TW200848427A - Ligand - Google Patents

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TW200848427A
TW200848427A TW097104963A TW97104963A TW200848427A TW 200848427 A TW200848427 A TW 200848427A TW 097104963 A TW097104963 A TW 097104963A TW 97104963 A TW97104963 A TW 97104963A TW 200848427 A TW200848427 A TW 200848427A
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single variable
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Laurent Jespers
Jasper Clube
Lucy Holt
Oliver Schon
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Description

200848427 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於雙特異性配位體。詳言之，本發明提供一 種製備雙特異性配位體之方法，該等雙特異性配位體包含 與第-抗原4抗原；^定基結合之第一免疫球蛋白單一可變 域及與第二抗原或抗原決定基結合之第二免疫球蛋白單一 可變域。更特定言之，本發明係關於雙特異性配位體，其 中與第一及第二抗原或抗原決定基中之至少一者的結合起 f 增加配位體之活體内半衰期的作用。描述包含一種以上結 合特異性之開放及閉合構形配位體。 本申巧案為2004年12月28曰申請之美國申請案第 1 1/023,959號的部份接續申請案，該案為2〇〇3年6月3〇曰申 請之國際申請案第PCT/GB2003/002804號的接續申請案， 其主張2002年6月28日申請之PCT/GB02/03014及2002年12 月27日申請之英國申請案第GB 0230202.4號的優先權，其 内容以引用的方式併入本文中。本申請案亦為2〇〇5年5月 ( 31日申請之WO 2005 1 1 8642的部份接續申請案，其主張 2〇〇4年6月1日申請之US 60/5 76,271及2004年12月2曰申請 之US 60/632361的權利，其内容以引用的方式併入本文 中0 【先前技術】 抗體之抗原結合域包含兩個分離區：重鏈可變域（νΗ)及 輕鏈可變域（VL :其可為νκ4 νλ)。抗原結合部位本身由六 個多肽環形成：三個來自VH域（HI、Η2及Η3)且三個來自 129025.doc 200848427 VL域（Ll、L2及L3)。由基因片段之組合重排產生編碼vH及 vL域之v基因的不同初始庫。藉由重組三個基因片段Vh、 D及JH產生VH基因。依賴於單倍型，在人類中存在約51種 功能性 VH 片段（Cook 及 Tomlinson (1995) /mm ㈣ 〇/ 少， 16· 237)、25種功能性 D 片段（Corbett等人，（1997) /. Mo/. 5/〇/.，268: 69)及 6種功能性 JH 片段（Ravetch 等人，（1981) CW/，27: 583)。VH片段編碼多肽鏈中形成^^域之第一及第 一抗原結合環（H1及H2)的區域，而vH、0及JH片段組合以 ( 形成Vh域之第三抗原結合環（H3)。藉由重組僅兩個基因片 段VL及JL產生VL基因。依賴於單倍型，在人類中存在約4〇 種功能性 VK 片段（Schable 及 Zachau (1993)的〇/· ㈣/% 374: 1〇〇1)、31 種功能性％ 片段（WilHam4 人（1996) J. Mo/. B/o/.，264: 220 ; Kawasaki 等人，（1997) 細·，7: 250)、5種功能性Jk片段（η_γ等人， (1982) 仍0/. 257: 15 16)及4種功能性从片段 (Vasicek 及 Leder (1990) 乂心My·，172: 6〇9)。& 片段編 碼多肽鏈中形成vL域之第一及第二抗原結合環（u&L2)的 區域’而VL及JL片段組合以形成火域之第三抗原結合環 (L3)。咸信選自此初級庫之抗體充分不同從而以至少適度 親和力肖合幾乎所有抗原。藉由重排基因之'親和办成熟" 產生高親和力抗體’其中藉由免疫系統基於提高之結合產 生且選擇點突變。 ^ ^ 抗體之結構及序列分析已展示六個抗原結合環中之5個 (Hi、H2、L1、L2、L3)具有有限數目之主鏈構形或規範 129025.doc 200848427 結構（Chothia 及 Lesk (1987) J. Μο/. Α·〇/.，196: 901 ; Chothia等人，（1989) TVaiwre，342: 877)。藉由以下確定主 鏈構形：（i)抗原結合環之長度；及（ii)抗原結合環及抗體 框架中某些關鍵位置處的特定殘基或殘基類型。環長度及 關鍵殘基之分析已使得吾人能夠預測由大多數人類抗體序 列編碼的HI、H2、LI、L2及L3之主鏈構形（Chothia等人， (1992) /· Mo/· 5沁/·，227: 799 ; Tomlinson等人，（1995) 五/·，14: 4628 ; Williams等人，（1996) J. Mo/·仏〇/.， 264: 220)。儘管H3區在序列、長度及結構方面愈加不同 (歸因於使用D片段），但對於短環長度而言，其亦形成有 限數目之主鏈構形，此依賴於環及抗體框架中關鍵位置處 特定殘基之長度及存在或殘基類型（Martin等人，（1996) «/. Μο/· βζ·ο/·，263: 800 ; Shirai等人，（1996) 心的以， 399: 1) 〇 在此項技術中已知包含V η區及V l區互補對的雙特異性 抗體。該等雙特異性抗體必須包含兩對^及VL，各vh/Vl 對與單一抗原或抗原決定基結合。所述方法包括雜交融合 瘤（Milstein & Cuello AC，Nature 305:537-40)、微型抗體 (Ηυ等人，（1996) Cancer Res 56:3055-3061)、雙功能抗體 (Holliger 等人，（1993) Proc. Natl. Acad· Sci. USA 90, 6444-6448; WO 94/13804)、螯合重組抗體（CRAb)(Neri 等 人 ’（1995) J. Mol. Biol. 246，367-373))、biscFv(例如 Atwell等人，（1996) Mol· Immunol· 33，1301-1312)、，’孔杵 吻合（knobs in holes)’’ 穩定化抗體（Carter 等人，（1997) 129025.doc 200848427 ―6,781-788)。在各情況下，各抗體種類包含兩 個抗原結合部位，各自特徵為Vh域及&域的互補對。藉
此，各抗體能夠同時與兩種不同抗原或抗原決定基結合’曰 其中與各抗原或抗原決定基之結合由及U
導。該等技術之每-者均有其特定缺點；例如在雜交融合 瘤情況下’失活VH/Vd可極大地減少雙特異性igG部分。 此外，多數雙特異性方法依賴於不同vh/vl對之接合或VH 及乂!^鏈之接合以重新產生兩個不同Vh/乂結合部位。因 此’不可能控制裝配分子中結合部位與各抗m原決定 基之比率’且因此許多裝配分子將與一種抗原或抗原決定 基結合，而不與其他者結合。在某些情況下，可能將在子 單元界面上之重鏈或輕鏈工程化（Carter等人，1997)以提 高具有兩種抗原或抗原決定基之結合部位的分子之數目， 但此舉不能使得所有分子均具有與兩種抗原或抗原決定基 結合之能力。 存在一些證據：可將兩種不同抗體結合特異性併入同一 結合部位’但此荨通常表示兩種或兩種以上對應於結構相 關抗原或抗原決定基或廣泛交叉反應性抗體的特異性。例 如’已描述交叉反應性抗體，通常其中兩個抗原在序列及 結構上相關’諸如雞卵白溶菌酶及火雞溶菌酶（McCafferty 等人’ WO 92/01047)或與游離半抗原及與載劑結合之半抗 原相關（Griffiths AD等人，五ΜδΟ 1994 13:14 3245-60)。 在另一實例中 ’ WO 02/02773(Abbott Laboratories)描述具 有”雙特異性π之抗體分子。所提及之抗體分子為針對多個 129025.doc 200848427 抗原培養或選擇使得其特異性跨度超過單一抗原之抗沪。 WO 02/02773之抗體中的各互補Vh/Vl對指㈣兩種=種 以上結構相關抗原之單一結合特異性；該等互補對中之Vh 及VL域並非各自具有獨立特異性。因此，抗體具有包涵兩 種結構相關抗原之廣泛單—特異⑲。此外，已描述天然自 體抗體具有多反應性（CasaU & N〇tkins，Ann. Rev, Immunol· 7, 515-531)，其與至少兩種（通常更多種）結構不 相關之不同抗原或抗原決定基反應。亦已展示使用基於單 株抗體之噬菌體呈現技術選擇隨機肽庫將鑑別出一系列適 配抗原結合部位之肽序列。該等序列中之某些高度相關， 適配一致序列，而其他序列極度不同且已稱為模擬抗原決 定基（mim〇t〇pe)(Lane & Stephen, Current Opinion in
Immunology, 1993，5，268-271)。因此清楚包含接合及互補 VH及VL域的天然4鏈抗體具有結合來自無數已知抗原之許 多不同抗原之潛能。較不清楚的是如何在同一抗體中產生 與兩種給定抗原之結合部位，尤其與結構未必相關之抗原 之結合部位。 已表明蛋白質工程化方法可能與此相關。例如，亦已提 出可產生具有經由一個可變域與金屬離子結合之活性及經 由金屬離子及互補可變域接點與半抗原（底物）結合之活性 的催化性抗體（Barbas 等人，1993 Proc· Natl· Acad. Sci USA 90，6385-6389)。然而，在此情況下，認為底物（第一 抗原）之結合及催化需要與金屬離子（第二抗原）之結合。因 此，與VH/VL對之結合與單一但多組份抗原相關。 129025.doc -10- 200848427 ，已描述自m體重鏈單—域產生雙特異性抗體之方 中在個可餸域中產生一種抗原之結合接點且在第 -可义域中產生第二抗原之結合接點。然而’該等可變域 、、’不互補因此’針對第—抗原選擇第-重鏈可變域且針 對第二抗原選擇第二重鏈可變域，且隨後在同一鏈上將兩 個域連接在-起以提供雙特異性抗體片段（c_th等人，了
Chem’ 270’ 27589-27594)。然而，駱乾重鏈單一域之異 ㊉之處在於其獲自無輕鏈之m轮抗體，且實際上該等 重鏈單-域不能與駱銳輕鏈相接合以形成互補對。 ▲亦已描述獲自天然抗體之通常與輕鏈接合的單一重鏈可 變域（來自單株抗體或來自域之庫；參見Ep_A_G3嶋4)。 已展示該等重鏈可變域與一或多種相關抗原特異性相互作 用’但其尚未與其他重鏈或輕鏈可變域組合以產生對兩種 或兩種以上不同抗原具有特異性的配位體。此外，已展示 該等單-域具有極短活體内半衰期。因此，該等域具有有 限治療價值。 已提出藉由將不同特異性之重鏈可變域連接在一起擊造 雙特異性抗體片段⑼上所述卜此方法之缺點為經分離抗 體可變域可具有疏水性界面，其通常與輕鏈相互作用且暴 露於溶劑中且可具有"黏性”’使單一域與疏水性表面相二 合。此外，在不存在搭配輕鏈之情況下，兩種或兩種以上 不同重鏈可變域之組合及其可能經由其疏水性界面之接 合，可防止其與一個而非兩個能夠獨立結合的配位體結 合。此外，在此情況下，重鏈可變域將不與互補輕鏈；、變 129025.doc -11 - 200848427 域相接合且因此可能較不穩定且易於展開（w〇rn &
Pluckthun，1998 Biochemistry 37, 13120-7)。 【發明内容】 本發明者在同在申請中之國際專利申請案w〇 〇3/〇〇26〇9 以及同在申請中之未公開υκ專利申請案〇23〇2〇3 2中已描 述雙特異性免疫球蛋白配位體，其包含各具有不同特異性 之免疫球蛋白單-可變域。該等域可彼此競爭或獨立仙 以結合標靶分子上之抗原或抗原決定基。 在第一組態中，本發明提供如本發明者所研發之雙特里 性配位體之進一步改良，其中配位體之一種特異性係針對 生物體中活體内存在之蛋白質或多肽，其可藉由結合配位 體來用以增加配位體之半衰期。 因此’在第一態樣中’提供包含第一免疫球蛋白單一可 k域及二二互補免疫球蛋白單—可變域之雙特異性配位 體，該第-免疫球蛋白單一可變域具有結合第一抗原或抗 原決定基之特異性’該第二互補免疫球蛋白單一可變域具 有結合第二抗原或抗原決定基之活性，其中該等抗原或抗 原決定基之一或兩者用以增加配位體之活體内半衰期，且 其中該第-及第二域缺乏共有相同特異性之相互互補域， 其限制條件為該雙特異性配位體不由抗HSA VH域及抗β半 礼糖芽酶^域組成。較佳地，第一可變域或第二可變域均 不與人類血清白蛋白（HSA)結合。 ^文所描述增加配位體之半衰期的抗原或抗原決定基 有利地存在於生物體中活體内見到之蛋白質或多肽上。實 129025.doc -12- 200848427 例包括胞外基質蛋白質、血液蛋白f及存在於生物體之各 種組織中之蛋白質。該等蛋白質藉由(例如)充當增量劑或 藉由將配位㈣定至所需作用部位用鱗低配位體自血液 中之清除速率。於下文附錄！中給出增加活體内半衰期之 抗原/抗原決定基之實例。 增加半衰期適用於免疫球蛋白、尤其抗體及最尤其小型 抗體片段之活體内應用。該等片段(Fv、二硫化物鍵結之
Fv、Fab、scFv、dAb)遭受自身體快速清除；因此，儘管 其能夠快速達到身體之大多數部分，且快速起效且易於控 制但其活體内應肖&受活體内僅短暫存留所限制。本發 明藉由提供活體内半衰期增加之配位體且因此延長配位體 之功能性活性在身體内的持續時間來解決此問題。 藥物代谢動力學分析方法及配位體半衰期之測定將為熟 習此項技術者所熟知。細節可見Kenneth，A等人· Chemicai Stability 〇f Pharmaceuticals: a Handb〇〇k f〇r 抑隱以心且 見 ers 專人，Pharmacokinetc analysis: A Practical
Approach (I996)。亦參考由 Marcel Dekker 出版之 ’’Pharmacokinetics”，μ Gibaldi & D Perr〇n，第二修訂版 (1982)，其描述諸如氓及邙半衰期及曲線下面積（auc)之藥 物代謝動力學參數。 可自配位體之血清濃度相對於時間之曲線確定半衰期 (t/2 α及以β)及AUC。例如，可使用winN〇nHn分析程式包 (由 Pharsight Corp·，Mountain view，CA94040, USA獲得）來 建立曲線核型。在第一階段階段），配位體在具有某些 129025.doc 200848427
，除之情況下在患者中進行主要分布。第二階 敢後階段，此時配位體已分布且由於配位體自患者清除ΐ 使血清漢度降低。叫衰期為第一階段之半衰期且料衰 期為第二階段之半衰期。因此，有利地，本發明提供配位 體或包含根據本發明之配位體之組合物，該配位體具有在 :5:-或15分鐘以上範圍内之比半衰期。在一實施例中， 忒靶圍之下限為3〇分鐘、45分鐘、i小時、2小時、3小 時' 4小日^ 5小時、6小時、7小時、料時、η小時或12 、 卜或他，根據本發明之配位體或組合物將具有 在同達12小時且包括12小時之範圍内的w半衰期。在一實 乜例中4範圍之上限為i ii 〇、9、8、7、6或5小時。 適田犯圍之實例為小時、2至5小時或3至4小時。 有利地，本發明提供配位體或包含根據本發明之配位體 、、、、、白物4配位體具有在2 5小時或2 5小時以上範圍内 半农期。在一實施例中，該範圍之下限為3小時、*小 才5 J、日守、6小時、7小時、1〇小時、工工小時或η小時。 另外或其他，根據本發明之配位體或組合物具有在高達21 天之範圍内的tp半衰期。在一實施例中，該範 圍之上限為12小時、24小時、2天、3天、以、1()天、15 天或20天有利地，根據本發明之配位體或組合物將具有 在12至60 J、日守範圍内之叩半衰期。在另一實施例中，其將 在12至48小日守範圍内。在另_實施例中，其將在η至％小 時範圍内。 &上述標準外或替代上述標準，本發明提供配位體或包 129025.doc -14- 200848427 含根據本發明之配位體的組合物，該配位體具有在1 mg/min/ml或1 mg/min/ml以上範圍内之AUC值（曲線下面 積）。在一實施例中，該範圍之下限為5、1 〇、1 5、20、 30、100、200或300 mg/min/m卜另外或其他，根據本發 明之配位體或組合物具有在尚達6〇〇 mg/min/ml範圍内之 AUC。在一實施例中，該範圍之上限為5〇〇、4〇0、3〇〇、 200、150、100、75或50 mg/min/m卜有利地，根據本發
明之配位體將具有在選自但較佳不限於由以下各範圍組成 之群的範圍内之AUC · 15至150 mg/min/ml、15至1〇〇 mg/min/m卜 15 至 75 mg/min/ml及 15 至 50 mg/min/m卜 在第一實施例中’雙特異性配位體包含兩個互補可變 域，亦即兩個在天然環境中能夠作為同源對或組一起發揮 作用之可變域，即使在本發明之環境中，其亦分別結合至 其同源抗原決定基。例如，互補可變域可為免疫球蛋白重 鏈及輕鏈可變域（vH及Vl)。藉由scFv或Fab抗體片段有利 地提供vH及VL域。可藉由（例如）以下將可變域連接在一起 以形成多價配位體：在各V域之〇末端提供鉸鏈區及在鉸 鏈區之半胱胺酸之間的二硫化物鍵結；或提供dAb，各自 在該域之C末端具有半胱胺酸，該等半胱胺酸經二硫化物 鍵、。在起，或產生v-cH及v-cL以產生Fab形式；或使用 肽連接子（例如，下文中論述之Gly4se礎接子）以產生二聚 體、二聚體及其他多聚體。 發明者已發現互補可變域 一起且與溶劑隔離。此外， 之使用允許兩個域表面緊 互補域能夠使彼此穩定 縮在 0另 129025.doc 15 200848427 外，其允許在無如先丽技術中所用之雜交融合瘤之缺點或 無需在亞單元界面處將重鏈或輕鏈工程化的情況下產生雙 特異性IgG抗體。本發明第一態樣之雙特異性配位體具有 至少-個Vh/Vl對。因此’根據本發明之雙特異性⑽將包 含兩個該等對’ Y形分子之各個臂上各有一對。因此，不 同於習知雙特異性抗體或雙功能抗體，其中所用鍵之比率 決定其製備之成功性且產生實踐難題’而本發明之雙特显 性配位體不存在鏈平衡問題。兩個不同vL鏈與兩個不同V'H 鍵之接合導致習知雙特異性抗體之鏈不平衡，其中VW 與乂1^鏈1 一起能夠與抗原或抗原決定基丨結合，且&鏈2與 VH鏈2—起能夠與抗原或抗原決定基2結合，且兩個正確配 對以某種方式彼此連接。因此，在單—分子中，僅當^鍵 1與^鏈1配對且乂鏈2與Vh鏈2配對時.，才產生雙特異 性。可以兩種不同方式產生該等雙特異性分子。首先，其 可藉由接合兩個各自結合不同抗原或抗原決定基之現存 Vh/Vl對產生（例如，在雙特異性丨旳中）。在此情況下， 對M i: ut率同時出現’以產生均具有雙特異性 之分顿體。不會出現雙特異性分子與僅能夠結合一種抗 原或抗原決定基而不結合其他者之分子的混合物（即使當 ^補W或藉由•，孔#吻合"工程化增強時）。產生雙特異性 抗體之第二種方式係藉由同時接合兩個不同％鍵與兩個不 同^鍵（例如’在雙特異性雙功能抗體中）。在此情況下， k &傾向於乂鏈…先與^鍵^己對及^鍵：優先與^鍵： ’十（’、可藉由VL及vH域之"孔杵吻合"工程化增強），但此 129025.doc -16- 200848427 配對不會在所有分子中實現，會產生混合調配物，藉此發 生錯誤配對使得不能結合抗原或者抗原決定基。 根據本發明第一態樣之雙特異性配位體方法構築之雙特 異性抗體克服所有該等問題，由於分別地，與抗原或抗原 決定基1之結合存在於VH或VL域内且與抗原或抗原決定基2 之結合存在於互補Vl*vh域内。由於γΗ及VL域基於1:1配 對’因此所有Vh/Vl對將具有雙特異性且因此使用該等 Vh/Vi^構築之所有形式（Fv、scFv、Fab、微型抗體、 等）將具有100%雙特異性活性。 在本發明之上下文中，第一及第二”抗原決定基，，應理解 為並不相同且並不由單一單特異性配位體結合之抗原決定 基。在本發明之第一組態中，其有利地處於不同抗原上， 其一者用以增加配位體之活體内半衰期。同樣，第一抗原 與第二抗原有利地不同。 本备月之雙特異性配位體並不包括如WO 02/02773所述 ,配位體。因Λ ’本發明之配位體並不包含協作地結合任 何或多個抗原或抗原決定基之互補vH/Vd。相反，根 據本^明第一態樣之配位體包含VH/VL互補對，其中v域具 有不同特異性。 八 蓥此外，根據本發明第一態樣之配位體包含VH/VL互補 I 2對非結構相關之抗原決定基或抗原具有不同特異 ^、、。構相關之抗原決定基或抗原為具有充分結構相似性 :待由以協作方式作用以結合抗原或抗原決定基之習知 補對結合的抗原決定基或抗原；在結構相關抗原 129025.doc 17 200848427 决疋基之情況下，抗原決定基在結構上充分相似使得其 ”適合”進入在vH/vL二聚體之抗原結合部位形成的相同結 合袋中。
在第二態樣中，本發明提供包含第一免疫球蛋白可變域 及第二免疫球蛋白可變域之配位體，該第一免疫球蛋白可 變域具有第-抗原或抗原決定基結合特異性，該第二免疫 球蛋白可變域具有第二抗原或抗原決定基結合特異性，其 中該第-及第二可變域之一或兩者與增加該配位體之活體 内半衣期的抗原結合，且該等可變域並不彼此互補。 在一實施例中，與一可變域之結合調節配位體與第二可 變域之結合。 貝也例中，可變域可為（例如）νΗ域之對或vL域之 對:抗原在第—部位之結合可調節（諸如提高或抑制）抗原 在：二部：之結合。例如，在第一部位之結合至少部分抑 才原在第一邛位之結合。在該實施例中，配位體可（例 )工由加配位體之半衰期的蛋白質結合而使其活體 :料在受檢者生物體之體内，直至其與第二標靶抗原結 合且與半衰期增加蛋白質解離之時。 由於抗原結合部位相對於彼此之結構接近性實現在上 文中之結合調節。可駐 7糟由連接兩種或兩種以上抗原結合部 有以緊之：質實現該結構接近性，例如藉由提供具 有二近性容納抗原結合部位之相對剛性結構之配位 接近，二’：種或兩種以上抗原結合部位彼此實體緊密 接近使传—個部位藉由包括免疫球蛋白分子内位阻及/ 129025.doc -18 - 200848427 或構形變化之過程調節抗原在另一部位之結合。 第一抗原結合域與第二抗原結合域可共價或非共價接 合。在該等域係共價接合之情況下，則該接合可經（例如） 二硫化物鍵或經諸如（Gly4Ser)n之多肽連接子介導，其中 1 至 8，例如 2、3、4、5 或 7 〇 可將根據本發明之配位體組合成非免疫球蛋白多配位體 結構以形成多價複合物，其結合具有相同抗原之標靶分 子，藉此提供優良親和性，而至少一個可變域結合抗原以 增加多聚體之半衰期。例如，已將諸如SpA之天然細菌受 體用作用於移植CDR以產生特異性結合一或多種抗原決定 基之配位體的支架。該程序之細節描述於U s 5，8 3 1，012 中。其他適¥支架包括彼等基於纖連蛋白（fibronectin)及 AffibodiesTM者。適當程序之細節描述於w〇 98/58965中。 其他適當支架包括如van den Beuken等人，J. Mol. Biol. (2001) 310，591-601中所述之脂質運載蛋白（Hp〇callin)及 CTLA4，及諸如彼等描述於w〇 〇〇699〇7(英國醫學研究委 員會（Medical Research Council))中之支架，其基於（例如） 細菌GroEL·或其他陪伴分子多肽之環狀結構。 可將蛋白質支架組合；例如可將CDR移植至CTL A4支架 上且連同免疫球蛋白Vh*Vl域一起使用以形成配位體。同 樣，可組合纖連蛋白、脂質運載蛋白及其他支架。 在可變域係選自（例如）使用如本文所述之噬菌體呈現技 術選擇的V基因庫之情況下，則該等可變域可包含通用框 呆區使得其可由如本文所定義之特異性通用配位體識 129025.doc -19- 200848427 別。通用框架、通用配位體及其類似物之用途描述於 WO 99/20749中。在本發明巾，提及的噬菌體呈現包括 菌體及/或噬菌粒的使用。 Λ 右：用V基因庫，則多肽序列之變異較佳位於可變域之 構衣内S彳交域之多肽序列可經改組或突變作 用改變以提高各可變域與其互補對之相互作用。
=本發明之較佳實施例中，，雙特異性配位體，為單鏈卜 1段。在本發明之替代性實施例中，，雙特異性配位體，由 抗體之Fab區組成。術語” Fab區，，包括Fab樣區，其中使用 兩個VH域或兩個vL域。 可變域可獲自針對標靶抗原或抗原決定基之抗體。或 者〃可獲自諸如彼等表現於絲狀細菌噬菌體表面上者之 單一抗體域之庫。可按如下所述進行選擇。 在第三態樣中，本發明提供一種產生包含具有第一結合 特異性之第一免疫球蛋白單一可變域及具有第二（不同）結 合特異性之第二單一免疫球蛋白單一可變域的配位體之方 法結合特異性之一或兩者對增加配位體之活體内半衰期 的抗原具有特異性，該方法包含以下步驟： 〇)依據結合第一抗原決定基之能力選擇第一可變域； (b) 依據結合第二抗原決定基之能力選擇第二可變域·， (c) 組合該等可變域；及 (d) 依據結合該第一抗原決定基及該第二抗原決定基之能 力選擇配位體。 配位體可同時與第一及第二抗原決定基結合，或若結合 129025.doc -20- 200848427 域之間存在對抗原決定基結合之競爭，則一個域之結合可 旎排除另一域與其同源抗原決定基之結合。因此，在一實 施例中，上文之步驟（d)要求與第一及第二（及可能其他）抗 原決定基同時結合；在另_實施例中，與第—及第二抗原 決定基之結合並不同時進行。 抗原決定基較佳位於獨立抗原上。
如上所述，配位體有利地包含免疫球蛋白可變域之 Vh/Vl、、且a或VH/VH或VL/VL組合。此夕卜，配位體可包含 駱馬羊駝（Camelid)VHH域，其限制條件為如c〇nrath等人， (2001) JBC 276:7346-7350&W〇 99/23221 中所述，對增加 配位體之活體内半衰期的抗原具有特異性之Vhh域不結合 雞卵白溶菌酶（HEL)、豬胰腺心澱粉酶或Nm(>A; hcg、 BSA連接之RR6偶氮染料或變形鏈球菌（y職,_)即982細 胞，兩個參考文獻均未描述對於增加半衰期之抗原之特異 性用以增加配位體之活體内半衰期的用途。 在一實施例中，纟不存在互補可變域之情況下針對與該 第一抗原決定基結合選擇該第一可變域。在另一實施例 中在存在第一可交域之情況下針對與該第一抗原決定基/ 抗原結合選擇該第一可變域，其中該第三可變域不同於該 第一可夂域且與第一域互補。相似地，可在不存在或存在 互補可變域之情況下選擇第二域。 上由本發明之配位體乾向之増加配位體的半衰期之抗原或 抗原决定基不限於血’月白蛋白標靶。由本發明之配位體靶 向之增加配位體的活體内半衰期之抗原或抗原衫基的其 129025.doc -21 - 200848427 他實施例包括（但較佳不限於）彼等列於下文附錄丨中之 及抗原決定基。 ~ μ 由本發明之配位體靶向之抗原或抗原決定基（除半衰期 提高蛋白質外）可為任何抗原或抗原決定|，但有利地為 經靶向具有治療益處的抗原或抗原決定基。本發明提供包 括開放構形、閉合構形及分離之dAb單體配位體之配位 體，其對任何此標把、尤其本文進一步鐘別之彼等標乾具 有特異性。該等標靶可為或屬於可天然存在或合成之多 肽蛋白貝或核酸。在此方面，本發明之配位體可結合抗 原決定基或抗原且充當拮抗劑或促效劑（例如Ep〇受體促效 劑）。熟習此項技術者應理解選擇為廣泛多樣的。其可為 (例如）人類或動物蛋自f、細胞激素、細胞激素受體，其 中細胞激素X體包括細胞激素、酶、酶輔因子或dna結合 蛋白質Μ體。適當細胞激素及生長因？包括（但較佳不 限於）：ApoE、AP〇-SAA、BDNF、心營養素-1(Cardi〇tr〇phin一 1)、EGF、EGF受體、ENA_78、嗜酸性粒細胞趨化因子 (Eotaxin)、嗜酸性粒細胞趨化因子_2、次級淋巴組織趨化 因子（Ex〇dUS_2)、EpoR、酸性FGF、鹼性FGF、纖維母細 胞生長因子-10、FLT3配位體、神經趨化素（CX3C)、 GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-βΙ、胰島素、ΙΡΝ_γ、IGF_ IIGF-II、IL-la、IL_lp、iL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL- 6 IL-7 > IL-8(72 a.a.) - IL-8(77 a.a.) ^ IL-9 - IL-10 - IL- 11、IL-12、IL-13、IL-15、il-16、IL-17、IL-18(IGIF)、 抑制素a、抑制素β、Ip_1〇、角質細胞生長因子_2(kgf_ 129025.doc -22- 200848427 2)、KGF、瘦體素（Leptin)、LIF、淋巴細胞趨化因子、繆 勒氏管抑制物質（Mullerian inhibitory substance)、單核細 胞集落抑制因子、單核細胞引誘蛋白質、m-csf、 MDC(67 a.a·)、MDC(69 a.a.)、MCP-l(MCAF)、MCP-2、 MCP-3、MCP-4、MDC(67 a.a·)、MDC(69 a.a·)、MIG、 ΜΙΡ-Ια、ΜΙΡ-1β、ΜΙΡ-3α、ΜΙΡ-3β、MIP-4、骨髓祖代抑 制因子-l(myeloid progenitor inhibitor factor-1，MPIF-1)、 NAP-2、神經營養因子、神經生長因子、β-NGF、NT-3、 NT-4、制瘤素 M(Oncostatin Μ)、PDGF-AA、PDGF-AB、 PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDFloc、SDFip、SCF、 SCGF、幹細胞因子（SCF)、TARC、TGF-a、TGF-β、TGF-β2、TGF-P3、腫瘤壞死因子（TNF)、TNF-a、TNF-β、TNF 受體 I、TNF 受體 n、TNIL-1、TPO、VEGF、VEGF 受體 1、VEGF 受體 2、VEGF 受體 3、GCP-2、GRO/MGSA、 GRO-β、GRO-γ、HCC1、1-309、HER 1、HER 2、HER 3 及HER 4、C〇4、人類趨化激素受體CXCR4或CCR5、來自 C型肝炎病毒之3型非結構性蛋白質（NS3)、TNF-a、IgE、 IFN-γ、MMP-12、CEA、幽門螺旋菌（7/. 、TB、流 感、E型肝炎、MMP-12、在某些細胞上過度表現之内化受 體（諸如上皮生長因子受體（EGFR)、腫瘤細胞上之ErBb2受 體（内化細胞受體）、LDL受體、FGF2受體、ErbB2受體、 運鐵蛋白受體、PDGF受體、VEGF受體）、PsmAr(胞外基 質蛋白質）、彈性蛋白、纖連蛋白、層黏連蛋白、al-抗胰 蛋白酶、組織因子蛋白酶抑制劑、PDK1、GSK1、Bad、 129025.doc -23- 200848427 ^斯蛋㈣_9(easpase_9)、叉頭（FQrkhead)、幽門螺旋菌之 抗原^結核分枝桿菌（M_⑽⑺·㈣⑽咖,叫之抗原 及流感病毒之抗原。應理解此列表絕非詳盡列表。 一在本發明之一實施例中’可變域獲自針：抗：或抗原決 疋基之個別抗體。在一較佳實施例中，可變域獲自單一可 變抗體域之庫。 在另一態樣中，本發明接批_十夕# μ 4知/3捉仏或多種編碼至少一插如太 ί
文所定義之雙特異性配㈣的核酸分子。可在單—核酸分 子上編碼該雙特異性配位體，戋 乂香可猎由獨立核酸分子編 碼各域。若配位體經單一核酸合早 / 干桫13夂刀子編碼，則域可以scFv分 子形式經表現為融合多狀，或可妳八 次j經分別表現且隨後（例如） 使用化學連接劑連接在一起。藉由. ^稽由週*方式將由獨立核酸 表現之配位體連接在一起。 表現後’核酸可進一步編碼信號序列以將多肽自宿主細 胞輸出’且表現後可與絲狀細㈣菌體顆粒之表面組份 (或選擇呈現系統之其他組份）融合。 在另-態樣巾’本㈣提供—種包含編碼根據本發明之 雙特異性配位體的核酸之載體。 在另-態樣中’本發明提供—種經編碼根據本發明之雙 特異性配位體的載體轉染之宿主細胞。 又 自該載體之表現可經組態以(例如)在細菌噬菌體顆粒表 面上產生用以選擇之可變域。此允許使用本發明之方法選 擇所呈現可變域且因此選擇，雙特異性配位體，。 本發明㊆-步提供-種包含至少一種根據本發明之雙特 129025.doc -24- 200848427 異性配位體的套組。
根據本發明之雙特異性配位體較佳包含重鏈域與輕鏈域 之組合。例如，該雙特異性配位體可包含vH域及Vl域，該 4域可以scFv之形式連接在一起。另外，配位體可包含一 或多個CH或CL域。例如，配位體可包含cHi域、cH2域或 CH3域及/或CL域，〇：μ1、C|Ll2、C|Ll3或C|Ll4域或其任何組 合。亦可包括鉸鏈區域。該等域組合可（例如）模擬天然抗 體，諸如IgG或IgM，或其片段，諸如Fv、scFv、Fab或 F(ab’）2分子。預期諸如包含Vh、vL、Ch1&Cl域之IgG分 子之單一臂的其他結構。 在本發明之較佳實施例中，可變區係選自單一域V基因 庫通节單抗體域之庫呈現在絲狀細菌噬菌體之表面 上。在一較佳實施例中，藉由將噬菌體庫與抗原結合選擇 各單一抗體域。 、在本發明之較佳實施例中，可在不存在互補可變區之情 況下針_與;^ &抗原《抗原&定基結合選擇纟單一可變 域。在-替代性實施例中’可在存在互補可變區之情況下 針對與標乾抗原或抗原決定基結合選擇單—可變域。因 '可在存在第二互補可變域之情況下選擇第一單一可變 域’且可在存在第四互補可變域之情況下選擇第二可變 域。互補第三或第四可變域可為具有與所測試單-域相同 的特異性之天然同源可變域，或諸如，，虛設(d_y)”可變 域之非同源互補域。 車乂 {土地，本發明之錐^主 又特〃性配位體包含僅兩個可變域， 129025.doc -25- 200848427 儘管可將數個該等配位體一起併 ▲ 同蛋白質中，例如可 將兩個該等配位體併入;[gG或多
^ ♦尤疚球蛋白，諸如IgM 中。或者，在另一實施例中，可 了將稷數個雙特異性配位體 、、且曰以幵》成多聚體。例如， 將兩個不同雙特異性配位體 組合以產生四特異性分子。 熟習此項技術者應瞭解根據本發明之方法產生的雙特里 性配位體之輕鏈可變域及重鏈可變域可處於同—多狀鍵或
者不同多肽鏈上。在可變域處於不同多肽mu， 則其可經由連接子、通常可撓性連接子（諸如多肽鏈）、化 學連接基團或在此項技術中已知之任何其他方法連接。 在另-態樣中，本發明提供—種包含可藉由本發明之方 法獲得的雙特異性配位體及醫藥學上可接受之載劑、稀釋 劑或賦形劑之組合物。 此外，本發明提供一種使用根據本發明之，雙特異性配 位體’或組合物治療及/或預防疾病之方法。 在第一組恶中，本發明提供包含至少兩個非互補可變域 之多特異性配位體。例如，該等配位體可包含—對％域或 一對^域。有利地’該等域為非路馬羊駿來源；較佳地其 為人類域或包含人類框架區（FW)及一或多個異源cdr。 CDR及框架區為如免疫學相Μ蛋白質序列之Kabat數據庫 中所定義的免疫球蛋白可變域之彼等區。 較佳人類框架區為彼等經生殖細胞系基因片段及 DPK9編碼者。有利地，VH或VL域之FW1、FW2及FW3具 有來自DP47或DPK9之FW1、FW2或FW3之序列。人類框 129025.doc -26- 200848427 架：視情況含有突變，例如在用於本發明之配位體的人類 框架中含有總計高達約5個胺基酸變化或高達約ι〇個胺基 酸變化。 、根據本發明之第二組態的多特異性配位體巾之可變域可 、碭放或閉合構形排列；亦即其可經排列使得可變域可獨 同時、、Ό 口其同源配位體，或使得僅一個可變域可在 任一時刻結合其同源配位體。
月者已Μ識到在某些結構條件下，非互補可變域（例 如兩個^可變域或兩個重鏈可變域）可存在於配位體之 使知第抗原決定基與第一可變域之結合抑制第二抗 原決Μ與第二可變域之結合，即使該等非互補域並不以 同源對形式一起發揮作用。 有利地，配位體包含兩對或兩對以上ϋ %域；^卩# 包含至少4個可變域。有利地該4個可變域包含人類來源 之框架。 在車乂仏實施例中，人類框架與人類生殖細胞系序列之 框架相同。 本發明者認為該等抗體在用於治療及其他用途之配位體 結合檢定中將具有特定用途。 因此’在第二紙態之第—態樣中，本發明提供-種產生 多特異性配位體之方、、土 〈万法，其包含以下步驟： 勾依據結合第一抬馬^甘 抗原決疋基之能力選擇第一抗原決定基 結合域； b) 依據結合第二h 4 # 一抗原決疋基之能力選擇第二抗原決定基 129025.doc -27 - 200848427 結合域； C) 組合該等抗原決定基結合域；及 d) 依據結合該第一抗原決定基及該第二抗原決定基之能 力選擇閉合構形多特異性配位體。 在第二組態之另一態樣中，本發明提供一種製備閉合構 形多特異性配位體之方法，該配位體包含具有第一抗原決 定基結合特異性之第一抗原決定基結合域及具有第二抗原 決定基結合特異性之非互補第二抗原決定基結合域，其中 該第一結合特異性與第二結合特異性競爭結合抗原決定 基，使得該閉合構形多特異性配位體不可同時結合兩個抗 原決定基，該方法包含以下步驟： a) 依據結合第一抗原決定基之能力選擇第一抗原決定基 結合域； b) 依據結合第二抗原決定基之能力選擇第二抗原決定基 結合域； c) 組合該等抗原決定基結合域使得該等域為閉合構 形；及 d) 依據結合該第一抗原決定基及該第二抗原決定基、而 不同時結合該第一及第二抗原決定基之能力選擇閉合構形 多特異性配位體。 此外，本發明提供一種閉合構形多特異性配位體，其包 含具有第一抗原決定基結合特異性之第一抗原決定基結合 域及具有第二抗原決定基結合特異性之非互補第二抗原決 定基結合域，其中該第一結合特異性與第二結合特異性競 129025.doc -28- 200848427 性配位體不可 爭抗原決定基結合，使得該閉合構形多特異 同時結合兩個抗原決定基。 本發明第二組態之上述態樣之替代性實施例視情況包含 另-步驟⑽，其包含選擇第三或另—抗原決定基結合 域。以此方式產生之多特異性配位體(無論開放或閉合構 形）包含兩種以上抗原決定基結合特異性。在本發明第二 組態之較佳態樣中1多特異性配位體包含兩個以上抗原
決定基結合域’㈣等域中之至少兩者為閉合構形且競爭 結合；其他域可競爭結合或可與其同源抗原決定基獨立地 自由接合。 根據本發明，術語，多特異性配位體，係指具有一種以上 如本文所定義之抗原決定基結合特異性之配位體。 如本文所定《，術語，閉合構形，（多特異性配位體）意謂配 位體之抗原決定基結合域視情況藉助於蛋白質骨架彼此連 接或接合，使得一個抗原決定基結合域之抗原決定基結合 Y另抗原決定基結合域之抗原決定基結合競爭。亦即， 同源抗原決定基可經各抗原決定基結合域單獨而非同時結 合。可使用本文所述之方法實現配位體之閉合構形。 開放構形”意謂配位體之抗原決定基結合域視情況藉助 於蛋白貝骨架彼此連接或接合，使得—個抗原決^基結合 或之抗原决疋基結合不與另一抗原決定基結合域之抗原決 定基結合競爭。 如本文所述’術語’競爭，意謂當第二抗原決定基與其同 源k原決定基結合域結合時，第_抗原決定基與其同源抗 129025.doc •29- 200848427 原決定基結合域之結合受抑制。例如，結合可藉由（例如） 實體阻斷結合域或藉由改變結合域之結構或環境使得其對 抗原決定基之親和力或親和性降低而在空間上受抑制。 在本發明之第二組態之另一實施例中，結合時抗原決定 基可彼此置換。例如，第一抗原決定基可存在於抗原上， 當與其同源第一結合域結合時，引起第二結合域之位阻或 其構形變化，其置換與第二結合域結合之抗原決定基。 有利地，結合降低25%或25%以上、有利地降低40%、 5 0%、60%、70%、80%、90%或90%以上，且較佳高達 100%或幾乎100%，使得結合完全受抑制。可藉由諸如 ELISA之習知抗原結合檢定，藉由包括FRET之基於螢光之 技術，或藉由諸如量測分子質量的表面電漿共振之技術量 測抗原決定基之結合。可藉由包括（例如）Scatchard分析及/ 或諸如放射免疫檢定（RIA)、諸如ELISA之酶免疫檢定及夾 層競爭檢定之競爭結合檢定及其不同變型之適當檢定測定 抗原結合蛋白質與抗原或抗原決定基之特異性結合。 較佳使用表面電漿共振（SPR)及Biacore(Karlsson等人， 1991)，使用Biacore系統（Uppsala，Sweden)測定結合親和 力。Biacore系統使用表面電漿共振（SPR，Welford K. 1991，Opt. Quant. Elect. 23:1 ; Morton 及 Myszka，1998, Methods in Enzymology 295: 268)實時監控生物分子相互 作用，且使用表面電漿共振，表面電漿共振可偵測由於高 達300 nm以外表面折射率之變化引起光在玻璃支撑物上金 薄膜之表面上之共振角變化。Biacore分析便利地產生接合 129025.doc -30- 200848427 速率常數、解離速率常數、平衡解離常數及親和力常數。 藉由使用Biacore表面電漿共振系統⑺^⑶代，Inc )評估接 合及解離速率常數來獲得結合親和力。根據製造商 (Biacore)之用法說明書將生物傳感器晶片活化用以共價偶 聯標靶。接著將標靶稀釋且注射在晶片上以獲得固定材料 之反應單位計之信號。由於以共振單位計之信號與固 疋材料之質量成正比，因此此表示基質上固定標革巴密度之 範圍。將解離數據擬合為單點模型以獲得匕計"sd(量測 值之私準差）。計异各接合曲線之假一級速率常數且 作為蛋白質濃度之函數作圖以獲得k。〆/· s e•(擬合標準 差）。由SPR量測據koff/kon計算結合之平衡解離常數^^、。 如 Phizicky及 Field於 Microb. Rev. (1995) 59:114-115 中所 述，將諸如HSA之適當抗原固定在葡聚糖聚合物上，且使 含有諸如單一可變域之HSA之配位體的溶液流經池，與固 定HSA接觸。由固定HSA保持之單一可變域改變入射光之 共振角，使得藉由增加量之蛋白質（亦即葡聚糖聚合物附 近之單一可變域）實現折射率改變。由於所有蛋白質均具 有相同折射率且由於共振角位移與表面附近的蛋白質濃度 之間存在線性相關性，因此可量測歸因於蛋白質/蛋白結 合之表面上蛋白質濃度之改變，參見phizicky& Fidd，前 述。為測定結合常數，藉由使單一可變域蛋白質之溶液流 經固定配位體（HSA)直至RU值穩定，量測隨時間變化之共 振單位（RU)之增加，接著在用缺乏單一可變域之緩衝液之 情況下量測隨時間變化之RU之下降。在單一可變域蛋白 129025.doc -31- 200848427 質之數個不同濃度下重複該程序。由R· Karlss〇n等人， (991) J· Immunol Methods，145, 229描述詳細理論背景及程 序。 如上所述，儀器軟體得到平衡解離常數（尤心。美國專利 5,5 73,957描述經由使用表面電漿共振測定之平衡解離常 數，如基於dRA/dt及RA值之表，其中此實例中尺為如藉由 Biacores：測之以共振單位計之hsa/單一可變域複合物， 且其中dR/dt為HSA/單一可變域複合物之形成速率，亦即 結合曲線之導數；將圖dRA/dt對數種不同濃度之單一可變 域的RA作圖，且隨後將此等線之斜率對單一可變域之濃度 作圖’此第二圖之斜率為接合速率常數（M_i，s-i)。可使用 Biacore產生之解離曲線確定解離速率常數或HS A與單一可 變域彼此釋放之速率。藉由作圖且確定反應之下降對數對 時間曲線的斜率，可量測解離速率常數。平衡解離常數 Kd=解離速率常數/接合速率常數。 根據本發明之方法，有利地，各結合單一可變域之抗原 決定基具有不同抗原決定基結合特異性。 在本發明之上下文中，第一及第二，，抗原決定基”應理解 為並不相同且並不由單一單特異性配位體結合之抗原決定 基。其可處於不同抗原或同一抗原上，但以充分距離隔開 以致其並不形成可藉由習知抗體之單一單特異性 合對結合之單一實體。實驗上，若單鏈抗體形式之兩個個 別可變域（域抗體或dAb)分別藉由針對兩個抗原決定基之 單特異性VH/VL配位體競爭，則認為彼等兩個抗原決定基 129025.doc -32- 200848427 相隔不夠遠’根據本發明不可將其視為獨立抗原決定基。 本發明之閉合構形多特異性配位^ 包括如 WOO搬773所述之配位體。^，本發明之配位體並不 包含協作地結合任何-或多個抗原或抗原決定基之互補 vh/vl對。相反，根據本發明之配位體較佳包含非互補Vh_ VH或Vl-火對。有利地’各Vh_v“Vl，中之各v“Vl 域具有不同抗原決定基結合特異性，且抗原決定基結合部
位經排列以致抗原決定基在—個部位之結合與抗原決定基 在另一部位之結合競爭。 根據本發明’有利地’各抗原決^基結合域包含免疫球 蛋白可變域。更有利地，各抗原決定基結合域將為抗體之 可變輕鏈域（VL)或可變重鏈域（Vh)。在本發明之第二組態 中，當免疫球蛋白域存在於根據本發明之配位體上時，其 為非互補域，亦即其並不接合以形成vh/vl抗原結合部 位。因此，如本發明之第二組態中定義之多特異性配位體 包含相同子型之免疫球蛋㈣’亦即可變輕鏈域㈤或可 變重鏈域（vH)。此外，若根據本發明之配位體為閉合構 形，則免疫球蛋白域可為駱馬羊駝VHH型。 在-替代性實施例中’根據本發明之配位體並不包含路 馬羊駝VHH域。更特定言之，本發明之配位體並不包含一 或多個與對人類VH域相比對駱馬羊轮VHH域具有特異性之 胺基酸殘基。 不同抗原或抗原決定 可藉由人類免疫作用 有利地，單一可變域獲自對於針對 基之結合活性而選擇之抗體。例如， 129025.doc -33· 200848427 ===在此項技術…替代性一 人頡抗體庫分離及人工抗體基因合成法。 在：選實施例中，單一可變域為天然存在之單一可變 或。在其他所選實施例中，單一可變域為非 一可變域。本文中使用術語"天然 g ^ 7 , 廿牡木晶不可在自然界 糾如蛋白質域（例如單一可變域或抗體單一可變域） 才丁 □此，諸如抗體之V區的天然存在之蛋白質域存
\ 動物、齧齒動物'#、、鳥、爬行動物等)表現之例如抗體 鏈蛋白貝的蛋白質中。為避免疑義，自由活體外引入多樣 ϋ的核I表現之多肽庫分離之單—可變域為非天然存在之 單一可變域。為進一步避免疑義，源自由動物免疫產生之 抗體的抗體單一可變域為天然存在之單一可變域。 可變域有利地結合諸如蛋白質Α或蛋白質L之超級抗 原。與超級抗原之結合為正確摺疊抗體可變域之特性，且 允許該等域自（例如）重組或突變域之庫分離。 根據本發明之抗原決定基結合域包含蛋白質支架及抗原 決定基相互作用部位（其有利地處於蛋白質支架之表面 上）。 抗原決定基結合域亦可基於除免疫球蛋白域以外的蛋白 質支架或骨架。例如，已將諸如SpA之天然細菌受體用作 用於移植CDR以產生特異性結合一或多個抗原決定基之配 位體的支架。該程序之細節描述於US 5,831，012中。其他 適當支架包括基於纖連蛋白及親和體（affib〇dy)之支架。適 129025.doc -34- 200848427 當程序之細節描述於W〇 98/58965中。其他適當支架包括 如 πη den Beuken等人，J· Mol· Biol· (2001) 310, 591_6〇1 中所述之脂質運載蛋白及CTLA4，及諸如彼等描述於 WO 0〇69907(英國醫學研究委員會）中之支架，其基於（例 如）細菌GroEL或其他陪伴分子多肽之環狀結構。 可將蛋白質支架組合；例如可將CDR移植至A4支架 上且連同免疫球蛋白VH*VL域一起使用以形成多價配位 體。同樣，可組合纖連蛋白、脂質運載蛋白及其他支架。 熟習此項技術者應瞭解根據本發明之方法產生的閉合構 形多特異性配位體之抗原決定基結合域可處於同一多肽鏈 或者不同多肽鏈上。在可變域處於不同多肽鏈上之情況 下’則其可經由連接子、有利地可撓性連接子（諸如多肽 鍵）、化學連接基團或在此項技術中已知之任何其他方法 連接。 第一抗原決定基結合域與第二抗原決定基結合域可共價 或非共價接合。在該等域經共價接合之情況下，則接合可 例如經二硫化物鍵介導。 在本發明之第二組態中，第一抗原決定基與第二抗原決 定基較佳不同。其可為或屬於可天然存在或合成之多肽、 蛋白質或核酸。在此方面，本發明之配位體可結合抗原決 疋基或抗原且充當拮抗劑或促效劑（例如Ep〇受體促效 劑）。在一實施例中，配位體之抗原決定基結合域具有相 同抗原決定基特異性，且當抗原決定基之多個複本存在於 同一抗原上時可（例如）同時結合其抗原決定基。在另一實 129025.doc -35- 200848427 施例中，該等抗原決定基提供於不同抗原上使得配位體可 結合抗原決定基且橋接抗原。熟習此項技術者應理解抗原 決定基及抗原之選擇廣泛多樣。其可為（例如）人類或動物 蛋白質、細胞激素、細胞激素受體、酶、酶輔因子或DNA 結合蛋白質。適當細胞激素及生長因子包括（但較佳不限 於）：ApoE、Apo-SAA、BDNF、心營養素-1、EGF、EGF 受體、ENA-78、嗜酸性粒細胞趨化因子、嗜酸性粒細胞 趨化因子-2、次級淋巴組織趨化因子、EpoR、酸性FGF、 鹼性FGF、纖維母細胞生長因子-10、FLT3配位體、神經 趨化素（CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-βΙ、胰島 素、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、IL-Ια、IL-Ιβ、IL-2、IL-3、 IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(72 a.a·)、IL-8(77 a.a.)、 IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18(IGIF)、抑制素cx、抑制素β、IP-10、角質細胞 生長因子-2(KGF-2)、KGF、瘦體素、LIF、淋巴細胞趨化 因子、繆勒氏管抑制物質、單核細胞集落抑制因子、單核 細胞引誘蛋白質、M-CSF、MDC(67 a.a.)、MDC(69 a.a·)、 MCP-l(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC(67 a.a·)、MDC(69 a.a.)、MIG、MIP-la、MIP-Ιβ、MIP-3oc、 ΜΙΡ-3β、MIP-4、骨髓祖代抑制因子-l(MPIF-l)、NAP-2、 神經營養因子、神經生長因子、β-NGF、NT-3、NT-4、制 瘤素 Μ、PDGF-AA > PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、 RANTES、SDFla、SDFip、SCF、SCGF、幹細胞因子 (SCF)、TARC、TGF-a、TGF-β、TGF-P2、TGF-03、腫瘤 129025.doc -36- 200848427 壞死因子（TNF)、TNF-α、TNF-β、TNF 受體 I、TNF 受體 II、TNIL-1、ΤΡΟ、VEGF、VEGF 受體 1、VEGF 受體 2、 VEGF 受體 3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、 HCC1、1-309、HER 1、HER 2、HER 3、HER 4、TACE識 別部位、TNF BP-I及TNF BP-II、CD4、人類趨化激素受體 CXCR4或CCR5、來自C型肝炎病毒之3型非結構性蛋白質 (NS3)、TNF-ot、IgE、IFN-γ、MMP-12、CEA、幽門螺旋 菌、TB、流感、E型肝炎、MMP-12、在某些細胞上過度 表現之内化受體（諸如上皮生長因子受體（EGFR)、腫瘤細 胞上之ErBb2受體（内化細胞受體）、LDL受體、FGF2受 體、ErbB2受體、運鐵蛋白受體、pDGF受體、VEGF受 體）、PsmAr(胞外基質蛋白質）、彈性蛋白、纖連蛋白、層 黏連蛋白、α 1 -抗胰蛋白酶、組織因子蛋白酶抑制劑、 PDK1、GSK1、Bad、卡斯蛋白酶-9、叉頭、幽門螺旋菌 之抗原、結核分枝桿菌之抗原及流感病毒之抗原，以及任 一揭示於本文附錄2或附錄3中之標靶’附錄中闡明之物質 可為以不同組合方式組合之物質或單獨之物質。細胞激素 受體包括上述細胞激素之受體’例如江-1&1、1]^6尺、几-1 OR、IL-18R，以及附錄2或附錄3中所闡明之細胞激素受 體，以及附錄2及3所揭示之受體。應理解此列表絕非詳盡 列表。若多特異性配位體與兩個抗原決定基（在同一抗原 或不同抗原上）結合，則抗原可選自此列表。 有利地，雙特異性配位體可用以靶向細胞激素及其他在 生物體之體内治療情況下協同發揮作用之分子。因此’本 129025.doc -37- 200848427 I明k供一種使兩種或兩種以上細胞激素之活性協同之方 法’其包含投與能夠與該兩種或兩種以上細胞激素結合之 雙特異性配位體。在本發明之此態樣中，該雙特異性配位 體可為任何雙特異性配位體，其包括由互補域及/或非互 補域組成之配位體、開放構形之配位體及閉合構形之配位 體。例如’本發明之此態樣係關於vH域與&域之組合、僅 νΗ域及僅vL域。 可以多種方式實現治療環境中之協同作用。例如，僅當 配位體乾向兩個標乾時，標|巴組合可在治療上有效，而僅 靶向一個標靶，則在治療上無效。在另一實施例中，僅一 個標靶可提供少許或極小治療效應，但連同第二標靶一起 之組合提供協同增加之治療效應。 較佳地’由本發明之此態樣的雙特異性配位體結合之細 胞激素係選自附錄2所示之列表。 此外，雙特異性配位體可用於腫瘤學應用，其中一種特 異性靶向由細胞毒素細胞表現之CD89，且另一者為腫瘤 特異f生。在附錄3中給出可執向之腫瘤抗原之實例。 在本發明之第二組態之一實施例中，可變域獲自針對第 抗原或抗原決定基及/或第二抗原或抗原決定基之抗 體。在-較佳實施例巾，可變域獲自單_可變抗體域之 庫。在-實例中，該庫為並非在動物中產生或不為合成庫 之庫。在另一實例巾，單一可變域並非藉由動物免疫作用 而（至少部分）分離。因此，單一域可自原態資料庫 (library)分離。 129025.doc •38 - 200848427 在另一態樣中，本發明之 一抗原決定基結合特異性之 弟二抗原決定基結合特異性 域之多特異性配位體。第— 可相同或不同。 第一組怨提供一種包含具有第 第一抗原決定基結合域及具有 之非互補第二抗原決定基結合 結合特異性與第二結合特異性 / \ 在另-態樣中，本發明提供—種閉合構形多特異性配位 體，其包含具有第一抗原決定基結合特異性之第一抗原決 定基結合域及具有第二抗原決定基結合特異性之非互補第 二抗原決定基結合域，#中該第—結合特異性與第二結合 特異性能夠競爭抗原決定基結合’使得該閉合構形多特昱 性配位體不能同時結合兩個抗原決定基。 、 複本的標乾，諸如 IL_5、PDGF-AA、PDGF_BB、TGF_p、 TGF-P2、TGF-P3、及TNFa，以及人類ΤΝρ受體i及人類 TNFa。 在另-態樣中，本發明提供包含非互補結合域之開放構 形配位體’其中該等域對同，上之不同抗原決定基具 有特異性。該等配位體以增加之親和性與標減合。相似 地’本發明提供多價配位體’其包含對相同抗原決定基呈 有特異性之非互補結合域且針對包含該抗原決定基之多個 在相似態樣中，根據本發明之配位體可經組態以以低親 和力結合個別抗原決定基，使得與個別抗原決定基之結合 無治療意義η旦由與兩個抗原決定基結合產生之增加之親 和性提供治療益處。在特定㈣中，μ向在正常細胞類 型上早獨存在，而在諸如腫瘤細胞之異常或患病細胞上一 129025.doc -39- 200848427 起存在之抗原決定基。在此情況下，根據本發明之雙特異 性配位體僅有效地靶向異常或患病細胞。 對同才不上之相同抗原決定基或鄰近抗原決定基的多 個複本具有特異性之配位體(稱為螯合d A b)亦可為包含3 個、4個或更多個非互補結合域之三聚或多聚(四聚或以上) 配位體。例如，可構築包含3個或4個％域或&域之配位 體。 此外，提供與多亞單元標靶結合之配位體，其中各结人 域對該標靶之亞單元具有特異性。該配位體可為二聚了I 聚或多聚配位體。 較佳地，可藉由本發明之第一態樣的方法獲得根據本發 明之上述態樣的多特異性配位體。 根據本發明之第二組態之上述態樣，有利地，如本文所 疋義，第一抗原決定基結合域及第二抗原決定基結合域為 非互補免疫球蛋白可變域。亦即vh_vh*vL_vL可變域。 詳言之’可根據本發明之較佳態樣製備螯合dAb，亦即 使用錨定dAb，其中使用包含在連接子序列上游或下游的 恆定dAb且在連接子之另一側插入第二、第三及其他dAb 之庫的載體構築二聚、三聚或多聚dAb之資料庫。例如， 錦定或引導 dAb 可為 TAR1-5(VK)、TAR1-27(VK)、TAR2h_ 5(vh)或 TAR2h_6(VK)。 在替代性方法中，可（例如）藉由使用諸如VH& VK之結合 域之間的非共價鍵結或天然親和性避免使用連接子。因 此’本發明提供一種製備螯合多聚配位體之方法，其包含 129025.doc -40- 200848427 以下步驟： ⑷提供包含編碼對標乾上之第一抗原決定基具有特異性 的早一結合域之核酸序列之載體； ⑼提供編碼包含對該標乾上之第二抗原決定基且有特里 性的第二結合域之庫之載體，該抗原決定基可與該第叶 原決定基相同或不同，該第二抗原決定基與該第 定基鄰近；及 (C)表現該第一及第二結合域；及 W分離組合在一起以產生標革巴'结合二聚體之第一與第 二結合域之彼等組合。 、 第一抗原決定基與第：抗原決定基鄰近，使得多聚配位 體能夠同時與兩個抗原決定基結合。若結合’則此提供具 有增加之親和性優勢的配位體。若抗原決定基相同，則藉 由標'上抗原決定基之多個複本的存在獲得增加之親^ 性’允許至少兩個複本同時結合以獲得增加之親和性效 應。 可藉由數種方法以及使用連接子將結合域接合。例如， 結合域可包含cys殘基、抗生物素蛋白及抗生蛋白鏈菌素 基團或其他用於合成後非共價連接之構件；分離與標無有 效結合之彼等組合。或者，例如如上所述，連接子可存在 =第結合域與第二結合域之間’纟經表示為包含第一結 合域、連接子及第^結合域之庫的《單—载 肽。 平夕 在一較佳態樣中，當與抗原結合時第一結合域與第二結 129025.doc -41 - 200848427 口域天然接合；例如，當與鄰近抗原決定基結合時，％域 /、Vl(例如Vi〇域將以三向（three-way)相互作用天然接合以 形成穩定二聚體。可在標靶結合檢定中分離出該等接合蛋 白質。此程序之優點為僅與緊密鄰近抗原決定基結合之結 合域將以正確構形接合且因此由於其對標靶之增加親和性 而得以分離。
在本么月之弟一組悲之上述態樣的一替代性實施例中， 至夕一個抗原決定基結合域包含如本文所定義之非免疫球 2白’蛋白質支架，或，蛋白質骨架，。適當非免疫球蛋白蛋白 質支架包括（但較佳不限於）彼等選自由以下各物組成之群 之任一者··如上文所闡明之SPA、纖連蛋白、GroEL及其 他陪伴分子、脂質運載蛋白、CCTLA4及親和體。 根據本發明之第二組態之上述態樣，有利地，將抗原決 定基結合域連接至，蛋白質骨架，。有利地，根據本發明2 蛋白質骨架為免疫球蛋白骨架。 根據本發明，術語，免疫球蛋白骨架，係指包含至少一個 免疫球蛋白摺疊且充當—或多個如本文所定義之抗原決定 基結合域之核的蛋白質。 如本文所定義之較佳免疫球蛋白骨架包括彼等選自以下 各物之任何一或多I:包含至少以下各物之免疫球蛋白分 子：⑴抗體之4(κ4λ子類）域；或（ii)抗體重鏈之域· t抗體重鏈之ch1及ch2域之免疫球蛋白分子；^含抗體 2之⑸、ch2及ch3域之免疫球蛋白分子：或聯合抗體 之m子類)域的(ii)中之任—子集。亦可包括鉸鏈區 129025.doc -42· 200848427 =域、:合可(例如)模擬天然抗體， 或其片段，諸如Fv、scFV κ 技術者將認識到該列表並非詳==，)2分子。熟習此項 定：，可在多肽級別實現骨架與抗原決定基結 :之仿表現編碼骨架及/或抗原決定基結合 攄太^ “ °或者’可在核酸級別下進行連接步驟。將根 據2明之蛋白質骨架連接至一或多個抗原決定基結合域 之包括使用為熟習此項技術者所熟知且描述於本文中 之蛋白質化學及/或分子生物學技術。 八有利2 ’閉合構形多特異性配位體可包含能夠結合標乾 :子U-域及能夠結合延長配位體之半衰期的分子或基 二域。例如’分子或基團可為諸如HSA或細胞基質 蛋白質之龐大試劑。如本文中所用，短語，延長配位體之半 W的刀子或基團’係指當投與動物時，相對於不結合彼分 子或基團之配位體而言’在由如本文所述之雙特異性配位 體結合時增加該雙特異性配位體之活體内半衰期的分子或 化學基團。延長配位體之半衰期的分子或基團之實例描述 於下文中。在一較佳實施例中，閉合構形多特異性配位體 可月匕夠僅在置換半衰期提高分子或基團時結合標乾分子。 因此’例如，藉由諸如HSA之龐大分子將閉合構形多特異 ^配位體維持在受檢者之血流循環中。當遇到標乾分子 時’ P才’合構形多特異性配位體之結合域之間的 HSA置換及標靶結合。 根據本發明之任一態樣的配位體包括具有至少一個單一 129025.doc •43- 200848427 可變域或由至少一個單一可變域組成之配位體，該單一可 變域以單體單一可變域之形式或以多個單一可變域（亦即 多聚體）之形式。配位體可經修飾以含有諸如融合蛋白質 或結合物之其他部分。該（例如）雙特異性配位體形式之多 聚配位體及/或該包含單一可變域或由單一可變域（亦即適 用於構築該多聚配位體之dAb單體）組成之配位體可有利地 與其同源標靶解離，如（例如）藉由表面電漿共振所測定， Kd為300 nM或以下、300 nM至5 pM(亦即3χ10·7至 5x10 12 M)、較佳 50 nM至 20 pM或 5 nM至 200 pM或 1 nM至 100 pM、lxlO7 μ或以下、ixi〇_8 jy[或以下、lxlCT9 Μ或 以下、lxl〇-1G Μ或以下、ΐχίο·11 μ或以下；及/或KGff速率 常數為 5χ10-1 至 lxl(T7 S-1、較佳 ΐχΐ〇-2 至 ι><ι〇·6 s·1 或 5x10 3至 1χ1〇·5 S-1，或 5x10」S-1或以下，或 lxl〇-2 S-1或以 下，或lxlO-、-1或以下，或ixi〇-4S-】或以下，或lxl〇-5s-i 或以下，或lxlO·6 S·1或以下。Kd速率常數定義為 Koff/Kon。通常認為大於i莫耳濃度之Kd值指示非特異性結 合。較佳地，單一可變域將以小於50〇 nM、較佳小於200 nM且更佳小於1〇 nM，諸如小於5〇〇 PM之親和力特異性結 合標靶抗原或抗原決定基。 詳言之，本發明提供一種抗TNFa dAb單體（或包含該 dAb之雙特異性配位體）、均二聚體、雜二聚體或均三聚體 配位體，其中各dAb結合TNFa。配位體與TNFa結合，如 藉由表面電漿共振所測定，Kd為300 nM至5 PM(亦即 3xl(T7至 5χ1(Γ12Μ)、較佳 50 nM 至 20 pM、更佳 5 nM 至 200 129025.doc • 44 - 200848427 pM且最佳1 nM至100 pM ;以替代性方式表示，其Kd為 1ΧΗΓ7 Μ或以下，較佳lxl0-8 M或以下，更佳ΐχΐ〇_9 “或 以下，有利地1x10，Μ或以下且最佳1χ1〇-ιι…或以下； 及/或其Κ。"速率常數為5x10·〗至ixi〇-7 、較佳lxl〇-2至 1x10 S 、更佳 5χΐ(Γ3 至 ixi〇-5 s-i，例如 5χ1(Γΐ s.】或以 下，較佳lxio·2 S·1或以下，更佳lxl0-3 S-1或以下，有利地 1 x 10 S或以下，更有利地1 X 1 〇·5 或以下且最佳1 χ 1 〇·6 S·1或以下。 較佳地’在標準L929檢定中配位體中和TNFa之ND50為 5 00 nM至50 PM、較佳或1〇〇 nM至50 pM、有利地1〇 nM至 1 00 pM、更佳1 nM至1 〇〇 pM ;例如50 nlV[或以下、較佳5 nM或以下、有利地5〇〇 PM或以下、更佳2〇〇 PM或以下且 最佳1 00 pM或以下。 較佳地，配位體抑制TNFa與TNFa受體I(p55受體）之結 合’其IC50 為 500 nM 至 50 pM、較佳 1〇〇 nM 至 50 pM、更 佳10 nM至1〇〇 PM、有利地1 nM至1〇〇 pM ;例如50 nM或 以下、較佳5 nM或以下、更佳500 pM或以下、有利地2〇〇 pM或以下且最佳1〇〇 pm或以下。較佳地，TNFa為人類 TNFa。 此外’本發明提供抗TNF受體I dAb單體或包含該dAb之 雙特異性配位體，其與TNF受體I結合，較佳如藉由表面電 漿共振所測定，Kd為300 nM至5 pM(亦即3xl〇·7至 5χ1(Τ12Μ)、較佳 50 nM 至 20 ρΜ、更佳 5 nM 至 200 ΡΜ 且最 佳1 nM至100 ρΜ，例如lxl(T7 Μ或以下、較佳ιχ1〇-8 129025.doc -45- 200848427 以下，更佳lxio·9 Μ或以下，有利地1χ1〇·1() Μ或以下，且 最佳lxlO·11 Μ或以下；及/或Kw速率常數為hlO·1至 lxlO·7 S·1、較佳 lxi〇-2 至 1χ10·6 s·1、更佳 5χ10·3 至 lxl〇-5 S·1，例如5x10」S·1或以下，較佳lxl(T2 S-1或以下，有利 地lxl(T3S-1或以下，更佳ixio^s·1或以下，更佳lxl(T5S-1 或以下且最佳ixicr6s-1或以下。 較佳地，在標準檢定（例如本文所述之L929或HeLa檢定） 中dAb單體配位體中和TNFa的ND50為500 nM至50 pM、較 佳100 nM至50 pM、更佳10 nM至100 pM、有利地1 nM至 100 pM ;例如50 nM或以下，較佳5 nM或以下，更佳500 pM或以下，有利地2〇〇 pM或以下且最佳100 pM或以下。 較佳地，dAb單體或配位體抑制TNFa與TNFa受體I(P55 受體）之結合，其IC50為500 nM至50 pM、較佳1〇〇 nM至50 pM、更佳1〇 nM至1〇〇 pM、有利地1 nM至100 pM ;例如 50 nM或以下，較佳5 nM或以下，更佳500 pM或以下，有 利地200 PM或以下且最佳100 pM或以下。較佳地，TNF受 體I標靶為人類TNFa。 此外’本發明提供dAb單體（或包含該dAb之雙特異性配 位體），其以1 nM至500 μΜ(亦即1χ1〇-9至5χ1〇·4)、較佳⑽ nM至10 μΜ之Kd與血清白蛋白（SA)結合。較佳地，對於另 一標靶之包含第一抗SA dAb及第二dAb之雙特異性配位體 而吕，第二dAb對其標靶之親和力（例如，如藉由表面電漿 共振例如使用BiaCore所量測之Kd及/或K〇ff)為第一 對 SA之親和力的丨至100000倍（較佳1〇〇至ι〇〇〇〇〇、更佳⑼ 129025.doc •46- 200848427 至100000、或10000至100000倍）。例如，第一dAb以約l〇 μΜ之親和力結合SA,而第二dAb#1〇〇 pM之親和力結合 其軚靶。較佳地，血清白蛋白為人類血清白蛋白（hsa)。 在一實施例中，第一dAb(或dAb單體）以約5〇 nM、較佳 70 nM 且更佳 100 nM、15〇 11]^或2〇〇 nMiKd 結合 sa(例如 HSA)。 此外根據本發明之上述態樣，本發明提供上述dAb單 體之二聚體、三聚體及聚合物。 可將根據本發明包括dAb單體、二聚體及三聚體之配位 體與包含CH2及CH3域中之一或兩者及視情況鉸鏈區之抗體 FC區連接。例如，編碼作為單一核苷酸序列連接至Fc區的 配位體之載體可用以製備該等多肽。 在本务明之第二組態之另一態樣中，本發明提供一或多 種編碼至少一種如本文所定義之多特異性配位體的核酸分 子在實她例中，多特異性配位體為閉合構形配位體。 在另貝施例中，其為開放構形配位體。可在單一核酸分 子上編碼該多特異性配位體，或者可藉由獨立核酸分子編 碼各抗原決定基結合域。#多特異性配位體經單一核酸分 子編碼，則域可經表現為融合多月太，或可經分別表現且隨 後（例如）使用化學連接劑連接在一起。藉由適當方式將由 獨立核酸表現之配位體連接在一起。 表現後，核酸可進一步編碼信號序列用以將多肽自宿主 細胞^出’且表現後可與絲狀細g㈣體顆粒之表面組份 (或透擇呈現系統之其他組份）融合。可用於細菌表現及/或 129025.doc •47· 200848427 嗟菌體或噬菌粒呈現之引導序列包括pelB、stII、〇mpA、 phoA、bla及 pelA。 在本發明之第二組態之另一態樣中，本發明提供包含根 據本發明之核酸的載體。 在另一態樣中，本發明提供經根據本發明之载體轉染的 宿主細胞。 自該載體之表現可經組態以（例如）在細菌噬菌體顆粒之 表面上產生用以選擇之抗原決定基結合域。此允許使用本 發明之方法選擇所呈現之域且因此選擇，多特異性配位 在本發明之第二組態之一較佳實施例中，抗原決定基結 合域為免疫球蛋白可變域且係選自單一域V基因庫。通 系，將單一抗體域之庫呈現在絲狀細菌噬菌體之表面上。 在一較佳實施例中，藉由將噬菌體庫與抗原結合選擇各單 一抗體域。
在本發明之第二組態之另 本發明提供一種包 一態樣中
醫藥學上可接受之載劑、 得的閉合構形多特異性配位體及 稀釋劑或賦形劑之組合物。 129025.doc -48- 200848427 此外，本發明提供-種使用根 特異性配位體，或組合物治療疾病之方法。月之閉。構开” 在本發明之一較佳實施 —t上 々疾病為癌症或發炎性疾 病，例如類風濕性關節炎、 、 disease)。 孝而或克羅恩氏病(C — 在本發明之第二組態 、从姐 、 之另憑樣中，本發明提供一種用 以移k/f之方法，包括使用奸嫌 史用根據本發明之閉合構形多特異性
配位體或組合物診斷疾病。田 y 展扃因此，通常，分析物與閉合構 幵> 多特異性配位體之結合可經使 便用以置換试劑，其使得置 換時信號產生。例如，分析物（第二抗原）之結合可置換與 提供免疫檢定之基礎的抗體結合之酶(第一抗原），尤其是 經由其活性部位保持至抗體的酶。 因此’在第二組態之最終態樣中，本發明提供—種偵測 標革巴分子之存在的方法，其包含： 〇)提供與試劑結合之閉合構形多特異性配位體，該配位 體對該標乾分子及該試劑具有特異性，其中藉由配位體結 合之該試劑自配位體置換時導致可偵測信號產生； (b) 使閉合構形多特異性配位體暴露於該標靶分子；及 (c) 偵測由於試劑置換產生之信號。 根據本發明之第二組態之上述態樣，有利地，該試劑為 酶’該酶在藉由閉合構形多特異性配位體結合時失活。或 者’試劑可為選自由以下各物組成之群的任何一或多者： 酶底物及螢光、發光或發色分子，其由配位體結合時失活 或淬滅。 129025.doc -49· 200848427 與本文所揭示之序列相似或同源的序列（例如至少約70% 序列一致性）亦為本發明之部分。在某些實施例中，胺基 酸級別之序列一致性可為約80%、85%、90%、91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高 〇 在核酸級別上，序列一致性可為約70%、75%、80%、 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 9 8%、99%或更高。或者，當核酸片段將在選擇性雜交條 件下（例如極高嚴格性雜交條件）與互補鏈雜交時存在大體 一致性。核酸可存在於整個細胞中、存在於細胞溶解產物 中或以部分純化或大體上純形式存在。 一致性百分數可指沿胺基酸或核苷酸序列之整個拉伸長 度的一致性百分數。當指定時，胺基酸或核酸序列之一致 性百分數係指與自參比胺基酸或核酸序列之一或多個不連 續區的序列之一致性百分數，例如沿一或多個抗體CDR區 及/或沿一或多個抗體可變框架區。例如，在胺基酸級別 上跨越抗體重鏈或輕鏈單一可變域之一或多個CDR的序列 可與抗體重鏈或輕鏈單一可變域之相應CDR之胺基酸序列 分別具有約 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%或更高的一致性。在核酸級 別上，編碼抗體重鏈或輕鏈單一可變域之一或多個CDR的 核酸序列可與編碼抗體重鏈或輕鏈單一可變域之相應CDR 之核酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 更高的一致性。在核酸級別上，編碼抗體重鏈或輕鏈單一 129025.doc -50- 200848427 可變域之一個CDR的核酸序列與編碼抗體重鏈或輕鏈單一 可變域之相應CDR之核酸序列相比可分別具有至少80%、 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 9 8%、99%或更高之一致性百分數。在某些實施例中，將 一致性百分數之結構特性偶聯至功能態樣。例如，在某些 實施例中，亦需要與參比核酸或胺基酸序列具有小於 1 00% —致性之核酸序列或胺基酸序列來呈現參比胺基酸 序列或由參比核酸編碼之胺基酸序列的至少一個功能態 樣。在其他實施例中，亦需要與參比核酸或胺基酸序列分 別具有小於100% —致性之核酸序列或胺基酸序列來呈現 參比胺基酸序列或由參比核酸編碼之胺基酸序列之至少一 個功能態樣，但彼功能特性可經稍微改變，例如相對於參 比而s ’賦予對指定抗原的增加之親和力。 兩個序列之間”同源性，，或”序列一致性，，或，，相似度”（本文 中該等術語可互換使用）之計算如下進行。為了最佳比較 目的，將序列比對（例如，為了最佳比對，可將缺口引入 第一及第二胺基酸或核酸序列之一或兩者，且為了比較目 的’可忽略非同源序列）。在一較佳實施例中，出於比較 目的而對準之參比序列的長度為參比序列長度之至少 30%、較佳至少40%、更佳至少5〇%，甚至更佳至少6〇%且 甚至更佳至少7G%、8G%、9G%、100%。接著比較相應胺 基酸位置或核苷酸位置之胺基酸殘基或核苷酸。當第一序 列中之位置由第二序列中之相應位置上的之相同胺基酸殘 基或核苦酸佔據時，則分子在彼位置處一致（如本文中所 129025.doc -51 - 200848427 用胺基酸或核酸π同源性，，等效於胺基酸或核酸，，一致性，,）。 兩個序列之間的一致性百分數為序列共有之相同位置的數 目之函數，考慮缺口之數目及各缺口之長度，為最佳比對 兩個序列需要引入缺口。 有利地，採用BLAST算法（2.0版）進行序列比對，其丧數 設定為默認值。在美國國立（”g0V”）之國家衛生研究院 Γ’ΝΙΗ”）之國家生物技術資訊中心（"ncbi”）的環球網址 (’’WWW’，）中，在"/Blast/，，目錄中，在” blast—helphtml，，文件 中詳細地描述BLAST算法。搜索參數定義如下，且有利地 設定為所定義之默認參數。 BLAST(基本局部比對搜索工具（Basic Local Alignment
Search Tool))為 blastp、blastn、blastx、tblastn及 tblastx程 式採用的啟發式搜索算法；該等程式之重要性歸於其使用
Karlin及 Altschul，1990, Pr〇c· Natl· Acad· Sci. USA 87 (6)·· 2264-8(參見如上所述之”blast—help.html，，文件）之統計法之 具有少數改進的發現。BLAST程式經定製用以序列相似度 技索，例如用以鑑別與查詢序列之同源性。該等程式通常 並不適用於基元型式搜索。對於序列數據庫之相似度搜索 中之基本問題的論述’參見Altschul等人，（1994)。 在國家生物技術資訊中心網址可獲得之5種BLAST程式 執行以下任務： blastp”比較胺基酸查詢序列與蛋白質序列數據庫； ffblastn”比較核苷酸查詢序列與核苷酸序列數據庫； nblastx”比較核苷酸查詢序列（兩個鏈）之六框架概念轉譯 129025.doc -52- 200848427 產物（six-frame conceptual translation product)與蛋白質序 列數據庫； ’’tblastn"比較蛋白質查詢序列與在所有六個閱讀框架中 動態轉譯之核苷酸序列數據庫（兩個鏈）；’’tblastx”比較核 苷酸查詢序列之六框架轉譯物與核苷酸序列數據庫之六框 架轉譯物。 BLAST使用以下搜索參數： HISTOGRAM呈現各檢索分數之直方圖；默認值為’’是” f (參見BLAST手冊之參數Η)。 DESCRIPTIONS限定所報導匹配序歹ij之簡短說明的數目 為指定數目；默認極限為1 00個說明。（參見手冊頁面之參 數 V)。亦參見 EXPECT及 CUTOFF。 ALIGNMENTS限定數據庫序歹J為指定數目，報導其之高 分值片段對（HSP)，默認極限為50。若大於此極限之數據 庫序列偶然滿足報導之統計顯著性臨限值（參見下文之 EXPECT及CUTOFF)，貝4僅報導歸因於最大統計顯著性之 ( 匹配（參見BLAST手冊中之參數B)。 EXPECT ：用於報導與數據庫序列匹配之統計顯著性臨 限值，默認值為10，使得根據Karlin及Altschul (1990)之隨 機模型預期僅偶然發現1 〇個匹配。若歸因於匹配之統計顯 著性大於EXPECT臨限值，則將不報導匹配。EXPECT下 限臨限值更嚴格，導致報導匹配之機會較少。分數值可接 受（參見BLAST手冊之參數E)。 CUTOFF ：用於報導高分值片段對之截止分值。由 EXPECT值（參見上文）計算默認值。僅當歸因於HSP之統計 129025.doc -53 - 200848427 顯著性至少與歸因於等於截止值之分值的獨立HSP—般高 時，HSP用於數據庫序列報導。截止值上限更加嚴格，導 致報導匹配之機會較少。（參見BLAST手冊之參數S)。通 常，可使用EXPECT更直觀地控制顯著性臨限值。 MATRIX ：指定 BLASTP 、 BLASTX 、 TBLASTN 及 TBLASTX之替代分值矩陣。默認矩陣為BLOSUM62 (Henikoff & Henikoff, 1992, Proc. Natl. Aacad. Sci. USA 89 (22): 10915-9)。有效替代選擇包括：PAM40、PAM120、 PAM250及IDENTITY。非替代分值矩陣可用於BLASTN ; 指定在BLASTN請求中MATRIX指令回饋誤差反應。 STRAND : P艮定丁BLASTN搜索為僅數據庫序列之上鏈或 下鏈；或限定BLASTN、BLASTX或TBLASTX搜索為僅查 詢序列之上鏈或下鏈上的閱讀框架。 FILTER:屏蔽如 Wootton & Federhen (1993) Computers and Chemistry 17: 149-163之SEG程式所測定具有低組成複 雜度的查詢序列之片段，或如Claverie & States，1993, Computers and Chemistry 17:191-201 之XNU程式或者對於 BLASTN 而言，由 Tatusov及 Lipman之 DUST程式（參見 NCBI 之環球網址）所測定由短週期性内部重複子組成之片段。 過渡可自波輸出中消除統計學顯著但無生物學意義之報導 (例如對常見酸、驗或脯胺酸富集區的採樣），留下查詢序 列之更具生物學意義的區用於與數據庫序列進行特異性匹 配。 在核苷酸序列中使用"Νπ(例如”N”重複13次）及在蛋白質 129025.doc -54- 200848427 序列中使用字母”x”（例如”x”重複9次）取代過濾程式發現 之低複雜度序列。 過濾僅應用於查詢序列（或其轉譯產物），不應用於數據 庫序列。對於BLASTN，默認過渡為DUST，對於其他程 式，默認過濾為SEG。 通常根本沒有可經SEG、χΝυ或兩者屏蔽者，當應用於 SWISS-PROT之序列日寺，因此預期過濾並非總是產生效 應。此外，在某些情況下，序列全部被屏蔽，此指示應懷 Γ 疑相對於未㈣、查詢序列所報導的任何匹配之統計顯著 性0 NCBI-gi:除寄存及/或定位名稱之外，還使NCBi_gi鑑 別符展示在輸出中。 最佳地，使用在如上所述之Ncm環球網址中在 "/blast”目錄中提供之簡單BLAST搜索算法進行序列比 較。 【實施方式】
定義
一”互補”若兩個免疫球蛋白域屬於形成同源對或組之結構 家族或其獲自該等家族且保持此特徵，則該兩個免疫球蛋 :域為”互補，，的。例如’抗體之^域與1域互補；兩個VH 二=二兩個VL域並不互補。可在免疫球蛋白超家族 之其他成貝中發現互補域，諸如τ細胞受體之V 及δ)域。在本發明之第二組態之上 協作地結合標衫子，但獨立作用於可處於同〜補=不 同分子上之不嶋抗原決定基上。人工域(諸二、= 129025.doc -55- 200848427 抗原決定基之基於蛋白質支架之域）為非互補域，除非其 經工程化以結合抗原決定基。同樣，兩個（例如）基於免疫 球蛋白域及纖連蛋白域之域並不互補。 f κ 免疫球蛋白’’此係指保持抗體分子之免疫球蛋白摺疊特 徵多肽之家族，其含有兩個β摺疊片及通常一個保守二硫 化物鍵。&疫球蛋㈣家族之成員牵涉於活體内細胞及非 細胞相互作用之許多^，包括在免疫系統（例如抗體、Τ 細胞受體分子及其類似物）中之普遍作用、牽涉於細胞黏 附（例如ICAM分子）及細胞内信號轉導（例如受體分子，諸 如Ρ·受體)中。本發明適用於所有具有結合域之免疫球 蛋白超家族分子。較佳地，本發明係關於抗體。 ’’組合”將根據本發明之可變域組合以形成一組域；例如 可將互補域組合，諸如將&域與Vh域組合。亦可組合非互 補域。可以許多方式組合域，包括藉由共價或非共價方 連接域。 "域，，域為獨立於蛋白質之其餘部分而保持三級結構之摺 疊蛋白質結構。通常，城引妞1 a # ^ ^ 吊竦5丨起蛋白質之不連續功能特性， 且在多數情況下’可在不損失蛋白質及/或域之剩餘部分 的功能之情況下添加'移除或轉移至其他蛋白質。 如本文所用，"單-可變域"為可獨立地（亦即不需要另一 結合域來協作結合抗原決定基、抗原或配位體)特異性社 合抗原決定基、抗原或配位體之域。該抗原決定基： 或配位體可為天然存在的，， ’、 峰狀天然存在之抗 原決疋基'抗原或配位體，或可為合成的。單-可變域之 ”可變”部分基本上決定各μ單-可變域之結合特異性。 129025.doc -56- 200848427 了交域之上下文中術語”可變 變性並不在單—可料埒a χ 欠係礼·序列可 了芰域上均勻为布，而係基 -可變域之框架或骨架部分之刀布在早 域中，可變性隼φ, ㈣在抗體單-可變 之片枰中、 纟二個通常稱為互補決定區(CDR) 广又中。该-或多個⑽可分布在輕鏈或重鏈之抗體框 個CDR分布在TCR框架域之間
V 之間以分別形成抗體輕鏈單—可變域或抗體重鍵 二可變域，其每-者獨立於另-結合域特異性結合抗原 决疋基。相似結構為τ細胞受體單一可變域，其之一至二 因此，賦予單_可變域之結合特異性之可變部分可在序 列上廣泛不同於其他具有大體上相同剩餘支架部分之單一 可k域，且因此其可具有不同範圍之結合特異性。單一可 變域之支架包括抗體框m 一致抗體框架及^源於及/ 或獲自細菌蛋白質（例如GroEL、GroEs、SpA、SpG)及真 核蛋白質（例如CTLA-4、脂質運载蛋白、纖連蛋白等）之支 架。單一可變域之可變部分的一個來源包括一或多個 CDR，可將其移植至非免疫球蛋白支架以及抗體框架支架 上以產生抗體單一可變域。單一可變域中變異之另一來源 可為諸如纖連蛋白之非免疫球蛋白框架支架中所選位置之 多樣化’以使用諸如NNK密碼子多樣性之分子生物學技術 產生單一可變域。相似地，此變異之來源亦可適用於抗體 單一可變域。 抗體單一可變域可獲自藉由抗體產生物質編碼及/或產 生之抗體序列，且包括抗體可變區之片段及/或衍生物， 129025.doc -57- 200848427 包括一或多個框架區或框架一致序列及/或一或多個 CDR 因此，抗體單一可變域包括抗體輕鏈可變區或抗體 重鏈可變區或抗體vHH區之片段及/或衍生物。例如，抗體 VHH區包括彼等駱馬羊駝類（例如駱駝及美洲駝）内生之 區，及來自護士鯊（nurse)及鬚鯊（w〇bbeg〇ng shark)之新抗 原受體（NAR)(roux等人，1998 pnas 95 (20): 11804_9)， 及來自科氏兔銀鮫（spotted ratfish)之VH區域（Rast等人， 1998 Immrni0genetics 47:234_245)。抗體輕鏈可變域及抗 體重鏈可變域包括彼等動物物種内源之可變域，動物物種 包括（但較佳不限於）人類、小鼠、大鼠、豬、獼猴、倉 鼠、馬、母牛、山羊、狗、貓及鳥類物種，例如分別為人 類VK及人類Vh3。抗體輕鏈可變區及抗體重鏈可變區亦包 括如下文所述之一致抗體框架，包括諸如Vh3家族之V區 家族之一致抗體框架。T細胞受體單一可變域為獲自例如 α、β、γ及δ鏈之T細胞受體鏈且獨立於抗原決定基、抗原 或配位體之另一結合域結合彼抗原決定基或抗原或配位體 之單一可變域，其類似於抗體單一可變域。 抗體單一可變域亦包涵蛋白質域，該蛋白質域包含並非 獲自抗體或Τ細胞受體之支架且其已藉由併入支架中 CDR1、CDR2及/或CDR3、其衍生物或片段或整個抗體ν 域中之一或多者而經遺傳工程化以相對於其工程化前之狀 態呈現結合特異性多樣性。抗體單一可變域亦可包括如藉 由下文所述之GroEL單一可變域多聚體說明之非免疫球蛋 白支架與免疫球蛋白支架。較佳地，CDR係來自抗體鏈之 129025.doc -58- 200848427 抗體v域，例如vH、VlAVhh。抗體鍵可為與第二抗⑽ -致之特異性結合抗原或抗原決定基之鏈，或抗體鍵可為 獨立於第二抗體鏈特異性結合抗原或抗原決定基之鏈，諸 如VHH鏈。一或多個CDR整合於包含非免疫球蛋白支竿之 抗體單一可變域中必定導致非免疫球蛋白支架單一可二或 獨立於抗原決定基、抗原或配位體之另一結合域特異性結 合彼抗原決定基或抗原或配位體之能力。 藉由在經設計以成為結合部位之部位處引入多樣性，接 著使用（例如）呈現技術選擇所需結合特徵將單一域轉型為 單-可變域。可藉由使支架之特定環之胺基酸序列隨機 化，例如藉由引入NNK密碼子將多樣性引入所關注之非免 疫球蛋白支架的特定部位。選擇所需結合特徵前，該產生 多樣性之機制與由實際上構成抗體結合部位之環中產生的 多樣性產生之高親和力、抗原特異性抗體的自然選擇相 似。理想地，將小且含有類似於抗體環之摺疊的摺疊之單 一域轉型為單-可變單一可變域之變體得以表現，由 此可自含有大量單一可變域變體之庫選擇含有所需結合特 異性及特徵的單一可變域。 早一可變域之命名：有時抗體單一可變域之命名藉由除 去第一個Π(Γ而簡化或簡化為字母，，Dom”，例如Ab7h24與 dAb7h24相同，dAb7h24與 D〇M7h24相同。 抗體單可麦域意謂包含抗體可變域的序列特徵之摺疊 多狀域。因此’其包括完整抗體可變域及修飾之可變域， 例如其中一或多個環經不具有抗體可變域之特徵的序列置 129025.doc -59- 200848427 換’或經截斷或包含N或C末端姑袖7 不鳊延伸之抗體可變域，以及 保持全長域之至少部分結合活性 丨王汉符呉性之可變域之摺疊 片段。 ’丨庫（Repertoire)”不同變體之隼合 〜木口，例如初始序列不同之 多肽變體。本發明使用之資料庫將肖 只π /早肘巴/函包含至少i 〇〇〇個成 員之多肽庫。
