ES2581229T3

ES2581229T3 - Proteínas de unión a antígeno capaces de unirse a linfopoyetina estromal tímica

Info

Publication number: ES2581229T3
Application number: ES08830362.3T
Authority: ES
Inventors: Michael R. Comeau; James F. Smothers; Bo-Rin P. Yoon; Christopher Mehlin
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2007-09-10
Filing date: 2008-09-09
Publication date: 2016-09-02
Anticipated expiration: 2028-09-09
Also published as: PE20140232A1; HUS2200051I1; US7982016B2; NL301207I1; PH12017501025A1; US20090238823A1; CY2022036I2; CR11319A; JP2024161358A; CN101809035B; JP5956716B2; US20120190829A1; PT2205635T; US20160152700A1; DK2205635T3; JP2010538608A; JP2015091820A; AU2008300028B2; CA2698382A1; SG178781A1

Abstract

Un anticuerpo humano anti-LPET que comprende: a. un dominio variable de cadena ligera que comprende: i. una secuencia CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 13; ii. una secuencia CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 60; y iii. una secuencia CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 105; y b. un dominio variable de cadena pesada que comprende: i. una secuencia CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 145; ii. una secuencia CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:173; y iii. una secuencia CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 212; y

Description

DESCRIPCION

Protemas de union a antigeno capaces de unirse a linfopoyetina estromal tfmica Campo de la invencion

El campo de esta invencion se refiere a composiciones de anticuerpos humanos capaces de unirse a linfopoyetina 5 estromal timica humana, asf como a metodos relacionados.

Antecedentes de la invencion

La prevalencia de enfermedades alergicas tales como asma, rinitis alergica, dermatitis atopica y alergias alimentarias parece estar aumentando en los ultimos anos, sobre todo en los pafses desarrollados, afectando a un porcentaje cada vez mayor de la poblacion (Kay, N Engl. J. Med. 344:30-37 (2001)). La linfopoyetina estromal tfmica (LPET) es 10 una citoquina derivada de celulas epiteliales producida en respuesta a los estfmulos pro-inflamatorios. Se ha descubierto que la LPET promueve respuestas inflamatorias alergicas principalmente a traves de su actividad sobre celulas dendnticas y mastocitos (Soumelis et al., Nat Immun 3(7):673-680 (2002), Allakhverdi et al., J. Exp. Med. 204(2):253-258 (2007)). Se ha informado de que la expresion de LPET humana aumenta en las vfas respiratorias asmaticas en correspondencia con la gravedad de la enfermedad (Ying et al., J. Immunol. 174:8183-8190 (2005)). 15 Ademas, los niveles de protema de LPET son detectables en el lfquido de lavado broncoalveolar (LBA) concentrado de los pacientes de asma, y otros pacientes que sufren trastornos alergicos. Ademas, se encuentra aumento de los niveles de protema y ARNm de LPET en la piel lesional de la dermatitis atopica (DA) de los pacientes. Por lo tanto, los antagonistas de LPET senan utiles en el tratamiento de trastornos inflamatorios.

Ademas, tambien se ha encontrado que la LPET promueve la fibrosis, como se informa en la Solicitud de los 20 Estados Unidos con el Num. de Serie 11/344.379. La enfermedad fibrotica se produce durante el proceso de reparacion de tejidos si la fase de fibrosis continua sin control, dando lugar a una amplia remodelacion tisular y la formacion de tejido cicatrizal permanente (Wynn, Nature Rev. Immunol. 4, 583 (2004)). Se ha estimado que hasta 45% de las muertes en los Estados Unidos se puede atribuir a enfermedades fibroproliferativas, que pueden afectar a muchos tejidos y sistemas de organos (Wynn, mas arriba, en 595 (2004)). El documento WO 2007/096149 25 describe anticuerpos para LPET.

Actualmente, los tratamientos anti-inflamatorios se utilizan para tratar trastornos fibroticos, ya que la fibrosis es comun a muchas enfermedades inflamatorias persistentes, tales como la fibrosis pulmonar idiopatica, la enfermedad renal progresiva, y la cirrosis hepatica. Sin embargo, los mecanismos implicados en la regulacion de la fibrosis parecen ser distintos de los de la inflamacion, y las terapias anti-inflamatorias no siempre son eficaces en la 30 reduccion o prevencion de la fibrosis (Wynn, mas arriba). Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de desarrollo de tratamientos para reducir y prevenir la fibrosis.

Por lo tanto, se esperana que los antagonistas de LPET fueran utiles para el tratamiento de estos trastornos inflamatorios y fibroticos. La presente descripcion proporciona tales tratamientos y metodos de tratamiento.

Compendio de la invencion

35 La presente descripcion proporciona una protema de union a antfgeno aislada que comprende a. una secuencia de CDR3 de cadena ligera seleccionada entre i. una secuencia de CDR3 de cadena ligera que difiere en no mas de un total de dos adiciones, sustituciones, y/o deleciones de aminoacidos de una secuencia de CDR3 seleccionada del grupo que consiste en secuencias de CDR3 de cadena ligera de A1 a A27; ii. QQAXaSFPLT (SEQ ID NO: 251); y b. una secuencia de CDR3 de cadena pesada seleccionada entre i. una secuencia de CDR3 de cadena pesada que 40 difiere en no mas de un total de tres adiciones, sustituciones, y/o deleciones de aminoacidos de una secuencia de CDR3 seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de CDR3 de cadena pesada de A1 a A27; ii. GGGIX12VADYYX13YGMDV (SEQ ID NO: 255); iii. DX21GX22SGWPLFX23Y (SEQ ID NO: 259); en donde Xa es un residuo de N o un residuo de D; X12 es un residuo de P o un residuo de A; X13 es un residuo de Y o un residuo de F; X21 es un residuo de G o un residuo de R; X22 es un residuo de S o un residuo de T; X23 es un residuo de A o un 45 residuo de D, y en donde dicha protema de union a antfgeno se une espedficamente a LPET.

La protema de union a antfgeno aislada de la presente descripcion comprende adicionalmente al menos uno de los siguientes: a. una secuencia de CDR1 de cadena ligera seleccionada entre i. una secuencia de CDR1 de cadena ligera que difiere en no mas de tres adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoacidos de una secuencia de CDR1 de cadena ligera de A1-A27; ii. RSSQSLX1YSDGX2TYLN (SEQ ID NO: 246);

50 iii. RASQX4X5SSWLA (SEQ ID NO: 249); b. una secuencia de CDR2 de cadena ligera seleccionada entre i. una secuencia de CDR2 de cadena ligera que difiere en no mas de dos adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoacidos de una secuencia de CDR2 de A1-A27; ii. KVSX3 (residuos 1-4 del SEC ID NO: 247); iii. X6X7SSLQS (SEQ ID NO: 250); o iv. QDXgKRPS (SEQ ID NO: 252); y c. una secuencia de CDR1 de cadena pesada seleccionada entre i. una secuencia de CDR1 de cadena pesada que se diferencia en no mas de dos adiciones, 55 sustituciones y/o deleciones de aminoacidos de una secuencia de cDR1 de A1-A27; ii. X10YGMH (SEQ ID NO: 253);

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y iii. X15X16YMX17 (SEQ ID NO: 257); y d. una secuencia de CDR2 de cadena pesada seleccionada entre i. una secuencia de CDR2 de cadena pesada que se diferencia en no mas de tres adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoacidos de una secuencia de CDR2 de A1-A27; ii. VIWX11DGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO: 254); iii. VISYDGSX14KYYADSVKG (SEQ ID NO: 256); y iv. WINPNSGGTNX18X19X20KFQG (SEQ ID NO: 258); en donde X1 es un residuo de V o un residuo de I; X2 es un residuo de N o un residuo de D; X3 es un residuo de Y o un residuo de N; X4 es un residuo de G o un residuo de S; X5 es un residuo de L o un residuo de de I; X6 es un residuo de N o un residuo de T; X7 es un residuo de T o un residuo de A; X9 es un residuo de K o un residuo de N; X10 es un residuo de S o un residuo de N; X11 es un residuo de Y o un residuo de F; X14 es un residuo de Y o un residuo de N; X15 es un residuo de D o un residuo de G; X16 es un residuo de Y o un residuo de D; X17 es un residuo de Y o un residuo de H; X18 es un residuo de Y o un residuo de H; X19 es un residuo de V o un residuo de A; X20 es un residuo de Q o un residuo de R, y en donde dicha protema de union a antfgeno se une espedficamente a LPET.

La protema de union a antigeno aislada comprende: a. un dominio variable de cadena ligera que comprende: i. una secuencia de CDR1 de cadena ligera seleccionada entre A1-A27; ii una secuencia de CDR2 de cadena ligera seleccionada entre A1-A27; iii. una secuencia de CDR3 de cadena ligera seleccionada entre A1-A27; o b. un dominio variable de cadena pesada que comprende i. una secuencia de CDR1 de cadena pesada seleccionada entre A1- A27; ii. una secuencia de cDR2 de cadena pesada seleccionada entre A1-A27, y iii. una secuencia de CDR3 de cadena pesada seleccionada entre A1-A27; o c. el dominio variable de cadena ligera de (a) el dominio variable de cadena pesada de (b).

La protema de union a antigeno aislada comprende a. una secuencia de dominio variable de cadena ligera seleccionada entre i. aminoacidos que tienen una secuencia identica en al menos 80% a una secuencia de dominio variable de cadena ligera seleccionada entre L1-L27; ii. una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de polinucleotido que es identica en al menos 80% a una secuencia de polinucleotido que codifica la secuencia del dominio variable de cadena ligera de L1-L27; iii. una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de polinucleotido que hibrida en condiciones moderadamente rigurosas con el complemento de un polinucleotido que consiste en una secuencia de dominio variable de cadena ligera de L1-L27; b. una secuencia del dominio variable de cadena pesada seleccionada entre i. una secuencia de aminoacidos que es identica en al menos 80% a una secuencia de dominio variable de cadena pesada de H1-H27; ii. una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de polinucleotido que es identica en al menos 80% a una secuencia de polinucleotido que codifica la secuencia del dominio variable de cadena pesada de H1-H27; iii. una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de polinucleotido que hibrida en condiciones moderadamente rigurosas con el complemento de un polinucleotido que consiste en una secuencia de dominio variable de cadena pesada de H1-H27; o c. el dominio variable de cadena ligera de (a) y el dominio variable de cadena pesada de (b), en donde dicha protema de union a antfgeno se une espedficamente a LPET.

Una protema de union a antfgeno aislada de la presente descripcion comprende: a. una secuencia de dominio variable de cadena ligera seleccionada entre: L1-L27; b. una secuencia de dominio variable de cadena pesada seleccionada entre H1-H27; o, c. el dominio variable de cadena ligera de (a) y el dominio variable de cadena pesada de (b), en donde la protema de union a antfgeno se une espedficamente a LpET.

En un aspecto, la invencion se refiere a un anticuerpo humano anti-LPET que comprende:

a. un dominio variable de la cadena ligera que comprende:

i. una secuencia CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos del SEQ ID NO: 13;

ii. una secuencia CDR2 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos del SEQ ID NO:

60; y

iii. una secuencia CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos del SEQ ID NO:

105;

b. un dominio variable de la cadena pesada que comprende:

i. una secuencia CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos del SEQ ID NO:

145;

ii. una secuencia CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos del SEQ ID NO:

173; y

iii. una secuencia CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos del SEQ ID NO:

212.

Mas espedficamente, la invencion se refiere a un anticuerpo humano anti-LPET que comprende: a. una secuencia del dominio variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en:

i. aminoacidos que tienen una secuencia identica en al menos 80% al SEQ ID NO: 363;

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ii. una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de polinucleotido que es identica en al menos 80% al SEQ ID NO: 362;

iii. una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de polinucleotido que hibrida en condiciones moderadamente rigurosas con el complemento de un polinucleotido que consiste en el SEQ ID NO: 362;

y

b. una secuencia del dominio variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en:

i. una secuencia de aminoacidos que es identica en al menos 80% al SEQ ID NO: 361;

ii. una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de polinucleotido que es identica en al menos 80% al SEQ ID NO: 360;

iii. una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de polinucleotido que hibrida en condiciones moderadamente rigurosas con el complemento de un polinucleotido que consiste en el sEq ID NO: 360.

En un aspecto adicional, el anticuerpo humano anti-LPET comprende una secuencia de dominio variable de la cadena ligera y una secuencia de dominio variable de la cadena pesada seleccionadas entre L19.2H19, L20.1H20, L20.2H20, L21H21, L22H22, L23H23, L24H24, L25H25, L26H26.

En un aspecto adicional, el anticuerpo humano anti-LPET comprende una protema de union que se une a LPET sustancialmente con la misma Kd que un anticuerpo de referencia A5. En otro aspecto, la protema de union a antigeno aislado comprende una protema de union que inhibe la actividad de LPET de acuerdo con el analisis de OPG celular primario con la misma CI50 que un anticuerpo de referencia A5.

En un aspecto adicional mas, el anticuerpo humano anti-LPET compite de manera cruzada por la union de LPET a un anticuerpo de referencia. En otro aspecto, la protema de union a antigeno aislada se une al mismo epftopo que un anticuerpo de referencia.

En un aspecto, el anticuerpo humano anti-LPET se selecciona entre un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, anticuerpo quimerico, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, un fragmento de anticuerpo de union a antigeno, un anticuerpo de cadena sencilla, un diacuerpo, un triacuerpo, un tetracuerpo, un fragmento Fab, un fragmento F(fa')x, un anticuerpo de dominio, un anticuerpo IgD, un anticuerpo IgE, y el anticuerpo IgM, y el anticuerpo IgG1, y el anticuerpo IgG2, y el anticuerpo IgG3, y el anticuerpo IgG4, y el anticuerpo IgG4 que tiene al menos una mutacion en la region bisagra que alivia la tendencia a enlaces disulfuro intra cadena H. En un aspecto, la protema de union a antfgeno aislada es un anticuerpo humano.

Tambien se proporciona una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de polinucleotido que codifica el dominio variable de cadena ligera, el dominio variable de cadena pesada, o ambos, del anticuerpo de la presente descripcion. En una realizacion, el polinucleotido comprende una secuencia variable de cadena ligera L1- L27, y/o una secuencia variable de cadena pesada H1-H27, o ambas.

