЗП МеС РЬе 35 тгр Уа1 Агд С1п А1а 40 Рго С1у Ьуз С1у Ьеи 45 С1и Тгр Уа1
Зег РЬе 50 11е Зег С1п ТЬг С1у 55 Агд Ьеи ТЬг Тгр Туг 60 А1а Азр Зег Уа1
Ьуз 65 С1у Агд РЬе ТЬг 11е 70 Зег Агд Азр Азп Зег 75 Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 80
Ьеи <31п МеС Азп Зег 85 Ьеи Агд А1а <31и Азр 90 ТЬг А1а Уа1 Туг Туг 95 Суз
А1а Ьуз ТЬг Ьеи 100 С1и Азр РЬе Азр Туг 105 Тгр С1у αΐη С1у ТЬг 110 Ьеи Уа1
ТЬг Уа1 Зег 5ег 115
<210> 107
<211> 324
<212> ДНК
<213> Ното зареепз
<220>
<221> СЬЗ
- 179 020464 <222> ίί),.(324) <400> 107
дас асе сад асд асе сад ССС сса Ссс
Азр 1 Пе Й1п Мес ТЬг 5 С1п Зег РГО Зег
дас сде дСс асе аСс асе Сдс сдд дса
Азр Агд Уа1 ТЬг 20 Пе ТЬг Суз Агд А1а 25
На Ьдд Сдд Сас сад сад ааа сса ддд
Ьеи Тгр Тгр 35 Туг <31п С1п Ьуз Рго 40 С1у
СаС асд дса Ссс ааС ССд саа аде ддд
Туг МеС 50 А1а Зег Азп Ьеи С1п 55 Зег О1у
адС дда ССС ддд аса даС ССС асС ссс
Зег 65 С1у Зег С1у ТЬг Азр 70 РЬе ТЬг ьеи
даа даС ССС дсС асд Сас Сас СдС саа
С1и Азр РЬе А1а ТЬг 85 Туг Туг Суэ 61п
асд ССс ддс саа ддд асе аад дьд даа
ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и
100 105
Ссс сСд СсС дса СсС дСа дда 48
Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у 10 15 адС сад аде дСС аад дад ССС 96
Зег С1п Зег Уа! Ьуэ О1и РЬе ааа дсс ссС аад сСс сСд асе 144
Ьуэ А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е дСс сса Сса сдС ССс адС ддс 192
Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег О1у
асе ТЬг асе Пе 75 аде Зег адС Зег сСд ьеи саа С1п ссС Рго 80
сад аад ссс аад сСд ссС сдС
С1п Ьуз РЬе Ьуз Ьеи Рго Агд
90 95
аСс ааа сдд
Пе Ьуз Агд
<210> 108 <211> 103 <212> ΠΡΤ <213> Ното зар!епз <400> 108
Азр 1 Пе С1п МеС ТЬг 5 С1п Зег Рго Зег
Азр Агд Уа1 ТЬг 20 Пе ТЬг Суз Агд А1а 25
Ьеи Тгр Тгр 35 Туг С1п Θΐη Ьуз Рго 40 <31у
Туг мес 50 А1а зег Азп Ьеи С1п 55 Зег С1у
Зег 65 61у Зег С1у ТЬг Азр 70 РЬе ТЬг Ьеи
<31и Азр РЬе А1а ТЬг 85 Туг Туг Суз С1п
ТЬг РЬе С1у <31п 100 С1у ТЬг Ьуе Ча1 С1и 105
Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у 10 15
Зег С1п Зег Уа1 Ьуз С1и РЬе 30
Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е 45
Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у 60
ТЬг Пе Зег Зег Ьеи О1п Рго 75 80
О1п Ьуз РЬе Ьуз Ьеи Рго Агд 90 95
Ие Ьуз Агд
- 180 020464
<210» 109 <211» 362 <212> ДНК <213> Ното зархепз
<400» 109 даддбдсадс СдСЬддадЪс Ьдддддаддс ЫддЬасадс сЬддддддЬс ссЬдсдГсЬс 60
ЬссСдьдсад ссСссддаЬС сассСЬЬдад СддЬаЬСдда ьдддььдддь ссдссаддсЪ 120
ссадддаадд дЬсЬададЬд ддЬсЬсадсЬ аЬЬадЬддЬа дЬдд'ЬддЬад сасаЬасЬас 130
дсадасЬссд Ьдаадддссд дЁСсассаЬс бсссдсдаса аЬЬссаадаа сасдсЬдЬаЬ 240
сСдсаааЬда асадссСдсд ьдссдаддас ассдсддиаб аССасСдСдс дааадььаад 300
Ыдддддддд ддссТааыт ЬдасСасЬдд ддссадддаа сссСддЬсас сдЬсЬсдадс 360
дс 362
<210> 110 <211» 120 <212> ПРТ <213» Ношо зарТепз
<400» 110 С1и Уа1 51п Ьеи Ьеи <31и Зег С1у С1у 61у Ьеи 7а1 С1п Рго С1у <31у
10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суе А1а А1а Зег О1у РЬе ТЬг РЬе С1и Тгр Туг 20 25 30
Тгр Меб О1у Тгр Уа1 Агд О1п А1а Рго 51у Ьуз <31у Ьеи О1и Тгр Уа1 35 40 45
Зег А1а Не Зег <31у Зег С1у С1у Зег ТЬг Туг Туг А1а Азр Зег ’7а1 50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 65 70 75 80
Ьеи С1п МеС Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 90 95
А1а Ьуз 7а 1 Ьуз Ьеи С1у О1у С1у Рго Азп РЬе Азр Туг Тгр 31у С1п 100 105 110
С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг 7а1 Зег Зег 115 120 <210> 111 <211» 360 <212» ДНК
- 181 020464 <21Э> Ното заргепз <220>
<221> СОЗ <222> (1),.(360) <400> 111
дад дьд сад сед еед Зад есе ддд дда
51и 1 νΐιΐ О1п Ьеи Ьеи 5 С1и зег 61у С1у
Лее сед еде сес есс еде дса дсс есс
Бег Ьеи Агд Ьеи 20 Зег Суз А1а А1а Зег 25
сдд аед дде едд дес сдс сад дсе сса
Тгр МеС С1у 35 Тгр 7а1 Агд О1п А1а 40 Рго
ееа дсс асе аде дде аде дде дде аде
Бег А1а 50 Пе Зег 61 у Зег 61у 55 С1у Зег
аад дде едд сес асе аРс есс сдс да с
Ьуз 65 61у Агд РЬе ТЬг Не 70 Зег Агд АЗр
сед саа аСд аас аде сед сдС дсс дад
ьеи О1п мес Азп Зег 85 Ьеи Агд А1а 61и
дед ааа дСС аад еед ддд ддд ддд ссС
А1а Ьуз Уа1 Ьуз 100 Ьеи С1у 61у С1у Рго 105
дда асе сед дсс асе дсс Сед аде
61у ТЬг Ьеи 115 7а1 ТЬг Уа1 Зег Зег 120
ддс еед дса сад ссС ддд ддд 48
61у 10 Ьеи Уа1 <31л Рго 61у 15 С1у
дда еьс асе еее дад ьдд еае 96
С1у РЬе ТЬг РЬе б1и 30 Тгр туг
ддд аад ддь сСа дад едд дес 144
О1у Ьуз С1у Ьеи 45 С1и Тгр Уа1
аса Сас Сас дса дас есс дед 192
ТЬг Туг Туг 60 А1а Азр Зег Уа1
ааС Ссс аад аас асд сСд СаС 240
Азп Зег 75 Ьуз АЗП ТЬг Ьеи туг 80
дас асе дед дСа СаС Сас еде 288
Азр 90 ТЬг А1а Уа1 Туг Туг 95 Суз
ааС еее дас Сас Сдд ддс сад 336
Азп РЬе Азр Туг Тгр 110 С1у С1п 360
<210^ <211> <212> е213> 112 324
ДНК Ното зархепз
<220> с221> СОЗ
<222> (1) . . (324) 1
<400> 112
дас аЬс сад аСд асе сад СсС сса Ссс
Азр Не 61п МеС ТЬг 61п Зег Рго Зег
1 5
дас еде дСс асе аСс асе Сдс сдд дса
Азр Агд \?а! ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а
20 25
ееа саС Сдд Сас сад сад ааа сса ддд
Ьеи Ηί3 Тгр туг αΐη С1п Ьуз Рго <31у
35 40
СаС адС дса Сес дад еед саа аде ддд
Туг Бег А1а Зег О1и Ьеи С1п Зег 61у
СсС Зег 10 сЬд Ьеи СсС Зег дса А1а СсС Зег дСа νβΐ 15 дда <31у 48
аде сад аде асе даС адС еае 96
Зег С1п Зег Не Азр 30 Зег Туг
ааа дсс ссС аад сес сед асе 144
ьуз А1а Рго Ьуз 45 Ьеи Ьеи Пе
дСс сса Сса еде еес аде ддс 192
Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег О1у
182 020464
50 55 60
адС дда ССС ддд аса даС ССс асе ссс асе асе аде аде сед саа ссе
Зег <31у Зег <31у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
даа даС ССЬ дсС асд Сас Сас СдС саа сад дсс дьд ьдд сдС ссе ССС
О1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Уа1 Уа1 Тгр Агд Рго РЬе
85 90 95
асд ССс ддс саа ддд асе аад дьд даа асе ааа сдс
ТЬг РЬе (31 у С1п <31у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз Агд
100 105
<210? 113 <211? 108 <212? ПРТ
<213? Нопто ΐ зархепз
<400? 113 Азр Не С1п МеС ТЬг <31п Зег Рго Зег Бег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у
1 5 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Зег Не Азр Зег Туг
20 25 30
Ьеи Н1з Тгр Туг <31п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а РГО Ьуз Ьеи Ьеи Не
35 40 45
Туг Зег А1а Зег С1и Ьеи О1п Зег О1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе зег С1у
50 55 60
Зег С1у Зег О1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1ь <31п Уа1 Уа1 Тгр Агд Рго РЬе
35 90 95
ТЬг РЬе Ыу С1п <31у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз Агд
100 105
<210? 114 <211? 324 <212> ДНК
<213? Нотс : зархепз
<220? <221? СЕЙ <222? (1).. (324 >
<400? 114 дас асе сад асд асе сад СсС сса Ссс Ссс сед Ссе дса Ссе дса дда
Азр 11е С1п МеС ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Бег А1а Зег Уа1 С1у
1 5 10 15
дас сдС дСс асе акс асС Сдс едд дса адС сад аде аСС ССС аСд ааС
- 183
Авр Агд Уа.1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег Οίη Зег 11е РЬе МеД Азп 20 25 30
ДДа ДДд Ддд Дас сад сад ааа сса ддд ааа дсс ссД аад сДс сДд аДс Ьеи Ьеи Тгр Туг С1п О1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьув Ьеи Ьеи 11е
40 45
144
ДаД аад дса Дсс дДд ДДд саа адД ддд дДс сса Дса сдд ДДс адд ддс Туг Азп А1а Зег Уа1 Ьеи <31п Зег О1у \7а1 Рго Зег Агд РЬе Зег 01у
55 60
192
адД 99-т ДсД 995 аса дад ДДС асд сДс асе аДс аде адД сДд саа ссД
Зег <31у Бег е1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Бег Бег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
даа даД ДДД дед асд Дас Дас ДдД саа сад ддд дДд ддд сдд ссД ДДД
<31и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг суз <31п С1п Уа1 Уа1 Тгр Агд Рго РЬе
85 90 95
240
2В8 асд ДДс ддс саа ддд асе аад ддд даа аДс ааа сдд ТЬг РЬе С1у (31п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз Агд 100 105
324 <210? 115 <211? 108 <212> ПРТ <213? Ното заргепз <400? 115
Азр Не С1п МеД ТЬг С1п Зег Рго Бег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 <31у 15 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Зег 11е РЬе МеД Азп 20 25 30
Ьеи Ьеи Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е 35 40 45
Туг Азп А1а Зег Та1 Ьеи С1п Зег С1у 37а1 Рго Бег Агд РЬе Зег <31у 50 55 60
Зег <31у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи <31п Рго 65 70 75 80 <31и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п <31п Уа1 Уа1 Тгр Агд Рго РЬе 85 90 95
ТЬг РЬе 01у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз Агд 100 105
<210? 116
<211? 324
<212> ДНК
<213? Ното заргепз
<220?
184 020464 <221? СОЗ <222? (1)..(324) <400? 116
дас аСс сад асд асе сад СсС сса Ссс
Азр 1 Не С1п МеС ТЬг 5 С1п Зег Рго Зег
дас сдС дСс асе аСс асС Сдс сдд дса
Азр Агд Уа1 ТЬг 20 Не ТЬг Суз Агд А1а 25
ЪСа дад ьдд Сас сад сад ааа сса ддд
Ьеи <31и Тгр 35 Туг (31ь 61η Ьуз Рго 40 <31у
сас асС дса Ссс сдд ССд саа аде ддд
Туг ТЬс 50 А1а Зег Агд Ьеи <31п 55 Зег С1у
аде дда ъес ддд аса да С ССс асе сСс
Зег 65 С1у Зег О1у ТЬг Азр 70 РЬе ТЬг Ьеи
даа даС ССС дсС асд Сас Сас СдС саа
С1и Азр РЬе А1а ТЬг 85 Туг Туг суз С1п
асд ССс ддс саа ддд асе аад дед даа
ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 01и
100 105
Ссс сСд ЬсС дса СсЬ дСа дда 48
Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа). С1у 10 15 адС сад аде аСС СаС даС дед 96
Зег С1п Зег 11е Туг Аар А1а ааа дсс ссс аад сес сСд аСс 144
Ьуз А1а Рго ьуз Ьеи ьеи 11е дсс сса Ъса сдС ссс адС ддс 192
Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
асе ТЬг асе Не 75 аде Зег ад С Зег сед Ьеи саа О1п ССС Рго 80 240
сад дсс аСд сад сдС ссС дСС 288
С1п νβΐ МеС С1п Агд Рго Уа1
90 95
аСс ааа сдд 324
Не Ьуз Агд
<210? 117 <211? 108 <212> ПРТ <213? Пото зартепз <400? 117
Азр 1 Не <31п Мес ТЬг 5 <31п Зег Рго Зег
Абр Агд Уа1 ТЬг 20 Не ТЬг Су в Агд А1а 25
Ьеи С1и Тгр 35 Туг С1п О1п Ьуз Рго 40 <31у
Туг ТЬг 50 А1а Зег Агд Ьеи С1п 55 Зег С1у
Зег 65 С1у Зег С1у ТЬг Азр 70 РЬе ТЬг Ьеи
<31и Азр РЬе А1а ТЬг 85 Туг Туг Суз αΐη
ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и
Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 <31у 10 15
Зег О1п Зег Не Туг Азр А1а 30
Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е 45
Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег <з1у 60
ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1п Рго 75 80 η 7а 1 Мес <31п Агд Рго Уа1 90 95
11е Ьуз Агд
- 185
100 105 <210г 118 <211> 324 <212> ДНК <213 > Нолю заргепз <220>
<221> СЬБ <222> (1).,(324) <400> 118
дас асе сад асд асе сад ссс сса есс
Азр 1 Не О1п МеС ТЬг 5 С1п Бег Рго Бег
дас еде дСс асе аСс асе Сдс сдд дса
Азр Агд Уа1 ТЬг 20 Не ТЬг Суз Агд А1а 25
ССа сад <^дд еас сад сад ааа сса ддд
Ьеи О1п Тгр 35 туг αΐη С1п ьуз Рго 40 С1у
СаС асе дса есс сдд сед саа адС ддд
Туг ТЬг 50 А1а Бег Агд Ьеи С1п 55 Бег О1у
аде дда еее ддд аса дас есс асС сСс
Бег 65 С1у Бег С1у ТЬг Азр 70 РЬе ТЬг Ьеи
даа дас ССС дсС асд сас сас еде саа
01и Азр РЬе А1а ТЬг 85 Туг ΗΪ3 Суз С1п
асд еес ддс саа ддд асе аад дед даа
ТЬг РЬе С1у С1п 100 (51у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 105
Ссс сед Ссе дса СсС дСа дда 48
Бег Ьеи Бег А1а Бег 17а1 (31у 10 15 аде сад аде аСС СаС даС дсС 96
Бег С1п Бег Не Туг Азр А1а ааа дсс ссе аад ссс сед аСс 144
Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не дСс сса Сса сдС ССс адС ддс 192
Уа1 Рго Бег Агд РЬе Бег С1у
асе ТЬг аСс Не 75 аде Бег аде Бег еСд Ьеи саа С1п ссе Рго 80
сад дее аСд сад сдС ссе дее
О1п Уа1 МеС <31п Агд Рго Уа1
90 95
аСс ааа сдд
Не Ьуз Агд
<210> 119 <211> 108 <212> ПРТ < 213 > НОЛЮ еар!епз
<400> 119
Авр Пе αΐη 1 мее ТЬг 5 С1п Бег Рго Бег
Азр Агд Уа1 ТЬг 20 Не ТЬг Суз Агд А1а 25
Бег Ьеи Бег А1а Бег Уа1 С1у 10 15
Бег С1п Бег Не Туг Азр А1а 30
Ьеи С1п Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у
35 40
Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не 45
Туг ТЬг А1а Бег Асд Ьеи С1п Бег <31у
50 55
А7а1 Рго Бег Агд РЬе Бег б1у 60
- 186 020464
Зег <31у Зег а1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
О1и Азр РЬе А1а ТЬг туг ΗΪ3 Суз С1п 61п Уа1 Меь О1п Агд Рго Уа1
85 90 95
ТЫ РЬе С1у О1п С31у ты Ьуз Уа1 С1и Пе Ьуз Агд
100 105
<210? 120 <211? 324 <212? ДНК <213? Ното ί заргепз
<220?
<221? СОЗ
<222 !? (1) . . (324: 1
<400? 120
дас аСс сад аСд асе сад СсС сса ссс Ссс сСд СсС дса СсС дСа дда 48
Азр Пе 01п МеС ТЬг <Э1п Зег Рго Зег Зег Ьеи зег А1а Зег V»! С1у
1 5 10 15
дас сде дСс асе асе асе сде сдд дса аде сад аде дсс аад дад ссс 96
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Зег νβΐ Ьуз С1и РЬе
20 25 30
ССа сдд Сдд Сас сад сад ааа сса ддд ааа дсс ссс аад ссс ссд аСс 144
Ьеи Тгр Тгр Туг 01п <Э1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Пе
35 40 45
СаС асд дса Ссс ааС ССд саа аде ддд дСс сса Сса сдС ССс адС дде 192
Туг Мес А1а Зег Азп Ьеи <31п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
аде дда ССС ддд аса дас ССС асе ССС асе асе аде аде ссд саа ссС 240
Бег 31у Зег 01у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 30
даа дас ССС дсС асд Сас Сас сдс саа сад аад ссс аад ссд ссС сдС 288
С1и Авр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз О1п <31п Ьуз РЬе Ьуз Ьеи Рго Агд
85 90 95
асд ССс дде саа ддд асе аад дед даа аСс ааа сдд 324
ТЫ РЬе С1у О1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз Агд
100 105 <210? 121 <211? 108 <212> ПРТ <213? Ното заргепз
<400? 121
Азр Пе С1п МеС ТЬг 01п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у
1 5 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг Пе ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Ьуз С1и РЬе
20 25 30
- 187
Ьеи Тгр Тгр 35 Туг Я1п Е1п Ьуз Рго 40 Е1у
Туг МеС 50 А1а Зег Азп Ьеи С1п 55 Зег 01у
Зег 65 <31у Зег <31у ТЫ Азр 70 РЬе ТЫ Ьеи
61и Азр РЬе А1а ТЬг 85 Туг Туг Суз С1п
ТЬг РЬе С1у Θΐη <31у ТЫ Ьуз Уа1 01и
100 105
Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не 45 'Ла1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у 60
ТЬг Не Зег Зег Ьеи <31п Рго 75 30
01п Ьуд РЬе Ьуе Ьеи Рго Агд 90 95
Не Ьуз Агд <210? 122 <211? 324 <212> ДНК
<213? Ното зархепз
<220? <221? СРЗ <222? (1),. <400? 122 (324)
дас аСс сад асд асе сад СсС сса Ссс
Азр 1 11е ΰΐη МеС ТЫ 5 31п Зег Рго Зег
дас сдс дСс асе асе асе Сдс сдд дса
Азр Агд Уа1 ТЬг 20 Не ТЬг Сув Агд А1а 25
ССа саС сдд Сас сад сад ааа сса 999
Ьеи Ηίε Тгр 35 туг С1п 61п Ьуз Рго 40 С1у
сас асд дса Ссс адС ьсд саа аде 999
Туг МеС 50 А1а Зег Зег Ьеи <31п 55 Зег <31у
ад С дда СсС 939 аса даС ССс асС сСс
Зег 65 С1у Зег <Э1у ТЬг Азр 70 РЬе ТЬг Ьеи
даа даС ССС дсС асд Сас Сас сдс саа
С1и Авр РЬе А1а ТЬг 85 Туг Туг Суз С1п
асд ССс ддс саа 999 асе аад дед даа
ТЬг РЬе Е1у С1п 100 С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 105
Ссс сед СсС дса СсС дса дда 43
Зег Ьеи Зег А1а Зег 7а1 С1у 10 15 адС сад аде аСС Сдд асд аад 96
Зег С1п Зег Не Тгр ТЬг Ьуз ааа дсс ссС аад сСс сед аСс 144
Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е дСс сса Сса сдС ССс адС ддс 192
7а1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
асе ТЬг аСс 11е 75 аде Зег адС Зег сСд Ьеи саа С1п ссС Рго 80
сад ьдд ССС ад С аас ссС адС
С1п Тгр РЬе Зег Азп Рго Зег
90 95
асе ааа сдс
Не Ьуз Агд
<210? 123
<211? 108
<212> ПРТ
<213? Ното зараепз
- 188 020464 <400? 123
Азр 1 11е <31п МеЕ ТЬг 5 С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а 10 Зег Уа1 15 С1у
Азр Агд ν»1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Зег Не Тгр ТЬг Ьуз
20 25 30
Ьеи Н1з Тгр Туг Θΐη С1п Ьуз РГО С1у Ьуэ АХа Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не
35 40 45
Туг МеЕ А1а Зег Зег Ьеи 01 η Зег 61у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег <31у
50 55 60
Вег <31у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи О1п Рго
65 70 75 80
О1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз <31п О1п Тгр РЬе Зег Азп Рго Зег
85 90 95
ТНг РЬе С1у С1п О1у ТЬг Ьуз Уа1 61и 11е Ьуз Агд
100 105 <210? 124 <211? 324 <212> ДНК <213? Ното заргепз <220?
<221? СОЗ <222? (1),.(324) <400? 124
дас Азр 1 аЕс 11е сад С1п аЕд МеЕ асе ТЬг 5 сад С1п ЕсЕ Зег сса Рго Есс Зег Есс Зег 10 сЕд ьеи ЕсЕ Зег дса А1а ЕсЕ Зег дЕа Уа1 15 дда <31у 48
да с сдЕ дЕс асе аЕс асЕ Еде едд дса адЕ сад аде аЕЕ Еад ссд аЕЕ 96
Азр Агд Уа1 ТЬг 20 Не ТЬг Суз Агд А1а 25 Зег <31п Зег Не С1п 30 Рго Не
ЕЕа ЕдЕ Едд Еас сад сад ааа сса ддд ааа дсс ССЕ аад сЕс с Ед аЕс 144
Ьеи Суз Тгр 35 Туг О1п С1п Ьуз Рго 40 <31у Ьуз А1а Рго Ьуэ 45 Ьеи Ьеи Не
ЕаЕ дсЕ дса Есс адЕ ЕЕд саа адЕ ддд дЕс сса Еса сдЕ ЕЕс адЕ ддс 192
Туг А1а 50 А1а Зег Зег Ьеи С1п 55 Зег С1у Уа1 Рго Зег 60 Агд РЬе Зег С1у
адЕ дда Зег О1у 65 ЕСЕ Зег ддд О1у аса ТЬг даЕ Азр 70 ЕЕС РЬе асЕ ТЬг сЕс Ьеи асе ТЬг аЕс Не 75 аде Зег адЕ Зег сЕд Ьеи саа С1п ссЕ Рго 80
даа даЕ ЕЕЕ дсЕ асд Еас Еас ЕдЕ саа сад аЕЕ сад саЕ аЕЕ ссЕ дЕд
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Не С1п Н1д Не Рго Уа1
85 90 95
- 189 020464
асд ТЬг ьсс РЬе ддс <31у саа ддд 01п С1у 100 асе ТЬг аад дБд Ьуз З/аТ да а С1и 105 аЕс ааа едд Агд 324
Не Ьуз
<210> 125
<211> 103
<212> ПРТ
с213> Ното ί зарЬепз
<400> 125
Азр Не С1п МеБ ТЬг С1п Бег Рго Бег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 СТу
1 5 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг Пе ТЬг Суз Агд А1а Бег С1п Зег Пе СТп Рго Пе
20 25 30
Беи Суз Тгр Туг 01п С1п Ьуз Рго 01у Ьуз АЬа Рго Ьуз Ьеи Ьеи Пе
35 40 45
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи Οίη Бег С1у Уа1 Рго Бег Агд РЬе Бег ОТу
50 55 60
Зег 01у Зег 01у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи СТп Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЬе АЬа ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Не СТп Ηί3 Пе Рго 3/аТ
85 90 95
ТЬг РЬе 01у С1п СТу ТЬг Ьуз 7а1 СТи Не Ьуз Агд
100 105 <210> 126 <211> 324 <212> ДНК
<213> Ното зарТепз
<220> <221> СОЗ <222> (1).. (324}
<400> 126 дас аБс сад аЬд асе сад БсБ сса Бсс Бсс сБд БсБ дса БсБ дБа 9да 48
Азр Пе СТп Мес ТЫ СТп Бег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег УаТ СТу
1 5 10 15
дас сдБ дБс асе аБс асБ Бдс едд дса адБ сад аде аББ 999 Бад даБ 96
Азр Агд УаТ ТЬг Пе ТЬг Суз Агд А1а Зег СТп Зег Пе СТу СТп Азр
20 25 30
ББа саБ Бдд Бас сад сад ааа сса 939 ааа дсс ссЕ аад сБс сБд аБс 144
Ьеи Ηιξ Тгр Туг СТп С1п Ьуз Рго СТу Ьуз АЬа Рго Ьуз Ьеи Ьеи Пе
35 40 45
БаБ асд дса БСС сББ ББд саа ад Б 999 дбе сса Бса сдБ ББС адБ ддс 192
Туг ТЬг А1а Зег Ьеи Ьеи СТп Зег СТу УаТ Рго Зег Агд РЬе Зег СТу
50 55 60
- 190 020464
адЕ дда ЕсЕ ддд аса даЕ ЕЕС асЕ сЕс асе аЕс аде адЕ сЕд саа ссЕ
Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе тЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
даа даЕ ЕЕЕ дсЕ асд Еае Еае ЕдЕ саа сад сад адЕ дсЕ ЕЕЕ ссЕ ааЕ
<31и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз αΐη С1п С1п Зег А1а РЬе Рго Азп
85 90 95
асд сЕс дде саа ддд асе аад дЕд даа аЕс ааа едд
ТЬг Ьеи С1у С1п <Э1у ТЬг Ьуз Уа1 <31и Не Ьуз Агд
100 105
<210? 127 <211? 108 <212? ПРТ
<213? Ното ! зар1епз
<400? 127 Азр 11е С1п МеЕ тьг <31п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 <31у
1 5 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Зег Не С1у Οίη Азр
20 25 30
Ьеи Пае Тгр Туг О1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не
35 40 45
Туг ТЬг А1а Зег Ьеи Ьеи С1п Зег С1у νβΐ Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
Зег Ну Зег С31у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
<31и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п О1п С1п Бег А1а РЬе Рго Азп
85 90 95
ТЬг Ьеи <?1у 01 η О1у ТЬг Ьуз νβΐ <31и Не Ьуз Агд
100 105
<210? 128 <211? 324 <212> ДНК
<213? Ното : эар1еп5
<220? <221? СРЗ <222? (1).. (324) 1
<400? 128 дас аЕс сад аЕд асе сад ЕсЕ сса Есс Есс сЕд ЕсЕ дса Есс дЕа дда
Азр 11е С1п МеЕ ТЬг С1П Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 О1у
1 5 10 15
дас сдЕ дЕс асе аЬс асЕ Еде едд дса адЕ сад аде аЕа асд аад ааЕ
Азр Агд Уа1 ТЬг Пе ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Зег Не ТЬг Ьуз Азп
- 191
20 25 30
СЬа СДД Ддд Дас сад сад ааа сса ддд ааа дсс ссД аад сДс сДд аДс 144
Ьеи Ьеи Тгр Туг С1п С1п ьув Рго <31у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не
35 40 45
ЕаЪ Дад дса Дсс ДСД ддд саа адд ддд дДс сса Дса сдД ДДс адД ддс 192
Туг С1п А±а Зег Зег Ьеи С1п Бег О1у Ча1 Рго Бег Агд РЬе Бег С1у
адД дда ДсД ддд аса даД ДДС асд сДс асе аДс аде адД сдд саа ССД
Зег <31у Бег О1у ТЬг Азр РЬе ТЬг ьеи ТЬг Не Бег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
даа даД ДДД дед асд Дас дас ддд саа сад сдд сдд саД аад ссД сед
<31и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Ьеи Агд Нгз Ьув Рго Рго
85 90 95
240
283 асд ДДс ддс саа ддд асе аад дДд даа аДс ааа сдд ТЬг РЬе С31у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз Агд 100 105
324 <210? 129 <211> 108 <212? ПРТ <213? Ното заргепз <400? 129
Азр Не <31п МеД ТЬг <31п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у 15 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Зег Не ТЬг Ьуз Азп 20 25 30
Ьеи Ьеи Тгр Туг 01η Θΐη Ьуз Рго 31у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не 35 40 45
Туг С1п А1а Зег Зег Ьеи С1п Бег С1у Уа1 Рго Бег Агд РЬе Бег С1у 50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго 65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п О1п Ьеи Агд Нгз Ьуз Рго Рго 85 90 95
ТЬг РЬе 31у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз Агд 100 105
<210? 130
<211? 324
<212> ДНК
<213? Ното заргепз
<220?
<221? СОЗ
- 192 020464 <222? (1)..(324) <400? 130
дас аСс сад аСд асе сад СсС сса Ссс
Азр 1 Не 01п МеС ТЬг 5 σΐη Зег Рго Зег
дас сдС дсс асе асе асе Сдс едд деа
Азр Агд Уа1 ТЬг 20 Не ТЬг Суз Агд А1а 25
ССа адд едд Сас сад сад ааа сса ддд
Ьеи Агд Тгр 35 Туг С1п С1п Ьуз Рго 40 С1у
сас саС деа Ссс дас ссд саа адС ддд
Туг Ηί.8 50 А1а Зег Азр Ьеи 61п 55 Зег С1у
адС дда СсС ддд аса даС ССс асС сСс
Зег 65 С1у Зег 01у ТЬг Азр 70 РЬе ТЬг Ьеи
даа дас ССС дсс асд Сас сас СдС саа
О1и Авр РЬе А1а ТЬг 85 Туг туг Суз С1п
асд СЬс ддс саа ддд асе аад дьд даа
ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и
100 105
Ссс сСд СсС деа СсС дСа дда 48
Зег Ьеи Зег А1а Зег νβΐ С1у 10 15 адС сад аде аСС Сад аад СсС 96
Зег С1п Зег 11е <31п Ьуз Зег ааа дсс ссе аад сСс сед аСс 144
Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е дсс сса Сса сде ССс аде ддс 192
Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег О1у
асе ТЬг аСс Не 75 аде Зег адС Зег сСд Ьеи саа <31п ссС Рго 80 240
сад аСд дСС аас аде ссС дсс 288
С1п Мес Уа1 Азп Зег Рго Уа1
90 95
аСс ааа едд 324
Не Ьуз Агд
<210? 131 <211? 108 <212? ПРТ <213? Ношо зараепз <400? 131
Азр 1 Не О1п МеС ТЬг 5 О1п Зег Рго Зег
Азр Агд Уа1 ТЬг 20 11е ТЬг Суз Агд А1а 25
Ьеи Агд Тгр 35 Туг С1п О1п Ьуз Рго 40 <31у
Туг Ηί3 50 А1а Зег Азр Ьеи С1п 55 Зег С1у
Зег 65 С31у Зег <31у ТЬг Азр 70 РЬе ТЬг Ьеи
С1и Азр РЬе А1а ТЬг 85 Туг Туг Суз С1п
ТЬг РЬе 61у С1п 100 <31у ТЬг Ьуз Уа1 <31и 105
Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа! С1у 10 15
Зег С1п Зег 11е С1п Ьуз Зег 30
Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е 45 '/а1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у 60
ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго 75 80
С1п МеС Уа1 Азп Зег Рго Ή 90 95
Не Ьуз Агд
- 193 020464 <210> 132 <211> 324 <212> ДНК <213> ното зархепз <220>
<221> СРЗ <222> (1)..(324) <400> 132
да с Азр 1 аСс Не сад С1п аСд МеС асе ТЬг 5 сад С1п СсС Зег сса Рго Ссс Зег Ссс Зег 10 сед Ьеи СсС Зег дса А1а ССС Зег дСа Уа1 15 дда С1у 48
дас сдс дСс асе аСс асе Сдс сдд дса адС сад аде аСС Сад асд дед 96
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Зег 11е С1п ТЬг А1а
20 25 30
ССа саС сдд Сас сад сад ааа сса ддд ааа дсс ссС аад сСс ССд аСс 144
Ьеи Ηίβ Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не
35 40 45
СаС СсС дса Ссс ад С ССд саа аде ддд дСс сса Сса сдс ССс адС ддс 192
Туг Зег А1а Зег зег Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
ад С дда СсС ддд аса да С ССс асе сСс асе аСс аде адС сСд саа ссС 240
Зег <51у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
даа даС ССС дсс асд Сас Сас СдС саа сад Сед аде ССС ССд ссС ссс 288
С1и Азр РНе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Зег Бег РЬе Ьеи Рго РЬе
85 90 95
асд ССС 9дс саа 999 асе аад дед даа аСс ааа сдд 324
ТЬг РНе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 <31и Не Ьуз Агд
100 105 <210> 133 <211> 108 <212> ПРТ <213> Ното зархепз <400> 133
Азр 1 11е <31п Мес ТЬг 5 31п Зег Рго Зег Зег 10 Ьеи Зег А1а Зег Уа1 15 С1у
Азр Агд Уа1 ТЬг 20 Не ТЬг Суз Агд Д1а 25 Зег С1п Зег Не С1п 30 ТЬг А1а
Ьеи ΗΪ3 Тгр 35 Туг 61η αϊπ Ьуз Рго 40 <31у Ьуз А1а Рго Ьуз 45 Ьеи Ьеи Не
Туг Зег 50 А1а Зег Зег Ьеи <31п 55 Зег С1у 17а 1 Рго Зег 60 Агд РЬе Зег <31у
Зег <31у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Бег Ьеи С1п Рго
- 194 020464
65 70 75 80
αίνι Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз αΐη С1п Зег Зег РЬе Ьеи Рго РЬе
85 90 95
ТЬг РЬе <11 у 31п 61у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз Агд
100 105
<210» 134 <211» 324 <212> ДНК
<213» Ното : зар1епз
<220» <221» СОЗ <222» (1) . . <324)
<400» 134 дас аСс сад асд асе сад СсС сса Ссс Ссс сСд СсС дса СсС дСа дда 48
Азр Не С1п Мес тЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег 7а1 С1у
1 5 10 15
дас сдс дСс асе аСс ас С Сдс сдд дса адС сад аде асе ддд ссд аас 96
Азр Агд 7а 1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег О1п Зег 11е С1у Рго Абп
20 25 30
ССа дад Сдд Сас сад сад ааа сса ддд ааа дсс ссС аад сСс ссд асе 144
Ьеи 51и Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не
35 40 45
СаС дсс дса Ссс адС ССд саа адС ддд дСс сса Сса сде ССс адС ддс 192
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи 61п Зег 01у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
адС дда СсС ддд аса даС ССс асе сСс асе аСс аде адС сед саа ссс 240
Зег О1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
даа дас ССС дсС асд Сас сас сдс саа сад сад аСд ддд сде ССС сдд 288
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз <31п С1п С1п МеС С1у Агд Рго Агд
85 90 95
асд ССс ддс саа ддд асе аад дСд даа аСс ааа сдд 324
ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 О1и Не Ьуз Агд
100 105
<210» 135 <211» 108 <212» ПРТ
<213» Ното : зархепз
<400» 135 Азр Не С1п МеС ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Ца1 С1у
1 5 10 15
Азр Агд 7а 1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Зег Не С1у Рго Азп
20 25 30
- 195
Ьеи С1и Тгр 35 Туг С1п 51п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е
