CN101965364A - 抗血清白蛋白的抗体单个可变区 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种双特异性配体，其包含具有第一结合特异性的第一免疫球蛋白可变区和具有第二结合特异性的互补或非互补的免疫球蛋白可变区。

Description

抗血清白蛋白的抗体单个可变区
相关申请
本申请是2004年12月28日提交的美国申请11/023,959的部分继续申请，后者是2003年6月30日提交的国际申请PCT/GB2003/002804的部分继续申请，后者要求2002年6月28日提交的PCT/GB02/03014和2002年12月27日提交的英国申请GB0230202.4的优先权，它们的内容通过引用并入本文。本申请还是2005年5月31日提交的WO2005118642的部分继续申请，后者要求2004年6月1日提交的US 60/576,271和2004年12月2日提交的US 60/632361的优先权，它们的内容通过引用并入本文。本申请还要求2007年2月8日提交的US 11/704,832的优先权。
本发明涉及双特异性配体。具体而言，本发明提供了一种制备双特异性配体的方法，该配体包括结合第一抗原或表位的第一免疫球蛋白单个可变区，和结合第二抗原或表位的第二免疫球蛋白单个可变区。更具体地，本发明涉及双特异性配体，其中结合第一和第二抗原或表位中的至少一种，即可以起到增强该配体的体内半衰期的作用。本发明描述了包含一个以上结合特异性的开放和闭合构象配体。
引言
抗体中的抗原结合区包括两个分开的区域：重链可变区(VH)和轻链可变区(VL：其可以是Vκ或Vλ)。抗原结合位点本身由6个多肽环组成：3个来自VH区(H1、H2和H3)，3个来自VL区(L1、L2和L3)。基因片段的组合重排造成编码VH和VL的V区基因的多种多样的初始功能库。VH基因是由3个基因片段即VH、D和JH重组而成。根据独特型，人类大约有51种功能性VH基因片段(Cookand Tomlinson(1995)Immunol Today，16：237)，25种功能性D基因片段(Corbett et al.(1997)J.Mol.Biol.，268：69)和6种功能性JH基因片段(Ravetch et al.(1981)Cell，27：583)。VH基因片段编码VH区中形成第一和第二抗原结合环(H1和H2)的多肽链的区域，而VH、D和JH基因片段共同编码VH区中第三抗原结合环(H3)多肽链。VL基因只由2个基因片段即VL和JL重组而成。根据独特型，人类大约有40种功能性Vκ基因片段(
Figure G2008800104821D00021
and Zachau(1993)Biol.Chem.Hoppe-Seyler，374：1001)，31种功能性Vλ基因片段(Williamset al.(1996)J.Mol.Biol.，264：220；Kawasaki et al.(1997)GenomeRes.，7：250)，5种功能性Jκ基因片段(Hieter et al.(1982)J.Biol.Chem.，257：1516)和4种功能性Jλ基因片段(Vasicek and Leder(1990)J.Exp.Med.，172：609)。VL基因片段编码VL区中形成第一和第二抗原结合区(L1和L2)的多肽链区域，而VL和JL基因片段共同编码VL区中形成第三抗原结合环(L3)的多肽链。据认为，从这些初始功能库中可以充分选择出至少能以中等亲和力与几乎所有抗原结合的不同种类的抗体。经过基因重排的“亲和力成熟”可产生高亲和力抗体，在此过程中，发生点突变，并根据结合能力的增强由免疫系统进行选择。
分析抗体的结构和序列表明6个抗原结合环中的5个(H1、H2、L1、L2和L3)具有数目受限的主链构象和规范结构(Chothia andLesk(1987)J.Mol.Biol.，196：901；Chothia et al.(1989)Nature，342：877)。主链构象取决于(i)抗原结合环的长度，和(ii)特殊残基或抗原结合环和抗体骨架中特定关键部位残基的种类。分析抗原结合环的长度和关键残基可以推测由大多数人类抗体序列编码的H1、H2、L1、L2和L3主链构象(Chothia et al.(1992)J.Mol.Biol.，227：799；Tomlinson et al.(1995)EMBO J.，14：4628；Williams er al.(1996)J.Mol.Biol.，264：220)。虽然H3区在序列、长度和结构方面变化较大(由于D片段的作用)，但其长度、特殊残基的存在或抗原结合环和抗体骨架中关键部位残基的种类决定该区也形成一个数目受限的主链短环(Martin et al.(1996)J.Mol.Biol.，263：800；Shirai et al.(1996)FEBS Letters，399：1)。
本领域已知双特异性抗体包含VH和VL区互补对。这些双特异性抗体必须包含两对VH区和VL区，每对VH/VL结合单个抗原或表位。曾经描述的方法包括杂交瘤技术(Milstein&Cuello AC，Nature305：537-40)，微体(Hu et al.，(1996)Cancer Res 56：3055-3061)，双抗体(Holliger et al.，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，6444-6448；WO 94/13804)，螯合重组抗体(CRAbs；(Neri et al.，(1995)J.Mol.Biol.246，367-373)，双链Fv抗体(biscFv)(例如Atwell et al.，(1996)Mol.Immunol.33，1301-1312)，“凸凹吻合(knobs into holes)”稳定抗体(Carter et al.，(1997)Protein Sci.6，781-788)。每种情况下每种抗体包括两个抗原结合位点，每个抗体的特点为VH和VL区的互补对。因此，通过一个VH区和它的互补区VL区结合每个抗原或表位，使得每种抗体能同时结合两种不同的抗原或表位。这些技术的每一种均有其特有的缺点，例如：杂交瘤技术中无活性的VH/VL对可大大减少双特异性IgG的级分(fraction)。此外，大多数双特异性方法依赖于不同VH/VL对的结合或VH和VL链的结合而重新产生两种不同的VH/VL结合位点。因此，在组装分子中不可能控制对每种抗原或表位的结合位点比率，所以许多组装分子只结合一种抗原或表位，而不结合其他表位。在一些情况下已可以设计亚单位界面上的重链或轻链(Carter et al.，1997)，以增加具有结合上述两种的抗原或表位的位点的分子的数目，但这样不能使所有的分子都具有结合所述两种抗原或表位的能力。
有些证据表明两种不同抗体结合特异性可以共同结合同一结合位点，但通常这些抗体表现出对结构相关的抗原或表位或广泛交叉反应性抗体的两种以上特异性。例如，描述过的交叉反应性抗体，通常见于两种在序列或结构上相关的抗原如：鸡卵白溶菌酶和火鸡溶菌酶(McCafferty et al.，WO 92/01047)或游离半抗原和与载体交联的半抗原(Griffiths AD et al.EMBO J 199413：143245-60)。另一例见WO 02/02773(Abbott Laboratories)描述的具有“双特异性”的抗体分子。这里所涉及的抗体分子是抗多样性抗原的，也就是说它们的特异性范围多于一种抗原。在WO 02/02773描述的抗体中，每对互补VH/VL具有针对两种或两种以上结构相关抗原的单一结合特异性，这些互补对中的VH区和VL区不具有单独的特异性。因此，所述抗体具有对结构上相关的两种抗原的广泛的单一(broad single)特异性。此外，已描述过的天然自身抗体是多反应性的(Casali&Notkins，Ann.Rev.Immunol.7，515-531)，可与至少两种(通常更多)结构上无关的不同的抗原或表位反应。已表明采用基于单克隆抗体的噬菌体展示技术选择的随机肽库将能确定一系列与抗原结合位点匹配的肽序列。某些序列是高度相关的，适合于共有序列，而其他序列是非常不同的，并且被命名为模拟位(mimotope)(Lane&Stephen，Current Opinion in Immunology，1993，5，268-271)。因此，很显然含有相关和互补VH和VL区的天然四肽链抗体能够结合无数已知抗原中的许多不同抗原。不明确的是如何在同一抗体中制备出与两种给定抗原结合的结合位点，特别是一些结构上未必相关的抗原。
蛋白基因工程技术方法提示其可在这方面有所帮助。例如，有人建议制备一种催化抗体，该抗体可通过一个可变区与金属离子结合，通过金属离子和一个互补可变区接触而与半抗原(底物)结合(Barbas et al.，1993 Proc.Natl.Acad.Sci USA 90，6385-6389)。然而这种情况下，结合和催化底物(第一抗原)需要与金属离子的结合(第二抗原)。因此，与VH/VL对的结合与单一但多成分的抗原相关。
已描述过从骆驼(camel)抗体重链单区中制备的双特异性抗体，在抗体中通过一个可变区与一种抗原结合，通过第二个可变区与第二种抗原结合。然而，这些可变区不互补。因此，选择第一个重链可变区针对第一种抗原，第二种重链可变区针对第二种抗原，然后将这两个可变区连接在同一链上成为一个双特异性抗体片段(Conrath et al.，J.Biol.Chem.270，27589-27594)。然而，不同寻常的是骆驼重链单个功能区(single domain)来自无轻链的天然骆驼抗体，事实上，骆驼重链单区不能与骆驼轻链结合组成互补的VH和VL对。
还描述过源于天然抗体的单个重链可变区，该可变区通常与轻链结合(来自单克隆抗体或功能区库；见EP-A-0368684)。已表明这些重链可变区能特异性结合一种或一种以上的相关抗原，但不能与其他重链或轻链可变区组合成具有两种或两种以上不同抗原特异性的配体。此外，这些单个功能区在体内的半衰期很短，因此其治疗价值受限。
曾有人建议将不同特异性的重链可变区相连在一起制备双特异性抗体片段(如上所述)。但该策略的缺点是：分离的抗体可变区可能有一个通常可与轻链作用的疏水界面，其暴露于溶剂时可以是粘性的，从而允许单个区结合到疏水表面上。此外，缺乏轻链伴侣的两个或两个以上不同重链可变区及其组合可能通过疏水界面的结合，可阻止它们结合一个而不是两个在它们独立时能结合的配体。而且，这种情况下，重链可变区不与互补轻链可变区结合，故稳定定性很差，折叠易打开(Worn&Pluckthun，1998 Biochemistry37，13120-7)。
发明概述
本发明人在共同未决的国际专利申请WO 03/002609和共同未决的未公开的UK专利申请0230203.2中描述，双特异性免疫球蛋白配体包含免疫球蛋白单个可变区(single variable domains)，每个可变区具有不同特异性。这些区域结合靶分子上的抗原或表位时或相互竞争或互不依赖。
在第一框架中，本发明提供了由发明者开发的对双特异性配体的进一步改进，其中配体的一个特异性是针对存在于有机体内的蛋白或多肽，其可通过与之结合产生对配体半衰期的增加。
因此，在第一方面，本发明提供了一种双特异性配体，该配体包含第一免疫球蛋白单个可变区，该可变区对第一抗原或表位有结合特异性，该配体还包含互补的第二免疫球蛋白单个可变区，该可变区具有与第二种抗原或表位的结合活性，其中所述抗原或表位中的一种或两种起到延长配体在体内的半衰期的作用，并且其中所述的第一或第二免疫球蛋白单个可变区缺乏具有同一特异性的共同互补区域，条件是所述的双特异性配体不是由抗-HSA VH区和抗-β半乳糖苷酶Vκ区组成。优选地，第一和第二可变区都不与人血清白蛋白(HSA)结合。
本发明中所述的延长配体半衰期的抗原或表位是有机体的体内有利地存在的蛋白或多肽。例子包括胞外基质蛋白、血液蛋白和有机体各种组织蛋白。这些蛋白的作用是降低配体从血中的清除率，例如：可作为增容剂(bulking agents)或将配体锚定在所希望的作用位点上。延长配体体内半衰期的抗原/表位实例在下面附件1中给出。
延长半衰期在免疫球蛋白特别是抗体并且更特别地是小分子抗体片段的体内应用中十分有用。这些片段(Fvs，二硫化物结合的Fvs、Fabs、scFvs、dAbs)在体内经过快速清除；因此，一方面它们能快速到达身体大部分部位并迅速起效而且易于控制，一方面由于其在体内的存在短暂而影响了其在体内的应用。本发明提供了在体内半衰期延长的配体，致使配体的功能性活性在体内持续时间延长，从而解决了上述问题。
配体半衰期的药代动力学分析和测定的方法已为本领域技术人员熟知，详细资料可见于Kenneth，A et al：Chemical Stability ofPharmaceuticals：A Handbook for Pharmacists and in Peters et al，Pharmacokinetc analysis：A Practical Approach(1996)。还可参考“Pharmacokinetics”，M Gibaldi&D Perron，published by MarcelDekker，2nd Rev.ex edition(1982)，该书描述了tα半衰期、tβ半衰期和曲线下面积(AUC)等药代动力学参数。
半衰期(t1/2α和t1/2β)以及AUC可从配体的血清浓度对时间的关系曲线确定。例如可采用WinNonlin分析软件包(可从PharsightCorp.，Mountain View，CA94040，USA获得)模拟曲线。第一阶段(α相)主要是配体在患者体内分布并有一些清除。第二阶段(β相)是终末期，此时配体分布完毕且由于配体在病人体内清除其血浆浓度开始下降。tα半衰期是第一阶段半衰期，tβ半衰期是第二阶段半衰期。因此，有利地是，本发明提供了配体或包含本发明配体的组合物，其具有tα半衰期为15分钟或15分钟以上的范围。在一个实施方案中，所述范围的下限为30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、11小时或12小时。另外，或另选地，本发明配体或组合物的tα半衰期可在高达12小时的范围且包括12小时。在一个实施方案中，所述范围的上限为11、10、9、8、7、6或5小时。适宜范围的实例是1-6小时、2-5小时或3-4小时。
有利地，本发明提供了配体或包含本发明配体的组合物，其具有tβ半衰期为2.5小时或2.5小时以上的范围。在一个实施方案中，所述范围的下限为3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、11小时或12小时。另外，或另选地，本发明配体或组合物的tβ半衰期可在高达21天的范围且包括21天。在一个实施方案中，所述范围的上限为12小时、24小时、2天、3天、5天、10天、15天或20天。有利地，本发明的配体或组合物的tβ半衰期范围为12-60小时。在进一步的实施方案中，其范围为12-48小时。在再进一步的实施方案中，其范围为12-26小时。
除上述标准之外，或另选地，本发明提供了配体或包含本发明配体的组合物，其具有AUC值(曲线下面积)的范围为1mg/min/ml或更大。在一个实施方案中，所述范围的下限为5、10、15、20、30、100、200或300mg/min/ml。另外，或另选地，本发明配体或组合物具有AUC的范围高达600mg/min/ml。在一个实施方案中，所述范围的上限为500、400、300、200、150、100、75或50mg/min/ml。有利地，本发明的配体将具有选自，但非限制性的优选，以下范围的AUC：15-150mg/min/ml、15-100mg/min/ml、15-75mg/min/ml和15-50mg/min/ml。
在第一实施方案中，双特异性配体包括两个互补可变区，即这两个可变区在自然环境中可作为同源对(cognate pair)或组一起发挥作用，即使在本发明中，它们分别结合在它们的同源表位上。例如，互补可变区可以是免疫球蛋白重链和轻链可变区(VH和VL)。VH和VL可十分便利地由scFv或Fab抗体片段提供。可变区可以连接在一起形成多价配体，例如：通过每个V区C末端的铰链区以及铰链区半胱氨酸间的二硫键连接；或由功能区C末端的半胱氨酸经二硫键连在一起的dAb提供；或者由V-CH和V-CL组成的Fab形式，或者使用肽连接子(如下所述的Gly4Ser连接子)制备二聚体、三聚体和更多的多聚体。
发明者发现互补可变区的应用使得两个区的表面挤在一起(pack together)并与溶剂隔绝。此外，所述互补区能相互稳定。此外，还使得双特异性IgG抗体去除了过去所用的杂交瘤技术的缺点，或在亚单位界面上改造重链或轻链的需要。本发明第一方面的双特异性抗体具有至少一个VH/VL对。所以，本发明的双特异性IgG可包含两个这样的对，Y型分子的每个臂上各有一个对。因此，不同于常规的双特异性抗体或双抗体(diabodies)，它们制备过程中所用肽链的比率决定抗体制备的成功，因而制备存在着实际困难，而本发明的双特异性配体不存在肽链平衡问题。在常规双特异性抗体中的链不平衡产生原因是两种不同的VL链和两种不同的VH链的连接，其中V VL链1和VH链1在一起时能结合抗原或表位1，而VL链2和VH链2在一起时能结合抗原或表位2，并且两个正确匹配对可以某种方式彼此相连。因此，在单个分子中，只有VL链1和VH链1配对以及VL链2和VH链2配对后才能产生双特异性。此类双特异性分子可以两种不同方式产生。首先，它们是通过连接两个存在的结合不同抗原或表位的VH/VL对(例如，在双特异性IgG中)而产生。在此情况下，这样VH/VL对必须以1∶1的比率一起出现，以便合成的所有抗体分子群体为双特异性的。从未出现双特异性分子与只能与一种抗原或表位结合而不能与其它结合的分子的混合物(即使当通过“凸凹吻合”技术增强互补CH区时)。第二种方式是通过同时连接两个不同VH链和两个不同的VL链而产生双特异性抗体(例如，在双特异性双抗体中)。在此情况下，虽然倾向于VL链1与VH链1匹配，VL链2与VH链2匹配(这可通过VL区与VH区“凸凹吻合”的改造而增强)，这种匹配从未在所有分子中实现，导致形成混合物形式，使得错误匹配发生，导致它们不能结合任一抗原或表位。
根据本发明第一方面的双特异性配体方法构建的双特异性抗体克服了所有这些问题，原因是分别与VH或VL区中的抗原或表位1残基结合，以及与互补VL或VH区中的抗原或表位2残基结合。由于VH和VL区对是1∶1的，所以全部VH/VL对是双特异性的，并且应用这些VH/VL对构建的所有形式(Fv、scFvs、Fabs、微体(minibody)、IgG等)将会有100％双特异性的活性。
本发明上下文中的第一和第二“表位”(epitopes)可理解为不同的表位并且不被单一单特异性配体结合。在本发明的第一框架内，它们有利地在不同抗原上，其中之一的作用是增加配体体内半衰期。同样有利之处是第一和第二抗原不相同。
本发明中的双特异性配体不包括WO 02/02773所述的配体。因此，本发明中的配体不包括通过共同作用(co-operatively)结合任意一个或更多抗原或表位的互补VH/VL对。相反，本发明第一方面的配体包含VH/VL互补对，其中所述V区具有不同特异性。
此外，本发明第一方面的配体包括对结构上不相关的表位或抗原具有不同特异性的VH/VL互补对。结构上相关的表位或抗原与常规VH/VL互补对结合，它们具有充分的结构相似性，而这些常规互补对是通过共同作用方式结合表位或抗原；在结构相关的表位的情况下，所述表位在结构上十分相似，这使它们“适合”进入VH/VL二聚体抗原结合位点上形成的同一结合袋中。
在第二方面，本发明提供了一种配体，其包括具有第一抗原或表位结合特异性的第一免疫球蛋白可变区和具有第二抗原或表位结合特异性的第二免疫球蛋白可变区，其中所述第一和第二可变区之一或二者结合在增加配体在体内的半衰期的抗原上，并且可变区互相之间不互补。
在一个实施方案中，与一个可变区的结合调节配体与第二可变区的结合。
在该实施方案中，可变区可以例如是VH区对或VL区对。与抗原在第一位点的结合有可能调节(例如增强或抑制)与抗原在第二位点的结合。例如，第一位点的结合至少部分抑制抗原在第二位点的结合。在这样的实施方案中，配体可例如通过结合在一种可增加配体半衰期的蛋白上而使配体在宿主生物体内保持，直到配体与第二靶抗原结合并与延长半衰期的蛋白分离。
上文所述的结合调节是抗原结合位点相互间结构邻近的结果。这种结构邻近可通过连接两种或两种以上抗原结合位点的结构成分的本质决定，例如，提供一种容纳了紧邻的抗原结合位点的相对刚性结构的配体。有利地，两种或两种以上抗原结合位点在物理学上彼此十分接近，因此，通过免疫球蛋白分子中的空间位阻和/或构象变化而使一个位点调节抗原分子在另一个位点的结合。
第一和第二抗原结合区可以以共价或非共价方式结合。以共价方式结合时，结合可通过例如二硫键或多肽连接子如(Gly4Ser)n介导，其中n＝1-8，例如2、3、4、5或7。
本发明中配体可以与非免疫球蛋白多个配体结构结合形成多价复合物，与具有相同抗原的靶分子结合，因此具有高亲和力，同时至少一个可变区结合一种抗原以增加多聚体的半衰期。例如，天然细菌受体如SpA被用作支架结构(scaffold)，将CDRs移植以产生能特异性结合一种或更多表位的配体。这一过程细节在US 5,831,012中描述。其他适用的支架结构包括那些以纤连蛋白和亲合体(Affibody)TM为基础的物质。适用方法的细节在WO 98/58965中描述。其他合适的支架结构脂质运载蛋白(lipocallin)和CTLA4，参见van den Beuken et al.，J.Mol.Biol.(2001)310，591-601，以及例如描述于WO0069907(Medical Research Council)中的支架结构，它们是例如以细菌GroEL或其他伴侣多肽的环状结构为基础的。
蛋白支架结构可以是组合的，例如，CDRs可以被嫁接于CTLA4支架结构上，并与免疫球蛋白的VH或VL区一起应用形成配体。同样，纤连蛋白、脂质运载蛋白和其他支架结构也可以组合。
如果这里描述的可变区是来自采用噬菌体展示技术筛选的V-基因库的，那么这些可变区可以包含一个通用框架区，即可被在此定义的特异性属类配体(generic ligand)识别。通用框架、属类配体等的使用描述于WO99/20749。在本发明中，涉及的噬菌体展示包括噬菌体和/或噬菌粒的应用。
在采用V-基因库时，多肽序列的变异优选在可变区的结构环中。采用DNA改组或突变技术，可改变可变区多肽序列，以增强每个可变区与其互补对之间的相互作用。
在本发明的优选实施方案中，‘双特异性配体’是单链Fv片段。在本发明另选的实施方案中，‘双特异性配体’由抗体的Fab区组成。术语“Fab区”包括Fab样区，其中应用了两个VH区或两个VL区。
可变区可来自直接针对靶抗原或表位的抗体。或者，可变区也可来自诸如那些表达在丝状细菌噬菌体表面的单个抗体区的库中。选择方法如下所述。
在第三方面，本发明提供了一种制备配体的方法，该配体包括具有第一结合特异性的第一免疫球蛋白单个可变区和具有第二(不同)结合特异性的第二单个免疫球蛋单个可变区，所述结合特异性之一或二者是特异性针对一种能延长配体体内半衰期的抗原的，该方法包括以下步骤：
(a))通过其与第一表位结合的能力选择第一可变区，
(b))通过其与第二表位结合的能力选择第二可变区，
(c)组合所述可变区；和
(d))通过其与所述第一表位和所述第二表位结合的能力筛选配体。
配体能同时与上述第一和第二表位结合，或者当存在结合区间表位结合的竞争时而出现一个区域的结合排除另一个区域与其关联表位的结合。因此，在一个实施方案中，上述步骤(d)中要求同时结合第一和第二(可能更多)表位；在另一实施方案中，与第一和第二表位的结合不是同时的。
所述表位优选在不同抗原上。
有利的是，配体包括如上所述的免疫球蛋白可变区的VH/VL组合或者VH/VH或VL/VL组合。此外，配体可包括骆驼科VHH区，只要针对能延长配体体内半衰期的抗原特异性的VHH区不能结合如Conrath et al.，(2001)JBC 276：7346-7350和WO99/23221中所述的鸡卵白溶菌酶(Hen egg white lysozyme，HEL)、猪胰腺α淀粉酶或NmC-A、hcg、BSA-连接的RR6含氮染料或S.mutans HG982细胞，上述文献都未描述针对延长配体体内半衰期的抗原的特异性的应用。
在一个实施方案中，所述第一可变区是根据在缺乏互补可变区的情况下其能与上述第一表位结合而筛选的。在进一步的实施方案中，所述第一可变区是根据在第三可变区存在的情况下其能与所述述第一表位/抗原结合而筛选的，在这里所述第三可变区不同于所述第二可变区，它与第一区互补。类似地，该第二区也可在有或无互补可变区的情况下筛选。
由本发明配体靶向的可延长配体半衰期的抗原或表位不限于血清蛋白靶。由本发明配体靶向的可在体内延长配体半衰期抗原或表位的其它实施方案包括，但优选地不限于，下文附件1所列的那些抗原和表位。
由本发明配体靶向的抗原或表位，除了是能增加半衰期的蛋白外，也可以是任意抗原或表位，不过有利的是具有治疗价值的靶抗原或表位。本发明提供了配体，包括开放构象、闭合构象和分离的dAb单体配体，其特异性针对任何此类靶，特别是本文更进步确定的那些。这些靶可以是或部分是天然或合成的多肽、蛋白或核酸。在此方面，本发明中的配体可以结合表位或抗原，并可作为拮抗剂或激动剂起作用(例如，EPO受体激动剂)。本领域技术人员知道所述靶的选择是广泛多样的。例如，它们可以是人或动物蛋白、细胞因子、细胞因子受体，其中细胞因子受体包括针对细胞因子、酶、酶辅助因子或DNA结合蛋白的受体。适宜的细胞因子和生长因子包括，但优选不限于：ApoE，Apo-SAA，BDNF，心脏营养蛋白-1(Cardiotrophin-1)，EGF，EGF受体，ENA-78，嗜酸细胞活化趋化因子(eotaxin)，嗜酸细胞活化趋化因子-2，Exodus-2，EpoR，酸性FGF，碱性FGF，成纤维细胞生长因子-10，FLT3配体，Fractalkine(CX3C)，GDNF，G-CSF，GM-CSF，GF-β1，胰岛素，IFN-γ，IGF-I，IGF-II，IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8(72a.a.)，IL-8(77a.a.)，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18(IGIF)，抑制素(Inhibin)α，抑制素β，IP-10，角质形成细胞生长因子-2(KGF-2)，KGF，来普汀(Leptin)，LIF，淋巴细胞趋化因子，穆勒抑制物(Mullerian inhibitory substance)，单核细胞克隆抑制因子，单核细胞趋化蛋白，M-CSF，MDC(67a.a.)，MDC(69a.a.)，MCP-1(MCAF)，MCP-2，MCP-3，MCP-4，MDC(67a.a.)，MDC(69a.a.)，MIG，MIP-1α，MIP-1β，MIP-3α，MIP-3β，MIP-4，髓样祖细胞抑制因子-1(myeloid progenitor inhibitor factor，MPIF-1)，NAP-2，Neurturin，神经生长因子，β-NGF，NT-3，NT-4，制瘤素M(Oncostatin M)，PDGF-AA，PDGF-AB，PDGF-BB，PF-4，RANTES，SDF1α，SDF1β，SCF，SCGF，干细胞因子(SCF)，TARC，TGF-α，TGF-β，TGF-β2，TGF-β3，肿瘤坏死因子(TNF)，TNF-α，TNF-β，TNF受体I，TNF受体II，TNIL-1，TPO，VEGF，VEGF受体1，VEGF受体2，VEGF受体3，GCP-2，GRO/MGSA，GRO-β，GRO-γ，HCC1，1-309，HER 1，HER 2，HER 3和HER 4，CD4，人趋化因子受体CXCR4或CCR5，来自丙肝病毒的3型非结构蛋白(NS3)，TNF-α，IgE，IFN-γ，MMP-12，CEA，幽门螺旋杆菌(幽门螺旋杆菌)，TB，流感病毒(influenza)，戊型肝炎，MMP-12，在某些细胞中过表达的陷入(internalising)受体在某些细胞中过表达的陷入受体例如表皮生长因子受体(EGFR)，肿瘤细胞中的ErBb2受体其为一种陷入细胞的受体，LDL受体，FGF2受体，ErbB2受体，转铁蛋白受体，PDGF受体，VEGF受体，PsmAr，一种细胞外基质蛋白，弹性蛋白，纤连蛋白，层粘连蛋白，α1-抗胰蛋白酶，组织因子蛋白酶抑制剂，PDK1，GSK1，Bad，半胱天冬酶-9，Forkhead，幽门螺旋杆菌的抗原，结核分支杆菌的抗原，以及流感病毒的抗原。应理解为，以上所列并不表示穷举。
在本发明一个实施方案中，可变区来自针对抗原或表位的不同的抗体。在优选实施方案中，可变区来自抗体单个可变区的库。
在进一步的方面，本发明提供了一种或更多核酸分子，其编码至少一种在本文定义的双特异性配体。单个核酸分子可编码双特异性配体；或者每个区可分别由一个独立的核酸分子编码。由单个核酸分子编码的配体，功能区可以融合多肽、scFv分子形式表达，或者分别表达最后连接在一起，例如用化学连接剂。不同核酸分子表达的配体可以适当的方式连接在一起。
核酸可进一步编码信号序列以引导宿主细胞表达的多肽输出，还可在表达时与丝状细菌噬菌体粒表达的表面成分(或筛选展示系统的其他成分)发生融合。
本发明进一步提供了一种载体，其包含编码本发明双特异性配体的核酸。
在进一步的方面，本发明提供了一种宿主细胞，其转染有编码本发明双特异性配体的载体。
由此种载体的表达可以被构建，以产生(例如在细菌噬菌体粒表面)用于筛选的可变区。这样采用本发明的方法允许筛选所展示的可变区以及由此筛选的‘双特异性配体’。
本发明进一步提供了包含至少一种本发明双特异性配体的试剂盒。
本发明双特异性配体优选包含重链区和轻链区的组合产物(combination)。例如，双特异性配体可包含VH区和VL区，它们以scFv形式连接在一起。此外，配体可包括一个或更多个CH或CL区。例如，配体可包含CH1区、CH2或CH3区，和/或CL区，Cμ1、Cμ2、Cμ3或Cμ4区，或它们的任意组合。铰链区也可以包含在内。这些功能区的结合可例如模拟天然抗体如：IgG或IgM，或它们的片段，例如Fv，scFv，Fab或F(ab’)2分子。其他结构如包含有VH、VL、CH1和CL区的IgG分子的单臂也在设想当中。
本发明优选实施方案中，可变区是从单个V区基因库中筛选的。通常，单个抗体功能区的库是在丝状细菌噬菌体表面上展示的。在优选实施方案中，每一单个抗体区是通过噬菌体库与抗原结合的方式筛选的。
在本发明的优选实施方案中，每一单个可变区是在缺乏互补可变区的情况下根据其与靶抗原或表位的结合筛选的。在另选实施方案中，单个可变区是在互补可变区存在的情况下根据其与靶抗原或表位的结合筛选的。因此，第一个可变区可以在第三互补可变区存在情况下筛选，第二可变区可以在第四互补可变区存在情况下筛选。互补的第三或第四可变区可以是具有与受试单个可变区相同特异性的天然同源可变区，或者是非同源互补区-例如“模拟(dummy)”可变区。
本发明的双特异性配体优选包括仅两个可变区，尽管几个这样的配体可以组合在一起形成同一蛋白，例如两个这样的配体可以被纳入IgG或多聚免疫球蛋白，例如IgM。或者，在另一实施方案中，多个双特异性配体组合在一起形成多聚体。例如，两种不同的双特异性配体组合生成四特异性分子。
本领域技术人员将会理解，依照本发明方法制备的双特异性配体的轻链和重链可变区可以在同一多肽链上，或者在不同的多肽链上。如果可变区在不同多肽链上，那么它们可以通过一个连接子，通常是一个柔韧的连接子如多肽链，化学连接基团，或本领域已知的任意其他方法连接。
在进一步的方面，本发明提供了一种组合物，其包含一种由本发明方法获得的双特异性配体和药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
此外，本发明提供了一种采用本发明‘双特异性配体’或组合物治疗和/或预防疾病的方法。
在第二框架中，本发明提供了包含至少两个非互补可变区的多特异性配体。例如，配体可包含一对VH区或一对VL区。优势之处在于可变区是非骆驼科来源的，优选它们是人源的功能区或者包括人源框架区(FWs)以及一种或一种以上的异源CDRs。CDRs和框架区是免疫相关蛋白序列的Kabat数据库中定义的免疫球蛋白可变区。
优选的人源框架区是由胚系基因片段DP47和DPK9编码的。优势之处在于VH区或VL区中的FW1、FW2和FW3具有来自DP47或DPK9的FW1、FW2或FW3序列。人源的框架可以任选包含突变，例如，在本发明配体中使用的人源框架中可包含例如至多约5个氨基酸的改变或至多约10个氨基酸的改变。
本发明中第二框架的多特异性配体可变区可以一种开放或闭合构象排列，也就是说，它们可以同时独立地结合在关联配体上，或者只有一个可变区在任一时刻结合在它的关联配体上。
发明者意识到在一些结构状态下，非互补可变区(例如两个轻链可变区或两个重链可变区)可以出现在一个配体中，以致第一表位与第一可变区的结合抑制第二表位与第二可变区的结合，即使这种非互补区不以同源对方式一起发挥作用。
有利地，配体包含两对或两对以上可变区，也就是说，包含至少4个可变区。有利地，这四个可变区含有人源框架。
在优选实施方案中，人源框架与人胚系序列一致。
本发明者认为这种抗体在治疗或其他应用中的配体结合分析中具有特殊用途。
因此，在第二框架的第一方面，本发明提供了制备多特异性配体的方法，该包括以下步骤：
a)选择能与第一表位结合的第一表位结合区，
b)选择能与第二表位结合的第二表位结合区，
c)组合所述表位结合区，和
d)筛选能与所述第一表位和所述第二表位结合的闭合构象的多特异性配体。
在第二框架的进一步的方面，本发明提供了一种制备闭合构象的多特异性配体的方法，该多特异性配体包括具有结合第一表位特异性的第一表位结合区和具有结合第二表位特异性的非互补的第二表位结合区，其中第一和第二结合特异性竞争结合表位，致使该闭合构象多特异性配体可以不同时结合两个表位，所述方法包括以下步骤：
a)选择能与第一表位结合的第一表位结合区，
b)选择能与第二表位结合的第二表位结合区，
c)组合所述表位结合区以使所述区域处在闭合构象中，和
d)根据与所述第一表位和所述第二表位结合的能力而不是同时与所述两表位结合的能力筛选闭合构象的多特异性配体。
此外，本发明提供了一种闭合构象多特异性配体，包含具有结合第一表位特异性的第一表位结合区和具有结合第二表位特异性的非互补的第二表位结合区，其中，第一和第二结合特异性竞争表位结合，致使闭合构象多特异性配体可以不同时结合两个表位。
本发明第二框架的以上方面的另选实施方案可任选包含另外的步骤(b1)，包括筛选第三或进一步的表位结合区。这样，不管是开放或闭合构象，所产生的多特异性配体均含有两个以上表位结合特异性。本发明第二框架的优选方面，当多特异性配体包含两个以上的表位结合区时，所述区中的至少两个区为闭合构象且竞争结合；其它区可以竞争结合也可以独立自由地与其同源表位结合。
根据本发明，术语‘多特异性配体’是指本文定义的具有一种以上的表位结合特异性的配体。
这里定义的术语‘闭合构象’(多特异性配体)是指配体的表位结合区相互依附相互连接，任选通过蛋白骨架相连，致使一个表位结合区的表位结合可与另一个表位结合区的表位结合竞争。也就是说，同源表位被每个表位结合区单独而不是同时结合。配体的闭合构象可通过本文描述的方法获得。
“开放构象”是指配体的表位结合区相互依附相互连接，任选通过蛋白骨架相连，致使一个表位结合区的表位结合不与另一个表位结合区的表位结合竞争。
本文提及的术语“竞争”是指当第二表位与其同源表位结合区结合时，第一表位与其同源表位结合区的结合受到抑制。例如，结合可以在空间上被抑制，例如通过结合区的物理封闭或通过结合区的结构或环境的改变，致使与表位结合的亲和力或亲合力降低。
本发明第二框架的进一步实施方案中，表位在结合时可相互转位(displace)。例如，第一表位可存在于抗原上，第一表位与其同源第一结合区结合时可造成对第二结合区的空间位阻或者构型改变，这样转移了与第二结合区结合的表位。
优选结合降低25％或更多，优选40％，50％，60％，70％，80％，90％或更多，优选高达100％或近乎100％，以致结合被完全抑制。表位的结合可用常规的抗原结合分析法，例如ELISA；或荧光技术，例如FRET，或表面等离振子共振技术(表面等离振子共振)测量分子质量等方法测定。抗原结合蛋白与抗原或表位的特异性结合可通过适宜的分析法确定，该分析法包括，例如捕获分析法(catchard analysis)和/或竞争结合分析法，例如放射免疫分析法(RIA)，酶免疫分析法例如ELISA和夹层(sandwich)竞争分析法，以及它们的不同的变型。
结合亲和力优选使用表面等离振子共振(SPR)以及使用Biacore系统(Uppsala，Sweden)的Biacore法(Karlsson et al.，1991)确定。该Biacore系统使用表面等离振子共振法(SPR，Welford K.1991，Opt.Quant.Elect.23：1；Morton and Myszka，1998，Methods inEnzymology 295：268)是监测生物分子实时相互作用，并且使用了这样的表面等离振子共振，其可检测光线在玻璃支撑的薄金箔片表面上的共振角的变化，在该表面的折光系数的变化的结果高达300nm远。Biacore分析可方便地得到缔合速率常数、解离速率常数、平衡解离速率常数和亲和力常数。结合亲和力是通过使用Biacore表面等离振子共振系统(Biacore，Inc.)来评价缔合和解离速率常数而获得的。根据供应商(Biacore)指令使生物传感器芯片活化以用于共价偶合靶标。然后将靶稀释，再注入芯片中，获得固定物质共振单元中的信号。由于该共振单元(RU)的信号与固定物质的量成比例，这代表了在基质上的固定靶密度的范围。将解离数据拟合成一-点模型，获得koff+/-s.d.(测定的标准偏差)。针对每一缔合曲线计算假一级速率常数(Kd’s)，并给布鞋成蛋白浓度的函数，得到kon+/-s.e.(拟合的标准误差)。结合的平衡解离速率常数Kd′s是由SPR计算的，测得为koff/kon。
如由Phizicky和Field在Microb.Rev.(1995)59：114-115中描述的，一种适宜的抗原例如HSA被固定在葡聚糖聚合物上，再使含有针对HSA的配体例如单个可变区的溶液流过池子细胞，使之接触该固定的HSA。由固定的HSA滞留的单个可变区改变了碰撞光(impinging light)的共振角，导致接近于葡聚糖聚合物的蛋白即单个可变区的增加量所带来的折射率的改变。由于所有蛋白均具有相同的折射率，而且由于共振角偏移和近表面的蛋白浓度之间的线性关系，由于蛋白/蛋白结合而造成的表面蛋白浓度的改变可以被测得，参见Phizicky and Field，同上。为了测定结合常数，共振单元(RU)的增加是以通过单个可变区蛋白溶液到固定配体(HSA)直到RU值稳定的时间函数测定的，而RU的减小是以缓冲剂缺乏单个可变区的时间函数测定的。以若干不同浓度的单个可变区蛋白重复此操作。详细的理论背景和操作描述于R.Karlsson，et.al.(991)J.Immunol Methods，145，229。
该仪器软件得到如上文所述的平衡解离常数(Kd)。通过使用表面等离振子共振测定的平衡解离常数描述于美国专利5,573,957中，其基于dRA/dt和RA值的表格，其中R在此实施例中是在共振单元中由Biacore测定的HSA/单个可变区复合物，而dR/dt是HSA/单个可变区复合物的形成速率，即结合曲线衍生的；针对若干不同浓度的单个可变区绘制dRA/dt对RA的图，接着绘制这些线对单个可变区浓度的斜率，此第二图的斜率为缔合速率常数(M-1，s-1)。解离速率常数或速率(此时HSA和单个可变区相互释放)可以使用由Biacore生成的解离曲线来确定。通过绘制和确定响应对时间曲线中并入的log的斜率，可以测定该解离速率常数。平衡解离常数Kd＝解离速率常数/缔合速率常数。
根据本发明的方法，有利地，每一个表位结合区具有不同的表位结合特异性。
本发明上下文中的第一和第二“表位”可理解为不相同的表位且不被单一的单特异性配体结合。它们可以在不同抗原上，或在相同抗原上，但以充分的距离隔开，不形成能被常规抗体中单个单一特异性的VH/VL结合对结合的单体。实验中，如果单链抗体(功能域抗体(domain antibody)，或dAb)中独立的两个可变区被一个针对两个表位的单一特异性的VH/VL配体分别竞争的话，那么认为这两个表位不够远，不能认为是本发明所指的分开的表位。
本发明中闭合构象的多特异性抗体不包括WO 02/02773中描述的配体。因此，本发明配体不包括能通过共同作用结合任一种或多种抗原或表位的互补VH/VL对。取而代之，本发明配体优选包括非互补的非互补的VH-VH或VL-VL对。有利地，在每一个VH-VH或VL-VL对中的每一个VH区或VL区具有不同的表位结合特异性，并且表位结合位点如此排列使得一位点上的表位结合竞争抑制另一个位点上的表位结合。
根据本发明，有利的是，每一表位结合区包含免疫球蛋白可变区。更有利的是，每一表位结合区可以是抗体的可变轻链区(VL)或可变重链区(VH)。发明的第二框架中，存在于本发明配体中的免疫球蛋白的功能区是非互补的，也就是说，它们不相连成VH/VL抗原结合位点。因此，本发明中第二框架中定义的多特异性配体包含同一亚类的免疫球蛋白的功能区，即，可变轻链区(VL)或可变重链区(VH)。此外，本发明配体是闭合构象时，所述免疫球蛋白的功能区可以是骆驼科VHH型。
在另选实施方案中，本发明的配体不包含骆驼科VHH区。更具体地，本发明中的配体不包括相对于人VH区而言是骆驼科VHH区特有的一个或多个氨基酸残基。
有利的是，单个可变区来自针对不同抗原或表位有结合活性的抗体。例如，通过人工免疫法至少可部分分离出可变区。其它的方法在本领域也是已知的，包括从人抗体库的分离或通过人工抗体基因的合成。
在选择的实施方案中，单个可变区是天然存在的单个可变区。在其它选择的实施方案中，单个可变区是非天然存在。术语″天然存在″用于本文是指一种物体例如蛋白区，如单个可变区或抗体单个可变区，其可在自然界找到。因此，天然存在蛋白区例如抗体的V区存在于自然界表面的蛋白中，例如存在于抗体链蛋白中，例如存在于非重组物种中，例如哺乳动物、灵长类、啮齿类、鱼类、鸟类、爬行动物类等。为避免疑义，单个可变区是从核酸表达的多肽的文库分离而来的，对于该多肽而言多样性被引入到体外，上述单个可变区是一种非天然存在的单个可变区。为进一步避免疑义，来源于动物免疫所得抗体的抗体单个可变区是天然存在的单个可变区。
可变区可优选结合超抗原，例如蛋白A或蛋白L。能结合超抗原是正确折叠的抗体可变区的一个特性，使得这些可变区从重组或突变的功能区文库中分离出来。
本发明表位结合区包含蛋白支架和表位作用位点(优选存在于蛋白支架表面)。
表位结合区也可以基于蛋白支架或骨架而不是免疫球蛋白功能区。例如，天然细菌受体如SpA等已被用作嫁接CDRs的支架，以生成能与一种或多种表位特异性结合的配体。这一方法的详细资料参见US 5,831,012。其他适宜支架包括基于纤连蛋白和亲和体的那些。适用方法在WO 98/58965中详述。其他适用支架包括：脂质运载蛋白和CTLA4，参见van den Beuken et al.，J.Mol.Biol.(2001)310，591-601，以及诸如在WO0069907(Medical Research Council)中描述的那些支架，它们是基于例如细菌GroEL或其他伴侣多肽的环状结构。
蛋白骨架可以组合；例如，CDR可以嫁接于CTLA4骨架上，并与免疫球蛋白VH或VL区一起使用形成多价配体。同样，纤连蛋白、脂质运载蛋白和其他支架也可以组合。
本领域技术人员将会理解，依照本发明方法制备的闭合构象多特异性配体的表位结合区可以在同一多肽链上，或者在不同的多肽链上。
如果可变区在在不同多肽链上，那么它们可以通过一个连接子，优选通常是一个柔韧的连接子(例如多肽链)、化学连接基团或本领域已知的任意其他方法。
第一和第二表位结合区可以通过共价或非共价方式结合，如果所述区是共价结合，那么结合可例如由二硫键介导。
在本发明第二框架中，第一和第二表位优选是不同的。它们可以全部或部分是多肽，蛋白或核酸，可以是天然的或合成的。这样，本发明配体可以结合表位或抗原，并作为拮抗剂或激动剂起作用(例如，EPO受体激动剂)。在一个实施方案中配体的表位结合区具有相同的表位特异性，可以例如同时结合其相应表位(当多个表位拷贝出现在同一种抗原上时)。在另一个实施方案中，这些表位由不同的抗原提供，因此配体能结合表位并桥联所述抗原。本领域技术人员理解表位和抗原的选择是广泛多样的。例如，它们可以是人或动物蛋白、细胞因子、细胞因子受体，酶辅助因子或DNA结合蛋白。适宜的细胞因子和生长因子包括，但优选不限于：ApoE，Apo-SAA，BDNF，心脏营养蛋白-1，EGF，EGF受体，ENA-78，嗜酸细胞活化趋化因子，嗜酸细胞活化趋化因子-2，Exodus-2，EpoR，酸性FGF，碱性FGF，成纤维细胞生长因子-10，FLT3配体，Fractalkine(CX3C)，GDNF，G-CSF，GM-CSF，GF-β1，胰岛素，IFN-γ，IGF-I，IGF-II，IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8(72a.a.)，IL-8(77a.a.)，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18(IGIF)，抑制素α，抑制素β，IP-10，角质形成细胞生长因子-2(KGF-2)，KGF，来普汀，LIF，淋巴细胞趋化因子，穆勒抑制物，单核细胞克隆抑制因子，单核细胞趋化蛋白，M-CSF，MDC(67a.a.)，MDC(69a.a.)，MCP-1(MCAF)，MCP-2，MCP-3，MCP-4，MDC(67a.a.)，MDC(69a.a.)，MIG，MIP-1α，MIP-1β，MIP-3α，MIP-3β，MIP-4，髓样祖细胞抑制因子-1(MPIF-1)，NAP-2，Neurturin，神经生长因子，β-NGF，NT-3，NT-4，制瘤素M，PDGF-AA，PDGF-AB，PDGF-BB，PF-4，RANTES，SDF1α，SDF1β，SCF，SCGF，干细胞因子(SCF)，TARC，TGF-α，TGF-β，TGF-β2，TGF-β3，肿瘤坏死因子(TNF)，TNF-α，TNF-β，TNF受体I，TNF受体II，TNIL-1，TPO，VEGF，VEGF受体1，VEGF受体2，VEGF受体3，GCP-2，GRO/MGSA，GRO-β，GRO-γ，HCC1，1-309，HER 1，HER 2，HER 3，HER 4，TACE识别位点，TNF BP-I和TNF BP-II，CD4，人趋化因子受体CXCR4或CCR5，来自丙肝病毒的3型非结构蛋白(NS3)，TNF-α，IgE，IFN-γ，MMP-12，CEA，幽门螺旋杆菌，TB，流感病毒，戊型肝炎，MMP-12，在某些细胞中过表达的陷入受体例如表皮生长因子受体(EGFR)，肿瘤细胞中的ErBb2受体其为一种陷入细胞的受体，LDL受体，FGF2受体，ErbB2受体，转铁蛋白受体，PDGF受体，VEGF受体，PsmAr，一种细胞外基质蛋白，弹性蛋白，纤连蛋白，层粘连蛋白，α1-抗胰蛋白酶，组织因子蛋白酶抑制剂，PDK1，GSK1，Bad，半胱天冬酶-9，Forkhead，幽门螺旋杆菌的抗原，结核分支杆菌的抗原，以及流感病毒的抗原，以及在本文附件2和附件3中公开的任何靶物质，附件中阐述的物质可以是以不同的组合方式组合的物质或独立存在的物质。细胞因子受体包括以上细胞因子的受体，例如IL-1R1；IL-6R；IL-10R；IL-18R，以及附件2或附件3中所述细胞因子的受体，以及附件2和3中公开的受体。应理解为，以上所列并不表示穷举。当多特异性配体结合两个表位(在相同或不同的抗原上)时，所述抗原可以从此列表中选择。
有利的是，双特异性配体可用于靶向作用于细胞因子和其他在生物体治疗情形下起协同作用的分子。因此，本发明提供了增加两种或两种以上细胞因子活性的方法，该方法包括：给予一种能结合所述两种或两种以上细胞因子的双特异性配体。在本发明的这方面，双特异性配体可以是任何双特异性配体，包括：含有互补和/或非互补区的配体，开放构象的配体和闭合构象的配体。例如，本发明这方面涉及VH区和VL区组配物(combination)，只有VH区的组配物和只有VL区的组配物。
治疗环境中的协同作用可通过多种途径获得。例如，如果在两个靶位被配体瞄准的条件下，目的组配物才具有治疗活性，而只瞄准一个靶位无治疗活性。在另一实施方案中，一个靶单独可提供少许或极小的治疗效果，不过，与第二靶位结合在一起可提供一种协同治疗效应。
优选本发明这方面的双特异性配体结合的细胞因子是从附件2所示列表中选出的。
另外，双特异性配体可用于肿瘤学应用中，其中一个特异性靶是表达在细胞毒细胞上的CD89，另一个是肿瘤特异性的。作为靶的肿瘤抗原的例子在附件3中给出。
在本发明第二框架的一个实施方案中，可变区来自直接针对第一和/或第二抗原或表位的抗体中。在优选实施方案中，可变区来自单个可变抗体区的库中。在一个实例中，该库不是在动物体内产生的或人工合成的。在另一实例中，单个可变区不是通过动物免疫分离(至少部分)的。因此单个功能区可以从初始文库(
Figure G2008800104821D00221
library)中分离。
在本发明第二框架的另一方面，提供了一种多特异性配体，其包括具有结合第一表位特异性的第一表位结合区和具有结合第二表位特异性的非互补第二表位结合区。所述第一和第二结合特异性可以相同或不同。
在进一步的方面，本发明提供了一种闭合构象的多特异性配体，其包含具有结合第一表位特异性的第一表位结合区和具有结合第二表位特异性的非互补的第二表位结合区，其中，第一和第二结合特异性能竞争结合表位，致使闭合构象的多特异性配体不能同时结合两个表位。
在再进一步的方面，本发明提供了开放构象的配体，其包含非互补结合区，其中，结合区是特异性针对同一靶上的不同表位。这种配体以增强的亲和力结合靶。同样，本发明提供了多价配体，其包含特异性针对相同表位的非互补结合区，指向包含多拷贝所述表位的靶，如：IL-5，PDGF-AA，PDGF-BB，TGF-β，TGF-β2，TGF-β3和TNFα，以及例如人TNF受体1和人TNFα。
在类似的方面，本发明的配体可构建为低亲和力结合独立表位的配体，致使结合独立表位无治疗意义；但是，结合两个表位所增加的亲和力可提供治疗益处。在特别的实例中，正常细胞类型上独立存在的而在异常病变细胞如肿瘤细胞上合并存在的表位可被靶向结合。这种情况下，只有异常或病变细胞才能被本发明中的双特异性配体有效结合。
特异性针对相同靶上的多拷贝同一表位或相邻表位的配体(称为螯合dAbs)可以是三聚体或多聚体(四聚体或更多)配体，包含3个、4个或更多非互补结合区。例如，配体可以构建成含有3个或4个VH区或VL区。
另外，还提供了结合多个亚单位靶的配体，其中，每个结合区特异性针对所述靶的亚单位。配体可以是二聚体、三聚体或多聚体。
优选的是根据本发明上述方面的多特异性配体可通过本发明条一方面的方法获得。
根据发明的第二框架的上述方面，有利的是，第一表位结合区和第二表位结合区是如本文定义的非互补免疫球蛋白可变区。即：既可以是VH-VH或VL-VL可变区。
特别是，鳌合dAbs可根据本发明优选的方面来制备即，采用锚定dAbs制备，其中采用一个载体构建了二聚、三聚或多聚dAbs文库，该载体包含恒定的dAb，位于连接子序列上游或下游，并在连接子的另一端插入第二、第三或其他dAbs库。例如，锚定或引导dAb可以是TAR1-5(Vκ)，TAR1-27(Vκ)，TAR2h-5(VH)或TAR2h-6(Vκ)。
在另选的方法中，可以避免连接子的应用，例如，可采用非共价键或结合区如VH和Vκ之间的天然亲和力。因此本发明提供了一种制备鳌合多价配体的方法，该方法包括如下步骤：
(a)提供一种载体，其含有编码特异性针对靶的第一表位的单个结合区的核酸序列；
(b)提供一种载体，其编码包含特异针对所述靶上第二表位的第二结合区的库，该表位可以与第一表位相同或不同，所述第二表位和所述第一表位邻近；和
(c)表达所述第一和第二结合区；和
(d)分离那些第一和第二结合区结合在一起的组配物，制备成靶结合二聚体。
第一和第二表位是邻近的，故多聚配体能同时结合在这些表位上。这样提供的配体具有结合时亲和力增强的优势。当表位相同时，增强的亲和力是通过靶上存在多拷贝表位而获得的，为了获得亲和力增强的效果，允许至少同时有两个拷贝的表位被结合。
结合区可通过几种方法连接，以及使用连接子。例如，结合区可包括cys残基、抗生物素蛋白(avidin)和抗生物素蛋白链菌素(streptavidin)基团或其他方式以在合成后非共价结合；有效结合靶的那些组配物将被分离。或者，连接子可出现在第一和第二结合区之间，这些结合区可从单个载体中以单个多肽形式表达，该多肽包括第一结合区、连接子和第二结合区库，例如上文所述的。
在一个优选方面，结合抗原时，第一和第二结合区是自然相连的，例如，VH和VL(例如Vκ)在结合相邻表位时将自然地以三种相互作用方式连接成稳定二聚体。这种结合的蛋白能在靶结合实验中分离出来。这一方法优势在于，只有结合相近邻的表位的结合区才能以正确构型连接，因此由于其对靶的高亲和力而被分离。
在本发明第二框架的以上方面的另选实施方案中，至少一个表位结合区包含非免疫球蛋白‘蛋白支架’或‘蛋白骨架’，其如本文定义的。适宜的非免疫球蛋白支架包括但优选不限于从SpA、纤连蛋白、GroEL和其他伴侣分子、脂质运载蛋白、CCTLA4和亲合体以及上面提到的物质中选出的任一种。
根据本发明第二框架的以上方面，有利的是，表位结合区连接在‘蛋白骨架’上。有利的是，本发明蛋白骨架是免疫球蛋白骨架。
本发明中术语“免疫球蛋白骨架”是指包括至少一个免疫球蛋白折叠的蛋白，并且可作为一种或多种表位结合区的核，如本文所定义的。
本文定义的优选免疫球蛋白骨架包括从以下选出的任一种或多种：一种免疫球蛋白分子，其至少包括(i)抗体的CL(κ或λ亚型)区，或者(ii)抗体重链的CH1区；一种免疫球蛋白分子，其包含抗体重链的CH1和CH2区；一种免疫球蛋白分子，其包含抗体重链CH1、CH2和CH3区；或(ii)中任一亚类与抗体CL(κ或λ亚型)区的结合物。铰链区也可包含在内。这些区的组配物可以例如模拟天然抗体，如IgG或IgM，或其片段如Fv、scFv、Fab或F(ab’)2分子。本领域技术人员会理解该举例不是穷尽性的。
骨架与如本文定义的表位结合区之间的连接可以在多肽水平获得，即在编码骨架和/或表位结合区的核酸表达之后。或者，连接步骤可以在核酸水平上进行。依照本发明连接蛋白骨架和一种或多种表位结合区的方法包括采用蛋白化学和/或分子生物学技术，这些方法是本领域技术人员熟知的，并在本文有描述。
有利的是，闭合构象的多特异性配体可包含能结合靶分子的第一区和能结合延长配体半衰期的分子或基团的第二区。例如，所述分子或基团可以是增容剂例如HSA或细胞基质蛋白。如本文使用的，短语“延长配体半衰期的分子或基团”是指这样的分子或化学基团，它们通过本文所述双特异性配体结合后，相对于未结合这些分子或基团的配体而言，会增加这些双特异性配体在动物体内半衰期。在下文中描述了能延长配体半衰期的分子和基团的例子。在优选实施方案中，闭合构象多特异性配体只有在半衰期增强分子或基团置换时才能结合靶分子。因此，例如，闭合构象多特异性配体可借助大分子如HSA使其在宿主血循环中维持。当遇到靶分子时，闭合构象多特异性配体的结合区之间竞争导致HSA置换并结合靶。
本发明任一方面的配体，包括具有至少一个单个可变区的配体或由至少一个单个可变区组成的配体，呈单体单个可变区的形式或呈多单个可变区即多聚体的形式。该配体可以被修改以含有另外的部分，例如融合蛋白或缀合物。此多聚配体例如呈双特异性配体的形式和/或包含单个可变区或由单个可变区组成的此配体，即构建此多聚配体中所用的dAb单体优选它们能与其同源靶解离，解离的Kd为300nM或更小，300nM至5pM(即，3×10-7至5×10-12M)，优选50nM至20pM，或5nM至200pM或1nM至100pM，1×10-7M或更小，1×10-8M或更小，1×10-9M或更小，1×10-10M或更小，1×10-11M或更小；和/或Koff速率常数为5×10-1至1×10-7S-1，优选1×10-2至1×10-6S-1，或5×10-3至1×10-5S-1，或5×10-1S-1或更小，或1×10-2S-1或更小，或1×10-3S-1或更小，或1×10-4S-1或更小，或1×10-5S-1或更小，或1×10-6S-1或更小，其通过例如表面等离振子共振测得。Kd速率常数定义为Koff/Kon。Kd值大于1通常被认为是显示非特异性结合。优选地，单个可变区将特异性地结合靶抗原或表位，结合亲和力为小于500nM，优选小于200nM，并且更优选小于10nM，例如小于500pM。
特别地，本发明提供了抗-TNFα dAb单体(或包含该dAb的双特异性配体)、同二聚体、异质二聚体或同三聚体配体，其中每个dAb结合TNFα。配体与TNFα结合的Kd为300nM至5pM (即，3×10-7至5×10-12M)，优选50nM至20pM，更优选5nM至200pM并且最优选1nM至100pM；若以另一种方式表达，Kd为1×10-7M或更小，优选1×10-8M或更小，更优选1×10-9M或更小，优选1×10-10M或更小并且最优选1×10-11M或更小；和/或Koff速率常数为5×10-1至1×10-7S-1，优选1×10-2至1×10-6S-1，更优选5×10-3至1×10-5S-1，例如5×10-1S-1或更小，优选1×10-2S-1或更小，更优选1×10-3S-1或更小，优选1×10-4S-1或更小，更优选1×10-5S-1或更小，并且最优选1×10-6S-1或更小，其通过表面等离振子共振测定。
优选地，采用标准L929分析得出配体中和TNFα的ND50为500nM至50pM，优选100nM至50pM，优选10nM至100pM，更优选1nM至100pM；例如50nM或更小，优选5nM或更小，优选500pM或更小，更优选200pM或更小并且最优选100pM或更小。
优选地，配体抑制TNFα与TNFα受体I(p55受体)结合，其IC50为500nM至50pM，优选100nM至50pM，更优选10nM至100pM，优选1nM至100pM；例如50nM或更小，优选5nM或更小，更优选500pM或更小，优选200pM或更小，并且最优选100pM或更小。优选地，TNFα是人TNFα。
此外，本发明提供了抗-TNF受体I dAb单体或者包含此dAb的双特异性配体，其结合TNF受体I，Kd为300nM至5pM(即，3×10-7至5×10-12M)，优选50nM至20pM，更优选5nM至200pM并且最优选1nM至100pM，例如1×10-7M或更小，优选1×10-8M或更小，更优选1×10-9M或更小，优选1×10-10M或更小并且最优选1×10-11M或更小；和/或Koff速率常数为5×10-1至1×10-7S-1，优选1×10-2至1×10-6S-1，更优选5×10-3至1×10-5S-1，例如5×10-1S-1或更小，优选1×10-2S-1或更小，优选1×10-3S-1或更小，更优选1×10-4S-1或更小，再更优选1×10-5S-1或更小，并且最优选1×10-6S-1或更小，优选由表面等离振子共振测定。
优选地，dAb单体配体以标准分析法(例如，本文描述的L929或HeLa分析法)中和TNFα，其ND50为500nM至50pM，优选100nM至50pM，更优选10nM至100pM，优选1nM至100pM；例如50nM或更小，优选5nM或更小，更优选500pM或更小，优选200pM或更小，并且最优选100pM或更小。
优选地，dAb单体或配体抑制TNFα与TNFα受体I(p55受体)，其IC50为500nM至50pM，优选100nM至50pM，更优选10nM至100pM，优选1nM至100pM；例如50nM或更小，优选5nM或更小，更优选500pM或更小，优选200pM或更小，并且最优选100pM或更小。优选地，TNF受体I靶是人TNFα。
此外，本发明提供了dAb单体(或包含此dAb的双特异性配体)，其结合血清白蛋白(SA)，Kd为1nM至500μM(即，1×10-9至5×10-4)，优选100nM至10μM。优选地，对于包含第一抗-SA dAb和第二dAb对另一靶的的双特异性配体，该第二dAb对其靶的亲和力(例如Kd和/或Koff，如由表面等离振子共振测定，例如使用Biacore)是该第一dAb对SA的亲和力的1至100000倍(优选100至100000，更优选1000至100000，或10000至100000倍)。例如，该第一dAb结合SA的亲和力为约10μM，而该第二dAb对其靶的亲和力为100pM。优选地，血清白蛋白人血清白蛋白(HSA)。
在一个实施方案中，该第一dAb(或dAb单体)结合SA(例如，HSA)的Kd为约50，优选70，并且更优选100、150或200nM。
本发明还提供了前述dAb单体的二聚体，三聚体和多聚体，这与本发明前述方面相一致。
依照本发明的含有dAb单体、二聚体和三聚体的配体可与抗体Fc区相连，Fc区包括CH2和CH3区或其中之一，还可任选包含铰链区。例如，编码作为一种单核苷酸序列与一个Fc区连接的配体的载体可用来制备这种多肽。
在本发明第二框架的进一步方面，本发明提供了一种或一种以上编码本文定义的至少一种多特异性配体的核酸分子。在一个实施方案中，多特异性配体是一种闭合构象配体。在另一实施方案中，多特异性配体是一种开放构象配体。该多特异性配体可由单个核酸分子编码；或者，每个表位结合区可由独立的核酸分子编码。由单个核苷酸分子编码多特异性配体时，所述功能区可以表达为一种融合多肽，或者分开表达然后连在一起，例如采用化学连接剂。由独立的核酸分子表达的配体可通过适当的方式连在一起。
核酸可进一步编码信号序列，用于在表达时多肽从宿主细胞中输出，并且表达时可与丝状噬菌粒表面成分(或筛选展示系统的其他成分)融合。可用于细菌表达和/或噬菌体或噬菌粒展示中的引导序列包括pelB、stII、ompA、phoA、bla和pelA。
本发明第二框架的进一步的方面，提供了一种包含本发明核酸的载体。
在进一步的方面，本发明提供了一种转染有本发明载体的宿主细胞。
由这种载体的表达可以被装配，以例如在细菌噬菌体粒的表面产生用于筛选的表位结合区。因此，采用本发明的方法可选择所展示的功能区以及多特异性配体。
本发明第二框架的一个优选实施方案中，表位结合区是免疫球蛋白可变区并且从单个区域V基因库中选出。通常单个抗体的功能区的库是在丝状细菌噬菌体表面展示的。在优选实施方案中，每一单个抗体的功能区(domain)是通过噬菌体库与抗原结合的方式选出的。
本发明进一步提供了试剂盒，其至少包括根据本发明的多特异性配体，其可以是开放构象配体或闭合构象配体。本发明试剂盒可以是例如：诊断试剂盒、治疗试剂盒或者化学或生物种系检测试剂盒等等。
在本发明第二框架的进一步的方面，提供了一种利用本发明配体的均相免疫测定法(homogenous immunoassay)。
在本发明第二框架的再进一步的方面，本发明提供了一种组合物，其包含可通过本发明方法获得的闭合构象多特异性配体，和药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
此外，本发明提供了采用本发明的‘闭合构象多特异性配体’或组合物治疗疾病的方法。
在本发明的优选实施方案中，该疾病是癌症或炎症性疾病，例如类风湿关节炎、哮喘或克罗恩氏病。
在本发明第二框架的进一步的方面，本发明提供了一种诊断方法，其包括采用本发明的闭合构象多特异性配体或组合物诊断疾病。因此，通常一种分析物(analyte)与闭合构象多特异性配体的结合可用作置换一种试剂，导致置换过程中信号产生。例如，分析物(第二抗原)的结合能置换与提供免疫测定基础的抗体分子结合的酶(第一抗原)，特别是通过活性位点与抗体结合的酶。
因此，在第二框架的最后一方面，本发明提供了一种检测靶分子存在的方法，其包括：
(a)提供一种结合在一种试剂上的闭合构象多特异性配体，所述配体特异性针对所述靶分子和所述试剂，其中，结合在配体上的所述试剂从配体置换时导致一种可测信号的产生；
(b)使闭合构象多特异性配体暴露于所述靶分子；和
(c)检测作为试剂置换结果所产生的信号。
根据本发明第二框架的上述方面，有利的是，该试剂是酶，该酶与闭合构象多特异性配体结合时无活性。或者，该试剂可以是选自以下的一种或多种：酶的底物、荧光分子、发光分子或发色分子，其与配体结合时无活性或被淬灭。
与本文公开的序列类似或同源(例如，至少约70％序列一致)的序列也是发明的一部分。在某些实施方案中，在氨基酸水平上，序列一致性可能约为80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高。在核酸水平上，序列一致性可能约为70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高。或者，当核酸片段在选择杂交条件下(如：极严格杂交条件下)与其互补链杂交时，存在基本的一致性(substantialidentity)。核酸可存在于整个细胞或细胞裂解物中，或以部分纯化或充分纯化形式存在。
一致性百分数可以指代氨基酸或核苷酸序列完全伸展长度的一致性百分数。当指明时，氨基酸或核酸序列的一致性百分数是指所指定的氨基酸或核酸序列的一个或多个不连续区域的的序列的一致性百分数，例如沿着一个或多个抗体CDR区，和/或沿着一个或多个抗体可变框架区。例如，在氨基酸水平上横跨抗体重链或轻链单个可变区的一个或多个CDR的序列一致性分别与抗体重链或轻链单个可变区的相应CDR的氨基酸序列可具有约80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的一致性。在核酸水平，编码抗体重链或轻链单个可变区的一个或多个CDR的核酸序列与编码抗体重链或轻链单个可变区的相应CDR的核酸序列可具有至少70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更变的一致性。在核酸水平，编码抗体重链或轻链单个可变区的一个CDR的核酸序列分别与编码抗体重链或轻链单个可变区的相应CDR的核酸序列可具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的一致性百分数。在一些实施方案中，一致性百分数的结构特征与功能方面是相关联的。例如，在一些实施方案中，具有与参比核酸或氨基酸序列小于100％一致性的核酸序列或氨基酸序列也要求展示参比氨基酸序列或者由参比核酸编码的氨基酸序列的至少一个功能方面。在其它实施方案中，具有与参比核酸或氨基酸序列小于100％一致性的核酸序列或氨基酸序列也分别要求展示参比氨基酸序列或者由参比核酸编码的氨基酸序列的至少一个功能方面，但是功能特征可以轻微改变，例如，相对于参比品来说，对特异性抗原具有增加的亲和力。
两个序列的“同源性”或“序列一致性”或“相似性”(在本文中这些术语可交替使用)的计算按下法进行。为了最佳比较目的，对序列进行比对(如：为了最佳比对，可在第一和第二个氨基酸或核酸序列的一个中或者二者中引入间隔，并且非同源序列可为比较目的而被忽略)。在优选实施方案中，用于比较目的的所比对的参考序列的长度为至少30％，优选至少40％，更优选至少50％，甚至更优选至少60％，并且甚至更优选至少70％、80％、90％、100％的参考序列的长度。然后，比较相应氨基酸位置或核酸序列位置上的氨基酸残基或核酸残基。当第一序列中一个位置被第二序列相应位置上的相同氨基酸残基或核苷占据时，那么所述分子在这个位置上是相同的(如用于本文的，基酸或核酸“同源”等价于氨基酸或核酸“一致”)。两个序列一致的百分比是所述序列共有相同位置的数目的函数，考虑间隔数目和每个间隔的长度，间隔缺口的引入是两个序列达到最佳比对所需。
有利的是，有默认值参数的BLAST运算法则(2.0版)可用来序列比对。在美国国立(“gov”)卫生研究院(“NIH”)的生物技术信息中心(“NCBI”)网址(“www”)中详细叙述BLAST运算法则，在“/Blast/”地址录中的“blast_help.html”文件中。搜索参数定义如下，并且方便地设置了定义的默认值。
BLAST(基本局部比对研究工具(Basic Local Alignment SearchTool))是启发式搜索法则，被blastp，blastn，blastx，tblastn和tblastx程序所应用；这些程序的重要意义归因于Karlin and Altschul，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(6)：2264-8中发现和应用的标准方法(参见上述“blast_help.html”文件)，有少数改进。BLAST程序经改造用于序列相似性搜索，例如确定未知序列同源性。该程序通常不适用于基序-模式搜索。有关相似性搜索序列数据库中基本问题参见Altschul et al.(1994)。
在国立生物技术信息中心网址中可以找到5种BLAST程序，它们执行以下任务：
“blastp”将氨基酸未知序列与蛋白序列数据库比较；
“blastn”将核苷酸未知序列与核苷酸序列数据库比较；
“blastx”将核苷酸未知序列(双链)六读框(six-frame)的推测翻译产物与蛋白序列数据库比较；
“tblastn”将蛋白未知序列与核苷序列数据库的动态全部六阅读框(双链)的翻译比较；
“tblastx”将核苷酸未知序列六读框翻译与核苷序列数据库的六读框翻译比较。
BLAST采用以下搜索参数：
HISTOGRAM显示每次搜索得分的柱状图；默认值是“yes”(见BLAST菜单中参数H)。
DESCRIPTIONS限定所报告指定数目的匹配序列简短描述的数目；默认值是100。(见菜单页参数V)也可参照EXPECT和CUTOFF。
ALIGNMENTS(比对)限制指定数目数据库序列以便报告高分值片段对(HSPs)；默认限值是50。如果大于此值的数据库序列偶然符合报告的统计学显著性差异阈值(见以下EXPECT和CUTOFF)，那么只有最大统计学差异的匹配才被报告。(见BLAST菜单中参数B)。
EXPECT统计学显著性阈值用来报告与数据库序列的匹配；默认值是10，这样根据Karlin and Altschul(1990)的随机样本10个匹配只能被偶然发现。如果由于匹配的统计学显著性大于EXPECT闽值，则匹配将不被报告。EXPECT下限阈值更为严格，导致报告匹配的机会较少。分数值也可接受。(见BLAST菜单中参数E)。
CUTOFF Cutoff分值报告高分值片段对。默认值可从EXPECT值中计算出(见上)。只有在HSPs的统计学显著性差异至少与等于CUTOFF值的单个HSP显著性差异一样高时，HSPs用作数据库序列报告。CUTOFF值上限十分严格，导致报告匹配的机会较少。(见BLAST菜单中参数s)。通常采用EXPECT，显著性阈值可以被更直观地控制。
MATRIX详细说明BLASTP，BLASTX，TBLASTN和TBLASTX的可选择的分分值矩阵。默认值是BLOSUM62(Henikoff&Henikoff，1992，Proc.Natl.Aacad.Sci.USA 89(22)：10915-9)。有效备选包括：PAM40，PAM 120，PAM250和IDENTITY。非变量分值矩阵可用于BLASTN；详细说明BLASTN请求中MATRIX指示回复误差反应。
STRAND限定TBLASTN搜索，以调节数据库序列的上下线；或限制BLASTN、BLASTX或TBLASTX搜索，以调节未知序列的上下线的阅读框。
FILTER屏蔽具有较低结构复性的未知序列片段，如Wootton&Federhen(1993)Computers and Chemistry 17：149-163中SEG程序测定的序列；或屏蔽短周期内部重复子组成的片段，如由Claverie&States，1993，Computers and Chemistry 17：191-201中XNU程序测定的重复子；或者，用在Tatusov and Lipman(见NCBI网址)DUST程序中的BLASTN。过滤能去除波输出中的统计学显著但无生物学意义的报告(例如，普通的酸、碱或富含脯氨酸区的发现)，剩余未知序列中有生物学意义的区域可用作与数据库特异性匹配。
由滤过程序发现的低复杂性序列，在核苷酸序列中用字母“N”(如：N重复13次)代替，在蛋白序列中用字母“X”(如：X重复9次)代替。
滤过只用于未知序列(或其翻译产物)，不用于数据库序列。BLASTN中默认滤过是DUST，其他程序默认滤过是SEG。
当应用在SWISS-PROT中的序列时，通常根本无可被SEG和XNU中一个或二者所屏蔽的，所以滤过通常不会产生效果。此外，在某些情况下，序列被完全屏蔽，表明所报告的对未滤过的未知序列的任何匹配是不可信的。
NCBI-gi使NCBI gi标式符显示在输出中，其中还包括进入(accession)和/或定位名称(locus name)。
最优选地，序列的比较是采用简单BLAST搜索算法进行的，该算法在上述NCBI网址中的“/BLAST”目录中提供。
附图简述
图1：显示在VH/HSA的多样性，分布于VH/HSA抗原结合部位中H50，H52，H52a，H53，H55，H56，H58，H95，H96，H97，H98(分别编码的DVT或NNK)位点上。VK序列在L50和L53位点上有多样性。
图2：显示以噬菌体展示/ScFv形式存在的：
库1：VK/DVT VH胚系，
库2：VK/NNK VH胚系，
库3：VH/DVT VK胚系，
库4：VH/NNK VK；
这些库是通过与属类配体(generic ligand)蛋白A和蛋白L结合后预先筛选的，所以绝大多数克隆和筛选库都是功能性的。这些库通过HSA(第一轮)和β-gal(第二轮)或HSA β-gal选择过程或通过β-gal(第一轮)和HSA(第二轮)β-gal HSA选择过程选择的。来自这些PCR克隆的可溶性scFv在序列中被扩增。选择编码双特异性抗体K8的一个克隆以备下一步工作。
图3：显示VH链和Vκ链的比对。
图4：显示K8抗体结合特性的描述，通过单克隆噬菌体ELISA法定性的K8抗体的结合特性，双特异性K8抗体因能与HSA和β-gal结合并能在噬菌体表面展示，吸收信号大于1.0。未测出与其他蛋白的交叉反应。
图5：显示用已知浓度的K8抗体片段进行的可溶性scFvELISA。用浓度为10μg/ml和100μg/ml的100μg的HSA、BSA和β-gal以及浓度为1μg/ml的100μg的ProteinA包被96孔板。应用50μg的K8 scFv连续稀释液，并且用蛋白L-HRP检测所结合的抗体片段。ELISA结果证实K8抗体的双特异性本质。
图6：显示采用可溶性scFv ELISA分析克隆K8VK/模拟VH的结合特性。如Harrison et al，Methods Enzymol.1996；267：83-109描述的经IPTG诱导产生的产物可溶性scFv片段，直接测定上清中scFv的含量。可溶性scFv ELISA分析的操作如实施例1描述，结合的scFvs用蛋白L-HRP检测。ELISA结果表明该克隆仍能结合β-gal而不能结合BSA。
图7：显示可变区载体1和2的序列。
图8：是用于构建VH1/VH2多特异性配体的CH载体图。
图9：是用于构建Vκ1/Vκ2多特异性配体的Vκ载体图。
图10：TNF受体分析比较TAR1-5二聚体4、TAR1-5-19二聚体4和TAR1-5-19单体。
图11：TNF受体分析比较TAR1-5二聚体1-6。所有二聚体经过FPLC纯化，并显示了最佳二聚物的种类。
图12：不同形式的TAR1-519同型二聚体的TNF受体分析：带有3U、5U或7U连接子的dAb-连接子-dAb形式，Fab形式和半胱氨酸铰链连接子形式。
图13：库1中模拟VH序列。VH框架序列基于DP47-JH4b胚系序列。库1中并入了随机化(randomisation)的NNK(N＝A或T或C或G核苷酸：K＝G或T核苷酸)用粗体下划线标出。
图14：库2中模拟VH序列。VH框架序列基于DP47-JH4b胚系序列。库2中并入了随机化的NNK(N＝A或T或C或G核苷酸；K＝G或T核苷酸)用粗体下划线标出。
图15：库3中模拟Vκ序列。VK框架序列基于DPK9-JK1胚系序列。库3中并入随机化的NNK(N＝A或T或C或G核苷酸；K＝G或T核苷酸)用粗体下划线标出。
图16：抗MSA dAbs MSA 16和MSA26的核苷酸和氨基酸序列。
图17：MSA 16和MSA 26抑制性生物大分子互相作用分析仪(Biacore)检测。采用抑制性生物大分子互相作用分析仪方法测定纯化的dAbs MSA16和MSA26的Kd值。简言之，检测能在包被高密度MSA的生物大分子互相作用分析仪CM5芯片上获得200RUs反应所需dAb的浓度。一旦所需dAb浓度确定，将浓度在预期Kd值左右的MSA抗原与dAb预先混合并孵育过夜。然后，以30μl/分钟的高流速测定dAb与包被biacore芯片的MSA的结合。
图18：注射后MSA16血清水平。测定小鼠体内dAb MSA16的血清半衰期。给CD1小鼠一次静脉注射MSA16，剂量大约为1.5mg/kg。2区室模型显示MSA16的t1/2α为0.98hr，t1/2β为36.5hr，AUC为913hr.mg/ml。与HEL4(抗鸡卵白溶菌酶dAb)相比，MSA16具有相对延长的半衰期，HEL4的t1/2α为0.06hr并且t1/2β为0.34hr。
图19：ELISA(a)和TNF受体分析(c)显示TNF与一个含有MSA26Ck和TAR1-5-19CH的Fab样片段结合的抑制作用。含有Fab样片段的MSA的添加能降低抑制水平。用双特异性VκCH和VκCκFab样片段探查包被有1μg/ml TNFα的ELISA板，同时用TNFα结合dAb作对照，其浓度根据ELISA中能产生相同信号的浓度来计算。双特异性和对照dAb用来探查有/无2mg/ml MSA的ELISA板。双特异性孔中的信号减少超过50％，而dAb孔中信号丝毫未降低(见图19a)。相同的双特异性蛋白也用于有/无MSA的受体分析中，MSA的竞争也在图中显示(见图19c)。这表明MSA和双特异性分子的结合可被与TNFα结合所竞争。
图20：TNF受体分析显示TNF结合TAR1-5-19 dAb和MSA16dAb经二硫键连成的异质二聚体的抑制。带有二聚体的MSA的增加能以剂量依赖方式降低抑制水平。TNF受体分析(图19(b))操作中，采用恒定浓度(18nM)的异质二聚体和一系列稀释浓度的MSA和HSA。浓度范围高达2mg/ml的HSA不能使二聚体抑制TNFα的能力降低。然而，MSA的增加以剂量依赖方式引起二聚体抑制TNFα的能力降低(图19a)。这表明MSA和TNFα竞争结合cys连接的TAR1-5-19、MSA16二聚体。分析中MSA和HSA单独不影响TNF结合水平的作用。
图21：人血清白蛋白(HSA)的纯化的重组区，条带1-3分别含有HSA区域I、II和III。
图22：免疫沉淀反应的实施例，显示了HSA-结合dAb结合全长HSA(条带8)和HSA区域II(条带6)，但未结合HSA区域I和III(分别为条带5和7)。非-HSA-结合dAb未使全长HSA或HSA区域I、II或III降低(条带1-4)。
图23：由表面等离振子共振鉴别的dAb结合HSA区域的鉴别的实施例。将研究的dAb根据所描述的方法注入到低密度包裹的人血清白蛋白CM5传感器芯片(Biacore)中。在第1点处，将研究的dAb以1μM单独注射。在第2点处，使用共同注射指示，将样品注射转换到1μM dAb加7μM的毕赤酵母属产生的HSA区域1、2或3的混合物中。在第3点处，停止样品注射，但继续缓冲液流。两种不同的dAb的结果显示于23a)和23b)。当dAb与其结合的HSA区域注射时，其形成在芯片上不再结合HSA的复合物，因此Biacore在第2点处下降，off-率反映了dAb、可溶性HSA区域和结合HSA的芯片之间三者的平衡。当该区域不结合dAb时，信号在在第2点处仍未变化，而仅在在第3点处开始下降，此时液流转换成缓冲剂。在所有这些情况下，dAb结合HSA区域2。
图24：由噬菌体筛选鉴定的AlbudAbTM(一种特异性结合血清白蛋白的dAb)克隆的抗体序列。所有克隆与人胚系基因比对。与胚系相同的残基由‘.’表示。在VH CDR3中，符号‘-’用于帮助比对，但不代表残基。所有克隆选自基于单一人框架的文库，该文库包含重链胚系基因V3-23/DP47和JH4b(针对VH文库)以及κ轻链基因O12/O2/DPK9和Jκ1(针对Vκ文库)，其具有掺入到抗原结合点的位置的侧链多样性。
图25：人血清白蛋白的三个区域的比对。可清楚地看过程存留有半胱氨酸残基。
发明详述
定义
“互补的(Complementary)”当两个免疫球蛋白功能区属于组成同源对或组的结构家族或者它们来自这些家族并保留其特性时，那么这两个免疫球蛋白区是“互补的”。例如，抗体的VH区和VL区是互补的，两个VH区不是互补的，两个VL区不是互补的。互补区也可在免疫球蛋白超家族其他成员中发现，例如T细胞受体的Vα和Vβ(或者γ和δ)区。本发明第二框架的上下文中，非互补区不能共同作用结合一个靶分子，但能独立地作用于相同或不同分子上的不同靶表位。人工合成区例如不能结合表位的基于蛋白支架结构的区域，是不互补的，除非设计其能结合表位。同样，(例如)基于免疫球蛋白区和纤连蛋白区的两个区域不是互补的。
“免疫球蛋白”：指保留抗体分子的免疫球蛋白折叠特性的多肽家族，包括两个β片层并且通常为一个保守的二硫键。免疫球蛋白超家族成员之间参与体内细胞和非细胞相互作用的多个方面，包括在免疫系统中的广泛作用(例如，抗体、T细胞受体分子及类似物)，参与细胞粘附(例如，ICAM分子)和细胞内信号(例如，受体分子，如PDGF受体)。本发明适用于所有具有结合区的免疫球蛋白超家族分子。优选的是本发明涉及抗体。
“结合(combining)”：本发明中结合的可变区组成一系列组合区域；例如：互补区可以结合如与VH区结合的VL区。非互补区也可结合。所述区域可通过多种方式结合，包括通过共价和非共价方式连接。
“功能区(区，区域(domain))”：功能区是一种折叠蛋白结构，不依赖于蛋白的其它部分而保持其三级结构。通常，功能区具有蛋白的部分功能特性，并且在很多情况下，所述功能区可被添加、去除或转移给其他蛋白而不降低蛋白和/或区域剩余部分的功能。
如本文使用的，“单个可变区”是一个能独立地特异性地结合表位、抗原或配体的区域，即，不要求另一结合区协同结合表位、抗原或配体表位、抗原或配体。此表位、抗原或配体可以是天然存在的，或者可以是天然存在的表位、抗原或配体的修饰物，或者可以是合成的。单个可变区的“可变的”部分基本上决定的每一特定单个可变区的结合特异性。因此，在单个可变区的语境中，术语“可变的”是指这样的情况，即序列变异性不是均匀地分布在单个可变区中，但基本上分布在单个可变区的框架或骨架部分之间。例如，抗体单个可变区中，变异性集中于公知为互补决定区(CDR)的1至3个片段中。一个或多个CDR可以分布中轻链或重链的抗体框架区(FR)之间，以分别形成抗体轻链单个可变区或抗体重链单个可变区，其各自与另一结合区独立的表位。类似结构是T-细胞受体单个可变区，其有1至3个CDR分布于TCR框架区域之间。
因此，参照单个可变区的结合特异性的可变部分远不同于其它单个可变区的序列，所述其它单个可变区基本上具有相同的其余支架结构部分，相应地，可具有结合特异性的不同范围。单个可变区的支架结构包括抗体框架支架结构，一致性抗体框架，以及起源于和/或衍生自细菌蛋白的支架结构例如GroEL、GroEs、SpA、SpG，以及衍生自真核蛋白例如CTLA-4、脂质运载蛋白、纤连蛋白等。单个可变区可变部分的一个来源包括一个或多个CDR，其可以移植到非-免疫球蛋白支架结构中以及抗体框架支架结构中，以产生抗体单个可变区。单个可变区变异的另一来源可以是非-免疫球蛋白框架支架结构中所选位置的多样化例如纤连蛋白，以产生单个可变区，其使用分子生物学技术，例如例如NNK密码子多样性。类似地，此变异的来源还适用于抗体单个可变区。
抗体单个可变区可衍生自由产生种属的抗体编码和/或产生的抗体序列，并且包括抗体可变区的片段和/或衍生物，其包括一个或多个框架区或者框架共有序列和/或一个或多个CDR。相应地，抗体单个可变区包括抗体轻链可变区的片段和/或衍生物，或者抗体重链可变区的片段和/或衍生物，或者抗体VHH区的片段和/或衍生物。例如，抗体VHH区对于骆驼科而言是内源性的那些：例如，骆驼和骆马，以及来自护士(nurse)和须鲨科(wobbegong)鲨的的新抗原受体(NAR)(Roux et al.，1998PNAS 95(20)：11804-9)，和来自斑纹鱼(spotted ratfish)的VH  区(Rast et al.，1998 Immunogenetics47：234-245)。抗体轻链可变区和抗体重链可变区包括但优选不限于对以下动物种属是内源性的那些：人、小鼠、大鼠、猪、短尾猴、仑鼠、马、牛、山羊、狗、猫，以及鸟类物种，例如分别为人Vκ和人VH3。抗体轻链可变区和抗体重链可变区还包括一致性抗体框架，如下文所述，包括V区域家族例如VH3家族的那些。T-细胞受体单个可变区是衍生自T-细胞受体链例如α、β、γ和δ链的单个可变区，并且其结合表位或抗原或配体而不依赖于类似于抗体单个可变区的表位、抗原或配体的另一结合区。
抗体单个可变区还包括蛋白区，其包含不是衍生自抗体或T-细胞受体的支架结构，并且其在遗传操作上展示相对于其预操作状态下的结合特异性的多样性，其方式是向该支架结构中并入一个或多个CDR1、CDR2和/或CDR3，它们的衍生物或片段，或者整个抗体V区域。抗体单个可变区还包括非-免疫球蛋白支架结构和免疫球蛋白支架结构，正如下文所述GroEL单个可变区多聚体所说明的。优选地，该CDR是来自抗体链的抗体V区，例如VH、VL和VHH。该抗体链可以是特异性结合与第二抗体链相一致的抗原或表位的抗体链，或者该抗体链可以是特异性结合独立于第二抗体链的抗原或表位的抗体链，例如VHH链。一个或多个CDR整合到包含非-免疫球蛋白支架结构的抗体单个可变区中，这必将导致非免疫球蛋白支架结构的单个可变区能够特异性结合不依赖于另一结合区的表位、抗原或配体的表位或抗原或配体。
单个区域可以转变成单个可变区，其转变方式是通过在指定的位置引入多样性以变成结合位点，接着使用例如展示技术筛选需要的结合特性。可以将多样性引入到感兴趣的非-免疫球蛋白支架结构的特异性位置，其引入方式是通过使支架结构的特异性环的氨基酸序列随机化，例如通过引入NNK密码子。这种产生多样性接着筛选需要的结合特性的机制类似于在自然界由生成于环中的多样性所产生的高亲和力、抗原特异性抗体的自然筛选，所述环形成抗体结合位点。理想的是，小而且含有类似于抗体环的折叠以单个区域被转变成单个可变区，表达单个可变区的变型，据此含有需要的结合特异性和性质的单个可变区可选自含有大量单个可变区的变型的文库。
单个可变区的命名：有时候抗体单个可变区的命名是由去掉第一个“d”或者字母集“Dom”缩写而成的，例如Ab7h24等同于dAb7h24，其又等同于DOM7h24。
单个抗体可变区是指包含抗体可变区序列特征的一个折叠多肽区域。因此，它包括完全抗体可变区和经修饰的可变区，例如，其中一个或多个环被不具有抗体可变区特征的序列取代的可变区，或者被删减的抗体可变区或包含N-或C-末端延伸的抗体可变区，以及保留全长区域至少部分活性和特异性的可变区折叠片段。
“库(Repertoire)”：不同变异体的集合。例如，在它们的初级序列(primary sequence)中的不同的多肽变异体。本发明中应用的库包含至少1000个成员的多肽集合。
“文库(Library)”：术语文库指异源多肽或核酸的混合物。文库由多个成员组成，每个成员具有单一多肽或核酸序列。在这层意义上，文库和库相同。文库的成员中序列之间的不同是文库中多样性的成因。文库可以是一种简单的多肽或核酸混合物形式，或者可以是被核酸文库转化的有机体或细胞形式，例如：细菌、病毒、动物或植物细胞及其类似物。优选的是，每个微生物或细胞单体包含只一个或有限数目的文库成员。有利的是，核酸整合入表达载体中，以便表达核酸编码的多肽。因此，在一个优选方面，文库可以是宿主生物群的形式，每一生物包含表达载体的一个或多个拷贝，载体包含核酸文库单一成员，从所述核酸能表达产生相应的多肽成员。这样，宿主生物群具有编码遗传多样性多肽变异体大库的潜能。
“闭合构象多特异性配体(closed conformation multi-speciticligand)”：描述本文定义的多特异性配体，其包含至少两个本文定义的表位结合区。术语‘闭合构象’(多特异性配体)是指配体表位结合区的排列使得一个表位结合区的表位结合竞争另一个表位结合区的表位结合。即：同源表位可被每个表位结合区单独而非同时结合。闭合构象配体可用本文描述的方法制备。
“抗体”：抗体(例如IgG，IgM，IgA，IgD或IgE)或片段(例如Fab，F(ab’)2，Fv，二硫键连接的Fv，scFv，闭合构象多特异性抗体，二硫键连接的scFv，双抗体)不管是来自自然产生抗体的任何胚系或通过重组DNA技术产生；或者从血清、B细胞、杂交瘤、转染体、酵母或细菌中分离得来)。
“双特异性配体”：一种配体，其包含本文定义的第一免疫球蛋白单个可变区和第二免疫球蛋白单个可变区，其中可变区能结合两个不同抗原或同一抗原上的两个表位，所述抗原或表位通常不被单特异性免疫球蛋白结合。例如，两个表位可存在于同一半抗原上，但不是相同表位或充分接近而被单特异性免疫球蛋白结合。本发明双特异性配体由具有不同特异性的可变区组成，并且不包括具有相同特异性的彼此互补的可变区对。因此，如本文定义的含有两个单个可变区的双特异性配体是多聚配体的亚组，该多聚配体是如本文定义的含有两个或多个单个可变区的，其中所述单个可变区中至少两个能够结合两种不同的抗原或者结合在同一抗原上的两个不同表位。此外，本文定义的双特异性配体也不同于包含抗体单个可变区以及第二抗原和/或不是单个可变区的表位结合区的配体。更进一步的，本文定义的双特异性配体也不同于含有第一和第二抗原/表位结合区的配体，其中抗原/表位结合区均不是本文定义的单个可变区。
“抗原”：一种被本发明配体结合的分子。通常抗原被抗体配体结合并且能提高体内抗体反应。它可以是多肽、蛋白、核酸或其他分子。一般来说，本发明中的双特异性配体是通过针对特定抗原的靶特异性而选出的。对于常规抗体和其片段，由可变区环(L1，L2，L3和H1，H2，H3)定义的抗体结合位点能结合抗原。
“表位”：常规被免疫球蛋白VH/VL对结合的结构单位。表位定义抗体的最小结合位点，因此代表抗体的特异性靶。针对单区抗体来说，表位代表被可变区独立结合的结构单位。表位结合区包含蛋白支架结构和表位相互作用位点(它们在蛋白支架结构的表面是有利的)。表位结合区可包含非线性的表位相互作用位点，例如其中该表位结合区包含多个介于它们之间的插入区的表位相互作用位点，例如通过FR分离的CDR，或者存在于分离的多肽链上。或者，表位结合区可包含由在一个多肽链上连续编码氨基酸的线性表位相互作用位点。
“属类配体(generic ligand)”：结合库中所有成员的配体。通常，不通过上述抗原结合位点结合。非限制性例子包括蛋白A、蛋白L和蛋白G。
“选择”：通过筛选或达尔文选择方法衍化而来，在选择过程中，结合作用发生在区与抗原或表位之间或者抗体与抗原或表位之间。因此，第一可变区的选择是通过结合抗原或表位选择的，互补可变区可有可无。
“通用框架(Universal framework)”：对应于序列保守抗体区域的单个抗体框架序列如Kabat所定义的(“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”，US Department of Health and HumanServices)，或对应于人胚系免疫球蛋白库或结构，如Chothia andLesk，(1987)J.Mol.Biol.196：910-917所定义的。本发明提供了单个框架的用途或一系列这样的框架，发现通过高变区单独变异可引起实质上任何结合特异性的衍生。
如本文使用的″缀合物″是指一种组合物，其包含结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段，所述血清白蛋白与药物结合。
如本文使用的，术语″小分子″表示具有分子量小于1,500道尔顿，优选小于1000道尔顿的化合物。
此类缀合物包括″药物缀合物″，它们包含结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段，所述血清白蛋白与药物共价结合，而″非共价药物缀合物″包含结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段，所述血清白蛋白与药物非共价结合。
如本文使用的，″药物缀合物″是指一种组合物，其包含结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段，所述血清白蛋白与共价药物结合。该药物可通过适宜的连接子部分直接或间接地共价连接到抗原结合片段。该药物可在任何适宜的位置结合到抗原结合片段上，例如在氨基末端、羧基末端或者通过适宜的氨基酸侧链(例如，赖氨酸的氨基)。
“半衰期”：配体体内血清浓度降低到50％所需时间，例如，由于配体降解和/或通过自然机制引起的配体清除或隔离。本发明配体在体内能被稳定化，而且通过结合能抵抗降解和/或清除或隔离的分子而延长其半衰期。通常这些分子是天然蛋白，它们本身具有较长的体内半衰期。如果配体在体内的功能活性持续的时间比无半衰期增加分子特异性的类似配体延长，那么该配体的半衰期即得到了延长。因此，比较针对HSA和靶分子的特异性配体和不存在HSA特异性的类似配体，后者不结合HSA但结合另一分子。例如，它可以结合靶分子的第二表位。通常，半衰期可增加10％，20％，30％，40％，50％或更多。增加的范围可能是所述半衰期的2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或以上。或者或此外，增加的范围高达所述半衰期的30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍。
短语“基本上相同”，当其用于宿主中的配体Tβ半衰期与血清白蛋白Tβ半衰期时，其表示宿主中的配体Tβ半衰期与相同宿主中其自身血清白蛋白Tβ半衰期的改变不超过50％，所述宿主优选人宿主，例如，此配体的Tβ半衰期比特定宿主的血清白蛋白Tβ半衰期不超过50％以下或者不超过50％以上。优选地，当提及短语“基本上相同”时，宿主的配体Tβ半衰期与其自身血清白蛋白的半衰期相比改变不超过20％至10％，并且更优选地，与其自身血清白蛋白的半衰期相比改变不超过9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％或1％或者更低，或者与其自身血清白蛋白的半衰期相比根本没有改变。
或者，短语“未基本上相同”，当其用于宿主中的配体Tβ半衰期与血清白蛋白Tβ半衰期时，其表示宿主中的配体Tβ半衰期与相同宿主中其自身血清白蛋白Tβ半衰期的改变至少50％，所述宿主优选人宿主，例如，此配体的Tβ半衰期比特定宿主的血清白蛋白Tβ半衰期不超过50％以下或者超过50％以上。
“均相免疫分析(Homogeneous immunoassay)”：一种免疫分析方法，分析物的检测不需要分离结合和非结合试剂的步骤。
“基本相同(substantially iderltical)”或“基本同源(substantiallyhomologous)”：第一个氨基酸或核苷酸序列与第二个氨基酸或核苷酸序列含有足够数目的相同或相等的氨基酸残基和核苷酸(例如具有相同侧链，例如保守的氨基酸置换)，因此，第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有相同活性。在本文描述的第一和第二抗体和/或单个可变区的情况下，所述第二抗体或单个可变区与所述第一抗体具有相同的结合特异性，并且具有所述第一抗体或单个可变区的亲和力的至少50％，或者至少多达55％，60％，70％，75％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。
如本文使用的，术语“低严格度”、“中等严格度”、“高严格度”或“非常高严格度条件”描述核酸杂交和冲洗的条件。杂交反应操作指南可见于Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6，其全文通过引用并入本文。水法和非水法在文献中都有描述，两法兼可用。本文涉及的特异杂交条件如下所述：
(1)低严格度杂交条件是在约45℃的6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中孵育，接着用至少50℃的0.2×SSC和0.1％SDS洗涤两次(低严格度条件洗涤温度可升至55℃)；(2)中等严格度杂交条件是在约45℃的6×SSC中孵育，接着在60℃用0.2X SSC和0.1％SDS洗涤一次或一次以上；(3)高严格度杂交条件是在约45℃的6×SSC中孵育，接着65℃用0.2×SSC和0.1％SDS洗涤一次或多次；以及优选的(4)非常高严格度杂交条件是在65℃下0.5M磷酸钠和7％SDS中孵育，接着在65℃用0.2X SSC和1％SDS洗涤一次或多次。非常高严格度条件(4)是优选条件，并且是无其他指定方法时应采用的条件。
“表面等离振子共振”竞争分析可用于测定特异性抗原或表位例如人血清白蛋白是否与另一抗原或表位例如短尾猴血清白蛋白竞争，以结合到结合了本文所述配体的血清白蛋白上，例如特异性dAb。类似的竞争分析可用于测定第一配体例如dAb是否与第二配体例如结合靶抗原或表位的dAb竞争。术语“竞争”如本文使用的是指物质例如分子、化合物，优选蛋白，它能够与两个或多个分子之间特异性结合干扰以任何程度干扰。短语“不竞争性抑制”表示例如物质例如分子、化合物，优选蛋白，它与不与两个或多个分子之间特异性结合干扰以任何可测的或显著的程度干扰。两个或多个分子间的特异性结合干扰优选包括单个可变区和其同源配对或靶之间的特异性结合干扰。干扰或竞争分子可以是另一个单个可变区，或者它可以是结构和/或类似于同源配对或靶的分子。
单个可变区包括免疫球蛋白单个可变区和非-免疫球蛋白单个可变区，其含有免疫球蛋白可变区来自例如抗体可变区的一个、两个、三个或多个CDR区，包括抗体重链或抗体轻链单个可变区。该单个可变区可衍生自动物，包括人、大鼠、小鼠、猪、猴子、骆驼科，例如抗体可变(V)区，或者在GroEL和GroEs的非免疫球蛋白支架结构的情况下其可衍生自微生物例如大肠杆菌。单个可变区可以部分或全部是人工的，或者可以使用重组分子生物学技术产生。
测定单个可变区与另一靶结合区例如另一单个可变区竞争结合靶的能力的体外竞争分析法以及测定Kd的体外竞争分析法是本领域技术人员公知的。一种优选的竞争分析法是表面等离振子共振分析法，其具有快速、灵敏和蛋白浓度适用范围广以及需要少量样品材料的优点。优选的表面等离振子共振分析竞争法是竞争Biacore试验。竞争Biacore试验可用于确定例如短尾猴血清白蛋白和人血清白蛋白是否竞争结合配体例如dAb DOM7h-x。此实施例的一个试验方案如下。
例如，在25℃下以约1000共振单元(RUs)的人血清白蛋白(HSA)包被CM5传感器芯片(Biacore AB)之后，将纯化的dAb以单一浓度(例如，1um)单独注射到抗原表面，以及与系列稀释的短尾猴血清白蛋白(CSA)组合注射到抗原表面。将系列稀释的HSA与恒定浓度(40nM)的纯化的dAb混合物。适宜的系列稀释的CSA从5uM CSA开始，以6个二倍稀释至78nM CSA。在注射前必需使这些溶液达到平衡。注射之后，进行响应读数，以测定针对单独dAb和若干dAb/CSA混合物的每一个所得的结合RU，所用的数据与BIA评价软件一致，得到每个AlbudAbTM(一种dAb，其特异性地结合血清白蛋白)结合芯片的CSA抑制作用的剂量-响应曲线，在所述芯片上固定有HSA。通过比较单独dAb的结合RU与dAb+CSA的结合RU，人们能够发现CSA是否与HSA竞争结合dAb。如果是竞争，则随着溶液中CSA浓度的增加，dAb结合HSA的RU将降低。如果无竞争，则加入CSA将不会对dAb结合HSA产生多大影响。
熟练技术人员将知晓如何改变这种或其它方案，以便针对不同的配体执行此竞争分析法，所述配体包括本文描述的结合血清白蛋白的若干配体。不同的配体包括，但不限于，单体单个可变区其包括包含免疫球蛋白和/或非-免疫球蛋白支架结构的单个可变区、dAb、双特异性配体，以及这些配体的多聚体。熟练技术人员将知晓如何改变这种方案，以便使用这种竞争分析法比较抗原和/或表位的若干不同配对与配体的结合。
这些竞争试验可提供截止值(numeric cut-off)，人们可以由该截止值确定抗原或表位是否与另一抗原或表位竞争结合特异性配体优选dAb。例如，例如在上文的试验中，如果在溶液中5μM CSA导致dAb结合HSA的RU降低10％或更低，则可以认为结合无竞争。相应地，在CSA存在下，dAb结合HSA的RU降低大于10％则显示由于CSA而存在dAb结合HSA的竞争。dAb结合HSA的RU降低小于10％将表明不存在由于CSA对dAb结合HSA的竞争，降低9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％和1％逐渐显示缺乏竞争。dAb结合HSA的RU降低越大，竞争越大。因此，竞争水平的增加可根据结合HSA的RU降低百分数来分级，即至少15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或多达100％降低。
如本文使用的片段是指小于序列的100％(例如，多达99％，90％，80％，70％，60％，50％，40％，30％，20％，10％等)，但包含5，6，7，8，9，10，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25个或更多个连续氨基酸。片段长到足以使血清白蛋白结合的益处保持在亲和力为1×10-6M或更小。如本文使用的片段亦指一个或多个氨基酸的任选的插入、缺失和取代，其基本上不改变改变的多肽结合抑制靶产生的单个区域抗体的能力。氨基酸插入、缺失和取代的数目优选多达1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69或70个氨基酸。
发明详述
所有本文应用的科技术语除非另有定义，通常与本领域(例如，细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学)一般技术人员常规理解的意思相同。标准技术应用于分子、遗传和生化方法(通常参见Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2d ed.(1989)Cold  Spring Harbor Laboratory Press，Cold  SpringHarbor，N.Y.，以及Ausubel et al.，Short Protocols in MolecularBiology(1999)4th Ed，John Wiley&Sons，Inc.，其通过引用并入本文)和化学方法。表面等离振子共振分析的标准技术包括Jan TerjeAndersen et al.(2006)Eur.J.Immunol.36：304-3051 Fagerstam(1991)Tech.Protein Chem.2：65-71，以及Johnsson et al(1991)Anal.Biochem 198：268-277。
基于免疫球蛋白的多特异性配体的制备
本发明的双特异性配体无论是根据发明预想构型中的开放式或闭合式构象均可以根据以前建立应用于抗体基因工程中的技术而制备。如制备scFv、噬菌体抗体和其他基因工程抗体分子。抗体特别是双特异性抗体的制备技术实例在下列综述和引用文献中描述：Winter&Milstein，(1991)Nature 349：293-299；Plueckthun(1992)Immunological Reviews 130：151-188；Wright et al.，(1992)Crit..Rev.Immunol.12：125-168；Holliger，P.&Winter，G.(1993)Curr.Op.Biotechn.4，446-449；Carter，et al.(1995)J.Hematother.4，463-470；Chester，K.A.&Hawkins，R.E.(1995)Trends Biotechn.13，294-300；Hoogenboom，H.R.(1997)Nature Biotechnol.15，125-126；Fearon，D.(1997)Nature Biotechnol.15，618-619；Plückthun，A.&Pack，P.(1997)Immunotechnology 3，83-105；Carter，P.&Merchant，A.M.(1997)Curr.Opin.Biotechnol.8，449-454；Holliger，P.&Winter，G.(1997)Cancer Immunol.Immunother.45，128-130。
本发明提供了针对两个不同抗原或表位的可变区的选择以及这些可变区的后续组合。
选择可变区的技术采用本领域中众所周知的库和筛选程序。自然库(Marks et al.(1991)J.Mol.Biol.，222：581；Vaughan et al.(1996)Nature Biotech.，14：309)是从人B细胞中获得的重排V基因，这是本领域技术人员所熟知的。合成库(Hoogenboom&Winter(1992)J.Mol.Biol.，227：381；Barbas et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4457；Nissim et al.(1994)EMBO J.，13：692；Griffiths et al.(1994)EMBO J.，13：3245；De Kruif et al.(1995)J.Mol.Biol.，248：97)是通过克隆免疫球蛋白V基因制备的，通常采用PCR法。PCR中的误差能导致高度随机性。VH和/或VL库可以针对靶抗原或表位分别或一起选择，在前一种情况下，单区结合直接选择。
根据本发明中制备双特异性配体的优选方法包括应用一种选择系统，在这个系统中，一个可变区库是通过结合第一抗原或表位而选择的，一个可变区库是通过结合第二抗原或表位而选择的。然后，选择出的可变的第一和第二可变区结合在一起，并且选择出能同时结合第一和第二抗原或表位的双特异性配体。闭合构象配体的选择是根据能分别而不是同时结合第一和第二抗原或表位选择出的。
A.文库载体系统
本领域已知的多种选择系统适用于本发明。下面举例描述这些系统。
λ噬菌体表达系统可作为噬菌体斑或溶源性克隆直接筛选，二者先前已有描述(Huse et al.(1989)Science，246：1275；Caton andKoprowski(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87；Mullinax et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87：8095；Persson et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88：2432)并在本发明中应用。同时这些表达系统能用以筛选高达106种不同的库成员，它们不适用于大量成员(大于106成员)的筛选。
文库构建的特殊用途是展示系统的筛选，展示系统能使核酸连接到它所表达的多肽中。正如本文应用的一样，筛选展示系统是采用适当展示方法通过结合通用和/或靶配体筛选文库中的独立成员的系统。
本领域已知分离大文库中目的成员的筛选程序，噬菌体展示技术可作为代表。在这些系统中不同肽序列展示在丝状噬菌体表面上。已证明这些系统在制造抗体片段库中(以及编码它们的核苷酸序列)(Scott and Smith(1990)Science，249：386)和体外筛选和扩增结合靶抗原的特异性抗体片段中是有用(McCafferty et al.，WO92/01047)是有用的。编码VH和VL区的核苷酸序列连接在编码引导信号的基因片段上，引导信号指导VH和VL区到达大肠杆菌周质空间，结果合成的抗体片段展示在噬菌体表位，典型例子是与噬菌体表面蛋白(例如，pIII或pVIII)融合物。或者，抗体片段可向外展示在λ噬菌体衣壳上(phagebodies)。基于噬菌体的展示系统优点是选择的库成员能通过简单的在细菌细胞中扩增包含所选库成员的噬菌体而扩增，因为它们是生物系统。此外，由于编码多肽库成员的核酸序列包含在噬菌体或噬粒载体中，测序、表达和后序的基因操作是相当直接简单的。
构建细菌噬菌体抗体展示文库和λ噬菌体表达文库的方法已在在本领域是公知的(McCafferty et al.(1990)Nature，348：552；Kanget al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88：4363；Clackson et al.(1991)Nature，352：624；Lowman et al.(1991)Biochemistry，30：10832；Burton et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，88：10134；Hoogenboom et al.(1991)Nucleic Acids Res.，19：4133；Chang et al.(1991)J.Immunol.，147：3610；Breitling et al.(1991)Gene，104：147；Marks et al.(1991)同上；Barbas et al.(1992)同上；Hawkins andWinter(1992)J.Immunol.，22：867；Marks et al.，1992，J.Biol.Chem.，267：16007；Lerner et al.(1992)Science，258：1313，通过引用并入本文)。
一个特别有利的方法是scFv噬菌体文库的应用(Huston et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，85：5879-5883；Chaudhary et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，87：1066-1070；McCafferty et al.(1990)同上；Clackson et al.(1991)Nature，352：624；Marks et al.(1991)J.Mol.Biol.，222：581；Chiswell et al.(1992)Trends Biotech.，10：80；Marks et al.(1992)J.Biol.Chem.，267)。展示在细菌噬菌体衣壳蛋白上的scFv文库的多种实施方案已描述过。已知晓噬菌体展示方法的精确细节，正如在WO96/06213和WO92/01047(MedicalResearch Council et al.)以及WO97/08320(Morphosys)中描述的一样，它们通过引用并入本文。
产生多肽文库的其他系统包括在体外合成库成员的无细胞酶设备。在一个方法中，通过针对靶配体的不同轮的筛选和PCR扩增筛选RNA分子(Tuerk and Gold(1990)Science，249：505；Ellingtonand Szostak(1990)Nature，346：818)。同样方法可以用于鉴定结合预定人转录因子的DNA序列(Thiesen and Bach(1990)Nucleic AcidsRes.，18：3203；Beaudry and Joyce(1992)Science，257：635；WO92/05258和WO92/14843)。同样，体外翻译能用于合成多肽，可作为一种产生大文库的方法。通常包含稳定的多核糖体复合体的方法在WO88/08453，WO90/05785，WO90/07003，WO91/02076，WO91/05058和WO92/02536中进一步描述。其他基于非噬菌体展示系统如：在WO95/22625和WO95/11922(Affymax)中公开的方法是采用多核糖体展示多肽用于筛选。
又一种技术包括在人造区室中筛选库，使基因与其产物连接。例如一种筛选系统中编码目的基因产物的核酸可以在油包水乳剂组成的微囊中筛选，这在WO99/02671、WO00/40712和Tawfik&Griffiths(1998)Nature Biotechnol 16(7)，652-6中描述。编码具有目的活性的基因产物的基因元件定位于微囊中，然后在微囊中转录和/或翻译成它们相应的基因产物(RNA或蛋白)。然后将产生具有目的活性基因产物的基因元件进行分选。该法通过多种手段检测目的活性而选择感兴趣的基因产物。
B.文库的构建
目的选择库的构建可采用本领域已知的技术，例如上述方法或通过商业渠道购买。例如本发明应用的库在例如WO99/20749中被描述。一旦选择了载体系统并且一种或多种编码感兴趣多肽的核苷酸序列克隆入该载体中，那么通过表达前突变可产生克隆分子中的多样性；或者，如上所述，在突变和其他选择循环发生之前，编码蛋白可以表达和选择。编码结构上优化的多肽的核苷酸序列的突变是通过标准分子方法进行的。典型用法是聚合酶链反应或PCR，(Mullis and Faloona(1987)Methods Enzymol.，155：335，通过引用并入本文)。PCR是本领域公知的方法，是通过采用一种热稳定性DNA依赖的DNA聚合酶催化DNA复制的多个循环来扩增感兴趣的靶序列。多种抗体库的构建已在Winter et al.(1994)Ann.Rev.Immunology 12，433-55以及其中所引用文献中讨论过。
PCR过程采用DNA模板(至少1fg；较常用1-1000ng)和至少25pmol的寡核苷酸引物；当引物组严重异质时，使用大量引物可能是有利的，因为每个序列只代表所述组的分子中的一小部分，并且在较后的扩增循环中引物的量变得有限。典型的反应混合物包括：2μl的DNA、25pmol的寡核苷酸引物、2.5μl的10X PCR缓冲液1(Perkin-Elmer，Foster City，CA)、0.4μl的1.25μM dNTP、0.15μl(或2.5单位)的Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer，Foster City，CA)和去离子水，总体积为25μl。用矿物油覆盖反应体系，用程序化热循环仪进行PCR。PCR循环的每一步的长度和温度以及循环数可根据效果需要严格调节。退火温度和时间均根据引物退火至模板的效率和能允许的错配度来决定的；显然，当核苷酸分子同时扩增和突变时，错配至少在合成的第一循环是必需的。优化引物退火条件的严格度是本领域普通技术人员具备的能力。采用的退火温度为30℃至72℃。模板分子最初变性是在92℃至99℃之间变性4分钟，接着发生20-40个循环，其包括：变性(94-99℃，15秒-1分钟)、退火(根据上述讨论决定的温度，1-2分钟)、延伸(72℃，1-5分钟，根据扩增产物的长度)。最后延伸通常是72℃、4分钟，并且可以接着一个不限定的步骤(0-24小时，4℃)。
C.单个可变区的结合
本发明所用的区，一旦被选出就可以通过本领域已知的多种方法，包括共价和非共价方法连接起来。
优选方法包括使用多肽连接子，正如在scFv分子中所描述过的(Bird et al.，(1988)Science 242：423-426)。适用的连接子的讨论在Bird et al.Science 242，423-426；Hudson et al，Journal ImmunolMethods 231(1999)177-189；Hudson et al，Proc Nat Acad Sci USA85，5879-5883中提供。连接子最好是能变形的，允许两个单个功能区相互作用。一个连接子的例子是(Gly4 Ser)n连接子，其中n＝1至8例如2，3，4，5或7。在双抗体中应用的连接子虽柔韧性较差也可以应用(Holliger et al.，(1993)PNAS(USA)90：6444-6448)。
在一个实施方案中，所用连接子不是免疫球蛋白铰链区。
可变区也可用连接子以外的方法结合，例如，二硫键的使用，通过自然发生或设计的半胱氨酸残基可以开发稳定的VH-VH、VL-VL或VH-VL二聚体(Reiter et al.，(1994)Protein Eng.7：697-704)或通过重新改造可变区之间相互作用以促进吻合和作用的稳定(Ridgeway et al.，(1996)Protein Eng.7：617-621；Zhu et al.，(1997)Protein Science 6：781-788)。
其他连接或稳定免疫球蛋白可变区特别是抗体VH区的技术也可以适当应用。
根据本发明，双特异性配体可在溶液中呈“闭合”构象。“闭合”构象是两个区(例如VH和VL)以结合形式存在，如结合的VH-VL对组合成抗体结合位点。例如，scFv可以呈现闭合构象，取决于连接VH和VL区连接子的排列。如果连接子足以柔韧，允许区域间结合或严格将区域固定在结合部位，所述区域有可能呈现闭合构象。
同样，VH区对和VL区对也可以闭合构象存在。通常，这将是区域闭合结合的一种功能，如由配体分子中的刚性连接子连接的结合。闭合构象配体不能既结合配体半衰期增加分子又结合第二靶分子。因此，配体通常只结合与配体半衰期增加分子分离的第二靶分子。
此外，无连接子的VH/VH，VL/VL或VH/VL二聚体的构建提供了区域之间的竞争。
此外，本发明中配体可以是开放式构象。这种构象的配体将能同时结合配体半衰期增加分子和第二靶分子。代表性地，开放式构象的可变区(在VH-VL对的情况下)保持足够远的距离以便区域之间不能相互作用，不能组成一个抗体结合位点，并且不竞争结合各自的表位。在VH/VH或VL/VL二聚体的情况下，该区域未被刚性连接子连在一起。自然情况下，这些区域对将不竞争结合抗原也不组成抗体结合位点。
虽然可以理解的是开放和闭合式双特异性配体很可能在不同情况下以均衡多样性存在，Fab片段和整个抗体将主要以闭合构象存在。配体与靶的结合有可能将所述平衡向开放式构象转换。因此，本发明的某些配体在溶液中能以两种构象存在，其中之一(开放形式)能独立地结合两个抗原或表位，而另一种构型(闭合构象)只能结合一个抗原或表位；因此，抗原或表位竞争结合这种构型的配体。
虽然双特异性配体的开放形式在溶液中可与闭合形式平衡存在，可以设想的是平衡趋向于闭合形式；此外，通过靶位结合，开放形式能隐变为闭合构象。因此，优选的是本发明的某些双特异性配体是呈现两种构象(开放和闭合)共存的平衡形式存在。
本发明的双特异性配体可以改进以便有利于开放式构象或闭合式构象的形成。例如，VH-VL与二硫键的相互作用的稳定性能稳定闭合构象。此外，可以构建用于连接区域(包括VH区和VL区对)的连接子以便有利于开放式构象的形成；例如，连接子可在空间阻挡所述区域的结合，如在适宜部位并入大的氨基酸残基或设计一个适当的刚性结构以保持区域间物理空间的分开。
D.双特异性配体的特性
双特异性配体与其特异性抗原或表位的结合能通过本领域中技术人员所熟知的包括ELISA的方法进行检测。本发明的优选实施方案中，结合是采用单克隆噬菌体ELISA方法进行检测的。
噬菌体ELISA方法可根据任一适用程序进行操作：下面提供了这种方法的一个实例。
每一轮选择产生的噬菌体群能通过ELISA方法测定其与所选抗原或表位的结合而得到筛选，以鉴别“多克隆”噬菌体抗体。然后，这些群体中的单个感染细菌克隆中的噬菌体能通过ELISA方法筛选以确定“单克隆”噬菌体抗体。同样有希望筛选出结合抗原或表位的可溶性抗体片段，并且也可通过ELISA方法采用诸如针对C-或N-末端标记的试剂而进行(参见例如Winter et al.(1994)Ann.Rev.Immunology 12，433-55以及其所引文献)。
选出的噬菌体单克隆抗体多样性也可采用PCR产物的凝胶电泳(Marks et al.1991，同上；Nissim et al.1994同上)、探针法(Tomlinson et al.，1992)J.Mol.Biol.227，776)或通过载体DNA测序来评价。
E.“双特异性配体“的结构
如上所述，本文的抗体定义为抗体(例如IgG，IgM，IgA，IgA，IgE)或片段(Fab，Fv，二硫键连接的Fv，scFv，双抗体)，所述片段含有至少一个重链和轻链可变区、至少两个重链可变区或至少两个轻链可变区。抗体可以是至少部分源于某些种属自然产生的抗体或通过DNA重组技术产生的；或是从血清、B细胞、杂交瘤、转染体、酵母或细菌中分离的。
本发明优选实施方案中的双特异性配体至少包含抗体的一个单一的重链可变区和一个单一的轻链可变区，或者两个单一的重链或轻链可变区。例如，配体可包含VH/VL对或一对VH区或一对VL区。
这种配体的第一和第二可变区可在相同多肽链上，或者，它们也可在不同的多肽链上。在相同多肽链的情况下，它们可由连接子连接，连接子优选肽序列，如上所述。
第一和第二可变区可以共价或非共价结合。如果是共价结合，共价键可以是二硫键。
如果可变区是从V基因库中选出，例如采用本文描述的噬菌体展示技术，那么这些可变区包含通用框架区，这样它们可被本文定义的特异性属类配体所识别。通用框架、属类配体及其类似物在WO99/20749中描述。
当使用V-基因库时，多肽序列上的变异优选分布于可变区的结构环中。每个可变区的多肽序列可通过DNA改组或突变方法改变以增加每个可变区与它互补对之间的相互作用。DNA改组是本领域已知和教导的，例如Stemmer，1994，Nature 370：389-391以及美国专利No.6,297,053，二者通过引用并入本文。突变的其他方法对本领域技术人员而言是熟知的。
在本发明的一个优选实施方案中，“双特异性配体”是一个单链Fv片段。在本发明的另选实施方案中，“双特异性配体”由Fab形式组成。
在另一方面，本发明提供了一种苷酸，其编码至少一种本文定义的双特异性配体。
本领域技术人员依照本发明将理解两个抗原或表位可以同时结合相同抗体分子。或者，它们可以竞争结合同一抗体分子。例如，在两个表位同时被结合时，双特异性配体中两个可变区能独立地结合它们的靶表位。当功能区竞争时，一个可变区能结合它的靶，而另一个可变区不是同时与其同源靶结合；或者说，第一可变区能结合它的靶，而第二可变区不是同时结合其同源靶。
可变区可来自直接针对靶抗原或表位的抗体。另外，它们可以来自如表达在丝状噬菌体表面的单个抗体区域库，选择可如下文所述进行。
通常，本发明实施中需要的核酸分子和载体构建可以依照标准实验室手册构建和操作，例如Sambrook et al.(1989)MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，USA。
本发明中所用核酸分子操作通常在重组载体中实现。
因此，本发明进一步提供了一种包括编码至少一种本文定义的“双特异性配体”的核酸分子的载体。
如本文使用的，载体是指用于将异质DNA引入细胞以便后续表达和/或复制的一种不连续的元件。选择或构建以及后续应用这些载体为本领域一般技术人员熟知的。多种载体已公开并可利用，包括细菌质粒、噬菌体和人工染色体以及附加体载体。这些载体可用于简单克隆和突变；或者基因表达载体也采用。本发明所用载体可被选择以适应目的多肽编码序列的大小，通常大小为0.25千碱基(kb)至40kb或更长。一种适当宿主细胞可被经体外克隆操作后的载体所转化。每个载体包括多种功能成分，通常包括克隆(或“多连接子”)位点，复制起始点和至少一个选择标志基因。如果所给的载体是一种表达载体，它另外具有一个或更多如下成分：增强子元件、启动子、转录终止子和信号序列，每一种结构位于克隆位点附近，以便与编码本发明的配体的基因可操作地相连。
克隆和表达载体通常含有能使载体在一种或多种选择的宿主细胞中复制的核酸序列。在典型克隆载体中，这段序列是一种能使载体独立于宿主染色体DNA外复制，且包含复制起始位点或自主复制序列。这些序列对多种细菌、真菌和病毒而言是已知的。质粒pBR322的复制起始位点适用于绝大多数的革兰氏阴性菌，2微米质粒起始位点适用于酵母，不同的病毒起始位点(如，SV40，腺病毒)在哺乳动物细胞克隆载体中有用。通常，哺乳动物表达载体不需要复制起始位点，除非它们用于能高水平复制DNA的哺乳动物细胞中，如COS细胞。
有利的是，克隆或表达载体包含选择基因，也称为筛选标志。该基因编码一种必需蛋白以供转化的宿主细胞在选择培养基中存活和生长。未被包含筛选基因的载体转化的宿主细胞将不能在培养基中存活。代表性的筛选基因编码的蛋白能对抗生素和其他毒素如：氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素产生抵抗，补充营养缺陷性不足或供给生长介质中不含的关键营养物。
由于编码本发明配体的载体复制可十分方便地在大肠杆菌中完成，采用大肠杆菌选择标志，如β-内酰胺酶基因能使大肠杆菌对氨苄青霉素产生抵抗。这些标志能从大肠杆菌质粒例如pBR322或pUC质粒如pUC18或pUC19中获得。
表达载体通常包含启动子，可被宿主生物体识别并与目的编码序列毗邻相连。该种启动子可以是诱导型的或组成型的。术语“可操作地连接”是指位置并列(juxtaposition)，其中所述成分之间的关系允许它们以既定方式发挥作用。“可操作地连接”于编码序列的控制序列以这种方式连接，以便使编码系列在与控制序列一致的条件下获得表达。
适用于原核宿主的启动子包括，例如，β-内酰胺酶和乳糖启动子系统，碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子例如tac启动子。细菌系统所用启动子也通常包括可操作连接于编码序列的Shine-Delgarno序列。
优选载体是能使多肽库成员对应的核苷酸序列表达的表达载体。因此，筛选第一和/或第二抗原或表位可通过表达多肽文库成员的单个克隆分开的繁殖和表达或应用任意的选择展示系统来完成。如上所述，优选的筛选展示系统是细菌噬菌体展示技术。因此，可采用噬菌体或噬菌粒载体例如pIT1或pIT2。
本发明中应用的引导序列包括pelB，stII，ompA，phoA，bla和pelA。一个例子是噬粒载体，其包含大肠杆菌复制起始点(适于双链复制)，也可以是噬菌体复制起始点(适于单链DNA复制)。这些载体的操作和表达是本领域熟知的(Hoogenboom and Winter(1992)同上；Nissim et al.(1994)同上)。简言之，载体包含β-内酰胺酶基因以赋予噬菌粒和位于表达盒上游的乳糖启动子的选择性，表达盒组成(从N至C末端)为：pelB引导序列(其指导表达多肽到达周质空间)、多克隆位点(为了克隆文库成员的核苷酸翻译)、任选的一个或多个肽标记(用于检测)、任选的一个或多个TAG终止密码子和噬菌体蛋白pIII。因此，采用不同的抑制或非抑制大肠杆菌菌株，另加葡萄糖、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)或辅助噬菌体例如VCSM13，所述载体能作为质粒复制而不表达，只产生大量的多肽文库成员或产生噬菌体，其中某些噬菌体表面至少含有一拷贝的多肽-pIII融合物。
编码本发明配体的载体构建采用常规的连接技术。分离的载体或DNA片段被裂解、剪裁和重新连接形成所需载体的形式。如果需要，可用已知方式分析鉴定构建载体序列中的正确序列。构建表达载体、准备体外转录、将DNA引入宿主细胞和分析评价表达和功能等适用方法为本领域技术人员所熟知。样本中基因序列的存在或其检测、扩增和/或表达的定量可通过常规方法进行，例如Southern或Northern分析，西式印迹法(Western blotting)，DNA、RNA或蛋白斑点印迹法、原位杂交、免疫细胞化学或者核酸或蛋白分子序列分析。如果需要，本领域技术人员将很容易地想到如何修改这些方法。
闭合构象多特异性配体的结构
依照本发明第二框架的一个方面，两个或两个以上的非互补表位结合区连接在一起以便它们形成一种本文定义的闭合构象。有利的是，它们可进一步与一个骨架相连，骨架也可用本文描述的连接子进行添加或取代，以促进表位结合位点之间的闭合构象的形成和/或维持。
(I)骨架
骨架可基于免疫球蛋白分子或来自上述的非免疫球蛋白中。本文定义的优选免疫球蛋白骨架包括从以下选出的一种或多种：免疫球蛋白分子，其至少包含(i)抗体CL区(κ或λ亚类)；或(ii)抗体重链的CH1区；免疫球蛋白分子，其包含抗体重链的CH1和CH2区；免疫球蛋白分子，其包含抗体重链的CH1、CH2或CH3区；或与抗体CL(κ或λ亚类)区相连的任何亚型(subset)(ii)。铰链区也可包括在内。这种区域结合物例如可模拟抗体分子例如IgG或IgM，或者其片段，如例如Fv，scFv，Fab或F(ab’)2分子。本领域技术人员知道所列物质并不是穷尽性的。
(II)蛋白支架结构
每个表位结合区包括蛋白支架结构和一个或多个CDR区，CDR区参与区域与一个或多个表位间的特异性相互作用。有利的是，本发明表位结合区包含3个CDR。适用的蛋白支架结构包括从下列选出的任意一种：基于免疫球蛋白区域的、基于纤连蛋白的，基于亲和体的，基于CTLA4的，基于伴侣分子如GroEL的、基于脂质运载蛋白的和基于细菌Fc受体SpA和SpD的那些蛋白支架。本领域技术人员知道这些举例并不是穷尽性的。
F：用于双特异性配体构建的支架结构
i.主链构象的选择
免疫球蛋白超家族成员的多肽链均具有相似折叠。例如，虽然抗体在原始序列上高度不同，比较其序列和晶体结构结果显示与预期相反，抗体分子中6个抗原结合环中的5个(H1，H2，L1，L2，L3)采用有限数目的主链构象或规范结构(Chothia and Lesk(1987)J.Mol.Biol.，196：901；Chothia et al.(1989)Nature，342：877)。因此，分析环长度和关键残基能推测大多数人类抗体中的H1，H2，L1，L2和L3的主链构象(Chothia et al.(1992)J.Mol.Biol.，227：799；Tomlinson et al.(1995)EMBO J.，14：4628；Williams et al.(1996)J.Mol.Biol.，264：220)。虽然H3区在序列、长度和结构上(由于D片段的应用)变化非常大，它也由于短环长度组成少数主链构象，所述短环长度取决于环和抗体框架上关键部位的特殊残基的出现和长度或残基的种类(Martin et al.(1996)J.Mol.Biol.，263：800；Shirai etal.(1996)FEBS Letters，399：1)。
本发明双特异性抗体优势在于它们是区域文库组装而成，例如VH区文库和/或VL区文库。此外，本发明双特异性配体本身以文库的形式被提供。在本发明的一方面，双特异性配体和/或区域文库设计为在特定环长度和关键残基的选择上能保证成员的主链构象是已知的。有利的是，它们是天然免疫球蛋白超家族分子的真正构象，以减少它们无功能的几率，如上文所述。胚系V基因片段可作为构建抗体或T细胞受体库的一种适用基础框架；其他序列也可应用。变异可低频发生，以便少数功能成员可以具有变化的主链构象，而不影响其功能。
规范结构理论(canonical structure theory)也用于评估配体编码的不同主链构象的数目，用于推测基于配体序列的主链构象，用于选择为了多样化而不影响其规范结构的残基。已知人Vκ区中的L1环能采用4个规范结构中的一种，L2环有单一独规范结构，并且90％的Vκ区的L3环采用4或5个规范结构中的1个(Tomlinson et al.(1995)同上)；因此，在单独的Vκ区中，不同规范结构能结合组成一系列不同的主链结构。假设Vλ区为L1、L2和L3环编码不同范围的规范结构，Vκ和Vλ区能与编码H1和H2环几种规范结构的任意VH区配对，那么观察到的这5个环的规范结构的数目很大。这意味着主链构象多样性的产生在广谱结合特异性的产生中可能是必要的。然而，通过构建基于单一已知的主链构象的抗体库，结果发现与预期的相反，在针对所有实际抗原靶的充分多样性产生中主链构象多样性不是必需的。更令人惊讶的是，单个主链构象不需要一致的结构-单个自然形成的构象可用作整个库的基础。因此，在优选的方面，本发明的双特异性配体具有单一已知的主链构象。
选出的单个主链构象优选在被讨论的免疫球蛋白超家族类型分子中是常见的。观察大量自然发生的分子采用某种构象是平常的事。因此，依照本发明的一个优选方面，分别考虑每个免疫球蛋白区域结合环的自然发生的不同主链构象，那么可选择自然发生的可变区，它们具有针对不同环的主链构象的所需结合。如无适合的，最接近的等同物也可选。优选的是针对不同环的主链构象的所需结合是通过编码目的主链构象的胚系基因的选择而产生。更优选的是，所选胚系基因片段其本质上是频繁表达的，更优选的是它们是所有胚系基因片段表达最频繁的。
在设计双特异性配体及其库时，6个抗原结合环的每一个的不同主链构象的出现几率可分别考虑。对于H1、H2、L1、L2和L3，给定构象是采用自然产生分子的20％至100％的抗原结合环来选择的。通常是它测得的出现几率大于35％(即：介于35％～100％之间)，理想时大于50％或甚至大于65％。由于绝大多数H3环无规范结构，最好是选择呈现规范结构的环中普通的主链构象。对于每个环，在自然库中经常观测的构象因此被选择。在人抗体中每个环最流行的规范结构(CS)如下：H1-CS 1(表达库的79％)，H2-CS 3(46％)，Vκ的L 1-CS 2(39％)，L2-CS 1(100％)，Vκ的L3-CS 1(36％)(计算假设κ∶λ比率为70∶30，Hood et al.(1967)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，48：133)。对于具有规范结构的H3环，7个残基长度的CDR3(Kabat et al.(1991)Sequences of proteins of immunologicalinterest，U.S.Department of Health and Human Services)最常见，其在第94到101残基之间含有一个盐桥。在EMBL数据库中至少有16种人类抗体序列具有必需的H3长度和关键残基以组成这种构象，并且在蛋白数据库中至少有两种晶体结构能用作抗体模型的基础(2cgr和1tet)。最常表达的胚系基因片段即规范结构间的结合是VH片段3-23(DP-47)、JH片段JH4b、Vκ片段O2/O12(DPK9)和Jκ片段Jκ1。VH片段DP45和DP38也适用。因此这些片段结合可作为基础以构建有需要的单个主链构象的库。
另外，基于每个独立结合环的自然发生的不同主链构象而选择的单个主链构象，取而代之的是自然发生的主链构象结合物用作选择单个主链构象的基础。例如，就抗体而言，能确定出任意2个、3个、4个、5个或所有6个抗原结合环的规范结构结合物的自然出现。这里，优选选择的构象在自然发生抗体中常见，最优选的是在自然库中最经常观测到。因此，例如在人类抗体中，当考虑5个抗原结合环H1、H2、L1、L2和L3的自然结合物时，决定最常见的规范结构结合物并与H3环最通用的构造结合，作为选择单个主链构象的基础。
ii.规范序列的多样化
已经选择了几个已知的主链构象或优选的单个已知主链构象，本发明的双特异性配体或本发明所用库能通过改变分子结合位点而构建，以产生具有结构和/或功能多样性的库。这意味着变体的产生使得它们在结构和/或功能上具有充分多样性，以便能提供一系列活性。
目的多样性通常通过在一或多个部位改变所选分子而产生。这些改变的部位可随机选择或优先选择。然后变异的获得既可通过随机化即常规氨基酸被任意氨基酸或其自然或合成类似物取代以产生大量变异体，或可通过用一种或多种限定氨基酸子集(subset)取代常规氨基酸以产生有限数目的变异体。
已报道多种方法引入这种多样性。易错PCR(Hawkins et al.(1992)J.Mol.Biol.，226：889)，化学诱变(Deng et al.(1994)J.Biol.Chem.，269：9533)或细菌变异株(Low et al.(1996)J.Mol.Biol.，260：359)可用于将随机突变引入编码分子的基因中。选择部位的突变方法也是本领域熟知的，并且包括错配寡核苷酸或退化寡核苷酸的应用，其中伴有或无PCR的应用。例如，通过靶向突变抗原结合环已制备出几种合成抗体库。人破伤风类毒素结合的Fab的H3区已随机化生成一系列新的结合特异性(Barbas et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4457)。随机或半随机H3和L3区域已附加入胚系V基因片段中生成具有突变框架区的大文库(Hoogenboom&Winter(1992)J.Mol.Biol.，227：381；Barbas et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4457；Nissim et al.(1994)EMBO J.，13：692；Griffiths et al.(1994)EMBO J.，13：3245；De Kruif et al.(1995)J.Mol.Biol.，248：97)。这种多样化已延伸到某些或所有其他抗原结合环(Crameri et al.(1996)Nature Med.，2：100；Riechmann et al.(1995)Bio/Technology，13：475；Morphosys，WO97/08320，同上)。
由于环随机化具有产生大约超过1015种单独H3结构以及类似数目的其他5个环的变异体的能力，采用现行的转化技术或采用无细胞系统生产代表所有可能结合物的库是不可行的。例如，在一种目前构建的最大库中，产生6×1010种不同抗体，只是所设计库中潜在多样性的一部分(Griffiths et al.(1994)同上)。
在优选实施方案中，只有那些直接涉及分子的目的功能的产生或修饰的残基是多样化的。对于许多分子来说，所述功能将是结合某靶，因此多样化应该集中于靶结合位点，同时避免分子完整包装中或维持选择主链构象中的关键残基的变化。
用于抗体区域的规范序列的多样化
至于抗体双特异性配体的情况，靶结合位点通常是抗原结合点。因此，在非常优选的方面，本发明提供了用于抗体双特异性配体组装的库，其中只有那些抗原结合位点上的残基是变化的。这些残基在人抗体库中非常多样化，并已知在高分辨率抗体/抗原复合物中产生接触。例如，已知在自然发生抗体的L2中第50和53的位置上残基是多样的，并且观察到它们与抗原接触。相对而言，常规方法将使相应互补决定区(CDR1)，Kabat et al.(1991，同上)定义的，所有残基发生多样化，而相比之下本发明所用库中两个多样化部位大约7个残基。这说明功能多样化的重大改进需要创造一系列抗原结合特异性。
抗体多样性的自然形成是两个过程的结果：胚系基因V、D、J基因片段的体细胞重组以产生初始初级功能库(naive primaryrepertoire)(也称为胚系和连接多样性)，和由V基因重排造成的体细胞高频突变。人类抗体序列分析表明初始功能库中的多样性集中在抗原结合位点中心，而体细胞高频突变将多样性扩散到抗原结合位点周围即初始功能库中高度保守的部位(参见Tomlinson et al.(1996)J.Mol.Biol.，256：813)。这一补充有可能发展为搜索序列空间的有效策略，虽然主要针对抗体，但也能易于用在其他多肽库。变化的残基是组成靶结合点的子集。在靶结合点残基的不同(包括重叠)子集，如果需要，则在选择过程的不同阶段具有多样性。
对于抗体库来说，起初的“初始(naive)”库产生在某些而不是全部的抗原结合位点残基多样性之处。正如本文在此引用的术语“初始”是指未预先决定靶的抗体分子。这些分子类似那些未经免疫多样化个体的免疫球蛋白基因编码分子，如胎儿和新生儿的免疫系统未受广泛大量的抗原刺激过。针对一系列抗原或表位的库即被选出。如果需要，可在初始库多样化区域之外引入更多的多样性。这种成熟的库能根据改进的功能、特性或亲和力而得到选择。
本发明提供了构建双特异性配体结合区的两种不同初始库，或双特异性配体初始库，其中抗原结合位点的某些或全部残基被改变。“初始”库模拟了自然发生的初始库，多样性局限在抗原结合位点中心的残基上，这些部位在胚系V基因片段(胚系多样性)上具有多样性或在重组过程中被多样化(连接多样性)。那些多样化残基包括，但优选不仅限于，H50，H52，H52a，H53，H55，H56，H58，H95，H96，H97，H98，L50，L53，L91，L92，L93，L94和L96。在“体细胞”库中，多样性局限在重组过程中发生多样化(连接多样性)的残基上或体细胞高频突变时。发生多样化的残基包括，但优选不仅限于：H31，H33，H35，H95，H96，H97，H98，L30，L31，L32，L34和L96。上述所列的适于这些库发生多样化的所有残基，已知在一种或多种抗体-抗原复合物中产生接触。由于在两种库中不是所有抗原结合位点的残基是多样化的，所以，如果需要，可在选择过程中可通过改变剩余残基的方法引入其他多样性。本领域技术人员清楚任何这些残基的任何亚集(或包含在抗原结合位点中的其它残基)能用作抗原结合点的最初和/或后续多样化。
在构建本发明所用库中，选择部位的多样化主要在核酸水平上获得，其方式是通过改变多肽特异性序列的编码序列以便使一定数目的氨基酸(全部20种或其子集)能整合在那个部位上。采用IUPAC命名法，最通用密码子是NNK，它编码所有氨基酸以及TAG终止密码子。NNK密码子优选采用目的是引入所需多样性。其他获得相同目的的密码子也可采用，包括NNN密码子，它可导致额外终止密码子TGA和TAA的产生。
人类抗体的抗原结合位点的侧链多样化特征是对某些氨基酸残基有明显的偏爱。如果计算每个VH、Vκ和Vλ区域的10个常见多样化位置的氨基酸组成的总和，大于76％的侧链多样性只来自7个不同的残基，它们是丝氨酸(24％)、酪氨酸(14％)，天门冬酰胺(11％)，甘氨酸(9％)，丙氨酸(7％)，天门冬氨酸(6％)和苏氨酸(6％)。这种对能提供主链的适应性的亲水残基和小残基的偏爱或许反映了倾向于结合广泛抗原或表位的表面的进化过程，也可以有助于解释在初始库中抗体所需的混杂。
因为优选的是模仿这种氨基酸分布，被改变部位的氨基酸分布优选模拟抗体的抗原结合位点。这种氨基酸置换的偏爱，允许选择某些针对一系列靶抗原的多肽(不只是抗体多肽)，易于用在任意多肽库中。有多种方法用于偏置改变部位的氨基酸分布(包括采用三核苷酸诱变法，见WO97/08320)，由于其易于合成，最优选方法是采用常规兼并密码子。通过比较由所有兼并密码结合物(单、双、三和四兼并比率在每个位置上是相同的)编码的具有天然氨基酸作用的氨基酸分布图，能计算出最有代表性的密码子。密码子(AGT)(AGC)T、(AGT)(AGC)C和(AGT)(AGC)(CT)，也可分别用IUPAC命名为DVT、DVC和DVY，它们十分接近目的氨基酸的分布图：它们编码22％丝氨酸和11％酪氨酸、天门冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸、苏氨酸和半胱氨酸。因此，优选地，可取的是在每个多样化部位既可采用DVT、DVC或DVY密码子密码子构建文库。
G：能增加配体主衰期的抗原
本发明的双特异性配体一方面能与一种或多种能增加配体体内半衰期的分子结合。通常所述分子是体内自然发生的多肽，其能抵抗机体内部排除非必要物质内源机制的降解和移除。例如，增加有机体半衰期的分子可从以下筛选：
细胞外基质蛋白；例如胶原蛋白，层粘连蛋白，整合素和纤连蛋白。胶原蛋白是细胞外基质主要蛋白。目前大约知道位于机体不同部位的15种胶原分子，如I型胶原(占机体胶原90％)分布于骨、皮肤、肌腱、韧带、角膜和内脏中，或者II型胶原分布于软骨、脊椎盘、脊索、眼玻璃体中。
血液中蛋白包括：血浆蛋白如纤维蛋白、α-2巨球蛋白、血清白蛋白和纤维蛋白原A、纤维蛋白原B、血清淀粉样蛋白A、七珠蛋白、抑制蛋白，遍在蛋白质(ubiquitin)，子宫珠蛋白(uteroglobulin)和β-2-微球蛋白；
酶和抑制剂如纤溶酶原、溶菌酶、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、α-1-抗胰蛋白酶和胰腺胰蛋白酶抑制剂。纤溶酶原是胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶纤溶酶的无活性前体。通常在血流循环中发现。当纤溶酶原激活后转变纤溶酶，显露出有效酶区以溶解凝结血细胞的纤维蛋白原纤维。这称为纤维蛋白溶解。
免疫系统蛋白如：IgE、IgG、IgM。
运输蛋白如：视黄醇结合蛋白、α-1微球蛋白。
防卫素如：β防卫素1，神经防卫素1、2和3。
血脑屏障或神经组织上发现的蛋白如：黑色素受体、髓磷脂、抗坏血酸转移物。
转铁蛋白受体特异性配体-神经药剂融合蛋白(见US5977307)；
脑毛细血管内皮细胞受体、转铁蛋白、转铁蛋白受体、胰岛素、胰岛素样生长因子1(IGF 1)受体、胰岛素样生长因子2(IGF 2)受体、胰岛素受体。
位于肾脏的蛋白如：多聚胱氨酸(polycystin)、IV型胶原、有机阴离子转移子K1、Heymann’s抗原。
位于肝脏的蛋白如：乙醇脱氢酶、G250。
凝血因子X。
α1抗胰蛋白酶
HNF 1α
位于肺脏的蛋白如：分泌成分(结合IgA)。
位于心脏的蛋白如：HSP 27。这与扩张性心肌病相关。
位于皮肤的蛋白如：角质蛋白。
骨特异性蛋白如：骨成型蛋白(BMPs)是转化生长因子β超家族的一个亚类，具有生骨活性。实例包括BMP-2，-4，-5，-6，-7(也称为生骨蛋白(OP-1)以及BMP-8(OP-2)。
肿瘤特异性蛋白包括：人滋养层抗原、赫赛汀(herceptin)受体、雌激素受体、组织蛋白酶如组蛋白酶B(见于肝和脾中)。
疾病特异性蛋白，如只表达在活化T细胞上的抗原：包括LAG-3(淋巴细胞活化基因)，护骨蛋白(osteoprotegerin)配体(OPGL)其参见Nature 402，304-309；1999，OX40(一组TNF受体家族成员，表达在活化T细胞上，并且是唯一已知在I型T细胞白血病病毒(HTLV-I)产生细胞上被特异性上调表达的共刺激T细胞分子)，见JImmunol.2000 Jul 1；165(1)：263-70；金属蛋白酶(与关节炎/癌症关联)，包括CG6512果蝇、人截瘫蛋白(paraplegin)、人FtsH、人AFG3L2、小鼠ftsH；血管生成生长因子，其包括酸性成纤维生长因子(FGF-1)、碱性成纤维生长因子(FGF-2)、血管内皮生长因子/血管渗透因子(VEGF/VPF)、转化生长因子-a(TGF a)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血管生成素、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-8(IL-8)、血小板衍生内皮生长因子(PD-ECGF)、胎盘生长因子(P1GF)、肝素结合细胞因子(midkine)、血小板衍生的生长因子-BB(PDGF)、CX3C趋化因子(fractalkine)。
应激蛋白(热休克蛋白，HSP)。HSP一般在细胞内发现。当在胞外发现HSP时，提示细胞死亡并将内容物溢出。这种非程序性细胞死亡(坏死)只在外伤、疾病或损伤的情况下导致的体内损伤时出现，胞外HSP引发免疫系统应答从而抗感染和疾病。结合胞外HSP的双特异配体可被定位于疾病部位。
涉及Fc转运的蛋白
Brambell受体(也称为FcRB)
这种Fc受体有两种功能，二者在转运中有潜在的用途。
所述功能是
(1)通过胎盘将IgG从母体转运给胎儿
(2)防止IgG降解以延长其血清半衰期。据认为受体使IgG在内质网中发生再循环。
参见Holliger et al，Nat Biotechnol 1997 Jul；15(7)：632-6。
本发明中配体可设计成上述靶特异性而不需要任何增加或不增加体内半衰期。例如，本发明中的配体能特异性地针对从前述组织筛选的靶，从而能使双特异性配体具有组织特异性靶向，或者dAb单体结合组织特异性治疗相关靶，不考虑半衰期的增加，尽管该结果也可达到。此外，当配体或dAb单体靶向作用于肾或肝时，这可以改变配体或dAb单体的体内清除途径(例如，配体可从肝清除途径改为肾清除途径)。
如上文所述，包含本文定义的单个可变区的本文描述的配体可特异性筛选靶，并且优选可具有增加靶体内半衰期的额外性质，尽管这不是必需的。双特异性配体可包括具有对第一表位或抗原结合特异性的抗体重链单个可变区，以及具有对第二表位或抗原结合特异性的抗体轻链单个可变区，其中所述抗原的一个或两者可以是血清白蛋白，或者所述表位的一个或两者是血清白蛋白的表位。在一个实施方案中，两个血清白蛋白表位相同，在另一实施方案中，各个血清白蛋白表位是不同的。
除了具有增加靶体内半衰期特性的这些双特异性配体，本文还描述了配体的其它结构形式，它们具有或包含至少一个如本文定义的单个可变区，该单个可变区具有增加靶体内结合配体的半衰期的特性，例如通过结合血清白蛋白。例如，该配体可包含或含有如本文定义的结合血清白蛋白的单体单个可变区；或者该配体可以呈包含多个本文定义的单个可变区的形式，其中该单个可变区的一个或多个结合血清白蛋白，即多聚体。多聚体和单体均可进一步包含除了一个或多个结合血清白蛋白的单个可变区的其它实体，例如，呈融合蛋白和/或缀合物的形式。此融合蛋白优选是单个多肽链，并且可包含例如两个或多个连接的如本文定义的单个可变区；该连接的单个可变区可以相互相同或者它们可以相互不同。此类实体包括例如一个或多个本文定义的另外的单个可变区其具有针对抗原或表位而非血清白蛋白的特异性，和/或一种或多种药物，和/或一个或多个靶结合区其具有针对抗原或表位而非血清白蛋白的特异性并且其不是本文定义的单个可变区。就其单个可变区而言，此多聚体可具有多价态，例如单价、二价、三价、四价。此多聚体可具有IgG结构的形式或者如本文定义的双特异性配体的形式，以及其它结构的形式例如IgM，IgE，IgD或IgA，和/或其片段，包括但不限于例如scFv片段、Fab、Fab’等的片段。可修饰该配体以含有另外的部分，例如融合蛋白或缀合物。
如本文描述的双特异性配体或单体配体或多聚体配体的抗体重链单个可变区可特异性结合血清白蛋白，并且包含抗体重链单个可变区的氨基酸序列。此抗体重链单个可变区可选自，但优选不限于，下列区域中的一种：dAb7r20，dAb7r21，dAb7r22，dAb7r23，dAb7r24，dAb7r25，dAb7r26，dAb7r27，dAb7r28，dAb7r29，dAb7r30，dAb7r31，dAb7r32，dAb7r33，dAb7h21，dAb7h22，dAb7h23，Ab7h24，Ab7h25，Ab7h26，dAb7h27，dAb7h30和dAb7h31，或者具有至少80％与其相同，多达和包括85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％与其相同的并且特异性结合血清白蛋白的氨基酸序列的区域。或者，该配体包含抗体单个可变区，优选抗体重链单个可变区，其与下列区域中的一个竞争结合血清白蛋白：dAb7r20，dAb7r21，dAb7r22，dAb7r23，dAb7r24，dAb7r25，dAb7r26，dAb7r27，dAb7r28，dAb7r29，dAb7r30，dAb7r31，dAb7r32，dAb7r33，dAb7h21，dAb7h22，dAb7h23，Ab7h24，Ab7h25，Ab7h26，dAb7h27，dAb7h30dAb7h31，dAb7m12，dAb7m16，dAb7m26，dAb7r1，dAb7r3，dAb7r4，dAb7r5，dAb7r7，dAb7r8，dAb7r13，dAb7r14，dAb7r15，dAb7r16，dAb7r17，dAb7r18，dAb7r19，dAb7h1，dAb7h2，dAb7h6，dAb7h7，dAb7h8，dAb7h9，dAb7h10，dAb7h11，dAb7h12，dAb7h13，dAb7h14，dAb7p1和dAb7p2，或者与具有至少80％与其相同，多达和包括85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％与其相同的并且特异性结合血清白蛋白的氨基酸序列的区域竞争。或者，除了抗体重链单个可变区外，该配体还包含抗体轻链单个可变区，其可特异性结合血清白蛋白并且包含抗体轻链单个可变区的氨基酸序列。此抗体轻链单个可变区可选自，但优选不限于，下列区域中的一种：dAb7m12，dAb7m16，dAb7m26，dAb7r1，dAb7r3，dAb7r4，dAb7r5，dAb7r7，dAb7r8，dAb7r13，dAb7r14，dAb7r15，dAb7r16，dAb7r17，dAb7r18，dAb7r19，dAb7h1，dAb7h2，dAb7h6，dAb7h7，dAb7h8，dAb7h9，dAb7h10，dAb7h11，dAb7h12，dAb7h13，dAb7h14，dAb7p1和dAb7p2，或者具有至少80％与其相同，多达和包括85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％与其相同的并且特异性结合血清白蛋白的氨基酸序列的区域。或者，该配体包含抗体单个可变区，优选抗体轻链单个可变区，其与可选自但优选不限于下列区域中的一个区域竞争结合血清白蛋白：dAb7r20，dAb7r21，dAb7r22，dAb7r23，dAb7r24，dAb7r25，dAb7r26，dAb7r27，dAb7r28，dAb7r29，dAb7r30，dAb7r31，dAb7r32，dAb7r33，dAb7h21，dAb7h22，dAb7h23，Ab7h24，Ab7h25，Ab7h26，dAb7h27，dAb7h30dAb7h31，dAb7m12，dAb7m16，dAb7m26，dAb7r1，dAb7r3，dAb7r4，dAb7r5，dAb7r7，dAb7r8，dAb7r13，dAb7r14，dAb7r15，dAb7r16，dAb7r17，dAb7r18，dAb7r19，dAb7h1，dAb7h2，dAb7h6，dAb7h7，dAb7h8，dAb7h9，dAb7h10，dAb7h11，dAb7h12，dAb7h13，dAb7h14，dAb7p1或dAb7p2，或者具有至少80％与其相同，多达和包括85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％与其相同的并且特异性结合血清白蛋白的氨基酸序列的区域。在一个实施方案中，该配体可以是具有上述双特异性配体之一或者两个的任意组合的IgG免疫球蛋白。在一个实施方案中，该配体可含有上文所列举的单个可变区的一个或多个单体，其中如果该配体含有多于一个的这些单个可变区，则所述单个可变区可以相互相同，或者相互不同。
在一个实施方案中，该配体可以是一种双特异性配体，其具有具有第一抗原或表位结合特异性的第一免疫球蛋白单个可变区以及具有第二抗原或表位结合特异性的第二免疫球蛋白单个可变区，所述第一和第二免疫球蛋白单个可变区是抗体重链单个可变区，并且其中所述第一和第二抗体重链单个可变区中的一个或者两个特异性结合血清白蛋白，并且具有抗体重链单个可变区的氨基酸序列，该抗体重链单个可变区可选自但优选不限于下列抗体重链单个可变区中的一个：dAb7r20，dAb7r21，dAb7r22，dAb7r23，dAb7r24，dAb7r25，dAb7r26，dAb7r27，dAb7r28，dAb7r29，dAb7r30，dAb7r31，dAb7r32，dAb7r33，dAb7h21，dAb7h22，dAb7h23，Ab7h24，Ab7h25，Ab7h26，dAb7h27，dAb7h30和dAb7h31，或者至少80％与其相同，多达和包括85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％与其相同的氨基酸序列。此配体的一个实施方案是一种双特异性配体，其具有具有第一抗原或表位结合特异性的第一免疫球蛋白单个可变区以及具有第二抗原或表位结合特异性的第二免疫球蛋白单个可变区，所述第一和第二免疫球蛋白单个可变区是抗体重链单个可变区，并且其中所述第一和第二抗体重链单个可变区中的一个或者两个特异性结合血清白蛋白，并与单个可变区竞争结合血清白蛋白，其具有抗体单个可变区的氨基酸序列，该抗体单个可变区可选自但优选不限于下列抗体单个可变区中的一个：dAb7r20，dAb7r21，dAb7r22，dAb7r23，dAb7r24，dAb7r25，dAb7r26，dAb7r27，dAb7r28，dAb7r29，dAb7r30，dAb7r31，dAb7r32，dAb7r33，dAb7h21，dAb7h22，dAb7h23，Ab7h24，Ab7h25，Ab7h26，dAb7h27，dAb7h30dAb7h31，dAb7m12，dAb7m16，dAb7m26，dAb7r1，dAb7r3，dAb7r4，dAb7r5，dAb7r7，dAb7r8，dAb7r13，dAb7r14，dAb7r15，dAb7r16，dAb7r17，dAb7r18，dAb7r19，dAb7h1，dAb7h2，dAb7h6，dAb7h7，dAb7h8，dAb7h9，dAb7h10，dAb7h11，dAb7h12，dAb7h13，dAb7h14，dAb7p1和dAb7p2，或者至少80％与其相同或多达和包括85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％与其相同的序列。在一个实施方案中，该配体可以是具有上述双特异性配体之一或者两个的任意组合的IgG免疫球蛋白。在一个实施方案中，该配体可含有上文所列举的单个可变区的一个或多个单体，其中如果该配体含有多于一个的这些单个可变区，则所述单个可变区可以相互相同，或者相互不同。
在一个实施方案中，双特异性配体具有具有第一抗原或表位结合特异性的第一免疫球蛋白单个可变区以及具有第二抗原或表位结合特异性的第二免疫球蛋白单个可变区，所述第一和第二免疫球蛋白单个可变区是抗体轻链单个可变区，并且该第一和第二抗体轻链单个可变区中的一个或者两个特异性地结合血清白蛋白，并且具有抗体轻链单个可变区的氨基酸序列，该抗体轻链单个可变区可选自但优选不限于下列抗体重链单个可变区中的一个：dAb7m12，dAb7m16，dAb7m26，dAb7r1，dAb7r3，dAb7r4，dAb7r5，dAb7r7，dAb7r8，dAb7r13，dAb7r14，dAb7r15，dAb7r16，dAb7r17，dAb7r18，dAb7r19，dAb7h1，dAb7h2，dAb7h6，dAb7h7，dAb7h8，dAb7h9，dAb7h10，dAb7h11，dAb7h12，dAb7h13，dAb7h14，dAb7p1和dAb7p2，或者至少80％与其相同或多达和包括85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％与其相同的序列。
在一个实施方案中，该配体可以是一种双特异性配体，其具有具有第一抗原或表位结合特异性的第一免疫球蛋白单个可变区以及具有第二抗原或表位结合特异性的第二免疫球蛋白单个可变区，所述第一和第二免疫球蛋白单个可变区是抗体轻链单个可变区，并且所述第一和第二抗体轻链单个可变区中的一个或者两个特异性结合血清白蛋白，并与抗体轻链单个可变区竞争结合血清白蛋白，该抗体轻链单个可变区具有抗体单个可变区的氨基酸序列，所述抗体单个可变区可选自，但优选不限于，下列抗体单个可变区中的一个：dAb7r20，dAb7r21，dAb7r22，dAb7r23，dAb7r24，dAb7r25，dAb7r26，dAb7r27，dAb7r28，dAb7r29，dAb7r30，dAb7r31，dAb7r32，dAb7r33，dAb7h21，dAb7h22，dAb7h23，Ab7h24，Ab7h25，Ab7h26，dAb7h27，dAb7h30dAb7h31，dAb7m12，dAb7m16，dAb7m26，dAb7r1，dAb7r3，dAb7r4，dAb7r5，dAb7r7，dAb7r8，dAb7r13，dAb7r14，dAb7r15，dAb7r16，dAb7r17，dAb7r18，dAb7r19，dAb7h1，dAb7h2，dAb7h6，dAb7h7，dAb7h8，dAb7h9，dAb7h10，dAb7h11，dAb7h12，dAb7h13，dAb7h14，dAb7p1和dAb7p2，或者至少80％与其相同或多达和包括85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％与其相同的序列。
本文描述了具有一个或多个抗体重链单个可变区的配体，其中该一个或多个抗体重链单个可变区特异性地结合血清白蛋白，并且具有选自位优选不限于下列的抗体重链单个可变区的氨基酸序列：dAb8，dAb10，dAb36，dAb7r20，dAb7r21，dAb7r22，dAb7r23，dAb7r24，dAb7r25，dAb7r26，dAb7r27，dAb7r28，dAb7r29，dAb7r30，dAb7r31，dAb7r32，dAb7r33，dAb7h21，dAb7h22，dAb7h23，Ab7h24，Ab7h25，Ab7h26，dAb7h27，dAb7h30，dAb7h31，以及至少80％与其相同或者多达和包括85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％与其相同的序列。
本文描述了具有一个或多个抗体重链单个可变区的配体，其中该一个或多个抗体重链单个可变区特异性地结合血清白蛋白，并且与抗体单个可变区竞争结合血清白蛋白，该抗体单个可变区具有选自但优选不限于下列中的一个的抗体单个可变区的氨基酸序列：dAb8，dAb10，dAb36，dAb7r20，dAb7r21，dAb7r22，dAb7r23，dAb7r24，dAb7r25，dAb7r26，dAb7r27，dAb7r28，dAb7r29，dAb7r30，dAb7r31，dAb7r32，dAb7r33，dAb7h21，dAb7h22，dAb7h23，Ab7h24，Ab7h25，Ab7h26，dAb7h27，dAb7h30，dAb7h31，dAb2，dAb4，dAb7，dAb11，dAb12，dAb13，dAb15，dAb16，dAb17，dAb18，dAb19，dAb21，dAb22，dAb23，dAb24，dAb25，dAb26，dAb27，dAb30，dAb31，dAb33，dAb34，dAb35，dAb38，dAb41，dAb46，dAb47，dAb52，dAb53，dAb54，dAb55，dAb56，dAb7m 12，dAb7m 16，dAb7m26，dAb7r1，dAb7r3，dAb7r4，dAb7r5，dAb7r7，dAb7r8，dAb7r13，dAb7r14，dAb7r15，dAb7r16，dAb7r17，dAb7r18，dAb7r19，dAb7h1，dAb7h2，dAb7h6，dAb7h7，dAb7h8，dAb7h9，dAb7h10，dAb7h11，dAb7h12，dAb7h13，dAb7h14，dAb7p1和dAb7p2。
本文描述了一种配体，其具有具有特异性结合第一抗原或其表位的抗体重链单个可变区，以及具有特异性结合第二抗原或其表位的抗体轻链单个可变区，其中所述第一抗原和所述第二抗原中的一个或者两个是血清白蛋白，并且其中该抗体重链单个可变区特异性地结合血清白蛋白，并且与抗体单个可变区竞争结合血清白蛋白，该抗体单个可变区具有选自但优选不限于下组的抗体单个可变区的氨基酸序列：dAb8，dAb 10，dAb36，dAb7r20，dAb7r21，dAb7r22，dAb7r23，dAb7r24，dAb7r25，dAb7r26，dAb7r27，dAb7r28，dAb7r29，dAb7r30，dAb7r31，dAb7r32，dAb7r33，dAb7h21，dAb7h22，dAb7h23，Ab7h24，Ab7h25，Ab7h26，dAb7h27，dAb7h30，dAb7h31，dAb2，dAb4，dAb7，dAb11，dAb12，dAb13，dAb15，dAb16，dAb17，dAb 18，dAb 19，dAb21，dAb22，dAb23，dAb24，dAb25，dAb26，dAb27，dAb30，dAb31，dAb33，dAb34，dAb35，dAb38，dAb41，dAb46，dAb47，dAb52，dAb53，dAb54，dAb55，dAb56，dAb7m12，dAb7m16，dAb7m26，dAb7r1，dAb7r3，dAb7r4，dAb7r5，dAb7r7，dAb7r8，dAb7r13，dAb7r14，dAb7r15，dAb7r16，dAb7r17，dAb7r18，dAb7r19，dAb7h1，dAb7h2，dAb7h6，dAb7h7，dAb7h8，dAb7h9，dAb7h10，dAb7h11，dAb7h12，dAb7h13，dAb7h14，dAb7p1，dAb7p2，并且其中该抗体轻链单个可变区特异性地结合血清白蛋白，并且具有选自位优选不限于下列那些的抗体轻链单个可变区的氨基酸序列：dAb2，dAb4，dAb7，dAb11，dAb12，dAb13，dAb15，dAb16，dAb17，dAb18，dAb19，dAb21，dAb22，dAb23，dAb24，dAb25，dAb26，dAb27，dAb30，dAb31，dAb33，dAb34，dAb35，dAb38，dAb41，dAb46，dAb47，dAb52，dAb53，dAb54，dAb55，dAb56，drdAb7m12，dAb7m16，dAb7m26，dAb7r1，dAb7r3，dAb7r4，dAb7r5，dAb7r7，dAb7r8，dAb7r13，dAb7r14，dAb7r15，dAb7r16，dAb7r17，dAb7r18，dAb7r19，dAb7h1，dAb7h2，dAb7h6，dAb7h7，dAb7h8，dAb7h9，dAb7h10，dAb7h11，dAb7h12，dAb7h13，dAb7h14，dAb7p1和dAb7p2，以及至少80％与其相同或者多达和包括85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％与其相同的序列。
本文描述了一种配体，其具有具有特异性结合第一抗原或其表位的抗体重链单个可变区，以及具有特异性结合第二抗原或其表位的抗体轻链单个可变区，其中所述第一抗原和所述第二抗原中的一个或者两个是血清白蛋白，并且其中该抗体重链单个可变区特异性地结合血清白蛋白，并且具有选自但优选不限于下组的抗体重链单个可变区的氨基酸序列：dAb8，dAb10，dAb36，dAb7r20，dAb7r21，dAb7r22，dAb7r23，dAb7r24，dAb7r25，dAb7r26，dAb7r27，dAb7r28，dAb7r29，dAb7r30，dAb7r31，dAb7r32，dAb7r33，dAb7h21，dAb7h22，dAb7h23，Ab7h24，Ab7h25，Ab7h26，dAb7h27，dAb7h30，dAb7h31，以及至少80％与其相同或者多达和包括85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％与其相同的序列，并且其中该抗体轻链单个可变区特异性地结合血清白蛋白，并且与抗体单个可变区竞争结合血清白蛋白，该抗体单个可变区包含选自但优选不限于下组的抗体单个可变区的氨基酸序列：dAb8，dAb10，dAb36，dAb7r20，dAb7r21，dAb7r22，dAb7r23，dAb7r24，dAb7r25，dAb7r26，dAb7r27，dAb7r28，dAb7r29，dAb7r30，dAb7r31，dAb7r32，dAb7r33，dAb7h21，dAb7h22，dAb7h23，Ab7h24，Ab7h25，Ab7h26，dAb7h27，dAb7h30，dAb7h31，dAb2，dAb4，dAb7，dAb11，dAb12，dAb13，dAb15，dAb16，dAb17，dAb18，dAb19，dAb21，dAb22，dAb23，dAb24，dAb25，dAb26，dAb27，dAb30，dAb31，dAb33，dAb34，dAb35，dAb38，dAb41，dAb46，dAb47，dAb52，dAb53，dAb54，dAb55，dAb56，dAb7m12，dAb7m16，dAb7m26，dAb7r1，dAb7r3，dAb7r4，dAb7r5，dAb7r7，dAb7r8，dAb7r13，dAb7r14，dAb7r15，dAb7r16，dAb7r17，dAb7r18，dAb7r19，dAb7h1，dAb7h2，dAb7h6，dAb7h7，dAb7h8，dAb7h9，dAb7h10，dAb7h11，dAb7h12，dAb7h13，dAb7h14，dAb7p1和dAb7p2。
本文描述了一种配体，其具有一个或多个具有特异性结合第一抗原或其表位的抗体重链单个可变区，以及一个或多个具有特异性结合第二抗原或其表位的抗体轻链单个可变区，其中该第一抗原和第二抗原中的一个或者两个是血清白蛋白，并且其中一个或多个抗体重链单个可变区特异性地结合血清白蛋白，并且与抗体单个可变区竞争结合血清白蛋白，该抗体单个可变区具有选自但优选不限于下组的抗体单个可变区的氨基酸序列：dAb8，dAb10，dAb36，dAb7r20，dAb7r21，dAb7r22，dAb7r23，dAb7r24，dAb7r25，dAb7r26，dAb7r27，dAb7r28，dAb7r29，dAb7r30，dAb7r31，dAb7r32，dAb7r33，dAb7h21，dAb7h22，dAb7h23，Ab7h24，Ab7h25，Ab7h26，dAb7h27，dAb7h30，dAb7h31，dAb2，dAb4，dAb7，dAb11，dAb12，dAb13，dAb15，dAb16，dAb17，dAb18，dAb19，dAb21，dAb22，dAb23，dAb24，dAb25，dAb26，dAb27，dAb30，dAb31，dAb33，dAb34，dAb35，dAb38，dAb41，dAb46，dAb47，dAb52，dAb53，dAb54，dAb55，dAb56，dAb7m12，dAb7m16，dAb7m26，dAb7r1，dAb7r3，dAb7r4，dAb7r5，dAb7r7，dAb7r8，dAb7r13，dAb7r14，dAb7r15，dAb7r16，dAb7r17，dAb7r18，dAb7r19，dAb7h1，dAb7h2，dAb7h6，dAb7h7，dAb7h8，dAb7h9，dAb7h10，dAb7h11，dAb7h12，dAb7h13，dAb7h14，dAb7p1，dAb7p2，并且其中一个或多个抗体轻链单个可变区特异性地结合血清白蛋白，并且包含选自但优选不限于下组的抗体轻链单个可变区的氨基酸序列：dAb2，dAb4，dAb7，dAb11，dAb12，dAb13，dAb15，dAb16，dAb17，dAb18，dAb19，dAb21，dAb22，dAb23，dAb24，dAb25，dAb26，dAb27，dAb30，dAb31，dAb33，dAb34，dAb35，dAb38，dAb41，dAb46，dAb47，dAb52，dAb53，dAb54，dAb55，dAb56，drdAb7m12，dAb7m16，dAb7m26，dAb7r1，dAb7r3，dAb7r4，dAb7r5，dAb7r7，dAb7r8，dAb7r13，dAb7r14，dAb7r15，dAb7r16，dAb7r17，dAb7r18，dAb7r19，dAb7h1，dAb7h2，dAb7h6，dAb7h7，dAb7h8，dAb7h9，dAb7h10，dAb7h11，dAb7h12，dAb7h13，dAb7h14，dAb7p1和dAb7p2，以及至少80％与其相同或者多达和包括85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％与其相同的氨基酸序列。
本文描述了一种配体，其具有一个或多个具有特异性结合第一抗原或其表位的抗体重链单个可变区，以及一个或多个具有特异性结合第二抗原或其表位的抗体轻链单个可变区，其中所述第一抗原和所述第二抗原中的一个或者两个是血清白蛋白，并且其中一个或多个抗体重链单个可变区特异性地结合血清白蛋白，并且具有选自但优选不限于下组的抗体重链单个可变区的氨基酸序列：dAb8，dAb10，dAb36，dAb7r20，dAb7r21，dAb7r22，dAb7r23，dAb7r24，dAb7r25，dAb7r26，dAb7r27，dAb7r28，dAb7r29，dAb7r30，dAb7r31，dAb7r32，dAb7r33，dAb7h21，dAb7h22，dAb7h23，Ab7h24，Ab7h25，Ab7h26，dAb7h27，dAb7h30，dAb7h31，以及至少80％与其相同或者多达和包括85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％与其相同的序列，并且其中一个或多个抗体轻链单个可变区特异性地结合血清白蛋白，并且与抗体单个可变区竞争结合血清白蛋白，该抗体单个可变区具有选自下组的抗体单个可变区的氨基酸序列：dAb8，dAb10，dAb36，dAb7r20，dAb7r21，dAb7r22，dAb7r23，dAb7r24，dAb7r25，dAb7r26，dAb7r27，dAb7r28，dAb7r29，dAb7r30，dAb7r31，dAb7r32，dAb7r33，dAb7h21，dAb7h22，dAb7h23，Ab7h24，Ab7h25，Ab7h26，dAb7h27，dAb7h30，dAb7h31，dAb2，dAb4，dAb7，dAb11，dAb12，dAb13，dAb15，dAb16，dAb17，dAb18，dAb19，dAb21，dAb22，dAb23，dAb24，dAb25，dAb26，dAb27，dAb30，dAb31，dAb33，dAb34，dAb35，dAb38，dAb41，dAb46，dAb47，dAb52，dAb53，dAb54，dAb55，dAb56，dAb7m12，dAb7m16，dAb7m26，dAb7r1，dAb7r3，dAb7r4，dAb7r5，dAb7r7，dAb7r8，dAb7r13，dAb7r14，dAb7r15，dAb7r16，dAb7r17，dAb7r18，dAb7r19，dAb7h1，dAb7h2，dAb7h6，dAb7h7，dAb7h8，dAb7h9，dAb7h10，dAb7h11，dAb7h12，dAb7h13，dAb7h14，dAb7p1和dAb7p2。
本文描述了一种配体，其具有一个或多个抗体轻链单个可变区，并且其中该一个或多个抗体轻链单个可变区特异性地结合血清白蛋白，并且具有选自但优选不限于下组的抗体轻链单个可变区的氨基酸序列：dAb2，dAb4，dAb7，dAb11，dAb12，dAb13，dAb15，dAb16，dAb17，dAb18，dAb19，dAb21，dAb22，dAb23，dAb24，dAb25，dAb26，dAb27，dAb30，dAb31，dAb33，dAb34，dAb35，dAb38，dAb41，dAb46，dAb47，dAb52，dAb53，dAb54，dAb55，dAb56，drdAb7m12，dAb7m16，dAb7m26，dAb7r1，dAb7r3，dAb7r4，dAb7r5，dAb7r7，dAb7r8，dAb7r13，dAb7r14，dAb7r15，dAb7r16，dAb7r17，dAb7r18，dAb7r19，dAb7h1，dAb7h2，dAb7h6，dAb7h7，dAb7h8，dAb7h9，dAb7h10，dAb7h11，dAb7h12，dAb7h13，dAb7h14，dAb7p1，dAb7p2，以及至少80％与其相同或者多达和包括85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％与其相同的序列。
本文描述了一种配体，其具有一个或多个抗体轻链单个可变区，其中该一个或多个抗体轻链单个可变区特异性地结合血清白蛋白，并且与抗体单个可变区竞争结合血清白蛋白，该抗体单个可变区具有选自但优选不限于下组的抗体单个可变区的氨基酸序列：dAb8，dAb10，dAb36，dAb7r20，dAb7r21，dAb7r22，dAb7r23，dAb7r24，dAb7r25，dAb7r26，dAb7r27，dAb7r28，dAb7r29，dAb7r30，dAb7r31，dAb7r32，dAb7r33，dAb7h21，dAb7h22，dAb7h23，Ab7h24，Ab7h25，Ab7h26，dAb7h27，dAb7h30，dAb7h31，dAb2，dAb4，dAb7，dAb11，dAb12，dAb13，dAb15，dAb16，dAb17，dAb18，dAb19，dAb21，dAb22，dAb23，dAb24，dAb25，dAb26，dAb27，dAb30，dAb31，dAb33，dAb34，dAb35，dAb38，dAb41，dAb46，dAb47，dAb52，dAb53，dAb54，dAb55，dAb56，dAb7m12，dAb7m16，dAb7m26，dAb7r1，dAb7r3，dAb7r4，dAb7r5，dAb7r7，dAb7r8，dAb7r13，dAb7r14，dAb7r15，dAb7r16，dAb7r17，dAb7r18，dAb7r19，dAb7h1，dAb7h2，dAb7h6，dAb7h7，dAb7h8，dAb7h9，dAb7h10，dAb7h11，dAb7h12，dAb7h13，dAb7h14，dAb7p1和dAb7p2。
本文描述了一种配体，其具有一个或多个单个可变区，其中该一个或多个单个可变区特异性地结合血清白蛋白，并且与抗体单个可变区竞争结合血清白蛋白，该抗体单个可变区具有选自但优选不限于下组的抗体单个可变区的氨基酸序列：dAb8，dAb10，dAb36，dAb7r20，dAb7r21，dAb7r22，dAb7r23，dAb7r24，dAb7r25，dAb7r26，dAb7r27，dAb7r28，dAb7r29，dAb7r30，dAb7r31，dAb7r32，dAb7r33，dAb7h21，dAb7h22，dAb7h23，Ab7h24，Ab7h25，Ab7h26，dAb7h27，dAb7h30，dAb7h31，dAb2，dAb4，dAb7，dAb11，dAb12，dAb13，dAb15，dAb16，dAb17，dAb18，dAb19，dAb21，dAb22，dAb23，dAb24，dAb25，dAb26，dAb27，dAb30，dAb31，dAb33，dAb34，dAb35，dAb38，dAb41，dAb46，dAb47，dAb52，dAb53，dAb54，dAb55，dAb56，dAb7m12，dAb7m16，dAb7m26，dAb7r1，dAb7r3，dAb7r4，dAb7r5，dAb7r7，dAb7r8，dAb7r13，dAb7r14，dAb7r15，dAb7r16，dAb7r17，dAb7r18，dAb7r19，dAb7h1，dAb7h2，dAb7h6，dAb7h7，dAb7h8，dAb7h9，dAb7h10，dAb7h11，dAb7h12，dAb7h13，dAb7h14，dAb7p1和dAb7p2。优选地，该一个或多个单个可变区包含选自但优选不限于下列的支架结构：CTLA-4、脂质运载蛋白、SpA、亲合体、avimer、GroE1和纤连蛋白，并且与抗体单个可变区竞争结合血清白蛋白，该抗体单个可变区具有选自但优选不限于下组的抗体单个可变区的氨基酸序列：dAb8，dAb10，dAb36，dAb7r20，dAb7r21，dAb7r22，dAb7r23，dAb7r24，dAb7r25，dAb7r26，dAb7r27，dAb7r28，dAb7r29，dAb7r30，dAb7r31，dAb7r32，dAb7r33，dAb7h21，dAb7h22，dAb7h23，Ab7h24，Ab7h25，Ab7h26，dAb7h27，dAb7h30，dAb7h31，dAb2，dAb4，dAb7，dAb11，dAb12，dAb13，dAb15，dAb16，dAb17，dAb18，dAb19，dAb21，dAb22，dAb23，dAb24，dAb25，dAb26，dAb27，dAb30，dAb31，dAb33，dAb34，dAb35，dAb38，dAb41，dAb46，dAb47，dAb52，dAb53，dAb54，dAb55，dAb56，dAb7m12，dAb7m16，dAb7m26，dAb7r1，dAb7r3，dAb7r4，dAb7r5，dAb7r7，dAb7r8，dAb7r13，dAb7r14，dAb7r15，dAb7r16，dAb7r17，dAb7r18，dAb7r19，dAb7h1，dAb7h2，dAb7h6，dAb7h7，dAb7h8，dAb7h9，dAb7h10，dAb7h11，dAb7h12，dAb7h13，dAb7h14，dAb7p1和dAb7p2。
本文描述了一种配体，其具有具有第一抗原或表位结合特异性的第一免疫球蛋白单个可变区以及具有第二抗原或表位结合特异性的第二免疫球蛋白单个可变区，其中该第一和第二免疫球蛋白单个可变区是抗体重链单个可变区，其中该第一抗体重链单个可变区特异性结合血清白蛋白，并且具有选自但优选不限于下组的抗体重链单个可变区的氨基酸序列：dAb8，dAb10，dAb36，dAb7r20，dAb7r21，dAb7r22，dAb7r23，dAb7r24，dAb7r25，dAb7r26，dAb7r27，dAb7r28，dAb7r29，dAb7r30，dAb7r31，dAb7r32，dAb7r33，dAb7h21，dAb7h22，dAb7h23，Ab7h24，Ab7h25，Ab7h26，dAb7h27，dAb7h30，dAb7h31，以及至少80％与其相同或者多达和包括85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％与其相同的序列，并且其中该第二抗体重链单个可变区特异性地结合血清白蛋白，并且与抗体单个可变区竞争结合血清白蛋白，该抗体单个可变区具有选自下组的抗体单个可变区的氨基酸序列：dAb8，dAb10，dAb36，dAb7r20，dAb7r21，dAb7r22，dAb7r23，dAb7r24，dAb7r25，dAb7r26，dAb7r27，dAb7r28，dAb7r29，dAb7r30，dAb7r31，dAb7r32，dAb7r33，dAb7h21，dAb7h22，dAb7h23，Ab7h24，Ab7h25，Ab7h26，dAb7h27，dAb7h30，dAb7h31，dAb2，dAb4，dAb7，dAb11，dAb12，dAb13，dAb15，dAb16，dAb17，dAb18，dAb19，dAb21，dAb22，dAb23，dAb24，dAb25，dAb26，dAb27，dAb30，dAb31，dAb33，dAb34，dAb35，dAb38，dAb41，dAb46，dAb47，dAb52，dAb53，dAb54，dAb55，dAb56，dAb7m12，dAb7m16，dAb7m26，dAb7r1，dAb7r3，dAb7r4，dAb7r5，dAb7r7，dAb7r8，dAb7r13，dAb7r14，dAb7r15，dAb7r16，dAb7r17，dAb7r18，dAb7r19，dAb7h1，dAb7h2，dAb7h6，dAb7h7，dAb7h8，dAb7h9，dAb7h10，dAb7h11，dAb7h12，dAb7h13，dAb7h14，dAb7p1和dAb7p2。
本文描述了一种配体，其具有具有第一抗原或表位结合特异性的第一免疫球蛋白单个可变区以及具有第二抗原或表位结合特异性的第二免疫球蛋白单个可变区，其中该第一和第二免疫球蛋白单个可变区是抗体轻链单个可变区，其中该第一抗体轻链单个可变区特异性结合血清白蛋白，并且具有选自但优选不限于下组的抗体轻链单个可变区的氨基酸序列：dAb2，dAb4，dAb7，dAb11，dAb12，dAb13，dAb15，dAb16，dAb17，dAb18，dAb19，dAb21，dAb22，dAb23，dAb24，dAb25，dAb26，dAb27，dAb30，dAb31，dAb33，dAb34，dAb35，dAb38，dAb41，dAb46，dAb47，dAb52，dAb53，dAb54，dAb55，dAb56，drdAb7m12，dAb7m16，dAb7m26，dAb7r1，dAb7r3，dAb7r4，dAb7r5，dAb7r7，dAb7r8，dAb7r13，dAb7r14，dAb7r15，dAb7r16，dAb7r17，dAb7r18，dAb7r19，dAb7h1，dAb7h2，dAb7h6，dAb7h7，dAb7h8，dAb7h9，dAb7h10，dAb7h11，dAb7h12，dAb7h13，dAb7h14，dAb7p1，dAb7p2，以及至少80％与其相同或者多达和包括85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％与其相同的序列，并且其中该第二抗体轻链单个可变区特异性地结合血清白蛋白，并且与抗体单个可变区竞争结合血清白蛋白，该抗体单个可变区具有选自但优选不限于下组的抗体单个可变区的氨基酸序列：dAb8，dAb10，dAb36，dAb7r20，dAb7r21，dAb7r22，dAb7r23，dAb7r24，dAb7r25，dAb7r26，dAb7r27，dAb7r28，dAb7r29，dAb7r30，dAb7r31，dAb7r32，dAb7r33，dAb7h21，dAb7h22，dAb7h23，Ab7h24，Ab7h25，Ab7h26，dAb7h27，dAb7h30，dAb7h31，dAb2，dAb4，dAb7，dAb11，dAb12，dAb13，dAb15，dAb16，dAb17，dAb18，dAb19，dAb21，dAb22，dAb23，dAb24，dAb25，dAb26，dAb27，dAb30，dAb31，dAb33，dAb34，dAb35，dAb38，dAb41，dAb46，dAb47，dAb52，dAb53，dAb54，dAb55，dAb56，dAb7m12，dAb7m16，dAb7m26，dAb7r1，dAb7r3，dAb7r4，dAb7r5，dAb7r7，dAb7r8，dAb7r13，dAb7r14，dAb7r15，dAb7r16，dAb7r17，dAb7r18，dAb7r19，dAb7h1，dAb7h2，dAb7h6，dAb7h7，dAb7h8，dAb7h9，dAb7h10，dAb7h11，dAb7h12，dAb7h13，dAb7h14，dAb7p1和dAb7p2。
前面和本文描述的配体的实施方案还包括具有这样的结构的那些，即它们包含具有一个或两个上述双特异性配体的任何组合的IgG结构，和/或包含非-免疫球蛋白支架结构的单个可变区。此免疫球蛋白结构可具有抗体单个可变区的不同组合，其包括含有4个抗体重链单个可变区的IgG结构，或者含有4个抗体轻链单个可变区的IgG结构，以及含有两个链对的IgG结构，每一对含有抗体重链单个可变区和抗体轻链单个可变区。除了这些IgG结构外，本文描述的配体可含有单个可变区的一个或多个单体，其包括但优选不限于上文所列的单个可变区，其中如果该配体含有多于一个的这些单个可变区，则该单个可变区可以相互相同，或者相互不同。
包含一个或多个单个可变区的配体的实施方案包括包括，但优选不限于，本文描述的dAb、包含至少一个单个可变区的双特异性单体、包含抗体单链单体的双特异性IgG分子、和包含如本文所述的抗体单链单体的多价IgG分子。这些实施方案可进一步包括属类配体的结合位点。该属类配体可包括，但优选不限于，蛋白A、蛋白L和蛋白G。对于此类双特异性配体，包括呈IgG形式的那些，各个第二抗原或表位结合特异性的靶包括，但优选不限于，抗原的结合特异性，该抗原可表征为选自下列的组：细胞因子、细胞因子受体、酶类、酶辅助因子和DNA结合蛋白，并且可选自，但优选不限于，EPO受体，ApoE，Apo-SAA，BDNF，心脏营养蛋白-1，EGF，EGF受体，ENA-78，嗜酸细胞活化趋化因子，嗜酸细胞活化趋化因子-2，Exodus-2，EpoR，酸性FGF，碱性FGF，成纤维细胞生长因子-10，FLT3配体，Fractalkine(CX3C)，GDNF，G-CSF，GM-CSF，GF-β1，胰岛素，IFN-γIL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，1L-8(72a.a.)，IL-8(77a.a)，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18(IGIF)，抑制素α，抑制素β，IP-10角质形成细胞生长因子-2(KGF-2)，KGF，来普汀，L1F，淋巴细胞趋化因子，穆勒抑制物，单核细胞克隆抑制因子，单核细胞趋化蛋白，M-CSF，MDC(67a.a)，MDC(69a.a.)，MCP-1(MCAF)，MCP-2，MCP-3，MCP-4，MDC(67a.a.)，MDC(69a.a)，MIG，MLP-1α，MIP-3α，MIP-3β，MIP-4，髓样祖细胞抑制因子-1(MPIF-1)，NAP-2，Neurturin，神经生长因子，β-NGF，NT-3，NT-4，制瘤素M，PDGF-AA，PDGF-AB，PDGF-BB，PF-4，RANTES，SDF1α，SDF1β，TGF-β，TGF-β2，TGF-β，TNF-β，TNF受体1，TNF受体II，TNIL-1，TPO，VEGF，VEGF受体1，VEGF受体2，VEGF受体3，GCP-2，GRO/MGSA，GRO-β，GRO-γ，HCC1，1-309，HER 1，HER 2，HER3，HER4，CD4，人趋化因子受体CXCR4or CCR5，来自丙肝病毒的3型非结构蛋白(NS3)，，TNF-α，IgE，IFN-γ，MMP-12，CEA，幽门螺旋杆菌，TB，流感病毒，戊型肝炎，MMP-12，陷入受体例如表皮生长因子受体(EGFR)，肿瘤细胞中的ErBb2受体其为一种陷入细胞的受体，LDL受体，FGF2受体，ErbB2受体，转铁蛋白受体，PDGF受体，VEGF受体，PsmAr，一种细胞外基质蛋白，弹性蛋白，纤连蛋白，层粘连蛋白，α1-抗胰蛋白酶，组织因子蛋白酶抑制剂，PDK1，GSK1，Bad，半胱天冬酶-9，Forkhead，幽门螺旋杆菌的抗原，结核分支杆菌的抗原，和流感病毒的抗原。在此类双特异性配体中，包括存在于IgG形式中的那些双特异性配体，一个或两个单个可变区特异性结合表位或抗原，解离常数(Kd)可选自但优选不限于1×10-3M或更小，1×10-4M或更小，1×10-5M或更小，1×10-6M或更小，1×10-7M或更小，1×10-8M或更小，和1×10-9M或更小，其例如通过表面等离振子共振法测定。此类双特异性配体，包括存在于IgG形式中的那些双特异性配体，可进一步包含一个或多个实体，该实体包括但优选不限于指示物、标记物和药物。此类双特异性配体，包括存在于IgG形式中的那些双特异性配体，以及含有上文所列单个可变区的一个或多个单体的多聚配体，它们可以存在于药盒中，存在于组合物包括药物组合物中，该组合物含有双特异性配体及其载体。
类似地，对于包含一个或多个本文所述的单个可变区的配体，包括如上文定义的单体形式的配体和多聚体形式的配体，该一个或多个单个可变区特异性地结合表位或抗原，解离常数(Kd)可选自但优选不限于1×10-3M或更小，1×10-4M或更小，1×10-5M或更小，1×10-6M或更小，1×10-7M或更小，1×10-8M或更小，和1×10-9M或更小，其例如通过表面等离振子共振法测定。此配体可进一步包含一个或多个实体，该实体包括但优选不限于指示物、标记物和药物。此配体可以存在于药盒中，存在于组合物包括药物组合物中，该组合物含有该配体及其载体。
当引用于本文时，一致性百分数可以指沿着氨基酸或核苷酸序列的整个伸展长度的一致性百分数。具体地说，该氨基酸或核酸序列的一致性百分数是指参比氨基酸或核酸序列的一个或多个分离区域的序列的一致性百分数，例如，沿着一个或多个抗体CDR区域和/或沿着一个或多个抗体可变区框架区。例如，跨越多肽的一个或多个CDR的氨基酸水平的序列一致性与抗体重链或轻链单个可变区的相应CDR的氨基酸序列相比可具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％或更高的一致性。类似地，多肽的一个或多个框架区的氨基酸水平的序列一致性与抗体重链或轻链单个可变区的相应框架的氨基酸序列相比可具有至少80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％或更高的一致性。在核酸水平，编码多肽的一个或多个CDR的核酸序列与编码抗体重链或轻链单个可变区的相应CDR的核酸序列相比可具有至少70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％或更高的一致性。在核酸水平，编码多肽的一个或多个框架区的核酸序列与与编码抗体重链或轻链单个可变区的相应框架区的核酸序列相比可分别具有至少70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％或更高的一致性。框架区(FW)优选来自抗体框架区，例如人V3-23[DP47]JH4B重链或者人κ轻链DPK9/JK1。如果该框架区是发现于人的V3-23[DP47]/JH4B重链V区，则该一致性百分数靶向于其框架区和/或优选靶向于一个或多个CDR区，如图24所示。如果该框架框架是发现于人的DPK9/JK1轻链V区，则该一致性百分数可与其参比的框架区比较和/或优选与一个或多个CDR区比较，如图24所示。
所述的CDR优选是抗体可变区的那些，优选但不限于抗体单个可变区的那些。
在一些实施方案中，一致性百分数的结构特征是与功能方面匹配的。例如，在一些实施方案中，与参比核酸或氨基酸序列相比具有小于100％一致性的核酸序列或氨基酸序列还要求展示参比氨基酸序列或由参比核酸编码的氨基酸序列的至少一个功能方面。在其它实施方案中，分别与参比核酸或氨基酸序列相比具有小于100％一致性的核酸序列或氨基酸序列也要求展示参比氨基酸序列或由参比核酸编码的氨基酸序列的至少一个功能方面，但是该功能特征可以稍有改变，例如，相对于参比的而言，产生了对特定抗原增加的亲和力。
H：本发明第二框架的多特异性配体的应用
依照本发明第二框架方法的多特异性配体可应用于体内治疗和预防、体内外诊断、体外分析和反应试剂用途等等。例如，抗体分子可用于抗体分析技术，如ELISA技术，这些方法是本领域熟知的。
如上所间接提到的，本发明多特异性配体可用于诊断、预防和治疗。本发明多特异性抗体在诊断上的用途是采用标准免疫组化手段进行Western分析和原位蛋白检测；在这些应用中，配体根据本领域已知的技术而标记。此外，当与亲和层析支持物如树脂复合时，这种抗体多肽可备用于亲和层析程序。所有这些方法为本领域技术人员熟知。
本发明闭合构象的多特异性配体的诊断用途包括对分析物的均相分析，应用的是闭合构象的多特异性配体能竞争结合两个靶位的能力，从而两个靶不能同时结合(闭合构象)，或应用它们能同时结合两个靶的能力(开放构象)。
药物开发应用的诊断和研究分析系统的制造商已十分热切地寻求真正的均相免疫分析形式。主要诊断市场包括：医院、诊所和门诊、涉及商业的实验室、血库和家庭中，不用于人的诊断(例如：食品检测、水检测、环境检测、生物防护和兽医检测)，以及最终研究(包括：药物开发、基础研究和学术研究)。
目前，所有这些市场应用的免疫分析系统都围绕化学发光、ELISA、荧光或有时采用的放免技术而建立。每一种分析形式需要分离步骤(从非结合试剂中分离结合的试剂)。在某些情况下，需要几步分离的步骤。增加这些附加步骤增加了试剂和自动化操作、需要时间、影响最终分析结果。在人类诊断中，分离步骤是自动化的，这会掩饰问题，但不能解决问题。机器人技术、添加试剂、添加孵育时间等增加了相当大的成本和复杂性。在药物开发中如高通量筛选中，用非常低水平测试分子马上逐个测试数百万样本，添加附加分离步骤可使执行筛选的能力丧失。然而，不进行分离会在读数中产生太多的噪音。所以，需要一个真正的均相形式以提供目前分析形式可得到的范围之内的灵敏度。优选的是一种具有高灵敏性和较大动态范围的完全定量读数分析方法。灵敏度是一个非常重要的条件，这样降低所需样品量。这些特征都是均相系统提供的特征。这在健康检测中和在药物开发中样品很珍贵时非常重要。异相系统，作为当前通用的技术，需要大量样本和昂贵的试剂。
均相分析用途包括：癌症检测，最大分析是用来筛选前列腺癌患者中的前列腺特异性抗原。其他用途包括生育力检查，其给打算怀孕的妇女提供一系列检测，包括妊娠的β-hcg。感染性疾病的实验包括：肝炎、HIV、风疹和其他病毒以及微生物和性传播疾病。实验可用于血库检测，特别是检测HIV，A型、B型、C型和非A非B型肝炎。治疗性药物监测实验包括跟踪监测在患者体内显效的处方药水平以避免毒性，例如：心率失常所用地高辛、精神病患者的镇静安眠剂水平、哮喘所用的氨茶碱。诊断实验还可用于滥用药物检测，如可卡因、大麻及类似物的检测。代谢实验用于测定甲状腺功能、贫血和其他生理功能紊乱。
均相免疫分析形式还可用于标准临床化验。集免疫分析和化验于同一仪器上在诊断实验中十分占优势。适当的化学分析包括测定葡萄糖、胆固醇和钾等等。
均相免疫分析另一个主要用途是发现药物和药物开发：高通量筛选包括测定针对超高容量靶的组合化学文库。检测信号，然后将阳性群体分成更小组，最终在细胞和动物体中检测。均相免疫分析可用于所有这些类型的检测。在药物开发中，特别是动物研究和临床试验大量采用免疫分析。均相分析大大的促进和简化了这些操作。其他用途包括食物和饮料检测：测定肉和其他食物中的大肠杆菌、沙门氏菌等；水检测包括水培养物的所有污染物包括大肠杆菌的检测；以及兽医检测。
在一个主要实施方案中，本发明提供了一种结合分析法，其包括一种结合在发明闭合构象多特异性配体中的可检测的试剂，并且通过分析物与所述闭合构象多特异性配体的结合改变可检测特性。这种分析法可设定成多种不同方式，每一种均利用上述闭合构象多特异性配体的特性。
分析依赖于分析物直接或间接置换制剂，导致所述制剂的可检测特性发生改变。例如当所述制剂是能催化一个具有可检测终点的反应的一种酶时，所述酶能被配体结合从而阻断其活性位点，因此使酶失活。能被闭合构象多特异性配体结合的分析物可置换酶，通过释放活性位点而使酶具有活性。然后该酶与底物反应，产生一种可检测事件。在另选实施方案中，配体可以结合在酶活性位点之外，影响酶的构象从而改变其活性。例如，活性位点的结构可被结合的配体局限，或活性必需的辅因子的结合被阻止。
所述分析的物理实施条件可采用本领域已知的任一种形式。例如，闭合构象多特异性配体/酶复合物可以测试条形式提供；底物可在测试条不同区域提供，包含分析物的溶剂允许通过配体/酶复合物迁移，置换酶，并且将它带到底物区域产生信号。或者，配体/酶复合物可以测试棒或其他固相提供，浸在一种分析物/底物溶液中，将酶释放到溶液中以应答分析物的存在。
由于每个分析物分子潜在释放一个酶分子，所以所述分析是定量的，规定时间内产生的信号强度依赖溶液中分析物的浓度。
采用闭合构象的分析物有更多可能的构型。例如，闭合构象的多特异性配体可以设计成结合酶非变构部位的形式，从而激活酶。在这一实施方案中，无分析物存在时酶是有活性的。加入分析物可置换酶并且消除变构激活，因此使酶失活。
在上述实施方案的上下文利用酶活性衡量分析物的浓度，酶活化或失活是指酶活性的增加和减少，通过测量酶催化信号生成反应的能力测量。例如，酶可以催化不可测底物转化为它的可测形式。例如，辣根过氧化物酶以及发色剂和化学发光剂底物在本领域被广泛应用，所述酶和发色剂或化学发光剂底物可方便的买到。酶活性的增加和下降介于10％和100％之间，例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％；如果是活性增加，所述增加可大于100％，即：200％、300％、500％或更多，如果被抑制的酶基线活性测不出，百分比不能检测到。
在更多构型中，闭合构象多特异性配体可以结合酶/底物对中的底物而不是酶。因此底物难以接触到酶，直到通过结合分析物酶从闭合构象多特异性配体中释放出来。这种构型的实施涉及结合酶的构型。
此外，分析可以设定为结合一种荧光分子，如荧光素或另一种荧光团，当结合配体时荧光就淬灭。这种情况下，分析物与配体结合将置换荧光分子，因此产生一个信号。本发明所用的选择的荧光分子包括发光剂，例如荧光素/荧光素酶，以及发色剂其包括常用于免疫分析的制剂如HRP。
本发明制备的多特异性配体的治疗和预防用途涉及给哺乳动物受试者例如人应用配体。多特异性能允许抗体以高亲和力结合多价抗原。多特异性配体能使两个抗原交叉连接，例如在募集细胞毒性T细胞介导肿瘤细胞系的杀伤过程中。
至少90-95％同质性的基本上纯净的配体或其结合蛋白，例如dAb单体，优选给药于哺乳动物，98-99％或更高同质性最优选用于药用，特别是当哺乳动物是人时。一旦纯化，部分或完全达到所需同质性的配体可用于诊断或治疗(包括体外应用)或开发和应用分析方法、免疫荧光染色等(Lefkovite and Pernis，(1979 and 1981)Immunological Methods，Volumes I and II，Academic Press，NY)。
配体或其结合蛋白例如本发明中的dAb单体将通常用于预防、抑制或治疗炎症状态、过敏性超敏反应、癌症、细菌或病毒感染，以及自身免疫病(其包括，但优选不仅限于I型糖尿病、哮喘、多发性硬化、系统性红斑狼疮、Crohn′s病和重症肌无力)。
在本申请中，术语“预防”包括在诱导疾病前给予保护性组合物。“抑制”是指诱导事件后但在疾病临床表现前给予组合物。“治疗”包括疾病症状明显后给予保护性组合物。
可利用动物模型系统，用于筛选抗体或其结合蛋白在防止或治疗疾病中的有效性。在敏感小鼠中检测系统性红斑狼疮(SLE)的方法在本领域是已知的(Knight et al.(1978)J.Exp.Med.，147：1653；Reinersten et al.(1978)New Eng.J.Med.，299：515)。重症肌无力(MG)在SJL/J雌性小鼠中测得，其方式是通过用另一种系的可溶性AchR受体蛋白诱导该病(Lindstrom et al.(1988)Adv.Immunol.，42：233)。通过注射II型胶原给易感种系小鼠诱导关节炎(Stuart et al.(1984)Ann.Rev.Immunol.，42：233)。已经描述了通过注射分支杆菌热休克蛋白诱导易感大鼠发生佐剂型关节炎的模型(Van Eden et al.(1988)Nature，331：171)。小鼠甲状腺炎的诱导是通过给予所描述的甲状腺球蛋白(Maron et al.(1980)J.Exp.Med.，152：1115)。胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)自然发生或在某些种系小鼠中诱导，如Kanasawa et al.(1984)Diabetologia，27：113所描述的。EAE小鼠和大鼠作为人多发性硬化(MS)的模型。在这种模型中，神经脱髓鞘疾病是通过给予髓磷脂碱性蛋白诱导的(见Paterson(1986)Textbookof Immunopathology，Mischer et al.，eds.，Grune and Stratton，NewYork，pp.179-213；McFarlin et al.(1973)Science，179：478；以及Satoh et al.(1987)J.Immunol.，138：179)。
包含单个可变区的配体或其组合物，其特异性地结合vWF例如人vWF、vWF A1区、活化的vWF的A1区或vWF A3区，可以进一步包含血栓溶解剂。这种血栓溶解剂可通过本领域技术人员已知的共价或非共价方式非共价或共价连接到单个可变区，特别是连接到抗体单个可变区。非共价方式包括通过蛋白质相互作用例如生物素/抗生物素蛋白链菌素(biotin/strepavidin)或者通过免疫缀合物的方式。或者，血栓溶解剂可与由结合如上文所述的vWF或vWF区的单个可变区组成的或包括它们的配体或其组合物同时、分别或连续地给药。本发明的血栓溶解剂可包括，例如，链激酶(staphylokinase)、组织纤维蛋白溶酶原激活剂、链激酶(streptokinase)、单链链激酶、尿激酶和酰基纤溶酶原链激酶复合物。
本文还描述了包被单个可变区、或包含单个可变区的配体、或其组合物、或由本文所述筛选方法得到的单个可变区的侵袭性医疗装置。该装置的非限制性实例包括外科输液管、闭塞装置、假体装置。所述装置的应用包括外科手术操作，其需要在侵袭位置附近调节血小板介导的凝集(例如一种包被特异性结合vWF的单个可变区的装置)或者调节炎症(例如一种包被特异性结合TNFα的单个可变区的装置)。
通常，本发明的配体将以纯化形式加适当药物载体而应用。通常，这些载体包括水溶液或醇/水溶液、乳剂或悬浮剂、包含盐和/或缓冲介质的任何载体。注射用载体包括氯化钠溶液、Ringer′s葡萄糖、葡萄糖和氯化钠和乳酸盐Ringer′s液。如果必须保持多肽复合物呈悬浮态，适当的生理上能接受的佐剂可以选自增稠剂如：羧甲基纤维素、多聚乙烯吡咯酮烷、凝胶和藻酸盐。
静脉注射用载体包括液态营养补充物和电解质补充物，例如那些基于Ringer′s葡萄糖的物质。防腐剂和其他添加剂，例如抗菌剂和抗氧化剂、螯合剂和惰性气体也可存在(Mack(1982)Remington′sPharmaceutical Sciences，16th Edition)。
本发明的配体可用作独立给药的组合物或者与其他药物联合使用。这些药物包括各种免疫治疗药，例如环孢菌素、甲氨蝶呤、阿霉素或顺铂、以及免疫毒素。药物组合物可能包括各种细胞毒制剂的“混合物(cocktails)”或其他与本发明配体联合应用的药物，或者甚至具有不同特异性的配体结合物，例如用不同靶抗原或表位选择的配体，不管它们是否在使用前汇聚。
本发明药物组合物的给药途径可以是那些本领域任何的一般技术人员知道的。对于治疗，非限制地包括免疫治疗，用标准方法将本发明所选配体给予任一病人。用药可通过任何适当模式，其包括：非肠道的、静脉内的、肌肉内的、经皮的、经肺途径或也可适当地通过导管直接灌注。用药的剂量和频率将根据年龄、性别和病人条件、是否与其他药物同时给予、临床医生必须考虑的禁忌和其他参数来决定。
本发明的配体能冻干保存并且在使用前能在适宜载体中复溶(reconstitute)。这种技术已显示对于常规免疫球蛋白是有效的，并且可使用本领域已知的冻干和复溶技术。本领域技术人员知道冻干和复溶能导致不同程度的抗体活性的丢失(例如，对于常规免疫球蛋白，IgM抗体比IgG抗体倾向于具有更大的活性损失)，并且应用水平可以被调节以给予补偿。
包含本发明配体或其混合物的组合物能给药用于预防和/或治疗。在一些治疗应用中，达到至少部分抑制、阻止、调节、杀伤所选择细胞群的适当剂量，或达到某些其他可测参数的适当剂量被定义为“治疗有效剂量”。需要达到这个剂量的量将依赖于疾病的严重程度和病人本身免疫系统的一般状态，不过通常的剂量范围是每千克体重0.005至5.0mg配体，例如抗体、受体(例如T细胞受体)或其结合蛋白，0.05至2.0mg/kg/剂量较常用。预防用药时，包含本发明配体或其混合物的组合物给药时可以用相同的或略低的剂量。
与治疗前出现的症状或与未用该组合物治疗个体(人或动物模型)的症状相比，如果一种或一种以上的症状减轻(例如，至少减轻10％或至少减轻临床评价标准的一个分点)，那么用这里描述的组合物进行的治疗认为是“有效的”。根据所治疗的疾病或紊乱的不同，症状将明显不同，但可由普通技术熟练的临床医师或技师测得。例如，这些症状能通过跟踪检测疾病或紊乱的一种或多种生化指标的水平而测量(例如，与疾病相关的酶或代谢物的水平，受侵袭的细胞数目等)，通过监测身体表现(如，炎症、肿瘤大小等)，或通过公认的临床评价标准，例如，伸展无力状况等级(Expanded DisabilityStatus Scale，用于肌无力)、Irvine肠炎调查问卷(Irvine InflammatoryBowel Disease Questionnaire，32个分点评价涉及肠功能、全身症状、社会功能和情感状况的生活质量的得分，范围为32-224，高分表示生活质量较好)，类风湿性关节炎生活质量评分或本领域已知的其他公认的临床评分等级。疾病或紊乱的症状的持续减轻(例如，一天或一天以上或优选更长时间)至少10％或临床给定等级的一个或一个以上分点则表明是“有效”治疗。同样，与未经组合物治疗的相同个体(人或动物模型)的相应症状相比，如果一种或多种症状的发病或严重性被推迟、降低或消除，那么本发明所述的组合物用于预防的作用是“有效的”。
包含本发明配体或其混合物的组合物可用于预防和治疗环境，以帮助改变、灭活、杀伤或消除哺乳动物中选择的靶细胞群。另外，本文描述的多肽选择库可用于体外选择性地杀伤、耗尽或者有效消除异质细胞集合中的靶细胞群。哺乳动物血液能在体外结合配体，例如抗体、细胞表面受体或其结合蛋白，藉此血液中不想要的细胞被杀死或者从血液中移除，然后按照标准技术将血液回输给哺乳动物。
I：本发明半衰期增加的双特异性配体的应用
本发明方法制备的双特异性配体以及包含一个或多个本文定义的单个可变区可以用于体内治疗和预防应用、体内诊断应用等。
本发明制备的双特异性配体以及包含一个或多个本文定义的单个可变区的治疗和预防用途包括将本发明的配体给药于哺乳动物受者例如人。本发明的双特异性抗体以及包含一个或多个本文定义的单个可变区包含至少一种针对半衰期增强分子的特异性；一种或更多特异性可定向针对靶分子。例如，双特异性IgG可以特异性针对4个表位，其中之一是在半衰期增强分子上。双特异性以及三特异性以及高价态能允许包含至少一个单个可变区的配体以高亲和力结合多价抗原。双特异性抗体能使两个抗原交叉连接，例如在募集细胞毒性T细胞介导肿瘤细胞系的杀伤过程中所发生的。
本发明方法制备的基本上纯净的双特异性配体以及包含一个或多个本文定义的单个可变区或其结合蛋白例如至少90-95％同质性的单个可变区单体(即dAb单体)优选被给药于哺乳动物，98-99％或更多同质性最优选用于药用，特别是当所述哺乳动物是人时。一旦纯化，部分或达到所需同质性，所述配体可用于诊断或治疗(包括体外)或者用于开发应用分析方法、免疫荧光染色等(Lefkovite andPernis，(1979and 1981)Immunological Methods，Volumes I and II，Academic Press，NY)。
本发明方法的双特异性配体以及包含一个或多个本文定义的单个可变区通常发现用于预防、抑制或治疗炎症状态、过敏超敏反应、癌症、细菌或病毒感染以及自身免疫病(其包括，但优选不仅限于，I型糖尿病、多发性硬化、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、Crohn′s病和重症肌无力)。
在本申请中，术语“预防”包括在诱发疾病前给予保护性组合物。“抑制”是指诱发疾病后先于疾病临床表现出现时给予组合物。“治疗”包括疾病症状明显后给予保护性组合物。
可利用动物模型系统，用于筛选双特异性配体在防护或治疗疾病中的有效性。在敏感小鼠中检测系统性红斑狼疮(SLE)的方法是本领域已知的(Knight et al.(1978)J.Exp.Med.，147：1653；Reinersten et al.(1978)New Eng.J.Med.，299：515)。重症肌无力(MG)在SJL/J雌性小鼠中测得，其方式是通过用另一种系的可溶性AchR蛋白诱导该疾病(Lindstrom et al.(1988)Adv.Immunol.，42：233)。通过注射II型胶原给易感种系小鼠诱导关节炎(Stuart et al.(1984)Ann.Rev.Immunol.，42：233)。已经描述了通过注射分支杆菌热休克蛋白诱导易感大鼠发生佐剂型关节炎的模型(Van Eden et al.(1988)Nature，331：171)。小鼠甲状腺炎是通过给予所描述的甲状腺球蛋白诱导的(Maron et al.(1980)J.Exp.Med.，152：1115)。胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)是自然发生的，或在某些种系小鼠例如Kanasawa et al.(1984)Diabetologia，27：113所描述的小鼠中诱导。EAE小鼠和大鼠作为人MS的模型。在这种模型中，神经脱髓鞘病变是通过给予髓磷脂碱性蛋白诱导的(见Paterson(1986)Textbookof Immunopathology，Mischer et al.，eds.，Grune and Stratton，NewYork，pp.179-213；McFarlin et al.(1973)Science，179：478；以及Satoh et al.(1987)J.Immunol.，138：179)。
本发明双特异性配体和dAb单体能结合涉及内吞作用(如Clathrin)的胞外靶，能使双特异性配体被内吞，使另一种能结合细胞内靶的特异性被释放到细胞内环境。这一策略需要双特异性配体具有在细胞内保持功能的物理特征。或者，如果配体的最终目的细胞内区室定位是氧化性的，一种适当折叠的配体可能不要求是无二硫键的。
通常，本双特异性配体将以纯化形式加适当药物载体而应用。通常，这些载体包括水溶液或醇/水溶液、乳剂或悬浮剂、包含盐和/或缓冲介质的任意载体。注射用载体包括氯化钠溶液、Ringer′s葡萄糖、葡萄糖和氯化钠和乳酸盐Ringer′s液。如果必须保持多肽复合物呈悬浮态，适当的生理上能接受的佐剂可以选自增稠剂例如羧甲基纤维素、多聚乙烯吡咯酮烷、凝胶和藻酸盐。
静脉用载体包括液态营养补充物和电解质补充物，例如基于Ringer′s葡萄糖的那些。防腐剂和其他添加剂，例如抗菌剂和抗氧化剂、螯合剂和惰性气体也可存在(Mack(1982)Remington′sPharmaceutical Sciences，16th Edition)。
本发明的配体可用作独立给药的组合物或和其他药物联合使用。这些药放包括各种免疫治疗药例如环孢菌素、甲氨蝶呤、阿霉素或顺铂和免疫毒素。药物组合物可以包括各种细胞毒制剂的“混合物”或其他与本发明配体偶联的药物。
本发明药物组合物的给药途径可以是本领域普通技术人员公知的那些。对于治疗，非限制性的包括免疫治疗，用标准方法将本发明配体给予任一病人。用药能通过任何适当模式，包括非肠道的、静脉内的、肌内的、经皮的、经肺途径或也可适当地通过导管直接灌注。用药的剂量和频率将根据患者的年龄、性别和状况、其他药物的同时给予、临床医生必须考虑的禁忌和其他参数来决定。
本发明的配体能冻干保存并且在使用前能在适宜载体中复溶(reconstitute)。这种技术已显示对于常规免疫球蛋白是有效的，并且可使用本领域已知的冻干和复溶技术。本领域技术人员知道冻干和复溶能导致不同程度的抗体活性的丢失(例如，对于常规免疫球蛋白，IgM抗体比IgG抗体倾向于具有更大的活性损失)，并且应用水平可以被调节以给予补偿。
包含本发明配体或其混合物的组合物能给药用于预防和/或治疗。在一些治疗应用中，达到至少部分抑制、阻止、调节、杀伤所选择细胞群的适当剂量，或达到某些其他可测参数的适当剂量被定义为“治疗有效剂量”。需要达到这个剂量的量将依赖于疾病的严重程度和病人本身免疫系统的一般状态，不过通常的剂量范围是每千克体重0.005至5.0mg配体，0.05至2.0mg/kg/剂量较常用。预防用药时，包含本发明配体或其混合物的组合物给药时可以用相同的或略低的剂量。
包含本发明配体的组合物可用于预防和治疗环境，以帮助改变、灭活、杀伤或移除哺乳动物中选择的靶细胞群。
另外，本文描述的多肽选择库可用于体外选择性地杀伤、耗尽或者有效消除异质细胞集合中的靶细胞群。哺乳动物血液能在体外结合配体，例如抗体、细胞表面受体或其结合蛋白，藉此血液中不想要的细胞被杀死或者从血液中移除，然后按照标准技术将血液回输给哺乳动物。
包含单个可变区的配体以用于结合来自一系列物种的血清白蛋白的筛选和表征
配体可包含一个或多个单个可变区，例如，免疫球蛋白单个可变区和/或非-免疫球蛋白单个可变区，其中至少一个单个可变区特异性地结合来自人以及来自非人类物种的血清白蛋白。在一个实施方案中，该单个可变区仅特异性地结合人内源性的血清白蛋白。在另一实施方案中，该单个可变区特异性地结合来自非人类物种的血清白蛋白。或者，该单个可变区特异性地结合人内源性的血清白蛋白以及一种或多种非人类物种内源性的血清白蛋白。作为非限制性实例，此单个可变区可特异性地结合人和短尾猴内源性的血清白蛋白，或者结合人和大鼠内源性的血清白蛋白，或者结合人和小鼠内源性的血清白蛋白，或者结合人和猪鼠内源性的血清白蛋白。或者，该单个可变区特异性地结合两种或多种来自两种或多种非人类物种的血清白蛋白。如本文使用的，血清白蛋白可由物种内源性基因表达即天然血清白蛋白，和/或由其同等的重组体表达。在一个实施方案中，血清白蛋白包括天然和重组血清白蛋白的片段、类似物和衍生物。血清白蛋白的此类片段包括含有区域I、区域II和/或区域III的片段，或者血清白蛋白优选人血清白蛋白的各个区域I、II和III中的一个或二个或多个的组合。血清白蛋白的区域II优选作为本文定义的单个可变区的靶。其它优选组合是区域I和区域II；区域I和区域III；区域II和区域III；以及单独区域I；单独区域II；和单独区域III；以及区域I和区域II和区域III。在一个实施方案中，该血清白蛋白是重组血清白蛋白，其外源性地表达于非人类宿主例如动物宿主，或者单细胞宿主例如酵母菌或细菌。
内源性血清白蛋白的物种包括表达内源性血清白蛋白的任何物种，其包括，但优选不限于，人、小鼠、鼠类、大鼠、短尾猴、猪、狗、猫、马、山羊和仑鼠的物种。在某些情况下，排除骆驼或美洲驼的内源性血清白蛋白。
该单个可变区可以是免疫球蛋白单个可变区，其包括但优选不限于抗体重链单个可变区、抗体VHH重链单个可变区、人抗体重链单个可变区、人VH3重链单个可变区、抗体轻链单个可变区、人抗体轻链单个可变区、人抗体κ轻链单个可变区、和/或人λ轻链单个可变区。
特异性地结合血清白蛋白的单个可变区可以是包含免疫球蛋白支架结构或非-免疫球蛋白支架结构的单个可变区。结合血清白蛋白的单个可变区可包含来自抗体可变区优选来自单个可变区的CDR1、CDR2和CDR3中的一个或两个或三个，其中该CDR区域提供于非-免疫球蛋白支架结构上，例如CTLA-4、脂质运载蛋白、葡萄球菌性蛋白A(SPA)、GroEL和纤连蛋白、转铁蛋白(商业得自Biorexis)，一种AvimerTM和亲合体TM支架结构。或者，结合血清白蛋白的非-免疫球蛋白单个可变区可既不含有抗体CDR区域也不与抗体竞争结合区。或者，结合血清白蛋白的单个可变区可以是包含来自抗体可变区优选单个可变区的CDR1、CDR2和CDR3中的一个或两个或三个的单个可变区；这些CDR区域可提供于重链或轻链抗体框架区上。框架包括，例如，VH框架，例如VH3(包括DP47、DP38和DP45)和上述的VHH框架，以及VL框架，包括Vκ(例如DPK9)，和Vλ框架。在一些实施方案中，该可变区包括至少一个具有由人胚系抗体基因片段编码的氨基酸序列的人框架区，或者与由人胚系抗体基因片段编码的氨基酸序列相比包含多达5个氨基酸差异的氨基酸序列。在其它实施方案中，该可变区包含四个框架区FW1、FW2、FW2和FW4，其具有由人胚系抗体基因片段编码的氨基酸序列，或者FW1、FW2、FW3和FW4的氨基酸序列，此四个氨基酸序列与由人胚系抗体基因片段编码的氨基酸序列相比共同包含多达10个氨基酸差异。在一个实施方案中，全部三个CDR区域提供于本文描述的免疫球蛋白支架结构上(例如，重链或轻链抗体支架结构)或非-免疫球蛋白支架结构上，它们中的任一个可以是非人类的、合成的、半合成的。或者，CDR1、CDR2和/或CDR3区域中的一个、两个或全部三个的任意组合提供于免疫球蛋白支架结构上或非-免疫球蛋白支架结构上，例如，单独CDR3区域、或CDR2和CDR3区域一起、或CDR1和CDR2提供于免疫球蛋白支架结构上或非-免疫球蛋白支架结构上。对于此CDR移植的适宜的支架结构和技术对于熟练技术人员而言是清楚的并且是本领域公知的，例如参见美国专利申请07/180,370；WO 01/27160；EP 0 605 522；EP 0 460167；美国专利申请-07/054,297；Nicaise et al.，Protein Science(2004)，13：1882-1891；Ewert et al.，Methods，2004Oct；34(2)：184-199；Kettleborough et al.，Protein Eng.1991Oct；4(7)：773-783；O′Brienand Jones，Methods Mol.Biol.2003：207：81-100；以及Skerra，J.Mol.Recognit.2000：13：167-187；和Saerens et al.，J.Mol.Biol.2005 Sep23；352(3)：597-607，以及本文引用的更多的文献。
所述配体包含一个或多个特异性的结合血清白蛋白的此类单个可变区，优选包含至少一个单个可变区，该单个可变区特异性的结合人内源性的血清白蛋白和至少一个另外的非人类物种内源性的血清白蛋白。在一个实施方案中，此单个可变区特异性地结合血清白蛋白，该血清白蛋白是人内源性的，并且其Kd值是特异性结合(即与之杂交反应)至少一种非人类物种内源性的血清白蛋白的Kd值的10倍。或者，此单个可变区特异性地结合血清白蛋白，该血清白蛋白是人内源性的，并且其Kd值是特异性结合(即与之交叉反应)至少一种非人类物种内源性的血清白蛋白的Kd值的15、20、25、30、50或多达约100倍以内。在一些实施方案中，该Kd值的范围为300nM至约5pM。在其它实施方案中，该单个可变区特异性地结合血清白蛋白，Koff为至少5×10-1S-1、5×10-2S-1、5×10-3S-1、5×10-4S-1、5×10-5S-1、5×10-6S-1、5×10-7S-1、5×10-8S-1、5×10-9S-1、5×10-10S-1或更小，优选的Koff范围为1×10-6S-1至1×10-8S-1。
在一个实施方案中，此单个可变区特异性地结合血清白蛋白，该血清白蛋白是第一非人类物种内源性的，并且其Kd值是特异性结合(即与之交叉反应)至少一种第二非人类物种内源性的血清白蛋白的Kd值的10倍以内。或者，此单个可变区特异性地结合血清白蛋白，该血清白蛋白是第一非人类物种内源性的，并且其Kd值是特异性结合(即与之交叉反应)至少一种第二非人类物种内源性的血清白蛋白的Kd值的15、20、25、30、50或多达约100倍以内。在一些实施方案中，该Kd范围可为300nM至约5pM。在其它实施方案中，该单个可变区特异性地结合血清白蛋白，Koff为至少5×10-1S-1、5×10-2S-1、5×10-3S-1、5×10-4S-1、5×10-5S-1、5×10-6S-1、5×10-7S-1、5×10-8S-1、5×10-9S-1、5×10-10S-1或更小，优选的Koff范围为1×10-6S-1至1×10-8S-1。
例如，此配体可包括免疫球蛋白单个可变区，其中该免疫球蛋白单个可变区特异性地结合人血清白蛋白和小鼠血清白蛋白，并且其中该配体Tβ半衰期与小鼠宿主中的小鼠血清白蛋白的Tβ半衰期基本上相同。在此配体的一个变型中，所述表位结合区含有特异性地结合人血清白蛋白和小鼠血清白蛋白的非-免疫球蛋白支架结构，并且其中该配体Tβ半衰期与小鼠宿主中的小鼠血清白蛋白的Tβ半衰期基本上相同。短语“基本上相同”表示该配体在小鼠宿主中的Tβ半衰期是在小鼠宿主中的小鼠血清白蛋白Tβ半衰期的至少50％，其是在小鼠宿主中的小鼠血清白蛋白Tβ半衰期的至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、101％、102％、105％、110％、125％和多达150％。所述的非-免疫球蛋白支架结构可任选包括抗体单个可变区的片段，例如抗体可变区的一个或多个CDR区，包括的抗体单个可变区在人类宿主中的Tβ半衰期是人血清白蛋白在人类宿主中的Tβ半衰期的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、101％、102％、105％、110％、125％或多达150％。
例如，一个实施方案是单个可变区，其中该单个可变区特异性地结合人血清白蛋白和大鼠血清白蛋白，并且其中在大鼠宿主中该配体Tβ半衰期与大鼠血清白蛋白的Tβ半衰期基本上相同。在此配体的一个变型中，该单个可变结合区含有特异性地结合人血清白蛋白和大鼠血清白蛋白的非-免疫球蛋白支架结构，并且其中在大鼠宿主中该配体Tβ半衰期与大鼠血清白蛋白的Tβ半衰期基本上相同。短语“基本上相同”表示该配体在大鼠宿主中的Tβ半衰期是大鼠血清白蛋白在大鼠宿主中的至少50％，其多达大鼠血清白蛋白在大鼠宿主中的Tβ半衰期的55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、101％、102％、105％、110％、125％、多达150％。该非-免疫球蛋白支架结构可任选包括抗体单个可变区的片段，例如抗体可变区的一个或多个CDR区。
例如，配体可包括免疫球蛋白单个可变区，其中该免疫球蛋白单个可变区特异性地结合人血清白蛋白和猪血清白蛋白，并且其中该配体Tβ半衰期与猪血清白蛋白在猪宿主中的Tβ半衰期基本上相同。在此配体的一个变型中，该表位结合区含有特异性地结合人血清白蛋白和猪血清白蛋白的非-免疫球蛋白支架结构，并且其中该配体Tβ半衰期与猪血清白蛋白在猪宿主中的Tβ半衰期基本上相同。短语“基本上相同”表示该配体在猪宿主中的Tβ半衰期是猪血清白蛋白在猪宿主中的至少50％，其多达猪血清白蛋白在猪宿主中的Tβ半衰期的55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、101％、102％、105％、110％、125％、多达150％。该非-免疫球蛋白支架结构可任选包括抗体单个可变区的片段，例如抗体可变区的一个或多个CDR区，包括抗体单个可变区。
例如，配体可包括免疫球蛋白单个可变区，其中该免疫球蛋白单个可变区特异性地结合人血清白蛋白和短尾猴血清白蛋白，并且其中该配体Tβ半衰期与短尾猴血清白蛋白在短尾猴宿主中的Tβ半衰期基本上相同。在此配体的一个变型中，结合血清白蛋白的该区域含有特异性地结合人血清白蛋白和短尾猴血清白蛋白的非-免疫球蛋白支架结构，并且其中该配体Tβ半衰期与短尾猴血清白蛋白在短尾猴宿主中的Tβ半衰期基本上相同。短语“基本上相同”表示该配体在短尾猴宿主中的Tβ半衰期是短尾猴血清白蛋白在短尾猴宿主中的至少50％，其多达短尾猴血清白蛋白在短尾猴宿主中的Tβ半衰期的55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、101％、102％、105％、110％、125％、多达150％。该非-免疫球蛋白支架结构可任选包括抗体单个可变区的片段，例如抗体可变区的一个或多个CDR区。
在一个实施方案中，配体和/或双特异性配体含有特异性地结合人内源性血清白蛋白的单个可变区，其在人类宿主中的Tβ半衰期是人类宿主中人血清白蛋白的至少50％，是人类宿主中人血清白蛋白的多达55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、101％、102％、105％、110％、125％或多达150％。在优选实施方案中，特异性地结合非人内源性的血清白蛋白的该单个可变区，该单个可变区在各个非人类宿主中的Tβ半衰期是在其各个非人类宿主中非人血清白蛋白的至少50％，是在其各个非人类宿主中非人血清白蛋白的多达55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、101％、102％、105％、110％、125％或多达150％。在优选实施方案中，该单个可变区特异性地结合人内源性血清白蛋白，并且其还特异性地结合来自至少一种非人类物种的血清白蛋白，该单个可变区在人类宿主中的Tβ半衰期在人类宿主中人血清白蛋白的多达55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、101％、102％、105％、110％、125％或多达150％，并且在非人类宿主中的Tβ半衰期是在其各个非人类宿主中非人血清白蛋白的多达55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、101％、102％、105％、110％、125％或多达150％。在一些实施方案中，特异性地结合血清白蛋白的单个可变区的Tβ半衰期的范围可为小到2小时，多至并且包括3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、1天、2天、3天、4天、4天、6天、8天、10天、12天、14天、16天、18天，多达高至21天或更多。在人类宿主以及非人类宿主例如猪、短尾猴、大鼠、鼠类、小鼠宿主中，特异性地结合血清白蛋白的单个可变区的Tβ半衰期的范围可为小到2小时，多至并且包括3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、1天、2天、3天、4天、4天、6天、8天、10天、12天、14天、16天、18天，多达高至21天或更多。包含特异性地结合血清白蛋白的单个可变区的配体的其它优选的Tβ半衰期包括：在猴宿主中为约3至约5、6、7或8天，包括小到2小时，多至并且包括3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、1天、2天、3天、4天、4天、6天、8天、10天、12天、14天、16天、18天，多达高至21天。在大鼠或小鼠宿主中，特异性地结合血清白蛋白的单个可变区的Tβ半衰期的范围可为小到40小时到高至约75小时，并且包括小到2小时，多至并且包括3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、1天、2天、3天、4天、4天、6天、8天、10天、12天、14天、16天、18天，多达高至21天。
特异性地结合血清白蛋白的单个可变区包括Vκ单个可变区，其选自，但优选不限于DOM7h-9 DOM7h-1、DOM7h-8、DOM7h-9、DOM7h-11、DOM7h-12、DOM7h-13和DOM7h-14。DOM7r-3和DOM7r-16，和/或与单个可变区竞争结合血清白蛋白(优选人血清白蛋白)的那些区域，所述单个可变区选自但优选不限于dAb7r20，dAb7r21，dAb7r22，dAb7r23，dAb7r24，dAb7r25，dAb7r26，dAb7r27，dAb7r28，dAb7r29，dAb7r30，dAb7r31，dAb7r32，dAb7r33，dAb7h21，dAb7h22，dAb7h23，Ab7h24，Ab7h25，Ab7h26，dAb7h27，dAb7h30dAb7h31，dAb7m12，dAb7m16，dAb7m26，dAb7r1，dAb7r3，dAb7r4，dAb7r5，dAb7r7，dAb7r8，dAb7r13，dAb7r14，dAb7r15，dAb7r16，dAb7r17，dAb7r18，dAb7r19，dAb7h1，dAb7h2，dAb7h6，dAb7h7，dAb7h8，dAb7h9，dAb7h10，dAb7h11，dAb7h12，dAb7h13，dAb7h14，dAb7p1和dAb7p2。特异性地结合血清白蛋白的单个可变区可以是抗体重链单个可变区，特别是人VH3或VHH。前述单个可变区还另外特异性地结合人血清白蛋白，该结合的Koff至少为5×10-1S-1、5×10-2S-1、5×10-3S-1、5×10-4S-1、5×10-5S-1、5×10-6S-1、5×10-7S-1、5×10-8S-1、5×10-9S-1、5×10-10S-1或更小，优选地Koff范围为1×10-6S-1至1×10-8S-1。特异性结合人血清白蛋白和非人类物种内源性的血清白蛋白的单个可变区可进一步结合第三、四、五、六、七、八、九或十种非人类物种内源性的血清白蛋白。在一个非限制性的实施方案中，特异性地结合人血清白蛋白和大鼠血清白蛋白的单个可变区进一步特异性地结合短尾猴血清白蛋白。在另一个非限制性的实施方案中，特异性地结合人血清白蛋白和小鼠血清白蛋白的单个可变区进一步特异性地结合短尾猴血清白蛋白。
如本文描述的，含有一个特异性地结合血清白蛋白的单个可变区(单体)或者一个以上特异性地结合血清白蛋白的单个可变区(多聚体，融合蛋白，缀合物和双特异性配体，如本文定义的)的配体，其可进一步包含一个或多个选自但优选不限于以下的实体：标记、标签、另外的单个可变区、dAb、抗体和抗体片段、标记物和药物。这些实体的一个或多个可位于包含单个可变区(免疫球蛋白或非-免疫球蛋白单个可变区)的配体的COOH末端或N末端，或者位于N末端和COOH末端二者处。这些实体的一个或多个可位于特异性结合配体的血清白蛋白的单个可变区的COOH末端、或N末端、或N末端和COOH末端二者处，所述配体含有含有一个单个可变区(单体)或一个以上单个可变区(多聚体、融合蛋白、缀合物和双特异性配体，如本文定义的)。可以位于这些末端之一或二者处的标签的非限制性实例包括HA、his或myc标签。所述实体，包括一个或多个标签、标记和药物，其含有一个单个可变区(单体)或多于一个单个可变区(多聚体、融合蛋白、缀合物和双特异性配体，如本文定义的)，其直接结合血清白蛋白，或者通过下文分离切片中描述的连接子结合血清白蛋白。
其含有一个单个可变区(单体)或多于一个单个可变区(多聚体、融合蛋白、缀合物和双特异性配体，如本文定义的)的配体，其特异性地结合血清白蛋白，或者其特异性地结合人血清白蛋白和至少一种非-人血清白蛋白，该配体可特异性地结合下文进一步描述的人血清白蛋白的区域I和/或区域II和/或区域III的一个或多个。除了含有一个或多个单个可变区(例如，结合免疫球蛋白单个可变区的血清白蛋白，或者结合非-免疫球蛋白单个可变区的血清白蛋白)，该单个可变区特异性地结合血清白蛋白例如人血清白蛋白，或者该单个可变区特异性地结合人血清白蛋白和至少一个非-人血清白蛋白，该配体可含有能够特异性结合抗原和/或表位而非血清白蛋白的一个或多个另外的区域，所述抗原或表位选自任何动物蛋白，其包括衍生自微生物、病原体、单细胞生物、昆虫、病毒、藻类和植物的细胞因子和/或抗原。这些结合不同于血清白蛋白的部分的一个或多个另外的区域可以是非-免疫球蛋白结合区、非-免疫球蛋白单个可变区和/或免疫球蛋白单个可变区。
在一些实施方案中，双特异性配体含有一个或多个单个可变区(免疫球蛋白单个可变区或非-免疫球蛋白单个可变区)，其特异性地结合血清白蛋白例如人血清白蛋白，或者其特异性地结合人血清白蛋白和至少一个非-人血清白蛋白，该双特异性配体可由(a)特异性地结合血清白蛋白的单个可变区以及特异性地结合不同于血清白蛋白的配体的单个可变区组成，此二种单个可变区均为重链单个可变区组成；或者由(b)特异性地结合血清白蛋白的单个可变区以及特异性地结合不同于血清白蛋白的配体的单个可变区，此二种单个可变区均为轻链单个可变区组成；或者由(c)特异性地结合血清白蛋白的单个可变区其为重链单个可变区以及特异性地结合不同于血清白蛋白的抗原的单个可变区其为轻链单个可变区组成；或者由(d)特异性地结合血清白蛋白的单个可变区其为轻链单个可变区以及特异性地结合不同于血清白蛋白的抗原的单个可变区其为重链单个可变区组成。
本文还包括的是编码本文所述任何配体的分离的核酸，例如该配体含有一个单个可变区(单体)或多于一个单个可变区(例如，多聚体、融合蛋白、缀合物和双特异性配体，如本文定义的)，其特异性地结合血清白蛋白，或者其特异性地结合人血清白蛋白和至少一个非-人血清白蛋白，或其功能活性片段。本文还包括的是载体和/或其表达载体；包含该载体的宿主细胞植物或动物细胞和/或用载体转化的细胞系；表达和/或产生一种或多种配体的方法，所述配体含有一个单个可变区(单体)或多于一个单个可变区(例如，多聚体、融合蛋白、缀合物和双特异性配体，如本文定义的)，其特异性地结合血清白蛋白，或者其由所述载体编码的片段，该方法在某些实例中包括培养所述宿主细胞以便表达一种或多种配体或其片段，以及任选的回收该配体，该配体含有一个单个可变区(单体)或多于一个单个可变区(例如，多聚体、融合蛋白、缀合物和双特异性配体，如本文定义的)，其特异性地从宿主细胞培养基中结合血清白蛋白。还包括的是使本文所述配体与血清白蛋白(其血清白蛋白和/或非-人血清白蛋白)、和/或一种或多种不同于血清白蛋白接触的方法，其中该靶包括生物活性分子，并且包括动物蛋白、上文所列的细胞因子；还包括这样的方法，其中该接触是在体外，并且向个体宿主动物或体内和/或离体细胞给予本文所述的任何配体。优选地，给予本文所述的配体，该配体包含针对血清白蛋白和/或非-人血清白蛋白的单个可变区(免疫球蛋白或非-免疫球蛋白)，以及一种或多种针对一种或多种不同于血清白蛋白的靶的区域，给予该配体将会增加半衰期，包括抗-靶配体的Tβ半衰期。本文描述了编码单个区域的核酸分子，其包含配体或其片段，包括其功能片段。本文描述了编码核酸分子的载体，其包括但优选不限于表达载体，它们是来自含有一种或多种此类表达载体的细胞系或有机物的宿主细胞。还公开了制备任何含有配体的单个区域的方法，所述配体包括但优选不限于前述核酸、载体和宿主细胞中的任一项。
血清白蛋白的表位绘图
来自哺乳动物物种的血清白蛋白具有相似结构，它们含有三个优势区域并具有类似的折叠和二硫键合图，如图25中的亮点。该蛋白据认为来自两个串联的复制事件，以及随后残基的多样化。
人血清白蛋白的结构已通过X-射线结晶法来解析，用/未用多种键合配体。
·人血清白蛋白的原子结构和化学。He XM，Carter DC.
·Nature.1992；358：209-15.勘误于：Nature 1993；364：362.
·人血清白蛋白的原子结构和化学。He XM，Carter DC；J MolBiol.2001；314：955-60.
·与单不饱和和多不饱和脂肪酸络合的人血清白蛋白的晶体结构。Petitpas I，Grune T，Bhattacharya AA，Curry S.；J Biol Chem.2001；276：22804-9.
已显示人血清白蛋白是一种心脏形状的分子。称为I、II和III的单个区域大多数是螺旋状的，并且各自是由称为IA、IB、IIA、2B、IIIA和IIIB的两个亚区域组成。它们通过易曲的、随机螺旋连接。
本文描述了一种配体，其一个或多个单个可变区，该单个可变区特异性地结合人血清白蛋白的区域II。该单个可变区可以是VH抗体单个可变区。该单个可变区可以是VHH抗体单个可变区。该VH单个可变区可以是VH3单个可变区该VH3单个可变区可以是人VH3单个可变区。该配体可选地或者另外地包括单个可变区，该单个可变区是包括下列之一的Vκ抗体单个可变区：DOM7h-1、DOM7h-8、DOM7h-9、DOM7h-11、DOM7h-12、DOM7h-13、DOM7h-14、DOM7r-3和DOM7r-16，或者是具有与有约80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％更高一致性的氨基酸序列的区域的Vκ抗体单个可变区。
该抗体单个可变区可包括一组四个Kabat框架区(FR)，它们是由抗体VH优选VH3框架胚系抗体基因片段编码的。该VH3框架选自DP47、DP38和DP45。该抗体单个可变区可包括一组四个Kabat框架区(FRs)，它们是由抗体VL框架优选Vκ框架胚系抗体基因片段编码的。优选地，该κ框架是DPK9。
含有特异性地结合人血清白蛋白的区域II的一个或多个单个可变区的配体，可以进一步包括一个或多个能够特异性结合不同于血清白蛋白的部分的区域，并且可进一步包含一个或多个实体，该实体包括标记、标签和药物中的一个或多个。该一个或多个能够特异性结合不同于血清白蛋白的部分的区域可是以免疫球蛋白单个可变区。本文还描述了一种配体，其含有一个或多个特异性地结合人血清白蛋白的区域II的单个可变区，该区域包括非-免疫球蛋白支架结构和CDR1、CDR2和/或CDR3区域，或者其中CDR1、CDR2和/或CDR3区域中的至少一个是来自结合人血清白蛋白的区域II的抗体单个可变区的单个可变区。非-免疫球蛋白支架结构包括，但优选不限于，CTLA-4、脂质运载蛋白、葡萄球菌性蛋白A(SPA)、亲合体TM、AvimersTM、GroEL和纤连蛋白。
含有一个或多个特异性地结合人血清白蛋白的区域II的单个可变区的配体包括那些区域，它们特异性地结合人人血清白蛋白，Kd小于或等于300nM。含有一个或多个特异性地结合人血清白蛋白的区域II的单个可变区的配体可进一步包含一个或多个实体，该实体包括标记、标签和药物中的一个或多个。所述的标签可包括C-末端HA或myc标签或N末端HA或myc标签中的一个或多个。
所述配体可含有一个或多个特异性地结合人血清白蛋白的区域II的单个可变区，并且可进一步包括一个或多个能够特异性结合不同于血清白蛋白的部分的区域，而且其可任选进一步包含一个或多个包括标记、标签和药物中的一个或多个实体，所述配体可通过它的单个可变区中的至少一个结合抗原，该抗原包括但优选不限于细胞因子受体，EPO受体，ApoE，Apo-SAA，BDNF，心脏营养蛋白-1，EGF，EGF受体，ENA-78，嗜酸细胞活化趋化因子，嗜酸细胞活化趋化因子-2，Exodus-2，EpoR，酸性FGF，碱性FGF，成纤维细胞生长因子-10，FLT3配体，Fractalkine(CX3C)，GDNF，G-CSF，GM-CSF，GF-β1，胰岛素，IFN-γ，IGF-I，IGF-II，IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，1L-8(72a.a.)，IL-8(77a.a)，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18(IGIF)，抑制素α，抑制素β，IP-10角质形成细胞生长因子-2(KGF-2)，KGF，来普汀，L1F，淋巴细胞趋化因子，穆勒抑制物，单核细胞克隆抑制因子，单核细胞趋化蛋白，M-CSF，MDC(67a.a.)，MDC(69a.a.)，MCP-1(MCAF)，MCP-2，MCP-3，MCP-4，MDC(67a.a.)，MDC(69a.a)，MIG，MLP-1α，MIP-3α，MIP-3β，MIP-4，髓样祖细胞抑制因子-1(MPIF-1)，NAP-2，Neurturin，神经生长因子，β-NGF，NT-3，NT-4，制瘤素M，PDGF-AA，PDGF-AB，PDGF-BB，PF-4，RANTES，SDF1α，SDF1β，SCF，SCGF，干细胞因子(SCF)，TARC，TGF-α，TGF-β，TGF-β2，TGF-β3，肿瘤坏死因子(TNF)，TNF-α，TNF-β，TNF受体1，TNF受体II，TNIL-1，TPO，VEGF，VEGF受体1，VEGF受体2，VEGF受体3，GCP-2，GRO/MGSA，GRO-β，GRO-γ，HCC1，1-309，HER 1，HER 2，HER3和HER4，CD4，人趋化因子受体CXCR4或CCR5，来自丙肝病毒的3型非结构蛋白(NS3)，TNF-α，IgE，IFN-γ，MMP-12，CEA，幽门螺旋杆菌，TB，流感病毒，戊型肝炎，MMP-12，在某些细胞中过表达的陷入受体例如表皮生长因子受体(EGFR)，肿瘤细胞中的ErBb2受体其为一种陷入细胞的受体，LDL受体，FGF2受体，ErbB2受体，转铁蛋白受体，PDGF受体，VEGF受体，PsmAr，一种细胞外基质蛋白，弹性蛋白，纤连蛋白，层粘连蛋白，α1-抗胰蛋白酶，组织因子蛋白酶抑制剂，PDK1，GSK1，Bad，半胱天冬酶-9，Forkhead，一种幽门螺旋杆菌的抗原，结核分支杆菌的抗原，和流感病毒的抗原。
所述配体可含有一个或多个特异性地结合人血清白蛋白的区域II的单个可变区，并且可进一步包括一个或多个能够特异性结合不同于血清白蛋白的部分的区域，所述配体是最低限度的双特异性配体，其可具有下列结构之一：(a)所述特异性地结合血清白蛋白的区域II的单个可变区和所述特异性结合不同于血清白蛋白的部分的区域的单个可变区中的每一个是抗体重链单个可变区；或者(b)所述特异性地结合血清白蛋白的区域II的单个可变区和所述特异性结合不同于血清白蛋白的部分的区域的单个可变区中的每一个是抗体轻链单个可变区；或者(c)所述特异性地结合血清白蛋白的区域II的单个可变区是抗体重链单个可变区，并且所述特异性地结合不同于血清白蛋白的抗原的单个可变区是抗体轻链单个可变区；或者(d)所述特异性地结合血清白蛋白的区域II的单个可变区是抗体轻链单个可变区，并且所述特异性地结合不同于血清白蛋白的抗原的单个可变区是抗体重链单个可变区。包括了编码任何配体或其片段包括本文描述的其功能性片段的核酸分子，载体其包括但优选不限于表达载体，含有一种或多种此类表达载体的任何类型的细胞系或有机物的宿主细胞，和/或制备任何配体(其包括但优选不限于任何前述的核酸、载体和宿主细胞)的方法。
与其它血清蛋白相比，血清白蛋白具有长的血清半衰期，并且血清浓度与分级分解率之间具有正相关性(即SA浓度越高，则降解量越高)，这是与IgG共有的性质。最近形成了IgG和血清白蛋白均具有由新生Fc受体FcRn介导的再循环机制。FcRn是I型MHC家族成员，由膜锚定的FCRGT链的异质二聚体以及非膜结合的β-2微球蛋白组成。FcRn或β-2微球蛋白的小鼠敲除突变体表达无功能的FcRn，并且显示出增加的血清白蛋白的生物合成速率(～20％增加)，以及增加的血清白蛋白的分解代谢，导致血清白蛋白的血清水平低40％以及更短的半衰期(Chaudhry et al 2005)。在人类中，β-2微球蛋白中的突变显示，得到更加降低的功能性FcRn水平，并且最终导致IgG缺乏和血白蛋白减少，特征是降低的HSA的半衰期(Wani et al 2006，PNAS)。
尽管不希望受理论的束缚，拟提出的FcRn-介导的补救的机制如下：
1.血浆蛋白可能通过全部血管内皮衬里的细胞以及可能的血管外腔胞饮活化细胞而被胞饮。这是非特异性的步骤，并且在循环中的所有蛋白将被吸收。在血清pH约pH 7.4下，FcRn针对白蛋白(和IgG类)具有非常低的亲和力。
2.一旦被胞饮，形成的囊泡酸化到pH 5.0。在酸性条件下，FcRn针对白蛋白具有更高的亲和力，并且结合白蛋白以及IgG。由此白蛋白和IgG结合FcRn受体。FcRn在区域III中的位置通过与结合IgG不同的位置结合人血清白蛋白。
3.发生分类事件，通过该事件，大多数非受体结合蛋白被分类到核内体中，在此处大多数蛋白将定向降解。受体结合白蛋白以及IgG被分类到靶向细胞表面的囊泡中，并由此避免了降解。
4.然后靶向细胞表面的囊泡与细胞表面融合，或短暂地与细胞膜融合。在这些条件下，核内体的pH增加到接近pH 7.4，针对白蛋白的FcRn亲和力减小，并且白蛋白释放回到循环中。
因此我们针对具有最大半衰期的任何SA结合蛋白可以定义出一组清晰的需要的参数。这些参数可以使用血清白蛋白补充受体FcRn作为模型来清楚地说明，虽然还要使用介导延长的半衰期的其它受体。
·血清白蛋白结合的亲和力优选地使得SA结合蛋白在经过肾中肾小球滤过时不与白蛋白分离，由此使在尿中的损失降到最小，和/或
·与SA的结合优选不会对血清白蛋白与任何负责维持循环中血清白蛋白水平的受体的结合具有决定性的作用，这将会抑制循环，并且因此降低血清白蛋白和SA结合子的半衰期。因此结合dAb的SA优选结合来自由在HSA区域III中的FcRn结合的不同表位，并且该SA/dAb络合物优选还能够连接FcRn，和/或
·与SA的结合将优选维持在这样的条件下，即受体和结合的SA/SA结合子复合物被分类和再循环。核内体的pH显示接近pH 5.0，因此期望dAb与血清白蛋白在pH7.4和pH 5.0下均稳定的结合。
如下文实施例15所述，大多数dAb结合到HSA的第2区域，因此不能希望人血清白蛋白与FcRn完全结合。两个dAb(DOM7h-27和DOM7h-30)结合到区域III。
在7.4至5.0的pH范围内保持对SA足够的亲和力抗-SA DAb。
除了对SA的亲和力以及不存在与SA:FcRn复合物形成的竞争，在血清pH 7.4至核内体pH 5.0的pH范围内，血清-白蛋白-特异性dAb将优选保持对SA的亲和力，以获得FcRn-介导的补充通路的完全的益处。
在此pH范围内，仅组氨酸残基和具有扰乱的pKa的氨基酸侧链有可能改变它们的质子化状态。如果氨基酸侧链对该复合物的结合能产生显著的贡献，则人们能够期待pH在该范围内从一个极端变化到另一个极端会导致降低该复合物的结合亲和力。虽然不期望受理论的束缚，这将会导致增加这种可能性，即SA-特异性dAb进入降解途径，而不是通过FcRn-介导的补充通路来挽救。
因此，对于SA结合的AlbudAbTM(一种dAb，其特异性地结合血清白蛋白)，希望选择一种对血清白蛋白不随pH而显著改变(在5.0至7.4的范围内)的结合特性。确保的直接方法是针对CDR中的组氨酸残基的缺乏来分析抗-SA dAb的氨基酸序列。如下文所示，可以考虑针对此一特性的若干筛选操作：
例如，第一轮筛选是以
Figure G2008800104821D01051
dAb噬菌体库进行的，使用固定的人血清白蛋白，条件是缓冲液的pH为pH 7.4(例如PBS)。然后将回收和扩增的噬菌体群提供给第二轮筛选，在第二轮筛选中缓冲液为pH 5.0。缓冲液和pH的更换任选在其它筛选轮中重复，以便在两种pH下保持dAb结合HSA的筛选压力。
在第二实例中，所有筛选轮是以
Figure G2008800104821D01052
dAb噬菌体库进行的，使用固定的人血清白蛋白，条件是缓冲液的pH为pH 7.4(例如PBS)。但是在用PBS(或补充了吐温的PBS)洗去未结合的噬菌体之后且在洗脱结合的噬菌体之前，在pH 5.0下增加另外的洗脱/培养步骤达一延长的时间(例如长达4小时)。在此期间，噬菌体展示在pH 5.0下不能结合SA(但在pH 7.4下能结合)的dAb与固定的SA分离。在第二系列的洗脱步骤(在pH 5.0下，有(没有)吐温)之后，回收并分析结合的噬菌体。
在第三实例中，所有筛选轮是以
Figure G2008800104821D01061
dAb噬菌体库进行的，使用固定的人血清白蛋白，条件是缓冲液的pH为pH 7.4(例如PBS)。然后通过筛选确定最佳dAb候选者(即，能够在pH 7.4和pH5.0下结合的)。通常，编码dAb的基因是从混合筛选的亚克隆到表达载体中的噬菌体中回收的，该噬菌体针对大肠杆菌培养物上清液中的可溶性dAb。挑选单个的克隆，分别在微滴定板中生长，并诱导表达。然后将上清液(可纯化的dAb)直接加载到Biacore芯片中，以确定这些dAb对固定的血清白蛋白展示亲和力。针对与HSA的结合(主要为传感图的截止率迹线(off-rate trace))筛选每一上清液，条件是该‘运行(running)’缓冲液为pH 7.4或pH 5.0。应当指出，结合在Biacore上的dAb的筛选亦将用作优选的方法，以鉴别来自以上二项试验的最佳前导物。
本文描述了一种包含本文定义的单个可变区的配体，其中该单个可变区在天然血清pH下和在细胞内囊泡pH下均特异性地结合血清白蛋白。天然血清pH为约7(例如，7.4)，并且其中所述的细胞内囊泡pH范围为约4.8至5.2，或者可以为约5的pH。在一个实施方案中，the单个可变区可约7至5的pH范围特异性地结合血清白蛋白，或者可以在pH 7.4下结合。尽管不希望受理论的束缚，此配体的其它特征中于，它的特异性地结合血清白蛋白的单个可变区在肾中经过肾小球滤过时基本上不与血清白蛋白分离。尽管不希望受理论的束缚，此配体的其它特征中于，它的特异性地结合血清白蛋白的单个可变区基本上不干扰FcRn与血清白蛋白的结合。此单个可变区可以是抗体单个可变区；该抗体单个可变区可以是VH3区域和/或该抗体单个可变区可以是Vκ区域。此单个可变区可包含非-免疫球蛋白支架结构，例如，CTLA-4、脂质运载蛋白、SpA、亲合体TM、GroEL、AvimerTM或纤连蛋白支架结构，并且可包含来自抗体单个可变区的CDR1、CDR2和/或CDR3中的一种或多种，该抗体单个可变区(尽管不是必需的)特异性地结合血清白蛋白。此配体的单个可变区可特异性地结合人血清白蛋白，和/或包括来自一种或多种物种的血清白蛋白，该物种例如人、大鼠、猴、猪(procine)、兔、仑鼠、小鼠或山羊。细胞内腔室可以是任何动物的任何细胞的任何细胞内腔室，包括核内体内腔室或细胞内囊泡或新生囊泡。该核内体内腔室可具有约5或5.0的pH。本文描述的配体可含有一个或多个包括免疫球蛋白和/或非-免疫球蛋白区的单个可变区，其中血清白蛋白与该单个可变区的结合基本上不竞争性地抑制FcRn与血清白蛋白的结合。这些一个或多个单个可变区可优选特异性地结合血清白蛋白，结合的平衡解离速率常数(Kd)小于或等于300nM。
本文描述了一种用于筛选包含单个可变区的配体的方法，该配体含有一个单个可变区(单体)或者一个以上的单个可变区(例如，多聚体、融合蛋白、缀合物和双特异性配体，如本文定义的)，其特异性地结合血清白蛋白，其中该单个可变区在中性血清pH下特异性地结合人血清白蛋白，并且其中该单个可变区不竞争性抑制人血清白蛋白与FcRn的结合，并且其中该单个可变区在细胞内腔室的pH下特异性地结合人血清白蛋白，该方法包括以下步骤：(A)筛选包含单个可变区的配体，该单个可变区不会结合人血清白蛋白的结合FcRn的区域，(B)根据步骤(A)筛选的配体，筛选包含单个可变区的配体，该单个可变区在所述中性血清pH下结合血清白蛋白，(C)针对在所述细胞内腔室的pH下结合血清白蛋白那些筛选步骤(B)所选的配体。或者步骤(A)和(B)可以如下颠倒：(A)筛选包含单个可变区的配体，该单个可变区在所述中性血清pH下结合人血清白蛋白，(B)根据步骤(A)筛选的配体，筛选包含单个可变区的配体，该单个可变区在HSA结合FcRn的区域外部结合人血清白蛋白，和(C)针对在所述细胞内腔室的所述pH下结合血清白蛋白那些筛选步骤(B)所选的配体。还描述了一种筛选包含单个可变区的配体的方法，其中该单个可变区在中性血清pH下特异性地结合人血清白蛋白，其中该单个可变区不竞争性抑制人血清白蛋白与FcRn的结合，并且其中该单个可变区在细胞内腔室的pH下特异性地结合人血清白蛋白，该方法包括以下步骤：(A)筛选包含单个可变区的配体，该单个可变区不会结合人血清白蛋白的结合FcRn的区域，(B)根据步骤(A)筛选包含在所述中性血清pH下结合血清白蛋白的单个可变区的配体，(C)遗传修饰步骤(B)的单个可变区，使其在所述细胞内腔室的所述pH下结合血清白蛋白。或者步骤(A)和(B)可以如下颠倒：(A)筛选包含在所述中性血清pH下结合血清白蛋白的单个可变区的配体，(B)根据步骤(A)筛选的配体，筛选包含单个可变区的配体，该单个可变区不结合人血清白蛋白的结合FcRn的区域，和(C)遗传修饰步骤(B)的单个可变区，使其在所述细胞内腔室的所述pH下结合血清白蛋白。
确定单个可变区是否不竞争性抑制人血清白蛋白与FcRn的结合的分析法：竞争Biacore试验可用于确定单个可变区是否不竞争性抑制人血清白蛋白与FcRn的结合。此实施例的一个试验方案如下。在25℃下以约1100共振单元(RUs)的pH 7.4的纯化的FcRn包被CM5传感器芯片(Biacore AB)之后，将人血清白蛋白(HSA)以单一浓度(例如，1um)单独注射到抗原表面，以及与系列稀释的混合物组合注射到抗原表面，每一混合物具有HSA和增加量的讨论的单个可变区。对单独HSA和每一HSA/单个可变区混合物测定所得的结合RU。通过比较单独HSA的结合RU与HSA+单个可变区的结合RU，人们将会看到该FcRn是否与该单个可变区竞争结合HSA。如果有竞争，则随着溶液中单个可变区浓度增加，HSA结合FcRn的RU将降低。如果无竞争，则加入单个可变区将不会对HSA结合FcRn产生多大影响。此竞争分析可任选在pH 5.0下对在pH 5.0下结合HSA的单个可变区进行重复，以便确定该单个可变区是否在pH 5.0下竞争抑制人血清白蛋白与FcRn的结合。
这些具有单个可变区的配体，其含有一个单个可变区(单体)或多于一个单个可变区(例如，多聚体、融合蛋白、缀合物和双特异性配体，如本文定义的)，其特异性地结合血清白蛋白，其中该单个可变区在中性血清pH下和在细胞内囊泡pH下均特异性地结合血清白蛋白，所述配体可进一步至少一个另外的单个可变区，其中每一个另外的单个可变区在中性血清pH下特异性地结合不同于血清白蛋白的抗原，但在细胞内囊泡pH下不结合抗原。中性血清pH为约7.4，而所述细胞内囊泡的pH范围为约4.8至5.2，在一些实施方案中，所述细胞内囊泡的pH为约5。
基于以上思路的方法包括双特异性结合子的用途，该双特异性结合子具有针对半衰期针对的血清白蛋白的亲和力以及针对如上文所述的期望靶抗原的亲和力，针对降解或循环的结合抗原。如上文所述，选择血清白蛋白结合部分，使得在pH 5.0下以高亲和力结合，从而该分子分类为在核内体内通过FcRn介导的过程非降解。然后使用类似于如上文所述的技术选择需要的靶抗原结合部分，不同之处在于，如上文所述在pH 7.4和pH 5下筛选高亲和力结合，优选在pH 7.4下筛选高亲和力结合，而在pH 5下对靶抗原为低亲和力或零亲和力。实现它的一种方式是通过筛选在接触表面有组氨酸的部分。然后通过常规分子生物学技术、或者通过化学衍生和交联、或者通过基因融合制备在2个分子之间的融合蛋白。通过设计在pH 5下结合SA的结合dAb的SA，同时具有结合配体的配偶体dAb，其在pH 5下具有低亲和力或零亲和力，结果增加了体内给定AlbudAbTM(一种dAb，其特异性地结合血清白蛋白)的效能。尽管不希望受理论的束缚，在核内体再循环时，该靶分子将会被释放，并靶向降解性的核内体并降解，同时该AlbudAbTM(一种dAb，其特异性地结合血清白蛋白)被再循环以通过FcRn介导的再循环结合新鲜的配体。比之于PEG化分子或其它延长半衰期技术，此方法提供了关键的益处，而此方法是不能再生的。推测在这些案例中，结合配体仅位于PEG化部分并占据了它。
本文描述了针对降解抗原的方法，该方法包括给予一种配体，该配体具有至少一个单个可变区，其中该单个可变区在中性血清pH下和在细胞内囊泡pH下均特异性地结合血清白蛋白；并且该配体进一步具有至少一个另外的单个可变区，其中该单个可变区在中性血清pH下特异性地结合不同于血清白蛋白的抗原，但在细胞内囊泡pH下不结合所述抗原，由此针对降解靶向该抗原而不是血清白蛋白。本文还描述了一种配体，其进一步包含至少一个另外的单个可变区，其中所述的单个可变区在中性血清pH下特异性地结合不同于血清白蛋白的抗原，但在细胞内囊泡pH下不结合所述抗原。
在代谢产物存在下体外筛选dAb
本文描述的配体包括包含单个可变区的配体，其含有一个单个可变区(单体)或多于一个单个可变区(例如，多聚体、融合蛋白、缀合物和双特异性配体，如本文定义的)，其特异性地结合血清白蛋白，其中该单个可变区特异性地结合人血清白蛋白，并且其中血清白蛋白通过该单个可变区的特异性结合基本上不被药物和/或代谢产物和/或小分子与血清白蛋白上的一个或多个位点结合所阻断。人血清白蛋白上的一个或多个位点包括Sudlow位点1和Sudlow位点2。该一个或多个位点可位于选自区域I、区域II和区域III的一个或多个人血清白蛋白的区域的任何组合上。
本文描述的配体包括包含单个可变区的配体，其含有一个单个可变区(单体)或多于一个单个可变区(例如，多聚体、融合蛋白、缀合物和双特异性配体，如本文定义的)，其特异性地结合血清白蛋白，其中该单个可变区特异性地结合人血清白蛋白，并且其中血清白蛋白通过所述单个可变区的特异性结合不会改变血清白蛋白对结合SA的药物和/或代谢产物和/或小分子的结合性质。在一个实施方案中，该配体的单个可变区在存在和/或不存在药物、代谢产物或其它小分子时均结合血清白蛋白。而在另一实施方案中，血清白蛋白通过所述单个可变区的特异性结合基本上不会改变血清白蛋白对体内自然结合SA的药物和/或代谢产物和/或小分子的结合性质。所述药物和/或代谢产物和/或小分子包括但优选不限于Fasanoet al.(2005)57(12)：787-96，The extraordinary ligand bindingproperties of human serum albumin，以及Bertucci，C.et al.(2002)9(15)：1463-81，Reversible and covalent binding of drugs to humanserum albumin：methodological approaches and physiologicalrelevance中描述的那些药物和/或代谢产物和/或小分子。
结合SA的药物和/或代谢产物和/或小分子会或者不会与药物和/或代谢产物和/或小分子重叠，后一药物和/或代谢产物和/或小分子基本上不与结合该单个可变区的血清白蛋白抑制或竞争。药物和/或代谢产物包括，但优选不仅限于华法林、布洛芬、维生素B6、θ胆红素、血晶质(hemin)、甲状腺素、脂肪酸、乙醛、脂肪酸代谢产物、酰基葡萄糖醛酸苷、胆红素的代谢物、氟烷、水杨酸盐/酯、benzodapenes和1-O-吉非贝齐-B-D-葡萄糖醛酸苷。这种血清白蛋白通过小分子结合单个可变区的抑制或竞争作用可通过直接替换或者通过别构效应发生，例如小分子结合诱发其它小分子结合的改变，参见Ascenzi et al.(2006)Mini Rev.Med.Chem.6(4)：483-9.Allosteric modulation of drug binding to human serum albumin，以及Ghuman J.et al.(2005)J.Mol.Biol.353(1)：38-52 Structural basis ofthe drug-binding to human serum albumin。在一个实施方案中，该小分子单独或者与一种或多种其它小分子和/或代谢产物和/或蛋白和/或药物一起结合血清白蛋白。在另一实施方案中，该小分子单独或者与一种或多种其它小分子和/或代谢产物和/或蛋白和/或药物一起抑制或竞争血清白蛋白与该单个可变区的结合。在另一实施方案中，该小分子单独或者与一种或多种其它小分子和/或代谢产物和/或蛋白和/或药物一起基本上抑制或竞争血清白蛋白与该单个可变区的结合。
该单个可变区可以是抗体单个可变区。该抗体单个可变区可以是VH3区域。该抗体单个可变区可以是Vκ区域。该单个可变区可包含一个或多个非-免疫球蛋白支架结构。该非-免疫球蛋白支架结构可包括但优选不限于CTLA-4、脂质运载蛋白、SpA、GroEL和纤连蛋白中的一个或多个，并且包括亲合体TM和AvimerTM。
本文描述了一种筛选结合血清白蛋白的单个可变区的方法，该方法包括在一种或多种代谢产物和/或药物的存在下通过其与血清白蛋白的结合能力筛选第一可变区，其中该筛选是在一种或多种代谢产物和/或药物存在下进行的。本文还描述了一种生产双特异性配体的方法，该双特异性配体包含在一种或多种代谢产物和/或药物存在下对血清白蛋白具有第一结合特异性的第一免疫球蛋白单个可变区和具有第二结合特异性的第二免疫球蛋白单个可变区，该方法包括以下步骤：(a)在一种或多种代谢产物和/或药物存在下通过其结合第一表位的能力筛选第一可变区，(b)通过其结合第二表位的能力筛选第二可变区，(c)组合所述可变区；和(d)在所述一种或多种代谢产物和/或配体以及所述第二表位存在下通过其结合血清白蛋白的能力筛选该配体。此方法还可包括一个这样的步骤，其中该在不存在互补可变区时针对结合所述第一表位筛选该第一可变区，和/或其中在第三互补可变区存在下针对结合所述第一表位筛选该第一可变区，其中所述第三可变区不同于所述第二可变区。这些筛选步骤可以在代谢产物和/或药物和/或蛋白和/或小分子的混合物存在下进行。所述筛选步骤还可如下进行：(a)在第一代谢产物和/或药物和/或小分子存在下筛选结合血清白蛋白的单个可变区；和(b)从步骤(a)筛选的区域中，在第二代谢产物和/或药物和/或小分子存在下筛选一个区域。还包括一种产生双特异性配体的方法，该双特异性配体具有在一种或多种代谢产物和/或药物和/或小分子存在下对血清白蛋白具有第一结合特异性的第一免疫球蛋白单个可变区和具有第二结合特异性的第二免疫球蛋白单个可变区，该方法具有以下步骤：(a)在一种或多种代谢产物和/或药物和/或小分子存在下通过它们结合血清白蛋白的能力筛选第一可变区，(b)通过它们结合表位的能力筛选第二可变区，(c)组合所述可变区，得到包含第一和第二可变区的配体；和(d)从步骤(c)得到的配体中，通过其在一种或多种代谢产物和/或药物存在下结合血清白蛋白的能力以及其结合所述表位的能力筛选配体，从而产生双特异性配体。在一个实施方案中，在下存在互补可变区时针对与血清白蛋白的结合筛选该第一可变区。在另一实施方案中，在存在互补可变区时针对与该第一表位的结合筛选该第一可变区，其中该互补可变区不同于该第二可变区。
本文描述了一种包含单个可变区的配体，其中该单个可变区在pH 7和细胞内腔室pH下在体外特异性地结合血清白蛋白，并且其中该单个可变区是非-天然存在的单个可变区。本文还描述了一种包含抗体单个可变区的配体，其中该抗体单个可变区在pH 7和细胞内腔室pH下在体外特异性地结合血清白蛋白。在一个实施方案中，细胞内腔室pH范围为4.8至5.2。在另一实施方案中，血清白蛋白与抗体单个可变区的结合基本上不抑制FcRn与血清白蛋白的结合，这是由体外表面等离振子共振竞争分析法测定的。在另一实施方案中，该抗体单个可变区是抗体重链单个可变区。该抗体重链单个可变区可以是VH3单个可变区，并且在另外的实施方案中该VH3单个可变区可以是人VH3单个可变区。在另一实施方案中，该抗体单个可变区是抗体轻链单个可变区。在一个实施方案中该抗体轻链单个可变区是Vκ单个可变区，在另一实施方案中是Vλ单个可变区。
在另一实施方案中，该抗体单个可变区包含一个或多个选自下列的抗体CDR区域：CDR1、CDR2和CDR3。在另一实施方案中，该抗体单个可变区包含选自下列的支架结构：CTLA-4、脂质运载蛋白、葡萄球菌性蛋白A(SpA)、GroEL、GroES、转铁蛋白和纤连蛋白。在一个实施方案中，血清白蛋白与单个可变区的结合基本上不与FcRn与血清白蛋白的结合竞争；在另一实施方案中，该抗体单个可变区特异性地结合血清白蛋白，结合的平衡解离速率常数(Kd)小于或等于300nM。
在另一实施方案中，该抗体单个可变区进一步包含至少一个另外的抗体单个可变区，其中该另外的抗体单个可变区在pH 7下特异性地结合不同于血清白蛋白的抗原，但在细胞内腔室pH下不结合该抗原。本文还描述了在个体中引导抗原降解的方法，该方法包括给予该个体包含单个可变区例如抗体单个可变区的配体，该单个可变区在pH 7和细胞内腔室pH下在体外特异性地结合血清白蛋白，该配体进一步包含至少一个另外的包含单个可变区例如抗体单个可变区的抗体单个可变区，其中该不同于血清白蛋白的抗原是针对降解的抗原。
在本发明配体的一个实施方案中，人血清白蛋白通过抗体单个可变区的特异性结合是被预先确定的药物和/或代谢产物和/或小分子与人血清白蛋白上的一个或多个位点结合所阻断。在这些实施方案中，该另外的抗体单个可变区可以是抗体重链单个可变区或抗体轻链单个可变区，其包含一个或多个选自下列的抗体CDR区域：CDR1、CDR2和/或CDR3。该单个可变区可包含选自下列的支架结构：CTLA-4、脂质运载蛋白、葡萄球菌性蛋白A(SpA)、GroEL、GroES、转铁蛋白和纤连蛋白。
本文描述的配体的另一实施方案是包含单个可变区的配体，其中该单个可变区是非-天然存在的单个可变区，其中该单个可变区在pH 7和细胞内腔室pH下在体外特异性地结合人血清白蛋白，其中该单个可变区与人血清白蛋白的特异性结合不被预定的药物和/或代谢产物和/或小分子与该人血清白蛋白上的一个或多个位点的结合所阻断，其中该人血清白蛋白上的一个或多个位点包括Sudlow位点1和Sudlow位点2，或者所述一个或多个位点位于选自下列的人血清白蛋白的一个或多个区域：区域I、区域II和区域III。
连接子
将AlbudAbTM(一种dAb，其特异性地结合血清白蛋白)(抗-血清白蛋白抗体区域或单个可变区)与另一生物活性部分连接可通过重组基因工程技术获得。基本地，编码感兴趣的两种蛋白的基因被融合在框架中。可以考虑若干形式，其中该抗-血清白蛋白抗体区域是在融合物的N-末端(即AlbudAbTM-Y，其中Y是生物活性多肽)，在融合物的C-末端(即Z-AlbudAbTM，其中Z是生物活性肽)。在某些情况下，人们可以考虑使一个以上的生物活性多肽与AlbudAbTM(一种dAb，其特异性地结合血清白蛋白)融合，产生一些可能可考虑的融合物设计。例如，该融合物可以如下：Z-Y-AlbudAbTM、Z-AlbudAbTM-Y或AlbudAbTM-Z-Y。
在所有这些融合物分子中，两个多肽通过至少一个肽键共价连接在一起。在其最简单的方法中，AlbudAbTM(一种dAb，其特异性地结合血清白蛋白)和生物多肽是直接连接的。因此，该AlbudAbTM(一种dAb，其特异性地结合血清白蛋白)与多肽之间的连接可以如下：
a)对于AlbudAbTM(一种dAb，其特异性地结合血清白蛋白)，在C-末端，
其中该AlbudAbTM是VK：-
xxxDIQ
xxxNIQ
xxxAIQ
xxxAIR
xxxVIW
xxxDIV
xxxDVV
xxxEIV
xxxETT
其中该AlbudAbTM(一种dAb，其特异性地结合血清白蛋白)是Vλ：-
xxxQSV
xxxQSA
xxxSYE
xxxSSE
xxxSYV
xxxLPV
xxxQPV
xxxQLV
xxxQAV
xxxNFM
xxxQTV
xxxQAG
其中该AlbudAbTM(一种dAb，其特异性地结合血清白蛋白)是VH(例如，人VH)：-
xxxQVQ
xxxQMQ
xxxEVQ
xxxQIT
xxxQVT
xxxQLQ
其中该AlbudAbTM(一种dAb，其特异性地结合血清白蛋白)是VHH(例如，骆驼科重链可变区)：-
xxxEVQ
xxxQVQ
xxxDVQ
xxxQVK    
xxxAVQ
b)对于AlbudAbTM(一种dAb，其特异性地结合血清白蛋白)，在N-末端，
其中该AlbudAbTM(一种dAb，其特异性地结合血清白蛋白)是VK：-
KVEIKxxx
KLEIKxxx
KVDIKxxx
RLEIKxxx
EIKRxxx
其中该AlbudAbTM(一种dAb，其特异性地结合血清白蛋白)是Vλ：-
KVDVLxxx
KLDVLxxx
QLDVLxxx
其中该AlbudAbTM(一种dAb，其特异性地结合血清白蛋白)是VH(例如，人VH)：-
VTVSSxxx
其中该AlbudAbTM(一种dAb，其特异性地结合血清白蛋白)是VHH(例如，骆驼科重链可变区)：-
VTVSSxxx
‘xxx’表示与AlbudAbTM(一种dAb，其特异性地结合血清白蛋白)融合的(第一)生物活性多肽的最先或最后三个氨基酸。
然后，可能的情况是，恢复了两种多肽的功能活性的重组融合蛋白的产生可以被促进，其促进方式是通过使编码基因与编码肽连接子的桥接DNA片段连接，该肽连接子接合在串联连接的多肽之间。最佳的肽连接子长度通常经验性地设计为：其可以短到一个氨基酸，或者长到50个氨基酸。已经提出了不同设计的连接子，并且是本领域公知的。下面的实例表示提供了一种宽泛的-但非包罗广泛的-可能的连接子方式的列举：
Figure G2008800104821D01161
柔性连接子：
当连接两个多肽部分时，设计柔性连接子以适应不稳定的次级结构，由此使得构象在该融合蛋白中有个范围。这些连接子在性质上优选是亲水性的，以防止它们与一个或两个融合多肽相互作用。通常小极性残基例如甘氨酸和丝氨酸普遍存在于这些连接子中，以便分别增加肽骨架的柔性和亲水性。这些连接子的长度是可变的，并且最好根据经验确定或者借助3D计算机法确定。通常，优选的连接子长度是与感兴趣的自然功能和结构的良好表达、良好溶解度和完全恢复具有最小一致性的。由于它们的柔性特征，柔性连接子可构成良好的用于内源性蛋白酶的底物。一般地，除非是需要的性质，柔性连接子缺乏氨基酸例如带电荷的氨基酸或者大的疏水性/芳香性氨基酸，它们容易被具有广泛底物特异性的内源性蛋白酶所识别。此外，优选避免半胱氨酸残基，因为游离半胱氨酸可以在一起反应形成半胱氨酸，从而导致(i)通过该连接子将两个融合蛋白桥接，和/或(ii)如果一个或多个生物活性多肽包含一个或多个半胱氨酸残基(‘半胱氨酸无规化(scrambling)’)，则折中表达/折叠融合蛋白。
柔性连接子的实例是：(i)基于(GGGGS)y基序复制的富含甘氨酸的连接子，其中y至少为1，尽管y可以是2，3，4，5，6，7，8和9或更多(参见PCT国际公开号：EP 0 753 551、US 5 258 498、EP 0 623679)，(ii)基于(SSSSG)y基序复制的富含丝氨酸的连接子，其中y至少为1，尽管y可以是2，3，4，5，6，7，8和9或更多(参见PCT国际公开号：EP 0 573 551、US 5 525 491)。
Figure G2008800104821D01171
约束连接子：
当连接两个多肽部分时，设计设计约束连接子(Constrainedlinker)以适应稳定的次级结构，由此限制构象在该融合蛋白的范围。此类连接子通常通常采取跨越若干转角的螺旋结构。而且这些连接子的长度是可变的，并且最好根据经验确定或者借助计算机法确定。选择约束连接子的主要原因是保持该融合物的每一多肽之间的最大距离。这在两多肽具有形成杂聚集物的倾向时是特别相关的。由于它们的结构，约束连接子对蛋白水解的降解更具耐受性，从而在体具注射时提供益处。
约束连接子的实例引证于PCT国际公开号：WO 00/24884(例如SSSASASSA、GSPGSPG或ATTTGSSPGPT)、US 6,132,992(例如螺旋状肽连接子)。
Figure G2008800104821D01172
‘天然’连接子：
天然连接子是(长度可变的)多肽序列，其-相反地-不是合成的，即包含该连接子的多肽序列是在自然界发现的。天然连接子可以是柔性的或者是受约束的，并且在氨基酸序列和组成上可以是非常变化多样的。它们耐受蛋白水解作用的程度取决于它们起源于哪些蛋白以及这些蛋白在自然界面临哪种生物环境(细胞外、细胞内、原核的、真核的，等等)。对于开发人用生物治疗法而言有一类连接子是特别相关的：基于人类蛋白中发现的肽的连接子。事实上此类连接子是天然的非-或非常弱的免疫原性，从而对于人用治疗可能更安全。
天然连接子的实例是：(i)KESGSVSSEQLAQFRSLD(参见Birdet al.(1988)Science，242，423-426)，(ii)与缺乏长链的免疫球蛋白的铰链区域相应的序列(参见Hamers-Casterman et al.(1993)Nature，363，446-448和PCT国际公开号：WO 096/34103)。与抗-白蛋白抗体区域(例如，人、人化的、骆驼科化的人或骆驼科VHH抗体区域)使用的连接子的实例是EPKIPQPQPKPQPQPQPQPKPQPKPEPECTCPKCP和GTNEVCKCPKCP。衍生自人和骆驼科铰链的其它连接子公开于EPO656946，通过引用并入本文。铰链衍生的连接子可具有可变的长度，例如为0至约50个氨基酸，包括1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48或49个氨基酸。
如本文使用的，″药物″是指任何化合物(例如，小的有机分子、核酸、多肽)，它们可以给予个体以通过在个体中与生物靶分子结合或者改变生物靶分子的功能而产生有益的、治疗或诊断的作用。该靶分子可以是由该个体的基因组编码的内源性靶分子(例如由该个体的基因组编码的酶、受体、生长因子、细胞因子)或者由病原体的基因组编码的外源性靶分子(例如由病毒、细菌、真菌、线虫或其它病原体的基因组编码的酶)。
药物组合物可以是缀合物，其中该药物是共价的或非共价的连接于多肽连接部分。该药物可以直接或间接地共价或非共价连接到该多肽结合部分(例如通过适宜的连接子和/或附属结合配偶体(例如，生物素和抗生物素蛋白)的非共价结合)。当应用附属结合配偶体时，结合配偶体之一可以直接或者通过适宜的连接子部分共价连接到该药物上，并且该附属结合配偶体可以直接或者通过适宜的连接子部分共价连接到该多肽连接部分。当该药物是多肽或肽时，该药物组合物可以是融合蛋白，其中该多肽或肽、药物以及多肽连接部分是连续多肽链的分离的部分(部分)。如本文描述的，该多肽连接部分和多肽药物部分可以直接通过肽键相互连接，或者通过适宜的氨基酸、或肽或多肽连接子连接。
降低的免疫原性
本文描述了一种降低药物免疫原性的方法，该方法包括修饰所述药物使得该药物进一步包含单个可变区，其中该单个可变区在体内和/或体外特异性地结合血清白蛋白，并且其中该药物可包括药物、代谢产物、配体、抗原和蛋白。该血清白蛋白可以是人血清白蛋白。该单个可变区可以是免疫球蛋白单个可变区。该免疫球蛋白单个可变区可以是VH抗体单个可变区。该VH单个可变区可以是VH3单个可变区。该VH3单个可变区可以是人VH3单个可变区。该单个可变区可以是Vκ或Vλ抗体单个可变区。该抗体单个可变区可包含一组四个Kabat框架区(FR)，它们是由VH3框架胚系抗体基因片段编码的。该VH3框架选自选自DP47、DP38和DP45。该抗体单个可变区可包含一组四个Kabat框架区(FR)，它们是由Vκ框架胚系抗体基因片段编码的。κ框架的非限制性实例是DPK9。该单个可变区可含有免疫球蛋白或非-免疫球蛋白支架结构，其含有CDR1、CDR2和/或CDR3区域，其中该CDR1、CDR2和CDR3区域中的至少一个来自特异性地结合血清白蛋白的抗体可变区。该非-免疫球蛋白支架结构可包括但优选不限于CTLA-4、脂质运载蛋白、SpA、亲合体TM、GroEL、AvimersTM和纤连蛋白。该血清白蛋白可以是人血清白蛋白。该免疫球蛋白单个可变区和/或该非-免疫球蛋白单个可变区可以特异性地结合人血清白蛋白，结合的Kd小于300nM。该免疫球蛋白单个可变区和/或该非-免疫球蛋白单个可变区可特异性地结合人血清白蛋白和一个或多个非-人血清白蛋白，结合的Kd值相互间在10倍以内。该免疫球蛋白单个可变区和/或非-免疫球蛋白单个可变区可特异性地结合人血清白蛋白和一个或多个非-人血清白蛋白，并且其中该配体Tβ半衰期在人类宿主中与人血清白蛋白的Tβ半衰期基本上相同。此外，该免疫球蛋白单个可变区和/或非-免疫球蛋白单个可变区可人血清白蛋白的特异性地结合区域II。该免疫球蛋白单个可变区和/或该非-免疫球蛋白单个可变区可在中性血清pH下和在细胞内囊泡pH下进一步特异性地结合血清白蛋白。血清白蛋白通过所述免疫球蛋白单个可变区和/或该非-免疫球蛋白单个可变区的特异性结合优选基本上不受药物和/或代谢产物与血清白蛋白上的一个或多个位点结合所阻断。在一个实施方案中，血清白蛋白通过该单个可变区的特异性结合不会改变血清白蛋白针对结合于SA的药物和/或代谢产物和/或小分子的结合性质。在一个实施方案中，修饰药物的方法导致形成修饰的药物，该修饰的药物具有包括以下的式子：a-(X)n1-b-(Y)n2-c-(Z)n3-d或a-(Z)n3-b-(Y)n2-c-(X)n-d，其中X是具有针对第一靶的结合特异性的多肽药物；Y是单个可变区，例如在体内和/或体外抗体特异性地结合血清白蛋白的单个可变区；Z是具有针对第二靶的结合特异性的多肽药物；a、b、c和d独立地是包含一个至约氨基酸残基的多肽或者是不存在；n1为1至约10；n2为1至约10；以及n3为0至约10。在进一步的实施方案中，当n1和n2均为1并且n3是0时，X不包含抗体链或抗体链的片段。
本文描述了一种降低药物免疫原性的方法，该方法包括修饰所述药物使得该药物进一步包含单个可变区，其中该单个可变区特异性地结合血清白蛋白，其中该单个可变区是非-天然存在单个可变区，并且其中该药物选自：药物、代谢产物、配体、抗原和蛋白。本文还描述了一种降低药物免疫原性的方法，该方法包括修饰所述药物使得该药物进一步包含抗体单个可变区，其中该抗体单个可变区特异性地结合血清白蛋白，并且其中该药物选自：药物、代谢产物、配体、抗原和蛋白。在一个实施方案中，该抗体单个可变区是抗体重链单个可变区例如抗体VH3单个可变区或人抗体VH3单个可变区。在另一实施方案中，该抗体单个可变区是抗体轻链单个可变区例如抗体Vκ或抗体Vλ单个可变区。在一个实施方案中，该抗体单个可变区包含CDR1、CDR2和CDR3区域，其中CDR1、CDR2和CDR3区域中的至少一个来自特异性地结合血清白蛋白的抗体可变区，并且任选地进一步包含选自下列的支架结构：CTLA-4、脂质运载蛋白、葡萄球菌性蛋白A(SpA)、GroEL、GroES、转铁蛋白和纤连蛋白。在这些方法的另一实施方案中，该单个可变区例如抗体单个可变区特异性地结合人血清白蛋白，结合的kd小于300nM；在这些方法的另一实施方案中，该单个可变区例如抗体单个可变区特异性地结合人血清白蛋白和一个或多个非-人血清白蛋白，结合的Kd值相互在10倍以内。在这些方法的另一实施方案中，该单个可变区例如抗体单个可变区特异性地结合人血清白蛋白和非-人血清白蛋白，并且在人类宿主中该配体Tβ半衰期与人血清白蛋白的Tβ半衰期基本上相同。在这些方法的另一实施方案中，该单个可变区例如抗体单个可变区特异性地结合人血清白蛋白的区域II。在这些方法的另一实施方案中，该单个可变区例如抗体单个可变区在pH 7和细胞内腔室pH下特异性地结合血清白蛋白。
仅仅是为了说明的目的，本发明在以下实施例中作进一步的描述。如本文使用的，为了dAb命名的目的，人TNFα称作TAR1，人TNFα受体1(p55受体)称作TAR2。
实施例1.针对人血清白蛋白(HSA)和β-半乳糖苷酶(β-gal)的双特异性scFv抗体(K8)的筛选
本实施例解释了制备针对β-gal和HSA的双特异性抗体的方法，其中选择连接到胚系(模拟)VH区的Vκ可变区库以用于结合β-gal，选择连接到胚系(模拟)Vκ区的VH可变区库以用于结合HSA。然后组合选出的可变的VH HSA和Vκβ-gal区，并且根据能结合β-gal和HSA而选择出抗体。HSA是在人血液中发现的半衰期增强蛋白。
四种用在本实验中的人噬菌体抗体库。
库1-胚系Vκ/DVT VH 8.46×107
库2-胚系Vκ/NNK VH 9.64×107
库3-胚系VH/DVT Vκ 1.47×108
库4-胚系VH/NNK Vκ 1.45×108
所有抗体库基于单一的人VH(V3-23/DP47和JH4b)以及Vκ(O12/O2/DPK9和Jκ1)框架，其具有的侧链多样性掺入了互补决定区(CDR2和CDR3)。
库1和库2包含模拟Vκ序列，而VH序列在H50，H52，H52a，H53，H55，H56，H58，H95，H96，H97和H98(分别编码DVT或NNK)位置上多样化(图1)。库3和库4包括模拟VH序列，而Vκ序列在L50，L53，L91，L92，L93，L94和L96(分别编码DVT或NNK)位置上多样化(图1)。这些库是噬菌粒pIT2/ScFv形式(图2)，并且已经根据结合属类配体、蛋白A和蛋白L而预先选择，所以未筛选库中的绝大多数克隆是有功能的。上面所显示库的大小相当于预筛选后的大小。库1和库2在用抗原筛选前混合生成单个的VH/模拟Vκ库，库3和库4混合形成单个Vκ/模拟VH库。
对β-gal应用Vκ/模拟VH库执行3个选择循环，对HSA应用VH/模拟Vκ库执行3个选择循环。就β-gal来说，噬菌体滴度从第一循环的1.1×106上升到第三循环的2.0×108。就HSA来说，噬菌体滴度从第一循环的2×104上升到第三循环的1.4×109。该选择的执行如Griffith et al.，(1993)所描述的，除了采用KM 13辅助噬菌体(其包含一种pIII蛋白，在D2和D3区之间具有蛋白酶裂解位点)，并且用含1mg/ml胰蛋白酶的PBS洗提噬菌体。胰蛋白酶的添加是裂解来自辅助噬菌体的pIII蛋白(但不是那些来自噬粒的)，并且通过在c-myc标记处切割来洗提结合的scFv-噬菌体融合物(图2)，因此进一步丰富了表达功能性scFvs的噬菌体而背景相应地减少(Kristensen&Winter，Folding&Design 3：321-328，Jul 9，1998)。选择是采用包被有100μg/ml浓度的HSA或β-gal的免疫试管。
为了检测结合，每次选择的第三个循环来源的24个克隆可通过单克隆噬菌体ELISA法筛选。噬菌体微粒按Harrison et al.，MethodsEnzymol.1996；267：83-109所描述制备。用在PB S液中的浓度为10μg/ml的100μl的HSA或β-gal包被96孔ELISA板，在44℃条件下过夜。然后进行标准ELISA操作步骤(Hoogenboom et al.，1991)，采用具有抗-M13-HRP缀合物的结合噬菌体的检测方法。克隆选择释放ELISA信号在50μl上清中大于1.0。
接着，采用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)，对HSA筛选的VH/模拟Vκ库和对β-gal筛选的Vκ/模拟VH库中制备DNA预产物(preps)。为获得最大多样性，DNA预产物可从选择过程3个循环的每个循环中制备，然后一起收集对每一种抗原的DNA预产物。然后用SalI/NotI在37℃过夜消化DNA预产物。经凝胶纯化片段后，在β-gal上筛选的来自Vκ/模拟VH库的Vκ链被连接，替代对HSA筛选的VH/模拟Vκ库中的模拟Vκ链，生成3.3×109个克隆。
这个库既可以是HSA/β-gal选择即选择HSA(第一轮)和β-gal(第二轮)；或者可以是1β-gal/HSA选择即选择β-gal(第一轮)和HSA(第二轮)。选择过程如上所述。每当第二轮选择之后，采用单克隆噬菌体ELISA方法(如上所述)和可溶性scFv片段的ELISA法检测结合HSA和β-gal的48个克隆。可溶性抗体片段的制备如Harrison et al.，(1996)描述的一样，标准ELISA程序按照Hoogenboom et al.(1991)Nucleic Acids Res.，19：4133所述的方法，除了采用2％Tween/PBS作为封闭缓冲液且结合的scFvs用蛋白L-HRP检测。HSA/β-gal选择中的3个克隆(E4、E5和ES)和β-gal/HSA选择中的2个克隆(K8和K10)能结合两种抗原。PCR扩增这些克隆中的scFvs并进行测序，如Ignatovich et al.，(1999)J MolBiol 1999 Nov 26；294(2)：457-65所述，使用引物LMB3和pHENseq。测序分析显示所有克隆是同样的。因此，只选择一个编码双特异性抗体的克隆(K8)用于进一步工作中(图3)。
实施例2.K8抗体结合性能的表征
首先，用单克隆噬菌体ELISA法表征K8抗体的结合特性。用含HSA、携带碱性磷酸酶(APS)的β-gal、牛血清白蛋白(BSA)、花生凝集素(peanut agglutinin)、溶菌酶和细胞色素c的，浓度为10μg/ml的(阻止交叉反应)100μl PBS在4℃过夜包被96孔板。用KM13拯救来自K8克隆的噬菌粒，方法如Harrison et al.，(1996)所描述的，直接分析含噬菌体的上清(50μl)。然后进行标准ELISA程序(Hoogenboom et al.，1991)，采用具有抗-M13-HRP缀合物的结合噬菌体的检测方法。当展示于噬菌体表面的吸收信号大于1.0时，发现双特异性K8抗体能结合HSA和β-gal(图4)。也可以观察到对BSA强的结合(图4)。由于HSA和BSA在氨基酸水平上有76％是同源的，所以K8抗体能识别两种结构相关蛋白是不足为奇的。未观察到与其他蛋白的交叉反应(图4)。
其次，K8抗体的结合特性可用可溶性scFv ELISA法检测。可溶性scFv片段的产生通过IPTG诱导，正如Harrison et al.，(1996)描述的。为确定K8 scFv表达水平，用蛋白A琼脂糖柱纯化50ml诱导上清中的可溶性抗体片段，正如Harlow and Lane，Antibo dies：aLaboratory Manual，(1988)Cold Spring Harbor描述的。然后采用Sambrook et al.，(1989)描述的方法测定OD280并计算蛋白浓度。上清中K8 scFv产物浓度为19mg/l。
然后用已知浓度的K8抗体片段进行可溶性scFv ELISA检测。用100μl含HSA、BSA和β-gal的浓度为10μg/ml溶液和100μl浓度为1μg/ml的蛋白A包被96孔板。应用连续稀释的K8 scFv溶液50μl，用蛋白L-HRP检测结合抗体片段。ELISA结果证实了K8抗体的双特异性性质(图5)。
为确定结合β-gal是由Vκ区决定以及结合HSA/BSA是由K8 scFv抗体的VH区决定，用SalI/NotI消化K8 scFv DNA将Vκ区从中切下，连接到包含模拟VH链的经SalI/NotI消化过的pIT2载体上(图1和2)。产生的克隆K8Vκ/模拟VH的结合特性通过可溶性scFv ELISA法分析。可溶性scFv片段的产生通过IPTG诱导，如Harrison et al.，(1996)描述的，再直接分析含有scFvs的上清(50μ)。可溶性scFv ELISA法按实施例1中操作，结合的scFvs用蛋白L-HRP检测。ELISA结果显示该克隆还能结合β-gal，而与BSA的结合被消除(图6)。
实施例3.针对抗原A和抗原B的单个VH区抗体和针对抗原C和抗原D的单个Vκ区抗体的筛选
本实施例描述了一种制备针对抗原A和抗原B的单个VH区抗体和针对抗原C和抗原D的单个Vκ区抗体的方法，其方式是通过筛选无互补可变区存在时结合这些抗原的初始(virgin)单个抗体可变区的库。
结合克隆的筛选和表征通过前述方法进行(参见实施例5，PCT/GB 02/003014)。选择出4个用于进一步研究的克隆：
VH1-抗A VH
VH2-抗B VH
VK1-抗C Vκ
VK2-抗D Vκ
可以采用上述实施例1-3描述的程序，用所描述的相同方式制备包含VH区结合物(combination)(即，VH-VH配体)和VL区结合物(VL-VL配体)的二聚体分子。
实施例4.双特异性SeFv抗体的制备和表征(针对抗原A和B的VH1/VH2和针对抗原C和D的VK1/VK2)
该实施例证实了双特异性ScFv抗体(针对抗原A和B的VH1/VH2和针对抗原C和D的VK1/VK2)能通过针对ScFv载体中的相应抗原筛选的Vκ和VH单个功能区的结合而制备。
为制备双特异性抗体VH1/VH2，用NcoI/XhoI消化来自可变区载体1(图7)中的VH1单个区域，再将其连接于NcoI/XhoI消化后的可变区载体2中(图7)，以产生VH1/可变区载体2。VH2单个区是从可变区载体1中经PCR扩增的，其中使用引物在5’端引入SalI限制酶位点，在3’端引入NotI限制酶位点。然后PCR产物用SalI/NotI消化并将其连接于SalI/NotI消化后的VH1/可变区载体2中，以产生VH1/VH2/可变区载体2。
VK1/VK2/可变区载体2用同样方式生成。制备的VH1/VH2ScFv和VK1/VK2 ScFv的双特异性性质是通过前述的可溶性scFvELISA法证实(参见实施例6，PCT/GB 02/003014)。竞争ELISA按前述方法进行(参见实施例8，PCT/GB 02/003014)。
可能的结果：
-VH1/VH2 ScFv能同时结合抗原A和B
-VK1/VK2 ScFv能同时结合抗原C和D
-VH1/VH2 ScFv的结合是竞争性的(当与抗原A结合时，VH1/VH2 ScFv不能结合抗原B)
-VK1/VK2 ScFv的结合是竞争性的(当与抗原C结合时，VK1/VK2 ScFv不能结合抗原D)
实施例5.双特异性VH1/VH2 Fab和VK1/VK2 Fab的构建及其结合特性的分析
为制备VH1/VH2 Fab，将VH1单个区域连接入NcoI/XhoI消化的CH载体中(图8)，以生成VH1/CH；并将VH2单个区域接入SalI/NotI消化的CK载体中(图9)，以生成VH2/CK。将来自VH1/CH和VH2/CK的质粒共转柒感受态大肠杆菌细胞，方法如前述(参见实施例8，PCT/GB 02/003014)。
然后用IPTG诱导包含VH1/CH和VH2/CK质粒的克隆，以制备可溶性VH1/VH2Fab，方法如前述(参见实施例8，PCT/GB02/003014)。
VK1/VK2 Fab用同样方法制备。
通过前述的竞争性ELISA法(参见实施例8，PCT/GB 02/003014)验证制备的Fab的结合性能。
可能的结果：
-VH1/VH2 Fab能同时结合抗原A和抗原B
-VK1/VK2 Fab能同时结合抗原C和D
-VH1/VH2 Fab的结合是竞争性的(当与抗原A结合时，VH1/VH2 Fab不能结合抗原B)
-VK1/VK2 Fab的结合是竞争性的(当与抗原C结合时，VK1/VK2 Fab能结合抗原D)
实施例6螯合dAb二聚体
概述
VH和VK同二聚体是用能变形的多肽连接子连成dAb-连接子-dAb形式。载体构建于dAb连接子-dAb形式中，其含有不同长度的甘氨酸-丝氨酸连接子3U：(Gly4Ser)3、5U：(Gly4Ser)5、7U：(Gly4Ser)7。二聚体库的构建采用将dAb导向连接子上游：TAR1-5(VK)，TAR1-27(VK)，TAR2-5(VH)或TAR2-6(VK)，并且在连接子下游的第二dAb的对应库。采用该法，选出新的二聚体dAb。二聚化对抗原结合的效应能通过ELISA、BIAcore研究、细胞中和和受体结合分析测定。的二聚化大大改善了结合亲和力和中和水平。
1.0方法
1.1库生成
1.1.1载体
设计pEDA3U，pEDA5U和pEDA7U载体以导入与dAb-连接子-dAb形式兼容的不同长度的连接子。对于pEDA3U，有义链和反义链73个碱基对寡核苷酸连接子通过在缓冲液中的缓慢退火机制退火(95℃-5分钟，80℃-10分钟，70℃-15分钟，56℃-15分钟，42℃直到应用)，所述缓冲液包含0.1M NaCl、10mM Tris-HCl pH7.4；并使用Xho1和Not1限制性位点克隆。连接子包含3个(Gly4Ser)单位和一个位于Sal1和Not1克隆位点之间的填充区域(图解1)。为了减少噬菌体展示技术选出单体dAb的可能性，填充区域设计成包含3个终止密码子、SacI限制性位点和框移突变，目的是当无第二个dab存在时，将所述区域置于读框外。对于pEDA5U和7U，由于连接子长度的需要，每个载体设计了重叠的寡核苷酸连接子，用Klenow酶进行退火和延伸。然后，在使用Xho1和Not1限制性位点克隆前纯化片段并用适当的酶消化。
Figure G2008800104821D01271
图解1
1.1.2库制备
使用Nco1和Xho1限制性位点，将对应于引导dAb的N末端V基因克隆于连接子的上游。VH基因存在相应位点，然而克隆VK基因需要引入适当的限制性位点。这可以采用修饰后的PCR引物(VK-DLIBF：5’cggccatggcgtcaacggacat；VKXho1R：5’atgtgcgctcgagcgtttgattt 3’)和2∶1的SuperTaq(HTBiotechnology Ltd)和pfu turbo(Stratagene)混合物经30个循环的PCR扩增而获得。这维持了5’末端的Nco1位点而破坏了相邻的Sal1位点并在3’末端引入了Xho1位点。5个引导dAb被克隆入3个二聚体载体的每一个载体中：TAR1-5(VK)，TAR1-27(VK)，TAR2-5(VH)，TAR2-6(VK)和TAR2-7(VK)。所有构建物均经测序分析鉴定。
在每个载体中(pEDA3U、5U和7U)的连接子上游克隆了引导dAb：TAR1-5(VK)，TAR1-27(VK)，TAR2-5(VH)或TAR2-6(VK)后，相应的第二个dAb库被克隆在连接子下游。为达到这一目的，互补(complimentary)dAb库是由第一轮筛选获得的噬菌体的PCR扩增的，筛选既可以是当TAR1-5或TAR1-27是引导dAb时针对人TNFα的VK库筛选(第一轮循环后大约1×106的多样性)，也可以是当TAR2-5或TAR2-6分别是引导dAb时针对人p55TNF受体的VH或VK库筛选(第一轮循环后二者均大约有1×105的多样性)。对于VK库，PCR扩增是通过采用引物和2∶1的SuperTaq和pfu turbo混合物经30个循环的PCR扩增而获得。VH库是采用能在基因5’端引入一个Sal1限制性位点的引物经PCR扩增而获得。用适当的限制酶消化dAb库的PCRs产物，并用Sal1/Not1限制性位点将其连入相应载体中的连接子下游，并经电穿孔进入新鲜制备的感受态TG1细胞中。
获得的各个库的滴度如下：
TAR1-5：pEDA3U＝4×108，pEDA5U＝8×107，pEDA7U＝1×108
TAR1-27：pEDA3U＝6.2×108，pEDA5U＝1×108，pEDA7U＝1×109
TAR2h-5：pEDA3U＝4×107，pEDA5U＝2×108，pEDA7U＝8×107
TAR2h-6：pEDA3U＝7.4×108，pEDA5U＝1.2×108，pEDA7U＝2.2×108
1.2筛选
1.2.1TNFα
采用包被有人TNFα的免疫管(immunotube)进行筛选。简言之，用1-4ml所需抗原过夜包被免疫管。然后用PBS洗免疫管3次，并用含2％奶粉的PBS封闭1-2小时，再用PBS洗3次。用含2％奶粉的PBS稀释噬菌体溶液并在室温下孵育2小时。然后用PBS冼管，用含1mg/ml胰蛋白酶-PBS洗脱噬菌体。研究了三种选择TAR1-5二聚体库的策略。第一轮筛选是在用1μg/ml或20μg/ml人TNFα包被的免疫管中进行，用含0.1％Tween的PBS洗20次。用洗提的噬菌体感染TG1细胞并测定其滴度(例如，Marks et al J MolBiol.1991 Dec 5；222(3)：581-97；Richmann et al Biochemistry.1993Aug 31；32(34)：8848-55)。
收获滴度为：
pEDA3U＝2.8×107(1μg/ml TNF)1.5×108(20μg/ml TNF)，
pEDA5U＝1.8×107(1μg/ml TNF)，1.6×108(20μg/ml TNF)
pEDA7U＝8×106(1μg/ml TNF)，7×107(20μg/ml TNF).
采用三种不同的方法进行第二轮筛选。
1.在免疫管中，洗涤20次后过夜孵育，再洗10次。
2.在免疫管中，洗涤20次后在含有(1μg/ml TNFα)的洗涤缓冲液中室温孵育1小时，再洗10次。
3.在抗生物素蛋白链菌素珠上筛选，其中使用33pM生物素化的人TNFα(Henderikx et al.，2002，Selection of antibody againstbiotinylated antigens.Antibody Phage Display：Methods andprotocols，Ed.O′Brien and Atkin，Humana Press)。将第二轮筛选的单个克隆挑入到96孔板中，再在96孔板中制备粗制上清预产物2ml。
 第1轮人TNFα免疫管包被浓度   第2轮筛选方法1   第2轮筛选方法2   第2轮筛选方法3
  pEDA3U  1μg/ml   1×109   1.8×109   2.4×1010
  pEDA3U  20μg/ml   6×109   1.8×1010   8.5×1010
  pEDA5U  1μg/ml   9×108   1.4×109   2.8×1010
  pEDA5U  20μg/ml   9.5×109   8.5×109   2.8×1010
  pEDA7U  1μg/ml   7.8×108   1.6×108   4×1010
  pEDA7U  20μg/ml   1×1010   8×109   1.5×1010
关于TAR1-27的选择按前述方法进行，并作以下修改。第一轮筛选是在用1μg/ml或20μg/ml人TNFα包被的免疫管中进行，用含0.1％Tween的PBS洗20次。第二轮筛选是洗涤20次后过夜孵育再洗20次。将来自第二轮筛选的单个克隆挑入到96孔板中，在96孔板中制备粗制上清预产物2ml。
TAR1-27滴度如下：
  人TNFα免疫管包被浓度   第1轮   第2轮
  pEDA3U   1μg/ml   4×109   6×109
  pEDA3U   20μg/ml   5×109   4.4×1010
  pEDA5U   1μg/ml   1.5×109   1.9×1010
  pEDA5U   20μg/ml   3.4×109   3.5×1010
  pEDA7U   1μg/ml   2.6×109   5×109
  pEDA7U   20μg/ml   7×109   1.4×1010
1.2.2TNF受体1(p55受体；TAR2)
如前述方法筛选TAR2h-5库。3轮筛选是用1μg/ml人p55 TNF受体或10μg/ml人p55 TNF受体包被的免疫管中进行，用含0.1％Tween的PBS洗20次后过夜孵育，再洗20次。从第2、3轮筛选的单个克隆挑入到96孔板中，在96孔板中制备粗制上清预产物2ml。
TAR2h-5滴度如下：
  第1轮人p55TNF受体免疫管包被浓度   第1轮   第2轮   第3轮
  pEDA3U   1μg/ml   2.4×106   1.2×107   1.9×109
  pEDA3U   10μg/ml   3.1×107   7×107   1×109
  pEDA5U   1μg/ml   2.5×106   1.1×107   5.7×108
  pEDA5U   10μg/ml   3.7×107   2.3×108   2.9×109
  pEDA7U   1μg/ml   1.3×106   1.3×107   1.4×109
  pEDA7U   10μg/ml   1.6×107   1.9×107   3×1010
1.3筛选
单个克隆是从不同筛选方法适当筛选的每个3U、5U和7U库的第2或3轮筛选中挑选出的。克隆在含有100μg/ml氨苄青霉素和1％葡萄糖的2×TY中37℃孵育过夜。将这种培养物的1/100稀释液接种于2ml的含100μg/ml氨苄青霉素和0.1％葡萄糖的2×TY的96孔板中，37℃震荡培养直到OD600约为0.9。然后培养物经1mMIPTG诱导在30℃诱导过夜。上清在sorval平板离心机中以4000rpm离心15分钟。上清预产物用于最初筛选。
1.3.1ELISA
采用蛋白A/L ELISA或抗原ELISA法比较单体和二聚体重组蛋白的结合活性。简言之，用抗原或蛋白A/L于4℃过夜包被96孔板。用含0.05％Tween的PBS洗板，用2％Tween-PBS封闭2小时。将样品加入板中室温孵育1小时。洗板，再用第二试剂室温孵育1小时。洗板，再用TMB底物显色。蛋白A/L-HRP或India-HRP用作第二试剂。对于抗原ELISAs来说，所用抗原浓度是PBS中1μg/ml的人TNFα和人THF受体1。由于引导dAb的存在，在大多数情况下二聚体释放阳性ELISA信号，因此可通过Biacore检测发出信号率测定值(off rate determination)。
1.3.2Biacore
对TAR1-5和TAR2h-5进行Biacore分析。为了筛选，使高密度(大约10000RUs)的人TNFα与CM5芯片偶连。使50μl的人TNFα(50μg/ml)偶连到pH5.5醋酸缓冲液中的芯片上(5μl/min)。用标准方法分析后芯片的再生是不可能的，因为人TNFα不稳定，因此每个样本分析之后，芯片用缓冲液洗10分钟。
对于TAR1-5，第二轮筛选的克隆上清用Biacore筛选。
48个克隆是从用以下筛选方法获得的每一个3U、5U和7U库中筛选的：
R1：1μg/ml的TNFα免疫管，R2 1μg/ml的TNFα免疫管，过夜洗涤。
R1：20μg/ml的TNFα免疫管，R2 20μg/ml的TNFα免疫管，过夜洗涤。
R1：1μg/ml的TNFα免疫管，R2 33pM生物素化的人TNFα珠。
R1：20μg/ml的TNFα免疫管，R2 33pM生物素化的人TNFα珠。
为了筛选，使高密度(大约4000Rus)的人p55 TNF受体与CM5芯片偶连。使100μl的人p55 TNF受体(10μg/ml)偶连到pH5.5醋酸缓冲液中的芯片上(5μl/min)。检测标准再生条件(pH2或pH3的甘氨酸)，但在每种情况下抗原从芯片表面移出如携带TNFα的情况，因此每次分析样本后，芯片用缓冲液洗10分钟。
对于TAR2.5，筛选第二轮选择的克隆上清。
48个克隆是用以下筛选方法从每一个3U、5U和7U库中筛选的：
R1：1μg/ml人p55 TNF受体免疫管，R2 1μg/ml人p55 TNF受体免疫管，过夜洗涤。
R1：10μg/ml人p55 TNF受体免疫管，R2 10μg/ml人p55 TNF受体免疫管，过夜洗涤。
1.3.3受体和细胞分析
在受体分析中二聚体的中和能力如下进行：
受体结合
针对TNF与重组TNF受体1(p55)结合的抑制能力测试抗-TNFdAb。简言之，用30mg/ml的抗人Fc小鼠单克隆抗体(Zymed，SanFrancisco，USA)过夜孵育Maxisorp板。用含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液(PBS)洗孔，然后在与100ng/ml TNF受体1Fc融合蛋白(R&D Systems，Minneapolis，USA)孵育前，用含1％BSA的PBS封闭孔。抗-TNF dAb与TNF混合后加入洗好的孔中，终浓度为10ng/ml。检测TNF结合是用0.2mg/ml生物素化的抗-TNF抗体(HyCultbiotechnology，Uben，Netherlands)，接着用1∶500稀释的辣根过氧化物酶标记的抗生物素蛋白链菌素(Amersham Biosciences，UK)，然后与TMB底物(KPL，Gaithersburg，USA)孵育。加入HCl终止反应，读出450nm处的吸光度。抗-TNF dAb活性导致TNF结合的减少，所以与TNF对照组相比吸光度下降。
L929细胞毒分析
针对中和小鼠L929成纤维细胞中的TNF的细胞毒活性的能力，也可以检测抗-TNF dAb(Evans，T.(2000)Molecular Biotechnology15，243-248)。简言之，将L929细胞装入微滴定板中与抗-TNF dAb和100pg/ml TNF以及1mg/ml放线菌素D(Sigma，Poole，UK)孵育过夜。与[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓(Promega，Madison，USA)孵育后通过读取490nm处的吸光度测定细胞活力。抗-TNF dAb活性导致TNF细胞毒活性下降，所以与TNF对照组相比吸光度增加。
在最初的筛选中，上述制备用于Biacore分析的上清也可用于受体分析中。所选二聚体的进一步分析也可在采用纯化蛋白的受体和细胞分析中来进行。
HeLa IL-8分析
抗-TNFR1或抗-TNFαdAb的测试可根据其对TNF诱导Hela细胞分泌IL-8的中和能力来进行(采用根据Akeson，L.et al(1996)Journal of Biological Chemistry 271，30517-30523的方法改造的方法，其中描述了IL-1诱导HUVEC产生IL-8；这里我们观察了人TNFα的诱导作用，并且我们采用HeLa细胞取代HUVEC细胞系)。简言之，将HeLa细胞装入微滴定板中与dAb和300pg/ml TNF共同孵育过夜。孵育后将上清吸走，用夹层ELISA(R&D Systems)测定细胞和IL-8浓度。与TNF对照组相比，抗-TNFR1 dAb活性导致分泌入上清中的IL-8下降。
L929分析广泛用于下列实验；然而，HeLa IL-8分析的用途优选用来测定抗-TNF受体1(p55)配体；L929分析中小鼠p55的存在造成其应用中的某些限制。
1.4序列分析
测定在Biacore和受体分析筛选中被证明具有有意义特性的二聚体的序列。序列详细描述于序列表中。
1.5格式化(Formatting)
1.5.1TAR1-5-19二聚体
显示具有良好中和特性的TAR1-5二聚体在细胞和受体分析中被重定格式(re-formatted)和分析。TAR1-5引导dAb(TAR1-5 guidingdAb)被亲和力成熟的克隆TAR1-5-19取代。为实现这一目的，从单独二聚体对中克隆出TAR1-5并用PCR扩增的TAR1-5-19取代。此外，TAR1-5-19同二聚体(homodimer)也在3U、5U和7U载体中构建。基因N-末端拷贝经PCR扩增并用上述方法克隆，且C-末端基因片段利用存在的Sal1和Not1限制性位点克隆。
1.5.2突变
琥珀终止密码子出现在dAb2中，通过定点突变将TAR1-5二聚体对中的一个C-末端dAb突变成谷氨酰胺。
1.5.3Fabs
使包含TAR1-5或TAR1-5-19的二聚体重定格式进入Fab表达载体中。用Sfi1和Not1限制性位点将dAb克隆入含有CK或CH基因的表达载体中，并对其进行测序分析确证。CK载体衍生自一种基于耐氨苄青霉素的pUC载体，CH载体衍生自一种耐氯霉素的pACYC载体。为了表达Fab，将dAb-CH和dAb-CK构建体共同转染进HB2151细胞中，在含有0.1％葡萄糖、100μg/ml氨苄青霉素和10μg/ml氯霉素的2×TY中生长培养。
1.5.3铰链二聚作用
测定由胱氨酸键构成的dAb的二聚作用。一段修改后的人IgGC1铰链区氨基酸短序列EPKSGDKTHTCPPCP通过基因基因工程加入到dAb的C末端区。按前述方法对编码此序列的寡核苷酸连接子进行合成和退火。用Xho1和Not1限制性位点将连接子克隆入含有TAR1-5-19的pEDA载体中。二聚作用原位发生于外周胞质。
1.6表达和纯化
1.6.1表达
如前所述，96孔板中制备的2ml上清用于初始筛选。初筛后进一步分析筛选的二聚体。二聚体构建体表达在TOP10F’或HB2151细胞的上清中。简要地说，新鲜划线平板上的单个菌落在含有100μg/ml氨苄青霉素和1％葡萄糖的2×TY中于37℃孵育过夜。将这种培养物的1/100稀释液接种于含100μg/ml氨苄青霉素和0.1％葡萄糖的2×TY中37℃震荡培养直到OD600约为0.9。然后培养物经1mM IPTG在30℃诱导过夜。通过离心去除细胞并用蛋白A或L琼脂糖纯化上清。
Fab和半胱氨酸铰链二聚体在HB2152细胞中表达为外周胞质蛋白。过夜培养物1∶100稀释后加入到含有0.1％葡萄糖和适当的抗生素的2×TY中生长，30℃震荡生长直到OD600约为0.9。然后，培养物用1mM IPTG在温度25℃下诱导3-4小时。通过离心收集细胞，沉淀重悬于外周胞质制备缓冲液中(30mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA，20％蔗糖)。离心后保留上清，沉淀重悬于5mM MgSO4中。再次离心收集上清，汇集并纯化。
1.6.2蛋白A/L的纯化
对来自蛋白L琼脂糖(Affitech，Norway)或蛋白A琼脂糖(Sigma，UK)的二聚体蛋白的纯化的优化进行检测。用蠕动泵分批或柱洗脱蛋白。测试三种缓冲液0.1M磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液pH2.6、0.2M甘氨酸pH2.5和0.1M甘氨酸pH2.5。最优化条件确定为在蠕动泵条件下采用0.1M甘氨酸pH2.5洗脱10个柱体积。从蛋白A中的纯化是在蠕动泵条件下采用0.1M甘氨酸pH2.5进行的。
1.6.3FPLC纯化
进一步纯化是采用AKTA Explorer 100系统(AmershamBiosciences Ltd)通过FPLC分析进行的。通过离子交换层析(1mlResource S-AmershamBiosciences Ltd)分级分离TAR1-5和TAR1-5-19二聚体，用50mM醋酸盐缓冲液(pH4)中0-1M浓度梯度的NaCl洗脱。铰链二聚体通过离子交换纯化(1ml Resource QAmersham Biosciences Ltd)，用25mM Tris HCl pH 8.0中0-1M NaCl浓度梯度洗脱。通过大小排阻层析法纯化Fabs，采用superose 12柱(Amersham Biosciences Ltd)进行，含0.05％tween的PBS流速为0.5ml/min。纯化之后，使用vivaspin 5K截留(cut off)浓缩器(Vivascience Ltd)将样品浓缩。
2.0结果
2.1TAR1-5二聚体
6×96个克隆是从包括所有库和所有筛选条件的第二轮选择中挑选的。上清预产物的制备和分析是采用抗原和蛋白L ELISA、Biacore和受体分析进行的。在ELISA中，每种筛选方法获得的阳性结合克隆被鉴定并且被分布于3U、5U和7U库之间。然而，由于引导dAb一直存在，所以此法不能区别高和低亲和力结合子(binder)，故采用Biacore分析。
Biacore分析采用2ml上清液进行。Biacore分析显示：与单体TAR1-5相比二聚体的Koff率大大改进。单体Koff率范围是10-1M，相比之下二聚体Koff率范围是10-3-10-4M。选出显示非常缓慢的降低率的16个克隆，它们来自3U、5U和7U库，并进行测序。此外，在受体分析中，针对中和人TNFα的能力对上清进行分析。
对这些分析中有中和作用的6个引导克隆(下称d1-d6)进行测序分析。结果显示：所得6个克隆中只有3个不同的第二dAb(dAb1、dAb2和dAb3)，但是在第二个dAb出现一次以上的地方，它们通过不同长度的连接子连接。
TAR1-5d1：3U连接子2nd dAb＝dAb1-1μg/ml Ag免疫管过夜洗涤
TAR1-5d2：3U连接子2nd dAb＝dAb2-1μg/ml Ag免疫管过夜洗涤
TAR1-5d3：5U连接子2nd dAb＝dAb2-1μg/ml Ag免疫管过夜洗涤
TAR1-5d4：5U连接子2nd dAb＝dAb3-20μg/ml Ag免疫管过夜洗涤
TAR1-5d5：5U连接子2nd dAb＝dAb1-20μg/ml Ag免疫管过夜洗涤
TAR1-5d6：7U连接子2nd dAb＝dAb1-R1：1μg/ml Ag免疫管过夜洗涤，R2：珠子。
进一步测定6个引导克隆。用蛋白L琼脂糖纯化外周胞质和上清液中的蛋白并用细胞和受体分析测定。中和作用水平是变化的(表1)。确定蛋白制备的优化条件。从HB2151细胞中制备的蛋白产量最高(大约是培养物的10mg/L)。将上清与蛋白L琼脂糖室温条件下孵育2小时或在4℃下孵育过夜。用PBS/NaCl清洗珠子并用蠕动泵上柱于FPLC柱上。用10倍柱体积的PBS/NaCl洗珠子，再用0.1M甘氨酸pH2.5洗脱。一般情况下，二聚体在单体后洗脱下来。
通过FPLC纯化TAR1-5d1-6二聚体。通过FPLC纯化获得3个种类，并通过SDS-PAGE鉴定。一类相当于单体，另两类相当于不同大小的二聚体。两类中较大的可能由于C末端标记的存在。用受体分析检测这些蛋白。表1中给出的数据代表从两个二聚体种类中获得的最优结果(图11)。
二聚体对(即，dAb1、dAb2和dAb3)中的3个第二dAb作为单体被克隆，并通过ELISA在细胞和受体分析中检测。所有3种dAb通过抗原ELISA能特异性结合TNF，不与塑料和BSA发生交叉反应。作为单体，在细胞或受体分析中无一种dAb具有中和作用。
2.1.2TAR1-5-19二聚体
用TAR1-5-19取代6个引导克隆中的TAR1-5。在细胞和受体分析法中分析所有TAR1-5-19二聚体，采用的是总蛋白(仅蛋白L纯化)，除非另有说明(表2)。在细胞分析中，TAR1-5-19d4和TAR1-5-19d3具有最好的ND50(～5nM)，这与受体分析结果一致，并且比TAR1-5-19单体(ND50～30nM)有改进。虽然纯化的TAR1-5二聚体在受体和细胞分析中结果是变化的，但TAR1-5-19二聚体的结果比较一致。变化表现在蛋白纯化中使用不同洗脱缓冲液时。用0.1M磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液pH2.6或0.2M甘氨酸pH2.5缓冲液，尽管能从蛋白L琼脂糖中除去所有蛋白，但在多数情况下使蛋白功能大大降低。
在发酵罐中表达TAR1-5-19d4，并用离子交换FPLC法纯化，获得完全纯化的二聚体。用FPLC纯化获得3种TAR1-5d4，相当于一种单体和两种二聚体。对该二聚体进行氨基酸测序。然后用受体分析检测TAR1-5-19单体和TAR1-5-19d4，结果是单体IC50为30nM，二聚体IC50为8nM。TAR1-5-19单体、TAR1-5-19d4和TAR1-5d4比较的受体分析结果如图10显示。
制备表达3U、5U和7U载体载体中的TAR1-5-19同二聚体，并用蛋白L纯化。用细胞和受体分析法测定蛋白，测定了结果IC50(针对受体分析)和ND50(针对细胞分析)(表3，图12)。
2.2Fabs
还将TAR1-5和TAR1-5-19二聚体克隆成Fab形式，表达并用蛋白L琼脂糖纯化。用受体分析评估Fabs(表4)。结果显示：TAR1-5-19和TAR1-5二聚体的中和作用水平与其起源的初始Gly4Ser连接子连接的二聚体相同。表达展示在CH和CK上的TAR1-5-19的TAR1-5-19 Fab，用蛋白L纯化并用受体分析评估。IC50结果约为1nM。
2.3TAR1-27二聚体
3×96个克隆是从包括所有库和所有筛选条件的第二轮选择中挑选的。制备2ml上清预产物以便用ELISA和生物分析法分析。抗原ELISA分析得到71个阳性克隆。粗制上清的受体分析得到42个具有抑制活性的克隆(TNF结合0-60％)。多数情况下抑制特性与强的ELISA信号相关。测定42个克隆的序列，其中39个有独特的第二dAb序列。进一步分析具有最好抑制活性的12种二聚体。
将12个中和作用的克隆表达在200ml上清预产物中，用蛋白L纯化。用蛋白L和抗原ELISA、Biacore和受体分析评价。在所有情况下获得强阳性ELISA信号。Biacore分析提示所有克隆具有快速Kon和Koff率(fast on and off rate)。与单体TAR1-27相比，Koff率(off rate)有所改进，然而TAR1-27二聚体的Koff率(Koff范围大约是10-1至10-2M)比先前测得的TAR1-5二聚体快(Koff率范围大约是10-3-10-4M)。纯化二聚体的稳定性令人怀疑，因此为了增加其稳定性，在两种TAR1-27二聚体(d2和d16)的纯化过程中添加5％甘油、0.5％Triton X100或0.5％NP40(Sigma)。NP40或Triton X100TM的加入能使纯化物产量提高约2倍。用受体分析评价所述两种二聚体。在所有纯化条件下，TAR1-27d2的IC50为～30nM。TAR1-27d16在不用稳定剂时纯化后无中和作用，但在稳定条件下纯化时，其IC50为～50nM。未进行进一步的分析。
2.4TAR2-5二聚体
3×96个克隆是从包括所有库和所有筛选条件的第二轮选择中挑选的。制备2ml上清预产物用于分析。对每块板进行蛋白A和抗原ELISAs分析。采用Biacore分析确定了30个感兴趣的克隆具有好的Koff率(Koff率范围介于10-2-10-3M之间)。对克隆测序，并通过测序分析确定了13个独特的二聚体。
表1：TAR1-5二聚体
  二聚体   细胞类型   纯化   蛋白级分   洗脱条件   受体/细胞分析
  TAR1-5d1   HB2151   蛋白L+FPLC   小的二聚体种类   0.1M甘氨酸pH2.5   RA～30nM
  TAR1-5d2   HB2151   蛋白L+FPLC   小的二聚体种类   0.1M甘氨酸pH2.5   RA～50nM
  TAR1-5d3   HB2151   蛋白L+FPLC   大的二聚体种类   0.1M甘氨酸pH2.5   RA～300nM
  TAR1-5d4   HB2151   蛋白L+FPLC   小的二聚体种类   0.1M甘氨酸pH2.5   RA～3nM
  TAR1-5d5   HB2151   蛋白L+FPLC   大的二聚体种类   0.1M甘氨酸pH2.5   RA～200nM
  TAR1-5d6   HB2151   蛋白L+FPLC   大的二聚体种类   0.1M甘氨酸pH2.5   RA～100nM
*注意，二聚体2和二聚体3具有相同的第二dAb(称为dAb2)，但具有不同长度的连接子(d2＝(Gly4Ser)3，d3＝(Gly4Ser)3)。dAb1是二聚体1、5和6中的伴侣dAb。dAb3是二聚体4中的伴侣dAb。伴侣dAb单独无中和作用。除非另外说明，FPLC纯化是通过阳离子交换。经FPLC获得的每个二聚体的最佳二聚体种类通过这些分析确定。
表2：TAR1-5-19二聚体
  二聚体   细胞类型   纯化   蛋白级分   洗脱条件   受体/细胞分析
  TAR1-5-19d1   top10F’   蛋白L   总蛋白   0.1M甘氨酸pH2.0   RA～15nM
  TAR1-5-19d2(无终止密码子)   top10F’   蛋白L   总蛋白   0.1M甘氨酸pH2.0+0.05％NP40   RA～2nM
  TAR1-5-19d3(无终止密码子)   top10F’   蛋白L   总蛋白   0.1M甘氨酸pH2.5+0.05％NP40   RA～8nM
  TAR1-5-19d4   top10F’   蛋白L+FPLC   FPLC  纯化的级分   0.1M甘氨酸pH2.0   RA～2-5nMCA～12nM
  TAR1-5-19d5   top10F’   蛋白L   总蛋白   0.1M甘氨酸pH2.0+NP40   RA～8nMCA～10nM
  TAR1-5-19d6   top10F’   蛋白L   总蛋白   0.1M甘氨酸pH2.0   RA～10nM
表3：TAR1-5-19同二聚体
  二聚体   细胞类型   纯化   蛋白级分   洗脱条件   受体/细胞分析
  TAR1-5-19 3U同二聚体   HB2151   蛋白L   总蛋白   0.1M甘氨酸pH2.5   RA～20nMCA～30nM
  TAR1-5-19 5U同二聚体   HB2151   蛋白L   总蛋白   0.1M甘氨酸pH25   RA～2nMCA～3nM
  TAR1-5-19 7U同二聚体   HB2151   蛋白L   总蛋白   0.1M甘氨酸pH2.5   RA～10nMCA～15nM
  TAR1-5-19 cys铰链   HB2151   蛋白L+FPLC   FPLC纯化的二聚体级分   0.1M甘氨酸pH2.5   RA～2nM
  TAR1-5-19CH/TAR1-5-19CK   HB2151   蛋白   总蛋白   0.1M甘氨酸pH2.5   RA～1nM
表4：TAR1-5/TAR1-5-19 Fabs
  二聚体   细胞类型  纯化   蛋白级分   洗脱条件   受体/细胞分析
  TAR1-5CH/dAb1 CK   HB2151  蛋白L   总蛋白   0.1M柠檬酸盐pH2.6   RA～90nM
  TAR1-5CH/dAb2 CK   HB2151  蛋白L   总蛋白   0.1M甘氨酸pH2.5   RA～30nMCA～60nM
  dAb3 CH/TAR1-5CK   HB2151  蛋白L   总蛋白   0.1M柠檬酸盐pH2.6   RA～100nM
  TAR1-5-19CH/dAb1 CK   HB2151  蛋白L   总蛋白   0.1M甘氨酸pH2.0   RA～6nM
  dAb1 CH/TAR1-5-19CK   HB2151  蛋白L   0.1M甘氨酸pH2.0   Myc/flag   RA～6nM
  TAR1-5-19CH/dAb2 CK   HB2151  蛋白L   总蛋白   0.1M甘氨酸pH2.0   RA～8nMCA～12nM
  TAR1-5-19CH/dAb3 CK   HB2151  蛋白L   总蛋白   0.1M甘氨酸pH2.0   RA～3nM
实施例7通过末端半胱氨酸键合二聚化dAb
概要
为了dAb二聚化，游离的半胱氨酸业已重组在蛋白的C-末端。当蛋白表达为二聚体时，可通过两步纯化法得到纯化。
TAR1-5-19CYS二聚体的PCR构建
见实施例8描述的dAb三聚体。三聚体的制备方法产生单体、二聚体和三聚体的混合物。
TAR1-5-19CYS二聚体的的表达和纯化
用蛋白L琼脂糖捕获法从培养上清中纯化二聚体，如实施例8所述。
从TAR1-5-19CYS二聚体中分离TAR1-5-19CYS单体
按照厂商指南操作，阳离子交换之前，采用PD-10柱(AmershamPharmacia)将混合的单体/二聚体样品缓冲交换入50mM乙酸钠缓冲液pH4.0中。然后将样品应用于已用50mM乙酸钠溶液pH 4.0平衡过的1mL Resource S阳离子交换柱中(Amersham Pharmacia)。采用以下的50mM乙酸钠pH 4.0中的盐浓度梯度分离单体和二聚体：
150至200mM氯化钠，经15个柱体积
200至450mM氯化钠，经10个柱体积
450至1000mM氯化钠，经15个柱体积
用SDS-PAGE鉴定只含有二聚体的级分，然后汇集，最后加入1/5柱体积的1M Tris pH 8.0将pH增加到8。
体外的功能结合分析：TNF受体分析和细胞分析
采用TNF受体和细胞分析法确定人TNFa二聚体的亲和力。受体分析中IC50大约为0.3-0.8nM；细胞分析中的ND50大约为3-8nM。
其他可能的TAR1-5-19CYS二聚体形式
PEG二聚体和常规合成的马来酰亚胺二聚体
Nektar(Shearwater)提供一系列双马来酰亚胺PEGs[mPEG2-(MAL)2或mPEG-(MAL)2]，其能使单体形成二聚体，二聚体具有一个小连接子将dAb分开，两个dAb均连接在大小为5至40KDa的PEG上。在TNF受体分析中，已显示5kDa的mPEG-(MAL)2(即，[TAR1-5-19]-Cys-马来酰亚胺-PEGx2，其中马来酰亚胺在二聚体中被连接在一起)的亲和力为～1-3nM。同样也可采用TMEA(Tris[2-马来酰亚胺乙基]胺(Pierce Biotechnology)或其他双功能连接子制备二聚体。
化学偶连方法用2，2’-二硫二吡啶(Sigma Aldrich)制备二硫化物二聚体和还原的单体也是可能的。
在dAb的C-末端加入多肽连接子或绞链
小连接子可以是(Gly4Ser)n，这里n＝1-10，例如1、2、3、4、5、6或7，也可以是一种免疫球蛋白(例如，IgG铰链区或随机肽序列(例如，从随机肽序列库中筛选的)，能重组在dAb和末端半胱氨酸之间。这可用于制备上述二聚体
实施例8dAb三聚作用
概要
为了dAb三聚化，在蛋白的C-末端需要游离的半胱氨酸。半胱氨酸残基一旦还原释放出游离硫醇，那么能用于特异性地偶连蛋白形成三聚的马来酰亚胺分子，例如：TMEA(Tris[2-马来酰亚胺乙基]胺)。
TAR1-5-19CYS的PCR构建
下列寡核苷酸用于特异性用SalI和BamHI位点PCR TAR1-5-19克隆以及引入C-末端半胱氨酸残基。
SalI
～～～～～～-
    Trp Ser Ala Ser Thr Asp＊Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1   TGG AGC GCG TCG ACG GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCT CTG TCT GCA TCT GTA
    ACC TCG CGC AGC TGC CTG TAG GTC TAC TGG GTC AGA GGT AGG AGA GAC AGA CGT AGA CAT
    Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Ser Tyr Leu His Trp
61  GGA GAC CGT GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT GAT AGT TAT TTA CAT TGG
    CCT CTG GCA CAG TGG TAG TGA ACG GCC CGT TCA GTC TCG TAA CTA TCA ATA AAT GTA ACC
    Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Glu Leu Gln
121 TAC CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT AGT GCA TCC GAG TTG CAA
    ATG GTC GTC TTT GGT CCC TTT CGG GGA TTC GAG GAC TAG ATA TCA CGT AGG CTC AAC GTT
    Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
181 AGT GGG GTC CCA TCA CGT TTC AGT GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC
    TCA CCC CAG GGT AGT GCA AAG TCA CCG TCA CCT AGA CCC TGT CTA AAG TGA GAG TGG TAG
    Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Val Trp Arg Pro
241 AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCT ACG TAC TAC TGT CAA CAG GTT GTG TGG CGT CCT
    TCG TCA GAC GTT GGA CTT CTA AAA CGA TGC ATG ATG ACA GTT GTC CAA CAC ACC GCA GGA
BamHI
～～～～～～～～
    Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Cys ＊＊＊＊＊＊Gly Ser Gly
301 TTT ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGG TGC TAA TAA GGA TCC GGC
    AAA TGC AAG CCG GTT CCC TGG TTC CAC CTT TAG TTT GCC ACG ATT ATT CCT AGG CCG
(*TAR1-5-19CYS序列的起始)
正向引物
5’-TGGAGCGCGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCA-3’
反向引物
5’-TTAGCAGCCGGATCCTTATTAGCACCGTTTGATTTCCAC-3’
PCR反应(50μL体积)如下建立：200μM dNTPs、0.4μM的各种引物、5μL的10x PfuTurbo缓冲液(Stratagene)、100ng的模板质粒(编码TAR1-5-19)、1μL的PfuTurbo酶(Stratagene)，用无菌水调节反应体积为50μL。使用以下PCR条件：初始变性步骤94℃达2分钟，然后进行以下25个循环：94℃达30秒、64℃达30秒和72℃达30秒。还包括最后的延伸步骤为72℃达5分钟。纯化PCR产物并用SalI和BamHI消化后，连接到经同样限制酶消化的载体上。采用DNA测序证实正确克隆。
TAR1-5-19CYS的表达和纯化
按照操作指南将TAR1-5-19CYS载体转化入BL21(DE3)pLysS化学处理的感受态细胞(Novagen)。使用100μg/mL羧苄青霉素和37μg/mL氯霉素选择携带dAb质粒的细胞。培养物建立在一个含有500ml极好肉汤(Sigma-Aldrich)、100μg/mL羧苄青霉素和37μg/mL氯霉素的2L带档板的烧瓶中。使培养物在30℃和200rpm下生长，直到O.D.600为1-1.5，然后用1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖(thiogalactopyranoside)，来自Melford Laboratories)诱导培养物。允许dAb在30℃条件下表达12-16小时。发现绝大多数dAb存在于培养基中。因此，离心(8,000xg，30分钟)分离培养基中的细胞，上清用于纯化dAb。在每升上清中加入30mL的蛋白L琼脂糖(Affitech)，使dAb间歇搅拌结合2小时。然后，在吸出上清前使树脂借重力沉淀1小时。然后将琼脂糖装入一个XK 50的柱(Amersham Phamacia)中，用10倍体积的PBS洗柱。用100mM甘氨酸pH 2.0洗脱结合的dab，然后加入1/5体积的1M Tris pH 8.0中和含有蛋白的级分。每升培养物上清中分离出20mg纯蛋白，其中单体和二聚体的比例为50∶50。
TAR1-5-19CYS的三聚化
用5mM二硫苏糖醇还原2.5ml的100μM TAR1-5-19CYS，室温放置20分钟。然后用PD-10柱(Amersham Pharmacia)缓冲交换。柱子已预先用5mM EDTA、50mM磷酸钠pH 6.5平衡，按照操作说明进行样品处理和洗脱。将样品置于冰上备用。TMEA(Tris[2-马来酰亚胺乙基]胺))购自Pierce Biotechnology。20mM TMEA的储存液在100％DMSO(二甲基亚砜)中制备。已发现TMEA浓度大于3∶1(dAb∶TMEA的摩尔比)时导致蛋白的快速沉淀和交联。同时随着pH的增加，沉淀和交联率也升高。因此，用100μM还原的TAR1-5-19CYS，加入25μM TMEA使蛋白三聚化，反应在室温下进行2小时。发现在偶联反应进行时加入添加剂如甘油或乙二醇至20％(v/v)，能明显降低三聚体的沉淀。偶联反应后，用SDS-PAGE分析显示在溶液中存在单体、二聚体和三聚体。
TAR1-5-19CYS的三聚体的纯化
每毫升TMEA-TAR1-5-19cys反应物中加入40μL的40％冰醋酸以使pH值降到～4。然后将样品应用于已用50mM乙酸钠液pH4.0预平衡过的1mL Resource S阳离子交换柱(Amersham Pharmacia)中。采用30个柱体积的50mM乙酸钠pH 4.0中340-450mM盐浓度梯度的氯化钠部分分离二聚体和三聚体。只含有三聚体的级分用SDS-PAGE鉴定，然后汇集并加入1/5体积的1M Tris pH 8.0将pH增加到8。为防止在浓缩步骤中三聚体发生沉淀(采用5K截留Viva旋转浓缩器；Vivascience)，样品中加入10％甘油。
体外功能的结合分析：TNF受体分析和细胞分析
采用TNF受体和细胞分析可测定三聚体与人TNFα的亲和力。受体分析中的IC50是0.3nM；细胞分析中的ND50范围在3至10nM(例如，3nM)之间(例如，3nM)。
其他可能的TAR1-5-19CYS三聚体形式
TAR1-5-19CYS也可采用下列试剂形成三聚体：
PEG三聚体和常规合成的马来酰亚胺三聚体
Nektar(Shearwater)提供一系列多臂PEG，其能化学修饰PEG末端。因此，采用一种在每个臂末端具有马来酰亚胺功能团的PEG三聚体使dAb发生三聚化，方式与前述的采用TMEA的方法相似。PEG还具有增加三聚体的溶解度的优点，可防止三聚体的聚集。因此，可生成一种dAb三聚体，其中每个dAb具有连接在马来酰亚胺功能团上的C末端半胱氨酸，马来酰亚胺功能团连接到PEG三聚体上。
在dAb的C-末端加入多肽连接子或铰链
小连接子可以是(Gly4Ser)n，其中n＝1-10，例如1、2、3、4、5、6或7，也可以是一种免疫球蛋白(例如，IgG铰链区或随机肽序列(例如，从随机肽序列库中筛选的)，能重组在dAb和末端半胱氨酸残基之间。当用于制备多聚合体(例如，二聚体或三聚体)时，这还能在单个单体间引入更大的弹性度和距离，这有助于改进对靶的结合特性，例如，如同人TNFα的多亚基靶。
实施例9.针对人血清白蛋白(HSA)和小鼠血清白蛋白(MSA)的单个区域抗体(dAb)的集合物的筛选
本实施例解释一种制备针对血清白蛋白的单个区域抗体(dAb)方法。描述了同时针对小鼠血清白蛋白(MSA)和人血清白蛋白(HSA)的dAb的筛选。在实验中利用了三种人噬菌体展示抗体库，每一种基于单个人VH框架(见图13：基于V3-23/DP47和JH4b的模拟VH的序列)或Vκ框架(见图15：基于o12/o2/DPK9和Jk1的模拟Vκ的序列)，具有纳入互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)的NNK密码子编码的侧链多样性。
库1(VH)：
多样性位于：H30，H31，H33，H35，H50，H52，H52a，H53，H55，H56，H58，H95，H97，H98.
库大小：6.2×109
库2(VH)：
多样性位于：H30，H31，H33，H35，H50，H52，H52a，H53，H55，H56，H58，H95，H97，H98，H99，H 100，H100a，H100b.
库大小：4.3×109
库3(Vκ)：
多样性位于：L30，L31，L32，L34，L50，L53，L91，L92，L93，L94，L96
库大小：2×109
VH和Vκ库已通过各自结合蛋白A和蛋白L属类配体预筛选，因此未选择库中的大多数克隆是功能性的。上述库大小与预筛选后的大小一致。
分别采用每一种库进行针对血清白蛋白的两轮筛选。每一轮筛选中，抗原用4ml PBS配成100μg/ml的浓度用于包被免疫管(nunc)。第一轮选择中，3种库的每一种针对HSA(Sigma)和MSA(Sigma)分别淘选(panned)。在第二轮选择中，来自6个第一轮选择的每一个的噬菌体针对(i)相同抗原(如：第一轮MSA，第二轮MSA)再一次被淘选和针对(ii)相互的抗原(如：第一轮MSA，第二轮HSA)被淘选，导致总共12次第二轮筛选。在每种情况下，第二轮选择后，鉴定48个克隆结合HSA和MSA的特性。可溶性dAb片段的制备按照Harrison et al，Methods Enzymol.1996；267：83-109所述的scFv片段方法进行，接着进行标准ELISA方法(Hoogenboom et al.(1991)Nucleic Acids Res.，19：4133)，只是用2％tween PBS作为封闭缓冲液，结合的dAb的检测既可用蛋白L-HRP(Sigma)(对于Vκ)又可以用蛋白A-HRP(Amersham Pharmacia Biotech)(对于VH)。
在ELISA不溶性形式中，针对单独结合塑料但全部对血清白蛋白呈特异性测试了dAb，该dAb产生了显示结合MSA、HSA或它们二者的高于背景的信号。然后对所述克隆测序(见表5)，提示确定了21个独特的dAb序列。筛选的VκdAb克隆之间最小相似度(氨基酸水平)为86.25％((69/80)×100；此是当所有多样化残基不同时的结果，例如：克隆24和34)。筛选的VH dA克隆之间最小相似度为94％((127/136)×100)。
接下来，根据能从溶液中捕获生物素化抗原的能力测定血清白蛋白结合dAb。遵循上述ELISA方法，不同的只是用1μg/ml蛋白L(对于Vκ克隆)和1μg/ml蛋白A(对于VH克隆)包被ELISA板。在该方法中，从溶液中捕获的是可溶性dAb，是用生物素化的MSA或HSA以及抗生物素蛋白链菌素HRP检测。根据操作说明制备生物素化的MSA和HSA，以达到获得每个血清白蛋白分子平均2个生物素分子的目的。鉴定出24个克隆能在ELISA中从溶液中捕获生物素化的MSA，表5。其中2个(以下的克隆2和38)也能捕获生物素化的HSA。接着，根据它们结合包被在CM5 Biacore芯片(chip)上的MSA的能力检测dAb。发现8个克隆能结合Biacore上的MSA。
表5
dAb(全部捕在                             Biacore 捕获生物
获生物素化                               中结合  素化的
的MSA)        H或κCDR1 CDR2 CDR3        MSA      HSA
Vκ库3模板
(模拟)        κ XXXLX XASXLQS QQXXXXPXT
                                            √所有4
2，4，7，41， κ SSYLN RASPLQS QQTYSVPPT    个都结合
                                            √两个都
38，54        κ SSYLN RASPLQS QQTYRIPPT    结合
46，47，52，56κ FKSLK NASYLQS QQVVYWPVT
13，15        κ YYHLK KASTLQS QQVRKVPRT
30，35        κ RRYLK QASVLQS QQGLYPPIT
19，          κ YNWLK RASSLQS QQNVVIPRT
22，          κ LWHLR HASLLQS QQSAVYPKT
23，          κ FRYLA HASHLQS QQRLLYPKT
24，          κ FYHLA PASKLQS QQRARWPRT
31，          κ IWHLN RASRLQS QQVARVPRT
33，          κ YRYLR KASSLQS QQYVGYPRT
34，          κ LKYLK NASHLQS QQTTYYPIT
53，          κ LRYLR KASWLQS QQVLYYPQT
11，          κ LRSLK AASRLQS QQVVYWPAT    √
12，          κ FRHLK AASRLQS QQVALYPKT    √
17，          κ RKYLR TASSLQS QQNLFWPRT    √
18，          κ RRYLN AASSLQS QQMLFYPKT    √
16，21        κ IKHLK GASRLQS QQGARWPQT    √
25，26        κ YYHLK KASTLQS QQVRKVPRT    √
27，          κ YKHLK NASHLQS QQVGRYPKT    √
55，          κ FKSLK NASYLQS QQVVYWPVT    √
VH库1(和2)
模板(模拟)H XXYXXX XIXXXGXXTXYADSVKG XXXX(XXXX)FDY
8，10     H WVYQMD SISAFGAKTLYADSVKG LSGKFDY
36，      H WSYQMT SISSFGSSTLYADSVKG GRDHNYSLFDY
在所有情况下，该框架结构与相应模拟序列中的框架结构相同，在CDRs中具有表5指出的多样性。
能结合Biacore芯片上MSA的8个克隆中，选择两个能在大肠杆菌中高表达的克隆(克隆MSA16和MSA26)以备进一步研究(参见实施例10)。图16中给出MSA16和26的核苷酸和氨基酸全长序列。
实施例10.
测定MSA结合dAbs MSA16和MSA26的亲和力和在小鼠体内的血清半衰期。
如US20060251644描述的，测定结合亲和力的一种普通方法是通过使用BiacoreTM表面等离振子共振系统(Biacore，Inc.)评价缔合和解离速率常数。根据制造商(Biacore)的说明书将生物传感器芯片活化以用于共价偶合靶。然后将该靶稀释，再注射在芯片上，以在固定物质的响应单元(RU)中获得信号。由于在RU中的信号与该固定物质的质量成比例，这表示在基质上固定的靶的密度的范围。将解离数据拟合成一-点模型，获得koff+/-s.d.(测定的标准偏差)。对每个缔合曲线计算假一级速率常数(Kd’s)，并绘制成蛋白浓度的函数，获得kon+/-s.e(拟合的标准误差)。结合的平衡解离速率常数Kd′s是由SPR测定计算的，为koff/kon。
dAbs MSA16和MSA26表达在大肠杆菌外周胞质中，用蛋白L-琼脂糖亲和树脂(Amtech，Norway)分批吸附法纯化，接着用pH 2.2的甘氨酸洗脱。然后用Biacore抑制分析纯化的dAb以确定Kd值。简言之，测试纯化的MSA16和MSA26以确定能在包被有高密度MSA的Biacore CM5芯片上获得200RUs反应时所需dAb的浓度。一旦所需dAb浓度确定，在预期Kd值左右范围浓度的MSA抗原预先与dAb混合并孵育过夜。然后在30μl/分钟的高流率测量每份预混合物中结合到包被在Biacore芯片上的MSA上的dAb。使用表面等离振子共振(SPR)和Biacore(Karlsson et al.，1991)测定亲和力。该Biacore系统(Uppsala，Sweden)是测定结合亲和力的优选方法。该Biacore系统使用表面等离振子共振(SPR，Welford K.1991，Opt.Quant.Elect.23：1；Morton and Myszka，1998，Methods inEnzymology 295：268)，以实时监测生物分子相互作用。Biacore分析可方便地得到缔合速率常数、解离速率常数、平衡解离速率常数和亲和力常数。结果曲线用于生成Klotz图(Klotz，I.M.(1982)Science 217：1247-1249和Klotz，I.M.(1983)J.Trends in Pharmacol.Sci.4：253-255)，得到估算的Kd为：200nM(对于MSA16)和70nM(对于MSA 26)(图17A和B)。
接着，将克隆MSA16和MSA26克隆入具有HA标记(核酸序列：TATCCTTATGATGTTCCTGATTATGCA，氨基酸序列：YPYDVPDYA)的表达载体中，以2-10mg的量表达在大肠杆菌中，用蛋白L-琼脂糖亲和树脂(Affitech，Norway)纯化上清，并用pH2.2的甘氨酸洗脱。测定dAb在小鼠体内的血清半衰期。将大约1.5mg/kg剂量的MSA26和MSA16单次静脉注射到CD1小鼠体内。用羊抗-HA(Abcam，UK)捕获和蛋白L-HRP(invitrogen)检测ELISA法分析血清水平，用4％Marve封闭。0.05％Tween PBS洗涤。用存在于1x小鼠血清中已知浓度的dAb建立标准曲线，以保证与实验样品的可比性。用2区室模型模拟显示MSA-26的t1/2α为0.16hr、t1/2β为14.5hr和曲线下面积(AUC)的465hr.mg/ml(资料未提供)，MSA-16的t1/2α为0.98hr、t1/2β的36.5hr和AUC为913hr.mg/ml(图18)。与HEL4(抗鸡卵白溶菌酶dAb)相比，两种抗-MSA克隆具有相当长的半衰期，其t1/2α为0.06hr，t1/2β为0.34hr。
实施例11.VH-VH和Vκ-Vκ双特异性Fab样片段的制备
本实施例描述一种制备VH-VH和Vκ-Vκ双特异性Fab样片段的方法。在构建所述每种Fab样片段之前，结合所选靶的dAb先从类似于实例9中描述的dAb库中选出。分离结合鸡卵溶菌酶(Sigma)的VH dAb即HEL4，同时分离结合TNFα受体(R和D系统)的第二VH dAb(TAR2h-5)。这些序列在序列列表中给出。通过筛选和亲和力成熟分离能结合TNFα(TAR1-5-19)的VκdAb，其序列也在序列列表中给出。描述于实施例9的第二VκdAb(MSA 26)在图17B中，其亦用于本试验。
用酶SalI和NotI消化包含上述4种dAb表达载体的DNA，以切除编码dAb的DNA。通过在琼脂糖凝胶上进行消化并切除该条带，接着通过用Qiagen凝胶纯化试剂盒(Qiagen，UK)进行凝胶纯化，以纯化预期大小的条带(300-400bp)。然后将编码dAb的DNA插入CH或Cκ载体载体中(图8和图9)，如表6所示。
表6
  dAb   靶抗原   dAb VH或dAb Vκ   插入载体  标记(C末端)   抗生素抗性
  HEL4   鸡卵溶菌酶   VH   CH  myc   氯霉素
  TAR2-5   TNF受体   VH   Cκ  flag   氨苄青霉素
  TAR1-5-19   TNFα   Vκ   CH  myc   氯霉素
  MSA 26   小鼠血清白蛋白   Vκ   Cκ  flag   氨苄青霉素
用VH CH和VH Cκ构建物共同转化HB2151细胞。另外，用VκCH和VκCκ构建物共同转化HB2151细胞。每一转染细胞系培养物过夜生长(含5％葡萄糖、10μg/ml氯霉素和100μg/ml氨苄青霉素的2×Ty，以维持对CH和Cκ质粒的抗生素选择性)。使用过夜培养物以接种新鲜培养基(2×Ty，10μg/ml氯霉素和100μg/ml氨苄青霉素)，生长直到OD值为0.7-0.9，然后添加IPTG以表达它们的CH和Cκ构建物。然后，用蛋白A纯化法(对于共同转化的VH CH和VH Cκ)和MSA亲和树脂纯化法(对于共同转化的VκCH和VκCκ)从外周胞质中纯化表达的Fab样片段。
VH-VH双特异性
用凝胶分离蛋白以测试VH CH和VH Cκ双特异性的表达。吸干凝胶，再通过myc标记和flag标记的Western印迹方法检测Fab片段的期望大小的条带，表明Fab样片段的VH CH和VH Cκ部分都存在。接着，为了测定双特异性的两半是否存在于同一Fab样片段中，用含3mg/ml鸡卵溶菌酶(HEL)的碳酸氢钠缓冲液4℃过夜包被ELISA板，100μl/孔。然后，用2％Tween PBS将板封闭(如实施例1所述)，接着与VH CH/VH Cκ双特异性Fab样片段孵育。用9e10(一种结合myc标记的单克隆抗体，Roche)和抗小鼠IgG-HRP(Amersham Pharmacia Biotech)检测双特异性物质通过非同源链(non cognatechain)与HEL的结合。VH CH/VH Cκ双特异性Fab样片段的信号是0.154，而单独表达的VH Cκ链的背景信号是0.069。这说明Fab样片段对靶抗原具有结合特异性。
Vκ-Vκ双特异性
在MSA亲和树脂上纯化共转化的VκCH和VκCκ双特异性Fab样片段后，所得蛋白用于探查包被有1μg/ml TNFα和包被有10μg/mlMSA的ELISA板。正如预期一样，当用蛋白L-HRP检测两种ELISA板时，出现高于背景的信号(数据未显示)。这表明蛋白片段能结合MSA(因此用MSA亲和柱纯化)，在接下来的ELISA中也能结合TNFα，从而确定了抗体片段的双特异性。这种蛋白片段后来用于两个后续实验。首先，用双特异性VκCH和VκCκFab样片段探查包被有1μg/ml TNFα的ELISA板，同时用能在ELISA上释放相同信号时测得浓度的TNFα结合dAb作为对照。在存在和不存在2mg/mlMSA时双特异性和对照dAb用于探查ELISA板。双特异孔中的信号减少大于50％，而地dAb孔中的信号一点没有减少(见图19a)。同样蛋白用于有和无MSA的受体分析中，也显示了MSA竞争(见图19c)。这表明MSA与TNFα竞争结合双特异性蛋白片段。
实施例12.具有对小鼠血清白蛋白和TNFα双特异性的cys连接的Vκ-Vκ双特异抗体的制备
本实施例描述了一种通过二硫键的化学偶联制备对小鼠血清白蛋白和TNFα特异性的双特异性抗体片段的方法。MSA16(来自实施例1)和TAR1-5-19 dAb被再克隆进入一个基于pET的有C末端半胱氨酸而无标记的载体中。两种dAb以4-10mg的水平表达，并用蛋白L-琼脂糖亲和树脂(Affitiech，Norway)从上清中纯化所述dAb。然后用二硫苏糖醇还原半胱氨酸标记的dAb。用二硫代二吡啶偶联TAR1-5-19 dAb，以阻止二硫键的重新合成导致PEP 1-5-19同二聚体的形成。然后在pH 6.5下混合两种不同的dAb，以促进二硫键的形成，并生成TAR1-5-19、MSA16 cys连接的异质二聚体。这种制备两种不同蛋白缀合物的方法最初由King等描述(King TP，Li Y Kochoumian L Biochemistry.1978 vol 17：1499-506 Preparationof protein conjugates via intermolecular disulfide bond formation)。通过阳离子交换从单体中分离异质二聚体。通过在SDS凝胶中存在预期大小的条带而确认分离。用TNF受体分析鉴定所得异质二聚体的种类，发现中和TNF的IC50大约为18nM。然后，用恒定浓度(18nM)的异质二聚体和一系列稀释的MSA和HSA重复进行受体分析。一定浓度范围内(高达2mg/ml)存在的HSA不会引起二聚体抑制TNFα的能力的降低。然而，MSA的加入导致二聚体剂量依赖地抑制TNFα的能力下降(图20)。这表明MSA和TNFα竞争结合cys连接的TAR1-5-19，MSA16二聚体。
数据总结
前面实施例中的试验中获得的数据总结见附件4。
实施例13.
结合来自一系列物种的血清白蛋白的dAb的筛选和表征。
抗人血清白蛋白、小鼠血清白蛋白和猪血清白蛋白的dAb是如前文针对抗-MSA dAb所述进行筛选的，不同之处是对方案作以下修改：合成VH区的噬菌体文库是文库4G和6G，其基于人VH3(该人VH3包含DP47胚系基因和针对VH的JH4片段)和人Vκ1(该人Vκ1包含DPK9胚系基因和针对Vκ的Jκ1片段)。所述文库包含1×1010个单个的克隆。一个VH和Vκ文库的亚组已经预筛选用于分别结合属类配体蛋白A和蛋白L，以便使未筛选文库中的大多数克隆功能化。上面所示文库的大小与预筛选之后的大小相符。
分别使用VH和Vκ文库在小鼠、猪和人血清白蛋白中进行两轮或三轮筛选。对于每一筛选，将抗原(i)在4ml的PBS中以100μg/ml的浓度包被在免疫管(nunc)中，或者(ii)生物素化(bitotinylated)然后用于溶解筛选物，接着捕获到抗生物素蛋白链菌素珠或neutravidin珠上。在每一情况下，在第二轮或第三轮筛选之后，来自该筛选的DNA被克隆到表达载体中以用于产生可溶性dAb，挑选单个的克隆。通过Harrison et al(Methods Enzymol.1996；267：83-109)针对scFv片段所述产生可溶性dAb片段，对于每一筛选，对于与一系列血清白蛋白的结合测试了96个可溶性克隆。
结合来自一系列物种的血清白蛋白的克隆的筛选是使用Biacore表面等离振子共振仪(Biacore AB)进行的。在流通池(flowcell)2至4的每一个中以高密度使CM-5 Biacore芯片包被来自不同物种的血清白蛋白。表现出与感兴趣的一种或多种血清白蛋白结合的dAb以50ml规模排序和表达，在蛋白L上纯化，然后在CM-5Biacore芯片上针对与血清白蛋白格板的结合以已知浓度进行筛选，该CM-5 Biacore芯片在流通池中包被低密度的血清白蛋白。发现有结合来自一系列不同物种的血清白蛋白的若干dAb，在表7中列出了优选的候选者，以及它们的结合模式。
表7
          HSA(亲和力，如  RSA(亲和力，  MSA(亲和犬(亲和力，
          果测定)         如果测定)     力，如果测定)如果测定)
DOM7h-9   结合200nM       结合          结合         结合
DOM7h-10  结合            ND            ND           ND
DOM7h-11  结合            结合          结合         结合
DOM7h-12  结合            ND            结合         结合
DOM7h-13  结合            结合          结合
          结合                          结合
DOM7h-14  38nM            结合          27nM         结合123nM
在本实验中，我们分离了结合HSA和来自一系列非人类物种的一种或多种的白蛋白的dAb。例如，我们发现了这样的dAb，它们结合(i)人和小，(ii)人和短尾猴，(iii)人和大鼠以及(iv)人、小鼠、大鼠和犬白蛋白。
实施例14.
大鼠和短尾猴的结合dAb/HA表位标签或dAb/myc表位标签融合蛋白的血清白蛋白的血清半衰期的测定以及血清半衰期的测定
使抗-短尾猴血清白蛋白dAb用大肠杆菌的外周胞质中的C-末端HA或myc标签表达，并使用对蛋白L-琼脂糖亲和树脂(Affitech，Norway)的批量吸收(对于Vk dAb)和对蛋白A亲和树脂的批量吸收(对于VH dAb)进行纯化，接着于pH 2.0用甘氨酸洗脱。为了测定血清半衰期，给予3只一组短尾猴猕猴单次i.v.注射2.5mg/Kg的DOM7h-9、DOM7h-11或DOM7h-14。经21天时间通过从股静脉或动脉连续放血获得血液样品，再从每一样品制备血清。通过夹层酶联免疫分析(sandwich ELISA)使用包被在ELISA板上的羊抗-HA(Abcam，Cambridge UK)或羊抗myc(Abcam，Cambridge UK)分析血清样品，接着用蛋白L-HRP检测。已知浓度的dAb的标准曲线是在短尾猴存在下以试验样品相同浓度建立的，以确保与测试样品的可比性。将用2隔室模型拟合双指数模型(使用kaleidograph软件(Synergy软件，PA，USA))用于计算t1/2β，见表8。
使抗-大鼠血清白蛋白dAb用大肠杆菌的外周胞质中的C-末端HA或myc标签表达，并使用对蛋白L-琼脂糖亲和树脂(Affitech，Norway)的批量吸收(对于Vk dAb)进行纯化，接着于pH 2.0用甘氨酸洗脱。然后使用以下方法用3H标记dAb：制备每蛋白一瓶：将300μL的NSP分散于该瓶中，再在≤30℃下和轻轻的的氮气流下除去溶剂。然后将残余物混悬于DMSO(100μL)中。将一整份的蛋白溶液(2.5mL)加至该DMSO溶液中，再在室温下将该混合物孵育60分钟。然后准确地将2.5ml的该溶液加载到预先平衡PD10柱(用25mL磷酸盐缓冲盐水，PBS)中，丢弃洗脱液。加入磷酸盐缓冲盐水(PBS，3.5mL)，收集洗脱液。这样得到标记的蛋白溶液，约为2mg/mL。测定该物质的比活性并视有效标记而定，立即使用该溶液或者在-20℃下保存直到需要用。
为了测定血清半衰期，给予4只一组的大鼠单次i.v.注射2.5mg/Kg的DOM7h-9、DOM7h-11、DOM7h-13或DOM7h-14。历经7天时间从尾静脉获得血液样品，并制备血浆。通过液体闪烁计数法测定3H的水平，根据试验开始时给予的蛋白的已知比活性计算每一样品的标记的蛋白浓度。将用2隔室模型拟合双指数模型(使用kaleidograph软件(Synergy软件，PA，USA))用于计算t1/2β，见表8。
表8
  药物   支架结构   t1/2β(犬)   t1/2β(大鼠)
  DOM7h-9   Vκ   3.8天   66小时
  DOM7h-11   Vκ   5.2天   61小时
  DOM7h-13   Vκ   未测定   73小时
  DOM7h-14   Vκ   6.8天   56小时
  DOM7r-3   Vκ   53小时
  DOM7r-16   Vκ   43小时
  药物   支架结构   t1/2β(犬)   t1/2β(大鼠)
  DOM7h-9   Vκ   3.8天   66小时
  DOM7h-11   Vκ   5.2天   61小时
  DOM7h-13   Vκ   未测定   73小时
  DOM7h-14   Vκ   6.8天   56小时
  DOM7r-3   Vκ   53小时
  DOM7r-16   Vκ   43小时
大鼠和短尾猴白蛋白的半衰期分别为53小时(试验确定)和7-8天(估计的)。从表8可见，大鼠中dAb DOM7r-3、DOM7h-9、DOM7h-11、DOM7h-13和DOM7h-14的半衰期达到大鼠白蛋白的半衰期或者与大鼠白蛋白的半衰期基本上相同。此外，可以看出短尾猴中的dAb DOM7h-11和DOM7h-14的半衰期达到短尾猴白蛋白的半衰期或者与短尾猴白蛋白的半衰期基本上相同。在大鼠和短尾猴中dAb DOM7h-14具有的半衰期与在两种物种白蛋白的半衰期基本上相同。
实施例15.表位绘图(Mapping)
人血清白蛋白的三个区域已在以前表达于毕赤酵母(DockalCarter and Ruker(1999)J.Biol.Chem.2000 Feb 4；275(5)：3042-50。我们使用毕赤酵母pPICZaA载体表达相同区域，并且要求在Mimetic Blue SA基质(供应商：Prometic Biosciences)上使它们纯化至同质性，图21。由dAb结合的血清白蛋白区域的鉴别是通过两种方法之一评价的，这两种方法是抗体区域免疫沉淀法和竞争Biacore。结果显示于以下图22和图23。
对于免疫沉淀分析，将1ml的表达HSA区域I、II或III的毕赤酵母上清液调节至pH7.4，再与1μg dAb和10μl的蛋白A或蛋白L琼脂糖(分别针对VH或VK dAb)混合。通过倒置将该混合物混合1小时，使复合物形成，然后将结合复合物的琼脂糖通过13,000xg离心10分钟回收，倾去上清液，再将沉积的物质用PBS洗涤一次，再通过离心回收。然后将珠子混悬到SDS-PAGE加样缓冲液中，该缓冲液含有二硫苏糖醇(DTT)，加热至70℃达10分钟，然后在4-12％NuPAGE SDS-PAGE凝胶(供应商：Invitrogen)上进行洗脱，再用SimplyBlue安全染料(safestain)染色。
对于竞争Biacore分析法，将纯化的dAb在pH7.4的HBS-EP中制成1μM，或者在pH5.0的50mM枸橼酸磷酸缓冲液、150mMNaCl中制成1μM，此时要求有7μM纯化的HSA区域。在CM5芯片表面以30μl/min的流速进行Biacore运行，该CM5芯片表面包被有500-1000RU的人血清白蛋白，空白对照池用于进行基线扣除。
表9
提供了对人血清白蛋白和人血清白蛋白区域特异性的dAb的列表，对它们进行了绘图(由免疫沉淀和/或Biacore测定)：
表9
  克隆   H/K  绘制的HSA区域
  DOM7h-1   K  区域II
  DOM7h-2   K  Nd
  DOM7h-6   K  Nd
  DOM7h-7   K  Nd
  DOM7h-8   K  区域II
  DOM7h-9   K  区域II
  DOM7h-10   K  Nd
  DOM7h-11   K  区域II
  DOM7h-12   K  区域II
  DOM7h-13   K  区域II
  DOM7h-14   K  区域II
  DOM7h-21   H  Nd
  DOM7h-22   H  区域I+III
  DOM7h-23   H  Nd
  DOM7h-24   H  Nd
  DOM7h-25   H  Nd
  DOM7h-26   H  Nd
  DOM7h-27   H  区域III
  DOM7h-30   H  区域III
  DOM7h-31   H  Nd
Nd：未测定
总之，大部分的dAb与HSA的第二区域结合，并且因此不期望与人血清白蛋白与FcRn的结合竞争。两个dAb(DOM7h-27和DOM7h-30)与区域III结合。
  dAb  结合的HSA区域   RU HSA结合，1μM，pH7.4   RU HSA结合，1μM，pH5.0  His，在CD R中
  DOM7h-1  II   600c   150  无
  DOM7h-3  NI   0   0
  DOM7h-4  NI   0   0
  DOM7h-8  II   1000   250  无
  DOM7h-9  II   150   0  CDR1
  DOM7h-11  II   250   0  CDR3
  DOM7h-12  IIa   55   0  无
  DOM7h-13  II   300   40  2，在CDR3中
  DOM7h-14  II   20   0  无
  DOM7h-22  I+IIIb   100c   0  CDR2
  DOM7h-27  III   50   0  无
  DOM7h-30  III   320   35  无
结合AlbudAbTM(特异性地结合血清白蛋白的dAb)的HSA的表位绘图以及在pH7.4和5.0处的Biacore数据的结果汇总。
实施例16在代谢物存在下体外筛选dAb
在它们约19天的寿命期内，白蛋白分子累积了暴露于血清中的其它化合物的作用。这些作用包括许多分子的结合，这些分子具有对白蛋白质的亲和力，其包括但优选不限于以混合的二硫化物保持的半胱氨酸和谷光苷肽、维生素B6、δ-bilurubin、血晶质、甲状腺素、长链和中链脂肪酸以及携带于ε-氨基基团上的葡萄糖。此外，代谢产物例如乙醛(一种在肝脏中的乙醇代谢的产物)、脂肪酸代谢产物、酰基葡萄糖醛酸苷和胆红素的代谢产物。此外，许多药物例如华法林，氟烷，水杨酸盐/酯、苯并二氮杂
Figure G2008800104821D01591
类和其它(综述于Fasano et al 2005，IUBMB Life))以及1-O-吉非贝齐-β-D-葡萄糖醛酸苷与血清白蛋白结合。
发现结合血清白蛋白的化合物倾向于在该白蛋白分子的某些位点结合，从而潜在地阻断这些结合其它分子AlbudAbsTM(一种dAb，其特异性地结合血清白蛋白)例如的位点。已经鉴定了针对许多配体的结合位点，主要的并且最充分表征的结合位点称为“Sudlow位点1”和“Sudlow位点2”。根据此命名法，位点1位于亚-区域IIA，并且结合华法林和其它药物，它们通常是庞大的、杂环阴离子分子。位点2位于亚区域IIIA，并结合具有扩展构象的、负电荷朝向一端的芳香族羧酸，例如立体典型位点2配体布洛芬。华法林和布洛芬二者的第二结合位点已分别鉴定于区域II和I上。还存在它们的其它结合位点和亚位点，表明在循环中，血清白蛋白与结合配体的复合物混合物存在，其亲和力在1×10-2M至1×10-8M间改变。例如油酸结合在SA上的7个位点上(J Mol Biol.2001；314：955-60)。
人血清白蛋白在与脂肪酸的复合物中结晶(Petitpas I，Grune T，Bhattacharya AA，Curry S.Nat.Struct Biol.(1998)5：827-35)。这些分子的结合位点位于SA表面周围的疏水裂缝处，呈不对称分布，尽管接近HSA分子对称性的3倍。最近，各种血清白蛋白的重组片段的应用已有助于更准确地指定形成结合位点的区域的贡献(例如：Protein Sci(2000)9：1455-65；J Biol Chem.(1999)274：29303-10)。来自SA的结合配体的取代在药物相互作用中发挥重要作用，例如华法林的半衰期随着其从SA中被乙醇取代而降低(J Biol Chem.(2000)275：38731-8)。其它药物对SA的亲和力是通过其它药物存在于其它结合位点而被减轻。例如，安定结合位点2增加了位点1对替诺昔康的亲和力，结果中结合中构象改变。这显著地影响了药物动力学性质(Fundam Clin Pharmacol.(1989)3：267-79)。
因此，对于结合AlbudAbTM(一种dAb，其特异性地结合血清白蛋白)的SA，期望选择一个不改变血清白蛋白对结合SA的药物的结合性质的SA。此外，当药物结合显示出改变SA的构象时，期望有一种AlbudAbTM(一种dAb，其特异性地结合血清白蛋白)，该AlbudAbTM在药物存在或缺乏时均结合SA。这些方法表明，有可能鉴别出一种AlbudAbTM(一种dAb，其特异性地结合血清白蛋白)，从而与关键药物无显著的阳性或阴性的药物相互作用。因此，本实施例描述了一种噬菌体筛选法，以鉴别dAb，该dAb在可能出现体内结合白蛋白的化合物和代谢产物存在的情况下结合血清白蛋白。噬菌体筛选法是在一种或若干代谢产物或化合物存在下进行的，所述代谢产物或化合物已知在体内与血清白蛋白相互作用。这些筛选法鉴别了AlbudAbTM(一种dAb，其特异性地结合血清白蛋白)，它们会以一种这样的方式结合血清白蛋白，即不太可能因代谢产物或其它化合物的存在而受到干扰。
实施例1中描述的噬菌体文库被如实施例1所述用于从包括人、短尾猴、大鼠和小鼠的一系列物种中的一种或多种中筛选抗白蛋白。用作抗原的白蛋白与实施例1中所述的白蛋白不同之处在于它与代谢产物或化合物预孵育过夜，所述代谢产物或化合物比该白蛋白本身高10-100倍浓度。这可以与单个化合物或代谢产物预孵育，或者可以与多于一种的化合物或代谢产物预孵育。具体地，可以存在化合物占据白蛋白位点I或位点II或者两者。代谢产物的这种浓度也存在于用于包被有抗原的免疫管的缓冲液中，以及存在于筛选关键步骤中使用的缓冲液中。存在代谢产物的步骤包括：用于阻断包被免疫管的抗原或者生物素化抗原的MPBS封闭缓冲液(对于溶液筛选)，以及噬菌体文库被阻断的缓冲液。在此方式下，当将阻断的噬菌体加至该免疫管或生物素化抗原时，代谢产物的浓度被维持。因此，在与白蛋白结合的噬菌体被筛选的整个筛选阶段，也存在这样的代谢产物，它们可在体内阻断白蛋白分子上的某些位点，与噬菌体竞争以结合和偏移感兴趣的那些dAb的筛选，该dAb结合白蛋白上不同于被代谢产物阻断的那些位点。
在另一组筛选中，在存在和不存在结合化合物或代谢产物的情况下进行抗血清白蛋白筛选的交替轮回。这确保了dAb能够在存在和不存在结合化合物被筛选的情况下结合血清白蛋白。在两种筛选方案中，有可能筛选能够替代结合血清白蛋白的药物的dAb，并且这可以通过测定AlbudAbTM(一种dAb，其特异性地结合血清白蛋白)替代结合药物的SA的能力来筛选。此类分析法对于小分子药物而言是充分确定了的，并且容易为此目的进行修改。本领域公知的许多方法可用于测定AlbudAbTM(一种dAb，其特异性地结合血清白蛋白)替代结合药物的SA的能力。这些方法范围为平衡透析法、基于固定配体或血清白蛋白的色谱法到NMR分析法。以下实施例描述了最简单的平衡透析法的应用。其它更多的技术上复杂的方法将给出基本上相同的信息。
血清白蛋白的溶液是在生理缓冲液中以确定的浓度制备的，该缓冲液例如20mM磷酸钠缓冲液、150mM NaCl，pH7.4。药物制备于类似缓冲液中，并且对其处理以便使它保持其原始生理性质，便将其放射标记，例如用氚或14C。结合抗体片段的血清白蛋白在类似缓冲液中以确定的浓度制备的。
将血清白蛋白溶液置于一系列试管中，再加入逐渐增加量的AlbudAbTM(一种dAb，其特异性地结合血清白蛋白)，使得在每一个试管中的血清白蛋白的浓度固定(例如为1％w/v，约150μM)，同时(一种dAb，其特异性地结合血清白蛋白)TM浓度范围在试管系列中为0至150μM。这包括一个试验组。
含有固定浓度的每一组放射标记的配体的透析管或容器加至试管中。适用的浓度范围为0.2至10mM，这取决于所用的配体、其亲和力和溶解度。
用于透析的膜的截留大小应为使得血清白蛋白和AlbudAbTM(一种dAb，其特异性地结合血清白蛋白)不会扩散通过，但放射标记的配体可自由扩散。3.5Kda的截留大小满足此目的。
将该混合物在固定温度例如37℃下搅拌一固定时间，使得放射标记的药物在两腔室间平衡，例如达5小时。此后应当达到平衡，这受AlbudAbTM(一种dAb，其特异性地结合血清白蛋白)结合血清白蛋白以抑制药物结合的能力的影响。
对两腔室取样，再使用闪烁计数器计数放射活性。结合配体的白蛋白的浓度可通过两腔室之间计数的差异来确定。化学计量的结合常数K’可根据方程K’＝b/c(p-b)算得，b为结合配体的平衡浓度，c为游离配体的平衡浓度，p为白蛋白的平衡浓度。这里假设1摩尔配体结合1摩尔血清白蛋白。
然后可以根据方程r/c＝nk-rk使用斯卡恰特作图法(Scatchardplot)测定结合数据，式中r是配体结合的白蛋白的分数(即b/p)，n是每一白蛋白分子的结合位点的数目，k该位点缔合常数。n和k的值可由r/c对r的曲线图确定。
当AlbudAbTM(一种dAb，其特异性地结合血清白蛋白)的结合阻断放射标记的配体结合时，这会影响配体的化学计量的结合常数以及针对该配体的结合位点的表观数目。可以预见，当AlbudAbTM(一种dAb，其特异性地结合血清白蛋白)在血清白蛋白表面的一个确定位点结合时，一些配体会在血清白蛋白上有多于一个的结合位点，不是所有的结合位点会被阻断。在AlbudAbTM(一种dAb，其特异性地结合血清白蛋白)特异性地结合复合血清白蛋白的药物并替代它的情况下，以及该药物具有低治疗指数并且结合血清的情况下，截止亲和力范围为10nM至100nM，该截止亲和力在能够代替结合药物的血清白蛋白的AlbudAbTM(一种dAb，其特异性地结合血清白蛋白)与不能够代替结合药物的血清白蛋白的AlbudAbTM(一种dAb，其特异性地结合血清白蛋白)之间是不同的。这种方法在以下论文中有示例：Livesey and Lund Biochem J.204(1)：265-272 Binding of branched-chain 2-oxo acids to bovine serumalbumin。
实施例17：通过CDR移植产生包含结合血清白蛋白的CTLA-4非-免疫球蛋白支架结构的双特异性配体
以下方式将dAb7h14的CDR区域用于构建结合人血清白蛋白的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)非-免疫球蛋白支架结构多肽：将dAb7h14的CDR1(RASQWIGSQLS；SEQ ID NO.：_)、CDR2(WRSSLQS；SEQ ID NO.：_)和CDR3(AQGAALPRT；SEQID NO.：_)序列移植到CTLA-4的可溶性截短突变体中，该突变体包含CTLA-4 V-样区域(如在WO 99/45110中描述的；任选为CTLA-4的一种基因工程化形式，例如其中A2和A3区域被删除)以替代原型CTLA-4氨基酸残基，该CTLA-4氨基酸残基在S1-S2环(BC环)中相应于CDR1(SPGKATE；SEQ ID NO.：_)，在S5-S6环中分别相应于CDR2(YMMGNELTF；SEQ ID NO.：_)和CDR3(LMYPPPYYL；SEQ ID NO.：_)(CTLA-4支架结构组合物和/或结合的细节参见WO 00/60070；WO 99/45110；Metzler et al.Nat.Struct.Biol.4：527-53；以及Nuttall et al.Proteins Struct.Funct.Genet.36：217-27，其全部以其整体通过引用并入本文)。用大部分单体可溶性蛋白的预期产物，进行此CLTA-4-衍生的多肽在基于pGC-、基于pPOW-或其它本领域认可的表达系统中的表达。检查此CTLA-4-衍生的多肽的蛋白溶解度，并且预期优于天然细胞外CTLA-4多肽。使用ELISA分析检查纯化的单体多肽是否特异性地结合人血清白蛋白，其与非特异性抗原比较，并且与用非特异性多肽移植的细胞外CTLA-4-衍生的多肽比较(例如，在CDR1环结构中生长抑素取代的)。通过Biacore进行实时结合分析，以评估人血清白蛋白是否特异性地结合固定的CTLA-4-衍生的多肽，该多肽包含dAb7h14的抗-人血清白蛋白CDR区域。(本领域技术人员理解，结合亲和力可使用任何适当的方法来评估，包括，例如标记的人血清白蛋白的沉淀法、竞争性Biacore分析法等)。任选地，CTLA-4抗-人血清白蛋白多肽的表达是使用接合重叠PCR以掺入对大肠杆菌表达优选的密码子调节编码序列而增强的。如果检测到无或者低人血清白蛋白亲和力(例如，Kd值为μM范围或更高)，则应用许多策略中的至少一种以改善CDR-移植的CTLA-4多肽的人血清白蛋白结合性质，包括以下任何有助于结合亲和力的方法。
通过诱变优选存在dAb7h14 CDR的CDR-移植的CTLA-4多肽的人血清白蛋白结合，任选与如下文所述的平行和/或迭代筛选方法和/或其它本领域已知的方法组合。使环绕移植的dAb7h14 CDR多肽序列的CTLA-4支架结构多肽区域经历随机的和/或NNK诱变，如上所述进行。此诱变是在CTLA-4多肽序列内在非-CDR氨基酸残基上进行的，目的是产生新的或改良的人血清白蛋白-结合多肽。任选地，使存在于CDR-移植的CTLA-4多肽中的dAb7h14 CDR多肽区域经历诱变，例如通过随机诱变、NNK诱变、透视(look-through)诱变和/或其它本领域认可的方法。任选将PCR用于进行此类诱变方法，导致CDR-移植的CTLA-4多肽中产生通过靶序列的序列多样性。此类方法类似于以下针对dAb文库产生所述的那些方法。除了随机诱变和/或透视诱变法以外，应用靶向的氨基酸残基的定向诱变，其中结构信息确立了特异性氨基酸残基对于人血清白蛋白的结合是关键的。
使包含如上面所述基因工程化的移植的dAb7h14 CDR序列的CTLA-4多肽进行平行和/或迭代筛选方法，以鉴别对人血清白蛋白结合是最优化的那些CTLA-4多肽。例如，根据dAb7h14 CDR-移植的CTLA-4多肽序列的文库的产生，将此多肽该文库展示于噬菌体上，并经历多轮要求血清白蛋白结合和/或增殖的筛选，正如下文针对血清白蛋白-结合来自dAb文库的dAb的筛选所述的。任选地，对固定在免疫管上的血清白蛋白或者在溶液中的抗生物素化的血清白蛋白进行筛选。任选地，结合亲和力的测定使用表面等离振子共振(SPR)以及应用Biacore系统(Uppsala，Sweden)的Biacore(Karlsson et al.，1991)，完全优化的CTLA-4-衍生的多肽理想地达到了人血清白蛋白结合亲和力Kd值在nM范围内或者更佳。
以下鉴定了结合人血清白蛋白的CTLA-4-衍生的多肽，然后通过下文所述任何方法使此类多肽用于生产双特异性配体组合物。
实施例18：通过血清白蛋白结合部分的筛选产生包含结合血清白蛋白的CTLA-4非-免疫球蛋白支架结构的双特异性配体
CTLA-4的可溶性截短的突变体包含天然的CTLA-4V-样区域(如WO 99/45110中所述；任选为一种CTLA-4的基因工程形式，例如其中删除了A2和A3区域)，并且其已被基因工程化以含有变异区域，使该突变体展示于文库中并经历筛选和任选的亲和力成熟技术以便产生人结合血清白蛋白的CTLA-4非-免疫球蛋白支架结构分子，以用于本发明的配体。
进行此CLTA-4-衍生的多肽在基于pGC-、基于pPOW-或其它本领域认可的表达系统中的表达。检查此CTLA-4-衍生的多肽的蛋白溶解度，并进行诱变以增强CTLA-4-衍生的多肽的相对于天然的细胞外CTLA-4多肽的溶解度。使用ELISA分析检查纯化的单体多肽是否任选特异性地结合人血清白蛋白，其与包含CTLA-4衍生的支架结构的非特异性单个可变区比较，并且与用非特异性多肽移植的细胞外CTLA-4-衍生的多肽比较(例如，在CDR1环结构中生长抑素取代的CTLA-4多肽)。通过Biacore进行实时结合分析，以评估人血清白蛋白是否特异性地结合固定的CTLA-4-衍生的多肽。任选地，CTLA-4抗-人血清白蛋白多肽的表达是使用接合重叠PCR以掺入对大肠杆菌表达优选的密码子调节编码序列而增强的。根据CTLA-4多肽对人血清白蛋白的无或者低结合亲和力的检测(例如，Kd值为μM范围或更高)，应用许多策略中的至少一种以赋予对CTLA-4多肽的人血清白蛋白结合性质，包括以下有助于结合亲和力的一种或多种方法。
通过诱变方法实现和优化人血清白蛋白结合的CTLA-4支架结构多肽，任选地组合了如下文所述的平行和/或迭代筛选方法和/或本领域已知的其它方法。使CTLA-4多肽区域经历随机和/或NNK诱变，如下文所述进行。此诱变是在完整的CTLA-4多肽上进行的，或者在CTLA-4多肽中的特异性序列上进行的，任选地靶向相应于CDR的氨基酸(例如，CDR1和/或CDR3序列是随机的，并使所得多肽经历筛选，例如，WO 99/45110的实施例6中所述的)。任选地，确定或预期结构上对CDR-样环存在重要的特异性氨基酸残基被靶向诱变。进行诱变特别是随机诱变，以便进化成新的或改良的人血清白蛋白-结合的多肽。任选将PCR用于进行此类诱变方法，导致CTLA-4多肽中产生通过靶序列的序列多样性。(此类方法类似于以下针对dAb文库产生所述的那些方法)。除了随机诱变方法，应用靶向的氨基酸残基的定向诱变，其中结构信息确立了CTLA-4多肽的特异性氨基酸残基对于人血清白蛋白的结合是关键的。
使如上面所述基因工程化的CTLA-4多肽进行平行和/或迭代筛选方法，以鉴别对人血清白蛋白结合是最优化的那些CTLA-4多肽。例如，根据诱变的CTLA-4多肽序列的文库的产生，将所述多肽文库展示于噬菌体上，并经历多轮要求血清白蛋白结合和/或增殖的筛选，正如下文针对血清白蛋白-结合来自dAb文库的dAb的筛选所述的。任选地，对固定在免疫管上的血清白蛋白或者在溶液中的抗生物素化的血清白蛋白进行筛选。任选地，结合亲和力的测定使用表面等离振子共振(SPR)以及应用Biacore系统(Uppsala，Sweden)的Biacore(Karlsson et al.，1991)，完全优化的CTLA-4-衍生的多肽理想地达到了人血清白蛋白结合亲和力Kd值在nM范围内或者更佳。
以下鉴定了结合人血清白蛋白的CTLA-4-多肽，然后通过下文所述任何方法使此类多肽用于生产双特异性配体组合物。
CTLA-4V-样区域
CTLA-4是非-免疫球蛋白配体的一个实例，其结合特异性结合配偶体，并且还包含V-样区域。这些V-样区域区别于抗体或T-细胞受体的那些，原因是它们没有与Fv-型分子连接在一起的倾向。此非-免疫球蛋白配体提供了一种备选的框架以用于开发新型的对靶分子有高亲和力的结合部分。单个区域V-样结合分子衍生自CTLA-4，其是可溶性的因此是需要的。
细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)在免疫应答中与T-细胞调节有关。CTLA-4是一种44Kda的同二聚体，其首先并且短暂地表达于活化的T-细胞表面，在此处其与抗原呈递细胞上的CD80和CD86表面抗原相互作用，以影响免疫应答的调节(Waterhouse et al.1996 Immunol Rev 153：183-207；van der Merwe et al.1997 J ExpMed 185：393-403)。每个CTLA-4单体亚单元是由N-末端细胞外区域、跨膜区域和C-末端细胞内区域组成。该细胞外区域包含N-末端V-样区域(VLD；约14Kda的与免疫球蛋白超家族同源的预计分子量)和一柄(stalk)使VLD与该跨膜区域连接的约10个残基。该VLD包含抗体V-区域的CDR-1、CDR-2和CDR-3相应的表面环(Metzler et al.1997 Nat Struct Biol 4：527-531)。最近对CTLA-4的结构和突变研究显示，与CD80和CD86的结合是通过VLD表面发生的，该VLD表面是从A′GFCC′V-样β-链(strand)形成的，还是从CDR3-样表面环中的高度保守的MYPPPY序列形成的(Peach et al.1994 J Exp Med 180：2049-2058；Morton et al.1996 J.Immunol.156：1047-1054；Metzleret al.1997 Nat Struct Biol 4：527-531)。CTLA-4单体之间的二聚作用是通过在该两柄的半胱氨酸残基(CYS120)之间的二硫键而发生的，其导致两个细胞外区域的圈合(tethering)，但在V-样区域之间无任何明显的直接缔合(Metzler et al.1997 Nat Struct Biol 4：527-531)。
在VLD中的CDR环结构的转换在以前已经显示会导致单体的产生、具有改变的结合特异性的正确的折叠分子以及改善的溶解度。因此，在某些实施方案中，产生了一个结合部分，该结合部分包含衍生自CTLA-4的至少一个单体V-样区域(VLD)，其中该至少一个单体V-样区域的特征在于，至少一个CDR环结构或其部分被修饰或取代，以致于与未修饰的VLD相比该修饰的VLD的溶解度得以改善。
在某些实施方案中，至少一个CDR环结构或其部分被修饰或取代，以致于(i)与未修饰的VLD中的相应CDR环结构相比该CDR环结构的大小增加；和/或(ii)该修饰或取代导致一个或多个CDR环结构内或之间形成二硫键。
在某些实施方案中，本发明提供了一种结合部分，其包含衍生自CTLA-4的至少一个单体V-样区域(VLD)，该至少一个单体V-样区域的特征在于，至少一个CDR环结构或其部分被修饰或取代，以致于(i)与未修饰的VLD中的相应CDR环结构相比CDR环结构的大小被改变；和/或(ii)该修饰或取代导致一个或多个CDR环结构内或之间形成二硫键。
在某些实施方案中，CDR环结构的大小增加了至少2个，更优选至少3个，更优选至少6个以及更优选至少9个氨基酸残基。在进一步的实施方案中，本发明该修饰的结合部分与未修饰的结合部分相比还表现出改变的结合亲和力或特异性。优选地，取代或修饰CDR环结构的作用减小或消除了VLD对一个或多个未修饰的VLD的天然配体的亲和力。优选地，取代或修饰CDR环结构的作用还改变了VLD的结合特异性(例如，产生结合人血清白蛋白的组合物)。因此，优选的是，该修饰的VLD结合特异性结合配偶体(例如，人血清白蛋白)，这与未修饰的VLD不同。
短语“VLD″是指与可变重链(VH)或可变轻链(VL)抗体具有相似结构性质的区域。这些相似的结构性质包括CDR环结构。
如本文使用的，术语″CDR环结构″是指表面多肽环结构或区域，如在抗体V-区域中的互补决定区。
应理解，本发明CTLA-4-衍生的结合部分可以化学或遗传性地偶合在一起，形成多价或多功能试剂。例如，将C-末端尾部添加到例如具有Cys′20的天然CTLA-4中会产生二聚体。本发明的结合部分还可与其它分子偶合以用于不同的组成，包括包含双特异性配体的那些。例如，所述的CTLA-4 VLD可包含C-末端多肽尾或者可以与抗生物素蛋白链菌素或生物素偶合。所述的CTLA-4 VLD还可以与放射性同位素、染料标记物或其它显像试剂偶合以用于癌症、血凝块等的体内检测和/或定位。所述的CTLA-4 VLD还可以通过偶合到不溶性装置和平台上而被固定，以用于诊断和生物传感器应用。
在本发明的某些实施方案中，使用细胞外CTLA-4V-样区域。CTLA-4V-样区域的一个或多个表面环并且优选CDR1、CDR2或CDR3环结构被多肽取代，该多肽具有对血清白蛋白的结合亲和力(例如，dAb7h14的CDR区域和从这里衍生的序列，如下文示例的)。可以理解，这些CTLA-4 VLD可以是多特异性的，具有由它们的自然表面和修饰的多肽环定向的亲和力。
CTLA-4 VLD的一个或多个CDR环结构可以被衍生自抗体的一个或多个CDR环结构取代。该抗体可衍生自任何物种。在优选实施方案中，该抗体衍生自人、大鼠、小鼠、骆驼、骆马或鲨鱼。CDR1和CDR3环结构可采用非-规范构象，其长度上是极其异源性的。该V-样区域还具有二硫键以使CDR1和CDR3环结构相互连接(在一些骆驼VHH抗体中发现)，或使CDR2和CDR3环结构相互连接(在一些骆马VHH抗体中发现)。
对于体内应用，优选的是VLD与治疗或诊断的受试者是同源的，并且除去任何可能的异种抗原。相应地，优选的是，用于临床应用的VLD分子天然存在的人免疫球蛋白超家族成员基本上是同源的。
结合CTLA-4多肽的血清白蛋白(例如，衍生自CTLA-4的VLD)可通过筛选对血清白蛋白有亲和力的结合部分而被优化，例如，包括筛选多核苷酸的文库以用于表达对血清白蛋白有亲和力的结合部分，其中该多核苷酸已经历诱变，导致在至少一个CDR环结构在至少一个VLD中修饰或取代，并且其中与分离的未修饰的VLD相比该分离的修饰的VLD的溶解度被改善。
本领域技术人员理解，在此亲和力筛选方法的情况下，随机或靶向诱变的任何方法可用于向该V-样区域中引入修饰。在优选实施方案中，该诱变靶向诱变。任选的，该靶向诱变与使用例如接合重叠或其它PCR技术取代至少一个CDR环结构中的至少一个序列有关。
本领域技术人员还理解，该多核苷酸文库可含有编码包含CDR环结构的VLD的序列，该CDR环结构与天然存在的免疫球蛋白中发现的CDR环结构基本上相同；和/或编码包含非-天然存在的CDR环结构的VLD的序列。任选地，该筛选方法包括将修饰的V-样区域如同基因III蛋白融合物展示在细菌噬菌体粒的表面。
该文库可包含细菌噬菌体载体，例如pHFA、fd-tet-dog或pFAB.5c，其含有编码该V-样区域的多核苷酸。该筛选方法还可包括将修饰的V-样区域展示在核糖体展示筛选系统中。
本发明优选的CTLA-4-衍生的血清白蛋白结合分子提供了以下优点：(i)天然人蛋白的应用消除了对重组分子后续人类化的需求，这是在人类治疗应用中保护抑制免疫系统应答通常需要的步骤；(ii)该区域如上面所述天然就是单体的(在C-末端尾部掺入残基Cys120，导致生成二聚体分子)；和(iii)结构修饰导致大肠杆菌表达水平改善。
天然CTLA-4结构的初始测定用于与抗体CDR1、2和3区域相应的区域的建模和预测。假设这些区域对突变或取代敏感而对分子框架基本上无影响，并且因此使正确折叠分子表达。发表的CTLA-4的结构(Metzler et al.1997 Nat Struct Biol 4：527-531)显示这些预测是准确的，尽管CDR1与配体结合位点有意想不到的分离，并且CDR3的广泛结合形成与配体结合面紧邻的平坦表面。
V-样区域提供了用于构建可溶性单个区域分子的基本框架，其中该分子的结合特异性可通过CDR环结构的修饰而被基因工程化。该V-样区域的基本框架残基可根据存在于骆驼科抗体中的结构特征而被修饰。骆驼重链免疫球蛋白与″常规″抗体结构不同之处在于其由VHH链组成(Hamers-Casterman et al.1993 Nature 363：446-448)。骆驼科(Cammelid)抗体由两条重链组成，每条重链包含一个VHH区域。一些独特的特征使得这些抗体克服了溶解性和不能存在足够大的抗原结合表面的双重问题。
首先，在暴露的框架残基上的一些非常规取代(大部分在自然界在两极是疏水性的)减小了疏水表面，同时保持了固有的β-片层框架结构(Desmyter et al.1996 Nat Struct Biol 3：803-811)。此外，在三个CDR环中，若干用于补偿抗原结合表面损失的结构特征通常是由VL区提供了。虽然CDR2环并非与其它VH区广泛不同，CDR1和CDR3环采取非-规范构象，它们在长度上是极其异源性的。例如，与在Ig分子中常见的五个相比，H1环可包含在2-8位残基上的任何地方。然而，该CDR3环显示出最大的变异：在17个骆驼抗体序列中报道的，此区域的长度变化为7至21个残基(Muyldermans et al.1994Protein Eng 7：1129-1135)。第三，许多骆驼科VHH区域具有二硫键，其在骆驼的情况下与CDR1和CDR3相互连接，在骆马的情况下与相互连接(Vu et al.1997 Molec.Immunol.34：1121-113)。此结构特征的功能表现为维持环稳定性并提供更多的波状轮廓(contoured)，与平面不同，环构象在抗原中结合袋蛋白(pockets)并产生增加的表面积。然而，并非所有的骆驼科抗体都具有此二硫键，表明这不是绝对的结构需求。
本发明还涉及一种用于产生和筛选对靶分子(例如，人血清白蛋白)具有新结合亲和力的单个VLD分子的方法。此方法包括将公知分子开发技术应用于CTLA-4-衍生的多肽。该方法可包括生产噬菌体或核糖体展示文库以用于筛选大量突变的CTLA-4-衍生的多肽。
丝状fd-细菌噬菌体基因组被基因工程化，使得在它们表面上的该噬菌体展示蛋白例如Ig-样蛋白(scFv、Fabs)，被是由包含在噬菌体中的DNA编码的(Smith，1985 Science 228：1315-1317；Huse et al.1989 Science 246：1275-81；McCafferty et al.，1990 Nature 348：552-4；Hoogenboom et al.，1991 Nucleic Acid Res.19：4133-4137)。蛋白分子可以展示在Fd细菌噬菌体的表面，与由基因III编码或者更少通用基因VIII的噬菌体衣壳蛋白共价偶合。抗体基因插入到该基因III衣壳蛋白中，每个噬菌体位于其末端产生3-5个重组蛋白分子。相反，抗体基因插入到该基因VIII中，每个噬菌体颗粒潜在地展示约2000个重组蛋白的复制物，然而这是一种多价体系统，它能掩饰单个展示蛋白的亲和力。还使用了Fd噬菌粒载体，因为它们能够容易从fd-细菌噬菌体表面的功能Ig-样片段的展示转变成在大肠杆菌中分泌可溶性Ig-样片段。具有基因III衣壳蛋白的N-末端的噬菌体-展示的重组蛋白融合物可能是由位于两个蛋白基因之间的琥珀(amber)密码子策略性制成的。在大肠杆菌的琥珀抑制基因种中，所得的Ig区域-基因III融合物在该噬菌体衣膜中变得被锚定。
基于蛋白亲和力的筛选方法可用于任何高亲和力结合试剂例如抗体、抗原、受体和配体(参见，例如，Winter and Milstein，1991Nature 349：293-299，其全部内容通过引用并入本文)。因此，偶合展示于细菌噬菌体上的最高亲和力结合蛋白的筛选，以回收编码该蛋白的基因。Ig-或非-Ig支架结构-展示噬菌体可通过结合到与珠子共价偶合的或以类似于ELISA或固相放射免疫分析法的方式被吸附到塑料表面的同源结合配偶体来筛选亲和力。虽然几乎任何塑料表面会吸附蛋白抗原，为此目的特别地制备了一些商用产品，例如Nunc免疫管。
核糖体展示文库包括在无细胞翻译系统中从头合成的并且展示在用于筛选目的的核糖体表面的多肽(Hanes and Pluckthun，1997Proc.Natl.Acad.Sci.USA.94：4937-4942；He and Taussig，1997 Nucl.Acids Res.25：5132-5134)。″无细胞翻译系统″包含核糖体、蛋白合成所需的可溶性酶类(通常来自与该核糖体相同的细胞)、转移RNAs、三磷酸腺苷、三磷酸鸟嘌呤核苷、三磷酸核糖核苷再生系统(例如磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸激酶)，以及合成由外源性mRNA编码的蛋白所需的盐和缓冲剂。可在保持完整的多核糖体的条件下进行多肽的翻译，即在核糖体、mRNA分子和翻译的多肽联合在单个复合物中的情况下。这有效地导致翻译的多肽的″核糖体展示″。对于筛选，与相应核糖体复合物缔合的该翻译的多肽与靶(例如，血清白蛋白)分子混合，该靶分子与基质(例如，Dynabeads)结合。展示翻译的多肽的核糖体会结合该靶分子，并且这些复合物可以被筛选，并使用RT-PCR扩增该mRNA。
尽管存在若干备选方法以修饰结合分子，用于所有展示蛋白的通用方法符合这样一种模式，在该模式中个别结合试剂通过与它们的同源配体和/或受体亲和力而选自展示文库。编码这些试剂的基因是通过许多体内和体外突变策略的任一种或组合来修饰的，并且构成为一种新的基因库以用于展示和筛选最高亲和力结合分子。
结合亲和力的评价
在某些实施方案中，针对靶向蛋白(例如，人血清白蛋白)的结合亲和力，评价了本发明的双特异性配体包括其组成分子(例如，结合人血清白蛋白的非-免疫球蛋白分子)。靶蛋白表位的结合可通过常规抗原结合分析法例如ELISA、基于荧光的技术包括FRET、或例如表面等离振子共振的技术来测定，该表面等离振子共振法测定分子的质量。抗原结合蛋白与抗原或表位的特异性结合可通过适宜的分析法来测定，所述分析法包括，例如Scatchard分析法和/或竞争结合分析法，例如放射免疫分析法(RIA)，酶免疫分析法如ELISA和夹层竞争分析法，以及它们的不同变型。
结合亲和力优选使用表面等离振子共振(SPR)和采用Biacore系统(Uppsala，Sweden)的Biacore(Karlsson et al.，1991)测定。该Biacore系统使用表面等离振子共振(SPR，Welford K.1991，Opt.Quant.Elect.23：1；Morton and Myszka，1998，Methods inEnzymology 295：268)，以实时监测生物分子相互作用，并且使用在玻璃支架上薄金膜表面光共振角的变化的表面等离振子共振，其为直到300nm远的表面折光系数的改变的结果。Biacore分析法可方便地生成缔合速率常数、解离速率常数、平衡解离速率常数和亲和力常数。结合亲和力是通过使用Biacore表面等离振子共振系统(Biacore，Inc.)评价缔合和解离速率常数而获得的。根据制造商(Biacore)的说明书将生物传感器芯片活化以用于靶的共价偶合。然后将靶稀释并注射在芯片上，以获得固定物质的响应单元(RU)的信号。由于在RU中的信号与固定物质的质量成比例，这代表了基质上的固定靶密度的范围。将解离数据拟合成一-位点模型(one-sitemodel)，以获得koff+/-s.d.(测定的标准偏差)。对每一缔合曲线计算假一级速率常数(Kd’s)，并以蛋白浓度的函数绘图，获得kon+/-s.e.(拟合的标准误差)。由SPR测定计算结合的平衡解离速率常数Kd′s，为koff/kon。
如Phizicky和Field在Microb.Rev.(1995)59：114-115中所述的，使适宜的抗原例如HSA固定在葡聚糖聚合物上的，并使含有针对HSA例如单个可变区的配体的溶液流过含有固定的HSA的池子。由固定的HSA保持的该单个可变区改变了碰撞光的共振角，导致由接近于葡聚糖聚合物的增加量的蛋白即单个可变区所引起的折射率改变。由于所有蛋白具有相同折射率，而且由于共振角变化和接近表面的蛋白浓度之间有线性相关性，可以测定在该表面由于蛋白/蛋白结合所致的蛋白浓度的变化，参见上面Phizicky和Field。为了测定结合常数，测定共振单元的增加为单个可变区蛋白溶液通过固定配体(HSA)直到RU值稳定的时间的函数，测定RU的降低为缺乏单个可变区的缓冲剂的时间的函数。在单个可变区蛋白的若干不同浓度下重复此操作。详细的理论背景和操作法由R.Karlsson，et.al.(991)J.Immunol Methods，145，229描述。
如上所述仪器软件生成平衡解离速率常数(Kd)。通过使用表面等离振子共振(SPR)测定的平衡解离速率常数描述于美国专利5,573,957，其基于dRA/dt和RA值的图表，其中在此实例中R是由在共振单元中的Biacore测定的HSA/单个可变区复合物，而dR/dt是HSA/单个可变区复合物形成比率，即结合曲线的导数；对若干不同浓度的单个可变区绘制dRA/dt对RA的图，接着绘制这些线对单个可变区浓度的斜率，该第二图的斜率即为缔合速率常数(M-1，s-1)。解离速率常数或者HSA和单个可变区相互释放时的速率可使用Biacore中生成的解离曲线测定。通过绘制和测定应答下降对时间曲线的log值的斜率，可以测定解离速率常数。平衡解离速率常数Kd＝解离速率常数/缔合速率常数。
本发明任一方面的配体包括这样的配体，其具有至少一个单个可变区或者由至少一个单个可变区组成，呈单体单个可变区的形式或者呈多重单个可变区的形式即多聚体。可以修饰该配体以含有另外的部分，例如融合蛋白或缀合物。这种多聚配体例如呈双特异性配体的形式，和/或这种包含单个可变区或由单个可变区组成的配体即可用于构建此类多聚配体的dAb单体，它们可以有利地与它们的同源靶解离，解离的Kd值为300nM或更小，300nM至5pM(即，3×10-7至5×10-12M)，优选50nM至20pM，或5nM至200pM或1nM至100pM，1×10-7M或更小，1×10-8M或更小，1×10-9M或更小，1×10-10M或更小，1×10-11M或更小；和/或Koff速率常数范围为5×10-1至1×10-7S-1，优选1×10-6至1×10-8S-1，优选1×10-2至1×10-6S-1，或5×10-3至1×10-5S-1，或5×10-1S-1或更小，或1×10-2S-1或更小，或1×10-3S-1或更小，或1×10-4S-1或更小，或1×10-5S-1或更小，或1×10-6S-1或更小，其由例如表面等离振子共振测定。Kd速率常数定义为Koff/Kon。优选地，单个可变区会特异性地结合靶抗原或表位，结合亲和力小于500nM，优选小于200nM，并且更优选小于10nM，例如小于500pM。
脂质运载蛋白
实施例19：通过筛选血清白蛋白结合部分生成包含结合血清白蛋白的脂质运载蛋白(Lipocalin)非-免疫球蛋白支架结构的双特异性配体
后胆色素结合蛋白(BBP)是一种衍生自大菜粉蝶(Pierisbrassicae)的脂质运载蛋白，该后胆色素结合蛋白(BBP)可通过组合蛋白设计而被整形，使它能识别人血清白蛋白。为了此目的，使天然BBP经达文库筛选，再任选地经过亲和力成熟，以便产生结合人血清白蛋白的BBP分子以用于本发明的双特异性配体。
天然BBP结合人血清白蛋白的能力最初是通过Biacore分析法确认的，如下文针对CTLA-4-衍生的多肽所述的。(本领域技术人员理解，结合亲和力可使用任何适宜的方法评价，所述方法例如，标记的人血清白蛋白的沉淀作用、竞争性Biacore分析法等)。在BBP对人血清白蛋白无或低结合亲和力(例如，Kd值在μM范围或更高)的检测之后，将诸多策略的至少一个用于使人血清白蛋白具有对BBP的结合性质，包括一种或多种促成结合亲和力的以下方法。
BBP和BBP-衍生的多肽的人血清白蛋白结合是通过诱变方法实现和优化的，任选地与如下文所述的平行和/或迭代筛选方法和/或本领域已知的其它方法组合。使BBP多肽区域经历随机和/或NNK诱变，如下文所述进行。此诱变是在完整的BBP(或BBP-衍生的)多肽上进行的，和/或是在BBP多肽中的特异性序列上进行的，包括鉴定为位于天然BBP结合位点中心处的16个氨基酸残基，其是通过8链β-桶(barrel)顶部的四个环形成的(Beste et al.1999 Proc.NatlAcad.Sci.USA 96：1898-903)。任选地，此诱变操作是随机的，以便演化为新的或改良的结合人血清白蛋白的多肽；可以在生成BBP过程中进行多轮诱变，所述BBP优选结合人血清白蛋白。任选将PCR用于进行此类诱变方法，导致通过BBP(或BBP-衍生的)多肽中的靶序列中生成序列多样性。(此类方法类似于下文针对dAb文库生成中所述的那些)。除了随机诱变方法以外，应用靶向的氨基酸残基的定向诱变，其中结构信息证实了BBP(或BBP-衍生的)多肽的特异性氨基酸残基对于人血清白蛋白的结合是关键的。
使如上面所述基因工程化的BBP(或BBP-衍生的)多肽进行平行和/或迭代筛选方法，以鉴别对于人血清白蛋白结合来说是最优化的那些BBP多肽。例如，在产生诱变处理的BBP多肽序列的文库之后，将所述多肽的文库展示在噬菌体上，再经过多轮要求血清白蛋白结合和/或增殖的筛选，正如下面从dAb的文库中筛选结合血清白蛋白的dAb所述的。任选地，对固定在免疫管上的血清白蛋白或者在溶液中的抗生物素化的血清白蛋白进行筛选。任选地，使用表面等离振子共振(SPR)以及采用Biacore系统(Uppsala，Sweden)的Biacore(Karlsson et al.，1991)测定结合亲和力，完全优化的BBP-衍生的多肽理想地达到了人血清白蛋白结合亲和力Kd值在nM范围或更好。
在鉴别结合人血清白蛋白的BBP多肽之后，然后通过下文所述任何方法使此类多肽用于生产双特异性配体组合物。
脂质运载蛋白支架结构蛋白
脂质运载蛋白(Pervaiz and Brew，FASEB J.1(1987)，209-214)是一个小的家族，通常是从各种有机体中分离的单体分泌蛋白，而且它们的生理作用在于保存或运输不同的配体，以及更为复杂的生物学功能(Flower，Biochem.J.318(1996)，1-14)。脂质运载蛋白显示出相对更小的相互序列相似性，并且首先通过X-射线结构分析阐明了它们发球相同蛋白结构家族(Sawyer et al.，Nature 327(1987)，659)。
已知空间结构的第一个脂质运载蛋白是视黄醇结合蛋白(Rbp)，其影响水不溶性维生素A在血清中的运输(Newcomer et al.，EMBOJ.3(1984)，1451-1454)。此后不久，测定了来自蝴蝶大菜粉蝶的后胆色素结合蛋白(Bbp)的三级结构(Huber et al.，J.Mol.Biol.195(1987)，423-434)。此类蛋白的基本结构特征是以这种脂质运载蛋白的空间结构来说明的。在脂质运载蛋白的折叠结构中的中央成分是圆柱状β-褶状片层结构，即所谓的β-桶，其由8个近似圆形排列的反向平行的β-链组成。
这种超级二级结构成分还可以认为是″夹层″-排列的两个四链β-片层结构。另外的结构成分扩展到多肽链的氨基末端的片段以及接近于羧基末端的α-螺旋，其本身接着有一个扩展片段。然而，这些另外的特征在所有脂质运载蛋白中显示是非必需的。例如，N-末端片段的重要部分在附睾视黄酸结合蛋白中缺失(Newcomer，Structure(1993)1：7-18)。另外的独特的结构成分也是已知的，例如膜锚着点(Bishop and Weiner，Trends Biochem.Sci.(1996)21：127)，其仅存在于某些脂质运载蛋白中。
β-桶在一端通过密集氨基酸包裹以及环片段而被闭合。在另一端，该β-桶形成结合袋，其中各个脂质运载蛋白的配体是复合的。各自以配对方式通过发夹结构连接的8个邻近的反向平行的β-链弯曲在多肽链中，它们与邻近的氨基酸一起各自形成环成分，所述邻近的氨基酸仍然部分位于圆柱状β-褶状片层结构的区域。配体的结合袋是通过这些总计四个肽环形成的。在Bbp的情况下，胆绿素Ixγ复合到此结合袋中。在Rbp以及β-乳球蛋白的情况下，脂质运载蛋白的另一典型配体是维生素A(Papiz et al.，Nature 324(1986)，383-385)。
例如在美国公开的No.20060058510中描述的，多肽的脂质运载蛋白家族的成员可用于生产一类称为“抗运载蛋白(anticalin)”的分子，该“抗运载蛋白”被设计用于通过氨基酸突变来识别新配体，所述氨基酸位于圆柱状β-褶状片层结构末端的四个肽环区域，并且所述氨基酸的特征在于它们以可测定的亲和力结合给定的配体(例如，人血清白蛋白)。
脂质运载蛋白的配体结合位点在结构上比免疫球蛋白的更为简单。脂质运载蛋白多肽仅包含8个反向平行的β-链中的一个环：β-桶。这种环状β-褶状片层结构在该脂质运载蛋白的蛋白折叠中是保守的。结合位点通过四个肽环形成于β-桶的入口区域，每个肽环与另一个连接两个邻近的β-链。这些肽环在它们的脂质运载蛋白家族的个别成员之间的结构中可能是非常显著的。
为了将脂质运载蛋白多肽用作非-免疫球蛋白支架结构，形成脂质运载蛋白的配体结合位点四个肽环中的一个或多个经历诱变，接着筛选，即筛选那些蛋白变异体(突变蛋白)，它们对给定配体表现出需要的结合活性。以此方式获得的脂质运载蛋白突变蛋白称为“抗运载蛋白”。
脂质运载蛋白的四个肽环，它们在抗运载蛋白产生期间通过诱变修饰了它们的序列，它们的特征在于在BBP的线性多肽序列中的那些片段包含Bbp的氨基酸位置28至45、58至69、86至99以及114至129位。这些序列片段的每一个在β-桶开放侧的一个保守β-链的C-末端之前开始，包括实际的肽发夹结构，并在该序列中紧接着的同样保守的β-链的N-末端之后结束。
序列比对或结构叠合使得赋予Bbp的序列位置指定到其它脂质运载蛋白。例如，与Peitsch and Boguski(New Biologist 2(1990)，197-206)的公开的比对相应的序列比对提示了ApoD的四个肽环包括氨基酸位置28至44、59至70、85至98和113至127。还可能在新的脂质运载蛋白中鉴别相应的肽环，其适用于以相同方式诱变。
在某些情况下，脂质运载蛋白的相对弱的序列同源性可能证明在保守β-链的测定中是有问题的。因此该多肽序列形成由8个反向平行的β-链组成的环状β-褶状片层结构的能力是极难的。这可以通过应用结构分析方法例如蛋白结晶学或多维核磁共振光谱学来测定。
在非-Bbp脂质运载蛋白中，例如ApoD或Rbp，适用于诱变的序列片段可以容易地比之于基于肽环个别变化结构的Bbp更长或更短。通过删除或插入一个或多个氨基酸来另外修饰序列片段的长度甚至可能是有利的。在某些实施方案中，与Bbp的序列位置34至37、58、60、69、88、90、93、95、97、114、116、125和127相应的那些氨基酸位置被突变。相应地，在ApoD的情况下，序列位置34至37，59，61，70，87，89，92，94，96，113，115，123和125优选用于诱变。然而，为了产生抗运载蛋白，并非以上所列的所有序列位置均要经历诱变。
其它脂质运载蛋白也适合作为潜在的用于产生抗运载蛋白的结构。优选地，使用所述的脂质运载蛋白Rbp、Bbp或ApoD，现已对它们的生物化学作了详尽的研究。人源脂质运载蛋白的应用对于产生抗运载蛋白而言是特别优选的。当应用所得的时抗运载蛋白，这种特别的应用计划用于人，因为例如在体内诊断或治疗应用中，与来自其它有机体的脂质运载蛋白相比，预期具有最低限度的免疫原性作用。然而，其它脂质运载蛋白以及可能迟早要发现的脂质运载蛋白对于产生抗运载蛋白可能证明是特别有益的。结构上等同于脂质运载蛋白的β-桶的具有折叠成分的人造蛋白也可被使用。
本发明优选的抗运载蛋白分子应当能够以可测定的亲和力结合需要的配体(例如，人血清白蛋白)，即以至少105M-1的亲和力常数结合。低于它的亲和力通常不再能用普通方法准确地测定，并且因此对于实际应用而言是次要的。特别优选的是抗运载蛋白，其以至少106M-1的亲和力结合需要的配体，该亲和力相对于复合物的解离常数为1μM。抗运载蛋白与需要的配体的结合亲和力可通过本领域技术人员经许多方法来测定，例如通过荧光滴定法、竞争ELISA或表面等离振子共振技术。
可以由本领域技术人员通过已知方法产生和克隆的脂质运载蛋白cDNA可以用作肽环诱变的起始点，其例如针对Bbp所述的(Schmidt and Skerra，Eur.J.Biochem.219(1994)，855-863)。另外，基因组DNA还可用于基因合成，或者可以进行这些方法的组合。为了诱变所述四个肽环中的氨基酸，本领域技术人员处理各种已知方法以用于位置-定向诱变或通过聚合酶链反应的方式诱变。例如，所述诱变方法的特征在于，合成寡脱氧核苷酸的混合物(其在需要的位置具有退化的基本组分)可用于诱导突变。核苷酸构建具有减少的碱基对特异性的封闭物例如肌苷的实现也是将诱变引导到筛选的序列片段或氨基酸位置中的选项。配体结合位点的诱变的操作法与抗体相比是简化了的，因为对于脂质运载蛋白来说，仅有四个而非六个序列片段-相对于四个上面提及的肽环-为此目的而作了处理。
在实现合成寡脱氧核苷酸的位置定向随机诱变的方法中，在脂质运载蛋白结构中的被突变的相关氨基酸位置可以预先测定。待突变的理想筛选的氨基酸位置可一方面取决于所用的脂质运载蛋白，另一方面取决于需要的配体(例如，人血清白蛋白)。它可用于使单个试验中突变的氨基酸位置总数保持足够低，以致于由所述诱变获得的变异体的采集(即所谓的文库)可以为其总数，或者至少为从其中典型筛选的，不但在编码核酸的水平而且在基因产物的水平上其组合复杂性均可以认为尽可能完全。
当结构信息存在与所使用的脂质运载蛋白本身有关时，如在BBP和Rbp的情况下；或者至少与具有相似结构的脂质运载蛋白有关时，如在ApoD的情况下，可能以有意义的方式筛选待突变的氨基酸位置。氨基酸位置筛选的设定可进一步取决于需要的配体的性质。将在配体结合袋中的区域单个氨基酸位置排除诱变也可证明是有利的，只要这些例如证明对于蛋白的折叠效率或折叠稳定性是必要的。脂质运载蛋白诱变的基于特异性寡核苷酸的方法已描述在例如美国公开No.20060058510中，其全部内容通过引用并入本文。
在表达编码核酸序列经历诱变之后，携带用于结合给定配体(例如，人血清白蛋白)的抗运载蛋白的遗传信息的克隆可以选自所获得的文库的不同克隆。已知的表达策略和筛选策略可以作为这些克隆筛选的工具。这一种类的方法已描述于重组抗体片段的产生或基因工程化的背景中，例如″噬菌体展示″技术或″克隆筛选″方法(Skerraet al.，Anal.Biochem.196(1991)，151-155)。
″噬菌体展示″技术的描述已发现于例如：Hoess，Curr.Opin.Struct.Biol.3(1993)，572-579；Wells and Lowman，Curr.Opin.Struct.Biol.2(1992)，597-604；和Kay et al.，Phage Display ofPeptides and Proteins--A Laboratory Manual(1996)，Academic Press。简而言之，在示例性的实施方案中，生产了噬粒，其影响突变的脂质运载蛋白结构基因作为融合蛋白的表达，该融合蛋白在N-末端具有信号序列优选OmpA-信号序列，并且具有噬菌体M13的衣壳蛋白pIII(Model和Russel，在″The Bacteriophages″，Vol.2(1988)，Plenum Press，New York，375-456中)或此衣壳蛋白的片段，其在C-末端掺入噬菌体衣壳中。噬菌体衣壳蛋白的C-末端片段ApIII仅含有天然衣壳蛋白pIII的氨基酸217至406，被优选用于产生融合蛋白。特别优选的是来自pIII中的C-末端片段，其中在位置201处的半胱氨酸残基缺失或被另一氨基酸取代。可用于脂质运载蛋白以产生具有特异性结合性质的“抗运载蛋白”的噬菌体展示方法、筛选方法等的其它描述例如详见于美国公开No.20060058510，其全部内容通过引用并入本文。
例如使用上述方法鉴别和产生对给定配体(例如，人血清白蛋白)具有高亲和力的抗运载蛋白。抗运载蛋白可达到大于106M-1的配体结合常数，甚至是在新配体无论对胆绿素IXγ，Bbp的原始配体(参见美国公开No.20060058510)都不具有结构相关性。新配体与抗运载蛋白可达到的此种亲和力与已知是对来自二次免疫应答的抗体的亲和力具有可比性。此外，还可能存在使抗运载蛋白经历产生出进一步任选的部分随机诱变，以便从由此获得的亲文库中筛选具有甚至更高亲和力的变异体。对于重组抗体片段的情况，为了″亲和力成熟″的目的已经描述了相应的操作法(Low et al.，J.Mol.Biol.260(1996)，359-368；Barbas and Burton，Trends Biotechnol.14(1996)，230-234)，并且也可以相应方式由本领域技术人员用于抗运载蛋白。
葡萄球菌性蛋白A(SPA)/亲合体
实施例20：通过筛选血清白蛋白结合部分产生包含结合血清白蛋白的亲合体(葡萄球菌性蛋白A(SPA))非-免疫球蛋白支架结构的双特异性配体
使葡萄球菌性蛋白A(SPA)的Z区域经历文库筛选和任选的亲和力成熟技术，以便产生结合人血清白蛋白的SPA-衍生的非-免疫球蛋白支架结构分子(称为“亲合体”)，以用于本发明确规定双特异性配体。
执行Biacore的实时结合分析以评价人血清白蛋白是否特异性地结合固定的SPA多肽。(本领域技术人员理解，可以使用任何适宜的方法评价结合亲和力，包括，例如，标记的人血清白蛋白的沉淀作用、竞争性Biacore分析法等)。在未改变的SPA多肽对人血清白蛋白的无或低结合亲和力(例如，Kd值在μM范围或更高)的检测之后，许多策略中的至少一项可用于赋予人血清白蛋白对SPA多肽的结合性质，包括一个或多项以下设计用于赋予和/或增强该分子对靶抗原的结合亲和力的方法。
通过诱变方法实现和优化人血清白蛋白结合的SPA支架结构多肽，任选地组合了如下文所述的平行和/或迭代筛选方法和/或本领域已知的其它方法。SPA支架结构多肽区域经历随机和/或NNK诱变，如下文所述进行。此诱变是在完整的SPA多肽的Z区域上进行的，或者在SPA多肽中的特异性序列上进行的，例如，在区域Z的13个溶剂可及表面残基上，如Nord et al.(1997 Nat.Biotechnol.15：772-77)所鉴定的，并且任选是随机的，以便演化为新的或改良的结合人血清白蛋白的多肽。PCR任选用于执行此类诱变方法，导致SPA多肽中产生通过靶序列的序列多样性。(此类方法类似于以下针对dAb文库产生所述的那些方法)。除了随机诱变方法以外，应用靶向的氨基酸残基的定向诱变，其中结构信息证实了SPA多肽的特异性氨基酸残基对于人血清白蛋白的结合是关键的。在某些实施方案中，突变体Z区域基因所有组分被组装并插入到噬菌粒载体以适合于单价噬菌体展示。包含例如数百万转化体的文库是使用例如NN(G/T)或用于诱变的备选的(C/A/G)NN简并来构成的。
使如上面所述基因工程化的SPA多肽进行平行和/或迭代筛选方法，以鉴别对于人血清白蛋白结合来说是最优化的那些SPA多肽。例如，在产生诱变处理的SPA多肽序列的文库之后，将所述多肽的文库展示在噬菌体上，再经过多轮要求血清白蛋白结合和/或增殖的筛选，正如下面从dAb的文库中筛选结合血清白蛋白的dAb所述的。
对人血清白蛋白靶蛋白进行生物淘洗以实现对血清白蛋白结合SPA分子的显著富集。接着使筛选的克隆表达于大肠杆菌中，并通过SDS-PAGE、圆二色谱法以及通过生物特异性相互作用分析对人血清白蛋白进行结合研究来进行分析。结合人血清白蛋白的该SPA分子(亲合体)预期具有类似于天然Z区域的二级结构，并且对它们的各自靶具有微摩尔解离常数(Kd)，范围为μM或更好(例如，nM或pM)。
任选地，对固定在免疫管上的血清白蛋白或者在溶液中的抗生物素化的血清白蛋白进行筛选。任选地，使用表面等离振子共振(SPR)以及采用Biacore系统(Uppsala，Sweden)的Biacore(Karlssonet al.，1991)测定结合亲和力，完全优化的SPA-衍生的多肽理想地达到了人血清白蛋白结合亲和力Kd值在nM范围或更好。
在鉴别结合人血清白蛋白的SPA多肽之后，然后通过下文所述任何方法使此类多肽用于生产双特异性配体组合物。
葡萄球菌性蛋白A(SPA)亲合体多肽
细菌受体的溶剂暴露表面可被靶向随机诱变接着进行为呈递目的的表型筛选，例如，血清白蛋白与此类受体分子的结合亲和力。此类蛋白可以是非常稳定的，这使得它们适用于各种应用(Alexander et al.(1992)Biochemistry 31：3597-3603)。具体地，对于含有螺旋管束结构的细菌受体，该构象有望能耐受不与螺旋包裹接口有关的残基侧链的变化。此类分子的实例是相对较小(58个残基)的葡萄球菌性蛋白A(SPA)的IgG-结合区域B以及区域B的合成类似物，命名为区域Z(Nilsson et al.(1987)Protein Engineering 1：107-113)。
为了构建具有新颖结合性质的区域变异体的目的，SPA-衍生的区域Z是用作支架结构的SPA的主要区域(参见，例如，WO00/63243和WO 95/19374，通过引用以其全部内容并入本文)。该SPAZ区域是无半胱氨酸的三-螺旋管束区域的58个氨基酸残基，其用作支架结构以用于构建组合噬菌粒文库，使用噬菌体展示技术从该文库筛选靶向需要的分子(例如，人血清白蛋白)的变异体(Nilsson etal.1987 Protein Eng.1：107-113；Nord et al.1997 Nat.Biotechnol.15：772-777；Nord et al.2000 J.Biotechnol.80：45-54；Hansson et al.1999 Immunotechnology 4：237-252；Eklund et al.，2002 Proteins 48：454-462；
Figure G2008800104821D01831
et al.2002Eur.J.Biochem.269：2647-2655)。筛选此类称为“亲合体”分子的靶结合变异体作为结合剂，以通过组合文库的噬菌体展示靶向蛋白，在该组合文库中，在Z区域中的螺旋1和2表面上典型的13个侧链(Q9，Q10，N11，F13，Y14，L17，H18，E24，E25，R27，N28，Q32和K35)已被随机化(Lendel et al.2006 J.Mol.Biol.359：1293-304)。此类亲合体分子的简单、稳定的结构以及它们的低分子量(7Kda)使得它们适用于广泛的用途。被证明的效能已显示于生物过程-和试验室-规模生物分离技术(Nord et al.2000J.Biotechnol.80：45-54；Nord et al.2001 Eur.J.Biochem.268：4269-4277；et al.2002 J.Biotechnol.99：41-50)，并且在评价亲合体配体作为检测试剂时获得了有希望的结果(
Figure G2008800104821D01833
and Nygren 2001 Anal.Biochem.295：22-30；
Figure G2008800104821D01834
et al.2002 J.Immunol.Methods 261：199-211)，以设计腺病毒趋向性(Henning etal.2002 Hum.Gene Ther.13：1427-1439)以及抑制受体相互作用(
Figure G2008800104821D01835
et al.2003 Protein Eng.16：691-697)。因此，基因工程化的亲合体配体例如结合人血清白蛋白的那些是本发明的某些双特异性配体组合物所需要的组分。
衍生自葡萄球菌性蛋白A的Z区域的多肽的文库可由本领域已知的和/或如下文描述的任何诱变方法来产生。在产生此类多肽文库之后，能够结合需要的靶分子(例如，人血清白蛋白)的变异体可以使用例如体外筛选技术例如噬菌体展示(Dunn 1996；Smith andPatrenko 1997；Hoogenboom et al.1998)、核糖体展示(Hanes andPluckthun 1997；He and Taussig 1997)、肽披质粒(Schatz 1993)或细胞展示(Georgiou et al.1997)而被有效地筛选和鉴别。对于此类筛选，文库大小(复杂性)与更高亲和力(KD＝10-8M或更低)的分离结合剂的相似性之间的关系已作了理论上的考虑(Perelson and Oster1979)和试验上的证明(Griffiths et al.1994；Vaughan et al.1996；Aujame et al.1997)。
亲合体比传统抗体具有若干优点，例如(i)制备成本更低；(ii)更小的尺寸；(iii)增加的稳定性和稳健性；和(iv)能够在细菌宿主中产生重组体，或者通过化学合成，其避免了病毒污染的风险。
亲合体是一种多肽，其是葡萄球菌性蛋白A(SPA)区域的衍生物，所述SPA区域是B或Z区域，其中许多氨基酸残基已被其它氨基酸残基取代，所述取代基本上未损失所述SPA区域的基本结构和稳定性，并且所述取代导致了所述多肽与靶抗原(例如，人血清白蛋白)的至少一个区域的相互作用能力。取代的氨基酸残基的数目可以为1至约30个，或者1至约13个。其它可能的范围为4至约30个；4至约13个；5至约20，或者5至约13个氨基酸残基。熟练技术人员将会理解，例如，根据Nord et al.1997 Nat.Biotechnol.15：772-777，位于Z-区域表面的优选氨基酸残基可以被取代，同时管束的核心将保持不变，以保持该分子的结构性质。
制备亲合体的方法描述于例如WO 00/63243中，为本发明目的可包括例如以下步骤：(i)展示，通过例如噬菌体展示(综述参见例如Kay，K.et al.(eds.)Phage Display of Peptides and Proteins：ALaboratory Manual，Academic Press，San Diego，ISBN 0-12-402380-0)、核糖体展示(综述参见例如Hanes，J.et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：14130-14135)或细胞展示(综述参见例如Daugherty，P.S.et al.(1998)Protein Eng.11：825-832)，使来自蛋白文库的多肽变异体体现出衍生自SPA区域B或Z的多肽变异体的组成成分；(ii)筛选结合人血清白蛋白的表达多肽的克隆；和(iii)通过所选克隆的重组表达或通过化学合成产生多肽。
Avimer
实施例21：通过CDR移植产生包含结合血清白蛋白的Avimer的双特异性配体
以下方式将dAb7h14的CDR区域用于构建结合人血清白蛋白的avimer多肽。将dAb7h14的CDR1(RASQWIGSQLS；SEQ IDNO.：_)、CDR2(WRSSLQS；SEQ ID NO.：_)和CDR3(AQGAALPRT；SEQ ID NO.：_)序列分别移植到C2单体(描述于美国专利公开No.2005/0221384，其分部内容通过引用并入本文)的残基17-28、49-53和78-85处，其分别构成C2单体的环区域1、2和3。通过Biacore进行实时结合分析，以评价人血清白蛋白是否特异性地结合包含dAb7h14的抗-人血清白蛋白CDR区域的固定的C2-衍生的单体多肽。(本领域技术人员理解，结合亲和力可使用任何适宜方法来评价，包括，例如，标记的人血清白蛋白的沉淀作用、竞争性Biacore分析法等)。如果检测到无或低人血清白蛋白亲和力(例如，Kd值在μM范围或更高)，许多策略中的至少一项可用于改善CDR-移植的C2单体(和/或avimer二聚体、三聚体和其它更高级重复组合物的那些)的人血清白蛋白结合性质，包括有助于结合亲和力的任何下列方法。
通过使用连接子多肽调节初始C2单体多肽(和/或迭代产生的avimer二聚体、三聚体等多肽的那些)的dAb7h14 CDR-移植的区域的长度所述dAb7h14 CDR-移植的区域相应于天然C2单体(和/或在用于avimer组合物中的其它天然单体)中的溶剂暴露的环区域。例如，dAb7h14的9个氨基酸残基CDR3肽序列可使用氨基酸连接子延长到13个氨基酸残基的长度，其中该氨基酸连接子为，例如，位于dAb7h14 CDR3多肽序列的N-或C-末端侧面之一或二者的长度为0至4个残基的氨基酸连接子，从而在相应于C2单体多肽的环的CDR3移植的区域中达到总共移植肽序列长度为13个氨基酸。这种连接子多肽的应用连接子序列、CDR序列和/或非-CDR C2单体多肽序列的诱变组合(例如，使用如下面所述的诱变优化操作法)，以便改善CDR-移植的C2单体多肽的人血清白蛋白结合能力(例如，通过优化CDR-移植的C2单体多肽中的CDR和C2单体多肽序列)。用于此目的的多肽连接子具有预定的序列，或者，任选地，选自通过含连接子的CDR-移植的C2单体多肽的人血清白蛋白结合能力的评价的随机多肽连接子序列群组。优化方法是平行和/或迭代进行的。平行和迭代优化(例如，亲和力成熟)方法应用如下文所述的筛选方法和/或本领域已知可用于优化多肽结合性质的筛选方法。
通过诱变优化人血清白蛋白结合的出现dAb7h14 CDR的CDR-移植的C2单体多肽(和/或二聚体、三聚体等迭代产生的更高级组合物的那些，或者个别另外的单体促成的那些)，任选地组合了如下文所述的平行和/或迭代筛选方法和/或本领域已知的其它方法。对于示例性的C2单体支架结构多肽，使环绕移植的dAb7h14 CDR多肽序列的区域经历随机的和/或NNK诱变，如上所述进行。此诱变任选是在C2单体多肽序列内在例如美国专利公开No.2005/0221384所述筛选的氨基酸残基上进行的，或者任选是在所有非-CDR氨基酸残基上进行的，并且任选是随机的，以便演化为新的或改良的结合人血清白蛋白的多肽。任选地，使存在于CDR-移植的C2单体多肽中的dAb7h14 CDR多肽区域经历诱变，例如通过随机诱变、NNK诱变、透视(look-through)诱变和/或其它本领域认可的方法。PCR任选用于执行此类诱变方法，导致CDR-移植的C2单体多肽中产生通过靶序列的序列多样性。此类方法类似于以下针对dAb文库产生所述的那些方法。除了随机诱变和/或透视诱变法以外，应用靶向的氨基酸残基的定向诱变，其中结构信息确立了特异性氨基酸残基对于人血清白蛋白的结合是关键的。
使包含如上面所述基因工程化的移植的dAb7h14 CDR序列的C2单体多肽(和/或迭代产生的包含个别单体的avimer组合物)进行平行和/或迭代筛选方法，以鉴别对人血清白蛋白结合是最优化的那些C2单体多肽(和avimer组合物)。例如，在产生dAb7h14 CDR-移植的C2单体多肽序列的文库之后，将此多肽的该文库展示在噬菌体上，再经过多轮要求血清白蛋白结合和/或增殖的筛选，正如下面从dAb的文库中筛选结合血清白蛋白的dAb所述的。任选地，对固定在免疫管上的血清白蛋白或者在溶液中的抗生物素化的血清白蛋白进行筛选。任选地，使用表面等离振子共振(SPR)以及采用Biacore系统(Uppsala，Sweden)的Biacore(Karlsson et al.，1991)测定结合亲和力，完全优化的包含C2-衍生的单体的avimers理想地达到了人血清白蛋白结合亲和力Kd值在nM范围或更好。
在鉴定结合人血清白蛋白的C2单体-衍生的多肽后，此初始单体的人血清结合特性可进一步通过使此单体与其它单体组合而被增强，接着进一步诱变和/或筛选，从而形成对人血清白蛋白具有特异亲和力的avimer组合物。在鉴别对人血清白蛋白具有亲和力的avimer组合物之后，然后将此avimer多肽用于通过下文所述任何方法产生双特异性配体组合物。
实施例22：通过筛选血清白蛋白结合部分产生包含结合血清白蛋白的Avimer非-免疫球蛋白支架结构的双特异性配体
使描述的天然C2单体多肽经历文库筛选，并且任选地区经历亲和力成熟技术，然后与另外的单体(例如，纤连蛋白单体，针对该单体可任选使人血清白蛋白亲和力平行优化)合并，再任选迭代经历文库筛选以及任选的亲和力成熟技术，，以便产生结合人血清白蛋白的avimer非-免疫球蛋白支架结构分子以用于本发明的双特异性配体。
通过Biacore执行实时结合分析以评价人血清白蛋白是否特异性地结合固定的C2单体多肽(和/或迭代产生的avimer分子)。在C2单体多肽对人血清白蛋白的无或低结合亲和力(例如，Kd值在μM范围或更高)的检测之后，许多策略中的至少一项可用于赋予人血清白蛋白对C2单体多肽的结合性质，包括促成结合亲和力的以下方法中的一种或多种。
通过诱变方法实现和优化人血清白蛋白结合的C2单体多肽(和/或迭代产生的avimer二聚体、三聚体等分子)，任选地组合了如下文所述的平行和/或迭代筛选方法和/或本领域已知的其它方法。C2单体多肽区域经历随机和/或NNK诱变，如下文所述进行。此诱变是在完整的C2单体多肽上进行的，或者在C2单体多肽中在所述筛选的氨基酸残基上的特异性序列上进行的，例如，见美国专利公开No.2005/0221384，并且任选是随机的，以便演化为新的或改良的结合人血清白蛋白的多肽。PCR任选用于执行此类诱变方法，导致C2单体多肽和/或avimer分子中产生通过靶序列的序列多样性。(此类方法类似于以下针对dAb文库产生所述的那些方法)。除了随机诱变方法以外，应用靶向的氨基酸残基的定向诱变，其中结构信息证实了C2单体和/或avimer分子的特异性氨基酸残基对于人血清白蛋白的结合是关键的。
使如上面所述基因工程化的C2单体多肽进行平行和/或迭代筛选方法，以鉴别对于人血清白蛋白结合来说是最优化的那些C2单体多肽和/或avimer分子。例如，在产生诱变处理的C2单体多肽序列的文库之后，将所述多肽的文库展示在噬菌体上，再经过多轮要求血清白蛋白结合和/或增殖的筛选，正如下面从dAb的文库中筛选结合血清白蛋白的dAb所述的。任选地，筛选轮次可包括迭代，在该迭代中加入了另外的单体亚单元以形成新的avimer分子。任选地，对固定在免疫管上的血清白蛋白或者在溶液中的抗生物素化的血清白蛋白进行筛选。任选地，使用表面等离振子共振(SPR)以及采用Biacore系统(Uppsala，Sweden)的Biacore(Karlsson et al.，1991)测定结合亲和力，完全优化的包含C2-衍生的单体多肽的avimers理想地达到了人血清白蛋白结合亲和力Kd值在nM范围或更好。
在鉴定结合人血清白蛋白的C2单体-衍生的多肽后，此初始单体的人血清结合特性可进一步通过使此单体与其它单体组合而被增强，接着进一步诱变和/或筛选，从而形成对人血清白蛋白具有特异亲和力的avimer组合物。在鉴别对人血清白蛋白具有亲和力的avimer组合物之后，然后将此avimer多肽用于通过下文所述任何方法产生双特异性配体组合物。
Avimer多肽的产生和应用
Avimer是从人细胞外受体区域的一个大家族进化来的，其进化方式是通过体外外显子改组和噬菌体展示，产生具有结合和/或抑制性质的多区域蛋白。结合多重独立结合区(例如，以迭代方式筛选以用于结合靶蛋白例如人血清白蛋白)产生亲和力，并导致与常规单个-表位结合蛋白比较有改善的亲和力和特异性。其它潜在的优点包括在大肠杆菌中简单且有效地产生多靶-特异性分子，改善的热稳定性和对蛋白酶耐受。可以产生对靶蛋白具有亚-nM亲和力的Avimer。例如，产生了基于细胞分析以0.8pM IC50抑制白细胞介素6的avimer，并以生物学活性进行了表征(Silverman et al.2005 NatureBiotechnology 23：1556-1561；还参见，例如，美国专利申请公开No.2005/0221384，2005/0164301，2005/0053973和2005/0089932，2005/0048512以及2004/0175756，其各自以其全部内容在此通过引用并入本文)。
Avimer合成包括噬菌体展示衍生自A区域的人组成成分的文库。将合成重组用于高度不同的单体群，如Silverman等所述(2005Nature Biotechnology 23：1556-1561)。产生单体群之后，对靶蛋白(例如，人血清白蛋白)筛选该单体群。鉴别初始的候选者，加入另外的单体，再对靶蛋白筛选所得的二聚体文库，以鉴别候选的结合靶的二聚体。然后使该方法反复，以获得对靶蛋白具有极高结合亲和力的三聚体，以及任选的，可以进一步重复以鉴别更高级别的候选复合物。鉴定对靶蛋白具有高亲和力和特异性的候选复合物称之为avimer(针对“亲和力多聚体”而言)。
Avimer的单体区域可以是任何大小的多肽链。例如，单体区域可具有约25至约500、约30至约200、约30至约100、约90至约200、约30至约250、约30至约60、约9至约150、约100至约150、约25至约50或约30至约150个氨基酸。类似地，avimer的单体区域可包含例如约30至约200个氨基酸；约25至约180个氨基酸；约40至约150个氨基酸；约50至约130个氨基酸；或约75至约125个氨基酸。单体区域和免疫区域可通常在溶液中保持稳定构象。有时，avimer的单体区域和免疫区域可独立地折叠成稳定构象。该稳定构象可通过金属离子稳定。该稳定构象可任何含有二硫键(例如，至少一个、两个、或三个或更多个二硫键)。该二硫键可任选在两个半胱氨酸残基之间形成。
描述单体区域和嵌合蛋白的出版物以及其中引述的文献包括如下：Hegyi，H and Bork，P.1997 J.Protein Chem.，16：545-551；Baron et al.1991 Trends Biochem.Sci.16：13-17；Ponting et al.2000Adv.Protein Chem.54：185-244；Doolittle 1995 Annu.Rev.Biochem64：287-314；Doolitte and Bork 1993 Scientific American 269：50-6；和Bork 1991 FEBS letters 286：47-54。用于avimer的单体区域还可包括Pfam数据库和SMART数据库中的那些区域。参见Schultz et al.2000 Nucleic Acid Res.28：231-34。
特别适用于avimer组合物的单体区域是(1)β-夹层区域；(2)β-桶区域；或(3)包含二硫键的富含半胱氨酸的区域。用于avimer的富含半胱氨酸的区域通常不会形成α-螺旋、β-片层或β-桶结构。通常，该二硫键促进该区域折叠成三维结构。通常，富含半胱氨酸的区域具有至少两个二硫键，更通常至少三个二硫键。
Avimer的单体区域可具有任何数量的特征。例如，该区域在动物(例如，人)中具有低的免疫原性或无免疫原性。区域具有小的尺寸，例如，该区域可以小到足以渗透皮肤或其它组织。区域可具有一定范围的体内半衰期或稳定性。
适用于avimer组合物的示例性单体区域包括，例如，EGF-样区域、Kringle-区域、纤连蛋白I型区域、纤连蛋白II型区域、纤连蛋白III型区域、PAN区域、Gla区域、SRCR区域、Kunitz/Bovine胰蛋白酶抑制剂区域、Kazal-型丝氨酸蛋白酶抑制剂区域、Trefoil(P型)区域、血管假性血友病因子(von Willebrand factor)C型区域、过敏毒素-样区域、CUB区域、甲状腺球蛋白I型重复、LDL-受体A类区域、Sushi区域、Link区域、血小板凝血酶敏感蛋白(Thrombospondin)I型区域、甲状腺球蛋白单体区域、免疫球蛋白-样区域、C凝集素区域、MAM区域、血管假性血友病因子A型区域、生长调节素(Somatomedin)B区域、WAP-型四个二硫键(fourdisulfide)核心区域、F5/8C型区域、血红素蛋白区域、SH2区域、SH3区域、层粘连蛋白-型EGF-样区域、C2区域和本领域普通技术人员已知的其它此类区域，以及其衍生物和/或变异体。美国专利公开No.20050221384提供了在LDL-受体家族分子中发现的各种示例性的单体区域形式的示意图。
适宜的单体区域(例如，有独立或与一些有限帮助折叠的能力的区域)可选自含有β-夹层或β-桶三维结构的蛋白区域的家族，所述β-夹层或β-桶三维结构由计算序列分析工具例如单模块结构研究工具(Simple Modular Architecture Research Tool，SMART；参见Shultzet al.2000 Nucleic Acids Research 28：231-234)或CATH(参见Pearlet al.2000 Nucleic Acids Research 28：277-282)来确定。示例性的avimer的单体区域还包括纤连蛋白III型区域、抗运载蛋白区域和来自CTLA-4的Ig-样区域。这些区域的一些方面描述于Lipovsek等的WO 01/64942、Beste等的WO99/16873和Desmet等的WO00/60070，它们的内容以其整体通过引用并入本文。
Avimer的单体区域任选是富含半胱氨酸的。适宜的富含半胱氨酸的单体区域包括，例如，LDL受体A类区域(″A-区域″)或EGF-样区域。该单体区域还可具有一群负电荷残基。任选地，该单体区域含有重复序列，例如在β-螺旋(β-Propeller)区域中发现的YWTD。适用于avimer的另一示例性单体区域是C2区域。用于avimer生产的示例性的A区域和C2区域序列和共有序列，包括最希望用于诱变靶的氨基酸残基(例如，外露表面环残基)的示例性筛选，提供于美国专利公开No.2005/0221384。
编码该单体区域的多核苷酸(亦称为核酸)通常用于通过表达制备单体区域。编码单体区域的核酸可衍生自多种不同的来源。单体区域的文库可通过表达许多不同的编码天然存在单体区域、改变的单体区域(即，单体区域变异体)或其组合的核酸来制备。
与筛选或需要的配体(例如，人血清白蛋白)或配体混合物结合的单体区域被鉴别，任选地作为生产中的初始步骤。在一些实施方案中，针对需要的性质(例如，人血清白蛋白的结合亲和力)鉴别和筛选单体区域和/或免疫区域，然后使该单体区域和/或免疫区域形成多聚体。对于这些实施方案，可以使用任选导致筛选具有需要的性质(例如，人血清白蛋白结合)的区域的方法。例如，所述方法可包括提供许多不同的核酸，各核酸编码单体区域；翻译该许多不同的核酸，从而提供许多不同的单体区域；针对需要的配体或配体混合物的结合筛选该许多不同的单体区域；以及鉴别结合需要的配体或配体混合物的许多不同的单体区域。
用于avimer生产的单体区域可以是天然出现的或者改变的(非天然的变异体)。用于本文的术语″天然存在″是指一种可在自然界找到的物体。例如，天然单体区域可包括人单体区域或者任选的衍生自不同物种或来源的区域，例如，哺乳动物、灵长类、啮齿类、鱼类、鸟类、爬行类动物、植物等。天然出现的单体区域可通过许多方法获得，例如通过基因组DNA或cDNA的PCR扩增。术语“天然”，如本文使用的，用于指未通过诱变或通过执行下文所述任何方法改变的核酸和/或多肽。
Avimer的单体区域可以是天然存在的区域或者非-天然存在的变异体。用于合成avimer的单体区域的文库可含有天然存在的单体区域、非-天然存在单体区域变异体或其组合。
许多报道展示载体或系统可用于表达编码单体区域和avimer的核酸，以及用于测试需要的活性(例如，人血清白蛋白结合)。例如，噬菌体展示系统是一种系统，在该系统中，单体区域被表达为在噬菌体表面上的融合蛋白(Pharmacia，Milwaukee Wis.)。噬菌体展示可包括提供在丝状细菌噬菌体的表面编码单体区域和/或免疫区域的多肽序列，通常为一种具有细菌噬菌体衣壳蛋白的融合物。亲和力富集和噬菌体展示的示例性方法例如描述于PCT专利公开No.91/17271、91/18980和91/19818以及93/08278中，其全部内容通过引用并入本文。
其它展示系统的实例包括核糖体展示、核苷酸-结合的展示(参见，例如，美国专利No.6,281,344；6,194,550、6,207,446、6,214,553和6,258,558)，细胞表面展示等。细胞表面展示包括多种细胞，例如，大肠杆菌、酵母和/或哺乳动物细胞。当将细胞用作展示时，核酸，例如通过PCT扩增接着消化而获得的，被导入细胞中并翻译。任选地，可将编码单体区域或avimer的多肽例如通过注射导入细胞中。
如下文和本领域描述的，avimer是多聚体组合物。在示例性的实施方案中，多聚体包含至少两个单体区域和/或免疫区域。例如，本发明的多聚体可包含2至约10个单体区域和/或免疫区域，2至约8个单体区域和/或免疫区域，约3至约10个单体区域和/或免疫区域，约7个单体区域和/或免疫区域，约6个单体区域和/或免疫区域，约5个单体区域和/或免疫区域，或约4个单体区域和/或免疫区域。在一些实施方案中，该多聚体包含至少3个单体区域和/或免疫区域。通常，该单体区域被预筛选用于结合感兴趣的靶分子(例如，人血清白蛋白)。
在avimer中，每个单体区域可特异性地结合一个靶分子(例如，人血清白蛋白)。任选地，每个单体在靶分子上结合不同位置(类似于表位)。结合相同靶分子的多个单体区域和/或免疫区域可产生亲和力作用，导致与每个单个的单体相比多聚体avimer对靶分子的亲和力改善。任选地，该多聚体可具有至少约1.5、2、3、4、5、10、20、50或100倍于单个单体区域对靶蛋白(例如，人血清白蛋白)的亲和力。
筛选的单体区域可通过连接子连接以形成多聚体(avimer)。例如，连接子位于多聚体中的每个分离的不连续的单体区域之间。通常，免疫区域还相互连接，或者与还与单体区域通过连接子部分连接。可以容易地用于使免疫区域变异体连接在一起的连接子部分与单体区域变异体的多聚体所描述的那些相同。适用于使免疫区域变异体与其它区域连接到多聚体中的示例性连接子部分在本文作了描述。
通过连接子连接筛选的单体区域以形成avimer可使用本领域已知的多种技术实现。例如，编码筛选的单体区域的多核苷酸的组合装配可通过DNA连接作用来实现，或者任选通过基于PCR的、自身引发的重叠反应来实现。在鉴别该单体结合靶多聚体的能力之前，或者在对结合靶多聚体的能力而筛选该单体之后，可以使该连接子连接于单体。
如上所述，包含avimer的多肽可以被改变。产生修饰或改变的编码这些多肽的核酸序列的许多多样性产生操作法的说明在上文和下文描述于以下出版物和其中引述的文献：Soong，N.et al.，Moecular breeding of viruses，(2000)Nat Genet 25(4)：436-439；Stemmer，et al.，Molecular breeding of viruses for targeting and otherclinical properties，(1999)Tumor Targeting 4：1-4；Ness et al.，DNAShuffling of subgenomic sequences of subtilisin，(1999)NatureBiotechnology 17：893-896；Chang et al.，Evolution of a cytokine usingDNA family shuffling，(1999)Nature Biotechnology 17：793-797；Minshull and Stemmer，Protein evolution by molecular breeding，(1999)Current Opinion in Chemical Biology 3：284-290；Christians etal.，Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylationusing DNA family shuffling，(1999)Nature Biotechnology17：259-264；Crameri et al.，DNA shuffling of a family of genes fromdiverse species accelerates directed evolution，(1998)Nature391：288-291；Crameri et al.，Molecular evolution of an arsenatedetoxification pathway by DNA shuffling，(1997)NatureBiotechnology 15：436-438；Zhang et al.，Directed evolution of aneffective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling andscreening(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-4509；Patten etal.，Applications of DNA Shuffling to Pharmaceuticals and Vaccines，(1997)Current Opinion in Biotechnology 8：724-733；Crameri et al.，Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNAshuffling，(1996)Nature Medicine 2：100-103；Crameri et al.，Improved green fluorescent protein by molecular evolution usingDNA shuffling，(1996)Nature Biotechnology 14：315-319；Gates et al.，Affinity selective isolation of ligands from peptide libraries throughdisplay on a lac repressor `headpiece dimer`，(1996)Journal ofMolecular Biology 255：373-386；Stemmer，Sexual PCR and AssemblyPCR，(1996)In：The Encyclopedia of Molecular Biology.VCHPublishers，New York.pp.447-457；Crameri and Stemmer，Combinatorial multiple cassette mutagenesis creates all thepermutations of mutant and wildtype cassettes，(1995)BioTechniques18：194-195；Stemmer et al.，Single-step assembly of a gene and entireplasmid form large numbers of oligodeoxy-ribonucleotides，(1995)Gene，164：49-53；Stemmer，The Evolution of Molecular Computation，(1995)Science 270：1510；Stemmer.Searching Sequence Space，(1995)Bio/Technology 13：549-553；Stemmer，Rapid evolution of a protein invitro by DNA shuffling，(1994)Nature 370：389-391；以及Stemmer，DNA shuffling by random fragmentation and reassembly：In vitrorecombination for molecular evolution，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751。
产生多样性的突变方法包括，例如，位置定向诱变(Ling et al.，Approaches to DNA mutagenesis：an overview，(1997)Anal Biochem.254(2)：157-178；Dale et al.，Oligonucleotide-directed randommutagenesis using the phosphorothioate method，(1996)Methods Mol.Biol.57：369-374；Smith，In vitro mutagenesis，(1985)Ann.Rev.Genet.19：423-462；Botstein&Shortle，Strategies and applications ofin vitro mutagenesis，(1985)Science 229：1193-1201；Carter，Site-directed mutagenesis，(1986)Biochem.J.237：1-7；以及Kunkel，The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis，(1987)inNucleic Acids&Molecular Biology(Eckstein，F.and Lilley，D.M.J.eds.，Springer Verlag，Berlin))；使用尿嘧啶的包含模板的诱变(Kunkel，Rapid and efficient site-specific mutagenesis withoutphenotypic selection，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel et al.，Rapid and efficient site-specific mutagenesis withoutphenotypic selection，(1987)Methods in Enzymol.154，367-382；以及Bass et al.，Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities，(1988)Science 242：240-245)；寡核苷酸-定向诱变((1983)Methods inEnzymol.100：468-500；(1987)Methods in Enzymol.154：329-350；Zoller&Smith，Oligonucleotide-directed mutagenesis usingM13-derived vectors：an efficient and general procedure for theproduction of point mutations in any DNA fragment，(1982)NucleicAcids Res.10：6487-6500；Zoller&Smith，Oligonucleotide-directedmutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors，(1983)Methods in Enzymol.100：468-500；以及Zoller&Smith，Oligonucleotide-directed mutagenesis：a simple method using twooligonucleotide primers and a single-stranded DNA template，(1987)Methods in Enzymol.154：329-350)；磷硫酰-修饰的DNA诱变(Taylor et al.，The use of phosphorothioate-modified DNA inrestriction enzyme reactions to prepare nicked DNA，(1985)Nucl.Acids Res.13：8749-8764；Taylor et al.，The rapid generation ofoligonucleotide-directed mutations at high frequency usingphosphorothioate-modified DNA，(1985)Nucl.Acids Res.13：8765-8787；Nakamaye&Eckstein，Inhibition of restrictionendonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and itsapplication to oligonucleotide-directed mutagenesis，(1986)Nucl.Acids Res.14：9679-9698；Sayers et al.，Y-T Exonucleases inphosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis，(1988)Nucl.Acids Res.16：791-802；以及Sayers et al.，Strand specificcleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction withrestriction endonucleases in the presence of ethidium bromide，(1988)Nucl.Acids Res.16：803-814)；使用缺口双链体DNA的诱变(Krameret al.，The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directedmutation construction，(1984)Nucl.Acids Res.12：9441-9456；Kramer&Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutationsvia gapped duplex DNA，(1987)Methods in Enzymol.154：350-367；Kramer et al.，Improved enzymatic in vitro reactions in the gappedduplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction ofmutations，(1988)Nucl.Acids Res.16：7207；以及Fritz et al.，Oligonucleotide-directed construction of mutations：a gapped duplexDNA procedure without enzymatic reactions in vitro，(1988)Nucl.Acids Res.16：6987-6999)。
其它适宜的方法包括点错配修复(Kramer et al.，Point MismatchRepair，(1984)Cell 38：879-887)，使用修复缺陷宿主株的诱变(Carteret al.，Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13vectors，(1985)Nucl.Acids Res.13：4431-4443；以及Carter，Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors，(1987)Methods in Enzymol.154：382-403)，缺失诱变(Eghtedarzadeh&Henikoff，Use of oligonucleotides to generate large deletions，(1986)Nucl.Acids Res.14：5115)，限制筛选和限制纯化(Wells et al.，Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transitionstate of subtilisin，(1986)Phil.Trans.R.Soc.Lond.A 317：415-423)，通过全基因合成的诱变(Nambiar et al.，Total synthesis and cloningof a gene coding for the ribonuclease S protein，(1984)Science 223：1299-1301；Sakamar and Khorana，Total synthesis and expression of agene for the a-subunit of bovine rod outer segment guaninenucleotide-binding protein(transducin)，(1988)Nucl.Acids Res.14：6361-6372；Wells et al.，Cassette mutagenesis：an efficient method forgeneration of multiple mutations at defined sites，(1985)Gene34：315-323；以及Grundstrom et al.，Oligonucleotide-directedmutagenesis by microscale `shot-gun` gene synthesis，(1985)Nucl.Acids Res.13：3305-3316)，双链断裂修复(Mandecki，Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids ofEscherichia coli：a method for site-specific mutagenesis，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：7177-7181；以及Arnold，Proteinengineering for unusual environments，(1993)Current Opinion inBiotechnology 4：450-455)。许多以上方法的其它细节可见于第154卷酶学法(Methods in Enzymology)，其还描述可用于以各种诱变方法抑制干扰-发射(trouble-shooting)问题。
有关各种多样性产生的方法的其它细节可见于以下美国专利、PCT公开和申请以及EPO公开：Stemmer的美国专利No.5,605,793(Feb.25，1997)，″Methods for In Vitro Recombination″；Stemmer等的美国专利No.5,811,238(Sep.22，1998)″Methods for GeneratingPolynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selectionand Recombination″；Stemmer等的美国专利No.5,830,721(Nov.3，1998)，″DNA Mutagenesis by Random Fragmentation andReassembly″；Stemmer等的美国专利No.5,834,252(Nov.10，1998)″End-Complementary Polymerase Reaction″；Minshull等的美国专利No.5,837,458(Nov.17，1998)，″Methods and Compositions forCellular and Metabolic Engineering″；Stemmer和Crameri的WO95/22625，″Mutagenesis by Random Fragmentation andReassembly″；Stemmer和Lipschutz的WO 96/33207″EndComplementary Polymerase Chain Reaction″；Stemmer和Crameri的WO 97/20078″Methods for Generating Polynucleotides havingDesired Characteristics by Iterative Selection and Recombination″；Minshull和Stemmer的WO 97/35966，″Methods and Compositionsfor Cellular and Metabolic Engineering″；Punnonen等的WO99/41402″Targeting of Genetic Vaccine Vectors″；Punnonen等的WO 99/41383″Antigen Library Immunization″；Punnonen等的WO99/41369″Genetic Vaccine Vector Engineering″；Punnonen等的WO99/41368″Optimization of Immunomodulatory Properties of GeneticVaccines″；Stemmer和Crameri的EP 752008，″DNA Mutagenesis byRandom Fragmentation and Reassembly″；Stemmer的EP0932670″Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive SequenceRecombination″；Stemmer等的WO 99/23107，″Modification of VirusTropism and Host Range by Viral Genome Shuffling″；Apt等的WO99/21979，″Human Papillomavirus Vectors″；del Cardayre等的WO98/31837″Evolution of Whole Cells and Organisms by RecursiveSequence Recombination″；Patten和Stemmer的WO 98/27230，″Methods and Compositions for Polypeptide Engineering″；Stemmer等的WO 98/27230，″Methods for Optimization of Gene Therapy byRecursive Sequence Shuffling and Selection″，WO 00/00632，″Methods for Generating Highly Diverse Libraries″，WO 00/09679，″Methods for Obtaining in Vitro Recombined PolynucleotideSequence Banks and Resulting Sequences″；Arnold等的WO 98/42832，″Recombination of Polynucleotide Sequences Using Random orDefined Primers″；Arnold等的WO 99/29902，″Method for CreatingPolynucleotide and Polypeptide Sequences″；Vind的WO 98/41653，″An in Vitro Method for Construction of a DNA Library″；Borchert等的WO 98/41622，″Method for Constructing a Library Using DNAshuffling″；以及Pati and Zarling的WO 98/42727，″SequenceAlterations using Homologous Recombination″；Patten等的WO00/18906，″Shuffling of Codon-Altered Genes″；del Cardayre等的WO 00/04190″Evolution of Whole Cells and Organisms by RecursiveRecombination″；Crameri等的WO 00/42561，″OligonucleotideMe diated Nucleic Acid Recombination″；Selifonov和Stemmer的WO00/42559″Methods of Populating Data Structures for Use inEvolutionary Simulations″；Selifonov等的WO 00/42560，″Methodsfor Making Character Strings，Polynucleotides&Polypeptides HavingDesired Characteristics″；Welch等的WO 01/23401，″Use ofCodon-Varied Oligonucleotide Synthesis for Synthetic Shuffling″；以及Affholter的PCT/US01/06775″Single-Stranded核酸Template-Mediated Recombination and Nucleic Acid FragmentIsolation″。
用于本发明的多肽(例如，avimer)任选表达于细胞中。多聚体区域可以使用本领域公知的表达系统以单个蛋白合成。除了上文提及的许多文章外，本文使用描述分子生物学技术(包括应用载体、启动子和筛选的单体区域、多聚体和/或筛选的多聚体)的一般文章，包括Berger and Kimmel，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology volume 152 Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.(Berger)；Sambrook et al.，Molecular Cloning--A LaboratoryManual(2nd Ed.)，Vol.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，N.Y.，1989(″Sambrook″)以及Current Protocols inMolecular Biology，F.M.Ausubel et al.，eds.，Current Protocols，ajoint venture between Greene Publishing Associates，Inc.and JohnWiley&Sons，Inc.，(1999年全年增补本)(″Ausubel″))。足以指导熟练技术人员通过体外扩增方法的技术实例，用于鉴别、分离和克隆单体区域和编码核酸的多聚体，包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、Q-复制酶扩增和其它RNA聚合酶介导的技术(例如，NASBA)，它们可见于Berger、Sambrook和Ausubel以及Mullis等的(1987)美国专利No.4,683,202；PCR Protocols A Guide to Methodsand Applications(Innis et al.eds)Academic Press Inc.San Diego，Calif.(1990)(Innis)；Arnheim&Levinson(Oct.1，1990)C&EN36-47；The Journal Of NIH Research(1991)3，81-94；(Kwoh et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，1173；Guatelli et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，1874；Lomell et al.(1989)J.Clin.Chem 35，1826；Landegren et al.，(1988)Science 241，1077-1080；VanBrunt(1990)Biotechnology 8，291-294；Wu and Wallace，(1989)Gene 4，560；Barringer et al.(1990)Gene 89，117，以及Sooknananand Malek(1995)Biotechnology 13：563-564。克隆体外扩增的核酸的改良方法描述于Wallace等的美国专利No.5,426,039。通过PCR扩增大核酸的改良方法总结于Cheng et al.(1994)Nature 369：684-685和其中的文献中，其中产生了多达40kb的PCR扩增子。熟练技术人员理解，基本上任何RNA均可转化成双链DNA，以适用于限制性消化、PCR扩展和使用逆转录酶和聚合酶测序。
编码例如单体区域和/或avimer的载体可以被导入通过重组技术产生和/或筛选的宿主细胞中。宿主细胞是用此载体基因工程化的(即转导、转化或转染)，该载体可以例如是克隆载体或表达载体。该载体可以例如是质粒、病毒颗粒、噬菌体等的形式。该基因工程化的宿主细胞可在在常规营养培养基中培养，该培养基被改良以适用于激活启动子、筛选转化体或扩增感兴趣的单体区域、筛选的单体区域、多聚体和/或筛选的多聚体基因。培养条件例如温度、pH等是以前针对表达筛选的宿主细胞所使用的那些，对本领域技术人员而言是显然的，并且在本文引述的文献中，包括，例如，Freshney(1994)Culture of Animal Cells，a Manual of Basic Technique，thirdedition，Wiley-Liss，New York以及其中引用的文献。
本发明的多肽还可产生于非动物细胞例如植物、酵母、真菌、细菌等中。事实上，如在上下文中指出的，噬菌体展示对于生产此多肽而言是特别相关的技术。除了Sambrook、Berger和Ausubel以外，有关细胞培养的细节可见于Payne et al.(1992)Plant Cell andTissue Culture in Liquid Systems John Wiley&Sons，Inc.New York，N.Y.；Gamborg and Phillips(eds)(1995)Plant Cell，Tissue and OrganCulture；Fundamental Methods Springer Lab Manual，Springer-Verlag(Berlin Heidelberg New York)；以及Atlas and Parks(eds)TheHandbook of Microbiological Media(1993)CRC Press，Boca Raton，Fla。
Avimer还可具有变化的单体区域、免疫区域和/或多聚体，其改善了药理学性质、降低了免疫原性，或者促进了多聚体和/或单体区域进入细胞或组织的转运(例如，通过血脑屏障，或通过皮肤)。这些类型的改变包括许多种修饰(例如，添加糖基或者糖基化作用)，添加PEG，添加结合某种蛋白的蛋白区域(例如，HSA或其它血清蛋白)，添加信号运动或转入、转出或通过细胞的蛋白片段或序列。其它组分也被加入到多聚体和/或单体区域以处理该多聚体和/或单体区域的性质。还可以加入许多组分，包括例如结合已知受体的区域(例如，结合Fc受体的Fc-区域蛋白区域)，毒素或毒素的部分，可任选被裂解成活化的多聚体或单体区域的前区域(prodomain)，受体分子(例如，绿色荧光蛋白)，结合受体分子的组分(例如用于放射治疗的放射性核素，生物素或抗生物素蛋白)或者修饰的组合。
如本文使用的，″定向演化″是指一种过程，通过该过程，以递归过程针对活性(例如，对人血清白蛋白靶蛋白具有结合活性的多肽)产生、表达和筛选了多核苷酸变异体。选择该筛选中的一种或多种候选物，然后使用编码该筛选的候选物的多核苷酸重复该过程，以产生新的变异体。定向演化包括至少两轮变异生成，并且可包括3，4，5，10，20或更多轮变异生成和筛选。可通过本领域已知的任何方法产生变异，包括，例如，通过易错PCR、基因改组、化学诱变等。
术语″改组″用于本文是指非全同序列之间的重组。在一些实施方案中，改组可包括通过同源重组或通过非同源重组来交换，例如通过cre/lox和/或flp/frt系统。可通过应用许多不同形式进行改组，包括例如，体外和体内改组形式、硅(silico)内改组形式、使用双链或单链的模板的改组形式、基于引物的改组形式、基于核酸碎片改组形式、和寡核苷酸介导的改组形式，所有这些均基于非全同序列之间的重组事件并且在本文下文作更详细的描述或参考，以及其它相似的基于重组的形式。
术语″随机″如本文使用的是指一种多核苷酸序列或氨基酸序列，其由两个或多个氨基酸组成，并且由随机或随机过程构成。随机多核苷酸序列或氨基酸序列可包括框架或支架结构基序，其可包含不变的序列。
GroEL和GroES
实施例24：通过CDR移植产生包含结合血清白蛋白的cpn10(GroES)非-免疫球蛋白支架结构的双特异性配体
DAb7h14的CDR3区域被用于以以下方式构建结合人血清白蛋白的cpn10(GroES)非-免疫球蛋白支架结构多肽。将dAb7h14的CDR3(AQGAALPRT；SEQ ID NO.：_)序列移植到cpn10多肽以替换位于19-27处的天然cpn10氨基酸残基(易变(mobile)环残基)。通过Biacore进行实时结合分析，以评价人血清白蛋白是否特异性地结合固定的cpn10-衍生的多肽，该多肽包含dAb7h14的抗-人血清白蛋白CDR3区域。(本领域技术人员理解，结合亲和力可使用任何适宜方法来评价，包括，例如，标记的人血清白蛋白的沉淀作用、竞争性Biacore分析法等)。如果检测到无或低人血清白蛋白亲和力(例如，Kd值在μM范围或更高)，许多策略中的至少一项可用于改善CDR3-移植的cpn10多肽的人血清白蛋白结合性质，包括有助于结合亲和力的任何下列方法。
相应于天然cpn10多肽中易变环区域的cpn10多肽的dAb7h14CDR3-移植区域的长度是通过删除氨基酸残基和/或使用连接子多肽而被调节的。例如，使用长度为0至7个残基的氨基酸连接子使dAb7h14的9个氨基酸残基CDR3肽序列长度延长到16个氨基酸残基，该氨基酸连接子位于dAb7h14 CDR3多肽序列的N-或C-末端侧面的一侧或两侧，从而在该天然cpn10序列中相应于该易变环的CDR3-移植的区域内达到16个氨基酸的总移植肽序列长度。连接子多肽的这种应用任选地与连接子序列、CDR3序列和/或非-CDRcpn10序列的诱变组合(例如，使用如下面所述的诱变优化操作法)，以便改善CDR3-移植的cpn10多肽的人血清白蛋白结合能力(例如，通过优化CDR3-移植的cpn10多肽中的CDR和纤连蛋白序列)。用于此目的的多肽连接子具有预定的序列，或者，任选地，选自通过含连接子的CDR3-移植的cpn10多肽的人血清白蛋白结合能力的评价的随机多肽连接子序列群组。优化方法是平行和/或迭代进行的。平行和迭代优化(例如，亲和力成熟)方法应用如下文所述的筛选方法和/或本领域已知可用于优化多肽结合性质的筛选方法。
通过诱变优化人血清白蛋白结合的出现dAb7h14CDR3的CDR-移植的cpn10多肽，任选地组合了如下文所述的平行和/或迭代筛选方法和/或本领域已知的其它方法。使环绕移植的dAb7h14CDR3多肽序列的cpn10支架结构多肽区域经历随机的和/或NNK诱变，如上所述进行。此诱变是在cpn10多肽序列内在非-移植的氨基酸残基上进行的，并且任选是随机的，以便演化为新的或改良的结合人血清白蛋白的多肽。任选地，使存在于CDR3-移植的cpn10多肽中的dAb7h14 CDR3多肽区域经历诱变，例如通过随机诱变、NNK诱变、透视诱变和/或其它本领域认可的方法。PCR任选用于执行此类诱变方法，导致CDR3-移植的cpn10多肽中产生通过靶序列的序列多样性。此类方法类似于以下针对dAb文库产生所述的那些方法。除了随机诱变和/或透视诱变法以外，应用靶向的氨基酸残基的定向诱变，其中结构信息确立了特异性氨基酸残基对于人血清白蛋白的结合是关键的。
使包含如上面所述基因工程化的移植的dAb7h14 CDR3序列的cpn10多肽进行平行和/或迭代筛选方法，以鉴别对人血清白蛋白结合是最优化的那些cpn10多肽。例如，在产生dAb7h14 CDR3-移植的cpn10多肽序列的文库之后，将此多肽的该文库展示在噬菌体上，再经过多轮要求血清白蛋白结合和/或增殖的筛选，正如下面从dAb的文库中筛选结合血清白蛋白的dAb所述的。任选地，对固定在免疫管上的血清白蛋白或者在溶液中的抗生物素化的血清白蛋白进行筛选。任选地，使用表面等离振子共振(SPR)以及采用Biacore系统(Uppsala，Sweden)的Biacore(Karlsson et al.，1991)测定结合亲和力，完全优化的单体和/或低聚体cpn10-衍生的多肽理想地达到了人血清白蛋白结合亲和力Kd值在nM范围或更好。
在鉴定结合人血清白蛋白的单体cpn10-衍生的多肽后，此初始单体的人血清结合特性可进一步通过使此单体与其它单体组合而被增强，接着进一步诱变和/或筛选，从而形成对人血清白蛋白具有特异亲和力的低聚cpn10/GroES组合物。在鉴别对人血清白蛋白具有亲和力的低聚物cpn10/GroES组合物之后，然后通过下文所述任何方法使此类多肽用于生产双特异性配体组合物。
实施例25：通过筛选血清白蛋白结合部分产生包含结合血清白蛋白的cpn10非-免疫球蛋白支架结构的双特异性配体
使天然cpn10多肽经历文库筛选，以及任选的亲和力成熟技术，以便产生结合人血清白蛋白的cpn10非-免疫球蛋白支架结构分子以用于本发明的双特异性配体。
天然cpn10结合人血清白蛋白的能力最初是通过如上文所述Biacore分析法确定的。在cpn10多肽对人血清白蛋白的无或低结合亲和力(例如，Kd值在μM范围或更高)的检测之后，许多策略中的至少一项可用于赋予人血清白蛋白对cpn10多肽的结合性质，包括促成结合亲和力的以下方法中的一种或多种。
通过诱变方法实现和优化人血清白蛋白结合的cpn10支架结构多肽，任选地组合了如下文所述的平行和/或迭代筛选方法和/或本领域已知的其它方法。Cpn10支架结构多肽区域经历随机和/或NNK诱变，如下文所述进行。此诱变是在完整的cpn10多肽上进行的，或者在cpn10多肽中的特异性序列上进行的，包括在19-27处的易变环氨基酸残基，并且任选是随机的，以便演化为新的或改良的结合人血清白蛋白的多肽。PCR任选用于执行此类诱变方法，导致cpn10多肽中产生通过靶序列的序列多样性。(此类方法类似于以下针对dAb文库产生所述的那些方法)。除了随机诱变方法以外，应用靶向的氨基酸残基的定向诱变，其中结构信息证实了cpn10多肽的特异性氨基酸残基对于人血清白蛋白的结合是关键的。
使如上面所述基因工程化的cpn10多肽进行平行和/或迭代筛选方法，以鉴别对于人血清白蛋白结合来说是最优化的那些cpn10多肽。例如，在产生诱变处理的cpn10多肽序列的文库之后，将所述多肽的文库展示在噬菌体上，再经过多轮要求血清白蛋白结合和/或增殖的筛选，正如下面从dAb的文库中筛选结合血清白蛋白的dAb所述的。任选地，对固定在免疫管上的血清白蛋白或者在溶液中的抗生物素化的血清白蛋白进行筛选。任选地，使用表面等离振子共振(SPR)以及采用Biacore系统(Uppsala，Sweden)的Biacore(Karlsson et al.，1991)测定结合亲和力，完全优化的单体和/或低聚体cpn10-衍生的多肽理想地达到了人血清白蛋白结合亲和力Kd值在nM范围或更好。
在鉴定结合人血清白蛋白的单体cpn10-衍生的多肽后，此初始单体的人血清结合特性可进一步通过使此单体与其它单体组合而被增强，接着进一步诱变和/或筛选，从而形成对人血清白蛋白具有特异亲和力的低聚cpn10/GroES组合物。在鉴别对人血清白蛋白具有亲和力的低聚物cpn10/GroES组合物之后，然后通过下文所述任何方法使此类多肽用于生产双特异性配体组合物。
GroEL多肽
GroEL是一种在大肠杆菌中的关键分子伴侣，其由14个亚单元组成，每个约57.5Kd分子量，排列成两个七元环(Braig et al.1994Proc.Natl.Acad.Sci.90：3978-3982)。在GroEL环系统中有大量空穴，并且普遍认为该空穴需要成功的蛋白折叠活化。为了最佳活化，需要有共同-伴侣GroES，它是由10Kd亚单元的七元环组成(Hunt etal.1996 Nature 379：37-45)。每个GroES亚单元使用具有与GroEL相互作用的保守的疏水三肽的易变环(Landry et al.1993 Nature 364：255-258)。该易变环长度通常小于16个氨基酸，并经历从混乱的环到β-发夹结构的转变，同时结合GroEL的尖端区域(Shewmaker et al.2001 J.Biol.Chem.276：31257-31264)。GroEL/GroES复合物的活化需要ATP。GroEL和GroES广泛分布于所有有机体内，并且通常分别是指伴侣素(cpn)分子cpn60和cpn10。
GroEL是一种变构蛋白。变构蛋白是特殊种类的低聚蛋白，其在结合配体和底物期间在两种或多种不同三维结构之间交替变化。变构蛋白通常与生物的控制过程有关，或者通常与机械和物理-化学能的互变有关。ATP的作用是触发这种变构变化，造成GroEL从紧密结合变性蛋白的状态转变成微弱结合变性蛋白的状态。共同-伴侣GroES通过使该微弱结合状态有利而有助于此过程。其还可以作为帽子，密封GroEL的空穴。此外，它的与GroEL的结合有可能直接与变性底物的结合竞争。净结果是，GroES和ATP与以其变性形式结合底物的GroEL的结合使变性底物释放到该空穴中或者释放到其可重新折叠的溶液中。
GroEL和GroES是可用于多聚化单体多肽或蛋白区域的多肽支架结构，以产生任何需要的特征的多聚体蛋白。如在下文描述的，例如avimer组合物，其通常希望多聚化为多肽单体。
许多蛋白需要分子伴侣的帮助，以便以高产率在体内折叠或在体外重新折叠。分子伴侣是蛋白质，它们通常是大的并且需要能量源例如ATP以功能化。大肠杆菌中的关键分子伴侣是GroEL，其由14个亚单元组成，每个约57.5Kd分子量，排列成两个七元环。在GroEL环系统中有大量空穴，并且普遍认为该空穴需要成功的蛋白折叠活化。为了最佳活化，需要有共同-伴侣GroES，它是由10Kda亚单元的七元环组成。GroEL/GroES复合物的活化需要能量源ATP。
小型伴侣已详细描述于其它地方(参见国际专利申请WO99/05163，其公开内容通过引用并入本文)。小型伴侣多肽在呈单体形式时具有伴侣活性，并且在ATP形式时不需要能量。GroEL的顶端区域长度约143-186个氨基酸残基的确定的片段在溶液中在单体条件下或者在单分散或附着于载体上时具有针对蛋白质的分子伴侣活性。
GroEL和/或GroES支架结构使多肽低聚反应，以形成功能蛋白低聚物，其具有优于重组单体多肽的活性。Cpn10是cpn60/cpn10伴侣素系统的广泛分布的组分。cpn10的实例包括细胞GroES和细菌噬菌体T4 Gp31，并且还罗列于下文。cpn10家族的其它成员对于本领域技术人员而言是已知的。
蛋白支架结构亚单元装配形成蛋白支架结构。此支架结构可具有任何形状，并且可包含任意数目的亚单元。对于某些GroEL和GroES实施方案，该支架结构包含2至20个亚单元，5至15个亚单元，或约10个亚单元。天然存在的cpn10家族成员的支架结构包含7个亚单元，呈七元环或孔环的形状。因此，在某些实施方案中，该支架结构是七元环。
异源性氨基酸序列可以是例如衍生自具有对靶蛋白(例如，人血清白蛋白)亲和力的抗体或其抗原结合片段的CDR3区域，或者任选地，其可以是使其它基团或分子与该支架结构连接的单个残基例如半胱氨酸，该异源性氨基酸序列可以被插入到可低聚反应的蛋白支架结构亚单元的序列中，使得通过该可低聚反应的蛋白支架结构亚单元的序列形成该多肽单体的N-和C-末端。因此，该异源性多肽包括该支架结构亚单元的序列，例如通过取代它们的一个或多个氨基酸。
已知cpn10亚单元在其结构中具有″易变环″。该易变环位于大肠杆菌GroES序列的氨基酸15和34之间，优选氨基酸16至33之间，等同于cpn10家族的其它成员的位置。T4 Gp31的易变环位于残基22至45之间，优选23至44之间。任选地，可通过取代cpn10家族多肽的全部或部分易变环来插入该异源性多肽。当蛋白支架结构亚单元是cpn10家族多肽时，该异源性序列还可被并入到其N-或C-末端，或者并入到等同于cpn10家族肽的顶端β发夹结构的位置。此位置位于细菌噬菌体T4 Gp31的位置54至67之间，优选55至66之间，优选59到61之间，或者位于大肠杆菌GroES的位置43至63之间，优选44至62之间，优选50至53之间。
任选地，多肽可被插入到支架结构亚单元的N-或C-末端，与其亚单元的环状排列缔合。环状排列描述于Graf and Schachman，PNAS(USA)1996，93：11591。基本上，该多肽是通过存在的N-和C-末端的融合传递的，此外多肽链的裂解产生了新的N-和C-末端。本发明优选实施方案中，该异源性多肽可在环状排列形成之后包括在N-和/或C-末端处。新末端形式的位置可根据需要的性质筛选，并且可包括易变环和/或顶端β发夹结构。
有利的是，异源性序列(其可以相同或不同)可以在该蛋白支架结构亚单元的一个以上的位置和/或在与上述位置的不同位置被插入。因此，每个亚单元可包含两个或多个异源性多肽，它们在支加要结构被组装时展示于该支架结构中。异源性多肽可以以游离或受约束的形式展示于支架结构亚单元上，这取决于由插入到支架结构序列中的位置提供的自由度。例如，改变位于支架结构中的移动或β发夹结构环的序列的长度，将会调节插入到其中的任何异源性多肽的约束程度。
GroEL和/或GroES组合物还可包括包含两个或多个单体的多肽低聚物。该低聚物可配置成包含插入到该支架结构中的两个或多个不同氨基酸序列的异型低聚物(heterooligomer)，或者配置成同型低聚物(homooligomer)，其中插入到支架结构中的所述序列是相同的。
构成该低聚物的单体可相共价交联。可通过重组方法实现交联，例如使该单体从头开始表达为低聚物，另选的，可在支架结构的Cys残基上实现交联。例如，插入到GroES支架结构的位置50至53之间或者cpn10家族其它成员的等同位置的独立的Cys残基可用于交联支架结构亚单元。
插入到支架结构单元的异源性多肽性质可随意筛选。在某些实施方案中，合成了支架结构蛋白，其展示抗体或其片段例如scFv、天然的或骆驼科化的VH区以及VH CDR3片段。
在示例性的实施方案中，能够低聚反应的多肽单体可如上文所述和/或如WO 00/69907中所述制备，其全部内容通过引用并入本文。该制备的方法可包括，使编码异源性多肽的核酸序列插入到编码可低聚反应的蛋白支架结构的亚单元的核酸序列中，使所得核酸掺入到表达载体中，以及表达该核酸以产生多肽单体。任选地，然后可通过一种方法产生多肽低聚物，该方法包括使如上文产生的多肽单体结合到该低聚物中。在某些实施方案中，该单体被交联以形成低聚物。
在某些实施方案中，支架结构多肽是以cpn10/Hsp10家族成员例如GroES或其类似物为基础的。非常优选的类似物是T4多肽Gp31。GroES类似物(包括Gp31)具有易变环(Hunt，J.F.，et al.，(1997)Cell90，361-371；Landry，S.J.，et al.，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93，11622-11627)，该易变环可以被插入或取代，以便使该异源性多肽与支架结构融合。
Cpn10同系物广泛分布于动物、植物和细菌中。例如，GenBank的寻找表明，cpn10同系物在以下物种中是已知的：放线共生放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)；胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)；杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicida)；根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)；Allochromatium vinosum；大变形虫共生菌(Amoeba proteussymbiotic bacterium)；超嗜热菌(Aqui/ex aeolicus)；拟南芥(Arabidopsis thaliana)；芽孢杆菌(Bacillus sp)；嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)；枯草杆菌(Bacillus subtilis)；横塞巴尔通体(Bartonella henselae)；百日咳杆菌(Bordetella pertussis)；包氏螺旋体菌；流产杆菌(Brucella abortus)；Buchnera aphidicola；洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)；越南伯克霍尔德氏菌(Burkholderia vietnamiensis)；空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)；新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)；鼠型沙眼衣原体(Chlamydia muridarum)；沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)；肺炎衣原体(Chlamydophila pneumoniae)；丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)；产气荚膜梭状芽胞杆菌(Clostridium perfringens)；热纤梭菌(Clostridium thermocellum)；大肠杆菌噬菌体T-反刍动物考德里氏体(Cowdria ruminantium)；Cyanelle Cyanophora paradoxa；犬埃里希体(Ehrlichia canis)；查菲埃立克体(Ehrlichia chaffeensis)；马埃里希体(Ehrlichia equi)；嗜噬胞埃里希体(Ehrlichia phagocytophila)；立氏埃里希体(Ehrlichiaristicii)；腺热埃里希体(Ehrlichia sennetsu)；埃里希氏体′HE剂(Ehrlichia sp′HGE agent)；产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)；聚团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)；栖水肠肝菌(Enterobacteramnigenus)；阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae)；日沟维肠杆菌(Enterobacter gergoviae)；中间肠杆菌(Enterobacter intermedius)；Erwinia aphidicola；胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)；草生欧文菌(Erwinia herbicola)；大肠杆菌(Escherichia coli)；兔热病杆菌(Francisella tularensis)；Glycine max；软性下疳嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)；流感嗜血杆菌Rd(Haemophilus influenzaeRd)；幽门螺旋杆菌；嗜核全孢螺菌(Holospora obtuse)；智人(Homo sapiens)；解鸟氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)；奥克西托克雷白杆菌(Klebsiella oxytoca)；植物克雷白杆菌(Klebsiellaplanticola)；肺炎克雷白杆菌(Klebsiella pneumoniae)；瑞士乳杆菌(Lactobacillus helvetictis)；乳酸菌7eae；乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)；细胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis)；问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)；嗜甲基菌属SS株(Methylovorus sp strainSS)；鸟型分枝杆菌(Mycobacterium avium)；鸟型分枝杆菌亚属菌(Mycobacterium avium subsp avium)；鸟型分枝杆菌亚属副结核菌(Mycobacterium avium subsp paratuberculosis)；麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)；鸟型结核杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)；生殖器支原体(Mycoplasma genitalium)；肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)；桃蚜原发性内共生体(Myzus persicaeprimary endosymbiont)；淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)；颤藻属NKBG，-菠萝泛菌(Oscillatoria sp NKBG，-Pantoea ananas)；出血败血性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)；牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)；绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)；绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)；沟鼠(Rattus norvegicus)；沟鼠(Rattusnorvegicus)；根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)；荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)；球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)；海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus)；普瓦基克氏立克次体(Rickettsia prowazekii)；立克氏立克次体(Rickettsia rickettsii)；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；无花果沙雷菌(Serratiaficaria)；粘质沙雷菌(Serratia marcescens)；悬钩子沙雷菌(Serratiarubidaea)；根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)；米曲霉主要内共生体(Sitophilus oryzae principal endosymbiont)；嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)；肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)；白色链霉菌(Streptomyces albus)；天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)；天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)；变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)；转基因聚球藻(Synechococcus sp)；聚球藻属蓝藻(Synechococcus vulcanus)；集胞藻属(Synechocystis sp)；布氏嗜热杆菌(Thermoanaerobacterbrockii)；海栖热袍菌(Thermotoga maritime)；嗜热水生菌(Thermusaquaticus)；梅毒螺旋体(Treponema pallidum)；沃尔巴克氏体属(Wolbachia sp)；运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)。
cpn10家族亚单元的优点在于，它们具有负责天然伴侣素的蛋白折叠活性的易变环，其可以被除去而不影响支架结构。删除易变环的Cpn10不具有生物学活性，使得它有利地使支架结构无活性，由此使任何潜在的有害作用降到最低。
适宜的生物活性多肽的插入可以使由此产生的该新多肽赋予生物学活性(例如，人血清白蛋白结合)。事实上，插入的多肽的生物学活性可通过使生物活性多肽掺入到该支架结构中而被改善，特别是，例如，当本文所述基于诱变和亲和力的筛选方法用于优化存在支架结构的多肽的靶蛋白结合。
用于肽插入的备优位点是可能的。有利的优项在等效于GroES中的顶端β发夹结构的位置。这其中包括通过需要的肽代替Gp31中的Glu-。该氨基酸序列为Pro(59)-Glu(60)-Gly(61)。这在编码Pro-Gly的DNA水平(CCC：GGG)方便地转变为SmaI位点，离开钝端限制性位点以用于作为DNA片段的肽插入。类似地，在GroES序列的50至53位之间以及在其它cpn10家族成员的等同位置可进行插入。或者，可使用反向PCR，以使该肽展示在支架结构的相反位点。
伴侣素分子的cpn60/Hsp60家族的成员亦可用作支架结构。例如，可以使用四十聚体细菌(tetradecameric bacterial)伴侣素GroEL。在某些实施方案中，异源性多肽将插入到191至376位之间，特别是在197至333位之间(由SacII基因工程化工厂手独特的Cla I位点表示)，以维持中纬线与顶端区域之间的铰链区的完整性，以便使插入的多肽赋予流动性。支架结构的选择可取决于低聚物(或者包含此低聚物和/或衍生自该低聚物的双特异性配体)的预期应用：例如，如果该低聚物期望用于接种疫苗的目的，则免疫原性支架结构(例如衍生自鸟型结核杆菌的免疫原性支架结构)应用是非常有益的，并赋予辅助的作用。
也可以使用cpn60分子的突变体。例如GroEL的单环突变体(GroELSRI)含有四个点突变，其影响到GroEL的两个环(R452E、E461A、S463A和V464A)之间的大部分连接，并且体外功能失活，原因是它被释放以结合GroES。GroELSR2在Glu191-Gly上具有另外的突变，其通过降低对GroES的亲和力而恢复活性。所有这些突变均形成环结构，并且适用作支架结构。
某些天然存在的支架结构分子是细菌噬菌体产物：基于此原因，天然存在的针对此支架结构的抗体是罕见的。这增强了支架结构融合物作为疫苗剂的应用。删除了环的T4 Gp31不具有生物学活性(除了针对T4细菌噬菌体的显性负相或细胞内疫苗以外)，由此使针对宿主的有害作用最小化。然而，插入编码多肽的适宜序列可赋予该新蛋白质生物学活性。事实上，生物学活性可通过插入支架结构蛋白中而被改善。
对于抗原(例如，人血清白蛋白)的抗体或抗体片段的亲和力可通过本发明的低聚反应而增加。抗体片段可以是例如Fv、Fab和F(ab′)2片段，或者是它们的任何衍生物，例如单链Fv片段。抗体或抗体片段可以是非重组的、重组的或人化的。该抗体可以是任何免疫球蛋白亚型例如IgG、IgM等的抗体。
在某些实施方案中，该抗体片段可以是骆驼科化的VH区。已知抗体与其同源抗原之间的主要的分子间相互作用是通过VHCDR3介导的。
下文所述和本领域已知的GroEL和/或GroES(cpn10)支架结构分子的应用提供了VH区或VH CDR3区域的低聚反应，以生产高亲和力的低聚物。两个或多个区域可包括在此低聚物中；在基于cpn10支架结构的低聚物中，可包括多达7个区域，形成结合靶蛋白(例如，人血清白蛋白)的七聚低聚物分子(七聚体(heptabody))。
为了呈递和/或优化某些支架结构多肽/低聚物针对靶蛋白(例如，人血清白蛋白)的亲和力的目的，可以将变异体引入到插入到支架结构多肽中的异源性多肽中，使得此类多肽/低聚物对它们的配体/底物的特异性和/或亲和力可以被检测和/或绘图。可以产生相同环的变异体，或者可以设计为一组标准的不同环，以便快速评价新型多肽对靶蛋白(例如，人血清白蛋白)的亲和力。要以根据已知技术例如PCR通过序列随机化产生变异体。在掺入到蛋白支架结构中之前，可以通过筛选方案例如噬菌体展示使它们经历筛选。
本文提及的“可低聚化的支架结构”是一种能够低聚化或被低聚化以形成支架结构并且异源性多肽可以与该支架结构融合的多肽，优选地，该融合优选通过共价作用而不会使低聚反应能力消失。因此，根据本发明，提供了一种″支架结构″，使用该″支架结构″可以使多肽排列到多聚体中。任选地，可衍出生支架结构的部分野生型多肽可以被除去，例如通过用该异源性多肽取代，该异源性多肽存在于该支架结构上。
单体是具有低聚化或被低聚化能力的多肽。可通过在该多肽中掺入可低聚化的支架结构亚单元而引起低聚反应，如果组合有的话，该可低聚化的支架结构亚单元会与其它支架结构亚单元低聚化。任选地，可通过使用本领域认可的用于与单体结合在一起为目的的连接子而引起低聚反应。
如本文使用的，″低聚物″与″聚合物″或″多聚体″的同义，并用于指代所讨论的不是单体的那些物质。因此，低聚多肽包含至少两个通过共价或非共价连接在一起的单体单元。所使用的单体单元的数目取决于欲使用的低聚物，并且可以为2至20个或者更多。任选地，其为5至10个，并且优选约7个。
噬菌体展示
已经证明噬菌体展示技术在生物学研究中非常有用。其使配体能够从分子大文库中筛选。支架结构技术可以使噬菌体展示的能量以独特的有益方式固定。cpn10分子可以在fd细菌噬菌体中展示为单体，类似于单链Fv分子展示。插入物的文库(代替高度易变环，例如，使用衍生自结合人血清白蛋白的抗体的CDR3多肽)是通过标准方法构建的，并产生针对感兴趣的分子的筛选的文库。此筛选是以亲和力为基础的。在鉴别具有针对靶蛋白(例如，人血清白蛋白)的亲和力之后，有可能通过一次或多次反复的诱变、表达(GroEL蛋白-57.5 Kda GroEL和-10Kda GroES可以如以前所述被表达和纯化(Chatellier et al.1998Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：9861-9866；Corrales and Fersht 19961：265-273)，或者通过任何本领域认可的方法表达和纯化)和亲和力筛选，可以使此类分子低聚化，从而得到此类分子亲和力的优点。任选地，某些筛选的单体能够与它们的结合配偶体交联或低聚化。
纤连蛋白
实施例26：通过CDR移植产生包含结合血清白蛋白的纤连蛋白非-免疫球蛋白支架结构的双特异性配体
以以下方式将dAb7h14的CDR区域用于构建结合人血清白蛋白的纤连蛋白非-免疫球蛋白支架结构多肽。将dAb7h14的CDR1(RASQWIGSQLS；SEQ ID NO.：_)、CDR2(WRSSLQS；SEQ IDNO.：_)和CDR3(AQGAALPRT；SEQ ID NO.：_)序列移植到10Fn3中，分别在21-31(BC环)、51-56(DE环)和76-88(FG环)位置替换天然10Fn3氨基酸残基。通过Biacore进行实时结合分析，以评价人血清白蛋白是否特异性地结合包含dAb7h14的抗-人血清白蛋白CDR区域的固定的纤连蛋白-衍生的多肽。(本领域技术人员理解，结合亲和力可使用任何适宜方法来评价，包括，例如，标记的人血清白蛋白的沉淀作用、竞争性Biacore分析法等)。如果检测到无或低人血清白蛋白亲和力(例如，Kd值在μM范围或更高)，许多策略中的至少一项可用于改善CDR-移植的纤连蛋白多肽的人血清白蛋白结合性质，包括有助于结合亲和力的任何下列方法。
与天然纤连蛋白多肽中的溶剂暴露的环区域相应的纤连蛋白多肽的dAb7h14 CDR-移植的区域的长度是通过使用连接子多肽调节的。例如，使用位于dAb7h14 CDR3多肽序列的N-或C-末端一侧和/或两侧的氨基酸连接子，dAb7h14的9个氨基酸残基CDR3肽序列扩展到13个13氨基酸残基长度，从而达到与天然纤连蛋白序列中的FG环相应的CDR3-移植的区域中13个氨基酸的总移植肽序列长度。连接子多肽的这种应用任选与连接子序列、CDR序列和/或非-CDR纤连蛋白序列的诱变组合(例如，使用如下面所述的诱变优化操作法)，以便改善CDR-移植的纤连蛋白多肽的人血清白蛋白结合能力(例如，通过优化CDR-移植的纤连蛋白多肽中的CDR和纤连蛋白序列)。用于此目的的多肽连接子具有预定的序列，或者，任选地，选自通过含连接子的CDR-移植的纤连蛋白多肽的人血清白蛋白结合能力的评价的随机多肽连接子序列群组。优化方法是平行和/或迭代进行的。平行和迭代优化(例如，亲和力成熟)方法应用如下文所述的筛选方法和/或本领域已知可用于优化多肽结合性质的筛选方法。
通过诱变优化人血清白蛋白结合的出现dAb7h14 CDR的CDR-移植的纤连蛋白多肽，任选地组合了如下文所述的平行和/或迭代筛选方法和/或本领域已知的其它方法。使环绕移植的dAb7h14 CDR多肽序列的10Fn3支架结构多肽区域经历随机的和/或NNK诱变，如上所述进行。此诱变是在10Fn3多肽序列内在氨基酸1-9、44-50、61-54、82-94(β片层的边缘)、19、21、30-46(偶数)、79-65(奇数)(两β片层的溶剂可及面)以及14-16和36-45(非-CDR-样溶剂可及环和β转角)上进行的，并且任选是随机的，以便演化为新的或改良的结合人血清白蛋白的多肽。任选地，使存在于CDR-移植的纤连蛋白多肽中的dAb7h14 CDR多肽区域经历诱变，例如通过随机诱变、NNK诱变、透视诱变和/或其它本领域认可的方法。PCR任选用于执行此类诱变方法，导致CDR-移植的纤连蛋白多肽中产生通过靶序列的序列多样性。此类方法类似于以下针对dAb文库产生所述的那些方法。除了随机诱变和/或透视诱变法以外，应用靶向的氨基酸残基的定向诱变，其中结构信息确立了特异性氨基酸残基对于人血清白蛋白的结合是关键的。
使包含如上面所述基因工程化的移植的dAb7h14 CDR序列的纤连蛋白多肽进行平行和/或迭代筛选方法，以鉴别对人血清白蛋白结合是最优化的那些纤连蛋白多肽。例如，在产生dAb7h14 CDR-移植的纤连蛋白多肽序列的文库之后，将此多肽的该文库展示在噬菌体上，再经过多轮要求血清白蛋白结合和/或增殖的筛选，正如下面从dAb的文库中筛选结合血清白蛋白的dAb所述的。任选地，对固定在免疫管上的血清白蛋白或者在溶液中的抗生物素化的血清白蛋白进行筛选。任选地，使用表面等离振子共振(SPR)以及采用Biacore系统(Uppsala，Sweden)的Biacore(Karlsson et al.，1991)测定结合亲和力，完全优化的纤连蛋白-衍生的多肽理想地达到了人血清白蛋白结合亲和力Kd值在nM范围或更好。在鉴别结合人血清白蛋白的纤连蛋白-衍生的多肽之后，然后通过下文所述任何方法使此类多肽用于生产双特异性配体组合物。
实施例27：通过筛选血清白蛋白结合部分产生包含结合血清白蛋白的纤连蛋白非-免疫球蛋白支架结构的双特异性配体
使天然纤连蛋白-特别是纤连蛋白的10Fn3多肽-经历文库筛选和任选的亲和力成熟技术，以便产生结合人血清白蛋白的纤连蛋白非-免疫球蛋白支架结构分子以用于本发明的双特异性配体。
通过Biacore进行实时结合分析，以评价人血清白蛋白是否特异性地结合固定的天然纤连蛋白和/或纤连蛋白-衍生的多肽。在纤连蛋白多肽对人血清白蛋白的无或低结合亲和力(例如，Kd值在μM范围或更高)的检测之后，许多策略中的至少一项可用于赋予人血清白蛋白对纤连蛋白多肽的结合性质，包括促成结合亲和力的以下方法中的一种或多种。
通过诱变方法实现和优化人血清白蛋白结合的纤连蛋白支架结构多肽，任选地组合了如下文所述的平行和/或迭代筛选方法和/或本领域已知的其它方法。10Fn3支架结构多肽区域经历随机和/或NNK诱变，如下文所述进行。此诱变是在完整的10Fn3多肽上进行的，或者在10Fn3多肽中的特异性序列上进行的，包括氨基酸1-9、44-50、61-54、82-94(β片层的边缘)；19、21、30-46(偶数)、79-65(奇数)(两β片层的溶剂可及面)；21-31、51-56、76-88(CDR-样溶剂可及环)；以及14-16和36-45(其它溶剂可及环和β转角)，并且任选是随机的，以便演化为新的或改良的结合人血清白蛋白的多肽。PCR任选用于执行此类诱变方法，导致纤连蛋白多肽中产生通过靶序列的序列多样性。(此类方法类似于以下针对dAb文库产生所述的那些方法)。除了随机诱变方法以外，应用靶向的氨基酸残基的定向诱变，其中结构信息证实了纤连蛋白多肽的特异性氨基酸残基对于人血清白蛋白的结合是关键的。
使如上面所述基因工程化的纤连蛋白多肽进行平行和/或迭代筛选方法，以鉴别对于人血清白蛋白结合来说是最优化的那些纤连蛋白多肽。例如，在产生诱变处理的纤连蛋白多肽序列的文库之后，将所述多肽的文库展示在噬菌体上，再经过多轮要求血清白蛋白结合和/或增殖的筛选，正如下面从dAb的文库中筛选结合血清白蛋白的dAb所述的。任选地，对固定在免疫管上的血清白蛋白或者在溶液中的抗生物素化的血清白蛋白进行筛选。任选地，使用表面等离振子共振(SPR)以及采用Biacore系统(Uppsala，Sweden)的Biacore(Karlsson et al.，1991)测定结合亲和力，完全优化的纤连蛋白-衍生的多肽理想地达到了人血清白蛋白结合亲和力Kd值在nM范围或更好。
在鉴别结合人血清白蛋白的纤连蛋白多肽之后，然后通过下文所述任何方法使此类多肽用于生产双特异性配体组合物。
纤连蛋白非-免疫球蛋白支架结构
在本发明的某些实施方案中，包含纤连蛋白或其功能部分和/或片段的非-免疫球蛋白支架结构被基因工程化以结合血清白蛋白。使用衍生自纤连蛋白III型模块(Fn3)的非-免疫球蛋白支架结构。该纤连蛋白III型模块是一咱在哺乳动物血液和结构蛋白中发现的共同区域，它们在蛋白序列数据库中出现400次以上，并且到目前为止估计出现于全部蛋白序列的2％中。包括Fn3模块序列的蛋白包括纤连蛋白、结合腕蛋白(tenascin)、细胞内细胞骨架蛋白和原核酶(Bork and Doolittle，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：8990，1992；Borket al.，Nature Biotech.15：553，1997；Meinke et al.，J.Bacteriol.175：1910，1993；Watanabe et al.，J.Biol.Chem.265：15659，1990)。一种特别的纤连蛋白的非-免疫球蛋白支架结构是人Fn3(10Fn3)的第十模块，其包含94个氨基酸残基。此区域的所有折叠与最小功能抗体片段的即重链的可变区域紧密相关，其在骆驼和骆马IgG中包含全部的抗原识别单元。骆驼和骆马区域与10Fn3区域之间的主要差别在于：(i)10Fn3具有较少的β链(7个比9个)以及(ii)在骆驼和骆马区域中两个相互相对包裹的β片层通过二硫键连接，但在10Fn3中未连接。
与IgG重链的抗原结合环相应的三个10Fn3环在氨基酸残基21-31(BC)、51-56(DE)和76-88(FG)之间延续(参见美国专利No.7,115,396的图3，其全部内容通过引用并入本文)。长度分别为11和6个残基的BC和DE环落入到抗体重链中发现的相应的抗原识别环的狭窄范围，即分别为7-10和4-8个残基。相应地，CDR移植策略可以容易地应用于将重链CDR序列引入这些区域中。另外的和/或另选的，这两个环可通过任何本领域认可的方法引入遗传变异性(例如，位置定向、透视或其它诱变方法、随机化等等)，并且任选的，可以针对高抗原亲和力筛选所得的多肽。(另选地，引入遗传变异性和/或筛选操作法可用于鉴别具有降低的结合亲和力和/或优化的特征例如稳定性、毒性等的组合物)。通过使用这些方法，纤连蛋白的BC和DE环可以被基因工程化，使得与抗原的接触点等同于抗体中的相应CDR1和CDR2区域的接触点。
与BC和DE环不同，10Fn3的FG环是为12个残基长，然而抗体重链中的相应环范围为4-28个残基。相应地，为优化抗原结合，10Fn3的FG环可在长度(例如，通过随机化和/或使用多肽连接子序列(其也可以是随机的))以及序列上变化，以覆盖4-28个残基的CDR3长度范围，在抗原结合中获得最大可能的柔性和亲和力。事实上，对于其中的CDR直接移植到纤连蛋白支架结构中的那些方法以及其中的天然纤连蛋白支架结构被筛选和/或优化以用于结合血清白蛋白(或其它靶抗原)的那些方法，抗体模拟物的CDR样环的长度和序列可以在体外或体内亲和力成熟期间被随机化(如下文详述的)。
第十个纤连蛋白III型区域10Fn3即便在低温下也迅速重新折叠；在5℃下其骨架构象在1秒种内恢复。10Fn3的热稳定性高(ΔGu＝24kJ/mol＝5.7千卡/mol)，与其110℃的高熔化温度相关。
10Fn3的生理作用之一是作为纤连蛋白的亚单元，其为一种糖蛋白，以可溶性形式存在于体液中，或者以不溶性形式存在于细胞外基质中(Dickinson et al.，J.Mol.Biol.236：1079，1994)。220-250Kd的纤连蛋白单体含有12个I型模块、2个II型模块、和17个纤连蛋白III型模块(Potts and Campbell，Curr.Opin.Cell Biol.6：648，1994)。不同的III型模块参与纤连蛋白与整联蛋白、肝素和硫酸软骨素的结合。发现10Fn3通过整联蛋白结合在它的一个暴露的环上的Arg-Gly-Asp(RGD)基序介导细胞粘附。已显示相似的RGD基序通过其它蛋白例如纤维蛋白原、von Wellebrand因子和玻璃体结合蛋白(vitronectin)参与整联蛋白结合(Hynes et al.，Cell 69：11，1992)。对于10Fn3，没有描述其它基质-或细胞-结合作用。
10Fn3比含有RGD的短肽仅具有稍多的粘附活性的观测，其与10Fn3的细胞-结合活性局限于RGD肽而非分布在整个10Fn3结构中的结论是相符的(Baron et al.，Biochemistry 31：2068，1992)。无RGD基序的10Fn3不大可能结合其它血浆蛋白或细胞外基质的事实，使得10Fn3是一种替代抗体的有用的支架结构。此外，在血流中的天然纤维蛋白原中存在10Fn3表明，10Fn3本身在原始有机体中不大可能是免疫原性的。
此外，已显示10Fn3框架具有暴露的随机化的环序列，促进了抗体拟似物的各种群体的产生。这一测定是通过检测10Fn3序列的柔性来实现的。具体地，使人10Fn3序列与来自其它来源的纤连蛋白的序列以及关联蛋白的序列进行比对，将此比对的结果绘图于人10Fn3区域的三维结构中。此比对表明，大多数的保守残基发现于β片层夹层的核心，而高度可变的残基位于沿着β片层的边缘(包括N-和C-末端)、两β片层的溶剂可及面上、以及三个溶剂可及环上，该溶剂可及环可用作用于抗体拟似物的亲和力成熟高度可变环。考虑到这些结果，确定这三个环的随机化，不大可能对10Fn3框架本身的整体折叠或稳定性有不良作用。
对于人10Fn3序列，此分析最低限度地表明，氨基酸1-9、44-50、61-54、82-94(β片层的边缘)；19、21、30-46(偶数)、79-65(奇数)(两β片层的溶剂可及面)；21-31、51-56、76-88(CDR-样溶剂可及环)；以及14-16和36-45(其它溶剂可及环和β转角)可以被随机化，以演化为新的或改善的化合物-结合蛋白。此外，如上文讨论的，改变一个或多个溶剂暴露环的长度也可以包括在此类定向演化方法中。
另选地，β-片层序列的改变也可用于演化新蛋白。这些突变体改变了支架结构，从而间接改变了环结构。如果采用此方法，突变体不会使该序列饱和，但可以引入相当少的突变体。优选地，通过此方法不会超过3-20个变化会引入到β-片层序列。
序列变异可通过任何技术引起，所述技术包括，例如，通过Taq聚合酶的诱变(Tindall and Kunkel，Biochemistry 27：6008(1988))、片段重组或其组合。类似地，文库的结构多样性的增加可用于引起非-免疫球蛋白支架结构的进一步改善，所述增加例如通过改变出现的CDR和/或CDR-样环的长度和序列，或者通过基于筛选的库群中发现的有利的框架突变体的结构重新设计。
包含纤连蛋白支架结构多肽的融合蛋白
本文描述的纤连蛋白支架结构多肽可以与其它蛋白区域融合。例如，鉴别为结合人血清白蛋白的纤连蛋白支架结构多肽可以与重链单个可变区或其抗原结合片段融合，以便产生包含基于纤连蛋白的血清白蛋白结合部分的本发明双特异性配体。通过使IgG(Fc)的恒定区域与纤连蛋白支架结构多肽例如10Fn3模块融合，优选通过10Fn3的C-末端，纤连蛋白支架结构多肽还可以与人免疫应答整合。在此10Fn3-Fc融合分子中的Fc会激活免疫应答的补体成分，并且可用于增加基因工程化的纤连蛋白多肽的治疗价值。类似地，纤连蛋白支架结构多肽例如10Fn3与补体蛋白例如C1q之间的融合可以用于靶向细胞，纤连蛋白支架结构多肽例如10Fn3与毒素之间的融合可以用于特别地破坏带有特定抗原的细胞。这些融合物的任一项均可通过标准技术产生，例如，通过使用公众可得的基因序列和/或文所述的其它构建军的从重组融合基因表达融合蛋白。
支架结构多聚体
除了单体，本文描述的任何纤连蛋白支架结构构造可以被生成为支架结构的二聚体或多聚体，例如以增加效价并因此增加抗原(例如，血清白蛋白)结合的亲和力的方式。此类多聚体可通过共价结合产生。例如，可以结合单个10Fn3模块，其方式是通过模仿天然8Fn3-9Fn3-10Fn3 C-至-N-末端结合，或者通过模仿通过它们的恒定区域结合在一起的抗体二聚体。可以开发10Fn3-Fc构造，以设计10Fn3-Fc::Fc-10Fn3的一般方案的二聚体。基因工程化进入到Fc::Fc界面的键可以是共价的或非共价的。此外，不同于Fc的二聚化或多聚化配偶体(例如其它非-免疫球蛋白支架结构部分和/或基于免疫球蛋白的抗原结合部分)可用于杂交(例如10Fn3杂交)，以产生这种更高级别的结构。多聚体的其它实例包括本文描述的单个可变区。
在特别的实施例中，共价结合的多聚体可构建编码该多聚体的融合基因而产生，或者另选地通过使针对半胱氨酸残基的密码子基因工程化进入单体序列并使得产表达产物之间发生二硫键形成而产生。非共价结合的多聚体也可通过多种技术产生。这些技术包括向单体序列中引入相应于阳性和/或阴性电荷残基的密码子，以及在表达产物中使这些残基之间(并且因此在单体之间)发生相互作用。可通过采用天然存在于单体亚单元中的有利的荷电残基例如纤连蛋白的负电荷残基来简化该方法。产生包含纤连蛋白支架结构多肽的非共价结合组合物的另一方法是向该单体基因(例如，在氨基-或羧基-末端)中引入针对感兴趣的蛋白或蛋白区域的编码序列。此类蛋白或蛋白区域包括线圈-线圈(coil-coil)基序、亮氨酸拉链基序，以及已知直接形成二聚体或更高级多聚体的任何众多蛋白亚单元(或其片段)。
纤连蛋白-样分子
尽管10Fn3代表了一种优选的用于产生抗体拟似物的支架结构，在本文所述分子中可以用其它分子代替10Fn3。这些分子非限制性的包括人纤连蛋白模块1Fn3-9Fn3和11Fn3-17Fn3以及来自非人类动物和原核生物的相关Fn3模块。此外，还可以使用来自其它蛋白的具有与10Fn3序列同源性的Fn3模块，例如结合腕蛋白和粗纤维调节素(undulin)。具有免疫球蛋白样折叠的其它示例性支架结构(但是具有与VH区不相关的序列)包括N-钙粘蛋白、ICAM-2、肌联蛋白(titin)、GCSF受体、细胞因子受体、糖苷酶抑制剂、E-钙粘蛋白和抗生素色蛋白。具有相关结构的其它区域可以衍生自髓鞘膜粘附分子P0、CD8、CD4、CD2、I类MHC、T-细胞抗原受体、CD1、C2和VCAM-1的I组区域、肌球蛋白-结合蛋白C的I-组免疫球蛋白区域、肌球蛋白-结合蛋白H的I-组免疫球蛋白区域、telokin的I-组免疫球蛋白区域、telikin、NCAM、twitchin、神经胶质蛋白、生长激素受体、促红细胞生成素受体、催乳素受体、GC-SF受体、干扰素-γ受体、β-半乳糖苷酶/葡糖醛酸糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶和转谷氨酰胺酶。另外，可以使用包括一个或多个免疫球蛋白-样折叠的任何其它蛋白。此类蛋白可以被鉴别，例如，使用SCOP程序(Murzin et al.，J.Mol.Biol.247：536(1995)；Lo Conte et al.，NucleicAcids Res.25：257(2000)。
通常，表现出与VH区有结构亲缘关系的任何分子(例如使用以上SCOP计算机程序所鉴别的)可以被用作非-免疫球蛋白支架结构。此类分子可以(如纤连蛋白)包括在分子的N-末端一极的三个环以及在C-末端一极的三个环，它们各自可以被随机化，以产生不同的文库；另选地，可以使用更大的区域，具有更大数目的环，只要许多此类表面可随机化的环在空间上位置足以接近到使它们能够参与抗原结合。具有位置相互接近的三个以上环的多肽的实例包括T-细胞抗原受体和超氧化物歧化酶，它们各自具有四个可以被随机化的环；以及Fn3二聚体、组织因子区域和细胞因子受体区域，它们各自具有包括两个类似区域的三组，其中三个可随机化的环是此两个区域的一部分(使得环的总数达到6个)。
在再另一备选方案中，具有在空间上位置足够接近的可变环的任何蛋白可以用作候选的结合蛋白产物。例如，可以使用具有空间关联、溶剂可及环的大蛋白，甚至可以使用与免疫球蛋白-样折叠结合不相关的那些蛋白。示例性的蛋白非限制性地包括细胞色素F、绿色荧光蛋白、GroEL和竹芋蛋白(thaumatin)。通过这些蛋白展示的环可以被随机化，并且优选为选自如本文描述的随机化文库的结合子，例如实施例1。由于它们的大小，可以获得这样的分子，它们表现为抗原结合表面比之于抗体-抗原相互作用中发现的表面大得多。其它有用的此类支架结构也可使用SCOP程序鉴别(Murzin etal.，J.Mol.Biol.247：536(1995))，以监视具有许多环特别是位于平行β片层中的环或者具有许多α-螺旋(α-helices)的候选蛋白.
来自不同有机体和母体蛋白的模块可能最适合不同的用途。例如，在设计本发明的纤连蛋白支架结构多肽中，可能最希望产生来自对该有机体而言是天然的纤连蛋白或纤连蛋白-样分子的蛋白，对该有机体而言希望有治疗作用。相反，该原始有机体重要性低，或者甚至对于待用于体外应用例如诊断或作为研究试剂的纤连蛋白支架结构而言是不相关的。
对于任意的这些分子，可以通过本文描述的任何方法产生文库并且用于筛选结合蛋白。
基于支架结构的结合蛋白的定向演化
本文描述的非-免疫球蛋白支架结构可在任何技术中用于演化新的或改善的结合蛋白。在一个特别的实例中，结合的靶(例如，血清白蛋白)被固定在固体载体例如柱树脂或微量滴定板孔上，且该靶与候选基于非-免疫球蛋白支架结构的结合蛋白的文库接触。此文库可由纤连蛋白支架结构克隆组成，例如从天然(野生型)10Fn3支架结构通过序列随机化和/或10Fn3 CDR-样环的长度构造的10Fn3克隆。如果需要，此文库可以是RNA-蛋白融合文库，其例如通过如下所述技术产生：Szostak et al.，美国序列号No.09/007,005和序列号No.09/247,190；Szostak et al.，WO98/31700；和Roberts&Szostak，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)vol.94，p.12297-12302。或者，其可以为DNA-蛋白文库(例如，描述于Lohse，DNA-ProteinFusions and Uses Thereof，美国序列号No.60/110,549，美国序列号No.09/459,190和WO 00/32823)。使该融合物文库与固定的靶孵育，洗涤该载体以除去非特异性结合子，在非常严格的条件下洗脱最紧密的结合子，再进行PCR以回收序列信息，或者产生新的结合子的文库，其可以用于重复该筛选过程，用或不用进一步的序列诱变。可以进行许多轮的诱变，直到获得对抗原(例如，血清白蛋白)有足够亲和力的结合子。
在一个特别的实例中，该10Fn3支架结构可用作筛选靶。例如，如果如果需要结合存在于10个残基环上的特异性肽序列(例如，血清白蛋白)的蛋白，则构建单个10Fn3克隆，其中它的一个环被设定为10的长度并设定为需要的序列。该新克隆在体内表达并纯化，然后固定在固体载体上。然后使基于适宜支架结构的RNA-蛋白融合文库与该载体相互作用，然后将该载体洗涤，再洗脱需要的分子并如上文所述重新筛选。
类似地，本文所述的支架结构例如10Fn3支架结构可被用于寻找天然蛋白，该天然蛋白与通过例如在10Fn3环中的支架结构展示的肽序列相互作用。该支架结构蛋白例如10Fn3蛋白如上文所述被固定，并筛选RNA-蛋白融合文库以用于该展示环的结合子。通过多轮筛选富集该结合子并通过DNA测序鉴别。
此外，在以上方法中，尽管RNA-蛋白文库代表了用于定向演化的示例性文库，任何类型的基于支架结构的文库均可被用于本发明的筛选方法。
纤连蛋白支架结构多肽的应用
本文描述的纤连蛋白支架结构多肽可以被演化以结合血清白蛋白或任何感兴趣的抗原。此纤连蛋白支架结构蛋白具有优于天然抗体的热力学性质，并且可以在体外迅速增长被演化。相应地，这些纤连蛋白支架结构多肽可应用于产生结合区，以用于研究、治疗和诊断领域。
诱变的亲和力成熟
在全部或一个亚组的筛选步骤之后，本文描述的筛选还可以与诱变组合，以进一步增加文库样性。可以使用亲和力成熟的方法，例如易错PCR(Cadwell and Joyce，PCR Methods Appl 2：28(1992))或者随机诱变、下文所述NNK诱变、透视诱变的备选形式(其中CDR-移植的纤连蛋白支架结构多肽通过使用天然存在的CDR多样性而被基因工程化以优化抗原结合-参见，例如，WO 06/023144，其通过引用并入本文)，和/或基它本领域认可的用于产生多肽多样性的诱变方法，其与针对抗原结合亲和力的一或多轮筛选组合。
以下描述的任何支架结构蛋白均可相互组合，以用于例如本发明的双特异性配体组合物。例如，CDR可以被移植到CTLA-4支架结构，并与抗体VH或VL区一起使用，以形成多价配体。同样，可以组合纤连蛋白、脂质运载蛋白、亲合体和其它支架结构。
本说明书提及的全部出版物和所述出版物中引用的参考文献通过引用并入本文。本发明方法和系统的各种各样的修改和变更对本领域技术人员来说是显而易见，并且不会脱离本发明的范围和精神。尽管本发明结合具体的优选实施方案进行了描述，但应理解所要求的本发明不应该过度局限于这些具体的实施方案。事实上，对完成本发明所述模式的各种修改对于分子生物学或相关领域中的技术人员而言是显而易见的，它们都在所附权利要求的范围之内。
附录1：增加体内半衰期的多肽
α-1糖蛋白(α酸性糖蛋白)(AAG)
α-1抗胰凝乳蛋白(ACT)
α-1抗胰蛋白酶(AAT)
α-1微球蛋白(蛋白HC)(AIM)
α-2巨球蛋白(A2M)
抗凝血酶III(AT III)
载脂蛋白A-1(Apo A-1)
载脂蛋白B(Apoliprotein B，Apo B)
β-2-微球蛋白(B2M)
血浆铜蓝蛋白(Cp)
补体成分(C3)
补体成分(C4)
C1酯酶抑制剂(C1 INH)
C-反应蛋白(CRP)
半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cys C)
铁蛋白(FER)
纤维蛋白原(FIB)
纤连蛋白(FN)
触珠蛋白(Hp)
血液结合素(HPX)
免疫球蛋白A(IgA)
免疫球蛋白D(IgD)
免疫球蛋白E(IgE)
免疫球蛋白G(IgG)
免疫球蛋白M(IgM)
免疫球蛋白轻链(κ/λ)
脂蛋白(a)[Lp(a)]
甘露糖结合蛋白(MBP)
肌球蛋白(Myo)
纤溶酶原(PSM)
前白蛋白(甲状腺素运载蛋白)(PAL)
视黄醇结合蛋白(RBP)
类风湿因子(RF)
血清淀粉状蛋白A(SAA)
可溶性转铁蛋白受体(sTfR)
转铁蛋白(Tf)
附件2
  配对   治疗相关参考
  TNFα/TGF-β   ·将TGF-b和TNF注射到胶原诱导关节炎模型的踝关节内明显增强关节的炎症。对非胶原攻击的小鼠无效。
  TNFα/IL-1   ·TNF和IL-1在葡萄膜炎的病理中起协同作用。·TNF和IL-1在疟疾的病理中起协同作用(低血糖，NO)。·TNF和IL-1在炎症中协同诱导多型核白细胞(PMN)的迁移。·IL-1和TNF协同诱导PMN浸透进入腹膜。·IL-1和TNF协同诱导内皮细胞分泌IL-1。炎症时很重要。·IL-1或TNF单独诱导某些细胞浸润到关节滑膜中。IL-1诱导PMN、TNF诱导单核细胞。由于增加的PMN，它们一起诱导更严重的炎症反应。·循环的心肌抑制物(休克时存在)是低水平的协同起作用的IL-1和TNF。
  TNFα/IL-2   ·与杀伤性T细胞的协同活化最相关。
  TNFα/IL-3   ·肿瘤坏死因子α诱导次级造血细胞因子，从而导致白细胞介素3和肿瘤坏死因子α协同刺激急性髓性白血病母细胞的克隆增生。·Cancer Res.1992 Apr 15；52(8)：2197-201.
  TNFα/IL-4   ·IL-4和TNF协同诱导内皮细胞上VCAM表达。提示在哮喘中发挥作用。同样在RA中与滑膜有关。·TNF和IL-4协同诱导角质形成细胞中IL-6的表达。·TNF-α与IL-4或IL-13的组合能通过增加mRNA的稳定性，使培养的成纤维细胞样的滑膜细胞中VCAM一1的水平持续升高。Am J Pathol.1999Apr；154(4)：1149-58
  TNFα/IL-5   ·支气管过敏成人及其儿童中肿瘤坏死因子系统和血清中白细胞介素-4、白细胞介素-5、白细胞介素-8、嗜酸细胞阳离子蛋白和免疫球蛋白E水平之间的关系。Allergy Asthma Proc.2003 Mar-Apr；24(2)：111-8.
  TNFα/IL-6   ·TNF和IL-6是一种新的人类骨髓瘤细胞细胞系OH-2
  细胞的有效生长因子。Eur J Haematol.1994Jul；53(1)：31-7.
  TNFα/IL-8   ·TNF和IL-8与PMN协同激活血小板。提示在急性呼吸窘迫综合症中的作用。·见IL-5/TNF(哮喘)。中性粒细胞介导的血小板活化中白细胞介素-8和肿瘤坏死因子-α之间的协同作用。Eur Cytokine Netw.1994Sep-Oct；5(5)：455-60.(成人呼吸窘迫综合征(ARDS))
  TNFα/IL-9
  TNFα/IL-10   ·IL-10诱导并与TNF协同诱导慢性感染T细胞上HIV的表达。
  TNFα/IL-11   ·细胞因子协同诱导破骨细胞分化：被永生化细胞或正常的颅盖细胞所支持。Am J Physiol Cell Physiol.2002 Sep；283(3)：C679-87.(骨丢失)
  TNFα/IL-12
  TNFα/IL-13   ·培养的纤维母细胞样滑膜成纤维细胞中的持续高水平的VCAM-1可通过TNF-α合并IL-4或IL-13增加mRNA稳定性而实现。Am J Pathol.1999Apr；154(4)：1149-58.·白细胞介素-13和肿瘤坏死因子-α协同诱导人鼻纤维母细胞中嗜酸细胞活化趋化因子的产生。Clin ExpAllergy.2000 Mar；30(3)：348-55.·白细胞介素-13和肿瘤坏死因子-α协同诱导人鼻纤维母细胞中嗜酸细胞活化趋化因子的产生。Clin ExpAllergy.2000 Mar；30(3)：348-55(过敏性炎症)。·在儿童肾病综合症治疗反应中血清TNF-β和L-13的关系。Cytokine.2003 Feb 7；21(3)：155-9.
  TNFα/IL-14   ·吸入性肿瘤坏死因子α在轻度哮喘患者中的作用。THorax.2002 Sep；57(9)：774-8.
  TNFα/IL-15   ·吸入性肿瘤坏死因子α在轻度哮喘患者中的作用。Thorax.2002 Sep；57(9)：774-8.
  TNFα/IL-16   ·肿瘤坏死因子-α-诱导的呼吸道内皮细胞中白细胞介
  素-16的合成：5-羟色胺的刺激激活。Am J Respir CellMol Biol.2003 Mar；28(3)：354-62.(呼吸道炎症)。·风湿性关节炎患者中促炎症反应细胞因子与循环白细胞介素16之间的相关性。Rheumatology(Oxford).2001 Apr；40(4)：474-5。无摘要。·白细胞介素16在克罗恩病中被上调节，并参与小鼠TNBS结肠炎。Gastroenterology.2000Oct；119(4)：972-82.
  TNFα/IL-17   ·抑制白细胞介素-17可预防包氏螺旋体菌(Borreliaburgdorferi)感染小鼠关节炎的发展。Infect Immun.2003 Jun；71(6)：3437-42.·白细胞介素17协同肿瘤坏死因子α在体外诱导软骨损伤。Ann Rheum Dis.2002Oct；61(10)：870-6.·MG-CSF在IL-17和TNF-α引起的呼吸道中性粒细胞聚集中的作用。Eur Respir J.2003 Mar；21(3)：387-93.(呼吸道炎症)·概括了白细胞介素-1、肿瘤坏死因子α和白细胞介素-17协同上调节人膝关节炎半月板移植体中NO和前列腺素E2的生成。Arthritis Rheum.2001Sep；44(9)：2078-83.
  TNFα/IL-18   ·类风湿性关节炎患者膝关节滑膜组织中白细胞介素-18的表达与白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子α水平增高的相关性。Arthritis Rheum.2003Feb；48(2)：339-47.·概括了II型糖尿病患者血清中白细胞介素-18和肿瘤坏死因子-α水平的增高：与糖尿病肾病的关系。Metabolism.2003 May；52(5)：605-8.
  TNFα/IL-19   ·概括了IL-19诱导IL-6和TNF-α的产生并通过TNF-α引起细胞凋亡。J Immunol.2002 Oct15；169(8)：4288-97.
  TNFα/IL-20   ·细胞因子概要：IL-20——种新的皮炎效应分子。CurrBiol.2001 Jul 10；11(13)：R531-4
  TNFα/补体   ·炎症与凝集：对于败血症患者的关系。Clin InfectDis.2003 May 15；36(10)：1259-65.Epub 2003 May 08.综述。
  TNFα/IFN-γ   ·诱导大脑中。·协同抗病毒反应/IFN-β诱导。·中性粒细胞活化/呼吸爆发。·内皮细胞活化·注意应用TNF/IFN-γ作为抗病毒治疗时的毒性作用·人星型胶质细胞表达Fractalkine。·许多关于炎症反应即LPS亦为巨噬细胞活化的论文。·抗-TNF和抗-IFN-γ协同保护小鼠避免致死性内毒素血症。
  TGF-β/IL-1   ·人造骨细胞合成前列腺素·小肠内皮细胞产生IL-6(炎症模型)·刺激肺成纤维细胞中的IL-11和IL-6(炎症模型)·视网膜中IL-6和IL-8的生成
  TGF-β/IL-6   ·骨肉瘤(Chondrocarcoma)增殖
  IL-1/IL-2   ·B-细胞活化·LAK细胞活化·T-细胞活化·在淋巴因子激活的杀伤细胞的产生中IL-1和IL-2的协同作用是由TNF-α和β(淋巴毒素)介导的。Cytokine.1992 Nov；4(6)：479-87.
  IL-1/IL-3
  IL-1/IL-4   ·B-细胞活化·IL-4诱导内皮细胞活化中IL-1的表达。
  IL-1/IL-5
  IL-1/IL-6   ·B细胞活化·T细胞活化(可代替辅助细胞)·IL-1诱导IL-6表达·C3和血清淀粉状蛋白表达(急性期反应)
  ·HIV表达·软骨胶原损伤。
  IL-1/IL-7   ·IL-1诱导的胸腺细胞增殖中IL-7是必需的。IL-7涉及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子或肿瘤坏死因子与IL-1协同作用的。J Immunol.1992 Jan1；148(1)：99-105.
  IL-1/IL-8
  IL-1/IL-10
  IL-1/IL-11   ·细胞因子协同诱导破骨细胞分化：被永生或正常的颅顶细胞所支持。Am J Physiol Cell Physiol.2002Sep；283(3)：C679-87.(骨丢失)
  IL-1/IL-16   ·类风湿性关节炎患者中促炎症反应细胞因子与循环白细胞介素16的相关性。Rheumatology(Oxford).2001 Apr；40(4)：474-5。无摘要。
  IL-1/IL-17   ·白细胞介素-17的抑制作用可预防包氏螺旋体菌感染小鼠关节炎的发展。Infect Immun.2003Jun；71(6)：3437-42.·白细胞介素17在骨关节炎中人软骨破坏和滑膜炎症中的作用。Osteoarthritis Cartilage.2002Oct；10(10)：799-807.·概括了白细胞介素-1、肿瘤坏死因子α和白细胞介素-17协同上调节人膝关节炎半月板移植体中NO和前列腺素E2的生成。Arthritis Rheum.2001Sep；44(9)：2078-83.
  IL-1/IL-18   ·类风湿性关节炎患者膝关节滑膜组织中IL-18表达与白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子α水平增高的相关性。Arthritis Rheum.2003 Feb；48(2)：339-47.
  IL-1/IFN-g
  IL-2/IL-3   ·T-细胞增殖·B细胞增殖
  IL-2/IL-4   ·B-细胞增殖·T-细胞增殖
  ·(选择性诱导CD8和NK淋巴细胞的活化)IL-2R β拮抗剂P1-30可协同IL-2，IL-4，IL-9和IL-15的作用：生物学和分子效应。J Immunol.2000 Oct 15；165(8)：4312-8.
  IL-2/IL-5   ·B-细胞增殖/Ig分泌·IL-5诱导B细胞上的IL-2受体
  IL-2/IL-6   ·细胞毒性T细胞的发育
  IL-2/IL-7
  IL-2/IL-9   ·参见IL-2/IL-4(NK-细胞)
  IL-2/IL-10   ·B-细胞活化
  IL-2/IL-12   ·IL-12协同IL-2诱导人类新鲜NK细胞中淋巴因子激活的细胞毒性、穿孔素和颗粒酶基因的表达。CellImmunol.1995 Oct 1；165(1)：33-43.(T-细胞活化)
  IL-2/IL-15   ·参见IL-2/IL-4(NK细胞)·(T细胞活化和增殖)IL-15和IL-2：体内T细胞生死问题。Nat Med.2001 Jan；7(1)：114-8.
  IL-2/IL-16   ·IL-16和IL-2协同激活CD4+T细胞。J Immunol.1998Mar 1；160(5)：2115-20.
  IL-2/IL-17   ·白细胞介素17早期参与人和实验性肾脏异体移植排斥的证据。J Pathol.2002 Jul；197(3)：322-32.
  IL-2/IL-18   ·白细胞介素18(IL-18)协同IL-2诱导小鼠致死性肺损伤：间质性肺炎发病中细胞因子、趋化因子和自然杀伤细胞的潜在作用。Blood.2002 Feb15；99(4)：1289-98.
  IL-2/TGF-β   ·CD4效应子命运的控制：转化生长因子β1和白细胞介素2协同防止凋亡并促进效应子扩增。J Exp Med.1995 Sep 1；182(3)：699-709.
  IL-2/IFN-γ   ·B-细胞分泌Ig·IL-2诱导T细胞表达IFN-γ
  IL-2/IFN-α/β   ·无
  IL-3/IL-4   ·协同肥大细胞生长·IL-4与GM-CSF或IL-3在诱导人单核细胞表达CD23
  中的协同效应：IFN-α和IFN-γ的调节效应。Cytokine.1994 Jul；6(4)：407-13.
  IL-3/IL-5
  IL-3/IL-6
  IL-3/IFN-γ   ·IL-4和IFN-γ协同增加人小肠内皮细胞中全部多聚IgA受体水平。蛋白酪氨酸激酶的作用。J Immunol.1996 Jun 15；156(12)：4807-14.
  IL-3/GM-CSF   ·细胞因子对人嗜酸性细胞IL-3、IL-5和GM-CSF受体α-链表达的差别调节：IL-3、IL-5和GM-CSF下调IL-5受体α表达，伴随有对IL-5反应的降低，但上调IL-3受体α表达。J Immunol.2003 Jun 1；170(11)：5359-66.(过敏性炎症)
  IL-4/IL-2   ·IL-4协同增加IL-2和IL-12诱导小鼠NK细胞表达IFN-{γ}。Blood.2003 Mar 13[Epub印刷前]
  IL-4/IL-5   ·增加肥大细胞对IgE反应时组胺等的分泌·类天疱疮中相关的Th2样细胞因子反应。IL-4和IL-5在发病机理中的作用。Int J ImmunopatholPharmacol.1999 May-Aug；12(2)：55-61.
  IL-4/IL-6
  IL-4/IL-10
  IL-4/IL-11   ·维持小鼠初始造血干细胞增殖过程中白细胞介素-11和白细胞介素-4之间的协同交互作用。Blood.1991Sep 15；78(6)：1448-51.
  IL-4/IL-12   ·IL-4和IL-18对树突状细胞产生IL-12依赖性IFN-γ的协同效应。J Immunol.2000 Jan 1；164(1)：64-71.(增加Th1/Th2分化)·IL-4协同增加IL-2和IL-12诱导的小鼠NK细胞表达IFN-{γ}。Blood.2003 Mar 13[Epub印刷前]
  IL-4/IL-13   ·概括了白细胞介素-4和白细胞介素-13信号连接图。Science.2003 Jun 6；300(5625)：1527-8.(过敏、哮喘)·抑制IL-4/IL-13受体系统预防过敏敏感性而不影响过敏性哮喘小鼠模型的建立。J Allergy Clin Immunol.
  2003 Jun；111(6)：1361-1369.
  IL-4/IL-16   ·(哮喘)白细胞介素(IL)-4/IL-9和外源性IL-16诱导BEAS-2B细胞产生，BEAS-2B细胞是一种支气管上皮细胞系。Cell Immunol.2001 Feb 1；207(2)：75-80
  IL-4/IL-17   ·白细胞介素(IL)-4和IL-17协同刺激人结肠肌纤维母细胞中IL-6的分泌。Int J Mol Med.2002Nov；10(5)：631-4.(肠炎)
  IL-4/IL-24   ·IL-24是由大鼠和人巨噬细胞表达的。Immunobiology.2002 Jul；205(3)：321-34.
  IL-4/IL-25   ·概述了新的IL-17家族成员促进肺中Th1或Th2反应：新的细胞因子IL-25的体内作用。J Immunol.2002 Jul1；169(1)：443-53.(过敏性炎症)·概述了FcεRI-介导激活肥大细胞产生白细胞介素-25。Blood.2003 May 1；101(9)：3594-6.Epub 2003 Jan02.(过敏性炎症)
  IL-4/IFN-γ   ·概述了白细胞介素4诱导内皮细胞产生白细胞介素6：与干扰素-γ的协同作用。Eur J Immunol.1991Jan；21(1)：97-101.
  IL-4/SCF   ·干细胞因子和IL-4调节人小肠肥大细胞。ImmunolRev.2001 Feb；179：57-60.综述。
  IL-5/IL-3   ·细胞因子对人嗜酸性细胞IL-3，IL-5和GM-CSF受体α链表达的差别调节：IL-3、IL-5和GM-CSF下调节IL-5受体α表达，伴随有对IL-5反应的降低，但上调IL-3受体α表达。J Immunol.2003 Jun1；170(11)：5359-66.(过敏性炎症，参见摘要)
  IL-5/IL-6
  IL-5/IL-13   ·用地塞米松抑制小鼠过敏性呼吸道炎症和呼吸道超敏反应：嗜酸性细胞、IL-5、嗜酸细胞活化趋化因子和IL-13的作用。J Allergy Clin Immunol.2003May；111(5)：1049-61.
  IL-5/IL-17   ·小鼠过敏性哮喘模型吸入过敏原后白细胞介素-17协同中性粒细胞在呼吸道中的浸润。Am J Respir Cell
  Mol Biol.2003 Jan；28(1)：42-50.
  IL-5/IL-25   ·概述了新的IL-17家族成员促进肺中Th1或Th2反应：新的细胞因子IL-25的体内作用。J Immunol.2002 Jul1；169(1)：443-53.(过敏性炎症)·概述了FcεRI-介导激活肥大细胞产生白细胞介素-25。Blood.2003 May 1；101(9)：3594-6.Epub 2003 Jan02.(过敏性炎症)
  IL-5/IFN-γ
  IL-5/GM-CSF   ·细胞因子对人嗜酸性细胞IL-3、IL-5和GM-CSF受体α链表达的差别调节：IL-3、IL-5和GM-CSF下调IL-5受体α表达，伴随有对IL-5反应的降低，但上调IL-3受体α表达。J Immunol.2003 Jun1；170(11)：5359-66.(过敏性炎症)
  IL-6/IL-10
  IL-6/IL-11
  IL-6/IL-16   ·白细胞介素-16刺激人单核细胞促炎症反应细胞因子的表达和产生。Immunology.2000 May；100(1)：63-9.
  IL-6/IL-17   ·白细胞介素(IL)-17通过IL-6旁分泌/自分泌环刺激呼吸道粘液素基因表达。J Biol Chem.2003 May9；278(19)：17036-43.Epub 2003 Mar 06.(呼吸道炎症，哮喘)
  IL-6/IL-19   ·概括了IL-19诱导IL-6和TNF-α的产生并通过TNF-α导致细胞凋亡。J Immunol.2002 Oct15；169(8)：4288-97.
  IL-6/IFN-g
  IL-7/IL-2   ·白细胞介素7加重移植物抗宿主疾病。Blood.2002Oct 1；100(7)：2642-9.
  IL-7/IL-12   ·在人T细胞活化上IL-7和IL-12的协同效应。JImmunol.1995 May 15；154(10)：5093-102.
  IL-7/IL-15   ·白细胞介素-7和白细胞介素-15调节皮肤T细胞淋巴瘤细胞中bcl-2和c-myb基因表达。Blood.2001 Nov1；98(9)：2778-83.(生长因子)
  IL-8/IL-11   ·红细胞增多症中白细胞介素(IL)-11和IL-8的异常产生。Cytoking.2002 Nov 21；20(4)：178-83.
  IL-8/IL-17   ·关节损伤中IL-17的作用。Drug News Perspect.2002Jan；15(1)：17-23.(关节炎)·概述了白细胞介素-17刺激人呼吸道内皮细胞表达白细胞介素-18、生长相关癌基因-α和粒细胞克隆刺激因子。Am J Respir Cell Mol Biol.2002Jun；26(6)：748-53.(呼吸道炎症)
  IL-8/GSF   ·白细胞介素-8：一种针对人类造血前体细胞的自分泌/旁分泌生长因子，其作用是协同集落刺激因子-1促进单核-巨噬细胞生长和分化。Exp Hematol.1999Jan；27(1)：28-36.
  IL-8/VGEF   ·在原发或复发性恶性神经胶质瘤中腔内VEGF、bFGF、IL-8、IL-12的水平。J Neurooncol.2003May；62(3)：297-303.
  IL-9/IL-4   ·抗-白细胞介素-9抗体治疗可抑制小鼠哮喘模型呼吸道炎症和超敏反应。Am J Respir Crit Care Med.2002 Aug 1；166(3)：409-16.
  IL-9/IL-5   ·肺部IL-9的过表达诱导Th2细胞因子表达，导致免疫病理。J Clin Invest.2002 Jan；109(1)：29-39.·Th2细胞因子和哮喘。白细胞介素-9作为一种治疗哮喘的靶。Respir Res.2001；2(2)：80-4.Epub 2001 Feb15.综述。·概括了白细胞介素-9增强白细胞介素-5受体的表达、分化和人嗜酸性细胞生存。Blood.2000 Sep15；96(6)：2163-71(哮喘)
  IL-9/IL-13   ·抗-白细胞介素-9抗体治疗可抑制小鼠哮喘模型呼吸道炎症和超敏反应。Am J Respir Crit Care Med.2002 Aug 1；166(3)：409-16.·白细胞介素-13对内皮细胞的直接效应导致哮喘中呼吸道超敏反应和粘液过量产生。Nat Med.2002Aug；8(8)：885-9.
  IL-9/IL-16   ·参见IL-4/IL-16
  IL-10/IL-2   ·在体液免疫应答中白细胞介素-10(IL-10)和白细胞介素-2(IL-2)的相互作用：IL-10协同IL-2增强人B淋巴细胞反应，其机制不同于CD25表达上调。CellImmunol.1994 Sep；157(2)：478-88.
  IL-10/IL-12
  IL-10/TGF-β   ·在正常免疫和特异性免疫治疗中IL-10和TGF-β协同调节T细胞对粘膜过敏原的应答。Eur J Immunol.2003 May；33(5)：1205-14.
  IL-10/IFN-γ
  IL-11/IL-6   ·白细胞介素-6和白细胞介素-11通过RANKL非依赖机制维持破骨细胞的形成。Bone.2003 Jan；32(1)：1-7.(炎症中骨吸收)
  IL-11/IL-17   ·急、慢性皮肤损坏之间IL-11和IL-17体内表达的两极化。J Allergy Clin Immunol.2003 Apr；111(4)：875-81.(过敏性皮炎)·IL-17通过NF-κB配体/护骨素(护骨蛋白)受体激活物失衡促进小鼠胶原诱导关节炎骨侵蚀。J Immunol.2003 Mar 1；170(5)：2655-62.
  IL-11/TGF-β   ·急、慢性皮肤损坏之间II-11和IL-17体内表达的两极化。J Allergy Clin Immunol.2003 Apr；111(4)：875-81.(过敏性皮炎)
  IL-12/IL-13   ·系统性红斑狼疮中白细胞介素-12和白细胞介素-13失衡与类属特异性风湿因子和抗心磷脂抗体之间的关系。Clin Rheumatol.2003 May；22(2)：107-11.
  IL-12/IL-17   ·活动性炎症肠疾病中白细胞介素-12和-17的上调。Scand J Gastroenterol.2003 Feb；38(2)：180-5.
  IL-12/IL-18   ·白细胞介素12和白细胞介素18对自然杀伤细胞的协同增殖和活化作用。Cytokine.1999Nov；11(11)：822-30.·IL-12和IL-18引起的炎性肝脂肪变性。J InterferonCytokine Res.2003 Mar；23(3)：155-62.
  IL-12/IL-23   ·脑自身免疫病炎症的关键细胞因子是白细胞介素-23而不是白细胞介素-12。Nature.2003 Feb13；421(6924)：744-8.·概括了在促进细胞免疫过程中IL-23的独特作用。JLeukoc Biol.2003 Jan；73(1)：49-56.综述。
  IL-12/IL-27   ·概括了由EB13和p28蛋白组成的异质二聚体细胞因子IL-27诱导初始CD4(+)T细胞的增殖。Immunity.2002 Jun；16(6)：779-90.
  IL-12/IFN-γ   ·IL-12通过B和T细胞作为免疫刺激部分诱导IFN-γ表达。
  IL-13/IL-5   ·参见IL-5/IL-13
  IL-13/IL-25   ·概述新的IL-17家族成员促进肺中Th1或Th2反应：新的细胞因子IL-25的体内作用。J Immunol.2002 Jul1；169(1)：443-53.(过敏性炎症)·概述了FcεRI-介导激活肥大细胞产生白细胞介素-25。Blood.2003 May 1；101(9)：3594-6.Epub 2003 Jan02.(过敏性炎症)
  IL-15/IL-13   ·白细胞介素(IL)-13和IL-15在子宫内膜异位症和正常生育妇女中异位内膜和正常内膜上的差异表达。AmJ Reprod Immunol.2003 Feb；49(2)：75-83.
  IL-15/IL-16   ·皮肤T细胞淋巴瘤中IL-15和IL-16的过表达：蕈样霉菌病进展中阶段依赖性增加。Exp Dermatol.2000Aug；9(4)：248-51.
  IL-15/IL-17   ·概括了在脂多糖诱导的呼吸道中性粒细胞增多中，由淋巴细胞和中性粒细胞产生的IL-17是必需的：IL-15作为一种可能触发剂。J Immunol.2003 Feb15；170(4)：2106-12.(呼吸道炎症)
  IL-15/IL-21   ·IL-21与IL-15或IL-18协同增加人NK细胞和T细胞产生IFN-γ。J Immunol.2003 Jun 1；170(11)：5464-9.
  IL-17/IL-23   ·白细胞介素-23促进明显的CD4T细胞活化状态，其特征表现为白细胞介素-17的产生。J Biol Chem.2003Jan 17；278(3)：1910-4.Epub 2002 Nov 03
  IL-17/TGF-β   ·急、慢性皮肤损伤之间IL-11和IL-17体内表达的两极化。J Allergy Clin Immunol.2003 Apr；111(4)：875-81.(过敏性皮炎)
  IL-18/IL-12   ·白细胞介素12和白细胞介素18对自然杀伤细胞的协同增殖和活化作用。Cytokine.1999Nov；11(11)：822-30.·概括了IL-12对小鼠慢性移植物抗宿主疾病中体外免疫球蛋白产生的抑制作用：与IL-18协同作用。Eur JImmunol.1998 Jun；28(6)：2017-24.
  IL-18/IL-21   ·IL-21与IL-15或IL-18协同增加人NK细胞和T细胞产生IFN-γ。J Immunol.2003 Jun 1；170(11)：5464-9.
  IL-18/TGF-β   ·用皮质类固醇治疗Graves′病眼病患者血清中的白细胞介素18和转化生长因子β1。Int Immunopharmacol.2003 Apr；3(4)：549-52.
  IL-18/IFN-γ
  抗-TNFα/抗-CD4   对DBA/1关节炎小鼠的协同治疗作用。
附件3：肿瘤结合物(Oncology combinations)
  靶   疾病  配对物
  CD89*   用作细胞毒细胞的募集者  全部
  CD19   B细胞淋巴瘤  HLA-DRCD5
  HLA-DR   B细胞淋巴瘤  CD89CD19CD5
  CD38   多发性骨髓瘤  CD138CD56HLA-DR
  CD138   多发性骨髓瘤  CD38CD56HLA-DR
  CD138   肺癌  CD56CEA
  CD33   急性髓样淋巴瘤  CD34HLA-DR
  CD56   肺癌  CD138CEA
  CEA   泛癌(Pan carcinoma)  MET受体
  VEGF   泛癌  MET受体
  VEGF受体   泛癌  MET受体
  IL-13   哮喘/肺炎  IL-4IL-5嗜酸细胞活化趋化因子(s)MDCTARCTNFαIL-9EGFR
 CD40LIL-25MCP-1TGFβ
  IL-4   哮喘  IL-13IL-5嗜酸细胞活化趋化因子(s)MDCTARCTNFαIL-9EGFRCD40LIL-25MCP-1TGFβ
  嗜酸细胞活化趋化因子   哮喘  IL-5嗜酸细胞活化趋化因子-2嗜酸细胞活化趋化因子-3
  EGFR   癌症  HER2/neuHER3HER4
  HER2   癌症  HER3HER4
  TNFR1   RA/克罗恩病  IL-1RIL-6RIL-18R
  TNFα   RA/克罗恩病  IL-1α/βIL-6IL-18ICAM-1IL-15
 IL-17
  IL-1R   RA/克罗恩病  IL-6RIL-18R
  IL-18R   RA/克罗恩病  IL-6R
Figure G2008800104821D02431
Figure G2008800104821D02441
Figure G2008800104821D02451
Figure ISB00000329182400011
Figure ISB00000329182400021
Figure ISB00000329182400031
Figure ISB00000329182400041
Figure ISB00000329182400051
Figure ISB00000329182400061
Figure ISB00000329182400071
Figure ISB00000329182400081
Figure ISB00000329182400091
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Claims (79)

1.包含抗体单个可变区的配体，其中该抗体单个可变区特异性地结合血清白蛋白并且包含选自下列的氨基酸序列：dAb7r14，dAb7h11，dAb2，dAb4，dAb7，dAb11，dAb12，dAb13，dAb15，dAb16，dAb17，dAb18，dAb 19，dAb21，dAb22，dAb23，dAb24，dAb25，dAb26，dAb27，dAb30，dAb31，dAb33，dAb34，dAb35，dAb38，dAb41，dAb46，dAb47，dAb52，dAb53，dAb54，dAb55，dAb56，drdAb7m12，dAb7m16，dAb7m26，dAb7r1，dAb7r3，dAb7r4，dAb7r5，dAb7r7，dAb7r8，dAb7r13，dAb7r15，dAb7r16，dAb7r17，dAb7r18，dAb7r19，dAb7h1，dAb7h2，dAb7h6，dAb7h7，dAb7h8，dAb7h9，dAb7h10，dAb7h12，dAb7h13，dAb7h14，dAb7p1和dAb7p。
2.包含一个或多个单个可变区的配体，其中所述一个或多个单个可变区中的至少一个是特异性地结合血清白蛋白的单个可变区，并且其中所述一个或多个单个可变区是非天然存在的单个可变区。
3.包含一个或多个单个可变区的配体，其中所述一个或多个单个可变区中的至少一个是抗体单个可变区，其特异性地结合血清白蛋白。
4.权利要求3的配体，其中所述的配体包含单体抗体单个可变区，其特异性地结合血清白蛋白。
5.权利要求4的配体，其中所述的单体抗体单个可变区与药物缀合。
6.权利要求4的配体，其中所述的配体是双特异性配体，其中所述的双特异性配体包含第一抗体单个可变区，其中所述的第一抗体单个可变区特异性地结合血清白蛋白。
7.权利要求6的双特异性配体，其中所述的双特异性配体进一步包含第二抗体单个可变区，其中所述的第二抗体单个可变区特异性地结合不同于血清白蛋白的靶。
8.权利要求7的双特异性配体，其中；
a.各所述第一抗体单个可变区和所述第二单个抗体单个可变区是抗体重链单个可变区；或者
b.各所述第一抗体单个可变区和所述第二单个抗体单个可变区是抗体轻链单个可变区；或者
c.所述第一抗体单个可变区是抗体重链单个可变区，并且所述第二单个抗体单个可变区是抗体轻链单个可变区；或者
d.所述第一抗体单个可变区是抗体轻链单个可变区，并且所述第二单个抗体单个可变区是抗体重链单个可变区。
9.包含权利要求8的双特异性配体的IgG，其中所述的IgG包含四个抗体单个可变区。
10.权利要求3的配体，其中所述的抗体单个可变区包含一组四个Kabat抗体框架区(FRs)，所述组由人框架胚系抗体基因片段编码。
11.权利要求3、4和5任一项的配体，其中所述的配体包含抗体重链单个可变区，其中所述的抗体重链单个可变区选自下列的抗体重链单个可变区的氨基酸序列：dAb8，dAb 10，dAb36，dAb7r20，dAb7r21，dAb7r22，dAb7r23，dAb7r24，dAb7r25，dAb7r26，dAb7r27，dAb7r28，dAb7r29，dAb7r30，dAb7r31，dAb7r32，dAb7r33，dAb7h21，dAb7h22，dAb7h23，Ab7h24，Ab7h25，Ab7h26，dAb7h27，dAb7h30，dAb7h31，以及至少80％与其相同的氨基酸序列。
12.权利要求3、4和6任一项的配体，其中所述的其中所述的配体包含抗体轻链单个可变区，其中所述的抗体轻链单个可变区包含选自下列的抗体轻链单个可变区的氨基酸序列：dAb2，dAb4，dAb7，dAb11，dAb12，dAb13，dAb15，dAb16，dAb17，dAb18，dAb19，dAb21，dAb22，dAb23，dAb24，dAb25，dAb26，dAb27，dAb30，dAb31，dAb33，dAb34，dAb35，dAb38，dAb41，dAb46，dAb47，dAb52，dAb53，dAb54，dAb55，dAb56，drdAb7m12，dAb7m16，dAb7m26，dAb7r1，dAb7r3，dAb7r4，dAb7r5，dAb7r7，dAb7r8，dAb7r13，dAb7r14，dAb7r15，dAb7r16，dAb7r17，dAb7r18，dAb7r19，dAb7h1，dAb7h2，dAb7h6，dAb7h7，dAb7h8，dAb7h9，dAb7h10，dAb7h11，dAb7h12，dAb7h13，dAb7h14，dAb7p1和dAb7p2，以及至少80％与其相同的氨基酸序列。
13.权利要求3、4和6任一项的配体，其中所述的配体包含体单个可变区，其特异性地结合血清白蛋白，并且其中所述的抗体单个可变区与包含选自下列的抗体单个可变区的氨基酸序列的抗体单个可变区竞争结合血清白蛋白：dAb8，dAb10，dAb36，dAb7r20，dAb7r21，dAb7r22，dAb7r23，dAb7r24，dAb7r25，dAb7r26，dAb7r27，dAb7r28，dAb7r29，dAb7r30，dAb7r31，dAb7r32，dAb7r33，dAb7h21，dAb7h22，dAb7h23，Ab7h24，Ab7h25，Ab7h26，dAb7h27，dAb7h30，dAb7h31，dAb2，dAb4，dAb7，dAb11，dAb12，dAb13，dAb15，dAb16，dAb17，dAb18，dAb19，dAb21，dAb22，dAb23，dAb24，dAb25，dAb26，dAb27，dAb30，dAb31，dAb33，dAb34，dAb35，dAb38，dAb41，dAb46，dAb47，dAb52，dAb53，dAb54，dAb55，dAb56，dAb7m12，dAb7m16，dAb7m26，dAb7r1，dAb7r3，dAb7r4，dAb7r5，dAb7r7，dAb7r8，dAb7r13，dAb7r14，dAb7r15，dAb7r16，dAb7r17，dAb7r18，dAb7r19，dAb7h1，dAb7h2，dAb7h6，dAb7h7，dAb7h8，dAb7h9，dAb7h10，dAb7h11，dAb7h12，dAb7h13，dAb7h14，dAb7p1和dAb7p2。
14.权利要求3或4的配体，其中所述的抗体单个可变区包含来自选自下列的抗体单个区域抗体的一个或多个CDR：dAb8，dAb 10，dAb36，dAb7r20，dAb7r21，dAb7r22，dAb7r23，dAb7r24，dAb7r25，dAb7r26，dAb7r27，dAb7r28，dAb7r29，dAb7r30，dAb7r31，dAb7r32，dAb7r33，dAb7h21，dAb7h22，dAb7h23，Ab7h24，Ab7h25，Ab7h26，dAb7h27，dAb7h30，dAb7h31，dAb2，dAb4，dAb7，dAb11，dAb12，dAb13，dAb15，dAb16，dAb17，dAb18，dAb19，dAb21，dAb22，dAb23，dAb24，dAb25，dAb26，dAb27，dAb30，dAb31，dAb33，dAb34，dAb35，dAb38，dAb41，dAb46，dAb47，dAb52，dAb53，dAb54，dAb55，dAb56，dAb7m12，dAb7m16，dAb7m26，dAb7r1，dAb7r3，dAb7r4，dAb7r5，dAb7r7，dAb7r8，dAb7r13，dAb7r14，dAb7r15，dAb7r16，dAb7r17，dAb7r18，dAb7r19，dAb7h1，dAb7h2，dAb7h6，dAb7h7，dAb7h8，dAb7h9，dAb7h10，dAb7h11，dAb7h12，dAb7h13，dAb7h14，dAb7p1和dAb7p2。
15.权利要求14的配体，其中所述的抗体单个可变区还包含选自下列的框架：CTLA4、脂质运载蛋白、葡萄球菌性蛋白A(SpA)、亲合体、avimer、GroEl、GroES、转铁蛋白和纤连蛋白。
16.权利要求7的配体，其中所述第二抗原或表位结合特异性对抗原是结合特异性的，所述抗原选自：细胞因子，细胞因子受体、酶、酶辅助因子和DNA结合蛋白。
17.权利要求2、3、6和8任一项的配体，其中所述的抗体单个可变区特异性地以一解离常数(Kd)结合表位或抗原，该解离常数(Kd)选自：1×10-3M或更小，1×10-4M或更小，1×10-5M或更小，1×10-6M或更小，1×10-7M或更小，1×10-8M或更小，和1×10-9M或更小，其通过表面等离振子共振测定。
18.权利要求1、2、4和6任一项的配体，其中所述的配体还包含一个或多个选自下列的实体：标记、标签和药物。
19.一种组合物，其包含权利要求2、3、4和6任一项的配体和其载体。
20.包含单个可变区的配体，其中所述的单个可变区特异性地结合人血清白蛋白和非-人血清白蛋白，结合的Kd值相互间在10倍以内，并且其中所述的单个可变区是非-天然存在的单个可变区。
21.包含抗体单个可变区的配体，其中所述的抗体单个可变区特异性地结合人血清白蛋白和非-人血清白蛋白，结合的Kd值相互间在10倍以内。
22.权利要求21的配体，其中所述的配体T β半衰期在人类宿主中与人血清白蛋白的T β半衰期基本上相同。
23.权利要求21的配体，其中所述的抗体单个可变区特异性地结合人血清白蛋白和小鼠血清白蛋白。
24.权利要求21的配体，其中所述的抗体单个可变区特异性地结合人血清白蛋白和大鼠血清白蛋白。
25.权利要求21的配体，其中所述的抗体单个可变区特异性地结合人血清白蛋白和猪血清白蛋白。
26.权利要求21的配体，其中所述的抗体单个可变区特异性地结合人血清白蛋白和短尾猴血清白蛋白。
27.权利要求21的配体，其中所述的抗体单个可变区是抗体重链单个可变区。
28.权利要求27的配体，其中所述的抗体重链单个可变区是抗体VH3单个可变区。
29.权利要求28的配体，其中所述的抗体VH3单个可变区是人抗体VH3单个可变区。
30.权利要求21的配体，其中所述的抗体单个可变区是抗体轻链单个可变区。
31.权利要求30的配体，其中所述的抗体轻链单个可变区是抗体Vκ轻链单个可变区。
32.权利要求30的配体，其中所述的配体包含至少一个抗体Vκ单个可变区，其包含选自下列的抗体单个可变区的的氨基酸序列：DOM7h-9，DOM7h-11，DOM7h-13，DOM7h-14，DOM7r-3和DOM7r-16，以及至少80％与其相同的氨基酸序列。
33.权利要求30的配体，其中所述的配体包含至少一个抗体Vκ单个可变区，其与选自下列的抗体单个可变区竞争结合血清白蛋白：dAb8，dAb10，dAb36，dAb7r20，dAb7r21，dAb7r22，dAb7r23，dAb7r24，dAb7r25，dAb7r26，dAb7r27，dAb7r28，dAb7r29，dAb7r30，dAb7r31，dAb7r32，dAb7r33，dAb7h21，dAb7h22，dAb7h23，Ab7h24，Ab7h25，Ab7h26，dAb7h27，dAb7h30，dAb7h31，dAb2，dAb4，dAb7，dAb11，dAb12，dAb13，dAb15，dAb16，dAb17，dAb18，dAb19，dAb21，dAb22，dAb23，dAb24，dAb25，dAb26，dAb27，dAb30，dAb31，dAb33，dAb34，dAb35，dAb38，dAb41，dAb46，dAb47，dAb52，dAb53，dAb54，dAb55，dAb56，dAb7m12，dAb7m16，dAb7m26，dAb7r1，dAb7r3，dAb7r4，dAb7r5，dAb7r7，dAb7r8，dAb7r13，dAb7r14，dAb7r15，dAb7r16，dAb7r17，dAb7r18，dAb7r19，dAb7h1，dAb7h2，dAb7h6，dAb7h7，dAb7h8，dAb7h9，dAb7h10，dAb7h11，dAb7h12，dAb7h13，dAb7h14，dAb7p1和dAb7p2。
34.权利要求23、24、25和26任一项的配体，其中所述的抗体单个可变区包含一组四个Kabat抗体框架区(FRs)。
35.权利要求34的配体，其中所述的四个Kabat抗体框架区(FRs)的组是由抗体VH3框架胚系抗体基因片段编码的。
36.权利要求34的配体，其中所述的四个Kabat抗体框架区(FRs)的组是由人Vκ框架胚系抗体基因片段编码的。
37.权利要求34的配体，其中一组CDR被移植到包含一组四个Kabat抗体框架区的所述单个可变区中，其中所述的CDR组包含CDR1、CDR2和CDR3。
38.权利要求20、21、23、24、25和26任一项的配体，其进一步包含一个或多个能够特异性结合不同于血清白蛋白的靶的单个可变区。
39.权利要求38的配体，其中所述的一个或多个能够特异性结合不同于血清白蛋白的靶的单个可变区是抗体单个可变区。
40.权利要求21的配体，其中所述的抗体单个可变区包含至少一个CDR区域，其中所述的至少一个CDR区域选自：CDR1、CDR2和CDR3，并且其中至少一个CDR区域是来自抗体V区域或抗体单个可变区。
41.权利要求39的配体，其中至少一个所述特异性地结合不同于血清白蛋白的靶的抗体单个可变区包含至少一个CDR区域，其中所述的至少一个CDR区域选自：CDR1、CDR2和CDR3，并且其中至少一个所述的CDR区域是来自抗体V区域或抗体单个可变区。
42.权利要求40的配体，其中所述的抗体单个可变区还包含选自下列的支架结构：CTLA-4、脂质运载蛋白、葡萄球菌性蛋白A(SPA)、GroEL、GroES、转铁蛋白和纤连蛋白。
43.权利要求21、23、24、25和26任一项的配体，其中所述的抗体单个可变区特异性地结合人血清白蛋白，结合的Kd小于或等于300nM。
44.权利要求21、23、24、25和26任一项的配体，其中所述的特异性地结合人血清白蛋白的抗体单个可变区特异性地结合人血清白蛋白的区域II。
45.权利要求39的配体，其中所述的配体是双特异性配体，并且其中：
a.各所述特异性地结合血清白蛋白的抗体单个可变区和所述特异性地结合不同于血清白蛋白的靶的抗体单个可变区是抗体重链单个可变区；或者
b.各所述特异性地结合血清白蛋白的抗体单个可变区和所述特异性地结合不同于血清白蛋白的靶的抗体单个可变区是抗体轻链单个可变区；或者
c.所述特异性地结合血清白蛋白的抗体单个可变区是抗体重链单个可变区，并且所述特异性地结合不同于血清白蛋白的靶的抗体单个可变区是抗体轻链单个可变区；或者
d.所述特异性地结合血清白蛋白的抗体单个可变区是抗体轻链单个可变区，并且所述特异性地结合不同于血清白蛋白的靶的抗体单个可变区是抗体重链单个可变区。
46.包含单个可变区的配体，其中所述的单个可变区特异性地结合人血清白蛋白的区域II，并且其中所述的单个可变区是非-天然存在的单个可变区。
47.包含抗体单个可变区的配体，其中所述的抗体单个可变区特异性地结合人血清白蛋白的区域II。
48.权利要求47的配体，其中所述的抗体单个可变区是非-天然存在的抗体单个可变区。
49.权利要求47的配体，其中所述的抗体单个可变区是天然存在的抗体单个可变区。
50.权利要求47的配体，其中所述的抗体单个可变区是抗体重链单个可变区。
51.权利要求50的配体，其中所述的抗体重链单个可变区是抗体VH3单个可变区。
52.权利要求51的配体，其中所述的抗体VH3单个可变区是人抗体VH3单个可变区。
53.权利要求47的配体，其中所述的抗体单个可变区是抗体Vκ单个可变区。
54.权利要求53的配体，其中所述的抗体Vκ单个可变区选自：DOM7h-1，DOM7h-8，DOM7h-9，DOM7h-11，DOM7h-12，DOM7h-13和DOM7h-14.DOM7r-3和DOM7r-16。
55.权利要求47的配体，其中所述的抗体单个可变区包含一组四个Kabat抗体框架区(FRs)，所述的组是由抗体VH3框架胚系抗体基因片段编码的。
56.权利要求47的配体，其中所述的抗体单个可变区包含一组四个Kabat抗体框架区(FRs)，所述的组是由Vκ框架胚系抗体基因片段编码的。
57.权利要求47的配体，其进一步包含一个或多个能够特异性结合不同于血清白蛋白的靶的单个可变区。
58.权利要求57的配体，其中所述的一个或多个能够特异性结合不同于血清白蛋白的靶的单个可变区是抗体单个可变区。
59.权利要求47的配体，其中所述的抗体单个可变区包含至少一个抗体CDR1、CDR2和/或CDR3区域。
60.权利要求59的配体，其中所述的抗体单个可变区还包含选自下列的支架结构：CTLA-4、脂质运载蛋白、葡萄球菌性蛋白A(SPA)、GroEL、GroES、转铁蛋白和纤连蛋白。
61.权利要求47的配体，其中所述的抗体单个可变区特异性地结合人血清白蛋白，结合的Kd小于或等于300nM。
62.权利要求58的配体，其中所述的配体是双特异性配体，并且其中：
a.各所述特异性地结合血清白蛋白的区域II的抗体单个可变区和所述特异性地结合不同于血清白蛋白的靶的抗体单个可变区是抗体重链单个可变区；或者
b.各所述特异性地结合血清白蛋白的区域II的抗体单个可变区和所述特异性地结合不同于血清白蛋白的靶的抗体单个可变区是抗体轻链单个可变区；或者
c.所述特异性地结合血清白蛋白的区域II的抗体单个可变区是抗体重链单个可变区，并且所述抗体特异性地结合不同于血清白蛋白的抗原的单个可变区是抗体轻链单个可变区；或者
d.所述特异性地结合血清白蛋白的区域II的抗体单个可变区是抗体轻链单个可变区，并且所述特异性地结合不同于血清白蛋白的抗原的抗体单个可变区是抗体重链单个可变区。
63.一种融合蛋白，其包含特异性地结合血清白蛋白的第一单个可变区和第二单个可变区，其中各所述第一和第二单个可变区是非-天然存在的单个可变区，并且其中：1)该第一单个可变区与该第二单个可变区的N末端连接，或者2)该第一单个可变区与该第二单个可变区的C末端连接，或者3)该第一单个可变区与该第二单个可变区的N末端连接和该第二单个可变区的C末端连接均连接。
64.权利要求63的融合蛋白，其中所述的融合蛋白还包含另外的单个可变结合区，其中所述的单个可变区是非-天然存在的单个可变区，并且其中所述另外的单个可变结合区与所述第一单个可变区连接，或者所述另外的单个可变结合区与该第一单个可变区的N末端连接，或与与该第一单个可变区的C末端连接。
65.权利要求63的融合蛋白，其中所述的第一单个可变区是抗体单个可变区，并且该抗体单个可变区的N末端直接连接到该第二单个可变区的COOH末端，形成结合处，其中所述第二单个可变区的所述COOH末端与所述抗体单个可变区的N末端氨基酸连接，其中所述的抗体单个可变区选自：Vκ区域、Vλ区域、抗体重链区域和VHH区域。
66.权利要求65的融合蛋白，其中所述的抗体单个可变区是Vκ区域，并且所述的结合处包含选自以下的氨基酸序列：XXXDIQ，XXXNIQ，XXXAIQ，XXXAIR，XXXVIW，XXXDIV，XXXDVV，XXXEIV和XXXETT，并且其中XXX代表该第二单个可变区的最后三个氨基酸。
67.权利要求65的融合蛋白，其中所述的抗体单个可变区是Vλ区域，其中所述的结合处包含选自以下的氨基酸序列：XXXQSV，XXXQSA，XXXSYE，XXXS SE，XXXSYV，XXXLPV，XXXQPV，XXXQLV，XXXQAV，XXXNFM，XXXQTV和XXXQAG，并且其中XXX代表该第二单个可变区的最后三个氨基酸。
68.权利要求65的融合蛋白，其中所述的抗体单个可变区是抗体重链单个可变区，并且所述的结合处包含选自以下的氨基酸序列：XXXQVQ，XXXQMQ，XXXEVQ，XXXQIT，XXXQVT和XXXQLQ，并且其中XXX代表该第二单个可变区的最后三个氨基酸。
69.权利要求65的融合蛋白，其中所述的抗体单个可变区是VHH区域，并且所述的结合处包含选自以下的氨基酸序列：XXXEVQ，XXXQVQ，XXXDVQ，XXXQVK和XXXAVQ，并且其中XXX代表该第二单个可变区的最后三个氨基酸。
70.权利要求63的融合蛋白，其中所述的第一单个可变区是抗体单个可变区，其中该抗体单个可变区的COOH末端直接连接到该第二单个可变区的N末端，形成结合处，其中所述第二单个可变区的所述N末端与所述抗体单个可变区的COOH末端氨基酸连接，并且其中所述的抗体单个可变区选自：Vκ区域、Vλ区域、抗体重链区域和VHH区域。
71.权利要求70的融合蛋白，其中所述的抗体单个可变区是Vκ区域，并且所述的结合处包含选自以下的氨基酸序列：KVEIKXXX，KLEIKXXX，KVDIKXXX，RLEIKXXX和EIKXXX，并且其中XXX代表该第二单个可变区的最初三个氨基酸。
72.权利要求70的融合蛋白，其中所述的抗体单个可变区是Vλ区域，并且所述的结合处包含选自以下的氨基酸序列：KVDVLXXX，KLDVLXXX和QLDVLXXX，并且其中XXX代表该第二单个可变区的最初三个氨基酸。
73.权利要求70的融合蛋白，其中所述的抗体单个可变区是抗体重链单个可变区，并且所述的结合处包含VTVSSXXX的氨基酸序列，并且其中XXX代表该第二单个可变区的最初三个氨基酸。
74.权利要求70的融合蛋白，其中所述的抗体单个可变区是VHH区域，并且所述的结合处包含VTVSSXXX的氨基酸序列，并且其中XXX代表该第二单个可变区的最初三个氨基酸。
75.权利要求65的融合蛋白，其中所述的抗体单个可变区通过肽连接子与所述第二单个可变区连接，并且其中所述的肽连接子选自：柔性连接子、约束连接子和天然连接子。
76.权利要求75的融合蛋白，其中该抗体单个可变区的N末端通过肽连接子与该第二单个可变区的COOH末端连接，或者其中该抗体单个可变区的区域的COOH末端通过肽连接子与该第二单个可变区的N末端连接。
77.权利要求75的融合蛋白，其中所述的柔性连接子是富含甘氨酸的连接子或者富含丝氨酸的连接子。
78.权利要求75的融合蛋白，其中所述的约束连接子具有选自以下的序列：SSSASASSA，GSPGSPG和ATTTGSSPGPT。
79.权利要求75的融合蛋白，其中所述的天然连接子具有选自以下的序列：KESGSVSSEQLAQFRSLD，EPKIPQPQPKPQPQPQPQPKPQPKPEPECTCPKCP和GTNEVCKCPKCP。
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