KR101886898B1 - Ｔｇｆ-베타 수용체 ｉｉ에 결합하는 리간드 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다. 적합하게는, 본 개시내용에 따른 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 서열 1-38, 204, 206, 208, 214, 234, 236, 238, 240, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289 또는 291 중 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 가지며 5개 이하의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 것이다. 본 개시내용은 TGF베타 신호전달과 연관된 질환 및 적합하게는 조직 섬유증, 예컨대 특발성 폐 섬유증을 포함하는 폐 섬유증; 간경변증 및 만성 간염을 포함하는 간 섬유증; 류마티스 관절염; 안구 장애; 피부의 켈로이드를 포함하는 피부의 섬유증; 뒤퓌트랑 구축; 신장 섬유증, 예컨대 신염 및 신경화증; 상처 치유; 반흔형성 감소; 및 혈관 병태, 예컨대 재협착의 군으로부터 선택되는 질환의 치료를 위한 폴리펩티드 및 제약 조성물을 추가로 제공한다.

Description

ＴＧＦ-베타 수용체 ＩＩ에 결합하는 리간드 {LIGANDS THAT BIND TGF-BETA RECEPTOR II}
전환 성장 인자-β (TFG베타; TGFβ (TGF-β))는 TGF베타 수용체 (TGF베타R; TGFβR (TGF-βR))에 대한 결합을 통해 세포 내로의 신호 전달을 매개하는 신호전달 분자이다. TGF베타 신호전달 활성은 세포 종류에 따라 세포 분화 및 성장, 그의 효과의 성질을, 즉, 세포 성장-프로모터, 성장-서프레서 (suppressor) 또는 다른 세포 기능의 인듀서 (inducer)로서 조절한다 (문헌 [Roberts, et al., The transforming growth factor-betas, Peptide Growth Factors and Their Receptors, Part I, ed. by Sporn, M.B. & Roberts, A.B., Springer-Verlag, Berlin, 1990, p.419-472] 참조).
TGF베타는 매우 다양한 세포 종류에 의해 생산되고, 그의 동족 (cognate) 수용체는 매우 다양한 기관 및 세포에서 발현된다 (문헌 [Shi and Massague, Cell, Volume 113, Issue 6, 13 June 2003, Pages 685-700]; [Biol. Signals., Vol. 5, p.232, 1996] 및 [Pulmonary Fibrosis, Vol. 80 of Lung Biology in Health and Disease Series, ed. by Phan, et al., p.627, Dekker, New York, 1995] 참조). TGF베타 수용체는 3가지 종류로 나누어지는 것으로 확인되었다: TGF베타RI (TGFβRI) (TGF베타 타입 I 수용체 (문헌 [Franzen et al., Cell, Vol. 75, No. 4, p. 681, 1993]; 진뱅크 (GenBank) 기탁 번호 L11695); TGF베타RII (TGFβRII) (TGF베타 타입 II 수용체 (문헌 [Herbert et al., Cell, Vol. 68, No. 4, p. 775, 1992]; [진뱅크 기탁 번호 M85079]) 및 TGF베타RIII (TGF베타 타입 III 수용체 (문헌 [Lopez-Casillas, Cell, Vol. 67, No. 4, p. 785, 1991]; 진뱅크 기탁 번호 L07594)). TGF베타RI 및 TGF베타RII는 TGF-베타의 신호 전달에 필수적인 것으로 나타났지만 (문헌 [Laiho et al., J. Biol. Chem., Vol. 265, p. 18518, 1990] 및 [Laiho et al., J. Biol. Chem., Vol. 266, p. 9108, 1991]), TGF베타RIII은 필수적인 것으로 생각되지 않는다.
TGF베타 신호전달은 TGF베타RI 및 RII 둘 모두에 대한 그의 결합을 통해 매개된다. 리간드가 세포외 리간드 결합 도메인에 결합할 때, 2개의 수용체는 함께 회합하여, RII가 RI을 인산화하고 Smad 단백질의 인산화를 통한 신호전달 캐스케이드의 개시를 허용한다 (상기 문헌 [Shi and Massague] 참조).
TGF베타의 3개의 이소형, 즉 TGF베타1, TGF베타2, 및 TGF베타3이 포유동물에서 확인되었다. 각각의 이소형은 다기능성이고, 발생 과정에서 생체이용률을 제어하고 조직 항상성을 유지하는 자가-조절 피드백 메카니즘에서 작용한다 (문헌 [ten Dijke and Arthur, Nature Reviews, Molecular Cell Biology, Vol. 8, Nov. 2007, p. 857-869]에서 검토됨). TFG베타의 수준은 TGF베타 발현을 통한 조절 및 프로테오글리칸, 즉, 세포외 매트릭스 (ECM)에 대한 결합을 통한 조절에 의해 제어된다.
탈조절된 (dysregulated) TGF베타 신호전달, 예컨대 과량의 TGF베타 신호전달 및 높은 수준의 생체이용성 TGF베타는 다양한 조직의 섬유증, 예컨대 폐 섬유증 및 간경변증, 만성 간염, 류마티스 관절염, 안구 장애, 혈관 재협착, 피부의 켈로이드, 및 신경화증의 발병을 포함하는 많은 병상에 연관된다.
따라서, 특이적인 방식으로, 예컨대 TGF베타 수용체 II에 대한 결합을 통해 TGF베타 신호전달을 차단하거나 붕괴시키는 화합물을 제공할 필요성이 존재한다. 상기 화합물은 치료제에 사용될 수 있다.
개요
본 개시내용은 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인에 관한 것이다. 적합하게는, 본 개시내용에 따른 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 10 pM 내지 50 nM, 임의로 10 pM 내지 10 nM, 임의로 100 pM 내지 10 nM의 평형 해리 상수 (KD)로 TGF베타RII에 결합하는 것이다. 한 실시양태에서, 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 고 친화도 (높은 효능)로 TGF베타RII에 결합하고 평형 해리 상수가 10 pM 내지 500 pM인 것이다. 한 실시양태에서, 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 대략 100 pM의 친화도 (KD)로 TGF베타RII에 결합하는 것이다. 한 실시양태에서, 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 100 pM 미만의 친화도 (KD)로 TGF베타RII에 결합하는 것이다. 또 다른 실시양태에서, 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 중등도 친화도 (낮은 효능)로 TGF베타RII에 결합하고 500 pM 내지 50 nM, 바람직하게는 500 pM 내지 10 nM의 평형 해리 상수를 갖는 것이다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 적합하게는, 단리된 폴리펩티드는 인간 TGF베타RII에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 또한 상이한 종, 예컨대 마우스, 개 또는 원숭이, 예컨대 시노몰거스 원숭이 (시노 (cyno))로부터 유래된 TGF베타RII에 결합한다. 적합하게는, 단리된 폴리펩티드는 마우스 및 인간 TGF베타RII 둘 모두에 결합한다. 인간 및 다른 종으로부터의 TGF베타RII 사이의 상기 교차 반응성은 동일한 항체 구축물을 동물 질환 모델, 및 인간에서 사용하도록 허용한다.
본 개시내용의 한 측면에서, 서열 1-38, 204, 206, 208, 214, 234, 236, 238, 240, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285 및 287 중 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 가지며 5개 이하의 아미노산 변경을 갖는 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인이 제공되고, 여기서 각각의 아미노산 변경은 아미노산 치환, 결실 또는 부가, 즉, 5개 이하의 아미노산 치환, 결실 또는 부가의 임의의 조합이다. 특정 실시양태에서, 아미노산 치환은 보존적 치환이다.
한 실시양태에서, 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 서열 234 또는 279에 제시된 아미노산 서열을 가지며 5개 이하의 아미노산 변경을 갖고, 여기서 각각의 아미노산 변경은 아미노산 치환, 결실 또는 부가이다. 특정 실시양태에서, 아미노산 변경(들)은 CDR3 내에, 보다 구체적으로 CDR3 및 CDR1, 또는 CDR3 및 CDR2 내에, 보다 구체적으로 임의의 CDR 내에 존재하지 않는다. 한 실시양태에서, 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 서열 1-38, 204, 206, 208, 214, 234, 236, 238, 240, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285 및 287 중 임의의 하나로 이루어진다. 한 실시양태에서, 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 서열 234 또는 236의 아미노산 서열로 이루어진다.
WO 2011012609에 개시된 임의의 구체적인 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 서열을 포함하는 것은 의도되지 않는다. 의심의 여지를 없애기 위해 WO 2011012609에 개시된 각각의 및 모든 서열은 본 발명으로부터 권리가 포기될 수 있다. 특히, WO 2011012609에 개시된 DOM23h-271 (서열 4) 및 DOM-23h-439 (서열 10)는 권리가 포기될 수 있다. 본원에서 서열 199 또는 201에 제시된 아미노산 서열로 이루어지는 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 권리가 포기될 수 있다.
본 발명에 따른 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 하나 이상의 (예를 들어 1, 2, 3, 4, 또는 5개의) C-말단 알라닌 잔기를 포함할 수 있다. 별법으로, 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 길이가 5개 이하의 아미노산인 C-말단 펩티드를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, C-말단 펩티드는 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산을 포함한다.
당업자는 제시된 단일 가변 도메인 서열, 예를 들어 서열 1-38, 204, 206, 208, 214, 234, 236, 238, 240, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285 및 287 중 임의의 하나에 제시된 서열을 갖는 것으로부터, 어떤 CDR 서열, 예를 들어 [Kabat (1987)], [Chothia (1989)], AbM 또는 접촉 방법, 또는 이들 방법의 조합을 참고로 하여 규정된 CDR 서열이 그 내에 포함되는지를 본원에 개략된 다양한 방법을 사용하여 추정할 수 있다. 적합하게는, CDR 서열은 본원에서 설명되는 카바트 (Kabat) 방법을 사용하여 결정된다. 한 실시양태에서, 각각의 서열의 CDR 서열은 표 1, 2, 9, 및 13에 제시된 것이다.
본 발명의 한 측면에서, 본 개시내용의 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 서열 1-28로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열에 90% 또는 90% 초과의 서열 동일성을 갖는다.
본 발명의 한 측면에서, 본 개시내용의 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 25개 이하의 아미노산 변화를 갖는, 서열 1-28로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 20개 이하, 15개 이하, 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 또는 5개 이하의 아미노산 변화를 갖는, 서열 1-28로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.
본 개시내용의 한 측면에서, 본 개시내용의 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 특히 서열 1-38, 204, 206, 208, 214, 234, 236, 238, 240, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285 및 287로 이루어지는 군 중에선 선택되는 아미노산 서열에 동일한 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인을 포함하고 TGF베타RII에 결합하는 단리된 폴리펩티드가 제공된다.
본 개시내용의 한 측면에서, 서열 39-66의 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 핵산 서열에 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고 TGF베타RII에 결합하는 단리된 폴리펩티드가 제공된다.
본 개시내용의 임의의 측면에 따른 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드는 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인의 위치 39의 R, 위치 48의 I, 위치 53의 D, 위치 61의 N, 위치 61의 R, 위치 61의 K, 위치 64의 R, 위치 64의 F, 위치 64의 D, 위치 64의 E, 위치 64의 Y, 위치 102의 H, 또는 위치 103의 S 중 임의의 아미노산을 포함할 수 있고, 상기 위치는 카바트 넘버링 규약에 따른 것이다. 한 실시양태에서, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드는 이들 아미노산의 조합을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드는 61에 아미노산 N 및 64에 R을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드는 위치 61에 아미노산 R 또는 K를 포함한다. 한 실시양태에서, 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 위치 61 및/또는 64에 상기 언급된 잔기 중 임의의 하나에 추가로 위치 48에 I를 포함한다. 상기 실시양태에서, 아미노산 넘버링은 예를 들어 서열 1-38, 204, 206, 208, 214, 234, 236, 238, 240, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285 및 287에 제시된 서열에 의해 예시되는 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인의 것이다.
본 개시내용의 임의의 측면에 따른 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드는 다음 군 중에서 선택되는 아미노산 조합 중 하나를 포함할 수 있다: 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인의 위치 61의 N 및 위치 64의 R; 위치 61의 R 및 위치 64의 E; 위치 61의 R 및 위치 64의 M; 위치 61의 R 및 위치 64의 F; 위치 61의 R 및 위치 64의 Y; 및 위치 61의 R 및 위치 64의 D. 한 실시양태에서, 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 위치 61 및 64에 상기 언급된 잔기의 조합 중 임의의 하나에 추가로 위치 48에 I를 포함한다.
또 다른 측면에서, TGF베타RII에 대한 결합 특이성을 갖고 서열 1-28의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인의 TGF베타RII에 대한 결합을 억제하는 리간드 또는 결합 모이어티 (moiety)가 제공된다.
본 개시내용의 추가의 측면에서, 본 개시내용의 임의의 측면에 따른 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드를 포함하는 융합 단백질이 제공된다.
한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드, 리간드 또는 융합 단백질은 TGF베타 활성을 중화하는 것이다. 적합하게는, 본 개시내용에 따른 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드는 TGF베타의 TGF베타RII에 대한 결합을 억제한다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드는 TGF베타RII를 통한 TGF베타 신호전달 활성을 억제한다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드는 TGF베타 활성, 특히, TGF베타 세포 성장 활성 및/또는 섬유형성 (fibrogenic) 활성을 억제한다. 적합하게는, TGF베타RII는 인간 TGF베타RII이다.
한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드, 리간드 또는 융합 단백질은 15 마이크로몰 (μM)에서 TGF베타RII 효능제 활성을 갖지 않는다.
또 다른 측면에서, 반감기 연장 모이어티를 추가로 포함하는 본 개시내용의 임의의 측면에 따른 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드, 리간드 또는 융합 단백질이 제공된다. 적합하게는, 반감기 연장 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티, 혈청 알부민 또는 그의 단편, 트랜스페린 수용체 또는 그의 트랜스페린-결합부, 또는 생체 내에서 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 부위를 포함하는 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시양태에서, 반감기 연장 모이어티는 혈청 알부민 또는 신생아 Fc 수용체에 대한 결합 부위를 포함하는 항체 또는 항체 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 반감기 연장 모이어티는 dAb, 항체 또는 항체 단편이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 임의의 측면에 따른 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드, 리간드 또는 융합 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 또는 재조합 핵산을 제공한다.
한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자 또는 재조합 핵산 분자는 서열 39-76, 203, 205, 207, 212, 233, 235, 237, 239, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286에 제시된 서열을 갖는 임의의 핵산 분자의 군 중에서 선택되는 핵산 분자를 포함하거나 이로 이루어진다.
한 측면에서, 본 개시내용은 서열 39-66에 제시된 서열을 갖는 임의의 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열에 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하고, TGF베타RII에 특이적으로 결합하는 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 또는 재조합 핵산을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용에 따른 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다.
추가의 측면에서, 본 개시내용에 따른 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 본 개시내용의 또 다른 측면에서, 본 개시내용에 따른 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드 또는 리간드 또는 융합 단백질을 포함하는 폴리펩티드의 생산 방법이 제공되고, 이 방법은 상기 핵산 또는 벡터의 발현에 적합한 조건 하에 본 개시내용에 따른 숙주 세포를 유지시켜서 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드 또는 융합 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 생산하는 것을 포함한다. 임의로, 이 방법은 폴리펩티드를 단리하고, 임의로 단리된 폴리펩티드보다 개선된 친화도 (Kd); 또는 표준 검정에서 TGF베타 중화를 위한 EC50을 갖는 변이체, 예를 들어, 돌연변이된 변이체를 생산하는 단계를 추가로 포함한다. TGF베타 활성에 대한 적합한 검정, 예컨대 셀 센서 (Cell Sensor) 검정을 본원에서, 예를 들어 실시예 섹션에서 설명한다.
본 개시내용의 한 측면에서, 본 개시내용에 따른 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드 또는 융합 단백질은 의약으로서 사용하기 위한 것이다. 따라서, 의약으로서 사용하기 위한, 본 개시내용에 따른 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드 또는 융합 단백질을 포함하는 조성물이 제공된다.
본 개시내용의 한 측면에서, 의약의 제조를 위한, 특히 TGF베타 신호전달과 연관된 질환의 치료에 사용하기 위한, 본 개시내용에 따른 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드 또는 융합 단백질의 용도가 제공된다.
적합하게는, 본 개시내용에 따른 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드 또는 융합 단백질 또는 조성물은 TGF베타 신호전달과 연관된 질환의 치료를 위한 것이다. 적합하게는, 질환은 조직 섬유증, 예컨대 특발성 폐 섬유증을 포함하는 폐 섬유증; 간경변증 및 만성 간염을 포함하는 간 섬유증; 류마티스 관절염; 안구 장애; 또는 피부의 켈로이드를 포함하는 피부의 섬유증; 뒤퓌트랑 구축 (Dupuytren's Contracture); 및 신장 섬유증, 예컨대 신염 및 신경화증; 또는 혈관 병태, 예컨대 재협착이다. TGF베타 신호전달과 연관된 다른 질환은 혈관 질환, 예컨대 고혈압, 자간전증, 유전성 출혈성 모세혈관확장증 타입 I (HHT1), HHT2, 폐 동맥 고혈압, 대동맥류, 마르팡 (Marfan) 증후군, 가족성 동맥류 장애, 로이-디에츠 (Loeys-Dietz) 증후군, 동맥 비틀림 증후군 (ATS)을 포함한다. TGF베타 신호전달과 연관된 다른 질환은 근골격계 질환, 예컨대 뒤시엔느 (Duchenne) 근이영양증 및 근육 섬유증을 포함한다. TGF베타 신호전달과 연관된 추가의 질환은 암, 예컨대 결장, 위, 및 췌장의 암, 및 신경교종 및 NSCLC를 포함한다. 또한, 본 개시내용은 종양 혈관신생에서 TGF베타 신호전달을 조정함으로써 암을 표적화하는 방법을 제공한다. 다른 질환 또는 병태는 조직 반흔형성에 관한 것을 포함한다. 다른 질환은 폐 질환, 예컨대 COPD (만성 폐쇄성 폐 질환)을 포함한다. 본 개시내용에 따른 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드 또는 융합 단백질 또는 조성물은 상처 치유에 사용되고/되거나 반흔형성을 억제 또는 개선하기 위해 사용될 수 있다. 한 측면에서, 본 개시내용은 피내 전달을 위한 항-TGF베타RII 단일 가변 도메인, 리간드 또는 길항제, 조성물 또는 융합 단백질을 제공한다. 한 측면에서, 본 개시내용은 환자의 피부에 전달하기 위한 항-TGF베타RII 단일 가변 도메인, 리간드 또는 길항제 또는 융합 단백질을 제공한다. 한 측면에서, 본 개시내용은 피내 전달을 위한 의약의 제조에 있어서 항-TGF베타RII 단일 가변 도메인, 리간드 또는 길항제 또는 융합 단백질의 용도를 제공한다. 한 측면에서, 본 개시내용은 환자의 피부에 전달하기 위한 의약의 제조에 있어서 본 개시내용에 따른 항-TGF베타RII 단일 가변 도메인 또는 길항제 또는 융합 단백질의 용도를 제공한다.
한 실시양태에서, 가변 도메인은 실질적으로 단량체이다. 특정 실시양태에서, 가변 도메인은 SEC-MALS에 의해 측정시 용액 내의 65%-98% 단량체이다. 또 다른 실시양태에서, 가변 도메인은 SEC-MALS에 의해 측정시 용액 내의 65%-100%, 70%-100%, 75%-100%, 80%-100%, 85%-100%, 90%-100%, 95%-100% 단량체이다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 가변 도메인, 리간드, 융합 단백질 또는 폴리펩티드는 특히 제약 조성물 내에 존재할 때, 다음과 같은 번역후 변형 중 임의의 하나 또는 조합 또는 전부를 포함하지 않는다: 탈아미드화, 산화 또는 글리코실화. 특정 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 가변 도메인, 리간드, 융합 단백질 또는 폴리펩티드는 탈아미드화되지 않는다.
적합하게는, 조성물은 인간에서 TGF베타-매개 병태의 치료 또는 예방을 위한 것이다.
따라서, 한 실시양태에서, 피부의 섬유증, 특히 켈로이드 질환 또는 뒤퓌트랑 구축의 치료를 위한 항-TGF베타RII dAb가 제공된다. 적합하게는, 항-TGF베타RII dAb는 바람직하게는 임의의 태그, 예컨대 myc 또는 또 다른 정제 태그가 결여된 (즉, 비태깅된 (untagged)) 피내 전달을 위한 실질적으로 단량체인 dAb로서 제공된다.
한 측면에서, 조성물은 제약 조성물이고, 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 인간 환자에서 TGF베타-매개 병태의 치료 및/또는 예방 방법이 제공되고, 이 방법은 본 개시내용에 따른 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드를 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
추가의 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 따른 조성물을 포함하는 피내 전달 장치를 제공한다. 적합하게는, 상기 장치는 미세바늘 (microneedle) 또는 미세바늘의 집합체이다.
추가의 측면에서, 본원에 개시된 항-TGF베타RII 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드 및 상기 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드를 피부에 적용하기 위한 장치, 예컨대 피내 전달 장치를 포함하는 키트가 제공된다.
상세한 설명
본 명세서 내에서, 본 개시내용은 명확하고 정밀한 설명서의 작성이 가능하도록 하는 방식으로 실시양태를 참고로 하여 기재되었다. 실시양태는 본 개시내용으로부터 벗어나지 않으면서 다양하게 조합되거나 분리될 수 있음이 의도되고, 이해되어야 한다.
달리 규정되지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 학술 용어는 당해 기술 분야 (예를 들어, 세포 배양, 분자 유전학, 핵산 화학, 혼성화 기술 및 생화학)의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 표준 기술이 분자, 유전자 및 생화학적 방법 (일반적으로 본원에 참고로 포함된 문헌 [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.] 및 [Ausubel, et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc.] 참조) 및 화학적 방법에 대해 사용된다.
이뮤노글로불린: 본원에서 사용되는 바와 같이, "이뮤노글로불린"은 2개의 β 시트, 및 대체로 보존된 디술피드 결합을 함유하는 항체 분자의 이뮤노글로불린 폴드 (fold) 특징을 보유하는 일군의 폴리펩티드를 의미한다.
도메인: 본원에서 사용되는 바와 같이, "도메인"은 단백질의 나머지와 무관하게 그의 3차 구조를 보유하는 폴딩된 (folded) 단백질 구조를 의미한다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 별개의 기능적 특성을 담당하고, 많은 경우에 단백질 및/또는 도메인의 나머지의 기능을 상실하지 않으면서 부가되거나 제거되거나 다른 단백질로 전달될 수 있다. 단일 항체 가변 도메인 또는 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 항체 가변 도메인의 서열 특성을 포함하는 폴딩된 폴리펩티드 도메인을 의미한다. 따라서, 이것은 완전한 항체 가변 도메인, 및 예를 들어 하나 이상의 루프가 항체 가변 도메인에 특유하지 않은 서열로 교체된 변형된 가변 도메인, 또는 말단절단되었거나 또는 N- 또는 C-말단 연장을 포함하는 항체 가변 도메인, 및 전장 도메인의 결합 활성 및 특이성을 적어도 부분적으로 보유하는 가변 도메인의 폴딩된 단편을 포함한다.
이뮤노글로불린 단일 가변 도메인: 문구 "이뮤노글로불린 단일 가변 도메인"은 상이한 또는 다른 V 영역 또는 도메인과 무관하게 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는, 즉 1가인 항체 가변 도메인 (VH, VHH, VL) 또는 결합 도메인을 의미한다. 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 다른 영역 또는 도메인이 단일 이뮤노글로불린 가변 도메인에 의한 항원 결합에 필요하지 않은 경우에 (즉, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인이 추가의 가변 도메인에 무관하게 항원에 결합하는 경우에) 다른 가변 영역 또는 가변 도메인과 특정 포맷 (예를 들어, 동종- 또는 이종-다량체)으로 존재할 수 있다. "도메인 항체" 또는 "dAb"는 본원에서 사용되는 "이뮤노글로불린 단일 가변 도메인"이다. "단일 항체 가변 도메인" 또는 "항체 단일 가변 도메인"은 본원에서 사용되는 "이뮤노글로불린 단일 가변 도메인"과 동일하다. 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 한 실시양태에서 인간 항체 가변 도메인이지만, 다른 종, 예컨대 설치류로부터의 단일 항체 가변 도메인 (예를 들어, 그 내용이 전부 본원에 참고로 포함된 WO 00/29004에 개시됨), 수염상어 및 낙타류 VHH dAb도 포함한다. 낙타류 VHH는 천연적으로 경쇄가 결여된 중쇄 항체를 생산하는, 낙타, 라마, 알파카, 단봉낙타 및 과나코 (guanaco)를 포함하는 종으로부터 유래된 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드이다. VHH는 인간화될 수 있다.
본 개시내용의 모든 측면에서, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 항체 중쇄 및 경쇄 단일 가변 도메인, 예를 들어 VH, VL 및 VHH로부터 독립적으로 선택된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "항체"는 항체를 천연적으로 생산하는 임의의 종으로부터 유래되거나, 또는 재조합 DNA 기술에 의해 생산된; 예를 들어 혈청, B-세포, 하이브리도마, 트랜스펙토마 (transfectoma), 효모 또는 세균로부터 단리된 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 또는 단편 (예컨대 Fab, F(ab')2, Fv, 디술피드 연결된 Fv, scFv, 닫힌 (closed) 입체형태 다중특이적 항체, 디술피드-연결된 scFv, 디아바디 (diabody))을 의미한다.
항체 포맷: 한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드는 임의의 항체 포맷으로 제공될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "항체 포맷"은 그 구조 상에 항원에 대한 결합 특이성을 부여하도록 하나 이상의 항체 가변 도메인이 도입된 임의의 적합한 폴리펩티드 구조를 의미한다. 다양한 적합한 항체 포맷, 예컨대, 키메릭 (chimeric) 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 단일 사슬 항체, 이중특이적 항체, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 동종이량체 및 이종이량체, 이들 중 임의의 것의 항원-결합 단편 (예를 들어, Fv 단편 (예를 들어, 단일 사슬 Fv (scFv), 디술피드 결합된 Fv), Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편), 단일 항체 가변 도메인 (예를 들어, dAb, VH, VHH, VL), 및 이들 중 임의의 것의 변형된 버전 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 적합한 중합체 또는 인간화 VHH의 공유 부착에 의해 변형됨)이 공지되어 있다. 한 실시양태에서, 다른 항체 포맷은 본 개시내용에 따른 임의의 분자의 CDR이 적합한 단백질 스캐폴드 또는 골격, 예컨대 아피바디 (affibody), SpA 스캐폴드, LDL 수용체 클래스 A 도메인, 아비머 (avimer) (예를 들어, U.S. 특허 출원 공개 2005/0053973, 2005/0089932, 2005/0164301 참조) 또는 EGF 도메인 상에 그라프팅될 수 있는 다른 스캐폴드를 포함한다. 또한, 리간드는 본원에서 설명되는 바와 같이 2가 (이종2가) 또는 다가 (이종다가)일 수 있다. 다른 실시양태에서, "유니버설 (Universal) 프레임워크"가 사용될 수 있고, 여기서 "유니버설 프레임워크"는 카바트 ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services)에 의해 규정된 바와 같은 서열 내에 보존된 항체의 영역에 대응하는 또는 문헌 [Chothia and Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:910-917]에 의해 규정된 바와 같은 인간 생식계열 (germline) 이뮤노글로불린 레퍼토리 (repertoire) 또는 구조에 대응하는 단일 항체 프레임워크 서열을 의미한다. 본 개시내용은 단지 초가변 영역 내의 변이를 통해 실질적으로 임의의 결합 특이성의 유도를 허용하는 것으로 밝혀진 단일 프레임워크, 또는 상기 프레임워크의 세트를 제공한다.