Tambien se proporcionan vectores que comprenden los polinucleotidos de la presente descripcion. En una realizacion, el vector es un vector de expresion. Tambien se proporciona una celula anfitriona que comprende el vector. Tambien se proporciona un hibridoma capaz de producir la protema de union a antfgeno de la presente invencion. Tambien se proporciona un metodo de fabricacion de la protema de union a antfgeno que comprende cultivar la celula anfitriona bajo condiciones que permitan que se exprese la protema de union a antfgeno.

Tambien se proporciona una composicion farmaceutica que comprende los anticuerpos de la presente invencion. En una realizacion, la composicion farmaceutica comprende un anticuerpo humano. Tambien se proporciona un metodo de tratamiento de una afeccion inflamatoria relacionada con LPET en un sujeto que necesite tal tratamiento que comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de la composicion al sujeto. En una realizacion, la afeccion inflamatoria es el asma alergica, la rinosinusitis alergica, la conjuntivitis alergica, o la dermatitis atopica. Tambien se proporciona un metodo de tratamiento de un trastorno fibrotico relacionado con LPET en un sujeto que necesite tal tratamiento que comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de la composicion al sujeto. En una realizacion, el trastorno fibrotico es la esclerodermia, la enfermedad pulmonar intersticial, la fibrosis pulmonar idiopatica, la fibrosis resultante de la hepatitis B o C cronica, la fibrosis inducida por radiacion y la fibrosis resultante de la cicatrizacion de heridas.

Breve descripcion de los dibujos

FIG. 1A-FIG. 1F. La FIG. proporciona la secuencia de aminoacidos de las regiones CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena ligera de A1-A27. Adicionalmente se proporciona una secuencia de nucleotidos ilustrativa que codifica cada CDR.

FIG. 2A-FIG. 2F. La FIG. proporciona la secuencia de aminoacidos de las regiones CDR1, CDR2, y CDR3 de

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cadena pesada de A1-A27. Adicionalmente se proporciona una secuencia de nucleotidos ilustrativa que codifica cada CDR.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion se refiere a anticuerpos humanos anti-LPET que se unen espedficamente a la citoquina linfopoyetina estromal timica humana (LPET), incluyendo protemas de union a antfgeno que inhiben la union y senalizacion de LPET, tales como anticuerpos antagonistas de LPET, fragmentos de anticuerpos y derivados de anticuerpos. Los anticuerpos son utiles para inhibir o bloquear la union de LPET a su receptor, y para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, enfermedades fibroticas, y otras afecciones relacionadas.

La presente invencion proporciona adicionalmente composiciones, kits, y metodos referentes a anticuerpos humanos que se unen a LPET. Tambien se proporcionan moleculas de acido nucleico, y derivados y fragmentos de los mismos, que comprenden una secuencia de polinucleotido que codifica la totalidad o una porcion de un polipeptido que se une a LPET, tal como un acido nucleico que codifica todo o parte de un anticuerpo anti-LPET, fragmento de anticuerpo, o derivado de anticuerpo. La presente invencion proporciona adicionalmente vectores y plasmidos que comprenden tales acidos nucleicos, y celulas o lmeas celulares que comprenden tales acidos nucleicos y/o vectores y plasmidos. Los metodos proporcionados incluyen, por ejemplo, metodos de preparacion, identificacion o aislamiento de anticuerpos anti-LPET, metodos para determinar si un anticuerpo se une a LPET, metodos de preparacion de composiciones, tales como composiciones farmaceuticas, que comprenden un anticuerpo que se une a LPET, y metodos para la administracion de un anticuerpo que se une a LPET en un sujeto, por ejemplo, metodos para el tratamiento de una afeccion mediada por LPET, y para la modulacion de una actividad biologica asociada con la senalizacion de LPET in vivo o in vitro.

LPET

La linfopoyetina estromal tfmica (LPET) se refiere a una citoquina de tipo I de cuatro haces a-helicoidales que es un miembro de la familia IL-2, pero muy estrechamente relacionada con lL-7. Las citoquinas son protemas reguladoras de bajo peso molecular secretadas en respuesta a ciertos estfmulos, que actuan sobre los receptores en la membrana de las celulas diana. Las citoquinas regulan una variedad de respuestas celulares. Las citoquinas se describen en general en referencias tales como Cytokines, A. Mire-Sluis y R. Thorne, ed., Academic Press, Nueva York, (1998).

La LPET se clono originalmente de una lmea de celulas del estroma tfmico murino (Sims et al., J. Exp. Med 192 (5), 671-680 (2000)), y se encontro que apoyaba el desarrollo temprano de celulas B y T. La LPET humana se clono y se encontro que tema una identidad de 43 por ciento en la secuencia de aminoacidos con el homologo murino (Quentmeier et al. Leukemia 15, 1286-1292 (2001), y Patente de Estados Unidos Num. 6.555.520). Las secuencias de polinucleotido y de aminoacidos de LPET humana se presentan en el SEQ ID NO: 1 y 2 respectivamente. Se encontro que LPET se urna con baja afinidad a una cadena del receptor de la familia de receptores de hematopoyetina denominado receptor de LPET (RLPET), que se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos Num. 09/895.945 (Publicacion Num. 2002/0068323) (SEQ ID NO: 3 y 4). La secuencia de polinucleotido que codifica RLPET humano se presenta como SEQ ID NO: 3 de la presente solicitud, y la secuencia de aminoacidos se presenta como SEC ID NO: 4 de la presente solicitud, respectivamente. El dominio soluble de RLPET abarca aproximadamente los aminoacidos 25 a 231 del SEQ ID NO: 4. La LPET se une con alta afinidad a un complejo heterodimerico de RLPET y el receptor alfa de interleuquina 7 IL-7Ra (Park et al., J. Exp. Med 192: 5 (2000), Solicitud de Patente de Estados Unidos Num. 09/895.945, Numero de publicacion U.S. 2002/0068323). La secuencia del receptor a de IL-7 se muestra en la Figura 2 de la Patente de Estados Unidos Num. 5.264.416. La secuencia del dominio soluble del receptor a de IL-7 abarca los aminoacidos 1-219 de la Figura 2 en la Patente de Estados Unidos Num. 5.264.416.

Segun se utiliza en la presente memoria el termino "polipeptidos de LPET" se refiere a diversas formas de LPET utiles como inmunogenos. Estos incluyen LPET expresadas en forma modificada, en la que un sitio de escision de furina se ha eliminado mediante la modificacion de la secuencia de aminoacidos, como se describe en la publicacion de la solicitud de patente PCT WO 03/032898. La LPET modificada conserva la actividad, pero la secuencia completa se expresa mas facilmente en celulas de mamffero tales como celulas CHO. Los ejemplos de polipeptidos de LPET incluyen el SEQ ID NO: 2, el SEQ ID NO: 373, y el SEQ ID NO: 375.

Ademas, la LPET de cinomolgo se ha identificado y se muestra en el Ejemplo 1 a continuacion y se define en el SEQ ID NO: 380, por ejemplo.

La LPET se produce en celulas epiteliales humanas, incluyendo celulas de la piel, bronquiales, traqueales, y epiteliales de las vfas respiratorias, queratinocitos, celulas estromales y mastocitos, celulas del musculo liso, y fibroblastos de pulmon y dermicos, como se determina por medio de analisis de ARNm cuantitativo (Soumelis et al., Nature Immunol. 3 (7) 673-680 (2002)). La LPET tanto murina como humana estan involucradas en la promocion de la inflamacion alergica.

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TABLA 1

Nombre de la protema: Especie Sinonimos Bases de datos (o Solicitud de Patente) Num. de Acceso

LPET: Homo sapiens Protema linfopoyetina estromal tfmica GenBank/SEQ ID NO: 2 de la patente de los Estados Unidos Num. 6555520 AAK67940/

LPET modificada: Homo sapiens Linfopoyetina estromal tfmica SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 17, 18 del documento WO 03/032898

LPET: Mus musculus Linfopoyetina derivada de estroma tfmica Linfopoyetina derivada de estroma tfmica GenBank AAF81677

RLPET: Homo sapiens Factor 2 de tipo receptor de citoquina (CRL2); IL-xR; receptor de protema linfopoyetina estromal tfmica SEQ ID NO: 5 del documento US 2002/0068323

RLPET: Mus Factor 2 de tipo receptor de citoquina; Receptor delta de citoquina de tipo 1; molecula 2 de tipo receptor de citoquina (CRLM-2); receptor de protema linfopoyetina estromal tfmica GenBank, SWISSPROT Q8CII9

IL-7R: Homo sapiens Receptor de la interleuquina-7 GenBank/Patente de Estados Unidos Num: 5264416 NM_002185

Actividad LPET

Las actividades de LPET incluyen la proliferacion de celulas BAF que expresan RLPET humano (BAF/HTR), como se describe en la publicacion de la solicitud de patente PCT WO 03/032898. El bioanalisis BAF/HTR utiliza una lmea celular pro-linfocitos B murinos, que ha sido transfectada con el receptor de LPET humano. Las celulas BAF/HTR dependen de huLPET para el crecimiento, y proliferan en respuesta a huLPET activa anadida en muestras de ensayo. Despues de un penodo de incubacion, se mide la proliferacion celular por medio de la adicion de colorante Azul Alamar I o timidina tritiada. La proliferacion tambien se puede medir usando un kit comercialmente disponible tal como el kit de analisis de proliferacion celular CyQUANT (Invitrogen).

Otros analisis para la actividad de huLPET incluyen, por ejemplo, un analisis de medicion de la induccion de crecimiento de celulas T de la medula osea humana por LPET como se describe en la Patente de los Estados Unidos 6.555.520. Otra actividad de LPET es la capacidad de activar STAT5 como se describe en la referencia a Levin et al., J. Immunol. 162: 677-683 (1999) y en la publicacion de patente PCT WO 03/032898.

Otros analisis incluyen la produccion de CCL17/TARC inducida por LPET a partir de monocitos humanos primarios y celulas dendnticas como se describe en la publicacion de la solicitud de los Estados Unidos Num. 2006/0039910 (numero de serie. 11/205.909).

Los analisis basados en celulas utiles para la medicion de actividad de LPET se describen en los ejemplos siguientes. Estos incluyen el analisis de proliferacion de celulas BAF descrito anteriormente, asf como el analisis de celulas primarias descrito a continuacion que mide la produccion de osteoprotegerina (OPG) inducida por LPET a partir de celulas dendnticas humanas primarias, asf como el analisis de celulas mononucleares de sangre periferica de cinomolgo, tambien descrito a continuacion.

Las actividades de LPET incluyen ademas actividades in vivo. Estas se pueden medir en modelos de raton, por ejemplo, tales como los descritos en Zhou et al., Nat Immunol 6(10), 1047-1053 (2005), y Yoo et al., J Exp Med. 202 (4), 541-549 (2005). Por ejemplo, un anticuerpo anti-LPET murina demostro que disminrna la celularidad de LBAF y los niveles en LBAF de IL-5 e IL-13 en un modelo de asma por Ova (Zhou et al).

Definiciones

Las secuencias de polinucleotidos y polipeptidos se indican usando las abreviaturas de una o tres letras convencionales. A menos que se indique lo contrario, las secuencias de polipeptidos tienen sus extremos amino a la

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izquierda y sus extremos carboxi a la derecha, y las secuencias de acidos nucleicos de hebra sencilla, y la hebra superior de las secuencias de acidos nucleicos de doble hebra tienen sus extremos 5' a la izquierda y sus extremos 3' a la derecha. Tambien se puede describir una secuencia de polipeptidos o polinucleotidos concreta explicando como difiere de una secuencia de referencia.

Las secuencias de polinucleotidos y polipeptidos de los dominios variables de la cadena ligera y pesada concretas, L1 ("dominio 1 variable de la cadena ligera"), H1 ("dominio 1 variable de la cadena pesada"), etc. Los anticuerpos que comprenden una cadena ligera y una cadena pesada se indican combinando el nombre de los dominios variables de la cadena ligera y de la cadena pesada. Por ejemplo, "L4H7," indica un anticuerpo que comprende el dominio variable de cadena ligera de L4 y el dominio variable de cadena pesada de H7.

A menos que se defina lo contrario en la presente memoria los terminos cientificos y tecnicos utilizados en relacion con la presente invencion tendran los significados que se entienden comunmente por los expertos normales en la tecnica. Ademas, a menos que sea requerido por el contexto, los terminos en singular incluiran el plural y los terminos en plural incluiran el singular. Generalmente, las nomenclaturas utilizadas en relacion con, y las tecnicas de, cultivo de celulas y tejidos, biologfa molecular, inmunologfa, microbiologfa, genetica y qrnmica de protemas y de acidos nucleicos e hibridacion descritas en la presente memoria son aquellas bien conocidas y comunmente utilizadas en la tecnica. Los metodos y tecnicas de la presente invencion se realizan generalmente de acuerdo con metodos convencionales bien conocidos en la tecnica y como se describe en diversas referencias generales y mas espedficas que se citan y discuten a lo largo de la presente memoria descriptiva a menos que se indique lo contrario. Veanse, p. ej., Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), y Harlow y Lane Antiboides: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990). Las reacciones enzimaticas y las tecnicas de purificacion se realizan segun las especificaciones del fabricante, comunmente logradas en la tecnica o como se describe en la presente memoria. La terminologfa utilizada en relacion con, y los procedimientos y tecnicas de laboratorio, de la qrnmica analftica, la qrnmica organica sintetica, y qrnmica medica y farmaceutica descritas en la presente memoria son aquellas bien conocidas y comunmente utilizadas en la tecnica. Las tecnicas convencionales se pueden utilizar para smtesis qrnmicas, analisis qrnmicos, preparacion farmaceutica, formulacion, y suministro, y el tratamiento de los pacientes.