40 45
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи О1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег <31у
50 55 60
Зег С1у Зег 01 у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЬе АЬа ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п О1п МеР С1у Агд Рго Агд
35 90 95
ТЬг РЬе С1у 01п С1у ТЬг Ьуз Уа1 О1и Не Ьуз Агд
100 105 <210? 136 <211? 324 <212> ДНК <213? Нотпо заргепз
<220? <221? СОЗ
<222? С υ .. (324)
<400? 136
дас асе сад аСд асе сад СсС сса есс Ссс сед ССС дса СсС дса дда 48
Азр Пе Οίη МеС ТЬг <31п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 О1у
1 5 10 15
дас сдС дСс асе аСс асС Сдс сдд дса адС сад аде асе аад саС Сад 96
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег Οίη Зег Не Ьуз Ηϊξ С1п
20 25 30
ССа дсс сдд Сас сад сад ааа сса ддд ааа дсс ССС аад сСс сСд аСс 144
Ьеи А1а Тгр Туг 31п С1п Ьуз Рго О1у Ьуз АЬа Рго Ьуз Ьеи Ьеи Пе
35 40 45
СаС аад дса Ссс дед сед саа аде ддд дсс сса Сса сдС ССС адС ддс 192
Туг ьуз А1а Зег Уа1 Ьеи 01п Зег О1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег О1у
50 55 60
адС дда ССС ддд аса дас ССС асе ссс асе асе аде адС сСд саа ссС 240
Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Пе Зег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
даа дас ССС дсс асд Сас сас сдс саа сад ССС адд сдс сде ссС асе 288
01и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз 01п С1п Ьеи Агд Агд Агд Рго ТЬг
85 90 95
асд ССс ддс саа ддд асе аад дед даа аСс ааа сдд 324
ТЬг РЬе С1у Н1п О1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз Агд
100 105 <210? 137 <211? 108 <212? ПРТ <213? Ното заргепе
- 196 020464 = 400'- 137
Азр 1 Не С1п мее ТЬг 5 е1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а 10 Зег Уа1 15 С1у
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег σΐη Бег Не Ьуз Нгз С1п
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг С1п αΐη Ьуе Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не
35 40 45
Туг Ьуз А1а Зег Уа1 Ьеи <31п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Бег <31у
50 55 60
Зег <31у Зег 01у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Бег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз <31п 01п Ьеи Агд Агд Агд Рго ТЬг
85 90 95
ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз Агд
100 105 <210> 138 <211> 324 <212> ДНК <213> Ното заргепз <220>
<221> СПЗ <222> (1)..(324) <400> 138
дас Азр 1 аСс Не сад С1п аСд МеС асе ТЬг 5 сад СсС <31п Зег сса Рго Ссс Зег Ссс Зег 10 еСд Ьеи СсС Зег дса А1а СсС Зег дСа Уа1 15 дда С1у 48
дас сдс дСс асе аСс асС Сдс сдд дса аде сад аде дСС аад дсс Сад 96
Азр Агд Уа1 тЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Ьуз А1а С1п
20 25 30
СЬа асе сдд Сас сад сад ааа сса ддд ааа дсс ссе аад ССс еСд аСс 144
Ьеи ТЬг Тгр Туг αΐη С1ц Ьуз Рго С31у Ьуе А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не
35 40 45
ЬаС аад дса Ссс асС ССд саа адС ддд дСс сса Сса сдС ССс адС ддс 192
Туг Ьуз А1а Зег ТЬг Ьеи αΐη Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег О1у
50 55 60
аде дда СсС ддд аса даС ССс асС сСс асе аСс аде адС еСд саа ссЬ
Зег 65 С1у Зег О1у ТЬг Азр 70 РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не 75 Зег Зег Ьеи <31п Рго 80
даа даС ССС дсС асд Сас Сас СдС саа сад саС адС СсС адд ссС
<31и Азр РЬе А1а ТЬг 85 Туг Туг суз <31п О1п 90 НГЗ Зег Зег Агд Рго 95 Туг
- 197 020464
асд ТЬг слс РЬе ддс а1у саа С1п 100 ддд С1у асе аад дСд даа О1и 105 аСс Не ааа Ьуз едд Агд 324
ТЬг Ьуз Уа1
<210? 139 <211? юе
<212 :? прт
<213 1? Нопто зараепз
<400> 139
Азр Не <31п Мес ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег ьеи Зег А1а Зег Уа1 51у
1 5 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Зег Уа1 Ьуз А1а С1п
20 25 30
Ьеи ТЬг Тгр Туг С1п С1ь Ьуз Рго О1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не
35 40 45
Туг Ьуз А1а Зег тЬг Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег <31у
50 55 60
Зег О1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Бег Бег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз αΐη <31п Ηί3 Зег Зег Агд Рго Туг
85 90 95
ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз Агд
100 105
<210? 140 <211? 324 <212? ДНК
<213? Нопто : зархепз
<22С )>
<221? СРЗ <222? (1).. 1324}
<400? 140
дас аСс сад асд асе сад ССС сса Ссс Ссс сед ссс дса СсС дса дда 48
Азр Не С1п МеС ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег \/а1 61у
1 5 10 15
дас сдС дСс асе аСс асС Сдс едд дса адС сад аде аСС дад ааС едд 96
Аер Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег <31ь Зег Не <31и Азп Агд
20 25 30
ССа ддс едд Сас сад сад ааа сса ддд ааа дсс ссС аад сСс сСд аСс 144
Ьеи С1у Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго 01у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не
35 40 45
сас Сад дед Ссс ссд ССд саа адС ддд дСс сса Сса сдС ССс аде ддс 192
Туг С1п А1а Бег Ьеи Ьеи О1ь Зег в1у Ца1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
- 198 020464
адЕ Зег 65 дда С1у ЕСЕ Зег 393 01у аса ТЬг даЕ Азр 70 ЕЕС РЬе асЕ ТЬг сЕс Ьеи асе ТЬг аЕс Не 75 аде Зег адЪ Зег С Ед Ьеи саа 31п ссЕ Рго 80
даа даЕ ЕЕЕ дсЕ асд Еае Еае ЕдЕ саа сад даЕ Есд ЕЕЕ ССЕ сдЕ
С1и Аер РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Азр Зег Туг РЬе Рго Агд
85 90 95
асд ЕЕс 93= саа ддд асе аад дЕд даа аЕс ааа =дд
ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 О1и Не Ьуз Агд
100 105
<210? 141 <211? 108 <212? ПРТ <213? Ното зартепз ехп Зег Рго Зег Зег 10 Ьеи Зег АТа Зег Уа1 15 С1у
<400? 141 Азр Не С1п МеЕ 1 ТЬг 5
Азр Агд Уа! ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег <31п Зег Не С1и Азп Агд
20 25 30
Ьеи С1у Тгр 35 Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а 40 Рго Ьуз 45 Ьеи Ьеи Не
Туг С1п А1а Зег Ьеи Ьеи <31п Зег С1у Уа1 Рго Бег Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
Зег <31у Зег <31у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
<31и Аер РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз οίη αΐη Азр Зег Туг РЬе Рго Агд
85 90 95
ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз Агд
100 105
<210? 142
<211? 324
<212? ДНК
<213? Ногао : зархепз
<220 >>
<221? СЬЗ
<222 :? (1) . . (324)
<400? 142
дас аЕс сад аЕд асе сад ЕсЕ сса Есс Есс сЕд ЕсЕ дса ЕсЕ дЕа дда
Аер Не С1п МеЕ ТЬг <31п Зег Рго Зег Бег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у
1 5 10 15
дас сдЕ дЕс асе аЕс асЕ Еде едд дса адЕ сад аде аЕЕ аЕд даЕ аад
199
Азр Агд Уа1 ГЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Зег Не МеС Азр Ьуз 20 25 30
ССа аад Сдд Сас сад сад ааа сса ддд ааа дсс ссС аад сСс сСд асе Ьеи Ьуз Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьув А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е
40 45
144
Сас сад дса Ссс асе ссд саа адС ддд дСс сса Сса сдС ССс адС ддс Туг С1п А1а Зег Не Ьеи С1п Зег <31у 7а1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
55 60
192
аде дда СсС ддд аса дас ЁСС асе сСс асе асе аде адС сСд саа ссС
Зег С1у Бег О1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Бег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
даа дас ССС дсс асд Сас Ъас сдс саа сад да С адЪ ддд ддь ссС аас
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг туг Суз С1п С1п Азр Бег О1у С1у Рго Азп
85 90 95
240
288 асд ССс ддс саа ддд асе аад дед даа асе ааа сдд ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз 7а1 С1и 11е Ьуа Агд 100 105
324 <210? 143 <211? 108 <212? ПРТ <213? Ното заргепз <400? 143
Азр Не С1п МеС ТЬг <31п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 <31у 15 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Зег 11е МеС Азр Ьуз 20 25 30
Ьеи Ьуз Тгр Туг С1п О1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е 35 40 45
Туг С1п А1а Зег 11е Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у 50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи 61п Рго 65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Азр Зег С1у С1у Рго Азп 85 90 95
ТЬг РЬе С1у 01п С1у ТЬг Ьуз Уа1 О1и 11е Ьуз Агд 100 105
<210? 144
<211? 324
<212? ДНК
<213? Ното заргепз
<220?
200 020464 <321? СИЗ <222? (1)..(324) <400? 144
да с асе сад аЕд асе сад ЕСЕ сса Есс
Азр 1 Пе Е1п МеЕ ТЬг 5 С1п Зег Рго Зег
дас сде дЕс асе аЕс асе Сдс сдд дса
Азр Агд Ча1 ТЬг 20 Пе ТЬг Суз Агд А1а 25
ССа дад Сдд Сас сад сад ааа сса ддд
Ьеи б1и Тгр 35 Туг С1п <31п Ьуз Рго 40 С1у
ЕаЕ даС дса ссс саЕ ЕЕд саа адЕ ддд
Туг Азр 50 А1а Зег Ηίβ Ьеи С1п 55 Зег С1у
аде дда ссс ддд аса дас ЕЕс асЕ сЕс
Зег 65 О1у Зег 01у ТЬг Азр 70 РЬе ТЬг Ьеи
даа даС ССС дсс асд Еас Еас ьдь саа
С1и Азр РЬе А1а ТЬг 85 Туг Туг Суз С1п
асд ССс ддс саа ддд асе аад дЕд даа
ТЬг РЬе С1у О1п С1у ТЬг Ьуз Ча1 О1и
100 105
Ссс сЕд СсЬ дса ЬсС дЕа дда 48
Зег Ьеи Зег А1а Зег Ча1 С1у 10 15 аде сад аде аЕЕ ддд адд аас 96
Зег Я1п Зег Пе Я1у Агд Азп ааа дсс ссЬ аад сСс сСд аЕс 144
Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е дсс сса Сса сдс ССс аде ддс 192
7а1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
асе ТЬг аЕс Пе 75 аде Зег адЕ Бег сЕд Ьеи саа С1п ссЕ Рго 80
сад Ссд сдЕ Едд сЕЕ ССЕ сдЕ
<31п Зег Агд Тгр Ьеи Рго Агд
90 95
аЕс ааа сдд
Пе Ьуз Агд
<210? 145 <211? 108 <212? ПРТ <213? Ното заргепе <400? 145
Азр 1 Пе О1п МеЕ ТЬг 5 <31п Зег Рго Зег
Азр Агд Уа1 ТЬг 20 Пе ТЬг Суз Агд А1а 25
Ьеи <31и Тгр 35 Туг С1п С1п Ьуз Рго 40 С1у
Туг Азр 50 А1а Зег Ηί3 Ьеи С1п 55 Зег С1у
Зег 65 С1у Зег 51у ТЬг Азр 70 РНе ТЬг Ьеи
С1и Азр РЬе А1а ТЬг 85 Туг Туг Суз С1п
ТЬг РЬе е1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и
Зег Ьеи Зег А1а Зег 7а1 С1у 10 15
Зег <31п Зег 11е С1у Агд Азп 30
Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е 45
Ча1 Рго Зег Агд РЬе Зег О1у 60
ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго 75 80
С1п Зег Агд Тгр Ьеи Рго Агд 90 95
Не Ьуе Агд
201 020464
100
105 <210> 146 <211> 324 <212> ДНК <213 > Ното зар1епз <220>
<221> СРЗ <222> {X)..(324) <400> 146 дас аСс сад аед асе сад есе сса есс Ссс сед есе дса есе дса дда Азр 11е С1п Мес ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег 7а1 С1у 15 10 15 дас еде дСс асе аСс асС Сдс сдд дса адС сад аде аСС адд аад аед Азр Агд 7а1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Зег 11е Агд Ьуз МеС
25 30 ееа дСС Ьдд Сас сад сад ааа сса ддд ааа дсс ссС аад сес сед аСс Ьеи 7а1 Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е
40 45
144
СаС сдд дса Ссс СаС ССд саа аде ддд дСс сса Сса сдС ССс аде дде Туг Агд А1а Зег Туг Ьеи С1п Зег <31у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
55 60
192
аде дда СсС ддд аса даС ССс асе сСс асе аЬс аде аде сед саа ссе
Зег С1у Зег С1у ТЬг Аэр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег зег Ьеи <31п РГО
65 70 75 80
даа дае еее дсе асд Сас Сас еде саа сад дсе еее сдд сдд ссе адд
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз αΐη С1п А1а РЬе Агд Агд Рго Агд
85 90 95
240
283 асд еес дде саа ддд асе аад дед даа аСс ааа сдд ТЬг РЬе С1у С1и С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз Агд 100 105
324 <210> 147 <211? 108 <212> ПРТ <213? Ното зар!епз <400> 147
Азр Не Οίη Мес ТЬг О1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у 15 10 15
Аэр Агд 7а1 ТЬг Не ТЬг Суд Агд А1а Зег С1п Зег Не Агд Ьуз Мее 20 25 30
Ьеи 7а1 Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не 35 40 45
Туг Агд А1а Зег Туг Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Аед РЬе Зее С1у 50 55 60
- 202 020464
Бег СДу Бег СДу ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Бег Бег Ьеи СДп Рго
65 70 75 80
СДи Аэр РЬе АДа ТЬг Туг Туг Суз СДп С1п А1а РЬе Агд Агд Рго Агд
85 90 95
ТЬг РЬе СДу С1п СДу ТЬг Ьуз УаД СДи Не Ьуз Агд
100 105
<210? 148 <211? 345 <212> ДНК <213? Ното ! зар1епз
<220?
<221? СРЗ <222? (1).. (345)
<400? 148
дад дьд сад сдд СДд дад ДсД ддд дда ддс ДДд дДа сад ссС ддд ддд 48
СДи УаД СДп Ьеи Ьеи СДи Бег СДу СДу СДу Ьеи УаД СДп Рго СДу СДу
1 5 10 15
Дсс сдд сдД сДс дсс ддд дса дсс Дсс дда ДДС асе ДДД даД СДД ДаД 96
Бег Ьеи Агд Ьеи Бег Суз А1а АДа Бег СДу РЬе ТЬг РЬе Азр Ьеи Туг
20 25 30
ааД аДд ДДД сдд ддс сдс сад дед сса ддд аад ддс с Да дад ддд дДс 144
Азп МеД РЬе Тгр УаД Агд СДп АДа Рго СДу Ьуз СДу Ьеи СДи Тгр УаД
35 40 45
Дса ДДД ад Д адд сад асд ддд адд СДД аса ьдд Дас дса дас Дсс дед 192
Бег РЬе Не Бег СДп ТЬг СДу Агд Ьеи ТЬг Тгр Туг АДа Аэр Бег УаД
50 55 60
аад ддс сдд ДДс асе аде Дсс сдс дас ааД Дсс аад аас асд сдд дад 240
Ьуэ СДу Агд РЬе ТЬг Не Бег Агд Азр Азп Бег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
сДд саа аДд аас аде сДд сдД дсс дад дас асе дед дДа ДаД Дас ДдД 288
Ьеи СДп МеД Азп Бег Ьеи Агд АДа СДи Азр ТЬг АДа УаД Туг Туг Суз
85 90 95
дед ааа асд сДд дад даД ДДД дас Дас едд ддс сад дда асе сДд дДс 336
АДа Ьуз ТЬг Ьеи СДи Азр РЬе Азр Туг Тгр СДу СДп СДу ТЬг Ьеи УаД
100 105 110
асе дДс Дед 345
ТЬг УаД Бег
115
<210? 149
<211? 115
<212? ПРТ
<213? Ното зархепз
<400? 149
СДи УаД СДп Ьеи Ьеи СДи Зег СДу СДу СДу Ьеи УаД СДп Рго СДу СДу
1 5 10 15
- 203 020464
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Азр Ьеи Туг 20 25 30
Азп МеС РЬе Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи (31и Тгр Л7а1 35 40 45
Зег РЬе Ие Зег С1п ТЬг С1у Агд Ьеи ТЬг Тгр Туг А1а Азр Зег Уа1 50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг Ие Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 65 70 75 80
Ьеи С1п МеС Азп Зег Ьеи Агд А1а <31и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 90 95
А1а Ьуз ТЬг Ьеи Ни Азр РЬе Азр Туг Тгр С1у <31п Ну ТЬг Ьеи Ча1 100 105 110
ТЬг Уа1 Зег 115 <210? 150 <211? 357 <212? ДНК <213? Ното зархепз <220?
<221? СОЗ <222? (1)..(357) <400? 150 дад дед сад сед ССд дад СсС ддд дда дде ссд дСа сад ссс ддд ддд С1и Уа1 Пп Ьеи Ьеи С1и Зег С1у С1у <31у Ьеи Д7а1 С1п Рго С1у С1у 15 10 15
Ссс сед сде сСс Ссс СдС дса дсс Ссс дда ССс асе ССС ссд дСС СаС Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег 61у РЬе ТЬг РЬе Рго Уа1 Туг
25 30 аСд аСд ддС Сдд дСс сдс сад дсС сса ддд аад ддС сСа дад Сдд дСс МеС МеС С1у Тгр Уа1 Агд Ип А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
40 45
144
Сса Ссд аСС даС дсС сСС ддС ддд сдд аса ддС Сас дса дас Ссс дед Зег Зег 11е Азр А1а Ьеи <31у Иу Агд ТЬг С1у Туг А1а Азр Зег Уа1
55 60
192 аад дде сдд ССс асе аСс Ссс сдс дас ааС Ссс аад аас асд сСд СаС Ьуз Иу Агд РЬе ТЬг Ие Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 65 70 75 80
240 сед саа асд аас аде сед сде дсс дад дас асе дед дса СаС Сас СдС Ьеи С1п МеС Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
90 95
283 дед ааа асе асд Ссд аас аад асд сас асд ССС дас Сас Сдд дде сад
336
- 204 020464
А1а ьуз тьг МеБ Зег Азп Ьуз тЬг ΗΪ3 ТЬг РЬе Азр Туг Тгр С1у О1п
100 105 110
дда асе сБд дБс асе дБс Бед 357
<31у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег
115
<210? 151 <211> 119 <212? ПРТ
< 213 > Ното ! эархепе
<400> 151 <31и Уа1 С1п Ьеи Ьеи <31и Зег О1у О1у О1у Ьеи Уа1 С1п Рго <31у С1у
1 5 10 15
Бег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а АТа Бег 51у РЬе ТЬг РЬе Рго Уа1 Туг
20 25 30
МеБ МеБ С1у Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго О1у Ьуз <31у Ьеи <31и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Зег 11е Азр А1а Ьеи <31у С1у Агд ТЬг О1у Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеБ Азп Зег ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Ьуз ТЬг МеБ Зег Азп Ьуз ТЬг ΗίΒ ТЬг РЬе Азр Туг Тгр С1у С1п
100 105 110
С1у тЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег
115
<210? 152 <211? 345 <212> ДНК
<213> Ното ί зархепз
<220> <221> ССЗ <222> (1).. (345)
<400? 152 дад дБд сад сБд ББд дад БСБ ддд дда ддс ББд дБа сад ссБ ддд ддд 48
<31и Уа1 <31п Ьеи Ьеи <31и Зег С1у С1у О1у Ьеи Уа1 О1п Рго С1у 61у
1 5 10 15
Бсс сБд сдБ СБС Бсс БдБ дса дсс Бсс дда ББс асе БББ дБд до Б БаБ 96
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег О1у РЬе ТЬг РЬе УаТ А1а Туг
20 25 30
- 205
аас Азп асд МеС асС ТЬг 35 сдд дСс Тгр Уа1 сдс Агд сад дсС сса Рго ддд С1у аад Ьуз ддс С1у сСа Ьеи 45 дад С1и Сдд Тгр дСс Уа1 144
С1п А1а 40
Сса аде аСС аас асе ССС ддс аас Сад аса адд сас дса дас Ссс дед 192
Зег Зег Пе АЗП ТЬг РЬе С1у Азп <31п ТЬг Агд туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
аад ддс сдд ССс асе аСс Ссс сдс дас ааС Ссс аад аас асд сед сас 240
Ьуз <31у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
сед саа асд аас аде сСд сдС дсс дад дас асе дед дСа СаС Сас СдС 288
Ьеи С1п МеС Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
дед ааа ддС аде адд ссс ССС дас Сас сдд ддс сад дда асе сед дСс 336
А1а Ьуз С1у Зег Агд Рго РЬе Азр Туг Тгр С1у С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1
100 105 110
асе дСс Сед 345
ТЬг Уа1 Зег
115 <210а 153 <211> 115 <212> ПРТ <213> Ното зарЬепз <400> 153
61и 1 Уа1 С1п Ьеи Ьеи С1и Зег 5 С1у С1у С1у 10 Ьеи Уа1 <31п Рго С1у С1у 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег 61у РЬе ТЬг РЬе Уа1 А1а Туг
20 25 30
Азп МеС тЬг Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Зег Пе Азп ТЬг РЬе О1у АЗП Е1п ТЬг Агд Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз О1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеС Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Ьуз С1у Зег Агд Рго РЬе Азр Туг Тгр 51у С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1
100 105 110
тЬг Уа1 Зег 115 <210> 154
- 206 <211? 357 <212> ДНК <213? Ното еархепе <220?
<221? СОЗ <222? (1)..(357) <400? 154
дад дСд сад 61п сСд сед дад сес Зег ддд дда ддс <31у 10 ССд Ьеи дСа Уа1 сад 61 п ссС Рго ддд 01у 15 ддд О1у 48
61и 1 Уа1 Ьеи Ьеи 5 61и 61у С1у
Ссс сСд сдс осе Ссс ьдс дса дсс Ссс дда Сес асе ССС Сад ддд Сас 96
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе 61п 61у Туг
20 25 30
сдс аСд ддС ьдд дСс сдс сад дсс сса ддд аад ддь сСа дад Сдд дсс 144
Агд МеС <Э1у Тгр Уа1 Агд О1п А1а Рго О1у Ьуз е1у Ьеи Й1и Тгр Уа1
35 40 45
Сса сдд аСС асд сдС асе ддс ддд асд аса сад Сас дса дас Ссс дед 192
Зег Тгр Не ТЬг Агд ТЬг О1у С1у ТЬг ТЬг С1п Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
аад ддс сдд ССс асе аСс Ссс сдс дас аае Ссс аад аае асд сед еае 240
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
сСд саа асд аае аде сед сдс дсс дад дас асе дед дСа СаС Сас Сдс 288
Ьец 51п МеС Азп Зег Ьеи Агд А1а 61и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
дед ааа ссд дед аад ССС дсс ддд дСЬ ддд ССС дас Сас сдд ддс сад 336
А1а Ьуз Рго А1а Ьуз Ьеи Уа1 С1у Уа1 С1у РЬе Азр Туг тгр 61у 61п
100 105 но
дда асе сСд дСс асе дСс Ссд 357
61у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег
115
<210? 155 <211? 119 <212> ПРТ
<213? Ното вар1епз
<400? 155 С1и Уа1 61п Ьеи Ьеи 61и Зег 61у 61у С1у Ьеи Уа1 61 п Рго 61у 61у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе 61п 61у Туг
20 25 30
Агд МеС С1у Тгр Уа1 Агд 61п А1а Рго 61у Ьуз С1у Ьеи 61и Тгр Уа1
35 40 45
Зег тгр Не ТЬг Агд ТЬг С1у С1у ТЬг ТЬг С1п Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
207
ьуз 65 С1у Агд РЬе ТЬг 11е 70 Зег Агд Азр Азп Зег 75 Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 80
Ьеи σΐη Мес Азп Зег 85 Ьеи Агд А1а 01и Азр 90 ТЬг А1а Уа1 Туг Туг 95 Суз
А1а Ьуз Рго А1а 100 Ьуз Ьеи Уа1 С1у Уа1 105 С1у РЬе Азр Туг Тгр 110 С1у С1п
С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег
115 <210? 156 <211? 357 <212> ДНК
<213? Нот» : зархепз
<220?
<221? СРЗ
<222? С 1) . . {357: 1
<400? 156
дад дед сад сед ссд дад есе ддд дда ддс ссд дСа сад ссС ддд ддд 48
С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи <31и Зег 01у С1у 61у Ьеи Уа1 01п Рго 61 у С1у
1 5 10 15
есс ссд сдС сСс Ссс СдС деа дсс есс дда ССс асе ССС едд аад сас 96
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе тЬг РЬе Агд Ьуз Туг
20 25 30
Сад асд ддд едд дсс сдс сад дсс сса ддд аад ддс сСа дад едд дсс 144
С1п мес С1у Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Сса сад асе ддс дед аад ддс сад сес аса дас Сас деа дас Ссс дед 192
Зег С1п 11е С1у А1а Ьуз С1у 31п Зег ТЬг Азр Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
аад ддс едд еес асе асе есс сдс дас аас Ссс аад аас асд сед сас 240
Ьуз О1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 30
сСд саа аСд аас аде сСд сдС дсс дад дас асе дед дСа СаС Сас еде 288
Ьеи С1п МеС Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
дед ааа аад аад адд ддд дад аас еае ССС ССС дас Сас едд ддс сад 336
А1а Ьуз Ьуз Ьуз Агд С1у С1и Азп Туг РЬе РЬе Азр Туг Тгр С1у 61п
100 105 но
дда асе сСд дСс асе дСс Ссд 357
С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег
115 <210? 157 <211? 119 <212> ПРТ <213? Ното зарДепз
- 208 020464 <400» 157
<31и Уа1 1 (31п Ьеи Ьеи 5 <31и Зег С1у С1у С1у 10 Ьеи 7а1 <31п Рго 61у 15 С1у
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Агд Ьуз Туг
20 25 30
С31п МеС 61у Тгр Уа1 Агд <31п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С31и Тгр Л/а 1
35 40 45
Зег 61п Не е1у А1а Ьуз С1у С1п Зег ТЬг Азр Туг А1а Азр Зег 7а1
50 55 60
Ьуз <31у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п Мес АЗП Зег Ьеи Агд А1а 01и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Ьуз Ьуз Ьуз Агд Й1у С1и Азп Туг РЬе РЬе Азр Туг Тгр <31у С1п
100 105 110
С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг νβΐ Зег
115 <210» 158 <211» 357 <212» ДНК <213» Ношо зараепз <220» <221» СОЗ
<222» <1).. (357)
<400» 158
дад дед сад ссд ССд дад СсС ддд дда ддс ССд дСа сад ссС ддд ддд 48
31и νβΐ О1п Ьеи Ьеи О1и Зег С1у Й1у С1у Ьеи νβΐ О1п Рго 61у О1у
1 5 10 15
Ссс сСд сдс сСс Ссс ьдь дса дсс Ссс дда ССс асе ССС сдд сдд СаС 96
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Агд Агд Туг
20 25 30
адС аСд Ссд ьдд дсс сдс сад дсс сса ддд аад ддь сСа дад Сдд дСс 144
Зег МеС Зег Тгр Уа1 Агд <31п А1а Рго С1у Ьуз <31у Ьеи <31и Тгр Уа1
35 40 45
Сса дас ас С ССС сде СсС ддс сдд СаС аса сас Сас дса дас Ссс дед 192
Зег Азр Не Зег Агд Зег <31у Агд Туг ТЬг Н1а Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
аад ддс сдд ССс асе аСс Ссс сдс дас аас Ссс аад аас асд сед СаС 240
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг Пе зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
сСд саа аСд аас аде сСд сдС дсс дад дас асе дед дСа СаС Сас ьдь 288
- 209 020464
Ьеи С1п Мес АЗП Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
дед ааа сдС аСЬ даС СсС СсС сад аас ддд ССС дас Сас Сдд ддс сад 336
А1а Ьуз Агд Не Азр Зег зег С1и Азп С1у РЬе Азр Туг Тгр О1у С1п
100 105 НО
дда асе сСд дсс асе дСс Сед 357
31у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег
115
<210? 159 <211? 119 <212> ПРТ
<213? Ното : зархепз
<400? 159 С1и Уа1 С31п Ьеи Ьеи С1и Зег С1у С1у С1у ьеи Ца1 О1п Рго <?1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Агд Агд Туг
20 25 30
Зег МеС Зег Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз О1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Азр Не Зег Агд Зег С1у Агд Туг ТЬг Н1 5 Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеС Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Ьуз Агд Не Азр Зег Зег С1п Азп С1у РЬе Азр Туг Тгр С1у 61η
то 105 110
С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег
115
<210? 160 <211? 345 <212? ДНК
<213? Ното ! эархепе
<220? <221? СРЗ
<222? (1).. (345)
<400? 160 дад дЬд сад ССд ССд дад ссс ддд дда ддс ССд дСа сад ссС ддд ддд 48
С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи <Э1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 <31п Рго <31у С1у
1 5 10 15
- 210 020464
Ссс Зег сСд сдС Ьеи Агд сСс Ьеи 20 Ссс Зег СдС Суз дса А1а дсс А1а Ссс Зег 25 дда С1у ССс РЬе асе ТЬг ССС РЬе Сад <31п 30 ддд С1у СаС Туг 96
аад аСд ССС Сдд дСс сдс сад дсС сса ддд аад сСа дад ьдд дСс 144
Ьуз мес РЬе Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Сса дсС аСС адС ддь адС дд£ дд£ аде аса Сас ьас дса дас Ссс д^д 192
Зег А1а Ие Зег Е1у Зег 01у С1у Зег ТЬг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
аад дде сдд ссс асе аСс Ссс сдс дас ааС Ссс аад аас асд сСд СаС 240
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг Ие Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
ссд саа асд аас аде сСд сдС дсс дад дас асе дед дСа СаС Сас СдС 288
Ьеи С1п МеС Азп Зег Ьеи Агд А1а <31и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
дед ааа сад аад дад ааС ССС дас Сас ^дд дде сад дда асе сСд дСс 336
А1а Ьуз С1п Ьуз <31и Азп РЬе Азр Туг Тгр С1у С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1
100 105 110
асе дСс Ссд 345
ТЬг Уа1 Зег
115 <210? 161 <211? 115 <212> ПРТ <213? Ното зартепз <400? 161
<31и 1 Уа1 <31п Ьеи Ьеи 5 С1и Зег <31у 01у <31у 10 Ьеи Уа1 С1п Рго С1у 15 С1у
Зег Ьеи Агд Ьеи 20 Зег Суз А1а А1а Зег 25 С1у РЬе ТЬг РЬе С1п 30 С1у Туг
Ьуз МеС РЬе 35 Тгр Уа1 Агд О1п А1а 40 Рго С1у Ьуз 61у Ьеи 45 С1и Тгр Уа1
Зег А1а 50 Не Зег <31у Зег <31у 55 <31у Зег ТЬг Туг Туг 60 А1а Азр Зег Уа1
Ьуз 65 С1у Агд РЬе ТЬг Не 70 Зег Агд Азр Азп Зег 75 Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 80
Ьеи С1п МеС Азп Зег 85 Ьеи Агд А1а <31и Азр 90 ТЬг А1а Уа1 Туг туг 95 Суз
А1а Ьуз С1п Ьуз 100 С1и Азп РЬе Азр Туг 105 Тгр С1у 61п С1у ТЬг 110 Ьеи Уа1
ТЬг Уа1 Зег
- 211 020464
115 <210? 162 <211? 357 <212? ДНК <213? Ното зарьепз <220?
<221? СПЗ <222? (1) . , (357) <400? 162
дад дСд сад 61п сСд Ьеи ССд Ьеи 5 дад С1и СсС Зег ддд С1у дда <31у ддс <31у 10 ССд Ьеи дСа νβΐ сад ссС ддд С1у 15 ддд С1у 48
<31и 1 Уа1 61п Рго
Ссс сед сдс ссс Ссс сдс дса дсс Ссс дда ССс асе ССС ддд даС СаС 96
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег Е1у РЬе ТЬг РЬе О1у Азр Туг
20 25 30
дсС аСд сдд сдд дсс сдс сад дсС сса ддд аад ддс сса дад сдд дСс 144
А1а МеС Тгр Тгр Уа1 Агд <31п А1а Рго <31у Ьуе <31у Ьеи <31и Тгр Уа1
35 40 45
Сса дСд аСС адС Ссд ааС ддС ддд адС аса ССС Сас дса дас Ссс дСд 192
Зег Уа1 11е Зег Зег Азп О1у <31у Зег ТЬг РЬе Туг А1а Азр Зег νβΐ
50 55 60
аад ддс сдд ССс асе аСс Ссс сдс дас ааС Ссс аад аас асд ссд СаС 240
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
ссд саа аСд аас аде сСд сдС дсс дад дас асе дед дСа СаС Сас сдс 288
Ьеи С1п МеС Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
дед ааа еде дсс сдС аад адд асе ссС дад ССС дас Сас сдд ддс сад 336
А1а Ьуз Агд Уа1 Агд Ьуз Агд ТЬг Рго <31и РЬе Азр Туг Тгр С1у С1п
100 105 но
дда асе сед дСс асе дСс Ссд 357
в1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег
115
<210? 163 <211? 119 <212? ПРТ <213? Ното ! <400? 163 С1и Уа1 С1п 1 заргепе Рго С1у О1у 15