본 개시내용 전체에 걸쳐서 설명된 본 개시내용의 실시양태에서, 본 개시내용의 펩티드 또는 리간드에 항-TGF베타RII "dAb"를 사용하는 대신에, 당업자는 TGF베타RII에 결합하는 본 개시내용의 dAb의 CDR (예를 들어, 적합한 단백질 스캐폴드 또는 골격, 예를 들어 아피바디, SpA 스캐폴드, LDL 수용체 클래스 A 도메인 또는 EGF 도메인 상에 그라프팅된 CDR) 중 하나 이상 또는 3개 전부를 포함하는 폴리펩티드 또는 도메인을 사용할 수 있음이 고려된다. 따라서, 본 개시내용은 dAb 대신에 상기 도메인을 사용하여 폴리클로날 항체의 개시내용을 제공하기 위해 전체로서 고려되어야 한다. 이와 관련하여, 그 개시내용이 참고로 포함된 WO2008096158을 참조한다.
한 실시양태에서, 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 임의의 적합한 이뮤노글로불린 가변 도메인이고, 임의로 인간 가변 도메인 또는 인간 프레임워크 영역 (예를 들어, DP47 또는 DPK9 프레임워크 영역)을 포함하거나 이로부터 유래된 가변 도메인이다.
항원: 본원에서 설명되는 바와 같이, "항원"은 본 개시내용에 따른 결합 도메인에 의해 결합되는 분자이다. 일반적으로, 항원은 항체 리간드에 의해 결합되고, 생체 내에서 항체 반응을 유도할 수 있다. 이것은 예를 들어 폴리펩티드, 단백질, 핵산 또는 다른 분자일 수 있다.
에피토프: "에피토프"는 통상적으로 이뮤노글로불린 VH/VL 쌍에 의해 결합되는 구조 단위이다. 에피토프는 항체에 대한 최소 결합 부위를 규정하고, 따라서 항체의 특이성의 표적을 나타낸다. 단일 도메인 항체의 경우에, 에피토프는 단리시에 가변 도메인에 의해 결합되는 구조 단위를 나타낸다.
결합: 일반적으로, 특이적 결합은 50 나노몰 이하, 임의로 250 피코몰 이하의 해리 상수 (Kd)로 표시된다. 항원-결합 단백질의 항원 또는 에피토프에 대한 특이적 결합은 예를 들어 스캐챠드 (Scatchard) 분석 및/또는 경쟁적 결합 검정, 예컨대 방사성면역검정 (RIA), 효소 면역검정 예컨대 ELISA 및 샌드위치 경쟁 검정, 및 이들의 상이한 변형 방법을 포함하는 적합한 검정에 의해 결정될 수 있다.
결합 친화도: 결합 친화도는 임의로 표면 플라스몬 공명 (SPR) 및 비아코어(BIACORE)™ 시스템 (스웨덴 웁살라)을 사용하는 비아코어™ (Karlsson et al., 1991)를 사용하여 결정된다. 비아코어™ 시스템은 생체분자 상호작용을 실시간으로 모니터링하기 위해 표면 플라스몬 공명을 이용하고 (문헌 [SPR, Welford K. 1991, Opt. Quant. Elect. 23:1]; [Morton and Myszka, 1998, Methods in Enzymology 295: 268]), 300 nm까지의 표면의 굴절률 변화의 결과로서 유리 지지체 상의 얇은 금 필름의 표면에서 광의 공명 각도의 변화를 검출할 수 있는 표면 플라스몬 공명을 이용한다. 비아코어™ 분석은 회합율 상수, 해리율 상수, 평형 해리 상수, 및 친화도 상수를 편리하게 제시한다. 결합 친화도는 비아코어™ 표면 플라스몬 공명 시스템 (비아코어™, 인크.)을 사용하여 회합 및 해리율 상수를 평가함으로써 얻는다. 바이오센서 칩을 제조자 (비아코어™)의 지시에 따라 표적의 공유 커플링을 위해 활성화한다. 이어서, 표적을 희석하고 고정된 물질의 반응 단위에서 신호를 얻기 위해 칩 상에 주입한다. 공명 단위 (RU)의 신호는 고정된 물질의 질량에 비례하기 때문에, 신호는 매트릭스 상의 고정화된 표적 밀도의 범위를 나타낸다. 해리 데이터는 koff +/- s.d. (측정치의 표준 편차)를 얻기 위해 1-부위 (one-site) 모델에 피팅된다. 유사 1차 속도 (pseudo-first order rate) 상수 (Kd)는 각각의 회합 곡선에 대해 계산하고, kon +/- s.e. (피트 (fit)의 표준 오차)를 얻기 위해 단백질 농도의 함수로서 플로팅한다. 결합에 대한 평형 해리 상수 Kd는 koff/kon으로서 SPR 측정치로부터 계산한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 인간 TGF베타RII에 특이적으로 결합하는 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다. 한 실시양태에서, 가변 도메인은 약 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM 이하, 임의로 약 9, 8, 7, 6 또는 5 nM 이하, 임의로 약 4 nM 이하, 약 3 nM 이하 또는 약 2 nM 이하 또는 약 1 nM 이하, 임의로 약 500 pM 이하의 평형 해리 상수 (KD)로 인간 TGF베타RII에 결합한다. 적합하게는, 가변 도메인의 평형 해리 상수가 약 50 nM 내지 500 pM인 경우, 관심있는 조직, 예컨대 폐에 대한 국소 투여가 특히 적합하다. 상기 실시양태에서, 고농도의 상기 "중등도 친화도" 결합제가 유효 치료제로서 제공될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 가변 도메인은 약 500 pM 이하, 임의로 약 450 pM, 400 pM, 350 pM, 300 pM, 250 pM, 200 pM, 150 pM, 100 pM, 50 pM 이하, 임의로 약 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM 이하의 평형 해리 상수 (KD)로 인간 TGF베타RII에 결합한다. 적합하게는, 가변 도메인의 해리 상수가 약 500 pM 내지 10 pM인 경우에, 임의의 하나의 관심있는 조직 내의 양이 효과적인 요법을 제공하기에 충분하도록 전신 투여가 특히 적합하다. 상기 실시양태에서, 저농도의 상기 "고 친화도" 결합제가 효과적인 치료제로서 제공될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 단일 가변 도메인은 인간 TGF베타RII와 또 다른 종으로부터의 TGF베타RII, 예컨대 마우스 TGF베타RII 사이의 교차반응성을 보인다. 상기 실시양태에서, 가변 도메인은 인간 및 마우스 TGF베타RII에 특이적으로 결합한다. 이것은 약물 개발이 일반적으로 약물이 인간에서 시험되기 전에 마우스 시스템에서 선도 약물 후보의 시험을 필요로 하기 때문에 특히 유용하다. 인간 및 마우스 종에 결합할 수 있는 약물을 제공하면, 상기 시스템에서 결과를 시험하고 동일한 약물을 사용한 데이터의 동시 비교를 수행할 수 있다. 이 때문에 마우스 TGF베타RII에 작용하는 약물 및 인간 TGF베타RII에 작용하는 별개의 약물을 발견하기 위해 필요한 복잡한 과정을 피할 수 있고, 또한 동일하지 않은 약물을 사용한 인간 및 마우스에서의 결과를 비교할 필요성도 피할 수 있다. 질환 모델에 사용되는 다른 종, 예컨대 개 또는 원숭이, 예컨대 시노몰거스 원숭이 사이의 교차반응성도 또한 고려된다.
임의로, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인의 적어도 마우스 TGF베타RII에 대한 결합 친화도 및 인간 TGF베타RII에 대한 결합 친화도는 10, 50 또는 100 이하의 인수만큼 상이하다.
CDR: 본원에서 설명되는 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 (dAb)은 상보성 결정 영역 (CDR1, CDR2 및 CDR3)을 함유한다. CDR의 위치 및 프레임워크 (FR) 영역 및 넘버링 시스템은 카바트 등에 의해 규정되었다 (문헌 [Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)]). 본원에 개시된 VH (CDRH1 등) 및 VL (CDRL1 등) (Vκ) dAb의 CDR (CDR1, CDR2, CDR3)의 아미노산 서열은 공지의 카바트 아미노산 넘버링 시스템 및 CDR의 정의를 기초로 하여 당업자게 쉽게 명백할 것이다. 서열 가변성을 기초로 하여 가장 통상적으로 사용되는 방법인 카바트 넘버링 시스템에 따르면, 중쇄 CDR-H3은 다양한 길이를 갖고, 삽입은 잔기 H100과 H101 사이에 K까지의 문자로 넘버링된다 (즉, H100, H100A ... H100K, H101). CDR은 별법으로 코티아 (Chothia)의 시스템 (구조적 루프 영역의 위치를 기초로 함) (문헌 [Chothia et al., (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p877-883])을 사용하여, AbM (카바트와 코티아 사이의 절충)에 따라 또는 다음과 같은 접촉 방법 (결정 구조 및 항원과 접촉하는 잔기의 예측)에 따라 결정될 수 있다. CDR 결정에 적합한 방법에 대해서는 http://www.bioinf.org.uk/abs/를 참조한다.
각각의 잔기가 넘버링된 후에, 다음 CDR 정의를 적용할 수 있다:
카바트:
CDR H1: 31-35/35A/35B
CDR H2: 50-65
CDR H3: 95-102
CDR L1: 24-34
CDR L2: 50-56
CDR L3: 89-97
코티아:
CDR H1: 26-32
CDR H2: 52-56
CDR H3: 95-102
CDR L1: 24-34
CDR L2: 50-56
CDR L3: 89-97
AbM:
(카바트 넘버링 사용): (코티아 넘버링 사용):
CDR H1: 26-35/35A/35B 26-35
CDR H2: 50-58 -
CDR H3: 95-102 -
CDR L1: 24-34 -
CDR L2: 50-56 -
CDR L3: 89-97 -
접촉:
(카바트 넘버링 사용): (코티아 넘버링 사용):
CDR H1: 30-35/35A/35B 30-35
CDR H2: 47-58 -
CDR H3: 93-101 -
CDR L1: 30-36 -
CDR L2: 46-55 -
CDR L3: 89-96 -
("-"은 카바트와 동일한 넘버링을 의미한다)
따라서, 당업자는 제시된 단일 가변 도메인 서열, 예를 들어 서열 1-38, 204, 206, 208, 214, 234, 236, 238, 240, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285 및 287 중 임의의 하나에 제시된 서열을 갖는 것으로부터, 어떤 CDR 서열 그 내에 포함되는지를 본원에 개략된 다양한 방법을 사용하여 추정할 수 있다. 예를 들어, 제시된 단일 가변 도메인 서열, 예를 들어 서열 1에 대해 당업자는 상기 언급된 CDR 정의 방법 중 임의의 하나 또는 조합을 사용하여 그 내에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 결정할 수 있다. 카바트 CDR 정의를 사용할 때, 당업자는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열이 각각 서열 77, 113 및 149에 제시된 것임을 결정할 수 있다. 적합하게는, CDR 서열은 본원에서 설명되는 카바트의 방법을 사용하여 결정된다. 한 실시양태에서, 각각의 서열의 CDR 서열은 표 1, 2, 9 및 13에 제시된 것이다. 한 실시양태에서, CDR1 서열은 서열 77-112, 241, 244, 247, 및 250으로부터 선택되는 CDR1 서열이다. 한 실시양태에서, CDR2 서열은 서열 113-148, 242, 245, 248, 및 251로부터 선택되는 CDR2 서열이다. 한 실시양태에서, CDR3 서열은 서열 149-184, 243, 246, 249, 및 252로부터 선택되는 CDR3 서열이다.
CDR 변이체 또는 변이체 결합 단위는 적어도 하나의 아미노산에 의해 변형된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 변형은 아미노산 서열의 화학적 또는 부분적인 변경 (예를 들어 10개 이하의 아미노산에 의한 것)일 수 있고, 상기 변형은 변이체가 비변형된 서열의 생물학적 특징을 보유하도록 허용한다. 예를 들어, 변이체는 TGF베타RII에 특이적으로 결합하는 기능성 변이체이다. CDR 아미노산 서열의 부분적인 변경은 1 내지 몇 개의 아미노산의 결실 또는 치환, 또는 1 내지 몇 개의 아미노산의 부가 또는 삽입, 또는 이들의 조합 (예를 들어 10개 이하의 아미노산에 의한 것)에 의한 것일 수 있다. CDR 변이체 또는 결합 단위 변이체는 아미노산 서열 내에 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 임의의 조합으로 함유할 수 있다. CDR 변이체 또는 결합 단위 변이체는 아미노산 서열 내에 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 임의의 조합으로 함유할 수 있다. 아미노산 잔기 내의 치환은 보존적 치환, 예를 들어, 하나의 소수성 아미노산의 다른 소수성 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들어, 류신은 발린 또는 이소류신으로 치환될 수 있다.
TGF베타RII: 본원에서 사용되는 바와 같이, "TGF베타RII" (전환 성장 인자 베타 타입 II 수용체; TGFβRII)는 천연 생성 또는 내인성 포유동물 TGF베타RII 단백질 및 천연 생성 또는 내인성의 대응하는 포유동물 TGF베타RII 단백질과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질 (예를 들어, 재조합 단백질, 합성 단백질 (즉, 합성 유기 화학의 방법을 사용하여 생산된 것))을 의미한다. 따라서, 본원에서 규정되는 바와 같이, 이 용어는 성숙 TGF베타RII 단백질, 다형태성 또는 대립유전자 변이체, 및 TGF베타RII의 다른 이소형 및 이들의 변형된 또는 비변형된 형태 (예를 들어, 지질화, 글리코실화)를 포함한다. 천연 생성 또는 내인성 TGF베타RII는 포유동물 (예를 들어, 인간, 비-인간 영장류)에서 천연 생성되는 야생형 단백질, 예컨대 성숙 TGF베타RII, 다형태성 또는 대립유전자 변이체 및 다른 이소형 및 돌연변이체 형태를 포함한다. 그러한 단백질은 예를 들어 TGF베타RII를 천연적으로 발현하는 공급원으로부터 회수되거나 단리될 수 있다. 이들 단백질 및 천연 생성 또는 내인성 대응하는 TGF베타RII와 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질은 대응하는 포유동물의 명칭에 따라 언급된다. 예를 들어, 대응하는 포유동물이 인간인 경우, 단백질은 인간 TGF베타RII로 지정된다. 인간 TGF베타RII는 예를 들어 문헌 [Lin, et al., Cell 1992, Vol. 68(4), p.775-785] 및 진뱅크 기탁 번호 M85079에 설명되어 있다.
인간 TGF베타RII는 대략 159개 아미노산의 세포외 도메인, 막횡단 (transmembrane) 도메인 및 신호 전달을 위한 단백질 키나제 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 갖는 567개 아미노산으로 이루어진 막횡단 수용체이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "TGF베타RII"는 또한 TGF베타RII의 일부 또는 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 일부 또는 단편은 TGF베타RII의 세포외 도메인 또는 그의 일부를 포함한다.
이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드, 리간드, 융합 단백질 등에 관련한 "항-TGF베타RII"는 TGF베타RII를 인식하고 이에 결합하는 모이어티를 의미한다. 한 실시양태에서 "항-TGF베타RII"는 단백질 TGF베타RII를 특이적으로 인식하고/하거나 특이적으로 결합하고, 적합하게는 인간 TGF베타RII이다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 또한 마우스 TGF베타RII (진뱅크 기탁 번호 NM_029575; 예를 들어 문헌 [Massague et al., Cell 69 (7), 1067-1070 (1992)]에 기재됨)에 결합한다.
"TGF베타"는 TGF베타1, TGF베타2 및 TGF베타3과 같은 이소형을 포함한다.
TGF베타는 TGF베타RII에 결합하고, TGF베타RI과의 복합체에서 신호전달 경로를 개시한다. 따라서, TGF베타 활성 및 TGF베타 활성의 억제 또는 중화는 TGF베타 신호전달의 출력을 측정하는 임의의 검정을 통해 결정될 수 있다. TGF베타 신호전달은 예를 들어 문헌 [Itoh, et al., Eur. J. Biochem 2000, Vol. 267, p.6954]; [Dennler, et al., Journal of Leucocyte Biol. 2002, 71(5), p. 731-40]에서 검토되었다. 따라서, TGF베타 활성은 당업자에게 잘 알려진 많은 상이한 검정에서 시험될 수 있다. "억제" 또는 "중화"는 TGF베타의 생물학적 활성이 본 개시내용의 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인의 부재 하의 TGF베타의 활성에 비해 상기 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인의 존재 하에 완전히 또는 부분적으로 감소됨을 의미한다.
한 실시양태에서, TGF베타 활성의 억제 또는 중화는 IL-11 방출 검정에서 시험된다. 상기 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인의 능력은 세포, 예컨대 A549 세포로부터 인간 TGF베타1 (TGF베타1; TGF-β1) 자극된 IL-11 방출을 억제하는 그의 능력에 대해 시험된다. TGF베타1 (TGF-β1)은 TGF베타RII (TGF-βRII)에 직접 결합하고, TGF베타RI/RII (TGF-βRI/II) 복합체의 회합을 유도한다. TGF베타RI (TGF-βRI)은 인산화되고 Smad4 경로를 비롯한 몇몇 경로를 통해 신호를 전달할 수 있다. Smad4 경로의 활성화는 IL-11의 방출을 일으킨다. IL-11은 세포 상청액 내로 분비되고, 따라서 비색 ELISA에 의해 측정된다. 적합한 IL-11 방출 검정, 예컨대 R&D 시스템즈 (R&D systems)에 의해 공급되는 인간 IL-11 콴티킨 (Quantikine) ELISA 검정 키트 (ref. D1100)이 본원에서 설명된다.
또 다른 실시양태에서, TGF베타 활성은 MC3T3-E1 루시퍼라제 검정으로 MC3T3-E1 세포에서 CAGA-루시퍼라제의 TGF베타-유도된 발현을 억제하는 본 개시내용에 따른 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인의 능력에 대한 검정에서 시험된다. CAGA 박스로 불리는 TGF베타-반응성 서열 모티프의 3개 카피가 인간 PAI-1 프로모터 내에 존재하고, Smad3 및 4 단백질에 특이적으로 결합한다. 다수 카피의 CAGA 박스를 루시퍼라제 리포터 구축물 내로 클로닝하면 리포터 시스템으로 형질감염된 세포에 TGF베타 반응성을 부여한다. 하나의 적합한 검정이 본원에서 설명되고, [CAGA]12-루시퍼라제 리포터 구축물로 안정하게 형질감염된 MC3T3-E1 세포 (마우스 골모세포)를 사용한다 (문헌 [Dennler, et al., (1998) EMBO J. 17, 3091-3100]).
다른 적합한 검정은 인간 SBE 베타-락타마제 세포 검정 (인비트로겐(INVITROGEN)®, 셀 센서 검정)을 포함한다. 적합한 검정의 예를 본원에서 설명한다.
적합하게는, 본 개시내용에 따른 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드, 리간드 또는 융합 단백질은 그 자체가 TGF베타RII 수용체 신호전달을 활성화하지 않는다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드, 리간드 또는 융합 단백질은 10 μM에서 TGF베타RII 효능제 활성을 갖지 않는다. 효능제 활성은 TGF베타의 부재 하에 본원에서 설명되는 TGF베타RII 검정으로 관심있는 화합물을 시험함으로써 결정될 수 있다. TGF베타가 부재하는 경우에, 관심있는 화합물의 효능제 활성은 TGF베타RII 신호전달을 검출함으로써 검출될 것이다.
상동성: 본원에 개시된 서열에 유사한 또는 상동성 (예를 들어, 적어도 약 70% 서열 동일성)인 서열도 본 개시내용의 일부이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 수준에서 서열 동일성은 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과일 수 있다. 핵산 수준에서, 서열 동일성은 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과일 수 있다. 별법으로, 실질적인 동일성은 핵산이 선택적인 혼성화 조건 (예를 들어, 매우 고 엄격성 혼성화 조건) 하에 가닥의 상보체에 혼성화할 때 존재한다. 핵산은 전체 세포에, 세포 용해물에, 또는 부분적으로 정제된 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "저 엄격성", "배지 엄격성", "고 엄격성", 또는 "매우 높은 엄격성" 조건은 핵산 혼성화 및 세척을 위한 조건을 설명한다. 혼성화 반응의 수행에 대한 지침은 그 전체가 본원에 참고로 포함된 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]에서 볼 수 있다. 수성 및 비수성 방법이 상기 문헌에 설명되어 있고, 어느 한 방법을 사용할 수 있다. 본원에서 언급되는 특이적 혼성화 조건은 다음과 같다: (1) 낮은 엄격성 혼성화 조건: 약 45℃의 6X 염화나트륨/나트륨 시트레이트 (SSC), 이어서 적어도 50℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS 내의 2회 세척 (세척액의 온도는 낮은 엄격성 조건에 대해 55℃로 높일 수 있다); (2) 배지 엄격성 혼성화 조건: 약 45℃의 6X SSC, 이어서 60℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS 내의 1회 이상의 세척; (3) 고 엄격성 혼성화 조건: 약 45℃의 6X SSC, 이어서 65℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS 내의 1회 이상의 세척; 및 임의로 (4) 매우 고 엄격성 혼성화 조건은 65℃의 0.5M 인산나트륨, 7% SDS, 이어서 65℃에서 0.2X SSC, 1% SDS의 1회 이상의 세척이다. 매우 높은 엄격성 조건 (4)이 바람직한 조건이고, 달리 특정되지 않으면 사용되어야 하는 조건이다.
두 서열 사이의 "상동성" 또는 "서열 동일성" 또는 "유사성" (이들 용어는 본원에서 교환가능하게 사용됨)의 계산은 다음과 같이 수행한다. 서열은 최적의 비교를 위해 정렬된다 (예를 들어, 최적 정렬을 위해 제1 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 모두에 갭이 도입될 수 있고, 비-상동성 서열은 비교 목적을 위해 무시될 수 있다). 한 실시양태에서, 비교를 위해 정렬되는 참조 서열의 길이는 참조 서열 길이의 적어도 약 30%, 임의로 적어도 약 40%, 임의로 적어도 약 50%, 임의로 적어도 약 60%, 및 임의로 적어도 약 70%, 80%, 85% 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 이어서, 대응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 비교된다. 제1 서열 내의 위치가 제2 서열 내의 대응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유되면, 분자는 그 위치에서 동일한 것이다 (본원에서 사용되는 바와 같이 아미노산 또는 핵산 "상동성"은 아미노산 또는 핵산 "동일성"과 동등한다). 두 서열 사이의 동일성 비율은 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수, 및 각각의 갭의 길이를 고려하여 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다.
아미노산 및 뉴클레오티드 서열 정렬 및 본원에서 규정되는 바와 같은 상동성, 유사성 또는 동일성은 디폴트 파라미터 (문헌 [Tatusova, T. A. et al.., FEMS Microbiol Lett, 174: 187-188 (1999)])를 사용하여 알고리즘 BLAST 2 Sequences에 의해 임의로 준비되고 결정된다. 별법으로, BLAST 알고리즘 (버전 2.0)이 서열 정렬을 위해 사용되고, 이때 파라미터는 디폴트 값으로 설정된다. BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)는 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn, 및 tblastx에 의해 사용되는 휴리스틱 검색 (heuristic search) 알고리즘이고; 이들 프로그램은 문헌 [Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(6): 2264-8]의 통계적 방법을 사용하여 그의 발견에 유의성을 부여한다.
리간드: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "리간드"는 TGF베타RII에 대한 결합 특이성을 갖는 결합 부위를 갖는 적어도 하나의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 모이어티를 포함하는 화합물을 의미한다. 리간드는 또한 "결합 모이어티"로도 언급될 수 있다.
본 개시내용에 따른 리간드 또는 결합 모이어티는 임의로 상이한 결합 특이성을 갖는 이뮤노글로불린 가변 도메인을 포함하고, 함께 표적 화합물에 대한 결합 부위를 형성하는 가변 도메인 쌍을 함유하지 않는다 (즉, 함께 TGF베타RII에 대한 결합 부위를 형성하는 이뮤노글로불린 중쇄 가변 도메인 및 이뮤노글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함하지 않는다). 임의로, 표적에 대한 결합 특이성을 갖는 결합 부위를 갖는 각각의 도메인은 요구되는 표적 (예를 들어, TGF베타RII)에 대한 결합 특이성을 갖는 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 (예를 들어, 이뮤노글로불린 단일 중쇄 가변 도메인 (예를 들어, VH, VHH), 이뮤노글로불린 단일 경쇄 가변 도메인 (예를 들어, VL))이다.
따라서, "리간드"는 각각 상이한 표적에 결합하는 2개 이상의 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 리간드는 또한 상이한 표적에 결합하는 적어도 2개의 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 또는 단일 가변 도메인의 CDR 서열을 적합한 포맷, 예컨대 항체 포맷 (예를 들어, IgG-유사 포맷, scFv, Fab, Fab', F(ab')2) 또는 적합한 단백질 스캐폴드 또는 골격, 예컨대 아피바디, SpA 스캐폴드, LDL 수용체 클래스 A 도메인, EGF 도메인, 아비머 및 본원에서 설명되는 이중- 및 다중-특이적 리간드로 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
표적 (예를 들어, TGF베타RII)에 대한 결합 특이성을 갖는 결합 부위를 갖는 폴리펩티드 도메인은 또한 요구되는 표적에 대한 결합 부위를 포함하는 단백질 도메인일 수 있고, 예를 들어, 단백질 도메인은 아피바디, SpA 도메인, LDL 수용체 클래스 A 도메인, 아비머로부터 선택된다 (예를 들어, U.S. 특허 출원 공개 2005/0053973, 2005/0089932, 2005/0164301 참조). 요구될 경우, "리간드"는 각각 독립적으로 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 모이어티 또는 비-펩티드성 모이어티 (예를 들어, 폴리알킬렌 글리콜, 지질, 탄수화물)일 수 있는 하나 이상의 추가의 모이어티를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 리간드는 본원에서 설명되는 반감기 연장 모이어티 (예를 들어, 폴리알킬렌 글리콜 모이어티, 알부민, 알부민 단편 또는 알부민 변이체를 포함하는 모이어티, 트랜스페린, 트랜스페린 단편 또는 트랜스페린 변이체를 포함하는 모이어티, 알부민에 결합하는 모이어티, 신생아 Fc 수용체에 결합하는 모이어티)를 추가로 포함할 수 있다.
경쟁하다: 본원에서 언급되는 바와 같이, 용어 "경쟁하다"는 제1 표적 (예를 들어, TGF베타RII)의 그의 동족 표적 결합 도메인 (예를 들어, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인)에 대한 결합이 상기 동족 표적에 특이적인 제2 결합 도메인 (예를 들어, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인)의 존재 하에 억제됨을 의미한다. 예를 들어, 결합은 예를 들어 결합 도메인의 물리적 차단에 의해 또는 표적에 대한 그의 친화도 또는 결합력이 감소되도록 결합 도메인의 구조 또는 환경의 변경에 의해 입체적으로 억제될 수 있다. 제1 및 제2 결합 도메인 사이의 경쟁을 결정하기 위해 경쟁 ELISA 및 경쟁 비아코어™ 실험을 수행하는 방법의 상세한 내용에 대해서는, 본 개시내용에 사용하기 위한 분명한 개시내용을 제공하기 위해 그의 상세한 내용이 본원에 참고로 포함된 WO2006038027을 참조한다. 본 개시내용은 서열 1-38의 단일 가변 도메인 중 임의의 하나와 경쟁하는 항원 결합 단백질, 구체적으로 단일 가변 도메인, 폴리펩티드, 리간드 및 융합 단백질을 포함한다. 특정 실시양태에서, 서열 1-38의 단일 가변 도메인 중 임의의 하나와 경쟁하고 TGF베타RII에 대해 50 nM 이하의 KD를 갖는 TGF베타RII 결합 단백질이 제공된다. 특정 실시양태에서, KD는 10 pM 내지 50 nM이다. 특정 실시양태에서, KD는 10 pM 내지 10 nM이다. 특정 실시양태에서, KD는 100 pM 내지 10 nM이다. 특정 실시양태에서, KD는 대략 100 pM이다.
