KR20090114445A - 혈청 알부민에 대한 항체 단일 가변 도메인 - Google Patents

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KR20090114445A
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자스퍼 클루베
루시 홀트
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Abstract

본 발명은 제1 결합 특이성을 갖는 제1 면역글로불린 가변 도메인 및 제2 결합 특이성을 갖는 상보적이거나 비상보적인 면역글로불린 가변 도메인을 포함하는 이중-특이적 리간드를 제공한다.

Description

혈청 알부민에 대한 항체 단일 가변 도메인{ANTIBODY SINGLE VARIABLE DOMAINS AGAINST SERUM ALBUMIN}
관련 출원
본 출원은 2002년 6월 28일 출원된 PCT/GB02/03014호 및 2002년 12월 27일 출원된 영국 출원 GB 0230202.4호의 우선권을 주장하는 2003년 6월 30일 출원된 국제 출원 PCT/GB2003/002804호의 계속 출원인 2004년 12월 28일 출원된 미국 출원 11/023,959의 일부 계속 출원이며, 이들의 내용은 본원에 참조로서 포함된다. 본 출원은 또한 2004년 6월 1일 출원된 미국 60/576,271호 및 2004년 12월 2일 출원된 미국 60/632361호의 이익을 주장하는 2005년 5월 31일 출원된 WO2005118642호의 일부 계속 출원이며, 이들의 내용은 본원에 참조로서 포함된다. 본 출원은 또한 2007년 2월 8일 출원된 미국 11/704,832호의 우선권을 주장한다.
본 발명은 이중 특이적 리간드에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 제1 항원 또는 에피토프에 결합되는 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 제2 항원 또는 에피토프에 결합되는 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 이중-특이적 리간드를 제조하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 제1 및 제2 항원 또는 에피토프 중 하나 이상에 대한 결합이 생체내 리간드의 반감기를 증가시키도록 기능하는 이중-특이적 리간드에 관한 것이다. 하나를 초과하는 결합 특이성 을 포함하는 개방 및 폐쇄 형태의 리간드가 개시된다.
항체의 항원 결합 도메인은 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL: Vκ 또는 Vλ일 수 있다)의 두 분리된 영역을 포함한다. 항원 결합 부위 자체는 6개의 폴리펩티드 루프(loop)로 형성된다: VH 도메인으로부터 3개 (H1, H2 및 H3) 및 VL 도메인으로부터 3개 (L1, L2 및 L3). VH 및 VL 도메인을 엔코딩하는 V 유전자의 다양한 1차 레퍼토리는 유전자 세그먼트의 조합 재배열에 의해 생성된다. VH 유전자는 3개의 유전자 세그먼트인 VH, D 및 JH의 재조합에 의해 생성된다. 인간에는 일배체형에 따라서 대략 51개의 기능성 VH 세그먼트 (Cook and Tomlinson (1995) Immunol Today, 16: 237), 25개의 기능성 D 세그먼트 (Corbett et al . (1997) J. Mol . Biol, 268: 69) 및 6개의 기능성 JH 세그먼트 (Ravetch et al . (1981) Cell, 27: 583)가 존재한다. VH 세그먼트는 VH 도메인의 제1 및 제2 항원 결합 루프를 형성하는 (H1 및 H2) 폴리펩티드 사슬의 영역을 엔코딩하는 한편, VH, D, JH 세그먼트는 조합되어 VH 도메인의 제3 항원 결합 루프를 형성한다 (H3). VL 유전자는 단 두 개의 유전자 세그먼트인 VL 및 JL의 재조합에 의해 생성된다. 인간에는 일배체형에 따라서 대략 40개의 기능성 Vκ 세그먼트 (Schable and Zachau (1993) Biol . Chem . Hoppe - Seyler, 374: 1001), 31개의 기능성 Vλ 세그먼트 (Williams et al . (1996) J. Mol . Biol, 264: 220; Kawasaki et al. (1997) Genome Res., 7: 250), 5개의 기능성 Jκ 세그먼트 (Hieter et al . (1982) J. Biol . Chem., 257: 1516) 및 4개의 기능성 Jλ 세그먼트 (Vasicek and Leder (1990) J. Exp . Med., 172: 609)가 존재한다. VL 세그먼트는 VL 도메인의 제1 및 제2 항원 결합 루프를 형성하는 (L1 및 L2) 폴리펩티드 사슬의 영역을 엔코딩하는 한편, VL 및 JL 세그먼트는 조합되어 VL 도메인의 제3 항원 결합 루프를 형성한다 (L3). 이러한 1차 레퍼토리에서 선택된 항체는 적어도 보통의 친화력으로 거의 모든 항원에 결합되기에 충분히 다양한 것으로 여겨진다. 고 친화력 항체는 재배열된 유전자의 "친화력 성숙"에 의해 생성되며, 여기서 점 돌연변이가 개선된 결합에 기초하여 면역계에 의해 생성되고 선택된다.
항체의 구조 및 서열 분석은 6개의 항원 결합 루프 중 5개가 (H1, H2, L1, L2, L3) 제한된 수의 주요-사슬 형태 또는 표준 구조를 소유함을 나타내었다 (Chothia and Lesk (1987) J. Mol . Biol, 196: 901; Chothia et al . (1989) Nature, 342: 877). 주요-사슬 형태는 항원 결합 루프 및 항체 프레임워크의 특정 중요한 위치에서 (i) 항원 결합 루프의 길이, 및 (ii) 특정 잔기, 또는 잔기의 유형에 의해 결정된다. 루프 길이 및 중요한 잔기의 분석으로 우리는 대부분의 인간 항체 서열에 의해 엔코딩된 H1, H2, L1, L2 및 L3의 주요-사슬 형태를 예상할 수 있었다 (Chothia et al . (1992) J. Mol . Biol, 227: 799; Tomlinson et al . (1995) EMBO J., 14: 4628; Williams et al . (1996) J. Mol . Biol, 264: 220). H3 영역이 서열, 길이 및 구조에 있어서 훨씬 더 다양하나 (D 세그먼트의 사용으로 인해), 이것도 루프 및 항체 프레임워크의 중요한 위치에서 특정 잔기의 길이 및 존재, 또는 잔기의 유형에 의존적으로 짧은 루프 길이에 대해 제한된 수의 주요-사슬 형태를 형성한다 (Martin et al . (1996) J. Mol . Biol, 263: 800; Shirai et al. (1996) FEBS Letters, 399: 1).
VH 및 VL 영역의 상보적인 쌍을 포함하는 2특이적 항체가 당 분야에 공지되어 있다. 이러한 2특이적 항체는 2쌍의 VH 및 VL을 포함하여야 하고, 각각의 VH/VL 쌍은 단일 항원 또는 에피토프에 결합된다. 개시된 방법은 하이브리드 하이브리도마 (Milstein & Cuello AC, Nature, 305:537-40), 미니보디(minibodies) (Hu et al., (1996) Cancer Res 56:3055-3061;), 디아보디(diabodies) (Holliger et al ., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448; WO 94/13804), 킬레이팅 재조합 항체 (CRAbs; (Neri et al ., (1995) J. Mol. Biol. 246, 367-373), biscFv (예컨대, Atwell et al ., (1996) Mol. Immunol. 33, 1301-1312), "놉 인 홀스(nobs in holes)" 안정화된 항체 (Carter et al ., (1997) Protein Sci. 6, 781-788)를 포함한다. 각 경우에, 각각의 항체 종은 두 항원-결합 부위를 포함하는데, 각각은 VH 및 VL 도메인의 상보적인 쌍에 의해 형성된다. 이에 의해 각 항체는 두 상이한 항원 또는 에피토프에 동시에 결합될 수 있으며, 각 항원 또는 에피토프에 대한 결합 은 VH 및 이의 상보적인 VL 도메인에 의해 매개된다. 이러한 기술들은 각각 특수한 단점들을 보인다; 예를 들어, 하이브리드 하이브리도마의 경우, 비활성 VH/VL 쌍은 2특이적 IgG의 분획을 크게 감소시킬 수 있다. 더욱이, 대부분의 2특이적 접근법은 두 상이한 VH/VL 결합 부위를 재현하기 위해 상이한 VH/VL 쌍의 결합(association) 또는 VH 및 VL 사슬의 결합에 의존한다. 따라서, 어셈블링된 분자에서 각 항원 또는 에피토프에 대한 결합 부위의 비율을 조절할 수 없으므로 많은 어셈블링된 분자가 다른 하나가 아닌 하나의 항원 또는 에피토프에 결합될 것이다. 몇몇 경우에, 서브-유닛 계면에서 중쇄 또는 경쇄를 공학처리하는 것이 가능하여 (Carter et al., 1997) 두 항원 또는 에피토프 모두에 대한 결합 부위를 지니는 분자의 수를 향상시킬 수 있었으나 이것은 결코 모든 분자가 두 항원 또는 에피토프 모두에 결합되게 하지 않는다.
두 상이한 항체 결합 특이성이 동일한 결합 부위에 포함될 수 있으나, 이것은 일반적으로 구조적으로 관련된 항원 또는 에피토프 또는 광범하게 교차-반응성인 항체에 상응하는 둘 이상의 특이성을 나타내는 것이라는 일부 증거가 있다. 예를 들어, 일반적으로 두 세그먼트가 서열 및 구조에 있어서 관련이 있는 교차-반응성 항체가 개시되었고, 예컨대 계란의 난백 리소자임 및 칠면조 리소자임 (McCafferty et al., WO 92/01047) 또는 유리 합텐 및 담체에 컨주게이션된 합텐 (Griffiths AD et al. EMBO J 1994 13:14 3245-60)이 있다. 추가 예에서, WO 02/02773호 (Abbott Laboratories)는 "이중 특이성"을 지닌 항체 분자를 기술한다. 언급된 항체 분자는 이들의 특이성이 단일 항원을 초과하여 확장되도록 다중 항원에 대해 생성되거나 선택된다. WO 02/02773호의 항체에 있는 각각의 상보적인 VH/VL 쌍은 둘 이상의 구조적으로 관련된 항원에 대해 단 하나의 결합 특이성을 조건으로서 지정하며; 이러한 상보적인 쌍의 VH 및 VL 도메인은 분리된 특이성을 각각 소유하지 않는다. 따라서, 항체는 구조적으로 관련된 두 항원을 포함하는 광범한 단일 특이성을 지닌다. 더욱이, 천연의 자가항체는 구조적으로 관련되지 않은 적어도 2개의 (일반적으로 더 많은) 상이한 항원 또는 에피토프와 반응하는, 다작용성 (Casali & Notkins, Ann. Rev. Immunol. 7, 515-531)인 것으로 기술되었다. 모노클로날 항체에 대한 파지 디스플레이 기술을 이용한 랜덤 펩티드 레퍼토리의 선택은 항원 결합 부위에 맞는 범위의 펩티드 서열을 동정하는 것으로 밝혀졌다. 서열의 일부는 매우 관련이 있어서 일치(consensus) 서열에 꼭 맞는 한편, 그 외는 매우 상이하여 미모토프 (mimotopes)로 명명되었다 (Lane & Stephen, Current Opinion in Immunology, 1993, 5, 268-271). 따라서, 결합되고 상보적인 VH 및 VL 도메인을 포함하는 천연의 4-사슬 항체가 대량의 공지된 항원으로부터의 수많은 상이한 항원에 결합될 가능성을 지님이 명백하다. 동일한 항체에서, 특히 필수적으로 구조적 관련성이 없는 두 개의 주어진 항원에 대한 결합 부위를 어떻게 생성시키는지는 그다지 명백하지 않다.
이와 관계가 있을 수 있는 단백질 공학처리 방법이 제안되었다. 예를 들어, 촉매 항체가 하나의 가변 도메인을 통해 금속 이온에 대해, 그리고 금속 이온 및 상보적인 가변 도메인과의 접촉을 통해 합텐 (기질)에 대해 결합 활성을 지니도록 생성될 수 있음이 제안되었다 (Barbas et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci USA 90, 6385-6389). 그러나, 이 경우에, 기질 (제1 항원)의 결합 및 촉매현상은 금속 이온 (제2 항원)의 결합을 필요로 한다고 제안된다. 따라서, VH/VL 쌍에 대한 결합은 다중-성분 항원이 아닌 단일 성분 항원과 관련된다.
하나의 항원에 대한 결합 접촉이 한 가변 도메인에서 생성되고 두 번째 항원에 대해 두 번째 가변 도메인에서 생성되는 낙타 항체 중쇄 단일 도메인들로부터 2특이적 항체를 생성하기 위한 방법이 기술되었다.
그러나, 가변 도메인은 상보적이지 않았다. 따라서, 제1 중쇄 가변 도메인을 제1 항원에 대해 선택하고, 제2 중쇄 가변 도메인을 제2 항원에 대해 선택한 다음, 두 도메인을 동일한 사슬 위에서 함께 결합시켜 2특이적 항체 단편을 생성하였다 (Conrath et al., J. Biol. Chem. 270, 27589- 27594). 그러나, 낙타 중쇄 단일 도메인은 이들이 경쇄를 지니지 않는 천연 낙타 항체로부터 유래된다는 점에서 보통과 다르며, 실제로 중쇄 단일 도메인은 낙타 경쇄와 결합되어 상보적인 VH 및 VL 쌍을 형성할 수 없다.
보통은 경쇄 (모노클로날 항체 또는 도메인의 레퍼토리로부터; 참조 EP-A-0368684)와 결합된 천연 항체로부터 유래된 단일 중쇄 가변 도메인도 기술되었다. 이러한 중쇄 가변 도메인은 하나 이상의 관련 항원과 특이적으로 상호작용하나, 둘 이상의 상이한 항원에 대해 특이성을 지니는 리간드를 생성하기 위해 다른 중쇄 또 는 경쇄 가변 도메인과 조합되지 않는 것으로 나타났다. 게다가, 이러한 단일 도메인은 매우 짧은 생체내 반감기를 지니는 것으로 나타났다. 따라서, 이러한 도메인은 제한된 치료적 가치를 지닌다.
상이한 특이성의 중쇄 가변 도메인들을 함께 결합시킴에 의해 (상기 개시됨) 2특이적 항체 단편을 제조하는 것이 제안되었다. 이러한 접근법의 단점은 단리된 항체 가변 도메인이 보통은 경쇄와 상호작용하고 용매에 노출되는 소수성 계면을 지닐 수 있고 이것은 단일 도메인이 소수성 표면에 결합되게 하는 "점착성(sticky)"일 수 있다는 것이다. 더욱이, 파트너 경쇄의 부재하에 둘 이상의 상이한 중쇄 가변 도메인 및 이들의 결합물의 조합은, 아마도 이들의 소수성 계면을 통해, 단리 시에 결합될 수 있는 리간드 둘 모두는 아니더라도 하나에 대한 결합을 방해할 수 있다. 더욱이, 이 경우에, 중쇄 가변 도메인이 상보적인 경쇄 가변 도메인에 결합되지 않아서 덜 안정하고 용이하게 폴딩되지 않을 수 있다 (Worn & Pluckthun, 1998 Biochemistry 37, 13120-7).
발명의 개요
본 발명자들은 공동계류중인 국제 특허 출원 WO 03/002609호 및 공동계류중인 미공개된 UK 특허 출원 0230203.2호에서, 각각이 상이한 특이성을 갖는 면역글로불린 단일 가변 도메인들을 포함하는 이중 특이적 면역글로불린 리간드를 기술하였다. 도메인들은 서로 경쟁적으로 또는 독립적으로 표적 분자 상의 항원 또는 에피토프에 결합하도록 작용할 수 있다.
첫 번째 구성에서, 본 발명은 본 발명자들에 의해 개발된 이중 특이적 리간드에 있어서 추가의 개선점을 제공하며, 여기서 리간드의 일 특이성은 유기체의 생체내에 존재하는 단백질 또는 폴리펩티드에 관한 것인데 이들은 리간드에 결합됨에 의해 리간드의 반감기를 증가시키도록 기능할 수 있다.
따라서, 첫 번째 양태에서, 제1 항원 또는 에피토프에 대해 결합 특이성을 지니는 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 제2 항원 또는 에피토프에 대해 결합 활성을 지니는 제2의 상보적인 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 이중-특이적 리간드가 제공되며, 여기서 상기 항원 또는 에피토프들 중 하나 또는 둘 모두는 리간드의 생체내 반감기를 증가시키도록 기능하고, 상기 제1 및 제2 도메인에는 동일한 특이성을 공유하는 상호간에 상보적인 도메인이 결여되어 있으며, 단, 상기 이중 특이적 리간드는 항-HSA VH 도메인 및 항-β 갈락토시다제 Vκ 도메인으로 구성되지 않는다. 바람직하게는, 제1 또는 제2 가변 도메인 어느 것도 인간 혈청 알부민 (HSA)에 결합되지 않는다.
본원에 개시된 리간드의 반감기를 증가시키는 항원 또는 에피토프는 생체내 유기체에서 발견되는 단백질 또는 폴리펩티드 상에 존재하는 것이 유리하다. 예로는 세포외 매트릭스 단백질, 혈액 단백질, 및 유기체의 다양한 조직에 존재하는 단백질이 있다. 단백질은, 예를 들어 벌크제(bulking agent)로서 작용함에 의해 또는 리간드를 요망되는 작용 부위에 고정(anchoring)시킴에 의해 혈액으로부터의 리간드 청소율을 감소시키도록 기능한다. 생체내 반감기를 증가시키는 항원/에피토프의 예는 하기 부록 1에 제공된다.
증가된 반감기는 면역글로불린, 특히 항체 및 가장 특히 작은 크기의 항체 단편을 생체내 적용하는데 유용하다. 이러한 단편 (Fvs, 이황화 결합된 Fvs, Fabs, scFvs, dAbs)은 신체로부터의 신속한 청소를 경험하므로, 이들은 신체의 대부분에 신속하게 도달하고 생성이 빠르며 다루기가 용이한 한편, 이들의 생체내 적용은 생체내에서의 이들의 짧은 지속성에 의해 제한되어 왔다. 본 발명은 증가된 반감기의 생체내 리간드 및 결과적으로 신체에서 보다 긴 지속 시간을 갖는 기능성 활성의 리간드를 제공함에 의해 이러한 문제를 해결한다.
리간드 반감기를 약물동력학적으로 분석하고 결정하는 방법은 당업자에게 익숙할 것이다. 상세한 내용은 문헌[Kenneth , A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and in Peters et al, Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996)]에서 찾아볼 수 있다. t 알파 및 t 베타 반감기 및 곡선하 면적 (AUC)과 같은 약물동력학적 파라메터를 기술하고 있는 문헌["Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. ex edition (1982)]도 참고한다.
반감기 (t½ 알파 및 t½ 베타) 및 AUC는 시간에 대한 리간드의 혈청 농도의 곡선으로부터 결정될 수 있다. 예를 들어, 곡선을 모델링하기 위해 윈논린(WinNonlin) 분석 패키지 (Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, USA로부터 시판됨)를 이용할 수 있다. 첫 번째 상 (알파 상)에서, 리간드는 일부 제거와 함께 환자에서의 분포를 주로 진행한다. 두 번째 상 (베타 상)은 리간드가 분포되고 리간드가 환자로부터 제거됨에 따라 혈청 농도가 감소하는 말단 상이다. t 알파 반감기는 첫 번째 상의 반감이기고 t 베타는 두 번째 상의 반감기이다. 따라서, 유리하게는, 본 발명은 tα 반감기가 15분 이상인 리간드 또는 본 발명에 따른 리간드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일 구체예에서, 범위의 하한은 30분, 45분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 10시간, 11시간 또는 12시간이다. 추가로 또는 대안적으로, 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 12시간 이하 및 12시간을 포함하는 범위의 tα 반감기를 지닐 것이다. 일 구체예에서, 상기 범위의 상한은 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5시간이다. 적합한 범위의 예는 1 내지 6시간, 2 내지 5시간, 또는 3 내지 4시간이다.
유리하게는, 본 발명은 tβ 반감기가 2.5 시간 이상인 리간드 또는 본 발명에 따른 리간드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 범위의 하한은 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 10시간, 11시간 또는 12시간이다. 추가로 또는 대안적으로, 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 21시간 이하 및 21시간을 포함하는 범위의 tβ 반감기를 지닌다. 일 구체예에서, 상기 범위의 상한은 12시간, 24시간, 2일, 3일, 5일, 10일, 15일 또는 20일이다. 유리하게는, 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물이 12 내지 60시간 범위의 tβ 반감기를 지닐 것이다.
추가의 구체예에서, 이것의 범위는 12 내지 48시간일 것이다. 여전히 추가의 구체예에서, 이것의 범위는 12 내지 26시간일 것이다.
상기 기준에 추가하여 또는 대안적으로, 본 발명은 AUC 값 (곡선하 면적)이 1 mg/분/ml 이상인 리간드 또는 본 발명에 따른 리간드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 범위의 하한은 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 또는 300 mg/분/ml이다. 추가로 또는 대안적으로, 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 600 mg/분/ml 이하의 AUC를 갖는다. 일 구체예에서, 상기 범위의 상한은 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 또는 50 mg/분/ml이다. 유리하게는, 본 발명에 따른 리간드가 이로 제한되지 않는 것이 바람직하나 15 내지 150mg/분/ml, 15 내지 100 mg/분/ml, 15 내지 75 mg/분/ml, 및 15 내지 50 mg/분/ml로 구성된 군으로부터 선택된 범위의 AUC를 지닐 것이다.
첫 번째 구체예에서, 이중 특이적 리간드는 두 상보적인 가변 도메인, 즉 본 발명과 관련하여 이들이 따로따로 이들의 동족(cognate) 에피토프에 결합된다 하더라도, 이들의 천연 환경에서 동족 쌍 또는 그룹으로서 함께 작동할 수 있는 두 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 상보적인 가변 도메인은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 (VH 및 VL)일 수 있다. VH 및 VL 도메인은 scFv 또는 Fab 항체 단편에 의해 제공되는 것이 유리하다. 가변 도메인은 함께 결합되어, 예를 들어 각 V 도메인의 C-말단에 힌지 영역의 제공 및 힌지 영역에 있는 시스테인 사이에 이황화 결합의 제공; 또는 도메인의 C-말단에서 함께 이황화 결합된 시스테인을 각각 지니는 dAb의 제공; 또는 Fab 포맷을 제공하는 V-CH & V-CL의 제공; 또는 이량체, 삼량체 및 그 위의 다량체를 제공하는 펩티드 링커(예를 들어, Gly4Ser 링커가 하기 본원에서 논의된다)의 사용에 의해 다가 리간드를 형성할 수 있다.
본 발명자들은 상보적인 가변 도메인의 이용이 두 도메인 표면을 함께 패킹시켜 용매로부터 격리시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 더욱이, 상보적인 도메인은 서로를 안정화시킬 수 있다. 또한, 종래 기술에 사용된 하이브리드 하이브리도마의 단점 없이, 또는 서브-유닛 계면에서 중쇄 또는 경쇄를 공학처리할 필요 없이 이중-특이적 IgG 항체를 생성할 수 있다. 본 발명의 첫 번째 양태의 이중-특이적 리간드는 하나 이상의 VH/VL 쌍을 지닌다. 본 발명에 따른 2특이적 IgG는 따라서 Y-형상 분자의 각 아암에 한 쌍씩, 두 쌍의 그러한 쌍을 포함할 것이다. 따라서, 통상적인 2특이적 항체 또는 디아보디와 달리, 사용된 사슬의 비가 제조의 성공에 있어서 결정적인 요인이고 실제상의 어려움을 초래하는 경우에, 본 발명의 이중 특이적 리간드는 사슬 균형의 문제가 없다. 통상적인 2특이적 항체의 사슬 불균형은 두 상이한 VL 사슬과 두 상이한 VH 사슬의 결합으로부터 초래되는데, 여기서 VH 사슬 1과 함께 VL 사슬 1은 항원 또는 에피토프 1에 결합될 수 있고 VH 사슬 2와 함께 VL 사슬 2는 항원 또는 에피토프 2에 결합될 수 있으며 두 정확한 페어링(pairing)은 어떻게든 해서 또 다른 하나에 결합된다. 따라서, 단일 분자에서 VL 사슬 1이 VH 사슬 1에 페어링되고 VL 사슬 2가 VH 사슬 2에 페어링될 때에만 2특이성이 생성된다. 이러한 2특이적 분자는 상이한 두 방법으로 생성될 수 있다. 먼저, 이들은 각각 상이한 항원 또는 에피토프 (예를 들어, 2특이적 IgG에서)에 결합된 존재하는 두 VH/VL 페어링의 결합에 의해 생성될 수 있다. 이 경우에, VH/VL 페어링은 모두가 2특이적인 분자의 집단을 생성하기 위해 모두 함께 1:1 비로 결합되어야 한다. 이것은 결코 (상보적인 CH 도메인이 "놉 인투 홀스" 공학처리에 의해 향상될 때 조차도) 2특이적 분자의 혼합물 및 하나의 항원 또는 에피토프에 결합될 뿐 다른 하나에는 결합될 수 없는 분자를 초래하지 않는다. 2특이적 항체를 생성하는 두 번째 방법은 두 상이한 VL 사슬을 지니는 두 상이한 VH 사슬의 동시 결합에 의해서이다 (예를 들어, 2특이적 디아보디에서). 이 경우, VL 사슬 1이 VH 사슬 1에 페어링되고 VL 사슬 2가 VH 사슬 2에 페어링되려는 경향이 있긴 하나 (이것은 VL 및 VH 도메인의 "놉 인투 홀스" 공학처리에 의해 개선될 수 있다), 이러한 페어링이 결코 모든 분자에서 달성되지 않으며 혼합된 제형을 생성시켜 항원 또는 에피토프에 결합될 수 없는 부정확한 페어링이 발생한다.
본 발명의 첫 번째 양태에 따른 이중-특이적 리간드 접근법에 따라 구성된 2특이적 항체는 항원 또는 에피토프 1에 대한 결합이 VH 또는 VL 도메인 내에 있고 항원 또는 에피토프 2에 대한 결합이 상보적인 VL 또는 VH 도메인 내에 각각 있기 때문에 이러한 모든 문제가 해소된다. VH 및 VL 도메인이 1:1 기준으로 페어링되므로, VH/VL 도메인은 2특이적일 것이고, 따라서 이러한 VH/VL 페어링을 이용하여 구성된 모든 포맷(Fv, scFvs, Fabs, 미니보디, IgGs 등)이 100% 2특이적 활성을 지닐 것이다.
본 발명과 관련하여, 제1 및 제2 "에피토프"는 동일하지 않고 단일 1특이적 리간드에 의해 결합되지 않은 에피토프인 것으로 이해된다. 본 발명의 첫 번째 구성에서, 이들은 유리하게는 상이한 항원 상에 있고, 그 중 하나는 생체내 리간드의 반감기를 증가시키도록 기능한다. 유사하게, 제1 및 제2 항원은 동일하지 않은 것이 유리하다.
본 발명의 이중 특이적 리간드는 WO 02/02773호에 개시된 리간드를 포함하지 않는다. 따라서, 본 발명의 리간드는 임의의 하나 이상의 항원 또는 에피토프에 공동-작용가능하게 결합된 상보적인 VH/VL 쌍을 포함하지 않는다. 대신, 본 발명의 첫 번째 양태에 따른 리간드는 VH/VL 상보적인 쌍을 포함하며, 여기서 V 도메인은 상이한 특이성을 지닌다.
더욱이, 본 발명의 첫 번째 양태에 따른 리간드는 구조적으로 관련되지 않은 에피토프 또는 항원에 대해 상이한 특이성을 갖는 VH/VL 상보적인 쌍을 포함한다. 구조적으로 관련된 에피토프 또는 항원은 항원 또는 에피토프에 결합되도록 공동-작용가능한 방식으로 기능하는 통상적인 VH/VL 상보적인 쌍에 의해 결합되기에 충분한 구조적 유사성을 소유하는 에피토프 또는 항원이다: 구조적으로 관련된 에피토프의 경우에, 에피토프는 구조에 있어서 충분히 유사하여 이들은 VH/VL 이량체의 항원 결합 부위에 형성된 동일한 결합 포켓으로 "맞추어질 수 있다(fit)".
두 번째 양태에서, 본 발명은 제1 항원 또는 에피토프 결합 특이성을 갖는 제1 면역글로불린 가변 도메인 및 제2 항원 또는 에피토프 결합 특이성을 갖는 제2 면역글로불린 가변 도메인을 포함하는 리간드를 제공하며, 여기서 상기 제1 및 제2 가변 도메인 중 하나 또는 둘 모두는 생체내 리간드의 반감기를 증가시키는 항원에 결합되고, 가변 도메인은 또 다른 하나에 상보적이지 않다. 일 구체예에서, 하나의 가변 도메인에 대한 결합은 제2 가변 도메인에 대한 리간드의 결합을 조절한다.
일 구체예에서, 가변 도메인은, 예를 들어 VH 도메인의 쌍 또는 VL 도메인의 쌍일 수 있다. 첫 번째 부위에서 항원의 결합은 두 번째 부위에서의 항원의 결합을 조절, 예컨대 향상시키거나 억제할 수 있다. 예를 들어, 첫 번째 부위에서의 결합은 두 번째 부위에서의 항원의 결합을 적어도 부분적으로 억제한다. 이러한 구체예에서, 리간드는, 예를 들어 두 번째 표적 항원에 결합되어 반감기 증가 단백질로부터 분리되는 그러한 시간까지 리간드의 반감기를 증가시키는 단백질로의 결합을 통해 피검 유기체의 신체에서 생체내 유지될 수 있다.
상기 문맥에서 결합의 조절은 또 다른 하나에 대한 항원 결합 부위의 구조적 근접성의 결과로서 달성된다. 이러한 구조적 근접성은 둘 이상의 항원 결합 부위를 결합시키는 구조적 성분의 특성에 의해, 예컨대 항원 결합 부위를 근접하게 유지하는 비교적 단단한 구조를 지니는 리간드의 제공에 의해 달성될 수 있다. 유리하게는, 둘 이상의 항원 결합 부위를 또 다른 하나에 물리적으로 근접시켜 한 부위가 면역글로불린 분자 내에서 입체 장애 및/또는 형태 변화를 포함하는 공정에 의해 또 다른 부위에서의 항원의 결합을 조절하도록 한다.
제1 및 제2 항원 결합 도메인은 공유적으로 또는 비공유적으로 결합될 수 있다. 도메인이 공유적으로 결합되는 경우에, 결합은, 예를 들어 이황화 결합 또는 (Gly4Ser)n (여기서, n은 1 내지 8이고, 예컨대 2, 3, 4, 5 또는 7이다)와 같은 폴리펩티드 링커에 의해 매개될 수 있다.
본 발명에 따른 리간드는 비-면역글로불린 다중-리간드 구조에 조합되어 다가 복합체를 형성할 수 있고, 이것은 동일한 항원을 지니는 표적 분자에 결합됨으로써 우수한 결합력(avidity)을 제공하는 한편, 하나 이상의 가변 도메인은 항원에 결합되어 다량체의 반감기를 증가시킨다. 예를 들어, SpA와 같은 천연 세균 수용체를 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합되는 리간드를 생성하기 위해 CDR을 그래프팅하기 위한 스캐폴드(scaffold)로서 이용하였다. 상기 절차에 대한 상세한 설명은 US 5,831,012호에 기술된다. 다른 적합한 스캐폴드는 피브로넥틴 및 애피보디(Affibodies)™에 기초한 것들을 포함한다. 적합한 절차에 대한 상세한 설명은 WO 98/58965호에 개시되어 있다. 다른 적합한 스캐폴드는 문헌[van den Beuken et al, J. Mol. Biol. (2001) 310, 591-601]에 개시된 리포칼린 및 CTLA4, 및 WO0069907호 (Medical Research Council)에 개시된 것들과 같은 스캐폴드를 포함하며, 이들은 예를 들어 세균 GroEL 또는 다른 샤프롱(chaperone) 폴리펩티드의 고리 구조에 기초한다.
단백질 스캐폴드는 조합될 수 있다; 예를 들어 CDR은 CTLA4 스캐폴드 상으로 그래프팅되고 면역글로불린 VH 또는 VL 도메인과 함께 이용되어 리간드를 형성할 수 있다. 유사하게, 피브로넥틴, 리포칼린 및 다른 스캐폴드가 조합될 수 있다.
가변 도메인이, 예를 들어 본원에 개시된 파지 디스플레이 기술을 이용하여 선택된 V-유전자 레퍼토리로부터 선택되는 경우에, 이러한 가변 도메인은 유니버셜 프레임워크 영역을 포함할 수 있어서, 이들은 본원에 정의된 특이적 제네릭(generic) 리간드에 의해 인식될 수 있다. 유니버셜 프레임워크, 제네릭 리간드 등의 이용은 WO99/20749호에 개시되어 있다. 본 발명에서, 파지 디스플레이에 대한 언급은 파지 및/또는 파지미드 둘 모두의 이용을 포함한다.
V-유전자 레퍼토리를 이용하는 경우, 폴리펩티드 서열에서의 변이는 바람직하게는 가변 도메인의 구조적 루프 내에 위치한다. 가변 도메인의 폴리펩티드 서열은 DNA 셔플링 (shuffling) 또는 돌연변이에 의해 변경되어 각 가변 도메인과 그 상보적인 쌍의 상호작용을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, '이중-특이적 리간드'는 단쇄 Fv 단편이다. 본 발명의 대안적인 구체예에서, '이중-특이적 리간드'는 항체의 Fab 영역으로 구성된다. "Fab 영역"이라는 용어는 2개의 VH 또는 2개의 VL 도메인이 사용된 Fab-유사 영역을 포함한다.
가변 도메인은 표적 항원 또는 에피토프에 대해 유도된 항체로부터 유래될 수 있다. 대안적으로 이들은 섬유상 박테리오파지의 표면 상에서 발현된 것들과 같은 단일 항체 도메인의 레퍼토리로부터 유래될 수 있다. 선택은 하기 개시된 대로 수행될 수 있다.
세 번째 양태에서, 본 발명은 제1 결합 특이성을 갖는 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 제2 (상이한) 결합 특이성을 갖는 제2 단일 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하고, 결합 특이성 중 하나 또는 둘 모두가 생체내 리간드의 반감기를 증가시키는 항원에 특이적인 리간드를 생성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
(a) 제1 에피토프에 결합되는 능력에 의해 제1 가변 도메인을 선택하는 단계,
(b) 제2 에피토프에 결합되는 능력에 의해 제2 가변 도메인을 선택하는 단계,
(c) 가변 도메인들을 조합시키는 단계, 및
(d) 상기 제1 에피토프 및 상기 제2 에피토프에 결합되는 능력에 의해 리간드를 선택하는 단계를 포함한다.
리간드는 제1 및 제2 에피토프에 동시에 결합될 수 있거나, 에피토프 결합에 대해 결합 도메인간에 경쟁이 있는 경우, 한 도메인의 결합이 이의 동족 에피토프에 대한 또 다른 도메인의 결합을 방해할 수 있다. 일 구체예에서, 따라서, 상기 단계 (d)는 제1 및 제2 (및 가능하게는 추가의) 에피토프 둘 모두에 대한 동시 결합을 요구하며; 또 다른 구체예에서, 제1 및 제2 에피토프에 대한 결합은 동시에 일어나지 않는다.
에피토프는 별개의 항원 상에 있는 것이 바람직하다.
리간드는 유리하게는 상기 개시된 대로 면역글로불린 가변 도메인의 VH/VL 조합, 또는 VH/VH 또는 VL/VL 조합을 포함한다. 더욱이 리간드는 카멜리드(camelid) VHH 도메인을 포함할 수 있고, 단 생체내 리간드의 반감기를 증가시키는 항원에 특이적인 VHH 도메인은 계란 난백 리소자임 (HEL), 돼지 췌장 알파-아밀라제 또는 NmC-A; hcg, BSA-결합된 RR6 아조 염료 또는 에스. 뮤탄스(S. mutans) HG982 세포에 결합되지 않는다 (문헌[Conrath et al., (2001) JBC 276:7346-7350 및 WO99/23221호]에 개시됨, 이들 중 어느 것도 생체내 리간드의 반감기를 증가시키기 위해 반감기를 증가시키는 항원에 대한 특이성의 이용을 개시하고 있지 않다).
일 구체예에서, 상기 제1 가변 도메인은 상보적인 가변 도메인의 부재하에 상기 제1 에피토프에 결합되기 위해 선택된다. 추가의 구체예에서, 상기 제1 가변 도메인은 제3 가변 도메인의 존재하에 상기 제1 에피토프/항원에 결합되기 위해 선택되며, 여기서 상기 제3 가변 도메인은 상기 제2 가변 도메인과 상이하고 제1 도메인에 상보적이다. 유사하게, 제2 가변 도메인은 상보적인 가변 도메인의 부재 또는 존재하에 선택될 수 있다.
리간드의 반감기를 증가시키는 본 발명의 리간드가 표적으로 하는 항원 또는 에피토프는 혈청 알부민 표적에 제한되지 않는다. 생체내 리간드의 반감기를 증가시키는 본 발명의 리간드가 표적으로 하는 항원 또는 에피토프의 다른 예로는 하기 부록 1에 나열된 항원 및 에피토프가 있으나 바람직하게는 이로 제한되지 않는다.
반감기 향상 단백질에 추가하여, 본 발명의 리간드가 표적으로 하는 항원 또는 에피토프는 임의의 항원 또는 에피토프일 수 있으나, 유리하게는 치료적 이익을 목적으로 하는 항원 또는 에피토프이다. 본 발명은 임의의 그러한 표적, 특히 본원에서 추가로 동정된 표적에 특이적인 개방 형태, 폐쇄 형태 및 단리된 dAb 단량체 리간드를 포함하는 리간드를 제공한다. 이러한 표적은 천연 발생되거나 합성될 수 있는 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산이거나 이들의 일부일 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 리간드는 에피토프 또는 항원에 결합하여 길항제 또는 효능제로서 기능할 수 있다 (예컨대, EPO 수용체 효능제). 당업자는 그 선택의 범위가 크고 다양함을 이해할 것이다. 예를 들어, 이들은 인간 또는 동물 단백질, 시토킨, 시토킨 수용체 (시토킨 수용체는 시토킨에 대한 수용체를 포함한다), 효소, 효소에 대한 보조-인자 또는 DNA 결합 단백질일 수 있다. 적합한 시토킨 및 성장 인자로는 ApoE, Apo-SAA, BDNF, 카르디오트로핀-1, EGF, EGF 수용체, ENA-78, 에오탁신, 에오탁신-2, 엑소두스-2, EpoR, FGF-산성, FGF-염기성, 섬유모세포 성장 인자-10, FLT3 리간드, 프랙트알킨 (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-β1, 인슐린, IFN-γ, IGF-I, IGF-II, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 a.a.), IL-8 (77 a.a.), IL-9, IL-1O, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IGIF), 인히빈 α, 인히빈 β, IP-1O, 각질세포 성장 인자-2 (KGF-2), KGF, 렙틴, LIF, 림포탁틴, 뮬레리안 억제 물질, 단핵구 콜로니 억제 인자, 단핵구 유인 단백질, M-CSF, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MIG, MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, MIP-3β, MIP-4, 골수세포 선조 억제 인자-1 (MPIF-1), NAP-2, 뉴르투린, 신경 성장 인자, β-NGF, NT-3, NT-4, 온코스타틴 M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1α, SDF1β, SCF, SCGF, 줄기 세포 인자 (SCF), TARC, TGF-α, TGF-β, TGF-β2, TGF-β3, 종양 괴사 인자 (TNF), TNF-α, TNF-β, TNF 수용체 I, TNF 수용체 II, TNIL-1, TPO, VEGF, VEGF 수용체 1, VEGF 수용체 2, VEGF 수용체 3, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-β, GRO-γ, HCC1, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3 및 HER 4, CD4, 인간 케모킨 수용체 CXCR4 또는 CCR5, C형 간염 바이러스로부터의 비구조 단백질 유형 3 (NS3), TNF-알파, IgE, IFN-감마, MMP-12, CEA, 에이치. 파일로리 (H. pylori), TB, 인플루엔자, E형 간염, MMP-12, 특정 세포 상에서 과발현된 내재화 수용체, 예컨대 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 종양 세포 상의 ErBb2 수용체, 내재화 세포 수용체, LDL 수용체, FGF2 수용체, ErbB2 수용체, 트랜스페린 수용체, PDGF 수용체, VEGF 수용체, PsmAr, 세포외 매트릭스 단백질, 엘라스틴, 피블로넥틴, 라미닌, α1-항트립신, 조직 인자 프로테아제 억제제, PDKl, GSKl, Bad, 카스파제-9, 포르크헤드(Forkhead), 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori)의 항원, 미코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis)의 항원 및 인플루엔자 바이러스의 항원이 있으나 이로 제한되지 않는다. 상기 목록은 배타적인 것이 아님을 이해할 것이다.
본 발명의 일 구체예에서, 가변 도메인은 항원 또는 에피토프에 대해 유도된 개개 항체로부터 유래된다. 바람직한 구체예에서, 가변 도메인은 단일 가변 항체 도메인의 레퍼토리로부터 유래된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 적어도 본원에 정의된 이중-특이적 리간드를 엔코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 제공한다. 이중 특이적 리간드는 단일 핵산 분자 상에서 엔코딩될 수 있고; 대안적으로, 각 도메인은 별개의 핵산 분자에 의해 엔코딩될 수 있다. 리간드가 단일 핵산 분자에 의해 엔코딩되는 경우, 도메인은 scFv 분자의 방식으로 융합 폴리펩티드로서 발현될 수 있거나, 개별적으로 발현된 후, 예를 들어 화학적 결합제를 이용하여 함께 결합될 수 있다. 분리된 핵산으로부터 발현된 리간드는 적합한 수단에 의해 함께 결합될 것이다.
핵산은 발현시 숙주 세포로부터의 폴리펩티드의 수송을 위한 시그널 서열을 추가로 엔코딩할 수 있고 발현시 섬유상 박테리오파지 입자 (또는 선택 디스플레이 시스템의 다른 성분)의 표면 성분에 융합될 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 이중 특이적 리간드를 엔코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
여전히 추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 이중 특이적 리간드를 엔코딩하는 벡터로 트랜스펙션된(transfected) 숙주 세포를 제공한다.
이러한 벡터로부터의 발현은, 예를 들어 박테리오파지 입자의 표면 상에서 선택을 위해 가변 도메인을 생성하도록 구성될 수 있다. 이것은 디스플레이된 가변 도메인을 선택함으로써 본 발명의 방법을 이용한 '이중-특이적 리간드'의 선택을 가능하게 한다.
본 발명은 적어도 본 발명에 따른 이중-특이적 리간드를 포함하는 키트를 추가로 제공한다.
본 발명에 따른 이중-특이적 리간드는 바람직하게는 중쇄 및 경쇄 도메인의 조합을 포함한다. 예를 들어, 이중 특이적 리간드는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함할 수 있고, 이들은 scFv의 형태로 함께 결합될 수 있다. 또한, 리간드는 하나 이상의 CH 또는 CL 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 리간드는 CH1 도메인, CH2 또는 CH3 도메인, 및/또는 CL 도메인, Cμ1, Cμ2, Cμ3 또는 Cμ4 도메인, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 힌지 영역 도메인도 포함될 수 있다. 도메인의 이러한 조합은, 예를 들어 모방 천연 항체, 예컨대 IgG 또는 IgM, 또는 이들의 단편, 예컨대 Fv, scFv, Fab 또는 F(ab')2 분자일 수 있다. VH, VL, CH1 및 CL 도메인을 포함하는 IgG 분자의 단일 아암과 같은 다른 구조가 구상된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 가변 영역은 단일 도메인 V 유전자 레퍼토리로부터 선택된다. 일반적으로, 단일 항체 도메인의 레퍼토리는 섬유상 박테리오파지의 표면 위에 디스플레이된다. 바람직한 구체예에서, 각 단일 항체 도메인은 항원에 대한 파지 레퍼토리의 결합에 의해 선택된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 각 단일 가변 도메인은 상보적인 가변 영역의 부재하에 이의 표적 항원 또는 에피토프에 대한 결합에 대해 선택될 수 있다. 대안적인 구체예에서, 단일 가변 도메인은 상보적인 가변 영역의 존재하에 이의 표적 항원 또는 에피토프에 대한 결합에 대해 선택될 수 있다. 따라서, 첫 번째 단일 가변 도메인은 제3 상보적인 가변 도메인의 존재하에 선택될 수 있고, 두 번째 가변 도메인은 제4 상보적인 가변 도메인의 존재하에 선택될 수 있다. 상보적인 제3 또는 제4 가변 도메인은 시험되는 단일 도메인과 동일한 특이성을 지니는 자연 그대로의 동족 가변 도메인일 수 있거나, 비-동족 상보적인 도메인 -예컨대 "더미(dummy)" 가변 도메인일 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 이중 특이적 리간드가 단 두 개의 가변 도메인을 포함하나, 수 개의 이러한 리간드가 동일한 단백질에 함께 포함될 수 있고, 예를 들어 두 개의 이러한 리간드가 IgG 또는 다량체 면역글로불린, 예컨대 IgM에 포함될 수 있다. 대안적으로, 또 다른 구체예에서, 다수의 이중 특이적 리간드가 조합되어 다량체를 형성할 수 있다. 예를 들어, 두 상이한 이중 특이적 리간드가 조합되어 4특이적 분자를 생성한다.
본 발명의 방법에 따라 생성된 이중-특이적 리간드의 경쇄 및 중쇄 도메인이 동일한 폴리펩티드 사슬에 있을 수 있거나, 대안적으로 상이한 폴리펩티드 사슬에 있을 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 가변 도메인이 상이한 폴리펩티드 사슬 위에 있는 경우, 이들은 링커, 일반적으로 가요성 링커 (예컨대, 폴리펩티드 사슬), 화학적 결합기, 또는 당 분야에 공지된 임의의 다른 방법에 의해 결합될 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득될 수 있는 이중-특이적 리간드, 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다.
추가로, 본 발명은 본 발명에 따른 '이중-특이적 리간드' 또는 조성물을 이용하여 질병을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
두 번째 구성에서, 본 발명은 2개 이상의 비-상보적인 가변 도메인을 포함하는 다중특이적 리간드를 제공한다. 예를 들어, 리간드는 VH 도메인의 쌍 또는 VL 도메인의 쌍을 포함할 수 있다. 유리하게는, 도메인이 비-카멜리드 기원(origin)이고; 바람직하게는 이들이 인간 도메인이거나 인간 프레임워크 영역 (FW) 및 하나 이상의 이종성 CDR을 포함한다. CDR 및 프레임워크 영역은 면역적으로 관심있는 단백질 서열의 카바트(Kabat) 데이타베이스에 정의된 면역글로불린 가변 도메인의 영역이다.
바람직한 인간 프레임워크 영역은 생식세포(germ line) 유전자 세그먼트 DP47 및 DPK9에 의해 엔코딩된 것들이다. 유리하게는 VH 또는 VL 도메인의 FW1, FW2 및 FW3이 DP47 또는 DPK9로부터의 FWl, FW2 또는 FW3의 서열을 지닌다. 인간 프레임워크는 본 발명의 리간드에 사용된 인간 프레임워크에서 임의로 돌연변이를 함유할 수 있고, 예를 들어 집합적으로 약 5개 이하의 아미노산 변화 또는 약 10개 이하의 아미노산 변화를 함유할 수 있다.
본 발명의 두 번째 구성에 따른 다중특이적 리간드의 가변 도메인은 개방 또는 폐쇄 형태로 배열될 수 있다; 즉, 이들은 가변 도메인이 독립적으로 및 동시에 이들의 동족 리간드에 결합될 수 있거나, 가변 도메인 중 단 하나만이 임의의 한 시점에 이의 동족 리간드에 결합할 수 있도록 배열될 수 있다.
본 발명자들은 특정 구조적 조건하에, 비-상보적인 가변 도메인 (예를 들어, 두 경쇄 가변 도메인 또는 두 중쇄 가변 도메인)이 리간드에 존재할 수 있어서, 그러한 비-상보적인 도메인이 동족 쌍으로서 함께 작동하지 않을지라도 제1 가변 도메인에 대한 제1 에피토프의 결합이 제2 가변 도메인에 대한 제2 에피토프의 결합을 억제할 수 있음을 깨달았다.
유리하게는, 리간드가 두 쌍 이상의 가변 도메인을 포함한다; 즉, 적어도 네 개의 가변 도메인을 포함한다. 유리하게는, 네 개의 가변 도메인이 인간 기원의 프레임워크를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 인간 프레임워크는 인간 생식세포 서열의 것과 동일하다.
본 발명자들은 이러한 항체가 치료 및 기타 용도를 위한 리간드 결합 검정에서 특정 용도를 지닐 것으로 고려한다.
따라서, 두 번째 구성의 첫 번째 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하여, 다중특이적 리간드를 생성하는 방법을 제공한다:
a) 제1 에피토프에 결합되는 능력에 의해 제1 에피토프 결합 도메인을 선택하는 단계,
b) 제2 에피토프에 결합되는 능력에 의해 제2 에피토프 결합 도메인을 선택하는 단계,
c) 에피토프 결합 도메인들을 조합시키는 단계, 및
d) 상기 제1 에피토프 및 상기 제2 에피토프에 결합되는 능력에 의해 폐쇄 형태 다중특이적 리간드를 선택하는 단계.
두 번째 구성의 추가의 양태에서, 본 발명은 제1 에피토프 결합 특이성을 갖는 제1 에피토프 결합 도메인 및 제2 에피토프 결합 특이성을 갖는 비-상보적인 제2 에피토프 결합 도메인을 포함하는 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드를 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 제1 및 제2 결합 특이성은 에피토프 결합에 대해 경쟁함으로써 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드가 동시에 두 에피토프 모두에 결합되지 않을 수 있게 하며, 상기 방법은
a) 제1 에피토프에 결합되는 능력에 의해 제1 에피토프 결합 도메인을 선택하는 단계,
b) 제2 에피토프에 결합되는 능력에 의해 제2 에피토프 결합 도메인을 선택하는 단계,
c) 도메인이 폐쇄 형태로 있도록 에피토프 결합 도메인들을 조합시키는 단계, 및
d) 상기 제1 에피토프 및 상기 제2 에피토프에 결합되나 상기 제1 및 제2 에피토프 둘 모두에 동시에 결합되는 것은 아닌 이의 능력에 의해 폐쇄 형태 다중특이적 리간드를 선택하는 단계를 포함한다.
더욱이, 본 발명은 제1 에피토프 결합 특이성을 갖는 제1 에피토프 결합 도메인 및 제2 에피토프 결합 특이성을 갖는 비-상보적인 제2 에피토프 결합 도메인을 포함하는 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드를 제공하며, 여기서 제1 및 제2 결합 특이성은 에피토프 결합에 대해 경쟁함으로써 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드가 동시에 두 에피토프 모두에 결합되지 않을 수 있게 한다.
본 발명의 두 번째 구성의 상기 양태의 대안적인 구체예는 제3 또는 추가의 에피토프 결합 도메인을 선택하는 것을 포함하는 추가 단계 (b1)을 포함하거나 포함하지 않는다. 이러한 방식으로, 생성된 다중-특이적 리간드는, 개방 또는 폐쇄 형태인지와 무관하게, 두 개를 초과하는 에피토프 결합 특이성을 포함한다. 본 발명의 두 번째 구성의 바람직한 양태에서, 다중-특이적 리간드가 두 개를 초과하는 에피토프 결합 도메인을 포함하는 경우, 상기 도메인들 중 적어도 두 개는 폐쇄 형태이고 결합에 대해 경쟁한다; 다른 도메인들은 결합에 대해 경쟁할 수 있거나 독립적으로 이들의 동족 에피토프(들)에 자유롭게 결합될 수 있다.
본 발명에 따르면, '다중-특이적 리간드'라는 용어는 본원에 정의된 하나를 초과하는 에피토프 결합 특이성을 소유하는 리간드를 언급한다.
본원에서 정의된 '폐쇄 형태'(다중-특이적 리간드)라는 용어는 하나의 에피토프 결합 도메인에 의한 에피토프 결합이 또 다른 에피토프 결합 도메인에 의한 에피토프 결합과 경쟁하도록 리간드의 에피토프 결합 도메인이 임의로 단백질 골격에 의해 서로 부착되거나 결합되는 것을 의미한다. 즉, 동족 에피토프가 개별적으로 각 에피토프 결합 도메인에 의해 결합될 수 있으나, 동시에 결합되지 않는다. 리간드의 폐쇄 형태는 본원에 개시된 방법을 이용하여 달성될 수 있다.
"개방 형태"는 하나의 에피토프 결합 도메인에 의한 에피토프 결합이 또 다른 에피토프 결합 도메인에 의한 에피토프 결합과 경쟁하지 않도록 리간드의 에피토프 결합 도메인이 임의로 단백질 골격에 의해 서로 부착되거나 결합되는 것을 의미한다.
본원에서 언급된 '경쟁'이라는 용어는 제1 에피토프의 이의 동족 에피토프 결합 도메인에 대한 결합이 제2 에피토프가 이의 동족 에피토프 결합 도메인에 결합될 때 억제되는 것을 의미한다. 예를 들어, 결합은, 예를 들어 결합 도메인의 물리적 차단에 의해서나 결합 도메인의 구조 또는 환경의 변화에 의해 입체적으로 억제되어, 에피토프에 대한 이의 친화력 또는 결합력이 감소되게 할 수 있다.
본 발명의 두 번째 구성의 추가의 구체예에서, 에피토프들은 결합에 대하여 서로를 대신할 수 있다. 예를 들어, 제1 에피토프는 이의 동족 제1 결합 도메인에 결합시, 제2 결합 도메인의 입체 장애 또는 그 안에 형태 변화를 야기시키는 항원 상에 존재할 수 있는데, 이것이 제2 결합 도메인에 결합된 에피토프를 대체한다.
유리하게는, 결합이 25% 이상만큼 감소되고, 유리하게는 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 이를 초과하여, 및 바람직하게는 100% 이하 또는 그에 가깝게 감소되어, 결합이 완전히 억제되도록 한다. 에피토프의 결합은 ELISA와 같은 통상적인 항원 결합 검정, FRET를 포함하는 형광성 기재 기술, 또는 분자의 질량을 측정하는 표면 플라스몬 공명과 같은 기술에 의해 측정될 수 있다. 항원 또는 에피토프에 대한 항원-결합 단백질의 특이적 결합은, 예를 들어 스캐차드 분석 및/또는 경쟁적인 결합 검정, 예컨대 방사면역검정 (RIA), ELISA와 같은 효소 면역검정 및 샌드위치 경쟁 검정을 포함하는 적합한 검정 및 이들의 상이한 변형에 의해 결정될 수 있다.
결합 친화력은 표면 플라스몬 공명 (SPR) 및 Biacore (Karlsson et al., 1991)를 이용하여, Biacore 시스템을 (Uppsala, Sweden) 이용하여 바람직하게 결정된다. Biacore 시스템은 생체분자의 상호작용을 실시간으로 모니터링하기 위해 표면 플라스몬 공명 (SPR, Welford K. 1991, Opt. Quant. Elect. 23:1; Morton and Myszka, 1998, Methods in Enzymology 295: 268)을 이용하고, 300 nm 이하만큼 떨어진 표면의 굴절율 변화의 결과로서 유리 지지체 상에 있는 얇은 금 필름의 표면에서 빛의 공명 각의 변화를 검출할 수 있는 표면 플라스몬 공명을 이용한다. Biacore 분석은 편리하게 결합율 상수, 해리율 상수, 평형 해리 상수, 및 친화력 상수를 생성한다. 결합 친화력은 Biacore 표면 플라스몬 공명 시스템 (Biacore, Inc.)을 이용하여 결합 및 해리율 상수를 평가함에 의해 수득된다. 바이오센서 칩은 제조자 (Biacore)의 지시에 따라 표적의 공유 커플링을 위해 활성화된다. 이후 표적을 희석하고 칩 상에 주입하여 고정된 물질의 반응 유닛에 있어서 시그널을 수득한다. 공명 유닛(RU)의 시그널이 고정된 물질의 질량에 비례하기 때문에, 이것은 매트릭스 상에서 고정된 표적 밀도의 범위를 나타낸다. 해리 데이터는 1-부위 모델에 맞추어져 koff +/- s.d. (측정치의 표준 편차)을 수득하게 한다. 슈도-1차 속도 상수 (Kd's)는 각 결합 곡선으로부터 산출되고 단백질 농도의 함수로서 플롯팅되어 kon +/- s.e. (핏의 표준 오차)를 생성한다. 결합에 대한 평형 해리 상수 Kd's는 SPR 측정치로부터 koff/kon로서 산출된다.
문헌[Phizicky and Field in Microb. Rev. (1995) 59:114-115]에 개시된 대로, HSA와 같은 적합한 항원이 덱스트란 중합체 상에 고정되고, 단일 가변 도메인과 같은, HSA에 대한 리간드를 함유하는 용액이 세포를 통해 흘러서 고정된 HSA에 접촉된다. 고정된 HSA에 의해 보유된 단일 가변 도메인은 충돌하는 빛의 공명 각을 변경시켜 덱스트란 중합체에 가까운 단백질, 즉 단일 가변 도메인의 증가된 양에 의해 발생된 굴절율의 변화를 초래한다. 모든 단백질이 동일한 굴절율을 지니고 공명 각 변동과 표면에 가까운 단백질 농도 간에 선형 상관관계가 있기 때문에, 단백질/단백질 결합으로 인한 표면에서의 단백질 농도의 변화가 측정될 수 있다 (참조, Phizicky and Field, 상술함). 결합 상수를 결정하기 위해, RU 값이 안정될 때까지 단일 가변 도메인 단백질의 용액을 고정된 리간드 (HSA)를 지나서 통과시킴에 의해 공명 유닛 (RU)에서의 증가를 시간의 함수로서 측정하고, 단일 가변 도메인이 결여된 완충액을 이용하여 시간의 함수로서 RU에서의 감소를 측정한다. 상기 절차를 단일 가변 도메인 단백질의 여러 상이한 농도에서 반복한다. 상세한 이론적 배경 및 절차가 문헌[R. Karlsson, et. al. (991) J. Immunol Methods, 145, 229]에 개시되어 있다.
기계 소프트웨어는 상기 개시된 평형 해리 상수 (Kd)를 제시한다. 표면 플라스몬 공명의 이용을 통해 결정된 평형 해리 상수가 미국 특허 5,573,957호에 개시되어 있고, 이는 dRA/dt 및 RA 값의 표에 기초하며 (여기서, 상기 예의 R은 공명 유닛에서 Biacore에 의해 측정된 HSA/단일 가변 도메인 복합체이고 dR/dt는 HSA/단일 가변 도메인 복합체의 형성 속도, 즉 결합 곡선의 도함수(derivative)이다); 여러 상이한 농도의 단일 가변 도메인에 대해 dRA/dt 대 RA의 그래프를 플롯팅하고, 후속하여 상기 라인의 기울기 대 단일 가변 도메인의 농도를 플롯팅하며, 두 번째 그래프의 기울기는 결합율 상수 (M-1, s-1)이다. 해리율 상수 또는 HSA 및 단일 가변 도메인이 서로에게서 떨어지는 속도는 Biacore 상에 생성된 해리 곡선을 이용하여 결정될 수 있다. 플롯팅하고 반응 대 시간 곡선에서 강하 로그의 기울기를 결정함에 의해, 해리율 상수를 결정할 수 있다. 평형 해리 상수 Kd = 해리율 상수/결합율 상수이다.
본 발명에 따라서, 유리하게는, 각 에피토프 결합 단일 가변 도메인이 상이한 에피토프 결합 특이성을 지닌다.
본 발명과 관련하여, 제1 및 제2 "에피토프"는 동일하지 않고 단일 1특이적 리간드에 의해 결합되지 않는 에피토프인 것으로 이해된다. 이들은 상이한 항원 또는 동일한 항원 상에 있을 수 있으나, 충분한 거리만큼 떨어져 있어서 통상적인 항체의 단일 1특이적 VH/VL 결합 쌍에 의해 결합될 수 있었던 단일 실체를 형성하지 않는다. 실험적으로, 단일 사슬 항체 형태의 개개 가변 도메인 (도메인 항체 또는 dAbs) 둘 모두가 두 에피토프에 대해 1특이적 VH/VL 리간드에 의해 따로따로 경쟁하는 경우, 이러한 두 에피토프는 본 발명에 따라 분리된 에피토프로서 고려될 정도로 충분히 떨어져 있지 않은 것이다.
본 발명의 폐쇄 형태 다중특이적 리간드는 WO 02/02773호에 개시된 리간드를 포함하지 않는다. 따라서, 본 발명의 리간드는 공동-작동가능하게 하나 이상의 임의의 항원 또는 에피토프에 결합되는 상보적인 VH/VL 쌍을 포함하지 않는다. 대신, 본 발명에 따른 리간드는 비-상보적인 VH-VH 또는 VL-VL 쌍을 포함하는 것이 바람직하다. 유리하게는, 각 VH 또는 VL 도메인이 각각 VH-VH 또는 VL-VL 쌍에서 상이한 에피토프 결합 특이성을 갖고, 에피토프 결합 부위는 한 부위에서의 에피토프 결합이 다른 부위에서의 에피토프의 결합과 경쟁하도록 배열된다.
본 발명에 따르면, 유리하게는, 각 에피토프 결합 도메인이 면역글로불린 가변 도메인을 포함한다. 보다 유리하게는, 각 에피토프 결합 도메인이 항체의 가변 경쇄 도메인 (VL) 또는 가변 중쇄 도메인 (VH)일 것이다. 본 발명의 두 번째 구성에서, 본 발명에 따른 리간드에 존재하는 경우 면역글로불린 도메인은 비-상보적이며, 즉 이들은 결합되어 VH/VL 항원 결합 부위를 형성하지 않는다. 따라서, 본 발명의 두 번째 구성에 정의된 다중-특이적 리간드는 동일한 아형의 면역글로불린 도메인을 포함하며, 이것은 가변 경쇄 도메인 (VL) 또는 가변 중쇄 도메인 (VH)이다. 더욱이, 본 발명에 따른 리간드가 폐쇄 형태인 경우, 면역글로불린 도메인은 카멜리드 VHH 유형일 수 있다.
대안적인 구체예에서, 본 발명에 다른 리간드(들)는 카멜리드 VHH 도메인을 포함하지 않는다. 보다 특히, 본 발명의 리간드(들)는 인간 VH 도메인에 비해 카멜리드 VHH 도메인에 특이적인 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하지 않는다.
유리하게는, 단일 가변 도메인이 상이한 항원 또는 에피토프에 대한 결합 활성을 위하여 선택된 항체로부터 유래된다. 예를 들어, 가변 도메인은 인간 면역화에 의해 적어도 부분적으로 단리될 수 있다. 인간 항체 라이브러리로부터의 단리 및 인위적인 항체 유전자의 합성을 포함하는 대안적인 방법이 당 분야에 공지되어 있다.
선택된 구체예에서, 단일 가변 도메인은 천연 발생 단일 가변 도메인이다. 다른 선택된 구체예에서, 단일 가변 도메인은 비-천연 발생이다. "천연 발생"이라는 용어는 대상물, 예컨대 단백질 도메인, 예컨대 단일 가변 도메인 또는 항체 단일 가변 도메인이 자연적으로 발견될 수 있음을 나타내기 위해 사용된다. 따라서, 천연 발생 단백질 도메인, 예컨대 항체의 V 영역은 자연적으로, 예컨대 포유동물, 영장류, 설치류, 어류, 조류, 파충류 등과 같은 비-재조합 종에서 발현되는 단백질, 예컨대 항체 사슬 단백질로 존재한다. 확실히 하기 위해, 시험관내에서 변화가 도입된 핵산으로부터 발현된 폴리펩티드의 레퍼토리로부터 단리된 단일 가변 도메인은 비-천연 발생 단일 가변 도메인이다. 더 확실히 하기 위해, 동물의 면역화로부터 초래된 항체에서 비롯된 항체 단일 가변 도메인은 천연 발생 단일 가변 도메인이다.
가변 도메인은 단백질 A 또는 단백질 L과 같은 초항원(superantigen)에 결합되는 것이 유리하다. 초항원에 대한 결합은 정확하게 폴딩된 항체 가변 도메인의 특성이고, 이는 상기 도메인이, 예를 들어 재조합 또는 돌연변이 도메인의 라이브러리로부터 단리될 수 있게 한다.
본 발명에 따른 에피토프 결합 도메인은 단백질 스캐폴드 및 에피토프 상호작용 부위 (유리하게는 단백질 스캐폴드 상에 존재한다)를 포함한다.
에피토프 결합 도메인도 면역글로불린 도메인 이외의 단백질 스캐폴드 또는 골격에 기초할 수 있다. 예를 들어, SpA와 같은 천연 세균 수용체가 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합되는 리간드를 생성하기 위해 CDR을 그래프팅하기 위한 스캐폴드로서 사용되어 왔다. 상기 절차의 상세한 설명이 US 5,831,012호에 개시되어 있다. 다른 적합한 스캐폴드는 피브로넥틴 및 애피보디에 기초한 것들을 포함한다. 상기 절차의 상세한 설명은 WO98/58965호에 개시되어 있다. 다른 적합한 스캐폴드로는 문헌[van den Beuken et al., J. Mol. Biol. (2001) 310, 591-601]에 개시된 리포칼린 및 CTLA4, 및 세균 GroEL 또는 다른 샤프롱 폴리펩티드의 고리 구조에 기초한, WO0069907호 (Medical Research Council)에 개시된 것들과 같은 스캐폴드가 있다.
단백질 스캐폴드는 조합될 수 있고; 예를 들어 CDR은 CTLA4 스캐폴드 상으로 그래프팅되고 면역글로불린 VH 또는 VL 도메인과 함께 사용되어 다가 리간드를 형성할 수 있다. 유사하게, 피브로넥틴, 리포칼린 및 다른 스캐폴드를 조합시킬 수 있다.
당업자는 본 발명의 방법에 따라 생성된 폐쇄 형태 다중특이적 리간드의 에피토프 결합 도메인이 동일한 폴리펩티드 사슬 상에 있을 수 있거나, 대안적으로 상이한 폴리펩티드 사슬 상에 있을 수 있음을 이해할 것이다. 가변 도메인이 상이한 폴리펩티드 사슬 위에 있는 경우, 이들은 링커, 유리하게는 가요성 링커 (예컨대, 폴리펩티드 사슬), 화학적 결합기, 또는 당 분야에 공지된 임의의 다른 방법을 통해 결합될 수 있다.
제1 및 제2 에피토프 결합 도메인은 공유적으로 또는 비공유적으로 결합될 수 있다. 도메인이 공유적으로 결합되는 경우, 그 결합은, 예를 들어 이황화 결합에 의해 매개될 수 있다.
본 발명의 두 번째 구성에서, 제1 및 제2 에피토프는 상이한 것이 바람직하다. 이들은 천연 발생이거나 합성일 수 있는 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산이거나, 이들의 일부일 수 있다. 상기 양태에서, 본 발명의 리간드는 에피토프 또는 항원에 결합하여 길항제 또는 효능제로서 기능할 수 있다 (예컨대, EPO 수용체 효능제). 일 구체예에서 리간드의 에피토프 결합 도메인은 동일한 에피토프 특이성을 지니고, 에피토프의 다중 복사체가 동일한 항원 상에 존재할 때, 예를 들어 동시에 이들의 에피토프에 결합될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이러한 에피토프는 리간드가 에피토프에 결합되고 항원을 브릿징할 수 있도록 상이한 항원 상에 제공된다. 당업자는 에피토프 및 항원의 선택이 광범위하게 다양함을 이해할 것이다. 예를 들어, 이들은 인간 또는 동물 단백질, 시토킨, 시토킨 수용체, 효소, 효소에 대한 보조-인자 또는 DNA 결합 단백질일 수 있다. 적합한 시토킨 및 성장 인자로는 ApoE, Apo-SAA, BDNF, 카르디오트로핀-1, EGF, EGF 수용체, ENA-78, 에오탁신, 에오탁신-2, 엑소두스-2, EpoR, FGF-산성, FGF-염기성, 섬유모세포 성장 인자-10, FLT3 리간드, 프랙트알킨 (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-β1, 인슐린, IFN-γ, IGF-I, IGF-II, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 a.a.), IL-8 (77 a.a.), IL-9, IL-1O, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IGIF), 인히빈 α, 인히빈 β, IP-1O, 각질세포 성장 인자-2 (KGF-2), KGF, 렙틴, LIF, 림포탁틴, 뮬레리안 억제 물질, 단핵구 콜로니 억제 인자, 단핵구 유인 단백질, M-CSF, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MIG, MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, MIP-3β, MIP-4, 골수세포 선조 억제 인자-1 (MPIF-1), NAP-2, 뉴르투린, 신경 성장 인자, β-NGF, NT-3, NT-4, 온코스타틴 M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1α, SDF1β, SCF, SCGF, 줄기 세포 인자 (SCF), TARC, TGF-α, TGF-β, TGF-β2, TGF-β3, 종양 괴사 인자 (TNF), TNF-α, TNF-β, TNF 수용체 I, TNF 수용체 II, TNIL-1, TPO, VEGF, VEGF 수용체 1, VEGF 수용체 2, VEGF 수용체 3, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-β, GRO-γ, HCC1, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3 및 HER 4, TACE 인식 부위, TNF BP-I 및 TNF BP-II, CD4, 인간 케모킨 수용체 CXCR4 또는 CCR5, C형 간염 바이러스로부터의 비구조 단백질 유형 3 (NS3), TNF-알파, IgE, IFN-감마, MMP-12, CEA, 에이치. 파일로리 (H. pylori), TB, 인플루엔자, E형 간염, MMP-12, 특정 세포 상에서 과발현된 내재화 수용체, 예컨대 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 종양 세포 상의 ErBb2 수용체, 내재화 세포 수용체, LDL 수용체, FGF2 수용체, ErbB2 수용체, 트랜스페린 수용체, PDGF 수용체, VEGF 수용체, PsmAr, 세포외 매트릭스 단백질, 엘라스틴, 피블로넥틴, 라미닌, α1-항트립신, 조직 인자 프로테아제 억제제, PDKl, GSKl, Bad, 카스파제-9, 포르크헤드(Forkhead), 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori)의 항원, 미코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis)의 항원 및 인플루엔자 바이러스의 항원 뿐만 아니라 이에 관해 부록 2 또는 부록 3에 개시된 임의의 표적이 있으나 바람직하게는 이로 제한되지 않으며, 이들은 부록에 개시된 바와 같이 조합되든지, 상이한 조합이든지, 개별적일 수 있다. 시토킨 수용체는 상기 시토킨, 예컨대 IL-1 R1; IL-6R; IL-10R; IL-18R에 대한 수용체 뿐만 아니라 부록 2 또는 부록 3에 개시된 시토킨에 대한 수용체 및 또한 부록 2 및 3에 개시된 수용체를 포함한다. 상기 목록은 배타적인 것이 아님을 이해할 것이다. 다중특이적 리간드가 두 에피토프 (동일하거나 상이한 항원 상에서)에 결합될 때, 항원(들)은 상기 목록에서 선택될 수 있다.
유리하게는, 이중 특이적 리간드가 유기체 몸의 치료적 상황에 있어서 상승적으로 협력하는 시토킨 및 다른 분자를 목표로 하도록 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 둘 이상의 시토킨에 결합될 수 있는 이중 특이적 리간드를 투여하는 것을 포함하여, 둘 이상의 시토킨의 활성을 상승시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 이러한 양태에서, 이중 특이적 리간드는 상보적 및/또는 비-상보적인 도메인으로 구성된 리간드, 개방 형태의 리간드, 및 폐쇄 형태의 리간드를 포함하는 임의의 이중 특이적 리간드일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 이러한 양태는 VH 도메인 및 VL 도메인의 조합, 유일한 VH 도메인 및 유일한 VL 도메인에 관한 것이다.
치료와 관련된 상승작용은 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 한 표적만을 표적화하는 것은 치료적으로 유효하지 않은데 반해, 표적 조합물은 두 표적 모두가 리간드에 의해 표적이 될 경우에만 치료적으로 활성일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 한 표적만이 다소 낮거나 최소의 치료 효과를 제공할 수 있으나 두 번째 표적과의 조합물은 치료 효과에 있어서 상승적인 증가를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명의 이러한 양태의 이중 특이적 리간드에 의해 결합된 시토킨이 부록 2에 제시된 목록으로부터 선택된다.
더욱이, 이중 특이적 리간드는 종양학 적응증에 이용될 수 있는데, 한 특이성은 CD89를 표적으로 하고, 이는 세포독성 세포에 의해 발현되며, 다른 하나는 종양 특이적이다. 표적이 될 수 있는 종양 항원의 예는 부록 3에 제시된다.
본 발명의 두 번째 구성의 일 구체예에서, 가변 도메인은 제1 및/또는 제2 항원 또는 에피토프에 대해 유도된 항체로부터 유래된다. 바람직한 구체예에서, 가변 도메인은 단일 가변 항체 도메인의 레퍼토리로부터 유래된다. 일례에서, 레퍼토리는 동물에서 생성되지 않는 레퍼토리이거나 합성 레퍼토리이다. 또 다른 예에서, 단일 가변 도메인은 동물 면역화에 의해 (적어도 부분적으로) 단리되지 않는다. 따라서, 단일 도메인은 나이브(naive) 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 두 번째 구성은 제1 에피토프 결합 특이성을 갖는 제1 에피토프 결합 도메인 및 제2 에피토프 결합 특이성을 갖는 비-상보적인 제2 에피토프 결합 도메인을 포함하는 다중-특이적 리간드를 제공한다. 제1 및 제2 결합 특이성은 동일하거나 상이할 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 제1 에피토프 결합 특이성을 갖는 제1 에피토프 결합 도메인 및 제2 에피토프 결합 특이성을 갖는 비-상보적인 제2 에피토프 결합 도메인을 포함하는 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드를 제공하며, 여기서 제1 및 제2 결합 특이성은 에피토프 결합에 대해 경쟁할 수 있어서 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드가 두 에피토프 모두에 동시에 결합될 수 없게 한다.
여전히 추가의 양태에서, 본 발명은 비-상보적인 결합 도메인을 포함하는 개방 형태 리간드를 제공하며, 여기서 도메인은 동일한 표적 상에 있는 상이한 에피토프에 특이적이다. 상기 리간드는 증가된 결합력으로 표적에 결합된다. 유사하게, 본 발명은 동일한 에피토프에 특이적인 비-상보적인 결합 도메인을 포함하고 상기 에피토프, 예컨대 IL-5, PDGF-AA, PDGF-BB, TGF-β, TGF-β2, TGF-β3 및 TNFα 뿐만 아니라 인간 TNF 수용체 1 및 인간 TNFα의 다중 복사체를 포함하는 표적에 대해 유도된 다가 리간드를 제공한다..
유사한 양태에서, 본 발명에 따른 리간드는 낮은 친화력으로 개개 에피토프에 결합하도록 구성될 수 있어서, 개개 에피토프에 대한 결합이 치료적으로 현저하지 않으나 두 에피토프에 대한 결합으로부터 비롯된 증가된 결합력이 치료적 이익을 제공하도록 할 수 있다. 특정 예에서, 정상 세포 유형에 대해 개별적으로 존재하나 종양 세포와 같은 비정상적이거나 병적인 세포에서만 함께 존재하는 에피토프를 표적으로 할 수 있다. 이러한 상황에서, 비정상적이거나 병적인 세포만이 본 발명에 따른 2특이적 리간드에 의해 효과적으로 표적화된다.
동일한 표적 상에서 (킬레이팅 dAb로서 공지됨) 동일한 에피토프, 또는 인접한 에피토프의 다중 복사체에 특이적인 리간드는 3개, 4개 또는 이를 초과하는 비-상보적인 결합 도메인을 포함하는 삼량체 또는 중합체 (사량체 이상) 리간드일 수도 있다. 예를 들어, 리간드는 3개 또는 4개의 VH 도메인 또는 VL 도메인을 포함하도록 구성될 수 있다.
더욱이, 다중서브유닛 표적에 결합되는 리간드가 제공되며, 여기서 각 결합 도메인은 상기 표적의 서브유닛에 특이적이다. 리간드는 이량체, 삼량체 또는 중합체일 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 상기 양태에 다른 다중-특이적 리간드는 본 발명의 첫 번째 양태의 방법에 의해 수득될 수 있다.
본 발명의 두 번째 구성의 상기 양태에 따르면, 유리하게는 제1 에피토프 결합 도메인 및 제2 에피토프 결합 도메인이 본원에 정의된 비-상보적인 면역글로불린 가변 도메인이다. 이것은 VH-VH 또는 VL-VL 가변 도메인이다.
특히 킬레이팅 dAb는 본 발명의 바람직한 양태에 따라서, 즉 앵커 dAb의 이용에 의해 제조될 수 있고, 이량체, 삼량체 또는 다량체 dAb의 라이브러리가 링커 서열의 업스트림 또는 다운스트림에서 불변 dAb를 포함하는 벡터를 이용하여 구성되며, 두 번째, 세 번째 및 추가의 dAb의 레퍼토리가 링커의 다른 측에 삽입된다. 예를 들어, 앵커 및 가이딩 dAb는 TAR1-5 (Vκ), TAR1-27(Vκ), TAR2h-5(VH) 또는 TAR2h-6(Vκ)일 수 있다.
대안적인 방법에서, 링커의 이용은 VH 및 Vκ와 같은 결합 도메인 간에, 예를 들어 비-공유적인 결합 또는 자연 친화력을 이용하여 회피될 수 있다. 따라서, 본 발명은 하기 단계를 포함하여 킬레이팅 다량체 리간드를 제조하는 방법을 제공한다:
(a) 표적 상의 제1 에피토프에 특이적인 단일 결합 도메인을 엔코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공하는 단계;
(b) 상기 표적 상의 제2 에피토프에 특이적인 제2 결합 도메인을 포함하는 레퍼토리를 엔코딩하는 벡터를 제공하는 단계로서, 상기 제2 에피토프가 상기 제1 에피토프에 인접한 단계;
(c) 상기 제1 및 제2 결합 도메인을 발현시키는 단계; 및
(d) 함께 조합된 제1 및 제2 결합 도메인의 이러한 조합물을 단리시켜 표적-결합 이량체를 생성하는 단계.
제1 및 제2 에피토프는 다량체 리간드가 두 에피토프 모두에 동시에 결합할 수 있도록 인접하여 있다. 이는 결합시 증가된 결합력의 이점을 갖는 리간드를 제공한다. 에피토프가 동일한 경우, 증가된 결합력은 표적 상의 에피토프의 다중 복사체의 존재에 의해 수득되며, 이는 적어도 두 개의 복사체가 동시에 결합되어 증가된 결합력 효과를 달성하도록 한다.
결합 도메인은 여러 방법 뿐만 아니라 링커의 사용에 의해 결합될 수 있다. 예를 들어, 결합 도메인은 cys 잔기, 아비딘 및 스트렙타비딘기 또는 합성 후 비-공유 부착을 위한 다른 수단을 포함할 수 있고; 표적에 결합된 이러한 조합물이 효율적으로 단리될 것이다. 대안적으로, 링커는 제1 및 제2 결합 도메인 사이에 존재할 수 있으며, 이는 단일 벡터로부터의 단일 폴리펩티드로서 발현되고, 예를 들어 상기 개시된 대로 제1 결합 도메인, 링커 및 제2 결합 도메인의 레퍼토리를 포함한다.
바람직한 양태에서, 제1 및 제2 결합 도메인은 항원에 결합될 때 자연적으로 결합된다; 예를 들어, VH 및 VL (예컨대, Vκ) 도메인은 인접한 에피토프에 결합될 때 3-방향 상호작용으로 자연적으로 결합되어 안정한 이량체를 형성할 것이다. 이렇게 결합된 단백질은 표적 결합 검정으로 단리될 수 있다. 이러한 절차의 이점은 정확한 형태에서 가깝게 인접한 에피토프에 결합된 결합 도메인만이 결합될 것이므로 표적에 대한 이들의 증가된 결합력의 결과로서 단리될 것이라는 점이다.
본 발명의 두 번째 구성의 상기 양태의 대안적인 구체예에서, 하나 이상의 에피토프 결합 도메인은 본원에 정의된 비-면역글로불린 '단백질 스캐폴드' 또는 '단백질 골격'을 포함한다. 적합한 비-면역글로불린 단백질 스캐폴드는 상기 개시된 대로 SpA, 피브로넥틴, GroEL 및 기타 샤프롱, 리포칼린, CCTLA4 및 애피보디로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 것들을 포함하나 바람직하게는 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 두 번째 형태의 상기 양태에 따르면, 유리하게는, 에피토프 결합 도메인이 '단백질 골격'에 부착된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 단백질 골격이 면역글로불린 골격이다.
본 발명에 따라서, '면역글로불린 골격'이라는 용어는 본원에 정의된 대로 하나 이상의 면역글로불린 폴드를 포함하고 하나 이상의 에피토프 결합 도메인에 대해 핵으로서 기능하는 단백질을 언급한다.
본원에 정의된 바람직한 면역글로불린 골격은 하기로부터 선택된 것들 중 임의의 하나 이상을 포함한다: 적어도 (i) 항체의 CL (카파 또는 람다 서브클래스) 도메인; 또는 (ii) 항체 중쇄의 CHl 도메인을 포함하는 면역글로불린 분자; 항체 중쇄의 CH1 및 CH2 도메인을 포함하는 면역글로불린 분자; 항체 중쇄의 CH1, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린 분자; 또는 항체의 CL (카파 또는 람다 서브클래스)과 함께 임의의 서브셋 (ii). 힌지 영역 도메인도 포함될 수 있다. 도메인의 이러한 조합은, 예를 들어 모방 천연 항체, 예컨대 IgG 또는 IgM, 또는 이의 단편, 예컨대 Fv, scFv, Fab 또는 F(ab')2 분자일 수 있다. 당업자는 상기 목록이 배타적인 것이 아님을 이해할 것이다.
본원에 정의된 대로 에피토프 결합 도메인에 대한 골격의 결합은 폴리펩티드 수준에서, 즉 골격 및/또는 에피토프 결합 도메인을 엔코딩하는 핵산의 발현 이후에 달성될 수 있다. 대안적으로, 결합 단계는 핵산 수준에서 수행될 수 있다. 본 발명에 따라 단백질 골격을 하나 이상의 에피토프 결합 도메인에 결합시키는 방법은 당업자에게 익숙하거나 본원에 개시된 단백질 화학 및/또는 분자 생물학 기술의 이용을 포함한다.
유리하게는, 폐쇄 형태 다중특이적 리간드는 표적 분자에 결합될 수 있는 제1 도메인 및 리간드의 반감기를 연장시키는 분자 또는 기에 결합될 수 있는 제2 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 분자 또는 기가 HSA 또는 세포 매트릭스 단백질과 같은 벌크제일 수 있다. 본원에서 사용된 "리간드의 반감기를 연장시키는 분자 또는 기"라는 용어는 본원에 정의된 이중-특이적 리간드에 의해 결합될 때 동물에 투여된 그러한 이중 특이적 리간드의 생체내 반감기를 분자 또는 기에 결합되지 않은 기에 비해 증가시키는 분자 또는 화학적 기를 언급한다. 리간드의 반감기를 연장시키는 분자 또는 기의 예가 하기 본원에 개시되어 있다. 바람직한 구체예에서, 폐쇄 형태 다중특이적 리간드는 반감기를 향상시키는 분자 또는 기의 전위시에만 표적 분자에 결합될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 폐쇄 형태 다중특이적 리간드가 HSA와 같은 벌크 분자에 의해 피검체의 혈류에서 순환이 유지된다. 표적 분자와 마주치면, 폐쇄 형태 다중특이적 리간드의 결합 도메인들 간에 경쟁이 HSA의 전위 및 표적의 결합을 초래한다.
본 발명의 임의의 양태에 따른 리간드는 단량체 단일 가변 도메인 형태 또는 다중 단일 가변 도메인 형태, 즉 다량체인 하나 이상의 단일 가변 도메인을 지니거나 이로 구성된 리간드를 포함한다. 리간드는 융합 단백질과 같은 추가의 부분 또는 컨주게이트를 함유하도록 개질될 수 있다. 예컨대 이중 특이적 리간드 형태의 그러한 다량체 리간드 및/또는 단일 가변 도메인을 포함하거나 이로 구성된 그러한 리간드, 즉 그러한 다량체 리간드를 구성하는데 유용한 dAb 단량체는 이들의 동족 표적(들)로부터 300 nM 이하의 Kd, 300 내지 5pM (즉, 3 x 10-7 내지 5 x 10-12 M), 바람직하게는 50 nM 내지 20 pM, 또는 5 nM 내지 200 pM 또는 1 nM 내지 100 pM, 1 x 10-7 M 이하, 1 x 10-8 M 이하, 1 x 10-9 M 이하, 1 x 10-10 M 이하, 1 x 10-11 M 이하의 Kd; 및/또는, 예를 들어 표면 플라스몬 공명에 의해 결정된 5 x 10-1 내지 1 x 10-7S-1의 Koff 속도 상수, 바람직하게는 1 x 10-2 내지 1 x 10-6S-1, 또는 5 x 10-3 내지 1 x 10-5S-1, 또는 5 x 10-1S-1 이하, 또는 1 x 10-2S-1 이하, 또는 1 x 1O-3S-1 이하, 또는 1 x 10-4S-1 이하, 또는 1 x 10-5S-1 이하, 또는 1 x 10-6S-1 이하의 Koff 속도 상수로 해리되는 것이 유리할 수 있다. Kd 속도 상수는 Koff/Kon으로 정의된다. 1 몰농도(Molar)를 초과하는 Kd 값은 일반적으로 비-특이적 결합을 나타내는 것으로 고려된다. 바람직하게는, 단일 가변 도메인이 500 nM 미만, 바람직하게는 200 nM 미만, 및 보다 바람직하게는 10 nM 미만, 예컨대 500 pM 미만의 친화력으로 표적 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합될 것이다.
특히 본 발명은 항-TNFα dAb 단량체 (또는 그러한 dAb를 포함하는 이중 특이적 리간드), 동종이량체, 이종이량체 또는 동종삼량체 리간드를 제공하며, 각 dAb는 TNFα에 결합된다. 리간드는 TNFα에 30OnM 내지 5pM (즉, 3 x 10-7 내지 5 x 10-12M)의 Kd, 바람직하게는 5OnM 내지 2OpM, 보다 바람직하게는 5nM 내지 20OpM 및 가장 바람직하게는 1nM 내지 10OpM의 Kd로 결합되며; 대안적인 방식으로 표현해 보면, Kd는 1 x 10-7 M 이하, 바람직하게는 1 x 10-8 M 이하, 보다 바람직하게는 1 x 10-9 M 이하, 유리하게는 1 x 10-10 M 이하 및 가장 바람직하게는 1 x 10-11 M 이하이고/거나 Koff 속도 상수는 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 대로 5 x 10-1 내지 1 x 10-7S-1, 바람직하게는 1 x 10-2 내지 1 x 10-6S-1, 보다 바람직하게는 5 x 10-3 내지 1 x 10-5S-1, 예를 들어 5 x lO-1S-1 이하, 바람직하게는 1 x 10-2S-1 이하, 보다 바람직하게는 1 x 10-3S-1 이하, 유리하게는 1 x 10-4S-1 이하, 추가로 유리하게는 1 x 10-5S-1 이하, 및 가장 바람직하게는 1 x 10-6S-1 이하이다.
바람직하게는, 리간드가 표준 L929 검정에서 TNFα를 500 nM 내지 50 pM, 바람직하게는 100 nM 내지 50 pM, 유리하게는 10 nM 내지 100 pM, 보다 바람직하게는 1 nM 내지 100 pM; 예를 들어 50 nM 이하, 바람직하게는 5 nM 이하, 유리하게는 500 pM 이하, 보다 바람직하게는 200 pM 이하 및 가장 바람직하게는 100 pM 이하의 ND50으로 중화시킨다.
바람직하게는 리간드가 TNF 알파 수용체 I (p55 수용체)에 대한 TNF 알파의 결합을 500 nM 내지 50 pM, 바람직하게는 100 nM 내지 50 pM, 보다 바람직하게는 10 nM 내지 100 pM, 유리하게는 1nM 내지 100 pM; 예를 들어 50 nM 이하, 바람직하게는 5 nM 이하, 보다 바람직하게는 500 pM 이하, 유리하게는 20OpM 이하, 및 가장 바람직하게는 100 pM 이하의 IC50으로 억제한다. 바람직하게는 TNFα가 인간 TNFα이다.
또한, 본 발명은 TNF 수용체 I에 300 nM 내지 5 pM (즉, 3 x 10-7 내지 5 x 10-12M), 바람직하게는 50 nM 내지 20 pM, 보다 바람직하게는 5nM 내지 200 pM 및 가장 바람직하게는 1nM 내지 100 pM, 예를 들어, 1 x 10-7 M 이하, 바람직하게는 1 x 10-8 M 이하, 보다 바람직하게는 1 x 10-9 M 이하, 유리하게는 1 x 10-10 M 이하 및 가장 바람직하게는 1 x 10-11 M 이하의 Kd; 및/또는 바람직하게는 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 대로, 5 x 10-1 내지 1 x 10-7S-1, 바람직하게는 1 x 10-2 내지 1 x 10-6S-1, 보다 바람직하게는 5 x 10-3 내지 1 x 10-5S-1, 예를 들어 5 x 10-1S-1 이하, 바람직하게는 1 x 10-2S-1 이하, 유리하게는 1 x 10-3S-1 이하, 보다 바람직하게는 1 x 10-4S-1 이하, 여전히 보다 바람직하게는 1 x 10-5S-1 이하, 및 가장 바람직하게는 1 x 10-6S-1 이하의 Koff 속도 상수로 결합되는, 그러한 dAb를 포함하는 이중 특이적 리간드, 또는 항-TNF 수용체 I dAb 단량체를 제공한다.
바람직하게는, dAb 단량체 리간드가 표준 검정 (예컨대, 본원에 개시된 L929 또는 HeLa 검정)에서 50OnM 내지 5OpM, 바람직하게는 10OnM 내지 5OpM, 보다 바람직하게는 1OnM 내지 10OpM, 유리하게는 1nM 내지 10OpM; 예를 들어 5OnM 이하, 바람직하게는 5nM 이하, 보다 바람직하게는 50OpM 이하, 유리하게는 20OpM 이하, 및 가장 바람직하게는 1OOpM 이하의 ND50으로 TNFα를 중화시킨다.
바람직하게는, dAb 단량체 또는 리간드가 TNF 알파 수용체 I (p55 수용체)에 대한 TNF 알파의 결합을 500 nM 내지 50 pM, 바람직하게는 100 nM 내지 50 pM, 보다 바람직하게는 10 nM 내지 100 pM, 유리하게는 1nM 내지 100 pM; 예를 들어 50 nM 이하, 바람직하게는 5 nM 이하, 보다 바람직하게는 500 pM 이하, 유리하게는 20OpM 이하, 및 가장 바람직하게는 100 pM 이하의 IC50으로 억제한다. 바람직하게는 TNF 수용체 I 표적이 인간 TNFα이다.
더욱이, 본 발명은 혈청 알부민 (SA)에 1nM 내지 500μM (즉, 1 x 10-9 내지 5 x 10-4), 바람직하게는 10OnM 내지 lOμM의 Kd로 결합되는 dAb 단량체 (또는 그러한 dAb 단량체를 포함하는 이중 특이적 리간드)를 제공한다. 바람직하게는, 제1 항-SA dAb 및 또 다른 표적에 대한 제2 dAb를 포함하는 이중 특이적 리간드의 경우, 제2 dAb의 이의 표적에 대한 친화력 (예컨대, 표면 플라스몬 공명, 예컨대 Biacore에 의해 측정된 Kd 및/또는 Koff)은 SA에 대한 제1 dAb의 친화력의 1 내지 100000배 (바람직하게는 100 내지 100000배, 보다 바람직하게는 1000 내지 10000O배 또는 10000 내지 100000배)이다. 예를 들어, 제1 dAb는 약 10 μM의 친화력으로 SA에 결합되는 한편, 제2 dAb는 100 pM의 친화력으로 이의 표적에 결합된다. 바람직하게는, 혈청 알부민이 인간 혈청 알부민 (HSA)이다.
일 구체예에서, 제1 dAb (또는 dAb 단량체)는 대략 50 nM, 바람직하게는 70 nM, 및 보다 바람직하게는 100, 150 또는 200 nM의 Kd로 SA (예컨대 HSA)에 결합된다.
본 발명은 또한 본 발명의 상기 양태에 따라서, 앞서 언급된 dAb 단량체의 디량체, 삼량체 및 중합체를 제공한다.
dAb 단량체, 이량체 및 삼량체를 포함하는 본 발명에 따른 리간드는 CH2 및 CH3 도메인 중 하나 또는 둘 모두와 임의로 힌지 영역을 포함하는 항체 Fc 영역에 결합될 수 있다. 예를 들어, Fc 영역에 단일 누클레오티드 서열로서 결합된 리간드를 엔코딩하는 벡터가 그러한 폴리펩티드를 제조하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 두 번째 구성의 추가의 양태에서, 본 발명은 적어도 본원에 정의된 다중특이적 리간드를 엔코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 제공한다. 일 구체예에서, 다중특이적 리간드는 폐쇄 형태 리간드이다. 또 다른 구체예에서, 이것은 개방 형태 리간드이다. 다중특이적 리간드는 단일 핵산 분자 상에서 엔코딩될 수 잇고; 대안적으로, 각 에피토프 결합 도메인이 별개의 핵산 분자에 의해 엔코딩될 수 있다. 다중특이적 리간드가 단일 핵산 분자에 의해 엔코딩되는 경우, 도메인은 융합 폴리펩티드로서 발현되거나 따로 발현된 후, 예를 들어 화학적 결합기를 이용하여 함께 결합될 수 있다. 분리된 핵산으로부터 발현된 리간드는 적합한 수단에 의해 함께 결합될 것이다.
핵산은 발현시 숙주 세포로부터 폴리펩티드의 수송을 위한 시그널 서열을 추가로 엔코딩할 수 있고 발현시 섬유상 박테리오파지 입자의 표면 성분 (또는 선택 디스플레이 시스템의 다른 성분)에 융합될 수 있다. 세균 발현 및/또는 파지 또는 파지미드 디스플레이에 이용될 수 있는 리더 서열은 pelB, stII, ompA, phoA, bla 및 pelA를 포함한다.
본 발명의 두 번째 구성의 추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 벡터로 트랜스펙션된 숙주 세포를 제공한다.
그러한 벡터로부터의 발현은, 예를 들어 박테리오파지 입자의 표면 상에 선택을 위한 에피토프 결합 도메인을 생성하도록 구성될 수 있다. 이는 디스플레이된 도메인의 선택을 가능하게 하므로 본 발명의 방법을 이용한 '다중특이적 리간드'를 선택할 수 있게 한다.
본 발명의 두 번째 구성의 바람직한 구체예에서, 에피토프 결합 도메인은 면역글로불린 가변 도메인이고 단일 도메인 V 유전자 레퍼토리로부터 선택된다. 일반적으로 단일 항체 도메인의 레퍼토리는 섬유상 박테리오파지의 표면 상에 디스플레이된다. 바람직한 구체예에서, 각 단일 항체 도메인은 항원에 대한 파지 레퍼토리의 결합에 의해 선택된다.
본 발명은, 개방 형태 또는 폐쇄 형태 리간드일 수 있는, 적어도 본 발명에 따른 다중특이적 리간드를 포함하는 키트를 추가로 제공한다. 본 발명에 따른 키트는, 예를 들어 진단 키트, 치료 키트, 화학적 또는 생물학적 종의 검출용 키트 등일 수 있다.
본 발명의 두 번째 구성의 추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 리간드를 이용한 동종 면역검정법을 제공한다.
본 발명의 두 번째 구성의 추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득될 수 있는 폐쇄 형태 다중특이적 리간드, 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다.
더욱이, 본 발명은 '폐쇄 형태 다중특이적 리간드' 또는 본 발명에 따른 조성물을 이용하여 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 질환은 암 또는 염증 질환, 예컨대 류마티스 관절염, 천식 또는 크론병이다.
본 발명의 두 번째 구성의 추가의 양태에서, 본 발명은 폐쇄 형태 다중특이적 리간드, 또는 본 발명에 따른 조성물을 이용하여 질환을 진단하는 것을 포함하는 진단 방법을 제공한다. 따라서, 일반적으로, 폐쇄 형태 다중특이적 리간드에 대한 분석물의 결합은 제제를 전위시키는데 이용되고, 이것이 전위에 대한 시그널의 발생을 초래한다. 예를 들어, 분석물 (제2 항원)의 결합은 항체에 결합된 효소 (제1 항원)를 전위시킬 수 있어서, 특히 효소가 이의 활성 부위를 통해 항체에 유지된 경우 면역검정에 대한 기초를 제공하였다.