Se entendera que los siguientes terminos, a menos que se indique de otro modo, tienen los siguientes significados: El termino "molecula aislada" (donde la molecula es, por ejemplo, un polipeptido, un polinucleotido, o un anticuerpo) es una molecula que en virtud de su origen o fuente de derivacion (1) no esta asociada con los componentes asociados de forma natural que lo acompanan en su estado nativo, (2) esta sustancialmente libre de otras moleculas de la misma especie (3) es expresada por una celula de una especie diferente, o (4) no se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, una molecula que se sintetiza qmmicamente, o se expresa en un sistema celular diferente de la celula a partir de la cual se origina naturalmente, estara "aislada" de sus componentes asociados de forma natural. Una molecula tambien puede volverse sustancialmente libre de los componentes asociados de forma natural por aislamiento, utilizando mecanismos de purificacion bien conocidos en la tecnica. La pureza u homogeneidad de la molecula se puede analizar por medio de una serie de medios bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, la pureza de una muestra de polipeptido se puede analizar utilizando electroforesis en gel de poliacrilamida y tincion del gel para visualizar el polipeptido utilizando mecanismos bien conocidos en la tecnica. Para ciertos propositos, se puede proporcionar una mayor resolucion mediante el uso de HPLC u otros medios bien conocidos en la tecnica para la purificacion.

Los terminos "inhibidor de LPET" y "antagonista de LPET" se utilizan indistintamente. Cada uno es una molecula que inhibe de forma detectable la senalizacion de LPET. La inhibicion causada por un inhibidor de LPET no tiene que ser completa siempre que sea detectable utilizando un analisis. Por ejemplo, el analisis basado en celulas descrito en el Ejemplo 4 a continuacion, demuestra un analisis util para determinar la inhibicion de senalizacion de LPET.

Los terminos "peptido" "polipeptido" y "protema" se refieren a una molecula que comprende dos o mas residuos de aminoacidos unidos entre sf por enlaces peptfdicos. Estos terminos abarcan, p. ej., protemas nativas y artificiales, fragmentos de protemas y analogos de polipeptidos (tales como mutemas, variantes y protemas de fusion) de una secuencia de protema, asf como protemas modificadas post-traduccionalmente, o de otra manera covalentemente o no covalentemente. Un peptido, polipeptido o protema puede ser monomerico o polimerico.

El termino "fragmento de polipeptido" segun se utiliza en la presente memoria se refiere a un polipeptido que tiene una delecion amino-terminal y/o carboxi-terminal en comparacion con una protema completa correspondiente. Los fragmentos pueden tener, por ejemplo, al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 50, 70, 80, 90, 100, 150 o 200 aminoacidos de longitud. Los fragmentos tambien pueden tener, por ejemplo, a lo sumo 1000, 750, 500, 250, 200, 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 14, 13, 12, 11, o 10 aminoacidos de longitud. Un fragmento puede comprender adicionalmente, en uno o ambos de sus extremos, uno o mas aminoacidos adicionales, por ejemplo, una secuencia de aminoacidos de una protema de origen natural diferente (p. ej., un dominio Fc o de cremallera de leucina) o una secuencia de aminoacidos artificial (p. ej., una secuencia conectora artificial).

Los polipeptidos de la invencion incluyen polipeptidos que han sido modificados en cualquier forma y por cualquier

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razon, por ejemplo, para: (1) reducir la susceptibilidad a la proteolisis, (2) reducir la susceptibilidad a la oxidacion, (3) alterar la afinidad de union para formar complejos de protemas, (4) alterar las afinidades de union, y (4) conferir o modificar otras propiedades fisicoqmmicas o funcionales. Los analogos incluyen mutemas de un polipeptido. Por ejemplo, las sustituciones de uno o varios aminoacidos (p. ej., sustituciones de aminoacidos conservativas) se pueden realizar en la secuencia de origen natural (p. ej., en la porcion del polipeptido fuera del dominio o los dominios que forman contactos intermoleculares). Una "sustitucion de aminoacidos conservativa" es una que no cambia sustancialmente las caractensticas estructurales de la secuencia parental (p. ej., un aminoacido de sustitucion no debe tender a romper una helice que existe en la secuencia original, o alterar otros tipos de estructura secundaria que caracterizan la secuencia parental o que sean necesarios para su funcionalidad). Los ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipeptidos reconocidas en la tecnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, Nueva York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)); y Thornton et al. Nature 354: 105 (1991).

Una "variante" de un polipeptido comprende una secuencia de aminoacidos en donde uno o mas residuos de aminoacidos se insertan, eliminan, y/o sustituyen en la secuencia de aminoacidos con respecto a otra secuencia de polipeptidos. Las variantes de la invencion incluyen protemas de fusion. Las variantes de anticuerpos descritas en la presente memoria tambien incluyen las que resultan del procesamiento. Tales variantes incluyen las que tienen uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o mas aminoacidos adicionales en el extremo N-terminal de una cadena ligera o pesada, p. ej., como resultado de la escision de la secuencia senal ineficaz. Tales variantes incluyen tambien aquellas que pierden uno o mas aminoacidos del extremo N o C de una cadena ligera o pesada.

Un "derivado" de un polipeptido es un polipeptido (p. ej., un anticuerpo) que ha sido modificado qmmicamente, p. ej., a traves de la conjugacion a otro radical qmmico tal como, por ejemplo, polietilenglicol, albumina (p. ej., albumina de suero humano), fosforilacion, y glicosilacion. A menos que se indique lo contrario, el termino "anticuerpo" incluye, ademas de los anticuerpos que comprenden dos cadenas pesadas completas y dos cadenas ligeras completas, derivados, variantes, fragmentos y mutemas de los mismos, cuyos ejemplos se describen a continuacion.

Una "protema de union a antigeno" de acuerdo con la presente descripcion es una protema capaz de unirse a un antfgeno y, opcionalmente, un armazon o una porcion marco que permite que la porcion de union al antfgeno adopte una conformacion que promueva la union de la protema de union a antfgeno al antfgeno. En una realizacion una protema de union a antfgeno de la presente invencion comprende al menos una CDR. Los ejemplos de las protemas de union a antfgeno incluyen anticuerpos, fragmentos de anticuerpos (p. ej., una porcion de union a antfgeno de un anticuerpo), derivados de anticuerpos, y analogos de anticuerpos. La protema de union a antfgeno puede comprender, por ejemplo, un armazon de protema alternativo o armazon artificial con CDR o derivados de CDR injertados. Tales armazones incluyen, pero no se limitan a, los armazones derivados de anticuerpos que comprenden mutaciones introducidas, por ejemplo, para estabilizar la estructura tridimensional de la protema de union a antfgeno, asf como armazones totalmente sinteticos que comprenden, por ejemplo, un polfmero biocompatible. Veanse, por ejemplo, Korndorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, Volumen 53, Artmulo 1:121-129; Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20: 639-654. Ademas, se pueden utilizar mimeticos de anticuerpos peptfdicos ("PAM"), asf como armazones basados en mimeticos de anticuerpos que utilizan componentes de fibronectina como armazon.

Una protema de union a antfgeno puede tener, por ejemplo, la estructura de una inmunoglobulina de origen natural. Una "inmunoglobulina" es una molecula tetramerica. En una inmunoglobulina de origen natural, cada tetramero esta compuesto de dos pares identicos de cadenas polipeptfdicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La porcion amino-terminal de cada cadena incluye una region variable de aproximadamente 100 a 110 o mas aminoacidos principalmente responsables del reconocimiento del antfgeno. La porcion carboxi-terminal de cada cadena define una region constante responsable principalmente de la funcion efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa, o epsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligera y pesada, las regiones variable y constante estan unidas por una region "J" de aproximadamente 12 o mas aminoacidos, con la cadena pesada incluyendo tambien una region "D" de aproximadamente 10 aminoacidos mas. Vease, en general, Fundamental Immunology. Capftulo 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Las regiones variables de cada par de cadenas ligera/pesada forman el sitio de union del anticuerpo de manera que una inmunoglobulina intacta tiene dos sitios de union.

Las cadenas de inmunoglobulina de origen natural exhiben la misma estructura general de las regiones marco relativamente conservadas (FR) unidas por tres regiones hipervariables, tambien llamadas regiones determinantes de la complementariedad o CDR. Desde el extremo N al extremo C, tanto las cadenas ligeras como las pesadas comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignacion de aminoacidos a cada dominio se realiza de acuerdo con las definiciones de Kabat et al. en Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication num. 91-3242, 1991. Los anticuerpos intactos incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, quimericos, humanizados o completamente humanos que tienen cadenas pesadas y ligeras completas.

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Un "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina intacta o a una porcion de union a antfgeno de la misma que compite con el anticuerpo intacto por la union espedfica, a menos que se especifique lo contrario. Las porciones de union a antfgeno pueden ser producidas por tecnicas de ADN recombinante o por escision enzimatica o qmmica de anticuerpos intactos. Las porciones de union a antfgeno incluyen Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, y anticuerpos de dominios (dAbs), y fragmentos de regiones determinates de la complementariedad (CDR), anticuerpos de cadena sencilla (scFv), diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, y polipeptidos que contienen al menos una porcion de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir al polipeptido la union a un antigeno espedfico.

Un fragmento Fab es un fragmento monovalente que tiene los dominios Vl, Vh, Cl y Ch1; un fragmento F(ab')2 es un fragmento bivalente que tiene dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la region bisagra; un fragmento Fd tiene los dominios Vh y Ch1; un fragmento Fv tiene los dominios Vl y Vh de un solo brazo de un anticuerpo; y un fragmento dAb tiene un dominio Vh, un dominio Vl, o un fragmento de union a antfgeno de un dominio Vh o Vl (Patentes de los Estados Unidos Nums. 6.846.634, 6.696.245, Publicaciones de las Solicitudes de los Estados Unidos Nums. 05/0202512, 04/0202995, 04/0038291, 04/0009507, 03/0039958, Ward et al Nature 341: 544-546, 1989).

Un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) es un anticuerpo en el que una region Vl y una region Vh estan unidas por medio de un conector (p. ej., una secuencia sintetica de residuos de aminoacidos) para formar una cadena de protema continua en donde el conector es lo suficientemente largo como para permitir que la cadena de protema se pliegue sobre si misma y forme un sitio de union a antfgeno monovalente (veanse, p. ej., Bird et al., 1988, Science 242:. 423-26 y Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 5879-83). Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes que comprenden dos cadenas polipeptfdicas, en donde cada cadena polipeptfdica comprende dominios Vh y Vl unidos por un conector que es demasiado corto como para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, permitiendo asf que cada dominio se empareje con un dominio complementario en la otra cadena polipeptfdica (vease, p. ej., Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-48, y Poljak et al., 1994, Structure 2: 1121-1123). Si las dos cadenas polipeptfdicas de un diacuerpo son identicas, en ese caso, un diacuerpo resultante de su emparejamiento tendra dos sitios de union a antfgeno identicos. Las cadenas polipeptfdicas que tienen diferentes secuencias se pueden utilizar para elaborar un diacuerpo con dos sitios de union a antfgeno diferentes. Del mismo modo, los triacuerpos y los tetracuerpos son anticuerpos que comprenden tres y cuatro cadenas de polipeptidos, respectivamente, y que forman tres y cuatro sitios de union a antfgeno, respectivamente, que pueden ser iguales o diferentes.

Las regiones determinantes de complementariedad (CDR) y las regiones marco (FR) de un anticuerpo dado se pueden identificar usando el sistema descrito por Kabat et al. en Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication num. 91-3242, 1991. Se pueden incorporar una o mas CDR a una molecula ya sea covalentemente o no covalentemente para que sea una protema de union a antfgeno. Una protema de union a antfgeno puede incorporar una o varias CDR como parte de una cadena polipeptfdica mas grande, puede unir covalentemente una o varias CDR a otra cadena polipeptfdica, o puede incorporar una o varias CDR de forma no covalente. Las CDR permiten que la protema de union a antfgeno se una espedficamente a un antfgeno concreto de interes.

Una protema de union a antfgeno puede tener uno o mas sitios de union. Si hay mas de un sitio de union, los sitios de union pueden ser identicos entre sf o pueden ser diferentes. Por ejemplo, una inmunoglobulina humana de origen natural tfpicamente tiene dos sitios de union identicos, mientras que un anticuerpo "biespedfico" o "bifuncional" tiene dos sitios de union diferentes.

El termino "anticuerpo humano" incluye todos los anticuerpos que tienen una o mas regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. En una realizacion, todos los dominios variables y constantes derivan de secuencias de inmunoglobulina humana (un anticuerpo completamente humano). Estos anticuerpos se pueden preparar en una variedad de formas, cuyos ejemplos se describen a continuacion, incluyendo a traves de la inmunizacion con un antfgeno de interes de un raton que se modifica geneticamente para expresar los anticuerpos derivados de genes que codifican la cadena pesada y/o ligera humana.

Un anticuerpo humanizado tiene una secuencia que difiere de la secuencia de un anticuerpo derivado de una especie no humana por una o mas sustituciones, deleciones, y/o adiciones de aminoacidos, de modo que es menos probable que el anticuerpo humanizado induzca una respuesta inmunitaria, y/o induce una respuesta inmunitaria menos severa, en comparacion con el anticuerpo de una especie no humana, cuando se administra a un sujeto humano. En una realizacion, ciertos aminoacidos del marco y los dominios constantes de las cadenas pesada y/o ligera del anticuerpo de especie no humana se mutan para producir el anticuerpo humanizado. En otra realizacion, el dominio o los dominios constantes de un anticuerpo humano se fusionan con el dominio o los dominios variables de una especie no humana. En otra realizacion, uno o mas residuos aminoacidos de una o mas secuencias de CDR de un anticuerpo no humano se cambian para reducir la probabilidad de inmunogenicidad del anticuerpo no humano cuando se administra a un sujeto humano, en donde los residuos de aminoacido cambiados o bien no son cnticos para la union inmunoespedfica del anticuerpo a su antfgeno, o bien los cambios en la secuencia de aminoacidos que se realizan son cambios conservativos, de manera que la union del anticuerpo humanizado al antfgeno no es significativamente peor que la union del anticuerpo no humano al antfgeno. Los ejemplos de como elaborar anticuerpos humanizados se pueden encontrar en las Patentes de los Estados Unidos Nums. 6.054.297, 5.886.152 y

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El termino "anticuerpo quimerico" se refiere a un anticuerpo que contiene una o mas regiones de un anticuerpo y una o mas regiones de uno o mas anticuerpos distintos. En una realizacion, una o mas de las CDR derivan de un anticuerpo anti-LPET humana. En otra realizacion, todas las CDR derivan de un anticuerpo anti-LPET humana. En otra realizacion, las CDR de mas de un anticuerpos anti-LPET humana se mezclan y se emparejan en un anticuerpo quimerico. Por ejemplo, un anticuerpo quimerico puede comprender una CDR1 de la cadena ligera de un primer anticuerpo anti-LPET humana, una CDR2 y una CDR3 de la cadena ligera de un segundo anticuerpo anti-LPET humana y las CDR de la cadena pesada de una tercer anticuerpo anti-LPET. Adicionalmente, las regiones marco pueden derivar de uno de los mismos anticuerpos anti-LPET, de uno o mas anticuerpos diferentes, tales como un anticuerpo humano, o de un anticuerpo humanizado. En un ejemplo de un anticuerpo quimerico, una porcion de la cadena pesada y/o ligera es identica, homologa a, o derivada de un anticuerpo de una especie particular o perteneciente a una clase o subclase de un anticuerpo particular, mientras que el resto de las cadenas son identicas a, homologas a, o derivadas de uno o varios anticuerpos de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo. Tambien se incluyen fragmentos de tales anticuerpos que exhiben la actividad biologica deseada (es decir, la capacidad de unirse espedficamente al receptor de LPEt humana).