TGF베타 신호전달: 적합하게는, 본 개시내용의 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드는 TGF베타RII를 통한 TGF베타 신호전달을 중화할 수 있다. "중화하는"은 TGF베타의 존재가 TGF베타RII 신호전달에 대한 중화 효과를 갖도록 TGF베타의 정상적인 신호전달 효과가 차단됨을 의미한다. 중화 효과 측정에 적합한 방법은 본원에서 설명되는 바와 같은 TGF베타 신호전달에 대한 검정을 포함한다. 한 실시양태에서, 중화는 TGF베타 신호전달 검정에서 TFG베타 활성의 억제 %로서 관찰된다. 한 실시양태에서, 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드는 TGF베타RII의 세포외 도메인에 결합하여, TGF베타RII의 세포외 도메인에 대한 TGF베타의 결합을 억제/차단한다. 적합하게는, 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드는 과량의 생체이용성 TGF베타가 존재하고 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드가 그의 동족 수용체 TGF베타RII에 대한 TGF베타의 결합의 억제를 통해 생체이용성 TGF베타의 신호전달 활성을 억제하는 작용을 하는 경우에 유용하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "TGF베타RII의 길항제" 또는 "항-TGF베타RII 길항제" 등은 TGF베타RII에 결합하고 TGF베타RII의 (하나 이상의) 기능을 억제할 수 있는 작용제 (예를 들어, 분자, 화합물)를 의미한다. 예를 들어, TGF베타RII의 길항제는 TGF베타RII에 대한 TGF베타의 결합을 억제하고/하거나 TGF베타RII를 통해 매개된 신호 전달을 억제할 수 있다. 따라서, TGF베타-매개 과정 및 세포 반응은 TGF베타RII의 길항제로 억제될 수 있다.
한 실시양태에서, TGF베타RII에 결합하는 리간드 (예를 들어, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인)는 ≤약 10 μM, ≤약 1 μM, ≤약 100 nM, ≤약 50 nM, ≤약 10 nM, ≤약 5 nM, ≤약 1 nM, ≤약 500 pM, ≤약 300 pM, ≤약 100 pM, 또는 ≤약 10 pM의 억제 농도 50 (IC50)으로 TGF베타RII 수용체에 대한 TGF베타의 결합을 억제한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인의 IC50은 15 μM 이하이다. IC50은 임의로 시험관 내 TGF베타 수용체 결합 검정, 또는 세포 검정, 예컨대 본원에서 설명되는 검정을 사용하여 결정된다
또한, 리간드 (예를 들어, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인)는 ≤약 10 μM, ≤약 1 μM, ≤약 100 nM, ≤약 50 nM, ≤약 10 nM, ≤약 5 nM, ≤약 1 nM, ≤약 500 pM, ≤약 300 pM, ≤약 100 pM, ≤약 10 pM, ≤약 1 pM, ≤약 500 fM, ≤약 300 fM, ≤약 100 fM, ≤약 10 fM의 중화 용량 50 (ND50)으로 적합한 시험관 내 검정에서 TGF베타RII 유도 기능을 임의로 억제하는 것이 고려된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 TGF-β의 40% 초과의 중화를 달성한다.
"이중-특이적 리간드": 한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드는 제1 항원 또는 에피토프 결합 부위 (예를 들어, 제1 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인) 및 제2 항원 또는 에피토프 결합 부위 (예를 들어, 제2 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인)을 포함하는 리간드를 의미하는 "이중-특이적 리간드"의 일부일 수 있고, 여기서 결합 부위 또는 가변 도메인은 2개의 항원 (예를 들어, 상이한 항원 또는 2 카피의 동일한 항원) 또는 정상적으로는 단일특이적 이뮤노글로불린에 의해 결합되지 않는 동일한 항원 상의 2개의 에피토프에 결합할 수 있다. 예를 들어, 2개의 에피토프는 동일한 항원 상에 존재할 수 있지만, 동일한 에피토프이거나 또는 단일특이적 리간드에 의해 결합될 정도로 충분히 인접하여 존재하지는 않는다. 한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 이중-특이적 리간드는 상이한 특이성을 갖는 결합 부위 또는 가변 도메인으로 이루어지고, 동일한 특이성을 갖는 상호 상보성인 가변 도메인 쌍 (즉, VH/VL 쌍)을 포함하지 않는다 (즉, 단일 결합 부위를 형성하지 않음).
한 실시양태에서, "이중-특이적 리간드"는 TGF베타RII 및 또 다른 표적 분자에 결합할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 이중-특이적 리간드가, 본 개시내용에 따른 항-TGF베타RII 폴리펩티드 또는 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인이 관심있는 조직에 대해 표적화되게 만들 수 있도록, 또 다른 표적 분자는 조직-특이적 표적 분자일 수 있다. 상기 조직은 폐, 간 등을 포함한다.
다중특이적 dAb 다량체가 또한 제공된다. 이것은 본 개시내용의 임의의 측면에 따른 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 및 각각 상이한 표적 (예를 들어 TGF베타RII 이외의 다른 표적)에 결합하는 하나 이상의 단일 가변 도메인을 포함하는 dAb 다량체를 포함한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 dAb 다량체, 예를 들어 본 개시내용의 임의의 측면에 따른 하나 이상의 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 및 제2의 상이한 표적에 결합하는 하나 이상의 dab를 포함하는 dab 다량체가 제공된다. 한 실시양태에서, 삼중특이적 dAb 다량체가 제공된다.
본 개시내용의 리간드 (예를 들어, 폴리펩티드, dAb 및 길항제)는 제2 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인에 직접 융합된 제1 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인을 함유하는 융합 단백질의 포맷을 가질 수 있다. 필요한 경우, 상기 포맷은 반감기 연장 모이어티를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 리간드는 혈청 알부민에 결합하는 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인에 직접 융합된 제2 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인에 직접 융합된 제1 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인을 포함할 수 있다.
일반적으로, 표적에 대한 결합 특이성을 갖는 결합 부위를 갖는 폴리펩티드 도메인의 배향, 및 리간드의 링커 포함 여부는 설계 선택 상의 문제이다. 그러나, 링커가 존재하거나 존재하지 않는 일부 배향은 다른 배향보다 양호한 결합 특성을 제공할 수 있다. 본 개시내용에 의해 포함되는 모든 배향 (예를 들어, dAb1-링커-dAb2; dAb2-링커-dAb1)은 스크리닝에 의해 쉽게 확인될 수 있는 요구되는 결합 특성을 제공하는 배향을 갖는 리간드이다.
본 개시내용에 따른 폴리펩티드 및 dAb 단량체, 이량체 및 삼량체를 포함한 dAb는 CH2 및 CH3 도메인 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 항체 Fc 영역, 및 임의로 힌지 영역에 연결될 수 있다. 예를 들어, Fc 영역에 단일 뉴클레오티드 서열로서 연결된 리간드를 코딩하는 벡터가 상기 폴리펩티드의 제조를 위해 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, dAb-Fc 융합체가 제공된다.
본 개시내용은 또한 상기 언급된 dAb 단량체의 이량체, 삼량체 및 중합체를 제공한다.
표적: 본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "표적"은 결합 부위를 갖는 폴리펩티드 도메인이 결합할 수 있는 생물학적 분자 (예를 들어, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 지질, 탄수화물)를 의미한다. 표적은 예를 들어 세포내 표적 (예를 들어, 세포내 단백질 표적), 가용성 표적 (예를 들어, 분비된 것), 또는 세포 표면 표적 (예를 들어, 막 단백질, 수용체 단백질)일 수 있다. 한 실시양태에서, 표적은 TGF베타RII이다. 또 다른 실시양태에서, 표적은 TGF베타RII 세포외 도메인이다.
상보성: 본원에서 사용되는 바와 같이, "상보성"은 2개의 이뮤노글로불린 도메인이 동족 쌍 또는 군을 형성하는 구조의 패밀리에 속하거나 또는 상기 패밀리로부터 유래되고 상기 특징을 보유함을 나타낸다. 예를 들어, 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인은 상보성이고; 2개의 VH 도메인은 상보성이 아니고, 2개의 VL 도메인은 상보성이 아니다. 상보성 도메인은 이뮤노글로불린 수퍼패밀리의 다른 구성원, 예컨대 T-세포 수용체의 Vα 및 Vβ (또는 γ 및 δ) 도메인에서 볼 수 있다. 인공 도메인, 예컨대 에피토프에 결합하도록 조작되지 않으면 결합하지 않는 단백질 스캐폴드를 기초로 한 도메인은 비-상보성이다. 마찬가지로, (예를 들어) 이뮤노글로불린 도메인 및 피브로넥틴 도메인을 기초로 한 2개의 도메인은 상보성이 아니다.
"친화도" 및 "결합력"은 결합 상호작용의 강도를 설명하는 기술 용어이다. 본 개시내용의 리간드에 대해서, 결합력은 세포 상의 표적 (예를 들어, 제1 표적 및 제2 표적)과 리간드 사이의 총 결합 강도를 의미한다. 결합력은 개별 표적에 대한 개별 친화도의 합보다 크다.
핵산 분자, 벡터 및 숙주 세포: 본 개시내용은 또한 본원에서 설명되는 리간드 (단일 가변 도메인, 융합 단백질, 폴리펩티드, 이중-특이적 리간드 및 다중특이적 리간드)를 코딩하는 단리된 및/또는 재조합 핵산 분자를 제공한다.
본원에서 "단리된" 것으로 언급되는 핵산은 그의 공급원의 게놈 DNA 또는 세포 RNA의 핵산으로부터 분리된 핵산이고 (예를 들어, 핵산은 세포에 또는 핵산의 혼합물, 예컨대 라이브러리에 존재하기 때문에), 본질적으로 순수한 핵산, 화학적 합성에 의해, 생물학적 및 화학적 방법의 조합에 의해 생산된 핵산, 및 단리된 재조합 핵산을 비롯하여 본원에서 설명되는 방법 또는 다른 적합한 방법에 의해 얻은 핵산을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Daugherty, B.L. et al., Nucleic Acids Res., 19(9): 2471 2476 (1991)]; [Lewis, A.P. and J.S. Crowe, Gene, 101: 297-302 (1991)] 참조).
본원에서 "재조합"으로 언급되는 핵산은 인공 재조합 방법, 예컨대 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 및/또는 제한 효소를 이용한 벡터 내로의 클로닝에 의존하는 절차에 의해 생산되는 핵산을 비롯하여 재조합 DNA 방법에 의해 생산된 핵산이다.
특정 실시양태에서, 단리된 및/또는 재조합 핵산은 본원에서 설명되는 바와 같이 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 리간드는 본원에 개시된 TGF베타RII에 결합하는 dAb의 아미노산 서열, 예를 들어 임의의 서열 1-38에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 뉴클레오티드 서열 동일성은 선택된 항-TGF베타RII dAb를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐 결정될 수 있다. 한 실시양태에서, 핵산 서열은 서열 39-66 중 임의의 하나에 적어도 80% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 한 실시양태에서, 핵산 서열은 서열 39-76 중 임의의 하나의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 개시내용의 실시양태는 또한 예를 들어 세균, 포유동물 또는 효모 세포 내에서 발현에 최적화된, 본원에 개시된 폴리펩티드 및 가변 도메인을 코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열을 제공한다.
본 개시내용은 본 개시내용의 재조합 핵산 분자를 포함하는 벡터를 또한 제공한다. 특정 실시양태에서, 벡터는 본 개시내용의 재조합 핵산에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 발현 제어 요소 또는 서열을 포함하는 발현 벡터이다. 본 개시내용은 또한 본 개시내용의 재조합 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 본 개시내용의 재조합 숙주 세포를 생산하기에 적합한 벡터 (예를 들어, 플라스미드, 파지미드), 발현 제어 요소, 숙주 세포 및 방법은 당업계에 공지되어 있고, 그 예가 본원에서 추가로 설명된다.
적합한 발현 벡터는 많은 성분, 예를 들어 복제 기점, 선택가능한 마커 유전자, 하나 이상의 발현 제어 요소, 예컨대 전사 제어 요소 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 종결인자) 및/또는 하나 이상의 번역 신호, 신호 서열 또는 리더 (leader) 서열 등을 함유할 수 있다. 존재할 경우, 발현 제어 요소 및 신호 서열은 벡터 또는 다른 공급원에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 항체 사슬을 코딩하는 클로닝된 핵산의 전사 및/또는 번역 제어 서열이 발현 유도에 사용될 수 있다.
프로모터는 요구되는 숙주 세포에서의 발현을 위해 제공될 수 있다. 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 핵산의 전사를 유도하도록 항체, 항체 사슬 또는 그의 일부를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결될 수 있다. 원핵 숙주 (예를 들어, 이. 콜라이 (E. coli)에 대한 lac, tac, T3, T7 프로모터) 및 진핵 숙주 (예를 들어, 원숭이 바이러스 40 조기 또는 후기 프로모터, 라우스 (Rous) 육종 바이러스 긴 말단 반복 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터)에 적합한 다양한 프로모터가 이용가능하다.
또한, 발현 벡터는 일반적으로 벡터를 보유하는 숙주 세포의 선택을 위한 선택가능 마커, 및 복제가능 발현 벡터의 경우 복제 기점을 포함한다. 항생제 또는 약물 내성을 부여하는 생성물을 코딩하는 유전자는 통상적인 선택가능 마커이고, 원핵 (예를 들어, 락타마제 유전자 (암피실린 내성), 테트라사이클린 내성을 위한 Tet 유전자) 및 진핵 세포 (예를 들어, 메오마이신 (G418 또는 게네티신), gpt (미코페놀산), 암피실린, 또는 히그로마이신 내성 유전자)에서 사용될 수 있다. 디히드로폴레이트 리덕타제 마커 유전자는 다양한 숙주에서 메토트렉세이트를 사용한 선택을 허용한다. 숙주의 영양요구성 마커의 유전자 생성물 (예를 들어, LEU2, URA3, HIS3)을 코딩하는 유전자는 종종 효모에서 선택가능한 마커로서 사용된다. 바이러스 (예를 들어, 바큘로바이러스) 또는 파지 벡터, 및 숙주 세포, 예컨대 레트로바이러스 벡터의 게놈 내로 통합할 수 있는 벡터도 고려된다. 포유동물 세포 및 원핵 세포 (이. 콜라이), 곤충 세포 (드로소필라 슈니더 (Drosophila Schnieder) S2 세포, Sf9) 및 효모 (피. 메타놀리카 (P. methanolica), 피. 파스토리스 (P. pastoris), 에스. 세레비지애 (S. cerevisiae))에서의 발현에 적합한 발현 벡터는 당업계에 공지되어 있다.
적합한 숙주 세포는 원핵, 예를 들어 세균 세포, 예컨대 이. 콜라이, 비. 섭틸리스 및/또는 다른 적합한 세균; 진핵 세포, 예컨대 진균 또는 효모 세포 (예를 들어, 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris), 아스페르길루스 (Aspergillus) 종, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa)), 또는 다른 하등 진핵 세포, 및 고등 진핵세포의 세포, 예컨대 곤충의 세포 (예를 들어, 드로소필라 슈니더 S2 세포, Sf9 곤충 세포 (WO 94/26087 (O'Connor)), 포유동물 (예를 들어, COS 세포, 예컨대 COS-1 (ATCC 기탁 번호 CRL-1650) 및 COS-7 (ATCC 등록 번호 CRL-1651), CHO (예를 들어, ATCC 기탁 번호 CRL-9096, CHO DG44 (문헌 [Urlaub, G. and Chasin, LA., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77(7):4216-4220 (1980)])), 293 (ATCC 기탁 번호 CRL-1573), HeLa (ATCC 기탁 번호 CCL-2), CV1 (ATCC 기탁 번호 CCL-70), WOP (문헌 [Dailey, L, et al., J. Virol., 54:739-749 (1985)]), 3T3, 293T (문헌 [Pear, W. S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:8392-8396 (1993)]), NS0 세포, SP2/0, HuT 78 세포 등, 또는 식물 (예를 들어, 담배)일 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ausubel, F.M. et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc. (1993)] 참조). 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 단리된 숙주 세포이고, 다세포 유기체 (예를 들어, 식물 또는 동물)의 일부가 아니다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 비-인간 숙주 세포이다. 본 개시내용은 또한 본 개시내용의 재조합 핵산을 포함하는 재조합 숙주 세포를 재조합 핵산의 발현에 적합한 조건 하에 유지함으로써 재조합 핵산이 발현되고 리간드가 생산되는 것을 포함하는, 본 개시내용의 리간드 (예를 들어, 이중-특이적 리간드, 다중특이적 리간드)의 생산 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 리간드의 단리를 추가로 포함한다.
본 개시내용의 실시양태에 적용될 수 있는 개시내용의 상세한 내용에 대해서는 WO200708515의 페이지 161, 24행 내지 페이지 189, 10행을 참조한다. 상기 개시내용은 마치 본 개시내용의 명세서에 명백하게 제시되고 본 개시내용의 실시양태에 관련되는 것처럼, 및 하기 청구의 범위 내에 포함되는 본 개시내용에 대한 명백한 지지를 제공하기 위해 본원에 참고로 포함된다. 이것은 "이뮤노글로불린 기반 리간드의 제조", "라이브러리 벡터 시스템", "라이브러리 구축", "조합 단일 가변 도메인", "리간드의 특성", "리간드의 구조", "골격", "단백질 스캐폴드", "리간드 구축에 사용하기 위한 스캐폴드", "정규 서열의 다양성" 및 "치료 및 진단 조성물 및 용도", 및 "작동가능하게 연결된", "나이브 (naive)", "예방", "억제", "치료", "알러지성 질환", "Th2-매개 질환", "치료 유효 용량" 및 "효과적인"의 정의에 대한 상세한 내용을 제공하는 WO200708515, 페이지 161, 24행 내지 페이지 189, 10행에 제시된 개시내용을 포함한다.
문구 "반감기"는 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드의 혈청 농도가 예를 들어 리간드의 분해 및/또는 천연 메카니즘에 의한 리간드의 소실 또는 제거에 의해 생체 내에서 50% 감소하는데 걸리는 시간을 의미한다. 본 개시내용의 리간드는 분해 및/또는 소실 또는 제거에 저항하는 분자에 대한 결합에 의해 생체 내에서 안정화되고, 그 반감기가 증가될 수 있다. 일반적으로, 상기 분자는 생체 내에서 그 자체가 긴 반감기를 갖는 천연 생성 단백질이다. 반감기 증가 분자에 특이적이지 않은 유사한 리간드보다 더 장기간 동안 생체 내에서 그의 기능적 활성이 지속된다면 리간드의 반감기는 증가된다. 따라서, HSA 및 표적 분자에 특이적인 리간드는 HSA에 결합하지 않지만 또 다른 분자에는 결합하는, HSA에 대한 특이성이 존재하지 않는 동일한 리간드와 비교된다. 일반적으로, 반감기는 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 그 초과로 증가한다. 2x, 3x, 4x, 5x, 10x, 20x, 30x, 40x, 50x 또는 그 초과의 반감기가 가능하다. 별법으로, 또는 추가로, 반감기의 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x, 100x, 150x까지의 증가가 가능하다.
포맷: 증가된 반감기는 이뮤노글로불린, 특히 항체, 가장 특히 작은 크기의 항체 단편의 생체 내 적용에 유용할 수 있다. 상기 단편 (Fv, 디술피드 결합된 Fv, Fab, scFv, dAb)은 일반적으로 신체로부터 신속하게 소실된다. 본 개시내용에 따른 dAb, 폴리펩티드 또는 리간드는 증가된 생체 내 반감기 및 이에 따른 리간드의 기능적 활성의 신체 내에서 보다 긴 지속 시간을 제공하도록 조정될 수 있다.
리간드 반감기의 약동학적 분석 및 결정을 위한 방법에 대해 당업자는 잘 알고 있을 것이다. 상세한 내용은 문헌 [Kenneth, A et al.: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists] 및 [Peters et al., Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996)]에서 볼 수 있다. 또한, 약동학적 파라미터, 예컨대 t 알파 및 t 베타 반감기 및 곡선하 면적 (AUC)을 설명하는 문헌 ["Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. ex edition (1982)]을 참조한다.
반감기 (t1/2 알파 및 t1/2 베타) 및 AUC는 시간에 따른 리간드의 혈청 농도의 곡선으로부터 결정될 수 있다. 예를 들어 곡선을 모델링하기 위해 윈놀린(WINNONLIN)™ 분석 패키지 (파사이트 코프. (Pharsight Corp., 미국 CA94040 마운틴 뷰))를 사용할 수 있다. 제1 상 (알파 상)에서, 리간드는 대부분 환자에게 분배되고, 일부가 제거된다. 제2 상 (베타 상)은 리간드가 분배되고 리간드가 환자로부터 소실되기 때문에 혈청 농도가 감소하는 종료 상이다. t 알파 반감기는 제1 상의 반감기이고, t 베타 반감기는 제2 상의 반감기이다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 개시내용은 tα 반감기가 15분 이상의 범위인 본 개시내용에 따른 리간드 또는 이를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 범위의 하한은 30분, 45분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 10시간, 11시간 또는 12시간이다. 추가로, 또는 별법으로, 본 개시내용에 따른 리간드 또는 조성물의 tα 반감기는 12시간 이하이다. 한 실시양태에서, 범위의 상한은 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5시간이다. 적합한 범위의 예는 1 내지 6시간, 2 내지 5시간 또는 3 내지 4시간이다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 tβ 반감기가 약 2.5시간 이상의 범위인 본 개시내용에 따른 리간드 (폴리펩티드, dAb 또는 길항제) 또는 이를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 범위의 하한은 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 10시간, 약 11시간, 또는 약 12시간이다. 추가로, 또는 별법으로, 본 개시내용에 따른 리간드 또는 조성물의 tβ 반감기는 21일 이하이다. 한 실시양태에서, 범위의 상한은 약 12시간, 약 24시간, 약 2일, 약 3일, 약 5일, 약 10일, 약 15일 또는 약 20일이다. 한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 리간드 또는 조성물의 tβ 반감기는 약 12 내지 약 60시간일 것이다. 추가의 실시양태에서, 이 반감기는 약 12 내지 약 48시간일 것이다. 추가의 실시양태에서, 이 반감기는 약 12 내지 약 26시간일 것이다.
상기 기준에 추가로, 또는 별법으로, 본 개시내용은 AUC 값 (곡선하 면적)이 약 1 mg·min/ml 이상의 범위인 본 개시내용에 따른 리간드 또는 이를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 범위의 하한은 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 30, 약 100, 약 200 또는 약 300 mg·min/ml이다. 추가로, 또는 별법으로, 본 개시내용에 따른 리간드 또는 조성물의 AUC 범위는 약 600 mg·min/ml 이하이다. 한 실시양태에서, 범위의 상한은 약 500, 약 400, 약 300, 약 200, 약 150, 약 100, 약 75 또는 약 50 mg·min/ml이다. 한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 리간드의 AUC의 범위는 다음으로 이루어지는 군 중에서 선택될 것이다: 약 15 내지 약 150 mg·min/ml, 약 15 내지 약 100 mg·min/ml, 약 15 내지 약 75 mg·min/ml, 및 약 15 내지 약 50 mg·min/ml.
본 개시내용의 폴리펩티드 및 dAb 및 이를 포함하는 길항제는 예를 들어 PEG 기, 혈청 알부민, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체 또는 적어도 그의 트랜스페린-결합부, 항체 Fc 영역의 부착에 의해, 또는 항체 도메인에 대한 접합에 의해 보다 큰 유체역학적 크기를 갖도록 포맷될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 dAb 및 길항제는 항체의 보다 큰 항원-결합 단편으로서 또는 항체로서 포맷된다 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, IgG, scFv로서 포맷된다).
본원에서 사용되는 바와 같이, "유체역학적 크기"는 수용액을 통한 분자의 확산을 기초로 한 분자 (예를 들어, 단백질 분자, 리간드)의 겉보기 크기를 의미한다. 용액을 통한 단백질의 확산 또는 운동은 단백질의 겉보기 크기를 유도하기 위해 처리될 수 있고, 크기는 단백질 입자의 "스토크스 (Stokes) 반경" 또는 "유체역학적 반경"으로 제시된다. 단백질의 "유체역학적 크기"는 동일한 분자 질량을 갖는 2개의 단백질이 단백질의 전체적인 입체형태를 기초로 하여 상이한 유체역학적 크기를 가질 수 있도록 질량 및 형태 (입체형태) 둘 모두에 의해 좌우된다.
본 개시내용의 리간드 (예를 들어, dAb 단량체 및 다량체)의 유체역학적 크기는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 겔 여과 크로마토그래피는 리간드의 유체역학적 크기를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 리간드의 유체역학적 크기를 결정하기 위한 적합한 겔 여과 매트릭스, 예컨대 가교결합된 아가로스 매트릭스가 공지되어 있고 쉽게 이용가능하다.
리간드 포맷의 크기 (예를 들어, dAb 단량체에 부착된 PEG 모이어티의 크기)는 요구되는 용도에 따라 상이할 수 있다. 예를 들어, 리간드가 순환계로부터 벗어나 말초 조직 내로 도입되는 것이 의도될 경우, 혈류로부터의 유출을 용이하게 하기 위해 리간드의 유체역학적 크기를 작게 유지하는 것이 바람직하다. 별법으로, 리간드가 보다 장기간 동안 전신 순환계에 유지되는 것이 요구될 경우, 리간드의 크기는 예를 들어 Ig 유사 단백질로서 포맷함으로써 증가될 수 있다.
생체 내에서 반감기를 증가시키는 항원 또는 에피토프의 표적화에 의한 반감기 연장: 리간드의 유체역학적 크기 및 그의 혈청 반감기는 또한 본 개시내용의 TGF베타RII 결합 폴리펩티드, dAb 또는 리간드를 본원에서 설명되는 바와 같이 반감기를 생체 내에서 증가시키는 항원 또는 에피토프에 결합하는 결합 도메인 (예를 들어, 항체 또는 항체 단편)에 접합시키거나 회합시킴으로써 증가될 수 있다. 예를 들어, TGF베타RII 결합제 (예를 들어, 폴리펩티드)는 항-혈청 알부민 또는 항-신생아 Fc 수용체 항체 또는 항체 단편, 예를 들어 항-SA 또는 항-신생아 Fc 수용체 dAb, Fab, Fab' 또는 scFv에, 또는 항-SA 아피바디 또는 항-신생아 Fc 수용체 아피바디 또는 항-SA 아비머, 또는 항-SA 결합 도메인 (CTLA-4, 리포칼린, SpA, 아피바디, 아비머, GroEI 및 피브로넥틴으로 이루어지는 군 중에서 선택되고 이로 제한되지 않는 스캐폴드를 포함) (상기 결합 도메인의 개시내용에 대해서는, 도메인 및 그의 서열이 본원에 참고로 포함되고 본원 명세서의 개시내용의 일부를 형성하는 WO2008096158 참조)에 접합되거나 연결될 수 있다. 접합은 결합 도메인, 예컨대 혈청 알부민에 결합하는 결합 도메인에 결합 (공유 또는 비공유)된 본 개시내용의 폴리펩티드, dAb 또는 길항제를 포함하는 조성물을 나타낸다.
일반적으로, 생체 내에서 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드는, 생체 내에서 천연 생성되고 유기체 (예를 들어, 인간)로부터 원치 않는 물질을 제거하는 내인성 메카니즘에 의한 분해 또는 제거에 저항하는 폴리펩티드이다. 예를 들어, 생체 내에서 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드는 세포외 매트릭스로부터의 단백질, 혈액에서 발견되는 단백질, 혈액 뇌 장벽 또는 신경 조직에서 발견되는 단백질, 신장, 간, 폐, 심장, 피부 또는 뼈에 위치하는 단백질, 스트레스 단백질, 질환-특이적 단백질, 또는 Fc 수송에 관여하는 단백질로부터 선택될 수 있다. 적합한 폴리펩티드는 예를 들어 WO2008/096158에 기재되어 있다.
상기 방법은 또한 본 개시내용에 따른 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드의 관심있는 조직에 대한 표적화 전달을 위해 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 고 친화도 단일 가변 도메인의 표적화 전달이 제공된다.
혈청 알부민에 결합하는 dAb: 한 실시양태에서 본 개시내용은 폴리펩티드 또는 길항제 (예를 들어, TGF베타RII에 결합하는 항-TGF베타RII dAb (제1 dAb) 및 혈청 알부민 (SA)에 결합하는 제2 dAb (SA 결합 제2 dAb)를 포함하는 이중 특이적 리간드)를 제공한다. 이중 특이적 리간드의 상세한 내용은 WO03002609, WO04003019, WO2008096158 및 WO04058821에서 볼 수 있다.