따라서, 두 번째 구성의 마지막 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하여, 표적 분자의 존재를 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 제제에 결합된 폐쇄 형태 다중특이적 리간드를 제공하고, 상기 리간드는 표적 분자 및 제제에 특이적이며, 여기서 리간드에 의해 결합된 제제가 리간드로부터 전위시에 검출가능한 시그널의 발생을 유도하고;
(b) 폐쇄 형태 다중특이적 리간드를 표적 분자에 노출시키고;
(c) 제제의 전위 결과 생성된 시그널을 검출한다.
본 발명의 두 번째 구성의 상기 양태에 따르면, 유리하게는, 제제가 폐쇄 형태 다중-특이적 리간드에 의해 결합될 때 비활성인 효소이다. 대안적으로, 제제는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 1종 이상일 수 있다: 효소용 기질, 및 리간드에 의해 결합될 때 비활성이거나 켄칭될 수 있는 형광, 발광 또는 색원체 분자.
본원에 개시된 서열과 유사하거나 상동인 (예컨대, 적어도 약 70%의 서열 동일성) 서열도 본 발명의 일부이다. 일부 구체예에서, 아미노산 수준에서의 서열 동일성은 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 이보다 높을 수 있다. 핵산 수준에서, 서열 동일성은 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 이보다 높을 수 있다. 대안적으로, 실질적은 동일성은 핵산 세그먼트가 선택적인 하이브리드화 조건 (예컨대, 매우 높게 엄격한 하이브리드화 조건) 하에 가닥의 상보서열(complement)에 하이브리드화될 때 존재한다. 핵산은 전체 세포, 세포 용해물 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다.
퍼센트 동일성은 아미노산 또는 누클레오티드 서열 길이의 전체 스트레치에 따른 퍼센트 동일성을 언급할 수 있다. 명시된 경우, 아미노산 또는 핵산 서열의 퍼센트 동일성은, 예를 들어 하나 이상의 항체 CDR 영역 및/또는 하나 이상의 항체 가변 프레임워크 영역을 따라 참조가 된 아미노산 또는 핵산 서열의 하나 이상의 분리된 영역으로부터의 서열(들)에 대한 퍼센트 동일성을 언급한다. 예를 들어, 항체 중쇄 또는 경쇄 단일 가변 도메인의 하나 이상의 CDR을 가로지느는 아미노산 수준에서의 서열 동일성은 각각 항체 중쇄 또는 경쇄 단일 가변 도메인의 상응하는 CDR의 아미노산 서열에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 이를 초과하는 동일성을 지닐 수 있다. 핵산 수준에서, 항체 중쇄 또는 경쇄 단일 가변 도메인의 하나 이상의 CDR을 엔코딩하는 핵산 서열은 항체 중쇄 또는 경쇄 단일 가변 도메인의 상응하는 CDR을 엔코딩하는 핵산 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 이를 초과하는 동일성을 지닐 수 있다. 핵산 수준에서, 항체 중쇄 또는 경쇄 단일 가변 도메인의 하나의 CDR을 엔코딩하는 핵산 서열은 각각 항체 중쇄 또는 경쇄 단일 가변 도메인의 상응하는 CDR을 엔코딩하는 핵산 서열에 비해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 이를 초과하는 퍼센트 동일성을 지닐 수 있다. 일부 구체예에서, 퍼센트 동일성의 구조적 특징은 기능성 양태와 관련된다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 참조가 되는 핵산 또는 아미노산 서열에 100% 미만의 동일성을 갖는 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 참조 아미노산 서열 또는 참조가 되는 핵산에 의해 엔코딩된 아미노산 서열의 하나 이상의 기능성 양태를 나타낼 것이 요구된다. 다른 구체예에서, 참조가 되는 핵산 또는 아미노산 서열에 각각 100% 미만의 동일성을 갖는 핵산 서열 또는 아미노산 서열도 참조 아미노산 서열 또는 참조가 되는 핵산에 의해 엔코딩된 아미노산 서열의 하나 이상의 기능성 양태를 나타낼 것이 요구되나, 기능적 특징은 다소 변경될 수 있고, 예컨대 명시된 항원에 참조에 비해 증가된 친화력을 부여할 수 있다.
두 서열 사이에 "상동성" 또는 "서열 동일성" 또는 "유사성"(본원에서 상호 교환하여 사용될 수 있는 용어)의 계산은 하기와 같이 실시된다. 서열은 최적의 비교 목적으로 정렬된다(예컨대, 최적의 정렬을 위해 첫 번째 또는 두 번째 아미노산 또는 핵산 서열의 하나 또는 양쪽에 갭이 삽입될 수 있고, 비-상동성 서열은 비교를 목적으로는 고려될 수 없다). 바람직한 구체예에서, 비교를 목적으로 정렬된 참조 서열의 길이는 참조 서열 길이의 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 더 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 60%, 및 심지어 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 80%, 90%, 또는 100% 일 수 있다. 상응하는 아미노산 위치 또는 누클레오티드 위치에서의 아미노산 잔기 또는 누클레오티드를 비교한다. 첫번째 서열에 있는 위치가 두 번째 서열의 상응하는 위치와 같은 아미노산 잔기 또는 핵산으로 채워져 있는 경우, 그때 상기 분자들은 그 위치에서 동일하다(본원에서 아미노산 또는 핵산 "상동성"은 아미노산 또는 핵산 "동일성"과 같은 것으로 사용된다). 2개 서열 간의 퍼센트 동일성은 2개 서열의 최적의 정렬을 위해 도입되어질 필요가 있었던 각 갭의 길이, 갭의 수를 고려하여, 상기 서열들이 공유하는 동일한 위치의 갯수의 함수이다.
유리하게는, BLAST 알고리듬(버젼 2.0)을 디폴트 값으로 설정된 파라미터를 이용하여 서열 정렬에 적용시킨다. BLAST 알고리듬은 미국 정부 ("gov")의 내셔널 인스티튜트 오브 헬쓰 ("NIH")의 내셔널 센터 포 바이테크놀로지 인포메이션 ("NCBI")의 웹 사이트 ("www")에 "/Blst/" 디렉토리로 "blast_help.html" 파일에 상세하게 개시되어 있다. 검색 파라미터는 하기 정의된 대로이고, 정의된 디폴트 파라미터로 설정하는 것이 유리하다.
BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)는 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx로 사용되는 학습 검색 알고리듬이다; 이들 프로그램을 약간 개선시켜 문헌[Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(6):2264-8]의 통계 방법을 이용한 이들의 발견에 의의를 둔다 (참조, "blast_help.html" 파일, 상기 개시됨). BLAST 프로그램은, 예를 들어 조회되는 서열에 대한 상동성을 동정하기 위해 서열 유사성 검색용으로 맞추어졌다. 이 프로그램은 일반적으로 모티프-스타일 검색에 유용하지 않다. 서열 데이터베이스의 유사성 검색에 있어서의 기본적인 문제의 논의는 문헌[Altschul et al. (1994)]을 참고한다.
내셔널 센터 포 바이테크놀로지 인포메이션의 웹 사이트에서 이용가능한 5개의 BLAST 프로그램은 하기 과제를 수행한다:
"blastp"는 조회되는 아미노산 서열을 단백질 서열 데이터베이스에 대해 비교한다;
"blastn"는 조회되는 누클레오티드 서열을 누클레오티드 서열 데이터베이스에 대해 비교한다;
"blastx"는 조회되는 누클레오티드 서열 (두 가닥 모두)의 6-프레임 개념상 번역 생성물을 단백질 서열 데이터베이스에 대해 비교한다;
"tblastn"는 조회되는 단백질 서열을 6개 모두의 리딩 프레임에서 역학적으로 번역된 누클레오티드 서열 데이터베이스 (두 가닥 모두)에 대해 비교한다.
"tblastx"는 조회되는 누클레오티드 서열의 6-프레임 번역물을 누클레오티드 서열 베이터베이스의 6-프레임 번역물에 대해 비교한다.
BLAST는 하기 검색 파라미터를 이용한다:
HISTOGRAM은 각 검색에 대한 점수의 막대그래프를 보여준다; 디폴트는 예스이다 (BLAST 매뉴얼의 파라미터 H 참조).
DESCRIPTIONS는 명시된 숫자로 보고된 매칭 서열의 짧은 설명의 번호를 제한한다; 디폴트 한계는 100개 설명이다 (매뉴얼 페이지의 파라미터 V 참조). 또한 EXPECT 및 CUTOFF 참조.
ALIGNMENTS는 높은-점수 세그먼트 쌍 (HSP)이 보고되는 명시된 번호에 대한 데이터베이스 서열을 제한한다; 디폴트 한계는 50이다. 이 보다 더 많은 데이타베이스서열이 보고를 위한 통계적 유의성 역치를 만족하는 경우 (참조, 하기 EXPECT 및 CUTOFF), 가장 큰 통계적 유의성에 속한 매칭만이 보고된다 (BLAST 매뉴얼의 파라미터 B 참조).
EXPECT 데이터베이스 서열에 대한 매칭을 보고하기 위한 통계적 유의성 역치; 디폴트 값은 10이어서, 10개의 매칭이 문헌[Karlin and Altschul (1990)]의 확률 모델에 따라 단지 우연히 발견될 것으로 예상된다. 매칭에 기인한 통계적 유의성이 EXPECT 역치 보다 큰 경우, 매칭은 보고되지 않을 것이다. 낮은 EXPECT 역치가 더욱 엄격하며, 이는 매칭 기회가 거의 보고되지 않도록 한다. 단편 값이 허용될 수 있다 (BLAST 매뉴얼의 파라미터 E 참조).
CUTOFF 높은-점수 세그먼트 쌍을 보고하는 컷오프 점수. 디폴트 값은 EXPECT 값 (상기 참조)으로부터 계산된다. HSP는 이들에 기인하는 통계적 유의성이 적어도 CUTOFF 값과 동일한 점수를 갖는 단독 HSP에 기인하는 것 만큼 높을 시에만 데이터베이스 서열에 대해 보고된다. CUTOFF 값이 더 높을수록 더 엄격하며, 이는 매칭 기회가 거의 보고되지 않도록 한다 (BLAST 매뉴얼의 파라미터 S 참조). 통상적으로, 유의성 역치는 EXPECT를 이용하여 더욱 직관적으로 조정될 수 있다.
MATRIX는 BLASTP, BLASTX, TBLASTN 및 TBLASTX에 대한 교대 스코어링 매트릭스를 나타낸다. 디폴트 매트릭스는 BLOSUM62이다 (Henikoff & Henikoff, 1992, Proc. Natl. Aacad. Sci. USA 89(22):10915-9). 유효한 대안적인 선택으로는 PAM40, PAM120, PAM250 및 IDENTITY가 있다. 어떠한 교대 스코어링 매트릭스도 BLASTN에 대해 이용될 수 없다; BLASTN 요구에서 MATRIX 지령을 지정하는 것은 에러 반응을 되돌린다.
STRAND는 데이터베이스 서열의 상부 또는 바닥 가닥으로만 TBLASTN 검색을 제한하거나; 조회되는 서열의 상부 또는 바닥 가닥에 있는 리딩 프레임으로만 BLASTN, BLASTX 또는 TBLASTX 검색을 제한한다.
FILTER는 SEG 프로그램 (Wootton & Federhen (1993) Computers and Chemistry 17:149-163)에 의해 결정된 대로 낮은 구성적 복잡성을 갖는 조회되는 서열의 세그먼트, 또는 XNU 프로그램 (Claverie & States, 1993, Computers and Chemistry 17:191-201) 또는 BLASTN의 경우, DUST 프로그램 (Tatusov and Lipman (see the world wide web site of the NCBI))에 의해 결정된 대로 짧은-주기성 내부 반복으로 구성된 세그먼트를 차단한다. 필터링은 통계적으로 유의할 수 있으나 생물학적으로 관심이 없는 보고서를 blast 출력으로부터 제거할 수 있어서 (예컨대, 공통의 산성-, 염기성- 또는 프폴린-부화 영역에 대한 히트), 데이터베이스 서열에 대한 특이적 매칭에 이용가능한 생물학적으로 더욱 흥미로운 조회 서열의 영역을 남겨 둔다.
필터 프로그램에 의해 발견된 낮은 복잡성 서열은 누클레오티드 서열에서 "N" 문자를 이용하여 치환되고 (예컨대, 13회 반복되는 "N") 단백질 서열에서 "X" 문자를 이용하여 치환된다 (예컨대, 9회 반복되는 "X").
필터링은 데이터베이스 서열이 아니라 조회 서열 (또는 이의 번역 생성물)에만 적용된다. 디폴트 필터링은 BLASTN에 대해 DUST, 다른 프로그램에 대해 SEG이다.
SWISS-PROT에 적용될 때, 어떤 것도 SEG, XNU, 또는 둘 모두에 의해 전혀 차단되지 않는 것이 보통이므로, 필터링이 항상 효과를 나타낼 것으로 예상되어서는 안된다. 더욱이, 일부 경우에, 서열은 그 전체가 차단되는데, 이는 필터링되지 않은 조회 서열에 대해 보고된 임의의 매칭의 통계적 유의성이 의심되어야 함을 나타낸다.
NCBI-gi는 액세션 및/또는 자리 이름에 추가하여, 출력물에 제시될 NCBI gi 아이덴티파이어(identifier)를 야기한다.
가장 바람직하게는, 서열 비교가 상기 개시된 NCBI 웹 사이트에서 "/BLAST" 디렉토리로 제공된 단순한 BLAST 검색 알고리듬을 이용하여 수행된다.
도면의 간단한 설명
도 1은 VH HSA의 항원 결합 부위에 있는 위치 H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98 (각각 DVT 또는 NNK 엔코딩됨)에서 VH/HSA의 다양성을 도시한다. Vκ의 서열은 위치 L50, L53에서 다양화된다.
도 2는 라이브러리 1: 생식세포(Germ line) Vκ/DVT VH,
라이브러리 2: 생식세포 Vκ/NNK VH,
라이브러리 3: 생식세포 VH/DVT Vκ
라이브러리 4: 생식세포 VH/NNK Vκ를 도시한다.
파스 디스플레이/ScFv 포맷에서. 이러한 라이브러리는 클론 및 선택된 라이브러리의 대부분이 기능성이도록 제네릭 리간드 단백질 A 및 단백질 L로의 결합에 대해 미리 선택되었다. 라이브러리는 HSA (제1 라운드) 및 β-gal (제2 라운드) 또는 HSA β-gal 선택 또는 β-gal (제1 라운드) 및 HSA (제2 라운드) β-gal HSA 선택에 대하여 선택되었다. PCR의 이러한 클론으로부터의 가용성 scFv를 서열에서 증폭시킨다. 이중 특이적 항체 K8을 엔코딩하는 한 클론을 추가 작업을 위해 선택하였다.
도 3은 VH 사슬 및 Vκ 사슬의 정렬을 도시한다.
도 4는 K8 항체의 결합 성질의 특성규명을 도시하는데, K8 항체의 결합 성질은 모노클로날 파지 ELISA에 의해 특성규명되며, 이중 특이적 K8 항체는 HSA 및 β-gal에 결합되는 것으로 나타났고 파지 표면에 1.0을 초과하는 흡수 시그널을 나타내었다. 다른 단백질과의 교차 반응성은 검출되지 않았다.
도 5는 K8 항체 단편의 공지된 농도를 이용하여 수행된 가용성 scFv ELISA를 도시한다. 96-웰 플레이트를 100 ㎍의 HSA, 1O ㎍/ml의 BSA 및 β-gal 및 lOO ㎍/ml의 단백질 A로 1 ㎍/ml 농도로 코팅하였다. K8 scFv의 50 ㎍의 연속 희석액을 적용하고 결합된 항체 단편을 단백질 L-HRP로 검출하였다. ELISA 결과로 K8 항체의 이중 특이적 특성을 확인하였다.
도 6은 가용성 scFv ELISA를 이용하여 분석된 클론 K8Vκ/더미(dummy) VH의 결합 특성을 도시한다. 가용성 scFv 단편의 생성은 문헌[Harrison et al, Methods Enzymol. 1996;267:83-109]에 개시된 대로 IPTG에 의해 유도하였고 scFv를 함유하는 상청액은 직접 검정하였다. 가용성 scFv ELISA를 실시예 1에 개시된 대로 수행하고 결합된 scFv를 단백질 L-HRP로 검출하였다. ELISA 결과는 이 클론이 β-gal에 여전히 결합될 수 있는 한편 BSA 결합은 없어졌음을 나타내었다.
도 7은 가변 도메인 벡터 1 및 2의 서열을 도시한다.
도 8은 VH1/VH2 다중특이적 리간드를 구성하기 위해 사용된 CH 벡터의 맵이다.
도 9는 Vκ1/Vκ2 다중특이적 리간드를 구성하기 위해 사용된 Vκ 벡터의 맵이다.
도 10은 TAR1-5 이량체 4, TAR1-5-19 이량체 4 및 TAR1-5-19 단량체를 비교하는 TNF 수용체 검정을 도시한다.
도 11은 TAR1-5 이량체 1-6을 비교하는 TNF 수용체 검정을 도시한다. 모든 이량체가 FPLC 정제되었고 최적 이량체 종에 대한 결과가 도시된다.
도 12는 상이한 포맷에서 TAR1-5 19 동종이량체의 TNF 수용체 검정을 도시한다: 3U, 5U 또는 7U 링커를 지니는 dAb-링커-dAb 포맷, Fab 포맷 및 시스테인 힌지 링커 포맷.
도 13은 라이브러리 1의 더미 VH 서열이다. VH 프레임워크의 서열은 생식세포 서열 DP47-JH4b에 기초하였다. NNK 랜덤화 (N=A 또는 T 또는 C 또는 G 누클레오티드이고; K = G 또는 T 누클레오티드이다)가 라이브러리 1에 혼입되는 위치가 굵은 밑줄로 본문에 표시된다.
도 14는 라이브러리 2의 더미 VH 서열이다. VH 프레임워크의 서열은 생식세포 서열 DP47-JH4b에 기초하였다. NNK 랜덤화 (N=A 또는 T 또는 C 또는 G 누클레오티드이고; K = G 또는 T 누클레오티드이다)가 라이브러리 2에 혼입되는 위치가 굵은 밑줄로 본문에 표시된다.
도 15는 라이브러리 3의 더미 Vκ 서열이다. Vκ 프레임워크의 서열은 생식세포 서열 DPκ9-Jκ1에 기초하였다. NNK 랜덤화 (N=A 또는 T 또는 C 또는 G 누클레오티드이고; K = G 또는 T 누클레오티드이다)가 라이브러리 3에 혼입되는 위치가 굵은 밑줄로 본문에 표시된다.
도 16은 항 MSA dAb MSA 16 및 MSA 26의 누클레오티드 및 아미노산 서열이다.
도 17은 MSA 16 및 26의 억제 Biacore이다. 정제된 dAb MSA16 및 MSA26을 억제 Biaocre에 의해 분석하여 Kd를 결정하였다. 간단히 말해, dAb를 시험하여 고밀도의 MSA로 코팅된 Biaocre CM5 칩 상에서 200RU의 반응을 달성하는데 요구되는 dAb의 농도를 결정하였다. 일단 요구되는 농도의 dAb가 결정되면, 예상되는 Kd 주변의 농도 범위에서 MSA 항원을 dAb와 미리 혼합시키고 밤새 인큐베이션하였다. 프리믹스 각각에서 MSA 코팅된 dAb의 Biacore 칩에 대한 결합을 30 ㎕/분의 높은 유속으로 측정하였다.
도 18은 주입 후 MSA16의 혈청 수준을 도시한다. dAb MSA16의 혈청 반감기를 마우스에서 측정하였다. MSA16을 대략 1.5 mg/kg의 단일 i.v. 주사로서 CD1 마우스에게 투여하였다. 2 구획 모델을 이용한 모델링은 MSA16이 0.98 시간의 t1/2α, 36.5 시간의 t1/2β 및 913 hr.mg/ml의 AUC를 지님을 나타내었다. MSA16은 0.06 시간의 t1/2α 및 0.34 시간의 t1/2β를 지니는 HEL4 (항-계란 난백 리소자임 dAb)에 비해 상당히 연장된 반감기를 지녔다.
도 19는 MSA26Ck 및 TAR1-5-19CH를 포함하는 Fab-유사 단편을 이용한 TNF 결합의 억제를 도시하는 ELISA (a) 및 TNF 수용체 검정 (c)를 도시한다. Fab-유사 단편을 지니는 MSA의 첨가는 억제 수준을 감소시킨다. 1 ㎍/ml의 TNFα로 코팅된 ELISA 플레이트를 이중 특이적 Vκ CH 및 VκCκ Fab 유사 단편 및 또한 ELISA 상에서 유사한 시그널을 제공하도록 계산된 농도의 조절 TNFα 결합 dAb로 프로빙하였다. 이중 특이적 및 조절 dAb 둘 모두를 2 mg/ml의 MSA의 존재 및 부재하에 ELISA 플레이트를 프로빙하기 위해 이용하였다. 이중 특이적 웰에서의 시그널을 50% 넘게 감소시켰으나 dAb 웰에서의 시그널은 전혀 감소되지 않았다 (도 19a 참조). 동일한 이중 특이적 단백질도 MSA와 함께 그리고 MSA 없이 수용체 검정으로 처리하였고 MSA에 의한 경쟁도 도시하였다 (도 19c 참조). 이는 이중 특이성에 대한 MSA의 결합이 TNFα에 대한 결합과 경쟁함을 입증한다.
도 20은 TAR1-5-19 dAb 및 MSA16 dAb의 이황화 결합된 이종이량체와 TNF 결합의 억제를 도시하는 TNF 수용체 검정을 도시한다. 이량체를 지닌 MSA의 첨가는 용량 의존적인 방식으로 억제 수준을 감소시킨다. TNF 수용체 검정 (도 19(b))을 일정한 농도의 이종이량체 (18 nM) 및 MSA와 HSA의 연속 희석액의 존재하에 수행하였다. 농도 범위 (2 mg/ml 이하)의 HSA의 존재는 TNFα를 억제하는 이량체의 능력에 있어서 감소를 초래하지 않았다. 그러나, MSA의 첨가는 TNFα를 억제하는 이량체의 능력에 있어서 용량 의존적인 감소를 야기하였다 (도 19a). 이는 MSA 및 TNFα가 cys 결합된 TAR1-5-19, MSA16 이량체로의 결합에 대하여 경쟁함을 입증한다. MSA 및 HSA 단독은 검정에서 TNF 결합 수준에 대하여 아무런 효과도 갖지 않았다.
도 21은 인간 혈청 알부민 (HSA)의 정제된 재조합 도메인이고, 레인 1-3은 각각 HSA 도메인 I, II 및 III을 함유한다.
도 22는 HSA-결합 dAb가 전장 HSA (레인 8) 및 HSA 도메인 II (레인 6)에 결합되나 HSA 도메인 I 및 III (각각 레인 5 및 7)에는 결합되지 않음을 보여주는 면역침전의 예이다. 비-HSA-결합 dAb는 전장 HSA 또는 HSA 도메인 I, II, 또는 III (레인 1-4)을 허물지 않는다.
도 23은 표면 플라스몬 공명에 의해 동정된 dAb에 의해 HSA 도메인 결합을 동정하는 예이다. 연구 중인 dAb를 저밀도 코팅된 인간 혈청 알부민 CM5 센서 칩 (Biacore) 위로 개시된 대로 주사하였다. 포인트 1에서, 연구 중인 dAb는 단지 1μM으로 주사되었다. 포인트 2에서, 보조-주사 지시를 이용하여, 샘플 주사를 피치아 (Pichia)에서 제공된, 1 μM의 dAb 플러스 7 μM의 HSA 도메인 1, 2 또는 3의 혼합물로 스위칭하였다. 포인트 3에서, 샘플 주사를 중단하고, 완충액 흐름을 지속시켰다. 두 상이한 dAb에 대한 결과를 도 23a 및 23b에 도시한다. dAb를 이것이 결합된 HSA 도메인과 함꼐 주입할 때, 이것은 칩 상에서 HSA에 더 이상 결합될 수 없는 복합체를 형성하므로, Biacore 시그널이 포인트 2로 떨어지는데, 이는 dAb, 가용성 HSA 도메인, 및 칩 결합된 HSA 간에 3-원 평형을 반영하는 오프-레이트(off-rate)이다. 도메인이 dAb에 결합되지 않을 때, 시그널은 포인트 2에서 변화되지 않고 유지되고, 포인트 3에서만 떨어지기 시작하며, 여기서 흐름이 완충액으로 스위칭된다. 두 경우 모두에, dAb는 HSA 도메인 2에 결합된다.
도 24는 파지 선택에 의해 동정된 AlbudAb™ (혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 dAb) 클론의 항체 서열을 도시한다. 모든 클론은 인간 생식세포 유전자로 정렬되었다. 생식세포와 동일한 잔기를 '.'로 표시하였다. VH CDR3에서, 기호 '-'는 정렬을 쉽게 하기 위해 사용되었으나 잔기를 나타내는 것은 아니다. 모든 클론을, VH 라이브러리의 경우 중쇄 생식세포 유전자 V3-23/DP47 및 JH4b를 포함하고, 항원 결합 부위의 위치에 혼입된 측쇄 다양성을 갖는 Vκ 라이브러리의 경우 κ 경쇄 유전자 O12/O2/DPK9 및 Jκ1을 포함하는 단일 인간 프레임워크에 기초하여 라이브러리로부터 선택하였다.
도 25는 인간 혈청 알부민의 3개 도메인의 정렬을 도시한다. 시스테인 잔기의 보존을 명백히 확인할 수 있다.
발명의 상세한 설명
정의
"상보적" 두 면역글로불린 도메인이 동족쌍(cognate pairs) 또는 그룹을 형성하는 구조의 패밀리에 속하거나, 이러한 패밀리로부터 유래되며, 이러한 특징을 보유하는 경우에 두 면역글로불린 도메인은 "상보적"이다. 예를들어, 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인은 상보적이고; 두 개의 VH 도메인은 상보적이지 않고, 두 개의 VL 도메인은 상보적이지 않다. 상보적 도메인은 면역글로불린 수퍼패밀리의 다른 구성원, 예를들어 T 세포 수용체의 Vα 및 Vβ (또는 γ 및 δ) 도메인에서 발견될 수 있다. 본 발명의 두 번째 구성과 관련하여, 비-상보적 도메인은 표적 분자에 협력하여 결합되지 않으나 동일하거나 상이한 분자일 수 있는 상이한 표적 에피토프에 대해 독립적으로 작용한다. 인공적인 도메인, 예를들어 그렇게 되도록 공학처리되지 않는 한 에피토프에 결합되지 않는 단백질 골격에 기초한 도메인은 비-상보적이다. 마찬가지로, (예를들어) 면역글로불린 도메인 및 피브로넥틴 도메인에 기초한 두 개의 도메인은 상보적이지 않다.
"면역글로불린" 이것은 두 개의 β 시트 및 보통 보존된 이황화 결합을 보유하는, 항체 분자의 면역글로불린 폴드(fold) 특성을 보유하는 폴리펩티드 패밀리를 의미한다. 면역글로불린 수퍼패밀리의 구성원은 면역계에서의 광범위한 역할(예를들어, 항체, T 세포 수용체 분자 등)을 포함하는 세포 및 비세포 상호작용의 다양한 양태, 세포 부착 (예를들어, ICAM 분자) 및 세포내 신호 전달 (예를들어, 수용체 분자, 예를들어 PDGF 수용체)에 수반된다. 본 발명은 결합 도메인을 지니는 모든 면역글로불린 수퍼패밀리에 적용가능하다. 바람직하게는, 본 발명은 항체에 관한 것이다.
"조합" 본 발명에 따른 가변 도메인은 조합되어 도메인의 그룹을 형성한다; 예를 들어, 상보적 도메인이 조합될 수 있는데, 예컨대 VL 도메인이 VH 도메인과 조합된다. 비-상보적 도메인도 조합될 수 있다. 도메인은 공유 또는 비-공유 수단에 의한 도메인들의 결합을 포함하는 다수의 방식으로 조합될 수 있다.
"도메인" 도메인은 단백질의 나머지와는 독립적인 삼차 구조를 보유하는 폴딩된 단백질 구조이다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 별개의 기능 특성을 담당하고, 많은 경우에 나머지 단백질 및/또는 도메인의 기능의 손실 없이 다른 단백질로 첨가되거나, 제거되거나 이동될 수 있다.
본원에서 사용된 "단일 가변 도메인"은 독립적으로, 즉 에피토프, 항원 또는 리간드에 협력하여 결합되는 또 다른 결합 도메인을 요구하지 않으며 에피토프, 항원 또는 리간드에 특이적으로 결합될 수 있는 도메인이다. 이러한 에피토프, 항원 또는 리간드는 천연 발생이거나, 천연 발생 에피토프, 항원 또는 리간드의 변형물이거나, 합성일 수 있다. 단일 가변 도메인의 "가변" 부분은 본질적으로 각 특정 단일 가변 도메인의 결합 특이성을 결정한다. 따라서, 단일 가변 도메인과 관련된 "가변"이라는 용어는 서열 가변성이 단일 가변 도메인을 통해 고르게 분포되어 있지 않으나 단일 가변 도메인의 프레임워크 또는 골격 부분 사이에 본질적으로 분포되어 있다는 사실을 언급한다. 예를 들어, 항체 단일 가변 도메인에서, 가변성은 상보성 결정 영역 (CDR)으로서 일반적으로 공지된 1 내지 3개의 세그먼트에 집중된다. 하나 이상의 CDR이 경쇄 또는 중쇄의 항체 프레임워크 영역 (FR) 사이에 분포하여 항체 경쇄 단일 가변 도메인 또는 항체 중쇄 단일 가변 도메인을 각각 형성할 수 있고, 이들 각각은 또 다른 결합 도메인의 에피토프에 독립적으로 결합된다. T-세포 수용체 단일 가변 도메인이 유사하게 구성되며, 이의 하나 내지 3개의 CDR이 TCR 프레임워크 도메인 사이에 분포된다.
따라서, 단일 가변 도메인의 결합 특이성을 부여하는 가변 부분은 실질적으로 동일한 남아있는 스캐폴드 부분을 지니는 다른 단일 가변 도메인과 서열에 있어서 광범위하게 상이할 수 있어서 다양한 범위의 결합 특이성을 지닐 수 있다. 단일 가변 도메인의 스캐폴드는 항체 프레임워크 스캐폴드, 일치 항체 프레임워크, 및 세균 단백질로부터 비롯되고/거나 유래된 스캐폴드, 예컨대 GroEL, GroEs, SpA, SpG, 및 진핵 단백질로부터 비롯되고/거나 유래된 스캐폴드, 예컨대 CTLA-4, 리포칼린, 피브로넥틴 등을 포함한다. 단일 가변 도메인의 가변 부분의 한 공급원은 하나 이상의 CDR을 포함하며, 이것은 비-면역글로불린 스캐폴드 뿐만 아니라 항체 프레임워크 스캐폴드로 그래프팅되어 항체 단일 가변 도메인을 생성할 수 있다. 단일 가변 도메인에 있어서 변이의 또 다른 공급원은 피브로넥틴과 같은 비-면역글로불린 프레임워크 스캐폴드에 있어서 선택된 위치의 다양화일 수 있으며, 이는 NNK 코돈 변화와 같은 분자 생물학 기술을 이용하여 단일 가변 도메인을 생성한다. 유사하게는, 이러한 변이의 공급원이 항체 단일 가변 도메인에도 적용될 수 있다.
항체 단일 가변 도메인은 항체 생성 종에 의해 엔코딩되고/거나 생성된 항체 서열로부터 유래될 수 있고, 하나 이상의 프레임워크 영역 또는 프레임워크 일치 서열, 및/또는 하나 이상의 CDR을 포함하는, 항체 가변 영역의 단편(들) 및/또는 유도체를 포함한다. 따라서, 항체 단일 가변 도메인은 항체 경쇄 가변 영역, 또는 항체 중쇄 가변 영역, 또는 항체 VHH 영역의 단편(들) 및/또는 유도체(들)을 포함한다. 예를 들어, 항체 VHH 영역은 카멜리드: 예컨대, 낙타 및 라마에 내인성인 것들, 및 너스(nurse) 및 우베공(wobbegong) 상어로부터의 신규한 항원 수용체(NAR) (Roux et al., 1998 PNAS 95(20): 11804-9) 및 얼룩 래트피쉬로부터의 VH 영역 (Rast et al., 1998 Immunogenetics 47:234-245)을 포함한다. 항체 경쇄 가변 도메인 및 항체 중쇄 가변 도메인은 인간, 마우스, 래트, 돼지, 시노몰거스, 햄스터, 말, 암소, 염소, 개, 고양치 및 조류 종, 예컨대 인간 V카파 및 인간 VH3을 포함하나 바람직하게는 이로 제한되지 않는 동물 종에 각각 내인성인 것들을 포함한다. 항체 경쇄 가변 영역 및 항체 중쇄 가변 영역도 상술한 대로 V 영역 패밀리, 예컨대 VH3 패밀리의 것들을 포함하는 일치 항체 프레임워크를 포함한다. T-세포 수용체 단일 가변 도메인은 T-세포 수용체 사슬(들), 예컨대 α, β, γ 및 δ 사슬로부터 유래되고, 항체 단일 가변 도메인과 유사하게 그 에피토프, 항원 또는 리간드에 대한 또 다른 결합 도메인과 독립적으로 에피토프 또는 항원 또는 리간드에 결합되는 단일 가변 도메인이다.
항체 단일 가변 도메인은 또한 항체 또는 T-세포 수용체로부터 유래되고, 스캐폴드에 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3, 이의 유도체 또는 단편, 또는 전체 항체 V 도메인 중 하나 이상을 포함시킴에 의해, 공학처리되기 전 상태에 비해 결합 특이성에 있어서 다양성을 나타내도록 유전적으로 공학처리된 스캐폴드를 포함하는 단백질 도메인을 포함한다. 항체 단일 가변 도메인은 아래 기술된 GroEL 단일 가변 도메인 다량체에 의해 예시된 면역글로불린 스캐폴드 및 비-면역글로불린 스캐폴드 둘 모두를 포함할 수 있다. 바람직하게는, CDR(들)은 항체 사슬, 예컨대 VH, VL, 및 VHH의 항체 V 도메인으로부터 온 것이다. 항체 사슬은 두 번째 항체 사슬과 함께 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합된 것일 수 있거나, 두 번째 항체 사슬, 예컨대 VHH 사슬과 독립적으로 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합된 것일 수 있다. 비-면역글로불린 스캐폴드를 포함하는 항체 단일 가변 도메인에 하나 이상의 CDR을 통합시키는 것은 그 에피토프, 항원 또는 리간드에 대한 또 다른 결합 도메인과 독립적으로 에피토프 또는 항원 또는 리간드에 특이적으로 결합되는 비-면역글로불린 스캐폴드의 단일 가변 도메인의 능력을 초래하여야 한다.
단일 도메인은 결합 부위가 되도록 고안된 부위(들)에 다양성을 도입시키고, 예를 들어 디스플레이 기술을 이용하여 요망되는 결합 특성에 대해 선택함으로써 단일 가변 도메인으로 형질전환된다. 다양성은 스캐폴드의 특이적 루프의 아미노산 서열을 랜덤화함에 의해, 예컨대 NNK 코돈을 도입함에 의해 관심있는 비-면역글로불린 스캐폴드의 특이적 부위에 도입될 수 있다. 다양성 생성 이후 요망되는 결합 특성을 선택하는 이러한 메카니즘은 천연적으로 항체 결합 부위를 구성하는 루프에서 생성된 다양성으로부터 초래되는 고 친화력, 항원-특이적 항체의 자연 그대로의 선택과 유사하다. 전형적으로, 소형이며 항체 루프의 것과 유사한 폴드를 함유하는 단일 도메인이 단일 가변 도메인으로 형질전환되고, 단일 가변 도메인의 변이체가 발현되며, 이로부터 요망되는 결합 특이성 및 특성을 함유하는 단일 가변 도메인이 다수의 단일 가변 도메인의 변이를 함유하는 라이브러리로부터 선택될 수 있다.
단일 가변 도메인의 명명법: 때로 항체 단일 가변 도메인의 명칭은 처음 "d" 또는 문자 "Dom"을 생략하여 쓰며, 예를 들어 Ab7h24는 dAb7h24와 동일하며, 이것은 DOM7h24와 동일한 것이다.
항체 단일 가변 도메인은 항체 가변 도메인의 서열 특성을 포함하는 폴딩된 폴리펩티드 도메인을 의미한다. 따라서, 이것은 완전한 항체 가변 도메인 및 개질된 가변 도메인을 포함하며, 예를 들어 여기서 하나 이상의 루프가 항체 가변 도메인의 특색을 이루지 않는 서열, 또는 트렁케이션되거나 N- 또는 C-말단 연장부를 포함하는 항체 가변 도메인 뿐만 아니라 전장 도메인의 결합 활성 및 특이성을 적어도 부분적으로 보유하는 가변 도메인의 폴딩된 단편에 의해 교체된다.
"레퍼토리"라는 용어는 다양한 변이체, 예를들어 1차 서열에 있어서 상이한 다른 폴리펩티드 변이체의 집합을 의미한다. 본 발명에 사용되는 라이브러리는 1000개 이상의 구성원을 포함하는 폴리펩티드의 레퍼토리를 포함할 것이다.
"라이브러리" 이 용어는 이종 폴리펩티드 또는 핵산의 혼합물을 의미한다. 라이브러리는 각각이 단일 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 지니는 구성원으로 구성된다. 이러한 맥락에서, "라이브러리"와 "레퍼토리"는 유의어이다. 라이브러리 구성원 사이의 서열 차이는 라이브러리에 존재하는 다양성을 책임진다. 라이브러리는 폴리펩티드 또는 핵산의 단순한 혼합물의 형태를 취하거나, 핵산의 라이브러리로 형질전환된 유기체 또는 세포, 예를들어 세균, 바이러스, 동물 또는 식물 세포 등의 형태일 수 있다. 바람직하게는, 각각의 개별적 유기체 또는 세포는 단지 하나 또는 제한된 수의 라이브러리 구성원을 함유한다. 유리하게는, 핵산이 발현 벡터로 통합되어, 핵산에 의해 엔코딩된 폴리펩티드의 발현을 가능케 한다. 따라서, 한 바람직한 측면에서, 라이브러리는 각각의 유기체가 상응하는 폴리펩티드 구성원을 생성시키기 위해 발현될 수 있는 핵산 형태의 라이브러리의 단일 구성원을 함유하는 발현 벡터의 하나 이상의 복사체를 함유하는, 숙주 유기체의 개체군의 형태를 취할 수 있다. 따라서, 숙주 유기체의 개체군은 유전적으로 다양한 폴리펩티드 변이체의 광범위한 레퍼토리를 엔코딩하는 잠재성을 지닌다.
"폐쇄 형태 다중-특이적 리간드"는 본원에 정의된 둘 이상의 에피토프 결합 도메인을 포함하는 본원에 정의된 다중-특이적 리간드를 기술한다. '폐쇄 형태'(다중-특이적 리간드)라는 용어는 리간드의 에피토프 결합 도메인이, 한 에피토프 결합 도메인에 의한 에피토프 결합이 또 다른 에피토프 결합 도메인에 의한 에피토프 결합과 경쟁하도록 배열된 것을 의미한다. 즉, 동족 에피토프가 개별적으로 각 에피토프 결합 도메인에 의해 결합될 수 있으나, 동시에 결합되는 것은 아니다. 리간드의 폐쇄 형태는 본원에 기술된 방법을 이용하여 달성될 수 있다.
"항체" 천연적으로 항체를 생성하는 임의의 종으로부터 유래되거나, 재조합 DNA 기술에 의해 생성되고; 혈청, B 세포, 하이브리도마, 트랜스펙토마(transfectoma), 효모 또는 세균로부터 단리되든지 간에, 항체 (예를 들어, IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE) 또는 단편 (예를들어, Fab, F(ab')2, Fv, 이황화 결합된 Fv, scFv, 폐쇄 형태의 다중특이적 항체, 이황화 결합된 scFv, 디아보디)을 언급한다.
"이중특이적 리간드"는 본원에 정의된 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드로서, 상기 가변 도메인은 단일특이적 면역글로불린에 의해 일반적으로 결합되지 않는 두 개의 상이한 항원 또는 동일한 항원의 두 개의 에피토프에 결합될 수 있다. 예를 들어, 두개의 에피토프는 동일한 합텐일 수 있으나, 동일한 에피토프가 아니거나 단일특이적 리간드에 의해 결합되기에 충분히 인접하지 않다. 본 발명에 따른 이중특이적 리간드는 상이한 특이성을 지니는 가변 도메인으로 구성되고, 동일한 특이성을 지니는 서로 상보적인 가변 도메인쌍을 함유하지 않는다. 따라서, 본원에 정의된 두 단일 가변 도메인을 함유하는 이중 특이적 리간드는 본원에 정의된 둘 이상의 단일 가변 도메인을 함유하는 다량체 리간드의 서브셋이고, 여기에서 단일 가변 도메인 중 둘 이상은 두 개의 상이한 항원 또는 동일한 항원 상에 있는 두 개의 상이한 에피토프에 결합될 수 있다. 추가로, 본원에 정의된 이중 특이적 리간드는 항체 단일 가변 도메인, 및 단일 가변 도메인이 아닌 두 번째 항원 및/또는 에피토프 결합 도메인을 포함하는 리간드와 별개이다. 추가로, 본원에 정의된 이중 특이적 리간드는 제1 및 제2 항원/에피토프 결합 도메인을 함유하는 리간드와 별개이며, 여기서 항원/에피토프 결합 도메인은 본원에 정의된 단일 가변 도메인이 아니다.
"항원"은 본 발명에 따른 리간드에 의해 결합되는 분자이다. 통상적으로, 항원은 항체 리간드에 의해 결합되고, 생체내에서 항체 반응을 일으킬 수 있다. 이는 폴리펩티드, 단백질, 핵산 또는 기타 분자일 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 이중특이적 리간드는 특정 항원에 대한 특이성을 표적으로 하기 위해 선택된다. 통상적인 항체 및 이의 단편의 경우, 가변 루프 (L1, L2, L3 및 H1, H2, H3)로 규정된 항체 결합 부위가 항원에 결합될 수 있다.
"에피토프"는 면역글로불린 VH/VL 쌍에 의해 통상적으로 결합된 구조의 유닛이다. 에피토프는 항체에 대한 최소 결합 부위를 규정하고, 따라서 항체의 특이성 표적을 나타낸다. 단일 도메인 항체의 경우, 에피토프는 단리시 가변 도메인에 의해 결합된 구조의 유닛을 의미한다. 에피토프 결합 도메인은 단백질 스캐폴드 및 에피토프 상호작용 부위 (단백질 스캐폴드의 표면 상에 있는 것이 유리하다)를 포함한다. 에피토프 결합 도메인은 비선형 에피토프 상호작용 부위를 포함할 수 있고, 예컨대 여기서 에피토프 결합 도메인은 FR에 의해 분리된 CDR과 같은, 이들 사이에 개재 영역을 지니는 다중 에피토프 상호작용 부위를 포함하거나, 분리된 폴리펩티드 사슬 상에 존재한다. 대안적으로, 에피토프 결합 도메인은 하나의 폴리펩티드 사슬 상에서 연속하여 엔코딩된 아미노산으로 구성된 선형 에피토프 상호작용 부위를 포함할 수 있다.
"제네릭 리간드"는 레퍼토리의 모든 구성원에 결합되는 리간드를 언급한다. 일반적으로 상기 정의된 대로 항원 결합 부위를 통해 결합되지 않는다. 비제한적인 예로는 단백질 A, 단백질 L 및 단백질 G가 있다.
"선택"은 스크리닝에 의해 유도되거나, 다윈적(Darwinian) 선택 공정에 의해 유도되며, 여기서 결합 상호작용은 도메인과 항원 또는 에피토프간 또는 항체와 항원 또는 에피토프간에 이루어진다. 따라서, 제1 가변 도메인은 상보적인 가변 도메인의 존재 또는 부재하에 항원 또는 에피토프와의 결합에 대해 선택될 수 있다.
"유니버셜 프레임워크(universal framework)"는 카바트의 문헌["Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services]에 의해 정의된 서열에 보존된 항체의 영역 또는 문헌[Chothia and Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:910-917]에 정의된 인간 생식세포 면역글로불린 레퍼토리 또는 구조에 상응하는 단일 항체 프레임워크 서열이다. 본 발명은 과변이 영역 단독에서의 변이를 통한 실질적으로 임의의 결합 특이성의 유도를 허용하는 것으로 밝혀진, 단일 프레임워크, 또는 상기 프레임워크의 세트의 용도를 제공한다.
본원에서 사용된 "컨주게이트"는 약물에 결합된 혈청 알부민에 결합되는 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 언급한다.
본원에서 사용된 "소 분자"라는 용어는 분자량이 1,500 돌턴 미만, 바람직하게는 1000 돌턴 미만인 화합물을 의미한다.
상기 컨주게이트는 "약물 컨주게이트"를 포함하며, 이는 약물이 공유적으로 결합되어 있는 혈청 알부민에 결합되는 항체의 항원-결합 단편을 포함하고, 비공유 약물 컨주게이트"는 약물이 비공유적으로 결합되어 있는 혈청 알부민에 결합되는 항체의 항원-결합 단편을 포함한다.
본원에서 사용된 "약물 컨주게이트"는 약물이 공유적으로 결합되어 있는 혈청 알부민에 결합되는 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을 언급한다. 약물은 적합한 링커 부분을 통해 직접적으로 또는 간접적으로 항원-결합 단편에 공유적으로 결합될 수 있다. 약물은 아미노-말단, 카르복실-말단과 같은 임의의 적합한 위치에서 또는 적합한 아미노산 측쇄 (예컨대, 리신의 아미노기)를 통해 항원-결합 단편에 결합될 수 있다.
"반감기"는 예를들어 천연 메커니즘에 의한 리간드의 분해 및/또는 리간드의 제거 또는 분리로 인해, 생체 내에서 리간드의 혈청 농도가 50%로 감소되는데 걸리는 시간이다. 본 발명에 따른 리간드는 생체 내에서 안정적이고, 이들의 반감기는 분해 및/또는 제거 또는 분리에 내성인 분자로의 결합에 의해 증가된다. 통상적으로, 이러한 분자는 스스로 생체 내에서 긴 반감기를 지니는 천연 발생 단백질이다. 리간드의 반감기는 기능 활성이 반감기 증가 분자에 대해 특이적이지 않은 유사한 리간드보다 긴 기간 동안 생체 내에서 지속되는 경우에 증가된다. 따라서, HSA에 특이적인 리간드 및 표적 분자는 HSA에는 결합하지 않지만 다른 분자에는 결합하는 HSA에 대한 특이성이 존재하지 않는 동일한 리간드와 비교된다. 예를들어, 세포 분자상의 제2 에피토프에 결합될 수 있다. 통상적으로, 반감기는 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 이를 초과하여 증가된다. 2x, 3x, 4x, 5x, 10x, 2Ox, 30x, 4Ox, 50x 또는 이를 초과하는 범위의 반감기의 증가가 가능하다. 대안적으로 또는 추가로, 30x, 40x, 50x, 6Ox, 7Ox, 80x, 9Ox, 10Ox, 150x 이하의 범위의 반감기의 증가가 가능하다.
리간드의 T 베타 반감기를 숙주의 혈청 알부민의 T 베타 반감기와 비교하기 위해 이용된 "실질적으로 동일한"이라는 표현은 숙주 리간드의 T 베타 반감기가 동일한 숙주, 바람직하게는 인간 숙주 자체의 혈청 알부민의 T 베타 반감기로부터 50% 이하로 변화됨을 의미하며, 예컨대 이러한 리간드의 T 베타 반감기는 특정된 숙주의 혈청 알부민의 T 베타 반감기보다 50% 이하만큼 더 적거나 50% 이하만큼 더 크다. 바람직하게는, "실질적으로 동일한"이라는 표현을 언급할 때, 숙주의 리간드의 T 베타 반감기는 혈청 알부민 자체의 반감기로부터 20% 내지 10% 이하로 변화되고, 보다 바람직하게는 혈청 알부민 자체의 반감기로부터 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1%, 또는 그 미만으로 변화되거나, 혈청 알부민 자체의 반감기로부터 전혀 변화가 없다.
대안적으로, 리간드의 T 베타 반감기를 숙주의 혈청 알부민의 T 베타 반감기와 비교하기 위해 이용된 "실질적으로 동일하지 않은"이라는 표현은 숙주 리간드의 T 베타 반감기가 동일한 숙주, 바람직하게는 인간 숙주 자체의 혈청 알부민의 T 반감기로부터 50% 이상 변화되는 것을 의미하며, 예컨대 리간드의 T 베타 반감기는 특정된 숙주의 혈청 알부민의 T 베타 반감기보다 50%를 초과하여 더 크다.
"동종 면역검정법"은 결합된 시약과 결합되지 않은 시약을 분리하는 단계를 요구하지 않으며 분석물이 검출되는 면역검정법이다.
"실질적으로 동일한" 또는 "실질적으로 상동"이라는 것은 제1 및 제2 아미노산 또는 누클레오티드 서열이 유사한 활성을 지니도록 제1 아미노산 또는 누클레오티드 서열이 제2 아미노산 또는 누클레오티드 서열과 충분히 동일하거나 동등한 (예컨대, 유사한 측쇄, 예컨대 보존된 아미노산 치환을 지님) 수의 아미노산 잔기 또는 누클레오티드를 함유하는 것을 의미한다. 본원에 개시된 제1 및 제2 항체 및/또는 단일 가변 도메인의 경우, 제2 항체 또는 단일 가변 도메인은 첫 번째 것과 동일한 결합 특이성을 지니고 제1 항체 또는 단일 가변 도메인의 친화력의 50% 이상, 또는 적어도 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 이하의 친화력을 지닌다.
본원에 기술된 용어 "저 엄격성(low stringency)", "중간 엄격성", "고 엄격성" 또는 "매우 높은 엄격성 조건"은 핵산 하이브리드화 및 세척에 대한 조건을 기술한다. 하이브리드화 반응을 수행하는 가이드는 본 발명에서 전체가 참조로 통합되는 문헌(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.(1989), 6.3.1-6.3.6)에 기재되어 있다. 수용성과 비수용성 방법이 상기 참고문헌에 기재되어 있으며, 상기 방법이 모두 사용될 수 있다. 본원에서 기술되는 특정 하이브리드화 조건은 다음과 같다: (1) 약 45℃에서 6X 염화나트륨/구연산나트륨 (SSC)에 저 엄격성 하이브리드화 조건으로, 그 다음은 적어도 50℃ (세척 온도는 저엄격성 조건에 비해 55℃까지 올릴 수 있다)에서 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 두번의 세척을 거친다; (2) 약 45℃에서 6X SSC에 중간 엄격성 하이브리드화 조건으로, 그 다음은 60℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS에 한번 이상의 세척을 거친다; (3) 약 45℃에서 6X SSC에 고 엄격성 하이브리드화 조건과, 65℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 한번 이상의 세척을 거친다; (4) 매우 높은 하이브리드화 조건은 65℃에서 0.5M 인산나트륨, 7% SDS이고, 다음은 65℃에서 0.2X SSC, 1% SDS에서 한번 이상의 세척을 거친다. 매우 높은 엄격성 조건(4)이 바람직한 조건이며 다른 것으로 특정이 되지 않는다면 사용되어야 한다.
"표면 플라스몬 공명" 경쟁 검정을 이용하여 인간 혈청 알부민과 같은 특이적 항원 또는 에피토프가 시노몰거스 혈청 알부민과 같은 또 다른 항원 또는 에피토프와 본원에 개시된 혈청 알부민 결합 리간드, 예컨대 특이적 dAb와의 결합에 대해 경쟁하는지를 결정할 수 있다. 유사하게, 경쟁 검정은 dAb와 같은 제1 리간드가 표적 항원 또는 에피토프와의 결합에 대해 dAb와 같은 제2 리간드와 경쟁하는지를 결정하는데 이용될 수 있다. 본원에서 사용된 "경쟁하다"는 둘 이상의 분자간 특이적 결합 상호작용을 임의의 한도로 방해할 수 있는 물질, 예컨대 분자, 화합물, 바람직하게는 단백질을 언급한다. "경쟁적으로 억제하지 않는다"라는 표현은 물질, 예컨대 분자, 화합물, 바람직하게는 단백질이 둘 이상의 분자간 특이적 결합 상호작용을 임의의 측정가능하거나 현저한 정도로 방해하지 않는 것을 의미한다. 둘 이상의 분자간 특이적 결합 상호작용은 바람직하게는 단일 가변 도메인 및 이의 동족 파트너 또는 표적간 특이적 결합 상호작용을 포함한다. 방해하거나 경쟁하는 분자는 또 다른 단일 가변 도메인이거나 동족 파트너 또는 표적과 구조적으로 및/또는 기능적으로 유사한 분자일 수 있다.
단일 가변 도메인은 항체 중쇄 또는 항체 경쇄 단일 가변 도메인을 포함하는 면역글로불린 가변 도메인, 예컨대 항체 가변 도메인으로부터의 1, 2, 3 또는 이를 초과하는 CDR 영역을 함유하는 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 비-면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함한다. 단일 가변 도메인은 인간, 래트, 마우스, 돼지, 원숭이, 카멜리드, 예컨대 항체 가변 (V) 영역을 포함하는 동물로부터 유래될 수 있거나, GroEL 및 GroEs의 비-면역글로불린 스캐폴드의 경우 대장균 (E. coli)과 같은 미생물로부터 유래될 수 있다. 단일 가변 도메인은 부분적으로 또는 완전히 인공적일 수 있거나, 재조합 분자 생물학 기술을 이용하여 생성될 수 있다.
표적과의 결합에 대해 또 다른 표적 결합 도메인, 예컨대 또 다른 단일 가변 도메인과 경쟁하는 단일 가변 도메인의 능력을 결정하고 Kd를 결정하는 시험관내 경쟁 검정은 당 분야에 공지되어 있다. 한 바람직한 경쟁 검정은 표면 플라스몬 공명 검정이며, 이는 광범한 범위의 단백질 농도에 걸쳐 신속하고 민감하고 유용하며, 소량의 샘플 물질을 요구하는 이점을 지닌다. 바람직한 표면 플라스몬 공명 검정의 경쟁은 경쟁 Biacore 실험이다. 경쟁 Biacore 실험은, 예를 들어 시노몰거스 혈청 알부민 및 인간 혈청 알부민이 dAb DOM7h-x와 같은 리간드와의 결합에 대해 경쟁하는 지를 결정하는데 이용될 수 있다. 이러한 예에 대한 한 실험 프로토콜은 다음과 같다.
예를 들어, CM5 센서 칩 (Biacore AB)을 대략 1000 공명 유닛 (RU)의 인간 혈청 알부민 (HSA)으로 25℃에서 코팅한 후, 정제된 dAb를 단일 농도 (예컨대, 1 um)만으로, 및 시노몰거스 혈청 알부민 (CSA)의 연속 희석액과 함께 항원 표면 상에 주입한다. HSA의 연속 희석액을 일정 농도 (40 nM)의 정제된 dAb와 혼합하였다. 적합한 CSA의 연속 희석액은 5 uM CSA에서 시작되며, 6회의 2배 희석은 78 nM CSA까지 내려간다. 이러한 용액들은 주입 전에 평형에 도달하여야 한다. 주입 후, 반응 판독을 수행하여 dAb 단독 및 여러 dAb/CSA 혼합물 각각에 대해 생성된 결합 RU를 측정하며, 데이터를 BIA 평가 소프트웨어에 따라 이용하여, HSA가 고정된 칩에 대한 AlbudAb™의 (혈청 알부민에 특이적으로 결합된 dAb) 결합의 CSA 억제 각각에 대하여 용량-반응 곡선을 생성한다. dAb만의 결합된 RU를 dAb + CSA의 결합된 RU와 비교하여, CAS가 dAb와의 결합에 대해 HSA와 경쟁하는 지를 확인할 수 있다. 만약 이것이 경쟁한다면, 용액의 CSA 농도가 증가함에 따라, HSA에 결합된 dAb의 RU가 감소할 것이다. 경쟁이 없다면, CSA의 첨가는 dAb가 HSA에 얼마나 많이 결합되는 지에 아무런 영향을 미치지 않을 것이다.
당업자는 혈청 알부민에 결합되는 본원에 개시된 여러 리간드를 포함하는 다양한 여러 리간드에 대하여 상기 경쟁 검정을 수행하기 위해 상기 프로토콜 또는 다른 프로토콜을 어떻게 적용시킬 지를 알고 있을 것이다. 다양한 리간드는 면역글로불린 및/또는 비-면역글로불린 스캐폴드를 포함하는 단일 가변 도메인을 포함하는 단량체 단일 가변 도메인, dAbs, 이중 특이적 리간드 및 이러한 리간드의 다량체를 포함하나 이로 제한되지 않는다. 당업자는 상기 경쟁 검정을 이용하여 리간드에 대한 항원 및/또는 에피토프의 여러 상이한 쌍의 결합을 비교하기 위해 상기 프로토콜을 어떻게 적용시킬 지를 알고 있을 것이다.
이러한 경쟁 실험은 항원 또는 에피토프가 특이적 리간드, 바람직하게는 dAB와의 결합에 대해 또 다른 항원 또는 에피토프와 경쟁하는 지를 결정할 수 있는 수치적 컷-오프(cut-off)를 제공할 수 있다. 예를 들어, 상기 개요된 실험에서, 용액의 5 μM CSA가 HSA에 결합되는 dAb의 RU에 있어서 10% 이하의 감소를 초래할 때, 결합에 대해 경쟁은 없는 것으로 고려된다. 따라서, CSA의 존재하에 HSA에 대한 dAb의 결합의 RU에 있어서 10%를 초과하는 감소는 HSA에 결합되는 dAb의 결합이 CSA에 의해 경쟁됨을 나타낼 것이다. HSA에 결합되는 dAb의 RU에 있어서 10% 미만의 감소는 HSA에 결합되는 dAb에 대하여 CSA에 의한 경쟁이 존재하지 않음을 나타낼 것이고, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 및 1%의 감소는 점진적으로 경쟁의 부재를 나타내기 위한 보다 엄격한 요건이다. HSA에 결합되는 dAb의 RU가 더 크게 감소할수록, 경쟁이 더 커진다. 따라서, 증가된 수준의 경쟁은 HSA에 결합되는 RU의 퍼센트 감소에 따라 등급이 매겨질 수 있고, 즉 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 이하의 감소이다.
본원에 이용된 단편은 서열의 100% 미만 (예컨대, 99%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 이하 등)이나, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 이상의 연속하는 아미노산을 포함하는 서열을 언급한다. 단편은 관심있는 혈청 알부민 결합이 1 x 10-6 M 이하의 친화력을 유지하기에 충분한 길이이다. 본원에 이용된 단편은 표적에 대해 생성된 단일 도메인 항체에 결합되는 변경된 폴리펩티드의 능력을 실질적으로 변화시키지 않는 하나 이상의 아미노산의 임의적 삽입체, 결실체 및 치환체를 언급한다. 아미노산 삽입체, 결실체 또는 치환체의 수는 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 또는 70개 아미노산 이하이다.
발명의 상세한 설명
달리 정의되지 않는 한, 본원에 이용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자가 보통 이해하는 것과 동일한 의미를 지닌다 (예컨대, 세포 배양, 분자 유전학, 핵산 화학, 하이브리드화 기술 및 생화학). 표준 기술이 분자, 유전자 및 생화학 방법 (참조, 일반적으로 Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. and Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc. 본원에 참조로서 포함됨) 및 화학적 방법에 대해 이용된다. 표면 플라스몬 공명 검정에 대한 표준 기술은 문헌[Jan Terje Andersen et al. (2006) Eur. J. Immunol. 36:304-3051 Fagerstam (1991) Tech. Protein Chem. 2:65-71, and Johnsson et al (1991) Anal. Biochem 198:268-277]을 포함한다.
면역글로불린 기재 다중-특이적 리간드의 제조
본 발명의 요망되는 구성에 따른 형태에 있어서 이것이 개방이든 폐쇄이든 간에, 본 발명에 따른 다중 특이적 리간드는 scFv, "파지" 항체 및 공학처리된 다른 항체 분자의 제조를 위해 항체 공학처리 분야에서 사용되는 이미 확립된 기술에 따라 제조될 수 있다. 항체, 및 특히 2특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 예를들어 하기 문헌 및 여기에 인용된 참고문헌에 기재되어 있다: Winter & Milstein, (1991) Nature 349:293-299; Plueckthun (1992) Immunological Reviews 130:151-188; Wright et al, (1992) Crit. Rev. Immunol.12: 125-168; Holliger, P. & Winter, G. (1993) Curr. Op. Biotechn. 4, 446-449; Carter, et al. (1995) J. Hematother. 4, 463-470; Chester, K.A. & Hawkins, R.E. (1995) Trends Biotechn. 13, 294-300; Hoogenboom, H.R. (1997) Nature Biotechnol. 15, 125-126; Fearon, D. (1997) Nature Biotechnol. 15, 618-619; Pluckthun, A. & Pack, P. (1997) Immunotechnology 3, 83-105; Carter, P. & Merchant, A.M. (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8, 449-454; Holliger, P. & Winter, G. (1997) Cancer Immunol. Immunother. 45,128-130.
본 발명은 두 상이한 항원 또는 에피토프에 대한 가변 도메인의 선택, 및 가변 도메인의 후속적인 조합을 제공한다.
가변 도메인을 선택하기 위해 적용된 기술은 당 분야에 공지된 라이브러리 및 선택 절차를 이용한다. 인간 B 세포로부터 회수된 재정렬된 V 유전자를 이용하는 천연 라이브러리 (Marks et al (1991) J. Mol . Biol, 222: 581; Vaughan et al. (1996) Nature Biotech, 14: 309)가 당업자에게 널리 공지되어 있다. 일반적으로 PCR을 이용하여 면역글로불린 V 유전자를 클로닝함에 의해 합성 라이브러리를 제조한다 (Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol . Biol, 227: 381; Barbas et al (1992) Proc. Natl Acad . Sci . USA, 89: 4457; Nissim et al (1994) EMBO J, 13: 692; Griffiths et al. (1994) EMBO J, 13: 3245; De Kruif et al. (1995) J Mol . Biol, 248: 97). PCR 과정에서의 오류는 고도의 랜덤화를 초래할 수 있다. VH 및/또는 VL 라이브러리는 표적 항원 또는 에피토프에 대해 개별적으로 또는 함께 선택될 수 있고, 개별적으로 선택되는 경우 단일 도메인 결합이 각각에 대해 직접 선택된다.
본 발명에 따른 이중 특이적 리간드를 제조하기 위한 바람직한 방법은 가변 도메인의 레퍼토리가 제1 항원 또는 에피토프에 대한 결합에 대해 선택되고 가변 도메인의 레퍼토리가 제2 항원 또는 에피토프에 대한 결합에 대해 선택되는 선택 시스템을 이용하는 것을 포함한다. 선택된 가변 제1 및 제2 가변 도메인을 이후에 조합시키고 이중-특이적 리간드를 제1 및 제2 항원 또는 에피토프 둘 모두와의 결합에 대해 선택하였다. 단리시에 동시에 일어나는 것이 아닌 제1 및 제2 항원 또는 에피토프와의 결합 둘 모두에 대해 폐쇄 형태 리간드를 선택한다.
A. 라이브러리 벡터 시스템
본 발명에서 사용하기에 적합한 다양한 선택 시스템이 당 분야에 공지되어 있다. 이러한 시스템의 예가 하기 기재된다.
박테리오파지 람다 발현 시스템은 박테리오파지 플라크로서 또는 리소겐(lysogen)의 콜로니로서 직접 스크리닝될 수 있는데, 이 둘 모두는 이미 공지되어 있고 (Huse et al. (1989) Science, 246: 1275; Caton and Koprowski (1990) Proc. Natl . Acad . Sci . U.S.A., 87; Mullinax et al. (1990) Proc . Natl . Acad . Sci. U.S.A., 87: 8095; Persson et al. (1991) Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A., 88: 2432), 본 발명에서 사용된다. 이러한 발현 시스템은 라이브러리의 106개 이하의 상이한 구성원을 스크리닝하는 데에 사용될 수 있지만, 보다 많은 수 (106개가 넘는 구성원)를 스크리닝하는 데에는 실제로 적합하지 않다.
라이브러리를 작제하는 데에 있어서 특히 사용되는 것은 선택 디스플레이 시스템이며, 이는 핵산을 이러한 핵산이 발현하는 폴리펩티드에 결합될 수 있게 한다. 본원에서 사용된 선택 디스플레이 시스템은 제네릭(generic) 리간드 및/또는 표적 리간드와 결합함으로써 적절한 디스플레이 수단에 의한 라이브러리의 개개의 구성원의 선택을 가능하게 하는 시스템이다.
거대한 라이브러리의 요망되는 구성원을 분리하기 위한 선택 프로토콜은 당 분야에 공지되어 있는데, 대표적으로 파지 디스플레이 기술이 있다. 다양한 펩티드 서열이 섬유상 박테리오파지의 표면상에서 디스플레이되는 이러한 시스템 (Scott and Smith (1990) Science, 249: 386)은 표적 항원과 결합하는 특이적 항체 단편의 시험관내 선택 및 증폭을 위해 항체 단편 (및 이를 엔코딩하는 누클레오티드 서열)의 라이브러리를 생성시키는 데에 유용한 것으로 입증되었다 (McCafferty et al., WO 92/01047). VH 및 VL 영역을 엔코딩하는 누클레오티드 서열은 리더 시그널을 엔코딩하는 유전자 단편에 연결되어 있고, 상기 리더 시그널은 상기 영역을 대장균 (E. coli)의 원형질막주위 공간으로 유도하는데, 그 결과 생성된 항체 단편은 통상적으로 박테리오파지 외피 단백질 (예를들어, pIII 또는 pVIII)에 융합된 형태로서 박테리오파지의 표면상에서 디스플레이된다. 대안적으로, 항체 단편은 람다 파지 캡시드 (파지보디(phagebody))상에서 외부로 디스플레이된다. 파지 기재 디스플레이 시스템의 장점은 이러한 시스템이 생물학적 시스템이므로 선택된 라이브러리 구성원이 선택된 라이브러리 구성원을 함유하는 파지를 세균 세포에서 단순히 증식시킴으로써 증폭될 수 있다는 것이다. 또한, 폴리펩티드 라이브러리 구성원을 엔코딩하는 누클레오티드 서열이 파지 또는 파지미드 벡터에 함유되어 있으므로, 발현 및 후속 유전자 조작이 비교적 간단하다.
박테리오파지 항체 디스플레이 라이브러리 및 람다 파지 발현 라이브러리를 구성하는 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다 (McCafferty et al. (1990) Nature, 348: 552; Kang et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88: 4363; Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624; Lowman et al. (1991) Biochemistry, 30: 10832; Burton et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88: 10134; Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133; Chang et al. (1991) J. Immunol., 147: 3610; Breitling et al. (1991) Gene, 104: 147; Marks et al. (1991) supra; Barbas et al., (1992) supra; Hawkins and Winter (1992) J. Immunol., 22: 867; Marks et al., 1992, J. Biol. Chem., 267: 16007; Lerner et al. (1992) Science, 258: 1313; 이들 문헌은 본원에 참조로 포함됨).
특히 유리한 한 가지 방법은 scFv 파지-라이브러리를 사용하는 것이다 (Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 85: 5879-5883; Chaudhary et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 87: 1066-1070; McCafferty et al (1990) supra; Clackson et al (1991) Nature, 352: 624; Marks et al (1991) J. Mol. Biol, 222: 581; Chiswell et al. (1992) Trends Biotech., 10: 80; Marks et al. (1992) J. Biol. Chem., 267). 박테리오파지 외피 단백질상에서 디스플레이된 scFv 라이브러리의 다양한 구체예가 기술되어 있다. 파지 디스플레이 방법의 정교화된 형태가 또한 알려져 있는데, 예를들어 본원에 참조로 포함되는 WO96/06213과 WO92/01047 (Medical Research Council et al.) 및 WO97/08320 (Morphosys)에 기재되어 있다.
폴리펩티드 라이브러리를 생성하는 기타 시스템은 라이브러리 구성원의 시험관내 합성을 위한 무세포 효소 기작의 사용을 포함한다. 한 방법에서, RNA 분자는 표적 리간드에 대한 선택 및 PCR 증폭을 교대 반복함으로써 선택된다 (Tuerk and Gold (1990) Science, 249:505; Ellington and Szostak (1990) Nature, 346:818). 유사한 기법이 소정의 인간 전사 인자에 결합하는 DNA 서열을 식별하는데 사용될 수 있다 (Thiesen and Bach (1990) Nucleic Acids Res., 18:3203; Beaudry and Joyce (1992) Science, 257: 635; WO92/05258 and WO92/14843). 유사한 방식으로, 시험관내 번역이 거대 라이브러리를 생성하기 위한 방법으로서 폴리펩티드를 합성하는데 이용될 수 있다. 일반적으로, 안정화된 폴리좀 복합체를 포함하는 이러한 방법이 추가로 WO88/08453, WO90/05785, WO90/07003, WO91/02076, WO91/05058, 및 WO92/02536에 기술되어 있다. WO95/22625 및 WO95/11922 (Affymax)에 기술된 바와 같은, 파지를 기재로 하지 않은 대안적인 디스플레이 시스템은 선택을 위해 폴리펩티드를 디스플레이하기 위해 폴리좀을 이용한다.
추가 부류의 기법은 유전자와 이의 유전자 생성물의 결합을 가능하게 하는 인공 구획에서의 레퍼토리의 선택을 포함한다. 예를들어, 바람직한 유전자 생성물을 엔코딩하는 핵산이 유중수 에멀션에 의해 형성된 마이크로캡슐내에서 선택될 수 있는 선택 시스템이 WO99/02671, WO00/40712 및 문헌 [Tawfik & Griffiths (1998) Nature Biotechnol 16(7), 652-6]에 기술되어 있다. 요망되는 활성을 갖는 유전자 생성물을 엔코딩하는 유전자 엘리먼트는 마이크로캡슐 내로 구획화되며, 전사 및/또는 번역되어 마이크로캡슐 내에서 이들 각각의 유전자 생성물 (RNA 또는 단백질)을 생성한다. 요망되는 활성을 갖는 유전자 생성물을 생성하는 유전자 엘리먼트는 후에 분류된다. 이러한 방법은 다양한 수단에 의해 목적하는 활성을 검출함으로써 관심있는 유전자 생성물을 선택한다.
B. 라이브러리 작제
선택을 위한 라이브러리는 예를들어, 상기 기술된 바와 같은 당해 분야에 공지된 기법을 이용하여 작제될 수 있거나, 시중의 공급원으로부터 구입할 수 있다. 본 발명에 유용한 라이브러리는 예를들어, WO99/20749에 기술되어 있다. 벡터 시스템이 선택되고, 대상 폴리펩티드를 엔코딩하는 하나 이상의 핵산 서열이 라이브러리 벡터내로 클로닝되면, 발현 전에 돌연변이를 유발시켜 클로닝된 분자 내에서 다양성을 유도시킬 수 있으며; 대안적으로, 엔코딩된 단백질이 돌연변이 유발전에 상기 기술된 바와 같이 발현되고 선택되고, 추가적인 선택 단계가 수행된다. 구조적으로 최적화된 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 서열의 돌연변이 유발은 표준 분자 방법으로 수행된다. 특히, 중합효소 연쇄 반응 또는 PCR이 이용될 수 있다 (본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Mullis and Faloona (1987) Methods Enzymol., 155:335]). 대상 표적 서열을 증폭하기 위해 열에 안정한 DNA-의존성 DNA 중합효소에 의해 촉매된 DNA 복제의 반복 사이클을 이용하는 PCR은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 다양한 항체 라이브러리의 작제는 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55]에 기술되어 있다.
PCR은 주형 DNA (적어도 1 fg; 더욱 일반적으로는, 1-1000ng) 및 적어도 25pmol의 올리고누클레오티드 프라이머를 사용하여 수행되며; 프라이머 풀이 매우 이종성인 경우, 각각의 서열이 풀의 분자의 단지 작은 분획만을 나타내고, 양이 후속 증폭 사이클로 제한되기 때문에, 더 많은 양의 프라이머를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 통상적인 반응 혼합물은 2㎕의 DNA, 25pmol의 올리고누클레오티드 프라이머, 2.5㎕의 10X PCR 완충액 1 (Perkin-Elmer, Foster City, CA), 0.4㎕의 1.25μM dNTP, 0.15㎕ (또는 2.5 유닛)의 Taq DNA 중합효소 (Perkin Elmer, Foster City, CA) 및 총 부피가 25㎕가 되게 하는 탈이온수를 포함한다. 미네랄 오일이 입혀지고, PCR이 프로그램가능한 열 사이클러를 사용하여 수행된다. PCR 사이클 각각의 단계의 길이 및 온도, 및 사이클 수는 실제의 엄격성 요건에 따라 조절된다. 어닐링 온도 및 타이밍은 프라이머가 주형에 어닐링되는 것으로 예상되는 효능 및 묵인될 수 있는 미스매치의 정도에 의해 결정되며; 명백하게는, 핵산 분자가 동시에 증폭되고 돌연변이 유발되는 경우, 미스매치는 적어도 제 1회차 합성에서 일어나야 한다. 엄격한 프라이머 어닐링 조건을 최적화시키는 능력은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 30℃ 내지 72℃의 어닐링 온도가 이용된다. 주형 분자의 최초 변성 (denaturation)은 일반적으로, 92℃ 내지 99℃에서 4분 동안 발생하며, 이어서 20 내지 40회의 변성 (94-99℃에서 15초 내지 1분), 어닐링 (상기 기술된 바와 같이 결정된 온도; 1-2분) 및 연장 (증폭된 생성물의 길이에 따라 72℃에서 1-5분)으로 이루어진다. 최종 연장은 일반적으로 72℃에서 4분 동안 처리되며, 이어서 4℃에서 무수 단계 (indefinite step) (0-24시간)로 처리될 수 있다.
C. 단일 가변 도메인의 조합
선택된 본 발명에 유용한 도메인은 공유 및 비공유 방법을 포함한 당해 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 조합될 수 있다.
바람직한 방법은 예를들어, scFv 분자와 관련하여 기술된 바와 같이 폴리펩티드 링커의 사용을 포함한다 (Bird et al., (1988) Science 242:423-426). 적합한 링커에 대한 논의는 문헌 [Bird et al., Science 242, 423-426; Hudson et al., Jounal Immunol Methods 231 (1999) 177-189; Hudson et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85, 5879-5883]에 제공되어 있다. 링커는 바람직하게는, 가요성이어서, 두개의 단일 도메인이 상호작용하게 한다. 하나의 링커 예로는 (Gly4 Ser)n 링커 (여기서, n = 1 내지 8, 예를들어, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7)이다. 덜 가요성인 디아보디 (diabody)에 사용되는 링커가 또한 사용될 수 있다 (Holliger et al., (1993) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448).
일 구체예에서, 사용된 링커는 면역글로불린 힌지 영역이 아니다.
가변 도메인은 링커 이외의 방법으로 조합될 수 있다. 예를들어, 자연 발생 또는 공학처리된 시스테인 잔기를 통해 제공된 이황화결합의 사용은 VH-VH , VL-VL 또는 VH-VL 이량체를 안정화시키거나 (Reiter et al., (1994) Protein Eng. 7:697-704), 가변성 도메인간의 계면을 리모델링시켜 "맞춤성 (fit)"을 개선시켜 상호작용의 안정성을 증대시키는데 활용될 수 있다 (Ridgeway et al., (1996) Protein Eng. 7:617-621; Zhu et al., (1997) Protein Science 6:781-788).
면역글로불린의 가변 도메인, 및 특히, 항체 VH 도메인을 결합시키거나 안정화시키기 위한 기타 기법은 적당하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 이중 특이적 리간드는 용액에서 "폐쇄" 형태일 수 있다. "폐쇄" 형태는 두 개의 도메인 (예를 들어, VH 및 VL)이 항체 결합 부위를 형성하는 결합된 VH-VL 쌍과 같이 결합된 형태로 존재하는 것이다. 예를 들어, scFv는 VH 및 VL 도메인을 결합시키는데 이용된 링커의 정렬에 따라서, 폐쇄 형태로 존재할 수 있다. 이것이 도메인이 결합될 정도로 충분히 가요성이거나, 이들을 결합된 위치에서 강하게 유지하면, 도메인은 아마 폐쇄 형태를 채택할 것이다.
유사하게, VH 도메인 쌍 및 VL 도메인 쌍은 폐쇄 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 이것은 리간드 분자에서 강성 링커와 같은, 도메인의 밀접한 결합의 작용일 것이다. 폐쇄 형태의 리간드는 리간드 및 제2 표적 분자의 반감기를 증가시키는 두 분자 모두에 결합될 수 없을 것이다. 따라서, 리간드는 통상적으로 리간드의 반감기를 증가시키는 분자로부터 분리에 대해 제2 표적 분자에만 결합될 것이다.
추가로, 링커가 없는 VH/VH, VL/VL 또는 VH/VL 이량체의 구성은 도메인간 경쟁을 제공한다.
본 발명에 따른 리간드는 또한 개방 형태일 수 있다. 이러한 형태에서, 리간드는 리간드 및 제2 표적 분자의 반감기를 증가시키는 두 분자 모두에 동시에 결합될 수 있을 것이다. 통상적으로, 개방 형태의 가변 도메인은 (VH-VL 쌍의 경우에) 도메인들이 상호작용하지 않고 항체 결합 부위를 형성하지 않으며 이들의 개개 에피토프에 대한 결합에 대하여 경쟁하지 않도록 충분히 멀리 떨어진 채로 유지된다. VH/VH 또는 VL/VL 다량체의 경우, 도메인은 강성 링커에 의해 함께 힘을 받지 않는다. 물론, 이러한 도메인 쌍은 항원 결합에 대해 경쟁하지 않거나 항체 결합 부위를 형성하지 않을 것이다.
개방 및 폐쇄 이중 특이적 리간드가 상이한 환경 하에 다양한 평형상태로 존재할 것으로 이해되나, Fab 단편 및 전체 항체는 주로 폐쇄 형태로 존재할 것이다. 표적에 대한 리간드의 결합은 평형의 균형을 개방 형태로 이동시킬 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 특정 리간드는 용액에서 두 형태로 존재할 수 있고, 그 중 하나 (개방 형태)는 두 개의 항원 또는 에피토프에 독립적으로 결합될 수 있는 한편, 다른 형태 (폐쇄 형태)는 하나의 항원 또는 에피토프에만 결합될 것이므로, 항원 또는 에피토프는 이 형태에서 리간드와의 결합에 대하여 경쟁한다.
따라서 이중 특이적 리간드의 개방 형태가 용액에서 폐쇄 형태와 평형으로 존재할 수 있으나, 평형은 폐쇄 형태에 유리할 것으로 예견되며; 또한 개방 형태는 폐쇄 형태로의 표적 결합에 의해 격리될 수 있다. 바람직하게는, 따라서, 본 발명의 특정 이중 특이적 리간드는 두 (개방 및 폐쇄) 형태간에 평형으로 존재한다.
본 발명에 따른 이중 특이적 리간드는 개방 또는 폐쇄 형태에 유리하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 이황화 결합을 이용한 VH-VL 상호작용의 안정화는 폐쇄 형태를 안정화시킨다. 또한, VH 도메인 및 VL 도메인 쌍을 포함하는 도메인들을 연결하는데 이용된 링커는 개방 형태가 유리하도록 구성될 수 있다; 예를 들어, 적합한 위치에서 큰 아미노산 잔기의 포함, 또는 도메인을 물리적으로 이격된 채로 유지할 적합한 강성 구조의 고안에 의해서와 같이, 링커가 도메인의 결합을 입체적으로 방해할 수 있다.
D. 이중-특이적 리간드의 특징
이중-특이적 리간드의 이의 특이적 항원 또는 에피토프로의 결합은 ELISA를 포함한 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 시험될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 결합은 모노클로날 파지 ELISA를 사용하여 시험된다.
파지 ELISA는 임의의 적합한 공정에 따라 수행될 수 있다: 한 예시적 프로토콜이 하기에 제시되어 있다.
각 라운드에 선택시 생성된 파지 군집을 선택된 항원 또는 에피토프로의 결합에 대해 ELISA에 의해 스크리닝하여 "폴리클로날" 파지 항체를 확인할 수 있다. 이들 군집으로부터의 단일한 감염된 세균 콜로니로부터의 파지를 ELISA에 의해 스크리닝하여 "모노클로날" 파지 항체를 확인할 수 있다. 또한, 항원 또는 에피토프에 결합되는 가용성 항체 단편을 스크리닝하는 것이 바람직하며, 이는 시약 예를들어, C- 또는 N-말단 tag를 사용하여 ELISA에 의해 수행될 수 있다 (예를들어, 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55] 참조).
선택된 파지 모노클로날 항체의 다양성은 또한, PCR 생성물의 겔 전기영동 (Marks et al. 1991, supra; Nissim et al. 1994 supra), 프로빙 (Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 227, 776) 또는 벡터 DNA의 시퀀싱에 의해 평가될 수 있다.
E. '이중-특이적 리간드'의 구조
상기 개시된 대로, 항체는 본원에서 하나 이상의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인, 둘 이상의 중쇄 가변 도메인 또는 둘 이상의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체 (예를 들어, IgG, IgM, IgA, IgA, IgE) 또는 단편 (Fab, Fv, 이황화 결합된 Fv, scFv, 디아보디)으로서 정의된다. 이것은 자연적으로 항체를 생성하는 임의의 종으로부터 적어도 부분적으로 유래될 수 있거나 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다: 혈청, B-세포, 하이브리도마, 트랜스펙토마, 효모 또는 세균으로부터 단리됨.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 이중-특이적 리간드는 항체의 하나 이상의 단일 중쇄 가변 도메인 및 항체의 하나의 단일 경쇄 가변 도메인, 또는 두 단일 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 리간드는 VH/VL 쌍, VH 도메인의 쌍 또는 VL 도메인의 쌍을 포함할 수 있다.
상기 리간드의 제1 및 제2 가변 도메인은 동일한 폴리펩티드 사슬 상에 있을 수 있다. 대안적으로, 이들은 별개의 폴리펩티드 사슬 상에 있을 수 있다. 이들이 동일한 폴리펩티드 사슬 위에 존재하는 경우, 이들은 상기 개시된 대로, 우선적으로 펩티드 서열인 링커에 의해 결합될 수 있다.
제1 및 제2 가변 도메인은 공유적으로 또는 비-공유적으로 결합될 수 있다. 이들이 공유적으로 결합되는 경우, 공유 결합은 이황화 결합일 수 있다.
가변 도메인이 예를들어, 본원에 기술된 바와 같이 파지 디스플레이 기법에 의해 선택된 V-유전자 레퍼토리로부터 선택되는 경우, 이들 가변 도메인은 유니버셜 프레임워크 영역을 포함하여 본원에 정의된 바와 같이 제네릭 리간드에 의해 인지될 수 있다. 유니버셜 프레임워크, 제네릭 리간드 등의 사용은 WO99/20749호에 기술되어 있다.
V-유전자 레퍼토리가 사용되는 경우, 폴리펩티드 서열에서의 변형(variation)은 바람직하게는, 가변 도메인의 구조적 루프내에 위치한다. 가변 도메인의 폴리펩티드 서열은 각각의 가변 도메인과 이의 상보적 쌍과의 상호작용을 향상시키기 위해 DNA 셔플링 (shuffling) 또는 돌연변이에 의해 변경될 수 있다. DNA 셔플링은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를들어, 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [Stemmer, 1994, Nature 370: 389-391 and U.S. Patent No. 6,297,053]에 교시되어 있다. 돌연변이 유발을 위한 기타 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, '이중-특이적 리간드'는 단쇄 Fv 단편이다. 본 발명의 대안적인 구체예에서, '이중-특이적 리간드'는 Fab 포맷으로 구성된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 적어도 본원에서 정의된 '이중-특이적 리간드'를 엔코딩하는 핵산을 제공한다.
당업자는 본 발명의 양태에 따라서 항원 또는 에피토프 둘 모두가 동시에 동일한 항체 분자에 결합될 수 있음을 이해할 것이다. 대안적으로, 이들은 동일한 항체 분자와의 결합에 대해 경쟁할 수 있다. 예를 들어, 두 에피토프 모두가 동시에 결합되는 경우, 이중 특이적 리간드의 가변 도메인 둘 모두는 독립적으로 이들의 표적 에피토프에 결합될 수 있다. 도메인이 경쟁하는 경우, 한 가변 도메인은 이의 표적에 결합될 수 있으나, 동시에 다른 가변 도메인은 이의 동족 표적에 결합되지 않거나; 제1 가변 도메인은 이의 표적에 결합될 수 있으나, 동시에 제2 가변 도메인은 이의 동족 표적에 결합될 수 없다.
가변 도메인은 표적 항원 또는 에피토프에 대해 유도된 항체로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 이들은 섬유상 박테리오파지의 표면 상에서 발현되는 것들과 같은 단일 항체 도메인의 레퍼토리로부터 유래될 수 있다. 선택은 하기 기술된 대로 수행될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 수행에 요구되는 핵산 분자 및 벡터 작제물은 표준 실험 설명서 예를들어, 문헌 [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USA]에 기술된 바와 같이 작제되고 조작될 수 있다.
본 발명에 유용한 핵산의 조작은 통상적으로 재조합 벡터에서 수행된다.
따라서, 추가의 양태에서, 본 발명은 적어도 본원에 정의된 '이중-특이적 리간드'를 엔코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
본원에 사용된 바와 같이, 벡터는 이종성 DNA의 발현 및/또는 복제를 위해 세포에 이러한 이종성 DNA를 유입시키는데 사용되는 분리된 엘리먼트를 나타낸다. 이러한 벡터를 선택하거나 작제하고, 이어서 이를 사용하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 세균 플라스미드, 박테리오파지, 인공 염색체 및 에피솜 벡터를 포함하는 많은 벡터가 입수가능하다. 이러한 벡터는 단순한 클로닝 및 돌연변이유발에 사용될 수 있으며; 대안적으로, 유전자 발현 벡터가 사용된다. 본 발명에 따른 용도의 벡터는 바람직한 크기, 통상적으로 0.25 킬로베이스 (kb) 내지 40kb 이상의 길이의 폴리펩티드 코딩 서열을 수용하도록 선택될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 시험관내 클로닝 조작 후 벡터로 형질전환된다. 각각의 벡터는 다양한 작용 성분을 함유하며, 이들은 일반적으로 클로닝 (또는 "폴리링커") 부위, 복제 기점(origin) 및 하나 이상의 선택가능한 마커 유전자를 포함한다. 제공된 벡터가 발현 벡터인 경우, 이는 추가적으로 하기중 하나 이상을 갖는다: 클로닝 부위의 부근에 각각 위치한 인핸서 엘리먼트, 프로모터, 전사, 말단 및 시그널 서열. 이들은 본 발명에 따른 리간드를 엔코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결되어 있다.
클로닝 및 발현 벡터 둘 모두는 일반적으로, 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 벡터가 복제가능하게 하는 핵산 서열을 함유한다. 통상적으로, 클로닝 벡터에서, 이러한 서열은 벡터가 독립적으로 숙주 염색체 DNA의 복제를 가능하게 하는 서열이며, 복제 기점 또는 자가 복제 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다양한 세균, 효모 및 바이러스에 대해 널리 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람-네거티브 세균에 적합하며, 2 미크론 플라스미드 기점은 효모에 적합하며, 다양한 바이러스 기점 (예를들어, SV40, 아데노바이러스)은 포유동물 세포의 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 기점은 높은 수준의 DNA를 복제할 수 있는 포유동물 세포, 예를들어 COS 세포에 사용되지 않는 한 포유동물 발현 벡터에 필요하지 않는다.
유리하게는, 클로닝 또는 발현 벡터는 선택가능한 마커로서 불리는 선택 유전자를 함유할 수 있다. 이러한 유전자는 선택 배양 배지에서 성장된 형질전환된 숙주 세포의 생존 또는 성장에 필요한 단백질을 엔코딩한다. 따라서, 선택 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환되지 않은 숙주 세포는 배양 배지에서 생존하지 못할 것이다. 통상적인 선택 유전자는 항생제 및 기타 독소 (예를들어, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라시클린)에 대해 내성을 부여하거나, 영양요구성 결핍을 보완하거나, 성장 배지에서는 이용 불가능한 중요 영양분을 공급하는 단백질을 엔코딩한다.
본 발명에 따른 리간드를 엔코딩하는 벡터의 복제가 가장 편리하게는, 대장균(E. coli)에서 수행되기 때문에, 대장균(E. coli)-선택성 마커 예를들어, 항생제 암피실린에 내성을 부여하는 β-락타마아제 유전자가 사용된다. 이는 대장균(E. coli) 플라스미드 예를들어, pBR322 또는 pUC 플라스미드 예를들어, pUC18 또는 pUC19로부터 수득될 수 있다.
발현 벡터는 일반적으로, 숙주 유기체에 의해 인식되고, 대상 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 이러한 프로모터는 유도성이거나 항시성일 수 있다. 용어 "작동 가능하게 연결된"은 기술된 성분이 이의 의도된 방식으로 작용하게 하는 관계로 병렬 위치함을 나타낸다. 코딩 서열에 "작동 가능하게 연결된" 조절 서열은 코딩 서열의 발현이 조절 서열과 양립가능한 조건하에 달성되는 방식으로 리게이션된다.
원핵 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터는 예를들어, β-락타마아제 및 락토오스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 및 하이브리드 프로모터 예를들어, tac 프로모터를 포함한다. 세균 시스템에 사용하기 위한 프로모터는 일반적으로, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 샤인-델가노 (Shine-Delgarno) 서열을 함유할 것이다.
바람직한 벡터는 폴리펩티드 라이브러리 구성원에 상응하는 누클레오티드 서열의 발현을 가능하게 하는 발현 벡터이다. 따라서, 제1 및/또는 제2 항원 또는 에피토프로의 선택은, 폴리펩티드 라이브러리 구성원을 발현하는 단일 클론의 별도의 증식 및 발현에 의해 또는 임의의 선택 디스플레이 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 기술된 바와 같이, 바람직한 선택 디스플레이 시스템은 박테리오파지 디스플레이이다. 따라서, 파지 또는 파지미드 벡터 예를들어, pIT1 또는 pIT2가 사용될 수 있다. 본 발명에 유용한 리더 서열은 pelB, stII, ompA, phoA, bla 및 pelA를 포함한다. 한 예로는, 대장균(E. coli) 복제 기점 (이중 가닥 복제용) 및 파지 복제 기점 (단일 가닥 DNA의 생성용)을 갖는 파지미드 벡터가 있다. 이러한 벡터의 조작 및 발현은 당해 분야에 널리 공지되어 있다 (Hoogenboom and Winter (1992) supra; Nissim et al. (1994) supra). 간단하게는, 벡터는 파지미드에 선택성을 부여하기 위한 β-락타마아제 유전자, 및 pelB 리더 서열 (이는 발현된 폴리펩티드를 세포내 간극으로 유도), 다중 클로닝 부위 (라이브러리 구성원의 누클레오티드 버젼을 클로닝하기 위한 것임), 임의로 하나 이상의 펩티드 tag (검출용), 임의로 하나 이상의 TAG 정지 코돈 및 파지 단백질 pIII로 이루어진 (N 내지 C 말단) 발현 카세트의 lac 프로모터 업스트림을 함유한다. 따라서, 대장균(E. coli)의 다양한 억제인자 및 비억제 인자 균주와 글루코오스, 이소프로필 티오-β-D-갈락토시드 (IPTG) 또는 헬퍼 파지 예를들어, VCS M13를 사용함으로써, 벡터는 발현되지 않는 플라스미드로서 복제되거나, 단지 폴리펩티드 라이브러리 구성원을 대량 생성하거나, 파지중 일부의 표면에 폴리펩티드-pIII 융합물의 하나 이상의 복사체를 함유하는 파지를 생성할 수 있다.
본 발명에 따른 리간드를 엔코딩하는 벡터의 작제는 통상적인 리게이션 기법을 이용한다. 분리된 벡터 또는 DNA 단편은 요망되는 벡터를 생성하는데 요구되는 형태로 절단되고, 테일링되고, 다시 리게이션된다. 필요시, 정확한 서열이 작제된 벡터내에 존재하는지의 여부를 확인하기 위한 분석이 공지된 방식으로 수행될 수 있다. 발현 벡터를 작제하고, 시험관내 전사체를 준비하고, DNA를 숙주 세포로 유입시키고, 발현 및 작용을 평가하기 위한 분석을 수행하는데 적합한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 샘플중의 유전자 서열의 존재가 검출되거나, 통상적인 방법 예를들어, 서던 또는 노던 분석, 웨스턴 블롯팅, DNA, RNA 또는 단백질의 도트 블롯팅, 동일반응계내(in situ) 하이브리드화, 면역세포화학 또는 핵산 또는 단백질 분자의 서열 분석에 의해 이의 증폭 및/또는 발현이 정량된다. 당업자는 이들 방법을 필요에 따라 어떻게 변형시킬 지를 용이하게 구상할 것이다.
폐쇄 형태 다중특이적 리간드의 구조
본 발명의 두 번째 구성의 일 양태에 따르면, 둘 이상의 비-상보적인 에피토프 결합 도메인이 본원에 정의된 폐쇄 형태로 존재하도록 결합된다. 유리하게는 이들은 본원에 개시된 링커에 대안적이거나 이에 추가하여 또 다른 하나에 대한 에피토프 결합 부위의 폐쇄 형태의 형성 및/또는 유지를 촉진할 수 있는 골격에 추가로 부착될 수 있다.
(I) 골격
골격은 면역글로불린 분자를 기재로 하거나, 상기 언급된 기점의 비면역글로불린일 수 있다. 본원에 정의된 바와 같은 바람직한 면역글로불린 골격은 하기로부터 선택된 하나 이상의 골격을 포함한다: 적어도 (i) 항체의 CL (카파 또는 람다 서브클래스) 도메인; 또는 (ii) 항체 중쇄의 CH1 도메인을 포함하는 면역글로불린 분자; 항체 중쇄의 CH1 및 CH2 도메인을 포함하는 면역글로불린 분자; 항체 중쇄의 CH1, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린 분자; 또는 상기 (ii)와 항체의 CL (카파 또는 람다 서브클래스) 도메인의 임의의 서브셋. 힌지 영역 도메인이 또한 포함될 수 있다. 이러한 도메인의 조합물들은 예를들어 천연 항체, 예를들어 IgG 또는 IgM, 또는 이의 단편, 예를들어 Fv, scFv, Fab 또는 F(ab')2 분자를 모방할 수 있다. 당업자는 상기 목록에 기재된 것만이 포함되는 것이 아님을 인지할 것이다.
(II) 단백질 스캐폴드
각각의 에피토프 결합 도메인은 단백질 스케폴드 및 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있으며, 이들은 하나 이상의 에피토프와 도메인의 특이적 상호작용에 관여한다. 유리하게는, 본 발명에 따른 에피토프 결합 도메인은 세 개의 CDR을 포함한다. 적합한 단백질 스캐폴드는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 것을 포함한다: 면역글로불린 도메인을 기재로 하는 단백질 스캐폴드, 피브로넥틴을 기재로 하는 단백질 스캐폴드, 애피보디를 기재로 하는 단백질 스캐폴드, CTLA4를 기재로 하는 단백질 스캐폴드, 샤프롱 예컨대, GroEL을 기재로 하는 단백질 스캐폴드, 리포칼린을 기재로 하는 단백질 스캐폴드 및 세균 Fc 수용체 SpA 및 SpD를 기재로 하는 단백질 스캐폴드. 당업자는 상기 리스트에 기재된 것만이 포함되는 것이 아님을 알고 있을 것이다.