"資料庫（Library)··術語資料庫係指㈣多肽或核酸之混 合物。資料庫係由各具有單一多肽或核酸序列之成員組 成。在此程度上，，存肩與彦同義。資料庫成員之間的序 列差異引起資料庫中存在之多樣性。資料庫可呈多狀或核 酸之簡單混合物之形式，或可呈經核酸資料庫轉型的例如 細菌、病毒、動物或植物細胞及其類似物之生物體或細胞 之形式。較佳地，各個別生物體或細胞僅含有一個或有限 數目之資料庫成員。有利地，將核酸併入表現載體中以 允許表現該核酸編碼之多肽。因&，在—較佳態樣令，資 料庫可呈宿主生物體群體之形式，各生物體含有一或多個 含有呈核酸形式之資料庫之單—成員的表現載體之複本， 自核酸可表現產生其相應多肽成員。因此，宿主生物體之 群體具有編碼遺傳不同多肽變體之大庫之潛能。 ”閉合構形多肖異性配位體，，描述如本文所定義包含至少 兩個如本文所疋義之抗原決定基結合域的多特異性配位 體術閉。構形'（多特異性配位體）意謂配位體之抗原決 定基結合域經排列使得-個抗原決定基結合域之抗原決定 基結合與另—抗原決定基結合域之抗原決^基結合競爭。 129025.doc -60- 200848427 亦即，同源抗原決定基可經各抗原決定基結合域單獨而非 同時結合。可使用本文所述之方法實現配位體之閉合構 形0 π抗體”無論獲自天然產生抗體之任何物種或藉由DNA重 組技術產生；或者自血清、B細胞、融合瘤、轉染瘤、酵 母或細菌分離之抗體（例如IgG、igM、IgA、IgD或IgE)或 片段（諸如Fab、F(ab，）2、Fv、二硫化物連接之Fv、scFv、
閉合構形多特異性抗體、二硫化物連接之scFv、雙功能抗 體）。 ”雙特異性配位體”如本文中所定義包含第一免疫球蛋白 單一可變域及第二免疫球蛋白單一可變域之配位體，其中 該等可變域能夠與通常並不由單特異性免疫球蛋白結合之 同一抗原上之兩個不同抗原或兩個抗原決定基結合。例 如，兩個抗原決定基可處於同一半抗原上，但不為相同抗 原決定基或充分鄰近而由單特異性配位體結合。根據本發 明之雙特異性配位體由具有不同特異性之可變域組成且不 含具有相同特異性之相互互補之可變域對。因此，如本文 所定義含有兩個單一可變域之雙特異性配位體為如本文所 定義含有兩個4兩個以上單一彳變域之多聚配位體之子 集，其中單一可變域中之至少兩者能夠與兩個不同抗原結 合或與同-抗原上之兩個不同抗原決定基結合。另外，如 本文所定義之雙特異性配位體亦與包含抗體單_可變域及 不為早一可變域之第二抗原及/或抗原決定基結合域之配 位體不同。另夕卜’如本文較義之雙特異性配位體亦與含 129025.doc -61 - 200848427 有抗原/抗原決定基結合域均不為如本文所定義之單一可 變域的第-及第二抗原/抗原決定基結合域之配位體不 同。 ’’抗原”由根據本發明之配位體結合的分子。通常，抗原 由抗體配位體結合且能夠增加活體内抗體反應。其可為多 狀、蛋白質、核酸或其他分子。通常，针對特定抗原的標 乾特異性選擇根據本發明之雙特異性配位體。在f知抗體 及其片段之情況下，由可變環(L1、L2mHi、H2、 H3)定義之抗體結合部位能夠與抗原結合。 ”抗原決定基”通常由免疫球蛋白Vh/v^結合之結構單 疋。抗原決定基定義抗體之最小結合部位，且因此表示抗 體之特異性標靶。在單一域抗體之情況下，抗原決定基表 示由可變域獨立結合之結構單元。抗原決定基結合域包含 蛋白質支架及抗原決定基相互作用部位（其有利地處於蛋 白質支架之表面上）。抗原決定基結合域可包含為非線性 之抗原決定基相互作用部位’例如其中抗原決定基結合域 包含多個抗原決定基相互作用部位，在該等抗原決定基相 :作用部位之間具有插入區，例如由叹隔開之⑽，或該 專抗原決定基相互作用部位存在於獨立多肽鏈上。或者， =決定基結合域可包含由在—個多肽鏈上經連續編碼之 胺基酸組成的線性抗原決定基相互作用部位。 ”通用配位體"與庫之所有成員結合的配位體。通常，不 = 二上所定義之抗原結合部位結合。非限制性實例包 括蛋白貝A、蛋白質L及蛋白質G。 ’’選擇，，藉由筛選獲得或藉由達爾文氏選擇法(― 129025.doc -62- 200848427 selection process)獲得，其中在域與抗原或抗原決定基之 間’或在抗體與抗原或抗原決定基之間發生結合相互作 用。因此’可在存在或不存在互補可變域之情況下針對與 抗原或抗原決定基結合選擇第一可變域。 通用框木對應於如 Kabat ("Sequences of Proteins of Immunological Interest^, US Department of Health and Human Services(美國衛生及人類服務部》所定義之序列保 守之抗體之區域或對應於如Chothia及Lesk，（1987) J, Mol. Biol. 196:910-917所定義之人類生殖細胞系免疫球蛋白庫 或結構的單一抗體框架序列。本發明提供單一框架或一組 該等框架之用途，已發現經由高變區之單獨變異允許實質 上任何結合特異性之衍生。 如本文所用結合物”係指包含結合血清白蛋白之抗體之 與藥物結合的抗原結合片段之組合物。 如本文所用術語”小分子，I意謂具有小於J，5〇〇道爾頓、較 佳小於1000道爾頓之分子量之化合物。 該等結合物包括”藥物結合物”，其包含結合血清白蛋白 之抗體之共價鍵結藥物的抗原結合片段，及"非共價藥物 、’、。口物’其包含結合血清白蛋白之抗體之非共價鍵結藥 物的抗原結合片段。 士本文所用藥物結合物”係指包含結合血清白蛋白之抗 體之共價鍵結藥物的抗原結合片段之組合物。藥物可直接 或經由適當連接子部分間接共價鍵結至抗原結合片段。藥 物可在諸如胺基末端、羧基末端之任一適當位置或經由適 129025.doc -63- 200848427 當胺基酸側鏈（例如離胺酸之胺基）鍵結至抗原結合片段。 π半衰期’’例如歸因於配位體降解及/或配位體經天然機制 清除或隔離，配位體之活體内血清濃度下降50%所用之時 間。藉由與抗降解及/或清除或隔離之分子結合使本發明 之配位體活體内穩定且增加其半衰期。通常，該等分子為 自身具有長活體内半衰期之天然存在之蛋白質。若與對半 衰期增加分子不具有特異性之相似配位體相比，配位體之 功能活性在活體内持續期限延長，則配位體之半衰期得以 增加。因此，比較對HS Α及標靶分子具有特異性之配位體 與不存在對HS A之特異性的相同配位體，後者不結合HS A 但結合另一分子。例如，其可結合標靶分子上之第二抗原 決定基。通常，半衰期增加10%、20%、30%、40%、50% 或50%以上。半衰期增加在2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、 20倍、3 0倍、40倍、5 0倍或5 0倍以上範圍内係可能的。或 者或另外，半衰期增加在高達30倍、40倍、50倍、60倍、 70倍、80倍、90倍、100倍、150倍範圍内係可能的。 當用以比較在宿主中配位體之Τβ半衰期與血清白蛋白之 Τβ半衰期時，短語’’大體上相同’’意謂在宿主中配位體之Τβ 半衰期自在相同宿主（較佳人類宿主）中血清白蛋白本身之 Τβ半衰期變化不超過50%，例如在指定宿主中該配位體之 Τβ半衰期比血清白蛋白之Τβ半衰期低不超過50%或高不超 過50%。較佳地，當提及短語’’大體上相同’’時，在宿主中 配位體之Τβ半衰期自血清白蛋白本身之半衰期變化不超過 20%至10%，且更佳自血清白蛋白本身之半衰期變化不超 129025.doc -64- 200848427 過 9%、8%、7% ' 6%、5%、4%、3%、2%或1%或1% 以 下，或自血清白蛋白本身之半衰期根本不變化。 或者，當用以比較在宿主中配位體之邛半衰期與血清白 蛋白之Τβ半衰期時，短語，，大體上不相同，，意謂宿主中配位 體之Τβ半衰期自在相同宿主（較佳人類宿主）中血清白蛋白 本身之Τβ半衰期變化至少50%，例如在指定宿主中配位體 之Τβ半衰期比血清白蛋白之丁β半衰期大超過5〇%。 π均質免疫檢定’’無需分離結合試劑與未結合試劑之步驟 的偵測分析物之免疫檢定。 ’’大體上一致，，或"大體上同源”含有足夠數目之與第二胺 基酸或核苷酸序列相同或等效（例如具有相似側鏈，例如 保守胺基酸取代）之胺基酸殘基或核苷酸使得第一及第二 胺基酸或核苷酸序列具有相似活性的第一胺基酸或核苦酸 序列。在本文所述之第一及第二抗體及/或單一可變域之 情況下’第二抗體或單一可變域具有與第一抗體或單一可 Μ域相同之結合特異性且具有至少5〇%或至少高達55%、 60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、 99%或1〇〇%之第一抗體或單一可變域的親和力。 如本文所用，術語，，低嚴格性”、”中等嚴格性”、”高嚴袼 性”或’’極高嚴格性條件”描述核酸雜交及洗滌之條件。執 4亍雜父反應之指導可見於μ从 少，John Wiley & Sons，Ν·Υ· (1989) 6·3·1-6.3·6中，其 以引用的方式全部併入本文中。水性及非水性方法描述於 彼參考文獻且可使用任一者。本文中所提及之特定雜交條 129025.doc -65- 200848427 件如下：（i)低嚴格性雜交條件為在約45tT保持在以氯 化納/檸檬酸納（SSC)t，接著在至少5{rc下以〇2χ ssc、 f
〇 · 1 % S D S錢2次（對於低嚴格性條件洗滌之溫度可升高至 55°C) ; (2)巾等嚴格性雜交條件為在㈣。口保持在6χ ssc中’接著在6(rc下以0.2X ssc、〇 ι%伽洗務一或多 次；（3)高嚴格性雜交條件為在約饥下保持在⑼说 中，接著在65。(：下以〇.2X ssc、〇 1%⑽洗務一或多次； 且較佳地⑷極高嚴格性雜交條件為在机下保持在〇5 μ 鱗酸鈉、7%⑽中，接著在价下以0.2X SSC、1% SDS 洗務-或多次。極高嚴格性條件⑷為較佳條件且除非另有 說明’否則應使用之該條件。 可使用”表面電渡丘步，，it*·至μ 振只兄肀铋疋測定諸如人類血清白蛋 白之特異性抗原或抗原決定基是否與諸如獼猴血清白蛋白 之另一抗原或抗原決定基競爭結合諸如特異性⑽的本文 所述之血清白蛋白結合配位體。可使用相似競爭檢定測定 諸如dAb之第—配位體是否與諸如⑽之第二配位體競爭 1 合躲抗原或抗原決定基。如本文所用之術語，，競爭，，係 十刀子化σ物、較佳蛋白質之物質能夠以任何程度 干擾兩個或兩個以上分子之間的特異性結合相互作用。短 語"非所競爭性地抑制"意謂諸如分子、化合物、較佳蛋白質 了里測或顯者程度干擾兩個或兩個以上分 子之間的特異性結合相互作用。兩個或兩個以上分子之門 的特異性結合相互 刀于之間 物φ帛^土包括單一可變域與其同源搭配 之間的特異性結合相互作用。干擾或競爭分子可
為另一單一可豢敁 彳仕_、 丁刀丁 J 5 5 /、可為結構及/或功能上類似於同 129025.doc -66 - 200848427 源搭配物或標靶之分子。 扣早可變域包括免疫球蛋白單一可變域及非免疫球蛋白 單可又域，後者含有—個、兩個、三個或三個以上來自 免=球蛋白可變域之⑶㈣，諸如包括抗體重鏈或抗體輕 鍵單彳變域之抗體可變域。單一可變域可獲自包括人 、 、】、鼠、豬、猴、絡馬羊騎屬（camelidae)之動 物諸如抗體可變（v)區，或在GroEL&GroE之非免疫球 f 蛋白支木情況下，其可獲自諸如大腸桿菌（Ε· coli)之微生 ' 物單可變域可為部分或完全人工單一可變域，或其可 使用重組分子生物學技術產生。 在此項技術中熟知用以測定單一可變域與諸如另一單一 可k域之另一標靶結合域競爭結合標靶之能力以及用以測 疋Kd的活體外競爭檢定。一種較佳之競爭檢定為表面電漿 共振檢定，其具有快速、靈敏且適用於寬範圍之蛋白質濃 度且需要少量試樣材料之優點。較佳表面電漿共振檢定競 I 爭為競爭實驗。可使用競爭Biacore實驗測定（例如） 獼猴血清白蛋白與人類血清白蛋白是否競爭結合諸如dAb D0M7h-x之配位體。該實例之一種實驗方案如下。 例如，在25°C下以約1000共振單位（RU)之人類血清白蛋 白（HSA)塗佈CM5傳感器晶片（Biacore AB)後，僅將單一濃 度（例如1 μηι)之純化dAb注射在抗原表面上及將單一濃度 之純化dAb與連續稀釋之獨猴血清白蛋白（csa)組合注射 在抗原表面上。將HS A之連續稀釋液與恆定濃度（4〇nM)之 純化dAb相混合。以5 μΜ CSA開始將CSA適當連續稀釋， 129025.doc -67- 200848427 6次兩倍稀釋降至78 nM CSA。注射前必需使該等溶液達 到平衡。注射後，獲得反應讀數以量測單獨dAb及數種 dAb/CSA混合物之各者的所得結合RU，所用數據與BIA評 估軟體一致，產生對於AlbudAbTM(特異性結合血清白蛋白 之dAb)與固定HS A之晶片的結合之各CSA抑制之劑量_反應 曲線。藉由比較單獨dAb之結合RU與dAb + CSA之結合 RU，將能夠瞭解CSA是否與HSA競爭結合dAb。若競爭， 則當溶液中之CSA濃度增加時，與HSA結合之dAb之RU將 降低。若不存在競爭，則添加CSA將對dAb與HSA之結合 量無影響。 熟習此項技術者將瞭解如何修改此方案或其他方案以對 包括本文所述之結合血清白蛋白之數種配位體的多種不同 配位體執行此競爭檢定。該多種配位體包括（但不限於）包 括包含免疫球蛋白及/或非免疫球蛋白支架之單一可變域 的單體單一可變域、dAb、雙特異性配位體及該等配位體 之多聚體。熟習此項技術者亦已知如何修改此方案以使用 該競爭檢定比較數種不同抗原及/或抗原決定基對與配位 體之結合。 該等競爭實驗可提供可確定抗原或抗原決定基是否與另 一抗原或抗原決定基競爭結合特異性配位體、較佳dAb之 數字截止點。例如，在上述實驗中，若溶液中之5 μΜ CSA引起與HSA結合之dAb的RU降低10%或10%以下，則 視為無結合競爭。因此，在CS A存在下與HSA結合之dAb 的RU降低大於10%將指示CSA對於結合HSA之dAb存在競 129025.doc -68- 200848427 爭結合。與HSA結合之dAb的RU降低小於l〇%將指示CSA 對於結合HAS之dAb不存在競爭，降低9%、8%、7。/〇、 6%、5%、4%、3%、2%及1。/。為指示不存在競爭之逐漸更 嚴格之要求。與HSA結合之dAb的RU降低值愈大，競爭愈 強。因此，可根據與HS A結合之RU的降低百分比，亦即降 低至少 1 5 %、2 0 %、2 5 %、3 0 %、3 5 %、4 0 %、4 5 %、5 0 %、 55〇/〇、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或 高達100%，將競爭升高程度分級。 如本文所用，片段係指小於100%(例如至多99%、90%、 80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%等），但 包含5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25或更多個鄰接胺基酸之 序列。片段具有足夠長度使得以1x1 Ο·6 Μ或1 xlO·6 Μ以下 之親和力維持所關注之血清白蛋白結合。如本文所用之片 段亦係指一或多個胺基酸之可選插入、缺失及取代，其大 體上並不改變所改變多肽結合針對標乾提出之單一域抗體 之能力。胺基酸插入、缺失或取代之數目較佳為多達1 個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、 11 個、12 個、13 個、14 個、15 個、16 個、17 個、18 個、19 個、2 0個、21個、2 2個、2 3個、2 4個、2 5個、2 6個、2 7 個、2 8個、2 9個、3 0個、3 1個、3 2個、3 3個、3 4個、3 5 個、3 6個、3 7個、3 8個、3 9個、4 0個、41個、4 2個、4 3 個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51 個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59 129025.doc -69· 200848427 個、60個、61個、62個、63個、64個' 65個、66個、67 個、68個、69個或70個胺基酸。 詳細描述 除非另作定義，否則本文使用之所有技術及科學術語具 有與一般熟習此項技術者（例如在細胞培養、分子遺傳 學、核酸化學、雜交技術及生物化學中）通常所理解相同 的含義。將標準技術用於分子、遺傳及生物化學法（通常 參見 Sambrook 等人 ’Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第二版（i989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，Ν·Υ·及 Ausubel 等人，Short Protocols in Molecular Biology(1999)第 4版，John Wiley &
Sons，Inc·，其以引用的方式併入本文中）及化學法中。用 於表面電漿共振檢定之標準技術包括了抓Terje Andersen等 人，(2006) Eur. J. Immunol. 36:304-3051 ； Fagerstam (1991) Tech，Protein Chem· 2:65-71 ;及 Johnsson 等人， (1991) Anal. Biochem 198:268-277。 製備基於免疫球蛋白的多特異性配位體 可根據先前確定之用於抗體工程化領域之用以製備 scFv、”噬菌體”抗體及其他工程化抗體分子之技術製備無 論為根據本發明之所需組態中的開放構形或閉合構形的根 據本發明之雙特異性配位體。用以製備抗體且尤其雙特異 性抗體之技術描述於（例如）下列綜述及其中引用之象考文 獻申：Winter & Milstein，（1991) Nature 349:293-299 ;
Plueckthun (1992) Immunological Reviews 130:151-188 ； 129025.doc -70 - 200848427
Wright等人，（1992) Crit·· Rev. Immunol. 12:125-168 ; Holliger, P. & Winter, G. (1993) Curr. Op. Biotechn. 45 446-449 ; Carter 等人，（1995) J. Hematother· 4，463-470 ; Chester, K.A. & Hawkins, R.E. (1995) Trends Biotechn. 13, 294-300 ; Hoogenboom，H.R· (1997) Nature Biotechnol. 15, 125-126 ； Fearon, D. (1997) Nature Biotechnol. 15? 618-619，Pltickthun，A· & Pack，P· (1997) Immunotechnology 3, 83-105 ； Carter, P. & Merchant, A.M. (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8? 449-454 ； Holliger, P. & Winter, G. (1997) Cancer Immunol. Immunother. 45，128-130 ° 本發明提供針對兩個不同抗原或抗原決定基之可變域的 選擇，及該等可變域之後續組合。 用以選擇可變域之技術採用在此項技術中已知之資料庫 及遠擇程序。熟習此項技術者熟知使用自人類B細胞獲得 之重排V基因的天然資料庫（Marks等人，（1991)/. Mo/. 222: 581 ; Vaughan等人，（1996) Ttowre 价okc/z·，14: 309)。藉由通常使用1>(：11選殖免疫球蛋白v基因製備合成 資料庫（Ho〇genb〇〇m & Wintei· (1992) / 227: 381 ; Barbas等人，（1992)户⑽细/ 々Μ 89: 4457 ; Nissim等人，（1994)五細〇 乂，13 : 692 ; Griffiths等 人，（1994)五⑽ 〇 乂，13: 3245 ;以 Kruif等人，（1995)义 Mo/K 248: 97)。PCR方法之誤差可導致高度隨機化。 可分別或一起針對標靶抗原或抗原決定基選擇^^及/或乂 資料庫，在前一者情況下直接選擇單一域結合。 129025.doc 200848427 用以製備根據本發明之雙特異性配位體之較佳方法包含 使用選擇系統，在該選擇系統中針對與第一抗原或抗原決 定基結合選擇可變域之庫且針對與第二抗原或抗原決定基 結合選擇可變域之4。接著組合所選擇之可冑第一及第二 可變域，且針對與第一及第二抗原或抗原決定基結合選擇 雙特異性配位體。針對獨立而不同時結合第—及第二抗原 或抗原決定基選擇閉合構形配位體。 A·資料庫載體系統
在此項技術中已知多種適用於本發明之選擇系統。下文 描述該等系統之實例。 可直接篩選λ細菌噬菌體表現系統作為細菌噬菌斑或作 為溶源體之群落，二者均如先前所述（Huse等人，（198汐 246. 1275 ; Caton及 Koprowski (1990) iVoc. _/· U.S.A., 87 ； Mullinax^A，(1990) Natl.
Id 級 Π儿，87: _5 ; Perss〇n等人，（i99i) ^ 88:2432)，且將其用於本發明。儘 管該等表現系統可用於篩選多達106個不同成員之資料 庫，但其實際上並不適於筛選更大數目（大於106個）成員。 在資料庫之構築中尤其使用選擇呈現系統，其使得核酸 能夠=其表現之多肽連接。如本文所用，選擇呈現系統為 允。午藉由適田主現方式’藉由結合通用及/或標靶配位體 選擇資料庫之個別成員的系統。 在此項技術中已知用以分離大資料庫之所需成s之選擇 方案，如由噬菌體呈現技術所代表。已證明不同肽序列呈 129025.doc -72- 200848427 現在絲狀細菌噬菌體表面上（Scott&Smith (199〇)此心 249: 386)之該等系統適用於產生抗體片段（及編碼其之核 苷酸序列）之資料庫，以用以活體外選擇且擴增結合標靶 抗原之特異性抗體片段（McCafferty等人，WO 92/01047)。 將編碼VH及VL區之核苷酸序列與編碼引導信號之基因片段 連接，該引導信號指引Vh&Vl區至大腸桿菌之壁膜間隙， 且因此所得抗體片段通常以與細菌噬菌體外被蛋白（例如 pill或pVIII)之融合物之形式呈現在細菌噬菌體表面上。或 者，將抗體片段在外部呈現於λ噬菌體衣殼（phageb〇dy) 上。基於兔菌體之呈現系統之優點為由於其為生物系統， 因此所選資料庫成員可僅藉由使含有所選擇資料庫成員之 噬菌體在細菌細胞中生長而擴增。此外，由於編碼多肽資 料庫成員之核苷酸序列含於噬菌體或噬菌粒載體上，因此 定序、表現及後續基因操作相對簡單。 在此項技術中熟知用以構築細菌噬菌體抗體呈現資料庫 及λ嗟囷體表現貧料庫之方法（jyjcCafferty等人，（1990) TVaiwre，348: 552 ; Kang等人，（1991) —i/· 汰 5W. 88: 4363 ; Clackson等人，（1991) TVaiwM，352: 624 ; Lowman 等人，（1991)价oc/zemz.Wry，30: 10832 ; Burton等人，（1991) W". AW. 5W m 88: 10134 ; Hoogenboom等人，（1991) Nucleic Acids Res·，19: 4133 ; Chang 等人，（1991) J. /mmw⑽/·，147: 3610 ; Breitling 等人，（1991) Gwe，104: 147 ; Marks 等人， (1991) ’ 前述；Barbas 等人，（1992)，前述；Hawkins 及 129025.doc -73- 200848427
Winter (1992) J. Immunol.,, 22: 867 ； Marks^ A 5 1992，J. 5/(9/. CZ/em·，267: 16007 ; Lerner 等人，（1992) iScknce， 258: 1313，其以引用的方式併入本文中）。 一種尤其有利之方法為使用scFv噬菌體資料庫（Huston等 人，1988，Proc. Natl· Acad. Sci U.S.A·，85: 5879-5883 ; Chaudhary等人，（1990) Proc· Natl· Acad. Sci U.S.A·，87: 1066_1070 ; McCafferty 等人，（1990)，前述；Clackson 等 A ^ (1991) Nature, 352: 624 ; Marks等人，(1991) 乂 Mol· 5/(9/·，222: 581 ; Chiswell等人，（1992) Trends Biotech·， 10: 80 ; Marks 等人，（1992) J. Biol. C/zem·，267)。已描述 呈現在細菌噬菌體外被蛋白上之scFv資料庫之各種實施 例。例如，如 WO 96/06213 及 WO 92/01047 (Medical Research Council 等）及 WO 97/08320(Morphosys)中所述，亦已知噬 菌體呈現方法之改進，該等專利以引用的方式併入本文 中〇 其他用以產生多肽資料庫之系統包括使用活體外合成資 料庫成員之無細胞之酶機構。在一種方法中，藉由針對標 靶配位體交替輪選擇及PCR擴增選擇RNA分子（Tuerk及 Gold (1990) Science, 249: 505 ； Ellington A Szostak (1990) TVWwrq 346: 818)。可使用相似技術來鑑別結合預定人類 轉錄因子之DNA 序列（Thiesen 及 Bach (1990) 18: 3203 ; Beaudry 及 Joyce (1992) iSWena，257: 63 5 ; WO 92/0525 8及WO 92/14843)。以相似方式，可使用 活體外轉譯合成多肽作為產生大資料庫之方法。該等通常 129025.doc -74- 200848427 包含使多核糖體複合物穩定之方法進一步描述於 WO 88/08453、WO 90/05785、WO 90/07003、WO 91/02076、 WO 91/05058及WO 92/02536中。諸如彼等揭示於 WO 95/22625 及 WO 95/11922(Affymax)中者之並非基於噬 菌體的替代呈現系統使用多核糖體呈現用以選擇之多肽。 其他類型之技術包括在允許連接基因與其基因產物之人 工隔室中選擇庫。例如，可在藉由油包水乳液形成之微膠 囊中選擇編碼所需基因產物之核酸的選擇系統描述於 WO 99/02671、WO 00/40712及 Tawfik & Griffiths (1998) TVaiwre 1 6(7)，65 2-6中。將編碼具有所需活性之 基因產物的基因元件分隔於微膠囊中，且隨後經轉錄及/ 或轉譯以在微膠囊内產生其個別基因產物（RNA或蛋白 質）。隨後將產生具有所需活性之基因產物之基因元件分 類。此方法藉由多種方式偵測所需活性來選擇所關注之基 因產物。 B.資料庫構築 可使用在此項技術中已知之例如如上所闡明之技術構築 預定用於選擇之資料庫，或其可自商業來源購得。於（例 如）WO 99/20749中描述適用於本發明之資料庫。選擇載體 系統且將一或多個編碼所關注之多肽之核酸序列選殖入資 料庫載體後，可在表現前藉由進行誘變在所選殖分子内產 生多樣性；或者可如上所述在執行誘變及其他輪之選擇前 表現且選擇所編碼之蛋白質。藉由標準分子方法進行編碼 結構最優化多肽之核酸序列之誘變。尤其使用聚合酶鏈反 129025.doc -75- 200848427 應或 PCR(Mullis及 Faloona (1987) 五/72^mo/.，155: 3 3 5 ’其以引用的方式併入本文中）。在此項技術中熟知 PCR，其使用藉由熱穩定、DNA依賴型DNA聚合酶催化之 多個循環之DNA複製來擴增所關注之標靶序列。各種抗體 庫之構桌已論述於 Winter等人，（1994) Ann. Rev. Immunology 12,433_55及其中引用之參考文獻中。 使用模板DNA(至少1 fg;更有用地uooo ng)及至少25 pmol之寡核苷酸引子執行PCR;當引子池嚴重異源時，使 用較大量之引子可為有利的，因為僅藉由池之分子中之小 部分表示各序列且後續擴增循環中引子量變得有限。典型 反應混合物包括· 2 μΐ DNA、25 pmol寡核苦酸引子、2.5 μΐ 10X PCR緩衝液 l(Perkin-Elmer，Foster City，CA)、0.4 μΐ 1·25 μΜ dNTP、〇·15 μΐ(或 2.5 單位）Taq DNA 聚合酶 (Perkin-Elmer，Foster City，CA)及去離子水，總體積為 25 μΐ。用礦物油覆蓋且使用可程式熱循環器執行pCR。根 據貝際厭格性要求ό周郎P C R循環之各步驟之持續時間及溫 度以及循環數目。藉由預期引子退火至模板之效率及耐受 之錯配程度石隹疋退火溫度與時間；顯然，當同時擴增且誘 變核酸分子時，至少在第一輪合成中需要錯配。使引子退 火條件之嚴格性最優化之能力完全處於中度熟習此項技術 者之知識内。使用介於3(rc與72。〇之間的退火溫度。模板 分子之初始變性通常發生在92它與99〇c之間，歷時4分 鐘，接著為20-40個循環，其由變性（94-99。〇，歷時Η秒至 1分鐘）、退火（如以上所論述確定之溫度；分鐘）及擴展 129025.doc -76· 200848427 (72°C，歷時i_5分鐘，依賴於所擴增產物之長度）組成。最 終擴展通常為在72°C下歷時4分鐘且隨後可為在4它下之不 明確（0-24小時）步驟。 C.組合單一可變域 選擇後，可藉由多種在此項技術中已知之包括共價及非 共價方法之方法將適用於本發明之域組合。 較佳方法包括使用如（例如）結合scFv所述之多肽連接子 (Bird等人，（1988) Science 242:423-426)。適當連接子之 論述提供於扪d等人，Science 242，423-426 ;分“心州等 人，Journal Immunol Methods 231 (1999) 177-189 ; //w心⑽等人，proc Nat Acad sci USA 85, 5879-5883 中。連 接子較佳為可撓性連接子，允許兩個單一域相互作用。一 個連接子實例為（GlyJeOn連接子，其中n=i至8，例如2、 3、4、5或7。亦可採用用於雙功能抗體之可撓性較差之連 接子（Holliger等人，（1993)PNAS (USA) 90:6444-6448)。 在一實施例中，所用連接子不為免疫球蛋白鉸鏈區。 可使用除連接子以外的方法組合可變域。例如，可利用 經由天然存在或工程化半胱胺酸殘基提供之二硫化物橋以 使 VH-VH、VL-VL 或 VH-VL二聚體穩定（Reiter 等人，（1994) Protein Eng. 7:697-704)或藉由重塑可變域之間的界面以提 高’’適配度’’且因此提高相互作用之穩定性（Ridgeway等 人，（1996) Protein Eng. 7:617-621 ; Zhu等人，（1997)
Protein Science 6:781-788) ° 可適當採用使免疫球蛋白之可變域且尤其抗體Vh域連結 -77- 129025.doc 200848427 或穩定的其他技術。 开/ \本^卩在洛液中雙特異性配位體可具有”閉人"構 在的組能，諸如；：個域(例如W)以接合形式存 態。例：，㈣：：合部位之接合、、對之組 scFvp右 用以連接Vh^域之連接子的排列， scFv可具有閉合構 固定保持在接人位置中許域接合或將其 形。 °巾，則該等域將有可能採用閉合構 ’ VH域對及％域對可以閉合構形形式存在。通 吊，此將為配位體分子中域諸如藉由岡lm 之功能。閉合構形之配位 篆山接s 期的分子位體之半衰 ”弟-軚靶刀子。因此，配位體通常將僅在自辦 加配位體之半衰期的分子解離時結合第二標乾分子。曰 取此外，在無連接子情況下構築Vh/Vh、心/m^二 4體提供域之間的競爭。 此外’根據本發明之配位體可具有開放構形。在該構形 一中^己位體將能同時結合增加配位體之半衰期的分子與第 -&革巴分子。通常’開放組態之可變域（在Vh_Vl對情況 ^呆^足夠遠之距離以便域之間不相互作用及形成抗體 、。合部位且不競爭結合其個別抗原以基。在Vh/Vh$ VL/Vf聚體情況下，該等域未藉由剛性連接子強制合在 :起。自然地，該等域配對將不競爭結合抗原或形成抗體 結合部位。 刚段及整個抗體將主要以閉合構形存在，儘管應理 129025.doc •78- 200848427 解在不同環境下開放及閉合雙特異性配位體可能以多種平 衡存在。配位體與標靶之結合可能使平衡之均勢向開放組 態移動。因此，根據本發明之某些配位體在溶液中可以兩 種構形存在，其中之一（開放形式）可獨立地結合兩個抗原 或抗原決定基，而替代性構形（閉合形式）僅可結合一個抗 原或抗原決定基；因此，抗原或抗原決定基競爭結合此構 形之配位體。
儘管，在溶液中雙特異性配位體之開放形式可因此與封 閉形式平衡存在，但預期該平衡將有利於閉合形式；此 外，可藉由標靶結合將開放形式隱變為閉合構形。因此， 較佳地，本發明之某些雙特異性配位體以兩種（開放與閉 合）構形之間的平衡形式存在。 可修飾根據本發明之雙特異性配位體以有利於開放或閉 合構形。例如，VH_VL相互作用經二硫化物鍵之穩定化使 閉合構形穩定。此外，卩構築用以連結包括VH域與vL域對 之域之連接子使得有利於開放形式；例如諸如藉由在適宜 位置併人大胺基酸殘基或設計將㈣域實體隔開之適當剛 性結構，使連接子可在空間上阻礙域之接合。 D·雙特異性配位體之表徵 可精由熟習此項技術者所熟知且包括ELISA之方法測試 雙特異性配位體與其特異性抗原或抗原決定基之結合。在 本發明之較佳實施例中，使料株㈣魏似測試結 可根據任何適 备程序執行噬菌體ELIS A : 於下文闡明例 129025.doc -79- 200848427 示性方案。 可藉由ELISA針對與所選抗原或抗原決定基之結合篩選 各輪選擇產生之噬菌體群體以鑑別”多株”嗟菌體抗體。隨 後可藉由ELISA篩選來自該等群體之單一感染菌落之噬菌 體以鑑別”單株，，嗟菌體抗體。亦需要針對與抗原或抗原決 疋基之結合篩選可溶性抗體片段，且此亦可藉由£乙1§八使 用（例如）針對C或N末端標記物之試劑進行（參見例如Winter 等人，（1994) Ann· Rev· immunology 12，433-55及其中引 用之參考文獻）。 亦ΊΓ藉由PCR產物之凝膠電泳（Marks等人，1991，前 述；Nissim等人，1994，前述）、探測（T〇mUns〇n等人， (1992) J· Mol. Biol· 227，776)或藉由載體DNA之定序評估 所選擇噬菌體單株抗體之多樣性。 Ε· ’雙特異性配位體|之結構 如上所述，抗體在本文中經定義為包含至少一個重鏈及 輕鏈可變域、至少兩個重鏈可變域或至少兩個輕鏈可變域 之抗體（例如 IgG、IgM、IgA、lgA、IgE)或片段（Fab、
Fv、二硫化物連接之Fv、scFv、雙功能抗體）。其可至少 部分地獲自天然產生抗體之任何物種，或由DNA重組技術 產生，或自血清、B細胞、融合瘤、轉染瘤、酵母或細菌 分離。 在本發明之較佳實施例中，雙特異性配位體至少包含抗 體之一個單一重鏈可變域及抗體之_個單一輕鏈可變域或 兩個單一重鏈或輕鏈可變域。例如，配位體可包含^^/% 129025.doc -80 - 200848427 對、一對v η域或一對v l域。 該配位體之第一及第二可變域可處於同一多肽鏈上。或 者，其可處於獨立多肽鏈上。在其處於同一多肽鏈上之情 況下，其可由較佳為如上所述之肽序列的連接子連接。 第一可變域與第二可變域可共價或非共價接合。在其經 共價接合之情況下，共價鍵可為二硫化物鍵。 在可變域係例如使用如本文所述之噬菌體呈現技術選自 V基因庫之情況下，則該等可變域包含通用框架區，使得 其可由如本文所定義之特異性通用配位體識別。通用框 架、通用配位體及其類似物之用途描述於WO 99/20749 中。 若使用V基因庫，則多肽序列之變異較佳位於可變域之 結構環内。任一可變域之多肽序列可經DNA改組或突變作 用改變’以提高各可變域與其互補對之相互作用。改 組在此項技術中已知且其由Stemmer，1994，Nature 370: 389-391及美國專利第6,297,053號教示，其兩者以引用的 方式併入本文中。熟習此項技術者熟知其他誘變方法。 在本發明之較佳實施例中，，雙特異性配位體，為單鏈以 片段。在本發明之替代性實施例中，，雙特異性配位體，由 Fab形式組成。 在另一悲樣中，本發明提供編碼至少一種如本文所定義 之1雙特異性配位體，的核酸。 熟習此項技術者應理解，依賴於本發明之態樣，抗原或 抗原決定基可同時與同一抗體分子結合。或者，其可競爭 129025.doc -81 - 200848427 結合同-抗體分子。例如，若兩個抗原決定基同時結合， 則雙特異性配位體之兩個可變域能夠獨立地結合其標輕抗 原决疋基。若該等域競爭，則一個可變域能夠結合其標 革巴，而同時另一並不同時結合其同源標乾；或第-可變域 能夠結合其標靶’而第二可變域並不同時結合其同源標 靶。 可變域可獲自針對標乾抗原或抗原決定基之抗體。或 者，其可獲自諸如彼等表現於絲狀細菌嗟菌體表面上者之 單一抗體域之庫。選擇可如下所述來執行。 通吊，可如諸如 Sambrook 等人，（1989) M〇/ecw/ar C7⑽j 施麵/，c〇ld Spring Harb〇r，USA之 標準實驗手冊中所闊明構築且操作執行本發明所需之核酸 分子及載體構築體。 通常在重組載體中進行適用於本發明之核酸之操作。 因此，在另一態樣中，本發明提供一種包含編碼至少一 種如本文所定義之，雙特異性配位體，的核酸之載體。 如本文所用，載體係指用以將異#DNA引入細胞中以表 現及/或複製其之離散元件。一般熟習此項技術者熟知選 擇或構築及隨後使用該等載體之方法。許多載體可公開獲 得，包括細菌質粒、細菌噬菌體、人工染色體及游離型載 體。該等載體可用於簡單選殖及誘變；或者採用基因表現 載體。可選擇根據本發明使用之載體以容納長度通常為 〇·25千鹼基（kb)至4〇以或4〇 kb以上之所需大小之多肽編碼 序列適^伯主細胞在經活體外選殖操作後以載體來轉 129025.doc -82- 200848427 型。各載體含有各種功能組份，其通常包括選殖（或，，聚連 接子”）部位、複製起點及至少一個可選擇標記基因。若所 給載體為表現載體，則其另外具有一或多個各位於選殖部 位附近之以下各物：增強子元件、啟動子、轉錄終止子及 信號序列，使得其可與編碼根據本發明之配位體的基因操 作性連接。 選殖與表現載體通常含有使載體能夠在一或多種所選擇 俏主細胞中複製之核酸序列。通常，在選殖載體中，該序 ( 列為使載體能夠獨立於宿主染色體DNA外複製且包括複製 起點或自主複製序列之序列。熟知多種細菌 '酵母及病毒 之該等序列。質體PBR322之複製起點適於多數革蘭氏陰 性細菌（Gram-negative bacteria)，2微米質體起點適於酵 母，且各種病毒起點（例如Sv 4〇、腺病毒）適於哺乳動物細 胞中之選殖載體。通常，除非哺乳動物表現載體用於能夠 複製高含量DNA之諸如COS細胞的哺乳動物細胞中，否則 哺乳動物表現載體無需複製起點。 有利地，選殖或表現載體可含有亦稱為可選擇標記之選 擇基因。該基因編碼在選擇性培養基中生長之所轉型宿主 細胞之存活或生長所必需的蛋白質。因此，未經含有選擇 基因之載體轉型的宿主細胞將不會在培養基中存活。典型 選擇基因編碼賦予對抗生素及其他毒素（例如胺苄青黴素 (amPicUlin)、新黴素（ne〇mycin)、曱胺喋呤（meth〇trexate) 或四環素（tetracycline))之抗性、補體營養缺陷性缺乏 (c〇mPlement auxotrophic deficiencies)或供應生長培養基中 129025.doc -83 · 200848427 不含的關鍵營養素的蛋白質。 由於最便利地在大腸桿菌φ 囷中執行編碼根據本發 體之載體的複製，因此使用 月之配位 便用賦予對抗生素胺苄 性的大腸桿菌可選擇性桿# 月镟常之抗 大腸桿菌可選擇性標記 u此寻 ^ 又自大知桿菌質體，諸如 PBR322或pUC質體，諸如pUci%⑽9。 表現載體通常含有由宿主生物 物體所識別且可與所關注之 編碼序列操作性連接的啟動子。 、 丁 °亥啟動子可為誘導型或組 成型啟動子。術語”可握祚料、击 、 ’、 連接係才曰邮t鄰，其中所述组 份之間的關係允許其以其預定方式發揮作用。，，可操作性 連接"至編碼序列之控制序列以此方式連接使得在與控制 序列相容之條件下實現編碼序列之表現。 適用於原核宿主之啟動子包括（例如）卜内醯胺酶及乳糖 啟動子系、统’鹼性磷酸酶、色胺酸(trp)啟動子系統及諸如 tac啟動子之雜交啟動子。用於細菌系統之啟動子通常亦將 含有可與編碼序列操作性連接之Shine-Delgarno序列。 較佳載體為能夠使對應於多肽資料庫成員之核苷酸序列 的表現載體。因此，可藉由表現多肽資料庫成員的單一純 系之獨立繁殖及表現或藉由使用任何選擇呈現系統執行第 一及/或第二抗原或抗原決定基之選擇。如上所述，較佳 選擇呈現系統為細菌噬菌體呈現。因此，可使用噬菌體或 嗟菌粒載體，例如pITl或pIT2。適用於本發明之引導序列 包括 pelB、stll、ompA、phoA、bla及 pelA。一個實例為具 有大腸桿菌複製起點（適於雙鏈複製）以及噬菌體複製起點 129025.doc -84 - 200848427 (適於產生單鏈DNA)之噬菌粒載體。在此項技術中熟知該 等載體之操作及表現（Hoogenboom及Winter (1992)，前 述；Nissim等人，（1994)，前述）。簡言之，載體含有卜内 醯胺酶基因以賦予噬菌粒選擇性及表現卡匣上游之lac啟動 子，表現卡匣（N至C末端）由pelB引導序列（其指引所表現 多肽至壁膜間隙）、多個選殖部位（用以選殖資料庫成員之 核苷酸型式）、視情況一或多個肽標記物（用以偵測）、視情 況一或多個TAG終止密碼子及噬菌體蛋白質ρΐπ組成。因 此，使用各種抑制及非抑制大腸桿菌菌株且添加葡萄糖、 異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)或諸如vcs Μη之輔助噬 菌體，載體能夠作為質體複製而無表現，僅產生大量多肽 資料庫成員或產生噬菌體，其中一些噬菌體在其表面上含 有至少一個複本之多肽叩出融合物。 編碼根據本發明之配位體之載體的構築採用習知連接技 4¾•。以產生所需載體所需之形式裂解、定製且再連接經分 離載體或DNA片段。婪+面 乃奴右而要，可以已知方式執行分析以證 實正確㈣存在於所構築之載體中。熟習此項技術者已知 用以構築表現載體、製備活體外轉錄產物、將膽A引入宿 主細胞且執行分析評估表現及功能的適當方法。藉由習知 旦务偵I式樣巾基因序列之存在或將其擴增及/或表現定 :'方法諸如南方或北方分析，西方墨點法，DNA、 RNA或蛋白質之黑 ,^ 、’土 ·、”居’原位雜交、免疫細胞化學或核酸 或蛋白質分子之序列分 ^ ^ J刀析。热習此項技術者將易於設想 (右斤系）可如何改進此等方法。 129025.doc -85 - 200848427 閉合構形多特異性配位體之結構 根據本發明之第二組態之一態樣，兩個或兩個以上非互 補抗原決定基結合域經連接以使其具有如本文所定義之閉 合構形。有利地，可將其進一步與骨架連接，骨架可作為 本文所述之連接子之替代或添加促進抗原決定基結合部位 關於彼此形成及/或保持閉合構形。 (I)骨架 如上所闡明，骨架可基於免疫球蛋白分子或可來自非免 疫球蛋白。如本文所定義之較佳免疫球蛋白骨架包括彼等 選自以下者之任何一或多者：至少包含以下各物之免疫球 蛋白分子：⑴抗體之cL(K5iu子類）域；或（ii)抗體重鏈之 CH1域；包含抗體重鏈之Ch1及Ch2域之免疫球蛋白分子； 包含抗體重鏈之CH1、Ch2及Ch3域之免疫球蛋白分子；或 聯合抗體之CL(K或λ子類）域的（ii)中之任一子集。亦可包括 鉸鏈區域。該等域組合可（例如）模擬天然抗體，諸如igG 或IgM ’或其片段，諸如Fv、scFv、㈣或F(a…分子。熟 習此項技術者將認識到該列表並非詳盡列表。 (Π)蛋白質支架 各抗原蚊基結合域包含蛋白f支架及_或多個牵涉於 該等域與-或多個抗原決定基之特異性相互作用中的 CDR。有利地，根據本發明之抗原決定基結合域包含三個 CDR。適當蛋白質支架包括彼等選自由以下各物組成之群 的任-者：彼等基於免疫球蛋白域者、彼等基於纖連蛋白 者、彼等基於親和體者、彼等基於CTLA#、彼等基於諸 129025.doc -86- 200848427 如GroEL之陪伴分子者、彼等基於脂質運載蛋白者及彼等 基於細gFe受體SpA及SpD者。熟f此項技術者應理解此 列表並非詳盡列表。 F ·用於構築雙特異性配位體之支架 i·選擇主鏈構形 免疫球蛋白超家族之成員之多肽鏈均共有相似摺疊。例 如，儘管抗體就其初級序列而言高度不同，但比較序列及 晶體結構已顯示與預期相反，6個抗原結合環中之5個 ^ (H1、H2、LI、L2、L3)採用有限數目之主鏈構形或規範 結構（Chothia 及 Lesk (1987) J· Mo/· 5b/·，196: 901 ; Chothia等人，（1989) ⑼re，342: 877)。因此，分析環長 度及關鍵殘基能夠預測多數人類抗體中所見的Η1、H2、 L1、L2 及 L3 之主鏈構形（Chothia 等人，（1 992) 71/0厂 万/〇/·，227: 799 ; Tomlinson等人，（1995) J·，14: 4628 ; Williams等人，（1996) /· Μο/. βζ·〇/·，264: 220)。儘 , 管就序列、長度及結構而言Η3區愈加不同（歸因於使用d片 ^ 段），但對於短環長度，其亦形成有限數目之主鏈構形， 短環長度依賴於環及抗體框架中關鍵位置處特定殘基之長 度及存在或殘基類型（Martin等人，（1996) «/· Mo/.別〇/.， 263: 800 ; Shirai等人，（1996) 399: 1)。 自諸如VH域資料庫及/或VL域資料庫的域資料庫有利地 裝配本發明之雙特異性配位體。此外，本發明之雙特異性 配位體本身可以資料庫形式提供。在本發明之一態樣中， 設計雙特異性配位體及/或域之資料庫，其中已選擇某些 129025.doc -87- 200848427 環長度及關鍵殘基以確保已知成員之域構形。有利地， :以上所論述，此等構形為自然界中所見之免疫球蛋白超 豕知分子之真實構形，以最小化其無功能之機會。生殖細 胞系V基因片ϋ當用以構築抗體或丁細胞受冑資料庫之 -種適當基本框架；亦使用其他序列。變異可以低頻率存 在，使得少數功能性成員可具有不影響其功能之經改變之 主鏈構形。
亦使用規範結構理論評估由配位體編碼之不同主鏈構形 之數目，以基於配位體序列預測主鏈構形且以選擇用於多 樣化而不影響規範結構之殘基。已知在人類Vk域中，⑴衰 可採用四種規範結構中之-者，L2it具有單—規範結構， 且90%之人類Vk域的L3環採用四種或五種規範結構之一者 (T〇mnnson等人，（1995)，前述）；因此僅在火域中可將 不同規範結構組合以產生—系列不同主鏈構形。假設^域 編碼不同範圍之L1、L2及L3環之規範結構且域可 ，可編碼m及H2環之數種規範結構的任一 Vh域配對，則 觀察到之此5個環之規範結構組合之數目極大。此暗指主 鏈構形中多樣性之產生對於產生寬範圍之結合特異性可為 必需。然而’藉由基於單_已知主鏈構形構築抗體資料 庫’發現與預期㈣，產生乾向大體上全部抗原之足夠多 樣性無需主鏈構形之多樣性。甚至更意外地，I —主鍵構 形不必為-致結構，可使用單—天然存在之構形作為整個 身料庫之基礎。心’在較佳態樣中，本發明之雙特異性 配位體具有單一已知主鏈構形。 129025.doc -88 - 200848427 抑在所討論之免疫球蛋白超家族類型之分 皁一主鏈構形較佳為常見者。觀察到大量天然、之 採用某種構形為常見的事。因此 …、子之分子 . 在本發明之較伟能i羊 中別考慮免疫球蛋白域之各結合… 士 μ冰… < 旧大然存在之不同 主鏈構形，且隨後選擇具有針對不同 ,. 、之主鍵構形的所雲 組合之天然存在之可變域。若盔一 η而 …、了用，則可選擇最接近 :物。“猎由選擇編碼所需主鏈構形之生 基因片段產生針對不同環之主鏈構形的所需組合所 選擇生殖細胞系基因片段在自然界中頻繁表現，且最佳其 在所有自然生殖細胞系基因片段中最頻繁表現。 在設計雙特異性配位體或其資料庫中，可分別考慮六個 抗原結合環之各者的不同主鏈構形之出現率。對於⑴、 H2、L1、L2及L3，選擇天然存在分子之2〇%與⑽％之間 的抗原結合環所採用的給定構形。通常，其之觀察出現率 高於35%(亦即介於35%與1〇〇%之間）且理想地高於5〇%或 甚至高於65〇/〇。由於大多數H3環不具有規範結構，因此較 佳選擇在顯示規範結構之彼等環中常見的主鏈構形。對於 各環，因此選擇在天然庫中最通常觀測到之構形。在人類 抗體中，各環之最普遍規範結構（cs)如下：H1_cs丨
之表現庫）、H2»CS 3(46%)、VK之 L1-CS 2(39%)、L2-CS 1(100%)、VK 之 L3-CS 1(36%)(計算假定 κ:λ 比為 7〇:3〇， ΙΙοοά專 Κ，（\96乃 Cold Spring Harbor Symp, Quant· Bi〇L, 48: 133)。對於具有規範結構之出環，具有殘基94至殘基 101鹽橋之7個殘基長度的cDR3(Kabat等人，（1991) Sequences of proteins of immun〇i〇gicai fnterest，矣風健象 129025.doc -89- 200848427
Department of Health and Human 和人類服務部（u.s·
Services))似乎最常見。在EMBL數據庫中存在至少丨ό種具 有所需H3長度及關㈣基以形成此構形之人類抗體序列， 且在蛋白質數據庫中存在至少兩種可用作抗體建模之基礎 的晶體結構（2啦及1tet)。最頻繁表現之生殖細胞系基因片 段即此規範結構組合為Vh片段3_23(Dp_47)、&片段、 VK片段02/012(DPK9RJk片段Jk1。％片段〇ρ45及则8亦 Γ 適m ’此等片段可組合使用作為構築具有所需單一 主鏈構形之資料庫的基礎。 或者’代替基於各獨立結合環之天然存在的不同主鏈構 形選擇單-主鏈構形，將天然存在的主鏈構形之組合用作 選擇單一主鏈構形之基礎。在抗體情況下，例如，可確定 任何兩個、二個、四個、五個或所有六個抗原結合環之規 1“口構組合的天然存纟。此冑，較佳所選擇構形在天然存 在抗體中常見，且最佳其在天然f料庫中最常觀察到。因 此，在人類抗體中，例如 當考慮5個抗原結合環H1、
H2、Ll、L2及L3之天然組合時，確定規範結構之最常組 合且隨後與H3環之最普遍構形組合，作為選擇單一主鏈構 形之基礎。 ii·規範序列之多樣化 已選擇數種已知主鏈構形或較佳單一已知主鏈構形，可 藉由改、交分子之結合部位以產生具有結構及/或功能多樣 t生之庫來構築根據本發明之雙特異性配位體或用於本發明 之資料庫。此意謂變體經產生使得其結構及/或功能具有 足夠多樣性，以便其能夠提供一系列活性。 129025.doc -90- 200848427 通常藉由在一或多個位置改變所選擇分子產生所需多樣 性。可隨機選擇待改變之位置或較佳地選擇待改變之位 置。可隨後藉由隨機化實現變異，在此期間藉由任一天然 或合成胺基酸或其類似物置換固有胺基酸，產生極大量變 體’或藉由以一或多種限定胺基酸子集替換固有胺基酸， 產生更有限數目之變體。 已報導各種引入該多樣性之方法。可使用易錯 PCR(Hawkins等人，（1992) J· Mo/·价〇/·，226: 889)、化學 誘變（Deng等人，（1994) J·价6)/· C/zd，269: 9533)或細菌 增變鹵株（Low等人，（1996) Mo/· 5ίο/·, 260: 359)將隨機 突變作用引入編碼分子之基因中。在此項技術中亦熟知使 所選擇位置突變之方法且其包括在使用或不使用PCR之情 況下使用錯配募核苷酸或簡併寡核苷酸。例如，已藉由抗 原結合環之靶向突變作用產生數種合成抗體資料庫。已使 結合人類破傷風類毒素之Fab之Η3區隨機化以產生一系列 新結合特異性（Barbas等人，（1992) Proc. iVai/. dead. 5cz·. tASd，89: 4457)。已將隨機或半隨機H3及L3區附接至生殖 細胞系V基因片段以產生具有未突變框架區之大資料庫 (Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol·，227: 381 ；
Barbas等人，（1992) /Voe. dead. Sc/. [/5^4，89: 4457 ; Nissim等人，（1994)五MBO /·，13: 692 ; Griffiths等人， (1994) EMBO J., 13: 3245 ; De Kruif 等人，（1995) J. Mo/· 5ζ·ο/·，248: 97)。該多樣化已經擴展以包括某些或所有其他 抗原結合環（Crameri等人，（1996) 2: 100 ; 129025.doc -91 - 200848427
Riechmann 等人，（1995)价〇/7^/^〇/〇狀 13: 475 ;
Morphosys，WO 97/08320，前述）。 由於環隨機化具有產生約超過1015種單獨H3結構及相似 數目之其他5個環的變體之潛能，因此使用當前轉型技術 或甚至藉由使用無細胞系統產生表示所有可能組合之資料 庫係不可行的。例如，在一個迄今為止構築之最大庫文 中，產生6xl01G個不同抗體，僅為此設計之資料庫的潛在 多樣性之一部分（Griffiths等人，（1994)，前述）。 在一較佳實施例中，僅彼等直接牵涉於分子之所需功能 的產生或改進之殘基為多樣化的。對於許多分子，功能將 為結合標靶且因此多樣性應集中在標靶結合部位，而避免 改變對分子總體包裝或保持所選擇主鏈構形關鍵之殘基。 當應用於抗體域時規範序列之多樣化 在抗體雙特異性配位體情況下，標靶之結合部位最通常 為抗原結合部位。因此，在高度較佳態樣中，本發明提供 抗體雙特異性配位體或用於裝配抗體雙特異性配位體之資 料庫，其中僅改變彼等處於抗原結合部位中之殘基。在人 類抗體庫中此等殘基極其不同且已知其在高解析度抗體/ 抗原複合物中產生接觸。例如，已知在天然存在抗體中在 L2中位置50及53的殘基不同，且觀測到其與抗原接觸。與 此相反，習知方法將使如Kabat等人（1991，前述）所定義之 相應互補決定區（CDR1)中之所有殘基多樣化，而相比而言 根據本發明使用之資料庫中的兩個多樣化部位約7個殘 基。就產生一系列抗原結合特異性所需之功能多樣性而 129025.doc -92- 200848427 5 ’此表不顯者改良。 貝際上’抗體多樣性為兩個過程之結果：生殖細胞系 V、D及J基因片段之體細胞重組以產生原態初級庫（所謂的 生殖細胞系及連接多樣性）及所得重排V基因之體細胞超突 1。为析人類抗體序列展示初級庫之多樣性集中在抗原結 合部位之中心，而體細胞超突變使多樣性散布至在初級庫 中高度保守之抗原結合部位周邊之區域（參見T〇mHns〇n等 ί 人，（1996) J· Mo/· 5z〇/·，256: 813)。此補充可能已發展為 搜索序列間隔之有效對策，且儘管顯然僅抗體專有，但其 可容易地應用至其他多肽庫。改變之殘基為彼等形成標靶 之結合部位者之子集。若需要，在選擇期間在不同階段標 靶結合部位中殘基之不同（包括重疊）子集為多樣化的。 在抗體庫情況下，產生初始，原態，庫，其中抗原結合部 位中之某些但非全部殘基為多樣化的。如本文在此上下文 中所用，術語，原態，係指無預定標靶之抗體分子。此等分 子類似於彼等經尚未進行免疫多樣化之個體的免疫球蛋白 基因編碼之分子，胎兒及新生個體即為該種個體，其免疫 系統尚未經多種抗原刺激物激發。接著針對一系列抗原或 抗原决疋基選擇此庫。若需要，可隨後在初始庫中經多樣 化之區域外弓丨人另—多樣性。可針對改進之功能、特異性 或親和力選擇此成熟庫。 本：明提供用於構築雙特異性配位體之結合域之兩種不 ^ 庫或又特異性配位體之原態庫，其中改變抗原結合 部位中之某些或全部殘基。”初級”資料庫模擬天然初、： 129025.doc •93- 200848427 庫，多樣性侷限於生殖細胞系v基因片段不同（生殖細胞系 多樣性）或在重組過程中多樣化（連接多樣性）之抗原結合部 位之中心處的殘基。彼等多樣化之殘基包括（但較佳不限 於）H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、 H96 、 H97 、 H98 、 L50 、 L53 、 L91 、 L92 、 L93 、 L94及 L96。在”體細胞”資料庫中，多樣性侷限於在重組過程中 多樣化（連接多樣性）或經高度體細胞突變之殘基。彼等多 樣化之殘基包括（但較佳不限於）H31、H33、H35、H95、 H96、H97、H98、L30、L31、L32、L34 及 L96。已知上文 所列出之適於在該等庫中多樣化之所有殘基在一或多種抗 體-抗原複合物中產生接觸。由於在2個資料庫中並非改變 抗原結合部位中之所有殘基，因此，若需要，在選擇期間 藉由改變剩餘殘基併入另一多樣性。熟習此項技術者應顯 而易見可使用任何該等殘基之任一子集（或包含在抗原結 合部位之其他殘基）用於抗原結合部位之初始及/或後續多 樣化。 在構築用於本發明之資料庫中，通常藉由改變指定多肽 之序列使得許多可能之胺基酸（全部2〇個或其子集）可併入 彼位置之編碼序列，在核酸級別上實現所選位置之多樣 化。使用IUPAC命名法，最通用密碼子為NNK，其編碼所 有胺基酸以及TAG終止密碼子。較佳使用NNK密碼子以引 入所需多樣性。亦使用其他實現相同目的之密碼子，包括 NNN岔碼子，其導致產生其他終止密碼子tgA及丁aa。 人類抗體之抗原結合部位中侧鏈多樣性之特徵顯著偏 129025.doc -94- 200848427 離，此有利於某些胺基酸殘基。若將Vh、Vk及义區之各者 中ίο個最不同位置之胺基酸組成取和，則超過76%之側鏈 多樣性僅來自7種不同殘基，此等殘基為絲胺酸（24%)、酪 胺酸（14%)、天冬醯胺酸〇1%)、甘胺酸（9%)、丙胺酸 (7%)、天冬胺酸（6%)及蘇胺酸（6%)。該向可提供主鏈可撓 性之親水性殘基及小殘|之偏#可能反映傾向於結合多種 抗原或抗原決定基的表面之進展且可有助於說明初級庫中 所需之抗體混雜。 由於較佳模擬胺基酸之此分布，因此待改變位置處胺基 酸之分布較佳模擬抗體之抗原結合部位中所見者。易於將 允許針對一系列標靶抗原選擇某些多肽（不僅僅抗體多肽） 之胺基酸取代中之該偏離應用於任一多肽庫。存在各種用 於使待改變位置處的胺基酸分布偏離之方法（包括使用三 核苷酸誘變，參見wo 97/08320)，歸因於合成簡易性，較 佳方法係使用習知簡併密碼子。藉由比較由所有簡併密碼 子組合（在各位置處單、雙、三及四重簡併比率相同）編碼 之胺基酸分布圖與所用天然胺基酸，可計算出最具代表性 之密碼子。密碼子（AGT)(AGC)T、（agt)(agc)c及 (agt)(Agc)(ct)(使用IUPAC命名法分別為DVT、Dvc及 DVY)為最接近所需胺基酸分布圖者：其編碼22%絲胺酸及 11%酪胺酸、天冬醯胺酸、甘胺酸、丙胺酸、天冬胺酸、 蘇胺酸及半胱胺酸。因此，較佳地，在各多樣化位置使用 DVT、DVC或DVY密碼子構築資料庫。 G :能夠增加配位體半衰期之抗原 129025.doc -95- 200848427 根據本發明之雙特異性配位體在其一個組態中能夠與一 或多種可增加配位體之活體内半衰期的分子結合。通常， 該等分子為天然存在於活體内且抵抗自生物體移除不當物 質之内生機制降解或移除之多肽。例如，增加生物體之半 衰期之分子可選自以下各物：
來自胞外基質之蛋白質；例如膠原蛋白、層黏連蛋白、 整合素及纖連蛋白。膠原蛋白為胞外基質之主要蛋白質。 目觔已知力1 5種在身體之不同部分見到的膠原蛋白分子， 例如在骨、皮膚、肌腱、韋刃帶、角膜、内臟中見到之㈤ 膠原蛋白(佔身體膠原蛋白之9〇%)，或在軟骨、椎間盤、 脊索、眼玻璃體中見到之„型膠原蛋白； 在血液中見到之蛋白f，其包括：血漿蛋白f，諸如血 纖維蛋白、cx-2巨球蛋白、血清白蛋白、血纖維蛋白原a、 血、截、准蛋白原B、血清澱粉樣蛋白質A、七珠蛋白 (hePtagl〇bin)、抑制蛋白、泛素⑽咖itin)、子宮球蛋白 (ukroglobulin)及 β-2-微球蛋白； 酶及抑制劑，諸如纖維 合酶原、〉谷囷酶、半胱胺酸蛋白 _抑制劑C、α-l-抗胰蛋白酶 仏 文曰每及胰腺胰蛋白酶抑制劑。纖 維溶酶原為胰蛋白酶 、’ 妒。ϋ〜 樣、、、“馱蛋白酶纖維溶酶之失活前驅 體。其通常在血流循環中 成_% —紿± 中見至J。®纖維溶酶原活化且轉化 , ^ ，、”、、出，谷解在血塊中糾纏血細胞之血纖 維蛋白原纖維之有效醢 κ纖 辦域。此稱作纖維蛋白溶解； 免疫糸統蛋白質，諸如τ =
姑 貝省如_、lgG、！ M 轉運蛋白質，铋a 、日廿 • 〇；?汽醇結合蛋白、（X4微球蛋白； 129025.doc -96- 200848427 防衛素⑴efensin)，諸如β_防衛素卜嗜中性白 素1、2及3 ; 防俾1 在血腦障壁或神經組織中見収蛋白f，諸如黑皮素受 體、碟脂、抗壞血酸鹽轉運體，· 、 運鐵蛋白又體特異性配位體_神經藥劑融合蛋 US 5977307) ； V " ^ 腦毛細血管内皮細胞受體、運鐵蛋白、運鐵 姨島素、姨島素樣生長因子1(IGF1)受體、 丑 因子2(IGF2)受體、姨島素受體； ”樣生長 定位於腎臟之蛋白質，諸如多囊素 機陰離子轉運㈣、哈裏曼（Heymann)抗/原蛋白有 定位於肝臟之蛋白質，例如乙醇脫氫酶、G250; 凝血因子X ; a 1抗胰蛋白酶，· HNF Ια ; 定位於肺之蛋白暂# 蛋白貝，啫如分泌組份(結合 定位於心臟之蛋白質，例如Hsp 相關聯； 。此舁擴張型心肌病 定位於皮膚之蛋白質，例如角蛋白； 骨特異性蛋白質，諸如A a 證明成骨活性之轉型生長:二：生蛋白質_?)，其為 BMP-2、BMIM、BMp 5 矢之子集。實例包括 白質，⑽A及ΒΜΡ_8(ορ_2) ΒΜΡ·7(亦稱為成骨蛋 腫瘤特異性蛋白質，其 貝，兹蚕層抗原、赫赛汀 129025.doc -97. 200848427 (herceptin)受體、雌激素受體、例如組織蛋白酶B之組織蛋 白酶（在肝臟及脾臟中見到）； 疾病特異性蛋白質，諸如僅在活化了細胞上表現之抗 原··包括LAG-3(淋巴細胞活化基因）、骨保護素配位體 (OPGL)(參見 Nature 402, 3〇4-309; 1999)、〇X4〇(TNF受體 家族之成員，表現在活化T細胞上，且唯一已知在1型人類 T細胞白血病病毒（HTLV-I)產生細胞中經特異性上調之協 同刺激1\細胞分子）（參見<//所所_〇厂2〇〇〇年7月1日；165 ( 〇): 263-70);金屬蛋白酶（與關節炎/癌症相關），包括 CG6512果蠅、人類截癱蛋白、人類FtsH、人類afg3l2、 鼠類ftsH ;血管生成生長因子，包括酸性纖維母細胞生長 因子（FGF-1)、鹼性纖維母細胞生長因子（FGF_2)、血管内 皮細胞生長因子/血管通透因子（VEGF/vpF)、轉型生長因 子a(TGF a)、腫瘤壞死因子_a(TNF_a)、血管生成素、介白 素-3(IL-3)、介白素-8(IL-8)、血小板衍化内皮細胞生長因 子（PD-ECGF)、胎盤生長因子（plGF)、中期因子血小板衍 化生長因子-BB(PDGF)、神經趨化因子； 應激蛋白質（熱休克蛋白質，HSP)。HSP通常在細胞内 見到。當在細胞外見到時，其指示細胞已死亡且散出其内 含物。此非漸進式細胞死亡（壞死）僅在由於外傷、疾病或 損傷且因此細胞外HSP活體内觸發對抗感染及疾病之免疫 系統反應時發生。可將與細胞外HSp結合之雙特異性配位 體定位於疾病部位； 牽涉於Fc轉運之蛋白質； 129025.doc -98- 200848427
Brambe11受體（亦稱為FcRB); 4 Fcx體具有兩種功能，其兩者均可潛在用於輸送。 該等功能為： (1) 經胎盤將IgG自母體轉運至胎兒 (2) 防止IgG降解，藉此延長IgG血清半衰期。認為受體使 IgG自内體再循環。 參見 Holliger 等人，Nat Biotechnol 1997年 7 月；15 (7)· 632-6 〇 i 根據本發明之配位體可經設計以對上述標靶具有特異性 而無需任何增加或不增加活體内半衰期。例如，根據本發 月之配位體可對選自彼等如上所述者之組織特異性標乾具 有特異性，藉此無關於任何半衰期增加（儘管此可產生）使 得能夠組織特異性靶向雙特異性配位體或dAb單體結合組 織特異性治療相關標靶。此外，若配位體或dAb單體靶向 腎臟或肝臟，則此可改變配位體或dAb單體的活體内替代 ( 清除途徑（例如，可使配位體自肝臟清除途徑指向腎臟清 1 除途徑）。 如上所述，本文所述包含如本文所定義之單一可變域之 配位體可經選擇對標靶具有特異性，且較佳可具有增加標 靶活體内半衰期之額外屬性（儘管並非必需）。雙特異性配 位體可由具有第-抗原決定基或抗原結合特異性之抗體重 鏈單一可變域以及具有第二抗原決定基或抗入 之抗體輕鏈單-可變域組成，其中該等抗原之一或兩者可 為血清白蛋白，或該等抗原決定基之一或兩者為血清白蛋 129025.doc -99- 200848427 白之抗原決定基。在—實施例、 基相同，在另一實施例中， 血清白蛋白抗原決定 因。 &清白蛋白抗原決定基不 除該等具有增加標靶活體内半 位體外，本文中描述1他 " 〖生之雙特異性配 -個如本文中所定義之式之配位體，其具有至少 衰期之屬性（例如藉由結合血^標=合_想活趙内半
該早，域組成。例如’配位體可由如本文所定義之結 合血清白蛋白的單體單一可 、文或、、且成或含有該單體單一 變域；或配位體可呈包含多^早體早了 、 3夕個如本文所定義之單一可變域 之形式，亦即多聚體，其中 口 ’ 合企清白蛋白。除該可變域之一或多者結 ’、 ，夕個結合血清白蛋白之單一可變 域外，多聚體與單體均可進一步包含其他實體，例如呈融 合蛋白質及/或結合物形式。該融合蛋白 肽，且可包含（例如）兩個或兩個以上連接之如本文所定義 之單可欠域，所連接之單—可變域可彼此相同或其可彼 此不同。该等實體包括（例如）—或多個如本文所定義之其 他單-可變域，其對除血清白蛋白外之抗原或抗原決定 基，及/或一或多種藥物，及/或一或多種標靶結合域具有 特異性’該等標革巴結合域對除血清白蛋白外之抗原或抗原 决定基具有特異性且不為如本文中所定義之單一可變域。 該多聚體關於其單一可變域可具有多價態，例如單價、二 價、三價、四價。該多聚體可具有IgG結構或如本文所定 義之雙特異性配位體以及其他諸如IgM、IgE、IgD或“A及/ 129025.doc -100- 200848427 或其片段之結構形式，該等片段包括（但不限於）諸如scFv 片段、Fab、Fab’等之片段。配位體可經修飾以含有諸如融 合蛋白質或結合物之其他部分。 如本文所述之雙特異性配位體或單體配位體或多聚體配 位體之抗體重鏈單一可變域可特異性結合血清白蛋白，且 包含抗體重鏈單一可變域之胺基酸序列。該抗體重鏈單一 可變域可選自（但較佳不限於）以下域中之一者： dAb7r20、dAb7r21、dAb7r22、dAb7r23、dAb7r24、 dAb7r25、dAb7r26、dAb7r27、dAb7r28、dAb7r29、 dAb7r30、dAb7r31、dAb7r32、dAb7r33、dAb7h21、 dAb7h22、dAb7h23、Ab7h24、Ab7h25、Ab7h26、 dAb7h27、dAb7h30 及 dAb7h31，或具有與其至少 80% — 致、與其高達（且包括）85%、90%、95%、96%、97%、 98%、99%—致之胺基酸序列且特異性結合血清白蛋白之 域。或者，配位體包含與以下域中之一者競爭結合血清白 蛋白的抗體單一可變域、較佳抗體重鏈單一可變域： dAb7r20、dAb7r21、dAb7r22、dAb7r23、dAb7r24、 dAb7r25、dAb7r26、dAb7r27、dAb7r28、dAb7r29、 dAb7r30、dAb7r31、dAb7r32、dAb7r33、dAb7h21、 dAb7h22、dAb7h23 、Ab7h24、Ab7h25、Ab7h26、 dAb7h27、dAb7h30、dAb7h31、dAb7ml2、dAb7ml6、 dAb7m26、dAb7rl、dAb7r3、dAb7r4、dAb7r5、dAb7r7、 dAb7r8、dAb7rl3、dAb7rl4、dAb7rl5、dAb7rl6、 dAb7rl7 、 dAb7rl8 、 dAb7rl9 、 dAb7hl 、 dAb7h2 、 129025.doc -101 - 200848427 dAb7h6 、dAb7h7 、dAb7h8 、dAb7h9 、dAb7hlO 、 dAb7hll 、 dAb7hl2 、 dAb7hl3 、 dAb7hl4 、 dAb7pl 及 dAb7p2，或具有與其至少80% —致、與其高達（且包 括）85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%—致之胺基 酸序列且特異性結合血清白蛋白之域。或者，除抗體重鏈 單一可變域外，配位體還包含可特異性結合血清白蛋白且 包含抗體輕鏈單一可變域之胺基酸序列的抗體輕鏈單一可 變域。該抗體輕鏈單一可變域可選自（但較佳不限於）以下 域中之一者：dAb7ml2、dAb7ml6、dAb7m26、dAb7rl、 dAb7r3、dAb7r4、dAb7r5、dAb7r7、dAb7r8、dAb7rl3、 dAb7rl4、dAb7rl5、dAb7rl6、dAb7rl7、dAb7rl8、 dAb7rl9 、dAb7hl 、dAb7h2 、dAb7h6 、dAb7h7 、 dAb7h8、dAb7h9、dAb7hlO、dAb7hll、dAb7hl2、 dAb7hl3、dAb7hl4、dAb7pl 及 dAb7p2，或具有與其至少 80%—致、與其高達（且包括）85%、90%、95%、96%、 97%、98%、99% —致之胺基酸序列且特異性結合血清白 蛋白之域。或者，配位體包含與可選自（但較佳不限於）以 下域中之一者的域競爭結合血清白蛋白之抗體單一可變 域、較佳抗體輕鏈單一可變域：dAb7r20、dAb7r21、 dAb7r22、dAb7r23、dAb7r24、dAb7r25、dAb7r26、 dAb7r27、dAb7r28、dAb7r29、dAb7r30、dAb7r31、 dAb7r32、dAb7r33、dAb7h21、dAb7h22、dAb7h23、 Ab7h24、Ab7h25、Ab7h26、dAb7h27、dAb7h30、 dAb7h31 、dAb7ml2 、dAb7ml6 、 dAb7m26 、dAb7rl 、 129025.doc -102- 200848427 dAb7r3、dAb7r4、dAb7r5、dAb7r7、dAb7r8、dAb7rl3、 dAb7rl4、dAb7rl5、dAb7rl6、dAb7rl7、dAb7rl8、 dAb7rl9 、dAb7hl 、dAb7h2 、dAb7h6 、dAb7h7 、 dAb7h8、dAb7h9、dAb7hlO、dAb7hll 、dAb7hl2、 dAb7hl3、dAb7hl4、dAb7p 1 及 dAb7p2，或具有與其至少 80%—致、與其高達（且包括）85%、90%、95%、96%、 97%、98%、99%—致之胺基酸序列且具有血清白蛋白結 合特異性之域。在一實施例中，配位體可為具有上述雙特 異性配位體之一或兩者之任何組合的IgG免疫球蛋白。在 一實施例中，配位體可含有上文所列出之單一可變域之一 或多個單體，其中若配位體含有一個以上此等單一可變 域，則單一可變域可彼此相同或彼此不同。 在一實施例中，配位體可為雙特異性配位體，其具有具 有第一抗原或抗原決定基結合特異性之第一免疫球蛋白單 一可變域及具有第二抗原或抗原決定基結合特異性之第二 免疫球蛋白單一可變域，該第一及第二免疫球蛋白單一可 變域為抗體重鏈單一可變域，且其中第一及第二抗體重鏈 單一可變域之一或兩者特異性結合血清白蛋白，且具有可 選自（但較佳不限於）以下抗體重鏈單一可變域中之一者的 抗體重鏈單一可變域之胺基酸序列：dAb7r20、dAb7r21、 dAb7r22、dAb7r23、dAb7r24、dAb7r25、dAb7r26、 dAb7r27、dAb7r28、dAb7r29、dAb7r30、dAb7r31、 dAb7r32、dAb7r33、dAb7h21、dAb7h22、dAb7h23、 Ab7h24 、 Ab7h25 、 Ab7h26 、 dAb7h27 、 dAb7h30 及 129025.doc -103- 200848427 dAb7h31，或與其至少80%—致、與其高達（且包括）85%、 9 0°/〇、95%、96%、97%、98% 或 99%—致之胺基酸序歹ij。 在一實施例中，該配位體可為雙特異性配位體，其具有具 有第一抗原或抗原決定基結合特異性之第一免疫球蛋白單 一可變域及具有第二抗原或抗原決定基結合特異性之第二 免疫球蛋白單一可變域，該第一及第二免疫球蛋白單一可 變域為抗體重鏈單一可變域，且其中第一及第二抗體重鏈 單一可變域之一或兩者特異性結合血清白蛋白，且與具有 可選自（但較佳不限於）以下抗體單一可變域中之一者的抗 體單一可變域之胺基酸序列或與其至少80% —致或與其高 達（且包括）85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%—致 之序列之單一可變域競爭結合血清白蛋白：dAb7r20、 dAb7r21、dAb7r22、dAb7r23、dAb7r24、dAb7r25、 dAb7r26、dAb7r27、dAb7r28、dAb7r29、dAb7r30、 dAb7r31、dAb7r32、dAb7r33、dAb7h21、dAb7h22、 dAb7h23、Ab7h24、Ab7h25、Ab7h26、dAb7h27、 dAb7h30、dAb7h31、dAb7ml2、dAb7ml6、dAb7m26、 dAb7rl、dAb7r3、dAb7r4、dAb7r5、dAb7r7、dAb7r8、 dAb7rl3、dAb7rl4、dAb7rl5、dAb7rl6、dAb7rl7、 dAb7rl8 、dAb7rl9 、dAb7hl 、dAb7h2 、dAb7h6、 dAb7h7、dAb7h8 、dAb7h9、dAb7hlO、dAb7hll 、 dAb7hl2、dAb7hl3、dAb7hl4、dAb7p 1 及 dAb7p2 ° 在一 實施例中，配位體可為具有上述雙特異性配位體之一或兩 者的任何組合之IgG免疫球蛋白。在一實施例中，配位體 129025.doc -104- 200848427 可含有上文所列出之單一可變域之一或多個單體，其中若 配位體含有一個以上此等單一可變域，則單一可變域可彼 此相同或彼此不同。 在一實施例中，雙特異性配位體具有具有第一抗原或抗 原決定基結合特異性之第一免疫球蛋白單一可變域及具有 第二抗原或抗原決定基結合特異性之第二免疫球蛋白單一 可變域，該第一及第二免疫球蛋白單一可變域為抗體輕鏈 單一可變域，且第一及第二抗體輕鍵單一可變域之一或兩 者特異性結合血清白蛋白，且具有可選自（但較佳不限於） 以下抗體輕鏈單一可變域中之一者的抗體輕鏈單一可變域 之胺基酸序列：dAb7ml2、dAb7ml6、dAb7m26、 dAb7rl、dAb7r3、dAb7r4、dAb7r5、dAb7r7、dAb7r8、 dAb7rl3、dAb7rl4、dAb7rl5、dAb7rl6、dAb7rl7、 dAb7rl8 、dAb7rl9 、dAb7hl 、dAb7h2 、dAb7h6 、 dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7hlO、dAb7hll 、 dAb7hl2、dAb7hl3、dAb7hl4、dAb7p 1 及 dAb7p2，或與 其至少80% —致或與其高達（且包括）85%、90%、95%、 96%、97%、98%或 99%—致之序列。 在一實施例中，配位體可為雙特異性配位體，其具有具 有第一抗原或抗原決定基結合特異性之第一免疫球蛋白單 一可變域及具有第二抗原或抗原決定基結合特異性之第二 免疫球蛋白單一可變域，第一及第二免疫球蛋白單一可變 域為抗體輕鏈單一可變域，且第一及第二抗體輕鏈單一可 變域之一或兩者特異性結合血清白蛋白，且與具有可選自 129025.doc -105- 200848427 (但較佳不限於）以下抗體單一可變域中之一者的抗體單一 可變域之胺基酸序列或與其至少80%—致或與其高達（且包 括）85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%—致之序列 的抗體輕鏈單一可變域競爭結合血清白蛋白：dAb7r20、 dAb7r21、dAb7r22、dAb7r23、dAb7r24、dAb7r25、 dAb7r26 、 dAb7r27 、 dAb7r28 、 dAb7r29 、 dAb7r30 、 dAb7r31 、dAb7r32 、 dAb7r33 、dAb7h21 、dAb7h22 、 dAb7h23 、 Ab7h24 、 Ab7h25 、 Ab7h26 、 dAb7h27 、 dAb7h30、dAb7h31 、dAb7ml2、dAb7ml6、dAb7m26、 dAb7rl、dAb7r3、dAb7r4、dAb7r5、dAb7r7、dAb7r8、 dAb7rl3、dAb7rl4、dAb7rl5、dAb7rl6、dAb7rl7、 dAb7rl8 、dAb7rl9 、dAb7hl 、dAb7h2 、dAb7h6、 dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7hlO、dAb7hll 、 dAb7hl2、dAb7hl3、dAb7hl4、dAb7pl 及 dAb7p2 ° 本文描述具有一或多個抗體重鏈單一可變域之配位體， 其中該一或多個抗體重鏈單一可變域特異性結合血清白蛋 白且具有選自（但較佳不限於）以下之抗體重鏈單一可變域 之胺基酸序列：dAb8、dAb 10、dAb36、dAb7r20、 dAb7r21、dAb7r22、dAb7r23、dAb7r24、dAb7r25、 dAb7r26、dAb7r27、dAb7r28、dAb7r29、dAb7r30、 dAb7r31、dAb7r32、dAb7r33、dAb7h21、dAb7h22、 dAb7h23 、Ab7h24、Ab7h25、Ab7h26、dAb7h27、 dAb7h3 0、dAb7h31，及與其至少80% —致或與其高達（且 包括）8 5%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%— 致之序 129025.doc -106- 200848427 列。 本文描述具有一或多個抗體重鏈單一可變域之配位體， 其中該一或多個抗體重鏈單一可變域特異性結合血清白蛋 白，且與具有選自（但較佳不限於）以下各者中之一者的抗 體單一可變域之胺基酸序列的抗體單一可變域競爭結合血 清白蛋白：dAb8、dAb 10、dAb36、dAb7r20、dAb7r21、 dAb7r22、dAb7r23、dAb7r24、dAb7r25 > dAb7r26、 dAb7r27、dAb7r28、dAb7r29、dAb7r30、dAb7r31、 dAb7r32、dAb7r33、dAb7h21、dAb7h22、dAb7h23、 Ab7h24 、 Ab7h25 、 Ab7h26 、 dAb7h27 、 dAb7h30 、 dAb7h31、dAb2、dAb4、dAb7、dAbll、dAbl2、dAbl3、 dAb 15 、 dAbl6 、 dAbl7 、 dAbl8 、 dAbl9 、 dAb21 、 dAb22 、 dAb23 、 dAb24 、 dAb25 、 dAb26 、 dAb27 、 dAb30 、 dAb31 、 dAb33 、 dAb34 、 dAb35 、 dAb38 、 dAb41 、 dAb46 、 dAb47 、 dAb52 、 dAb53 、 dAb54 、 dAb55 、 dAb56 、 dAb7m 12 、 dAb7m 16 、 dAb7m26 、 dAb7r 1、dAb7r3、dAb7r4、dAb7r5、dAb7r7、dAb7r8、 dAb7rl3 、 dAb7rl4 、 dAb7rl5 、 dAb7rl6 、 dAb7rl7 、 dAb7rl8 、dAb7rl9 、dAb7hl 、dAb7h2 、dAb7h6 、 dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7hlO、dAb7hll 、 dAb7hl2、dAb7hl3、dAb7hl4、dAb7pl 及 dAb7p2 ° 本文描述具有一個對於第一抗原或其抗原決定基具有結 合特異性之抗體重鏈單一可變域及一個對於第二抗原或其 抗原決定基具有結合特異性之抗體輕鏈單一可變域的配位 129025.doc -107- 200848427 體，其中該第一抗原及該第二抗原之一或兩者為血清白蛋 白，其中該抗體重鏈單一可變域特異性結合血清白蛋白， 且與具有一個選自（但較佳不限於）以下群之抗體單一可變 域之胺基酸序列的抗體單一可變域競爭結合於血清白蛋 白：dAb8、dAb 10、dAb36、dAb7r20、dAb7r21 ' dAb7r22 、 dAb7r23 、 dAb7r24 、 dAb7r25 、 dAb7r26 、 dAb7r27 、 dAb7r28 、 dAb7r29 、 dAb7r30 、 dAb7r31 、 dAb7r32 、dAb7r33 、dAb7h21 、dAb7h22 、dAb7h23 、
Ab7h24 、 Ab7h25 、 Ab7h26 、 dAb7h27 、 dAb7h30 、 dAb7h31、dAb2、dAb4、dAb7、dAbll、dAbl2、dAbl3、 dAbl5、dAbl6、 dAb22、dAb23、 dAb30 、 dAb31 、 dAbl7、dAbl8、 dAb24、dAb25、 dAb33 、 dAb34 、 dAbl9、dAb21、 dAb26、dAb27、 dAb35 、 dAb38 、 dAb41 、 dAb46 、 dAb47 、 dAb52 、 dAb53 、 dAb54 、 dAb55 、 dAb56 、 dAb7ml2 、 dAb7ml6 、 dAb7m26 、 dAb7rl、dAb7r3、dAb7r4、dAb7r5、dAb7r7、dAb7r8、 dAb7rl3 、 dAb7rl4 、 dAb7rl5 、 dAb7rl6 、 dAb7rl7 、 dAb7rl8 、dAb7rl9、dAb7hl 、dAb7h2 、dAb7h6、 dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7hlO、dAb7hll 、 dAb7hl2、dAb7hl3、dAb7hl4、dAb7pl、dAb7p2，且其 中抗體輕鏈單一可變域特異性結合血清白蛋白，且具有一 個選自（但較佳不限於）以下之抗體輕鏈單一可變域之胺基 酸序歹: dAb2、dAb4、dAb7、dAbll、dAbl2、dAbl3、 dAbl5 、 dAbl6 、 dAbl7 、 dAbl8 、 dAbl9 、 dAb21 、 129025.doc -108- 200848427 dAb22、dAb23、 dAb30、dAb31 、 dAb41 、 dAb46 、 dAb55 、 dAb56 、 dAb24、dAb25、 dAb33、dAb34、 dAb47 、 dAb52 、 dAb26、dAb27、 dAb35 、 dAb38 、 dAb53 、 dAb54 、 drdAb7m 12 、 dAb7m 16 、 dAb7m26 、 dAb7rl、dAb7r3、dAb7r4、dAb7r5、dAb7r7、dAb7r8、 dAb7rl3 、 dAb7rl4 、 dAb7rl5 、 dAb7rl6 、 dAb7rl7 、 dAb7rl8 、 dAb7rl9 、 dAb7hl 、 dAb7h2 、 dAb7h6 、 dAb7h7 、 dAb7h8 、 dAb7h9 、 dAb7hlO 、 dAb7hll 、 dAb7hl2、dAb7hl3、dAb7hl4、dAb7p 1 及 dAb7p2，及與 其至少80%—致或達（且包括）85%、90%、95%、96%、 97%、98%或99%—致之序歹J。 i 本文描述具有一個對於第一抗原或其抗原決定基具有結 合特異性之抗體重鏈單一可變域及一個對於第二抗原或其 抗原決定基具有結合特異性之抗體輕鏈單一可變域的配位 體，其中該第一抗原及該第二抗原之一或兩者為血清白蛋 白，其中抗體重鏈單一可變域特異性結合血清白蛋白，且 具有一個選自（但較佳不限於）以下群之抗體重鏈單一可變 域之胺基酸序列：dAb8、dAblO、dAb36、dAb7r20、 dAb7r21 、 dAb7r22 、 dAb7r23 、 dAb7r24 、 dAb7r25 、 dAb7r26、dAb7r27、dAb7r28、dAb7r29、dAb7r30、 dAb7r31 、dAb7r32 、 dAb7r33 、 dAb7h21 、dAb7h22 、 dAb7h23、Ab7h24、Ab7h25、Ab7h26、dAb7h27、 dAb7h30、dAb7h31，及與其至少80% —致或與其高達（且 包括）85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%— 致之序 129025.doc -109- 200848427 列，且其中抗體輕鏈單一可變域特異性結合血清白蛋白且 與包含選自（但較佳不限於）以下群之抗體單一可變域之胺 基酸序列的抗體單一可變域競爭結合血清白蛋白：dAb8、 dAb 10、dAb3 6 、dAb7r20、dAb7r21 、dAb7r22、 dAb7r23、dAb7r24、dAb7r25、dAb7r26、dAb7r27、 dAb7r28、dAb7r29、dAb7r30、dAb7r31、dAb7r32、 dAb7r33、dAb7h21、dAb7h22、dAb7h23、Ab7h24、 Ab7h25、Ab7h26、dAb7h27、dAb7h30、dAb7h31、 dAb2、dAb4、dAb7、dAbll、dAbl2、dAbl3、dAbl5、 dAbl6、dAbl7、dAbl8、dAb 19、dAb21、dAb22、 dAb23、dAb24、dAb25、dAb26、dAb27、dAb30、 dAb31、dAb33、dAb34、dAb35、dAb38、dAb41、 dAb46、dAb47、dAb52、dAb53、dAb54、dAb55、 dAb56、dAb7ml2、dAb7ml6、dAb7m26、dAb7r 1 、 dAb7r3、dAb7r4、dAb7r5、dAb7r7、dAb7r8、dAb7rl3、 dAb7rl4、dAb7rl5、dAb7rl6、dAb7rl7、dAb7rl8、 dAb7rl9 、dAb7hl 、dAb7h2 、dAb7h6 、dAb7h7 、 dAb7h8、dAb7h9、dAb7hlO、dAb7hll、dAb7hl2、 dAb7hl3、dAb7hl4、dAb7pl及 dAb7p2 〇 本文描述具有一或多個具有第一抗原或其抗原決定基結 合特異性之抗體重鏈單一可變域及一或多個具有第二抗原 或其抗原決定基結合特異性之抗體輕鏈單一可變域的配位 體，其中該第一抗原及該第二抗原之一或兩者為血清白蛋 白，且其中該一或多個抗體重鏈單一可變域特異性結合血 -110- 129025.doc 200848427 清白蛋白且與具有選自（但較佳不限於）以下群之抗體單一 可變域之胺基酸序列的抗體單一可變域競爭結合血清白蛋 白：dAb8、dAb 10、dAb36、dAb7r20、dAb7r21、 dAb7r22、dAb7r23、dAb7r24、dAb7r25、dAb7r26、 dAb7r27 、 dAb7r28 、 dAb7r29 、 dAb7r30 、 dAb7r31 、 dAb7r32 、dAb7r33 、dAb7h21 、dAb7h22 、dAb7h23 、
