JP6062375B2 - Tgf−ベータ受容体iiに結合するリガンド - Google Patents
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Description
Kabat:
CDR H1:31〜35/35A/35B
CDR H2:50〜65
CDR H3:95〜102
CDR L1:24〜34
CDR L2:50〜56
CDR L3:89〜97
Chothia:
CDR H1:26〜32
CDR H2:52〜56
CDR H3:95〜102
CDR L1:24〜34
CDR L2:50〜56
CDR L3:89〜97
AbM:
(Kabatナンバリング使用): (Chothiaナンバリング使用):
CDR H1:26〜35/35A/35B 26〜35
CDR H2:50〜58 −
CDR H3:95〜102 −
CDR L1:24〜34 −
CDR L2:50〜56 −
CDR L3:89〜97 −
Contact:
(Kabatナンバリング使用): (Chothiaナンバリング使用):
CDR H1:30〜35/35A/35B 30〜35
CDR H2:47〜58 −
CDR H3:93〜101 −
CDR L1:30〜36 −
CDR L2:46〜55 −
CDR L3:89〜96 −
(「−」はKabatと同じナンバリングを意味する)
マウスTGFベータRIIに結合するdAbの選択
ナイーブ選択:抗体単一可変ドメインを提示するファージライブラリーである4Gおよび6Gナイーブファージライブラリーを用いた。4GはGAS1リーダー配列(国際公開第2005093074号参照)から発現された抗体単一可変ドメインを提示し、6Gはそれに加熱/冷却による前選択が加わっている(国際公開第04101790号参照)。マウスおよびヒトの組換えTGF−βRII/Fcキメラタンパク質に対してVHおよびVKライブラリーのプール(4G H11〜19および6G VH2〜4(VH dAb)並びに4G κ1、4G κ2、および6G κ(Vκ dAb)として同定)をパニングすることにより、DOM23リードが単離された。これらのキメラタンパク質は、ヒト胚性腎細胞系列(HEK−F)中でヒトIgG1のFc領域に融合させたヒトII型TGF−β受容体の細胞外ドメインのアミノ酸残基24〜159をコードするDNA配列(Lin, et al., 1992, Cell 68:775-785)を発現させることにより作製した。
ヒトTGFベータRIIに結合するdAbの選択
第1および第2ラウンドでそれぞれ150および15nMのビオチン化ヒトTGFbRII/Fcを用いたこと以外はマウスTGFbRIIに記載したように、ナイーブ選択を行った。1.5nMビオチン化ヒトTGFbRII/Fcを用いて第2ラウンドと同じ方法で第3ラウンドを行った。
このアッセイを用いて、抗TGFbRII dAbの結合活性を決定した。TGFbRII−Fc抗原をMSDプレート上にコーティングした後、ブロッキングして非特異的結合を防いだ。可溶性FLAGタグ化dAbを含む段階希釈した上清を加えた。インキュベーション後、プレートを洗浄し、TGFBRII−Fcに特異的に結合したdAbのみがプレートに結合したまま残った。ルテニウム化抗FLAGタグ化抗体およびMSD Read Bufferを用いて結合dAbを検出した。上清希釈物中のdAb濃度を蛍光偏光濃度測定アッセイで決定した場合、濃度結合曲線をプロットした。
このアッセイは、上清中に発現された可溶性FLAGタグ化dAbの濃度を決定することができる。蛍光標識されたFLAGペプチドを抗FLAG抗体と混合した。蛍光分子を波長531nMの偏光で励起し、放射された偏光を波長595nMで読み取った。FLAGタグ化dAbを加えると、抗FLAG抗体から蛍光ペプチドが外れ、発光シグナルの偏光が減少した。既知濃度の精製FLAGタグ化VHダミーdAbの標準曲線を作製し、上清中の可溶性dAbの濃度を逆算するために用いた。濃度データを結合活性データと合わせ、dAb上清の濃度結合曲線をプロットできるようにした。
励起フィルター:BODIPY TMR FP 531
発光フィルター1:BODIPY TMR FP P pol 595
発光フィルター2:BODIPY TMR FP P pol 595
ミラー:BODIPY TMR FP Dual Enh
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示差走査熱量測定(DSC)を用いてdAbの熱安定性を決定した。dAbを終濃度1mg/mlでPBS中に一晩透析した。透析バッファーを全サンプルの参照として用いた。GE HEALTHCARE(商標)−MICROCAL(商標)VP−DSCキャピラリーセルマイクロ熱量計を用いて180℃/時間の加熱速度でDSC測定を行った。典型的なスキャンレンジは参照バッファーおよびタンパク質サンプルの両方で20〜90℃とした。これらの実験条件下でのタンパク質のリフォールディングの程度を評価するために各時点でリスキャンを行った。各タンパク質サンプルのスキャン後、5%DECON(商標)(フィッシャーサイエンティフィック社)の水溶液でキャピラリーセルを洗浄し、次いでPBSスキャンを行った。得られたデータトレースをOrigin7.0ソフトウェアで分析した。参照バッファースキャンから得られたDSCトレースをタンパク質サンプルスキャンから引いた。タンパク質サンプルの正確なモル濃度をデータ分析ルーチンに入力して、融解温度(Tm)、エンタルピー(ΔH)、およびファント・ホッフのエンタルピー(ΔHv)の値を得た。データを非2状態モデル(non−2−state model:N2M)に当てはめた。最良適合を1または2遷移事象のいずれかで得た。本特許に記載のdAbに得られたTm値は52.1℃〜73.3℃である。Tm値およびリフォールディングの割合を表3に示す。
MC3T3−E1ルシフェラーゼアッセイ−方法m1:
MC3T3−E1ルシフェラーゼアッセイは、MC3T3−E1細胞中でTGFβにより誘導されるCAGA−ルシフェラーゼの発現をdAbが阻害する能力を測定する。CAGAボックスと名付けられた3コピーのTGFβ応答性配列モチーフがヒトPAI−1プロモーター中に存在し、Smad3および4タンパク質に特異的に結合する。マルチコピーのCAGAボックスをルシフェラーゼレポーターコンストラクト中にクローニングすることにより、レポーターシステムで形質移入された細胞にTGFβ応答性が付与される。このアッセイは、[CAGA]12−ルシフェラーゼレポーターコンストラクトが安定的に形質移入されたMC3T3−E1細胞(マウス骨芽細胞)を使用する(Dennler, et al. (1998) EMBO J. 17, 3091-3100)。
MC3T3−E1細胞を1.25×104/ウェルで96ウェルプレート(ヌンク社製13610)の「プレート培地」(MEM−アルファ+リボヌクレオシド、+デオキシリボヌクレオシド(インビトロジェン社、22571)、5%活性炭処理FCS(ペルビオサイエンスUK社(Perbio Sciences UK Ltd);SH30068.03)、1/100ピルビン酸ナトリウム(インビトロジェン社、11360)、250μg/mlのジェネテシン50mg/ml(インビトロジェン社、10131027)中に加え、37℃、5%CO2で一晩インキュベートした。細胞の培地を「アッセイ培地」(DMEM(インビトロジェン社、31966021)、25mMヘペス(インビトロジェン社))と交換し、4×最終アッセイ濃度で精製dAbを含むPBSを「アッセイ培地」中に滴定し、細胞プレートに加え、次いで4×EC80でTGF−β1(R&D社、240B)を加えた。プレートを37℃、5%CO2で6時間インキュベートした。STEADYLITE(商標)ルシフェラーゼ試薬(パーキンエルマー社、6016987)をウェルに加え、室温で30分間インキュベートし、得られた発光をENVISION(商標)プレートリーダー上で測定した。
A549インターロイキン−11(IL−11)放出アッセイは、ヒトTGF−β1で刺激されるA549細胞からのIL−11放出をdAbが阻害する能力を測定する。TGF−β1はTGF−βRIIに直接結合し、TGF−βRI/II複合体の構築を誘導する。TGF−βRIはリン酸化され、Smad4経路等の複数の経路を介してシグナル伝達することができる。Smad4経路が活性化されるとIL−11が放出される。IL−11が細胞上清中に分泌され、次いで比色ELISAで測定する。
シグナル伝達分子のSmadファミリーのメンバーは、TGF−βシグナルを細胞表面から核に伝達する細胞内経路の構成要素である。TGF−β1はTGF−βRIIに直接結合し、TGF−βRI/II複合体の構築を誘導する。次いで、Smad2およびSmad3がTGF−βRIによってリン酸化され、その後、共smadファミリーメンバーであるSmad4とヘテロマー複合体を形成する。これらの複合体は核に移動され、そこでDNAに結合して遺伝子転写を調節する。
(前述の)好適な生物物理学的特徴を有し且つ活性であるとして同定されたdAbの親和性を向上させるためにエラープローン(error−prone)突然変異誘発を行った。
DOM23h−855−21 核酸配列(配列番号203)
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DOM23h−271 アミノ酸配列(配列番号199)
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271−7R1deg CDR1
(GCAGCCTCCGGATTCACCTTTacSgaStatagSATGtgSTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGG)(配列番号189);
271−7R2deg CDR2
(GGGTCTCGAGTGGGTCTCAgcSATTgaSccSatSggSaaScgSACATACTACGCAGACTCCGTG)
(配列番号190);
271−7R3deg CDR3:
(GCGGTATATTACTGTGCGAAAcaSatSccSggScgSaaStgSacSgcSaaStcScgSttSGACTACTGGGGTCAGGG)(配列番号191)。
本質的に国際公開第2006018650号に記載されているようにscArc DNA結合タンパク質を用いたDNAディスプレイおよびエマルション中でのインビトロ区画化(in vitro compartmentalisation)を用いて選択を行った。簡潔に述べると、TGFbRII−FC抗原を、5:1のモル比のビオチンおよびEZ−LINK(商標) Sulpho−NHS−LC−ビオチンキット(サーモ社、#21327)を用いてビオチン化した。Arcオペレーター配列と多様化dAbライブラリーを含む発現カセットとを含むDNA断片を、フランキングプライマーを用いてpIE2A2ベクターからPCR増幅した。生成物をeGel(インビトロジェン社)から精製して、1mg/mlBSA中に1.7または0.85nMで希釈した。改善された結合物質の選択に、ドープおよびトリプレットライブラリーをわずかに異なる条件下で別個に処理した。トリプレットCDRライブラリーを組み合わせて、プールされたCDR1、2、または3のライブラリーを得た。各タイプのライブラリーに選択を10ラウンド行った。両方の方法で、2回の選択サイクル後、スプライス重複伸長PCRにより多様化CDRを増幅して組み換え、3つ全てのCDR中に変異を有する4番目のライブラリーを作製した。
別個のCDR1、CDR2、およびCDR3プールのトリプレットまたはドープライブラリーを、前述したようにファージ選択ラウンドに供した:ビオチン化ヒトTGF−βRII/Fc抗原に対して、それぞれ濃度10nM、1nM、100pM、および20pMの4ラウンドまたは20pM抗原の後に2pM抗原を用いた2ラウンドの選択。ファージ選択で得られたインサートをpDOM10発現ベクターにクローニングし、親と比べて解離速度が向上した上清を更なる実験に選択した。ドメイン抗体を発現させ、前述したようにBIACORE(商標) T100上または細胞センサーアッセイ中で試験したヒトTGF−βRII/Fc抗原に対する親和性および生物活性に基づいて精製した(データ示さず)。選択されたクローンのヒトTGFbRII−FCに対する親和性を表8に示す。