리간드 및 길항제의 특정 실시양태에서, dAb는 인간 혈청 알부민에 결합하고 알부민에 대한 결합을 위해 WO2004003019에 개시된 임의의 dAb 서열 (이 서열 및 그의 핵산 대응물은 본원에 참고로 포함되고 본원 명세서의 일부를 형성함), WO2007080392에 개시된 임의의 dAb 서열 (이 서열 및 그의 핵산 대응물은 본원에 참고로 포함되고 본원 명세서의 일부를 형성함), WO2008096158에 개시된 임의의 dAb 서열 (이 서열 및 그의 핵산 대응물은 본원에 참고로 포함되고 본원 명세서의 일부를 형성함)로 이루어지는 군 중에서 선택된 dAb와 경쟁한다.
특정 실시양태에서, dAb는 인간 혈청 알부민에 결합하고, WO2004003019, WO2007080392 또는 WO2008096158에 기재된 dAb의 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 96%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 인간 혈청 알부민에 결합하는 dAb는 임의의 상기 dAb의 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 96%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, dAb는 인간 혈청 알부민에 결합하고, 임의의 상기 dAb의 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 96%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
보다 특정한 실시양태에서, dAb는 인간 혈청 알부민에 결합하는 Vκ dAb이다. 보다 특정한 실시양태에서, dAb는 인간 혈청 알부민에 결합하는 VH dAb이다.
혈청 알부민에 결합하는 적합한 낙타류 VHH는 WO2004041862 (Ablynx N .V.) 및 WO2007080392에 개시된 것을 포함한다 (VHH 서열 및 그의 핵산 대응물은 본원에 참고로 포함되고 본원 명세서의 개시내용의 일부를 형성함). 특정 실시양태에서, 낙타류 VHH는 인간 혈청 알부민에 결합하고, WO2007080392에 개시된 서열 또는 서열 518-534 (이들 서열 번호는 WO2007080392 또는 WO 2004041862에서 언급된 것에 대응함) 중 임의의 하나와 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 96%, 또는 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시양태에서, 길항제 또는 리간드는 TGF베타RII (예를 들어, 인간 TGF베타RII)에 특이적인 결합 모이어티를 포함하고, 여기서 모이어티는 WO2008096158에 설명된 비-이뮤노글로불린 서열을 포함하고, 상기 결합 모이어티, 그의 생산 및 선택 방법 (예를 들어, 다양한 라이브러리로부터)의 개시내용 및 그 서열은 본원 명세서의 개시내용의 일부로서 본원에 참고로 포함된다.
반감기 연장 모이어티 (예를 들어, 알부민)에 대한 접합: 한 실시양태에서, (하나 이상의) 반감기 연장 모이어티 (예를 들어, 알부민, 트랜스페린 및 그의 단편 및 유사체)는 본 개시내용의 TGF베타RII-결합 폴리펩티드, dAb 또는 길항제와 접합되거나 회합된다. TGF베타RII-결합 포맷에 사용하기 위한 적합한 알부민, 알부민 단편 또는 알부민 변이체의 예는 그 개시내용이 본원에 참고로 포함되고 본원 명세서의 개시내용의 일부를 형성하는 WO2005077042에 기재되어 있다.
TGF베타RII-결합 포맷에 사용하기 위한 적합한 알부민, 그의 단편 및 유사체의 추가의 예는 그 개시내용이 본원에 참고로 포함되고 본원 명세서의 개시내용의 일부를 형성하는 WO 03076567에 기재되어 있다.
(하나 이상의) 반감기 연장 모이어티 (예를 들어, 알부민, 트랜스페린 및 그의 단편 및 유사체)가 본 개시내용의 TGF베타RII-결합 폴리펩티드, dAb 및 길항제를 포맷하기 위해 사용될 경우에, 이 모이어티는 임의의 적합한 방법을 사용하여, 예컨대 융합 단백질을 코딩하는 단일 뉴클레오티드 구축물을 사용함으로써 TGF베타RII-결합 모이어티 (예를 들어, 항-TGF베타RII dAb)에 대한 직접 융합에 의해 접합될 수 있고, 여기서 융합 단백질은 TGF베타RII 결합 모이어티의 N- 또는 C-말단에 위치하는 반감기 연장 모이어티를 갖는 단일 폴리펩티드 사슬로서 코딩된다. 별법으로, 접합은 모이어티 사이에 펩티드 링커, 예를 들어 WO03076567 또는 WO2004003019에서 설명되는 펩티드 링커를 사용하여 달성될 수 있다 (상기 링커 개시내용은 본 개시내용에서 사용하기 위한 예를 제공하기 위해 본 개시내용에 참고로 포함된다).
PEG에 대한 접합: 다른 실시양태에서, 반감기 연장 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티이다. 한 실시양태에서, 길항제는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티 (임의로, 상기 모이어티는 약 20 내지 약 50 kDa의 크기를 갖고, 임의로 약 40 kDa의 선형 또는 분지형 PEG임)에 연결된 본 개시내용의 단일 가변 도메인을 포함한다 (임의로 이로 이루어진다). dAb 및 결합 모이어티의 PEG화에 대한 보다 상세한 내용에 대해서는 WO04081026을 참조한다. 한 실시양태에서, 길항제는 PEG에 연결된 dAb 단량체로 이루어지고, 여기서 dAb 단량체는 본 개시내용에 따른 단일 가변 도메인이다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 단일 가변 도메인, 리간드 또는 폴리펩티드는 독소 모이어티 또는 독소에 연결될 수 있다.
프로테아제 내성: 본 개시내용에 따른 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드는 프로테아제 분해에 대한 그들의 내성을 개선하기 위해 변형될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "프로테아제 분해에 대한 내성"인 펩티드 또는 폴리펩티드 (예를 들어 도메인 항체 (dAb))는 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에 프로테아제와 함께 인큐베이팅할 때 프로테아제에 의해 실질적으로 분해되지 않는다. 폴리펩티드 (예를 들어, dAb)는 프로테아제 활성에 적합한 온도, 예를 들어 37 또는 50℃에서 약 1시간 동안 프로테아제와 함께 인큐베이팅한 후, 약 25% 이하, 약 20% 이하, 약 15% 이하, 약 14% 이하, 약 13% 이하, 약 12% 이하, 약 11% 이하, 약 10% 이하, 약 9% 이하, 약 8% 이하, 약 7% 이하, 약 6% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1% 이하의 단백질이 프로테아제에 의해 분해되거나, 또는 실질적으로 어떠한 단백질도 분해되지 않을 때 실질적으로 분해되지 않은 것이다. 단백질 분해는 임의의 적합한 방법, 예를 들어 SDS-PAGE 또는 본원에서 설명되는 기능적 검정 (예를 들어, 리간드 결합)에 의해 평가될 수 있다.
향상된 프로테아제 내성을 갖는 dAb의 생성 방법은 예를 들어 WO2008149143에 개시되어 있다. 한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드는 류코자임 및/또는 트립신에 의한 분해에 대해 내성이다. 본 개시내용의 폴리펩티드, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 및 리간드는 다음 중 하나 이상에 대해 내성일 수 있다: 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파르테이트 프로테아제, 티올 프로테아제, 매트릭스 메탈로프로테아제, 카르복시펩티다제 (예를 들어, 카르복시펩티다제 A, 카르복시펩티다제 B), 트립신, 키모트립신, 펩신, 파파인, 엘라스타제, 류코자임, 판크레아틴, 트롬빈, 플라스민, 카텝신 (예를 들어, 카텝신 G), 프로테이나제 (예를 들어, 프로테이나제 1, 프로테이나제 2, 프로테이나제 3), 테르몰리신, 키모신, 엔테로펩티다제, 카스파제 (예를 들어, 카스파제 1, 카스파제 2, 카스파제 4, 카스파제 5, 카스파제 9, 카스파제 12, 카스파제 13), 칼파인, 피카인, 클로스트리파인, 악티니다인, 브로멜라인, 및 세파라제. 특정 실시양태에서, 프로테아제는 트립신, 엘라스타제 또는 류코자임이다. 프로테아제는 또한 생물학적 추출액, 생물학적 균질물 또는 생물학적 제제에 의해 제공될 수 있다. 본원에 개시된 폴리펩티드, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 및 리간드는 상기 폴리펩티드, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 및 리간드가 폐 프로테아제에 대해 내성이 되도록 상기 폐 프로테아제의 존재 하에 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 프로테아제는 가래, 점액 (예를 들어, 위 점액, 콧물, 기관지 점액), 기관지 폐포 세척액, 폐 균질물, 폐 추출액, 췌장 추출물, 위액, 타액에서 발견되는 프로테아제이다. 한 실시양태에서, 프로테아제는 눈 및/또는 눈물에서 발견되는 것이다. 상기 눈에서 발견되는 프로테아제의 예는 카스파제, 칼파인, 매트릭스 메탈로프로테아제, 디스인테그린, 메탈로프로테이나제 (예를 들어 ADAM - 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제) 및 트롬보스폰딘 모티프를 갖는 ADAM, 프로테오좀, 조직 플라스미노겐 활성자 (activator), 세크레타제, 카텝신 B 및 D, 시스타틴 C, 세린 프로테아제 PRSS1, 유비퀴틴 프로테오좀 경로 (UPP)를 포함한다. 한 실시양태에서, 프로테아제는 비 세균 프로테아제이다. 한 실시양태에서, 프로테아제는 동물, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간 프로테아제이다. 한 실시양태에서, 프로테아제는 GI관 프로테아제 또는 폐 조직 프로테아제, 예를 들어, 인간에서 발견되는 GI관 프로테아제 또는 폐 조직 프로테아제이다. 본원에서 나열된 상기 프로테아제는 라이브러리의 레퍼토리를 프로테아제에 노출시키는 것을 수반하는, 예를 들어 WO2008149143에 기재된 방법에도 사용될 수 있다.
안정성: 본 개시내용의 한 측면에서, 본 개시내용의 폴리펩티드, 단일 가변 도메인, dAb, 리간드, 조성물 또는 제제는 브리튼 로빈슨 (Britton Robinson) 또는 PBS 완충제 내에서 14일 동안 37 내지 50℃에서 인큐베이션 (1 mg/ml의 폴리펩티드 또는 가변 도메인의 농도에서) 후에 실질적으로 안정하다. 한 실시양태에서, 적어도 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%의 폴리펩티드, 길항제 또는 가변 도메인 등은 상기 37℃에서 인큐베이션 후에 비응집된 상태로 유지된다. 한 실시양태에서, 적어도 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%의 폴리펩티드 또는 가변 도메인은 상기 37℃에서 인큐베이션 후에 단량체로 유지된다.
한 실시양태에서, 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%의 폴리펩티드, 길항제 또는 가변 도메인은 상기 50℃에서의 인큐베이션 후에 비응집된 상태로 유지된다. 한 실시양태에서, 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%의 폴리펩티드 또는 가변 도메인은 상기 50℃에서의 인큐베이션 후에 단량체로 유지된다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드, 가변 도메인, 길항제의 어떠한 응집도 임의의 하나의 상기 인큐베이션 후에 관찰되지 않는다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 가변 도메인의 pI는 브리튼-로빈슨 완충제 내의 1 mg/ml의 폴리펩티드 또는 가변 도메인의 농도로 37℃에서 인큐베이션한 후에 변하지 않거나 또는 실질적으로 변하지 않은 상태로 유지된다. 본 개시내용의 한 측면에서, 본 개시내용의 폴리펩티드, 가변 도메인, 길항제, 조성물 또는 제제는 7 내지 7.5의 pH (예를 들어, pH7 또는 pH7.5)의 브리튼 로빈슨 완충제 또는 PBS 내에서 7일 동안 4℃에서 인큐베이션 (100 mg/ml의 폴리펩티드 또는 가변 도메인의 농도에서)한 후에 실질적으로 안정하다. 한 실시양태에서, 적어도 95, 95.5, 96, 96.5, 97, 97.5, 98, 98.5, 99 또는 99.5%의 폴리펩티드, 길항제 또는 가변 도메인은 상기 인큐베이션 후에 비응집된 상태로 유지된다. 한 실시양태에서, 적어도 95, 95.5, 96, 96.5, 97, 97.5, 98, 98.5, 99 또는 99.5%의 폴리펩티드 또는 가변 도메인은 상기 인큐베이션 후에 단량체로 유지된다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드, 가변 도메인, 길항제의 어떠한 응집도 임의의 하나의 상기 인큐베이션 후에 관찰되지 않는다.
본 개시내용의 한 측면에서, 본 개시내용의 폴리펩티드, 가변 도메인, 길항제, 조성물 또는 제제는 예를 들어 제트 연무기, 예를 들어 Pari LC+ 컵에서, 예를 들어 실온, 20℃ 또는 37℃에서 1시간 동안 연무 (nebulisation) (예를 들어 40 mg/ml의 폴리펩티드 또는 가변 도메인의 농도에서) 후에 실질적으로 안정하다. 한 실시양태에서, 적어도 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95.5, 96, 96.5, 97, 97.5, 98, 98.5, 99 또는 99.5%의 폴리펩티드, 길항제 또는 가변 도메인은 상기 연무 후에 비응집된 상태로 유지된다. 한 실시양태에서, 적어도 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95.5, 96, 96.5, 97, 97.5, 98, 98.5, 99 또는 99.5%의 폴리펩티드 또는 가변 도메인은 상기 연무 후에 단량체로 유지된다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드, 가변 도메인, 길항제의 어떠한 응집도 임의의 하나의 상기 연무 후에 관찰되지 않는다.
단량체 형태: 한 실시양태에서, 본 개시내용의 dAb는 우선적으로 단량체인 것으로 확인된다. 적합하게는, 본 개시내용은 (실질적으로) 순수한 단량체를 제공한다. 한 실시양태에서, dAb는 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 순수한 또는 100% 순수한 단량체이다. dAb는 단량체인지 또는 용액에서 보다 고차수의 올리고머를 형성하는지 결정하기 위해서 SEC-MALLS에 의해 분석될 수 있다. SEC MALLS (다중 각도 레이저 광 산란을 사용한 크기 배제 크로마토그래피)는 임의의 당업자에게 친숙한 용액 내의 거대분자의 특성화를 위한 비-침습적 기술이다. 간단히 설명하면, 단백질 (완충제 둘베코 (Dulbecco)의 PBS 내의 1 mg/mL의 농도에서)은 크기 배제 크로마토그래피 (컬럼: TSK3000; S200)에 의해 그의 유체역학적 특성에 따라 분리된다. 분리 후에, 단백질이 광을 산란하는 경향은 다중 각도 레이저 광 산란 (MALLS) 검출기를 사용하여 측정된다. 단백질이 검출기를 통과하는 동안 산란된 광의 강도는 각도의 함수로서 측정한다. 굴절률 (RI) 검출기를 사용하여 결정된 단백질 농도와 함께 상기 측정치는 적절한 식 (분석 소프트웨어 아스트라 (Astra) v.5.3.4.12의 구성 요소)을 사용한 몰 질량의 계산을 허용한다.
치료 용도: 본 개시내용은 TGF베타 신호전달과 연관된 질환의 치료, 억제 또는 예방 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 질환은 탈조절된 TGF베타 신호전달, TGF베타의 과다발현 또는 높은 수준의 생체이용성 TGF베타에 의해 야기되거나 그 결과가 될 수 있다. TGF베타 신호전달과 연관된 질환은 다양한 조직의 섬유증에 관한 질환, 예컨대 폐 섬유증, 예를 들어 특발성 폐 섬유증 (IPF) 및 다른 간질성 폐 질환, 예컨대 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 간경변증 및 만성 간염을 포함하는 간의 섬유증, 류마티스 관절염, 안구 장애, 혈관 병태, 예컨대 재협착, 피부의 섬유증, 예를 들어 피부의 켈로이드 및 상처 치유 후의 반흔형성 및 뒤퓌트랑 구축, 및 신장, 예컨대 신염, 신장 섬유증 및 신경화증 또는 혈관 병태, 예컨대 재협착을 포함한다. TGF베타 신호전달과 연관된 다른 질환은 혈관 질환, 예컨대 고혈압, 자간전증, 유전성 출혈성 모세혈관확장증 타입 I (HHT1), HHT2, 폐 동맥 고혈압, 대동맥류, 마르팡 증후군, 가족성 동맥류 장애, 로이-디에츠 증후군, 동맥 비틀림 증후군 (ATS)을 포함한다. TGF베타 신호전달과 연관된 다른 질환은 근골격계의 질환, 예컨대 뒤시엔느 근이영양증 및 근육 섬유증을 포함한다. TGF베타 신호전달과 연관된 추가의 질환은 암, 예컨대 결장, 위 및 췌장 암 및 신경교종 및 NSCLC를 포함한다. 또한, 본 개시내용은 예를 들어 종양 혈관신생에서 TGF베타 신호전달을 조정하거나 또는 암 기질의 치료를 통해 암을 표적화하는 방법을 제공한다. 다른 질환 또는 병태는 조직 반흔형성에 관련된 것을 포함한다. 다른 질환은 폐 질환, 예컨대 COPD (만성 폐쇄성 폐 질환), 간 질환, 예컨대 간 기능 부전 (예를 들어 바이러스 간염, 알콜, 비만, 자가면역, 대사, 폐쇄성), 신부전을 포함하는 신장 질환 (예를 들어 당뇨병, 고혈압), 비대성 심근병증, 이식 거부 (폐/간/신장) 및 비대성 및 켈로이드 반흔형성을 포함한다.
"섬유증"은 조직의 과도성장, 반흔형성 및/또는 경화를 야기하는 세포외 매트릭스 성분, 예컨대 콜라겐의 과도한 침착의 결과이다.
"피부 섬유증": 피부 섬유증은 상이한 병인을 갖지만 결합 조직 대사, 특히 진피 섬유모세포의 공통적인 탈조절이 있는 다양한 인간 장애를 포함한다. 피부 섬유증의 구체적인 예는 켈로이드 질환, 비대성 반흔 (HS) 및 공피증을 포함한다. 켈로이드 질환 및 비대성 반흔은 동일한 조건의 하위군이 아니지만 둘 모두 상처 치유 후의 반흔형성에 의해 생성되고, 켈로이드는 원래의 상처 부위를 넘어서서 퍼지지만 비대성 반흔은 원래의 상처 가장자리 내에 제한된다. 그러나, 공피증은 다수의 기관의 섬유증을 야기하는 전신 질환인 전신 경화증에서 피부의 섬유증을 설명하기 위해 사용된다. 한 실시양태에서, 본원에 개시된 가변 도메인, 리간드, 융합 단백질 또는 폴리펩티드는 켈로이드 질환, 비대성 반흔 또는 공피증의 예방 또는 치료를 위해 사용된다.
"켈로이드"는 유전적으로 취약한 개체에서 비정상적인 상처 치유 과정의 결과로서 형성되는 피부 손상 부위에서의 섬유성 과도성장이고, 정상적인 반흔과 달리 퇴행하지 않는다. 검게 착색된 피부를 갖는 환자에서 우세하게 관찰되는 "켈로이드 질환"은 절대 악성으로 되지 않는, 인간에 특유한 양성 진피 섬유증식성 종양이다.
"뒤퓌트랑 구축"은 손바닥 피부 아래의 반흔 조직의 국소 형성이다. 반흔형성은 잡기 위해 손가락을 잡아당기는 건을 정상적으로 덮는 조직 (근막)에 축적된다. 뒤퓌트랑 구축이 진행되면서, 보다 많은 근막이 두꺼워지고 단축되고, 손가락이 손바닥을 향해 굽혀지고 완전히 뻗을 수 (곧게 펼 수) 없어 극단적인 경우에 손을 사용할 수 없게 하는 굴곡 구축을 야기한다.
반흔형성은 수술, 손상 또는 신체 내의 조직 또는 기관에 대한 외상 후에 발생한다. 이들은 상실되는 정상적인 조직을 교체하기 위해 세포외 매트릭스를 생성하는 복구 메카니즘의 결과이다. 피부는 가장 빈번하게 손상되어 진피 반흔형성을 야기하는 조직이고, 다음을 포함하는 유해한 결과를 초래할 수 있다: 기능의 상실; 구축; 및 고통받는 자에게 심리적인 영향을 줄 수 있는 불량한 심미성. 반흔은 상처 치유의 최종 생성물에 의한 피부 구조의 정상적인 구조 및 기능의 육안상 장애로서 규정될 수 있다 (문헌 [Fergusson et al., 1996]). 현재 반흔형성을 효과적으로 예방하거나 개선하기 위한 요법이 존재하지 않는다.
폐 섬유증에서 TGF베타의 역할이 관찰되었다 (문헌 [Wynn et al., J. Pathology 2008, 214, p.199-210]; [Sime et al. J. Clinical Immunology 1997, Vol.100, p. 768-776]). Th2 시토카인의 생산 증가 및 Th1 시토카인의 생산 감소로의 전환은 미지의 폐 손상의 결과로서 관찰된다. TGF베타의 과다발현은 혈관신생, 섬유모세포 활성화, ECM의 침착, 및 섬유생성을 자극한다. 동물 모델 (예를 들어 TGF베타 과다발현, SMAD3 KO, TGF베타R 신호전달의 억제)은 TGF베타가 폐 섬유증의 발생에 대한 핵심 매개체임을 보여준다.
"특발성 폐 섬유증 (IPF)"은 원인이 알려지지 않은 폐 간질 내의 섬유증 조직의 비정상적인 및 과도한 침착을 야기하는 만성 및 진행성 질환이다. 매년 미국에서 100,000명당 대략 10-20명의 환자가 발생한다. 유병률은 나이와 함께 급격하게 증가하고, 75세 이상에서는 100,000명당 175명의 환자에 도달하고, 대체로 50세 내지 70세에 발병한다. 5년 생존률은 20%이고, 평균 생존 기간은 2.8년이다. 증상은 마른 기침 및 진행성 호흡곤란, 비정상적인 흉부 x-선 또는 HRCT 및 감소된 폐 부피를 포함한다. 현재 치료제는 코르티코스테로이드 (프레드니손), 면역억제제 (시클로포스파미드) 또는 이식을 포함하지만, 현재 이용가능한 어떠한 요법도 효능이 입증되지 않았다. 한 실시양태에서, 본 개시내용의 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드는 IPF에 대한 치료제를 제공한다.
적합하게는, 특발성 폐 섬유증 (IPF)에 대한 성공적인 치료는 폐 섬유모세포 증식의 감소, 폐 섬유모세포 세포자멸의 증가, 과도한 세포외 매트릭스 합성 및 침착의 감소, 세포외 매트릭스 파괴 및 재형성의 증가 중 임의의 하나를 보이거나 또는 진행하는 조직 손상에 대한 몇몇 보호 및 정상적인 조직병리학의 회복을 보일 것이다.
적합하게는, 성공적인 치료는 질환 진행의 속도를 감소시킬 것이다.
IPF에 대한 치료 효능은 블레오마이신 유도 폐 섬유증 모델에서 입증될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 개시내용의 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인은 그의 효능이 마우스 모델에서 시험될 수 있도록 마우스 TGF베타RII와 교차반응한다.
TGF베타는 눈 조직에서 세포 거동의 조정에서 중요한 세포 신호전달 분자이다. TGF베타의 과다활성화는 눈 조직 내의 섬유증 질환의 발병에 연관되고, 이것은 상처 치유에 관련되고 시력 및 눈의 조직 항상성 손상을 유발할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Saika, Laboratory Investigation (2006), 86, 106-115]에서 검토됨).
따라서, 한 실시양태에서, TGF베타 신호전달과 연관된 질환은 안구 장애, 예컨대 눈 조직의 섬유증 질환을 포함한다. 눈의 섬유증 질환은 각막, 결막, 수정체 또는 망막에서 발생할 수 있다. 안구 장애는 증식성 유리체망막증 (PVR), 망막 박리 후의 장애 및 망막 섬유증, 당뇨성 망막증, 녹내장, 예컨대 개방각 녹내장, 우각 폐색, 선천적 및 위-박리 (pseudo-exfoliation) 증후군, 예컨대 화학물질 또는 열 화상 후의 수정체의 상처 치유 반응, 또는 스티븐스-존슨 (Stevens-Johnson) 증후군, 및 백내장 수술 후 합병증을 포함한다. TGF베타는 또한 백내장 발생에서 일정 기능을 수행한다 (문헌 [Wormstone et al. Exp Eye Res; 83 1238-1245, 2006]). 많은 안구 장애는 수술 후에 섬유증의 결과로서 발생한다. 또한, TGF베타2 (전환 성장 인자 β2)의 과다 활성은 녹내장 누공 수술 후에 눈 내 및 주위의 반흔형성을 유발하는 것으로 생각된다. TGF베타2는 각막, 망막, 결막 및 섬유주를 포함하는 눈의 조직의 병리학적 반흔형성에 연관되는 우세한 이소형이다. 섬유주의 반흔형성 또는 섬유증은 정상적인 수성 유출 경로의 폐쇄를 야기하여 안내압의 상승 및 녹내장 발생의 위험을 유발할 수 있다. TGF베타 2는 녹내장 질환의 전-임상 모델에서 병리학적 작용제인 것으로 밝혀졌다. TGF베타2 수준은 녹내장 환자에서 상승하고, huTM 세포의 TGF베타-2를 사용한 시험관 내 치료는 ECM 조정 단백질 (MMP-2, PAI-I)의 표현형 변화 및 상향조절을 유도한다 (문헌 [Lutjen-Drecol (2005), Experimental Eye Research, Vol. 81, Issue 1, pages 1-4]; [Liton (2005), Biochemical and Biophysical Research Communications Vol. 337, issue 4, p.1229-1236]; [Fuchshofer et al. (2003), Experimental Eye Research, Vol. 77, issue 6, p. 757-765]; [Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) conference poster #1631 2009]). 또한, 눈 내의 TGF베타의 과다발현은 마우스에서 녹내장-유사 병상을 유발하고 (ARVO 회의 포스터 #5108 2009) 및 AAV를 사용한 TGF베타-2의 전달은 녹내장 래트 모델에서 망막 신경절 세포 상실을 억제하는 것으로 밝혀졌다 (ARVO 회의 포스터 #5510 2009). 보다 최근에, 배양된 인간 시신경 유두 성상세포에서 산화 스트레스 유도는 TFG베타2 분비를 증가시키는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Yu et al. (2009) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50: 1707-1717]). 이들은 모두 TGF베타 2 수준의 감소가 녹내장에서 관찰되는 특징적인 시신경 유두 변화를 최소화할 수 있음을 나타낸다. 그러나, TGF베타는 또한 면역억제 기능을 갖는 것으로 알려져 있고, 따라서 몇몇 측면에서 보호성일 수 있고, 따라서 완전한 낙다운 (knock down)보다 상승한 수준의 TGF베타2가 만성 눈의 병태, 예컨대 녹내장의 치료에 바람직할 수 있다. 따라서, 본 개시내용에 따른 dAb 및 조성물 등을 사용하여 치료될 수 있는 질환은 녹내장 누공 수술 후의 반흔형성을 포함한다.
따라서, 한 측면에서 치료 유효 용량 또는 양의 본 개시내용에 따른 폴리펩티드, 융합 단백질, 단일 가변 도메인, 길항제 또는 조성물을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, TGF베타 신호전달, 특히, 탈조절된 TGF베타 신호전달과 연관된 질환의 치료, 억제 또는 예방을 위한 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 의약으로서 사용하기 위한 본 개시내용에 따른 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드, 리간드 또는 융합 단백질을 제공한다. 적합한 의약은 본원에 설명된 바와 같이 포맷된 본 개시내용에 따른 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 등을 포함할 수 있다.
적합하게는, 의약은 제약 조성물이다. 본 개시내용의 추가의 측면에서, 본 개시내용에 따른 폴리펩티드, 단일 가변 도메인, 리간드, 조성물 또는 길항제 및 생리학상 또는 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물 (예를 들어, 제약 조성물)이 제공된다. 한 실시양태에서, 조성물은 전달을 위한 비히클을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드, 융합 단백질, 단일 가변 도메인, 길항제 또는 조성물은 폐 전달을 통해, 예컨대 흡입 (예를 들어, 기관지내, 비내 또는 경구 흡입, 예컨대 점적에 의한 비내)에 의해 또는 전신 전달 (예를 들어, 비경구, 정맥내, 근육내, 복강내, 동맥내, 경막내, 관절내, 피하, 질내 또는 직장 투여)에 의해 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 폴리펩티드, 단일 가변 도메인, 리간드 또는 융합 단백질 또는 조성물은 국소 투여에 의해, 점안제, 미립자 중합체 시스템, 겔 또는 임플란트로서, 또는 안내, 예를 들어 유리체 내로의 주사에 의해 눈에 투여된다. 전달은 눈의 특정 영역, 예컨대 눈의 표면, 또는 누관 또는 누선에 또는 눈의 전방 또는 후방, 예컨대 유리체에 대해 표적화된다. 또한, 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인, 조성물 등이 눈의 투과 촉진제, 예를 들어 카프르산나트륨 또는 점도 증진제, 예를 들어 히드록시프로필메틸셀룰로스 (HPMC)와 함께 눈에 전달되는 것이 유용할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 폴리펩티드, 융합 단백질, 단일 가변 도메인, 길항제 또는 조성물은 피부 표면에 대한 국소 전달 및/또는 피부 내의 영역(들)에 대한 전달, 예를 들어 피내 전달에 의해 피부에 투여된다.
전달을 위한 신체의 가장 접근가능한 기관이지만, 피부의 최외부 장벽인 각질층 (SC)은 약물 전달을 위한 속도 제한 장벽으로서 작용한다. 전통적으로, 피내 주사는 보다 깊은 피부층 내의 작용 부위로 약물의 전달을 허용하도록 SC를 피하기 위해 필요하였다. 그러나, 전달은 다른 경피 전달 방법을 통해 달성될 수 있다. SC의 지질 구조를 변경하는 화학적 향상제; 모낭을 통한 수송을 가능하게 하는 펩티드 촉진자; 및 지질의 국소 유동화 및 연장된 효과를 위한 데포 (depot)의 형성을 돕는 것으로 생각되는 리포좀, 니오좀 (niosome), 에토좀 (ethosome) 및 트랜스퍼좀 (transfersome)을 포함하는 입자의 캡시드 내 봉입 (encapsidation)을 포함하는 제제화 방법이 전달을 위해 이용될 수 있다. 피부를 가로지른 작은 전위의 적용을 수반하는 이온영동은 국소 약물 전달을 위해 사용되었다. 이온영동은 각각 전기이동 및 전기삼투에 의한 하전 분자 및 중성 분자의 전달을 허용한다. 미세바늘을 이용하여 SC를 극복하기 위해 피부에 마이크로미터 크기의 채널을 생성함으로써 단백질이 이들 채널을 통해 하면 표피로 통과할 수 있다. 미세바늘은 속이 꽉 찬 및 속이 빈 미세바늘로 넓게 분류될 수 있다. 속이 꽉 찬 미세바늘은 약물 투여 전에 SC를 붕괴시키기 위해 사용되고, 약물이 바늘로부터 용해되면서 전달되도록 코팅되거나, 또는 바늘이 제자리에서 용해되면서 약물 방출을 허용하도록 가용성일 수 있다. 속이 빈 미세바늘은 약물 물질의 액체 제제의 주입을 허용한다. 이온영동과 달리 전기천공은 약물 투과를 향상시키기 위해 피부 투과성을 변경하기 위해 >50V의 고전압을 필요로 한다. 열 및 고주파 절제 방법은 SC의 국소 가열 및 절제를 통해 SC를 붕괴시킨다. 열 절제에서 붕괴는 짧은 기간 동안 고온의 적용 후에 발생하고, 고주파 절제는 피부 상에 마이크로전극을 진동시켜 국소 발열을 야기하기 위한 고주파의 사용을 수반한다. 또한, SC의 붕괴는 레이저 연마, 저주파 초음파의 인가 (초음파 영동) 및 SC를 통해 약물을 추진하기 위해 고속을 이용하는 제트 주입기를 통해 달성될 수 있다.
또한, 본 개시내용은 본 개시내용에 따른 폴리펩티드, 단일 가변 도메인, 조성물, 리간드 또는 길항제를 사용하여 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 질환은 조직 섬유증, 예컨대 켈로이드 질환 또는 뒤퓌트랑 구축이다.
본 개시내용의 한 측면에서, 폴리펩티드, 단일 가변 도메인, 리간드, 조성물 또는 길항제는 인간에서 TGF베타 신호전달과 연관된 질환 또는 병태의 치료 및/또는 예방을 위해 제공된다. 또 다른 측면에서, 인간에서 TGF베타 신호전달과 연관된 질환 또는 병태의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에 있어서 폴리펩티드, 단일 가변 도메인, 조성물 또는 길항제의 용도가 제공된다. 또 다른 측면에서, 폴리펩티드, 단일 가변 도메인, 조성물 또는 길항제를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 환자에서 TGF베타 신호전달과 연관된 질환 또는 병태의 치료 및/또는 예방 방법이 제공된다. 본 개시내용은 또한 본 개시내용의 치료 유효량의 리간드 (예를 들어, 길항제, 또는 단일 가변 도메인)를 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법에 관한 것이다.
다른 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 치료 유효량의 리간드 (예를 들어, 길항제, 또는 단일 가변 도메인)를 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 특발성 폐 섬유증의 치료 방법에 관한 것이다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 조성물 (예를 들어, 제약 조성물)을 포함하는 약물 전달 장치에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 약물 전달 장치는 다수의 치료 유효 용량의 리간드를 포함한다.
다른 실시양태에서, 약물 전달 장치는 비경구 전달 장치, 정맥내 전달 장치, 근내 전달 장치, 복강내 전달 장치, 경피 또는 피내 전달 장치, 폐 전달 장치, 동맥내 전달 장치, 경막내 전달 장치, 관절내 전달 장치, 피하 전달 장치, 비내 전달 장치, 눈 전달 장치, 질내 전달 장치, 직장 전달 장치, 주사기, 경피 전달 장치, 피내 전달 장치, 캡슐, 정제, 연무기, 흡입기, 아토마이저 (atomizer), 에어로졸화기 (aerosolizer), 미스터 (mister), 건조 분말 흡입기, 계량 용량 흡입기, 계량 용량 분무기, 계량 용량 미스터, 계량 용량 아토마이저, 및 카테터로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 약물 전달 장치는 경피 또는 피내 전달 장치이다.
적합하게는, 본 개시내용은 본 개시내용에 따른 폴리펩티드, 단일 가변 도메인, 조성물 또는 길항제를 포함하는 폐 전달 장치를 제공한다. 이 장치는 흡입기 또는 비내 투여 장치일 수 있다. 적합하게는, 폐 전달 장치를 사용함으로써 치료 유효 용량의 본 개시내용에 따른 리간드 등을 전달할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 따른 폴리펩티드, 단일 가변 도메인, 조성물 또는 길항제를 포함하는 눈 전달 장치를 제공한다. 적합하게는, 눈 전달 장치를 사용함으로써 치료 유효 용량의 본 개시내용에 따른 리간드 등을 전달할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "용량"은 한번에 (단위 용량), 또는 규정된 시간 간격에 걸친 2회 이상의 투여로 대상체에게 투여되는 리간드의 양을 의미한다. 예를 들어, 용량은 1일 (24시간) (1일 용량), 2일, 1주, 2주, 3주 또는 1 이상의 개월 (예를 들어, 단일 투여에 의해, 또는 2회 이상의 투여에 의해)의 과정에 걸쳐 대상체에게 투여되는 리간드 (예를 들어, TGF베타RII에 결합하는 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드)의 양을 의미할 수 있다. 용량 사이의 간격은 임의의 목적하는 시간의 양일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드는 매주 또는 2주일마다 또는 7-10일마다, 예를 들어 7, 8, 9 또는 10일마다 주사에 의해, 특히 피내 전달에 의해 피부 내로 투여된다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 단일 가변 도메인은 임의로 비포맷된 (예를 들어, PEG화 또는 반감기 연장되지 않은) 또는 PEG에 연결된 dAb 단량체로서, 임의로 건조 분말 제제로서, 임의로 흡입에 의한 환자에의 전달 (예를 들어, 폐 전달)을 위해, 임의로 폐 병태 (예를 들어, 특발성 폐 섬유증)의 치료 및/또는 예방을 위해 제공된다.
본 개시내용의 리간드는 몇 가지의 잇점을 제공한다. 예를 들어, 본원에서 설명되는 바와 같이, 리간드는 요구되는 생체 내 혈청 반감기를 갖도록 조정될 수 있다. 도메인 항체는 통상적인 항체보다 훨씬 더 작고, 통상적인 항체보다 우수한 조직 투과를 달성하기 위해 투여될 수 있다. 따라서, dAb 및 dAb를 포함하는 리간드는 질환, 예컨대 TGF베타-신호전달-매개 질환을 치료하기 위해 투여될 때 통상적인 항체에 비해 잇점을 제공한다. 특히, 특발성 폐 섬유증의 치료를 위한 본 개시내용의 dAb의 폐 전달은 TGF베타 신호전달의 억제제의 특이적 국소 전달을 가능하게 한다. 유리하게는, TGF베타RII에 특이적으로 결합하고 억제하는 비포맷된 dAb 단량체는 폐 전달을 통해 폐 내로 흡수되기에 충분히 작다.
WO2007085815의 예는 본 개시내용의 리간드에 동등하게 적용될 수 있는 관련 검정, 포맷팅 (formatting) 및 실험의 상세한 내용을 제공하기 위해 본원에 참고로 포함된다.
본 명세서에서 언급된 특허 및 특허 출원을 포함하고 이로 제한되지 않는 모든 간행물은 마치 완전히 제시된 것처럼 본원에 참고로 포함된다.
본원은 단지 예시를 우해 다음 실시예에서 추가로 설명된다.
실시예
실시예 1. TGF 베타 RII 에 결합하는 dAb 의 선택
마우스 TGF 베타 RII 에 결합하는 dAb 의 선택
나이브 선택: 4G에 대해 GAS1 리더 서열 (WO2005093074 참조)로부터 발현된 항체 단일 가변 도메인을 디스플레이하고 추가로 6G에 대해 가열/냉각 예비선택 (WO04101790 참조)된 파지 라이브러리인 4G 및 6G 나이브 파지 라이브러리를 사용하였다. DOM23 리드 (lead)는, 재조합 마우스 및 인간 TGF-β RII/Fc 키메라 단백질에 대해 VH 및 VK 라이브러리 (4G H11-19 및 6G VH2-4 (VH dAb) 및 4G κ1, 4G κ2 및 6G κ (Vκ dAb))의 풀을 패닝 (panning)함으로써 단리하였다. 이들 키메릭 단백질은 인간 배아 신장 세포주인 HEK-F에서 인간 IgG1의 Fc 영역에 융합된 인간 TGF-β 수용체 타입 II의 세포외 도메인의 아미노산 잔기 24 내지 159 (문헌 [Lin, et al., 1992, Cell 68:775-785])를 코딩하는 DNA 서열의 발현에 의해 제조되었다.
재조합 마우스 및 인간 TGF-β RII/Fc 키메라 단백질을 EZ-LINK™ 술포-NHS-LC-비오틴 시약 (피어스 (Pierce, 미국 록포드))을 사용하여 비오티닐화하였다 (문헌 [Henderikx, et al., 2002, Selection of antibodies against biotinylated antigens. Antibody Phage Display: Methods and protocols, Ed. O'Brien and Atkin, Humana Press]). 파지 라이브러리를 6개의 군으로 모았다; 4G κ1 및 κ2, 6G κ, 4G H11-13, 4G H14-16, 4G H17-19 및 6G VH2-4. 라이브러리당 1x1011 개의 파지를 모았다.
파지를 1시간 동안 10 μM 인간 IgG Fc 단편 (인간 골수종 혈장 IgG로부터 유래된 천연 IgG Fc 단편, 칼바이오켐 (Calbiochem, 미국 캘리포니아주), cat. no. 401104)을 부가하면서 포스페이트 완충 염수 내의 2% 마블(MARVEL)™ 분유 (MPBS) 내에서 차단하였다. 200 nM 비오티닐화된 마우스 TGF-β RII/Fc를 차단된 파지 및 Fc 단편 혼합물과 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅한 후, 스트렙타비딘 디나비드(DYNAbeads)™ (다이날 (Dynal, 영국)) 상에서 5분 동안 포획하였다. 비드를 1 ml 포스페이트 완충 염수/0.1% 트윈(TWEEN)™ (PBST)으로 7회 세척한 후, 1 ml 포스페이트 완충 염수 (PBS)로 세척하였다. 비오티닐화된 마우스 TGF-β RII/Fc-결합된 파지를 10분 동안 PBS 내의 500 ㎕ 1 mg/ml 트립신에 용리시킨 후, 30분 동안 1.75 ml의 대수증식기 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli) TG1을 감염시키기 위해 사용하였다. 세포를 15 ㎍/ml 테트라사이클린을 보충한 2 x TYE (트립톤 효모 추출액) 아가 플레이트 상에 플레이팅하였다. 후속적인 선택 라운드를 위해, 세포를 플레이트로부터 긁어내고, 파지 증폭을 위해 밤새 37℃에서 성장시킨 50 ml 2 x TY (트립톤 효모) + 15 ㎍/ml 테트라사이클린 배양액을 접종하기 위해 사용하였다.
4566 g에서 10분 동안 밤새 배양액을 원심분리하여 증폭된 파지를 회수하였다. 증폭된 파지를 함유하는 40 ml의 상청액을 10 ml의 PEG/NaCl (20% v/w PEG 8000 + 2.5M NaCl)에 첨가하고, 얼음 상에서 45 내지 60분 동안 인큐베이팅하였다. 샘플을 30분 동안 4566 g에서 원심분리하여 침전된 파지를 펠렛화하였다. 상청액을 폐기하고, 파지 펠렛을 2 ml 15% v/v 글리세롤/PBS 내에 재현탁하였다. 파지 샘플을 2 ml 에펜도르프 튜브에 옮기고, 10분 동안 g에서 원심분리하여 임의의 남아있는 세균 세포 파편을 제거하였다. 파지가 제2 선택 라운드를 위한 투입 파지로서 사용되었다. 제2 선택 라운드는 대략 1 x 1010 개의 파지가 첨가되고 200 nM 인간 TGF-β RII/Fc 또는 20 nM 마우스 TGF-β RII/Fc가 선택에서 사용된 것을 제외하고 제1 라운드에 대해 설명된 바와 같이 수행하였다.
제2 라운드 결과물을 fd-파지 벡터인 pDOM4로부터 pDOM10 내로 클로닝하였다. 벡터 pDOM4는 유전자 III 신호 펩티드 서열이 효모 당지질 고정된 (anchored) 표면 단백질 (GAS) 신호 펩티드로 교체된 fd 파지 벡터의 유도체이다. 이것은 또한 리더 서열과 유전자 III 사이에 c-myc 태그를 포함하고, 이것은 다시 유전자 III를 다시 인 프레임 (in frame)으로 배치한다. 상기 리더 서열은 파지 디스플레이 벡터뿐만 아니라 다른 원핵 발현 벡터에서도 기능하고, 보편적으로 사용될 수 있다. pDOM10은 dAb의 가용성 발현을 위해 설계된 플라스미드 벡터이다. 이것은 pUC119 벡터를 기재로 한 것이고, LacZ 프로모터의 제어 하에 발현된다. dAb의 상청액 내로의 발현은 N-말단 단부에서 dAb 유전자의 보편적인 GAS 리더 신호 펩티드 (WO2005093074 참조)에 대한 융합에 의해 보장되었다. 또한, FLAG-태그는 dAb의 C-말단 단부에 부가되었다.
퀴아프렙(QIAPREP)™ 스핀 미니프렙(Spin MINIPREP)™ 키트를 제조자의 지시 (cat. no. 27104, 퀴아젠 (Qiagen))에 따라 사용하여 선택된 dAb를 디스플레이하는 fd-파지에 의해 감염된 세포로부터 pDOM4 DNA를 단리함으로써 dAb 유전자의 서브클로닝을 수행하였다. DNA를 비오티닐화된 올리고뉴클레오티드 DOM57 (5' TTGCAGGCGTGGCAACAGCG-3' (서열 197) 및 DOM6 (5'-CACGACGTTGTAAAACGACGGCC-3' (서열 198))를 사용하여 PCR에 의해 증폭하고, SalI 및 NotI 제한 엔도뉴클레아제로 소화하고, SalI 및 NotI으로 소화된 pDOM10과 결찰하였다. 결찰 생성물을 전기천공에 의해 이. 콜라이 HB2151 세포 내로 형질전환시키고, 100 ㎍/ml의 카르베니실린을 보충한 TYE 플레이트 (트립톤 효모 추출액) (TYE-carb) 상에 플레이팅하였다. 개별 클론을 선발하여 96-웰 플레이트 내에서 100 ㎍/ml 카르베니실린을 보충한 밤새 발현 자가-유도 배지 (고수준 단백질 발현 시스템, 노바겐 (Novagen))에서 발현시키고, 30℃ 또는 37℃에서 진탕하면서 성장시켰다. 이어서, 이들 발현 플레이트를 1800 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 마우스 및/또는 인간 TGF-β RII/Fc에 결합한 dAb 클론은 ELISA 및 비아코어™ (지이 헬쓰케어(GE HEALTHCARE)™) 스크린에 의해 또는 MSD (메조 스케일 디스커버리 (Meso Scale Discovery) 결합 검정 스크린에 의해 확인하였다. ELISA를 위해, 96-웰 맥시소프(Maxisorp)™ 면역 플레이트 (넝크 (Nunc, 덴마크))를 인간 또는 마우스 TGF-β RII/Fc로 밤새 4℃에서 코팅하였다. 웰을 PBST로 3회 세척한 후, PBS 내의 1% 트윈™ (1% TPBS)으로 1시간 동안 실온에서 차단하였다. 차단을 제거하고, 1% TPBS 및 dAb 상청액의 1:1 혼합물을 1시간 동안 실온에서 첨가하였다. 플레이트를 PBST로 3회 세척하고, 검출 항체 (모노클로날 항-FLAG M2-퍼옥시다제 항체, 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich, 영국))를 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 플레이트를 비색 기질 (슈어블루(SUREBLUE)™ 1-성분 TMB 마이크로웰 퍼옥시다제 용액, KPL, 미국 메릴랜드주)을 사용하여 발색시키고, 광학 밀도 (OD)를 450 nM에서 측정하였고, OD450은 결합된 검출 항체의 양에 비례하였다. 비아코어™를 위해, 상청액을 HBS-EP 완충제에 1:1 희석하고, 비오티닐화된 인간 및 마우스 TGF-β RII/Fc에 대한 결합에 대해 비아코어™ (제조자의 권장사항에 따라 1500 Ru 비오티닐화된 hRII-Fc 및 1550 Ru 비오티닐화된 mRII-Fc로 코팅된 SA 칩) (비아코어™, 지이 헬쓰케어™)으로 스크리닝하였다. 샘플을 50 ㎕/min의 유량으로 비아코어™에서 이동시켰다.
나이브 인간 선택 및 스크리닝
인간 TGF 베타 RII 에 결합하는 dAb 의 선택
나이브 선택을 마우스 TGFbRII에 대해 설명된 바와 같이 수행하되, 150 및 15 nM 비오티닐화된 인간 TGFbRII/Fc를 각각 라운드 1 및 2에서 사용하였다. 제3 라운드는 라운드 2에 대한 것과 동일한 방법을 이용하여 수행하되, 1.5 nM 비오티닐화된 인간 TGFbRII/Fc를 사용하였다.
제3 라운드 결과물을 fd-파지 벡터인 pDOM4로부터 pDOM10 내로 클로닝하였다. 퀴아프렙™ 스핀 미니프렙™ 키트를 제조자의 지시 (cat. no. 27104, 퀴아젠)에 따라 사용하여 선택된 dAb를 디스플레이하는 fd-파지에 의해 감염된 세포로부터 pDOM4 DNA를 단리함으로써 dAb 유전자의 서브클로닝을 수행하였다. 플라미스드 DNA를 SalI 및 NotI 제한 엔도뉴클레아제로 소화하고, dAb 유전자 삽입체를 SalI, NotI 및 PstI 제한 엔도뉴클레아제로 소화된 pDOM10과 결찰하였다. 결찰 생성물을 전기천공에 의해 이. 콜라이 HB2151 세포 내로 형질전환시키고, 100 ㎍/ml의 카르베니실린을 보충한 TYE 플레이트 (트립톤 효모 추출액) (TYE-carb) 상에 플레이팅하였다. 개별 클론을 선발하여 100 ㎍/ml 카르베니실린을 보충한 밤새 발현 자가-유도 배지 (노바겐)에서 1 ml/웰에서 250 rpm, 30℃에서 72시간 동안 96-웰 플레이트 내에서 발현시켰다. 이어서, 이들 플레이트를 1800 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 가용성 dAb 상청액을 형광 편광 농도 결정 검정과 조합한 TGFbRII MSD 결합 검정으로 항원 결합에 대해 스크리닝하였다. 인간 TGFbRII 결합제의 수는 많았고, 추가의 특성결정을 진행하기에는 너무 많은 클론이 존재하였다. 따라서, 클론의 하위세트의 서열을 결정하고, 특유한 서열을 갖는 것의 특성을 추가로 결정하였다.
TGFBRII MSD 결합 검정
상기 검정은 항-TGFbRII dAb의 결합 활성을 결정하기 위해 사용되었다. TGFbRII-Fc 항원을 MSD 플레이트 상에 코팅한 후, 비-특이적 결합을 방지하기 위해 차단하였다. 가용성 FLAG-태깅된 dAb를 함유하는 연속 희석한 상청액을 첨가하였다. 인큐베이션 후에, 플레이트를 세척하고, TGFBRII-Fc에 특이적으로 결합된 dAb만이 플레이트에 결합된 상태로 유지되었다. 결합된 dAb는 루테닐화된 항-FLAG 태깅된 항체 및 MSD 판독 완충제로 검출되었다. 상청액 희석액 내의 dAb의 농도는 형광 편광 농도 결정 검정을 사용하여 결정한 후, 농도 결합 곡선을 작성하였다.
0.5 ㎕/웰의 60 ㎍/ml 인간 TGFbRII-Fc, 60 ㎍/ml 마우스 TGFbRII-Fc 또는 60 ㎍/ml 인간 IgG1 Fc (R&D 시스템즈, 카탈로그 번호 110-HG)을 384 웰 MSD 고결합 플레이트 (메조 스케일 디스커버리) 상에 스포팅하였다. 플레이트를 실온에서 최소 4시간 동안 내지 최장 밤새 동안 공기건조하였다. 플레이트를 트리스 (Tris) 완충 염수 (TBS) 내의 50 ㎕/웰의 5% 마블™ + 0.1% 트윈™ 20으로 1시간 동안 실온에서 또는 밤새 4℃에서 차단하였다. 차단 시약을 플레이트를 가볍게 털어 웰로부터 제거하였다. 1:3 희석 계열의 dAb 상청액을 2xTY 배지로 제조하였다. dAb는 pDOM10 발현 벡터 내에서 발현되어, dAb 단백질은 FLAG 융합 단백질로서 발현되었다. 차단 시약을 제거하고, 10 ㎕/웰의 희석된 dAb 상청액을 차단된 MSD 플레이트에 옮겼다. dAb 상청액을 4점 곡선 또는 11점 곡선으로서 스크리닝하였다. 희석된 dAb 상청액에 추가로, 2개의 대조군이 각각의 플레이트에 포함되었고, 하나는 TGFbRII 결합 특이성이 없는 낮은 대조군 (0% 결합으로 정규화됨)이고, 다른 하나는 높은 TGFbRII 결합 특이성을 갖는 높은 대조군 (100% 결합으로 정규화됨)이었다 (데이터 비제시).
플레이트를 dAb 상청액 및 대조 샘플과 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅한 후, 50 ㎕/웰의 TBS + 0.1% 트윈™으로 3회 세척하였다. 15 ㎕/웰의 루테닐화된 항-FLAG 항체를 플레이트에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 항-FLAG 항체 (항-FLAG M2 모노클로날 항체, 시그마 (시그마, 영국), 카탈로그 번호 F3165)를 제조자의 지시 (메조 스케일 디스커버리, 카탈로그 번호 R91BN-1)에 따라 루테늄 II 트리스-비피리딘 N-히드록시 숙신이미드에 접합하였다. 루테닐화된 항-FLAG 항체를 마우스 항-인간 IgG1 Fc 항체 대조 웰을 제외하고 모든 웰에 첨가하였다. 그 대신, 15 ㎕/웰의 항-마우스 MSD 태그 (메조 스케일 디스커버리, 카탈로그 번호 R31AC-1)를 첨가하였다. 항-마우스 MSD 태그를 TBS 내의 2% 마블™ + 0.1% 트윈™ 20에 750 ng/ml의 최종 농도로 희석하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅하고, 50 ㎕/웰의 TBS + 0.1% 트윈™으로 3회 세척하였다. 35 ㎕ 1x MSD 판독 완충제 (메조 스케일 디스커버리)를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 MSD 섹터 (Sector) 6000 판독기 (메조 스케일 디스커버리) 상에서 판독하였다.
XC50 액티비티 베이스 (Activity Base)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 모든 데이터는 각각의 플레이트에 대해 높은 및 낮은 대조 웰의 평균에 정규화하고, 낮은 대조군은 0% 결합으로 정규화되고 높은 대조군은 100% 결합으로 정규화되었다. 4개의 파라미터 곡선 피트가 정규화된 데이터에 적용되었고, 상청액 검정에서 dAb의 형광 편광 농도 결정을 이용하여 계산된 dAb 농도를 사용하여 농도 결합 곡선을 작성하였다.
사용된 4개의 파라미터 피트는 다음과 같았다:
y = {(a-d)/[1+(x/c)b]}+d
여기서, a는 최소이고, b는 힐 기울기 (Hill slope)이고, c는 XC50이고, d는 최대이다.
상청액 검정에서 dAb 의 형광 편광 농도 결정
상기 검정에 의해, 상청액에서 발현되는 가용성 FLAG-태깅된 dAb의 농도를 결정할 수 있다. 형광 표지된-FLAG 펩티드를 항-FLAG 항체와 혼합하였다. 형광 분자는 531 nm의 파장에서 편광된 광으로 여기되고, 방출된 편광된 광은 595 nm의 파장에서 판독되었다. FLAG-태깅된 dAb의 첨가는 항-FLAG 항체로부터 형광 펩티드의 대체를 유발하고, 이것은 다시 방출 신호의 편광을 감소시켰다. 공지 농도의 정제된 FLAG-태깅된 VH 더미 (dummy) dAb의 표준 곡선을 작성하고, 상청액 내의 가용성 dAb의 농도를 역계산하기 위해 사용하였다. 농도 데이터를 결합 활성 데이터와 조합하여, 농도 결합 곡선을 dAb 상청액에 대해 작성하였다.
dAb 상청액을 2xTY 배지에 1:2로 연속 희석하고 (1:2, 1:4, 1:8 및 1:16), 이어서 포스페이트 완충 염수 (PBS)에 1:10 희석하였다. 희석된 상청액을 흑색 384 웰 플레이트에 옮겼다. 표준 곡선을 PBS 내의 10% v/v 2xTY 배지에 정제된 VH 더미 dAb를 1:1.7로 연속 희석함으로써 작성하였다. 최고 dAb 농도는 10 μM이고, 총 16개의 희석액이 존재하였다. 5 ㎕의 각각의 희석액을 384 웰 플레이트에 옮겼다. c-말단에서 Cy3b로 표지된 5 nM FLAG 펩티드, 100 mM 항-FLAG M2 모노클로날 항체 (시그마, 카탈로그 번호 F3165), 2 mM CHAPs 완충제 내의 0.4 mg/ml 소 혈청 알부민 (BSA)의 혼합물을 제조하였다. 5 ㎕의 혼합물을 희석된 dAb가 존재하는 웰 (상청액 및 표준 곡선 웰 둘 모두)에 옮겼다. 플레이트를 1000 rpm (216 g)에서 1분 동안 원심분리한 후, 암소에서 실온에서 15분 동안 인큐베이팅하였다. 플레이트를 다음 필터가 구비된 엔비젼(ENVISION)™ 판독기 (퍼킨 엘머 (Perkin Elmer))로 판독하였다:
여기 필터: BODIPY TMR FP 531
방출 필터 1: BODIPY TMR FP P pol 595
방출 필터 2: BODIPY TMR FP P pol 595
미러 (Mirror): BODIPY TMR FP Dual Enh
표준 곡선을 작성하고, 상청액 내의 가용성 dAb의 농도를 역계산하기 위해 사용하였다.
ELISA, 비아코어™ 및 MSD 결합 검정에서 확인된 마우스 및 인간 TGF-β RII/Fc-결합 dAb를 30℃에서 48 내지 72시간 동안 밤새 발현 자가유도 배지 (오넥스™, 노바겐)에서 발현시켰다. 배양액을 원심분리하고 (4,600 rpm에서 30분 동안), 상청액을 스트림라인(STREAMLINE)™-단백질 A 비드 (아머샴 바이오사이언시스 (Amersham Biosciences), 지이 헬쓰케어™, 영국, 결합 용량: 5 mg의 dAb/비드의 ml)와 함께 밤새 4℃에서 또는 실온에서 적어도 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 비드로 크로마토그래피 컬럼을 채우고, 1x 또는 2xPBS, 이어서 10 또는 100 mM 트리스-HCl pH 7.4 (시그마, 영국)로 세척하였다. 결합된 dAb를 0.1 M 글라이신-HCl pH 2.0으로 용리하고, 1 M 트리스 pH 8.0으로 중화하였다. dAb의 280 nm에서의 OD를 측정하고, 단백질 농도를 dAb의 아미노산 조성으로부터 계산된 흡광 계수를 사용하여 결정하였다.
항-인간 및 항-뮤린 TGFRII dAb 나이브 리드의 아미노산 및 핵산 서열을 아래에 제시한다.
Figure 112013070489309-pct00001
Figure 112013070489309-pct00002
Figure 112013070489309-pct00003
Figure 112013070489309-pct00004
Figure 112013070489309-pct00005
Figure 112013070489309-pct00006
Figure 112013070489309-pct00007
Figure 112013070489309-pct00008
Figure 112013070489309-pct00009
상기 항-인간 및 항-뮤린 TGFRII dAb 나이브 리드의 카바트에 의해 규정된 CDR이 각각 아래 표 1 및 2에 제시된다.
Figure 112013070489309-pct00010
Figure 112013070489309-pct00011
Figure 112013070489309-pct00012
실시예 2. DSC (시차 주사 열량측정법) - 나이브 클론
dAb 열 안정성을 시차 주사 열량측정법 (DSC)을 이용하여 결정하였다. dAb를 1 mg/ml의 최종 농도로 PBS 내로 밤새 투석하였다. 투석 완충제를 모든 샘플에 대한 참조물로서 사용하였다. DSC 측정은 지이 헬쓰케어™-MICROCAL™VP-DSC 모세 셀 미세열분석기를 사용하여 180℃/시의 가열 속도에서 수행하였다. 전형적인 스캔 범위는 참조 완충제 및 단백질 샘플 모두에 대해 20-90℃이었다. 이들 실험 조건 하에 단백질 재폴딩의 정도를 평가하기 위해 재스캔을 매번 수행하였다. 각각의 단백질 샘플 스캔 후에, 모세 셀을 물 중 5% 데콘(DECON)™ (피셔-사이언티픽 (Fisher-Scientific))의 용액으로 세정한 후 PBS 스캔을 수행하였다. 생성되는 데이터 트레이스 (trace)를 오리진(Origin) 7.0 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 참조 완충제 스캔으로부터 얻어진 DSC 트레이스를 단백질 샘플 스캔의 것으로부터 공제하였다. 단백질 샘플의 정확한 몰 농도를 데이터 분석 루틴 (routine)에 입력하여 용융 온도에 대한 값 (Tm), 엔탈피 (ΔH) 및 반트호프 (Van't Hoff) 엔탈피 (ΔHv) 값을 얻었다. 데이터를 비-2-상태 모델 (N2M)에 피팅시켰다. 최상의 피트 (best fit)는 1 또는 2 전이 사건을 이용하여 얻어졌다. 본원에 설명된 dAb에 대해 얻어진 Tm 값은 52.1℃ 내지 73.3℃이다. Tm 값 및 재폴딩의 비율을 표 3에 제시한다.
Figure 112013070489309-pct00013
Figure 112013070489309-pct00014
모든 분자는 가열 시에 적어도 52℃까지 3차 구조를 유지한다.
실시예 3. SEC - MALS ( 다각도 - LASER -광 산란을 갖는 크기 배제 크로마토그래피) - 나이브 클론
dAb가 용액 내에서 단량체성인지 보다 고차 올리고머를 형성하는지 결정하기 위해, 이들을 SEC-MALLS (다각도-LASER-광 산란을 갖는 크기 배제 크로마토그래피)에 의해 분석하였다. 오토샘플러 (autosampler) 및 UV 검출기 (엠파워 (Empower) 소프트웨어에 의해 제어됨)가 설치된 애질런트 (Agilent) 1100 시리즈 HPLC 시스템을 와이엇 미니 돈 트레오스 (Wyatt Mini Dawn Treos; 레이저 광산란 (LS) 검출기) 및 와이엇 옵티랩 (Optilab) rEX DRI (시차 굴절률 (RI) 검출기)에 연결하였다. 검출기는 다음 순서로 연결하였다: -UV-LS-RI. RI 및 LS 기기는 모두 658 nm의 파장에서 작동하고; UV 신호는 280 nm 및 220 nm에서 모니터링하였다. 도메인 항체 (PBS 내에 1 mg/mL의 농도에서 100 마이크로리터 주사)를 지이 헬쓰케어™ 10/300 수퍼덱스 (Superdex) 75 컬럼을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 그들의 유체역학적 특성에 따라 분리하였다. 이동상은 PBS + 10% 에탄올이었다. 단백질이 검출기를 통과하는 동안 산란된 광의 강도는 각도의 함수로서 측정하였다. RI 검출기를 사용하여 결정된 단백질 농도와 함께 상기 측정치는 적절한 식 (분석 소프트웨어 아스트라 v.5.3.4.14의 구성 요소)을 사용한 몰 질량의 계산을 허용하였다. 본원에서 설명되는 모든 dAb의 단량체 함량은 65% 내지 98%이다. 데이터를 표 4에 제시한다.
Figure 112013070489309-pct00015
표 3 및 4에 나열된 분자는 용액 상태 (단량체에 대한 성향) 함량 및 열 안정성에 기초하여 선택하였다. 모든 분자는 65% 이상의 단량체에 대한 성향을 보이고, 가열 시에 적어도 52℃까지 3차 구조를 유지한다.
실시예 4. TGF 베타 RII 억제에 대한 검정 ( 나이브 클론)
MC3T3 - E1 루시퍼라제 검정 - 방법 m1:
MC3T3-E1 루시퍼라제 검정은 MC3T3-E1 세포에서 CAGA-루시퍼라제의 TGFβ-유도된 발현을 억제하는 dAb의 능력을 측정한다. CAGA 박스로 불리는 TGFβ-반응성 서열 모티프의 3개 카피가 인간 PAI-1 프로모터 내에 존재하고, Smad3 및 4 단백질에 특이적으로 결합한다. 다수 카피의 CAGA 박스를 루시퍼라제 리포터 구축물 내로 클로닝하면 리포터 시스템으로 형질감염된 세포에 TGFβ 반응성을 부여한다. 본 검정은 [CAGA]12-루시퍼라제 리포터 구축물로 안정하게 형질감염된 MC3T3-E1 세포 (마우스 골모세포)를 사용한다 (문헌 [Dennler, et al., (1998) EMBO J. 17, 3091-3100]).
가용성 dAb를 Smad3/4 경로를 통해 TGF-β1 신호전달을 차단하는 그들의 능력에 대해 시험하였다.
표 5에 방법 m1로서 나타내는 데이터를 생성하기 위해 사용된 프로토콜은 다음과 같다. 간단히 설명하면, 검정 배지 (RPMI 배지 (깁코 (Gibco), 인비트로겐 엘티디 (Invitrogen Ltd, 영국 페이즐리), 10% 열 불활성화된 태소 혈청, 및 1% 페니실린/스트렙토마이신) 내의 2.5x104 MC3T3-E1 세포/웰을 조직 배양 96 웰 플레이트 (넝크)에 첨가한 후, dAb 및 TGF-β1 (최종 농도 1 ng/ml)을 첨가하고, 6시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이팅하였다. dAb를 PBS 내로 투석한 후 검정에서 시험하였다. BRIGHTGLOW™ 루시퍼라제 시약 (프로메가 (Promega, 영국))을 웰에 첨가하고, 실온에서 2분 동안 인큐베이팅하여 세포를 용해시키고, 생성되는 발광을 발광계에서 측정하였다.
최대 억제 % 값의 평균 및 범위를 얻기 위해 검정을 수회 수행하고, 이를 표 5에 요약한다. 상기 방법을 변형하였고 아래에 설명한다.
변형된 MC3T3 - E1 루시퍼라제 검정 - 방법 m2:
MC3T3-E1 세포를 "플레이팅 배지" (MEM-알파 + 리보뉴클레오시드 + 데옥시리보뉴클레오시드 (인비트로겐 22571), 5% 활성탄 스트리핑된 FCS (페르비오 사이언시스 유케이 엘티디 (Perbio Sciences UK Ltd); SH30068.03), 1/100 피루브산나트륨 (인비트로겐 11360), 250 ㎍/ml의 게네티신 50 mg/ml (인비트로겐, 10131027) 내에서 96 웰 플레이트 (넝크 13610)에 1.25 x 104/웰로 첨가하고, 37℃, 5% CO2에서 밤새 인큐베이팅하였다. 세포로부터 배지를 "검정 배지" (DMEM (인비트로겐 31966021) 25 mM Hepes (인비트로겐))으로 교체하고, 4x 최종 검정 농도의 PBS 내의 정제된 dAb를 "검정 배지" 내에 적정하고, 세포 플레이트에 첨가한 후, TGF-β1 (R&D, 240B)를 4x EC80로 첨가하였다. 플레이트를 6시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이팅하였다. 스테디라이트(STEADYLITE)™ 루시퍼라제 시약 (퍼킨엘머 6016987)을 웰에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이팅하고, 생성되는 발광을 엔비젼™ 플레이트 판독기 상에서 측정하였다.
각각의 dAb를 검정에서 이중으로 적정하고, 최대 억제 %를 결정하였다 (n=2). 최대 억제% 값의 평균 및 범위를 얻기 위해 검정을 수회 수행하고, 이를 표 5에 요약한다. 검정 QC 파라미터가 일치되었다; 사내 (in-house) 소분자는 마우스 검정에 대해 100 내지 900 nM의 IC50 범위를 보인다. 또한, 로버스트 (robust) Z 인자는 0.4보다 크고, TGF-β EC80은 검정에 첨가된 농도의 6배 이내에 있었다.
A549 IL -11 방출 검정 - h1:
A549 인터루킨-11 (IL-11) 방출 검정은 A549 세포로부터 인간 TGF-β1 자극된 IL-11 방출을 억제하는 dAb의 능력을 측정한다. TGF-β1은 TGF-βRII에 직접 결합하고, TGF-βRI/II 복합체의 회합을 유도한다. TGF-βRI은 인산화되고 Smad4 경로를 비롯한 몇몇 경로를 통해 신호를 전달할 수 있다. Smad4 경로의 활성화는 IL-11의 방출을 일으킨다. IL-11은 세포 상청액 내로 분비되고, 따라서 비색 ELISA에 의해 측정된다.
가용성 dAb를 Smad4 경로를 통한 TGF-β1 신호전달을 차단하는 그들의 능력에 대해 시험하였다. 간단히 설명하면, "검정 배지" (DMEM 고글루코스 배지 (깁코TM, 인비트로겐 엘티디, 영국 페이즐리), 10% 열 불활성화된 태소 혈청 (PAA, 오스트리아), 10 mM HEPES (시그마, 영국) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (PAA, 오스트리아)) 내의 1x105 A549 세포/웰을 조직 배양 96 웰 플레이트 (넝크)에 첨가한 후, dAb 및 TGF-β1 (최종 농도 3 ng/ml) (R&D 시스템즈, 영국 애빙던)를 첨가하고, 37℃, 5% CO2에서 밤새 인큐베이팅하였다. dAb를 PBS 내로 투석한 후 검정하였다. 상청액 내로 방출된 IL-11의 농도를 제조자의 지시에 따라 인간 IL-11 듀오셋(DUOSET)™ (R&D 시스템즈, 영국 애빙던)을 사용하여 측정하였다.
A549 IL-11 방출 검정을 표 5 및 6에서 검정 방법 h1로서 언급한다. 최대 억제 % 값의 평균 및 범위를 얻기 위해 검정을 수회 수행하고, 이를 표 5에 요약한다. 검정 QC 파라미터가 일치되었다; 사내 소분자는 인간 검정에 대해 50 내지 500 nM의 IC50 범위를 보인다.
SBE - bla HEK 293T 셀 센서 검정 - h2:
신호 전달 분자의 Smad 패밀리의 구성원은 TGF-β 신호를 세포 표면으로부터 핵으로 전송하는 세포내 경로의 성분이다. TGF-β1은 TGF-II에 직접 결합하고, TGF-βRI/II 복합체의 회합을 유도한다. 이어서, Smad2 및 Smad3은 TGF-βRI에 의해 인산화되고, 후속적으로 동시-smad 패밀리 구성원 Smad4와 함께 헤테로머 복합체를 형성한다. 이들 복합체는 핵에 전위하고, 여기서 DNA에 결합하고, 유전자 전사를 조절한다.
셀 센서 SBE-bla HEK 293T 세포는 HEK 293T 세포 내로 안정하게 통합된 Smad 결합 요소 (SBE)의 제어 하의 베타-락타마제 리포터 유전자를 함유한다 (인비트로겐, 영국). 세포는 TGF-βI에 반응성이고, Smad2/3 신호전달 경로의 효능제/길항제를 검출하기 위해 사용될 수 있다.
가용성 dAb를 인비트로겐, 영국 (세포주 K1108)의 최적화된 방법에 기반한 아래 방법에 따라 상기 경로를 통한 TGF-β1 신호전달을 차단하는 그들의 능력에 대해 시험하였다.
성장 배지 (DMEM 고글루코스, 인비트로겐 21068028, 10% 투석된 U.S. FBS (인비트로겐 26400-044), 0.1 mM (1/100) 비필수 아미노산 (인비트로겐 11140-050), 25 mM (1/40) HEPES 완충제 (시그마 H0887), 1 mM (1/100) 피루브산나트륨 (인비트로겐 11360-070), 1% 글루타맥스(GLUTAMAX)™ (200 mM 인비트로겐 35050038), 5 ㎍/ml의 블라스티시딘 (인비트로겐 R21001)) 내에서 적어도 4회 계대배양을 위해 성장시키고 사내 동결된 (4x107/ml에서) 동결된 세포로부터 직접 검정을 수행하였다. 세포를 플레이팅 배지 (1% FCS를 함유하고 블라스티시딘을 함유하지 않으면서 상기한 바와 같음) 내에서 세포 배양 플레이트 (코스타 (Costar) 3712) 내에 20,000 세포/웰로 플레이팅하였다. 세포를 밤새 인큐베이팅한 후에, 정제된 dAb를 "검정 배지" (DMEM (인비트로겐 31966021), 25 mM Hepes (인비트로겐)) 내에 희석하고, 세포에 4x 최종 검정 농도로 첨가하였다. 37℃에서 1시간 인큐베이션 후에, TGF-β (R&D 시스템즈; 240B)를 4x EC80로 첨가하고, 추가로 5시간 동안 인큐베이팅하였다. 리브블레이저(LIVEBLAZER)™ 기질 (인비트로겐 K1030)을 제조자의 지시에 따라 제조하고, 8x 부피로 첨가하였다. 플레이트를 암소에서 실온에서 16시간 동안 인큐베이팅하고, 인비트로겐 프로토콜에 따라 엔비젼™ 플레이트 판독기 상에서 판독하였다.
SBE-bla HEK 셀센서(CELLSENSOR)™ 검정을 표 5 및 6에 방법 h2로서 언급한다. 각각의 dAb를 검정에서 이중으로 적정하고, IC50을 결정하고 최대 억제 %를 결정하였다 (n=2). 마우스 검정에서 전체 곡선을 얻기 어렵기 때문에, 억제 %만을 표 5에 언급한다. 값의 평균 및 범위를 얻기 위해 검정을 수회 수행하였고, 이를 표 5 및 6에 요약한다. 산술 평균 IC50은 pIC50 (IC50의 -로그)을 이용하여 계산하고, 범위는 평균 pIC50으로부터 로그 표준 편차를 더하고 공제한 후 IC50으로 역변환시킴으로써 계산하였다. 검정 QC 파라미터가 일치되었다; 사내 소분자는 인간 검정에 대해 50 내지 500 nM의 IC50 범위를 보인다. 또한, 로버스트 Z 인자는 0.4보다 크고, TGF-β EC80은 검정에 첨가된 농도의 6배 이내에 있었다.
결과를 표 5 및 6에 제시한다.
Figure 112013070489309-pct00016
Figure 112013070489309-pct00017
마우스 클론은 몇몇 검정에서 TGF-β의 40% 초과의 중화를 보이는 것에 기초하여 선택하였다. 이것에 대한 유일한 예외는 DOM23m-72이었다. 클론은 또한 우수한 중화 곡선을 보였다 (데이터를 제시하지 않는다). 인간 클론은 평균 IC50이 15 μM 미만인 것에 기초하여 선택하였다.
실시예 5. 나이브 클론 ( 실시예 1로부터)의 실수 유발 ( Error Prone ) 친화도 성숙
(상기 설명된) 적합한 생물리학적 특징을 갖는 활성으로서 확인된 dAb의 친화도를 개선하기 위해 실수 유발 돌연변이유발을 수행하였다.
파지 라이브러리 제작: DOM23h-843, DOM23h-850, DOM23h-854, DOM23h-855, DOM23h-865, DOM23h-866, DOM23h-874, DOM23h-883, DOM23h-439 및 DOM23h-903의 실수 유발 라이브러리를 젠모르프(GENEMORPH)™ II 랜덤 돌연변이유발 키트 (스트라타젠 (Stratagene), Cat No 200550)를 사용하여 제조하였다. 표적 dAb 유전자를 제조자의 지시에 따라 Taq DNA 중합효소 및 올리고뉴클레오티드 DOM008 (5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3' (서열 185)) 및 DOM009 (5'- CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3' (서열 186))를 사용한 PCR에 의해 증폭한 후, 희석시킨 PCR 생성물을 올리고뉴클레오티드 DOM172 (5'-TTGCAGGCGTGGCAACAGCG-3' (서열 187)) 및 DOM173 (5'-CACGACGTTGTAAAACGACGGCC-3' (서열 188)), 및 뮤타자임(MUTAZYME)™ II DNA 중합효소를 사용하여 재-증폭하였다. 상기 PCR 생성물을 Taq DNA 중합효소 및 올리고뉴클레오티드 DOM172 및 DOM173을 사용하여 추가로 증폭하여, DNA 생성물 수율을 증가시켰다. PCR 생성물을 Sal I 및 Not I 제한 엔도뉴클레아제로 소화하였다. 소화되지 않은 생성물 및 소화된 단부들을 스트렙타비딘 비드 (다이날 바이오테크 (Dynal Biotech, 영국))를 사용하여 소화된 생성물로부터 제거하였다. 항-인간 실수 유발 선택을 위해, 소화된 생성물을 Sal I 및 Not I 제한 엔도뉴클레아제로 소화한 pDOM4 파지 벡터 내로 결찰시키고, 이. 콜라이 TB1 세포를 형질전환시키기 위해 사용하였다. 형질전환된 세포를 15 ㎍/ml 테트라사이클린을 보충한 2xTY 아가 상에 플레이팅하여, >1x107 형질전환체의 라이브러리 크기를 얻었다.
인간 TGF베타RII 특이적 dAb 실수 유발 선택: DOM23h-843, DOM23h-850, DOM23h-854, DOM23h-855, DOM23h-865, DOM23h-866, DOM23h-874, DOM23h-883, DOM23h-903, 및 DOM23h-439 라이브러리를 사용하여 3회 선택 라운드를 수행하였다. 라운드 1은 1 nM 비오티닐화된 인간 TGF베타RII/Fc (N13241-57)를 사용하여 수행하였다. 라운드 2 및 3에 대해 2가지 상이한 방법을 따랐다: 방법 1에서는 이량체성 TGF베타RII/Fc 형태의 항원을 사용하고, 방법 2에서는 가용성 단량체 형태의 TGF베타RII를 사용하였다. 방법 1: 라운드 2는 1 μM 비-비오티닐화된 인간 TGF베타RII/Fc 경쟁자와 함께 1 nM 비오티닐화된 인간 TGF베타RII/Fc를 사용하여 수행하였다. 라운드 3은 1 μM 비-비오티닐화된 인간 TGF베타RII/Fc (N12717-4)와 함께 100 pM 비오티닐화된 인간 TGF베타RII/Fc을 사용하여 수행하였다. 방법 2: 라운드 2는 1 μM 비-비오티닐화된 인간 TGF베타RII 경쟁자와 함께 1 nM 비오티닐화된 인간 TGF베타RII를 사용하여 수행하였다. 라운드 3은 1 μM 비-비오티닐화된 인간 TGF베타RII 경쟁자와 함께 100 pM 비오티닐화된 인간 TGF베타RII를 사용하여 수행하였다.
제2 및 제3 라운드 선택 결과물을 상기 설명된 바와 같이 pDOM13 벡터 내로 서브클로닝하였다. 개별 클론을 선발하여 96-웰 플레이트 내에서 850 rpm, 37℃, 90% 습도에서 24시간 동안 100 ㎍/ml 카르베니실린을 보충한 밤새 발현 자가-유도 배지에서 0.5 ml/웰로 발현시켰다. 이어서, 플레이트를 1800 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 HBS-EP 완충제 내에 1/5 또는 1/2로 희석하고, 비오티닐화된 인간 TGF-β RII/Fc에 대한 결합에 대해 비아코어™ (제조자의 권장사항에 따라 1000 Ru 비오티닐화된 hRII-Fc로 코팅된 SA 칩) (비아코어™, 지이 헬쓰케어™) 상에서 스크리닝하였다. 샘플을 50 ㎕/min의 유량으로 비아코어™ 상에서 이동시켰다. 높은 수의 공명 단위 (RU)와 또는 모 클론에 비해 개선된 오프율 (off-rate)을 가지면서 결합된 클론을 50 ml 밤새 발현 자가유도 배지 내에서 30℃에서 48 내지 72시간 동안 발현시키고, 4,600 rpm에서 30분 동안 원심분리하였다. 상청액을 스트림라인-단백질 비드와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 이어서, 비드로 드립 (drip) 컬럼을 채우고, 5 컬럼 부피의 2xPBS에 이어, 1 층 (bed) 부피의 10 mM 트리스-HCl pH 7.4로 세척하고, 결합된 dAb를 0.1 M 글라이신-HCl pH 2.0으로 용리하고, 1 M 트리스-HCl pH 8.0으로 중화하였다. dAb의 280 nm에서 OD를 측정하고, 단백질 농도를 dAb의 아미노산 조성으로부터 계산된 흡광 계수를 사용하여 결정하였다.
오프율 개선된 실수 유발 선택의 시험관내 분석: 정제된 dAb를 나이브 선택에서와 동일한 시험, 즉, 비아코어, SBE-bla HEK 293T 셀 센서 검정 (h2), DSC, 및 SEC-MALS로 처리하였다. 모 클론에 비해 개선된 클론의 예를 표 6A에 제시한다. IC50 값은 'n'번의 실험의 평균이다.
<표 6A>
Figure 112013070489309-pct00018
친화도 성숙된 서열
Figure 112013070489309-pct00019
실시예 6. DOM23h -271-7 계통의 친화도 성숙
Figure 112013070489309-pct00020
둘 모두 WO 2011/012609에 설명된 바와 같이 도메인 항체 DOM23h-271 (서열 199)은 선행 선택 캠페인 (campaign)에서 파지 라이브러리로부터 단리되었고, 변이체 DOM23h-271-7 (서열 201)은 실수 유발 친화도 성숙 후에 단리되었다. DOM23h-271-7 (서열 201)은 그의 결합 운동학, 서열 및 생물리학적 거동을 기초로 하여 추가의 친화도 성숙을 위해 선택되었다. 친화도 성숙은 CDR을 재다양화하기 위해 변성 (degenerative) 돌연변이유발을 사용하여 수행하고, 개선된 리드는 DNA 디스플레이 또는 파지 디스플레이를 이용하여 확인하였다. CDR을 재다양화하기 위해 2가지 종류의 라이브러리를 제작하였고, 이들을 삼중체 (triplet) 및 도핑된 (doped) 라이브러리로서 칭한다. 삼중체 라이브러리를 제조하기 위해, 각각의 CDR을 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하고, 각각의 프라이머 내에서 3개의 아미노산에 대한 코돈을 NNS 코돈으로 교체하여 3개의 위치를 다양화하였다. 각각의 CDR 내의 모든 표적화되는 아미노산, 즉 CDR1의 경우 2개, CDR2의 경우 3개 및 CDR3의 경우 6개를 포함하기 위해 다수의 올리고뉴클레오티드를 사용하였다. 상보성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 각각의 돌연변이된 CDR을 포함하는 서열 단편, 및 또한 dAb 코딩 서열의 나머지를 포함하는 중첩되는 서열 단편을 증폭하기 위해 사용하였다. 이들 단편을 혼합하고, 스플라이스 연장 중첩 PCR에 의해 회합시켜 전장 dAb 코딩 서열을 생산하였다. 상기 생성물을 프라이머 DOM172 (서열 187) 및 DOM173 (서열 188)을 사용하여 PCR 증폭하고, SalI 및 NotI로 소화하고, 파지 선택을 위해 유사하게 절단된 pDOM4 (상기 설명됨), 또는 DNA 디스플레이 선택을 위해 pIE2A2 (WO2006018650에 설명됨) 내로 결찰하였다. 도핑된 라이브러리는 본질적으로 WO2006018650에서 설명되는 바와 같이 유사한 방법을 이용하여 제작하였다. 단일 축퇴성 (degenerate) 올리고뉴클레오티드 프라이머를 각각의 CDR 내의 모든 돌연변이를 포함하기 위해 사용하였다. 각각의 프라이머 내의 다양화되는 아미노산은 다수의 아미노산을 명시하기 위해 축퇴성 코돈을 사용하여 명시되었다. 5개의 아미노산이 CDR1에서, 7개의 아미노산이 CDR2에서, 13개의 아미노산이 CDR3에서 다양화되었다. 프라이머 내에서, 다음 축퇴성 코돈이 사용된다: 'a' = 91% A + 3% T + 3% G + 3% C; 'g' = 91% G + 3% T + 3% C + 3% A; 'c' = 91% C + 3% T + 3% G + 3% A; 't' = 91% T + 3% A + 3% G + 3% C; 'S' = 50% G 및 50% C. 대문자는 100%의 명시된 뉴클레오티드를 나타낸다. 사용된 프라이머는 다음과 같았다:
Figure 112013070489309-pct00021
축퇴성 라이브러리 프라이머를 삼중체 프라이머와 동일한 방식으로 사용하였다. 각각의 다양화된 CDR을 따로 증폭시킨 후, 스플라이스 연장 중첩을 사용하여 모 서열 단편과 조합하였다. 단편을 SalI 및 NotI을 사용하여 pDOM4 및 pIE2A2에 서브클로닝하였다.