F: 이중 특이적 리간드 작제에 사용하기 위한 스캐폴드
i. 주쇄 형태 선택
면역글로불린 수퍼패밀리의 구성원 모두는 이들의 폴리펩티드 사슬에 대해 유사한 폴드를 공유한다. 예를들어, 항체는 이들의 일차 서열에 있어서 매우 다양하지만, 서열 및 결정학적 구조를 비교하면 예상과 달리, 항체의 6개 항원 결합 루프중 5개 (H1, H2, L1, L2, L3)가 제한된 수의 주쇄 형태 또는 표준 구조를 채택하는 것으로 밝혀졌다 (Chothia and Lesk (1987) J. Mol . Biol., 196:901; Chothia et al. (1989) Nature, 342:877). 따라서, 루프 길이 및 주요 잔기의 분석에 의해 대부분의 인간 항체에서 발견되는 H1, H2, L1, L2 및 L3의 주쇄 형태를 예측할 수 있다 (Chothia et al. (1992) J. Mol . Biol., 227: 799; Tomlinson et al. (1995) EMBO J., 14:4628; Williams et al. (1996) J. Mol . Biol., 264:220). H3 영역이 서열, 길이 및 구조에 있어서 더욱 다양성을 띠지만 (D 세그먼트의 사용으로 인해), 이는 또한, 루프 및 항체 프레임워크의 주요 위치에서 특정 잔기의 길이 및 존재 여부, 또는 잔기의 종류에 따라 짧은 루프 길이에 대해 제한된 수의 주쇄 형태를 형성한다 (Martin et al. (1996) J. Mol . Biol., 263:800; Shirai et al. (1996) FEBS Letters, 399:1).
본 발명의 이중 특이적 리간드는 VH 도메인의 라이브러리 및/또는 VL 도메인의 라이브러리와 같은 도메인들의 라이브러리로부터 어셈블링되는 것이 유리하다. 더욱이, 본 발명의 이중 특이적 리간드는 그 자체가 라이브러리의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, 구성원의 주쇄 입체형태가 알려지도록 특정 루프 길이 및 주요 잔기가 선택된 이중 특이적 리간드 및/또는 도메인의 라이브러리가 설계될 수 있다. 유리하게는, 이들은 이들이 상기 논의된 바와 같이 비작용성이 되는 기회를 최소화시키는, 자연적으로 발견되는 면역글로불린 수퍼패밀리 분자의 실제 입체형태로 되어 있다. 생식세포 V 유전자 세그먼트는 항체 또는 T-세포 수용체 라이브러리를 작제하기 위한 하나의 적합한 기본 프레임워크로 작용하며; 다른 서열이 또한 사용되기도 한다. 적은 수의 작용 구성원이 이의 기능에는 영향을 미치지 않으면서 변경된 주쇄 입체형태를 가질 수 있도록, 적은 빈도로 변형이 일어날 수 있다.
리간드 서열을 토대로 주쇄 입체형태를 예측하고 표준 구조에 영향을 미치지 않는 변형을 위한 잔기를 선택하기 위해, 표준 구조 이론이 또한 리간드로 엔코딩된 다양한 주쇄 입체형태의 수를 평가하는데 사용된다. 인간 Vκ 도메인에서, L1 루프는 4개의 표준 구조 중 1개를 채택할 수 있고, L2 루프는 하나의 표준 구조를 가지며, 인간 Vκ 도메인의 90%는 L3 루프에 대해 4개 또는 5개의 표준 구조 중 하나를 채택하는 것으로 공지되어 있다 [참조: Tomlinson et al. (1995) 상기됨]; 따라서, Vκ 도메인 단독에서, 다양한 표준 구조가 조합되어 일정 범위의 다양한 주쇄 입체형태를 형성할 수 있다. Vλ 도메인이 L1, L2 및 L3 루프에 대한 다양한 범위의 표준 구조를 엔코딩하고 Vκ 및 Vλ 도메인이 H1 및 H2 루프에 대해 다수개의 표준 구조를 엔코딩할 수 있는 임의의 VH 도메인과 짝을 이룰 수 있는 경우에, 이들 5개의 루프에 대해 확인된 표준 구조 조합의 수는 매우 크다. 이것은, 주쇄 입체형태에서의 변형 발생이 광범위한 결합 특이성을 생성시키는데 필수적일 수 있음을 암시한다. 그러나, 단일의 공지된 주쇄 입체형태를 토대로 항체 라이브러리를 작제하는 경우, 예상과는 반대로, 실질적으로 모든 항원을 표적화하기에 충분한 변형을 생성시키는데 주쇄 입체 형태에서의 변형이 요구되지 않음이 밝혀졌다. 더욱 더 놀랍게는, 단일의 주쇄 입체형태는 컨센서스 구조 (conseusus structure)일 필요는 없다 - 단일의 천연 입체형태는 전체 라이브러리를 위한 토대로 사용될 수 있다. 따라서, 바람직한 양태에서, 본 발명의 이중 특이적 리간드는 단일의 공지된 주쇄 입체형태를 보유한다.
선택되는 단일의 주쇄 입체형태는 바람직하게는 당해 면역글로불린 수퍼패밀리 타입의 분자들 중에 일반적으로 존재하는 것이다. 상당수의 천연 분자가 입체형태를 채택하는 것으로 확인되는 경우에 입체형태는 일반적이게 된다. 따라서, 본 발명의 바람직한 한 양태에서, 면역글로불린 도메인의 각 결합 루프에 대한, 천연 발생되는 다양한 주쇄 입체형태는 별개로 간주되며, 이후 다양한 루프에 대해 요망되는 조합의 주쇄 입체형태를 갖는 천연의 변형가능한 도메인이 선택된다. 어느 것도 이용가능하지 않는 경우, 가장 근접한 등가물이 선택될 수 있다. 다양한 루프에 대한 주쇄 입체형태의 요망되는 조합은, 요망되는 주쇄 입체형태를 엔코딩하는 생식세포 유전자 세그먼트를 선택함으로써 형성되는 것이 바람직하다. 선택된 생식세포 유전자 세그먼트가 실제로 빈번하게 발현되는 것이 더욱 바람직하며, 모든 천연 생식세포 유전자 세그먼트가 가장 빈번하게 발현되는 것이 가장 바람직하다.
이중 특이적 리간드 또는 이의 라이브러리를 설계함에 있어서, 6개의 항원 결합 루프 각각에 대한 다양한 주쇄 입체형태의 발생은 개별적인 것으로 간주될 수 있다. H1, H2, L1, L2 및 L3에 대해서는, 천연 분자의 20 내지 100%의 항원 결합 루프에 의해 채택되는 소정 입체형태가 선택된다. 통상적으로, 이의 확인된 발생율은 35% 초과 (즉, 35% 내지 100%)이며, 50% 초과 또는 심지어 65% 초과가 이상적이다. H3 루프의 많은 부분은 표준 구조를 가지지 않기 때문에, 표준 구조를 나타내는 상기 루프 중에 일반적으로 존재하는 주쇄 입체형태를 선택하는 것이 바람직하다. 따라서, 각각의 루프에 대해, 천연 레퍼토리에서 가장 빈번하게 확인되는 입체형태가 선택된다. 인간 항체에서, 각각의 루프에 대한 가장 일반적인 표준 구조 (CS)는 다음과 같다: H1-CS 1 (발현된 레퍼토리의 79%), H2-CS 3 (46%), Vκ의 L1-CS 2 (39%), L2-CS 1 (100%), Vκ의 L3-CS 1 (36%) (상기 계산은 κ:λ 비를 70:30로 추정함, Hood et al . (1967) Cold Spring Harbor Symp . Quant . Biol., 48:133). 표준 구조를 갖는 H3 루프에 대해서, 잔기 94 내지 잔기 101의 염-브릿지가 있는 7개 잔기의 CDR3 길이 (Kabat et al . (1991) Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Department of Health and Human Services)가 가장 일반적인 것으로 여겨진다. 이 입체형태를 형성시키고 항체 모델링 (2cgr 및 1tet)을 위한 토대로 사용될 수 있는 단백질 데이터 뱅크에서 적어도 2개의 결정그래프 구조 (crystallographic structures)을 형성시키는데 필요한 H3 길이 및 주요 잔기를 갖는 EMBL 데이터 라이브러리에는 적어도 16개의 인간 항체 서열이 존재한다. 가장 빈번하게 발현된 생식세포 유전자 세그먼트는, 표준 구조의 이러한 조합이 VH 세그먼트 3-23 (DP-47), JH 세그먼트 JH4b, Vκ 세그먼트 O2/O12 (DPK9) 및 Jκ 세그먼트 Jκ1인 것이다. VH 세그먼트 DP45 및 DP38이 또한 적합하다. 따라서, 이들 세그먼트는 요망되는 단일 주쇄 입체형태를 갖는 라이브러리를 작제하기 위한 토대로 조합되어 사용될 수 있다.
대안적으로, 단리시 결합 루프의 각각에 대해 천연 발생되는 다양한 주쇄 입체형태를 기초로 단일의 주쇄 입체형태를 선택하는 것 대신에, 천연 발생되는 주쇄 입체형태의 조합은 단일의 주쇄 입체형태를 선택하기 위한 토대로 이용된다. 항체의 경우에, 예를들어, 항원 결합 루프 중 임의의 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 전부에 대한 천연 발생되는 표준 구조 조합이 측정될 수 있다. 여기서, 선택된 입체형태가 천연 발생하는 항체에서 일반적으로 존재하는 것이 바람직하고, 이 입체형태가 천연 레퍼토리에서 가장 흔하게 확인되는 것이 가장 바람직하다. 따라서, 인간 항체에서, 예를들어 5개의 항원 결합 루프, H1, H2, L1, L2 및 L3의 천연 조합이 고찰되는 경우, 표준 구조의 가장 빈번한 조합이 측정된 다음, 이는 단일의 주쇄 입체형태를 선택하기 위한 토대로 H3 루프에 대한 가장 일반적인 입체형태와 조합된다.
ii. 표준 서열의 변형
본 발명에 사용하기 위해 선택된 다수의 공지된 주쇄 입체형태, 또는 바람직하게는 단일의 공지된 주쇄 형태의 이중 특이적 리간드 또는 라이브러리는 구조적으로 및/또는 기능적으로 변형된 레퍼토리를 발생시키도록 분자의 결합 부위를 변경시킴으로써 작제될 수 있다. 이는 변이체가 이들의 구조 및/또는 기능에서 충분히 변형되어 일정 범위의 활성을 제공할 수 있도록 생성됨을 의미한다.
요망되는 다양성은 통상적으로 선택된 분자를 하나 이상의 위치에서 변형시킴으로써 생성된다. 변형될 위치는 무작위적으로 선택될 수 있거나 바람직하게 선택된다. 이후, 변형은, 그 동안 상주 아미노산이 임의의 아미노산, 또는 천연 또는 합성의 이의 유사체로 대체되어 매우 다수의 변이체를 생성시키는 무작위화에 의해서, 또는 상주 아미노산이 하나 이상의 한정된 서브셋의 아미노산으로 대체되어 더욱 한정된 수의 변이체를 생성시킴으로써 수행될 수 있다.
상기한 변형을 도입시키기 위한 다양한 방법이 보고되었다. 에러-프로운 (error-prone) PCR (Hawkins et al . (1992) J. Mol . Biol., 226: 889), 화학적 돌연변이 형성 (Deng et al. (1994) J. Biol . Chem ., 269: 9533) 또는 세균성 돌연변이 유발 균주 (Low et al. (1996) J. Mol . Biol ., 260: 359)가 분자를 엔코딩하는 유전자 내로 무작위적인 돌연변이를 도입시키는데 사용될 수 있다. 선택된 위치를 돌연변이화하는 방법 또한 당업계에 널리 공지되어 있고, 여기에는 PCR을 사용하거나 사용하지 않고 불일치된 올리고누클레오티드 또는 축퇴 올리고누클레오티드를 사용하는 것이 포함된다. 예를들어, 돌연변이를 항원 결합 루프로 표적화함으로써 다수의 합성 항체 라이브러리가 형성되었다. 인간 파상풍 변성 독소-결합 Fab의 H3 영역을 일정 범위의 신규 결합 특이성을 발생시키도록 무작위화시켰다 [참조: Barbas et al . (1992) Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 89: 4457]. 돌연변이화하지 않은 프레임워크 영역를 갖는 큰 라이브러리를 생성시키기 위해 무작위성 또는 반무작위성 H3 및 L3 영역이 생식세포 V 유전자 세그먼트에 첨가되었다 [참조: Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol . Biol ., 227: 381; Barbas et al . (1992) Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89: 4457; Nissim et al . (1994) EMBO J., 13: 692; Griffiths et al . (1994) EMBO J., 13: 3245; De Kruif et al . (1995) J. Mol . Biol., 248: 97]. 상기한 변형은 다른 항원 결합 루프의 일부 또는 전부를 포함하도록 확대되었다 [참조: Crameri et al . (1996) Nature Med., 2: 100; Riechmann et al . (1995) Bio / Technology, 13: 475; Morphosys, WO 97/08320호, 상기됨].
루프 랜덤화가 H3 단독에 대해서 대략 1015개를 초과하는 구조를 형성시키고 다른 5개의 루프에 대해서는 유사한 다수의 변이체를 형성시킬 잠재력을 지니고 있기 때문에, 현재의 전환 기술을 사용하거나 심지어는 세포 비함유 시스템을 이용함으로써 모든 가능한 조합을 나타내는 라이브러리를 생성시키는 것은 실행불가능하다. 예를들어, 현재까지 작제된 최대 라이브러리 중 하나에서, 이러한 설계의 라이브러리에 대한 잠재적인 변형을 나타내는 단 하나의 분획인 6 ×1010의 다양한 항체가 생성되었다 [참조: Griffiths et al. (1994) 상기됨].
바람직한 구체예에서, 분자의 요망되는 기능을 생성시키거나 변형시키는 것에 직접적으로 관련되는 유일한 잔기가 변형된다. 대부분의 분자에 대해, 상기 기능은 표적을 결합시키는 것일 것이며, 이에 따라 변형은 표적 결합 부위에 집중되는 동시에, 분자의 전반적인 패킹에 또는 선택된 주쇄 입체형태를 유지하는데 중요한 잔기를 변형시키지 않아야 한다.
항체 도메인에 적용되는 표준 서열의 변형
항체 이중-특이적 리간드의 경우에, 표적에 대한 결합 부위는 가장 흔한 항원 결합 부위이다. 따라서, 매우 바람직한 양태에서, 본 발명은 항원 결합 부위에서의 잔기만이 변형된 항체 이중-특이적 리간드의 라이브러리 또는 어셈블리를 제공한다. 이들 잔기는 인간 항체 레퍼토리에서 매우 다양하며, 고해상도의 항체/항원 복합체에서 접촉하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, L2에서, 위치 50 및 53은 천연 항체에서 다양하며 항원과 접촉하는 것으로 확인됨이 공지되어 있다. 반대로, 종래의 방법은, 카바트 등 (Kabat et al . (1991, 상기됨))에 의해 규정된 상응하는 상보성 결정 영역 (CDR1)에서의 모든 잔기, 즉 본 발명에 따라 사용하기 위한 라이브러리에서 변형된 2개에 비교되는 일부 7개의 잔기를 변형시켰다. 이는 일정 범위의 항원 결합 특이성을 생성시키는데 필요한 기능적 다양성의 측면에서 현저한 개선을 나타낸다.
사실상, 항체 변형은 나이브(naive) 주요 레퍼토리 (이는 생식세포 및 접합 변형으로 불리기도 함)를 형성시키기 위한 생식세포 V, D 및 J 유전자 부분의 체세포 재조합, 및 생성되는 재배열된 V 유전자의 체세포 과돌연변이의 2가지 과정의 결과이다. 인간 항체 서열의 분석으로부터, 주요 레퍼토리에서의 변형이 항원 결합 부위의 중심에 집중되는 반면, 체세포 과돌연변이는 변형을 주요 레퍼토리에서 고도로 보존되는 항원 결합 부위의 주변에 있는 부위로 확산시키는 것으로 밝혀졌다 [참조: Tomlinson et al . (1996) J. Mol . Biol ., 256: 813]. 이러한 상보성은 아마도 서열 스페이스를 탐색하기 위한 효율적인 전략으로 발전되었고, 항체에 대해서는 완전히 독특한 것은 아니지만 상기 상보성은 다른 폴리펩티드 레퍼토리에 용이하게 적용될 수 있다. 변형되는 잔기는 표적에 대한 결합 부위를 형성하는 잔기의 서브셋이다. 표적 결합 부위에서의 잔기의 다양한 (오버렙핑을 포함하여) 서브셋은 필요한 경우 선택 동안의 다양한 단계에서 변형된다.
항체 레퍼토리의 경우에, 항원 결합 부위에 있는 잔기의 전부가 아닌 일부가 변형되는 초기의 "나이브(naive)" 레퍼토리가 생성될 수 있다. 이 문맥에서 본원에 사용된 용어 "나이브"는 소정 표적을 갖지 않는 항체 분자를 지칭한다. 이들 분자는 면역 변형되지 않는 개체의 면역글로불린 유전자에 의해 엔코딩되는 분자와 유사한데, 상기한 면역 변형되지 않는 개체는 면역계가 광범위한 항원성 자극에 의해 공격받지 않는 태아 및 신생 개체의 경우에 해당한다. 이후, 이 레퍼토리는 일정 범위의 항원 또는 에피토프에 대항하여 선택된다. 필요한 경우, 이후 추가 변형이 초기 레퍼토리에서 변형된 부위 외측에 도입될 수 있다. 이렇게 성숙된 레퍼토리는 변형된 기능, 특이성 또는 친화력을 위해 선택될 수 있다.
본 발명은 항원 결합 부위에서의 잔기의 일부 또는 전부가 변형된 이중 특이적 리간드 또는 이중 특이적 리간드의 나이브 라이브러리의 작제를 위한 결합 도메인의 두 상이한 나이브 레퍼토리를 제공한다. "주요" 라이브러리는, 변형이 생식세포 V 유전자 부분 (생식세포 변형)에서 변형되는 항원 결합 부위의 중심에 있는 잔기에 제한되거나 재조합 과정 동안에 변형되는 (접합 변형) 천연 주요 레퍼토리를 모방한다. 변형되는 그러한 잔기는 이들로 제한되는 것은 아니나 H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98, L50, L53, L91, L92, L93, L94 및 L96을 포함한다. "체세포" 라이브러리에서, 변형은 재조합 과정 동안 변형 (접합 변형)되거나 고도로 체세포적으로 돌연변이화되는 잔기에 제한된다. 변형되는 그러한 잔기는 이들로 제한되는 것은 아니나 H31, H33, H35, H95, H96, H97, H98, L30, L31, L32, L34 및 L96을 포함한다. 이들 라이브러리에서 변형에 적합한 것으로 상기 나열된 모든 잔기는 하나 이상의 항체-항원 복합체에서 접촉하는 것으로 알려져 있다. 둘 모두의 라이브러리에서, 항원 결합 부위에 있는 모든 잔기가 변형되는 것이 아니며, 부가적인 변형이, 필요한 경우 남아있는 잔기를 변형시킴에 의해 선택 동안 도입된다. 이들 잔기 (또는 항원 결합 부위를 포함하는 부가적인 잔기)의 임의의 것의 임의 서브셋이 항원 결합 부위의 초기 및/또는 후속하는 변형을 위해 사용될 수 있음이 당업자에게는 자명할 것이다.
본 발명에 사용하기 위한 라이브러리의 작제에서, 선택된 위치의 변형은 통상적으로 가능한 아미노산의 수 (모두 20 또는 이의 서브셋)가 그 위치에서 도입될 수 있도록 폴리펩티드의 서열을 특정하는 코딩 서열을 변형시킴으로써 핵산 수준에서 이루어진다. IUPAC 명명법을 이용하여, 가장 다재다능한 코돈은 NNK이며, 이 코돈은 모든 아미노산 및 TAG 정지 코돈을 엔코딩한다. 상기 NNK 코돈은 바람직하게는 필요한 변형을 도입시키기 위해 사용된다. 부가적인 정지 코돈 TGA 및 TAA의 생성을 유도하는 NNN 코돈을 포함하는, 동일한 말단을 형성시키는 다른 코돈이 또한 사용된다.
인간 항체의 항원 결합 부위에서 측쇄 변형의 특징은, 특정 아미노산 잔기를 선호하는 뚜렷한 치우침(bias)이 존재한다는 것이다. VH, Vκ 및 Vλ영역 각각에서 가장 변형된 10개 위치의 아미노산 조성이 합해지는 경우, 측쇄 변형의 76% 초과는 단지 7개의 다양한 잔기로부터 비롯되는데, 이들 잔기는 세린 (24%), 티로신 (14%), 아스파라긴 (11%), 글리신 (9%), 알라닌 (7%), 아스파르테이트 (6%) 및 트레오닌 (6%)이다. 주쇄 가요성을 제공할 수 있는 친수성 잔기 및 작은 잔기로의 이러한 치우침은 아마도 광범위한 항원 또는 에피토프를 결합시키기 위해 사전 조치되는 (predisposed) 표면의 진화를 반영할 것이며, 주요 레퍼토리에서 항체의 요망되는 뒤섞임을 설명하는데 도움이 될 수 있다.
아미노산의 이러한 분포를 모방하는 것이 바람직하기 때문에, 변형되는 위치에서 아미노산의 분포는 항체의 항원 결합 부위에서 확인되는 것을 모방하는 것이 바람직하다. 일정 범위의 표적 항원에 대해 특정 폴리펩티드 (단지 항체 폴리펩티드는 아님)의 선택을 허용하는 아미노산의 치환에서 상기 치우침은 임의의 폴리펩티드 레퍼토리에도 용이하게 적용된다. 변형되는 위치에서 아미노산 분포를 치우치게 하는 다양한 방법 (트리-누클레오티드 돌연변이형성을 이용하는 것을 포함함, 참조 WO 97/08320호)이 존재하는데, 합성의 용이함 때문에 상기 방법의 바람직한 방법은 통상적인 축퇴 코돈을 사용한다. (각 위치에서 동일한 비율로 1개, 2개, 3개 및 4개의 축퇴를 갖는) 축퇴된 코돈의 모든 조합에 의해 엔코딩된 아미노산 프로파일을 천연 아미노산 사용과 비교함으로써, 가장 대표적인 코돈을 계산할 수 있게 된다. 코돈 (AGT)(AGC)T, (AGT)(AGC)C 및 (AGT)(AGC)(CT) - 즉, 각각 IUPAC 명명법을 이용하여 DVT, DVC 및 DVY는 요망되는 아미노산 프로파일에 가장 근접한 것들이다: 이들은 22%의 세린 및 11%의 티로신, 아스파라긴, 글리신, 알라닌, 아스파르테이트, 트레오닌 및 시스테인을 엔코딩한다. 그러므로, 바람직하게는 변형된 각각의 위치에서 DVT, DVC 또는 DVY 코돈을 이용하여 라이브러리가 작제된다.
G: 리간드의 반감기를 증가시킬 수 있는 항원
본 발명에 따른 이중 특이적 리간드는 이의 한 구성에 있어서, 생체내 리간드의 반감기를 증가시킬 수 있는 하나 이상의 분자에 결합될 수 있다. 통상적으로, 이러한 분자는 생체내에서 자연적으로 발생하고 원치 않는 물질을 유기체로부터 제거하는 내인성 메카니즘에 의한 분해 또는 제거에 저항하는 폴리펩티드이다. 예를 들어, 유기체의 반감기를 증가시키는 분자는 하기로부터 선택될 수 있다:
세포외 매트릭스로부터의 단백질: 예를들어, 콜라겐, 라미닌, 인테그린 및 피브로넥틴. 콜라겐은 세포외 매트릭스의 주된 단백질이다. 약 15종의 콜라겐 분자가 현재 알려져 있고, 신체의 다른 부분, 예를들어 뼈, 피부, 힘줄, 인대, 각막, 내부기관에서 제1형 콜라겐(신체 콜라겐의 90%를 차지함) 또는 연골, 척추 디스크, 척색 및 눈의 유리체 액에서 제2형 콜라겐이 발견된다.
혈액에서 발견되는 단백질: 피브린과 같은 혈장 단백질, α-2 매크로글로불린, 혈청 알부민, 피브리노겐 A, 피브리노겐 B, 혈청 아밀로이드 단백질 A, 햅토글로빈, 프로필린, 유비퀴틴, 우테로글로불린 및 β-2-마이크로글로불린을 포함한다.
효소 및 억제제, 예컨대 플라스미노겐, 리소자임, 시스타틴 C, 알파-1-항트립신 및 췌장 트립신 억제제. 플라스미노겐은 트립신-유사 세린 프로테아제 플라스민의 비활성 전구체이다. 이것은 일반적으로 혈류를 통해 순환하는 것이 발견된다. 플라스미노겐이 활성화되어 플라스민으로 전환되면, 이것은 혈병에서 혈액 세포를 얽히게 하는 피브리노겐 섬유를 용해시키는 유력한 효소 도메인을 언폴딩시킨다. 이것을 섬유소용해라 한다.
면역계 단백질, 예컨대 IgE, IgG, IgM.
수송 단백질, 예컨대 레티놀 결합 단백질, α-1 마이크로글로불린.
디펜신, 예컨대 베타-디펜신 1, 뉴로필 디펜신 1, 2 및 3.
혈뇌 장벽 또는 신경 조직에서 발견되는 단백질, 예컨대 멜라노코르틴 수용체, 미엘린, 아스코르브산염 수송체.
트랜스페린 수용체 특이적인 리간드-신경약제 융합 단백질 (참조 US5977307);
뇌 모세관 내피 세포 수용체, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 1 (IGF 1) 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 2 (IGF-2) 수용체, 인슐린 수용체.
신장에 국한된 단백질, 예컨대 폴리시스틴, 제4형 콜라겐, 유기 음이온 수송체 K1, 헤이만스 항원.
간에 국한된 단백질, 예를들어, 알코올 탈수소화효소, G250.
혈액 응고 인자 X
α1 항트립신
HNF 1α
폐에 국한된 단백질, 예를들어 분비 성분 (IgA와 결합됨)
심장에 국한된 단백질, 예를들어 HSP27. 이것은 팽창된 심근병증과 관련된다.
피부에 국한된 단백질, 예를들어 케라틴.
골 특이적 단백질, 예컨대 뼈발생 활성이 입증된 형질전환 성장 인자 β 슈퍼패밀리의 서브셋인 골 형태발생 단백질 (BMP). 예로는 BMP-2, -4, -5, -6, -7 (뼈발생 단백질 (OP-1)로서도 언급됨) 및 -8 (OP-2)이 있다.
종양 특이적 단백질, 인간 영양막 항원, 헤르셉틴 수용체, 오에스트로겐 수용체, 카텝신, 예컨대 카텝신 B (간과 비장에서 발견됨)를 포함한다.
질병-특이적 단백질, 예컨대 LAG-3 (림프구 활성 유전자), 오스테오프로테게린 리간드 (OPGL; Nature 402, 304-309; 1999 참조), OX40 (TNF 수용체 패밀리의 구성원, 활성화된 T 세포 및 특이적으로 인간 T 세포 백혈병 바이러스 타입 I (HTLV-1)-생산 세포에서 상향 조절되는 것으로 공지된 공자극 T 세포 분자에서만 발현됨; J Immunol. 2000 Jul 1; 165(1): 263-70 참조)을 포함하는 활성화된 T 세포에서만 발현되는 항원; CG6512 드로소필라, 인간 파라프레긴, 인간 FtsH, 인간 AFG3L2, 뮤린 ftsH를 포함하는 메탈로프로테아제 (관절염/암과 관련) 및 산성 섬유모세포 성장 인자 (FGF-1), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (FGF-2), 혈관 내피 성장 인자/혈관 삼투성 인자 (VEGF/VPF), 형질전환 성장 인자-α (TFG-α), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α), 안지오제닌, 인터루킨-3 (IL-3), 인터루킨-8 (IL-8), 혈소판-유래 내피 성장 인자 (PD-ECGF), 태반 성장 인자 (P1GF), 미드킨 혈소판-유래 성장 인자-BB (PDGF) 및 프랙탈킨을 포함하는 혈관신생 성장 인자를 포함한다.
스트레스 단백질 (열 쇼크 단백질) HSP는 보통 세포내에서 발견된다. 이들이 세포외에서 발견될 때, 이것은 세포가 치사되어 그 내용물이 유출되었다는 척도이다. 외상, 질병 또는 상해의 결과로서 생체내에서 세포외 HSP가 감염 및 질병과 싸우는 면역계로부터의 반응을 일으킬 때에만, 이렇게 프로그래밍되지 않은 세포 치사 (괴사)가 발생한다. 세포외 HSP에 결합되는 이중 특이적 리간드는 질병 부위에 국한될 수 있다.
Fc 수송에 수반되는 단백질
브람벨 수용체 (FcRB라고도 공지됨)
이러한 Fc 수용체는 2가지 기능이 있고, 이들 모두는 전달에 잠재적으로 유용하다.
기능은
(1) 태반을 통하여 엄마로부터 아이에게 IgG의 수송
(2) 분해로부터 IgG를 보호하여 IgG의 혈청 반감기를 연장시키는 것이다. 상기 수용체는 엔도솜으로부터 IgG를 재생하는 것으로 생각된다
참조 문헌(Holliger et al., Nat Biotechnol 1997 Jul; 15(7): 632-6.
본 발명에 따른 리간드는 생체내 반감기에 있어서 임의의 증가를 요구하지 않거나 이를 증가시키지 않으며 상기 표적에 특이적이도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 리간드는 조직-특이적인 상기 개시된 것들로부터 선택된 표적에 특이적일 수 있어서, 비록 반감기에 있어서의 임의의 증가가 초래될지라도 이와 무관하게, 이중 특이적 리간드 또는 치료적으로 관련된 조직-특이적 표적에 결합된 dAb 단량체의 조직-특이적 표적화를 가능하게 할 수 있다. 또한, 리간드 또는 dAb 단량체가 신장 또는 간을 표적으로 하는 경우, 이것은 생체내 대안적인 청소 경로로 리간드 또는 dAb 단량체를 재유도할 수 있다 (예를 들어, 리간드는 간 청소로부터 신장 청소로 유도될 수 있다).
상기 개시된 대로, 본원에 정의된 단일 가변 도메인을 포함하는 본원에 개시된 리간드는 표적에 특이적이도록 선택될 수 있고, 바람직하게는 비록 요구되지는 않으나, 생체내 표적의 반감기를 증가시키는데 추가로 기여할 수 있다. 이중-특이적 리간드는 제1 에피토프 또는 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 항체 중쇄 단일 가변 도메인 및 또한 제2 에피토프 또는 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 항체 경쇄 단일 가변 도메인으로 구성될 수 있고, 항원들 중 하나 또는 둘 모두는 혈청 알부민일 수 있거나, 에피토프들 중 하나 또는 둘 모두는 혈청 알부민의 에피토프(들)이다. 일 구체예에서, 혈청 알부민 에피토프 둘 모두는 동일하고, 또 다른 구체예에서, 각 혈청 알부민 에피토프는 상이하다.
생체내 표적의 반감기를 증가시키는데 기여하는 이러한 이중-특이적 리간드에 추가하여, 예컨대 혈청 알부민에 결합됨에 의해 생체내 표적 결합 리간드의 반감기를 증가시키는 특성이 있는 본원에 정의된 하나 이상의 단일 가변 도메인을 지니거나 이로 구성된 리간드의 다른 구조적 형태가 본원에 기술된다. 예를 들어, 리간드는 혈청 알부민에 결합되는 본원에 정의된 단량체 단일 가변 도메인으로 구성되거나 이를 함유할 수 있거나; 리간드는 본원에 정의된 다중 단일 가변 도메인을 포함하는 형태일 수 있으며, 여기서 단일 가변 도메인의 하나 이상은 혈청 알부민에 결합되며, 즉 다량체이다. 다량체 및 단량체 둘 모두는 혈청 알부민에 결합되는 하나 이상의 단일 가변 도메인(들)에 추가하여 다른 실체를 추가로 포함할 수 있으며, 예컨대 융합 단백질 및/또는 컨주게이트의 형태이다. 이러한 융합 단백질은 바람직하게는 단일 폴리펩티드 사슬이고 예를 들어 본원에 정의된 둘 이상의 결합된 단일 가변 도메인을 포함할 수 있으며; 결합된 단일 가변 도메인은 서로 동일하거나 서로 상이할 수 있다. 이러한 실체는, 예컨대 본원에 정의된 하나 이상의 추가 단일 가변 도메인을 포함하며, 이것은 혈청 알부민 이외의 항원 또는 에피토프, 및/또는 하나 이상의 약물, 및/또는 혈청 알부민 이외의 항원 또는 에피토프에 특이성이 있고 본원에 정의된 단일 가변 도메인이 아닌 하나 이상의 표적 결합 도메인에 특이성을 지닌다. 이러한 다량체는 이의 단일 가변 도메인(들)에 다중 결합가를 지닐 수 있어서, 예컨대 1가, 2가, 3가, 4가이다. 이러한 다량체는 본원에 정의된 이중 특이적 리간드 또는 IgG 구조의 형태 뿐만 아니라 IgM, IgE, IgD, 또는 IgA와 같은 다른 구조, 및/또는 scFv 단편, Fab, Fab' 등을 포함하나 이로 제한되지 않는 이의 단편의 형태를 지닐 수 있다. 리간드는 융합 단백질 또는 컨주게이트와 같은 추가 부분을 함유하도록 변형될 수 있다.
본원에 개시된 이중 특이적 리간드 또는 단량체 리간드 또는 다량체 리간드의 항체 중쇄 단일 가변 도메인은 혈청 알부민에 특이적으로 결합될 수 있고 항체 중쇄 단일 가변 도메인의 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 항체 중쇄 단일 가변 도메인은 하기 도메인 중 하나로부터 선택될 수 있으나 바람직하게는 이로 제한되지 않는다: dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30 및 dAb7h31, 또는 이와 적어도 80% 동일하고, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이하로 동일하며 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 아미노산 서열을 지닌 도메인. 대안적으로, 리간드는 항체 단일 가변 도메인, 바람직하게는 하기 도메인 중 하나와 혈청 알부민과의 결합에 대해 경쟁하는 항체 중쇄 단일 가변 도메인을 포함한다: dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7r13, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h1O, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p1, 및 dAb7p2, 또는 이와 적어도 80% 동일하고, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이하로 동일하며 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 아미노산 서열을 지닌 도메인. 대안적으로, 리간드는 항체 중쇄 단일 가변 도메인에 추가하여, 혈청 알부민에 특이적으로 결합될 수 있고 항체 경쇄 단일 가변 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄 단일 가변 도메인을 포함한다. 이러한 항체 경쇄 단일 가변 도메인은 하기 도메인 중 하나로부터 선택될 수 있으나 바람직하게는 이로 제한되지 않는다: dAb7m12, dAb7ml6, dAb7m26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7rl3, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h1O, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p1, 및 dAb7p2, 또는 이와 적어도 80% 동일하고, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이하로 동일하며 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 아미노산 서열을 지닌 도메인. 대안적으로, 리간드는 항체 단일 가변 도메인, 바람직하게는 하기 도메인 중 하나로부터 선택될 수 있으나 바람직하게는 이로 제한되지 않는 도메인과 혈청 알부민과의 결합에 대해 경쟁하는 항체 경쇄 단일 가변 도메인을 포함한다: dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7r13, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h1O, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p1, 및 dAb7p2, 또는 이와 적어도 80% 동일하고, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이하로 동일하며 혈청 알부민에 대해 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열을 지닌 도메인. 일 구체예에서, 리간드는 상기 이중 특이적 리간드 중 하나 또는 두 개의 임의의 조합을 지니는 IgG 면역글로불린일 수 있다. 일 구체예에서, 리간드는 상기 나열된 단일 가변 도메인의 하나 이상의 단량체를 함유할 수 있고, 여기서 리간드가 이러한 단일 가변 도메인들 중 하나를 초과는 도메인을 함유하는 경우, 그 단일 가변 도메인들은 서로 동일하거나 서로 동일하지 않을 수 있다.
일 구체예에서, 리간드는 제1 항원 또는 에피토프 결합 특이성을 갖는 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 제2 항원 또는 에피토프 결합 특이성을 갖는 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인을 지니는 이중 특이적 리간드일 수 있고, 제1 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인은 항체 중쇄 단일 가변 도메인이고, 여기서 제1 및 제2 항체 중쇄 단일 가변 도메인들 중 하나 또는 둘 모두는 혈청 알부민에 특이적으로 결합되며 하기 항체 중쇄 단일 가변 도메인 중 하나로부터 선택될 수 있으나 바람직하게는 이로 제한되지 않는 항체 중쇄 단일 가변 도메인의 아미노산 서열을 지닌다: dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30 및 dAb7h31, 또는 이와 적어도 80% 동일하고, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이하로 동일한 아미노산 서열. 상기 리간드의 일 구체예는 제1 항원 또는 에피토프 결합 특이성을 갖는 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 제2 항원 또는 에피토프 결합 특이성을 갖는 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인을 지니는 이중 특이적 리간드이며, 제1 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인은 항체 중쇄 단일 가변 도메인이고, 여기서 제1 및 제2 항체 중쇄 단일 가변 도메인들 중 하나 또는 둘 모두는 혈청 알부민에 특이적으로 결합되고 혈청 알부민과의 결합에 대해 하기 항체 단일 가변 도메인 중 하나로부터 선택될 수 있으나 바람직하게는 이로 제한되지 않는 항체 단일 가변 도메인의 아미노산 서열을 지니는 단일 가변 도메인과 경쟁한다: dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7r13, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7rl9, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h1O, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p1, 및 dAb7p2, 또는 이와 적어도 80% 동일하거나 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이하로 동일한 서열. 일 구체예에서, 리간드는 상기 이중 특이적 리간드 중 하나 또는 두 개의 임의의 조합을 지니는 IgG 면역글로불린일 수 있다. 일 구체예에서, 리간드는 상기 나열된 단일 가변 도메인의 하나 이상의 단량체를 함유할 수 있고, 이 때 리간드가 이러한 단일 가변 도메인들 중 하나를 초과하는 도메인을 함유한다면, 그 단일 가변 도메인은 서로 동일하거나 서로 상이할 수 있다.
일 구체예에서, 이중 특이적 리간드는 제1 항원 또는 에피토프 결합 특이성을 갖는 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 제2 항원 또는 에피토프 결합 특이성을 갖는 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인을 지니며, 제1 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인은 항체 경쇄 단일 가변 도메인이고, 제1 및 제2 항체 경쇄 단일 가변 도메인들 중 하나 또는 둘 모두는 혈청 알부민에 특이적으로 결합되고 하기 항체 경쇄 단일 가변 도메인들 중 하나로부터 선택될 수 있으나 바람직하게는 이로 제한되지 않는 항체 경쇄 단일 가변 도메인의 아미노산 서열을 지닌다: dAb7ml2, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7r13, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h1O, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p1, 및 dAb7p2, 또는 이와 적어도 80% 동일하거나 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이하로 동일한 서열.
일 구체예에서, 리간드는 제1 항원 또는 에피토프 결합 특이성을 갖는 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 제2 항원 또는 에피토프 결합 특이성을 갖는 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인을 지니는 이중 특이적 리간드일 수 있고, 제1 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인은 항체 경쇄 단일 가변 도메인이고, 제1 및 제2 항체 경쇄 단일 가변 도메인들 중 하나 또는 둘 모두는 혈청 알부민에 특이적으로 결합되고 혈청 알부민과의 결합에 대해 하기 항체 단일 가변 도메인들 중 하나로부터 선택될 수 있으나 바람직하게는 이로 제한되지 않는 항체 단일 가변 도메인의 아미노산 서열을 지니는 항체 경쇄 단일 가변 도메인과 경쟁한다: dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7r13, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h1O, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p1 및 dAb7p2, 또는 이와 적어도 80% 동일하거나 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이하로 동일한 서열.
하나 이상의 항체 중쇄 단일 가변 도메인이 혈청 알부민에 특이적으로 결합되고 하기로부터 선택되나 바람직하게는 이로 제한되지 않는 항체 중쇄 단일 가변 도메인의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 항체 중쇄 단일 가변 도메인을 지니는 리간드가 본원에 개시된다: dAb8, dAb10, dAb36, dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, 및 이와 적어도 80% 동일하거나 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이하로 동일한 서열.
하나 이상의 항체 중쇄 단일 가변 도메인이 혈청 알부민에 특이적으로 결합되고 혈청 알부민과의 결합에 대해 하기 중 하나로부터 선택되나 바람직하게는 이로 제한되지 않는 항체 단일 가변 도메인의 아미노산 서열을 지니는 항체 단일 가변 도메인과 경쟁하는 하나 이상의 항체 중쇄 단일 가변 도메인을 지니는 리간드가 본원에 개시된다: dAb8, dAb10, dAb36, dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7r13, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h1O, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p1, 및 dAb7p2.
제1 항원 또는 이의 에피토프에 결합 특이성을 갖는 항체 중쇄 단일 가변 도메인 및 제2 항원 또는 이의 에피토프에 결합 특이성을 갖는 항체 경쇄 단일 가변 도메인을 지니는 리간드로서, 제1 항원 및 상기 제2 항원 중 하나 또는 둘 모두가 혈청 알부민이고, 항체 중쇄 단일 가변 도메인이 혈청 알부민에 특이적으로 결합되고 혈청 알부민과의 결합에 대해 그룹 dAb8, dAb10, dAb36, dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7r13, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h1O, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p1, dAb7p2로부터 선택되나 바람직하게는 이로 제한되지 않는 항체 단일 가변 도메인의 아미노산 서열을 갖는 항체 단일 가변 도메인과 경쟁하고, 항체 경쇄 단일 가변 도메인이 혈청 알부민에 특이적으로 결합되고 dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, drdAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7r13, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h1O, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p1, 및 dAb7p2, 및 이와 적어도 80% 동일하거나 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이하로 동일한 서열로부터 선택되나 바람직하게는 이로 제한되지 않는 항체 경쇄 단일 가변 도메인의 아미노산 서열을 갖는 리간드가 본원에 제공된다.
제1 항원 또는 이의 에피토프에 결합 특이성을 갖는 항체 중쇄 단일 가변 도메인 및 제2 항원 또는 이의 에피토프에 결합 특이성을 갖는 항체 경쇄 단일 가변 도메인을 지니는 리간드로서, 상기 제1 항원 및 상기 제2 항원 중 하나 또는 둘 모두가 혈청 알부민이고, 항체 중쇄 단일 가변 도메인이 혈청 알부민에 특이적으로 결합되고 하기 군 dAb8, dAb10, dAb36, dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, 및 이와 적어도 80% 동일하거나 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이하로 동일한 서열로부터 선택되나 바람직하게는 이로 제한되지 않는 항체 중쇄 단일 가변 도메인의 아미노산 서열을 지니며, 항체 경쇄 단일 가변 도메인이 혈청 알부민에 특이적으로 결합되고 혈청 알부민과의 결합에 대해 하기 군 dAb8, dAb10, dAb36, dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7r13, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7hlO, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p1 및 dAb7p2로부터 선택되나 바람직하게는 이로 제한되지 않는 항체 단일 가변 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 항체 단일 가변 도메인과 경쟁하는 리간드가 본원에 제공된다.
제1 항원 또는 이의 에피토프에 결합 특이성을 갖는 하나 이상의 항체 중쇄 단일 가변 도메인 및 제2 항원 또는 이의 에포토프에 결합 특이성을 갖는 하나 이상의 경쇄 단일 가변 도메인을 지니는 리간드로서, 제1 항원 및 제2 항원 중 하나 또는 둘 모두가 혈청 알부민이고, 하나 이상의 항체 중쇄 단일 가변 도메인이 혈청 알부민에 특이적으로 결합되고 혈청 알부민과의 결합에 대해 하기 군 dAb8, dAb10, dAb36, dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7ml2, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7r13, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h1O, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p1, dAb7p2로부터 선택되나 바람직하게는 이로 제한되지 않는 항체 단일 가변 도메인의 아미노산 서열을 지니는 항체 단일 가변 도메인과 경쟁하고, 하나 이상의 항체 경쇄 단일 가변 도메인이 혈청 알부민에 특이적으로 결합되고 하기 dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, drdAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7r13, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h1O, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p1, 및 dAb7p2, 및 이와 적어도 80% 동일하거나 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이하로 동일한 아미노산 서열로부터 선택되나 바람직하게는 이로 제한되지 않는 항체 경쇄 단일 가변 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 리간드가 제공된다.
제1 항원 또는 이의 에피토프에 결합 특이성을 갖는 하나 이상의 항체 중쇄 단일 가변 도메인 및 제2 항원 또는 이의 에피토프에 결합 특이성을 갖는 하나 이상의 항체 경쇄 단일 가변 도메인을 지니는 리간드로서, 상기 제1 항원 및 상기 제2 항원 중 하나 또는 둘 모두가 혈청 알부민이고, 하나 이상의 항체 중쇄 단일 가변 도메인이 혈청 알부민에 특이적으로 결합되고 하기 군 dAb8, dAb10, dAb36, dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r3O, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, 및 이와 적어도 80% 동일하거나 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이하로 동일한 서열로부터 선택되나 바람직하게는 이로 제한되지 않는 항체 중쇄 단일 가변 도메인의 아미노산 서열을 지니며, 하나 이상의 항체 경쇄 단일 가변 도메인이 혈청 알부민에 특이적으로 결합되고 혈청 알부민과의 결합에 대해 하기 군 dAb8, dAb10, dAb36, dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7r13, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h1O, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p1 및 dAb7p2으로부터 선택된 항체 단일 가변 도메인의 아미노산 서열을 지니는 항체 단일 가변 도메인과 경쟁하는 리간드가 본원에 제공된다.
하나 이상의 항체 경쇄 단일 가변 도메인을 지니는 리간드로서, 하나 이상의 항체 경쇄 단일 가변 도메인이 혈청 알부민에 특이적으로 결합되고 하기 군 dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, drdAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7r13, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h1O, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p1, dAb7p2, 및 이와 적어도 80% 동일하거나 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이하로 동일한 서열로부터 선택되나 바람직하게는 이로 제한되지 않는 항체 경쇄 단일 가변 도메인의 아미노산 서열을 지니는 리간드가 본원에 제공된다.
하나 이상의 항체 경쇄 단일 가변 도메인을 지니는 리간드로서, 하나 이상의 항체 경쇄 단일 가변 도메인이 혈청 알부민에 결합되고 혈청 알부민과의 결합에 대해 하기 군 dAb8, dAb10, dAb36, dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, aAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7r13, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h1O, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p1, 및 dAb7p2로부터 선택되나 바람직하게는 이로 제한되지 않는 항체 단일 가변 도메인의 아미노산 서열을 지니는 항체 단일 가변 도메인과 경쟁하는 리간드가 제공된다.
하나 이상의 단일 가변 도메인을 지니는 리간드로서, 하나 이상의 단일 가변 도메인이 혈청 알부민에 특이적으로 결합되고 혈청 알부민과의 결합에 대해 하기 군 dAb8, dAb10, dAb36, dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7r13, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h1O, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p1, 및 dAb7p2로부터 선택되나 바람직하게는 이로 제한되지 않는 항체 단일 가변 도메인의 아미노산 서열을 지니는 항체 단일 가변 도메인과 경쟁하는 리간드가 제공된다. 바람직하게는, 하나 이상의 단일 가변 도메인이 CTLA-4, 리포칼린, SpA, 애피보디, 아비머(avimer), GroEl 및 피브로넥틴으로 구성된 군으로부터 선택되나 바람직하게는 이로 제한되지 않는 스캐폴드를 포함하고, 혈청 알부민과의 결합에 대해 하기 군 dAb8, dAb10, dAb36, dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7r13, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7hlO, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p1, 및 dAb7p2로부터 선택되나 바람직하게는 이로 제한되지 않는 항체 단일 가변 도메인의 아미노산 서열을 갖는 항체 단일 가변 도메인과 경쟁한다.
제1 항원 또는 에피토프 결합 특이성을 갖는 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 제2 항원 또는 에피토프 결합 특이성을 갖는 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인을 지니는 리간드로서, 제1 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 항체 중쇄 단일 가변 도메인이고, 제1 항체 중쇄 단일 가변 도메인이 혈청 알부민에 특이적으로 결합되고 하기 군 dAb8, dAb10, dAb36, dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, 및 이와 적어도 80% 동일하거나 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이하로 동일한 서열로부터 선택되나 바람직하게는 이로 제한되지 않는 항체 중쇄 단일 가변 도메인의 아미노산 서열을 지니며, 제2 항체 중쇄 단일 가변 도메인이 혈청 알부민에 특이적으로 결합되고 혈청 알부민과의 결합에 대해 하기 군 dAb8, dAb10, dAb36, dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r73 dAb7r8, dAb7r13, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7hlO, dAb7hll, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p1, 및 dAb7p2로부터 선택된 항체 단일 가변 도메인의 아미노산 서열을 지니는 항체 단일 가변 도메인과 경쟁하는 리간드가 본원에 제공된다.
제1 항원 또는 에피토프 결합 특이성을 갖는 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 제2 항원 또는 에피토프 결합 특이성을 갖는 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인을 지니는 리간드로서, 제1 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인이 항체 경쇄 단일 가변 도메인이고, 제1 항체 경쇄 단일 가변 도메인이 혈청 알부민에 특이적으로 결합되고 하기 군 dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, drdAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7r13, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h1O, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p1, dAb7p2, 및 이와 적어도 80% 동일하거나 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이하로 동일한 서열로부터 선택되나 바람직하게는 이로 제한되지 않는 항체 경쇄 단일 가변 도메인의 아미노산 서열을 지니며, 제2 항체 경쇄 단일 가변 도메인이 혈청 알부민에 특이적으로 결합되고 혈청 알부민과의 결합에 대해 하기 군 dAb8, dAb10, dAb36, dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7r13, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7hlO, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p1, 및 dAb7p2로부터 선택되나 바람직하게는 이로 제한되지 않는 항체 단일 가변 도메인의 아미노산 서열을 갖는 항체 단일 가변 도메인과 경쟁하는 리간드가 본원에 제공된다.
상기 및 본원에 개시된 리간드의 구체예로는 상기 이중 특이적 리간드 중 하나 또는 두 개의 임의의 조합을 지니는 IgG 구조를 포함하는 구조를 지니는 것들, 및/또는 비-면역글로불린 스캐폴드를 포함하는 단일 가변 도메인을 지니는 것들이 있다. 이러한 면역글로불린 구조는 네 개의 항체 중쇄 단일 가변 도메인을 함유하는 IgG 구조 또는 네 개의 항체 경쇄 단일 가변 도메인을 함유하는 IgG 구조 뿐만 아니라 두 쌍의 사슬을 함유하는데 각 쌍이 항체 중쇄 단일 가변 도메인 및 항체 경쇄 단일 가변 도메인을 함유하는 IgG 구조를 포함하는, 항체 단일 가변 도메인의 다양한 조합을 지닐 수 있다. 이러한 IgG 구조에 추가하여, 본원에 개시된 리간드는 상기 개시된 단일 가변 도메인을 포함하나 바람직하게는 이로 제한되지 않는 단일 가변 도메인의 하나 이상의 단량체를 함유할 수 있으며, 여기서 리간드가 상기 단일 가변 도메인들 중 하나를 초과하는 도메인을 함유하는 경우, 단일 가변 도메인은 서로 동일하거나 동일하지 않을 수 있다.
하나 이상의 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드의 예는 본원에 개시된 dAb, 하나 이상의 단일 가변 도메인을 포함하는 이중 특이적 단량체, 항체 단쇄 단량체를 함유하는 이중 특이적 IgG 분자, 및 본원에 개시된 항체 단쇄 단량체를 포함하는 다가 IgG 분자를 포함하나 이로 제한되지 않는다. 이러한 구체예는 제네릭 리간드에 대한 결합 부위를 추가로 포함할 수 있다. 제네릭 리간드는 단백질 A, 단백질 L 및 단백질 G를 포함할 수 있으나 바람직하게는 이로 제한되지 않는다. IgG 포맷의 것들을 포함하는 이러한 이중 특이적 리간드의 경우, 각 제2 항원 또는 에피토프 결합 특이성에 대한 표적(들)은 시토킨, 시토킨 수용체, 효소, 효소 보조-인자 및 DNA 결합 단백질로부터 선택된 군에서 특성규명될 수 있는 항원에 대한 결합 특이성을 포함하나 바람직하게는 이로 제한되지 않고, 바람직하게는 이로 제한되지 않으나 EPO 수용체, ApoE, Apo-SAA, BDNF, 카르디오트로핀-1, EGF, EGF 수용체, ENA-78, 에오탁신, 에오탁신-2, 엑소두스-2, EpoR, FGF-산성, FGF-염기성, 섬유모세포 성장 인자-10, FLT3 리간드, 프랙트알킨 (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-β1, 인슐린, IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 a.a.), IL-8 (77 a.a.), IL-9, IL-1O, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IGIF), 인히빈 α, 인히빈 β, IP-1O, 각질세포 성장 인자-2 (KGF-2), KGF, 렙틴, LIF, 림포탁틴, 뮬레리안 억제 물질, 단핵구 콜로니 억제 인자, 단핵구 유인 단백질, M-CSF, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MIG, MIP-1α, MIP-3α, MIP-3β, MIP-4, 골수세포 선조 억제 인자-1 (MPIF-1), NAP-2, 뉴르투린, 신경 성장 인자, β-NGF, NT-3, NT-4, 온코스타틴 M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1α, SDF1β, TGF-β, TGF-β2, TGF-β3, TNF-β, TNF 수용체 I, TNF 수용체 II, TNIL-1, TPO, VEGF, VEGF 수용체 1, VEGF 수용체 2, VEGF 수용체 3, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-β, GRO-γ, HCC1, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3, HER 4, CD4, 인간 케모킨 수용체 CXCR4 또는 CCR5, C형 간염 바이러스로부터의 비구조 단백질 유형 3 (NS3), TNF-알파, IgE, IFN-감마, MMP-12, CEA, 에이치. 파일로리 (H. pylori), TB, 인플루엔자, E형 간염, MMP-12, 내재화 수용체, 예컨대 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 종양 세포 상의 ErBb2 수용체, 내재화 세포 수용체, LDL 수용체, FGF2 수용체, ErbB2 수용체, 트랜스페린 수용체, PDGF 수용체, VEGF 수용체, PsmAr, 세포외 매트릭스 단백질, 엘라스틴, 피블로넥틴, 라미닌, α1-항트립신, 조직 인자 프로테아제 억제제, PDKl, GSKl, Bad, 카스파제-9, 포르크헤드(Forkhead), 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori)의 항원, 미코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis)의 항원 및 인플루엔자 바이러스의 항원으로부터 선택될 수 있다. IgG 포맷으로 존재하는 이중 특이적 리간드를 포함하는 이러한 이중 특이적 리간드에서, 하나 또는 둘 모두의 단일 가변 도메인이, 예를 들어 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시 1 x lO-3 M 이하, 1 x 10-4 M 이하, 1 x 10-5 M 이하, 1 x 10-6 M 이하, 1 x 10-7 M 이하, 1 x 10-8 M 이하, 및 1 x 10-9 M 이하로부터 선택될 수 있으나 바람직하게는 이로 제한되지 않는 해리 상수 (Kd)로 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합된다. IgG 포맷으로 존재하는 이중 특이적 리간드를 포함하는 이러한 이중 특이적 리간드는 표지, tag 및 약물을 포함하나 바람직하게는 이로 제한되지 않는 하나 이상의 실체를 추가로 함유할 수 있다. IgG 포맷으로 존재하는 이중 특이적 리간드를 포함하는 이러한 이중-특이적 리간드 및 상기 나열된 단일 가변 도메인 중 하나 이상의 단량체를 함유하는 다량체 리간드는 키트, 및 이중 특이적 리간드 및 이의 담체를 함유하는 약제학적 조성물을 포함하는 조성물로 존재할 수 있다.
유사하게, 단량체 형태의 리간드 및 상기 정의된 다량체 형태의 리간드를 포함하는 본원에 개시된 하나 이상의 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드의 경우, 하나 이상의 단일 가변 도메인이, 예를 들어 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시 1 x 10-3 M 이하, 1 x 10-4 M 이하, 1 x 10-5 M 이하, 1 x 10-6 M 이하, 1 x 10-7 M 이하, 1 x 10-8 M 이하, 및 1 x 10-9 M 이하로부터 선택될 수 있으나 바람직하게는 이로 제한되지 않는 해리 상수 (Kd)로 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합된다. 이러한 리간드는 표지, tag 및 약물을 포함하나 바람직하게는 이로 제한되지 않는 하나 이상의 실체를 추가로 함유할 수 있다. 이러한 리간드는 키트, 및 리간드 및 이의 담체를 함유하는 약제학적 조성물을 포함하는 조성물로 존재할 수 있다.
본원에 인용된 퍼센트 동일성은 퍼센트 동일성은 아미노산 또는 누클레오티드 서열 길이의 전체 스트레치에 따른 퍼센트 동일성을 언급할 수 있다. 명시된 경우, 아미노산 또는 핵산 서열의 퍼센트 동일성은, 예를 들어 하나 이상의 항체 CDR 영역 및/또는 하나 이상의 항체 가변 프레임워크 영역을 따라 참조가 된 아미노산 또는 핵산 서열의 하나 이상의 분리된 영역으로부터의 서열(들)에 대한 퍼센트 동일성을 언급한다. 예를 들어, 폴리펩티드의 하나 이상의 CDR을 가로지르는 아미노산 수준에서의 서열 동일성은 항체 중쇄 또는 경쇄 단일 가변 도메인의 상응하는 CDR의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 이를 초과하는 동일성을 지닐 수 있다. 유사하게, 폴리펩티드의 하나 이상의 프레임워크 영역을 가로지르는 아미노산 수준에서의 서열 동일성은 항체 중쇄 또는 경쇄 단일 가변 도메인의 상응하는 프레임워크의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 이를 초과하는 동일성을 지닐 수 있다. 핵산 수준에서, 폴리펩티드의 하나 이상의 CDR을 엔코딩하는 핵산 서열은 항체 중쇄 또는 경쇄 단일 가변 도메인의 상응하는 CDR을 엔코딩하는 핵산 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 이를 초과하는 동일성을 지닐 수 있다. 핵산 수준에서, 폴리펩티드의 하나 이상의 프레임워크 영역을 엔코딩하는 핵산 서열은 항체 중쇄 또는 경쇄 단일 가변 도메인의 상응하는 프레임워크 영역을 각각 엔코딩하는 핵산 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 이를 초과하는 동일성을 지닐 수 있다. 프레임워크 영역 (FW)은 바람직하게는 항체 프레임워크 영역, 예컨대 인간 V3-23[DP47]JH4B 중쇄 또는 인간 카파 경쇄 DPK9/JK1으로부터 온 것이다. 프레임워크 영역(들)이 인간 V3-23[DP47]JH4B 중쇄 V 영역에서 발견되는 것일 때, 퍼센트 동일성은 이의 프레임워크 영역 및/또는 바람직하게는 도 24에 도시된 CDR 영역 중 하나 이상에 표적화될 수 있다. 프레임워크가 인간 DPK9/JK1 경쇄 V 영역에서 발견되는 것일 때, 퍼센트 동일성은 이의 참조가 되는 프레임워크 영역 및/또는 바람직하게는 도 24에 도시된 CDR 영역 중 하나 이상과 비교될 수 있다.
CDR은 바람직하게는 항체 가변 도메인의 것들이나, 바람직하게는 항체 단일 가변 도메인의 것들로 제한되지 않는다.
일부 구체예에서, 퍼센트 동일성의 구조적 특징은 기능성 양태와 관련된다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 참조가 되는 핵산 또는 아미노산 서열에 100% 미만의 동일성을 갖는 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 참조 아미노산 서열 또는 참조가 되는 핵산에 의해 엔코딩된 아미노산 서열의 하나 이상의 기능성 양태를 나타낼 것이 요구된다. 다른 구체예에서, 참조가 되는 핵산 또는 아미노산 서열에 각각 100% 미만의 동일성을 갖는 핵산 서열 또는 아미노산 서열도 참조 아미노산 서열 또는 참조가 되는 핵산에 의해 엔코딩된 아미노산 서열의 하나 이상의 기능성 양태를 나타낼 것이 요구되나, 기능적 특징은 다소 변경될 수 있고, 예컨대 참조에 비해 명시된 항원에 증가된 친화력을 부여할 수 있다.
H: 본 발명의 두 번째 구성에 따른 다중특이적 리간드의 용도
본 발명의 두 번째 구성의 방법에 따른 다중특이적 리간드는 생체내 치료적 및 예방적 적용, 시험관내 및 생체내 진단 적용, 시험관내 검정 및 시약 적용 등에 이용될 수 있다. 예를 들어, 항체 분자는 당업자에게 공지된 방법에 따라 ELISA 기술과 같은 항체 기재 검정 기술에 이용될 수 있다.
상기에 언급된 대로, 본 발명에 따른 다중특이적 리간드는 진단, 예방 및 치료 절차에 이용된다. 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 표준 면역조직화학적 절차에 의한 웨스턴 분석 및 동일반응계내 단백질 검출에 진단적으로 이용되고; 이러한 적용에 사용되기 위해, 리간드는 당 분야에 공지된 기술에 따라 표지될 수 있다. 또한, 이러한 항체 폴리펩티드는 수지와 같은 크로마토그래피 지지체와 함께 이용될 때 친화력 크로마토그래피 절차에서 예비적으로 이용될 수 있다. 모든 이러한 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
본 발명에 따른 폐쇄 형태 다중특이적 리간드의 진단적 용도는 두 표적이 동시에 결합될 수 없도록 두 표적에 경쟁적으로 결합되는 폐쇄 형태 다중특이적 리간드의 능력, 또는 대안적으로 두 표적에 동시에 결합되는 (개방 형태) 이들의 능력을 활용하는 분석물에 대한 동종 검정을 포함한다.
진정한 동종 면역검정 포맷은 약물 발견 및 개발에 사용되는 진단 및 탐색 검정 시스템의 제조자들에 의해 추구되어 왔다. 주요 진단 시장은 병원, 의사 진료실 및 클리닉에서의 인간 시험, 표준 검진 의원, 혈액 뱅크 및 가정, 비-가정 진단학 (예를 들어, 식품 검사, 수질 검사, 환경 검사, 바이오-방어 및 수의적 검사), 및 마지막으로 연구 (약물 개발 포함; 기본적인 연구 및 학술 연구)를 포함한다.
현재 이러한 모든 시장은 대략 화학발광, ELISA, 형광성 또는 드물게 방사성-면역검정 기술에 기초한 면역검정 시스템을 이용한다. 이러한 검정 포맷 각각은 분리 단계 (미결합된 시약으로부터 결합된 시약 분리)를 필요로 한다. 일부 경우에, 여러 분리 단계가 요구된다. 이러한 분리 단계를 추가하는 것은 시약 및 오토메이션을 부가시키며, 시간이 걸리고, 검정의 궁극적인 성과에 영향을 미친다. 인간 진단학에서, 분리 단계는 자동화될 수 있는데, 이것은 문제를 감출 수 있으나 이를 제거하지는 못한다. 로봇식 조작, 추가 시약, 추가 인큐베이션 시간 등은 상당한 비용과 복잡성을 가중시킨다. 사실상 수 백만 개의 샘플을 매우 낮은 수준의 시험 분자를 이용하여 한번에 시험하는 고 출력 스크리닝과 같은 약물 개발에서, 부가의 분리 단계의 추가는 스크리닝을 수행하는 능력을 없애 버릴 수 있다. 그러나, 분리의 회피는 정보 판독에 있어서 너무 많은 노이즈를 생성한다. 따라서, 현재 검정 포맷으로부터 수득될 수 있는 범위에서 민감성을 제공하는 진정한 동종 포맷에 대한 요구가 존재한다. 유리하게는, 검정이 높은 민감성과 큰 동적 범위를 지니는 양적으로 충분한 정보 판독치를 소유한다. 민감성은 요구되는 샘플의 양을 감소시키는 중요한 요건이다. 이러한 특징들 둘 모두는 동종 시스템이 제공하는 특징이다. 이것은 현장 검사 (point of care testing), 및 샘플이 비싼 약물 개발에 있어서 매우 중요하다. 당 분야에서 현재 이용가능한 이종 시스템은 다량의 샘플 및 비싼 시약을 요구한다.
동종 검정에 대한 적용은 사람에게서 전립선 암을 스크리닝하는데 이용되는, 가장 큰 검정이 전립선 특이적 항원에 대한 것인 암 시험을 포함한다. 다른 적용으로는 생식능력 시험이 있는데, 이는 임신하고자 하는 여성에 대한 임신에 대한 베타-hcg를 포함하는 일련의 시험을 제공한다. 간염, HIV, 루벨라 및 다른 바이러스 및 미생물 및 성적으로 전염된 질병을 포함하는 감염성 질환에 대한 시험. 시험은 혈액 뱅크에 의해 이용되며, 특히 HIV, A형, B형, C형, 비A형 비B형 간염에 대한 시험이다. 시험을 모니터링하는 치료 약물은 효능을 위해 그리고 독성을 회피하기 위해 환자에게 처방된 약물의 수준을 모니터링하는 것을 포함하고, 예를 들어 부정맥의 경우 디곡신이고, 정신이상의 경우 페노바르비탈 수준이며; 천식의 경우 테오필린이다. 진단적 시험은 또한 남용된 약물 시험, 예컨대 코카인, 마리화나 등에 대한 시험에 유용하다. 대사 시험은 갑상선 기능, 빈혈증 및 다른 생리적 질환 및 기능을 측정하는데 이용된다.
동종 면역검정 포맷은 또한 표준 임상 화학 검정의 제조에 유용하다. 동일한 기구 상에 면역검정 및 화학 검정을 포함시키는 것이 진단 시험에 있어서 매우 유리하다. 적합한 임상 검정으로는 글루코오스, 콜레스테롤, 칼륨 등에 대한 시험이 있다.
동종 면역검정의 추가의 주요 적용은 약물 발견 및 개발이다: 고 출력 스크리닝은 조합 화학 라이브러리 대 초고(ultra high) 부피에서의 표적을 포함한다. 시그널을 검출한 다음, 포지티브 그룹을 더 작은 그룹으로 분할하고, 결국 세포에 이어 동물에서 시험한다. 동종 검정은 이러한 모든 유형의 시험에 이용될 수 있다. 약물 개발, 특히 동물 연구 및 임상 시험에서, 다량의 면역검정이 이용된다. 동종 검정은 이러한 절차를 크게 진척시키고 단순화시킨다. 다른 적용으로는 식품 및 음료 시험: 대장균(E. coli), 살모넬라(salmonella) 등에 대한 육류 및 기타 식품 시험; 대장균(E. coli)을 포함하는 모든 유형의 오염물에 대한 수설비에서의 시험을 포함하는 수질 시험; 및 수의적 시험이 있다.
광범한 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폐쇄 형태 다중특이적 리간드에 결합된 검출가능한 제제로서, 이의 검출가능한 특성이 분석물이 상기 폐쇄 형태 다중특이적 리간드에 결합됨에 의해 변화되는 검출가능한 제제를 포함하는 결합 검정을 제공한다. 이러한 검정은 여러 상이한 방법으로 구성될 수 있고, 각각은 폐쇄 형태 다중특이적 리간드의 상기 특성을 활용한다.
본 검정은 분석물에 의한 제제의 직접 또는 간접 전위에 의존하여, 제제의 검출가능한 특성을 변화시킨다. 예를 들어, 제제가 검출가능한 종료점을 지니는 반응을 촉매화할 수 있는 효소인 경우, 상기 효소는 이의 활성 부위를 차단하도록 리간드에 결합될 수 있어서, 효소가 불활성화된다. 페쇄 형태 다중특이적 리간드에 의해 결합된 분석물도 효소를 전위시켜, 이것이 활성 부위를 자유롭게 함에 의해 활성이 되도록 한다. 효소는 기질과 반응하여 검출가능한 사건을 일으킬 수 있다. 대안적인 구체예에서, 리간드는 활성 부위의 외부에서 효소에 결합될 수 있어서, 효소의 형태에 영향을 주고 이로써 활성을 변화시킨다. 예를 들어, 활성 부위의 구조는 리간드의 결합에 의해 강제될 수 있거나, 활성에 필요한 보조인자의 결합이 방해될 수 있다.
검정의 물리적 수행은 당 분야에 공지된 임의의 형태일 수 있다. 예를 들어, 폐쇄 형태 다중특이적 리간드/효소 복합체를 시험 스트립 상에서 제공할 수 있고; 기질을 시험 스트립의 상이한 영역에 제공할 수 있고, 분석물을 함유하는 용매가 리간드/효소 복합체를 통해 이동하고, 효소를 전위시키고, 이것을 기질 영역으로 운반하여 시그널을 생성할 수 있다. 대안적으로, 리간드/효소 복합체를 시험 스틱 또는 다른 고체 상 위에 제공하고, 분석물/기질 용액에 담그고, 효소를 분석물의 존재에 반응하여 용액으로 방출시킬 수 있다.
분석물의 각 분자가 잠재적으로 한 효소 분자를 방출시키기 때문에, 검정은 정량적이며, 주어진 시간에 생성된 시그널의 강도는 용액 중 분석물의 농도에 의존적이다.
폐쇄 형태의 분석물을 이용한 추가의 구성이 가능하다. 예를 들어, 폐쇄 형태 다중특이적 리간드는 입체성 다른자리에서 효소에 결합하여 효소를 활성화시키도록 구성될 수 있다. 이러한 구체예에서, 효소는 분석물의 부재하에 활성이다. 분석물의 첨가는 효소를 전위시키고 입체성 다른자리 활성화를 제거시켜 효소를 불활성화시킨다.
효소 활성을 분석물 농도의 치수로서 이용하는 상기 구체예와 관련하여, 효소의 활성화 및 불활성화는 시그널-생성 반응을 촉매작용하는 효소의 능력으로서 측정된, 효소 활성의 증가 또는 감소를 언급한다. 예를 들어, 효소는 검출불가능한 기질의 이의 검출가능한 형태로의 전환을 촉매화할 수 있다. 예를 들어, 호스래디쉬 과산화효소는 색원체 또는 화학발광 기질과 함께 당 분야에 널리 이용되며, 시판된다. 효소 활성의 증가 또는 감소 수준은 10% 내지 100%, 예컨대 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%일 수 있고; 활성이 증가하는 경우, 그 증가는 100% 초과, 즉 200%, 300%, 500% 또는 이를 초과하거나, 억제된 효소의 기준 활성이 검출불가능한 경우, 백분율로서 측정될 수 없다.
추가의 구성에서, 폐쇄 형태 다중특이적 리간드는 효소보다는 효소/기질 쌍의 기질에 결합될 수 있다. 따라서, 기질은 분석물의 결합을 통해 폐쇄 형태 다중특이적 리간드로부터 방출될 때까지 효소에 대해 이용할 수 없다. 이러한 구성에 대한 고찰은 효소에 결합된 구성에 대한 것과 같다.
더욱이, 검정은 형광성이 리간드에 결합시 켄칭되도록 하는 형태에서, 플루오레세인 또는 또 다른 플루오로포어와 같은 형광 분자에 결합하도록 구성될 수 있다. 이러한 경우, 분석물의 리간드에 대한 결합은 형광 분자를 제거할 것이므로 시그널을 생성한다. 본 발명에서 유용한 형광 분자에 대한 대안으로는 발광제, 예컨대 루시페린/루시퍼라제, 및 HRP와 같이 면역검정에 일반적으로 이용되는 제제를 포함하는 색원체가 있다.
본 발명에 따라 제조된 다중특이적 리간드의 치료적 및 예방적 사용은 본 발명에 따른 리간드를 인간과 같은 수용하는 포유동물에게 투여하는 것을 포함한다. 다중-특이성은 항체가 큰 결합력으로 다량체 항원에 결합하도록 할 수 있다. 다중특이적 리간드는, 예를 들어 종양 세포 라인의 치사를 매개하기 위해 세포독성 T-세포를 동원함에 있어서, 두 항원을 가교시킬 수 있다.
실질적으로 순수한 리간드 또는 이의 결합 단백질, 예를 들어 적어도 90 내지 95%의 균질성의 dAb 단량체가 포유동물에게 투여하기에 바람직하고, 98 내지 99% 이상의 균질성이, 특히 포유동물이 인간일 때, 약제학적 용도에 가장 바람직하다. 일단 부분적으로 또는 요망되는 균질성으로 정제되면, 리간드는 진단 또는 치료적으로 이용될 수 있거나 (체외적인 것 포함) 검정 절차, 면역형광 염색 등을 개발하고 수행하는데 이용될 수 있다 (Lefkovite and Pernis, (1979 and 1981) Immunological Methods, Volumes I and H5 Academic Press, NY).
리간드 또는 이의 결합 단백질, 예를 들어 본 발명의 dAb 단량체는 통상적으로 염증 상태, 알레르기 과민감성, 암, 세균 또는 바이러스 감염, 및 자가면역 질환 (이로 제한하는 것은 아니나 타입 I 당뇨병, 천식, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 전신 홍반 루푸스, 크론병 및 중증 근무력증을 포함한다)을 예방, 억제 또는 치료하는데 사용될 것이다.
본 출원에서, 용어 "예방"은 질병의 발생 전에 보호 조성물을 투여하는 것을 포함한다. "억제"는 질병의 발생 후, 그러나 질병의 임상적 양상 전에 조성물을 투여하는 것을 의미한다. "치료"는 질병의 증상이 명백해진 후에 보호 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 치료는 질병과 관련된 증상을 개선시키고, 질병의 발병을 예방하거나 지연시키고, 질병의 증상의 중증도 또는 빈도를 감소시키는 것을 포함한다.
질병에 대해 보호하거나 질병을 치료하는데 있어서 항체 또는 이의 결합 단백질의 유효성을 스크리닝하는데 이용될 수 있는 동물 모델 시스템을 이용할 수 있다. 감수성 마우스에서 전신 홍반 루푸스 (SLE)를 시험하는 방법은 당 분야에 공지되어 있다 (Knight et al. (1978) J. Exp . Med., 147: 1653; Reinersten et al. (1978) New Eng . J. Med., 299: 515). 중증 근무력증 (MG)은 다른 종으로부터의 가용성 AchR 단백질로 질환을 유도함에 의해 SJL/J 암컷 마우스에서 시험된다 (Lindstrom et al. (1988) Adv . Immunol., 42: 233). 관절염은 타입 II 콜라겐의 주사에 의해 마우스의 감수성 주에서 유도된다 (Stuart et al. (1984) Ann . Rev . Immunol., 42: 233). 애주번트 관절염이 미코박테리윰 열 쇼크 단백질의 주사에 의해 감수성 래트에서 유도된 모델이 기술되었다 (Van Eden et al. (1988) Nature, 331: 171). 갑상선염이 개시된 대로 티로글로불린의 투여에 의해 마우스에서 유도된다 (Maron et al. (1980) J. Exp . Med., 152: 1115). 인슐린 의존성 당뇨병 (IDDM)이 자연적으로 발생하거나 예컨대 문헌[Kanasawa et al. (1984) Diabetologia, 27: 113]에 개시된 대로 특정 주의 마우스에서 유도될 수 있다. 마우스 및 래트의 EAE는 인간의 MS에 대한 모델로서 기능한다. 이 모델에서, 말이집탈락 질환이 말이집 염기성 단백질의 투여에 의해 유도된다 (참조 Paterson (1986) Textbook of Immunopathology, Mischer et al ., eds., Grune and Stratton, New York, pp. 179-213; McFarlin et al. (1973) Science, 179: 478: and Satoh et al, (1987) J Immunol, 138: 179).
vWF, 예컨대 인간 vWF, vWF A1 도메인, 활성화된 vWF의 A1 도메인 또는 vWF A3 도메인에 특이적으로 결합되는 단일 가변 도메인 또는 이의 조성물을 포함하는 리간드가 혈전용해제를 추가로 포함할 수 있다. 이 혈전용해제는 단일 가변 도메인, 특히 항체 단일 가변 도메인에 당업자에게 공지된 공유적 또는 비-공유적 수단을 통해 비-공유적으로 또는 공유적으로 부착될 수 있다. 비-공유적 수단은 비오틴/스트렙타비딘과 같은 단백질 상호작용 또는 면역컨주게이트에 의한 것을 포함한다. 대안적으로, 혈전용해제는 상기 개시된 vWF 또는 vWF 도메인에 결합되는 단일 가변 도메인 또는 이의 조성물로 구성되거나 이를 포함하는 리간드와 관련하여 동시에, 따로따로 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 혈전용해제는 예를 들어 스타필로키나제, 조직 플라스미노겐 활성화제, 스트렙토키나제, 단쇄 스트렙토키나제, 유로키나제 및 아실 플라스미노겐 스트렙토키나제 복합체를 포함할 수 있다.
단일 가변 도메인 또는 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드 또는 이의 조성물, 또는 본원에 개시된 스크리닝 방법으로부터 초래된 단일 가변 도메인으로 코팅된 침습성 의학 장치가 본원에 개시된다. 장치의 비제한적인 예로는 외과용 튜빙, 폐색 장치, 보철 장치가 있다. 상기 장치의 적용은 침습 부위 주변에 혈소판-매개된 응집의 조절을 요구하거나 (에컨대, vWF에 특이적으로 결합되는 단일 가변 도메인으로 코팅한 장치) 또는 염증의 조절을 요구하는 (예컨대, TNF 알파에 특이적으로 결합되는 단일 가변 도메인으로 코팅한 장치) 외과적 절차를 포함한다.
일반적으로, 본 발명에 따른 리간드는 약리학적으로 적합한 담체와 함께 정제된 형태로 이용될 것이다. 통상적으로, 이러한 담체는 염수 및/또는 완충 매질을 포함한, 수성 또는 알코올성/수용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨 및 락테이트화된 링거를 포함한다. 적합한 생리학적으로 허용되는 애주번트는, 현탁액에서 폴리펩티드 복합체를 유지시킬 필요가 있는 경우, 증점제, 예를들어 카르복시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴 및 알기네이트로부터 선택될 수 있다.
정맥내 비히클은 유체 및 영양소 공급제 및 전해질 공급제, 예를들어 링거 덱스트로스를 기재로 한 것을 포함한다. 보존제 및 다른 첨가제, 예를들어, 항미생물제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 가스가 또한 존재할 수 있다(Mack (1982). Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition).
본 발명의 리간드는 개별적으로 투여되는 조성물로 사용될 수 있거나, 기타 제제와 함께 사용될 수 있다. 이들은 다양한 면역치료 약물, 예컨대 실코스포린, 메토트렉세이트, 아드리아마이신 또는 시스플라티눔, 및 면역독소를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 투여 전에 이들이 풀링(pooled)되는 지와 무관하게 본 발명에 따른 리간드, 또는 심지어 다른 특이성을 지닌 본 발명에 따른 리간드의 조합물, 예를들어 상이한 표적 항원 또는 에피토프를 이용하여 선택된 리간드의 조합물과 함께 다양한 세포독성 또는 다른 제제의 "칵테일"을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여 경로는 당업자에게 통상적으로 공지된 임의의 투여 경로일 수 있다. 비제한적으로 면역 치료를 포함하는 치료를 위해, 본 발명의 선택된 리간드는 표준 기술에 따라 임의의 환자에게 투여될 수 있다. 투여는 임의의 적절한 방법, 예를들어 비경구, 정맥내, 근육내, 복막내, 경피, 폐 경로를 통해서나 적합하게는 카테터를 이용한 직접 주입에 의해 이루어질 수 있다. 투여 용량 및 횟수는 환자의 나이, 성별 및 상태, 다른 약물의 동시 투여, 임상의에 의해 고려되는 반대징후 및 다른 파라미터에 따를 것이다.
본 발명에 따른 리간드는 저장을 위해 동결건조되고 사용전에 적절한 담체에 재구성될 수 있다. 이러한 기술은 통상적인 면역글로불린으로 효과적인 것으로 나타났으며, 당해 분야에 공지된 동결건조 및 재구성 기술이 사용될 수 있다. 동결건조 및 재구성은 항체 활성 손실의 정도를 변경시킬 수 있으며(예를들어 통상적인 면역글로불린과 함께, IgM 항체는 IgG 항체 보다 큰 활성 손실을 초래한다), 사용 수준이 보상되도록 상향으로 조절될 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다.
본 리간드를 함유하는 조성물 또는 이의 칵테일은 예방적 및/또는 치료학적 처치를 위해 투여될 수 있다. 특정한 치료 분야에서, 선택된 세포 집단의 적어도 부분적 저해, 억제, 조절, 사멸 또는 일부 다른 측정가능한 파라미터를 달성하기 위한 적절한 양은 "치료학적-유효량"으로서 규정된다. 이러한 용량을 달성하기 위해 필요한 양은 질병의 증증도 및 환자 자신의 면역계의 일반적인 상태에 따를 것이나, 일반적으로 이러한 양은 체중 1kg 당 0.005 내지 5.0 mg의 리간드, 예컨대 항체, 수용체 (예컨대, T-세포 수용체) 또는 이의 결합 단백질일 수 있으며, 더욱 일반적으로 0.05 내지 2.0 mg/kg/용량으로 사용된다. 예방 적용의 경우, 본 발명에 따른 리간드 또는 이의 칵테일을 함유한 조성물도 유사하거나 조금 낮은 용량으로 투여될 수 있다.
치료 전 나타나는 증상에 비해서 또는 그러한 조성물로 치료되지 않은 개체(인간 또는 모델 동물)에서의 증상에 비해서 하나 또는 하나를 초과하는 증상이 경감되면 (예를들어, 적어도 10% 또는 적어도 임상적인 평가 척도에서 1 포인트) 본 명세서에 기재된 조성을 사용하여 수행된 치료는 "효과적"인 것으로 간주된다. 증상은 목표로 하는 질환 또는 질병에 따라 명확히 상이하지만, 당업자 또는 전문가에 의해서 측정될 수 있다. 그러한 증상은 예를들어, 질환 또는 질병의 하나 이상의 생화학적 척도의 수준을 모니터링하거나 (예를들어, 질환과 연관된 효소 또는 대사물질의 수준, 병에 걸린 세포의 수 등), 외과적 징후를 모니터링하거나 (예를들어, 염증, 종양 크기 등), 또는 용인되는 임상적인 평가 척도, 예를들어 익스팬디드 디스어빌러티 스태튜스 스케일 (Expanded Disability Status Scale) (다발성 경화증에 대해서), 어빈 인플라매터리 보울 디지즈 퀘스쳐너리 (Irvine Inflammatory Bowel Disease Questionnaire) (내장 기능, 전신 증상, 사회적 기능, 감정적 상태에 관하여 삶의 질을 평가하는 32 포인트 평가 - 32 내지 224점의 범위이며, 높은 점수일수록 더 나은 삶의 질을 나타낸다), 퀄러티 오브 라이프 류마토이드 아르쓰리티스 스케일 (Quality of Life Rheumatoid Arthritis Scale) 또는 당업계에 알려진 다른 용인되는 임상적인 평가 척도에 의해 측정될 수 있다. 적어도 10% 또는 주어진 임상 척도에서 1 이상 만큼의 질환 또는 질병 증상에서의 일관된 (예를들어, 하루 이상, 더 길수록 바람직) 감소는 "효과적인" 치료를 나타내는 것이다. 유사하게, 상기 조성물로 치료되지 않은 유사한 개체 (인간 또는 동물 모델)에서의 증상에 비해서 하나 이상의 증상의 발병 또는 중증도를 지연시키고, 감소시키고 또는 제거한다면 본원에 기재된 조성물을 사용하여 수행되는 예방법은 "효과적인" 것이다.
본 발명에 따른 리간드 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물은 포유동물에서 선택된 표적 세포 집단의 변화, 불활성화, 치사 또는 제거를 보조하기 위한 예방적 또는 치료적 세팅으로 사용될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 폴리펩티드의 선택된 레퍼토리는 세포의 이종 집합체로부터 목적 세포 집단을 치사시키거나, 고갈시키거나 달리 효과적으로 제거하기 위하여 체외 또는 시험관내에서 선택적으로 사용될 수 있다. 포유동물로부터의 혈액은 리간드, 예를들어 항체, 세포 표면 수용체, 또는 이의 결합 단백질과 같은 리간드와 체외에서 조합될 수 있어서, 요망되지 않는 세포가 치사되거나 표준 기술에 따라 포유동물로 돌아가도록 혈액으로부터 달리 제거된다.
I: 본 발명에 따른 반감기 향상된 이중-특이적 리간드의 용도
본 발명의 방법에 따른 이중-특이적 리간드 및 본원에 정의된 하나 이상의 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드는 생체내 치료적 및 예방적 적용, 생체내 진단 적용 등에 적용될 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 이중-특이적 리간드 및 본원에 정의된 하나 이상의 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드의 치료적 및 예방적 사용은 본 발명에 따른 리간드를 인간과 같은 수용하는 포유동물에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명에 따른 이중 특이적 항체 및 본원에 정의된 하나 이상의 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드는 반감기 향상 분자에 대한 1종 이상의 특이성을 포함하고; 하나 이상의 추가의 특이성이 표적 분자에 대해 유도될 수 있다. 예를 들어, 이중-특이적 IgG는 네 개의 에피토프에 특이적일 수 있는데, 이 중 하나가 반감기 향상 분자 상에 있다. 이중-특이성 및 삼중-특이성 및 높은 결합가는 하나 이상의 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드가 큰 결합력으로 다량체 항원에 결합되게 할 수 있다. 이중-특이적 항체는, 예를 들어 종양 세포 라인의 치사를 매개하기 위해 세포독성 T-세포를 동원함에 있어서, 두 항원을 가교시킬 수 있다.
적어도 90 내지 95%의 균질성의 본 발명의 방법에 따른 실질적으로 순수한 이중-특이적 리간드 및 본원에 정의된 하나 이상의 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드 또는 이의 결합 단백질, 예컨대 단일 가변 도메인 단량체 (즉, dAb 단량체)가 포유동물에게 투여하기에 바람직하고, 98 내지 99% 이상의 균질성이, 특히 포유동물이 인간일 때, 약제학적 용도에 가장 바람직하다. 일단 부분적으로 또는 요망되는 균질성으로 정제되면, 리간드는 진단 또는 치료적으로 이용될 수 있거나 (체외적인 것 포함) 검정 절차, 면역형광 염색 등을 개발하고 수행하는데 이용될 수 있다 (Lefkovite and Pernis, (1979 and 1981) Immunological Methods, Volumes I and H5 Academic Press, NY).
본 발명의 방법에 따른 이중-특이적 리간드 및 본원에 정의된 하나 이상의 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드는 통상적으로 염증 상태, 알레르기 과민감성, 암, 세균 또는 바이러스 감염, 및 자가면역 질환 (이로 제한하는 것은 아니나 타입 I 당뇨병, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 전신 홍반 루푸스, 크론병 및 중증 근무력증을 포함한다)을 예방, 억제 또는 치료하는데 사용될 것이다.
본 출원에서, 용어 "예방"은 질병의 발생 전에 보호 조성물을 투여하는 것을 포함한다. "억제"는 질병의 발생 후, 그러나 질병의 임상적 양상 전에 조성물을 투여하는 것을 의미한다. "치료"는 질병의 증상이 명백해진 후에 보호 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
질병에 대해 보호하거나 질병을 치료하는데 있어서 이중 특이적 리간드의 유효성을 스크리닝하는데 이용될 수 있는 동물 모델 시스템을 이용할 수 있다. 감수성 마우스에서 전신 홍반 루푸스 (SLE)를 시험하는 방법은 당 분야에 공지되어 있다 (Knight et al. (1978) J. Exp . Med., 147: 1653; Reinersten et al. (1978) New Eng . J. Med., 299: 515). 중증 근무력증 (MG)은 다른 종으로부터의 가용성 AchR 단백질로 질환을 유도함에 의해 SJL/J 암컷 마우스에서 시험된다 (Lindstrom et al. (1988) Adv . Immunol., 42: 233). 관절염은 타입 II 콜라겐의 주사에 의해 마우스의 감수성 주에서 유도된다 (Stuart et al. (1984) Ann . Rev . Immunol., 42: 233). 애주번트 관절염이 미코박테리윰 열 쇼크 단백질의 주사에 의해 감수성 래트에서 유도된 모델이 기술되었다 (Van Eden et al. (1988) Nature, 331: 171). 갑상선염이 개시된 대로 티로글로불린의 투여에 의해 마우스에서 유도된다 (Maron et al. (1980) J. Exp . Med., 152: 1115). 인슐린 의존성 당뇨병 (IDDM)이 자연적으로 발생하거나 예컨대 문헌[Kanasawa et al. (1984) Diabetologia, 27: 113]에 개시된 대로 특정 주의 마우스에서 유도될 수 있다. 마우스 및 래트의 EAE는 인간의 MS에 대한 모델로서 기능한다. 이 모델에서, 말이집탈락 질환이 말이집 염기성 단백질의 투여에 의해 유도된다 (참조 Paterson (1986) Textbook of Immunopathology, Mischer et al ., eds., Grune and Stratton, New York, pp. 179-213; McFarlin et al. (1973) Science, 179: 478: and Satoh et al, (1987) J Immunol, 138: 179).
세포내이입에 수반된 세포외 표적 (예컨대, 클라트린)에 결합될 수 있는 본 발명에 따른 이중 특이적 리간드 및 dAb 단량체는 세포내 표적에 결합될 수 있는 또 다른 특이성이 세포내 환경에 전달될 수 있게 하면서, 이중 특이적 리간드가 세포내이입될 수 있게 한다. 이러한 전략은 세포 내부에서 기능을 유지할 수 있는 물리적 특성을 지닌 이중 특이적 리간드를 요구한다. 대안적으로, 최종 용도의 세포내 구획이 산화되는 경우, 잘 폴딩된 리간드가 무-이황화물일 것이 요구되지 않을 수 있다.
일반적으로, 본 이중 특이적 리간드는 약리학적으로 적합한 담체와 함께 정제된 형태로 이용될 것이다. 통상적으로, 이러한 담체는 염수 및/또는 완충 매질을 포함한, 수성 또는 알코올성/수용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨 및 락테이트화된 링거를 포함한다. 적합한 생리학적으로 허용되는 애주번트는, 현탁액에서 폴리펩티드 복합체를 유지시킬 필요가 있는 경우, 증점제, 예를들어 카르복시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴 및 알기네이트로부터 선택될 수 있다.
정맥내 비히클은 유체 및 영양소 공급제 및 전해질 공급제, 예를들어 링거 덱스트로스를 기재로 한 것을 포함한다. 보존제 및 다른 첨가제, 예를들어, 항미생물제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 가스가 또한 존재할 수 있다(Mack (1982). Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition).
본 발명의 리간드는 개별적으로 투여되는 조성물로 사용될 수 있거나, 기타 제제와 함께 사용될 수 있다. 이들은 다양한 면역치료 약물, 예컨대 실코스포린, 메토트렉세이트, 아드리아마이신 또는 시스플라티눔, 및 면역독소를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 본 발명에 따른 리간드와 함께 다양한 세포독성 또는 다른 제제의 "칵테일"을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여 경로는 당업자에게 통상적으로 공지된 임의의 투여 경로일 수 있다. 비제한적으로 면역 치료를 포함하는 치료를 위해, 본 발명에 따른 리간드는 표준 기술에 따라 임의의 환자에게 투여될 수 있다. 투여는 임의의 적절한 방법, 예를들어 비경구, 정맥내, 근육내, 복막내, 경피, 폐 경로를 통해서나 적합하게는 카테터를 이용한 직접 주입에 의해 이루어질 수 있다. 투여 용량 및 횟수는 환자의 나이, 성별 및 상태, 다른 약물의 동시 투여, 임상의에 의해 고려되는 반대징후 및 다른 파라미터에 따를 것이다.
본 발명에 따른 리간드는 저장을 위해 동결건조되고 사용전에 적절한 담체에 재구성될 수 있다. 이러한 기술은 통상적인 면역글로불린으로 효과적인 것으로 나타났으며, 당해 분야에 공지된 동결건조 및 재구성 기술이 사용될 수 있다. 동결건조 및 재구성은 항체 활성 손실의 정도를 변경시킬 수 있으며(예를들어 통상적인 면역글로불린과 함께, IgM 항체는 IgG 항체 보다 큰 활성 손실을 초래한다), 사용 수준이 보상되도록 상향으로 조절될 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다.
본 리간드 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물은 예방적 및/또는 치료학적 처치를 위해 투여될 수 있다. 특정한 치료 분야에서, 선택된 세포 집단의 적어도 부분적 저해, 억제, 조절, 사멸 또는 일부 다른 측정가능한 파라미터를 달성하기 위한 적절한 양은 "치료학적-유효량"으로서 규정된다. 이러한 용량을 달성하기 위해 필요한 양은 질병의 증증도 및 환자 자신의 면역계의 일반적인 상태에 따를 것이나, 일반적으로 이러한 양은 체중 1kg 당 0.005 내지 5.0 mg의 리간드일 수 있으며, 더욱 일반적으로 0.05 내지 2.0 mg/kg/용량으로 사용된다. 예방 적용의 경우, 본 발명에 따른 리간드 또는 이의 칵테일을 함유한 조성물도 유사하거나 조금 낮은 용량으로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 리간드를 함유하는 조성물은 포유동물에서 선택된 표적 세포 집단의 변화, 불활성화, 치사 또는 제거를 보조하기 위해 예방적 또는 치료적 세팅으로 사용될 수 있다.
또한, 본원에 기재된 폴리펩티드의 선택된 레퍼토리는 세포의 이종 집합체로부터 목적 세포 집단을 치사시키거나, 고갈시키거나 달리 효과적으로 제거하기 위하여 체외 또는 시험관내에서 선택적으로 사용될 수 있다. 포유동물로부터의 혈액은 리간드, 예를들어 항체, 세포 표면 수용체, 또는 이의 결합 단백질과 같은 리간드와 체외에서 조합될 수 있어서, 요망되지 않는 세포가 치사되거나 표준 기술에 따라 포유동물로 돌아가도록 혈액으로부터 달리 제거된다.
일정 범위의 종으로부터의 혈청 알부민에 결합되는 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드의 선택 및 특성규명
리간드는 하나 이상의 단일 가변 도메인, 예컨대 면역글로불린 단일 가변 도메인 및/또는 비-면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함할 수 있고, 여기서 단일 가변 도메인 중 1종 이상이 인간 및 비-인간 종으로부터의 혈청 알부민에 특이적으로 결합된다. 일 구체예에서, 단일 가변 도메인은 인간에게 내인성인 혈청 알부민에만 특이적으로 결합된다. 또 다른 구체예에서, 단일 가변 도메인은 비-인간 종으로부터의 혈청 알부민에 특이적으로 결합된다. 대안적으로, 단일 가변 도메인은 인간에 내인성인 혈청 알부민 및 하나 이상의 비-인간 종에 내인성인 혈청 알부민 둘 모두에 특이적으로 결합된다. 비제한적인 예로서, 이러한 단일 가변 도메인은 인간 및 시노몰거스 둘 모두에 내인성인 혈청 알부민 또는 인간 및 래트 둘 모두에 내인성인 혈청 알부민 또는 인간 및 마우스 둘 모두로부터의 혈청 알부민 또는 인간 및 돼지 둘 모두로부터의 혈청 알부민에 특이적으로 결합될 수 있다. 대안적으로, 단일 가변 도메인은 둘 이상의 비-인간 종으로부터의 둘 이상의 혈청 알부민에 특이적으로 결합된다. 본원에서 이용된 대로, 혈청 알부민은 종에 내인성인 유전자에 의해 발현될 수 있고, 즉 천연 혈청 알부민이고/거나 이의 재조합 등가물에 의해 발현될 수 있다. 일 구체에에서, 혈청 알부민은 천연 및 재조합 혈청 알부민의 단편, 유사체 및 유도체를 포함한다. 혈청 알부민의 이러한 단편은 도메인 I, 도메인 II 및/또는 도메인 III 또는 혈청 알부민, 바람직하게는 인간 혈청 알부민의 도메인 I, II 및 III 각각의 하나 또는 둘 이상의 조합물을 함유하는 단편을 포함한다. 혈청 알부민의 도메인 II는 본원에 정의된 단일 가변 도메인의 표적으로서 바람직하다. 다른 바람직한 조합은 도메인 I 및 도메인 II; 도메인 I 및 도메인 III; 도메인 II 및 도메인 III; 및 도메인 I 단독; 도메인 II 단독; 및 도메인 III 단독; 도메인 I 및 도메인 II 및 도메인 III이다. 일 구체예에서, 혈청 알부민은 동물 숙주와 같은 비-인간 숙주 또는 효모 또는 세균과 같은 단세포 숙주에서 외생적으로 발현된 재조합 혈청 알부민이다.
혈청 알부민이 내인성인 종은 내인성 혈청 알부민을 발현시키는 임의의 종을 포함하며, 인간, 마우스, 뮤린, 래트, 시노몰거스, 돼지, 개, 고양이, 말, 염소 및 햄스터 종을 포함하나 바람직하게는 이로 제한되지 않는다. 일부 예에서, 낙타 또는 라마에 내인성인 혈청 알부민이 제외된다.
단일 가변 도메인은 항체 중쇄 단일 가변 도메인, 항체 VHH 중쇄 단일 가변 도메인, 인간 항체 중쇄 단일 가변 도메인, 인간 VH3 중쇄 단일 가변 도메인, 항체 경쇄 단일 가변 도메인, 인간 항체 경쇄 단일 가변 도메인, 인간 항체 카파 경쇄 단일 가변 도메인, 및/또는 인간 람다 경쇄 단일 가변 도메인을 포함하나 바람직하게는 이로 제한되지 않는 면역글로불린 단일 가변 도메인일 수 있다.
혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 단일 가변 도메인은 면역글로불린 스캐폴드 또는 비-면역글로불린 스캐폴드를 포함하는 단일 가변 도메인일 수 있다. 혈청 알부민에 결합되는 단일 가변 도메인은 항체 가변 도메인, 바람직하게는 단일 가변 도메인으로부터의 CDR1, CDR2 및 CDR3 중 하나 또는 둘 또는 세 개를 포함할 수 있고, 여기서 CDR 영역(들)은 CTLA-4, 리포칼린, 스타필로코커스 단백질 A (SPA), GroEL 및 피브로넥틴, 트랜스페린 (Biorexis로부터 시판됨), 아비머™ 및 애피보디™ 스캐폴드와 같은 비-면역글로불린 스캐폴드 상에 제공된다. 대안적으로, 혈청 알부민에 결합되는 비-면역글로불린 단일 가변 도메인은 항체 CDR 영역(들) 또는 항체로부터의 완전한 결합 도메인을 함유하지 않을 수 있다. 대안적으로 혈청 알부민에 결합되는 단일 가변 도메인(들)은 항체 가변 도메인, 바람직하게는 단일 가변 도메인으로부터의 CDR1, CDR2 및 CDR3 중 임의의 하나 또는 둘 또는 세 개를 포함하는 단일 가변 도메인일 수 있고; 이러한 CDR 영역들은 중쇄 또는 경쇄 항체 프레임워크 영역에 제공될 수 있다. 프레임워크는, 예를 들어 VH 프레임워크, 예컨대 VH3 (DP47, DP38 및 DP45 포함) 및 상기 개시된 VHH 프레임워크 뿐만 아니라 V 카파 (예컨대 DPK9) 및 V람다 프레임워크를 포함하는 VL 프레임워크를 포함한다. 일부 구체예에서, 가변 도메인은 인간 생식세포 항체 유전자 세그먼트에 의해 엔코딩된 아미노산 서열 또는 인간 생식세포 항체 유전자 세그먼트에 의해 엔코딩된 아미노산 서열에 비해 5개 이하의 아미노산 차이를 포함하는 아미노산 서열을 지니는 하나 이상의 인간 프레임워크 영역을 포함한다. 다른 구체예에서, 가변 도메인은 인간 생식세포 항체 유전자 세그먼트에 의해 엔코딩된 아미노산 서열을 지니는 네 개의 인간 프레임워크 영역, FW1, FW2, FW3 및 FW4, 또는 인간 생식세포 항체 유전자 세그먼트에 의해 엔코딩된 아미노산 서열에 비해 집합적으로 10개 이하의 아미노산 차이를 함유하는 FW1, FW2, FW3 및 FW4의 아미노산 서열을 포함한다. 일 구체예에서, 세 개의 모든 CDR 영역이 면역글로불린 스캐폴드 (예컨대, 중쇄 또는 경쇄 항체 스캐폴드) 또는 본원에 정의된 비-면역글로불린 스캐폴드 상에 제공되며, 이는 비-인간, 합성 반-합성일 수 있다. 대안적으로, CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 중 하나, 둘 또는 세 개 모두의 임의의 조합이 면역글로불린 스캐폴드 또는 비-면역글로불린 스캐폴드 상에 제공되고, 예를 들어, CDR3 영역 단독, 또는 CDR2 및 CDR3 영역이 함께, 또는 CDR1 및 CDR2가 면역글로불린 스캐폴드 또는 비-면역글로불린 스캐폴드 상에 제공된다. 이러한 CDR 그래프팅에 적합한 스캐폴드 및 기술은 당업자에게 자명할 것이고 당 분야 (참조, 예를 들어 US application 07/180,370, WO 01/27160, EP 0 605 522, EP 0 460 167, US-application -07/054,297, Nicaise et al., Protein Science (2004), 13:1882-1891; Ewert et al., Methods, 2004 Oct; 34(2):184-199; Kettleborough et al.; Protein Eng. 1991 Oct; 4(7): 773-783; O'Brien and Jones, Methods Mol. Biol. 2003: 207: 81-100; and Skerra, J. MoI. Recognit. 2000: 13: 167-187, and Saerens et al., J. Mol. Biol. 2005 Sep 23;352(3):597-607) 및 여기에 인용된 추가의 참고문헌에 널리 공지되어 있다.
리간드는 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 그러한 단일 가변 도메인 중 하나 이상을 포함하고, 바람직하게는 인간에게 내인성인 혈청 알부민 및 비-인간 종에 내인성인 하나 이상의 추가의 혈청 알부민 둘 모두에 특이적으로 결합되는 하나 이상의 단일 가변 도메인을 포함한다. 일 구체예에서, 이러한 단일 가변 도메인은 비-인간 종에 내인성인 하나 이상의 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 (즉, 교차 반응하는) Kd 값의 10배 이내의 Kd 값으로 인간에게 내인성인 혈청 알부민에 특이적으로 결합된다. 대안적으로, 이러한 단일 가변 도메인은 비-인간 종에 내인성인 하나 이상의 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 (즉, 교차 반응하는) Kd 값의 15, 20, 25, 30, 50배 이내 또는 대략 100배 이하의 Kd 값으로 인간에게 내인성인 혈청 알부민에 특이적으로 결합된다. 일부 구체예에서, Kd는 300 nM 내지 약 5pM의 범위일 수 있다. 다른 구체예에서, 단일 가변 도메인은 혈청 알부민에 적어도 5 x 10-1S-1, 5 x 10-2S-1, 5 x 10-3S-1, 5 x 10-4S-1, 5 x 10-5S-1, 5 x 10-6S-1, 5 x 10-7S-1, 5 x 10-8S-1, 5 x 10-9S-1, 5 x 10-10S-1 이하의 Koff, 바람직하게는 1 x 10-6S-1 내지 1 x 10-8S-1 범위의 Koff로 특이적으로 결합된다.
일 구체예에서, 단일 가변 도메인은 제2 비-인간 종에 내인성인 하나 이상의 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 (즉, 교차 반응하는) Kd 값의 10배 이내의 Kd 값으로 제1 비-인간 종에 내인성인 혈청 알부민에 특이적으로 결합된다. 대안적으로, 이러한 단일 가변 도메인은 제2 비-인간 종에 내인성인 하나 이상의 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 (즉, 교차 반응하는) Kd 값의 15, 20, 25, 30, 50배 이내 또는 대략 100배 이하의 Kd 값으로 제1 비-인간 종에 내인성인 혈청 알부민에 특이적으로 결합된다. 일부 구체예에서, Kd는 300 nM 내지 약 5pM의 범위일 수 있다. 다른 구체예에서, 단일 가변 도메인은 혈청 알부민에 적어도 5 x 10-1S-1, 5 x 10-2S-1, 5 x 10-3S-1, 5 x 10-4S-1, 5 x 10-5S-1, 5 x 10-6S-1, 5 x 10-7S-1, 5 x 10-8S-1, 5 x 10-9S-1, 5 x 10-10S-1 이하의 Koff, 바람직하게는 1 x 10-6S-1 내지 1 x 10-8S-1 범위의 Koff로 특이적으로 결합된다.
예를 들어, 이러한 리간드는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함할 수 있는데, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 인간 혈청 알부민 및 마우스 혈청 알부민에 특이적으로 결합되고, 리간드의 T 베타 반감기는 실질적으로 마우스 숙주의 마우스 혈청 알부민의 T 베타 반감기와 동일하다. 이러한 리간드의 한 버젼에서, 에피토프 결합 도메인은 인간 혈청 알부민 및 마우스 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 비-면역글로불린 스캐폴드를 함유하며, 여기서 리간드의 T 베타 반감기는 실질적으로 마우스 숙주의 마우스 혈청 알부민의 T 베타 반감기와 동일하다. "실질적으로 동일"하다는 것은 리간드가 마우스 숙주의 마우스 혈청 알부민의 적어도 50%인 마우스 숙주의 T 베타 반감기를 지니고 이것은 마우스 숙주의 마우스 혈청 알부민의 T 베타 반감기의 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 101%, 102%, 105%, 110%, 125%, 및 150% 이하임을 의미한다. 비-면역글로불린 스캐폴드는 항체 가변 도메인의 CDR 영역 중 1종 이상과 같은 항체 단일 가변 도메인의 단편을 임의로 포함할 수 있으며, 인간 숙주의 인간 혈청 알부민의 T 베타 반감기의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 101%, 102%, 105%, 110%, 125%, 또는 150% 이하인 인간 숙주의 T 베타 반감기를 지니는 항체 단일 가변 도메인을 포함한다.
예를 들어, 일 구체예는 단일 가변 도메인으로서, 단일 가변 도메인이 인간 혈청 알부민 및 래트 혈청 알부민에 특이적으로 결합되고, 리간드의 T 베타 반감기가 래트 숙주의 래트 혈청 알부민의 T 베타 반감기와 실질적으로 동일한 단일 가변 도메인이다. 이러한 리간드의 한 버젼에서, 단일 가변 결합 도메인은 인간 혈청 알부민 및 래트 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 비-면역글로불린 스캐폴드를 함유하며, 여기서 리간드의 T 베타 반감기는 실질적으로 래트 숙주의 래트 혈청 알부민의 T 베타 반감기와 동일하다. "실질적으로 동일"하다는 것은 리간드가 래트 숙주의 래트 혈청 알부민의 적어도 50%인 래트 숙주의 T 베타 반감기를 지니고, 이것은 래트 숙주의 래트 혈청 알부민의 T 베타 반감기의 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 101%, 102%, 105%, 110%, 125%, 150% 이하임을 의미한다. 비-면역글로불린 스캐폴드는 항체 가변 도메인의 CDR 영역 중 1종 이상과 같은 항체 단일 가변 도메인의 단편을 임의로 포함할 수 있다.
예를 들어, 리간드는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함할 수 있고, 여기서 면역글로불린 단일 가변 도메인은 인간 혈청 알부민 및 돼지 혈청 알부민에 특이적으로 결합되고, 리간드의 T 베타 반감기는 돼지 숙주의 돼지 혈청 알부민의 T 베타 반감기와 실질적으로 동일하다. 리간드의 한 버젼에서, 에피토프 결합 도메인은 인간 혈청 알부민 및 돼지 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 비-면역글로불린 스캐폴드를 함유하며, 여기서 리간드의 T 베타 반감기는 실질적으로 돼지 숙주의 돼지 혈청 알부민의 T 베타 반감기와 동일하다. "실질적으로 동일"하다는 것은 리간드가 돼지 숙주의 돼지 혈청 알부민의 적어도 50%인 돼지 숙주의 T 베타 반감기를 지니고, 이것은 돼지 숙주의 돼지 혈청 알부민의 T 베타 반감기의 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 101%, 102%, 105%, 110%, 125%, 150% 이하임을 의미한다. 비-면역글로불린 스캐폴드는 항체 단일 가변 도메인을 포함하는 항체 가변 도메인의 CDR 영역 중 1종 이상과 같은 항체 단일 가변 도메인의 단편을 임의로 포함할 수 있다.
예를 들어, 리간드는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함할 수 있고, 여기서 면역글로불린 단일 가변 도메인은 인간 혈청 알부민 및 시노몰거스 혈청 알부민에 특이적으로 결합되고, 리간드의 T 베타 반감기는 시노몰거스 숙주의 시노몰거스 혈청 알부민의 T 베타 반감기와 실질적으로 동일하다. 리간드의 한 버젼에서, 혈청 알부민에 결합되는 도메인은 인간 혈청 알부민 및 시노몰거스 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 비-면역글로불린 스캐폴드를 함유하며, 여기서 리간드의 T 베타 반감기는 실질적으로 시노몰거스 숙주의 시노몰거스 혈청 알부민의 T 베타 반감기와 동일하다. "실질적으로 동일"하다는 것은 리간드가 시노몰거스 숙주의 시노몰거스 혈청 알부민의 적어도 50%인 시노몰거스 숙주의 T 베타 반감기를 지니고, 이것은 시노몰거스 숙주의 시노몰거스 혈청 알부민의 T 베타 반감기의 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 101%, 102%, 105%, 110%, 125%, 또는 150% 이하임을 의미한다.
비-면역글로불린 스캐폴드는 항체 가변 도메인의 CDR 영역 중 1종 이상과 같은 항체 단일 가변 도메인의 단편을 임의로 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 리간드 및/또는 이중 특이적 리간드는 인간에게 내인성인 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 단일 가변 도메인을 함유하고, 인간 숙주의 인간 혈청 알부민의 적어도 50%, 인간 숙주의 인간 혈청 알부민의 T 베타 반감기의 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 101%, 102%, 105%, 110%, 125% 이하 또는 150% 이하인 인간 숙주의 T 베타 반감기를 지닌다. 바람직한 구체예에서, 비-인간에게 내인성인 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 단일 가변 도메인은 개개 비-인간 숙주의 비인간 혈청 알부민의 적어도 50%, 개개 비-인간 숙주의 비인간 혈청 알부민의 T 베타 반감기의 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 101%, 102%, 105%, 110%, 125% 이하 또는 150% 이하인 개개 비-인간 숙주의 T 베타 반감기를 지닌다. 바람직하게는, 인간에게 내인성인 혈청 알부민에 특이적으로 결합되고 또한 1종 이상의 비-인간 종으로부터의 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 단일 가변 도메인은 인간 숙주의 인간 혈청 알부민의 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 101%, 102%, 105%, 110%, 125% 이하 또는 150% 이하의 인간 숙주의 T 베타 반감기 및 이의 개개 비-인간 숙주의 비-인간 혈청 알부민의 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 101%, 102%, 105%, 110%, 125% 이하 또는 150% 이하의 비-인간 숙주의 T 베타 반감기를 지닌다. 일부 구체예에서, 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 단일 가변 도메인의 T 베타 반감기는 2시간 만큼 짧은 시간으로부터 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간, 20시간, 22시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 6일, 8일, 10일, 12일, 14일, 16일, 18일 이하, 21일 이하이거나 이를 초과하는 범위일 수 있다. 돼지, 시노몰거스, 래트, 뮤린, 마우스 숙주와 같은 비-인간 숙주 뿐만 아니라 인간 숙주에서, 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 단일 가변 도메인의 T 베타 반감기는 2시간 만큼 짧은 시간으로부터 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간, 20시간, 22시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 6일, 8일, 10일, 12일, 14일, 16일, 18일 이하, 21일 이하이거나 이를 초과하는 범위일 수 있다. 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드의 다른 바람직한 T 베타 반감기는 원숭이 숙주에서 2시간 만큼 짧은 시간으로부터 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간, 20시간, 22시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 6일, 8일, 10일, 12일, 14일, 16일, 18일 이하, 21일 이하를 포함하며, 약 3일 내지 약 5, 6, 7, 또는 8일이다. 래트 또는 마우스 숙주에서, 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 단일 가변 도메인의 T 베타 반감기는 40시간 만큼 짧은 시간으로부터 약 75시간 만큼 긴 시간의 범위일 수 있고, 짧게는 2시간부터 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간, 20시간, 22시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 6일, 8일, 10일, 12일, 14일, 16일, 18일 이하, 21일 이하이거나 이를 초과하는 시간을 포함한다.
혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 단일 가변 도메인은 하기로부터 선택되나 바람직하게는 이로 제한되지 않는 V카파 단일 가변 도메인을 포함한다: DOM7h-9 DOM7h-1, DOM7h-8, DOM7h-9, DOM7h-11, DOM7h-12, DOM7h-13 및 DOM7h-14. DOM7r-3 및 DOM7r-16, 및/또는 혈청 알부민, 바람직하게는 인간 혈청 알부민과의 결합에 대해 dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7r13, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h1O, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p1, 및 dAb7p2로부터 선택되나 바람직하게는 이로 제한되지 않는 단일 가변 도메인과 경쟁하는 도메인들. 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 단일 가변 도메인은 항체 중쇄 단일 가변 도메인, 특히 인간 VH3 또는 VHH일 수 있다. 상기 언급된 단일 가변 도메인은 또한 추가적으로 인간 혈청 알부민에 적어도 5 x 10-1S-1, 5 x 10-2S-1, 5 x 10-3S-1, 5 x 10-4S-1, 5 x 10-5S-1, 5 x 10-6S-1, 5 x 10-7S-1, 5 x 10-8S-1, 5 x 10-9S-1, 5 x 10-10S-1 이하의 Koff, 바람직하게는 1 x 10-6S-1 내지 1 x 10-8S-1 범위의 Koff로 특이적으로 결합될 수 있다. 인간 혈청 알부민 및 비인간 종에 내인성인 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 단일 가변 도메인은 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 또는 제10의 비인간 종에 내인성인 혈청 알부민에 추가로 결합될 수 있다. 비제한적인 일 구체예에서, 인간 혈청 알부민 및 래트 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 단일 가변 도메인은 시노몰거스 혈청 알부민에 추가로 특이적으로 결합된다. 또 다른 비제한적인 구체예에서, 인간 혈청 알부민 및 마우스 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 단일 가변 도메인은 시노몰거스 혈청 알부민에 추가로 특이적으로 결합된다.
본원에 개시된 대로, 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 하나의 단일 가변 도메인 (단량체) 또는 하나를 초과하는 단일 가변 도메인 (본원에 개시된 다량체, 융합 단백질, 컨주게이트 및 이중 특이적 리간드)을 함유하는 리간드는 표지, tag, 추가의 단일 가변 도메인, dAb, 항체, 항체 단편, 마커 및 약물로부터 선택되나 바람직하게는 이로 제한되지 않는 하나 이상의 실체를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 실체들 중 하나 이상은 단일 가변 도메인 (면역글로불린 또는 비-면역글로불린 단일 가변 도메인)을 포함하는 리간드의 COOH 말단 또는 N 말단 또는 N 말단과 COOH 말단 둘 모두에 위치할 수 있다. 이러한 실체들 중 하나 이상은 하나의 단일 가변 도메인 (단량체) 또는 하나를 초과하는 단일 가변 도메인 (본원에 개시된 다량체, 융합 단백질, 컨주게이트 및 이중 특이적 리간드)을 함유하는 리간드의 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 단일 가변 도메인의 COOH 말단 또는 N 말단 또는 N 말단과 COOH 말단 둘 모두에 위치할 수 있다. 상기 말단들 중 하나 또는 둘 모두에 정위될 수 있는 tag의 비제한적인 예로는 HA, his 또는 myc tag가 있다. 하나 이상의 tag, 표지 및 약물을 포함하는 실체는 혈청 알부민에 직접 또는 하기 다른 섹션에 기재된 대로 링커를 통해 결합된 하나의 단일 가변 도메인 (단량체) 또는 하나를 초과하는 단일 가변 도메인 (본원에 개시된 다량체, 융합 단백질, 컨주게이트 및 이중 특이적 리간드)를 함유하는 리간드에 결합될 수 있다.
혈청 알부민에 특이적으로 결합되거나 인간 혈청 알부민 및 하나 이상의 비-인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합된 하나의 단일 가변 도메인 (단량체) 또는 하나를 초과하는 단일 가변 도메인 (본원에 개시된 다량체, 융합 단백질, 컨주게이트 및 이중 특이적 리간드)을 함유하는 리간드는 하기에 추가로 개시된 대로 인간 혈청 알부민의 도메인 I 및/또는 도메인 II 및/또는 도메인 III 중 하나 이상에 특이적으로 결합될 수 있다. 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 알부민에 특이적으로 결합되거나 인간 혈청 알부민 및 하나 이상의 비-인간 혈청 알부민 둘 모두에 특이적으로 결합되는 하나 이상의 단일 가변 도메인 (예를 들어, 혈청 알부민에 결합되는 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 혈청 알부민에 결합되는 비-면역글로불린 단일 가변 도메인)을 함유하는 것에 추가하여, 리간드는 혈청 알부민 이외의 항원 및/또는 에피토프에 특이적으로 결합될 수 있는 하나 이상의 추가의 도메인을 함유할 수 있고, 항원 또는 에피토프는 시토킨을 포함하는 임의의 동물 단백질 및/또는 미생물, 병원균, 단세포 유기체, 곤충, 바이러스, 해조류 및 식물로부터 유래된 항원으로 구성된 군으로부터 선택된다. 혈청 알부민 이외의 부분에 결합되는 이러한 하나 이상의 추가 도메인(들)은 비-면역글로불린 결합 도메인, 비-면역글로불린 단일 가변 도메인 및/또는 면역글로불린 단일 가변 도메인일 수 있다.
일부 구체예에서, 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 알부민에 특이적으로 결합되거나 인간 혈청 알부민 및 하나 이상의 비-인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 하나 이상의 단일 가변 도메인 (면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 비-면역글로불린 단일 가변 도메인)을 함유하는 이중 특이적 리간드는 (a) 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 단일 가변 도메인 및 혈청 알부민 이외의 리간드에 특이적으로 결합되는 단일 가변 도메인 (두 단일 가변 도메인은 모두 중쇄 단일 가변 도메인이다) 또는 (b) 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 단일 가변 도메인 및 혈청 알부민 이외의 리간드에 특이적으로 결합되는 단일 가변 도메인 (두 단일 가변 도메인은 모두 경쇄 단일 가변 도메인이다) 또는 (c) 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 단일 가변 도메인 (이것은 중쇄 단일 가변 도메인이다) 및 혈청 알부민 이외의 항원에 특이적으로 결합되는 단일 가변 도메인 (이것은 경쇄 단일 가변 도메인이다) 또는 (d) 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 단일 가변 도메인 (이것은 경쇄 단일 가변 도메인이다) 및 혈청 알부민 이외의 항원에 특이적으로 결합되는 단일 가변 도메인 (이것은 중쇄 단일 가변 도메인이다)으로 구성될 수 있다.
본원에 개시된 임의의 리간드, 예컨대 혈청 알부민에 특이적으로 결합되거나 인간 혈청 알부민 및 하나 이상의 비-인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 하나 이상의 단일 가변 도메인 (단량체) 또는 하나를 초과하는 단일 가변 도메인 (예컨대, 본원에 개시된 다량체, 융합 단백질, 컨주게이트 및 이중 특이적 리간드)을 함유하는 리간드를 엔코딩하는 단리된 핵산 또는 이의 기능적으로 활성인 단편도 본원에 포함된다. 벡터 및/또는 이의 발현 벡터, 벡터를 포함하는 숙주 세포, 예컨대 벡터로 형질전환된 식물 또는 동물 세포 및/또는 세포주, 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 하나의 단일 가변 도메인 (단량체) 또는 하나를 초과하는 단일 가변 도메인 (예컨대, 본원에 정의된 다량체, 융합 단백질, 컨주게이트 및 이중 특이적 리간드)을 함유하는 하나 이상의 리간드를 발현시키고/거나 생성하는 방법 또는 상기 벡터에 의해 엔코딩된 이의 단편(들)이 본원에 포함되고, 일부 경우에 하나 이상의 리간드 또는 이의 단편이 발현되도록 숙주 세포를 배양하고, 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 하나의 단일 가변 도메인 (단량체) 또는 하나를 초과하는 단일 가변 도메인 (예컨대, 본원에 정의된 다량체, 융합 단백질, 컨주게이트 및 이중 특이적 리간드)을 함유하는 리간드를 숙주 세포 배양 배지로부터 임의로 회수하는 것을 포함한다. 또한 본원에 개시된 리간드를 혈청 알부민 및/또는 비-인간 혈청 알부민(들) 및/또는 혈청 알부민 이외의 하나 이상의 표적을 포함하는 혈청 알부민과 접촉시키는 방법이 포함되며, 여기서 표적은 생물학적으로 활성인 분자를 포함하고, 상기 나열된 동물 단백질인 시토킨을 포함하며, 접촉이 시험관내에서 이루어지고 본원에 개시된 임의의 리간드를 개개 숙주 동물 또는 세포에 생체내 및/또는 생체외에서 투여하는 방법을 포함한다. 바람직하게는, 혈청 알부민 및/또는 비-인간 혈청 알부민(들)에 대해 유도된 단일 가변 도메인 (면역글로불린 또는 비-면역글로불린) 및 혈청 알부민 이외의 하나 이상의 표적에 대해 유도된 하나 이상의 도메인을 포함하는 본원에 개시된 리간드를 투여하는 것이 항-표적 리간드의 반감기, 예컨대 T 베타 반감기를 증가시킬 것이다. 리간드 또는 이의 단편, 예컨대 이의 기능성 단편을 함유하는 단일 도메인을 엔코딩하는 핵산 분자가 본원에 개시된다. 발현 벡터를 포함하나 바람직하게는 이로 제한되지 않는 핵산 분자를 엔코딩하는 벡터가 본원에 개시되며, 숙주 세포는 이러한 발현 벡터들 중 1종 이상을 함유하는 세포주 또는 유기체로부터 온 것이다. 바람직하게는 비제한적으로 상기 언급된 핵산, 벡터 및 숙주 세포를 포함시켜 리간드를 함유하는 임의의 단일 도메인을 생성하는 방법도 개시된다.
혈청 알부민의 에피토프 맵핑
포유동물 종으로부터의 혈청 알부민은, 도 25에 강조된 대로 유사한 폴딩 및 이황화 결합 패턴을 지니는 세 개의 우세한 도메인을 함유하는 유사한 구조를 지닌다. 단백질은 두 탠덤 중복 및 후속적인 잔기의 다양화로부터 생성된 것으로 여겨진다.
인간 혈청 알부민의 구조는 다양한 결합 리간드와 함께/리간드 없이 X-선 결정학에 의해 분석되었다:
· 인간 혈청 알부민의 원자 구조 및 화학. He XM, Carter DC.
· Nature. 1992; 358: 209-15. Erratum in: Nature 1993; 364: 362.
· 인간 혈청 알부민의 원자 구조 및 화학. He XM, Carter DC; J Mol Biol. 2001; 314: 955-60.
· 모노불포화된 지방산 및 폴리불포화된 지방산과 복합체화된 인간 혈청 알부민의 결정 구조. Petitpas I, Grune T, Bhattacharya AA, Curry S.; J Biol Chem. 2001 ;276: 22804-9.
인간 혈청 알부민은 하트 쉐입드(heart shaped) 분자인 것으로 나타났다. I, II 및 III으로 불리는 개개 도메인은 현저하게 나선형이며, 각각 IA, IB, IIA, 2B, IIIA, 및 IIIB로 불리는 두 서브-도메인으로 구성된다. 이들은 가요성 랜덤 코일에 의해 연결된다.
인간 혈청 알부민의 도메인 II에 특이적으로 결합되는 하나 이상의 단일 가변 도메인을 함유하는 리간드가 본원에 개시된다. 단일 가변 도메인은 VH 항체 단일 가변 도메인일 수 있다. 단일 가변 도메인은 VHH 항체 단일 가변 도메인일 수 있다. VH 단일 가변 도메인은 VH3 단일 가변 도메인일 수 있다. VH3 단일 가변 도메인은 인간 VH3 단일 가변 도메인일 수 있다. 리간드는 대안적으로 또는 추가로 하기 중 하나를 포함하는 V카파 단일 가변 도메인인 단일 가변 도메인을 포함할 수 있다: DOM7h-1, DOM7h-8, DOM7h-9, DOM7h-11, DOM7h-12, DOM7h-13, DOM7h-14. DOM7r-3 및 DOM7r-16, 또는 이와 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 이를 초과하는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 지니는 도메인의 V카파 항체 단일 가변 도메인.
항체 단일 가변 도메인은 4개의 카바트 프레임워크 영역 (FR) 세트를 포함할 수 있으며, 이는 항체 VH 바람직하게는, VH3 프레임워크 생식선 항체 유전자 세그먼트에 의해 엔코딩된다. VH3 프레임워크는 DP47, DP38 및 DP45로 구성된 군으로부터 선택된다. 항체 단일 가변 도메인은 항체 VL 프레임워크, 바람직하게는, V카파 프레임워크, 생식선 항체 유전자 세그먼트에 의해 엔코딩되는 4개의 카바트 프레임워크 영역 (FR) 세트를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 카파 프레임워크는 DPK9이다.
인간 혈청 알부민의 도메인 II에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 단일 가변 도메인을 함유하는 리간드는 혈청 알부민 이외의 부분에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 도메인을 추가로 포함할 수 있으며, 하나 또는 그 초과의 라벨, 태그 및 약물을 포함하는 하나 이상의 물질을 추가로 포함할 수 있다. 혈청 알부민 이외의 부분에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 도메인은 면역글로불린 단일 가변 도메인일 수 있다. 일간 혈청 알부민의 도메인 II에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 단일 가변 도메인을 함유하는 리간드가 또한 기술되어 있으며, 상기 도메인은 비-면역글로불린 골격 및 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역을 포함하거나, 여기서 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역중 하나 이상은 인간 혈청 알부민의 도메인 II에 결합하는 항체 단일 가변 도메인의 단일 가변 도메인으로부터 유래된다. 비-면역글로불린 골격은 바람직하게는, 비제한적으로, CTLA-4, 리포칼린, 스타필로코커스 단백질 A (SPA), 아피바디 (AffibodyTM), 아비머스 (AvimersTM), GroEL 및 피브로넥틴을 포함한다.
인간 혈청 알부민의 도메인 II에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 단일 가변 도메인을 함유하는 리간드는 300nM 이하의 Kd로 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 도메인을 포함한다. 인간 혈청 알부민의 도메인 II에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 가변 도메인을 함유하는 리간드는 추가로 하나 이상의 라벨, 태그 및 약물을 포함하는 하나 이상의 물질을 추가로 포함할 수 있다. 태그는 C-말단 HA 또는 myc 태그 또는 N-말단 HA 또는 myc 태그중 하나 이상을 포함할 수 있다.
인간 혈청 알부민의 도메인 II에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 단일 가변 도메인을 함유하며, 혈청 알부민 이외의 부분에 특이적으로 결합할수 있는 하나 이상의 도메인을 추가로 포함할 수 있으며, 하나 이상의 라벨, 태그 및 약물을 포함하는 하나 이상의 물질을 선택적으로 추가로 포함할 수 있는 리간드는 이의 하나 이상의 단일 가변 도메인을 통해, 바람직하게는 비제한적으로, 사이토킨 수용체, EPO 수용체, ApoE, Apo-SAA, BDNF, 카디오트로핀-1, EGF, EGF 수용체, ENA-78, 에오탁신 (Eotaxin), 에오탁신-2, 엑소더스 (Exodus)-2, EpoR, FGF-산성, FGF -염기성, 섬유아세포 성장 인자-10, FLT3 리간드, 프랙트알킨 (Fractalkine) (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-β1, 인슐린, IFN-γ, IGF-I, IGF-II, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 a.a.), IL-8 (77 a.a.), IL-9, IL-1O, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IGIF), 인히빈 (Inhibin) α, 인히빈 β, IP-IO, 케라티노사이트 성장 인자-2 (KGF-2), KGF, 렙틴, LIF, 림포탁틴 (Lymphotactin), 뮬러 억제 물질 (Mullerian inhibitory substance), 모노사이트 콜로니 억제 인자 (monocyte colony inhibitory factor), 모노사이트 유인 단백질 (monocyte attractant protein), M-CSF, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MIG, MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, MIP-3β, MIP-4, 골수계 전구체 억제 인자 (myeloid progenitor inhibitor factor)-1 (MPIF-1), NAP-2, 뉴투린 (Neurturin), 신경 성장 인자 (Nerve growth factor), β-NGF, NT-3, NT-4, 온코스타틴 M (Oncostatin M), PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1α, SDF1β, SCF, SCGF, 줄기 세포 인자 (SCF), TARC, TGF-α, TGF-β, TGF-β2, TGF-β3, 종양 괴사 인자 (TNF), TNF-α, TNF-β, TNF 수용체 I, TNF 수용체 II, TNIL-I, TPO, VEGF, VEGF 수용체 1, VEGF 수용체 2, VEGF 수용체 3, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-β, GRO-γ, HCCl, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3 및 HER 4, CD4, 인간 케모카인 수용체 CXCR4 또는 CCR5, C형 간염 바이러스로부터의 비구조적 단백질 타입 3 (NS3), TNF-알파, IgE, IFN-감마, MMP-12, CEA, H. 피롤리, TB, 인플루엔자, E형 간염, MMP-12, 특정 세포에서 과다발현하는 내화 수용체, 예컨대, 외피 성장 인자 수용체 (EGFR), 종양 세포상의 ErBb2 수용체, 내화 세포 수용체, LDL 수용체, FGF2 수용체, ErbB2 수용체, 트랜스페린 수용체, PDGF 수용체, VEGF 수용체, PsmAr, 세포외 매트릭스 단백질, 엘라스틴, 피브로넥틴, 라미닌, α1-안티트립신, 조직 인자 프로테아제 억제제, PDKl, GSK1, 배드 (Bad), 카스파아제-9, 포크헤드 (Forkhead), 헬리코박터 피롤리의 항원, 마이코박테리아 투베르쿨로시스의 항원, 및 인플루엔자 바이러스의 항원을 포함하는 항원에 결합할 수 있다.
인간 혈청 알부민의 도메인 II에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 단일 가변 도메인을 함유하며, 혈청 알부민 이외의 부분에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 도메인을 추가로 포함할 수 있는 리간드는 최소한 이중 특이적 리간드이며, 이는 하기 구조중 하나를 가질 수 있다: (a) 혈청 알부민의 도메인 II에 특이적으로 결합하는 각각 상기 단일 가변 도메인 및 혈청 알부민 이외의 부분에 특이적으로 결합하는 상기 단일 가변 도메인은 항체의 중쇄 단일 가변 도메인이거나; (b) 혈청 알부민의 도메인 II에 특이적으로 결합하는 각각의 상기 단일 가변 도메인 및 혈청 알부민 이외의 부분에 특이적으로 결합하는 상기 단일 가변 도메인은 항체의 경쇄 단일 가변 도메인이거나; (c) 혈청 알부민의 도메인 II에 특이적으로 결합하는 상기 단일 가변 도메인은 항체의 중쇄 단일 가변 도메인이고, 혈청 알부민 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 상기 단일 가변 도메인은 항체의 경쇄 단일 가변 도메인이거나; (d) 혈청 알부민의 도메인 II에 특이적으로 결합하는 상기 단일 가변 도메인은 항체의 경쇄 단일 가변 도메인이고, 혈청 알부민 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 상기 단일 가변 도메인은 항체의 중쇄 단일 가변 도메인이다. 본원에 기술된 임의이 리간드 또는 이의 작용 단편을 포함하는 이의 단편을 엔코딩하는 핵산 분자, 바람직하게는, 비제한적으로 발현 벡터를 포함하는 벡터, 및 이러한 발현 벡터중 하나 이상을 함유하는 임의의 유형의 세포주 또는 유기체의 숙주 세포, 및/또는 상기 언급된 핵산, 벡터 및 숙주 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 리간드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
혈청 알부민은 다른 혈청 단백질과 비교하여 긴 혈청 반감기를 가지며, IgG와 공유하는 성향인 분획 이화 속도와 혈청 농도간에 양의 관계를 갖는다 (즉, SA의 농도가 높을 수록, 분해되는 양이 더 많다). IgG와 혈청 알부민이 신생아 Fc 수용체 FcRn에 의해 매개되는 재순환 메카니즘을 공유한다는 점이 최근에 밝혀졌다. FcRn은 멤브레인 엔커링된 FCRGT 사슬의 헤테로다이머 및 비막계 베타-2- 마이크로글로불린으로 이루어진 타입 I MHC 패밀리 구성원이다. FcRn 또는 베타-2- 마이크로글로불린의 마우스 넉아웃 변이체는 작용성 FcRn을 발현하지 않으며, 혈청 알부민의 증가된 생합성율 (~20% 증가) 및 혈청 알부민의 증가된 이화작용을 나타내며, 이는 더 짧아진 반감기와 함께 혈청 알부민의 40% 낮은 혈청 수준을 유도한다 (Chaudhry et al 2005). 인간에서, 베타-2 마이크로글로불린에서의 변이는 매우 저하된 작용성 FcRn 수준을 제공하여, 궁극적으로 HSA의 감소된 혈청 반감기를 특징으로 하는 저알부민혈증 및 IgG 결핍증을 초래하는 것으로 나타났다 (Wani et al 2006, PNAS).
이론에 얽매이는 것은 아니지만, FcRn-매개된 구조 (salvage)에 대해 제안된 메카니즘은 하기와 같다:
1. 혈장 단백질은 모든 혈관을 라이닝하는 내피 세포에 의해 그리고, 아마도 혈관외 구획의 음작용적으로 활성적인 세포에 의해 세포흡수된다. 이는 비특이적 단계이며, 순환하는 모든 단백질이 흡수될 것이다. FcRn은 혈청 pH 약 7.4에서 알부민 (및 IgG)에 대한 매우 낮은 친화도를 갖는다.
2. 일단 세포흡수되면, 형성된 소포는 pH 5.0으로 산성화된다. 산성 조건하에서, FcRn는 알부민에 대해 더 높은 친화도를 가지며, 알부민 및 또한, IgG에 결합한다. 이렇게 하여, 알부민 및 IgG는 FcRn 수용체에 결합한다. FcRn은 IgG에 결합되는 부위와 별개의 부위를 통해 도메인 III상의 부위에서 인간 혈청 알부민에 결합한다.
3. 분류가 발생하며, 이에 의해 대부분의 수용체 미결합된 단백질이 엔도좀으로 분류되며, 여기서 대부분의 단백질은 분해의 표적이 될 것이다. 수용체 결합된 알부민 및 IgG는 세포 표면에 대해 표적화된 소포로 분류되어, 따라서 분해되지 않는다.
4. 세포 표적화된 소포는 세포 표면과 융합되거나, 간단하게는 세포막과 융합된다. 이러한 상태에서, 엔도좀의 pH는 pH 7.4에 근접하게 증가하고, 알부민에 대한 FcRn 친화도를 감소하여, 알부민이 다시 순환계로 방출된다.
따라서, 본 발명자들은 최대 반감기를 갖도록 임의의 SA 결합 단백질에 대한 바람직한 파라미터 세트를 규정할 수 있다. 이러한 파라미터는 모델로서 혈청 구조 (salvage) 수용체 FcRn을 사용하여 명백하게 예시될 수 있으며, 이는 또한 연장된 반감기를 매개하는 다른 수용체에도 적용될 것이다.
ㆍ 혈청 알부민 결합 친화도는 바람직하게는, SA 결합 단백질이 알부민으로부터 해리되지 않으면서, 신장에서 사구체 여과를 수행하여 소변으로의 손실을 최소화시킬 정도이며/거나
ㆍ SA로의 결합은 바람직하게는, 순환계에서 혈청 알부민 수준을 유지시키는데 기여하는 임의의 수용체로의 혈청 알부민의 결합에 해로운 영향을 끼치지 않아야 하며, 그 이유는 이러한 영향은 순환을 방해하여 혈청 알부민 및 SA 결합인자 둘 모두의 반감기를 감소시킬 것이기 때문이다. 이와 같이, SA 결합 dAb는 바람직하게는, HSA 도메인 III상의 FcRn에 의해 결합된 에피토프와 별개의 에피토프에 결합하며, SA/dAb 복합체는 바람직하게는, 또한, FcRn와 맞물릴 수 있고/거나
ㆍ SA로의 결합은 바람직하게는, 수용체 및 결합된 SA/SA 결합인자 착물이 분류되거나 재순환되는 조건하에서 유지될 것이다. 엔도좀 pH는 pH 5.0으로 근접하므로, pH7.4 및 pH 5.0에서의 혈청 알부민으로의 dAb의 안정한 결합이 바람직하다.
하기 실시예 15에 예시된 바와 같이, 대부분의 dAb는 HSA의 2차 도메인에 결합하며, 따라서, 인간 혈청 알부민의 FcRn으로의 결합과 경쟁하지 않는 것으로 예상된다. 두개의 dAb (DOM7h-27 및 DOM7h-30)은 도메인 III에 결합한다.
7.4 내지 5.0의 pH에서 SA에 대한 충분한 친화도를 보유하는 항-SA DAb
SA에 대한 친화도 이외에, SA:FcRn 복합물 형성과의 경쟁의 부재하에, 혈청-알부민-특이적 dAb는 FcRn-매개된 구조 경로의 충분한 이점을 획득하기 위해 바람직하게는, 혈청에서의 pH 7.4 내지 엔도좀에서의 pH 5.0의 pH 범위내에서 SA에 대한 친화도를 유지해야 할 것이다.
이러한 pH 범위내에서, 교란된 pKa를 갖는 단지 히스티딘 잔기 및 아미노산 측쇄가 이들의 양성자화 상태를 변화시키는 것으로 여겨진다. 아미노산 측쇄가 복합물의 결합 에너지에 현저하게 기여하는 경우, 상기 범위내의 한 극단의 pH로부터 다른 극단의 pH로의 pH 이동이 복합물의 결합 친화도를 감소시킬 것으로 예상할 수 있다. 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 이는 SA-특이적 dAb가 FcRn-매개된 구조 경로를 통해서 구조되기 보다는 분해 경로에 유입될 가능성을 증가시킬 것이다.
따라서, SA 결합 AlbudAbTM (혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 dAb)에 있어서, pH (5.0 내지 7.4의 범위)에 의해 현저하게 변화되지 않는 혈청 알부민의 결합 특징을 갖는 것을 선택하는 것이 바람직하다. 이를 보장하기 위한 간단한 방법은 CDR에서 히스티딘 잔기의 부재에 대해 항-SA dAb의 아미노산 서열을 분석하는 것이다. 하기 나타낸 바와 같이, 이러한 특성에 대한 수개의 선택 공정이 고려될 수 있다:
예를 들어, 첫번째 선택 라운드는 완충제의 pH가 7.4인 pH 조건 (예를 들어, PBS)하에서 고정화된 인간 혈청 알부민을 사용하여 '미가공 (naive)' dAb 파아지 레퍼토리로 수행하는 것이다. 그 후, 회수되고 증폭된 파아지 군집을 인큐베이션 완충제의 pH가 5.0인 두번째 선택 라운드에 공급한다. 두 pH 모두에서 HSA로의 dAb 결합에 대한 선택압을 유지하기 위해 완충제 및 pH 교체를 추가의 라운드에서 임의적으로 반복한다.
두번째 예에서, 모든 선택 라운드는 완충제의 pH가 7.4인 pH 조건 (예를 들어, PBS)하에서 고정화된 인간 혈청 알부민을 사용하여 '미가공' dAb 파아지 레퍼토리로 수행하는 것이다. 그러나, PBS (또는 트윈이 보충된 PBS)로 비결합된 파아지를 세척한 직후 및 결합된 파아지를 용출시키기 전, 연장된 기간 (예를 들어, 4시간 이하) 동안 pH 5.0에서 추가적인 세척/인큐베이션 단계를 부가한다. 이러한 기간 동안 pH 5.0에서 SA에 결합할 수 없는 (그러나, pH 7.4에서는 결합할 수 있는) dAb를 나타내는 파아지를 고정화된 SA로부터 분리한다. 두번째 일련의 세척 단계 (pH 5.0에서 트윈의 존재 또는 부재하에) 후, 결합된 파아지를 회수하고 분석한다.
세번째 예에서, 모든 선택 라운드는 완충제의 pH가 7.4인 pH 조건 (예를 들어, PBS)하에서 고정화된 인간 혈청 알부민을 사용하여 '미가공' dAb 파아지 레퍼토리로 수행하는 것이다. 그 후, 가장 우수한 dAb 후보 (즉, pH 7.4 및 ph 5.0에서 결합할 수 있는)를 스크리닝에 의해 확인한다. 전형적으로, dAb를 엔코딩하는 유전자를 풀링된 선택된 파아지로부터 회수하고, E.coli 배양물중의 상청액에서 가용성 dAb를 유도하는 발현 벡터로 서브클로닝한다. 개별 클론을 채집하고, 마이크로역가 플레이트 웰에 별도로 성장시키고, 발현을 유도한다. 그 후, 상청액 (또는 정제된 dAb)을 바이아코아 칩 (Biacore chip)에 직접 로딩하여 고정화된 혈청 알부민에 대한 친화성을 나타내는 dAb를 확인한다. 각각의 상청액은 "수행 (running)" 완충제가 pH 7.4 또는 pH 5.0인 조건하에서 HSA로의 결합 (주로, 센서그램 (sensorgram)의 오프-레이트 기록 (off-rate trace))에 대해 스크리닝된다. 바이아코어상에서 dAb 결합 스크리닝은 상기 언급된 예로부터 가장 우수한 것을 확인하기 위한 바람직한 방법으로서 사용될 것임을 주목해야 한다.
본원에 기술된 바와 같은 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드로서, 단일 가변 도메인이 천연 혈청 pH 및 세포내 소포 pH 둘 모두에서 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 리간드가 본원에 기술된다. 천연 혈청 pH는 약 7 (예를 들어, 7.4)이며, 여기서 상기 상기 세포내 소포 pH는 약 4.8 내지 5.2의 범위일 수 있거나, 약 5의 pH일 수 있다. 일 구체예에서, 단일 가변 도메인은 약 7 내지 5의 pH 범위에서 혈청 알부민에 특이적으로 결합할 수 있거나, 7.4의 pH에서 결합할 수 있다. 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 이러한 리간드의 추가의 특징은, 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 이의 단일 가변 도메인이 혈청 알부민으로부터 실질적으로 분리되지 않으면서 신장에서 사구체 여과 처리된다는 점이다. 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 이러한 리간드의 추가의 특징은 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 이의 단일 가변 도메인이 FcRn의 혈청 알부민으로의 결합을 실질적으로 방해하지 않는다는 점이다. 이러한 단일 가변 도메인은 항체 단일 가변 도메인일 수 있다; 이러한 항체 단일 가변 도메인은 VH3 도메인일 수 있고/거나 항체 단일 가변 도메인은 V 카파 도메인일 수 있다. 이러한 단일 가변 도메인은 비-면역글로불린 골격 예를 들어, CTLA-4, 리포칼린, SpA, 아피바디TM, GroEL, 아비머TM 또는 피브로넥틴 골격을 포함할 수 있으며, 반드시 그런 것은 아니지만, 바람직하게는, 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 항체 단일 가변 도메인으로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3중 하나 이상을 함유할 수 있다. 이러한 리간드의 단일 가변 도메인(들)은 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합할 수 있거/거나 하나 이상의 종, 예를 들어, 인간, 래트, 원숭이, 프로신 (procine), 래빗, 햄스터, 마우스 또는 염소로부터의 혈청 알부민을 포함하는 혈청 알부민에 특이적으로 결합한다. 세포내 구획은 엔도좀 구획 또는 세포내 소포 또는 발아 소포를 포함하는 임의의 동물의 임의의 세포의 세포내 구획일 수 있다. 엔도좀 구획은 약 5 또는 5.0의 pH를 가질 수 있다. 본원에 기술된 리간드는 단일 가변 도메인으로부터의 혈청 알부민의 결합이 FcRn의 혈청 알부민으로의 결합을 경쟁적으로 실질적으로 억제하지 않는 면역글로불린 및/또는 비-면역글로불린 도메인을 포함하는 하나 이상의 단일 가변 도메인을 함유할 수 있다. 이러한 하나 이상의 단일 가변 도메인은 바람직하게는, 300nM 이하의 평형 해리 상수 (Kd)로 혈청 알부민에 특이적으로 결합할 수 있다.
혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 하나의 단일 가변 도메인 (모노머) 또는 하나 초과의 단일 가변 도메인 (예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 멀티머, 융합 단백질, 컨주게이트, 및 이중 특이적 리간드)를 함유하는, 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드를 선택하는 방법으로서, 단일 가변 도메인은 천연 혈청 pH에서 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하며, 단일 가변 도메인은 FcRn으로의 인간 혈청 알부민의 결합을 경쟁적으로 억제하지 않으며, 단일 가변 도메인은 세포내 구획의 pH에서 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하며; (A) FcRn에 결합하는 일간 혈청 알부민의 영역에 결합하지 않는 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드를 선택하는 단계, (B) 단계 (A)로부터 선택된 리간드로부터, 상기 천연 혈청 pH에서 혈청 알부민에 결합하는 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드를 선택하는 단계, (C) 단계 (B)에서 선택된 리간드로부터 상기 세포내 구획의 pH에서 혈청 알부민에 결합하는 리간드를 선택하는 단계를 포함한다. 대안적으로, 단계 (A) 및 (B)는 하기와 같이 역으로 될 수 있다: (A) 상기 천연 혈청 pH에서 인간 혈청 알부민에 결합하는 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드를 선택하는 단계, (B) 단계 (A)에서 선택된 리간드로부터, FcRn에 결합하는 HSA의 영역 이외에서 인간 혈청 알부민에 결합하는 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드를 선택하는 단계, 및 (C) 단계 (B)에서 선택된 리간드로부터, 상기 세포내 구획의 상기 pH에서 혈청 알부민에 결합하는 리간드를 선택하는 단계. 또한, 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드를 스크리닝 하는 방법으로서, 단일 가변 도메인은 천연 혈청 pH에서 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하고, 단일 가변 도메인은 FcRn으로의 인간 혈청 알부민의 결합을 경쟁적으로 억제하지 않으며, 단일 가변 도메인이 세포내 구획의 pH에서 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하며, (A) FcRn에 결합하는 인간 혈청 알부민의 영역에 결합하지 않는 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드를 선택하는 단계, (B) 단계 (A)로부터, 상기 천연 혈청 pH에서 혈청 알부민에 결합하는 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드를 선택하는 단계, 및 (C) 상기 세포내 구획의 상기 pH에서 혈청 알부민에 결합하도록 단계 (B)의 단일 가변 도메인을 유전적으로 변형시키는 단계를 포함하는 방법이 기술된다. 대안적으로, 단계 (A) 및 (B)는 하기와 같이 역으로 될 수 있다: (A) 상기 천연 혈청 pH에서 혈청 알부민에 결합하는 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드를 선택하는 단계, (B) 단계 (A)에서 선택된 리간드로부터, FcRn에 결합하는 인간 혈청 알부민의 영역에 결합하지 않는 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드를 선택하는 단계, 및 (C) 상기 세포내 구획의 상기 pH에서 혈청 알부민에 결합하도록 단계 (B)의 단일 가변 도메인을 유전적으로 변형시키는 단계.
단일 가변 도메인이 FcRn으로의 인갈 혈청 알부민의 결합을 경쟁적으로 억제하지 않는 지의 여부를 결정하기 위한 검정법: 경쟁 바이아코어 실험은 단일 가변 도메인이 FcRn으로의 혈청 알부민의 결합을 경쟁적으로 억제하는지의 여부를 결정하기 위해 이용될 수 있다. 이러한 예를 위한 한 실험 프로토콜은 하기와 같다. pH 7.4에서 정제된 FcRn의 약 1100 공명 단위 (RU)로 25℃에서 CM5 센서 칩 (Biacore AB)를 코팅한 후, 인간 혈청 알부민 (HSA)을 단일 농도 (예를 들어, 1um) 단독으로 항원 표면 위로 주입하며 혼합물을 연속 희석하고, 각각의 혼합물은 HSA 및 증가된 양의 해당 단일 가변 도메인을 갖는다. 생성된 결합 RU는 HSA 단독에 대해 그리고, 각 HSA/단일 가변 도메인 혼합물에 대해 측정된다. HSA 단독의 결합 RU와 HSA+단일 가변 도메인의 결합 RU를 비교함으로써, FcRn이 HSA로의 결합에 대해 단일 가변 도메인과 경쟁하는 지의 여부를 확인할 수 있을 것이다. 경쟁이 있다면, 용액중의 단일 가변 도메인 농도가 증가함에 따라, FcRn에 결합된 HSA의 RU는 감소될 것이다. 경쟁이 없다면, 단일 가변 도메인의 첨가는 얼마나 많은 HSA가 FcRn에 결합하는 지에 대해 영향을 끼치지 않을 것이다. 이러한 경쟁 검정은 단일 가변 도메인이 pH 5.0에서 FcRn으로의 혈청 알부민의 결합을 경쟁적으로 억제하는 지의 여부를 결정하기 위해 pH 5.0에서 HAS에 결합하는 단일 가변 도메인에 대해 pH 5.0에서 임의적으로 반복될 수 있다.
단일 가변 도메인을 갖는 리간드로서, 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 하나의 단일 가변 도메인 (모노머) 또는 하나 초과의 단일 가변 도메인 (예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은, 멀티머, 융합 단백질, 컨주게이트, 및 이중 특이적 리간드)을 함유하며, 단일 가변 도메인이 천연 혈청 pH 및 세포내 소포 pH 둘 모두에서 혈청 알부민에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드는 추가로, 하나 이상의 추가적인 단일 가변 도메인을 포함할 수 있으며, 여기서 각 추가적인 단일 가변 도메인은 천연 혈청 pH에서 혈청 알부민 이외의 항원에 특이적으로 결합하나, 세포내 소포 pH에서는 이러한 항원에 결합하지 않는다. 천연 혈청 pH는 약 7.4이며, 상기 세포내 소포의 pH는 약 4.8 내지 5.2의 범위이며, 일부 구체예에서, 상기 세포내 소포의 pH는 약 5이다.
상기 개념에 기초한 방법은 반감기를 연장시키기 위한 혈청 알부민에 대한 친화성을 가지며, 분해 또는 재순환을 위한 결합된 항원을 유도하기 위해 상기 기술된 바와 같은 목적하는 표적 항원에 대한 친화성을 갖는 이특이적 결합인자의 사용을 포함한다. 상기 기술된 바와 같이, 결합이 pH 5.0에서 높은 친화도를 띠게 하여, 분자가 FcRn 매개된 공정에 의해 엔도좀에서 비분해물로서 분류되도록 혈청 알부민 결합 부분이 선택된다. 그 후, 목적하는 표적 항원 결합 부분은 상기 기술된 pH 7.4 및 pH 5에서의 높은 친화도 결합에 대해 선택되는 것 대신에, 표적 항원에 대한 pH 5에서의 낮은 또는 0의 친화도 및 pH 7.4에서의 높은 친화도 결합에 대해 선택하는 상기 기술된 바와 같은 유사한 기법을 이용하여 선택된다. 이를 달성하기 위한 한 방법은 접촉 표면에서 히스티딘을 갖는 부분을 선택하는 것이다. 그 후, 2개 분자 사이의 융합 단백질이 통상적인 분자 생물학 기법에 의해, 화학적 유도체화 및 가교에 의해, 또는 유전자 융합에 의해 제조된다. 그 결과, pH 5에서 낮은 또는 0의 친화도 리간드에 결합하는 파트너 dAb를 가지면서, pH 5에서 SA에 결합하는 SA 결합 dAb를 고안함으로써, 생체내에서 주어진 AlbudAbTM (혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 dAb)의 효능을 증가시킨다. 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 엔도좀 재순환시, 표적 분자는 방출될 것이며, 분해성 엔도좀에 표적화되어 분해되는 반면, AlbudAbTM (혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 dAb)는 FcRn 매개된 재순환을 통해 새로운 리간드에 결합하기 위해 재순환된다. 이러한 방법은 페길화된 분자 또는 다른 반감기 연장 기법에 대해 주요 이점을 제공하며, 여기서 이런 경로는 재생에 이용가능하지 않다. 이러한 경우, 아마도, 결합된 리간드는 페길화된 부분에 위치하여 이를 차지한다.
천연 혈청 pH 및 세포내 소포 pH 둘 모두에서 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 단일 가변 도메인을 가지며, 천연 혈청 pH에서는 혈청 알부민 이외의 항원에 특이적으로 결합하나, 세포내 소포체 pH에서는 상기 항원에 결합하지 않아, 분해를 위한 혈청 알부민 이외의 항원을 표적으로 하는 하나 이상의 추가의 단일 가변 도메인을 추가로 갖는 리간드를 투여하는 것을 포함하여 분해를 위한 항원을 유도하는 방법이 기술된다. 또한, 천연 혈청 pH에서 혈청 알부민 이외의 항원에 특이적으로 결합하나, 세포내 소포 pH에서는 상기 항원에 결합하지 않는 하나 이상의 추가적인 단일 가변 도메인을 추가로 포함하는 리간드가 기술되어 있다.
대사물의 존재하에 실험관내에서 dAb의 선택
혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 하나의 단일 가변 도메인 (모노머) 또는 하나 초과의 단일 가변 도메인 (예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 멀티머, 융합 단백질, 컨주게이트, 및 이중 특이적 리간드)를 함유하는 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드로서, 단일 가변 도메인이 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하며, 여기서, 단일 가변 도메인에 의한 혈청 알부민의 특이적 결합은 혈청 알부민의 하나 이상의 부위로의 약물 및/또는 대사물 및/또는 소분자의 결합에 의해 본질적으로 차단되지 않는 리간드가 본원에 기술된 리간드에 포함된다. 인간 혈청 알부민상의 하나 이상의 부위는 Sudlow 부위 1 및 Sudlow 부위 2를 포함한다. 하나 이상의 부위는 도메인 I, 도메인 II 및 도메인 III로 구성된 군으로부터 선택된 인간 혈청 알부민의 하나 이상의 도메인의 임의의 조합에 위치할 수 있다.
혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 하나의 단일 가변 도메인 (모노머) 또는 하나 초과의 단일 가변 도메인 (예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 멀티머, 융합 단백질, 컨주게이트, 및 이중 특이적 리간드)를 함유하는 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드로서, 단일 가변 도메인은 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하며, 상기 단일 가변 도메인에 의해 혈청 알부민의 특이적 결합이 SA로의 약물 및/또는 대사물 및/또는 소분자 결합에 대한 혈청 알부민의 결합 특징을 변화시키지 않는 리간드는 본원에 기술된 리간드에 포함된다. 일 구체예에서, 리간드의 단일 가변 도메인은 약물, 대사물 또는 다른 소분자의 존재 및/또는 부재하에 혈청 알부민에 결합한다. 또 다른 구체예에서, 상기 단일 가변 도메인에 의한 혈청 알부민의 특이적 결합은 문헌 [Fasano et al. (2005) 57 (12):787-96. The extraordinary ligand binding properties of human serum albumin, and Bertucci, C. et al. (2002) 9(15):1463-81, Reversible and covalent binding of durgs to human serum albumin: methodological approaches and physiological relevance]에 기술된 약물 및/또는 대사물 및/또는 소분자를 비제한적으로 포함하는, 생체내에서 천연적으로 SA에 결합된 약물 및/또는 대사물 및/또는 소분자에 대한 혈청 알부민의 결합 특징을 실질적으로 변화시키지 않는다.
SA에 결합된 약물 및/또는 대사물 및/또는 소분자는 단일 가변 도메인으로의 결합에 대해 혈청 알부민을 실질적으로 억제하지 않거나 이와 경쟁하지 않는 약물 및/또는 대사물 및/또는 소분자와 중복될 수 있거나 없다. 약물 및/또는 대사물은 바람직하게는, 비제한적으로, 와파린 (warfarin), 이부프로펜 (ibuprofen), 비타민 B6, 세타 빌리루빈 (bilirubin), 헤민, 티록신, 지방산, 아세트알데히드, 지방산 대사물, 아실 글루쿠로니드, 빌리루빈의 대사물, 할로탄 (halothane), 살리실레이트, 벤조다펜스 및 1-O-겜피브로질-B-D-글루쿠로니드 (1-O-gemfibrozil-B-D-glucuronide)를 포함한다. 소분자에 의한 혈청 알부민의 단일 가변 도메인으로의 결합 억제 또는 경쟁은 다른 소분자의 결합에 대한 변화를 유도하는 소분자 결합에 대해 기술된 바와 같이 직접 변위 및 알로스테릭 효과 둘 모두에 의해 발생할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Ascenzi et al. (2006) Mini Rev. Med. Chem. 6(4):483-9. Allosteric modulation of drug binding to human serum albumin, and Ghuman J. et al. (2005) J. Mol. Biol. 353(1):38-52 Structural basis of the drug-binding to human serum albumin] 참조. 일 구체예에서, 소분자는 단독으로 또는 하나 이상의 다른 소분자 및/또는 대사물 및/또는 단백질 및/또는 약물과 함께 혈청 알부민에 결합한다. 다른 구체예에서, 소분자는 단독으로 또는 하나 이상의 다른 소분자 및/또는 대사물 및/또는 단백질 및/또는 약물과 함께 혈청 알부민이 단일 가변 도메인에 결합하는 것을 실질적으로 억제하거나 이와 경쟁하지 않는다. 또 다른 구체예에서, 소분자는 단독으로 또는 하나 이상의 다른 소분자 및/또는 대사물 및/또는 단백질 및/또는 약물과 함께 혈청 알부민이 단일 가변 도메인에 결합하는 것을 실질적으로 억제하거나 경쟁한다.
단일 가변 도메인은 항체 단일 가변 도메인일 수 있다. 항체 단일 가변 도메인은 VH3 도메인일 수 있다. 항체 단일 가변 도메인은 V카파 도메인일 수 있다. 단일 가변 도메인은 하나 이상의 비-면역글로불린 골격을 포함할 수 있다. 비-면역글로불린 골격은 바람직하게는, 비제한적으로 CTLA-4, 리포칼린, SpA, GroEL 및 피브로넥틴을 포함할 수 있으며, 아피바디TM 및 아비머TM를 포함한다.
혈청 알부민에 결합하는 단일 가변 도메인을 선택하는 방법으로서, 하나 이상의 대사물 및/또는 약물의 존재하에 혈청 알부민에 결합하는 이의 능력에 의해 제 1 가변 도메인을 선택하는 것을 포함하며, 선택이 하나 이상의 대사물 및/또는 약물의 존재하에 수행되는 방법이 기술되어 있다. 또한, 하나 이상의 대사물 및/또는 약물의 존재하에 혈청 알부민에 대한 제 1 결합 특이성을 갖는 제 1 면역글로불린 단일 가변 도메인, 및 제 2 결합 특이성을 갖는 제 2 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 이중 특이적 리간드를 생성시키는 방법으로서, (a) 하나 이상의 대사물 및/또는 약물의 존재하에 제 1 에피토프에 결합하는 능력에 의해 제 1 가변 도메인을 선택하는 단계, (b) 제 2 에피토프에 결합하는 능력에 의해 제 2 가변 도메인을 선택하는 단계, (c) 이러한 가변 도메인을 조합시키는 단계; 및 (d) 상기의 하나 이상의 대사물 및/또는 리간드의 존재하에 혈청 알부민 및 상기 제 2 에피토프에 결합하는 능력에 의해 리간드를 선택하는 단계를 포함하는 방법이 기술되어 있다. 이러한 방법은 상보적 가변 도메인의 부재하에 상기 제 1 에피토프로 결합하는 제 1 가변 도메인이 선택되고/거나 상기 제 2 가변 도메인과 상이한 제 3의 상보적 가변 도메인의 존재하에 상기 제 1 에피토프에 결합하는 제 1 가변 도메인이 선택되는 단계를 또한 포함할 수 있다. 이러한 선택 단계는 대사물 및/또는 약물 및/또는 단백질 및/또는 소분자의 혼합물의 존재하에 수행될 수 있다. 선택 단계는 하기와 같이 수행될 수 있다: (a) 제 1 대사물 및/또는 약물 및/또는 소분자의 존재하에 혈청 알부민에 결합하는 단일 가변 도메인을 선택하는 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 선택된 도메인으로부터, 제 2 대사물 및/또는 약물 및/또는 소분자의 존재하에 도메인을 선택하는 단계. 또한, 하나 이상의 대사물 및/또는 약물 및/또는 소분자의 존재하에 혈청 알부민에 대한 제 1 결합 특이성을 갖는 제 1 면역글로불린 단일 가변 도메인, 및 제 2 결합 특이성을 갖는 제 2 면역글로불린 단일 가변 도메인을 갖는 이중 특이적 리간드를 제조하는 방법으로서, (a) 하나 이상의 대사물 및/또는 약물 및/또는 소분자의 존재하에 혈청 알부민으로의 결합 능력에 의해 제 1 가변 도메인을 선택하는 단계, (b) 에피토프에 결합하는 능력에 의해 제 2 가변 도메인을 선택하는 단계, (c) 이러한 가변 도메인을 조합하여 제 1 및 제 2 가변 도메인을 포함하는 리간드를 제공하는 단계, 및 (d) 단계 (c)에 의해 제공된 리간드로부터, 하나 이상의 대사물 및/또는 약물의 존재하에 혈청 알부민에 결합하는 능력 및 상기 에피토프에 결합하는 능력에 의해 리간드를 선택하여, 이중 특이적 리간드를 생성시키는 방법이 포함된다. 일 구체예에서, 상보적 가변 도메인의 부재하에 혈청 알부민에 결합하는 제 1 가변 도메인이 선택된다. 또 다른 구체예에서, 제 2 가변 도메인과 상이한 상보적 가변 도메인의 존재하에 제 1 에피토프에 결합하는 제 1 가변 도메인이 선택된다.
단일 가변 도메인을 포함하는 리간드로서, 단일 가변 도메인이 pH 7 및 세포내 구획 pH 둘 모두에서 실험관내에서 혈청 알부민에 특이적으로 결합하며, 단일 가변 도메인은 비천연 단일 가변 도메인인 리간드가 기술된다. 또한, 항체 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드로서, 항체 단일 가변 도메인이 pH 7 및 세포내 구획 pH 둘 모두에서 실험관내에서 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 리간드가 기술된다. 일 구체예에서, 세포내 구획 pH는 4.8 내지 5.2이다. 또 다른 구체예에서, 항체 단일 가변 도메인으로의 혈청 알부민의 결합은, 실험관내 표면 플라즈몬 공명 경쟁 분석에 의해 측정되는 바와 같이, 혈청 알부민으로의 FcRn의 결합을 실질적으로 억제하지 않는다. 또 다른 구체예에서, 항체 단일 가변 도메인은 항체 중쇄 단일 가변 도메인이다. 추가의 구체예에서, 항체 중쇄 단일 가변 도메인은 VH3 단일 가변 도메인일 수 있으며, VH3 단일 가변 도메인은 인간 VH3 단일 가변 도메인일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 항체 단일 가변 도메인은 항체 경쇄 단일 가변 도메인이다. 항체 경쇄 단일 가변 도메인은 일 구체예에서, V카파 단일 가변 도메인이며, 다른 구체예에서는, V람다 단일 가변 도메인이다.
또 다른 구체예에서, CDR1, CDR2 및 CDR3로 구성된 군으로부터 선택된 항체 CDR 영역중 하나 이상을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항체 단일 가변 도메인은 CTLA-4, 리포칼린, 스타필로코커스 단백질 A (SpA), GroEL, GroES, 트랜스페린 및 피브로넥틴으로 구성된 군으로부터 선택된 골격을 포함한다. 단일 가변 도메인으로의 혈청 알부민의 결합은 일 구체예에서 혈청 알부민으로의 FcRn의 결합과 실질적으로 경쟁하지 않으며, 또 다른 구체예에서, 항체 단일 가변 도메인은 300nM 이하의 평형 해리 상수 (Kd)로 혈청 알부민에 특이적으로 결합한다.
또 다른 구체예에서, 항체 단일 가변 도메인은 하나 이상의 추가적인 항체 단일 가변 도메인을 추가로 포함하며, 여기서 추가적인 항체 단일 가변 도메인은 pH 7에서 혈청 알부민 이외의 항원에 특이적으로 결합하나, 세포내 구획 pH에서는 이러한 항원에 결합하지 않는다. 또한, pH 7 및 세포내 구획 pH하에 실험관내에서 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 항체 단일 가변 도메인과 같은 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드를 개체에 투여하는 것을 포함하여, 개체에서 분해를 위한 항원을 유도하는 방법으로서, 리간드가 단일 가변 도메인 예를 들어, 항체 단일 가변 도메인을 포함하는 하나 이상의 추가적인 항체 단일 가변 도메인을 추가로 포함하며, 혈청 알부민 이외의 항원은 분해를 위해 표적화된 항원인 방법이 기술되어 있다.
본 발명의 리간드의 일 구체예에서, 항체 단일 가변 도메인에 의한 인간 혈청 알부민의 특이적 결합은, 소정의 약물 및/또는 대사물 및/또는 소분자가 인간 혈청 알부민상의 하나 이상의 부위에 결합하는 것에 의해 차단되지 않는다. 이러한 구체예에서, 추가적인 항체 단일 가변 도메인은 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 항체 CDR을 포함하는 항체 경쇄 단일 가변 도메인 또는 항체 중쇄 단일 가변 도메인일 수 있다. 단일 가변 도메인은 CTLA-4, 리포칼린, 스타필로코커스 단백질 A (SpA), GroEL, GroES, 트랜스페린 및 피브로넥틴으로 구성된 군으로부터 선택된 골격을 포함할 수 있다.
본원에 기술된 리간드의 또 다른 구체예는 단일 가변 리간드를 포함하는 리간드이며, 단일 가변 도메인은 비천연 단일 가변 도메인이며, 단일 가변 도메인은 pH7 및 세포내 구획 pH에서 실험관내에서 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하며, 단일 가변 도메인에 의한 인간 혈청 알부민의 특이적 결합은 소정의 약물 및/또는 대사물 및/또는 소분자가 인간 혈청 알부민상의 하나 이상의 부위에 결합하는 것에 의해 차단되지 않으며, 인간 혈청 알부민상의 하나 이상의 부위는 Sudlow 부위 1 및 Sudlow 부위 2를 포함하거나, 이러한 하나 이상의 부위는 도메인 I, 도메인 II 및 도메인 III로 구성된 군으로부터 선택된 인간 혈청 알부민의 하나 이상의 도메인에 위치한다.
링커
AlbudAbTM (혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 dAb) (항-혈청 알부민 도메인 항체 또는 단일 가변 도메인)의 다른 생물학적 활성 부분으로의 연결은 재조합 조작 기법에 의해 달성될 수 있다. 기본적으로, 대상 단백질 모두를 엔코딩하는 유전자가 프레임내에 융합된다. 항-혈청 알부민 도메인 항체가 융합물의 N-말단 ( 즉, AlbudAbTM-Y, 여기서, Y는 생물학적으로 활성인 폴리펩티드임), 융합물의 C-말단 (즉, Z-AlbudAbTM, 여기서, Z는 생물학적으로 활성인 폴리펩티드임)인 수개의 포맷이 고려될 수 있다. 일부 예에서, AlbudAbTM(혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 dAb)에 하나 초과의 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 융합하여 융합물 설계에 대한 많은 가능성을 유도하는 것이 고려될 수 있다. 예를 들어, 융합물은 하기와 같을 수 있다: Z-Y-AlbudAbTM, Z-AlbudAbTM-Y 또는 AlbudAbTM-Z-Y.
모든 이러한 융합 분자에서, 두개의 폴리펩티드는 하나 이상의 펩티드 결합을 통해 서로 공유적으로 연결된다. 이의 가장 간단한 방법으로서, AlbudAbTM(혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 dAb) 및 생물학적으로 활성인 폴리펩티드(들)이 직접 연결된다. 이와 같이, AlbudAbTM(혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 dAb)와 폴리펩티드 사이의 접합물은 하기와 같은 것이다:
a) C-말단에서의 AlbudAbTM(혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 dAb)에 있어서,
AlbudAbTM(혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 dAb)이 VK인 경우:-
xxxDIQ
xxxNIQ
xxxAIQ
xxxAIR
xxxVIW
xxxDIV
xxxDVV
xxxEIV
xxxETT
AlbudAbTM(혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 dAb)이 Vλ인 경우:-
xxxQSV
xxxQSA
xxxSYE
xxxSSE
xxxSYV
xxxLPV
xxxQPV
xxxQLV
xxxQAV
xxxNFM
xxxQTV
xxxQAG
AlbudAbTM(혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 dAb)이 VH (예를 들어, 인간 VH)인 경우:-
xxxQVQ
xxxQMQ
xxxEVQ
xxxQIT
xxxQVT
xxxQLQ
AlbudAbTM(혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 dAb)이 VHH (예를 들어, 카멜리드 (Camelid) 중쇄 가변 도메인)인 경우:-
xxxEVQ
xxxQVQ
xxxDVQ
xxxQVK
xxxAVQ
b) N-말단에서의 AlbudAbTM(혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 dAb)에 있어서,
AlbudAbTM(혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 dAb)이 VK인 경우:-
KVEIKxxx
KLEIKxxx
KVDIKxxx
RLEIKxxx
EIKRxxx
AlbudAbTM(혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 dAb)이 Vλ인 경우:-
KVDVLxxx
KLDVLxxx
QLDVLxxx
AlbudAbTM(혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 dAb)이 VH (예를 들어, 인간 VH)인 경우:-
VTVSSxxx
AlbudAbTM(혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 dAb)이 VHH (예를 들어, 카멜리드 (Camelid) 중쇄 가변 도메인)인 경우:-
VTVSSxxx
'xxx'는 AlbudAb(혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 dAb)에 융합된 (제 1) 생물학적으로 활성인 폴리펩티드의 첫번째 또는 마지막 3개의 아미노산을 나타낸다.
그러나, 두 폴리펩티드의 작용성 활성을 복구하는 재조합 융합 단백질의 생성이, 직렬로 연결된 폴리펩티드 사이에 스플라이싱된 펩티드 링커를 엔코딩하는 브릿징 DNA 세그먼트와 엔코딩 유전자를 연결함으로써 촉진될 수 있는 경우가 있을 수 있다. 최적의 펩티드 링커 길이는 일반적으로 실험에 의해 고안된다: 이는 하나의 아미노산과 같이 짧을 수 있거나 50개 까지의 아미노산으로 연장된 것일 수 있다. 다양한 디자인의 링커가 제안되어 있으며, 당해분야에 널리 공지되어 있다. 하기 예는 가능한 링커의 광범위한 - 그러나, 포괄적이지 않은 - 목록을 제공하기 위한 것이다:
1. 가요성 링커:
가요성 링커는 두개의 폴리펩티드 부분을 연결할 경우 안정적이지 않은 이차 구조를 채택하도록 설계되어 융합 단백질의 다양한 형태를 허용한다. 이러한 링커는 바람직하게는 본래 친수성이어서 이들이 하나 또는 양쪽 모두의 융합된 폴리펩티드와 상호작용하는 것을 방지한다. 일반적으로, 작은 극성 잔기 예컨대, 글리신 및 세린은 펩티드 백본의 가요성 및 친수성 특징 각각을 증가시키기 위해 이들 링커에 우세하게 존재한다. 이러한 링커의 길이는 다양하며, 3D 컴퓨터 처리 방법에 의해 또는 경험치로 가장 잘 결정된다. 일반적으로, 바람직한 링커 길이는 대상의 천연 기능 및 구조의 우수한 발현, 우수한 용해도 및 충분한 복구성과 양립되는 가장 작은 길이일 것이다. 이들의 가용성 특정으로 인해, 가요성 링커는 내생성 프로테아제에 대한 우수한 기질로 구성될 수 있다. 일반적으로, 바람직한 특징이 아닌 경우, 가요성 링커는 광범위한 기질 특이성을 갖는 내생성 프로테아제에 의해 용이하게 인지되는 하전된 아미노산과 같은 아미노산 또는 큰 소수성/방향성이 회피된다. 또한, 시스테인 잔기는, 유리 시스테인과 함께 반응하여 시스테인을 형성할 수 있기 때문에 바람직하게는, 회피되어, (i) 두 융합 단백질을 링커를 통해 브릿징시키고/거나 (ii) 하나 이상의 생활성 폴리펩티드가 하나 이상의 시스테인 잔기 ('시스테인 스크램블링')을 포함하는 경우 융합 단백질의 절충된 발현/폴딩을 유도한다.
가요성 링커의 예로는 (i) (GGGGS)y 부분 (여기서, y는 1이상이지만, y는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9 또는 그 초과일 수 있음)를 기재로 하는 글리신-풍부 링커 (PCT 국제 공개: EP 0 753 551, US 5 258 498, EP 0 623 679 참조), (ii) (SSSSG)y 부분 (여기서, y는 1이상이지만, y는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9 또는 그 초과일 수 있음)를 기재로 하는 세린-풍부 링커 (PCT 국제 공개: EP 0 573 551, US 5 525 491)이다.
2. 제약 (constrained) 링커:
제약 링커는 두 폴리펩티드 부분을 연결할 경우 안정한 이차 구조를 채택하도록 설계되어 융합 단배질의 형태 범위를 한정한다. 이러한 링커는 일반적으로 수개의 턴에 걸친 나선형 구조를 채택한다. 또한, 이러한 링커의 길이는 다양하며, 3D 컴퓨터 처리 방법에 의해 또는 경험치로 가장 잘 결정된다. 제약 링커를 선택하는 주된 이유는 융합물의 각 폴리펩티드 사이의 가장 긴 간격을 유지하기 위함이다. 이는 특히, 두 폴리펩티드가 이종-응집물을 형성하는 경향을 띠는 경우와 관련있다. 이러한 구조 덕분에, 제약 링커는 또한 단백질 분해에 대해 더욱 내성을 띠어 생체내 주입되는 경우 유리하게 된다.
제약 링커의 예는 PCT 국제 공개 WO 00/24884 (예를 들어, SSSASASSA, GSPGSPG, 또는 ATTTGSSPGPT), US 6,132,992 (예를 들어, 나선형 펩티드 링커)에 언급되어 있다.
3. '천연' 링커:
천연 링커는 (다양한 길이의) 폴리펩티드로서, 비합성인 즉, 천연에서 발견되는 링커를 포함하는 폴리페티드 서열이다. 천연 링커는 가요성 또는 제약 링커일 수 있으며, 아미노산 서열 및 조성이 매우 다양할 수 있다. 단백질 분해에 대한 이들의 내성 정도는 이들이 기원된 단백질 및 이러한 단백질이 천연적으로 접하는 생물학적 환경 (세포외, 세포내, 원핵성, 진핵성 등)에 의존적이다. 한 부류의 링커는 인간의 생물학적 치료제의 개발과 특히 관련되어 있다: 인간 단백질에서 발견된 펩티드를 기재로 하는 링커. 실제로 이러한 링커는 자연적으로 비 - 또는 매우 약한 - 면역원성을 띠며, 따라서, 인간 치료에 잠재적으로 안전하다.
천연 링커의 예는 다음과 같다: (i) KESGSVSSEQLAQFRSLD (Bird et al. (1988) Science, 242, 423-426), (ii) 경쇄가 없는 면역글로불린의 힌지 도메인에 상응하는 서열 (Hamers-Casterman et al. (1993) Nature, 363, 446-448, and PCT International Publication No: WO 096/34103). 항-알부민 도메인 항체에 사용하기 위한 링커의 예 (예를 들어, 인간, 인간화된, 카멜라이징된 인간 또는 카멜라이징된 VHH 도메인 항체)는 EPKIPQPQPKPQPQPQPQPKPQPKPEPECTCPKCP 및 GTNEVCKCPKCP이다. 인간 및 카멜링된 힌지로부터 유래된 다른 링커는 참조로서 본원에 통합된 EPO656946에 기술되어 있다. 힌지 유래된 링커는 다양한 길이 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 또는 49개 아미노산을 포함하는 0 내지 약 50개 아미노산 길이를 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "약물"은 개체에서 생물학적 표적 분자의 기능을 변화시키고/거나 결합을 통해 유리한 효과, 치료학적 또는 예방적 효과를 유도하기 위해 개체에 투여될 수 있는 임의의 화합물 (예를 들어, 소유기분자, 핵산, 폴리펩티드)을 나타낸다. 표적 분자는 개체의 게놈에 의해 엔코딩된 내인성 표적 분자 (예를 들어, 개체의 게놈에 의해 엔코딩된 효소, 수용체, 성장 인자, 사이토킨) 또는 병원체의 게놈에 의해 엔코딩된 외인성 표적 분자 (예를 들어, 바이러스, 박테리아, 진균류, 선충류 또는 기타 병원균에 의해 엔코딩된 효소)일 수 있다.
약물 조성물은 약물이 폴리펩티드 결합 부분에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합되는 컨주게이트일 수 있다. 약물은 공유적으로 또는 비공유적으로 폴리펩티드 결합 부분에 직접적으로 또는 간접적으로 (예를 들어, 적합한 링커를 통해 및/또는 상보적 결합 파트너 (예를 들어, 바이오틴 및 아비딘)의 비공유 결합을 통해) 결합될 수 있다. 상보적 결합 파트너가 사용되는 경우, 결합 파트너중 하나는 약물에 직접적으로 또는 적당한 링커 부분을 통해 공유적으로 결합될 수 있거나, 상보적 결합 파트너는 직접적으로 또는 적당한 링커 부분을 통해 폴리펩티드 결합 부분에 공유적으로 결합할 수 있다. 약물이 폴리펩티드 또는 펩티드인 경우, 약물 조성물은 융합 단백질일 수 있으며, 여기서, 폴리펩티드 또는 펩티드, 약물 및 폴리펩티드 결합 부분은 연속 폴리펩티드 사슬의 불연속적인 부분이다. 본원에 기술된 바와 같이, 폴리펩티드 결합 부분 및 폴리펩티드 약물 부분은 펩티드 결합을 통해 서로 직접 결합되거나, 적합한 아미노산 또는 펩티드 또는 폴리펩티드 링커를 통해 연결된다.
감소된 면역원성
약제가 단일의 가변 도메인 구역을 추가로 함유하도록 약제를 개질시키는 것을 포함하여 약제의 면역원성을 감소시키는 방법으로서, 상기 단일 가변 도메인이 구체적으로 생체내 및/또는 생체외에서 혈청 알부민을 결합시키고, 약제가 약물, 대사산물, 리간드, 항원 및 단백질을 포함할 수 있는 방법이 본원에 기술된다. 혈청 알부민은 사람 혈청 알부민일 수 있다. 단일의 가변 도메인은 면역글로불린 단일 가변 도메인일 수 있다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은 VH 항체 단일 가변 도메인일 수 있다. VH 단일 가변 도메인은 VH3 단일 가변 도메인일 수 있다. 상기 VH3 단일 가변 도메인은 사람 VH3 단일 가변 도메인일 수 있다. 단일 가변 도메인은 브카파(Vkappa) 또는 블람다(Vlambda) 항체 단일 가변 도메인일 수 있다. 항체 단일 가변 도메인은, VH3 프레임워크 생식세포 항체 유전자 단편에 의해 엔코딩되는, 한 세트의, 3개 카배트(Kabat) 프레임워크 구역(FR)을 포함할 수 있다. VH3 프레임워크는 DP47, DP38 및 DP45로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 항체 단일 가변 도메인은 한 세트의, VKappa 프레임워크 생식세포 항체 유전자 단편으로 엔코딩되는 4개의 카배트 프레임워크 구역(FR)을 포함할 수 있다. 카파 프레임워크의 비제한적인 예는 DPK9이다. 단일 가변 도메인은 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 구역을 포함하는 면역글로불린 또는 비-면역글로불린 골격을 함유할 수 있으며, 여기서 CDR1, CDR2 및 CDR3 구역 중 하나 이상은 혈청 알부민을 특이적으로 결합시키는 항체 가변 도메인으로부터 비롯된다. 비-면역글로불린 골격은 바람직하게는 이들로 한정되는 것은 아니나, CTLA-4, 리포칼린, SpA, 애피바디(Affibody)TM, 그로엘(GroEL), 아비머(Avimers)TM 및 피브로넥틴을 포함할 수 있다. 혈청 알부민은 사람 혈청 알부민일 수 있다. 면역글로불린 단일 가변 도메인 및/또는 비-면역글로불린 단일 가변 도메인은 Kd가 300 nM 미만인 사람 혈청 알부민에 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인 및/또는 비-면역글로불린 단일 가변 도메인은, Kd 값이 서로 10배 이내에 있는 사람 혈청 알부민과 하나 이상의 비-사람 혈청 알부민 둘 모두에 특이적으로 결합할 수 있다. 면역글로불린 단일 가변 도메인 및/또는 비-면역글로불린 단일 가변 도메인은 사람 혈청 알부민과 하나 이상의 비-사람 혈청 알부민 모두에 특이적으로 결합할 수 있고, 리간드의 T 베타 반감기는 사람 숙주에서 사람 혈청 알부민의 T 베타 반감기와 실질적으로 동일하다. 뿐만 아니라, 면역글로불린 단일 가변 도메인 및/또는 비-면역글로불린 단일 가변 도메인은 사람 혈청 알부민의 도메인 II에 특이적으로 결합할 수 있다. 면역글로불린 단일 가변 도메인 및/또는 비-면역글로불린 단일 가변 도메인은 자연 혈청 pH에서 그리고 세포내 소포 pH 둘 모두에서 혈청 알부민을 추가로 특이적으로 결합시킬 수 있다. 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인 및/또는 비-면역글로불린 단일 가변 도메인에 의한 혈청 알부민의 특이적인 결합은 바람직하게는 약물 및/또는 대사산물의 혈청 알부민 상의 하나 이상의 부위로 결함함으로써 실질적으로 차단되지 않는다. 일 구체예에서, 단일 가변 도메인에 의한 혈청 알부민의 특이적 결합은 SA에 결합된 약물 및/또는 대사산물 및/또는 소분자에 대한 혈청 알부민의 결합 특성을 변경시키지 않는다. 일 구체예에서, 약제를 개질시키는 방법에 의해 a-(X)n1-b-(Y)n2-c(Z)n3-d 또는 a-(Z)n3-b-(Y)n2-c-(X)n-d [상기 식에서, X는 제 1 표적에 대한 결합 특이성을 갖는 폴리펩타이드 약물이고; Y는 단일 가변 도메인, 예를 들어 생체내 및/또는 생체외에서 혈청 알부민을 특이적으로 결합시키는 항체 단일 가변 도메인이고; Z는 제 2 표적에 대해 결합 특이성을 갖는 폴리펩타이드 약물이며; a, b, c 및 d는 독립적으로 하나 내지 대략 아미노산 잔기를 포함하는 또는 전혀 포함하지 않는 폴리펩타이드이며; n1은 1 내지 약 10이고; n2는 1 내지 약 10이고; n3은 0 내지 약 10이다]를 포함하는 화학식을 갖는 개질된 약제가 형성된다. 추가의 구체예에서, n1 및 n2는 동시에 1이고 n3은 0이며, X는 항체 사슬, 또는 이 항체 사슬의 단편을 포함하지 않는다.
약제가 단일의 가변 도메인을 추가로 포함하도록 약제를 개질시키는 것을 포함하여 약제의 면역원성을 감소시키는 방법으로서, 상기 단일 가변 도메인이 혈청 알부민을 특이적으로 결합시키고, 단일 가변 도메인이 비-자연적으로 발생하는 단일 가변 도메인이며, 약제는 약물, 대사산물, 리간드, 항원 및 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법이 본원에 기술된다. 약제가 항체 단일 가변 도메인 구역을 추가로 포함하도록 약제를 개질시키는 것을 포함하여 약제의 면역원성을 감소시키는 방법으로서, 상기 항체 단일 가변 도메인이 혈청 알부민을 특이적으로 결합시키고,약제가 약물, 대사산물, 리간드, 항원 및 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법이 본원에 기술된다. 일 구체예에서, 항체 단일 가변 도메인은 항체 중쇄(heavy chain) 단일 가변 도메인, 예를 들어 항체 VH3 단일 가변 도메인, 또는 사람 항체 VH3 단일 가변 도메인이다. 다른 구체예에서, 항체 단일 가변 도메인은 항체 단일 경쇄(light chain) 가변 도메인, 예를 들어 항체 Vkappa 또는 항체 Vlambda 단일 가변 도메인이다. 일 구체예에서, 항체 단일 가변 도메인은 CDR1, CDR2 및 CDR3 구역을 포함하며, 여기서 CDR1, CDR2 및 CDR3 구역 중 하나 이상은 혈청 알부민을 특이적으로 결합시키는 항체 가변 도메인으로부터 비롯되고, 상기 항체 단일 가변 도메인은 CTLA-4, 리포칼린, 스타필로코컬 단백질 A(SpA), 그로엘(GroEL), 그로에스(GroES), 트랜스페린 및 피브로넥틴으로 이루어지는 군으로부터 선택된 골격을 추가로 포함한다. 이들 방법의 다른 구체예는, 단일 가변 도메인, 예를 들어 항체 단일 가변 도메인이, kd가 30 nM 미만인 사람 혈청 알부민에 특이적으로 결합하고, 이들 방법의 다른 구체예에서 단일 가변 도메인, 예를 들어 항체 단일 가변 도메인은 Kd 값이 서로 10배 이내인, 사람 혈청 알부민 및 하나 이상의 비사람 혈청 알부민에 특이적으로 결합한다. 이들 방법의 다른 구체예에서, 단일 가변 도메인, 예를 들어 항체 단일 가변 도메인은 사람 혈청 알부민 및 비-사람 혈청 알부민에 특이적으로 결합하고, 리간드의 T 베타 반감기는 사람 숙주에서 사람 혈청 알부민의 T 베타 반감기와 실질적으로 동일하다. 이들 방법의 다른 구체예에서, 단일 가변 도메인, 예를 들어 항체 단일 가변 도메인은 사람 혈청 알부민의 도메인 II에 특이적으로 결합한다. 이들 방법의 다른 구체예에서, 단일 가변 도메인, 예를 들어 항체 단일 가변 도메인은, pH 7에서 그리고 세포내 구획 pH에서 혈청 알부민에 특이적으로 결합한다.
본 발명을 하기 실시예에서 단지 예시를 목적으로 추가로 설명한다. 본원에 사용된 용어 dAb에 대해 사람 TNFα는 TAR1로 지칭되며 사람 TNFα 수용체 1(p55 수용체)은 TAR2로 지칭된다.
실시예 1. 사람 혈청 알부민(HSA) 및 β-갈락토시다아제(β-gal)를 향하는 이중의 특이적인 scFv 항체(K8)의 선택
본 실시예는 β-gal 및 HSA를 향하는 이중의 특이적인 항체를 제조하는 방법으로서, 생식세포(더미) VH 도메인에 연결된 Vκ 가변 도메인의 레퍼토리가 β-gal로의 결합을 위해 선택되고, 생식세포(더미) Vκ 도메인에 연결된 VH 가변 도메인의 레퍼토리가 HSA로의 결합을 위해 선택되는 방법을 설명한다. 선택된 가변 VH HSA 및 Vκ β-gal 도메인은 이후 결합되고, β-gal 및 HSA로의 결합을 위해 항체가 선택된다. HSA는 사람 혈액에서 확인된 반감기를 증가시키는 단백질이다.
4개의 사람 파아지 항체 라이브러리가 본 실험에 사용되었다.
라이브러리 1 - 생식세포 Vκ/DVT VH 8.46 ×107
라이브러리 2 - 생식세포 Vκ/NNK VH 9.64 ×107
라이브러리 3 - 생식세포 VH/DVT Vκ 1.47 ×108
라이브러리 4 - 생식세포 VH/NNK Vκ 1.45 ×108
모든 라이브러리는 상보성 결정 구역(CDR2 및 CDR3)에 혼입된 측쇄 다양성을 지니는 VH(V3-23/DP47 및 JH4b) 및 Vκ(O12/O2/DPK9 및 Jκ1)에 대한 단일의 사람 프레임워크를 기초로 한다.
라이브러리 1 및 라이브러리 2는 더미 Vκ 서열을 함유하는 반면, Vκ의 서열은 위치 H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97 및 H98에서 다양화되어 있다(각각 엔코딩된 DVT 또는 NNK)(도 1). 라이브러리 3 및 라이브러리 4는 더미 VH 서열을 함유하는 반면, Vκ의 서열은 위치 L50, L53, L91, L92, L93, L94, 및 L96에서 다양화되어 있다(각각 엔코딩된 DVT 또는 NNK)(도 1). 라이브러리는 파아지미드(phagemid) pIT2/ScFv 포맷(도 2)으로 되어 있고, 일반적인 리간드, 단백질 A 및 단백질 L에 결합하여, 선택되지 않은 라이브러리에서의 클론의 대부분이 기능성이 되도록 미리 선택되었다. 상기된 라이브러리의 크기는 사전선택 후 크기에 상응한다. 라이브러리 1 및 라이브러리 2는 선택되기 전에 항원 상에서 혼합되어 단일의 VH /더미 Vκ 라이브러리를 생성하고, 라이브러리 3 및 라이브러리 4는 혼합되어 단일의 Vκ/더미 VH 라이브러리를 생성한다.
Vκ/더미 VH 라이브러리를 이용하여 세 라운드의 선택을 β-gal 상에서 실시하였고, VH/더미 Vκ 라이브러리를 이용하여 HSA 상에서 세 라운드의 선택을 실시하였다. β-gal의 경우에, 파아지 역가가 제 1 라운드에서의 1.1 ×106에서 제 3 라운드에서의 2.0 ×108로 증가되었다. HSA의 경우에, 파아지 역가(phage titre)가 제 1 라운드에서의 2 ×104에서 제 3 라운드에서의 1.4 ×109으로 증가되었다. KMB 헬퍼 파아지(D2와 D3 도메인 사이에서 프로테아제 분할 위치를 갖는 pIII 단백질을 함유함)를 사용하고, 파아지를 PBS 중의 1 mg/ml 트립신을 사용하여 용리시키는 것을 제외하고는, 문헌(Griffith et al., (1993))에 기재된 바대로 선택을 실시하였다. 트립신의 첨가는 헬퍼 파아지로부터 유래한 pIII 단백질(파아지미드로부터의 것들은 아님)을 분할시키고, c-myc 태그에서의 분할에 의해 결합된 scFv-파아지 융합물을 용리시켜(도 2), 파아지 발현 작용성 scFv를 추가로 풍부하게 하고 백그라운드에서의 상응하는 감소를 제공한다(Kristensen & Winter, Folding & Design 3: 321-328, Jul 9, 1998). 100 ㎍/ml 농도에서 HSA 또는 β-gal로 코팅된 면역튜브를 이용하여 선택을 실시하였다.
결합을 체크하기 위해, 제 3 라운드의 각 선택으로부터의 24개 콜로니를 단일클론성 파아지 ELISA로 스크리닝하였다. 파아지 입자를 문헌(Harrison et al., Methods Enzymol. 1996; 267: 83-109)에 기재된 바와 같이 생성하였다. 96웰 ELISA를 4℃에서 밤새 PBS 중의 10 ㎍/ml 농도에서 100 ㎕의 HSA 또는 β-gal로 코팅하였다. 항-M13-HRP 컨쥬게이트와 결합된 파아지의 검출을 이용하여 표준 ELISA 프로토콜을 시행하였다(Hoogenboom et al., 1991). 클론의 선택은 50 ㎕ 상청을 이용한 1.0 초과의 ELISA 신호를 제공하였다.
다음으로, DNA 제조물을 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트(QIAprep Spin Miniprep kit (Qiagen))를 이용하여 HSA 상에서 선택된 VH/더미 Vκ 라이브러리로부터 그리고 β-gal 상에서 선택된 Vκ/더미 VH 라이브러리로부터 제조하였다. 대부분의 다양성을 평가하기 위해서, DNA 제조물을 세 라운드의 선택의 각각으로부터 제조한 다음, 각각의 항원에 대해 함께 끌어모았다. 이후, DNA 제조물을 37℃에서 밤새 Sal1/Not1로 소화시켰다. 단편을 겔 정제한 후에, HSA 상에서 선택된 VH/더미 Vκ 라이브러리의 더미 Vκ 사슬 대신에 β-gal 상에서 선택된 Vκ/더미 VH 라이브러리로부터의 Vκ 사슬을 결찰시켜 3.3 ×109개 클론의 라이브러리를 생성시켰다.
이후 이 라이브러리를 HSA(제 1 라운드) 및 β-gal(제 2 라운드), HSA/β-gal 선택 상에서, 또는 β-gal(제 1 라운드) 및 HSA(제 2 라운드), β-gal/HSA 선택 상에서 선택하였다. 각각의 경우에, 제 2 라운드 후에 48개의 클론이 단일클론성 파아지 ELISA(상기 기술됨) 및 가용성 scFv 단편의 ELISA에 의해 HSA 및 β-gal로의 결합에 대해 시험하였다. 가용성 항체 단편을 문헌(Harrison et al., (1996))에 기술된 바와 같이 생산하고, 2% 트윈/PBS를 차단 완충제로 사용하고 결합된 scFv를 단백질 L-HRP로 검출하는 것을 제외하고는 표준 ELISA 프로토콜을 수행하였다(Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133). HSA/β-gal 선택으로부터의 3개의 클론(E4, E5 및 E8) 및 β-gal/HSA 선택으로부터의 2개의 클론(K8 및 K10)은 둘 모두의 항원에 결합할 수 있었다. 이들 클론으로부터의 scFv를 PCR 증폭시키고, 프라이머 LMB3 및 pHENseq를 이용하여 문헌(Ignatovich et al., (1999) J Mol Biol 1999 Nov 26; 294(2): 457-65)에 의해 기술된 바대로 서열화하였다. 서열 분석으로부터, 모든 클론이 동일함이 밝혀졌다. 따라서, 이중의 특이적인 항체(K8)를 엔코딩하는 단 하나의 클론이 추가 작업을 위해 선택되었다(도 3).