Los fragmentos o analogos de anticuerpos pueden ser facilmente preparados por los expertos normales en la tecnica siguiendo las ensenanzas de esta memoria descriptiva y utilizando mecanismos bien conocidos en la tecnica. Los extremos amino- y carboxi preferidos de los fragmentos o analogos se encuentran cerca de los lfmites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales pueden identificarse por comparacion de los datos de las secuencias de nucleotidos y/o aminoacidos con bases de datos de secuencias publicas o privadas. Se pueden utilizar metodos de comparacion computarizados para identificar motivos de secuencia o dominios de conformacion de protema pronosticados que existen en otras protemas de estructura y/o funcion conocidas. Los metodos de identificacion de secuencias de protemas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida son conocidos. Vease, por ejemplo, Bowie et al., 1991, Science 253: 164.

A "anticuerpo injertado con CDR" es un anticuerpo que comprende una o mas CDR derivadas de un anticuerpo de una especie o isotipo en particular y el marco de otro anticuerpo de la misma o diferente especie o isotipo.

Un "anticuerpo multi-espedfico" es un anticuerpo que reconoce mas de un epftopo en uno o mas antfgenos. Una subclase de este tipo de anticuerpo es un "anticuerpo biespedfico", que reconoce dos epftopos distintos en el mismo o diferentes antfgenos.

Una protema de union a antfgeno, incluyendo un anticuerpo, "se une espedficamente" a un antfgeno, tal como LPET si se une al antfgeno con una elevada afinidad de union tal como se determina por un valor de Kd (o el correspondiente Kb, como se define a continuacion) de 10-7 M o menos.

Un "dominio de union a antfgeno", una "region de union a antfgeno" o un "sitio de union a antfgeno" es una porcion de una protema de union a antfgeno que contiene residuos de aminoacido (u otros radicales) que interaccionan con un antfgeno y contribuyen a la especificidad de la protema de union a antfgeno y a la afinidad por el antfgeno. Para un anticuerpo que se une espedficamente a su antfgeno, esto incluira al menos una parte de al menos uno de sus dominios CDR.

El "porcentaje de identidad" de dos secuencias de polinucleotidos o polipeptidos se determina comparando las secuencias utilizando el programa informatico GAP (una parte del GCG Wisconsin Package, version 10.3 (Accelrys, San Diego, CA)) utilizando sus parametros por defecto.

Los terminos "polinucleotido", "oligonucleotido" y "acido nucleico" se utilizan indistintamente e incluyen moleculas de ADN (p. ej., AdNc o ADN genomico), moleculas de ARN (p. ej., ARNm), analogos de ADN o ARN generados utilizando analogos de nucleotidos (p. ej., acidos peptidonucleicos y analogos de nucleotidos de origen no natural), y sus hfbridos. La molecula de acido nucleico puede ser de hebra sencilla o de doble hebra. En una realizacion, las moleculas de acido nucleico de la invencion comprenden un marco de lectura abierto contiguo que codifica un anticuerpo, o un fragmento, derivado, mutema, o variante del mismo, de la invencion.

Dos polinucleotidos de hebra sencilla son "complementos" entre sf si sus secuencias se pueden alinear en una orientacion antiparalela de tal manera que todos los nucleotidos de un polinucleotido se enfrentan a sus nucleotidos complementarios en el otro polinucleotido, sin la introduccion de huecos, y sin nucleotidos no apareados en el extremo 5' o el extremo 3' de cualquier secuencia. Un polinucleotido es "complementario" a otro polinucleotido, si los dos polinucleotidos pueden hibridar entre sf en condiciones moderadamente rigurosas. Por lo tanto, un polinucleotido puede ser complementario a otro polinucleotido sin ser su complemento.

Un "vector" es un acido nucleico que se puede utilizar para introducir otro acido nucleico conectado a el en una celula. Un tipo de vector es un "plasmido", que se refiere a una molecula de ADN de doble hebra lineal o circular en el que se pueden ligar segmentos de acido nucleico adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral (p. ej., retrovirus de replicacion defectuosa, adenovirus y virus adeno-asociados), en donde se pueden introducir segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Ciertos vectores son susceptibles de replicacion autonoma en una celula anfitriona en la que se introducen (p. ej., vectores bacterianos que comprenden un origen de replicacion bacteriano y

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vectores episomales de mamnferos). Otros vectores (p. ej., vectores no episomales de mai^eras) se integran en el genoma de una celula anfitriona tras la introduccion en la celula anfitriona, y de ese modo replican junto con el genoma del anfitrion. Un "vector de expresion" es un tipo de vector que puede dirigir la expresion de un polinucleotido seleccionado.

Una secuencia de nucleotidos esta "unida operablemente" a una secuencia reguladora si la secuencia reguladora afecta a la expresion (p. ej., el nivel, el tiempo, o la ubicacion de la expresion) de la secuencia de nucleotidos. Una "secuencia reguladora" es un acido nucleico que afecta a la expresion (p. ej., el nivel, el tiempo, o la ubicacion de la expresion) de un acido nucleico al que esta unida operablemente. La secuencia reguladora puede, por ejemplo, ejercer sus efectos directamente sobre el acido nucleico regulado, o a traves de la accion de una o mas de otras moleculas (p. ej., polipeptidos que se unen a la secuencia reguladora y/o al acido nucleico). Los ejemplos de las secuencias reguladoras incluyen promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresion (p. ej., senales de poliadenilacion). Otros ejemplos de secuencias reguladoras son descritos, por ejemplo, por Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Ca y Baron et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23: 3605-06.

Una "celula anfitriona" es una celula que se puede utilizar para expresar un acido nucleico, p. ej., un acido nucleico de la invencion. Una celula anfitriona puede ser un procariota, por ejemplo, E. coli, o puede ser un eucariota, por ejemplo, un eucariota unicelular (p. ej., una levadura u otro hongo), una celula vegetal (p. ej., una celula vegetal de tabaco o tomate), una celula animal (p. ej., una celula humana, una celula de mono, una celula de hamster, una celula de rata, una celula de raton, o una celula de insecto) o un hibridoma. Las celulas anfitrionas ilustrativas incluyen lmeas celulares de ovario de hamster chino (CHO) o sus derivados incluyendo la cepa CHO DXB-11, que tiene deficiencia de DHFR (vease Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-20), lmeas de celulas CHO que crecen en medio libre de suero (vease Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28:31), celulas CS-9, un derivado de celulas CHO DXB-11, y celulas AM-1/D (descrito en la Patente de los Estados Unidos Num. 6.210.924). Otras lmeas de celulas CHO incluyen CHO-K1 (ATCC num. CCL-61), EM9 (ATCC num. CRL-1861), y UV20 (ATCC num. CRL-1862). Los ejemplos de otras celulas anfitrionas incluyen la lmea COS-7 de celulas de rinon de mono (ATCC CRL 1651) (vease Gluzman et al., 1981, Cell 23: 175), celulas L, celulas C127, celulas 3T3 (ATCC CCL 163), celulas HeLa, lmeas celulares BHK (ATCC CRL 10), la lmea celular CV1/EBNA derivada de la lmea celular de rinon de mono verde africano CV1 (ATCC CCL 70) (vease McMahan et al., 1991, EMBO J. 10: 2821), celulas de rinon de embriones humanos tales como 293, 293 EBNA o MSR 293, celulas A431 epidermicas humanas, celulas Colo205 humanas, otras lmeas celulares de primate transformadas, celulas diploides normales, cepas celulares derivadas de cultivo in vitro de tejido primario, explantes primarios, celulas HL -60, U937, HaK o Jurkat. Tfpicamente, una celula anfitriona es una celula cultivada que puede ser transformada o transfectada con un acido nucleico que codifica el polipeptido, que puede ser expresado a continuacion en la celula anfitriona. La frase "celula anfitriona recombinante" se puede utilizar para referirse a una celula anfitriona que ha sido transformada o transfectada con un acido nucleico que se va a expresar. Una celula anfitriona tambien puede ser una celula que comprende el acido nucleico, pero no lo expresa a un nivel deseado a menos que se introduzca una secuencia reguladora en la celula anfitriona de tal manera que se una operablemente con el acido nucleico. Se entiende que el termino celula anfitriona se refiere no solo a la celula sujeto particular sino a la progenie o progenie potencial de dicha celula. Debido a que pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido, por ejemplo, a mutacion o influencias ambientales, tal progenie puede no ser, de hecho, identica a la celula parental, pero aun esta incluida dentro del alcance del termino segun se utiliza en la presente memoria.

Protemas de union a antfgeno

En un aspecto, la presente descripcion proporciona anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, derivados de anticuerpos, mutemas de anticuerpos, y variantes de anticuerpos que se unen a LPET humana. Las protemas de union a antfgeno de acuerdo con la presente descripcion incluyen protemas de union a antfgeno que se unen a LPET humana, y de ese modo reducen la actividad de LPET. Por ejemplo, las protemas de union a antfgenos pueden interferir en la union de LPET a su receptor, y por lo tanto reducir la actividad de LPET.

[0065] Se describe una protema de union a antfgeno que comprende una o mas secuencias de CDR que difieren de una secuencia de CDR mostrada en la FIG. 1A-1F o en la FIG. 2A-2F en no mas de 5, 4, 3, 2, 1, o 0 residuos de aminoacido.

Al menos una secuencia de CDR3 de la protema de union a antfgeno es una secuencia de la FIG. 1A-1F o la FIG. 2A-2F. La secuencia de CDR3 de la cadena ligera de la protema de union a antfgeno es una secuencia de cadena ligera de A1 a A27, y la secuencia de la cadena pesada de la protema de union al antfgeno es una secuencia de CDR3 de la cadena pesada de A1 a A27.

La protema de union a antfgeno comprende adicionalmente 1, 2, 3, 4, o 5 secuencias de CDR que difieren cada una de forma independiente en 5, 4, 3, 2, 1, o 0 adiciones, sustituciones, y/o deleciones de aminoacidos individuales de una secuencia de CDR de A1-A27. Las CDR de cadena ligera de las protemas de union a antfgeno ilustrativas A1- A27 y las CDR de la cadena pesada de las protemas de union a antfgeno ilustrativas A1-A27 se muestran en la FIG... 1A-1F y en la FIG. 2A-2F, respectivamente. Tambien se muestran las secuencias de polinucleotidos que codifican las secuencias de aminoacidos de las CDR. Ademas, las secuencias consenso de las secuencias de CDR

se proporcionan a continuacion. SECUENCIAS CONSENSO DE CDR

CDR DE CADENA LIGERA VARIABLE

Grupo 1a

Consenso CDR1 LC







: X! X2

A16.1: R S S Q S L V Y S D G N T Y L N

A18.1: V N

A13.1: V D

A19.1: V D

A20.1: V D

A14.1: V N

A15.1: I N

R S S S Q LX1YSDGX2TYLN (SEQ ID NO: 246)

X1 es un residuo de V (valina) o un residuo de I (isoleucina),

5 X2 es un residuo de N (asparragina) o un residuo de D (acido aspartico);

Consenso CDR2 LC




: X3

A16.1: K V S Y W D S

A18.1: Y

A13.1: N

A19.1: N

A20.1: N

A14.1: N

A15.1: N

KVSX3WDS (SEQ ID NO: 247)

X3 es un residuo de Y (tirosina) o un residuo de N (asparragina); Consenso CDR3 de LC

A16.1: M Q G T H W P P A

A18.1

A13.1

A19.1

A20.1

A14.1

A15.1

10 MQGTHQPPA (SEQ ID NO: 248) Grupo 1b





: X4 X5

A13.2: R A S Q G L S S W L A

A14.2: G L

A19.2: G L

A20.2: G L

A16.2: S L

A18.2: S L

A15.2: G I

RASQX4X5SSWLA (SEQ ID NO: 249)

X4 es residuo de G (glicina) o un residuo de S (serina);

X5 es un residuo de L (leucina) o un residuo de I (isoleucina);

5 Consenso CDR2 LC

: X6 X7

A13.2: N T S S L Q S

A14.2: N T

A19.2: N T

A20.2: N T

A16.2: N A

A18.2: N A

A15.2: T T

XaXySSLQS (SEQ ID NO: 250)

X6 es un residuo de N (asparragina) o un residuo de T (treonina); X7 es un residuo de T (treonina) o un residuo de A (alanina); Consenso CDR3 LC




: X8

A13.2: Q Q A N S F P L T

A14.2: N

A19.2: N

A20.2: N

A16.2: N

A18.2: N

A15.2: D

10 QQAX8SFPLT (SEQ ID NO: 251)

X8 es un residuo de N (asparragina) residuo de D (acido aspartico); Grupo 2

Consenso CDR1 LC

A6: S G D K L G D K Y A C

A8

SGDKLGDKYAC (SEQ ID NO: 15)



: X

A6: Q D K K R P S

A8: N

QDXgKRPS (SEQ ID NO: 252)