Ьеи Ьеи 5 С1и Зег С1у С1у С1у 10 Ьеи 7а1 01п
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе <31у Азр туг
20 25 30
А1а МеС Тгр Тгр Уа1 Агд С31п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи 01и Тгр Уа1
35 40 45
212 020464
Зег 7а1 Пе Зег Зег Азп <31у С1у Зег ТЬг РЬе Туг А1а Азр Зег Уа1 50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп тЬг ьеи Туг 65 70 75 80
Ьеи 51п МеС Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 90 95
А1а Ьуз Агд 7а1 Агд Ьуз Агд ТЬг Рго 61и РЬе Азр Туг Тгр 31у С1п 100 105 110
С1у ТЬг Ьеи 7а1 ТЬг Уа1 Зег 115 <210> 164 <211> 357 <212> ДНК <213? Ното зартепз <220?
<221> СБЗ <222> (1),.(357) <400? 164 дад дСд сад сСд «д дад СсС ддд дда дде ССд дса сад ссе ддд ддд С1и 7а1 б1п Ьеи Ьеи С1и Зег С1у О1у <31у Ьеи Уа1 С1п Рго а1у С]у 15 10 15
Ссс сСд сдС сСс Ссс СдС дса дсс Ссс дда ссе асе ССС адд адд ЬаЬ Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Агд Агд Туг
25 30 аад асд дде Сдд дСс сдс сад дсс сса ддд аад дде сСа дад Сдд дСс Ьуз МеС С1у Тгр 7а1 Агд С1п А1а Рго 61у Ьуз С1у Ьеи 61и Тгр Уа1
40 45
144
Сса дед асе ддд адд аас дде асд аад аса аас Сас дса дас Ссс дед Зег А1а 11е С1у Агд Азп <31у ТЬг Ьуз ТЬг Азп Туг А1а Азр Зег 7а 1
55 60
192 аад дде сдд ССс асе аСс Ссс сдс дас ааС Ссс аад аас асд сСд СаС Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 65 70 75 80
240 сСд саа асд аас аде сСд сдс дсс дад дас асе дед дса СаС Сас СдС Ьеи <31п Мес Азп Зег Ьеи Агд А1а 61и Азр ТЬг А1а 7а1 Туг Туг Суз
90 95
288 дед ааа аСС СаС асд ддд аад ссе дсс дед ССС дас Сас Сдд дде сад А1а Ьуз Не Туг ТЬг <31у Ьуз Рго А1а А1а РЬе Азр Туг Тгр (31у С1п
100 105 110
336
- 213
дда асе сСд дСс асе дСс Сед 357
С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег
115
<210> 165
<211? 119
<212> ПРТ
<213 > Ното зархепз
<400> 165
С1и νβΐ С1п Ьеи Ьеи 61и Зег О1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго <31у <31у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Агд Агд Туг
20 25 30
Ьуз МеС 51у Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз е1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег А1а Не С1у Агд Азп С1у ТЬг Ьуз ТЬг Азп Туг А1а Азр 5ег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеС Азп зег Ьеи Агд А1а <31и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Ьуз Не Туг ТЬг О1у Ьуз Рго А1а А1а РЬе Авр Туг Тгр С1у С1п
100 105 но
С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег
115 <210? 166 <211> 357 <212> ДНК
<213? Ното зарЬепз
<220? <221? СОЗ <222? (1) . . (357)
<400> 166
дад дед сад сСд ССд дад ддд дда ддс ССд дса сад ссС ддд ддд 48
С1и Уа1 51п Ьеи Ьеи <31и Зег С1у 51у 61у Ьеи ν»ι С1п Рго <31у О1у
1 5 10 15
Ссс сСд сдС сСс Ссс СдС дса дсс Ссс дда ССс асе ССС аад аад СаС 96
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег <31у РЬе ТЬг РЬе Ьуз Ьуз Туг
20 25 30
Сад асд СсС Сдд дСс сдс сад дсс сса ддд аад ддс сСа дад Сдд дСс 144
С1п МеС Бег Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз 01у Ьеи С1и Тгр Уа1
- 214 020464
35 40 45
Еса дсЕ аЕЕ адЕ ддЕ адЕ ддь ддЕ аде аса Еас Еас дса дас Есс дЕд 192
Зег А1а 11е Бег С1у Бег С1у С1у Зег ТЬг Туг Туг А1а Азр Зег Ча1
50 55 60
аад ддс сдд ЕЕс асе аЕс Есс сдс дас ааЕ Есс аад аас асд сЕд ЕаЕ 240
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Бег Агд АЗр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
сЕд саа аЕд аас аде ссд СдЕ дсс дад дас асе дед дЕа ЕаЕ Еас ЕдЕ 288
Ьеи О1п МеЕ Аэп Зег Ьеи Агд А1а О1и Азр тЬг А1а ча1 Туг Туг Суз
85 90 95
дед ааа аЕд сЕд адд асЕ аад ааЕ аад дьд ЕЕЕ дас Еас Едд ддс сад 336
А1а Ьуе МеЕ Ьеи Агд ТЬг Ьуз Азп Ьуз Ча1 РЬе Азр Туг Тгр С1у С1п
100 105 110
дда асе сЕд дЕс асе дЕс Есд 357
С1у ТЬг Ьеи Ча! ТЬг Ча1 Зег
115 <210? 167 <211? 119 <212> ПРТ
<213? Ното <400? 167 зархепз С1и Бег С1у СХу СХу Ьеи Ча1 С1п Рго С1у □1у
Ьеи Ьеи 5
С1и ν&Ι 1 61п
10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а АХа Бег 61у РЬе ТЬг РЬе Ьуз Ьуе Туг
20 25 30
С1п МеЕ Зег Тгр Ча1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Ча!
35 40 45
Зег А1а 11е Зег СХу Зег С1у С1у Зег ТЬг Туг Туг А1а Азр Зег Ча1
50 55 60
ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр АЗП Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеЕ Азп Зег Ьеи Агд АХа С1и Азр ТЬг А1а Ча1 Туг Туг Суз
35 90 95
А1а Ьуз МеЕ Ьеи Агд ТЬг Ьуз Азп Ьуз Ча1 РЬе Азр Туг Тгр С1у С1п
100 105 110
СХу ТЬг Ьеи 7а1 ТЬг 7а1 Зег 115 <210? 168 <211? 357 <212? ДНК
- 215 020464 <213? Ното зархепз <220?
<221? СРЗ <222? (1)..(357) <400? 168
Зад 51и 1 дед сад сед Уа1 Θΐη Ьеи ссд Ьеи 5 дад О1и СсС Зег ддд дда С1у 31у дде 31у 10 ссд Ьеи дСа Уа1 сад О1п еес Рго ддд С1у 15 ддд <31у 48
ССС сЬд сдС сЬс Ссс СдС дса дсс Ьее дда ССс асе ССС адд адд СаС 96
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Агд Агд Туг
20 25 30
аад аСд дде Сдд дСс еде сад дсС сса ддд аад дде сЬа дад Сдд дСс 144
Ьуз мес О1у Тгр Уа1 Агд (31п А1а Рго С31у Ьуз 61у Ьеи <31и Тгр Уа1
35 40 45
Сса дед асе ддд адд ааС дде асд аад аса ааС Сае дса дас Ссс дед 192
Зег А1а Не С1у Агд Азп С1у ТЬг Ьуэ ТЬг Азп Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
аад дде едд ССс асе аСс Ссс еде дас ааС Ссс аад аас асд сЬд СаС 240
Ьуз 31у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Авр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
сСд саа аЬд аас аде сЬд сдС дсс дад дас асе дед дЬа СаС Сае еде 288
Ьеи 31п МеС Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
дед ааа аСС СаС асд ддд аад ссС дсс дед ССС дас Сае Сдд дде сад 336
А1а ьуз Не Туг ТЬг О1у Ьуз Рго А1а А1а РЬе Азр Туг тгр <31у С1п
100 105 но
дда асе сСд дСс асе дСс Сед 357
С1у ТНг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег
115 <210? 169 <211? 119 <212> ПРТ <213? Ното зарХепз <400? 169
С1и 1 Уа1 С1п Ьеи Ьеи 5 С1и Зег <31у С1у <31у 10 Ьеи Уа1 С1п Рхо <31у 15 <31у
Зег Ьеи Агд Ьеи 20 Зег Суз А1а А1а Зег 25 С1у РЬе ТЬг РЬе Агд 30 Агд Туг
Ьуз Мес С1у 35 Тгр Уа1 Агд С1п А1а 40 Рго 61у Ьуз С1у Ьеи 45 С1и Тгр Уа1
Зег А1а 50 Не <31у Агд Азп <31у 55 ТЬг Ьуз ТЬг Азп Туг 60 А1а Азр Зег Уа1
Ьуз 65 <31у Агд РЬе ТЬг Не 70 Зег Агд Азр Азп Зег 75 Ьуз Авп ТЬг Ьеи Туг 80
216 020464
Ьеи С1п МеС Азп Зег 85 Ьеи Агд А1а <31и Азр 90 ТЬг А1а Уа1 Туг Туг 95 Суз
А1а Ьуз 11е Туг 100 ТЬг О1у ьуз Рго А1а 105 А1а РЬе АЗр Туг Тгр но Й1у С1п
С1у ТЬг ьеи 115 Уа1 ТЬг Уа1 Зег
<210> 170 <211> 357 <212> ДНК <213> ното ί заруепэ
<220ь
<221> СОЗ
<22! :> С 1) . . (357)
<400> 170
дад дСд сад еСд ССд дад СсС ддд дда ддс ССд дса сад ссе ддд ддд 48
<31и Уа1 <31п Ьеи Ьеи С1и Зег <31у <31у О1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у <31у
1 5 10 15
Ссс сед сдс ссс Ссс сдс дса дсс Ссс дда ССс асе ссс Сад ад С СаС 96
Зег Ьеи Агд ьеи Зег Суз А1а А1а Зег 61у РЬе ТЬг РЬе С1п Зег Туг
20 25 30
сдд аСд ддс сдд дСс сдс сад дсС сса ддд аад ддс сСа дад Сдд дСс 144
Агд Мес С1у Тгр Уа1 Агд <31п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи О1и тгр νβΐ
35 40 45
Сса адС аСС Ссд Ссд адд ддс адд сас аса СсС Сас дса дас Ссс дед 192
Зег Зег 11е Зег Зег Агд С1у Агд Нгз ТЬг Зег Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
аад ддс сдд ССс асе аСс Ссс сдс дас ааС Ссс аад аас асд еСд СаС 240
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Авр Авп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
сед саа асд аас аде сед ед С дсс дад дас асе дед дса сас сас СдС 288
Ьеи С1п МеС Азп Зег Ьеи Агд АДа С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг туг Суз
85 90 95
дед ааа адд дсс ссд ддс сдд ддд сдЬ СсС ССС дас сас сдд ддс сад 336
А1а Ьуз Агд Уа1 Рго 61у Агд С1у Агд Зег РЬе Азр Туг Тгр О1у С1п
100 105 но
дда асе еСд дСс асе дСс Ссд 357
<31у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег
115
- 217 020464
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз АДа АДа Зег СДу РЬе ТЬг РЬе СДп зег Туг
20 25 30
Агд Мес СДу Тгр УаД Агд СДп АДа Рго СДу Ьуз СДу Ьеи СДи Тгр УаД
35 40 45
Зег Зег 11е Зег Зег Агд СДу Агд Ηίε ТЬг Зег Туг АДа Азр Зег УаД
50 55 60
Ьуз СДу Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр АЗП Зег Ьуз Αεη ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
ьеи СДп Мес Азп Зег Ьеи Агд АДа СДи Азр ТЬг АДа УаД Туг Туг Суз
85 90 95
АДа Ьуз Агд УаД Рго СДу Агд СДу Агд Зег РЬе Αερ Туг тгр СДу СДп
100 105 110
СДу ТЬг Ьеи УаД ТЬг УаД Зег
115 <210? 172 <211? 357 <212? ДНК <213? Ното заргепз <220?
<221? СОЗ <222? (1)..(357} <400? 172
дад дед сад сСд ССд дад СсС ддд дда ддс ССд дса сад ссС ддд ддд
СДи 1 УаД СДп Ьеи Ьеи 5 СДи Зег СДу СДу СДу 10 Ьеи УаД СДп Рго СДу 15 СДу
Ссс сСд сдС сСс Ссс СдС дса дсс Ссс дда ССс ссс ССС сдС сдд СаС
Зег Ьеи Агд Ьеи 20 Зег Суз АДа АДа Зег 25 □Ду РЬе Рго РЬе Агд 30 Агд Туг
сдд асд адд сдд дСс сдс сад дсс сса ддд аад ддс сСа дад Сдд дсс
Агд МеС Агд 35 Тгр УаД Агд СДп АДа 40 Рго СДу Ьуз СДу Ьеи 45 СДи Тгр УаД
Сса ддс аСС СсС ссд ддс ддС аад саС аса асд Сас дса дас Ссс дед
Зег СДу 50 Не Зег Рго СДу СДу 55 Ьуз Нтз ТЬг ТЬг Туг 60 АДа Азр Зег УаД
аад ддс сдд ССс асе аСс Ссс сдс дас ааС Ссс аад аас асд сСд СаС
Ьув 65 СДу Агд РЬе ТЬг 11е 70 Зег Агд Аер Азп Зег 75 Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 30
сед саа асд аас аде сСд сдС дсс дад дас асе дед дса СаС Сас СдС
Ьеи СДп МеС Азп Зег 85 Ьеи Агд АДа СДи Азр 90 ТЬг АДа УаД туг Туг 95 Суе
144
192
240
238
- 218 020464
дед ааа ддС дад ддд ддд дед адС СсС дед ССС дас Сас едд ддс сад 336
А1а Ьуз Е1у 01и С1у 51у А1а Зег Зег А1а РЬе Азр Туг Тгр С1у Θΐη
100 105 110
дда асе сСд дСс асе дСс Ссд 357
С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег
115
<210? 173 <211? 119 <212> ПРТ
<213? НОТОО 1 варгепз
<400? 173 31и Уа1 С1п Ьеи Ьеи <31и Зег 01у С1у С1у Ьеи Уа1 О1п Рго С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе Рго РЬе Агд Агд Туг
20 25 30
Агд МеС Агд Тгр Уа1 Агд 61п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зет С1у 11е Зег Рго <31у <31у Ьуз Н±з ТЬг ТЬг туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи О1п МеС Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
35 90 95
А1а Ьуз С1у С1и С1у <31у А1а Зег Бег А1а РЬе Азр Туг тгр С1у αΐη
100 105 110
(31 у ТЬг Ьеи νθΐ ТЬг Уа1 Зег
115
<210? 174 <211? 357 <212> ДНК
<213? Ното : зар!епз
<220? <221? СЬЗ <222? (1) . . (357)
<400? 174 дад дед сад ссд ССд дад СсС ддд дда ддс ССд дса сад ссС ддд ддд 43
<31и 7а1 <31п Ьеи Ьеи <31и Зег <31у <31у О1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у <31у
1 5 10 15
Ссс сед сдС ссс Ссс ьдь дса дсс Ссс дда ССс асе ССС Сад едд еас 96
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег <31у РЬе ТЬг РЬе <31п Агд Туг
- 219 020464
20 25 30
ддд аБд дББ Бдд дБс сдс сад дсБ сса ддд аад ддБ сБа дад Бдд дБс 144
С1у МеБ УаТ Тгр Уа1 Агд СТп А1а Рго С1у Ьуз СТу Ьеи С1и Тгр УаТ
35 40 45
Бса дсБ аББ адБ ддБ адБ ддБ ддБ аде аса Бас Бас дса дас Бсс дБд 192
Зег АТа Пе Зег СТу Зег СТу С1у Зег ТЬг Туг Туг АТа Азр Зег УаТ
50 55 60
аад ддс едд ББС асе аБс Бсс сдс дас ааБ Бсс аад аас асд сБд БаБ 240
Ьуз СТу Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
СБд саа аБд аас аде СБд сдБ дсс дад дас асе дед дБа БаБ Бас БдБ 288
Ьеи СТп МеБ Азп Зег Ьеи Агд АТа С1и Азр ТЬг А1а УаТ Туг Туг Суз
85 90 95
дед ааа едд саБ адБ БсБ дад дсБ адд сад БББ дас Бас Бдд ддс сад 336
АТа Ьуз Агд Нгз Зег Зег СТи АТа Агд СТп РЬе Азр Туг Тгр СТу СТп
ТОО 105 Т10
дда асе сБд дБс асе дБс Бед 357
ОТу ТЬг Ьеи УаТ ТЬг УаТ Зег
115 <210? 175 <211? 119 <212> ПРТ
<213? Ното <400? 175 зархепз
Ьеи Ьеи 5 С1и Зег С1у С1у СТу Ьеи Уа1 10 ст Рго С1у СТу 15
С1и УаТ 1 С1п
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе СТп Агд Туг
20 25 30
О1у МеБ Уа1 Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго СТу Ьуз С1у Ьеи СТ и Тгр Уа1
35 40 45
Зег А1а 11е Зег С1у Зег С1у С1у Зег ТЬг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр АЗП зег ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи ст МеБ Азп Зег Ьеи Агд АТа СТи Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
АТа Ьуз Агд Нлз Зег Зег С1и АТа Агд СТп РЬе Азр Туг Тгр СТу СТп
100 105 110
СТу тЬг Ьеи Уа1 ТЬг УаТ Зег 115
- 220 020464 <210> 176 <211? 720 <212? ДНК <213? Ното зараепз <220?
<221? СО2 <222> (1>.,(720) <400? 176 дад дСд сад сСд СЬд дад СсС ддд дда дде ССд дса сад ссС ддд ддд С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи С1и Зег С1у 01у С31у Ьеи Уа1 <31п Рго С1у С1у 15 10 15
Ссс сЬд сдС сСс Ссс СдС дса дсс ссс дда ССс асе ссс аде аде сас Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг
25 30 дсс асд аде Сдд дСс сдс сад дсс сса ддд аад дде сса дад Сдд дес А1а МеЬ Зег Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи О1и Тгр Уа1
40 45
Сса дсС асе адС ддС адС ддС ддС аде аса Сас Сас дса дас Ссс дСд Зег А1а Не Зег С1у Зег С1у С1у Зег ТЬг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
55 60 аад дде сдд ЬСс асе асе Ссс сдс дас аас Ссс аад аас асд сСд еае Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 65 70 75 80 сСд саа аЬд аас аде сСд сдС дсс дад дас асе дед дЬа СаС Сас СдС Ьеи О1п Мес Азп Зег Ьеи Агд А1а (31и Азр тЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
90 95 дед ааа адС СаС ддС дсЪ СЬС дас Сас Сдд дде сад дда асе сСд дСс А1а Ьуз Зег Туг С1у А1а РЬе Азр Туг Тгр С1у С1п 61у ТЬг Ьеи Уа1
100 105 110 асе дес Сед аде ддС дда дде ддС Сса дде дда ддС дде аде дде дде ТЪг Уа1 Бег Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у С1у
115 120 125 дде ддд Сед асд дас аСс сад асд асе сад СсС сса Ссс Ссс сСд СсС С1у С1у Зег ТЪг Азр Не δΐη МеС ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег
130 135 140 дса СсС дЬа дда дас сдС дСс асе аСс асС Сдс сдд дса адС сад аде А1а Зег Уа1 О1у Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег <31п Зег 145 150 155 160 асе аде аде еае сса аас сдд еае сад сад ааа сса ддд ааа дсс ссС Не Зег Зег Туг Ьеи Азп Тгр Туг С1п 01п Ьуз Рго <31у Ьуз А1а Рго
165 170 175 аад сСс сЬд аСс СаЬ дсС дса Ссс адС Сдд саа адС ддд дСс сса Сса Ьуз Ьеи Ьеи Не Туг А1а А1а Зег Зег Тгр С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег
180 185 190 сдС ССс адС дде адС дда СсС ддд аса даС ССс асС сСс асе аСс аде Агд РЬе Зег С1у Зег С1у Бег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег
195 200 205 адС сСд саа ссС даа даС ССС дсС асд Сас Сас СдС саа сад аде Сас
144
192
240
288
336
384
432
480
528
576
624
672
- 221 020464
720
Зег Ьеи С1п Рго <31и Азр РЬе А. 1а ТЬг Туг Туг Суз <31п 01п Зег Туг
210 215 220
адС асе ссс ааС асд ССс ддс саа ддд асе аад дед даа аСс ааа сдд
Зег ТЬг Рго Азп ТЬг РЬе <31у 01п <31у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Ие Ьуз Агд
225 230 235 240
<210? 177 <211? 240 <212> ПРТ <213? Ното заргепз <400? 177
С1и Уа1 <31п Ьеи Ьеи С1и Зег С1у С1у <31у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у 15 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг 20 25 30
А1а МеС Зег Тгр УаТ Агд <31п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1 35 40 45
Зег А1а Не Зег <31у Зег (31у С1у Зег ТЬг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1 50 55 60
Ьуз <31у Агд РЬе ТЬг Пе Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 65 70 75 80
Ьеи <31п Мес Азп Зег Ьеи Агд А1а е1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 90 95
А1а Ьуз Зег Туг С1у А1а РЬе Азр Туг Тгр <31у <31п <31у ТЬг Ьеи Уа1 100 105 110
ТЬг Уа1 Зег Зег С1у <31у С1у С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег С1у 51у 115 120 125
С1у С1у Зег ТЬг Азр Пе С1п МеС ТЬг О1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег 130 135 140
А1а Зег Уа1 С1у Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Зег 145 150 155 160
Не Зег Зег Туг Ьеи Азп Тгр Туг С1п 61п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго 165 170 175
Ьуз Ьеи Ьеи Пе Туг А1а А1а Зег Зег Тгр С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег 180 185 190
Агд РЬе Зег 31у Зег О1у Зег О1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Пе Зег 195 200 205
- 222 020464
Зег Ьеи С1п Рго 01и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз <31п <31п Зег Туг 210 215 220
Зег ТЬг Рго Азп ТЬг РЬе О1у С1п 61у ТЬг Ьуз \7а1 <31и 11е Ьуз Агд 225 230 235 240 <210? 178 <211? 269 <212> ДНК <213? ното заргепз <220?
<221? СЬЗ <222? (69)..(269) <400? 178 саддааасад сСаСдассаС даССасдсса адсССдсаСд саааССсСаС ССсааддада 60 садСсаСа асд ааа Сас сса ССд ссС асд деа дсс дсС дда ССд ССа ССа 110
МеС Ьуз Туг Ьеи Ьеи Рго ТЬг А1а А1а А1а С1у Ьеи Ьеи Ьеи
1 5 10
сес дед дсс сад ссд дсс асд дсс дад дСд ссс дас Сас едд ддс сад 158
Ьеи А1а А1а О1п Рго А1а МеС А1а <31и Уа1 РЬе АЗр Туг Тгр О1у σΐη
15 20 25 30
дда асе сСд дСс асе дсс Ссд аде ддс дда ддс ддс сса ддс дда ддс 206
С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег С1у С1у 61у С1у Зег С1у С1у С1у
35 40 45
ддс аде ддс ддс ддс ддд Ссд асд дас аЪс сад аСд асе сад дед дсс 254
С1у Зег С1у С1у С1у С1у Зег ТЬГ Азр Не С1п МеС ТЬг 61 п А1а А1а
50 55 60
деа даа саа ааа сСс 269
А1а С1и 61п Ьуз Ьеи
<210? 179 <211? 67 <212? ПРТ
<213? Ното <400? 179 мес ьуз Туг 1 зархепз Ьеи А1а 15
Ьеи Ьеи 5 Рго ТЬг А1а А1а А1а 10 С1у Ьеи Ьеи Ьеи
А1а <31п Рго А1а 20 Мес А1а <31и Уа1 РЬе 25 Азр Туг Тгр С1у Θΐη 30 С1у ТЬг
Ьеи Уа1 ТЬг 35 Уа1 Зег зег <31у О1у <31у 40 61у Зег С1у О1у О1у 45 <31у Зег
С1у С1у С1у 50 С1у Зег ТЬг АЗр 55 11е С1п МеС ТЬг <31п А1а А1а 60 А1а С1и
- 223 020464
С1п Ьуз Ьеи 65 <210» 180 <211» 90 <212> ДНК <213» Ношо зархепе <220» <221» СЬЗ <222» (1).,(90) <400» 180
саС ΗΪ3 1 сас Н13 саС Ηίβ сас ΗΪ3 сас Нгз 5 сас Ηίε ддд О1у дсс А1а дса А1а асе Не 10 £са Зег даа О1и дад <31и даС Азр ссд Ьеи 15 аас Азп 48
ддд дсс дса Сад асе дсс даа аде сдс сса дса ааа ССС сас 90
й1у А1а А1а С1п ТЬг Уа1 <31и Зег Суз ьеи А1а Ьуз Рго Ηίε
20 25 30
<210» 181 <211» 30 <212» ПРТ <213» Ното зар!епз
<400» 181 ΗΪ3 Н1з Н1з 1 Н1з Н1з 5 Н1з <31у А1а А1а Не 10 Зег С1и С1и Азр Ьеи Азп 15
31у А1а А1а <31 п ТЬг Уа1 С1и Зег Суз ьеи А1а Ьуз Рго ΗΪ3
25 30 <210» 182 <211» 116 <212> ПРТ <213» Ното зар!епз
<400» 182
О1и 7а1 1 С1п Ьеи Ьеи С1и Зег <31у О1у <31у Ьеи Уа1 С1п Рго О1у 15 С1у
5 10
Зег Ьеи Агд Ьеи 20 Зег Суз А1а А1а Зег Й1у 25 РЬе ТЬг РЬе Зег 30 Зег Туг
А1а МеС Зег Тгр 35 7а1 Агд С1п А1а Рго С1у 40 Ьуз С1у Ьеи 45 С1и Тгр Уа1
Зег А1а 50 11е Зег С1у Зег С1у 55 С1у Зег ТЬг Туг Туг А1а 60 Азр Зег Уа1
Ьуз <31у 65 Агд РЬе ТЬг Не Зег 70 Агд Азр Азп Зег 75 Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 80
Ьеи С1п МеС Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
224 020464
А1а Ьуз Зег Туг С1у А1а РЬе Азр Туг Тгр С1у С1п С1у ТЬг Ьеи Ча1 100 105 110
ТЬг Ча1 Зег Зег 115 <210? 183 <211? 116 <212? ПРГ <213? Ното заргепз <400? 183
С1и Ча1 С1п Ьеи Ьеи С1и Зег С1у С1у 01у Ьеи Ча1 01д Рго С1у С1у 15 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег 31у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг
25 30
А1а МеЕ Зег Тгр Ча1 Агд <31п А1а Рго <31у Ьуз С1у Ьеи <31и Тгр Ча1 35 40 45
Зег Ηΐ3 11е Зег Рго Туг С31у А1а Азп ТЬг Агд Туг А1а Азр Зег Ча1 50 55 60
Ьуз 61у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 65 70 75 80
Ьеи С1п МеС Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Ча1 Туг Туг Суз 85 90 95
А1а Ьуз С1у Ьеи Агд А1а РЬе Азр Туг Тгр <31у <31п <31у ТЬг Ьеи Ча1 100 105 110
ТЬг Ча1 Зег Зег 115 <210? 184 <211? 116 <212? ПРТ <213? Ното зархепз <400? 184
С1и Ча1 С1п Ьеи Ьеи С1и Зег С1у С1у 61у Ьеи Ча1 θΐη Рго С1у С1у 15 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег Б1у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг 20 25 30
А1а МеС Зег Тгр Ча1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Ча1
225 020464
Зег Азр 11е С1у А1а ТЬг С1у Зег Ьуз ТЬг 61у Туг А1а Азр Рго Уа1 50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп. Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 65 70 75 80
Ьеи С1п МеС Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа! Туг Туг Суз 85 90 95
А1а Ьуз Ьуз Уа1 Ьеи ТЬг РЬе Азр Туг Тгр 61у С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1 100 105 110
ТЬг Уа1 Зег Зег 115 <210а 185 <211> 116 <212> ПРТ <213 > Нотпо зархепз <400> 185
С1и Уа1 Οίη Ьеи Ьеи С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго <31у 01у 15 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег <31у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг 20 25 30
А1а Мес Зег Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи <31и Тгр Уа1 35 40 45
Зег Агд Пе Азп Е1у Рго С1у Е1п А1а ТЬг 01у Туг А1а Азр Зег Уа1 50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг Пе Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 65 70 75 80
Ьеи С1п Пе Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 90 95
А1а Ьуз Ηί3 С1у А1а Рго РЬе Азр Туг Тгр С1у <31п С1у ТЬг Ьеи Уа1 100 105 110
ТЬг Уа1 Зег Зег 115 <210> 186 <211> 116 <212> ПРТ
- 226 020464 <213? Ното заргепз <400? 186 <31и Уа1 <31п Ьеи Ьеи С1и Зег С1у О1у 61у Ьеи 7а1 С1п Рго <31у С1у 15 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг 20 25 30
А1а Мес Азп Тгр Уа1 Агд <31п А1а Рго 61у Ьуз 61у Ьеи 31и Тгр ’7а1 35 40 45
Зег Зег 11е Рго А1а Зег С1у Ьеи Нгэ ТЬг Агд Туг А1а Азр Зег 7а 1 50 55 60
Ьуз 61у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 65 70 75 80
Ьеи С1п МеС Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 90 95
А1а Ьуз Рго О1у Ьеи С1у РЬе Азр Туг Тгр С1у 61п 61у ТЬг Ьеи 7а1 100 105 110
ТЬг Уа1 Зег Зег 115 <210? 187 <211? 116 <212? ПРТ <213? Ното заргепз <400? 187
31и 7а1 С1п Ьеи Ьеи <31и Зег <31у <31у <31у Ьеи 7а1 С1п Рго О1у С1у 15 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег 61у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг 20 25 30
А1а МеС Зег Тгр νβΐ Агд 61п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр 7а1 35 40 45
Зег Азр 11е 61и Агд ТЬг 61у Туг С1п ТЬг Агд Туг А1а Азр Зег 7а1 50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Бег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 65 70 75 80
Ьеи <31п МеС Азп Зег Ьеи Агд А1а О1и Азр ТЬг А1а 7а1 Туг Туг Суз 85 90 95
- 227 020464
АЬа Ьуз Ьуз УаЬ Ьеи Уа1 РЬе Азр Туг Тгр СЬу СЬп СЬу ТЬг Ьеи УаЬ
100 105 110
ТЬг УаЬ Зег Зег
115 <210? 188 <211? 116 <212> ПРТ <213? Ното зарЬепз <400? 188
С1и УаЬ СЬп Ьеи Ьеи СЬи Зег СЬу СЬу СЬу Ьеи УаЬ С1п Рго СЬу СЬу 15 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз АЬа АЬа Зег СЬу РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг 20 25 30
А1а МеС Зег Тгр УаЬ Агд СЬп А1а Рго СЬу Ьуз ОЬу Ьеи СЬи Тгр УаЬ 35 40 45
Зег СЬи 11е Зег А1а Азп ОЬу Зег Ьуз ТЬг СЬп Туг А1а Азр Зег УаЬ 50 55 60
Ьуз С1у Агд Ьеи ТЬг Пе Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 65 70 75 80
Ьеи СЬп МеС Азп Зег Ьеи Агд АЬа СЬи Азр ТЬг АЬа УаЬ Туг Туг Суз 85 90 95
АЬа Ьуз Ьуз УаЬ Ьеи СЬп РЬе Азр Туг Тгр СЬу СЬп С1у ТЬг Ьеи УаЬ
100 105 110
ТЬг УаЬ Зег Зег 115 <210? 189 <211? 116 <212? ПРТ <213? Ното зарЬепз <400? 189
С1и УаЬ С1п Ьеи Ьеи СЬи Зег С1у СЬу СЬу Ьеи УаЬ СЬп Рго С1у СЬу 15 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз АЬа АЬа Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг 20 25 30
АЬа МеС Зег Тгр Уа1 Агд СЬп АЬа Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи С1и Тгр УаЬ 35 40 45
- 228 020464
Зег ТЪг 11е Рго А1а Азп <31у Οίη 7а1 ТЪг Агд Туг А1а Азр Зег Уа1
55 60
Ьуз С1у Агд РЪе ТЪг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЪг Ьеи Туг 65 70 75 80
Ьеи С1п МеС Азп Зег Ьеи Агд А1а 01и Азр ТЪг А1а 7а1 Туг Туг Суз 85 90 95
А1а Ьуз Зег Ьеи Ьеи 61п РЪе Азр Туг Тгр 01у С1п 61у ТЪг Ьеи Уа1 100 105 110
ТЪг Уа1 Зег Зег 115 <210> 190 <211? 116 <212> ПРТ <213 > Ното зархепз <400> 190
С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи 61и Зег С1у С1у О1у Ьеи 7а1 01п Рго 01у О1у 15 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег 01у РЪе ТЪг РЪе Зег Зег Туг 20 25 30
А1а МеС Зег Тгр 7а_ Агд 01п А1а Рго 01у Ьуз 01у Ьеи 01и Тгр Уа1 35 40 45
Зег Азр Не А1а А1а ТЪг 01у Зег А1а ТЪг Зег Туг А1а Азр Зег Уа1 50 55 60
Ьуз О1у Агд РЪе ТЪг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЪг Ьеи Туг 65 70 75 80
Ьеи С1п МеС Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЪг А1а 7а 1 Туг Туг Суз 85 90 95
А1а Ьуз Ьуз Не Ьеи Ьуз РЪе Азр Туг Тгр С1у 01п 61у ТЪг Ьеи 7а1 100 105 110
ТЪг 7а1 Зег Зег 115 <210> 191 <211> 116 <212? ПРТ <213? Ното эарЪепз
- 229 020464 <400? 191
31и Уа! О1п Ьеи Ьеи О1и Зег 31у С1у 01у Ьеи Уа1 С1п Рго О1у С1у 15 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег О1у Зег ТНг РНе Зег Зег Туг 20 25 30
А1а МеС Зег Тгр Уа1 Агд О1п А1а Рго <31у Ьуз <31у Ьеи С1и Тгр Уа1 35 40 45
Зег ТНг Не Зег Зег Уа1 С1у С1п Зег ТНг Агд Туг А1а Азр Зег Уа1 50 55 60
Ьуз С1у Агд РНе ТНг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТНг Ьеи Туг 65 70 75 80
Ьеи О1п МеС Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 90 95
А1а Ьуз Азп ьеи мес зег РНе Азр Туг тгр О1у Θΐη О1у тНг ьеи Уа1 100 105 110
ТНг Уа1 Зег Зег
115 <210? 192 <211? 108 <212> ПРТ <213? Ното заргепз <400? 192
Азр 11е С1п МеС ТНг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег '7а 1 С1у 15 10 15
Азр Агд Уа1 ТНг Пе ТНг Суз Агд А1а Зег С1п Зег Не Зег Зег Туг 20 25 30
Ьеи Азп Тгр Туг С1п <31п Ьуз Рго О1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Пе 35 40 45
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег О1у Уа1 Рго Зег Агд РНе Зег С1у 50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТНг Азр РЬе ТНг Ьеи ТНг Пе Зег Зег Ьеи О1п Рго 65 70 75 80 <31и Азр РНе А1а ТНг Туг Туг Суз С1п С1п Зег Туг Зег ТНг Рго Азп 85 90 95
ТНг РЬе С1у С1п О1у ТНг Ьуз Уа1 С1и Пе Ьуз Агд
- 230 020464
100
105 <210? 193 <211> 108 <212? ПРТ <213? Ното еардепз <400? 193
Азр 11е С1п МеС ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа! С1у 15 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег <31п Бег 11е Зег Зег Туг 20 25 30
Ьеи Азп Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго <31у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е
40 45
Туг Агд А1а Бег Низ Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у 50 55 60
Зег 51у Бег б1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго
70 75 80
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Рго Тгр Агд Зег Рго С1у 35 90 95
ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз 7а1 Ии Не Ьуз Агд 100 105 <210? 194 <211? 103 <212> ПРТ <213? Ното зараепз <400? 194
Азр Не Ип МеС ТЬг <31п Зег Рго Бег Бег Ьеи Зег А1а Бег Уа1 С1у 15 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Бег Ип Зег Уа1 Зег Бег Туг 20 25 30