Ab7h24 、 Ab7h25 、 Ab7h26 、 dAb7h27 、 dAb7h30 、 dAb7h31、dAb2、dAb4、dAb7、dAbll、dAbl2、dAbl3、 dAbl5 、 dAb 16 、 dAbl7 、 dAb 18 、 dAbl9 、 dAb21 、 dAb22 、 dAb23 、 dAb24 、 dAb25 、 dAb26 、 dAb27 、 dAb30 、 dAb31 、 dAb33 、 dAb34 、 dAb35 、 dAb38 、 dAb41 、 dAb46 、 dAb47 、 dAb52 、 dAb53 、 dAb54 、 dAb55 、 dAb56 、 dAb7ml 2 、 dAb7ml 6 、 dAb7m26 、 dAb7rl、dAb7r3、dAb7r4、dAb7r5、dAb7r7、dAb7r8、 dAb7rl3 、 dAb7rl4 、 dAb7rl5 、 dAb7rl6 、 dAb7rl7 、 dAb7rl8、dAb7rl9、dAb7hl 、dAb7h2、dAb7h6、 dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7hlO、dAb7hll 、 dAb7hl2、dAb7hl3、dAb7hl4、dAb7pl、dAb7p2，且其 中該一或多個抗體輕鏈單一可變域特異性結合血清白蛋白 且包含選自（但較佳不限於）以下群之抗體輕鏈單一可變域 之胺基酸序列·· dAb2、dAb4、dAb7、dAbll、dAbl2、 dAbl3 、 dAbl5 、 dAbl6 、 dAb 17 、 dAbl8 、 dAbl9 、 dAb21 、 dAb22 、 dAb23 、 dAb24 、 dAb25 、 dAb26 、 dAb27 、 dAb30 、 dAb31 、 dAb33 、 dAb34 、 dAb35 、 129025.doc -Ill - 200848427 dAb38、dAb41 、dAb46、dAb47、dAb52、dAb53、 dAb54 、dAb5 5 、dAb5 6 、drdAb7m 12 、dAb7m 16 、 dAb7m26、dAb7rl、dAb7r3、dAb7r4、dAb7r5、dAb7r7、 dAb7r8、dAb7rl3、dAb7rl4、dAb7rl5、dAb7rl6、 dAb7rl7、dAb7rl8、dAb7rl9、dAb7hl 、dAb7h2、 dAb7h6 、dAb7h7 、dAb7h8 、dAb7h9 、dAb7hlO 、 dAb7hll 、 dAb7hl2 、 dAb7hl3 、 dAb7hl4 、 dAb7pl 及 dAb7p2，及與其至少80°/。一致或與其高達（且包括）85°/〇、 90%、95%、96%、97%、9 8% 或 99%—致之胺基酸序歹ij。 本文描述具有一或多個具有第一抗原或其抗原決定基結 合特異性之抗體重鏈單一可變域及一或多個具有第二抗原 或其抗原決定基結合特異性之抗體輕鏈單一可變域的配位 體，其中該第一抗原及該第二抗原之一或兩者為血清白蛋 白，且其中該一或多個抗體重鏈單一可變域特異性結合血 清白蛋白且具有選自（但較佳不限於）以下群之抗體重鏈單 一可變域之胺基酸序列：dAb8、dAb 10、dAb36、 dAb7r20、dAb7r21、dAb7r22、dAb7r23、dAb7r24、 dAb7r25、dAb7r26、dAb7r27、dAb7r28、dAb7r29、 dAb7r30、dAb7r31、dAb7r32、dAb7r33、dAb7h21、 dAb7h22、dAb7h23、Ab7h24、Ab7h25、Ab7h26、 dAb7h27、dAb7h30、dAb7h31，及與其至少 80%— 致或與 其高達（且包括）85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 一致之序列，且其中該一或多個抗體輕鏈單一可變域特異 性結合血清白蛋白且與具有選自以下群之抗體單一可變域 129025.doc -112- 200848427 的胺基酸序列之抗體單一可變域競爭結合血清白蛋白： dAb8、dAb 10、dAb36、dAb7r20、dAb7r21、dAb7r22、 dAb7r23 、 dAb7r24 、 dAb7r25 、 dAb7r26 、 dAb7r27 、 dAb7r28 、 dAb7r29 、 dAb7r30 、 dAb7r31 、 dAb7r32 、 dAb7r33 、 dAb7h21 、 dAb7h22 、 dAb7h23 、 Ab7h24 、
Ab7h25 、 Ab7h26 、 dAb7h27 、 dAb7h30 、 dAb7h31 、 dAb2、dAb4、dAb7、dAb 11 > dAbl2、dAbl3、dAbl5、 dAbl6、dAbl7 dAb23、dAb24 dAb31 、 dAb33 dAbl8、dAbl9 dAb25、dAb26 dAb34、dAb35 dAb21、dAb22、 dAb27 、 dAb30 、 dAb38 、 dAb41 、 dAb46 、 dAb47 、 dAb52 、 dAb53 、 dAb54 、 dAb55 、 dAb56 、 dAb7ml2 、 dAb7ml6 、 dAb7m26 、 dAb7rl 、 dAb7r3、dAb7r4、dAb7r5、dAb7r7、dAb7r8、dAb7rl3、 dAb7rl4、dAb7rl5、dAb7rl6、dAb7rl7、dAb7rl8、 dAb7rl9 、dAb7hl 、dAb7h2 、dAb7h6 、dAb7h7 、 dAb7h8、dAb7h9、dAb7hlO、dAb7hll、dAb7hl2、 dAb7hl3、dAb7hl4、dAb7pl 及 dAb7p2。 本文描述具有一或多個抗體輕鏈單一可變域之配位體且 其中該一或多個抗體輕鏈單一可變域特異性結合血清白蛋 白且具有選自（但較佳不限於）以下群的抗體輕鏈單一可變 域之胺基酸序列及與其至少80% —致或與其高達（且包 括）8 5%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% — 致之序 列：dAb2、dAb4、dAb7、dAb 11、dAb 12、dAbl3、 dAbl5 、 dAbl6 、 dAb 17 、 dAbl8 、 dAbl9 、 dAb21 、 129025.doc -113 - 200848427 dAb22、 dAb23 dAb30、 dAb31 dAb41 、 dAb46 dAb24、dAb25、 dAb33、dAb34、 dAb47 、 dAb52 、 dAb26、dAb27、 dAb35 、 dAb38 、 dAb53 、 dAb54 、 dAb55、dAb56、drdAb7m 12、dAb7m 16、dAb7m26、 dAb7rl、dAb7r3、dAb7r4、dAb7r5、dAb7r7、dAb7r8、 dAb7rl3 、 dAb7rl4 、 dAb7rl5 、 dAb7rl6 、 dAb7rl7 、 dAb7rl8 、 dAb7rl9 、 dAb7hl 、 dAb7h2 、 dAb7h6 、 dAb7h7 、 dAb7h8 、 dAb7h9 、 dAb7hlO 、 dAb7hll 、
dAb7hl2 、 dAb7hl3 、 dAb7hl4 、 dAb7pl 、 dAb7p2 ° 本文描述具有一或多個抗體輕鏈單一可變域之配位體， 其中該一或多個抗體輕鏈單一可變域特異性結合血清白蛋 白，且與具有選自（但較佳不限於）以下群之抗體單一可變 域之胺基酸序列的抗體單一可變域競爭結合血清白蛋白： dAb8、dAb 10、dAb36、dAb7r20、dAb7r21、dAb7r22、 dAb7r23、dAb7r24、dAb7r25、dAb7r26、dAb7r27、 dAb7r28 、 dAb7r29 、 dAb7r30 、 dAb7r31 、 dAb7r32 、 dAb7h23 、 Ab7h24 dAb7r33 dAb7h21 dAb7h22
Ab7h25
Ab7h26 dAb7h27 dAb7h30 dAb7h31 dAb2、dAb4、dAb7、dAbll、dAbl2、dAbl3、dAb 15 dAb 16 ^ dAb 17 、 dAb 18 、 dAb 19 、 dAb21 、 dAb22 dAb23 dAb24 dAb25 dAb26 dAb27 dAb30 dAb31 dAb33 dAb34 dAb35 dAb38 dAb41 dAb46 dAb47 dAb52 dAb53 dAb54 dAb55 dAb56 dAb7ml2 dAb7ml 6 dAb7m26 dAb7rl 129025.doc -114- 200848427 dAb7r3、dAb7r4、dAb7r5、dAb7r7、dAb7r8、dAb7rl3、 dAb7rl4、dAb7rl5、dAb7rl6、dAb7rl7、dAb7rl8、 dAb7rl9 、dAb7hl 、dAb7h2 、dAb7h6 、dAb7h7 、 dAb7h8、dAb7h9、dAb7hlO、dAb7hll、dAb7hl2、 dAb7hl3、dAb7hl4、dAb7pl 及 dAb7p2 ° 本文描述具有一或多個單一可變域之配位體，其中該一 或多個單一可變域特異性結合血清白蛋白，且與具有選自 (但較佳不限於）以下群之抗體單一可變域之胺基酸序列的 抗體單一可變域競爭結合血清白蛋白·· dAb8、dAb 10、 dAb36、dAb7r20、dAb7r21 、dAb7r22、dAb7r23 、 dAb7r24 、 dAb7r25 、 dAb7r26 、 dAb7r27 、 dAb7r28 、 dAb7r29 、 dAb7r30 、 dAb7r31 、 dAb7r32 、 dAb7r33 、 dAb7h21 、 dAb7h22 、 dAb7h23 、 Ab7h24 、 Ab7h25 、
Ab7h26、dAb7h27、dAb7h30、dAb7h31、dAb2、dAb4、 dAb7、dAbll、dAbl2、dAbl3、dAbl5、dAbl6、dAbl7、 dAbl8 、 dAbl9 、 dAb21 、 dAb22 、 dAb23 、 dAb24 、 dAb25 、 dAb26 、 dAb27 、 dAb30 、 dAb31 、 dAb33 、 dAb34 、 dAb35 、 dAb38 、 dAb41 、 dAb46 、 dAb47 、 dAb52 、dAb53 、dAb54、dAb55 、dAb56、dAb7ml2 、 dAb7m 16 、dAb7m26 、dAb7r 1 、dAb7r3 、dAb7r4、 dAb7r5 、 dAb7r7 、 dAb7r8 、 dAb7rl3 、 dAb7rl4 、 dAb7rl5 、 dAb7rl6 、 dAb7rl7 、 dAb7rl8 、 dAb7rl9 、 dAb7hl 、 dAb7h2 、 dAb7h6 、 dAb7h7 、 dAb7h8 、 dAb7h9 、 dAb7hlO 、dAb7hll 、dAb7hl2 、 dAb7hl3 、dAb7hl4 、 129025.doc -115- 200848427 dAb7pl及dAb7p2。較佳地，該一或多個單一可變域包含 選自（但較佳不限於）由以下各物組成之群的支架·· CTLA-4、脂質運載蛋白、SpA、親和體、avimer·、GroEl及纖連 蛋白，且與具有選自（但較佳不限於）以下群之抗體單一可 變域之胺基酸序列的抗體單一可變域競爭結合血清白蛋 白：dAb8、dAb 10、dAb36、dAb7r20、dAb7r21、 dAb7r22、dAb7r23、dAb7r24、dAb7r25、dAb7r26、 dAb7r27、dAb7r28、dAb7r29、dAb7r30、dAb7r31、 dAb7r32、dAb7r33、dAb7h21、dAb7h22、dAb7h23、 Ab7h24、Ab7h25、Ab7h26、dAb7h27、dAb7h30、 dAb7h31、dAb2、dAb4、dAb7、dAbll、dAbl2、dAbl3、 dAbl5 、 dAbl6 、 dAbl7 、 dAb 18、dAb 19 、dAb21、 dAb22 、 dAb23 、 dAb24 、 dAb25、dAb26 、dAb27、 dAb30 、 dAb31 、 dAb33 、 dAb34、dAb35 、dAb38、 dAb41 、 dAb46 、 dAb47 、 dAb52、dAb53 、dAb54 、 dAb55 、 dAb56 、 dAb7ml2 > dAb7ml 6 、 dAb7m26、 dAb7r 1、 dAb7r3、 dAb7r4、 dAb7r5、dAb7r7 、dAb7r8、 dAb7rl3 、 dAb7rl4 、 dAb7rl5 、 dAb7rl6 、 dAb7rl7 、 dAb7rl8 、dAb7rl9 、dAb7hl 、dAb7h2 、dAb7h6、 dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7hlO、dAb7hll 、 dAb7hl2、dAb7hl3、dAb7hl4、dAb7pl 及 dAb7p2 ° 本文描述具有具有第一抗原或抗原決定基結合特異性之 第一免疫球蛋白單一可變域及具有第二抗原或抗原決定基 結合特異性之第二免疫球蛋白單一可變域之配位體，其中 129025.doc -116- 200848427 第一及第二免疫球蛋白單一可變域為抗體重鏈單一可變 域，其中第一抗體重鏈單一可變域特異性結合血清白蛋白 且具有選自（但較佳不限於）以下群之抗體重鏈單一可變域 之胺基酸序列：dAb8、dAb 10、dAb36、dAb7r20、 dAb7r21、dAb7r22、dAb7r23、dAb7r24、dAb7r25、 dAb7r26 、 dAb7r27 、 dAb7r28 、 dAb7r29 、 dAb7r30 、 dAb7r31、dAb7r32、dAb7r33、dAb7h21、dAb7h22、 dAb7h23、Ab7h24、Ab7h25、Ab7h26、dAb7h27、 dAb7h30、dAb7h31，及與其至少80% —致或與其高達（且 包括）85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%— 致之序 列，且其中第二抗體重鏈單一可變域特異性結合血清白蛋 白且與具有選自以下群之抗體單一可變域的胺基酸序列之 抗體單一可變域競爭結合血清白蛋白：dAb8、dAb 10、 dAb36、dAb7r20、dAb7r21 、dAb7r22、dAb7r23 、 dAb7r24、dAb7r25、dAb7r26、dAb7r27、dAb7r28、 dAb7r29、dAb7r30、dAb7r31、dAb7r32、dAb7r33、 dAb7h21 、 dAb7h22 、 dAb7h23 、 Ab7h24 、 Ab7h25 、
Ab7h26、dAb7h27、dAb7h30、dAb7h31、dAb2、dAb4、 dAb7、dAbll、dAbl2、dAbl3、dAbl5、dAbl6、dAbl7、 dAb 18 、 dAbl9 、 dAb21 、 dAb22 、 dAb23 、 dAb24 、 dAb25 、 dAb26 、 dAb27 、 dAb30 、 dAb31 、 dAb33 、 dAb34 、 dAb35 、 dAb38 、 dAb41 、 dAb46 、 dAb47 、 dAb52、dAb53 、dAb54、dAb55 、dAb56、dAb7ml2、 dAb7ml 6 、 dAb7m26 、 dAb7r 1 、 dAb7r3 、 dAb7r4 、 129025.doc -117- 200848427 dAb7r5 、dAb7r7 、 dAb7r8 、dAb7rl3 、 dAb7rl4 、 dAb7r 1 5、dAb7r 16、dAb7r 17、dAb7r 1 8、dAb7r 19、 dAb7hl、dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、 dAb7hlO、dAb7hll、dAb7hl2、dAb7hl3、dAb7hl4、 dAb7pl 及 dAb7p2。 本文描述具有具有第一抗原或抗原決定基結合特異性之 第一免疫球蛋白單一可變域及具有第二抗原或抗原決定基 結合特異性之第二免疫球蛋白單一可變域之配位體，其中 第一及第二免疫球蛋白單一可變域為抗體輕鏈單一可變 域，其中第一抗體輕鏈單一可變域特異性結合血清白蛋白 且具有選自（但較佳不限於）以下群之抗體輕鏈單一可變域 之胺基酸序列：dAb2、dAb4、dAb7、dAbll、dAbl2、 dAbl3、dAbl5、dAbl6、dAbl7、dAbl8、dAbl9、 dAb21 、 dAb22 、 dAb23 、 dAb24 、 dAb25 、 dAb26 、 dAb27 、 dAb30 、 dAb31 、 dAb33 、 dAb34 、 dAb35 、 dAb38 、 dAb41 、 dAb46 、 dAb47 、 dAb52 、 dAb53 、 dAb54 、 dAb55 、 dAb56 、 drdAb7m 12 、 dAb7ml 6 、 dAb7m26、dAb7rl、dAb7r3、dAb7r4、dAb7r5、dAb7r7、 dAb7r8 、 dAb7rl3 、 dAb7rl4 、 dAb7rl5 、 dAb7rl6 、 dAb7rl7、dAb7rl8、dAb7rl9、dAb7hl 、dAb7h2、 dAb7h6 、dAb7h7 、dAb7h8 、dAb7h9 、dAb7hlO 、 dAb7hll 、 dAb7hl2 、 dAb7hl3 、 dAb7hl4 、 dAb7pl 、 dAb7p2，及與其至少80% —致或與其高達（且包括）85%、 90%、95%、96%、97%、98%或99%—致之序列，且其中 129025.doc -118- 200848427 第二抗體輕鏈單一可變域特異性結合血清白蛋白且與具有 選自（但較佳不限於）以下群之抗體單一可變域之胺基酸序 列的抗體單一可變域競爭結合血清白蛋白：dAb8、dAb 10、dAb36、dAb7r20、dAb7r21、dAb7r22、dAb7r23、 dAb7r24、dAb7r25、dAb7r26、dAb7r27、dAb7r28、 dAb7r29、dAb7r30、dAb7r31、dAb7r32、dAb7r33、 dAb7h21、dAb7h22、dAb7h23、Ab7h24、Ab7h25、 Ab7h26、dAb7h27、dAb7h30、dAb7h31、dAb2、dAb4、 C dAb7、dAbll、dAbl2、dAbl3、dAbl5、dAbl6、dAbl7、 dAbl8、dAbl9、dAb21、dAb22、dAb23、dAb24、 dAb25、dAb26、dAb27、dAb30、dAb31、dAb33、 dAb34、dAb35、dAb38、dAb41、dAb46、dAb47、 dAb52、dAb53、dAb54、dAb55、dAb56、dAb7ml2、 dAb7ml6、dAb7m26、dAb7rl 、dAb7r3 、dAb7r4、 dAb7r5 、dAb7r7 、dAb7r8 、dAb7rl3 、dAb7rl4 、 dAb7rl5、dAb7rl6、dAb7rl7、dAb7rl8、dAb7rl9、 I dAb7hl、dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、 dAb7hlO、dAb7hll、dAb7hl2、dAb7hl3、dAb7hl4、 dAb7pl 及 dAb7p2 o 前述及本文中描述之配位體之實施例亦包括彼等具有包 含IgG結構之結構者，該IgG結構具有上述雙特異性配位體 之一或兩者之任一組合，及/或包含非免疫球蛋白支架之 單一可變域。該免疫球蛋白結構可具有抗體單一可變域之 各種組合，包括含有4個抗體重鏈單一可變域之IgG結構， -119- 129025.doc 200848427 或含有4個抗體輕鏈單一可變域之lgG結構，以及含有兩對 鍵之IgG、、Ό構，各對含有一個抗體重鏈單一可變域及一個 抗體輕鍵單一可變域。除該等IgG結構之外，本文所述之 配位體可含有單一可變域之-或多個單體，包括（但較佳 不限於）上文所列之單一可變域，其中若配位體含有一個 以上3等單一可變域，則單一可變域可彼此相同或彼此不 同。 包含一或多個單一可變域之配位體之實施例包括（但較 佳不限於）本文所述之dAb、包含至少一個單一可變域之雙 特異性單體、含有抗體單鏈單體之雙特異性IgG分子及包 含如本文所述之抗體單鏈單體之多價IgG分子。該等實施 例可進一步包含通用配位體之結合部位。通用配位體可包 括（但較佳不限於）蛋白質A、蛋白質l及蛋白質G。對於該 等雙特異性配位體（包括彼等以IgG形式者）而言，各第二 抗原或抗原決定基結合特異性之標靶包括（但較佳不限於） 對於可以選自細胞激素、細胞激素受體、酶、酶輔因子及 DNA結合蛋白之群表徵的抗原之結合特異性，且可選自 (但較 it 不限於）· EPO 受體、Ap〇E、Apo_SAA、BDNF、 心營養素-1、EGF、EGF受體、ΕΝΑ·”、嗜酸性粒細胞趨 化因子、嗜酸性粒細胞趨化因子_2、次級淋巴組織趨化因 子、Ep〇R、酸性FGF、鹼性FGF、纖維母細胞生長因子_ 1〇、FLT3配位體、神經趨化引子（(^3(：:)、（}〇财、〇-CSF、GM-CSF、GF-βΙ、胰島素、IFN_y、IL]p、IL 2、 IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、lL-8(72 a.a·)、lL-8(77 129025.doc -120- 200848427 a.a.)、IL-9、IL-10、IL-ll、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18(IGIF)、抑制素 α、抑制素 β、ΙΡ_1〇、角 質細胞生長因子-2(KGF-2)、KGF、瘦體素、L1F、淋巴細 胞趨化因子、繆勒氏管抑制物質、單核細胞集落抑制因 子、單核細胞引誘蛋白質、M-CSF、MDC(67 a.a.)、 MDC(69a.a.)、MCP-l(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC(67a.a.)、MDC(69a.a.)、MIG、MIP-la、MIP-3a、ΜΙΡ-3β、MIP-4、骨髓祖代抑制因子-l(MPIF-l)、 NAP-2、神經營養因子、神經生長因子、β-NGF、NT-3、 NT-4、 4、RANTES、SDFla、SDFip、TGF-P、TGF-p2、TGF-β、TGF-β、TNF 受體 I、TNF 受體 II、TNIL-1、TPO、 VEGF、VEGF受體 1、VEGF受體 2、VEGF受體 3、GCP-2、 GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCCl、1-309、HER 1、 HER 2、HER 3、HER 4、CD4、人類趨化激素受體CXCR4 或CCR5、來自C型肝炎病毒之3型非結構性蛋白質（NS3)、 TNF-a、IgE、IFN-γ、MMP-12、CEA、幽門螺旋菌、TB、 流感、E型肝炎、MMP-12、内化受體（諸如上皮生長因子 受體（EGFR)、腫瘤細胞上之ErBb2受體（内化細胞受體）、 LDL受體、FGF2受體、ErbB2受體、運鐵蛋白受體、pDGF 受體、VEGF受體）、PsmAr(胞外基質蛋白質）、彈性蛋 白、纖連蛋白、層黏連蛋白、al-抗胰蛋白酶、組織因子 蛋白酶抑制劑、PDK1、GSK1、Bad、卡斯蛋白酶、又 頭、幽門螺旋菌之抗原、結核分枝椁菌之抗原及流感病毒 129025.doc -121 - 200848427 之抗原。在該雙特異性配位體（包括彼等以IgG形式存在之 雙特異性配位體）中，如（例如）藉由表面電漿共振所測定， 一個或兩個單一可變域以可選自（但較佳不限於）以下之解 離常數（Kd)特異性結合抗原決定基或抗原：1χΐ(Γ3 %或以 下、lxio-4 Μ或以下、1χ1〇·5 Μ或以下、1χ1〇-6 Μ或以 下、1x10 “或以下、lxio·8 Μ或以下及lxl〇_9 Μ或以 下。該雙特異性配位體（包括彼等以IgG形式存在之雙特異 性配位體）可進一步含有一或多個包括（但較佳不限於）標 籤、標記物及藥物之實體。該雙特異性配位體（包括彼等 以IgG形式存在之雙特異性配位體以及含有上文所列之單 一可變域之一或多個單體之多聚配位體）可存在於套組及 組合物中，該組合物包括含有雙特異性配位體及其載劑之 醫藥組合物。 相似地，對於包含一或多個如本文所述之單一可變域的 配位體（包括如前所定義之以單體形式之配位體及以多聚 形式之配位體）而言，如（例如）藉由表面電漿共振所測定， 该一或多個單一可變域以可選自（但較佳不限於）以下之解 離常數（Kd)特異性結合抗原決定基或抗原：1χ1〇_3 M或以 下、lxio·4 Μ或以下、lxl〇-5 M或以下、1χ1〇_6 M或以 下、lxlO·7 Μ或以下、lxl〇-8 M或以下及1><1〇_9 M或以 下。該配位體可進一步含有一或多個包括（但較佳不限於） 標籤、標記物及藥物之實體。該配位體可存在於套組、組 合物中’該組合物包括含有配位體及其載劑之醫藥組合 物。 129025.doc -122- 200848427 本文所列舉處之一致性百分數可指沿胺基酸或核苦酸序 列之整個拉伸長度的一致性百分數。當指定時’胺基酸或 核酸序列之一致性百分數係指與自參比胺基酸或核酸序列 之一或多個不連續區域的序列之一致性百分數’例如沿一 或多個抗體CDR區及/或沿一或多個抗體玎變域框架區。 例如，在胺基酸級別上跨越多肽之一或多個CDR的序列可 與抗體重鏈或輕鏈單一可變域之相應CDR之胺基酸序列具 有至少 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%或99%或99%以上的一致性。相似地’在 胺基酸級別上跨越多肽之一或多個框架區的序列可與抗體 重鏈或輕鏈單一可變域之相應框架之胺基酸序列具有至少 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94。/。、95%、96%、 97%、98%或99%或99%以上的一致性。在核酸級別上’編 碼多肽之一或多個CDR的核酸序列可與編碼抗體重鏈或輕 鏈單一可變域之相應CDR之核酸序列具有至少70%、 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%或99%或99%以上的一致性。在核酸級別 上，編碼多肽之一或多個框架區的核酸序列可與編碼抗體 重鏈或輕鏈單一可變域之相應框架區之核酸序列分別具有 至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 或 99% 以上的一致 性。框架區（FW)較佳來自抗體框架區，諸如人類V3-23[DP47]JH4B重鏈或人類κ輕鏈DPK9/JK1。若框架區為在 人類V3-23[DP47]/JH4B重鏈V區中所見到者，則可將一致 129025.doc -123- 200848427 性百分數靶向其框架區及/或較佳地靶向如圖24所說明之 一或多個CDR區。若框架為在人類DPK9/JK1輕鏈V區中所 見到者，可將一致性百分數與其參比框架區相比較及/或 較佳地與如圖24所說明之一或多個CDR區相比較。 CDR較佳為抗體可變域之CDR，較佳為（但不限於）抗體 單一可變域之CDR。 在某些實施例中，將一致性百分數之結構特性與功能態 樣偶聯。例如，在某些實施例中，亦需要與參比核酸或胺 基酸序列具有小於1 〇〇% —致性之核酸序列或胺基酸序列 來呈現參比胺基酸序列或由參比核酸編碼之胺基酸序列的 至少一個功能態樣。在其他實施例中，亦需要與參比核酸 或胺基酸序列分別具有小於100% 一致性之核酸序列或胺 基酸序列來呈現參比胺基酸序列或由參比核酸編碼之胺基 酸序列之至少一個功能態樣，但彼功能特性可經稍微改 變，例如賦予相對於參比之親和力而言增加之對指定抗原 的親和力。 Η :根據本發明之第二組態之多特異性配位體之用途 可在活體内治療及預防性應用、活體外及活體内診斷應 用、活體外檢定及試劑應用及其類似應用中使用根據本發 明之第一組悲之方法的多特異性配位體。例如，根據熟習 此項技術者已知之方法可將抗體分子用於基於抗體之檢定 技術，諸如ELISΑ技術。 如上所間接提及，將根據本發明之多特異性配位體用於 診斷、預防性及治療性程序。在西方分析及原位蛋白質偵 129025.doc -124- 200848427 測中，藉由標準免疫組織化學程序將根據本發明之多特異 性抗體用於診斷，對於在該等應用中使用而言，配位體可 根據在此項技術中已知之技術標記。另外，當與諸如樹脂 之層析載體複合時，該等抗體多肽可備用於親和性層析程 序中。熟習此項技術者熟知所有該等技術。 根據本發明 < 閉合構形多特異性配位冑之診斷用途包括 刀析物的均質檢冑，其利用_合構形多特異性配位體競爭
結合兩個標靶使得兩個標靶不能同時結合之能力（閉合構 形），或者其同時結合兩個標靶之能力（開放構形）。 用於藥物發現及開發之診斷及研究檢定系統之製造商已 ^切地尋求真正的均質免疫檢定形式。主要診斷市場包括 酉院、沴所及門診部，涉及商業之實驗室、血庫及家庭 中，非人類診斷（例如食物測試、水測試、環境測試、生 物防禦及獸醫學測試）及最終研究（包括藥物開發；基礎研 究及學術研究）。 目前，所有該等市場利用圍繞化學發光、elisa、螢光 或有時放射免疫檢定技術構建之免疫檢定系統。該等檢定 形式之每一者需要分離步驟(自未結合試劑中分離結合試 浏）。在某些情況下，需要若干個分離步驟。增加該等額 外步驟增加試劑及自動操作、費時且影響檢定之最終結 果。在人類診斷中’可自動進行分離步驟，其掩蔽問題但 未解除問題。機器人技術、額外試劑、額外培育時間及其 類似物增加相當大成本及複雜度。在諸 物開發中，以極低量之測試分子立刻測試幾乎 129025.doc -125 - 200848427 樣丄增加額外分離步驟使執行筛選之能力喪失。然而，消 、木义0在項數中產生過多雜訊。因此，需要提供在可獲 自當别檢定形式之範圍内之靈敏度的真正均質形式。有利 1，檢定具有高靈敏度及大動態範圍之完全定量讀數。如 IV低忒樣里所需’靈敏度為一個重要需要條件。兩個此等 特徵均為均質系統提供的特徵。就重點照護檢驗㈣加〇f 一及試樣珍貴之藥物開發而言，此極其重要。作 = 此項技術中當前可用之異源系統，其要求大量試樣及 叩貝试劑。 、=質檢定之應用包括癌症測試，其中最大檢定為用於用 以師選男性前列腺癌之前列腺特異性抗原者。其他應 括生育力測試，其為試圖懷孕之女性提供一系列測試，包 =::g。測試包括肝炎、，、風療及其他病毒及微 〇性傳播疾病之感染性疾病。測試用於血庫尤其測 型、Β型、㈣、非Α非Β型肝炎。治療藥物監斤 測試包括監控患者體内有效之處方藥物含量以避免^控 2用♦於心律不整之地高辛（dig〇xin)及在精神病情況下所 之本巴比女（Phenobarbital)含量；用於哮喘之茶驗。此 外，#斷測試適用於濫用藥物測試，諸如測試可卡因 麻及其類似物。將代謝測士十田 其他生理病症及=用於！測甲狀腺功能、貧血及
此：二質免疫檢定形式適用於製造標準臨 ^木免疫檢疋及化學檢定”_儀器上在診斷檢驗 度有利。適當化學檢定包括測試葡萄糖、膽固醇、鉀及I 129025.doc -126 - 200848427 類似物。 均貝免疫檢定之另一主要庫用 旦μ @ 』 以用為樂物發現及開發··高通 試針對超高容量標乾的組合化學資料庫μ貞 測“號且接著將陽性組分成較 、 、、 且取終在細胞且隨後 1 W試。均質檢定可用於所有該等類型之測試。在 樂物:二:尤其動物研究及臨床試驗中，大量使用免疫檢 =“&定極大地加速且簡化該等程序。其他應用包括
艮物及飲科測試··針對大腸桿菌、沙門氏菌㈣卿⑽⑷等 之肉及其他食物測試；水測試，包括針對包括大腸桿菌之 所有類型之污染物的水生植物測試；及獸醫學測試。 在-個主要實施例中’本發明提供一種包含與根據本發 明之閉合構形多特異性配位體結合且藉由使分析物與該閉 合構形多特異性配位體結合改變可谓測特性的可偵測藥劑 之結合檢定。該檢定可以數種不同方式組態，各自利用閉 合構形多特異性配位體之上述特性。 檢定依賴於藥劑藉由分析物直接或間接置換，使得藥劑 之可偵測特性改變。例如’若藥劑為能夠催化具有可们則 終點之反應之酶’則該酶可由該配位體結合以便阻隔其活 性部位，藉此使酶失活。亦由閉合構形多特異性配位體結 合之分析物置換酶，致使其經由釋放活性部位而具有活 性。接著，酶能夠與底物反應，產生可偵測事件。在替代 性實施例中，配位體可在活性部位以外結合酶，影響酶之 構形且因此改變其活性。例如，可藉由結合配位體而約束 活性部位之結構，或可防止結合活性所必需之辅因子。 129025.doc -127- 200848427 檢疋之物理實施可採用在此項技術中已知之任一形式。 例如’可在測試條帶上提供閉合構形多特異性配位體/酶 =合物；可在測試條帶之不同區域提供底物，且允許含有 刀析物之溶劑遷移穿過配位體/酶複合物，置換酶且將其 ，載至底物區域以產生信號。或者，可在測試棒或其他固 才目上提供配位體/酶複合物，且將其浸人分析物/底物溶液 中，響應分析物之存在將酶釋放於溶液中。 、；刀析物之各分子潛在地釋放―個酶分子，因此檢定 =量的’其中在給^時間内所產生信號之強度依賴於溶 液中分析物之濃度。 使用閉合構形之分析物的其他組態係可能的。例如，閉 合構形多特異性配位體可經組態以結合酶之變構部位，藉 此活化酶。在該實施例中，在不存在分析物的情況下酶^ 有活性。添加分析物置換酶且移除變構活化，因此使酶失 活0
在上述採用酶活性作為分析物濃度之量度的實施例之上 下文中’酶之活化或失活係指如酶催化信號產生反應之能 力所量測酶活性的增加或降低。例如，酶可催化不可侦測 底物向其可制形式之轉化。例如，將辣根過氧化物酶連 同商業上可購得之發色或化學發光底物一起廣泛用於此項 技術中。酶活性增加或降低之程度可介於10%盘職之 間，諸如20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或 90%，在活性增加之情況下’增加可超過⑽％，亦即 麵、300%、麵或5_以±U受抑_之基線活 性不可偵測，則百分數不能量測到。 129025.doc -128- 200848427 在另一組態中，閉合構形多特異性配位體可結合酶/底 物對之底物而非酶。因此，直至底物經由結合分析物自閉 合構形多特異性配位體中釋放出，其才可接觸酶。此組態 之實施涉及結合酶之組態。 此外，該檢定可經組態以結合諸如螢光素或另一螢光團 之螢光分子，此構形使得與配位體結合時螢光淬滅。在此 情況下，分析物與配位體之結合將置換螢光分子，因此產 生信號。適用於本發明之螢光分子之替代者包括發光劑， 諸如螢光素/螢光素酶；及發色劑，包括通常用於免疫檢 定之諸如HRP之試劑。 根據本發明製備之多特異性配位體之治療及預防性用途 包括將根據本發明之配位體投與諸如人類之哺乳動物接受 者。夕特異性可允許抗體以極大親和性結合多聚抗原。多 特異性配位體可允許兩個抗原交聯，例如在募集細胞毒性 T細胞以介導腫瘤細胞株之殺死過程中。 大體上純之配位體或其結合蛋白質（例如至少9〇_95%均 質之dAb單體）較佳用於向哺乳動物投藥，且98_99%或99% 以上之均貝性最佳用於醫藥用途，尤其當哺乳動物為人類 曰寸。一旦純化，部分或完全達至所需均質性之配位體可用 於衫斷或治療（包括體外）或發展及執行檢定程序、免疫螢 光柒色及其類似程序中（Lefkovite及Pernis，（1979及1981)
ImmUn〇l〇gical Methods，第工卷及第 π卷，以川， NY) 〇 本發明之配位體或其結合蛋白質（例如dAb單體）通常將 129025.doc -129- 200848427 Γ 或治療發炎性病況、過敏性超敏反應、癌 生感染及自體免疫性病症(其包括(但較佳 ^w 病、哮喘、多發性硬化症、類風濕性關節 人王性紅斑性狼瘡症、克羅恩氏病及重症肌無力)。 :本申請案中，術語"預防，，包括在誘導疾病之前投與保 δ '組合物° "抑止’’係指在誘導事件後但在疾病之臨床表 現刖投與組合物° ”治療”包括在疾病症狀表現後投與保護 性組合物。
可利用在保4不H病影響或治療疾病中可用於筛選抗 體或其結合蛋白質之有效性的動物模型系統。在此項技術 中已知在易感小鼠中測試全身性紅斑性狼瘡症（SLE)之方 法（Knight 等人，（i978) J·五;φ· MW.，147: 1653 ; Reinersten等人，（1978) g J , 299 515)。藉 由以來自另一物種之可溶性AchR蛋白質誘導疾病在sjl/j 雌性小鼠中測試重症肌無力（MG)(Lindstr〇m等人，（1988) ^办· 42: 233)。藉由注射II型膠原蛋白在易感小 鼠品系中誘導關節炎（Stuart等人，（1984).及ev /mm⑽〇/·，42: 233)。已描述藉由注射分枝桿菌熱激蛋白在 易感大鼠中誘導佐劑性關節炎之模型（Van Eden等人， (1988) 331: 171)。如所述藉由投與甲狀腺球蛋白 在小鼠中誘導甲狀腺炎（Maron等人，（1980) 乂五x/?. Med.， 152: 1115)。胰島素依賴型糖尿病（IDDM)係天然發生的或 可在某些品系小鼠（諸如Kanasawa等人，（1984) £)ζ·α心27: 113所述者）中誘導。EAE小鼠及大鼠充 129025.doc -130- 200848427 當人類MS之模型。在該模型中，藉由投與髓磷脂鹼性蛋 白質誘導脫髓:鞘病（參見Paterson (1 986) Textbook of Immunopathology, Mischer 等人，編，Grune 及 Stratton， New York，第 179-213 頁；McFarlin等人，（1973) 179·· 478 ;及 Satoh等人，（1987) /. /所臟㈣/·，138: 179)。
包含特異性結合例如人類vWF之vWF、vWF A1域、活化 vWF之A1域或VWF A3域的單一可變域之配位體或其組合物 可進一步包含溶解血栓劑。此溶解血栓劑可非共價或共價 連接於單一可變域，尤其經由如熟習此項技術者已知之共 價或非共價方式連接於抗體單一可變域。非共價方式包括 經由蛋白質相互作用，諸如生物素/抗生蛋白鏈菌素或經 由免疫結合物。或者，可關於由結合如上所述之vWf或 vWF域的單一可變域組成或包含其之配位體或其組合物同 時、分別或依次投與溶解血栓劑。根據本發明之溶解血栓 劑可包括（例如）葡激酶、組織纖維溶酶原活化劑、鏈激 酶、單鏈鏈激酶、尿激酶及醯基纖維 土纖、、隹/合酶原鏈激酶複合 本文中亦描述經單一可變域或包含 .# ^ \匕3早可變域之配位體 或八、、且a物或由本文所述之篩選 瓦屋生的早一可變域塗偏 之侵入性醫療裝置。裝置之非限制 ^ 管、阻突壯罢攸卜 Γ灵例包括外科手術 阻塞衣置、修復裝置。該等裝置 侵入邻仿闽m 1 應用包括需要調節 輕周圍血小板介導之聚集(
之單一可辦nA ^ 工特異性結合VWF 早 了艾域塗佈之裝置）或調節發炎 TNFn夕σσ (丨】如經特異性壯人 TNFa之早一可變域塗佈之裝置）的 吁/、〖生、、口 σ π于術裎序。 129025.doc -131 - 200848427 通常’本發明配位體將以純化形式連同藥理學上適當载 劑一起利用。通常，該等載劑包括水性或醇/水性溶液、 乳液或懸浮液、包括鹽水及/或緩衝介質之任何載劑。非 經知媒劑包括氟化納 >谷液、林格氏（Ringer,s)右旋糖、右旋 糖及氣化鈉及乳酸化林格氏溶液。若需要將多肽複合物保 持在懸浮液中，則適當生理學上可接受之佐劑可選自諸如 叛甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、明膠及海藻酸鹽之稠化 劑。 靜脈内媒劑包括流體及營養素補充劑及電解質補充劑， 諸如彼專基於林格氏右旋糖者。亦可存在防腐劑及諸如殺 菌劑、抗氧化劑、螯合劑及惰性氣體之其他添加劑（Mack (\9S2) Remington’s pharmaceutical Sciences，第 16版）〇 可以獨立投與之組合物形式或聯合其他藥劑一起使用本 發明之配位體。該等其他藥劑可包括各種免疫治療藥物， 諸如環孢素（Cylcosporine)、甲胺喋呤、阿德力黴素 (adnamycin)或順鉑（cisplatinum)，及免疫毒素。醫藥組合 物可包括各種細胞毒素之”混合物（c〇cktail)，，或聯合本發明 之配位體之其他藥劑或甚至根據本發明具有不同特異性之 配位體之組合’該等配位體諸如使用不同標靶抗原或抗原 決定基選擇之配位體，無論其在投與前是否彙集。 根據本發明之醫藥組合物之投藥途徑可為一般熟習此項 技術者通常已知之任一途徑。對於包括(但不限於)免疫療 之療法，可根據標準技術將本發明之所選配位體投與任 何患者。可藉由任何適當模式投藥，包括非經腸、靜脈 129025.doc -132- 200848427 内、肌肉内、腹膜内、經皮、經由肺部途徑，或亦適當地 藉由以導管直接輸注。投藥之劑量及頻率將依賴於患者之 年齡、性別及病狀、其他藥物之同時投與、臨床醫師所考 慮之反適應症（counterindication)及其他參數。 可將本發明之配位體凍乾用以儲存及在使用前在適當載 劑中復水。該技術已展示對於習知免疫球蛋白有效且可使 用此項技術中已知之凍乾及復水技術。熟習此項技術者應 瞭解凍乾及復水可導致不同程度之抗體活性損失（例如， 對於習知免疫球蛋白，IgM抗體比IgG抗體趨向於具有更大 的活性損失）且可能必需上調用量以抵消損失。 了才又與含有本發明配位體或其混合物之組合物用以預防 性及/或治療性治療。在某些治療性應用中，將實現至少 部分抑制、抑止、調節、殺死所選細胞群體或某些其他可 ϊ測之參數的足夠量定義為”治療有效劑量"。實現該劑量 所需之量將依賴於疾病之嚴重性及患者自身免疫系統之總 體狀況，但通常在每公斤體重〇〇〇5至5.〇 mg2配位體，例 如抗體、受體（例如T細胞受體）或其結合蛋白範圍内，更 通吊/使用每劑〇·05至2 〇 mg/kg之劑量。對於預防性應用， 亦可以相似或稍微低之劑量投與含有本發明配位體或其混 合物之組合物。 么:相對於治療前存在之一或多種症片大，或才目對於未經該 、、且口物冶療之個體（人類或模型動物）的一或多種症狀，兮 等症狀減輕（例如減輕至少1〇%或根據臨床評估量表減輕至 少一個點），則認為使用本文所述之組合物執行之治療，，有 129025.doc -133- 200848427 效”。症狀顯然將依賴於所靶向疾病或病症而變化，但可 藉由普通热練臨床醫師或技師量測。可藉由以下量測該等 症狀·例如監控疾病或病症之一或多種生化指示劑之含量 (例如與疾病相關的酶或代謝物之含量、受影響細胞數目 等），監控實體表現（例如發炎、腫瘤大小等）；或已接受之 臨床評估量表，例如擴展殘疾狀況量表（Expanded Disability Status Scale)(用於多發性硬化症）、伊爾文發炎 性腸病調查問卷（Inflammat〇ry Bowel Disease Questi〇nnaire) (評價關於腸功能、全身性症狀、社會功能及情緒狀態之 生命品質的32點評估-得分在32至224範圍内，較高得分指 示較佳生命品質）、類風濕性關節炎生命品質表（Quamy 〇f Life Rheumatoid Arthritis Scale)或該領域中已知之其他已 接受之臨床評估量表。疾病或病症症狀持續（例如一或多 天，較佳更久）減輕至少1〇%或給定臨床量表的一或多個點 指示治療”有效”。相似地，若相對於未經組合物治療之相 似個體（人類或動物模型）之一或多種症狀，該等症狀之發 作或嚴重性延遲、降低或破壞，則使用如本文所述之組合 物執行之預防”有效"。 可在預防性及治療性環境中利用含有根據本發明之配位 體或其混合物之組合物以輔助改變、滅活、殺死或移除哺 号L動物中之所選把標細胞群體。另外，可體外或活體外選 擇性地使用本文所述之多狀之所選庫以殺死、耗盡或者有 效地移除來自異質細胞集合之靶標細胞群體。可體外組合 哺乳動物之血液與配位體，例如抗體、細胞表面受體或其 129025.doc -134- 200848427 結合蛋白質’藉此使來自血液的不當細胞殺死或者自血液 中移除，使血液根據標準技術返回至哺乳動物中。 I:根據本發明之半衰期增強之雙特異性配位體的用途 可在活體内治療及預防性應用、活體内診斷應用及立類 似應用令使用根據本發明之方法之雙特異性配位體以及包 s或夕個士口纟文所疋義4單一可變域的配位體。 根據本發明製備之雙特異性配㈣以及包含—^個如 本文所定義之單-可變域的配位體之治療及預防性用途包 括將根據本發明之配位體投與哺乳動物接受者，諸如人 類:根據本發明之雙特異性抗體以及包含一或多個如本文 Z定義之單一可變域之配位體包含至少一種對半衰期提高 刀子之特異性；-或多種其他特異性可針對標乾分子。例 士又特異性IgG可對4種抗原決定基具有特異性，其中一 二於半哀期提高分子上。雙特異性以及三特異性以及高 貝〜可允0午包含至少一個單一可變域之配位冑以極大親和 ϋ結合多聚抗原。雙特異性配位體可允許兩個抗原交聯， 例如在募集細胞毒性τ細胞以介導腫瘤細胞株之殺死過程 中。 人根據本發明之方法之大體上純之雙特異性配位體以及包 ^或夕個如本文所定義之單一可變域的配位體或其結合 蛋白貝（諸如至少9〇·95%均質之單一可變域單體，例如⑽ 單體）車乂仏用於向哺乳動物投藥，且98-99%或99%以上之 句貝r生最仏用於醫藥用途，尤其當哺乳動物為人類時。一 一、、、屯化，°卩分或完全達至所需均質性之配位體可用於診斷 129025.doc -135- 200848427 或治療（包括體外）或發展及執行檢定程序、免疫螢光染色 及其類似程序中（Lefk〇vite及pernis， （1979及 1981)Immunological Meth〇ds，第 I卷及第 1]：卷，Academic Press，NY) 〇 根據本發明之方法之雙特異性配位體以及包含一或多個 如本文所定義之單一可變域的配位體通常將用於預防、抑 止或治療發炎性病況、過敏性超敏反應、癌症、細菌或病 毒性感染及自體免疫性病症（其包括（但較佳不限於}1型糖 尿病、多發性硬化症、類風濕性關節炎、全身性紅斑性狼 瘡症、克羅恩氏病及重症肌無力）。 在本申請案中，術語”預防”包括在誘導疾病之前投與保 護11、、且a物。抑止”係指在誘導事件後但在疾病之臨床表 現前投與組合物。，，治療”包括在疾病症狀表現後投與保護 性組合物。 可利用在保護不受疾病影響或治療疾病中可用於篩選雙 特異性配位體之有效性的動物模型系統。在此項技術中已 知在易感小鼠中測試全身性紅斑性狼瘡症（SLE)之方法 (Kmght等人，（1978) j•細施必147: 1653 ;汉如⑽加 等人，（1978) TVs ·孚乂 Md，299: 515)。藉由以來自另 一物種之可溶性AchR蛋白質誘導疾病在s JL/J雌性小鼠中 測试重症肌無力（MG)(Lindstrom等人，（1988) 42: 233)。藉由注射„型膠原蛋白在易感小鼠品 系中誘導關節炎（Stuart等人，（1984)知細7_關〇/， 42: 233)。已描述藉由注射分枝桿菌熱激蛋白在易感大鼠 129025.doc -136 - 200848427 中誘導佐劑性關節炎之模型（Van Eden等人，（1988) iVa〜n，331: 171)。如所述藉由投與甲狀腺球蛋白在小鼠 中誘導甲狀腺炎（Maron等人，（1980) 乂五;φ. Md.，152: 1115)。胰島素依賴型糖尿病（IDDM)係天然發生的或可在 諸如 Kanasawa等人，（1984) 27: 113所述之某 些品系小鼠中誘導。EAE小鼠及大鼠充當人類MS之模型。 在該模型中，藉由投與髓磷脂鹼性蛋白質誘導脫髓鞘病 (參見 Paterson (1986) 〇//麵灯，
Mischer 等人，編，Grune及 Stratton，New York，第 179-213 頁，McFarlin 等人 ’（1973) 179: 478 ;及 Satoh 等 人，(19 8 7) J. /所 m ο / ·，1 3 8: 1 7 9) 〇 能夠與内飲作用（endocytosis)中涉及之細胞外標靶（例如 内涵蛋白（Clathrin))結合之根據本發明之雙特異性配位體 及dAb單體使得雙特異性配位體能夠被内飲，使另一能夠 結合細胞内標乾之特異性能夠輸送至細胞内環境。該對策 茜要雙特異性配位體具有使得在細胞内能夠保留功能的物 理特性。或者，若最終目的地細胞内室為氧化的，則適當 摺疊之配位體不可能要求不含二硫化物。 通常，本發明雙特異性配位體將以純化形式連同藥理學 上適當載劑一起利用。通常，該等載劑包括水性或醇/水 性溶液、乳液或懸浮液、包括鹽水及/或緩衝介質之任何 載劑。非經腸媒劑包括氣化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋 糖及氯化鈉及乳酸化林格氏溶液。若需要將多肽複合物保 持在懸浮液中，則適當生理學上可接受之佐劑可選自諸如 129025.doc -137- 200848427 幾甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、明膠及海藻酸鹽之稠化 劑0 靜脈内媒劑包括流體及營養素補充劑及電解質補充劑， 諸如彼等基於林格氏右旋糖者。亦可存在防腐劑及諸如殺 菌劑、抗氧化劑、螯合劑及惰性氣體之其他添加劑（Mack
Remington’s Pharmaceutical Sciences，第 \6版）〇 了以獨立投與之組合物形式或聯合其他藥劑一起使用本 發明之配位體。該等其他藥劑可包括各種免疫治療藥物， 諸如環孢素、甲胺喋呤、阿德力黴素或順鉑，及免疫毒 素。醫藥組合物可包括各種細胞毒素之，，混合物"或聯合本 發明之配位體之其他藥劑。
根據本發明之醫藥組合物之投藥途徑可為一般熟習此項 技術者通常已知之任一途徑。對於包括(但不限於)免疫療 法之療法，可根據標準技術將本發明之配位體投與任何患 者。可藉由任何適當模式投藥，包括非經腸、靜脈内、^ 肉=、腹膜内、經皮、經由肺部途徑，或亦適當地藉由以 導管直接輸注。投藥之劑量及頻率將依賴於患者之年齡、 性別及病狀，其他藥物之同時投與、臨床醫師所 適應症及其他參數。 u 可將本發明之配位體; 東乾用以儲存及在使用前在適當載 劑中復水。該技術已展示對於習知免疫球蛋白有效且; ==已:°之_復水技術。熟習此項技術者應 瞭解康乾及设水可導致不同程度之抗體活性損失(例如對 於習知免疫球蛋白’ IgM抗體比IgG抗體趨向於具有更大的 129025.doc -138- 200848427 活性損失）且可能必需上調用量以抵消損失。 可投與含有本發明配位體 e 物之組合物用以預防 f生及/或療性治療。在此 部分抑制、抑止ί節Γ/ 中，將實現至少 旦、，, Ρ周即、咸死所選細胞群體或某些其他可 里測之參數的足夠量定羞兔π、么 義為&療有效劑量，，。實現該劑量 所品之置將依賴於疾病之嚴 ^ u, ^ y i 4里炫夂心者自身免疫系統之總 體狀況，但通常在每公斤體 内，更通常使用每劑。。5至2。./ mg配位體範圍 麻用，* g/kg之劑量。對於預防性 μ '、可以相似或稍微低之劑量投虚含;^# Μ 或其混合物之組合物。 ^又心有本發明配位體 可在預防性及治療性環境中利用含有根據本發明之配位 物以輔助改變、滅活、殺死或移除哺乳動物中之 所遠靶標細胞群體。 另外，可體外或活體外選擇性地使用本文所述之多肽之 =庫：殺死、耗盡或者有效地移除來自異質細胞集合之 ί 革巴^群體。可體外組合哺乳動物之血液與配位體，例 如抗體、細胞表面受體式盆&士人 认私 又體次其結合蛋白質，藉此使來自血液 的不¥細胞殺死或者自血液中 , 有目血液中移除’使血液根據標準技術 返回至哺乳動物中。 包含用於結合一系列物福之A、主 ^ ^物種之血/，白蛋白的單 位體之選擇及表徵 U之配 配位體可包含一或多個單一 又^ 例如免疫球蛋白置 一可變域及/或非免疫球蛋白單一 ^ j文域，其中該等單一 可k域之至少一者特異性結合 ^ M及非人類物種之血清 129025.doc -139- 200848427 生【：。在一實施例令’單-可變域僅特異性“人類内 生性血清白蛋白。在另-實 、1°口人類内 合非人類物種之化生也例十，早—可變域特異性結 入人類二。或者，單-可變域特異性社 口人類内生性血清白蛋白以及— 性、、口 性血清白 次夕種非人類物種之内生 蛋白作為-個非限制性實例，該 特異性結合人類與獼猴 U ° 鼠之内生性血清白蛋白血清白蛋白，或人類與大 人猫， 蛋白或人類與小鼠之血清白蛋白，或 自 次者，早一可變域特異性結合來 自兩種或兩種以上非人類物種之兩種或兩種以上血清白蛋 如本文所用，血清白蛋白可藉由物種之内生性基因， 然血清白蛋白’及/或藉由其重組等效物表現。在 貫知例中’血清白蛋白包括天然及重組血清白蛋白之片 =、類似物及衍生物。血清白蛋白之該等片段包括含有血 清白蛋白、較佳人類血清白蛋白之域！、域咖或細， 或各域I、II及III的一或兩種或更多種的組合之片段。血清 蛋白之域II較佳作為如本文所定義之單一可變域的標 靶。其他較佳組合為域〗與域π ; 與域ΠΙ ;域〗〖與域 及僅域1 ’僅域11 ;及僅域111 ;及域I與域II與域III。 在一貫施例中，血清白蛋白為在諸如動物宿主之非人類宿 主或諸如酵母或細菌之單細胞宿主中外生表現之重組血清 白蛋白。 内生血Θ白蛋白之物種包括表現内生性企清白蛋白之任 何物種，包括（但較佳不限於）人類、小鼠、鼠類、大鼠、 獼猴、豬、狗、貓、馬、山羊及倉鼠之物種。在某些情況 129025.doc -140- 200848427 下’排除絡·|它或羊馬它（lama)之内生性血、、主 h白蛋白。 單-可變域可為免疫球蛋白單—可變域，其包括 佳不限於）抗體重鏈單-可變域、抗體％重鏈單—可: 域、人類抗體重鏈單-可變域、人類Vh3重鏈單_可^ 域、抗體輕鏈單一可變域、人類抗體輕鏈單一可變域、= 類抗體K輕鏈單一可變域及/或人類λ輕鏈單一可變域' 人
特異性結合血清白蛋白之單一可變域可為包含免疫球蛋 白支架或非免疫球蛋白支架之單一可變域。血清白蛋白社 合之單一可變域可包含來自抗體可變域、 :
«，CDR.CDR2,CDR3^^,lt：：；；I 中將CDR區提供在非免疫球蛋白支架上，該等支架諸如 CTLA-4、脂質運載蛋白、葡萄球菌蛋白A(spA)、仏〇此及 纖連蛋白、運鐵蛋白（可購自Bi〇rexis)、AvimerTM及 Affibody™支架。或者，血清白蛋白結合之非免疫球蛋白 單一可變域可既不含抗體CDR區亦不含抗體之完整結合 域。或者’血清白蛋白結合之單一可變域可為包含來自抗 體可變域、較佳來自單一可變域之Cdrj、CDR2及CDR3 之任一者中的一者或兩者或三者之單一可變域；可將該等 CDR區提供在重鏈或輕鏈抗體框架區上。框架包括（例如） 諸如VH3(包括DP47、dp38及DP45)2Vh框架及前述Vhh框 架以及包括vK(諸如DPK9)& νλ框架之Vl框架。在某些實 施例中’可變域包含至少一個具有由人類生殖細胞系抗體 基因片段編碼之胺基酸序列或相對於由人類生殖細胞系抗 體基因片段編碼之胺基酸序列包含多達5個胺基酸差異之 129025.doc -141 - 200848427 胺基酸序列的人類框架區。在其他實施例中，可變域包含 4個人類框架區FW1、FW2、FW2及FW4，其具有由人類生 殖細胞系抗體基因片段編碼之胺基酸序列或相對於由人類 生殖細胞糸抗體基因片段編碼之胺基酸序列共同含有多達 10個胺基酸差異之FW1、FW2、FW3及FW4的胺基酸序 列。在一實施例中，將所有三個CDR區提供在如本文所定 義之免疫球蛋白支架（例如重鏈或輕鏈抗體支架）或非免疫 球蛋白支架上，任一支架均可為非人類、合成、半合成的 支架。或者，將CDR1、CDR2及/或CDR3區中之一者、兩 者或所有三者之任何組合提供在免疫球蛋白支架或非免疫 球蛋白支架上，例如，僅將CDR3區或將CDR2及CDR3區 一起，或將CDR1及CDR2提供在免疫球蛋白支架或非免疫 球蛋白支架上。用於該等CDR移植之適當支架及技術為熟 習此項技術者所清楚且在此項技術中熟知，參看例如美國 申請案 07/180,370 ; WO 01/27160 ; EP 0 605 522 ; EP 0 460 167 ;美國申請案-07/054,297 ; Nicaise 等人，Protein Science (2004)，13:1882-1891 ; Ewert等人，Methods，2004 年 1〇月；34(2): 1 84-199 ; Kettleborough等人，Protein Eng· 1991 年 10 月；4(7): 773-783 ; O’Brien 及 Jones，Methods Mol· Biol. 2003: 207: 81-100 ;及 Skerra，J. Mol· Recognit. 2000： 13: 167-187 ;及 Saerens等人 ’ J· Mol· Biol. 2005年 9 月23日；352(3): 597-607，及其中引用之其他參考文獻。 配位體可包含一或多個該特異性結合血清白蛋白之單一 可變域，其較佳包含至少一個特異性結合人類内生性血清 129025.doc -142- 200848427
白蛋白與至少一種非人類物種内源之其他血清白蛋白的單 -可變域。在-實施例中’該單—可變域以在其特異性結 合（亦即交叉反應）至少一種非人類物種内生性血清=蛋白σ 之Kd值的10倍内之Kd值特異性結合人類内生性血清白蛋 白。或者，該單一可變域以在其特異性結合（亦即交又反 應）至少一種非人類物種内生性血清白蛋白之Kd值的Η、 2〇、25、30、50或多達約10〇倍内之轉特異性結合人類 内生性血清白蛋白。在某些實施例中，Kd可在⑽心至 約5 PM範圍内。在其他實施例中，單一可變域以至少 5X10-1 S·1、5Xl〇-2 S·1、S·1、叫〜、5x1〇-5 S·】、5X1G·6 S_1、5X1G·7 s.1、f、5x1g.9 y、 5X10·1 ❶ S-U5x10- s·’以下之^，較佳 h US」範圍内之K〇ff特異性結合血清白蛋白。 在-實施例中，該單-可變域以在其特異性結合（亦即 交叉反應)至少-個第二非人類物種内生性血清白蛋白之
Kdr的1G倍内之咖特異性結合第-非人類物種内生性 血/月白蛋自$者，該單_可變域以在其特異性处人（亦 即交叉反應）至少-個第二非人類物㈣ 之Kd值的15、20、25、30、/月曰隻白 旦士八第一 、 或多達約1〇0倍内之Kd值特 .r , 0 月白蛋白。在某肚實施 例中，Kd可在3〇〇nM至約5pM範圍 ：: 中，箪一可轡只 在其他實加例 中早了夂域Μ至少5xl(rl ^、叫〇 S·1、5ΧΗΓ4 S.1、5χ1〇·5 ! 、5X10 一〜〜5 /: S'—·1、
^ N 5xi〇-i〇 Q-i λ, r tA S或5x10-10 p以下之 129025.doc -143- 200848427
Koff，較佳以lxio·6 S-1至lxio·8 S·1範圍内之Koff特異性結 合jk清白蛋白。 例如，該配位體可包括免疫球蛋白單一可變域，其中該 免疫球蛋白單一可變域特異性結合人類血清白蛋白及小鼠 血清白蛋白，且其中在小鼠宿主中配位體之τβ半衰期與小 鼠血清白蛋白之Τβ半衰期大體上相同。在該配位體之一種 型式中，抗原決定基結合域含有特異性結合人類血清白蛋 白及小鼠血清白蛋白之非免疫球蛋白支架，且其中配位體 之Τβ半衰期大體上與小鼠宿主中之小鼠血清白蛋白之Τβ半 衰期相同。短語”大體上相同”意謂在小鼠宿主中配位體的 Τβ半哀期為小鼠宿主中小鼠血清白蛋白之Τβ半衰期的至少 5 0%，小鼠宿主中小鼠血清白蛋白之Τβ半衰期的至少 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、 94%、95%、96%、97% - 98%、99%、100%、101%、 102%、105%、110%、125%及高達150%。非免疫球蛋白 支架可視情況包括抗體單一可變域之片段，諸如抗體可變 域之一或多個CDR區，包括在人類宿主中具有在人類宿主 中人類血清白蛋白之Τβ半衰期的至少50%、55%、60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、94°/。、95%、 96%、97%、98%、99%、101%、102%、105%、110〇/〇 ' 125%或高達150%之Τβ半衰期的抗體單一可變威。 例如，一個實施例為單一可變域，其中該單〆 < 變域特 異性結合人類血清白蛋白及大鼠血清白蛋白，真其中配位 體之Τβ半衰期與大鼠宿主中大鼠血清白蛋白之Τβ半衰期大 129025.doc •144- 200848427 體上相同。在該配位體之一種塑式中，單一可變結合域含 有特異性結合人類血清白蛋白及大鼠血清白蛋白之非免疫 球蛋白支架，且其中在大鼠宿主中配位體之τβ半衰期與大 鼠血清白蛋白之Τβ半衰期大體上相同。短語π大體上相同π 意謂在大鼠宿主中配位體的τβ半农期為大鼠宿主中大鼠企 清白蛋白之Τβ半衰期的至少50°/。，高達大鼠宿主中大鼠血 清白蛋白之Τβ半衰期的55%、60%、65%、70%、75%、 80〇/〇、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%、100%、101%、102%、105%、110%、125%、高達 1 50%。非免疫球蛋白支架可視情況包括抗體單一可變域 之片段，諸如抗體可變域之一或多個CDR區。 例如，配位體可包括免疫球蛋白單一可變域，其中該免 疫球蛋白單一可變域特異性結合人類血清白蛋白及豬血清 白蛋白，且其中在猪宿主中配位體之Τβ半哀期與豬血清白 蛋白之Τβ半衰期大體上相同。在配位體之一種型式中，抗 原決定基結合域含有特異性結合人類血清白蛋白及豬血清 白蛋白之非免疫球蛋白支架，且其中在豬宿主中配位體之 Τβ半衰期與緒血清白蛋白之τβ半衣期大體上相同。短語 ，，大體上相同，，意謂在豬宿主中配位體之Τβ半衰期為豬宿主 中豬血清白蛋白之Τβ半衰期的至少5 0°/()，高達豬宿主中豬 血清白蛋白之Τβ半衰期的55%、60%、65%、70%、75%、 80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%、100%、1〇1〇/0、102%、105%、uo%、125%、高達 1 50%。非免疫球蛋白支架可視情況包括抗體單一可變域 129025.doc -145 - 200848427 之片段，諸如抗體可變域之一或多個CDR區，包括抗體單 一可變域。 例如，配位體可包括免疫球蛋白單一可變域，其中該免 疫球蛋白單一可變域特異性結合人類血清白蛋白及獼猴血 清白蛋白，且其中在獼猴宿主中配位體之Τβ半衰期與獼猴 血清白蛋白之Τβ半衰期大體上相同。在配位體之一種型式 中，結合血清白蛋白之域含有特異性結合人類血清白蛋白 及獼猴血清白蛋白之非免疫球蛋白支架，且其中在獼猴宿 主中配位體之Τβ半衰期與獼猴血清白蛋白之Τβ半衰期大體 上相同。短語”大體上相同”意謂在獼猴宿主中配位體之Τβ 半衰期為獼猴宿主中獼猴血清白蛋白之Τβ半衰期的至少 50%，高達獼猴宿主中獼猴血清白蛋白之Τβ半衰期的 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、101%、 102%、105%、110%、125%或高達 150%。 非免疫球蛋白支架可視情況包括抗體單一可變域之片 段，諸如抗體可變域之一或多個CDR區。 在一實施例中，配位體及/或雙特異性配位體含有特異 性結合人類内生性血清白蛋白之單一可變域，其在人類宿 主中之Τβ半衰期為人類宿主中人類血清白蛋白之Τβ半衰期 的至少50%，高達人類宿主中人類血清白蛋白之Τβ半衰期 的 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、 92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、 101%、102%、105%、110%、125°/。或高達 150%。在一較 129025.doc -146- 200848427 佳實施例中，特異性結合非人類内生性血清白蛋白之單一 可變域在其個別非人類宿主中之τβ半衰期為其個別非人類 宿主中非人類血清白蛋白之τβ半衰期的至少5〇%，高達個 別非人類宿主中非人類血清白蛋白之τρ半衰期的55%、 60%、65%、70%、75%、8〇%、85%、9〇%、92%、94%、 95%、96%、97〇/〇、98〇/〇、99〇/〇、100%、1〇1%、1〇2%、 1〇5%、110%、125%或高達15〇%。在一較佳實施例中，特 異性結合人類内生性血清白蛋白且亦特異性結合至少一種 非人類物種之血清白蛋白的單一可變域在人類宿主中之τβ 半衰期高達人類宿主中人類血清白蛋白之叩半衰期的 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、9〇%、92%、 94%、95%、96%、97%、98%、99。/。、1〇1%、1〇2%、 105%、110%、125%或高達15〇%，且在非人類宿主中之邛 半衰期高達其個別非人類宿主中非人類血清白蛋白之Τρ半 衰期的 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、 92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、1〇0%、 101%、102%、105%、110%、125%或高達 15〇%。在某些 實施例中，特異性結合血清白蛋白之單一可變域之半衰 期可在低至2小時至多達（且包括）3小時、4小時、5小時、6 小時、7小時、8小時、9小時、1〇小時、u小時、12小 時、14小時、16小時、18小時、20小時、22小時、i天、2 天、3天、4天、4天、6天、8天、10天、12天、14天、16 天、18天、高達21天或更久時間範圍内。在人類宿主以及 諸如豬、獼猴、大鼠、鼠類、小鼠宿主之非人類宿主中， 129025.doc -147- 200848427
特異性結合血清白蛋白之單一可變域之邛半衰期可在低至 2士小時至多達（且包括）3小時、4小時、5小時、6小時、7小 時、M、時、9小時、1G小時、u小時、12小時、14小時、 16小時、18小時、2〇小時、22小時、i天、2天、3天、4 天6天、8天、1〇天、12天、14天、16天、18天、 高達21天或更久時間範圍内。包含特異性結合血清白蛋白 的單一可變域之配位體之其他較佳Τβ半衰期包括：在猴宿 主中約3至約5、6、7或8天，包括低至2小時至多達（且包 括）3小呀、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小 時、ίο小時、u小時、12小時、14小時、16小時、18小 時、20小時、22小時、i天、2天、3天、4天、4天、6天、 8天、10天、12天、14天、16天、18天、高達21天。在大 鼠或小鼠宿主中，特異性結合血清白蛋白之單一可變域之 Τβ半衰期可在低至40小時至高達約75小時範圍内，且包括 低至2小時至多達（且包括）3小時、4小時、5小時、6小時、 7小時、8小時、9小時、1 〇小時、11小時、12小時、14小 時、16小時、18小時、20小時、22小時、1天、2天、3 天、4天、4天、6天、8天、10天、12天、14天、16天、18 天、高達21天。 特異性結合血清白蛋白之單一可變域包括VK單^-*可變 域，其選自（但較佳不限於瓜0河711-900]\4711-1、001^711-8、DOM7h-9、DOM7h-ll 、DOM7h-12、DOM7h-13 及 DOM7h-14。DOM7卜3及DOM7r_16，及/或彼等與選自（但 較佳不限於）以下之單一可變域競爭結合血清白蛋白（較佳 129025.doc •148· 200848427 人類血清白蛋白）之域：dAb7r20、dAb7r21、dAb7r22、 dAb7r23 、 dAb7r24 、 dAb7r25 、 dAb7r26 、 dAb7r27 、 dAb7r28 、 dAb7r29 、 dAb7r30 、 dAb7r31 、 dAb7r32 、 dAb7r33 、 dAb7h21 、 dAb7h22 、 dAb7h23 、 Ab7h24 、
Ab7h25 、 Ab7h26 、 dAb7h27 、 dAb7h30 、 dAb7h31 、 dAb7m 12 、 dAb7m 16 、 dAb7m26 、 dAb7r 1 、 dAb7r3 、 dAb7r4 、 dAb7r5 、 dAb7r7 、 dAb7r8 、 dAb7r 13 、 dAb7rl4、dAb7rl5、dAb7rl6、dAb7rl7、dAb7rl8、 dAb7rl9 、dAb7hl 、dAb7h2 、dAb7h6 、dAb7h7 、 dAb7h8、dAb7h9、dAb7h 10、dAb7hl 1 、dAb7hl 2、 dAb7hl3、dAb7hl4、dAb7pl 及 dAb7p2。特異性結合血清 白蛋白之單一可變域可為抗體重鏈單一可變域，尤其為人 類Vh3或Vhh。前述單一可變域亦可以至少5X10·1 S·1、 5xl〇·2 S-1、5xl〇·3 S-1、5χ10'4 S·1、5χ10'5 S*1 > 5χ10'6 S·1、5xl(T7 S·1、5χ1(Γ8 S-1、5xl〇-9 S-1、5χ1(Γ10 S.1 或 5xl〇-10 S_1以下之Koff，較佳以範圍介於lxio·6 s·1至lxlO-8 S_1之Koff另外特異性結合人類血清白蛋白。特異性結合人 類血清白蛋白及非人類物種内生性血清白蛋白之單一可變 域可進一步結合第三、第四、第五、第六、第七、第八、 第九或第十非人類物種之内生性血清白蛋白。在一個非限 制性實施例中，特異性結合人類血清白蛋白及大鼠血清白 蛋白之單一可變域進一步特異性結合獼猴血清白蛋白。在 另一非限制性實施例中，特異性結合人類血清白蛋白及小 鼠血清白蛋白之單一可變域進一步特異性結合獼猴血清白 -149- 129025.doc 200848427 蛋白。 如本文所述，含有特異性結合血清白蛋白之一個單一可 變域（單體）或-個以上單—可變域（如本文所定義之多聚 體、融合蛋白質、結合物及替牲s❿^ 口 μ汉又特異性配位體）之配位體可 進一步包含一或多種選自（作軔件π阳 〜《、丨-平乂仫不限於）以下各物之實 體·標戴、_示s己物、另一單一可傲 早可纟交域、dAb、抗體及抗體 片段、標記及藥物。一或多種此等實體可位於包含單一可 變域（免疫球蛋白或非免疫球蛋白單一可變域）之配位體之 COOH末端或N末端或N末端與c〇〇H末端。一或多種此等 實體可位於配位體之特異性結合血清白蛋白之單一可變域 的COOH末端或N末端或N末端與COOH末端，該配位體含 有一個單一可變域（單體）或一個以上單一可變域（如本文所 定義之多聚體、融合蛋白質、結合物及雙特異性配位 體）。可位於5亥專末端之一或兩者的標記物之非限制性實 例包括HA、his或myc標記物。包括一或多種標記物、標 籤及藥物之實體可與含有一個單一可變域（單體）或一個以 上單一可變域（如本文所定義之多聚體、融合蛋白質、結 合物及雙特異性配位體）之配位體結合，該單一可變域直 接或經由如下文獨立部分中所述之連接子結合血清白蛋 白。 如下文進一步所述，含有一個單一可變域（單體）或一個 以上單一可變域（如本文所定義之多聚體、融合蛋白質、 結合物及雙特異性配位體）之配位體可特異性結合人類血 清白蛋白之域I及/或域II及/或域III中之一或多者，該單一 129025.doc -150- 200848427 可變域特異性結合血清白 白與至少-種非人類血清白結合人類血清白蛋 結合諸如人類▲清白蛋主。除3有-或多個特異性 血清白蛋白與至少一種非人：白f白或特異性結合人類 類血清白蛋白之單一可變:Μέ (例如血清白蛋白結合免疫球 早^欠域 占士 ’蛋白早一可變域或jk清白| 白、、、。a非免疫球蛋白單一 了文域）外，配位體還可含有一 或多個其他能夠特異性結 ,
C
或抗原決定基之域，該抗原：:；白蛋白以外的抗原及/ 激ώ 原或抗原決定基選自由包括細胞 病毒、藻類及植物之抗/二早細胞生物體、昆蟲、 筮一十夕 抗原之任何動物蛋白質組成之群。該 总〜 以蛋白料的部分之額外域可為非 免疫球蛋白結合域、 為非 球蛋白單-可變域。球蛋白早—可變域及/或免疫 在某些實施例中，含右— 4夕個特異性結合諸如人類血 少一白蛋白或特異性結合人類血清白蛋白與至 人類血清白蛋白之單-可變域(免疫球蛋白單 可變域或非免疫球蛋白單一可 (:蛋白早- 包含⑷特異性結“清白蛋白之單Λ)的雙特異性配位體可 除血清白蛋白Μ…早—可變域及特異性結合 域均為重-體之單一可變域’兩個單-可變 ，、、'鏈早-可變域；或⑻特異性結合血清 一可變域及特異性結合除 之早 可〜七 σ除血，月白蛋白以外的配位體之單一 性單-可變域，特異 異性結合除血重鍵單-可變域，且特 β蛋白以外的抗原之單一可變域為輕鍵單 129025.doc -151 - 200848427 -：變域：或⑷特異性結合血清白蛋白之單一可變域為輕 j早-可變域’且特異性結合除血清白蛋白以外的抗原之 單一可變域為重鏈單一可變域。 本文亦包涵編碼本文所述之任何配位體或其功能活性片 段的經分離核酸，例如含有一個單一可變域（單體）或一個 以上皁一可變域(例如，如本文所定義之多聚體、融合蛋 白質、結合物及雙特異性配位體）之配位體，該單一可變 域特異性結合血清白蛋白或特異性結合人類血清白蛋白與 至少一種非人類血清白蛋白。本文亦包涵其載體及/或表 現載體、包含該載體之宿主細&，例如經載體轉型之植物 或動物細胞及/或細胞株，表現及/或產生一或多種含有一 個單一可變域（單體）或一個以上單一可變域（例如，如本文 所定義之多聚體、融合蛋白質、結合物及雙特異性配位 體）之配位體或其由該載體編碼的片段之方法，該單一可 變域特異性結合血清白蛋白，該方法在某些情況下包括培 養佰主細胞以便表現該一或多種配位體或其片段，及視情 況自佰主細胞培養基回收該含有一個單一可變域（單體）或 一個以上單一可變域（例如，如本文所定義之多聚體、融 合蛋白質、結合物及雙特異性配位體）的配位體，該單一 可變域特異性結合血清白蛋白。亦包涵使本文所述之配位 體與包括血清白蛋白及/或非人類血清白蛋白之血清白蛋 白及/或一或多種除血清白蛋白以外的標靶接觸之方法， 其中该專彳示革巴包括生物學活性分子且包括如上文所列之動 物蛋白質細胞激素，且包括活體外接觸以及活體内及/或 離體將本文所述之任何配位體投與個體宿主動物或細胞之 129025.doc -152· 200848427 方法。較佳地’投與本文所述之包含針對血清白蛋白及/ 或非人類血清白蛋白之單一可變域（免疫球蛋白或非免疫 球蛋白）及一或多個針對除血清白蛋白以外的一或多種標 靶之域的配位體將增加抗標靶配位體之半衰期，包括I半 衣期。本文描述編碼含有單一域之配位體或其片段（包括 其功能片段）的核酸分子。本文描述編碼核酸分子之包括 (但較佳不限於）表現載體之載體，如來自含有一或多種該 等表現載體之細胞株或生物體的宿主細胞。亦描述產生任 何含有單一域之配位體（包括（但較佳不限於）上述核酸、載 體及宿主細胞之任一者）的方法。 血清白蛋白之抗原決定基定位 哺乳動物物種之血清白蛋白具有相似結構，如圖25所突 出顯示，其含有三個具有類似摺疊及二硫化物鍵結之圖案 的主要域。咸信該蛋白質由於兩個順接重複事件及後續殘 基多樣化而產生。 已在有/無多種結合配位體之情況下，由X-射線晶體繞 射解釋人類血清白蛋白之結構： • Atomic structure and chemistry of human serum albumin. He XM，Carter DC· • 1992; 358: 209-15.於Arwwre 1993; 364: 362 中勘誤。 • Atomic structure and chemistry of human serum albumin. He XM? Carter DC; J Mol BioL 2001; 314: 955-60 〇 129025.doc -153 - 200848427 • Crystal structures of human serum albumin complexed with monounsaturated and polyunsaturated fatty acids, Petitpas I, Grune T, Bhattacharya AA? Curry S.; J Biol C/z亂 2001; 276: 22804-9。 已展示人類血清白蛋白為心形分子。稱為I、II及ΠΙ之個 別域主要為螺旋狀，且各由兩個稱為ΙΑ、IB、ΙΙΑ、2Β、 ΙΙΙΑ及ΙΙΙΒ之子域組成。其由可撓性無規線圈連接。 本文描述含有一或多個特異性結合人類血清白蛋白之域 II的單一可變域之配位體。單一可變域可為VH抗體單一可 變域。單一可變域可為VHH抗體單一可變域。VH單一可變 域可為VH3單一可變域。VH3單一可變域可為人類VH3單一 可變域。配位體可或者或另外包括單一可變域，該單一可 變域為包括以下單一可變域之一者的vK抗體單一可變域： DOM7h-l、DOM7h-8、DOM7h-9、DOM7h-ll、DOM7h-12、DOM7h-13、DOM7h-14、DOM7r-3 及 DOM7r-16 或具 有與其約 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%或99%以上一致之胺基酸序 列的域之VK抗體單一可變域。 抗體單一可變域可包括一組4個Kabat框架區（FR)，其由 抗體VH、較佳VH3、框架生殖細胞系抗體基因片段編碼。 VH3框架係選自由DP47、DP38及DP45組成之群。抗體單 一可變域可包括一組4個Kabat框架區（FR)，其由抗體框 架、較佳VK框架、生殖細胞系抗體基因片段編碼。κ框架 較佳為DPK9。 129025.doc -154- 200848427 可變域之配位體可進一步包括一或多個能夠特異性結合除 血：：蛋白以外的部分之域，且可進一步包含一或多種包 括標籤、標記物及藥物中之一或多者之實體。該一或多個 能_異性結合除血清白蛋白以外的部分之域可為免疫球 蛋白單彳變域。本文亦描述含有一或多個特異性結合人 3有或多個特異性結合人類血清白蛋白之域n的單—
類血仴白蛋白之域π的單—可變域之配位體，該域包括非 免疫球蛋白支架及CDR1、CDR2&/或CDR3區或其中 、CDR2及/或CDR3區域中之至少一者來自結合人類 血Θ白蛋白之域II的抗體單一可變域之單一可變域。非免 疫球蛋白支架包括（但較佳不限於）CTLA_4、脂質運載蛋 白、葡萄球菌蛋白 A(SPA)、AffibodyTM、AvimersTM、
GroEL及纖連蛋白。 3有或夕個特異性結合人類血清白蛋白之域II的單一 可變域之配位體包括彼等以小於或等於3〇〇 nM2Kd特異 :、° 口人類血’月白蛋白之域。含有-或多個特異性結合人 類血/月白蛋白之域η的單一可變域之配位體可進一步包含 或夕個包括一或多種標籤、標記物及藥物之實體。標記 物可包括或多種C末端以或myc標記物或Ν末端以或 myc標記物。 含有一或多個特異性結合人類血清白蛋白之域II的單-可夂域i可進-步包括一或多個能夠特異性結合除血清 白蛋白以外的部分之域，且可視情況進一步包含一或多種 匕括1籤己物及藥物中之—或多者之實體的配位體可 129025.doc -155- 200848427 經由其單一可變域中之至少一者結合包括（但較佳不限於） 以下之抗原：細胞激素受體、EPO受體、ApoE、Apo-SAA、BDNF、心營養素-1、EGF、EGF受體、ENA-78、嗜 酸性粒細胞趨化因子、嗜酸性粒細胞趨化因子-2、次級淋 巴組織趨化因子、EpoR、酸性FGF、鹼性FGF、纖維母細 胞生長因子-10、FLT3配位體、神經趨化引子（CX3C)、 GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-βΙ、胰島素、IFN-γ、IGF- I、 IGF-II、IL-la、IL-lp、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(72a.a.)、IL-8(77a.a.)、IL-9、IL-10、IL- II、 IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18(IGIF)、 抑制素a、抑制素β、IP-10、角質細胞生長因子-2(KGF-2)、KGF、瘦體素、LIF、淋巴細胞趨化因子、繆勒氏管 抑制物質、單核細胞集落抑制因子、單核細胞引誘蛋白 質、M-CSF、MDC(67 a.a·)、MDC(69 a.a.) > MCP-l(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC(67 a.a·)、 MDC(69 a.a.)、MIG、ΜΙΡ-Ια、ΜΙΡ-3α、ΜΙΡ-3β、MIP-4、骨髓祖代抑制因子-l(MPIF-l)、NAP-2、神經營養因 子、神經生長因子、β-NGF、NT-3、NT-4、制瘤素Μ、 PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、 SDFloc、SDFip、SCF、SCGF、幹細胞因子（SCF)、 TARC、TGF-oc、TGF-β、TGF-β〗、TGFJ3、腫瘤壞死因 子（TNF)、TNF-a、TNF-β、TNF 受體 I、TNF 受體 II、 TNIL-1、TPO、VEGF、VEGF受體 1、VEGF受體 2、VEGF 受體 3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC1、 129025.doc -156- 200848427 1-309、her !、HER 2、HER 3 及 HER 4、CD4、人類趨化 激素受體CXCR4或CCR5、來自C型肝炎病毒之3型非結構 性蛋白質（NS3)、TNF-α、IgE、IFN-γ、MMP-12、CEA、 幽門螺旋菌、TB、流感、E型肝炎、MMP-12、在某些細 胞上過度表現之内化受體（諸如上皮生長因子受體 (EGFR)、腫瘤細胞上之ErBb2受體（内化細胞受體）、ldl 受體、FGF2受體、ErbB2受體、運鐵蛋白受體、pDGF受 體、VEGF受體）、psmAr(細胞外基質蛋白質）、彈性蛋 白、纖連蛋白、層黏連蛋白、al-抗胰蛋白酶、組織因子 蛋白酶抑制劑、PDK1、GSK1、Bad、卡斯蛋白酶_9、又 頭、幽門螺旋菌之抗原、結核分枝桿菌之抗原及流感病毒 之抗原。 含有一或多m寺異性結合人類血清白}白之域π的單一 可變域且可進一步包括一或多個能夠特異性結合除血清白 蛋白以外的部分之域之配位體最低限度為雙特異性2位 體，其可具有以下結構之一者：（a)各該特異性結 蛋白之域II的單-可變域及該特異性結合除血清白蛋^ 外的部分之單—可變域為抗體重鏈單-可變域；或（b)各节 特異性結合血清白蛋白之域„的單—可變域及該特里性:
合除金清白蛋白以外的部分之單-可變域為抗體輕鏈單I 可變域；或⑷該特異性結合企清白蛋白之域π的單一可微 域為抗體重鏈單-可變域，且該特異性結合除血 ： 以外的抗原之單一可變域為抗體輕 ^ 硬早一可變域；或 特異性結合血清白蛋白之域„的單— ° J欠域為抗體輕鏈單 129025.doc -157- 200848427 可k域，且該特異性結合除血清白蛋白以外的抗原之單 一可變域為抗體重鏈單一可變域。包括編碼本文所述之任 何配位體或其片段（包括功能性片段）之核酸分子、包括（但 較佳不限於）表現載體之載體及含有一或多種該等表現載 體之任何類型細胞株或生物體之宿主細胞，及/或產生任 何配位體（包括（但較佳不限於）上述核酸、载體及宿主細胞 之任一者）的方法。 與其他血清蛋白質相比，血清白蛋白具有長血清半衰期 以及血清濃度與部分分解代謝速率之間的正關係（亦即sa 之濃度愈高，所降解量愈高），其與IgG共有此特徵。近來 已出現IgG與血清白蛋白共有由新生Fc受體以以所介導之 再循環機制。FcRn為I型MHC家族成員，其由膜銷定 FCRGT鍵與非膜結合β_2微球蛋白之雜二聚體組成。FcRn 或β-2微球蛋白之小鼠基因剔除突變體表現非功能性 FcRn，且顯示增加之血清白蛋白生物合成速率（增加約 20%)及增加之血清白蛋白分解代謝，引起血清白蛋白之血 清含量降低40%，半衰期縮短（Chaudhry等人，2〇〇5)。在 人類中，β-2微球蛋白之突變作用已展示提供大量降低之 功能性FcRn含量且最終展示以HSA血清半衰期降低表徵之 IgG缺乏及低白蛋白血症（Wani等人2〇〇6, pNAS)。 儘管不希望受理論約束，但所提出之FcRn介導補救的機 制如下： 1.血漿蛋白質經所有血管内襯之内皮細胞及可能的血管 外隔室之内飲活性細胞内飲。此為非特異性步驟，且將吸 129025.doc -158- 200848427 收所有循環蛋白質。在血清pH即約pH 7·4下，FcRn對白蛋 白（及IgG)具有極低親和力。 2 · 内飲後，所形成之微脂粒酸化至pH 5 · 〇。在酸性條件 下，FcRn對白蛋白具有較高親和力且結合白蛋白以及 IgG。因此’白蛋白及1§(5與FcRn受體結合。FcRn在域πι 上之部位經由不同於結合IgG之部位的部位結合人類血清 白蛋白。 3.分選事件發生，藉由其將多數非受體結合蛋白質分選 入内體中，其中大多數蛋白質將針對降解而革巴向。將受體 結合白蛋白及IgG分選入靶向細胞表面之微脂粒中，且因 此免於降解。 4· 接著，革e 革巴向細偷▲矣而夕激Γ日矣私也3一 .