실시예 2. K8 항체의 결합 특성에 대한 특성결정
먼저, K8 항체의 결합 특성을 단일클론성 파아지 ELISA로 특성결정하였다. 96웰 플레이트를 4℃에서 밤새 PBS 중의 10 ㎍/ml 농도에서 알칼리성 포스파타아제(APS), 소 혈청 알부민(BSA), 피넛 아글루티닌, 리소자임 및 사이토크롬 c와 함께(교차 반응성을 체크하기 위해) 100 ㎕의 HSA 및 β-gal로 코팅하였다. K8 클론으로부터의 파아지미드를 문헌(Harrison et al., (1996))에 기술된 바와 같이 KM13으로 구조하고, 파아지를 하유하는 상청(50 ㎕)을 직접 검정하였다. 항-M13-HRP 컨쥬게이트와 결합된 파아지의 검출을 이용하여 표준 ELISA 프로토콜을 실시하였다(Hoogenboom et al., 1991). 이중의 특이적인 K8 항체가, 1.0 초과의 흡수 신호를 갖는 파아지의 표면 상에 표시되면 HSA 및 β-gal에 결합하는 것으로 확인되었다(도 4). BSA로의 강력한 결합이 또한 확인되었다(도 4). HSA 및 BSA가 아미노산 수준에 대해 76% 상동성이기 때문에, K8 항체가 이들의 구조적으로 관련된 단백질 모두를 인식한 것은 놀랍지 않다. 다른 단백질과의 어떠한 교차-반응성도 검출되지 않았다(도 4).
다음으로, K8 항체의 결합 특성을 가용성 scFv ELISA로 시험하였다. 가용성 scFv 단편의 생산을 문헌(Harrison et al., (1996))에 기재된 바와 같이 IPTG에 의해 유도하였다. K8 scFv의 발현 수준을 측정하기 위해, 가용성 항체 단편을 문헌(Harlow and Lane, Antibodies: a Laboratory Manual, (1988) Cold Spring Harbor)에 기재된 바와 같이 단백질 A-세파로오즈 컬럼을 이용하여 50 ml 유도물(induction)의 상청으로부터 정제하였다. 그런 다음 OD280을 측정하고 단백질 농도를 문헌(Sambrook et al., (1998))에 기재된 바와 같이 계산하였다. K8 scFv를 상청에서 19 mg/l로 생산하였다.
이후 가용성 scFv ELISA를 공지된 농도의 K8 항체 단편을 이용하여 수행하였다. 96웰 플레이트를 10 ㎍/ml에서 HSA, BSA 및 β-gal 100 ㎕, 및 1 ㎍/ml의 농도의 단백질 A 100 ㎕로 코팅하였다. K8 scFv의 연속 희석물 50 ㎕를 적용하고, 결합된 항체 단편을 단백질 L-HRP로 검출하였다. ELISA 결과로부터 K8 항체의 이중 특이적인 특성을 확인하였다(도 5).
β-gal로의 결합이 Vκ 도메인에 의해 결정되고 HSA/BSA로의 결합이 K8 scFv 항체의 VH 도메인에 의해 결정되는 지를 확인하기 위해서, Vκ 도메인을 Sal1/Not1 소화에 의해 K8 scFv DNA로부터 잘라내고 이것을 더미 VH 사슬을 함유하는 Sal1/Not1 소화된 pIT2 벡터로 결찰시켰다(도 1 및 2). 생성되는 클론 K8 Vκ/더미 VH의 결합 특성을 가용성 scFv ELISA로 분석하였다. 가용성 scFv 단편의 생산을 문헌(Harrison et al., (1996))에 기재된 바대로 IPTG에 의해 유도하고, scFvs를 함유하는 상청(50 μ)을 직접 검정하였다. 가용성 scFv ELISA를 실시예 1에 기재된 대로 수행하고, 결합된 scFv를 단백질 L-HRP로 검출하였다. ELISA 결과로부터, 이 클론이 여전히 β-gal로는 결합할 수 있으나, BSA로는 결합되지 않음이 나타났다(도 6).
실시예 3. 항원 A 및 B를 향하는 단일 VH 도메인 항체, 및 항원 C 및 D를 향하는 단일 Vκ 도메인 항체의 선택
본 실시예는 상보적인 가변 도메인의 부재시에 이들 항원으로 결합시키기 위한 순수한 단일 항체 가변 도메인의 레퍼토리를 선택함으로써, 항원 A 및 B를 향하는 단일 VH 도메인 항체, 및 항원 C 및 D를 향하는 단일 Vκ 도메인 항체를 제조하는 방법을 설명한다.
결합하는 클론의 선택 및 특성결정은 종래에 기술된 바와 같이(PCT/GB02/003014호의 실시예 5 참조) 실시하였다. 하기한 4개의 클론을 추가 작업을 위해 선택한다:
VH1 - 항 A VH
VH2 - 항 B VH
VK1 - 항 C Vκ
VK2 - 항 D Vκ
실시예 1 내지 3에 기술된 과정을, VH 도메인의 배합물(즉, VH - VH 리간드) 및 VL 도메인의 배합물(VL -VL 리간드)을 포함하는 다이머 분자를 생산하기 위해, 기술된 것과 유사한 방식으로 사용하였다.
실시예 4. 이중의 특이적인 ScFv 항체의 생성 및 특성결정(항원 A 및 B를 향하는 VH1/VH2, 및 항원 C 및 D를 향하는 VK1/VK2)
본 실시예는 ScFv 벡터에서 각각의 항원을 향하도록 선택된 Vκ 단일 도메인과 VH 단일 도메인을 조합시켜서 이중의 특이적인 ScFv 항체(항원 A 및 B를 향하는 VH1/VH2, 및 항원 C 및 D를 향하는 VK1/VK2)를 생성시킬 수 있음을 증명한다.
이중의 특이적인 항체 VH1/VH2를 생성시키기 위해서, VH1 단일 도메인을 NcoI/XhoI 소화에 의해 가변 도메인 벡터 1(도 7)로부터 잘라내고, 이것을 NcoI/XhoI 소화된 가변 도메인 벡터 2(도 7) 내로 결찰시켜 VH1/가변 도메인 벡터 2를 생성하였다. VH2 단일 도메인을 Sal1 제한 부위를 5' 말단으로 도입시키고 Not1 제한 부위를 3' 말단으로 도입시키기 위해 프라이머를 이용하여 가변 도메인 벡터 1로부터 PCR 증폭시켰다. PCR 생성물을 이후 Sal1/Not2로 소화시키고, Sal1/Not1 소화된 VH1/가변 도메인 벡터 2 내로 결찰시켜 VH1/VH2/가변 도메인 벡터 2를 생성하였다.
VK1/VK2/가변 도메인 벡터 2를 유사한 방식으로 생성하였다. 생성된 VH1/VH2 ScFv 및 VK1/VK2 ScFv의 이중 특이성을 종래 기술된 바와 같이(PCT/GB02/003014호의 실시예 6 참조) 가용성 ScFv ELISA로 시험하였다. 경쟁 ELISA를 종래 기술된 바대로 실시하였다(PCT/GB02/003014호의 실시예 8 참조).
가능한 결과:
- VH1/VH2 ScFv는 동시에 항원 A 및 B에 결합할 수 있다.
- VK1/VK2 ScFv는 동시에 항원 C 및 D에 결합할 수 있다.
- VH1/VH2 ScFv 결합은 경쟁적이다(항원 A에 결합되는 경우, VH1/VH2 ScFv는 항원 B에는 결합될 수 없다).
- VK1/VK2 ScFv 결합은 경쟁적이다(항원 C에 결합되는 경우, VK1/VK2 ScFv는 항원 D에는 결합될 수 없다).
실시예 5. 이중의 특이적인 VH1/VH2 Fab 및 VK1/VK2 Fab의 구성, 및 이들의 결합 특성의 분석
VH1/VH2 Fab를 생성하기 위해, VH1 단일 도메인을 NcoI/XhoI 소화된 CH 벡터(도 8) 내로 결찰시켜 VH1/CH를 생성시키고, VH2 단일 도메인을 Sal1/Not1 소화된 CK 벡터(도 9) 내로 결찰시켜 VH2/CK를 생성시켰다. VH1/CH 및 VH2/CK로부터의 플라스미드 DNA를 종래에 기술된 바와 같이(PCT/GB02/003014호의 실시예 8 참조) 반응력 있는(competent) E. coli 세포를 공동-형질전환(co-transform)시키는데 사용한다.
이후, VH1/CH 및 VH2/CK 플라스미드를 함유하는 클론을 IPTG로 도입시켜 종래 기술된 바와 같이(PCT/GB02/003014호의 실시예 8 참조) 가용성 VH1/VH2 Fab를 생성시켰다.
VK1/VK2 Fab를 유사한 방식으로 생성하였다.
생성된 Fab의 결합 특성을 종래 기술된 바와 같이(PCT/GB02/003014호의 실시예 8 참조) 경쟁 ELISA로 시험하였다.
가능한 결과:
- VH1/VH2 Fab는 동시에 항원 A 및 B에 결합할 수 있다.
- VK1/VK2 Fab는 동시에 항원 C 및 D에 결합할 수 있다.
- VH1/VH2 Fab 결합은 경쟁적이다(항원 A에 결합되는 경우, VH1/VH2 Fab는 항원 B에는 결합될 수 없다).
- VK1/VK2 Fab 결합은 경쟁적이다(항원 C에 결합되는 경우, VK1/VK2 Fab는 항원 D에는 결합될 수 없다).
실시예 6 킬레이팅 dAb 다이머
요약
VH 및 VK 호모-다이머를 가요성 폴리펩타이드 링커를 이용하여 dAb-링커-dAb 포맷으로 생성하였다. 벡터를 상이한 길이의 글리신-세린 링커, 3U:(Gly4Ser)3, 5U:(Gly4Ser)5, 7U:(Gly4Ser)7를 함유하는 dAb-링커-dAb 포맷으로 생성하였다. 다이머 라이브러리를 링커 상류의 가이딩 dAb: TAR1-5(VK), TAR1-27(VK), TAR2-5(VH) 또는 TAR2-6(VK) 및 링커 이후의 상응하는 제 2 dAb의 라이브러리를 이용하여 생성하였다. 이 방법으로, 신규한 다이머 dAb가 선택되었다. 항원 결합에 대한 다이머화의 효과를 ELISA 및 바이어코어(Biacore) 연구에 의해 그리고 세포 무력화 및 수용체 결합 검정으로 측정하였다. TAR1-5 및 TAR1-27 둘 모두의 다이머화에 의해 결합 친화도 및 중화 수준에서 현저한 개선이 얻어졌다.
1.0 방법
1.1 라이브러리 생성
1.1.1 벡터
dAb-링커-dAb 포맷에 필적하는 상이한 링커 길이를 도입시키도록 pEDA3U, pEDA5U 및 pEDA7U 벡터를 설계하였다. pEDA3U에 대해서, 센스 및 안티-센스 73-염기쌍 올리고 링커를 0.1M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7.4를 함유하는 완충제 중에서 완속 어닐링 프로그램(95℃ - 5분, 80℃ - 10분, 70℃ - 15분, 56℃ - 15분, 42℃ 사용시까지)을 이용하여 어닐링하고, Xho1 및 Not1 제한 부위를 이용하여 클로닝하였다. 링커는 3(Gly4Ser) 유닛을 포함하였고, Sal1/Not1 클로닝 부위 사이에 하우징된 스터퍼 구역(stuffer region)을 포함하였다(도식 1). 모노머 dAb가 파아지 표시를 위해 선택될 가능성을 낮추기 위해서, 스터퍼 구역을, 제 2 dAb가 존재하지 않는 경우 프레임 밖에 상기 구역이 놓이도록 3개의 정지 코돈, Sac1 제한 부위 및 프레임 이동 돌연변이를 포함하도록 설계하였다. pEDA5U 및 7U에 대해서는 요구된 링커의 길이로 인해 각각의 벡터에 대해 중첩되는 올리고-링커가 설계되고, 어닐링되고 클레노우(Klenow)를 이용하여 연장되었다. 이후, 단편을 정제하고 Xho1 및 Not1 제한 부위를 이용하여 클로닝시키기 전에 적합한 효소로 소화시켰다.
Figure 112009055188415-PCT00001
도식 1
1.1.2 라이브러리 제조
가이딩 dAb에 상응하는 N-말단 V 유전자를 Nco1 및 Xho1 제한 부위를 이용하여 링크의 상류에서 클로닝하였다. VH 유전자는 실재의 친화성 부위를 지니고 있었으나 클로닝되는 VK 유전자는 적합한 제한 부위를 도입해야 했다. 이는, 수퍼태크(SuperTaq: HTBiotechnology Ltd)와 pfu 터보(Stratagene)의 2:1 혼합물을 이용하는 30주기의 PCR 증폭으로 개질되는 PCR 프라이머(VK-DLIBF: 5' cggccatggcgtcaacggacat; VKXho1R: 5' atgtgcgctcgagcgtttgattt 3')를 이용함으로써 실시되었다. 이것은 5' 말단에 Nco1 부위를 유지하는 반면, 인접한 Sal1 부위를 파괴시키고 3' 말단에 Xho1 부위를 도입시켰다. 5개의 가이딩 dAb를 하기한 3개의 다이머 벡터 각각으로 클로닝하였다: TAR1-5(VK), TAR1-27(VK), TAR2-5(VH), TAR2-6(VK) 및 TAR2-7(VK). 모든 작제물을 서열 분석으로 확인하였다.
각각의 벡터(pEDA3U, 5U 및 7U)에서 링커 상류의 가이딩 dAb를 클로닝하고: TAR1-5(VK), TAR1-27(VK), TAR2-5(VH) 또는 TAR2-6(VK), 링커 이후의 상응하는 제 2 dAb의 라이브러리를 클로닝하였다. 이를 위해, 상보성 dAb 라이브러리를 TAR1-5 또는 TAR1-27이 가이딩 dAb인 경우에 사람 TNFα를 향하는 VK 라이브러리(제 1 라운드 후에 약 1 ×106 개로 분기된), 또는 TAR2-5 또는 TAR2-6이 각각 가이딩 dAb인 경우에 사람 p55 TNF 수용체를 향하는 VH 또는 VK 라이브러리(제 1 라운드 후에 약 1 ×105개로 분기된)의 제 1 라운드 선택으로부터 수거한 파아지로부터 PCR 증폭시켰다. VK 라이브러리에 있어서, 수퍼태크와 pfu 터보의 2:1 혼합물을 사용하는 30주기의 PCR 증폭에서 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하였다. VH 라이브러리를 유전자의 5' 말단에 Sal1 제한 부위를 도입시키도록 프라이머를 이용하여 PCR 증폭시켰다. dAb 라이브러리 PCR을 적합한 제한 부위로 효소시키고, Sal1/Not1 제한 부위를 이용하여 링커 하류의 상응하는 벡터 내로 결찰시키고, 갓 제조한 반응력있는 TG1 세포 내로 전기천공(electroporation)시켰다.
각 라이브러리에 대해 얻어진 역가는 하기와 같다:
TAR1-5: pEDA3U = 4 ×108, pEDA5U = 8 ×107, pEDA7U = 1 ×108
TAR1-27: pEDA3U = 6.2 ×108, pEDA5U = 1 ×108, pEDA7U = 1 ×109
TAR2h-5: pEDA3U = 4 ×107, pEDA5U = 2 ×108, pEDA7U = 8 ×107
TAR2h-6: pEDA3U = 7.4 ×108, pEDA5U = 1.2 ×108, pEDA7U = 2.2 ×108
1.2 선택
1.2.1 TNFα
면역튜브 상에 비반응성으로(passively) 코팅된 사람 TNFα를 이용하여 선택을 실시하였다. 간단히 말해, 면역튜브를 1 내지 4 ml의 요구된 항원으로 밤새 코팅하였다. 이후, 면역튜브를 PBS로 3회 세척하고, PBS 중의 2% 우유 분말로 1 내지 2시간 동안 차단한 다음, PBS로 3회 더 세척하였다. 파아지 용액을 PBS 중의 2% 우유 분말로 희석시키고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 튜브를 PBS로 세척하고 파아지를 1 mg/ml 트립신-PBS로 용리시켰다. 3개의 선택 방법을 TAR1-5 다이머 라이브러리에 대해 시험하였다. 제 1 라운드의 선택을, 1 ㎍/ml 또는 20 ㎍/ml에서 코팅되고 PBS 0.1% Tween 중에서 20회 세척한 사람 TNFα을 이용하여 면역튜브 중에서 실시하였다. TG1 세포를 용리시킨 파아지로 감염시키고 역가를 측정하였다(예를 들어, Marks et al., J Mol Biol. 1991 Dec 5; 222(3): 581-97, Richmann et al Biochemistry. 1993 Aug 31; 32(34): 8848-55).
얻어진 역가는 하기와 같다:
pEDA3U = 2.8 ×107(1 ㎍/ml TNF), 1.5 ×108(20 ㎍/ml TNF),
pEDA5U = 1.8 ×107(1 ㎍/ml TNF), 1.6 ×108(20 ㎍/ml TNF),
pEDA7U = 8 ×106(1 ㎍/ml TNF), 7 ×107(20 ㎍/ml TNF),
제 2 라운드의 선택을 하기한 3개의 상이한 방법으로 실시하였다.
1. 면역튜브에서, 밤새 인큐베이션시킨 20회의 세척물을 추가로 10회 더 세척한다.
2. 면역튜브에서, 20회 세척시킨 다음 1 ㎍/ml TNFα를 함유하는 세척 완충제 중에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시키고 10회 더 세척한다.
3. 33 pmole의 비오티닐화된 사람 TNFα를 이용하여 스트렙타비딘 비드 상에서 선택을 실시한다(Henderikx et al., 2002, Selection of antibodies aganist biotinylated antigens. Antibody Phage Display: Methods and protocols, Ed. O'Brien and Atkin, Humans Press). 제 2 라운드의 선택으로부터의 단일 클론을 96웰 플레이트 내로 모으고, 미정제 상청 제조물을 2 ml의 96웰 플레이트로 제조하였다.
제 1 라운드 사람 TNFα 면역 튜브 코팅 농도 제 2 라운드 선택 방법 1 제 2 라운드 선택 방법 2 제 2 라운드 선택 방법 3
pEDA3U 1 ㎍/ml 1 ×109 1.8 ×109 2.4 ×1010
pEDA3U 20 ㎍/ml 6 ×109 1.8 ×1010 8.5 ×1010
pEDA5U 1 ㎍/ml 9 ×108 1.4 ×109 2.8 ×1010
pEDA5U 20 ㎍/ml 9.5 ×109 8.5 ×109 2.8 ×1010
pEDA7U 1 ㎍/ml 7.8 ×108 1.6 ×108 4 ×1010
pEDA7U 20 ㎍/ml 1 ×1010 1.8 ×109 1.5 ×1010
TAR1-27에 대해서, 선택을 하기 변경 사항을 적용하면서 종래 기술된 바와 같이 실시하였다. 제 1 라운드의 선택을 1 ㎍/ml 또는 20 ㎍/ml에서 코팅되고 PBS 0.1% Tween 중에서 20회 세척한 사람 TNFα을 이용하여 면역튜브 상에서 실시하였다. 제 2 라운드의 선택을 밤새 인큐베이션시키면서 20회 세척시킨 다음 추가로 2회 더 세척하면서 면역튜브 상에서 실시하였다. 제 2 라운드 선택으로부터의 단일 클론을 96웰 플레이트로 모으고, 미정제 상청 제조물을 2 ml의 96웰 플레이트 포맷으로 제조하였다.
TAR1-27의 역가가 하기되어 있다:
사람 TNFα 면역 튜브 코팅 농도 제 1라운드 제 2 라운드
pEDA3U 1 ㎍/ml 4 ×109 6 ×109
pEDA3U 20 ㎍/ml 5 ×109 4.4 ×1010
pEDA5U 1 ㎍/ml 1.5 ×109 1.9 ×1010
pEDA5U 20 ㎍/ml 3.4 ×109 3.5 ×1010
pEDA7U 1 ㎍/ml 2.6 ×109 5 ×109
pEDA7U 20 ㎍/ml 7 ×109 1.4 ×1010
1.2.2 TNF 수용체 1(p55 수용체; TAR2)
오로지 TAR2h-5 라이브러리에 대해서만 종래 기술된 바와 같이 선택을 실시하였다. 3회 라운드의 선택을 밤새 인큐베이션시키면서 PBS 0.1% Tween 중에서 20회 세척한 다음 추가로 20회 더 세척한 1 ㎍/ml 사람 p55 TNF 수용체 또는 10 ㎍/ml 사람 p55 TNF 수용체를 이용하여 면역튜브에서 실시하였다. 제 2 라운드 및 제 3 라운드 선택으로부터의 단일 클론을 96웰 플레이트 내로 모으고, 미정제 상청 제조물을 2 ml의 96웰 플레이트 포맷으로 제조하였다.
TAR2h-5의 역가가 하기되어 있다:
제 1 라운드 사람 p55 TNF 수용체 면역튜브 코팅 농도 제 1 라운드 제 2 라운드 제 3 라운드
pEDA3U 1 ㎍/ml 2.4 ×106 1.2 ×107 1.9 ×109
pEDA3U 10 ㎍/ml 3.1 ×107 7 ×107 1 ×108
pEDA5U 1 ㎍/ml 2.5 ×106 1.1 ×107 5.7 ×108
pEDA5U 10 ㎍/ml 3.7 ×107 2.3 ×108 2.9 ×109
pEDA7U 1 ㎍/ml 1.3 ×106 1.3 ×107 1.4 ×109
pEDA7U 10 ㎍/ml 1.6 ×107 1.9 ×107 3 ×1010
1.3 스크리닝
제 2 또는 제 3 라운드 선택으로부터의 단일 클론을, 적합한 경우 상이한 선택 방법으로부터의 3U, 5U 및 7U 라이브러리 각각으로부터 모았다. 클론을 100 ㎍/ml 암피실린 및 1% 글루코스를 함유하는 2 ×TY 중에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 이 배양물의 1/100 희석물을 2 ml, 96웰 플레이트 포맷으로, 100 ㎍/ml 암피실린 및 0.1% 글루코스를 함유하는 2 ml의 2 ×TY 내로 접종시키고 OD600이 대략 0.9가 될때까지 진탕시키면서 37℃에서 성장시켰다. 이후, 배양물을 30℃에서 밤새 1 mM IPTG로 유도하였다. 상청을 소발(sorval) 플레이트 원심분리기에서 15분 동안 4000 rpm에서 원심분리로 정화하였다. 이 상청 제조물을 초기 스크리닝을 위해 사용하였다.
1.3.1 ELISA
다이머 재조합 단백질의 결합 활성을 단백질 A/L ELISA에 의해 또는 항원 ELISA에 의해 단량체와 비교하였다. 간단히 말해, 96웰 플레이트를 4℃에서 밤새 항원 또는 단백질 A/L로 코팅하였다. 이 플레이트를 0.05% Tween-PBS로 세척하고, 2% Tween-PBS로 1시간 동안 차단하였다. 샘플을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 세척하고, 실온에서 1시간 동안 2차 시약과 함께 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, TMB 기질과 함께 현상하였다. 단백질 A/L-HRP 또는 인디아-HRP를 2차 시약으로 사용하였다. 항원 ELISA에 있어서, 사용된 항원 농도는 사람 TNFα 및 사람 THF 수용체 1에 대해서는 PBS 중의 1 ㎍/ml이었다.
대부분의 경우에 가이딩 dAb의 존재로 인해, 다이머는 양의 ELISA 신호를 나타냈고, 이에 따라 오프 레이트(off rate) 측정을 바이어코어로 조사하였다.
1.3.2 바이어코어
TAR1-5 및 TAR2h-5 클론에 대해서는 바이어코어 분석을 실시하였다. 스크리닝을 위해, 사람 TNFα를 고밀도(대략 10000 RU)에서 CM5 칩에 연결시켰다. 50 ㎕의 사람 TNFα(50 ㎍/ml)를 pH 5.5의 아세테이트 완충제 중에서 5 ㎍/min로 칩에 연결시켰다. 표준 방법을 이용하여 분석한 후에 칩의 재생은, 사람 TNFα의 불안정성으로 인해 불가능하므로, 각 샘플을 분석한 후에 칩을 완충제로 10분 동안 세척하였다.
TAR1-5에 대해서는, 제 2 라운드 선택으로부터의 클론 상청을 바이어코어로 스크리닝하였다. 48개의 클론을 하기 선택 방법을 사용하여 얻어진 3U, 5U 및 7U 라이브러리 각각으로부터 스크리닝하였다.
R1: 1 ㎍/ml 사람 TNFα 면역튜브, R2 1 ㎍/ml 사람 TNFα 면역튜브, 밤새 세척.
R1: 20 ㎍/ml 사람 TNFα 면역튜브, R2 20 ㎍/ml 사람 TNFα 면역튜브, 밤새 세척.
R1: 1 ㎍/ml 사람 TNFα 면역튜브, R2 비드 상의 33 pmoles 비오티닐화된 사람 TNFα.
R1: 20 ㎍/ml 사람 TNFα 면역튜브, R2 33 pmoles 비오티닐화된 사람 TNFα 비드.
스크리닝을 위해, 사람 p55 TNF 수용체를 고밀도(대략 4000 RU)에서 CM5 칩 상에 연결시켰다. 100 ㎕의 사람 p55 TNF 수용체(10 ㎍/ml)를 pH 5.5의 아세테이트 완충제 중에 5 ㎕/ml로 칩에 연결시켰다. 표준 재생 상태를 조사하였으나(글리신 pH2 또는 pH3), 각각의 경우에 TNFα을 지닌 항원을 칩의 표면으로부터 제거하고, 이에 따라 각 샘플을 분석한 후에 칩을 완충제로 10분 동안 세척하였다.
TAR2-5에 대해서는, 제 2 라운드 선택으로부터의 클론 상청을 스크리닝하였다. 48개의 클론을 하기 선택 방법을 이용하여 3U, 5U 및 7U 라이브러리의 각각으로부터 스크리닝하였다:
R1: 1 ㎍/ml 사람 p55 TNF 수용체 면역튜브, R2 1 ㎍/ml 사람 p55 TNF 수용체 면역튜브, 밤새 세척.
R1: 10 ㎍/ml 사람 p55 TNF 수용체 면역튜브, R2 10 ㎍/ml 사람 p55 TNF 수용체 면역튜브, 밤새 세척.
1.3.3 수용체 및 세포 검정
무력화되는 다이머의 능력을 수용체 분석에서 하기와 같이 검정하였다:
수용체 결합
항-TNF dAb를 재조합 TNF 수용체 1(p55)로의 TNF의 결합을 억제하는 능력에 대해 시험하였다. 간단히 말해, 맥시소프 플레이트를 30 mg/ml 항-사람 Fc 마우스 단일클론성 항체(미국 샌프란시스코 지메드)와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 웰을 0.05% Tween-20을 함유하는 인산염 완충 염수(PBS)로 세척한 후에, PBS 중의 1% BSA로 차단시키고 나서, 100 ng/ml TNF 수용체 1 Fc 융합 단백질(미국 미네아폴리스 R & D 시스템스)과 함께 인큐베이션하였다. 항-TNF dAb를, 10 ng/ml의 최종 농도에서 세척된 웰에 첨가된 TNF와 혼합하였다. THF 결합을 0.2 mg/ml 비오티닐화된 항-TNF 항체(네덜란드 우벤 히컬트 바이오테크놀로지) 및 홀스 래디쉬 퍼옥시다아제 표지된 스트렙타비딘(영국 아머샴 바이오사이언씨즈) 500:1 희석물로 검출한 다음, TMB 기질(미국 가이터스버그 KPL)과 함께 인큐베이션하였다. HCl을 첨가하여 반응을 중단시키고 450 nm에서 흡광도를 판독하였다. 항-TNF dAb 활성은 TNF 결합을 감소시켰고, 이에 따라 대조군인 TNF와 비교하여 흡광도에서의 감소가 얻어졌다.
L929 세포독성 검정
항-TNF dAb를 마우스 L929 섬유아세포 상에서 TNF의 세포독성 활성을 무력화시키는 능력에 대해 시험하였다[Evans, T. (2000) Molecular Biotechnology 15, 243-248]. 간단히 말해, 미세역가판에 플레이팅된 L929 세포를 항-TNF dAb, 100 pg/ml TNF 및 1 mg/ml 액티노마이신 D(영국 풀레 시그마)와 함께 밤새 인큐베이션시켰다. [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨(미국 매디슨 프로메가)과 함께 인큐베이션시킨 후에, 490 nm에서 흡광도를 판독함으로써 세포 생존력을 측정하였다. 항-TNF dAb 활성은 TNF 세포독성을 감소시켰고, 이에 따라 대조군인 TNF와 비교하여 흡광도가 증가하였다.
초기 스크린에서, 상기 기술된 바이어코어 분석을 위해 준비된 상청을 또한 수용체 검정에서도 사용하였다. 선택된 다이머의 추가 분석을, 정제된 단백질을 사용하여 수용체 및 세포 검정에서 실시하였다.
HeLa IL-8 검정
항-TNFR1 또는 항-TNF 알파 dAb를 HeLa 세포 중의 TNF에 의해 IL-8 분비의 유도를 무력화시키는 능력에 대해 시험하였다[HUVEC에서 IL-1에 의해 IL-8의 유도를 기술하고 있는 문헌(Akeson, L. et al (1996) Journal of Biological Chemistry 271, 30517-30523)으로부터 채택된 방법; 여기서 본 발명자들은 사람 TNF 알파에 의한 유도에 주목하고, HUVEC 세포주 대신에 HeLa 세포를 사용한다]. 간단히 말해, 미세역가판에 플레이팅된 HeLa 세포를 dAb 및 300 pg/ml TNF와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후의 상청을 세포로부터 흡출시키고, IL-8 농도를 샌드위치 ELISA(R&D 시스템스)를 통해 측정하였다. 항-TNFR1 dAb 활성은 대조군인 TNF와 비교하여 상청 내로의 IL-8의 분비를 감소시켰다.
하기 실험 전반에 걸쳐 L929 검정을 이용한다; 그러나, HeLa IL-8 검정의 사용은 항-TNF 수용체 1(p5) 리간드를 측정하는데 바람직하다; L929 검정에서 마우스 p55의 존재는 이의 사용에 특정한 제한을 가한다.
1.4 서열 분석
바이어코어 및 수용체 검정 스크린에서 흥미로운 특성을 갖는 것으로 입증된 다이머를 서열화하였다. 서열은 서열 목록에 상술되어 있다.
1.5 포맷팅
1.5.1 TAR1-5-19 다이머
양호한 무력화 특성을 갖는 것으로 확인된 TAR1-5 다이머를 재포맷하고, 세포 및 수용체 검정에서 분석하였다. TAR1-5 가이딩 dAb를 친화력 미숙한(affinity-matured) 클론 TAR1-5-19로 교체하였다. 이를 성취하기 위해, TAR1-5를 개개의 다이머 쌍 밖으로 클로닝하고, PCR에 의해 증폭시킨 TAR1-5-19로 교체하였다. 또한, TAR1-5-19 호모다이머를 또한 3U, 5U 및 7U 벡터로 작제하였다. 유전자의 N 말단 카피를 PCR로 증폭시키고, 상기한 바와 같이 클로닝하고, C-말단 유전자 단편을 실재하는 Sal1 및 Not1 제한 부위를 이용하여 클로닝하였다.
1.5.2 돌연변이형성
TAR1-5 다이머 쌍의 C-말단 dAb 중 하나인 dAb2에 존재하는 황갈색의 정지 코돈을 부위 지향성 돌연변이 형성에 의해 글루타민으로 돌연변이화하였다.
1.5.3 Fabs
TAR1-5 또는 TAR1-5-19를 함유하는 다이머를 Fab 발현 벡터로 재포맷하였다. dAb를 Sfi1 및 Not1 제한 부위를 이용하여 CK 또는 CH 유전자를 함유하는 발현 벡터 내로 클로닝하고, 서열 분석으로 확인하였다. CK 벡터를 pUC 기재의 암피실린 내성 벡터로부터 얻고, CH 벡터는 pACYC 클로람페니콜 내성 벡터로부터 얻는다. Fab 발현에 대해서는 dAb-CH 및 dAb-CK 작제물을 HB2151 세포내로 공동-형질변환시켰고, 0.1% 글루코스, 100 ㎍/ml 암피실린 및 10 ㎍/ml 클로람페니콜을 함유하는 2xTY 중에서 성장시켰다.
1.5.3 힌지 다이머화
시스테인 결합 형성을 통한 dAb의 다이머화를 조사하였다. 사람 IgGC1 힌지의 개질된 형태인 아미노산 EPKSGDKTHTCPPCP의 짧은 서열을 dAb 상의 C 말단 구역에서 조작하였다. 이 서열을 엔코딩하는 올리고 링커를 종래 기술한 바와 같이 합성하고 어닐링하였다. 링커를 Xho1 및 Not1 제한 부위를 이용하여 TAR1-5-19를 함유하는 pEDA 벡터 내로 클로닝하였다. 다이머화가 주변세포질(periplasm)의 상피(in situ)에서 일어난다.
1.6 발현 및 정제
1.6.1 발현
상청을 종래에 기술된 바와 같이 초기 스크리닝을 위해 2 ml의 96웰 플레이트 포맷으로 제조하였다. 초기 스크리닝 과정을 실시한 후에 선택된 다이머를 추가로 분석하였다. 다이머 작제물을 상청인 TOP10F' 또는 HB2152 세포 중에서 발현시켰다. 간단히 말해, 새로운 줄무늬(streaked) 플레이트로부터의 개별 콜로니를 100 ㎍/ml 암피실린 및 1% 글루코스를 함유하는 2xTY 중에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 이 배향물의 1/100 희석물을 100 ㎍/ml 암피실린 및 0.1% 글루코스를 함유하는 2xTY로 접종하고, OD600이 대략 0.9가 될때까지 진탕시키면서 37℃에서 성장시켰다. 이후, 배양물을 30℃에서 밤새 1 mM IPTG로 유도하였다. 세포를 원심분리로 제거하고, 상청을 단백질 A 또는 L 아가로스로 정제하였다.
Fab 및 시스테인 힌지 다이머는 HB2152 세포에서 주변세포질 단백질로 발현되었다. 밤새 배양시킨 배양물의 1/100 희석물을 0.1% 글루코스 및 적합한 항생물질을 함유하는 2xTY 내로 접종시키고, OD600이 대략 0.9가 될때까지 진탕시키면서 30℃에서 성장시켰다. 이후, 배양물을 25℃에서 3 내지 4시간 동안 1mM IPTG로 유도하였다. 세포를 원심분리로 수확하고 펠릿을 주변세포질 제조 완충제(30 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 20% 수크로스) 중에 재현탁시켰다. 원심분리하여, 상청을 유지하고 펠릿을 5 mM MgSO4 중에 재현탁하였다. 상청을 원심분리로 다시 수확하고, 풀링하고, 정제하였다.
1.6.2 단백질 A/L 정제
단백질 L 아가로스(노르웨이 애피테크) 또는 단백질 A 아가로스(영국 시그마)로부터의 다이머 단백질의 정제의 최적화를 시험하였다. 단백질을 연동식 펌프를 이용하여 컬럼 용리에 의해 또는 배치(batch)에 의해 용리하였다. 3개의 완충제, 0.1M 인산염-시트르산염 완충제 pH 2.6, 0.2M 글리신 pH 2.5 및 0.1M 글리신 pH 2.5를 시험하였다. 최적 조건은 연동식 펌프 조건 하에서 10 컬럼 부피에 걸쳐 0.1M 글리신 pH 2.5를 사용하는 경우인 것으로 측정되었다. 단백질 A로부터의 정제를 0.1M 글리신 pH 2.5를 사용하여 연동식 펌프 조건 하에서 실시하였다.
1.6.3 FPLC 정제
AKTA 익스플로러 100 시스템(아머샴 바이오사이언씨즈 리미티드) 상에서의 FPLC 분석으로 추가 정제를 실시하였다. TAR1-5 및 TAR1-5-19 다이머를, 50 mM 아세테이트 완충제 pH 4 중에서의 0 내지 1M NaCl 구배로 용리시킨 양이온 교환 크로마토그래피(1 ml 리소스 S - 아머샴 바이오사이언씨즈 리미티드)에 의해 분별 증류하였다. 힌지 다이머를 25 mM Tris HCl pH 8.0 Fabs 중의 0 내지 1 M NaCl 구배로 용리시킨 이온 교환(1 ml 리소스 Q 아머샴 바이오사이언씨즈 리미티드)으로 정제하였다. Fabs를, 0.05% Tween을 함유하는 PBS 중에서 0.5 ml/min의 유속에서 작동하는 수퍼로즈 12(아머샴 바이오사이언씨즈 리미티드) 컬럼을 이용하는 크기 배제 크로마토그래피로 정제하였다. 정제 후 샘플을 비바스핀 5K 컷 오프 농축기(비바사이언스 리미티드)를 이용하여 농축시켰다.
2.0 결과
2.1 TAR1-5 이합체
모든 라이브러리 및 선택 조건을 포함하는 라운드 2 선택으로부터 6 x 96개의 클론을 채집하였다. 상층액 프렙(prep)을 만들고, 항원 및 단백질 L ELISA, 비아코어(Biacore) 및 수용체 검정으로 분석하였다. ELISA에서, 각각의 선택 방법으로부터 양성 결합 클론을 확인하고, 3U, 5U 및 7U 라이브러리 사이에 분배하였다. 그러나, 가이딩(guiding) dAb가 항상 존재함에 따라, 상기 방법에 의해 고 친화성 결합체와 저 친화성 결합체를 구별하는 것이 가능하지 않으므로, 비아코어 검정을 수행하였다.
2ml 상층액을 이용하여 비아코어 검정을 수행하였다. 비아코어 검정은 이합체 Koff 속도가 단량체 TAR1-5에 비해 매우 개선된 것을 나타내었다. 단량체 Koff 속도는 10-3 - 10-4M의 범위의 이합체 Koff 속도에 비해 10-1M의 범위였다. 매우 느린 분리 속도를 갖는 것으로 보이는 16개의 클론을 선택하였고, 이들을 3U, 5U 및 7U 라이브러리로부터 수득된 것이며, 서열 분석하였다. 또한, 수용체 검정으로 인간 TNFα를 중화시키는 능력에 대해 상층액을 분석하였다.
상기 분석에서 6개의 리드(lead) 클론(하기 d1-d6)이 중화되었고, 이를 서열분석하였다. 결과는 수득된 6개의 클론 중, 단지 3개의 상이한 제 2 dAb(dAb1, dAb2 및 dAb3)가 존재하나; 제 2의 dAb가 다양한 길이의 링커로 연결되는 것 보다 많이 발견됨을 나타낸다.
TAR1-5d1: 3U 링커 2nd dAb=dAb1 - 1μg/ml Ag 면역튜브 밤새 세척
TAR1-5d2: 3U 링커 2nd dAb=dAb2 - 1 μg/ml Ag 면역튜브 밤새 세척
TAR1-5d3: 5U 링커 2nd dAbr=dAb2 - 1 μg/ml Ag 면역튜브 밤새 세척
TAR1-5d4: 5U 링커 2nd dAb=dAb3 - 20μg/ml Ag 면역튜브 밤새 세척
TAR1-5d5: 5U 링커 2nd dAb=dAb1 - 20μg/ml Ag 면역튜브 밤새 세척
TAR1-5d6:7U 링커 2nd dAb=dAb1 - R1:1μg/ml Ag 면역튜브 밤새 세척, R2:비드
6개의 리드 클론을 추가로 시험하였다. 원형질막 주위공간 및 상층액으로부터 단백질을 생성시키고, 단백질 L 아가로오스로 정제하고, 세포 및 수용체 검정으로 시험하였다. 중화 수준은 다양하였다(표 1). 단백질 제조를 위한 최적의 조건을 결정하였다. 상층액으로서 HB2151 세포로부터 생성된 단백질이 가장 높은 수율(약 10mgs/배양물 L)을 발생시켰다. 상층액을 실온에서 2시간 또는 4℃에서 밤새 단백질 L 아가로오스와 함께 인큐베이션하였다. 비드를 PBS/NaCl로 세척하고, 연동 펌프를 이용하여 FPLC 컬럼으로 패킹하였다. 비드를 10 컬럼 부피의 PBS/NaCl로 세척하고, 0.1M 글리신 pH2.5으로 용리시켰다. 일반적으로, 단량체 후에 이합체 단백질이 용리된다.
TAR1-5d1-6 이합체를 FPLC로 정제하였다. 3개의 종을 FPLC 정제에 의해 수득하고, SDS PAGE로 확인하였다. 1개의 종은 단량체에 해당하고, 다른 2개의 종은 상이한 크기의 이합체에 해당하였다. 2개의 종 중 더 큰 종은 아마 3 말단 태그(tag)의 존재로 인한 것이다. 이러한 단백질을 수용체 검정으로 시험하였다. 표 1에 제시된 데이터는 2개의 이합체 종으로부터 수득된 최적의 결과를 나타낸다(도 11).
이합체 쌍으로부터의 3개의 제 2 dAb(즉, dAb1, dAb2 및 dAb3)를 단량체로서 클로닝하고, ELISA 및 세포 및 수용체 검정으로 시험하였다. 모든 3개의 dAb는 항원 ELISA에 의해 TNF에 특이적으로 결합하고, 플라스틱 또는 BSA와 교차 반응하지 않았다. 단량체로서, 어느 dAb도 세포 또는 수용체 검정에서 중화시키지 않았다.
2.1.2 TAR1-5-19 이합체
6개의 리드 클론에서 TAR1-5를 TAR1-5-19로 대체하였다. 세포 및 수용체 검정에서 모든 TAR1-5-19 이합체의 분석을 달리 언급하지 않는 경우 전체 단백질(단지 단백질 L 정제됨)을 이용하여 수행하였다(표 2). TAR1-5-19d4 및 TAR1-5-19d3이 세포 검정에서 최상의 ND50(~5 nM)를 지니고, 이는 수용체 검정 결과와 일치하며, TAR1-5-19 단량체(ND50~30nM)에 비해 개선된 것이다. 정제된 TAR1-5 이합체는 수용체 및 세포 검정에서 다양한 결과를 발생시키나, TAR1-5-19 이합체는 보다 일치하는 결과를 발생시킨다. 단백질 정제 동안 다양한 용리 완충용액을 이용하는 경우 변동성이 나타났다. 비록 대부분의 경우 단백질 L 아가로오스로부터 모든 단백질을 제거하기는 하나, 0.1M 포스페이트-시트레이트 완충용액 pH2.6 또는 0.2M 글리신 pH2.5을 이용한 용리는 덜 기능성이 된다.
발효기에서 TAR1-5-19d4를 발현시키고, 양이온 교환 FPLC에서 정제하여, 완전히 순수한 이합체를 생성시켰다. TAR1-5d4를 이용한 바와 같이 3개의 종을 FPLC 정제로 수득하였고, 이 중 하나는 단량체 종에 해당하고, 2개는 이합체 종에 해당하였다. 이러한 이합체는 아미노산 서열 분석되었다. 이후, TAR1-5-19 단량체 및 TAR1-5-19d4를 수용체 검정에서 시험하였고, 단량체에 대해 생성된 IC50은 30nM이었고, 이합체에 대해서는 8nM이었다. TAR1-5-19 단량체, TAR1-5-19d4 및 TAR1-5d4를 비교하는 수용체 검정의 결과가 도 10에 도시되어 있다.
TAR1-5-19 동종이합체를 3U, 5U 및 7U 벡터에서 제조하고, 발현시키고, 단백질 L 상에서 정제시켰다. 세포 및 수용체 검정에서 단백질을 시험하였고, 생성된 IC50(수용체 검정에 대해) 및 ND50(세포 검정에 대해)을 결정하였다(표 3, 도 12).
2.2 Fab
TAR1-5 및 TAR1-5-19 이합체를 또한 Fab 포맷으로 클로닝하고, 발현시키고, 단백질 L 아가로오스 상에서 정제시켰다. 수용체 검정에서 Fab를 평가하였다(표 4). 결과는 TAR1-5-19 및 TAR1-5 이합체 둘 모두에 대해 중화 수준이, 이들이 유래된 본래의 Gly4Ser 링커 이합체와 유사함을 나타내었다. TAR1-5-19가 CH 및 CK 둘 모두에서 디스플레이된 TAR1-5-19 Fab를 발현시키고, 단백질 L 정제시키고, 수용체 검정으로 평가하였다. 생성된 IC50은 약 1 nM이었다.
2.3 TAR1-27 이합체
모든 라이브러리 및 선택 조건을 포함하는 라운드 2 선택으로부터 3 x 96개의 클론을 채집하였다. ELISA 및 생물학적 검정에서의 분석을 위해 2ml 상층액 프렙(prep)을 만들었다. 항원 ELISA는 71개의 양성 클론을 발생시켰다. 미정제 상층액의 수용체 검정은 억제 특성을 갖는 42개의 클론을 생성시켰다(TNF 결합 0-60%). 대부분의 경우에서, 억제 특성은 강한 ELISA 신호와 서로 상관이 있었다. 42개의 클론을 서열 분석하였고, 이중 39개가 독특한 제 2 dAb 서열을 지녔다. 최상의 억제 특성을 발생시킨 12개 이합체를 추가로 분석하였다.
12개의 중화 클론을 200ml 상층액 프렙으로 발현시키고, 단백질 L 상에서 정제시켰다. 이들을 단백질 L 및 항원 ELISA, 비아코어 및 수용체 검정으로 평가하였다. 강한 양성 ELISA 신호를 모든 경우에서 수득하였다. 비아코어 검정은 모든 클론이 신속한 결합 및 분리 속도를 갖는 것을 나타내었다. 분리 속도는 단량체 TAR1-27에 비해 개선되었으나, 이전에 시험된 TAR1-5 이합체(Koff가 약 10-3 - 10-4M의 범위임) 보다 TAR1-27 이합체의 분리 속도가 신속하였다(Koff가 약 10-1 및 10-2M의 범위임). 정제된 이합체의 안정성을 연구하였고, 이에 따라 안정성을 개선시키기 위해, 2개의 TAR1-27 이합체(d2 및 d16)의 정제에 5% 글리세롤, 0.5% 트리톤 X100 또는 0.5% NP40(Sigma)에 대한 첨가를 포함시켰다. NP40 또는 트리톤 X100™의 첨가는 정제된 생성물의 수율을 약 2배로 개선시켰다. 둘 모두의 이합체를 수용체 검정으로 평가하였다. 모든 정제 조건하에서 TAR1-27d2는 ~30nM의 IC50을 생성시켰다. TAR1-27d16은 안정화제의 사용 없이 정제되는 경우 중화 효과를 나타내지 않았으나, 안정화 조건하에서 정제되는 경우 ~50nM의 IC50을 발생시켰다. 추가 분석을 수행하지 않았다.
2.4 TAR2-5 이합체
모든 라이브러리 및 선택 조건을 포함하는 라운드 2 선택으로부터 3 x 96개의 클론을 채집하였다. 분석을 위해 2ml 상층액 프렙(prep)을 만들었다. 단백질 A 및 항원 ELISA를 각각의 플레이트에 대해 수행하였다. 30개의 관심 클론이 비아코어에 의해 우수한 분리 속도를 갖는 것으로 확인되었다(10-2 - 10-3M의 Koff 범위). 클론을 서열 분석하였고, 13개의 독특한 이합체가 서열 분석에 의해 확인되었다.
표 1: TAR1-5 이합체
이합체 세포 유형 정제 단백질 분획 용리 조건 수용체/세포 검정
TAR1-5d1 HB2151 단백질 L + FPLC 작은 이합체 종 0.1M 글리신 pH 2.5 RA~30nM
TAR1-5d2 HB2151 단백질 L + FPLC 작은 이합체 종 0.1M 글리신 pH 2.5 RA~50nM
TAR1-5d3 HB2151 단백질 L + FPLC 큰 이합체 종 0.1M 글리신 pH 2.5 RA~300nM
TAR1-5d4 HB2151 단백질 L + FPLC 작은 이합체 종 0.1M 글리신 pH 2.5 RA~3nM
TAR1-5d5 HB2151 단백질 L + FPLC 큰 이합체 종 0.1M 글리신 pH 2.5 RA~200nM
TAR1-5d6 HB2151 단백질 L + FPLC 큰 이합체 종 0.1M 글리신 pH 2.5 RA~100nM
* 이합체 2 및 이합체 3은 동일한 제 2 dAb(dAb2로 언급됨)을 가지나. 상이한 링커 길이(d2 = (Gly4Ser)3, d3 = (Gly4Ser)3)를 가짐을 주의하라. dAb1은 이합체 1, 5 및 6에 대한 파트너 dAb이다. dAb3은 이합체 4에 대한 파트너 dAb이다. 어떠한 파트너 dAb도 단독으로 중화시키지 않는다. 달리 언급되지 않는 경우 FPLC 정제는 양이온 교환에 의한 것이다. FPLC에 의해 수득된 각각의 이합체에 대한 최상의 이합체 종을 상기 분석에서 결정하였다.
표 2: TAR1-5-19 이합체
이합체 세포 유형 정제 단백질 분획 용리 조건 수용체/세포 검정
TAR1-5-19 d1 TOP1OF' 단백질 L 전체 단백질 0.1M 글리신 pH 2.0 RA~15nM
TAR1-5-19 d2 (정지 코돈이 없음) TOP1OF' 단백질 L 전체 단백질 0.1M 글리신 pH 2.0 + 0.05% NP40 RA~2nM
TAR1-5-19 d3 (정지 코돈이 없음) TOP1OF' 단백질 L 전체 단백질 0.1M 글리신 pH 2.5 + 0.05% NP40 RA~8nM
TAR1-5-19 d4 TOP1OF' 단백질 L + FPLC FPLC 정제 분획 0.1M 글리신 pH 2.0 RA~2-5nM CA~12nM
TAR1-5-19 d5 TOP1OF' 단백질 L 전체 단백질 0.1M 글리신 pH 2.0 + NP40 RA~8nM CA~10nM
TAR1-5-19 d6 TOP1OF' 단백질 L 전체 단백질 0.1M 글리신 pH 2.0 RA~10nM
표 3: TAR1-5-19 동종이합체
이합체 세포 유형 정제 단백질 분획 용리 조건 수용체/세포 검정
TAR1-5-19 3U 동종이합체 HB2151 단백질 L 전체 단백질 0.1M 글리신 pH 2.5 RA~20nM CA~30nM
TAR1-5-19 5U 동종이합체 HB2151 단백질 L 전체 단백질 0.1M 글리신 pH 2.5 RA~2nM CA~3nM
TAR1-5-19 7U 동종이합체 HB2151 단백질 L 전체 단백질 0.1M 글리신 pH 2.5 RA~10nM CA~15nM
TAR1-5-19 cyc 힌지 HB2151 단백질 L + FPLC FPLC 정제 이합체 분획 0.1M 글리신 pH 2.5 RA~2nM
TAR1-5-19CH/TAR1-5-19CK HB2151 단백질 전체 단백질 0.1M 글리신 pH 2.5 RA~1nM
표 4: TAR1-5/TAR1-5-19 Fabs
이합체 세포 유형 정제 단백질 분획 용리 조건 수용체/세포 검정
TAR1-5CH/dAb1 CK HB2151 단백질 L 전체 단백질 0.1M 시트레이트 pH 2.6 RA~90nM
TAR1-5CH/dAb2 CK HB2151 단백질 L 전체 단백질 0.1M 글리신 pH 2.5 RA~30nM CA~60nM
dAb3 CK/ TAR1-5CK HB2151 단백질 L 전체 단백질 0.1M 시트레이트 pH 2.6 RA~100nM
TAR1-5-19CH/dAb1 CK HB2151 단백질 L 전체 단백질 0.1M 글리신 pH 2.0 RA~6nM
dAb1 CH/TAR1-5-19CK HB2151 단백질 L 0.1M 글리신 pH 2.0 Myc/flag RA~6nM
TAR1-5-19CH/dAb2 CK HB2151 단백질 L 전체 단백질 0.1M 글리신 pH 2.0 RA~8nM CA~12nM
TAR1-5-19CH/dAb3CK HB2151 단백질 L 전체 단백질 0.1M 글리신 pH 2.0 RA~3nM
실시예 7 - 말단 시스테인 결합에 의한 dAb 이합체화
요약
dAb 이합체화를 위해, 자유 시스테인을 단백질의 C-말단에서 공학처리하였다. 발현시, 단백질은 2단계의 정제 방법에 의해 정제될 수 있는 이합체를 형성한다.
TAR1-5-19CYS 이합체의 PCR 작제
dAb 삼합체를 기재하는 실시예 8을 참조하라. 삼합체 프로토콜은 단량체, 이합체 및 삼합체의 혼합물을 발생시킨다.
TAR1-5-19CYS 이합체의 발현 및 정제
실시예 8에 기술된 바와 같이 단백질 L 아가로오스 상에서의 포획에 의해 배양 상층액으로부터 이합체를 정제하였다.
TAR1-5-19CYS 이합체로부터의 TAR1-5-19CYS 단량체의 분리
양이온 교환 분리 전에, 혼합된 단량체/이합체 샘플을 제조업체의 지침에 따라 PD-10 컬럼(Amersham Pharmacia)을 이용하여 50 mM 아세트산 나트륨 완충용액 pH 4.0으로 완충용액 교환하였다. 이후, 샘플을 50 mM 아세트산 나트륨 pH 4.0으로 미리 평형화된 1mL 리소스(Resource) S 양이온 교환 컬럼(Amersham Pharmacia)에 적용시켰다. 50 mM 아세트산 나트륨 pH 4.0 중에서의 하기 염 구배를 이용하여 단량체 및 이합체를 분리시켰다:
15 컬럼 부피를 초과하는 150 내지 200 mM의 염화나트륨
10 컬럼 부피를 초과하는 200 내지 450 mM의 염화나트륨
15 컬럼 부피를 초과하는 450 내지 1000 mM의 염화나트륨.
SDS-PAGE를 이용하여 이합체만을 함유하는 분획을 확인한 후, 풀링시키고, 1/5 부피의 1M 트리스 pH 8.0을 첨가하여 pH를 8로 증가시켰다.
시험관내 기능성 결합 검정: TNF 수용체 검정 및 세포 검정
인간 TNFα에 대한 이합체의 친화성을 TNF 수용체 및 세포 검정을 이용하여 결정하였다. 수용체 검정에서의 IC50은 약 0.3-0.8 nM이었고; 세포 검정에서의 ND50은 약 3-8 nM이었다.
다른 가능한 TAR1-5-19CYS 이합체 포맷
PEG 이합체 및 통상적 합성 말레이미드 이합체
넥타르(Nektar)(Shearwater)는 단량체가 dAb를 분리시키고, 둘 모두가 5 내지 40 Kda 크기의 PEG에 연결되는 작은 링커를 갖는 이합체로 포맷화되도록 하는 다양한 비-말레이미드 PEG[mPEG2-(MAL)2 또는 mPEG-(MAL)2]를 제공한다. 5Kda mPEG-(MAL)2(즉, [TAR1-5-19]-Cys-말레이미드-PEG x 2, 여기서 말레이미드는 이합체에서 함께 연결됨)가 TNF 수용체 검정에서 ~ 1-3 nM의 친화성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 또한, 이합체는 TMEA(트리스[2-말레이미도에틸]아민)(Pierce Biotechnology) 또는 다른 이기능성 링커를 이용하여 생성될 수도 있다.
2,2'-디티오디피리딘(Sigma Aldrich) 및 환원된 단량체를 이용하는 화학적 커플링 방법을 이용하여 또한 이황화물 이합체를 생성시킬 수 있다.
dAb의 C-말단으로의 폴리펩티드 링커 또는 힌지의 첨가.
작은 링커인 (Gly4Ser)n(여기서, n은 1 내지 10, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7임), 면역글로불린(예를 들어, IgG 힌지 영역) 또는 무작위 펩티드 서열(예를 들어, 무작위 펩티드 서열의 라이브러리로부터 선택됨)이 dAb와 말단 시스테인 잔기 사이에서 공학처리될 수 있다. 이후, 이는 상기 기재된 이합체를 제조하는데 사용될 수 있다.
실시예 8 - dAb 삼합체화
요약
dAb 삼합체화를 위해, 단백질의 C-말단에 자유 시스테인이 필요하다. 자유 티올을 생성시키기 위해 환원된 시스테인 잔기는 이후 단백질을 삼합체 말레이미드 분자, 예를 들어, TMEA(트리스[2-말레이미도에틸]아민)에 특이적으로 커플링시키기 위해 사용될 수 있다.
TAR1-5-19CYS의 PCR 작제
클로닝을 위해 SalⅠ 및 BamΗⅠ 부위를 이용하여 TAR1-5-19를 특이적으로 PCR시키고, 또한 C-말단 시스테인 잔기를 도입시키기 위해 하기 올리고누클레오티드를 사용하였다:
Figure 112009055188415-PCT00002
Figure 112009055188415-PCT00003
(* TAR1-5-19CYS 서열의 시작부)
정방향 프라이머
Figure 112009055188415-PCT00004
역방향 프라이머
Figure 112009055188415-PCT00005
PCR 반응(50μL 부피)을 다음과 같이 설정하였다: 200μM dNTPs, 0.4μM의 각각의 프라이머, 5 μL의 10x PfuTurbo 완충용액(Stratagene), 100 ng의 주형 플라스미드(TAR1-5-19를 엔코딩함), 1μL의 PfuTurbo 효소(Stratagene), 및 멸균수를 이용하여 50μL로 조정된 부피. 하기 PCR 조건을 사용하였다: 2분 동안 94℃의 최초 변성 단계, 이후 30초 동안 94℃, 30초 동안 64℃ 및 30초 동안 72℃의 25 주기. 5분 동안 72℃의 최종 신장 단계를 또한 포함시켰다. PCR 생성물을 정제시키고, SalⅠ 및 BamΗⅠ로 분해시키고, 동일한 제한 효소로 절단된 벡터로 라이게이션시켰다. DNA 서열분석에 의해 정확한 클론을 확인하였다.
TAR1-5-19CYS의 발현 및 정제
제조업체의 프로토콜에 따라 TAR1-5-19CYS 벡터를 BL21 (DE3) pLysS 화학 적격 세포(Novagen)에 형질전환시켰다. dAb 플라스미드를 지니는 세포를 100 μg/mL의 카르베니실린 및 37 μg/mL의 클로람페니콜을 이용하여 선택하였다. 500 mL의 테리픽 브로쓰(terrific broth)(Sigma-Aldrich), 100 μg/mL의 카르베니실린 및 37 μg/mL의 클로람페니콜을 함유하는 2L 배플드 플라스크(baffled flask)로 배양을 설정하였다. 배양물을 200 rpm에서 30℃에서 1-1.5의 O.D.600으로 성장시킨 후, 1 mM IPTG(이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노시드, Melford Laboratories사에서 구입)를 이용하여 유도시켰다. dAb의 발현을 30℃에서 12-16시간 동안 지속시켰다. 대부분의 dAb가 배양 배지에 존재하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 세포를 원심분리(30분 동안 8,000xg)에 의해 배지로부터 분리시키고, dAb를 정제하기 위해 상층액을 이용하였다. 상층액 리터 당, 30 mL의 단백질 L 아가로오스(Affitech)를 첨가하고, 2시간 동안 교반과 함께 dAb가 배치(batch) 결합되도록 하였다. 이후, 수지를 추가 1시간 동안 중력하에서 가라앉도록 하고, 상층액을 흡수시켰다. 이후, 아가로오스를 XK 50 컬럼(Amersham Pharmacia)으로 패킹시키고, 10 컬럼 부피의 PBS로 세척하였다. 결합된 dAb를 100 mM 글리신 pH 2.0으로 용리시킨 후, 단백질 함유 분획을 1/5 부피의 1M 트리스 pH 8.0의 첨가에 의해 중화시켰다. 배양 상층액 리터 당, 20 mg의 순수한 단백질이 분리되었고, 이는 50:50의 비의 단량체 대 이합체를 함유하였다.
TAR1-5-19CYS의 삼합체화
2.5 ml의 100 μM TAR1-5-19CYS를 5 mM 디티오트레이톨을 이용하여 환원시키고, 20분 동안 실온에 두었다. 이후, 샘플을 PD-10 컬럼(Amersham Pharmacia)을 이용하여 완충용액 교환하였다. 컬럼을 5 mM EDTA, 50 mM 인산나트륨 pH 6.5을 이용하여 미리 평형화시키고, 샘플을 적용시키고, 제조업체의 지침에 따라 용리시켰다. 샘플을 필요시까지 얼음 상에 두었다. TMEA(트리스[2-말레이미도에틸]아민)을 피어스 바이오테크놀로지(Pierce Biotechnology)사에서 구입하였다. TMEA의 20 mM 스톡 용액을 100% DMSO(디메틸 설폭시드) 중에서 제조하였다. 3:1(dAb:TMEA의 몰비)을 초과하는 TMEA의 농도가 단백질의 신속한 침전 및 가교를 야기시키는 것으로 밝혀졌다. 또한, 침전 속도 및 가교는 pH가 증가함에 따라 커졌다. 따라서, 100 μM 환원 TAR1-5-19CYS를 이용하여, 25 μM TMEA를 단백질을 삼합체화시키기 위해 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 반응을 진행시켰다. 글리세롤 또는 에틸렌 글리콜과 같은 첨가제의 20%(v/v)로의 첨가는 커플링 반응이 진행됨에 따라 삼합체의 침전을 현저하게 감소시켰다. 커플링 후, SDS-PAGE 분석은 용액 중의 단량체, 이합체 및 삼합체의 존재를 나타내었다.
삼합체 TAR1-5-19CYS의 정제
TMEA-TAR1-5-19cys 반응액의 mL 당 40 μL의 40% 빙초산을 첨가하여 pH를 ~4로 감소시켰다. 이후, 샘플을 50 mM 아세트산 나트륨 pH 4.0으로 미리 평형화된 1 mL 리소스(Resource) S 양이온 교환 컬럼(Amersham Pharmacia)에 적용시켰다. 이합체 및 삼합체를 30 컬럼 부피를 초과하는 340 내지 450 mM의 염화나트륨, 50 mM의 아세트산 나트륨 pH 4.0의 염 구배를 이용하여 부분적으로 분리시켰다. SDS-PAGE를 이용하여 삼합체만을 함유하는 분획을 확인하고, 풀링시키고, 1/5 부피의 1M 트리스 pH 8.0를 첨가하여 pH를 8로 증가시켰다. 농축 단계(5K cut off Viva spin concentrators를 이용함; Vivascience) 동안 삼합체의 침전을 방지하기 위해, 10% 글리세롤을 샘플에 첨가하였다.
시험관내 기능성 결합 검정: TNF 수용체 검정 및 세포 검정
인간 TNFα에 대한 삼합체의 친화성을 TNF 수용체 및 세포 검정을 이용하여 결정하였다. 수용체 검정에서의 IC50은 약 0.3 nM이었고; 세포 검정에서의 ND50은 약 3-10 nM(예를 들어, 3nM)이었다.
다른 가능한 TAR1-5-19CYS 삼합체 포맷
TAR1-5-19CYS는 또한 하기 시약을 이용하여 삼합체로 포맷화될 수 있다:
PEG 삼합체 및 통상적 합성 말레이미드 삼합체
넥타르(Nektar)(Shearwater)는 PEG의 말단에서 화학적으로 변형될 수 있는 다양한 다중 암(arm) PEG를 제공한다. 따라서, 각각의 암의 말단에서의 말레이미드 작용기와 함께 PEG 삼합체를 이용하는 것은 TMEA를 이용하는 상기 기술된 것과 유사한 방식으로 dAb의 삼합체화를 가능케 한다. PEG는 또한 삼합체의 가용성을 증가시키는데 이점을 가짐으로써, 응집의 문제를 방지한다. 따라서, 각각의 dAb가 말레이미드 작용기에 연결된 C-말단 시스테인을 갖고, 상기 말레이미드 작용기가 PEG 삼합체에 연결된 dAb 삼합체를 생성시킬 수 있다.
dAb의 C-말단으로의 폴리펩티드 링커 또는 힌지의 첨가
작은 링커인 (Gly4Ser)n(여기서, n은 1 내지 10, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7임), 면역글로불린(예를 들어, IgG 힌지 영역) 또는 무작위 펩티드 서열(예를 들어, 무작위 펩티드 서열의 라이브러리로부터 선택됨)이 dAb와 말단 시스테인 잔기 사이에서 공학처리될 수 있다. 중합체(예를 들어, 이합체 또는 삼합체)를 제조하기 위해 사용되는 경우, 이는 다시 개별적인 단량체 사이에 보다 큰 정도의 가요성 및 거리를 도입시키고, 이는 표적, 예를 들어, 다중서브유닛 표적, 예를 들어, 인간 TNFα에 대한 결합 특성을 개선시킬 수 있다.
실시예 9.
인간 혈청 알부민(HSA) 및 마우스 혈청 알부민(MSA)에 특이적인 단일 도메인 항체(dAbs) 수집물의 선택.
본 실시예는 혈청 알부민에 특이적인 단일 도메인 항체(dAb)를 제조하는 방법을 설명한다. 마우스 혈청 알부민(MSA) 및 인간 혈청 알부민(HSA)에 대한 dAb의 선택이 기술된다. 3개의 인간 파아지 디스플레이 항체 라이브러리를 본 실험에 사용하였고, 각각은 VH(도 13 참조: V3-23/DP47 및 JH4b에 기초한 더미(dummy) VH의 서열) 또는 Vκ(도 15 참조: o12/o2/DPK9 및 Jk1에 기초한 더미 Vκ의 서열)에 대한 단일 인간 프레임워크를 기초로 하며, 이는 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3)에 통합된 NNK 코돈에 의해 엔코딩되는 측쇄 다양성을 갖는다.
라이브러리 1(VH):
위치 H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97, H98에서의 다양성.
라이브러리 크기: 6.2 x 109
라이브러리 2(VH):
위치 H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97, H98, H99, H100, H100a, H100b에서의 다양성.
라이브러리 크기 : 4.3 x 109
라이브러리 3(Vκ):
위치 L30, L31, L32, L34, L50, L53, L91, L92, L93, L94, L96에서의 다양성.
라이브러리 크기 : 2 x 109
제네릭 리간드 단백질 A 및 단백질 L로의 결합에 대해 VH 및 Vκ 라이브러리를 각각 예비선택하여, 선택되지 않은 라이브러리의 클론 대부분이 기능성이 되도록 하였다. 상기 나타낸 라이브러리의 크기는 예비선택 후의 크기에 해당한다.
각각의 라이브러리를 개별적으로 이용하여 혈청 알부민에 대해 2 라운드의 선택을 수행하였다. 각각의 선택을 위해, 100μg/ml의 농도의 4ml의 PBS 중의 항원을 면역튜브(nunc)에 코팅시켰다. 첫번째 라운드의 선택에서, 3개의 라이브러리 각각을 HSA(Sigma) 및 MSA(Sigma)에 대해 개별적으로 패닝(panning)시켰다. 두번째 라운드의 선택에서, 6개의 첫번째 라운드의 선택의 각각으로부터의 파지를 (ⅰ) 동일한 항원(예를 들어, 첫번재 라운드 MSA, 두번째 라운드 MSA)으로 다시 및 (ⅱ) 상호 항원(reciprocal antigen)(예를 들어, 첫번째 라운드 MSA, 두번째 라운드 HSA)에 대해 패닝시켜, 전체 12개의 두번째 라운드 선택을 발생시켰다. 각각의 경우에서, 두번째 라운드의 선택 후, 48개의 클론을 HSA 및 MSA로의 결합에 대해 시험하였다. 가용성 dAb 단편을 문헌[Harrison et al, Methods Enzymol. 1996;267:83-109]에서 scFv 단편에 대해 기술된 바와 같이 생성시키고, 블로킹 완충용액으로서 2% tween PBS를 사용하고, 결합된 dAb를 단백질 L-HRP(Sigma)(Vκ에 대해) 및 단백질 A-HRP(Amersham Pharmacia Biotech)(VH에 대해)로 검출한 것을 제외하고는 표준 ELISA 프로토콜(Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133)을 따랐다.
MSA, HSA 또는 둘 모두로의 결합을 나타내는 백그라운드를 초과하는 신호를 발생시킨 dAb를 플라스틱 단독으로의 결합에 대해 ELISA 불용성 형태로 시험하였으나, 모두 혈청 알부민에 특이적이었다. 이후, 클론을 서열분석하였고(표 5 참조), 21개의 독특한 dAb 서열을 확인하였다. 선택된 Vκ dAb 클론 사이의 최소 유사성(아미노산 수준)은 86.25%((69/80)x100; 모든 다양화된 잔기가 상이한 경우의 결과, 예를 들어, 24 및 34)이었다. 선택된 VH dAb 클론 사이의 최소 유사성은 94%((127/136)x100)였다.
다음으로, 혈청 알부민 결합 dAb를 용액으로부터 비오티닐화된 항원을 포획하는 능력에 대해 시험하였다. ELISA 플레이트를 1μg/ml 단백질 L(Vκ 클론에 대해) 및 1μg/ml 단백질 A(VH 클론에 대해)로 코팅한 것을 제외하고는 ELISA 프로토콜(상기와 같음)에 따랐다. 가용성 dAb를 프로토콜에서와 같이 용액으로부터 포획하고, 비오티닐화된 MSA 또는 HSA 및 스트렙타비딘 HRP을 이용하여 검출하였다. 혈청 알부민 분자 당 평균 2개의 비오틴을 달성하기 위해 비오티닐화된 MSA 및 HSA를 제조업체의 설명서에 따라 제조하였다. 24개의 클론을, ELISA에서 용액으로부터의 포획된 비오티닐화된 MSA를 확인하였다, 도 5 참조. 이중 2개(하기 클론 2 및 38)이 또한 비오티닐화된 HSA를 포획하였다. 다음으로, dAb를 CM5 비아코어 칩 상에 코팅된 MSA에 결합하는 능력에 대해 시험하였다. 8개의 클론이 비아코어 상의 BSA에 결합한 것이 밝혀졌다.
표 5
Figure 112009055188415-PCT00006
Figure 112009055188415-PCT00007
Figure 112009055188415-PCT00008
모든 경우에서, 프레임워크는 상응하는 더미 서열의 프레임워크와 동일하였고, CDR 내의 다양성은 표 5에 표시되어 있다.
비아코어 상의 MSA에 결합한 8개의 클론 중, 대장균(E. coli)에서 고도로 발현되는 2개의 클론(클론 MSA16 및 MSA26)을 추가 연구를 위해 선택하였다(실시예 10 참조). MSA16 및 26에 대한 전장 누클레오티드 및 아미노산 서열이 도 16에 제공되어 있다.
실시예 10.
MSA 결합 dAbs MSA16 및 MSA26의 마우스에서의 친화성 및 혈청 반감기의 결정.
US20060251644호에 기재된 바와 같이, 결합 친화성을 결정하기 위한 한 통상적인 방법은 비아코어™ 표면 플라즈몬 공명 시스템(Biacore, Inc.)을 이용하여 결합 및 해리 속도 상수를 평가하는 것이다. 바이오센서 칩이 제조업체(Biacore)의 설명서에 따라 표적의 공유 커플링에 대해 활성화된다. 이후, 표적이 희석되고, 칩 상에 주입되어, 고정된 물질의 반응 단위(RU)의 신호가 수득된다. RU의 신호는 고정된 물질의 질량과 비례하므로, 이는 매트릭스 상의 다양한 고정된 표적 밀도를 나타낸다. 해리 데이터가 단일-위치(one-site) 모델에 적합화되어, koff +/- s.d.(측정값의 표준 편차)가 수득된다. 각각의 해리 곡선에 대해 유사 일차 속도 상수(Kd's)가 계산되고, 단백질 농도의 함수로서 작도되어, Kon +/- s.e.(적합도의 표준 오차)가 수득된다. 결합에 대한 평형 해리 상수 Kd's가 koff/kon로서 SPR 측정치로부터 계산된다.
dAbs MSA16 및 MSA26을 대장균의 원형질막 주위공간에서 발현시키고, 단백질 L-아가로오스 친화성 수지(Affitech, Norway)로의 배치 흡수 후에 pH 2.2에서 글리신을 이용한 용리를 이용하여 정제시켰다. 이후, Kd를 결정하기 위한 억제 비아코어에 의해 정제된 dAb를 분석하였다. 간단히, 고밀도의 MSA로 코팅된 비아코어 CM5 칩 상에서 200RU의 반응을 달성하는데 필요한 dAb의 농도를 결정하기 위해 정제된 MSA16 및 MSA26을 시험하였다. 필요한 dAb 농도가 결정된 후, 예상 Kd 부근의 다양한 농도의 MSA 항원을 dAb와 예비 혼합시키고, 밤새 인큐베이션하였다. 이후, 예비혼합물 각각에서의 dAb의 MSA 코팅된 비아코어 칩으로의 결합을 30 μl/분의 높은 유속에서 측정하였다. 표면 플라즈몬 공명(SPR) 및 비아코어(Karlsson et al., 1991)를 이용하여 친화성을 결정하였다. 비아코어 시스템(Uppsala, Sweden)이 결합 친화성을 결정하기 위한 바람직한 방법이다. 비아코어 시스템은 생체분자 상호작용을 실시간으로 모니터하기 위해 표면 플라즈몬 공명(SPR, Welford K. 1991, Opt. Quant. Elect. 23:1; Morton and Myszka, 1998, Methods in Enzymology 295: 268)을 이용한다. 비아코어 검정은 편리하게는 결합 속도 상수, 해리 속도 상수, 평형 해리 상수, 및 친화성 상수를 발생시킨다. 생성된 곡선을 클로츠(Klotz) 플롯(Klotz, I.M. (1982) Science 217:1247-1249 and Klotz, I.M. (1983) J. Trends in Pharmacol. Sci. 4:253-255)을 생성시키기 위해 사용하였고, 이는 MSA16에 대해 200nM 및 MSA26에 대해 70nM의 추정 Kd를 발생시켰다(도 17 A & B).
다음으로, 클론 MSA16 및 MSA26을 HA 태그(핵산 서열: TATCCTTATGATGTTCCTGATTATGCA 및 아미노산 서열: YPYDVPDYA)를 갖는 발현 벡터에 클로닝시키고, 2-10 mg의 양을 대장균에서 발현시키고, 단백질 L-아가로오스 친화성 수지(Affitech, Norway)를 이용하여 상층액으로부터 정제시키고, pH2.2에서 글리신으로 용리시켰다. dAb의 혈청 반감기를 마우스에서 결정하였다. MSA26 및 MSA16을 약 1.5 mg/kg을 CD1 마우스에 단일 정맥내 주사로 투여하였다. 염소 항-HA(Abcam, UK) 포획 및 4% 마벨(Marvel)로 블로킹된 단백질 L-HRP(invitrogen) 검출 ELISA에 의해 혈청 수준을 분석하였다. 0.05% tween PBS로 세척하였다. 공지된 농도의 dAb의 표준 곡선을 시험 샘플과의 양립성이 보장되는 1x마우스 혈청의 존재하에서 작성하였다. 2 구획 모델을 이용한 모델링은 MSA-26이 0.16시간의 t1/2α, 14.5시간의 t1/2β 및 465시간.mg/ml의 곡선하 영역(AUC)을 갖고(데이터는 나타내지 않음), MSA-16이 0.98시간의 t1/2α, 36.5시간의 t1/2β 및 913시간.mg/ml의 AUC를 갖는(도 18) 것을 나타내었다. 둘 모두의 항-MSA 클론은 0.06시간의 t1/2α 및 0.34시간의 t1/2β를 갖는 HEL4(항-계란 흰자위 라이소자임 dAb)에 비해 현저하게 연장된 반감기를 가졌다.
실시예 11. VH-VH 및 Vκ-Vκ 이중 특이적 Fab 유사 단편의 생성
본 실시예는 VH-VH 및 Vκ-Vκ 이중 특이적 Fab 유사 단편을 제조하는 방법을 기술한다. 기재된 Fab 유사 단편의 각각을 작제하기 전, 선택 표적에 결합하는 dAb를 먼저 실시예 9에 기재된 것과 유사한 dAb 라이브러리로부터 선택하였다. 계란 라이소자임(Sigma)에 결합하는 VH dAb인 HEL4를 분리하고, TNFα 수용체에 결합하는 제 2의 VH dAb(TAR2h-5)(R and D systems)를 또한 분리하였다. 이러한 서열은 서열 목록에 제공되어 있다. TNFα에 결합하는 Vκ dAb(TAR1-5-19)를 선택 및 친화성 성숙에 의해 분리시켰고, 상기 서열은 또한 서열 목록에 나열되어 있다. 서열이 도 17B에 도시된 실시예 9에 기재된 제 2의 Vκ dAb(MSA 26)를 또한 본 실험에 사용하였다.
상기 기재된 4개의 dAb를 함유하는 발현 벡터로부터의 DNA를 효소 SalＩ 및 NotＩ으로 절단하여, dAb를 코딩하는 DNA를 절제하였다. 예상 크기(300-400bp)의 밴드를 절제물을 아가로오스 겔에서 영동시키고, 밴드를 절제한 후, 키아젠(Qiagen)사의 겔 정제 키트(Qiagen, UK)를 이용하는 겔 정제에 의해 정제하였다. 이후, dAb를 코딩하는 DNA를 표 6에 나타낸 바와 같이 CH 또는 Cκ 벡터(도 8 및 9)에 삽입하였다.
표 6
dAb 표적 항원 dAb VH 또는 dAb Vκ 벡터로의 삽입 태그(C 말단) 항생제 내성
HEL4 계란 라이소자임 VH CH myc 클로람페니콜
TAR2-5 TNF 수용체 VH Cκ flag 앰피실린
TAR1-5-19 TNFα Vκ CH myc 클로람페니콜
MSA26 마우스 혈청 알부민 Vκ Cκ flag 앰피실린
VH CH 및 VH Cκ 작제물을 HB2151 세포로 공동형질전환시켰다. 별개로, Vκ CH 및 Vκ Cκ 작제물을 HB2151 세포에 공동형질전환시켰다. 공동형질전환된 세포주 각각의 배양물을 밤새 성장시켰다(5% 글루코오스, CH 및 Cκ 플라스미드 둘 모두에 대한 항생제 선택을 유지하기 위한 10 μg/ml 클로람페니콜 및 100 μg/ml 앰피실린을 함유하는 2xTy 중). 새로운 배지(2xTy, 10μg/ml 클로람페니콜 및 100μg/ml 앰피실린)에 접종시키기 위해 밤새의 배양물을 이용하였고, OD 0.7-0.9로 성장시키고, IPTG를 첨가하여 유도시켜, CH 및 Cκ 작제물을 발현시켰다. 발현된 Fab 유사 단편을 이후 단백질 A 정제(공동형질전환된 VH CH 및 VH Cκ에 대해) 및 MSA 친화성 수지 정제(공동형질전환된 Vκ CH 및 Vκ Cκ에 대해)에 의해 원형질막 주위공간으로부터 정제시켰다.
VH-VH 이중 특이적 Fab 유사 단편
VH CH 및 VH Cκ 이중 특이적 Fab 유사 단편의 발현을 단백질을 겔에서 영동시켜 시험하였다. 겔을 블로팅(blotting)시키고, Fab 단편에 대한 예상 크기의 밴드를 myc 태그 및 flag 태그 둘 모두를 통해 웨스턴 블롯 상에서 검출할 수 있었고, 이는 Fab 유사 단편의 VH CH 및 VH Cκ 부분 둘 모두가 존재하는 것을 나타낸다. 다음으로, 이중 특이적 Fab 유사 단편의 2개의 절반이 동일한 Fab-유사 단편에 존재하는지 결정하기 위해, 웰당 100 μl의 중탄산나트륨 완충용액 중의 3 mg/ml의 계란 라이소자임(HEL)으로 4℃에서 밤새 ELISA 플레이트를 코팅하였다. 이후, 플레이트를 2% tween PBS로 블로킹(실시예 1에 기재된 바와 같음)시킨 후, VH CH/VH Cκ 이중 특이적 Fab 유사 단편과 함께 인큐베이션시켰다. HEL로의 이중 특이적 Fab 유사 단편 결합을 9e10(myc 태그에 결합하는 모노클로날 항체, Roche) 및 항 마우스 IgG-HRP(Amersham Pharmacia Biotech)를 이용하는 비-동족(non cognate) 사슬을 통해 검출하였다. VH CH /VH Cκ 이중 특이적 Fab 유사 단편에 대한 신호는 단독으로 발현된 VH Cκ 사슬에 대한 0.069의 백그라운드 신호에 비해 0.154였다. 이는 Fab 유사 단편이 표적 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 것을 입증한다.
Vκ-Vκ 이중 특이적 Fab 유사 단편
MSA 친화성 수지에서의 공동형질전환된 Vκ CH 및 Vκ Cκ 이중 특이적 Fab 유사 단편의 정제 후, 생성된 단백질을 1μg/ml TNFα로 코팅된 ELISA 플레이트 및 10μg/ml MSA로 코팅된 ELISA 플레이트를 프로빙시키기 위해 사용하였다. 예측되는 바와 같이, 둘 모두의 ELISA 플레이트에서 단백질 L-HRP를 이용하여 검출하는 경우 백그라운드를 초과하는 신호가 있었다(데이터는 나타내지 않음). 이는 MSA에 결합할 수 있는 단백질의 분획(이에 따라, MSA 친화성 컬럼에서 정제됨)이 또한 이후의 ELISA에서 TNFα에도 결합할 수 있음을 나타내고, 이는 항체 단편의 이중 트이성을 입증한다. 이후, 이러한 단백질 분획을 2개의 이후의 실험에 사용하였다. 먼저, 1 μg/ml TNFα로 코팅된 ELISA 플레이트를 ELISA 상에서 유사한 신호를 발생시키도록 계산된 농도의 이중 특이적 Vκ CH 및 Vκ Cκ Fab 유사 단편, 및 또한 대조군 TNFα 결합 dAb로 프로빙시켰다. 이중 특이적 및 대조군 dAb 둘 모두를 2mg/ml MSA의 존재 및 부재하에서 ELISA 플레이트를 프로빙시키는데 사용하였다. 이중 특이적 Fab 유사 단편 웰에서의 신호는 50% 이상 감소하였으나, dAb 웰에서의 신호는 젼혀 감소하지 않았다(도 19a 참조). 동일한 단백질을 또한 MSA를 이용하거나 이용하지 않는 수용체 검정에 적용시켰고, MSA에 의한 경쟁이 또한 밝혀졌다(도 19c 참조). 이는 이중 특이적 Fab 유사 단편으로의 MSA의 결합이 TNFα로의 결합과 경쟁적임을 입증한다.
실시예 12. 마우스 혈청 알부민 및 TNFα에 대한 특이성을 갖는 Vκ- Vκ 이중 특이적인 cys 결합된 이중 특이적 Fab 유사 단편의 생성
본 실시예는 이황화 결합을 통한 화학적 커플링에 의해 마우스 혈청 알부민 및 TNFα 둘 모두에 대해 특이적인 이중 특이적 항체 단편을 제조하기 위한 방법을 기술한다. MSA16(실시예 1로부터 유래) 및 TAR1-5-19 dAb 둘 모두를 C 말단 시스테인을 갖고 태그를 갖지 않는 pET 기재 벡터로 재클로닝시켰다. 2개의 dAb를 4-10 mg의 수준으로 발현시키고, 단백질 L-아가로오스 친화성 수지(Affitiech, Norway)를 이용하여 상층액으로부터 정제시켰다. 이후, 시스테인 태깅(tagging)된 dAb를 디티오트레이톨로 환원시켰다. 이후, TAR1-5-19 dAb를 디티오피리딘과 커플링시켜 이황화 결합의 재형성을 차단하여, PEP 1-5-19 동종이합체를 형성시켰다. 이후, 2개의 상이한 dAb를 pH 6.5에서 혼합시켜 이황화 결합 형성 및 TAR1-5-19, MSA16 cys 결합된 이종이합체의 생성을 촉진시켰다. 이러한 2개의 유사하지 않은 단백질의 컨쥬게이트를 생성하는 방법은 본래 문헌[King et al. (King TP, Li Y Kochoumian L Biochemistry. 1978 voll7:1499-506 Preparation of protein conjugates via intermolecular disulfide bond formation.)]에 기재되어 있다. 양이온 교환에 의해 단량체 종으로부터 이종이합체를 분리시켰다. SDS 겔에서의 예상 크기의 밴드의 존재에 의해 분리를 확인하였다. 생성된 이종이합체 종을 TNF 수용체 검정에서 시험하였고, 약 18 nM의 TNF를 중화시키기 위한 IC50을 갖는 것으로 밝혀졌다. 다음으로, 일정한 농도의 이종이합체(18nM), 및 MSA 및 HSA의 연속 희석액을 이용하여 수용체 검정을 반복하였다. 다양한 농도(2 mg/ml 이하)의 HSA의 존재는 TNFα를 억제하는 이합체의 능력을 감소시키지 않았다. 그러나, MSA의 첨가는 TNFα를 억제하는 이합체의 능력의 용량 의존성 감소를 야기시켰다(도 20). 이는 MSA 및 TNFα가 cys 결합된 TAR1-5-19, MSA16 이합체로의 결합에 대해 경쟁하는 것을 입증한다.
데이터 요약
상기 실시예에서 기술된 실험에서 수득된 데이터의 요약이 부록 4에 나열되어 있다.
실시예 13
다양한 종으로부터의 혈청 알부민으로의 결합을 위한 dAb의 선택 및 특성규명.
인간 혈청 알부민, 마우스 혈청 알부민 및 돼지 혈청 알부민에 대한 dAb를 프로토콜에 대한 하기 변형을 제외하고는 항-MSA dAb에 대해 상기 기술된 바와 같이 선택하였다: 합성 VH 도메인의 파아지 라이브러리는 VH에 대해 DP47 생식선(germ line) 유전자 및 JH4 세그먼트를 포함하는 인간 VH3, 및 Vκ에 대해 DPK9 생식선 유전자 및 Jκ1 세그먼트를 포함하는 인간 Vκ1에 기초한 라이브러리 4G 및 6G였다. 상기 라이브러리는 1x1010개의 개별적 클론을 포함한다. VH 및 Vκ 라이브러리의 서브셋이 제네릭 리간드 단백질 A 및 단백질 L 각각으로의 결합에 대해 예비선택됨으로써, 선택되지 않은 라이브러리의 클론 대부분이 기능성이 되었다. 상기 나타낸 라이브러리의 크기는 예비선택 후의 크기에 해당한다.
2 또는 3개 라운드의 선택을 VH 및 Vκ 라이브러리의 서브셋을 이용하여 마우스, 돼지 및 인간 혈청 알부민에 대해 개별적으로 수행하였다. 각각의 선택을 위해, 항원을 (ⅰ) 4ml의 PBS 중에서 100μg/ml의 농도로 면역튜브(nunc)에 코팅시키거나, (ⅱ) 비오티닐화시킨 후, 가용성 선택 후, 스트렙타비딘 비드 또는 뉴트라비딘(neutravidin) 비드에서 포획시켰다. 각각의 경우, 2 또는 3 라운드의 선택 후, 선택으로부터의 DNA를 가용성 dAb의 생성을 위해 발현 벡터에 클로닝시키고, 개별적 콜로니를 채집하였다. 가용성 dAb 단편을 문헌[Harrison et al (Methods Enzymol. 1996;267:83-109)]에서 scFv 단편에 대해 기술된 바와 같이 생성시키고, 각각의 선택을 위해, 96개의 가용성 클론을 다양한 혈청 알부민으로의 결합에 대해 시험하였다.
다양한 종으로부터의 혈청 알부민으로의 결합에 대한 클론의 스크리닝을 비아코어 표면 플라즈몬 공명 기계(Biacore AB)를 이용하여 수행하였다. CM-5 비아코어 칩을 유동 셀(flow cell) 2 내지 4 각각에서 고밀도의 다양한 종으로부터의 혈청 알부민으로 코팅시켰다. 하나 이상의 관심 혈청 알부민에 대한 결합을 나타낸 dAb를 서열분석하고, 50 ml 스케일로 나타내고, 단백질 L 상에서 정제시킨 후, 유동 셀 2-4에서 저밀도의 혈청 알부민으로 코팅된 CM-5 비아코어 칩 상의 혈청 알부민 패널로의 결합에 대해 공지된 농도에서 스크리닝하였다. 다양한 상이한 종으로부터의 혈청 알부민에 결합하는 여러 dAb가 발견되었고, 바람직한 후보자가 이의 결합 프로파일과 함께 표 7에 나열되어 있다.
표 7
HSA(측정시의 친화성) RSA(측정시의 친화성) MSA(측정시의 친화성) Cyno(측정시의 친화성
DOM7h-9 결합 200 nM 결합 결합 결합
DOM7h-10 결합 ND ND ND
DOM7h-11 결합 결합 결합 결합
DOM7h-12 결합 ND 결합 결합
DOM7h-13 결합 결합 결합
DOM7h-14 결합 38 nM 결합 결합 27 nM 결합 123 nM
따라서, 이 실험에서, 본 발명자들은 HSA 및 하나 이상의 다양한 비인간 종으로부터의 알부민에 결합하는 dAb를 분리시켰다. 예를 들어, 본 발명자들은 (ⅰ) 인간 및 마우스, (ⅱ) 인간 및 시노몰구스, (ⅲ) 인간 및 래트, 및 (ⅳ) 인간, 마우스, 래트 및 시노몰구스 알부민에 결합하는 dAb를 발견하였다.
실시예 14
혈청 알부민 결합 dAb/HA 에피토프 태그 또는 dAb/myc 에피토프 태그 융합 단백질의 래트 및 시노몰구스 원숭이에서의 혈청 반감기의 결정 및 혈청 반감기의 결정.
항-시노몰구스 혈청 알부민 dAb를 대장균의 원형질막 주위공간에서 C-말단 HA 또는 myc 태그와 함께 발현시키고, Vκ dAb를 위해 단백질 L-아가로오스 친화성 수지(Affitech, Norway)로의 배치(batch) 흡수 및 VH dAb를 위해 단백질 A 친화성 수지로의 배치 흡수 후, pH 2.0에서 글리신을 이용한 용리를 이용하여 정제시켰다. 혈청 반감기를 결정하기 위해, 3 마리의 시노몰구스 마카케의 그룹에 2.5 mg/Kg의 DOM7h-9, DOM7h-11 또는 DOM7h-14를 단일 정맥내 주사로 투여하였다. 21일의 기간에 걸쳐 대퇴 정맥 또는 동맥으로부터 연속 채혈에 의해 혈액 샘플을 수득하고, 각각의 샘플로부터 혈청을 제조하였다. 혈청 샘플을 ELISA 플레이트에 코팅된 염소 항-HA(Abcam, Cambridge UK) 또는 염소 항 myc(Abcam, Cambridge UK)를 이용하는 샌드위치 ELISA에 의해 분석한 후, 단백질 L-HRP로 검출하였다. 공지된 농도의 dAb의 표준 곡선을 시험 샘플과의 양립성을 보장하기 위해 실험 샘플과 동일한 농도의 시노몰구스 혈청의 존재하에서 작성하였다. 2 구획 모델을 이용하는 이중 지수 모델 적합화(칼레이도그래프(kaleidograph) 소프트웨어(Synergy software, PA, USA)를 이용함)를 t1/2β를 계산하기 위해 사용하였다, 표 8 참조.
항-래트 혈청 알부민 dAb를 대장균의 원형질막 주위공간에서 C-말단 HA 또는 myc 태그와 함께 발현시키고, 단백질 L-아가로오스 친화성 수지(Affitech, Norway)로의 배치 흡수 후, pH 2.0에서 글리신을 이용한 용리를 이용하여 정제하였다. 이후, dAb를 하기 방법을 이용하여 3H로 표지하였다: 단백질당 1개의 바이얼을 제조하였다: 300 μL의 NSP를 바이얼에 분배시키고, 30℃ 이하에서 약한 질소의 스트림 하에서 용매를 제거하였다. 이후, 수지를 DMSO(100 μL)에 재현탁시켰다. 단백질 용액의 분취량(2.5 mL)을 DMSO 용액에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 60분 동안 인큐베이션시켰다. 이후, 정확히 2.5 ml의 용액을 미리 평형화된 PD10 컬럼(25 mL 인산염 완충 염수, PBS로 미리 평형화됨)에 로딩시키고, 용출액을 폐기하였다. 인산염 완충 염수(PBS, 3.5 mL)를 첨가하고, 용출액을 수거하였다. 이는 약 2 mg/mL의 표지된 단백질 용액을 제공하였다. 물질의 특정 활성 및 효과적인 표지에 대한 조건부를 결정하고, 용액을 즉시 사용하거나 필요시까지 -20℃에서 저장하였다.
혈청 반감기를 결정하기 위해, 4마리의 래트의 그룹에 2.5mg/Kg의 DOM7h-9, D0M7h-11, DOM7h-13 또는 DOM7h-14를 단일 정맥내 주사로 투여하였다. 7일의 기간에 걸쳐 꼬리 정맥으로부터 혈액 샘플을 수득하고, 혈장을 제조하였다. 액체 섬광 계수에 의해 3H의 수준을 결정하고, 각각의 샘플에서의 표지된 단백질의 농도를 실험 시작에서 결정된 단백질의 공지된 특정 활성에 따라 계산하였다. 2 구획 모델을 이용한 이중 지수 모델링 적합화(칼레이도그래프(kaleidograph) 소프트웨어(Synergy software, PA, USA)를 이용함)를 t1/2β를 계산하기 위해 사용하였다, 표 8 참조.
표 8
작용제 스캐폴드 t1/2β(시노몰구스) t1/2β(래트)
DOM7h-9 Vκ 3.8일 66시간
DOM7h-11 Vκ 5.2일 61시간
DOM7h-13 Vκ 시험되지 않음 73시간
DOM7h-14 Vκ 6.8일 56시간
DOM7r-3 Vκ 53시간
DOM7r-16 Vκ 43시간
작용제 스캐폴드 t1/2β(시노몰구스) t1/2β(래트)
DOM7h-9 Vκ 3.8일 66시간
DOM7h-11 Vκ 5.2일 61시간
DOM7h-13 Vκ 시험되지 않음 73시간
DOM7h-14 Vκ 6.8일 56시간
DOM7r-3 Vκ 53시간
DOM7r-16 Vκ 43시간
래트 및 시노몰구스 원숭이에서의 알부민의 반감기는 각각 53시간(실험에 의해 결정됨) 및 7-8일(추정치)이다. 래트 접근법에서의 dAbs DOM7r-3, DOM7h-9, DOM7h-11, DOM7h-13 및 DOM7h-14의 반감기는 표 8로부터 관찰될 수 있거나, 이는 래트에서의 알부민의 반감기와 실질적으로 동일하다. 또한, 시노몰구스 접근법에서의 dAbs DOM7h-11 및 DOM7h-14의 반감기가 관찰될 수 있거나, 이는 시노몰구스에서의 알부민의 반감기와 실질적으로 동일하다. dAb DOM7h-14는 래트 및 시노몰구스 둘 모두의 종에서의 알부민의 반감기와 실질적으로 동일한 래트 및 시노몰구스 둘 모두에서의 반감기를 갖는다.
실시예 15. 에피토프 맵핑(Mapping)
인간 혈청 알부민의 3개의 도메인이 기존에 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 기재되었다(Dockal Carter and Ruker (1999) J. Biol. Chem. 2000 Feb 4;275(5):3042-50). 본 발명자들은 피키아 파스토리스 pPICZaA 벡터를 이용하여 동일한 도메인을 발현시켰고, 이는 미메틱 블루(Mimetic Blue) SA 매트릭스(supplier: Prometic Biosciences)에서의 동질성을 위해 이들을 정제시키는 것을 필요로 하였다(도 21). dAb에 의해 결합된 혈청 알부민 도메인의 확인을 두 방법중 하나인 도메인 항체의 면역침전 및 경쟁 비아코어에 의해 평가하였다. 결과는 하기 도 22 및 도 23에 제시되어 있다.
면역침전 검정을 위해, HSA 도메인 Ⅰ, Ⅱ 또는 Ⅲ를 발현하는 1ml의 피키아 파스토리스 상층액을 pH 7.4로 조정하고, 1μg dAb, 및 1Oμl의 단백질 A 또는 단백질 L 아가로오스(VH 또는 Vκ dAb 각각에 대해)와 혼합하였다. 혼합물을 1시간 동안 역위에 의해 혼합시켜, 복합체를 형성시킨 후, 10분 동안 13,000xg에서 원심분리하여 아가로오스 결합된 복합체를 회수하고, 상층액을 폐기하고, 펠렛화된 물질을 PBS로 1회 세척하고, 원심분리에 의해 회수하였다. 이후, 비드를 디티오트레이톨(DTT)를 함유하는 SDS-PAGE 로딩 완충용액에 재현탁시키고, 10분 동안 70℃로 가열한 후, 4-12% NuPAGE SDS-PAGE 겔(supplier: mvitrogen)에서 영동시키고, 심플리블루 세이프스테인(SimplyBlue safestain)으로 염색하였다.
