CN103443126A - 结合TGFβ受体II的配体 - Google Patents

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Abstract

本文提供一种抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域。适宜地，依照本文的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域具有如SEQ ID NO:1-38、204、206、208、214、234、236、238、240、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289或291的任意一个中所列出的氨基酸序列，该序列有最多5个氨基酸取代、缺失或添加。本文还提供用于治疗与TGFβ信号传导相关的疾病和适宜地选自下组的疾病的多肽和药物组合物：组织纤维化，如肺纤维化，包括特发性肺纤维化；肝纤维化，包括肝硬化和慢性肝炎；类风湿性关节炎；眼部病症；皮肤的纤维化，包括皮肤的瘢痕疙瘩；杜普伊特伦氏挛缩；肾纤维化如肾炎和肾硬化；伤口愈合；减少疤痕；以及血管疾患，如再狭窄。

Description

结合TGFβ受体II的配体
发明背景
转化生长因子-β(TFGβ；TGFβ(TGF-β))是通过结合TGFβ受体(TGFβR；TGFβR(TGF-βR))介导信号转导进入细胞的一种信号传导分子。TGFβ信号传导活性调节细胞分化和生长，其作用性质(即作为细胞生长促进剂、生长抑制剂或其它细胞功能的诱导剂)依赖于细胞类型(参见Roberts等，Thetransforming growth factor-betas，Peptide Growth Factors and Their Receptors，Part I，Sporn，M.B.& Roberts，A.B.编，Springer-Verlag，Berlin，1990，第419-472页)。
TGFβ由多种细胞类型产生，且其关联受体在很多种器官和细胞中表达(参见Shi和Massague，Cell，第113卷，第6期、2003年6月13日，第685-700页；Biol.Signals.，第5卷，第232页，1996和Pulmonary Fibrosis，Lung Biologyin Health and Disease Series第80卷，Phan等编，第627页，Dekker，New York，1995)。已鉴定出TGFβ受体分为3种类型：TGFβRI(TGFβRI)(TGFβI型受体(Franzen等，Cell，第75卷，No.4，第681页，1993；GenBank登录号：L11695))；TGFβRII(TGFβRII)(TGFβII型受体(Herbert等，Cell，第68卷，No.4，第775页，1992；GenBank登录号：M85079))和TGFβRIII(TGFβIII型受体(Lopez-Casillas，Cell，第67卷，No.4，第785页，1991；GenBank登录号：L07594))。已显示TGFβRI和TGFβRII是TGF-β的信号转导所必要的(Laiho等，J.Biol.Chem.，第265卷，第18518页，1990和Laiho等，J.Biol.Chem.，第266卷，第9108页，1991)，但不认为TGFβRIII是必要的。
通过TGFβ对TGFβRI和RII两者的结合来介导TGFβ信号传导。当配体结合胞外配体结合域时，使这两种受体联合，从而允许RII磷酸化RI并经由Smad蛋白的磷酸化开始信号传导级联(参见前引Shi和Massague)。
已经在哺乳动物中鉴定出TGFβ的3种同等型：TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3。每种同等型均为多功能的，并且以自调节反馈机制作用来控制对发育过程的生物利用度(bioavailability)并维持组织内稳态(如在ten Dijke和Arthur，NatureReviews，Molecular Cell Biology，第8卷，Nov.2007，第857-869页中综述的)。通过经由TGFβ表达以及经由结合蛋白聚糖(即胞外基质(ECM))调节来控制TFGβ水平。
异常调节的TGFβ信号传导，如过度的TGFβ信号传导和高水平的生物可用的TGFβ涉及许多病理，包括各种组织形成纤维性组织，如肺纤维化和肝硬化、慢性肝炎、类风湿性关节炎、眼部病症、血管再狭窄(restenosis)、皮肤的瘢痕疙瘩(keloid)以及肾硬化的发病(onset)。
因此，需要提供以特定方式，如通过结合TGFβ受体II，来阻断或破坏TGFβ信号传导的化合物。这类化合物可以用于治疗。
发明概述
本文涉及一种抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域。适宜地，依照本文的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域是一种以范围为10pM至50nM，任选地10pM至10nM，任选地100pM至10nM的平衡解离常数(KD)结合TGFβRII的单可变域。在一个实施方案中，所述抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域以高亲和力(高效力)结合TGFβRII并且具有的平衡解离常数为10pM至500pM。在一个实施方案中，所述抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域以约100pM的亲和力(KD)结合TGFβRII。在一个实施方案中，所述抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域以低于100pM的亲和力(KD)结合TGFβRII。在另一个实施方案中，所述抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域以中等亲和力(低效力)结合TGFβRII并且具有的平衡解离常数为500pM至50nM，优选为500pM至10nM。在另一个方面，本文提供了分离的多肽，其包含抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域。适宜地，所述分离的多肽结合人TGFβRII。在另一个实施方案中，所述分离的多肽还结合来自不同物种如小鼠、犬或猴(如猕猴(cynomolgus monkeys，cyno))的TGFβRII。适宜地，所述分离的多肽结合小鼠和人TGFβRII两者。在来自人和其它物种的TGFβRII之间的这类交叉反应性允许同一抗体构建体用于动物疾病模型以及人中。
在本文的一个方面，提供一种抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域，其具有SEQ ID NO:1-38、204、206、208、214、234、236、238、240、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285和287的任意一个中所列出的氨基酸序列，并且具有最多5个氨基酸变更，其中每种氨基酸变更为氨基酸取代、缺失或添加，即，以任意方式组合的最多5个氨基酸取代、缺失或添加。在一个具体的实施方案中，所述氨基酸取代为保守取代。
在一个实施方案中，所述抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域具有如SEQ IDNO:234或279中列出的氨基酸序列且具有最多5个氨基酸变更，其中每种氨基酸变更为氨基酸取代、缺失或添加。在一个具体的实施方案中，所述氨基酸变更不在CDR3内，更具体地不在CDR3和CDR1内，或不在CDR3和CDR2内，更具体地不在任意一个CDR内。在一个实施方案中，所述抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域由以下任意一个序列组成：SEQ ID NO:1-38、204、206、208、214、234、236、238、240、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285和287。在一个实施方案中，所述抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域由SEQ ID NO:234或236的氨基酸序列组成。
不意图涵盖WO2011012609中披露的任何特定的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域序列。为了避免怀疑，本发明不要求保护WO2011012609中披露的每一条序列。具体地，可以不要求保护如WO2011012609中披露的DOM23h-271(SEQ ID NO:4)和DOM-23h-439(SEQ ID NO:10)。可以不要求保护由本文中SEQ ID NO:199或201中列出的氨基酸序列组成的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域。
依照本发明的一种抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域可以包含一个或多个(例如1、2，3，4或5个)C末端丙氨酸残基。或者，抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域可以包含长达5个氨基酸的C末端肽。在一个实施方案中，所述C末端肽包含1、2，3，4或5个氨基酸。
使用本文中列出的各种方法，本领域技术人员能从给定的单可变域序列，例如具有如SEQ ID NO:1-38、204、206、208、214、234、236、238、240、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285和287的任意一个中所列出的序列的单可变域序列推导出其中含有哪些CDR序列，例如如根据Kabat(1987)，Chothia(1989)，AbM或contact方法，或这些方法的组合定义的CDR序列。适宜地，使用本文中描述的Kabat方法来确定CDR序列。在一个实施方案中，每条序列的CDR序列是在表1、2，9和13中列出的那些。
在本发明的一个方面，本文的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域与选自由SEQ ID NO:1-28组成的组的氨基酸序列具有90%或大于90%的序列同一性。
在本发明的一个方面，本文的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1-28，其中有25个或更少的氨基酸变化。在一个具体的实施方案中，本文的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1-28，其中有20个或更少、15个或更少、10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、或5个或更少的氨基酸变化。
在本文的一个方面，提供了包含本文的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域，特别是包含与选自下组的氨基酸序列相同的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域的分离的多肽：SEQ ID NO:1-38、204、206、208、214、234、236、238、240、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285和287，其中所述分离的多肽结合TGFβRII。
在本文的一个方面，提供了由与选自SEQ ID NO:39-66的组的至少一条核酸序列有至少80%同一性的核苷酸序列所编码的分离的多肽，其中所述分离的多肽结合TGFβRII。
依照本文的任一方面的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域或多肽可以包含以下任一种氨基酸：在免疫球蛋白单可变域第39位的R、第48位的I、第53位的D、第61位的N、第61位的R、第61位的K、第64位的R、第64位的F、第64位的D、第64位的E、第64位的Y、第102位的H或第103位的S，所述位置依照kabat编号惯例。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白单可变域或多肽包含这些氨基酸的组合。在另一个实施方案中，所述免疫球蛋白单可变域或多肽包含第61位的氨基酸N和第64位的R。在另一个实施方案中，所述免疫球蛋白单可变域或多肽包含第61位的氨基酸R或K。在一个实施方案中，所述抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域除上述第61和/或64位的任一残基以外还包含第48位的I。在这些实施方案中，氨基酸编号是免疫球蛋白单可变域的编号，如例如由SEQ ID NO:1-38、204、206、208、214、234、236、238、240、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285和287中给出的那些序列所例示的。
依照本文的任一方面的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域或多肽可以包含选自下组的氨基酸组合之一：在免疫球蛋白单可变域第61位的N和第64位的R；第61位的R和第64位的E；第61位的R和第64位的M；第61位的R和第64位的F；第61位的R和第64位的Y；以及第61位的R和第64位的D。在一个实施方案中，所述抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域除上述第61和64位的残基组合以外还包含第48位的I。
在另一个方面，提供一种配体或结合模块(binding moiety)，其对TGFβRII具有结合特异性并且抑制抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域(包含选自SEQ IDNO:1-28的组的氨基酸序列)对TGFβRII的结合。
在本文的另一个方面，提供了包含依照本文任一方面的免疫球蛋白单可变域、多肽或配体的融合蛋白。
在一个实施方案中，依照本文的免疫球蛋白单可变域、多肽、配体或融合蛋白中和TGFβ活性。适宜地，依照本文的免疫球蛋白单可变域或多肽抑制TGFβ对TGFβRII的结合。在另一个实施方案中，依照本文的免疫球蛋白单可变域或多肽抑制经由TGFβRII的TGFβ信号传导活性。在另一个实施方案中，依照本文的免疫球蛋白单可变域或多肽抑制TGFβ活性，具体地，抑制TGFβ细胞生长活性和/或纤维生成活性。适宜地，TGFβRII是人TGFβRII。
在一个实施方案中，依照本文的免疫球蛋白单可变域、多肽、配体或融合蛋白在15微摩(μM)时缺乏TGFβRII激动剂活性。
在另一个方面，提供依照本文任一方面的免疫球蛋白单可变域、多肽、配体或融合蛋白，其进一步包含半衰期延长模块。适宜地，所述半衰期延长模块是聚乙二醇模块、血清白蛋白或其片段、转铁蛋白受体或其转铁蛋白结合部分、或包含针对增强体内半衰期的多肽的结合位点的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述半衰期延长模块是包含针对血清白蛋白或新生儿Fc受体的结合位点的抗体或抗体片段。在另一个实施方案中，所述半衰期延长模块是dAb、抗体或抗体片段。
在另一个方面，本文提供分离或重组的核酸，其编码包含依照本文任一方面的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域、多肽、配体或融合蛋白的多肽。
在一个实施方案中，所述分离或重组的核酸分子包含选自下组的核酸分子或由其组成：任何具有SEQ ID NO:39-76、203、205、207、212、233、235、237、239、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286中列出的序列的核酸分子。
在一个方面，本文提供分离或重组的核酸，其中所述核酸包含与具有SEQ ID NO:39-66中列出的序列的任一核酸分子的核苷酸序列有至少80%同一性的核苷酸序列，且其中所述核酸编码包含特异性结合TGFβRII的免疫球蛋白单可变域的多肽。
在另一个方面，提供包含依照本文的核酸的载体。
在又一个方面，提供包含依照本文的核酸或载体的宿主细胞。在本文的再一个方面，提供生成包含依照本文的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域、或多肽、或配体、或融合蛋白的多肽的方法，所述方法包括在适合表达所述核酸或载体的条件下维持依照本文的宿主细胞，由此生成包含免疫球蛋白单可变域、多肽、或配体、或融合蛋白的多肽。任选地，所述方法进一步包括分离所述多肽的步骤，并且任选地包括生成变体例如比分离的多肽的突变变体的步骤，所述突变变体具有改进的亲和力(Kd)，或在标准测定法中改善TGFβ中和的EC50。本文中描述了适合用于TGFβ活性的测定法如细胞传感器测定法，例如在实施例部分。
在本文的一个方面，将依照本文的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域、多肽、或配体或融合蛋白用作药物。因此，提供将包含依照本文的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域、多肽、或配体、或融合蛋白的组合物用作药物。
在本文的一个方面，提供依照本文的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域、多肽、或配体、或融合蛋白用于制备药物，特别是用于治疗与TGFβ信号传导相关的疾病的药物的用途。
适宜地，依照本文的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域、多肽、或配体、或融合蛋白、或组合物用于治疗与TGFβ信号传导有关的疾病。适宜地，所述疾病为组织纤维化，如肺纤维化，包括特发性肺纤维化；肝纤维化，包括肝硬化和慢性肝炎；类风湿性关节炎；眼部病症；或皮肤的纤维化，包括皮肤的瘢痕疙瘩；杜普伊特伦氏挛缩(Dupuytren’s Contracture)；和肾纤维化如肾炎和肾硬化；或血管疾患，如再狭窄。其它与TGFβ信号传导有关的疾病包括血管疾病如高血压、先兆子痫(pre-eclampsia)、I型遗传性出血性毛细管扩张症(hereditary haemorrhagic telangiectasia type I，HHT1)、HHT2、肺动脉高压、主动脉瘤、马方综合征(Marfan syndrome)、家族性动脉瘤病症(familialaneurysm disorder)、Loeys-Dietz综合征、动脉迂曲综合征(arterial tortuositysyndrome，ATS)。其它与TGFβ信号传导有关的疾病包括肌肉骨骼系统的疾病，如杜兴氏肌营养不良(Duchenne’s muscular dystrophy)和肌肉纤维化。另外与TGFβ信号传导有关的疾病包括癌症，如结肠癌、胃癌和胰腺癌，以及胶质瘤和NSCLC。另外，本文提供了通过调控肿瘤血管发生中的TGFβ信号传导来靶向癌症的方法。其它疾病或疾患包括那些与组织疤痕有关的。其它疾病包括肺部疾病如COPD(慢性阻塞性肺疾病)。依照本文的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域、多肽、或配体、或融合蛋白、或组合物可以用于伤口愈合和/或预防或改善瘢痕的形成。在一个方面，本文提供用于皮内递送的抗TGFβRII单可变域、配体或拮抗剂、组合物或融合蛋白。在一个方面，本文提供用于递送到患者皮肤的抗TGFβRII单可变域、配体或拮抗剂或融合蛋白。在一个方面，本文提供抗TGFβRII单可变域、配体或拮抗剂或融合蛋白在制备用于皮内递送的药物中的用途。在一个方面，本文提供依照本文的抗TGFβRII单可变域或拮抗剂或融合蛋白在制备用于递送到患者皮肤的药物中的用途。
在一个实施方案中，所述可变域基本为单体。在一个具体的实施方案中，所述可变域在溶液中65%-98%为单体，如由SEC-MALS测定的。在另一个实施方案中，所述可变域在溶液中65%-100%，70%-100%，75%-100%，80%-100%，85%-100%，90%-100%，95%-100%为单体，如由SEC-MALS测定的。
在另一个实施方案中，如本文中披露的可变域、配体、融合蛋白或多肽，尤其在药物组合物中时，不含以下任一翻译后修饰或其组合或所有：脱酰胺化、氧化或糖基化。在一个具体的实施方案中，依照本文的可变域、配体、融合蛋白或多肽不脱酰胺基。
适宜地，所述组合物用于治疗或预防人中TGFβ介导的疾患。
因此，在一个实施方案中，提供用于治疗皮肤纤维化，特别是瘢痕疙瘩疾病或杜普伊特伦氏挛缩的抗TGFβRII dAb。适宜地，以用于皮内递送的基本单体的dAb来提供所述抗TGFβRII dAb，其优选缺少任何标签(即为未标记的)，如myc或另外的纯化标签。
在一个方面，所述组合物是药物组合物并且还包含药学可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
在另一个方面，提供治疗和/或预防在人患者中的TGFβ介导的疾患的方法，所述方法包括对患者施用包含依照本文的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域、多肽或配体的组合物。
在另一个方面，本文提供含有依照本文的组合物的皮内递送装置。适宜地，这类装置是微型针或微型针的集合。
在又一个方面，提供了包含如本文中披露的抗TGFβRII单可变域或多肽、以及用于将所述单可变域或多肽施用于皮肤的装置(如皮内递送装置)的试剂盒。
发明详述
在本说明书中，采用使说明书撰写清楚而简洁的方式，参照实施方案对本文进行了描述。所述实施方案意图并且应当理解为可以按各种方式组合或分开，而不背离本文。
除非另有定义的，本文中使用的所有技术和科学术语与本领域(例如，细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学)普通技术人员通常理解的含义相同。分子、遗传和生物化学方法(一般参见Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版.(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.和Ausubel等，Short Prot°Cols inMolecular Biology(1999)第4版，John Wiley & Sons，Inc，其通过引用方式并入本文)和化学方法使用了标准技术。
免疫球蛋白：如本文中使用的，“免疫球蛋白”指保留抗体分子的免疫球蛋白折叠属性的多肽家族，其含有2个β层且通常含有保守的二硫键。
域：如本文中使用的，“域”指独立于蛋白质其余部分保留其三级结构的折叠的蛋白质结构。一般地，域负责蛋白质的离散功能特性，并且在许多情况下可以被加入、移除或转移至其它蛋白质而不损失蛋白质剩余部分和/或域的功能。单抗体可变域或免疫球蛋白单可变域是指一种包含抗体可变域特征性序列的折叠的多肽域。因此，它包括完整的抗体可变域和经修饰的可变域，例如其中1或多个环已被非抗体可变域特征性的序列替换，或者已截短或包含N或C末端延伸的抗体可变域，以及保留全长域的至少一部分结合活性和特异性的可变域的折叠片段。
免疫球蛋白单可变域：短语“免疫球蛋白单可变域”指独立于不同的或其它的可变区或可变域而特异性结合一种抗原或表位的抗体可变域(VH，VHH，VL)或结合域，即其为单价的。免疫球蛋白单可变域可以以某种形式(例如同型多聚体或异型多聚体)与其它可变区或可变域一起存在，其中其它区或域不是该单免疫球蛋白可变域结合抗原所需要的(即其中免疫球蛋白单可变域独立于另外的可变域而结合抗原)。“域抗体”或“(dAb)”是一种“免疫球蛋白单可变域”，如该术语在本文中使用的。“单抗体可变域”或“抗体单可变域”等同于“免疫球蛋白单可变域”，如该术语在本文中使用的。在一个实施方案中，免疫球蛋白单可变域是人抗体可变域，但其还包括来自其它物种如啮齿动物(例如在WO00/29004中披露的，其内容通过引用方式完整并入本文)、护士鲨(nurse shark)和骆驼类(camelid)VHH dAb的单抗体可变域。骆驼类VHH为自包括骆驼(camel)、美洲驼(llama)、羊驼(alpaca)、单峰骆驼(dromedary)和原驼(guanaco)在内的物种衍生的免疫球蛋白单可变域多肽，其产生天然没有轻链的重链抗体。VHH可以被人源化。
在本文的所有方面，所述免疫球蛋白单可变域独立地选自抗体重链和轻链单可变域，例如VH，VL和VHH。
如本文中使用的，“抗体”指自任何天然产生抗体的物种衍生或通过重组DNA技术创造出的IgG，IgM，IgA，IgD或IgE或片段(如Fab，F(ab’)2，Fv、二硫键连接的Fv、scFv、闭合构象的多特异性抗体、二硫键连接的scFv、双抗体)；不管是从例如血清、B细胞、杂交瘤、转染瘤、酵母还是从细菌分离的。