循環中。
处食平衰期的受體。
白質不 129025.doc ，因此使至尿 蛋白與負責維護循環中血 無不利影響，由於此將抑 -159- 200848427 制再循環，且由此降低血清白蛋白與S A結合物之半衰期。 因此，SA結合dAb較佳結合與由FcRn在HSA域III上之結合 不同的抗原決定基，且SA/dAb複合物較佳亦能夠接合 FcRn ;及/或 •與SA之結合較佳將保持在使受體及結合SA/SA結合物 複合物分選或再循環之條件下。已展示内體pH值接近pH 5.0，因此需要dAb與血清白蛋白在pH 7.4與pH 5.0下穩定 結合。 如下文實例15所說明，大多數dAb結合HSA之第二域， 且因此預期其不與FcRn競爭結合人類血清白蛋白。兩個 dAb(DOM7h-27 及 DOM7h_30)結合域 III。 抗-SA DAb在7.4至5.0之pH值.範圍内對SA保持足夠親和 力。 除對SA之親和力外以及在不存在與SA:FcRn複合物之形 成的競爭之情況下，在血清中pH 7.4至内體中pH 5.0之pH 範圍内血清白蛋白特異性dAb較佳將保持對SA之親和力以 獲得FcRn介導之補救途徑的全部益處。 在此pH範圍中，僅組胺酸殘基及具有干擾之pKa之胺基 酸側鏈可能改變其質子化狀態。若胺基酸側鏈對複合物之 結合能作出顯著貢獻，則可預期pH自該範圍内之一個極端 轉變至另一極端可導致複合物之結合親和力降低。儘管不 希望受理論約束，但此接著將導致SA特異性dAb進入降解 途徑而非經由FcRn介導之補救途徑援救的可能性增加。 因此，對於SA結合AlbudAbTM(特異性結合血清白蛋白 129025.doc -160- 200848427 之dAb)而言，需要選擇對血清白蛋白之結合特性並不隨pH 值（在5.0至7.4範圍内）顯著改變者。確保此點之直接方法 將為針對CDR中組胺酸殘基之缺乏分析抗S A dAb之胺基酸 序列。如下所示，可構想該特性之數種選擇程序。 例如，在緩衝液之pH值為pH 7.4(例如PBS)條件下使用 固定之人類血清白蛋白以’原態’ dAb噬菌體庫執行第一輪 選擇。接著使所回收及擴增之噬菌體群體經受第二輪選 擇，其中培育緩衝液之pH值為5.0。在另一輪中視情況重 複緩衝液及pH之交替以在兩個pH下保持對結合HSA之dAb 的選擇壓力。 在第二實例中，在緩衝液之pH值為pH 7.4(例如PBS)條 件下使用固定之人類血清白蛋白以’原態’ dAb噬菌體庫執 行所有輪選擇。然而，恰在以PBS(或補充有吐溫（Tween) 之PBS)洗滌除去未結合之噬菌體之後且在溶離結合之噬菌 體之前，增加另一在pH 5.0下之洗滌/培育步驟，歷時較長 時間段（例如多達4小時）。在此期間，將呈現在pH 5·0下不 能結合SA(但在pH 7.4下能夠結合）之dAb之噬菌體自固定 之SA分離。在第二系列之洗滌步驟（在pH 5·0下有（無）吐溫 下）後，回收且分析結合之嗤菌體。 在第三實例中，在緩衝液之pH值為pH 7·4(例如PBS)條 件下使用固定之人類血清白蛋白以’原態’dAb噬菌體庫執行 所有輪選擇。接著藉由篩選鑑別最佳dAb候選者（亦即在pH 7.4及pH 5.0下能夠結合）。通常，將編碼dAb之基因自所彙 集之所選噬菌體回收，次選殖入指引大腸桿菌培養物之上 129025.doc -161 - 200848427 /月液中的可溶性dAb之表現載體+。挑取個別純系，使其 分別在微量滴定盤之孔中生長，且誘導表現。接著將上清 液（或、、、屯化之dAb)直接裝載於Biac〇re晶片上以鑑別彼等呈 現對固定之血清白蛋白之親和力的dAb。在，流動，緩衝液處 於pH 7.4或pH 5.0之條件下篩選針對與HSA之結合（主要為 傳感圖譜之分解速率迹線）筛選各上清液。應注意Biacore 上dAb結合之篩選亦將用作鑑別以上兩個實例之最佳者的 較佳方法。
本文描述包含如本文中所定義之單一可變域之配位體， 其中a亥單一可變域在天然血清pH值與細胞内微脂粒pH值 下特異性結合血清白蛋白。天然血清pH值為約7(例如 7.4)，且其中該細胞内微脂粒口11值可在約4 8至範圍 内，或可為約5之pH值。在一實施例中，單一可變域可在 約7至5之pH範圍内，或可在pH 74下特異性結合血清白蛋 白。儘管不希望受理論約束，但此配位體之另一特徵為其 特異性結合血清白蛋白之單一可變域大體上不自血清白蛋 白解離，而在腎臟中經受腎小球過濾。儘管不希望受理論 約束，但此配位體之另一特徵為其特異性結合血清白蛋白 之單一可變域大體上不干擾FcRn與血清白蛋白之結合。此 單一可變域可為抗體單一可變域；抗體單一可變域可為 VH3域及/或抗體單一可變域可為％域。此單一可變域可包 含非免疫球蛋白支架，例如CTLA-4、脂質運载蛋白、 SpA、Affibody™、GroEL、AvimerTM 或纖連蛋白支架，且 可含有來自較佳（儘管並非必需）特異性結合血清白蛋白之 129025.doc -162- 200848427 抗體單一可變域的CDR1、CDR2&/或CDR3中之一或多 者。此配位體之單一可變域可特異性結合人類血清白蛋 白，及/或包括來自一或多種例如人類、大鼠、猴、豬、 兔、倉鼠、小鼠或山羊之物種之血清白蛋白。細胞内隔室 可為任何動物之任何細胞的任何細胞内隔室，包括内體隔 室或細胞内微脂粒或出芽微脂粒。内體隔室可具有約5或 5·〇之pH值。本文所述之配位體可含有一或多個包括免疫 球蛋白及/或非免疫球蛋白域之單一可變域，其中血清白 蛋白與單一可變域之結合大體上不競爭性地抑制與血 清白蛋白之結合。該等一或多個單一可變域較佳可以小於 或等於300 nM之平衡解離常數（Kd)特異性結合血清白蛋 白。 本文描述選擇包含單一可變域之配位體之方法，該配位 體含有一個單一可變域（單體）或一個以上單一可變域（例 如如本文中所疋義之多聚體、融合蛋白質、結合物及雙 特異性配位體），該單一可變域特異性結合血清白蛋白， 其中該單一可變域在天然血清pH下特異性結合人類血清白 蛋白，且其中該單一可變域不競爭性地抑制人類血清白蛋 白與FcRn之結合，且其中該單一可變域在細胞内隔室之 pH下特異性結合人類血清白蛋白，該方法包含以下步驟： (A)選擇包含不結合結合FcRn之人類血清白蛋白之區域的 單可變域之配位體，（B)自步驟（A)所選擇之配位體中選 擇包含在該天然血清pH下結合血清白蛋白之單一可變域之 配位體；（C)自步驟（B)中所選擇之配位體中選擇彼等在該 129025.doc -163 - 200848427 細胞内隔室之pH下結合血清白蛋白者。或者，步驟（A)及 (B)可如下顛倒：（A)選擇包含在該天然血清pH下結合人類 血清白蛋白之單一可變域之配位體；（B)自（A)中所選擇之 配位體中選擇包含在結合FcRn之HSA的區域外部結合人類 血清白蛋白之單一可變域之配位體；及（C)自步驟（B)中所 選擇之配位體中選擇彼等在該細胞内隔室之該pH下結合血 清白蛋白者。亦描述選擇包含單一可變域之配位體之方 法，其中該單一可變域在天然血清pH下特異性結合人類血 清白蛋白，其中該單一可變域不競爭性地抑制人類血清白 蛋白與FcRn之結合，且其中該單一可變域在細胞内隔室之 pH下特異性結合人類血清白蛋白，該方法包含以下步驟： (A)選擇包含不結合結合FcRn之人類血清白蛋白之區域的 單一可變域之配位體；（B)自步驟（A)選擇包含在該天然血 清pH下結合血清白蛋白單一可變域之配位體；及（C)遺傳 上修飾步驟（B)之單一可變域，使得其在該細胞内隔室之 該pH下結合血清白蛋白。或者，步驟（A)及（B)可如下顛 倒：（A)選擇包含在該天然血清pH下結合血清白蛋白之單 一可變域之配位體；（B)自（A)中所選擇之配位體中選擇包 含不結合結合FcRn之人類血清白蛋白之區域的單一可變域 之配位體；及（C)遺傳上修飾步驟（B)之單一可變域使得其 在該細胞内隔室之該pH下結合血清白蛋白。 測定單一可變域是否不競爭性地抑制人類血清白蛋白與 FcRn之結合的檢定：競爭Biacore實驗可用於測定單一可 變域是否競爭性地抑制血清白蛋白與FcRn之結合。該實例 129025.doc -164- 200848427 之一種實驗方案如下。在25°C下以約1100共振單位（RU)之 純化FcRn(pH 7.4)塗佈CM5傳感器晶片（Biacore AB)後，將 僅單一濃度（例如1 μιη)及組合有連續稀釋之混合物之人類 血清白蛋白（HSA)注射在抗原表面上，各混合物具有HSA 及增加量之所討論之單一可變域。測定僅HS A之所得結合 RU及HSA/單一可變域混合物之各者的所得結合RU。藉由 比較僅HSA之結合RU與HSA+單一可變域之結合RU，將能 夠看出FcRn是否與單一可變域競爭結合HSA。若競爭，則 當溶液中之單一可變域濃度增加時，與FcRn結合之HS A之 RU將降低。若不存在競爭，則增加單一可變域將對與 FcRn結合之HSA之量無影響。對於在pH 5.0下結合HAS之 單一可變域，可視情況在pH 5.0下重複此競爭檢定以測定 單一可變域是否競爭性地抑制血清白蛋白在pH 5 · 0下與 FcRn之結合。 此等具有單一可變域，含有一個單一可變域（單體）或一 個以上單一可變域（例如，如本文中所定義之多聚體、融 合蛋白質、結合物及雙特異性配位體）之配位體（該單一可 變域特異性結合血清白蛋白，其中該單一可變域在天然血 清pH下及在細胞内微脂粒pH下特異性結合血清白蛋白）可 進一步包含至少一個其他單一可變域，其中各其他單一可 變域在天然血清pH下特異性結合除血清白蛋白以外的抗 原，而在細胞内微脂粒pH下不結合該抗原。天然血清pH 值為約7.4，且該細胞内微脂粒之pH值在約4.8至5.2範圍 内，且在某些實施例中，該細胞内微脂粒之pH值為約5。 129025.doc -165- 200848427 基於上述理念之方法力扭/由田丄 麦匕括使用如上所述之對血清白蛋白 具有親和力以延長半衰期且對所需標乾抗原具有親和力之 雙特異性結合物，以指引結合抗原降解或再《。如上m 述’選擇血清白蛋白結合部分’使得結合在pH 5 〇下具有 高親和力，使得分子將針對在内體中不藉由FcRn介導之過 程降解來分選。接著，使用如上所述之相似技術選擇所需 標乾抗原結合部分，例外之處在於代替如上所述針對在阳 f' 7.4及^ 5下之高親和力結合之選擇，執行針對在pH 7.4下 、之高親和力結合及在PH 5下對標靶抗原之低或零親和力之 選擇。-種實現此之方法係藉由選擇在接觸表面中具有組 胺鲅之部分。接著藉由習知分子生物學技術，藉由化學衍 生及交聯或藉由遺傳融合製備2個分子之間的融合蛋白 質。藉由設計在PH 5下結合SA，同時具有在pH 5下以低或 零親和力結合配位體的搭配物咖之SA結合㈣，結果使 所給AlbudAbTM(特異性結合企清白蛋白之心）之活體内效 ( 力增加。儘管不希望受理論約束，但在内體再循環後，標 挺刀子將得以釋放且乾向降解之内體且降解，而
AlbudAb (特異性結合*清白蛋白之得以再循環以經 由FcRn ;丨導之再循環結合新配位體。此方法提供優於聚乙 一醇化刀子或其他半衰期延長技術之關鍵優點，其中此途 徑不可用於再生。推測在該等情況下，結合之配位體僅位 於聚乙二醇化部分上且佔據該部分。
本文描述指引抗原降解之方法，其包含投與具有至少一 個單可變域之配位體，其中該單一可變域在天然血清pH 129025.doc -166- 200848427 下及在細胞内微脂粒pH下特異性結合血清白蛋白，且該配 位體進一步具有至少一個其他單一可變域，其中該單一可 變域在天然血清p H下特異性結合除血清白蛋白以外的抗 原，而在細胞内微脂粒pH下不結合該抗原，因此靶向除血 清白蛋白以外的抗原以便降解。本文亦描述進一步包含至 少一個其他單一可變域之配位體，其中該單一可變域在天 然血清pH下特異性結合除血清白蛋白以外的抗原而在細 胞内微脂粒pH下不結合該抗原。 在代謝物存在下活體外選擇dAb 本文所述之配位體包涵包含單一可變域之配位體，其含 有一個單一可變域（單體）或一個以上單一可變域（例如；^如 本文中所疋義之多聚體、融合蛋白質、結合物及雙特異性 配位體），該單一可變域特異性結合血清白蛋白，其中該 單一可變域特異性結合人類血清白蛋白，且其中血清白蛋 白經該單一可變域之特異性結合基本上不由藥物及/或代 謝物及/或小分子與血清白蛋白上之一或多個部位之結合 阻斷。人類血清白蛋白上之該一或多個部位包括81^1〇〜部 位1及Sudlow部位2。該一或多個部位可位於人類血清白蛋 白之一或多個選自由域I、域II及域ΠΙ組成之群的域之組合 上。 本文所述之配位體包涵包含單一可變域之配位體，其含 有一個單一可變域（單體）或一個以上單一可變域（例如，如 本文中所定義之多聚體、融合蛋白質、結合物及雙特異性 配位體），該單一可變域特異性結合血清白蛋白，其中該 129025.doc -167 - 200848427
單-可變域特異性結合人類血清白蛋白，且其中血清白蛋 白經該,一可變域之特異性結合不改變血清白蛋白對結合 SA之藥物及/或代謝物及/或小分子之結合特徵。在一實施 例中，配位體之單-可變域在存在及/或不存在藥物:代 謝物或其他小分子之情況下結合血清白蛋白。且在另一實 施例中，血清白蛋白經該單__可變域之特異性結合大體上 不改變血清白蛋白對天然活體内結合从之藥物或代謝 物及/或小分子的結合特徵，該等藥物及/或代謝物及/或小 分子包括（但較佳不限於）彼等描述於Fasan〇等人，（2〇〇5) 57 (12): 787-96, The extraordinary ligand binding properties of human serum albumin ;及 Bertucci，c·等人，（2002) 9(15):1463-81, Reversible and covalent binding of drugs to human serum albumin: methodological approaches and physiological relevance中之藥物及/或代謝物及/或小分 子0 結合SA之藥物及/或代謝物及/或小分子可與或可不與大 體上不抑制血清白蛋白與單一可變域結合或大體上不與血 清白蛋白競爭結合單一可變域的藥物及/或代謝物及/或小 分子相一致。該等藥物及/或代謝物包括（但較佳不限於）華 法林（warfarin)、布洛芬（ibuprofen)、維生素B6、Θ膽紅素 (theta bilirubin)、氣高鐵血紅素（hemin)、甲狀腺素、脂肪 酸、乙盤、脂肪酸代謝物、醯基葡萄糖苷酸、膽紅素之代 謝物、氣烧、水楊酸鹽、苯并達品（benzodapenes)及1-〇_ 吉非羅齊（gemfibrozil)-B-D-葡萄糖苷酸。如對於小分子結 129025.doc -168- 200848427 合誘導之其他小分子結合的變化所述，此由小分子引起之 對血清白蛋白結合單一可變域的抑制或與血清白蛋白結合 單一可變域的競爭可藉由直接置換與藉由變構效應而發 生，參見AScenzi等人，（2006) Mini Rev Med· chem· 6 (4)： 483-9, Allosteric modulation of drug binding to human serum albumin ;及 Ghuman j·等人，（2〇〇5) j M〇1 則〇1 353(1):38-52, Structural basis of the drug^binding to human senun albumin。在一實施例中，僅小分子或同時有一或多 種其他小分子及/或代謝物及/或蛋白質及/或藥物結合血清 白蛋白。在另一實施例中，僅小分子或同時有一或多種其 他小分子及/或代謝物及/或蛋白質及/或藥物大體上不抑制 血清白蛋白與單一可變域的結合或大體上不與血清白蛋白 競爭結合單一可變域。在另一實施例中，僅小分子或同時 有一或多種其他小分子及/或代謝物及/或蛋白質及/或藥物 大體上抑制金清白蛋白與單一可變域的結合或與血清白蛋 白競爭結合單一可變域。 單一可變域可為抗體單一種可變域。抗體單_可變域可 為VH3域。抗體單一可變域可為\域。單一可變域可 -或多個非免疫球蛋白支架。非免疫球蛋白支架可包括以 下各物中之-或多種（但較佳不限於）：ctla+脂質運裁 蛋白、SPA、GwEL及纖連蛋白⑽削⑽⑷，且包括 Affibody™及 AvimerTM。 本文描述選擇結合血清白蛋白之單一可變域之方法，其 包含依據在一或多種代謝物及/或藥物存在下第一可變域 129025.doc -169- 200848427 、π白蛋白之能力選擇第一可變域，其中在該一或多 $代4ί物及/或藥物存在下執行選擇。本文亦描述產生包 Ζ在或夕種代謝物及/或藥物存在下對血清白蛋白具有 第—結合特異性之第一免疫球蛋白單一可變域及具有第二 、y 口特異|±之第二免疫球蛋白單一可變域的雙特異性配位 體之方法，該方法包含以下步驟：⑷依據在—或多種代謝 物及/或藥物存在下第一可變域結合第一抗原決定基之能 力選擇第一可變域；（b)依據第二可變域結合第二抗原決定 基之月b力選擇第二可變域；（c)組合該等可變域·且（句依 據在"亥或多種代謝物及/或配位體及該第二抗原決定基 存在下配位體結合血清白蛋白之能力選擇配位體。此方法 亦可包括在不存在互補可變域之情況下針對結合該第一抗 原决疋基述擇第一可變域及/或在存在第三互補可變域之 情況下針對結合該第一抗原決定基選擇第一可變域的步 驟，其中該第三可變域不同於該第二可變域。可在存在代 謝物及/或藥物及/或蛋白質及/或小分子之混合物之情況下 執行該等選擇步驟。選擇步驟亦可如下執行··（勾在存在第 一代謝物及/或藥物及/或小分子之情況下選擇結合血清白 蛋白之單一可變域；及（b)在存在第二代謝物及/或藥物及/ 或小分子之情況下自步驟（a)中所選之域中選擇域。亦包涵 產生具有在存在一或多種代謝物及/或藥物及/或小分子之 情況下對血清白蛋白具有第一結合特異性之第一免疫球蛋 白單一可變域及具有第二結合特異性之第二免疫球蛋白單 一可變域的雙特異性配位體之方法，該方法具有以下+ 129025.doc -170- 200848427 驟··（a)依據在存在一或多種代謝物及/或藥物及/或小分子 之情況下第一可變域結合血清白蛋白之能力選擇第一可變 域；（b)依據第二可變域結合抗原決定基之能力選擇第二可 變域；（c)組合該等可變域以提供包含第一及第二可變域之 配位體；及（d)依據在存在該一或多種代謝物及/或藥物之 情況下配位體結合血清白蛋白之能力及其結合該等抗原決 定基之能力，自步驟（c)提供之配位體中選擇 產生雙特異性配位體。在-實施财，在不存在^補= 域之情況下針對結合血清白蛋白選擇第一可變域。在另一 實施例中，在存在互補可變域之情況下針對結合第一抗原 決定基選擇第-可變域，其中該互補可變域不同於第二可 變域。 本文描述包含單一可變域之配位體，其中該單一可變域 在PH 7下及在細胞内隔室阳下活體外特異性結合血清白蛋 白，且其中該單一可變域為非天然存在之單一可變域。本 文亦描述包含抗體單一可變域 ^ 支巧之配位體，其中該抗體單一 :::在ΡΗ 7下及在細胞内隔室阳下活體外特異性結合血
〆月白蛋白。在一實施例令，細胞内隔室dH# / ^ Q IS肉—口 肥門^至PH值在4.8至5.2範 圍内。在另一實施例中， ^ ^ ^ 猎由，舌體外表面電漿共振競爭 ^, 舁抗體早一可變域之結合大驊卜 不抑制FcRn與血清白蛋白之6士人太玄每 體 早一可變域為抗體重鏈單_可 τ抗體 體重鏈單一可織祕叮& ^在八他η施例中，抗 .._ ^ 夂或可為Vh3單一可變域，且VH3單叮作 域可為人類Vh3單一 η早一可受 夂，。在另一實施例中，抗體單一 129025.doc • 171 - 200848427 可又域為抗體輕鏈單一可變域。在一實施例中，抗體輕鏈 單可隻域為Vk單一可變域，且在另一實施例中，其為、 單一可變域。 在另一實施例中，抗體單一可變域包含一或多個選自由 CDR1、CDR2及CDR3組成之群的抗體CDR區。在另一實 施例中’抗體單一可變域包含選自由以下各物組成之群的 支架：CTLA-4、脂質運載蛋白、葡萄球菌蛋白A(SpA)、 、GroES、運鐵蛋白及纖連蛋白。在一實施例中， 血清白蛋白與單一可變域之結合大體上不與FcRn與血清白 蛋白之結合競爭，且在另一實施例中，抗體單一可變域以 小於或等於300 nM之平衡解離常數（Kd)特異性結合血清白 蛋白。 在另一實施例中，抗體單一可變域進一步包含至少一個 其他抗體單一可變域，其中該其他抗體單一可變域在pH 7 下特異性結合除血清白蛋白以外的抗原，而在細胞内隔室 pH下不結合該抗原。本文亦描述在個體中指引抗原降解之 方法’其包含向個體投與包含諸如抗體單一可變域之單一 可變域之配位體，該單一可變域在pH 7下及在細胞内隔室 pH下活體外特異性結合血清白蛋白，該配位體進一步包含 至少一個其他抗體單一可變域（包含單一可變域，例如抗 體單一可變域），其中除血清白蛋白以外的抗原為靶向降 解之抗原。 在本發明之配位體之一實施例中，人類血清白蛋白經抗 體單一可變域之特異性結合並不由預定藥物及/或代謝物 129025.doc -172- 200848427 及/或小分子與人類血清白蛋白上之一或多個部位的結合 阻斷。在該等實施例中，其他抗體單一可變域可為抗體重 鍵單-可變域或抗體輕鏈單一可變域，其包含—或多個選 自由CDRl CDR2及/或CDR3組成之群的抗體CDR。單一 可變域可包含選自由以下各物組成之群的支架：CTLA_ 4、脂質運載蛋白、葡萄球菌蛋白A(SpA)、如虹、 GroES、運鐵蛋白及纖連蛋白。 本文所述之配位體之另一實施例為包含單一可變域之配 位體，其中該單-可變域為非天然存在之單—可變域，其 中》亥單可虻域在PH 7下及在細胞内隔室pH下活體外特異 性結合人類血清白蛋白，其中人類血清白蛋白經單一可變 域之特異性結合並不由預定藥物及/或代謝物及/或小分子 與人類血清白蛋白上之一或多個部位的結合阻斷，其中人 類血清白蛋白上之該一或多個部位包括Sudi〇w部位工及 Sudlow部位2，或該一或多個部位位於人類血清白蛋白之 一或多個選自由域ί、域„及域ΙΠ組成之群的域上。 連接子 可藉由重組工程技術獲得AlbudAbTM(特異性結合血清白 蛋白之dAb)(抗血清白蛋白域抗體或單一可變域）與另一生 物學活性部分之連接。基本上’同框融合編碼兩個所關注 蛋白質的基因。可考慮數種形式，其中抗血清白蛋白域抗 體處於融合物（亦即AlbudAbTM_Y，其中¥為生物學活性多 肽）之N末端、融合物（亦即Z-AlbudAbTM，其中z為生物學 活性肽）之C末端。在某些情況下，可考慮融合一種以上生 129025.doc -173- 200848427 物學活性多肽與AlbudAb™(特異性結合血清白蛋白之 dAb)，產生許多關於融合設計之可能性。例如，融合物可 如下：Z-Y-AlbudAbTM、Z-AlbudAbTM-Y 或 AlbudAbTM-Z-Y。 在所有該等融合分子中，經由至少一個肽鍵將兩個多肽 共價連接在一起。在多數過分簡化之方法中，直接連接 AlbudAbTM(特異性結合血清白蛋白之dAb)與生物學上多 肽。因此，AlbudAbTM(特異性結合血清白蛋白之dAb)與多 肽之間的接合將為如下： a)對於在C末端之AlbudAbTM(特異性結合血清白蛋白之 dAb)而言， 其中 AlbudAbTM 為 VK :-
xxxDIQ
xxxNIQ
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xxxETT 其中AlbudAbTM(特異性結合血清白蛋白之dAb)gVx :-
xxxQSV
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xxxSYE 129025.doc -174- 200848427
xxxSSE
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xxxLPV
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xxxQAG
其中AlbudAb™(特異性結合血清白蛋白之dAb)為VH(例 如人類VH):-xxxQVQ xxxQMQ xxxEVQ xxxQIT xxxQVT xxxQLQ
其中AlbudAbTM(特異性結合血清白蛋白之dAb)為VHH(例 如駱馬羊駝重鏈可變域）：-xxxEVQ xxxQVQ xxxDVQ xxxQVK xxxAVQ 129025.doc -175- 200848427 b)對於在N末端之AlbudAbTM(特異性結合血清白蛋白之 dAb)而言， 其中AlbudAb™(特異性結合血清白蛋白之dAb)為VK :- KVEIKxxx KLEIKxxx KVDIKxxx RLEIKxxx EIKRxxx 其中AlbudAb™(特異性結合血清白蛋白之dAb)為νλ :- KVDVLxxx KLDVLxxx QLDVLxxx 其中AlbudAbTM(特異性結合血清白蛋白之dAb)為VH(例 如人類VH):-VTVSSxxx 其中AlbudAbTM(特異性結合血清白蛋白之dAb)為VHH(例 如駱馬羊駝重鏈可變域）：-VTVSSxxx ’XXX*表示融合至AlbudAbTM(特異性結合血清白蛋白之 dAb)的（第一）生物學活性多肽之最前或最後三個胺基酸。 然而，可能存在可藉由連接編碼基因與編碼在串聯連接 之多肽之間剪接的肽連接子之橋接DNA片段促進產生重獲 兩個多肽之功能活性的重組融合蛋白質之情況。通常據經 驗設計最佳肽連接子長度：其可短至一個胺基酸或延長至 129025.doc -176- 200848427 5〇個胺基酸。已提出不同設計之連接子且其為在此項技術 中所熟知。以下實例意欲提供可能之連接子方法的廣泛但 非詳盡的列表： 1 · 可撓性連接子： 可撓性連接子經設計以在連接兩個多肽部分時採用不穩 定一級結構，因此允許一系列融合蛋白質構形。該等連接 子在性質上較佳為親水性的，以防止該等連接子與一個或 兩個融合多肽相互作用。通常，諸如甘胺酸及絲胺酸之小 極性殘基普遍存在於彼等連接子中，以分別增加肽骨架之 可撓性及親水性特徵。該等連接子之長度可變，且據經驗 或藉助於3D計算方法最佳確定。通常，較佳連接子長度將 /、所關/主之原生功旎及結構之優良表現、優良溶解性及完 全重獲性最小相容。由於其可撓性特徵，可撓性連接子可 構成内生蛋白酶之優良底物。通常，除非其為合意特徵， 否則可撓性連接子無諸如帶電胺基酸之胺基酸或易於由内 生蛋白酶以見底物特異性所識別的大疏水性/芳族基團。 另外，由於游離半胱胺酸可一起反應以形成半胱胺酸，藉 此若生物活性多肽之一或多|包含—或多個半胱胺酸殘基 Γ半胱胺酸拼接，），則導致⑴經由連接子橋接兩個融合蛋 白質；及/或（ii)損害融合蛋白質之表現/摺疊，因此較佳無 半胱胺酸殘基。 可撓性連接子之實例為：⑴基於（GGGGS)y重複基元之 甘胺酸富集連接子，其中y為至少1，但y可為2、3、4、 6 7 8及9或9以上（參見PCT國際公開案第Ep 〇 753 129025.doc -177- 200848427 551號、第 US 5 258 498號、第 EP 〇 623 679號）；⑼基於 (SSSSG)y重複基元之絲胺酸富集連接子，其中y為至少工， 但y可為2、3、4、5、6、7、8及9或9以上（參見PCT國際公 開案第 EP 0 573 551 號、第 US 5 525 491號）。 2· 約束連接子：
約束連接子經設計以在連接兩個多肽 級結構，因此限制融合蛋白質之構形範圍。該等連= 常採用跨過若干圈之螺旋結構，該等連接子之長度可 變，且據經驗或藉助於計#方法最佳衫。選#約束連接 子之主要原因係在融合物之各多肽之間保持最長距離。當 兩個多肽具有形成雜聚集體的傾向時，此尤其適^藉助 於其結構，約束連接子亦可更耐蛋自水解降解，藉此在活 體内注射時提供優點。 約束連接子之實例在PCT國際公開案第w〇 〇〇/24884號 (例如 SSSASASSA、GSPGSp(^ ATTTGsspGpT)、第仍 6，132,992號（例如螺旋肽連接子）中列舉。 3· ’天然f連接子： 天然連接子為（可變長度之）相反不為合成之多肽序列， 亦即在自然界中發現組成連接子之多肽序列。天然連接子 可為可m約束連接子且胺基酸序歹組成可極其不 =°其耐蛋白水解之程度依賴於其源自於何種蛋白質及此 寺蛋白質在自然界中面對何種生物環境（細胞外、細胞 内、原核、真核等）。對於開發人類之生物治療劑而言， 一類連接子尤其適當：基於人類蛋自#巾所見之肽的連接 129025.doc -178- 200848427 子。實際上，該等連接子在本質上為非免疫原性或極弱免 疫原性且因此對人類治療存在潛在安全。 天然連接子之實例為：（i)KESGSVSSEQLAQFRSLD(參 見 Bird等人，（1988) Science，242，423-426) ; (ii)對應於無 輕鏈的免疫球蛋白之鉸鏈域之序列（參見Hamers-Caster man 等人，（1993) Nature，363, 446-448 及 PCT 國際公開案第 WO 096/34103號）。用於抗白蛋白域抗體（例如人類、人類化、 駱馬羊駝類化人類或駱馬羊駝類VHH域抗體）之連接子的實 例為 EPKIPQPQPKPQPQPQPQPKPQPKPEPECTCPKCP 及 GTNEVCKCPKCP。獲自人類及駱馬羊駝類鉸鏈之其他連 接子揭示於EP0656946中，其以引用的方式併入本文中。 獲自鉸鏈之連接子可具有可變長度，例如〇至約50個胺基 酸，包括 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48 或 49 個胺基酸。 如本文中所用，’’藥物”係指可投與個體以經由結合個體 中生物標靶分子及/或改變其功能產生有利、治療或診斷 效應之任何化合物（例如小有機分子、核酸、多肽）。標靶 分子可為藉由個體之基因組編碼的内生標靶分子（例如藉 由個體之基因組編碼的酶、受體、生長因子、細胞激素） 或藉由病原體之基因組編碼的外生標靶分子（例如藉由病 毒、細菌、真菌、線蟲或其他病原體之基因組編碼的 129025.doc -179- 200848427 酶）。 藥物組合物可為藥物與多肽結合部分共價或非共價鍵結 物藥物可直接或間接共價或非共價鍵結至多狀結 口 口卩刀（例如經由適當連接子及/或互補結合搭配物（例如生 素及抗生物素蛋白）之非共價結合）。當採用互補結合搭 • Τ T將結合搭配物之-者直接或經由適當連接子部 $共價鍵結至藥物，且可將互補結合搭配物直接或經由適 (胃連接：邛刀共價鍵結至多肽結合部分。當藥物為多肽或 月太日守藥物組合物可為融合蛋白質，其中多肽或肽、藥物 ^夕肽、、、。合部分為連續多肽鏈之離散部分。如本文所述， 夕肽、口口邛刀及多肽藥物部分可經由肽鍵彼此直接鍵結， 或經由適當胺基酸或肽或多肽連接子連接。 降低之免疫原性 本文榀述Ρ“氐藥劑之免疫原性之方法，其包含修飾該藥 劑以使藥劑進一步含有單一可變域區域，其中該單一可變 I域活體内及/或離體特異性結合也清白蛋白，且其中該藥 劑可包括藥物'代謝物、配位體、抗原及蛋白質。血清白 蛋白可4為人類企清白蛋白。單一可變域可為免疫球蛋白單 、°欠或免疫球蛋白單一可變域可為γΗ抗體單一可變 域。〜早一可變域可為VH3單一可變域。Vh3單一可變域 可為人類V„3單-可變域。單一可變域可為^或^抗體單 一可變域。抗體單—可變域可包含-組4個由Vh3框架生殖 細胞系抗體基因片段編碼之Kabat框架區（FR)。Vh3框架係 選自由则7、DP38及DP45組成之群。抗體單一可變域可 129025.doc 200848427 含有一組4個由^框架生殖細胞系抗體基因片段編碼之 Kabat框架區（FR)。κ框架之非限制性實例為DpK9。單一可 變域可含有免疫球蛋白或非免疫球蛋白支架，其含有 CDR1、CDR2及 / 或 CDR3 區，其巾 CDR1、cdrmcdr3 區 / 域中之至父者來自特異性結合血清白蛋白之抗體可變 域。非免疫球蛋白支架可包括（但較佳不限於）ctla_4、脂 質運載蛋白、SpA、AffibodyTM、GroEL、AvimerSTM及纖 連蛋白。血，月白蛋白可為人類血清白蛋白。免疫球蛋白單 -可變域及/或非免疫球蛋白單一可變域可以小於則⑽ 之Kd特異性結合人類血清白蛋白。免疫球蛋白單一可變域 及/或非免疫球蛋白單一可變域可以在彼此丨〇倍之内的κ d 值特異性結合人類血清白蛋白與一或多種非人類血清白蛋 白。免疫球蛋白單一可變域及/或非免疫球蛋白卩一可變 域可特異性結合人類血清白蛋白與一或多種非人類企清白 蛋白，且其中配位體之Τβ半衰期與人類宿主中人類血清白 蛋白之Τβ半衰期大體上相同。另外，免疫球蛋白單一可變 域及/或非免疫球蛋白單-可變域可特異性結合人類血清 ，蛋白之域II。免疫球蛋白單一可變域及/或非免疫球蛋白 早一可變域可進-步在天然血清ΡΗ下及在細胞内微脂粒 ΡΗ下特異性結合血清白蛋白。血清白蛋白經該免疫球蛋白 皁—可變域及/或非免疫球蛋白單一可變域之特異性結合 較佳大體上並不由藥物及/或代謝物與血清白蛋白上之一 :多個部位的結合阻斷。在一實施例中，血清白蛋白經單 一可變域之特異性結合不改變血清白蛋白對與从結合之藥 129025.doc 200848427 物及/或代謝物及/或小分子之結合特徵。在一實施例中， 修飾藥劑之方法導致形成具有包含以下式的修飾藥劑： a-(X)nl-b_(Y)n2-C-(z)n3-d 或 a-(Z)n3-b-(Y)n2-C_(X)n_d，其 中X為對第一標靶具有結合特異性之多肽藥物；Y為單一 可i:域，例如活體内及/或 〜
抗體單一可變域，z為對第二標靶具有結合特異性之多肽 藥物，a、b、c及d獨立地為包含1至約個胺基酸殘基之多 狀或不存在；nlgi至約1〇 ;心為1至約1〇 ;且…為零至約 1 〇。在另一實施例中，當η 1及n2皆為1且n3為零時，χ不包 含抗體鍵或抗體鍵之片段。 本文描述降低藥劑之免疫原性之方法，纟包含修飾該藥 劑以使藥劑進一步包含單一可變域，纟中該單一可變域特 :性結：血清白蛋白，纟中該單一可變域為非天然存在之 單可艾域，且其中該藥劑係選自由以下各物組成之群· 藥物 '代謝物、配位體、抗原及蛋白f。本文亦描述降低 藥d之免疫原性之方法’其包含修飾該藥劑以使藥劑進一 步包含抗體單一可變域，其，該抗體單一可變域特異性結 :血：白蛋白’且其中該藥劑係選自由以下各物組成之 群·樂物、代謝物、配位體 服柷原及蛋白質。在一實施例 中’抗體早一可變域A h 戌為杬體重鏈早一可變域，例如抗體 VH3早一可變域或 yr ^ ^ 貝柷體Vh3早一可變域。在另一實施 例中，抗體單一可變域兔 抑 、 y 几_輕鏈單一可變域，例如抗體 ^几體νλ早一可變域。一告 t^CDRl . rno 只轭例中，抗體單一可變域
及 CDR3 區，iirDR /、rCDRl、CDR2及 CDR3 129025.doc -182- 200848427 區之至少一者來自特異性結合 包含iP ό I 血π白蛋白且視情況進一步 匕3遴自由以下各物組成之 ΓΤΤ Λ . f的支架之抗體可變域·· CTLA-4、脂質運載蛋白、葡 ^
Gr〇E, 赏㈣球讀蛋白A(SpA)、GroEL、
、運鐵蛋白及镞遠I 中，^ 纖連蛋白。在該等方法之另-實施例 中例如抗體單一可變域之單一可織a， ’交域以小於300 nM之kd 、，、性、、'吉合人類血清白蛋白， φ 亥4方法之另一實施例 例如抗體早一可變域之置 J欠块之早一可變域以在彼此】0倍之内 的Kd值特異性結合人
,月曰蛋白及一或多種非人類血清 Θ蛋白。在該等方法之另一眘 、σσ 力具苑例中，例如抗體單一可變 域之單一可變域特異性結合 顯血π白蛋白及非人類血清 白蛋白’且配位體之叩半衰期盥 η 丁衣Μ 14人類佰主甲人類血清白蛋 白之Τβ半衰期大體上相^在料方法之另—實施例中， 例如抗體單—可變、诚$ i _ J欠4之早一可變域特異性結合人類血清白 蛋▲之域II。在该等方法之另一實施例中，例如抗體單一 可變域之單一可變域在pH 7下及在細胞内隔室pH下特異性 結合血清白蛋白。 僅出於說明目的，在以下實例中進一步描述本發明。如 本文所用，出於命名dAb之目的，將人類TNFoc稱為TAR1 且將人類TNFa受體1 (p55受體）稱為TAR2。 貝例1·針對人類血清白蛋白出㈤及卜半乳糖苷酶之 雙特異性scFv抗體（K8)的選擇 忒實例說明製備針對β-gal及HSA的雙特異性抗體之方 法，其中針對結合卜料1選擇與生殖細胞系（虛設）VH域連接 的νκ可變域之庫，且針對結合HSA選擇與生殖細胞系（虛 129025.doc -183 - 200848427 设）Vk域連接的Vh可變域之庫。接著組合所選可變γΗ hs A 及VKp-gal域且根據結合β-gal及HSA而選擇出抗體。HSA為 在人類血液中發現之半衰期增加之蛋白質。 在此實驗中使用4種人類噬菌體抗體資料庫。 貧料庫1 生殖細胞系VK/DVT VH 8.46χ 10 資料庫2 生殖細胞系VK/NNK VH 9.64x10 資料庫3 生殖細胞系VH/DVT VK 1.47x10 資料庫4 生殖細胞系vh/nnk VK 1.45x10 所有資料庫均基於具有併入互補決定區（CDR2且CDR3) 之側鏈多樣性之單一人類VH(V3-23/DP47及JH4b)及 VK(012/02/DPK9及 JK1)框架。 資料庫1及資料庫2含有虛設νκ序列，而vH之序列在位置 H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H96、 H97及H98(分別經DVT或NNK編碼）上多樣化（圖1)。資料 庫3及資料庫4含有虛設VH序列，而γκ之序列在位置L50、 L53、L91、L92、L93、L94 及 L96(分別經 DVT 或 ΝΝΚ 編 碼）上多樣化（圖1)。資料庫為噬菌粒pIT2/ScFv形式（圖2)且 已針對結合通用配位體、蛋白質A及蛋白質l預先選擇， 以便未選擇資料庫中的多數純系具有功能性。上文展示之 貧料庫之大小對應於預選擇後之大小。在選擇抗原前混合 貢料庫1與資料庫2以產生單一 Vh/虛設Vk資料庫，且混合 資料庫3與資料庫4以形成單一 Vk/虛設^^資料庫。 使用VK/虛設VH資料庫對(3-gal執行三輪選擇，且使用Vh/ 虛設VK資料庫對HSA執行三輪選擇。在^別丨之情況下，噬 129025.doc -184- 200848427 菌體滴度自第一輪之l.lxl 06上升至第三輪之2·〇χ1 〇8。在 HAS之t月況下，％囷體滴度自第一輪之2χ104上升至第二 輪之1·4χ109。該等選擇如Griffith等人，（1993)所述執行， 除使用KM13輔助噬菌體，（其含有蛋白酶裂解位點介於〇2與 03域之間的pill蛋白質）且用1 mg/mi於pBS中之胰蛋白酶 溶離噬菌體。胰蛋白酶之添加裂解獲自輔助噬菌體之ρΐπ 蛋白貝（而非彼專來自％鹵粒者）且藉由在C-myC標記物處裂 解來溶離結合之scFv-噬菌體融合物（圖2)，藉此進一步富 集表現功能性scFv的噬菌體且相應減少背景（Kristensen &
Winter’ Folding & Design 3: 321-3 28，1998年 7月 9 日）。使 用經100 pg/ml濃度之HSA或β-gal塗佈之免疫探針執行選 擇。 為檢查結合，藉由單株噬菌體ELIS A篩選來自各選擇之 第二輪的24個群落。如Harrison等人，Methods Enzymol. 1996; 267: 83-109所述產生噬菌體顆粒。在4。〇下以1〇〇 μ1 於PBS中10 Mg/mi濃度之HSA或卜以丨塗佈90LELISA平板隔 仪。接著使用具有抗-Μ 1 3-HRP結合物之結合噬菌體之偵 測進行標準ELISA方案（Hoogenboom等人，1991)。以50 μΐ 上清液純系之選擇給出大於10之ELISA信號。 接著，使用 QIAprep Spin Miniprep 套組（Qiagen)由對 HSA述擇之vH/虛設νκ資料庫及由對j3_gai選擇之vj虛設Vh 貢料庫製備DNA預產物。為獲取更大多樣性，DNA預產物 係由三輪選擇之每一者製備，且隨後將針對抗原之每一者 的DNA預產物集中在一起。接著在37它下以將 129025.doc -185- 200848427 DNA預產物消化隔夜。凝膠純化片段後，代替對HS a選擇 之VH/虛設VK資料庫之虛設1鏈，連接來自對j^gal選擇之 VK/虛設VH資料庫的vκ鏈，產生3·3χ109個純系之資料庫。 因而’對HSA(第一輪）及β-gai(第二輪）選擇，即HSA/p-gal選擇；或對β-gai(第一輪）及hsa(第二輪）選擇，即β-gal/HSA選擇選擇該資料庫。如上所述執行選擇。在各情 況下’在第二輪之後，藉由單株噬菌體Elisa(如上所述） 且藉由可溶性scFv片段之ELISA針對結合HSA及β-gal測試 48個純糸。可溶性抗體片段如Harrison等人，（1996)所述 產生’且標準ELISA方案遵循Hoogenboom等人，（1991)
Nucleic Acids Res·，19: 4133，例外之處在於將 2% 吐溫 / PBS用作阻斷緩衝液且以蛋白質l-HRP偵測結合之scFv。 來自HSA/p-gal選擇之三個純系（E4、E5及E8)及來自β-gal/HSA選擇之兩個純系（K8&K1〇)能夠結合兩個抗原。如
Ignatovich等人，（1999) J Mol Biol 1999年 11 月 26; 294 (2)·· 45 7-65所述，使用引子LMB3及pHENseq將此等純系之scFv PCR擴增且定序。序列分析顯示所有純系相同。因此，僅 選擇一個編碼雙特異性抗體（K8)之純系用於進一步工作中 (圖 3) 〇 實例2· K8抗體之結合特性的表徵 首先，藉由單株噬菌體ELIS A表徵K8抗體之結合特性。 在4°C下以100 μΐ於PBS中10 pg/ml濃度之HSA及β-gal以及 鹼性碟酸酶（APS)、牛jk清白蛋白（BS A)、花生凝集素、溶 菌酶及細胞色素C(以檢查交又反應性）塗佈96孔平板隔 129025.doc -186- 200848427 夜。如Harrison等人（1996)所述以KM13援救K8純系之噬菌 粒，且直接檢定含有嗤菌體之上清液（50 μΐ)。接著使用具 有抗-Ml 3-HRP結合物之結合噬菌體之偵測進行標準ELISA 方案（Hoogenboom等人，1991)。當以大於1.0之吸光率信 號呈現在噬菌體表面上時，發現雙特異性K8抗體結合HS A 及β-gal(圖4)。亦觀察到與BSA之強結合（圖4)。由於HSA 及BSA在胺基酸級別上76%同源，因此K8抗體識別兩個該 等結構相關蛋白質並不足為奇。未偵測到與其他蛋白質之 交叉反應性（圖4)。 其次，以可溶性scFv ELIS A測試K8抗體之結合特性。如 Harrison等人，（1996)所述藉由IPTG誘導產生可溶性scFv 片段。為測定K8 scFv之表現程度，如Harlow及Lane， Antibodies: a Laboratory Manual (1988) Cold Spring Harbor所述，使用蛋白質A-瓊脂糖管柱由50 ml誘導上清 液純化可溶性抗體片段。接著，如Sambrook等人，（1989) 所述量測OD28〇且計算蛋白質濃度。K8 scFv在上清液中以 19 mg/1產生。 接著使用已知濃度之K8抗體片段執行可溶性scFv ELISA。以 100 μΐ 之 10 pg/ml 之 HSA、BSA 及 β-gal 以及 100 μΐ之1 pg/ml濃度之蛋白質A塗佈96孔平板。塗覆50 μΐ連續 稀釋之Κ8 scFv且以蛋白質L-HRP偵測結合之抗體片段。 ELISA結果證實K8抗體之雙特異性性質（圖5)。 為證實與β-gal之結合由VK域決定，且與HSA/BSA之結 合由K8 scFv抗體之VH域決定，藉由Sal//Not/消化自K8 129025.doc -187- 200848427 scFv DNA奂切νκ域且將其連接至sau/N〇t/消化之含有虛設 乂1^鏈的1)1丁2載體（圖1及2)。藉由可溶性％1^]^18八分析所 得純系K8VK/虛設γΗ之結合特徵。如Harrison等人，（1996) 所述藉由IPTG誘導產生可溶性“以片段產生，且直接檢定 含有scFv之上清液（50 μ)。如實例1中所述執行可溶性scFv ELISA且以蛋白質l_HrP偵測結合之scFv。elisa結果顯 示忒純系仍能夠結合β-gal，而與BSA之結合受到破壞（圖 6) 〇 實例3·針對抗原a&b之單一 Vh域抗體及針對抗原 單一 VK域抗體的選擇 該實例描述藉由在不存在互補可變域之情況下選擇結合 抗原之原始單一抗體可變域之庫製備針對抗原A及b之單 一 VH域抗體及針對抗原c及d之單一 VK域抗體之方法。 如先鈾所述執行結合純系之選擇及表徵（參見PCt/gb
02/003014，實例5)。選擇4個純系用於進一步工作中。 VH1-抗 A VH Vh2-抗 B VH VKHC VK VK2-抗 D VK 可使用上文於實例1-3中所述之程序，以如所述相似之 方式產生包δ Vh域之組合（亦即V『Vh配位體）及Vl域之組 合（Vl-Vl配位體）的二聚體分子。 實例4.雙特異性ScFv抗體（針對抗原A及B之VH1/VH2及針對 才几原C及D之Vk1/Vk2)之產生及表徵 129025.doc -188- 200848427 該實例證明雙特異性ScFv抗體（針對抗原a及B之 VH1/VH2及針對抗原（：及D之Vk1/Vk2)可藉由組合針對ScFv 載體申之個別抗原選擇之VK與VH單一域產生。 為產生雙特異性抗體VH1/VH2，藉由1〇1/办〇1消化自可 變域載體1(圖7)切除VH1單一域且將其連接至TVcoI/ZAoI消 化之可變域載體2中（圖7)以產生Vh1/可變域載體2。使用引 子將心/1限制性部位引入5’末端且將限制性部位引入3, 末端而自可變域載體i PCr擴增VH2單一域。接著以 夕α/1/Λ^Ι消化PCR產物且將其連接至仏消化之Vh1/ 可變域載體2中以產生vh1/Vh2/可變域載體2。 以相似方式產生VK1/VK2/可變域載體2。如先前所述以 可溶性ScFv ELISA測試所產生之Vh1/Vh2 ScFv及VK1/VK2 ScFv的雙特異性性質（參見PCT/GB 02/003014，實例6)。 如先前所述執行競爭ELISA(參見PCT/GB 02/003014，實例 8) ° 可能的結果： -VH1/VH2 ScFv能夠同時結合抗原a及b ; -VK1/VK2 ScFv能夠同時結合抗原c及d ; -VH1/VH2 ScFv結合具有競爭性（當與抗原a結合時， VH1/VH2 ScFv不能結合抗原b); -VK1/VK2 ScFv結合具有競爭性（當與抗原c結合時， VK1/VK2· ScFv不能結合抗原以。 實例5.雙特異性VHl/vH2 Fab及VK1/VK2 Fab之構築及其結 合特性之分析 129025.doc -189- 200848427 為產生VH1/VH2 Fab，將VH1單一域連接至消 化之CH載體中（圖8)以產生Vh1/CH，且將VH2單一域連接 至消化之CK載體中（圖9)以產生VH2/CK。如先前 所述使用來自Vh1/CH及VH2/CK之質體DNA將感受態大腸 桿菌細胞共轉型（參見PCT/GB02/003014，實例8)。 接著如先前所述藉由IPTG誘導含有Vh1/CH及VH2/CK質 體之純系以產生可溶性VH1/VH2 Fab(參見PCT/GB 02/003014，實例 8) ° 以相似方式產生VK1/VK2 Fab。 如先前所述，藉由競爭ELISA測試所產生Fab之結合特 性（參見 PCT/GB 02/003014，實例 8)。 可能的結果： -VH1/VH2 Fab能夠同時結合抗原A及B ; -VK1/VK2 Fab能夠同時結合抗原C及D ; -VH1/VH2 Fab結合具有競爭性（當與抗原A結合時， VH1/VH2 Fab不能結合抗原B); -VK1/VK2 Fab結合具有競爭性（當與抗原C結合時， VK1/VK2 Fab不能結合抗原D)。 實例6.螯合dAb二聚體 概要 使用可撓性多肽連接子以dAb-連接子-dAb形式產生VH 及VK均二聚體。以含有不同長度之甘胺酸-絲胺酸連接子 3U.(Gly4Ser)3、5U:(Gly4Ser)5、7U:(Gly4Ser)7 的 dAb 連接 子-dAb形式產生載體。使用在連接子上游之引導dAb ·· 129025.doc -190- 200848427 TARl-5 (VK)、TAR1-27(Vk)、TAR2-5(VH)或 TAR2-6(VK)及 連接子後之相應第二dAb之資料庫產生二聚體庫。使用該 方法，選擇新穎二聚dAb。藉由ELISA及Biacore研究且在 細胞中和及受體結合檢定中測定二聚作用對抗原結合之影 響。TAR1-5與TAR1-27之二聚作用導致結合親和力及中和 私度顯著提高。 1·0方法 1 · 1資料庫產生 1·1·1載體 PEDA3U、PEDA5U及pEDA7U載體經設計以引入與dAb-連接子-dAb形式相容的不同長度連接子。對於peda3U， 在含有〇·1 M NaCM、10 mM Tris-HCl pH 7·4之緩衝液中使 用緩慢退火程式（95 °C- 5 min、80 °C-10 min、70 °C-15 min、 56°C-15 min、42°C直至使用）將有義及反義73-鹼基對募連 接子退火，且使用办〇7及限制性部位選殖。連接子包 含3個（Glyder)單元及1個收容於〜/7與TVo"選殖部位之間 的填充序列區域（流程1)。為降低單體dAb經嗟菌體呈現選 出之可此性’填充序列區域經設計以包括3個終止密碼 子、1個Sac 1限制性部位及1個框架位移突變以當無第二 dAb存在時，將該區域放置在框架外。對於ρΕΕ)Α5υ及 7U ’歸因於所需連接子之長度，設計各載體之重疊聚連接 子，使用Klenow將其退火且延伸。接著純化片段且在使用 及限制性部位選殖之前使用適當酶消化。 129025.doc -191 - 200848427 連接子：
3U
Ncol - Xhol ————Sail - I „7U_ί 填充片段1 填充片段2 流程1 1.1.2資料庫製備 i 使用及ZAo/限制性部位在連接子上游選殖對應於引 導dAb之Ν末端V基因。VH基因具有現存可相容部位，然而 選殖VK基因需要引入適當限制性部位。這藉由使用修飾之 PCR 引子（Vk-DLIBF : 5’cggccatggcgtcaacggacat ; VKXholR : 5’atgtgcgctcgagcgtttgattt 3’）使用 SuperTaq (HTBiotechnology Ltd)與p/w turbo(Stratagene)之 2:1 混合物 經30個週期之PCR擴增而實現。此將部位保持在5’末 端，而破壞鄰近心"部位且在3’末端引入部位。將5個 引導 dAb : TAR1-5 (VK)、TAR1-27(VK)、TAR2-5(VH)、 TAR2-6(VK)及TAR2-7(VK)選殖入3個二聚體載體之每一者 中。藉由序列分析校驗所有構築體。 已在各載體（pEDA3U、5U及7U)中在連接子上游選殖引 導 dAb ·· TAR1-5 (VK)、TAR1-27(VK)、TAR2-5(VH)或 TAR2-6(VK)，在連接子後選殖相應第二dAb之資料庫。為 實現此目的，免費dAb資料庫係自回收自第一輪選擇之噬 菌體進行PCR擴增，當TAR1-5或TAR1-27為引導dAb時， 該選擇係針對人類TNFa之VK資料庫選擇（第1輪後約lxlO6 多樣性）或當TAR2-5或TAR2-6分別為引導dAb時，該選擇 129025.doc -192- 200848427 係針對人類p55 TNF受體之VH或VK資料庫選擇（第1輪後均 有約lxl 05多樣性）。對於VK資料庫，使用引子使用 SuperTaq與p/w turbo之2:1混合物經30個週期之PCR擴增進 行PCR擴增。使用引子以在基因之5’末端引入5W/限制性 部位使VH資料庫PCR擴增。將dAb資料庫PCR產物以適當 限制酶消化，使用5α/7/Λ^ί7限制性部位將其連接至相應載 體中之連接子下游，且經電穿孔進入新近製備之感受態 T G1細胞中。 各資料庫所獲得之滴度如下： TAR1-5 : pEDA3U=4xl08、pEDA5U=8xl07、pEDA7U=l><108 TAR1-27 : pEDA3U=6.2xl08、pEDA5U=lxl08、pEDA7U=l><109 TAR2h-5 : pEDA3U=4xl07、pEDA5U=2xl08、pEDA7U=8xl07 TAR2h-6 : pEDA3U=7.4xl08、pEDA5U=1.2xl08、pEDA7U=2.2xl08 1.2選擇 1.2.1 TNFa 使用被動塗佈於抗原管（immunotube)上之人類TNFa進行 選擇。簡言之，以1-4 ml所需抗原將抗原管塗佈隔夜。接 著，以PBS將抗原管洗滌3次，且以含2%乳粉之PBS阻斷 1-2小時，且以PBS進一步洗滌3次。用含2%乳粉之PBS稀 釋噬菌體溶液，且在室溫下培育2小時。接著，以PBS洗滌 管且以1 mg/ml胰蛋白酶-PBS溶離嗤菌體。研究三種選擇 TAR1-5二聚體資料庫之策略。在使用1 pg/ml或20 pg/ml人 類TNFa塗佈之抗原管中用含0,1 %吐溫之PBS洗滌20次進行 第一輪選擇。以溶離噬菌體感染TG1細胞，且測定滴度（例 129025.doc -193- 200848427 如 Marks等人，J Mol Biol. 1991 年 12月 5 日；222 (3): 581-97 ; Richmann 等人，Biochemistry. 1993 年 8 月 31 日；32 (34): 8848-55)。 重獲滴度為： pEDA3U=2.8xl07(l pg/ml TNF)、1 ·5χ 1 08(20 pg/ml TNF)， pEDA5U=1.8xl07(l pg/ml TNF)、1 ·6χ 1 08(20 pg/ml TNF)， pEDA7U=8xl06(l pg/ml TNF)、7xl07(20 pg/ml TNF)。 使用3種不同的方法進行第二輪選擇。 " 1. 在抗原管中，洗滌20次，培育隔夜，接著進一步洗滌 10次。 2. 在抗原管中，洗務20次，接著在室溫下在含1 pg/ml TNFa之洗滌緩衝液中培育1小時，且進一步洗滌1 0次。 3. 使用33皮莫耳之生物素化人類TNFa在抗生蛋白鏈菌 素珠粒上選擇（Henderikx 等人，2002，〇/ antibodies against biotinylated antigens· Antibody Phage Display: Methods and protocols，O’Brien 及 Atkin 編，
Humana Press)。將來自第2輪選擇之單一純系挑取入96孔 平板中，且在96孔平板中製備粗上清液預產物2 ml。 第1輪 人類TNFa 抗原管塗佈 濃度 第2輪 選擇方法1 第2輪 選擇方法2 第2輪 選擇方法3 pEDA3U 1 pg/ml ΙχΙΟ9 1.8χ109 2.4χ1010 pEDA3U 20 pg/ml 6χ109 1.8χ1010 8.5χ1010 pEDA5U 1 pg/ml 9χ108 1.4χ109 2.8χ1010 pEDA5U 20 pg/ml 9.5χ109 8.5χ109 2.8χ1010 129025.doc -194- 200848427 PEDA7U 1 pg/ml 7.8χ108 1.6xl〇8 4χ1〇10 PEDA7U 20 pg/ml ΙχΙΟ10 8x109 1.5χ1010 對於TARl-27，如先前所述進行選擇，存在以下變更。 在使用1 pg/ml或20 gg/ml人類丁NFa塗佈之抗原管中用含 〇·1 %吐溫之PBS洗滌20次進行第一輪選擇。在抗原管中使 用20次洗滌後培育隔夜，接著進一步洗滌2〇次進行第二輪 選擇。將來自第2輪選擇之單一純系挑取入96孔平板中， 且在96孔平板中製備粗上清液預產物2⑺卜 TAR1-27滴度如下： 人類TNFa 抗原管塗佈濃度 第1輪 第2輪 pEDA3U 1 pg/ml 4χ109 6x109 pEDA3U 20 pg/ml 5χ109 4.4χ1010 pEDA5U 1 pg/ml 1.5χ109 1.9χ1010 pEDA5U 20 pg/ml 3.4χ109 3·5χ1010 pEDA7U 1 pg/ml 2.6χ109 5χ109 pEDA7U 20 pg/ml 7χ109 1.4χ1010 1.2.2 TNF受體 1(ρ55受體；TAR2) 如先前所述僅對TAR2h-5資料庫進行選擇。在使用1 pg/ml人類p55 TNF受體或1〇 pg/ml人類p55 TNF受體的抗 原管中，用含0.1 %吐溫之PBS洗滌20次，培育隔夜接著進 一步洗滌20次進行3輪選擇。將來自第2輪及第3輪選擇之 單一純系挑取入96孔平板中，且在96孔平板中製備粗上清 液預產物2 ml。 TAR2h-5滴度如下： 129025.doc -195- 200848427 第1輪人類p55TNF 受體抗原管塗佈濃度 第1輪 第2輪 第3輪 pEDA3U 1 pg/ml 2.4xl〇6 1·2χ1〇7 1.9xl〇9 pEDA3U 10 pg/ml 3.1χ1〇7 7χ1〇7 lxlO9 ~ pEDA5U 1 pg/ml 2.5χ1〇6 Ι.ΙχΙΟ7 5.7χ1〇8 " pEDA5U 10 μ^/πύ 3.7χ1〇7 2.3χ1〇8 2·9χ1〇9 pEDA7U 1 pg/ml ---—— — 1·3χ1〇6 1.3χ107 1·4χ1 〇9 pEDA7U 10 pg/ml 1·9χ107 3x10^ '~~ 1.3篩選 若適當，自來自不同選擇方法之各3U、51；及7U資料庫 之第2輪或第3輪選擇中挑取單一純系。使純系在37χ：下在 具有100 pg/ml胺苄青黴素及1〇/〇葡萄糖之2χΤγ中生長隔 仪。將該培養物之1/1 〇〇稀釋液接種於在96孔平板中之2⑹ 具有100 pg/ml胺苄青黴素及葡萄糖之2χΤγ中，且使 其在37°C下生長，震盪直至〇D6〇〇為約〇 9。接著在3(Γ(： 下，以1 mM IPTG將培養物誘導隔夜。藉由在s〇rvai平板 離心分離機中以4000 rpm離心15分鐘使上清液澄清。將該 上清液預產物用於初始篩選。
1.3.1 ELISA 藉由蛋白質A/L ELISA或藉由抗原ELISA將二聚重組蛋 白質之結合活性與單體之結合活性相比較。簡言之，在 4°C下以抗原或蛋白質α/L將96孔平板塗佈隔夜。將平板以 0.05%吐溫-PBS洗滌，以2%吐溫-PBS阻斷2小時。將試樣 添加至平板中，在室溫下培育丨小時。將平板洗滌且在室 溫下以第二試劑培育1小時。洗滌平板且以TMB底物顯 影。將蛋白質A/L-HRP或India-HRP用作第二試劑。對於抗 原ELISA ’所用抗原濃度為對於人類TNFa及人類THF受體 129025.doc -196- 200848427 1而言於PBS中1 pg/ml。歸因於引導dAb之存在，在大多數 情況下二聚體給出陽性ELISA信號，因此藉由Biac〇re檢查 分解速率測定值（off rate determination)。 1.3.2 Biacore 對TAR1 -5及TAR2h-5純系進行Biacore分析。為進行筛 選’以高密度（約10000 RU)將人類TNFa與CM5晶片偶聯。 將50 μΐ人類TNFa(50 pg/ml)以5 μΐ/min與在乙酸鹽緩衝液_ PH 5·5中的晶片偶聯。歸因於人類TNFa之不穩定性，使用 標準方法再生分析後之晶片並不可能，因此分析各試樣 後，以緩衝液將晶片洗滌1 0分鐘。 對於TAR1-5，藉由Biacore篩選來自第2輪選擇之純系上 清液。使用以下選擇方法自所獲得之3U、5U及7U資料庫 之每一者篩選48個純系：
Rl : 1 pg/ml人類TNFa抗原管、R2 1 pg/ml人類TNFa抗原 管，洗滌隔夜。 R1 : 20 pg/ml 人類 TNFa抗原管、R2 20 pg/ml 人類 TNFa抗 原管，洗滌隔夜。
Rl : 1 pg/ml人類TNFa抗原管、R2珠粒上33皮莫耳生物素 化人類TNFa。 R1 : 20 pg/ml人類TNFot抗原管、R2 33皮莫耳生物素化人 類TNFa珠粒。 為進行篩選，以高密度（約4000 RU)將人類p55 TNF受體 與CM5晶片偶聯。將100 μΐ人類p55 TNF受體（10 pg/ml)以5 129025.doc -197- 200848427 μΐ/min與在乙酸鹽緩衝液·ρΗ 5.5中之晶片偶聯。檢查標準 再生條件（甘胺酸pH 2或ρΗ3)，但在各情況下，抗原自晶 片表面移出如攜帶TNFa，因此分析各試樣後，以緩衝液 將晶片洗務1 〇分鐘。 對於TAR2-5，篩選來自第2輪選擇之純系上清液。 使用以下選擇方法自3U、5U及7U資料庫之每一者篩選 48個純系：
Rl : 1 pg/ml人類P55 TNF受體抗原管、R2 1 pg/ml人類P55 TNF受體抗原管，洗滌隔夜。 R1 : 10 Mg/ml人類P55 TNF受體抗原管、R2 1〇 pg/ml人類 p5 5 TNF受體抗原管，洗滌隔夜。 1.3.3受體及細胞檢定 受體檢定中二聚體中和之能力如下進行： 受體結合 測試抗TNF dAb抑制TNF與重組TNF受體1(P55)結合之能 力。簡言之，以30 mg/ml抗人類Fc小鼠單株抗體（Zymed， San Francisco, USA)將Maxisorp平板培育隔夜。以含有 0.05%吐溫-20之填酸鹽緩衝生理食鹽水（pbs)洗務孔，且 隨後以含1% BSA之PBS中阻斷，之後以1〇〇 ng/ml TNF受 體 1 Fc融合蛋白質（R & D Systems，Minneapolis，USA)培 育。將抗TNF dAb與以10 ng/mi最終濃度添加至經洗滌孔 中之TNF混合。TNF結合係用〇·2 mg/mi生物素化抗tnF抗 體（HyCult biotechnology，Uben，Netherlands)，接著用 1:500稀釋之經辣根過氧化物酶標記之抗生蛋白鏈菌素 129025.doc -198- 200848427 (Amersham Biosciences，UK)且隨後以 TMB 底物（KPL， Gaithersburg，USA)培育來偵測。藉由添加HC1終止反應且 在45 0 nm下讀取吸光率。抗TNF dAb活性引起TNF結合下 降，且因此與僅TNF對照相比，吸光率下降。 L929細胞毒性檢定 亦測試抗TNF dAb之中和TNF對小鼠L929纖維母細胞之 細胞毒性活性的能力（Evans，T. (2000) Molecular Biotechnology 15，243-248)。簡言之，將裝於微量滴定盤 中之 L929細胞用抗TNF dAb、100 pg/ml TNF 及 1 mg/ml 放 線菌素D(Sigma，Poole，UK)培育隔夜。以[3-(4,5-二甲基嗟 唑-2-基）-5-(3-羧基曱氧基苯基）-2-(4-磺苯基）-2H-四唑鏽 (Promega，Madison，USA)培育後，藉由在490 nm下讀取吸 光率量測細胞生活力。抗TNF dAb活性引起TNF細胞毒性 下降，且因此與僅TNF對照相比，吸光率增加。 在初始篩選中，如上所述所製備用於Biacore分析之上清 液亦用於受體檢定中。亦在受體及細胞檢定中使用純化之 蛋白質進行所選擇二聚體之進一步分析。 海拉（Hela)lL-8檢定 測試抗TNFR1或抗TNFa dAb之中和經TNF誘導海拉細胞 中 IL-8 分泌之能力（自 Akeson，L·等人（1996) Journal of Biological Chemistry 271，305 17-30523 之描述 IL-1 誘導 HUVEC中之IL-8的方法改造之方法；此處檢查經人類 TNFa之誘導作用且使用海拉細胞代替HUVEC細胞株）。簡 言之，將裝於微量滴定盤中之海拉細胞以dAb及300 Pg/ml 129025.doc -199- 200848427 TNF培育隔夜。培育後，將上清液之細胞吸出，且經由夾 層ELISA(R & D Systems)量測IL-8濃度。與僅TNF對照相 比，抗TNFR1 dAb活性引起上清液中IL-8分泌下降。 在以下實驗中始終使用L929檢定；然而，較佳使用海拉 IL-8檢定量測抗TNF受體1(ρ55)配位體；L929檢定中小鼠 p55之存在對其用途造成某些限制。 1.4序列分析 將在Biacore及受體檢定篩選中證明具有受關注特性之二 聚體定序。序列詳述於序列表中。 1.5格式化 1.5.1 TAR1-5-19二聚體 在細胞及受體檢定中將經展示具有優良中和特性之 TAR1 _5二聚體重新格式化且分析。以親和力成熟純系 丁八111-5-19取代丁八111-5引導〇1八15。為實現此目的，將丁八111-5自個別二聚體對中選殖出，且以經PCR擴增之TAR1-5-19 取代。另外，亦在3U、5U及7U載體中構築丁八111-5-19均二 聚體。基因之N末端複本經PCR擴增且如上所述選殖且C末 端基因片段使用現存及限制性部位選殖。 1.5.2誘變 藉由定點誘變使dAb2(TARl-5二聚體對中的一個C末端 dAb)中存在之琥珀終止密碼子突變為麩醯胺酸。 1.5.3 Fab 使含有TAR1-5或TAR1-5-19之二聚體重新格式化至Fab 表現載體中。使用5//7及限制性部位將dAb選殖入含 129025.doc -200- 200848427 有CK或CH基因之表現載體中且藉由序列分析校驗。ck載 體獲自pUC基胺苄青黴素抗性載體且CH載體獲自pACYC 氣Μ素抗性載體。對於Fab表現而言，將dAb-CH及dAb-CK 構桌體共轉型入HB 2151細胞中，且在含有〇·ι%葡萄糖、 100 pg/ml胺苄青黴素及10 pg/mi氯黴素之2χτγ中生長。 1·5·3鉸鏈二聚作用 檢查dAb經由半胱胺酸鍵形成之二聚作用。在(1八1^之（：末 端區域將胺基酸短序列EPKSGDKTHTCPPCP(人類IgGCl金交 鏈之修飾形式）工程化。如先前所述，合成編碼該序列之 券連接子且使其退火。使用7及#〇 ί 7限制性部位將連接 子選殖入含有TAR1-5-19之pEDA載體中。在周質中原位發 生二聚作用。 1.6表現及純化 1.6.1表現 如先前所述，在96孔平板中製備上清液2 ml用於初始篩 選。初始篩選過程後，進一步分析所選擇之二聚體。將二 聚體構築體以上清液形式表現於Τοριορ或HB2151細胞 中。簡言之，在37°C下，使來自新鮮劃線平板之個別群落 在具有100 pg/ml胺苄青黴素及1%葡萄糖之2χΤγ中生長隔 仪。將該培養物之1/1 00稀釋液接種於具有100 胺苄 月撤素及0.1%葡甸糖之2χΤΥ中，且使其在37。〇下生長，震 盪直至OD600為約〇·9。接著在3〇。〇下，以1 mM IPTG將培 養物誘導隔夜。藉由離心移除細胞且以蛋白質A或L瓊脂 糖純化上清液。 129025.doc -201 - 200848427
Fab及半胱胺酸鉸鏈二聚體在HB2 152細胞中表現為周質 蛋白質。將隔夜培養物之1/100稀釋液接種於具有〇1%葡 萄糖及適當抗生素之2xTY中，且使其在3(rc下生長，震盛 直至OD600為約〇.9。接著，在25°C下以1 mM IPTG將培養 物誘導3-4小時。藉由離心收集細胞，且將顆粒再懸浮於 周質製備緩衝液（30 mM Tris-HCl pH 8·0、1 mM EDTA、 20%薦糖）中。離心後，保留上清液且將顆粒再懸浮於$ mM MgS〇4中。再次藉由離心收集上清液、彙集且純化。 1.6.2蛋白質a/L純化 檢查來自蛋白質L瓊脂糠（Affitech，Norway)或蛋白質A 瓊脂糖（Sigma，UK)之二聚體蛋白質之純化的最優化。使用 蠕動泵藉由分批或管柱溶離來溶離蛋白質。檢查三種緩衝 液：〇·1 Μ磷酸鹽-擰檬酸鹽緩衝液ρΗ 2·6、〇·2 M甘胺酸pH 2·5及0·1 M甘胺酸pH 2.5。最佳條件確定為在蠕動泵條件 下使用0·1 Μ甘胺酸pH 2.5溶離10個管柱體積。自蛋白質A 之純化係在瑞動果條件下使用0 · 1 Μ甘胺酸pH 2.5進行。 1.6.3 FPLC純化 藉由 FPLC 分析在 AKTA Explorer 1〇〇 系統（Amersham Biosciences Ltd)上進行進一步純化。藉由陽離子交換層析 (1 ml Resource S-Amersham Biosciences Ltd)以 50 mM 乙酸 鹽緩衝液pH 4中之0-1 M NaCl梯度溶離分級分離tAR1-5及 TAR1-5-19二聚體。藉由離子交換（1 ml Res〇UIXe q
Amersham Biosciences Ltd)以 25 mM Tris HC1 pH 8 〇 中之 0-1 M NaCl梯度溶離純化鉸鏈二聚體。藉由尺寸排阻層析 129025.doc -202- 200848427 法使用在含0.05%吐溫之PBS中以0.5 ml/min流速操作之 superose 12(Amersham Biosciences Ltd)管柱 I屯 4匕 Fab 。 I屯 化後，使用 vivaspin 5K斷流濃縮器（cut off concentrator) (VivascienceLtd·)濃縮試樣。 2.0結果 2.1 TAR1-5二聚體 自包涵所有資料庫及選擇條件之第二輪選擇挑取6x96個 純系。製備上清夜預產物且藉由抗原及蛋白質L ELISA、 Biacore及在受體檢定中檢定。在ELISA中，鑑別來自各選 擇方法之陽性結合純系，將其分布在3U、5U及7U資料庫 之間。然而，由於引導dAb總是存在，因此不可能藉由該 方法區別高及低親和力結合物，因此進行Biacore分析。 使用2 ml上清液進行Biacore分析。Biacore分析顯示，與 單體TAR1-5相比，二聚體Kw速率大大提高。與在10·3-10·4 Μ範圍内的二聚體反。以速率相比，單體Koff速率在10·1 Μ之 範圍内。選擇似乎具有極慢分解速率之1 6個純系，此等純 系來自3U、5U及7U資料庫且將其定序。另外，分析上清 液在受體檢定中中和人類TNFa之能力。 在該等檢定中中和且已定序之6個前導純系（下文之dl-d6)。結果展示所獲得之6個純系中僅存在3個不同第二 dAb(dAbl、dAb2及dAb3);然而，若第二dAb出現一次以 上，則其由不同長度連接子連接。 TARl-5dl ·· 3U 連接子第二 dAb = dAbl-l pg/ml Ag 抗原管 洗滌隔夜； 129025.doc -203 · 200848427 TARl-5d2: 3U 連接子第二 dAb = dAb2-l pg/ml Ag 抗原管 洗滌隔夜； TARl-5d3: 5U 連接子第二 dAb=dAb2-l pg/ml Ag 抗原管 洗滌隔夜； TARl-5d4: 5U連接子第二dAb=dAb3_20 pg/ml Ag抗原 管洗滌隔夜； TARl-5d5 : 5U連接子第二dAb=dAbl-20 pg/ml Ag抗原 管洗滌隔夜； TARl-5d6 ·· 7U連接子第二 dAb=dAbl-Rl:l pg/ml Ag抗 原管洗滌隔夜；R2:珠粒。 進一步檢查六個前導純系。自周質及上清液產生蛋白 質，以蛋白質L瓊脂糖純化且在細胞及受體檢定中檢查。 中和程度可變（表1)。確定蛋白質製備之最佳條件。以上清 液形式自HB2 15 1細胞產生之蛋白質提供最高產率（約10 mg/L培養物）。在室溫下以蛋白質L瓊脂糖將上清液培育2 小時，或在4°C下培育隔夜。以PBS/NaCl洗滌珠粒且使用 蠕動泵裝填於FPLC管柱上。將珠粒以1 0個管柱體積之 PBS/NaCl洗滌且以0.1 Μ甘胺酸pH 2.5溶離。通常，二聚 蛋白質在單體後溶離出。 藉由FPLC純化TARl-5dl-6二聚體。藉由FPLC純化獲得 三種物質且藉由SDS PAGE鑑別。一種物質對應於單體且 其他兩種物質對應於不同尺寸之二聚體。兩種物質之較大 可能歸因於C末端標記物之存在。在受體檢定中檢查該等 蛋白質。表1中提供之數據表示獲自兩種二聚物質之最佳 129025.doc -204- 200848427 結果（圖11)。 將來自二聚體對之三種第二dAb(亦即dAbl、dAb2及 dAb3)選殖為單體且藉由ELISA且在細胞及受體檢定中檢 查。所有三種dAb藉由抗原ELISA特異性結合TNF且不與 塑料或BSA交叉反應。作為單體，dAb在細胞或受體檢定 中均不中和。 2.1.2 TAR1-5-19二聚體 TAR1-5-19取代6個前導純系中之TAR1-5。除非另作說 明，否則使用總蛋白質（僅純化蛋白質L)在細胞及受體檢 定中進行所有TAR1-5-19二聚體之分析（表2)。TAR1-5-19d4及TARl-5-19d3在細胞檢定中具有最佳ND50(約5 nM)，此與受體檢定結果一致，且較TAR1-5-19單體（ND50 約30 nM)有提高。儘管純化之TAR1-5二聚體在受體及細胞 檢定中提供可變結果，但TAR1-5-19二聚體較一致。當在 蛋白質純化期間使用不同溶離緩衝液時展示可變性。使用 0.1 Μ磷酸鹽-檸檬酸鹽緩衝液pH 2.6或0.2 Μ甘胺酸pH 2.5 溶離，儘管移除來自蛋白質L瓊脂糖之所有蛋白質，但在 大多數情況下致使其功能降低。 將TARl-5-19d4表現於醱酵罐中，且在陽離子交換FPLC 上純化以產生完全純的二聚體。如TARl-5d4般，藉由 FPLC純化獲得三種對應於單體及兩種二聚體物質之物 質。對該二聚體進行胺基酸定序。接著，在受體檢定中檢 查TAR1-5-19單體及TARl-5-19d4，且單體之所得IC50為30 nM且二聚體之所得IC50為8 nM。將比較TAR1-5-19單體、 129025.doc -205 - 200848427 TARl-5-19d4及TARl-5d4之受體檢定之結果展示於圖l〇 中〇 在3U、5U及7U載體中製備TARK5_19均二聚體、表現且 用蛋白質L純化。在細胞及受體檢定中檢查蛋白質且測定 所得ICW對於受體檢定）及NDs〆對於細胞檢定）（表3，圖 12) 〇 2.2 Fab 亦將TAR 1-5及TAR1-5-19二聚體選殖入Fab形式中、表 現且用蛋白質L複脂糖純化。在受體檢定中評估Fab(表 4)。結果展示對於TAR1-5-19與TAR1-5二聚體，中和程度 與衍生其之初始Glyjer連接子二聚體相似。表現呈現在 CH與CK上之TAR1-5-19的TARH19Fab、用蛋白質L純化 且在受體檢定中評估。所得IC5〇為約i nM。 2·3 TAR1-27二聚體 自包含所有 > 料庫及選擇條件之第2輪選擇挑取3><96個 純系。製備2 ml上清液預產物用以在EusA及生物檢定中 刀析才几原ELISA提供71個陽性純系。粗上清液之受體檢 定產生42個具有抑制特性之純系（TNF結合0-60%)。在大多 數情況下，抑制特性與飢似信號相關。將42個純系定 序，此等純系中之39個具有獨特第二dAb序列。進一步分 析12種提供最佳抑制特性之二聚體。 以2 0 0 m 1上清液預產物形式表現i 2個中和純系且用蛋白 貝L、'屯化肖由蛋白質L及抗原ELISA、Biacore且受體檢定 評估該等純系。在所有情況下均獲得強陽性ELISA信號。 129025.doc -206- 200848427
Biacore刀析顯示所有純系具有快結合及分解速率。與單體 TAR1-27相比分解速率提高，然而與先前檢查之TAR1-5二 聚體（κ。^約在10·3_10-4 M範圍内）相比，tAR1-27二聚體之 分解速率較快（K〇ff約在1〇·ι及1〇-2 Μ範圍内）。純化之二聚 體之穩疋性尚有疑問，且因此為提高穩定性，在2種TAR1 -27二聚體（d2及dl6)之純化中添加5%甘油、〇.5〇/0 Triton X100或0.5。/DNP40(Sigma)。添加NP40或TritonX100TM將純 化產物之產量提尚約2倍。在受體檢定中評估2種二聚體。 在所有純化條件下，TARl-27d2提供約30 nM之IC50。當 不使用穩定劑而進行純化時，TAR1_27dl6展示無中和效 應，但當在穩定條件下純化時，提供約5〇 nMiIC5〇。不 進行進一步分析。 2.4 TAR2-5二聚體 自包含所有資料庫及選擇條件之第2輪選擇挑取3χ96個 純系。製備2 ml上清液預產物用以分析。對各平板進行蛋 白質A及抗原ELISA。經Biacore鑑別3〇個受關注純系具有 優良分解速率（K-範圍介於1 〇·2-丨〇-3 M之間）。將純系^序 且藉由序列分析鑑別13個獨特二聚體。 129025.doc 207- 200848427 表1 : TAR1-5二聚體 二聚體 細胞類型 純化 蛋白質溶離份 溶離條件 受體/細胞檢定 TARl-5dl HB2151 蛋白質 L+FPLC 小二聚物質 0.1 Μ甘胺酸 pH 2.5 RA 約 30nM TARl-5d2 HB2151 蛋白質 L+FPLC 小二聚物質 0.1 Μ甘胺酸 pH 2.5 RA 約 50nM TARl-5d3 HB2151 蛋白質 L+FPLC 大二聚物質 0.1 Μ甘胺酸 pH 2.5 RA 約 300nM TARl-5d4 HB2151 蛋白質 L+FPLC 小二聚物質 0.1 Μ甘胺酸 pH 2.5 RA 約 3nM TARl-5d5 HB2151 蛋白質 L+FPLC 大二聚物質 0.1 M甘胺酸 pH 2.5 RA 約 200nM TARl-5d6 HB2151 蛋白質 L+FPLC 大二聚物質 0.1 Μ甘胺酸 pH 2.5 RA 約 ΙΟΟηΜ *註釋：二聚體2及二聚體3具有相同第二dAb(稱為dAb2)， 然而具有不同長度連接子（d2 = (Gly4Ser)3 、 d3 = (Gly4Ser)3)。dAbl 為二聚體 1、5 及 6之搭配物 dAb。 dAb3為二聚體4之搭配物dAb。搭配物dAb單獨無中和作 用。除非另作說明，否則藉由陽離子交換進行FPLC純 化。在該等檢定中測定藉由FPLC獲得之各二聚體之最佳 二聚物質。 129025.doc 208 - 200848427 表2 : TAR1-5-19二聚體 二聚體 細胞類型 純化 蛋白質溶離份 溶離條件 受體/細胞 檢定 TARl-5-19dl TOPI OF 蛋白質L 總蛋 白質 0.1 Μ甘胺酸 pH 2.0 RA 約 15nM TARl-5-19d2 (無終止密碼 子） TOPI OF 蛋白質L 總蛋白質 0.1 Μ甘胺酸 pH 2.0+ 0.05% NP40 RA 約 2nM TARl-5-19d3 (無終止密碼 子） TOPIOF 蛋白質L 總蛋白質 0.1 Μ甘胺酸 pH 2.5+ 0.05% NP40 RA 約 8 nM TARl-5-19d4 TOPI OF 蛋白質 L+FPLC FPLC純化之溶 離份 0.1 Μ甘胺酸 pH 2.0 RA 約 2-5 nM CA 約 12nM TARl-5-19d5 TOPIOF 蛋白質L 總蛋白質 0.1 M甘胺酸 pH 2.0+ NP40 RA 約 8nM CA約 ΙΟηΜ TARl-5-19d6 TOPIOF' 蛋白質L 總蛋白質 0.1 Μ甘胺酸 pH 2.0 RA 約 ΙΟηΜ
表3 : TAR1-5-19均二聚體 二聚體 細胞類型 純化 蛋白質溶離份 溶離條件 受體/細胞檢定 TAR1-5-19 3U均二聚體 HB2151 蛋白質L 總蛋白質 0.1 Μ甘胺酸 pH 2.5 RA 約 20nM CA 約 30nM TAR1-5-19 5U均二聚體 HB2151 蛋白質L 總蛋白質 0.1 Μ甘胺酸 pH 2.5 RA 約 2nM CA 約 3 nM TAR1-5-19 7U均二聚體 HB2151 蛋白質L 總蛋白質 0.1 Μ甘胺酸 pH 2.5 RA 約 ΙΟηΜ CA約 15nM TAR1-5-19 cys鉸鏈 HB2151 蛋白質 L+FPLC —------- FPLC純化之二 聚體溶離份 0.1 Μ甘胺酸 pH 2.5 RA 約 2nM TAR1-5-19CH/TAR1 -5-19 CK HB2151 蛋白質 總蛋白質 0.1 M甘胺酸 pH 2.5 RA 約 1 nM 129025.doc -209- 200848427 表 4 : TAR1-5/TAR1-5-19 Fab
二聚體 細胞類型 純化 蛋白質溶離份 溶離條件 受體/細胞檢定 TAR1-5CH/ dAbl CK HB2151 蛋白質L 總蛋白質 0.1 Μ檸檬 酸鹽pH 2.6 RA 約 90nM TAR1-5CH/ dAb2 CK HB2151 蛋白質L 總蛋白質 0.1 Μ甘胺 酸pH 2.5 RA 約 30nM CA 約 60nM dAb3CH/ TAR1-5CK HB2151 蛋白質L 總蛋白質 0.1 Μ檸檬 酸鹽pH 2.6 RA 約 ΙΟΟηΜ TAR1-5-19CH/ dAbl CK HB2151 蛋白質L 總蛋白質 0.1 Μ甘胺 酸pH 2.0 RA 約 6nM dAbl CH/ TAR1-5-19CK HB2151 蛋白質L 0.1 Μ甘胺酸 ρΗ2·0 Myc/flag RA 約 6nM TAR1-5-19CH/ dAb2 CK HB2151 蛋白質L 總蛋白質 0.1 Μ甘胺 酸pH 2.0 RA 約 8nM CA 約 12nM TAR1-5-19CH/ dAb3 CK HB2151 蛋白質L 總蛋白質 0.1 Μ甘胺 酸pH 2.0 RA 約 3nM 實例7 ·藉由末端半胱胺酸連接之dAb二聚作用 概要 對於dAb二聚作用，在蛋白質之C末端將游離半胱胺酸 工程化。當表現時，蛋白質形成可藉由兩步純化法純化之 二聚體。 TAR1-5-19CYS二聚體之PCR構築 參見描述dAb三聚體之實例8。三聚體方案產生單體、二 聚體及三聚體之混合物。 TAR1-5-19CYS二聚體之表現及純化 藉由如實例8中所概述捕獲在蛋白質L瓊脂糖上自培養物 之上清液純化二聚體。 129025.doc -210- 200848427 分離 TARl-5-1 9CYS 單體與 TAR 1-5-19CYS二聚體 陽離子交換分離前，使用PD-10管柱（Amersham Pharmacia)遵循製造商之指導原則，將混合之單體/二聚體 試樣緩衝交換於50 mM乙酸鈉緩衝液pH 4.0中。接著，將 試樣施加至已用50 mM乙酸鈉pH 4.0預平衡之1 mL Resource S陽離子交換管柱（Amersham Pharmacia)中。使用 以下在50 mM乙酸鈉pH 4.0中之鹽梯度分離單體與二聚 體： 15個管柱體積以上之150至200 mM氯化鈉； 10個管柱體積以上之200至450 mM氣化鈉； 15個管柱體積以上之450至1000 mM氯化納。 使用SDS-PAGE鑑別僅含有二聚體之溶離份，且隨後彙 集且藉由添加1/5體積之1 M Tris pH 8.0使pH值增至8。 活體外功能結合檢定：TNF受體檢定及細胞檢定 使用TNF受體及細胞檢定測定二聚體對人類TNFa之親和 力。受體檢定中之IC50為約0.3-0.8 nM ;細胞檢定中之 ND50為約 3·8 nM。 其他可能的丁八111-5-190丫8二聚體形式 PEG二聚體及常規合成之順丁烯二醯亞胺二聚體
Nektar(Shearwater)提供一系列雙順丁稀二龜亞胺PEG [mPEG2-(MAL)2或mPEG-(MAL)2]，其將允許單體格式化 為二聚體，二聚體具有小連接子將dAb分開，且兩者均連 接至尺寸範圍在5至40 Kda之PEG。已展示5 Kda mPEG-(MAL)2(亦即，[TARl-5-19]_Cys-順丁 烯二醯亞胺- 129025.doc •211 - 200848427 PEGx2 ， ，其中在二聚體中順丁烯 TNF受體檢定中具有約1 TMEA(參[2-順 丁烯二 丁烯二 丁烯二醯亞胺係連接在一起）在 -3 nM之親和力。亦可使用 醯亞胺基乙基]胺）（Pierce
Biotechnology)或其他雙功能連接子產生二聚體。
Aldrich)及還原單體產生二硫化物二聚體。 將多肽連接子或鉸鏈添加至dAbtC末端 可在dAb與末端半胱胺酸殘基之間將小連接子 ((Gly4Ser)n，其中 1〇 ’例如 1、2、3、4、5、6 或 7， 或者免疫球蛋白（例如IgG鉸鏈區或隨機肽序列（例如選自 隨機狀序列之資料庫川工程化。此可隨後用以製備如上所 概述之二聚體。 實例8. dAb三聚作用 概要 對於dAb三聚作用，在蛋白質之c末端需要游離半胱胺 酸。半脱胺酸殘基經還原為游離硫醇後，可隨後用以將蛋 白質特異性偶聯至三聚順丁烯二醯亞胺分子，例如 TME A(參[2-順丁烯二醯亞胺基乙基]胺）。 了八111_5_19(：¥8之1>(^11構築 以下募核苷酸用以用心//及5謂///部位特異性PCR TAR1-5-19選殖’以及引入c末端半胱胺酸殘基： 129025.doc •212- 200848427
Sail 〜〜〜〜〜〜〜〜
Trp Ser Ala Ser Thr Asp* lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 TGG AGC GCG TCG ACG GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCT CTG TCT GCA TCT GTA
ACC TCG CGC AGC TGC CTG TAG GTC TAC TGG GTC AGA GGT AGG AGA GAC AGA CGT AGA CAT
Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Asp Ser Tyr Leu His Trp
61 GGA GAC CGT GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT GAT AGT TAT TTA CAT TGG
CCT CTG GCA CAG TGG TAG TGA ACG GCC CGT TCA GTC TCG TAA CTA TCA ΑΤΑ AAT GTA ACC
Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ser Ala Ser Glu Leu Gin
121 TAC CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT AGT GCA TCC GAG TTG CAA
ATG GTC GTC TTT GGT CCC TTT CGG GGA TTC GAG GAC TAG ATA TCA CGT AGG CTC AAC GTT
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie
181 AGT GGG GTC CCA TCA CGT TTC AGT GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC
TCA CCC CAG GGT AGT GCA AAG TCA CCG TCA CCT AGA CCC TGT CTA AAG TGA GAG TGG TAG
Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Val Val Trp Arg Pro
241 AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCT ACG TAC TAC TGT CAA CAG GTT GTG TGG CGT CCT
TCG TCA GAC GTT GGA CTT CTA AAA CGA TGC ATG ATG ACA GTT GTC CAA CAC ACC GCA GGA
BamHI
Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg Cys ★★★ *** Gly Ser Gly
301 TTT ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGG TGC TAA TAA GGA TCC GGC