경쟁 비아코어 검정을 위해, 정제된 dAb를 pH7.4의 HBS-EP 중에서 1 μM, 또는 50 mM 시트레이트 포스페이트 완충용액, 150 mM NaCl, pH5.0 중에서 1 μM로, 요망시 7 μM의 정제된 HSA 도메인과 함께 제조하였다. 비아코어 실험을 500-1000 RU의 인간 혈청 알부민으로 코팅된 CM5 칩 표면 상에서 30 μl/분의 유속으로 수행하고, 블랭크(blank) 참조 세포를 기준선 공제를 수행하기 위해 사용하였다.
표 9는 dAb가 맵핑하는 인간 혈청 알부민 및 인간 혈청 알부민의 도메인(들)에 특이적인 dAb의 목록을 제공한다(면역침전 및/또는 비아코어에 의해 결정됨):
표 9
클론 H/K 맵핑된 HSA 도메인
DOM7h-1 K 도메인 Ⅱ
DOM7h-2 K Nd
DOM7h-6 K Nd
DOM7h-7 K Nd
DOM7h-8 K 도메인 Ⅱ
DOM7h-9 K 도메인 Ⅱ
DOM7h-10 K Nd
DOM7h-11 K 도메인 Ⅱ
DOM7h-12 K 도메인 Ⅱ
DOM7h-13 K 도메인 Ⅱ
DOM7h-14 K 도메인 Ⅱ
DOM7h-21 H Nd
DOM7h-22 H 도메인 Ⅰ+ Ⅲ
DOM7h-23 H Nd
DOM7h-24 H Nd
DOM7h-25 H Nd
DOM7h-26 H Nd
DOM7h-27 H 도메인 Ⅲ
DOM7h-30 H 도메인 Ⅲ
DOM7h-31 H Nd
Nd: 결정되지 않음
결론적으로, 대부분의 dAb는 HSA의 두번째 도메인에 결합하고, 따라서 FcRn으로의 인간 혈청 알부민의 결합과 경쟁하는 것으로 예상되지 않는다. 2개의 dAb(DOM7h-27 및 DOM7h-30)은 도메인 Ⅲ에 결합한다.
dAb 결합된 HSA 도메인 1μM pH7.4에서의 RU HSA 결합 1μM pH5.0에서의 RU HSA 결합 CDR 내의 his
DOM7h-1 Ⅱ 600c 150 없음
DOM7h-3 NI 0 0
DOM7h-4 NI 0 0
DOM7h-8 Ⅱ 1000 250 없음
DOM7h-9 Ⅱ 150 0 CDR1
DOM7h-11 Ⅱ 250 0 CDR3
DOM7h-12 Ⅱa 55 0 없음
DOM7h-13 Ⅱ 300 40 CDR 중에 2개
DOM7h-14 Ⅱ 20 0 없음
DOM7h-22 Ⅰ + Ⅲb 100c 0 CDR2
DOM7h-27 Ⅲ 50 0 없음
DOM7h-30 Ⅲ 320 35 없음
HSA 결합 AlbudAb™(혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 dAb)의 에피토프 맵핑 결과 및 pH7.4 및 5.0에서의 비아코어 데이터의 요약.
실시예 16 - 대사물질의 존재하에서의 시험관내 dAb 선택
알부민 분자는 약 19일의 존재 기간 동안 혈청에서 다른 화합물에 대한 노출의 효과를 축적한다. 이러한 효과는 혼합된 이황화물로서 운반되는 시스테인 및 글루타티온, 비타민 B6, δ-비루루빈(bilurubin), 헤민, 티록신, 긴 사슬 및 중간 사슬의 지방산 및 ε-아미노기로 운반되는 글루코오스를 포함하나 바람직하게는 이에 제한되지는 않는, 알부민에 대한 친화성을 갖는 다수의 분자의 결합을 포함한다. 또한, 아세트알데히드(간에서의 에탄올 대사의 생성물), 지방산 대사물질, 아실 글루쿠로니드 및 빌리루빈의 대사물질과 같은 대사물질. 또한, 와파린(warfarin), 할로탄(halothane), 살리실레이트, 벤조디아제핀 및 기타 물질(참조: Fasano et al 2005, IUBMB Life) 및 1-O-젬피브로질(gemfibrozil)-β-D-글루쿠로니드와 같은 다수의 약제가 혈청 알부민에 결합한다.
혈청 알부민에 결합되는 것으로 밝혀진 화합물은 알부민 분자 상의 특정 부위에 결합함으로써, AlbudAbs™(혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 dAb)와 같은 다른 분자의 결합에 대해 상기 부위를 잠재적으로 차단하는 경향이 있다. 다수의 리간드에 대한 결합 부위가 확인되었고, 주요한 대부분의 널리 특성규명된 결합 부위가 "수드로우(Sudlow) 부위 1" 및 "수드로우 부위 2"로 언급된다. 이러한 명명법에 따르면, 부위 1이 서브-도메인 ⅡA에 위치하며, 와파린 및 일반적으로 부피가 큰 헤테로시클릭 음이온성 분자인 다른 약물에 결합한다. 부위 2는 서브-도메인 ⅢA에 위치하며, 한쪽 말단으로의 음전하를 갖는 연장된 형태를 갖는 방향족 카르복실산, 예를 들어, 상투적인 부위 2 리간드인 이부프로펜에 결합한다. 와파린 및 이부프로펜 둘 모두에 대한 제 2의 결합 부위는 도메인 Ⅱ 및 Ⅰ에서 각각 확인되었다. 다른 결합 부위 및 이의 하위-부위가 또한 존재하며, 이는 순환에서 혈청 알부민이 1 x 10-2M 내지 1x10-8M으로 다양한 친화성과 함께, 결합된 리간드의 복합한 혼합물과 함께 존재함을 의미한다. 예를 들어, 올레산은 SA 상에서 7개의 부위에 결합한다(J Mol Biol. 2001;314:955-60).
인간 혈청 알부민이 지방산과의 결정화된 혼합물로 존재한다(Petitpas I, Grune T, Bhattacharya AA, Curry S. Nat. Struct Biol. (1998) 5: 827-35). 상기 분자에 대한 결합 부위는 근처의 HSA 분자의 거의 3배의 좌우상칭에도 불구하고 비대칭적 분포로 SA 표면 근처의 소수성 클레프트(cleft)에 위치한다. 이후, 혈청 알부민의 다양한 재조합 단편의 사용이 결합 부위의 형성에 대한 도메인의 기여의 보다 정확한 지정을 돕는다(참조: Protein Sci (2000) 9:1455-65; J Biol Chem. (1999) 274:29303-10). SA로부터의 결합된 리간드의 대체는 약물 상호작용에서 중요한 역할을 하며, 예를 들어, SA가 에탄올로 대체됨에 따라 와파린의 반감기가 감소된다(J Biol Chem. (2000) 275:38731-8). SA에 대한 다른 약물 친화성은 다른 결합 부위에서의 다른 약물의 존재에 의해 변형된다. 예를 들어, 부위 2로의 디아제팜 결합은 결합에서의 형태 변화의 결과로서 테녹시캄에 대한 부위 1의 친화성을 증가시킨다. 이는 약동학 특성에 현저한 영향을 미친다(Fundam Clin Pharmacol. (1989) 3:267-79).
따라서, SA 결합 AlbudAb™(혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 dAb)에 대해, SA에 결합된 약물에 대한 혈청 알부민의 결합 특성을 변경시키지 않는 것을 선택하는 것이 바람직하다. 추가로, 약물 결합이 SA의 형태를 변경시키는 것으로 밝혀진 경우, 약물의 존재 또는 부재 둘 모두에서 SA에 결합하는 AlbudAb™(혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 dAb)를 갖는 것이 바람직하다. 이러한 접근법은 중요한 약제와의 현저한 양성 또는 음성 약물 상호작용이 존재하지 않도록 AlbudAb™(혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 dAb)를 확인하는 것이 가능함을 의미한다. 따라서, 이러한 실시예는 생체내에서 알부민에 결합되어 존재하는 것으로 보이는 화합물 및 대사물질의 존재하에서 혈청 알부민에 결합하는 dAb를 확인하기 위한 파아지 선택을 기술한다. 파아지 선택이 생체내에서 혈청 알부민과 상호작용하는 것으로 공지된 하나 또는 여러개의 대사물질 또는 화합물의 존재하에서 수행된다. 이러한 선택은 대사물질 또는 다른 화합물의 존재에 의해 방해되지 않는 방식으로 혈청 알부민에 결합하는 AlbudAb™(혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 dAb)를 확인한다.
실시예 1에 기재된 파아지 라이브러리가 인간, 시노몰구스 원숭이, 래트 및 마우스를 포함하는 하나 이상의 다양한 종으로부터의 알부민에 대한 선택을 위해 실시예 1에 기재된 바와 같이 사용된다. 항원으로 사용된 알부민은 알부민 자체 보다 10-100배 높은 농도의 대사물질 또는 화합물과 밤새 예비인큐베이션되는 점에서 실시예 1에 기재된 것과 상이하다. 이는 단일한 화합물 또는 대사물질, 또는 하나 이상의 화합물 또는 대사물질과 이루어질 수 있다. 특히, 이는 알부민 부위 Ⅰ 또는 부위 Ⅱ 또는 둘 모두를 점유하는 화합물의 존재하에서 이루어질 수 있다. 이러한 농도의 대사물질은 또한 항원으로 면역튜브를 코팅하기 위해 사용되는 완충용액 및 선택의 중요한 단계 동안 사용되는 완충용액에 존재한다. 대사물질이 존재하는 단계는 항원 코팅된 면역튜브 또는 비오티닐화된 항원(용액 선택을 위함)을 블로킹하는데 사용되는 MPBS 블로킹 완충용액, 및 파아지 라이브러리가 블로킹되는 완충용액을 포함한다. 이렇게 하여, 블로킹된 파아지가 면역튜브 또는 비오티닐화된 항원에 첨가되는 경우, 대사물질의 농도가 유지된다. 따라서, 알부민에 결합하는 파아지가 선택되는 선택 단계를 통해, 생체내에서 알부민 분자에 대한 특정 부위를 블로킹할 수 있는 대사물질이 또한 존재하며, 이는 대사물질에 의해 블로킹되는 부위와 상이한 알부민 상의 부위에 결합하는 dAb의 결합, 및 이의 선택 편향에 대해 파아지와 경쟁한다.
또 다른 세트의 선택에서, 결합된 화합물 또는 대사물질의 존재 및 부재하에서 혈청 알부민에 대한 대안적 라운드의 선택을 수행하였다. 이는 결합된 화합물의 존재 또는 부재하에서 혈청 알부민에 결합할 수 있는 dAb가 선택되는 것을 보장한다. 둘 모두의 선택 계획에서, 결합된 약물을 혈청 알부민으로 대체할 수 있는 dAb가 선택되는 것이 가능하며, 이는 SA 결합된 약물을 대체시키는 AlbudAb™(혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 dAb)의 능력을 측정함으로써 스크리닝된다. 이러한 분석법은 소분자 약물에 대해 잘 확립되어 있으며, 이는 본 목적에 용이하게 적합화된다. 당 분야에 널리 공지된 다양한 방법이 SA 결합된 약물을 대체시키는 AlbudAb™(혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 dAb)의 능력을 결정하는데 사용될 수 있다. 이는 고정된 리간드 또는 혈청 알부민에 대한 평형 투석, 크로마토그래피 방법으로부터 NMR 분석까지 다양하다. 하기 실시예는 가장 간단한 평형 투석 방법의 사용을 기술한다. 다른 보다 기술적으로 복잡한 방법은 본질적으로 동일한 정보를 발생시킬 것이다.
혈청 알부민의 용액을 생리학적 완충용액, 예를 들어, 20mM 인산나트륨 완충용액, 150mM NaCl, pH7.4 중에서 규정된 농도로 제조하였다. 약물을 유사한 완충용액에서 제조하였고, 이는 본래의 약리학적 특성을 보유하나, 예를 들어, 트리튬 또는 14C로 방사선 표지되도록 합성하였다. 혈청 알부민 결합 항체 단편을 유사한 완충용액에서 규정된 농도로 제조하였다.
혈청 알부민 용액을 일련의 튜브에 배치하고, 각각의 튜브 내의 혈청 알부민의 농도가 고정(예를 들어, 1% w/v, 약 150 μM)되면서, (혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 dAb)™ 농도가 일련의 튜브 상에서 0 내지 150μM이 되도록, 증가하는 양의 AlbudAb™(혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 dAb)을 첨가하였다. 이는 하나의 실험 세트를 포함한다.
각각의 세트에 대해 고정된 농도의 방사선 표지된 리간드를 함유하는 투석 튜브 또는 용기를 튜브에 첨가하였다. 사용되는 리간드, 이의 친화성 및 가용성에 따라 0.2 내지 10 mM의 농도 범위가 적절하다.
투석에 사용된 막의 컷오프(cut-off) 크기는 혈청 알부민 및 AlbudAb™(혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 dAb)이 확산되지 않으나, 방사선 표지된 리간드는 자유롭게 확산될 수 있도록 하여야 한다. 3.5Kda의 컷오프 크기가 본 목적에 충분하다.
혼합물을 고정된 기간, 예를 들어, 5시간 동안 고정된 온도, 예를 들어, 37℃에서 교반하여, 둘 모두의 구획 사이의 방사선 표지된 약물을 평형화시켰다. 이 시간 후, 혈청 알부민에 결합하여 약물 결합을 억제하는 AlbudAb™(혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 dAb)의 능력에 의해 영향을 받는 평형이 달성되어야 한다.
둘 모두의 구획은 샘플이며, 섬광 계수기를 이용하여 방사능을 계수하였다. 알부민 결합 리간드의 농도를 두 구획 사이의 수의 차이로 결정할 수 있었다. 화학양론적 결합 상수 K'은 식 K'= b/c(p-b)에 따라 결합된 리간드 b, 자유 리간드 c, 및 알부민 p의 평형 농도로부터 계산할 수 있다. 이는 1 분자의 혈청 알부민으로의 1 분자의 리간드의 결합을 추정한다.
이후, 결합 데이터는 식 r/c=nk-rk에 따라 스캐차드 플롯을 이용하여 측정될 수 있고, 여기서 r은 리간드가 결합되는 알부민의 분획(즉, b/p)이고, n은 알부민 분자 당 결합 부위의 수이고, k는 부위 결합 상수이다. n 및 k의 값은 r에 대한 r/c의 플롯으로부터 결정될 수 있다.
AlbudAb™(혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 dAb)의 결합이 방사선 표지된 리간드 결합을 블로킹하는 경우, 이는 리간드의 화학양론적 결합 상수, 및 리간드에 대한 결합 부위의 명백한 수 둘 모두에 영향을 미칠 것이다. AlbudAb™(혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 dAb)가 혈청 알부민의 표면 상의 하나의 규정된 부위에 결합함에 따라, 일부 리간드가 혈청 알부민 상의 하나 이상의 결합 부위를 갖고, 모든 결합 부위가 블로킹되지 않음이 예측될 수 있다. AlbudAb™(혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 dAb)가 혈청 알부민에 복합체화된 약물에 특이적으로 결합하여, 이를 대체시키는 상황에서, 약물은 낮은 치료 지표를 갖고, 혈청 결합되며, 이후 약물에 결합된 혈청 알부민을 대체시킬 수 없는 AlbudAb™(혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 dAb)과 약물에 결합된 혈청 알부민을 대체시킬 수 있는 AlbudAb™(혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 dAb) 사이를 구별하기 위한 컷오프 친화성은 10nM 내지 100nM의 범위가 될 것이다. 이러한 방법은 하기 논문에 예시되어 있다:[Livesey and Lund Biochem J. 204(1): 265-272 Binding of branched-chain 2-oxo acids to bovine serum albumin].
실시예 17: CDR 이식을 통한 혈청 알부민-결합 CTLA-4 비-면역글로불린 스캐폴드를 포함하는 이중 특이적 리간드의 생성
하기 방식으로 인간 혈청 알부민에 결합하는 세포독성 T-림프구 관련 항원 4(CTLA-4) 비-면역글로불린 스캐폴드 폴리펩티드를 작제하기 위해 dAb7h14의 CDR 도메인을 사용하였다. dAb7h14의 CDR1(RASQWIGSQLS; SEQ ID NO.:_), CDR2(WRSSLQS; SEQ ID NO.:_), 및 CDR3(AQGAALPRT; SEQ ID NO.:_) 서열을 S1-S2 루프(BC 루프) 내의 CDR1(SPGKATE; SEQ ID NO.:_), S5-S6 루프 내의 CDR2(YMMGNELTF; SEQ ID NO.:_) 및 CDR3(LMYPPPYYL; SEQ ID NO.:_) 각각에 해당하는 천연 CTLA-4 아미노산 잔기가 대체된 CTLA-4 V-유사 도메인을 포함하는 가용성의 CTLA-4의 트렁케이션된 돌연변이(WO 99/45110에 기재되어 있음; 임의로, 예를 들어, A2 및 A3 도메인이 결실된 CTLA-4의 공학처리된 형태)에 이식하였다(CTLA-4 스캐폴드 조성물 및/또는 구조의 세부사항은 WO 00/60070; WO 99/45110; Metzler et al. Nat. Struct. Biol. 4: 527-53; and Nuttall et al. Proteins Struct. Funct. Genet. 36:217-27 참조, 이들의 전체 내용음 참조로서 본원에 포함됨). pGC-, pPOW-기재, 또는 다른 당 분야에 인정된 발현 시스템에서의 상기 CLTA-4-유래 폴리펩티드의 발현을 우선적으로 단량체의 가용성 단백질의 예기 생성(anticipated production)과 함께 수행하였다. 이러한 CTLA-4-유래 폴리펩티드의 단백질 가용성을 시험하고, 천연 세포외 CTLA-4 폴리펩티드에 비해 우수한 것으로 예상되었다. 정제된 단량체 폴리펩티드가 비특이적 항원, 및 비특이적 폴리펩티드로 이식된 세포외 CTLA-4-유래 폴리펩티드(예를 들어, CDR1 루프 구조 내에서 치환된 소마토스타틴)에 비해 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는지 시험하기 위해 ELISA 분석을 이용하였다. 인간 혈청 알부민이 dAb7h14의 항-인간 혈청 알부민 CDR 도메인을 포함하는 고정된 CTLA-4-유래 폴리펩티드에 결합하는지 평가하기 위해 비아코어에 의한 실시간 결합 검정을 수행하였다(당업자는 결합 친화성이, 예를 들어, 표지된 인간 혈청 알부민의 침전, 경쟁 비아코어 검정 등을 포함하는 임의의 적절한 방법을 이용하여 평가될 수 있음을 인지할 것이다). 임의로, CTLA-4 항-인간 혈청 알부민 폴리펩티드의 발현을 대장균 발현에 우선적인 코돈을 통합시키는 스플라이스 오버랩(splice overlap) PCR을 이용하여 코딩 서열의 조정을 통해 향상시켰다. 인간 혈청 알부민 친화성이 검출되지 않거나, 낮은 인간 혈청 알부민 친화성이 검출되는 경우(예를 들어, μM 범위 또는 이 이상의 Kd 값), 결합 친화성에 기여하는 하기 방법 중 임의의 방법을 포함하는 다수의 접근법 중 하나 이상이 CDR-이식된 CTLA-4 폴리펩티드의 인간 혈청 알부민 결합 특성을 개선시키기 위해 사용된다.
dAb7h14 CDR을 제공하는 CDR-이식된 CTLA-4 폴리펩티드(들)의 인간 혈청 알부민 결합은, 임의로 하기 기재되고/되거나 당 분야에 달리 공지된 병행 및/또는 반복 선택 방법과 조합된, 돌연변이유발을 통해 최적화된다. 이식된 dAb7h14 CDR 폴리펩티드 서열을 둘러싸는 CTLA-4 스캐폴드 폴리펩티드 도메인이 하기 기재되는 바와 같이 수행되는 무작위 및/또는 NNK 돌연변이 유발에 적용된다. 이러한 돌연변이유발은 신규하거나 개선된 인간 혈청 알부민 결합 폴리펩티드를 생성시키기 위한 목적으로, 비-CDR 아미노산 잔기 상의 CTLA-4 폴리펩티드 서열 내에서 수행된다. 임의로, CDR-이식된 CTLA-4 폴리펩티드 내에 제공된 dAb7h14 CDR 폴리펩티드 도메인은 돌연변이유발, 예를 들어, 무작위 돌연변이유발, NNK 돌연변이유발, 룩-스루(look-through) 돌연변이유발 및/또는 다른 당 분야에 인정된 방법에 적용된다. 상기 돌연변이유발 방법을 수행하기 위해 PCR이 임의로 사용되며, 이는 CDR-이식된 CTLA-4 폴리펩티드 내의 표적 서열 전역에서 서열 다양성을 발생시킨다. 이러한 접근법은 dAb 라이브러리 생성을 위한 하기에 기재되는 접근법과 유사하다. 돌연변이유발의 무작위 및/또는 룩-스루 방법에 더하여, 구조적 정보가 인간 혈청 알부민의 결합에 중요한 특정 아미노산 잔기를 확립한 경우 표적 아미노산 잔기의 직접적인 돌연변이유발이 이용된다.
상기 기재된 바와 같이 공학처리된 이식된 dAb7h14 CDR 서열을 포함하는 CTLA-4 폴리펩티드가 인간 혈청 알부민 결합에 최적화된 CTLA-4 폴리펩티드를 확인하기 위한 병행 및/또는 반복 선택 방법에 적용된다. 예를 들어, dAb7h14 CDR-이식된 CTLA-4 폴리펩티드 서열의 라이브러리의 생성 후, 이러한 상기 폴리펩티드의 라이브러리가 파아지에 디스플레이되고, dAb의 라이브러리로부터의 혈청 알부민-결합 dAb의 선택을 위해 하기 기재되는 바와 같이 혈청 알부민 결합 및/또는 증식을 필요로 하는 다중 라운드의 선택에 적용된다. 임의로, 면역튜브 상에 고정된 혈청 알부민 또는 용액 중의 비오티닐화된 혈청 알부민에 대해 선택이 수행된다. 임의로, 표면 플라즈몬 공명(SPR), 및 비아코어 시스템(Uppsala, Sweden)을 이용하는 비아코어(Karlsson et al., 1991)를 이용하여 결합 친화성이 결정되고, 완전히 최적화된 CTLA-4-유래 폴리펩티드는 이상적으로는 nM 범위 또는 이 이상의 인간 혈청 알부민 결합 친화성 Kd 값을 달성한다.
인간 혈청 알부민에 결합하는 CTLA-4-유래 폴리펩티드의 확인 후, 이러한 폴리펩티드는 이후 하기 기재되는 임의의 방법에 의해 이중 특이적 리간드 조성물을 생성하는데 사용된다.
실시예 18: 혈청 알부민 결합 부분의 선택을 통한 혈청 알부민 결합 CTLA-4 비-면역글로불린 스캐폴드를 포함하는 이중 특이적 리간드의 생성
천연 CTLA-4 V-유사 도메인(WO 99/45110에 기재된 바와 같음; 임의로, 예를 들어, A2 및 A3 도메인이 결실된 CTLA-4의 공학처리된 형태)을 포함하고, 변이성 영역(들)을 함유하도록 공학처리된 가용성의 트렁케이션된 CTLA-4의 돌연변이가 라이브러리에 디스플레이되고, 선택에 적용되고, 임의로 본 발명의 리간드에 사용하기 위한 인간 혈청 알부민-결합 CTLA-4 비-면역글로불린 스캐폴드 분자를 생성하기 위한 친화성 성숙 기술에 적용된다.
pGC-, pPOW-기재, 또는 다른 당 분야에 인정된 발현 시스템에서의 상기 CLTA-4-유래 폴리펩티드의 발현이 수행된다. 이러한 CTLA-4-유래 폴리펩티드의 단백질 가용성이 시험되고, 천연 세포외 CTLA-4 폴리펩티드의 가용성에 비해 CTLA-4-유래 폴리펩디드(들)의 가용성을 향상시키기 위해 돌연변이유발이 수행된다.
정제된 단량체 폴리펩티드가 임의로 CTLA-4 유래 스캐폴드를 포함하는 비-특이적 단일 가변 도메인, 및 비-특이적 폴리펩티드가 이식된 세포외 CTLA-4-유래 폴리펩티드(예를 들어, CDR1 루프 구조 내에 치환된 소마토스타틴을 갖는 CTLA-4 폴리펩티드)에 비해 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는지 시험하기 위해 ELISA 분석이 이용된다. 비아코어에 의한 실시간 결합 검정을 인간 혈청 알부민이 고정된 CTLA-4-유래 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는지 평가하기 위해 수행하였다. 임의로, CTLA-4 항-인간 혈청 알부민 폴리펩티드의 발현이 대장균 발현에 우선적인 코돈을 통합시키기 위한 스플라이스 오버랩(splice overlap) PCR을 이용하여 코딩 서열의 조정을 통해 향상된다. 인간 혈청 알부민에 대한 CTLA-4 폴리펩티드의 존재하지 않거나 낮은 결합 친화성(예를 들어, μM 범위 또는 이 이상의 Kd 값)의 검출 후, CTLA-4 폴리펩티드에 인간 혈청 알부민 결합 특성을 제공하기 위해 결합 친화성에 기여하는 하기 방법 중 하나 이상을 포함하는 다수의 방법 중 하나 이상이 이용된다.
CTLA-4 스캐폴드 폴리펩티드(들)의 인간 혈청 알부민 결합이 돌연변이유발 방법과, 임의로 하기 기재되는 병행 및/또는 반복 선택 방법 및/또는 당 분야에 공지된 다른 방법을 통해 달성되고 최적화된다. CTLA-4 폴리펩티드 도메인이 하기에 기재되는 바와 같이 수행되는 무작위 및/또는 NNK 돌연변이유발에 적용된다. 이러한 돌연변이유발은 CTLA-4 폴리펩티드 전체 또는 CTLA-4 폴리펩티드 내의 특정 서열, 임의로 표적 CDR 해당 아미노산에 대해 수행된다(예를 들어, CDR1 및/또는 CDR3 서열이 무작위화되고, 생성된 폴리펩티드가, 예를 들어, WO 99/45110의 실시예 6에 기재된 바와 같은 선택에 적용된다). 임의로, CDR-유사 루프 존재에 구조적으로 중요한 것으로 결정되거나 예측된 특정 아미노산 잔기가 돌연변이유발에 대해 표적화된다. 돌연변이유발, 특히 무작위 돌연변이유발이 신규하거나 개선된 인간 혈청 알부민-결합 폴리펩티드를 개발하기 위해 수행된다. 상기 돌연변이유발 방법을 수행하기 위해 PCR이 임의로 사용되고, 이는 CTLA-4 폴리펩티드 내에 표적 서열 전역에서 서열 다양성을 발생시킨다(이러한 접근법은 dAb 라이브러리 발생을 위해 하기 기술되는 접근법과 유사하다). 돌연변이유발의 무작위 방법에 더하여, 구조적 정보가 인간 혈청 알부민의 결합에 중요한 CTLA-4 폴리펩티드의 특정 아미노산 잔기를 확립한 경우 표적 아미노산 잔기의 직접적인 돌연변이유발이 이용된다.
상기 기재된 바와 같이 공학처리된 CTLA-4 폴리펩티드가 인간 혈청 알부민 결합에 최적화된 CTLA-4 폴리펩티드를 확인하기 위한 병행 및/또는 반복 선택 방법에 적용된다. 예를 들어, 돌연변이유발된 CTLA-4 폴리펩티드 서열의 라이브러리의 생성 후, 상기 폴리펩티드의 라이브러리가 파아지에 디스플레이되고, dAb의 라이브러리로부터의 혈청 알부민-결합 dAb의 선택을 위해 하기 기재되는 바와 같이 혈청 알부민 결합 및/또는 증식을 필요로 하는 다중 라운드의 선택에 적용된다. 임의로, 면역튜브 상에 고정된 혈청 알부민 또는 용액 중의 비오티닐화된 혈청 알부민에 대해 선택이 수행된다. 임의로, 표면 플라즈몬 공명(SPR), 및 비아코어 시스템(Uppsala, Sweden)을 이용하는 비아코어(Karlsson et al., 1991)를 이용하여 결합 친화성이 결정되고, 완전히 최적화된 CTLA-4-유래 폴리펩티드는 이상적으로는 nM 범위 또는 이 이상의 인간 혈청 알부민 결합 친화성 Kd 값을 달성한다.
인간 혈청 알부민에 결합하는 CTLA-4 폴리펩티드의 확인 후, 이러한 폴리펩티드는 이후 하기 기재되는 임의의 방법에 의해 이중 특이적 리간드 조성물을 생성하는데 사용된다.
CTLA-4 V-유사 도메인
CTLA-4는 특이적 결합 파트너에 결합하고, 또한 V-유사 도메인을 포함하는 비-면역글로불린 리간드의 예이다. 이러한 V-유사 도메인은 이들이 Fv-유형 분자로 함께 연결되는 성향을 갖지 않으므로 항체 또는 T 세포 수용체의 V-유사 도메인과 구별된다. 이러한 비-면역글로불린 리간드는 표적 분자에 대해 높은 친화성을 갖는 신규한 결합 부분의 개발을 위한 대안적 프레임워크를 제공한다. 따라서, 가용성인 CTLA-4로부터 유래된 단일 도메인 V-유사 결합 분자가 요망된다.
세포독성 T-림프구 관련 항원 4(CTLA-4)가 면역 반응 동안 T-세포 조절에 관여된다. CTLA-4는 활성화된 T 세포의 표면에서 주로 및 일시적으로 발현되는 44 Kda의 동종이합체이고, 이는 항원 제시 세포 상의 CD80 및 CD86 표면 항원과 상호작용하여, 면역 반응을 조절한다(Waterhouse et al. 1996 Immunol Rev 153: 183-207, van der Merwe et al. 1997 J Exp Med 185: 393-403). 각각의 CTLA-4 단량체 서브유닛은 N-말단 세포외 도메인, 막횡단 영역 및 C-말단 세포내 도메인으로 구성된다. 세포외 도메인은 N-말단 V-유사 도메인(VLD; 면역글로불린 상과와 동일한 약 14 Kda의 예측 분자량) 및 막횡단 영역에 VLD를 연결시키는 약 10개 잔기의 줄기(stalk)를 포함한다. VLD는 항체 V-도메인의 CDR-1, CDR-2 및 CDR-3에 해당하는 표면 루프를 포함한다(Metzler et al. 1997 Nat Struct Biol 4: 527-531). CTLA-4에 대한 최근의 구조 및 돌연변이 연구는 CD80 및 CD86에 대한 결합이 A'GFCC' V-유사 베타 가닥 및 CDR3-유사 표면 루프 내의 고도로 보존된 MYPPPY 서열로부터 형성된 VLD 표면을 통해 발생하는 것을 나타낸다(Peach et al. 1994 J Exp Med 180: 2049-2058; Morton et al. 1996 J. Immunol. 156: 1047-1054; Metzler et al. 1997 Nat Struct Biol 4: 527-531). CTLA-4 단량체 사이의 이합체화는 두개의 줄기(stalk) 내의 시스테인 잔기(CYS120) 사이의 이황화 결합을 통해 발생하며, 이는 V-유사 도메인 사이의 임의의 명백한 직접적인 회합 없이 2개의 세포외 도메인의 구속(tethering)을 발생시킨다(Metzler et al. 1997 Nat Struct Biol 4: 527-531).
VLD 내의 CDR 루프 구조의 대체는 변경된 결합 특이성 및 개선된 가용성을 갖는 단량체의 정확하게 폴딩된 분자를 생성시키는 것으로 이전에 밝혀졌다. 따라서, 특정 구체예에서, CTLA-4로부터 유래된 하나 이상의 단량체 V-유사 도메인(VLD)을 포함하는 결합 부분이 생성되고, 여기서 하나 이상의 단량체 V-유사 도메인은 하나 이상의 CDR 루프 구조 또는 이의 일부가 변형되고 대체되어 변형된 VLD의 가용성이 변형되지 않은 VLD와 비교하는 경우에 개선되는 것을 특징으로 한다.
특정 구체예에서, 하나 이상의 CDR 루프 구조 또는 이의 일부가 변형되거나 대체되어, (ⅰ) CDR 루프 구조의 크기가 변형되지 않은 VLD 내의 상응하는 CDR 루프 구조에 비해 증가되고/되거나; (ⅱ) 변형 또는 대체가 CDR 루프 구조 중 하나 이상 내 또는 이들 사이에 이황화 결합을 형성시킨다.
특정 구체예에서, 본 발명은 CTLA-4로부터 유래된 하나 이상의 단량체 V-유사 도메인(VLD)을 포함하는 결합 부분을 제공하고, 상기 하나 이상의 단량체 V-유사 도메인은 하나 이상의 CDR 루프 구조 또는 이의 일부가 변형되거나 대체되어, (ⅰ) CDR 루프 구조의 크기가 변형되지 않은 VLD 내의 상응하는 CDR 루프 구조와 비교하여 변경되고/되거나; (ⅱ) 변형 또는 대체가 CDR 루프 구조 중 하나 이상 내 또는 이들 사이에 이황화 결합을 형성시키는 것을 특징으로 한다.
특정 구체예에서, CDR 루프 구조의 크기는 2개 이상, 더욱 바람직하게는 3개 이상, 더욱 바람직하게는 6개 이상, 더욱 바람직하게는 9개 이상의 아미노산 잔기이다. 추가 구체예에서, 본 발명의 변형된 결합 부분은 또한 변형되지 않은 결합 부분과 비교시 변경된 결합 친화성 또는 특이성을 나타낸다. 바람직하게는, CDR 루프 구조의 대체 또는 변경 효과는 변형되지 않은 VLD의 하나 이상의 천연 리간드에 대한 VLD의 친화성을 감소시키거나 제거하는 것이다. 바람직하게는, CDR 루프 구조의 대체 또는 변형 효과는 또한 VLD의 결합 특이성을 변화시키는 것이다(예를 들어, 인간 혈청 알부민에 결합하는 조성물을 생성한다). 따라서, 변형된 VLD가 변형되지 않은 VLD의 결합 파트너와 상이한 특정 결합 파트너(예를 들어, 인간 혈청 알부민)에 결합하는 것이 바람직하다.
구 "VLD"는 가변 중쇄(VH) 또는 가변 경쇄(VL) 항체에 대해 유사한 구조 특징을 갖는 도메인을 의미한다. 이러한 유사한 구조적 특징은 CDR 루프 구조를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "CDR 루프 구조"는 항체 V-도메인 내의 상보성 결정 영역과 유사한 표면 폴리펩티드 루프 구조 또는 영역을 의미한다.
본 발명의 CTLA-4-유래 결합 부분이 화학적으로 또는 유전학적으로 함께 커플링되어 다가 또는 다기능성 시약을 형성할 수 있음이 인지될 것이다. 예를 들어, Cys'20을 갖는 천연 CTLA-4에서와 같은 C-말단 꼬리의 첨가는 이합체를 생성시킬 것이다. 본 발명의 결합 부분은 또한 이중 특이적 리간드를 포함하는 것을 포함하는 다양한 제형을 위해 다른 분자에 커플링될 수 있다. 예를 들어, CTLA-4 VLD는 C-말단 폴리펩티드 꼬리를 포함할 수 있거나, 스트렙타비딘 또는 비오틴에 커플링될 수 있다. CTLA-4 VLD는 또한 암, 혈액 응고 등의 생체내 검출 및/또는 국소화를 위해 방사성 동위원소, 염료 마커 또는 다른 이미지화 작용제에 커플링될 수 있다. CTLA-4 VLD는 또한 진단 및 바이오센서 적용을 위한 불용성 장치 및 플랫폼으로의 커플링에 의해 고정될 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 세포외 CTLA-4 V-유사 도메인이 이용된다. CTLA-4 V-유사 도메인의 하나 이상의 표면 루프 및 바람직하게는 CDR1, CDR2 또는 CDR3 루프 구조가 혈청 알부민에 대해 결합 친화성을 갖는 폴리펩티드(예를 들어, 하기 예시되는, dAb7h14의 CDR 도메인 및 이로부터 유래된 서열)로 대체된다. 이러한 CTLA-4 VLD가 천연 표면 및 변형된 폴리펩티드 루프 둘 모두에 특이적인 친화성을 갖는 다중특이성일 수 있음이 인지될 것이다.
CTLA-4 VLD의 CDR 루프 구조 중 하나 이상은 항체로부터 유래된 하나 이상의 CDR 루프 구조로 대체될 수 있다. 항체는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 한 바람직한 구체예에서, 항체는 인간, 래트, 마우스, 낙타, 라마 또는 상어로부터 유래된다. CDR1 및 CDR3 루프 구조는 길이에 있어서 극도로 이종성인 비-표준 형태를 채택할 수 있다. V-유사 도메인은 또한 CDR1 및 CDR3 루프 구조(몇몇 낙타 VHH 항체에서 발견됨) 또는 CDR2 및 CDR3 루프 구조(몇몇 라마 VHH 항체에서 발견됨)를 상호연결시키는 이황화 결합을 포함할 수 있다.
생체내 적용을 위해, VLD가 치료 또는 진단 피검체와 상동이고, 임의의 가능한 이종항원이 제거되는 것이 바람직하다. 따라서, 임상 적용에 사용하기 위한 VLD 분자는 천연 발생 인간 면역글로불린 상과 일원과 실질적으로 상동인 것이 바람직하다.
CTLA-4 폴리펩티드(예를 들어, CTLA-4로부터 유래된 VLD)의 혈청 알부민 결합은, 예를 들어, 혈청 알부민에 대한 친화성을 갖는 결합 부분의 발현을 위한 폴리누클레오티드의 라이브러리를 스크리닝하는 것을 포함하는, 혈청 알부민에 대한 친화성을 갖는 결합 부분의 선택을 통해 최적화될 수 있고, 상기 폴리누클레오티드는 하나 이상의 VLD 내의 하나 이상의 CDR 루프 구조의 변형 또는 대체를 발생시키는 돌여변이유발에 적용되고, 분리된 변형된 VLD의 가용성은 분리된 변형되지 않은 VLD에 비해 개선된다.
상기 친화성 스크리닝 방법의 상황에서, 무작위 또는 표적 돌연변이유발의 임의의 방법이 V-유사 도메인으로 변형을 도입시키기 위해 사용될 수 있음이 당업자에 의해 인지될 것이다. 한 바람직한 구체예에서, 돌연변이유발은 표적 돌연변이유발이다. 임의로, 표적 돌연변이유발은, 예를 들어, 스플라이스 오버랩 또는 다른 PCR 기술을 이용하여 하나 이상의 CDR 루프 구조 내에 하나 이상의 서열을 대체하는 것을 포함한다.
폴리누클레오티드 라이브러리가 천연 발생 면역글로불린에서 발견되는 CDR 루프 구조와 실질적으로 동일한 CDR 루프 구조를 포함하는 VLD를 엔코딩하는 서열 및/또는 비-천연 발생 CDR 루프 구조를 포함하는 VLD를 엔코딩하는 서열을 포함할 수 있음이 당업자에게 인지될 것이다. 임의로, 스크리닝 방법은 박테리오파아지 입자의 표면 상에 유전자 Ⅲ 단백질 융합체로서 변형된 V-유사 도메인을 디스플레이하는 것을 포함한다.
라이브러리는 V-유사 도메인을 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함하는 pHFA, fd-tet-dog 또는 pFAB.5c와 같은 박테리오파아지 벡터를 포함할 수 있다. 스크리닝 방법은 또한 리보솜 디스플레이 선택 시스템에서 변형된 V-유사 도메인을 디스플레이하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 CTLA-4-유래 혈청 알부민 결합 분자는, (ⅰ) 천연 인간 단백질의 사용이 인간 치료에 사용되는 경우 면역계 반응에 대한 보호를 종종 필요로 하는 단계인, 재조합 분자의 차후의 인간화의 필요를 회피하고; (ⅱ) 도메인이 상기 기재된 바와 같은 천연 단량체(C-말단 꼬리에의 잔기 Cys120의 통합은 이합체 분자를 생성시킴)이고; (ⅲ) 구조적 변형이 개선된 대장균 발현 수준을 발생시키는 장점을 제공한다.
천연 CTLA-4 구조의 최초 결정은 항체 CDR1, 2 및 3 영역에 해당하는 영역의 모델링 및 예측을 가능케 하였다. 이러한 영역이 분자 프레임워크에 대한 실질적인 효과 없이 돌연변이 또는 치환에 민감함으로써, 정확하게 폴딩된 분자의 발현을 가능케하는 것으로 가정되었다. CTLA-4의 공개된 구조(Metzler et al. 1997 Nat Struct Biol 4: 527-531)는 리간드 결합 부위로부터의 CDR1의 예기치 않은 분리, 및 리간드 결합면과 인접한 평면상의 표면을 형성하는 CDR3의 광범위한 굴곡에도 불구하고 상기 예측이 정확함을 나타내었다.
V-유사 도메인은 가용성의 단일 도메인 분자를 작제하기 위한 기초 프레임워크를 제공하며, 상기 분자의 결합 특이성은 CDR1 루프 구조의 변형에 의해 공학처리될 수 있다. V-유사 도메인의 기초 프레임워크 잔기는 카멜리드 항체에 존재하는 구조적 특증에 따라 변형될 수 있다. 낙타 중쇄 면역글로불린은 VHH 사슬로 이루어짐으로써 "통상적인" 항체 구조와 상이하다(Hamers-Casterman et al. 1993 Nature 363: 446-448). 카멜리드 항체는 각각이 VHH 도메인을 포함하는 2개의 중쇄로 구성된다. 여러 독특한 특징이 상기 항체가 가용성 및 무능력의 이중 문제를 극복하여 충분히 큰 항원 결합 표면에 존재하도록 한다.
먼저, 노출된 프레임워크 잔기에서의 여러 통상적이지 않은 치환(주로 자연적으로 극성에 대해 소수성)은 소수성 표면을 감소시키면서, 내부 베타-시트(beta-sheet) 프레임워크 구조를 유지시킨다(Desmyter et al. 1996 Nat Struct Biol 3:803-811). 추가로, 3개의 CDR 루프내에서, 여러 구조적 특징이 VL 도메인에 의해 보통 제공되는 항원 결합 표면의 상실을 보충한다. CDR2 루프는 다른 VH 도메인과 광범위하게 상이하지 않은 반면, CDR1 및 CDR3 루프는 길이에 있어서 극도로 이종성인 비-표준 형태를 채택한다. 예를 들어, H1 루프는 Ig 분자 내에서의 보통 5개에 비해 2-8개 사이의 잔기를 어디에도 포함할 수 있다. 그러나, 매우 큰 변이를 나타내는 CDR3 루프가 존재하며: 보고된 17개의 낙타 항체 서열에서, 상기 영역의 길이는 7 내지 21개의 잔기로 다양하였다(Muyldermans et al. 1994 Protein Eng 7: 1129-1135). 셋째로, 다수의 카멜리드 VHH 도메인은 낙타의 경우 CDR1 및 CDR3를 상호연결하하고, 라마의 경우 CDR1 및 CDR2를 상호연결하는 이황화 결합을 포함한다(Vu et al. 1997 Molec. Immunol. 34: 1121-113). 이러한 구조적 특징의 기능은 루프 안정성을 유지시키고, 항원 내의 포켓으로의 결합을 허용하고 증가된 표면 영역을 제공하는 평면과 다른 보다 윤곽을 지닌 루프 형태를 제공하는 것으로 보인다. 그러나, 모든 카멜리드 항체가 이러한 이황화 결합을 포함하는 것은 아니며, 이는 절대적인 구조적 필요조건이 아님을 나타낸다.
본 발명은 또한 표적 분자(예를 들어, 인간 혈청 알부민)에 대한 신규한 결합 친화성을 갖는 단일한 VLD 분자를 생성하고 선택하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 CTLA-4-유래 폴리펩티드에 대한 널리 공지된 분자 발전 기술의 적용을 포함한다. 상기 방법은 매우 많은 수의 돌연변이된 CTLA-4-유래 폴리펩티드를 스크리닝하기 위한 파아지 또는 리보솜 디스플레이 라이브러리의 생성을 포함할 수 있다.
섬유상 fd-박테리오파아지 유전체가, 파아지가 이의 표면 상에 파아지 내에 함유된 DNA에 의해 엔코딩되는 Ig-유사 단백질(scFv, Fabs)과 같은 단백질을 디스플레이하도록 공학처리된다(Smith, 1985 Science 228: 1315-1317; Huse et al. 1989 Science 246: 1275-81; McCafferty et al., 1990 Nature 348: 552-4; Hoogenboom et al., 1991 Nucleic Acids Res. 19: 4133-4137). 유전자 Ⅲ, 덜 통상적으로는 유전자 Ⅷ에 의해 엔코딩된 파아지 코트 단백질에 공유적으로 커플링된 단백질 분자가 Fd 박테리오파아지의 표면 상에 디스플레이될 수 있다. 유전자 Ⅲ 코트 단백질로의 항체 유전자의 삽입은 말단에 위치된 파아지 당 3-5개의 재조합 단백질 분자를 발현시킨다. 대조적으로, 유전자 Ⅷ로의 항체 유전자의 삽입은 파아지 입자 당 약 2000 카피의 재조합 단백질을 디스플레이하는 잠재성을 지니지만, 이는 단일한 디스플레이된 단백질의 친화성을 가릴 수 있는 다가 시스템이다. Fd 파아지미드(phagemid) 벡터가 또한 사용되는데, 이는 이들이 fd-박테리오파아지의 표면 상의 기능성 Ig-유사 단편의 디스플레이로부터 대장균에서의 가용성 Ig-유사 단편의 분비로 용이하게 전환될 수 있기 때문이다. 유전자 Ⅲ 코트 단백질의 N-말단을 갖는 파아지-디스플레이된 재조합 단백질 융합체가 2개의 단백질 유전자 사이에 전략적으로 위치된 앰버 코돈(amber codon)에 의해 제조될 수 있다. 대장균의 앰버 억제인자 균주에서, 생성된 Ig 도메인-유전자 Ⅲ 융합체가 파아지 코트에 정착된다.
단백질 친화성에 기초한 선택 방법은 항체, 항원, 수용체 및 리간드와 같은 임의의 고친화성 결합 시약에 적용될 수 있다(예를 들어, Winter and Milstein, 1991 Nature 349: 293-299 참조, 이의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함됨). 따라서, 박테리오파아지 상에 디스플레이된 가장 높은 친화성 결합 단백질의 선택이 상기 단백질을 엔코딩하는 유전자의 회수와 커플링된다. Ig- 또는 비-Ig 스캐폴드-디스플레이 파아지가 비드에 공유적으로 커플링되거나, ELISA 또는 고상 방사선면역측정법과 유사한 방식으로 플라스틱 표면에 흡착된 동족 결합 파트너로의 결합에 의해 친화성 성택될 수 있다. 대부분의 임의의 플라스틱 표면은 단백질 항원을 흡착할 것이나, 눈크 이뮤노튜브스(Nunc Immunotubes)와 같은 일부 시판 제품이 상기 목적을 위해 특별히 사용된다.
리보솜 디스플레이 라이브러리는 세포 비함유 번역 시스템에서 새로이 합성되고, 선택 목적을 위해 리보솜의 표면에 디스플레이된 폴리펩티드를 포함한다(Hanes and Pluckthun, 1997 Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 94: 4937-4942; He and Taussig, 1997 Nucl. Acids Res. 25: 5132-5134). "세포 비함유 번역 시스템"은 리보솜, 단백질 합성에 필요한 가용성 효소(보통 리보솜과 동일한 세포로부터 유래), 전달 RNA, 아데노신 트리포스페이트, 구아노신 트리포스페이트, 리보누클레오시드 트리포스페이트 재생 시스템(예를 들어, 포스포에놀 피루베이트 및 피루베이트 키나아제), 및 외인성 mRNA에 의해 엔코딩되는 단백질을 합성하는데 필요한 염 및 완충용액을 포함한다. 폴리펩티드의 번역은 온전한 폴리솜(polysome)을 유지하는 조건하에서 발생하도록, 즉, 리보솜, mRNA 분자 및 번역된 폴리펩티드가 단일한 복합체로 회합되도록 제조될 수 있다. 이는 번역된 폴리펩티드의 "리보솜 디스플레이"를 효과적으로 발생시킨다. 선택을 위해, 대응 리보솜 복합체와 회합된 번역된 폴리펩티드가 매트릭스(예를 들어, 디아나비드(Dynabead))에 결합된 표적(예를 들어, 혈청 알부민) 분자와 혼합된다. 번역된 폴리펩티드를 디스플레이하는 리보솜은 표적 분자에 결합할 것이고, 이러한 복합체는 선택될 수 있고, mRNA는 RT-PCR을 이용하여 재증폭될 수 있다.
비록 결합 분자를 변형시키기 위한 여러 대안적 방법이 존재하나, 모든 디스플레이된 단백질에 대한 일반적인 접근법은 개별적 결합 시약이 동족 리간드 및/또는 수용체에 대한 친화성에 의해 디스플레이 라이브러리로부터 선택되는 패턴을 따른다. 이러한 시약을 엔코딩하는 유전자는 다수의 생체내 및 시험관내 돌연변이 전략 중 임의의 하나 또는 이의 조합에 의해 변형되고, 가장 높은 친화성 결합 분자의 디스플레이 및 선택을 위한 신규한 유전자 풀로 작제된다.
결합 친화성의 평가
특정 구체예에서, 본 발명의 이중 특이적 리간드 및 이의 구성요소 분자(예를 들어, 인간 혈청 알부민에 결합하는 비-면역글로불린 분자)를 표적 단백질(예를 들어, 인간 혈청 알부민)에 대한 결합 친화성을 평가하였다. 표적 단백질 에피토프의 결합은 통상적인 항원 결합 검정, 예를 들어, ELISA, FRET을 포함하는 형광 기재 기술, 또는 분자량을 측정하는 표면 플라즈몬 공명과 같은 기술에 의해 측정될 수 있다. 항원 또는 에피토프에 대한 항원 결합 단백질의 특정 결합은, 예를 들어, 스캐차드 분석 및/또는 경쟁 결합 검정, 예를 들어, 방사선면역측정법(RIA), 효소 면역분석법, 예를 들어, ELISA 및 샌드위치 경쟁 분석, 및 이들의 다양한 변형을 포함하는 적절한 검정에 의해 결정될 수 있다.
결합 친화성은 바람직하게는 표면 플라즈몬 공명(SPR) 및 비아코어 시스템(Uppsala, Sweden)을 이용하는 비아코어(Karlsson et al., 1991)를 이용하여 결정된다. 비아코어 시스템은 실시간으로 생체분자 상호작용을 모니터하기 위해 표면 플라즈몬 공명(SPR, Welford K. 1991, Opt. Quant. Elect. 23: 1; Morton and Myszka, 1998, Methods in Enzymology 295: 268)을 이용하고, 300 nm 이하 떨어진 표면의 굴절 지수에서의 변화의 결과로서 유리 지지체 상의 얇은 금 필름의 표면에서의 광의 공명각에서의 변화를 검출할 수 있는 표면 플라즈몬 공명을 이용한다. 비아코어 검정은 편리하게는 결합 속도 상수, 해리 속도 상수, 평형 해리 상수, 및 친화성 상수를 발생시킨다. 결합 친화성은 비아코어 표면 플라즈몬 공명 시스템(Biacore, Inc.)을 이용하여 결합 및 해리 속도 상수를 평가함으로써 수득된다. 바이오센서 칩이 제조업체(Biacore)의 설명서에 따라 표적의 공유 커플링에 대해 활성화된다. 이후, 표적이 희석되고, 칩 상에 주입되어, 고정된 물질의 반응 단위(RU)의 신호가 수득된다. RU에서의 신호는 고정된 물질의 질량에 비례하므로, 이는 매트릭스 상의 다양한 고정된 표적 밀도를 나타낸다. 해리 데이터가 koff +/- s.d.(측정값의 표준 편차)를 수득하기 위해 단일-위치(one-site) 모델에 적합화된다. 각각의 해리 곡선에 대해 유사 일차 속도 상수(Kd's)가 계산되고, 단백질 농도의 함수로서 작도되어, Kon +/- s.e.(적합도의 표준 오차)가 수득된다. 결합에 대한 평형 해리 상수 Kd's가 koff/kon로서 SPR 측정치로부터 계산된다.
문헌[Phizicky and Field in Microb. Rev. (1995) 59: 114-115]에 기재된 바와 같이, HSA와 같은 적절한 항원이 덱스트란 중합체에 고정되고, HSA에 대한 리간드, 예를 들어, 단일 가변 도메인을 함유하는 용액이 세포를 통해 유동하여, 고정된 HSA와 접촉된다. 고정된 HSA에 의해 유지된 단일 가변 도메인은 충돌하는 광의 공명각을 변경시켜, 증가된 양의 단백질, 즉 덱트스란 중합체 근처의 단일 가변 도메인에 의해 발생된 굴절 지수를 변화시킨다. 모든 단백질은 동일한 굴절 지수를 갖고, 공명각 변화와 표면 근처의 단백질 농도 사이의 선형 상광관계가 존재하므로, 단백질/단백질 결합으로 인한 표면에서의 단백질 농도의 변화가 측정될 수 있다. 상기 문헌[Phizicky and Field] 참조. 결합 상수를 결정하기 위해, 공명 단위에서의 증가가 RU 값이 안정화될때까지 고정된 리간드(HSA)를 넘어 단일 가변 도메인 단백질의 용액을 통과시킴으로써 시간의 함수로 측정된 후, RU에서의 감소가 단일 가변 도메인 비함유 완충용액을 이용한 시간의 함수로서 측정된다. 이러한 과정이 여러 상이한 농도의 단일 가변 도메인 단백질에서 반복된다. 상세한 이론적 배경 및 과정이 문헌[R. Karlsson, et. al. (991) J. Immunol Methods, 145, 229]에 기재되어 있다.
기계 소프트웨어는 상기 기재된 바와 같이 평형 해리 상수(Kd)를 발생시킨다. 표면 플라즈몬 공명(SPR)의 사용을 통해 결정된 평형 해리 상수는 미국 특허 제5,573,957호에 기재되어 있고, 이는 dRA/dt 및 RA 값의 표를 기초로 하고(여기서, 이러한 예에서의 R은 비아코어에 의해 측정되는 공명 단위의 HSA/단일 가변 도메인 복합체이고, dR/dt는 HSA/단일 가변 도메인 복합체의 형성 속도, 즉, 결합 곡선의 미분 계수(derivative)임); 여러 상이한 농도의 단일 가변 도메인에 대한 그래프 dRA/dt 대 RA를 작도한 후, 이러한 선(line) 대 단일 가변 도메인의 농도의 기울기를 작도함에 따라 결정되고, 이러한 제 2의 그래프의 기울기는 결합 속도 상수(M-1, s-1)가 된다. 해리 속도 상수, 또는 HSA 및 단일 가변 도메인이 서로로부터 방출되는 속도는 비아코어에서 생성된 해리 곡선을 이용하여 결정될 수 있다. 반응 대 시간 곡선에서의 하락의 log의 기울기를 작도하고 결정함으로써, 해리 속도 상수가 측정될 수 있다. 평형 해리 상수 Kd는 해리 속도 상수/결합 속도 상수이다.
본 발명의 임의의 양태에 따른 리간드는 단량체 단일 가변 도메인 또는 다중 단일 가변 도메인, 즉, 중합체 형태의 하나 이상의 단일 가변 도메인을 갖거나 이로 구성되는 리간드를 포함한다. 리간드는 추가 부분, 예를 들어, 융합 단백질, 또는 컨쥬게이트를 포함하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 이중 특이적 리간드 형태의 중합체 리간드, 및/또는 단일 가변 도메인, 즉, 중합체 리간드를 작제하는데 유용한 dAb 단량체를 포함하거나 이로 구성되는 리간드는 유리하게는, 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명으로 결정시, 300 nM 이하, 300 nM 내지 5pM(즉, 3 x 10-7 내지 5 x 10-12M), 바람직하게는 50 nM 내지 20 pM, 또는 5 nM 내지 200 pM 또는 1 nM 내지 100 pM, 1 x 10-7 M 이하, 1 x 10-8M 이하, 1 x 10-9 M 이하, 1 x 10-10 M 이하, 1 x 10-11M 이하의 Kd; 및/또는 5 x 10-1 내지 1 x 10-7 S-1, 바람직하게는 1 x 10-6 내지 1 x 10-8 S-1, 바람직하게는 1 x 10-2 내지 1 x 10-6 S-1, 또는 5 x 10-3 내지 1 x 10-5 S-1, 또는 5 x 10-1 S-1 이하, 또는 1 x 10-2 S-1 이하, 또는 1 x 10-3 S-1 이하, 또는 1 x 10-4 S-1 이하, 또는 1 x 10-5 S-1 이하, 또는 1 x 10-6 S-1 이하의 Koff 속도 상수로 동족 표적(들)로부터 해리될 수 있다. Kd 속도 상수는 Koff/Kon으로 정의된다. 바람직하게는, 단일 가변 도메인은 500 nM 미만, 바람직하게는 200 nM 미만, 더욱 바람직하게는 10 nM 미만, 예를 들어, 500 pM 미만의 친화성으로 표적 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합할 것이다.
리포칼린
실시예 19: 혈청 알부민 결합 부분의 선택을 통한 혈청 알부민 결합 리포칼린 비-면역글로불린 스캐폴드를 포함하는 이중 특이적 리간드의 생성
피에리스 브라시카에(Pieris brassicae)로부터 유래된 리포칼린인 빌린-결합 단백질(BBP)은 인간 혈청 알부민을 인지하도록 통상적인 단백질 디자인에 의해 변형될 수 있다. 이를 위해, 천연 BBP가 라이브러리 선택, 및 임의로 친화성 성숙에 적용되어, 본 발명의 이중특이적 리간드에 사용하기 위한 인간 혈청 알부민-결합 BBP 분자가 생성된다.
인간 혈청 알부민에 결합하는 천연 BBP의 능력은 먼저 CTLA-4-유래 폴리펩티드에 대해 하기 기술되는 바와 같은 비아코어 검정을 통해 확인된다(당업자는, 예를 들어, 표지된 인간 혈청 알부민의 침전, 경쟁 비아코어 검정 등을 포함하는 임의의 적절한 방법을 이용하여 결합 친화성이 평가될 수 있음을 인지할 것이다). 인간 혈청 알부민에 대한 BBP의 존재하지 않거나 낮은 결합 친화성(예를 들어, μM 범위 또는 이 이상의 Kd 값)의 검출 후, BBP에 인간 혈청 알부민 결합 특성을 제공하기 위해 결합 친화성에 기여하는 하기 방법 중 하나 이상을 포함하는 다수의 방법 중 하나 이상이 이용된다.
BBP 및 BBP-유래 폴리펩티드(들)의 인간 혈청 알부민 결합이 돌연변이유발 방법과, 임의로 하기 기재되는 병행 및/또는 반복 선택 방법 및/또는 당 분야에 공지된 다른 방법을 통해 달성되고 최적화된다. BBP 폴리펩티드 도메인이 하기에 기재되는 바와 같이 수행되는 무작위 및/또는 NNK 돌연변이유발에 적용된다. 이러한 돌연변이유발은 BBP(또는 BBP-유래) 폴리펩티드 전체에서 수행되고/되거나, 8-가닥의 베타-바렐(beta-barrel)의 상부의 4개의 루프에 의해 형성되는 천연 BBP 결합 부위의 중심부에 존재하는 것으로 확인된 16개의 아미노산 잔기를 포함하는 BBP 폴리펩티드 내의 특정 서열에서 수행된다(Beste et al. 1999 Proc. Natl Acad. Sci. USA 96: 1898-903). 임의로, 이러한 돌연변이유발 과정은 신규하거나 개선된 인간 혈청 알부민 결합 폴리펩티드를 개발하기 위해 무작위화되고; 인간 혈청 알부민에 최적으로 결합하는 BBP를 생성시키는 과정 동안 다중 라운드의 돌연변이유발이 수행될 수 있다. 상기 돌연변이유발 방법을 수행하기 위해 PCR이 임의로 사용되고, 이는 BBP(또는 BBP-유래) 폴리펩티드 내에 표적 서열 전역에서 서열 다양성을 발생시킨다(이러한 접근법은 dAb 라이브러리 발생을 위해 하기 기술되는 접근법과 유사하다). 돌연변이유발의 무작위 방법에 더하여, 구조적 정보가 인간 혈청 알부민의 결합에 중요한 BBP(또는 BBP-유래) 폴리펩티드의 특정 아미노산 잔기를 확립한 경우 표적 아미노산 잔기의 직접적인 돌연변이유발이 이용된다.
상기 기재된 바와 같이 공학처리된 BBP(또는 BBP-유래) 폴리펩티드가 인간 혈청 알부민 결합에 최적화된 BBP 폴리펩티드를 확인하기 위한 병행 및/또는 반복 선택 방법에 적용된다. 예를 들어, 돌연변이유발된 BBP 폴리펩티드 서열의 라이브러리의 생성 후, 상기 폴리펩티드의 라이브러리가 파아지에 디스플레이되고, dAb의 라이브러리로부터의 혈청 알부민-결합 dAb의 선택을 위해 하기 기재되는 바와 같이 혈청 알부민 결합 및/또는 증식을 필요로 하는 다중 라운드의 선택에 적용된다. 임의로, 면역튜브 상에 고정된 혈청 알부민 또는 용액 중의 비오티닐화된 혈청 알부민에 대해 선택이 수행된다. 임의로, 표면 플라즈몬 공명(SPR), 및 비아코어 시스템(Uppsala, Sweden)을 이용하는 비아코어(Karlsson et al., 1991)를 이용하여 결합 친화성이 결정되고, 완전히 최적화된 BBP-유래 폴리펩티드는 이상적으로는 nM 범위 또는 이 이상의 인간 혈청 알부민 결합 친화성 Kd 값을 달성한다.
인간 혈청 알부민에 결합하는 BBP 폴리펩티드의 확인 후, 이러한 폴리펩티드는 이후 하기 기재되는 임의의 방법에 의해 이중 특이적 리간드 조성물을 생성하는데 사용된다.
리포칼린 스캐폴드 단백질
리포칼린(Pervaiz and Brew, FASEB J. 1 (1987), 209-214)은 다양한 유기체로부터 분리된 작은, 종종 단량체인 분비 단백질 패밀리이며, 이의 생리학적 역할은 저장 또는 다양한 리간드의 수송 뿐만 아니라 보다 복잡한 생물학적 기능이 있다(Flower, Biochem. J. 318 (1996), 1-14). 리포칼린은 비교적 적은 상호 서열 유사성을 나타내고, 동일한 단백질 구조 패밀리에 대한 특성은 X-선 구조 분석에 의해 처음 밝혀졌다(Sawyer et al., Nature 327 (1987), 659).
공지된 공간 구조의 첫번째 리포칼린은 혈청 내에서 수불용성의 비타민 A를 수송하는 레티놀 결합 단백질인 Rbp였다(Newcomer et al., EMBO J. 3 (1984), 1451-1454). 그 후 곧바로, 나비 피에리스 브라시카에로부터의 빌린 결합 단백질 Bbp의 삼차 구조가 결정되었다(Huber et al., J. Mol. Biol. 195 (1987), 423-434). 이러한 부류의 단백질의 필수적인 구조적 특징은 이러한 리포칼린의 공간 구조에 예시되어 있다. 리포칼린의 폴딩 구조에서의 중심 요소는 8개의 거의 원형으로 배열된 역평행 β-가닥으로 이루어진 소위 β-바렐의 원통형 β-병풍 구조(pleated sheet structure)이다.
이러한 초이차(supersecondary) 구조 성분은 또한 2개의 4-가닥의 β-시트 구조의 "샌드위치"-배열로 관찰될 수 있다. 추가 구조 성분은 폴리펩티드 사슬의 아미노 말단의 연장된 세그먼트, 및 카르복시 말단에 근접한 α-헬릭스이며, 이 다음에 연장된 세그먼트가 후속된다. 그러나, 이러한 추가 특징이 모든 리포칼린에서 반드시 나타나지는 않는다. 예를 들어, N-말단 세그먼트의 유의한 부분이 부고환 레티노산 결합 단백질에 결실되어 있다(Newcomer, Structure (1993) 1: 7-18). 추가의 독특한 구조 성분, 예를 들어, 특정 리포칼린에만 존재하는 막 앵커가 또한 공지되어 있다(Bishop and Weiner, Trends Biochem. Sci. (1996) 21: 127).
β-바렐은 밀집한 아미노산 패킹 뿐만 아니라 루프 세그먼트에 의해 한쪽 말단에 밀집되어 있다. 다른 말단에는, β-바렐이 리포칼린의 각각의 리간드가 복합체화되어 있는 결합 포켓을 형성한다. 8개의 인접하는 역평행 β-가닥이, 원통형 β-병풍 구조의 영역에 여전히 부분적으로 위치된 인접한 아미노산과 함께 폴리펩티드 사슬 내의 헤어핀 굴곡부에 의해 각각의 짝을 이룬 방식으로 연결되어, 각각 루프 구성요소를 형성한다. 리간드에 대한 결합 포켓은 전체 4개의 펩티드 루프에서 상기에 의해 형성된다. Bbp의 경우, 빌리베르딘 Ⅸγ이 상기 결합 포켓에서 복합체를 이룬다. 리포칼린에 대한 또 다른 통상적인 리간드는 Rbp 뿐만 아니라 β-락토글로불린의 경우 비타민 A이다(Papiz et al., Nature 324 (1986), 383-385).
예를 들어, 미국 공개 공보 제20060058510호에 기재된 바와 같이, 폴리펩티드의 리포칼린 패밀리의 일원은 원통형 β-병풍 구조의 말단에서 4개의 펩티드 루프의 영역에 위치되고, 결정가능한 친화성으로 제공된 리간드(예를 들어, 인간 혈청 알부민)에 결합하는 것을 특징으로 하는 아미노산의 돌연변이를 통해 신규한 리간드를 인지하도록 디자인된, "안티칼린(anticalin)"으로 언급되는 분자 부류를 생성시키는데 사용될 수 있다.
리포칼린의 리간드 결합 부위는 면역글로불린의 리간드 결합 부위보다 더 간단히 작제된다. 리포칼린 폴리펩티드는 8개의 역평행 β-가닥의 단지 하나의 고리인 β-바렐을 포함한다. 이러한 시클릭 β-병풍 구조는 리포칼린의 단백질 폴드에 보존된다. 결합 부위는 4개의 펩티드 루프에 의해 β-바렐의 진입 영역에 형성되며, 4개 펩티드 루프 각각은 서로 인접하는 2개의 β-가닥을 연결한다. 이러한 펩티드 루프는 리포칼린 패밀리의 개별적 일원 사이의 구조에서 현저하게 다양할 수 있다.
비-면역글로불린 스캐폴드로서 리포칼린 폴리펩티드를 사용하기 위해, 리포칼린의 리간드 결합 부위를 형성하는 4개의 펩티드 루프 중 하나 이상이 돌연변이유발에 적용된 후, 선택, 즉, 제공된 리간드에 대해 요망되는 결합 활성을 나타내는 단백질 변이체(뮤테인)가 선택된다. 이러한 방식으로 수득된 리포칼린 뮤테인이 "안티칼린"으로 명명되었다.
안티칼린의 생성 동안 돌연변이유발에 의해 서열이 변형되는 리포칼린의 4개의 펩티드 루프는 Bbp의 아미노산 위치 28 내지 45, 58 내지 69, 86 내지 99 및 114 내지 129를 포함하는 BBP의 선형 폴리펩티드 서열 내의 세그먼트를 특징으로 한다. 이러한 서열 세그먼트 각각은 β-바렐의 개방면에 보존된 β-가닥 중 하나의 C-말단 앞에서 시작하고, 사실상 펩티드 헤어핀을 포함하고, 상기 서열에 후속되는 마찬가지의 보존된 β-가닥의 N-말단 이후에 종결된다.
서열 정렬 또는 구조 중첩은 Bbp에 대해 제공된 서열 위치가 다른 리포칼린에 대해 지정되는 것을 가능케 한다. 예를 들어, 문헌[Peitsch and Boguski (New Biologist 2 (1990), 197-206)]의 공개된 정렬에 상응하는 서열 정렬은 ApoD의 4개의 펩티드 루프가 아미노산 위치 28 내지 44, 59 내지 70, 85 내지 98 및 113 내지 127을 포함하는 것을 나타낸다. 동일한 방식으로 돌연변이유발에 적합한 신규한 리포칼린 내의 상응하는 펩티드 루프를 확인하는 것이 또한 가능하다.
몇몇 경우에, 리포칼린의 비교적 약한 서열 상동성은 보존된 β-가닥의 결정에서 문제가 되는 것으로 증명될 수 있다. 따라서, 폴리펩티드 서열이 8개의 역평행 β-가닥으로 구성된 시클릭 β-병풍 구조를 형성할 수 있는 것이 중요하다. 이는 단백질 결정학 또는 다차원 핵자기공명분광법과 같은 구조 분석 방법을 이용함으로써 결정될 수 있다.
비-Bbp 리포칼린, 예를 들어, ApoD 또는 Rbp에서, 돌연변이유발에 적합한 서열 세그먼트는 펩티드 루프의 개별적으로 변화하는 구조에 기초하여 용이하게 Bbp의 서열 세그먼트보다 길거나 짧게 될 수 있다. 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 삽입에 의해 서열 세그먼트의 길이를 추가로 변형시키는 것도 이로울 수 있다. 특정 구체예에서, Bbp의 서열 위치 34 내지 37, 58, 60, 69, 88, 90, 93, 95, 97, 114, 116, 125 및 127에 해당하는 아미노산 위치가 돌연변이된다. 상응하게, ApoD의 경우, 서열 위치 34 내지 37, 59, 61, 70, 87, 89, 92, 94, 96, 113, 115, 123 및 125가 돌연변이유발에 바람직하다. 그러나, 안티칼린의 생성을 위해, 상기 나열된 모든 서열 위치가 돌연변이유발에 적용되어야 하는 것은 아니다.
다른 리포칼린이 또한 안티칼린의 생성을 위한 기초 구조로 적절하다. 바람직하게는, 현재 생화학적으로 이미 철저히 연구된 리포칼린 Rbp, Bbp 또는 ApoD가 사용된다. 인간 기원의 리포칼린의 사용이 안티칼린의 생성에 특히 바람직하다. 이는 특히 생성되는 안티칼린(들)의 적용, 예를 들어, 생체내에서의 진단 또는 치료 적용과 같이 인간을 위한 것인 경우에 적용되며, 다른 유기체로부터의 리포칼린에 비해 최소 면역원 효과가 예상된다. 그러나, 다른 리포칼린 뿐만 아니라, 가능하게는 이제부터 발견되는 리포칼린이 안티칼린의 생성에 특히 이로운 것으로 증명될 수 있다. 리포칼린의 β-바렐과 구조적으로 동등한 폴딩 성분을 갖는 인공 단백질이 또한 사용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 안티칼린 분자는 결정가능한 친화성, 즉 105 M-1 이상의 친화성 상수로 요망되는 리간드(예를 들어, 인간 혈청 알부민)에 결합할 수 있어야 한다. 이보다 낮은 친화성은 더 이상 일반적으로 통상적인 방법으로 정확하게 측정될 수 없고, 따라서 실질적인 적용에서 부차적으로 중요하다. 1 μM의 복합체에 대한 해리 상수에 해당하는 106 M-1 이상의 친화성으로 요망되는 리간드에 결합하는 안티칼린이 특히 바람직하다. 요망되는 리간드에 대한 안티칼린의 결합 친화성은 다수의 방법, 예를 들어, 형광 적정, 경쟁 ELISA, 또는 표면 플라즈몬 공명 기술에 의해 당업자에 의해 측정될 수 있다.
공지의 방법에 의해 당업계의 통상의 기술자에 의해 생산 및 클로닝될 수 있는, 리포칼린 cDNA는, 예를 들어, Bbp에 관해 기재된 것과 같이(Schmidt and Skerra, Eur. J. Biochem. 219 (1994), 855-863), 펩티드 루프의 돌연변이유발을 위한 개시점으로 역할할 수 있다. 대안적으로, 게노믹 DNA가 또한 유전자 합성에 사용될 수 있거나 이러한 방법들의 조합이 실행될 수 있다. 4개의 펩티드 루프내 아미노산의 돌연변이유발의 경우, 당업계의 통상의 기술자는 위치-지정(site-directed) 돌연변이유발 또는 중합효소 연쇄 반응에 의한 돌연변이유발에 관한 다양한 공지의 방법을 그의 마음대로 사용한다. 돌연변이유발 방법은, 예를 들어, 요망되는 위치에 축퇴된 염기 조성을 지니는, 합성 올리고데옥시뉴클레오티드의 혼합물이 돌연변이의 도입을 위해 사용될 수 있다는 점에서 특징지워질 수 있다. 예를 들어, 이노신과 같이, 감소된 염기쌍 특이성을 지니는 뉴클레오티드 빌딩 블록의 완성(implementation)은, 또한 선택된 서열 세그먼트 또는 아미노산 위치로 돌연변이의 도입을 위한 옵션이 된다. 리간드-결합 부위의 돌연변이유발을 위한 절차는, 리포칼린의 경우, 6개 서열 세그머트 대신 오직 4개(위에 언급된 4개의 펩티드 루프에 상응함)만 이 목적을 위해 조작되어야 하기 때문에, 항체와 비교하여 단순하다.
합성 올리고데옥시뉴클레오티드를 완성시키는 위치-지정 무작위 돌연변이유발 방법에서, 돌연변이 유발될 리포칼린 구조내 적절한 아미노산 위치는 미리 결정될 수 있다. 돌연변이될 아미노산 위치의 이상적인 선택은 한편으로는 사용되는 리포칼린에 의존할 수 있고, 다른 한편으로는 요망되는 리간드(예를 들어, 사람 혈청 알부민)에 의존할 수 있다. 돌연변이유발에 의해 획득된 변이체의 콜렉션, 즉, 소위 라이브러리가, 이의 전체성(totality)에 있어서 또는, 적어도 이로부터의 대표적인 선별에 있어서, 코딩 핵산의 수준에서 뿐만 아니라, 유전자 생성물의 수준에서도, 이의 조합 복잡성(combinatorial complexity)에서 가능한 완전히 달성될 수 있도록 충분히 적은 단일 실험내에서 돌연변이된 아미노산 위치의 총 갯수를 유지하는데 유용할 수 있다.
BBP와 Rbp의 경우 또는 적어도 유사한 구조를 지니는 리포칼린과 관련된 경우에서와 같이(예를 들어, ApoD의 경우에서와 같이), 사용될 리포칼린 그 자체와 관련되어 구조 정보가 존재하는 경우 특히 의미있는 방식으로 돌연변이될 아미노산 위치를 선택하는 것이 가능하다. 선택된 아미노산 위치의 세트는 추가로 요망되는 리간드의 특징에 의존할 수 있다. 또한, 이들이, 예를 들어, 단백질의 폴딩 효율또는 폴딩 안정성에 필수적인 것으로 입증된다면, 돌연변이유발로부터 리간드-결합 포켓의 영역에서 단일 아미노산 위치를 배제시키는데 유리한 증거가 될 수 있다. 리포칼린 돌연변이유발의 특이적 올리고뉴클레오티드-기반 방법은, 예를 들어, 미국 공개특허 20060058510호에 기재되어 있는데, 상기 문헌은 참고문헌으로써 본 명세서에 포함된다.
돌연변이유발을 거친 코딩 핵산 서열을 발현시킨 후, 주어진 리간드(예를 들어, 사람 혈청 알부민)에 결합하는 안티칼린에 관한 유전자 정보를 나르는 클론이 획득된 라이브러리의 다양한 클론으로부터 선택될 수 있다. 공지의 발현 전략 및 선택 전략은 이러한 클론의 선별에 대해 실행될 수 있다. 이러한 종류의 방법은 재조합 항체 단편의 생산 또는 조작의 문맥, 예컨대, "파지 디스플레이" 기술 또는 "콜로니 스크리닝" 방법에 기재되어 있다(Skerra et al., Anal. Biochem. 196 (1991), 151-155).
"파지 디스플레이" 기술의 설명은, 예를 들어, 하기 문헌들에서 발견된다: Hoess, Curr. Opin. Struct. Biol. 3 (1993), 572-579; Wells and Lowman, Curr. Opin. Struct. Biol. 2 (1992), 597-604; 및 Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins - A Laboratory Manual (1996), Academic Press. 요약하면, 대표적인 구체예에서, N-말단에 신호 서열, 바람직하게는 OmpA-신호 서열을 지니며, C-말단에, 파지 코트내로 통합되는, 파지 M13의 코트 단백질 pIII(Model and Russel, in "The Bacteriophages", Vol. 2 (1988), Plenum Press, New York, 375-456) 또는 이 코트 단백질의 단편을 지니는 융합 단백질로서 돌연변이된 리포칼린 구조 유전자의 발현을 달성하는 플라스미드가 생산된다. 천연 코트 단백질 pIII의 아미노산 217 내지 406 만을 함유하는, 파지 코트 단백질의 C-말단 단편 ApIII가, 바람직하게는, 융합 단백질을 생산하는데 사용된다. 특히, 위치 201에서의 시스테인 잔기는 소실되거나 또 다른 아미노산을로 대체된, pIII로부터의 C-말단 단편이 선호된다. 특이적 결합 특성을 보유한 "안티칼린"의 생산에 있어서 리포칼린에 적용될 수 있는 파지 디스플레이 방법, 선별 방법 등에 관한 추가 설명은 예를 들어, 미국 공개특허 20060058510호에 상세히 기재되어 있으며, 상기 문헌의 전체 내용은 참고문헌으로써 본 명세서에 포함된다.
안티칼린은, 예를 들어, 상기한 방법을 사용하여, 주어진 리간드(예를 들어, 사람 혈청 알부민)에 대한 높은 친화력을 소유하도록 식별되고 생산될 수 있다. 안티칼린의 경우 106 M-1 이상의 리간드 결합 상수가 달성될 수 있는데, 심지어 신규한 리간드가 Bbp의 본래 리간드인, 빌리버딘(biliverdin) IXγ에 대한 어떠한 구조적 연관관계를 지니지 않는 경우라 할지라도 그러하다(미국 공개특허 20060058510호 참조). 안티칼린으로 달성가능한 신규한 리간드의 그러한 친화력은 2차 면역 반응으로부터 항체에 관해 알려진 친화력과 견줄 수 있다. 더욱이, 그에 따라 획득된 신규한 라이브러리로부터 훨씬 더 높은 친화력을 지니는 변이체를 선별하기 위해 생산된 안티칼린이 추가의, 임의의 부분 무작위 돌연변이유발을 거치게 될 가능성이 추가적으로 존재한다. 상응하는 절차가 "친화력 성숙"을 위하여 재조합 항체 단편의 경우에 관해 이미 소개되었으며(Low et ah, J. Mol. Biol. 260 (1996), 359-368; Barbas and Burton, Trends Biotechnol. 14 (1996), 230-234), 또한 상기 절차는 당업계의 통상의 기술자에 의해 상응하는 방식으로 안티칼린에 대해 적용될 수 있다.
스태필로코쿠스 단백질 A(SPA)/애피바디
실시예 20: 혈청 알부민 결합 부분의 선별을 통한 혈청 알부민-결합 애피바디(스태필로코쿠스 단백질 A(SPA)) 비-면역글로불린 스캐폴드를 포함하는 이중-특이적 리간드의 제조
스태필로코쿠스 단백질 A(SPA)의 Z 도메인은 본 발명의 이중-특이적 리간드로 사용하기 위한 사람 혈청 알부민-결합 SPA-유래 비-면역글로불린 스캐폴드 분자 ("애피바디"로 지칭됨)를 생산하기 위해 라이브러리 선별 및, 임의로 친화력 성숙 기법을 거치게 된다.
사람 혈청 알부민이 고정된 SPA 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는지 여부를 평가하기 위해 비아코어(Biacore)에 의한 실시간 결합 분석이 수행된다. (당업계의 통상의 기술자는 결합 친화력이, 예를 들어, 표지된 사람 혈청 알부민의 침전, 경쟁적 비아코어 검정 등을 포함하는 임의의 적절한 방법을 사용하여 평가될 수 있음을 인지할 것이다.) 사람 혈청 알부민에 대해 결합 친화력이 없거나 낮은(예를 들어, μM 범위이거나 이를 초과하는 범위의 Kd 값을 나타내는) 비변형된 SPA 폴리펩티드의 검출후, 표적 항원에 대하여 당해 분자의 결합 친화력을 부여하고/거나 증강시키기 위해 고안된 하기 방법들 중 하나 이상을 포함하는 다수의 전략들 중 하나 이상의 전략이 SPA 폴리펩티드에 사람 혈청 알부민 결합 특성을 부가하기 위해 사용된다.
SPA 스캐폴드 폴리펩티드(들)의 사람 혈청 알부민 결합은 하기한 것 및/또는 달리 당업계에 공지된 병렬적 및/또는 반복적 선별 방법과 임의로 조합하여, 돌연변이유발 방법을 통해 달성 및 최적화된다. SPA 스캐폴드 폴리펩티드 도메인은 아래에 기재된 바와 같이 수행된, 무작위 돌연변이유발 및/또는 NNK 돌연변이유발을 거치게 된다. 그러한 돌연변이유발은 SPA 폴리펩티드의 Z 도메인의 전체 또는 SPA 폴리펩티드내의 특정 서열, 예를 들어, 문헌[Nord et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15: 772-77]에서 확인된 것과 같은 도메인 Z의 13개의 용매-접근가능 표면 잔기에 대해 수행되며, 신규하거나 개선된 사람 혈청 알부민-결합 폴리펩티드를 발달시키기 위해 임의로 무작위화된다. PCR이 SPA 폴리펩티드내의 표적화된 서열에 걸쳐 서열 다양성의 발생을 야기시키는, 그러한 돌연변이유발 방법을 수행하기 위해 사용된다. (이와 같은 접근법은 dAb 라이브러리 제조에 관해 아래에 기술된 방법과 유사하다.) 무작위 돌연변이유발 방법 이외에, 구조 정보가 사람 혈청 알부민의 결합에 결정적인 SPA 폴리펩티드의 특정 아미노산 잔기를 확립시키는 곳에 표적화된 아미노산 잔기의 직접 돌연변이유발이 사용된다. 특정 구체예에서, 돌연변이 Z 도메인 유전자의 레퍼토리가 조립되고 1가 파지 디스플레이를 위한 개조된 파지미드 벡터내로 삽입된다. 예를 들어, 수백만개의 변형체(transformants)를 포함하는 라이브러리가 예를 들어, 돌연변이유발을 위한 NTST(G/T) 또는 대안적인 (C/A/G)NN 축퇴성을 사용하여 제작된다.
상기한 바와 같이 조작된 SPA 폴리펩티드는 사람 혈청 알부민 결합에 대해 최적화된 그러한 SPA 폴리펩티드를 확인하기 위해 병렬적 및/또는 반복적 선별 방법을 거친다. 예를 들어, 돌연변이유발된 SPA 폴리펩티드 서열의 라이브러리의 생산후, 상기 폴리펩티드의 라이브러리는, dAb의 라이브러리로부터 혈청 알부민-결합 dAb의 선별에 대해 아래에 기재된 것과 같이, 파지상에 디스플레이되고 혈청 알부민 결합 및/또는 증식을 요하는 복수의 선별 라운드를 거치게 된다. 사람 혈청 알부민 표적 단백질에 대한 바이오패닝(biopanning)이 혈청 알부민 결합 SPA 분자에 대한 유의미한 농축(enrichment)을 달성하기 위해 수행된다. 이어서 선별된 클론은 E. coli에서 발현되고 SDS-PAGE, 원형 2색성 분광분석, 및 이특이적 상호작용 분석에 의한 사람 혈청 알부민에 대한 결합 연구에 의해 분석된다. 사람 혈청 알부민에 결합하는 SPA 분자(애피바디)는 천연 Z 도메인과 유사한 2차 구조를 지니고 μM 범위 또는 이보다 큰 범위(예를 들어, nM 또는 pM)로 이들 각각의 표적에 대한 마이크로몰 해리 상수(Kd)를 지닐 것으로 예상된다.
임의로, 선별은 면역튜브(immunotubes) 상에 고정된 혈청 알부민 또는 용액 중의 비오티닐화된 혈청 알부민에 대해 수행된다. 임의로, 결합 친화력은 μM 범위 또는 이를 초과하는 범위로 사람 혈청 알부민 결합 친화력 Kd 값을 이상적으로 달성시키는 완전히 최적화된 SPA-유래 폴리펩티드와 함께, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 및 비아코어(Karlsson et al., 1991)(비아코어 시스템(Uppsala, Sweden)을 사용함)를 사용하여 측정된다.
사람 혈청 알부민에 결합하는 SPA 폴리펩티드의 확인후, 이와 같은 폴리펩티드는 이후 아래에 기재된 방법들 중 임의의 방법에 의해 이중-특이적 리간드 조성물을 생산하는데 사용된다.
스태필로코쿠스 단백질 A(SPA) 애피바디 폴리펩티드
박테리아 수용체의 용매-노출 표면은 무작위 돌연변이유발에 후속하여, 예를 들어, 그러한 수용체 분자에 대한 혈청 알부민의 결합 친화력을 부여하기 위한 표현형 선별의 표적이 될 수 있다. 그러한 단백질은 특이하게 안정할 수 있는데, 이러한 안정성은 이들 단백질이 다양한 적용에 적합하게 만든다(Alexander et al. (1992) Biochemistry 31: 3597-3603). 특히, 나선 번들 구조를 함유하는 박테리아 수용체의 경우, 형태(conformation)는 나선 패킹 인터페이스에 연루되지 않은 잔기의 측쇄내 변화에 대한 내성이 있을 것으로 기대될 수 있다. 그러한 분자는 스태필로코쿠스 단백질 A(SPA)의 비교적 작은(58개 잔기) IgG-결합 도메인 B와 도메인 Z로 지정된 도메인 B의 합성 유사체이다(Nilsson et al. (1987) Protein Engineering 1: 107-113).
SPA-유래 도메인 Z는 신규한 결합 특성을 지니는 도메인 변이체를 제작하기 위한 스캐폴드로서 활용되는 SPA의 주요 도메인이다(예를 들어, 전체로 참고문헌으로 본 명세서에 포함되는, WO 00/63243호 및 WO 95/19374호를 참조). SPA Z 도메인은 조합 파지미드 라이브러리의 제작을 위한 스캐폴드로서 사용되는 58개의 아미노산 잔기로 구성된 무-시스테인 3중-나선 번들 도메인이며, 상기 라이브러리로부터 파지 디스플레이 기술을 사용하여 요망되는 분자를 표적으로 삼는 변이체가 선별된다(Nilsson et al. 1987 Protein Eng. 1: 107-113; Nord et al. 1997 Nat. Biotechnol. 15: 772-777; Nord et al. 2000 J. Biotechnol. 80: 45-54; Hansson et al. 1999 Immunotechnology 4: 237-252; Eklund et al., 2002 Proteins 48: 454-462; Ronnmark et al. 2002 Eur. J. Biochem. 269: 2647-2655). "애피바디" 분자로 지칭되는, 이와 같은 표적-결합 변이체는, 전형적으로 Z 도메인내 헬릭스 1과 2의 표면 상의 13개의 측쇄(Q9, QlO, Nil, F13, Y14, L17, H18, E24, E25, R27, N28, Q32 및 K35)가 무작위화된(Lendel et al. 2006 J. Mol. Biol. 359: 1293-304), 조합 라이브러리의 파지 디스플레이에 의해 단백질을 표적으로 삼는 결합자(binders)로서 선별된다. 이와 같은 애피바디 분자의 단순하고, 강건한 구조와 더불어, 이들의 낮은 분자량(7 Kda)은 이들 분자가 매우 다양한 적용에 적합하게 만든다. 문헌으로 소개된 효능은 생물공정- 및 실험실-규모의 생체분리(bioseparations)에서 제시되었고(Nord et al. 2000 J. Biotechnol. 80: 45-54; Nord et al. 2001 Eur. J. Biochem. 268: 4269^277; Graslund et al. 2002 J. Biotechnol. 99: 41?50), 아데노바이러스 향성을 조작하기 위해(Henning et al. 2002 Hum. Gene Ther. 3: 1427-1439) 그리고 수용체 상호작용을 억제시키기 위하여(Sandstrom et al. 2003 Protein Eng. 16: 691-697), 검출 시약으로서 애피바디 리간드를 평가한 경우 전도유망한 결과가 획득되었다(Karlstrom and Nygren 2001 Anal. Biochem. 295: 22-30; Ronnmark et al. 2002 J. Immunol. Methods 261: 199-211). 따라서, 예를 들어, 사람 혈청 알부민에 결합하는 조작된 애피바디 리간드는 본 발명의 특정 이중-특이적 리간드 조성물의 요망되는 성분이다.
스태필로코쿠스 단백질 A의 Z 도메인에서 유래된 폴리펩티드의 라이브러리는 당업계에 공지되고/거나 아래에 기재된 바와 같은 임의의 돌연변이유발 방법에 의해 제조될 수 있다. 그러한 폴리펩티드 라이브러리의 생성후, 요망되는 표적 분자(예를 들어, 사람 혈청 알부민)에 결합할 수 있는 변이체가, 예를 들어, 시험관내 선별 기술, 예컨대, 파지 디스플레이(Dunn 1996; Smith and Patrenko 1997; Hoogenboom et al. 1998), 리보좀 디스플레이(Hanes and Pluckthun 1997; He and Taussig 1997), 플라스미드 상의 펩티드(Schatz 1993) 또는 박테리아 디스플레이(Georgiou et al. 1997)를 사용하여 효율적으로 선별 및 확인될 수 있다. 그러한 선별을 위해, 라이브러리 크기(복잡성(complexity))와 더 높은 친화력(KD = 10-8 M 또는 그 미만)을 갖는 분리된 결합체에 대한 가능성 사이의 상관관계가 이론적으로 고려되고(Perelson and Oster 1979) 실험적으로 입증된다(Griffiths et al. 1994; Vaughan et al. 1996; Aujame et al. 1997).
애피바디는, 예를 들어 (i) 더 낮은 제조 비용; (ii) 더 작은 크기; (iii) 증가된 안정성 및 강건성; 및 (iv) 바이러스 오염에 관한 위험을 미연에 방지하는, 박테리아 숙주내에서 재조합적으로, 또는 화학 합성에 의해 생산되는 능력과 같은, 관용적인 항체를 능가하는 몇몇 이점을 갖는다.
애피바디는 스태필로코쿠스 단백질 A(SPA) 도메인의 유도체인 폴리펩티드이고, 상기 SPA 도메인은 B 또는 Z 도메인이고, 여기서 다수의 아미노산 잔기는 다른 아미노산 잔기들로 대체되며, 상기 대체는 상기 SPA 도메인의 기본 구조 및 안정성의 실질적인 손실없이 이루어지며, 상기 대체는 결과적으로 표적 항원(예를 들어, 사람 혈청 알부민)의 하나 이상의 도메인과 상기 폴리펩티드의 상호작용 능력을 초래한다. 치환된 아미노산 잔기의 수는 1 내지 약 30, 또는 1 내지 약 13일 수 있다. 다른 가능한 범위는 4 내지 약 30개; 4 내지 약 13개; 5 내지 약 20개, 또는 5 내지 약 13개 아미노산 잔기들이다. 우선적으로 Z-도메인의 표면에 위치한 아미노 잔기들이 치환될 수 있고, 번들의 코어가 분자의 구조적 특성을 보존시키기 위해 그대로 유지되어야 한다는 것은 예를 들어, 문헌[Nord et al. 1997 Nat. Biotechnol. 15: 772-777]으로부터, 당업자에 의해 이해될 것이다.
애피바디의 제조를 위한 공정은, 예를 들어, WO 00/63243호에 설명되어 잇으며, 본 발명의 목적을 위해, 예를 들어, 하기 단계를 포함할 수 있다: (i) 예를 들어, 파지 디스플레이(검토를 위해, 예를 들어, 문헌[Kay, K. et al. (eds.) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, ISBN 0-12-4023 80-0)참조), 리보좀 디스플레이(검토를 위해, 예를 들어, 문헌[Hanes, J. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 14130-14135)]참조) 또는 세포 디스플레이(검토를 위해, 예를 들어, 문헌[Daugherty, P. S. et al. (1998) Protein Eng. 11: 825-832)] 참조)에 의한, SPA 도메인 B 또는 Z에서 유래된 폴리펩티드 변이체의 레퍼토리를 구현하는 단백질 라이브러리로부터의 폴리펩티드 변이체를 디스플레이하는 단계; (ii) 사람 혈청 알부민에 결합하는 폴리펩티드를 발현하는 클론을 선별하는 단계; 및 (iii) 선별된 클론의 재조합 발현 또는 화학 합성으로 폴리펩티드를 생산하는 단계.
아비머
실시예 21: CDR 이식을 통한 혈청 알부민-결합 아비머를 포함하는 이중-특이적 리간드의 제조
dAb7h14의 CDR 도메인을 사용하여 하기 방식으로 사람 혈청 알부민에 결합하는 아비머 폴리펩티드를 제작한다. dAb7h14의 CDR1(RASQWIGS QLS; 서열번호:_ ), CDR2(WRSSLQS; 서열번호:_ ), 및 CDR3(AQGAALPRT; 서열번호: _ ) 서열은, 각각, 잔기 17-28, 49-53 및 78-85에서 C2 모노머(전체로 참고문헌으로써 본 명세서에 포함되는, US 공개특허 2005/0221384호에 기재됨)내로 이식되는데, 상기 잔기들은 각각 C2 모노머의 루프 영역 1, 2 및 3을 구성한다. 비아코어에 의한 실시간 결합 분석을 수행하여 사람 혈청 알부민이 특이적으로 dAb7h14의 항-사람 혈청 알부민 CDR 도메인을 포함하는 고정된 C2-유래 모노머 폴리펩티드에 결합하는지 여부를 평가한다. (당업계의 통상의 기술자는 결합 친화력이 예를 들어, 표지된 사람 혈청 알부민의 침전, 경쟁적 비아코어 검정 등을 포함하는, 임의의 적절한 방법을 사용하여 평가될 수 있음을 인지할 것이다.) 사람 혈청 알부민 친화력이 없거나 낮게 검출되면(예를 들어, μM 범위 또는 이를 초과하는 범위의 Kd 값), 결합 친화력에 기여하는 하기 방법들 중 임의의 방법을 포함하는, 다수의 전략들 중 하나 이상의 전략이 CDR-이식된 C2 모노머(및/또는 아비머 이량체, 삼량체 및 기타 고차 반복 조성물)의 사람 혈청 알부민 결합 특성을 개선시키기 위해 사용된다.
천연 C2 모노머 (및/또는 아비머 조성물로 사용된 다른 천연 모노머) 내부의 용매-노출 루프 영역에 상응하는 초기 C2 모노머 폴리펩티드(및/또는 반복적으로-생산된 아비머 이량체, 삼량체 등 폴리펩티드)의 dAb7h14 CDR-이식된 영역의 길이(들)은 링커 폴리펩티드의 사용을 통해 조정된다. 예를 들어, dAb7h14의 9개 아미노산 잔기 CDR3 펩티드 서열은, 예를 들어, dAb7h14 CDR3 폴리펩티드 서열의 N- 또는 C-말단 플랭크(flanks) 중 어느 하나 및/또는 둘 모두 상에 위치된 0 내지 4개 잔기 길이의 아미노산 링커를 사용하여 13개 아미노산 잔기 길이로 연장될 수 있고, 그로 인해 C2 단량체 폴리펩티드의 루프 3에 상응하는 CDR3-이식된 도메인 내부의 13개 아미노산의 총 이식된 펩티드 서열 길이가 달성된다. (예를 들어, CDR-이식된 C2 단량체 폴리펩티드 내부의 CDR과 C2 단량체 폴리펩티드 서열 둘 모두의 최적화를 통해) CDR-이식된 C2 단량체 폴리펩티드(들)의 사람 혈청 알부민 결합 능력을 개선시키기 위해, 이와 같은 링커 폴리펩티드(들)의 사용은 (예를 들어, 하기한 것과 같은 돌연변이유발 최적화 절차를 사용하여) 링커 서열, CDR 서열 및/또는 비-CDR C2 단량체 폴리펩티드 서열의 돌연변이유발과 임의로 조합된다. 그러한 목적을 위해 사용된 폴리펩티드 링커는 미리결정된 서열을 소유하거나, 임의로, 링커-함유 CDR-이식된 C2 단량체 폴리펩티드의 사람 혈청 알부민 결합 능력의 평가를 통해 무작위화된 폴리펩티드 링커 서열군으로부터 선택된다.