Ьеи Азп Тгр Туг С1п Пп Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Пе
40 45
Туг Ьеи А1а Зег Агд Ьеи Ип Бег Ну Уа1 Рго Бег Агд РЬе Бег С1у
55 60
Зег С1у Зег Пу ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1п Рго 65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз Θΐη Θΐη Азп Тгр Тгр Ьеи Рго Рго
- 231 020464
ТЬг РЬе С1у <31п С1у ТЬг Ьуз Ча1 С1и Не Ьуз Агд 100 105 <210? 195 <211? 108 <212? ПРТ <213? Ното зархепз <400? 195
Азр 11е 31п Мес ТЬг 31п Бег Рго Бег Бег Ьеи Бег А1а Бег Ча1 <31у 15 10 15
Аэр Агд Ча1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Бег С1п Бег 11е Бег Бег Туг 20 25 30
Ьеи Азп Тгр Туг <з1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не 35 40 45
Туг С1п А1а Бег Ьеи Ьеи С1п Бег О1у Ча1 Рго Бег Агд РЬе Бег С1у 50 55 60
Бег Я1у Бег Пу ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Бег Бег Ьеи С1п Рго 65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Агд Ча1 Туг Азр Рго Ьеи 85 90 95
ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Ча1 Пи Не Ьуз Агд 100 105 <210? 196 <211? 269 <212> ДНК <213? Ното зараепз <220?
<221? СОЗ <222? (69)..(269) <400? 196 саддааасад сСаСдассаС даССасдсса адсССдсаСд саааССсСаС ССсааддада садСсаСа асд ааа Сас сСа ССд ссС асд дса дсс дсс дда ССд ССа ССа НО
МеС Ьуз Туг Ьеи Ьеи Рго ТЬг А1а А1а А1а С1у Ьеи Ьеи Ьеи 15 10 сСс дед дсс сад ссд дсс аСд дсс дад дСд ССС дас Сас Сдд ддс сад 158
Ьеи А1а А1а С1п Рго А1а МеС А1а Пи Ча1 РЬе Азр Туг Тгр С1у 51п
20 25 30 дда асе сед дСс асе дСс Ссд аде ддс дда ддс ддс Сса ддс дда ддс. 206
С1у ТЬг Ьеи Ча1 ТЬг Ча1 Бег Бег С1у (Пу С1у 61у Бег С1у Пу Я1у
40 45
- 232 020464 дде аде дде ддС дде ддд Сед асд дас аСс сад аСд асе сад дед дсс СДу Зег 61у С1у С1у 01у Зег ТЬг Айр Ие <31п МеС ТЬг <31п А1а А1а
55 60 дса даа саа ааа сСс АДа С1и <31п Ьуз Ьеи
254
269 <210? 197 <211? 67 <212> ПРТ <213? Ното зар!епз <400? 197
МеС Ьуз Туг Ьеи Ьеи Рго ТЬг А1а А1а А1а С1у Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи А1а 15 10 15
А1а 01п Рго А1а МеС А1а СДи Уа1 РЬе Азр Туг Тгр СДу СДп СДу ТЬг 20 25 30
Ьеи νβΐ ТЬг УаД Зег Зег СДу СДу С1у СДу Зег С1у СДу СДу СДу Зег 35 40 45
СДу СДу СДу СДу Зег ТЬг Азр Не С1п МеС ТЬг СДп АДа АДа А1а СДи 50 55 60
СДп Ьуз Ьеи 65 <210? 198 <211? 90 <212? ДНК <213? Ното зарДепе <220?
<221? СОЗ <222? (1).,(90) <400? 198
сас сас сас сас сас сас ддд дсс дса аСс Сса даа дад дас сСд аас 46
ΗΪ3 ΗΪ3 ΗΪ3 ΗΪ3 Нгз Н1з СДу А1а АДа Не Зег С1и <31и Азр Ьеи Азп
1 5 10 15
999 дсс дса Сад асС дсс даа адЕ СдС ССа дса ааа ссС саС 90
СДу А1а А1а СДп ТЬг УаД СДи Зег Суз Ьеи А1а ьуз Рго ΗίΞ
20 25 30
<210? 199 <211? 30 <212? ПРТ <213? Ното зархепз <400? 199
НДз НДз Ηϊξ НДз Нгз Нгз СДу А1а А1а Не Зег СДи СДи Азр Ьеи Азп 15 10 15
- 233
61у А1а А1а 61п ТЬг Уа1 С1и Бег Суз Ьеи А1а Ьуз Рго Наз
20 25 30
<210? 200 <211? 348 <212> ДНК <213? Ното ί заргепз
<220?
<221? СРЗ <222? (1).. (348)
<400? 200
дад дед сад сед ссд дад СсС ддд дда ддс ссд дса сад ссс ддд ддд 48
С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи О1и Бег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго <31у О1у
1 5 10 15
Ссс сСд сдс сСс Ссс СдС дса дсс Ссс дда ССс асе ссс аде аде СаС 96
Бег Ьеи Агд Ьеи Бег Суз А1а А1а Бег <31у РЬе ТЬг РЬе Бег Бег Туг
20 25 30
дсс аСд аде Сдд дСс сдс сад дсс сса ддд аад ддс сСа дад Сдд дсс 144
А1а МеС Бег Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Сса дсс асе адС ддс адС ддс ддс аде аса Сас Сас дса дас Ссс дед 192
Бег А1а 11е Бег <31у Бег С1у <31у Бег ТЬг Туг Туг А1а Азр Бег Уа1
50 55 60
аад ддс сдд ССс асе аСс Ссс сдС дас ааС Ссс аад аас асд сСд СаС 240
Ьуз О1у Агд РЬе ТЬг 11е Бег Агд Азр Азп Бег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
сСд саа аСд аас аде сед сдс дсс дад дас асе дед дса сас сас сдс 288
Ьеи <31п МеС Азп Зег Ьеи Агд А1а 31и АЗр ТЬг А1а Уа1 Туг туг Суз
35 90 95
дед ааа адС СаС ддС дсС ССС дас Сас Сдд ддс сад дда асе сСд дСс 336
А1а Ьуз Бег Туг С1у А1а РЬе Азр Туг Тгр О1у О1п <31у ТЬг Ьеи Уа1
100 105 110
асе дСс Сед аде 348
ТЬг Уа1 Зег Бег 115 <210? 201 <211? 360 <212> ДНК <213? Ното зарсепз <220?
<221? СЬЗ <222? (1)..(360) <220?
<221? тосИ£1еД_Ьазе <222? (307)..(308) <223? а, о, С, д, неизвестно или другое <220?
<221? тоЛ£1ес!_Ьазе <222? (310),.(311)
- 234 020464 <223? а, с, С, д, неизвестно или другое <220?
<221? то<и£1еа_Ъазе <222? (313),.(314) <223? а, с, С, д, неизвестно или другое <220?
<221? тос(г£Дес1_Ьазе <222? (316)..(317) <223? а, с, С, д, неизвестно или другое <400? 201
дад СДи 1 дед УаД сад СДп сед ссд дад СсС ддд дда ддс ССд дСа Ьеи УаД сад СДп ссС Рго ддд ОДу 15 ддд СДу
Ьеи Ьеи О1и Зег 5 □Ду СДу СДу 10
Ссс сСд сдс сСс Ссс ьдь дса дсс Ссс дда ССс асе ССС аде аде СаС
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Су 5 АДа АДа Зег СДу РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг
20 25 30
дсс аСд аде Сдд дСс сдс сад дсС сса ддд аад ддь сСа дад Сдд дСс
АДа МеС Зег Тгр УаД Агд СДп АДа Рго СДу Ьуэ СДу Ьеи СДи Тгр УаД
35 40 45
Сса дсС аСС адС ддь адС ддь ддс аде аса Сас Сас дса дас Ссс дСд
Зег АДа 11е Зег СДу Зег СДу СДу Зег ТЬг Туг Туг АДа Азр Зег УаД
50 55 60
аад ддс сдд ссс асе аСс Ссс сдс дас аас Ссс аад аас асд ссд СаС
ьуэ СДу Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Αερ Αεη Зег Ьуз Аэп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
сЪд Ьеи саа С1п аСд аас аде Зег 85 сСд Ьеи сдС Агд дсс АДа дад СДи дас Азр 90 асе дед дСа УаД СаС Туг Сас Туг 95 СдС Суэ
МеС Азп ТЬг АДа
дед ааа адС СаС ддс дсС ппк ппк ппк ппк ССС дас Сас сдд ддс сад
АДа Ьуз Зег Туг СДу А1а Хаа Хаа Хаа Хаа РЬе Азр Туг Тгр СДу СДп
100 105 но
дда асе сСд дСс асе дСс Ссд аде
С1у ТНг Ьеи УаД ТЬг УаД Зег Зег
115 120
<210? 202 <211? 120 <212? ПРТ <213? Ното заргепз
<220? <221? ΜΟϋ_ΚΕΞ <222? (103) . . (106) <223> Вариабельная аминокислота <400? 202 СДи УаД СДп Ьеи Ьеи СДи Бег СДу СДу СДу Ьеи УаД С1п Рго С1у С1у
1 5 10 15
Бег Ьеи Агд Ьеи Бег Суз АДа АДа Бег СДу РЬе ТЬг РЬе Бег Зег Туг
20 25 30
- 235 020464
А1а МеС Зег Тгр 35 Уа1 Агд С1п АДа Рго С1у Ьуз 40 СДу Ьеи С1и Тгр 7а1 45
Зег А1а 11е Зег С1у Зег СДу СДу Зег ТЬг Туг Туг А1а Авр зег Уа1
50 55 60
Ьуз СДу Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеС Авп Зег Ьеи Агд АДа СДи Авр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Ьуз Зег Туг С1у А1а хаа хаа Хаа Хаа РЬе Авр Туг Тгр С1у СДп
100 105 110
С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг УаД Зег Зег
115 120 <210> 203 <211> 324 <212> ДНК
<213 > Ното : варгепз
<220>
<221 г СОЗ
<22! :> <П . . (324)
<40С Ь 203
дас асе сад асд асе сад СсС сса Ссс Ссс сед СсС дса Ссс дСа дда 48
АВр 11е С1п мес ТЬг СДп Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег АДа Зег УаД СДу
1 5 10 15
дас сдс дСс асе аСс асС сде сдд дса адС сад аде асе аде аде СаС 96
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг суз Агд А1а Зег Οίη Зег 11е Зег Зег Туг
20 25 30
ССа ааС Сдд Сас сад сад ааа сса ддд ааа дсс ссс аад сСс сед аСс 144
Ьеи Авп Тгр Туг СДп Οίη Ьуз Рго СДу Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е
35 40 45
СаС дсС дса Ссс адС ССд саа адС ддд дСс сса Сса сдс ССс адС ддс 192
Туг А1а АДа Зег Зег Ьеи ОДп Зег 61у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег ОДу
50 55 60
адС дда ССС ддд аса дас ССс асС сСс асе аСс аде адС еСд саа ссС 240
Зег С1у Зег СДу ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи СДп Рго
65 70 75 80
даа дас ССС дсс асд Сас Сас СдС саа сад ад С Сас адС асе ссС ааС 288
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Сув СДп СДп Зег Туг Зег ТЬг Рго Азп
85 90 95
асд ССс ддс саа ддд асе аад д^д даа аСс ааа сдд 324
ТЬг РЬе СДу Οίη СДу ТЬг Ьуз УаД СДи 11е Ьуз Агд
100 105
- 236 <210? 204 <211> 108 <212> ПРТ <213 > Ното варгепз <400? 204
Αερ 1 Пе С1п МеС ТЬг 5 С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 <31у
10 15
Αερ Агд Уа1 ТЬг Пе ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Зег Пе Зег Зег Туг
20 25 30
Ьеи Азп Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Пе
35 40 45
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи Е1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
зег С1у Зег 01у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Зег Туг Зег ТЬг Рго Азп
85 90 95
ТЬг РЬе С1у О1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Пе Ьуз Агд
100 105 <210> 205 <211> 324 <212> ДНК <213 > Ното заргепв <220>
<221? СРЗ <222? (1)..(324) <400? 205
дас аСс сад асд асе сад СсС сса Ссс Ссс сед ссс дса ссс дса дда
Азр 1 Пе С1п мес ТЬг 5 С1п Зег Рго Бег Зег 10 Ьеи Зег А1а Бег ν«ι 15 С1у
дас сдС дСс асе аСс асС Сдс сдд дса адС сад аде аСС аСС аад саС
Авр Агд Уа1 ТЬг 20 Пе ТЬг Суз Агд А1а 25 Зег Е1п Зег Пе 11е 30 Ьуз Нгз
ССа аад ^дд Сас сад сад ааа сса ддд ааа дсс ссс аад ссс сед асе
Ьеи Ьуз Тгр 35 Туг 01п С1п Ьуз Рго 40 О1у Ьуз А1а Рго Ьуз 45 ьеи Ьеи 11е
СаС ддс дса Ссс сдд ССд саа адС ддд дСс сса сса сде ССс аде ддс
Туг <31у 50 А1а Зег Агд Ьеи С1п 55 Зег ΰΐγ Уа1 Рго Бег 60 Агд РЬе Бег С1у
аде дда СсС ддд аса дас ссс асе сСс асе асе аде аде сСд саа ссС
Зег 65 <31у Зег С1у ТЬг Азр 70 РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Пе 75 Зег Зег Ьеи <31п Рго 80
144
192
240
- 237 020464
даа дас ССС дсС асд Сас Сас ьдс саа сад ддд дсс сдд сдд ссС сад 288
О1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п 01у А1а Агд Тгр Рго С1п
В5 90 95
асд ССс ддс саа ддд асе аад дед даа аСс ааа =дд 324
ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз Агд
100 105
<210? 206 <211? 108 <212> ПРТ
<213? Ното : зар1епз
<400? 206 Азр Не Θΐη МеС ТЬг 61п Бег Рго Бег Бег Ьеи Бег А1а Бег Уа1 С1у
1 5 10 15
Азр Агд 7а 1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Бег 61п Бег Не Пе Ьуз ΗΪ3
20 25 30
Ьеи Ьуз Тгр Туг О1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Пе
35 40 45
Туг 61у А1а Зег Агд Ьеи 01п Зег С1у Уа1 Рго Бег Агд РЬе Зег 01у
50 55 60
Зег <31у Зег 61у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Бег Бег Ьеи 01п Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз 01п С1п 01у А1а Агд Тгр Рго С1п
85 90 95
ТЬг РЬе С1у О1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 01и 11е Ьуз Агд
100 105
<210? 207 <211? 324 <212> ДНК
<213? Ното : зархепв
<220? <221? СИЗ <222? (1).. (324)
<400? 207 дас аСс сад асд асе сад СсС сса Ссс Ссс ссд СсС дса СсС дса дда 48
Авр Не О1п МеС ТЬг 61п Бег Рго Бег Бег Ьеи Бег А1а Бег Уа1 61у
1 5 10 15
дас сдс дсс асе аСс асе Сдс сдд дса аде сад аде асе сас СаС сас 96
Азр Агд 7а 1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Бег 01п Зег Пе Туг Туг Нсз
20 25 30
ССа аад Сдд Сас сад сад ааа сса ддд ааа дсс ссС аад сСс ссд аСс 144
Ьеи Ьуз Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго 01у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Пе
- 238 020464
35 40 45
БаБ аад дса Бсс асд ББд саа адБ ддд дБс сса Бса сдБ ББС адБ ддс 192
Туг Ьуз А1а Зег ТЬг Ьеи О1п Зег О1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
адБ дда БСБ ддд аса даБ ББС асБ сБс асе аБс аде адБ сБд саа ССБ 240
Зег О1у Зег О1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи О1п Рго
65 70 75 80
даа даБ БББ дсБ асд Бас Бас БдБ саа сад дББ едд аад дБд ссБ едд 288
О1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг туг Суз С1п 61ь УаТ Агд ьуз УаТ Рго Агд
85 90 95
асд ББС ддс саа ддд асе аад дБд даа аБс ааа едд 3Ξ4
ТЫ РЬе ОТу О1п ОТу ТЫ Ьуз УаТ ОТи 11е Ьуз Агд
100 105 <210> 208 <211> 108 <212> ПРТ <213> Ното зараепз <400> 208
Азр 1 11е ОТп МеБ ТЬг 5 О1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег АТа Зег УаТ О1у
10 15
Азр Агд Уа1 ТЫ 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег О1п Зег 11е Туг Туг Нтз
20 25 30
Ьеи ьуз тгр туг О1п οίη Ьуз Рго О1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не
35 40 45
Туг Ьуз А1а Зег ТЫ Ьеи О1п Зег О1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег ОТу
50 55 60
Зег О1у Зег О1у ТЫ Азр РЬе ТЫ Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз О1п О1п Уа1 Агд Ьуз УаТ Рго Агд
85 90 95
ТЫ РЬе ОТу О1п Οΐγ ТЬг Ьуз УаТ ОТи Не Ьуз Агд
100 105 <210? 209 <211? 108 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400? 209
Азр Не <31п МеБ ТЫ С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег АТа Зег Уа1 О1у
- 239 020464
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег <31п Зег 11е РЬе Агд Н1з 20 25 30
Ьеи Ьуз Тгр Туг Οίη Οίη Ьуе Рго С1у Ьуе А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е 35 40 45
Туг А1а А1а Зег Агд Ьеи О1п Зег О1у 1'а1 Рго Зег Агд РЬе Зег О1у 50 55 60
Зег О1у Зег О1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи О1п Рго 65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз Οίη О1п Уа1 А1а Ьеи Туг Рго Ьуз 85 90 95
ТЬг РЬе С1у С1п О1у ТЬг Ьуз Уа1 О1и 11е Ьуз Агд 100 105 <210? 210 <211? 108 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400? 210
Азр 11е С1п МеЬ ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 <31у 15 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Зег Не Не Ьуз Н1з 20 25 30
Ьеи Ьуз Тгр Туг 6ΐη О1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не 35 40 45
Туг С1у А1а Зег Агд Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у 50 55 60
Зег С1у Зег О1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго 65 70 75 80
О1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п С1у А1а Агд Тгр Рго С1п 85 90 95
ТЬг РЬе <31у С1п <31у ТЬг Ьуз Ча1 С1и Не Ьуз Агд 100 105
- 240 020464 <210? 211 <211? 108 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223? Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400? 211 Рго Зег Зег ЬО Ьеи Зег АЬа Зег УаЬ 15 С1у
Азр 1 11е СЬп МеЬ ТЬг СЬп 5 Зег
Азр Агд УаЬ ТЬг Ые ТЬг Суз Агд АЬа Зег СЬп Зег Пе Туг Туг Нтз
20 25 30
ьеи Ьуз Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго ОЬу ьуз АЬа Рго Ьуз Ьеи Ьеи Ые
35 40 45
Туг Ьуз АЬа Зег ТЬг ьеи СЬп Зег ОЬу УаЬ Рго Зег Агд РЬе Зег СЬу
50 55 60
Зег С1у Зег еЬу ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи тЬг Пе Зег Зег Ьеи СЬп Рго
65 70 75 80
СЬи Азр РЬе АЬа ТЬг Туг Туг Суз СЬп СЬп УаЬ Агд Ьуз УаЬ Рго Агд
85 90 95
ТЬг РЬе СЬу СЬп СЬу ТЬг Ьуз УаЬ СЬи 11е Ьуз Агд
100 105 <210? 212 <211? 108 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223? Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400? 212
Азр 11е СЬп ТЬг ТЬг СЬп Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег УаЬ сЬу 15 10 15
Аер Агд УаЬ ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег СЬп туг 11е СЬу Агд Туг 20 25 30
Ьеи Агд Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго ОЬу Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е 35 40 45
Туг Азр Зег Зег УаЬ Ьеи СЬп Бег СЬу УаЬ Рго Зег Агд РЬе Зег С1у 50 55 60
- 241 020464
Зег <31у Зег С1у ТЪг Азр РЪе ТЪг Ьеи ТЪг 11е Зег Зег Ьеи С1п Рго 65 70 75 80
С1и Азр РЪе А1а ТЪг Туг Туг Суз С1п С1п Агд Туг Агд Мес Рго Туг 85 90 95
ТЪг РЪе <31у Οίη С1у ТЪг Агд Уа1 С1и 11е Ьуз Агд 100 105 <210? 213 <211? 103 <212? ПРТ <213? Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400? 213
Аер 11е С1п Мес ТЪг <31п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег 7а1 С1у 15 10 15
Азр Агд '.'я.1 ТЪг 11е ТЪг Суз Агд А1а Зег С1п Туг 11е С1у Агд Туг 20 25 30
Ьеи Агд Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е 35 40 45
Туг Азр Зег Зег 7а1 Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЪе Зег С1у 50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЪг Азр РЪе ТЪг Ьеи ТЪг 11е Зег Зег Ьеи О1п Рго 65 70 75 80
О1и Азр РЪе А1а ТЪг Туг Туг Суз С1п 61п Агд Туг МеС 61п Рго РЪе 85 90 95
ТЪг РЪе <31у С1п О1у ТЪг Ьуз Уа1 О1и 11е Ьуз Агд 100 105 <210? 214 <211? 108 <212? ПРТ <213? Искусственная последовательность <220?
<223? Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400? 214
Азр Не С1п МеС ТЪг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 <31у 15 10 15
- 242 020464
Азр Агд Уа1 ТНг Пе ТНг Суз Агд А1а Зег С1п Тгр Пе 01у Агд Туг 20 25 30
Ьеи Агд Тгр Туг Οίη С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не 35 40 45
Туг Аеп С1у Зег С1п Ьеи <31п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у 50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе тЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго 65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Агд Туг Ьеи (31п Рго Туг 85 90 95
ТЬг РЬе <31у 61η С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз Агд 100 105 <210? 215 <211? 108 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400? 215
Азр Пе С1п Мес тЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у 15 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг Пе ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Туг Пе Зег Агд 01п 20 25 30
Ьеи Агд Тгр Туг Е1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Агд Ьеи Ьеи Пе 35 40 45
Туг С1у А1а Уа1 Зег Ьеи С1п Зег <31у 11е Рго Зег Агд РЬе Зег 61у 50 55 60
Зег 01у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Пе Зег Зег Ьеи С1п Рго 65 70 75 80
31и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Агд Туг Пе ТЬг Туг Азп 85 90 95
ТЬг РЬе С1у С1п Н1у ТЬг Ьуз \Га1 61и >.'а1 Ьуз Агд 100 105 <210? 216
- 243 020464 <211? 108 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400? 216
Азр Пе С1п МеС ТЬг О1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Ча1 С1у 15 10 15
Азр Агд Ча1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Туг 11е <31у Агд Туг 20 25 30
Ьеи Агд Тгр Туг О1п С1п Ьуз Рго 61у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е 35 40 45
Туг Азр Зег Зег Ча1 Ьеи <31п Зег С1у Ча1 Рго Зег Агд РЬе Зег 31у 50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Пе Зег Зег Ьеи 31п Рго 65 70 75 80 <31и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п е1п Агд Туг Зег Зег Рго Туг 85 90 95
ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Ча1 С1и 11е Ьуз Агд 100 105 <210? 217 <211? 103 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности; Синтетический полипептид <400? 217
Азр 11е С1п МеЕ ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Ча1 С1у 15 10 15
Азр Агд Ча! ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п тгр 11е н!з Агд Я1п 20 25 30
Ьеи Ьуз Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е 35 40 45
Туг Туг А1а Зег Пе Ьеи С1п зег С1у Ча1 Рго Зег Агд РЬе зег Я1у 50 55 60
Зег 61у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Х1е Зег Зег Ьеи βΐη Рго
- 244 020464 □ 1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п Е1п ТЬг РЬе Зег Ьуз Рго Зег 85 90 95
ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз ν&1 С1и Не Ьуз Агд 100 105 <210? 218 <211? 108 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223? Описание искусственной последовательности; Синтетический полипептид <400? 218
Азр Не <31п МеС ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег 7а 1 <31у 15 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Шз Не Ηίβ Агд <31и 20 25 30
Ьеи Агд Тгр Туг О1п 31 η Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Пе 35 40 45
Туг 31п А1а Зег Агд Ьеи 31п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег 31у 50 55 60
Зег С1у Зег 31у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи 31п Рго 65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п 31п Ьуз Туг Ьеи Рго Рго Туг 85 90 95
ТЬг РЬе 01у <31п <31у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Пе Ьуз Агд 100 105 <210? 219 <211? 108 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223? Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400? 219
Азр Пе С1п МеС ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег 7а1 31у 15 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег 31п Нгз Пе Ηίε Агд 31и
- 245 020464
Ьеи Агд Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не 35 40 45
Туг С1п А1а Зег Агд Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег 01у 50 55 60
Зег С1у Зег <31у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго 65 70 75 80 □1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз 61η 61п Агд Туг Агд Ή Рго Туг 85 90 95
ТЬг РЬе С1у 61п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз Агд 100 105 <210? 220 <211? 108 <212? ПРТ <213? Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400? 220
Азр 11е <31п МеЬ ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег С1у
10 15
Аер Агд 7 а ] ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег <31п Зег Не С1у Агд Агд 20 25 30
Ьеи Ьуз Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у А1а А1а Рго Агд Ьеи Ьеи Не 35 40 45
Туг Агд ТЬг Зег Тгр Ьеи С1п Зег С1у 7а1 Рго Зег Агд РЬе Зег <31у 50 55 60
Зег С1у Зег 01 у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи О1п Рго 65 70 75 80 <31и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п ТЬг Зег С1п Тгр Рго Н1з 85 90 95
ТЬг РЬе С1у СТп С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз Агд 100 105 <210? 221 <211? 108 <212? ПРТ
- 246 020464 <213> Искусственная последовательность <220» <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400» 221 01п Зег Рго Зег Зег 10 Ьеи Зег А1а Зег Уа1 15 С1у
Азр 1 Пе <31п МеС ТЬг 5
АЗр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п ьуз Не Туг Ьуз АЗП
20 25 30
Ьеи Агд Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго 61у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не
35 40 45
Туг Азп Зег зег 11е ьеи О1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи О1п Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п <31п Агд Туг Ьеи Зег Рго Туг
85 90 95
ТЬг РЬе С1у С1п 31у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз Агд
100 105 <210» 222 <211» 108 <212» ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 247 020464
СДи Азр РЬе АДа ТЬг Туг Туг Суз СДп С1п Агд Тгр Агд АДа Рго Туг 85 90 95
ТЬг РЬе СДу СДп СДу ТЬг Ьуз УаД СДи Ие Ьуз Агд 100 105 <210? 223 <211? 108 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400? 223
Азр Ие С1п МеС ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у 15 10 15
Азр Агд УаД ТЬг Не ТЬг Суз Агд АДа Зег СДп Тгр Пе Туг Ьуз Зег 20 25 30
Ьеи СДу Тгр Туг СДп СДп Ьуз Рго СДу Ьуз АДа Рго Ьуз Ьеи Ьеи Пе 35 40 45
Туг СДп Зег Зег Ьеи Ьеи 01п Зег СДу Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег СДу 50 55 60
Зег С1у Зег СДу ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Пе Зег Зег Ьеи СДп Рго 65 70 75 80
СДи Азр РЬе АДа ТЬг Туг Туг Суз О1п СДп Туг НДз СДп МеС Рго Агд 85 90 95
ТЬг РЬе С1у С1п СДу ТЬг Ьуз Уа1 СДи Пе Ьуз Агд 100 105 <210? 224 <211? 108 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<22 3> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400? 224
Азр Пе СДп МеС ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег УаД С1у 15 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг Пе ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Тгр Пе Туг Агд НДв 20 25 30
- 248 020464
Ьеи Агд Тгр Туг σΐη О1п Ьуз Рго <31у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е
35 40 45
Туг Авр А1а Зег Агд Ьеи С1п Зег о1у Уа1 Рго ТЬг Агд РЬе Бег О1у
50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг Авр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи О1п Рго
65 70 75 80
61и Азр РЬе А1а ТЫ туг Туг Суз О1п οίη ТЬг Н1з Азп Рго Рго Ьуз
85 90 95
ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз Агд
100 105
<210? 225
<211? 108
<212? ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400? 225
Азр 1 Не С1п мес ТЬг <31п Бег 5 Рго Зег Зег 10 Ьеи Бег А1а Зег Уа1 15 С1у
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Зег 11е Зег Зег туг
20 25 30
Ьеи Азп Тгр Туг <31п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не
35 40 45
туг Агд АЗП Зег РЬе Ьеи О1п Зег О1у Уа1 Рго ТЬг Агд РЬе Зег О1у
50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи 61п Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суе С1п С1п ТЬг Туг ТЬг Уа1 Рго Рго
85 90 95
ТЬг РЬе О1у С1п О1у ТЬг Ьуз Уа1 О1и 11е Ьуз <31п
100 105 <210? 226 <211? 108 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 249 <220?
<22 3> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400? 226
Азр 11е <31п МеЕ ТЬг С1п Зег Рго Вег Зег Ьеи Зег А1а Зег Ча1 Я1у 15 10 15
Азр Агд Ча1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд АХа Зег С1п Ьуз 11е А1а ТЬг Туг 20 25 30
Ьеи Азп Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е 35 40 45
Туг Агд Зег Зег Зег Ьеи <31п Зег А1а Ча1 Рго ТЬг Агд РЬе Зег С1у 50 55 60
Зег О1у Зег С1у ТЬг Ча1 РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1п Рго 65 70 75 80
О1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз Я1п С1п ТЬг Туг А1а Ча1 Рго Рго 85 90 95
ТЬг РЬе <31у О1п С1у ТЬг Ьуз Ча1 <31и 11е Ьуз Агд 100 105 <210? 227 <211? 108 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223? Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400? 227
Азр 11е С1п МеЕ ТЬг Я1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Ча1 С1у 15 10 15
Азр Агд Ча1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Зег 11е Зег Зег Туг 20 25 30
Ьеи Азп Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго ТЬг Ьеи Ьеи 11е 35 40 45
Туг Агд Ьеи Зег Ча1 Ьеи С1п Зег С1у Ча1 Рго ТЬг Агд РЬе Бег <31у 50 55 60
Зег С1у Зег 01у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи О1п Рго 65 70 75 80 <31и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п Я1п ТЬг Туг Азп Ча! Рго Рго
- 250 020464
ТЪг РЪе С1у С1п <31у ТЪг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз Агд 100 105 <210? 228 <211? 108 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<22 3> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400? 228
Азр Не 61п Мес ТЪг οίη Зег Рго Зег Зег ьеи зег А1а Зег Уа1 <31у 15 10 15
Азр Агд Уа1 ТЪг 11е ТЪг Суз Агд А1а Зег с1п зег 11е Зег Зег туг 20 25 30
Ьеи Азп Тгр Туг С1п <31п Ьуз Рго О1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е 35 40 45
Туг Агд Азп Зег С1п ьеи С1п Зег <31у Уа1 Рго ТЪг Агд РЪе Зег О1у 50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЪг Азр РЪе ТЪг Ьеи ТЪг 11е Зег Зег Ьеи С31п Рго 65 70 75 80
61и Азр РЪе А1а ТЪг Туг Туг Суз <31п С1п ТЪг РЪе А1а Уа1 Рго Рго 85 90 95
ТЪг РЪе С1у С1п С1у ТЪг Ьуз Уа1 О1и 11е Ьуз Агд 100 105 <210? 229 <211? 108 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400? 229
Азр 11е <31п Ме!. ТЪг <31п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег '/а! Н1у 15 10 15