抗体形式：在一个实施方案中，可以以任意抗体形式提供依照本文的免疫球蛋白单可变域、多肽或配体。如本文中使用的，“抗体形式”是指任何合适的多肽结构，其中可以掺入一或多个抗体可变域从而赋予结构上对抗原的结合特异性。本领域有多种已知的合适抗体形式，如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体、双特异抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体重链和/或轻链的同型二聚体和异型二聚体、任何以上所述的抗原结合片段(例如Fv片段(例如单链Fv(scFv)，二硫键连接的Fv)、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段)、单抗体可变域(例如dAb、VH、VHH、VL)和任何以上所述的经修饰版(例如通过共价附接聚乙二醇或其他合适聚合物修饰或人源化VHH)。在一个实施方案中，备选的抗体形式包括备选的支架，其中可以将依照本文的任何分子的CDR嫁接到合适的蛋白质支架或骨架，如亲和体、SpA支架、LDL受体A类域、avimer(参见例如美国专利申请公开Nos.2005/0053973、2005/0089932、2005/0164301)或EGF域上。此外，配体如本文中描述的可以是二价(异二价)或多价(异多价)的。在其它实施方案中，可以使用“通用框架”，其中“通用框架”指对应于序列保守的抗体区(如由Kabat定义(“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”，US Department of Health and Human Services))或对应于人种系免疫球蛋白全集或结构(如由Chothia和Lesk，(1987)J.Mol.Biol.196:910-917定义)的单抗体框架序列。本文提供了单框架或一组这类框架的用途，已发现其允许通过仅在高可变区变异就实质上衍生出任何的结合特异性。
在贯穿本文描述的实施方案中，除了在本文的肽或配体中使用抗TGFβRII“dAb”以外，还涵盖本领域普通技术人员能使用包含结合TGFβRII的本文dAb的一个或多个或所有3个CDR的多肽或域(例如嫁接到合适的蛋白质支架或骨架例如亲和体(affibody)、SpA支架、LDL受体A类域或EGF域上的CDR)。因此，本文作为整体应解译为披露了使用这类域代替dAb的多肽。在此方面，参见WO2008096158，其公开内容通过引用方式并入。
在一个实施方案中，所述抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域是任何合适的免疫球蛋白可变域，并且任选地是人可变域，或包含人框架区或自人框架区衍生的可变域(例如DP47或DPK9框架区)。
抗原：如本文中描述的，“抗原”是被依照本文的结合域结合的分子。通常抗原被抗体配体结合且能提高体内抗体应答。它可以是例如多肽、蛋白质、核酸或其它分子。
表位：“表位”是被免疫球蛋白VH/VL对常规结合的结构的单位。表位限定抗体的最小结合位点，且由此代表抗体的特异性靶物。在单dAb的情况中，表位代表被孤立的可变域结合的结构单位。
结合：典型地，50纳摩或更低，任选地250皮摩或更低的解离常数(Kd)指示特异性结合。可以通过合适的测定法来测定抗原结合蛋白对抗原或表位的特异性结合，所述测定法包括例如Scatchard分析和/或竞争性结合测定法，如放射免疫测定法(RIA)、酶免疫测定法如ELISA和夹心竞争测定法，以及其不同变体。
结合亲和力：任选地，使用表面等离子共振(SPR)和BIACORETM(Karlsson等，1991)，使用BIACORETM系统(Uppsala，Sweden)来测定结合亲和力。BIACORETM系统使用表面等离子共振(SPR，Welford K.1991，Opt.Quant.Elect.23:1；Morton和Myszka，1998，Methods in Enzymology295:268)来监测实时生物分子相互作用，并且使用能检测出作为达300nm远的表面折射指数变化的结果，在玻璃支持物上的薄金膜表面的光共振角变化的表面等离子共振。BIACORETM分析方便地产生结合速率常数、解离速率常数、平衡解离常数和亲和力常数。通过使用BIACORETM表面等离子共振系统(BIACORETM，Inc.)评估结合和解离速率常数来获得结合亲和力。依照制造商(BIACORETM)说明书将生物传感器芯片激活以共价偶联靶物。然后将靶物稀释并注射经过芯片以获得固定化材料的以应答单位计的信号。由于以应答单位(RU)计的信号与固定化的材料的质量成比例，因此这代表了基质上的固定化靶物密度的范围。将解离数据拟合至单位点模型以获得k解离+/-s.d.(测量的标准偏差)。对每条结合曲线计算伪一级速率常数(Kd的)，并且作为蛋白质浓度的函数绘出以获得k结合+/-s.e.(拟合的标准误差)。从SPR测量计算出结合的平衡解离常数Kd为k解离/k结合。
本文的另一个方面提供特异性结合人TGFβRII的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域。在一个实施方案中，所述可变域以约50nM，40nM，30nM、20nM，10nM或更低，任选地约9，8，7，6或5nM或更低，任选地约4nM或更低，约3nM或更低，或约2nM或更低，或约1nM或更低，任选地约500pM或更低的平衡解离常数(KD)结合人TGFβRII。适宜地，当可变域具有范围在约50nM至500pM的平衡解离常数时，特别适合局部施用到感兴趣的组织如肺。在此实施方案中，可以提供高浓度的这类“中等亲和力”结合物作为有效治疗物。在另一个实施方案中，所述可变域以约500pM或更低，任选地约450pM，400pM，350pM，300pM、250pM、200pM，150pM，100pM，50pM或更低，任选地约40pM，30pM、20pM，10pM或更低的平衡解离常数(KD)结合人TGFβRII。适宜地，当可变域具有范围在约500pM至10pM的解离常数时，特别适合全身性施用从而使得在任何一种感兴趣的组织中的量均足以提供有效治疗。在此实施方案中，可以提供低浓度的这类“高亲和力”结合物作为有效治疗物。
在一个实施方案中，本文的单可变域显示出在人TGFβRII与来自另一物种的TGFβRII如小鼠TGFβRII之间的交叉反应性。在此实施方案中，所述可变域特异性结合人和小鼠TGFβRII。这是特别有用的，因为药物开发在人中进行测试前通常需要在小鼠系统中测试先导药物候选物。提供能结合人和小鼠物种的药物允许测试在这些系统中的结果并使用同一药物进行并排比较。这避免了需要寻找针对小鼠TGFβRII作用的药物以及针对人TGFβRII作用的另外的药物的复杂化，并且还避免了比较在人和小鼠中使用不相同药物的结果的需要。还涵盖了在疾病模型中使用的其它物种如犬或猴(如猕猴)之间的交叉反应性。
任选地，对至少小鼠TGFβRII的免疫球蛋白单可变域的结合亲和力与对人TGFβRII的结合亲和力相差不超过10，50或100倍的因数。
CDR：本文中描述的免疫球蛋白单可变域(dAb)含有互补决定区(CDR1，CDR2和CDR3)。CDR和框架(FR)区的位置以及编号系统已由Kabat等(Kabat，E.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，U.S.Government Printing Office(1991))定义。对于本领域技术人员，基于公知的Kabat氨基酸编号系统和CDR定义，本文中披露的VH(CDRH1等)和VL(CDRL1等)(Vκ)dAb的CDR(CDR1，CDR2，CDR3)的氨基酸序列是容易明显的。依照Kabat编号系统(最常使用的基于序列变异性的方法)，重链CDR-H3具有各种长度，残基H100和H101之间的插入以达到K的字母编号(即H100，H100A...H100K，H101)。或者如下地，可以使用Chothia的系统(基于结构性环区的位置)(Chothia等，(1989)Conformations of immunoglobulin hypervariable regions；Nature342，p877-883)、依照AbM(Kabat和Chothia间的折中)或依照Contact方法(基于晶体结构并用抗原来预测接触残基)来确定CDR。对用于确定CDR的合适方法，参见http://www.bioinf.org.uk/abs/。
一旦已将每个残基编号，就可以应用下列CDR定义：
Kabat:
CDR H1:31-35/35A/35B
CDR H2:50-65
CDR H3:95-102
CDR L1:24-34
CDR L2:50-56
CDR L3:89-97
Chothia:
CDR H1:26-32
CDR H2:52-56
CDR H3:95-102
CDR L1:24-34
CDR L2:50-56
CDR L3:89-97
AbM:
Figure BDA0000378234380000131
Contact:
Figure BDA0000378234380000132
(“-”意味着与Kabat相同的编号)
因此，使用本文中概述的各种方法，本领域技术人员能从给定的单可变域序列，例如具有如在SEQ ID NO:1-38、204、206、208、214、234、236、238、240、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285和287的任意一个中所列序列的单可变域序列，推导出其中含有的CDR序列。例如，对于给定的单可变域序列例如SEQ ID NO:1，技术人员能够使用上文所提述的CDR定义方法中的任意一种或其组合来确定其中含有的CDR1、CDR2和CDR3序列。当使用Kabat CDR定义时，技术人员能确定CDR1，CDR2和CDR3序列分别是那些在SEQ ID NO:77，113和149中列出的。适宜地，使用本文中描述的Kabat方法来确定CDR序列。在一个实施方案中，每条序列的CDR序列是那些在表1、2，9和13中列出的。在一个实施方案中，CDR1序列是选自SEQ ID NO:77-112、241、244、247和250的CDR1序列。在一个实施方案中，CDR2序列是选自SEQ ID NO:113-148、242、245、248和251的CDR2序列。在一个实施方案中，CDR3序列是选自SEQ ID NO:149-184、243、246、249和252的CDR3序列。
CDR变体或变体结合单位包含有至少1个氨基酸修饰的氨基酸序列，其中所述修饰可以是对氨基酸序列的化学或部分变更(例如不超过10个氨基酸)，所述修饰允许变体保留未修饰序列的生物学属性。例如，所述变体是特异性结合TGFβRII的功能性变体。对CDR氨基酸序列的部分变更可以是通过缺失或取代一个到数个氨基酸，或通过加入或插入一个到数个氨基酸，或通过其组合(例如不超过10个氨基酸)。CDR变体或结合单位变体在氨基酸序列中可以含有1、2，3，4，5或6个以任意方式组合的氨基酸取代、添加或缺失。CDR变体或结合单位变体在氨基酸序列中可以含有1、2或3个氨基酸取代、插入或缺失。氨基酸残基中的取代可以是保守性取代，例如将一个疏水性氨基酸取代为备选的疏水性氨基酸。例如可以用缬氨酸或异亮氨酸来取代亮氨酸。
TGFβRII：如本文中使用的，“TGFβRII”(转化生长因子β II型受体；TGFβRII)指天然存在或内源性的哺乳动物TGFβRII蛋白，而且指具有与天然存在或内源性的相应哺乳动物TGFβRII蛋白相同的氨基酸序列的蛋白质(例如重组蛋白、合成蛋白(即使用合成有机化学方法生成))。因此，如本文中定义的，该术语包括成熟的TGFβRII蛋白、多态性或等位变体、以及TGFβRII的其它同等型和前述项的经修饰或未修饰的形式(例如脂质化、糖基化的)。天然存在或内源性的TGFβRII包括野生型蛋白质如成熟的TGFβRII、多态性或等位变体以及在哺乳动物(例如人、非人灵长类)中天然存在的其它同等型和突变形式。可以例如从天然表达TGFβRII的来源回收或分离这类蛋白质。这些蛋白质和具有与天然存在或内源性的相应TGFβRII相同的氨基酸序列的蛋白质，通过相应哺乳动物的名称来指代。例如，当相应哺乳动物是人时，所述蛋白质称为人TGFβRII。人TGFβRII由例如Lin等，Cell1992，第68卷(4)，第775-785页和GenBank登录号M85079描述。
人TGFβRII是由约159个氨基酸的胞外域、跨膜域和包含用于信号转导的蛋白质激酶域的细胞质域的567个氨基酸组成的跨膜受体。
如本文中使用的，“TGFβRII”还包含TGFβRII的部分或片段。在一个实施方案中，这类部分或片段包含TGFβRII或其部分的胞外域。
关于免疫球蛋白单可变域、多肽、配体、融合蛋白等的“抗TGFβRII”是指识别并结合TGFβRII的模块。在一个实施方案中，“抗TGFβRII”特异性地识别和/或特异性地结合蛋白TGFβRII，以及适宜地人TGFβRII。在另一个实施方案中，依照本文的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域还结合小鼠TGFβRII(GenBank登录号NM_029575；例如记载于Massague等，Cell69(7)，1067-1070(1992))。
“TGFβ”包括同等型如TGFβ1，TGFβ2和TGFβ3。
TGFβ结合TGFβRII，并且与TGFβRI复合时启动信号传导途径。因此，可以通过任何测量TGFβ信号传导输出的测定法来测定TGFβ活性和对TGFβ活性的抑制或中和。对TGFβ信号传导的综述见例如Itoh等，Eur.J.Bi°Chem2000，第267卷，第6954页；Dennler等，Journal of Leuc°Cyte Biol.2002，71(5)，第731-40页。如此，可以在本领域技术人员熟悉的许多不同的测定法中测试TGFβ活性。“抑制”或“中和”意味着在存在本文的免疫球蛋白单可变域的情况下，与不存在这类免疫球蛋白单可变域的情况下TGFβ的活性相比，总体或部分降低TGFβ的生物学活性。
在一个实施方案中，在IL-11释放测定法中测试对TGFβ活性的抑制或中和。在此实施方案中，测试依照本文的免疫球蛋白单可变域抑制受人TGFβ1(TGFβ1；TGF-β1)刺激的从细胞如A549细胞释放IL-11的能力。TGFβ1(TGF-β1)直接结合TGFβRII(TGF-βRII)并诱导TGFβRI/RII(TGF-βRI/II)复合体的装配。TGFβRI(TGF-βRI)被磷酸化并且能通过数个途径(包括Smad4途径)进行信号传导。对Smad4途径的激活导致IL-11的释放。IL-11被分泌到细胞上清液中，然后通过比色(colourmetric)ELISA进行测量。本文中描述了合适的IL-11释放测定法，如由R & D systems提供的人IL-11Quantikine ELISA测定试剂盒(ref.D1100)。
在另一个实施方案中，在测定法中测试TGFβ活性，其针对依照本文的免疫球蛋白单可变域在MC3T3-E1萤光素酶测定法中抑制CAGA萤光素酶在MC3T3-E1细胞中表达的能力，所述表达是由TGFβ诱导的。3个拷贝的TGFβ应答序列基序(称为CAGA盒)存在于人PAI-1启动子中，并特异性结合Smad3和4蛋白。将多拷贝的CAGA盒克隆到萤光素酶报告构建体中对用报告系统转染的细胞赋予TGFβ应答性。本文中描述了一种合适的测定法，其使用用[CAGA]12-萤光素酶报告构建体稳定转染的MC3T3-E1细胞(小鼠成骨细胞)(Dennler等，(1998)EMBO J.17，3091–3100)。
其它合适的测定法包括人SBEβ-内酰胺酶细胞测定法(
Figure BDA0000378234380000151
细胞传感器测定法)。本文中描述了合适的测定法的例子。
适宜地，依照本文的免疫球蛋白单可变域、多肽、配体或融合蛋白本身不激活TGFβRII受体信号传导。因此，在一个实施方案中，依照本文的免疫球蛋白单可变域、多肽、配体或融合蛋白在10μM时缺乏激动剂活性。可以通过在如本文中描述的TGFβRII测定法中在缺乏TGFβ的情况下测试感兴趣的化合物来测定激动剂活性。在缺乏TGFβ的情况下，感兴趣的化合物的激动剂活性将通过检测TGFβRII信号传导进行检测。
同源性：与本文中描述的序列相似或同源(例如至少约70%序列同一性)的序列也是本文的一部分。在一些实施方案中，在氨基酸水平上的序列同一性可以为约75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或更高。在核酸水平上，序列同一性可以是约60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或更高。或者，当核酸区段在选择性杂交条件(例如非常高的严格性的杂交条件)下将与链的互补体杂交时，存在实质性的同一性。核酸可以存在于全细胞中、细胞裂解物中或者以部分纯化或实质性纯化的形式存在。
如本文中使用的，术语“低严格性”、“中等严格性”、“高严格性”或“非常高的严格性”条件描述用于核酸杂交和清洗的条件。用于实施杂交反应的指导可见于Current Prot°Cols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6，其通过引用方式完整并入本文。在该参考内容中描述了水性和非水性方法，并且可以使用任一种。本文中所指的特定杂交条件如下：(1)低严格性杂交条件，在约45℃在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，接着在至少50℃在0.2X SSC，0.1%SDS中清洗两次(对于低严格性条件，清洗的温度可以提高至55℃)；(2)中等严格性杂交条件，在约45℃在6X SSC中，接着在60℃在0.2X SSC，0.1%SDS中清洗1次或多次；(3)高严格性杂交条件，在约45℃在6X SSC中，接着在65℃在0.2X SSC，0.1%SDS中清洗1次或多次；以及任选地(4)非常高严格性的杂交条件，在65℃在0.5M磷酸钠，7%SDS中，接着在65℃在0.2X SSC，1%SDS中清洗1次或多次。非常高严格性的条件(4)是优选的条件并且除非另外指定的话，是应当使用的条件。
如下实施对两条序列之间的“同源性”或“序列同一性”或“相似性”(术语在本文中可交换使用)的计算。将序列联配用于最佳比较目的(例如可以在第一和第二氨基酸或核酸序列之一或两者引入缺口以用于最佳比对，并且对于比较目的可以不考虑非同源性序列)。在一个实施方案中，联配用于比较目的的参照序列的长度是该参照序列长度的至少约30%、任选地至少约40%、任选地至少约50%、任选地至少约60%、以及任选地至少约70%，80%，85%90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或100%。然后比较相应的氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当在第一序列的某位置处占据的氨基酸残基或核苷酸与在第二序列中相应位置处的相同时，该分子在该位置处是相同的(如本文中使用的，氨基酸或核酸“同源性”等同于氨基酸或核酸“同一性”)。两序列之间的百分比同一性是考虑到两序列的最佳比对需要引入的缺口数以及每个缺口的长度，序列所共有的相同位置数的函数。
任选地，使用BLAST2序列算法，使用缺省参数来准备并测定如本文中定义的氨基酸和核苷酸序列比对和同源性、相似性或同一性(Tatusova，T.A.等，FEMS Microbiol Lett，174:187-188(1999))。或者，采用BLAST算法(版本2.0)进行序列比对，参数设定为缺省值。BLAST(基本局部比对搜索工具(Basic L°Cal Alignment Search Tool()是由程序blastp，blastn，blastx，tblastn和tblastx采用的启发式搜索算法；这些程序使用Karlin和Altschul，1990，Pr°C.Natl.Acad.Sci.USA87(6):2264-8的统计学方法来规定其发现的显著性。
配体：如本文中使用的，术语“配体”指包含至少一种具有对TGFβRII的结合特异性的结合位点的肽、多肽或蛋白质模块的化合物。配体还可以被称为“结合模块”。
任选地，依照本文的配体或结合模块包含具有不同结合特异性的免疫球蛋白可变域，且不含有针对靶化合物一起形成结合位点的可变域对(即不包含一起形成针对TGFβRII的结合位点的免疫球蛋白重链可变域和免疫球蛋白轻链可变域)。任选地，每个具有对靶物有结合特异性的结合位点的域是对期望靶物(例如TGFβRII)具有结合特异性的免疫球蛋白单可变域(例如免疫球蛋白单重链可变域(例如VH，VHH)、免疫球蛋白单轻链可变域(例如VL))。
如此，“配体”包括包含两种或更多种免疫球蛋白单可变域的多肽，其中每种免疫球蛋白单可变域结合不同的靶物。配体还包括包含至少两种免疫球蛋白单可变域或单可变域的CDR序列的多肽，其以合适的形式如抗体形式(例如IgG样形式、scFv、Fab、Fab’、F(ab’)2)或合适的蛋白质支架或骨架诸如如本文中描述的亲和体、SpA支架、LDL受体A类域、EGF域、avimer和双特异及多特异性配体结合不同靶物。
具有对靶物(例如TGFβRII)有结合特异性的结合位点的多肽域还可以是包含对期望靶物的结合位点的蛋白质域，例如蛋白质域选自亲和体、SpA域、LDL受体A类域、avimer(参见例如美国专利申请公开No.2005/0053973、2005/0089932、2005/0164301)。若期望的话，“配体”还可以包含一个或多个另外的模块，其可以各自独立地为肽、多肽或蛋白质模块或非肽模块(例如聚亚烃基二醇、脂质、碳水化合物)。例如，所述配体还可以包含如本文中描述的半衰期延长模块(例如聚亚烃基二醇模块，包含白蛋白、白蛋白片段或白蛋白变体的模块，包含转铁蛋白、转铁蛋白片段或转铁蛋白变体的模块，结合白蛋白的模块，结合新生儿Fc受体的模块)。
竞争：如本文中所指的，术语“竞争”意味着第一靶物(例如TGFβRII)对其关联靶物结合域(例如免疫球蛋白单可变域)的结合，在存在对所述关联靶物特异性的第二结合域(例如免疫球蛋白单可变域)的情况下受到抑制。例如，结合可以是空间上受到抑制的，例如通过将结合域物理封闭或通过变更结合域的结构或环境从而使其对靶物的亲和力或亲合力降低。关于如何实施竞争ELISA和竞争BIACORETM实验以测定第一和第二结合域之间的竞争的详情，参见WO2006038027，其详细内容通过引用方式并入本文以提供用于本文中的明确公开。本文包含与SEQ ID NO:1-38中的任意一种竞争的抗原结合蛋白，具体地为单可变域、多肽、配体和融合蛋白。在一个具体的实施方案中，提供了一种TGFβRII结合蛋白，其与SEQ ID NO:1-38单可变域中的任意一种竞争并且还具有对TGFβRII为50nM或更低的KD。在一个具体的实施方案中，KD为10pM至50nM。在一个具体的实施方案中，KD为10pM至10nM。在一个具体的实施方案中，KD为100pM和10nM。在一个具体的实施方案中，KD为约100pM。
TGFβ信号传导：适宜地，本文的单可变域、多肽或配体能通过TGFβRII中和TGFβ信号传导。“中和”是指TGFβ的正常信号传导效果被阻断从而使得TGFβ的存在在TGFβRII信号传导上具有中性效果。用于测量中和效果的合适方法包括如本文中描述的针对TGFβ信号传导的测定法。在一个实施方案中，中和观察为在TGFβ信号传导测定法中对TFGβ活性的%抑制。在一个实施方案中，所述单可变域或多肽结合TGFβRII的胞外域，由此抑制/阻断TGFβ对TGFβRII的胞外域的结合。适宜地，在生物可用TGFβ过量的情况下单可变域或多肽是有用的，而且单可变域或多肽通过抑制TGFβ对其关联受体TGFβRII的结合起着抑制生物可用的TGFβ的信号传导活性的作用。
如本文中使用的，术语“TGFβRII的拮抗剂”或“抗TGFβRII拮抗剂”等指结合TGFβRII并且能抑制TGFβRII的(即一种或多种)功能的物质(例如分子、化合物)。例如，TGFβRII的拮抗剂能抑制TGFβ对TGFβRII的结合和/或抑制经由TGFβRII介导的信号转导。因此，TGFβ介导的过程和细胞应答可以被TGFβRII的拮抗剂抑制。
在一个实施方案中，结合TGFβRII的配体(例如免疫球蛋白单可变域)以≤约10μM，≤约1μM，≤约100nM，≤约50nM，≤约10nM，≤约5nM，≤约1nM，≤约500pM，≤约300pM，≤约100pM，或≤约10pM的半数抑制性浓度(IC50)抑制TGFβ对TGFβRII受体的结合。在一个具体的实施方案中，本文的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域具有15μM或更低的IC50。任选地，使用体外TGFβ受体结合测定法或细胞测定法，如本文中描述的测定法来测定IC50。
还涵盖配体(例如免疫球蛋白单可变域)任选地在合适的体外测定法中以≤约10μM，≤约1μM，≤约100nM，≤约50nM，≤约10nM，≤约5nM，≤约1nM，≤约500pM，≤约300pM，≤约100pM，≤约10pM，≤约1pM≤约500fM，≤约300fM，≤约100fM，≤约10fM的半数中和剂量(ND50)抑制TGFβRII诱导的功能。在一个具体的实施方案中，本文的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域实现对TGF-β的超过40%的中和。
“双特异性配体”：在一个实施方案中，依照本文的免疫球蛋白单可变域、多肽或配体可以是“双特异性配体”的一部分，其指包含第一抗原或表位结合位点(例如第一免疫球蛋白单可变域)和第二抗原或表位结合位点(例如第二免疫球蛋白单可变域)的配体，其中结合位点或可变域能结合两份抗原(例如不同抗原或同一抗原的两份拷贝)或同一抗原上通常不被一种单特异性免疫球蛋白结合的两种表位。例如，两种表位可以在同一抗原上，但不是相同表位或不足够接近以使得能被一种单特异性配体结合。在一个实施方案中，依照本文的双特异性配体由具有不同特异性的结合位点或可变域构成，并且不含有具有相同特异性的互相互补的可变域对(即VH/VL对)(即不形成单一的结合位点)。
在一个实施方案中，“双特异性配体”可以结合TGFβRII并结合另一种靶分子。例如，另一种靶分子可以是组织特异性的靶分子，从而使本文的双特异性配体能够将依照本文的抗TGFβRII多肽或免疫球蛋白单可变域靶向感兴趣的组织。这类组织包括肺、肝等。