최적화 방법은 병렬적으로 및/또는 반복적으로 수행된다. 병렬적 및 반복적 최적화(예를 들어, 친화력 성숙) 과정 둘 모두가 폴리펩티드 결합 특성의 최적화를 위해 유용한 아래에 기재되고/거나 당업계에 공지된 것과 같은 선별 방법들을 사용한다.
dAb7h14 CDR을 제공하는 CDR-이식된 C2 단량체 폴리펩티드(들)(및/또는 아비머 이량체, 삼량체 등 반복적으로-생산된 고차 조성물, 또는 결합에 기여하는 개별적인 추가 단량체)의 사람 혈청 알부민 결합은 아래에 기재되고/되거나 달리 당업계에 공지된 것과 같은 병렬 및/또는 반복 선별 방법과 임의로 조합하여, 돌연변이유발을 통해 최적화된다. 대표적인 C2 단량체 스캐폴드 폴리펩티드의 경우, 이식된 dAb7h14 CDR 폴리펩티드 서열을 에워싼 도메인은 아래에 기재된 바와 같이 수행되는, 무작위화된 돌연변이유발 및/또는 NNK 돌연변이유발을 거치게 된다. 그러한 돌연변이유발은, 예를 들어, US 공개특허 2005/0221384호에 설명된 바와 같이, 선별된 아미노산 잔기에 대하여 C2 단량체 폴리펩티드 서열 내부에 임의로 수행되거나, 모든 비-CDR 아미노산 잔기에 대해 임의로 수행되며, 신규하거나 개선된 사람 혈청 알부민-결합 폴리펩티드를 개발하기 위해 임의로 무작위화된다. 임의로, CDR-이식된 C2 단량체 폴리펩티드 내부에 제공된 dAb7h14 CDR 폴리펩티드 도메인은, 예를 들어, 무작위 돌연변이유발, NNK 돌연변이유발, 룩-스루(look-through) 돌연변이유발 및/또는 기타 당업계-인지된 방법을 통해 돌연변이유발을 거치게 된다. PCR은 임의로 그러한 돌연변이유발 방법을 수행하는데 사용되며, 그 결과 CDR-이식된 C2 단량체 폴리펩티드 내부의 표적 서열에 걸쳐 서열 다양성을 생성을 야기시킨다. 이와 같은 접근법은 dAb 라이브러리 제조에 관하여 아래에 기재된 접근법과 유사하다. 무작위 및/또는 룩-스루 돌연변이유발 방법 이외에, 표적화된 아미노산 잔기의 직접 돌연변이유발이 구조 정보는 사람 혈청 알부민의 결합에 결정적인 특정 아미노산 잔기들을 확립시키는 곳에 사용된다.
상기한 바와 같이 조작된 이식된 dAb7h14 CDR 서열을 포함하는 C2 단량체 폴리펩티드(및/또는 개별 단량체를 포함하는 반복적으로 생산된 아비머 조성물)는 사람 혈청 알부민 결합에 관해 최적화된 그러한 C2 단량체 폴리펩티드(및 아비머 조성물)을 확인하기 위해 병렬적 및/또는 반복적 선별 방법을 거치게 된다. 예를 들어, dAb7h14 CDR-이식된 C2 단량체 폴리펩티드 서열의 라이브러리의 생산후, 이와 같은 폴리펩티드의 라이브러리는, dAb의 라이브러리로부터 혈청 알부민-결합 dAb의 선별에 관해 아래에 기재된 것과 같이, 파지 상에 디스플레이되고 혈청 알부민 결합 및/또는 증식을 요하는 다수의 선별 라운드를 거치게 된다. 임의로, 선별은 면역튜브 상에 고정된 혈철 알부민 또는 용액중의 비오티닐화된 혈청 알부민에 대해 수행된다. 임의로, 결합 친화력은 nM 범위 또는 이를 초과하는 범위로 사람 혈청 알부민 결합 친화력 Kd 값을 이상적으로 달성시키는 C2-유래 단량체를 포함하는 완전히 최적화된 아비머와 함께, 표면 플라스몬 공명(SPR)과 비아코어(Karlsson et al., 1991)(비아코어 시스템(Uppsala, Sweden)을 사용)를 사용하여 결정된다.
사람 혈청 알부민에 결합하는 C2 단량체-유래 폴리펩티드의 확인시, 그러한 초기 단량체의 사람 혈청 결합 특성은 다른 단량체와 그러한 단량체의 조합, 후속하여 추가의 돌연변이유발 및/또는 선별을 통해 추가로 향상될 수 있으며, 그로 인해 사람 혈청 알부민에 대한 특이적인 친화력을 소유한 아비머 조성물이 형성된다. 사람 혈청 알부민에 대한 친화력을 소유한 아비머 조성물의 확인후, 그러한 아비머 폴리펩티드는 이후 아래에 기재된 방법들 중 임의의 방법에 의해 이중-특이적 리간드 조성물을 제조하는데 사용된다.
실시예 22: 혈청 알부민 결합 부분의 선별을 통한 혈청 알부민-결합 아비머 비-면역글로불린 스캐폴드를 포함하는 이중-특이적 리간드의 제조
본 명세서에서 설명된 것과 같은 천연 C2 단량체 폴리펩티드는 라이브러리 선별 및, 임의로 친화력 성숙 기술을 거치고 난 다음, 추가 단량체(예를 들어, 사람 혈청 알부민 친화력이 임의로 병렬적으로 최적화될 수 있는, 피브로넥틴 단량체)와 결합되며 임의로 라이브러리 선별 및, 임의로 본 발명의 이중-특이적 리간드에 사용하기 위한 사람 혈청 알부민-결합 아비머 비-면역글로불린 스캐폴드 분자를 생산하기 위해 친화력 성숙 기술을 반복적으로 거치게 된다.
비아코어에 의한 실시간 결합 분석은 사람 혈청 알부민이 고정된 C2 단량체 폴리펩티드(및/또는 반복적으로-생산된 아비머 분자)에 특이적으로 결합하는지 여부를 평가하기 위해 수행된다. 사람 혈청 알부민에 대한 결합 친화력이 없거나 낮은(예를 들어, μM 범위 또는 이를 초과하는 범위의 Kd 값) C2 단량체 폴리펩티드의 검출후, 결합 친화력에 기여하는 하나 이상의 하기 방법들을 포함하는, 다수의 전략들 중 하나 이상의 전략이, C2 단량체 폴리펩티드에 대한 사람 혈청 알부민 결합 특성을 부여하기 위해 사용된다.
C2 단량체 폴리펩티드(들)(및/또는 반복적으로 생산된 아비머 이량체, 삼량체 등의 분자)의 사람 혈청 알부민 결합은 아래 기재되고/거나 달리 당업계에 공지된 병렬적 및/또는 반복적 선별 방법과 임의로 조합하여, 돌연변이유발 방법을 통해 달성 및 최적화된다. C2 단량체 폴리펩티드 도메인은, 아래에 기재된 것과 같이 수행되는, 무작위화 돌연변이유발 및/또는 NNK 돌연변이유발을 거치게 된다. 이와 같은 돌연변이유발은 C2 단량체 폴리펩티드의 전체에 대해 또는 C2 단량체 폴리펩티드 내부의 특이 서열에 대해, 예를 들어, 미국 공개특허 2005/0221384호에 설정된 것과 같은 선별된 아미노산 잔기에 대해 수행되고, 임의로 신규하거나 개선된 사람 혈청 알부민-결합 폴리펩티드를 발달시키기 위해 임의로 무작위화된다. PCR은 그러한 돌연변이유발 방법을 수행하는데 임의로 사용되어, 그 결과 C2 단량체 폴리펩티드 및/또는 아비머 분자 내부의 표적화된 서열에 걸쳐 서열 다양성의 생성을 초래한다. (이와 같은 접근법은 dAb 라이브러리 제조에 관해 아래에 기재된 방법과 유사하다.) 무작위 돌연변이유발 방법 이외에, 표적화된 아미노산 잔기의 직접 돌연변이유발이 구조 정보가 사람 혈청 알부민의 결합에 결정적인 C2 단량체의 특이 아미노산 잔기 및/또는 아비머 분자를 확립시키는 곳에 사용된다.
위에 기재된 것과 같이 조작된 C2 단량체 폴리펩티드는 사람 혈청 알부민 결합에 대해 최적화된 그러한 C2 단량체 폴리펩티드 및/또는 아비머 분자를 확인하기 위한 병력적 및/또는 반복적 선별 방법을 거치게 된다. 예를 들어, 돌연변이유발된 C2 단량체 폴리펩티드 서열의 라이브러리의 생산후, dAb의 라이브러리로부터 혈청 알부민-결합 dAb의 선별에 관하여 아래에 기재된 바와 같이, 폴리펩티드의 상기 라이브러리는 파지상에 디스플레이되고 혈청 알부민 결합 및/또는 증식을 요하는 다수의 선별 라운드를 거치게 된다. 임의로, 선별 라운드는 추가의 단량체 서브유닛이 신규한 아비머 분자를 형성하기 위해 첨가되는 반복을 포함할 수 있다. 임의로, 선별은 면역튜브상에 고정된 혈청 알부민에 대해 또는 용액 중의 비오티닐화된 혈청 알부민에 대해 수행된다. 임의로, 결합 친화력은 nM 범위 또는 이를 초과하는 범위로 사람 혈청 알부민 결합 친화력 Kd 값을 이상적으로 달성시키는 C2-유래 단량체를 포함하는 완전히 최적화된 아비머와 함께, 표면 플라스몬 공명(SPR)과 비아코어(Karlsson et al., 1991)(비아코어 시스템(Uppsala, Sweden)을 사용)를 사용하여 결정된다.
사람 혈청 알부민에 결합하는 C2 단량체-유래 폴리펩티드의 확인시, 그러한 초기 단량체의 사람 혈청 결합 특성은 다른 단량체와 그러한 단량체의 조합, 후속하여 추가의 돌연변이유발 및/또는 선별을 통해 추가로 향상될 수 있으며, 그로 인해 사람 혈청 알부민에 대한 특이적인 친화력을 소유한 아비머 조성물이 형성된다. 사람 혈청 알부민에 대한 친화력을 소유한 아비머 조성물의 확인후, 그러한 아비머 폴리펩티드는 이후 아래에 기재된 방법들 중 임의의 방법에 의해 이중-특이적 리간드 조성물을 제조하는데 사용된다.
아비머 폴리펩티드의 생산 및 이의 사용
아비머는 시험관내 엑손 셔플링 및 파지 디스플레이에 의해 사람 세포외 수용체 도메인의 거대 패밀리로부터 발달되어, 결합 및/또는 억제 특성을 지니는 멀티도메인 단백질을 생성시킨다. (예를 들어, 표적 단백질, 예를 들어, 사람 혈청 알부민에 대한 결합을 위한 반복적 방식으로, 선별된) 다수의 독립 결합 도메인을 연결하는 것은 결합력(avidity)을 생성시키고 결과적으로 관용적 단일-에피토프 결합 단백질과 비교하여 개선된 친화력과 특이성을 야기시킨다. 다른 잠재적인 이점은 E. coli내에서 다표적-특이적(multitarget-specific) 분자의 단순하고 효율적인 생산, 개선된 열안정성 및 프로테아제에 대한 저항성을 포함한다. 표적 단백질에 대한 nM 이하(sub-nM)의 친화력을 소유한 아비머가 생산될 수 있다. 예를 들어, 세포-기반 분석에서 0.8 pM IC50으로 인터루킨 6를 억제하는 아비머가 생물학적으로 활성있는 아비머로 생산 및 특성결정되었다(Silverman et al. 2005 Nature Biotechnology 23: 1556-1561; 또한, 예를 들어, 각각이 이의 전체로서 본 명세서에 참고문헌으로 여기에 통합되는, 미국 공개특허 2005/0221384호, 2005/0164301호, 2005/0053973호 및 2005/0089932호, 2005/0048512호, 및 2004/0175756호를 참조).
아비머 합성은 A 도메인의 사람 레퍼토리로부터 유래된 파지 디스플레이 라이브러리를 포함한다. 합성 재조합은 문헌[Silverman et al. (2005) Nature Biotechnology 23: 1556-1561]에 기재된 바와 같이, 고도로 다양한 단량체 풀을 생성시키는데 사용된다. 단량체의 풀의 제조후, 상기 풀은 표적 단백질(예를 들어, 사람 혈청 알부민)에 대해 스크리닝된다. 초기 후보자는 확인되고, 추가 단량체가 부가되고, 그 결과 얻어진 이량체 라이브러리가 후보 표적-결합 이량체를 확인하기 위해 상기 표적 단백질에 대해 스크리닝된다. 이후 이 방법은 표적 단백질에 대한 매우 높은 결합 친화력을 지니는 삼량체를 획득하기 위해 반복되며, 임의로, 고급(higher order) 후보자 복합체를 확인하기 위해 추가로 반복될 수 있다. 표적 단백질에 대해 높은 친화력 및 특이성을 갖고 결합하는 것으로 확인된 후보 복합체는 아비머("결합력 다량체")로 명명된다.
아비머의 단량체 도메인은 임의 크기의 폴리펩티드 쇄일 수 있다. 예를 들어, 단량체 도메인은 약 25 내지 약 500개, 약 30 내지 약 200개, 약 30 내지 약 100개, 약 90 내지 약 200개, 약 30 내지 약 250개, 약 30 내지 약 60개, 약 9 내지 약 150개, 약 100 내지 약 150개, 약 25 내지 약 50개, 또는 약 30 내지 약 150개 아미노산을 가질 수 있다. 유사하게, 아비머의 단량체 도메인은, 예를 들어, 약 30 내지 약 200개 아미노산; 약 25 내지 약 180개 아미노산; 약 40 내지 약 150개 아미노산; 약 50 내지 약 130개 아미노산; 또는 약 75 내지 약 125개 아미노산을 포함할 수 있다. 단량체 도메인과 면역-도메인은 전형적으로 용액중에서 안정한 형태를 유지할 수 있다. 때때로, 아비머의 단량체 도메인과 면역-도메인은 안정한 형태로 독립적으로 폴딩될 수 있다. 안정한 형태는 금속 이온에 의해 안정화될 수 있다. 안정한 형태는 임의로 이황화 결합(예를 들어, 1, 2, 또는 3개 이상의 이황화 결합)을 함유할 수 있다. 이황화 결합은 임의로 2개의 시스테인 잔기들 사이에 형성될 수 있다.
단량체 도메인 및 모자이크 단백질에 대해 기재된 간행물 및 이 간행물 내에서 인용된 참고문헌들은 하기 문헌들을 포함한다: Hegyi, H and Bork, P. 1997 J. Protein Chem., 16: 545-551; Baron et al. 1991 Trends Biochem. Sd. 16: 13-17; Ponting et al. 2000 Adv. Protein Chem. 54: 185-244; Doolittle 1995 Annu. Rev. Biochem 64: 287-314; Doolitte and Bork 1993 Scientific American 269: 50-6; 및 Bork 1991 FEBS letters 286: 47-54. 아비머에 사용된 단량체 도메인은 또한 Pfam 데이터베이스와 SMART 데이터베이스에서 발견된 그러한 도메인들을 포함할 수 있다. 문헌[Schultz et al. 2000 Nucleic Acid Res. 28: 231-34] 참조.
아비머 조성물에서 사용하기에 특히 적합한 단량체 도메인은 (1) β-샌드위치 도메인; (2) β-배럴(barrel) 도메인; 또는 (3) 이황화 결합을 포함하는 시스테인-풍부 도메인이다. 아비머에서 전형적으로 사용되는 시스테인-풍부 도메인은 α-헬릭스, β-시트, 또는 β-배럴 구조를 형성하지 않는다. 전형적으로, 이황화 결합은 3차원 구조로 상기 도메인의 폴딩을 촉진시킨다. 일반적으로, 시스테인-풍부 도메인은 2개 이상의 이황화 결합, 더 전형적으로 3개 이상의 이황화 결합을 지닌다.
아비머의 단량체 도메인은 임의 개수의 특징들을 지닐 수 있다. 예를 들어, 이 도메인은 동물(예를 들어, 사람)에서 낮은 면역원성을 지니거나 면역원성을 지니지 않을 수 있다. 도메인은 작은 크기를 가질 수 있는데, 예를 들어, 도메인은 충분히 작아서 피부 또는 다른 조직을 투과할 수 있다. 도메인은 생체내에서 소정 범위의 반감기 또는 안정성을 보유할 수 있다.
아비머 조성물에 사용하기에 적합한 예시적인 단량체 도메인은, 예를 들어, EGF-유사 도메인, 크링글(Kringle)-도메인, 피브로넥틴 타입 I 도메인, 피브로넥틴 타입 II 도메인, 피브로넥틴 타입 III 도메인, PAN 도메인, GIa 도메인, SRCR 도메인, 쿠니츠(Kunitz)/우 췌장 트립신 억제자 도메인(Bovine pancreatic trypsin Inhibitor domain), 카잘형 세린 프로테아제 억제자 도메인(Kazal-type serine protease inhibitor domain), 트레포일(Trefoil)(P-타입) 도메인, 폰 빌레브란드 인자 타입 도메인(von Willebrand factor type C domain), 아나필라톡신-유사 도메인(Anaphylatoxin-like domain), CUB 도메인, 티로글로불린(thyroglobulin) 타입 I 반복체, LDL-수용체 클래스 A 도메인, 스시(Sushi) 도메인, 링크(Link) 도메인, 트롬보스폰딘( Thrombospondin) 타입 I 도메인, 티로글로불린 단량체 도메인, 면역글로불린-유사 도메인, C-형 렉틴 도메인, MAM 도메인, 폰 빌레브란드 인자 타입 A 도메인, 소마토메딘 B 도메인, WAP-타입 4개 이황화 코어 도메인, F5/8 타입 C 도메인, 헤모펙신(Hemopexin) 도메인, SH2 도메인, SH3 도메인, 라미닌-타입 EGF-유사 도메인, C2 도메인, 당업계의 통상이 기술자에게 공지된 기타 그러한 도메인을 비롯한 이의 유도체 및/또는 변이체를 포함한다. 미국 공개특허 20050221384호는 LDL-수용체 패밀리내 분자에서 발견된 단량체 도메인의 다양한 대표적 형태에 대한 도식적 도표를 제공한다.
적합한 단량체 도메인(예를 들어, 독립적으로 폴딩되는 능력 또는 일부 제한된 보조(assistance)를 수반하는 도메인)은 단순 모듈 구조 연구 도구(Simple Modular Architecture Research Tool(SMART)(문헌[Shultz et al. 2000 Nucleic Acids Research 28: 231-234] 참조)로서 그러한 컴퓨터 서열 분석 도구 또는 CATH(문헌[Pearl et al. 2000 Nucleic Acids Research 28: 277-282] 참조)에 의해 규정된 β-샌드위치 또는 β-배럴 3차원 구조를 함유하는 단백질 도메인의 패밀리로부터 선택될 수 있다. 아비머의 대표적인 단량체 도메인은 또한 피브로넥틴 타입 III 도메인, 안티칼린 도메인 및 CTLA-4로부터의 Ig-유사 도메인의 도메인을 포함한다. 3가지 도메인의 일부 양상이 WO 01/64942호(Lipovsek et al.), WO99/16873호(Beste et al.), 및 WO 00/60070호(Desmet et al.)에 기재되어 있고, 상기 문헌들의 내용은 이의 전체로 참고문헌으로써 여기에 통합된다.
아비머의 단량체 도메인은 임의로 시스테인 풍부하다. 적합한 시스테인 풍부 단량체 도메인은, 예를 들어, LDL 수용체 클래스 A 도메인("A-도메인") 또는 EGF-유사 도메인을 포함한다. 단량체 도메인은 또한 음으로 하전된 잔기들의 무리를 지닐 수 있다. 임의로, 단량체 도메인은 반복된 서열, 예컨대, β-프로펠러(Propeller) 도메인에서 발견되는, YWTD를 함유한다. 아비머에 사용하기에 적합한 또 다른 대표적인 단량체 도메인은 C2 도메인이다. 돌연변이유발 표적화를 위해 가장 바람직할 수 있는 아미노산 잔기(예를 들어, 표면-노출 루프 잔기)의 대표적인 선별을 포함하는, 아비머 생산에 유용한 대표적인 A 도메인 및 C2 도메인 서열 및 컨센서스 서열은 미국 공개특허 2005/0221384호에 기재되어 있다.
단량체 도메인을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드(핵산으로도 지칭됨)는 전형적으로 발현을 통해 단량체 도메인을 제조하는데 사용된다. 단량체 도메인을 엔코딩하는 핵산은 다양한 상이한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 단량체 도메인의 라이브러리는 천연적으로 생성되는 단량체 도메인, 변형된 단량체 도메인(즉, 단량체 도메인 변이체), 또는 이의 조합물을 엔코딩하는 복수의 상이한 핵산을 발현시킴으로써 제조될 수 있다.
선별되거나 요망되는 리간드(예를 들어, 사람 혈청 알부민) 또는 리간드의 혼합물에 결합하는 단량체 도메인은 임의로 아비머 생산에서 초기 단계에서와 같이, 확인된다. 일부 구체예에서, 단량체 도메인 및/또는 면역-도메인은 요망되는 특성(예를 들어, 사람 혈청 알부민에 대한 결합 친화력)에 대해 확인 또는 선별되괴고 이후 단량체 도메인 및/또는 면역-도메인은 다량체로 형성된다. 그러한 구체예의 경우, 요망되는 특성(예를 들어, 사람 혈청 알부민 결합)을 지니는 도메인의 선별을 야기시키는 임의의 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 이 방법은 복수의 상이한 핵산을 제공하는 단계(각각의 핵산은 단량체 도메인을 엔코딩함); 상기 복수의 상이한 핵산을 번역시키고, 그로 인해 복수의 상이한 단량체 도메인을 제공하는 단계; 요망되는 리간드 또는 리간드의 혼합물의 결합에 대한 상기 복수의 상이한 단량체 도메인을 스크리닝하는 단계; 및, 상기 요망되는 리간드 또는 리간드의 혼합물에 결합하는 상기 복수의 상이한 단량체 도메인의 일원을 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
아비머 생산을 위한 단량체 도메인은 천연적으로-생성되거나 변형될 수 있다(비-천연 변이체). 용어 "천연적으로 생성된"은 목적물이 자연에서 발견될 수 있음을 나타내기 위해 본 명세서에서 사용된다. 예를 들어, 천연 단량체 도메인은 사람 단량체 도메인 또는 임의로, 상이한 종 또는 공급원, 예를 들어, 포유동물, 영장류, 설치류, 어류, 조류, 파충류, 식물 등에서 유래된 도메인을 포함할 수 있다. 천연적으로 생성되는 단량체 도메인은 다수의 방법들, 예를 들어, 게노믹 DNA 또는 cDNA의 PCR 증폭에 의해 획득될 수 있다. 본 명세서에 사용된, 용어 "천연의"는 돌연변이유발 또는 달리 아래에 기재된 방법들 중 임의의 방법의 수행을 통해 변형되지 않은 핵산 및/또는 폴리펩티드에 대한 설명에 사용된다.
아비머의 단량체 도메인은 천연적으로-생성된 도메인 또는 비-천연적으로 생성된 변이체일 수 있다. 아비머의 합성에 사용된 단량체 도메인의 라이브러리는 천연적으로-생성된 단량체 도메인, 비-천연적으로 생성된 단량체 도메인 변이체, 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다.
다양한 레포팅 디스플레이 벡터 또는 시스템은 단량체 도메인과 아비머를 엔코딩하는 핵산을 발현시키기 위해, 요망되는 활성(예를 들어, 사람 혈청 알부민 결합)에 대해 시험하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 시스템은 단량체 도메인이 파지 표면 상에서 융합 단백질로 발현되는 시스템이다(Pharmacia, Milwaukee Wis.). 파지 디스플레이는, 전형적으로 박테리오파지 코트 단백질과의 융합체로서, 필라멘트형 박테리오파지의 표면에 단량체 도메인 및/또는 면역-도메인을 엔코딩하는 폴리펩티드 서열의 제시(presentation)를 포함할 수 있다. 친화력 성숙(enrichment) 및 파지 디스플레이의 대표적인 방법은, 예를 들어, PCT 공개특허 91/17271호, 91/18980호, 91/19818호 및 93/08278호에 설명되어 있으며, 상기 문헌들은 이의 전체로 참고문헌으로써 본 명세서에 통합된다.
다른 디스플레이 시스템의 예는 리보좀 디스플레이, 뉴클레오티드-연관 디스플레이(예를 들어, 미국 특허 6,281,344호; 6,194,550호, 6,207,446호, 6,214,553호, 및 6,258,558호를 참조), 세포 표면 디스플레이 등을 포함한다. 세포 표면 디스플레이는, 다양한 세포, 예를 들어, E. coli, 효모 및/또는 포유동물 세포를 포함한다. 세포가 디스플레이로 사용되는 경우, 핵산, 예를 들어, PCR 증폭에 뒤이어 분해로 얻어진 핵산은, 상기 세포내로 도입되고 번역된다. 임의로, 단량체 도메인 또는 아비머를 엔코딩하는 폴리펩티드가, 예를 들어, 주입에 의해, 세포내로 도입될 수 있다.
아래에서 그리고 종래 기술에 기재된 바와 같이, 아비머는 다량체 조성물이다. 대표적인 구체예에서, 다량체는 2개 이상의 단량체 도메인 및/또는 면역-도메인을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 다량체는 2 내지 약 10개의 단량체 도메인 및/또는 면역-도메인, 2 내지 약 8개의 단량체 도메인 및/또는 면역-도메인, 약 3 내지 약 10개의 단량체 도메인 및/또는 면역-도메인, 약 7개의 단량체 도메인 및/또는 면역-도메인, 약 6의 단량체 도메인 및/또는 면역-도메인, 약 5의 단량체 도메인 및/또는 면역-도메인, 또는 약 4의 단량체 도메인 및/또는 면역-도메인을 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 다량체는 3개 이상의 단량체 도메인 및/또는 면역-도메인을 포함한다. 전형적으로, 단량체 도메인은 관심있는 표적 분자(예를 들어, 사람 혈청 알부민)에 대한 결합에 대해 사전-선별된다.
아비머 내부의, 각각의 단량체 도메인은 한 표적 분자(예를 들어, 사람 혈청 알부민)에 특이적으로 결합할 수 있다. 임의로, 각각의 단량체는 표적 분자 상의 (에피토프에 유사한) 상이한 위치에 결합한다. 동일한 표적 분자에 결합하는 다수의 단량체 도메인 및/또는 면역-도메인은 각각의 개별 단량체와 비교하여 표적 분자에 대한 다량체 아비머의 개선될 결합력을 초래하는 결합력 효과를 야기시킬 수 있다. 임의로, 다량체는 표적 단백질(예를 들어, 사람 혈청 알부민)에 대한 단독의 단량체 도메인의 결합력의 약 1.5배 이상, 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 50배 이상 또는 100배의 결합력을 소유할 수 있다.
선별된 단량체 도메인은 다량체(아비머)를 형성하기 위해 링커에 의해 연결될 수 있다. 예를 들어, 링커는 다량체내의 각각의 별개의 분리된 단량체 도메인들 사이에 위치한다. 전형적으로, 면역-도메인은 또한 링커 부분을 통해 각자 서로에게 연결되거나 단량체 도메인에 연결된다. 함께 면역-도메인 변이체를 연결하는데 용이하게 사용될 수 있는 링커 부분은 단량체 도메인 변이체의 다량체에 대해 기재된 것과 동일하다. 면역-도메인 변이체를 다른 도메인으로 연결시켜 다량체로 연결하는데 적합한 대표적인 링커 부분은 본 명세서에 기재되어 있다.
아비머를 형성하기 위해 링커를 통해 선별된 단량체 도메인을 연결시키는 것은 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 선별된 단량체 도메인을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드의 조합 조립은 DNA 라이게이션, 또는 임의로, PCR-기반의, 자가-프라이밍 중첩 반응에 의해 달성될 수 있다. 링커는 단량체가 표적 단량체에 결합하는 이의 능력에 대해 확인되기 전에 또는 단량체가 표적 다량체에 결합하는 능력에 대해 선별된 후 단량체에 부착될 수 있다.
위에 언급된 바와 같이, 아비머를 포함하는 폴리펩티드(들)은 변형될 수 있다. 이러한 폴리펩티드를 엔코딩하는 변형 또는 변화된 핵산 서열을 제조하기 위한 다양한 다양성을 생성시키는 절차에 관한 설명은 위에 기재되어 있고 아래의 다음과 같은 간행물과 이 간행물내에서 인용된 참고문헌들에 기재되어 있다: Soong, N. et al, Molecular breeding of viruses, (2000) Nat Genet 25(4):436-439; Stemmer, et al., Molecular breeding of viruses for targeting and other clinical properties, (1999) Tumor Targeting 4:1-4; Ness et al., DNA Shuffling of subgenomic sequences of subtilisin, (1999) Nature Biotechnology 17:893-896; Chang et al., Evolution of a cytokine using DNA family shuffling, (1999) Nature Biotechnology 17:793-797; Minshull and Stemmer, Protein evolution by molecular breeding, (1999) Current Opinion in Chemical Biology 3:284- 290; Christians et al., Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling, (1999) Nature Biotechnology 17:259-264; Crameri et al., DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution, (1998) Nature 391:288-291; Crameri et al., Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling, (1997) Nature Biotechnology 15:436-438; Zhang et al., Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Patten et al., Applications of DNA Shuffling to Pharmaceuticals and Vaccines, (1997) Current Opinion in Biotechnology 8:724-733; Crameri et al., Construction and evolution of antibody-phage library by DNA shuffling, (1996) Nature Medicine 2:100-103; Crameri et al., Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling, (1996) Nature Biotechnology 14:315-319; Gates et al., Affinity selective isolation of ligands from peptide library through display on a lac repressor "headpiece dimer" (1996) Journal of Molecular Biology 255:373-386; Stemmer, Sexual PCR and Assembly PCR, (1996) In: The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers, New York. pp. 447- 457; Crameri and Stemmer, Combinatorial multiple cassette mutagenesis creates all the permutant of mutant and wildtype cassettes, (1995) BioTechniques 18:194-195; Stemmer et al., Single-step assembly of a gene and entire plasmid form large numbers of oligodeoxy-ribonucleotides, (1995) Gene, 164:49-53; Stemmer, The Evolution of Molecular Computation, (1995) Science 270:1510; Stemmer. Searching Sequence Space, (1995) Bio/Technology 13:549-553; Stemmer, Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, (1994) Nature 370:389-391; 및 Stemmer, DNA shuffling by random frgmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751.
다양성을 생성시키는 돌연변이 방법은, 예를 들어, 위치-지정 돌연변이유발 (Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis: an overview, (1997) Anal Biochem. 254(2): 157-178; Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, (1996) Methods Mol. Biol. 57:369-374; Smith, In vitro mutagenesis, (1985) Ann. Rev. Genet. 19:423-462; Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, (1985) Science 229:1193-1201; Carter, Site-directed mutagenesis, (1986) Biochem. J. 237:1-7; and Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, (1987) in nucleic acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlin)); 우라실 함유 주형을 사용하는 돌연변이유발(Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, (1987) Methods in Enzymol. 154, 367-382; and Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, (1988) Science 242:240-245); oligonucleotide-directed mutagenesis ((1983) Methods in Enzymol. 100: 468-500; (1987) Methods in Enzymol. 154: 329-350; Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutant in any DNA frgments, (1982) Nucleic Acids Res. 10:6487-6500; Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA frgments cloned into M13 vectors, (1983) Methods in Enzymol. 100:468-500; 및 Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, (1987) Methods in Enzymol. 154:329-350); 포스포티오에이트-변형된 DNA 돌연변이유발(Taylor et al., The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, (1985) Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764; Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotide-directed mutant at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, (1985) Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787; Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, (1986) Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698; Sayers et al., Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, (1988) Nucl. Acids Res. 16:791-802; 및 Sayers et al., Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 803-814); 갭이 있는 이중나선 DNA를 사용한 돌연변이유발(Kramer et al., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, (1984) Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456; Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, (1987) Methods in Enzymol. 154:350-367; Kramer et al., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 7207; 및 Fritz et al., Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999)을 포함한다.
추가의 적합한 방법은 점 미스매치 수선(point mismatch repair)(Kramer et al., Point Mismatch Repair, (1984) Cell 38:879-887), 수선-결함 숙주 균주를 사용한 돌연변이유발 (Carter et al., Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M 13 vectors, (1985) Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443; 및 Carter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors, (1987) Methods in Enzymol. 154: 382-403), 결실 돌연변이유발(Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, (1986) Nucl. Acids Res. 14: 5115), 제한-선별과 제한-정제(Wells et al., Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, (1986) Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423), 전체 유전자 합성에 의한 돌연변이유발(Nambiar et al., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, (1984) Science 223: 1299-1301; Sakamar and Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein(transducin), (1988) Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372; Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, (1985) Gene 34:315-323; and Grundstrom et al., oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale v shot-gun" gene synthesis, (1985) Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316), double-strand break repair (Mandecki, oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181; 및 Arnold, Protein engineering for unusual environments, (1993) Current Opinion in Biotechnology 4:450-455)을 포함한다. 상기 방법들 중 많은 방법들에 대한 추가 세부내용은, 문헌[Methods in Enzymology Volume 154]에서 찾아 볼 수 있으며, 상기 문헌은 또한 다양한 돌연변이유발 방법들의 문제해결 문제들에 대한 유용한 콘트롤에 대해 기재하고 있다.
다양한 다양성 생성 방법에 관한 추가 세부내용은 하기 미국 특허, PCT 공개공보 및 출원서, 및 EPO 출원서에서 찾아 볼 수 있다: 미국 특허 5,605,793호(Stemmer (Feb. 25, 1997), "Methods for In Vitro Recombination"); 미국 특허 5,811,238호(Stemmer et al. (Sep. 22, 1998) "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative selection and Recombination"); 미국 특허 5,830,721호(Stemmer et al. (Nov. 3, 1998), "DNA mutagenesis by Random frgmentation and Reassembly"); 미국 특허 5,834,252호(Stemmer, et al. (Nov. 10, 1998) "End-Complementary Polymerase Reaction"); 미국 특허 5,837,458호(Minshull, et al. (Nov. 17, 1998), "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering"); WO 95/22625호(Stemmer and Crameri, "Mutagenesis by Random frgmentation and Reassembly"); WO 96/33207호(Stemmer and Lipschutz "End Complementary Polymerase Chain Reaction"); WO 97/20078호(Stemmer and Crameri "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination"); WO 97/35966호(Minshull and Stemmer, "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering"); WO 99/41402호(Punnonen et al. "Targeting of Genetic Vaccine Vectors"); WO 99/41383호(Punnonen et al. "Antigen Library Immunization"); WO 99/41369(호Punnonen et al. "Genetic Vaccine Vector Engineering"); WO 99/41368호(Punnonen et al. "Optimization of Immunomodulatory Properties of Genetic Vaccines"); EP 752008호(Stemmer and Crameri, "DNA mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly"); EP 0932670호(Stemmer "Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Sequence Recombination"); WO 99/23107호(Stemmer et al., "Modification of Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling"); WO 99/21979호(Apt et al., "Human Papillomavirus Vectors"); WO 98/31837호(del Cardayre et al. "Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination"); WO 98/27230호(Patten and Stemmer, "Methods and Composition for Polypeptide Engineering;" WO 98/27230(Stemmer et al., "Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence Shuffling and Selection"); WO 00/00632호("Methods for Generating Highly Diverse Library"); WO 00/09679호("Methods for Obtaining in Vitro Recombined Polynucleotide Sequence Banks and Resulting Sequence"); WO 98/42832호(Arnold et al., "Recombination of Polynucleotide Sequence Using Random or Defined Primers"); WO 99/29902호(Arnold et al., "Method for Creating Polynucleotide and Polypeptide Sequence"); WO 98/41653호(Vind, "An in Vitro Method for Construction of a DNA Library"); WO 98/41622호(Borchert et al., "Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling") 및 WO 98/42727호(Pati and Zarling, "Sequence Alterations using Homologous Recombination"); WO 00/18906(Patten et al., "Shuffling of Codon-Altered Genes"); WO 00/04190(del Cardayre et al. "Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Recombination"); WO 00/42561(Crameri et al., "Oligonucleotide Mediated Nucleic Acid Recombination"); WO 00/42559(Selifonov and Stemmer "Methods of Populating Data Structures for Use in Evolutionary Simulations"); WO 00/42560호(Selifonov et al., "Methods for Making Character Strings, Polynucleotides & Polypeptides Having Desired Characteristics"); WO 01/23401호(Welch et al., "Use of Codon-Varied oligonucleotide Synthesis for Synthesis Shuffling"); 및 PCT/USO 1/06775호("Single-Stranded Nucleic Acid Template-Mediated Recombination and Nucleic Acid Frgment Isolation" by Affholter).
본 발명에 사용되는 폴리펩티드(예를 들어, 아비머)는 임의로 세포에서 발현된다. 다량체 도메인은 당업계에 잘 알려진 발현 시스템을 사용하여 단일 단백질로서 합성될 수 있다. 위에 언급한 많은 문헌들 이외에, 핵산, 예컨대, 단량체 도메인, 선별된 단량체 도메인, 다량체 및/또는 선별된 다량체를 발현시키는데 적절한 벡터, 프로모터의 용도 및 다른 많은 주제를 포함하는, 본 명세서에 유용한 분자 생물학 기술을 기재하는 일반 교재는 하기 문헌들을 포함한다: Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 ("Sambrook") and Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 1999) ("Ausubel")). 중합효소 연쇄 반응(PCR), 리가아제 연쇄 반응(LCR), Q-레플리카제 증폭 및 다른 RNA 중합효소 매개 기술(예를 들어, NASBA)을 포함하는, 단량체 도메인 및 다량체 코딩 핵산을 식별, 분리 및 클로닝하는데 유용한, 시험관내 증폭 방법으로 당업자를 인도하기에 충분한 기술의 일예는, 문헌[Berger, Sambrook, and Ausubel]을 비롯한 하기 문헌들에서 확인된다: Mullis et al., (1987) U.S. 특허 출원 4,683,202호; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al. eds) Academic Press Inc. San Diego, Calif. (1990) (Innis); Arnheim & Levinson (Oct. 1, 1990) C&EN 36-47; The Journal OfNIH Research (1991) 3, 81-94; (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,1173; Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87,1874; Lomell et al. (1989) J. Clin. Chem 35, 1826; Landegren et al., (1988) Science 241, 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8, 291-294; Wu and Wallace, (1989) Gene 4, 560; Barringer et al. (1990) Gene 89, 117, 및 Sooknanan and Malek (1995) Biotechnology 13: 563-564. 시험관내에서 증폭된 핵산을 클로닝하는 개선된 방법은 문헌[Wallace et al., 미국 특허 5,426,039호]에 기재되어 있다. PCR에 의해 거대 핵산을 증폭시키는 개선된 방법은 문헌[Cheng et al. (1994) Nature 369: 684-685]과 상기 문헌내의 참고문헌에 요약되어 있으며, 최대 40kb의 PCR 앰플리콘(amplicons)이 생성된다. 당업자는 본질적으로 임의의 RNA가 제한효소 절단, PCR 확장 및 역 전사효소 및 중합효소를 사용하는 서열분석에 적합한 이중 가닥 DNA로 전환될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
예를 들어, 단량체 도메인 및/또는 아비머를 엔코딩하는 벡터는 숙주 세포로 도입되고, 재조합 기술에 의해 생산 및/또는 선별될 수 있다. 숙주 세포는 일반적으로 그러한 벡터로 조작(즉, 형질도입, 형질전환 또는 트랜스펙션)되는데, 상기 벡터는, 예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있다. 벡터는 플라스미드, 바이러스 입자, 파지 등의 형태로 존재할 수 있다. 조작된 숙주 세포는 프로모터 활성화, 형질전환체 선별, 또는 관심있는 단량체 도메인, 선별된 단량체 도메인, 다량체 및/또는 선별된 다량체 유전자(들) 증폭을 위해 적절하게 변형된 관용적인 영양 배지에서 배양될 수 있다. 온도, pH 등과 같은, 배양 조건은, 발현을 위해 선별된 숙주 세포와 더불어 이전에 사용된 그러한 조건이며, 당업계에서 그리고, 예를 들어, 문헌[Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley-Liss, New York] 및 상기 문헌에 인용된 참고문헌을 포함하는 본 명세서에서 인용된 참조문헌으로 통상의 기술자에게 자명할 것이다.
본 발명의 폴리펩티드는 또한 비동물 세포, 예컨대, 식물, 효모, 곰팡이, 박테리아 등에서 생산될 수 있다. 실제로, 곳곳에서 언급된 바와 같이, 파지 디스플레이는 그러한 폴리펩티드를 생산하기 위한 특히 적절한 기술이다. 문헌[Sambrook, Berger 및 Ausubel] 이외에, 세포 배양에 관한 세부내용은 하기 문헌들에서 찾아 볼 수 있다: Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, N. Y.; Gamborg and Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) and Atlas and Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, F1a.
아비머는 또한 약리학 특성을 개선시키거나, 면역원성을 감소시키거나, 다량체 및/또는 단량체 도메인의 세포 또는 조직내 운송(예를 들어, 혈-뇌 장벽을 통하거나, 피부를 통한 운송)을 촉진시키는 단량체 도메인, 면역-도메인 및/또는 다량체의 변형을 지닐 수 있다. 이러한 유형의 변형은 다양한 변형(예를 들어, 당-그룹의 첨가 또는 당화), PEG5의 첨가, 특정 단백질(예를 들어, HSA 또는 다른 혈청 단백질)에 결합하는 단백질 도메인의 첨가, 세포내, 세포밖 및 세포를 관통하는 이동 또는 운송 신호를 보내는 단백질 단편 또는 서열의 첨가를 포함한다. 부가적인 성분들이 또한 다량체 및/또는 단량체 도메인의 특성을 조작하기 위해 상기 다량체 및/또는 단량체 도메인에 부가될 수 있다. 또한, 예를 들어, 공지의 수용체에 결합하는 도메인(예를 들어, Fc 수용체에 결합하는 Fc-영역 단백질 도메인), 독소(들) 또는 독소의 일부분, 다량체 또는 단량체 도메인을 활성화시키기 위해 임의로 절단될 수 있는 프로도메인, 리포터 분자(예를 들어, 녹색 형광 단백질), 리포터 분자에 결합하는 성분(예컨대, 방사선요법용 방사성핵종, 비오틴 또는 아비딘) 또는 변형들의 조합을 포함하는, 다양한 성분들이 부가될 수 있다.
본 명세서에 사용된, "유도된 발달(directed evolution)"은 순환(recursive) 과정으로 폴리뉴클레오티드 변이체가 생성되고, 발현되고, 활성(예를 들어, 사람 혈청 알부민 표적 단백질에 대한 결합 활성을 지니는 폴리펩티드)에 대하여 스크리링되는 과정을 의미한다. 스크리닝에서 하나 이상의 후보자가 선별되고 이후 과정은 신규한 변이체를 생성시키기 위해 선별된 후보자를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 반복된다. 유도된 발달은 2회 이상의 변이 생성(variation generation) 라운드를 포함하며, 3, 4, 5, 10, 20회 또는 그 이상의 변이 생성 및 선별 라운드를 포함할 수 있다. 변이는, 예를 들어, 실수-유발(error-prone) PCR, 유전자 셔플링, 화학적 돌연변이유발 등을 포함하는, 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다.
용어 "셔플링"은 동일하지 않은 서열들 간의 재조합을 나타내기 위해 본 명세서에서 사용된다. 몇몇 구체예에서, 셔플링은 cre/lox 및/또는 flp/frt 시스템과 같은 상동성 재조합 또는 비상동성 재조합을 통한 교차를 포함할 수 있다. 셔플링은, 예를 들어, 시험관내 및 생체내 셔플링 포맷, 인실리코(in silico) 셔플링 포맷, 이중-가닥 또는 단일-가닥 주형을 활용하는 셔플링 포맷, 프라이머 기반 셔플링 포맷, 핵산 단편화-기반 셔플링 포맷, 및 올리고뉴클레오티드-매개 셔플링 포맷(상기 모든 포맷은 동일하지 않은 서열들 간의 재조합 사건에 기초하고 있으며 본 명세서의 아래에서 더 상세히 기재되거나 참조되어 있음)을 비롯한, 기타 유사 재조합-기반 포맷을 포함하는, 다양한 상이한 포맷을 사용함으로써 수행될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "무작위"는 2개 이상의 아미노산으로 구성되며 확률적(stochastic) 과정 또는 무작위 과정에 의해 제작된 폴리뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 의미한다. 무작위 폴리뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열은 프레임워크 또는 스캐폴딩 모티프를 포함할 수 있으며, 상기 서열은 불변 서열을 포함할 수 있다.
GwEL 및 GroES
실시예 24: CDR 이식을 통한 혈청 알부민-결합 cpn10(GroES) 비-면역글로불린 스캐폴드를 포함하는 이중-특이적 리간드의 제조
dAb7h14의 CDR3 도메인이 하기 방식으로 사람 혈청 알부민에 결합하는 cpn10 (GroES) 비-면역글로불린 스캐폴드 폴리펩티드를 제작하는데 사용된다. dAb7h14의 CDR3(AQGAALPRT; 서열번호:_ ) 서열이 위치 19-27(모바일(mobile) 루프 잔기)에서 천연 cpn10 아미노산 잔기의 대체로 cpn10 폴리펩티드내로 이식된다. 사람 혈청 알부민이 dAb7h14의 항-사람 혈청 알부민 CDR3 도메인을 포함하는 고정된 cpn10-유래 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는지 여부를 평가하기위해 비아코어에 의한 실시간 결합 분석이 수행된다. (당업계의 통상의 기술자는, 예를 들어, 표지된 사람 혈청 알부민의 침전, 경쟁적 비아코어 검정 등을 포함하는, 임의의 적절한 방법을 사용하여 평가될 수 있다는 것을 인지할 것이다.) 검출된 사람 혈청 알부민 친화력이 없거나 낮은 경우(예를 들어, μM 또는 이를 초과하는 범위의 Kd 값), 결합 친화력에 기여하는 하기 방법들 중 임의의 방법을 포함하는, 다수의 전략들 중 하나 이상의 전략이 CDR3-이식된 cpn10 폴리펩티드의 사람 혈청 알부민 결합 특성을 개선하기 위해 사용된다.
천연 cpn10 폴리펩티드 내부의 모바일 루프 영역에 상응하는 cpn10 폴리펩티드의 dAb7h14 CDR3-이식된 영역의 길이는 아미노산 잔기의 결실 및/또는 링커 폴리펩티드의 사용을 통해 조정된다. 예를 들어, dAb7h14의 9개 아미노산 잔기 CDR3 펩티드 서열은, 예를 들어, dAb7h14 CDR3 폴리펩티드 서열의 N- 또는 C-말단 플랭크(flanks) 중 어느 하나 및/또는 둘 모두에 위치한 0 내지 7개의 잔기 길이의 아미노산 링커를 사용하여 16개 아미노산 잔기 길이로 신장되고, 그로 인해 천연 cpn10 서열내 모바일 루프에 상응하는 CDR3-이식된 도메인 내부의 16개 아미노산의 총 이식된 펩티드 서열 길이가 달성된다. 이와 같은 링커 폴리펩티드(들)의 사용은, (예를 들어, CDR3-이식된 cpn10 폴리펩티드 내부의 CDR 및 피브로넥틴 서열 둘 모두의 최적화를 통해) CDR3-이식된 cpn10 폴리펩티드의 사람 혈청 알부민 결합 능력을 개선시키기 위하여, (예를 들어, 아래에 기재된 것과 같은 돌연변이 최적화 절차를 사용하여) 링커 서열, CDR3 서열(들) 및/또는 비-CDR cpn10 서열의 돌연변이유발과 임의로 조합된다. 이와 같은 목적을 위해 사용되는 폴리펩티드 링커는 사전결정된 서열을 보유하거나, 임의로, 링커-함유 CDR3-이식된 cpn10 폴리펩티드의 사람 혈청 알부민 결합의 평가를 통한 무작위화된 폴리펩티드 링커 서열군으로부터 선택된다. 최적화 방법은 병렬적 및/또는 반복적으로 수행된다. 병렬적 및 반복적 최적화(예를 들어, 친화력 성숙) 둘 모두는 아래에 기재되고/거나 폴리펩티드 결합 특성의 최적화에 유용한 것으로 당업계에 공지된 선별 방법을 사용한다.
dAb7h14 CDR3를 제시하는 CDR-이식된 cpn10 폴리펩티드(들)의 사람 혈청 알부민 결합은 임의로 아래에 기재되고/거나 달리 당업계에 공지된 병렬적 및/또는 반복적 선별 방법과 조합하여, 돌연변이유발을 통해 최적화된다. 이식된 dAb7h14 CDR3 폴리펩티드 서열을 에워싸는 cpn10 스캐폴드 폴리펩티드 도메인은, 아래에 기재된 것과 같이 수행되는, 무작위화 돌연변이유발 및/또는 NNK 돌연변이유발을 거치게 된다. 이와 같은 돌연변이유발은 비이식 아미노산 잔기에 대해 cpn10 폴리펩티드 서열내부에서 수행되며, 임의로 신규하거나 개선된 사람 혈청 알부민-결합 폴리펩티드를 개선시키기 위해 임의로 무작위화된다. 임의로, CDR3-이식된 cpn10 폴리펩티드 내부에 존재하는(presented) dAb7h14 CDR3 폴리펩티드 도메인은, 예를 들어, 무작위 돌연변이유발, NNK 돌연변이유발, 룩-스루 돌연변이유발 및/또는 다른 당업계에 인지된 방법을 통해, 돌연변이유발을 거치게 된다. PCR은 이와 같은 돌연변이유발 방법을 수행하는데 사용되며, 그 결과 CDR3-이식된 cpn10 폴리펩티드 내부의 표적화된 서열에 걸쳐 서열 다양성의 생성이 야기된다. 이와 같은 접근법은 dAb 라이브러리 제조를 위한 아래에 기재된 그러한 접근법과 유사하다. 무작위 및/또는 룩-스루 돌연변이유발 방법 이외에, 표적화된 아미노산 잔기의 직접 돌연변이유발이 구조 정보가 사람 혈청 알부민의 결합에 결정적인 특정 아미노산 잔기를 확립시키는 곳에 사용된다.
상기한 바와 같이 조작된 이식된 dAb7h14 CDR3 서열을 포함하는 cpn10 폴리펩티드는 사람 혈청 알부민 결합에 대해 최적화된 그러한 cpn10 폴리펩티드를 확인하기 위해 병렬적 및/또는 반복적 선별 방법을 거치게 된다. 예를 들어, dAb7h14 CDR3-이식된 cpn10 폴리펩티드 서열의 라이브러리의 생산후, 이와 같은 폴리펩티드의 이 라이브러리는 파지상에 디스플레이되고 dAb의 라이브러리로부터 혈청 알부민-결합 dAb의 선별을 위해 아래에 기재된 바와 같이, 혈청 알부민 결합 및/또는 증식을 요하는 다수의 선별 라운드를 거치게 된다. 임의로, 선별은 면역튜브 상에 고정된 혈청 알부민 또는 용액 중의 비오티닐화된 혈청 알부민에 대해 수행된다. 임의로, 결합 친화력은, 사람 혈청 알부민 결합 친화력 Kd 값을 nM 범위 또는 이를 초과하는 범위로 이상적으로 달성시키는 완전히 최적화된 단량체성 및/또는 올리고머 cpn1O-유래 폴리펩티드와 함께, 표면 플라스몬 공명(SPR)과 비아코어(Karlsson et al., 1991)(비아코어 시스템(Uppsala, Sweden)을 사용)를 사용하여 결정된다.
사람 혈청 알부민에 결합하는 단량체성 cpn10-유래 폴리펩티드의 확인시, 이와 같은 초기 단량체의 사람 혈청 결합 특성은, 다른 단량체와 이와 같은 단량체의 조합을 통해, 후속하여 추가의 돌연변이유발 및/또는 선별에 의해 추가로 향상될 수 있으며, 그로 인해 사람 혈청 알부민에 대한 특이적 친화력을 보유한 올리고머성 cpn10/GroES 조성물이 형성된다. 사람 혈청 알부민에 대한 친화력을 보유한 올리고머성 cpn10/GroES 조성물의 확인후, 이와 같은 폴리펩티드는 이후 아래에 기재된 방법들 중 임의의 방법에 의해 이중-특이적 리간드 조성물을 제조하기 위해 사용된다.
실시예 25: 혈청 알부민 결합 부분의 선별을 통한 혈청 알부민-결합 cpn10 비-면역글로불린 스캐폴드를 포함하는 이중-특이적 리간드의 제조
천연 cpn10 폴리펩티드는 라이브러리 선별과, 임의로, 본 발명의 이중-특이적 리간드로 사용하기 위한 사람 혈청 알부민-결합 cpn10 비-면역글로불린 스캐폴드 분자를 생산하기 위해 친화력 성숙 기술을 거치게 된다.
사람 혈청 알부민에 결합하는 천연 cpn10 폴리펩티드의 능력은 상기한 바와 같은 비아코어 검정을 통해 처음에 확정된다. 사람 혈청 알부민에 대한 cpn10 폴리펩티드의 없거나 낮은 결합 친화력(예를 들어, μM 또는 이를 초과하는 범위의 Kd 값)의 검출후, 결합 친화력에 기여하는 하기 방법들 중 하나 이상을 포함하는 다수의 전략들 중 하나 이상의 전략이 cpn10 폴리펩티드에 사람 혈청 알부민 결합 특성을 부여하기 위해 사용된다.
cpn10 스캐폴드 폴리펩티드(들)의 사람 혈청 알부민 결합은, 아래에 기재되고/거나 달리 당업계에 공지된 병렬적 및/또는 반복적 선별 방법과 임의로 좋바하여, 돌연변이유발 방법을 통해 달성 및 최적화된다. cpn10 스캐폴드 폴리펩티드 도메인은 아래에 기재된 것과 같이 수행된, 무작위화 돌연변이유발 및/또는 NNK 돌연변이유발을 거치게 된다. 이와 같은 돌연변이유발은 위치 19-27에 모바일 루프 아미노산 잔기를 포함하는, cpn10 폴리펩티드의 전체 또는 cpn10 폴리펩티드 내부의 특정 서열에 대해 수행되며, 신규하거나 개선된 사람 혈청 알부민-결합 폴리펩티드를 개선시키기 위해 임의로 무작위화된다. PCR은 그러한 돌연변이유발 방법ㅇ르 수행하기 위해 사용되어, 그 결과 cpn10 폴리펩티드 내부의 표적화된 서열에 걸쳐 서열 다양성의 생성이 초래된다. (이와 같은 접근법은 dAb 라이브러리 제조에 대해 아래에 기재한 접근법과 유사하다.) 무작위 돌연변이유발 방법 이외에, 표적화된 아미노산 잔기의 직접 돌연변이유발이 구조 정보가 사람 혈청 알부민의 결합에 결정적인 cpn10 폴리펩티드의 특정 아미노산 잔기를 확립시키는 곳에 사용된다.
상기한 바와 같이 조작된 cpn10 폴리펩티드는 사람 혈청 알부민 결합에 대해 최적화된 그러한 cpn10 폴리펩티드를 확인하기 위해 병력적 및/또는 반복적 선별 방법을 거치게 된다. 예를 들어, 돌연변이유발된 cpn10 폴리펩티드 서열의 라이브러리의 생산후, 상기 폴리펩티드 라이브러리는 파지 상에 디스플레이되고 dAb의 라이브러리로부터 혈청 알부민-결합 dAb의 선별을 위해 아래에 기재한 바와 같이, 혈성 알부민 결합 및/또는 증식을 요하는 다수의 선별 라운드를 거치게 된다. 임의로, 선별은 면역튜브 상에 고정된 혈청 알부민 똔느 용액 중의 비오티닐화된 혈청 알부민에 대해 수행된다. 임의로, 결합 친화력은 사람 혈청 알부민 결합 친화력 Kd 값을 nM 범위 또는 이를 초과하는 범위로 이상적으로 달성하는 완전히 최적화된 단량체성 및/또는 올리고머성 cpn1O-유래 폴리펩티드로, 표면 플라스몬 공명(SPR)과 비아코어(Karlsson et al., 1991)(비아코어 시스템(Uppsala, Sweden)을 사용)를 사용하여 결정된다.
사람 혈청 알부민에 결합하는 단량체성 cpn10-유래 폴리펩티드의 확인시, 이와 같은 초기 단량체의 사람 혈청 결합 특성은, 다른 단량체와 이와 같은 단량체의 조합을 통해, 후속하여 추가의 돌연변이유발 및/또는 선별에 의해 추가로 향상될 수 있으며, 그로 인해 사람 혈청 알부민에 대한 특이적 친화력을 보유한 올리고머성 cpn10/GroES 조성물이 형성된다. 사람 혈청 알부민에 대한 친화력을 보유한 올리고머성 cpn10/GroES 조성물의 확인후, 이와 같은 폴리펩티드는 이후 아래에 기재된 방법들 중 임의의 방법에 의해 이중-특이적 리간드 조성물을 제조하기 위해 사용된다.
GroEL 폴리펩티드
GroEL은 2개의 7원 고리로 정렬된 각각 대략 57.5 Kd 분자 질량의 14개 서브유닛으로 구성된 E. coli의 중요한 분자 샤페론이다(Braig et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sd. 90: 3978-3982). GroEL 고리 시스템내에 거대 공동이 존재하며, 상기 공동은 성공적인 단백질 폴딩 활성을 위해 요구되는 것으로 널리 믿어지고 있다. 최적 활성을 위해, 코-샤페론인, 10 Kd 서브유닛의 7원 고리로 구성된 GroES가 요구된다(Hunt et al. 1996 Nature 379: 37-45). 각각의 GxoES 서브유닛은 GroEL와의 상호작용을 위한 보존된 소수성 트리펩티드를 지니는 모바일 루프를 사용한다(Landry et al. 1993 Nature 364: 255-258). 상기 모바일 루프는 일반적으로 16개 미만의 아미노산 길이이며 GroEL의 정점(apical) 도메인과의 결합을 수반하는 비정렬된(disordered) 루프에서 β-헤어핀으로의 전이를 겪는다(Shewmaker et al. 2001 J Biol. Chem. 276: 31257-31264). GroEL/GroES 복합체의 활성은 ATP를 필요로 한다. GroEL 및 GroES는 모든 개체에 걸쳐 널리 퍼져 있고, 종종 샤페로닌(cpn) 분자, cpn60 및 cpn10으로 각각 지칭된다.
GroEL은 알로스테릭(allosteric) 단백질이다. 알로스테릭 단백질은 특별한 부류의 올리고머성 단백질인데, 리간드와 기질이 결합하는 동안 2개 이상의 상이한 3차원 구조들 사이를 오락가락한다. 알로스테릭 단백질은 종종 생물학에서 조절 과정 또는 기계적 및 물리-화학적 에너지가 상호전환되는 곳에 연루되어 있다. ATP의 역할은 이러한 알로스테릭 변화를 촉발시켜, GroEL이 변성된(denatured) 단백질에 강하게 결합하는 상태로부터 변성된 단백질에 약하게 결합하는 상태로의 전환을 초래한다. 코-샤페론인, GroES는 약한-결합 상태를 선호함으로써 이 과정을 보조한다. GroES는 또한 GroEL의 공동을 밀봉시키는, 캡으로서 역할할 수 있다. 추가로, GroEL에 대한 이의 결합은 변성된 기질의 결합과 직접적으로 경쟁할 가능성이 있다. 순 결과는 이의 변성된 형태로 결합된 기질을 지니는 GroEL에 대한 GroES 및 ATP의 결합이 상기 변성된 기질을 이것이 리폴딩될 수 있는 상기 공동 또는 용액내로 방출시키는 것이다.
GroEL 및 GroES는 임의의 요망되는 특징을 지니는 다량체성 단백질을 생산하기 위해, 단량체성 폴리펩티드 또는 단백질 도메인을 다량체화하기 위해 사용될 수 있는 폴리펩티드 스캐폴드이다. 또한, 예를 들어, 아비머 조성물에 대해 아래에 기재한 것과 같이, 폴리펩티드 단량체를 다량체화시키는 것이 종종 요망될 수 있다.
많은 단백질이 고수율로 생체내에서 폴딩되거나 시험관내에서 리폴딩되도록 하기 위해 분자 샤페론의 보조를 요한다. 분자 샤페론은 단백질인데, 흔히 거대하며 기능하기 위해 ATP와 같은 에너지 공급을 요한다. 대장균 (E. coli)에서 중요한 분자 샤페론은 GroEL인데, GroEL은 2개의 7원 고리로 정렬된 각각 대략 57.5 Kd 분자 질량의 14개 서브유닛으로 구성된다. GroEL 고리 시스템내에 거대 공동이 존재하며, 상기 공동은 성공적인 단백질 폴딩 활성을 위해 요구되는 것으로 널리 믿어지고 있다. 최적 활성을 위해, 코-샤페론인, 10 Kd 서브유닛의 7원 고리로 구성된 GroES가 요구된다. GroEL/GroES 복합체의 활성은 에너지 공급원 ATP를 필요로 한다.
미니샤페론은 도처에 상세하게 기재되어 있다(국제 특허출원 W099/05163호를 참조바라며, 상기 문헌의 개시내용은 참고문헌으로써 본 명세서에 통합된다). 미니샤페론 폴리펩티드는 단량체 형태로 존재할 때 샤페론 활성을 보유하며 ATP의 형태로 에너지를 필요로 하지 않는다. 대략 143-186개 아미노산 잔기 길이의 GroEL의 첨부 도메인의 정의된 단편은 단량체 조건하에서 용액 중에서 또는 단분산되고(monodispersed) 지지체에 부착된 경우 단백질을 지향하는 분자 샤페론 활성을 지닌다.
GroEL 및/또는 GroES 스캐폴드는 재조합 단량체 폴리펩티드의 활성을 능가하는 활성을 지니는 기능성 단백질 올리고머를 형성하기 위해 폴리펩티드의 올리고머화가 허락된다. cpn10은 cpn60/cpnl0 샤페로닌 시스템의 일반적인 성분이다. cpn10의 예는 박테리아 GroES와 박테리오파지 T4 Gp31을 포함하며, 또한 아래에 나열되어 있다. cpn10 패밀리의 추가 일원은 당업계의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이다.
단백질 스캐폴드 서브유닛은 단백질 스캐폴드를 형성하기 위해 조립된다. 이와 같은 스캐폴드는 임의의 형태를 지닐 수 있고 임의 갯수의 서브유닛을 포함할 수 있다. 특정 GroEL 및 GroES 구체예의 경우, 스캐폴드는 2 내지 20개의 서브유닛, 5 내지 15개의 서브유신, 약 10개의 서브유닛을 포함한다. cpn1O 패밀리 일원의 천연적으로 생성된 스캐폴드 구조는, 7원 고리 또는 환의 형태로, 7개의 서브유닛을 포함한다. 그러므로, 특정 구체예에서, 스캐폴드는 7원 고리이다.
표적 단백질(예를 들어, 사람 혈청 알부민)에 대한 친화력을 보유한 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로부터 유래된 CDR3 도메인이거나, 임의로 스캐폴드에 대한 추가 기 또는 분자의 연결을 가능케하는 시스테인과 같은 단일 잔기일 수 있는, 이종성 아미노산 서열은, 폴리펩티드 단량체의 N- 및 C-말단이 올리고머화될 수 있는 단백질 스캐폴드 서브유닛의 서열에 의해 형성되도록 올리고머화될 수 있는 단백질 스캐폴드 서브유닛의 서열내로 삽입될 수 있다. 따라서, 이종성 폴리펩티드는, 예를 들어, 이의 하나 이상의 아미노산을 대체함으로써, 스캐폴드 서브유닛의 서열과 함께 포함된다.
cpn10 서브유닛이 이들의 구조 내부에 "모바일 루프"를 보유하고 있다는 것은 공지되어 있다. 모바일 루프는 E. coli GroES의 아미노산 15와 34 사이, 바람직하게는 아미노산 16 내지 33 사이에 위치하고 있으며, cpn10 패밀리의 다른 일원들 상의 동등한 위치에 위치하고 있다. T4 Gp31의 모바일 루프는 잔기 22 내지 45 사이, 바람직하게는 23 내지 44 사이에 위치하고 있다. 임의로, 이종성 폴리펩티드는 cpn10 패밀리 폴리펩티드의 모바일 루프의 전부 또는 일부를 대체함으로써 삽입될 수 있다. 단백질 스캐폴드 서브유닛이 cpn10 패밀리 폴리펩티드인 경우, 이종성 서열은 더욱이 이의 N- 또는 C-말단에, 또는 cpn10 패밀리 펩티드의 루프 b 헤어핀과 동등한 위치에 통합될 수 있다. 이 위치는 박테리오파지 T4 Gp31의 위치 54와 67 사이, 바람직하게는 55와 66 사이, 바람직하게는 59과 61 사이, 또는 E. coli GroES의 위치 43과 63 사이, 바람직하게는 44와 62 사이, 유리하게는 50과 53 사이에 위치하고 있다.
임의로, 폴리펩티드는 서브유닛 그 자체의 고리 치환(circular permutation)과 연계하여 스캐폴드 서브유닛의 N- 또는 C-말단에 삽입될 수 있다. 고리 치환은 문헌[Graf and Schachman, PNAS(USA) 1996, 93: 11591]에 기재되어 있다. 필수적으로, 폴리펩티드는 기존 N- 및 C-말단의 융합과 신규한 N- 및 C-말단을 생성시키기 위해 도처의 폴리펩티드 쇄의 절단에 의해 고리화된다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 이종성 폴리펩티드는 고리 치환후 형성된 N- 및/또는 C-말단에 포함될 수 있다. 신규한 말단의 형성 부위는 요망되는 특징에 따라 선택될 수 있고, 모바일 루프 및/또는 루프 β 헤어핀을 포함할 수 있다.
유리하게는, 동일 또는 상이할 수 있는, 이종성 서열이 단백질 스캐폴드 서브유닛 내부의 하나 이상의 위치 및/또는 위에서 확인된 위치 이외의 상이한 위치에 삽입될 수 있다. 따라서, 각각의 서브유닛은 2개 이상의 이종성 폴리펩티드를 포함할 수 있는데, 상기 폴리펩티드들은 스캐폴드가 조립될 때 상기 스캐폴드 상에 디스플레이된다. 이종성 폴리펩티드는 스캐폴드 서열내로의 삽입 부위에 의해 제공되는 자유도에 좌우되어, 자유로운 형태 또는 억제된(constrained) 형태로 스캐폴드 서브유닛 상에 디스플레이될 수 있다. 예를 들어, 스캐폴드내의 모바일 또는 β 헤어핀 루프에 플랭킹하는(flanking) 서열의 길이를 변화시키는 것은 스캐폴드내로 삽입된 임의의 이종성 폴리펩티드의 억제도(degree of constraint)를 변화시킬 것이다.
GroEL 및/또는 GroES 조성물은 또한 2개 이상의 단량체를 포함하는 폴리펩티드 올리고머를 포함할 수 있다. 올리고머는 스캐폴드내로 삽입된 2개 이상의 상이한 아미노산 서열을 포함하는, 이종올리고머로서, 또는, 스캐폴드내로 삽입된 서열이 동일한, 동종올리고머(homooligomer)로서 배열될 수 있다.
올리고머를 구성하는 단량체는 각자 서로에 공유적으로 교차연결될 수 있다. 교차연결은, 단량체가 올리고머로서 최초부터(ab initio) 발현되도록, 재조합 접근법에 의해 수행될 수 있으며; 대안적으로, 교차연결은 스캐폴드내 Cys 잔기에서 수행될 수 있다. 예를 들어, GroES 스캐폴드의 위치 50과 53 사이 또는 cpn10 패밀리의 다른 일원 상의 동등한 위치에 삽입된 독특한 Cys 잔기가, 스캐폴드 서브유닛과 교차-연결되도록 사용될 수 있다.
스캐폴드 서브유닛내로 삽입된 이종성 폴리펩티드의 특성은 원하는대로 선택될 수 있다. 특정 구체예에서, 항체 또는 이의 단편, 예컨대 scFv, 천연 또는 천연 또는 카멜화된(camelised) VH 도메인과 VH CDR3 단편을 디스플레이하는 스캐폴드 단백질이 합성된다.
대표적인 구체예에서, 올리고머화될 수 있는 폴리펩티드 단량체는 위에 기술되고/거나 WO 00/69907호에 설명된 대로 제조될 수 있는데, 상기 문헌은 이의 전체로 참고문헌으로써 본 명세서에 통합된다. 이와 같은 제조 방법은 올리고머화될 수 있는 단백질 스캐폴드의 서브유닛을 엔코딩하는 핵산 사열내로 이종성 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 서열을 삽입시키는 단계, 그 결과 얻어진 핵산을 발현 벡터내로 통합시키는 단계, 폴리펩티드 단량체를 생산하기 위해 상기 핵산을 발현시키는 단계를 포함할 수 있다. 임의로, 폴리펩티드 올리고머는 이후 상기한 바와 같이 생산된 폴리펩티드 단량체를 올리고머로 결합시키는 단계를 포함하는 과정을 통해 생산될 수 있다. 특정 구체예에서, 단량체는 올리고머를 형성하기 위해 교차-연결된다.
특정 구체예에서, 스캐폴드 폴리펩티드는 cpn1O/HsplO 패밀리의 일원, 예컨대, GroES 또는 이의 유사체에 기초한다. 고도로 선호되는 유사체는 T4 폴리펩티드 Gp31이다. Gp31을 포함하는, GroES 유사체는, 스캐폴드에 이종성 폴리펩티드를 융합시키기 위해, 삽입되거나, 대체될 수 있는, 모바일 루프를 소유한다(Hunt, J. F., et al, (1997) Cell 90, 361-371; Landry, S. J., et al, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 11622-11627).
cpn10 상동체는 동물, 식물 및 박테리아에 걸쳐 널리 퍼져있다. 예를 들어, GenBank 검색은 cpn10 상동체가 하기 종들에서 공지되어 있음을 나타낸다: 악티노바실루스 악티노미세템코미탐(Actinobacillus actinomycetemcomitam); 악티노바실루스 플레우롭네우모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae); 에어로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida); 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens); 알로크로마티움 비노섬(Allochromatium vinosum); 아메바 프로테우스(Amoeba proteus) 공생 박테리아; 아퀴펙스 에오리쿠스(Aquifex aeolicus); 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana); 바실루스 종(Bacillus sp); 바실루스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus); 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis); 바르토넬라 센세래(Bartonella henselae); 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis); 보렐리아 브르그도르페리(Borrelia burgdorferi); 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus); 부크네라 아피디콜라(Buchnera aphidicola); 버콜데리아 세파시아(Burkholderia cepacia); 버콜데리아 비에트나미엔시스(Burkholderia vietnamiensis); 캅필로박터제주니(Campylobacterjejuni); 카울로박터 크레센투스(Caulobacter crescentus); 클라미디아 무리다룸(Chlamydia muridarum); 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis); 클라미도필라 뉴모니애(Chlamydophila pneumoniae); 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum); 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens); 클로스트리디움 써모셀룸(Clostridium thermocellum); 콜리파지(coliphage) T-카우드리아 루미난티움(Cowdria ruminantium); 시아넬레 시아노포라 파라독사(Cyanelle Cyanophora paradoxa); 에리키아 카니스(Ehrlichia canis); 에리키아 차페엔시스(Ehrlichia chaffeensis); 에리키아 에퀴(Ehrlichia equi); 에리키아 파고사이토피라(Ehrlichia phagocytophila); 에리키아 리스티시(Ehrlichia risticii); 에리키아 센네트수(Ehrlichia sennetsu); 에리키아종(Ehrlichia sp) 'HGE 제제; 엔테로박터 애로게네스(Enterobacter aerogenes); 엔테로박터 아그로머란스(Enterobacter agglomerans); 엔테로박터 암니게누스(Enterobacter amnigenus); 엔테로박터 아슈리애(Enterobacter ashuriae); 엔테로박터 게르고비애(Enterobacter gergoviae); 엔테로박터 인터메디우스(Enterobacter intermedius); 에르위니아 아피디콜라(Erwinia aphidicola); 에르위니아 카로토보라(Erwinia carotovora); 에르위니나 허비콜라(Erwinia herbicola); 에쉐리키아 콜리(Escherichia coli); 프란시셀라 투라렌시스(Francisella tularensis); 글리신 맥스(Glycine max); 해모필루스 두크레이(Haemophilus ducreyi); 해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) Rd; 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori); 홀로스포라 옵투사(Holospora obtusa); 호모 사피엔스(Homo sapiens); 클렙시엘라 오르니티놀티카(Klebsiella ornithinolytica); 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca); 클렙시엘라 플란티콜라(Klebsiella planticola); 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae); 락토바실루스 헬베틱티스(Lactobacillus helvetictis); 락토바실루스(Lactobacillus 7eae); 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis); 로소니아 인트라셀루라리스(Lawsonia intracellularis); 렙토스피라 인터로간스(Leptospira interrogans); 메틸로보루스 종(Methylovorus sp) 균주 SS; 미코박테리운 아비움(Mycobacterium avium); 미코박테리움 이비움 아종 아비움(Mycobacterium avium subsp avium); 미코박테리움 아비움 아종 파라투버큘로시스(Mycobacterium avium subsp paratuberculosis); 미코박테리움 레프래(Mycobacterium leprae); 미코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis); 미코플라즈마 제니틸리움(Mycoplasma genitalium); 미코플라스마 뉴모니애(Mycoplasma pneumoniae); 미주스 퍼시캐 프라이머리 엔도심비오이트(Myzus persicae primary endosymbioiit); 나이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae); 오실라토리아 종 NKBG(Oscillatoria sp NKBG),-판토아 아나나스(Pantoea ananas); 파스테우렐라 물토시다(Pasteurella multocida); 포피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis); 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa); 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa); 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida); 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus); 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus); 리조비움 레구미노사룸(Rhizobium leguminosarum); 로도박터 캡슐라투스(Rhodobacter capsulatus); 로도박터 스패로이데스(Rhodobacter sphaeroides); 로도써무스 마리누스(Rhodothermus marinus); 리케치아 프로와제키(Rickettsia prowazekii); 리케치아 리케치(Rickettsia rickettsii); 사카로미세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae); 세라티아 피카리아(Serratia ficaria); 세라티아 마르세스센스(Serratia marcescens); 세라티아 루비다애(Serratia rubidaea); 시노르히조비움 멜리로티(Sinorhizobium meliloti); 시토필루스 오이재(Sitophilus oiyzae) 주요 내부공생체; 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia); 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae); 스트렙토미세스 알부스(Streptomyces albus); 스트렙토미세스 코엘레콜로(Streptomyces coelicolor); 스트렙토미세스 코엘리콜로(Streptomyces coelicolor); 스트렙토미세스 리비단스(Streptomyces lividans); 시네코코쿠스종(Synechococcus sp); 시네코코쿠스 불카누스(Synechococcus vulcanus); 시네코시스티스종(Synechocystis sp); 써모아내로박터 브록키(Thermoanaerobacter brockii); 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima); 틸리어무스 아쿠아티쿠스(Tliermus aquaticus); 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum); 볼바키아 종(Wolbachia sp); 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis).
cpn10 패밀리 서브유닛의 이점은 이들이 천연 샤페로닌의 단백질 폴딩 활성에 관여하는, 모바일 루프를 보유한다는 것인데, 상기 루프는 스캐폴드에 영향줌이 없이 제거될 수 있다. 제거되는 모바일 루프를 지니는 cpn10은 생물학적 활성을 보유하지 않으며, 유리하게 불활성 스캐폴드를 만들고, 그에 따라 임의의 잠재적으로 해로운 영향을 최소화시킨다.
생물학적으로 활성있는 적절한 폴리펩티드의 삽입은 그에 따라 생성된 신규한 폴리펩티드에 생물학적 활성(예를 들어, 사람 혈청 알부민 결합)을 부여할 수 있다. 실제로, 삽입된 폴리펩티드의 생물학적 활성은 스캐폴드내로의 생물학적으로 활성있는 폴리펩티드의 통합에 의해 개선될 수 있는데, 특히, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 것과 같은 돌연변이유발 및 친화력-기반 스크리닝 방법이 스캐폴드-제공(scafold-presented) 폴리펩티드의 표적 단백질 결합을 최적화시키기 위해 사용될 때, 그러하다.
펩티드 삽입을 위한 다른 부위가 가능하다. 유리한 옵션은 GroES내 루프 β 헤어핀과 동등한 위치내에 존재한다. 이것은 요망되는 펩티드에 의한 Gp31내 Glu-의 대체를 포함한다. 아미노산 서열은 Pro(59)-Glu(60)-Gly(61)이다. 이것은, DNA 단편으로서 펩티드 삽입을 위한 비점착성 말단(blunt-ended) 제한 부위를 남기는, Pro-Gly를 엔코딩하는 DNA 수준(CCC:GGG)에서 SmaI 부위로 통상적으로 전환된다. 유사하게, 삽입은 GroES 서열의 위치 50과 53 사이, 및 다른 cpn10 패밀리 일원내의 동등한 위치에서 이루어질 수 있다. 대안적으로, 역 PCR이 스캐폴드의 반대쪽 측면상에 펩티드를 디스플레이하기 위해, 사용될 수 있다.
샤페로닌 분자의 cpn60/Hsp60 패밀리의 일원은 또한 스캐폴드로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 4십량체(tetradecameric) 박테리아 샤페로닌 GroEL이 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 이종성 폴리펩티드는 삽입된 폴리펩티드에 운동성을 부여하기 위해 적도(equatorial) 및 첨부 도메인 사이에 온전한 힌지 영역을 유지시키기 위해 위치 191과 376 사이, 특히 위치 197과 333 사이에(조작된 SacII 및 독특한 ClaI 부위로 대별됨) 삽입될 것이다. 스캐폴드의 선택은 올리고머(또는 이와 같은 올리고머를 포함하고/거나 이로부터 유래된 이중-특이적 리간드)의 의도된 적용에 좌우될 것이다: 예를 들어, 올리고머가 면역화(vaccination) 목적으로 의도된 경우, 미코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis)에서 유래된 것과 같은 면역원성 스캐폴드는, 매우 유익하며 애주번트 효과를 부여한다.
cpn60 분자의 돌연변이체가 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, GroEL의 단일 고리 돌연변이체(GroELSRI)는 GroEL의 2개 고리 사이의 주요한 부착부에 영향을 미치는 4개의 점 돌연변이(R452E, E461A, S463A 및 V464A)를 포함하며 이것은 GroES에 결합하기 위해 방출되기 때문에 시험관내에서 기능적으로 불활성이다. GroELSR2는 Glul91-Gly에서 추가 돌연변이를 지니는데, GroES에 대한 친화력을 감소시킴으로써 활성을 회복한다. 이러한 돌연변이체 둘 모두는 고리 구조를 형성하며 스캐폴드로서 사용하기에 적합할 것이다.
천연적으로-생성되는 특별한 스캐폴드 분자는 박테리오파지 산물이다: 이러한 이유로, 이와 같은 스캐폴드에 대한 천연적으로 생성되는 항체는 드물다. 이것은 백신 제제로서 스캐폴드 융합체(fusions)의 사용을 강화시킨다. 결실되는 루프를 지니는 T4 Gp31은 생물학적 활성을 지니지 아니하며(단, T4 박테리오파지에 대한 우세-음성(dominant-negative) 또는 세포내 백신으로서 활성은 예외로 함) 그에 따라 숙주에 대한 해로운 효과가 최소화된다. 그러나, 폴리펩티드를 엔코딩하는 적절한 서열의 삽입은 신규한 단백질에 생물학적 활성을 부여할 수 있다. 실제로, 생물학적 활성은 스캐폴드 단백질내로의 삽입에 의해 개선될 수 있다.
항원(예를 들어, 사람 혈청 알부민)에 대한 항체 또는 항체 단편의 친화력은 본 발명에 따른 올리고머화에 의해 증가될 수 있다. 항체 단편은 Fv, Fab 및 F(ab')2 단편과 같은 단편 또는 이의 임의의 유도체, 예컨대, 단일쇄 Fv 단편일 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 재조합되지 않거나, 재조합되거나 인간화될 수 있다. 항체는 임의의 면역글로불린 이소형(isotype), 예를 들어, IgG, IgM 등등일 수 있다.
특정 구체예에서, 항체 단편은 카멜화된 VH 도메인일 수 있다. 항체와 이들의 동족 항원 사이의 주요 분자간 상호작용은 VH CDR3를 통해 매개된다는 것은 알려져 있다.
아래에 기재되어 있고 당업계에 공지된 GroEL 및/또는 GroES(cpn10) 스캐폴드 분자의 사용은 고-친화력 올리고머를 생산하기 위해, VH 도메인, 또는 VH CDR3 도메인의 올리고머화를 제공한다. 2개 이상의 도메인이 이와 같은 올리고머내에 포함될 수 있다; cpn10 스캐폴드에 기반한 올리고머에서, 최대 7개의 도메인이 포함되어, 표적 단백질(예를 들어, 사람 혈청 알부민)에 결합하는 7량체 올리고머 분자(헵타바디(heptabody))를 형성할 수 있다.
표적 단백질(예를 들어, 사람 혈청 알부민)에 대한 특정 스캐폴드 폴리펩티드/올리고머의 친화력 부여 및/또는 최적화를 위해, 폴리펩티드/올리고머의 리간드/기질에 대한 이와 같은 폴리펩티드/올리고머의 특이성 및/또는 친화력이 시험 및/또는 맵핑될 수 있도록, 변이가 스캐폴드 폴리펩티드내로 삽입된 이종성 폴리펩티드내로 도입될 수 있다. 변이체는 동일한 루프에서 생산될 수 있거나, 표적 단백질(예를 들어, 사람 혈청 알부민)에 대한 신규한 폴리펩티드의 친화력을 빠르게 평가하기 위해, 표준의 상이한 루프의 세트가 고안될 수 있다. 변이체는 공지의 기술, 예컨대, PCR에 따라 서열의 무작위화에 의해 생성될 수 있다. 이들은 단백질 스캐폴드내로 통합되기 이전에, 파지 디스플레이와 같은, 스크리닝 프로토콜에 의해 선별을 거칠 수 있다.
본 명세서에서 언급된 것과 같은, "올리고머화될 수 있는 스캐폴드"는 스캐폴드를 형성하기 위하여 올리고머화할 수 있거나 올리고머화될 수 있으며, 올리고머화 능력을 폐기시키지 않으면서, 이종성 폴리펩티드가, 융합(바람직하게는 공유적으로 융합)될 수 있는, 폴리펩티드이다. 따라서, 본 발명에 따라서 다량체로 배열될 수 있는 폴리펩티드를 사용하여 "스캐폴드"를 제공한다. 임의로, 스캐폴드가 유래되는 야생형 폴리펩티드의 일부분은, 예를 들어, 상기 스캐폴드상에 제공되어지는 이종성 폴리펩티드로 대체에 의해, 제거될 수 있다.
단량체는 올리고머화하거나 올리고머화되는 잠재력을 보유한 폴리펩티드이다. 올리고머화는, 함께 조합되면, 추가의 스캐폴드 서브유닛과 올리고머화될 올리고머화할 수 있는 스캐폴드 서브유닛의, 폴리펩티드내, 통합에 의해 야기될 수 있다. 임의로, 올리고머화는 단량체들을 함께 연결시키기 위해 당업계에 인지된 링커의 사용을 통해 야기될 수 있다.
본 명세서에 사용된, "올리고머"는 "중합체" 또는 "다량체"와 동의어이며 문제된 대상이 단량체가 아님을 나타내기 위해 사용된다. 따라서, 올리고머성 폴리펩티드는 공유적으로 또는 비공유적으로 함께 연결되는 2개 이상의 단량체성 유닛을 포함한다. 사용되는 단량체성 유닛의 갯수는 올리고머의 의도된 용도에 좌우될 것이며, 2 내지 20개 이상일 수 있다. 임의로, 갯수는 5 내지 10개, 바람직하게는 약 7개이다.
파지 디스플레이
파지 디스플레이 기술은 생물학 연구에서 어마어마하게 유용한 것으로 입증되었다. 이것은 리간드가 분자의 거대 라이브러리로부터 선택될 수 있게 한다. 스캐폴드 기술은 독특하게 유익한 방식으로 파지 디스플레이의 파워를 이용할 수 있다. cpn10 분자는 단일쇄 Fv 분자 디스플레이와 유사한, fd 박테리오파지 상의 단량체로서 디스플레이될 수 있다.
(예를 들어, 사람 혈청 알부민-결합 항체로부터 유래된 CDR3 폴리펩티드를 사용하여, 고도의 모바일 루프를 대신하여) 삽입물(insertions)의 라이브러리가 표준 방법에 의해 제작되고, 그 결과 얻어진 라이브러리가 관심있는 분자에 대해 스크리닝된다. 이와 같은 선별은 친화력에 기반한다. 유력하게 1회 이상의 돌연변이유발 반복, 발현(GroEL 단백질, ~57.5 Kda GroEL 및 ~10 Kda GroES은 이전에 기재된 것과 같이(Chatellier et al. 1998 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 9861-9866; Corrales and Fersht 1996 1: 265-273) 또는 임의의 당업계에 인지된 방법에 의해 발현 및 정제될 수 있음) 및 친화력 스크리닝을 통해, 단백질(예를 들어, 사람 혈청 알부민)에 대한 친화력을 보유한 분자의 확인후, 이와 같은 분자는 올리고머화되고, 그로 인해 이와 같은 분자의 결합력을 이용할 수 있다. 임의로, 특별한 선별된 단량체는 이들의 결합 파트너와 교차연결되거나 올리고머화될 수 있을 것이다.
피브로넥틴
실시예 26: CDR 이식을 통한 혈청 알부민-결합 피브로넥틴 비-면역글로불린 스캐폴드를 포함하는 이중-특이적 리간드의 제조
dAb7h14의 CDR 도메인은 하기 방식으로 사람 혈청 알부민에 결합하는 피브로넥틴 비-면역글로불린 스캐폴드 폴리펩티드를 제작하기 위해 사용된다. dAb7h14 의 CDR1(RASQWIGSQLS; SEQ ID NO.:_ ) CDR2(WRSSLQS; SEQ ID NO.:__), 및 CDR3(AQGAALPRT; SEQ ID NO.:_) 서열이, 각각, 위치 21-31(BC 루프), 51-56(DE 루프), 및 76-88(FG 루프)에서 천연 10Fn3 아미노산 잔기를 대체하여 10Fn3내로 이식된다. 사람 혈청 알부민이 dAb7h14의 항-사람 혈청 알부민 CDR 도메인을 포함하는 고정된 피브로넥틴-유래 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는지 여부를 평가하기 위해 비아코어에 의한 실시간 결합 분석이 수행된다. (당업계의 통상의 기술자는 결합 친화력이, 예를 들어, 표지된 사람 혈정 알부민의 침전, 경쟁적 비아코어 검정 등을 포함하는, 임의의 적절한 방법을 사용하여 평가될 수 있음을 인지할 것이다.) 검출된 사람 혈청 알부민 친화력이 없거나 낮은 경우(예를 들어, μM 또는 이를 초과하는 범위의 Kd 값), 결합 친화력에 기여하는 하기 방법들 중 임의의 방법을 포함하는, 다수의 전략들 중 하나 이상의 전략이 CDR3-이식된 피브로넥틴 폴리펩티드의 사람 혈청 알부민 결합 특성을 개선하기 위해 사용된다.
천연 피브로넥틴 폴리펩티드 내부의 용매-노출된 루프 영역에 상응하는 피브로넥틴 폴리펩티드의 dAb7h14 CDR3-이식된 영역의 길이(들)은 링커 폴리펩티드의 사용을 통해 조정된다. 예를 들어, dAb7h14의 9개 아미노산 잔기 CDR3 펩티드 서열은, 예를 들어, dAb7h14 CDR3 폴리펩티드 서열의 N- 또는 C-말단 측부(flanks) 중 어느 하나 및/또는 둘 모두에 위치한 0 내지 4개 잔기 길이의 아미노산 링커를 사용하여 13개 아미노산 잔기 길이로 신장되고, 그로 인해 천연 피브로넥틴 서열내 FG 루프에 상응하는 CDR3-이식된 도메인 내부의 16개 아미노산의 총 이식된 펩티드 서열 길이가 달성된다. 이와 같은 링커 폴리펩티드(들)의 사용은, (예를 들어, CDR3-이식된 피브로넥틴 폴리펩티드 내부의 CDR 및 피브로넥틴 서열 둘 모두의 최적화를 통해) CDR3-이식된 피브로넥틴 폴리펩티드의 사람 혈청 알부민 결합 능력을 개선시키기 위하여, (예를 들어, 아래에 기재된 것과 같은 돌연변이 최적화 절차를 사용하여) 링커 서열, CDR3 서열(들) 및/또는 비-CDR 피브로넥틴 서열의 돌연변이유발과 임의로 조합된다. 이와 같은 목적을 위해 사용되는 폴리펩티드 링커는 사전결정된 서열을 보유하거나, 임의로, 링커-함유 CDR3-이식된 피브로넥틴 폴리펩티드의 사람 혈청 알부민 결합의 평가를 통하여 무작위화된 폴리펩티드 링커 서열군으로부터 선택된다. 최적화 방법은 병렬적 및/또는 반복적으로 수행된다. 병렬 및 반복적 최적화(예를 들어, 친화력 성숙) 둘 모두는 아래에 기재되고/거나 폴리펩티드 결합 특성의 최적화에 유용한 것으로 당업계에 공지된 선별 방법을 사용한다.
dAb7h14 CDR3를 제시하는 CDR-이식된 피브로넥틴 폴리펩티드(들)의 사람 혈청 알부민 결합은 아래에 기재되고/거나 달리 당업계에 공지된 병렬적 및/또는 반복적 선별 방법과 임의로 조합하여, 돌연변이유발을 통해 최적화된다. 이식된 dAb7h14 CDR3 폴리펩티드 서열을 에워싸는 10Fn3 스캐폴드 폴리펩티드 도메인은, 아래에 기재된 것과 같이 수행되는, 무작위화 돌연변이유발 및/또는 NNK 돌연변이유발을 거치게 된다. 이와 같은 돌연변이유발은 아미노산 1-9, 44-50, 61-54, 82-94(베타 시트의 모서리); 19, 21, 30-46(짝수), 79-65(홀수)(두 베타 시트의 용매-접근가능 면(solvent-accessible faces)); 및 14-16과 36-45(비-CDR-유사 용매-접근가능 루프 및 베타 턴)에 대해 10Fn3 폴리펩티드 서열 내부에서 수행되며, 신규하거나 개선된 사람 혈청 알부민-결합 폴리펩티드를 개선시키기 위해 임의로 무작위화된다. 임의로, CDR3-이식된 피브로넥틴 폴리펩티드 내부에 존재하는 dAb7h14 CDR3 폴리펩티드 도메인은, 예를 들어, 무작위 돌연변이유발, NNK 돌연변이유발, 룩-스루 돌연변이유발 및/또는 당업계에 인지된 다른 방법을 통해, 돌연변이유발을 거치게 된다. PCR은 그러한 돌연변이유발 방법을 수행하는데 사용되며, 그 결과 CDR3-이식된 피브로넥틴 폴리펩티드 내부의 표적화된 서열에 걸쳐 서열 다양성의 생성이 야기된다. 이와 같은 접근법은 dAb 라이브러리 제조를 위한 아래에 기재된 그러한 접근법과 유사하다. 무작위 및/또는 룩-스루 돌연변이유발 방법 이외에, 표적화된 아미노산 잔기의 직접 돌연변이유발이 구조 정보가 사람 혈청 알부민의 결합에 결정적인 특정 아미노산 잔기를 확립시키는 곳에 사용된다.
상기한 바와 같이 조작된 이식된 dAb7h14 CDR 서열을 포함하는 피브로넥틴 폴리펩티드는 사람 혈청 알부민 결합에 대해 최적화된 그러한 피브로넥틴 폴리펩티드를 확인하기 위해 병렬적 및/또는 반복적 선별 방법을 거치게 된다. 예를 들어, dAb7h14 CDR-이식된 피브로넥틴 폴리펩티드 서열의 라이브러리의 생산후, 이와 같은 폴리펩티드의 상기 라이브러리는 파지상에 디스플레이되고 dAb의 라이브러리로부터의 혈청 알부민-결합 dAb의 선별에 대해 아래에 기재된 것과 같이, 혈청 알부민 결합 및/또는 증식을 요하는 다수의 선별 라운드를 거치게 된다. 임의로, 선별은 면역튜브 상에 고정된 혈청 알부민 또는 용액중의 비오티닐화된 혈청 알부민에 대해 수행된다. 임의로, 결합 친화력은, 이상적으로 사람 혈청 알부민 결합 친화력 Kd 값을 nM 범위 또는 이를 초과하는 범위로 달성시키는 완전히 최적화된 피브로넥틴-유래된 폴리펩티드와 함께, 비아코어 시스템(Uppsala, Sweden)을 사용하는, 표면 플라스몬 공명(SPR) 및 비아코어(Karlsson et al., 1991)을 사용하여 결정된다. 사람 혈청 알부민을 결합하는 피브로넥틴-유래된 폴리펩티드의 확인후, 이와 같은 폴리펩티드는 이후 아래에 기재된 방법들 중 임의의 방법에 의해 이중-특이적 리간드 조성물을 생성시키는데 사용된다.
실시예 27: 혈청 알부민 결합 부분의 선별을 통한 혈청 알부민-결합 피브로넥틴 비-면역글로불린 스캐폴드를 포함하는 이중-특이적 리간드의 제조
천연 피브로넥틴 단백질-특히 피브로넥틴의 10Fn3 폴리펩티드-은 라이브러리 선별 및, 임의로 본 발명의 이중-특이적 리간드로 사용하기 위한 사람 혈청 알부민-결합 피브로넥틴 비-면역글로불린 스캐폴드 분자를 생산하기 위한 친화력 성숙 기술을 거치게 된다.
비아코어에 의한 실시간 결합 분석은 사람 혈청 알부민이 고정된 천연 피브로넥틴 및/또는 피브로넥틴-유래 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는지 여부를 평가하기 위해 수행된다. 사람 혈청 알부민에 대한 피브로넥틴 폴리펩티드의 없거나 낮은 결합 친화력(예를 들어, μM 범위 또는 이를 초과하는 범위의 Kd 값)의 검출후, 겨합 친화력에 기여하는 하기 방법들 중 하나 이상의 방법을 포함하는, 다수의 전략들 중 하나 이상의 전략이 피브로넥틴 폴리펩티드에 사람 혈청 알부민 결합 특성을 부여하기 위해 사용된다.
피브로넥틴 스캐폴드 폴리펩티드(들)의 사람 혈청 알부민 결합은 아래에 기재되고/거나 달리 당업계에 공지된 병렬적 및/또는 반복적 선별 방법과 임의로 조합하여, 돌연변이유발 방법을 통해 달성 및 최적화된다. 10Fn3 스캐폴드 폴리펩티드 도메인은, 아래에 기재된 것과 같이 수행되는, 무작위화 돌연변이유발 및/또는 NNK 돌연변이유발을 거치게 된다. 이와 같은 돌연변이유발은, 아미노산 1-9, 44-50, 61-54, 82-94(베타 시트의 모서리); 19, 21, 30-46(짝수), 79-65(홀수)(두 베타 시트의 용매-접근가능 면); 21-31, 51-56, 76-88(CDR-유사 용매-접근가능 루프); 및 14-16과 36-45(다른 용매-접근가능 루프 및 베타 턴)를 포함하는, 10Fn3 폴리펩티드 전체에 대해 또는 10Fn3 폴리펩티드 내부의 특정 서열에 대해 수행되며, 신규하거나 개선된 사람 혈청 알부민-결합 폴리펩티드를 개선시키기 위해 임의로 무작위화된다. PCR은 그러한 돌연변이유발 방법을 수행하는데 임의로 사용되며, 그 결과 피브로넥틴 폴리펩티드 내부의 표적화된 서열에 걸쳐 서열 다양성의 생성이 야기된다. (이와 같은 접근법은 dAb 라이브러리 제조를 위한 아래에 기재된 그러한 접근법과 유사하다.) 무작위 돌연변이유발 방법 이외에, 표적화된 아미노산 잔기의 직접 돌연변이유발이 구조 정보가 사람 혈청 알부민의 결합에 결정적인 특정 아미노산 잔기를 확립시키는 곳에 사용된다.