Азр Агд Уа1 ТЪг 11е ТЪг Суз Агд А1а Зег С1п Зег 11е Зег Зег Туг 20 25 30
Ьеи Αεη Тгр Туг С31п (31п Ьуз Рго (31. у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е
- 251 020464
Туг Агд Азп Зег Рго Ьеи С1п Зег С1у 7а1 Рго ТЫ Агд РЬе Зег С1у 50 55 60
Зег Е1у Зег Е1у ТЫ Азр РЬе ТЫ Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи <31п Рго 65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз Е1п 01п тЬг туг Агд Уа1 Рго Рго 35 90 95
ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЫ Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз Агд 100 105 <210? 230 <211? 109 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400? 230
Азр 11е С1п МеС ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у 15 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Ыз Не С1у Ьеи Тгр 20 25 30
Ьеи Н1з Азп Тгр Туг 31п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи 35 40 45
Не Туг Агд Зег Зег Ьеи Ьеи С1п Зег <31у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег 50 55 60
Ыу Зег С1у Зег 31у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи <31п 65 70 75 80
Рго С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Ьуз Туг Азп Ьеи Рго 85 90 95
Туг ТЬг Зег С1у С1п С1у ТЫ Ьуз Ча1 С1и Не Ьуз Агд 100 105 <210? 231 <211? 108 <212? ПРТ <213? Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
- 252 020464
полипептид
<400? 231 Мес ТЬг 5 С1п Зег Рго Рго Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у
Азр 1 Не С1п
10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег О1п Зег Не Зег Зег Туг
20 25 30
Ьеи Азп Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а РГО ьуз Ьеи Ьеи Не
35 40 45
Туг Агд Азп Зег Рго Ьеи Е1п Зег С1у Уа1 Рго ТЬг Агд РЬе Зег О1у
50 55 60
Зег С31у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи Θΐη Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п ТЬг Туг Зег Не Рго Рго
85 90 95
ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз νβΐ О1и Не Ьуз Агд
100 105
<210? 232 <211? 108 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400? 232
Азр 11е С1п МеС ТЬг О1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег 7а1 С1у 15 10 15
Азр Агд Уа1 ТНг 11е ТНг Суз Агд А1а Зег Агд Рго Не С1у ТЬг ТЬг 20 25 30
Ьеи Зег Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго <31у Ьуз А1а Рго ТЬг Ьеи Ьеи Не 35 40 45
Тгр РЬе С1у Зег Агд Ьеи Е1п Зег С1у Уа1 Рго ТЬг Агд РЬе Зег <31у 50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго 65 70 75 80 <31и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз А1а О1п А1а О1у ТЬг Нгз Рго ТЬг 85 90 95
- 253
ТЬг РЬе <31у С1п 31у ТЬг Ьуз Уа1 <31и Не Ьуз Агд 100 105 <210? 233 <211? 10Э <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400? 233
Азр Не О1п Мер ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 (31у 15 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег Ьуз Туг Не С1у Зег Θΐη 20 25 30
Ьеи Азп Тгр Туг 31п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго ТЬг Ьеи Ьеи Не 35 40 45
А1а Тгр А1а Зег Уа1 Ьеи С1п Зег 01у Уа1 Рго ТЬг Агд РЬе Зег 01у 50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго 65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз Агд С1п С1у А1а А1а Зег Рго Агд 85 90 95
ТЬг РЬе С1у О1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 61и Не Ьуз Агд 100 105 <210? 234 <211? 108 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400? 234
Азр Не Οίη МеР ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 О1у 15 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п РЬе Не Туг Агд Туг 20 25 30
Ьеи Зег Тгр Туг О1п <31п Ьуз Рго О1у Ьуз Уа1 Рго ТЬг Ьеи Ьеи Не 35 40 45
- 254 020464
туг Азп АДа Зег Туг Ьеи СДп Бег СДу УаД Рго ТЬг Агд РЬе Бег СДу
50 55 60
Бег СДу Бег СДу ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Ие Бег Бег Ьеи СДп Рго
65 70 75 80
СДи Азр РЬе АДа ТЬг Туг Туг Суз СДп СДп нДз АДа ΗΪ5 Ьеи Рго Агд
85 90 95
ТЬг РЬе СДу СДп СДу ТЬг Ьуз УаД СДи Пе Ьуз Агд
100 105
<210? 235
<211? 108
<212? ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400? 235
Азр 1 Ие С1п Мер ТЬг 5 СДп Бег Рго Бег Бег 10 Ьеи Бег АДа Бег УаД 15 СДу
Азр Агд УаД ТЬг Не ТЬг Суз Агд АДа Бег СДп Тгр Не СДу Бег СДп
20 25 30
Ьеи Бег Тгр Туг СДп СДп Ьуз Рго СДу Ьуз АДа Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не
35 40 45
МеЬ Тгр Агд Бег Бег Ьеи СДп Бег СДу УаД Рго ТЬг Агд РЬе Бег СДу
50 55 60
Бег СДу Бег СДу ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Бег Бег Ьеи СДп Рго
65 70 75 80
СДи Азр РЬе АДа ТЬг Туг Туг Суз АДа СДп СДу АДа АДа Ьеи Рго Агд
85 90 95
ТЬг РЬе СДу СДп СДу ТЬг ьуз УаД СДи Не Ьуз Агд
100 105
<210? 236
<211? 108
<212? ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<22 0?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
- 255 020464 <400> 236
Азр Не С1п МеС ТЫ 01п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 (31у 15 10 15
Азр Агд Ή1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п Зег 11е Зег Зег Туг 20 25 30
Ьеи Азп Тгр Туг С1п. С1п Ьуз Рго <31у Ьуз А1а Рго ТЬг Ьеи Ьеи Не 35 40 45
Агд Агд Уа1 Зег Уа1 Ьеи 01п Зег С1у Уа1 Рго ТЬг Агд РЬе Зег С1у 50 55 60
Зег С1у Зег 01у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи <31п Рго 65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз Зег С1п 31у Агд Тгр Рго Рго Агд 85 90 95
ТЬг РЬе <31у <Э1п <31у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз Агд 100 105 <210> 237 <211> 108 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 237
Азр Пе С1п МеС ТЬг О1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег νβΐ С1у 15 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег Θΐη Зег Не Зег Зег Туг 20 25 30
Ьеи Азп. Тгр Туг О1п С31п Ьуз Рго С1у Ьуз А1а Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не 35 40 45
Туг Туг С1у Зег Уа1 Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго ТЬг Агд РЬе Зег <31у 50 55 60
Зег 01у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1п Рго 65 70 75 80
С1и Αερ РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз Зег С1п <31у Агд Тгр Рго Рго Агд 85 90 95
ТЬг РЬе С1у О1п 61у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз Агд
- 256 020464 доо
105 <210? 238 <211? 116 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400? 238
С1и УаД СДп Ьеи Ьеи СДи Зег СДу СДу СДу ьеи УаД СДп Рго СДу СДу 15 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз АДа АДа Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Тгр Рго Туг 20 25 30
ТЬг МеЬ Зег Тгр УаД Агд СДп АДа Рго СДу Ьуз СДу Ьеи СДи Тгр УаД 35 40 45
Зег ТЬг 11е Зег Рго РЬе СДу Зег ТЬг ТЬг Туг Туг АДа Азр Зег УаД 50 55 60
Ьуз СДу Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 65 70 75 80
Ьеи СДп МеД Авп Зег Ьеи Агд АДа СДи Азр ТЬг АДа УаД Туг Туг Суз 85 90 95
АДа Ьуз ОДу СДу ьуз Азр РЬе Азр Туг Тгр СДу СДп СДу ТЬг Ьеи УаД 100 105 110
ТЬг Уа1 Зег Зег 115 <210? 239 <211? 117 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400? 239
СДи УаД СДп Ьеи Ьеи СДи Зег СДу СДу СДу Ьеи УаД СДп Рго СДу СДу 15 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Сув АДа АДа Зег СДу РЬе ТЬг РЬе Тгр Рго Туг 20 25 30
ТЬг МеС Зег Тгр УаД Агд СДп АДа Рго СДу Ьуз СДу Ьеи СДи Тгр УаД
257 020464
Зег ТЬг 11е Зег Рго РЬе С1у Зег ТЬг ТЬг Туг Туг А1а Аер Зег Уа1 50 55 60
Ьуз 61у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
70 75 80
Ьеи О1п Мот Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 90 95
А1а ьуз 61у Азп ьеи С1и Рго РЬе Азр Туг Тгр СЯу 61п О1у тЬг Ьеи 100 105 110
Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115 <210? 240 <211? 117 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400? 240
С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи 61и Зег <31у СЯу <31у Ьеи Уа1 <31п Рго С1у <31у 15 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег СЯу РЬе ТЬг РЬе Тгр Рго Туг 20 25 30
ТЬг МеЬ Зег Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз О1у Ьеи С1и Тгр Уа1 35 40 45
Зег ТЬг Не Зег Рго РЬе СЯу Зег ТЬг ТЬг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1 50 55 60
Ьуз <31у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 65 70 75 80
Ьеи СЯп Мет Азп Зег Ьеи Агд А1а О1и Азр ТЬг А1а 7а1 Туг Туг Суз
90 95
А1а Ьуз Ьуз Ьеи Зег Азп С1у РЬе Азр Туг Тгр СНу СНп СНу ТЬг Ьеи 100 105 110
Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115
- 258 020464 <210? 241 <211? 118 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности полипептид <400? 241
С1и Ча1 61η Ьеи Ьеи О1и Бег С1у С1у С1у Ьеи Ча1
10
Синтетический
С1п Рго 21у С1у
Бег ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг 20 25
РЬе Тгр Рго Туг 30
ТЬг МеС Зег Тгр Ча1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у 35 40
Ьеи С1и Тгр Ча1 45
Зег ТЬг Пе Зег Рго РЬе <31 у Зег ТЬг ТЬг Туг Туг 50 55 60
А1а Азр Зег Ча!
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг Пе Зег Агд Авр Аап Зег Ьуз 65 70 75
Азп ТЬг Ьеи Туг 80
Ьеи 21п МеС Азп Бег Ьеи Агд А1а О1и Аар ТЬг А1а
90
Ча1 Туг Туг Суз 95
А1а Ьуз Ча1 Ча1 Ьуз Аар Азп ТЬг РЬе Азр Туг Тгр 100 105
21у 21п <31у ТЬг
110
Ьеи Ча1 ТЫ Ча1 Зег Зег 115 <210? 242 <211? 118 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности полипептид <400? 242
С1и Уа1 61п Ьеи Ьеи 01и Зег С1у С1у С1у Ьеи Ча1
10
Синтетический
21п Рго С1у С1у 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег О1у РЬе ТЬг 20 25
РЬе Тгр Рго Туг 30
ТЬг Мес Зег Тгр Ча1 Агд С1п А1а Рго 01у Ьуе 21у 35 40
Ьеи 21и Тгр Ча1 45
- 259
Зег ТЬг Не Зег РГО РЬе СДу Зег ТЬг ТЬг Туг Туг АДа Αερ Зег УаД 50 55 60
Ьуз СДу Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Аар Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 65 70 75 80
Ьеи СДп Мер Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз 35 90 95
АДа Ьуз Азп ТЬг СДу СДу Ьуз СДп РЬе Азр Туг Тгр СДу СДп СДу ТЬг 100 105 110
Ьеи УаД ТЬг УаД Зег Зег 115 <2Д0> 243 <211> 118 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220;* <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 243
С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи С1и Зег СДу СДу СДу Ьеи УаД СДп Рго СДу ОДу 15 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз АДа АДа Зег СДу РЬе ТЬг РЬе Тгр Рго Туг 20 25 30
ТЬг МеЬ Зег Тгр УаД Агд СДп АДа Рго СДу Ьуз СДу Ьеи СДи Тгр УаД 35 40 45
Зег ТЫ 11е Зег Рго РЬе СДу Зег ТЬг ТЬг Туг Туг АДа Азр Бег УаД 50 55 60
Ьуз ОДу Агд РЬе ТЬг 1Де Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 65 70 75 80
Ьеи ОДп МеД Азп Зег Ьеи Агд АДа СДи Азр ТЬг АДа УаД Туг Туг Суз 85 90 95
А1а Ьуз Ьуе ТЬг СДу Рго Зег Зег РЬе Азр Туг Тгр С1у СДп С1у ТЬг 100 105 110
Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115 <210;» 244
- 260 020464 <211» 120 <212» ПРТ <213> Искусственная последовательность <220» <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400» 244 Ьеи С1и 5 Зег <31у С1у С1у Ьеи 10 Уа1 С1п Рго С1у 15 01у
С1и 1 Уа1 С1п Ьеи
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Тгр Рго Туг
20 25 30
ТЬг МеС Зег Тгр 7а1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр νβΐ
35 40 45
Зег ТЬг Не Зег Рго РЬе С1у Зег ТЬг ТЬг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеС Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Ьуз Агд ТЬг С1и Азп Агд С1у Зег РЬе Азр Туг Тгр С1у С1п
100 105 110
С1у ТЬг Ьеи 7а1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120
<210 1» 245
<211» 122
<212» ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220» <223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400» 245
О1и 7а1 С1п Ьеи Ьеи О1и Зег 61у (31у О1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у <31у 15 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег <31у РЬе ТЬг РЬе Тгр Рго туг 20 25 30
ТЬг МеС Зег Тгр 7а 1 Агд <31п А1а Рго С1у Ьуз 61у Ьеи С31и Тгр Уа1 35 40 45
Зег ТЬг Не Зег Рго РЬе <31у Зег ТЬг ТЬг Туг Туг А1а Авр Зег Уа!
- 261 020464
50 55 60
Ьуз <31у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи <31п МеС Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг туг Суз
85 90 95
А1а Ьуэ Зег Аэр Уа1 Ьеи Ьуэ тЬг 01у Ьеи Азр 01у РЬе Азр Туг Тгр
100 105 110
01у 01п С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120
<210? 246 <211? 119 <212? ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400? 246
01и Уа1 С1п Ьеи Ьеи 01и Зег С1у С1у С1у Ьеи 7а1 С1п Рго С1у С1у 15 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег <31у РЬе ТЬг РЬе МеС А1а Туг 20 25 30 <31п МеС А1а Тгр Уа1 Агд <31п А1а Рго С1у Ьуз О1у Ьеи С1и Тгр Уа1 35 40 45
Зег ТЬг Не Нгз С1п ТЬг <31у РЬе ТЬг Туг Туг А1а Аар Зег Уа1 Ьуз 50 55 60
С1у Агд РЬе ТЬг Т1е Зег Агд Аар Аэп Зег Ьуэ Азп ТЬг Ьеи Туг Ьеи 65 70 75 80
С1п МеС Аэп Зег Ьеи Агд А1а <31и Аэр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз А1а 85 90 95
Ьуз Уа1 Агд Зег МеС Агд Рго Туг Ьуз РЬе Азр Туг Тгр С1у С1п С1у 100 105 110
ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115 <210? 247 <211? 120 <212? ПРТ
- 262 020464 <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400? 247
СДи УаД СДп Ьеи Ьеи СДи Зег ОДу СДу СДу Ьеи УаД СДп Рго СДу СДу 15 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а АДа Зег СДу РЬе ТЬг РЬе Ьуз Азр Туг 20 25 30
Азр МеС ТЬг Тгр УаД Агд СДп АДа Рго ОДу Ьуз СДу Ьеи ОДи Тгр УаД 35 40 45
Зег МеС ДДе Зег Зег Зег СДу Ьеи Тгр ТЬг туг Туг АДа Азр Зег УаД 50 55 60
Ьуз СДу Агд РЬе ТЬг ДДе Зег Агд Азр Αεη Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 65 70 75 80
Ьеи СДп МеС Азп Зег Ьеи Агд АДа СДи Азр ТЬг АДа УаД Туг Туг Суз 85 Э0 95
АДа Ьуз СДу РЬе Агд Ьеи РЬе Рго Агд ТЬг РЬе Азр Туг Тгр СДу СДп 100 105 110
СДу ТЬг Ьеи УаД ТЬг УаД Зег Зег 115 120 <210? 248 <211? 121 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400? 248
С1и УаД СДп Ьеи Ьеи СДи Зег СДу СДу СДу Ьеи УаД СДп Рго ОДу СДу 15 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз АДа АДа Зег ОДу РЬе ТЬг РЬе Ηίβ Азр Туг 20 25 30
УаД Мес СДу Тгр АДа Агд СДп АДа Рго СДу Ьуз СДу Ьеи ОДи Тгр УаД 35 40 45
Зег Ьеи Не Ьуз Рго Азп СДу Зег Рго ТЬг Туг Туг АДа Азр Зег УаД 50 55 60
- 263 020464
Ьуз 01у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 65 70 75 30
Ьеи СТп МеБ Азп Зег Ьеи Агд А1а ОТи Азр ТЬг АТа Уа1 Туг Туг Суз 85 90 95
А1а Ьуз О1у Агд ОТу Агд РЬе Азп УаТ Ьеи СТп РЬе Азр Туг Тгр С1у 100 105 110
СТп 01у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг УаТ Зег Зег
115 120 <210> 249 <211> 118 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400? 249
С1и Уа1 Οίη Ьеи Ьеи О1и Зег С1у С1у С1у Ьеи УаТ С1п Рго С1у С1у 15 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз Агд АТа Зег О1у РЬе ТЬг РЬе Агд НТз Туг 20 25 30
Агд МеБ О1у Тгр Уа1 Агд ОТп А1а Рго О1у Ьуз О1у Ьеи С1и Тгр Уа1 35 40 45
Зег Тгр 11е Агд Рго Азр ОТу ТЬг РЬе тЬг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1 50 55 60
Ьуз О1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 65 70 75 80
Ьеи С1п МеБ Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг АТа Уа1 Туг Туг Суз 85 90 95
А1а Ьуз Зег Туг МеБ О1у Авр Агд РЬе Азр Туг Тгр О1у О1п О1у ТЬг 100 105 110
Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115 <210? 250 <211> 116 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность
- 264 020464 <220?
<223? Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400? 250 <31и 7а1 61п Ьеи Ьеи О1и Зег 51у 61у 61у Ьеи 7а1 О1п Рго 61у О1у 15 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЪе ТЪг РЪе Ме! Тгр Азр 20 25 30
Ьуз Ме! <31у Тгр 7а1 Агд <31п А1а Рго С1у Ьуз Е1у Ьеи С1и Тгр Уа1 35 40 45
Зег РЪе 11е О1у Агд С1и С1у Туг <31у ТЪг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1 50 55 60
Ьуз С1у Агд РЪе ТЪг 11е Бег Агд Азр Азп Бег Ьуз Азп ТЪг Ьеи Туг 65 70 75 80
Ьеи σΐη Ме! Азп Бег Ьеи Агд А1а <31и Азр ТЪг А1а 7а1 Туг Туг Суз 95 90 95
А1а Ьуз Зег 7а 1 А1а Бег РЪе Азр Туг Тгр С1у 31п С1у ТЪг Ьеи Уа1 100 105 110
ТЪг Уа1 Бег Бег
115 <210? 251 <211? 117 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400? 251 <31и Уа1 С1п Ьеи Ьеи С1и Зег (31у <31у С1у Ьеи Уа] С1п Рго С1у С1у 15 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Бег Суз А1а А1а Зег С1у РЪе ТЪг РЪе тгр А1а туг 20 25 30
Рго Ме! Зег Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз <31у Ьеи С1и Тгр Уа1 35 40 45
Зег Зег Не Зег Зег Тгр С1у ТЪг С1у ТЪг Туг Туг А1а Азр Зег 7а1 50 55 60
Ьуз С1у Агд РЪе ТЪг 11е Бег Агд Азр Азп Бег Ьуз Азп ТЪг Ьеи Туг
- 265 020464
Ьеи С1п Мер Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 90 95
А1а Ьуз С1у С1у С1п С1у Зег РЬе Азр Туг Тгр С1у 01п 01у ТЬг Ьеи 100 105 110
Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115 <210? 252 <211? 120 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223? Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400? 252 <31и Уа! О1п Ьеи Ьеи С1и Зег С1у С1у 61у Ьеи Уа1 <31п Рго С1у С1у 15 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз АЬа А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Азр Ьеи Туг 20 25 30
Азр Мер Зег Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1 35 40 45
Зег Зег Не Уа1 Азп Зег Е1у Уа1 Агд ТЬг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1 50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуе Азп ТЬг Ьеи Туг 65 70 75 80
Ьеи С1п Мер Азп Зег Ьеи Агд А1а О1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз В5 90 95
А1а Ьуз Ьеи Азп С1п Зег Туг ΗΪ3 Тгр Азр РЬе Азр Туг Тгр С1у С1п 100 105 110
С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115 120 <210? 253 <211? 123 <212? ПРТ <213? Искусственная последовательность <220?
<223? Описание искусственной последовательности: Синтетический
- 266 020464
полипептид
<400? 253
С1и Уа1 СПп Ьеи Ьеи С1и Зег Е1у 61у 61у Ьеи νβΐ <31п Рго С1у 61у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Ьуз Туг
20 25 30
Тгр Мер Зег Тгр Уа1 Агд О1п А1а Рго <31у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Зег Не Азр РЬе Мер С1у Рго Шз ТЬг Туг Туг А1а Азр Зег 17а 1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п Мер Азп Бег Ьеи Агд А1а 61и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Ьуз С1у Агд ТЬг Зег Мер Ьеи Рго МеЬ Ьуз О1у Ьуз РЬе Азр Туг
100 105 НО
Тгр С1у С1п О1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120 <210> 254 <211? 119 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
42235 Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 254
С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи 01и Зег <31у С1у <31у Ьеи Ή1 С1п Рго С1у С1у 15 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег 01 у РЬе ТЬг РЬе Туг Азр Туг 20 25 30
Азп Мер Зег Тгр Уа1 Агд С1п Д1а Рго 01у Ьуз С1у Ьеи 01и Тгр Уа1 35 40 45
Зег ТЬг 11е ТЬг Ηίδ ТЬг <31у О1у Уа! Зег ТЬг Туг Туг А1а Азр Зег 50 55 60
Уа1 Ьуз (Ну Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи 65 70 75 80
- 267 020464
Туг Ьеи С1п Мес Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а 7а1 Туг туг 85 90 95
Суз А1а Ьуз С1п Азп Рго Зег Туг С1п РЬе Азр Туг Тгр С1у С1п <31у 100 105 110
ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115 <210? 255 <211? 110 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400? 255 <31и Уа1 С1п Ьеи Ьеи С1и Зег С1у С1у <31 у Ьеи С'а1 <31п Рго С1у С1у 15 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Шз Агд Туг 20 25 30
Зег МеС Зег Тгр \/а1 Агд Я1п А1а рго <31у ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1 35 40 45
Зег ТЬг 11е Ьеи Рго <31у С1у Азр \7а1 ТЬг Туг Туг А1а Азр Зег Ув1 50 55 60
Ьуз 31у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 65 70 75 80
Ьеи С1п МеС Азп Зег Ьеи Агд АТа С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 90 95
А1а Ьуз <31п ТЬг Рго Азр Туг МеС РЬе Азр Туг Тгр С1у Θΐη С1у ТЬг 100 105 110
Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115 <210? 256 <211? 117 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
- 268 020464
<400? 256 Уа1 С1п Рго СДу 15 О1у
СДи Уа1 1 С1п Ьеи Ьеи С1и 5 Зег С1у С1у С1у 10 Ьеи
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз 20 АДа А1а Зег С1у 25 РЬе ТЬг РЬе Тгр 30 Ьуз Туг
Азп МеС А1а 35 Тгр Уа1 Агд СДп А1а Рго С1у 40 Ьуз СДу Ьеи 45 СДи Тгр УаД
Зег ТЬг 50 Не Ьеи СДу С1и СДу Азп Азп ТЬг 55 Туг Туг 60 АДа Азр Зег Уа1
Ьуз С1у 65 Агд РЬе ТЬг Не 70 Зег Агд Азр Азп Зег 75 Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 80
Ьеи СДп МеС Азп Зег Ьеи 85 Агд АДа С1и Азр 90 ТЬг А1а Уа1 Туг Туг 95 Суз
АДа Ьуз ТЬг МеС Азр Туг Ьуз РЬе Азр Туг 100 105 Уа1 ТЬг УаД Зег Зег 115 <210? 257 <211? 118 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность Тгр СДу СДп СДу 110 ТНг Ьеи
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400? 257
С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи СДи Зег СДу СДу СДу Ьеи УаД С1п Рго СДу СДу 15 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз ТЬг АДа Зег СДу РЬе ТЬг РЬе Азр С1и Туг 20 25 30
Азп МеС Зег Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго СДу Ьуз СДу Ьеи СДи Тгр Уа1 35 40 45
Зег ТЬг Не Ьеи Рго Шз СДу Азр Агд ТЬг Туг Туг А1а Авр Зег Уа1 50 55 60
Ьуз СДу Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 65 70 75 80
Ьеи СДп МеС Азп Зег Ьеи Агд АДа С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
- 269 020464
90 95
А1а Ьуэ <31п Аар Рго Ьеи Туг Агд РЬе Азр Туг Тгр С1у О1п С1у ТЬг 100 105 НО
Ьеи Уа1 ТЬг ’7а1 Зег Зег
115 <210? 258 <211? 118 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400? 258
С1и 1 Уа1 С1п Ьеи Ьеи 5 С1и Зег С1у С1у <31у 10 Ьеи Уа1 С1п РГО С1у 15 С1у
Зег Ьеи Агд Ьеи 20 Зег Суз А1а А1а зег 25 С1у РЬе ТЬг РЬе зег 30 Азр Туг
Агд МеГ Зег 35 Тгр Уа1 Агд С1п А1а 40 Рго С1у Ьуз 61у Ьеи 45 С1и Тгр Уа1
Зег ТЬг 50 Не Не Зег Азп О1у 55 Ьуз РЬе ТЬг Туг Туг 60 А1а Азр Зег Уа1
Ьуз 65 61у Агд РЬе ТЬг Не 70 Зег Агд Азр Азп Зег 75 Ьуз Аеп ТЬг Ьеи Туг 80
Ьеи αΐη Ме5 Азп Зег 85 Ьеи Агд А1а С1и Азр 90 ТЬг А1а Уа1 Туг Туг 95 Суз
А1а Ьуз С1п Азр 100 Тгр МеД Туг Меб РЬе 105 Аер Туг Тгр С1у <31п 110 С1у ТЬг
Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 <210? 259 <211? 118 <212? ПРТ <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400? 259
С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи С1и Зег <31у С1у <31у Ьеи Уа1 С1п Рго О1у 31у
- 270 020464
5ег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз АДа АДа Зег СДу РЬе ТЬг РЬе Агд ТЬг Туг 20 25 30
ТЬг МеЬ АДа Тгр УаД Агд СДп А1а Рго СДу Ьуз СДу Ьеи СДи Тгр УаД 35 40 45
Зег Зег 1Де ТЬг Зег Зег СДу Зег Зег ТЬг Туг Туг АДа Азр Зег УаД 50 55 60 ьуз СДу Агд РЬе ТЬг 1Де Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 65 70 75 80
Ьеи СДп Мес Азп Зег Ьеи Агд АДа СДи Азр ТЬг АДа УаД Туг Туг Суз 85 90 95
АДа Ьуз УаД Азп Зег Ьеи Туг Ьуз РЬе Азр Туг Тгр СДу СДп СДу ТЬг 100 105 110
Ьеи Уа1 ТЬг УаД Зег Зег 115 <210> 260 <211> 118 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 260
СДи УаД СДп Ьеи Ьеи СДи Зег 61у СДу СДу Ьеи УаД СДп Рго СДу СДу 15 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз АДа АДа Зег СДу РЬе ТЬг РЬе Агд Рго ТЬг 20 25 30
Азп МеЪ Зег Тгр УаД Агд СДп АДа Рго СДу Ьуз СДу Ьеи СДи Тгр УаД 35 40 45
Зег ТЬг 1Де ТЬг СДу ТЬг СДу АДа АДа ТЬг Туг Туг АДа Азр Зег УаД 50 55 60
Ьуз СДу Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуа Азп ТЬг Ьеи Туг 65 70 75 80
Ьеи СДп МеГ Азп Зег Ьеи Агд АДа СДи Азр ТЬг АДа УаД Туг Туг Суз 85 90 95
- 271 020464
АДа Ьуз СДп Азп Зег Агд туг Агд РЬе Азр Туг Тгр СДу СДп СДу ТЬг 100 105 НО
Ьеи УаД ТЬг УаД Зег Зег 115 <210? 261 <211? 197 <212? ПРТ <213? Ното зарДепз <400? 261
Азр АДа НДз Ьуз Зег СДи УаД АДа НДз Агд РЬе Ьуз Азр Ьеи СДу СДи 15 10 15
СДи Азп РЬе Ьуз АДа Ьеи УаД Ьеи 11е АДа РЬе АДа СДп Туг Ьеи СДп 20 25 30
СДп Суз Рго РЬе СДи Азр нДз УаД Ьуз Ьеи УаД Азп СДи УаД ТЬг СДи 35 40 45
РЬе АДа Ьуз ТЬг Суз УаД АДа Азр СДи Зег АДа СДи Азп суз Азр Ьуз 50 55 60
Бег Ьеи НДз ТЬг Ьеи РЬе СДу Авр Ьуз Ьеи Суз ТЬг УаД АДа ТЬг Ьеи 65 70 75 80
Агд СДи ТЬг Туг СДу СДи Меб АДа Азр Суз Суз АДа Ьуз СДп СДи Рго 85 90 95
СДи Агд Азп СДи Суз РЬе Ьеи СДп НДз Ьуз Азр Азр Азп Рго Азп Ьеи 100 105 110
Рго Агд Ьеи Уа1 Агд Рго С1и УаД Азр УаД Меб Суз ТЬг АДа РЬе НДз 115 120 125
Азр Азп СДи СДи ТЬг РЬе Ьеи Ьуз Ьуз Ьеи Туг Ьеи СДи 11е АДа Агд 130 135 140
Агд НДз Рго Туг РЬе Туг АДа Рго СДи Ьеи Ьеи РЬе РЬе АДа Ьуз Агд 145 150 155 160
Туг Ьув А1а А1а РЬе ТЬг СДи Суз Суз СДп АДа АДа Азр Ьуз АДа АДа 165 170 175
Суз Ьеи Ьеи Рго Ьуз Ьеи Азр СДи Ьеи Агд Азр СДи СДу Ьув АДа Зег 180 185 190
Зег А1а Ьуз СДп Агд
- 272 020464
195
<210? 262
<211? 196
<212? ПРТ
<213? Ното зархепз
<400? 262
С1у Ьуз А1а Зег Зег
Ьуз РЬе О1у 61и Агд А1а РЬе Ьуз А1а Тгр А1а Уа1 А1а Агд Ьеи Зег 20 25 30 <31п Агд РЬе Рго Ьуз А1а С1и РЬе А1а С1и Уа1 Зег Ьуз Ьеи Уа1 ТЬг 35 40 45
Азр Ьеи ТЬг Ьуз 7а1 Ηίδ ТЬг С1и Суз Суз Шз <31у Азр Ьеи Ьеи С1и 50 55 60
Суз А1а Азр Азр Агд А1а Азр Ьеи А1а Ьуз Туг 11е Суз О1и Ази 61п 65 70 75 80
Азр Бег 11е Бег Бег Ьуз Ьеи Ьуз С31и Суз Суз С1и Ьуз Рго Ьеи Ьеи 85 Э0 95
01и Ьуз Зег Ηΐβ Суз 11е А1а О1и 7а1 61и Азп Азр С1и МеС Рго А1а 100 105 110
Азр Ьеи Рго Зег Ьеи А1а А1а Азр РЬе 7а1 б1и Зег Ьуз Азр Уа1 Суз 115 120 125
Ьуз Азп Туг А1а С1и А1а Ьуз Азр Уа1 РЬе Ьеи С1у МеС РЬе Ьеи Туг 130 135 140
О1и Туг А1а Агд Агд Ηΐβ Рго Азр Туг Зег Уа1 Уа1 Ьеи Ьеи Ьеи Агд
145 150 155 160 ьеи А1а Ьуз ТЬг Туг С1и ТЬг ТЬг Ьеи С51и Ьуз Суз Суз А1а А1а А1а 165 170 175
Азр Рго ΗΪ3 С1и Суз Туг А1а Ьуз Уа1 РЬе Азр С1и РЬе Ьуз Рго Ьеи 180 135 190
Уа1 <31и О1и Рго 195 <210? 263 <211? 204 <212? ПРТ
- 273 020464 <213> Ното заргепз <400> 263
Уа1 1 С1и С1и Рго Е1п 5 АЗП Ьеи 11е Ьуз С1п Азп Суз (31и 10 Ьеи РЬе 15 С1и
©1п Ьеи С1у С1и Туг Ьуз РЬе С1п Азп А1а Ьеи Ьеи Уа1 Агд Туг ТЬг
20 25 30
Ьуз Ьуз Уа1 Рго <31п Уа1 Зег ТЬг Рго ТЬг Ьеи νβΐ С1и Уа1 Зег Агд
35 40 45
Азп Ьеи <31у ьуз νβΐ <31у Зег Ьуз Суз Суз Ьуз Н1з Рго <31и А1а Ьуз
50 55 60
Агд МеС Рго Суз А1а С1и АЗр Туг Ьеи Зег Уа1 Уа1 Ьеи АЗП С1п Ьеи
65 70 75 80
Суз Уа1 Ьец Н13 <31и ьуз ТЬг Рго Уа1 Зег Азр Агд Уа1 ТЬг Ьуз Суз
85 90 95
Суз ТЬг 61и Бег Ьеи Уа1 АЗП Агд Агд Рго Суз РЬе Зег А1а Ьеи С1и
100 105 110
Уа1 Азр С1и ТЬг Туг Уа1 Рго Ьуз С1и РЬе Азп А1а С1и ТЫ РЬе ТЫ
115 120 125
РЬе ΗΪ3 А1а Азр Пе Суз ТЬг Ьеи Зег О1и Ьуз <31и Агд <31п Пе Ьуз
130 135 140
Ьуз 31п ТЬг А1а Ьеи Уа1 01и Ьеи Уа1 Ьуз НЬз Ьуз Рго Ьуз А1а ТЬг
14 5 150 155 160
Ьуз С1и 01п Ьеи Ьуз А1а Па1 МеЬ Азр Азр РЬе А1а А1а РЬе Ча1 <31и
165 170 175
Ьуз Суз Суз Ьуз А1а Азр Азр Ьуз С1и ТЬг Суз РЬе А1а 01и С1и 61у
180 185 190
Ьуз Ьуз Ьеи Уа1 А1а А1а Зег С1п А1а А1а Ьеи О1у
195 200
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (12)