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CM4チップ上の捕捉表面を用いてBIACORE(商標)分析を行った。抗ヒトIgGを捕捉物質(capturing agent)として用い、一級アミンカップリングによりCM4バイオセンサーチップにカップリングした。ヒトFcに融合させた抗原分子をこの固定化表面上に250〜300レゾナンスユニットのレベルで捕捉し、ランニングバッファーで希釈した所定濃度のドメイン抗体をこの捕捉表面上に通過させた。捕捉抗原表面にバッファーを注入して二重参照に用いた。各ドメイン抗体注入後に3M塩化マグネシウム溶液を用いて捕捉表面を再生した。再生は、捕捉された抗原は除去したが、その後のサイクルにおいて表面が抗原を捕捉する能力には有意に影響しなかった。全てのランは、HBS−EPバッファーをランニングバッファーとして用いて25℃で行った。データはBIACORE(商標) T100で生成し、ソフトウェアに附属の1:1結合モデルに当てはめた。最高濃度で非特異的結合が見られた場合、この濃度の結合曲線を分析セットから除いた。
親和性が最高のDOM23h−271−7誘導体は96および100B位にメチオニンを有していた。99、100D、100E、および100G位に加えてこれらの位置をNNK突然変異誘発を用いて多様化して、置換が可能であるかどうかを決定した。DOM23h−271−22またはDOM23h−271−102を背景として選択した位置に多様性を導入するプライマーPEP−26−Fを用いて前述のようにNNKライブラリーを構築した。DOM23h−271−102は、DOM23h−271−7よりも向上した親和性を付与する27および55位の変異を有している。
GCGGTATATTACTGTGCGAAACAGNNSCCCGGCNNSAAGTGGNNSGCCNNSNNSCGCNNSGACTACTGGGGTCAGGGAACC
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATCCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTCATAGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGGCGCCCGGCGAGAAGTGGCTCGCCCGGGGCCGCTTGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
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過去に種々のTGFRβII dAb系列中にD61NおよびK64R二重変異が導入され、効力を向上させることが示されている(国際公開第2011/012609号)。これらの変異をTGFbRII dAb DOM23h−271系列に導入して、同様な効力向上が実現され得るかどうかを見た。この部位での別の変異を調べ、効力の更なる上昇が実現され得るかどうかを決定した。
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GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTAATCGTACATACTACGCACGCTCCGTGGACGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGATGCCCGGCCAGAAGTGGATGGCCAAGTCCCGCTTCGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
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GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTAATCGTACATACTACGCACGCTCCGTGTTCGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGATGCCCGGCCAGAAGTGGATGGCCAAGTCCCGCTTCGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
ドメイン抗体DOM23h−855−21(配列番号204)およびDOM23h−843−13(配列番号206)は、実施例5に詳述されているようにそれぞれナイーブクローンDOM23h−855(配列番号13)およびDOM23h−843(配列番号10)に対して行ったエラープローン親和性成熟から単離された。ドメイン抗体DOM23h−439は国際公開第2011/012609号に記載されている以前の選択実験でファージライブラリーから単離され、その後、実施例5に詳述されているようにエラープローン親和性成熟によりバリアントDOM23h−439−20(配列番号208)が単離された。実施例6に詳述されているように、CDR標的親和性成熟バリアントDOM23h−271−22(配列番号30)のCDR3の再多様化により、ドメイン抗体DOM23h−271−50(配列番号214)が作製された。DOM23h−855−21、DOM23h−843−13、DOM23h−439−20、およびDOM23h−271−50全てを、それらの結合キネティクス、SBE−bla HEK 293T 細胞センサーアッセイによる効力、配列、および生物物理学的挙動に基づいて更なる親和性成熟に選択した。ディジェネレート突然変異誘発を用いてCDRを再多様化することにより親和性成熟を行い、ファージディスプレイを用いて、改善されたリードを同定した。ドープまたはNNKライブラリーのいずれかの構築により、CDRに多様性を導入した。