AAA TGC AAG CCG GTT CCC TGG TTC CAC CTT TAG TTT GCC ACG ATT ATT CCT AGG CCG (*TARl-5-19CYS序列開始點） 前置引子 5 ’-TGGAGCGCGTCGACGGAC ATCCAGATGACCCAGTCTCCA-3 ’ 反置引子 5 ’-TTAGCAGCCGGATCCTTATTAGC ACCGTTTGATTTCCAC-3， PCR反應（50 μί體積）設定如下：200 μΜ dNTPs、0.4 μΜ 各引子、5 μί l〇x/ywTurbo緩衝液（Stratagene)、100 ng模板 質體（編碼 TAR1-5-19)、1 pL P/wTurbo酶（Stratagene)且使 用無菌水將體積調整至50 μί。使用以下PCR條件：初始變 性步驟，94°C歷時2分鐘，接著進行25個以下循環：94°C 歷時30秒、64°C歷時30秒及72°C歷時30秒。亦包括72°C歷 時5分鐘之最終擴展步驟。純化PCR產物且以W/及5am/// -213 - 129025.doc 200848427 /肖化且連接至亦經相同限制酶切割之載體上。藉由DNA 序列校驗正確純系。 TAR1-5-19CYS之表現及純化 遵循製造商之方案，將TAR1-5_19CYS載體轉型入 BL21(DE3)pLysS 化學感受態細胞（N〇vagen) 中。使用100 pg/ml羧苄青黴素及37 μ§/ιη1氯黴素選擇攜帶dAb質體之細 胞。將培養物置於含有500㈤乙極品肉湯（Sigma-Aldrich)、 ...1〇0 μ§/ΐΏΐ羧苄青黴素及37 Pg/ml氯黴素之2 L·裝 有隔板的 燒瓶中。使培養物在3〇°C下在200 rpm下生長直至1-1.5之 O.D.600，且隨後以！ mM IpTG(異丙基_p_D —硫代吡喃半乳 糖皆’得自Melford Laboratories)誘導。使dAb之表現在 30 C下持績12-16小時。發現大多數dAb存在於培養基中。 因此’藉由離心（8,0〇〇xg 30分鐘）自培養基分離出細胞， 且使用上清液純化dAb。每公升上清液添加3〇 mL蛋白質L 瓊脂糖（Affitech)，且攪拌下使dAb間歇結合2小時。接 r 著’在虹吸抽出上清液之前，使樹脂在重力下另外沈澱1 小日守。接者’將瓊脂糖裝填於XK 50管柱（Amersham
Pharmacia)中且以10個管柱體積之pbs洗滌。以loo 胺酸pH 2.0溶離結合之dAb，且接著藉由添加1/5體積之1 M Tris pH 8.0中和含有蛋白質之溶離份。每公升培養物上 清液分離出20 mg純蛋白質，其含有比率為5〇:5〇之單體與 二聚體。 TAR1-5-19CYS之三聚作用 以5 mM —硫棘糖醇逛原2.5 ml之1 〇〇 μΜ TAR1-5- 129025.doc -214- 200848427 19CYS，且在室溫下靜置20分鐘。接著使用PD-10管柱 (Amersham Pharmacia)緩衝交換試樣。管柱已用5 mM EDTA、50 mM磷酸鈉pH 6.5預平衡，且遵循製造商之指導 原則施加試樣且溶離。將試樣置於冰上備用。自Pierce Biotechnology購得TMEA(參[2-川員丁稀二醯亞胺基乙基] 胺）。在100% DMSO(二甲基亞砜）中製備TMEA之20 mM儲 備溶液。發現大於3:l(dAb:TMEA之莫耳比）之TMEA濃度 導致快速沈澱及蛋白質交聯。隨著pH值增大，沈澱及交聯 速率亦變大。因此，使用100 μΜ還原之TAR1-5-19CYS， 添加25 μΜ ΤΜΕΑ以使蛋白質三聚化，且使反應在室溫下 進行2小時。發現隨著偶聯反應進行，加入諸如甘油或乙 二醇之添加劑之至20%(ν/ν)顯著降低三聚體之沈澱。偶聯 後，SDS-PAGE分析展示在溶液中存在單體、二聚體及三 聚體。 三聚丁八111-5-190丫8之純化 向每毫升TMEA-TARl-5-19cys反應物中添加40 pL 40% 冰乙酸以將pH值降低至約4。接著，將試樣施加至已用50 mM乙酸納pH 4.0預平衡之1 mL Resource S陽離子交換管 柱（Amersham Pharmacia)。使用30個管柱體積以上之50 mM乙酸鈉pH 4.0中3 40至450 mM鹽梯度之氯化鈉部分分離 二聚體及三聚體。使用SDS-PAGE鑑別僅含有三聚體之溶 離份，且隨後彙集且藉由添加1/5體積之1 M Tris pH 8.0使 pH值增至8。為防止濃縮步驟期間三聚體沈澱（使用5K斷流 Viva旋轉濃縮器；Vivascience)，將10%甘油添加至試樣 129025.doc -215- 200848427 中ο 活體外功能結合檢定：TNF受體檢定及細胞檢定 使用TNF受體及細胞檢定測定三聚體對人類TNFa之親和 力。受體檢定中IC50為0.3 nM;細胞檢定中ND50在3至10 nM範圍内（例如3 nM)。 其他可能的丁八111-5-190丫8三聚體形式 亦可使用以下試劑將TAR1-5-19CYS格式化為三聚體： PEG三聚體及常規合成之順丁烯二醯亞胺三聚體
Nektar(Shearwater)提供一系歹ij多臂PEG，其可在PEG之 末端經化學修飾。因此，使用在各臂末端具有順丁烯二醯 亞胺官能基之PEG三聚體將允許dAb以類似於上文所概述 使用TMEA之方式三聚化。PEG亦可具有增加三聚體溶解 性，因此防止聚集問題之優點。因此，可產生dAb三聚 體，其中各dAb具有與順丁烯二醯亞胺官能基連接之C末 端半胱胺酸，該順丁烯二醯亞胺官能基與PEG三聚體連 接。 將多肽連接子或鉸鏈添加至dAb之C末端 可在dAb與末端半胱胺酸殘基之間將小連接子 ((Gly4Ser)n，其中 n=l 至 10，例如 1、2、3、4、5、6或 7， 或者免疫球蛋白（例如IgG鉸鏈區或隨機肽序列（例如選自 隨機肽序列之資料庫）））工程化。當用以產生多聚體（例如 二聚體或三聚體）時，此將在個別單體之間再次引入較大 可撓度及距離，此可提高對例如多亞單元標靶（諸如人類 TNFa)之標靶之結合特徵。 129025.doc -216- 200848427 實例9 選擇針對人類血清白蛋白（HSA)及小鼠血清白蛋白 (MSA)之單一域抗體集合物（dAb)。 此實例說明製備針對血清白蛋白之單一域抗體（dAb)之 方法。描述針對小鼠血清白蛋白（MS A)與人類血清白蛋白 (HSA)之dAb的選擇。在此實驗中，使用三種人類噬菌體 呈現抗體資料庫，各資料庫基於VH單一人類框架（參見圖 13 ··基於V3-23/DP47及JH4b之虛設VH的序列）4VK單一人 類框架（參見圖15 :基於ol2/o2/DPK9及Jkl之虛設VK的序 列），其具有併入互補決定區（CDR1、CDR2及CDR3)的經 NNK密碼子編碼之側鏈多樣性。 資料庫1(VH): 多樣性位於位置·· H30、H31、H33、H35、H50、H52、 H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H97、H98。 資料庫大小：6·2χ109 資料庫2(VH): 多樣性位於位置·· H30、H31、H33、H35、H50、H52、 H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H97、H98、H99、 H100、HlOOa、HlOOb。 資料庫大小：4.3 χΙΟ9 資料庫3(VK): 多樣性位於位置：L30、L31、L32、L34、L50、L53、 L91、L92、L93、L94、L96 資料庫大小：2x1 09 129025.doc -217- 200848427 VH及VK資料庫已分別針對結合於一般性配位體蛋白質a 及蛋白質L預選擇，以便未經選擇之資料庫中的大多數純 系具有功能性。上文展示之資料庫之大小對應於預選後之 大小。 分別使用各資料庫對血清白蛋白進行2輪選擇。對於各 選擇，抗原以100 pg/ml之濃度於4 ml PBS中塗佈在抗原管 (nunc)上。在第一輪選擇中，分別針對HSA(Sigma)及 MS A(Sigma)淘選（pan)三個資料庫之每一者。在第二輪選 擇中’再次（i)針對相同抗原（例如第一輪MS A，第二輪 MSA)及（ii)針對相互抗原（例如第一輪msa，第二輪HSA) 淘選六個第一輪選擇之每一者的噬菌體，導致總計12次第 二輪選擇。在各情況下，在第二輪選擇後，測試48個純系 與 HSA 及 MSA 之結合。如 Harrison等人，Methods Enzymol. 1996; 267:83-109關於scFv片段所述產生可溶性dAb片段， 且除2%吐溫PBS用作阻斷緩衝液以外，進行標準ELIS A方 案（Hoogenboom等人（1991)Nucleic Acids Res·，19: 4133)， 且以蛋白質L-HRP(Sigma)(對於VKS)及蛋白質A-HRP(Amersham Pharmacia Biotech)(對於 VHs)偵測結合之 dAbs 〇 以不溶形式ELISA測試給出指示與MSA、HSA或兩者結 合之超過背景之信號的dAb單獨與塑料結合，但所有dAb 均對血清白蛋白具有特異性。接著將純系定序（參見表5)， 顯示已鑑別出21種獨特dAb序列。所選擇之Vk dAb純系之 間的最小相似度（在胺基酸級別上）為86·25%((69/80)χ 129025.doc -218- 200848427 1 00 ;此為當所有多樣化殘基均不同時之結果，例如純系 24及34)。所選擇之VH dAb純系之間的最小相似度為 940/〇((127/136)xlOO)。 接著，測試血清白蛋白結合dAb自溶液捕獲生物素化抗 原之能力。除以1 pg/ml蛋白質L(對於VK純系）及1 pg/ml蛋 白質A(對於VH純系）塗佈ELISA平板以外，遵循ELISA方案 (如上所述）。如方案中般自溶液捕獲可溶性dAb，且使用 生物素化MS A或HS A及抗生蛋白鏈菌素HRP偵測。已根據 製造商之用法說明書製備生物素化MS A及HS A，目的在於 實現每個血清白蛋白分子平均2個生物素。在ELISA中鑑 別出24個自溶液捕獲生物素化MSA之純系，表5。該等純 系中之兩者（下文之純系2及38)亦捕獲生物素化HSA。接 著，測試（1八1)結合塗佈於01^5 31&(：〇^晶片上的1^8八之能 力。發現8個純系結合Biacore上之MS A。 表5
dAb(均捕獲生 物素化MS A) Η 或κ CDR1 CDR2 CDR3 Biacore 中結合 MSA 捕獲生物 素化HSA VK資料庫3 模板(虛設） Κ XXXLX XASXLQS QQXXXXPXT 2、4、7、41 Κ SSYLN RASPLQS QQTYSVPPT /所有4者 均結合 38、54 Κ SSYLN RASPLQS QQTYRIPPT 〆兩者結 合 46、47、52、 56 Κ FKSLK NASYLQS QQVVYWPVT 13、15 Κ YYHLK KASTLQS QQVRKVPRT 30、35 Κ RRYLK QASVLQS QQGLYPPIT 129025.doc -219- 200848427
19 K YNWLK RASSLQS QQNVVIPRT 22 K LWHLR HASLLQS QQSAVYPKT 23 K FRYLA HASHLQS QQRLLYPKT 24 K FYHLA PASKLQS QQRARWPRT 31 K IWHLN RASRLQS QQVARVPRT 33 K YRYLR KASSLQS QQYVGYPRT 34 K LKYLK NASHLQS QQTTYYPIT 53 K LRYLR KASWLQS QQVLYYPQT 11 K LRSLK AASRLQS QQVVYWPAT 12 K FRHLK AASRLQS QQVALYPKT V 17 K RKYLR TASSLQS QQNLFWPRT 〆 18 K RRYLN AASSLQS QQMLFYPKT / 16、21 K IKHLK GASRLQS QQGARWPQT V 25、26 K YYHLK KASTLQS QQVRKVPRT / 27 K YKHLK NASHLQS QQVGRYPKT 〆 55 K FKSLK NASYLQS QQVVYWPVT 〆 VH資料庫1(及 2)模板(虛設） Η XXYXXX XIXXXGXXTXYADSVKG XXXX(XXXX)FDY 8 > 10 Η WVYQMD SISAFGAKTLYADSVKG LSGKFDY 36 Η WSYQMT SISSFGSSTLYADSYKG GRDHNYSLFDY
在所有情況下，框架與相應虛設序列中之框架相同，在 CDR中具有如表5中所指示之多樣性。 結合Biacore上之MSA的8個純系中，選擇2個高度表現 於大腸桿菌中之純系（純系MSA16及MS A26)用於進一步研 究（參見實例10)。於圖16中給出MSA16及26之全部核苷酸 及胺基酸序列。 實例10 測定MS A結合dAb : MS A16及MS A26的親和力及在小鼠 中之血清半衰期。 如US2006025 1644所述，一種用於測定結合親和力之常 129025.doc -220- 200848427 規方法係藉由使用BiacoreTM表面電漿共振系統（Biacore， Inc.)評估接合及解離速率常數。根據製造商（Biacore)之用 法說明書將生物傳感器晶片活化用以共價偶聯標靶。接著 將標靶稀釋且注射在晶片上以獲得以固定材料之反應單位 (RU)計之信號。由於以RU計之信號與固定材料之質量成 正比，因此此表示基質上固定標靶密度之範圍。將解離數 據擬合為單點模型以獲得kQff+/- s.d·(量測值之標準差）。計 算各接合曲線之假一級速率常數（Kd’s)且作為蛋白質濃度 之函數作圖以獲得kon+/- s.e.(擬合標準差）。由SPR量測據 koff/k。。計算結合之平衡解離常數Kd’s。 將dAb MS A16及MS A26表現於大腸桿菌之周質中且使用 分批吸收至蛋白質L-瓊脂糖親和力樹脂（Affitech，Norway) 進行純化，接著以甘胺酸pH 2.2溶離。接著藉由抑制 Biacore分析純化之dAb以測定Kd。簡言之，測試純化之 MSA16及MSA26以測定在經高密度MSA塗佈之Biacore CM5晶片上實現200 RU反應所需的dAb濃度。已測定所需 dAb濃度後，將圍繞預期Kd之濃度範圍的MSA抗原與dAb 預混合且培育隔夜。接著以30微升/分鐘之高流率量測各 預混合物中dAb與經MSA塗佈的Biacore晶片之結合。使用 表面電漿共振（SPR)及Biacore測定親和力（Karlsson等人， 1 991)。Biacore系統（Uppsala，Sweden)為測定結合親和力 之較佳方法。Biacore系統使用表面電漿共振（SPR，Welford Κ· 1991，Opt. Quant· Elect. 23:1，Morton及 Myszka，1998, Methods in Enzymology 295: 268)實時監控生物分子相互 129025.doc -221 - 200848427 作用。Biacore分析便利地產生接合速率常數、解離速率常 數、平衡解離常數及親和力常數。所得曲線用以產生 Klotz圖（Klotz，Ι·Μ· (1982) Science 217:1247-1249及 Klotz， I.Μ· (1983) J. Trends in Pharmacol· Sci· 4:253-255)，對於 MSA16其提供200 nM之估算Kd且對於MSA 26提供70 nM之 估算Kd(圖17 A及B)。 接著，將純系]^8八16及厘8八26選殖入具有11八標記物（核 酸序列：TATCCTTATGATGTTCCTGATTATGCA及胺基酸 序歹，J : YPYDVPDYA)之表現載體中，且將2-10 mg量表現 於大腸桿菌中，且以蛋白質L-瓊脂糖親和力樹脂（Affitech， Norway)自上清液純化，且以甘胺酸pH 2.2溶離。測定dAb 在小鼠中之血清半衰期。以單次靜脈内注射以約1.5 mg/kg 將MSA26及MSA16給與CD1小鼠。藉由山羊抗HA(Abcam， UK)捕獲及經4% Marvel阻斷之蛋白質L-HRP(invitrogen)债 測ELISA分析血清濃度。使用0.05%吐溫PBS洗滌。用存在 於1 X小鼠血清中已知濃度之dAb建立標準曲線以確保與測 試試樣之可比性。以2隔室模型模擬展示MSA-26具有0.16 h 之 tl/2a，14.5 h 之 1:1/2β 及 465 h.mg/ml 之曲線下面積 (AUC)(數據未展示），且MSA-16具有 0.98 h之tl/2cx、36.5 h 之 ΐ1/2β 及 913 h.mg/ml 之 AUC(圖 18)。與具有 0.06 h 之 tl/2a 及0.34 h之1:1/2β的HEL4(抗雞卵白溶菌酶dAb)相比，兩個 抗MSA純系均具有顯著延長之半衰期。 實例11·產生VH-VH及VK-VK雙特異性Fab樣片段 此實例描述製備VH-VH及VK-VK雙特異性Fab樣片段之方 129025.doc -222- 200848427 法。在構築所述之各Fab樣片段之前，結合所選標乾之dAb 首先自類似於實例9所述之dAb資料庫中選擇。分離結合雞 卵溶菌酶（Sigma)之VH dAb，HEL4，且亦分離結合TNFa受 體（R and Dsystems)之第二 VH dAb(TAR2h-5)。此等 dAb之 序列在序列表中給出。藉由選擇及親和力成熟分離結合 TNFa(TARl-5-19)之VK dAb，且亦將序列闡明於序列表 中。亦將實例9中所述之第二VK dAb(MSA 26)用於該等實 驗中，其序列在圖17B中。 以酶Sail及Notl消化含有4個如上所述之dAb的表現載體 之DNA以切下編碼dAb之DMA 〇藉由在瓊月旨糖凝膠上進行 消化純化預期尺寸（300-400 bp)之條帶且切下該條帶，接 著使用Qiagen凝膠純化套組（Qiagen，UK)凝膠純化。接著 如表6所指示將編碼dAb之DNA插入CH或CK載體中（圖8及 9) 〇 表6 dAb 標抗原 dAb VH 或dAb vK 插入 載體中 標記物 (c末端） 抗生素抗性 HEL4 雞卵溶菌 酶 —------ VH CH myc 氣黴素 TAR2-5 TNF受體 Vh Ck flag 胺苄青黴素 TAR1-5- 19 TNFa Vk Ch myc 氯黴素 MSA 26 小氣血清 白蛋白 vK Ck flag 胺苄青黴素 129025.doc -223 - 200848427 將VH CH及VH CK構築體共轉型入HB2151細胞中。將νκ CH及VK CK構築體分別共轉型入ΗΒ2151細胞中。使各共轉 型之細胞株之培養物生長隔夜（在含有5%葡萄糖、1〇 pg/ml氯黴素及1 00 pg/mi胺苄青黴素之2xTy中以保持對cH 與CK質體之抗生素選擇）。使用隔夜培養物接種新鮮培養 基（2xTy，10 pg/ml氯黴素及100 μ§/ηιι胺苄青黴素）且在藉 由添加IPTG誘導之前使其生長至〇d為〇.7-〇.9以表現其Ch 及CK構築體。接著藉由蛋白質a純化（對於共轉型之vH cH 及VH CK)及MSA親和力樹脂純化（對於共轉型之Vk Ch及I CK)自周質純化所表現之Fab樣片段。 VH-VH雙特異性 藉由在凝膠上操作蛋白質測試Vfi CH及VH CK雙特異性之 表現。將凝膠點潰’且可經由myc標記物與乜叫標記物以 西方墨點法偵測Fab片段之預期尺寸的條帶，指示Fab樣片 段之VH CH與VH CK部分均存在。接著，為測定雙特異性之 兩半是否存在於同一 Fab樣片段中，在4°C下以每孔1〇〇 μ1 含3 mg/mL雞卵溶菌酶（HEL)之碳酸氫鈉緩衝液將ELIS Α平 板塗佈隔夜。隨後（如實例丨中所述）以2%吐溫PBS阻斷平 板’接著以VH CH/VH CK雙特異性Fab樣片段培育。使用 9el0(結合myc標記物之單株抗體，R〇che)及抗小鼠IgG_ HRP(Amersham Pharmacia Biotech)该測雙特異性物質經由 非同源鏈與HEL之結合。與單獨表現之vH Ck鏈之0,069之 背景信號相比，VH CH/VH CK雙特異性Fab樣片段之信號為 0.154。此證明Fab樣片段對標靶抗原具有結合特異性。 129025.doc -224- 200848427 νκ-νκ雙特異性 在1^八親和力樹脂上純化共轉型之1(^及1(^雙特異 性Fab樣片段後，使用所得蛋白質探測經1 μ§/ηι1 TNFa塗 佈之ELISA平板及經10 pg/mi MSA塗佈之ELISA平板。如 所預測，當以蛋白質L-HRP偵測兩個ELISA平板時，出現 高於背景之信號（數據未展示）。此指示能夠結合MSA(且因 此在MSA親和力管柱上純化）之蛋白質之溶離份亦能夠在 後續ELISA中結合TNFa，證實抗體片段之雙特異性。接著 將蛋白質之此溶離份用於兩個後續實驗。首先，用雙特異 性¥<(^及乂<(^?313樣片段以及用在£1^8八上發出相似信 號時計算出的濃度之結合dAb之TNFa作為對照探測經1 pg/ml TNFa塗佈之ELISA平板。在存在及不存在2 mg/mL MSA之情況下使用雙特異性dAb與對照dAb探測ELISA平 板。雙特異性孔之信號降低超過50%，但dAb孔之信號根 本未降低（參見圖19a)。在有或無MSA之情況下亦將相同雙 特異性蛋白質進行受體檢定，且亦展示MSA競爭（參見圖 19c)。此證明MS A與TNFa競爭結合雙特異性物。 實例12.對小鼠血清白蛋白及TNFa具有特異性的Vk-Vk雙 特異性cys鍵結之雙特異性物的產生 此實例描述藉由經二硫化物鍵結化學偶聯來製備對小鼠 血清白蛋白與TNFa具有特異性之雙特異性抗體片段之方 法。將MSA16(來自實例1)與TAR1-5-19 dAb再次選殖入具 有C末端半胱胺酸且無標記物之基於pET之載體中。兩種 dAb之表現量為4-10 mg且使用蛋白質L-瓊脂糖親和力樹脂 129025.doc -225 - 200848427 (Affitiech，Norway)自上清液純化。接著以二硫蘇糖醇還 原半胱胺酸標記之dAb。接著將TAR1-5-19 dAb與二硫基二 吡啶偶聯以阻斷二硫化物鍵之再形成，使得PEP 1-5-19均 二聚體形成。接著在pH 6.5下混合兩種不同dAb以促進二 硫化物鍵形成且產生TAR1-5-19，MSA16 cys鍵結之雜二聚 體。King 等人（King TP，Li Y Kochoumian L Biochemistry-1978 第 17卷 ： 1499-506 Preparation of protein conjugates via intermolecular disulfide bond formation)最先描述此用 於產生兩種不同蛋白質之結合物的方法。藉由陽離子交換 將雜二聚體與單體物質分離。由SDS凝膠上存在預期尺寸 之條帶證實分離。在TNF受體檢定中測試所得雜二聚物 質，且發現其中和TNF之IC50為約18 nM。接著，以恆定 濃度之雜二聚體（18 nM)與連續稀釋之MSA及HSA重複受 體檢定。一定濃度範圍内（至多達2 mg/mL)HSA之存在並 未導致二聚體抑制TNFa之能力降低。然而，添加MS A導 致二聚體抑制TNFa之能力劑量依賴型降低（圖20)。此證明 MSA與TNFa競爭結合cys鍵結之TAR1-5-19，MSA16二聚 體。 資料總結 於附錄4中闡明先前實例中所闡明之實驗中所獲得的資 料之總結。 實例13 結合來自一系列物質之血清白蛋白之dAb的選擇及表徵 除以下方案改進外，如先前關於抗MS A dAb所述選擇針 129025.doc -226- 200848427 對人類血清白蛋白、小鼠血清白蛋白及豬血清白蛋白之 dAb ·合成VH域之噬菌體資料庫為資料庫4(}及6G，其基於 包含DP47生殖細胞系基因及Vh2 Jh4片段的人類Vh3，及 包含DPK9生殖細胞系基因及1之Jk1片段的人類。資 料庫包含ΐχΐ〇Μ個個別純系。Vh&Vk資料庫之子集已針對 分別結合通用配位體蛋白質A及蛋白質1預先選擇，以便 未選擇之資料庫中的大多數純系具有功能性。上文展示之 資料庫之大小對應於預選擇後之大小。 分別使用vH&vK資料庫之子集對小鼠、豬及人類血清白 蛋白進行兩或三輪選擇。對於各選擇，將抗原⑴以在4 ml PBS中100 pg/ml之濃度塗佈在抗原管（nunc)上；或（ii)生物 素化且隨後用於可溶性選擇，接著在抗生蛋白鏈菌素珠粒 或中性鏈親和素珠粒上捕獲。在各情況下，在第二或第三 輪選擇後，將選出之DNA選殖入表現載體中以產生可溶性 dAb，且挑取個別群落。如Harris〇n等人（仏化_
Enzymol· 1996; 267:83-109)關於scFv片段所述產生可溶性 dAb片段，且對於各選擇，測試96個可溶性純系與一系列 血清白蛋白之結合。 使用Biacore表面電漿共振儀（Biac〇re AB)篩選結合來自 一系列物種之血清白蛋白之純系。以來自不同物種之血清 白蛋白以高密度在流動單元2至4之每一者上塗佈cm_5 Biacore晶片。將顯示與一或多種所關注之血清白蛋白結合 之dAb定序，且在50 ml等級表現，用蛋白質L純化，且隨 後在已知/辰度下師選以於在流動單元2至4上經低密度血清 129025.doc -227- 200848427 白蛋白塗佈之CM-5 Biacore晶片上結合血清白蛋白之組。 發現結合來自一系列不同物種之血清白蛋白之數種dAb， 在表7中列出較佳候選者以及其結合概況。 表7
HSA(親和 力，若量 測到） RSA(親和 力，若量測 到） MSA(親和 力，若量測 到） Cyno(親和 力，若量測 到） DOM7h-9 結合 200 nM 結合 結合 結合 DOM7h-10 結合 ND ND ND DOM7h-ll 結合 結合 結合 結合 DOM7h-12 結合 ND 結合 結合 DOM7h-13 結合 結合 結合 DOM7h-14 結合 38 nM 結合 結合 27 nM 結合 123 nM 在此實驗中，因此已分離出結合來自一系列非人類物種 之一或多種的HS A及白蛋白之dAb。例如，發現結合（i)人 類及小鼠；（Π)人類及獼猴；（iii)人類及大鼠；及（iv)人 類、小鼠、大鼠及犬白蛋白之dAb。 實例14 測定結合dAb/HA抗原決定基標記物或dAb/myc抗原決定 基標記物融合蛋白質的血清白蛋白在大鼠及獼猴中之血清 半衰期，且測定血清半衰期。 在大腸桿菌周質中以C末端HA或myc標記物表現抗獼猴 血清白蛋白dAb，且針對Vk dAb使用分批吸附至蛋白質L 瓊脂糖親和力樹脂（Affitech，Norway)純化及針對VH dAb使 129025.doc - 228 - 200848427
用分批吸附至蛋白質A親和力樹脂純化，接著以甘胺酸pH 2 ·0溶離。為測定血清半衰期，將2.5 mg/kg DOM7h-9、 DOM7h_ll或DOM7h-14以單次靜脈内注射給與3隻獼猴短 尾猿之組。藉由經2 1天期限自股靜脈或動脈連續放血獲得 血樣，且自各試樣製備血清。藉由夾層ELISA使用塗佈於 ELISA平板上之山羊抗HA(Abcam，Cambridge UK)或山羊 抗myc(Abcam，Cambridge UK)分析血清試樣，接著以蛋白 質L-HRP偵測。已知濃度之dAb之標準曲線是在與實驗試 樣相同濃度之獼猴血清存在下確立以確保與測試試樣之可 比性。使用擬合雙指數模型與2隔室模型（使用kaleidograph 軟體（Synergy software，PA，USA))計算 ί1/2β，參見表 8 〇 以C末端HA或myc標記物在大腸桿菌之周質中表現抗大 鼠血清白蛋白dAb，且使用分批吸收至蛋白質L-瓊脂糖親 和力樹脂（Affitech，Norway)進行純化，接著以甘胺酸pH 2.0溶離。接著使用以下方法以3H標記dAb :製備每種蛋白 質一個小瓶：將300 pL NSP分配於小瓶中且在平緩氮流下 在S30°C下移除溶劑。接著將殘餘物再懸浮於DMSO(100 μΙ〇中。將蛋白質溶液之等分試樣（2·5 mL)添加至DMSO溶 液中，且在室溫下將混合物培育60分鐘。接著，將恰好 2.5 ml溶液裝載於經預平衡之PD10管柱（經25 mL磷酸鹽緩 衝生理食鹽水PBS預平衡）上且棄去溶離液。添加磷酸鹽緩 衝生理食鹽水（PBS，3.5 mL)且收集溶離液。此提供約2 mg/mL之經標記蛋白質溶液。測定該物質之特異性活性， 且在有效標記條件下，直接使用溶液或將其儲存在-20°C 129025.doc -229- 200848427 備用。 為測定血清半衰期，將2.511^/1^00“711-9、00^1711-1 1、DOM7h-13或DOM7h-14以單次靜脈内注射給與4隻大 鼠之組。經7天期限自尾靜脈獲得血樣且製備血漿。藉由 液體閃爍計數測定3H之含量，且根據在開始實驗時所投與 蛋白質之已知特異性活性計算各試樣中經標記蛋白質之濃 度。使用擬合雙指數模型與2隔室模型（使用kaleidograph軟 體（Synergy software，PA，USA))計算 1:1/2β，參見表 8。 藥劑 支架 ί1/2β(獼猴) ί1/2β(大鼠） DOM7h-9 vK 3·8天 66小時 DOM7h-ll vK 5.2天 61小時 DOM7h-13 VK 未測到 73小時 DOM7h-14 Vk 6.8天 56小時 DOM7r-3 Vk 53小時 DOM7r-16 Vk 43小時 藥劑 支架 ΐ1/2β(獼猴） ί1/2β(大鼠） DOM7h-9 Vk 3.8天 66小時 DOM7h-ll Vk 5·2天 61小時 DOM7h-13 Vk 未測到 73小時 DOM7h-14 Vk 6·8天 56小時 DOM7r-3 Vk 53小時 DOM7r_16 Vk 43小時 白蛋白在大鼠及獼猴中之半衰期分別為53小時（實驗測 定）及7-8天（估算）。自表8可見dAb DOM7r-3、DOM7h-9、 129025.doc -230- 200848427 D〇M7h_ll、DOM7h-13及DOM7h-14在大鼠中之半衰期與 白蛋白在大鼠中之半衰期接近或大體相同。亦可見dAb DOM7h-ll及DOM7h-14在獼猴中之半衰期與白蛋白在獼猴 中之半衰期接近或大體相同。dAb DOM7h-14在大鼠與獼 猴中具有大體上與白蛋白在兩物種中之半衰期相同的半衰 期。 實例15.抗原決定基定位 人類血清白蛋白之三個域先前已表現於巴斯德畢赤酵母 中（Dockal Carter及 Ruker (1999) /· 5/〇/· CAem· 2000年2月4曰；275 (5): 3 042_5 0)。使用巴斯德畢赤 酵母pPICZaA載體表現相同域，且（若需要）在模擬藍 SA(Mimetic Blue SA)基質（供應商：Prometic Biosciences) 上將其純化至均質，圖21。藉由兩種方法：域抗體免疫沈 殿及競爭Biacore中之一種評估dAb結合之血清白蛋白域之 鑑別。結果於下文展示於圖22及圖23中。 對於免疫沈澱檢定，將1 ml表現HSA域I、II或III之巴斯 德畢赤酵母上清液調節至pH 7·4，且與1 gg dAb及10 μΐ蛋 白質Α或蛋白質L瓊脂糖（分別對於VH dAb或VK dAb)混 合。藉由倒置將混合物混合歷時1小時以允許形成複合 物，接著藉由以13,000xg離心10分鐘回收瓊脂糖結合複合 物，傾析上清液，且以PBS將顆粒物質洗滌一次，且藉由 離心回收。接著，將珠粒再懸浮於含有二硫蘇糖醇（DTT) 之SDS-PAGE負載緩衝液中，加熱至70°C歷時1〇分鐘，接 著在 4-12% NuPAGE SDS-PAGE 凝膠（供應商：Invitrogen) 129025.doc -231 - 200848427 上操作，且以Simply Blue safestain染色。 對於競爭Biacore檢定，在HBS-EP pH 7.4中使純化之 dAb達到1 μΜ，或在50 mM擰檬酸鹽磷酸鹽緩衝液、150 mM NaCl pH 5.0中使其達到1 μΜ，且（若需要）使用7 μΜ純 化之HSA域。在經500-1000 RU人類血清白蛋白塗佈之 CM5晶片表面上以30微升/分鐘之流速進行Biacore操作， 且使用空白參比單元進行基線扣除。 表9提供對人類血清白蛋白具有特異性之dAb及其定位之 人類血清白蛋白之域（如藉由免疫沈殿及/或Biacore所測定） 的列表： 表9
純系 H/K 經定位之HAS域 DOM7h-l K 域II DOM7h-2 K Nd DOM7h-6 K Nd DOM7h-7 K Nd DOM7h-8 K 域II DOM7h-9 K 域II DOM7h-10 K Nd DOM7h-ll K 域II DOM7h-12 K 域II DOM7h-13 K 域II DOM7h-14 K 域II DOM7h-21 H Nd DOM7h-22 H 域 I+III 129025.doc - 232 - 200848427 DOM7h-23 H Nd DOM7h-24 H Nd DOM7h-25 H Nd DOM7h-26 H Nd DOM7h-27 H 域III DOM7h-30 H 域III DOM7h-31 H Nd Nd :未偵測到 總之，大多數dAb結合HS A之第二域，且因此預期其不 與人類血清白蛋白競爭結合FcRn。兩種dAb(DOM7h-27及 DOM7h-3 0)均結合域III。 dAb 結合之 HSA域 在 1 μΜρΗ7·4 下 HSA結合之RU 在 1 μΜρΗ5·0 下 HSA結合之RU CDR中之His DOM7h-l II 600c 150 無 DOM7h-3 NI 0 0 DOM7h-4 NI 0 0 DOM7h-8 II 1000 250 無 DOM7h-9 II 150 0 CDR1 DOM7h-ll II 250 0 CDR3 DOM7h-12 Ha 55 0 無 DOM7h-13 II 300 40 CDR3中2個 DOM7h-14 II 20 0 無 DOM7h-22 I+IIIb 100c 0 CDR2 DOM7h-27 III 50 0 無 DOM7h-30 III 320 35 無 129025.doc -233 - 200848427 HSA結合AlbudAbTM(特異性結合血清白蛋白之dAb)的抗 原決定基定位之結果及pH 7.4及5.〇iBiac〇re資料的總 結。 實例1 6·在存在代謝物之情況下活體外選擇dAb 在約19天壽命期間，白蛋白分子累積暴露至血清中之其 他化合物之效應。此等效應包括結合對白蛋白具有親和力 之許多分子，該等分子包括（但較佳不限於）以混合二硫化 物形式攜帶之半胱胺酸與麵胱甘肽、維生素&、膽紅 素、氯高鐵血紅素、甲狀腺素、長鏈及中鍵脂肪酸及_ 基上攜帶之葡萄糖。還有諸如乙醛（肝臟中乙醇新陳代謝 之產物）、脂肪酸代謝物、醯基葡萄糖苷酸及膽紅素代謝 物之代物。另外，諸如華法林、氟烷、水楊酸鹽、苯并 二氮呼及其他藥物之許多藥物（Fasan〇等人，2〇〇5, iubmb
Life綜述中）以及bo·吉非羅齊葡萄糖苷酸結合血清 白蛋白。 發現與血清白蛋白結合之化合物趨向於在白蛋白分子上 之某些部位結合，藉此潛在地阻斷此等部位與諸如 AibudAbs™(特異性結合血清白蛋白之dAb)之其他分子結 合。已鑑別出許多配位體之結合部位，主要且最充分表徵 之結合部位稱為”Sudlow部位！ ”及，，Sudl〇w部位2"。根據此 π名法，部位1位於子域IIA且結合華法林及其他通常為龐 大雜％陰離子分子之藥物。部位2位於子域ΙΠΑ且結合 具有負電荷朝向一端之擴展構形的芳族羧酸，諸如立體典 型部位2配位體，布洛芬。華法林與布洛芬之第二結合部 129025.doc -234 · 200848427 位已分別在域II及I上鑑別出。該等配位體之其他結合部位 及子部位亦存在’此意謂在循環中血清白蛋白與結合配位 體之複合混合物一起存在，其親和力在1 x 1〇·2 Μ至1 X 1〇-8 Μ變化。例如，油酸結合SA上之多達7個部位（J 价〇/ 2001; 314:955-60)。 人類血清白蛋白已與脂肪酸形成為結晶複合物（pethpas
I, Grune T, Bhattacharya AA? Curry S. Nat. Struct Biol (1998) 5: 827-35)。儘管HSA分子存在近三重對稱（near three-fold symmetry)，但該等分子之結合部位位於sa表面 周圍之疏水性間隙中，具有不對稱分布。隨後，血清白蛋 白之各種重組片段之使用有助於域對形成結合部位之貢獻 的更精確分配（例如：夕以（2〇〇〇) 9 1455_65 ;彳价w CAem· (1999) 274:293 03-10)。結合配位體自SA之置換在藥 物相互作用令起重要作肖，例如當華法林藉由乙醇自^置 換時，其半衰期縮短(2〇〇()) 275: 3873 1_8)。 對SA具有親和力之其他藥物藉由其他結合部位中存在之盆 他藥物而改變。例士口，由於結合時之構形變化，與部位2 結合之二氮雜環庚烷增加部位丨對替諾昔康…Mxicam)2 親和力。此顯著影響藥物代謝動力學特性.
Pharmacol· (1989) 3:267-79)。 因此，對於SA結合AlbudAbTM(特異性結合血清白蛋白 之dAb)而言，需要選擇不改變血清白蛋白對與⑽合之 藥物的結合特徵者。另外，若 / 力Γ右已展不樂物結合改變SA之構 形’則需要在存在或不存在藥物之情況下均結合sa之 129025.doc -23$ - 200848427
AlbUdAbTM(特異性結合血清白蛋白之d J 吻寺方法音謂 將有可能鑑別AlbudAbTM(特異性結合血清白蛋白之明 使得與關鍵醫藥無顯著正或負藥物相互作用。因2dA=者 例描㈣菌體選擇以鑑別在活體内存在可能與白蛋白= 之化合物及代謝物之情況下結合血清白蛋白之·。：二 在一或數種已知與血清白蛋白活體内相 子 般門相互作用之代謝物或 ί 化合物之情況下進㈣菌體選擇。該等選擇_將以未必 因代謝物或其他化合物之存在而受阻礙的方式與血清白蛋 白結合之AlbudAbTM(特異性結合血清白蛋白之dAb)。 如實例i所述，使用實例i中所述之嗟菌體資料庫用於針 對來自-系列包括人類、獼猴、+鼠及大鼠之物種的一或 多種之白蛋白選擇。用作抗原之白蛋白與實例^所述者 之不同之處在於其將用代謝物或化合物在比白蛋白本身高 10-100倍之濃度下預培育隔夜。此可使用單一化合物或代 謝物或使用一種以上化合物或代謝物。詳言之，在化合物 存在下，其可佔據白蛋白部位][或部位„或兩者。該濃度之 代謝物亦存在於用以用抗原塗佈抗原管之緩衝液及在選擇 之關鍵步驟期間使用的緩衝液中。代謝物存在之步驟包括 用以阻斷抗原塗佈之抗原管或生物素化抗原（對於溶液選 擇）之MPBS阻斷緩衝液，以及噬菌體資料庫經阻斷之緩衝 液。以此方式，當將阻斷之噬菌體添加至抗原管或生物素 化4几原中日守’代谢物之;農度得以保持。因此，貫穿選擇與 白蛋白結合之％囷體的選擇階段’亦存在可活體内阻斷白 蛋白分子上之某些部位之代謝物，其與噬菌體競爭結合且 129025.doc -236- 200848427 3選擇偏移，有料彼等結合白蛋白上之不㈣彼等 謝物阻斷之部位的dAb。 在另-組選擇中，在存在及不存在結合化合物或代謝物 之情況下執行針對血清白蛋白之交替輪的選擇。此確保選 擇能夠在存在與不存在結合化合物m均結合血清白 蛋白之⑽。在兩種選擇方案中，可選擇能夠置換與血清 白蛋白結合之藥物之dAb，且此藉由量測、特異
性結合血清白蛋白之dAb)置換結合从之藥物之能力筛 選。對於小分子藥物而言’該等檢定已充分確立且其易於 文適用於此目的。多種在此項技術中熟知之方法可用以測 疋AlbudAb (特異性結合血清白蛋白之dAb)置換結合 之藥物之能力。該等方法為平衡渗析、固定配位體或血清 白蛋白層析法及NMR分析1下實例描述最簡單平衡滲析 法之用it。其他技術上更複雜之方法|本上會提供相同資 訊0 在例如20 mM磷酸鈉緩衝液、15〇 mM Naa、pH 74之 生理學緩衝液中製備規定濃度之血清白蛋白溶液。在相似 缓衝液中製備藥物，且其已經合成使得其保持其初始藥理 學特性，但經（例如）氚或i4C放射性標記。在類似緩衝液中 製備規定濃度之結合血清白蛋白之抗體片段。 將血清白蛋白溶液置於一系列管中，且添加漸增量之 AlbudAb™(特異性結合血清白蛋白之dAb)，使得各管中血 清白蛋白之濃度固定（例如1% w/v，約丨5〇 μΜ)，而管系列 之（特異性結合血清白蛋白之dAb)TM之濃度範圍在〇至15〇 129025.doc -237- 200848427 μΜ。此構成一個實驗組。 將滲析官或容1§所含之用⑨各組之固定濃度的放射性標 記之配位體添加至管中。依賴於所用配位體、其親和力及 溶解性，〇.2至10„1^1之濃度範圍可為適當的。 用於滲析之膜的截止尺寸應使得血清白蛋白及 AlbudAbTM(特異性結合血清白蛋白之dAb)並不擴散通過， 但放射性標記之配位體可自由擴散。3·5 Kda之截止尺寸足 以滿足此目的。 在例如37。〇之固定溫度下將混合物攪拌固定時間期限， 以允許放射性標記之藥物在兩個隔室之間平衡，例如5小 時。該時間後，應實現受AlbudAbTM(特異性結合血清白蛋 白之dAb)結合血清白蛋白以抑制藥物結合之能力影響的平 對兩個隔室採樣且使用閃爍計數器對放射能計數。可藉 由兩個隔室之間計數的差異測定結合白蛋白之配位體之濃 度。可由結合之配位體之平衡濃度b、游離配位體之平衡 /辰度c及白蛋白之平衡濃度p根據方程式K，=b/C(p_b)計算化 學什里結合常數K’。此假定1分子配位體與丨分子血清白蛋 白結合。 隨後可使用Scatchard圖，根據方程式r/c=nk-rk估量結合 數據，其中r為配位體結合之白蛋白的分數（亦即b/p)，且^^ 為每個白蛋白分子結合部位之數目，且k為部位接合常 數。可自r/c對r之圖測定η及k值。 右AlbudAb™(特異性結合血清白蛋白之dAb)之結合阻斷 129025.doc -238 - 200848427 放射性標記之配位體結合，則此將影響配位體之化學計量 結合常數以及配位體之結合部位的表觀數目。由於 AlbudAb™(特異性結合血清白蛋白之dAb)將在血清白蛋白 表面上之一個規定部位處結合，且某些配位體在血清白蛋 白上具有一種以上結合部位，因此可預測並非所有結合部 位均被阻斷。在AlbudAb™(特異性結合血清白蛋白之dAb) 特異性結合藥物複合之血清白蛋白且將其置換且該藥物具 有低治療指數且經血清結合之情況下，則區別能夠置換結 合血清白蛋白之藥物的AlbudAb™(特異性結合血清白蛋白 之dAb)與不能夠置換結合血清白蛋白之藥物的 AlbudAbTM(特異性結合血清白蛋白之dAb)之截止親和力將 在10 nM至100 nM範圍内。在以下論文中例示此方法： Livesey及 Lund Biochem J. 204 (1): 265·272 Bin(jing 〇f branched-chain 2-oxo acids to bovine serum albumin ° 實例17 :經由CDR移植產生包含血清白蛋白結合CTLa_4 非免疫球蛋白支架之雙特異性配位體
使用dAb7hl4之CDR域以以下方式構築結合人類血清白 蛋白之細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(CTLA-4)非免疫球蛋 白支架多肽。將 dAb7hl4 之 CDR1(RASQWIGSQLS ; SEQ ID NO·:——）、CDR2(WRSSLQS ; SEQ ID NO·:_)及 CDR3(AQGAALPRT ; SEQ ID NO·:__)序歹，J 移植入包含 〇1^八-4\^樣域（如\¥〇 99/45110所述；視情況(^丁1^4之工 程化形式’例如其中A2及A3域缺失）的CTLA-4之可溶性截 斷突變體，其置換分別對應於S1-S2環（BC環）内之 129025.doc -239- 200848427 CDR1(SPGKATE ； SEQ ID NO.:_)、S5-S6 環内之 CDR2(YMMGNELTF ； SEQ ID NO.;_)及 CDR3 (LMYPPPYYL ； SEQ ID NO.:一)的原生 CTLA-4胺基酸殘 基（對於CTLA-4支架組成及/或結構之細節參看WO 00/60070 ； WO 99/451 10 ； Metzler# A ^ Nat. Struct. Biol· 4: 527-53 ; ANuttall^A J Proteins Struct· Fund. Genet, 3 6:217-27，其以引用的方式全部併入本文中）。在基於 pGC、基於pPOW或其他此項技術中認可之表現系統中執 行此CLTA-4衍生之多肽表現，預期主要產生單體可溶性蛋 白質。檢查此CTLA-4衍生之多肽的蛋白質溶解性且預期 其優於原生細胞外CTLA-4多肽。使用ELISA分析檢查與非 特異性抗原相比且與移植有非特異性多肽之細胞外CTLA-4衍生之多肽相比（例如在CDR1環結構中經取代之促生長 素抑制素），純化單體多肽是否特異性結合人類血清白蛋 白。執行Biacore實時結合分析以評估人類血清白蛋白是否 特異性結合包含dAb7hl4之抗人類血清白蛋白CDR域的固 定CTLA-4衍生之多肽。（熟習此項技術者將認識到可使用 任一適當方法評估結合親和力，該方法包括例如經標記之 人類血清白蛋白之沈殿、競爭性Biacore檢定等）。視情 況，經由使用剪接重疊PCR以併入大腸桿菌優先表現之密 碼子調節編碼序列來增強CTLA-4抗人類血清白蛋白多肽 之表現。若未偵測到人類血清白蛋白親和力或偵測到低人 類血清白蛋白親和力（例如，Kd值在μΜ範圍内或以上）， 則採用許多策略中之至少一種來提高CDR移植之CTLA-4 129025.doc -240- 200848427 多肽的人類血清白蛋白結合特性，包括以下促進結合親和 力之方法中之任一種。 如下所述及/或如在此項技術中另外已知，經由誘變， 視情況組合平行及/或重複選擇法優化提供dAb7hl4 CDR之 CDR移植之CTLA-4多肽的人類血清白蛋白結合。使包圍 移植dAb7hl4 CDR多肽序列之CTLA-4支架多肽域經受如 下所述執行之隨機化及/或NNK誘變。在CTLA-4多肽序列 内對非CDR胺基酸殘基執行該誘變，以產生新或改良之人 類血清白蛋白結合多肽。視情況，經由例如隨機誘變、 NNK誘變、精確誘變及/或其他此項技術中認可之方法使 提供於CDR移植之CTLA-4多肽内的dAb7hl4 CDR多肽域經 受誘變。視情況使用PCR執行該等誘變方法，使得在CDR 移植之CTLA-4多肽内的所靶向序列上產生序列多樣性。 該等方法類似於彼等下文關於dAb資料庫產生所述者。除 隨機誘變及/或精確誘變方法外，採用所靶向胺基酸殘基 之定向誘變，其中結構資訊確定特定胺基酸殘基對人類血 清白蛋白之結合為關鍵的。 使包含如上所述工程化之移植dAb7hl4 CDR序列之 CTLA-4多肽經受平行及/或重複選擇法以鑑別彼等針對人 類金清白蛋白結合優化之CTLA-4多肽。例如，產生 dAb7hl4 CDR-移植之CTLA-4多肽序列之資料庫後，將該 等多肽之此資料庫呈現在噬菌體上且如下文關於自dAb資 料庫選擇血清白蛋白結合dAb所述，使其經受多輪需要血 清白蛋白結合及/或增殖之選擇。視情況，針對固定在抗 129025.doc -241 - 200848427 原管上之血清白蛋白或針對溶液中之生物素化血清白蛋白 執行選擇。視情況，使用表面電漿共振（SPR)及 Biacore(Karlsson等人，1991)，使用 Biacore 系統（Uppsala， Sweden)測定結合親和力，其中完全優化之CTLA-4衍生之 多肽理想地獲得nM範圍或更佳之人類血清白蛋白結合親 和力Kd值。 鑑別結合人類血清白蛋白的CTLA-4衍生之多肽後，接 著藉由下文所述之任一方法使用該等多肽產生雙特異性配 位體組合物。 實例1 8 :經由選擇血清白蛋白結合部分產生包含血清白蛋 白結合CTLA-4非免疫球蛋白支架之雙特異性配位體 將包含原生（：丁1^八-4¥樣域（如\¥〇 99/45 1 10中所述；視 情況CTLA-4之工程化形式，例如其中A2及A3域缺失）且已 經工程化以包含可變性區域的CTLA-4之可溶性截斷突變 體呈現於資料庫中，且使其經受選擇及視情況親和力成熟 技術以產生適用於本發明之配位體的人類血清白蛋白結合 CTLA-4非免疫球蛋白支架分子。 在基於pGC、基於pPOW或其他此項技術中認可之表現 系統中執行此CLTa-4衍生之多肽的表現。檢查此CTLA-4 衍生之多肽的蛋白質溶解性且執行誘變以相對於原生細胞 外CTLA-4多肽之溶解性提高CTLA-4衍生之多肽的溶解 性。使用ELISA分析檢查與包含CTLA-4衍生之支架的非特 異性單一可變域相比且與移植有非特異性多肽的細胞外 CTLA-4衍生之多肽（例如，CDR1環結構内經促生長素抑制 129025.doc -242 - 200848427
i 素取代之CTLA-4多肽）相比，純化單體多肽是否視情況特 異性結合人類血清白蛋白。執行Biae〇re實時結合分析以呼 估人類血清白蛋白是否特異性結合固定化CTLA_4衍生之 多肽。視情況，經由使用剪接重疊PCR以併入大腸桿菌優 先表現之密碼子調節編碼序列來增強CTLA_4抗人類血清 白蛋白多肽之表現。偵測到CTLA_4多肽對人類血清白蛋 白之無結合親和力或有低結合親和力（例如在μΜ·圍或以 上之Kd值）後，採用許多策略中之至少一種將人類血清白 蛋白結合特性賦予CTLA_4多肽，該等策略包括一或多種 以下促進結合親和力之方法。 ^ Γ Γί] ，丨。^ ,從田誘變 法，視冑況組合平行及/或重複選擇法獲得且優化ctla_4 支架多肽之人類血清白蛋白結合。使ctla_4多肽域經受 如下所㈣行之隨機化及/或NNK誘變。對整個CM部 肽或對CTLA-4多肽内之特定序列執行該誘變，視情況乾 向CDR相應胺基酸（例如，如（例如）w〇 99/45㈣之實例峋 述，將CDRM/或CDR3序列隨機化，且使所得多狀經受選 擇）。視情況，對於誘變，乾向經測定或預測對於提供 ⑽樣環具有結構重要性之特定胺基酸殘基。執行誘變:、 尤其隨機化誘變，以發展新或改良之人類血清白蛋白“ 視情況使㈣R執行該等誘變方法，使得在CTL^ 夕肽：之所乾向序列上產生序列多樣性。(該等方法類似 於彼等在下文關於dAb資料庫 、 ..十厍產生所述者）。除隨機誘變方 法外’採用㈣向胺基酸殘基之定向誘變，其中結構資訊 129025.doc -243 - 200848427 確定CTLA-4多肽的特定胺基酸殘基對人類血清白蛋白之 結合為關鍵的。 使如上所述工程化之CTLA-4多肽經受平行及/或重複選 擇法以鑑別彼等針對人類血清白蛋白結合優化之CTLA-4 多肽。例如，產生經誘變之CTLA-4多肽序列之資料庫 後，將多肽之該資料庫呈現在噬菌體上且如下文關於自 dAb資料庫選擇血清白蛋白結合dAb所述，使其經受多輪 需要血清白蛋白結合及/或增殖之選擇。視情況，針對固 定在抗原管上之血清白蛋白或針對溶液中之生物素化血清 白蛋白執行選擇。視情況，使用表面電漿共振（SPR)及 Biacore(Karlsson 等人，1991)，使用 Biacore 系統（Uppsala， Sweden)測定結合親和力，其中完全優化之CTLA-4衍生之 多肽理想地獲得nM範圍或更佳之人類血清白蛋白結合親 和力Kd值。 鑑別結合人類血清白蛋白之CTLA-4多肽後，接著藉由 下文所述之任一方法使用該等多肽產生雙特異性配位體組 合物。 CTLA-4 V樣域 CTLA-4為名吉|斗寺異I生名吉酉己斗勿i亦包f Vi i或t #免 疫球蛋白配位體之實例。該等V樣域不同於抗體或T細胞 受體之V樣域，此係因為其不具有連結在一起形成Fv型分 子之傾向。該非免疫球蛋白配位體提供用於發展對標靶分 子具有高親和力之新穎結合部分的替代性框架。因此需要 衍生自CTLA-4之可溶性單一 V樣域結合分子。 129025.doc -244- 200848427 細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(CTLA-4)牵涉於免疫反應 期間的T細胞調節中。CTLA-4為在活化T細胞表面上主要 且瞬時表現之44 Kda均二聚體，其中其與抗原呈現細胞上 之CD80及CD86表面抗原相互作用以實現免疫反應之調節 (Waterhouse等人，1996 153: 183-207 ; van der Merwe 等人，1997 J 五印 Med 1 85 : 393·403) 0 各 CTLA-4單體亞單元由N末端細胞外域、跨膜區及C末端細胞内域 組成。細胞外域包含N末端V樣域（VLD ;依據與免疫球蛋 白超家族之同源性預測分子量為約14 Kda)及連接VLD與跨 膜區之約10個殘基的莖。VLD包含對應於抗體V域之CDR-1、CDR-2及 CDR-3 之表面環（Metzler 等人，1997 汾rwci 仏〇/ 4: 527-53 1)。近期關於CTLA-4之結構及突變研究指示 與CD80及CD86之結合經由由A’GFCC’ V-樣β鏈以及CDR3 樣表面環中之高度保守之ΜΥΡΡΡΥ序列形成之VLD表面發 生（Peach等人，1994 J Med 180: 2049-2058 ; Morton等 人，1996 c/· 156: 1047-1054 ; Metzler等人，1997 4: 527-53 1)。CTLA-4單體之間的二聚作用 經由兩個莖中之半胱胺酸殘基（CYS 120)之間的二硫化物鍵 發生’其導致繫鍵兩個細胞外域，但V樣域之間無任何明 顯直接接合（Metzler等人，1997 τΥαί 4: 527- 531)。 先前已表明置換VLD内之CDR環結構導致產生具有改變 之結合特異性及提高之溶解性的正確摺疊之單體分子。因 此，在某些實施例中，產生包含至少一個衍生自CTLA-4 129025.doc -245 - 200848427 的單體V樣域（VLD)之結合部分，其中該至少一個單體V樣 域之特徵在於至少一個CDR環結構或其部分經修飾或置 換，使得當與未經修飾之VLD相比時，經修飾之VLD之溶 解性提高。 在某些實施例中，至少一個CDR環結構或其部分經修飾 或置換，使得（i)當與未經修飾之VLD中的相應CDR環結構 相比時，該CDR環結構之尺寸增加；及/或（ii)該修飾或置 換導致在一或多個CDR環結構内或其之間形成二硫化物 鍵。 在某些實施例中，本發明提供一種包含至少一個衍生自 CTLA-4之單體V樣域（VLD)之結合部分，該至少一個單體 V樣域之特徵在於至少一個CDR環結構或其部分經修飾或 置換，使得（i)當與未經修飾之VLD中的相應CDR環結構相 比時，該CDR環結構之尺寸改變；及/或（ii)該修飾或置換 導致在一或多個CDR環結構内或其之間形成二硫化物鍵。 在某些實施例中，CDR環結構之尺寸增加至少兩個、更 佳至少三個、更佳至少六個且更佳至少九個胺基酸殘基。 在其他實施例中，當與未經修飾之結合部分相比時，本發 明之經修飾之結合部分亦顯示改變之結合親和力或特異 性。較佳地，置換或修飾CDR環結構之作用係降低或破壞 VLD對未經修飾之VLD的一或多個天然配位體之親和力。 較佳地，置換或修飾CDR環結構之作用亦為改變VLD之結 合特異性（例如，以產生結合人類血清白蛋白之組合物）。 因此，經修飾之VLD較佳結合不同於未經修飾之VLD結合 129025.doc -246- 200848427 之搭配物的特異性結合搭配物（例如人類血清白蛋白）。 短語”VLD”意欲指與可變重（VH)或可變輕（VL)抗體具有 相似結構特徵之域。該等相似結構特徵包括CDR環結構。 如本文所用，術語nCDR環結構”係指表面多肽環結構或 區域，如抗體V域中之互補決定區。 應理解可在化學上或遺傳上將本發明之CTLA-4衍生之 結合部分偶聯在一起以形成多價或多功能試劑。例如，諸 如在具有Cys’20之原生CTLA-4中添加C末端尾將產生二聚 體。亦可將本發明之結合部分與用於各種調配物之其他分 子偶聯，該等分子包括彼等包含雙特異性配位體者。例 如，CTLA-4 VLD可包含C末端多肽尾或可偶聯至抗生蛋白 鏈菌素或生物素。亦可將CTLA-4 VLD偶聯至放射性同位 素、染料標記或其他用於活體内偵測及/或定位癌症、血 塊等之成像試劑。亦可藉由偶聯至用於診斷及生物傳感器 應用之不溶性裝置及平台上將CTL A-4 VLD固定。 在本發明之某些實施例中，使用細胞外CTLA-4 V樣 域。CTLA-4 V樣域之一或多個表面環且較佳地CDR1、 CDR2或CDR3環結構經對血清白蛋白具有結合親和力之多 肽（例如，如下文所例示，dAb7hl4之CDR域及由此獲得之 序列）置換。應理解該等CTLA-4 VLD可具有多特異性，具 有藉由其天然表面與經修飾多肽環控制之親和力。 CTLA-4 VLD之一或多個CDR環結構可經一或多個獲自 抗體之CDR環結構置換。該抗體可獲自任何物種。在一較 佳實施例中，抗體獲自人類、大鼠、小鼠、駱駝、美洲駝 129025.doc -247- 200848427 魚。CDR1及CDR3環結構可採用長度極其不同之非規 範構形。v樣域亦可具有使CDR1&CDR3環結構互連（如在 某些駱駝Vhh抗體中所見）或使CDR2及CDR3環結構互連 (如在某些美洲駝Vhh抗體中所見）之二硫化物鍵。
對於活體内應用，VLD較佳與治療或診斷之受檢者同源 2移除任何可能的異種抗原。因此’用於臨床應用之VlD 刀子較佳與天然存在之人免疫球蛋白超家族成員大體同 源。 可、、、二由述擇對血清白蛋白具有親和力之結合部分，優化 ^TLA-4多肽（例如衍生自CTLA_4iVLD)之血清白蛋白結 合’該選擇例如包含篩選表現對血清白蛋白具有親和力的 、、口 口邛分之聚核苷酸之資料庫，其中該等聚核苷酸已經受 使得至少一個VLD中之至少一個cdr環結構經修飾或置換 之誘變，且其中當與未經單獨修飾之VLD相比時，經單獨 修飾之VLD的溶解性提高。 熟習此項技術者應瞭解在該親和力篩選法之範圍中，可 使用任何隨機或靶向誘變法將修飾引入v樣域。在一較佳 貝施例中，誘變為靶向誘變。視情況，靶向誘變包括使用 (例如）剪接重疊或其他PCR技術置換至少一個環結構 内之至少一個序列。 熟習此項技術者亦應瞭解聚核苷酸資料庫可含有編碼包 a大體上與天然存在之免疫球蛋白中所見的結構一 致之CDR環結構的VLD之序列，及/或編碼包含非天然存在 之CDR環結構之VLD的序列。視情況，篩選過程包括在細 129025.doc -248 - 200848427 菌噬菌體顆粒表面上以基因III蛋白質融合物形式呈現經修 飾之V樣域。 資料庫可包含諸如pHFA、fd-tet-dog或pFAB.5c之含有編 碼V樣域的聚核苷酸之細菌噬菌體載體。篩選過程亦可包 括在核糖體呈現選擇系統中呈現經修飾之V樣域。 本發明之較佳CTLA-4衍生之血清白蛋白結合分子提供 以下優點：（i)原生人類蛋白質之使用消除對於重組分子之 後續人源化（若用於人類治療中，為保護防止免疫系統反 應通常所需之步驟）之需要；（Π)域為如上所述之天然單體 (在C末端尾中併入殘基Cysl20使得產生二聚分子）；及（iii) 結構修飾已使得大腸桿菌表現程度提高。 原生CTLA-4結構之初始測定允許模擬且預測對應於抗 體CDR1、2及3區之區域。假定該等區域將對突變或取代 敏感而對分子框架無實質影響且由此將允許正確摺疊分子 之表現。儘管CDR1與配位體結合部位意外分離，但 CTLA-4之公開結構（Metzler等人，1997 TVai 4: 527-53 1)表明該等預測為正確的，且CDR3之廣泛彎曲形成 與配位體結合面鄰接之平坦表面。 V樣域提供用於構築可溶性單一域分子之基本框架，其 中可藉由修飾CDR環結構將分子之結合特異性工程化。可 根據駱馬羊駝類抗體中存在之結構特徵修飾V樣域之基本 框架殘基。駱駝重鏈免疫球蛋白因由VHH鏈組成與”習知’’ 抗體結構不同（Hamers_Casterman等人，1993 363: 446-448) 〇駱馬羊駝類抗體由兩個各包含VHH域之重鏈組 129025.doc -249- 200848427 成。數種獨特特徵允許该專抗體克服溶解性與不能提供足 夠大抗原結合表面之雙重問題。 首先，經暴露框架殘基處之數種非習知取代（在性質上 主要為疏水性至極性）減少疏水表面，同時保持内部β指最 片框架結構（Desmyter等人，1996 出0/ 3:8〇3_ 8 11)。其次，在三個CDR環内數種結構特徵補償通常由％ 域長:供之抗原結合表面之損失。儘管CDR2環並不廣泛不 同於其他Vh域，但CDR1及CDR3環採用長度極其不同之非 規範構形。例如，與Ig分子中之常見5種分子相比，Ηι環 可含有2-8殘基之間的任一者。然而，CDR3環顯示最大變 異：在所報導之17個駱駝抗體序列中，該區域之長度在7 與21個殘基之間變化（Muyidermans等人，1994 Proieh五叹 7: 1 129-1135)。第三，許多駱馬羊駝類Vhh域在駱駝情況 下具有互連CDR1與CDR3之二硫化物鍵且在美洲駝情況下 具有互連CDR1與CDR2之二硫化物鍵（vu等人，1997 Mo/ec. /mm⑽〇/· 34: 1121_113)。該結構特徵之功能似乎為 保持環穩定性且提供與平坦面不同之起伏更大的環構形， 该％構形允許與抗原内之凹穴結合且提供增加之表面積。 然而，並非所有駱馬羊駝類抗體均具有該二硫化物鍵，此 指示其並非絕對結構要求。 本發明亦係關於一種產生且選擇對標靶分子（例如人類 血清白蛋白）具有新穎結合親和力之單一 vld分子之方 法該方法包括對CTLA-4衍生之多肽應用熟知分子進化 技術。忒方法可包括產生噬菌體或核糖體呈現資料庫以便 129025.doc •250- 200848427 篩選大量突變之CTLA-4衍生之多肽。 將絲狀fd細菌噬菌體基因組工程化使得噬菌體在其表面 上呈現經含於③·囷體内的DNA編碼之諸如ig樣蛋白質 (scFv、Fab)之蛋白質（Smith，1985 228: 13 15- 1317 ; Huse等人，1989 Sczhce 246: 1275-81 ; McCafferty 專人 ’ 1990 TVaiwre 348: 552_4，Hoogenboom等人，1991 A/wc/dc dcz·心及19: 4133-4137)。可將蛋白質分子呈現 在Fd細菌噬菌體表面上，與經基因m或較不通常地基因 VIII編碼之噬菌體包被蛋白共價偶聯。將抗體基因插入基 因III包被蛋白提供每個噬菌體3_5個位於末端之重組蛋白 夤分子之表現。與此相反，將抗體基因插入基因VIII具有 呈現每個噬菌體顆粒約2000個重組蛋白質複本之潛能，然 而，此為可掩蔽經單一呈現之蛋白質之親和力的多價系 統。亦使用Fd噬菌粒載體，因為其可易於自在以細菌噬菌 體表面上呈現功能性Ig樣片段轉變為在大腸桿菌中分泌可 /谷性Ig樣片段。具有基因ΠΙ包被蛋白之N末端之噬菌體呈 現之重組蛋白質融合物可能藉由關鍵地位於兩個蛋白質基 因之間的琥珀密碼子製造。在大腸桿菌之琥珀抑制菌株 中，所得Ig域基因III融合物被錨定在噬菌體包被中。 可將基於蛋白質親和力之選擇方法應用於任何高親和力 結合試劑，諸如抗體、抗原、受體及配位體（參見，例如
Winter及 Milstein，1991 349: 293-299，其全部内容 以引用的方式併入本文中）。因此，將呈現在細菌噬菌體 上之最1¾親和力結合蛋白質之選擇與編碼彼蛋白質之基因 129025.doc -251 - 200848427 的回收相聯。可以類似於ELIS A或固相放射免疫檢定之方 式，藉由與共價偶聯珠粒或吸附至塑料表面之同源結合搭 配物結合來親和力選擇Ig或非Ig支架呈現嗟菌體。儘管幾 乎任何塑料表面都將吸附蛋白質抗原，但特定列出某此商 品用於該目的，諸如Nunc抗原管。 核糖體呈現資料庫包括在無細胞轉譯系統中重新合成且 呈現在核糖體表面上用於選擇目的之多肽（Hanes及 Pluckthun, 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94： 4937. ί 4942 ; He 及 Taussig，1997 油穴以 25: 5 132_ 5134)。”無細胞轉譯系統”包含核糖體、蛋白質合成所需之 可溶酶（通常來自與核糖體相同之細胞）、轉移RNA、三磷 酸腺苷、三磷酸鳥苷、三磷酸核苷再生系統（諸如磷酸烯 醇丙酮酸及丙酮酸激酶）及合成由外源m R N A編碼之蛋白質
所需的鹽及緩衝液。可在保持完整多核糖體之條件下進行 夕肽之轉厚，亦即其中核糖體、mRNA (I 經接合在單-複合物中。此有效地引起經轉譯 "核糖體呈現，，。對於選擇，將接合相應核糖體複合物之經 轉睪之夕肽14結合至基質（例如Dynabead)之標革巴（例如血清 )刀子此口。呈現經轉譯之多肽之核糖體將結合標 乾2且可選擇該等複合物且使用RT-PCR再擴增mRNA。 u *吕存在數種修飾結合分子之替代性方法，但對於所有 _ 蛋白貝之通用方法符合依據對同源配位體及/或受 體之親和力自呈現資料庫選擇個別結合試劑之模式。藉由 許多活體内及活體外突變策略之任一者或組合修飾編碼該 129025.doc -252- 200848427 等試劑之基因，且將其構築為用於呈現且選擇最高親和力 結合分子之新穎基因池。 評估結合親和力 在某些實施例中，評估本發明之雙特異性配位體，包括 其組成分子（例如結合人類血清白蛋白之非免疫球蛋白分 子）對標靶蛋白質（例如人類血清白蛋白）之結合親和力。可 藉由諸如ELISA之習知抗原結合檢定，藉由包括FRET之基 於螢光之技術，或藉由諸如量測分子質量的表面電漿共振 之技術量測標粗蛋白質抗原決定基之結合。可藉由適當檢 定測定結合抗原之蛋白質與抗原或抗原決定基之特異性結 合，該檢定包括例如Scatchard分析及/或諸如放射免疫檢 定（RIA)、諸如ELISA之酶免疫檢定及夾層競爭檢定之競爭 結合檢定及其不同變型。 較佳使用表面電漿共振（SPR)及Biacore(Karlsson等人， 1991)，使用Biacore系統（Uppsala，Sweden)測定結合親和 力。Biacore系統使用表面電漿共振（SPR，Welford K. 1991，五/eci. 23: 1 ; Morton及 Myszka，1998, 幻/ 295: 268)實時監控生物分子相互作 用，且使用表面電漿共振，表面電漿共振可偵測由於高達 300 nm以外表面折射率之變化引起光在玻璃支撐物上金薄 膜之表面上之共振角變化。Biacore分析便利地產生接合速 率常數、解離速率常數、平衡解離常數及親和力常數。藉 由使用Biacore表面電漿共振系統（Biacore，Inc)評估接合及 解離速率常數來獲得結合親和力。根據製造商（Biacore)之 129025.doc -253 - 200848427 用法說明書將生物傳感器晶片活化用以共價偶聯標靶。接 著將標靶稀釋且注射在晶片上獲得以固定材料之反應單位 (RU)計的信號。由於以RU計之信號與固定材料之質量成 正比，因此此表示基質上固定標靶密度之範圍。將解離數 據擬合為單點模型以獲得k〇ff+/- s d•(量測值之標準差）。計 算各接合曲線之假一級速率常數（Kd，s)且作為蛋白質濃度 之函數作圖以獲得k〇n+/- S.e •(擬合標準差）。由SPR量測據 koff/k。。計算結合之平衡解離常數Kd，s。 如 Phizicky 及 Field 於 MkroZ). (1995) 59-115 中所述， 將諸如HSA之適當抗原固定在葡聚糖聚合物上，且含有諸 如單一可變域之HSA之配位體的溶液流經單元，與固定 HS A接觸。由固定HSA保留之單一可變域改變入射光之共 振角，使得因增加量之蛋白質（亦即葡聚糖聚合物附近之 單一可變域）引起折射率改變。由於所有蛋白質均具有相 同折射率且由於共振角位移與表面附近的蛋白質濃度之間 存在線性相關性，因此可量測歸因於蛋白質/蛋白結合之 表面上蛋白質濃度之改變，參見phizicky& Field，前述。 為測定結合常數，#由使單一可變域蛋白質之溶液流經固 定配位體（HSA)直至RU值穩定，量測隨時間變化之共振單 位（RU)之增加，接著在用缺乏單一可變域之緩衝液之情況 下量測隨時間變化之RU之下降。在單一可變域蛋白質之 數個不同濃度下重複該程序。由R· Kadss〇n等人，（991) 乂 /mm⑽o/MWo心，145, 229描述詳細理論背景及程序。 如上所述，儀裔軟體得到平衡解離常數（尺匀。美國專利 129025.doc -254- 200848427 5,5 73,95 7描述經由使用表面電漿共振（8?11)測定之平衡解 離常數，如基於dRA/dt及RA值之表，其中此實例中R為如 藉由Biacore所量測之以共振單位計之HSA/單一可變域複 合物，且其中dR/dt為HSA/單一可變域複合物之形成速 率，亦即結合曲線之導數；將圖dRA/dt對數種不同濃度之 單一可變域的ra作圖，且隨後將此等線之斜率對單一可變 域之濃度作圖，此第二圖之斜率為接合速率常數（M」， s )。可使用Biacore產生之解離曲線確定解離速率常數或 S A /、單可隻域彼此釋放之速率。藉由作圖且確定反應 之下降對數對時間曲線的斜率，可量測解離速率常數。平 衡解離常數Kd=解離速率常數/接合速率常數。 根據本發明之任一態樣的配位體包括具有至少一個單一 可域或由至少一個單一可變域組成之配位體，該單一可 變域以單體單一可變域之形式或以多個單一可變域（亦即 多聚體）之形式。配位體可經修飾以含有諸如融合蛋白質 或結合物之其他部分。該（例如）雙特異性配位體形式之多 聚配位體及/或該包含單一可變域或由單一可變域（亦即適 用於構築該多聚配位體之dAb單體）組成之配位體可有利地 舁其同源標靶解離，如（例如）藉由表面電漿共振所測定， Kd為3〇〇 nM或以下、300 nM至5 PM(亦即3xl〇-7至 5X10 Μ)、較佳 50 ηΜ至 20 ρΜ或 5 ηΜ至 200 ρΜ或 1 ηΜ至 1〇〇 ΡΜ、1Χ10·7 Μ或以下、lxl〇-8 Μ或以下、1χ1{Γ9 Μ或 =下、1X10’以或以下、1χ10-η Μ或以下；及/或^速率 吊數為 5 χ 1 0 至 1 χ 1 (Γ7 S·1、較佳地 1 X 1 (Γ6 至 1 X 1 〇-8 S-1、較 129025.doc - 255 - 200848427 佳地 lxio·2至 lxi〇-6 々 c 1Λ_3 =s t υ S 或 5x10 至 lxio·5 s-1，或 5x10 S-】 或以下，或1 x 1 〇-2 d s或以下’或lxio-3 s·1或以下，或 1x 10-4 S-1或以下，十】 5】士 1 r 或1χ1〇 s或以下，或lxl0-6 s·1或以 下。Kd速率常數& # & 疋義為K0ff/K0n。車父佳地，單一可變域將 以小於500 nM、較佳小於細nM且更佳小於，諸如 小於500 PM之親和力特異性地結合標輕抗原或抗原決定 基。 脂質運载蛋白 f κ. 實例19 ·'經由選擇血清白蛋白結合部分產生包含血清白蛋 白結合―脂質運載蛋白非免疫球蛋白支架之雙特異性配位體 可藉由組合蛋白質設計使獲自大菜粉蝶 之脂質運載蛋白後膽色素結合蛋白（BBp)再成 型’使得其識別人類血清白蛋白。為此目的使原生卿 經文資料庫選擇及視情況親和力成熟，以產生用於本發明 之雙特異性配位體的人類血清白蛋白結合BBp分子。 首先如下文對於CTLA·传生之多肽所述經由-咖檢 定確定原生BBP結合人類血清白蛋白之能力。（熟習此項技 術者將認識到可使用任-適當方法評估結合親和力，該方 法包括例如經標記之人類血清白蛋白之沈澱、競=性 定等）。摘測到.對人類血清白蛋白無結人親 和力或有低結合親和力（例如在μΜ範圍或以上之K^值、 後，採用許多策略中之至少—種將人類血清白蛋白 性賦予卿’該等策略包括-或多種以下促進結合親:力寺 之方法。 129025.doc -256- 200848427 如下所述及/或如在此項技術中另外已知，經由誘變 法，視情況組合平行及/或重複選擇法獲得且優化Bbp及 BBP衍生之多肽的人類血清白蛋白結合。使bbp多肽域經 受如下所述執行之隨機化及/或NNK誘變。對整個BBp(或 BBP衍生之）多肽執行該誘變或對bBP多肽内之特定序列 (包括經鑑別為由4個在8鏈β桶之上的環形成之原生BBp結 合部位中心處之殘基的16個胺基酸殘基）執行該誘變（Beste 等人，1999 &ζ·仍」96: 1898 9〇3)。視 情況，將該等誘變程序隨機化以發展新或改良之人類血清 白蛋白結合多肽；且可在產生最佳結合人類血清白蛋白之 ΒΒΡ之過程中執行多輪誘變。視情況使用pCR執行該等誘 變方法，使得在BBP(或BBP衍生之）多肽内之所靶向序列 上產生序列多樣性。（該等方法類似於彼等下文關於dAb資 料庫產生所述者）。除隨機誘變方法外，採用所靶向胺基 西文殘基之定向誘變，其中結構資訊確定BBp(或BBp衍生 之）多肽的特定胺基酸殘基對人類血清白蛋白之結合為關 鍵的。 使如上所述工程化之BBP(或BBp衍生之）多肽經受平行 及/或重複選擇法以鑑別彼等針對人類血清白蛋白結合優 化之BBP夕肽。例如，產生經誘變之多肽序列之資料 庫後，將多肽之該資料庫呈現在噬菌體上且如下文關於自 ㈣資料庫選擇血清白蛋白結合^所述，使其經受多輪 需要血清白蛋白結合乃/ ―、 及/或增殖之選擇。視情況，針對固 定在抗原管上之血清白| & 白蛋白或針對溶液中之生物素化血清 129025.doc -257- 200848427 白蛋白執行選擇。視情況，使用表面電漿共振（SPR)及 Biacore(Karlsson等人，1991)，使用 Biacore 系統（Uppsala， Sweden)測定結合親和力，其中完全優化之bbp衍生之多 肽理想地獲得nM範圍或更佳之人類血清白蛋白結合親和 力Kd值。 鑑別結合人類血清白蛋白之BBP多肽後，接著藉由下文 所述之任一方法使用該等多肽產生雙特異性配位體組合 物。
脂質運載蛋白支架蛋白質 脂質運載蛋白（pervaiz&Brew，Μ從5 乂 j (1987)，2〇9_ 2 14)為已自各種生物體分離且生理學作用在於儲存或轉運 不同配位體以及更複雜生物學功能之小、通常為單體之分 /必蛋白貝之豕方矢（Fl〇wer，价办㈣丄3 ^ (工996)，1 -14)。 月曰貝運載蛋白顯示相對小之相互序列相似度，且藉由乂射 線⑽構刀析首次說明其屬於同一蛋白質結構家族 等人，iVaiwre 327 (1987)，659)。 已头立體結構之第一脂質運載蛋白為視黃醇結合蛋白 RbP ’其實現非水溶性維生素A在血液血清中之轉運 (NeWC〇_等人，£娜丄 3 (1984)，1451]454)。此後立 刻測定來自蝴蝶大菜粉蝶之後膽色素結合蛋白_之三級 ^^(Huber#A ^ J. M〇l. Biol. 195 (i987)? 423-434) 〇 ^ :::蛋白質之基本結構特徵說明於該脂質運載蛋白之立體 運載蛋白之摺疊結構中的中心元件為圓柱狀 暑所謂㈣桶，其由8個幾乎成環形排列之反平 129025.doc - 258 - 200848427 行β鏈組成。 亦可將該超二級結構元件視為兩個4鏈β-摺疊片結構之 ”夾層”排列。其他結構元件為在多肽鏈之胺基末端的擴展 片段及接近羧基末端之α-螺旋，其本身後接擴展片段。然 而，該等其他特徵未必顯示在所有脂質運載蛋白中。例 如，附睾視黃酸結合蛋白中缺少Ν末端片段之重要部分 (Newcomer，加此(1993) 1: 7·18)。亦已知其他特殊結 構元件，諸如僅存在於某些脂質運載蛋白中之膜錨 (membrane anchor)(Bishop及 Weiner，7>π办 ㈣·〜/ (1996) 21: 127)。 β-桶在一端接近緻密胺基酸封裝以及環片段。卜桶在另 一端形成脂質運載蛋白之個別配位體經複合之結合凹穴。 8個鄰近反平行卜鏈在此經多肽鏈中之髮夾樣彎（hairpin bend)以個別成對方式連接，其連同仍部分位於圓柱狀卜摺 $、纟。構之區域中的鄰近胺基酸一起各形成環元件。藉由該 等總計4個肽環來形成配位體之結合凹穴。在情況下， =綠素ΙΧγ係在該結合凹穴中複合。在叫以及卜乳球蛋白 f月况下’月曰質運載蛋白之另一典型配位體為維生素 A(PapiZ^ Λ > Nature 324 (1986), 383-385) 〇 士（例如）在美國公開案第200600585 10號中所述，可使 用多狀之脂暂；室-p 貝逆戟蛋白家族之成員經由胺基酸之突變作用 產峰 —”主丄 ^ .....抗運載蛋白”之分子，該等胺基酸位於圓柱 ' 〃且、°構的末端之4個肽環之區域中且特徵在於以可 測親和力结人邮 、口所$配位體（例如人類血清白蛋白），該等分 129025.doc -259- 200848427 子經設計以識別新穎配位體。 比免疫球蛋白之配位體結合部位更簡單地構築脂質運載 蛋白之配位體結合部位。脂質運載蛋白多狀僅包含8個反 平行β鏈之-個環：β桶。該環狀Mf疊結構在脂質運载蛋 白之蛋白質指疊中保守。藉由4個各將兩個鄰近β-鏈彼此 連接之肽環在β-桶之入口區域卞形成結合部位。該等狀環 之結構在脂f運載蛋白家族個別成員之間可顯著不同。 為將脂質運载蛋白多肽用作非免疫球蛋白支架，使形成 脂質運載蛋白之配位體結合部位的4個狀環中之一或多者 經受誘變，接著選擇彼等對所給配位體顯示所需結合活性 之蛋白質變體（突變型蛋白質）。已將以此方式獲得之脂質 運載蛋白突變型蛋白質稱為”抗運載蛋白”。 在產生抗運載蛋白期間藉由誘變使序列經修飾之脂質運 載蛋白之4個肽環藉由彼等在腑之線性多肽序列中包含 Bbp之胺基酸位置28至45、58至69、86至99及114至UR 片段表徵。該等序列片段之每—者在β_桶之開放側的保守 β_鏈之-者的C末端前開始，包括真正肽髮夾序列且在遵 循該序列之同樣保守β-鏈之Ν末端後結束。 序列比對或結構重合允許提供給Bbp之序列位置指派給 其他脂f運載蛋白。例如，對應於Peitseh及BogUski(New B1〇l〇glst 2 (199G)，197-2G6)之公開比對的序列比對顯示 poD之4個肽環包括胺基酸位置28至料、π至7〇、以至％ 及113至127。亦可能在適合於以相同方式誘變之新脂質運 载蛋白中鑑別相應肽環。 、 129025.doc • 260 - 200848427 、在某些情況下，可證明脂質運載蛋白之相對差的序列同 源ϋ在測定保守β鏈中成為問題。因此關鍵在於多肽序列 能夠形成由8個反平行β鏈構成的環狀卜摺疊結構。此可藉 由才木用諸如蛋白質晶體學或多維核磁共振譜之結構分析法 測定。 在諸如AP〇D或Rbp之非Bbp脂質運載蛋白t，基於個別 改變之肽環結構，適於誘變之序列片段可易於比Bbp之序 列片段長或短。甚至可有利地藉由一或多個胺基酸之缺失 或插入另外修飾序列片段之長度。在某些實施例中，使彼 等對應於Bbp之序列位置34至37、58、6〇、69、88、9〇、 95 97、114、116、125及127的胺基酸位置突變。相 應地，在AP〇D情況下’序列位置34至37 ' 59、61、几、 :、89、92、94、96、113、115、123及 125較佳用於誘 欠Λ、、:而，對於產生抗運載蛋白而言，並非必需使上文所 列之所有序列位置均經受誘變。 其他脂質運載蛋白亦適用作產生抗運載蛋白之潛在結 構。較佳地，使用目前在生物化學上已詳盡研究之脂質= 載蛋白Rbp、Bbp或Ap〇D。對於產生抗運載蛋白使用人類 來源之脂質運載蛋白尤其較佳。當所得抗運載蛋白預定應 用於人類時，此尤其適用，此係由於例如在活體内診斷或 治療應用中’當與來自其他生物體之脂質運載蛋白相比時 預期有最小免疫原性效應。然而，可證明其他脂質運心 白以及可能仍有待發現之脂質運載蛋白尤其有利於產生疒 運載蛋白。亦可使用具有在結構上等效於脂質運載蛋白= 129025.doc -261 - 200848427 β-桶的摺疊元件之人工蛋白質。 較佳地’本發明之抗運載蛋白分子將能夠以可測親和 力，亦即以至少1〇5 Μ-ι之親和力常數結合所需配位體（例 如人類血清白蛋白）。低於此之親和力以常見方法通常不 再可精確量測，且因此對於實際應用其具有次級重要性。 尤其較佳者為以對應於1 μΜ之複合物解離常數的至少1〇6 Μ·1之親和力結合所需配位體之抗運載蛋白。可由熟習此 項技術者藉由大量方法，例如藉由螢光滴定、藉由競爭 ELISA或藉由表面電漿共振技術量測抗運載蛋白對所需配 位體之結合親和力。 如（例如）對於Bbp所述，可由熟習此項技術者藉由已知 方法產生且選殖之脂質運載蛋白cDNA可充當肽環之誘變 起點（Schmidt及 Skerra，五wr· J· ㈣· 219 (1994)，855- 863)。或者，染色體組DNA亦可用於基因合成，或可執行 該等方法之組合。對於4個肽環中之胺基酸誘變，熟習此 項技術者可隨意使用各種已知方法用於定點誘變或用於藉 助於聚合酶鏈反應誘變。誘變方法之特徵可在於（例如）可 使用在所需位置具有簡併鹼基組成的合成寡脫氧核苷酸之 混合物引入突變。如（例如）肌苷之具有降低之鹼基對特異 性的核苷酸基本組份之實施亦為將突變作用引入所選擇序 列片段或胺基酸位置之選擇。與抗體相比，配位體結合部 位之誘變的程序得以簡化，由於對於脂質運載蛋白，出於 該目的必須操控僅4個而非6個對應於4個上文所述肽環之 序列片段。 129025.doc -262- 200848427 在實施合成寡脫氧核苦酸之定點隨機誘變方法中，可預 先測定待突變之脂質運載蛋白結構中之相關胺基酸位置。 待突變胺基酸位置之理想選擇一方面可依賴於所用脂質運 载蛋白，1另-方面依賴於所需配位體(例如人類血清白 蛋白）。以下可為適时：保持單_實驗内之突變胺基酸 位置之總數足夠低’使得藉由誘變獲得之變體集合(亦即 所謂資料庫）之全體或至少自此的代表性選擇可儘可能在
組合複雜度下，不僅在編碼核酸級別上而亦在基因產物級 別上完全地實現。 白本身（如BBP及 尤其當存在關於待使用之脂質運載蛋
Rbp情況下）或至少關於具有相似結構的脂質運載蛋白（如 例如在AP〇D情況下）的結構資訊時，可能以有意義方式選 擇待突變胺基酸位置。所選擇之胺基酸位置之調整可進一 步依賴於所需配位體的特徵。亦可證明··若（例如）配位體_ 結合凹穴區域中之單一胺基酸位置經證明為蛋白質之摺疊 效能或摺疊穩定性所必需，則排除該等位置誘變為有利 的。脂質運載蛋㈣變之基於特定寡核苦酸之方法描述於 (例如）美國公開案第20060058510號中，其全部内容以引用 的方式併入本文中。 表現經受誘變之編碼核酸序列後，可自所獲得資料庫之 不同純系選擇結合所給配位體（例如人類血清白蛋白）之才崔 帶抗運載蛋白的遺傳資訊之純系。可實施已知表現策略及 選擇策略用於選擇該等純系。該類方法已描述於產生重組 抗體片段或將其工程化之上下文中，諸如”噬菌體呈現，，技 129025.doc -263 - 200848427 術或π群落篩選”方法（Skerra等人，4似/.价196 (1991)，151-155)。 口益囷體壬現”技術之描述見（例如）Η〇es s，CwOp/w. iSVrwci. 5/o/· 3 (1993)，572-579 ; Wells 及 Lowman，Cwrr OpM. 5ζ·ο/· 2 (1992)，597-604 ;及Kay等人，Phage
Display of Peptides and Proteins-A Laboratory Manual (1996)，Academic Press。簡言之，在例示性實施例中，產 生使突變脂質運載蛋白結構基因作為融合蛋白質之表現實 現的嗤菌粒’該融合蛋白質在N末端具有信號序列，較佳 OmpA-信號序列，且在C末端具有併入噬菌體包被的噬菌 體M13之包被蛋白pin(Model及Russel ，於，，The Bacteriophages”，第 2卷（1988)，Plenum Press，New Y〇rk
New York，375-456中）或該包被蛋白之片段。較佳使用僅 含有天然包被蛋白pill的胺基酸217至406之噬菌體包被蛋 白之C末端片段ΑρΙΙΙ產生融合蛋白質。尤其較佳為位置 201之半胱胺酸殘基缺失或經另一胺基酸置換的ρΙΠ之c末 ‘片段。在例如美國公開案第20060058510號中詳述在產 生具有特異性結合特性之"抗運载蛋白”中可應用於脂質運 載蛋白之噬菌體呈現方法、選擇方法等之進一步描述，該 公開案之全部内容以引用的方式併入本文中。
可例如使用上述方法鑑別且產生抗運載蛋白以使其對所 給配位體（例如人類血清白蛋白）具有高親和力。甚至在新 穎配位體不具有與膽綠素IXy(Bbp之初始配位體）之任何妹 構關係之情況下，抗運載蛋白亦可獲得超過ι〇6 之配Z 129025.doc -264- 200848427 體結合常數（參看美國公開案第20060058510號）。抗運載蛋 可獲得之對新穎配位體之該等親和力與自第二免疫反應 已知之對於抗體的親和力可相當。此外，另外存在使所產 生抗運載蛋白經受進一步視情況部分隨機誘變以自因此獲 得之新資料庫選擇甚至更高親和力變體之可能性。對於重 組抗體片段情況已描述相應程序用於”親和力成熟，，目的 (Low等人，j 偏心/ 26〇 (1996)，359 368 ;以如及 Burton’ 14 (1996)，23〇_234)，且其亦可 由熟習此項技術者以相應方式應用於抗運載蛋白。 葡萄球菌蛋白A(SPA)/親和體 實例20 ··經由選擇血清白蛋白結合部分產生包含血清白蛋 白結合親和體（葡萄球菌蛋白A(SPA))非免疫球蛋白支架之 雙特異性配位體 使葡萄球菌蛋白a(spa)之Z域經受資料庫選擇及視情況 親和力成熟技術以產生適用於本發明之雙特異性配位體的 人類血清白蛋白結合SPA衍生之非免疫球蛋白支架分子（稱 為”親和體’·）。 執行Biacore實時結合分析以評估人類血清白蛋白是否特 異性結合固定SPA多肽。（熟習此項技術者將認識到可使用 任一適當方法評估結合親和力，該方法包括例如經標記之 人類血清白蛋白之沈澱、競爭性Biac〇re檢定等）。偵測到 未改變之SPA多肽對人類血清白蛋白無結合親和力或有低 結合親和力（例如Kd值在μΜ範圍或以上）後，採用許多策 略中之至少一種將人類血清白蛋白結合特性賦予“A多 129025.doc - 265 - 200848427 肽，包括一或多種以下經設計以賦予及/或提高分子對標 敦》抗原之結合親和力之方法。 如下所述及/或如在此項技術中另外已知，經由誘變 法，視情況組合平行及/或重複選擇法獲得且優化spA支架 多肽之人類血清白蛋白結合。使SpA支架多肽域經受如下 所述執行之隨機化及/或NNK誘變。對SPA多肽之整個2域 或對SPA多肽内之特定序列，例如對如N〇rd等人（1997 #加 , 15: 772-77)所鑑別之域2的13個溶劑可及表面 ( 殘基執行該誘變，且將其視情況隨機化以發展新或改良之 人類血清白蛋白結合多肽。視情況使用pCR執行該等誘變 方法，使得在SPA多肽内之所靶向序列上產生序列多樣 1*生（4專方法類似於彼等下文關於dAb資料庫產生所述 者）。除隨機誘變方法外，採用所靶向胺基酸殘基之定向 誘變，其中結構資訊確定SPA多肽的特定胺基酸殘基對人 類血清白蛋白之結合為關鍵的。在某些實施例中，裝配突 變體Z域基因之庫且將其插入適合於單價噬菌體呈現之噬 菌粒載體中。使用例如用於誘變之NN(G/T)或替代性 (C/A/G)NN簡併構築包含例如數百萬轉型子之資料庫。 使如上所述工程化之SPA多肽經受平行及/或重複選擇法 以鑑別彼等針對人類血清白蛋白結合優化之spA多肽。例 如、產生經誘變之SPA多肽序列之資料庫後，將多肽之該 貝料庫王現在噬菌體上且如下文關於自dAb資料庫選擇血 清白蛋白結合dAb所述，使其經受多輪需要血清白蛋白結 合及/或增殖之選擇。針對人類血清白蛋白標靶蛋白質執 129025.doc -266 - 200848427 行生物淘選以實現血清白蛋白結合SPA分子之顯著f集。 隨後將所選擇純系表現於大腸桿菌中且藉由SDS_pAGE、 圓二色譜及藉由生物特異性互相作用分析之人類血清白蛋 白之結合研究分析。預期結合人類血清白蛋白之spA分子 (親和體）具有類似於原生Z域之二級結構且對其個別標革巴 具有在μΜ或更佳（例如nM或PM)範圍内之微莫耳濃度解離 常數（Kd)。 ( 視情況，針對固定在抗原管上之血清白蛋白或針對溶液 中之生物素化血清白蛋白執行選擇。視情況m吏用表面電 漿共振（SPR)及Biacore(Karlss〇n等人，1991)，使用心㈣ 系統（Uppsala，Sweden)測定結合親和力，其中完全優化之 S P A衍生之多肽理想地獲得n M範圍或更佳之人類*清白蛋 白結合親和力Kd值。 鑑別結合人類血清白蛋白之SPA多肽後，接著藉由下文 所述之任-方法使用該等多肽產生雙特異性配位體組合 葡萄球菌蛋白A(SPA)/親和體多肽 可革巴向、、、田菌$體之溶劑暴露表面用於隨機誘變，接著出 於將對金清白I 4士么^ 蛋白之、、、口曰親和力賦予該等受體分子之目的 t行表型轉。該f蛋自質可異乎尋f地敎，此使得其 適於各種應用（族纖der等人，（ 3597-3603)。詳士之，料从人 * ^ &之對於含有螺旋束結構之細菌受體而 之改三預Μ構形耐$未牽涉於螺旋堆積界面的殘基側鏈 文。料分子之實例為葡萄球菌蛋白A(SPA)之相對小 129025.doc -267- 200848427 (58個殘基）IgG結合域B及域B之合成類似物（稱為域 Z)(Nilsson等人，（1987) Protein Engineering 1: 107-113)。 SPA衍生之域Z為用作支架以構築具有新穎結合特性之 域變體的SPA之初級域（參看，例如WO 00/63243及WO 95/193 74，其以引用的方式全部併入本文中）。SPA Z域為 58個胺基酸殘基之無半胱胺酸的三個螺旋束域，其用作用 於構築組合噬菌粒資料庫之支架，使用噬菌體呈現技術自 該資料庫選擇靶向所需分子（例如人類血清白蛋白）之變體 (Nilsson等人，1987 Protein Eng. 1: 107-113 ; Nord等人， 1997 Nat. Biotechnol· 15: 772-777 ; Nord等人，2000 J. Biotechnol. 80: 45-54 ； Hansson 等 人， 1999
Immunotechnology 4: 237-252 ; Eklund 等人，2002
Proteins 48: 454-462 ; Ronnmark 等人，2002 Eur. J.