1. Лиганд. содержащий отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела, специфично связывающий сывороточный альбумин и включающий одну из аминокислотных последовательностей йАЬ7Ь14, йАЬ7Ь11. йАЬ7Ь9. представленных на фиг. 24. или аминокислотных последовательностей, по меньшей мере на 80% идентичных указанным последовательностям.
2. Лиганд по п.1, где указанный отдельный вариабельный домен антитела специфично связывает человеческий сывороточный альбумин и сывороточный альбумин из источника, не являющегося человеком, со значениями константы диссоциации Кй. отличающимися друг от друга не более чем в 10 раз.
3. Лиганд по п.1, где указанный отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела специфично связывает домен II человеческого сывороточного альбумина.
4. Лиганд по п.1, где указанный отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела, специфично связывающий сывороточный альбумин, содержит один или более гипервариабельных участков (СИК) из отдельного вариабельного домена антитела, выбранного из йАЬ7Ь14, йАЬ7Ь11 и йАЬ7Ь9. где процент идентичности, указанный в п.1, относится к СИК участкам.
- 274 020464
5. Лиганд по п.4, где указанный отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела, специфично связывающий сывороточный альбумин, дополнительно содержит каркас, выбранный из группы, состоящей из СТЬА-4, липокалина, стафилококкового белка А (8рА), аГПЬобу. авимера, СгоЕ1, СгоЕк, трансферрина и фибронектина.
6. Лиганд по любому из пп.1-5, где указанный отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела, специфично связывающий сывороточный альбумин, связывает человеческий сывороточный альбумин и крысиный сывороточный альбумин и где период полувыведения Τβ указанного лиганда и период полувыведения Τβ крысиного сывороточного альбумина в крысе-хозяине, по существу, одинаковы.
7. Лиганд по любому из пп.1-5, где указанный отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела, специфично связывающий сывороточный альбумин, связывает человеческий сывороточный альбумин и сывороточный альбумин обезьян рода Супото1дик и где период полувыведения Τβ указанного лиганда и период полувыведения Τβ сывороточного альбумина обезьян рода Супото1дик в хозяине, представляющем собой обезьяну рода Супото1ди8, по существу, одинаковы.
8. Лиганд по любому из пп.1-7, где указанный отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела способен специфично связывать крысиный, человеческий сывороточный альбумин и сывороточный альбумин обезьян рода Супото1ди8.
9. Лиганд по любому из пп.1-7, где указанный отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела способен специфично связывать мышиный, человеческий сывороточный альбумин и сывороточный альбумин обезьян рода Супото1ди8.
10. Лиганд по любому из пп.1-7, где указанный отдельный вариабельный домен легкой цепи антитела способен специфично связывать крысиный, мышиный, человеческий сывороточный альбумин и сывороточный альбумин обезьян рода Супото1дик.
11. Слитый белок, содержащий первый отдельный вариабельный домен, как он определен в п.1, специфично связывающий сывороточный альбумин, и второй отдельный вариабельный домен, где каждый из указанных первого и второго отдельных вариабельных доменов представляет собой отдельный вариабельный домен, не встречающийся в природе, и где либо (1) первый отдельный вариабельный домен связан с Ν-концевой областью второго отдельного вариабельного домена, либо (2) первый отдельный вариабельный домен связан с С-концевой областью второго отдельного вариабельного домена, либо (3) первый отдельный вариабельный домен присоединен как к Ν-концевой области второго отдельного вариабельного домена, так и к С-концевой области второго отдельного вариабельного домена.
12. Лиганд по п.1, где указанный отдельный вариабельный домен антитела специфично связывает сывороточный альбумин ш νίΙΐΌ как при рН 7, так и при рН внутриклеточного компартмента.
Н1 ню Н20 НЗО Б V ΰ ь Б 8 с с с Ь V О Р С С 8 Ь к Ь 5 С А А 5 ΰ Б* т Б 3 САО ОТб САС стс ттс САС тст ссс ССА ссс ттс СТА САС ССТ ссс ссс ТСС СТС АСА СТС ТСС тст ССА ССС ТСТ С6А ТТС АСС ттт АСС Н40 Н50 Н52 а 5 Υ А к 5 М V к с А Р С К С ь Б и V 5 А I 5 с 5 с £ 5 Т Υ Υ АСС ТАГ ССС АТС АСС ТСС стс ссс САС ССТ ССА ССС ААС ссс стс САС тсс стс ТСА РИ АТТ ведаветжет ССТ еетлКю АСА ТАС НСОК1 НСС1В2 Н60 НТС Н80 Н82 а ь £ А 0 5 V К с к г т I 5 К О N 8 К N т Ь Υ ь 0 М N 3 ί К А Е О
EA200900955A 2007-02-08 2008-02-08 Отдельные вариабельные домены антител против сывороточного альбумина EA020464B9 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11/704,832 US9321832B2 (en) 2002-06-28 2007-02-08 Ligand
PCT/GB2008/000453 WO2008096158A2 (en) 2007-02-08 2008-02-08 Antibody single variable domains against serum albumin