Xg es un residuo de K (lisina) o un residuo de N (asparragina); Consenso CDR3 LC

A6: Q A W D S S T V V

A8

5 QAWDSSTVV (SEQ ID NO: 107) Grupo 3

Consenso CDR1 LC

A3: T G S S S N I G A G F D V H

A4

TGSSSNIGAGFDVH (SEQ ID NO: 10) Consenso CDR2 LC

A3: D N N N R P S

A4

10 DNNNRPS (SEQ ID NO: 57)

LC consenso CDR3

A3: Q S Y D S N L S G S I V V

A4

QSYDSNLSGSIVV (SEQ ID NO: 102) CDR DE CADENA PESADA VARIABLE Grupo 1

Consenso CDR1 HC

: X10

A13: S Y G M H

A14: S

A19: S

A20: S

A16: N

A18: N

A15: N

15 X10YGMH (SEQ ID NO: 253)

X10 es un residuo de S (serina) o un residuo de N (asparragina);




: Xu

A13: V I W Y D G S N K Y Y A D S V K G

A14: Y

A19: Y

A20: Y

A16: Y

A18: Y

A15: F

VIWX11DGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO: 254)

X11 es un residuo de Y(tirosina) o un residuo de F (fenilalanina). Consenso CDR3 HC





: X12 X13

A13: G G G I P V A D Y Y Y Y G M D V

A14: P Y

A19: P Y

A20: P Y

A16: A Y

A18: A Y

A15: A F

5 GGGIX12VADYYX13YGMDV (SEQ ID NO: 255)

X12 es un residuo de P (prolina) o un residuo de A (alanina);

X13 es un residuo de Y (tirosina) o un residuo de F (fenilalanina). Grupo 2

Consenso CDR1 HC

A6: S Y G I H

A8

10 SYGIH (SEQ ID NO: 147) Consenso CDR2 HC








: X14

A6: V I S Y D G S Y K Y Y A D S V K G

A8: N

VISYDGSX14KYYADSVKG (SEQ ID NO: 256)

X14 es un residuo de Y (tirosina) o un residuo de N (asparagina). Consenso CDR3 HC

A6: G D S W N D R L N Y Y F Y D M D V

A8

15 GDSWNDRLNYYFYDMDV (SEQ ID NO: 214)

Grupo 3

: X15 X16 X17

A3: D Y Y M Y

A4: G D H

X15X16YMX17 (SEQ ID NO: 257)

X15 es un residuo de D (acido aspartico) o un residuo de G (glicina); 5 X16 es un residuo de Y (tirosina) o un residuo de D (acido aspartico);

X17 es un residuo de Y (tirosina) o un residuo de H (histidina). Consenso CDR2 HC











: X18 X19 X20

A3: W I N P N S G G T N Y V Q K F Q G

A4: H A R

WINPNSGGTNX18X19X20KFQG (SEQ ID NO: 258)

X18 es un residuo de Y (tirosina) o un residuo de H (histidina);

10 X19 es un residuo de V (valina) o un residuo de A (alanina);

X20 es un residuo de Q (glutamina) o un residuo de R (arginina). Consenso CDR3 HC


: X21 X22 X23

A3: D G G S S G W P L F A Y

A4: R T D

(SEQ ID NO: 259)

X21 es un residuo de G (glicina) o un residuo de G (arginina);

15 X22 es un residuo de S (serina) o un residuo de T (treonina);

X23 es un residuo de A (alanina) o un residuo de D (acido aspartico).

La Tabla 2 siguiente proporciona las secuencias de acido nucleico (ADN) que codifican los dominios pesados variables (H num.) y los dominios ligeros variables (L num.), y las secuencias de aminoacidos de los dominios pesados variables y ligeros variables para las protemas de union a antfgeno LPET ilustrativas A1-A27, 20 respectivamente. Las CDR 1, 2 y 3 para cada dominio variable son sucesivas desde el principio hasta el final de cada secuencia. Las regiones marco (FR) estan subrayadas. Los marcos 1, 2, 3 y 4 para cada dominio variable son sucesivos desde el principio hasta el final de cada secuencia (p. ej., la primera porcion subrayada de la secuencia es Fr1, la segunda es Fr2, la tercero es Fr3 y la ultima es Fr4 en cada secuencia).

TABLA 2

ADN H1

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACT

CTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAACTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGC

■TCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCA'GTTATATGGTATGATGGAAGTAATAAATACT

ATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCAfcfCCAGAGACAATfCCAAGAACACGCTG

tatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtatattactgtgcgagtct

AGTGGGAGCTACCAACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCG

TCTCCTCA

(SEQ ID NO: 260)

Protema H1

OVOLVESGGGWOPGRSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVROAPGKGLEWVAVIWYDGSNKY

YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAVWCASLVGATNYYGMDVWGOG~TTVtV

ss

(SEQ ID NO: 261)

ADN L1

TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATC

ACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGG

AC AGGCCCCTGT ACTTGTC ATCTCTGGT AA AAACT ACCGGCCCTCAGGGATCCC AG ACCG

ATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGA

AGATGAGGCTGACTACTACTGTAACTCCCGGGACAGAAGTGGTAACCATCTGGTGTTTTC

GGCGGAGG G ACC A AGCTG ACCGTCCT A

(SEQ ID NO: 262)

Protema L1

imagen1

ADN H2

GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGTCGTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACT

CTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTTTACCATGCACTGGGTCCGTCAAGCT

CCGGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTCTCTCTTATTAGTTGGGATGGTGGTAGCACATACTAT

GCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACAGCAAAAACTCCCTGTA

TATGCAAATGAACAGTCTGAGAACTGAGGACAGCGCCTTGTATTACTGTGCAAGAGGTC

CTTACTACTACTTCTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCf

CA (SEQ ID NO: 2641

Protema H2

EVOLVESGGVVVOPGGSLRLSCAASGFTFDDFTMHWVROAPGKGLEWVSLISWDGGSTYY ADSVKGRFTISRDNSKNSLYMOMNSLRTEDSALYYCARGPYYYFYGMDVWGOGTTVTVSS ISEOIDNO: 265)

ADN L2

TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATC

ACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAACCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGG

ACAGGCCCCTATACTTGTCATCTCTGATAAAAACAACCGGCGCTCAGGGATCCCAGACCG

ATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGA AGATGAGGCTGACTATTACTGTAACTCCCGGGACAGCAGTGATAACCATCTAGTGGTATT TCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA (SEP ID NO: 2661

Protema L2

imagen2

ADN H3

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGT CTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGACTACTATATGTACTGGGTGCGACAGGC CCCTGGACAAGGGCCTGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTAACAGTGGTGGCACAAAGT ATGTACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCC TACATGGAGCTGAGCAGGATGAGATCCGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGA TGGGGGTAGCAGTGGCTGGCCCCTCTTTGCCTACTGGGGCCTGGGAACCCTGGTCACCGT CTCCTCA rSEO ID NO: 2681

Protema H3

imagen3

ADN L3

CAGTCTGTGCTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCAT

CTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTTTGATGTACACTGGTACCAGCA

GCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGATAACAACAATCGGCCCTCAGGGGT

CCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCT

CCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAACCTGAGTGGTTC

GATTGTGGTTTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA fSEO IP NO: 2701

Protema L3

OSVLTOPPSVSGAPGORVTISCTGSSSNIGAGFDVHWYOOLPGTAPKLLIYDNNNRPSGVPPR FSGSKSGTSASLAITGLOAEDEADYYCOSYPSNLSGSrvVFGGGTKLTVL (SEP ID NO: 271)

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGT CTCCTGCA AGGCTTCTGG AT ACATCTTC ACCGGCGACT ATATGCACTGGGTGCG ACAGGC CCCTGGACAAGGGCTGGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTAACAGTGGTGGCACAAACC ATGCACGGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCC TACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGTGAGAGA T AGGGGT ACC AGTGGCTGGCCACTCTTTGACT ATTGGGGCC AGGG A ACACTGGTC ACCGT CTCCTCA (SEP ID NO: 272)

Protema H4

OVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTGDYMHWVROAPGOGLEWMGWINPN SGGTN HARKFOGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCVRDRGTSGWPLFDYWGOGTLVTV SSfSEOIDNO: 213)

ADN L4

CAGTCTGTGCTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCAT

CTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTTTGATGTGCACTGGTACCAGCT

GCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTTTGATAACAACAATCGCCCCTCAGGGGT

CCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCT

CCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAACCTGAGTGGTTC

G ATTGTGGT ATTTCGGCGG AGGG ACC A AGCTG ACCGTCCT A TSEO ID NO: 2741

Protema L4

imagen4

ADN H5

CAGATGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACT

CTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGAACCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGC

TCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGATGGAAGTAATAAACACT

ATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCACCAGAGACAATTCCAAGAACACTCTG

AATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGC

CCCTCAGTGGGAGCTAGTTCATGAAGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCAC

CGTCTCTTCA (SEP fD NO: 360)

Protema H5

OMOLVESGGGVVOPGRSLRLSCAASGFTFRTYGMHWVROAPGKGLEWVAVIWYDGSNICH Y APSVKGRFTITRDNSKNTLNLOMNSLRAEPT AVYY CARAPO WELVHEAFDIWGOGTMVT VSS (SEP ID NO: 36H

ADN L5

TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCCCCAGGACAGACGGCCAGGATT ACCTGTGGGGG AAAC AACCTTGG AAGT AAAAGTGTGCACTGGT ACCAGCAG AAGCC AGG CCAGGCCCCTGTGCTGGTCGTCTATGATGATAGCGACCGGCCCTCATGGATCCCTGAGCG ATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGGCGAAGCCG GGGATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGGGATAGTAGTAGTGATCATGTGGTATTTC GGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA (SEP ID NO: 3621

SYVLTOPPSVSVAPGOTARITCGGNNLGSKSVHWYOOKPGOAPVLVVYDDSDRPSWIPERFS

GSNSGNTATLTISRGEAGDEADYYCOVWPSSSDHVVFGGGTKLTVL

(SEP ID NO: 3631

ADN H6

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACT

CTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCATTTTCAGTAGCTATGGCATTCACTGGGTCCGCCAGGCT

CCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTTATAAATACTA

TGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGT

ATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGGG

GACTCCTGGAACGACAGATTAAACTACTACTTCTACGATATGGACGTCTGGGGCCAAGG

GACCACGGTCACCGTCTCCTCA

(SEP ID NO: 2761

Protema H6

OVOLVESGGGVVOPGRSLRLSCAASGFIFSSYGIHWVROAPGKGLEWVAVISYDGSYKYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCARGDSWNDRLNYYFYDMDVWGOGT TVTVSS (SEP ID NO: 2771

ADN L6

TCCTATGAGCTGACTCAGGCACCCTCAGTGTCCGTGTCCCCAGGACAGACAGCCAGCATC

ACCTGCTCTGGAGATAAATTGGGGGATAAATATGCTTGCTGGTATCAGCAGAAGCCAGG

CCAGTCCCCTGTGCTGGTCATCTATCAAGATAAGAAGCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCG

ATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACAGCCACTCTGACCATCAGCGGGACCCAGGCTAT

GG ATG AGGCTG ACT ATT ACTGTCAGGCGTGGGACAGCAGC ACTGTGGT ATTTCGGCGG A

GGGACCAAGCTGACCGTCCTA

(SEP IP NO: 2781

Protema L6

imagen5

ADN H7

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCT

CACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTGGTGGTTACTACTGGAGCTGGATCCG

CCAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTTCATCCATTACAGTGGGACCACCT

ACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGACTTACCCTATCAGTAGACACGTCTAAGAGCCAGT

TCTCCCTGAAGCTGAACTCTGTGACTCiCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAG

AAGTTGGCAGCTCGTCGGGTAACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACC

GTCTCCTCA (SEP ID NO: 2801

Protema H7

OVOLOESGPGLVKPSOTLSLTCTVSGGSISSGGYYWSWIROHPGKGLEWIGFIHYSGTTYYNP SLKSRLTLSVDTSKSOFSLKLNSVTAADTAVYYCAREVGSSSGNWFDPWGOGTLVTVSS (SEP ID NO: 281)

TCCTATGAGCTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCCGTGTCCCCAGGACAGACAGCCAGCATC

ACCTGCTCTGG AG AT AA ATTGGGGG ATAAAT ATGCTTGCTGGT ATC AGCAG A AGCC AGG

CCAGTCCCCTGTGGTGGTCATCTATCAAGATAACAAGCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCG

ATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACAGCCACTTTGACCATCAGCGGGACCCAGGCTAT

GGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGGCGTGGGACAGCACCACTGCGATATTTCGGCGGA

GGGACCAAGCTGACCGTCCTA

fSEO ID NO: 2821

Protema L7

SYELTOPPSVSVSPGOTASITCSGDKLGDKYACWYOOKPGOSPVW1YODNKRPSGIPERPSG SN SGNTATLTISGTQ AMDEADYY COA WDSTT AIFGGGTKLTVL rSEOIDNO: 2831

ADN H8

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACT

CTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATTCACTGGGTCCGCCAGGC

TCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACT

ATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTG

TATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGG

GGACTCCTGGAACGACAGATTAAACTACTACTTCTACGATATGGACGTCTGGGGCCAAG

GGACCACGGTCACCGTCTCCTCA

fSEO ID NO: 2841

Protema H8

OVOLVESGGGWOPGRSLRLSCAASGFTFSSYGIHWVROAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYA DSVKGRFT1SRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCARGDSWNDRLNYYFYDMDVWGOGT TVTVSS (SEP ID NO: 285)

ADN L8

TCCTATGAGCTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCCGTGTCCCCAGGACAGACAGCCAGCATC

ACCTGCTCTGGAGATAAATTGGGGGATAAATATGCTTGCTGGTATCAGCAGAAGCCAGG

CCAGTCCCCTGT ACTGGTCATCT ATCAAGAT AACAAGCGGCCCTC AGGG ATCCCTGAGCG

ATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACAGCCACTTTGACCATCAGCGGGACCCAGGCTAT

GGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGGCGTGGGACAGCAGCACTGTGGTATTTCGGCGGA

GGGACCAAGCTGACCGTCCTA

fSEO IP NO: 2861

Protema L8

imagen6

CAGGTGCAGTTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACT CTCCTGTGCAGCGTCTGG AT AT ACCTTCA AT AGCT ATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGC TCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTT AT ATGGT ATGATGG A AGTA AT ACAT ACT ATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACATTTCCAAGAACACTCTGT ATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAG GTCCGGGCGT AT AGCAGTGGCTGGT ACGCCGCCTTTG ACTACTGGGGCCAGGG AACCCT GGTCACCGTCTCCTCA fSEO ID NO: 2881

Protema H9

OVOLVESGGGVVOPGRSLRLSCAASGYTFNSYGMHWYROAPGKGLEWVAVIWYDGSNTY YADSVKGRFTISRDISKNTLYLOMNSLRAEPTAVYYCAREVRAYSSGWYAAFDYWGOGTL VTVSS (SEP ID NO: 289)

ADN L9

TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATC

ACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAATCTTTTATGCAAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGG

ACAGGCCCCTGTAGTTGTCTTCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCG

ATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGCGGCTCAGGCGGA

AGATGAGGCTGACTATTATTGTAACTCCCGGGACAGCAGTGGTAACCATGTGGTATTTCG

GCGGAGGGACCACGCTGACCGTCCTA

fSEO ID NO; 2901

Protema L9

SSELTQDPAVSV ALGOTVRITCOGDSLRIFY AN WYOOKPGOAPVWFY GKNNRPSGIPDRFS

GSSSGNTASLTITAAOAEDEADYYCNSRDSSGNHVVFGGGTTLTVL

(SEP ID NO: 291)

ADN H10

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACT

CTCCTGTGCAACGTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGC

TCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGATGGAAGTAGTAAATACT

ATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTG

TATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGT

AAG AAGTGGG AGCTACTACGAACAGT ATTACT ACGGT ATGGACGTCTGGGGCCA AGGG A

CCACGGTCGCCGTCTCCTCA

fSEO ID NO: 2921

Protema H10

ovolvesgggvvopgrslrlscatsgftfssygmhwvrqapgkglewvaviwydgsskyy

ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCARVRSGSYYEOYYYGMDVWGOGTT VAVSS fSEO ID NO: 293^

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC

ATCACTTGCCGGGCAAATCAGTACATTAGCACCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCA

GGGAAAGCCCCTAAGGTCCTGATTTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCA

AGGTTCAGTGGCAGTGGATTTGAGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCT

G AAG ATTTTGCAACTT ACT ACTGTCAGCAG AGCT AC ACT ACCCCGATCACCTTTCGGCCA

AGGGACACGACTGGAGATTAAA

fSEO ID NO: 2941

Protema L10

DIOMTQSPSSLSASVGDRVTITCRANQYISTYLNWYOOKPGKAPKVLIYAASSLOSGVPSRFS

GSGFETDFTLT1SSLQPEDFATYYCOQSYTTPITFGOGTRLEIK

(SEP ID NO: 295^1

ADN H11

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACT

CTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATAGCATGAACTGGGTCCGCCAGGC

TCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTGGTCGTACTAGTAGCGTATACTA

CGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACTCACTGT

ATCTGCAC ATG A ACAGCCTG AG AG ACG AGG ACACGGCTGTGT ATT ACTGTGCG AG AAGT

GGGATCTACTACGACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGT

CTCCTCA rSEO ID NO: 296)

Protema H11

EVOLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVROAPGKGLEWVSYISGRTSSVYYA DSVKGRFTISRDNAKNSLYLHMNSLRDEDTAVYYCARSGIYYDYYGMDVWGOGTTVTVSS (SEP ID NO: 2971

ADN L11

GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCCCC ATCAACTGC A AGTCC AGCCAG AGTGTTTT A AAC AGCTCC A AC AAT A AG A ACT ACTT AGCT TGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGACATCCACCCGG GAAGGCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCAC CATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATTTTACTAC TCCGTGGACGTTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA (SEP ID NO: 298^

Protema L11

DIVMTOSPDSLAVSLGERAPINCKSSOSVLNSSNNKNYLAWYOOKPGOPPKLLIYWTSTREG GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYYCQOYFTTPWTFGOGTKVEIK (SEP ID NO: 299)

ADN H12

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACT

CTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGC

TCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGATGGAAGTAATAAATACT

ATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTG

TATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGG

GGC AGCC ACTGCT AT AG ATT ACT ACT ACTCCT ACGGT ATGG ACGTCTGGGGCCT AGGG AC

CACGGTCACCGTCTCCTCA

rSEO ID NO: 3001

OVOLVESGGGVVOPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVROAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCARGAATAIDYYYSYGMDVWGLGTT VTVSS fSEOIDNO: 3011

ADN L12

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACC

ATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGTAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCGGAAACCA

GG A AAAGCCCCT A AGTTCCTGATCT ATACTGCATCCAGTTTGCA AAGTGGGGTCCCATC A

CGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCT

GAAGATTCTGCAACTTACTATTGTCAACAGGCTGACAGTTTCCCGCTCACTTTTCGGCGG

AGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

fSEO ID NO: 3021

Protema L12

DIQMTOSPSSVSASVGDRVTITCRASOGISSWLAWYORKPGKAPKFLIYTASSLOSGVPSRFS

GSGSGTDFTLTISSLOPEDSATYYCOOADSFPLTFGGGTKVEIK

fSEOIDNO: 3031

ADN H13

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACT

CTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGC

TCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGATGGAAGTAATAAATACT

ATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTG

TATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGG

GGGGGGT ATACC AGT AGCTG ACT ACTACT ACTACGGT ATGGACGTCTGGGGCC AAGGG A

CCACGGTCACCGTCTCCTCA

(SEP ID NO: 3041

Protema H13

OVOLVESGGGVVOPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVROAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCARGGGIPVADYYYYGMDVWGQGTT VTVSS (SEP IP NO: 3051

ADN L13.1

GATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCC

ATCTCCTGCAGGTCTAGTCAAAGCCTCGTCTACAGTGATGGAGACACCTACTTGAATTGG

TTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCAAGGCGCCTAATTTATAAGGTTTCTAACTGGGAC

TCTGGGGTCCCATACAGATTCAGCGGCAGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGCAAATC

AGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGATTTACTACTGCATGCAAGGTACACACTGGCC

TCCGGCCTTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA fSEO ID NO: 3061

Protema L13.1

imagen7

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC

ATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTCTTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCA

GGGAAAGCCCCCAAGCTCCTGATGTATAACACATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATC

AAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCAGTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGC

CTGAAGATTTTGCAAGTTACTATTGTCAACAGGCTAACAGTTTCCCTCTCACTTTTCGGCG

GAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

rSEO ID NO: 308^)

Protema L13.2

D10MT0SPSSVSASVGDRVTITCRASQGLSSWLAWY00KPGKAPKLLMYNTSSLQSGVPSRF

SGSGSGTDFSLTISSLOPEDFASYYCOQANSFPLTFGGGTKVEIK

(SEP ID NO; 309)

ADN H14

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACT

CTCCTGTGC AGCGTCTGGATTCACCTTCAGT AGCT ATGGCATGCACTGGGTCCGCC AGGC

TCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGATGGAAGTAATAAATACT

ATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTG

TATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGG

GGGGGGTATACCAGTAGCTGACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGA

CCACGGTCACCGTCTCCTCA

CSEO TD NO: 3041

Protema H14

OVOLVESGGGVVOPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVROAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCARGGG1PVADYYYYGMDVWGOGTT VTVSS fSEO ID NO: 305)

ADN L14.1

GATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCC

ATCTCCTGCAGGTCTAGTCAAAGCCTCGTCTACAGTGATGGAAACACCTACTTGAATTGG

TTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCAAGGCGCCTAATTTATAAGGTTTCTAACTGGGAC

TCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCATTGGGTCAGGCACTGACTTCACACTGAAAATC

AGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTACTACTGCATGCAAGGTACACACTGGCC

TCCGGCCTTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA (SEP ID NO: 3101

Protema L14.1

imagen8

ADN L14.2

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC

ATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTCTTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCA

GGGAAAGCCCCCAAGCTCCTGATGTATAACACATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATC

AAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCAGTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGC

CTGAAGATTTTGCAAGTTACTATTGTCAACAGGCTAACAGTTTCCCTCTCACTTTTCGGCG

GAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

fSEO IP NO: 3121

DIOMTOSPSSVSASVGDRVTITCRASOGLSSWLAWYOOKPGKAPKLLMYNTSSLOSGVPSRF

SGSGSGTDPSLTISSLOPEDFASYYCOOANSFPLTFGGGTKVEIK

(SEP ID NO: 3091

ADN H15

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAAGTCCCTGAGACT

CTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCCCCTTCAGTAACTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGC

TCCAGGCAAGGGACTGGAATGGGTGGCAGTTATATGGTTTGATGGAAGTAATAAATACT

ATGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATCCCAAGAACACGCTG

TATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGG

GGGGGGT AT AGC AGTGGCTG ACT ACT ACTTCT ACGGT ATGG ACGTCTGGGGCC A AGGG A

CCACGGTCACCGTCTCCTCA

rSEO ID NO: 3131

Protema H15

OVOLVESGGGVVOPGKSLRLSCAASGFPFSNYGMHWVROAPGKGLEWVAVIWFDGSNKYY ADSVKGRFTISRDNPKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCARGGGIAVADYYFYGMDVWGOGTT VTVSS (SEP ID NO: 314^1

ADN L15.1

GATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCC ATCTCCTGCAGGTCTAGTCAAAGCCTCATATACAGTGATGGAAACACTTACTTGAATTGG TTTCAACAGAGGCCAGGCCAATCTCCAAGGCGCCTAATTTATAAGGTTTCTAACTGGGAC TCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCAGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGAAAAT CAGCAGGGTGG AGGCTG AGGATGTTGGGATTT ATT ACTGCATGCA AGGT AC ACACTGGC CTCCGGCCTTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA (SEP ID NO: 3151

Protema L15.1

imagen9

ADN L15.2

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC ATTACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCA GGGAAAGCCCCTAAGGTCCTGACCTATACTACATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCA AGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCT GAAGATTTTGCTACTTACTTTTGTCAACAGGCTGACAGTTTCCCTCTCACTTTTCGGCGGG GGGACCAAGGTGGAGATCAAA CSEO ID NO: 3171

DIOMTOSPSSVSASVGDRVTITCRASOGISSWLAWYOOKPGKAPKVLTYTTSSLOSGVPSRFS

GSGSGTDFTLT1SSLOPEDFATYFCOOADSFPLTFGGGTKVE1K

fSEO ID NO: 3181

CAGGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACT

CTCCTGTGC AGCGTCTGGATTC ACCTTC AGT AACT ATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGC

TCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGATGGAAGTAATAAATACT

ATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTG

TATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGG

GGGGGGTATAGCAGTGGCTGACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGA

CCACGGTCACCGTCTCCTCA

(SEP ID NO: 3191

Protema H16

OVOLVESGGGVVOPGRSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVROAPGKGLBWVAVIWYDGSNKY YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCARGGGIAVAPYYYYGMDVWGOG TTVTVSS (SEP ID NO: 320)

ADN L16.1

GATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCC

ATCTCCTGCAGGTCTAGTCAAAGCCTCGTATACAGTGATGGAAACACCTACTTGAATTGG

TTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCAAGGCGCCTAATTTATAAGGTTTCTTACTGGGAC

TCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCAGTGGGTCAAGCACTGATTTCACACTGAAAAT

CAGTAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGGTACACACTGGC

CTCCGGCCTTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA (SEP ID NO: 32 H

Protema L16.1

imagen10

ADN L16.2

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC

ATCACTTGTCGGGCGAGTCAGAGTCTTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCA

GGGAAAGCCCCTAAACTCCTGCTCCATAATGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCA

AGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCT

GAAGATTTTGTAAATTACTATTGTCAACAGGCTAACAGTTTCCCTCTCACTTTTCGGCGGA

GGGACCAGGGTGGAGATCAAA

rSEO ID NO: 323^)

Protema L16.2

imagen11

ADN H17

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTAAGACT CTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTAAGTAGTTATGGCATGCTCTGGGTCCGCCAGGC TCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTTTATGGTTTG ATGG A AGTTATA A A A ATT ATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTG TATCTGCAAATGAACAGCCTGCGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGA TAGT AC A ACT ATGGCCC ACTTTG ACT ACTGGGGCC AGGG AACCCTGGTC ACCGTCTCCTC A (SEP ID NO: 3251

imagen12

ADN L17

CAGACTGTGGTGACCCAGGAGCCATCGTTCTCAGTGTCCCCTGGAGGGACAGTCACACTC

ACTTGTGGCTTGAACTCTGGCTCAGTCTCTACTAGTTACTTCCCCAGCTGGTACCAGCAG

ACCCCAGGCCAGGCTCCACGCACGCTCATCTACAGCACAAACAGTCGCTCTTCTGGGGTC

CCTGATCGCTTCTCTGGCTCCATCCTTGGGAACAAAGCTGCCCTCACCATCACGGGGGCC

CAGGCAGATGATGAATCTGATTATTACTGTGTGCTGTATATGGGTAGAGGCATTTGGGTG

TTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA ISEO ID NO: 3271

Protema L17

imagen13

ADN H18

CAGGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACT

CTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAACTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGC

TCCAGGC A AGGGGCTGGAGTGGGTGGC AGTT ATATGGT ATGATGG AAGT AAT A A AT ACT

ATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTG

TATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGG

GGGGGGTATAGCAGTGGCTGACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGA

CCACGGTCACCGTCTCCTCA

(SEP ID NO: 3191

Protema H18

OVOLVESGGGVVOPGRSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVROAPGKGLEWVAVIWYDGSNKY YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCARGGGIAVADYYYYGMDVWGOG TTVTVSS rSEO ID NO; 32(tt

ADN L18.1

GATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCC ATCTCCTGCAGGTCTAGTCAAAGCCTCGTATACAGTGATGGAAACACCTACTTGAATTGG TTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCAAGGCGCCTAATTTATAAGGTTTCTTACTGGGAC TCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCAGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGAAAAT CAGT AGGGTGG AGGCTG AGG ATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGGT ACAC ACTGGC CTCCGGCCTTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATCAAA fSEO ID NO: 3291