Biochem. 269: 2647-2655)。選擇該等稱為’·親和體n分子之 標靶結合變體作為結合物，以藉由組合資料庫之噬菌體呈 現革巴向蛋白質，在該組合資料庫中通常已使Z域中螺旋1及 2之表面上的 13個側鏈（Q9、Q10、N11、F13、Y14、L17、 H18、E24、E25、R27、N28、Q32 及 K35)P遺機化（Lendel 等 人，2006 J. Mol. Biol. 359: 1293-304)。該等親和體分子 之簡單、穩固結構連同其低分子量（7 Kda)—起使其適於多 種應用。已將所證明功效展示於生物製程及試驗室規模之 生物分離中（Nord等人，2000 J· Biotechnol. 80: 45-54 ; Nord 等人，2001 Eur. J· Biochem· 268: 4269-4277 ;
Graslund等人，2002 J· Biotechnol· 99: 41-50)，且當作為 129025.doc -268- 200848427 偵測試劑評估親和體配位體時已獲得期望結果（KarlstrSm 及 Nygren 2001 Anal. Biochem. 295: 22-30 ; Ronnmark 等 人，2002 J. Immunol· Methods 261: 199-211)，以將腺病毒 趨性工程化（Henning 等人，2002 Hum. Gene Ther. 13: 1427-143 9)且抑制受體相互作用（8&11(1311*0111等人，2003 Protein Eng. 16: 691-697)。因此，例如結合人類血清白蛋 白之工程化之親和體配位體為本發明之某些雙特異性配位 體組合物之所需組份。 ，· i 可藉由如在此項技術中已知及/或如下文所述之任何誘 變方法產生衍生自葡萄球菌蛋白A之Z域的多肽之資料 庫。產生該等多肽資料庫後，可例如使用諸如噬菌體呈現 (Dunn 1996 ; Smith及 Patrenko 1997 ; Hoogenboom 等人， 1 998)、核糖體呈現（Hanes及 Pluckthun 1 997 ; He及 Taussig 1997)質體（Schatz 1993)上肽或細菌呈現（Georgiou等人 1997)之活體外選擇技術有效地選擇且鑑別能夠結合所需 標靶分子（例如人類血清白蛋白）之變體。對於該等選擇， ( 已在理論上考慮（Perelson及Oster 1979)且在實驗上證明 (Griffiths 等人，1994 ; Vaughan 等人，1996 ; Aujame 等 人，1997)資料庫大小（複雜度）與分離較高親和力（KD=1(T8 Μ或以下）之結合物的可能性之間的相關性。 親和體具有數種優於傳統抗體之優點，例如⑴較低製造 成本；（ii)較小尺寸；（iii)增加之穩定性及穩固性；及（iv) 在細菌宿主中重組產生或藉由化學合成產生之能力，其免 除病毒污染之風險。 129025.doc -269- 200848427 親和體為多肽’其為葡萄球菌蛋白A(SPA)域之衍生物， 該SPA域為B或Z域，其中許多胺基酸殘基已經其他胺基酸 殘基取代，該取代在大體上不損失該SPA域之基本結構及 穩定性之情況下進行，且該取代使得該多肽能夠與標靶抗 原（例如人類血清白蛋白）之至少一個域相互作用。經取代 之胺基酸殘基之數目可為1個至約30個或1個至約13個。其 他可能之範圍為4個至約3 〇個；4個至約1 3個；5個至約2 0 個或5個至約1 3個胺基酸殘基。熟習此項技術者例如自
Nord等人，1997 Nat· Biotechnol· 15: 772-777將瞭解可優 選取代位於Z域表面上之胺基殘基，而束之核心應保持恆 定以使分子之結構特性保守。 製造親和體之方法闡明於例如W0 00/63243中，且出於 本發明之目的，其可包括例如以下步驟：⑴藉由例如噬菌 體呈現（綜上，參見例如Kay，K.等人（編）Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press，San Diego，ISBN (M2-4023 80-0)、核糖體呈現（綜 上’參見例如 Hanes，J·等人，（1998) Proc. TVai/.」cad. Scz·. 95: 14130-14135)或細胞呈現（綜上，參見例如
Daugherty，P.S·等人，（1998) 11: 825-832)、 自體現衍生自SPA域B或Z之多肽變體之庫的蛋白質資料庫 呈現多肽變體；（Π)選擇表現結合人類血清白蛋白之多肽 之純系；且（iii)藉由重組表現所選純系或藉由化學合成產 生多肽。 高親和性多聚艘 129025.doc -270- 200848427 實例2 1 ··經由CDR移植產生包含血清白蛋白結合高親和性 多聚體之雙特異性配位體 使用dAb7hl4之CDR域以以下方式構築結合人類血清白 蛋白之高親和性多聚體多肽。將dAb7hl4之 CDR1(RASQWIGSQLS ； SEQ ID NO·:_) 、CDR2 (WRSSLQS ； SEQ ID NO.:—)及 CDR3(AQGAALPRT ; SEQ ID NO.: _)序列分別在殘基17-28、49-53及78-85處移植入 C2單體中（描述於美國專利公開案第2005/0221 384號中， 其以引用的方式全部併入本文中），該等序列分別構成C2 單體之環區域1、2及3。執行Biacore實時結合分析以評估 人類血清白蛋白是否特異性結合包含dAb7hl4之抗人類血 清白蛋白CDR域的固定C2衍生之單體多肽。（熟習此項技 術者將認識到可使用任一適當方法評估結合親和力，該方 法包括例如經標記之人類血清白蛋白之沈澱、競爭性 Biacore檢定等）。若偵測到無人類血清白蛋白親和力或有 低人類血清白蛋白親和力（例如Kd值在μΜ範圍或以上）， 則採用許多策略中之至少一種提高CDR移植之C2單體（及/ 或高親和性多聚體二聚體、三聚體及其他更高級重複組合 物）的人類血清白蛋白結合特性，其包括以下促進結合親 和力之方法的任一者。 經由使用連接子多肽調節對應於原生C2單體内（及/或用 於高親和性多聚體組合物之其他原生單體内）之溶劑暴露 環區域的初始C2單體多肽（及/或重複產生之高親和性多聚 體二聚體、三聚體等多肽）之dAb7hl4 CDR移植之區域的 129025.doc -271 - 200848427 長度。例如，可使用位於dAb7hl4 CDR3多肽序列之N末端 側或C末端側及/或兩側的（例如）長度為〇至4個殘基之胺基 酸連接子將dAb7hl4之9個胺基酸殘基CDR3肽序列擴展至 長度為13個胺基酸殘基，藉此在對應於C2單體多肽的環3 之CDR3移植域内獲得總長為丨3個胺基酸之移植肽序列。 視情況組合連接子多肽之該用途與連接子序列、CDR序列 及/或非CDR C2單體多肽序列之誘變（例如使用如下所述之 誘變優化程序），以提高CDR移植之C2單體多肽的人類血 清白蛋白結合能力（例如經由優化CDR移植之C2單體多肽 内的CDR與C2單體多肽序列）。用於該目的之多肽連接子 具有預定序列或經由評估含有連接子之CDR移植C2單體多 肽的人類血清白蛋白結合能力視情況自隨機化多肽連接子 序列之群體中選擇。平行及/或重複執行優化方法。平行 與重複優化（例如親和力成熟）方法採用如下所述及/或如在 此項技術中已知適用於優化多肽結合特性之選擇法。 如下所述及/或如在此項技術中另外已知，經由誘變， 視情況組合平行及/或重複選擇法優化提供dAb7hl4 CDR之 CDR移植之C2單體多肽（及/或高親和性多聚體二聚體、三 聚體等重複產生之更高級組合物，或促進其之個別其他單 體）的人類血清白蛋白結合。對於例示性C2單體支架多肽 而言’使包圍移植dAb7hl4 CDR多肽序列之域經受如下所 述執行之隨機化及/或NNK誘變。視情況在C2單體多肽序 列内對如（例如）美國專利公開案第2005/0221384號所闡明 之所選胺基酸殘基執行該誘變，或視情況對所有非（：〇尺胺 129025.doc -272- 200848427 2酸殘基執行該誘變，且視情況使該誘變隨機化以發展新 或改良之人類血清白蛋白纟士人 夕肽。視情況，經由例如隨 誘交、NNK誘變、精確誘變及/或其他此項技術中認可
之方法使提供於CDR移植之C2單體多肽内的dAb7h 1 4 CDR 多肽域經受誘變。視情況使用pCR執行該等誘變方法，使 得在CDR移植之C2單體多肽㈣所㈣序列上產生序列多 樣性。該等方法類似於彼等下文關於⑽諸庫產生所述 者。除隨機及/或精確誘變方法外，採用所乾向胺基酸殘 基之定向誘變，其中結構資訊確定特定胺基酸殘基對結合 人類血清白蛋白為關鍵的。 使包3如上所述工程化之移植(1八1^71114 cdr序列之以單 體夕肽(及/或包含個別單體之重複產生之高親和性多聚體 、、、曰物）、’工又平行及/或重複選擇法以鑑別彼等針對人類血 清白蛋白結合優化之C2單體多肽（與高親和性多聚體組合 物）。例如，產生（1八1371114 CDR_移植之C2單體多肽序列之 貪料庫後，將該等多肽之此資料庫呈現在噬菌體上且如下 文關於自dAb資料庫選擇血清白蛋白結合dAb所述，使其 經又多輪需要血清白蛋白結合及/或增殖之選擇。視情 況，針對固定在抗原管上之血清白蛋白或針對溶液中之生 物素化血清白蛋白執行選擇。視情況，使用表面電漿共振 (SPR)ABlacore(Karlss〇n等人，1991)，使用心。⑽系統 (Uppsala，Sweden)測定結合親和力其中包含〇衍生之單 體的70全優化之高親和性多聚體理想地獲得nM範圍或更 佳之人類血清白蛋白結合親和力Kd值。 129025.doc -273 - 200848427 鑑別結合人類企清白蛋白之C2單體衍生之多狀後，可經 由組合該等單體與其他單體，接著進_步誘變及/或選擇 進一步增強該等初始單體之人類血清結合特性，藉此形成 對人類血β白蛋白具有特定親和力之高親和性多聚體組合 物k別對人類血清白蛋白具有親和力之高親和性多聚體 組口物後，接著藉由τ文所述之任—方法使用該等高親和 性多聚體多肽產生雙特異性配位體組合物。 實例22 :㈣選擇血清白蛋白結合部分產生包含血清白蛋 白、、、口 〇 Ν親和性多聚體非免疫球蛋白支架之雙特異性配 位體 使如所述之原生C2單體多肽經受資料庫選擇及視情況親 和力成熟技術，接著將其與另一單體（例如纖連蛋白單 體，對於其可平行優化人類血清白蛋白親和力）組合且視 情況使其重複經受資料庫選擇及視情況親和力成熟技術， 以產生適用於本發明之雙特異性配位體的人類血清白蛋白 結合高親和性多聚體非免疫球蛋白支架分子。 執行Biacore實時結合分析以評估人類血清白蛋白是否特 異性結合固定C2單體多肽（及/或重複產生之高親和性多聚 體分子）。偵測到C2單體多肽對人類血清白蛋白無結合親 和力或有低結合親和力（例如尺4值在μΜ範圍或以上）後， 採用許多策略中之至少一種將人類血清白蛋白結合特性賦 予C2單體多肽，該等策略包括促進結合親和力之以下方法 中的一或多種。 如下所述及/或如在此項技術中另外已知，經由誘變方 129025.doc -274- 200848427 ^ ’視情❹合平行及/或重複選擇法獲得且優化c2單體 夕肽(及/或重複產生之高親和性多聚體二聚體、三 分子)之人類血清白蛋白結合，單體多肽域經 所述執行之隨機化及/或NNK誘變。對整㈣單體多 =C2早體多肽内之特定序列’對如（例如以國專利公開案 弟200主5/0221384號所闊明之所選胺基酸殘基執行該誘變一，、 且視情況使該誘變隨機化以發展新或改良之人類血清白蛋 白、=合多肽。視情況使用pCR執行該等誘變方法使得在 C2早體多肽及/或高親和性多聚體分子内之所靶向序列上 產生序列多樣性。(該等方法類似於彼等下文關於心資料 庫產生所述者）。除隨機誘變方法外，採用所乾向胺基酸 殘基之定向誘變，其中結構資訊確定C2單體及/或高親和 性多聚體分子的特定胺基酸殘基對人類血清白蛋白之結合 為關鍵的。 使如上所述工程化之。單體多肽經受平行及，或重複選 擇法以落別彼等針對人類血清白蛋白結合優化之Ο單體多 肽及/或高親和性多聚體分子。例如，產生經誘變之。單 體夕肽序列之貝料庫後，將多肽之該資料庫呈現在嗟菌體 上且如下文關於自dAb資料庫選擇血清白蛋白結合㈣所 述使其經叉多輪需要血清白蛋白結合及/或增殖之選 擇視情況，該等輪之選擇可包括重複添加其他單體亞單 元=形成新高親和性多聚體分子。視情況，針對固定在抗 原&上之血清白蛋白或針對溶液中之生物素化企清白蛋白 執行選擇。視情況’使用表面電漿共振（spR)及 129025.doc -275 - 200848427
Biac〇re(Karlsson等人，1991)，使用心咖系統（up㈣& Sweden)測定結合親和力，其中咖生之單體多肽的完全 優化之高親和性多聚體理想地獲得nM範圍或更佳之人類 血Μ白蛋白結合親和力K d值。 鑑別結合人類血清白蛋白之C2單體衍生之多肽後，可經 由組合該等單體與其他單體，接著進—步誘變及/或選擇 進-步增強該等初始單體之人類企清結合特性藉此形成 對人類血清白蛋白具有特定親和力之高親和性多聚體組合 物。鑑別對人類血清白蛋白具有親和力之高親和性多聚體 組合物後’接著藉由下文所述之任—方法使用該等高親和 性多聚體多肽產生雙特異性配位體組合物。 高親和性多聚體多肽之產生及用途 精由活體外外顯子改組及嗟菌體呈現自人類細胞外受體 域之大家族發展高親和性多聚體，產生具有結合及/或抑 制特|±之夕域蛋白冑。連接多個獨立結合域(例如，以結 〇例如人類血π白蛋白之標靶蛋白質的重複方式選擇）產 生親和性且產生與習知單一抗原決定基結合蛋白相比提高 之親和力及特異性。其他潛在優勢包括在大腸桿菌中簡單 j有放地產生夕;^特異性分子，对熱性及蛋白酶抗性提 =。可產生對標乾蛋白質具有次nM親和力之高親和性多 私體例如已產生在基於細胞之檢定中以〇·8 pM IC5〇抑 制介白素6之高親和性多聚體且經表徵其具有生物學活性 (Silverman等人，2005 Nature Biotechnology 23·· 1556- ’亦參見’例如美國專利申請公開案第 129025.doc -276- 200848427 號、第 2005/0164301 跦 外 唬、第2005/0053973號及第 2005/0089932號、第 2〇〇5/ 號及弟 2〇〇4/〇175756 號:據此其每-者以引用的方式全部併人本文中）。 高親和性多聚體合成包括衍生自A域之人類庫之嗤菌體 呈現貧料庫。如Silverman等人（聽細咖Μ —
23·· 1556-1561)所述，❹合成重組產生單體之高度不同 池。產生單體池後，針對標乾蛋白質（例如人類血清白蛋 白)篩選該池。鑑別初始候選者’且添加另一單體且針對 標乾蛋自質㈣所得二聚體諸庫以鑑㈣選標減合二 聚體。接著重複該方法以獲得對標無蛋白質具有極高結合 親和力之三聚體，且可視情況重複以進—步鑑別更高級候 選複合物。將經識別以高卑g法口六Θ w。 賊々」Λ问親和力及特異性結合標靶蛋白質 之候選複合物稱為高親和性多聚體（”親和性多聚體”）。 高親和性多聚體之單體域可為任何尺寸之多肽鏈。例 如，單體域可具有約25至約500、約3〇至約2〇〇、約％至約 100'約90至約200'約3〇至約25〇、約3〇至約6〇、約9至約 15〇、約ΗΗ)至約150、約25至約5〇或約3〇至約15〇個胺基 酸。相似地，高親和性多聚體之單體域可包含（例如）約3〇 至約200個胺基酸；約25至約18〇個胺基酸；約仂至約I% 個胺基酸；約50至約13〇個胺基酸；或約75至約125個胺基 酸。單體域及免疫域在溶液中通常可維持穩定構形。有 時’高親和性多聚體之單體域及免疫域可獨立地摺疊成穩 定構形。可藉由金屬離子使該穩定構形穩定。穩定構形可 視情況含有二硫化物鍵（例如至少一個、兩個或三個或三 129025.doc -277- 200848427 個以上二硫化物鍵）。可視情況在兩個半胱胺酸殘基之間 形成二硫化物鍵。 描述單體域及嵌紋蛋白質之公開案及其中引用之參考文 獻包括以下：Hegyi，Η及Bork, P· 1997 户⑽心C〜m·， 16: 545-551 ; Baron等人，1991 7>π心出oc/2㈣.SCZ·. ι6: 13-17 ’ Ponting等人，2000 乂办./>，〇^/”（；/^所.54:185- 244 , Doolittle, 1995 Annu. Rev. Biochem 64: 287-314 ；
Doolitte及 Bork，1993 dmerz.c㈣ 269: 50-6;及
Bork，1991只五似286: 47-54。用於高親和性多聚體 之單體域亦可包括彼等在Pfam數據庫及SMArt數據庫中 所見之域。參見Schultz等人，2000 TVwc/ez.c AW 28: 231-34 。 尤其適用於高親和性多聚體組合物之單體域為卜夾層 域，（2)β-桶域，或（3)包含二硫化物鍵之半胱胺酸富集 域。用於高親和性多聚體之半胱胺酸富集域通常並不形成 α-螺旋、β-摺疊片或卜桶結構。通常，二流化物鍵促進域 摺疊成立體結構。通常，半胱胺酸富集域具有至少兩個二 硫化物鍵，更通常至少三個二硫化物鍵。 高親和性多聚體之單體域可具有許多特徵。例如，該等 域在動物（例如人類）中可具有低免疫原性或無免疫原性。 域可具有小尺寸，例如域可足夠小以便滲透皮膚或其他組 織。域可具有一定範圍之活體内半衰期或穩定性。 適用於尚親和性多聚體組合物之說明性單體域包括（例 如）EGF樣域、Kdngie域、纖連蛋白〗型域、纖連蛋白〖工型 129025.doc -278- 200848427 域、纖連蛋白III型域、PAN域、Gla域、SRCR域、昆庫茲 (Kunitz)/牛胰腺胰蛋白酶抑制劑域、昆庫兹型絲胺酸蛋白 酶抑制劑域、三葉（Trefoil)(P型）域、v〇n willebrand因子C 型域、過敏毒素（Anaphylatoxin)樣域、CUB域、曱狀腺球 蛋白I型重複、LDL-受體A類域、Sushi域、連接域、血小 板凝血酶敏感蛋白（Thrombospondin)I型域、甲狀腺球蛋白 單體域、免疫球蛋白樣域、C型凝集素域、MAM域、V〇n Willebrand因子A型域、體介素B域、WAP型4個二硫化物 核心域、F5/8 C型域、血色素結合蛋白域、SH2域、SH3 域、層黏連蛋白型EGF樣域、C2域及一般熟習此項技術者 已知之其他該等域以及其衍生物及/或變體。美國專利公 開案第20050221 384號提供在LDL-受體家族之分子中所見 的單體域之各種例示性形式之示意圖。 適當單體域（例如具有獨立摺疊能力或具有某些受限輔 助的域）可選自含有如諸如Simple Modular Architecture Research Tool(SMART ;參見 Shultz 等人，2000 iVwc/e/c 乂{：/(^7?以^厂6^ 28:23 1-234)或€八丁11(參見？6&1*1等人，2000 dc/办 28: 277-282)之計算序列分析工具 所限定的β-夾層或β-桶立體結構之蛋白質域家族。高親和 性多聚體之例示性單體域亦包括纖連蛋白III型域、抗運載 蛋白域及CTLA-4之Ig樣域之域。該等域之某些態樣描述於 Lipovsek 等人之 WO 01/64942、Beste 等人之 WO 99/16873 及Desmet等人之WO 00/60070中，其内容以引用的方式全 部併入本文中。 129025.doc -279- 200848427 险夕♦體之早體域視情況富集半胱胺酸。適當半 胱胺酸舍隹即—^ ^ , 田杲早體域包括（例如）LDL受體A類域（” A域，，）或 GF樣域。單體域亦可具有帶負電荷之殘基叢集。視情
單體域含有重複序列，諸如β-螺旋槳域中所見之 Y W^TD 另一適用於高親和性多聚體之例示性單體域為C2 0 jfr 菜 ^ 果國專利公開案第2005/0221384號中提供適用於產 生向親和性多聚體例示性A域及C2域序列及一致序列，包 括例不性選擇誘變靶向最需要之胺基酸殘基（例如表面暴 露之環殘基）。 •通^使用編碼單體域之聚核苷酸（亦稱為核酸）經由表現 製備單體域。編碼單體域之核酸可獲自多種不同來源。可 藉由表現複數種編碼天然存在之單體域、改變之單體域 (亦即單體域變體）或其組合之不同核酸製備單體域之資料 庫。 視U况作為兩親和性多聚體產生之起始步驟，鑑別結合 所k或所需配位體（例如人類血清白蛋白）或配位體之混合 物的單體域。在某些實施例中，鑑別或選擇單體域及/或 免j域之所需特性（例如對人類血清白蛋白之結合親和力） 且隨後使單體域及/或免疫域形成多聚體。對於彼等實施 例，可使用任何產生具有所需特性（例如人類血清白蛋白 結合）的域之選擇的方法。例如，該等方法可包含提供複 =種不同核酸，各核酸編碼單體域；轉譯該複數種不同核 酸，精此提供複數個不同單體域；篩選該複數個不同單體 便…a所需配位體或配位體之混合物；及鑑別該複數 129025.doc 200848427 個不同單體域之結合所需配位體或配位體混合物之成員。 用於產生高親和性多聚體之單體域可天然存在或經改變 (非天然的變體）。本文中使用術語，，天然存在”指示可在自 然界中見到之目標。例如，天然單體域可包括人類單體域 或視情況獲自例如哺乳動物、靈長類動物、齧齒動物、 魚、鳥、爬行動物、植物等不同物種或來源之域。天然存 在之早體域可藉由許多方法，例如藉由染色體組dna或 cDNA之PCR擴增獲得。如本文中所用術語，，原生，，用於指並 未經㈣變或者經由執行下文所述之任一方法而改變之核 酸及/或多狀。 高親和性多聚體之單體域可為天然存在之域或非天然存 在之變體。用於合成高親和性多聚體之單體域之資料庫可 含有天然存在之單體域、非天然存在之單體域變體或其組 合。 可使用多種報導呈現載體或系統表現編碼單體域及高親 和性多聚體之核酸且測試所需活性（例如人類血清白蛋白 結合）。例如，噬菌體呈現系統為在噬菌體表面上將單體 域表現為融合蛋白質之系統（Pharmacia，MUwaukee wis) 〇 噬菌體呈現可包括在絲狀細菌噬菌體表面上通常以與細菌 噬菌體包被蛋白之融合物形式提供編碼單 域之多狀序列。親和力富集及嗔菌體呈現之二= 明於（例如）PCT專利公開案第91/17271號、第91/1_號及 第91/19818號及第93/〇8278號中，其以引用的方式全部併 入本文中。 129025.doc -281 - 200848427 其他呈現系統之實例包括核糖體呈現、核苷酸連接之呈 現（參見’例如美國專利第6,281，344號、第6，194,550號、 第6,207,446號、第6,214,553號及第6,258,558號）、細胞表 面呈現及其類似者。細胞表面呈現包括多種細胞，例如大 腸桿菌、酵母及/或哺乳動物細胞。當細胞用於呈現時， 將例如藉由PCR擴增接著消化獲得之核酸引入細胞中且轉 譯。視情況，可例如藉由注射將編碼單體域或高親和性多 聚體之多肽引入細胞中。 如下文及在此項技術中所述，高親和性多聚體為多聚組 合物。在例示性實施例中，多聚體包含至少兩個單體域及/ 或免疫域。例如，本發明之多聚體可包含2至約1〇個單體 域及/或免疫域、2至約8個單體域及/或免疫域、約3至約1〇 個單體域及/或免疫域、約7個單體域及/或免疫域、約6個 單體域及/或免疫域、約5個單體域及/或免疫域或約4個單 體域及/或免疫域。在某些實施例中，多聚體包含至少3個 單體域及/或免疫域。通常，已針對結合所關注之標靶分 子（例如人類血清白蛋白）預先選擇單體域。 在高親和性多聚體内，各單體域可特異性結合一個標靶 刀子（例如人類血清白蛋白）。視情況，各單體結合標靶分 子上之不同位置（與抗原決定基類似）。結合同一標靶分子 之多個單體域及/或免疫域可產生親和性效應，使得與各 個別單體相比多聚體高親和性多聚體對標靶分子之親和性 提间。視情況，多聚體之親和性可為單體域單獨對標靶蛋 白貝（例如人類血清白蛋白）之親和性的至少約丨·$、2、3、 129025.doc -282 - 200848427 、、10 、 20 、 50或100倍。 ^错由連接子連結所選單體域以形成多聚體（高親和性 ^體）、。例如，將連接子安置於多㈣中之各獨立不連 續早！域之間。通常，免疫域亦經由連接子部分彼此連接 或與早體域連接。可容易地用以將免疫域變體連接在一起 之連接子部分與對於單體域變體之多聚體所述的連接子部 分相同。本文描述適於連結免疫域變體與其他域形成多聚 體之例示性連接子部分。 可使用在此項技術中已知之多種技術實現所選單體域經 由連接子之連結以形成高親和性多聚體。例如，可藉由 DNA連接或視情況藉由基於pCR之自引發重疊反應實現編 碼所選單體域的聚核苷酸之組合裝配。可在針對結合標靶 夕♦體之能力鑑別單體前，或已針對結合標革巴多聚體之能 力選擇單體後將連接子附接至單體。 如上所述，可改變包含高親和性多聚體之多肽。上文及 下文在以下公開案及其中引用之參考文獻中描述多種用於 產生編碼a亥荨多狀之經修飾或改變之核酸序列的多樣性產 生程序之描述：Soong，N·等人，Molecular breeding of viruses，（2000) Nat Genet 25(4):436-439 ; Stemmer等人，
Molecular breeding of viruses for targeting and other clinical properties，（1999) Tumor Targeting 4:1-4 ; Ness 等 人，DNA Shuffling of subgenomic sequences of subtilisin’ (1999) Nature Biotechnology 17:893-896 ; Chang等人， Evolution of a cytokine using DNA family shuffling, (1999) 129025.doc -283 - 200848427
Nature Biotechnology 17:793-797 ; Minshull 及 Stemmer， Protein evolution by molecular breeding，（1999) Current Opinion in Chemical Biology 3:284-290 ; Christians等人，
Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling, (1999) Nature Biotechnology 17:259-264 ； Crameri 等人，DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution，（1998) Nature 391:288-291 ; Crameri 等 人，Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling, (1997) Nature Biotechnology 1 5:436-438 ; Zhang 等人，Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening (1997) Proc. Natl. Acad. Sci· USA 94:4504-4509 ； Patten 等人，Applications of DNA Shuffling to
Pharmaceuticals and Vaccines, (1997) Current Opinion in Biotechnology 8:724-733 ; Crameri 等人，Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling， (1996) Nature Medicine 2:100-103 ; Crameri 等人，
Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling, (1996) Nature Biotechnology 14:315-319 ; Gates 等人，Affinity selective isolation of ligands from peptide libraries through display on a lac repressor 'headpiece dimer'，(1996) Journal of Molecular Biology 255:373-386 ； Stemmer，Sexual PCR and Assembly PCR， 129025.doc -284- 200848427 (1996) In: Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers，New York·第 447-457 頁；Crameri 及 Stemmer， Combinatorial multiple cassette mutagenesis creates all the permutations of mutant and wildtype cassettes， (1995) BioTechniques 18:194-195 ; Stemmer 等人，Single-step assembly of a gene and entire plasmid form large numbers of oligodeoxy-ribonucleotides, (1995) Gene，164:49-53 ;
Stemmer，The Evolution of Molecular Computation，（1995) Science 270:1510 ; Stemmer. Searching Sequence Space, (1995) Bio/Technology 13:549-553 ； Stemmer, Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling，（1994) Nature 370:389-391 ；及 Stemmer，DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751 。 產生多樣性之突變方法包括（例如）定點誘變（Ling等人， Approaches to DNA mutagenesis: an overview, (1997) Anal Biochem. 254(2): 157-178 ; Dale 等人，Oligonucleotide- directed random mutagenesis using the phosphorothioate method，（1996) Methods Mol· Biol· 57:369-374 ; Smith，In vitro mutagenesis，(1985) Ann. Rev. Genet. 19:423-462 ；
Botstein & Shortle，Strategies and applications of in vitro mutagenesis, (1985) Science 229:1193-1201 ； Carter, Site-directed mutagenesis, (1986) Biochem. J· 237:1-7 ;及 129025.doc -285 - 200848427
Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, (1987)，於 Nucleic Acids & Molecular Biology(Eckstein，F.及 Lilley，D. M. J.編，Springer Verlag，Berlin)中）；使用含有尿喊咬之模板誘變（Kunkel， Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 ; Kunkel等人，Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection，(1987) Methods in Enzymol. 154，367-382 ;及 Bass 等人，Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, (1988) Science 242:240-245);寡核苷酸定向誘變（（1983) Methods in Enzymol. 100: 468-500 ; (1987) Methods in Enzymol. 1 54: 329-350 ； Zoller & Smith，Oligonucleotide-directed mutagenesis using Ml3-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, (1982) Nucleic Acids Res. 10:6487-6500; Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, (1983) Methods in Enzymol. 100:468-500 ;及 Zoller & Smith，
Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template，（1987) Methods in Enzymol. 154:329-350); 經硫代填酸醋修飾之DNA誘變（Taylor等人，The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme 129025.doc •286- 200848427 reactions to prepare nicked DNA，(1985) Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764 ; Taylor 等人，The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, (1985) Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787 ； Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, (1986) Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698 ; Sayers 等人，Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis，(1988) Nucl. Acids Res. 16:791-802;及 Sayers 等人，Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide，（1988) Nucl. Acids Res. 16: 803-814);使用缺口 雙螺旋 DNA 誘變（Kramer 等人，The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, (1984) Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456 ; Kramer & Fritz
Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, (1987) Methods in Enzymol. 154:350-367 ; Kramer等人，Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 7207 ;及Fritz等人，Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without 129025.doc -287- 200848427 enzymatic reactions in vitro, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999) ° 其他適當方法包括點錯配修復（Kramer等人，Point Mismatch Repair，（1984) Cell 38:879-887);使用修復缺乏 宿主菌株誘變（Carter等人，Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using Ml 3 vectors, (1985) Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443 ;及 Carter，Improved oligonucleotide- directed mutagenesis using Ml 3 vectors，(1987) Methods in Enzymol. 154: 382-403);缺失誘變（Eghtedarzadeh &
Henikoff， Use of oligonucleotides to generate large deletions，（1986) Nucl. Acids Res. 14: 5115);限制選擇及 限制純化（Wells 等人 ’ Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin， (1986) Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423);藉由全 基因合成誘變（Nambiar等人，Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, (1984) ί
Science 223: 1299-1301 ; Sakamar 及 Khorana，Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), (1988) Nucl. Acids Res. 14: 6361-63 72 ; Wells 等人，Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites，（1985) Gene 34:3 15-323 ;及 Grundstrom 等人，
Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot- 129025.doc -288- 200848427 gun' gene synthesis, (1985) Nucl. Acids Res. 13: 3305-33 16);雙鏈斷裂修復（Mandecki，Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis，(1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 83:7177-71 81 ;及 Arnold， Protein engineering for unusual environments, (1993) Current Opinion in Biotechnology 4:450-455)。關於上述方法之多 者的補充細節可見於Methods in Enzymology，第154卷 中，其亦描述以各種誘變方法解決問題之適用對照。 關於各種多樣性產生方法之補充細節可見於以下美國專 利、PCT公開案及申請案及EPO公開案中：Stemmer之美國 專利第 5,605,793 號（1997 年 2 月 25 曰），’’Methods for In Vitro Recombination" ; Stemmer 等人之美國專利第 5,811，238 號（1998 年 9 月 22 日），"Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination” ； Stemmer 等人之美國專利第 5,830,721 號（1998 年 11 月 3 日），，，DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly” ； Stemmer等人之 美國專利第 5,834,252 號（1998 年 11 月 10 a)，"End-Complementary Polymerase Reaction” ； Minshull等人之美 國專利第 5,837,458 號（1998 年 11 月 17 日），"Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering” ； Stemmer 及 Crameri 之 WO 95/22625，"Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassemblyf, •’ Stemmer 及 129025.doc -289- 200848427
Lipschutz 之 WO 96/33207 ， ’’End Complementary
Polymerase Chain Reaction” ； Stemmer 及 Crameri 之 WO 97/20078，’’Methods for Generating Polynucleotides having
Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination” ； Minshull 及 Stemmer 之 WO 97/3 5966， ’’Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering” ； Punnonen 等人之 WO 99/41402，"Targeting of Genetic Vaccine Vectors’· ； Punnonen 等人之 WO 99/41383，"Antigen Library Immunization” ； Punnonen 等 人之WO 99/41369，’’Genetic Vaccine Vector Engineering” ； Punnonen 等人之 WO 99/41368 ，"Optimization of
Immunomodulatory Properties of Genetic Vaccines11 ; Stemmer 及 Crameri 之 EP 752008，nDNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly11 ; Stemmer 之 EP 0932670，’’Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Sequence Recombination” ； Stemmer 等人之 WO 99/23 107， ffModification of Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling” ； Apt 等人之 WO 99/21979，"Human Papillomavirus Vectors'1 del Cardayre 等人之 WO 98/3 1837，’’Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination1' ; Patten及 Stemmer之 WO 98/27230，’’Methods and Compositions for Polypeptide Engineering” ； Stemmer 等人之 WO 98/27230，’’Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence 129025.doc -290- 200848427
Shuffling and Selection11 ; WO 00/00632，’’Methods for Generating Highly Diverse Libraries” ； WO 00/09679， ’’Methods for Obtaining in Vitro Recombined Polynucleotide Sequence Banks and Resulting Sequences” ； Arnold等人之 WO 98/42832，"Recombination of Polynucleotide Sequences Using Random or Defined Primers” ； Arnold 等人之 WO 99/29902 ， ’’Method for Creating Polynucleotide and
Polypeptide Sequences” ； Vind 之 WO 98/41653，"An in /
Vitro Method for Construction of a DNA Library” ； Borchert 等人之 WO 98/41622，"Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling” ；及 Pati 及 Zarling 之 WO 98/42727 ， ’’Sequence Alterations using Homologous
Recombination” ； Patten 等人之 WO 00/18906，"Shuffling of Codon-Altered Genes” ； del Cardayre 等人之 WO 00/04190，"Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Recombination” ； Crameri 等人之 WO 00/42561， "Oligonucleotide Mediated Nucleic Acid Recombination” ； Selifonov 及 Stemmer 之 WO 00/42559，’’Methods of
Populating Data Structures for Use in Evolutionary Simulations，，； Selifonov 等人之 WO 00/42560，"Methods for Making Character Strings， Polynucleotides & Polypeptides Having Desired Characteristics” ； Welch等人 之 WO 01/23401，’’Use of Codon-Varied Oligonucleotide Synthesis for Synthetic Shuffling” ；及 Affholter 之 129025.doc -291 - 200848427 PCT/US01/06775 ， ’’Single-Stranded Nucleic Acid
Template-Mediated Recombination and Nucleic Acid Fragment Isolation，，。 視情況將用於本發明之多肽（例如高親和性多聚體）表現 於細胞中。可使用在此項技術中熟知之表現系統合成單一 蛋白質形式之多聚體域。除上文所述之許多文字外，描述 本文中適用的分子生物技術之一般性文字（包括載體、啟 動子之用途及與表現核酸有關的許多其他主題，諸如單體 域、所選擇單體域、多聚體及/或所選擇多聚體）包括： Berger及 Kimmel，Guide to Molecular Cloning Techniques， Methods in Enzymology，第 152卷，Academic Press，Inc.， San Diego, Calif. (Berger) ; Sambrook 等人，Molecular Cloning_A Laboratory Manual(第 2 版），第 1-3 卷，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor, Ν·Υ·， 1989("Sambrook”）；及 Current Protocols in Molecular Biology，F· M. Ausubel等人編，Current Protocols，a joint venture between Greene Publishing Associates，Inc.及 John Wiley & Sons，Inc.，（1999年增補）（"Ausubel"))。足以指引 熟習此項技術者通過適用於鑑別、分離且選殖單體域及多 聚體編碼核酸之活體外擴增方法（包括聚合酶鏈反應 (PCR)、連接酶鏈式反應（LCR)、Q-複製酶擴增及其他RNA 聚合酶介導之技術（例如NASBA))之技術的實例見於： Berger、Sambrook 及 Ausubel 以及 Mullis等人，（1987)美國 專利第 4,683,202號；PCR Protocols A Guide to Methods 129025.doc -292- 200848427 and Applications(Innis 等人編）Academic Press Inc. San Diego，Calif· (1990) (Innis) ; Arnheim & Levinson(1990年 10 月 1 日）C&EN 36-47 ； The Journal Of NIH Research (1991) 3, 81-94 ; Kwoh等人，（1989) Proc. Natl. Acad. Sci· USA 86, 1 173 ; Guatelli等人，（1990) Proc. Natl. Acad· Sci. USA 87，1874 ; Lomell等人，（1989) J. Clin. Chem 35, 1826 ; Landegren等人，（1988) Science 241，1077-1080 ; Van Brunt (1990) Biotechnology 8，291-294 ; Wu及 Wallace， (1989) Gene 4，560 ; Barringer 等人，（1990) Gene 89, 117;及 Sooknanan及 Malek (1995) Biotechnology 13: 563-5 64。活體外選殖擴增之核酸的改良方法描述於Wallace等 人，美國專利第5,426,039號中。藉由PCR擴增大核酸之改 良方法概括於Cheng等人，（1994) Nature 369: 684-685及其 參考文獻中，其中產生高達40 kb之PCR擴增子。熟習此項 技術者將瞭解基本上可將任何^^八轉化為適於使用逆轉錄 酶及聚合酶限制消化、PCR擴張及定序之雙鏈DNA。 可將編碼例如單體域及/或高親和性多聚體之載體引入 宿主細胞中，藉由重組技術產生及/或選擇。以該等可為 (例如）選殖載體或表現載體之載體將宿主細胞遺傳地工程 化（亦即轉導、轉型或轉染）。載體可（例如）呈質體、病毒 顆粒、噬菌體等之形式。可在經適當改質之習知培養基中 培養經工程化之宿主細胞，以活化啟動子、選擇轉型子或 擴增所關注之單體域、所選單體域、多聚體及7或所選多 聚體基因。諸如溫度、pH值及其類似條件之培養條件為彼 129025.doc -293 - 200848427 等先前用於針對表現而選擇之宿主細胞者，且其對於熟習 此項技術者將顯而易見且處於本文所引用之參考文獻中， 該等參考文獻包括（例如）Freshney (1994) Culture Df Animal Cells，a Manual of Basic Technique，第三版， Wiley-Liss，New York及其中引用之參考文獻。 亦可在諸如植物、酵母、真菌、細菌及其類似物之非動 物細胞令產生本發明之多肽。實際上，如全文所述，嗟菌 體呈現為產生該等多肽之尤其適當技術。除Sambr〇〇k、 f X Berger及Ausubel外，關於細胞培養之細節可見payne等 人 ’（1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons，Inc. New York，Ν·Υ· ; Gamborg 及 Phillips(編）（1995) Plant Cell，Tissue and Organ Culture;
Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-
Verlag (Berlin Heidelberg New York);及 Atlas 及 Parks(編）The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press，Boca Raton，Fla 〇 / ~ 高親和性多聚體亦可具有單體域、免疫域及/或多聚體 之改變，其提高藥理學特性、降低免疫原性或促進多聚體 及/或單體域至細胞或組織中（例如穿過血腦屏障或穿過皮 膚）之轉運。該等類型之改變包括多種修飾（例如添加糖基 或糖基化）、添加PEG、添加結合某一蛋白質（例如HS A或 其他血清蛋白）之蛋白質域、添加發出移動或轉運入、出 且穿過細胞之信號的蛋白質片段或序列。亦可將另一組份 添加至多聚體及/或單體中以操控多聚體及/或單體域之特 129025.doc -294- 200848427 性。亦可添加多種組份’其包括例如結合已知受體之域 (例如結合Fc受體之Fc區蛋白質域）、毒素或毒素之部分、 可視隋況裂解以活化多聚體或單體域之前結構域、報導子 刀子（例如綠色螢光蛋白質），結合報導子分子之組份（諸如 用於放射線療法之放射性核、生物素或抗生物素蛋白）或 修韩之組合。 如本文中所用”定向發展”係指以遞歸過程產生、表現且 f 篩選聚核普酸變體之活性（例如，對人類血清白蛋白標靶 蛋白貝具有結合活性之多肽）的方法。選擇篩選中之一或 多個候選者，且接著使用編碼所選候選者之聚核苷酸重複 孩過程以產生新變體。定向發展包括至少兩輪變異產生且 可包括3、4、5、1〇、20或更多輪變異產生及選擇。可藉 由熟習此項技術者已知之任一方法產生變異，包括例如易 錯PCR、基因改組、化學誘變及其類似方法。 本文中使用術語”改組”指示非一致序列之間的重組。在 ( 某些實施例中’改組可包括經由同源重組或經由非同源重 組，諸如經由cre/lox及/或^卩/加系統交叉。可藉由採用多 種不同形式進行改組，該等形式包括例如活體外及活體内 改組形式、silico改組形式、使用雙鏈或單鏈模板之改組 形式、基於引子之改組形式、基於核酸分裂之改組形式及 寡核苷酸介導之改組形式（其全部基於非一致序列之間的 重組事件且在下文更詳細描述或提及）以及其他相似的基 於重組之形式。 如本文中所用術語”隨機，，係指由兩種或兩種以上胺基酸 129025.doc -295 - 200848427 組成且藉由隨機過程構築之聚核苷酸序列或胺基酸序列。 隨機聚核苷酸序列或胺基酸序列可包括框架或支架基元， 其可包含不變序列。
GroEL 及 GroES 實例24 :經由CDR移植產生包含血清白蛋白結合 epnlO(GroES)非免疫球蛋白支架之雙特異性配位體 使用dAb7hl4之CDR3域以以下方式構築結合人類血清白 蛋白之cpnlO(GroES)非免疫球蛋白支架多肽。將dAb7hl4 之 CDR3(AQGAALPRT; SEQ ID NO·:—)序列移植入 cpnl〇 多肽代替位置19-27處之原生cpni〇胺基酸殘基（移動環殘 基）。執行Biacore實時結合分析以評估人類血清白蛋白是 否特異性結合包含dAb7hl4之抗人類血清白蛋白CI)R3域的 固疋cpn 1 0衍生之多肽。（熟習此項技術者將認識到可使用 任一適當方法評估結合親和力，該方法包括例如經標記之 人類血清白蛋白之沈殿、競爭性Biac〇re檢定等）。若偵測 到無人類血清白蛋白親和力或有低人類血清白蛋白親和力 (例如Kd值在μΜ範圍或以上），則採用許多策略中之至少 一種提高CDR3移植之cpnl0#肽的人類血清白蛋白結合特 性，該等策略包括以下促進結合親和力之方法中的任一 種。 經由胺基酸殘基缺失及/或使用連接子多肽調節對應於 原生cpnlO多肽内之移動環區域之cpnl〇多肽的dAb7hi4 CDR3移植之區域之長度。例如，可使用位於 CDR3多肽序列之N末端側或c末端側及/或兩側的（例如）長 129025.doc -296- 200848427 度為0至7個殘基之胺基酸連接子將dAb7hl4之9個胺基酸殘 基CDR3肽序列擴展至長度為16個胺基酸殘基，藉此在對 應於原生cpnlO序列的移動環之CDR3移植域内獲得總長為 1 6個胺基酸之移植肽序列。視情況組合連接子多肽之該用 途與連接子序列、CDR3序列及/或非CDR cpnl〇序列之誘 (例如使用如下所述之誘變優化程序），以提高CDR3移植 之cpnlO多肽的人類血清白蛋白結合能力（例如經由優化 CDR移植之cpni〇多肽内的CDR與纖連蛋白序列）。用於該 目的之多肽連接子具有預定序列或經由評估含有連接子之 CDR3移植之cpnl0多肽的人類血清白蛋白結合能力，視情 況選自隨機化多肽連接子序列之群體。平行及/或重複執 行優化方法。平行優化與重複優化（例如親和力成熟）方法 採用如下所述及/或如在此項技術中已知適用於優化多肽 結合特性之選擇法。 如下所述及/或如在此項技術中另外已知，經由誘變， 視情況組合平行及/或重複選擇法優化提供dAb7hl4 CDR3 之CDR移植之cpnl〇多肽的人類血清白蛋白結合。使包圍 移植dAb7hl4 CDR3多肽序列之CpnlO支架多肽域經受如下 所述執行之隨機化及/或NNK誘變。在cpnlO多肽序列内對 非移植胺基酸殘基執行該誘變，且視情況將該誘變隨機化 以發展新或改良之人類血清白蛋白結合多肽。視情況，經 由例如隨機誘變、NNK誘變、精確誘變及/或其他此項技 術中認可之方法使提供於CDR3移植之cpnl〇多肽内的 dAb7hl4 CDR3多肽域經受誘變。視情況使用PCR執行該等 129025.doc -297- 200848427 誘變方法，使得在CDR3移植之cpn 1 0多肽内的所乾向序列 上產生序列多樣性。該等方法類似於彼等下文關於dAb資 料庫產生所述者。除隨機及/或精確誘變方法外，採用戶斤 輕向胺基酸殘基之定向誘變，其中結構資訊確定特定胺基 酸殘基對人類血清白蛋白之結合為關鍵的。 使包含如上所述工程化之移植dAb7hl4 CDR3序列的 CpnlO多肽經受平行及/或重複選擇法以鑑別彼等針對人類 血清白蛋白結合優化之cpnlO多肽。例如，產生dAb7hl4 CDR3-移植之cpnlO多肽序列之資料庫後，將該等多肽之 此資料庫呈現在嗤菌體上且如下文關於自dAb資料庫選擇 血清白蛋白結合dAb所述，使其經受多輪需要血清白蛋白 結合及/或增殖之選擇。視情況，針對固定在抗原管上之 血清白蛋白或針對溶液中之生物素化血清白蛋白執行選 擇。視情況，使用表面電漿共振（SPR)及Biac〇re(Karlsson 荨人，1991)，使用 Biacore 糸統（Uppsala，Sweden)測定結 合親和力’其中元全優化之單體及/或募聚Cpn 1 〇衍生之多 肽理想地獲得nM範圍或更佳之人類血清白蛋白結合親和 力Kd值。 鑑別結合人類血清白蛋白之單體cpnl〇衍生之多肽後， 可經由組合該等單體與其他單體，接著進一步誘變及/或 選擇進一步增強該等初始單體之人類血清結合特性，藉此 形成對人類血清白蛋白具有特定親和力之募聚 cpnlO/GroES組合物。鑑別對人類血清白蛋白具有親和力 之券聚cpnlO/GroES組合物後，接著藉由下文所述之任一 129025.doc -298- 200848427 方法使用該等多肽產生雙特異性配位體組合物。 貝例25 .經由選擇血清白蛋白結合部分產生包含血清白蛋 白結合cpn 1 0非免疫球蛋白支架之雙特異性配位體 使原生cpnl 〇多肽經受資料庫選擇及視情況親和力成熟 技術以產生適用於本發明之雙特異性配位體的人類血清白 蛋白結合cpnl 〇非免疫球蛋白支架分子。 士上所述，隶初經由檢定確定原生Cpni〇多肽結 合人類血清白蛋白之能力。偵測到cpnlO多肽對人類血清 白蛋白之無結合親和力或有低結合親和力（例如尺(1值在 範圍或以上）後，採用許多策略中之至少一種將人類血清 白蛋白結合特性賦予cpnl〇多肽，該等策略包括以下促進 結合親和力之方法中的一或多種。 如下所述及/或如在此項技術中另外已知，經由誘變 法，視情況組合平行及/或重複選擇法獲得且優化邛“❻支 架多肽之人類血清白蛋白結合。使以111〇支架多肽域經受 如下所述執行之隨機化及/或NNK誘變。對整.cpni〇多肽 執行該誘變，或對cpnlO多肽内之特定序列，包括位置19_ 7處之移動％胺基酸殘基執行該誘變，且視情況將該誘變 隨機化以發展新或改良之人類血清白蛋白結合多肽。視情 況使用PCR執行該㈣變方法，使得在_1()多肽内之所 爾列上產生序列多樣性。（該等方法類似於彼等下文 關於⑽資料庫產生所述者）。除隨機誘變方法外，採用所 革巴向胺基酸殘基之定向誘變，其中結構資訊確定_〇多 肽的特定胺基酸殘基對人類血清白蛋白之結合為關鍵的。 129025.doc -299- 200848427 使如上所述工程化之CpnlO多肽經受平行及/或重複選擇 法以鑑別彼等針對人類丘清白蛋白結合優化之Cpn丨〇多 肽。例如，產生經誘變之cpnl0多肽序列之資料庫後，將 多肽之該資料庫呈現在噬菌體上且如下文關於自dAb資料 庫選擇血清白蛋白結合dAb所述，使其經受多輪需要血清 白蛋白結合及/或增殖之選擇。視情況，針對固定在抗原 管上之jk清白蛋白或針對溶液中之生物素化血清白蛋白執 行選擇。視情況，使用表面電漿共振（spR)及
Biacore(Karlsson 等人，1991)，使用 Biacore 系統（Uppsala，
Sweden)測定結合親和力，其中完全優化之單體及/或募聚 cpn 1 0竹生之夕狀理想地獲得在範圍或更佳之人類血清 白蛋白結合親和力Kd值。 鑑別結合人類血清白蛋白之單體cpn丨〇衍生之多肽後， 可經由組合該等單體與其他單體，接著進一步誘變及/或 選擇進一步增強該等初始單體之人類血清結合特性，藉此 形成對人類血清白蛋白具有特定親和力之募聚 cpnlO/GroES組合物。鑑別對人類血清白蛋白具有親和力 之寡聚cpnlO/GroES組合物後，接著藉由下文所述之任一 方法使用該#多肽產生雙特異性配位體組合物。
GroEL多肽
GroEL為大腸桿菌中之關鍵分子伴隨蛋白，其由個亞 單元組成，各亞單元具有約57.5 Kd分子質量、排列在兩 個7員環中（Braig等人，1994 斤如々Μ如· ％: 3978-3982)。在GroEL環系統中存在一個大空腔，且普遍 129025.doc -300- 200848427 認為該空腔為蛋白質之成功摺疊活性所需。對於最優活 性，需要由10 Kd亞單元之7員環組成之輔伴隨蛋白 GroES(Hunt 等人，1996 編，379: 37-45)。各 GroES亞單 元使用具有保守疏水性三肽的移動環以與GroEL相互作用 (Landry等人，1993 仏π 364: 255-258)。移動環之長度 通常小於16個胺基酸且經受自無序環至β-髮夾之過渡，伴 隨有GroEL之頂端結構域的結合（Shewmaker等人，2001 5/〇/· 276: 3 1257-3 1264)。GroEL/GroES複合物之活 性需要ATP。GroEL及GroES遍布於所有生物體中，且其通 常稱為伴隨蛋白（cpn)分子，分別為cpn60及cpnlO。
GroEL為變構蛋白。變構蛋白為特殊類寡聚蛋白質，其 在結合配位體及底物期間在兩種或兩種以上不同立體結構 之間交替。變構蛋白通常牽涉於生物學或機械及物理化學 能量互變之控制過程中。ATP之作用係引發該變構變化， 引起GroEL自緊密結合變性蛋白之狀態轉化為微弱結合變 性蛋白之狀態。輔伴隨蛋白GroES因有利於微弱結合狀態 而輔助該過程。其亦可充當封蓋，密封GroEL之空腔。另 外，其與GroEL之結合可能直接與變性底物之結合競爭。 最後結果為GroES及ATP與具有以變性形式結合之底物的 GroEL之結合使變性底物釋放於空腔或其可再摺疊之溶液 中 〇
GroEL及GroES為可用於使單體多肽或蛋白質域多聚以 產生具有任何所需特徵的多聚蛋白質之多肽支架。亦如下 文對於（例如）高親和性多聚體組合物所述，通常需要使多 129025.doc -301 - 200848427 月太单體多聚。 二多蛋白質需要分子伴隨蛋白之幫助以以高產量活體内 指金或活體外再摺疊。分子伴隨蛋白為通常大且需要諸如 ATP之能源來起作用的蛋白質。大腸桿菌中之關鍵分子伴 隨蛋白為GroEL，JL由1 4伽兀口口 八由14個亞早元組成，各亞單元具有約 Z⑽分子f量、排列於2個7員環中。杨。EL環系統 „子在一個大空腔’且普遍認為該空腔為蛋白質之成功摺 f f舌性所需。對於最優活性，需要由IGKda亞單元之7員 環組成的輔伴隨蛋白Grop^ n 。GtoEL/GroES複合物之活性 需要能源ATP。 小伴隨蛋& ^細描述於其他處（參見國際專利申請宰 w〇99/〇5163,其揭示内容以引用的方式併入本文中）^ 伴隨蛋白多肽在呈單體形式時具有伴隨活性，且益需以 ATP形式之能量。長度為物μ%個胺基酸殘基之如虹 ，頂端結構域之限定片段在溶液中在單體條件下或當單分 散且附接至支撐物時對蛋白質具有分子伴隨蛋白活性。 /祕及/扣_支架允許多肽寡聚以 組早體多狀之活性的活性之功能蛋白寡聚物。Cpnl。： ypnl〇伴隨蛋白系統之普遍組份。cpni〇之實例包括 細囷GroES及噬菌體丁4 G 31，且亦 之其他成員將為熟習此項技術者已J。於下文，1〇家族 蛋白質支架亞單元裝配形成蛋白質支架。該 =形狀Μ包含許多亞單元。對於某些G通及如Μ A例而5 ’支架包含介於2與20個之間的亞單元，介於5 129025.doc -302- 200848427 二5:間的亞單元或約10個亞單元。cpnl。家族成員之天 :存在之支架結構包含7個呈七員環形狀之亞單元。因 4 ’在某些實施例中，支架為七員環。 可將可為（例如）衍生自對標乾蛋白質（例如人類金清白蛋 主）具有親和力之抗體或其抗原結合片段的域， f i 為諸如半胱胺酸之允許其他基團或分子連接至支竿 一殘基之異源胺基酸序列插入可寡聚蛋白質支架亞單 兀之序列中，使得藉由可寡聚蛋白質支架亞單元之序列來 形成多肽單體U末端與c末端。因此，例如藉由置換— 或多個胺基酸，支架亞單元之序列包括異源多肽。 已去cpnio亞早凡在其結構内具有"移動環,，。該移動環 位於大腸桿菌GroES之序列的胺基酉㈣㈣之間，較佳位 於胺基酸_之間及cpnl〇家族之其他成員的等效位置 處。T4 Gp31之移動環位於殘基2_5之間較㈣與44 之間。視情況’可藉由置換_1〇家族多肽之所有或部分 移動環插入異源多肽。若蛋白質支架亞單元為咖〇家族 多狀’則此外可在其N末端或C末端或在等效於CP副家族 肽之屋頂b髮夹的位置中併入異源序列。該位置位於細菌 嗟菌體T4 GP3!之位置54與67之間’較佳冲心間且較 佳59與6!之間，或位於大腸桿菌如防之位置㈣之 間、較佳44與62之間、有利地5〇與53之間。 視情況，可與亞單元本身之循環排列相關聯在支架亞單 …或C末端插入多肽。循環排列描述…及 Schachman，PNAS (USA) 1996’ 93: U59i 中基本上藉 129025.doc •303 · 200848427 由融合現有N及C末端且在其他處裂解多肽鏈以產生新汉及 C末端來使多肽循環。在本發明之一較佳實施例中，循環 排列後可在所形成之N及/或C末端包括異源多肽。可根據 所需特徵選擇新末端形成之部位，且該部位可包括移動環 及/或屋頂β髮夾。 又 有利地，可在蛋白質支架亞單元内之一個以上位置及/ 或不同於上文鑑別之位置的位置處插入可相同或不同之異 源序列。因此，各亞單元可包含兩個或兩個以上異源= 肽，當裝配支架時其呈現在支架上。依賴於由插入支架序 列之部位所提供之自由度’可以游離或約束形式將異源多 肽呈現在支架亞單元上。例如，&變支架中側接移動或β 髮夾壤之序列之長度將調節插入其中之任何異源多肽的約 束程度。
GroEL及/或GroES組合物亦可包含包括兩個或兩個以上 早體之多肽寡聚物。寡聚物可經組態成雜寡聚物，其包含 兩個或兩個以上插人支架中之不同胺基酸序列，或組態成 均泰聚物’其中插入支架中之序列相同。 可使構成寡聚物之單體彼此共價交聯。 執行交聯，使得單體自開始表現為募聚物 中之^殘基處執行交聯。例如，可使用在&似支架之位 置50與53之間或cpnl0家族之其他成員上的等效位置處插 入之獨特Cys殘基交聯支架亞單元。 可隨意選擇插入支架亞單元中之異源多肽之性質。在某 些實施例中，合成呈現抗體或其片段（諸如scFv、天然或 129025.doc •304- 200848427 駱駝化vH域及Vh CDR3片段）之支架蛋白質。 在一例示性實施例中，可如上所述及/或如W〇 〇〇/699〇7 所闡明製備能夠募聚之多肽單體，該專利以引用的方式全 部併入本文中。該製備方法可包含將編碼異源多肽之核酸 序列插入編碼可募聚蛋白質支架的亞單元之核酸序列中， 將所得核酸併入表現載體中且表現該核酸以產生多肽單 體。視h況’隨後可經由包含使如上所述產生的多肽單體 接合入养聚物之方法產生多肽寡聚物。在某些實施例中， 使單體交聯以形成寡聚物。 在某些實施例中，支架多肽基Kcpnlo/Hspi〇家族之成 員，諸如GroES或其類似物。高度較佳之類似物為丁4多肽 Gp3卜包括Gp31之GroES類似物具有可插入或置換以將異 源多肽融合至支架中之移動環（Hunt，J. F·等人，（1997) Cell 90，361-371，Landry，S· J·等人，（1996) Proc. Natl· Acad· Sci. U.S.A· 93, 11622-1 1627)。
CpnlO同源物遍布於動物、植物及細菌中。例如， GenBank之搜索指示在以下物種中已知cpni〇同源物：放線 共生放、線才旱菌actinomycetemcomitans) \ 月匈 膜肺炎放線桿菌;殺魚圭 氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)； 根癌農桿菌 (Agrobacterium tumefaciens) ·，酒色著色菌（Allochromatium vinosum)；大變形蟲共生細菌 bacterium)；超嗜熱菌(Aquifex ;擬南芬 (Arabidopsis thaliancT) ·，等抱择德（Bacillus sp) ·，。考熱鹿肪 129025.doc -305 - 200848427 芽孢桿菌;枯草桿菌 Μάίζ·/;)) ,·漢賽巴爾通體（方ari<9/7e//(2 ZzMw/ae);百日咳桿 菌;博氏疏螺旋體（5<9rre/z_a burgdorferi) ·，布氏择镜（Brucella ahriws);桃虫牙專性内共 生菌ap/nWco/a);洋蔥伯克霍爾德氏菌 (Burkholderia cepacia) ·，越南伯免氏菌（Burkholderia 似以）；空腸彎麴菌;新月 柄桿菌（Caw/Macier crescMiws); 鼠型沙眼衣原體 {Chlamydia muridarum);砂眼彼衣菌 trachomatis) ·，肺炎故农蛰（Chlamydophila pneumoniae) ·， 丙酮丁醇梭菌（C/osirM/wm ;產氣英膜梭茵 {Clostridium perfringens);熱纖梭菌(Clostridium ;大腸桿菌嗤菌體可厥氏體T-Cowdria ruminantium);藍色小體奇異藍藻 Cyanophora paradoxa) ·，欠艾利希體（Ehrlichia canis) ·，查 蘇埃 jL 免後（Ehrlichia chaffeensis) ·，馬埃 iL 先後（Ehrlichia equi) ·，呑嗤細胞埃 Sl l 體（Ehrlichia phagocytophila) ·，Sl 氏埃立免體（Ehr丨ichia risticii) ·’膝熱埃立希體（Ehrlichia ;埃立克體’HGE 劑（五7/G£ ageni);產 氣腸桿菌(Enterobacter aerogena); 成團腸桿菌 {Enterobacter agglomerans) \ 河生腸桿菌（Ewiero厶acier amnigenus)；阿斯布腸桿菌（五aMt/riae);曰溝 維腸桿菌(Enterobacter gergoviae)； 中間腸桿菌 {Enterobacter ;虫牙蟲内腸桿菌（五rwkk 129025.doc - 306- 200848427 aphidicola)； 胡蘿蔔歐文氏軟腐桿菌（五rwzWa ;草生歐文氏菌（JSVwM/a ;大腸桿菌 (J^e/zer/c/π’α co//) ; 土 拉弗朗西斯菌（Franc/sd/a iw/are似b); 大豆（G/ycz·/^ max); 杜克氏嗜血桿菌 (Haemophilus ducreyi)；嗜血流感菌(Jiaemophilus i?(i);幽門螺旋菌/7J；/(9r/);鈍狀全 抱螺菌（Holospora obtusa) ·，智尺後（Homo sapiens) ·，解鳥 胺酸克雷伯菌（火㈣/jKi/ca);產酸克雷伯氏 菌{Klebsiella oxy/oca);植生克雷伯菌 /?/a；7ifco/a);肺炎克雷伯氏桿菌（X7e心/e//a ; 瑞 士 乳桿菌(Lactobacillus helvetictis)；乳桿菌 7eae(Z^ci0Z>ac///[AS 7eae);乳酸乳球菌 ;細胞内勞森菌（Ζαΐ4^<9/7/α /wiracd/w/ar/s);鉤端螺 旋體/nierrogaw); 食曱基5瓜菌屬菌株 SS(Methylovorus sp strain SS)；鳥分枝桿菌 {Mycobacterium avium); 鳥分枝桿菌鳥型亞種 {Mycobacterium avium subsp avium) \ 鳥分枝桿菌副結核亞 後[Mycobacterium avium subsp paratuberculosis) \ 麻風分 枝桿菌/e/7rae); 結核分枝桿菌 {Mycobacterium iwhrew/osb);生殖支原體（Mycop/似 ;肺炎支原體;桃虫牙 初生共生細菌endosymbiont)；奈 瑟氏淋病雙球菌{Neisseria gonorrhoeae) ·，氣讓 NKBG(Oscillatoria sp NKBG)；菠蘿軟腐菌（尸㈣ioea 129025.doc - 307- 200848427 ananas)；巴氏德样菌（Pasteurella multocida) ·，牙齦口卜琳單 胞菌⑽似 gkg/va/b);綠膿桿菌 aeruginosa) ； ^ # i {Pseudomonas aeruginosa)；戀臭你艾 單胞菌(Pseudomonas putida);褐家鼠(Rattus ;褐家鼠/7〇rvegiCWiy);豌豆根瘤菌 (Rhizobium leguminosarum)；荚膜紅多田菌(Rhodobacter capsulatus) ； ^ έχ ^ g {Rhodobacter sphaeroides)；海洋 。♦熱菌（Rhodothermus marinus) ·，普氏立先:欠體(jUckettsia prowazd/z·);立克氏立克次體（iiz’chi⑴·α ;酸酒 酵母菌cerevisiae)； 無花果沙雷氏菌 /VcarM);黏質沙雷氏菌marcace似）； 深紅沙雷菌;苜稽中華根瘤菌 (Sinorhizobium meliloti)；米象主要共生細菌（57iop/2/7w oryzae principal endosymbiont);嗜麥芽寡養單胞菌 (Stenotrophomonas maltophilia) ； 肺炎 鍵球菌 {Streptococcus pneumoniae);白色鏈黴菌(Streptomyces ;藍色鏈黴菌（57r叩coe/ico/or);天藍色鏈 黴菌coelicolor)；變船青鏈黴菌 {Streptomyces lividans) ·，览珠 1 焦[Synechococcus sp、·，览 球藻屬藍藻（办mc/z<9(7(9cci^ vulcanus)； 藍細菌 少5/?);嗜熱布氏桿菌 6rocA:z7);海棲熱袍菌（TT^rmoioga mar/i/ma);水生棲熱菌 (Thermus aquaticus、·，梅鮝碍、敬後[Treponema pallidum) ·， 沃爾巴克氏體α);運動酸酵單胞菌 129025.doc -308 - 200848427 {Zymomonas mobilis) 〇 cpnlO家族亞單元之優勢為其具有負責天然伴隨蛋白 蛋白質摺疊活性的移動環，可在不影響支架之情2下將2 移除。缺失移動環之Cpnio不具有生物活性，使其成為“ 利之惰性支架，因此使任何潛在有害效應最小化。 插入適當生物學活性多肽可對因此產生之新穎多肽賦予 生物活性（例如結合人類血清白蛋白）。實於 、’丁、 兀具（例 如）當使用如本文所述之誘變及基於親和力之篩選法優化 提供支架之多肽的標革巴蛋白結合時，可藉由將生物學活性 多肽併入支架改良所插入多肽之生物活性。 可能有肽插入之替代性部位。有利選擇等效於Gr〇Es中 之屋頂β髮夾的位置。此包括藉由所需肽置換Gp3l中之 Glu-。胺基酸序列為Pro(59)-Glu(6〇)_Gly(61)。此在編碼 Pro-Gly之DNA級別（CCC:GGG)上便利地轉化為Smai部 位，使用於肽插入之末端鈍化之限制性部位作為〇^^八片 段。相似地，可在GroES序列之位置50與53之間且在其他 cpn 10豕族成員之等效位置處進行插入。或者，可使用反 向PCR以在支架之對側上呈現肽。 亦可使用伴隨蛋白分子之cpn6〇/Hsp6〇家族的成員作為 支架。例如，可使用十四聚細菌伴隨蛋白Gr〇EL。在某些 貝方也例中，在位置191與376之間、尤其位置197與333(以 SacII工私化及獨特cia I部位表示）之間插入異源多肽以在 赤道結構域與頂端結構域之間保持完整鉸鏈區以將活動性 賦予所插入多肽。支架之選擇可依賴於寡聚物（或包含及/ 129025.doc -309- 200848427 或衍生自該寡聚物之雙特異性配位體）之預期應用：例如 若募聚物預期用於疫苗接種目的，則使用諸如獲自結核分 枝桿菌者之免疫原性支架高度有利且賦予輔助作用。 亦可使用cpn60分子之突變體。例如，Gr〇EL(Gr〇ELSRi) 之單環突變體含有實現GroEL之兩個環之間的主要附接之4 點突變（R452E、E461A、S463A及V464A)，且由於其經釋 放結合GroES而在功能上活體外失活。^〇此沾2在Giui9i_ Gly具有另一突變，其藉由降低對&〇別之親和力恢復活 性。兩個該等突變體均形成環狀結構且將適用作支架。 某些天然存在之支架分子為細菌噬菌體產物：因此該等 支杀之天然存在之抗體為稀有的。此點提高支架融合物作 為疫苗藥劑之用途。缺失環之T4 GP31無生物活性（除作為 針對T4細菌噬菌體之顯性陰性或細胞内疫苗外），因此使 對宿主之有害效應最小化。然而，插入編碼多肽之適當序 列可對新穎蛋白質賦予生物活性。實際上，可藉由插入支 木蛋白貝中改良生物活性。 根據本發明可藉由寡聚增加抗體或抗體片段對抗原（例 類血β白蛋白）之親和力。抗體片段可為諸如Fv、Fab 及以^)2片段之片段或其任何衍生物，諸如單鏈Fv片段。 抗體或抗體片段可為非重組、重組性或人類化抗體或抗體 片段。抗體可為任何免疫球蛋白同型，例如IgG、IgM等。 在某二只轭例中，抗體片段可為駱駝化VH域。已知經由 H 们"$抗體與其同源抗原之間的主要分子間相互作 129025.doc -310- 200848427 如下文所述且如在此項技術中已知Gr〇EL&/^ 心㈣咖U))支架分子之使用提供％域或％⑶们域之寡 聚以產生高親和力寡聚物。可將兩個或兩個以上域包括在 該寡聚物中；在基於cpnl0支架之寡聚物中可包括多達7個 域，形成結合標靶蛋白質（例如人類血清白蛋白）之七聚寡 聚分子（七聚體）。 f \ 出於賦予及/或優化某些支架多^寡聚物對#_ Μ (例如人類幻青白蛋白)之親和力的目的，可將變異引入插 入支架多肽中之異源多肽中’使得可檢查及/或定位該等 多肽/寡聚物_其配位體/底物之特異性及/或親和力。可產 生具有相同環之變體，或可設計_組標準不同冑，以迅速 評估新穎多肽對標乾蛋白質（例如人類血清白蛋白）之親和 力。可根據諸如PCR之已知技術’藉由序列之隨機化產生 :體。可在併入蛋白質支架中之前藉由諸如嗟菌體呈現之 篩選方案使其經受選擇。 如本文所提及，”可募聚支架"為能夠寡聚或經寡聚以形 成支架且在不破壞該等寡聚能力之情況下可使異源多肽與 其較佳共價融合之多肽。因此，其提供"支架"，根據本發 明使用該支架可將多肽排列成多聚體。視情況可藉由 (例如)以待存在於支架上之異源多肽置換移除衍生支架之 野生型多肽之部分。 單體為具有寡聚或待經寡聚之潛力的多肽。可藉由在多 ，中併入可寡聚支架亞單元實現寡聚’若該可寡㈣亞 早几與其他支架亞單元組合，則其二者將寡聚。視情況， 129025.doc -311 - 200848427 可經由使用此項技術 的之連接子實現寡聚 中^可之用於將單體連接在 一起之目 戈口孚文中所用 n ^ 养^物與聚合物”或f，多聚體”同義， 立用以‘不所讨論之目標 5小不加為早體。因此，寡聚多肽包含 至少兩個共價或非共價連接在一 罝麯口口〜^ ^之早體早疋。所採用之 Τ體早兀之數目將依賴於寡聚物之預期用途且可介於2個 與2 0個或更多個之間顽〖主 、 m間視f月况，其介於5個與 且較佳為約7個。 门 f 嗤菌體呈現 已證明噬菌體呈現技術極其適用於生物研究。1使得配 位體能夠選自分子之大資料庫。支架技術可以獨特有利之 方式利用噬菌體呈現。類似於單鏈Fv分子呈現，一1〇分 :可以單體形式呈現在fd細菌噬菌體上。#由標準方法構 築插入資料庫（代替高度移動環，例如使用衍生自人類血 清白蛋白結合抗體之CDR3多肽），且針對所關注之分子篩 選所得資料庫。該選擇基於親和力。潛在地經由一或多次 重複誘變、表現（可如先前所述（ChateUier等人，1998
Proc. Natl· Acad. Sci· USA 95: 9861-9866 ; Corrales 及
Fersht 1996 1: 265-273)或藉由任何在此項技術中認可之方 法表現且純化GroEL蛋白質（-57.5 Kda GroEL及-10 Kda
GroES))及親和力篩選鑑別對標革巴蛋白質（例如人類血清白 蛋白）具有親和力之分子後’可使該等分子募聚，藉此利 用該等分子之親和性。視情況，某些所選單體將能夠交聯 或募聚其結合搭配物。 129025.doc -312- 200848427 纖連蛋白 實例26 :經由CDR移植產生包含血清白蛋白結合纖連蛋白 非免疫球蛋白支架之雙特異性配位體 使用dAb7hl4之CDR域以以下方式構築結合人類血清白 蛋白之纖連蛋白非免疫球蛋白支架多肽。將dAb7hl 4之 CDR1(RASQWIGSQLS ； SEQ ID NO·:_) 、CDR2 (WRSSLQS ； SEQ ID NO.:—)及 CDR3(AQGAALPRT ; SEQ ID NO.:_)序列移植入1GFn3中，分別置換位置21-31(BC 環）、51-5 6(DE環）及76-88(FG環）之原生1GFn3胺基酸殘 基。執行Biacore實時結合分析以評估人類血清白蛋白是否 特異性結合包含dAb7hl4之抗人類血清白蛋白CDR域的固 定纖連蛋白衍生之多肽。（熟習此項技術者將認識到可使 用任一適當方法評估結合親和力，該方法包括例如經標記 之人類jk清白蛋白之沈殿、競爭性Biacore檢定等）。若偵 測到無人類血清白蛋白親和力或有低人類血清白蛋白親和 力（例如Kd值在μΜ範圍或以上），則採用許多策略中之至 少一種提高CDR移植之纖連蛋白多肽的人類血清白蛋白結 合特性，該等策略包括以下促進結合親和力之方法中的任 一種。 經由使用連接子多肽調節對應於原生纖連蛋白多肽内之 暴露於溶劑之環區域的纖連蛋白多肽之dAb7hl4 CDR移植 區域的長度。例如，使用位於dAb7hl4 CDR3多肽序列之N 末端側或C末端側及/或兩側的（例如）長度為0至4個殘基之 胺基酸連接子將dAb7hl4之9個胺基酸殘基CDR3肽序列擴 129025.doc -313- 200848427 展至長度為13個胺基酸殘基，藉此在對應於原生纖連蛋白 序列的FG環之CDR3移植域内獲得總長為13個胺基酸之移 植肽序列。視情況組合連接子多肽之該用途與連接子序 列、CDR序列及/或非CDR纖連蛋白序列之誘變（例如使用 如下所述之誘變優化程序），以提高CDR移植之纖連蛋白 多肽的人類血清白蛋白結合能力（例如經由優化CDR移植 之纖連蛋白多肽内的CDR與纖連蛋白序列）。用於該目的 之多肽連接子具有預定序列或經由評估含有連接子之CDR 移植纖連蛋白多肽的人類血清白蛋白結合能力，視情況自 隨機化多肽連接子序列之群體選擇。平行及/或重複執行 優化方法。平行與重複優化（例如親和力成熟）方法採用如 下所述及/或如在此項技術中已知適用於優化多肽結合特 性之選擇法。 如下所述及/或如在此項技術中另外已知，經由誘變、 視情況組合平行及/或重複選擇法優化提供dAb7hl4 CDR之 CDR移植之纖連蛋白多肽的人類血清白蛋白結合。使包圍 移植dAb7hl4 CDR多肽序列之10Fn3支架多肽域經受如下所 述執行之隨機化及/或NNK誘變。在10Fn3多肽序列内對胺 基酸 1-9、44-50、61-54、82-94(β摺疊片之邊緣）；19、 21、30-46(偶數）、79-65(奇數）（兩個β摺疊片之溶劑可及 面）；及14-16及36-45(非CDR樣溶劑可及環及β轉角）執行 該誘變，且視情況將該誘變隨機化以發展新或改良之人類 血π白蛋白結合多肽。視情況，經由（例如）隨機誘變、 ΝΝΚ誘變、精確誘變及/或其他此項技術中認可之方法使 129025.doc -314- 200848427 提供於CDR移植之纖連蛋白多肽内的dAb7hl4 CDR多肽域 經受誘變。視情況使用PCR執行該等誘變方法，使得在 CDR移植之纖連蛋白多肽内的所靶向序列上產生序列多樣 性。該等方法類似於彼等下文關於dAb資料庫產生所述 者。除隨機及/或精確誘變方法外，採用標靶胺基酸殘基 之定向誘變，其中結構資訊確定特定胺基酸殘基對人類血 清白蛋白之結合為關鍵的。
使包含如上所述工程化之移植dAb7hl4 CDR序列的纖連 蛋白多肽經受平行及/或重複選擇法以鑑別彼等針對人類 血清白蛋白結合優化之纖連蛋白多肽。例如，產生 dAb7hl4 CDR-移植之纖連蛋白多肽序列之資料庫後，將 該等多肽之此資料庫呈現在制體上且如下文關於自_ 資料庫選擇血清白蛋白結合dAb所述，使其經受多輪需要 血清白蛋白結合及/或增殖之選擇。視情況，針對固定在 抗原管上之血清白蛋白或針對溶液中之生物素化血清白蛋 白執行選擇。視情況，使用表面電漿共振及 版〇难__等人，1991)，使用⑽系統（Uppsala，
Sw蝴定結合親和力，#中完全優化之纖連蛋白衍生 之多肽理想地獲得在nM範圍或更佳之人類血清白蛋白結 合親和力Kd值。鑑別結合人類血清白蛋白之纖連蛋白衍： 之夕肽後’接者糟由下文所述之任—方法使用該等多狀產 生雙特異性配位體組合物。 實例27:經由選擇灰清白蛋白結合部分產生包含血清白蛋 白結合纖連蛋白非免疫球蛋白支架之雙特異性配位體 129025.doc -315 - 200848427 使原生纖連蛋白蛋白質（尤其纖連蛋白之i〇Fn3多肽）經受 資料庫選擇及視情況親和力成熟技術以產生適用於本發5 之雙特異性配位體的人類血清白蛋白結合纖連蛋白非免疫 球蛋白支架分子。 執行Biacore實時結合分析以評估人類血清白蛋白是否特 異性結合固定原生纖連蛋白及/或纖連蛋白衍生之多狀。 偵測到纖連蛋白多狀對人類血清白蛋白無結合親和力或有 低結合親和力（例如Kd值在μΜ範圍或以上）後，採用許多 策略中之至少一種將人類血清白蛋白結合特性賦予纖連蛋 白多肽，該等策略包括以下促進結合親和力之方法中的一 或多種。 如下所述及/或如在此項技術中另外已知，經由誘變 法，視情況組合平行及/或重複選擇法獲得且優化纖連蛋 白支架多肽之人類幻青白蛋白結合。使1〇Fn3支架多狀域 經受如下所述執行之隨機化及/或NNK誘變。對整個1〇〜3 多肽執行該誘變’或對，n3多肽内之特定序列，包括胺 基酸1-9、44-50 '61_54、82,摺疊片之邊緣）；19、 21、.30-46(偶數）、79_65(奇數）（兩個β指疊片之溶劑可及 面）’ 21 31、51-56、76-88(CDR樣溶劑可及環）；及 14_16 及36-45(其他溶劑可及環及β轉角）執行該誘變，且視情況 將該誘變隨機化以發展新或改良之人類▲清白蛋白結合多 肽0視情況使用PCR執扞兮笙兮綠+丄 夕" 執仃"亥4誘變方法，使得在纖連蛋白 二皮算之所靶向序列上產生序列多樣性。(該等方法類似 於彼專下文關於dAb資料庫產生所述者）。除隨機誘變方法 129025.doc -316- 200848427 外’採用所革巴向胺基酸殘基之定向誘變，其中結構資訊確 疋纖連蛋白多肽的特定胺基酸殘基對人類血清白蛋白之結 合為關鍵的。 使如上所述工程化之纖連蛋白多肽經受平行及/或重複 選擇法以鑑別彼等針對人類血清白蛋白結合優化之纖連蛋 白多狀。例如，產生經誘變之纖連蛋白多肽序列之資料庫 後’將多肽之該資料庫呈現在噬菌體上且如下文關於自 dAb貧料庫選擇血清白蛋白結合dAb所述，使其經受多輪 需要血清白蛋白結合及/或增殖之選擇。視情況，針對固 疋在抗原官上之血清白蛋白或針對溶液中之生物素化血清 白蛋白執行選擇。視情況，使用表面電漿共振（SPR)及 BiaC0re(KadSS0n等人，1991)，使用 Biac〇r0 統（Uppsala，
Sweden)測定結合親和力，其中完全優化之纖連蛋白衍生 之多肽理想地獲得在nM範圍或更佳之人類血清白蛋白結 合親和力Kd值。 鑑別結合人類血清白蛋白之纖連蛋白多肽後，接著藉由 下文所述之任一方法使用該等多肽產生雙特異性配位體組 合物。 纖連蛋白非免疫球蛋白支架 在本發明之某些實施例中，將包含纖連蛋白或其功能部 分及/或片段之非免疫球蛋白支架工程化以結合血清白蛋 白。使用衍生自纖連蛋白ΠΙ型組件（Fn3)之非免疫球蛋白 支架結構。纖連蛋白III型組件為在哺乳動物血液及結構性 蛋白中見到之常見域，其在蛋白序列數據庫中出現400次 129025.doc -317- 200848427 以上，且據估計在迄今為止定序之所有蛋白序列的2%中 出現。包括Fn3組件序列之蛋白質包括纖連蛋白、腱生蛋 白、細胞内細胞骨架蛋白及原核酶（Bork及Doolittle，Proe. 心，·. USA 89:8990，1992 ; Bork等人，7W/⑶re 1 5:553，1997 ; Meinke等人，175: 1910，1993 ; Watanabe等人，J. 5,o/. C/2㈣.265:15659, 1990)。纖連蛋白之特定非免疫球蛋白支架為人類Fn3之第 十組件（1GFn3)，其包含94個胺基酸殘基。該域之總摺疊與 包含駱駝及美洲駝IgG中之整個抗原識別單元的最小功能 性抗體片段、重鏈可變區之總摺疊緊密相關。駱駝及美洲 駝域與1GFn3域之間的主要差異為：（i)i〇Fn3具有較少p鏈（7 對9) ’及（Π)在駱騎及美洲駿域而非在i〇Fn3中藉由二硫化 物橋連接兩個相對於彼此堆積之β摺疊片。 三個對應於IgG重鏈之抗原結合環的iGFn3之環介於胺基 酸殘基21_31(BC)、51-56(DE)及76-88(FG)之間蔓延（參看 美國專利第7,1 1 5,396號之圖3，其全部内容以引用的方式 併入本文中）。長度分別為U個及6個殘基之bc及DE環屬 於在抗體重鏈中所見之窄範圍的相應抗原識別環，亦即分 別7-10及4-8個殘基。因此，可易於使用CDR移植策略將重 鏈CDR序列引入該等域中。另外及/或其他，可藉由任何 此項技術中認可之方法（例如定點、精確或其他誘變方 法、隨機化等）使該等兩個環經受遺傳變異引入，且可視 情況使所得多肽經受針對高抗原親和力之選擇。（或者， 可使用遺傳變異引入及/或選擇程序來鑑別具有降低之結 129025.doc -318- 200848427 合親和力及/或諸如穩定性、毒性等之優化特性之組合 物）。經由使用該等方法，可將纖連蛋白之3〇及£^環工程 化以產生等效於抗體中相應CDR1及(：；1：)112域之接點的抗原 接點。 不同於BC及DE環，i〇Fn3iFG環長度為12個殘基，而抗 體重鏈之相應環長度在4_28個殘基範圍内。因此，為優化 抗原結合，可使10Fn3之FG環長度可變（例如經由使用隨機 化及/或使用多肽連接子序列（其亦可經隨機化））以及序列 可變以涵蓋4-28個殘基之CDR3長度範圍以在抗原結合中 獲得儘可能最大之可撓性及親和力。實際上，對於將CDR 直接移植入纖連蛋白支架與選擇原生纖連蛋白支架及/或 將其針對結合血清白蛋白（或其他標靶抗原）優化之方法而 言，在活體外或活體内親和力成熟（如下文更詳細描述）期 間可將抗體擬似物之CDR樣環之長度以及序列隨機化。 即使在低溫下第十人類纖連蛋白III型域10Fn3亦迅速摺 疊；已在5°C下在1秒内重獲其骨架構形。1GFn3之熱力學穩 定性高（AGU=24千焦/莫耳=5·7千卡/莫耳），這與其ii(TC之 高熔融溫度有關。 1GFn3之生理學作用之一為作為纖連蛋白之亞單元：在 體液中呈可溶形式及在細胞外基質（Dickinson等人，J. Mol· Biol. 236··1079，1994)中呈不可溶形式存在之醣蛋 白。220-250 Kd之纖連蛋白單體含有12個I型組件、2個II 型組件及17個纖連蛋白III型組件（Potts及Campbell，Ct/rr.