DNA 디스플레이
선택은 에멀젼 내의 시험관내 구획화 (compartmentalisation) 및 본질적으로 WO2006018650에 기재된 바와 같이 scArc DNA 결합 단백질을 사용하는 DNA 디스플레이를 사용하여 수행하였다. 간단히 설명하면, TGFbRII-FC 항원을 5:1 몰비의 비오틴 및 EZ-LINK™ 술포-NHS-LC-비오틴 키트 (Thermo #21327)를 사용하여 비오티닐화하였다. Arc 오퍼레이터 서열을 포함하는 DNA 단편 및 다양화된 dAb 라이브러리를 포함하는 발현 카세트를 인접 프라이머를 사용하여 pIE2A2 벡터로부터 PCR 증폭하였다. 생성물을 eGel (인비트로겐)로부터 정제하고, 1 mg/ml BSA 내에 1.7 또는 0.85 nM로 희석하였다. 개선된 결합제의 선택을 위해, 도핑된 및 삼중체 라이브러리를 약간 상이한 조건 하에 따로 처리하였다. 삼중체 CDR 라이브러리를 조합하여 함께 모은 CDR 1, 2 또는 3 라이브러리를 생성하였다. 10 라운드의 선택을 각각의 종류의 라이브러리에 대해 사용하였다. 두 방법 모두에 대해, 2 선택 사이클 후에, 다양화된 CDR을 증폭하고 스플라이스 중첩 연장 PCR에 의해 재조합시켜 모든 3개의 CDR에 돌연변이를 갖는 제4 라이브러리를 생산하였다.
도핑된 라이브러리에 대해, 5x108 카피의 DNA를 50 ㎕의 익스프레스웨이(EXPRESSWAY)™ 시험관내 번역 믹스 (인비트로겐)와 혼합하였다. 각각의 반응물은 10.0 ㎕ SLYD™ 추출물; 10.0 ㎕ 2.5x 반응 완충제; 12.5 ㎕ 2x 피드 (feed) 완충제; 1.0 ㎕ 메티오닌 (75 mM); 1.25 ㎕ 아미노산 믹스 (50 mM); 15 ㎕ H2O; 0.5 ㎕ T7 중합효소; 0.25 ㎕ 항-HA mAb 3F10 (로슈 (Roche), cat. 1 867 423); 및 1.5 ㎕ 글루타치온 (100 mM) (시그마)을 함유하였다. 이를 4 ml 유리 바이알 (크로마콜(CHROMACOL)™ 4SV P837) 내의 800 ㎕의 소수성 상 (경질 백색 광물성 기름 (시그마) 내의 4.5% 스판(SPAN)™-80, (플루카 (Fluka)) + 0.5% 트리톤 (Triton) X-100 (시그마))에 첨가하고, 2000 rpm에서 4-5분 동안 교반하였다. 튜브를 밀봉하고, 3시간 동안 30℃에서 인큐베이팅하였다. 모든 후속적인 단계는 실온에서 수행하였다. DNA-단백질 복합체를 추출하기 위해서 200 ㎕의 C+ 완충제 (10 mM 트리스, 0.1 M KCl, 0.05% 트윈™-20, 5 mM MgCl2, 1% BSA, pH 7.4) 및 500 ㎕의 헥산을 바이알에 첨가하고, 혼합하고, 마이크로튜브에 옮기고, 13000 g에서 1분 동안 원심분리하였다. 유기상을 제거하고, 수성상을 계면이 거의 투명해질 때까지 800 ㎕의 헥산으로 3-5회 재추출하였다. 처음 5개의 선택 라운드를 위해, 비오티닐화된 TGFbRII-FC는 스트렙타비딘 디나비드™ (인비트로겐)에 미리 결합되었고, 추출된 복합체에 첨가하여 40, 40, 10, 5 및 5 nM 항원 (각각 라운드 1, 2, 3, 4 및 5)에 동등한 항원 농도를 제시하였다. T1 비드가 선택 1-3에 대해 사용되었고, C1은 선택 4 및 5에 대해 사용되었다. 30분 인큐베이션 후에, 비드를 C+ 완충제로 3-5회 세척하였다. 이어서, 비드에 결합된 상태로 유지되는 DNA 복합체를 인접 프라이머를 사용한 PCR에 의해 회수하였다. 선택 라운드 6-10은 '가용성' 선택으로 언급되고, 여기서 비오티닐화 TGFbRII-FC는 5, 5, 4, 5 및 5 nM의 농도 (각각 라운드 6, 7, 8, 9 및 10)를 제시하기 위해 추출 후에 직접 복합체에 첨가하였고, 결합이 확립되도록 30분 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 비-비오티닐화된 TGFbRII-FC를 경쟁자로서 74, 750, 400, 250 및 250 nM (각각 라운드 6, 7, 8, 9 및 10)로 첨가하고, 15, 15, 30, 30 및 30분 (각각 라운드 6, 7, 8, 9 및 10) 동안 인큐베이팅하였다. 라운드 9 및 10에서, ARC 오퍼레이터 서열을 함유하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를, 임의의 비-복합체화된 DNA와 에멀젼으로부터 방출된 과도한 단백질 사이의 교차 반응을 감소시키기 위해 헥산 추출에 사용된 C+ 완충제에 50 nM로 포함시켰다. 경쟁 기간 후에, 10 ㎕의 C1 스트렙타비딘 디나비드™를 첨가하였다. 10분 후에, 비드를 완충제 C+로 5회 세척하고, 결합된 복합체는 앞서 설명된 바와 같이 인접 프라이머를 사용한 PCR에 의해 회수하였다. PCR 생성물을 eGel 상에서 정제하고, 다음 선택 사이클에서 사용하였다. 제10 선택 후에, 회수된 생성물을 SalI 및 NotI 효소를 사용하여 절단하고, 발현을 위해 유사하게 절단된 pDOM13 내로 클로닝하였다.
삼중체 라이브러리를 유사한 방법을 이용하여 선택하되, 1x109 개의 DNA 카피를 제1 선택 라운드에서 사용하고, 이후에는 5x108 개를 사용하였다. 또한, 에멀젼에서 단백질 발현을 위한 인큐베이션 시간은 2시간으로 단축되었다. 가용성 비오티닐화 TGFbRII FC를 10개의 모든 선택 라운드에서 각각 25, 10, 5, 5, 5, 5, 2.5, 2.5, 2.5, 2.5, 2.5, 2.5 nM로 사용하였다. 비오티닐화 표적을 추출된 복합체와 함께 30분 동안 인큐베이팅하였다. 선택 라운드 5-10에서, 비-비오티닐화된 TGFbRII-FC 경쟁자를 각각 15, 30, 60, 60, 75, 및 90분 동안 250 nM의 최종 농도로 첨가한 후, C1 스트렙타비딘 디나비드™를 첨가하였다. 라운드 5에서, 경쟁 온도는 실온이었지만, 라운드 6으로부터 경쟁 온도는 30℃로 승온되었다. 결함 DNA의 교차 복합체화를 감소시키기 위해 Arc 오퍼레이터 디코이 (decoy) 올리고뉴클레오티드가 선택 라운드 1-4에 포함되었다.
선택 후에, 삽입체를 코딩하는 dAb를 SalI 및 NotI을 사용하여 DNA 디스플레이 발현 카세트로부터 절제하고, pDOM13 세균 발현 벡터 내로 클로닝하였다. dAb를 서열결정하고 TB 오넥스™ 배지에서 발현시키고, 상청액을 모 클론에 비해 개선된 오프율을 갖는 클론을 확인하기 위해 비아코어™에 의해 스크리닝하였다. 개선된 오프율을 갖는 클론을 발현시키고 정제하고, 비아코어™에 의해 친화도를 평가하고, 셀 센서 검정으로 효능을 평가하였다. 불량한 운동학 프로필을 보이거나, 바람직하지 않은 서열 모티프를 포함하거나, 또는 매우 낮은 수율을 제시하는 클론은 조사를 계속하지 않았다. 관심있는 3개의 클론이 추가로 선택되었다. 클론 DOM23h-271-21 (서열 29) 및 DOM23h-271-22 (서열 30)는 도핑된 라이브러리 선택으로부터 단리되었다. 클론 DOM23h-271-27 (서열 31)은 삼중체 라이브러리 선택으로부터 단리되었다. 인간 TGFbRII-FC에 대한 선택된 클론의 친화도를 표 7에 제시한다.
Figure 112013070489309-pct00022
파지 디스플레이:
별개의 CDR1, CDR2 및 CDR3 풀 내의 삼중체 또는 도핑된 라이브러리를, 각각 10 nM, 1 nM, 100 pM 및 20 pM의 농도로 4 라운드, 또는 20 pM, 이어서 2pM 항원을 사용한 2개의 선택 라운드에 걸쳐 비오티닐화된 인간 TGF-β RII/Fc 항원에 대해 상기 설명된 바와 같이 파지 선택 라운드로 처리하였다. 파지 선택으로부터의 삽입체를 pDOM10 발현 벡터 내로 클로닝하고, 모 클론에 비해 개선된 오프율을 갖는 상청액을 추가의 연구를 위해 선택하였다. 도메인 항체를 발현시키고, 인간 TGF-β RII/Fc 항원에 대한 정제된 그의 친화도 및 생체이용률을 비아코어™ T100 및 상기 설명된 셀 센서 검정 (데이터를 제시하지 않는다)으로 시험하였다. 인간 TGFbRII-FC에 대한 선택된 클론의 친화도를 표 8에 제시한다.
Figure 112013070489309-pct00023
개선된 활성을 갖는 선택된 클론의 서열을 결정하고, 전체 서열 및 CDR 서열을 아래에 제시한다.
Figure 112013070489309-pct00024
Figure 112013070489309-pct00025
Figure 112013070489309-pct00026
Figure 112013070489309-pct00027
Figure 112013070489309-pct00028
결합 운동학에 대한 일반적인 방법 - T100
비아코어™ 분석은 CM4 칩 상의 포획 표면을 사용하여 수행하였다. 항-인간 IgG를 포획제로서 사용하고, 1급 아민 커플링에 의해 CM4 바이오센서 칩에 결합시켰다. 인간 Fc에 융합된 항원 분자는 250 내지 300 공명 단위의 수준으로 상기 고정된 표면 상에 포획되었고, 이동 완충제에 희석된 규정된 농도의 도메인 항체를 상기 포획된 표면 상에 통과시켰다. 포획된 항원 표면 상의 완충제의 주사를 이중 참조를 위해 사용하였다. 포획된 표면을 3 M 염화마그네슘 용액을 사용하여 각각의 도메인 항체 주사 후에 재생하였고; 재생은 포획된 항원을 제거하였지만, 후속적인 사이클에서 항원을 포획하는 표면의 능력에 유의한 영향을 주지 않았다. 모든 이동은 25℃에서 이동 완충제로서 HBS-EP 완충제를 사용하여 수행하였다. 데이터는 비아코어™ T100을 사용하여 생성하고, 소프트웨어에 내재하는 1:1 결합 모델에 피팅하였다. 비-특이적 결합이 상위 농도에서 관찰될 때, 상기 농도에서의 결합 곡선은 분석 세트로부터 제거하였다.
CDR3 의 추가의 다양화
최고 친화도를 갖는 DOM23h-271-7 유도체는 위치 96 및 100B에 메티오닌을 포함하였다. 위치 99, 100D, 100E 및 100G와 함께 상기 위치는 치환이 이루어질 수 있는지를 결정하기 위해 NNK 돌연변이유발을 사용하여 다양화하였다. DOM23h-271-22 또는 DOM23h-271-102 배경에서 선택된 위치 다양성을 도입하기 위해 프라이머 PEP-26-F를 사용하여 상기 설명된 바와 같이 NNK 라이브러리를 제작하였다. DOM23h-271-102는 DOM23h-271-7보다 개선된 친화도를 부여하는 돌연변이를 위치 27 및 55에 함유한다.
Figure 112013070489309-pct00029
DNA 디스플레이 라이브러리를 제작하고, 연속적인 라운드에서 5 nM; 0.5 nM; O.1 nM; O.1 nM; O.1 nM; 및 O.1 nM의 농도를 사용하여 상기 설명된 바와 같이 비오티닐화된 hTGFbRII-FC에 대해 선택하였다. 선택 라운드 4-6에서, 비-비오티닐화된 TGFbRII-FC 경쟁자를 100 nM의 최종 농도로 각각 60, 90, 및 90분 동안 첨가한 후, C1 스트렙타비딘 디나비드™를 첨가하였다. 선택 후에, dAb 삽입체를 프라이머 PelB NcoVh 및 PEP011을 사용하여 PCR 증폭하고, NcoI 및 EcoRI으로 절단하고, 세균 발현 벡터 pC10 내로 클로닝하였다.
Figure 112013070489309-pct00030
클로닝된 생성물을 발현시키고 비아코어에 의해 스크리닝하였다. DOM23h-271-22와 유사한 또는 더 우수한 오프율을 갖는 클론을 서열 결정하고, 정제하고, 비아코어™에 의해 친화도를 및 셀 센서 검정으로 효능을 평가하였다. 불량한 운동학 프로필을 보이거나, 바람직하지 않은 서열 모티프를 포함하거나, 또는 매우 낮은 수율을 제시하는 클론은 조사를 계속하지 않았다. DOM23h-271-50은 추가의 친화도 성숙을 위해 선택하였다.
Figure 112013070489309-pct00031
실시예 7. 위치 61 및 64에서 TGFbRII dAb 서열 ( DOM23h -271 계통) 내로의 돌연변이의 도입
D61N 및 K64R 이중 돌연변이는 이전에 다양한 TGFRβII dAb 계통에 도입되었고, 효능을 개선하는 것으로 밝혀졌다 (WO2011/012609). 이들 돌연변이를 유사한 효능 개선이 달성될 수 있는지 조사하기 위해 TGFbRII dAb DOM23h-271 계통 내로 도입하였다. 추가의 효능 향상이 달성될 수 있는지 결정하기 위해서 상기 위치에서의 다른 돌연변이를 조사하였다.
돌연변이는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 사용한 중첩 연장에 의해 DOM23h-271 (서열 199) 백본 (backbone) 내로 도입되었고 (문헌 [Ho, et al., Gene 1989 77(1)]); 상보성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 중첩 또는 상보성 단부를 갖는 2개의 DNA 단편을 생성하기 위해 사용하였다. 이들 단편을 후속적인 회합 PCR에서 조합하였고, 여기서 중첩 말단부는 어닐링하고, 이에 의해 각각의 가닥의 3' 중첩부는 상보성 가닥 및 PCR에 의해 추가로 증폭되는 생성되는 융합 생성물의 3' 연장을 위한 프라이머로서 기능하였다. 뉴클레오티드 서열 내의 특이적 변경은 뉴클레오티드 변화를 중첩 올리고뉴클레오티드 프라이머 내로 도입함으로써 도입되었다. 표적 dAb 유전자 단편을 수퍼타크(SUPERTAQ)™ 중합효소 (HT 바이오테크놀로지 (HT Biotechnology))를 사용하는 2가지의 별개의 PCR에 의해 증폭하였다. 친화도의 개선이 비아코어™을 사용하여 분명하게 측정가능하도록 TGFbRII에 대한 낮은 친화도를 갖기 때문에 DOM23h-271을 선택하였다. 위치 61 및 64에서의 돌연변이는 두 위치를 조합하여 돌연변이시키는 축퇴성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 코딩되었고, 개선된 결합 친화도를 갖는 돌연변이체를 풍부하게 만들기 위한 친화도 선택을 사용하였다. NR 돌연변이가 우세한 것으로 알려져 있기 때문에, 상기 돌연변이는 위치 61에 제한된 코돈, 즉 NNG를 사용함으로써 라이브러리에서 회피되었다. 상기 코돈은 13개의 아미노산을 코딩하지만, 아미노산 F, Y, C, H, I, N 또는 D를 포함하지 않는다. 유리 Cys는 dAb 내에서 유리하지 않고, 아스파라긴도 상기 위치에서 원치 않는 것이고, 따라서 단지 5개의 바람직한 아미노산 조합만이 배제되었다. 위치 64에서, NNK 코돈은 가능한 아미노산의 전체 범위를 제공하기 위해 사용되었다.
돌연변이를 도입하기 위해 사용된 올리고뉴클레오티드 쌍은 271-6164 R (5'-GCGTAGTATGTACGATTACCAATCGG-3') (서열 193)와 함께 PE008 (dAb 유전자의 5' 출발부에 인접함: 5'-TTGCAGGCGTGGCAACAGCGTCGACAGAGGTGCAGCTGTTGGAG-3') (서열 192) 및 AS1309 (dAb 유전자의 3' 단부에 인접함: 5'- TGTGTGTGTGTGGCGGCCGCGCTCGAGACGGTGACCAGGGTTCCCTGACCCCA-3') (서열 195)와 함께 돌연변이된 271-6164 deg-F (돌연변이된 잔기는 밑줄로 표시함: 5'-GGTAATCGTACATACTACGCANNGTCCGTGNNKGGCCGGTTCACCATCTCCCGC-3') (서열 194)이었다. 2개의 PCR 단편은 프라이머의 첨가 없이 수퍼타크™ DNA 중합효소를 사용한 회합 PCR에서 조합되었다. 이어서, 융합 생성물을 PCR 반응물에 인접 프라이머 PE008 및 AS1309를 첨가함으로써 증폭하였다. 돌연변이된 dAb를 SalI 및 NotI 제한 엔도뉴클레아제로 소화하고, 유사하게 절단된 pDOM13 발현 벡터 내로 결찰하고, 이. 콜라이 HB2151 세포 내로 형질전환시켰다. D61N, K64R 돌연변이를 또한 동일한 방식으로 DOM23h-271 내에 도입하되, 271-6164 deg-F 대신에 프라이머 271-6164 NR-F (5'-GGTAATCGTACATACTACGCAAACTCCGTGCGCGGCCGGTTCACCATCTCCCGC-3') (서열 196)을 사용하였다. 돌연변이된 dAb를 서열결정에 의해 확인하였다. 위치 61 및 64에 돌연변이의 신규한 조합을 갖는 129개의 클론이 확인되었지만, 11개는 PCR 오류에 의한 추가의 돌연변이를 보유하였다. 이들을 표 11에 제시한다. 주의: 향상된 친화도를 갖는 클론은 밑줄로 표시한다. 추가의 돌연변이를 갖는 클론은 별표로 나타낸다.
돌연변이의 효과를 결정하기 위해, 선택된 클론을 96 웰 플레이트 내에서 TB 오넥스™에서 72시간 동안 30℃에서 또는 24시간 동안 37℃에서 발현시켰다. 상청액을 원심분리에 의해 투명하게 만들고, 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과한 후, 비아코어™에 의해 오프율을 평가하였다.
비아코어™ A100 분석은 CM5 칩 상의 포획 표면을 사용하여 수행하였다. 항-인간 IgG를 포획제로서 사용하고, 1급 아민 커플링에 의해 CM5 바이오센서 칩에 커플링시켰다. 인간 Fc에 융합된 항원 분자는 200 내지 300 공명 단위의 수준으로 상기 고정된 표면 상에 포획되었고, 상청액 또는 정제된 도메인 항체를 상기 포획된 표면 상에 통과시켰다. 포획된 항원 표면 상의 배지 또는 완충제의 주사를 이중 참조를 위해 사용하였다. 각각의 유동 셀 상에서, 단백질 A 스폿 (spot)은 주사된 각각의 샘플 상의 도메인 항체의 존재의 확인을 허용하였다. 표면을 3 M 염화마그네슘 용액을 사용한 각각의 도메인 항체 주사 후에 재생하였고; 재생은 포획된 항원을 제거하였지만, 후속적인 사이클에서 항원을 포획하는 표면의 능력에 유의한 영향을 주지 않았다. 모든 이동은 25℃에서 이동 완충제로서 HBS-EP 완충제를 사용하여 수행하였다. 데이터는 비아코어™ A100을 사용하여 생성하고, 그의 내재하는 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 정제된 샘플로부터의 운동학을 1:1 결합 모델에 피팅하고, 상청액 오프율은 1:1 해리 모델을 사용하여 및/또는 모 분자에 비해 각각의 샘플의 결합 수준 및 안정성 수준을 사용하여 분석하였다.
시험된 클론 중에서, 표 11에 나타낸 바와 같이 모 DOM23h-271 dAb에 비해 개선된 오프율을 갖는 46개의 클론이 확인되었다. 돌연변이 D61R 및 D61K는 위치 64에서의 돌연변이와 무관하게 결합을 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 많은 조합은 원래의 D61N, K64R 돌연변이보다 양호한 것으로 보였고, 이들은 RE, RM, RF 및 RY를 포함하였다.
개선된 오프율을 갖는 선택된 돌연변이체를 정제하고, 그 친화도를 결정하기 위해 전체 비아코어™ A100 운동학 분석에 적용하였다 (표 10). 또한, 돌연변이체의 열 안정성도 시프로(SYPRO)™ 오렌지 (Orange) (인비트로겐)의 존재 하에 용융 프로파일의 생성에 의해 결정하였다. 간단히 설명하면, 정제된 dAb를 PBS 내의 시프로™ 오렌지의 1:500 희석액 내에 50 및 100 ㎍/ml로 희석하고, 미니 옵티콘(Mini OPTICON)™ PCR 기기 (바이오라드 (BioRad))에서 30-90℃ 용융 곡선에 적용하였다. 주요 양성 전이의 Tm을 각각의 농도에서 결정하고, 비교를 위한 융용 온도의 지표로서 1 mg/ml의 추정된 Tm 값을 계산하기 위해 사용하였다 (표 10).
Tm에 대한 영향이 작으면서 양호한 친화도 개선을 갖기 때문에 돌연변이 D61R, K64D 및 D61R, K64F를 선택하였다. 이들 돌연변이를 dAb DOM23h-271-39 (서열 37) 및 DOM23h-271-40 (서열 38)을 만들기 위해 친화도 성숙된 DOM23h-271 유도체 DOM23h-271-22 (서열 30)로 옮겼다. 상기 돌연변이는 뮤린 TGFbRIIFC와의 교차 반응성을 비롯한, 비아코어™에 의한 친화도의 향상, 및 셀 센서 검정에 의한 향상된 효능을 제시하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 돌연변이는 또한 DSC에 의해 측정시에 Tm을 감소시키고 SEC MALLS에 의해 측정시에 PBS 내의 dab의 응집을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 이들 검정은 SEC MALLS를 위한 완충제가 0.4 M NaCl, 0.1 M 인산나트륨 및 10% 이소프로판올 pH 7인 것을 제외하고는 상기 설명된 바와 같이 수행하였다. 이들 결과를 표 12에 요약한다 (인간 셀 센서 검정 및 마우스 3T3 루시퍼라제 검정에 대한 평균 값이 제시된다).
본 실시예에 언급된 dab의 서열을 아래에 제시한다:
Figure 112013070489309-pct00032
Figure 112013070489309-pct00033
Figure 112013070489309-pct00034
Figure 112013070489309-pct00035
실시예 8. 계통 DOM23h -439-20, DOM23h -843-13, DOM23h -855-21 및 DOM23h -271-50의 CDR 다양화에 의한 친화도 성숙
도메인 항체 DOM23h-855-21 (서열 204) 및 DOM23h-843-13 (서열 206)은 실시예 5에서 상세히 설명된 바와 같이 각각 나이브 클론 DOM23h-855 (서열 13) 및 DOM23h-843 (서열 10)에 대해 수행된 실수 유발 친화도 성숙으로부터 단리되었다. 도메인 항체 DOM23h-439는 WO 2011/012609에 설명된 선행 선택 캠페인에서 파지 라이브러리로부터 단리되었고, 후속적으로 변이체 DOM23h-439-20 (서열 208)은 실시예 5에서 상세히 설명된 바와 같이 실수 유발 친화도 성숙에 의해 단리되었다. 도메인 항체 DOM23h-271-50 (서열 214)은 실시예 6에서 상세하게 설명된 바와 같이 CDR-지정 (directed) 친화도 성숙 변이체 DOM23h-271-22 (서열 30)의 CDR3 재-다양화에 의해 생성되었다. DOM23h-855-21, DOM23h-843-13, DOM23h-439-20 및 DOM23h-271-50은 모두 그들의 결합 운동학, SBE-bla HEK 293T 셀 센서 검정에서의 효능, 서열 및 생물리학적 거동을 기초로 하여 추가의 친화도 성숙을 위해 선택하였다. 친화도 성숙은 CDR을 재다양화하기 위해 변성 돌연변이유발을 사용하여 수행하고, 개선된 리드는 파지 디스플레이를 이용하여 확인하였다. 다양성은 도핑된 또는 NNK 라이브러리의 제작에 의해 CDR 내로 도입되었다.
DOM23h-271-50을 NNK 라이브러리 (포화 돌연변이유발)를 사용하여 친화도 성숙시키고, 각각의 CDR을 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하고, 각각의 프라이머 내에서 5개의 아미노산에 대한 코돈을 NNK 코돈으로 교체하여 5개의 위치를 동시에 다양화하였다. 각각의 CDR 내의 모든 표적화되는 아미노산, 즉 CDR1의 경우 1개, CDR2의 경우 2개 및 CDR3의 경우 3개를 포함하기 위해 단일 또는 다수의 올리고뉴클레오티드를 사용하였다. CDR-지정 친화도 성숙은 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여 달성하고; 상보성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 각각의 돌연변이된 CDR을 포함하는 서열 단편, 및 또한 dAb 코딩 서열의 나머지를 포함하는 중첩되는 서열 단편을 증폭하기 위해 사용하였다. 이들 단편을 혼합하고, 스플라이스 연장 중첩 PCR에 의해 회합시켜 전장 dAb 코딩 서열을 생산하였다. 상기 생성물을 프라이머 PelB NcoVh (서열 210) 및 PEP044 (5'-GGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCGGCCGCATAATAAGAATTCA-3' 서열 215)를 사용하여 PCR 증폭하고, NcoI 및 NotI으로 소화하고, NotI 및 NcoI 소화된 pDOM4-gene3-pelB 하이브리드 벡터 내로 결찰하였다. pDOM4-gene3-pelB 하이브리드 벡터는 상기 설명된 pDOM4 벡터의 변형된 버전이지만, GAS 리더 서열을 pelB (펙테이트 리아제 B) 신호 펩티드로 교체하도록 변형되었다.
도메인 항체 DOM23h-855-21, DOM23h-843-13 및 DOM23h-439-20을 도핑된 라이브러리를 사용하여 친화도 성숙시켰다. 도핑된 라이브러리를 본질적으로 상기하고 WO2006018650에 설명된 바와 같이 제작하였다. 단일 축퇴성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 각각의 CDR 내의 모든 돌연변이를 포함하기 위해 사용하였다. 각각의 프라이머 내의 다양화되는 아미노산은 다수의 아미노산을 코딩하기 위해 축퇴성 코돈을 사용하여 명시되었다. 다음 축퇴성 코돈을 사용하였다: 'a' = 85% A + 5% T + 5% G + 5% C; 'g' = 85% G + 5% T + 5% C + 5% A; 'c' = 85% C + 5% T + 5% G + 5% A; 't' = 85% T + 5% A + 5% G + 5% C; 'S' = 50% G 및 50% C. 대문자는 100%의 명시된 뉴클레오티드를 나타낸다. DOM23h-439-20 도핑된 라이브러리에 대해 위치 100에 페닐알라닌을 포함하도록 CDR1 내의 5개의 아미노산, CDR2 내의 6개의 아미노산 및 CDR3 내의 11개의 아미노산이 다양화되었다. DOM23h-855-21 도핑된 라이브러리에 대해 CDR1 내의 5개의 아미노산, CDR2 내의 7개의 아미노산 및 CDR3 내의 8개의 아미노산이 다양화되었다. DOM23h-843-13 도핑된 라이브러리에 대해 CDR1 내의 5개의 아미노산, CDR2 내의 6개의 아미노산 및 CDR3 내의 8개의 아미노산이 다양화되었고, CDR3 앞의 위치 94도 코돈 VRK를 도입함으로써 다양화되었다. 각각의 dAb에 대해, 4개의 도핑된 라이브러리를 제작하였고, 여기서 하나는 CDR1, 다른 하나는 CDR2를, 또 다른 하는 CDR3을 다양화하고, 제4 라이브러리는 모든 CDR이 다양화된 경우를 위한 것이었다. 축퇴성 라이브러리 프라이머를 삼중체 프라이머와 동일한 방식으로 사용하였다. 각각의 다양화된 CDR을 따로 증폭시킨 후, 스플라이스 연장 중첩을 이용하여 모 서열 단편과 조합하고, 전장 생성물을 프라이머 PelB NcoVh (서열 210) 및 DOM173 (서열 188)을 사용하여 증폭하였다. 단편을 NcoI 및 NotI을 사용하여 pDOM4-gene3-pelB 하이브리드 벡터에 서브클로닝하였다.