5’−GCAGCCTCCGGATTCACCTTTggSacSgagcagATGtggTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG−3’
5’−AAGGGTCTAGAGTTTGTCTCAcgSATTgattcSccSGGTggScgSACATACTACGCAGACTCCGTG−3’
5’−GCGGTATATTACTGTGCGAAAcgScatgcSgcSggSgtStcSggSacStaYtttGACTACTGGGGTCAGGGAACC−3’
5’−GCAGCCTCCGGATTCACCTTTgatcaggatcgSATGtggTGGGTCCGCCAGGCCCCAGGG−3’
5’−AAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAgcSATTgagtcSggSGGTcatcgSACATACTACGCAGACTCCGTG−3’
5’−ACCGCGGTATATTACTGTGCGVRKcagaataagtcSggScgStcSggSTTTGACTACTGGGGTCAGGGA−3’
5’−GCAGCCTCCGGATTCACCTTTgagaatacStcSATGggSTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG−3’
5’−AAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAcgSATTgatccSaagGGTtcScatACATACTACacSGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACC−3’
5’−GCGGTATATTACTGTGCGAAAcagcgSgagctSggSaagtcStaYTTTGACTACTGGGGTCAGGGA−3’
5’−GCAGCCTCCGGATTCACCTTTNNKNNKNNKNNKATGNNKTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTC−3’
5’−CCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCTCANNKATTNNKNNKNNKGGTNNKCGTACATACTACGCAGACTCCG−3’
5’−CCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGNNKNNKNNKNNKNNKACATACTACGCAGACTCCG−3’
5’−ACCGCGGTATATTACTGTGCGAAANNKNNKNNKNNKNNKAAGTGGATGGCCGTGGGCCGCTTGGACTACTGGGGTCAGGG−3’
5’−ACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGAAGCCCNNKNNKNNKNNKNNKGCCGTGGGCCGCTTGGACTACTGGGGTCAGGG−3’
5’−ACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGAAGCCCGGCCAGAAGTGGNNKNNKNNKNNKNNKTTGGACTACTGGGGTCAGGG−3’
別個のCDR1、CDR2、CDR3、並びに組み合わせたCDR1、2、および3のプールのNNKまたはドープライブラリーを、ブロッキングステップに以下の変更を加えて実施例1と同様に、100nM、10nM、1nM、1nM、0.1nM、および0.1nM(それぞれ第1、2、3、4、5、および6ラウンド)のビオチン化単量体ヒトTGF−βRII抗原に対する少なくとも6ラウンドの選択に供した:上記の実施例1で加えたヒトIgG Fc断片を省略し、ブロッキングステップを最低20分間行った。選択の第4および6ラウンドでは、標識抗原とのインキュベーションステップ後に100nM非ビオチン化抗原と30分間(第4および6ラウンド)インキュベートすることにより競合を導入した。DOM 23h−439−20(CDR1、CDR3、および組合せのプ−ル)およびDOM 23h−855−21(CDR3)では、第7ラウンドの選択を0.1nMビオチン化単量体ヒトTGF−βRII抗原および100nM競合物質に対して120分間または20pMビオチン化単量体ヒトTGF−βRII抗原および100nM競合物質に対して30分間行った。選択のラウンド間に、ファージ感染TG1細胞の一晩培養物を4000gで30分間遠心することによりファージを増幅した。増幅したファージを含む上清40mlを、10mlのPEG/NaCl(20v/v% PEG8000+2.5M NaCl)に加え、氷上で60分間インキュベートした。サンプルを4000gで40分間遠心して、沈殿したファージをペレット化した。上清を捨て、ファージペレットを1mlの15v/v%グリセロール/PBSに再懸濁した。ファージサンプルを2mlのエッペンドルフチューブに移し、10分間遠心して、残った細菌細胞片を全て除去した。ファージ選択から得られた多様化したドメイン抗体Vh遺伝子を、プライマーPEP011VHStopNotIR(5’−CCCTGGTCACCGTCTCGAGCTAATAGGCGGCCGCGAATTC−3’(配列番号231)およびNco1 VH F(5’−TATCGTCCATGGCGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGG−3’(配列番号232)を用いてPCR増幅し、NcoIおよびNotI制限エンドヌクレアーゼで消化し、同じくNcoIおよびNotIで消化したpC10ベクター中にライゲートした。pC10は、dAbの可溶性発現用に設計された、強化されたLacZプロモーターで発現が制御されている、pUC119ベクターをベースにしたプラスミドベクターである。dAb遺伝子をN末端でpelBシグナルペプチドに融合させることにより上清中へのdAbの発現が可能になっている。ライゲーション産物を化学的にコンピテントな大腸菌HB2151細胞に形質転換し、100μg/mlのカルベニシリンを添加した栄養寒天プレートにプレーティングした。個々のクローンを選び、100μg/mlカルベニシリンを添加した一晩発現自己誘導培地(高レベルタンパク質発現系、ノバジェン社)を含む96ウェルプレート中で発現させ、250rpmで振盪しながら、30℃で66時間または37℃で24時間増殖させた。次いで、発現プレートを3500gで15分間遠心し、上清を0.45μフィルタープレート(ミリポア社)で濾過した。BIACORE(商標) B4000上で、ヒトTGF−βRIIおよびヒトTGF−βRII/Fcに対して、ドメイン抗体を含む上清をスクリーニングし、解離速度(Kd)を決定した(データ示さず)。メーカーの取扱説明書に従ってビオチン化抗原をSAチップ上で捕捉し、HBS−EPバッファーを用いて25℃で分析を行った。サンプルを流速30μl/minでBIACORE(商標)に流した。低pHのグリシンを用いてチップを再生した。ソフトウェアに組み込まれている1:1解離モデルに解離期を当てはめることによりデータ(図示せず)を解離速度について分析し、更に上清をプロテインA結合について分析して発現レベルを推定した。親と比べて解離速度の向上したドメイン抗体を更なる研究に選択した。向上したクローンを、100μg/mlカルベニシリンおよび消泡剤(シグマ社)を添加した一晩発現自己誘導培地(ONEX(商標)、ノバジェン社)中で、250rpmで振盪しながら30℃で48〜72時間発現させた。培養物を遠心し(4,200rpmで40分)、上清をSTREAMLINE(商標)プロテインAビーズ(アマシャムバイオサイエンス社、GE HEALTHCARE(商標)社、英国;結合能:ビーズ1ml当たりdAb5mg)と共に4℃または室温で少なくとも1時間インキュベートした。ビーズをクロマトグラフィーカラムに充填し、PBSで、次いで10mMトリスHCl(pH7.4、シグマ社、英国)で洗浄した。結合したdAbを0.1Mグリシン−HCl(pH2.0)で溶出し、1Mトリス−HCL(pH8.0)で中和した。dAbの280nmのODを測定し、dAbのアミノ酸組成から算出された消衰係数を用いてタンパク質濃度を決定した。親和性成熟ドメイン抗体をBIACORE(商標) T200(2つの好ましいdAbのデータを実施例9に示す)およびSBE−bla HEK 293T細胞センサーアッセイ(2つの好ましいdAbのデータを実施例11に示す)で試験して、それらの親和性および抗力を決定した。示差走査熱量測定(DSC)並びに分子ふるいクロマトグラフィーおよび多角度レーザー光散乱(SEC−MALS)を用いて、熱安定性および溶液状態を含む生物物理学的性質を決定した(2つの好ましいdAbのデータを実施例10に示す)。
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGGACGGAGCAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTTTGTCTCACGTATTGATTCGCCTGGTGGGAGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACGGCGACCCACGGGGGTGTCCGGGACGTTTTATGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
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GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATCCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTCATAGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGGCGCCCAATCAGAGGTATGTTGCCCGGGGCCGCTTGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
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実施例7に記載のD61NおよびK64R変異を組み合わせてまたは別個にDOM23h−439−25、DOM23h−271−123、およびDOM23h−271−129親和性成熟dAbに導入した。DOM23h−439−25およびDOM23h−271−123dAbへのV48I変異の導入についても、効力の向上を付与し得るかどうか調べた。試験成熟およびCDR標的親和性成熟のいずれの後でも、DOM23h−439系列から得られた複数の向上dAbにおいて、kabat48位での自然発生的変異が観察された。更に、kabat残基113のすぐ後ろにあるVh領域のC末端のアラニンを、DOM23h−439−25、DOM23h−271−123、およびDOM23h−271−129並びに前述した変異を有するこれらのdAbの全てのバリアントに付加した。本質的に実施例7と同様にポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いた重複伸長法によりDOM23h−439−25(配列番号234)、DOM23h−271−123(配列番号236)、およびDOM23h−271−129(配列番号240)バックボーン中に変異を導入した。ヌクレオチド配列中の特異的変異は、重複オリゴヌクレオチドプライマー中にヌクレオチド変化を組み込むことにより導入し、Vh領域末端のアラニンの挿入は、kabat113位の後にアラニン残基が組み込まれるように設計した3’オリゴヌクレオチドを用いて実現した。
5’−GGGTCTAGAGTTTATTTCACGTATTGATTCGCC−3’
5’−GGGAGGACATACTACGCAAACTCCGTGAAGGGCCGG−3’
5’−CGCAGACTCCGTGCGTGGCCGGTTCACC−3’