Cd/价〇/. 6:648，1994)。不同III型組件牵涉於纖連 蛋白與整合素、肝素及硫酸軟骨素之結合中。發現〗GFn3 129025.doc -319- 200848427 經由其暴露環之一者上的整合素結合Arg-Gly-Asp(RGD)基 元介導細胞黏附。已展示相似RGD基元牵涉於諸如血纖蛋 白原、von Wellebrand因子及玻連蛋白之其他蛋白質之整 合素結合中（Hynes等人，Cell 69:11，1992)。尚未描述 1GFn3之其他基質或細胞結合作用。
1 GFn3僅具有稍微高於含有RGD之短肽之黏附活性的觀 測結果與以下結論一致：1GFn3之細胞結合活性定位在 RGD肽中而非分布在整個i〇Fn3結構中（Bar〇n等人， 价㈣Mr；； 3 1:2068，1992)。無RGD基元之10Fn3不可能 結合其他血漿蛋白或細胞外基質使l〇Fn3成為置換抗體之 適用支架。另外，血流中之天然血纖蛋白原中1()Fn3之存 在指示】GFn3本身不可能在來源生物體中具有免疫原性。 另外，展示1GFn3框架具有耐受隨機化之暴露之環序 列，促進產生不同池之抗體擬似物。藉由檢查10Fn3序列 之可撓性進行此敎m，比對人類】。Fn3序列與來 自其他來源之纖連蛋白之序列以及相關蛋白質之序列，且 將省比對之結果定位於人類、心域之立體結構上。該比 =示在β摺疊片夹層之核心中見到大多數保守殘基，而 ^殘基沿β摺疊片之邊緣（包括Ν及C末端）定位於兩個β摺 邊片之溶劑可及面上， ..,且疋位於充當用於抗體擬似物之親 處m 、之二個〉谷劑可及環上。鐾於該等結果， 隹疋3等二個環少P左 摺疊或穩有2 可能對1GFn3框架本身之總體 '注具有不利影響。 對於人類l〇Fn3序 J该刀析指示至少胺基酸1-9、44- 129025.doc -320· 200848427 數）、79-65(Γ數94_“ 之邊緣）；19、21、3〇-46(偶 65(可數)(_β擅疊片之溶劑可及面m 、'容心、76^8伽樣溶劑可及環），·及14·16及36-45(其他 結合蛋白…… &化以毛展新或改良之化合物 長声 °以上所討論，-或多個溶劑暴露環之 長X改文亦可包括於該定向發展方法中。 :::亦可使用嶋片序列之改變發展新蛋白質。該 用改變支架且藉此間接改變環結構。若採用此方 則：變不應使序列飽和，而是應引入極少突變。較佳 應精由該方法將不超過3_2〇個變化引入_疊片序 等
法 地 列 可藉由包括（例如）藉由Taq聚合酶誘變及Kunkel， 忍―吻27:6〇〇8 (1988))、片段重組或其組合之任何 技術引入序列變異。相似地，例如藉由改變CDR提供及/ 或CDR樣環之長度以及序列，或藉由基於所選池中所見之 有利框架結構重新設計而使資料庫之結構多樣性增加，其 可用於引入非免疫球蛋白支架之進一步改良。 包含織連蛋白支架多肽之融合蛋白質 可將本文所述之纖連蛋白支架多肽與其他蛋白質域融 a例如，可將經鑑別結合人類血清白蛋白之纖連蛋白支 架多肽與重鏈單一可變域或其抗原結合片段融合以產生本 發明之包含基於纖連蛋白之金清白蛋白結合部分的雙特異 性配位體。另外可較佳經由i〇Fn3iC末端藉由將Ig(}之恆 疋區（Fc)與諸如10Fn3組件之纖連蛋白支架多肽融合，整合 129025.doc -321 - 200848427 纖連蛋白支架多肽與人類免疫反應e fFn3_F^合分子 中之Fc活化免疫反應之補體組份，且可用以增加^刀 連蛋白多肽之治療價值。相似地，諸如1〇Fn3之纖連蛋白 支架多肽與諸如Clq之補體蛋白之間的融合可用以靶向細 胞，且諸如之纖連蛋白支架多肽與毒素之間的融: 可尤其用以破壞攜帶特定抗原之細胞。可藉由標準: 例如藉由自使用公開可得之基因序列及/或如下文另外所 f 述構築之重組融合基因表現融合蛋白質產生任何該等融合 物0 支架多聚體 除單體外’可產生王支架之二聚體或多聚體形式的本文 所述之纖連蛋白支架構築體之任一者，作為增加價態且因 此增加抗原（例如血清白蛋白）結合親和性之方式。可經由 共價鍵結產生該等多聚體。例如’可藉由模擬天然㈣· 制-胸3 MN末端結合或藉由模擬經由怪定區結合在 一起之抗體二聚體結合個別10Fn3組件。可利用丨〇Fn3_Fc 構築體開發购3-Fc::Fc_10Fn3之通用方案的二聚體。經 工程化至FC::FC界面中之鍵可為共價鍵或非共價鍵。另 外’使除Fc以外的諸如其他非免疫球蛋白支架部分及/或 基於免疫球蛋白之抗原結合部分之搭配物：聚或多聚可用 於雜交，諸如胸雜交’以產生該等較高級結構。多聚 體之其他實例包括本文所述之單一可變域。 在特定實例中’可藉由構築編碼多聚體之融合基因，或 者藉由使钱胺酸殘基之密碼子工程化為單體序列且允許 129025.doc -322- 200848427 二&化物鍵在表現產物之間形 成，產生共價鍵結之多聚 體。亦可藉由多種技術產生非妓 ^ ^ “鍵結之多聚體。該等技 術包括將對應於帶正電荷及/或 σσ Φ貝也何之殘基之密碼子 引入單體序列且允許表現產物中 < δ亥等殘基之間（且因此 單體之間）發生相互作用。可蕤 沖— j猎由利用天然存在於單體亞 單元中之帶電殘基，例如纖連蛋白 巧貪臼之▼負電荷殘基簡化此
質或蛋白質域包括捲曲螺旋基元、白胺酸拉鏈基元及已知 指引形成二聚體或更高級多聚體之許多蛋白質亞單元（或 其片段）中之任一者。 方法。產生包含纖連蛋白支架多肽之非共價鍵結之組合物 的另-方式係將已知相互作用之蛋白質或蛋白質域之編碼 序列引入單體基因（例如在胺基或祕末端）中。該等蛋白 纖連蛋白樣分子 儘管1GFn3表示用於產生抗體擬似物之較佳支架，但在 本文所述之分子中可以其他分子取代。該等分子包 括（但不限於）人類纖連蛋白組件iFn3JFn3及七^力心以 及來自非人類動物及原核生物之相關Fn3組件。另外，亦 可使用與10Fn3具有序列同源性之來自其他蛋白質之pn3組 件，諸如腱生蛋白及粗纖維調節素。具有免疫球蛋白樣摺 疊（但具有與VH域無關之序列）之其他例示性支架包括N_辦 黏蛋白、ICAM-2、肌聯蛋白、GCSF受體、細胞激素受 體、糖苷酶抑制劑、E-鈣黏蛋白及抗生素色蛋白。其他具 有相關結構之域可衍生自髓鞘膜黏附分子P〇、CD8、 CD4、CD2、I類 MHC、T細胞抗原受體、CD1、VCAM_1 之 129025.doc - 323 - 200848427 C2及I組域、肌凝蛋白-結合蛋白C之I組免疫球蛋白域、肌 凝蛋白-結合蛋白Η之I組免疫球蛋白域、帖洛金（tei〇kin)之 / I組免疫球蛋白域、帖力金（telikin)、NCAM、推琴 (twitchin)、神經膠質蛋白、生長激素受體、紅血球生成素 受體、促乳素受體、GC-SF受體、干擾素-γ受體、β_半乳 糖苷酶/葡糖醛酸酶、β-葡糖醛酸酶及轉麩胺醯胺酶。或 者，可使用包括一或多個免疫球蛋白樣摺疊之任何其他蛋 白質。可例如使用程式SC0P鑑別該等蛋白質（Murzin等 人，乂 Mo/·仏〇/· 247:536 (1995) ; Lo Conte等人，#此/… 及以· 25:257 (2000)) 〇 通常，可使用任何顯示與Vh域具有結構相關性（如例如 使用上文之SCOP電腦程式所鑑別）的分子作為非免疫球蛋 白支=。該等分子如纖連蛋白可包括在分子之财端桿的 三個環及在C末端桿的三個環，其每一者可經隨機化以產 生不同資料庫；或者可使用具有較大數目之環的較大域， :限制條件為+多該等表面可隨機化環在空間上充分緊密 女：以致其可芩與抗原結合。具有三個以上彼此緊密安置 ::::肽之實例包括τ細胞抗原受體及超氧化歧化酶， 及么於、* :個可經隨機化之環；及Fn3二聚體、組織因子域 及細胞激素受體域，A夂 一 三個可隨機化環為，：具有三組兩個相似域，其中 在另-替二=域之部分(使環的總數為6個)。 變環之任何蛋白質用1Γ有在空間上充分緊密安置之可 贫曰貝用於候選結合I白晳 在結構上與免疫球蛋 ”，即使 X伯$無關，亦可使用具有空間相 129025.doc -324 - 200848427 關溶劑可及環之大蛋白質。例示性蛋白質包括（不限於）細 胞色素F、、綠色螢光蛋白質、GroEL及祝馬丁（thaumatin)、。 可將該等蛋白質呈現之環隨機化，且自如本文（例如實 所述之隨機化資料庫選擇優良結合物。由於尺寸，可獲得 顯示抗原結合表面比抗體-抗原相互作用中所見者顯著大 之分子。亦可使用程式sc〇p(Murzin等人，乂 247: 536 (1995))鑑別該類型之其他適用支架以瀏覽具有許 多環、尤其安置在平行β摺疊片或許多心螺旋中之環的候 選蛋白質。 ' 來自不同生物體之組件及親本蛋白質可最適合於不同應 用。例如，在設計本發明之纖連蛋白支架多肽中，可能最 希望自預定使用治療劑之生物體原生的纖連蛋白或纖連蛋 白樣分子產生彼蛋白質。與此㈣，生物體來源係次要的 或甚至與待用於諸如診斷之待活體外應m作研究試劑 之纖連蛋白支架不相關。 對於任何該等分子，可產生資料庫且心藉由本文所述 之任一方法選擇結合蛋白質。 基於支架之結合蛋白質之定向發展 可將本文所述之非免疫球蛋白支㈣於用以發展新或改 良之結合蛋白質的任何技術。在—特定實例中，將結合之 標乾(例如血清白蛋白)固定於諸如管柱樹脂或微量滴定盤 孔之固相支撐物上，且使標乾與候選非免疫球蛋白基於支 :之結合蛋白之資料庫接觸。該資料庫可由諸如經由 w樣環之序列及/或長度之隨機化自原生(野生 129025.doc -325 - 200848427 型）Fn3支架構築之Fn3純系的纖連蛋白支架純系組成。 右舄要’ 5亥賀料庫可為例如藉由Szostak等人，美國第 09/007,005 號及第 09/247，190 號；Szostak 等人，w〇 98/31700 ;及 Roberts & Szostak，proc. Natl. Acad· Sci. US A( 1997)第94卷，第12297-123 02頁中描述之技術產生之 RNA-蛋白質融合資料庫。或者，其可為DNA_蛋白質資料 庫（例如，如 Lohse，DNA-Protein Fusi〇ns an(i uses Thereof、美國第 60/11 〇,549號、美國第 〇9/459，19〇號及 w〇 00/32823中所述）。以固定標靶培育融合資料庫，洗滌支撐 物以移除非特異性結合物，且將最緊密結合物在極嚴格條 件下溶離且使其經受P C R以重獲序列資訊或產生可用以在 有或無序列之其他誘變之情況下重複選擇過程之結合物之 新資料庫。可執行多輪選擇直至獲得對抗原（例如企清白 蛋白）具有足夠親和力之結合物。 在一特定實例中，可使用10Fn3支架作為選擇標靶。例 如’若需要結合存在於10個殘基環中之特異性肽序列（例 如血清白蛋白）之蛋白質，則構築單一 i〇Fn3純系，其中其 一個環經設定長度為10個且設定為所需序列。將新純系活 體内表現且純化，且隨後固定於固相支撐物上。接著使基 於適當支架之RNA-蛋白質融合資料庫與支撐物相互作 用，接著洗滌支撐物，且如上所述將所需分子溶離且再選 擇。 相似地，可使用本文所述之例如l〇Fn3支架之支架得到 與藉由例如在，η3環中的支架呈現之肽序列相互作用之 129025.doc -326- 200848427 天然蛋白質。如上所述固定諸如蛋白質之支架 貝且針對所呈現環的纟士人 < w、、。口物師選RNA-蛋白質融合資料 庫。該等結合物經由多輪選擇富集且藉由DNA定序梦別。 另外’在…法中，儘管RNA-蛋白質資料庫二 向發展之例不性資料庫，但在本發明之選擇方法中可使用 任何類型之基於支架之資料庫。 纖連蛋白支架多肽之用途 本文所述之纖連蛋白支架多肽可經發展以結合血清白蛋 白或任何所關注之抗原。該等纖連蛋白支架蛋白質具有優 於天然抗體之熱力學特性且可活體外迅速發展。因此，可 採用該等纖連蛋白支牟容日士方4 贫日叉木夕肽產生用於研究、治療及診斷 域之結合域。 誘變親和力成熟 本文所述之選擇亦可在所有選擇步驟或選擇步驟之子集 後與誘變組合以進一步增加資料庫多樣性。親和力成孰： 法可採用（例如）易錯PCR(Cadwe如。yee，⑽施祕 柳/ 2:28 (1992))或替代形式之隨機誘變、如下所述之 NNK誘變、精破誘變（其中經由使用天然存在之⑽多樣 性將CDR移植之纖連蛋白支架多肽工程化以優化抗原結 合’參看例如卿〇6/G23l44,其以引用的方式併入本文 中）及/或其他此項技術中認可之用以產生多肽多樣性的誘 變方法’將其與一或多輪針對抗原結合親和力之選擇組 合。 可使下文所述之任一支架蛋白質彼此組合以用於(例如) 129025.doc -327- 200848427 本七明之雙特異性配位體組合物中。例如，可將移植 = CTLA-4支架上且連同抗體vH或vL域一起使用以形成多 仏配位體。同樣，可組合纖連蛋白、脂質運載蛋白、親和 體及其他支架。 本說明書中所提及之所有公開案及該等公開案中引用之 多考文獻係以引用的方式併人本文巾。熟習此項技術者應 顯而易見不悖離本發明之範疇及精神之本發明所述方法及 系、、先之各種修改及變更的。儘管已關於特定較佳實施例描 述本發明，但應瞭解如所主張之本發明不應過度侷限於該 等特定實施例。實際上，希望對於熟習分子生物學或相關 領域者顯而易見的用以實施本發明之所述模式的各種改進 在以下申請專利範圍之範疇内。 【圖式簡單說明】 圖1展示Vh/HSA在處於VH HSA之抗原結合部位的位置 H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H96、 H97、H98(分別經DVT或NNK編碼）之多樣化。νκ之序列在 位置L50、L53多樣化。 圖2展示以噬菌體呈現/ScFv形式的： 資料庫1 :生殖細胞系VK/DVT VH ; 資料庫2 ··生殖細胞系VK/NNK VH ; 資料庫3 :生殖細胞系VH/DVT VK ; 資料庫4 :生殖細胞系VH/NNK VK。 該等資料庫經針對與通用配位體蛋白質A及蛋白質L結 合來預先選擇，以便大多數純系及所選擇庫具有功能性。 129025.doc -328 - 200848427 對HSA(第一輪）及β-gal(第二輪）或HSA β-gal選擇或對β-gal(第一輪）及HSA(第二輪）β-gal HSA選擇來選擇資料庫。 在序列中擴增來自此等PCR純系之可溶性scFv。選擇一個 編碼雙特異性抗體K8之純系用於進一步工作。 圖3展示VH鏈與VK鏈之比對。 圖4展示K8抗體之結合特性、以單株噬菌體ELISA表徵 之K8抗體之結合特性的表徵，發現雙特異性K8抗體結合 HSA及β-gal，且以大於1.0之吸收信號呈現在噬菌體之表 面上。未偵測到與其他蛋白質之交叉反應性。 圖5展示使用已知濃度之K8抗體片段執行之可溶性scFv ELISA。以 10 pg/ml 濃度之 100 pg 之 HSA、BSA 及 β-gal 及 1 pg/ml濃度之100 pg/ml之蛋白質A塗佈96孔平板。塗覆50 pg K8 scFv之連續稀釋液且以蛋白質L-HRP偵測結合抗體 片段。ELISA結果證實K8抗體之雙特異性性質。 圖6展示使用可溶性scFv ELISA分析的純系K8VK/虛設 Vh之結合特徵。如 Harrison等人，Methods Enzymol. 1996; 267:83-109所述藉由1卩丁〇誘導產生可溶性3〇?丫片段，且直 接檢定含有scFv之上清液。如實例1中所述執行可溶性 scFv ELISA且以蛋白質L-HRP偵測結合scFv。ELISA結果 顯示此純系仍能夠結合β-gal，而結合BSA受到破壞。 圖7展示可變域載體1及2之序列。 圖8為用以構築VH1/VH2多特異性配位體之CH載體的 圖。 圖9為用以構築VK1/VK2多特異性配位體之VK載體之圖。 129025.doc - 329- 200848427 圖10比較丁八111-5二聚體4、丁八111-5-19二聚體4及丁八111-5-19單體之TNF受體檢定。 圖11比較TAR1-5二聚體1-6之TNF受體檢定。所有二聚 體均已經FPLC純化且展示最佳二聚物質之結果。 圖12以下不同形式之TAR1-5 19均二聚體之TNF受體檢 定：具有3U、5U或7U連接子之dAb-連接子-dAb形式、Fab 形式及半胱胺酸鉸鏈連接子形式。 圖13資料庫1之虛設VH序列。VH框架之序列基於生殖細 胞系序列DP47-JH4b。以粗體加下劃線文字指示NNK隨機 化（N=A或T或C或G核苷酸；K=G或T核苷酸）併入資料庫1 之位置。 圖14貧料庫2之虛設V η序列。V η框架之序列基於生殖細 胞系序列DP47-JH4b。以粗體加下劃線文字指示ΝΝΚ隨機 化（N=A或T或C或G核苷酸；K=G或T核苷酸）併入資料庫2 之位置。 圖1 5資料庫3之虛設VK序列。VK框架之序列基於生殖細 胞系序列DPK9-JK1。以粗體加下劃線文字指示NNK隨機化 (N=A或T或C或G核苷酸；K=G或T核苷酸）併入資料庫3之 位置。 圖16抗MSA dAbs MSA 16及MSA 26之核苷酸及胺基酸 序列。 圖1 7 MS A 1 6及26之抑制Biacore。藉由抑制Biacore分析 純化的dAbs MSA16及MSA26以測定Kd。簡言之，測試 dAb以確定在經高密度MS A塗佈之Biacore CM5晶片上實現 129025.doc -330- 200848427 200 RU反應所需的dAb之濃度。已確定所需dAb濃度後， 將預期Kd左右之濃度範圍的MSA抗原與dAb預混合且培育 隔夜。接著以30微升/分鐘之高流動速率量測各預混合物 中dAb與經MSA塗佈的Biacore晶片之結合。 圖18注射後MS A16之血清含量。在小鼠中測定dAb MSA16之血清半衰期。以單一靜脈内注射形式以約1·5 mg/kg將MSA16給與CD1小鼠。以2隔室型之模型展示 MSA16具有0.98小時之tl/2a、36.5小時之ΐ1/2β及913 hr.mg/ml之AUC。與具有0.06小時之tl/2a及0.34小時之 tl/2p之HEL4(抗雞卵白溶菌酶dAb)相比，MSA16具有顯著 延長之半衰期。 圖19展示TNF結合經包含MSA26Ck及TAR1-5-19CH之 Fab樣片段抑制的ELISA(a)及TNF受體檢定（c)。添加具有 Fab樣片段之MSA降低抑制程度。以雙特異性VK CH及VK CK Fab樣片段以及在經計算以在ELISA中產生相似信號的 濃度結合dAb之對照TNFa探測經1 pg/ml TNFa塗佈之 ELISA平板。在存在及不存在2 mg/ml MSA之情況下使用 雙特異性與對照dAb探測ELISA平板。雙特異性孔之信號 降低超過50%，而dAb孔之信號根本未降低（參見圖19a)。 相同雙特異性蛋白質亦用於有或無MS A之受體檢定中，且 亦展示MSA競爭（參見圖19c)。此證明MSA與雙特異性之 結合與與TNFa之結合競爭。 圖20展示TNF結合經二硫化物鍵結之TAR1-5-19 dAb與 MSA16 dAb的雜二聚體抑制之TNF受體檢定。添加具有二 129025.doc •331 · 200848427 聚體之MS A以劑量依賴方式降低抑制程度。在存在恆定濃 度之雜二聚體（18 nM)及連續稀釋之MSA及HSA的情況下 進行TNF受體檢定（圖19(b))。某濃度範圍（高達2 mg/ml)之 HSA之存在並未引起二聚體抑制TNFa之能力的降低。然 而，添加MSA導致二聚體抑制TNFa之能力劑量依賴性降 低（圖19a)。此證明MSA與TNFa競爭結合cys鍵結之TAR1-5-19、MSA16二聚體。 圖21人類血清白蛋白（HSA)之純化重組域，色帶1-3分別 含有HSA域I、II及III。 圖22展示HSA結合dAb結合全長HSA(色帶8)及HSA域 Π(色帶6)，但不結合HSA域I及111(分別為色帶5及7)的免疫 沈殿之實例。非HSA結合dAb未沈殿（pull down)全長HSA 或 HSA域 I、II或 III(色帶 1-4)。 圖23如表面電漿共振所鑑別由dAb結合之HSA域的鑑別 實例。如所述將所研究之dAb注射於低密度塗佈之人類血 清白蛋白CM5傳感器晶片（Biacore)上。在點1處，單獨注 射1 μΜ之所研究之dAb。在點2處，使用共同注射指令， 試樣注射轉變成1 μΜ dAb加上7 μΜ在畢赤酵母中 產生之HS Α域1、2或3之混合物。在點3處，終止試樣注射 且使緩衝液持續流動。2種不同dAb之結果展示於23 a)及 23 b)中。當與dAb結合之HSA域一起注射dAb時，其形成 不再能結合晶片上之HS A之複合物，因此Biacore信號在點 2處下降，而解離速率反映dAb、可溶性HSA域與晶片結合 之HSA之間的3向平衡。當域不結合dAb時，信號在點2處 129025.doc - 332 - 200848427 保持不變，且僅在點3處開始降低，其中液流變成緩衝 液。在2種該等情況下，dAb結合HSA域2。 圖24藉由噬菌體選擇鑑別的AlbudAb™(特異性結合血清 白蛋白之dAb)純系之抗體序列。所有純系均已與人類生殖 細胞系基因比對。與生殖細胞系相同之殘基已以V表示。 在VH CDR3中，已使用符號來便於比對，但不表示殘 基。自基於包含VH庫之重鏈生殖細胞系基因V3_23/DP47及 JH4b及VK庫之κ輕鏈基因012/02/DPK9及JK1的單一人類框 架（在抗原結合部位中之位置處併入側鏈多樣性）之庫選擇 所有純系。 圖25人類血清白蛋白之三個域的比對。半胱胺酸殘基之 保守明顯可見。 129025.doc - 333 - 200848427 附錄1 :提高活體内半衰期之多肽 α-1醣蛋白（血清類黏蛋白）（AAG) α-1 抗胰凝乳蛋白（Antichyromotrypsin)(ACT) α-l抗胰蛋白酶（AAT) α-l微球蛋白（蛋白質HC)(AIM) ex-2巨球蛋白（A2M) 抗凝血酶III(AT III) 脂蛋白元A-l(Apo A-1) 脂蛋白元B(Apo B) β·2-微球蛋白（B2M) 血漿銅藍蛋白（Cp) 補體組份（C3) 補體組份（C4) C1酯酶抑制劑（Cl INH) C反應性蛋白（CRP) 半胱胺酸蛋白酶抑制劑C(Cys C) 鐵蛋白（FER) 血纖維蛋白原（FIB) 纖連蛋白（FN) 觸珠蛋白（Hp) 血色素結合蛋白（HPX) 免疫球蛋白A(IgA) 免疫球蛋白D(IgD) 免疫球蛋白E(IgE) -334 - 129025.doc 200848427 免疫球蛋白G(IgG) 免疫球蛋白M(IgM) 免疫球蛋白輕鏈（κ/λ) 脂蛋白（a)[Lp(a)] 甘露糖結合蛋白質（MBP) 肌血球素（Myo) 纖維溶酶原（PSM) 前白蛋白（運甲狀腺素蛋白）(PAL) 視黃醇結合蛋白（RBP) 類風濕因子（RF) 血清類澱粉A(SAA) 可溶性運鐵蛋白受體（sTfR) 運鐵蛋白（Tf) 335 - 129025.doc 200848427 附錄2 配對 治療相關參考文獻 TNF (ALPHA/TGF-β •當將TGF-b及TNF注射入膠原蛋白誘導之關節炎模型之 踝關節時TGF-b及TNF顯著提高增強關節發炎。在非'膠々 蛋白激發小鼠中無效應。 … TNFa/IL-1 • TNF與IL-1在葡萄膜炎之病理中協同作用。~ • TNF與IL-1在瘧疾(低血糖，NO)之病理中協同作用。 • TNF與IL-1在發炎中在誘導多形核(PMN)細胞遷移中協 同作用。 • IL-1與TNF協同作用以誘導PMN浸潤入腹膜。 • IL-1與TNF協同作用以誘導IL-1經内皮細胞之分泌。在 發炎中重要。 • IL-1或TNF單獨誘導某些細胞浸潤入膝滑膜中。几_1誘 導PMN、TNF單核細胞。歸因於增加之PMN，其一起誘 導更嚴重的浸潤。 •循環心肌抑制物質(存在於膿毒病中)為低含量之協同作 用之IL_1&TNF。 TNFa/IL-2 •與殺傷T細胞之協同活化最相關。 TNFoc/IL-3 •介白素3與腫瘤壞死因子a在刺激急性骨髓性白血病母 細胞之無性生長中之協同作用為藉由腫瘤壞死因子a誘導 次級造金細胞激素之結果。 • CancerRes· 1992年4 月 15 曰；52(8):2197-2(U。 TNFa/IL-4 • IL-4與TNF協同作用以誘導VCAM在内皮細胞上表現。 暗指在哮喘中發揮作用。對於滑膜同理-牽涉於RA中。 • TNF與IL-4協同作用以誘導IL-6在角質細胞中表現。 • Sustained elevated levels of VC AM -1 in cultured fibroblast-like synoviocytes can be achieved by TNF-alpha in combination with either IL-4 or IL-13 through increased mRNA stability· dm 1999年4月；154(4):1149-58。 TNFa/IL-5 • Relationship between the tumor necrosis factor system and the serum interleukin-4， interleukin-5， interleukin-8， eosinophil cationic protein, and immunoglobulin E levels in the bronchial hyperreactivity of adults and their children. 2003 年3 月-4 月；24(2):111-8 o 129025.doc •336 - 200848427 TNFa/IL-6 • TNF and IL-6 are potent growth factors for OH-2, a novel human myeloma cell line. Eur J Haematol 1994年7 月； 53(1):31-7 〇 TNFa/IL-8 • TNF及IL-8與PMN協同作用以活化血小板。牽涉於急 性呼吸窘迫綜合症中。 •參見IL-5/TNF(哮喘）。Synergism between interleukin-8 and tumor necrosis factor-alpha for neutrophil-mediated platelet activation. 1994 卓9 月-10 月； 5(5):455-60。（成人呼吸窘迫症候群(ARDS)) TNFa/IL-9 TNFa/IL-10 • IL-10誘導且在誘導HIV在慢性感染T細胞中表現中與 TNF協同作用。 TNFa/IL-11 • Cytokines synergistically induce osteoclast differentiation: support by immortalized or normal calvarial cells. Am J 户2002年9月；283(3):C679-87。（骨質流 失） TNFa/IL-12 TNFa/IL-13 • Sustained elevated levels of VCAM-1 in cultured fibroblast-like synoviocytes can be achieved by TNF-alpha in combination with either IL-4 or IL-13 through increased mRNAstability.AmJPathol. 1999年4月；154(4):1149-58。 • Interleukin-13 and tumour necrosis factor-alpha synergistically induce eotaxin production in human nasal fibroblasts· Clin Exp Allergy· 2000年3 月；30(3):348-55。 • Interleukin-13 and tumour necrosis factor-alpha synergistically induce eotaxin production in human nasal fibroblasts. C/k五2000年3月；30(3):348-55。（過 敏性發炎） • Implications of serum TNF-beta and IL-13 in the treatment response of childhood nephrotic syndrome. Cytokine. 2003^» 2月 7 日；21(3):155-9。 TNFa/IL-14 • Effects of inhaled tumour necrosis factor alpha in subjects with mild asthma· 77zorax. 2002年9月；57(9):774-8。 TNFa/IL-15 • Effects of inhaled tumour necrosis factor alpha in subjects with mild asthma. 772<9rax:. 2002年9 月；57(9):774-8 o 129025.doc - 337- 200848427 TNFa/IL-16 • Tumor necrosis factor-alpha-induced synthesis of interleukin-16 in airway epithelial cells: priming for serotonin stimulation, dm 7?烈O// Mo/ 2003 年 3 月； 28(3):354-62。（氣管發炎） • Correlation of circulating interleukin 16 with proinflammatory cytokines in patients with rheumatoid arthritis·及/2⑼matofogy (Oxford). 2001 年4 月；40(4):474-5。（無摘要） • Interleukin 16 is up-regulated in Crohn’s disease and participates in TNBS colitis in mice. Gastroenterology, 2000 年10月；119(4):972-82。 TNFa/IL-17 • Inhibition of interleukin-17 prevents the development of arthritis in vaccinated mice challenged with Borrelia burgdorferi·2003 年6 月；71(6):3437-42 o • Interleukin 17 synergises with tumour necrosis factor alpha to induce cartilage destruction in vitro. Ann Rheum Dis. 2002 年 10 月；61(10):870-6。 • A role of GM-CSF in the accumulation of neutrophils in the airways caused by IL-17 and TNF-alpha. Eur Respir J. 2003年3月；21(3)387-93。（氣管發炎） •摘要 Interleukin_l，tumor necrosis factor alpha, and interleukin-17 synergistically up-regulate nitric oxide and prostaglandin E2 production in explants of human osteoarthritic knee menisci· dr伙r/to 2〇01 年9 月； 44(9):2078-83。 TNFa/IL-18 • Association of interleukin-18 expression with enhanced levels of both interleukin-1 beta and tumor necrosis factor alpha in knee synovial tissue of patients with rheumatoid arthritis, 2003年2月；48(2):339-47 o •摘要Elevated levels of interleukin-18 and tumor necrosis factor-alpha in serum of patients with type 2 diabetes mellitus: relationship with diabetic nephropathy. Metabolism. 2003 年5 月；52(5):605-8。 TNFa/IL-19 •摘要IL-19 induces production of IL-6 and TNF-alpha and results in cell apoptosis through TNF-alpha. J Immunol 2002 年 10月 15 曰；169(8):4288-97。 TNFa/IL-20 •摘要Cytokines: IL-20-a new effector in skin inflammation· CurrBiol 2001^-7^ l〇a ； ll(13):R531-4 〇 129025.doc -338- 200848427
TNFoc/補體 • Inflammation and coagulation: implications for the septic patient. Clin Infect Dis, 2003^5^15 0 ； 36(10)-1259-65. 電子出版2003年5月08日。綜述。 TNFa/IFN-γ •大腦中之MHC誘導。 •在抗病毒反應zlFN-β誘導中協同作用。 •嗜中性白血球活化/呼吸爆發。 •内皮細胞活化。 •當以TNF/IFN-γ作為抗病毒療法治療患者時注意到毒 性。 •藉由人類星形細胞神經趨化引子表現。 •許多關於發炎性反應-亦即LPS，亦關於巨噬細胞活化 之論文。 •抗TNF與抗IFN-γ協同作用以保護小鼠不受致命内毒素 血症影響。 TGF-p/IL-l •成骨細胞合成前列腺素 •腸道上皮細胞產生IL-6(發炎模型） •刺激在肺纖維母細胞中的IL-11及IL-16(發炎模型） •在視網膜中IL-6及IL-8產生 TGF-p/IL-6 •軟骨肉瘤增殖 IL-l/IL-2 •B細胞活化 • LAK細胞活化 • T細胞活化 • IL-1 synergy with IL-2 in the generation of lymphokine activated killer cells is mediated by TNF-alpha and beta (lymphotoxin)· Cy〇A:z·脱 1992年n 月；4(6):479-87 0 IL-l/IL-3 IL-l/IL-4 • B細胞活化 • IL-4在内皮細胞活化中誘導il-1表現。 129025.doc -339- 200848427 IL-l/IL-5 IL-l/IL-6 •B細胞活化 • T細胞活化(可置換輔佐細胞） • IL-1誘導IL-6表現 • C3及血清類澱粉表現(急性期反應） • HIV表現 •軟骨膠原蛋白損壞。 IL-l/IL-7 • IL-7 is requisite for IL-1-induced thymocyte proliferation. Involvement of IL-7 in the synergistic effects of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or tumor necrosis factor with IL-1. «7/mmwm?/· 1992年1月 1 曰；148(1):99-105。 IL-l/IL-8 IL-l/IL-10 IL-l/IL-11 • Cytokines synergistically induce osteoclast differentiation: support by immortalized or normal calvarial cells. Am J P/^zWCW/P/^io/· 2002年9月；283(3):C679-87。（骨質流 失） IL-l/IL-16 • Correlation of circulating interleukin 16 with proinflammatory cytokines in patients with rheumatoid arthritis· (Oxford). 2001 年4 月；40(4):474- 5。無摘要。 IL-l/IL-17 • Inhibition of interleukin-17 prevents the development of arthritis in vaccinated mice challenged with Borrelia burgdorferi·2003年6月；71(6):3437-42 o • Contribution of interleukin 17 to human cartilage degradation and synovial inflammation in osteoarthritis. 2002年 10月；10(10):799-807 o •摘要 Interleukin-1，tumor necrosis factor alpha, and interleukin-17 synergistically up-regulate nitric oxide and prostaglandin E2 production in explants of human osteoarthritic knee menisci· 2001 年9 月； 44(9):2078-83。 IL-l/IL-18 • Association of interleukin-18 expression with enhanced levels of both interleukin-1 beta and tumor necrosis factor alpha in knee synovial tissue of patients with rheumatoid arthritis· 2003年2月；48(2):339-47 o 129025.doc -340- 200848427 IL-l/IFN-g IL-2/IL-3 • T細胞增殖 • Β細胞增殖 IL-2/IL-4 •Β細胞增殖 • Τ細胞增殖 •(選擇性誘導CD8及ΝΚ淋巴細胞活化)IL-2R beta agonist P1-30 acts in synergy with IL-2，IL-4，IL-9，and IL-15: biological and molecular effects, //mmimo/. 2000年10月 15 曰；165(8):4312-8。 IL-2/IL-5 • B細胞增殖/1 g分泌 • IL-5誘導B細胞上之IL-2受體 IL-2/IL-6 •細胞毒性T細胞之發育 IL-2/IL-7 IL-2/IL-9 •參見IL-2/IL-4(NK細胞） IL-2/IL-10 •B細胞活化 IL-2/IL-12 • IL-12 synergizes with IL-2 to induce lymphokine-activated cytotoxicity and perforin and granzyme gene expression in fresh human NK cells· CW/ /mmww/. 1995 年10 月 1 日； 165(1):33-43。（T細胞活化） IL-2/IL-15 •參見IL-2/IL-4(NK細胞） • (T細胞活化及增殖)IL-15 and IL-2: a matter of life and death for T cells //7 v/va TVai 2001 年1 月；7(1):114-8。 IL-2/IL-16 • Synergistic activation of CD4+T cells by IL-16 and IL-2. J /mmz仍〇/· 1998年3月 1 曰；160(5):2115-20。 IL-2/IL-17 • Evidence for the early involvement of interleukin 17 in human and experimental renal allograft rejection. J Pathol 2002年7 月；197(3)··322-32。 IL-2/IL-18 • Interleukin 18 (IL-18) in synergy with IL-2 induces lethal lung injury in mice: a potential role for cytokines, chemokines, and natural killer cells in the pathogenesis of interstitial pneumonia· 2002年2月 15 日；99(4):1289-98 ° 129025.doc -341 - 200848427 IL-2/TGF-P • Control of CD4 effector fate: transforming growth factor beta 1 and interleukin 2 synergize to prevent apoptosis and promote effector expansion· J Ex/? Med 1995 年9 月 1 曰； 182(3):699-709。 IL-2/IFN-y • B細胞分泌Ig • IL-2誘導T細胞表現IFN-γ IL-2/IFN-a/p •無 IL-3/IL-4 •在肥大細胞生長中協同作用 • Synergistic effects of IL-4 and either GM-CSF or IL-3 on the induction of CD23 expression by human monocytes: regulatory effects of IFN-alpha and IFN-gamma. Cytokine. 1994年7月；6(4):407-13。 IL-3/IL-5 IL-3/IL-6 IL-3/IFN-y • IL-4 and IFN-gamma synergistically increase total polymeric IgA receptor levels in human intestinal epithelial cells· Role of protein tyrosine kinases· //mmwm?/· 1996年6 月 15 曰；156(12):4807-14。 IL-3/GM-CSF • Differential regulation of human eosinophil IL-3? IL-5, and GM-CSF receptor alpha-chain expression by cytokines: IL-3, IL-5，and GM-CSF down-regulate IL-5 receptor alpha expression with loss of IL-5 responsiveness, but up-regulate IL-3 receptor alpha expression. J/mmw/w/· 2003 年6月 1 日； 170(11):5359-66。（過敏性發炎） IL-4/IL-2 • IL-4 synergistically enhances both IL-2- and IL-12-induced IFN-{gamma} expression in murine NK cells. Blood. 2003年3月13日[電子出版先於印刷出版] IL-4/IL-5 •響應IgE增強肥大細胞組織胺等分泌 • A Th2-like cytokine response is involved in bullous pemphigoid, the role of IL-4 and IL-5 in the pathogenesis of the disease· Twi P/zarmaw/· 1999年5 月-8 月；12(2):55-6 卜 IL-4/IL-6 IL-4/IL-10 129025.doc -342- 200848427 IL-4/IL-11 • Synergistic interactions between interleukin-11 and interleukin-4 in support of proliferation of primitive hematopoietic progenitors of mice· 1991 年9 月 15 日； 78(6):1448-51 〇 IL-4/IL-12 • Synergistic effects of IL-4 and IL-18 on IL-12-dependent IFN-gamma production by dendritic cells. JImmunol 2000^ 1月 1 曰；164(1):64-71。（增加Thl/Th2分化） • IL-4 synergistically enhances both IL-2- and IL-12-induced IFN-{gamma} expression in murine NK cells. Blood. 2003年3月13日[電子出版先於印刷出版] IL-4/IL-13 •摘要 Interleukin-4 and interleukin-13 signaling connections maps. Science· 2003 年 6 月 6 日 ； 300(5625):1527-8。（過敏、哮喘） • Inhibition of the IL-4/IL-13 receptor system prevents allergic sensitization without affecting established allergy in a mouse model for allergic asthma. J C7z>? /mmw”。/· 2003年6月；111(6):1361-1369。 IL-4/IL-16 •(哮喘)Interleukin (IL)-4/IL-9 and exogenous IL_ 16 induce IL-16 production by BEAS-2B cells, a bronchial epithelial cell line. ⑽/· 2001 年2月 1 日；207(2)··75-80。 IL-4/IL-17 • Interleukin (IL)-4 and IL-17 synergistically stimulate IL-6 secretion in human colonic myofibroblasts. Int J Mol Med, 2002年11月；10(5):631-4。（胃腸道發炎） IL-4/IL-24 • IL-24 is expressed by rat and human macrophages. 2002年7月；205(3):321-34 o IL-4/IL-25 •摘要New IL-17 family members promote Thl or Th2 responses in the lung: in vivo function of the novel cytokine IL-25· //mmwno/· 2002年7月 1 日；169(1):443-53。（過敏性 發炎） •摘要Mast cells produce interleukin-25 upon Fcepsilon RI-mediated activation. 2003年5月 1日；101(9):3594-6. 電子出版2003年1月2日。（過敏性發炎） IL-4/IFN-y •摘要 Interleukin 4 induces interleukin 6 production by endothelial cells: synergy with interferon-gamma. Eur J /iw⑽/?〇/. 1991 年1 月；21(1):97-101 0 129025.doc -343 - 200848427 IL-4/SCF • Regulation of human intestinal mast cells by stem cell factor and IL-4· i^v· 2001 年2月；179:57-60。綜 述。 IL-5/IL-3 • Differential regulation of human eosinophil IL-3, IL-5, and GM-CSF receptor alpha-chain expression by cytokines: IL-3, IL-5，and GM-CSF down-regulate IL-5 receptor alpha expression with loss of IL-5 responsiveness, but up-regulate IL-3 receptor alpha expression. JTmmw/w/. 2003 年6月 1 日； 170(11):5359-66。（過敏性發炎，參見摘要） IL-5/IL-6 IL-5/IL-13 • Inhibition of allergic airways inflammation and airway hyperresponsiveness in mice by dexamethasone: role of eosinophils, IL-5, eotaxin, and IL-13. JAllergy Clin Immunol 2003 年5 月；111(5):1049-61。 IL-5/IL-17 • Interleukin-17 orchestrates the granulocyte influx into airways after allergen inhalation in a mouse model of allergic asthma· dm CW/ ikfo/ 所(9/. 2003年1 月；28(1):42-50 ° IL-5/IL-25 •摘要New IL-17 family members promote Thl or Th2 responses in the lung: in vivo function of the novel cytokine IL-25. 2002年7月 1 日；169(1):443-53。（過敏性 發炎） •摘要Mast cells produce interleukin-25 upon Fcepsilon RI-mediated activation. 2003年5月 1日；101(9):3594-6. 電子出版2003年1月2日。（過敏性發炎） IL-5/IFN-y IL-5/GM-CSF • Differential regulation of human eosinophil IL-3, IL-5, and GM-CSF receptor alpha-chain expression by cytokines: IL-3, IL-5，and GM-CSF down-regulate IL-5 receptor alpha expression with loss of IL-5 responsiveness, but up-regulate IL-3 receptor alpha expression. J/mmww?/· 2003年6月 1 日； 170(11):5359-66。（過敏性發炎） IL-6/IL-10 IL-6/IL-11 IL-6/IL-16 • Interleukin-16 stimulates the expression and production of pro-inflammatory cytokines by human monocytes. 2000年5月；100(1):63-9 o 129025.doc -344- 200848427 IL-6/IL-17 • Stimulation of airway mucin gene expression by interleukin (IL)-17 through IL-6 paracrine/autocrine loop. J 所0/ CT^m. 2003年5月 9 日；278(19):17036-43.電子出版 2003年3月6曰。（氣管發炎，哮喘） IL-6/IL-19 •摘要IL-19 induces production of IL_6 and TNF-alpha and results in cell apoptosis through TNF-alpha. J Immunol 2002 年 10月 15 曰；169(8):4288-97。 IL-6/IFN-g IL-7/IL-2 • Interleukin 7 worsens graft-versus-host disease. Blood· 2002年 10月 1 日；100(7):2642-9。 IL-7/IL-12 • Synergistic effects of IL-7 and IL-12 on human T cell activation. J 1995 年 5 月 15 日；154(10):5093-102。 IL-7/IL-15 • Interleukin-7 and interleukin-15 regulate the expression of the bcl-2 and c-myb genes in cutaneous T-cell lymphoma cells·万/0沉/· 2001 年 11月 1 日；98(9):2778-83。（生長因子） IL-8/IL-11 • Abnormal production of interleukin (IL)-ll and IL-8 in polycythaemia vera· 2002年11 月 21 日；ZOGynS- IL-8/IL-17 • The Role of IL-17 in Joint Destruction. Drug News 2002年1 月；15(1):17-23。（哮喘） •摘要 Interleukin-17 stimulates the expression of interleukin-8， growth-related oncogene-alpha, and granulocyte-colony-stimulating factor by human airway epithelial cells, J CW/ M9/ 所0/· 2002年6月； 26⑹:748-53。（氣管發炎） IL-8/GSF • Interleukin-8: an autocrine/paracrine growth factor for human hematopoietic progenitors acting in synergy with colony stimulating factor-1 to promote monocyte-macrophage growth and differentiation. _Exp //emato/· 1999 年1 月； 27(1):28-36。 IL-8/VGEF • Intracavitary VEGF, bFGF? IL-8, IL-12 levels in primary and recurrent malignant glioma. JTVewraonco/. 2003 年5 月； 62(3):297-303。 129025.doc -345 - 200848427 IL-9/IL-4 • Anti-interleukin-9 antibody treatment inhibits airway inflammation and hyperreactivity in mouse asthma model. Am «77?烈pzrCr/ί Care Med 2002年8 月 1 日；166(3):409-16。 IL-9/IL-5 • Pulmonary overexpression of IL-9 induces Th2 cytokine expression, leading to immune pathology. J Clin Invest, 2002 年1 月；109(1):29-39。 • Th2 cytokines and asthma. Interleukin-9 as a therapeutic target for asthma· 2001 ;2(2):80-4.電子出版2001 年2月15日。綜述。 •摘要 Interleukin-9 enhances interleukin-5 receptor expression， differentiation, and survival of human eosinophils.5foc^· 2000年9月 15 曰；96(6):2163_71。（哮喘） IL-9/IL-13 • Anti-interleukin-9 antibody treatment inhibits airway inflammation and hyperreactivity in mouse asthma model. Am CrzY Care M^/· 2002年8 月 1 曰；166(3):409-16。 • Direct effects of interleukin-13 on epithelial cells cause airway hyperreactivity and mucus overproduction in asthma. Λ^Μ汉/· 2002年8月；8(8):885-9。 IL-9/IL-16 •參見IL-4/IL-16 IL-10/IL-2 • The interplay of interleukin-10 (IL-10) and interleukin-2 (IL-2) in humoral immune responses: IL-10 synergizes with IL-2 to enhance responses of human B lymphocytes in a mechanism which is different from upregulation of CD25 expression· 1994年9月；157(2):478-88 o IL-10/IL-12 IL-lO/TGF-β • IL-10 and TGF-beta cooperate in the regulatory T cell response to mucosal allergens in normal immunity and specific immunotherapy. Eur J Immunol 2003 年 5 月； 33(5):1205-14。 IL-lO/IFN-γ IL-ll/IL-6 • Interleukin-6 and interleukin-11 support human osteoclast formation by a RANKL-independent mechanism. 2003 年1月；32(1):1-7。（發炎中骨骼再吸收） 129025.doc -346- 200848427 IL-ll/IL-17 • Polarized in vivo expression of IL-11 and IL-17 between acute and chronic skin lesions. Jd/krgy 2003 年4月；111(4):875-8卜（過敏性皮炎） • IL-17 promotes bone erosion in murine collagen-induced arthritis through loss of the receptor activator of NF，kappa B ligand/osteoprotegerin balance· 2003 年3 月 1 日； 170(5):2655-62。 IL-ll/TGF-β • Polarized in vivo expression of IL-11 and IL-17 between acute and chronic skin lesions. J Allergy Clin Immunol 2003 年4月；111(4):875-81。（過敏性皮炎） IL-12/IL-13 • Relationship of Interleukin-12 and Interleukin-13 imbalance with class-specific rheumatoid factors and anticardiolipin antibodies in systemic lupus erythematosus. 似mato/· 2003年5月；22(2):107-U。 IL-12/IL-17 • Upregulation of interleukin-12 and -17 in active inflammatory bowel disease. Scand J Gastroenterol 2003^-2 月；38(2):180-5。 IL-12/IL-18 • Synergistic proliferation and activation of natural killer cells by interleukin 12 and interleukin 18· 1999年 11 月；11(11):822-30。 • Inflammatory Liver Steatosis Caused by IL-12 and IL-18. 及以.2003年3 月；23(3):155-62。 IL-12/IL-23 • Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain. Nature. 2003 年2 月 13 日；421(6924):744-8。 •摘要 A unique role for IL-23 in promoting cellular immunity. 2003年1 月；73(1):49-56。綜述。 IL-12/IL-27 •摘要IL-27，a heterodimeric cytokine composed of EBI3 and p28 protein, induces proliferation of naive CD4(+) T cells. 2002年6月；16(6):779-90 ° IL-12/IFN-y •作為免疫刺激之部分IL42誘導B及T細胞表現IFN-γ。 IL-13/IL-5 •參見IL-5/IL-13 129025.doc -347- 200848427 IL-13/IL-25 •摘要New IL-17 family members promote Thl or Th2 responses in the lung: in vivo function of the novel cytokine IL-25· «//服m#2〇/· 2002年7月 1 日；169(1):443-53。（過敏性 發炎） •摘要Mast cells produce interleukin-25 upon Fcepsilon RI-mediated activation. 2003年5月 1日；101(9):3594-6, 電子出版2003年1月2日。（過敏性發炎） IL-15/IL-13 • Differential expression of interleukins (IL)-13 and IL-15 in ectopic and eutopic endometrium of women with endometriosis and normal fertile women. Am J Reprod 2003 年2月；49(2):75-83。 IL-15/IL-16 • IL-15 and IL-16 overexpression in cutaneous T-cell lymphomas: stage-dependent increase in mycosis fungoides progression· Exp 2000年8 月；9(4):248_51 0 IL-15AL-17 •摘要IL-17, produced by lymphocytes and neutrophils，is necessary for lipopolysaccharide-induced airway neutrophilia: IL-15 as a possible trigger· 2003 年2 月 15 日； 170(4):2106-12。（氣管發炎） IL-15/IL-21 • IL-21 in Synergy with IL-15 or IL-18 Enhances IFN-gamma Production in Human NK and T Cells. / 2003 年6月 1 日；170(11):5464-9。 IL-17/IL-23 • Interleukin-23 promotes a distinct CD4 T cell activation state characterized by the production of interleukin-17. J Biol C7^m· 2003年 1 月 17 日；278(3):1910-4.電子出版2002年 11 月3曰。 IL-17/TGF-P • Polarized in vivo expression of IL-11 and IL-17 between acute and chronic skin lesions. J Allergy Clin Immunol 2003 年4月；111(4):875-81。（過敏性皮炎） IL-18/IL-12 • Synergistic proliferation and activation of natural killer cells by interleukin 12 and interleukin 18. 1999年 11 月；11(11):822-30。 •摘要Inhibition of in vitro immunoglobulin production by IL-12 in murine chronic graft-vs.-host disease: synergism with IL-18· EwrJTmmww?/· 1998年6月；28(6):2017-24 o 129025.doc -348 - 200848427 ί IL-18/IL-21 • IL-21 in Synergy with IL-15 or IL-18 Enhances IFN-gamma Production in Human NK and T Cells. J Immunol 2003年6月 1 日；170(11):5464-9。 IL-18/TGF-P • Interleukin 18 and transforming growth factor betal in the serum of patients with Graves1 ophthalmopathy treated with corticosteroids. Int Immunopharmacol 2003 年 4 月； 3(4):549-52。 IL-18/IFN-y 抗-TNFa/ 抗-CD4 •在DBA/1關節炎小鼠中之協同治療效應。 129025.doc •349· 200848427
附錄3:腫瘤學組合 標靶 疾病 與以下各物配對 CD89* 用作細胞毒性細胞募 集者 所有 CD19 B細胞淋巴瘤 HLA-DR CD5 HLA-DR B細胞淋巴瘤 CD89 CD19 CD5 CD38 多發性骨髓瘤 CD138 CD56 HLA-DR CD138 多發性骨髓瘤 CD38 CD56 HLA-DR CD138 肺癌 CD56 CEA CD33 急性骨髓淋巴瘤 CD34 HLA-DR CD56 肺癌 CD138 CEA CEA 泛癌(Pan carcinoma) MET受體 VEGF 泛癌 MET受體 VEGF受體 泛癌 MET受體 IL-13 哮喘/肺炎 IL-4 IL-5 嗜酸性粒細胞趨化因子 MDC TARC 129025.doc - 350 - 200848427 TNFa IL-9 EGFR CD40L IL-25 MCP-1 TGFP IL-4 哮喘 IL-13 IL-5 嗜酸性粒細胞趨化因子 MDC TARC TNFa IL-9 EGFR CD40L IL-25 MCP-1 TGFP 嗜酸性粒細胞趨 化因子 哮喘 IL-5 嗜酸性粒細胞趨化因子-2 嗜酸性粒細胞趨化因子-3 EGFR 癌症 HER2/neu HER3 HER4 HER2 癌症 HER3 HER4 TNFR1 RA/克羅恩氏病 IL-1R IL-6R IL-18R TNFa RA/克羅恩氏病 IL-la/β IL-6 IL-18 129025.doc -351 - 200848427 /
ICAM-1 IL-15 IL-17 IL-1R RA/克羅恩氏病 IL-6R IL-18R IL-18R RA/克羅恩氏病 IL-6R 129025.doc 352- 200848427 垅衮鳍碱 酬 500 nM至 50 ρΜ 作為TAR1 單體 作為TAR1 單體 =30 nM -3nM =15 nM 配位體檢定之IC50 500ηΜ 至 ΙΟΟρΜ 作為TAR1單體 作為TAR1單體 1 具有(Gly4Ser)3連接子=20 nm 具有(Gly4Ser)5連接子=2 nm 具有(Gly4Ser)7連接子=10 nm Fab 形式=1 nM 5X10·1 至 1χ ΙΟ'7 作為TAR1 單體 作為TAR1 單體 300ηΜ 至 5ρΜ(亦即 3xl(T7 至5χ10·12)，較佳50ηΜ至20 ρΜ 作為TAR1單體 作為TAR1單體 ί 30 nM dAb TAR1單體 TAR1二聚體 TAR1三聚體 TAR1-5 TAR1-27 TAR1-5-19 單體 TAR1-5-19 均二聚體 標靶 TAR1 129025.doc - 353 - 200848427 =12 nM =10ηΜ =12 ηΜ =60 nM 3-10nM (例如3 nM) 具有(Gly4Ser)n連接子 TARl-5-19d2=2nM TARl-5-19d3=8nM TAR1-5-19 d4=2-5 nM TAR1-5-19d5=8nM Fab形式 TAR1-5-19CH dlCK-6 nM TAR1-5-19CK dlCH=6 nM TAR1-5-19CH d2CK=8 nM TAR1-5-19CH d3CK=3 nM 具有(Gly4Ser)n連接子 TARl-5dl=30nM TARl-5d2=50 nM TARl-5d3=300 nM TARl-5d4=3 nM TARl-5d5=200nM TARl_5d6=100nM Fab形式 TAR1-5CH d2CK=30 nM TAR1-5CK d3CH=100 nM 0.3 nM TAR1-5-19 均二聚體 1 i j 1 1 TAR1-5 均二聚體 TAR1-5-19 均 三聚體 129025.doc - 354- 200848427 500 nM至 50 ρΜ 500ηΜ 至 ΙΟΟρΜ I sl| s Ip 〇 泠恭苳考 心 畹 £<έ〇 #Μ ^ ι—( 作為TAR1 單體 作為TAR1單體 § ξ % 無 42 οξ 治戔莩W 泛〇 趄3§ί 200 nM 70 nM TAR2單體 ί TAR2-10 TAR2-5 抗SA單體 MSA-16 MSA-26 TAR2 血清白蛋白 129025.doc - 355 - 200848427 附錄ι-序列表 HEL4
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C Ά Ά S G F S D E DM· GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT TAGGATTAGC GATGAGGATA • G W V R Q A P G K G LEW V s S I Y G P S G S T Y Y A V K G R · TGGGCTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTATCAAGC ATTTATGGCC CTAGCGGTAG CACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q Μ N SLR A E D T A V Y ASA L GTTCACCATC TCCCGTGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTATTGCGC GAGTGCTTTG E P L S E P L G F W G Q G T L V T V S S GAGCCGCTTT CGGAGCCCCT GGGCTTTTGG GGTCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCGAGC TAR2-5
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F D L Y N M · GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAT CTTTATAATA • F W V R Q A P G K G LEW V S F I S Q T G R L T w Y A V K G R TGTTTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATTT ATTAGTCAGA CTGGTAGGCT TACATGGTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q Μ N S L R A E D T A V Y A K T L GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAACGCTG E D F D Y W G Q G T L V T V S S GAGGATTTTG ACTACTGGGG CCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC TAR1-5-19 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A s Q K E F L W · GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA
GAGCGTTAAG GAGTTTTTAT
- 356 - 129025.doc 200848427
• W Y Q QKP G K A P KLL IYM A S N L QSG VPS R F S G S G S ·
GGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATATG GCATCCAATT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
•GTD FTLT ISS LQP E D F A TYY CQQ KFKL PR
T F G Q
TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG AAGTTTAAGC TGCCTCGTAC GTTCGGCCAA
G T K V EIK R GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG TAR2-10
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCC
GGATTCACCTTTGAGTGGTATTGGATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGCT
ATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCC
AAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGTTAAG
TTGGGGGGGGGGCCTAATTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCEVQLLESGGGLVQ
PGGSLRLSCAASGFTFEWYWMGWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRA
EDTAVYYCAKVKLGGGPNFDYWGQGTLVTVSS EVQL LES GGG LVQP GGS·
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC •LRL S C A A S G F TFE W Y W M ·
51 CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG TGGTATTGGA
• G W V R Q A PGKG LEW V S A
101 TGGGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGCT ISGS GGS TYY A D S V KGR·
151 ATTAGTGGTA GTGGTGGTAG CACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I SRDN SKN T L Y LQMN·
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA
• SLR A E D T A V Y Y C A KVK
251 ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGTTAAG L G G G P N F D Y W GQGT L V T · 301 TTGGGGGGGG GGCCTAATTT TGACTACTGG GGCCAGGGAA CCCTGGTCAC Aval -357 - 129025.doc 200848427 • V s s
351 CGTCTCGAGC TAR-1 dAb DNA及胺基酸序列 dAb 1、2及3為來自TAR1-5二聚體1-6之搭配物序列。dAbl為二聚體1、5及6之搭配物dAb 第二dAb相同，但連接子長度不同，同樣，dAb2為二聚體2與3之搭配物dAb，dAb3為二聚 體4之搭配物dAb。*指示存在琥珀終止密碼子。TAR1-5、TAR1-5-19與獨特第二dAb之間的 序列同源性為88% TAR1-5-19
DIQMTQS PSS LSASVGDRVT ITCRASQ
( SIDSYLH \
GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCT CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GAGCATTGAT AGTTATTTAC
CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGA GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CTCGTAACTA TCAATAAATG
W Y Q Q K P G K A P KLL IYS A S E L Q S G VPS
R F S G S G S
ATTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATAGT GCATCCGAGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
TAACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATATCA CGTAGGCTCA ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG
GTD FTLT ISS LQP E D F A T Ύ Y C Q Q V V W
R P F T F G Q
TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTAC.TA CTGTCAACAG GTTGTGTGGC GTCCTTTTAC GTTCGGC CAA
ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC CAACACACCG CAGGAAAATG CAAGCCGGTT
/ GTKV EIK R
^ GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGC
CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCG TAR1-5
DIQM TQS PSS L S A S VGD RVT I T C R A S
Q S I F Μ N L L
GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GAGCATTTTT ATGAATTTAT
CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CTCGTAAAAA TACTTAAATA 358 - 129025.doc 200848427
W Y Q QKP GKAP KLL IYN A S V L Q S G VP
S RFSG SGS
TGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATAAT GCATCCGTGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
ACACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATATTA CGTAGGCACA ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG
GTD FTLT ISS L Q P ED FA TYY CQQ V V W
R P F T F G Q
TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG GTTGTGTGGC GTCCTTTTAC GTTCGGCCAA
ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC CAACACACCG CAGGAAAATG CAAGCCGGTT
GTKV E I K R GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC 單體-dAbl : TARl-5dl中之搭配物dAb (3U連接子）、d5 (5U連接子）、d6 (7U連接子）
DIQM TQS P S S LSAS VGD R V T I T C R A S Q S I Y DALE
GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GAGCATTTAT GATGCGTTAG
CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CTCGTAAATA CTACGCAATC
WYQ QKP GKAP KLL I Y T A S R L QSG VPS
RFSG SGS
AGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATACT GCATCCCGGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
TCACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATATGA CGTAGGGCCA ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG
GTD FTLT ISS LQP E D F A TYY CQQ VMQ
R PVT F G Q
TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG GTTATGCAGC GTCCTGTTAC GTTCGGCCAA
ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC CAATACGTCG CAGGACAATG CAAGCCGGTT
GTKV EIK R
GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC 單體-dAb2 : TARl-5d2中之搭配物dAb (3U連接子）、d3 (5U連接子） DIQM TQS PSS LSAS VGD R V T 工 TCR A S Q SIY DAL*
GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GAGCATTTAT GATGCTTTAC 359- 129025.doc 200848427
CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CTCGTAAATA CTACGAAATG
W Y Q Q K P GKAP KLL IYT ASRL Q S G VPS R F S G S G S
AGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATACT GCATCCCGGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA
CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
TCACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATATGA CGTAGGGCCA ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG
GTD FTLT ISS LQP E D F A T Y H CQQ VMQ R PVT F G Q
TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACCA CTGTCAACAG GTTATGCAGC GTCCTGTTAC GTTCGGCCAA
ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGGT GACAGTTGTC CAATACGTCC7 CAGGACAATG CAAGCCGGTT
G T K V EIK R GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC 單體-dAb3 ·· TARl-5d4中之搭配物dAb (5U連接子）
DIQM TQS PSS L S A S VGD RVT ITCR A S Q SVK E F L W
GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GAGCGTTAAG GAGTTTTTAT
CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CTCGCAATTC CTCAAAAATA
WYQ Q K P GKAP KLL IYM A S N L QSG VPS R F S G S G S
GGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATATG GCATCCAATT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
CCACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATATAC CGTAGGTTAA ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG
GTD FTLT ISS LQP E D F A TYY CQQ K F K L P R T F G Q
TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG AAGTTTAAGC TGCCTCGTAC GTTCGGCCAA
ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC TTCAAATTCG ACGGAGCATG CAAGCCGGTT
G T K V EIK R GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC TAR1-27及相關搭配物dAb胺基酸及DNA序列（*指示存在琥珀終止密碼子）。 TAR1-27與獨特第二dAb之間的序列同源性為9〇. 4%。 129025.doc 360- 200848427 TARl-27
D I Q M TQS PSS L S A S VGD RVT ITCR AS Q S I W TKLH
GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GAGCATTTGG ACGAAGTTAC
CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CTCGTAAACC TGCTTCAATG
W Y Q Q K P G K A P K L L I Y M A S S L Q S G VPS R F S G S G S
ATTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATATG GCATCCAGTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
TAACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATATAC CGTAGGTCAA ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG
GTD FTLT ISS LQP EDFA TYY CQQ W F S N P S T F G Q
TGGGACAGAT TTCA.CTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TGGTTTAGTA ATCCTAGTAC GTTCGGCCAA
ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC ACCAAATCAT TAGGATCATG CAAGCCGGTT
GTKV EIK R GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGC CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCG TARl-27dl中之搭配物dAb單體（3U連接子）
I Q M TQS PSS L S A S VGD RVT ITCR A S P I L C
GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GAGCATTTAG CCGATTTTAT
CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CTCGTAAATC GGCTAAAATA
W Y Q Q K P G K A P K L L I Y A A S S L Q S G VPS S G S
GTTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGCT GCATCCAGTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
CAACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATACGA CGTAGGTCAA ACGTTTCACC CCAGCiGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG
GTD FTLT ISS LQP EDFA TY Y CQQ IQH I PVT F G Q
TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG ATTCAGCATA TTCCTGTGAC GTTCGGCCAA
ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC TAAGTCGTAT AAGGACACTG CAAGCCGGTT
GTKV EIK R GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC 361 - 129025.doc 200848427 TARl-27d2中之搭配物dAb單體（3U連接子）
diqm tqs pss l s a s vgd rvt itcr a s Q S I G * D L H
GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GAGCATTGGG TAGGATTTAC
CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CTCGTAACCC ATCCTAAATG
WYQ QKP G K A P KLL IYT ASLL Q S G VPS
R F S G S G S
ATTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATACG GCATCCCTTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
TAACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATATGC CGTAGGGAT^A ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG
GTD FTLT ISS LQP EDFA TYY C Q Q Q S A
F P N T L G Q
TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT G/^AGATTTTG CTACGTACTA CTGTCT^ACAG CAGAGTGCTT TTCCTAATAC GCTCGGCCAA
ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC GTCTCACGAA AAGGATTATG CGAGCCGGTT
GTKV EIK R
GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG
CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC TARl-27d7中之搭配物dAb單體（3U連接子）
DIQM TQS PSS LSAS VGD RVT ITCR AS
Q SIT KMLL
GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CCGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GAGCATAACG AAGAATTTAC
CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GGCATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CTCGTATTGC TTCTTAAATG
W Y Q QKP G K A P KLL IY* A S S L QSG VPS
R F S G S G S
TTTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATTAG GCATCCTCTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
f AAACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATAATC CGTAGGAGAA ACGTTTCACC CCAGGGTAGT
I GCAAAGTCAC CGTCACCTAG
GTD FTLT ISS LQP EDFA TYY C Q Q LRH K P P T F G Q
TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG CTTCGTCATA AGCCTCCGAC GTTCGGCCAA
ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC GAAGCAGTAT TCGGAGGCTG CAAGCCGGTT
GTKV EIK R
GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG 362- 129025.doc 200848427
CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC TARl-27d8中之搭配物dAb單體（3U連接子）
DIQM TQS P S S L S A S VGD R V T I T C R AS Q SI* KSLR
GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GAGCATTTAG AAGTCTTTAA
CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CTCGTAAATC TTCAGAAATT
WYQ QKP G K A P KLL 工 YH A S D L QSG VPS
R F S G S G S
GGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATCAT GCATCCGATT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
CCACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATAGTA CGTAGGCTAA ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG
G T D FTLT ISS L Q P ED FA T Y Y CQQ Μ V N
S PVT F G Q
f TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG ATGGTTAATA
GTCCTGTTAC GTTCGGCCAA
ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC TACCAATTAT CAGGACAATG CAAGCCGGTT
GTKV EIK R
GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG
CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC TARl-27dl2中之搭配物dAb單體（3U連接子）
DIQM TQS PSS L S A S VGD R V T ITCR A S Q SI* T A L H
GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GAGCATTTAG ACGGCGTTAC
CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CTCGTAAATC TGCCGCAATG
WYQ QKP G K A P KLL I Y S ASSL QSG VPS
R F S G S G S
ATTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATTCT GCATCCAGTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
TAACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATAAGA CGTAGGTC/y\ ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG
GTD FTLT ISS LQP E D F A TYY CQQ SSF
L P F T F G Q
TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TCGAGTTTTT TGCCTTTTAC GTTCGGCCAA
ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC AGCTCAAAAA ACGGAAAATG CAAGCCGGTT 363 - 129025.doc 200848427
G Τ Κ V ΕΙΚ R GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC TARl-27dl6中之搭配物dAb單體（3U連接子）
DIQM TQS PSS L S A S VGD R V T ITCR AS Q SIG P N L E
GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GAGCATTGGG CCGAATTTAG
CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CTCGTAACCC GGCTTAAATC
WYQ QKP G K A P KLL I Y A ASSL QSG VPS
R F S G S G S
AGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGCT GCATCCAGTT TGCAA.AGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
TCACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATACGA CGTAGGTCAA ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG
G T D FTLT ISS LQP E D F A TYY C Q Q QMG
R P R T F G Q
TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG CAGATGGGGC GTCCTCGGAC GTTCGGCCAA
ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC GTCTACCCCG CAGGAGCCTG CAAGCCGGTT
GTKV EIK R
GGGACC7VAGG TGGAAATCAA ACGG
CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC TARl-27d23中之搭配物dAb單體（5U連接子）
DIQM TQS PSS L S A S VGD RVT ITCR AS Q SIK H * L A
GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GAGCATTAAG CATTAGTTAG
CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CTCGTAATTC GTAATCAATC
W Y Q QKP G K A P KLL 工 YK A S V L QSG VPS
R F S G S G S
CTTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATAAG GCATCCGTGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
GAACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATATTC CGTAGGCACA ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG
GTD FTLT ISS LQP E D F A TYY C Q Q L R R
R P T T F G Q
TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG CTTAGGCGTC GTCCTACTAC GTTCGGCCAA 364 - 129025.doc 200848427
ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATC7AT GACAGTTGTC GAATCCGCAG CAGGATGATG CAAGCCGGTT G T K V EIK R GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC TARl-27d30中之搭配物dAb單體（7U連接子）
DIQM TQS PSS L S A S VGD RVT ITCR AS Q SVK A * L T
GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATC.ACTTGCC GGGCAAGTCA GAGCGTTAAG GCTTAGTTAA
CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CTCGCAATTC CGAATCAATT
W Y Q Q K P G K A P KLL IYK A S T L QSG VPS
R F S G S G S
CTTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATAAG GCATCCACTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
GT^ACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATATTC CGTAGGTGAA ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG
GTD FTLT ISS LQP EDFA TYY CQQ HSS
R P Y T F G Q
TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG CATAGTTCTA GGCCTTATAC GTTCGGCCAA
ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC GTATCAAGAT CCGGAATATG CAAGCCGGTT
GTKV EIK R
GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG
CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC TARl-27d31中之搭配物dAb單體（7U連接子）
DIQM TQS PSS L S A S VGD RVT ITCR AS Q S I E N R L G
f GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA i
GAGCATTGAG AATCGGTTAG
CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CTCGTAACTC TTAGCCAATC
WYQ QKP G K A P KLL I Y * A S L L QSG VPS R F S G S G S
GTTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATTAG GCGTCCTTGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
CAACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATAATC CGCAGGAACA ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG 365 - 129025.doc 200848427
GTD FTLT ISS LQP EDFA T Y Y CQQ D S Y F P R T F G Q
TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG GATTCGTATT TTCCTCGTAC GTTCGGCCAA
ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC CTAAGCATAA AAGGAGCATG CAAGCCGGTT
GTKVEIKR GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC TARl-27d36中之搭配物dAb單體（7U連接子）
D I Q Μ T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q SIM D K L K
GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GAGCATTATG GATAAGTTAA
CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CTCGTAATAC CTATTCAATT r \
W Y Q Q K P G K A P K L L I Y * A S I L Q S G VPS R F S G S G S
AGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATTAG GCATCCATTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
TCACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATAATC CGTAGGTAAA ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG
GTD FTLT ISS LQP EDFA TYY CQQ DSG G P N T F G Q
TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTC/yVCAG GATAGTGGGG GTCCTAATAC GTTCGGCCAA
ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC CTATCACCCC CAGGATTATG CAAGCCGGTT
G T K V EIK R GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC
TAR卜27d37中之搭配物dAb單體（7U連接子）
D I Q Μ T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q S I G R N L E
GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GAGCATTGGG AGGAATTTAG
CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CTCGTAACCC TCCTTAAATC
W Y Q Q K P G K A P K L L I Y D A S H L Q S G VPS S G S
AGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGAT GCATCCCATT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC 366- 129025.doc 200848427
TCACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATACTA CGTAGGGTAA ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG
gtd FTLT ISS LQP E D F A TYY C Q Q S R W L P R T F G Q
TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGC7VACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TCGCGTTGGC TTCCTCGTAC GTTCGGCCAA
ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC AGCGCAACCG AAGGAGCATG CAAGCCGGTT
GTKV EIK R GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC TARl-27d39中之搭配物dAb單體（7U連接子）
D I Q Μ T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q SIR K M L V
GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA , GAGCATTAGG AAGATGTTAG
、 CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT
CTCGTAATCC TTCTACAATC
W Y Q Q K P G K A P K L L I Y R A S Y L Q S G VPS R F S G S G S
TTTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATCGG GCATCCTATT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
AAACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATAGCC CGTAGGATAA ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG
G T D FTLT ISS LQP E D F A TYY CQQ A F R R P R T F G Q
TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCT^ACAG GCTTTTCGGC GGCCTAGGAC GTTCGGCCAA
ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC CGAAAAGCCG CCGGATCCTG CAAGCCGGTT
GTKV EIK R GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC / TAR2dAb胺基酸及DNA序列（*指示存在琥珀終止密碼子）。 TAR2h-5與獨特第二dAb之間的序列同源性為83. 5% TAR2h-5
EVQL L E S GGG L V Q P GGS LRL S C A A S G F TFD LYNM
GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAT CTTTATAATA -367- 129025.doc 200848427
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACTA GAAATATTAT
F W V R Q A PGKG LEW V S F 工 S Q T G R L T W Y A D S V K G R
TGTTTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATTT ATTAGTCAGA CTGGTAGGCT TACATGGTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACAAAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTAAA TAATCAGTCT GACCATCCGA ATGTACCATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
FT I SRDN S K N TLY L Q Μ N SLR A E D T A V Y Y C A K T L
GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAACGCTG
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTTGCGAC
EDFD YWG QGT LVTV S GAGGATTTTG ACTACTGGGG CCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCG CTCCTAAAAC TGATGACCCC GGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGC TAR2h-5dl中之搭配物dAb單體（3U連接子）
E V Q L LES GGG L V Q P GGS LRL S C A A S G F T F P V Y Μ M
GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTCCG GTTTATATGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAAGGC CAAATATACT
GWV R Q A PGKG LEW VSS I D A L GGR TGY A D S V K G R
TGGGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCG ATTGATGCTC TTGGTGGGCG GACAGGTTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACCCAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTAGC TAACTACGAG AACCACCCGC CTGTCCAATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
FTI SRDN S K N TLY L Q Μ N SLR Λ E D T A V
Y Y C A K T M
GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAACTATG
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTTGATAC
SNKT HTF DYW GQGT LVT VS
TCGAATAAGA CGCATACGTT TGACTACTGG GGCCAGGGT^A CCCTGGTCAC CGTCTCG
AGCTTATTCT GCGTATGCAA ACTGATGACC CCGGTCCCTT GGGACCAGTG GCAGAGC TAR2h-5d2中之搭配物dAb單體（3U連接子）
LRL S C A A S G
EVQL LES GGG L V Q P GGS
T F V
Y N M -368- 129025.doc 200848427
GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGTG GCTTATAATA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACAC CGAATATTAT
τ w V R Q A P G K G LEW V S S I N T F G N * TRY κ G R
TGACTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAAGT ATTAATACTT TTGGTAATTA GACAAGGTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACTGAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTCA TAATTATGAA AACCATTAAT CTGTTCCATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
FTI SRDN S K N TLY LQMN SLR A E D T A V Y Y C A KGS
GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGGTAGT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTCCATCA
R P F D Y W G QGT LVTV S AGGCCTTTTG ACTACTGGGG CCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCG TCCGGAAAAC TGATGACCCC GGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGC TAR2h-5d3中之搭配物dAb單體（3U連接子）
EVQL LES GGG LVQP G G S LRL S C A A S G F T F ，λ· G Y R M
GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGCtTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTTAG GGGTATCGTA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAAATC CCCATAGCAT
G W V R Q A P G K G LEW V S Wl I T R T G G T T Q Y
A D S V K G R
TGGGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATGG ATTACGCGTA CTGGTGGGAC GACACAGTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACCCAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAG7VGTACC TAATGCGCAT GACCACCCTG CTGTGTCATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
FTI SRDN S K N TLY LQMN SLR A E D T A V
Y Y C A K P A
GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGGCG
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGCCGC
KLVG V G F DYW GQGT LVT VS
AAGCTTGTTG GGGTTGGGTT TGACTACTGG GGCCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCG
TTCGAACAAC CCCAACCCAA ACTGATGACC CCGGTCCCTT GGGACCAGTG GCAGAGC TAR2h-5d4中之搭配物dAb單體（3U連接子） -369- 129025.doc 200848427
EVQL LES GGG LVQP GGS LRL S C A A S G F TFR K Y * M
GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTCGG AAGTATTAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAAGCC TTCATAATCT
G W V R Q A P G K G LEW V S Q I G A K G Q S T D Y K G R
TGGGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCACAG ATTGGTGCGA AGGGTCAGTC TACAGATTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACCCCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTGTC TAACCACGCT TCCCAGTCAG ATGTCTAATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