축퇴성 프라이머 서열:
Figure 112013070489309-pct00036
Figure 112013070489309-pct00037
파지 디스플레이:
별개의 CDR1, CDR2, CDR3 및 조합된 CDR1, 2 및 3 풀 내의 NNK 또는 도핑된 라이브러리를, 실시예 1에서 이전에 첨가된 인간 IgG Fc 단편을 생략하고 차단 단계를 최소 20분 동안 수행한 것을 제외하고는 실시예 1에 기재된 바와 같이 100 nM, 10 nM, 1 nM, 1 nM, 0.1 nM 및 0.1 nM (각각 라운드 1, 2, 3, 4, 5 및 6) 비오티닐화된 단량체 인간 TGF-β RII 항원에 대해 적어도 6회의 선택 라운드에 적용하였다. 선택 라운드 4 및 6에서 경쟁자는 100 nM 비-비오티닐화된 항원과 함께 30 min 동안의 인큐베이션에 의해 도입한 후 (라운드 4 및 6), 표지된 항원과 함께 인큐베이션 단계를 수행하였다. DOM 23h-439-20 (CDR1, CDR3 및 조합된 풀) 및 DOM 23h-855-21 (CDR3)에 대해, 제7 선택 라운드를 0.1 nM 비오티닐화된 단량체 인간 TGF-β RII 항원 및 100 nM 경쟁자에 대해 120 min 동안 또는 20 pM 비오티닐화된 단량체 인간 TGF-β RII 항원 및 100 nM 경쟁자에 대해 30 min 동안 수행하였다. 파지를 파지 감염된 TG1 세포의 밤새 배양액을 30분 동안 4000 g에서 원심분리함으로써 선택 라운드들 사이에서 증폭하였다. 증폭된 파지를 함유하는 40 ml의 상청액을 10 ml의 PEG/NaCl (20% v/w PEG 8000 + 2.5M NaCl)에 첨가하고, 얼음 상에서 60분 동안 인큐베이팅하였다. 샘플을 40분 동안 4000 g에서 원심분리하여 침전된 파지를 펠렛화하였다. 상청액을 버리고, 파지 펠렛을 1 ml 15% v/v 글리세롤/PBS 내에 재현탁하였다. 파지 샘플을 2 ml 에펜도르프 튜브에 옮기고, 10분 동안 원심분리하여 임의의 남아있는 세균 세포 파편을 제거하였다. 파지 선택으로부터 다양화된 도메인 항체 Vh 유전자를 프라이머 PEP011VHStopNotIR (5'-CCCTGGTCACCGTCTCGAGCTAATAGGCGGCCGCGAATTC-3' (서열 231) 및 Nco1 VH F (5'-TATCGTCCATGGCGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGG-3' (서열 232)를 사용하여 PCR 증폭하고, NcoI 및 NotI 제한 엔도뉴클레아제로 소화하고, 또한 NcoI 및 NotI으로 소화된 pC10 벡터에 결찰하였다. pC10은 pUC119 벡터를 기재로 한 플라스미드 벡터이고, dAb의 가용성 발현을 위해 설계된 향상된 LacZ 프로모터의 제어 하에 발현된다. dAb의 상청액 내로의 발현은 N-말단 단부에서 dAb 유전자의 pelB 신호 펩티드에 대한 융합에 의해 가능하다. 결찰 생성물을 화학적으로 적격성 (competent)인 이. 콜라이 HB2151 세포 내로 형질전환시키고, 100 ㎍/ml의 카르베니실린을 보충한 영양분 아가 플레이트에 플레이팅하였다. 개별 클론을 선발하여 96-웰 플레이트 내에서 100 ㎍/ml 카르베니실린을 보충한 밤새 발현 자가-유도 배지 (고수준 단백질 발현 시스템, 노바겐)에서 발현시키고, 30℃에서 66시간 동안 또는 37℃에서 24시간 동안 250 rpm에서 진탕하면서 성장시켰다. 이어서, 플레이트를 3500 g에서 15분 동안 원심분리하고, 상청액을 0.45 μ 필터 플레이트 (밀리포어 (Millipore))를 사용하여 여과하였다. 도메인 항체를 함유하는 상청액을 오프율 (Kd)를 결정하기 위해서 인간 TGF-β RII 및 인간 TGF-β RII/Fc에 대해 비아코어™ B4000으로 스크리닝하였다 (데이터 미제시). 비오티닐화된 항원을 제조자의 지시에 따라 SA 칩 상에 포획하고, 25℃에서 HBS-EP 완충제를 사용하여 분석을 수행하였다. 샘플을 30 ㎕/min의 유량으로 비아코어™에서 이동시켰다. 칩의 재생은 낮은 pH에서 글라이신을 사용하여 수행하였다. 해리 상을 소프트웨어에 내재하는 1:1 해리 모델에 피팅함으로써 데이터 (제시하지 않음)를 오프율에 대해 분석하고, 발현 수준을 추정하기 위해 단백질 A 결합에 대해 상청액을 또한 분석하였다. 모 항체에 비해 개선된 오프율을 갖는 도메인 항체를 추가의 연구를 위해 선택하였다. 개선된 클론을 250 rpm에서 진탕하면서 100 ㎍/ml 카르베니실린 및 소포제 (시그마)를 보충한 밤새 발현 자가유도 배지 (오넥스™, 노바겐)에서 30℃에서 48 내지 72시간 동안 발현시켰다. 배양액을 원심분리하고 (4,200 rpm, 40분), 상청액을 스트림라인™-단백질 비드 (아머샴 바이오사이언시스, 지이 헬쓰케어™, 영국. 결합 용량: 5 mg의 dAb/비드의 ml)와 함께 4℃ 또는 실온에서 적어도 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 비드로 크로마토그래피 컬럼을 채우고, PBS, 이어서 10 mM 트리스-HCl pH 7.4 (시그마, 영국)로 세척하였다. 결합된 dAb를 0.1 M 글라이신-HCl pH 2.0으로 용리하고, 1 M 트리스-HCl pH 8.0으로 중화하였다. dAb의 280 nm에서의 OD를 측정하고, 단백질 농도를 dAb의 아미노산 조성으로부터 계산된 흡광 계수를 사용하여 결정하였다. 친화도 성숙된 도메인 항체를 그의 친화도 및 효능을 결정하기 위해 비아코어™ T200 (2개의 바람직한 dAb에 대한 데이터를 실시예 9에 제시한다) 및 SBE-bla HEK 293T 셀 센서 검정 (2개의 바람직한 dAb에 대한 데이터를 실시예 11에 제시한다)에서 시험하였다. 열 안정성 및 용액 상태를 비롯한 생물리학 특성을 시차 주사 열량측정법 (DSC) 및 다각도-레이저-광 산란을 갖는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC-MALS)를 사용하여 결정하였다 (2개의 바람직한 dAb에 대한 데이터를 실시예 10에 제시한다).
친화도 성숙된 DOM23h-439-20 및 DOM23h-271-50 항-인간 TGFRII dAb의 아미노산 및 핵산 서열
Figure 112013070489309-pct00038
Figure 112013070489309-pct00039
상기 항-인간 TGFRII dAb 친화도 리드의 카바트에 의해 규정된 CDR을 표 13에 제시한다.
Figure 112013070489309-pct00040
DOM23h -439-25 및 DOM23h -271-123 뉴클레오티드 서열의 추가의 변형
실시예 7에 기재된 바와 같은 D61N 및 K64R 돌연변이를 조합하여 또는 따로 DOM23h-439-25, DOM23h-271-123 및 DOM23h-271-129 친화도 성숙된 dAb 내에 도입하였다. 효능의 개선을 부여할 수 있는지를 결정하기 위해서 DOM23h-439-25 및 DOM23h-271-123 dAb 내의 V48I 돌연변이의 도입을 또한 시험하였다. 카바트 위치 48에서의 자발적 돌연변이는 시험 성숙 및 CDR-지정 친화도 성숙 둘 모두 후에 DOM23h-439 계통으로부터 많은 개선된 dAb에서 관찰되었다. 카바트 잔기 113 바로 다음의 Vh 영역의 C-말단에서의 알라닌이 또한 DOM23h-439-25, DOM23h-271-123 및 DOM23h-271-129 및 상기 언급된 돌연변이를 갖는 상기 dAb의 모든 변이체에 부가되었다. 돌연변이는 본질적으로 실시예 7에 기재된 바와 같이 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 사용한 중첩 연장에 의해 DOM23h-439-25 (서열 234), DOM23h-271-123 (서열 236) 및 DOM23h-271-129 (서열 240) 백본 내로 도입되었다. 뉴클레오티드 서열 내의 특이적 돌연변이는 뉴클레오티드 변화를 중첩 올리고뉴클레오티드 프라이머 내에 포함함으로써 도입되었고, Vh 영역의 끝에 알라닌의 삽입은 카바트 위치 113 다음에 알라닌 잔기를 포함시키기 위해 설계된 3' 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써 달성되었다.
돌연변이를 도입하기 위해 다음 올리고뉴클레오티드를 사용하였다 (돌연변이된 잔기는 밑줄로 표시함):
Figure 112013070489309-pct00041
돌연변이의 효과를 결정하기 위해, dAb를 100 ㎍/ml 카르베니실린 및 소포제 (시그마)를 보충한 TB 오넥스™ 내에서 250 rpm에서 진탕하면서 30℃에서 72시간 동안 발현시켰다. 배양액을 원심분리하고 (4,200 rpm에서 40분 동안), dAb를 상기한 바와 같이 스트림라인™-단백질 비드 (아머샴 바이오사이언시스, 지이 헬쓰케어™, 영국)를 사용하여 친화도 정제하였다. 도메인 항체 변이체의 친화도 및 효능을 비아코어™ T200 (바람직한 dAb에 대한 데이터를 실시예 9에 제시한다)으로 및 SBE-bla HEK 293T 셀 센서 검정 (바람직한 dAb에 대한 데이터를 실시예 11에 제시한다)으로 결정하였다.
C-말단 알라닌 및 D61N, K64R 또는 V48I 돌연변이를 포함하도록 변형된 DOM23h-439-25 (서열 234) 및 DOM23h-271-123 (서열 236) 항-인간 TGFRII dAb의 아미노산 및 핵산 서열을 아래에 제시한다:
Figure 112013070489309-pct00042
Figure 112013070489309-pct00043
Figure 112013070489309-pct00044
Figure 112013070489309-pct00045
Figure 112013070489309-pct00046
Figure 112013070489309-pct00047
실시예 9. 친화도 성숙된 도메인 항체의 비아코어 운동학 분석
항-인간 IgG를 제조자의 지시에 따라 1급 아민 커플링에 의해 비아코어 CM4 칩 상에 고정시켰다. 인간 TGF-β RII/Fc, 시노몰거스 TGF-β RII/Fc 또는 인간 Fc 단편은 상기 표면 상에 포획되었다. 도메인 항체를 100, 10 및 1 nM (DOM23h-439 dAb) 또는 100, 25 및 6.25 nM (DOM23h-271 dAb)의 3가지 농도에서 2개의 포획된 수용체 상에 통과시켰다. 단지 100 nM 농도의 각각의 dab만이 인간 Fc 단편 상을 통과하여 세포외 TGF-β RII 도메인에 대한 결합의 특이성을 확인해 주었다. 포획된 항원 표면 상의 완충제의 주사를 이중 참조를 위해 사용하였다. 포획된 표면을 3 M 염화마그네슘 용액을 사용한 각각의 도메인 항체 주사 후에 재생하였고; 재생은 포획된 항원을 제거하였지만, 후속적인 사이클에서 항원을 포획하는 표면의 능력에 유의한 영향을 주지 않았다. 모든 이동은 25℃에서 이동 완충제로서 HBS-EP 완충제를 사용하여 수행하였다. 데이터는 비아코어™ T200을 사용하여 생성하고, 소프트웨어에 내재하는 1:1 결합 모델에 피팅하였다. 표 14는 시험된 dAb의 결합 운동학을 보여준다. DOM23h-271 dAb 및 DOM23h-439 계통을 별개의 실험에서 이동시켰다.
실시예 10. 친화도 성숙된 dAb 의 생물리학 평가
dAb의 열 안정성을 시차 주사 열량측정기 (DSC)를 사용하여 결정하였다. dAb를 PBS 내로 밤새 투석하고, 1 mg/ml의 최종 농도로 조정하였다. 투석 완충제를 모든 샘플에 대한 참조물로서 사용하였다. DSC는 모세 셀 미세열분석기 VP-DSC (지이 헬쓰케어/마이크로칼 (Microcal))를 사용하여 180℃/시간의 가열 속도에서 수행하였다. 전형적인 스캔 범위는 참조 완충제 및 단백질 샘플 모두에 대해 20-90℃이었다. 각각의 참조 완충제 및 샘플이 쌍을 형성한 후에, 모세 셀을 물 중 5% 데콘 (피셔-사이언티픽)의 용액으로, 이어서 PBS로 세정하였다. 생성되는 데이터 트레이스를 오리진 7.0 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 참조 완충제로부터 얻어진 DSC 트레이스를 샘플 트레이스로부터 공제하였다. 샘플의 정확한 몰 농도를 데이터 분석 루틴에 입력하여 용융 온도에 대한 값 (Tm), 엔탈피 (ΔH) 및 반트호프 엔탈피 (ΔHv) 값을 얻었다. 데이터를 비-2-상태 모델에 피팅시켰다. 최상의 피트 및 종속 값은 1 또는 2 전이 사건을 이용하여 얻어졌다. 또한, 개시 (on-set) 비폴딩 온도는 제로로부터 각각의 샘플 온도기록도를 적분함으로써 결정되었다. 이어서, 상기 값은 4%의 샘플이 비폴딩된 온도로서 결정되었다.
<표 14A>
Figure 112013070489309-pct00049
다각도 -레이저-광 산란을 갖는 크기 배제 크로마토그래피 ( SEC - MALLS )에 의한 용액 상태의 분석
dAb가 용액 내에서 단량체성인지 보다 고차 올리고머를 형성하는지 결정하기 위해, 이들을 SEC-MALLS (다각도-레이저-광 산란을 갖는 크기 배제 크로마토그래피)에 의해 분석하였다. 오토샘플러 및 UV 검출기 (엠파워 소프트웨어에 의해 제어됨)가 설치된 애질런트 1100 시리즈 HPLC 시스템을 와이엇 미니 돈 트레오스 (레이저 광산란 (LS) 검출기) 및 와이엇 옵티랩 rEX DRI (시차 굴절률 (RI) 검출기)에 연결하였다. 검출기는 다음 순서로 연결하였다: -UV-LS-RI. RI 및 LS 기기는 모두 658 nm의 파장에서 작동하고; UV 신호는 280 nm 및 220 nm에서 모니터링하였다. 도메인 항체 (PBS 내의 1 mg/mL의 농도에서 50 마이크로리터 주사)를 TSK2000 컬럼을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 그들의 유체역학적 특성에 따라 분리하였다. 이동상은 0.2 M NaCl, 0.1 M NaP04, 15% n-프로판올이었다. 단백질이 검출기를 통과하는 동안 산란된 광의 강도는 각도의 함수로서 측정하였다. RI 검출기를 사용하여 결정된 단백질 농도와 함께 상기 측정치는 적절한 식 (분석 소프트웨어 아스트라 v.5.3.4.14의 구성 요소)을 사용한 몰 질량의 계산을 허용하였다. 단량체 비율로서의 용액 상태를 표 15에 제시한다.
Figure 112013070489309-pct00050
실시예 11. SBE - bla HEK 293T 셀 센서 검정에서 친화도 성숙된 dAb 에 의한 TGF β- RII 억제
검정은 실시예 4, 검정 h2에서 개략된 바와 같이 동일하게 수행하였다.
표 16에 요약한 값의 평균 및 범위를 얻기 위해 검정을 수회 수행하였다. 산술 평균 IC50은 로그 IC50을 사용하여 계산하고, 범위는 평균 IC50으로부터 로그 표준 편차를 더하고 공제한 후, IC50으로 역변환시킴으로써 계산하였다. 검정 QC 파라미터가 충족되었고; 로버스트 Z 인자는 0.4보다 크고, TGF-β EC80은 검정에 첨가된 농도의 6배 이내에 있었다. 그 결과를 표 16에 제시한다.
Figure 112013070489309-pct00051
서열 일치 표
Figure 112013070489309-pct00052
Figure 112013070489309-pct00053
Figure 112013070489309-pct00054
Figure 112013070489309-pct00055
Figure 112013070489309-pct00056
Figure 112013070489309-pct00057
Figure 112013070489309-pct00058
SEQUENCE LISTING <110> BEATON, Andrew DIMECH, Caroline ERTL, Peter F. FORD, Susannah MCADAM, Ruth <120> LIGANDS THAT BIND TGF-BETA RECEPTOR I <130> PB64388 <150> 61/430,235 <151> 2011-01-06 <160> 291 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 1 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Glu Gly 20 25 30 Thr Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Leu Ala Ala Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Lys Arg Gln Glu Arg Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 2 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Gly 20 25 30 Arg Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Arg Asp Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys His Asp Asp Gly His Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 3 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Thr Asp Asp 20 25 30 Arg Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Gln Pro Asp Gly His Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Glu 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cacctttgat caggatcgga tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagct attgagagtg gtggtcatag gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacagaat 300 gagtcggggc gttcgggttt tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360 <210> 49 <211> 357 <212> DNA <213> Artifificla Sequence <400> 49 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgat gcggctagga tgtggtgggc ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagcg attgcggata ttggtaatac tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacagtct 300 ggttcggagg atcattttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 50 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <400> 50 gaggtgcagc tgttggagtc cgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgct caggatcgga tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacaggat 300 ttgcatggta ctagttcttt gtttgactac tggggtcagg gaaccctggt caccgtctcg 360 agc 363 <210> 51 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <400> 51 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag aatacgagta tgggttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacgt attgatccta agggtagtca tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa tacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacagcgt 300 gagttgggta agtcgcattt tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360 <210> 52 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <400> 52 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc 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gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttact agttatcgta tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagtt attgattcta ctggttcggc tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacagcag 300 gctgggagtg cgatggggga gtttgactac tggggtcagg gaaccctggt caccgtctcg 360 agc 363 <210> 55 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <400> 55 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aattatcgta tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagct attagtggta gtggtgataa gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacatggg 300 ctgtcgtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 56 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <400> 56 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttaat gatatgagga tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagtg attaatgctg atggtaatag gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaagatggg 300 ctgccttttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 57 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <400> 57 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttacg acttatggta tgggttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatgg attgagaaga cgggtaataa gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagcgggg 300 aggcatatta aggtgcgttc gagggatttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360 gtctcgagc 369 <210> 58 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <400> 58 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttaag aggtattcta tgggttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagtt attaatgatc tgggtagttt gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagggaat 300 attagtatgg tgaggccggg gagttggttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360 gtctcgagc 369 <210> 59 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <400> 59 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttttt gagtatccta tgggttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagtt attagtgggg atggtcagcg gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaagtcat 300 acggggactg tgaggcatct ggagacgttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360 gtctcgagc 369 <210> 60 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <400> 60 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttggt caggagagta tgtattgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaagtggt 300 acgcggatta agcagggttt tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360 <210> 61 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <400> 61 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttatg gattatagga tgtattgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaggg attgatccta ctggtttgcg gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaattaag 300 tggggggaga tggggagtta taagactttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360 gtctcgagc 369 <210> 62 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <400> 62 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttatg gattatgata tgagttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaatg attcgtgagg atggtggtaa gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagcgagg 300 gtgccttatc ggcgtgggca tagggataat tttgactact ggggtcaggg aaccctggtc 360 accgtctcga gc 372 <210> 63 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <400> 63 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cttccggatt cacctttgag ccggttatta tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagct attgaggcgc ggggtggggg gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacctggg 300 cggcatctta gtcaggattt tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360 <210> 64 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <400> 64 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgat cggtatcgta tgatgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg attgatcctg ctggtatgct tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaaggctg 300 gcttcgcgga gtcattttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 65 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <400> 65 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgcgcag cctccggatt caccttttct gagtatgata tggcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtcttgagtg ggtctcacgg attcgttctg atggtgttag gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagatcgt 300 gctaagaatg gttggtttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 66 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <400> 66 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgat aagtataaga tggcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctggagtg ggtctcactt atttttccga atggtgttcc tacatactac 180 gcaaactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaatatagt 300 ggtcaggggc gggattttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 67 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <400> 67 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttacc gagtatagga tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccggggaagg gtctcgagtg ggtctcagcg attgagccga ttggtaatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacagatg 300 ccgggccgga agtggacggc caagttccgc tgggactact ggggtcaggg aaccctggtc 360 atcgtctcga gc 372 <210> 68 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <400> 68 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttacg gagtatagga tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccggggaagg gtctcgagtg ggtctcagcg attgagccga ttggtaatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacagatg 300 cccggccaga agtggatggc caagtcccgc ttcgactact ggggtcaggg aaccctggtc 360 accgtctcga gc 372 <210> 69 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <400> 69 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttacg gagtatagga tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctcgagtg ggtctcagcg attgagccga ttggtcagaa gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacagatt 300 ccggggcgta agtggactgc taattcgcgg tttgactact ggggtcaggg aaccctggtc 360 atcgtctcga gc 372 <210> 70 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <400> 70 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttacg gagtatagga tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccggggaagg gtctcgagtg ggtctcagcg attgagccga ttggtaatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacagatt 300 ccggggcgta agtggactgc taatggtcgt aaggactact ggggtcaggg aaccctggtc 360 accgtctcga gc 372 <210> 71 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <400> 71 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 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accgtctcga gc 372 <210> 203 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <400> 203 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag aatacgagta tgggttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacgt attgatccta agggtagtca tacatactac 180 acagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa tacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacagcgt 300 gagttgggta agtcgtattt tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360 <210> 204 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 204 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Asn Thr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Asp Pro Lys Gly Ser His Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 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agtgggtctc agcsattgag tcsggsggtc atcgsacata ctacgcagac 60 tccgtg 66 <210> 221 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <400> 221 accgcggtat attactgtgc gvrkcagaat aagtcsggsc gstcsggstt tgactactgg 60 ggtcaggga 69 <210> 222 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <400> 222 gcagcctccg gattcacctt tgagaatacs tcsatgggst gggtccgcca ggctccaggg 60 <210> 223 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <400> 223 aagggtctag agtgggtctc acgsattgat ccsaagggtt cscatacata ctacacsgac 60 tccgtgaagg gccggttcac c 81 <210> 224 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <400> 224 gcggtatatt actgtgcgaa acagcgsgag ctsggsaagt cstaytttga ctactggggt 60 caggga 66 <210> 225 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <220> <221> misc_feature <222> 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 37, 38 <223> n = A,T,C or G <400> 225 gcagcctccg 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acid sequence <220> <221> misc_feature <222> 34, 35, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 46, 47 <223> n = A,T,C or G <400> 229 accgcggtat attactgtgc gaaacagaag cccnnknnkn nknnknnkgc cgtgggccgc 60 ttggactact ggggtcaggg 80 <210> 230 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <220> <221> misc_feature <222> 46, 47, 49, 50, 52, 53, 55, 56, 58, 59 <223> n = A,T,C or G <400> 230 accgcggtat attactgtgc gaaacagaag cccggccaga agtggnnknn knnknnknnk 60 ttggactact ggggtcaggg 80 <210> 231 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <400> 231 ccctggtcac cgtctcgagc taataggcgg ccgcgaattc 40 <210> 232 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <400> 232 tatcgtccat ggcggaggtg cagctgttgg agtctgg 37 <210> 233 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <400> 233 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttggg acggagcaga tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtt tgtctcacgt attgattcgc ctggtgggag gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacggcga 300 cccacggggg tgtccgggac gttttatgac tactggggtc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcgagc 366 <210> 234 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 234 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Thr Glu 20 25 30 Gln Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val 35 40 45 Ser Arg Ile Asp Ser Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Arg Arg Pro Thr Gly Val Ser Gly Thr Phe Tyr Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 235 <211> 372 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sequence <400> 240 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Arg Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Glu Pro Ile Gly His Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gln Ala Pro Asn Gln Arg Tyr Val Ala Arg Gly Arg Leu Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 241 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 241 Gly Ser Thr Phe Thr Glu Tyr Arg Met Trp 1 5 10 <210> 242 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 242 Ala Ile Glu Pro Ile Gly His Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 243 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 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sequence <400> 287 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Arg Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Glu Pro Ile Gly His Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gln Ala Pro Asn Gln Arg Tyr Val Ala Arg Gly Arg Leu Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 125 <210> 288 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <400> 288 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttggg acggagcaga tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtt tatttcacgt attgattcgc ctggtgggag gacatactac 180 gcaaactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacggcga 300 cccacggggg tgtccgggac gttttatgac tactggggtc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcgagcgcg 369 <210> 289 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 289 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Thr Glu 20 25 30 Gln Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Ile 35 40 45 Ser Arg Ile Asp Ser Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Arg Arg Pro Thr Gly Val Ser Gly Thr Phe Tyr Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210> 290 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence <400> 290 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttggg acggagcaga tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtt tatttcacgt attgattcgc ctggtgggag gacatactac 180 gcaaactccg tgcgtggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacggcga 300 cccacggggg tgtccgggac gttttatgac tactggggtc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcgagcgcg 369 <210> 291 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence <400> 291 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Thr Glu 20 25 30 Gln Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Ile 35 40 45 Ser Arg Ile Asp Ser Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Arg Arg Pro Thr Gly Val Ser Gly Thr Phe Tyr Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120

Claims (31)

  1. 서열 267의 아미노산 서열을 갖는 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인.
  2. 제1항에 있어서, 인간 TGF베타RII에 결합하는 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인.
  3. 제2항에 있어서, 마우스 TGF베타RII 및/또는 시노 (cyno) TGF베타RII에 또한 결합하는 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인.
  4. 제1항에 있어서, TGF베타 활성을 중화하는 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인.
  5. 제1항에 있어서, TGF베타RII에 대한 TGF베타의 결합을 억제하는 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인.
  6. 제1항에 있어서, CH2 및 CH3 도메인 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 항체 Fc 영역 및 임의로 힌지 영역에 연결된 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인을 포함하며 TGF베타RII에 결합하는 단리된 폴리펩티드.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 또는 이를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  9. 제8항에 있어서, 서열 266의 핵산 분자를 포함하는 단리된 핵산 분자.
  10. 제9항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  11. 제9항에 따른 핵산 분자 또는 이를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 또는 이를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를, 상기 핵산 분자 또는 벡터의 발현에 적합한 조건 하에 유지시켜서 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 생산하는 단계
    를 포함하는, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 생산 방법.
  13. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 또는 이를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, 암, 조직 섬유증; 간 섬유증; 류마티스 관절염; 안구 장애; 피부의 섬유증; 신장 섬유증; 상처 치유; 또는 혈관 병태의 치료를 위한 제약 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 간경변증, 만성 간염, 피부의 켈로이드, 뒤퓌트랑 구축 (Dupuytren's Contracture), 신염, 신경화증 또는 재협착의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
  15. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 또는 이를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, 종양 혈관신생에서 TGF베타 신호전달을 조정함으로써 암의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
  16. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항-TGF베타RII 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 또는 이를 포함하는 폴리펩티드, 및
    상기 이뮤노글로불린 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드를 피부에 적용하기 위한 장치
    를 포함하는, 암, 조직 섬유증; 간 섬유증; 류마티스 관절염; 안구 장애; 피부의 섬유증; 신장 섬유증; 상처 치유; 또는 혈관 병태의 치료를 위한 키트.
  17. 제16항에 있어서, 장치가 피내 전달 장치인 키트.
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