Publications (3)

Publication Number Publication Date
EA200900955A1 EA200900955A1 (ru) 2010-04-30
EA020464B1 true EA020464B1 (ru) 2014-11-28
EA020464B9 EA020464B9 (ru) 2015-10-30

Family

ID=39518148

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200900955A EA020464B9 (ru) 2007-02-08 2008-02-08 Отдельные вариабельные домены антител против сывороточного альбумина

Country Status (16)

Country Link
US (2) US9321832B2 (ru)
EP (4) EP2559703A1 (ru)
JP (2) JP5562650B2 (ru)
KR (2) KR20150014995A (ru)
CN (1) CN101965364A (ru)
AR (1) AR065260A1 (ru)
AU (1) AU2008212682B2 (ru)
BR (1) BRPI0807480A2 (ru)
CA (1) CA2677069A1 (ru)
CL (1) CL2008000423A1 (ru)
EA (1) EA020464B9 (ru)
ES (2) ES2629333T3 (ru)
MX (1) MX2009008490A (ru)
SG (1) SG185869A1 (ru)
TW (1) TW200848427A (ru)
WO (1) WO2008096158A2 (ru)

Families Citing this family (118)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG189682A1 (en) * 2008-03-31 2013-05-31 Glaxo Group Ltd Drug fusions and conjugates
CN102076355B (zh) 2008-04-29 2014-05-07 Abbvie公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
US9109026B2 (en) 2008-06-03 2015-08-18 Abbvie, Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
EP3002299A1 (en) 2008-06-03 2016-04-06 AbbVie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
KR20110031369A (ko) 2008-07-08 2011-03-25 아보트 러보러터리즈 프로스타글란딘 ｅ2 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
WO2010043057A1 (en) 2008-10-14 2010-04-22 National Research Counsil Of Canada Bsa-specific antibodies
CN102307897B (zh) 2008-12-05 2016-01-20 葛兰素集团有限公司 选出蛋白酶抗性多肽的方法
US20110301335A1 (en) * 2009-02-19 2011-12-08 Stephen Duffield Anti-tnfr1 polypeptides, antibody variable domains & antagonists
MA33052B1 (fr) * 2009-02-19 2012-02-01 Glaxo Group Ltd Variants de liaison anti-albumine sérique améliorés
AR075505A1 (es) 2009-02-19 2011-04-06 Glaxo Group Ltd Variantes de union a anti- albumina de suero mejoradas
TW201100104A (en) * 2009-03-27 2011-01-01 Glaxo Group Ltd Drug fusions and conjugates
WO2010122090A1 (en) 2009-04-24 2010-10-28 Glaxo Group Limited Fgfr1c antibody combinations
WO2011008814A2 (en) 2009-07-14 2011-01-20 Immune Tolerance Institute, Inc., A California Not-For-Profit Corporation Multiplexed measurement of exogenous and endogenous dna
CA2768460A1 (en) 2009-07-16 2011-01-20 Glaxo Group Limited Antagonists, uses & methods for partially inhibiting tnfr1
CN102574914A (zh) * 2009-07-16 2012-07-11 葛兰素集团有限公司 改进的抗血清清蛋白结合性单可变区
IN2012DN00412A (ru) 2009-07-29 2015-05-22 Glaxo Group Ltd
NZ598929A (en) * 2009-09-01 2014-05-30 Abbvie Inc Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US20120276098A1 (en) 2009-09-30 2012-11-01 Bruce Hamilton Drug fusions and conjugates with extended half life
CN102666875A (zh) * 2009-10-15 2012-09-12 雅培制药有限公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
ES2552177T3 (es) * 2009-10-27 2015-11-26 Glaxo Group Limited Polipéptidos anti-TNFR1 estables, dominios variables de anticuerpos y antagonistas
UY32979A (es) * 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
CA2786660A1 (en) 2010-01-14 2011-07-21 Glaxo Group Limited Liver targeting molecules
US20130045895A1 (en) 2010-04-21 2013-02-21 Rudolf Maria De Wildt Binding domains
EP2571900A1 (en) * 2010-05-20 2013-03-27 Glaxo Group Limited Improved anti-serum albumin binding variants
ES2674567T3 (es) 2010-05-21 2018-07-02 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Proteínas de fusión biespecíficas
EP2571898B1 (en) * 2010-05-21 2021-07-21 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services High-affinity fully functional soluble single-domain human cd4, antibodies, and related fusion proteins
BR112013002578A2 (pt) 2010-08-03 2019-05-14 Abbvie Inc. imunoglobinas de domínio variável duplo e usos das mesmas
EP2603522A1 (en) 2010-08-13 2013-06-19 GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Limited Improved anti-serum albumin binding variants
BR112013003899A2 (pt) * 2010-08-20 2016-06-07 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd domínio variável único da imunoglobina anti-albumina sérica (sa), ligando multiespecífico, proteína de fusão, composição, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira isolada, e, método de tratar ou previnir uma doença ou distúrbio em um paciente
AU2011293253B2 (en) 2010-08-26 2014-12-11 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
WO2012042026A1 (en) 2010-09-30 2012-04-05 Ablynx Nv Biological materials related to c-met
US11644471B2 (en) 2010-09-30 2023-05-09 Ablynx N.V. Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
KR20140032356A (ko) 2010-11-26 2014-03-14 몰리큘라 파트너스 아게 설계된 안키린 반복 단백질에 대한 개선된 n-말단 캡핑 모듈
WO2012072731A2 (en) 2010-12-01 2012-06-07 Glaxo Group Limited Improved anti-serum albumin binding single variable domains
CN103443126B (zh) 2011-01-06 2016-11-23 葛兰素集团有限公司 结合TGFβ受体II的配体
US20130310281A1 (en) 2011-02-02 2013-11-21 Glaxo Group Limited Novel antigen binding proteins
WO2012136790A1 (en) 2011-04-07 2012-10-11 Glaxo Group Limited Compositions comprising fusion proteins or conjugates with an improved half -life
WO2012136792A2 (en) 2011-04-07 2012-10-11 Glaxo Group Limited Cck compositions
SI2726510T1 (sl) 2011-05-27 2023-06-30 F. Hoffmann - La Roche Ag Dvojno ciljanje
WO2012163521A1 (en) 2011-05-27 2012-12-06 Dutalys Removal of monomeric targets
HUE031828T2 (en) * 2011-06-23 2017-08-28 Ablynx Nv Procedures for Predicting, Detecting, and Reducing Aspiration Protein Interference in Assays Containing Immunoglobulin Variable Single Domain
CA2839779C (en) * 2011-06-23 2020-10-06 Ablynx Nv Serum albumin binding proteins
EP3020728A1 (en) * 2011-06-23 2016-05-18 Ablynx N.V. Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobin single variable domains
US9346884B2 (en) 2011-09-30 2016-05-24 Ablynx N.V. Biological materials related to c-Met
DK2776466T3 (da) 2011-11-11 2017-11-20 Ucb Biopharma Sprl Albuminbindende antistoffer og bindingsfragmenter deraf
TW201333035A (zh) 2011-12-30 2013-08-16 Abbvie Inc 針對ｉｌ－１３及／或ｉｌ－１７之雙特異性結合蛋白
CN102661932B (zh) * 2012-04-17 2014-07-23 王利兵 一种基于表面等离子共振技术的种质资源中特定dna序列鉴定方法
AU2013257848A1 (en) 2012-05-07 2014-11-27 The University Court Of The University Of Aberdeen Single domain binding molecule
WO2014029752A1 (en) 2012-08-22 2014-02-27 Glaxo Group Limited Anti lrp6 antibodies
MY194330A (en) 2012-11-01 2022-11-28 Abbvie Inc Anti-dll4/vegf dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
WO2014111550A1 (en) 2013-01-17 2014-07-24 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Modified anti-serum albumin binding proteins
AU2014230741B2 (en) 2013-03-15 2017-04-13 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Anti-LAG-3 binding proteins
CN105324396A (zh) 2013-03-15 2016-02-10 艾伯维公司 针对IL-1β和/或IL-17的双重特异性结合蛋白
WO2014173959A2 (en) 2013-04-23 2014-10-30 The University Court Of The University Of Aberdeen Synthetic library of specific binding molecules
WO2015030539A1 (en) * 2013-08-30 2015-03-05 Aprilbio Co., Ltd An anti serum albumin fab-effector moiety fusion construct, and the preparing method thereof
US9580758B2 (en) 2013-11-12 2017-02-28 Luc Montagnier System and method for the detection and treatment of infection by a microbial agent associated with HIV infection
IL275497B (en) * 2014-03-20 2022-09-01 Bristol Myers Squibb Co Serum proteins with type iii fibronectin binding domains
KR20230053002A (ko) 2014-05-16 2023-04-20 아블린쓰 엔.브이. 개선된 면역글로불린 가변 도메인
TW201629215A (zh) * 2014-09-30 2016-08-16 拜耳保健有限責任公司 使用凝血酶之組成物及治療方法
US10093733B2 (en) 2014-12-11 2018-10-09 Abbvie Inc. LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins
JP6979577B2 (ja) * 2015-02-20 2021-12-15 アミロニクス アクティエボラーグ アルツハイマーａベータペプチド結合ポリペプチド
EP4272838A3 (en) 2015-04-02 2024-01-10 Molecular Partners AG Designed ankyrin repeat domains with binding specificity for serum albumin
MX2017014908A (es) 2015-05-21 2018-08-15 Harpoon Therapeutics Inc Proteinas de union triespecificas y metodos de uso.
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
ES2842306T3 (es) 2015-09-02 2021-07-13 Immutep Sas Anticuerpos anti LAG-3
ES2967078T3 (es) 2015-09-23 2024-04-25 Bristol Myers Squibb Co Dominios de fibronectina de tipo III de unión a seroalbúmina con velocidad de disociación rápida
JP7005019B2 (ja) 2015-10-02 2022-02-04 シルバー・クリーク・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 組織修復のための二重特異性治療用タンパク質
TWI756187B (zh) 2015-10-09 2022-03-01 美商再生元醫藥公司 抗ｌａｇ３抗體及其用途
NO2768984T3 (ru) 2015-11-12 2018-06-09
CN115925919A (zh) 2015-11-13 2023-04-07 埃博灵克斯股份有限公司 改进的血清白蛋白结合免疫球蛋白可变结构域
CN108473564B (zh) 2015-11-18 2022-04-08 埃博灵克斯股份有限公司 改进的血清白蛋白结合剂
UA125337C2 (uk) 2015-11-18 2022-02-23 Мерк Шарп І Доум Корп. Ctla4-зв'язувальні речовини
EP3377526A1 (en) 2015-11-18 2018-09-26 Merck Sharp & Dohme Corp. PD1/CTLA4 Binders
TW202216787A (zh) 2015-11-18 2022-05-01 美商默沙東藥廠 Pd1及／或 lag3結合劑
AU2017222700B2 (en) * 2016-02-26 2018-09-27 Imunexus Therapeutics Limited Multi-specific molecules
RU2018138122A (ru) 2016-04-05 2020-05-12 Глэксосмитклайн Интеллекчуал Проперти Дивелопмент Лимитед Новая терапия
WO2017189624A1 (en) * 2016-04-25 2017-11-02 Idea Orchard, Llc Engineered fha domains
KR102533456B1 (ko) 2016-05-18 2023-05-17 모더나티엑스, 인크. 릴랙신을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드
KR102530742B1 (ko) * 2016-05-20 2023-05-09 하푼 테라퓨틱스, 인크. 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질
SG11201810331YA (en) 2016-05-20 2018-12-28 Harpoon Therapeutics Inc Single chain variable fragment cd3 binding proteins
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
KR102275008B1 (ko) 2016-11-23 2021-07-13 하푼 테라퓨틱스, 인크. 전립선 특이 막 항원 결합 단백질
EP3544629A4 (en) 2016-11-23 2020-06-17 Harpoon Therapeutics, Inc. TRISPECIFIC PROTEINS CIBLANG PSMA AND METHODS OF USE
CN110049997B (zh) 2016-12-07 2023-09-22 埃博灵克斯股份有限公司 改进的血清白蛋白结合免疫球蛋白单可变结构域
CN117285623A (zh) * 2017-01-17 2023-12-26 埃博灵克斯股份有限公司 改进的血清白蛋白结合物
JP7300385B2 (ja) * 2017-01-17 2023-06-29 アブリンクス エン．ヴェー． 改善された血清アルブミン結合剤
EA201991673A1 (ru) 2017-02-10 2020-01-17 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Меченные радиоактивным изотопом антитела к lag3 для иммуно-пэт-визуализации
WO2018151868A2 (en) 2017-02-16 2018-08-23 Sonnet Bio Therapeutics Albumin binding domain fusion proteins
US11535668B2 (en) 2017-02-28 2022-12-27 Harpoon Therapeutics, Inc. Inducible monovalent antigen binding protein
JP6886854B2 (ja) * 2017-04-13 2021-06-16 シスメックス株式会社 被検物質の情報取得方法
CN115028727A (zh) 2017-05-12 2022-09-09 哈普恩治疗公司 靶向msln的三特异性蛋白质及使用方法
AU2018265856B2 (en) 2017-05-12 2023-04-27 Harpoon Therapeutics, Inc. Mesothelin binding proteins
AU2018280679A1 (en) * 2017-06-05 2019-12-05 Numab Therapeutics AG Novel anti-HSA antibodies
US11155607B2 (en) 2017-07-19 2021-10-26 Vib Vzw Serum albumin binding agents
BR112020006999A2 (pt) 2017-10-10 2020-10-06 Numab Therapeutics AG anticorpo multiespecífico, composição farmacêutica e método de produção
EP3470426A1 (en) 2017-10-10 2019-04-17 Numab Therapeutics AG Multispecific antibody
CN111630070A (zh) 2017-10-13 2020-09-04 哈普恩治疗公司 三特异性蛋白质及使用方法
BR112020007249B1 (pt) 2017-10-13 2022-11-22 Harpoon Therapeutics, Inc Roteína de ligação a antígeno de maturação de célula b, proteína de ligação multiespecífica e uso das referidas proteínas
CN112654633A (zh) 2018-06-22 2021-04-13 科优基因公司 基于细胞因子的可生物活化药物及其使用方法
CN112996805A (zh) 2018-08-30 2021-06-18 Hcw生物科技公司 多链嵌合多肽和其用途
JP7407822B2 (ja) 2018-08-30 2024-01-04 エイチシーダブリュー バイオロジックス インコーポレイテッド 単鎖キメラポリペプチドおよびその使用
CN112888445A (zh) 2018-08-30 2021-06-01 Hcw生物科技公司 治疗老年化相关病症的方法
CA3114038A1 (en) 2018-09-25 2020-04-02 Harpoon Therapeutics, Inc. Dll3 binding proteins and methods of use
GB201818460D0 (en) * 2018-11-13 2018-12-26 Crescendo Biologics Ltd Single domain antibodies that bind human serum albumin
CN111423509B (zh) * 2019-01-10 2021-07-09 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 抗hsa单域抗体及其融合蛋白的亲和层析纯化方法
WO2020257639A1 (en) * 2019-06-21 2020-12-24 HCW Biologics, Inc. Multi-chain chimeric polypeptides and uses thereof
EP3816185A1 (en) 2019-11-04 2021-05-05 Numab Therapeutics AG Multispecific antibody directed against pd-l1 and a tumor-associated antigen
GB201919061D0 (en) 2019-12-20 2020-02-05 Ucb Biopharma Sprl Multi-specific antibody
CA3170833A1 (en) 2020-02-21 2021-08-26 Harpoon Therapeutics, Inc. Flt3 binding proteins and methods of use
EP4133084A1 (en) 2020-04-09 2023-02-15 Autolus Limited Polypeptide
GB202007441D0 (en) 2020-05-19 2020-07-01 Autolus Ltd Polypeptide
EP3915580A1 (en) 2020-05-29 2021-12-01 Numab Therapeutics AG Multispecific antibody
EP3988568A1 (en) 2020-10-21 2022-04-27 Numab Therapeutics AG Combination treatment
US20240067758A1 (en) 2020-12-07 2024-02-29 UCB Biopharma SRL Multi-specific antibodies and antibody combinations
JP2024504471A (ja) 2021-02-02 2024-01-31 ヌマブ セラピューティックス アーゲー Ｒｏｒ１およびｃｄ３に対する特異性を有する多重特異性抗体
EP4183800A1 (en) 2021-11-19 2023-05-24 Medizinische Hochschule Hannover Novel sars-cov-2 neutralizing antibodies
WO2024038095A1 (en) 2022-08-16 2024-02-22 Iome Bio NOVEL ANTI-RGMb ANTIBODIES
WO2024084203A1 (en) * 2022-10-18 2024-04-25 Isogenica Limited Single domain antibodies binding to albumin

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004003019A2 (en) * 2002-06-28 2004-01-08 Domantis Limited Immunoglobin single variant antigen-binding domains and dual-specific constructs
WO2005118642A2 (en) * 2004-06-01 2005-12-15 Domantis Limited Bispecific fusion antibodies with enhanced serum half-life
WO2006059110A2 (en) * 2004-12-02 2006-06-08 Domantis Limited Plad domain peptides with increased serum half life due to conjugation to domain antibodies
WO2008052933A2 (en) * 2006-10-30 2008-05-08 Domantis Limited Prevention of aggregation of immunoglobulin light or heavy chains