FT I SRDN SKN TLY L Q Μ N SLR A E D T A V Y Y C A K K K
GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACC7CTGTAT CTGCiAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAAAGAAG
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTTTCTTC
辛 RGEN YFF DYW GQGT LVT VS
AGGGGGGAGA ATTATTTTTT TGACTACTGG GGCCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCG TCCCCCCTCT TAATAAAAAA ACTGATGACC CCGGTCCCTT GGGACCAGTG GCAGAGC TAR2h-5d5中之搭配物dAb單體（3U連接子）
EVQL LES GGG LVQP GGS LRL S C A A S G F TFR R Y S M
GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTCGG CGGTATAGTA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAAGCC GCCATATCAT
S W V R Q A P G K G LEW V S D I S R S G R Y THY K G R
TGTCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGAT ATTTCTCGTT CTGGTCGGTA TACACATTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACAGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTCTA TAAAGAGCAA GACCAGCCAT ATGTGTAATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
F T I SRDN SKN TLY LQMN SLR A E D T A V
Y Y C Ά K R I
GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACGTATT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGCATAA
D S S Q N G F DYW GQGT LVT VS
GATTCTTCTC AGAATGGGTT TGACTACTGG GGCCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCG CTAAGAAGAG TCTTACCCAA ACTGATGACC CCGGTCCCTT GGGACCAGTG GCAGAGC 370- 129025.doc 200848427 TAR2h-5d6中之搭配物dAb單體（3U連接子）
EVQL LES GGG LVQP GGS LRL S C A A S G
F T F * GYKM
GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTTAG GGGTATAAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAAATC CCCATATTCT
FWV R Q A PGKG LEW V S A ISGS GGS TYY
A D S V K G R
TGTTTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGCT ATTAGTGGTA GTGGTGGTAG CACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACAAAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTCGA TAATCACCAT CACCACCATC GTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
F T 1 SRDN SKN TLY LQMN SLR A E D T A V Y Y C A K Q K
GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACAGAAG
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGTCTTC
EMFD YWG Q G T LVTV S
GAGAATTTTG ACTACTGGGG CCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCG
CTCTTAAAAC TGATGACCCC GGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGC TAR2h-5d7中之搭配物dAb單體（3U連接子）
E V Q L LES GGG LVQP GGS LRL S C A A S G F T F G D Y A M
GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGGG GATTATGCTA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACCC CTAATACGAT
W w V R Q A PGKG LEW V S V ISSN G G S T F Y K G R
TGTGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGTG ATTAGTTCGA ATGGTGGGAG TACATTTTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACACCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTCAC TAATCAAGCT TACCACCCTC ATGTAAAATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
F T I SRDN SKN TLY LQMN SLR A E D T A V
Y Y C A K R V
GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACGTGTT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGCACAA
RKRT PEF D Y W GQGT LVT VS
CGTAAGAGGA CTCCTGAGTT TGACTACTGG GGCCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCG 371 - 129025.doc 200848427
GCATTCTCCT GAGGACTCAA ACTGATGACC CCGGTCCCTT GGGACCAGTG GCAGAGC TAR2h-5d8中之搭配物dAb單體（3U連接子）
EVQL LES GGG LVQP GGS LRL S C A A S G F T F R RYKM
GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAGG AGGTATAAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAATCC TCCATATTCT
G W V RQA PGKG LEW V S A I G R N GTK TNY
A D S V K G R
TGGGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGCG ATTGGGAGGA ATGGTACGAA GACAAATTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACCCAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTCGC TAACCCTCCT TACCATGCTT CTGTTTAATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
FT I SRD N S K N TLY L Q Μ N SLR A E D T A V
Y Y C A K I Y
GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAATTTAT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTTAAATA
TGKP A A F D Y W GQGT LVT VS
ACGGGGAAGC CTGCTGCGTT TGACTACTGG GGCCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCG
TGCCCCTTCG GACGACGCAA ACTGATGACC CCGGTCCCTT GGGACCAGTG GCAGAGC TAR2h-5d9中之搭配物dAb單體（3U連接子）
EVQL LES GGG LVQP GGS LRL S C A A S G F T F K K Y * M
GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAAG AAGTATTAGA
CTCCACC7TCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATC7TCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAATTC TTCATAATCT
SWV RQA PGKG LEW V S A ISGS GGS TYY
A D S V K G R
TGTCTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGCT ATTAGTGGTA GTGGTGGTAG CACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACAGAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTCGA TAATCACCAT CACCACCATC GTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
FTI SRDN S K N TLY L Q Μ N SLR A E D T A V
Y Y C A K M L
GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAATGCTG
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTTACGAC 372- 129025.doc 200848427
RTKN k v f d y w gqgt lvt vs AGGACTAAGA ATAAGGTGTT TGACTACTGG GGCCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCG TCCTGATTCT TATTCCACAA ACTGATGACC CCGGTCCCTT GGGACCAGTG GCAGAGC TAR2h-5dlO中之搭配物dAb單體（5U連接子）
E V Q L LES G G G LVQP GGS LRL S C A A S G
F TFR R Y K M
GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAGG AGGTATAAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAATCC TCCATATTCT
G W V R Q A P G K G LEW V S A I G R N GTK T N Y
A D S V K G R
TGGGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGCG ATTGGGAGGA ATGGTACGAA GACAAATTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACCCAACCCA GGCGGTCC.GA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTCGC TAACCCTCCT TACCATGCTT CTGTTTAATG / CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
< FTI SRDN SKN TLY LQMN SLR AED TAV
Y Y C A K I Y
GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAATTTAT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTTAAATA
T G K P A A F DYW GQGT LVT VS
ACGGGGAAGC CTGCTGCGTT TGACTACTGG GGCCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCG
TGCCCCTTCG GACGACGCAA ACTGATGACC CCGGTCCCTT GGGACCAGTG GCAGAGC TAR2h-5dll中之搭配物dAb單體（5U連接子）
E V Q L LES G G G LVQP GGS LRL S C A A S G F T F * S Y R M
GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTTAG AGTTATCGGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAAATC TCAATAGCCT
G W V R Q A P G K G LEW V S S I S S R G R H T S Y A D S V K G R
TGGGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAAGT ATTTCGTCGA GGGGTAGGCA TACATCTTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACCCAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTCA TAAAGCAGCT CCCCATCCGT ATGTAGAATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
FTI SRDN SKN TLY LQMN SLR AED TAV Y Y C A K R V - 373 - 129025.doc 200848427
GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAAGGGTT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA
TAATGACACG CTTTTCCCAA
PGRG RSF DYW GQGT L V T VS CCGGGTCGGG GGCGTTCTTT TGACTACTGG GGCCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCG GGCCCAGCCC CCGCAAGAAA ACTGATGACC CCGGTCCCTT GGGACCAGTG GCAGAGC TAR2h-5dl2中之搭配物dAb單體（5U連接子）
E V Q L L E S G G G L V Q P GGS L R L S C A A S G F P F R R Y R M
GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CCCCTTTCGT CGGTATCGGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GGGGAAAGCA GCCATAGCCT
RWV R Q A PGKG LEW VSG I S P G GKH TTY A D S V K G R
TGAGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGGT ATTTCTCCGG GTGGTAAGCA TACAACGTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACTCCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTCCA TAAAGAGGCC CACCATTCGT ATGTTGCATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
FTI S R D N SKN TLY LQMN SLR A E D T A V
Y Y C A K G E
GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGGTGAG
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTCCACTC
G G A S S A F DYW GQGT LVT VS
GGGGGGGCGA GTTCTGCGTT TGACTACTGG GGCCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCG
CCCCCCCGCT CAAGACGCAA ACTGATGACC CCGGTCCCTT GGGACCAGTG GCAGAGC TAR2h-5dl3中之搭配物dAb單體（5U連接子）
E V Q L L E S G G G L V Q P GGS L R L S C A A S G F T F * R Y G M
GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTTAG CGGTATGGGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAAATC GCCATACCCT
V W V R Q A PGKG LEW V S A ISGS GGS T Y Y A D S V K G R
TGGTTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGCT ATTAGTGGTA GTGGTGGTAG CACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACCAAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTCGA TAATCACCAT CACCACCATC GTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC 374- 129025.doc 200848427
F Τ I S R D N S K N TLY L Q Μ N SLR A E D T A
V Y Y C A K R H
GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACGGCAT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGCCGTA
S S E A R Q F D Y W GQGT LVT VS
AGTTCTGAGG CTAGGCAGTT TGACTACTGG GGCCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCG TCAAGACTCC GATCCGTCAA ACTGATGACC CCGGTCCCTT GGGACCAGTG GCAGAGC /. -375 - 129025.doc

Claims (1)

  1. 200848427 十、申請專利範圍： 1 · 一種配位體，其包含抗體單一可變域，其中該抗體單一 可變域特異性結合血清白蛋白且包含一個選自由以下組 成之群的胺基酸序列：dAb7rl4、dAb7hll、dAb2、 dAb4、dAb7、dAbll 、dAbl2、dAbl3、dAbl5、 dAbl6、dAbl7、dAbl8、dAbl9、dAb21、dAb22、 dAb23、dAb24、dAb25、dAb26、dAb27 > dAb30、 dAb31、dAb33、dAb34、dAb35、dAb38、dAb41、 dAb46、dAb47、dAb52、dAb53、dAb54 > dAb55、 dAb56、drdAb7ml2、dAb7ml6、dAb7m26、dAb7rl、 dAb7r3 、 dAb7r4 、 dAb7r5 、 dAb7r7 、 dAb7r8 、 dAb7rl3、dAb7rl5、dAb7rl6、dAb7rl7、dAb7rl8、 dAb7rl9、dAb7hl 、dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、 dAb7h8、dAb7h9、dAb7hlO、dAb7hl2、dAb7hl3、 dAb7hl4、dAb7pl 及 dAb7p ° 2. —種配位體，其包含一或多個單一可變域，其中該一或 多個單一可變域中之至少一者為特異性結合血清白蛋白 之單一可變域，且其中該一或多個單一可變域為非天然 存在之單一可變域。 3. —種配位體，其包含一或多個單一可變域，其中該一或 多個單一可變域中之至少一者為特異性結合血清白蛋白 之抗體單一可變域。 4· 如請求項3之配位體，其中該配位體包含特異性結合血 清白蛋白之單體抗體單一可變域。 129025.doc 200848427 5·如請求項4之配位體，其中該單體抗體單一可變域係與 藥物結合。 6·如請求項4之配位體，其中該配位體為雙特異性配位 體，其中該雙特異性配位體包含第一抗體單一可變域， 其中該第一抗體單一可變域特異性結合血清白蛋白。 7 ·如請求項6之雙特異性配位體，其中該雙特異性配位體 進一步包含第二抗體單一可變域，其中該第二抗體單一 可變域特異性結合除血清白蛋白以外的標乾。 8. 如請求項7之雙特異性配位體，其中： a·該第一抗體單一可變域及該第二單一抗體單一可變域 各自為抗體重鏈單一可變域；或 b. 該第一抗體單一可變域及該第二單一抗體單一可變域 各自為抗體輕鍵單一可變域；或 c. 該第一抗體單一可變域為抗體重鏈單一可變域且該第 二單一抗體單一可變域為抗體輕鏈單一可變域；或 d·該第一抗體單一可變域為抗體輕鏈單一可變域且該第 二單一抗體單一可變域為抗體重鏈單一可變域。 9. 一種IgG，其包含如請求項8之雙特異性配位體，其中該 IgG包含4個抗體單一可變域。 10 ·如請求項3之配位體，其中該抗體單一可變域包含一組4 個Kabat抗體框架區（FRs)，該組抗體框架區係經人類框 架生殖細胞系（germ line)抗體基因片段編碼。 11 ·如請求項3、4及5中任一項之配位體，其中該配位體包 含抗體重鏈單一可變域，其中該抗體重鏈單一可變域包 129025.doc -2 * 200848427 含一個選自由以下組成之群的抗體重鏈單一可變域之胺 基酸序歹|J ·· dAb8 、dAblO 、dAb36 、dAb7r20 、 dAb7r21、dAb7r22、dAb7r23、dAb7r24、dAb7r25、 dAb7r26、dAb7r27、dAb7r28、dAb7r29、dAb7r30、 dAb7r31、dAb7r32、dAb7r33、dAb7h21、dAb7h22、 dAb7h23、Ab7h24、Ab7h25、Ab7h26、dAb7h27、 dAb7h30、dAb7h3 1，及與其至少80% —致的胺基酸序 列。 12. 如請求項3、4及6中任一項之配位體，其中該配位體包 含抗體輕鏈單一可變域，其中該抗體輕鏈單一可變域包 含一個選自由以下組成之群的抗體輕鏈單一可變域之胺 基酸序歹|J : dAb2、dAb4、dAb7、dAbll、dAbl2、 dAbl3、dAbl5、dAbl6、dAbl7、dAbl8、dAbl9、 dAb21、dAb22、dAb23、dAb24、dAb25、dAb26、 dAb27、dAb30、dAb31、dAb33、dAb34、dAb35、 dAb38、dAb41、dAb46 ' dAb47、dAb52、dAb53、 dAb54、dAb55、dAb56、drdAb7m 12、dAb7m 16、 dAb7m26、dAb7r 1 、dAb7r3 、dAb7r4、dAb7r5 、 dAb7r7、dAb7r8、dAb7rl3、dAb7rl4、dAb7rl5、 dAb7rl6、dAb7rl7、dAb7rl8、dAb7rl9、dAb7hl、 dAb7h2、dAb7h6、dAb7h7、dAb7h8 、dAb7h9、 dAb7hlO、dAb7hll、dAb7hl2、dAb7hl3、dAb7hl4、 dAb7pl及dAb7p2，及與其至少80%—致的胺基酸序列。 13. 如請求項3、4及6中任一項之配位體，其中該配位體包 129025.doc 200848427 含特異性結合血清白蛋白之抗體單一可變域，且其中該 抗體單一可變域與包含一個選自由以下組成之群的抗體 單一可變域之胺基酸序列的抗體單一可變域競爭結合於 血清白蛋白：dAb8、dAblO、dAb36、dAb7r20、 dAb7r21、dAb7r22、dAb7r23、dAb7r24、dAb7r25、 dAb7r26、dAb7r27、dAb7r28 、dAb7r29、dAb7r30、 dAb7r31 、dAb7r32、dAb7r33、dAb7h21 、dAb7h22、 dAb7h23 、 Ab7h24 、 Ab7h25 、 Ab7h26 、 dAb7h27 、 ( dAb7h30、dAb7h31、dAb2、dAb4、dAb7、dAbll、 dAbl2 、 dAbl3 、 dAbl5 、 dAbl6 、 dAbl7 、 dAbl8 、 dAbl9、dAb21 、dAb22、dAb23 、dAb24、dAb25 、 dAb26、dAb27 、dAb30、dAb31 、dAb33 、dAb34、 dAb35 、dAb38 、 dAb41 、dAb46 、dAb47 、dAb52 、 dAb53 、 dAb54 、 dAb55 、 dAb56 、 dAb7ml2 、 dAb7ml 6 、 dAb7m26 、 dAb7rl 、 dAb7r3 、 dAb7r4 、 dAb7r5 、 dAb7r7 、 dAb7r8 、 dAb7rl3 、 dAb7rl4 、 dAb7rl5 、dAb7rl6 、dAb7rl7 、dAb7rl8 、dAb7rl9 、 dAb7hl 、 dAb7h2 、 dAb7h6 、 dAb7h7 、 dAb7h8 、 dAb7h9、dAb7hlO、dAb7hll、dAb7hl2、dAb7hl3、 dAb7hl4 ' dAb7pl 及 dAb7p2 o 14.如請求項3或4之配位體，其中該抗體單一可變域包含一 或多個來自選自由以下組成之群的抗體單一域抗體之 CDR : dAb8、dAblO、dAb36、dAb7r20、dAb7r21、 dAb7r22、dAb7r23 、dAb7r24、dAb7r25 、dAb7r26、 129025.doc -4 - 200848427 dAb7r27、dAb7r28、dAb7r29、dAb7r30、dAb7r31、 dAb7r32、dAb7r33、dAb7h21、dAb7h22、dAb7h23、 Ab7h24、Ab7h25、Ab7h26、dAb7h27、dAb7h30、 dAb7h31、dAb2、dAb4、dAb7、dAbll、dAbl2、 dAbl3、dAbl5、dAbl6、dAbl7、dAbl8、dAbl9、 dAb21、dAb22、dAb23、dAb24、dAb25、dAb26、 dAb27、dAb30、dAb31、dAb33、dAb34、dAb35、 dAb38、dAb41、dAb46、dAb47、dAb52 ' dAb53、 dAb54 、dAb55 、dAb56 、dAb7ml2 、dAb7ml6 、 dAb7m26、dAb7r 1 、dAb7r3 、dAb7r4、dAb7r5、 dAb7r7、dAb7r8、dAb7rl3、dAb7rl4、dAb7rl5、 dAb7rl6、dAb7rl7、dAb7rl8、dAb7rl9、dAb7hl、 dAb7h2、dAb7h6 、dAb7h7、dAb7h8 、dAb7h9、 dAb7hlO、dAb7hll、dAb7hl2、dAb7hl3、dAb7hl4、 dAb7pl 及 dAb7p2 o 15.如請求項14之配位體，其中該抗體單一可變域進一步包 含一個選自由以下組成之群的框架：CTL A4、脂質運載 蛋白（lipocallin)、葡萄球菌蛋白A(SpA)、親和體（Affibo-dy)、高親和性多聚體（avimer)、GroEl、GroES、運鐵蛋 白及纖連蛋白（fibronectin)。 16 ·如請求項7之配位體，其中該第二抗原或抗原決定基 (epitope)結合特異性為對於一種選自由以下組成之群的 抗原之結合特異性··細胞激素、細胞激素受體、酶、酶 輔因子及DNA結合蛋白。 129025.doc 200848427 17·如睛求項2、3、6及8中任一項之配位體，其中如表面電 水共振所測定，該抗體單一可變域以一個選自由以下組 成之群的解離常數（Kd)特異性結合一個抗原決定基或抗 原· Ιχίο·3 Μ或以下、ΐχ10-4 Μ或以下、ΐχΐ〇-5 Μ或以 下、1χΐ(Τ6 Μ或以下、ΐχ10-7 Μ或以下、1χ1〇-8 Μ或以下 及1 χ ΙΟ·9 Μ或以下。 18·如請求項1、2、4及6中任一項之配位體，其中該配位體 進步包含一或多個選自由標籤、標記物及藥物組成之 群的實體。 19· 一種組合物，其包含如請求項2、3、4及6中任一項之配 位體及其載劑。 20· —種配位體，其包含單一可變域，其中該單一可變域以 在彼此10倍之内的Kd值特異性結合於人類血清白蛋白及 非人類血清白蛋白，且其中該單一可變域為非天然存在 之單一可變域。 21 · —種配位體，其包含抗體單一可變域，其中該抗體單一 可變域以在彼此10倍之内的〖(1值特異性結合於人類血清 白蛋白及非人類血清白蛋白。 22. 如請求項21之配位體’其中在人類宿主中該配位體之邛 半衰期與人類血清白蛋白之Τβ半衰期大體上相同。 23. 如請求項21之配位體，其中該抗體單一可變域特異性結 合於人類血清白蛋白及小鼠血清白蛋白。 24. 如請求項21之配位體，其中該抗體單—可變域特異性結 合於人類血清白蛋白及大鼠血清白蛋白。 129025.doc 200848427 25. 如請求項21之配位體，其中該抗體單一可變域特異性結 合於人類血清白蛋白及豬血清白蛋白。 26. 如請求項2 1之配位體，其中該抗體單一可變域特異性結 合於人類血清白蛋白及獼猴（cynomolgus)血清白蛋白。 27. 如請求項2 1之配位體，其中該抗體單一可變域為抗體重 鍵單一可變域。 28. 如請求項27之配位體，其中該抗體重鏈單一可變域為抗 體VH3單一可變域。 29. 如請求項28之配位體，其中該抗體VH3單一可變域為人 類抗體VH3單一可變域。 3 0.如請求項21之配位體，其中該抗體單一可變域為抗體輕 鍵單一可變域。 3 1.如請求項30之配位體，其中該抗體輕鏈單一可變域為抗 體VK輕鏈單一可變域。 32. 如請求項30之配位體，其中該配位體包含至少一個抗體 VK單一可變域，其包含一個選自由以下組成之群的抗體 單一可變域之胺基酸序列：DOM7h-9、DOM7h-ll、 DOM7h-13、DOM7h-14、DOM7r-3 及 DOM7r-16，及與其 至少80%—致的胺基酸序列。 33. 如請求項30之配位體，其中該配位體包含至少一個抗體 VK單一可變域，其與一個選自由以下組成之群的抗體單 一可變域競爭結合於血清白蛋白：dAb8、dAblO、 dAb36、dAb7r20、dAb7r21、dAb7r22、dAb7r23、 dAb7r24 、dAb7r25 、dAb7r26、dAb7r27 、dAb7r28、 129025.doc 200848427 dAb7r29、dAb7r30、dAb7r31、dAb7r32、dAb7r33、 dAb7h21、dAb7h22、dAb7h23、Ab7h24、Ab7h25、 Ab7h26、dAb7h27、dAb7h30、dAb7h31、dAb2、 dAb4、dAb7、dAbll、dAbl2、dAbl3、dAbl5、 dAbl6、dAbl7、dAbl8、dAbl9、dAb21、dAb22、 dAb23、dAb24、dAb25 > dAb26、dAb27、dAb30、 dAb31、dAb33、dAb34、dAb35、dAb38、dAb41、 dAb46、dAb47、dAb52、dAb53、dAb54、dAb55、 dAb56、dAb7ml2、dAb7ml6、dAb7m26、dAb7rl、 dAb7r3 、 dAb7r4 、 dAb7r5 、 dAb7r7 、 dAb7r8 、 dAb7rl3、dAb7rl4、dAb7rl5、dAb7rl6、dAb7rl7、 dAb7rl8、dAb7rl9、dAb7hl、dAb7h2、dAb7h6、 dAb7h7、dAb7h8、dAb7h9、dAb7hlO、dAb7hll、 dAb7hl2 、 dAb7hl3 、 dAb7hl4 、 dAb7pl及dAb7p2 ° 34.如請求項23、24、25及26中任一項之配位體，其中該抗 體單一可變域包含一組4個Kabat抗體框架區（FRs)。 3 5.如請求項34之配位體，其中該組4個Kabat抗體框架區 (FRs)係由抗體VH3框架生殖細胞系抗體基因片段編碼。 3 6.如請求項34之配位體，其中該組4個Kabat抗體框架區 (FRs)係由人類Vjl架生殖細胞系抗體基因片段編碼。 3 7.如請求項34之配位體，其中一組CDRs移植於該包含一組 4個Kabat抗體框架區之單一可變域上，其中該組CDRs包 含 CDR1、CDR2及 CDR3。 3 8.如請求項20、21、23、24、25及26中任一項之配位體， 129025.doc 200848427 其進一步包含一或多個能夠特異性結合除血清白蛋白以 外的標靶之單一可變域。 39·如請求項38之配位體，其中該一或多個能夠特異性結合 除血清白蛋白以外的標靶之單一可變域為抗體單一可變 域。 40·如請求項21之配位體，其中該抗體單一可變域包含至少 一個CDR區，其中該至少一個cdr區係選自由CDR1、 CDR2及CDR3組成之群，且其中該⑶汉區之至少一者係 來自抗體V區或抗體單一可變域。 41·如請求項39之配位體，其中該等特異性結合除血清白蛋 白以外的標靶之抗體單一可變域中之至少一者包含至少 一個CDR區，其中該至少一個CDR區係選自由CDR1、 CDR2及CDR3組成之群，且其中該CDR區之至少一者係 來自抗體V區或抗體单^-可變域。 42·如請求項40之配位體，其中該抗體單一可變域進一步包 含一個選自由以下組成之群的支架（scaff〇ld) : CTLA-4、脂質運載蛋白、葡萄球菌蛋白A(SpA)、Gr〇EL、 GroES、運鐵蛋白及纖連蛋白。 43·如請求項21、23、24、25及26中任一項之配位體，其中 該抗體單一可變域以小於或等於3〇〇 nM之Kd特異性結合 人類血清白蛋白。 44·如請求項21、23、24、25及26中任一項之配位體，其中 该特異性結合於人類血清白蛋白之抗體單一可變域特異 性結合於人類A清白蛋白之域Η。 129025.doc -9- 200848427 45·如請求項39之配位體，其中該配位體為雙特異性配位 體，且其中： a·該特異性結合血清白蛋白之抗體單一可變域及該特異 性結合除血清白蛋白以外的標靶之抗體單一可變域各 為抗體重鍵單一可變域丨咬 b•該特異性結合血清白蛋白之抗體單一可變域及該特異 性結合除血清白蛋白以外的標靶之抗體單一可變域各 為抗體輕鍵單一可變域；咬 C·該特異性結合血清白蛋白之抗體單一可變域為抗體重 鏈單一可變域，且該特異性結合除血清白蛋白以外的 標靶之抗體單一可變域為抗體輕鏈單一可變域；或 d ·該特異性結合血清白蛋白之抗體單—可變域為抗體輕 鏈單一可變域，且該特異性結合除血清白蛋白以外的 標靶之抗體單一可變域為抗體重鏈單一可變域。 46. —種配位體，其包含單—可變域，其中該單一可變域特 異性結合於人類A清白蛋白之域„，且其中該單一可變 域為非天然存在之單一可變域。 47. -種配位體’其包含抗體單一可變域，其中該抗體單一 可變域特異性結合於人類血清白蛋白之域π。 48. 如請求項47之配位體，其中該抗體單一可變域為非天然 存在之抗體單一可變域。 49. 如請求項47之配位體，其中該抗體 卞」欠竦為天然存 在之抗體單一可變域。 50. 如請求項47之配位體，其中該抗 千 j欠域為抗體重 129025.doc -10- 200848427 鍵單一可變域。 5 1 ·如請求項50之配位體，其中該抗體重鏈單一可變域為抗 體VH3單一可變域。 52. 如請求項51之配位體，其中該抗體VH3單一可變域為人 類抗體VH3單一可變域。 53. 如請求項47之配位體，其中該抗體單一可變域為抗體VK 單一可變域。 54. 如請求項53之配位體，其中該抗體VK單一可變域係選自 由以下組成之群：DOM7h-l、DOM7h-8、DOM7h-9、 DOM7h-ll 、DOM7h-12、DOM7h-13 及 DOM7r-14。 DOM7r-3 及 DOM7r-16。 5 5.如請求項47之配位體，其中該抗體單一可變域包含一組 4個Kabat抗體框架區（FRs)，該組抗體框架區係經抗體 VH3框架生殖細胞系抗體基因片段編碼。 56.如請求項47之配位體，其中該抗體單一可變域包含一組 4個Kabat抗體框架區（FRs)，該組抗體框架區係經VK框架 生殖細胞糸抗體基因片段編碼。 5 7.如請求項47之配位體，其進一步包含一或多個能夠特異 性結合除血清白蛋白以外的標靶之單一可變域。 5 8.如請求項57之配位體，其中該一或多個能夠特異性結合 除血清白蛋白以外的標靶之單一可變域為抗體單一可變 域。 59.如請求項47之配位體，其中該抗體單一可變域包含至少 一個抗體CDR1、CDR2及/或CDR3區。 129025.doc 11 200848427 60.如請求項59之配位體，其中該抗體單一可變域進一步包 含一個選自由以下組成之群的支架：CTL A-4、脂質運載 蛋白、葡萄球菌蛋白A(SpA)、GroEL、GroES、運鐵蛋 白及纖連蛋白。 61 ·如請求項47之配位體，其中該抗體單一可變域以小於或 等於300 πΜ之Kd特異性結合人類血清白蛋白。 62·如請求項58之配位體，其中該配位體為雙特異性配位 體，且其中：
    a•該特異性結合於血清白蛋白之域Π的抗體單 及該特異性結合於除血清白蛋白以外的標靶之抗體單 一可變域各為抗體重鏈單一可變域；或 b.該特異性結合於血清白蛋白之域π的抗體單一可變域 及該特異性結合於除血清白蛋白以外的標靶之抗體單 一可變域各為抗體輕鏈單一可變域；或 c·忒特異性結合於血清白蛋白之域η的抗體單一可變域 為抗體重鏈單一可變㉟，且t亥特異性結合於除血清白 蛋白以外的抗原之抗體單一可變域為抗體輕鏈單—可 變域；或 d. 4特異性結合於血清白蛋白之域η的抗體單—可變域 為抗體輕鏈單-可變域，且該特異性結合於除血清白 蛋白以外的抗原之抗體單一可變域為抗 變域。 项早可 XJU 早 融合蛋白質，纟包含特異性結合血清白蛋白之第 早可變域，及第二單一可變域，其中該第一及第二 129025.doc -12- 200848427 一可變域各為非天然存在之單一可變域，且其中·· i)該 第一單一可變域係與該第二單一可變域之N端連接；或 2)該第一單一可變域係與該第二單一可變域之C端連 接；或3)該第一單一可變域係與該第二單一可變域之N 端及該第二單一可變域之C端連接。 64.如請求項63之融合蛋白質，其中該融合蛋白質進一步包 含另一單一可變結合域，其中該單一可變域為非天然存 在之單一可變域，且其中該另一單一可變結合域係與該 第一單一可變域鄰接，或該另一單一可變結合域係與該 第一單一可變域之N端連接或係與該第一單一可變域之C 端連接。 65 ·如請求項63之融合蛋白質，其中該第一單一可變域為抗 體單一可變域，且該抗體單一可變域之N端係與該第二 單一可變域之COOH端直接連接，形成該第二單一可變 域之該COOH端與該抗體單一可變域之N端胺基酸連接的 接點，其中該抗體單一可變域係選自由以下組成之群： VK域、νλ域、抗體重鏈域及VHH域。 66. 如請求項65之融合蛋白質，其中該抗體單一可變域為VK 域，且該接點包含一個選自由以下組成之群的胺基酸序 列：XXXDIQ、XXXNIQ、XXXAIQ、XXXAIR、 XXXVIW、XXXDIV、XXXDVV、XXXEIV 及 XXXETT， 且其中XXX表示該第二單一可變域之最後三個胺基酸。 67. 如請求項65之融合蛋白質，其中該抗體單一可變域為νλ 域，其中該接點包含一個選自由以下組成之群的胺基酸 129025.doc -13 - 200848427 序歹: XXXQSV、XXXQSA、XXXSYE、XXXSSE、 XXXSYV 、 XXXLPV 、 XXXQPV 、 XXXQLV 、 XXXQAV、XXXNFM、XXXQTV 及 XXXQAG，且其中 XXX表示該第二單一可變域之最後三個胺基酸。 68. 如請求項65之融合蛋白質，其中該抗體單一可變域為抗 體重鏈單一可變域，且該接點包含一個選自由以下組成 之群的胺基酉复序歹J : XXXQVQ、XXXQMQ、XXXEVQ、 XXXQIT、XXXQVT及XXXQLQ，且其中XXX表示該第 二單一可變域之最後三個胺基酸。 69. 如請求項65之融合蛋白質，其中該抗體單一可變域為 VHH域，且該接點包含一個選自由以下組成之群的胺基 酸序列：XXXEVQ、XXXQVQ、XXXDVQ、XXXQVK及 XXXAVQ，且其中XXX表示該第二單一可變域之最後三 個胺基酸。 70·如請求項63之融合蛋白質，其中該第一單一可變域為抗 體單一可變域，其中該抗體單一可變域之COOH端係與 該第二單一可變域之N端直接連接，形成該第二單一可 變域之該N端與該抗體單一可變域之COOH端胺基酸連接 的接點，且其中該抗體單一可變域係選自由以下組成之 群：VK域、乂^或、抗體重鏈域及VHH域。 71.如請求項70之融合蛋白質，其中該抗體單一可變域為VK 域，且該接點包含一個選自由以下組成之群的胺基酸序 歹丨j ： KVEIKXXX 、 KLEIKXXX 、 KVDIKXXX 、 RLEIKXXX及EIKXXX，且其中XXX表示該第二單一可 129025.doc -14- 200848427 變域之最前三個胺基酸。 72·如請求項70之融合蛋白質，其中該抗體單一可變域為νλ 域，且該接點包含一個選自由以下組成之群的胺基酸序 歹，J : KVDVLXXX、KLDVLXXX 及 QLDVLXXX，且其中 XXX表示該第二單一可變域之最前三個胺基酸。 73·如請求項70之融合蛋白質，其中該抗體單一可變域為抗 體重鏈單一可變域，且該接點包含VTVSSXXX胺基酸序 列，且其中XXX表示該第二單一可變域之最前三個胺基 酸。 74.如請求項70之融合蛋白質，其中該抗體單一可變域為 VHH域，且該接點包含VTVSSXXX胺基酸序歹，且其中 XXX表示該第二單一可變域之最前三個胺基酸。 75 ·如請求項65之融合蛋白質，其中該抗體單一可變域係經 由一個肽連接子連接至該第二單一可變域，且其中該肽 連接子係選自由可撓性連接子、約束（constrained)連接 子及天然連接子組成之群。 76. 如請求項75之融合蛋白質，其中該抗體單一可變域之N 端係經由該肽連接子連接至該第二單一可變域之C00H 端，或其中該抗體單一可變域之域的COOH端係經由該 肽連接子連接至該第二單一可變域之N端。 77. 如請求項75之融合蛋白質，其中該可撓性連接子為富含 甘胺酸之連接子或富含絲胺酸之連接子。 78. 如請求項75之融合蛋白質，其中該約束連接子具有一個 選自由 SSSASASSA、GSPGSPG及 ATTTGSSPGPT組成之 129025.doc -15· 200848427 群的序列。 79.如請求項75之融合蛋白質，其中該天然連接子具有一個 選自由 KESGSVSSEQLAQFRSLD、EPKIPQPQPKPQPQP QPQPKPQPKPEPECTCPKCP 及 GTNEVCKCPKCP 組成之 群的序列。
    129025.doc -16-
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Families Citing this family (118)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG189682A1 (en) * 2008-03-31 2013-05-31 Glaxo Group Ltd Drug fusions and conjugates
CN102076355B (zh) 2008-04-29 2014-05-07 Abbvie公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
US9109026B2 (en) 2008-06-03 2015-08-18 Abbvie, Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
EP3002299A1 (en) 2008-06-03 2016-04-06 AbbVie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
KR20110031369A (ko) 2008-07-08 2011-03-25 아보트 러보러터리즈 프로스타글란딘 ｅ2 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
WO2010043057A1 (en) 2008-10-14 2010-04-22 National Research Counsil Of Canada Bsa-specific antibodies
CN102307897B (zh) 2008-12-05 2016-01-20 葛兰素集团有限公司 选出蛋白酶抗性多肽的方法
US20110301335A1 (en) * 2009-02-19 2011-12-08 Stephen Duffield Anti-tnfr1 polypeptides, antibody variable domains & antagonists
MA33052B1 (fr) * 2009-02-19 2012-02-01 Glaxo Group Ltd Variants de liaison anti-albumine sérique améliorés
AR075505A1 (es) 2009-02-19 2011-04-06 Glaxo Group Ltd Variantes de union a anti- albumina de suero mejoradas
TW201100104A (en) * 2009-03-27 2011-01-01 Glaxo Group Ltd Drug fusions and conjugates
WO2010122090A1 (en) 2009-04-24 2010-10-28 Glaxo Group Limited Fgfr1c antibody combinations
WO2011008814A2 (en) 2009-07-14 2011-01-20 Immune Tolerance Institute, Inc., A California Not-For-Profit Corporation Multiplexed measurement of exogenous and endogenous dna
CA2768460A1 (en) 2009-07-16 2011-01-20 Glaxo Group Limited Antagonists, uses & methods for partially inhibiting tnfr1
CN102574914A (zh) * 2009-07-16 2012-07-11 葛兰素集团有限公司 改进的抗血清清蛋白结合性单可变区
IN2012DN00412A (zh) 2009-07-29 2015-05-22 Glaxo Group Ltd
NZ598929A (en) * 2009-09-01 2014-05-30 Abbvie Inc Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US20120276098A1 (en) 2009-09-30 2012-11-01 Bruce Hamilton Drug fusions and conjugates with extended half life
CN102666875A (zh) * 2009-10-15 2012-09-12 雅培制药有限公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
ES2552177T3 (es) * 2009-10-27 2015-11-26 Glaxo Group Limited Polipéptidos anti-TNFR1 estables, dominios variables de anticuerpos y antagonistas
UY32979A (es) * 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
CA2786660A1 (en) 2010-01-14 2011-07-21 Glaxo Group Limited Liver targeting molecules
US20130045895A1 (en) 2010-04-21 2013-02-21 Rudolf Maria De Wildt Binding domains
EP2571900A1 (en) * 2010-05-20 2013-03-27 Glaxo Group Limited Improved anti-serum albumin binding variants
ES2674567T3 (es) 2010-05-21 2018-07-02 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Proteínas de fusión biespecíficas
EP2571898B1 (en) * 2010-05-21 2021-07-21 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services High-affinity fully functional soluble single-domain human cd4, antibodies, and related fusion proteins
BR112013002578A2 (pt) 2010-08-03 2019-05-14 Abbvie Inc. imunoglobinas de domínio variável duplo e usos das mesmas
EP2603522A1 (en) 2010-08-13 2013-06-19 GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Limited Improved anti-serum albumin binding variants
BR112013003899A2 (pt) * 2010-08-20 2016-06-07 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd domínio variável único da imunoglobina anti-albumina sérica (sa), ligando multiespecífico, proteína de fusão, composição, ácido nucleico, vetor, célula hospedeira isolada, e, método de tratar ou previnir uma doença ou distúrbio em um paciente
AU2011293253B2 (en) 2010-08-26 2014-12-11 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
WO2012042026A1 (en) 2010-09-30 2012-04-05 Ablynx Nv Biological materials related to c-met
US11644471B2 (en) 2010-09-30 2023-05-09 Ablynx N.V. Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
KR20140032356A (ko) 2010-11-26 2014-03-14 몰리큘라 파트너스 아게 설계된 안키린 반복 단백질에 대한 개선된 n-말단 캡핑 모듈
WO2012072731A2 (en) 2010-12-01 2012-06-07 Glaxo Group Limited Improved anti-serum albumin binding single variable domains
CN103443126B (zh) 2011-01-06 2016-11-23 葛兰素集团有限公司 结合TGFβ受体II的配体
US20130310281A1 (en) 2011-02-02 2013-11-21 Glaxo Group Limited Novel antigen binding proteins
WO2012136790A1 (en) 2011-04-07 2012-10-11 Glaxo Group Limited Compositions comprising fusion proteins or conjugates with an improved half -life
WO2012136792A2 (en) 2011-04-07 2012-10-11 Glaxo Group Limited Cck compositions
SI2726510T1 (sl) 2011-05-27 2023-06-30 F. Hoffmann - La Roche Ag Dvojno ciljanje
WO2012163521A1 (en) 2011-05-27 2012-12-06 Dutalys Removal of monomeric targets
HUE031828T2 (en) * 2011-06-23 2017-08-28 Ablynx Nv Procedures for Predicting, Detecting, and Reducing Aspiration Protein Interference in Assays Containing Immunoglobulin Variable Single Domain
CA2839779C (en) * 2011-06-23 2020-10-06 Ablynx Nv Serum albumin binding proteins
EP3020728A1 (en) * 2011-06-23 2016-05-18 Ablynx N.V. Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobin single variable domains
US9346884B2 (en) 2011-09-30 2016-05-24 Ablynx N.V. Biological materials related to c-Met
DK2776466T3 (da) 2011-11-11 2017-11-20 Ucb Biopharma Sprl Albuminbindende antistoffer og bindingsfragmenter deraf
TW201333035A (zh) 2011-12-30 2013-08-16 Abbvie Inc 針對ｉｌ－１３及／或ｉｌ－１７之雙特異性結合蛋白
CN102661932B (zh) * 2012-04-17 2014-07-23 王利兵 一种基于表面等离子共振技术的种质资源中特定dna序列鉴定方法
AU2013257848A1 (en) 2012-05-07 2014-11-27 The University Court Of The University Of Aberdeen Single domain binding molecule
WO2014029752A1 (en) 2012-08-22 2014-02-27 Glaxo Group Limited Anti lrp6 antibodies
MY194330A (en) 2012-11-01 2022-11-28 Abbvie Inc Anti-dll4/vegf dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
WO2014111550A1 (en) 2013-01-17 2014-07-24 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Modified anti-serum albumin binding proteins
AU2014230741B2 (en) 2013-03-15 2017-04-13 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Anti-LAG-3 binding proteins
CN105324396A (zh) 2013-03-15 2016-02-10 艾伯维公司 针对IL-1β和/或IL-17的双重特异性结合蛋白
WO2014173959A2 (en) 2013-04-23 2014-10-30 The University Court Of The University Of Aberdeen Synthetic library of specific binding molecules
WO2015030539A1 (en) * 2013-08-30 2015-03-05 Aprilbio Co., Ltd An anti serum albumin fab-effector moiety fusion construct, and the preparing method thereof
US9580758B2 (en) 2013-11-12 2017-02-28 Luc Montagnier System and method for the detection and treatment of infection by a microbial agent associated with HIV infection
IL275497B (en) * 2014-03-20 2022-09-01 Bristol Myers Squibb Co Serum proteins with type iii fibronectin binding domains
KR20230053002A (ko) 2014-05-16 2023-04-20 아블린쓰 엔.브이. 개선된 면역글로불린 가변 도메인
TW201629215A (zh) * 2014-09-30 2016-08-16 拜耳保健有限責任公司 使用凝血酶之組成物及治療方法
US10093733B2 (en) 2014-12-11 2018-10-09 Abbvie Inc. LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins
JP6979577B2 (ja) * 2015-02-20 2021-12-15 アミロニクス アクティエボラーグ アルツハイマーａベータペプチド結合ポリペプチド
EP4272838A3 (en) 2015-04-02 2024-01-10 Molecular Partners AG Designed ankyrin repeat domains with binding specificity for serum albumin
MX2017014908A (es) 2015-05-21 2018-08-15 Harpoon Therapeutics Inc Proteinas de union triespecificas y metodos de uso.
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
ES2842306T3 (es) 2015-09-02 2021-07-13 Immutep Sas Anticuerpos anti LAG-3
ES2967078T3 (es) 2015-09-23 2024-04-25 Bristol Myers Squibb Co Dominios de fibronectina de tipo III de unión a seroalbúmina con velocidad de disociación rápida
JP7005019B2 (ja) 2015-10-02 2022-02-04 シルバー・クリーク・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 組織修復のための二重特異性治療用タンパク質
TWI756187B (zh) 2015-10-09 2022-03-01 美商再生元醫藥公司 抗ｌａｇ３抗體及其用途
NO2768984T3 (zh) 2015-11-12 2018-06-09
CN115925919A (zh) 2015-11-13 2023-04-07 埃博灵克斯股份有限公司 改进的血清白蛋白结合免疫球蛋白可变结构域
CN108473564B (zh) 2015-11-18 2022-04-08 埃博灵克斯股份有限公司 改进的血清白蛋白结合剂
UA125337C2 (uk) 2015-11-18 2022-02-23 Мерк Шарп І Доум Корп. Ctla4-зв'язувальні речовини
EP3377526A1 (en) 2015-11-18 2018-09-26 Merck Sharp & Dohme Corp. PD1/CTLA4 Binders
TW202216787A (zh) 2015-11-18 2022-05-01 美商默沙東藥廠 Pd1及／或 lag3結合劑
AU2017222700B2 (en) * 2016-02-26 2018-09-27 Imunexus Therapeutics Limited Multi-specific molecules
RU2018138122A (ru) 2016-04-05 2020-05-12 Глэксосмитклайн Интеллекчуал Проперти Дивелопмент Лимитед Новая терапия
WO2017189624A1 (en) * 2016-04-25 2017-11-02 Idea Orchard, Llc Engineered fha domains
KR102533456B1 (ko) 2016-05-18 2023-05-17 모더나티엑스, 인크. 릴랙신을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드
KR102530742B1 (ko) * 2016-05-20 2023-05-09 하푼 테라퓨틱스, 인크. 단일 도메인 혈청 알부민 결합 단백질
SG11201810331YA (en) 2016-05-20 2018-12-28 Harpoon Therapeutics Inc Single chain variable fragment cd3 binding proteins
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
KR102275008B1 (ko) 2016-11-23 2021-07-13 하푼 테라퓨틱스, 인크. 전립선 특이 막 항원 결합 단백질
EP3544629A4 (en) 2016-11-23 2020-06-17 Harpoon Therapeutics, Inc. TRISPECIFIC PROTEINS CIBLANG PSMA AND METHODS OF USE
CN110049997B (zh) 2016-12-07 2023-09-22 埃博灵克斯股份有限公司 改进的血清白蛋白结合免疫球蛋白单可变结构域
CN117285623A (zh) * 2017-01-17 2023-12-26 埃博灵克斯股份有限公司 改进的血清白蛋白结合物
JP7300385B2 (ja) * 2017-01-17 2023-06-29 アブリンクス エン．ヴェー． 改善された血清アルブミン結合剤
EA201991673A1 (ru) 2017-02-10 2020-01-17 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Меченные радиоактивным изотопом антитела к lag3 для иммуно-пэт-визуализации
WO2018151868A2 (en) 2017-02-16 2018-08-23 Sonnet Bio Therapeutics Albumin binding domain fusion proteins
US11535668B2 (en) 2017-02-28 2022-12-27 Harpoon Therapeutics, Inc. Inducible monovalent antigen binding protein
JP6886854B2 (ja) * 2017-04-13 2021-06-16 シスメックス株式会社 被検物質の情報取得方法
CN115028727A (zh) 2017-05-12 2022-09-09 哈普恩治疗公司 靶向msln的三特异性蛋白质及使用方法
AU2018265856B2 (en) 2017-05-12 2023-04-27 Harpoon Therapeutics, Inc. Mesothelin binding proteins
AU2018280679A1 (en) * 2017-06-05 2019-12-05 Numab Therapeutics AG Novel anti-HSA antibodies
US11155607B2 (en) 2017-07-19 2021-10-26 Vib Vzw Serum albumin binding agents
BR112020006999A2 (pt) 2017-10-10 2020-10-06 Numab Therapeutics AG anticorpo multiespecífico, composição farmacêutica e método de produção
EP3470426A1 (en) 2017-10-10 2019-04-17 Numab Therapeutics AG Multispecific antibody
CN111630070A (zh) 2017-10-13 2020-09-04 哈普恩治疗公司 三特异性蛋白质及使用方法
BR112020007249B1 (pt) 2017-10-13 2022-11-22 Harpoon Therapeutics, Inc Roteína de ligação a antígeno de maturação de célula b, proteína de ligação multiespecífica e uso das referidas proteínas
CN112654633A (zh) 2018-06-22 2021-04-13 科优基因公司 基于细胞因子的可生物活化药物及其使用方法
CN112996805A (zh) 2018-08-30 2021-06-18 Hcw生物科技公司 多链嵌合多肽和其用途
JP7407822B2 (ja) 2018-08-30 2024-01-04 エイチシーダブリュー バイオロジックス インコーポレイテッド 単鎖キメラポリペプチドおよびその使用
CN112888445A (zh) 2018-08-30 2021-06-01 Hcw生物科技公司 治疗老年化相关病症的方法
CA3114038A1 (en) 2018-09-25 2020-04-02 Harpoon Therapeutics, Inc. Dll3 binding proteins and methods of use
GB201818460D0 (en) * 2018-11-13 2018-12-26 Crescendo Biologics Ltd Single domain antibodies that bind human serum albumin
CN111423509B (zh) * 2019-01-10 2021-07-09 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 抗hsa单域抗体及其融合蛋白的亲和层析纯化方法
WO2020257639A1 (en) * 2019-06-21 2020-12-24 HCW Biologics, Inc. Multi-chain chimeric polypeptides and uses thereof
EP3816185A1 (en) 2019-11-04 2021-05-05 Numab Therapeutics AG Multispecific antibody directed against pd-l1 and a tumor-associated antigen
GB201919061D0 (en) 2019-12-20 2020-02-05 Ucb Biopharma Sprl Multi-specific antibody
CA3170833A1 (en) 2020-02-21 2021-08-26 Harpoon Therapeutics, Inc. Flt3 binding proteins and methods of use
EP4133084A1 (en) 2020-04-09 2023-02-15 Autolus Limited Polypeptide
GB202007441D0 (en) 2020-05-19 2020-07-01 Autolus Ltd Polypeptide
EP3915580A1 (en) 2020-05-29 2021-12-01 Numab Therapeutics AG Multispecific antibody
EP3988568A1 (en) 2020-10-21 2022-04-27 Numab Therapeutics AG Combination treatment
US20240067758A1 (en) 2020-12-07 2024-02-29 UCB Biopharma SRL Multi-specific antibodies and antibody combinations
JP2024504471A (ja) 2021-02-02 2024-01-31 ヌマブ セラピューティックス アーゲー Ｒｏｒ１およびｃｄ３に対する特異性を有する多重特異性抗体
EP4183800A1 (en) 2021-11-19 2023-05-24 Medizinische Hochschule Hannover Novel sars-cov-2 neutralizing antibodies
WO2024038095A1 (en) 2022-08-16 2024-02-22 Iome Bio NOVEL ANTI-RGMb ANTIBODIES
WO2024084203A1 (en) * 2022-10-18 2024-04-25 Isogenica Limited Single domain antibodies binding to albumin

Family Cites Families (206)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US700598A (en) 1901-03-21 1902-05-20 Le Carbone Sa Primary battery.
CU22545A1 (es) 1994-11-18 1999-03-31 Centro Inmunologia Molecular Obtención de un anticuerpo quimérico y humanizado contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico para uso diagnóstico y terapéutico
EP0467416A1 (en) 1983-09-01 1992-01-22 Hybritech Incorporated Antibody compositions of therapeutic agents having an extended serum half-life
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5120712A (en) 1986-05-05 1992-06-09 The General Hospital Corporation Insulinotropic hormone
SU1441787A1 (ru) 1987-04-29 1990-09-23 Институт Белка Ан Ссср Способ получени пептидов и белков в бесклеточной системе трансл ции
WO1988009344A1 (en) 1987-05-21 1988-12-01 Creative Biomolecules, Inc. Targeted multifunctional proteins
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
ES2056108T3 (es) 1987-07-07 1994-10-01 Hybrisens Ltd Empleo de interacciones anticuerpo/antigeno para proteger o modular la actividad biologica.
JP3040121B2 (ja) 1988-01-12 2000-05-08 ジェネンテク，インコーポレイテッド 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法
US5225540A (en) 1988-04-26 1993-07-06 Du Pont Merck Pharmaceutical Company Monoclonal antibodies to tissue plasminogen activator (t-pa) which prolong its functional half-life
AU4128089A (en) 1988-09-15 1990-03-22 Rorer International (Overseas) Inc. Monoclonal antibodies specific to human epidermal growth factor receptor and therapeutic methods employing same
AU634186B2 (en) 1988-11-11 1993-02-18 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
WO1990005785A1 (en) 1988-11-18 1990-05-31 The Regents Of The University Of California Method for site-specifically incorporating unnatural amino acids into proteins
SU1705302A1 (ru) 1988-12-22 1992-01-15 Институт Белка Ан Ссср Способ препаративной экспрессии генов в бесклеточной системе сопр женной транскрипции/трансл ции
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
CA2064754C (en) 1989-07-31 1996-06-18 Vladimir Ivanovich Baranov Method of preparing polypeptides in a cell-free translation system
SE509359C2 (sv) 1989-08-01 1999-01-18 Cemu Bioteknik Ab Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel
DK0486526T3 (da) 1989-08-07 1996-06-24 Peptide Technology Ltd Bindingsligander for tumornekrosefaktor
US6451983B2 (en) 1989-08-07 2002-09-17 Peptech Limited Tumor necrosis factor antibodies
US5977307A (en) 1989-09-07 1999-11-02 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific ligand-neuropharmaceutical agent fusion proteins
KR0185192B1 (ko) 1989-10-05 1999-04-01 제임스 더블유. 데이비 신규의 유전자 및 폴리펩티드의 무세포 합성 및 분리
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5459061A (en) 1990-01-26 1995-10-17 W. Alton Jones Cell Science Center, Inc. Hybridomas producing monoclonal antibodies which specifically bind to continuous epitope on the human EGF receptor and compete with EGF for binding to the EGF receptor
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
EP0600866B1 (en) 1990-06-01 1997-12-03 Chiron Corporation Compositions and methods for identifying biologically active molecules
US5723286A (en) 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
CA2109602C (en) 1990-07-10 2002-10-01 Gregory P. Winter Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
GB9016299D0 (en) 1990-07-25 1990-09-12 Brien Caroline J O Binding substances
AU8498091A (en) 1990-08-02 1992-03-02 Regents Of The University Of Colorado, The Systematic polypeptide evolution by reverse translation
US5843701A (en) 1990-08-02 1998-12-01 Nexstar Pharmaceticals, Inc. Systematic polypeptide evolution by reverse translation
WO1992005258A1 (en) 1990-09-20 1992-04-02 La Trobe University Gene encoding barley enzyme
US5726152A (en) 1990-09-21 1998-03-10 Merck & Co., Inc. Vascular endothelial cell growth factor II
CA2104698A1 (en) 1991-02-21 1992-08-22 John J. Toole Aptamers specific for biomolecules and methods of making
JPH06508985A (ja) 1991-02-27 1994-10-13 クリエイティブ　バイオモレキュルズ　インコーポレイテッド 富セリンペプチドリンカー
US5525491A (en) 1991-02-27 1996-06-11 Creative Biomolecules, Inc. Serine-rich peptide linkers
CA2082160C (en) 1991-03-06 2003-05-06 Mary M. Bendig Humanised and chimeric monoclonal antibodies
US6582959B2 (en) 1991-03-29 2003-06-24 Genentech, Inc. Antibodies to vascular endothelial cell growth factor
OA10149A (en) 1991-03-29 1996-12-18 Genentech Inc Vascular endothelial cell growth factor antagonists
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
WO1993000917A1 (en) 1991-07-05 1993-01-21 Seragen, Inc. Epidermal growth factor receptor targeted molecules for treatment of inflammatory arthritis
EP0605522B1 (en) 1991-09-23 1999-06-23 Medical Research Council Methods for the production of humanized antibodies
US5270170A (en) 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
DE69233782D1 (de) 1991-12-02 2010-05-20 Medical Res Council Herstellung von Autoantikörpern auf Phagenoberflächen ausgehend von Antikörpersegmentbibliotheken
US5965132A (en) 1992-03-05 1999-10-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors
DK1589107T3 (da) 1992-08-21 2010-04-26 Univ Bruxelles Immonuglobuliner uden lette kæder
ATE199392T1 (de) 1992-12-04 2001-03-15 Medical Res Council Multivalente und multispezifische bindungsproteine, deren herstellung und verwendung
HU225496B1 (en) 1993-04-07 2007-01-29 Scios Inc Pharmaceutical compositions of prolonged delivery, containing peptides
US5426039A (en) 1993-09-08 1995-06-20 Bio-Rad Laboratories, Inc. Direct molecular cloning of primer extended DNA containing an alkane diol
AU8124694A (en) 1993-10-29 1995-05-22 Affymax Technologies N.V. In vitro peptide and antibody display libraries
SE9400088D0 (sv) 1994-01-14 1994-01-14 Kabi Pharmacia Ab Bacterial receptor structures
IL112372A (en) 1994-02-07 2001-08-26 Res Dev Foundation Non-viral vector for the delivery of genetic information to cells
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5834252A (en) 1995-04-18 1998-11-10 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
US6335160B1 (en) 1995-02-17 2002-01-01 Maxygen, Inc. Methods and compositions for polypeptide engineering
GB9410533D0 (en) 1994-05-26 1994-07-13 Lynxvale Ltd In situ hybridisation and immuno-Chemical localisation of a growth factor
GB9416721D0 (en) 1994-08-18 1994-10-12 Short Brothers Plc A bias yarn assembly forming device
ATE208633T1 (de) 1994-09-16 2001-11-15 Merck Patent Gmbh Immunokonjugate
US5573957A (en) 1994-09-28 1996-11-12 Spectral Diagnostics, Inc. Monoclonal antibody to human cardiac myoglobin
US5712381A (en) 1994-10-19 1998-01-27 Genetics Institute, Inc. MADD, a TNF receptor death domain ligand protein
US5928939A (en) 1995-03-01 1999-07-27 Ludwig Institute For Cancer Research Vascular endothelial growth factor-b and dna coding therefor
EP0739981A1 (en) 1995-04-25 1996-10-30 Vrije Universiteit Brussel Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes
US7060808B1 (en) 1995-06-07 2006-06-13 Imclone Systems Incorporated Humanized anti-EGF receptor monoclonal antibody
US6410690B1 (en) 1995-06-07 2002-06-25 Medarex, Inc. Therapeutic compounds comprised of anti-Fc receptor antibodies
EP0753551B1 (en) 1995-07-11 2000-02-09 E.I. Du Pont De Nemours And Company Ink set and process for alleviating bleed in printed elements
ES2176484T3 (es) 1995-08-18 2002-12-01 Morphosys Ag Bancos de proteinas/(poli)peptidos.
US6020473A (en) 1995-08-25 2000-02-01 Genentech, Inc. Nucleic acids encoding variants of vascular endothelial cell growth factor
US5989830A (en) 1995-10-16 1999-11-23 Unilever Patent Holdings Bv Bifunctional or bivalent antibody fragment analogue
US6096548A (en) 1996-03-25 2000-08-01 Maxygen, Inc. Method for directing evolution of a virus
US5664034A (en) 1996-05-21 1997-09-02 Lucent Technologies Inc. Lightwave communication monitoring switch
US5922845A (en) 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
US6013780A (en) 1996-09-06 2000-01-11 Technion Research & Development Co. Ltd. VEGF145 expression vectors
US6750044B1 (en) 1996-10-17 2004-06-15 Genentech, Inc. Variants of vascular endothelial cell growth factor having antagonistic properties, nucleic acids encoding the same and host cells comprising those nucleic acids
GB9625640D0 (en) 1996-12-10 1997-01-29 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
DE69835360T2 (de) 1997-01-17 2007-08-16 Maxygen, Inc., Redwood City EVOLUTION Prokaryotischer GANZER ZELLEN DURCH REKURSIVE SEQUENZREKOMBINATION
US6326204B1 (en) 1997-01-17 2001-12-04 Maxygen, Inc. Evolution of whole cells and organisms by recursive sequence recombination
US20030165467A1 (en) 1997-01-21 2003-09-04 Technion Research & Development Co., Ltd. Angiogenic factor and use thereof in treating cardiovascular disease
EP1712623B1 (en) 1997-01-21 2011-10-19 The General Hospital Corporation Selection of proteins using RNA-protein fusions
US6294170B1 (en) 1997-08-08 2001-09-25 Amgen Inc. Composition and method for treating inflammatory diseases
US6485942B1 (en) 1997-02-14 2002-11-26 Genentech, Inc. Variants of vascular endothelial cell growth factor having altered pharmacological properties, and recombinant methods of production
AUPO561697A0 (en) 1997-03-13 1997-04-10 Crc For Cardiac Technology Haemocompatible surfaces
IL131966A0 (en) 1997-03-18 2001-03-19 Novo Industri As An in vitro method for construction of a dna library
ATE418608T1 (de) 1997-03-18 2009-01-15 Novozymes As Methode zur herstellung einer bibliothek mittels dna-shuffling
US5948653A (en) 1997-03-21 1999-09-07 Pati; Sushma Sequence alterations using homologous recombination
US6153410A (en) 1997-03-25 2000-11-28 California Institute Of Technology Recombination of polynucleotide sequences using random or defined primers
US20020032315A1 (en) 1997-08-06 2002-03-14 Manuel Baca Anti-vegf antibodies
CA2288992C (en) 1997-04-30 2012-06-12 Enzon, Inc. Single-chain antigen-binding proteins capable of glycosylation, production and uses thereof
US20020173629A1 (en) 1997-05-05 2002-11-21 Aya Jakobovits Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
WO1998058965A2 (en) 1997-06-20 1998-12-30 Innogenetics N.V. B7-binding molecules for treating immune diseases
DE69826697T2 (de) 1997-07-07 2006-02-16 Medical Research Council In vitro selektionsmethode
WO1999005163A1 (en) 1997-07-24 1999-02-04 Medical Research Council Refolding method using a foldase and a chaperone
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
EP1027439B1 (en) 1997-10-27 2010-03-17 Bac Ip B.V. Multivalent antigen-binding proteins
US6399383B1 (en) 1997-10-28 2002-06-04 Maxygen, Inc. Human papilloma virus vectors
WO1999023107A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Maxygen, Incorporated Modification of virus tropism and host range by viral genome shuffling
DK2270234T3 (da) 1997-12-08 2013-06-03 California Inst Of Techn Fremgangsmåde til fremstilling af polynukleotid- og polypeptidsekvenser
US6777534B1 (en) 1997-12-09 2004-08-17 Children's Medical Center Corporation Peptide antagonists of vascular endothelial growth factor
AU2719099A (en) 1998-01-23 1999-08-09 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Multipurpose antibody derivatives
EP1056842A2 (en) 1998-02-11 2000-12-06 Maxygen, Inc. Genetic vaccine vector engineering
JP2002507393A (ja) 1998-02-11 2002-03-12 マキシジェン， インコーポレイテッド 抗原ライブラリー免疫
AUPP221098A0 (en) 1998-03-06 1998-04-02 Diatech Pty Ltd V-like domain binding molecules
US20020192211A1 (en) 1998-03-17 2002-12-19 Hudziak Robert M. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
US20030224001A1 (en) 1998-03-19 2003-12-04 Goldstein Neil I. Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth of tumors
ZA200007412B (en) 1998-05-15 2002-03-12 Imclone Systems Inc Treatment of human tumors with radiation and inhibitors of growth factor receptor tyrosine kinases.
US20030175271A1 (en) 1998-05-20 2003-09-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. VEGF activity inhibitor
CN1308683A (zh) 1998-06-29 2001-08-15 菲洛斯公司 用于产生高多样性文库的方法
US20020172678A1 (en) 2000-06-23 2002-11-21 Napoleone Ferrara EG-VEGF nucleic acids and polypeptides and methods of use
US7264801B2 (en) 1998-08-11 2007-09-04 Genentech, Inc. EG-VEGF nucleic acids and polypeptides and method of use
FR2782323B1 (fr) 1998-08-12 2002-01-11 Proteus Procede de production in vitro de sequences polynucleotidiques recombinees, banques de sequences et sequences ainsi obtenues
PT1115874E (pt) 1998-09-24 2009-04-09 Pharmacia & Upjohn Co Llc Secretase da doença de alzheimer
KR20010085850A (ko) 1998-09-29 2001-09-07 추후제출 코돈 변형 유전자의 재편성
US7488590B2 (en) 1998-10-23 2009-02-10 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
EP1002861A1 (en) 1998-10-26 2000-05-24 Unilever Plc Antigen-binding proteins comprising a linker which confers restricted conformational flexibility
IL127127A0 (en) 1998-11-18 1999-09-22 Peptor Ltd Small functional units of antibody heavy chain variable regions
IL143238A0 (en) 1998-12-02 2002-04-21 Phylos Inc Dna-protein fusions and uses thereof
US7115396B2 (en) 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
JP4731016B2 (ja) 1998-12-22 2011-07-20 ジェネンテック， インコーポレイテッド 血管内皮細胞増殖因子アンタゴニストとその用途
GB9900298D0 (en) 1999-01-07 1999-02-24 Medical Res Council Optical sorting method
US6436675B1 (en) 1999-09-28 2002-08-20 Maxygen, Inc. Use of codon-varied oligonucleotide synthesis for synthetic shuffling
WO2000042559A1 (en) 1999-01-18 2000-07-20 Maxygen, Inc. Methods of populating data structures for use in evolutionary simulations
IL138002A0 (en) 1999-01-19 2001-10-31 Maxygen Inc Methods for making character strings, polynucleotides and polypeptides having desired characteristics
WO2000060070A1 (en) 1999-04-01 2000-10-12 Innogenetics N.V. A polypeptide structure for use as a scaffold
SE9901379D0 (sv) 1999-04-19 1999-04-19 Pharmacia & Upjohn Ab Receptor structures
NZ514918A (en) 1999-04-28 2003-11-28 Univ Texas Compositions and methods for cancer treatment by selectively inhibiting VEGF
US6703020B1 (en) 1999-04-28 2004-03-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibody conjugate methods for selectively inhibiting VEGF
US7049410B2 (en) 1999-05-14 2006-05-23 Majumdar Adhip P N Antibodies to a novel EGF-receptor related protein (ERRP)
IL146480A0 (en) 1999-05-14 2002-07-25 Imclone Systems Inc Treatment of refractory human tumors with epidermal growth factor receptor antagonists
CA2372198A1 (en) 1999-05-14 2000-11-23 Medical Research Council Protein scaffold and its use to multimerise monomeric polypeptides
CA2373822A1 (en) 1999-05-20 2000-11-30 Scios Inc. Vascular endothelial growth factor variants
US6849425B1 (en) 1999-10-14 2005-02-01 Ixsys, Inc. Methods of optimizing antibody variable region binding affinity
US7608681B2 (en) 1999-12-24 2009-10-27 Genentech, Inc. Methods and compositions for prolonging elimination half-times of bioactive compounds
WO2001058953A2 (en) 2000-02-11 2001-08-16 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Identification of a domain in the tumor necrosis factor receptor family that mediates pre-ligand receptor assembly and function
JP4981229B2 (ja) 2000-02-25 2012-07-18 ルードヴィッヒ インスティテュート フォー キャンサー リサーチ ハイブリッド血管内皮成長因子ＤＮＡｓおよびタンパク質に関与する物質および方法
WO2001072829A2 (en) 2000-03-31 2001-10-04 Institut Pasteur Peptides blocking vascular endothelial growth factor (vegf)-mediated angiogenesis, polynucleotides encoding said peptides and methods of use thereof
PL357939A1 (en) 2000-04-11 2004-08-09 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
US20030166524A1 (en) 2000-05-22 2003-09-04 John Ford Therapeutic uses of IL-1 receptor antagonist
US20020103345A1 (en) 2000-05-24 2002-08-01 Zhenping Zhu Bispecific immunoglobulin-like antigen binding proteins and method of production
GB0013810D0 (en) 2000-06-06 2000-07-26 Celltech Chiroscience Ltd Biological products
EP2042518A3 (en) 2000-06-29 2009-04-08 Abbott Laboratories Dual specificity antibodies and methods of making and using
DE10038624C2 (de) 2000-08-03 2002-11-21 Broekelmann Aluminium F W Wärmeübertragungsrohr mit gedrallten Innenrippen
JP2004529610A (ja) 2000-10-13 2004-09-30 ユーエイビー リサーチ ファンデーション ヒト抗上皮増殖因子受容体一本鎖抗体
CZ308214B6 (cs) 2000-12-07 2020-03-04 Eli Lilly And Company GLP-1 fúzní proteiny
WO2002051870A2 (en) 2000-12-22 2002-07-04 GRAD, Carole Legal Representative of KAPLAN, Howard Phage display libraries of human vh fragments
US7054297B1 (en) 2000-12-28 2006-05-30 Cisco Technology, Inc. Distribution of packets to high data rate communications devices using multicast protocols
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
WO2002072141A2 (en) 2001-03-09 2002-09-19 William Herman Targeted ligands
CN1294148C (zh) 2001-04-11 2007-01-10 中国科学院遗传与发育生物学研究所 环状单链三特异抗体
US7667004B2 (en) 2001-04-17 2010-02-23 Abmaxis, Inc. Humanized antibodies against vascular endothelial growth factor
DK1390535T3 (da) 2001-04-26 2010-12-06 Amgen Mountain View Inc Kombinatoriske biblioteker af monomer-domæner
US20050089932A1 (en) 2001-04-26 2005-04-28 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US20050053973A1 (en) 2001-04-26 2005-03-10 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US20050048512A1 (en) 2001-04-26 2005-03-03 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
US20040175756A1 (en) 2001-04-26 2004-09-09 Avidia Research Institute Methods for using combinatorial libraries of monomer domains
KR20040029975A (ko) 2001-05-08 2004-04-08 메르크 파텐트 게엠베하 항-ｅｇｆｒ 항체 및 항호르몬제를 이용한 병용 요법
KR20090125840A (ko) 2001-06-13 2009-12-07 젠맵 에이/에스 표피 성장 인자 수용체 (ｅｇｆｒ)에 대한 인간 모노클로날 항체
US20060073141A1 (en) 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
DK1399484T3 (da) 2001-06-28 2010-11-08 Domantis Ltd Dobbelt-specifik ligand og anvendelse af denne
US20050271663A1 (en) 2001-06-28 2005-12-08 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
WO2004058821A2 (en) 2002-12-27 2004-07-15 Domantis Limited Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand
EP1421113A4 (en) 2001-08-03 2005-04-13 Commw Scient Ind Res Org SCREENING METHODS BASED ON CRYSTALLINE EGF RECEPTOR STRUCTURE
MXPA04002751A (es) 2001-09-24 2005-09-08 Univ Oregon Health & Science Modificacion del comportamiento de alimentacion.
KR20050036875A (ko) 2001-10-15 2005-04-20 이뮤노메딕스, 인코오포레이티드 직접 표적형의 결합 단백질
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
AU2002349228B2 (en) 2001-11-30 2007-06-14 National Research Council Of Canada Self-assembly molecules
DE10163459A1 (de) 2001-12-21 2003-07-03 Merck Patent Gmbh Lyophilisierte Zubereitung enthaltend Antikörper gegen EGF-Rezeptor
AU2003201998C1 (en) 2002-01-10 2012-10-25 Imperial Innovations Limited Modification of feeding behavior
EP1487879B1 (en) 2002-03-01 2012-12-26 Immunomedics, Inc. Bispecific antibody point mutations for enhancing rate of clearance
WO2004001064A2 (en) 2002-06-21 2003-12-31 Dyax Corporation Serum protein-associated target-specific ligands and identification method therefor
ATE328906T1 (de) 2002-06-28 2006-06-15 Domantis Ltd Dual-specifische liganden mit erhöhter halbwertszeit
US7696320B2 (en) * 2004-08-24 2010-04-13 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor
NZ605429A (en) 2002-09-06 2014-08-29 Amgen Inc Therapeutic human anti-il-1r1 monoclonal antibody
TW200501960A (en) 2002-10-02 2005-01-16 Bristol Myers Squibb Co Synergistic kits and compositions for treating cancer
ES2533963T3 (es) 2002-10-10 2015-04-16 Merck Patent Gmbh Composiciones farmacéuticas dirigidas a receptores Erb-B1
EP3299393A1 (en) 2002-11-08 2018-03-28 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against tumour necrosis factor-alpha and uses therefor
RU2357974C2 (ru) 2003-01-10 2009-06-10 Аблинкс Н.В. Терапевтические полипептиды, их гомологи, их фрагменты и их применение для модуляции агрегации, опосредованной тромбоцитами
WO2004070010A2 (en) 2003-02-01 2004-08-19 Tanox, Inc. A method for generating high affinity antibodies
US20050043233A1 (en) 2003-04-29 2005-02-24 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combinations for the treatment of diseases involving cell proliferation, migration or apoptosis of myeloma cells or angiogenesis
EP2357237A1 (en) 2003-05-14 2011-08-17 Domantis Limited A process for recovering polypeptides that unfold reversibly from a polypeptide repertoire
RS20150135A1 (en) 2003-05-30 2015-08-31 Genentech Inc. TREATMENT WITH ANTI-VEGF ANTIBODIES
EP1631317A2 (en) 2003-06-06 2006-03-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of vegf inhibitors for tumor regression
CN104059147A (zh) 2003-06-27 2014-09-24 艾默根佛蒙特有限公司 针对表皮生长因子受体的缺失突变体的抗体及其使用
ATE414106T1 (de) 2003-06-30 2008-11-15 Domantis Ltd Pegylierte single-domain-antikörper (dab)
AR046510A1 (es) 2003-07-25 2005-12-14 Regeneron Pharma Composicion de un antagonista de vegf y un agente anti-proliferativo
WO2005044853A2 (en) 2003-11-01 2005-05-19 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
US20050196340A1 (en) 2003-08-06 2005-09-08 Jocelyn Holash Use of a VEGF antagonist in combination with radiation therapy
EP1651663B1 (en) 2003-08-08 2017-05-17 Immunomedics, Inc. Bispecific antibodies for inducing apoptosis of tumor and diseased cells
US20050164301A1 (en) 2003-10-24 2005-07-28 Avidia Research Institute LDL receptor class A and EGF domain monomers and multimers
ATE485307T1 (de) 2003-11-07 2010-11-15 Ablynx Nv Camelidae schwere ketten antikörper vhhs gegen epidermalen wachstumfaktor rezeptor (egfr) und ihre verwendung
US20050226863A1 (en) 2003-11-20 2005-10-13 Massachusetts Institute Of Technology Single-domain antibodies and uses thereof
ATE504599T1 (de) 2004-01-16 2011-04-15 Regeneron Pharma Zur aktivierung von rezeptoren fähige fusionspolypeptide
US7767792B2 (en) 2004-02-20 2010-08-03 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Antibodies to EGF receptor epitope peptides
WO2005118642A2 (en) 2004-06-01 2005-12-15 Domantis Limited Bispecific fusion antibodies with enhanced serum half-life
MX2007000105A (es) 2004-07-06 2007-07-18 Bioren Inc Mutagenesis look-through para crear polipeptidos alterados con propiedades mejoradas.
US7180370B2 (en) 2004-09-01 2007-02-20 Micron Technology, Inc. CMOS amplifiers with frequency compensating capacitors
CN101724071A (zh) 2004-10-08 2010-06-09 杜门蒂斯有限公司 抗肿瘤坏死因子受体1的单域抗体及其使用方法
KR20070094909A (ko) * 2004-12-02 2007-09-27 도만티스 리미티드 혈청 알부민 및 ｇｌｐ-1 또는 ｐｙｙ를 표적으로 삼는이중특이성 도메인을 갖는 항체
MX2007006593A (es) * 2004-12-02 2008-03-04 Domantis Ltd Anticuerpos de dominio simple anti-il 1r1 y sus usos terapeuticos.
MX2007006602A (es) 2004-12-02 2007-12-10 Domantis Ltd Peptidos de dominio plad con vida media en suero aumentada debido a conjugacion con anticuerpos de dominio.
PL1888641T3 (pl) 2005-05-18 2012-05-31 Ablynx Nv Białka wiążące albuminę surowicy
KR20080077261A (ko) * 2005-12-06 2008-08-21 도만티스 리미티드 Ｅｇｆｒ 및/또는 ｖｅｇｆ에 대해 결합 특이성이 있는리간드 및 그의 사용 방법
GB0621513D0 (en) 2006-10-30 2006-12-06 Domantis Ltd Novel polypeptides and uses thereof

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