5’−GGGAGGACATACTACGCAAACTCCGTGCGTGGCCGGTTCACC−3’
5’−GGACATACTACGCAAACTCCGTGAAGGGCCGG−3’
5’−CGCAGACTCCGTGCGTGGCCGGTTCACC−3’
5’−GGACATACTACGCAAACTCCGTGCGTGGCCGGTTCACC−3’
5’−CCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCGTAATAAGCGGCCGCAGATTA−3’
5’−ATAAGGCCATGGCGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTG−3’
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGGACGGAGCAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTTTGTCTCACGTATTGATTCGCCTGGTGGGAGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACGGCGACCCACGGGGGTGTCCGGGACGTTTTATGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCG
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抗ヒトIgGをメーカーの取扱説明書に従い一級アミンカップリングでBiacore CM4チップに固定化した。ヒトTGF−βRII/Fc、カニクイザルTGF−βRII/Fc、またはヒトFc断片をこの表面上に捕捉した。100、10、および1nM(DOM23h−439 dAb)または100、25、および6.25nM(DOM23h−271 dAb)の3つの濃度でドメイン抗体を2つの捕捉受容体上に通過させた。各dabの100nM濃度だけをヒトFc断片上に通過させて、細胞外TGF−βRIIドメインへの結合の特異性を確認した。捕捉抗原表面へのバッファーの注入を二重参照に用いた。各ドメイン抗体注入後、3M塩化マグネシウム溶液で捕捉表面を再生した。再生は、捕捉抗原を除去したがその後サイクルにおいて表面が抗原を捕捉する能力に有意な影響を与えなかった。全てのランは、HBS−EPバッファーをランニングバッファーとして用いて25℃で行った。BIACORE(商標) T200を用いてデータを生成し、ソフトウェア中の1:1結合モデルに当てはめた。試験したdAbの結合キネティクスを表14に示す。DOM23h−271 dAbおよびDOM23h−439系列は別個の実験で流した。
示差走査熱量計(DSC)を用いてdAbの熱安定性を決定した。dAbをPBSバッファー中に一晩透析し、終濃度1mg/mlに調整した。透析バッファーを全サンプルに対する参照として用いた。キャピラリーセルマイクロ熱量計VP−DSC(GE healthcare/Microcal)を用いて180℃/時間の加熱速度でDSCを行った。典型的なスキャンレンジは参照バッファーおよびタンパク質サンプルの両方で20〜90℃とした。各参照バッファーおよびサンプル対の後、5%Decon(フィッシャーサイエンティフィック社)水溶液、次いでPBSでキャピラリーセルを洗浄した。得られたデータトレースをOrigin 7.0ソフトウェアで分析した。参照バッファーから得られたDSCトレースをサンプルトレースから引いた。サンプルの正確なモル濃度をデータ分析ルーチンに入力して、融解温度(Tm)、エンタルピー(ΔH)、およびファント・ホッフエンタルピー(ΔHv)の値を得た。データを非2状態モデルに当てはめた。1または2遷移事象のいずれかで最良適合および依存性の値を得た。各サンプルのサーモグラムをゼロから積分することにより、開始アンフォールディング温度も決定された。次いで、この値をサンプルの4パーセントがアンフォールディングされる温度として求めた。
dAbが溶液中で単量体であるのか、より高次のオリゴマーを形成しているのかを決定するために、これらをSEC−MALLS(分子ふるいクロマトグラフィーおよび多角度レーザー光散乱)で分析した。(Empowerソフトウェアで制御される)オートサンプラーおよびUV検出器を備えたAgilent 1100シリーズHPLCシステムをWyatt Mini Dawn Treos(レーザー光散乱(LS)検出器)およびWyatt Optilab rEX DRI(示差屈折率(RI)検出器)に連結した。検出器は以下の順で連結した:UV−LS−RI。RIおよびLS機器の両方を波長658nmで作動させ、UVシグナルを280nmおよび220nmでモニタリングした。TSK2000カラムを用いた分子ふるいクロマトグラフィーにより、それらの流体力学的特性に従ってドメイン抗体を分離した(PBS中1mg/mLの濃度で50マイクロリットル注入)。移動相は0.2M NaCl、0.1M NaPO4、15%n−プロパノールである。タンパク質が検出器を通過する際の散乱光の強度を角度の関数として測定した。この測定と、RI検出器を用いて決定されたタンパク質濃度とから、適切な式(分析ソフトウェアAstra v.5.3.4.14の積分部分)を用いたモル質量の計算が可能になる。単量体の割合としての溶液状態を表15に示す。
アッセイは実施例4、アッセイh2に概説したのと全く同じように行った。
Claims (31)
- 配列番号267に記載されたアミノ酸配列を有する、抗TGFベータRII免疫グロブリン単一可変ドメイン。
- 請求項1に記載の抗TGFベータRII免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなる単離されたポリペプチドであって、TGFベータRIIに結合する、単離されたポリペプチド。
- ヒトTGFベータRIIに結合する、請求項1または2に記載の抗TGFベータRII免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチド。
- マウスTGFベータRIIおよび/またはカニクイザルTGFベータRIIにも結合する、請求項3に記載の抗TGFベータRII免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチド。
- TGFベータ活性を中和する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチド。
- TGFベータRIIへのTGFベータの結合を阻害する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチド。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗TGFベータRII免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドをコードする、単離された核酸。
- 配列番号266に記載された核酸分子を含んでなる、請求項7に記載の単離された核酸分子。
- 請求項7または8に記載の核酸分子を含んでなる、ベクター。
- 請求項7〜9のいずれか一項に記載の核酸またはベクターを含んでなる、宿主細胞。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗TGFベータRII免疫グロブリン単一可変ドメインを含んでなるポリペプチドを製造する方法であって、前記核酸またはベクターの発現に適した条件下に請求項10に記載の宿主細胞を維持することにより、免疫グロブリン単一可変部を含んでなるポリペプチドを生成させることを含んでなる、方法。
- 医薬として使用するための、請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗TGFベータRII免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチド。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗TGFベータRII免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドを含んでなる、医薬組成物。
- 組織線維症、肝線維症、関節リウマチ、眼障害、皮膚の線維症、腎線維症、創傷治癒、および血管病態の群から選択される疾患を処置するための、請求項12に記載の抗TGFベータRII免疫グロブリン単一可変ドメインもしくはポリペプチドまたは請求項13に記載の医薬組成物。
- 前記組織線維症が肺線維症である、請求項14に記載の抗TGFベータRII免疫グロブリン単一可変ドメインもしくはポリペプチドまたは医薬組成物。
- 前記肺線維症が特発性肺線維症である、請求項15に記載の抗TGFベータRII免疫グロブリン単一可変ドメインもしくはポリペプチドまたは医薬組成物。
- 前記肝線維症が肝硬変または慢性肝炎である、請求項14に記載の抗TGFベータRII免疫グロブリン単一可変ドメインもしくはポリペプチドまたは医薬組成物。
- 前記皮膚の線維症が皮膚のケロイドまたはデュピュイトラン拘縮である、請求項14に記載の抗TGFベータRII免疫グロブリン単一可変ドメインもしくはポリペプチドまたは医薬組成物。
- 前記腎線維症が腎炎または腎硬化症である、請求項14に記載の抗TGFベータRII免疫グロブリン単一可変ドメインもしくはポリペプチドまたは医薬組成物。
- 前記血管病態が再狭窄である、請求項14に記載の抗TGFベータRII免疫グロブリン単一可変ドメインもしくはポリペプチドまたは医薬組成物。
- 組織線維症の処置において使用するためのまたは創傷治癒および/もしくは瘢痕化軽減において使用するための、請求項12に記載の抗TGFベータRII免疫グロブリン単一可変ドメインもしくはポリペプチド、または請求項13に記載の医薬組成物。
- 前記疾患が、ケロイド疾患またはデュピュイトラン拘縮である、請求項12または14に記載の抗TGFベータRII免疫グロブリン単一可変ドメイン。
- 組織線維症、肝線維症、関節リウマチ、眼障害、皮膚の線維症、腎線維症、創傷治癒、および血管病態の群から選択される疾患を処置するための医薬の製造における、請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗TGFベータRII単一可変ドメインまたはポリペプチドの使用。
- 前記組織線維症が肺線維症である、請求項23に記載の使用。
- 前記肺線維症が特発性肺線維症である、請求項24に記載の使用。
- 前記肝線維症が肝硬変または慢性肝炎である、請求項23に記載の使用。
- 前記皮膚の線維症が皮膚のケロイドまたはデュピュイトラン拘縮である、請求項23に記載の使用。
- 前記腎線維症が腎炎または腎硬化症である、請求項23に記載の使用。
- 前記血管病態が再狭窄である、請求項23に記載の使用。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗TGFベータRII単一可変ドメインまたはポリペプチドと、前記単一可変ドメインまたはポリペプチドを皮膚に適用するためのデバイスとを含んでなる、キット。
- 前記デバイスが皮内送達デバイスである、請求項30に記載のキット。
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Cited By (1)
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Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11644471B2 (en) | 2010-09-30 | 2023-05-09 | Ablynx N.V. | Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains |
BR122017005075B1 (pt) | 2011-06-23 | 2022-09-20 | Ablynx N.V | Técnicas para prever, detectar e reduzir interferência de proteína não especifica em ensaios envolvendo domínios variáveis únicos de imunoglobulina |
CN105143258B (zh) * | 2013-03-15 | 2020-06-23 | Ac免疫有限公司 | 抗Tau抗体和使用方法 |
EP3705498A1 (en) | 2013-08-22 | 2020-09-09 | Acceleron Pharma Inc. | Tgf-beta receptor type ii variants and uses thereof |
CA2931309C (en) * | 2013-11-21 | 2022-06-21 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Compositions and methods for treating pulmonary hypertension |
BR112016016411A2 (pt) * | 2014-01-15 | 2017-10-03 | Hoffmann La Roche | VARIANTES DE REGIÕES-"Fc" COM PROPRIEDADES DE LIGAÇÃO DE "FcRn" MODIFICADAS |
CN106794233B (zh) * | 2014-08-01 | 2021-11-12 | 布里格姆及妇女医院股份有限公司 | 与肺动脉高压的治疗有关的组合物和方法 |
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US9884900B2 (en) | 2015-08-04 | 2018-02-06 | Acceleron Pharma Inc. | Methods for treating Janus kinase-associated disorders by administering soluble transforming growth factor beta type II receptor |
WO2017041114A2 (en) * | 2015-09-03 | 2017-03-09 | The Children's Mercy Hospital | Anti-nicotinamide phosphoribosyltransferase antibody genes and methods of use thereof |
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CN108883181A (zh) * | 2016-04-05 | 2018-11-23 | 葛兰素史密斯克莱知识产权发展有限公司 | 在免疫疗法中抑制TGFβ |
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GB201807693D0 (en) * | 2018-05-11 | 2018-06-27 | Autolus Ltd | Cell |
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KR102314157B1 (ko) * | 2020-01-10 | 2021-10-19 | 주식회사 뉴클릭스바이오 | TGF-β 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 이용방법 |
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Family Cites Families (26)
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---|---|---|---|---|
WO1994026087A2 (en) | 1993-05-14 | 1994-11-24 | Connor Kim C O | Recombinant protein production and insect cell culture and process |
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JP2001206899A (ja) * | 1999-11-18 | 2001-07-31 | Japan Tobacco Inc | TGF−βII型受容体に対するヒトモノクローナル抗体及びその医薬用途 |
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EP1578801A2 (en) | 2002-12-27 | 2005-09-28 | Domantis Limited | Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand |
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US20050164301A1 (en) | 2003-10-24 | 2005-07-28 | Avidia Research Institute | LDL receptor class A and EGF domain monomers and multimers |
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JO3096B1 (ar) * | 2008-11-07 | 2017-03-15 | Imclone Llc | الأجسام المضادة لمستقبل ii مضاد tgfb |
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