Family Cites Families (202)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US700598A (en) 1901-03-21 1902-05-20 Le Carbone Sa Primary battery.
CU22545A1 (es) 1994-11-18 1999-03-31 Centro Inmunologia Molecular Obtención de un anticuerpo quimérico y humanizado contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico para uso diagnóstico y terapéutico
EP0467416A1 (en) 1983-09-01 1992-01-22 Hybritech Incorporated Antibody compositions of therapeutic agents having an extended serum half-life
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5120712A (en) 1986-05-05 1992-06-09 The General Hospital Corporation Insulinotropic hormone
SU1441787A1 (ru) 1987-04-29 1990-09-23 Институт Белка Ан Ссср Способ получени пептидов и белков в бесклеточной системе трансл ции
WO1988009344A1 (en) 1987-05-21 1988-12-01 Creative Biomolecules, Inc. Targeted multifunctional proteins
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
ES2056108T3 (es) 1987-07-07 1994-10-01 Hybrisens Ltd Empleo de interacciones anticuerpo/antigeno para proteger o modular la actividad biologica.
JP3040121B2 (ja) 1988-01-12 2000-05-08 ジェネンテク，インコーポレイテッド 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法
US5225540A (en) 1988-04-26 1993-07-06 Du Pont Merck Pharmaceutical Company Monoclonal antibodies to tissue plasminogen activator (t-pa) which prolong its functional half-life
AU4128089A (en) 1988-09-15 1990-03-22 Rorer International (Overseas) Inc. Monoclonal antibodies specific to human epidermal growth factor receptor and therapeutic methods employing same
AU634186B2 (en) 1988-11-11 1993-02-18 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
WO1990005785A1 (en) 1988-11-18 1990-05-31 The Regents Of The University Of California Method for site-specifically incorporating unnatural amino acids into proteins
SU1705302A1 (ru) 1988-12-22 1992-01-15 Институт Белка Ан Ссср Способ препаративной экспрессии генов в бесклеточной системе сопр женной транскрипции/трансл ции
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
CA2064754C (en) 1989-07-31 1996-06-18 Vladimir Ivanovich Baranov Method of preparing polypeptides in a cell-free translation system
SE509359C2 (sv) 1989-08-01 1999-01-18 Cemu Bioteknik Ab Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel
DK0486526T3 (da) 1989-08-07 1996-06-24 Peptide Technology Ltd Bindingsligander for tumornekrosefaktor
US6451983B2 (en) 1989-08-07 2002-09-17 Peptech Limited Tumor necrosis factor antibodies
US5977307A (en) 1989-09-07 1999-11-02 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific ligand-neuropharmaceutical agent fusion proteins
KR0185192B1 (ko) 1989-10-05 1999-04-01 제임스 더블유. 데이비 신규의 유전자 및 폴리펩티드의 무세포 합성 및 분리
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5459061A (en) 1990-01-26 1995-10-17 W. Alton Jones Cell Science Center, Inc. Hybridomas producing monoclonal antibodies which specifically bind to continuous epitope on the human EGF receptor and compete with EGF for binding to the EGF receptor
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
EP0600866B1 (en) 1990-06-01 1997-12-03 Chiron Corporation Compositions and methods for identifying biologically active molecules
US5723286A (en) 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
CA2109602C (en) 1990-07-10 2002-10-01 Gregory P. Winter Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
GB9016299D0 (en) 1990-07-25 1990-09-12 Brien Caroline J O Binding substances
AU8498091A (en) 1990-08-02 1992-03-02 Regents Of The University Of Colorado, The Systematic polypeptide evolution by reverse translation
US5843701A (en) 1990-08-02 1998-12-01 Nexstar Pharmaceticals, Inc. Systematic polypeptide evolution by reverse translation
WO1992005258A1 (en) 1990-09-20 1992-04-02 La Trobe University Gene encoding barley enzyme
US5726152A (en) 1990-09-21 1998-03-10 Merck & Co., Inc. Vascular endothelial cell growth factor II
CA2104698A1 (en) 1991-02-21 1992-08-22 John J. Toole Aptamers specific for biomolecules and methods of making
JPH06508985A (ja) 1991-02-27 1994-10-13 クリエイティブ　バイオモレキュルズ　インコーポレイテッド 富セリンペプチドリンカー
US5525491A (en) 1991-02-27 1996-06-11 Creative Biomolecules, Inc. Serine-rich peptide linkers
CA2082160C (en) 1991-03-06 2003-05-06 Mary M. Bendig Humanised and chimeric monoclonal antibodies
US6582959B2 (en) 1991-03-29 2003-06-24 Genentech, Inc. Antibodies to vascular endothelial cell growth factor
OA10149A (en) 1991-03-29 1996-12-18 Genentech Inc Vascular endothelial cell growth factor antagonists
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
WO1993000917A1 (en) 1991-07-05 1993-01-21 Seragen, Inc. Epidermal growth factor receptor targeted molecules for treatment of inflammatory arthritis
EP0605522B1 (en) 1991-09-23 1999-06-23 Medical Research Council Methods for the production of humanized antibodies
US5270170A (en) 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
DE69233782D1 (de) 1991-12-02 2010-05-20 Medical Res Council Herstellung von Autoantikörpern auf Phagenoberflächen ausgehend von Antikörpersegmentbibliotheken
US5965132A (en) 1992-03-05 1999-10-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors
DK1589107T3 (da) 1992-08-21 2010-04-26 Univ Bruxelles Immonuglobuliner uden lette kæder
ATE199392T1 (de) 1992-12-04 2001-03-15 Medical Res Council Multivalente und multispezifische bindungsproteine, deren herstellung und verwendung
HU225496B1 (en) 1993-04-07 2007-01-29 Scios Inc Pharmaceutical compositions of prolonged delivery, containing peptides
US5426039A (en) 1993-09-08 1995-06-20 Bio-Rad Laboratories, Inc. Direct molecular cloning of primer extended DNA containing an alkane diol
AU8124694A (en) 1993-10-29 1995-05-22 Affymax Technologies N.V. In vitro peptide and antibody display libraries
SE9400088D0 (sv) 1994-01-14 1994-01-14 Kabi Pharmacia Ab Bacterial receptor structures
IL112372A (en) 1994-02-07 2001-08-26 Res Dev Foundation Non-viral vector for the delivery of genetic information to cells
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5834252A (en) 1995-04-18 1998-11-10 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
US6335160B1 (en) 1995-02-17 2002-01-01 Maxygen, Inc. Methods and compositions for polypeptide engineering
GB9410533D0 (en) 1994-05-26 1994-07-13 Lynxvale Ltd In situ hybridisation and immuno-Chemical localisation of a growth factor
GB9416721D0 (en) 1994-08-18 1994-10-12 Short Brothers Plc A bias yarn assembly forming device
ATE208633T1 (de) 1994-09-16 2001-11-15 Merck Patent Gmbh Immunokonjugate
US5573957A (en) 1994-09-28 1996-11-12 Spectral Diagnostics, Inc. Monoclonal antibody to human cardiac myoglobin
US5712381A (en) 1994-10-19 1998-01-27 Genetics Institute, Inc. MADD, a TNF receptor death domain ligand protein
US5928939A (en) 1995-03-01 1999-07-27 Ludwig Institute For Cancer Research Vascular endothelial growth factor-b and dna coding therefor
EP0739981A1 (en) 1995-04-25 1996-10-30 Vrije Universiteit Brussel Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes
US7060808B1 (en) 1995-06-07 2006-06-13 Imclone Systems Incorporated Humanized anti-EGF receptor monoclonal antibody
US6410690B1 (en) 1995-06-07 2002-06-25 Medarex, Inc. Therapeutic compounds comprised of anti-Fc receptor antibodies
EP0753551B1 (en) 1995-07-11 2000-02-09 E.I. Du Pont De Nemours And Company Ink set and process for alleviating bleed in printed elements
ES2176484T3 (es) 1995-08-18 2002-12-01 Morphosys Ag Bancos de proteinas/(poli)peptidos.
US6020473A (en) 1995-08-25 2000-02-01 Genentech, Inc. Nucleic acids encoding variants of vascular endothelial cell growth factor
US5989830A (en) 1995-10-16 1999-11-23 Unilever Patent Holdings Bv Bifunctional or bivalent antibody fragment analogue
US6096548A (en) 1996-03-25 2000-08-01 Maxygen, Inc. Method for directing evolution of a virus
US5664034A (en) 1996-05-21 1997-09-02 Lucent Technologies Inc. Lightwave communication monitoring switch
US5922845A (en) 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
US6013780A (en) 1996-09-06 2000-01-11 Technion Research & Development Co. Ltd. VEGF145 expression vectors
US6750044B1 (en) 1996-10-17 2004-06-15 Genentech, Inc. Variants of vascular endothelial cell growth factor having antagonistic properties, nucleic acids encoding the same and host cells comprising those nucleic acids
GB9625640D0 (en) 1996-12-10 1997-01-29 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
DE69835360T2 (de) 1997-01-17 2007-08-16 Maxygen, Inc., Redwood City EVOLUTION Prokaryotischer GANZER ZELLEN DURCH REKURSIVE SEQUENZREKOMBINATION
US6326204B1 (en) 1997-01-17 2001-12-04 Maxygen, Inc. Evolution of whole cells and organisms by recursive sequence recombination
US20030165467A1 (en) 1997-01-21 2003-09-04 Technion Research & Development Co., Ltd. Angiogenic factor and use thereof in treating cardiovascular disease
EP1712623B1 (en) 1997-01-21 2011-10-19 The General Hospital Corporation Selection of proteins using RNA-protein fusions
US6294170B1 (en) 1997-08-08 2001-09-25 Amgen Inc. Composition and method for treating inflammatory diseases
US6485942B1 (en) 1997-02-14 2002-11-26 Genentech, Inc. Variants of vascular endothelial cell growth factor having altered pharmacological properties, and recombinant methods of production
AUPO561697A0 (en) 1997-03-13 1997-04-10 Crc For Cardiac Technology Haemocompatible surfaces
IL131966A0 (en) 1997-03-18 2001-03-19 Novo Industri As An in vitro method for construction of a dna library
ATE418608T1 (de) 1997-03-18 2009-01-15 Novozymes As Methode zur herstellung einer bibliothek mittels dna-shuffling
US5948653A (en) 1997-03-21 1999-09-07 Pati; Sushma Sequence alterations using homologous recombination
US6153410A (en) 1997-03-25 2000-11-28 California Institute Of Technology Recombination of polynucleotide sequences using random or defined primers
US20020032315A1 (en) 1997-08-06 2002-03-14 Manuel Baca Anti-vegf antibodies
CA2288992C (en) 1997-04-30 2012-06-12 Enzon, Inc. Single-chain antigen-binding proteins capable of glycosylation, production and uses thereof
US20020173629A1 (en) 1997-05-05 2002-11-21 Aya Jakobovits Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
WO1998058965A2 (en) 1997-06-20 1998-12-30 Innogenetics N.V. B7-binding molecules for treating immune diseases
DE69826697T2 (de) 1997-07-07 2006-02-16 Medical Research Council In vitro selektionsmethode
WO1999005163A1 (en) 1997-07-24 1999-02-04 Medical Research Council Refolding method using a foldase and a chaperone
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
EP1027439B1 (en) 1997-10-27 2010-03-17 Bac Ip B.V. Multivalent antigen-binding proteins
US6399383B1 (en) 1997-10-28 2002-06-04 Maxygen, Inc. Human papilloma virus vectors
WO1999023107A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Maxygen, Incorporated Modification of virus tropism and host range by viral genome shuffling
DK2270234T3 (da) 1997-12-08 2013-06-03 California Inst Of Techn Fremgangsmåde til fremstilling af polynukleotid- og polypeptidsekvenser
US6777534B1 (en) 1997-12-09 2004-08-17 Children's Medical Center Corporation Peptide antagonists of vascular endothelial growth factor
AU2719099A (en) 1998-01-23 1999-08-09 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Multipurpose antibody derivatives
EP1056842A2 (en) 1998-02-11 2000-12-06 Maxygen, Inc. Genetic vaccine vector engineering
JP2002507393A (ja) 1998-02-11 2002-03-12 マキシジェン， インコーポレイテッド 抗原ライブラリー免疫
AUPP221098A0 (en) 1998-03-06 1998-04-02 Diatech Pty Ltd V-like domain binding molecules
US20020192211A1 (en) 1998-03-17 2002-12-19 Hudziak Robert M. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
US20030224001A1 (en) 1998-03-19 2003-12-04 Goldstein Neil I. Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth of tumors
ZA200007412B (en) 1998-05-15 2002-03-12 Imclone Systems Inc Treatment of human tumors with radiation and inhibitors of growth factor receptor tyrosine kinases.
US20030175271A1 (en) 1998-05-20 2003-09-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. VEGF activity inhibitor
CN1308683A (zh) 1998-06-29 2001-08-15 菲洛斯公司 用于产生高多样性文库的方法
US20020172678A1 (en) 2000-06-23 2002-11-21 Napoleone Ferrara EG-VEGF nucleic acids and polypeptides and methods of use
US7264801B2 (en) 1998-08-11 2007-09-04 Genentech, Inc. EG-VEGF nucleic acids and polypeptides and method of use
FR2782323B1 (fr) 1998-08-12 2002-01-11 Proteus Procede de production in vitro de sequences polynucleotidiques recombinees, banques de sequences et sequences ainsi obtenues
PT1115874E (pt) 1998-09-24 2009-04-09 Pharmacia & Upjohn Co Llc Secretase da doença de alzheimer
KR20010085850A (ko) 1998-09-29 2001-09-07 추후제출 코돈 변형 유전자의 재편성
US7488590B2 (en) 1998-10-23 2009-02-10 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
EP1002861A1 (en) 1998-10-26 2000-05-24 Unilever Plc Antigen-binding proteins comprising a linker which confers restricted conformational flexibility
IL127127A0 (en) 1998-11-18 1999-09-22 Peptor Ltd Small functional units of antibody heavy chain variable regions
IL143238A0 (en) 1998-12-02 2002-04-21 Phylos Inc Dna-protein fusions and uses thereof
US7115396B2 (en) 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
JP4731016B2 (ja) 1998-12-22 2011-07-20 ジェネンテック， インコーポレイテッド 血管内皮細胞増殖因子アンタゴニストとその用途
GB9900298D0 (en) 1999-01-07 1999-02-24 Medical Res Council Optical sorting method
US6436675B1 (en) 1999-09-28 2002-08-20 Maxygen, Inc. Use of codon-varied oligonucleotide synthesis for synthetic shuffling
WO2000042559A1 (en) 1999-01-18 2000-07-20 Maxygen, Inc. Methods of populating data structures for use in evolutionary simulations
IL138002A0 (en) 1999-01-19 2001-10-31 Maxygen Inc Methods for making character strings, polynucleotides and polypeptides having desired characteristics
WO2000060070A1 (en) 1999-04-01 2000-10-12 Innogenetics N.V. A polypeptide structure for use as a scaffold
SE9901379D0 (sv) 1999-04-19 1999-04-19 Pharmacia & Upjohn Ab Receptor structures
NZ514918A (en) 1999-04-28 2003-11-28 Univ Texas Compositions and methods for cancer treatment by selectively inhibiting VEGF
US6703020B1 (en) 1999-04-28 2004-03-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibody conjugate methods for selectively inhibiting VEGF
US7049410B2 (en) 1999-05-14 2006-05-23 Majumdar Adhip P N Antibodies to a novel EGF-receptor related protein (ERRP)
IL146480A0 (en) 1999-05-14 2002-07-25 Imclone Systems Inc Treatment of refractory human tumors with epidermal growth factor receptor antagonists
CA2372198A1 (en) 1999-05-14 2000-11-23 Medical Research Council Protein scaffold and its use to multimerise monomeric polypeptides
CA2373822A1 (en) 1999-05-20 2000-11-30 Scios Inc. Vascular endothelial growth factor variants
US6849425B1 (en) 1999-10-14 2005-02-01 Ixsys, Inc. Methods of optimizing antibody variable region binding affinity
US7608681B2 (en) 1999-12-24 2009-10-27 Genentech, Inc. Methods and compositions for prolonging elimination half-times of bioactive compounds
WO2001058953A2 (en) 2000-02-11 2001-08-16 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Identification of a domain in the tumor necrosis factor receptor family that mediates pre-ligand receptor assembly and function
JP4981229B2 (ja) 2000-02-25 2012-07-18 ルードヴィッヒ インスティテュート フォー キャンサー リサーチ ハイブリッド血管内皮成長因子ＤＮＡｓおよびタンパク質に関与する物質および方法
WO2001072829A2 (en) 2000-03-31 2001-10-04 Institut Pasteur Peptides blocking vascular endothelial growth factor (vegf)-mediated angiogenesis, polynucleotides encoding said peptides and methods of use thereof
PL357939A1 (en) 2000-04-11 2004-08-09 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
US20030166524A1 (en) 2000-05-22 2003-09-04 John Ford Therapeutic uses of IL-1 receptor antagonist
US20020103345A1 (en) 2000-05-24 2002-08-01 Zhenping Zhu Bispecific immunoglobulin-like antigen binding proteins and method of production
GB0013810D0 (en) 2000-06-06 2000-07-26 Celltech Chiroscience Ltd Biological products
EP2042518A3 (en) 2000-06-29 2009-04-08 Abbott Laboratories Dual specificity antibodies and methods of making and using
DE10038624C2 (de) 2000-08-03 2002-11-21 Broekelmann Aluminium F W Wärmeübertragungsrohr mit gedrallten Innenrippen
JP2004529610A (ja) 2000-10-13 2004-09-30 ユーエイビー リサーチ ファンデーション ヒト抗上皮増殖因子受容体一本鎖抗体
CZ308214B6 (cs) 2000-12-07 2020-03-04 Eli Lilly And Company GLP-1 fúzní proteiny
WO2002051870A2 (en) 2000-12-22 2002-07-04 GRAD, Carole Legal Representative of KAPLAN, Howard Phage display libraries of human vh fragments
US7054297B1 (en) 2000-12-28 2006-05-30 Cisco Technology, Inc. Distribution of packets to high data rate communications devices using multicast protocols
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
WO2002072141A2 (en) 2001-03-09 2002-09-19 William Herman Targeted ligands
CN1294148C (zh) 2001-04-11 2007-01-10 中国科学院遗传与发育生物学研究所 环状单链三特异抗体
US7667004B2 (en) 2001-04-17 2010-02-23 Abmaxis, Inc. Humanized antibodies against vascular endothelial growth factor
DK1390535T3 (da) 2001-04-26 2010-12-06 Amgen Mountain View Inc Kombinatoriske biblioteker af monomer-domæner
US20050089932A1 (en) 2001-04-26 2005-04-28 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US20050053973A1 (en) 2001-04-26 2005-03-10 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US20050048512A1 (en) 2001-04-26 2005-03-03 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
US20040175756A1 (en) 2001-04-26 2004-09-09 Avidia Research Institute Methods for using combinatorial libraries of monomer domains
KR20040029975A (ko) 2001-05-08 2004-04-08 메르크 파텐트 게엠베하 항-ｅｇｆｒ 항체 및 항호르몬제를 이용한 병용 요법
KR20090125840A (ko) 2001-06-13 2009-12-07 젠맵 에이/에스 표피 성장 인자 수용체 (ｅｇｆｒ)에 대한 인간 모노클로날 항체
US20060073141A1 (en) 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
DK1399484T3 (da) 2001-06-28 2010-11-08 Domantis Ltd Dobbelt-specifik ligand og anvendelse af denne
US20050271663A1 (en) 2001-06-28 2005-12-08 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
WO2004058821A2 (en) 2002-12-27 2004-07-15 Domantis Limited Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand
EP1421113A4 (en) 2001-08-03 2005-04-13 Commw Scient Ind Res Org SCREENING METHODS BASED ON CRYSTALLINE EGF RECEPTOR STRUCTURE
MXPA04002751A (es) 2001-09-24 2005-09-08 Univ Oregon Health & Science Modificacion del comportamiento de alimentacion.
KR20050036875A (ko) 2001-10-15 2005-04-20 이뮤노메딕스, 인코오포레이티드 직접 표적형의 결합 단백질
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
AU2002349228B2 (en) 2001-11-30 2007-06-14 National Research Council Of Canada Self-assembly molecules
DE10163459A1 (de) 2001-12-21 2003-07-03 Merck Patent Gmbh Lyophilisierte Zubereitung enthaltend Antikörper gegen EGF-Rezeptor
AU2003201998C1 (en) 2002-01-10 2012-10-25 Imperial Innovations Limited Modification of feeding behavior
EP1487879B1 (en) 2002-03-01 2012-12-26 Immunomedics, Inc. Bispecific antibody point mutations for enhancing rate of clearance
WO2004001064A2 (en) 2002-06-21 2003-12-31 Dyax Corporation Serum protein-associated target-specific ligands and identification method therefor
US7696320B2 (en) * 2004-08-24 2010-04-13 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor
NZ605429A (en) 2002-09-06 2014-08-29 Amgen Inc Therapeutic human anti-il-1r1 monoclonal antibody
TW200501960A (en) 2002-10-02 2005-01-16 Bristol Myers Squibb Co Synergistic kits and compositions for treating cancer
ES2533963T3 (es) 2002-10-10 2015-04-16 Merck Patent Gmbh Composiciones farmacéuticas dirigidas a receptores Erb-B1
EP3299393A1 (en) 2002-11-08 2018-03-28 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against tumour necrosis factor-alpha and uses therefor
RU2357974C2 (ru) 2003-01-10 2009-06-10 Аблинкс Н.В. Терапевтические полипептиды, их гомологи, их фрагменты и их применение для модуляции агрегации, опосредованной тромбоцитами
WO2004070010A2 (en) 2003-02-01 2004-08-19 Tanox, Inc. A method for generating high affinity antibodies
US20050043233A1 (en) 2003-04-29 2005-02-24 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combinations for the treatment of diseases involving cell proliferation, migration or apoptosis of myeloma cells or angiogenesis
EP2357237A1 (en) 2003-05-14 2011-08-17 Domantis Limited A process for recovering polypeptides that unfold reversibly from a polypeptide repertoire
RS20150135A1 (en) 2003-05-30 2015-08-31 Genentech Inc. TREATMENT WITH ANTI-VEGF ANTIBODIES
EP1631317A2 (en) 2003-06-06 2006-03-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of vegf inhibitors for tumor regression
CN104059147A (zh) 2003-06-27 2014-09-24 艾默根佛蒙特有限公司 针对表皮生长因子受体的缺失突变体的抗体及其使用
ATE414106T1 (de) 2003-06-30 2008-11-15 Domantis Ltd Pegylierte single-domain-antikörper (dab)
AR046510A1 (es) 2003-07-25 2005-12-14 Regeneron Pharma Composicion de un antagonista de vegf y un agente anti-proliferativo
WO2005044853A2 (en) 2003-11-01 2005-05-19 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
US20050196340A1 (en) 2003-08-06 2005-09-08 Jocelyn Holash Use of a VEGF antagonist in combination with radiation therapy
EP1651663B1 (en) 2003-08-08 2017-05-17 Immunomedics, Inc. Bispecific antibodies for inducing apoptosis of tumor and diseased cells
US20050164301A1 (en) 2003-10-24 2005-07-28 Avidia Research Institute LDL receptor class A and EGF domain monomers and multimers
ATE485307T1 (de) 2003-11-07 2010-11-15 Ablynx Nv Camelidae schwere ketten antikörper vhhs gegen epidermalen wachstumfaktor rezeptor (egfr) und ihre verwendung
US20050226863A1 (en) 2003-11-20 2005-10-13 Massachusetts Institute Of Technology Single-domain antibodies and uses thereof
ATE504599T1 (de) 2004-01-16 2011-04-15 Regeneron Pharma Zur aktivierung von rezeptoren fähige fusionspolypeptide
US7767792B2 (en) 2004-02-20 2010-08-03 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Antibodies to EGF receptor epitope peptides
MX2007000105A (es) 2004-07-06 2007-07-18 Bioren Inc Mutagenesis look-through para crear polipeptidos alterados con propiedades mejoradas.
US7180370B2 (en) 2004-09-01 2007-02-20 Micron Technology, Inc. CMOS amplifiers with frequency compensating capacitors
CN101724071A (zh) 2004-10-08 2010-06-09 杜门蒂斯有限公司 抗肿瘤坏死因子受体1的单域抗体及其使用方法
KR20070094909A (ko) * 2004-12-02 2007-09-27 도만티스 리미티드 혈청 알부민 및 ｇｌｐ-1 또는 ｐｙｙ를 표적으로 삼는이중특이성 도메인을 갖는 항체
MX2007006593A (es) * 2004-12-02 2008-03-04 Domantis Ltd Anticuerpos de dominio simple anti-il 1r1 y sus usos terapeuticos.
PL1888641T3 (pl) 2005-05-18 2012-05-31 Ablynx Nv Białka wiążące albuminę surowicy
KR20080077261A (ko) * 2005-12-06 2008-08-21 도만티스 리미티드 Ｅｇｆｒ 및/또는 ｖｅｇｆ에 대해 결합 특이성이 있는리간드 및 그의 사용 방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004003019A2 (en) * 2002-06-28 2004-01-08 Domantis Limited Immunoglobin single variant antigen-binding domains and dual-specific constructs
WO2005118642A2 (en) * 2004-06-01 2005-12-15 Domantis Limited Bispecific fusion antibodies with enhanced serum half-life
WO2006059110A2 (en) * 2004-12-02 2006-06-08 Domantis Limited Plad domain peptides with increased serum half life due to conjugation to domain antibodies
WO2008052933A2 (en) * 2006-10-30 2008-05-08 Domantis Limited Prevention of aggregation of immunoglobulin light or heavy chains

Also Published As

Publication number Publication date
EP2139918B1 (en) 2017-04-19
US20090259026A1 (en) 2009-10-15
EA200900955A1 (ru) 2010-04-30
EP2559702A1 (en) 2013-02-20
AU2008212682A1 (en) 2008-08-14
WO2008096158A8 (en) 2009-10-15
JP2010518062A (ja) 2010-05-27
JP5562650B2 (ja) 2014-07-30
WO2008096158A2 (en) 2008-08-14
EP2559704A1 (en) 2013-02-20
BRPI0807480A2 (pt) 2014-05-06
EP2559703A1 (en) 2013-02-20
ES2629333T3 (es) 2017-08-08
SG185869A1 (en) 2012-12-28
EP2139918A2 (en) 2010-01-06
CL2008000423A1 (es) 2008-10-24
CA2677069A1 (en) 2008-08-14
US20170145080A1 (en) 2017-05-25
EA020464B9 (ru) 2015-10-30
AR065260A1 (es) 2009-05-27
TW200848427A (en) 2008-12-16
CN101965364A (zh) 2011-02-02
AU2008212682B2 (en) 2013-09-26
WO2008096158A3 (en) 2008-12-18
KR20090114445A (ko) 2009-11-03
KR20150014995A (ko) 2015-02-09
EP2559702B1 (en) 2017-04-19
ES2629353T3 (es) 2017-08-08
JP2014193869A (ja) 2014-10-09
MX2009008490A (es) 2010-01-15
US9321832B2 (en) 2016-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA020464B1 (ru) Отдельные вариабельные домены антител против сывороточного альбумина
JP7252278B2 (ja) 活性化可能な結合ポリペプチドおよびその同定方法ならびに使用
US10781249B2 (en) Anti-GPC3 antibody
JP6678627B2 (ja) 治療的低密度リポタンパク質関連タンパク質６（ｌｒｐ６）多価抗体の組成物および使用方法
EP3604337A1 (en) B7-h3 antibody, antigen-binding fragment thereof and medical use thereof
EA022759B1 (ru) Связывающие элементы для пептида c5a с высоким ингибирующим действием
EA027071B1 (ru) АНТИТЕЛО К ActRIIB И СОДЕРЖАЩАЯ ЕГО КОМПОЗИЦИЯ
JP7373650B2 (ja) 抗ｐｄ－ｌ１シングルドメイン抗体
CN101654483A (zh) 产生嵌合异源多聚体的组合物和方法
KR20210050535A (ko) 항-bcma 단일 도메인 항체 및 그 적용
EA028178B1 (ru) Улучшенные связывающие сывороточный альбумин варианты
Lu et al. Frontier of therapeutic antibody discovery: The challenges and how to face them
JP7430924B2 (ja) 拮抗的抗原結合タンパク質
Eshghi et al. An extracellular Leptospira interrogans leucine‐rich repeat protein binds human E‐and VE‐cadherins
CN108148135A (zh) 抗vegf抗体
WO2020108463A1 (zh) 人源化抗人ox40单克隆抗体及其制备方法和用途
CN108285484A (zh) 抗vegf抗体
EP2928915A1 (en) Fgf-10 complexes
CN108064308A (zh) 细菌中产生双链蛋白的方法
AU2018203095A1 (en) Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
Ferguson et al. Use of Epivolve phage display to generate a monoclonal antibody with opsonic activity directed against a subdominant epitope on extracellular loop 4 of Treponema pallidum BamA (TP0326)
Jo et al. Escherichia coli inner membrane display system for high‐throughput screening of dimeric proteins
Miyazaki et al. Application of peptide barcoding to obtain high-affinity anti-PD-1 nanobodies
Mehta Investigation of VISTA as a Cancer Immune Checkpoint Via Structural Analysis and Therapeutic Antibody Development
Remy et al. Design and selection of anti-PD-L1 single-domain antibody and tumor necrosis factor superfamily ligands for an optimal vectorization in an oncolytic virus

Legal Events

Date Code Title Description
TH4A Publication of the corrected specification to eurasian patent
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU