ES2627299T3 - Ligandos que se unen al receptor II del TGF-beta - Google Patents

Ligandos que se unen al receptor II del TGF-beta Download PDF

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Abstract

Un dominio variable único de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII que comprende una secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ. ID. nº 267 que tiene hasta 5 sustituciones moderadas de aminoácidos en donde dichas sustituciones moderadas de aminoácidos no están comprendidas en ninguna de las CDR y en donde dicho dominio variable único de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII se une al TGFbetaRII humano con una constante de disociación (KD) del equilibrio de aproximadamente 10 pM o menos medida por resonancia de plasmón de superficie.

Description

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Ligandos que se unen al receptor II del TGF-beta Antecedentes de la invencion
El factor de crecimiento transformante p (TGFbeta; TGFp (TGF-p) es una molecula de senalizacion que media la transduccion de senales en las celulas mediante la union a un receptor del TGFbeta (TGFbetaR; TGFpR (TGF-pR)). La actividad de senalizacion del TGFbeta regula la diferenciacion y el crecimiento celular, y la naturaleza de su efecto, es decir, como activador del crecimiento celular, supresor del crecimiento o inductor de otras funciones celulares, dependiendo del tipo de celula (vease Roberts, et al., The transforming growth factor-betas, Peptide Growth Factors and Their Receptors, parte I, ed. por Sporn, M. B. y Roberts, A. B., Springer-Verlag, Berlin, 1990, pags. 419-472).
El TGFbeta es producido por una amplia variedad de tipos de celulas, y sus receptores afines se expresan en una amplia variedad de organos y celulas (vease Shi y Massague, Cell, volumen 113, numero 6, 13 de junio de 2003, paginas 685-700; Biol. Signals., vol. 5, pag. 232, 1996 y Pulmonary Fibrosis, vol. 80 de Lung Biology in Health and Disease Series, ed. por Phan, et al., pag. 627, Dekker, Nueva York, 1995). Se han identificado receptores del TGFbeta que pertenecen a tres tipos: TGFbetaRI (TGFpRI) (receptor del TGFbeta tipo I (Franzen et al., Cell, vol. 75, n° 4, pag. 681, 1993; n° de entrada en Genbank: L11695)); TGFbetaRII (TGFpRN) (receptor del TGFbeta tipo II (Herbert et al., Cell, vol. 68, n° 4, pag. 775, 1992; n° de entrada en Genbank: m85079)) y TGFbetaRIII (receptor del TGFbeta tipo III (Lopez-Casillas, Cell, vol. 67, n° 4, pag. 785, 1991; n° de entrada en Genbank: L07594)). Se ha demostrado que el TGFbetaRI y el TGFbetaRII son esenciales para la transduccion de senales del TGF-beta (Laiho et al., J. Biol. Chem., vol. 265, pag. 18518, 1990 y Laiho et al., J. Biol. Chem., vol. 266, pag. 9108, 1991), mientas que no se piensa que el TGFbetaRIII sea esencial.
La senalizacion del TGFbeta es mediada por su union tanto al TGFbetaRI como al RII. Cuando el ligando se une al dominio de union del ligando extracelular, los dos receptores se reunen, permitiendo que RII fosforile a RI y comience la cascada de senalizacion mediante la fosforilacion de las proteinas Smad (vease Shi y Massague como se menciono anteriormente).
Se han identificado tres isoformas del TGFbeta en mamiferos: TGFbeta1, TGFbeta2 y TGFbeta3. Cada isoforma es multifuncional y actua en mecanismos de retroalimentacion autorreguladores para controlar la biodisponibilidad durante los procesos del desarrollo y mantener la homeostasis de los tejidos (segun se examina en ten Dijke y Arthur, Nature Reviews, Molecular Cell Biology, vol. 8, Nov. 2007, pags. 857-869). Las concentraciones del TGFbeta se controlan por regulacion mediante la expresion del TGFbeta, asi como por la union al proteoglucano, es decir, la matriz extracelular (MEC).
La senalizacion desregulada del TGFbeta, tal como el exceso de senalizacion del TGFbeta y las altas concentraciones del TGFbeta biodisponible, esta implicada en muchas patologias, incluidas la fibrosis de varios tejidos, tales como la fibrosis pulmonar y la cirrosis, hepatitis cronica, artritis reumatoide, trastornos oculares, restenosis vascular, queloide de la piel y el inicio de nefroesclerosis.
El documento WO2011/012609 describe algunos dominios variables unicos de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII, tal como el DOM23h-439.
Por consiguiente, hay necesidad de proporcionar compuestos que bloqueen o alteren la senalizacion del TGFbeta de manera especifica, tal como mediante la union al receptor II del TGFbeta. Dichos compuestos pueden usarse en tratamientos.
Compendio
La descripcion se refiere a un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII. En el primer aspecto, la presente invencion proporciona un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII que comprende una secuencia de aminoacidos como se indica en la SEQ. ID. n° 267 que tiene hasta 5 sustituciones moderadas de aminoacidos en donde dichas sustituciones moderadas de aminoacidos no estan comprendidas en ninguna de las CDR y en donde dicho dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII se une al TGFbetaRII humano con una constante de disociacion (KD) del equilibrio de aproximadamente 10 pM o menos medida por resonancia de plasmon de superficie. En una realizacion, el dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII tiene la secuencia SEQ. ID. n° 267.
Se proporciona tambien un polipeptido aislado que comprende un dominio variable unico de inmunoglobulina anti- TGFbetaRII como se ha definido en el primer aspecto de la invencion. En una realizacion, el dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII o polipeptido tambien se une a TGFbetaRII de raton y/o TGFbetaRII de macaco. En una realizacion, el dominio variable unico o polipeptido de inmunoglobulina neutraliza la actividad de TGFbeta o inhibe la union de TGFbeta a TGFbetaRII. En una realizacion, el dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII o polipeptido se une a una region Fc del anticuerpo que comprende uno o ambos de los dominios CH2 y CH3 y opcionalmente una region bisagra.
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La presente invencion tambien proporciona un acido nucleico aislado que codifica un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII o polipeptido como se ha definido anteriormente. En una realizacion, la molecula de acido nucleico aislado comprende al menos una molecula de acido nucleico de la SEQ. ID. n° 266. La invencion tambien proporciona un vector que comprende dicha molecula de acido nucleico. Se proporciona tambien una celula anfitriona que comprende dicho acido nucleico o un vector.
Se proporciona ademas un metodo de produccion de un polipeptido que comprende un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII como se ha definido anteriormente, comprendiendo el metodo mantener una celula anfitriona segun la reivindicacion 9, en condiciones adecuadas para la expresion de dicho acido nucleico o vector, con lo que se produce un polipeptido que comprende una variable unico de inmunoglobulina.
La invencion proporciona ademas un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII o polipeptido como se ha definido anteriormente para su utilizacion como medicamento.
Ademas se proporciona una composicion farmaceutica que comprende un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII o polipeptido como se ha definido anteriormente.
Ademas se proporciona un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII o polipeptido como se ha definido anteriormente para su utilizacion en elegir como objetivo el cancer al modular la senalizacion del TGFbeta en la angiogenia tumoral.
Ademas se proporciona un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII o polipeptido, o una composicion farmaceutica como se ha definido anteriormente, para su utilizacion en el tratamiento del cancer, fibrosis hfstica, tal como la fibrosis pulmonar, incluida la fibrosis pulmonar idiopatica; fibrosis hepatica, incluidas la cirrosis y la hepatitis cronica; artritis reumatoide; trastornos oculares; fibrosis de la piel, incluido el queloide de la piel, y contractura de Dupuytren; fibrosis renal tales como la nefritis y nefroesclerosis; cicatrizacion de heridas; reduccion de cicatrices; y una enfermedad vascular, tal como la restenosis.
Ademas se proporciona la utilizacion de un dominio variable unico anti-TGFbetaRII o polipeptido como se ha definido anteriormente en la preparacion de un medicamento para su utilizacion en el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo siguiente: cancer, fibrosis hfstica, tal como la fibrosis pulmonar, incluida la fibrosis pulmonar idiopatica; fibrosis hepatica, incluidas la cirrosis y la hepatitis cronica; artritis reumatoide; trastornos oculares; fibrosis de la piel, incluido el queloide de la piel, y contractura de Dupuytren; fibrosis renal tales como la nefritis y nefroesclerosis, cicatrizacion de heridas; reduccion de cicatrices; y una enfermedad vascular, tal como la restenosis.
En un aspecto de la descripcion, se proporciona un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII que tiene una secuencia de aminoacidos como se expone en cualquiera de SEQ. ID. n° 1 a n° 38, n° 204, n° 206, n° 208,
n° 214, n° 234, n° 236, n° 238, n° 240, n° 263, n° 265, n° 267, n° 269, n° 271, n° 273, n° 275, n° 277, n° 279, n° 281,
n° 283, n° 285 y n° 287, y que tiene hasta 5 alteraciones de aminoacido, en donde cada alteracion de aminoacido es una sustitucion, eliminacion o adicion de aminoacido, es decir, hasta 5 sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoacido, en cualquier combinacion. En una realizacion determinada, las sustituciones de aminoacido son sustituciones moderadas.
En una realizacion, el dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII tiene la secuencia de aminoacidos indicada en la SEQ ID n° 234 o n° 279, y tiene hasta 5 alteraciones de aminoacido, en donde cada alteracion de aminoacido es una sustitucion, eliminacion o adicion de aminoacido. En una realizacion determinada, las alteraciones de aminoacido no estan en la CDR3, mas especfficamente no estan en la CDR3 ni en la CDR1, ni en la CDR3 ni en la CDR2, mas especfficamente ni en ninguna de las CDR. En una realizacion, el dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII consiste de cualquiera de las siguientes secuencias: SEQ ID n° 1 a n° 38, n° 204, n° 206, n° 208, n° 214, n° 234, n° 236, n° 238, n° 240, n° 263, n° 265, n° 267, n° 269, n° 271, n° 273, n° 275, n°
277, n° 279, n° 281, n° 283, n° 285 y n° 287. En una realizacion, el dominio variable unico de inmunoglobulina anti-
TGFbetaRII consiste en una secuencia de aminoacidos SEQ ID n° 234 o 236.
No se pretende abarcar cualquier secuencia especffica del dominio variable unico de inmunoglobulina anti- TGFbetaRII descrita en el documento WO 2011012609. Para que no haya duda, cada una y cualquier secuencia descrita en el documento WO 2011012609 puede ser rechazada en la presente invencion. En especial, pueden rechazarse DOM23h-271 (SEQ ID n° 4) y DOM-23h-439 (SEQ ID n° 10) como se describe en el documento WO 2011012609. En la presente memoria puede rechazarse un dominio variable unico de inmunoglobulina anti- TGFbetaRII que consiste en la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID n° 199 o n° 201.
Un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII segun la descripcion, puede comprender uno o mas (p. ej., 1, 2, 3, 4 o 5) restos de alanina en el terminal C. Alternativamente, un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII puede comprender un peptido con terminal C de hasta 5 aminoacidos de longitud. En una realizacion, el peptido con terminal C comprende 1, 2, 3, 4 o 5 aminoacidos.
Un experto en la tecnica es capaz de deducir a partir de una secuencia del dominio variable unico dada, p. ej., la que tiene una secuencia como se expone en cualquiera de las SEQ ID n° 1 a n° 38, n° 204, n° 206, n° 208, n° 214, n° 234, n° 236, n° 238, n° 240, n° 263, n° 265, n° 267, n° 269, n° 271, n° 273, n° 275, n° 277, n° 279, n° 281, n° 283, n°
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285 y n° 287 cuyas secuencias de la CDR estan contenidas dentro de ellas, usando los diversos metodos esbozados en la presente memoria, p. ej., secuencias de la CDR como se ha definido haciendo referencia a los metodos de Kabat (1987), Chothia (1989), AbM o por contacto, o una combinacion de estos metodos. Convenientemente, las secuencias de la CDR se determinan empleando el metodo de Kabat descrito en la presente memoria. En una realizacion, las secuencias de la CDR de cada secuencia, son las expuestas en las tablas 1, 2, 9 y 13.
En un aspecto de la invencion, un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII de la descripcion tiene 90% o mas de 90% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID n° 1 a n° 28.
En un aspecto, un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII de la descripcion tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID n° 1 a n° 28, con 25 o menos cambios de aminoacido. En una realizacion determinada, un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII de la descripcion tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID n° 1 a n° 28, con 20 o menos, 15 o menos, 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos o 5 o menos cambios de aminoacido.
En un aspecto de la descripcion, se proporciona un polipeptido aislado que comprende un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII de la descripcion, en particular un dominio variable unico de inmunoglobulina anti- TGFbetaRII identico a una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID n° 1 a n° 38, n° 204, n° 206, n° 208, n° 214, n° 234, n° 236, n° 238, n° 240, n° 263, n° 265, n° 267, n° 269, n° 271, n° 273, n° 275, n° 277, n° 279, n° 281, n° 283, n° 285 y n° 287, en donde dicho polipeptido aislado se une al TGFbetaRII.
En un aspecto de la descripcion, se proporciona un polipeptido aislado codificado por una secuencia de nucleotidos que es al menos 80% identica a al menos una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo de: las SEQ ID n° 39 a n° 66, en donde dicho polipeptido aislado se une al TGFbetaRII.
Un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII o un polipeptido segun cualquier aspecto de la descripcion puede comprender cualquiera de los siguientes aminoacidos: R en la posicion 39, I en la posicion 48, D en la posicion 53, N en la posicion 61, R en la posicion 61, K en la posicion 61, R en la posicion 64, F en la posicion 64, D en la posicion 64, E en la posicion 64, Y en la posicion 64, H en la posicion 102 o S en la posicion 103 del dominio variable unico de inmunoglobulina, siendo dicha posicion segun la convencion de numeracion de Kabat. En una realizacion, el dominio variable unico de inmunoglobulina o polipeptido comprende una combinacion de estos aminoacidos. En otra realizacion, el dominio variable unico de inmunoglobulina o polipeptido comprende el aminoacido N en 61 y R en 64. En otra realizacion, el dominio variable unico de inmunoglobulina o polipeptido comprende el aminoacido R o K en la posicion 61. En una realizacion, el dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII comprende un I en la posicion 48 ademas de cualquiera de los restos mencionados anteriormente en la posicion 61 y/o 64. En estas realizaciones, la numeracion de aminoacidos es la del dominio variable unico de inmunoglobulina, segun se ilustra, por ejemplo, mediante las secuencias dadas en las SEQ ID n° 1 a n° 38, n° 204, n° 206, n° 208, n° 214, n° 234, n° 236, n° 238, n° 240, n° 263, n° 265, n° 267, n° 269, n° 271, n° 273, n° 275, n° 277, n° 279, n° 281, n° 283, n° 285 y n° 287.
Un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII o polipeptido segun cualquier aspecto de la descripcion, puede comprender una de las siguientes combinaciones de aminoacidos seleccionada del grupo: N en la posicion 61 y R en la posicion 64; R en la posicion 61 y E en la posicion 64; R en la posicion 61 y M en la posicion 64; R en la posicion 61 y F en la posicion 64; R en la posicion 61 e Y en la posicion 64; y R en la posicion 61 y D en la posicion 64 del dominio variable unico de inmunoglobulina. En una realizacion, el dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII comprende una I en la posicion 48 ademas de cualquiera de las combinaciones de restos mencionadas anteriormente en las posiciones 61 y 64.
En otro aspecto, se describe un ligando o grupo de union que tiene especificidad de union por el TGFbetaRII e inhibe la union de un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo de las SEQ ID n° 1 a n° 28 al TGFbetaRII.
En otro aspecto de la descripcion, se proporciona una protefna de fusion que comprende un dominio variable unico de inmunoglobulina, polipeptido o ligando segun cualquier aspecto de la descripcion.
En una realizacion, el dominio variable unico de inmunoglobulina, polipeptido, ligando o protefna de fusion segun la descripcion, es uno que neutraliza la actividad del TGFbeta. Propiamente, el dominio variable unico de inmunoglobulina o polipeptido segun la descripcion inhibe la union del TGFbeta al TGFbetaRII. En otra realizacion, el dominio variable unico de inmunoglobulina o polipeptido segun la descripcion, inhibe la actividad de senalizacion del TGFbeta por el TGFbetaRII. En otra realizacion, el dominio variable unico de inmunoglobulina o polipeptido segun la descripcion suprime la actividad del TGFbeta, en especial, la actividad de crecimiento celular y/o la actividad fibrogena del TGFbeta. Convenientemente, el TGFbetaRII es el TGFbetaRII humano.
En una realizacion, el dominio variable unico de inmunoglobulina, polipeptido, ligando o protefna de fusion segun la descripcion, carece de actividad agonista del TGFbetaRII a 15 micromolar (pM).
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En otro aspecto, se proporciona un dominio variable unico de inmunoglobulina, polipeptido, ligando o protefna de fusion segun cualquier aspecto de la descripcion, que comprende ademas un grupo que prolonga la vida media. Propiamente, el grupo que prolonga la vida media es un grupo de polietilenglicol, albumina de suero o uno de sus fragmentos, receptor de transferrina o una de sus partes que se unen a transferrina, o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende un punto de union a un polipeptido que aumenta la vida media in vivo. En una realizacion, la parte que prolonga la vida media es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende un punto de union a albumina de suero o al receptor de Fc neonatal. En otra realizacion, el grupo que prolonga la vida media es un dAb, anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
En otro aspecto, la descripcion proporciona un acido nucleico recombinado o aislado que codifica un polipeptido que comprende un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII, polipeptido, ligando o protefna de fusion segun cualquier aspecto de la descripcion.
En una realizacion, la molecula de acido nucleico recombinado o aislado comprende o consiste en una molecula de acido nucleico seleccionada del grupo de cualquiera de las moleculas de acido nucleico que tienen las secuencias expuestas en las SEQ ID n° 39 a n° 76, n° 203, n° 205, n° 207, n° 212, n° 233, n° 235, n° 237, n° 239, n° 262, n° 264, n° 266, n° 268, n° 270, n° 272, n° 274, n° 276, n° 278, n° 280, n° 282, n° 284 y n° 286.
En un aspecto, la descripcion proporciona un acido nucleico recombinado o aislado, en donde el acido nucleico comprende una secuencia de nucleotidos que es por lo menos 80% identica a la secuencia de nucleotidos de cualquiera de las moleculas de acido nucleico que tienen las secuencias expuestas en las SEQ ID n° 39 a n° 66, y en donde el acido nucleico codifica un polipeptido que comprende un dominio variable unico de inmunoglobulina que se une especfficamente al TGFbetaRII.
En otro aspecto, se proporciona un vector que comprende un acido nucleico segun la descripcion.
En otro aspecto, se proporciona una celula anfitriona que comprende un acido nucleico o un vector segun la descripcion. En aun otro aspecto de la descripcion, se proporciona un metodo de produccion de un polipeptido que comprende un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII o un polipeptido o ligando o una protefna de fusion segun la descripcion, comprendiendo el metodo mantener una celula anfitriona segun la descripcion en condiciones adecuadas para la expresion de dicho acido nucleico o vector, por lo que se produce un polipeptido que comprende un dominio variable unico de inmunoglobulina, polipeptido o ligando o protefna de fusion. Opcionalmente, el metodo comprende ademas la etapa de aislar el polipeptido y opcionalmente producir una variante, p. ej., una variante mutada, con mejor afinidad (Kd); o EC50 para la neutralizacion del TGFbeta en un analisis habitual, que el polipeptido aislado. Analisis adecuados para la actividad del TGFbeta, tal como un analisis con detector de celulas, se describen en la presente memoria, por ejemplo, en el apartado Ejemplos.
En un aspecto de la descripcion, el dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII, polipeptido o ligando o protefna de fusion segun la descripcion, es para su utilizacion como medicamento. Por consiguiente, se proporciona una composicion que comprende un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII, polipeptido o ligando o protefna de fusion segun la descripcion, para su utilizacion como medicamento.
En un aspecto de la descripcion, se proporciona una utilizacion de un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII, polipeptido o ligando o protefna de fusion segun la descripcion, en la preparacion de un medicamento, en especial para su uso en el tratamiento de enfermedades relacionadas con la senalizacion del TGFbeta.
Propiamente, el dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII, polipeptido o ligando o protefna de fusion o composicion segun la descripcion, es para el tratamiento de una enfermedad relacionada con la senalizacion del TGFbeta. Propiamente, la enfermedad es una fibrosis hfstica, tal como fibrosis pulmonar incluida la fibrosis pulmonar idiopatica; fibrosis hepatica, incluida la cirrosis y la hepatitis cronica; artritis reumatoide; trastornos oculares; o fibrosis de la piel incluido el queloide de la piel; contractura de Dupuytren; y fibrosis renal tal como nefritis y nefroesclerosis; o una enfermedad vascular tal como restenosis. Otras enfermedades relacionadas con la senalizacion del TGFbeta incluyen enfermedades vasculares tales como hipertension, preeclampsia, telangiectasia hemorragica hereditaria tipo I (THH1), THH2, hipertension arterial pulmonar, aneurismas de la aorta, sfndrome de Marfan, trastorno de aneurisma familiar, sfndrome de Loeys-Dietz y sfndrome de tortuosidad arterial (STA). Otras enfermedades relacionadas con la senalizacion del TGFbeta incluyen enfermedades del sistema musculoesqueletico, tales como la distrofia muscular de Duchenne y fibrosis muscular. Otras enfermedades relacionadas con la senalizacion del TGFbeta incluyen el cancer, tales como cancer de colon, gastrico y pancreatico, asf como glioma y NSCLC. Ademas, la descripcion proporciona metodos para elegir como objetivo el cancer modulando la senalizacion del TGFbeta en angiogenia tumoral. Otras enfermedades o afecciones incluyen las relacionadas con la cicatrizacion de tejidos. Otras enfermedades incluyen enfermedades pulmonares tales como EPOC (enfermedad pulmonar obstructiva cronica). Un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII, polipeptido o ligando o protefna de fusion o composicion segun la descripcion, puede utilizarse en la cicatrizacion de heridas y/o para evitar o mejorar la formacion de cicatrices. En un aspecto, la descripcion proporciona el dominio variable unico anti-TGFbetaRII, ligando o antagonista, composicion o protefna de fusion, para administracion intradermica. En un aspecto, la descripcion proporciona el dominio variable unico anti-TGFbetaRII, ligando o
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antagonista o protefna de fusion, para administracion a la piel de un paciente. En un aspecto, la descripcion proporciona la utilizacion del dominio variable unico anti-TGFbetaRII, ligando o antagonista o protefna de fusion, en la preparacion de un medicamento para administracion intradermica. En un aspecto, la descripcion proporciona la utilizacion del dominio variable unico anti-TGFbetaRII o antagonista o protefna de fusion segun la descripcion en la preparacion de un medicamento para administracion a la piel de un paciente.
En una realizacion, el dominio variable es sustancialmente monomerico. En una realizacion determinada, el dominio variable es 65%-98% monomerico en solucion, segun se determina por SEC-MALLS. En otra realizacion, el dominio variable es 65%-100%, 70%-100%, 75%-100%, 80%-100%, 85%-100%, 90%-100% o 95%-100% monomerico en solucion, segun se determina por SEC-MALLS.
En otra realizacion, el dominio variable, ligando, protefna de fusion o polipeptido segun se describe en la presente, en particular cuando esta en una composicion farmaceutica, no contiene ninguna o una combinacion o la totalidad de las siguientes modificaciones despues de la traduccion: desamidacion, oxidacion o glucosilacion. En una realizacion determinada, el dominio variable, ligando, protefna de fusion o polipeptido segun la descripcion, no se desamida.
Propiamente, la composicion es para tratamiento o profilaxis de una enfermedad mediada por el TGFbeta en una persona.
Por consiguiente, en una realizacion, se describe un dAb anti-TGFbetaRII para el tratamiento de fibrosis de la piel, en particular la enfermedad queloide o la contractura de Dupuytren. Propiamente, el dAb anti-TGFbetaRII se proporciona como un dAb sustancialmente monomerico para administracion intradermica, preferiblemente careciendo de alguna etiqueta (es decir, sin etiqueta), tal como una etiqueta myc u otra de purificacion.
En un aspecto, la composicion es una composicion farmaceutica y comprende ademas un vehfculo, excipiente o diluyente farmaceuticamente aceptable.
En otro aspecto, se describe un metodo de tratamiento y/o prevencion de una afeccion mediada por el TGFbeta en un paciente humano, comprendiendo el metodo administrar al paciente una composicion que comprende un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII, polipeptido o ligando segun la descripcion.
En otro aspecto, la descripcion proporciona un dispositivo de administracion intradermica que contiene una composicion segun la descripcion. Propiamente, dicho dispositivo es una microaguja o coleccion de microagujas.
En otro aspecto, se describe un equipo que comprende un dominio variable unico anti-TGFbetaRII o polipeptido como se describe en la presente memoria y un dispositivo, tal como un dispositivo para administracion intradermica, para aplicar dicho dominio variable unico o polipeptido a la piel.
Descripcion detallada
En esta memoria, la descripcion se ha descrito, con referencia a realizaciones, de una manera que permite escribir una memoria clara y concisa. Se pretende y debe apreciarse que las realizaciones puedan combinarse o separarse de varias maneras sin apartarse de la descripcion.
A menos que se defina de otra manera, todos los terminos tecnicos y cientfficos empleados en la presente memoria tienen el mismo significado que el entendido normalmente por los expertos en la tecnica (p. ej., en tecnicas y bioqufmica de cultivo celular, genetica molecular, qufmica de acidos nucleicos e hibridacion). Se usan tecnicas normalizadas para metodos moleculares, geneticos y bioqufmicos (vease en general, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. y Ausubel, et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4a ed; John Wiley & Sons, Inc.) y metodos qufmicos.
Inmunoglobulina: Como se emplea en esta memoria, el termino “inmunoglobulina” se refiere a una familia de polipeptidos que conservan la caracterfstica de plegamiento de la inmunoglobulina de las moleculas de anticuerpo, las cuales contienen dos laminas p y, normalmente, un enlace disulfuro conservado.
Dominio: Como se emplea en esta memoria, “dominio” se refiere a una estructura de proterna plegada que conserva su estructura terciaria independientemente del resto de la protefna. En general, los dominios son responsables de las propiedades funcionales discretas de las protefnas, y en muchos casos pueden anadirse, eliminarse o transferirse a otras protefnas sin perdida de funcion del resto de la protefna y/o del dominio. Por dominio variable unico de anticuerpo o dominio variable unico de inmunoglobulina, se entiende un dominio de polipeptido plegado que comprende secuencias caracterfsticas de dominios variables del anticuerpo. Por lo tanto, incluye dominios variables completos del anticuerpo y dominios variables modificados, por ejemplo, en los cuales uno o mas bucles han sido reemplazados por secuencias que no son caracterfsticas de los dominios variables del anticuerpo, o dominios variables del anticuerpo que han sido truncados o comprenden prolongaciones del terminal N o C, asf como fragmentos plegados o dominios variables que conservan al menos en parte la actividad de union y especificidad de todo el dominio.
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Unico dominio variable de inmunoglobulina: La frase “dominio variable unico de inmunoglobulina” se refiere a un dominio variable de anticuerpo (Vh, Vhh, Vl) o a un dominio de union que se une especfficamente a un antfgeno o epftopo independientemente de otras regiones o dominios V diferentes, es decir, es monovalente. Un dominio variable unico de inmunoglobulina puede estar presente en un formato (p. ej., homo- o hetero-polfmero) con otras regiones variables o dominios variables en donde las demas regiones o dominios no se requieren para la union al antfgeno por el dominio variable unico de inmunoglobulina (es decir, en donde el dominio variable unico de inmunoglobulina se une al antfgeno independientemente de los dominios variables adicionales). Un “anticuerpo de dominio” o “dAb”, es un “dominio variable unico de inmunoglobulina” tal como se emplea el termino en esta memoria. Un “dominio variable unico de anticuerpo”, es lo mismo que un “dominio variable unico de inmunoglobulina” tal como se emplea el termino en esta memoria. Un dominio variable unico de inmunoglobulina es en una realizacion un dominio variable de anticuerpo humano, pero incluye tambien dominios variables unicos de anticuerpo de otras especies tales como los dAb de roedores (p. ej., como se describe en el documento WO 00/29004), tiburon nodriza y camelidos. Los Vhh de camelido son polipeptidos de dominio variable unico de inmunoglobulina que proceden de especies incluidas camello, llama, alpaca, dromedario y guanaco, que producen anticuerpos de cadena pesada carentes naturalmente de cadenas ligeras. El Vhh puede ser humanizado.
En todos los aspectos de la descripcion, el dominio variable unico de inmunoglobulina se selecciona independientemente de dominios variables unicos de cadena ligera y cadena pesada de anticuerpo, p. ej. Vh, Vl y
VHH.
Como se emplea en esta memoria, un “anticuerpo” se refiere a una IgG, IgM, IgA, IgD o IgE o un fragmento (tal como un fragmento Fab, F(ab')2, Fv, Fv unido a disulfuro, scFv, anticuerpo multiespecffico de configuracion cerrada, scFv unido a disulfuro, diacuerpo), ya sea derivado de alguna especie que produzca naturalmente un anticuerpo, o creado por ingenierfa genetica; ya sea aislado de, por ejemplo, suero, linfocitos B, hibridomas, transfectomas, levaduras o bacterias.
Formato de anticuerpo: En una realizacion, el dominio variable unico de inmunoglobulina, polipeptido o ligando segun la descripcion, puede proporcionarse en cualquier formato de anticuerpo. Como se emplea en esta memoeria, el termino “formato de anticuerpo” se refiere a cualquier estructura de polipeptido adecuada en la que uno o mas dominios variables del anticuerpo pueden incorporarse para conferir especificidad de union por el antfgeno en la estructura. Una variedad de formatos de anticuerpo adecuados se conocen en la tecnica, tales como los anticuerpos hfbridos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos biespecfficos, cadenas pesadas de anticuerpo, cadenas ligeras de anticuerpo, homodfmeros y heterodfmeros de cadenas pesadas y/o cadenas ligeras de anticuerpo, fragmentos de union al antfgeno de cualquiera de los anteriores (p. ej., un fragmento Fv (p. ej., Fv monocatenario (scFv), Fv unido a disulfuro), un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2), un dominio variable unico de anticuerpo (p. ej., un dAb, Vh, Vhh, Vl), y versiones modificadas de cualquiera de los anteriores (p. ej., modificadas por enlace covalente de polietilenglicol u otros polfmeros adecuados o un Vhh humanizado). En una realizacion, los formatos de anticuerpo alternativos incluyen andamiajes alternativos en los que las CDR de cualquier molecula segun la descripcion pueden injertarse en un andamiaje o esqueleto de protefna adecuado, tal como un aficuerpo, un andamiaje de SpA, un dominio de clase A de receptor de LDL, un avfmero (vease, p. ej., la solicitud de patente de EE.UU. publicacion n° 2005/0053973, n° 2005/0089932 y n° 2005/0164301) o un dominio del EGF. Ademas, el ligando puede ser bivalente (heterobivalente) o polivalente (heteropolivalente), como se describe en la presente memoria. En otras realizaciones, puede usarse una “estructura universal”, en donde “estructura universal” se refiere a una unica secuencia con estructura de anticuerpo que corresponde a las regiones de un anticuerpo conservadas en la secuencia como ha definido Kabat (“ Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services), o que corresponden al repertorio de inmunoglobulinas o estructuras de la estirpe germinativa humana, como han definido Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 910-917. La descripcion proporciona la utilizacion de una unica estructura, o una serie de dichas estructuras, que se ha visto que permiten la derivacion de virtualmente cualquier especificidad de union mediante la variacion en las regiones hipervariables solas.
En realizaciones de la descripcion descritas a lo largo de esta descripcion, en lugar de la utilizacion de un “dAb” anti - TGFbetaRII en un peptido o ligando de la descripcion, se contempla que cualquier experto en la tecnica pueda usar un polipeptido o dominio que comprenda una o mas o las 3 CDR de un dAb de la descripcion que se une al TGFbetaRII (p. ej., las CDR injertadas en un andamiaje o esqueleto de protefna adecuado, p. ej., un aficuerpo, un andamiaje de SpA, un dominio de clase A del receptor de LDL o un dominio del EGF). La descripcion en conjunto se debe considerar por consiguiente que proporciona la descripcion de polipeptidos que utilizan dichos dominios en lugar de un dAb. A este respecto, vease el documento WO2008096158.
En una realizacion, el dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII es cualquier dominio variable de inmunoglobulina adecuado, y opcionalmente es un dominio variable humano o un dominio variable que comprende o procede de una region de estructura humana (p. ej., las regiones con estructura DP47 o DPK9).
Antfgeno: Como se describe en la presente memoria, un “antfgeno” es una molecula que esta unida por un dominio de union segun la presente descripcion. Generalmente, los antfgenos estan unidos por ligandos de anticuerpo y son capaces de provocar una respuesta de anticuerpo in vivo. Puede ser, por ejemplo, un polipeptido, protefna, acido nucleico u otra molecula.
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Epftopo: Un “epftopo” es una unidad de estructura unida convencionalmente por un par Vh/Vl de inmunoglobulina. Los epftopos definen el punto de union mfnimo para un anticuerpo, y de esta manera representan el objetivo de especificidad de un anticuerpo. En el caso de un anticuerpo con un solo dominio, un epftopo representa la unidad de estructura unida por un dominio variable en aislamiento.
Union: Generalmente, la union especffica esta indicada por una constante de disociacion (Kd) de 50 nanomolar o menos, opcionalmente 250 picomolar o menos. La union especffica de una protefna de union al antfgeno para un antfgeno o epftopo puede determinarse mediante un analisis adecuado como por ejemplo, el analisis de Scatchard y/o analisis de union competitiva, tales como radioinmunoanalisis (RIA), inmunoanalisis enzimaticos tales como ELISA y analisis de competencia en sandwich, y los diferentes variantes de los mismos.
Afinidad de union: La afinidad de union se determina opcionalmente usando la resonancia de plasmones de superficie (SPR) y BIACORE™ (Karlsson et al., 1991), usando un sistema BIACORE™ (Uppsala, Suecia). El sistema BiAcoRe™ usa la resonancia de plasmones de superficie (SPR, Welford K. 1991, Opt. Quant. Elect. 23:1; Morton y Myszka, 1998, Methods in Enzymology 295: 268) para hacer el seguimiento de las interacciones biomoleculares en tiempo real, y utiliza la resonancia de plasmones de superficie que puede detectar cambios en el angulo de resonancia de la luz en la superficie de una pelfcula de oro delgada sobre un soporte de vidrio como resultado de cambios en el fndice de refraccion de la superficie hasta 300 nm de distancia. El analisis BIACORE™ genera convenientemente constantes de velocidad de asociacion, constantes de velocidad de disociacion, constantes de disociacion en equilibrio y constantes de afinidad. La afinidad de union se obtiene evaluando las constantes de velocidad de asociacion y disociacion utilizando un sistema de resonancia de plasmones de superficie BIACORE™ (BIACORE™, Inc.). Un chip biodetector es activado por el enlace covalente del objetivo segun las instrucciones del fabricante (BIACORE™). El objetivo se diluye e inyecta a continuacion sobre el chip para obtener una serial en unidades de respuesta de material inmovilizado. Dado que la serial en unidades de resonancia (UR) es proporcional a la masa del material inmovilizado, esto representa una gama de densidades del objetivo inmovilizado en la matriz. Los datos de disociacion se ajustan a un modelo de un solo sitio para obtener la koff +/- d.t. (desviacion tfpica de las mediciones). Se calculan las constantes de velocidad de pseudo primer orden (Kd) para cada curva de asociacion, y se representan en funcion de la concentracion de protefna para obtener kon +/- e.t. (error tfpico del ajuste). Las constantes de disociacion en equilibrio para la union, Kd, se calculan a partir de mediciones de la SPR como koff/kon.
Otro aspecto de la descripcion proporciona un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII que se une especfficamente al TGFbetaRII humano. En una realizacion, el dominio variable se une al TGFbetaRII humano con una constante de disociacion (KD) en equilibrio de aproximadamente 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM o menos, opcionalmente aproximadamente 9, 8, 7, 6 o 5 nM o menos, opcionalmente aproximadamente 4 nM o menos, aproximadamente 3 nM o menos o aproximadamente 2 nM o menos o aproximadamente 1 nM o menos, opcionalmente aproximadamente 500 pM o menos. Convenientemente, cuando el dominio variable tiene una constante de disociacion en equilibrio en el intervalo de aproximadamente 50 nM a 500 pM, es especialmente adecuado para administracion local a un tejido de interes tal como el pulmon. En esta realizacion, una alta concentracion de dicho enlazador de “afinidad moderada” puede proporcionarse como farmaco eficaz. En otra realizacion, el dominio variable se une al TGFbetaRII humano con una constante de disociacion (KD) en equilibrio de aproximadamente 500 pM o menos, opcionalmente aproximadamente 450 pM, 400 pM, 350 pM, 300 pM, 250 pM, 200 pM, 150 pM, 100 pM, 50 pM o menos, opcionalmente aproximadamente 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM o menos. Convenientemente, cuando el dominio variable tiene una constante de disociacion en el intervalo de aproximadamente 500 pM a 10 pM, es especialmente adecuado para administracion general, de manera que la cantidad en cualquier tejido de interes, es suficiente para proporcionar un tratamiento eficaz. En esta realizacion, una baja concentracion de dicho enlazador de “alta afinidad” puede proporcionarse como farmaco eficaz.
En una realizacion, los dominios variables unicos de la presente descripcion presentan reactividad cruzada entre el TGFbetaRII humano y el TGFbetaRII de otra especie, tal como el TGFbetaRII de raton. En esta realizacion, los dominios variables se unen especfficamente al TGFbetaRII humano y de raton. Esto es especialmente util, ya que el desarrollo de farmacos requiere generalmente la prueba de candidatos de farmaco destacados en sistemas de raton antes de que el farmaco se pruebe en personas. La provision de un farmaco que puede unirse a las especies humana y de raton permite probar los resultados en este sistema, y hacer comparaciones entre ellos de datos empleando el mismo farmaco. Esto evita la complicacion de la necesidad de encontrar un farmaco que funcione contra un TGFbetaRII de raton y un farmaco aparte que actua contra el TGFbetaRII humano, y evita tambien la necesidad de comparar los resultados en personas y ratones usando farmacos no identicos. Se contempla tambien la reactividad cruzada entre otras especies usadas en modelos de enfermedad tales como perros o monos tales como el mono cynomolgus.
Opcionalmente, la afinidad de union del dominio variable unico de inmunoglobulina para al menos el TGFbetaRII de raton, y la afinidad de union por el TGFbetaRII humano, difieren en mas de un factor de 10, 50 o 100.
CDR: Los dominios variables unicos de inmunoglobulina (dAb) descritos en la presente memoria contienen regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3). Las posiciones de las CDR y las regiones de estructura (FR) y un sistema de numeracion, han sido definidos por Kabat et al. (Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edicion, U.S. Department of Health and Human Services, U.S.
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Government Printing Office (1991)). Las secuencias de aminoacidos de las CDR (CDR1, CDR2, CDR3) de los dAb Vh (CDRH1, etc.) y Vl (CDRL1, etc.) (Vk) describes en la presente memoria, seran muy evidentes para los expertos en la tecnica en base al sistema de numeracion de aminoacidos de Kabat bien conocido y la definicion de las CDR. Segun el sistema de numeracion de Kabat, el metodo usado mas comunmente basado en la variabilidad de la secuencia, la CDR-H3 de cadena pesada tiene longitudes variables, y las inserciones se enumeran entre el resto H100 y H101 con letras hasta la K (es decir, H100, H100A ... H100K, H101). Las CDR pueden determinarse de forma alternativa usando el sistema de Chothia (basado en la posicion de las regiones de bucle estructurales) (Chothia et al., (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, pags. 877-883), segun AbM (compromiso entre Kabat y Chothia), o segun el metodo de Contact (basado en las estructuras cristalinas y la prediccion de los restos de contacto con el antfgeno) como sigue. Vease
http://www.bioinf.org.uk/abs/ para metodos adecuados para la determinacion de las CDR.
Una vez que cada resto ha sido enumerado, pueden aplicarse entonces las siguientes definiciones de la CDR:
Kabat:
CDR H1: 31-35/35A/35B CDR H2: 50-65 CDR H3: 95-102 CDR L1: 24-34 CDR L2: 50-56 CDR L3: 89-97 Chothia:
CDR H1: 26-32 CDR H2: 52-56 CDR H3: 95-102 CDR L1: 24-34 CDR L2: 50-56 CDR L3: 89-97 AbM:
(usando la numeracion de Kabat): (usando la numeracion de Chothia):

CDR H1: 26-35/35A/35B 26-35

CDR H2: 50-58 -

CDR H3: 95-102 -

CDR L1: 24-34 -

CDR L2: 50-56 -

CDR L3: 89-97 -
Contact:
(usando la numeracion de Kabat): (usando la numeracion de Chothia):

CDR H1: 30-35/35A/35B 30-35

CDR H2: 47-58 -

CDR H3: 93-101 -

CDR L1: 30-36 -

CDR L2: 46-55 -
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CDR L3: 89-96
(“-“ significa la misma numeracion que la de Kabat).
Por consiguiente, un experto en la tecnica es capaz de deducir a partir de una secuencia de dominio variable unico dado, p. ej., uno que tenga una secuencia como se expone en cualquiera de las SEQ ID n° 1 a n° 38, n° 204, n° 206, n° 208, n° 214, n° 234, n° 236, n° 238, n° 240, n° 263, n° 265, n° 267, n° 269, n° 271, n° 273, n° 275, n° 277, n° 279, n° 281, n° 283, n° 285 y n° 287, cuyas secuencias de la CDR esten contenidas dentro de ellas usando los varios metodos esbozados en la presente memoria. Por ejemplo, para una secuencia del dominio variable unico dado, p. ej. , SEQ ID n° 1, un experto en la tecnica es capaz de determinar las secuencias de la CDR1, CDR2 y CDR3 contenidas en las mismas, usando cualquiera o una combinacion de los metodos de definicion de la CDR mencionados anteriormente. Cuando se usa la definicion de la CDR de Kabat, el experto en la tecnica es capaz de determinar que las secuencias de la CDR1, CDR2 y CDR3, son las expuestas en SEQ ID n° 77, n° 113 y n° 149, respectivamente. Convenientemente, las secuencias de la CDR se determinan usando el metodo de Kabat descrito en la presente memoria. En una realizacion, las secuencias de la CDR de cada secuencia son las expuestas en las tablas 1, 2, 9 y 13. En una realizacion, una secuencia de la CDR1 es una secuencia de la CDR1 seleccionada de las SEQ ID n° 77 a 112, n° 241, n° 244, n° 247 y n° 250. En una realizacion, una secuencia de la CDR2 es una secuencia de la CDR2 seleccionada de las SEQ ID n° 113 a n° 148, n° 242, n° 245, n° 248 y n° 251. En una realizacion, una secuencia de la CDR3 es una secuencia de la CDR3 seleccionada de SEQ ID n° 149 a n° 184, n° 243, n° 246, n° 249 y n° 252.
Una variante de la CDR o unidad de union variante incluye una secuencia de aminoacidos modificada por al menos un aminoacido, en donde dicha modificacion puede ser qufmica o una alteracion parcial de la secuencia de aminoacidos (p. ej., de no mas de 10 aminoacidos), modificacion que permite que a la variante conservar las caracterfsticas biologicas de la secuencia inalterada. Por ejemplo, la variante es una variante funcional que se une especfficamente al TGFbetaRII. Una alteracion parcial de la secuencia de aminoacidos de la CDR puede ser por eliminacion o sustitucion de uno a varios aminoacidos, o por la adicion o insercion de uno a varios aminoacidos, o por una de sus combinaciones (p. ej., de no mas de 10 aminoacidos). La variante de la CDR o variante de la unidad de union puede contener 1, 2, 3, 4, 5 o 6 sustituciones, adiciones, o eliminaciones de aminoacidos, en cualquier combinacion, en la secuencia de aminoacidos. La variante de la CDR o variante de la unidad de union puede contener 1, 2 o 3 sustituciones, inserciones o eliminaciones de aminoacidos, en cualquier combinacion, en la secuencia de aminoacidos. Las sustituciones en los restos de aminoacido pueden ser sustituciones moderadas, por ejemplo, sustituyendo con un aminoacido hidrofobo por un aminoacido hidrofobo alternativo. Por ejemplo, la leucina puede ser sustituida por valina o isoleucina.
TGFbetaRII: Como se emplea en esta memoria, el termino “TGFbetaRII” (receptor del factor de crecimiento transformante beta tipo II; TGFpRII) se refiere a protemas del TGFbetaRII de mairnfero endogenas o de origen natural, y a protefnas que tienen una secuencia de aminoacidos que es la misma que la de una protefna del TGFbetaRII de origen natural o de mamffero endogena correspondiente (p. ej., protefnas recombinadas, protefnas sinteticas (es decir, producidas empleando los metodos de qufmica organica de sfntesis)). Por consiguiente, como se define en la presente memoria, el termino incluye la protefna del TGFbetaRII madura, variantes polimorficas o alelicas, y otras isoformas del TGFbetaRII y formas modificadas o no modificadas de las anteriores (p. ej., lipidadas, glucosiladas). El TGFbetaRII de origen natural o endogeno incluye protefnas sin tratamiento previo tales como TGFbetaRII maduro, variantes polimorficas o alelicas y otras isoformas y formas mutantes que se producen de forma natural en mamfferos (p. ej., seres humanos, primates no humanos). Dichas protefnas pueden recuperarse o aislarse de una fuente que expresa TGFbetaRII de forma natural, por ejemplo. Estas protefnas y las protefnas que tienen la misma secuencia de aminoacidos como un TGFbetaRII de origen natural o endogeno correspondiente, se citan por el nombre del mamffero correspondiente. Por ejemplo, cuando el mamffero correspondiente es un ser humano, la protefna se denomina TGFbetaRII humano. El TGFbetaRII humano es descrito, por ejemplo, por Lin, et al., Cell 1992, vol. 68(4), pags. 775-785, y el n° de entrada M85079 en Genbank.
El TGFbetaRII humano es un receptor transmembrana que consta de 567 aminoacidos con un dominio extracelular de aproximadamente 159 aminoacidos, un dominio de transmembrana y un dominio citoplasmico que comprende un dominio de protefna cinasa para la transduccion de senales.
Como se emplea en esta memoria, el “TGFbetaRII” incluye tambien una parte o fragmento del TGFbetaRII. En una realizacion, dicha porcion o fragmento incluye el dominio extracelular del TGFbetaRII o una parte del mismo.
Por “anti-TGFbetaRII” con relacion a un dominio variable unico de inmunoglobulina, polipeptido, ligando, protefna de fusion, etc., se entiende una resto que reconoce y se une al TGFbetaRII. En una realizacion un “anti-TGFbetaRII” reconoce especfficamente y/o se une especfficamente a la protefna TGFbetaRII y, convenientemente, el TGFbetaRII humano. En otra realizacion, el dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII segun la descripcion, se une tambien al TGFbetaRII de raton (numero de entrada NM_029575 en el GenBank; descrito, por ejemplo, en Massague et al., Cell 69 (7), 1067-1070 (1992)).
El “TGFbeta” incluye isoformas tales como TGFbetal, TGFbeta2 y TGFbeta3.
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El TGFbeta se une al TGFbetaRII y, en un complejo con el TGFbetaRI, inicia una via de senalizacion. Por consiguiente, la actividad del TGFbeta y la inhibicion o neutralizacion de la actividad del TGFbeta puede determinarse por cualquier analisis que mida un resultado de la senalizacion del TGFbeta. La senalizacion del TGFbeta se resena, por ejemplo, en Itoh, et al., Eur. J. Biochem. 2000, vol. 267, pag. 6954; Dennler, et al., Journal of Leucocyte Biol. 2002, 71 (5), pags. 731-40. De esta manera, la actividad de TGFbeta puede probarse en numerosos ensayos diferentes bien conocidas por los expertos en la tecnica. “Inhibicion” o “neutralizacion” significa que una actividad biologica de TGFbeta se reduce total o parcialmente en presencia del dominio variable unico de inmunoglobulina de la presente descripcion en comparacion con la actividad del TGFbeta en ausencia de dicho dominio variable unico de inmunoglobulina.
En una realizacion, una inhibicion o neutralizacion de la actividad del TGFbeta se prueba en un ensayo de liberacion de IL-11. En esta realizacion, la capacidad del dominio variable unico de inmunoglobulina segun la descripcion se prueba por su capacidad para inhibir la liberacion de IL-11 estimulada por TGFbeta1 humano (TGFbeta1; TGF-p1) de celulas tales como las celulas A549. El TGFbeta1 (TGF-p1) se une directamente al TGFbetaRII (TGF-pRII), e induce el montaje del complejo TGFbetaRI/RII (TGF-pRI/II). El TGFbetaRI (TGF-pRI) se fosforila y es capaz de senalizar por varias vfas incluida la via Smad 4. La activacion de la via Smad 4 da lugar a la liberacion de IL-11. La IL-11 se segrega en el sobrenadante celular y se mide entonces por ELISA colorimetrico. Ensayos de liberacion de IL-11 adecuados se describen en la presente memoria, tales como el equipo de prueba de ELISA Quantikine para IL-11 humana suministrado por R & D Systems (ref. D1100).
En otra realizacion, la actividad del TGFbeta se prueba en un ensayo para la capacidad del dominio variable unico de inmunoglobulina segun la descripcion, para inhibir la expresion de la CAGA-luciferasa inducida por el TGFbeta en celulas MC3T3-E1 en un ensayo de luciferasa en celulas MC3T3-E1. Tres copias de un motivo de secuencia sensible al TGFbeta, denominado secuencia CAGA, estan presentes en el activador PAI-1 humano, y se unen especfficamente a las protefnas Smad3 y 4. La clonacion de multiples copias de la secuencia CAGA en un montaje indicador de luciferasa, confiere sensibilidad del TGFbeta a las celulas transfectadas con el sistema indicador. Un ensayo adecuado se describe en la presente memoria, y utiliza celulas MC3T3-E1 (osteoblastos de raton) transfectadas establemente con un montaje informador de [CAGA]12-luciferasa (Dennler, et al., (1998) EMBO J. 17, 3091-3100).
Otros ensayos adecuados incluyen un ensayo celular con beta-lactamasa SBE humana (INVITROGEN®, ensayo detector de celulas). Ejemplos de pruebas adecuadas se describen en la presente memoria.
Propiamente, el dominio variable unico de inmunoglobulina, polipeptido, ligando o protefna de fusion segun la descripcion, no activa por si mismo la senalizacion del receptor TGFbetaRII. Por consiguiente, en una realizacion, el dominio variable unico de inmunoglobulina, polipeptido, ligando o protefna de fusion segun la descripcion, carece de actividad agonista a 10 pM. La actividad agonista puede determinarse probando un compuesto de interes en un ensayo del TGFbetaRII como se describe en la presente memoria, en ausencia de TGFbeta. Cuando TGFbeta esta ausente, la actividad agonista de un compuesto de interes se detectarfa detectando la senalizacion del TGFbetaRII.
Homologfa: Secuencias similares u homologas (p. ej., por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia) a las secuencias descritas en la presente memoria, tambien forman parte de la descripcion. En algunas realizaciones, la identidad de secuencia respecto a aminoacidos puede ser de aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor. Respecto a acidos nucleicos, la identidad de secuencia puede ser de aproximadamente 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor. Alternativamente, existe identidad sustancial cuando los segmentos de acido nucleico hibridan en condiciones de hibridacion selectiva (p. ej., condiciones de hibridacion de muy alta severidad), con el complemento de la cadena. Los acidos nucleicos pueden estar presentes en celulas enteras, en un lisado de celulas o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura.
Como se emplea en esta memoria, los terminos condiciones de “baja severidad”, “media severidad”, “alta severidad” o “muy alta severidad”, describen condiciones para la hibridacion y lavado de acidos nucleicos. Una gma para llevar a cabo las reacciones de hibridacion puede encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Metodos acuosos y no acuosos se describen en esa referencia y ambos pueden usarse. Las condiciones de hibridacion especfficas referidas en la presente memoria, son las siguientes: (1) condiciones de hibridacion a baja severidad en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido de dos lavados en 0,2x SSC, SDS al 0,1% por lo menos a 50°C (la temperatura de los lavados puede aumentarse hasta 55°C para las condiciones de baja severidad); (2) condiciones de hibridacion a severidad media en 6X SSC a aproximadamente 45°C, seguido de uno o mas lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1% a 60°C; (3) condiciones de hibridacion a alta severidad en 6X SSC a aproximadamente 45°C, seguido de uno o mas lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1% a 65°C; y opcionalmente (4) condiciones de hibridacion a muy alta severidad son fosfato de sodio 0,5 M, SDS al 7% a 65°C, seguido de uno o mas lavados a 0,2X SSC, SDS a 1% a 65°C. Las condiciones a muy alta severidad (4) son las condiciones preferidas, y las que deben usarse a menos que se especifique de otra manera.
Los calculos de “homologfa” o “identidad de secuencia” o “similitud” entre dos secuencias (los terminos se usan indistfntamente en la presente memoria), se llevan a cabo de la manera siguiente. Las secuencias se alinean para la
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comparacion optima (p. ej., pueden introducirse espacios en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoacidos o acido nucleico para alineacion optima, y las secuencias no homologas pueden ser pasadas por alto para la comparacion). En una realizacion, la longitud de una secuencia de referencia alineada para la comparacion es por lo menos aproximadamente 30%, opcionalmente por lo menos aproximadamente 40%, opcionalmente por lo menos aproximadamente 50%, opcionalmente por lo menos aproximadamente 60%, y opcionalmente por lo menos aproximadamente 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de la longitud de la secuencia de referencia. Los restos de aminoacido o nucleotidos en las posiciones de aminoacido o posiciones de nucleotido correspondientes se comparan entonces. Cuando una posicion en la primera secuencia esta ocupada por el mismo resto de aminoacido o nucleotido que la posicion correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moleculas son identicas en esa posicion (como se emplea en esta memoria, “homologfa” de aminoacidos o acidos nucleicos es equivalente a “identidad” de aminoacidos o acidos nucleicos). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias, tomando en cuenta el numero de espacios, y la longitud de cada espacio, que necesitan ser introducidos para la alineacion optima de las dos secuencias.
Las alineaciones y la homologfa, similitud o identidad de las secuencias de aminoacidos y acidos nucleicos, como se definen en la presente memoria, se preparan y se determinan opcionalmente usando el algoritmo BLAST 2 Sequences, utilizando parametros predeterminados (Tatusova, T. A. et al.., FEMS Microbiol Lett., 174:187-188 (1999)). Alternativamente, se emplea el algoritmo BLAST (version 2.0) para la alineacion de secuencias, con parametros establecidos para valores predeterminados. BLAST (Basic Local Aligment Search Tool), es el algoritmo heurfstico de busqueda empleado por los programas blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx; estos programas adscriben significancia a sus hallazgos usando los metodos estadfsticos de Karlin y Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(6): 2264-8.
Ligando: Como se emplea en esta memoria, el termino “ligando” se refiere a un compuesto que comprende por lo menos un grupo peptido, polipeptido o protefna que tiene un punto de union con especificidad de union por el TGFbetaRII. Puede referirse tambien a un ligando como un “grupo de union”.
Los ligandos o grupos de union segun la descripcion, comprenden opcionalmente dominios variables de inmunoglobulina que tienen diferentes especificidades de union, y no contienen pares de dominio variables que forman juntos un punto de union para el compuesto objetivo (es decir, no comprenden un dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina y un dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que forman juntos un punto de union para el TGFbetaRII). Opcionalmente, cada dominio que tiene un punto de union que tiene especificidad de union por un objetivo, es un dominio variable unico de inmunoglobulina (p. ej., dominio variable unico de la cadena pesada de inmunoglobulina (p. ej., Vh, Vhh), dominio variable unico de la cadena ligera de inmunoglobulina (p. ej., Vl)) que tiene especificidad de union por un objetivo deseado (p. ej., el TGFbetaRII).
De esta manera, los “ligandos” incluyen polipeptidos que comprenden dos o mas dominios variables unicos de inmunoglobulina, en donde cada dominio variable unico de inmunoglobulina se une a un objetivo diferente. Los ligandos incluyen tambien polipeptidos que comprenden por lo menos dos dominios variables unicos de inmunoglobulina o las secuencias de la CDR de los dominios variables unicos que se unen a diferentes objetivos en un formato adecuado, tal como un formato de anticuerpo (p. ej., formato tipo IgG, scFv, Fab, Fab', F(ab') 2) o un andamiaje o esqueleto de protefna adecuado, tal como un aficuerpo, un andamiaje de SpA, un dominio de clase A de receptor de LDL, un dominio del EGF, avfmero y ligandos bi- y multi-especfficos como se describen en la presente memoria.
El dominio del polipeptido que tiene un punto de union que tiene especificidad de union por un objetivo (p. ej., el TGFbetaRII), puede ser tambien un dominio de protefna que comprende un punto de union para un objetivo deseado, p. ej., un dominio de protefna se selecciona de un aficuerpo, un dominio de SpA, un dominio de clase A de receptor de lDl, un avfmero (vease, p. ej., las publicaciones de solicitud de patente de EE.UU. n° 2005/0053973, n° 2005/0089932 y n° 2005/0164301). Si se desea, un “ligando” puede comprender ademas uno o mas grupos adicionales que pueden ser cada uno independientemente un grupo peptido, polipeptido o protefna, o un grupo no peptfdico (p. ej., un polialquilenglicol, un lfpido, un hidrato de carbono). Por ejemplo, el ligando puede comprender ademas un grupo que prolonga la vida media como se describe en la presente memoria (p. ej., un grupo polialquilenglicol, un grupo que comprende albumina, un fragmento de albumina o variante de albumina, un grupo que comprende transferrina, un fragmento de transferrina o variante de transferrina, un grupo que se une a albumina, o un grupo que se une al receptor de Fc neonatal).
Compite: Como se refiere en la presente memoria, el termino “compite” significa que la union de un primer objetivo (p. ej., el TGFbetaRII) a su dominio de union objetivo affn (p. ej., dominio variable unico de inmunoglobulina), se inhibe en presencia de un segundo dominio de union (p. ej., dominio variable unico de inmunoglobulina) que es especffico para dicho objetivo affn. Por ejemplo, la union puede inhibirse estericamente, por ejemplo, por bloqueo ffsico de un dominio de union o por alteracion de la estructura o el medio de un dominio de union, de manera que su afinidad o avidez por un objetivo se reduce. Para detalles vease el documento WO2006038027 de como llevar a cabo el ELISA de competencia y experimentos BIACORE™ de competencia para determinar la competencia entre el primer y segundo dominios de union. La descripcion incluye protefnas de union al antfgeno, especfficamente dominios variables unicos, polipeptidos, ligandos y protefnas de fusion, que compiten con cualquiera de los dominios
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variables unicos de SEQ ID n° 1 a n° 38. En una realizacion determinada, se proporciona una protefna de union al TGFbetaRII que compite con cualquiera de los dominios variables unicos de SeQ ID n° 1 a n° 38, y tiene tambien una KD de 50 nM o menos para el TGFbetaRII. En una realizacion determinada, la KD esta comprendida entre 10 pM y 50 nM. En una realizacion determinada, la KD esta comprendida entre 10 pM y 10 nM. En una realizacion determinada, la KD esta comprendida entre 100 pM y 10 nM. En una realizacion determinada, la KD es de aproximadamente 100 pM.
Senalizacion del TGFbeta: Propiamente, el dominio variable unico, polipeptido o ligando de la descripcion, puede neutralizar la senalizacion del TGFbeta mediante el TGFbetaRII. Por “neutralizar”, se entiende que el efecto de senalizacion normal del TGFbeta esta bloqueado, de manera que la presencia del TGFbeta tiene un efecto neutro sobre la senalizacion del TGFbetaRII. Los metodos adecuados para medir un efecto de neutralizacion incluyen ensayos para la senalizacion del TGFbeta como se describen en la presente memoria. En una realizacion, la neutralizacion se observa como un % de inhibicion de la actividad del TGFbeta en un ensayo de senalizacion del TGFbeta. En una realizacion, el dominio variable unico o polipeptido se une al dominio extracelular del TGFbetaRII, inhibiendo/bloqueando de esta manera la union del TGFbeta al dominio extracelular del TGFbetaRII. Convenientemente, el dominio variable unico o polipeptido es util en donde existe un exceso del TGFbeta biodisponible, y el dominio variable unico o polipeptido sirve para inhibir la actividad de senalizacion del TGFbeta biodisponible, mediante la inhibicion de la union del TGFbeta a su receptor affn TGFbetaRII.
Como se emplea en esta memoria, el termino “antagonista del TGFbetaRII” o “antagonista anti-TGFbetaRII” o similares, se refiere a un agente (p. ej., una molecula, un compuesto) que se une al TGFbetaRII y puede inhibir una funcion (es decir, una o mas funciones) del TGFbetaRII. Por ejemplo, un antagonista del TGFbetaRII puede inhibir la union del TGFbeta al TGFbetaRII y/o inhibir la transduccion de senales mediada por el TGFbetaRII. Por consiguiente, procesos y respuestas celulares mediados por el TGFbeta pueden ser inhibidos con un antagonista del TGFbetaRII.
En una realizacion, el ligando (p. ej., dominio variable unico de inmunoglobulina) que se une al TGFbetaRII inhibe la union del TGFbeta a un receptor TGFbetaRII con una concentracion inhibidora 50 (CI50) que es < aproximadamente 10 pM, < aproximadamente 1 pM, < aproximadamente 100 nM, < aproximadamente 50 nM, < aproximadamente 10 nM, < aproximadamente 5 nM, < aproximadamente 1 nM, < aproximadamente 500 pM, < aproximadamente 300 pM, < aproximadamente 100 pM o < aproximadamente 10 pM. En una realizacion determinada, un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII de la descripcion tiene una CI50 de 15 pM o menos. La CI50 se determina opcionalmente usando un ensayo de union al receptor del TGFbeta in vitro, o una prueba celular, tal como la prueba descrita en la presente memoria.
Se contempla tambien que el ligando (p. ej., dominio variable unico de inmunoglobulina) inhibe opcionalmente las funciones inducidas por el TGFbetaRII en una prueba in vitro adecuada con una dosis de neutralizacion 50 (DN50) que es < aproximadamente 10 pM, < aproximadamente 1 pM, < aproximadamente 100 nM, < aproximadamente 50 nM, < aproximadamente 10 nM, < aproximadamente 5 nM, < aproximadamente 1 nM, < aproximadamente 500 pM, < aproximadamente 300 pM, < aproximadamente 100 pM, < aproximadamente 10 pM, < aproximadamente 1 pM, < aproximadamente 500 fM, < aproximadamente 300 fM, < aproximadamente 100 fM, < aproximadamente 10 fM. En una realizacion determinada, un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII de la descripcion, logra mas de 40% de neutralizacion del TGF-p.
“Ligando espedfico doble”: En una realizacion, el dominio variable unico de inmunoglobulina, polipeptido o ligando segun la descripcion, puede ser parte de un “ligando espedfico doble”, que se refiere a un ligando que comprende un primer punto de union al antfgeno o epftopo (p. ej., primer dominio variable unico de inmunoglobulina) y un segundo punto de union al antfgeno o epftopo (p. ej., segundo dominio variable unico de inmunoglobulina), en donde los puntos de union o dominios variables son capaces de unirse a dos antfgenos (p. ej., diferentes antfgenos o dos copias del mismo antfgeno) o dos epftopos en el mismo antfgeno que no estan normalmente unidos por una inmunoglobulina monoespecffica. Por ejemplo, los dos epftopos pueden estar en el mismo antfgeno, pero no son el mismo epftopo o estan suficientemente adyacentes para unirse por un ligando monoespecffico. En una realizacion, los ligandos especfficos dobles segun la descripcion estan compuestos de puntos de union o dominios variables que tienen diferentes especificidades, y no contienen pares de dominio variables complementarios entre si (es decir, pares Vh/Vl) que tienen la misma especificidad (es decir, no forman un punto de union unitario).
En una realizacion, un “ligando espedfico doble” puede unirse al TGFbetaRII y a otra molecula objetivo. Por ejemplo, otra molecula objetivo puede ser una molecula objetivo especffica para tejidos, de manera que el ligando especffico doble de la descripcion permite que un polipeptido anti-TGFbetaRII o dominio variable unico de inmunoglobulina segun la descripcion, sea dirigido hacia un tejido de interes. Dichos tejidos incluyen pulmon, hfgado, etc.
Se describen tambien polfmeros de dAb multiespecfficos. Esto incluye un polfmero de dAb que comprende un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII segun cualquier aspecto de la descripcion y uno o mas dominios variables unicos, cada uno de los cuales se une a un objetivo diferente (p. ej., un objetivo diferente del TGFbetaRII). En una realizacion, se proporciona un polfmero de dAb biespecffico, por ejemplo, un polfmero de dAb que comprende uno o mas dominios variables unicos de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII segun cualquier aspecto
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de la descripcion, y uno o mas dAb que se unen a un segundo objetivo diferente. En una realizacion, se describe un polfmero de dAb triespecffico.
Los ligandos de la descripcion (p. ej., polipeptidos, dAb y antagonistas) pueden formatearse como una protefna de fusion que contiene un primer dominio variable unico de inmunoglobulina que se fusiona directamente a un segundo dominio variable unico de inmunoglobulina. Si se desea, dicho formato puede comprender ademas un grupo que prolonga la vida media. Por ejemplo, el ligando puede comprender un primer dominio variable unico de inmunoglobulina que se fusiona directamente con un segundo dominio variable unico de inmunoglobulina que se fusiona directamente a un dominio variable unico de inmunoglobulina que se une a la albumina de suero.
En general, la orientacion de los dominios del polipeptido que tienen un punto de union con especificidad de union por un objetivo, y si el ligando comprende un enlazador, es un asunto de eleccion de diseno. Sin embargo, algunas orientaciones, con o sin enlazadores, pueden proporcionar mejores caracterfsticas de union que otras orientaciones. Todas las orientaciones (p. ej., dAb1-enlazador-dAb2; dAb2-enlazador-dAb1) estan comprendidas en la descripcion. Los ligandos que contienen una orientacion que proporciona las caracterfsticas de union deseadas pueden identificarse facilmente por tamizado.
Los polipeptidos y los dAb segun la descripcion, incluidos monomeros, dfmeros y trfmeros de dAb, pueden unirse a una region Fc de anticuerpo, comprendiendo uno o ambos de los dominios Ch2 y Ch3, y opcionalmente una region bisagra. Por ejemplo, vectores que codifican ligandos unidos como una secuencia de nucleotidos unica a una region Fc, pueden emplearse para preparar dichos polipeptidos. En una realizacion, se proporciona una fusion dAb-Fc.
La descripcion proporciona ademas dfmeros, trfmeros y polfmeros de los monomeros de dAb mencionados anteriormente.
Objetivo: Como se emplea en esta memoria, el termino “objetivo” se refiere a una molecula biologica (p. ej., peptido, polipeptido, protefna, lfpido, hidrato de carbono) a la que puede unirse un dominio de polipeptido que tiene un punto de union. El objetivo puede ser, por ejemplo, un objetivo intracelular (p. ej., un objetivo de protefna intracelular), un objetivo soluble (p. ej., un objetivo segregado) o un objetivo de la superficie de la celula (p. ej., una protefna de membrana, una protefna de receptor). En una realizacion, el objetivo es el TGFbetaRII. En otra realizacion, el objetivo es el dominio extracelular del TGFbetaRII.
Complementarios: Como se emplea en esta memoria, “complementarios” se refiere a cuando dos dominios de inmunoglobulina pertenecen a familias de estructuras que forman pares o grupos afines o proceden de dichas familias, y conservan esta caracterfstica. Por ejemplo, un dominio Vh y un dominio Vl de un anticuerpo son complementarios; dos dominios Vh no son complementarios, y dos dominios Vl no son complementarios. Pueden encontrarse dominios complementarios en otros miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas, tales como los dominios Va y Vp (o y y 6) del receptor de linfocitos T. Los dominios que son artificiales, tales como los dominios basados en andamiajes de protefna que no se unen a epftopos a menos que sean modificados geneticamente de esta manera, no son complementarios. Asimismo, dos dominios basados en (p. ej.) un dominio de inmunoglobulina y un dominio de fibronectina, no son complementarios.
“Afinidad” y “avidez” son terminos de la tecnica que describen la fuerza de una interaccion de union. Con respecto a los ligandos de la descripcion, la avidez se refiere a la fuerza de union general entre los objetivos (p. ej., primer objetivo y segundo objetivo) en la celula y el ligando. La avidez es mas que la suma de cada una de las afinidades por los objetivos individuales.
Moleculas de acido nucleico, vectores y celulas anfitrionas: La descripcion proporciona tambien moleculas de acido nucleico aislados y/o recombinados que codifican ligandos (dominios variables unicos, protefnas de fusion, polipeptidos, ligandos especfficos dobles y ligandos multiespecfficos), como se describe en la presente memoria.
Los acidos nucleicos mencionados en la presente como “aislados”, son acidos nucleicos que han sido separados de los acidos nucleicos del ADN genomico o ARN celular de su fuente de origen (p. ej., como existe en las celulas o en una mezcla de acidos nucleicos tal como una genoteca), e incluyen los acidos nucleicos obtenidos por los metodos descritos en la presente memoria u otros metodos adecuados, incluidos los acidos nucleicos esencialmente puros, acidos nucleicos producidos por sfntesis qufmica, mediante combinaciones de metodos biologicos y qufmicos, y acidos nucleicos recombinados que estan aislados (vease, p. ej., Daugherty, B. L. et al., Nucleic Acids Res., 19(9): 2471-2476 (1991); Lewis, A. P. y J. S. Crowe, Gene, 101: 297-302 (1991)).
Los acidos nucleicos mencionados en la presente como “recombinados”, son acidos nucleicos que han sido producidos por ingenierfa genetica, incluidos esos acidos nucleicos que se generan por procedimientos que dependen de un metodo de recombinacion artificial, tal como la reaccion en cadena de polimerasa (PCR) y/o la clonacion en un vector empleando enzimas de restriccion.
En determinadas realizaciones, el acido nucleico aislado y/o recombinado comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un dominio variable unico de inmunoglobulina, polipeptido o ligando, como se describe en la presente memoria, en donde dicho ligando comprende una secuencia de aminoacidos que tiene por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos
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aproximadamente 91%, por lo menos aproximadamente 92%, por lo menos aproximadamente 93%, por lo menos aproximadamente 94%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 96%, por lo menos aproximadamente 97%, por lo menos aproximadamente 98% o por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de aminoacidos, con la secuencia de aminoacidos de un dAb que se une al TGFbetaRII descrito en la presente memoria, por ejemplo, las secuencias de aminoacidos expuestas en cualquiera de las SEQ ID n° 1 a n° 38. La identidad de secuencia de nucleotidos puede determinarse en toda la longitud de la secuencia de nucleotidos que codifica el dAb anti-TGFbetaRII seleccionado. En una realizacion, la secuencia de acido nucleico comprende o consiste en una secuencia de acido nucleico por lo menos 80% identica a una cualquiera de las SEQ ID n° 39 a n° 66. En una realizacion, la secuencia de acido nucleico comprende o consiste en una secuencia de acido nucleico de una cualquiera de las SEQ ID n° 39 a n° 76.
Las realizaciones de la descripcion proporcionan tambien secuencias de nucleotidos optimizadas en codones que codifican polipeptidos y dominios variables como se describe en la presente memoria, p. ej., optimizadas para la expresion en celulas de bacterias, mamfferos o levaduras.
La descripcion proporciona tambien un vector que comprende una molecula de acido nucleico recombinado de la descripcion. En determinadas realizaciones, el vector es un vector de expresion que comprende uno o mas elementos o secuencias de control de la expresion que estan enlazados operativamente al acido nucleico recombinado de la descripcion. La descripcion proporciona tambien una celula anfitriona recombinada que comprende una molecula de acido nucleico recombinado o vector de la descripcion. Vectores adecuados (p. ej., plasmidos, fagemidos), elementos de control de la expresion, celulas anfitrionas y metodos para producir celulas anfitrionas recombinadas de la descripcion, son bien conocidos en la tecnica, y ejemplos de ellos se describen ademas en la presente memoria.
Vectores de expresion adecuados pueden contener numerosos componentes, por ejemplo, un origen de replicacion, un gen marcador seleccionable, uno o mas elementos de control de la expresion, tales como un elemento de control de la transcripcion (p. ej., activador, potenciador, terminador) y/o una o mas senales de traduccion, una secuencia senal o secuencia principal y similares. Los elementos de control de la expresion y una secuencia senal, si estan presentes, pueden ser proporcionados por el vector u otra fuente. Por ejemplo, las secuencias de control de la transcripcion y/o traduccion de un acido nucleico clonado que codifica una cadena de anticuerpo, pueden emplearse para dirigir la expresion.
Puede proporcionarse un activador para expresion en una celula anfitriona deseada. Los activadores pueden ser constitutivos o inducibles. Por ejemplo, un activador puede enlazarse operativamente a un acido nucleico que codifique un anticuerpo, cadena de anticuerpos o parte de la misma, de modo que dirija la transcripcion del acido nucleico. Esta disponible una variedad de activadores adecuados para anfitriones procarioticos (p. ej., activadores lac, tac, T3, T7 para E. coli) y eucarioticos (p. ej., activador precoz o tardfo del virus sfmico 40, activador de la repeticion terminal larga del virus del sarcoma de Rous, activador de citomegalovirus, activador tardfo de adenovirus).
Ademas, los vectores de expresion comprenden generalmente un marcador seleccionable para la seleccion de celulas anfitrionas que que llevan el vector y, en el caso de un vector de expresion replicable, un origen de replicacion. Los genes que codifican productos que confieren resistencia a antibioticos o farmacos son marcadores seleccionables frecuentes y pueden usarse en celulas procarioticas (p. ej., gen de lactamasa (para resistencia a la ampicilina), gen Tet (para resistencia a tetraciclina) y eucarioticas (p. ej., genes con resistencia a la neomicina (G418 o geneticina), gpt (acido micofenolico), a la ampicilina o a la higromicina). Los genes marcadores de dihidrofolato reductasa permiten la seleccion con metotrexato en una variedad de anfitriones. Los genes que codifican el producto genico de marcadores auxotrofos del anfitrion (p. ej., LEU2, URA3, HIS3), se usan con frecuencia como marcadores seleccionables en levaduras. Se contempla tambien el uso de vectores vfricos (p. ej., baculovirus) o de fagos, y vectores que son capaces de integrarse en el genoma de la celula anfitriona, tales como los vectores retrovfricos. Vectores de expresion adecuados para expresion en celulas de mamffero y celulas procarioticas (E. coli), celulas de insecto (Drosophila, celulas S2 de Schnieder, Sf9) y levaduras (P. methanolica, P. pastoris, S. cerevisiae) son bien conocidos en la tecnica.
Celulas anfitrionas adecuadas pueden ser procarioticas, incluidas las celulas bacterianas tales como E. coli, B. subtilis y/u otras bacterias adecuadas; celulas eucarioticas, tales como celulas de hongos o levaduras (p. ej., Pichia pastoris, Aspergillus sp., Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Neurospora crassa) u otras celulas eucarioticas inferiores, y celulas de eucariotas superiores tales como las de insectos (p. ej., Drosophila, celulas S2 de Schnieder, celulas Sf9 de insecto (documento WO 94/26087 (O'Connor)), de marnferos (p. ej., celulas COS, tales como COS-1 (n° de entrada en la ATCC CRL-1650) y COS-7 (n° de entrada en la ATCC CrL-1651), y celulas CHO (p. ej., n° de entrada en la ATCC CRL-9096, ChO DG44 (Urlaub, G. y Chasin, LA., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77(7):4216-4220 (1980))), 293 (n° de entrada en la ATCC CRL-1573), HeLa (n° de entrada en la ATCC CCL-2), CV1 (n° de entrada en la ATCC CCL-70), WOP (Dailey, L., et al., J. Virol, 54:739-749 (1985), 3T3, 293T (Pear, W. S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:8392-8396 (1993)), celulas NS0, SP2/0, HuT 78, similares, o vegetales (p. ej., tabaco). (Vease, por ejemplo, Ausubel, F. M. et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y John Wiley & Sons Inc. (1993). En algunas realizaciones, la celula anfitriona es una celula anfitriona aislada y no forma parte de un organismo pluricelular (p. ej., vegetal o animal). En determinadas
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realizaciones, la celula anfitriona es una celula anfitriona no humana. La descripcion proporciona tambien un metodo para producir un ligando (p. ej., ligando espedfico doble, ligando multiespedfico) de la descripcion, que comprende mantener una celula anfitriona recombinada que comprende un acido nucleico recombinado de la descripcion en condiciones adecuadas para la expresion del acido nucleico recombinado, por lo cual se expresa el acido nucleico recombinado y se produce un ligando. En algunas realizaciones, el metodo comprende ademas aislar el ligando.
Se hace referencia al documento WO200708515, pagina 161, lmea 24 a pagina 189, lmea 10, para detalles de la descripcion que es aplicable a las realizaciones de la presente descripcion. Esto incluye la descripcion presentada en el documento WO200708515, pagina 161 lmea 24, a pagina 189 lmea 10, que proporciona detalles de la “Preparacion de ligandos basados en inmunoglobulina”, “Sistemas de vectores de biblioteca”, “Construccion de bibliotecas”, “Combinacion de dominios variables unicos”, “Caracterizacion de ligandos”, “Estructura de los ligandos”, “Esqueletos”, “Andamiajes de protema”, “Andamiajes para su uso en la construccion de ligandos”, “Diversificacion de la secuencia canonica” y “Composiciones y usos terapeuticos y de diagnostico”, asf como definiciones de “operativamente unido”, “sin tratamiento previo”, “prevencion”, “supresion”, “tratamiento”, “enfermedad alergica”, “enfermedad mediada por Th2”, “dosis terapeuticamente eficaz” y “eficaz”.
La frase “vida media”, se refiere al tiempo transcurrido para que la concentracion del dominio variable unico de inmunoglobulina, polipeptido o ligando en suero, se reduzca en el 50%, in vivo, por ejemplo, debido a la degradacion del ligando y/o a la eliminacion o el secuestro del ligando por mecanismos naturales. Los ligandos de la descripcion pueden ser estabilizados in vivo, y su vida media puede ser aumentada por la union a moleculas que resisten a la degradacion y/o a la eliminacion o al secuestro. Generalmente, dichas moleculas son protemas de origen natural que tienen por sf mismas una larga vida media in vivo. La vida media de un ligando se incrementa, si su actividad funcional persiste, in vivo, durante un penodo mas largo que un ligando similar que no es espedfico para la molecula que incrementa la vida media. De esta manera, un ligando espedfico para la HSA y una molecula objetivo se compara con el mismo ligando en donde la especificidad por HSA no esta presente, es decir, no se une a HSA, pero se une a otra molecula. Generalmente, la vida media ha aumentado en 10%, 20%, 30%, 40%, 50% o mas. Son posibles aumentos en el intervalo de 2x, 3x, 4x, 5x, 10x, 20x, 30x, 40x, 50x o mas, de la vida media. Alternativamente, o ademas, son posibles aumentos en el intervalo de hasta 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x, 100x o 150x de la vida media.
Formatos: El aumento de la vida media puede ser util en aplicaciones de las inmunoglobulinas in vivo, especialmente anticuerpos y mas especialmente fragmentos de anticuerpo de pequeno tamano. Dichos fragmentos (Fv, Fv unidos por disulfuro, Fab, scFv, dAb) son en general rapidamente eliminados del cuerpo. Los dAb, polipeptidos o ligandos segun la descripcion, pueden ser adaptados para proporcionar aumento de la vida media in vivo, y en consecuencia tiempos de persistencia mas largos en el cuerpo de la actividad funcional del ligando.
Metodos para el analisis farmacocinetico y la determinacion de la vida media del ligando, seran bien conocidos por los expertos en la tecnica. Pueden encontrarse detalles en Kenneth, A. et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists, y en Peters et al., Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996). Se hace referencia tambien a “Pharmacokinetics", M. Gibaldi y D. Perron, publicado por Marcel Dekker, 2a edicion revisada (1982), que describe parametros de farmacocinetica tales como las vidas medias t alfa y t beta, y el area bajo la curva (ABC).
Pueden determinarse las vidas medias (t1^ alfa y t1^ beta) y el ABC, a partir de una curva de concentracion del ligando en el suero frente al tiempo. Para disenar la curva puede usarse, por ejemplo, el paquete de analisis WINNONLIN™ (disponible de Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, EE.UU.). En una primera fase (la fase alfa), el ligando esta experimentando principalmente distribucion en el paciente, con cierta eliminacion. Una segunda fase (fase beta), es la fase terminal cuando el ligando ha sido distribuido y la concentracion en el suero esta disminuyendo a medida que el ligando es eliminado del paciente. La vida media t alfa es la vida media de la primera fase, y la vida media t beta es la vida media de la segunda fase. Por lo tanto, en una realizacion, la presente descripcion proporciona un ligando o una composicion que comprende un ligando segun la descripcion que tiene una vida media t alfa en el intervalo de 15 minutos o mas. En una realizacion, el extremo inferior del intervalo es 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 10 horas, 11 horas o 12 horas. Ademas, o alternativamente, un ligando o composicion segun la descripcion tendra una vida media t alfa en el intervalo de hasta e incluyendo 12 horas. En una realizacion, el extremo superior del intervalo es 11, 10, 9, 8, 7, 6 o 5 horas. Un ejemplo de un intervalo adecuado es 1 a 6 horas, 2 a 5 horas o 3 a 4 horas.
En una realizacion, la presente descripcion proporciona un ligando (polipeptido, dAb o antagonista) o una composicion que comprende un ligando segun la descripcion que tiene una vida media tp en el intervalo de aproximadamente 2,5 horas o mas. En una realizacion, el extremo inferior del intervalo es aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 11 horas o aproximadamente 12 horas. Ademas, o alternativamente, un ligando o composicion segun la descripcion tiene una vida media tp en el intervalo de hasta e incluidos 21 dfas. En una realizacion, el extremo superior del intervalo es aproximadamente 12 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 2 dfas, aproximadamente 3 dfas, aproximadamente 5 dfas, aproximadamente 10 dfas, aproximadamente 15 dfas o aproximadamente 20 dfas. En una realizacion, un ligando o composicion segun la descripcion tendra una vida media tp en el intervalo de aproximadamente 12 a aproximadamente 60 horas. En otra
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realizacion, estara comprendido en el intervalo de aproximadamente 12 a aproximadamente 48 horas. En otra realizacion mas, estara en el intervalo de aproximadamente 12 a aproximadamente 26 horas.
Ademas, o alternativamente a los criterios anteriores, la presente descripcion proporciona un ligando o composicion que comprende un ligando segun la descripcion que tiene un valor de ABC (area bajo la curva) en el intervalo de aproximadamente 1 mg^min/ml o mas. En una realizacion, el extremo inferior del intervalo es aproximadamente 5, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 30, aproximadamente 100, aproximadamente 200 o aproximadamente 300 mg^min/ml. Ademas, o alternativamente, un ligando o composicion segun la descripcion tiene un ABC en el intervalo de hasta aproximadamente 600 mg^min/ml. En una realizacion, el extremo superior del intervalo es aproximadamente 500, aproximadamente 400, aproximadamente 300, aproximadamente 200, aproximadamente 150, aproximadamente 100, aproximadamente 75 o aproximadamente 50 mg^min/ml. En una realizacion, un ligando segun la descripcion tendra un ABC en el intervalo seleccionado del grupo que consiste en lo siguiente: aproximadamente 15 a aproximadamente 150 mg^min/ml, aproximadamente 15 a aproximadamente 100 mg^min/ml, aproximadamente 15 a aproximadamente 75 mg^min/ml y aproximadamente 15 a aproximadamente 50 mg^min/ml.
Los polipeptidos y dAb de la descripcion y los antagonistas que comprenden estos, pueden ser formateados para que tengan un tamano hidrodinamico mayor, por ejemplo, mediante el enlace a un grupo de PEG, albumina de suero, transferrina, receptor de transferrina o al menos la parte de la union a transferrina del mismo, una region Fc de anticuerpo, o por conjugacion a un dominio de anticuerpo. Por ejemplo, polipeptidos dAb y antagonistas formateados como un fragmento mayor de union al antfgeno de un anticuerpo, o como un anticuerpo (p. ej., formateados como un Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, IgG o scFv).
Como se emplea en esta memoria, “tamano hidrodinamico” se refiere al tamano aparente de una molecula (p. ej., una molecula de protefna, ligando) basado en la difusion de la molecula a traves de una solucion acuosa. La difusion o el movimiento de una protefna a traves de la solucion puede procesarse hasta obtener un tamano aparente de la protema, en donde el tamano viene dado por el “radio de Stokes” o “radio hidrodinamico” de la partmula de protema. El “tamano hidrodinamico” de una protema depende tanto de la masa como de la forma (configuracion), de modo que dos protefnas que tienen la misma masa molecular pueden tener diferentes tamanos hidrodinamicos en base a la configuracion general de la protefna.
El tamano hidrodinamico de los ligandos (p. ej., monomeros y polfmeros de dAb) de la descripcion puede determinarse empleando metodos que son bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, puede usarse cromatograffa de filtracion en gel para determinar el tamano hidrodinamico de un ligando. Matrices de filtracion en gel adecuadas para determinar los tamanos hidrodinamicos de los ligandos, tales como matrices de agarosa reticuladas, son bien conocidas y estan facilmente disponibles.
El tamano del formato de un ligando (p. ej., el tamano de un grupo PEG unido a un monomero de dAb) puede variarse, dependiendo de la aplicacion deseada. Por ejemplo, cuando se pretende que el ligando abandone la circulacion y entre en los tejidos perifericos, es deseable mantener bajo el tamano hidrodinamico del ligando para facilitar el extravasado del torrente sangufneo. Alternativamente, cuando se desea que el ligando permanezca en la circulacion general durante un perfodo mas largo, el tamano del ligando puede aumentarse, por ejemplo, formateando como una protefna tipo Ig.
Prolongacion de la vida media eligiendo como objetivo un antfgeno o epftopo que aumenta la vida media in vivo: El tamano hidrodinamico de un ligando y su vida media en el suero, puede aumentarse tambien por conjugacion o asociacion con un polipeptido que se une al TGFbetaRII, dAb o ligando de la descripcion con un dominio de union (p. ej., anticuerpo o fragmento de anticuerpo) que se une a un antfgeno o epftopo que aumenta la vida media in vivo, como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, el agente de union al TGFbetaRII (p. ej., polipeptido) puede conjugarse o unirse con un fragmento de anticuerpo o anticuerpo de receptor de Fc anti-neonatal o de albumina anti- suero, p. ej., un dAb de receptor de Fc anti-AS o anti-neonatal, Fab, Fab' o scFv, o con un aficuerpo de receptor de Fc anti-neonatal o aficuerpo anti-AS o un avfmero anti-AS, o un dominio de union anti-AS que comprende un andamiaje seleccionado de, pero no limitado a, el grupo que consiste en CTLA-4, lipocalina, SpA, un aficuerpo, un avfmero, GroEl y fibronectina (vease el documento WO2008096158 para una descripcion de estos dominios de union). La conjugacion se refiere a una composicion que comprende polipeptido, dAb o antagonista de la descripcion que esta unido (por enlace covalente o no) a un dominio de union tal como un dominio de union que se une a albumina de suero.
Generalmente, un polipeptido que mejora la vida media en el suero in vivo es un polipeptido de origen natural in vivo, y que resiste la degradacion o eliminacion por mecanismos endogenos que eliminan el material no deseado del organismo (p. ej., humano). Por ejemplo, un polipeptido que aumenta la vida media en el suero in vivo puede seleccionarse de protefnas de la matriz extracelular, protefnas encontradas en la sangre, protefnas encontradas en la barrera hemoencefalica o en el tejido nervioso, protefnas localizadas hacia el rinon, hfgado, pulmon, corazon, piel o hueso, protefnas del estres, protefnas especfficas de enfermedad, o protefnas implicadas en el transporte de Fc. En el documento WO2008/096158 se describen, por ejemplo, polipeptidos adecuados.
Dicho metodo puede emplearse tambien para la administracion dirigida de un dominio variable unico, polipeptido o
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ligando segun la descripcion, hacia un tejido de interes. En una realizacion, se proporciona la administracion dirigida de un dominio variable unico de alta afinidad segun la descripcion.
dAb que se unen a albumina de suero: La descripcion en una realizacion proporciona un polipeptido o antagonista (p. ej., ligando especffico doble que comprende un dAb anti-TGFbetaRII (un primer dAb)) que se une al TGFbetaRII, y un segundo dAb que se une a la albumina de suero (AS), uniendose a la AS el segundo dAb. Detalles de ligandos especfficos dobles se encuentran en los documentos WO03002609, WO04003019, WO2008096158 y WO04058821.
En determinadas realizaciones de los ligandos y antagonistas, el dAb se une a la albumina de suero humano y compite por la union a la albumina, con un dAb seleccionado del grupo que consiste en cualquiera de las secuencias de dAb descritas en el documento WO2004003019, cualquiera de las secuencias de dAb descritas en el documento WO2007080392, cualquiera de las secuencias de dAb descritas en el documento WO2008096158.
En determinadas realizaciones, el dAb se une a la albumina de suero humano y comprende una secuencia de aminoacidos que tiene por lo menos aproximadamente 80%, o por lo menos aproximadamente 85%, o por lo menos aproximadamente 90%, o por lo menos aproximadamente 95%, o por lo menos aproximadamente 96%, o por lo menos aproximadamente 97%, o por lo menos aproximadamente 98%, o por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de aminoacidos, con la secuencia de aminoacidos de un dAb descrito en cualquiera de los documentos WO2004003019, WO2007080392 o WO2008096158. Por ejemplo, el dAb que se une a la albumina de suero humano puede comprender una secuencia de aminoacidos que tiene por lo menos aproximadamente 90%, o por lo menos aproximadamente 95%, o por lo menos aproximadamente 96%, o por lo menos aproximadamente 97%, o por lo menos aproximadamente 98%, o por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de aminoacidos, con la secuencia de aminoacidos de cualquiera de estos dAb. En determinadas realizaciones, el dAb se une a la albumina de suero humano y comprende una secuencia de aminoacidos que tiene por lo menos aproximadamente 80%, o por lo menos aproximadamente 85%, o por lo menos aproximadamente 90%, o por lo menos aproximadamente 95%, o por lo menos aproximadamente 96%, o por lo menos aproximadamente 97%, o por lo menos aproximadamente 98%, o por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de aminoacidos, con la secuencia de aminoacidos de cualquiera de estos dAb.
En realizaciones mas especfficas, el dAb es un dAb de Vk que se une a la albumina de suero humano. En realizaciones mas especfficas, el dAb es un dAb de Vh que se une a la albumina de suero humano.
Vhh de camelido adecuados que se unen a la albumina de suero incluyen los descritos en el documento WO2004041862 (Ablynx N.V.) y en el documento WO2007080392. En determinadas realizaciones, el Vhh de camelido se une a la albumina de suero humano y comprende una secuencia de aminoacidos que tiene por lo menos aproximadamente 80%, o por lo menos aproximadamente 85%, o por lo menos aproximadamente 90%, o por lo menos aproximadamente 95%, o por lo menos aproximadamente 96%, o por lo menos aproximadamente 97%, o por lo menos aproximadamente 98%, o por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de aminoacidos, con aquellas secuencias descritas en el documento WO2007080392 o una cualquiera de las SEQ ID n° 518 a n° 534, correspondiendo estos numeros de secuencia a los citados en los documentos WO2007080392 o WO 2004041862.
En una realizacion alternativa, el antagonista o ligando comprende un grupo de union especffico para el TGFbetaRII (p. ej., el TGFbetaRII humano), en donde la porcion comprende secuencias no de inmunoglobulina como se describe en el documento WO2008096158.
Conjugacion con un grupo que prolonga la vida media (p. ej., albumina): En una realizacion, un (una o mas) grupo que prolonga la vida media (p. ej., albumina, transferrina y uno de sus fragmentos y analogos) esta conjugado o asociado con el polipeptido que se une al TGFbetaRII, dAb o antagonista de la descripcion. Ejemplos de albumina, fragmentos de albumina o variantes de albumina adecuados para su uso en un formato de union al TGFbetaRII se describen en el documento WO2005077042.
Otros ejemplos de albumina, fragmentos y analogos adecuados para su uso en un formato de union al TGFbetaRII se describen en el documento WO 03076567.
Cuando un (uno o mas) grupo que prolonga la vida media (p. ej., albumina, transferrina y fragmentos y analogos de la misma) se usa para formatear los polipeptidos que se unen al TGFbetaRII, dAb y antagonistas de la descripcion, pueden conjugarse usando cualquier metodo adecuado, tal como, mediante fusion directa con el grupo que se une al TGFbetaRII (p. ej., dAb anti-TGFbetaRII), por ejemplo, utilizando un montaje de nucleotido unico que codifica una protefna de fusion, en donde la protefna de fusion es codificada como una cadena de un solo polipeptido con el grupo que prolonga la vida media situado en el terminal N o C al grupo que se une al TGFbetaRII. Alternativamente, puede lograrse la conjugacion usando un enlazador de peptidos entre los grupos, p. ej., un enlazador de peptidos como se describe en los documentos WO03076567 o WO2004003019.
Conjugacion con PEG: En otras realizaciones, el grupo que prolonga la vida media es un grupo polietilenglicol. En una realizacion, el antagonista comprende (opcionalmente consiste en) un dominio variable unico de la descripcion unido a un grupo polietilenglicol (opcionalmente, en donde dicho grupo tiene un tamano de aproximadamente 20 a
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En otra realizacion, un dominio variable unico, ligando o polipeptido segun la descripcion, puede unirse a un resto de toxina o toxina.
Resistencia a las proteasas: Los dominios variables unicos, polipeptidos o ligandos segun la descripcion, pueden modificarse para mejorar su resistencia a la degradacion por proteasas. Como se emplea en esta memoria, un peptido o polipeptido (p. ej., un anticuerpo de dominio (dAb)) que es “resistente a la degradacion por proteasas”, no es degradado sustancialmente por una proteasa cuando se incuba con la proteasa en condiciones adecuadas para la actividad de la proteasa. Un polipeptido (p. ej., un dAb) no se degrada sustancialmente cuando no mas de aproximadamente 25%, no mas de aproximadamente 20%, no mas de aproximadamente 15%, no mas de

aproximadamente 14%, no mas de aproximadamente 13%, no mas de aproximadamente 12%, no mas de

aproximadamente 11%, no mas de aproximadamente 10%, no mas de aproximadamente 9%, no mas de aproximadamente 8%, no mas de aproximadamente 7%, no mas de aproximadamente 6%, no mas de

aproximadamente 5%, no mas de aproximadamente 4%, no mas de aproximadamente 3%, no mas de
aproximadamente 2%, no mas de aproximadamente 1%, o sustancialmente nada de la protefna es degradada por la proteasa despues de la incubacion con la proteasa durante aproximadamente una hora a una temperatura adecuada para la actividad de la proteasa. Por ejemplo, a 37 o 50°C. La degradacion de la protefna puede evaluarse empleando cualquier metodo adecuado, por ejemplo, por SDS-PAGE o por analisis funcional (p. ej., union al ligando), como se describe en la presente memoria.
Metodos para generar dAb con resistencia aumentada a las proteasas se describen, por ejemplo, en el documento WO2008149143. En una realizacion, el dominio variable unico, polipeptido o ligando segun la descripcion, es resistente a la degradacion por leucozima y/o tripsina. Los polipeptidos, dominios variables individuales de inmunoglobulina y ligandos de la descripcion, pueden ser resistentes a una o mas de las siguientes enzimas: serina proteasa, cistefna proteasa, aspartato proteasas, tiol proteasas, metaloproteasa de matriz, carboxipeptidasa (p. ej., carboxipeptidasa A, carboxipeptidasa B), tripsina, quimotripsina, pepsina, papafna, elastasa, leucozima, pancreatina, trombina, plasmina, catepsinas (p. ej., catepsina G), proteinasa (p. ej., proteinasa 1, proteinasa 2, proteinasa 3), termolisina, quimosina, enteropeptidasa, caspasa (p. ej., caspasa 1, caspasa 2, caspasa 4, caspasa 5, caspasa 9, caspasa 12, caspasa 13), calpafna, ficafna, clostripafna, actinidafna, bromelafna y separasa. En realizaciones especfficas, la proteasa es tripsina, elastasa o leucozima. La proteasa puede proporcionarse tambien por un extracto biologico, homogeneizado biologico o preparado biologico. Los polipeptidos, dominios variables unicos de inmunoglobulina y ligandos como se describe en la presente memoria, pueden seleccionarse en presencia de proteasas pulmonares, de modo que dichos polipeptidos, dominios variables unicos de inmunoglobulina y ligandos sean resistentes a dichas proteasas pulmonares. En una realizacion, la proteasa es una proteasa encontrada en el esputo, moco (p. ej., moco gastrico, moco nasal, moco bronquial), lavado broncoalveolar, homogeneizado de pulmon, extracto de pulmon, extracto pancreatico, fluido gastrico o saliva. En una realizacion, la proteasa es la encontrada en los ojos y/o las lagrimas. Ejemplos de dichas proteasas encontradas en el ojo incluyen caspasas, calpafnas, metaloproteasas de matriz, desintegrina, metaloproteinasas (p. ej. ADAMs - una desintegrina y metaloproteinasa) y ADAM con motivos de trombospondina, los proteosomas, activador de plasminogeno hfstico, secretasas, catepsina B y D, cistatina C, serina proteasa PRSS1 y via del proteosoma de ubiquitina (UPP). En una realizacion, la proteasa es una proteasa no bacteriana. En una realizacion, la proteasa es una proteasa de animal, p. ej., mamffero, p. ej., humano. En una realizacion, la proteasa es una proteasa del aparato digestivo, o una proteasa del tejido pulmonar, p. ej., una proteasa del aparato digestivo o una proteasa del tejido pulmonar encontrada en seres humanos. Dicha proteasa listada en la presente memoria puede usarse tambien en los metodos descritos, por ejemplo, en el documento WO2008149143, que implica la exposicion de un repertorio de biblioteca para una proteasa.
Estabilidad: En un aspecto de la descripcion, los polipeptidos, dominios variables unicos, dAb, ligandos, composiciones o formulaciones de la descripcion, son sustancialmente estables despues de incubacion (a una concentracion de polipeptido o dominio variable de 1 mg/ml) a 37 a 50°C durante 14 dfas en tampon Britton Robinson o PBS. En una realizacion, al menos 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% del polipeptido, antagonista o dominio variable, etc., continua estando desaglomerado despues de dicha incubacion a 37°C. En una realizacion, al menos 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% del polipeptido o dominio variable, continua siendo monomerico despues de dicha incubacion a 37°C.
En una realizacion, al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% del polipeptido, antagonista o dominio variable, continua estando desaglomerado despues de dicha incubacion a 50°C. En una realizacion, al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% del polipeptido o dominio variable, continua siendo monomerico despues de dicha incubacion a 50°C. En una realizacion, no se observa ningun aglomerado de los polipeptidos, dominios variables o antagonistas despues de cualquiera de dichas incubaciones. En una realizacion, el punto isoelectrico (pi) del polipeptido o dominio variable se mantiene inalterado o sustancialmente inalterado tras la incubacion a 37°C a una concentracion de polipeptido o dominio variable de 1 mg/ml en tampon de
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Britton-Robinson. En un aspecto de la descripcion, los polipeptidos, dominios variables, antagonistas, composiciones o formulaciones de la descripcion son sustancialmente estables despues de incubacion (a una concentracion de polipeptido o dominio variable de 100 mg/ml) a 4°C durante 7 dfas en tampon de Britton Robinson o PBS a un pH de 7 a 7,5 (p. ej., a pH 7 o pH 7,5). En una realizacion, por lo menos 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99 o 99,5% del polipeptido, antagonista o dominio variable continua estando desaglomerado despues de dicha incubacion. En una realizacion, por lo menos 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99 o 99,5% del polipeptido o dominio variable continua siendo monomerico despues de dicha incubacion. En una realizacion, no se observa ningun aglomerado de los polipeptidos, dominios variables o antagonistas despues de cualquiera de dichas incubaciones.
En un aspecto de la descripcion, los polipeptidos, dominios variables, antagonistas, composiciones o formulaciones de la descripcion, son sustancialmente estables despues de nebulizacion (p. ej., a una concentracion de polipeptido o dominio variable de 40 mg/ml) p. ej., a temperatura ambiente, 20°C o 37°C, durante 1 hora, p. ej. con un nebulizador a chorro, p. ej., en una copa Pari LC+. En una realizacion, por lo menos 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99 o 99,5% del polipeptido, antagonista o dominio variable, continua estando desaglomerado despues de dicha nebulizacion. En una realizacion, por lo menos 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99 o 99,5% del polipeptido o dominio variable, continua siendo monomerico despues de dicha nebulizacion. En una realizacion, no se observa ningun aglomerado de los polipeptidos, dominios variables o antagonistas, despues de dicha nebulizacion.
Forma monomerica: En una realizacion, se identifica que el dAb de la presente descripcion es preferentemente monomerico. Propiamente, la descripcion proporciona un monomero (sustancialmente) puro. En una realizacion, el dAb es un monomero por lo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% puro o 100% puro. Para determinar si los dAb son monomericos o forman oligomeros de orden superior en solucion, pueden analizarse por SEC-MALLS. SEC-MALLS (cromatograffa de exclusion por tamano con dispersion de luz laser de angulos multiples), es una tecnica no invasiva para la caracterizacion de las macromoleculas en solucion, que es bien conocida por los expertos en la tecnica. En resumen, las protefnas (a concentracion de 1 mg/ml en tampon de PBS de Dulbecco) se separan segun sus propiedades hidrodinamicas, por cromatograffa de exclusion por tamano (columna: TSK3000; S200). Despues de la separacion, la propension de la protefna a dispersar la luz se mide usando un detector de dispersion de luz laser de angulos multiples (MALLS). La intensidad de la luz dispersa mientras la protefna pasa a traves del detector, se mide en funcion del angulo. Esta medicion tomada junto con la concentracion de protefna determinada usando el detector de fndice de refraccion (IR), permite el calculo de la masa molar usando ecuaciones apropiadas (parte integral del programa informatico de analisis Astra v.5.3.4.12).
Uso terapeutico: La descripcion proporciona un metodo para el tratamiento, supresion o prevencion de enfermedades relacionadas con la senalizacion del TGFbeta. En una realizacion, dicha enfermedad puede ser causada o contribuida por la senalizacion desregulada del TGFbeta, por la sobreexpresion del TGFbeta, o por las altas concentraciones del TGFbeta biodisponible. Enfermedades relacionadas con la senalizacion del TGFbeta incluyen enfermedades relacionadas con la fibrosis de varios tejidos, tales como fibrosis pulmonar incluidas la fibrosis pulmonar idiopatica (FPI) y otra enfermedad pulmonar intersticial tal como el sfndrome del dolor respiratorio agudo (SDRA), fibrosis del hfgado incluidas la cirrosis y la hepatitis cronica, artritis reumatoide, trastornos oculares, afecciones vasculares tales como restenosis, fibrosis de la piel incluidos queloide de la piel y cicatrizacion despues de la curacion de heridas y contractura de Dupuytren, y del rinon tales como nefritis, fibrosis renal y nefroesclerosis, o una afeccion vascular tal como restenosis. Otras enfermedades relacionadas con la senalizacion del TGFbeta incluyen enfermedades vasculares tales como hipertension, preeclampsia, telangiectasia hemorragica hereditaria tipo I (THH1), THH2, hipertension arterial pulmonar, aneurismas aorticos, sfndrome de Marfan, trastorno de aneurisma familiar, sfndrome de Loeys-Dietz y sfndrome de tortuosidad arterial (STA). Otras enfermedades relacionadas con la senalizacion del TGFbeta incluyen enfermedades del sistema musculoesqueletico tales como la distrofia muscular de Duchenne y la fibrosis muscular. Otras enfermedades relacionadas con la senalizacion del TGFbeta incluyen el cancer tal como el cancer de colon, gastrico y pancreatico, asf como glioma y NSCLC. Ademas, la descripcion proporciona metodos para elegir como objetivo el cancer, por ejemplo, modulando la senalizacion del TGFbeta en la angiogenia tumoral o mediante el tratamiento del estroma canceroso. Otras enfermedades o afecciones incluyen aquellas relacionadas con la cicatrizacion de tejidos. Otras enfermedades incluyen enfermedades pulmonares tales como EPOC (enfermedad pulmonar obstructiva cronica), enfermedades hepaticas tales como insuficiencia hepatica (p. ej., hepatitis vfrica, por alcohol, por obesidad, autoinmunitaria, metabolica, obstructiva), enfermedades renales incluida la insuficiencia renal (p. ej. diabetes, hipertension), cardiomiopatfa hipertrofica, rechazo de trasplante (pulmon/hfgado/rinon) y cicatrizacion hipertrofica y queloide.
La “fibrosis” es el resultado del exceso de deposicion de componentes de la matriz extracelular tales como colageno que causa crecimiento excesivo, cicatrizacion y/o endurecimiento de los tejidos.
“Fibrosis de la piel”: La fibrosis cutanea abarca una variedad de trastornos humanos con diferente etiologfa, pero con una desregulacion comun del metabolismo del tejido conectivo, en particular de los fibroblastos dermicos. Ejemplos especfficos de fibrosis cutanea incluyen enfermedad queloide, cicatrices hipertroficas (HS) y esclerodermia. La enfermedad queloide y las cicatrices hipertroficas, aunque no son subgrupos de la misma afeccion, son el resultado de la cicatrizacion despues de la curacion de la herida, con queloides extendiendose mas alla del sitio original de la herida, mientras que la cicatriz hipertrofica esta constrenida dentro de los margenes de la herida original. Sin embargo, la esclerodermia se usa para describir la fibrosis de la piel en la esclerosis general, que es una
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enfermedad general que da lugar a fibrosis de multiples organos. En una realizacion, el dominio variable, ligando, protefna de fusion o polipeptido como se describe en la presente memoria, se usa para prevenir o tratar la enfermedad queloide, las cicatrices hipertroficas o la esclerodermia.
Los “queloides” son crecimientos excesivos fibrosos en sitios de lesion cutanea que se forman como resultado de un proceso anormal de curacion de la herida en individuos geneticamente sensibles y, a diferencia de las cicatrices normales, no retroceden. Predominantemente observada en los pacientes con piel de pigmentacion oscura, la “enfermedad queloide” es un tumor fibroproliferante dermico benigno exclusivo de las personas que nunca se vuelve maligno.
La “contractura de Dupuytren” es una formacion localizada de tejido cicatricial bajo la piel de la palma de la mano. La cicatrizacion se acumula en un tejido (fascia) que normalmente cubre los tendones que tiran de los dedos para el agarre. A medida que la contractura de Dupuytren evoluciona, una mayor parte de la fascia se vuelve gruesa y se acorta, dando lugar a la contractura de la mano por flexion donde los dedos se doblan hacia la palma de la mano y no pueden extenderse (enderezarse) complemente, dando lugar en casos extremos a la perdida del uso de la mano.
La cicatrizacion se produce despues de cirugfa, lesion o traumatismo de tejidos u organos en el cuerpo. Es una consecuencia de los mecanismos de reparacion que hacen que la matriz extracelular reemplace el tejido normal que falta. La piel representa el tejido lesionado con mas frecuencia, lo que da lugar a la cicatrizacion dermica, que puede producir consecuencias adversas como por ejemplo: perdida de la funcion; contractura; y estetica precaria que puede producir efectos psicologicos a quien la padece. Las cicatrices pueden definirse como “una alteracion macroscopica de la estructura y funcion normales de la contextura de la piel, resultante del producto final de la cicatrizacion de la herida” (Fergusson et al., 1996). Actualmente, no existen tratamientos para prevenir o mejorar eficazmente la cicatrizacion.
Se ha observado la funcion del TGFbeta en la fibrosis pulmonar (Wynn et al., J. Pathology 2008, 214, pags. 199-210; Sime et al., J. Clinical Immunology 1997, vol. 100, pags. 768-776). Se observa un cambio en el aumento de produccion de citocinas Th2 y en la disminucion de la produccion de citocinas Th1, como resultado de una lesion pulmonar desconocida. La sobreexpresion del TGFbeta estimula la angiogenia, la activacion de los fibroblastos, la deposicion de la MEC y la fibrogenia. Los modelos animales (p. ej., sobreexpresion del TGFbeta, SMAD3 KO, inhibicion de la senalizacion del TGFbetaR), demuestran que el TGFbeta es un mediador clave para el desarrollo de la fibrosis pulmonar.
La “fibrosis pulmonar idiopatica (FPI)”, es una enfermedad cronica y evolutiva que da lugar a deposicion anormal y excesiva de tejido fibrotico en el intersticio pulmonar sin una causa conocida. Existe una frecuencia de aproximadamente 10 a 20 casos por cada 100.000 en los Estados Unidos al ano. La frecuencia aumenta fuertemente con la edad, alcanzando 175 casos por cada 100.000 a la edad de 75 anos comenzando normalmente entre los 50 y 70 anos. La tasa de supervivencia quinquenal es del 20% con una supervivencia media de 2,8 anos. Los sfntomas incluyen una tos seca y falta de aliento evolutiva, radiograffas anormales del torax o HRCT y volumenes pulmonares reducidos. Los tratamientos actuales incluyen corticosteroides (Prednisona), inmunosupresores (ciclofosfamida) o trasplante, aunque ninguna de los tratamientos actualmente disponibles tiene una eficacia demostrada. En una realizacion, el dominio variable unico o polipeptido de la presente descripcion proporciona un tratamiento para la FPI.
Propiamente, un tratamiento logrado para la fibrosis pulmonar idiopatica (FPI) mostrara cualquiera de una disminucion en la proliferacion de fibroblastos del pulmon, un aumento de la apoptosis de fibroblastos del pulmon, una disminucion en la sfntesis y deposicion excesivas de la matriz extracelular o un aumento de la degradacion y reconstruccion de la matriz extracelular, o mostrara cierta proteccion contra la lesion del tejido en curso y restauracion de la histopatologfa normal.
Propiamente, un tratamiento logrado desacelerarfa la evolucion de la enfermedad.
La eficacia de un tratamiento para la FPI puede demostrarse en el modelo de fibrosis pulmonar inducida por bleomicina. En una realizacion, el dominio variable unico de inmunoglobulina de la presente descripcion reacciona en forma cruzada con el TGFbetaRII de raton, de modo que su eficacia puede ponerse a prueba en el modelo de raton.
El TGFbeta es una importante molecula de senalizacion celular en la modulacion del comportamiento celular en tejidos oculares. La sobreactivacion del TGFbeta esta implicada en la patogenia de enfermedades fibroticas en el tejido ocular, la cual puede estar relacionada con la cicatizacion de heridas y llevar a vision deteriorada y homeostasis del tejido ocular (examinado, por ejemplo, por Saika, Laboratory Investigation (2006), 86, 106-115).
Por consiguiente, en una realizacion, las enfermedades relacionadas con la senalizacion del TGFbeta incluyen trastornos oculares tales como enfermedades fibroticas del tejido ocular. La enfermedad fibrotica del ojo puede ocurrir en la cornea, la conjuntiva, el cristalino o la retina. Los trastornos oculares incluyen la vitreorretinopatfa proliferativa (VRP), un trastorno de posdesprendimiento retiniano y fibrosis retiniana, retinopatfa diabetica, glaucoma, tal como glaucoma de angulo abierto, glaucoma de angulo cerrado, sfndrome congenito y de pseudoexfoliacion,
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reacciones de cicatrizacion de la herida en el cristalino, tal como quemadura posqufmica o termica, o sfndrome de Stevens-Johnson, y complicaciones de cataratas tras la intervencion quirurgica. El TGFbeta tiene tambien una funcion en el desarrollo de cataratas (Wormstone et al. Exp. Eye Res.; 83 1238-1245, 2006). Muchos trastornos oculares ocurren como resultado de fibrosis despues de la intervencion quirurgica. Ademas, se cree que la actividad excesiva del TGFbeta2 (factor de crecimiento transformante p2) causa cicatrizacion en y alrededor del ojo despues de la cirugfa de filtracion del glaucoma. El TGFbeta2 es la isoforma predominante implicada en la cicatrizacion patologica de los tejidos oculares incluidos la cornea, la retina, la conjuntiva y la red trabecular. La cicatrizacion o fibrosis de la red trabecular puede llevar a la oclusion de la via de salida acuosa normal que lleva a presion intraocular elevada y riesgo de desarrollo de glaucoma. Se ha mostrado que el TGFbeta 2 es un agente patologico en modelos preclfnicos de glaucoma. Las concentraciones del TGFbeta2 son elevadas en los pacientes con glaucoma, y el tratamiento in vitro de celulas huTM con el TGFbeta-2, lleva a cambios fenotfpicos y aumento de las protefnas que modulan la MEC (MMP-2, PAI-I) (Lutjen-Drecol (2005), Experimental Eye Research, vol. 81, emision 1, pags. 1-4; Liton (2005), Biochemical and Biophysical Research Communications vol. 337, emision 4, pags. 12291236; Fuchshofer et al (2003), Experimental Eye Research, vol. 77, emision 6, pags. 757-765; Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) cartel de la conferencia n° 1631 2009). Ademas, la sobreexpresion del TGFbeta en el ojo, lleva a una patologfa tipo glaucoma en ratones (ARVO, cartel de conferencia n° 5108 2009) y se ha demostrado que la administracion del TGFbeta-2 usando AAV, inhibe la perdida de celulas ganglionares retinianas en un modelo de glaucoma de rata (ARVO, cartel de conferencia n° 5510 2009). Mas recientemente, se ha mostrado que la induccion de estres oxidativo en los astrocitos cultivados de la cabeza del nervio optico humano, aumentan la secrecion del TGFbeta2 (Yu et al (2009) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50: 1707-1717). Todo esto indica que la reduccion de las concentraciones del TGFbeta 2 podrfa reducir al mfnimo los cambios caracterfsticos de la cabeza del nervio optico observados en el glaucoma. Sin embargo, se sabe tambien que el TGFbeta tiene una funcion inmunosupresora, y de esta manera en algunos aspectos puede ser protector, de modo que una reduccion en las concentraciones elevadas de TGFbeta2 mas que un tratamiento de choque completo, puede preferirse en el tratamiento de afecciones oculares cronicas tales como el glaucoma. Por consiguiente, enfermedades que pueden tratarse usando los dAb y composiciones, etc. segun la descripcion, incluyen la cicatrizacion despues de la intervencion quirurgica de filtracion del glaucoma.
Por consiguiente, en un aspecto, se describe un metodo para el tratamiento, supresion o prevencion de una enfermedad relacionada con la senalizacion del TGFbeta y, en particular, la senalizacion desregulada del TGFbeta, que comprende administrar a un mamffero que necesita del mismo, una dosis o cantidad terapeuticamente eficaz de un polipeptido, protefna de fusion, dominio variable unico, antagonista o composicion segun la descripcion.
En otro aspecto, la descripcion proporciona un dominio variable unico de inmunoglobulina, polipeptido, ligando o protefna de fusion segun la descripcion, para su uso como medicamento. Un medicamento adecuado puede comprender un dominio variable unico de inmunoglobulina, etc. segun la descripcion, formateado como se describe en la presente memoria.
Propiamente, el medicamento es una composicion farmaceutica. En otro aspecto de la descripcion, se proporciona una composicion (p. ej., composicion farmaceutica) que comprende un polipeptido, dominio variable unico, ligando, composicion o antagonista segun la descripcion, y un vehfculo, diluyente o excipiente fisiologicamente o farmaceuticamente aceptable. En una realizacion, la composicion comprende un vehfculo para su administracion. En realizaciones especfficas, el polipeptido, protefna de fusion, dominio variable unico, antagonista o composicion se administra por administracion pulmonar, tal como por inhalacion (p. ej., inhalacion intrabronquial, intranasal u oral, inhalacion intranasal tal como mediante gotas), o mediante administracion general (p. ej., administracion parenteral, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intrarterial, intratecal, intraarticular, subcutanea, vaginal o rectal). En otra realizacion, el polipeptido, dominio variable unico, ligando o protefna de fusion o composicion segun la descripcion, se administra al ojo, p. ej., por administracion topica, como colirios, sistema de polfmero en partfculas, gel o implante, o por inyeccion intraocular, p. ej., en el humor vftreo. La administracion puede ser dirigida a regiones especfficas del ojo tales como la superficie del ojo, o los conductos lacrimales o glandulas lacrimales, o a las camaras anterior o posterior del ojo tal como el humor vftreo). Puede ser tambien util si el dominio variable unico de inmunoglobulina, composicion etc. se administra al ojo junto con un potenciador de penetracion ocular, por ejemplo, caprato de sodio o con un potenciador de viscosidad, por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC). En otras realizaciones, el polipeptido, protefna de fusion, dominio variable unico, antagonista o composicion se administra a la piel, por administracion topica a la superficie de la piel y/o administracion a una region dentro de la piel, p. ej., administracion intradermica.
Aunque el organo mas accesible del cuerpo para administracion, la barrera mas exterior de la piel, la capa cornea (CC), actua como una barrera limitativa de velocidad para la administracion de farmacos. Ademas, se ha requerido inyeccion intradermica para evitar la CC, permitiendo la administracion de farmacos en el punto de accion en capas mas profundas de la piel. Sin embargo, la administracion puede lograrse por otros procedimientos de administracion transdermica. Pueden utilizarse metodologfas de formulacion para administracion, incluidos: potenciadores qufmicos que alteran la estructura de lfpidos de la CC; facilitadores peptfdicos que permiten el transporte transfolicular; y la encapsulacion en partfculas como por ejemplo liposomas, niosomas, etosomas y transferosomas, que se cree facilitan la fluidificacion local de los lfpidos y la formacion de depositos para efecto prolongado. La iontoforesis, que implica la aplicacion de un pequeno potencial electrico a traves de la piel, se ha empleado para la administracion localizado de farmacos. La iontoforesis permite tanto la administracion de moleculas con carga como neutras por
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electromigracion y electroosmosis, respectivamente. Pueden emplearse microagujas para crear canales micronizados en la piel para superar la CC, permitiendo que las protemas pasen a traves de estos canales a la epidermis inferior. Las microagujas pueden clasificarse en lmeas generales en microagujas macizas y huecas. Pueden usarse microagujas macizas para romper la CC, antes de la administracion del farmaco, recubierto para permitir la administracion a medida que el farmaco se disuelve en las agujas, o soluble permitiendo la liberacion del farmaco a medida que se disuelve en las agujas in situ. Las microagujas huecas permiten la infusion de una formulacion lfquida de sustancia farmaceutica. La electroporacion, a diferencia de la iontoforesis, requiere voltajes mayores de 50V para alterar la permeabilidad de la piel, con objeto de mejorar la penetracion del farmaco. Las metodologfas de extirpacion termica y con radiofrecuencia permiten la disolucion de la CC mediante calentamiento localizado y extirpacion de la CC. En la extirpacion termica, esto tiene lugar despues de la aplicacion de una alta temperatura durante penodos cortos, mientras que la extirpacion por radiofrecuencia implica el empleo de radiofrecuencias, que hacen vibrar los microelectrodos sobre la piel, produciendo calentamiento localizado. La rotura de la CC puede lograrse tambien mediante abrasion con laser, la aplicacion de ondas de ultrasonidos de baja frecuencia (sonoforesis) e inyectores de chorro utilizando altas velocidades que impulsan el farmaco a traves de la CC.
Ademas, la presente descripcion proporciona un metodo para el tratamiento de enfermedades utilizando un polipeptido, dominio variable unico, composicion, ligando o antagonista segun la presente descripcion. En una realizacion, la enfermedad es una fibrosis fustica tal como la enfermedad queloide o la contractura de Dupuytren.
En un aspecto de la descripcion, el polipeptido, dominio variable unico, ligando, composicion o antagonista, se proporciona para el tratamiento y/o la profilaxis de una enfermedad o afeccion relacionada con la senalizacion del TGFbeta en un ser humano. En otro aspecto, se proporciona el uso del polipeptido, dominio variable unico, composicion o antagonista, en la preparacion de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de una enfermedad o afeccion relacionada con la senalizacion del TGFbeta en un ser humano. En otro aspecto, se proporciona un metodo de tratamiento y/o prevencion de una enfermedad o afeccion relacionada con la senalizacion del TGFbeta en un paciente humano, comprendiendo el metodo administrar el polipeptido, dominio variable unico, composicion o antagonista, al paciente. La descripcion se refiere tambien a metodos terapeuticos que comprenden administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de un ligando de la descripcion (p. ej., antagonista o dominio variable unico) a un sujeto que lo necesita.
En otras realizaciones, la descripcion se refiere a un metodo para el tratamiento de la fibrosis pulmonar idiopatica, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita, una cantidad terapeuticamente eficaz de un ligando de la descripcion (p. ej., antagonista o dominio variable unico).
La descripcion se refiere tambien a un dispositivo de administracion de farmacos que comprende la composicion (p. ej., la composicion farmaceutica) de la descripcion. En algunas realizaciones, el dispositivo de administracion de farmacos comprende un gran numero de dosis terapeuticamente eficaces de ligando.
En otras realizaciones, el dispositivo de administracion de farmacos se selecciona del grupo que consiste en un dispositivo de administracion parenteral, un dispositivo de administracion intravenosa, un dispositivo de administracion intramuscular, un dispositivo de administracion intraperitoneal, un dispositivo de administracion transdermica o intradermica, un dispositivo de administracion pulmonar, un dispositivo de administracion intrarterial, un dispositivo de administracion intratecal, un dispositivo de administracion intraarticular, un dispositivo de administracion subcutanea, un dispositivo de administracion intranasal, un dispositivo de administracion ocular, un dispositivo de administracion vaginal, un dispositivo de administracion rectal, una jeringuilla, un dispositivo de administracion transdermica, un dispositivo de administracion intradermica, una capsula, un comprimido, un nebulizador, un inhalador, un atomizador, un propulsor de aerosol, un vaporizador, un inhalador de polvo seco, un inhalador dosificador, un pulverizador dosificador, un nebulizador dosificador, un atomizador dosificador y un cateter. En una realizacion, el dispositivo de administracion de farmacos es un dispositivo de administracion transdermica o intradermica.
Propiamente, la descripcion proporciona un dispositivo de administracion pulmonar que contiene un polipeptido, dominio variable unico, composicion o antagonista segun la descripcion. El dispositivo puede ser un inhalador o un dispositivo de administracion intranasal. Propiamente, el dispositivo de administracion pulmonar permite la administracion de una dosis terapeuticamente eficaz de un ligando, etc. segun la descripcion.
En otra realizacion, la descripcion proporciona un dispositivo de administracion ocular que contiene un polipeptido, dominio variable unico, composicion o antagonista segun la descripcion. Propiamente, el dispositivo de administracion ocular permite la administracion de una dosis terapeuticamente eficaz de un ligando, etc. segun la descripcion.
Como se emplea en esta memoria, el termino “dosis” se refiere a la cantidad de ligando administrada a un sujeto toda a la vez (dosis unitaria), o en dos o mas administraciones durante un intervalo de tiempo definido. Por ejemplo, la dosis puede referirse a la cantidad de ligando (p. ej., ligando que comprende un dominio variable unico de inmunoglobulina que se une al TGFbetaRII) administrado a un sujeto durante a lo largo de un dfa (24 horas) (dosis diaria), dos dfas, una semana, dos semanas, tres semanas, o uno o mas meses (p. ej., mediante una sola
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administracion, o mediante dos o mas administraciones). El intervalo entre las dosis puede ser cualquier cantidad deseada de tiempo. En una realizacion determinada, el dominio variable unico o polipeptido de la invencion se administra en la piel mediante inyeccion, en particular por administracion intradermica, semanal o quincenalmente o cada 7 a 10 dfas, por ejemplo, cada 7, 8, 9 o 10 dfas.
En una realizacion, el dominio variable unico de la descripcion se proporciona como un monomero de dAb, opcionalmente no formateado (p. ej., no PEGilado o de vida media prolongada) o unido a un PEG, opcionalmente como una formulacion de polvo seco, opcionalmente para administracion a un paciente por inhalacion (p. ej., administracion pulmonar), opcionalmente para el tratamiento y/o la prevencion de una enfermedad pulmonar (p. ej., fibrosis pulmonar idiopatica).
Los ligandos de la descripcion proporcionan varias ventajas. Por ejemplo, como se describe en la presente memoria, el ligando puede adaptarse para que tenga una vida media deseada en el suero in vivo. Los anticuerpos de dominio son mucho mas pequenos que los anticuerpos convencionales, y pueden administrarse para conseguir mejor penetracion en los tejidos que los anticuerpos convencionales. De esta manera, los dAb y los ligandos que comprenden un dAb proporcionan ventajas sobre los anticuerpos convencionales cuando se administran para tratar una enfermedad, tal como una enfermedad mediada por la senalizacion del TGFbeta. En particular, la administracion pulmonar de un dAb de la presente descripcion para tratar la fibrosis pulmonar idiopatica, permite la administracion local especffica de un inhibidor de senalizacion del TGFbeta. De manera ventajosa, un monomero de dAb no formateado que se une especfficamente al TGFbetaRII y lo inhibe, es bastante pequeno para ser absorbido en el pulmon por administracion pulmonar.
Los ejemplos del documento WO2007085815 proporcionan detalles de pruebas relevantes, formateo y experimentos que pueden aplicarse igualmente a los ligandos de la presente descripcion.
La descripcion se describe ademas, solo a tftulo de ilustracion, en los siguientes ejemplos.
Ejemplos
Ejemplo 1. Seleccion de los dAb que se unen al TGFbetaRII Seleccion de los dAb que se unen al TGFbetaRII de raton
Selecciones sin tratamiento previo: Se utilizaron bibliotecas de fagos sin tratamiento previo 4G y 6G, bibliotecas de fagos que presentan dominios variables unicos de anticuerpo expresados a partir de la secuencia principal GAS1 (vease el documento WO2005093074) para 4G, y ademas con preseleccion con calor/frfo para 6G (vease el documento WO04101790). Las secuencias principales DOM23 se aislaron haciendo una panoramica de grupos de las bibliotecas de VH y VK (identificadas como 4G H11-19 y 6G VH2-4 (los dAb de VH) y 4G k1, 4G k2 y 6G k (los dAb de Vk) contra la protema tubrida TGF-pRII/Fc recombinada de raton y humana. Estas protemas hforidas se obtuvieron por expresion de una secuencia de ADN que codifica los restos de aminoacidos 24 a 159 del dominio extracelular del receptor del TGF-p tipo II humano (Lin, et al., 1992, Cell 68: 775-785) fusionado a la region Fc de la IgG1 humana en una estirpe celular de rinon embrionario humano, HEK-F.
Las protefnas hfbridas recombinadas TGF-p RII/Fc de raton y humanas se biotinilaron empleando el reactivo EZ- LINK™ Sulfo-NHS-LC-Biotina (Pierce, Rockford, EE.UU.) (Henderikx, et al., 2002, Selection of antibodies against biotinylated antigens. Antibody Phage Display: Methods and protocols, Ed. O'Brien y Atkin, Humana Press). Las bibliotecas de fagos se agruparon en seis grupos: 4G k1 y k2, 6G k, 4G H11-13, 4G H14-16, 4G H17-19 y 6G VH2-4. Se agruparon 1x1011 fagos por biblioteca.
Los fagos se bloquearon en leche en polvo MARVEL™ al 2% en solucion salina tamponada con fosfato (MPBS) con la adicion del fragmento Fc de IgG humana 10 pM (fragmento Fc de IgG natural obtenida de IgG de plasma de mieloma humano, Calbiochem, California, EE.uU., n° de catalogo 401.104) durante una hora. Se incubo TGF-p RII/Fc 200 nM de raton biotinilado con la mezcla de fago bloqueado y fragmento Fc durante 1 hora a temperatura ambiente, y a continuacion se capturo en DYNAbeads™ de estreptavidina (Dynal, Reino Unido) durante cinco minutos. Las perlas se lavaron siete veces con 1 ml de solucion salina tamponada con fosfato/TWEEN™ al 0,1% (PBST), seguido de un lavado con 1 ml de solucion salina tamponada con fosfato (PBS). El fago unido al TGF-p RII/Fc de raton biotinilado se eluyo en 500 pl de 1 mg/ml de tripsina en PBS durante 10 minutos, y se utilizo entonces para infectar 1,75 ml de TG1 de Escherichia coli en fase logarftmica durante 30 minutos. Las celulas se sembraron en placas de agar-agar 2 x TYE (extracto de levadura y triptona) enriquecidas con 15 pg/ml de tetraciclina. Para las rondas de selecciones posteriores, se rasparon las celulas de las placas y se usaron para inocular 50 ml de cultivos 2 x TY (levadura y triptona) + 15 pg/ml de cultivos con tetraciclina, que se cultivaron durante la noche a 37°C para la amplificacion del fago.
El fago amplificado se recupero por centrifugacion del cultivo de toda la noche durante 10 minutos a 4.566 g. Se anadieron 40 ml de sobrenadante que contenfa al fago amplificado a 10 ml de PEG/NaCl (PEG 8000 al 20% v/p + NaCl 2,5 M), y se incubaron en hielo durante 45 a 60 minutos. Las muestras se centrifugaron durante 30 minutos a 4.566 g para sedimentar el fago precipitado. El sobrenadante se desecho, y el sedimento del fago se volvio a poner en suspension en 2 ml de glicerol al 15% v/v de glicerol/PBS. La muestra del fago se transfirio a tubos Eppendorf de
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Los productos de la segunda ronda se clonaron a partir del vector de fago fd, pDOM4 en pDOM10. El vector pDOM4, es un derivado del vector del fago fd en el que la secuencia del peptido senal del gen III se sustituye por el peptido senal de la protefna de superficie anclada a glucolfpidos (GAS) de levadura. Contiene tambien una etiqueta c-myc entre la secuencia principal y el gen III, que vuelve a poner el gen III en el marco de lectura. Esta secuencia principal funciona bien en los vectores de presentacion de fagos, pero tambien en otros vectores de expresion procarioticos, y puede usarse generalmente. pDOM10 es un vector plasmido disenado para la expresion soluble de los dAb. Se basa en el vector pUC119, con expresion bajo el control del activador LacZ. La expresion de los dAb en el sobrenadante se garantizo mediante la fusion del gen del dAb al peptido senal principal GAS universal (vease el documento WO2005093074) en el extremo terminal N. Ademas, se anexo una etiqueta FLAG en el extremo terminal C de los dAb.
La subclonacion de los genes de los dAb se llevo a cabo aislando el ADN de pDOM4 de las celulas infectadas por el fago fd que presenta el dAb seleccionado usando un equipo QIAPREP™ Spin MINIPREP™, segun las instrucciones del fabricante (n° de catalogo 27.104, Qiagen). El ADN se amplifico por PCR usando los oligonucleotidos biotinilados DOM57 (5' TTGCAGGCGTGGCAACAGCG-3' (SEQ ID n° 197) y DOM6 (5'-CACGACGTTGTAAAACGACGGCC-3' (SEQ ID n° 198)), digeridos con las endonucleasas de restriccion SalI y Notl, y ligados con pDOM10 digerido con Sall y Notl. Los productos de ligadura se transformaron por electroporacion en celulas HB2151 de E. coli y se sembraron en placas con TYE (extracto de levadura y triptona) enriquecidas con 100 pg/ml de carbenicilina (TYE- carb). Se seleccionaron y expresaron clones aislados en medio de autoinduccion rapida durante la noche (sistema de expresion de protefnas de alto nivel, Novagen) enriquecido con 100 pg/ml de carbenicilina en placas de 96 pocillos, cultivadas con agitacion a 30°C o 37°C. Estas placas de expresion se centrifugaron entonces a 1.800 g durante 10 minutos. Los clones del dAb que unfan al TGF-p RII/Fc de raton y/o humano se identificaron por una ELISA y tamiz BIACORE™ (GE HEALTHCARE™) o mediante el tamiz de la prueba de union MSD (Meso Scale Discovery). Para el ELISA, inmunoplacas Maxisorp™ de 96 pocillos (Nunc, Dinamarca) se recubrieron con TGF-p RII/Fc humano o de raton durante la noche a 4°C. Se lavaron los pocillos tres veces con PBST y a continuacion se bloquearon con TWEEN™ al 1% en PBS (TPBS al 1%) durante 1 hora a temperatura ambiente. El bloqueo se suprimio y se anadio una mezcla 1:1 de TPBS al 1% y el sobrenadante del dAb se anadio durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavo tres veces con PBST, y se anadio anticuerpo de deteccion (anticuerpo monoclonal de peroxidasa M2 anti-FLAG, Sigma-Aldrich, Reino Unido) y se incubo durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se revelaron utilizando un substrato colorimetrico (solucion de peroxidasa de micropocillos TMB de 1 componente SUREBLUE™, KPL, Maryland, EE.UU.), y se midio la densidad optica (DO) a 450 nM, siendo la DO450 proporcional a la cantidad de anticuerpo de deteccion unido. Para BIACORE™, los sobrenadantes se diluyeron 1:1 en tampon de HBS-EP y se tamizaron en BIACORE™ para la union a TGF-p RII/Fc biotinilado humano y de raton (chip de AS recubierto con 1500 Ru de hRII-Fc biotinilado y 1550 Ru de mRII-Fc biotinilado, segun las recomendaciones del fabricante) (BIACORE™, GE HEALTHCARE™). Se introdujeron las muestras en BIACORE™ a un caudal de 50 pl/min.
Selecciones humanas sin tratamiento previo y deteccion de las mismas Seleccion de dAb que se unen al TGFbetaRII humano
Se llevaron a cabo selecciones sin tratamiento previo como se describio para el TGFbRII de raton, pero utilizando TGFbRII/Fc 150 y 15 nM humano biotinilado en las rondas uno y dos, respectivamente. Se llevo a cabo una tercera ronda utilizando el mismo metodo que para la ronda dos, pero con TGFbRII/Fc 1,5 nM humano biotinilado.
Los productos de la tercera ronda se clonaron a partir del vector del fago fd, pDOM4 en pDOM10. La subclonacion de los genes del dAb se llevo a cabo aislando el ADN de pDOM4 de las celulas infectadas por el fago fd seleccionado que presenta al dAb usando un equipo QIAPREP™ Spin MINIPREP™, segun las instrucciones del fabricante (n° de catalogo 27104, Qiagen). El ADN plasmido se digerio con las endonucleasas de restriccion SalI y NotI, y la insercion del gen del dAb se ligo con pDOM10 digerido con las endonucleasas de restriccion SalI, NotI y PstI. Los productos de ligadura se transformaron por electroporacion en celulas HB2151 de E. coli y se sembraron en placas de TYE (extracto de levadura y triptona) enriquecidas con 100 pg/ml de carbenicilina (TYE-carb). Los clones individuales se seleccionaron y expresaron en placas de 96 pocillos a 250 rpm, 30°C durante 72 horas, en 1 ml/pocillo de medio de autoinduccion rapida toda la noche (Novagen) enriquecido con 100 pg/ml de carbenicilina. Estas placas se centrifugaron a continuacion a 1.800 g durante 10 minutos. Los sobrenadantes solubles del dAb se cribaron para la union al antfgeno en la prueba de union al TGFbRII MSD combinada con la prueba de determinacion de la concentracion por polarizacion fluorescente. El numero de enlazadores del TGFbRII humano fue alto, y hubieron de adelantarse muchos clones para su caracterizacion posterior. Por lo tanto, se secuencio un subgrupo de clones y los que tienen secuencias unicas se caracterizaron mas.
Prueba de union al TGFpRII MSD
Esta prueba se uso para determinar la actividad de union de los dAb anti-TGFbRII. El antfgeno del TGFbRII-Fc se recubrio sobre una placa de MSD, que se bloqueo posteriormente para evitar la union inespecffica. Se anadieron los sobrenadantes diluidos en serie que contenfan al dAb soluble etiquetado con FLAG. Despues de la incubacion, se 5 lavo la placa, y solo los dAb que se unieron especfficamente al TGFBRII-Fc continuaron unidos a la placa. Los dAb unidos se detectaron con un anticuerpo etiquetado con anti-FLAG rutenilado y tampon de lectura de MSD. Si se determinaba la concentracion de los dAb en las diluciones del sobrenadante utilizando el analisis de determinacion de la concentracion de polarizacion por fluorescencia, entonces las curvas de union de la concentracion se representaban.
10 0,5 pl por pocillo de 60 pg/ml del TGFbRII-Fc humano, 60 pg/ml del TGFbRII-Fc de raton o 60 pg/ml de Fc de IgG1 humana (R&D Systems, numero de catalogo 110-FIG) se colocaron sobre placas de alta union MSD (Meso Scale Discovery) de 384 pocillos. Las placas se secaron al aire a temperatura ambiente durante un mfnimo de cuatro horas y no por mas que toda la noche. Las placas se bloquearon con 50 pl por pocillo de MARVEL™ al 5% en solucion salina tamponada Tris (TBS) + TWEEN™ 20 al 0,1% durante 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 15 4°C. El reactivo de bloqueo se retiro de los pocillos sacudiendo las placas. Se preparo una serie de diluciones 1:3 de los sobrenadantes del dAb en medio 2xTY. Los dAb se expresaron en el vector de expresion pDOM10, de modo que la protefna del dAb fuera expresada como una protefna de fusion de FLAG. Se retiro el reactivo de bloqueo, y se transfirieron 10 pl por pocillo de los sobrenadantes del dAb diluidos a las placas MSD bloqueadas. Los sobrenadantes de los dAb se detectaron como curvas de 4 puntos o como curvas de 11 puntos. Ademas de los 20 sobrenadantes del dAb diluidos, se incluyeron dos controles en cada placa, uno de referencia baja (normalizado a union de 0%) sin especificidad de union al TGFbRII, y uno de referencia alta (normalizado a union de 100%) con alta especificidad de union al TGFbRII, datos no mostrados.
Las placas se incubaron con los sobrenadantes del dAb y las muestras de referencia durante una hora a temperatura ambiente, y a continuacion se lavaron tres veces con 50 pl por pocillo de TBS + TWEEN™ al 0,1%. Se 25 anadieron 15 pl/pocillo de anticuerpo anti-FLAG rutenilado a las placas y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. El anticuerpo anti-FLAG (anticuerpo monoclonal M2 anti-FLAG, Sigma, Reino Unido, numero de catalogo F3165) se conjugo con tris-bipiridin N-hidroxi-succinimida de rutenio II, siguiendo las instrucciones del fabricante (Meso Scale Discovery, numero de catalogo R91BN-1). El anticuerpo anti-FLAG rutenilado se anadio a todos los pocillos, salvo a los pocillos de referencia del anticuerpo de Fc de IgG1 anti-humano de raton. En cambio 30 se anadieron 15 pl/pocillo de etiqueta MSD anti-raton (Meso Scale Discovery, numero de catalogo R31AC-1). La etiqueta MSD anti-raton se diluyo en MARVEL™ a 2% en TBS + TWEEN™ 20 al 0,1% hasta una concentracion final de 750 ng/ml. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante una hora y se lavaron tres veces con 50 pl por pocillo de TBS + TWEEN™ al 0,1%. Se anadieron 35 pl de 1x tampon de lectura MSD (Meso Scale Discovery) a cada pocillo y las placas se leyeron en un lector MSD Sector 6000 (Meso Scale Discovery).
35 Los datos se analizaron usando la base de actividad XC50. Todos los datos se normalizaron a la media de los pocillos de referencia alta y baja en cada placa, con la referencia baja normalizada para la union de 0%. y la alta referencia normalizada para la union de 100%. Se aplico un ajuste de la curva de cuatro parametros a los datos normalizados, y se representaron graficamente las curvas de union de la concentracion usando las concentraciones del dAb calculadas usando la determinacion de la concentracion de polarizacion por fluorescencia de los dAb en el 40 analisis de los sobrenadantes.
El ajuste de cuatro parametros empleado, fue el siguiente:
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en donde a es el mfnimo, b es la pendiente de Hill, c es la XC50, y d es el maximo.
Determinacion de la concentracion de polarizacion por fluorescencia de los dAb en la prueba de los sobrenadantes
Este analisis permite determinar la concentracion de los dAb solubles marcados con FLAG expresados en 45 sobrenadantes. Un peptido de FLAG marcado con fluorescencia se mezclo con un anticuerpo anti-FLAG. Las moleculas fluorescentes se excitaron con luz polarizada a una longitud de onda de 531 nM, y la luz polarizada emitida se leyo a una longitud de onda de 595 nM. La adicion de un dAb marcado con FLAG dio lugar al desplazamiento del peptido fluorescente procedente del anticuerpo anti-FLAG, lo cual dio lugar a su vez a la polarizacion reducida de la senal de emision. Se preparo una curva patron de concentraciones conocidas del dAb 50 placebo de VH purificado marcado con FLAG, y se uso para volver a calcular la concentracion de los dAb solubles en los sobrenadantes. Los datos de la concentracion se combinaron con los datos de la actividad de union, permitiendo representar las curvas de union de la concentracion para los sobrenadantes del dAb.
Los sobrenadantes del dAb se diluyeron en serie 1:2 en medio 2xTY (1:2, 1:4, 1:8 y 1:16), seguido de una dilucion 1:10 en solucion salina tamponada con fosfato (PBS). Los sobrenadantes diluidos se transfirieron a una placa negra 55 de 384 pocillos. Se trazo una curva patron diluyendo en serie el dAb placebo de VH purificado 1:1.7 en medio 2xTY al 10% en v/v en PBS. La concentracion mas alta del dAb fue de 10 pM, y hubo 16 diluciones en total. 5 pl de cada
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dilucion se transfirieron a la placa de 384 pocillos. Se preparo una mezcla de peptido FLAG 5 nM marcado en el extremo terminal C con Cy3b, anticuerpo monoclonal M2 anti-FLAG 100 mM (Sigma, numero de catalogo F3165), 0,4 mg/ml de albumina de suero de bovino (BSA) en tampon de CHAP 2 mM. 5 pl de la mezcla se transfirieron a los pocillos que contenfan los dAb diluidos (tanto sobrenadantes como los pocillos de la curva patron). La placa se centrifugo a 1.000 rpm (216 g) durante 1 minuto y a continuacion se incubo en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos. Las placas se leyeron en un lector ENVISION™ (Perkin Elmer) ajustado con los siguientes filtros:
Filtro de excitacion: BODIPY TMR FP 531 Filtro de emision 1: BODIPY TMR FP P pol 595 Filtro de emision 2: BODIPY TMR FP P pol 595 Espejo: BODIPY TMR FP Dual Enh.
Se represento la curva patron y se uso para volver a calcular las concentraciones de los dAb solubles en los sobrenadantes.
Los dAb que se unen al TGF-p RII/Fc de raton y humano identificados en las pruebas de union ELISA, BIACORE™ y MSD, se expresaron en medio de autoinduccion rapida toda la noche (ONEX™, Novagen) a 30°C durante 48 a 72 horas. Los cultivos se centrifugaron (4.600 rpm durante 30 minutos), y los sobrenadantes se incubaron con perlas de STREAMLINE™-protefna A (Amersham Biosciences, GE HEALTHCARE™, Reino Unido. Capacidad de union: 5 mg del dAb por ml de perlas), durante la noche a 4°C o a temperatura ambiente durante al menos una hora. Se relleno con las perlas una columna de cromatograffa y se lavaron con 1x o 2x PBS, seguido de Tris-HCl 10 o 100 mM, pH 7,4 (Sigma, Reino Unido). Los dAb unidos se eluyeron con glicina-HCl 0,1 M, pH 2,0, y se neutralizo con Tris 1 M, pH 8,0. Se midio la DO de los dAb a 280 nm, y se determinaron las concentraciones de protefna usando los coeficientes de extincion calculados a partir de las composiciones de aminoacidos de los dAb.
Se dan a continuacion las secuencias de aminoacidos y acidos nucleicos de los ejemplos sin tratamiento previo del dAb del TGFRII anti-humano y anti-murino.
Secuencia de aminoacidos de Dom23h 802 (SEQ ID n° 1)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSEGTMWWVRQAPGKGLEWVSAILAAGSNTYYADSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKKRQERDGFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de Dom23h 802 (SEQ ID n° 39)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATTCACCTTTAGTGAGGGGACGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCT
CAGCTATTTTGGCTGCTGGTTCTAATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGAC
AATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAA
AAAGAGGCAGGAGCGGGATGGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Secuencia de aminoacidos de Dom23h 803 (SEQ ID n° 2)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAGRMWWVRQAPGKGLEWVSAINRDGTRTYYADSVKGRFTISRDNS
KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHDDGHGNFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de Dom23h 803 (SEQ ID n° 40)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATTCACCTTTAGTGCTGGGCGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCT
CAGCGATTAATCGGGATGGTACTAGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGTGAC
AATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAA
ACATGATGATGGTCATGGTAATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-813 (SEQ ID n° 3)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTDDRMWWVRQAPGKGLEWVSAIQPDGHTTYYADSVKGRFTISRDNS
KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAEQDVKGSSSFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-813 (SEQ ID n° 41)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATCCACCTTTACGGATGATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCT
CAGCTATTCAGCCTGATGGTCATACGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGAC
AATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGGA
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ACAGGATGTTAAGGGGTCGTCTTCGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC Secuencia de aminoacidos de DOM23h-815 (SEQ ID n° 4)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAEDRMWWVRQAPGKGLEWVSAIDPQGQHTYYADSVKGRFTISRDNS
KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQSTGSATSDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-815 (SEQ ID n° 42)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATTCACCTTTGCGGAGGATCGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCT
CAGCTATTGATCCTCAGGGTCAGCATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGAC
AATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAA
ACAGTCTACTGGGTCTGCTACGTCTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-828 (SEQ ID n° 5)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFMSYRMWWVRQAPGKGLEWVSAISPSGSDTYYADSVKGRFTISRDNS
KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQVVEYSRTHKGVFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-828 (SEQ ID n° 43)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATTCACCTTTATGAGTTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTC
AGCTATTTCTCCGAGTGGTAGTGATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACA
ATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAA
CAGGTGGTGGAGTATTCGCGTACTCATAAGGGTGTGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTC
GAGC
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-830 (SEQ ID n° 6)
EVQLLESGGGLVQPGGFLRLSCAASGFTFEGYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIDSLGDRTYYADSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQGLTHQSPSTFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-830 (SEQ ID n° 44)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTTCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCT
CCGGATTCACCTTTGAGGGGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTC
AGCTATTGATTCTCTGGGTGATCGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACA
ATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAA
CAGGGGCTTACGCATCAGTCTCCGAGTACTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-831 (SEQ ID n° 7)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEAYKMTWVRQAPGKGLEWVSYITPSGGQTYYADSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYGSSFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-831 (SEQ ID n° 45)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCT
CCGGATTCACCTTTGAGGCGTATAAGATGACGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTCTC
ATATATTACGCCGTCTGGTGGTCAGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACA
ATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAA
TATGGTTCGAGTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-840 (SEQ ID n° 8)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGDGRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEGAGSDTYYADSVKGRFTISRDNS
KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQASRNSPFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-840 (SEQ ID n° 46)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATTCACCTTTGGGGATGGTCGTATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCT
CAGCTATTGAGGGGGCGGGTTCGGATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGA
CAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGA
AACAGGCGTCGCGGAATTCGCCGTTTGACTACTGGGGTCAGGGGACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
5
10
15
20
25
30
35
40
45
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDSEMAWARQAPGKGLEWVSLIRRNGNATYYADSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVTKDRSVLFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-842 (SEQ ID n° 47)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATTCACCTTTGATGATAGTGAGATGGCGTGGGCCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCT
CACTTATTCGGCGTAATGGTAATGCTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGAC
AATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAA
AGTTACGAAGGATCGTTCTGTGCTTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-843 (SEQ ID n° 10)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDQDRMWWVRQAPGKGLEWVSAIESGGHRTYYADSVKGRFTISRDNS
KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQNESGRSGFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-843 (SEQ ID n° 48)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATTCACCTTTGATCAGGATCGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCT
CAGCTATTGAGAGTGGTGGTCATAGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGA
CAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGA
AACAGAATGAGTCGGGGCGTTCGGGTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-850 (SEQ ID n° 11)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDAARMWWARQAPGKGLEWVSAIADIGNTTYYADSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQSGSEDHFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-850 (SEQ ID n° 49)
GAGGT GCAGCT GTT GGAGTCTGGGGGAGGCTTGGT ACAGCCTGGGGGGTCCCT GCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATTCACCTTTGATGCGGCTAGGATGTGGTGGGCCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCT
CAGCGATTGCGGATATTGGTAATACTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGAC
AATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAA
ACAGTCTGGTTCGGAGGATCATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-854 (SEQ ID n° 12)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAQDRMWWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNS
KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQDLHGTSSLFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-854 (SEQ ID n° 50)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCCGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATTCACCTTTGCTCAGGATCGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCT
CAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGAC
AATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAA
ACAGGATTTGCATGGTACTAGTTCTTTGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-855 (SEQ ID n° 13)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFENTSMGWVRQAPGKGLEWVSRIDPKGSHTYYADSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQRELGKSHFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-855 (SEQ ID n° 51)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATTCACCTTTGAGAATACGAGTATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCT
CACGTATTGATCCTAAGGGTAGTCATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGAC
AATTCCAAGAATACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAA
ACAGCGTGAGTTGGGTAAGTCGCATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-865 (SEQ ID n° 14)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSYEMTWVRQAPGKGLEWVSKIDPSGRFTYYADSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGRTDLQLFDYWGQGTLVTVSS
5
10
15
20
25
30
35
40
45
GAGGT GCAGCT GTT GGAGTCTGGGGGAGGCTTGGT ACAGCCTGGGGGGTCCCT GCGTCTCTCCTGTGCAGCC TCCGGATTCACCTTTCGTAGTTATGAGATGACTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTC AAAGATTGATCCTTCGGGTCGTTTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACA ATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAA GGTCGGACGGAT CTT CAGCTTTTT GACT ACTGGGGT CAGGGAACCCTGGTCACCGT CTCGAGC
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-866 (SEQ ID n° 15)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMRWARQAPGKGLEWVSYITPKGDHTYYADSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAESLHNERVKHFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-866 (SEQ ID n° 53)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATTCACCTTTTCGAATTATTGGATGCGGTGGGCCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCT
CATATATTACTCCTAAGGGTGATCATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGAC
AATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGGA
ATCGCTTCATAATGAGCGTGTTAAGCATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-874 (SEQ ID n° 16)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYRMWWVRQAPGKGLEWVSVIDSTGSATYYADSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQQAGSAMGEFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-874 (SEQ ID n° 54)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC TCCGGATTCACCTTTACTAGTTATCGTATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTC AGTTATTGATTCTACTGGTTCGGCTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACA ATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAA CAGCAGGCTGGGAGT GCGATGGGGGAGTTTGACTACTGGGGT CAGGGAACCCT GGT CACCGT CTCGAGC
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-883 (SEQ ID n° 17)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVNYRMWWVRQAPGKGLEWVSAISGSGDKTYYADSVKGRFTISRDNS
KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHGLSFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-883 (SEQ ID n° 55)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATTCACCTTTGTTAATTATCGTATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTC
AGCTATTAGTGGTAGTGGTGATAAGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACA
ATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAA
CATGGGCTGTCGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-903 (SEQ ID n° 18)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNDMRMWWVRQAPGKGLEWVSVINADGNRTYYADSVKGRFTISRDNS
KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGLPFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-903 (SEQ ID n° 56)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATTCACCTTTAATGATATGAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCT
CAGTGATTAATGCTGATGGTAATAGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGAC
AATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAA
AGATGGGCTGCCTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Secuencia de aminoacidos de DOM23m-4 (SEQ ID n° 19)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTTYGMGWVRQAPGKGLEWVSWIEKTGNKTYYADSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAGRHIKVRSRDFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23m-4 (SEQ ID n° 57)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATTCACCTTTACGACTTATGGTATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTC
ATGGATTGAGAAGACGGGTAATAAGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACA
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
ATTCCAAGAACACGCT GT ATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGT AT ATT ACT GT GCGAAA GCGGGGAGGCATATT AAGGT GCGTTCGAGGGATTTT GACTACTGGGGT CAGGGAACCCT GGTCACCGT CTCGA GC
Secuencia de aminoacidos de DOM23m-29 (SEQ ID n° 20)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKRYSMGWVRQAPGKGLEWVSVINDLGSLTYYADSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGNISMVRPGSWFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23m-29 (SEQ ID n° 58)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATTCACCTTTAAGAGGTATTCTATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTC
AGTTATTAATGATCTGGGTAGTTTGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACA
ATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAA
GGGAATATTAGTATGGTGAGGCCGGGGAGTTGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGA
GC
Secuencia de aminoacidos de DOM23m-32 (SEQ ID n° 21)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFFEYPMGWVRQAPGKGLEWVSVISGDGQRTYYADSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSHTGTVRHLETFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23m-32 (SEQ ID n° 59)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATTCACCTTTTTTGAGTATCCTATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTC
AGTTATTAGTGGGGATGGTCAGCGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGAC
AATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAA
AAGTCATACGGGGACTGTGAGGCATCTGGAGACGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCG
AGC
Secuencia de aminoacidos de DOM23m-62 (SEQ ID n° 22)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGQESMYWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSGTRIKQGFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23m-62 (SEQ ID n° 60)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATTCACCTTTGGTCAGGAGAGTATGTATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCT
CAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGAC
AATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAA
AAGTGGTACGCGGATTAAGCAGGGTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Secuencia de aminoacidos de DOM23m-71 (SEQ ID n° 23)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFMDYRMYWVRQAPGKGLEWVSGIDPTGLRTYYADSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKIKWGEMGSYKTFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23m-71 (SEQ ID n° 61)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATTCACCTTTATGGATTATAGGATGTATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTC
AGGGATTGATCCTACTGGTTTGCGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACA
ATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAA
ATTAAGTGGGGGGAGATGGGGAGTTATAAGACTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGA
GC
Secuencia de aminoacidos de DOM23m-72 (SEQ ID n° 24)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFMDYDMSWVRQAPGKGLEWVSMIREDGGKTYYADSVKGRFTISRDNS
KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKARVPYRRGHRDNFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23m-72 (SEQ ID n° 62)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATTCACCTTTATGGATTATGATATGAGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTC
AATGATTCGTGAGGATGGTGGTAAGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACA
ATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAA
GCGAGGGT GCCTT ATCGGCGTGGGCAT AGGGATAATTTT GACT ACTGGGGTCAGGGAACCCTGGT CACCGTCT CGAGC
Secuencia de aminoacidos de DOM23m-81 (SEQ ID n° 25)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEPVIMGWVRQAPGKGLEWVSAIEARGGGTYYADSVKGRFTISRDNSK 5 NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPGRHLSQDFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23m-81 (SEQ ID n° 63)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCTT CCGGATTCACCTTTGAGCCGGTTATTATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTC AGCTATTGAGGCGCGGGGTGGGGGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGA 10 CAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGA AACCTGGGCGGCATCTTAGTCAGGATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Secuencia de aminoacidos de DOM23m-99 (SEQ ID n° 26)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDRYRMMWVRQAPGKGLEWVSTIDPAGMLTYYADSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRLASRSHFDYWGQGTLVTVSS
15 Secuencia de acido nucleico de DOM23m-99 (SEQ ID n° 64)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC TCCGGATTCACCTTTGATCGGTATCGTATGATGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTC AACGATTGATCCTGCTGGTATGCTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACA ATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAA 20 AGGCTGGCTTCGCGGAGTCATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Secuencia de aminoacidos de DOM23m-101 (SEQ ID n° 27)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSEYDMAWVRQAPGKGLEWVSRIRSDGVRTYYADSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRAKNGWFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23m-101 (SEQ ID n° 65)
25 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGCGCAGCC TCCGGATTCACCTTTTCTGAGTATGATATGGCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTTGAGTGGGTCTC ACGGATTCGTTCTGATGGTGTTAGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACA ATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAA GATCGTGCTAAGAATGGTTGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
30 Secuencia de aminoacidos de DOM23h-352 (SEQ ID n° 28)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDKYKMAWVRQAPGKGLEWVSLIFPNGVPTYYANSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYSGQGRDFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-352 (SEQ ID n° 66)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC 35 TCCGGATTCACCTTTGATAAGTATAAGATGGCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTCTC ACTTATTTTTCCGAATGGTGTTCCTACATACTACGCAAACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAA TTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAT ATAGTGGTCAGGGGCGGGATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Las CDR definidas por Kabat, de estos ejemplos sin tratamiento previo de dAb del TGFRII anti-humano y anti- 40 murino, se muestran respectivamente en las tablas 1 y 2 siguientes.
Tabla 1
Secuencias de CDR de los dAb del TGFpRII anti-humano
Clon
CDR1 CDR2 CDR3
DOM23h-802
SEGTMW AILAAGSNTYYADSVKG KRQERDGFDY
(SEQ ID n° 77) (SEQ ID n° 113) (SEQ ID n° 149)
DOM23h-803
SAGRMW AIRNDGTRTYYADSVKG HDDGHGNFDY
(SEQ ID n° 78) (SEQ ID n° 114) (SEQ ID n° 150)
DOM23h-813
TDDRMW AIQPDGHTTYYADSVKG EQDVKGSSSFDY
(SEQ ID n° 79) (SEQ ID n° 115) (SEQ ID n° 151)
DOM23h-815
AEDRMW AIDPQGQHTYYADSVKG QSTGSATSDY
(SEQ ID n° 80) (SEQ ID n° 116 (SEQ ID n° 152)
DOM23h-828
MSYMRW AISPSGSDTYYADSVKG QVVEYSRTHKGVFDY
(SEQ ID n° 81) (SEQ ID n° 117 (SEQ ID n° 153)
DOM23h-830
EGYRMW AIDSLGDRTYYADSVKG QGLTHQSPSTFDY
(SEQ ID n° 82) (SEQ ID n° 118 (SEQ ID n° 154)
DOM23h-831
EAYKMT YITPSGGQTYYADSVKG YGSSFDY
(SEQ ID n° 83) (SEQ ID n° 119 (SEQ ID n° 155)
DOM23h-840
GDGRMW AIEGAGSDTYYADSVKG QASRNSPFDY
(SEQ ID n° 84) (SEQ ID n° 120 (SEQ ID n° 156)
DOM23h-842
DDSEMA (SEQ ID n° 85) LIRRNGNATYYADSVKG (SEQ ID n° 121) VTKDRSVLFDY (SEQ ID n° 157)
DOM23h-843
DQDRMW (SEQ ID n° 86) AIESGGHRTYYADSVKG (SEQ ID n° 122) QNESGRSGFDY (SEQ ID n° 158)
DOM23h-850
DAARMW (SEQ ID n° 87) AIADIGNTTYYADSVKG (SEQ ID n° 123) QSGSEDHFDY (SEQ ID n° 159)
DOM23h-854
AQDRMW (SEQ ID n° 88) AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID n° 124) QDLHGTSSLFDY (SEQ ID n° 160)
DOM23h-855
ENTSMG (SEQ ID n° 89) RIDPKGSHTYYADSVKG (SEQ ID n° 125) QRELGKSHFDY (SEQ ID n° 161)
DOM23h-865
RSYEMT (SEQ ID n° 90) KIDPSGRFTYYADSVKG (SEQ ID n° 126) GRTDLQLFDY (SEQ ID n° 162)
DOM23h-866
SNYWMR (SEQ ID n° 91) YITPKGDHTYYADSVKG (SEQ ID n° 127) SLHNERVKHFDY (SEQ ID n° 163)
DOM23h-874
TSYRMW (SEQ ID n° 92) VIDST GSATYYADSVKG (SEQ ID n° 128) QQAGSAMGEFDY (SEQ ID n° 164)
DOM23h-883
VNYRMW (SEQ ID n° 93) AISGSGDKTYYADSVKG (SEQ ID n° 129) HGLSFDY (SEQ ID n° 165)
DOM23h-903
NDMRMW (SEQ ID n° 94) VINADGNRTYYADSVKG (SEQ ID n° 130) DGLPFDY (SEQ ID n° 166)
Clon
CDR1 CDR2 CDR3
DOM23m-4
TTYGMG WIEKTGNKTYYADSVKG AGRHIKVRSRDFDY
(SEQ ID n° 95) (SEQ ID n° 131) (SEQ ID n° 167)
DOM23m-29
KRYSMG VINDLGSLTYYADSVKG GNISMVRPGSWFDY
(SEQ ID n° 96) (SEQ ID n° 132) (SEQ ID n° 168)
DOM23m-32
FEYPMG VISGDGQRTYYADSVKG SHTGTVRHLETFDY
(SEQ ID n° 97) (SEQ ID n° 133) (SEQ ID n° 169)
DOM23m-62
GQESMY AISGSGGSTYYADSVKGR SGTRIKQGFDY
(SEQ ID n° 98) (SEQ ID n° 134) (SEQ ID n° 170)
DOM23m-71
MDYRMY GIDPTGLRTYYADSVKG IKWGEMGSYKTFDY
(SEQ ID n° 99) (SEQ ID n° 135) (SEQ ID n° 171)
DOM23m-72
MDYDMS MIREDGGKTYYADSVKGR ARVPYRRGHRDNFDY
(SEQ ID n° 100) (SEQ ID n° 136) (SEQ ID n° 172)
DOM23m-81
EPVIMG AIEARGGGTYYADSVKG PGRHLSQDFDY
(SEQ ID n° 101) (SEQ ID n° 137) (SEQ ID n° 173)
DOM23m-99
DRYRMM TIDPAGMLTYYADSVKG RLASRSHFDY
(SEQ ID n° 102) (SEQ ID n° 138) (SEQ ID n° 174)
DOM23m-101
SEYDMA RIRSDGVRTYYADSVKG DRAKNGWFDY
(SEQ ID n° 103) (SEQ ID n° 139) (SEQ ID n° 175)
DOM23h-352
DKYKMA LIFPNGVPTYYANSVKG YSGQGRDFDY
(SEQ ID n° 104) (SEQ ID n° 140) (SEQ ID n° 176)
Ejemplo 2. DSC (calorimetrfa de barrido diferencial) - clones sin tratamiento previo
5 Se determino la estabilidad termica de los dAb utilizando calorimetrfa de barrido diferencial (DSC). Los dAb se dializaron durante la noche en PBS hasta una concentracion final de 1 mg/ml. El tampon de dialisis se utilizo como referencia para todas las muestras. Se llevaron a cabo mediciones de DSC usando el microcalorfmetro de celda capilar GE HEALTHCARE™-MICROCAL™VP-DSC, a un ritmo de calentamiento de 180°C/hora. Un intervalo de exploracion tfpico fue de 20 a 90°C tanto para el tampon de referencia como para la muestra de protefna. Una nueva 10 exploracion se llevo a cabo cada vez para evaluar el grado de replegamiento de la protefna en estas condiciones experimentales. Despues de la exploracion de cada muestra de protefna, la celda capilar se limpio con una solucion de DECON™ al 5% (Fisher-Scientific) en agua, seguido de una exploracion de la PBS. Los vestigios de los datos resultantes se analizaron usando el programa informatico Origin 7.0. Los vestigios de la DSC obtenidos a partir de la exploracion del tampon de referencia se sustrajeron de los de la exploracion de la muestra de protefna. La 15 concentracion molar precisa de la muestra de protefna se ingreso en la rutina del analisis de datos para dar valores de la temperatura de fusion (Tm), entalpfa (AH) y entalpfa de Van't Hoff (AHv). Los datos se ajustaron a un modelo que no era de 2 estados (N2M). El mejor ajuste se obtuvo con 1 o 2 casos de la transicion. Los valores de la Tm obtenidos para los dAb descritos en esta patente oscilan entre 52,1°C y 73,3°C. Los valores de la Tm y el porcentaje de replegamiento, se muestran en la tabla 3.
Nombre del dAb
Tm aparente de la DSC °C % de replegamiento
transicion 1 N2M transicion 2 N2M
Tm Tm1 Tm2
DOM23h-802
- 56,28 57,54 0
DOM23h-803
- 61,19 64,59 23
DOM23h-813
52,11 - - 100
DOM23h-815
65,13 - - 93
DOM23h-828
- 60,86 59,40 0
DOM23h-830
- 57,01 58,15 0
DOM23h-831
- 55,29 57,19 0
DOM23h-840
63,70 - - 100
DOM23h-842
63,08 - - 27
DOM23h-843
60,15 - - 60
DOM23h-850
58,27 - - 60
DOM23h-854
- 55,31 58,20 30
DOM23h-855
70,32 - - 88
DOM23h-865
63,02 - - 0
DOM23h-866
- 52,88 55,77 18
DOM23h-874
- 58,83 60,15 0
DOM23h-883
- 66,78 59,14 0
DOM23h-903
- 59,11 61,98 24
DOM23m-4
- 57,1 61,3 0
DOM23m-29
68 - - 0
DOM23m-32
- 70,4 73,3 25
DOM23m-62
- - - -
DOM23m-71
63 - - 0
DOM23m-72
- - - -
DOM23m-81
- - - -
DOM23m-99
- 58,5 59 0
DOM23m-101
64 - - 30
DOM23m-352
66 - - 50
Todas las moleculas mantienen la estructura terciaria hasta por lo menos 52°C tras el calentamiento.
Ejemplo 3. SEC-MALLS (cromatograffa de exclusion por tamano con dispersion de luz de laser de angulos multiples) 5 - clones sin tratamiento previo
Para determinar si los dAb son monomericos o forman oligomeros de orden superior en solucion, se analizaron por SEC-MALLS (cromatograffa de exclusion por tamano con dispersion de luz de laser de angulos multiples). Un sistema de HPLC serie 1100 de Agilent con un cargador automatico de muestras y un detector UV (controlado por el programa informatico Empower) se conecto al detector Wyatt Mini Dawn Treos (de dispersion de luz de laser (LS)) y 5 el detector Wyatt Optilab rEX DRI (de mdice de refraccion (IR) diferencial). Los detectores se conectaron en el siguiente orden -UV-LS-IR. Ambos instrumentos IR y LS operan a una longitud de onda de 658 nm; se controlo la senal UV a 280 nm y 220 nm. Se separaron los anticuerpos de dominio (inyeccion de 100 microlitros a una concentracion de 1 mg/ml en PBS), segun sus propiedades hidrodinamicas por cromatograffa de exclusion por tamano usando una columna GE HEALTHCARE™ 10/300 Superdex 75. La fase movil fue PBS mas etanol al 10%.
10 La intensidad de la luz dispersa mientras la protema pasaba a traves del detector se midio en funcion del angulo. Esta medicion tomada junto con la concentracion de protema determinada usando el detector IR, permitio el calculo de la masa molar empleando ecuaciones apropiadas (parte integral del programa informatico de analisis Astra v.5.3.4.14). Todos los dAb descritos en la presente memoria tienen un contenido monomerico que oscila entre 65% y 98%. Los datos se muestran en la tabla 4.
15 Tabla 4
Denominacion del dAb
Monomero por SEC-MALLS (%)
DOM23h-802
92,5
DOM23h-803
96,4
DOM23h-813
96,6
DOM23h-815
98
DOM23h-828
80
DOM23h-830
65
DOM23h-831
72
DOM23h-840
91
DOM23h-842
91,6
DOM23h-843
90,2
DOM23h-850
97,7
DOM23h-854
83,4
DOM23h-855
96,3
DOM23h-865
83
DOM23h-866
92,4
DOM23h-874
92,6
DOM23h-883
93,5
DOM23h-903
96,5
DOM23m-4*
93
DOM23m-29*
95
DOM23m-32*
92
DOM23m-62
No determinado
DOM23m-71*
88
DOM23m-72
No determinado
DOM23m-81
No determinado
DOM23m-99
79
DOM23m-101
77,4
DOM23m-352
93
*Estos dAb se introdujeron usando el mismo montaje que para SEC-MALLS descrito anteriormente, salvo que la HPLC utilizada fue un sistema Shimadzu LC-20AD Prominence. Estos dAb se introdujeron tambien en una columna Superdex75, pero el tampon de la fase movil fue PBS.
5 Las moleculas listadas en las tablas 3 y 4 se seleccionaron basandose en el contenido en estado en solucion (propension a la monomerizacion) y la estabilidad termica. Todas las moleculas presentan una propension >65% a la monomerizacion, y mantienen la estructura terciaria hasta por lo menos 52°C tras el calentamiento.
Ejemplo 4. Pruebas para la inhibicion del TGFbetaRII (clones sin tratamiento previo)
Prueba de la luciferasa MC3T3-E1 - metodo ml
10 La prueba de la luciferasa MC3T3-E1 mide la capacidad de los dAb para inhibir la expresion de la CAGA-luciferasa inducida por el TGFp en celulas MC3T3-E1. Tres copias de un motivo de secuencia sensible al TGFp, denominado secuencia CAGA, estan presentes en el activador PAl-1 humano y se unen especfficamente a las protefnas Smad3 y 4. La clonacion de copias multiples de la secuencia CAGA en una montaje indicador de luciferasa confiere sensibilidad del TGFp a las celulas transfectadas con el sistema indicador. Esta prueba emplea celulas MC3T3-E1 15 (osteoblastos de raton) transfectadas establemente con un montaje indicador de [CAGA]12-luciferasa (Dennler, et al. (1998) EMBO J. 17, 3091-3100).
Se determino la capacidad de los dAb solubles para bloquear la senalizacion del TGF-p1 por la via Smad3/4.
El protocolo utilizado para generar los datos que aparecen como metodo m1 en la tabla 5, es el siguiente. En resumen, 2,5 x 104 celulas MC3T3-E1 por pocillo en medio de ensayo (medio RPMI (Gibco, Invitrogen Ltd, Paisley, 20 Reino Unido), suero de ternera fetal al 10% inactivado con calor, y penicilina al 1 %/estreptomicina), se anadieron a una placa de cultivo hfstico de 96 pocillos (Nunc), seguido por el dAb y el TGF-p1 (concentracion final de 1 ng/ml) y se incubaron durante seis horas a 37°C, CO2 al 5%. Los dAb se dializaron en PBS antes de ser analizados en la prueba. Se anadio el reactivo de luciferasa BRIGHTGLOW™ (Promega, Reino Unido) a los pocillos y se incubaron a temperatura ambiente durante dos minutos para dejar lisar las celulas, y la luminiscencia resultante se midio en un 25 luminometro.
La prueba se llevo a cabo varias veces para obtener un promedio y el intervalo de valores de inhibiciones en % del maxima se resumen en la tabla 5. Este metodo se ha modificado y se describe a continuacion.
Prueba modificada de luciferasa MC3T3-E1 - metodo m2
Se anadieron celulas MC3T3-E1 a placas de 96 pocillos (Nunc 13610) a 1,25 x 104 por pocillo en “medio de siembra” 30 (MEM-alfa + ribonucleosidos + desoxirribonucleosidos (Invitrogen 22571), FCS arrastrado con vapor en carbon vegetal al 5% (Perbio Sciences UK Ltd; SH30068.03), 1/100 de piruvato de sodio (Invitrogen 11360), 250 pg/ml de geneticina 50 mg/ml (Invitrogen, 10131027), y se incubaron durante la noche a 37°C, CO2 al 5%. El medio de las celulas se reemplazo con “medio de ensayo” (DMEM (Invitrogen 31966021), Hepes 25 mM (Invitrogen)), y los dAb purificados en PBS a 4x concentracion de la prueba final se valoraron en el “medio de ensayo” y se anadieron a las 35 placas celulares, seguido del TGF-p1 (R&D, 240B) a 4x la EC80. Las placas se incubaron durante seis horas a 37°C, CO2 al 5%. Se anadio reactivo de luciferasa STEADYLITE™ (PerkinElmer 6016987) a los pocillos, y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos, y se midio la luminiscencia resultante en el lector de placas ENVISION™.
Cada dAb se valoro por duplicado en un analisis y se determino un % de inhibicion maxima (n=2). El analisis se 40 llevo a cabo veces multiples para obtener un promedio y el intervalo de valores de las inhibiciones en % del maximo que se resumen en la tabla 5. Se reunieron los parametros de QC del analisis; pequena molecula interna que muestra un intervalo de CI50 de 100 a 900 nM para las pruebas en ratones. Asimismo, los factores Z robustos fueron mayores de 0.4, y la EC80 del TGF-p estuvo comprendida dentro de 6 veces de la concentracion anadida a la prueba.
45 Prueba de liberacion de IL-11 de celulas A549 - h1
La prueba de liberacion de interleucina-11 (IL-11) de celulas A549 mide la capacidad de los dAb para inhibir la liberacion de IL-11 estimulada por el TGF-p1 humano de celulas A549. El TGF-p1 se une directamente al TGF-pRII e induce el montaje del complejo TGF-pRI/II. El TGF-pRI se fosforila y es capaz de senalizar por varias vfas incluida la via Smad4. La activacion de la via Smad4 da lugar a la liberacion de IL-11. La IL-11 se segrega en el 50 sobrenadante celular y se mide a continuacion por ELISA colorimetrico.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Se determino la capacidad de los dAb solubles para bloquear la senalizacion del TGF-p1 por la via Smad4. En resumen, 1x105 celulas A549 por pocillo en “medio de ensayo” (medio DMEM de alto contenido en glucosa (Gibco™, Invitrogen Ltd, Paisley, Reino Unido), suero de ternera fetal al 10% inactivado por calor (PAA, Austria), HEPES 10 mM (Sigma, Reino Unido) y penicilina al 1%/estreptomicina (PAA, Austria)), se anadieron a una placa de cultivo de 96 pocillos (Nunc), seguido del dAb y el TGF-p1 (concentracion final de 3 ng/ml) (R&D Systems, Abingdon, Reino Unido), y se incubaron durante la noche a 37°C, CO2 al 5%. Los dAb se dializaron en PBS antes de ser analizados. Se midio la concentracion de IL-11 liberada en el sobrenadante usando un DUOSET™ para IL-11 humana (R&D Systems, Abingdon, Reino Unido), segun las instrucciones del fabricante.
Para la prueba de liberacion de IL-11 de celulas A549 remitirse a las tablas 5 y 6 como metodo analftico h1. La prueba se llevo a cabo varias veces para obtener un promedio y el intervalo de valores de inhibiciones de % del maximo que se resumen en la tabla 5. Se reunieron los parametros de QC de la prueba: pequena molecula interna que muestra un intervalo de CI50 de 50 a 500 nM para las pruebas en personas.
Prueba del detector de celulas HEK 293T SBE-bla - h2
Los miembros de la familia Smad de moleculas de transduccion de senales son componentes de una via intracelular que transmite senales del TGF-p desde la superficie de la celula al nucleo. El TGF-p1 se une directamente al TGF- pRII e induce el montaje del complejo TGF-pRI/II. Smad2 y Smad3 son fosforilados a continuacion por el TGF-pRI, y forman posteriormente un complejo heteromerico con el miembro de la cofamilia smad, Smad4. Estos complejos son desplazados hacia el nucleo, donde se unen al ADN y regulan la transcripcion genica.
Las celulas HEK 293T del detector de celulas SBE-bla contienen un gen indicador de beta-lactamasa bajo el control del elemento de union Smad (SBE), el cual fue integrado establemente en celulas HEK 293T (Invitrogen, Reino Unido). Las celulas son sensibles al TGF-pl, y pueden usarse para detectar agonistas/antagonistas de la via de senalizacion Smad2/3.
Se determino la capacidad de los dAb solubles para bloquear la senalizacion del TGF-p1 por esta via siguiendo el siguiente metodo, que estaba basado en un metodo optimizado de Invitrogen, Reino Unido (estirpe celular K1108).
La prueba se llevo a cabo directamente en celulas congeladas que se habfan cultivado durante al menos 4 pasos en medio de cultivo (DMEM de alto contenido en glucosa, Invitrogen 21068028, FBS U.S. al 10% dializado, Invitrogen 26400-044, aminoacidos no esenciales 0,1 mM (1/100), Invitrogen 11140-050, tampon HEPES 25 mM (1/40), Sigma H0887, piruvato de sodio 1 mM (1/100), Invitrogen 11360-070, GLUTAMAX™ al 1% (200 mM, Invitrogen 35050038), 5 pg/ml de blasticidina, Invitrogen R21001) y congeladas en la propia empresa (en 4x107/ml). Las celulas se sembraron a razon de 20.000 celulas por pocillo en placas de cultivo de celulas (Costar 3712) en medio de siembra (como anteriormente con FCS a 1% y sin blasticidina). Despues de incubar las celulas durante la noche, los dAb purificados se diluyeron en “medio de ensayo” (DMEM (Invitrogen 31966021), Hepes 25 mM (Invitrogen), y se anadieron a las celulas a 4x concentracion de prueba final. Despues de 1 hora de incubacion a 37°C, se anadio TGF-p (R&D Systems; 240B) a 4x EC80, y se incubo durante otras 5 horas. El substrato LIVEBLAZER™ (Invitrogen K1030) se obtuvo segun las instrucciones del fabricante, y se anadio a 8x el volumen. Las placas se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente durante 16 horas y se leyeron en el lector de placas ENVISION™, segun el protocolo de Invitrogen.
Para la prueba SBE-bla HEK CELLSENSOR™ se remite a las tablas 5 y 6 como metodo h2. Cada dAb se valoro por duplicado en una analisis y se determino una CI50, y la inhibicion en % del maximo (n=2). Debido a la dificultad para obtener curvas completas en la prueba en ratones, solo se citan las inhibiciones en % en la tabla 5. La prueba se llevo a cabo varias veces hasta obtener un promedio y un intervalo de valores que se resumen en las tablas 5 y 6. Se calculo la media aritmetica CI50 usando las pCI50 (-log de CI50), y el intervalo calculado anadiendo y sustrayendo el logaritmo de la desviacion tfpica de la pCI50 media, y transformando entonces de nuevo hasta la CI50. Se reunieron los parametros de QC de la prueba; pequena molecula interna que presenta un intervalo de CI50 de 50 a 500 nM para las pruebas en personas. Ademas, los factores Z robustos fueron mayores de 0,4, y la EC80 del TGF-p estuvo comprendida dentro de 6 veces la concentracion anadida a la prueba.
Los resultados se muestran en las tablas 5 y 6.
Datos de prueba funcionales en celulas para clones especificos de raton mas dAb placebo de VH
Prueba de celulas 3T3 de raton Prueba de liberacion de IL-11 humana (hi) o SBE-bla HEK CELLSENSOR™ (h2)
Inhibicion en % del maximo Inhibicion en % del maximo
Metodo de ensayo Promedio D.T. Intervalo n Metodo de ensayo Promedio D.T. intervalo n
DOM23m-04
ml 73,3 8,4 68,8 - 83 3 hi 70.7 6,4 67-78 3
DOM23m-04
h2 69,0 1
DOM23m-29
ml 54,2 5,2 50,5 - 57,9 2
DOM23m-32
ml 39,7 4,0 36,9 - 42,5 2
DOM23m-62
ml 78,6 1 hi 79,0 1
DOM23m-71
ml 44,9 9,3 38,3-51,4 2 hi -2,0 1
DOM23m-72
ml 17,5 24,7 0 - 34,9 2 hi 1,7 1
DOM23m-81
m2 30,3 11,5 21 -47 4
DOM23m-99
m2 46,5 28,0 26,7 - 93,5 6
DOM23m-101
m2 48,0 19 22,0-74,1 12 h2 59,8 27,0 17-81 5
DOM23h-352
m2 48,0 23,9 16,8-78,9 16 h2 46,7 36,5 5,7 - 86 5
VHDUM-2
m2 21,4 13,2 21 -33,9 15 h2 46,0 29,6 17-84 6
VHDUM-2
ml 22,5 0 22,5 2
Datos funcionales en celulas para clones especfficos humanos mas dAb placebo de VH
dAb CI50 nM
Metodo de ensayo
Promedio Intervalo de CI50 (+/- log DT) n
h2
DOM23h-802 > 11.062 6.592 - 18.562 6
h2
DOM23h-803 > 11.619 5.890 - 22.922 6
h2
DOM23h-813 > 9.328 4.301 - 20.230 6
h2
DOM23h-815 7.122 3.026 - 16.764 4
h2
DOM23h-828 9.899,07 4.441 - 22.065 4
h2
DOM23h 830 6.299 5.442 - 7.291 4
h2
DOM23h-831 > 3.126 534 - 18.291 8
h2
DOM23h 840 2.915 650 - 13.081 7
h2
DOM23h 842 2.042 2.223 - 18.704 4
h2
DOM23h-843 > 9.007 3.396 -23.894 8
h2
DOM23h-850 5.350 2.358 - 12.137 6
h2
DOM23h-854 > 9.551 3.085 - 29.569 8
h2
DOM23h-855 > 4.467 1.088 - 18.339 8
h2
DOM23h 865 5.559 1.070 - 28.893 4
h2
DOM23h 866 > 1.762 195 - 15.900 6
h2
DOM23h 874 > 925 89 - 9.591 6
h2
DOM23h 883 10.123 60 - 17.344 6
h2
DOM23h 903 1.048 492 - 223 5
h2
VH placebo-2 > 25.119 25.000-250.000 12
Los clones de raton se seleccionaron sobre la base de que mostraron mas
5 Se seleccionaron clones de raton sobre la base de que presentaban mas del 40% de neutralizacion del TGF-p en varias pruebas. La unica excepcion a esto fue DOM23m-72. Los clones presentaban tambien curvas de neutralizacion validas (datos no mostrados). Los clones humanos se seleccionaron sobre la base de que los valores promedio de la CI50 fueron menores de 15 pM.
Ejemplo 5. Maduracion por afinidad propensa a error de clones sin tratamiento previo (del ejemplo 1)
10 Se llevo a cabo mutagenia propensa a error para mejorar la afinidad de los dAb identificados como activos con caracterfsticas bioffsicas adecuadas (descritas anteriormente).
Construccion de la biblioteca de fagos: Se obtuvieron bibliotecas propensas a error de DOM23h-843, DOM23h-850, DOM23h-854, DOM23h-855, DOM23h-865, DOM23h-866, DOM23h-874, DOM23h-883, DOM23h-439 y DOM23h- 903, usando el equipo GENEMORPH™ II Random Mutagenesis (Stratagene, n° de catalogo 200550). Los genes del 15 dAb objetivo fueron amplificados por PCR usando ADN polimerasa de Taq y los oligonucleotidos DOM008 (5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3' (SEQ ID n° 185)) y DOM009 (5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3' (SEQ ID n° 186)), seguido de reamplificacion del producto de PCR diluido con los oligonucleotidos DOM172 (5'-TTGCAGGCGTGGCAACAGCG-3' (SEQ ID n° 187)) y DOM173 (5'-CACGACGTTGTAAAACGACGGCC-3' (SEQ ID n° 188)) y la ADN polimerasa MUtAzYME™ II, segun las instrucciones del fabricante. Este producto de PCR se
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amplifico ademas usando ADN polimerasa de Taq y los oligonucleotidos DOM172 y DOM173, para aumentar el rendimiento del producto de ADN. El producto de la PCR se digerio con las endonucleasas de restriccion Sal I y Not I. El producto no digerido y los extremos digeridos se retiraron del producto digerido usando perlas de estreptavidina (Dynal Biotech, Reino Unido). Para las selecciones antihumanas propensas a error, el producto digerido se ligo en el vector del fago pDOM4 digerido con las endonucleasas de restriccion Sal I y Not I, y se uso para transformar las celulas TB1 de E. coli. Las celulas transformadas se sembraron en 2xTY agar-agar enriquecido con 15 pg/ml de tetraciclina, dando tamanos de biblioteca >1*107 transformantes.
Selecciones propensas a error de dAb especfficas del TGFbetaRII humano: Se llevaron a cabo tres rondas de seleccion con las bibliotecas DOM23h-843, DOM23h-850, DOM23h-854, DOM23h-855, DOM23h-865, DOM23h- 866, DOM23h-874, DOM23h-883, DOM23h-903 y DOM23h-439. La ronda uno se llevo a cabo usando TGFbetaRII/Fc 1 nM biotinilado humano (N13241-57). Se siguieron dos metodos diferentes para las rondas dos y tres, utilizando el metodo 1 la forma dimerica del TGFbetaRII/Fc del antfgeno, y utilizando el metodo 2 la forma monomerica soluble del TGFbetaRII. Metodo 1: La ronda dos se llevo a cabo con TGFbetaRII/Fc 1 nM biotinilado humano con el competidor TGFbetaRII/Fc 1 pM no biotinilado humano. La ronda tres se llevo a cabo con TGFbetaRII/Fc 100 pM biotinilado humano con TGFbetaRII/Fc 1 pM no biotinilado humano (N12717-4). Metodo 2: La ronda dos se llevo a cabo con TGFbetaRII 1 nM biotinilado humano con el competidor TGFbetaRII 1 pM no biotinilado humano. La ronda tres se llevo a cabo con TGFbetaRII 100 pM biotinilado humano con el competidor TGFbetaRII 1 pM no biotinilado humano.
Los productos de la segunda y tercera rondas de seleccion se subclonaron en el vector pDOM13, como se describio anteriormente. Se seleccionaron clones aislados y se expresaron en placas de 96 pocillos a 850 rpm, 37°C durante 24 horas, 90% de humedad en 0,5 ml/pocillo de medio de autoinduccion rapida durante la noche enriquecido con 100 pg/ml de carbenicilina. Las placas se centrifugaron a continuacion a 1.800 g durante 10 minutes. Los sobrenadantes se diluyeron a 1/5 o 1/2 en tampon de HBS-EP y se tamizaron sobre BIACORE™ para unirse al TGF-p RII/Fc biotinilado humano (chip de AS recubierto con 1000 Ru de hRII-Fc biotinilado segun las recomendaciones del fabricante) (BIACORE™, GE HEALTHCARE™). Las muestras se introdujeron en BIACORE™ a un caudal de 50 pl/min. Los clones que se unieron con un gran numero de unidades de resonancia (UR) o con una constante de velocidad de disociacion mejorada en comparacion con el clon original se expresaron en 50 ml de medio de autoinduccion rapida durante la noche a 30°C durante 48 a 72 horas y se centrifugaron a 4.600 rpm durante 30 minutos. Los sobrenadantes se incubaron durante la noche a 4°C con perlas de STREAMLINE- protefna A. Se rellenaron a continuacion columnas de goteo con las perlas, se lavaron con 5 volumenes de columna de 2xPBS, seguido de un volumen de lecho de Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, y los dAb unidos se eluyeron con glicina-HCl 0,1 M, pH 2,0 y se neutralizaron con Tris-HCl 1 M, pH 8,0. Se midio la Do de los dAb a 280 nm, y se determinaron las concentraciones de protefna utilizando coeficientes de extincion calculados a partir de las composiciones de aminoacidos de los dAb.
Analisis in vitro de selecciones propensas a error con constante de velocidad de disociacion mejorada: Los dAb purificados se sometieron a las mismas pruebas que los de las selecciones sin tratamiento previo, a saber, Biacore, prueba del detector de celulas SBE-bla HEK 293T (h2), DSC y SEC-MALLS. Ejemplos de los clones mejorados por encima del original se muestran en la tabla 6A. Los valores de la CI50 son un valor promedio del numero “n”de experimentos.
Tabla 6A
DOM23h
Constante de velocidad de asociacion ka1 (1/Ms) Constante de velocidad de disociacion kd 1 (1/s) KD de Afinidad Veces de mejora de ka Veces de mejora de kd Veces de mejora de KD CI50 media (nM)*
439
2,08E+06 5,02E-02 2,42E-08 3.570 (3)
439-20
4,43E+06 3,54E-03 7,99E-10 2,1 14,2 30,3 48 (10)
843
9,05E+05 3,43E-01 3,78E-07 1.947 (3)
843-13
5,11E+06 2,11 E-02 4,13E-09 5,6 16,2 91,7 540 (4)
855
3,35E+05 3,15E-01 9,41 E-07 > 25.000 (3)
855-21
1,86E+06 3,36E-02 1,80E-08 5,6 9,4 52,3 18.580 (6)
* El numero de experimentos para el calculo de los valores promedio de la CI50, aparece entre parentesis
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-855-21 (SEQ ID n° 203)
GAGGT GCAGCT GTT GGAGTCTGGGGGAGGCTTGGT ACAGCCTGGGGGGTCCCT GCGTCTCTCCTGTGCAGCC TCCGGATTCACCTTTGAGAATACGAGTATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCT CACGTATTGATCCTAAGGGTAGTCATACATACTACACAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGAC AATTCCAAGAATACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAA ACAGCGT GAGTT GGGT AAGTCGTATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGT CTCGAGC
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-855-21 (SEQ ID n° 204)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFENTSMGWVRQAPGKGLEWVSRIDPKGSHTYYTDSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQRELGKSYFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-843-13 (SEQ ID n° 205)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATTCACCTTTGATCAGGATCGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCCCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCT
CAGCTATTGAGAGTGGTGGTCATAGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGA
CAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGA
ATCAGAATAAGTCGGGGCGTTCGGGTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-843-13 (SEQ ID n° 206)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDQDRMWWVRQAPGKGLEWVSAIESGGHRTYYADSVKGRFTISRDNS
KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCANQNKSGRSGFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-439-20 (SEQ ID n° 207)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATTCACCTTTGGGACGGAGCAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTTTGTCT
CACGTATTGATTCGCCTGGTGGGAGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGA
CAATTCCAAGAACACGCTGTATCT GCAAAT GAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGA
AACGGCATGCGGCTGGGGTTTCGGGTACTTATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAG
C
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-439-20 (SEQ ID n° 208)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRHAAGVSGTYFDYWGQGTLVTVSS
Ejemplo 6. Maduracion por afinidad del linaje DOM23h-271-7
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-271 (SEQ ID n° 199)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGNRTYYADSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQIPGRKWTANSRFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-271 (SEQ ID n° 200)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATTCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCT
CAGCGATTGAGCCGATTGGTAATCGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGAC
AATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAA
ACAGATTCCGGGGCGTAAGTGGACTGCTAATTCGCGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTC
TCGAGC
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-271-7 (SEQ ID n° 201)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGNRTYYADSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQIPGRKWTANSRFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-271-7 (SEQ ID n° 202)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATTCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCT
CAGCGATTGAGCCGATTGGTAATCGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGAC
AATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAA
ACAGATTCCGGGGCGTAAGTGGACTGCTAATTCGCGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTC
TCGAGC
El anticuerpo de dominio DOM23h-271 (SEQ ID n° 199) se habfa aislado de las bibliotecas de fagos en una campana de seleccion previa, y la variante DOM23h-271-7 (SEQ ID n° 201) se aislo despues de la maduracion de la afinidad propensa a error, como se describe en el documento WO 2011/012609. Se selecciono DOM23h-271-7 5 (SEQ ID n° 201) para mas maduracion de la afinidad basandose en su cinetica de union, secuencia y comportamiento biofisico. Se llevo a cabo la maduracion de la afinidad usando mutagenia degenerativa para rediversificar las CDR, y se identificaron las secuencias principales mejoradas usando exposicion en ADN o exposicion en fagos. Se construyeron dos tipos de bibliotecas para rediversificar las CDR, y estas se denominan bibliotecas de tripletes y dopadas. Para construir las bibliotecas de tripletes, se disenaron cebadores 10 oligonucleotfdicos para abarcar cada CDR, y en cada cebador los codones para tres aminoacidos se sustituyeron por codones de NNS, de modo que se diversificaron tres posiciones. Se usaron varios oligonucleotidos para abarcar todos los aminoacidos elegidos como objetivo en de cada CDR: 2 para la CDR1, 3 para la CDR2 y 6 para la CDR3. Se utilizaron cebadores oligonucleotfdicos complementarios para amplificar un fragmento de secuencia que contenfa cada CDR mutada, y tambien un fragmento de secuencia superpuesta que abarcaba el resto de la secuencia 15 codificante del dAb. Estos fragmentos se mezclaron y se ensamblaron por PCR de ampliacion de superposicion por corte y empalme para producir la secuencia codificante del dAb completa. Este producto se amplifico por PCR usando los cebadores DOM172 (SEQ ID n° 187) y DOM173 (SEQ ID n° 188), se digerio con Sall y Notl, y se ligo en pDOM4 cortado de igual manera (descrito anteriormente) para las selecciones de fagos, o pIE2A2 (descrito en el documento WO2006018650) para las selecciones de exposicion en ADN. Las bibliotecas dopadas se construyeron 20 usando un metodo similar, esencialmente al descrito en el documento WO2006018650. Para cubrir todas las mutaciones dentro de cada CDR se uso un solo cebador oligonucleotfdico degenerado. Dentro de cada cebador, se especificaron los aminoacidos a diversificar usando codones degenerados que especifican varios aminoacidos. Se diversificaron cinco aminoacidos en la CDR1, 7 en la CDR2 y 13 en la CDR3. En los cebadores se utilizo la siguiente codificacion degenerada: 'a' = 91% de A + 3% de T + 3% de G + 3% de C; 'g' = 91% de G + 3% de T + 3% de C + 25 3% de A; 'c' = 91% de C + 3% de T + 3% de G + 3% de A; 't' = 91% de T + 3% de A + 3% de G + 3% de C; 'S' = 50% de G y 50% de C. Las letras mayusculas indican 100% del nucleotido especificado. Los cebadores utilizados fueron:
271-7R1deg CDR1
(GCAGCCTCCGGATTCACCTTTacSgaStatagSATGtgSTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGG) (SEQ ID n° 189); 271-7R2deg CDR2
30 (GGGTCTCGAGTGGGTCTCAgcSATTgaSccSatSggSaaScgSACATACTACGCAGACTCCGTG) (SEQ ID n° 190); 271-7R3deg CDR3:
(GCGGTATATTACTGTGCGAAAcaSatSccSggScgSaaStgSacSgcSaaStcScgSttSGACTACTGGGGTCAGGG) (SEQ ID n° 191).
Los cebadores degenerados de la biblioteca se utilizaron de la misma manera que los cebadores de tripletes. Cada 35 CDR diversificada se amplifico por separado y se combino a continuacion con un fragmento de secuencia original usando superposicion de la ampliacion por corte y empalme. Los fragmentos se subclonaron con pDOM4 y pIE2A2 usando SalI y NotI.
Exposicion en ADN
Se llevaron a cabo selecciones utilizando compartimentacion in vitro en emulsiones y exposicion en ADN utilizando 40 la protefna de union al ADN scArc esencialmente como se describe en el documento WO2006018650. En resumen, el antfgeno del TGFbRII-FC se biotinilo usando una relacion molar 5:1 de biotina y el equipo EZ-LINK™ Sulfo-NHS- LC-Biotina (Thermo n° 21327). Un fragmento de ADN que contiene las secuencias de operador Arc y la casete de expresion que contiene la biblioteca del dAb diversificada, se amplifico por PCR a partir del vector pIE2A2 usando cebadores flanqueantes. El producto se purifico en un eGel (Invitrogen), y se diluyo hasta 1,7 o 0,85 nM en 1 mg/ml 45 de BSA. Para la seleccion de los enlazadores mejorados, las bibliotecas dopadas y de tripletes se procesaron por separado en condiciones ligeramente diferentes. Las bibliotecas de tripletes de la CDR se combinaron para dar las bibliotecas agrupadas de la CDR 1, 2 o 3. Se emplearon diez rondas de seleccion para cada tipo de biblioteca. Para ambos metodos, despues de 2 ciclos de seleccion, las CDR diversificadas se amplificaron y recombinaron por PCR con superposicion de la ampliacion por corte y empalme, para producir una 4a biblioteca con mutaciones en las 3 50 CDR.
Para las bibliotecas dopadas, se mezclaron 5x108 copias de ADN con 50 pl de la mezcla de traduccion in vitro EXPRESSWAY™ (Invitrogen). Cada reaccion contema 10,0 pl de extracto SLYD™; 10,0 pl de 2,5x tampon de reaccion; 12,5 pl de 2x tampon de alimentacion; 1,0 pl de metionina (75 mM); 1,25 pl de mezcla de aminoacidos (50 mM); 15 pl de H2O; 0,5 pl de T7 polimerasa; 0,25 pl de mAb anti-HA 3F10 (Roche, n° de catalogo 1.867.423); y 1,5 55 pl de glutation (100 mM) (Sigma). Esto se anadio a 800 pl de la fase hidrofoba (SPAN™-80 a 4.5%, (Fluka) + Triton X-100 al 0,5% (Sigma) en aceite mineral blanco ligero (Sigma)) en un vial de vidrio de 4 ml (CHROMACOL™ 4SV P837), y se agito a 2.000 rpm durante 4 a 5 minutos. Los tubos se sellaron y se incubaron durante 3 horas a 30°C.
Todos los pasos posteriores se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Para extraer los complejos de ADN- protema, se anadieron al vial 200 pl de tampon C+ (Tris 10 mM, KCl 0,1 M, TWEEN™-20 al 0,05%, MgCh 5 mM, BSA al 1%, pH 7,4) y 500 pl de hexano, se mezclaron y se transfirieron a un microtubo y se centrifugaron a 13.000 g durante 1 minuto. La fase organica se retiro, y la fase acuosa se volvio a extraer con 800 pl de hexano 3 a 5 veces 5 mas hasta que la interfase fue casi clara. Para las primeras 5 rondas de selecciones, el TGFbRII-FC biotinilado se unio previamente a Estreptavidina DYNAbeads™ (Invitrogen) y se anadio a los complejos extrafdos para dar una concentracion de antfgeno equivalente a 40, 40, 10, 5 y 5 nM (rondas 1, 2, 3, 4 y 5, respectivamente). Las perlas T1 se utilizaron para las selecciones 1 a 3, y C1 para las selecciones 4 y 5. Despues de 30 minutos de incubacion, las perlas se lavaron 3 a 5 veces con tampon C+. Los complejos de ADN que quedaron unidos a las perlas se 10 recuperaron entonces por PCR con cebadores flanqueantes. Las rondas de seleccion 6 a 10 se denominaron selecciones “solubles”, cuando el TGFbRII-FC biotinilado se anadfa directamente a los complejos despues de la extraccion para dar una concentracion de 5, 5, 4, 5 y 5 nM (rondas 6, 7, 8, 9 y 10, respectivamente), y se incubaron durante 30 minutos para permitir que se estableciera la union. El TGFbRII-FC no biotinilado se anadio a continuacion como competidor a 74, 750, 400, 250 y 250 nM (rondas 6, 7, 8, 9 y 10 respectivamente), y se incubo durante 15, 15, 15 30, 30 y 30 minutos (rondas 6, 7, 8, 9 y 10, respectivamente). En las rondas 9 y 10, un oligonucleotido bicatenario que contenfa la secuencia del operador ARC se incluyo a 50 nM en el tampon C+ utilizado en las extracciones con hexano para reducir las reacciones cruzadas entre cualquier ADN no complejado y el exceso de protefna liberada de las emulsiones. Despues del penodo de competencia, se anadieron 10 pl de estreptavidina C1 DYNAbeads™. Despues de 10 minutos, las perlas se lavaron 5 veces con tampon C+, y los complejos unidos se recuperaron por 20 PCR con cebadores flanqueantes como se describio anteriormente. El producto de la PCR se purifico sobre un eGel y se utilizo para el siguiente ciclo de seleccion. Despues de la decima seleccion, el producto recuperado se corto con las enzimas SalI y NotI, y se clono en el pDOM13 cortado de igual manera para expresion.
Las bibliotecas de tripletes se seleccionaron usando un metodo similar, salvo que se usaron 1x109 copias de ADN en la primera ronda de seleccion, y 5x108 despues. Ademas, el tiempo de incubacion para la expresion de la protefna 25 en emulsion se redujo hasta 2 horas. El TGFbRII FC biotinilado soluble se uso en las diez rondas de seleccion a 25, 10, 5, 5, 5, 5, 2,5, 2,5, 2,5, 2,5, 2,5 y 2,5 nM, respectivamente. El objetivo biotinilado se incubo con los complejos extrafdos durante 30 minutos. En las rondas de seleccion 5 a 10, el competidor TGFbRII-FC no biotinilado se anadio a una concentracion final de 250 nM durante 15, 30, 60, 60, 75 y 90 minutos, respectivamente, antes de la adicion de estreptavidina C1 DYNAbeads™. En la ronda 5, la competencia fue a temperatura ambiente, pero a partir de la 30 ronda 6, la temperatura de competencia se incremento hasta 30°C. El oligomero senuelo del operador Arc se incluyo en las rondas de seleccion 1 a 4 para reducir la complejacion cruzada del ADN defectuoso.
Despues de las selecciones, las inserciones que codifican dAb se separaron de las casetes de expresion de exposicion en fagos usando SalI y NotI, y se clonaron en el vector de expresion bacteriano pDOM13. Los dAb se secuenciaron y expresaron en medio TB ONEX™, y los sobrenadantes se detectaron por BIACORE™ para 35 identificar los clones con constantes de velocidad de disociacion mejoradas, en comparacion con el original. Los clones con constantes de velocidad de disociacion mejoradas se expresaron y purificaron, y se evaluo la afinidad por BIACORE™ y la potencia en la prueba del detector de celulas. No se buscaron clones que dieran perfiles de cinetica deficientes, que contienen motivos de secuencia desfavorables, o dieran muy bajos rendimientos. Se seleccionaron tres por ser de mas interes. Los clones DOM23h-271-21 (SEQ ID n° 29) y DOM23h-271-22 (SEQ ID n° 30) se 40 aislaron de selecciones de bibliotecas dopadas. El clon DOM23h-271-27 (SEQ ID n° 31) se aislo de una seleccion de biblioteca de tripletes. La afinidad de los clones seleccionados por el TGFbRII-FC humano, se muestra en la tabla 7.
Tabla 7
Ka(M'1.s'1) Kd (s'1) KD (nM)
DOM23h-271-7*
5,37E+6 5,10E-2 9,49
DOM23h-271-21
3,21 E+6 4,72E-4 0,147
DOM23h-271-22
3,22E+6 9,19E-4 0,286
DOM23h-271-27
2,17E+6 1,26E-3 0,578
* Los valores en la tabla anterior, son solo para clasificacion, puesto que el ajuste para DOM23h-271-7 al modelo de 45 1:1 fue deficiente, aunque las muestras maduradas de afinidad se ajustaron bien a este modelo.
Exposicion en fagos
Bibliotecas de tripletes o dopadas en los grupos de CDR1, CDR2 y CDR3 por separado, se sometieron a rondas de seleccion de fagos como se describio anteriormente contra el antfgeno del TGF-p RII/Fc biotinilado humano durante 4 rondas en concentraciones de 10 nM, 1 nM, 100 pM y 20 pM, respectivamente, o dos rondas de seleccion usando 50 antfgeno 20 pM seguido de antfgeno 2 pM. Las inserciones de las selecciones de fagos se clonaron en el vector de expresion pDOM10, y los sobrenadantes con constantes de velocidad de disociacion mejoradas por encima del
original, se seleccionaron para su estudio posterior. Los anticuerpos de dominio se expresaron y purificaron y se probo su afinidad y bioactividad contra el antfgeno del TGF-p RII/Fc humano en el BIACORE™ T100 y en la prueba del detector de celulas descrito anteriormente (datos no mostrados). La afinidad de los clones seleccionados para el TGFbRII-FC humano, se muestra en la tabla 8.
5 Tabla 8
Muestra
Ka (M-1 .s-1) Kd (s-1) KD (M)
271-101
3,73E+06 0,02014 5,40E-09
271-102
9,35E+06 0,01531 1,64E-09
271-105a*
3,29E+06 0,00747 2,27E-09
271-105b*
3,07E+06 0,007977 2,60E-09
271-106a*
7,39E+06 0,02333 3,16E-09
271-106b*
6,77E+06 0,01947 2,88E-09
271-114
1,04E+07 0,07084 6,80E-09
271-7a*
3,04E+06 0,04193 1,38E-08
271-7b*
2,42E+06 0,04448 1,84E-08
* La designacion “a” y “b” se refiere a sobrenadantes separados procedentes de diferentes colonias de los clones numerados.
Se determino la secuencia de los clones seleccionados con actividad mejorada y a continuacion se muestran las 10 secuencias completas y las secuencias de la CDR.
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-271-21 (SEQ ID n° 29)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGNRTYYADSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQMPGRKWTAKFRWDYWGQGTLVIVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-271-21 (SEQ ID n° 67)
15 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC TCCGGATTCACCTTTACCGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCT CAGCGATTGAGCCGATTGGTAATCGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGAC AATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAA ACAGATGCCGGGCCGGAAGTGGACGGCCAAGTTCCGCTGGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCATCGT 20 CTCGAGC
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-271-22 (SEQ ID n° 30)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGNRTYYADSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQMPGQKWMAKSRFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-271-22 (SEQ ID n° 68)
25 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC TCCGGATTCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCT CAGCGATTGAGCCGATTGGTAATCGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGAC AATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAA ACAGATGCCCGGCCAGAAGTGGATGGCCAAGTCCCGCTTCGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTC 30 TCGAGC
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-271-27 (SEQ ID n° 31)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGQKTYYADSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQIPGRKWTANSRFDYWGQGTLVIVSS
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
GAGGT GCAGCT GTT GGAGTCTGGGGGAGGCTTGGT ACAGCCTGGGGGGTCCCT GCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATTCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCT
CAGCGATTGAGCCGATTGGTCAGAAGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGA
CAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGA
AACAGATTCCGGGGCGTAAGTGGACTGCTAATTCGCGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCATCGTC
TCGAGC
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-271-101 (SEQ ID n° 32)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGNRTYYADSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQIPGRKWTANGRKDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-271-101 (SEQ ID n° 70)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATTCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCT
CAGCGATTGAGCCGATTGGTAATCGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGAC
AATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAA
ACAGATTCCGGGGCGTAAGTGGACTGCTAATGGTCGTAAGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTC
TCGAGC
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-271-102 (SEQ ID n° 33)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGHRTYYADSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQIPGRKWTANSRFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-271-102 (SEQ ID n° 71)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATCCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCT
CAGCGATTGAGCCGATTGGTCATAGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGA
CAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGA
AACAGATTCCGGGGCGTAAGTGGACTGCTAATTCGCGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGT
CTCGAGC
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-271-105 (SEQ ID n° 34)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGNRTYYADSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQIPGQRWTGNSRFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-271-105 (SEQ ID n° 72)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATTCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCT
CAGCGATTGAGCCGATTGGTAATCGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGAC
AATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAA
ACAGATTCCGGGGCAGCGGTGGACTGGTAATTCGCGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTC
TCGAGC
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-271-106 (SEQ ID n° 35)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGNRTYYADSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQFPGRKWTANSRSDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-271-106 (SEQ ID n° 73)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATTCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCT
CAGCGATTGAGCCGATTGGTAATCGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGAC
AATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAA
ACAGTTTCCGGGGCGTAAGTGGACTGCTAATTCGCGGTCTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTC
TCGAGC
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-271-114 (SEQ ID n° 36)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGNRTYYADSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQIPGRKGTANSRFDYWGQGTLVTVSS
GAGGT GCAGCT GTT GGAGTCTGGGGGAGGCTTGGT ACAGCCTGGGGGGTCCCT GCGTCTCTCCTGTGCAGCC TCCGGATTCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCT CAGCGATT GAGCCGATT GGT AATCGT ACAT ACT ACGCAGACTCCGT GAAGGGCCGGTT CACCAT CTCCCGCGAC 5 AATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAA ACAGATTCCGGGGCGTAAGGGAACTGCTAATTCGCGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTC TCGAGC
Tabla 9. Secuencias de la CDR de 271 clones madurados por afinidad con actividad mejorada
CDR1 (Kabat 26-35) CDR2 (Kabat 50-65) CDR3 (Kabat 95-102)
DOM23h-271-
GFTFTEYRMW AIEPIGNRTYYADSVKG QMPGRKWTAKFRWDY
21
(SEQ ID n° 105) (SEQ ID n° 141) (SEQ ID n° 177)
DOM23h-271-
GFTFTEYRMW AIEPIGNRTYYADSVKG QMPGQKWMAKSRFDY
22
(SEQ ID n° 106) (SEQ ID n° 142) (SEQ ID n° 178)
DOM23h-271-
GFTFTEYRMW AIEPIGQKTYYADSVKG QIPGRKWTANSRFDY
27
(SEQ ID n° 107) (SEQ ID n° 143) (SEQ ID n° 179)
DOM23h-271-
GFTFTEYRMW AIEPIGNRTYYADSVKG QIPGRKWTANGRKDY
101
(SEQ ID n° 108) (SEQ ID n° 144) (SEQ ID n° 180)
DOM23h-271-
GSTFTEYRMW AIEPIGHRTYYADSVKG QIPGRKWTANSRFDY
102
(SEQ ID n° 109) (SEQ ID n° 145) (SEQ ID n° 181)
DOM23h-271-
GFTFTEYRMW AIEPIGNRTYYADSVKG QIPGQRWTGNSRFDY
105
(SEQ ID n° 110) (SEQ ID n° 146) (SEQ ID n° 182)
DOM23h-271-
GFTFTEYRMW AIEPIGNRTYYADSVKG QFPGRKWTANSRSDY
106
(SEQ ID n° 111) (SEQ ID n° 147) (SEQ ID n° 183)
DOM23h-271-
GFTFTEYRMW AIEPIGNRTYYADSVKG QIPGRKGTANSRFDY
114
(SEQ ID n° 112) (SEQ ID n° 148) (SEQ ID n° 184)
10 N.B. CDR2 y CDR3 son como fueron definidas por Kabat. CDR1 esta definida por una combinacion de los metodos de Kabat y Chothia.
Metodo generico para la cinetica de union - T100
Se llevo a cabo analisis BIACORE™ usando una superficie de captura sobre un chip CM4. Se utilizo IgG anti - humano como el agente de captura y se acoplo a un chip biodetector CM4 por acoplamiento de aminas primarias. La 15 molecula de antfgeno fusionada al Fc humano fue capturada sobre esta superficie inmovilizada hasta un nivel de 250 a 300 unidades de resonancia, y concentraciones definidas de los anticuerpos de dominio diluidos en tampon corriente se pasaron sobre esta superficie de captura. Una inyeccion de tampon sobre la superficie capturada del antfgeno se uso para doble referencia. Se regenero la superficie capturada, despues de cada inyeccion del anticuerpo de dominio usando una solucion de cloruro de magnesio 3 M; la regeneracion retiro el antfgeno 20 capturado, pero no afecto significativamente la capacidad de la superficie para capturar el antfgeno en un ciclo posterior. Todas las series se llevaron a cabo a 25°C usando tampon de HBS-EP como tampon corriente. Los datos se generaron utilizando el BIACORE™ T100 y se ajustaron al modelo de union 1:1 propio del programa informatico. Cuando se observo union inespecffica a la concentracion maxima, la curva de union a esta concentracion se retiro de la serie de analisis.
25 Diversificacion posterior de la CDR3
Los derivados de DOM23h-271-7 con mayor afinidad contenfan metioninas en las posiciones 96 y 100B. Estas posiciones, junto con las posiciones 99, 100D, 100E y 100G, se diversificaron empleando mutagenia de NNK para
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
determinar si podrfan hacerse las sustituciones. La biblioteca de NNK se construyo como se describio anteriormente usando el cebador PEP-26-F para introducir diversidad en las posiciones seleccionadas en el fondo de DOM23h- 271-22 o DOM23h-271-102. DOM23h-271-102 contiene mutaciones en las posiciones 27 y 55 que confieren afinidad mejorada sobre DOM23h-271-7.
PEP-26-F (SEQ ID n° 209)
GCGGTATATTACTGTGCGAAACAGNNSCCCGGCNNSAAGTGGNNSGCCNNSNNSCGCNNSGACTACTGGGGTC
AGGGAACC
Se construyeron bibliotecas de exposicion en ADN y se seleccionaron sobre hTGFbRII-FC biotinilado como se describio anteriormente usando concentraciones de 5 nM; 0,5 nM; 0,1 nM; 0,1 nM; 0,1 nM; y 0,1 nM en rondas sucesivas. En las rondas de seleccion 4 a 6, el competidor TGFbRII-FC no biotinilado se anadio a una concentracion final de 100 nM durante 60, 90 y 90 minutos, respectivamente, antes de la adicion de estreptavidina C1 DYNAbeads™. Despues de la seleccion, las inserciones del dAb se amplificaron por PCR usando los cebadores PelB NcoVh y PEP011, se cortaron con NcoI y EcoRI y se clonaron en el vector de expresion bacteriano pC10.
PelB NcoVh (SEQ ID n° 210) GCCCAGCCGGCCATGGCGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGG
PEP011 (SEQ ID n° 211) GAATTCGCGGCCGCCTATTAGCTCGAGACGGTGACCAGGG
Los productos clonados fueron expresados y detectados mediante Biacore. Los clones con constantes de velocidad de disociacion similares o mejores que DOM23h-271-22 se secuenciaron, purificaron y evaluaron para afinidad por BIACORE™ y potencia en la prueba del detector de celulas. No se buscaron clones que dieran perfiles de cinetica deficientes, contuvieran motivos de secuencia desfavorables, o dieran rendimientos muy bajos. Se selecciono DOM23h-271-50 para maduracion de la afinidad posterior.
Secuencia de acido nucleico de DOM-271-50 (SEQ ID n° 212)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATCCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCT
CAGCGATTGAGCCGATTGGTCATAGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGA
CAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGA
AACAGGCGCCCGGCGAGAAGTGGCTCGCCCGGGGCCGCTTGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCG
TCTCGAGC
Secuencia de aminoacidos de DOM-271-50 (SEQ ID n° 213 y entrada del duplicado SEQ ID n° 214)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGHRTYYADSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQAPGEKWLARGRLDYWGQGTLVTVSS
Ejemplo 7. Introduccion de mutaciones en las secuencias del dAb del TGFbRII (linaje de DOM23h-271) en las posiciones 61 y 64
Las mutaciones dobles D61N y K64R se han introducido previamente en varios linajes del dAb del TGFRpII, y se ha demostrado que mejoran la potencia (documento WO2011/012609). Estas mutaciones fueron introducidas en los linajes de DOM23h-271 del dAb del TGFbRII para ver si podrfa consegurse una mejora similar en la potencia. Se exploraron mutaciones alternativas en esta posicion para determinar si podrfan conseguirse mas mejoras en la potencia.
Se introdujeron mutaciones en el eje central de DOM23h-271 (SEQ ID n° 199) mediante ampliacion por superposicion usando la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) (Ho, et al., Gene 1989 77(1)); se utilizaron cebadores oligonucleotfdicos complementarios para generar dos fragmentos de ADN que tenfan extremos superpuestos o complementarios. Estos fragmentos se combinaron en una PCR de montaje posterior en la que los extremos superpuestos se hibridan, permitiendo que el superposicion en 3' de cada cadena sirva como cebador para la ampliacion 3' de la cadena complementaria, y el producto de fusion resultante sea amplificado mas mediante PCR. Se introdujeron alteraciones especfficas en la secuencia de nucleotidos incorporando cambios de nucleotidos en los cebadores oligonucleotfdicos superpuestos. Los fragmentos del gen del dAb objetivo se amplificaron mediante dos PCR por separado utilizando la polimerasa SUPERTAQ™ (HT Biotechnology). Se selecciono DOM23h -271, ya que tiene una baja afinidad por TGFbRII, de modo que las mejoras en la afinidad fueran claramente mensurables usando BIACORE™. Las mutaciones en las posiciones 61 y 64 se codificaron usando un oligonucleotido degenerado que muta ambas posiciones en combinacion, con la intencion de utilizar seleccion por afinidad para enriquecer los mutantes con afinidad de union mejorada. Puesto que se sabe que la mutacion NR domina esta mutacion, se evito en la biblioteca usando un codon restringido, NNG, en la posicion 61. Este codon codifica 13 aminoacidos, pero no incluye los aminoacidos F, Y, C, H, I, N o D. La Cys libre no estaba favorecida dentro de un dAb, y la asparagina tampoco se deseaba en esta posicion, de modo que solo se excluyeron 5 combinaciones de aminoacido deseables. En la posicion 64, se uso un codon NNK para proporcionar la gama completa de aminoacidos posibles.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Los pares de oligonucleotidos usados para introducir las mutaciones fueron PE008 (flanquea el inicio 5' del gen del dAb: 5'- TTGCAGGCGTGGCAACAGCGTCGACAGAGGTGCAGCTGTTGGAG-3') (SEQ ID n° 192) con 271-6164 R (5’-GCGTAGTATGTACGATTACCAATCGG-3') (SEQ ID n° 193) y 271-6164 deg-F mutado (restos mutados subrayados: 5’-GGTAATCGTACATACTACGCANNGTCCGTGNNKGGCCGGTTCACCATCTCCCGC-3’) (SEQ ID n° 194) con AS1309 (flanquea el extremo 3’ del gen del dAb: 5’-
TGTGTGTGTGTGGCGGCCGCGCTCGAGACGGTGACCAGGGTTCCCTGACCCCA-3’) (SEQ ID n° 195). Los dos fragmentos de PCR se recombinaron en una PCR de montaje usando la ADN polimerasa SUPERTAQ™ sin la adicion de cebadores. El producto de fusion se amplified a continuacion mediante la adicion de los cebadores flanqueantes PE008 y AS1309 a la reaccion de PCR. El dAb mutado se digerio con las endonucleasas de restriccion Sal I y Not I, se ligo en el vector de expresion pDOM13 cortado de igual manera y se transformo en celulas HB2151 de E. coli. La mutacion en D61N, K64R se introdujo tambien en DOM23h-271 de la misma manera, pero sustituyendo el cebador 271-6164 NR-F (5’-
GGTAATCGTACATACTACGCAAACTCCGTGCGCGGCCGGTTCACCATCTCCCGC-3’) (SEQ ID n° 196) por 2716164 deg-F. Los dAb mutados se identificaron por secuenciacion. Se identificaron 129 clones con combinaciones novedosas de mutaciones en la posicion 61 y 64, aunque 11 llevaban mutaciones adicionales procedentes de errores de la PCR. Estos se muestran en la tabla 11. Los clones con afinidad aumentada estan subrayados. Los clones con mutaciones adicionales estan indicados con asteriscos.
Para determinar el efecto de las mutaciones, los clones seleccionados se expresaron en TB ONEX™ en placas de 96 pocillos durante 72 horas a 30°C o 24 horas a 37°C. Los sobrenadantes se clarificaron por centrifugacion y se filtraron a traves de un filtro de 0,22 pm antes de la evaluacion de la constante de velocidad de disociacion por BIACORE™.
Se llevo a cabo el analisis BIACORE™ A100 utilizando una superficie de captura sobre un chip CM5. Se uso IgG anti-humano como agente de captura, y se acoplo a un chip biodetector cM5 mediante acoplamiento de aminas primarias. La molecula de antfgeno fusionada con el Fc humano se capturo sobre esta superficie inmovilizada hasta un nivel de 200 a 300 unidades de resonancia, y los sobrenadantes o los anticuerpos de dominio purificados se pasaron sobre esta superficie capturada. Una inyeccion de medio o tampon sobre la superficie capturada del antfgeno se uso para doble referencia. En cada celda de flujo, una mancha de protefna A permitio confirmar la presencia del anticuerpo de dominio en cada muestra inyectada. Se regeneraron las superficies, despues de cada inyeccion de anticuerpo de dominio usando una solucion de cloruro de magnesio 3 M; la regeneracion retiro el antfgeno capturado, pero no afecto significativamente la capacidad de la superficie para capturar el antfgeno en un ciclo posterior. Todas las series se llevaron a cabo a 25°C usando tampon de HBS-EP como tampon de la serie. Los datos se generaron usando el BIACORE™ T100 y se analizaron usando su programa informatico propio. Las cineticas de las muestras purificadas se ajustaron al modelo de union 1:1 mientras las constantes de velocidad de disociacion del sobrenadante se analizaron usando el modelo de disociacion 1:1 y/o usando el nivel de union y el nivel de estabilidad de cada muestra en comparacion con la molecula original.
De los clones probados, se identificaron 46 con constante de velocidad de disociacion mejorada en comparacion con el dAb de DOM23h-271 original, como se indica en la tabla 11. Se encontro que las mutaciones D61R y D61K aumentan la union independientemente de las mutaciones en la posicion 64. Varias combinaciones parecieron ser mejores que las mutaciones D61N, K64R originales, y estas incluyeron RE, RM, RF y RY.
Una seleccion de mutantes con constante de velocidad de disociacion mejorada se purifico y se sometio a analisis de cinetica BIACORE™ A100 completo, para determinar su afinidad (tabla 10). La estabilidad termica de los mutantes se determino tambien mediante la generacion de curvas de fusion en presencia de SYPRO™ Orange (Invitrogen). En resumen, los dAb purificados se diluyeron hasta 50 y 100 pg/ml en una dilucion 1:500 de SYPRO™ Orange en PBS, y se sometieron a una curva de fusion de 30 a 90°C en una maquina de PCR Mini OPTICON™ (BioRad). La Tm de la transicion positiva mayor se determino a cada concentracion y se uso para calcular un valor de Tm estimado en 1 mg/ml como una indicacion de la temperatura de fusion por comparacion (tabla 10).
Se seleccionaron las mutaciones D61R, K64D y D61R, K64F, ya que tenfan una buena mejora en afinidad por un impacto reducido en la Tm. Estas mutaciones se transfirieron a un derivado de DOM23h-271 madurado por afinidad, DOM23h-271-22 (SEQ ID n° 30), para obtener el DOM23h-271-39 (SEQ ID n° 37) y DOM23h-271-40 (SEQ ID n° 38) de los dAb. Se descubrio que estas mutaciones dan una mejora en afinidad mediante BIACORE™ como por ejemplo la reactividad cruzada con el TGFbRIIFc murino, y la potencia aumentada mediante la prueba del detector de celulas. Sin embargo, se descubrio ademas que las mutaciones reducen la Tm medida por DSC, y aumentan la agregacion de los dAb en PBS, medida por SEC MALLS. Estas pruebas se llevaron a cabo como se describio anteriormente, salvo que el tampon para SEC MALLS fue NaCl 0,4 M, fosfato de sodio 0,1 M e isopropanol a 10%, pH 7. Estos resultados se resumen en la tabla 12 (se dan los valores promedio para la prueba del detector de celulas humanas y la prueba de luciferasa 3T3 en raton).
A continuacion se dan las secuencias de los dAb citados en este ejemplo:
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-271-39 (SEQ ID n° 37)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGNRTYYARSVDGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQMPGQKWMAKSRFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-271-39 (SEQ ID n° 75)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC TCCGGATTCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCT 5 CAGCGATTGAGCCGATTGGTAATCGTACATACTACGCACGCTCCGTGGACGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGA CAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGA AACAGATGCCCGGCCAGAAGTGGATGGCCAAGTCCCGCTTCGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGT CTCGAGC
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-271-40 (SEQ ID n° 38)
10 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGNRTYYARSVFGRFTISRDNSK NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQMPGQKWMAKSRFDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-271-40 (SEQ ID n° 76)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC TCCGGATTCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCT 15 CAGCGATTGAGCCGATTGGTAATCGTACATACTACGCACGCTCCGTGTTCGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGAC AATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAA ACAGATGCCCGGCCAGAAGTGGATGGCCAAGTCCCGCTTCGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTC TCGAGC
Tabla 10
Descripcion
Mutacion Tm estimada 1 mg/ml KD (nM)
1A2
RA 53,08 2,24
1D9
RD 52,35 1,17
3F11
RE 53,08 3,27
1G11
RM 51,81 0,97
3C9
RF 54,08 1,39
1E6
RY 49,62 1,17
1B11
RV 53,41 1,88
3D9
KG 48,69 4,34
1D5
KF 48,09 3,69
3D4
KT 54,74 4,26
1H11
LW 53,68 4,17
1B2
VW 52,68 1,79
2C12
NR 51,49 3,34
271
DK 58,21 N/D
20
N.B. La mutacion corresponde a “XY”, en donde X es la posicion 61 e Y es la posicion 64.
61\64
A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V
A
1D6* 1C10 3B11 3C10* 3B10 1A12 3G3*
R
1A2 1 A3 3F4 1D9 2C4 1A8 3F11 3G8 1A4 3C2 1G11 3C9* 2F5 1H1 1H2 1E6 1B11
N
2C12
D
3H6 (wt)
C
Q
1B6* 1E8 1B10 1H12 1D11 1C8 3F7 2C10
E
2A3 1F12 2G4 3H7 1F10 2B11 3D6
G
1D1 1B5 3B12 1E5 3G11 3D12 2B6 2G5 2D5
H
I
L
1D2 3E11 2A9 1B4 1H3 1A9 1F1 1G9 1H10 1C9 2C9 1H5 1G2 1E4 1H11
K
2E5 2B4 3D9 3E12 1D5 1G7 2E9* 3D4 1B1 1F2
M
1G6 2D3* 1E7 2E6 3C12 2F6 3H1 3B5* 1A6 1E11 3B8*
F
P
2A8 1A5 2C11 3H2 1G5 3G12
S
3C3 3E7 3E5 1H4 2B10 1C11 1B7 2C8 3B1 3D5
T
1E3 1D10* 2C1 1C1 2A5 3G9 2H10 2A4 3D11
W
2F10 1E12 2C2 2A2 2A6 1D4 3B2 2B1
Y
V
1C12 2B9 1H6 1D3* 3C1 2G2 2F7 1F7 2H4 3C7 1B2 2G6
Los clones con constante de velocidad de disociacion mejorada estan subrayados. Los clones con mutaciones adicionales se indican mediante asteriscos.
Mutacion Detector de celulas humanas Prueba de luciferasa en celulas 3T3 de raton TGFbRII humano TGFbRII de cynomolgus TGRbRII de raton Tm (DSC) Agregacion (SEC-MALLS)
CI50 (nM) CI50 (nM) KD (pM) KD (pM) KD (pM)
DOM23h-271- 22
39,01 >17.780 202,00 225,00 60 91,8% de monomero 8,2% de dimero
DOM23h-271- 39
RD 1,17 11.120 14,90 24,00 1.780,00 57,5 51,6% eq. de M/D 38,5% eq. de D/T + agregados
DOM23h-271- 40
RF 0,53 1.200 9,99 11,25 548,50 55,6 91,6% eq. de M/D 8,4% de trimero/ oligomero
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Ejemplo 8 Maduracion por afinidad mediante la diversificacion de la CDR de los linajes DOM23h-439-20, DOM23h- 843-13, DOM23h-855-21 y DOM23h-271-50
Se aislaron los anticuerpos de dominio DOM23h-855-21(SEQ ID n° 204) y DOM23h-843-13 (SEQ ID n° 206) de la maduracion de la afinidad propensa a error llevada a cabo en los clones sin tratamiento previo DOM23h-855 (SEQ ID n° 13) y DOM23h-843 (sEq ID n° 10), respectivamente, como se detalla en el ejemplo 5. El anticuerpo de dominio DOM23h-439 se aislo de bibliotecas de fagos en una campana de seleccion previa descrita en el documento WO 2011/012609 y el DOM23h-439-20 variante (SEQ ID n° 208) se aislo posteriormente mediante maduracion de la afinidad propensa a error como se detalla en el ejemplo 5. Se genero el anticuerpo de dominio DOM23h-271-50 (SEQ ID n° 214) por re-diversificacion de la CDR3 de la variante DOM23h-271-22 (SEQ ID n° 30) madurada de afinidad dirigida por la CDR como se detalla en el ejemplo 6. Se seleccionaron DOM23h-855-21, DOM23h-843-13, DOM23h-439-20 y DOM23h-271-50 para mas maduracion de la afinidad basandose en su cinetica de union, potencia en la prueba del detector de celulas HEK 293T SBE-bla, secuencia y comportamiento bioffsico. Se llevo a cabo la maduracion de la afinidad usando mutagenia degenerada para rediversificar las CDR, y las secuencias principales mejoradas se identificaron usando exposicion en fagos. Se introdujo diversidad en las CDR mediante la construccion de bibliotecas dopadas o de NNK.
DOM23h-271-50 maduro la afinidad usando bibliotecas de NNK (mutagenia de saturacion), se disenaron oligonucleotidos cebadores para cubrir cada CDR, y en cada cebador los codones para 5 aminoacidos fueron reemplazados por codones de NNK, de modo que 5 posiciones sean diversificadas simultaneamente. Se usaron oligonucleotidos individuales o multiples para cubrir todos los aminoacidos elegidos como objetivo en cada CDR; 1 para la CDR1, 2 para la CDR2 y 3 para la CDR3. Se consiguio la maduracion de la afinidad dirigida por la CDR utilizando la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR); se utilizaron cebadores oligonucleotfdicos complementarios para amplificar un fragmento de secuencia que contenfa cada CDR mutada, y tambien un fragmento de secuencia superpuesto que cubre el resto de la secuencia que codifica el dAb. Estos fragmentos se mezclaron y se ensamblaron mediante PCR con superposicion de la ampliacion por corte y empalme para producir la secuencia codificante del dAb completa. Este producto se amplifico por PCR usando los cebadores PelB NcoVh (SEQ ID n° 210) y PEP044 (5'-
GGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCGGCCGCATAATAAGAATTCA-3' SEQ ID n° 215), se digerio con NcoI y NotI y se ligo en el vector hfbrido pDOM4-gene3-pelB digerido con NotI y NcoI. El vector hfbrido pDOM4-gene3-pelB es una version modificada del vector pDOM4 descrito anteriormente, pero se ha modificado para reemplazar la secuencia principal GAS por el peptido senal pelB (pectato liasa B).
Los anticuerpos de dominio DOM23h-855-21, DOM23h-843-13 y DOM23h-439-20 maduraron la afinidad usando bibliotecas dopadas. Las bibliotecas dopadas se construyeron esencialmente como se describio anteriormente y en el documento WO2006018650. Un solo cebador oligonucleotfdico degenerado se utilizo para cubrir todas las mutaciones en cada CDR. En cada cebador, los aminoacidos a ser diversificados se especificaron empleando codones degenerados que codifican varios aminoacidos. Se empleo la siguiente codificacion degenerada: 'a' = 85% de A + 5% de T + 5% de G + 5% de C; 'g' = 85% de G + 5% de T + 5% de C + 5% de A; 'c' = 85% de C + 5% de T + 5% de G + 5% de A; 't' = 85% de T + 5% de A + 5% de G + 5% de C; 'S' = 50% de G y 50% de C. Las letras mayusculas indican 100% del nucleotido especificado. Para la biblioteca dopada de DOM23h-439-20 se diversificaron cinco aminoacidos en la CDR1, 6 en la CDR2 y 11 en la CDR3 para incluir la fenilalanina en la posicion 100. Para la biblioteca dopada de DOM23h-855-21 se diversificaron cinco aminoacidos en la CDR1, 7 en la CDR2 y 8 en la CDR3. Para la biblioteca dopada de DOM23h-843-13 se diversificaron cinco aminoacidos en la CDR1, 6 en la CDR2 y 8 en la CDR3, la posicion 94, antes de la CDR3 se diversifico tambien introduciendo el codon VRK. Para cada uno de los dAb, se construyeron 4 bibliotecas dopadas, una para diversificar la CDR1, una para diversificar la CDR2, una para diversificar la CDR3, y una cuarta cuando todas las CDR fueron diversificadas. Los cebadores degenerados de la biblioteca se usaron de la misma manera que los cebadores de tripletes. Cada CDR diversificada se amplifico por separado y a continuacion se combino con un fragmento de secuencia original usando superposicion de ampliacion por corte y empalme, y el producto completo se amplifico usando los cebadores PelB NcoVh (SEQ ID n° 210) y DOM173 (SEQ ID n° 188). Los fragmentos se subclonaron con el vector hfbrido pDOM4- gene3-pelB utilizando NcoI y NotI.
Secuencias del cebador degenerado:
23h-439-20 CDRH1 (SEQ ID n° 216)
5'-GCAGCCTCCGGATTCACCTTTggSacSgagcagATGtggTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG-3'
23h-439-20 CDRH2 (SEQ ID n° 217)
5'-AAGGGTCTAGAGTTTGTCTCAcgSATTgattcSccSGGTggScgSACATACTACGCAGACTCCGTG-3'
23h-439-20 CDRH3 (SEQ ID n° 218)
5'-GCGGTATATTACTGTGCGAAAcgScatgcSgcSggSgtStcSggSacStaYtttGACTACTGGGGTCAGGGAACC-3' 23h-843-13 CDRH1 (SEQ ID n° 219)
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5'-GCAGCCTCCGGATTCACCTTTgatcaggatcgSATGtggTGGGTCCGCCAGGCCCCAGGG-3'
23h-843-13 CDRH2 (SEQ ID n° 220)
5'-AAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAgcSATTgagtcSggSGGTcatcgSACATACTACGCAGACTCCGTG-3'
23h-843-13 CDRH3 (SEQ ID n° 221)
5'-ACCGCGGTATATTACTGTGCGVRKcagaataagtcSggScgStcSggSTTTGACTACTGGGGTCAGGGA-3'
23h-855-21 CDRH1 (SEQ ID n° 222)
5'-GCAGCCTCCGGATTCACCTTTgagaatacStcSATGggSTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG-3'
23h-855-21 CDRH2 (SEQ ID n° 223)
5'-AAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAcgSATTgatccSaagGGTtcScatACATACTACacSGACTCCGTG-
AAGGGCCGGTTCACC-3'
23h-855-21 CDRH3 (SEQ ID n° 224)
5'-GCGGTATATTACTGTGCGAAAcagcgSgagctSggSaagtcStaYTTTGACTACTGGGGTCAGGGA-3'
H1-271-43 R (SEQ ID n° 225)
5'-GCAGCCTCCGGATT CACCTTTNN KNNKNNKNN KATGNNKTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTC-3' H2p1-271-43F (SEQ ID n° 226)
5'-CCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCTCANNKATTNNKNNKNNKGGTNNKCGTACATACT-
ACGCAGACTCCG-3'
H2p2-271-43 F (SEQ ID n° 227)
5'-CCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGT CTCGAGT GGGTCTCAGCGATT GAGNNKNNKNNKNNKNN KACATAC- TACGCAGACTCCG-3'
H3p1-271-43 F (SEQ ID n° 228)
5'-ACCGCGGT AT ATT ACTGTGCGAAANNKN NKNNKNNKNNKAAGTGGAT GGCCGTGGGCCGCTTGGACT AC- TGGGGTCAGGG-3'
H3p2-271-43 F (SEQ ID n° 229)
5'-ACCGCGGT AT ATT ACTGTGCGAAACAGAAGCCCNN KNNKNNKNNKNNKGCCGTGGGCCGCTTGGACT ACT G- GGGTCAGGG-3'
H3p3-271-43 F (SEQ ID n° 230)
5'-ACCGCGGT AT ATT ACTGTGCGAAACAGAAGCCCGGCCAGAAGT GGNN KNNKNNKNNKNNKTTGGACTACTG- GGGTCAGGG-3'
Exposicion en fagos:
Las bibliotecas de NNK o dopadas en los grupos de la CDR1, la CDR2 y la CDR3 por separado y de la CDR1, 2 y 3 combinados, se sometieron al menos a 6 rondas de seleccion contra el antfgeno del TGF-p RII 100 nM, 10 nM, 1 nM, 1 nM, 0,1 nM y 0,1 nM monomerico biotinilado humano (rondas 1, 2, 3, 4, 5 y 6, respectivamente) como
se describio en el ejemplo 1, con la siguiente desviacion para la etapa de bloqueo; el fragmento Fc de IgG humana que se anadio previamente en el ejemplo 1 se omitio y la etapa de bloqueo se realizo durante un mfnimo de 20 minutos. En las rondas 4 y 6 de seleccion, se introdujo competencia mediante incubacion con el antfgeno no biotinilado 100 nM durante 30 minutos (rondas 4 y 6) despues de la etapa de incubacion con el antfgeno marcado. Para DOM 23h-439-20 (CDR1, CDR3 y grupos combinados) y DOM 23h-855-21 (CDR3), se llevo a cabo una septima ronda de seleccion contra el antfgeno del TGF-p RII 0,1 nM monomerico humano biotinilado y competencia a 100 nM durante 120 minutos o el antfgeno del TGF-p RII 20 pM monomerico humano biotinilado con competencia a 100 nM durante 30 minutos. El fago se amplifico entre las rondas de seleccion por centrifugacion de un cultivo durante la noche de celulas TG1 infectadas con el fago durante 30 minutos a 4.000 g. Se anadieron 40 ml del sobrenadante que contenfa al fago amplificado a 10 ml de PEG/NaCl (PEG 8000 al 20% en v/p + NaCl 2,5 M), y se incubaron sobre hielo durante 60 minutos. Las muestras se centrifugaron durante 40 minutos a 4.000 g para sedimentar el fago precipitado. El sobrenadante se desecho, y el sedimento de fagos se volvio a poner en suspension en 1 ml de glicerol al 15%/PBS en v/v. La muestra de fagos se transfirio a tubos Eppendorf de 2 ml y se
5
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15
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55
centrifugo durante 10 minutos para retirar cualquier residuo celular bacteriano restante. Los genes del Vh del anticuerpo de dominio diversificados de las selecciones de fagos se amplificaron por PCR usando los cebadores PEP01 IVHStopNotIR (5'-CCCTGGTCACCGTCTCGAGCTAATAGGCGGCCGCGAATTC-3' (SEQ ID n° 231) y Nco1 VH F (5'-TATCGTCCATGGCGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGG-3' (SEQ ID n° 232), se digerieron con las endonucleasas de restriccion Ncol y Notl y se ligaron en el vector pC10 tambien digerido con Ncol y Notl. pC10 es un vector plasmido basado en el vector pUC119, con expresion bajo el control de un activador LacZ mejorado disenado para la expresion soluble de los dAb. La expresion de los dAb en el sobrenadante esta activada por la fusion del gen de los dAb con el peptido senal pEIB en el extremo terminal N. Los productos de ligadura se transformaron en celulas HB2151 de E. coli qufmicamente competentes y se sembraron en placas de agar-agar nutritivo enriquecido con 100 pg/ml de carbenicilina. Cada uno de los clones se seleccionaron y expresaron en medio de autoinduccion rapida durante la noche (sistema de expresion de protefnas de alto nivel, Novagen), se enriquecieron con 100 pg/ml de carbenicilina en placas de 96 pocillos y se cultivaron con agitacion a 250 rpm durante 66 horas a 30°C o 24 horas a 37°C. Las placas de expresion se centrifugaron a continuacion a 3.500 g durante 15 minutos y los sobrenadantes se filtraron usando placas de filtracion de 0,45 p (Millipore). Los sobrenadantes que conteman los anticuerpos de dominio se detectaron en el BIACORE™ B4000 contra el TGF-p Rll humano y el TGF-p RII/Fc humano, para determinar la constante de velocidad de disociacion (Kd) (datos no mostrados). Los antfgenos biotinilados se capturaron sobre un chip de AS segun las instrucciones del fabricante, se llevo a cabo el analisis a 25°C usando tampon de HBS-EP. Las muestras se introdujeron en el BIACORE™ a un caudal de 30 pl/min. Se consiguio la regeneracion del chip usando glicina a bajo pH. Los datos (no mostrados) se analizaron para la constante de velocidad de disociacion ajustando la fase de disociacion al modelo de disociacion 1:1 propio del programa informatico, se analizo tambien la union a protefna A en los sobrenadantes para estimar los niveles de expresion. Los anticuerpos de dominio con constantes de velocidad de disociacion mejoradas por encima del original se seleccionaron para estudio posterior. Los clones mejorados se expresaron en medio de autoinduccion rapida durante la noche (ONEX™, Novagen) enriquecido con 100 pg/ml de carbenicilina y antiespumante (Sigma) a 30°C durante 48 a 72 horas con agitacion a 250 rpm. Los cultivos se centrifugaron (4.200 rpm durante 40 minutos) y los sobrenadantes se incubaron con perlas de STREAMLINE™-protefna A (Amersham Biosciences, gE HEALTHCARE™, Reino Unido. Capacidad de union: 5 mg de dAb por ml de perlas), a 4°C o a temperatura ambiente durante por lo menos una hora. La columna de cromatograffa se relleno con las perlas y se lavo con PBS, seguido de Tris-HCl 10 mM pH 7,4 (Sigma, Reino Unido). Los dAb unidos se eluyeron con glicina-HCl 0,1 M, pH 2,0 y se neutralizaron con Tris-HCl 1 M, pH 8,0. La DO a 280 nm de los dAb se midio y se determinaron las concentraciones de protefna utilizando los coeficientes de extincion calculados a partir de las composiciones de aminoacidos de los dAb. Los anticuerpos de dominio madurado de afinidad se probaron en el BIACORE™ T200 (los datos para dos dAb preferidos se muestran en el ejemplo 9) y en la prueba del sensor de celulas SBE-bla HEK 293T (los datos para dos dAb preferidos se muestran en el ejemplo 11) para determinar su afinidad y potencia. Se determinaron propiedades bioffsicas incluidas la estabilidad termica y el estado en solucion usando calorimetrfa de barrido diferencial (DSC) y cromatograffa de exclusion por tamano con dispersion de luz de laser de angulos multiples (SEC-MALLS) (los datos para dos dAb preferidos se muestran en el ejemplo 10).
Se muestran a continuacion las secuencias de aminoacidos y de acido nucleico de los dAb del TGFRll anti-humano DOM23h-439-20 y DOM23h-271-50 madurados por afinidad.
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-439-25 (SEQ lD n° 233)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATTCACCTTTGGGACGGAGCAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTTTGTCT
CACGTATTGATTCGCCTGGTGGGAGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGA
CAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGA
AACGGCGACCCACGGGGGTGTCCGGGACGTTTTATGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAG
C
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-439-25 (SEQ lD n° 234)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRlDSPGGRTYYADSVKGRFTlSRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-271-123 (SEQ lD n° 235)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATCCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCT
CAGCGATTGAGCCGATTGGTCATAGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGA
CAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGA
AACAGGCGCCCGGCGAGAAGTGGGCGAGGCGGTGGGATTTGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCG
TCTCGAGC
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-271-123 (SEQ lD n° 236)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAlEPlGHRTYYADSVKGRFTlSRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQAPGEKWARRWDLDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-439-35 (SEQ ID n° 237)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC TCCGGATTCACCTTTGGGACCGATCAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTTTGTCT 5 CACGCATTGATTCCCCCGGTGGGCGGACATACTACGCAAACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGA CAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGA AACGGCAGCCGGCGGGGGTGTCGGGGAAGTACGTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGA GC
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-439-35 (SEQ ID n° 238)
10 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTDQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYANSVKGRFTISRDNSK NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRQPAGVSGKYVDYWGQGTLVTVSS
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-271-129 (SEQ ID n° 239)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC TCCGGATCCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCT 15 CAGCGATTGAGCCGATTGGTCATAGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGA CAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGA AACAGGCGCCCAATCAGAGGTATGTTGCCCGGGGCCGCTTGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGT CTCGAGC
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-271-129 (SEQ ID n° 240)
20 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGHRTYYADSVKGRFTISRDNSK NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQAPNQRYVARGRLDYWGQGTLVTVSS
Las CDR definidas por Kabat de estas secuencias principales de afinidad del dAb del TGFRII anti-humano se muestran en la tabla 13.
Tabla 13. Secuencias de la CDR de los dAb del TGFpRII anti-humano madurados por afinidad
CDR1 (Kabat 26-35) CDR2 (Kabat 50-65) CDR3 (Kabat 95-102)
DOM23h- 271-123
GSTFTEYRMW (SEQ ID n°241) AIEPIGHRTYYADSVKG (SEQ ID n° 242) QAPGEKWARRWDLDY (SEQ ID n° 243)
DOM23h- 271-129
GSTFTEYRMW (SEQ ID n° 244) AIEPIGHRTYYADSVKG (SEQ ID n° 245) QAPNQRYVARGRLDY (SEQ ID n° 246)
DOM23h- 439-25
GFTFGTEQMW (SEQ ID n° 247) RIDSPGGRTYYADSVKG (SEQ ID n° 248) RRPTGVSGTFYDY (SEQ ID n° 249)
DOM23h- 439-35
GFTFGTDQMW (SEQ ID n° 250) RIDSPGGRTYYANSVKG (SEQ ID n° 251) RQPAGVSGKYVDY (SEQ ID n° 252)
25
Modificacion posterior de la secuencia de nucleotidos de DOM23h-439-25 y DOM23h-271-123
Las mutaciones D61N y K64R descritas en el ejemplo 7 se introdujeron en los dAb madurados por afinidad DOM23h-439-25, DOM23h-271-123 y DOM23h-271-129 en combinacion o por separado. La introduccion de una mutacion V48I en los dAb de DOM23h-439-25 y DOM23h-271-123 se probo tambien para determinar si podrfan 30 conferir mejoras en potencia. Se observo mutacion espontanea en la posicion 48 de Kabat en numerosos dAb mejorados del linaje DOM23h-439 tanto despues de la prueba de maduracion como de la maduracion de la afinidad dirigida por la CDR. Una alanina en el extremo terminal C de la region Vh, inmediatamente despues del resto 113 de Kabat se anadio tambien a DOM23h-439-25, DOM23h-271-123 y DOM23h-271-129 y todas las variantes de estos dAb con las mutaciones mencionadas anteriormente. Las mutaciones se introdujeron en los ejes centrales de 35 DOM23h-439-25 (SEQ ID n° 234), DOM23h-271-123 (SEQ ID n° 236) y DOM23h-271-129 (SEQ ID n° 240) mediante ampliacion por superposicion usando la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) esencialmente como se describio en el ejemplo 7. Se introdujeron mutaciones especfficas en la secuencia de nucleotidos incorporando cambios de nucleotidos en los cebadores oligonucletfdicos superpuestos, la insercion de la alanina en el extremo de la region Vh se logro usando un oligonucleotido en 3' disenado para incorporar el resto de alanina de spues de la 40 posicion 113 de Kabat.
Se usaron los siguientes oligonucleotidos para introducir las mutaciones (los restos mutados estan subrayados):
5
10
15
20
25
30
35
40
45
439 48I SDM F (SEQ ID n° 253)
5'-GGGTCTAGAGTTTATTTCACGTATTGATTCGCC-3'
439 61N SDM F (SEQ ID n° 254)
5'-GGGAGGACATACTACGCAAACTCCGTGAAGGGCCGG-3'
439 64R SDM F (SEQ ID n° 255)
5'-CGCAGACTCCGTGCGTGGCCGGTTCACC-3'
439 61N 64R SDM F (SEQ ID n° 256)
5'-GGGAGGACATACTACGCAAACTCCGTGCGTGGCCGGTTCACC-3'
271 61N SDM F (SEQ ID n° 257)
5'-GGACATACTACGCAAACTCCGTGAAGGGCCGG-3'
271 64R SDM F (SEQ ID n° 258)
5'-CGCAGACTCCGTGCGTGGCCGGTTCACC-3'
271 61N 64R SDM F (SEQ ID n° 259)
5'-GGACATACTACGCAAACTCCGTGCGTGGCCGGTTCACC-3'
567 +A rev (flanquea el extremo 3' del gen de la Vh del dAb) (SEQ ID n° 260) 5'-CCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCGTAATAAGCGGCCGCAGATTA-3'
21-23 Fwd (flanquea el extremo 5' del gen de la Vh del dAb) (SEQ ID n° 261) 5'-ATAAGGCCATGGCGGAGGTGCAGCTGTTGGAGT CT G-3'
Para determinar el efecto de las mutaciones los dAb se expresaron en TB ONEX™ enriquecido con 100 pg/ml de carbenicilina y antiespumante (Sigma) a 30°C durante 72 horas con agitacion a 250 rpm. Los cultivos se centrifugaron (4.200 rpm durante 40 minutos), y los dAb se purificaron por afinidad usando perlas de STREAMLINE™-protema A (Amersham Biosciences, GE HEALTHCARE™, Reino Unido) como anteriormente. La afinidad y la potencia de las variantes de los anticuerpos de dominio se determinaron en el BIACORE™ T200 (los datos para los dAb preferidos se muestran en el ejemplo 9) y en la prueba del detector de celulas HEK 293T SBE- bla (los datos para los dAb preferidos se muestran en el ejemplo 11).
Se dan a continuacion las secuencias de aminoacidos y de acido nucleico de los dAb del TGFRII anti-humano DOM23h-439-25 (SEQ ID n° 234) y DOM23h-271-123 (SEQ ID n° 236) modificados para incluir la alanina del terminal C y las mutaciones D61N, K64R o V48I:
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-439-40 (DOM23h-439-25 + alanina del terminal C) (SEQ ID n° 262)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATTCACCTTTGGGACGGAGCAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTTTGTCT
CACGTATTGATTCGCCTGGTGGGAGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGA
CAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGA
AACGGCGACCCACGGGGGTGTCCGGGACGTTTTATGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAG
CGCG
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-439-40 (DOM23h-439-25 + alanina del terminal C) (SEQ ID n° 263)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSA
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-439-41 (DOM23h-439-25 + alanina del terminal C + 48I) (SEQ ID n° 264)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATTCACCTTTGGGACGGAGCAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTTTATTT
CACGTATTGATTCGCCTGGTGGGAGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGA
CAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGA
AACGGCGACCCACGGGGGTGTCCGGGACGTTTTATGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAG
CGCG
5
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20
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35
40
45
50
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-439-41 (DOM23h-439-25 + alanina del terminal C + 48I) (SEQ ID n° 265)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFISRIDSPGGRTYYADSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSA
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-439-42 (DOM23h-439-25 + alanina del terminal C + 61N) (SEQ ID n° 266)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATTCACCTTTGGGACGGAGCAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTTTGTCT
CACGTATTGATTCGCCTGGTGGGAGGACATACTACGCAAACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGA
CAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGA
AACGGCGACCCACGGGGGTGTCCGGGACGTTTTATGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAG
CGCG
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-439-42 (DOM23h-439-25 + alanina del terminal C + 61N) (SEQ ID n° 267)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYANSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSA
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-439-43 (DOM23h-439-25 + alanina del terminal C + 64R) (SEQ ID n° 268)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATTCACCTTTGGGACGGAGCAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTTTGTCT
CACGTATTGATTCGCCTGGTGGGAGGACATACTACGCAGACTCCGTGCGTGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGA
CAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGA
AACGGCGACCCACGGGGGTGTCCGGGACGTTTTATGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAG
CGCG
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-439-43 (DOM23h-439-25 + alanina del terminal C + 64R) (SEQ ID n° 269)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADSVRGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSA
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-439-44 (DOM23h-439-25 + alanina del terminal C + 61N64R) (SEQ ID n°
270)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATTCACCTTTGGGACGGAGCAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTTTGTCT
CACGTATTGATTCGCCTGGTGGGAGGACATACTACGCAAACTCCGTGCGTGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGA
CAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGA
AACGGCGACCCACGGGGGTGTCCGGGACGTTTTATGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAG
CGCG
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-439-44 (DOM23h-439-25 + alanina del terminal C + 61N64R) (SEQ ID n°
271)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYANSVRGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSA
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-271-130 (DOM23h-271-123 + alanina del terminal C) (SEQ ID n° 272)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATCCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCT
CAGCGATTGAGCCGATTGGTCATAGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGA
CAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGA
AACAGGCGCCCGGCGAGAAGTGGGCGAGGCGGTGGGATTTGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCG
TCTCGAGCGCG
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-271-130 (DOM23h-271-123 + alanina del terminal C) (SEQ ID n° 273)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGHRTYYADSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQAPGEKWARRWDLDYWGQGTLVTVSSA
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-271-131 (DOM23h-271-123 + alanina del terminal C + 61N) (SEQ ID n° 274)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATCCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCT
CAGCGATTGAGCCGATTGGTCATAGGACATACTACGCAAACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGAC
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
AATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAA ACAGGCGCCCGGCGAGAAGTGGGCGAGGCGGTGGGATTTGGACTACT GGGGTCAGGGAACCCT GGTCACCGT CTCGAGCGCG
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-271-131 (DOM23h-271-123 + alanina del terminal C + 61N) (SEQ ID n° 275)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGHRTYYANSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQAPGEKWARRWDLDYWGQGTLVTVSSA
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-271-132 (DOM23h-271-123 + alanina del terminal C + 64R) (SEQ ID n° 276)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATCCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCT
CAGCGATTGAGCCGATTGGTCATAGGACATACTACGCAGACTCCGTGCGTGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGA
CAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGA
AACAGGCGCCCGGCGAGAAGTGGGCGAGGCGGTGGGATTTGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCG
TCTCGAGCGCG
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-271-132 (DOM23h-271-123 + alanina del terminal C + 64R) (SEQ ID n° 277)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGHRTYYADSVRGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQAPGEKWARRWDLDYWGQGTLVTVSSA
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-271-133 (DOM23h-271-123+ alanina del terminal C + 61N64R) (SEQ ID n°
278)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATCCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCT
CAGCGATTGAGCCGATTGGTCATAGGACATACTACGCAAACTCCGTGCGTGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGAC
AATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAA
ACAGGCGCCCGGCGAGAAGTGGGCGAGGCGGTGGGATTTGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGT
CTCGAGCGCG
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-271-133 (DOM23h-271-123+ alanina del terminal C + 61N64R) (SEQ ID n°
279)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGHRTYYANSVRGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQAPGEKWARRWDLDYWGQGTLVTVSSA
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-271-134 (DOM23h-271-123+ alanina del terminal C + 48I) (SEQ ID n° 280)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATCCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGATTT
CAGCGATTGAGCCGATTGGTCATAGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGA
CAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGA
AACAGGCGCCCGGCGAGAAGTGGGCGAGGCGGTGGGATTTGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCG
TCTCGAGCGCG
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-271-134 (DOM23h-271-123+ alanina del terminal C + 48I) (SEQ ID n° 281)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWISAIEPIGHRTYYADSVKGRFTISRDNSKN
TLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQAPGEKWARRWDLDYWGQGTLVTVSSA
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-271-135 (DOM23h-271-129 + alanina del terminal C) (SEQ ID n° 282)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATCCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCT
CAGCGATTGAGCCGATTGGTCATAGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGA
CAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGA
AACAGGCGCCCAATCAGAGGTATGTTGCCCGGGGCCGCTTGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGT
CTCGAGCGCG
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-271-135 (DOM23h-271-129 + alanina del terminal C) (SEQ ID n° 283)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGHRTYYADSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQAPNQRYVARGRLDYWGQGTLVTVSSA
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-271-136 (DOM23h-271-129 + alanina del terminal C + 61N) (SEQ ID n°
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
GAGGT GCAGCT GTT GGAGTCTGGGGGAGGCTTGGT ACAGCCTGGGGGGTCCCT GCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATCCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCT
CAGCGATTGAGCCGATTGGTCATAGGACATACTACGCAAACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGAC
AATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAA
ACAGGCGCCCAATCAGAGGTATGTTGCCCGGGGCCGCTTGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTC
TCGAGCGCG
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-271-136 (DOM23h-271-129 + alanina del terminal C + 61N) (SEQ ID n° 285)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGHRTYYANSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQAPNQRYVARGRLDYWGQGTLVTVSSA
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-271-137 (DOM23h-271-129 + alanina del terminal C + 61N64R) (SEQ ID n° 286)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATCCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCT
CAGCGATTGAGCCGATTGGTCATAGGACATACTACGCAAACTCCGTGCGTGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGAC
AATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAA
ACAGGCGCCCAATCAGAGGTATGTTGCCCGGGGCCGCTTGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTC
TCGAGCGCG
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-271-137 (DOM23h-271-129 + alanina del terminal C + 61N64R) (SEQ ID n° 287)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGHRTYYANSVRGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQAPNQRYVARGRLDYWGQGTLVTVSSA
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-439-47 (DOM23h-439-42 + 48I) (SEQ ID n° 288)
GAGGT GCAGCT GTT GGAGTCTGGGGGAGGCTTGGT ACAGCCTGGGGGGTCCCT GCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATTCACCTTTGGGACGGAGCAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTTTATTT
CACGTATTGATTCGCCTGGTGGGAGGACATACTACGCAAACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGA
CAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGA
AACGGCGACCCACGGGGGTGTCCGGGACGTTTTATGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAG
CGCG
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-439-47 (DOM23h-439-42 + 48I) (SEQ ID n° 289)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFISRIDSPGGRTYYANSVKGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSA
Secuencia de acido nucleico de DOM23h-439-48 (DOM23h-439-44 + 48I) (SEQ ID n° 290)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCC
TCCGGATTCACCTTTGGGACGGAGCAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTTTATTT
CACGTATTGATTCGCCTGGTGGGAGGACATACTACGCAAACTCCGTGCGTGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGA
CAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGA
AACGGCGACCCACGGGGGTGTCCGGGACGTTTTATGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAG
CGCG
Secuencia de aminoacidos de DOM23h-439-48 (DOM23h-439-44 + 48I) (SEQ ID n° 291)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFISRIDSPGGRTYYANSVRGRFTISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSA
Ejemplo 9. Analisis cinetico por Biacore de anticuerpos de dominio madurados por afinidad
Se inmovilizo la IgG anti-humana en un chip CM4 de Biacore por acoplamiento de aminas primarias, segun las instrucciones del fabricante. Se capturaron en esta superficie TGF-p RII/Fc humano, TGF-p RIl/Fc de cynomolgus o fragmento Fc humano. Los anticuerpos de dominio se pasaron sobre los dos receptores capturados a 3 concentraciones de 100, 10 y 1 nM (dAb de DOM23h-439) o 100, 25 y 6,25 nM (dAb de DOM23h-271). Solo la concentracion de 100 nM de cada dAb se paso sobre el fragmento Fc humano para confirmar la especificidad de union con el dominio del TGF-p Rll extracelular. Una inyeccion de tampon sobre la superficie del antfgeno capturado se uso como doble referencia. La superficie capturada se regenero, despues de cada inyeccion del anticuerpo de dominio, empleando solucion de cloruro de magnesio 3 M; la regeneracion elimino el antfgeno capturado, pero no afecto significativamente la capacidad de la superficie para capturar el antfgeno en un ciclo posterior. Todas las
series se llevaron a cabo a 25°C usando tampon de HBS-EP como tampon corriente. Los datos se generaron usando el BIACORE™ T200 y se ajustaron al modelo de union 1:1 propio del programa informatico. La tabla 14 muestra la cinetica de union de los dAb probados. Los dAb del DOM23h-271 y los linajes de DOM23h-439 se pasaron en experimented separados.
5 Tabla 14
TGFBRII humano TGFBRII de cynomolgus
Muestra
Ka (M-1.s-1) Kd (s-1) KD (M) Ka (M-1.s-1) Kd (s-1) KD (M)
DOM23h-271-123
2,89E+06 2,93E-04 1,02E-10 3,08E+06 3,20E-04 1,04E-10
DOM23h-271-129
5,55E+06 4,11E-04 7,41 E-11 6,00E+06 4,27E-04 7,12E-11
DOM23h-271-130
2,51 E+06 3,09E-04 1,23E-10 2,61 E+06 3,24E-04 1,24E-10
DOM23h-271-131
6,26E+06 1,36E-04 2,17E-11 6,81 E+06 1,44E-04 2,12E-11
DOM23h-271-132
1,22E+07 2,22E-04 1,82E-11 1,29E+07 2,38E-04 1,85E-11
DOM23h-271-133
8,47E+06 7,70E-05 9,09E-12 8,84E+06 8,71E-05 9,85E-12
DOM23h-439-25
7,77E+06 6,34E-04 8,17E-11 8,99E+06 2,73E-03 3,04E-10
DOM23h-439-35
2,26E+07 2,22E-04 9,83E-12 2,32E+07 6,75E-04 2,91 E-11
DOM23h-439-40
1,34E+07 1,39E-03 1,04E-10 9,34E+06 3,42E-03 3,66E-10
DOM23h-439-41
1,81 E+07 1,87E-04 1,04E-11 1,57E+07 5,22E-04 3,33E-11
DOM23h-439-42
4,09E+07 1,31 E-04 3,20E-12 3,72E+07 4,10E-04 1,10E-11
DOM23h-439-43
8,83E+06 3,73E-04 4,23E-11 8,04E+06 1,20E-03 1,49E-10
DOM23h-439-44
2,39E+07 6,91 E-05 2,89E-12 2,17E+07 1,47E-04 6,77E-12
Ejemplo 10. Evaluacion bioffsica de los dAb madurados por afinidad
Se determino la estabilidad termica de los dAb usando calorimetrfa de barrido diferencial (DSC). Se dializaron los dAb durante la noche en tampon de PBS y ajustados a una concentracion final de 1 mg/ml. Se uso tampon de 10 dialisis como referencia para todas las muestras. La DSC se llevo a cabo usando un microcalorfmetro de celda capilar VP-DSC (GE healthcare/Microcal), a un ritmo de calentamiento de 180°C/hora. Un intervalo tfpico de exploracion fue de 20 a 90°C tanto para el tampon de referencia como para la muestra de protefna. Despues de cada par de tampon de referencia y muestra, la celda capilar se limpio con una solucion de Decon al 5% (Fisher- Scientific) en agua seguido de pBs. Los rastros de los datos resultantes se analizaron usando el programa 15 informatico Origin 7.0. El rastro de DSC obtenido a partir del tampon de referencia se sustrajo del rastro de la muestra. La concentracion molar exacta de la muestra se introdujo en la rutina del analisis de datos para dar valores para la temperatura de fusion (T m), entalpfa (AH) y entalpfa de Van't Hoff (AHv). Los datos se ajustaron a un modelo que no era de 2 estados. Se obtuvieron valores de mejor ajuste y de dependencia con 1 o 2 casos de transicion. Se determino tambien la temperatura de desplegamiento integrando a partir de cero cada termograma de la muestra. 20 Este valor se determino entonces como la temperatura a la que se desplego el 4% de la muestra.
Tabla 14A
Denominacion de la protefna
Tm aparente (°C) Temperatura de inicio (°C)
DOM23h-439-21
60,66 52,5
DOM23h-439-25
56,34 49
DOM23h-439-30
57,17 50
DOM23h-439-32
55,01 49
DOM23h-439-33
58,93 51
DOM23h-439-34
56,78 50
DOM23h-855-42
61,90 55
DOM23h-855-43
66,81 58,6
DOM23h-855-44
63,38 56
DOM23h-271-123
54,82 50,6
DOM23h-271-124
58,16 52
DOM23h-271-125
58,26 55
Analisis del estado de la solucion por cromatograffa de exclusion por tamano con dispersion de luz de laser con multiples angulos (SEC-MALLS)
5 Para determinar si los dAb son monomericos o forman oligomeros de orden superior en solucion, se analizaron por SEC-MALLS (cromatograffa de exclusion por tamano con dispersion de luz de laser con multiples angulos). Un sistema de HPLC serie 1100 de Agilent con un cargador automatico de muestras y un detector de UV (controlado por el programa informatico Empower) se conecto al detector Wyatt Mini Dawn Treos (detector de dispersion de luz laser (LS)) y Wyatt Optilab rEX DRI (detector de fndice de refraccion (IR) diferencial). Los detectores se conectaron 10 en el siguiente orden -UV-LS-RI. Los instrumentos IR y LS operan a una longitud de onda de 658 nm; la senal UV se controla a 280 nm y 220 nm. Los anticuerpos de dominio (50 microlitros de inyeccion a una concentracion de 1 mg/ml en PBS) se separaron segun sus propiedades hidrodinamicas por cromatograffa de exclusion por tamano usando una columna TSK2000. La fase movil fue NaCl 0,2 M, NaPO4 0,1 M y n-propanol al 15%. La intensidad de la luz dispersa mientras la protefna pasaba a traves del detector, se midio en funcion del angulo. Esta medicion tomada 15 junto con la concentracion de protefna determinada usando el detector de RI, permitio el calculo de la masa molar empleando ecuaciones apropiadas (parte integral del programa informatico de analisis Astra v.5.3.4.14). El estado de la solucion como porcentaje de monomero, se muestra en la tabla 15.
Tabla 15
Porcentaje de monomero
DOM23h-439-21
100%
DOM23h-439-25
100%
DOM23h-439-30
100%
DOM23h-439-32
100%
DOM23h-439-33
98,2%
DOM23h-439-34
97,7%
DOM23h-855-42
83,8%
DOM23h-855-43
83%
DOM23h-855-44
64,7%
DOM23h-271-123
100%
DOM23h-271-124
97,4%
Ejemplo 11. Inhibicion del TGFp-RII por los dAb madurados por afinidad en la prueba del detector de celulas HEK 293T SBE-bla
La prueba se llevo a cabo exactamente como se esbozo en el ejemplo 4, prueba h2.
5 La prueba se llevo a cabo varias veces para obtener un promedio y un intervalo de valores que se resumen en la tabla 16. Se calculo la media aritmetica de CI50 usando el logaritmo de los valores de CI50, y se calculo el intervalo anadiendo y sustrayendo el logaritmo de la desviacion tfpica a partir de la CI50 media, y volviendo a transformar a continuacion la CI50. Se reunieron los parametros de QC de la prueba: los factores Z robustos eran mayores de 0,4, y la EC80 del TGF-p estuvo dentro de 6 veces la concentracion anadida a la prueba. Los resultados se muestran en 10 la tabla 16.
Tabla 16
Datos del analisis funcional celular para clones especfficos humanos mas dAb placebo de vehfculo
CI50 nM
Valor medio
Intervalo de CI50 (+/- log DT) n
DOM23h-271-123
18,3 9,8-34,1 11
DOM23h-271-129
22,7 16,6-31,1 4
DOM23h-271-130
37,0 15,1-90,7 4
DOM23h-271-131
6,3 4,5-8,9 4
DOM23h-271-132
21,0 16,1-27,5 4
DOM23h-271-133
2,4 1,5-3,8 4
DOM23h-439-25
4,0 1,1-14,7 17
DOM23h-439-35
0,5 0,4-0,7 3
DOM23h-439-37
0,7 0,2-2,2 4
DOM23h-439-40
14 10,8-18,8 6
DOM23h-439-41
1,7 1,3-2,3 4
DOM23h-439-42
0,7 0,2-2,7 8
DOM23h-439-43
1,0 0,7-1,4 4
DOM23h-439-44
1,3 0,5-3,3 6
Placebo 2 de VH
> 25.119 25.119 13
Tabla de concordancia de las secuencias
SEQ ID n°
Numero de dominio Descripcion
1
DOM23h-802 Secuencia de aminoacidos - clon sin tratamiento previo
2
DOM23h-803 Secuencia de aminoacidos - clon sin tratamiento previo
3
DOM23h-813 Secuencia de aminoacidos - clon sin tratamiento previo
4
DOM23h-815 Secuencia de aminoacidos - clon sin tratamiento previo
5
DOM23h-828 Secuencia de aminoacidos - clon sin tratamiento previo
6
DOM23h-830 Secuencia de aminoacidos - clon sin tratamiento previo
7
DOM23h-831 Secuencia de aminoacidos - clon sin tratamiento previo
8
DOM23h-840 Secuencia de aminoacidos - clon sin tratamiento previo
9
DOM23h-842 Secuencia de aminoacidos - clon sin tratamiento previo
10
DOM23h-843 Secuencia de aminoacidos - clon sin tratamiento previo
11
DOM23h-850 Secuencia de aminoacidos - clon sin tratamiento previo
12
DOM23h-854 Secuencia de aminoacidos - clon sin tratamiento previo
13
DOM23h-855 Secuencia de aminoacidos - clon sin tratamiento previo
14
DOM23h-865 Secuencia de aminoacidos - clon sin tratamiento previo
15
DOM23h-866 Secuencia de aminoacidos - clon sin tratamiento previo
16
DOM23h-874 Secuencia de aminoacidos - clon sin tratamiento previo
17
DOM23h-883 Secuencia de aminoacidos - clon sin tratamiento previo
18
DOM23h-903 Secuencia de aminoacidos - clon sin tratamiento previo
19
DOM23m-4 Secuencia de aminoacidos - clon sin tratamiento previo
20
DOM23m-29 Secuencia de aminoacidos - clon sin tratamiento previo
21
DOM23m-32 Secuencia de aminoacidos - clon sin tratamiento previo
22
DOM23m-62 Secuencia de aminoacidos - clon sin tratamiento previo
23
DOM23m-71 Secuencia de aminoacidos - clon sin tratamiento previo
24
DOM23m-72 Secuencia de aminoacidos - clon sin tratamiento previo
25
DOM23m-81 Secuencia de aminoacidos - clon sin tratamiento previo
26
DOM23m-99 Secuencia de aminoacidos - clon sin tratamiento previo
27
DOM23m-101 Secuencia de aminoacidos - clon sin tratamiento previo
28
DOM23m-352 Secuencia de aminoacidos - clon sin tratamiento previo
29
DOM23h-271-21 Secuencia de aminoacidos - madurada por afinidad
30
DOM23h-271-22 Secuencia de aminoacidos - madurada por afinidad
31
DOM23h-271-27 Secuencia de aminoacidos - madurada por afinidad
32
DOM23h-271-101 Secuencia de aminoacidos - madurada por afinidad
33
DOM23h-271-102 Secuencia de aminoacidos - madurada por afinidad
34
DOM23h-271-105 Secuencia de aminoacidos - madurada por afinidad
35
DOM23h-271-106 Secuencia de aminoacidos - madurada por afinidad
36
DOM23h-271-114 Secuencia de aminoacidos - madurada por afinidad
37
DOM23h-271-39 Secuencia de aminoacidos - madurada por afinidad mas mutacion D61R K64D
38
DOM23h-271-40 Secuencia de aminoacidos - madurada por afinidad mas mutacion
D61R K64F
39
DOM23h-802 Secuencia de acido nucleico - clon sin tratamiento previo
40
DOM23h-803 Secuencia de acido nucleico - clon sin tratamiento previo
41
DOM23h-813 Secuencia de acido nucleico - clon sin tratamiento previo
42
DOM23h-815 Secuencia de acido nucleico - clon sin tratamiento previo
43
DOM23h-828 Secuencia de acido nucleico - clon sin tratamiento previo
44
DOM23h-830 Secuencia de acido nucleico - clon sin tratamiento previo
45
DOM23h-831 Secuencia de acido nucleico - clon sin tratamiento previo
46
DOM23h-840 Secuencia de acido nucleico - clon sin tratamiento previo
47
DOM23h-842 Secuencia de acido nucleico - clon sin tratamiento previo
48
DOM23h-843 Secuencia de acido nucleico - clon sin tratamiento previo
49
DOM23h-850 Secuencia de acido nucleico - clon sin tratamiento previo
50
DOM23h-854 Secuencia de acido nucleico - clon sin tratamiento previo
51
DOM23h-855 Secuencia de acido nucleico - clon sin tratamiento previo
52
DOM23h-865 Secuencia de acido nucleico - clon sin tratamiento previo
53
DOM23h-866 Secuencia de acido nucleico - clon sin tratamiento previo
54
DOM23h-874 Secuencia de acido nucleico - clon sin tratamiento previo
55
DOM23h-883 Secuencia de acido nucleico - clon sin tratamiento previo
56
DOM23h-903 Secuencia de acido nucleico - clon sin tratamiento previo
57
DOM23m-4 Secuencia de acido nucleico - clon sin tratamiento previo
58
DOM23m-29 Secuencia de acido nucleico - clon sin tratamiento previo
59
DOM23m-32 Secuencia de acido nucleico - clon sin tratamiento previo
60
DOM23m-62 Secuencia de acido nucleico - clon sin tratamiento previo
61
DOM23m-71 Secuencia de acido nucleico - clon sin tratamiento previo
62
DOM23m-72 Secuencia de acido nucleico - clon sin tratamiento previo
63
DOM23m-81 Secuencia de acido nucleico - clon sin tratamiento previo
64
DOM23m-99 Secuencia de acido nucleico - clon sin tratamiento previo
65
DOM23m-101 Secuencia de acido nucleico - clon sin tratamiento previo
66
DOM23m-352 Secuencia de acido nucleico - clon sin tratamiento previo
67
DOM23h-271-21 Secuencia de acido nucleico - madurada por afinidad
68
DOM23h-271-22 Secuencia de acido nucleico - madurada por afinidad
69
DOM23h-271-27 Secuencia de acido nucleico - madurada por afinidad
70
DOM23h-271-101 Secuencia de acido nucleico - madurada por afinidad
71
DOM23h-271-102 Secuencia de acido nucleico - madurada por afinidad
72
DOM23h-271-105 Secuencia de acido nucleico - madurada por afinidad
73
DOM23h-271-106 Secuencia de acido nucleico - madurada por afinidad
74
DOM23h-271-114 Secuencia de acido nucleico - madurada por afinidad
75
DOM23h-271-39 Secuencia de acido nucleico - madurada por afinidad mas mutacion D61R K64D
76
DOM23h-271-40 Secuencia de acido nucleico - madurada por afinidad mas mutacion D61R K64F
77
DOM23h-802 CDR1
113
CDR2
149
CDR3
78
DOM23h-803 CDR1
114
CDR2
150
CDR3
79
DOM23h-813 CDR1
115
CDR2
151
CDR3
80
DOM23h-815 CDR1
116
CDR2
152
CDR3
81
DOM23h-828 CDR1
117
CDR2
153
CDR3
82
DOM23h-830 CDR1
118
CDR2
154
CDR3
83
DOM23h-831 CDR1
119
CDR2
155
CDR3
84
DOM23h-840 CDR1
120
CDR2
156
CDR3
85
DOM23h-842 CDR1
121
CDR2
157
CDR3
86
DOM23h-843 CDR1
122
CDR2
158
CDR3
87
DOM23h-850 CDR1
123
CDR2
159
CDR3
88
DOM23h-854 CDR1
124
CDR2
160
CDR3
89
DOM23h-855 CDR1
125
CDR2
161
CDR3
90
DOM23h-865 CDR1
126
CDR2
162
CDR3
91
DOM23h-866 CDR1
127
CDR2
163
CDR3
92
DOM23h-874 CDR1
128
CDR2
164
CDR3
93
DOM23h-883 CDR1
129
CDR2
165
CDR3
94
DOM23h-903 CDR1
130
CDR2
166
CDR3
95
DOM23m-4 CDR1
131
CDR2
167
CDR3
96
DOM23m-29 CDR1
132
CDR2
168
CDR3
97
DOM23m-32 CDR1
133
CDR2
169
CDR3
98
DOM23m-62 CDR1
134
CDR2
170
CDR3
99
DOM23m-71 CDR1
135
CDR2
171
CDR3
100
DOM23m-72 CDR1
136
CDR2
172
CDR3
101
DOM23m-81 CDR1
137
CDR2
173
CDR3
102
DOM23m-99 CDR1
138
CDR2
174
CDR3
103
DOM23m-101 CDR1
139
CDR2
175
CDR3
104
DOM23m-352 CDR1
140
CDR2
176
CDR3
105
DOM23h-271-21 CDR1
141
CDR2
177
CDR3
106
DOM23h-271-22 CDR1
142
CDR2
178
CDR3
107
DOM23h-271-27 CDR1
143
CDR2
179
CDR3
108
DOM23h-271-101 CDR1
144
CDR2
180
CDR3
109
DOM23h-271-102 CDR1
145
CDR2
181
CDR3
110
DOM23h-271-105 CDR1
146
CDR2
182
CDR3
111
DOM23h-271-106 CDR1
147
CDR2
183
CDR3
112
DOM23h-271-114 CDR1
148
CDR2
184
CDR3
185
DOM008 cebador
186
DOM009 cebador
187
DOM172 cebador
188
DOM173 cebador
189
271-7R1deg CDR1 cebador
190
271-7R2deg CDR2 cebador
191
271-7R3deg CDR3 cebador
192
PE008 cebador
193
271-6164 R cebador
194
271-6164 deg-F cebador
195
AS1309 cebador
196
271-6164 NR-F cebador
197
DOM57 cebador
198
DOM6 cebador
199
DOM23h-271 Secuencia de aminoacidos - clon sin tratamiento previo
200
DOM23h-271 Secuencia de acido nucleico - clon sin tratamiento previo
201
DOM23h-271-7 Secuencia de aminoacidos - clon sin tratamiento previo
202
DOM23h-271-7 Secuencia de acido nucleico - clon sin tratamiento previo
203
DOM23h-855-21 Secuencia de acido nucleico - clon madurado en la prueba
204
DOM23h-855-21 Secuencia de aminoacidos - clon madurado en la prueba
205
DOM23h-843-13 Secuencia de acido nucleico - clon madurado en la prueba
206
DOM23h-843-13 Secuencia de aminoacidos - clon madurado en la prueba
207
DOM23h-439-20 Secuencia de acido nucleico - clon madurado en la prueba
208
DOM23h-439-20 Secuencia de aminoacidos - clon madurado en la prueba
209
PEP-26-F Cebador
210
PelB NcoVh Cebador
211
PEP011 Cebador
212
DOM-271-50 Secuencia de acido nucleico - clon madurado por afinidad dirigido por la CDR
213
DOM-271-50 Secuencia de aminoacidos - clon madurado por afinidad dirigido por la CDR
214
DOM-271-50 Secuencia de aminoacidos - clon madurado por afinidad dirigido por la CDR (*duplicado del 213 anterior*)
215
PEP044 Cebador
216
23h-439-20 CDRH1 Cebador
217
23h-439-20 CDRH2 Cebador
218
23h-439-20 CDRH3 Cebador
219
23h-843-13 CDRH1 Cebador
220
23h-843-13 CDRH2 Cebador
221
23h-843-13 CDRH3 Cebador
222
23h-855-21 CDRH1 Cebador
223
23h-855-21 CDRH2 Cebador
224
23h-855-21 CDRH3 Cebador
225
H1-271-43 R Cebador
226
H2p1-271-43F Cebador
227
H2p2-271-43 F Cebador
228
H3p1-271-43 F Cebador
229
H3p2-271-43 F Cebador
230
H3p3-271-43 F Cebador
231
PEP011VHStopNotIR Cebador
232
Nco1 VH F Cebador
233
DOM23h-439-25 Secuencia de acido nucleico - clon madurado por afinidad dirigido por la CDR
234
DOM23h-439-25 Secuencia de aminoacidos - clon madurado por afinidad dirigido por la CDR
235
DOM23h-271-123 Secuencia de acido nucleico - clon madurado por afinidad dirigido por la CDR
236
DOM23h-271-123 Secuencia de aminoacidos - clon madurado por afinidad dirigido por la CDR
237
DOM23h-439-35 Secuencia de acido nucleico - clon madurado por afinidad dirigido por la CDR
238
DOM23h-439-35 Secuencia de aminoacidos - clon madurado por afinidad dirigido por
la CDR
239
DOM23h-271-129 Secuencia de acido nucleico - clon madurado por afinidad dirigido por la CDR
240
DOM23h-271-129 Secuencia de aminoacidos - clon madurado por afinidad dirigido por la CDR
241
DOM23h-271-123 CDR1
242
DOM23h-271-123 CDR2
243
DOM23h-271-123 CDR3
244
DOM23h-271-129 CDR1
245
DOM23h-271-129 CDR2
246
DOM23h-271-129 CDR3
247
DOM23h-439-25 CDR1
248
DOM23h-439-25 CDR2
249
DOM23h-439-25 CDR3
250
DOM23h-439-35 CDR1
251
DOM23h-439-35 CDR2
252
DOM23h-439-35 CDR3
253
439 48I SDM F Cebador
254
439 61N SDM F Cebador
255
439 64R SDM F Cebador
256
439 61N 64R SDM F Cebador
257
271 61N SDM F Cebador
258
271 64R SDM F Cebador
259
271 61N 64R SDM F Cebador
260
567 +A rev Cebador
261
21-23 Fwd Cebador
262
DOM23h-439-40 Secuencia de acido nucleico - clon madurado por afinidad dirigido por la CDR
263
DOM23h-439-40 Secuencia de aminoacidos - clon madurado por afinidad dirigido por la CDR
264
DOM23h-439-41 Secuencia de acido nucleico - clon madurado por afinidad dirigido por la CDR
265
DOM23h-439-41 Secuencia de aminoacidos - clon madurado por afinidad dirigido por la CDR
266
DOM23h-439-42 Secuencia de acido nucleico - clon madurado por afinidad dirigido por la CDR
267
DOM23h-439-42 Secuencia de aminoacidos - clon madurado por afinidad dirigido por la CDR
268
DOM23h-439-43 Secuencia de acido nucleico - clon madurado por afinidad dirigido
por la CDR
269
DOM23h-439-43 Secuencia de aminoacidos - clon madurado por afinidad dirigido por la CDR
270
DOM23h-439-44 Secuencia de acido nucleico - clon madurado por afinidad dirigido por la CDR
271
DOM23h-439-44 Secuencia de aminoacidos - clon madurado por afinidad dirigido por la CDR
272
DOM23h-271-130 Secuencia de acido nucleico - clon madurado por afinidad dirigido por la CDR
273
DOM23h-271-130 Secuencia de aminoacidos - clon madurado por afinidad dirigido por la CDR
274
DOM23h-271-131 Secuencia de acido nucleico - clon madurado por afinidad dirigido por la CDR
275
DOM23h-271-131 Secuencia de aminoacidos - clon madurado por afinidad dirigido por la CDR
276
DOM23h-271-132 Secuencia de acido nucleico - clon madurado por afinidad dirigido por la CDR
277
DOM23h-271-132 Secuencia de aminoacidos - clon madurado por afinidad dirigido por la CDR
278
DOM23h-271-133 Secuencia de acido nucleico - clon madurado por afinidad dirigido por la CDR
279
DOM23h-271-133 Secuencia de aminoacidos - clon madurado por afinidad dirigido por la CDR
280
DOM23h-271-134 Secuencia de acido nucleico - clon madurado por afinidad dirigido por la CDR
281
DOM23h-271-134 Secuencia de aminoacidos - clon madurado por afinidad dirigido por la CDR
282
DOM23h-271-135 Secuencia de acido nucleico - clon madurado por afinidad dirigido por la CDR
283
DOM23h-271-135 Secuencia de aminoacidos - clon madurado por afinidad dirigido por la CDR
284
DOM23h-271-136 Secuencia de acido nucleico - clon madurado por afinidad dirigido por la CDR
285
DOM23h-271-136 Secuencia de aminoacidos - clon madurado por afinidad dirigido por la CDR
286
DOM23h-271-137 Secuencia de acido nucleico - clon madurado por afinidad dirigido por la CDR
287
DOM23h-271-137 Secuencia de aminoacidos - clon madurado por afinidad dirigido por la CDR
288
DOM23h-439-47 Secuencia de acido nucleico - DOM23h-439-42 + 48I
289
DOM23h-439-47 Secuencia de aminoacidos - DOM23h-439-42 + 48I
290
DOM23h-439-48 Secuencia de acido nucleico - DOM23h-439-44 + 48I
291
DOM23h-439-48 Secuencia de aminoacidos - DOM23h-439-44 + 48I

Claims (16)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    REIVINDICACIONES
    1. Un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII que comprende una secuencia de aminoacidos como se indica en la SEQ. ID. n° 267 que tiene hasta 5 sustituciones moderadas de aminoacidos en donde dichas sustituciones moderadas de aminoacidos no estan comprendidas en ninguna de las CDR y en donde dicho dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII se une al TGFbetaRII humano con una constante de disociacion (KD) del equilibrio de aproximadamente 10 pM o menos medida por resonancia de plasmon de superficie.
  2. 2. Un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII como en la reivindicacion 1 que tiene la secuencia de SEQ. ID. n° 267.
  3. 3. Un polipeptido aislado que comprende un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
  4. 4. Un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII o polipeptido segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII o polipeptido e a TGFbetaRII de raton y/o TGFbetaRII de cynomolgus.
  5. 5. Un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII o polipeptido segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho dominio variable unico de inmunoglobulina o polipeptido neutraliza la actividad de TGFbeta o inhibe la union de TGFbeta a TGFbetaRII.
  6. 6. Un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII o polipeptido segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que esta unido a una region Fc del anticuerpo que comprende uno o ambos de los dominios CH2 y CH3 y opcionalmente una region bisagra.
  7. 7. Un acido nucleico aislado que codifica un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII o polipeptido segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
  8. 8. Una molecula de acido nucleico aislado segun la reivindicacion 7, que comprende al menos una molecula de acido nucleico de SEQ. ID. n° 266.
  9. 9. Un vector que comprende una molecula de acido nucleico segun la reivindicacion 7 u 8.
  10. 10. Una celula anfitriona que comprende un acido nucleico o un vector segun cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.
  11. 11. Un metodo de produccion de un polipeptido que comprende un dominio variable unico de inmunoglobulina anti- TGFbetaRII segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, comprendiendo el metodo el mantenimiento de una celula anfitriona segun la reivindicacion 9 en condiciones adecuadas para la expresion de dicho acido nucleico o vector, por lo cual se produce un polipeptido que comprende una variable unica de inmunoglobulina.
  12. 12. Un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII o polipeptido segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su empleo como medicamento.
  13. 13. Una composicion farmaceutica que comprende un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII o polipeptido segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
  14. 14. Un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII o polipeptido segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su empleo en elegir como objetivo el cancer al modular la senalizacion del TGFbeta en la angiogenia tumoral.
  15. 15. Un dominio variable unico de inmunoglobulina anti-TGFbetaRII o polipeptido segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o una composicion farmaceutica segun la reivindicacion 13, para su empleo en el tratamiento del cancer, fibrosis hfstica, tal como la fibrosis pulmonar, incluida la fibrosis pulmonar idiopatica; fibrosis hepatica, incluidas la cirrosis y la hepatitis cronica; artritis reumatoide; trastornos oculares; fibrosis de la piel, incluido el queloide de la piel, y la contractura de Dupuytren; fibrosis renal tales como la nefritis y nefroesclerosis; cicatrizacion de heridas; reduccion de cicatrices; y una enfermedad vascular, tal como la restenosis.
  16. 16. Utilizacion de un dominio variable unico anti-TGFbetaRII o polipeptido segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la preparacion de un medicamento para su empleo en el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo siguiente: cancer, fibrosis hfstica, tal como la fibrosis pulmonar, incluida la fibrosis pulmonar idiopatica; fibrosis hepatica, incluidas la cirrosis y la hepatitis cronica; artritis reumatoide; trastornos oculares; fibrosis de la piel, incluido el queloide de la piel, y la contractura de Dupuytren; fibrosis renal tales como la nefritis y nefroesclerosis, cicatrizacion de heridas; reduccion de cicatrices; y una enfermedad vascular, tal como la restenosis.
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