상기한 바와 같이 조작된 피브로넥틴 폴리펩티드는 사람 혈청 알부민 결합에 대해 최적화된 그러한 피브로넥틴 폴리펩티드를 확인하기 위해 병렬적 및/또는 반복적 선별 방법을 거치게 된다. 예를 들어, 돌연변이유발된 피브로넥틴 폴리펩티드 서열의 라이브러리의 생산후, 상기 폴리펩티드 라이브러리는 파지상에 디스플레이되고 dAb의 라이브러리로부터의 혈청 알부민-결합 dAb의 선별에 대해 아래에 기재된 것과 같이, 혈청 알부민 결합 및/또는 증식을 요하는 다수의 선별 라운드를 거치게 된다. 임의로, 선별은 면역튜브 상에 고정된 혈청 알부민 또는 용액중의 비오티닐화된 혈청 알부민에 대해 수행된다. 임의로, 결합 친화력은 표면 플라스몬 공명(SPR) 및, 이상적으로 사람 혈청 알부민 결합 친화력 Kd 값을 nM 범위 또는 이를 초과하는 범위로 달성시키는 완전히 최적화된 피브로넥틴-유래된 폴리펩티드와 함께, 비아코어 시스템(Uppsala, Sweden)을 사용하는, 비아코어(Karlsson et al., 1991)를 사용하여 결정된다.
사람 혈청 알부민을 결합하는 피브로넥틴-유래된 폴리펩티드의 확인후, 이와 같은 폴리펩티드는 이후 아래에 기재된 방법들 중 임의의 방법에 의해 이중-특이적 리간드 조성물을 생성시키는데 사용된다.
피브로넥틴 비-면역글로불린 스캐폴드
본 발명의 특정 구체예에서, 피브로넥틴, 또는 이의 기능적 부분 및/또는 단편을 포함하는 비-면역글로불린 스캐폴드는, 혈청 알부민에 결합하도록 조작된다. 피브로넥틴 타입 III 모듈(Fn3)로부터 유래된 비-면역글로불린 스캐폴드 구조가 사용된다. 피브로넥틴 타입 III 모듈은 포유동물 혈액과 구조 단백질에서 발견된 공통 도메인인데, 단백질 서열 데이타베이스에서 400배 이상 발생하며 현재까지 모든 단백질 서열의 2% 내로 발생하는 것으로 평가되어 있다. Fn3 모듈 서열을 포함하는 단백질은 피브로넥틴, 테나신(tenascin), 세포내 세포골격 단백질(intracellular cytoskeletal proteinss), 및 원핵생물 효소를 포함한다(Bork and Doolittle, Proc. Natl. Acad. Sd. USA 89:8990, 1992; Bork et al, Nature Biotech. 15:553, 1997; Meinke et al, J. Bacteriol. 175:1910, 1993; Watanabe et al, J. Biol. Chem. 265:15659, 1990). 피브로넥틴의 특정 비-면역글로불린 스캐폴드는 사람 Fn3의 10번째 모듈(10Fn3)인데, 이것은 94개의 아미노산 잔기를 포함한다. 이 도메인의 전반적인 폴드(overall fold)는, 카멜 및 라마 IgG내의 전체 항원 인식 유닛을 포함하는, 가장 작은 기능성 항체 단편, 중쇄의 가변 영역의 폴드와 밀접하게 관련되어 있다. 카멜과 라마 도메인과 10Fn3 도메인 사이의 주요한 차이는 (i) 10Fn3은 더 적은 베타 스트랜드(7개 대 9개) 및 (ii) 서로에 대해 패킹된 2개의 베타 시트가 카멜과 라마 도메인에서는 이황화 브릿지에 의해 연결되나, 10Fn3에서는 그렇지 않다는 것이다.
IgG 중쇄의 항원-결합 루프에 상응하는 10Fn3의 3개의 루프는 아미노산 잔기 21-31(BC), 51-56(DE), 및 76-88(FG) 사이에서 움직인다(전체 내용이 참고문헌으로 본 명세서에 통합되는, 미국 특허 7,115,396호의 도 3 참조). 각각, 11개와 6개 잔기인, BC와 DE 루프의 길이는, 항체 중쇄에서 발견된 상응하는 항원-인지 루프의 좁은 범위내에(즉, 각각, 7-10개와 4-8개 잔기) 속한다. 따라서, CDR 이식 전략이 이들 도메인내로 중쇄 CDR 서열을 도입시키는데 용이하게 사용될 수 있다. 추가적으로 및/또는 대안적으로, 이들 2개의 루프는 임의의 당업계에 인지된 방법(예를 들어, 위치-지정, 룩-쓰루 또는 기타 돌연변이유발 방법, 무작위화, 등)에 의해 유전자 변이(variability)의 도입을 거치게 되며, 임의로 그 결과 얻어진 폴리펩티드는 높은 항원 친화려에 대한 선별을 거치게 된다. (대안적으로, 유전자 변이의 도입 및/또는 선별 절차는 저하된 결합 친화력 및/또는 최적화된 특성(예컨대, 안성성, 독성 등)을 지니는 조성물을 확인하는데 사용될 수 있다.) 그러한 방법의 사용을 통해, 피브로넥틴의 BC와 DE 루프는 항체내의 상응하는 CDR1과 CDR2 도메인의 접촉과 동등한 항원과의 접촉을 이루도록 조작될 수 있다
BC와 DE 루프와 달리, 10Fn3의 FG 루프는 12개 잔기 길이인 반면, 항체 중쇄내 상응하는 루프는 4-28개 잔기의 범위이다. 따라서, 항원 결합을 최적화시키기 위해, 10Fn3의 FG 루프는 길이(예를 들어, 무작위화의 사용 및/또는 폴리펩티드 링커 서열(이 서열 역시 무작위화될 수 있음)의 사용을 통해)에 있어서 변이될 수 있을 뿐만 아니라, 항원 결합에 있어서 가장 큰 가능한 유연성(flexibility) 및 친화력을 획득하기 위해 4-28 잔기의 길이 범위를 커버하기 위해 서열에서 변이될 수 있다. 실제로, CDR이 피브로넥틴 스캐폴드내로 직접적으로 이식되는 그러한 방법 및 천연 피브로넥틴 스캐폴드가 혈청 알부민(또는 다른 표적 항원)의 결합에 대해 선별되고/거나 최적화되는 그러한 방법 둘 모두의 경우, 항체 모방체(mimics)의 CDR-유사 루프의 길이를 비롯한 서열은 시험관내 또는 생체내 친화력 성숙이 일어나는 동안 (아래에 더 상세히 기재된 것과 같이) 무작위화될 수 있다.
10번째 사람 피브로넥틴 타입 III 도메인, 10Fn3는, 낮은 온도에서 훨씬 빠르게 리폴딩되며; 이의 백본 형태는 5℃에서 1초 이내에 회복된다. 10Fn3의 열역학적 안정성은 높으며(ΔGU=24 kJ/mol=5.7 kcal/mol), 이는 110℃의 이의 높은 녹는 온도와 서로 관련이 있다.
10Fn3의 생리학적 역할 중 하나는 피브로넥틴의 서브유닛으로서의 역할인데, 상기 피브로넥틴은 체액내에서 가용성 형태로 존재하며 세포외기질내에서 불용성 형태로 존재하는 당단백질이다(Dickinson et al, J. Mol. Biol. 236:1079, 1994). 220-250 Kd의 피브로넥틴 단량체는 12개의 타입 I 모듈, 2개의 타입 II 모듈, 및 17개의 피브로넥틴 타입 III 모듈을 포함한다(Potts and Campbell, Curr. Opin. Cell Biol. 6:648, 1994). 상이한 타입 III 모듈은 피브로넥틴의 인테그린, 헤파린, 및 콘드로이친 설페이트에 대한 결합에 관여한다. 10Fn3는 이의 노출된 루프 중 한 루프 상의 인테그린-결합 Axg-Gly-Asp(RGD) 모티프를 통한 세포 부착을 매개하는 것으로 밝혀졌다. 유사한 RGD 모티프는 피브리노겐, 폰 벨레브란드(von Wellebrand) 인자, 및 비트로넥틴과 같은, 다른 단백질에 의해 인테그린 결합에 관여하는 것으로 드러났다(Hynes et al., Cell 69:11, 1992). 다른 매트릭스- 또는 세포-결합 역할은 10Fn3에 대해 개시된 바가 없다.
10Fn3이 RGD를 함유하는 짧은 펩티드 보다 단지 조금 더 부착 활성을 갖는다는 관찰은 Fn3의 세포-결합 활성이 10Fn3 구조 전체에 걸쳐 분배되어 있다기 보다 RGD 펩티드내에 위치되어 있다는 결론과 합치된다(Baron et al, Biochemistry 31:2068, 1992). RGD 모티프 없이 10Fn3가 다른 혈장 단백질에 결합할 가능성이 없다는 사실은 10Fn3를 항체를 대체할 유용한 스캐폴드가 되게 한다. 또한, 혈류내 천연 피브리노겐내 10Fn3의 존재는 10Fn3 그 자체가 기원 개체에서 면역원성을 나타낼 가능성이 없음을 제시한다.
또한, 10Fn3 프레임워크가, 항체 모방체의 다양한 풀의 제조를 용이하게 하는, 무작위화에 저항성이 있는 노출된 루프 서열을 보유한다는 것이 드러났다. 이러한 결정은 10Fn3 서열의 유연성을 시험함으로써 이루어졌다. 특히, 사람 10Fn3 서열은 다른 공급원으로부텅의 피브로넥틴의 서열을 비롯한 관련 단백질의 서열과 정렬되었고, 이 정렬의 결과는 사람 10Fn3 도메인의 3-차원 구조로 맵핑되었다. 이 정렬은 보존된 잔기의 대다수가 베타 시트 샌드위치의 코어에서 발견되며, 반면 고도의 가변 잔기는, 두 베타 시트의 용매-접근가능 측면상 및 항체 모방체의 친화력 성숙에 관한 초가변 루프로서 역할하는 3개의 용매-접근가능 루프상의, N- 및 C-말단을 포함하는, 베타 시트의 모서리를 따라 위치되어 있음을 드러내었다. 이러한 결과를 고려하여, 이들 3개의 루프의 무작위화는 10Fn3 프레임워크 그 자체의 전체 폴드 또는 안정성에 부정적 영향을 미칠 가능성이 없는 것으로 결정되었다.
사람 10Fn3 서열의 경우, 이 분석은, 최소로, 아미노산 1- 9, 44-50, 61-54, 82-94(베타 시트의 모서리); 19, 21, 30-46(짝수), 79-65(홀수)(두 베타 시트의 용매-접근가능면); 21-31, 51-56, 76-88(CDR-유사 용매-접근가능 루프); 및 14-16 및 36-45(다른 용매-접근가능 루프 및 베타 턴)가 신규하거나 개선된 화합물-결합 단백질을 발달시키기 위해 무작위화될 수 있다. 또한, 위에서 논의한 바와 같이, 하나 이상의 용매 노출 루프의 길이에서의 변형은 또한 그러한 유도된 발달 방법에 포함될 수 있다.
대안적으로, β-시트 서열내 변화가 또한 신규 단백질을 발달시키기 위해 사용될 수 있다. 이들 돌연변이는 스캐폴드를 변화시키며 그로 인해 루프 구조(들)이 간접적으로 변형된다. 이 접근법이 채택되는 경우, 돌연변이는 서열을 포화시켜서는 아니되며, 오히려 소수의 돌연변이가 도입되어야 한다. 바람직하게는, 3-30개 이하의 변화가 이 접근법에 의해 β-시트에 도입되어야 한다.
서열 변이는, 예를 들어, Taq 중합효소(Tindall and Kunkel, Biochemistry 27:6008 (1988))에 의한 돌연변이유발, 단편 재조합, 또는 이의 조합을 포함하는, 임의의 기술에 의해 도입될 수 있다. 유사하게, 예를 들어, CDR-제공 및/또는 CDR-유사 루프의 길이를 비롯한 서열을 변이시킴으로써, 또는 선별된 풀내에서 발견되는 유익한 프레임워크 돌연변이에 기초한 구조 리디자인(redesign)에 의해, 라이브러리의 구조적 다양성의 증가는, 비-면역글로불린 스캐폴드에 추가 개선을 도입시키는데 사용될 수 있다.
피브로넥틴 스캐폴드 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질
본 명세서에 기재된 피브로넥틴 스캐폴드 폴리펩티드는 다른 단백질 도메인에 융합될 수 있다. 예를 들어, 사람 혈청 알부민에 결합하는 것으로 확인된 피브로넥틴 스캐폴드 폴리펩티드는, 피브로넥틴-기반 혈청 알부민 결합 부분을 포함하는 본 발명의 이중-특이적 리간드를 생성시키기 위해, 중쇄 가변 도메인, 또는 이의 항원 결합 단편과 융합될 수 있다. 피브로넥틴 스캐폴드 폴리펩티드는, 바람직하게는 10Fn3의 C-말단을 통해, IgG(Fc)의 불변 영역과 피브로넥틴 스캐폴드 폴리펩티드, 예컨대, 10Fn3 모듈을 융합시킴으로써 사람 면역 반응과 추가적으로 통합될 수 있다. 이와 같은 10Fn3-Fc 융합 분자내 Fc는 면역 반응의 보체 성분을 활성화시키고 조작된 피브로넥틴 폴리펩티드의 치료 지수(therapeutic value)를 증가시키는 역할을 할 수 있다. 유사하게, 피브로넥틴 스캐폴드 폴리펩티드(예컨대, 10FnS)와 보체 단백질(예컨대, C1q) 간의 융합은 세포를 표적으로 삼는데 사용될 수 있으며,피브로넥틴 스캐폴드 폴리펩티드(예컨대, 10Fn3)과 톡신 간의 융합은 특정 항원을 운반하는 세포를 특이적으로 파괴시키는데 사용될 수 있다. 이러한 융합들 중 임의의 융합은 표준 기술에 의해, 예를 들어, 공개적으로 입수가능한 유전자 서열을 사용하여 제작된 재조합 융합 유전자로부터의 융합 단백질의 발현에 의해 및/또는 달리 아래에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
스캐폴드 다량체
단량체 이외에, 본 명세서에 기재된 피브로넥틴 스캐폴드 작제물 중 임의의 작제물은 역가(valency)를 증가시키고 그로 인해 항원(예를 들어, 혈청 알부민) 결합의 결합력을 증가시키기 위한 수단으로써 스캐폴드의 이량체 또는 다량체로 생성될 수 있다. 이와 같은 다량체는 공유 결합을 통해 생성될 수 있다. 예를 들어, 개별 10Fn3 모듈은 천연 8Fn3-9Fn3-10Fn3 C-에서-N-말단 결합을 모방함으로써 또는 이들의 불변 영역을 통해 함께 유지되는 항체 이량체를 모방함으로써 결합될 수 있다. 10Fn3-Fc 작제물은 10Fn3-Fc::Fc-10Fn3의 일반적 구성(scheme)의 이량체를 디자인하기 위해 활용될 수 있다. Fc::Fc 인터페이스로 조작된 결합은 공유 또는 비공유 결합일 수 있다. 또한, Fc 이외의 다른 파트너(예컨대, 다른 비-면역글로불린 스캐폴드 부분 및/또는 면역글로불린-기반 항원-결합 부분)의 이량체화 또는 다량체화는, 고차 구조를 생성시키기 위해, 하이브리드, 예컨대, 10Fn3 하이브리드로 사용될 수 있다. 다량체의 다른 일예는 본 명세서에 기재된 단일 가변 도메인을 포함한다.
특별한 일예로, 공유적으로 결합된 다량체는 다량체를 엔코딩하는 융합 유전자를 제작함으로써, 또는 대안적으로 단량체 서열에서 시스테인 잔기에 대한 코돈을 조작하고 발현 생성물 사이에 이황화 결합 형성이 일어나도록 함으로써 생성될 수 있다. 비공유적으로 결합된 다량체는 또한 다양한 기술에 의해 생성될 수 있다. 이들 기술은 양으로 및/또는 음으로 하전된 잔기에 상응하는 코돈의, 단량체 서열내로의 도입과 발현 생성물 내의 이들 잔기들 간에(그에 따라 단량체들 간에) 상호작용이 일어나도록 하는 것을 포함한다. 이 접근법은 단량체 서브유닛내에 천연적으로 존재하는 하전된 잔기, 예를 들어, 피브로넥틴의 음으로 하전된 잔기를 이용함으로써 간소화될 수 있다. 피브로넥틴 스캐폴드 폴리펩티드를 포함하는 비공유적으로 결합된 조성물을 위한 또 다른 수단은, (예를 들어, 아미노- 또는 카르복시-말단에서) 단량체 유전자, 관심있는 공지의 단백질 또는 단백질 도메인에 관한 코딩 서열내로 도입시키는 것이다. 이와 같은 단백질 또는 단백질 도메인은 코일-코일 모티프, 류신 지퍼 모티프, 및 이량체 또는 고차 다량체의 형성을 유도하기 위한 공지된 다수의 단백질 서브유닛(또는 이의 단편) 중 임의의 것을 포함한다.
피브로넥틴-유사 분자
10Fn3가 항체 모방체의 생성을 위한 바람직한 스캐폴드를 대표하지만, 다른 분자가 본 명세서에 기재된 분자에서 10Fn3을 대신할 수 있다. 이들은, 사람 피브로넥틴 모듈 1Fn3-9Fn3 및 11Fn3-17Fn3을 비롯한 사람이 아닌 동물 및 원핵생물로부터의 관련 Fn3 모듈을 포함하나, 이로만 제한되지 아니한다. 또한, 10Fn3(예컨대, 테나신 및 운둘린)에 대한 서열 상동성을 지니는 다른 단백질로부터의 Fn3 모듈이 또한 사용될 수 있다. 면역글로불린-유사 폴드를 갖는 다른 대표적인 스캐폴드(그러나 VH 도메인과 비관련된 서열을 지님)는 N-카드헤린(cadherin), ICAM-2, 티틴(titin), GCSF 수용체, 사이토카인 수용체, 글리코시다제 억제자, E-카드헤린, 및 항생제 색소단백질을 포함한다. 관련 구조를 지니는 추가 도메인은 미엘린 막 부착 분자 PO, CD8, CD4, CD2, 클래스 I MHC, T-세포 항원 수용체, CD1, C2 및 VCAM-1의 I-세트 도메인, 미오신-결합 단백질 C의 I-세트 면역글로불린, 미오신-결합 단백질 H의 I-세트 면역글로불린, 텔로킨(telokin)의 I-세트 면역글로불린, 텔리킨(telikin), NCAM, 트위친(twitchin), 뉴로글리안(neuroglian), 성장 호르몬 수용체, 에리쓰로포이에틴 수용체, 크로락틴 수용체, GC-SF 수용체, 인터페론-감마 수용체, β-갈락토시다제/글루쿠로니다제, β-글루쿠로니다제, 및 트랜스글루타미나제에서 유래될 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 면역글로불린-유사 폴드를 포함하는 임의의 다른 단백질이 사용될 수 있다. 이와 같은 단백질은, 예를 들어, 프로그램 SCOP(Murzin et al, J. MoL Biol. 247:536 (1995); Lo Conte et al, Nucleic Acids Res. 25:257 (2000))를 사용하여, 확인될 수 있다.
일반적으로, (예를 들어, 상기 SCOP 컴퓨터 프로그램을 사용하여, 확인된 것과 같은) VH 도메인과 구조적 관련성(relatedness)을 나타내는 임의의 분자가 비-면역글로불린 스캐폴드로서 사용될 수 있다. 피브로넥틴과 같은, 그러한 분자는 분자의 N-말단 극에 3개의 루프 및 C-말단 극(pole)에 3개의 루프를 포함하는데, 이들 각각은 다양한 라이브러리를 생성시키기 위해 무작위화될 수 있다; 대안적으로, 더 많은 수의 루프를 지니는, 더 큰 도메인이, 다수의 그러한 표면 무작위화될 수 있는 루프가 공간내에 충분히 가깝게 위치하여 이들이 항원 결합에 참여할 수 있는 한, 사용될 수 있다. 각자 서로에 대해 밀접하여 위치하고 있는 3개 이상의 루프를 소유하는 폴리펩티드의 일예는 T-세포 항원 수용체 수퍼옥사이드 디스뮤타제(각각은 무작위화딜 수 있는 4개의 루프를 지님); 및 Fn3 이량체, 조직 인자 도메인, 및 사이토카인 수용체 도메인(각각은 3개의 무작위화될 수 있는 루프가 (루프의 총 갯수가 6이 되도록 하는) 2개의 도메인의 일부인 2개의 유사한 도메인의 3개 세트를 지님).
아직 또 다른 대안에서, 공간에서 충분히 가깝게 위치된 가변 루프를 지니는 임의의 단백질은 후보 결합 단백질 생산을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 공간적으로 관련된, 용매 접근가능 루프를 지니는 거대 단백질이, 면역글로불린-유사 폴드와 구조적으로 비관련된 경우라 할지라도, 사용될 수 있다. 대표적인 단백질은, 시토크롬 F, 녹색 형광 단백질, GroEL, 및 타우마틴(thaumatin)을 포함하나, 이로만 제한되지 아니한다. 이들 단백질에 의해 디스플레이되는 루프는 무작위화될 수 있고, 우수한 결합자가 본 명세서에 기재된 바와 같이(예를 들어, 실시예 1) 무작위화된 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 이들의 크기 때문에, 항체-항원 상호작용에서 발견된 것 보다 상당히 더 거대한 항원 결합 포면을 나타내는 분자가 획득될 수 있다. 이러한 유형의 다른 유용한 스캐폴드는 또한 수많은 루프, 특히 평행한 베타 시트 또는 다수의 알파-헬릭스 중에 위치한 루프를 지니는 후보 단백질 가운데서 검색하기 위하여 프로그램 SCOP(Murzin et al, J. Mol. Biol 247: 536 (1995))을 사용하여 확인될 수 있다.
상이한 개체로부터의 모듈 및 모 단백질은 상이한 적용에 관하여 가장 적절할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 피브로넥틴 스캐폴드 폴리펩티드 디자인시, 치료제가 의도되는 개체에 대하여 천연인 피브로넥틴 또는 피브로넥틴-유사 분자로부터의 그러한 단백질을 생성시키는 것이 가장 바람직할 수 있다. 반대로, 개체의 기원은 덜 중요하거나 시험관내 적용(예컨대, 진단제(diagnostics), 또는 연구 시약)을 위해 사용되는 피브로넥틴 스캐폴드와 심지어 관련이 없다.
이들 분자들 중 임의의 분자의 경우, 라이브러리는 본 명세서에 기재된 방법들 중 임의의 방법에 의해 생성되고 결합 단백질을 선별하기 위해 사용될 수 있다.
스캐폴드-기반 결합 단백질의 유도된 평가
본 명세서에 기재된 비-면역글로불린 스캐폴드는 신규 또는 개선된 결합 단백질을 개발하기 위한 임의의 기술에서 사용될 수 있다. 한 특별한 일예에서, 결합의 표적(예를 들어, 혈청 알부민)은 고체 지지체, 예컨대, 컬럼 레진 또는 마이크로타이터 플레이트 웰 상에 고정되며, 상기 표적은 후보 비-면역글로불린 스캐폴드-기반 결합 단백질의 라이브러리와 접촉된다. 이와 같은 라이브러리는 피브로넥틴 스캐폴드 클론, 예컨대, 10Fn3 CDR-유사 루프의 서열 및/또는 길이의 무작위화를 통한 천연(야생형) 10Fn3 스캐폴드로부터 제작된 10Fn3 클론으로 구성될 수 있다. 요망되는 경우, 이 라이브러리는, 예를 들어, 하기 문헌들에 기재된 기술들에 의해, 생성된 RNA-단백질 융합 라이브러리일 수 있다: 미국 특허 출원 09/007,005호 및 미국 특허 출원 09/247,190호(Szostak et al.); WO98/31700호(Szostak et al.); 및 Roberts & Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) vol. 94, p. 12297-12302. 대안적으로, 라이브러리는 DNA-단백질 라이브러리(예를 들어, Lohse(DNA-단백질 융합체와 이의 용도), 미국 특허 출원 60/110,549호, 미국 특허 출원 09/459,190호, 및 WO 00/32823호에 기재된 것과 같은 라이브러리). 융합 라이브러리는 고정된 표적과 함께 인큐베이션되며, 지지체는 비특이적 결합자를 제거하기 위해 세척되며, 가장 강하게 결합된 결합자는 매우 엄격한 조건하에서 용리되며 서열 정보를 회수하거나, 서열의 추가 돌연변이유발과 함께 또는 없이, 선별 과정을 반복하기 위해 사용될 수 있는 결합자의 신규 라이브러리를 생성시키기 위해 PCR을 거치게 된다. 다수의 선별 라운드는 항원(예를 들어, 혈청 알부민)에 대한 충분한 친화력의 결합자가 획득될 때까지 수행될 수 있다.
한 특별한 일예에서, 10Fn3 스캐폴드는 선별 표적으로써 사용될 수 있다. 예를 들어, 단백질이 10개 잔기 루프내에 존재하는 특이 펩티드 서열(예를 들어, 혈청 알부민)에 결합하는 경우, 이의 루프 중 하나가 종종 길이와 요망되는 서열에 대해 설정된, 단일 10Fn3 클론이 제작된다. 신규 클론은 생체내에서 발현되고, 정제되고, 이후 고체 지지체 상에 고정된다. 적절한 스캐폴드에 기반한 RNA-단백질 융합 라이브러리는 이후 지지체와 상호작용하도록 허용되는데, 상기 라이브러리는 이후 세척되며, 요망되는 분자가 상기한 바와 같이 용리되고 재선별된다.
유사하게, 본 명세서에 기재된 스캐폴드, 예를 들어, 10Fn3 스캐폴드는, 예를 들어, 10Fn3 루프내의, 스캐폴드에 의해 디스플레이된 펩티드 서열과 상호작용하는 천연 단백질을 발견하는데 사용되 수 있다. 스캐폴드 단백질, 예컨대, 10Fn3 단백질은, 상기한 바와 같이 고정되며, RNA-단백질 융합 라이브러리는 디스플레이된 루프에 대한 결합자에 관해 스크리닝된다. 결합자는 다수의 선별 라운드를 통해 농축되며 DNA 시퀀싱에 의해 확인된다.
또한, 상기 접근법에서, RNA-단백질 라이브러리가 유도된 개선에 관한 대표적인 라이브러리를 대표하지만, 임의 유형의 스캐폴드-기반 라이브러리가 본 발명의 선별 방법에서 사용될 수 있다.
피브로넥틴 스캐폴드 폴리펩티드의 용도
본 명세서에 기재된 피브로넥틴 스캐폴드 폴리펩티드는 혈청 알부민 또는 관심있는 임의의 항원에 결합하도록 전개될 수 있다. 이와 같은 피브로넥틴 스캐폴드 단백질은 천연 항체의 열역학 특성 보다 우수한 열역학 특성을 지니며 시험관내에서 빠르게 전개될 수 있다. 따라서, 이들 피브로넥틴 스캐폴드 폴리펩티드는 연구, 치료, 및 진단 분야에서 사용을 위한 결합 도메인을 생산하는데 사용될 수 있다.
돌연변이유발 친화력 성숙
본 명세서에 기재된 선별은 또한 라이브러리 다양성을 추가로 증가시키기 위해 선별 단계의 전부 또는 서브세트후 돌연변이유발과 조합될 수 있다. 친화력 성숙의 방법은, 항원-결합 친화력에 대해 하나 이상의 선별 라운드와 조합되는, 예를 들어, 실수-유발 PCR(Cadwell and Joyce, PCR Methods Appl 2:28 (1992)) 또는 무작위 돌연변이유발의 다른 형태, 아래에 기재된 것과 같은 NNK 돌연변이유발, 룩-스루 돌연변이유발(여기서 CDR-이식된 피브로넥틴 스캐폴드 폴리펩티드는 천연적으로-생성되는 CDR 다양성의 사용을 통해 항원 결합을 최적화시키기 위해 조작된다 - 예를 들어, 참고문헌으로 본 명세서에 통합된, WO 06/023144호를 참조), 및/또는 폴리펩티드 다양성을 생성시키기 위한 다른 당업계-인지된 돌연변이유발 접근법을 사용할 수 있다.
아래에 기재된 스캐폴드 단백질들 중 임의의 단백질은, 예를 들어, 본 발명의 이중-특이적 리간드 조성물에 사용하기 위해 서로 조합될 수 있다. 예를 들어, CDR은 CTLA-4 스캐폴드 상에 이식될 수 있으며 다가(multivalent) 리간드를 형성하기 위해 항체 VH 또는 VL 도메인과 함께 사용될 수 있다. 마찬가지로, 피브로넥틴, 리포칼린, 애피바디, 및 다른 스캐폴드가 조합될 수 있다.
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 상기 간행물에 인용된 참고문헌은 참고문헌으로써 본 명세서에 통합된다. 본 발명의 기재된 방법 및 시스템의 다양한 수정 및 변형이 본 발명의 영역과 정신을 벗어남이 없이 당업계의 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 본 발명이 특정 바람직한 구체예들과 연계하여 기재되었지만, 청구된 것과 같은 본 발명은 이와 같은 특정 구체예들로 부당하게 제한되어서는 아니된다는 것이 이해되어야 한다. 실제로, 분자 생물학 또는 관련 분야의 통상의 기술자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 기재된 양상의 다양한 변형이 하기 특허청구범위의 범위내에 포함되도록 의도된다.
부록 1; 생체내 반감기를 향상시키는 폴리펩티드.
알파-1 당단백질 (오로소뮤코이드) (AAG)
알파-1 항키로모트립신 (ACT)
알파-1 항트립신 (AAT)
알파-1 마이크로글로불린 (단백질 HC) (AIM)
알파-2 매크로글로불린 (A2M)
항트롬빈 III (AT III)
아포지단백질 A-1 (Apo A-1)
아포지단백질 B (Apo B)
베타-2-마이크로글로불린 (B2M)
세룰로플라스민 (Cp)
상보서열(Complement) 성분 (C3)
상보서열 성분 (C4)
C1 에스테라제 억제제 (C1 INH)
C-반응성 단백질 (CRP)
시스타틴 C (Cys C)
페리틴 (FER)
피브리노겐 (FIB)
피브로넥틴 (FN)
하프토글로빈 (Hp)
헤모펙신 (HPX)
면역글로불린 A (IgA)
면역글로불린 D (IgD)
면역글로불린 E (IgE)
면역글로불린 G (IgG)
면역글로불린 M (IgM)
면역글로불린 경쇄 (카파/람다)
지단백질(a) [Lp(a)]
만노오스-결합 단백질 (MBP)
미오글로빈 (Myo)
플라스미노겐 (PSM)
프릴부민 (트랜스티레틴) (PAL)
레티놀-결합 단백질 (RBP)
레오마토이드 인자 (RF)
혈청 아밀로이드 A (SAA)
가용성 트랜스페린 수용체 (sTfR)
트랜스페린 (Tf)
부록 2
페어링 치료적 관련 참조
TNF 알파/TGF-β · 콜라겐 유도된 관절염 모델의 발목 관절에 주입시 TGF-b 및 TNF는 관절 염증을 현저하게 개선시켰다. 비-콜라겐 챌린지된 마우스에서는 아무런 효과가 없었다.
TNF 알파/IL-1 · TNF 및 IL-1은 포도막염의 병리학에서 상승작용을 한다. · TNF 및 IL-1은 말라리아의 병리학에서 상승작용을 한다 (저혈당증, NO). · TNF 및 IL-1은 염증에 있는 다형핵(PMN) 세포 이동의 유도에 있어서 상승작용을 한다. · IL-1 및 TNF는 복막으로의 PMN 침윤을 유도하는데 상승작용한다. · IL-1 및 TNF는 내피 세포에 의한 IL-1의 분비를 유도하는데 상승작용한다. 염증에서의 중요성 · IL-1 또는 TNF는 단독으로 무릎 윤활막으로의 일부 세포 침윤을 유도한다. IL-1은 PMN을 유도하였다, TNF-단핵구. 이들은 함께 증가된 PMN으로 인한 더욱 심한 침윤을 유도하였다. · 순환하는 심장근 억제 물질 (패혈증에 존재함)의 수준이 IL-1 및 TNF의 상승적인 작용으로 낮아진다.
TNF 알파/IL-2 · 킬러 T-세포의 상승적인 활성화와 가장 많이 관련됨.
TNF 알파/IL-3 · 급성 골수 백혈병 모세포의 클로날 성장을 자극함에 있어서 인터루킨 3 및 종양 괴사 인자 알파의 상승작용은 종양 괴사 인자 알파에 의한 이차 조혈 시토킨의 유도 결과이다. · Cancer Res. 1992 Apr 15;52(8):2197-201.
TNF 알파/IL-4 · IL-4 및 TNF는 내피 세포 상에서 VCAM 발현을 유도하는데 상승작용한다. 천식에서 기능할 것을 암시한다. 윤활막에 대하여 동일하고 - RA에 관련된다. · TNF 및 IL-4는 각질세포에서 IL-6을 유도하는데 상승작용한다. · 배양된 섬유모세포-유사 윤활막세포에서 VCAM-1의 지속 상승된 수준은 증가된 mRNA 안정성을 통해 IL-4 또는 IL-13과 조합된 TNF-알파에 의해 달성될 수 있다. Am J Pathol. 1999 Apr;154(4):1149-58.
TNF 알파/IL-5 · 기관지 과반응성의 성인 및 이들의 아이에 있어서 종양 괴사 인자 시스템 및 혈청 인터루킨-4, 인터루킨-5, 인터루킨-8, 호산구 양이온 단백질 및 면역글로불린 E 수준의 상관관계. Allergy Asthma Proc. 2003 Mar-Apr;24(2):111-8.
TNF 알파/IL-6 · TNF 및 IL-6은 신규한 인간 골수종 세포주인 OH-2에 대한 유력한 성장 인자이다. Eur J Haematol. 1994 Jul;53(1):31-7.
TNF 알파/IL-8 · TNF 및 IL-8은 PMN과 상승작용하여 혈소판을 활성화시킨다. 급성 호흡 곤란 증후군과 관련된다. · IL-5/TNF 참조 (천식). 호중구-매개된 혈소판 활성화를 위한 인터루킨-8과 종양 괴사 인자-알파간의 상승작용. Eur Cytokine Netw. 1994 Sep-Oct;5(5):455-60 (성인 호흡 곤란 증후군 (ARDS))
TNF 알파/IL-9
TNF 알파/IL-10 · IL-10은 만성적으로 감염된 T-세포에서 HIV 발현을 유도함에 있어서 TNF를 유도하고 이와 상승작용한다.
TNF 알파/IL-11 · 시토킨은 상승적으로 파골세포 분화를 유도한다: 무한증식 또는 정상 두개관골 세포에 의해 지지됨. Am J Physiol Cell Physiol. 2002 Sep;283(3):C679-87. (Bone loss)
TNF 알파/IL-12
TNF 알파/IL-13 · 배양된 섬유모세포-유사 윤활막세포에서 VCAM-1의 지속 상승된 수준은 증가된 mRNA 안정성을 통해 IL-4 또는 IL-13과 조합된 TNF-알파에 의해 달성될 수 있다. Am J Pathol. 1999 Apr;154(4):1149-58. · 인터루킨-13 및 종양 괴사 인자-알파는 인간 코 섬유모세포에서 에오탁신 생성을 상승적으로 유도한다. Clin Exp Allergy. 2000 Mar;30(3):348-55. · 인터루킨-13 및 종양 괴사 인자-알파는 인간 코 섬유모세포에서 에오탁신 생성을 상승적으로 유도한다. Clin Exp Allergy. 2000 Mar;30(3):348-55 (알레르기성 염증). · 유아 콩팥 증후군의 치료 반응에 있어서 혈청 TNF-베타 및 IL-3의 관계. Cytokine. 2003 Feb 7;21(3):155-9.
TNF 알파/IL-14 · 가벼운 천식이 있는 피검체에서 흡입된 종양 괴사 인자 알파의 효과. Thorax. 2002 Sep;57(9):774-8.
TNF 알파/IL-15 · 가벼운 천식이 있는 피검체에서 흡입된 종양 괴사 인자 알파의 효과. Thorax. 2002 Sep;57(9):774-8.
TNF 알파/IL-16 · 기도 상피 세포에서 인터루킨-16의 종양 괴사 인자-알파-유도된 합성: 세로토닌 자극을 위해 프라이밍. Am J Respir Cell Mol Biol. 2003 Mar;28(3):354-62 (기도 염증). · 류마티스 관절염 환자에서 순환하는 인터루킨 16과 전염증 시토킨의 상관관계. Rheumatology (Oxford). 2001 Apr;40(4):474-5. 요약 이용할 수 없음 · 인터루킨 16은 크론병에서 상향조절되고 마우스에서의 TNBS 대장염에 관여한다. Gastroenterology. 2000 Oct;119(4):972-82.
TNF 알파/IL-17 · 인터루킨-17의 억제는 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi)로 챌린지된 백신화된 마우스에서 관절염의 발생을 예방한다. Infect Immun. 2003 Jun;71(6):3437-42. · 인터루킨 17은 시험관내에서 연골 파괴를 유도하는데 종양 괴사 인자 알파와 상승작용한다. Ann Rheum Dis. 2002 Oct;61(10):870-6. · IL-17 및 TNF-알파에 의해 야기된 기도에서의 호중구의 축적에 있어서 GM-CSF의 역할. Eur Respir J. 2003 Mar;21(3):387-93 (기도 염증). · 요약 인터루킨-1, 종양 괴사 인자 알파 및 인터루킨-17은 인간 골관절염 슬관절 반월판의 체외이식편에서 산화질소 및 프로스타글란딘 E2 생성을 상승적으로 상향조절한다. Arthritis Rheum. 2001 Sep;44(9):2078-83.
TNF 알파/IL-18 · 류마티스 관절염 환자의 무릎 윤활막 조직에서 인터루킨-1 베타 및 종양 괴사 인자 알파 둘 모두의 개선된 수준과 인터루킨-18 발현의 결합. Arthritis Rheum. 2003 Feb;48(2):339-47. · 요약 타입 2 당뇨병 환자의 혈청에서 인터루킨-18 및 종양 괴사 인자-알파의 상승된 수준: 당뇨 신장병증과의 상관관계. Metabolism. 2003 May;52(5):605-8.
TNF 알파/IL-19 · 요약 IL-19는 IL-6 및 TNF-알파의 생성을 유도하고 TNF-알파를 통해 세포 아폽토시스를 초래한다. J Immunol 2002 Oct 15;169(8):4288-97.
TNF 알파/IL-20 · 요약 시토킨:IL-20 - 피부 염증에서의 새로운 이펙터. Curr Biol 2001 Jul 10;11(13):R531-4.
TNF 알파/상보서열 · 염증 및 응고: 패혈 환자와 관련됨. Clin Infect Dis. 2003 May 15;36(10):1259-65. Epub 2003 May 08. Review
TNF 알파/IFN-γ · 뇌에서의 MHC 유도. · 항-바이러스 반응/IFN-β 유도에 있어서의 상승작용. · 호중구 활성화/호흡 터짐. · 내피 세포 활성화. · 환자를 항-바이러스 요법으로서 TNF/IFN-γ로 치료할 때 주목되는 독성. · 인간 별아교세포에 의한 프랙트알킨 발현. · 염증 반응에 대한 다수의 논문 - 즉, LPS, 또한 매크로파지 활성화. · 항-TNF 및 항-IFN-γ는 마우스를 치명적인 내독소혈증으로부터 보호하기 위해 상승작용한다.
TGF-β/IL-1 · 골모세포에 의한 프로스타글란딘 합성 · 장 상피 세포에 의한 IL-6 생성 (염증 모델) · 폐 섬유모세포에서 IL-11 및 IL-6 자극 (염증 모델) · 망막에서 IL-6 및 IL-8 생성
TGF-β/IL-6 · 연골육종 증식
IL-1/IL-2 · B-세포 활성화 · LAK 세포 활성화 · T 세포 활성화 · 림포킨 활성화된 킬러 세포의 생성에서 IL-1과 IL-2의 상승작용은 TNF-알파 및 베타에 의해 매개된다 (림포톡신). Cytokine. 1992 Nov;4(6):479-87.
IL-1/IL-3
IL-1/IL-4 · B-세포 활성화 · IL-4는 내피 세포 활성화에 있어서 IL-1 발현을 유도한다.
IL-1/IL-5
IL-1/IL-6 · B 세포 활성화 · T 세포 활성화 (보조 세포를 대체할 수 있다) · IL-1은 IL-6 발현을 유도한다. · C3 및 혈청 아밀로이드 발현 (급성 기 반응) · HIV 발현 · 연골 콜라겐 파괴
IL-1/IL-7 · IL-7은 IL-1-유도된 가슴샘세포 증식에 필요하다. 과립구-매크로파지 콜로니-자극 인자 또는 종양 괴사 인자와 IL-1의 상승 효과에 있어서 IL-7의 관련. J Immunol. 1992 Jan 1;148(1):99-105.
IL-1/IL-8
IL-1/IL-10
IL-1/IL-11 · 시토킨은 상승적으로 파골세포 분화를 유도한다: 무한증식 또는 정상 두개관골 세포에 의해 지지됨. Am J Physiol Cell Physiol. 2002 Sep;283(3):C679-87. (Bone loss)
IL-1/IL-16 · 류마티스 관절염 환자에서 순환하는 인터루킨 16과 전염증 시토킨의 상관관계. Rheumatology (Oxford). 2001 Apr;40(4):474-5. 요약 이용할 수 없음
IL-1/IL-17 · 인터루킨-17의 억제는 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi)로 챌린지된 백신화된 마우스에서 관절염의 발생을 예방한다. Infect Immun. 2003 Jun;71(6):3437-42. · 인간 연골 분해 및 골관절염에서 윤활막 염증에 대한 인터루킨 17의 기여. Osteoarthritis Cartilage. 2002 Oct;10(10):799-807. · 요약 인터루킨-1, 종양 괴사 인자 알파 및 인터루킨-17은 인간 골관절염 슬관절 반월판의 체외이식편에서 산화질소 및 프로스타글란딘 E2 생성을 상승적으로 상향조절한다. Arthritis Rheum. 2001 Sep;44(9):2078-83.
IL-1/IL-18 · 류마티스 관절염 환자의 무릎 윤활막 조직에서 인터루킨-1 베타 및 종양 괴사 인자 알파 둘 모두의 개선된 수준과 인터루킨-18 발현의 결합. Arthritis Rheum. 2003 Feb;48(2):339-47.
IL-1/IFN-g
IL-2/IL-3 · T-세포 증식 · B 세포 증식
IL-2/IL-4 · B-세포 증식 · T-세포 증식 · (선택적으로 CD8 및 NK 림프구의 활성화를 유도하는) IL-2R 베타 효능제 P1-30은 IL-2, IL-4, IL-9 및 IL-15와 상승적으로 작용한다: 생물학적 및 분자적 효과. J Immunol. 2000 Oct 15;165(8):4312-8.
IL-2/IL-5 · B-세포 증식/Ig 분비 · IL-5는 B-세포 상에서 IL-2 수용체를 유도한다
IL-2/IL-6 · 세포독성 T-세포의 발생
IL-2/IL-7
IL-2/IL-9 · IL-2/IL-4 (NK-세포) 참조
IL-2/IL-10 · B-세포 활성화
IL-2/IL-12 · IL-12는 새로운 인간 NK 세포에서 IL-2와 상승작용하여 림포킨-활성화된 세포독성 및 퍼포린(perforin) 및 그란자임(granzyme) 유전자 발현을 유도한다. Cell Immunol 1995 Oct 1;165(1):33-43. (T-세포 활성화)
IL-2/IL-15 · IL-2/IL-4 (NK-세포) 참조 · (T 세포 활성화 및 증식) IL-15 및 IL-12: 생체내 T 세포에 대한 생과 사의 문제. Nat Med. 2001 Jan;7(1):114-8.
IL-2/IL-16 · IL-16 및 IL-2에 의한 CD4+ T 세포의 상승적인 활성화. J Immunol. 1998 Mar 1;160(5):2115-20.
IL-2/IL-17 · 인간 및 실험적 신장 동종이식 거부에서 인터루킨 17의 초기 관련에 대한 입증. J Pathol. 2002 Jul;197(3):322-32.
IL-2/IL-18 · IL-2와 상승작용하는 인터루킨 18 (IL-18)은 마우스에서 치명적인 폐 손상을 유도한다: 사이질 폐렴의 발병기전에서 시토킨, 케모킨 및 천연 킬러 세포에 대한 잠재적인 역할. Blood. 2002 Feb 15;99(4):1289-98.
IL-2/TGF-β · CD4 이펙터 운명의 조절: 형질전환 성장 인자 베타 1 및 인터루킨 2는 아폽토시스를 예방하고 이펙터 확장을 촉진시키기 위해 상승작용한다. J Exp Med. 1995 Sep 1;182(3):699-709.
IL-2/IFN-γ · B-세포에 의한 Ig 분비 · IL-2는 T-세포에 의한 IFN-γ 발현을 유도한다.
IL-2/IFN-α/β · 없음
IL-3/IL-4 · 비만 세포 성장에서의 상승작용 · 인간 단핵구에 의한 CD23 발현 유도에 대한 IL-4 및 GM-CSF 또는 IL-3의 상승적인 효과: IFN-알파 및 IFN-감마의 조절 효과. Cytokine. 1994 Jul;6(4):407-13.
IL-3/IL-5
IL-3/IL-6
IL-3/IFN-γ · IL-4 및 IFN-감마는 인간 장 상피 세포에서 총 중합체 IgA 수용체 수준을 상승적으로 증가시킨다. 단백질 티로신 키나아제의 역할. J Immunol. 1996 Jun 15;156(12):4807-14.
IL-3/GM-CSF · 시토킨에 의한 인간 호산구 IL-3, IL-5 및 GM-CSF 수용체 알파-사슬 발현의 차등 조절: IL-3, IL-5 및 GM-CSF는 IL-5 반응성의 손실과 함께 IL-5 수용체 알파 발현을 하향조절하나 IL-3 수용체 알파 발현을 상향조절한다. J Immunol. 2003 Jun 1;170(11);5359-66. (알레르기 염증).
IL-4/IL-2 · IL-4는 뮤린 NK 세포에서 IL-2- 및 IL-12-유도된 IFN-(감마) 발현 둘 모두를 상승적으로 향상시킨다. Blood. 2003 Mar 13 [Epub ahead of print]
IL-4/IL-5 · IgE에 반응하여 개선된 비만 세포 히스타민 등 분비 · Th2-유사 시토킨 반응이 수포 유사천포창에 수반된다. 질병의 발병기전에 있어서 IL-4 및 IL-5의 역할. Int J Immunopathol Pharmacol. 1999 May-Aug;12(2):55-61.
IL-4/IL-6
IL-4/IL-10
IL-4/IL-11 · 마우스의 원시 조혈 선조의 증식을 지지함에 있어서 인터루킨-11 및 인터루킨-4의 상승적 상호작용. Blood. 1991 Sep 15;78(6):1448-51.
IL-4/IL-12 · 가지돌기 세포에 의한 IL-12-의존성 IFN-감마 생성에 대한 IL-4 및 IL-18의 상승적인 효과. J Immunol. 2000 Jan 1;164(1):64-71. (Th1/Th2 분화 증가) · IL-4는 뮤린 NK 세포에서 IL-2- 및 IL-12-유도된 IFN-(감마) 발현 둘 모두를 상승적으로 향상시킨다. Blood. 2003 Mar 13 [Epub ahead of print]
IL-4/IL-13 · 요약 인터루킨-4 및 인터루킨-13 시그널링 관계 맵. Science. 2003 Jun 6;300(5625):1527-8 (알레르기, 천식) · IL-4/IL-13 수용체 시스템의 억제는 알레르기 천식에 대한 마우스 모델에서 확립된 알레르기에 영향을 미치지 않고 알레르기 민감화를 예방한다. J Allergy Clin Immunol. 2003 Jun;111(6):1361-1369.
IL-4/IL-16 · (천식) 인터루킨(IL)-4/IL-9 및 외생성 IL-16은 기관지 상피 세포주인 BEAS-2B 세포에 의해 IL-16 생성을 유도한다. Cell Immunol. 2001 Feb 1;207(2):75-80.
IL-4/IL-17 · 인터루킨(IL)-4 및 IL-17은 인간 결장 근육섬유모세포에서 IL-6 분비를 상승적으로 자극한다. Int J Mol Med. 2002 Nov;10(5):631-4. (창자 염증)
IL-4/IL-24 · IL-24는 래트 및 인간 매크로파지에 의해 발현된다. Immunobiology. 2002 Jul;205(3):321-34.
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IL-5/IL-3 · 시토킨에 의한 인간 호산구 IL-3, IL-5 및 GM-CSF 수용체 알파-사슬 발현의 차등 조절: IL-3, IL-5 및 GM-CSF는 IL-5 반응성의 손실과 함께 IL-5 수용체 알파 발현을 하향조절하나 IL-3 수용체 알파 발현을 상향조절한다. J Immunol. 2003 Jun 1;170(11);5359-66. (알레르기 염증 요약 참조).
IL-5/IL-6
IL-5/IL-13 · 마우스에서 덱사메타손에 의한 알레르기 기도 염증 및 기도 과반응성의 억제: 호산구, IL-5, 에오탁신 및 IL-13의 역할. J Allergy Clin Immunol. 2003 May;111(5):1049-61.
IL-5/IL-17 · 인터루킨-17은 알레르기 천식의 마우스 모델에서 알레르겐 흡입 후 기도로의 과립구 유입을 편성한다. Am J Respir Cell Mol Biol. 2003 Jan;28(1):42-50.
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IL-5/IFN-γ
IL-5/GM-CSF · 시토킨에 의한 인간 호산구 IL-3, IL-5 및 GM-CSF 수용체 알파-사슬 발현의 차등 조절: IL-3, IL-5 및 GM-CSF는 IL-5 반응성의 손실과 함께 IL-5 수용체 알파 발현을 하향조절하나 IL-3 수용체 알파 발현을 상향조절한다. J Immunol. 2003 Jun 1;170(11);5359-66. (알레르기 염증).
IL-6/IL-10
IL-6/IL-11
IL-6/IL-16 · 인터루킨-16은 인간 단핵구에 의한 전염증 시토킨의 발현 및 생성을 자극한다. Immunology. 2000 May;100(1):63-9.
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IL-6/IFN-g
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IL-10/IL-2 ·체액 면역 반응에서 인터루킨-10 (IL-10) 및 인터루킨-2 (IL-2)의 상호작용: IL-10은 IL-2와 상승작용하여 CD25 발현의 상향조절과 상이한 메카니즘으로 인간 B 림프구의 반응을 향상시킨다. Cell Immunol. 1994 Sep;157(2):478-88.
IL-10/IL-12
IL-10/TGF-β · IL-10 및 TGF-베타는 정상 면역의 점막 알레르겐에 대한 조절 T 세포 반응 및 특이적 면역요법과 협력한다. Eur J Immunol. 2003 May;33(5):1205-14.
IL-10/IFN-γ
IL-11/IL-6 · 인터루킨-6 및 인터루킨-11은 RANKL-독립성 메카니즘에 의한 인간 파골세포 형성을 지지한다. Bone. 2003 Jan;32(1):1-7. (염증에서 골 재흡수)
IL-11/IL-17 · 급성 및 만성 피부 병변간 IL-11 및 IL-17의 분극된 생체내 발현. J Allergy Clin Immunol. 2003 Apr;111(4):875-81. (알레르기 피부염) ·IL-17은 NF-카파 B 리간드/오스테오프로테게린 균형의 수용체 활성화제의 손실을 통해 뮤린 콜라겐-유도된 관절염에서 골 진무름을 조장한다. J Immunol 2003 Mar 1;170(5):2655-62.
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IL-12/IL-13 · 전신 홍반 루푸스에서 인터루킨-12 및 인터루킨-13과 부류-특이적 류마티스유사 인자 및 항카디오리핀 항체의 불균형의 관련성. Clin Rheumatol. 2003 May;22(2):107-11.
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IL-12/IL-18 · 인터루킨 12 및 인터루킨-18에 의한 천연 킬러 세포의 상승적인 증식 및 활성화. Cytokine. 1999 Nov;11(11):822-30. · IL-12 및 IL-18에 의해 야기된 염증성 간 지방증. J Interferon Cytokine Res. 2003 Mar;23(3):155-62.
IL-12/IL-23 · 인터루킨-12 보다 인터루킨-23이 뇌의 자가면역 염증에 대해 중요한 시토킨이다. Nature. 2003 Feb 13;421(6924):744-8. · 요약 세포 면역을 촉진하는데 있어서 IL-23에 대한 독특한 역할. J Leukoc Biol. 2003 Jan;73(1):49-56. Review.
IL-12/IL-27 · 요약 EBI3 및 p28 단백질로 구성된 이종이량체 시토킨인 IL-27은 나이브 CD4(+) T 세포의 증식을 유도한다. Immunity. 2002 Jun;16(6):779-90.
IL-12/IFN-γ · IL-12는 면역 자극의 일부로서 B 및 T-세포에 의한 IFN-γ 발현을 유도한다.
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IL-15/IL-13 · 자궁내막증이 있는 여성 및 정상 가임성 여성의 이소성 및 유토픽(eutopic) 자궁내막에서 인터루킨 (IL)-13 및 IL-15의 차별적인 발현. Am J Reprod Immunol. 2003 Feb;49(2):75-83.
IL-15/IL-16 · 피부 T-세포 림프종에서 IL-15 및 IL-16 과발현: 균상 식육종 진행에 있어서 단계-의존성 증가. Exp Dermatol. 2000 Aug;9(4):248-51.
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IL-15/IL-21 · IL-21은 IL-15 또는 IL-18과 상승작용하여 인간 NK 및 T 세포에서 IFN-감마 생성을 향상시킨다. J Immunol. 2003 Jun 1;170(11):5464-9.
IL-17/IL-23 · 인터루킨-23은 인터루킨-17의 생성을 특징으로 하는 별개의 CD4 T 세포 활성화 상태를 촉진한다. J Biol Chem. 2003 Jan 17;278(3):1910-4. Epub 2002 Nov 03
IL-17/TGF-β · 급성 및 만성 피부 병변간 IL-11 및 IL-17의 분극된 생체내 발현. J Allergy Clin Immunol. 2003 Apr;111(4):875-81. (알레르기 피부염)
IL-18/IL-12 · 인터루킨 12 및 인터루킨-18에 의한 천연 킬러 세포의 상승적인 증식 및 활성화. Cytokine. 1999 Nov;11(11):822-30. · 요약 뮤린 만성 이식편대 숙주 질환에서 IL-12에 의한 시험관내 면역글로불린 생성의 억제: IL-18과 상승작용. Eur J Immunol, 1998 Jun;28(6):2017-24.
IL-18/IL-21 · IL-21은 IL-15 또는 IL-18과 상승작용하여 인간 NK 및 T 세포에서 IFN-감마 생성을 향상시킨다. J Immunol. 2003 Jun 1;170(11):5464-9.
IL-18/TGF-β · 코르티코스테로이드로 치료된 그레이브 눈병증 환자의 혈청에서 인터루킨 18 및 형질전환 성장 인자 베타1. Int Immunopharmacol. 2003 Apr;3(4):549-52.
IL-18/IFN-γ
항-TNF 알파/항-CD4 · DBA/1 관절염 마우스에서 상승적인 치료 효과.
부록 3: 종양학 조합
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부록 4
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Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 23 cggccatggc gtcaacggac at 22 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 24 atgtgcgctc gagcgtttga ttt 23 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 25 Glu Pro Lys Ser Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 26 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(50) <223> May or may not be present <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 26 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser 50 <210> 27 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS <222> (1)..(342) <400> 27 tgg agc gcg tcg acg gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tct ctg 48 Trp Ser Ala Ser Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 1 5 10 15 tct gca tct gta gga gac cgt gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag 96 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln 20 25 30 agc att gat agt tat tta cat tgg tac cag cag aaa cca ggg aaa gcc 144 Ser Ile Asp Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45 cct aag ctc ctg atc tat agt gca tcc gag ttg caa agt ggg gtc cca 192 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Glu Leu Gln Ser Gly Val Pro 50 55 60 tca cgt ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc 240 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 agc agt ctg caa cct gaa gat ttt gct acg tac tac tgt caa cag gtt 288 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val 85 90 95 gtg tgg cgt cct ttt acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 336 Val Trp Arg Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 cgg tgc taataaggat ccggc 357 Arg Cys <210> 28 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 28 Trp Ser Ala Ser Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 1 5 10 15 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln 20 25 30 Ser Ile Asp Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Glu Leu Gln Ser Gly Val Pro 50 55 60 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val 85 90 95 Val Trp Arg Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Cys <210> 29 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 29 tggagcgcgt cgacggacat ccagatgacc cagtctcca 39 <210> 30 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 30 ttagcagccg gatccttatt agcaccgttt gatttccac 39 <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 31 Ser Ser Tyr Leu Asn 1 5 <210> 32 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 32 Phe Lys Ser Leu Lys 1 5 <210> 33 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 33 Tyr Tyr His Leu Lys 1 5 <210> 34 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 34 Arg Arg Tyr Leu Lys 1 5 <210> 35 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 35 Tyr Asn Trp Leu Lys 1 5 <210> 36 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 36 Leu Trp His Leu Arg 1 5 <210> 37 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 37 Phe Arg Tyr Leu Ala 1 5 <210> 38 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 38 Phe Tyr His Leu Ala 1 5 <210> 39 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 39 Ile Trp His Leu Asn 1 5 <210> 40 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 40 Tyr Arg Tyr Leu Arg 1 5 <210> 41 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 41 Leu Lys Tyr Leu Lys 1 5 <210> 42 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 42 Leu Arg Tyr Leu Arg 1 5 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Variable amino acid <400> 49 Xaa Ala Ser Xaa Leu Gln Ser 1 5 <210> 50 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 50 Arg Ala Ser Pro Leu Gln Ser 1 5 <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 51 Asn Ala Ser Tyr Leu Gln Ser 1 5 <210> 52 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 52 Lys Ala Ser Thr Leu Gln Ser 1 5 <210> 53 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 53 Gln Ala Ser Val Leu Gln Ser 1 5 <210> 54 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 54 Arg Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 61 Lys Ala Ser Trp Leu Gln Ser 1 5 <210> 62 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 62 Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser 1 5 <210> 63 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 63 Thr Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 64 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 64 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 65 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 65 Gly Ala Ser Arg Leu Gln Ser 1 5 <210> 66 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(6) <223> Variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Variable amino acid <400> 66 Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr 1 5 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 67 Gln Gln Thr Tyr Ser Val Pro Pro Thr 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 68 Gln Gln Thr Tyr Arg Ile Pro Pro Thr 1 5 <210> 69 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 69 Gln Gln Val Val Tyr Trp Pro Val Thr 1 5 <210> 70 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 70 Gln Gln Val Arg Lys Val Pro Arg Thr 1 5 <210> 71 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 71 Gln Gln Gly Leu Tyr Pro Pro Ile Thr 1 5 <210> 72 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 72 Gln Gln Asn Val Val Ile Pro Arg Thr 1 5 <210> 73 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 73 Gln Gln Ser Ala Val Tyr Pro Lys Thr 1 5 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 74 Gln Gln Arg Leu Leu Tyr Pro Lys Thr 1 5 <210> 75 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 75 Gln Gln Arg Ala Arg Trp Pro Arg Thr 1 5 <210> 76 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 76 Gln Gln Val Ala Arg Val Pro Arg Thr 1 5 <210> 77 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 77 Gln Gln Tyr Val Gly Tyr Pro Arg Thr 1 5 <210> 78 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 78 Gln Gln Thr Thr Tyr Tyr Pro Ile Thr 1 5 <210> 79 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 79 Gln Gln Val Leu Tyr Tyr Pro Gln Thr 1 5 <210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 80 Gln Gln Val Val Tyr Trp Pro Ala Thr 1 5 <210> 81 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 81 Gln Gln Val Ala Leu Tyr Pro Lys Thr 1 5 <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 82 Gln Gln Asn Leu Phe Trp Pro Arg Thr 1 5 <210> 83 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 83 Gln Gln Met Leu Phe Tyr Pro Lys Thr 1 5 <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 84 Gln Gln Gly Ala Arg Trp Pro Gln Thr 1 5 <210> 85 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 85 Gln Gln Val Gly Arg Tyr Pro Lys Thr 1 5 <210> 86 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 86 Trp Val Tyr Gln Met Asp 1 5 <210> 87 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 87 Trp Ser Tyr Gln Met Thr 1 5 <210> 88 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(5) <223> Variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(8) <223> Variable amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Variable amino acid <400> 88 Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 89 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 89 Ser Ile Ser Ala Phe Gly Ala Lys Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 90 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 90 Ser Ile Ser Ser Phe Gly Ser Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 91 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 91 Leu Ser Gly Lys Phe Asp Tyr 1 5 <210> 92 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 92 Gly Arg Asp His Asn Tyr Ser Leu Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 93 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 93 tatccttatg atgttcctga ttatgca 27 <210> 94 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 94 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5 <210> 95 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 95 Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Ser Gln Leu Ser 1 5 10 <210> 96 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 96 Trp Arg Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 97 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 97 Ala Gln Gly Ala Ala Leu Pro Arg Thr 1 5 <210> 98 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98 Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu 1 5 <210> 99 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe 1 5 <210> 100 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu 1 5 <210> 101 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 101 Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 1 5 <210> 102 <211> 4 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism: Peptide <400> 102 Tyr Trp Thr Asp 1 <210> 103 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <400> 103 gag gtg cag ctg ttg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg 48 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg cgt ctc tcc tgt gca gcc tcc gga ttt agg att agc gat gag 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Ile Ser Asp Glu 20 25 30 gat atg ggc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggt cta gag tgg gta 144 Asp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 tca agc att tat ggc cct agc ggt agc aca tac tac gca gac tcc gtg 192 Ser Ser Ile Tyr Gly Pro Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cgg ttc acc atc tcc cgt gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac agc ctg cgt gcc gag gac acc gcg gta tat tat tgc 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg agt gct ttg gag ccg ctt tcg gag ccc ctg ggc ttt tgg ggt cag 336 Ala Ser Ala Leu Glu Pro Leu Ser Glu Pro Leu Gly Phe Trp Gly Gln 100 105 110 gga acc ctg gtc acc gtc tcg agc 360 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 104 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 104 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Ile Ser Asp Glu 20 25 30 Asp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Tyr Gly Pro Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Ala Leu Glu Pro Leu Ser Glu Pro Leu Gly Phe Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 105 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(348) <400> 105 gag gtg cag ctg ttg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg 48 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg cgt ctc tcc tgt gca gcc tcc gga ttc acc ttt gat ctt tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Leu Tyr 20 25 30 aat atg ttt tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggt cta gag tgg gtc 144 Asn Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 tca ttt att agt cag act ggt agg ctt aca tgg tac gca gac tcc gtg 192 Ser Phe Ile Ser Gln Thr Gly Arg Leu Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cgg ttc acc atc tcc cgc gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac agc ctg cgt gcc gag gac acc gcg gta tat tac tgt 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aaa acg ctg gag gat ttt gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc 336 Ala Lys Thr Leu Glu Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 acc gtc tcg agc 348 Thr Val Ser Ser 115 <210> 106 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 106 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Leu Tyr 20 25 30 Asn Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Phe Ile Ser Gln Thr Gly Arg Leu Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Thr Leu Glu Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 107 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 107 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac cgt gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc gtt aag gag ttt 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Lys Glu Phe 20 25 30 tta tgg tgg tac cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc 144 Leu Trp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat atg gca tcc aat ttg caa agt ggg gtc cca tca cgt ttc agt ggc 192 Tyr Met Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gct acg tac tac tgt caa cag aag ttt aag ctg cct cgt 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Lys Phe Lys Leu Pro Arg 85 90 95 acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgg 324 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 108 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 108 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Lys Glu Phe 20 25 30 Leu Trp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Met Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Lys Phe Lys Leu Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 109 <211> 362 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 109 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag tggtattgga tgggttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagttaag 300 ttgggggggg ggcctaattt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360 gc 362 <210> 110 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 110 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Trp Tyr 20 25 30 Trp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Lys Leu Gly Gly Gly Pro Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 111 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <400> 111 gag gtg cag ctg ttg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg 48 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg cgt ctc tcc tgt gca gcc tcc gga ttc acc ttt gag tgg tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Trp Tyr 20 25 30 tgg atg ggt tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggt cta gag tgg gtc 144 Trp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 tca gct att agt ggt agt ggt ggt agc aca tac tac gca gac tcc gtg 192 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cgg ttc acc atc tcc cgc gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac agc ctg cgt gcc gag gac acc gcg gta tat tac tgt 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aaa gtt aag ttg ggg ggg ggg cct aat ttt gac tac tgg ggc cag 336 Ala Lys Val Lys Leu Gly Gly Gly Pro Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 gga acc ctg gtc acc gtc tcg agc 360 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 112 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 112 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tct ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac cgt gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc att gat agt tat 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Ser Tyr 20 25 30 tta cat tgg tac cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc 144 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat agt gca tcc gag ttg caa agt ggg gtc cca tca cgt ttc agt ggc 192 Tyr Ser Ala Ser Glu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gct acg tac tac tgt caa cag gtt gtg tgg cgt cct ttt 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Val Trp Arg Pro Phe 85 90 95 acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgc 324 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 113 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 113 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Ser Tyr 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Glu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Val Trp Arg Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 114 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 114 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac cgt gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc att ttt atg aat 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Phe Met Asn 20 25 30 tta ttg tgg tac cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc 144 Leu Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat aat gca tcc gtg ttg caa agt ggg gtc cca tca cgt ttc agt ggc 192 Tyr Asn Ala Ser Val Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gct acg tac tac tgt caa cag gtt gtg tgg cgt cct ttt 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Val Trp Arg Pro Phe 85 90 95 acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgg 324 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 115 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 115 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Phe Met Asn 20 25 30 Leu Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Ser Val Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Val Trp Arg Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 116 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 116 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac cgt gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc att tat gat gcg 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Asp Ala 20 25 30 tta gag tgg tac cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc 144 Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat act gca tcc cgg ttg caa agt ggg gtc cca tca cgt ttc agt ggc 192 Tyr Thr Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gct acg tac tac tgt caa cag gtt atg cag cgt cct gtt 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Met Gln Arg Pro Val 85 90 95 acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgg 324 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 117 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 117 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Asp Ala 20 25 30 Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 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acc atc agc agt ctg caa cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gct acg tac cac tgt caa cag gtt atg cag cgt cct gtt 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Val Met Gln Arg Pro Val 85 90 95 acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgg 324 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 119 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 119 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Asp Ala 20 25 30 Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Thr Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Val Met Gln Arg Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 120 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 120 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac cgt gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc gtt aag gag ttt 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Lys Glu Phe 20 25 30 tta tgg tgg tac cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc 144 Leu Trp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat atg gca tcc aat ttg caa agt ggg gtc cca tca cgt ttc agt ggc 192 Tyr Met Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gct acg tac tac tgt caa cag aag ttt aag ctg cct cgt 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Lys Phe Lys Leu Pro Arg 85 90 95 acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgg 324 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 121 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 121 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Lys Glu Phe 20 25 30 Leu Trp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Met Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Lys Phe Lys Leu Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 122 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 122 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac cgt gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc att tgg acg aag 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Trp Thr Lys 20 25 30 tta cat tgg tac cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc 144 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat atg gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca cgt ttc agt ggc 192 Tyr Met Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gct acg tac tac tgt caa cag tgg ttt agt aat cct agt 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Phe Ser Asn Pro Ser 85 90 95 acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgc 324 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 123 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 123 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Trp Thr Lys 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Met Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile Gln His Ile Pro Val 85 90 95 acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgg 324 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 125 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 125 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gln Pro Ile 20 25 30 Leu Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile Gln His Ile Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 126 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 126 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac cgt gtc acc atc act tgc 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gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg 48 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg cgt ctc tcc tgt gca gcc tcc gga ttc acc ttt agc agc tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 gcc atg agc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggt cta gag tgg gtc 144 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 tca gct att agt ggt agt ggt ggt agc aca tac tac gca gac tcc gtg 192 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cgg ttc acc atc tcc cgt gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac agc ctg cgt gcc gag gac acc gcg gta tat tac tgt 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aaa agt tat ggt gct ttt gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc 336 Ala Lys Ser Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 acc gtc tcg agc ggt gga ggc 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Gln Gln Pro Trp Arg Ser Pro Gly 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 194 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 194 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Trp Trp Leu Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 195 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 195 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gln Ala Ser Leu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 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<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 197 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 20 25 30 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln Ala Ala Ala Glu 50 55 60 Gln Lys Leu 65 <210> 198 <211> 90 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(90) <400> 198 cat cat cat cac cat cac ggg gcc gca atc tca gaa gag gat ctg aat 48 His His His His His His Gly Ala Ala Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn 1 5 10 15 ggg gcc gca tag act gtt gaa agt tgt tta gca aaa cct cat 90 Gly Ala Ala Gln Thr Val Glu Ser Cys Leu Ala Lys Pro His 20 25 30 <210> 199 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 199 His His His His His His Gly Ala Ala Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn 1 5 10 15 Gly Ala Ala Gln Thr Val Glu Ser Cys Leu Ala Lys Pro His 20 25 30 <210> 200 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(348) <400> 200 gag gtg cag ctg ttg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg 48 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg cgt ctc tcc tgt gca gcc tcc gga ttc acc ttt agc agc tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 gcc atg agc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggt cta gag tgg gtc 144 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 tca gct att agt ggt agt ggt ggt agc aca tac tac gca gac tcc gtg 192 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cgg ttc acc atc tcc cgt gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac agc ctg cgt gcc gag gac acc gcg gta tat tac tgt 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aaa agt tat ggt gct ttt gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc 336 Ala Lys Ser Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 acc gtc tcg agc 348 Thr Val Ser Ser 115 <210> 201 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <220> <221> modified_base <222> (307)..(308) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (310)..(311) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (313)..(314) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (316)..(317) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 201 gag gtg cag ctg ttg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg 48 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg cgt ctc tcc tgt gca gcc tcc gga ttc acc ttt agc agc tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 gcc atg agc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggt cta gag tgg gtc 144 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 tca gct att agt ggt agt ggt ggt agc aca tac tac gca gac tcc gtg 192 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cgg ttc acc atc tcc cgt gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac agc ctg cgt gcc gag gac acc gcg gta tat tac tgt 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aaa agt tat ggt gct nnk nnk nnk nnk ttt gac tac tgg ggc cag 336 Ala Lys Ser Tyr Gly Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 gga acc ctg gtc acc gtc tcg agc 360 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 202 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (103)..(106) <223> Variable amino acid <400> 202 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Tyr Gly Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 203 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 203 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac cgt gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc att agc agc tat 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 tta aat tgg tac cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc 144 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca cgt ttc agt ggc 192 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gct acg tac tac tgt caa cag agt tac agt acc cct aat 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Asn 85 90 95 acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgg 324 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 204 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 204 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Asn 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 205 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 205 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 212 Asp Ile Gln Thr Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Gly Arg Tyr 20 25 30 Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ser Ser Val Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Tyr Arg Met Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 213 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 213 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Gly Arg Tyr 20 25 30 Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ser Ser Val Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr 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Synthetic polypeptide <400> 223 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Tyr Lys Ser 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gln Ser Ser Leu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Gln Met Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 224 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 224 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Tyr Arg His 20 25 30 Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 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Synthetic polypeptide <400> 246 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Met Ala Tyr 20 25 30 Gln Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile His Gln Thr Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Val Arg Ser Met Arg Pro Tyr Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 247 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 247 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Asp Tyr 20 25 30 Asp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Met Ile Ser Ser Ser Gly Leu Trp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 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<212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 249 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg His Tyr 20 25 30 Arg Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Trp Ile Arg Pro Asp Gly Thr Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Tyr Met Gly Asp Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 250 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 250 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Met Trp Asp 20 25 30 Lys Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 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Ser Ser 115 <210> 252 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 252 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Leu Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Val Asn Ser Gly Val Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Leu Asn Gln Ser Tyr His Trp Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 253 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 253 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Asp Phe Met Gly Pro His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Arg Thr Ser Met Leu Pro Met Lys Gly Lys Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 254 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 254 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Tyr Asp Tyr 20 25 30 Asn Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Thr His Thr Gly Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 50 55 60 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Lys Gln Asn Pro Ser Tyr Gln Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 255 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 255 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe His Arg Tyr 20 25 30 Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Leu Pro Gly Gly Asp Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gln Thr Pro Asp Tyr Met Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 256 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 256 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Lys Tyr 20 25 30 Asn Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Leu Gly Glu Gly Asn Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Thr Met Asp Tyr Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 257 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 257 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Glu Tyr 20 25 30 Asn Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Leu Pro His Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gln Asp Pro Leu Tyr Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 258 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 258 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Arg Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ile Ser Asn Gly Lys Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gln Asp Trp Met Tyr Met Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 259 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 259 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr 20 25 30 Thr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Thr Ser Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Asn Ser Leu Tyr Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 260 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 260 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Pro Thr 20 25 30 Asn Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Thr Gly Thr Gly Ala Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gln Asn Ser Arg Tyr Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 261 <211> 197 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 261 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Leu Tyr Leu Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg 195 <210> 262 <211> 196 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 262 Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln 1 5 10 15 Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser 20 25 30 Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr 35 40 45 Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu 50 55 60 Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln 65 70 75 80 Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu 85 90 95 Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala 100 105 110 Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys 115 120 125 Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr 130 135 140 Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg 145 150 155 160 Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala 165 170 175 Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu 180 185 190 Val Glu Glu Pro 195 <210> 263 <211> 204 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 263 Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu 1 5 10 15 Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr 20 25 30 Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg 35 40 45 Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys 50 55 60 Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu 65 70 75 80 Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys 85 90 95 Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu 100 105 110 Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr 115 120 125 Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys 130 135 140 Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr 145 150 155 160 Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu 165 170 175 Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly 180 185 190 Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly 195 200

Claims (79)

  1. 혈청 알부민에 특이적으로 결합되고 dAb7r14, dAb7h11, dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAbl7, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, drdAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7r13, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h1O, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p1, 및 dAb7p로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항체 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드.
  2. 하나 이상의 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드로서, 상기 하나 이상의 단일 가변 도메인 중 1종 이상이 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 단일 가변 도메인이고, 상기 하나 이상의 단일 가변 도메인이 비-천연 발생 단일 가변 도메인인 리간드.
  3. 하나 이상의 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드로서, 상기 하나 이상의 단일 가변 도메인 중 1종 이상이 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 항체 단일 가변 도메인인 리간드.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 리간드가 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 단량체 항체 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 단량체 항체 단일 가변 도메인이 약물에 컨주게이션된 리간드.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 리간드가 이중 특이적 리간드이고, 상기 이중 특이적 리간드가 제1 항체 단일 가변 도메인을 포함하고, 상기 제1 항체 단일 가변 도메인이 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 리간드.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 이중 특이적 리간드가 제2 항체 단일 가변 도메인을 추가로 포함하고, 상기 제2 항체 단일 가변 도메인이 혈청 알부민 이외의 표적에 특이적으로 결합되는 이중 특이적 리간드.
  8. 제 7항에 있어서,
    a. 상기 제1 항체 단일 가변 도메인 및 상기 제2 항체 단일 가변 도메인 각각이 항체 중쇄 단일 가변 도메인이거나;
    b. 상기 제1 항체 단일 가변 도메인 및 상기 제2 항체 단일 가변 도메인 각각이 항체 경쇄 단일 가변 도메인이거나;
    c. 상기 제1 항체 단일 가변 도메인이 항체 중쇄 단일 가변 도메인이고, 상 기 제2 항체 단일 가변 도메인이 항체 경쇄 단일 가변 도메인이거나;
    d. 상기 제1 항체 단일 가변 도메인이 항체 경쇄 단일 가변 도메인이고, 상기 제2 항체 단일 가변 도메인이 항체 중쇄 단일 가변 도메인인 이중 특이적 리간드.
  9. 제 8항의 이중 특이적 리간드를 포함하는 IgG로서, 상기 IgG가 네 개의 항체 단일 가변 도메인을 포함하는 IgG.
  10. 제 3항에 있어서, 상기 항체 단일 가변 도메인이 네 개의 카바트(Kabat) 항체 프레임워크 영역 (FR)의 세트를 포함하고, 상기 세트가 인간 프레임워크 생식세포(germ line) 항체 유전자 세그먼트에 의해 엔코딩되는 리간드.
  11. 제 3항, 제 4항 또는 제 5항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드가 항체 중쇄 단일 가변 도메인을 포함하고, 상기 항체 중쇄 단일 가변 도메인이 dAb8, dAb10, dAb36, dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, 및 이와 80% 이상 동일한 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 항체 중쇄 단일 가변 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 리간드.
  12. 제 3항, 제4항 또는 제 6항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드가 항체 경쇄 단일 가변 도메인을 포함하고, 상기 항체 경쇄 단일 가변 도메인이 dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, drdAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7r13, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h95 dAb7h1O, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p1, 및 dAb7p2, 및 이와 80% 이상 동일한 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 항체 경쇄 단일 가변 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 리간드.
  13. 제 3항, 제4항 또는 제 6항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드가 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 항체 단일 가변 도메인을 포함하고, 상기 항체 단일 가변 도메인이 혈청 알부민과의 결합에 대해 dAb8, dAb10, dAb36, dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r235 dAb7r24, dAb7r25, dAb7r265 dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb1, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7r13, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h1O, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p15 및 dAb7p2로 구성된 군으로부터 선택된 항체 단일 가변 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 항체 단일 가변 도메인과 경쟁하는 리간드.
  14. 제 3항 또는 제 4항에 있어서, 상기 항체 단일 가변 도메인이 dAb8, dAb10, dAb36, dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7r13, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h1O, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p1, 및 dAb7p2로 구성된 군으로부터 선택된 항체 단일 도메인 항체로부터의 하나 이상의 CDR을 포함하는 리간드.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 항체 단일 가변 도메인이 CTLA-4, 리포칼린, 스타필 로코커스 단백질 A (SpA), 애피보디(Affibody), 아비머(avimer), GroEl, GroES, 트랜스페린 및 피브로넥틴으로 구성된 군으로부터 선택된 프레임워크를 추가로 포함하는 리간드.
  16. 제 7항에 있어서, 상기 제2 항원 또는 에피토프 결합 특이성이 시토킨, 시토킨 수용체, 효소, 효소 보조-인자 및 DNA 결합 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 항원에 대한 결합 특이성인 리간드.
  17. 제 2항, 제 3항, 제 6항 또는 제 8항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 단일 가변 도메인이 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시 1 x 10-3M 이하, 1 x 10-4M 이하, 1 x 10-5M 이하, 1 x 10-6M 이하, 1 x 10-7M 이하, 1 x 10-8M 이하, 및 1 x 10-9M 이하로 구성된 군으로부터 선택된 해리 상수 (Kd)로 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합되는 리간드.
  18. 제 1항, 제 2항, 제 4항 또는 제 6항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드가 표지, tag 및 약물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 실체를 추가로 포함하는 리간드.
  19. 제 2항, 제 3항, 제 4항 또는 제 6항 중의 어느 한 항의 리간드 및 이의 담 체를 포함하는 조성물.
  20. 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드로서, 상기 단일 가변 도메인이 인간 혈청 알부민 및 비-인간 혈청 알부민에 서로의 10배 이내의 Kd 값으로 특이적으로 결합되고, 상기 단일 가변 도메인이 비-천연 발생 단일 가변 도메인인 리간드.
  21. 항체 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드로서, 상기 항체 단일 가변 도메인이 인간 혈청 알부민 및 비-인간 혈청 알부민에 서로의 10배 이내의 Kd 값으로 특이적으로 결합되는 리간드.
  22. 제 21항에 있어서, 리간드의 T 베타 반감기가 인간 숙주의 인간 혈청 알부민의 T 베타 반감기와 실질적으로 동일한 리간드.
  23. 제 21항에 있어서, 상기 항체 단일 가변 도메인이 인간 혈청 알부민 및 마우스 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 리간드.
  24. 제 21항에 있어서, 상기 항체 단일 가변 도메인이 인간 혈청 알부민 및 래트 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 리간드.
  25. 제 21항에 있어서, 상기 항체 단일 가변 도메인이 인간 혈청 알부민 및 돼지 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 리간드.
  26. 제 21항에 있어서, 상기 항체 단일 가변 도메인이 인간 혈청 알부민 및 시노몰거스 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 리간드.
  27. 제 21항에 있어서, 상기 항체 단일 가변 도메인이 항체 중쇄 단일 가변도메인인 리간드.
  28. 제 27항에 있어서, 상기 항체 중쇄 단일 가변 도메인이 항체 VH3 단일 가변 도메인인 리간드.
  29. 제 28항에 있어서, 상기 항체 VH3 단일 가변 도메인이 인간 항체 VH3 단일 가변 도메인인 리간드.
  30. 제 21항에 있어서, 상기 항체 단일 가변 도메인이 항체 경쇄 단일 가변 도메인인 리간드.
  31. 제 30항에 있어서, 상기 항체 경쇄 단일 가변 도메인이 항체 V카파 경쇄 단일 가변 도메인인 리간드.
  32. 제 30항에 있어서, 상기 리간드가 DOM7h-9, DOM7h-11, DOM7h-13, DOM7h-14, DOM7r-3 및 DOM7r-16, 및 이와 80% 이상 동일한 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 항체 단일 가변 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 항체 V카파 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드.
  33. 제 30항에 있어서, 상기 리간드가 혈청 알부민과의 결합에 대해 dAb8, dAb10, dAb36, dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7r13, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h1O, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p1, 및 dAb7p2로 구성된 군으로부터 선택된 항체 단일 가변 도메인과 경쟁하는 하나 이상의 항체 V카파 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드.
  34. 제 23항, 제 24항, 제 25항 및 제 26항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 단일 가변 도메인이 네 개의 카바트 항체 프레임워크 영역 (FR)의 세트를 포함 하는 리간드.
  35. 제 34항에 있어서, 상기 네 개의 카바트 항체 프레임워크 영역 (FR)의 세트가 항체 VH3 프레임워크 생식세포 항체 유전자 세그먼트에 의해 엔코딩되는 리간드.
  36. 제 34항에 있어서, 상기 네 개의 카바트 항체 프레임워크 영역 (FR)의 세트가 인간 V카파 프레임워크 생식세포 항체 유전자 세그먼트에 의해 엔코딩되는 리간드.
  37. 제 34항에 있어서, CDR의 세트가 네 개의 카바트 항체 프레임워크 영역의 세트를 포함하는 상기 단일 가변 도메인 위로 그래프팅(graft)되고, 이 때 상기 CDR의 세트가 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 리간드.
  38. 제 20항, 제 21항, 제 23항, 제 24항, 제 25항 또는 제 26항 중의 어느 한 항에 있어서, 혈청 알부민 이외의 표적에 특이적으로 결합될 수 있는 하나 이상의 단일 가변 도메인을 추가로 포함하는 리간드.
  39. 제 38항에 있어서, 혈청 알부민 이외의 표적에 특이적으로 결합될 수 있는 상기 하나 이상의 단일 가변 도메인이 항체 단일 가변 도메인인 리간드.
  40. 제 21항에 있어서, 상기 항체 단일 가변 도메인이 하나 이상의 CDR 영역을 포함하고, 이 때 상기 하나 이상의 CDR 영역이 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 CDR 영역 중 하나 이상이 항체 V 영역 또는 항체 단일 가변 도메인에서 비롯된 것인 리간드.
  41. 제 39항에 있어서, 혈청 알부민 이외의 표적에 특이적으로 결합되는 상기 항체 단일 가변 도메인 중 하나 이상이 하나 이상의 CDR 영역을 포함하고, 이 때 상기 하나 이상의 CDR 영역이 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 CDR 영역 중 하나 이상이 항체 V 영역 또는 항체 단일 가변 도메인에서 비롯된 것인 리간드.
  42. 제 40항에 있어서, 상기 항체 단일 가변 도메인이 CTLA-4, 리포칼린, 스타필로코커스 단백질 A (SpA), GroEl, GroES, 트랜스페린 및 피브로넥틴으로 구성된 군으로부터 선택된 스캐폴드를 추가로 포함하는 리간드.
  43. 제 21항, 제 23항, 제 24항, 제 25항 또는 제 26항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 단일 가변 도메인이 인간 혈청 알부민에 300 nM 이하의 Kd로 특이적으로 결합되는 리간드.
  44. 제 21항, 제 23항, 제 24항, 제 25항 및 제 26항 중의 어느 한 항에 있어서, 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 상기 항체 단일 가변 도메인이 인간 혈청 알부민의 도메인 II에 특이적으로 결합되는 리간드.
  45. 제 39항에 있어서, 상기 리간드가 이중 특이적 리간드이고,
    a. 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 상기 항체 단일 가변 도메인 및 혈청 알부민 이외의 표적에 특이적으로 결합되는 상기 항체 단일 가변 도메인 각각이 항체 중쇄 단일 가변 도메인이거나;
    b. 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 상기 항체 단일 가변 도메인 및 혈청 알부민 이외의 표적에 특이적으로 결합되는 상기 항체 단일 가변 도메인 각각이 항체 경쇄 단일 가변 도메인이거나;
    c. 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 상기 항체 단일 가변 도메인이 항체 중쇄 단일 가변 도메인이고, 혈청 알부민 이외의 표적에 특이적으로 결합되는 상기 항체 단일 가변 도메인이 항체 경쇄 단일 가변 도메인이거나;
    d. 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 상기 항체 단일 가변 도메인이 항체 경쇄 단일 가변 도메인이고, 혈청 알부민 이외의 표적에 특이적으로 결합되는 상기 항체 단일 가변 도메인이 항체 중쇄 단일 가변 도메인인 리간드.
  46. 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드로서, 상기 단일 가변 도메인이 인간 혈청 알부민의 도메인 II에 특이적으로 결합되고, 상기 단일 가변 도메인이 비-천연 발생 단일 가변 도메인인 리간드.
  47. 항체 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드로서, 상기 항체 단일 가변 도메인이 인간 혈청 알부민의 도메인 II에 특이적으로 결합되는 리간드.
  48. 제 47항에 있어서, 상기 항체 단일 가변 도메인이 비-천연 발생 항체 단일 가변 도메인인 리간드.
  49. 제 47항에 있어서, 상기 항체 단일 가변 도메인이 천연 발생 항체 단일 가변 도메인인 리간드.
  50. 제 47항에 있어서, 상기 항체 단일 가변 도메인이 항체 중쇄 단일 가변 도메인인 리간드.
  51. 제 50항에 있어서, 상기 항체 중쇄 단일 가변 도메인이 항체 VH3 단일 가변 도메인인 리간드.
  52. 제 51항에 있어서, 상기 항체 VH3 단일 가변 도메인이 인간 항체 VH3 단일 가변 도메인인 리간드.
  53. 제 47항에 있어서, 상기 항체 단일 가변 도메인이 항체 V카파 단일 가변 도메인인 리간드.
  54. 제 53항에 있어서, 상기 항체 V카파 단일 가변 도메인이 DOM7h-1, DOM7h-8, DOM7h-9, DOM7h-11, DOM7h-12, DOM7h-13 및 DOM7h-14, DOM7r-3 및 DOM7r-16으로 구성된 군으로부터 선택되는 리간드.
  55. 제 47항에 있어서, 상기 항체 단일 가변 도메인이 네 개의 카바트 항체 프레임워크 영역 (FR)의 세트를 포함하고, 상기 세트가 항체 VH3 프레임워크 생식세포 항체 유전자 세그먼트에 의해 엔코딩되는 리간드.
  56. 제 47항에 있어서, 상기 항체 단일 가변 도메인이 네 개의 카바트 항체 프레임워크 영역 (FR)의 세트를 포함하고, 상기 세트가 V카파 프레임워크 생식세포 항체 유전자 세그먼트에 의해 엔코딩되는 리간드.
  57. 제 47항에 있어서, 혈청 알부민 이외의 표적에 특이적으로 결합될 수 있는 하나 이상의 단일 가변 도메인을 추가로 포함하는 리간드.
  58. 제 57항에 있어서, 혈청 알부민 이외의 표적에 특이적으로 결합될 수 있는 상기 하나 이상의 단일 가변 도메인이 항체 단일 가변 도메인인 리간드.
  59. 제 47항에 있어서, 상기 항체 단일 가변 도메인이 하나 이상의 항체 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역을 포함하는 리간드.
  60. 제 59항에 있어서, 상기 항체 단일 가변 도메인이 CTLA-4, 리포칼린, 스타필로코커스 단백질 A (SpA), GroEl, GroES, 트랜스페린 및 피브로넥틴으로 구성된 군으로부터 선택된 스캐폴드를 추가로 포함하는 리간드.
  61. 제 47항에 있어서, 상기 항체 단일 가변 도메인이 인간 혈청 알부민에 300 nM 이하의 Kd로 특이적으로 결합되는 리간드.
  62. 제 58항에 있어서, 상기 리간드가 이중 특이적 리간드이고,
    a. 혈청 알부민의 도메인 II에 특이적으로 결합되는 상기 항체 단일 가변 도메인 및 혈청 알부민 이외의 표적에 특이적으로 결합되는 상기 항체 단일 가변 도메인 각각이 항체 중쇄 단일 가변 도메인이거나;
    b. 혈청 알부민의 도메인 II에 특이적으로 결합되는 상기 항체 단일 가변 도메인 및 혈청 알부민 이외의 표적에 특이적으로 결합되는 상기 항체 단일 가변 도메인 각각이 항체 경쇄 단일 가변 도메인이거나;
    c. 혈청 알부민의 도메인 II에 특이적으로 결합되는 상기 항체 단일 가변 도메인이 항체 중쇄 단일 가변 도메인이고, 혈청 알부민 이외의 항원에 특이적으로 결합되는 상기 항체 단일 가변 도메인이 항체 경쇄 단일 가변 도메인이거나;
    d. 혈청 알부민의 도메인 II에 특이적으로 결합되는 상기 항체 단일 가변 도메인이 항체 경쇄 단일 가변 도메인이고, 혈청 알부민 이외의 항원에 특이적으로 결합되는 상기 항체 단일 가변 도메인이 항체 중쇄 단일 가변 도메인인 리간드.
  63. 혈청 알부민에 특이적으로 결합되는 제1 단일 가변 도메인 및 제2 단일 가변 도메인을 포함하는 융합 단백질로서, 상기 제1 및 제2 단일 가변 도메인이 각각 비-천연 발생 단일 가변 도메인이고, 1) 제1 단일 가변 도메인이 제2 단일 가변 도메인의 N 말단 끝에 결합되거나, 2) 제1 단일 가변 도메인이 제2 단일 가변 도메인의 C 말단 끝에 결합되거나, 3) 제1 단일 가변 도메인이 제2 단일 가변 도메인의 N 말단 끝과 제2 단일 가변 도메인의 C 말단 끝에 부착된 융합 단백질.
  64. 제 63항에 있어서, 상기 융합 단백질이 부가의 단일 가변 결합 도메인을 추가로 포함하고, 상기 단일 가변 도메인이 비-천연 발생 단일 가변 도메인이고, 상기 부가의 단일 가변 결합 도메인이 상기 제1 단일 가변 도메인에 인접하거나, 상기 부가의 단일 가변 결합 도메인이 제1 단일 가변 도메인의 N 말단 끝에 부착되거나 제1 단일 가변 도메인의 C 말단 끝에 부착되는 융합 단백질.
  65. 제 63항에 있어서, 제1 단일 가변 도메인이 항체 단일 가변 도메인이고, 항체 단일 가변 도메인의 N 말단 끝이 제2 단일 가변 도메인의 COOH 말단 끝에 직접 결합되어, 상기 제2 단일 결합 도메인의 상기 COOH 말단 끝이 상기 항체 단일 가변 도메인의 N 말단 아미노산에 부착된 접합점(junction)을 형성하고, 상기 항체 단일 가변 도메인이 V카파 도메인, V람다 도메인, 항체 중쇄 도메인 및 VHH 도메인으로 구성된 군으로부터 선택되는 융합 단백질.
  66. 제 65항에 있어서, 상기 항체 단일 가변 도메인이 V카파 도메인이고, 상기 접합점이 XXXDIQ, XXXNIQ, XXXAIQ, XXXAIR, XXXVIW, XXXDIV, XXXDVV, XXXEIV 및 XXXETT로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며, XXX가 제2 단일 가변 도메인의 마지막 세 개 아미노산을 나타내는 융합 단백질.
  67. 제 65항에 있어서, 상기 항체 단일 가변 도메인이 V람다 도메인이고, 상기 접합점이 XXXQSV, XXXQSA, XXXSYE, XXXSSE, XXXSYV, XXXLPV, XXXQPV, XXXQLV, XXXQAV, XXXNFM, XXXQTV, 및 XXXQAG로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며, XXX가 제2 단일 가변 도메인의 마지막 세 개 아미노산을 나타내는 융합 단백질.
  68. 제 65항에 있어서, 상기 항체 단일 가변 도메인이 항체 중쇄 단일 가변 도메인이고, 상기 접합점이 XXXQVQ, XXXQMQ, XXXEVQ, XXXQIT, XXXQVT 및 XXXQLQ로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며, XXX가 제2 단일 가변 도메인의 마지막 세 개 아미노산을 나타내는 융합 단백질.
  69. 제 65항에 있어서, 상기 항체 단일 가변 도메인이 VHH 도메인이고, 상기 접합점이 XXXEVQ, XXXQVQ, XXXDVQ, XXXQVK 및 XXXAVQ로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며, XXX가 제2 단일 가변 도메인의 마지막 세 개 아미노산을 나타내는 융합 단백질.
  70. 제 63항에 있어서, 제1 단일 가변 도메인이 항체 단일 가변 도메인이고, 항체 단일 가변 도메인의 COOH 말단 끝이 제2 단일 가변 도메인의 N 말단 끝에 직접 결합되어, 상기 제2 단일 가변 도메인의 상기 N 말단 끝이 상기 항체 단일 가변 도메인의 COOH 말단 아미노산에 부착된 접합점을 형성하고, 상기 항체 단일 가변 도메인이 V카파 도메인, V람다 도메인, 항체 중쇄 도메인 및 VHH 도메인으로 구성된 군으로부터 선택되는 융합 단백질.
  71. 제 70항에 있어서, 상기 항체 단일 가변 도메인이 V카파 도메인이고, 상기 접합점이 KVEIKXXX, KLEIKXXX, KVDIKXXX, RLEIKXXX 및 EIKXXX로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며, XXX가 제2 단일 가변 도메인의 처음 세 개 아미노산을 나타내는 융합 단백질.
  72. 제 70항에 있어서, 상기 항체 단일 가변 도메인이 V람다 도메인이고, 상기 접합점이 KVDVLXXX, KLDVLXXX 및 QLDVLXXX로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며, XXX가 제2 단일 가변 도메인의 처음 세 개 아미노산을 나타내는 융합 단백질.
  73. 제 70항에 있어서, 상기 항체 단일 가변 도메인이 항체 중쇄 단일 가변 도메인이고, 상기 접합점이 VTVSSXXX의 아미노산 서열을 포함하며, XXX가 제2 단일 가변 도메인의 처음 세 개 아미노산을 나타내는 융합 단백질.
  74. 제 70항에 있어서, 상기 항체 단일 가변 도메인이 VHH 도메인이고, 상기 접합점이 VTVSSXXX의 아미노산 서열을 포함하며, XXX가 제2 단일 가변 도메인의 처음 세 개 아미노산을 나타내는 융합 단백질.
  75. 제 65항에 있어서, 상기 항체 단일 가변 도메인이 펩티드 링커를 통해 상기 제2 단일 가변 도메인에 결합되고, 상기 펩티드 링커가 가요성 링커, 구속된(constrained) 링커 및 천연 링커로 구성된 군으로부터 선택되는 융합 단백질.
  76. 제 75항에 있어서, 항체 단일 가변 도메인의 N 말단 끝이 제2 단일 가변 도메인의 COOH 말단 끝에 펩티드 링커를 통해 부착되거나, 항체 단일 가변 도메인의 COOH 말단 끝이 제2 단일 가변 도메인의 N 말단 끝에 펩티드 링커를 통해 부착되는 융합 단백질.
  77. 제 75항에 있어서, 상기 가요성 링커가 글리신 부화(rich) 링커 또는 세린 부화 링커인 융합 단백질.
  78. 제 75항에 있어서, 상기 구속된 링커가 SSSASASSA, GSPGSPG 및 ATTTGSSPGPT로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 지니는 융합 단백질.
  79. 제 75항에 있어서, 상기 천연 링커가 KESGSVSSEQLAQFRSLD, EPKIPQPQPKPQPQPQPQPKPQPKPEPECTCPKCP 및 GTNEVCKCPKCP로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 지니는 융합 단백질.
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