Protema L18.1

imagen14

ADN L18.2

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC

ATCACTTGTCGGGCGAGTCAGAGTCTTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCA

GGGAAAGCCCCTAAACTCCTGCTCTATAATGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGCCCCATCA

aggttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcct

gaagattttgtaacttactattgtcaacaggctaacagtttccctctcacttttcggcgga

gggaccagggtggagatcaaa

(SEP ID NO: 33 n

Protema L18.2

imagen15

ADN H19

caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagact

ctcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggc

tccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatgatggaagtaataaatagt

atgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctg

TATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGG GGGGGGTATACCAGTAGCTGACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGA CCACGGTCACCGTCTCCTCA (SEP ID NO: 304^)

Protema H19

OVOLVESGGGVVOPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVROAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCARGGGIPVADYYYYGMDVWGOGTT VTVSS (SEP ID NO: 305^

ADN L19.1

GATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCC

ATCTCCTGCAGGTCTAGTCAAAGCCTCGTCTACAGTGATGGAGACACCTACTTGAATTGG

TTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCAAGGCGCCTAATTTATAAGGTTTCTAACTGGGAC

TCTGGGGTCCCATACAGATTCAGCGGCAGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGCAAATC

AGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGATTTACTACTGCATGCAAGGTACACACTGGCC

TCCGGCCTTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA (SEP ID NO: 306)

Protema L19.1

DVVMTOSPLSLPVTLGOPAS1SCRSSOSLVYSDGDTYLNWFOORPGOSPRRLIYKVSNWDSG VPYRFSGSGSGTDFTLOISRVEAEDVGIYYCMOGTHWPPAFGOGTRLEIK (SEP ID NO: 307)

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC

ATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTCTTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCA

GGGAAAGCCCCCAAGCTCCTGATGTATAACACATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATC

AAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCAGTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGC

CTGAAGATTTTGCAAGTTACTATTGTCAACAGGCTAACAGTTTCCCTCTCACTTTTCGGCG

GAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

(SEP ID NO: 3081

Protema L19.2

DIOMTOSPSSVSASVGDRVTITCRASOGLSSWLAWYOOKPGKAPKLLMYNTSSLOSGVPSRF

SGSGSGTDFSLTISSLOPEDFASYYCOOANSFPLTFGGGTKVEIK

(SEP ID NO: 3091

ADN H20

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACT CTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGC TCCAGGC A AGGGGCTGG AGTGGGTGGCAGTT AT ATGGT ATG ATGG A AGT AAT AAATACT

ATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTG

TATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGG

GGGGGGTATACCAGTAGCTGACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGA

CCACGGTCACCGTCTCCTCA

rSEO ID NO: 3041

Protema H20

OVOLVESGGGVVOPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVROAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYY APSVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCARGGGIPVADYYYYGMPVWGOGTT VTVSS (SEP ID NO: 3051

ADN L20.1

GATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCC

ATCTCCTGCAGGTCTAGTCAAAGCCTCGTCTACAGTGATGGAGACACCTACTTGAATTGG

TTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCAAGGCGCCTAATTTATAAGGTTTCTAACTGGGAC

TCTGGGGTCCCATACAGATTCAGCGGCAGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGCAAATC

AGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGATTTACTACTGCATGCAAGGTACACACTGGCC

TCCGGCCTTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA (SEP ID NO: 3061

Protema L20.1

imagen16

GACATCCAGATGACCCAGTCCCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACC

ATC ACTTGTCGGGCG AGTC AGGGTCTT AGC AGCTGGTT AGCCTG GT ATC AGC AG A A ACC A

GGGAAAGCCCCCAAGCTCCTGATGTATAACACATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATC

AAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCAGTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGC

CTGAAGATTTTGCAAGTTACTATTGTCAACAGGCTAACAGTTTCCCTCTCACTTTTCGGCG

GAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

(SEP ID NO: 3331

Protema L20.2

imagen17

ADN H21

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACT

CTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGC

TCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCAATTAGTGGTAGTGGTGGAAGTACACACT

ACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTG

T ATCTGCA A ATG A ACAGCCTGAGAGCCGAGG ACACGGCCGT AT ATT ACTGTGCG AAAG A

TCTCAACTGGGGAGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA

ISEO ID NO: 3341

Protema H21

imagen18

ADN L21

CAGTCTGTGCTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCAT

CTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATTGGGGCGGGTTATGTTGTACATTGGTACCAGCA

GCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAGCAATCGGCCCTCAGGGGT

CCCTGACCAATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGACT

imagen19

Protema L21

imagen20

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGCACAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACT

CTCCTGTGCAGGCTCTGGATTCTCCTTTAGAGGCTATGTCATGACTTGGGTCCGCCAGGCT

CC AGGGA AGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGG A ATT AGTGGT AGTGGTGGT AGC AC ATAC.TA

CGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGT

GTCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGGA

GACAGCTCGAACTACTACTCCGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCATCGT

CTCCTCA fSEO ID NO: 3381

Protema H22

EVOLLESGGGLAOPGGSLRLSCAGSGFSFRGYVMTWVROAPGKGLEWYSGISGSGGSTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLCLOMNSLRAEDTAVYYCAKGDSSNYYSGMDVWGOGTTV1VSS fSEO ID NO: 339)

ADN L22

GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACC ATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTAT ACAACTCCAACA AT A AGA ACT ACTT AGCT TGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCTTCTACCCGG GAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACC ATCAGCAGCCTGCAGGCTGAGGATGTGGCAATTTATTACTGTCAGCAATTTTATGGTCCT CCTCTCACTTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA (SEP ID NO: 340T

Protema L22

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYNSNNKNYLAWYQOKPGOPPKLLIYWASTRES GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAIYYCOOFYGPPLTFGGGTKVEfK fSEO ID NO: 34H

ADN H23

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGT

CTCCTGC A AGGCTTCTGG AT AC ACCTTC ACCGG CT ACT AT ATGC ACTGGGTGCG AC AGGC

CCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTAACAATGGTGGCACAAACT

ATGGACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCC

TACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGG

GAACTGGAACGACGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTC

A fSEO ID NO: 3421

Protema H23

imagen21

ADN L23

TCCTATGAGCTGACTCAGTCACCCTCAGTGTCCGTGTCCCCAGGACAGACAGCCAGCATC

ACCTGTTCTGGTGATAAATTGGGGGATAAATTTGCTTTCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGC

CAGTCCCCTGTGCTGGTCATCTATCAAGATAGCAAGCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGA

TTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACAGCCACTCTGACCATCAGCGGGACCCAGGCTATG

GATGAGGCTGACTATTACTGTCAGGCGTGGGACAGCAGCGCCGGGGGGGTATTTCGGCG

G AGGG ACCAAGTTGACCGTCCT A

fSEO ID NO: 3441

imagen22

ADN H24

CAGGTGCAACTGGAGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACT

CTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGC

TCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGATGGAAGTAATAAATACT

ATGTAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTG

TATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAAT

GGGGTTTACTATGGTTCGGGGAGCCCTCTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGA

CCACGGTCACCGTCTCCTCA

(SEP ID NO: 3461

Protema H24

OVOLEESGGGVVOPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVROAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYY VDSVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCARMGFTMVRGALYYGMDVWGQGT TVTVSS (SEP ID NO: 3471

ADN L24

TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATC

ACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGCTATCATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGG

AC AGGCCCCTGT ACTTGTC ATCT ATGGTG AAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAG ACCG

ATTCTCTGACTCCAGTTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGA

AGATGAGGCTGACTATTATTGTAATTATCGGGACAACAGTGGTAACCATCTGGTGTTTCG

GCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA

(SEP ID NO: 348)

Protema L24

SSELTODPAVSVALGOTVRITCOGDSLRSYHASWYOOKPGOAPVLVIYGENNRPSGIPDRFSD

SSSGNTASLTITGAOAEDEADYYCNYRDNSGNHLVFGGGTKLTVL

(SEP IP NO: 349)

ADN H25

GAGGTGCAGCTGTTGGAATCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACT CTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGC TCCAGGGA AGGGGCTGG AGTGGGTCTCAGCTATT AGTCGT AGTGGT AGT ACC ACATACT ACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTG TATCTGCAA ATG AACAGCCTG AGAGCCGAGG ACACGGCCGT AT ATT ACTGTGTGGA ACC GAGATATTTTGACTGGTTATTAGGCGACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTC A (SEP ID NO: 3501

EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVROAPGKGLEWVSAISRSGSTTYYAD SVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCVEPRYFDWLLGDWGOGTLVTVSSfSEO ID NO: 3511

ADN L25

GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACC ATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATACAACTCCAACAATAAGAACTACTTAGCT TGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCTTCTACCCGG GAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACC ATCAGCAGCCTGCAGGCTGAGGATGTGGCAATTTATTACTGTCAGCAATTTTATGGTCCT CCTCTCACTTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA (SEP ID NO: 3401

Protema L25

imagen23

ADN H26

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCGGGGGGAGGCGTGOTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACT

CTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGC

TCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTAAATGGTATGAAGGAAGTAATAAATACT

ATGGAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTG

TATTTGCAAATGAACAGTCTGAGAGGCGAGGATACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGG

CGCCCACGACTACGGTGACTTCTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGG

TCACCGTCTCCTCA fSEO ID NO: 3521

Protema H26

OVOLVESGGGVVOPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVROAPGKGLEWVAVKWYEGSNKY YGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRGEDTAVYYCARGAHDYGDFYYGMDVWGOGTT VTVSS fSEO ID NO: 3531

ADN L26

TCCTATGAACTGACTCAGCCAGCCTCAGTGTCCGTGTCCCCAGGACAGATAGCCAGCATC

ACCTGCTCTGGAGATAATTTGGGGGATAAATATATTTGCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGC

CAGTCCCCTGTGCGGGTCATCTATCAAGATAACAAGCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGT

TTCTCTGGCTCCAATTCTGGGAACACAGCCACTCTGACCATCAGCGGGACCCAGGCTATG

GATGAGGCTGACTATTACTGTCAGGCGTGGGACAGCAGCACTGTGGTATTTCGGCGGAG

GGACCAAGCTGACCGTCCTA

fSEO ID 1^0:354^

Protema L26

SYELTOPASVSVSPGOIASITCSGDNLGDKYICWYOOKPGOSPVRVIYODNKRPSGIPERFSGS

NSGNTATLTISGTOAMDEADYYCOAWDSSTVVFGGGTKLTVL

(SEP ID NO: 3551

5

10

15

20

25

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACT

CTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGC

TCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTTATAGTGGCGGTAGCACATACT

ACGCAGGCTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTG

TATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGA

TCGGG AGGG AGCG ACTTGGT ACT ACGGT ATGG ACGTCTGGGGCC AAGGG ACC ACGGTC A

CCGTCTCCTCA (SEP ID NO: 3561

Protema H27

EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVROAPGKGLEWVSAISYSGGSTYYA GSVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCAKDREGATWYYGMDVWGOGTTVTV SS fSEO ID NO: 3571

ADN L27

TCCTATGAACTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCCGTGTCCCCAGGACAGACAGCCAGCATC

ACCTGCTCTGGAGATAAATTGGGGGAAAGCTATGCTTGCTGGTATCAGCAGAAGCCAGG

CCAGTCCCCTGTACTGGTCATCTATCAAGATTACAAGCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCG

CTTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACAGCCACTCTGACCATCAGCGGGACCCAGGCTAT

GG ATG AGGCTG ACT ATT ACTGTCAGGCGTGGGACAG AAGTACTGT ACTATTTCGGCGG A

GGGACCAAGCTGACCGTCCTA

(SEP ID NO: 3581

Protema L27

SYELTOPPSVSVSPGOTASITCSGDKLGESYACWYOOKPGOSPVLVIYODYKRPSGIPERFSGS

NSGNTATLT1SGTOAMDEADYYCOAWDRSTVLFGGGTKLTVL

(SEP IP NO: 3591

Se describen una o mas secuencias de aminoacidos que son identicas a las secuencias de aminoacidos de una o mas de las CDR y pueden comprender adicionalmente una o mas FR ilustradas anteriormente. La protema de union a antigeno comprende una secuencia de CDR1 de cadena ligera ilustrada mas arriba. La protema de union a antigeno comprende una secuencia de CDR2 de cadena ligera ilustrada mas arriba. La protema de union a antigeno comprende una secuencia de CDR3 de cadena ligera ilustrada mas arriba. La protema de union a antigeno

comprende una secuencia de CDR1 de cadena pesada ilustra mas arriba. La protema de union a antigeno

comprende una secuencia de CDR2 de cadena pesada ilustrada mas arriba. La protema de union a antigeno

comprende una secuencia de CDR3 de cadena pesada ilustrada mas arriba. La protema de union a antigeno

comprende adicionalmente una secuencia de FR1 de cadena ligera ilustrada mas arriba. La protema de union a antigeno comprende adicionalmente una secuencia de FR2 de cadena ligera ilustrada mas arriba. La protema de union a antigeno comprende adicionalmente una secuencia de FR3 de cadena ligera ilustrada mas arriba. La protema de union a antigeno comprende adicionalmente una secuencia de FR4 de cadena ligera ilustrada mas arriba. La protema de union a antigeno comprende adicionalmente una secuencia de FR1 de cadena pesada ilustrada mas arriba. La protema de union a antigeno comprende adicionalmente una secuencia de FR2 de cadena pesada ilustrada mas arriba. La protema de union a antigeno comprende adicionalmente una secuencia de FR3 de cadena pesada ilustrada mas arriba. La protema de union a antigeno comprende adicionalmente una secuencia de FR4 de cadena pesada ilustrada anteriormente.

La presente description proporciona una protema de union a antigeno que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que difiere de la secuencia del dominio variable de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste en L1 a L27 solo en 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 o 0 residuos, en donde cada una de tales diferencias en la secuencia es independientemente una deletion, insertion o sustitucion de un residuo de aminoacido. En otra realization, el dominio variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos que es identica en al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 99% a la secuencia de un dominio variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en L5. En otra realizacion, el dominio variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos que esta codificada por una secuencia de nucleotidos que es identica en al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 99% a una secuencia de nucleotidos que codifica un dominio variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en L5. En otra realizacion, el dominio variable

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de cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos que esta codificada por un polinucleotido que hibrida en condiciones moderadamente rigurosas con el complemento de un polinucleotido que codifica un dominio variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en L1-L27. En otra realizacion, el dominio variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos que esta codificada por un polinucleotido que hibrida en condiciones altamente rigurosas con un complemento de un polinucleotido de cadena ligera de L5.