还提供多特异性的dAb多聚体。这包括一种dAb多聚体，其包含依照本文任一方面的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域以及一种或多种各自结合不同靶物(例如TGFβRII以外的靶物)的单可变域。在一个实施方案中，提供双特异性的dAb多聚体，例如包含一或多种依照本文任一方面的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域和一或多种结合第二种不同靶物的dAb的dAb多聚体。在一个实施方案中，提供三特异性的dAb多聚体。
可以将本文的配体(例如多肽、dAb和拮抗剂)形成为融合蛋白，其含有直接融合至第二免疫球蛋白单可变域的第一免疫球蛋白单可变域。若期望的话，这类形式还可以包含半衰期延长模块。例如，所述配体可以包含直接融合至第二免疫球蛋白单可变域的第一免疫球蛋白单可变域，所述第二免疫球蛋白单可变域直接融合至结合血清白蛋白的免疫球蛋白单可变域。
一般地，具有对靶物有结合特异性的结合位点的多肽域的取向，以及配体是否包含接头，取决于设计选择。然而，一些取向，不管有或无接头，可以提供比其它取向更好的结合属性。所有取向(例如dAb1-接头-dAb2；dAb2-接头-dAb1)都涵盖在本文中并且可以通过筛选容易地鉴定出含有提供期望的结合属性的取向的配体。
可以将依照本文的多肽和dAb，包括dAb单体、二聚体和三聚体，连接至抗体Fc区(包含CH2和CH3域之一或两者)以及任选地铰链区。例如，可以使用编码配体的作为单独的核苷酸序列连接至Fc区的载体来制备这类多肽。在一个实施方案中，提供dAb-Fc融合。
此外，本文提供前述dAb单体的二聚体、三聚体和多聚体。
靶物：如本文中使用的，短语“靶物”指具有结合位点的多肽域能结合的生物学分子(例如肽、多肽、蛋白质、脂质、碳水化合物)。所述靶物可以是，例如细胞内靶物(例如细胞内蛋白质靶物)、可溶性靶物(例如分泌出的)、或细胞表面靶物(例如膜蛋白、受体蛋白)。在一个实施方案中，所述靶物是TGFβRII。在另一个实施方案中，所述靶物是TGFβRII胞外域。
互补：如本文中使用的，“互补”指两种免疫球蛋白域属于形成关联对或组的结构家族或自这类家族衍生且保留该特征的情况。例如，抗体的VH域和VL域是互补的；两个VH域是不互补的，且两个VL域是不互补的。可以在免疫球蛋白超家族的其它成员如T细胞受体的Vα和Vβ(或γ和δ)域中发现互补域。人工域，如基于不结合表位的蛋白质支架(除非经工程化来实现)的域是不互补的。同样地，基于(例如)免疫球蛋白域和纤连蛋白域的两种域是不互补的。
“亲和力”和“亲合力”是本领域中描述结合相互作用的强度的术语。就本文的配体而言，亲合力指细胞上的靶物(例如第一靶物和第二靶物)与配体之间的结合的总体强度。亲合力不仅仅是对各靶物的分别的亲和力的总和。
核酸分子、载体和宿主细胞：本文还提供分离和/或重组的编码如本文中描述的配体(单可变域、融合蛋白、多肽、双特异性配体和多特异性配体)的核酸分子。
本文中称为“分离的”核酸是已从基因组DNA的核酸或以其来源为起源的细胞RNA(例如如其存在于细胞或核酸混合物如库中的)分离的核酸，并且包括通过本文中描述的方法或其它合适的方法获得的核酸，包括基本上纯的核酸、通过化学合成产生的核酸、通过生物学和化学方法的组合产生的核酸、以及分离的重组核酸(参见例如Daugherty，B.L.等，Nucleic Acids Res.，19(9):2471 2476(1991)；Lewis，A.P.和J.S.Crowe，Gene，101:297-302(1991))。
本文中称为“重组的”核酸是通过重组DNA方法学产生的核酸，包括通过依赖于人工重组方法，如聚合酶链式反应(PCR)和/或使用限制性酶克隆到载体中的规程生成的那些核酸。
在某些实施方案中，所述分离的和/或重组的核酸包含编码如本文中描述的免疫球蛋白单可变域、多肽或配体的核苷酸序列，其中所述配体包含与本文中披露的结合TGFβ的dAb的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:1-38的任意一个中所列出的氨基酸序列)有至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。可以在编码所选抗TGFβRII dAb的核苷酸序列的全长上测定核苷酸序列同一性。在一个实施方案中，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:39-66的任一个具有至少80%同一性的核酸序列或由其组成。在一个实施方案中，所述核酸序列包含SEQ IDNO:39-76中任一个的核酸序列或由其组成。
本文的实施方案还提供编码如本文中披露的多肽和可变域的经密码子优化的核苷酸序列，所述优化例如是针对在细菌、哺乳动物或酵母细胞中的表达而优化的。
本文还提供包含本文的重组核酸分子的载体。在某些实施方案中，所述载体是包含可操作地连接于本文的重组核酸的一或多种表达控制元件或序列的表达载体。本文还提供包含本文的重组核酸分子或载体的重组宿主细胞。用于产生本文的重组宿主细胞的合适的载体(例如质粒、噬菌粒)、表达控制元件、宿主细胞和方法是本领域中公知的，并且本文中进一步描述了例子。
合适的表达载体可以含有许多组件，例如复制起点、可选择的标志基因、一或多种表达控制元件，如转录控制元件(例如启动子、增强子、终止子)和/或一或多种翻译信号、信号序列或前导序列等。表达控制元件和信号序列，若存在的话，可以由载体或其它来源提供。例如，编码抗体链的克隆的核酸的转录和/或翻译控制序列可以用于指导表达。
可以提供启动子以在期望的宿主细胞中表达。启动子可以是构成型或可诱导的。例如，可以将启动子可操作地连接于编码抗体、抗体链或其部分的核酸，从而使其指导该核酸的转录。有多种用于原核(例如用于大肠杆菌的lac，tac，T3，T7启动子)和真核(例如猿猴病毒40早期和晚期启动子、劳氏肉瘤病毒长末端重复启动子、巨细胞病毒启动子、腺病毒晚期启动子)宿主的合适的启动子。
另外，表达载体通常包含可选择标志用于选出携带载体的宿主细胞，并且在可复制表达载体的情况中，选出携带复制起点的宿主细胞。赋予抗生素或药物抗性的基因编码产物是常见的可选择标志，并且可以在原核(例如内酰胺酶基因(氨苄青霉素抗性)、用于四环素抗性的Tet基因)和真核细胞(例如新霉素(G418或遗传霉素)、gpt(霉酚酸)、氨苄青霉素或潮霉素抗性基因)中使用。二氢叶酸还原酶标志基因允许在多种宿主中用甲氨蝶呤选择。编码宿主的营养缺陷型标志的基因产物(例如LEU2，URA3，HIS3)的基因经常被用作酵母中的可选择标志。还涵盖使用病毒(例如杆状病毒)或噬菌体载体，以及能够整合到宿主细胞的基因组中的载体如逆转录病毒载体。适于在哺乳动物细胞和原核细胞(大肠杆菌)、昆虫细胞(Drosophila Schnieder S2细胞，Sf9)和酵母(甲醇毕赤酵母(P.methanolica)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、酿酒酵母(S.cerevisiae))中表达的表达载体是本领域中公知的。
合适的宿主细胞可以是原核的，包括细菌细胞如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和/或其它合适的细菌；真核细胞，如真菌或酵母细胞(例如巴斯德毕赤酵母、曲霉属(Aspergillus)菌种、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa))，或其它低等真核生物的细胞，以及高等真核生物的细胞如那些来自于昆虫(例如DrosophilaSchnieder S2细胞、Sf9昆虫细胞(WO94/26087(O’Connor))，哺乳动物(例如COS细胞，如COS-1(ATCC登录号CRL-1650)和COS-7(ATCC登录号CRL-1651)、CHO(例如ATCC登录号CRL-9096，CHO DG44(Urlaub，G.和Chasin，LA.，Pr°C.Natl.Acad.Sci.USA，77(7):4216-4220(1980)))、293(ATCC登录号CRL-1573)、HeLa(ATCC登录号CCL-2)、CV1(ATCC登录号CCL-70)、WOP(Dailey，L.等，J.Virol.，54:739-749(1985)，3T3、293T(Pear，W.S.等，Pr°C.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，90:8392-8396(1993))NS0细胞、SP2/0、HuT78细胞等，或植物(例如烟草)的细胞。参见例如Ausubel，F.M.等编.CurrentProt°Cols in Molecular Biology，Greene Publishing Ass°Ciates and John Wiley &Sons Inc.(1993)。在一些实施方案中，宿主细胞是分离的宿主细胞并且不是多细胞生物(例如植物或动物)的一部分。在某些实施方案中，所述宿主细胞是非人宿主细胞。
本文还提供用于生成本文的配体(例如双特异性配体、多特异性配体)的方法，包括在适合表达重组核酸的条件下维持包含本文的重组核酸的重组宿主细胞，由此表达该重组核酸并生成配体。在一些实施方案中，所述方法还包括分离配体。
对于适用于本文的实施方案的详细公开，参见WO200708515，第161页第24行到第189页第10行。由此通过引用方式将该公开内容并入本文，如其在本文的文本中明确出现并与本文的实施方案相关的，并且为并入下文权利要求中的披露提供明确支持。这包括在WO200708515第161页第24行到第189页第10行中呈现的公开内容，其提供了对以下的详细描述：“基于免疫球蛋白的配体的制备”、“库载体系统”、“库构建”、“组合单可变域”、“表征配体”、“配体的结构”、“骨架”、“蛋白质支架”、“用于构建配体的支架”、“规范序列的多样化”和“治疗和诊断用组合物及用途”，以及“可操作地连接”、“幼稚化(naive)”、“预防/防止”、“抑制”、“治疗”、“变应性疾病”、“Th2介导的疾病”、“治疗有效剂量”和“有效”的定义。
短语“半衰期”指由于例如通过自然机制的配体降解和/或配体清除或扣留，使免疫球蛋白单可变域、多肽或配体的血清浓度在体内降低50%所用的时间。通过结合抵抗降解和/或清除或扣留的分子，本文的配体可以在体内被稳定化并且提高其半衰期。典型地，这类分子是天然存在的蛋白质，其本身具有体内较长的半衰期。如果配体的功能活性在体内比类似的配体(不特异于半衰期延长分子)持续更长的时段，则该配体的半衰期延长。由此，将特异于HSA和靶分子的配体与其中不存在对HSA的特异性的相同配体(不结合HSA但结合另一分子)进行比较。半衰期通常延长10%、20%，30%，40%，50%或更长。范围在2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更多倍的半衰期延长是可能的。或者/另外地，范围高达30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍的半衰期的延长是可能的。
形式：延长的半衰期可用于免疫球蛋白，特别是抗体，最特别是尺寸较小的抗体片段的体内应用。这类片段(Fv、二硫键连接的Fv、Fab、scFv、dAb)一般被从体内快速清除。可以改变依照本文的dAb、多肽或配体以提供体内延长的半衰期并因此使配体的功能活性在体内具有更长的持续时间。
用于药代动力学分析和配体半衰期测定的方法将是本领域技术人员熟悉的。详情可见于Kenneth，A等:Chemical Stability of Pharmaceuticals:AHandbook for Pharmacists以及Peters等，Pharmacokinetic analysis:A PracticalApproach(1996)。还参照“Pharmacokinetics”，M Gibaldi & D Perron，MarcelDekker出版、2nd Rev.ex edition(1982)，其描述了药代动力学参数如tα和tβ半衰期以及曲线下面积(AUC)。
可以从配体的血清浓度随时间的曲线来测定半衰期(t1/2α和t1/2β)和AUC。可以使用WINNONLINTM分析包(可获自Pharsight Corp.，MountainView，CA94040，USA)例如来对曲线建模。在第一阶段(α阶段)中，配体主要经历在患者中的分布，伴随着一些消减。第二阶段(β阶段)是末端阶段，其时配体已分布且血清浓度正在降低，因为配体正被从患者清除。tα半衰期是第一阶段的半衰期而tβ半衰期是第二阶段的半衰期。由此，在一个实施方案中，本文提供了依照本文的配体或包含配体的组合物，其具有的tα半衰期的范围为15分钟或更长。在一个实施方案中，该范围的下限为30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、11小时或12小时。另外/或者，依照本文的配体或组合物将具有范围高达且包括12小时的tα半衰期。在一个实施方案中，该范围的上限为11，10，9，8，7，6或5小时。合适的范围的例子为1至6小时、2至5小时或3至4小时。
在一个实施方案中，本文提供了依照本文的配体(多肽、dAb或拮抗剂)或包含配体的组合物，其具有的tβ半衰期的范围为约2.5小时或更长。在一个实施方案中，该范围的下限为约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约10小时、约11小时或约12小时。另外/或者，依照本文的配体或组合物具有范围高达且包括21天的tβ半衰期。在一个实施方案中，该范围的上限为约12小时、约24小时、约2天、约3天、约5天、约10天、约15天或约20天。在一个实施方案中，依照本文的配体或组合物将具有范围在约12至约60小时的tβ半衰期。在另一个实施方案中，其范围将在约12至约48小时。在又一个实施方案中，其范围将在约12至约26小时。
对于上述标准，另外/或者，本文提供依照本文的配体或包含配体的组合物，其具有的AUC(曲线下面积)范围为约1mg·分钟/ml或更大。在一个实施方案中，该范围的下限为约5、约10、约15、约20、约30、约100、约200或约300mg·分钟/ml。另外/或者，依照本文的配体或组合物具有的AUC范围高达约600mg·分钟/ml。在一个实施方案中，该范围的上限为约500、约400、约300、约200、约150、约100、约75或约50mg·分钟/ml。在一个实施方案中，依照本文的配体将具有范围选自下组的AUC：约15至约150mg·分钟/ml、约15至约100mg·分钟/ml、约15至约75mg·分钟/ml和约15至约50mg·分钟/ml。
可以将本文的多肽和dAb以及包含这些的拮抗剂形式化以具有更大的流体力学尺寸，例如通过附接PEG基团、血清白蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白受体或至少其结合转铁蛋白的部分、抗体Fc区、或通过缀合抗体域来达成。例如，形式化为抗体的更大的抗原结合片段或形式化为抗体(例如形式化为Fab，Fab’，F(ab)2，F(ab’)2，IgG，scFv)的多肽dAb和拮抗剂。
如本文中使用的，“流体力学尺寸”指基于分子(例如蛋白质分子、配体)通过水性溶液的扩散的分子表观尺寸。可以对分子通过溶液的扩散或运动处理以得到蛋白质的表观尺寸，其中尺寸由蛋白质颗粒的“Stokes半径”或“流体力学半径”给出。蛋白质的“流体力学尺寸”取决于质量和形状(构象)两者，从而使得具有相同分子质量的两种蛋白质可能具有基于蛋白质总体构象的不同的流体力学尺寸。
可以使用本领域中公知的方法测定本文的配体(例如dAb单体和多聚体)的流体力学尺寸。例如，可以使用凝胶过滤色谱来测定配体的流体力学尺寸。用于测定配体的流体力学尺寸的合适的凝胶过滤基质，如交联的琼脂糖基质是公知且容易可获的。
根据期望的应用可以变化配体形式的尺寸(例如附接于dAb单体的PEG模块的尺寸)。例如，当配体意图离开循环而进入外围组织时，期望保持配体的流体力学尺寸较低以促进从血流外渗(extravazation)。或者，当期望使配体保持在全身性循环中更长一段时间时，可以增加配体的尺寸，例如通过形式化为Ig样蛋白质。
通过靶向延长体内半衰期的抗原或表位的半衰期延长：还可以通过将本文的TGFβRII结合多肽、dAb或配体缀合或联合如本文中描述的结合延长体内半衰期的抗原或表位的结合域(例如抗体或抗体片段)来增加配体的流体力学尺寸及其血清半衰期。例如，可以将TGFβRII结合剂(例如多肽)缀合或连接抗血清白蛋白或抗新生儿Fc受体抗体或抗体片段，例如抗SA或抗新生儿Fc受体dAb、Fab、Fab’或scFv，或抗SA亲和体或抗新生儿Fc受体Affibody或抗SA avimer，或包含选自但不限于下组的支架的抗SA结合域：CTLA-4、lip°Callin、SpA、亲和体、avimer、GroEl和纤连蛋白(对于这些结合域的公开，参见WO2008096158，通过引用方式将所述域及其序列并入本文中并且形成本文本的公开内容的一部分)。缀合指键合(共价或非共价地)结合域如结合血清白蛋白的结合域的包含本文的多肽、dAb或拮抗剂的组合物。
通常地，增强体内血清半衰期的多肽是天然存在于体内的肽，且其抵抗通过从生物体(例如人)除去不想要的材料的内源性机制所进行的降解或移除。例如，增强体内血清半衰期的多肽可以选自以下：来自胞外基质的蛋白质、在血液中发现的蛋白质、在血脑屏障或神经组织中发现的蛋白质、局部化于肾、肝、肺、心、皮肤或骨骼的蛋白质、应激蛋白质、疾病特异性蛋白质或涉及Fc运输的蛋白质。合适的多肽记载于例如WO2008/096158。
这类方法还可以用于将依照本文的单可变域、多肽或配体靶向递送到感兴趣的组织。在一个实施方案中，提供依照本文的高亲和力单可变域的靶向递送。
结合血清白蛋白的dAb：在一个实施方案中，本文提供结合TGFβRII的多肽或拮抗剂(例如包含抗TGFβRII dAb(第一dAb)的双特异性配体)和结合血清白蛋白(SA)的第二dAb(结合SA的第二dAb)。双特异性配体的详情可见于WO03002609，WO04003019，WO2008096158和WO04058821。
在配体和拮抗剂的具体的实施方案中，dAb结合人血清白蛋白并与选自下组的dAb竞争对白蛋白的结合：WO2004003019中披露的任意dAb序列(其序列及其相应核酸通过引用方式并入本文并形成本文公开内容的一部分)，WO2007080392中披露的任意dAb序列(其序列及其相应核酸通过引用方式并入本文并形成本文本公开内容的一部分)，WO2008096158中披露的任意dAb序列(其序列及其相应核酸通过引用方式并入本文并形成本文本公开内容的一部分)。
在某些实施方案中，所述dAb结合人血清白蛋白并且包含与WO2004003019、WO2007080392或WO2008096158的任一个中所描述的dAb的氨基酸序列具有至少约80%、或至少约85%、或至少约90%、或至少约95%、或至少约96%、或至少约97%、或至少约98%、或至少约99%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。例如，结合人血清白蛋白的dAb可以包含与这些dAb的任一个的氨基酸序列具有至少约90%、或至少约95%,、或至少约96%、或至少约97%、或至少约98%、或至少约99%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述dAb结合人血清白蛋白并且包含与这些dAb的任意一个的氨基酸序列具有至少约80%、或至少约85%、或至少约90%、或至少约95%、或至少约96%、或至少约97%、或至少约98%、或至少约99%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在更具体的实施方案中，所述dAb是结合人血清白蛋白的VκdAb。在更具体的实施方案中，所述dAb是结合人血清白蛋白的VHdAb。
合适的结合血清白蛋白的骆驼类VHH包括在WO2004041862(AblynxN.V.)和WO2007080392(其VHH序列及其相应核酸通过引用方式并入本文并且形成本文本公开内容的一部分)中披露的那些。在某些实施方案中，骆驼类VHH结合人血清白蛋白并且包含与WO2007080392中披露的那些序列或SEQ ID NO:518-534的任意一个具有至少约80%、或至少约85%、或至少约90%、或至少约95%、或至少约96%、或至少约97%、或至少约98%、或至少约99%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，这些序列编号对应于在WO2007080392或WO2004041862中引用的那些。
在一个备选的实施方案中，所述拮抗剂或配体包含特异于TGFβRII(例如人TGFβRII)的结合模块，其中所述模块包含如WO2008096158中描述的非免疫球蛋白序列，通过引用方式将这些结合模块、其产生和选择(例如从不同的库)方法以及其序列的公开内容作为本文本文的一部分并入本文中。
缀合半衰期延长模块(例如白蛋白)：在一个实施方案中，将一种(一个或多个)半衰期延长模块(例如白蛋白、转铁蛋白及其片段和类似物)缀合或联合于本文的结合TGFβRII的多肽、dAb或拮抗剂。用于TGFβRII结合形式的合适的白蛋白、白蛋白片段或白蛋白变体的例子记载于WO2005077042，其公开内容通过引用方式并入本文并且形成本文本文的一部分。
用于TGFβRII结合形式的合适的白蛋白、白蛋白片段或类似物的另外的例子记载于WO03076567，其公开内容通过引用方式并入本文并且形成本文本文的一部分。
当将一种(一个或多个)半衰期延长模块(例如白蛋白、转铁蛋白及其片段和类似物)用于形成本文的结合TGFβRII的多肽、dAb和拮抗剂的形式时，可以使用任何合适的方法来缀合，比如通过直接融合至TGFβRII结合模块(例如抗TGFβRII dAb)，例如通过使用编码融合蛋白的单一的核苷酸构建体，其中所述融合蛋白编码为具有位于TGFβRII结合模块N或C末端的半衰期延长模块的单个多肽链。或者，可以通过使用模块之间的肽接头，例如记载于WO03076567或WO2004003019(这些接头的公开通过引用方式并入本文中以提供用于本文的例子)的肽接头来实现缀合。
缀合PEG：在其它实施方案中，所述半衰期延长模块是聚乙二醇模块。在一个实施方案中，所述拮抗剂包含(任选地由其组成)连接于聚乙二醇模块的本文的单可变域(任选地，其中所述模块尺寸为约20至约50kDa，任选地约40kDa的线性或分支的PEG)。对于dAb和结合模块PEG化的更多详情，参见WO04081026。在一个实施方案中，所述拮抗剂由连接于PEG的dAb单体组成，其中所述dAb单体是依照本文的单可变域。
在另一个实施方案中，可以将依照本文的单可变域、配体或多肽连接至毒素模块或毒素。
蛋白酶抗性：可以修饰依照本文的单可变域、多肽或配体以提高其对蛋白酶降解的抗性。如本文中使用的，“对蛋白酶降解抗性”的肽或多肽(例如dAb(dAb))在适合于蛋白酶活性的条件下与蛋白酶温育时不被蛋白酶实质性降解。当与蛋白酶在适合蛋白酶活性的温度(例如在37或50℃)温育约1小时后，不超过约25%、不超过约20%、不超过约15%、不超过约14%、不超过约13%、不超过约12%、不超过约11%、不超过约10%、不超过约9%、不超过约8%、不超过约7%、不超过约6%、不超过约5%、不超过约4%、不超过约3%、不超过约2%、不超过约1%的蛋白质，或基本上没有蛋白质被蛋白酶降解时，则该多肽(例如dAb)是未被实质性降解的。可以使用任何合适的方法来评估蛋白质降解，例如通过SDS-PAGE或通过如本文中描述的功能性测定法(例如配体结合)。
用于生成具有增强的蛋白酶抗性的dAb的方法披露于例如WO2008149143中。在一个实施方案中，依照本文的单可变域、多肽或配体对leucozyme和/或胰蛋白酶的降解是抗性的。依照本文的多肽、免疫球蛋白单可变域和配体对以下一种或多种可以为抗性的：丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、硫醇蛋白酶、基质金属蛋白酶、羧肽酶(例如羧肽酶A、羧肽酶B)、胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、弹性蛋白酶、leukozyme、胰酶制剂、凝血酶、纤溶酶、组织蛋白酶(例如组织蛋白酶G)、蛋白酶(例如蛋白酶1、蛋白酶2、蛋白酶3)、嗜热菌蛋白酶、凝乳酶(chymosin)、肠肽酶、胱天蛋白酶(例如胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶12、胱天蛋白酶13)、钙蛋白酶(calpain)、无花果蛋白酶(ficain)、梭菌蛋白酶、奇异果蛋白酶(actinidain)、菠罗蛋白酶和分离酶(separase)。在具体的实施方案中，所述蛋白酶是胰蛋白酶、弹性蛋白酶或leucozyme。所述蛋白酶还可以由生物学提取物、生物学匀浆物或生物学制备物提供。可以在肺蛋白酶的存在下选择如本文中披露的多肽、免疫球蛋白单可变域和配体，从而使得所述多肽、免疫球蛋白单可变域和配体对所述肺蛋白酶为抗性的。在一个实施方案中，所述蛋白酶是在痰、粘液(例如胃粘液、鼻粘液、支气管粘液)、支气管肺泡灌洗物、肺匀浆物、肺提取物、胰腺提取物、胃流体、唾液中发现的蛋白酶。在一个实施方案中，所述蛋白酶是在眼和/或眼泪中发现的。在眼中发现的这类蛋白酶的例子包括胱天蛋白酶、钙蛋白酶、基质金属蛋白酶、解聚素(disintegrin)、金属蛋白酶(例如ADAM–一种解聚素和金属蛋白酶)和具有凝血酶敏感素(thrombospondin)基序的ADAM、蛋白体、组织纤溶酶原激活剂、分泌酶、组织蛋白酶B和D、胱抑蛋白(cystatin)C、丝氨酸蛋白酶PRSS1、泛素蛋白体途径(UPP)。在一个实施方案中，所述蛋白酶是非细菌的蛋白酶。在一个实施方案中，所述蛋白酶是动物例如哺乳动物，例如人的蛋白酶。在一个实施方案中，所述蛋白酶是GI管道蛋白酶或肺组织蛋白酶，例如在人中发现的GI管道蛋白酶或肺组织蛋白酶。此处列出的这类蛋白酶还可以用在记载于例如WO2008149143的方法中(牵涉将库全体暴露于蛋白酶)。
稳定性：在本文的一个方面，本文的多肽、单可变域、dAb、配体、组合物或制剂在Britton Robinson或PBS缓冲液中于37至50℃温育14天(多肽或可变域的浓度为1mg/ml)后基本上是稳定的。在一个实施方案中，在37℃的这类温育后至少65，70，75，80，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99%的多肽、拮抗剂或可变域等仍是未聚集的。在一个实施方案中，在37℃的这类温育后至少65，70，75，80，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99%的多肽或可变域仍为单体。
在一个实施方案中，在50℃的这类温育后至少5，10，15、20、25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99%的多肽、拮抗剂或可变域仍是未聚集的。在一个实施方案中，在50℃的这类温育后至少5，10，15、20、25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99%的多肽或可变域仍为单体。在一个实施方案中，在任一种这类温育之后未看到多肽、可变域、拮抗剂的聚集。在一个实施方案中，在37℃以Britton-Robinson缓冲液中1mg/ml的多肽或可变域浓度温育后，多肽或可变域的pI保持未变化或基本上未变化。在本文的一个方面，在4℃于Britton Robinson缓冲液或PBS中以7至7.5的pH(例如pH7或pH7.5)温育(多肽或可变域浓度为100mg/ml)7天后，本文的多肽、可变域、拮抗剂、组合物或制剂基本上是稳定的。在一个实施方案中，在这类温育后至少95，95.5，96，96.5，97，97.5，98，98.5，99或99.5%的多肽、拮抗剂或可变域仍是未聚集的。在一个实施方案中，在这类温育后至少95，95.5，96，96.5，97，97.5，98，98.5，99或99.5%的多肽或可变域仍为单体。在一个实施方案中，在任一种这类温育之后未看到多肽、可变域、拮抗剂的聚集。
在本文的一个方面，在例如于室温、20℃或37℃雾化(例如多肽或可变域浓度为40mg/ml)1小时后，例如喷气雾化，例如在Pari LC+cup中，本文的多肽、可变域、拮抗剂、组合物或制剂基本上是稳定的。在一个实施方案中，在这类雾化后至少65，70，75，80，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，95.5，96，96.5，97，97.5，98，98.5，99或99.5%的多肽、拮抗剂或可变域仍是未聚集的。在一个实施方案中，在这类雾化后至少65，70，75，80，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，95.5，96，96.5，97，97.5，98，98.5，99或99.5%的多肽或可变域仍为单体。在一个实施方案中，在任一种这类雾化之后未看到多肽、可变域、拮抗剂的聚集。
单体形式：在一个实施方案中，本文的dAb被鉴定为单体优先。适宜地，本文提供(基本上)纯的单体。在一个实施方案中，所述dAb是至少65%，70%，75%，80%，85%，90%，95%，98%，99%纯或100%纯的单体。为了测定dAb在溶液中是单体还是形成更高级的寡聚体，可以通过SEC-MALLS对其进行分析。SEC MALLS(具有多角度激光散射的尺寸排阻色谱)是本领域中任何技术人员都熟悉的一种用于表征溶液中的大分子的非侵入性技术。简言之，依照蛋白质(在缓冲液Dulbecco’s PBS中浓度为1mg/mL)的流体力学特性通过尺寸排阻色谱(柱：TSK3000；S200)将其分开。在分开后，使用多角度激光散射(MALLS)检测器来测量蛋白质散射光的倾向。将蛋白质通过检测器时散射的光的强度测量为角度的函数。此测量与使用折射指数(RI)检测器测定的蛋白质浓度一起允许使用合适的方程(分析软件Astra v.5.3.4.12的组成部分)来计算出摩尔质量。
治疗用途：本文提供了用于治疗、抑制或预防与TGFβ信号传导有关的疾病的方法。在一个实施方案中，这类疾病可能由异常调节的TGFβ信号传导、由TGFβ过表达或由高水平的生物可用的TGFβ导致或促成。与信号传导有关的疾病包括涉及各种组织形成纤维的疾病，如肺纤维化，包括特发性肺纤维化(IPF)和其它间质性肺疾病如急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、肝的纤维化包括肝硬化和慢性肝炎、类风湿性关节炎、眼部病症、血管疾患如再狭窄、皮肤的纤维化包括皮肤的瘢痕疙瘩，以及伤口愈合后的疤痕和杜普伊特伦氏挛缩，还有肾的疾患如肾炎、肾纤维化和肾硬化，或血管疾患如再狭窄。其它与TGFβ信号传导有关的疾病包括血管疾病如高血压、先兆子痫、I型遗传性出血性毛细管扩张症(HHT1)、HHT2、肺动脉高压、主动脉瘤、马方综合征、家族性动脉瘤病症、Loeys-Dietz综合征、动脉迂曲综合征(ATS)。其它与TGFβ信号传导有关的疾病包括肌肉骨骼系统的疾病，如杜兴氏肌营养不良和肌肉纤维化。另外与TGFβ信号传导有关的疾病包括癌症，如结肠癌、胃癌和胰腺癌，以及胶质瘤和NSCLC。另外，本文提供了通过调控肿瘤血管发生中的TGFβ信号传导或通过治疗癌症间质来靶向癌症的方法。其它疾病或疾患包括那些与组织疤痕有关的。其它疾病包括肺部疾病如COPD(慢性阻塞性肺疾病)、肝疾病如肝衰竭(例如病毒性肝炎、酒精性、肥胖型、自身免疫性、代谢性、阻碍性的)、肾疾病包括肾衰竭(例如糖尿病、高血压)、肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy)、移植排斥(肺/肝/肾)以及肥厚型和瘢痕疙瘩疤痕。
“纤维化”是细胞外基质组分如胶原的过度沉积从而导致组织的过度生长、疤痕和/或硬化的结果。
“皮肤纤维化”：皮肤的纤维化涵盖多种人病症，其具有不同病因但均有结缔组织代谢特别是皮肤成纤维细胞的调节不良。皮肤纤维化的特定例子包括瘢痕疙瘩疾病、肥厚型瘢痕(HS)和硬皮病。尽管瘢痕疙瘩疾病和肥厚型瘢痕不是同一疾患的亚型，但都起因于伤口愈合后的疤痕，其中瘢痕疙瘩散布到初始伤口位点以外而肥厚型瘢痕局限在初始伤口的边缘内。然而，硬皮病用于描述全身性硬化中皮肤的纤维化，它是导致多种器官纤维化的全身性疾患。在一个实施方案中，将如本文中披露的可变域、配体、融合蛋白或多肽用于预防或治疗瘢痕疙瘩疾病、肥厚型瘢痕或硬皮病。
“瘢痕疙瘩”是在遗传性易感的个体中作为异常的伤口愈合过程的结果形成的在皮肤损伤位点处的纤维性过度生长，并且与正常的瘢痕不同，它不消退。作为一种主要在具有黑色素皮肤的患者中观察到的疾病，“瘢痕疙瘩疾病”是人独有的良性的皮肤纤维性增殖性肿瘤，其从不变成恶性。
“杜普伊特伦氏挛缩”是在手掌皮肤下瘢痕组织的局部化形成。瘢痕在通常覆盖腱(牵引手指紧握)的组织(筋膜)中积累。随着杜普伊特伦氏挛缩进展，更多的筋膜变厚且变短，从而导致其中手指向手掌弯曲且不能完全伸展(拉直)的手的弯曲挛缩，在极端情况下导致不能使用手。
疤痕发生在对体内组织或器官的手术、损伤或创伤之后。它们是产生胞外基质以替换失去的正常组织的修复机制的结果。皮肤代表导致皮肤疤痕的最经常受损的组织，其能导致不良后果，包括：失去功能；挛缩；和可能对受害者产生心理影响的不美观。可以将瘢痕定义为对皮肤体系的正常结构和功能的肉眼可见的干扰，其由伤口愈合的终产物导致(Fergusson等，1996)。目前不存在有效预防或改善疤痕的疗法。
已观察到TGFβ在肺纤维化中的作用(Wynn等，J.Pathology2008、214，第199-210页；Sime等J.Clinical Immunology1997，第100卷，第768-776页)。观察到作为未知的肺损伤的结果，向Th2细胞因子生成增加和Th1细胞因子生成减少方向的转变。TGFβ的过表达刺激血管发生、成纤维细胞活化、ECM沉积和纤维发生。动物模型(例如TGFβ过表达、SMAD3KO、对TGFβR信号传导的抑制)显示TGFβ是肺纤维化产生的关键介导物。
“特发性肺纤维化(IPF)”是一种慢性和进展性疾病，其导致肺间质(interstitium)中起因未知的纤维化组织的异常和过度沉积。在美国每年每100,000人中发生约10-20例。流行程度随着年龄增长而急剧增加，超过75岁时每100,000人中达到175例，其开始通常发生在50岁和70岁之间。5年存活率为20%，均值存活期为2.8年。症状包括干咳和进展性呼吸困难(breathlessness)、异常胸X射线或HRCT和降低的肺容积。目前的治疗包括皮质类固醇(强的松(Prednisone))、免疫抑制剂(环磷酰胺)或移植，尽管现有的疗法都没有确证的功效。在一个实施方案中，本文的单可变域或多肽为IPF提供治疗。
适宜地，对特发性肺纤维化(IPF)的成功治疗会显示以下任意一种：肺成纤维细胞增殖降低、非成纤维细胞凋亡增加、过多胞外基质合成和沉积中的降低、胞外基质分解和重建的增加，或者会显示出针对正在发生的组织损伤的一些保护和正常组织病理学的复原。
适宜地，成功的治疗应当使疾病进展减缓。
可以在博来霉素诱导的肺纤维化模型中显示IPF治疗的功效。在一个实施方案中，本文的免疫球蛋白单可变域与小鼠TGFβRII交叉反应从而能在小鼠模型中测试其功效。
TGFβ是眼部组织中对细胞行为调控中的一种重要的细胞信号传导分子。TGFβ的过度活化涉及眼组织中纤维化疾病的发病机制，其可能是伤口愈合相关的并且导致受损的视力和眼部组织内稳态(由例如Saika，LaboratoryInvestigation(2006)，86，106-115综述)。
因此，在一个实施方案中，与TGFβ信号传导有关的疾病包括眼部病症如眼组织的纤维化疾病。眼的纤维化疾病可能发生于角膜、结膜、晶状体或视网膜。眼部病症包括增殖性玻璃体视网膜病变(vitreoretinopathy)(PVR，一种视网膜后脱离病症)和视网膜纤维化、糖尿病视网膜病变、青光眼如开角型青光眼、闭角型(angle-closure)、先天性和假性表皮剥脱综合征(pseudo-exfoliation syndrome)、晶状体中的伤口愈合反应如在化学烧伤或热烧伤后的、或Stevens-Johnson’s综合征、以及白内障术后并发症。TGFβ在白内障产生中也起着作用(Wormstone等Exp Eye Res；831238-1245、2006)。许多眼部病症的发生是术后纤维化的结果。另外，认为TGFβ2(转化生长因子β2)的过度活性导致青光眼滤过手术后眼中或眼周围疤痕。TGFβ2是涉及眼部组织，包括角膜、视网膜、结膜和小梁网(trabelular meshwork)的病理学疤痕的主要同等型。小梁网的疤痕或纤维化能导致正常水性流出路径的阻塞，从而导致眼内压升高和形成青光眼的风险。已经显示TGFβ2是青光眼疾病的预临床模型的病理剂。在患有青光眼的患者中TGFβ2水平升高，用TGFβ-2体外处理huTM细胞导致表型变化和ECM调控蛋白(MMP-2，PAI-I)的上调(Lutjen-Drecol(2005)，Experimental Eye Research，第81卷，第1期，pages1-4；Liton(2005)，Bi°Chemical and Biophysical Research Communications第337卷，第4期，第1229-1236页；Fuchshofer等(2003)，Experimental Eye Research，第77卷，第6期，第757-765页；Ass°Ciation for Research in Vision andOphthalmology(ARVO)会议海报#16312009)。此外，TGFβ在眼中的过表达在小鼠中导致青光眼样的病理学(ARVO会议海报#51082009)，并且已显示使用AAV递送TGFβ-2在青光眼大鼠模型中抑制视网膜神经节细胞损失(ARVO会议海报#5510 2009)。最近，已显示在培养的人视神经乳头星形胶质细胞中诱导氧化性应激提高TFGβ2分泌(Yu等(2009)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.50:1707-1717)。这些都指示，TGFβ2水平的降低可能使在青光眼中看到的视神经乳头变化最小化。然而，还已知TGFβ具有免疫抑制作用从而在一些方面可能是保护性的，因此在治疗慢性眼部疾患如青光眼时可能优选TGFβ2升高水平的降低而非完全敲低。因此，使用依照本文的dAb和组合物等可以治疗的疾病包括青光眼滤过手术后的疤痕。
因此，在一个方面提供用于治疗、抑制或预防与TGFβ信号传导，且特别是与异常调节的TGFβ信号传导有关的疾病的方法，包括对有此需要的哺乳动物施用治疗有效剂量或量的依照本文的多肽、融合蛋白、单可变域、拮抗剂或组合物。
在另一个方面，本文提供依照本文的免疫球蛋白单可变域、多肽、配体或融合蛋白用作药物。合适的药物可以包含如本文中描述的形式化的依照本文的免疫球蛋白单可变域等。
适宜地，所述药物是药物组合物。在本文的另一个方面，提供一种组合物(例如药物组合物)，其包含依照本文的多肽、单可变域、配体、组合物或拮抗物，以及生理学或药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方案中，所述组合物包含用于递送的媒介物。在具体的实施方案中，经由肺递送如通过吸入(例如支气管内、鼻内或口腔吸入，鼻内如通过滴剂)，或通过全身性递送(例如胃肠外、静脉内、肌内、腹膜内、动脉内、鞘内、关节内、皮下、阴道或直肠施用)来施用所述多肽、融合蛋白、单可变域、拮抗剂或组合物。在另一个实施方案中，例如通过局部施用，如眼滴剂、颗粒聚合物系统、凝胶或植入物，或通过眼内注射如注射到玻璃状液中来对眼施用依照本文的多肽、单可变域、配体或融合蛋白或组合物。递送可以靶向眼的特定区域如眼表面或泪小管或泪腺，或眼的前房或后房如玻璃状液。如果将免疫球蛋白单可变域、组合物等与眼渗透增强剂例如癸酸钠或粘度增强剂例如羟丙基甲基纤维素(HPMC)一起递送到眼时，也可以是有用的。在另外的实施方案中，将多肽、融合蛋白、单可变域、拮抗剂或组合物施用到皮肤；通过局部递送到皮肤表面和/或递送到皮肤内的区域例如皮内递送。
尽管皮肤是向身体递送的最可进入的器官，但皮肤的最外层屏障角质层(stratum corneum，SC)充当药物递送的限速障碍。传统上地，需要皮内注射来避开SC，从而允许药物递送到更深皮肤层的作用位点。然而，可以通过其它透皮递送办法来实现递送。可以将配制方法学用于递送，包括：改变SC的脂质结构的化学增强剂；使得能够跨滤泡运输的肽辅助物；以及在颗粒，包括脂质体、囊泡(niosome)、ethosome和transfersome中的壳体化(encapsidation)，据信其协助脂质的局部流态化以及延长效果的库的形成。已将离子电渗方法(iontophoresis)用于局部化的药物递送，其涉及跨皮肤应用小电位。离子电渗方法允许分别通过电迁移和电渗实现带电荷的和中性分子的递送。可以采用微型针在皮肤中创建微米尺寸的通道以越过SC，从而允许蛋白质经过这些通道到达更下层的表皮。可以将微型针广义分为实心的和中空的微型针。在药物施用前可以使用实心的微型针来扰乱SC，将其包被以允许药物从针头溶解时递送，或者是可溶性的，从而允许针头原位溶解时的药物释放。中空的微型针允许输注药物物质的液体制剂。与离子电渗方法不同，电穿孔需要更高的>50V的电压来改变皮肤渗透性以增强药物穿透。热力的和射频消蚀方法学允许通过局部化加热和消蚀SC来扰乱SC。在热消蚀中，这在应用高温较短时间段后发生，而射频消蚀涉及使用射频来振动皮肤上的微电极，从而导致局部化加热。还可以通过激光磨蚀(abrasion)、应用低频超声波(超声促渗(sonophoresis))和利用高速度推动药物通过SC的喷射注射器来实现对SC的扰乱。
此外，本文提供了使用依照本文的多肽、单可变域、组合物、配体或拮抗剂来治疗疾病的方法。在一个实施方案中，所述疾病是组织纤维化如瘢痕疙瘩疾病或杜普伊特伦氏挛缩。
在本文的一个方面，提供多肽、单可变域、配体、组合物或拮抗剂用于治疗和/或预防人中与TGFβ信号传导有关的疾病或疾患。在另一个方面，提供多肽、单可变域、组合物或拮抗剂在制备用于治疗或预防人中与TGFβ信号传导有关的疾病或疾患的药物中的用途。在另一个方面，提供治疗和/或预防人患者中与TGFβ信号传导有关的疾病或疾患的方法，所述方法包括对患者施用多肽、单可变域、组合物或拮抗剂。本文还涉及治疗方法，其包括对有此需要的受试者施用治疗有效量的本文的配体(例如拮抗剂或单可变域)。
在其它实施方案中，本文涉及用于治疗特发性肺纤维化的方法，包括对有此需要的受试者施用治疗有效量的本文的配体(例如拮抗剂或单可变域)。
本文还涉及包含本文的组合物(例如药物组合物)的药物递送装置。在一些实施方案中，所述药物递送装置包含配体的多个治疗有效剂量。
在其它实施方案中，所述药物递送装置选自下组：胃肠外递送装置、静脉内递送装置、肌内递送装置、腹膜内递送装置、透皮或皮内递送装置、肺部递送装置、动脉内递送装置、鞘内递送装置、关节内递送装置、皮下递送装置、鼻内递送装置、眼递送装置、阴道递送装置、直肠递送装置、注射器、透皮递送装置、皮内递送装置、胶囊剂、片剂、雾化器(nebulizer)、吸入器、喷雾器(atomizer)、烟雾器(aerosolizer)、产雾器(mister)、干粉吸入器、计量剂量的吸入器、计量剂量的喷雾机(sprayer)、计量剂量的产雾器、计量剂量的喷雾器和导管。在一个实施方案中，所述药物递送装置是透皮或皮内递送装置。
适宜地，本文提供肺部递送装置，其含有依照本文的多肽、单可变域、组合物或拮抗剂。所述装置可以是吸入器或鼻内施用装置。适宜地，所述肺部施用装置使得能够递送治疗有效剂量的依照本文的配体等。
在另一个实施方案中，本文提供眼递送装置，其含有依照本文的多肽、单可变域、组合物或拮抗剂。适宜地，所述眼递送装置使得能够递送治疗有效剂量的依照本文的配体等。
如本文中使用的，术语“剂量”指一次性对受试者施用的(单位剂量)，或者在限定的时间间隔内以两次或更多次施用的配体的量。例如，剂量可以指在1天(24小时)(每日剂量)、2天、1周、2周、3周或1个月以上的时程内对受试者施用(例如通过单次施用、或通过两次以上施用)的配体(例如包含结合TGFβRII的免疫球蛋白单可变域的配体)的量。剂量之间的时间间隔可以是任何期望的时长。在一个具体的实施方案中，通过注射，特别是通过皮内递送，每周或每两周或每7-10天地(例如每7，8，9或10天)将本发明的单可变域或多肽施用到皮肤内。
在一个实施方案中，以dAb单体，任选地未形式化(例如未PEG化或未经半衰期延长)或连接于PEG地，任选地作为干粉制剂地，来提供本文的单可变域，任选地通过吸入(例如肺递送)递送给患者，任选地用于治疗和/或预防肺疾患(例如特发性肺纤维化)。
本文的配体提供数个优点。例如，如本文中描述的，可以定制配体以使其具有期望的体内血清半衰期。dAb比常规抗体小得多，并且可以施用以实现比常规抗体更好的组织穿透。由此，dAb和包含dAb的配体在施用以治疗疾病，如TGFβ信号传导介导的疾病时，相对于常规抗体提供优点。具体地，肺递送本文的dAb来治疗特发性肺纤维化使得能特定的局部递送TGFβ信号传导的抑制剂。有利地，特异性结合并抑制TGFβRII的未形式化的dAb单体足够小以通过肺递送吸收到肺中。
通过引用方式将WO2007085815的例子并入本文中以提供可以同样应用于本文的配体的相关测定法、形式化和实验的详情。
本说明书中引用的所有公开内容，包括但不限于专利和专利申请，均通过引用方式如其完整列出的并入本文中。
仅出于例示目的，在下列实施例中对本文进行了进一步描述。
实施例
实施例1.选出结合TGFβRII的域抗体(dAb)
选出结合小鼠TGFβRII的dAb
幼稚化筛选(
Figure BDA0000378234380000371
Selection)：使用4G和6G幼稚化噬菌体库，对于4G，其为展示从GAS1前导序列表达的抗体单可变域噬菌体库(参见WO2005093074)，对于6G另外有加热/降温预选择(参见WO04101790)。通过在VH和VK库(鉴定为4G H11-19和6G VH2-4(VHdAb)以及4Gκ1，4Gκ2和6Gκ(VκdAb))的合集中淘选(panning)重组的小鼠和人TGF-β RII/Fc嵌合蛋白，来分离DOM23先导物(leads)。通过在人胚胎肾细胞系HEK-F中表达编码人TGFβ II型受体的胞外域的氨基酸残基第24至259位(Lin等，1992，Cell68:775-785)融合至人IgG1的Fc区的DNA序列来制备这些嵌合蛋白。
使用EZ-LINKTMSulfo-NHS-LC-生物素试剂(Pierce，R°Ckford，USA)将重组的小鼠和人TGF-β RII/Fc嵌合蛋白生物素化(Henderikx等、2002，Selection of antibodies against biotinylated antigens.Antibody Phage Display:Methods and prot°Cols，Ed.O’Brien and Atkin，Humana Press)。将噬菌体库合并成6组；4Gκ1和κ2，6Gκ，4G H11-13，4G H14-16，4G H17-19和6GVH2-4。每库合并有1x1011个噬菌体。
在2%MARVELTM奶粉的磷酸盐缓冲盐水(MPBS)中封闭噬菌体并加入10uM人IgG Fc片段(自人骨髓瘤血浆IgG衍生的天然IgG Fc片段，Calbi°Chem，California，US，目录号401104)达1小时。将200nM生物素化的小鼠TGF-β RII/Fc与封闭的噬菌体和Fc片段混合物在室温温育1小时，然后在链霉亲合素DYNAbeadsTM(Dynal，UK)上捕捉5分钟。将珠用1ml磷酸盐缓冲盐水/0.1%TWEENTM(PBST)清洗7次，接着用1ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗1次。将结合生物素化的小鼠TGF-βRII/Fc的噬菌体在500ul1mg/ml胰蛋白酶的PBS中洗脱10分钟，然后用于感染1.75ml对数期大肠杆菌TG1达30分钟。将细胞铺板到补充15ug/ml四环素的2x TYE(Trypton Yeast Extract)琼脂板上。对于后续的数轮选择，从平板上刮取细胞并用于接种50ml2x TY(Trypton Yeast)+15ug/ml四环素培养物，将其在37℃过夜生长用于噬菌体扩增。
通过将过夜培养物在4566g离心10分钟来回收扩增的噬菌体。含有扩增的噬菌体的40ml上清液加入10ml PEG/NaCl(20%v/w PEG8000+2.5M NaCl)并在冰上温育45至60分钟。将样品在4566g离心30分钟以使沉淀的噬菌体形成团粒。弃去上清液并将噬菌体团粒重悬于2ml15%v/v甘油/PBS中。将噬菌体样品转移至2ml Eppendorf管中并在g离心10分钟以除去任何残余的细菌细胞碎片。将此噬菌体用作第二轮选择的起始噬菌体。除了加入约1x1010个噬菌体以外，如对第一轮描述的来进行第二轮选择，并且在选择中使用200nM人TGF-βRII/Fc或20nM小鼠TGF-βRII/Fc。
将第二轮所得从fd-噬菌体载体pDOM4克隆到pDOM10中。载体pDOM4是fd噬菌体载体的衍生物，其中基因III信号肽序列被酵母糖脂锚定的表面蛋白(GAS)信号肽替换。它在前导序列和基因III之间还含有c-myc标签，其使基因III回到阅读框中。此前导序列在噬菌体展示载体以及其它原核表达载体中都功能良好并且可以通用。pDOM10是设计用于可溶性表达dAb的质粒载体。它基于pUC119载体，表达受到LacZ启动子的控制。通过将dAb基因在N末端融合通用GAS前导信号肽确保了dAb表达到上清液中(参见WO2005093074)。另外，在dAb的C末端附接有FLAG标签。
通过依照制造商说明书(目录号27104，Qiagen)使用QIAPREPTMSpinMINIPREPTM试剂盒从被所选的展示dAb的fd噬菌体感染的细胞分离pDOM4DNA来实施dAb基因的亚克隆。通过PCR来扩增DNA，其使用生物素化的寡核苷酸DOM57(5’TTGCAGGCGTGGCAACAGCG-3’(SEQ ID NO:197)和DOM6(5’-CACGACGTTGTAAAACGACGGCC-3’(SEQ ID NO:198))，用SalI和NotI限制性内切核酸酶消化并与用SalI和NotI消化的pDOM10连接。通过电穿孔将连接产物转化到大肠杆菌HB2151细胞中并铺板到用100μg/ml羧苄西林补充的TYE(Trypton Yeast Extract)板上(TYE-carb)。挑取各克隆，并在用100μg/ml羧苄西林补充的过夜表达的自诱导培养基(高水平蛋白质表达系统，Novagen)中表达，其在96孔板中于30℃或37℃伴随着摇动生长。然后将这些表达板在1800g离心10分钟。通过ELISA和BIACORETM(GEHEALTHCARETM)筛选或MSD(Meso Scale Discovery)结合测定法筛选鉴定出结合小鼠和/或人TGF-βRII/F的dAb克隆。对于ELISA，将96孔MaxisorpTM免疫板(Nunc，Denmark)在4℃用人或小鼠TGF-βRII/Fc过夜包被。将孔用PBST清洗3次，然后在室温用PBS中1%TWEENTM(1%TPBS)封闭1小时。除去封闭物并在室温加入1%TPBS和dAb上清液的1:1混合物达1小时。将板用PBST清洗3次并加入检测抗体(单克隆抗FLAG M2过氧化物酶抗体，Sigma-Aldrich，UK)，并在室温温育1小时。使用比色底物(SUREBLUETM1-组分TMB Microwell Peroxidase溶液，KPL，Maryland，USA)来显示板并在450nM处测量光密度(OD)，OD450与结合的检测抗体的量成比例。对于BIACORETM，将上清液在HBS-EP缓冲液中以1:1稀释并在BIACORETM上筛选对生物素化的人和小鼠TGF-βRII/Fc的结合(依照制造商推荐，SA芯片用1500Ru生物素化的hRII-Fc和1550Ru生物素化的mRII-Fc包被)(BIACORETM，GE HEALTHCARETM)。在BIACORETM上以50μl/分钟的流速运行样品。
幼稚化人的选择和筛选
选择结合人TGFβRII的dAb
如对小鼠TGFbRII描述的实施幼稚化选择，但在第一轮和第二轮分别使用150和15nM生物素化的人TGFbRII/Fc。使用与第二轮相同的方法来实施第三轮，但使用1.5nM生物素化的人TGFbRII/Fc。
从fd-噬菌体载体pDOM4克隆第三轮所得到pDOM10中。通过依照制造商说明书(目录号27104，Qiagen)使用QIAPREPTMSpin MINIPREPTM试剂盒从被所选的展示dAb的fd噬菌体感染的细胞分离pDOM4DNA来实施dAb基因的亚克隆。用SalI和NotI限制性内切核酸酶消化质粒DNA并将dAb基因插入与用SalI，NotI和PstI限制性内切核酸酶消化的pDOM10连接。通过电穿孔将连接产物转化到大肠杆菌HB2151细胞中并铺板到补充了100μg/ml羧苄西林的TYE(Trypton Yeast Extract)板上(TYE-carb)。挑取各克隆，并在96孔板中以250rpm，在30℃72小时在1ml/孔的用100μg/ml羧苄西林补充的过夜表达自诱导培养基(Novagen)中表达。然后将这些表达板在1800g离心10分钟。在与荧光极化浓度测定法组合的TGFbRII MSD结合测定法中针对抗原结合对可溶性dAb上清液进行筛选。人TGFbRII结合物的数量较高，且有太多用于进行进一步表征的克隆。因此，对克隆的子集测序并进一步表征具有独特序列的那些。
TGFβRII MSD结合测定法
此测定法用于测定抗TGFbRII dAb的结合活性。将TGFbRII-Fc抗原包被于MSD板上，然后将其封闭以防止非特异性结合。加入系列稀释的含可溶的经FLAG标记的dAb。在温育后，清洗板并且仅特异性结合TGFBRII-Fc的dAb保持与板结合。用钌化(ruthenylated)的抗经FLAG标记的抗体和MSD阅读缓冲液来检测结合的dAb。如果使用荧光极化浓度测定法来测定上清液稀释物中dAb的浓度，那么绘出浓度结合曲线。
将0.5ul每孔的60μg/ml人TGFbRII-Fc、60μg/ml小鼠TGFbRII-Fc或60ug/ml人IgG1 Fc(R&D systems，目录号110-HG)点样到384孔MSD高结合板(Meso Scale Discovery)上。将板在室温最少空气干燥4小时且不长于过夜。将板用50ul每孔的5%MARVELTM的Tris缓冲盐水(TBS)+0.1%TWEENTM20在室温封闭1小时或4℃过夜。通过轻弹板将封闭试剂从孔除去。在2xTY培养基中制备dAb上清液的1:3稀释系列。在pDOM10表达载体中表达dAb，从而使dAb蛋白表达为FLAG融合蛋白。除去封闭试剂并将10ul每孔的稀释的dAb上清液转移至封闭的MSD板中。以4点曲线或以11点曲线来筛选dAb上清液。除了稀释的dAb上清液外，在每板中包含2个对照，1个没有TGFbRII结合特异性的低对照(标准化至0%结合)，1个具有高TGFbRII结合特异性的高对照(标准化至100%结合)，数据未显示。
将板与dAb上清液和对照样品在室温温育1小时，然后用每孔50ul的TBS+0.1%TWEENTM清洗3次。将15ul/孔钌化的抗FLAG抗体加入板并在室温温育1小时。按照制造商说明书(Meso Scale Discovery，目录号R91BN-1)，将抗FLAG抗体(抗FLAG M2单克隆抗体，Sigma，UK，目录号F3165)与钌II三-双吡啶N-羟基琥珀酰亚胺缀合。除了小鼠抗人IgG1 Fc抗体对照孔之外，向所有孔加入钌化的抗FLAG抗体。作为替换，加入15ul/孔的抗小鼠MSD标签(Meso Scale Discovery，目录号R31AC-1)。将抗小鼠MSD标签在2%MARVELTMin TBS+0.1%TWEENTM20中稀释至终浓度为750ng/ml。将板在室温温育1小时并用50ul每孔的TBS+0.1%TWEENTM清洗3次。向每孔加入35ul1x MSD阅读缓冲液(Meso Scale Discovery)并在MSD Sector6000阅读器(Meso Scale Discovery)上读板。
使用XC50Activity Base来分析数据。将所有数据都标准化为每个板上的高和低对照孔的均值，低对照标准化为0%结合而高对照标准化为100%结合。将4参数曲线拟合应用于标准化的数据，并绘出使用dAb浓度的浓度结合曲线，所述dAb浓度是使用在上清液测定法中对dAb的荧光极化浓度测定计算出来的。
使用的4参数拟合如下：
，其中a为最小值，b为Hill斜率，c为XC50且d为最大值。
在上清测定法中测定dAb的荧光极化浓度
此测定法允许测定在上清液中表达的可溶性的经FLAG标记的dAb的浓度。将荧光标记的FLAG肽与抗FLAG抗体混合。用531nM波长处的偏振光激发荧光分子，并读出595nM波长处发射的偏振光。经FLAG标记的dAb的加入导致荧光肽从抗FLAG抗体位移，这相应地导致发射信号的偏振减少。作出已知浓度的纯化的经FLAG标记的VH模拟(dummy)dAb的标准曲线，并用于回推计算出上清液中可溶性dAb的浓度。将浓度数据与结合活性数据组合，从而允许针对dAb上清液绘出浓度结合曲线。
将dAb上清液在2xTY培养基中以1:2系列(1:2，1:4，1:8和1:16)稀释，接着在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中以1:10稀释。将稀释的上清液转移至黑色的384孔板中。通过将纯化的VH模拟dAb在PBS中10%v/v的2xTY培养基中以1:1.7系列稀释来设定标准曲线。最高dAb浓度为10uM，并且总共有16份稀释物。将每份稀释物5ul转移至384孔板中。制备5nM FLAG肽(在C末端用Cy3b标记)、100mM抗FLAG M2单克隆抗体(Sigma，目录号F3165)、0.4mg/ml牛血清白蛋白(BSA)在2mM CHAPs缓冲液中的混合物。将5ul混合物转移至含有稀释的dAb的孔中(上清液和标准曲线孔)。将板以1000rpm(216g)离心1分钟，然后在黑暗中在室温温育15分钟。在装有下列滤光器的ENVISIONTM阅读器(Perkin Elmer)上读板；
激发滤光器：BODIPY TMR FP531
发射滤光器1：BODIPY TMR FP P pol595
发射滤光器2：BODIPY TMR FP P pol595
反射器(Mirror)：BODIPY TMR FP Dual Enh
绘出标准曲线并用于回推计算上清液中可溶性dAb的浓度。
在过夜表达自诱导培养基(ONEXTM，Novagen)中于30℃表达在ELISA、BIACORETM和MSD测定法中鉴定的结合小鼠和人TGF-βRII/Fc的dAb达48至72小时。将培养物离心(4,600rpm，30分钟)并将上清液与STREAMLINETM-蛋白A珠(Amersham Biosciences，GE HEALTHCARETM，UK。结合能力：每ml珠5mg dAb)在4℃过夜温育或在室温温育至少1小时。将珠填充到色谱柱中并用1x或2xPBS清洗，接着通过10或100mM Tris-HCl pH7.4(Sigma，UK)清洗。用0.1M甘氨酸-HCl pH2.0洗脱结合的dAb并用1M Tris pH8.0中和。测量dAb在280nm处的OD，并使用从dAb的氨基酸组成计算出的消光系数来测定蛋白质浓度。
下面给出了抗人和抗鼠TGFRII dAb幼稚化先导物的氨基酸和核酸序列。
Dom23h802氨基酸序列(SEQ ID NO:1)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSEGTMWWVRQAPGKGLEWVSAILAAGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKKRQERDGFDYWGQGTLVTVSS
Dom23h802核酸序列(SEQ ID NO:39)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGTGAGGGGACGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGCTATTTTGGCTGCTGGTTCTAATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAAAGAGGCAGGAGCGGGATGGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Dom23h803氨基酸序列(SEQ ID NO:2)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAGRMWWVRQAPGKGLEWVSAINRDGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHDDGHGNFDYWGQGTLVTVSS
Dom23h803核酸序列(SEQ ID NO:40)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGTGCTGGGCGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGCGATTAATCGGGATGGTACTAGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGTGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACATGATGATGGTCATGGTAATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
DOM23h-813氨基酸序列(SEQ ID NO:3)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTDDRMWWVRQAPGKGLEWVSAIQPDGHTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAEQDVKGSSSFDYWGQGTLVTVSS
DOM23h-813核酸序列(SEQ ID NO:41)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATCCACCTTTACGGATGATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGCTATTCAGCCTGATGGTCATACGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGGAACAGGATGTTAAGGGGTCGTCTTCGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
DOM23h-815氨基酸序列(SEQ ID NO:4)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAEDRMWWVRQAPGKGLEWVSAIDPQGQHTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQSTGSATSDYWGQGTLVTVSS
DOM23h-815核酸序列(SEQ ID NO:42)
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DOM23m-4核酸序列(SEQ ID NO:57)
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DOM23m-72氨基酸序列(SEQ ID NO:24)
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DOM23m-81氨基酸序列(SEQ ID NO:25)
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DOM23m-99氨基酸序列(SEQ ID NO:26)
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YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRLASRSHFDYWGQGTLVTVSS
DOM23m-99核酸序列(SEQ ID NO:64)
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DOM23m-101氨基酸序列(SEQ ID NO:27)
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DOM23m-101核酸序列(SEQ ID NO:65)
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DOM23h-352氨基酸序列(SEQ ID NO:28)
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DOM23h-352核酸序列(SEQ ID NO:66)
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在下表1和2中分别显示了由这些抗人和抗鼠TGFRII dAb幼稚化先导物的Kabat定义的CDR。
表1.抗人TGFβRII dAb的CDR序列
Figure BDA0000378234380000561
Figure BDA0000378234380000571
表2.抗鼠TGFβRII dAb的CDR序列
Figure BDA0000378234380000581
实施例2.DSC(差示扫描量热法)-幼稚化的克隆
使用差示扫描量热法(DSC)测定dAb的热稳定性。将dAb过夜渗析到PBS中至终浓度为1mg/ml。将渗析缓冲液用作所有样品的参照。使用GEHEALTHCARETM-MICR°CALTMVP-DSC毛细管室微型热量计实施DSC测量，加热速率为180℃/小时。对于参照缓冲液和蛋白质样品，典型的扫描范围为20-90℃。每次都实施重扫描仪评估蛋白质在这些实验条件下的重折叠程度。在每次蛋白质样品扫描后，用水中5%的DECONTM(Fisher-Scientific)溶液清洁毛细管室，接着进行PBS扫描。使用Origin7.0软件分析所得数据迹线。从蛋白质样品扫描的DSC迹线减去从参照缓冲液扫描所获得的DSC迹线。将蛋白质样品的精确摩尔浓度输入到数据分析程序中以得到解链温度(Tm)值、焓(ΔH)和Van’t Hoff焓(ΔHv)值。将数据拟合于非2相模型(N2M)。用1或2个转变事件获得最佳拟合。本专利中描述的dAb获得的Tm值范围为52.1℃至73.3℃。在表3中显示Tm值和重折叠百分数。
表3
Figure BDA0000378234380000591
Figure BDA0000378234380000601
通过加热至高达至少52℃时，所有分子均保持三级结构。
实施例3.SEC-MALS(具有多角度激光散射的尺寸排阻色谱)-幼稚化的克隆
为了确定dAb在溶液中是单体还是形成更高级的寡聚体，通过SEC-MALLS(具有多角度激光散射的尺寸排阻色谱)对其进行分析。将具有自动采样器和UV检测器的Agilent1100系列HPLC系统(由Empower软件控制)连接到Wyatt Mini Dawn Treos(激光散射(LS)检测器)和Wyatt Optilab rEXDRI(差示折射指数(RI)检测器)。检测器以下列次序连接：-UV-LS-RI。RI和LS仪器均在658nm波长处运行；在280nm和220nm波长处监测UV信号。根据dAb的流体力学特性，使用GE HEALTHCARETM10/300Superdex75柱通过尺寸排阻色谱来将dAb(以PBS中1mg/mL的浓度注射100微升)分开。流动相为PBS加10%乙醇。蛋白质通过检测器时散射光的强度测量为角度的函数。该测量与使用RI检测器测定的蛋白质浓度一起允许使用合适方程(分析软件Astra v.5.3.4.14的组成部分)计算出摩尔质量。本文中描述的所有dAb具有范围从65%至98%的单体含量。数据显示在表4中。
表4
dAb名称 由SEC-MALLS测定的单体(%)
DOM23h-802 92.5
DOM23h-803 96.4
DOM23h-813 96.6
DOM23h-815 98
DOM23h-828 80
DOM23h-830 65
DOM23h-831 72
DOM23h-840 91
DOM23h-842 91.6
DOM23h-843 90.2
DOM23h-850 97.7
DOM23h-854 83.4
DOM23h-855 96.3
DOM23h-865 83
DOM23h-866 92.4
DOM23h-874 92.6
DOM23h-883 93.5
DOM23h-903 96.5
DOM23m-4* 93
DOM23m-29* 95
DOM23m-32* 92
DOM23m-62 未测定
DOM23m-71* 88
DOM23m-72 未测定
DOM23m-81 未测定
DOM23m-99 79
DOM23m-101 77.4
DOM23m-352 93
*使用如上述的同一SEC-MALLS设置运行这些dAb，只不过使用的HPLC为ShimadzuLC-20AD Prominence系统。还在Superdex75柱上运行这些dAb，但流动相缓冲液为PBS。
在溶液状态(对单体的倾向)和热稳定性基础上选择表3和4中列出的分子。在加热至高达至少52℃时，所有分组均显示出≥65%的单体化倾向并维持三级结构。
实施例4.针对TGFβRII抑制的测定法(幼稚化的克隆)
MC3T3-E1萤光素酶测定法-方法m1：
MC3T3-E1萤光素酶测定法测量dAb抑制MC3T3-E1细胞中TGFβ诱导的CAGA萤光素酶表达的能力。在人PAI-1启动子中存在3拷贝的TGFβ应答序列基序，称为CAGA盒，并且其特异性结合Smad3和4蛋白。将CAGA盒的多拷贝克隆到萤光素酶报告构建体中，使得用该报告系统转染的细胞具有TGFβ应答性。该测定法使用被[CAGA]12萤光素酶报告构建体稳定转染的MC3T3-E1细胞(小鼠成骨细胞)(Dennler，等(1998)EMBO J.17，3091–3100)。
测试可溶性的dAb阻断TGF-β1经由Smad3/4途径信号传导的能力。
用于产生数据的方案(表5中表示为方法m1)如下。简言之，向组织培养96孔板(Nunc)加入测定法培养基(RPMI培养基(Gibco，Invitrogen Ltd，Paisley，UK)，10%热灭活的胎牛血清和1%青霉素/链霉素)中每孔2.5x104个MC3T3-E1细胞，接着加入dAb和TGF-β1(终浓度1ng/ml)，并在37℃、5%CO2温育6小时。在该测定法中测试之前，将dAb渗析到PBS中。向孔中加入BRIGHTGLOWTM萤光素酶试剂(Promega，UK)，并在室温温育2分钟以允许细胞裂解，在发光计上测量所得发光。
将此测定法实施多次以获得在表5中汇总的最大%抑制值的平均值和范围。此方法经过修改并在下文描述。
修改后的MC3T3-E1萤光素酶测定法-方法m2
将MC3T3-E1细胞以“接种培养基(plating medium)”(MEM-α+核苷，+脱氧核苷(Invitrogen22571)，5%活性炭处理过的FCS(Perbio Sciences UK Ltd；SH30068.03)，1/100丙酮酸钠(Invitrogen11360)，250μg/ml遗传霉素50mg/ml(Invitrogen，10131027))中每孔1.25x104个加入96孔板(Nunc13610)中，并在37℃、5%CO2过夜温育。将来自细胞的培养基用“测定法培养基”(DMEM(Invitrogen31966021)，25mM Hepes(Invitrogen))替换，并将PBS中的纯化dAb以4倍终测定法浓度滴定到“测定法培养基”中并加到细胞板，接着以4倍EC80加入TGF-β1(R&D、240B)。将板在37℃、5%CO2温育6小时。将STEADYLITETM萤光素酶试剂(PerkinElmer6016987)加到孔中并在室温温育30分钟，在ENVISIONTM读板器上测量所得发光。
在测定法中一式两份地滴定每种dAb并测定最大%抑制(n=2)。将测定法实施多次以获得在表5中汇总的最大%抑制值的平均值和范围。达到测定法QC参数；内部(in-house)小分子对于小鼠测定法显示出100至900nM的IC50范围。还有，稳健Z因子大于0.4，且TGF-β EC80在加入测定法的浓度的6倍以内。
A549IL-11释放测定法-h1
A549白介素-11(IL-11)释放测定法测量dAb对人TGF-β1刺激的IL-11从A549细胞释放进行抑制的能力。TGF-β1直接结合TGF-βRII并诱导TGF-βRI/II复合物的装配。TGF-βRI是磷酸化的且能够通过数个途径包括Smad4途径来发信号。对Smad4途径的激活导致IL-11的释放。IL-11被分泌到细胞上清液中，然后通过比色ELISA测量。
测试可溶性dAb阻断TGF-β1经由Smad4途径信号传导的能力。简言之，将“测定法培养基”(DMEM高葡萄糖培养基(GibcoTM，Invitrogen Ltd，Paisley，UK)，10%热灭活的胎牛血清(PAA，Austria)，10mM HEPES(Sigma，UK)和1%青霉素/链霉素(PAA，Austria))中每孔1x105个A549细胞加到组织培养96孔板(Nunc)，接着加入dAb和TGF-β1(终浓度3ng/ml)(R&D Systems，Abingdon，UK)，并在37℃、5%CO2过夜温育。在测定前，将dAb渗析到PBS中。依照制造商说明书使用人IL-11DUOSETTM(R&D systems，Abingdon，UK)，测量释放到上清液中的IL-11的浓度。
A549IL-11释放测定法在表5和6中称为测定方法h1。将此测定法实施多次以获得在表5中汇总的最大%抑制值的平均值和范围。达到QC参数；内部小分子对于人测定法显示出50至500nM的IC50范围。
SBE-bla HEK293T细胞传感器测定法-h2
Smad信号转导分子家族的成员是将TGF-β信号从细胞表面传递到细胞核的胞内途径的组分。TGF-β1直接结合TGF-βRII并诱导TGF-βRI/II复合物的装配。然后Smad2和Smad3通过TGF-βRI磷酸化，接着与co-smad家族成员Smad4形成异聚复合物。这些复合物被移动到细胞核，在该处其结合DNA并调节基因转录。
Cell Sensor SBE-bla HEK293T细胞含有在Smad结合元件(SBE)控制下的β-内酰胺酶报告基因，其被稳定整合到HEK293T细胞(Invitrogen，UK)中。细胞对TGF-βI是应答的，并且可以用于检测Smad2/3信号传导途径的激动剂/拮抗剂。
根据以下方法测试可溶性dAb阻断TGF-β1经由该途径进行信号传导的能力，该方法基于来自Invitrogen，UK，(细胞系K1108)的优化方法。
直接从已在生长培养基(DMEM高葡萄糖，Invitrogen21068028，10%渗析的U.S.FBS，Invitrogen26400-044，0.1mM(1/100)非必需氨基酸，Invitrogen11140-050，25mM(1/40)HEPES缓冲物，Sigma H0887，1mM(1/100)丙酮酸钠，Invitrogen11360-070，1%GLUTAMAXTM.(200mM Invitrogen35050038)，5μg/ml杀稻瘟素(Blasticidin)，Invitrogen R21001)中生长至少4次传代并在内部冷冻(4x107/ml)的冷冻细胞实施测定法。将细胞以每孔20,000个细胞平板接种到细胞培养板(Costar3712)中的接种培养基(如上文，1%FCS无杀稻瘟素)内。在将细胞过夜温育后，将纯化的dAb在“测定法培养基”(DMEM(Invitrogen31966021)、25mM Hepes(Invitrogen))中稀释并以4倍终测定法浓度加到细胞。在37℃温育1小时后，以4倍EC80加入TGF-β(R&D Systems；240B)并再温育5小时。依照制造商说明书制备LIVEBLAZERTM底物(Invitrogen K1030)，并以8倍体积加入。在黑暗中于室温温育板16小时，并依照Invitrogen方案在ENVISIONTM读板器上读数。
SBE-bla HEK细胞ENSORTM测定法在表5和6中称为方法h2。在测定法中一式两份地滴定每种dAb并测定IC50和最大%抑制(n=2)。由于在小鼠测定法中获得完整曲线的困难性，在表5中仅提供%抑制。将测定法实施多次以获得在表5和6中汇总的值的平均值和范围。使用pIC50’s(IC50的负对数)计算算术均值IC50，并从均值pIC50加上和减去对数标准偏差来计算范围，然后转换回IC50。达到测定法QC参数；内部小分子对于人测定法显示出50至500nM的IC50范围。还有，稳健Z因子大于0.4，且TGF-βEC80在加入测定法的浓度的6倍以内。
结果显示在表5和6中。
表5.小鼠特异性克隆加VH模拟dAb的细胞功能测定法数据
Figure BDA0000378234380000641
Figure BDA0000378234380000651
表6.人特异性克隆物加VH模拟dAb的细胞功能数据.
Figure BDA0000378234380000652
小鼠克隆基于它们在数种测定法中显示出的对TGF-β超过40%的中和进行选择。对此唯一的例外是DOM23m-72。这些克隆还显示出较好的中和曲线(数据未显示)。人克隆基于平均IC50低于15μM进行选择。
实施例5.对幼稚化克隆(来自实施例1)的易错亲和力成熟
实施易错诱变以改进鉴定为有活性的、具有合适的生物物理学属性(上文已描述)的dAb的亲和力。
噬菌体库构建：使用GENEMORPHTMII随机诱变试剂盒(Stratagene，CatNo200550)来制备DOM23h-843，DOM23h-850，DOM23h-854，DOM23h-855，DOM23h-865，DOM23h-866，DOM23h-874，DOM23h-883，DOM23h-439和DOM23h-903的易错库。通过PCR扩增靶dAb基因，其使用Taq DNA聚合酶和寡核苷酸DOM008(5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’(SEQ IDNO:185))和DOM009(5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’(SEQ IDNO:186))，接着再扩增稀释的PCR产物，其使用寡核苷酸DOM172(5’TTGCAGGCGTGGCAACAGCG-3’(SEQ ID NO:187))和DOM173(5’-CACGACGTTGTAAAACGACGGCC-3’(SEQ ID NO:188))以及MUTAZYMETMII DNA聚合酶(依照制造商说明书)。进一步使用Taq DNA聚合酶和寡核苷酸DOM172和DOM173来扩增该PCR产物以增加DNA产物产量。用Sal I和Not I限制性内切核酸酶消化PCR产物。使用链霉亲合素珠(DynalBiotech，UK)将未消化的产物和消化后的末端从消化后的产物移走。对于抗人易错选择，将消化后的产物连接到用Sal I和Not I限制性内切核酸酶消化过的pDOM4噬菌体载体中，并用于转化大肠杆菌TB1细胞。将经转化的细胞铺板于用15μg/ml四环素补充的2xTY琼脂上，得到的库尺寸为超过1×107种转化体。
人TGFβRII特异性dAb易错选择：对DOM23h-843，DOM23h-850，DOM23h-854，DOM23h-855，DOM23h-865，DOM23h-866，DOM23h-874，DOM23h-883，DOM23h-903和DOM23h-439库实施3轮选择。第1轮使用1nM生物素化的人TGFβRII/Fc(N13241-57)实施。按照两种不同的方法来实施第2轮和第3轮，方法1使用抗原的二聚TGFβRII/Fc形式而方法2使用TGFβRII的可溶性的单体形式。方法1：第2轮用1nM生物素化的人TGFβRII/Fc和1uM未生物素化的人TGFβRII/Fc竞争物实施。第3轮用100pM生物素化的人TGFβRII/Fc和1uM未生物素化的人TGFβRII/Fc(N12717-4)实施。方法2：第2轮用1nM生物素化的人TGFβRII和1uM未生物素化的人TGFβRII竞争物实施。第3轮用100pM生物素化的人TGFβRII和1uM未生物素化的人TGFβRII竞争物实施。
将第2轮和第3轮选择所得亚克隆到pDOM13载体中，如上文描述的。挑取各克隆物并在96孔板中表达，其以850rpm、37℃、90%湿度在0.5ml/孔的补充有100μg/ml羧苄西林的过夜表达自诱导培养基中达24小时。然后以1800g将表达板离心10分钟。将上清液在HBS-EP缓冲液中以1/5或1/2稀释，并在BIACORETM上针对结合生物素化的人TGF-β RII/Fc(依照制造商的推荐方案用1000Ru生物素化的hRII-Fc包被SA芯片)(BIACORETM，GEHEALTHCARETM)进行筛选。在BIACORETM上以50μl/分钟的流速运行样品。在50ml过夜表达自诱导培养基中在30℃达48至72小时来表达以高数值的共振单位(RU)结合或相比于亲本克隆物具有改进的解离速率的克隆物，并以4,600rpm离心30分钟。将上清液在4℃与Streamline-蛋白A珠过夜温育。然后将珠填充到滴柱(drip column)中，用5个柱体积的2xPBS清洗，接着用1个床体积的10mM Tris-HCl pH7.4清洗，并且在0.1M glycine-HCl，pH2.0中洗脱结合的dAb，并用1M Tris-HCl，pH8.0中和。测量dAb在280nm处的OD，并使用从dAb的氨基酸组成计算出的消光系数来测定蛋白质浓度。
对改进解离速率的易错选择的体外分析：纯化后的dAb进行与幼稚化选择相同的测试，即Biacore、SBE-bla HEK293T细胞传感器测定法(h2)、DSC和SEC-MALS。在表6A中列出了比亲本改进的克隆物的例子。IC50值是‘n’个实验的均值。
表6A
Figure BDA0000378234380000671
*括号中提供用于计算均值IC50的实验次数
亲和力成熟的序列
DOM23h-855-21核酸序列(SEQ ID NO:203)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGAGAATACGAGTATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACGTATTGATCCTAAGGGTAGTCATACATACTACACAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAATACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGCGTGAGTTGGGTAAGTCGTATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
DOM23h-855-21氨基酸序列(SEQ ID NO:204)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFENTSMGWVRQAPGKGLEWVSRIDPKGSHTYYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQRELGKSYFDYWGQGTLVTVSS
DOM23h-843-13核酸序列(SEQ ID NO:205)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGATCAGGATCGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCCCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGCTATTGAGAGTGGTGGTCATAGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT
CTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAATCAGAATAAGTCGGGGCGTTCGGGTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
DOM23h-843-13氨基酸序列(SEQ ID NO:206)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDQDRMWWVRQAPGKGLEWVSAIESGGHRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCANQNKSGRSGFDYWGQGTLVTVSS
DOM23h-439-20核酸序列(SEQ ID NO:207)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGGACGGAGCAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTTTGTCTCACGTATTGATTCGCCTGGTGGGAGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACGGCATGCGGCTGGGGTTTCGGGTACTTATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
DOM23h-439-20氨基酸序列(SEQ ID NO:208)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRHAAGVSGTYFDYWGQGTLVTVSS
实施例6.DOM23h-271-7系的亲和力成熟
DOM23h-271氨基酸序列(SEQ ID NO:199)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGNRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQIPGRKWTANSRFDYWGQGTLVTVSS
DOM23h-271核酸序列(SEQ ID NO:200)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTAATCGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGATTCCGGGGCGTAAGTGGACTGCTAATTCGCGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
DOM23h-271-7氨基酸序列(SEQ ID NO:201)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGNRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQIPGRKWTANSRFDYWGQGTLVTVSS
DOM23h-271-7核酸序列(SEQ ID NO:202)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTAATCGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGATTCCGGGGCGTAAGTGGACTGCTAATTCGCGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
在之前的选择活动中已将域抗体DOM23h-271(SEQ ID No:199)从噬菌体库分离，并且在易错亲和力成熟后将变体DOM23h-271-7(SEQ ID NO:201)分离，均如WO2011/012609中所记载。基于DOM23h-271-7(SEQ ID NO:201)的结合动力学、序列和生物物理学行为来对其进一步的亲和力成熟进行选择。使用简并诱变来实施亲和力成熟以再多样化CDR，并且使用DNA展示或噬菌体展示来鉴定改进的先导物。构建两种类型的库以再多样化CDR，且这些被称为三联体和掺杂(doped)库。为了制备三联体库，将寡核苷酸引物设计为覆盖每个CDR，并且在每条引物内，将3个氨基酸的密码子用NNK密码子替换，从而使得3个位置多样化。使用多种寡核苷酸来覆盖每个CDR内所有的靶氨基酸；CDR1 2种、CDR2 3种、CDR3 6种。使用互补的寡核苷酸引物来扩增含每种突变CDR的序列片段，以及覆盖dAb编码序列剩余部分的重叠序列片段。将这些片段混合并通过剪接延伸重叠PCR装配以生成全长dAb编码序列。使用引物DOM172(SEQ ID NO:187)和DOM173(SEQ ID NO:188)将此产物PCR扩增，用SalI和NotI消化，并连接到类似切割的pDOM4(如上文描述的)中用于噬菌体选择，或连接到pIE2A2(记载于WO2006018650)中用于DNA展示选择。使用类似的方法，基本如记载于WO2006018650的来构建掺杂库。将单独的一种简并寡核苷酸引物用于覆盖每个CDR内的所有突变。在每个引物内，使用指定多个氨基酸的简并密码子来指定要多样化的氨基酸。在CDR1中使5个氨基酸多样化，在CDR2中使7个氨基酸且在CDR3中使13个氨基酸多样化。在引物中使用了下列简并编码：‘a’=91%A+3%T+3%G+3%C；‘g’=91%G+3%T+3%C+3%A；‘c’=91%C+3%T+3%G+3%A；‘t’=91%T+3%A+3%G+3%C；‘S’=50%G和50%C。大写字母指示100%的指定核苷酸。使用的引物为：
271-7R1简并CDR1
(GCAGCCTCCGGATTCACCTTTacSgaStatagSATGtgSTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGG)(SEQ ID NO:189)；
271-7R2简并CDR2
(GGGTCTCGAGTGGGTCTCAgcSATTgaSccSatSggSaaScgSACATACTACGCAGACTCCGTG)(SEQ ID NO:190)；
271-7R3简并CDR3:
(GCGGTATATTACTGTGCGAAAcaSatSccSggScgSaaStgSacSgcSaaStcScgSttSGACTACTGGGGTCAGGG)(SEQ ID NO:191)。
以与三联体引物相同的方式使用简并库引物。分别扩增每种多样化的CDR并使用剪接延伸重叠与亲本序列片段组合。使用SalI和NotI将片段亚克隆到pDOM4和pIE2A2中。
DNA展示
使用乳液中的体外区室化并使用scArc DNA结合蛋白的DNA展示来实施选择，基本如WO2006018650所记载。简言之，使用5:1摩尔比的生物素和EZ-LINKTMSulpho-NHS-LC-Biotin试剂盒(Thermo#21327)将TGFbRII-FC抗原生物素化。使用侧接引物，从pIE2A2载体PCR扩增出含有Arc操纵基因序列和表达盒(含多样化的dAb库)的DNA片段。从eGel(Invitrogen)纯化产物并在1mg/ml BSA中稀释为1.7或0.85nM。对于改进的结合物的选择，分别在稍微不同的条件下处理掺杂库和三联库。将三联CDR库组合以产生合并的CDR1、2或3库。对每一类型的库使用10轮选择。对于两种方法，在2轮选择循环后，通过剪接重叠延伸PCR将多样化的CDR扩增并重新组合以产生在所有3个CDR中有突变的第4个库。
对于掺杂库，将5x108个DNA拷贝与50ul EXPRESSWAYTM体外翻译混合物(Invitrogen)混合。每反应含有
Figure BDA0000378234380000721
SLYDTM提取物；
Figure BDA0000378234380000722
2.5x反应缓冲液；
Figure BDA0000378234380000723
2x饲养缓冲液；
Figure BDA0000378234380000724
甲硫氨酸(75mM)；
Figure BDA0000378234380000725
氨基酸混合物(50mM)；
Figure BDA0000378234380000726
H2O；0.5μl T7聚合酶；0.25μl抗HA单抗3F10(R°Che，cat.1867423)；以及
Figure BDA0000378234380000727
谷胱甘肽(100mM)(Sigma)。将其加入到4ml玻璃瓶(CHROMACOLTM4SV P837)中800μl的疏水相(4.5%SPANTM-80，(Fluka)+0.5%Triton X-100(Sigma)，在浅白矿物油(Sigma)中)，并以2000rpm搅动4-5分钟。将管密封并在30℃温育3小时。随后所有步骤均在室温进行。为了萃取DNA-蛋白质复合物，将200μl C+缓冲液(10mM Tris，0.1M KCl，0.05%TWEENTM-20，5mM MgCl2，1%BSA，pH7.4)和500μl Hexane加到瓶中、混合并转移至微管，并以13000g离心1分钟。移出有机相，并用800μlHexane再萃取水相3-5次直到界面几乎清楚为止。对于头5轮的选择，将生物素化的TGFbRII-FC预结合到Streptavidin DYNAbeadsTM(Invitrogen)并加到萃取的复合物中以产生等同于40，40，10，5和5nM抗原(分别为第1、2，3，4和5轮)的抗原浓度。将T1珠用于1-3轮的选择，C1用于第4和5轮的选择。在温育30分钟后，用C+缓冲液将珠清洗3-5次。然后将仍然保持与珠结合的DNA复合物通过用侧接引物PCR来回收。第6-10轮选择称为‘可溶性’选择，其中在萃取后将生物素化的TGFbRII-FC直接加到复合物中以产生5，5，4，5和5nM的浓度(分别为第6，7，8，9和10轮)，并温育30分钟以允许建立结合。然后加入作为竞争物的未生物素化的TGFbRII-FC至74，750，400、250和250nM(分别为第6，7，8，9和10轮)，并温育15，15，30，30和30分钟(分别为第6，7，8，9和10轮)。在第9和10轮中，在用于己烷萃取的C+缓冲液中包含50nM的含ARC操纵基因序列的双链寡核苷酸以降低任何未复合的DNA和从乳液释放的过多蛋白质之间的交叉反应。在竞争期后，加入10μl C1StreptavidinDYNAbeadsTM。10分钟后，用缓冲液C+将珠清洗5次并通过用侧接引物的PCR来回收所结合的复合物，如之前所描述的。在eGel上纯化PCR产物并用于下一轮选择循环。在第10次选择后，用SalI和NotI酶切割回收的产物，并克隆到类似切割的pDOM13中以用于表达。
使用类似的方法选择三联库，只不过在第一轮选择中使用1x109个DNA拷贝而其后使用5x108个DNA拷贝。而且，用于乳液中蛋白质表达的温育时间被降至2小时。在所有的10轮选择中分别以25，10，5，5，5，5、2.5、2.5、2.5、2.5、2.5、2.5nM使用可溶性生物素化的TGFbRII FC。将生物素化的靶物与提取的复合物温育30分钟。在第5-10轮选择中，在加入C1链霉亲合素DYNAbeadsTM之前，加入未生物素化的TGFbRII-FC竞争物至终浓度为250nM分别达15，30，60，60，75和90分钟。在第5轮中，竞争在室温进行，但从第6轮起竞争温度升至30℃。在第1-4轮选择中纳入Arc Operator诱饵寡聚体(decoy oligo)以降低缺陷DNA的交叉复合。
在选择后，使用SalI和NotI从DNA展示表达盒切取编码dAb的插入物，并克隆到pDOM13细菌表达载体中。将dAb测序并在TB ONEXTM培养基中表达，通过BIACORETM筛选上清液以鉴定出与亲本相比具有改进的解离速率的克隆物。表达并纯化具有改进的解离速率的克隆物，并通过BIACORETM评估亲和力，在细胞传感器测定法中评估效力。不采用产生较差的动力学谱、含有不喜欢的序列基序、或产生非常低的产量的克隆。选出3种有进一步兴趣的。从掺杂库选择分离出克隆DOM23h-271-21(SEQ ID NO:29)和DOM23h-271-22(SEQ ID NO:30)。从三联库选择分离出克隆DOM23h-271-27(SEQ ID NO:31)。所选的克隆对人TGFbRII-FC的亲和力显示于表7。
表7
Ka(M-1.s-1) Kd(s-1) KD(nM)
DOM23h-271-7* 5.37E+6 5.10E-2 9.49
DOM23h-271-21 3.21E+6 4.72E-4 0.147
DOM23h-271-22 3.22E+6 9.19E-4 0.286
DOM23h-271-27 2.17E+6 1.26E-3 0.578
*注意：上表中的值仅用于分级目的，因为DOM23h-271-7对1:1模型的拟合较差，尽管亲和力成熟的样品对该模型拟合较好。
噬菌体展示：
分别的CDR1，CDR2和CDR3池中的三联或掺杂库进行如上文描述的多轮噬菌体选择，其在4轮内针对浓度分别为10nM，1nM，100pM和20pM的生物素化的人TGF-βRII/Fc抗原，或2轮选择使用20pM抗原接着使用2pM抗原。将来自噬菌体选择的插入克隆到pDOM10表达载体中并选出具有比亲本改进的解离速率的上清液以进一步研究。表达并纯化dAb，并在BIACORETMT100上和上文所述细胞传感器测定法中测试其针对人TGF-βRII/Fc抗原的亲和力和生物活性(数据未显示)。在表8中显示了所选的克隆物对人TGFbRII-FC的亲和力。
表8
样品 Ka(M-1.s-1) Kd(s-1) KD(M)
271-101 3.73E+06 0.02014 5.40E-09
271-102 9.35E+06 0.01531 1.64E-09
271-105a* 3.29E+06 0.00747 2.27E-09
271-105b* 3.07E+06 0.007977 2.60E-09
271-106a* 7.39E+06 0.02333 3.16E-09
271-106b* 6.77E+06 0.01947 2.88E-09
271-114 1.04E+07 0.07084 6.80E-09
271-7a* 3.04E+06 0.04193 1.38E-08
271-7b* 2.42E+06 0.04448 1.84E-08
*名称“a”和“b”指从编号克隆物的不同菌落得到的分别的上清液。
测定所选的具有改进活性的克隆物的序列，并在下面显示了完整的序列和CDR序列。
DOM23h-271-21氨基酸序列(SEQ ID NO:29)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGNRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQMPGRKWTAKFRWDYWGQGTLVIVSS
DOM23h-271-21核酸序列(SEQ ID NO:67)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACCGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTAATCGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGATGCCGGGCCGGAAGTGGACGGCCAAGTTCCGCTGGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCATCGTCTCGAGC
DOM23h-271-22氨基酸序列(SEQ ID NO:30)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGNRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQMPGQKWMAKSRFDYWGQGTLVTVSS
DOM23h-271-22核酸序列(SEQ ID NO:68)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTAATCGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGATGCCCGGCCAGAAGTGGATGGCCAAGTCCCGCTTCGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
DOM23h-271-27氨基酸序列(SEQ ID NO:31)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGQKTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQIPGRKWTANSRFDYWGQGTLVIVSS
DOM23h-271-27核酸序列(SEQ ID NO:69)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTCAGAAGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGATTCCGGGGCGTAAGTGGACTGCTAATTCGCGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCATCGTCTCGAGC
DOM23h-271-101氨基酸序列(SEQ ID NO:32)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGNRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQIPGRKWTANGRKDYWGQGTLVTVSS
DOM23h-271-101核酸序列(SEQ ID NO:70)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTAATCGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGATTCCGGGGCGTAAGTGGACTGCTAATGGTCGTAAGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
DOM23h-271-102氨基酸序列(SEQ ID NO:33)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGHRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQIPGRKWTANSRFDYWGQGTLVTVSS
DOM23h-271-102核酸序列(SEQ ID NO:71)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATCCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTCATAGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGATTCCGGGGCGTAAGTGGACTGCTAATTCGCGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
DOM23h-271-105氨基酸序列(SEQ ID NO:34)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGNRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQIPGQRWTGNSRFDYWGQGTLVTVSS
DOM23h-271-105核酸序列(SEQ ID NO:72)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTAATCGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGATTCCGGGGCAGCGGTGGACTGGTAATTCGCGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
DOM23h-271-106氨基酸序列(SEQ ID NO:35)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGNRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQFPGRKWTANSRSDYWGQGTLVTVSS
DOM23h-271-106核酸序列(SEQ ID NO:73)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTAATCGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGTTTCCGGGGCGTAAGTGGACTGCTAATTCGCGGTCTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
DOM23h-271-114氨基酸序列(SEQ ID NO:36)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGNRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQIPGRKGTANSRFDYWGQGTLVTVSS
DOM23h-271-114核酸序列(SEQ ID NO:74)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTAATCGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGATTCCGGGGCGTAAGGGAACTGCTAATTCGCGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
表9.271种具有改进活性的亲和力成熟克隆物的CDR序列
Figure BDA0000378234380000781
Figure BDA0000378234380000791
注意：CDR2和CDR3按Kabat定义。CDR1由Kabat和Chothia方法的组合定义。
用于结合动力学的一般方法-T100
使用CM4芯片上的捕捉表面来实施BIACORETM分析。将抗人IgG用作捕捉剂并通过伯胺偶联偶联至CM4生物传感器芯片。在此固定化表面上捕捉的融合人Fc的抗原分子达到从250至300共振单位的水平，且使在运行缓冲液中稀释的限定浓度的dAb通过此捕获表面。将缓冲液注射经过捕获的抗原表面以用于双重参照。使用3M氯化镁溶液注射每种dAb后，使捕捉表面再生；该再生除去捕捉的抗原但不显著影响表面在后续循环中捕获抗原的能力。所有运行都在25℃使用HBS-EP缓冲液作为运行缓冲液来实施。使用BIACORETMT100产生数据并将其拟合软件内含的1：1结合模型。当在顶点浓度处看到非特异性结合时，将此浓度处的结合曲线从分析组移出。
CDR3的进一步多样化
具有最高亲和力的DOM23h-271-7衍生物在第96和100B位含有甲硫氨酸。将这些位置，连同第99，100D，100E和100G位使用NNK诱变多样化以确定是否可以进行取代。如上文描述的构建NNK库，其使用引物PEP-26-F以在DOM23h-271-22或DOM23h-271-102背景中的选定位置处引入多样性。DOM23h-271-102在第27和55位含有使之亲和力优于DOM23h-271-7的突变。
PEP-26-F(SEQ ID NO:209)
GCGGTATATTACTGTGCGAAACAGNNSCCCGGCNNSAAGTGGNNSGCCNNSNNSCGCNNSGACTACTGGGGTCAGGGAACC
构建DNA展示库，并如上文描述的在生物素化的hTGFbRII-FC上选择，其使用5nM；0.5nM；0.1nM；0.1nM；0.1nM的浓度；且在后续轮中为0.1nM。在第4-6轮选择中，在加入C1链霉亲合素DYNAbeadsTM之前，将未生物素化的TGFbRII-FC竞争物以终浓度为100nM加入达分别60，90和90分钟。在选择后，使用引物PelB NcoVh和PEP011将dAb插入进行PCR扩增，用NcoI和EcoRI切割并克隆到细菌表达载体pC10中。
PelB NcoVh(SEQ ID NO:210)
GCCCAGCCGGCCATGGCGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGG
PEP011(SEQ ID NO:211)
GAATTCGCGGCCGCCTATTAGCTCGAGACGGTGACCAGGG
表达克隆的产物并通过Biacore筛选。将具有类似于或优于DOM23h-271-22的解离速率的克隆物测序、纯化并通过BIACORETM对亲和力进行评估以及在细胞传感器测定法中评估效力。不采用产生较差的动力学谱、含有不喜欢的序列基序、或产生非常低的产量的克隆。选择DOM23h-271-50用于进一步的亲和力成熟。
DOM-271-50核酸序列(SEQ ID NO:212)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATCCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTCATAGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGGCGCCCGGCGAGAAGTGGCTCGCCCGGGGCCGCTTGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
DOM-271-50氨基酸序列(SEQ ID NO:213和重复条目SEQ ID NO:214)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGHRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQAPGEKWLARGRLDYWGQGTLVTVSS
实施例7.在TGFbRII dAb序列(DOM23h-271系)第61和64位引入突变
之前已将D61N和K64R双突变引入到各种TGFRβII dAb系中，并且已显示其改进效力(WO2011/012609)。将这些突变引入到TGFbRII域抗体DOM23h-271系以查看是否能实现在效力中的类似改进。探索在此位置的备选突变以确定是否能实现在效力中的进一步增强。
通过使用聚合酶链式反应(PCR)的重叠延伸将突变引入DOM23h-271(SEQ ID NO:199)主链(Ho等，Gene198977(1))；使用互补的寡核苷酸引物以生成具有重叠或互补端的两种DNA片段。将这些片段在使重叠端退火的后续装配PCR中组合，其允许每条链的3’重叠充当互补链3’延伸的引物以及所得融合产物进一步通过PCR扩增。通过将核苷酸变化掺入到重叠寡核苷酸引物中来在核苷酸序列中引入特定变更。通过使用SUPERTAQTM聚合酶(HTBiotechnology)的两个分开的PCR来扩增靶dAb基因片段。选择DOM23h-271，因其对TGFbRII具有低亲和力从而使亲和力中的改进可使用BIACORETM清楚地测量出来。使用简并寡核苷酸编码在第61和64位的突变以组合突变两个位置，其意图使用亲和力选择来富集具有改进的结合亲和力的突变体。由于已知NR突变占优势，因而通过在第61位采用受限制的密码子NNG来避免在库中有此突变。该密码子编码13种氨基酸但不包括氨基酸F，Y，C，H，I，N或D。在dAb内不喜欢游离的Cys，且在该位置也不想要天冬酰胺，因此仅排除5种期望的氨基酸组合。在第64位使用NNK密码子来提供全部范围的可能的氨基酸。
用于引入突变的寡核苷酸对为PE008(侧接dAb基因的5’开始：5’-TTGCAGGCGTGGCAACAGCGTCGACAGAGGTGCAGCTGTTGGAG-3’)(SEQ ID NO:192)和271-6164R(5’-GCGTAGTATGTACGATTACCAATCGG-3’)(SEQ ID NO:193)以及突变的271-6164deg-F(突变残基划线：5’-GGTAATCGTACATACTACGCANNGTCCGTGNNKGGCCGGTTCACCATCTCCCGC-3’)(SEQ ID NO:194)和AS1309(侧接dAb基因的3’端：5’-TGTGTGTGTGTGGCGGCCGCGCTCGAGACGGTGACCAGGGTTCCCTGACCCCA-3’)(SEQ ID NO:195)。使用SUPERTAQTMDNA聚合酶而不加入引物在装配PCR中再组合两条PCR片段。然后通过向PCR反应加入侧接引物PE008和AS1309来扩增融合产物。用Sal I和Not I限制性核酸内切酶消化突变的dAb，连接到类似切割的pDOM13表达载体中并转化到大肠杆菌HB2151细胞中。还以类似的方式将D61N，K64R突变引入到DOM23h-271中，但将引物271-6164NR-F(5’-GGTAATCGTACATACTACGCAAACTCCGTGCGCGGCCGGTTCACCATCTCCCGC-3’)(SEQ ID NO:196)取代为271-6164deg-F。通过测序鉴定突变的dAb。鉴定出在第61和64位具有新突变组合的129种克隆物，尽管有11种携带来自PCR错误的额外的突变。这些显示于表11。注意：具有增强亲和力的克隆物划线。具有另外突变的克隆物由星号指示。
为了测定突变的影响，在96孔板中的TB ONEXTM中于30℃培养达72小时或于37℃达24小时来表达所选的克隆物。在通过BIACORETM进行解离速率评估之前，通过离心及经由0.22μm滤器过滤来使上清液澄清。
使用CM5芯片上的捕捉表面来实施BIACORETMA100分析。将抗人IgG用作捕捉剂并通过伯胺偶联偶联至CM5生物传感器芯片。在此固定化表面上捕捉的融合人Fc的抗原分子达到从200至300共振单位的水平，且使上清液或纯化的dAb通过此捕获的表面。将培养基或缓冲液注射经过捕获的抗原表面以用于双重参照。在每个流动室上，蛋白A样点允许确认在注射的每份样品上dAb的存在。使用3M氯化镁溶液注射每种dAb后，使表面再生；该再生除去捕捉的抗原但不显著影响表面在后续循环中捕获抗原的能力。所有运行都在25℃使用HBS-EP缓冲液作为运行缓冲液来实施。使用BIACORETMA100产生数据并将其内含的软件进行分析。将来自纯化样品的动力学拟合至1:1结合模型，而使用1:1解离模型和/或使用每份样品相比于亲本分子的结合水平和稳定性水平来分析上清液解离速率。
在测试的克隆物中，鉴定出46个相比于亲本DOM23h-271dAb具有改进的解离速率的克隆物，如表11中指示的。发现突变D61R和D61K增强不依赖于第64位突变的结合。许多组合表现为比最初的D61N，K64R突变更佳，且这些包括RE，RM，RF和RY。
将所选的具有改进解离速率的突变体纯化并进行完整的BIACORETMA100动力学分析以测定其亲和力(表10)。还通过在SYPROTMOrange(Invitrogen)存在下产生解链谱来测定突变体的热稳定性。简言之，将纯化的dAb在SYPROTMOrange:PBS的1:500稀释液中稀释为50和100ug/ml，并且在Mini OPTICONTMPCR仪(BioRad)中生成30-90℃解链曲线。测定每个浓度处主要正向转变(positive transition)的Tm，并将其用于计算在1mg/ml的Tm估算值作为用于比较的解链温度的指示(表10)。
选择突变D61R，K64D和D61R，K64F，因为它们在亲和力方面具有使Tm降低的改进。将这些突变转移到亲和力成熟的DOM23h-271衍生物DOM23h-271-22(SEQ ID NO:30)以制备域抗体DOM23h-271-39(SEQ IDNO:37)和DOM23h-271-40(SEQ ID NO:38)。通过BIACORETM，包括与鼠TGFbRIIFC的交叉反应性，发现这些突变产生增强的亲和力，并且通过细胞传感器测定法发现产生增强的效力。然而，如由DSC测量的，还发现所述突变的Tm降低，并且如由SEC MALLS测量的，在PBS中的dAb聚集增加。这些测定法如上文所描述的实施，只不过用于SEC MALLS的缓冲液为0.4MNacl，0.1M磷酸钠和10%异丙醇pH7。这些结果汇总在表12中(给出人细胞传感器测定法和小鼠3T3萤光素酶测定法的均值)。
在此实施例中所指的dAb的序列在下面给出：
DOM23h-271-39氨基酸序列(SEQ ID NO:37)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGNRTYYARSVDGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQMPGQKWMAKSRFDYWGQGTLVTVSS
DOM23h-271-39核酸序列(SEQ ID NO:75)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTAATCGTACATACTACGCACGCTCCGTGGACGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGATGCCCGGCCAGAAGTGGATGGCCAAGTCCCGCTTCGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
DOM23h-271-40氨基酸序列(SEQ ID NO:38)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGNRTYYARSVFGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQMPGQKWMAKSRFDYWGQGTLVTVSS
DOM23h-271-40核酸序列(SEQ ID NO:76)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTAATCGTACATACTACGCACGCTCCGTGTTCGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGATGCCCGGCCAGAAGTGGATGGCCAAGTCCCGCTTCGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
表10
描述 突变 Tm估算值1mg/ml KD(nM)
1A2 RA 53.08 2.24
1D9 RD 52.35 1.17
3F11 RE 53.08 3.27
1G11 RM 51.81 0.97
3C9 RF 54.08 1.39
1E6 RY 49.62 1.17
1B11 RV 53.41 1.88
3D9 KG 48.69 4.34
1D5 KF 48.09 3.69
3D4 KT 54.74 4.26
1H11 LW 53.68 4.17
1B2 VW 52.68 1.79
2C12 NR 51.49 3.34
271 DK 58.21 N/D
注意：突变对应于‘XY’，其中X是第61位而Y是第64位
Figure BDA0000378234380000851
Figure BDA0000378234380000861
实施例8.通过对DOM23h-439-20、DOM23h-843-13、DOM23h-855-21和DOM23h-271-50系的CDR多样化来进行亲和力成熟
在幼稚化克隆DOM23h-855(SEQ ID NO:13)和DOM23h-843(SEQ IDNO:10)上实施易错亲和力成熟，从中分别分离出域抗体DOM23h-855-21(SEQID NO:204)和DOM23h-843-13(SEQ ID NO:206)，如实施例5所述。在WO2011/012609所述在先选择活动中，将域抗体DOM23h-439从噬菌体库分离，并随后按实施例5所述的易错亲和力成熟分离出变体DOM23h-439-20(SEQID NO:208)。如实施例6所述，通过对经过CDR指导而亲和力成熟的变体DOM23h-271-22(SEQ ID NO:30)进行CDR3再多样化，来生成域抗体DOM23h-271-50(SEQ ID NO:214)。DOM23h-855-21，DOM23h-843-13，DOM23h-439-20和DOM23h-271-50均基于其结合动力学、在SBE-bla HEK293T细胞传感器测定的效力、序列和生物物理学表现进行选择，以用于进一步亲和力成熟。亲和力成熟用简并性诱变来实施以便使所述CDR再多样化，用噬菌体展示来鉴定改进的先导物。通过构建掺杂库或NNK库将多样化引入CDR中。
使用NNK库将DOM23h-271-50亲和力成熟(饱和诱变)，寡核苷酸引物设计为覆盖每个CDR，并且在每条引物内，将5个氨基酸的密码子用NNK密码子替换，从而使得5个位置同时多样化。使用单或多种寡核苷酸来覆盖每个CDR内所有被靶定的氨基酸；CDR1有1种，CDR2有2种，CDR3有3种。使用聚合酶链式反应(PCR)来实现CDR导向的亲和力成熟；使用互补的寡核苷酸引物来扩增含每种成熟CDR的序列片段，以及覆盖dAb编码序列剩余部分的重叠序列片段。将这些片段混合并通过剪接延伸重叠PCR而装配以生成全长dAb编码序列。使用引物PelB NcoVh(SEQ ID NO:210)和PEP044(5’-GGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCGGCCGCATAATAAGAATTCA-3’SEQ ID NO:215)将该产物PCR扩增，用NcoI和NotI消化，并连接到NotI和NcoI消化过的pDOM4-基因3-pelB杂合载体中。pDOM4-基因3-pelB杂合载体是上文描述的pDOM4载体的修改后版本，并且已修改为用pelB(果胶酸裂合酶B)信号肽替换GAS前导序列。
使用掺杂库对域抗体DOM23h-855-21，DOM23h-843-13和DOM23h-439-20进行亲和力成熟。基本如上文所描述且记载于WO2006018650中的来构建掺杂库。使用单个简并寡核苷酸引物来覆盖每个CDR内所有的突变。在每条引物内，使用编码多种氨基酸的简并密码子来指定每条引物内要多样化的氨基酸。使用下列简并编码：‘a’=85%A+5%T+5%G+5%C；‘g’=85%G+5%T+5%C+5%A；‘c’=85%C+5%T+5%G+5%A；‘t’=85%T+5%A+5%G+5%C；‘S’=50%G和50%C。大写字母指示100%的指定核苷酸。对于DOM23h-439-20掺杂库，在CDR1中使5个氨基酸多样化，在CDR2中使6个氨基酸且在CDR3中使11个氨基酸多样化以在第100位包含苯丙氨酸。对于DOM23h-855-21掺杂库，在CDR1中使5个氨基酸多样化，在CDR2中使7个氨基酸且在CDR3中使8个氨基酸多样化。对于DOM23h-843-13掺杂库，在CDR1中使5个氨基酸多样化，在CDR2中使6个氨基酸且在CDR3中使8个氨基酸多样化，在CDR3之前的第94位也通过引入密码子VRK多样化。对于每种dAb，构建4个掺杂库，1个是使CDR1多样化，1个使CDR2多样化，1个使CDR3多样化，且第4个使所有CDR均多样化。以与三联体引物相同的方式使用简并库引物。分别扩增每种多样化的CDR并使用剪接延伸重叠与亲本序列片段组合，使用引物PelB NcoVh(SEQ ID NO:210)和DOM173(SEQ ID NO:188)来扩增全长产物。使用NcoI和NotI将片段亚克隆到pDOM4-基因3-pelB杂合载体中。
简并引物序列：
23h-439-20CDRH1(SEQ ID NO:216)
5’-GCAGCCTCCGGATTCACCTTTggSacSgagcagATGtggTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG-3’
23h-439-20CDRH2(SEQ ID NO:217)
5’-AAGGGTCTAGAGTTTGTCTCAcgSATTgattcSccSGGTggScgSACATACTACGCAGACTCCGTG-3’
23h-439-20CDRH3(SEQ ID NO:218)
5’-GCGGTATATTACTGTGCGAAAcgScatgcSgcSggSgtStcSggSacStaYtttGACTACTGGGGTCAGGGAACC-3’
23h-843-13CDRH1(SEQ ID NO:219)
5’-GCAGCCTCCGGATTCACCTTTgatcaggatcgSATGtggTGGGTCCGCCAGGCCCCAGGG-3’
23h-843-13CDRH2(SEQ ID NO:220)
5’-AAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAgcSATTgagtcSggSGGTcatcgSACATACTACGCAGACTCCGTG-3’
23h-843-13CDRH3(SEQ ID NO:221)
5’-ACCGCGGTATATTACTGTGCGVRKcagaataagtcSggScgStcSggSTTTGACTACTGGGGTCAGGGA-3’
23h-855-21CDRH1(SEQ ID NO:222)
5’-GCAGCCTCCGGATTCACCTTTgagaatacStcSATGggSTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG-3’
23h-855-21CDRH2(SEQ ID NO:223)
5’-AAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAcgSATTgatccSaagGGTtcScatACATACTACacSGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACC-3’
23h-855-21CDRH3(SEQ ID NO:224)
5’-GCGGTATATTACTGTGCGAAAcagcgSgagctSggSaagtcStaYTTTGACTACTGGGGTCAGGGA-3’
H1-271-43R(SEQ ID NO:225)
5’-GCAGCCTCCGGATTCACCTTTNNKNNKNNKNNKATGNNKTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTC-3’
H2p1-271-43F(SEQ ID NO:226)
5’-CCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCTCANNKATTNNKNNKNNKGGTNNKCGTACATACTACGCAGACTCCG-3’
H2p2-271-43F(SEQ ID NO:227)
5’-CCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGNNKNNKNNKNNKNNKACATACTACGCAGACTCCG-3’
H3p1-271-43F(SEQ ID NO:228)
5’-ACCGCGGTATATTACTGTGCGAAANNKNNKNNKNNKNNKAAGTGGATGGCCGTGGGCCGCTTGGACTACTGGGGTCAGGG-3’
H3p2-271-43F(SEQ ID NO:229)
5’-ACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGAAGCCCNNKNNKNNKNNKNNKGCCGTGGGCCGCTTGGACTACTGGGGTCAGGG-3’
H3p3-271-43F(SEQ ID NO:230)
5’-ACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGAAGCCCGGCCAGAAGTGGNNKNNKNNKNNKNNKTTGGACTACTGGGGTCAGGG-3’
噬菌体展示：
使分别的CDR1，CDR2，CDR3池以及组合的CDR1、2和3池中的NNK库或掺杂库，按实施例1所述进行至少6轮选择，它们针对100nM，10nM，1nM，1nM，0.1nM和0.1nM生物素化单体人TGF-βRII抗原(分别为第1、2，3，4，5和6轮)，但封闭步骤有以下变化；省略之前在实施例1中加入的人IgG Fc片段并且封闭步骤最少实施20分钟。在第4和6轮选择中，通过与经标记的抗原的温育步骤后与100nM未生物素化的抗原温育30分钟(第4和6轮)来引入竞争。对于DOM23h-439-20(CDR1，CDR3和组合的池)和DOM23h-855-21(CDR3)，针对0.1nM生物素化的单体人TGF-β RII抗原并以100nM竞争达120分钟，或者针对20pM生物素化的单体人TGF-β RII抗原并以100nM竞争达30分钟实施第7轮选择。通过将噬菌体感染的TG1细胞的过夜培养物以4000g离 心30分钟在数轮选择之间扩增噬菌体。将含有扩增的噬菌体的40ml上清液 加到10ml PEG/NaCl(20%v/w PEG8000+2.5M NaCl)并在冰上温育达60分 钟。将样品以4000g离心40分钟以使所沉淀的噬菌体形成团粒。弃去上清液 并将噬菌体团粒重悬于1ml15%v/v甘油/PBS中。将噬菌体样品转移至2mlEppendorf管并离心10分钟以除去任何剩余的细菌细胞碎片。使用引物PEP011VHStopNotIR(5’-CCCTGGTCACCGTCTCGAGCTAATAGGCGGCCGCGAATTC-3’(SEQ ID NO:231)和Nco1 VH F(5’-TATCGTCCATGGCGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGG-3’(SEQ ID NO:232)将来自噬菌体选择的多样化的dAbVh基因PCR扩增，用NcoI和NotI限制性内切核酸酶消化并连接到也用NcoI和NotI消化的pC10载体中。pC10是基于pUC119载体的质粒载体，其在设计用于可溶性表达dAb的增强的LacZ启动子的控制下表达。通过将dAb基因在N末端端融合至pelB信号肽使得dAb能表达到上清液中。将连接产物转化到化学感受态的大肠杆菌HB2151细胞中并铺板于营养琼脂板上，该板补充有100μg/ml羧苄西林。挑取各克隆物并在补充有100μg/ml羧苄西林的过夜表达自诱导培养基(高水平蛋白质表达系统，Novagen)中在96孔板中表达，并伴随250rpm的摇动在30℃培养66小时或在37℃培养24小时。然后以3500g将表达板离心15分钟，并使用0.45μ滤板(Millipore)将上清液过滤。在BIACORETMB4000上针对人TGF-β RII and人TGF-βRII/Fc筛选含dAb的上清液以测定解离速率(Kd)(数据未显示)。在SA芯片上依照制造商说明书捕捉生物素化的抗原，使用HBS-EP缓冲液在25℃实施分析。在BIACORETM上以30μl/分钟的流速运行样品。在低pH使用甘氨酸实现芯片再生。通过将解离阶段拟合到软件内含的1:1解离模型来分析数据(未显示)的解离速率，还针对蛋白A结合分析上清液以估算表达水平。选出相对于亲本有解离速率改进的dAb用于进一步研究。在补充有100μg/ml羧苄西林和消泡剂(Sigma)的过夜表达自诱导培养基(ONEXTM，Novagen)中表达改进的克隆物，其伴随250rpm的摇动在30℃培养48至72小时。将培养物离心(4,200rpm达40分钟)，并将上清液与STREAMLINETM-蛋白A珠(Amersham Biosciences，GEHEALTHCARETM，UK.结合能力：每ml珠5mg dAb)在4℃或在室温温育达至少1小时。将珠填充到色谱柱中并用PBS清洗，接着用10mM Tris-HCl pH7.4(Sigma，UK)清洗。将结合的dAb用0.1M甘氨酸-HCl pH2.0洗脱并与1MTris-HCL pH8.0中和。测量dAb在280nm处的OD，并使用从dAb的氨基酸组成计算出的消光系数来测定蛋白质浓度。在BIACORETMT200(两种优选的dAb的数据显示于实施例9)和在SBE-bla HEK293T细胞传感器测定法(两种优选的dAb的数据显示于实施例11)中测试亲和力成熟dAb以测定其亲和力和效力。使用差示扫描比色法(DSC)和具有多角激光散射的尺寸排阻色谱 (SEC-MALS)来测定包括热稳定性和溶液状态在内的生物物理学特性(两种优选的dAb的数据显示于实施例10)。
亲和力成熟的DOM23h-439-20和DOM23h-271-50抗人TGFRII dAb的氨基酸和核酸序列
DOM23h-439-25核酸序列(SEQ ID NO:233)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGGACGGAGCAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTTTGTCTCACGTATTGATTCGCCTGGTGGGAGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACGGCGACCCACGGGGGTGTCCGGGACGTTTTATGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
DOM23h-439-25氨基酸序列(SEQ ID NO:234)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSS
DOM23h-271-123核酸序列(SEQ ID NO:235)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATCCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTCATAGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGGCGCCCGGCGAGAAGTGGGCGAGGCGGTGGGATTTGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
DOM23h-271-123氨基酸序列(SEQ ID NO:236)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGHRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQAPGEKWARRWDLDYWGQGTLVTVSS
DOM23h-439-35核酸序列(SEQ ID NO:237)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTC
TCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGGACCGATCAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCT
CCAGGGAAGGGTCTAGAGTTTGTCTCACGCATTGATTCCCCCGGTGGGCGGACATACTAC
GCAAACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT
CTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACGGCAG
CCGGCGGGGGTGTCGGGGAAGTACGTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTC
TCGAGC
DOM23h-439-35氨基酸序列(SEQ ID NO:238)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTDQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYANSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRQPAGVSGKYVDYWGQGTLVTVSS
DOM23h-271-129核酸序列(SEQ ID NO:239)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTC
TCCTGTGCAGCCTCCGGATCCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCT
CCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTCATAGGACATACTAC
GCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT
CTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGGCG
CCCAATCAGAGGTATGTTGCCCGGGGCCGCTTGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTC
ACCGTCTCGAGC
DOM23h-271-129氨基酸序列(SEQ ID NO:240)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGHRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQAPNQRYVARGRLDYWGQGTLVTVSS
表13中显示了如通过Kabat定义的这些抗人TGFRII dAb亲和力先导物的CDR。
表13.亲和力成熟的抗人TGFβRII dAb的CDR序列
Figure BDA0000378234380000941
对DOM23h-439-25和DOM23h-271-123核苷酸序列的进一步修饰
将如实施例7中描述的D61N和K64R突变组合地或分别地引入DOM23h-439-25，DOM23h-271-123和DOM23h-271-129亲和力成熟dAb中。还测试在DOM23h-439-25和DOM23h-271-123dAb中引入V48I突变以确定其是否赋予效力中的改进。在许多来自DOM23h-439系的改进的dAb中，在测试成熟和CDR导向的亲和力成熟两者后观察到在kabat第48位的自发的突变。还将紧接kabat残基第113位、在Vh区C末端的丙氨酸加到DOM23h-439-25，DOM23h-271-123和DOM23h-271-129以及具有前述突变的这些dAb的所有变体。基本如实施例7中描述地，使用聚合酶链式反应(PCR)通过重叠延伸将突变引入到DOM23h-439-25(SEQ ID NO:234)，DOM23h-271-123(SEQ IDNO:236)和DOM23h-271-129(SEQ ID NO:240)主链中。通过将核苷酸变化掺入到重叠的寡核苷酸引物中来引入核苷酸序列中的特定突变，通过使用设计为在kabat第113位之后掺入丙氨酸残基的3’寡核苷酸来实现在Vh区端插入丙氨酸。
使用下列寡核苷酸来引入突变(突变残基划线)：
439 48I SDM F(SEQ ID NO:253)
5’-GGGTCTAGAGTTTATTTCACGTATTGATTCGCC-3’
439 61N SDM F(SEQ ID NO:254)
5’-GGGAGGACATACTACGCAAACTCCGTGAAGGGCCGG-3’
439 64R SDM F(SEQ ID NO:255)
5’-CGCAGACTCCGTGCGTGGCCGGTTCACC-3’
439 61N 64R SDM F(SEQ ID NO:256)
5’-GGGAGGACATACTACGCAAACTCCGTGCGTGGCCGGTTCACC-3’
271 61N SDM F(SEQ ID NO:257)
5’-GGACATACTACGCAAACTCCGTGAAGGGCCGG-3’
271 64R SDM F(SEQ ID NO:258)
5’-CGCAGACTCCGTGCGTGGCCGGTTCACC-3’
271 61N 64R SDM F(SEQ ID NO:259)
5’-GGACATACTACGCAAACTCCGTGCGTGGCCGGTTCACC-3’
567+A rev(侧接dAb Vh基因的3’端)(SEQ ID NO:260)
5’-CCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCGTAATAAGCGGCCGCAGATTA-3’
21-23Fwd(侧接dAb Vh基因的5’端)(SEQ ID NO:261)
5’-ATAAGGCCATGGCGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTG-3’
为了测定突变的影响，在补充有100μg/ml羧苄西林和防沫剂(Sigma)的TB ONEXTM中，伴随250rpm的摇动在30℃培养达72小时来表达dAb。将培养物离心(4,200rpm达40分钟)，并如前述的使用STREAMLINETM-蛋白A珠(Amersham Biosciences，GE HEALTHCARETM，UK)进行dAb亲和力纯化。在BIACORETMT200上(优选的dAb的数据显示于实施例9)并在SBE-bla HEK293T细胞传感器测定法(优选的dAb的数据显示于实施例11)中测定dAb的亲和力和效力。
下文给出了经修饰以包含C末端丙氨酸和D61N，K64R或V48I突变的DOM23h-439-25(SEQ ID NO:234)和DOM23h-271-123(SEQ ID NO:236)抗人TGFRII dAb的氨基酸和核酸序列：
DOM23h-439-40(DOM23h-439-25+C末端丙氨酸)核酸序列(SEQ IDNO:262)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGGACGGAGCAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTTTGTCTCACGTATTGATTCGCCTGGTGGGAGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACGGCGACCCACGGGGGTGTCCGGGACGTTTTATGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCG
DOM23h-439-40(DOM23h-439-25+C末端丙氨酸)氨基酸序列(SEQ IDNO:263)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSA
DOM23h-439-41(DOM23h-439-25+C末端丙氨酸+48I)核酸序列(SEQ IDNO:264)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGGACGGAGCAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTTTATTTCACGTATTGATTCGCCTGGTGGGAGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACGGCGACCCACGGGGGTGTCCGGGACGTTTTATGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCG
DOM23h-439-41(DOM23h-439-25+C末端丙氨酸+48I)氨基酸序列(SEQID NO:265)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFISRIDSPGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSA
DOM23h-439-42(DOM23h-439-25+C末端丙氨酸+61N)核酸序列(SEQID NO:266)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGGACGGAGCAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTTTGTCTCACGTATTGATTCGCCTGGTGGGAGGACATACTACGCAAACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACGGCGACCCACGGGGGTGTCCGGGACGTTTTATGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCG
DOM23h-439-42(DOM23h-439-25+C末端丙氨酸+61N)氨基酸序列(SEQID NO:267)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYANSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSA
DOM23h-439-43(DOM23h-439-25+C末端丙氨酸+64R)核酸序列(SEQID NO:268)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGGACGGAGCAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTTTGTCTCACGTATTGATTCGCCTGGTGGGAGGACATACTACGCAGACTCCGTGCGTGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACGGCGACCCACGGGGGTGTCCGGGACGTTTTATGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCG
DOM23h-439-43(DOM23h-439-25+C末端丙氨酸+64R)氨基酸序列(SEQID NO:269)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSA
DOM23h-439-44(DOM23h-439-25+C末端丙氨酸+61N64R)核酸序列(SEQ ID NO:270)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGGACGGAGCAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTTTGTCTCACGTATTGATTCGCCTGGTGGGAGGACATACTACGCAAACTCCGTGCGTGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACGGCGACCCACGGGGGTGTCCGGGACGTTTTATGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCG
DOM23h-439-44(DOM23h-439-25+C末端丙氨酸+61N64R)氨基酸序列(SEQ ID NO:271)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYANSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSA
DOM23h-271-130(DOM23h-271-123+C末端丙氨酸)核酸序列(SEQ IDNO:272)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATCCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTCATAGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGGCGCCCGGCGAGAAGTGGGCGAGGCGGTGGGATTTGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCG
DOM23h-271-130(DOM23h-271-123+C末端丙氨酸)氨基酸序列(SEQ IDNO:273)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGHRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQAPGEKWARRWDLDYWGQGTLVTVSSA
DOM23h-271-131(DOM23h-271-123+C末端丙氨酸+61N)核酸序列(SEQID NO:274)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATCCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTCATAGGACATACTACGCAAACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGGCGCCCGGCGAGAAGTGGGCGAGGCGGTGGGATTTGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCG
DOM23h-271-131(DOM23h-271-123+C末端丙氨酸+61N)氨基酸序列(SEQ ID NO:275)
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DOM23h-271-132(DOM23h-271-123+C末端丙氨酸+64R)核酸序列(SEQID NO:276)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATCCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTCATAGGACATACTACGCAGACTCCGTGCGTGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGGCGCCCGGCGAGAAGTGGGCGAGGCGGTGGGATTTGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCG
DOM23h-271-132(DOM23h-271-123+C末端丙氨酸+64R)氨基酸序列(SEQ ID NO:277)
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DOM23h-271-133(DOM23h-271-123+C末端丙氨酸+61N64R)核酸序列(SEQ ID NO:278)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATCCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTCATAGGACATACTACGCAAACTCCGTGCGTGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGGCGCCCGGCGAGAAGTGGGCGAGGCGGTGGGATTTGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC GCG
DOM23h-271-133(DOM23h-271-123+C末端丙氨酸+61N64R)氨基酸序列(SEQ ID NO:279)
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DOM23h-271-134(DOM23h-271-123+C末端丙氨酸+48I)核酸序列(SEQID NO:280)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATCCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGATTTCAGCGATTGAGCCGATTGGTCATAGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGGCGCCCGGCGAGAAGTGGGCGAGGCGGTGGGATTTGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCG
DOM23h-271-134(DOM23h-271-123+C末端丙氨酸+48I)氨基酸序列(SEQ ID NO:281)
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DOM23h-271-135(DOM23h-271-129+C末端丙氨酸)核酸序列(SEQ IDNO:282)
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DOM23h-271-135(DOM23h-271-129+C末端丙氨酸)氨基酸序列(SEQ IDNO:283)
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DOM23h-271-136(DOM23h-271-129+C末端丙氨酸+61N)核酸序列(SEQID NO:284)
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DOM23h-271-136(DOM23h-271-129+C末端丙氨酸+61N)氨基酸序列(SEQ ID NO:285)
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DOM23h-271-137(DOM23h-271-129+C末端丙氨酸+61N64R)核酸序列(SEQ ID NO:286)
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DOM23h-271-137(DOM23h-271-129+C末端丙氨酸+61N64R)氨基酸序列(SEQ ID NO:287)
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DOM23h-439-47(DOM23h-439-42+48I)核酸序列(SEQ ID NO:288)
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DOM23h-439-47(DOM23h-439-42+48I)氨基酸序列(SEQ ID NO:289)
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DOM23h-439-48(DOM23h-439-44+48I)核酸序列(SEQ ID NO:290)
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DOM23h-439-48(DOM23h-439-44+48I)氨基酸序列(SEQ ID NO:291)
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实施例9.对亲和力成熟的域抗体的Biacore动力学分析
依照制造商说明书，通过伯胺偶联将抗人IgG固定化于Biacore CM4芯片上。在此表面上捕获人TGF-βRII/Fc、猕猴TGF-βRII/Fc或人Fc片段。使dAb以100，10和1nM(DOM23h-439dAb)或100、25和6.25nM(DOM23h-271dAb)的3种浓度通过2种捕获的受体。仅使浓度为100nM的每种dAb通过人Fc片段以确认对胞外TGF-β RII域结合的特异性。注射缓冲液通过捕获抗原表面，将此用于双重参照。当使用3M氯化镁溶液注射每种dAb后，使捕捉表面再生；该再生除去捕获的抗原但不显著影响表面在后续循环中捕获抗原的能力。所有运行都在25℃使用HBS-EP缓冲液作为运行缓冲液来实施。使用BIACORETMT200产生数据并将其拟合于软件内含的1:1结合模型。表14显示所测试的dAb的结合动力学。在分别的实验中运行DOM23h-271dAb和DOM23h-439系。
表14
Figure BDA0000378234380001051
实施例10.对亲和力成熟dAb的生物物理评估
使用差示扫描热量计(DSC)来测定dAb的热稳定性。将dAb过夜渗析到PBS缓冲液中并调节终浓度为1mg/ml。将渗析缓冲液用作所有样品的参照。使用毛细管室微热量计VP-DSC(GE healthcare/Micr°Cal)，以180℃/小时的加热速率来实施DSC。对于参照缓冲液和蛋白质样品，典型的扫描范围均为20-90℃。在每对参照缓冲液和样品后，以水中5%Decon(Fisher-Scientific)的溶液继之以PBS来清洁毛细管室。使用Origin7.0软件来分析所得数据迹线。从样品迹线减去从参照缓冲液获得的DSC迹线。将样品的精确摩尔浓度输入数据分析程序以得到解链温度(Tm)的值、焓(ΔH)和Van’t Hoff焓(ΔHv)值。将数据拟合到非2相模型。用1或2个转变事件获得最佳拟合和依赖值。还通过对每份样品热分析图从0积分来测定起始解折叠温度(On-set unfoldingtemperature)。然后，该值被测定为4%的样品解折叠的温度。
表14A
蛋白质名称 表观Tm(C) 起始温度(C)
DOM23h-439-21 60.66 52.5
DOM23h-439-25 56.34 49
DOM23h-439-30 57.17 50
DOM23h-439-32 55.01 49
DOM23h-439-33 58.93 51
DOM23h-439-34 56.78 50
DOM23h-855-42 61.90 55
DOM23h-855-43 66.81 58.6
DOM23h-855-44 63.38 56
DOM23h-271-123 54.82 50.6
DOM23h-271-124 58.16 52
DOM23h-271-125 58.26 55
通过具有多角度激光散射的尺寸排阻色谱(SEC-MALS)来分析溶液状态
为了确定dAb在溶液中是单体或形成更高级的寡聚体，通过SEC-MALLS(具有多角激光散射的尺寸排阻色谱)对其进行分析。将具有自动采样器和UV检测器的Agilent1100系列HPLC系统(由Empower软件控制)连接至WyattMini Dawn Treos(激光散射(LS)检测器)和Wyatt Optilab rEX DRI(差示折射指数(RI)检测器)。检测器按以下次序-UV-LS-RI连接。RI和LS仪器均以658nm的波长操作；在280nm和220nm处监测UV信号。通过使用TSK2000柱的尺寸排阻色谱，根据dAb(以PBS中1mg/mL的浓度注射50微升)的流体力学特性将其分开。流动相为0.2M NaCl、0.1M NaPO4、15%正丙醇。蛋白质通过检测器时散射光的强度测量为角的函数。此测量加上使用RI检测器测定的蛋白质浓度允许使用合适的方程(分析软件Astra v.5.3.4.14的组成部分)来计算摩尔质量。在表15中以单体百分数显示了溶液状态。
表15
蛋白质名称 单体百分数
DOM23h-439-21 100%
DOM23h-439-25 100%
DOM23h-439-30 100%
DOM23h-439-32 100%
DOM23h-439-33 98.2%
DOM23h-439-34 97.7%
DOM23h-855-42 83.8%
DOM23h-855-43 83%
DOM23h-855-44 64.7%
DOM23h-271-123 100%
DOM23h-271-124 97.4%
实施例11.亲和力成熟dAb在SBE-bla HEK293T细胞传感器测定法中的TGFβ-RII抑制
如实施例4测定法h2中列出的精确实施此测定法。
将此测定法实施多次以获得平均值和值的范围，其在表16中汇总。使用对数IC50计算算术均值IC50，并且通过从均值IC50加上或减去log标准偏差来计算范围，然后变换回IC50。达到测定法QC参数；稳健Z因子大于0.4且TGF-βEC80在加入测定法的浓度的6倍以内。结果显示于表16中。
表16人特异性克隆物和VH模拟dAb的细胞功能测定法数据
Figure BDA0000378234380001071
Figure BDA0000378234380001081
序列索引表
Figure BDA0000378234380001091
Figure BDA0000378234380001101
Figure BDA0000378234380001121
Figure BDA0000378234380001131
Figure BDA0000378234380001141

Claims (31)

1.一种抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域，其包含SEQ ID NO:1-38、204、206、208、214、234、236、238、240、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289和291的任意一个中所列出的氨基酸序列，该序列有最多5个氨基酸取代、缺失或添加，所述取代、缺失或添加以任意方式组合。
2.权利要求1的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域，其包含SEQ ID NO:234或236中列出的氨基酸序列，该序列有最多5个氨基酸取代、缺失或添加，所述取代、缺失或添加以任意方式组合。
3.权利要求1或2的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域，其中所述氨基酸取代、缺失或添加不在CDR3内。
4.权利要求1、2或3的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域，其中所述氨基酸取代、缺失或添加不在任意一个CDR内。
5.一种抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1-38、204、206、208、214、234、236、238、240、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289和291。
6.权利要求5的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域，其包含SEQ ID NO:234或236的氨基酸序列。
7.前述权利要求中任一项的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域，其中所述抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域还包含C末端丙氨酸残基。
8.一种分离的多肽，其包含前述权利要求中任一项的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域，其中所述分离的多肽结合TGFβRII。
9.权利要求1-7中任一项的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域，或权利要求8的多肽，其还包含至少一种选自下组的下列氨基酸：在所述免疫球蛋白单可变域的第39位的R、第48位的I、第53位的D、第61位的N、第61位的R、第61位的K、第64位的R、第64位的F、第64位的D、第64位的E、第64位的M、第64位的Y、第102位的H或第103位的S，所述位置依照kabat编号惯例。
10.权利要求9的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域或多肽，其在第61位包含R或K。
11.权利要求1-7中任一项的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域，或权利要求8的多肽，其还包含选自下组的氨基酸组合之一：在所述免疫球蛋白单可变域的第61位的N和第64位的R；第61位的R和第64位的E；第61位的R和第64位的M；第61位的R和第64位的F；第61位的R和第64位的Y；以及第61位的R和第64位的D。
12.权利要求9、10或11的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域或多肽，其在第48位包含异亮氨酸残基。
13.权利要1-12中任一项的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域或多肽，其中所述抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域或多肽结合人TGFβRII。
14.权利要求13的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域或多肽，其中所述抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域或多肽还结合小鼠TGFβRII和/或猕猴TGFβRII。
15.权利要1-14中任一项的免疫球蛋白单可变域或多肽，其中所述免疫球蛋白单可变域或多肽中和TGFβ活性。
16.权利要1-15中任一项的免疫球蛋白单可变域或多肽，其中所述免疫球蛋白单可变域或多肽抑制TGFβ对TGFβRII的结合。
17.一种分离的核酸，其编码如权利要1-16中任一项的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域或多肽。
18.权利要求16的分离的核酸分子，其包含至少一种选自下组的核酸分子：SEQ ID NO:39-76、203、205、207、212、233、235、237、239、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290。
19.包含如权利要求17或18的核酸分子的载体。
20.包含如权利要求17-19中任一项的核酸或载体的宿主细胞。
21.一种生成包含如权利要求1-16中任一项的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域的多肽的方法，所述方法包括在适合表达所述核酸或载体的条件下维持权利要求20所述的宿主细胞，由此生成包含免疫球蛋白单可变域的多肽。
22.权利要求1-16中任一项的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域或多肽，其用作药物。
23.一种药物组合物，其包含权利要求1-16中任一项的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域或多肽。
24.权利要求22的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域或多肽，或权利要求23的药物组合物，其用于治疗与TGFβ信号传导相关的疾病。
25.权利要求24的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域、多肽或药物组合物，其中所述与TGFβ信号传导相关的疾病选自下组：组织纤维化，如肺纤维化，包括特发性肺纤维化；肝纤维化，包括肝硬化和慢性肝炎；类风湿性关节炎；眼部病症；皮肤的纤维化，包括皮肤的瘢痕疙瘩和杜普伊特伦氏挛缩；肾纤维化，如肾炎和肾硬化；伤口愈合；以及血管疾患，如再狭窄。
26.权利要求22的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域、多肽或药物组合物，其用于治疗组织纤维化或用于伤口愈合和/或减少疤痕。
27.权利要求22、24或25的抗TGFβRII免疫球蛋白单可变域，其中所述疾病为瘢痕疙瘩疾病或杜普伊特伦氏挛缩。
28.权利要求1-16中任一项的抗TGFβRII单可变域或多肽在制备用于治疗与TGFβ信号传导相关的疾病的药物中的用途。
29.一种在人患者中治疗和/或预防TGFβ介导的疾患的方法，所述方法包括以下步骤：对所述人患者施用包含如权利要求1-16中任一项的抗TGFβRII单可变域或多肽的组合物。
30.一种试剂盒，其包含权利要求1-16中任一项的抗TGFβRII单可变域或多肽，以及用于对皮肤施用所述单可变域或多肽的装置。
31.权利要求30的试剂盒，其中所述装置是皮内递送装置。
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