Se describe una protema de union a antfgeno que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que difiere de la secuencia de un dominio variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en H1-H27 solo en 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 o 0 residuos, en donde cada una de tales diferencias en la secuencia es independientemente una delecion, insercion o sustitucion de un residuo de aminoacido. En otra realizacion, el dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos que es identica en al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 99% a la secuencia del dominio variable de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en H5. En otra realizacion, el dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos que esta codificada por una secuencia de nucleotidos que es identica en al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, o 99% a una secuencia de nucleotidos que codifica un dominio variable de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en H5. En otra realizacion, el dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos que esta codificada por un polinucleotido que hibrida en condiciones moderadamente rigurosas con el complemento de un polinucleotido que codifica un dominio variable de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en H5. En otra realizacion, el dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos que esta codificada por un polinucleotido que hibrida en condiciones altamente rigurosas con el complemento de un polinucleotido que codifica un dominio variable de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en H5.

En la Tabla 2 anterior, dos cadenas ligeras se asocian con una unica cadena pesada, identificada, por ejemplo, como L-12.1, L-12.2, etc. Estas cadenas ligeras alternativas se emparejan cada una con una sola cadena pesada. La combinacion de cadena ligera y cadena pesada se puede analizar como se describe a continuacion y se puede seleccionar la combinacion de cadena ligera y cadena pesada que proporciona la mayor actividad neutralizadora de LPET.

Las realizaciones adicionales incluyen protemas de union a antfgeno que comprenden las combinaciones L5H5.

Los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y derivados de anticuerpos de la invencion pueden comprender, ademas, cualquier region constante conocida en la tecnica. La region constante de la cadena ligera puede ser, por ejemplo, una region constante de cadena ligera de tipo kappa o lambda, por ejemplo, una region constante de cadena ligera de tipo kappa o lambda humana. La region constante de la cadena pesada puede ser, por ejemplo, una region constante de cadena pesada de tipo alfa-, delta-, epsilon, gamma- o mu, p. ej., una region constante de cadena pesada de tipo alfa, delta, epsilon, gamma, o mu humana. En una realizacion, la region constante de cadena ligera o pesada es un fragmento, derivado, variante o mutema de una region constante de origen natural.

En una realizacion, los anticuerpos comprenden una IgG, tales como IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4.

Se conocen tecnicas para derivar un anticuerpo de una subclase o isotipo diferente de un anticuerpo de interes, es decir, cambio de subclase. Por lo tanto, los anticuerpos IgG pueden derivar de un anticuerpo IgM, por ejemplo, y viceversa. Tales tecnicas permiten la preparacion de nuevos anticuerpos que poseen las propiedades de union a antfgeno de un anticuerpo dado (el anticuerpo parental), pero tambien exhiben propiedades biologicas asociadas con un isotipo o subclase de anticuerpo diferente de los del anticuerpo parental. Se pueden emplear tecnicas de ADN recombinante. El ADNc clonado que codifica polipeptidos de anticuerpos concretos se puede emplear en tales procedimientos, p. ej., ADN que codifica el dominio constante de un anticuerpo del isotipo deseado. Vease tambien Lantto et al., 2002, Methods Mol. Biol. 178: 303-16.

En una realizacion, un anticuerpo humano anti-LPET de la invencion comprende el dominio constante de la cadena pesada de IgG1 o un fragmento del dominio constante de la cadena pesada de IgG1. En una realizacion, un anticuerpo humano anti-LPET de la invencion comprende adicionalmente los dominios kappa o lambda de la cadena ligera constante o un fragmento de estos. Las regiones constantes de la cadena ligera y los polinucleotidos que las codifican se proporcionan en la Tabla 3 a continuacion. En otra realizacion, un anticuerpo humano anti-LPET de la invencion comprende adicionalmente un dominio constante de la cadena pesada, o un fragmento del mismo, tal como la region constante de la cadena pesada de IgG2 mostrada a continuacion en la Tabla 3.

El acido nucleico (ADN) que codifica los dominios de la cadena ligera constante y pesada constante, y las secuencias de aminoacidos de los dominios de la cadena pesada y ligera se proporcionan a continuacion. Los dominios variables lambda se pueden fusionar con dominios constantes de lambda y los dominios variables kappa con los dominios constantes de kappa.

TABLA 3

ADN del dominio constante pesados de IgG2 (SEQ ID NO: 364)

gctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagcggccctgggctgcctggtcaaggact

acttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccagctgtcctacagtcctcaggactctact

ccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtgga

caagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaa

ggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtg

gacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcacc

aggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggc

agccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttcta

ccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctcctt

cttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccacta

cacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga

Protema del dominio constante pesado de IgG2 (SEQ ID NO: 365)

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY

SLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKP

KDTLMISRTPEVTC VV VDVSHEDPE V QFN WYVDG VEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVS VLTV

VHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK

GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA

LHNHYTQKSLSLSPGK*

ADN del dominio constante ligero Kappa (SEQ ID NO: 366)

cgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcc

cagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagca

cctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctc

gcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag

Protema del dominio constante ligero Kappa (SEQ ID NO: 367)

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK

DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*

ADN del dominio constante ligero Lambda (SEQ ID NO: 368)

ggccaaccgaaagcggcgccctcggtcactctgttcccgccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgac

ttctacccgggagccgtgacagtggcctggaaggcagatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaa

caacaagtacgcggccagcagctatctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggag

caccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttcatag

Protema del dominio constante ligero Lambda (SEQ ID NO: 369)

GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSN

NKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS*

Las protemas de union a antigeno de la presente invention incluyen aquellas que comprenden, por ejemplo, las combinaciones de dominio variable L5H5, que tienen un isotipo deseado (por ejemplo, IgA, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 5 IgM, IgE, e IgD), asi como los fragmentos Fab o F (ab')2 de los mismos. Por otra parte, si se desea una IgG4, tambien puede ser deseable introducir una mutation puntual en la region de bisagra como describen Bloom et al., 1997, Protein Science 6: 407 para aliviar una tendencia a formar enlaces disulfuro intra cadena-H que pueden conducir a la heterogeneidad en los anticuerpos IgG4.

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Anticuerpos y fragmentos de anticuerpos

Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "anticuerpo" se refiere a un anticuerpo intacto, o a un fragmento de union a antigeno del mismo, como se describe en la seccion de definiciones de la presente memoria. Un anticuerpo puede comprender una molecula de anticuerpo completa (incluyendo versiones policlonales, monoclonales, quimericas, humanizadas, o humanas que tienen cadenas pesadas y/o ligeras completas), o comprender un fragmento de union a antigeno de la misma. Los fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos F(ab')2, Fab, Fab', Fv, Fc, y Fd, y se pueden incorporar a anticuerpos de dominio unico, anticuerpos monovalentes, anticuerpos de una sola cadena, maxicuerpos, minicuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, v- NAR y bis-scFv (Vease, p. ej., "Hollinger y Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136). Los polipeptidos de anticuerpos se describen tambien en la Patente de los Estados Unidos Num. 6.703.199, Incluyendo monocuerpos polipeptfdicos de fibronectina. Otros polipeptidos de anticuerpos se describen en la Publicacion de Patente de los Estados Unidos 2005/0238646, que son polipeptidos de una sola cadena. Los fragmentos de anticuerpos monovalentes se describen en la Publicacion de Patente de los Estados Unidos 20050227324.

Los fragmentos de union a antfgeno derivados de un anticuerpo se pueden obtener, por ejemplo, por hidrolisis proteolftica del anticuerpo, por ejemplo, digestion con pepsina o papama de anticuerpos completos de acuerdo con los metodos convencionales. A modo de ejemplo, los fragmentos de anticuerpos pueden ser producidos por escision enzimatica de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S denominado F(ab')2. Este fragmento puede escindirse adicionalmente usando un agente reductor de tiol para producir fragmentos monovalentes 3,5S Fab'. Opcionalmente, la reaccion de escision se puede realizar utilizando un grupo de bloqueo para los grupos sulfhidrilo que son el resultado de la escision de enlaces disulfuro. Como alternativa, una escision enzimatica utilizando papama produce dos fragmentos Fab monovalentes y un fragmento Fc directamente. Estos metodos son descritos, por ejemplo, por Goldenberg, Patente de Estados Unidos Num. 4.331.647, Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89: 230, 1960; Porter, Biochem. J. 73: 119, 1959; Edelman et al., en Methods in Enzymology 1: 422 (Academic Press 1967); y por Andrews, S.M. y Titus, J. A. en Current Protocols in Immunology (Coligan J. E., et al., eds.), John Wiley & Sons, Nueva York (2003), paginas 2.8.1-2.8.10 y 2.10A.1-2.10A.5. Otros metodos para la escision de anticuerpos, tales como separacion de cadenas pesadas para formar fragmentos monovalentes de cadena ligera-pesada (Fd), la escision adicional de fragmentos, u otras tecnicas enzimaticas, qmmicas, o geneticas tambien se pueden utilizar, siempre que los fragmentos se unan al antfgeno que es reconocido por el anticuerpo intacto.

Un fragmento de anticuerpo tambien puede ser cualquier protema sintetica o manipulada geneticamente. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos aislados que consisten en la region variable de la cadena ligera, fragmentos "Fv" que consisten en las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, moleculas de polipeptidos de cadena sencilla recombinantes en las que las regiones ligeras y pesadas variables estan conectadas por un conector peptfdico (protemas scFv).

Otra forma de un fragmento de anticuerpo es un peptido que comprende una o mas regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo. Las CDR (tambien denominados "unidades mmimas de reconocimiento", o "region hipervariable") se pueden obtener mediante la construccion de polinucleotidos que codifican la CDR de interes. Tales polinucleotidos se preparan, por ejemplo, mediante el uso de la reaccion en cadena de la polimerasa para sintetizar la region variable utilizando ARNm de las celulas productoras de anticuerpos como molde (vease, por ejemplo, Larrick et al., Methods: A companion to Methods in Enzymology 2: 106, 1991; Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies" en Monoclonal Antibodies Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), pagina 166 (Cambridge University Press 1995); y Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies", in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al., (eds.), pagina 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)).

Por lo tanto, el agente de union comprende al menos una CDR como se describe en la presente memoria. El agente de union puede comprender adicionalmente al menos dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR como se describe en la presente memoria. El agente de union puede comprender adicionalmente al menos un dominio de la region variable de un anticuerpo descrito en la presente memoria. El dominio de la region variable puede ser de cualquier tamano o composicion de aminoacidos y generalmente comprendera al menos una secuencia CDR responsable de la union a LPET, por ejemplo la CDR1, CDR2, CDR3 de la cadena pesada y/o las CDR de la cadena ligera descritas espedficamente en la presente memoria y que es adyacente a o esta en marco con una o mas secuencias del marco. En terminos generales, el dominio de la region variable (V) puede estar en cualquier disposicion adecuada de los dominios variables de de la cadena pesada (Vh) y/o ligera (Vl) de inmunoglobulina. Asf, por ejemplo, el dominio de la region V puede ser monomerico y puede ser un dominio Vh o Vl, que es capaz de unirse de forma independiente a LPET humana con una afinidad al menos igual a 1 x 10-7 M o menos como se describe a continuacion. Alternativamente, el dominio de la region V puede ser dimerico y contener dfmeros Vh-Vh, Vh-VlO Vl- Vl. El dfmero de la region V comprende al menos una cadena Vh y al menos una Vl que puede estar asociado no covalentemente (en lo sucesivo denominado Fv). Si se desea, las cadenas pueden estar covalentemente acopladas ya sea directamente, por ejemplo mediante un enlace disulfuro entre los dos dominios variables, o a traves de un conector, por ejemplo, un conector peptfdico, para formar un Fv de cadena sencilla (scFvv).

El dominio de la region variable puede ser cualquier dominio variable de origen natural o una version manipulada del

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mismo. Por version manipulada se entiende un dominio de region variable que ha sido creado usando tecnicas de manipulacion de ADN recombinante. Tales versiones manipuladas incluyen las creadas, por ejemplo, a partir de una region variable de un anticuerpo espedfico mediante inserciones, deleciones o cambios en o a las secuencias de aminoacidos del anticuerpo espedfico. Los ejemplos concretos incluyen dominios de regiones variables manipulados que contienen al menos una CDR y opcionalmente uno o mas aminoacidos del marco de un primer anticuerpo y el resto del dominio de la region variable de un segundo anticuerpo.

El dominio de la region variable puede estar anclado covalentemente en un aminoacido C-terminal a al menos otro dominio de anticuerpo o un fragmento del mismo. Asf, por ejemplo, un dominio VH que esta presente en el dominio de la region variable puede estar unido a un dominio CH1 de la inmunoglobulina, o un fragmento del mismo. Del mismo modo un dominio Vl puede estar unido a un dominio Ck o un fragmento del mismo. De esta manera, por ejemplo, el anticuerpo puede ser un fragmento Fab en donde el dominio de union a antigeno contiene dominios Vh y Vl asociados unidos covalentemente en sus extremos C-terminales a un dominio CH1 y Ck, respectivamente. El dominio CH1 se puede extender con otros aminoacidos, por ejemplo para proporcionar una region bisagra o una porcion de un dominio de la region bisagra como se encuentra en un fragmento Fab', o para proporcionar mas dominios, tales como los dominios CH2 y CH3 del anticuerpo.

Derivados de protemas de union a antigeno

Las secuencias de nucleotidos mostradas en la FIG. 1A-1F, la FIG. 2A-2F, y en la Tabla 2 anterior se pueden modificar, por ejemplo, mediante mutagenesis aleatoria o mediante mutagenesis dirigida al sitio (p. ej., mutagenesis espedfica de sitio dirigida por oligonucleotidos) para crear un polinucleotido alterado que comprende uno o mas sustituciones, deleciones, o inserciones concretas de nucleotidos en comparacion con el polinucleotido no mutado. Los ejemplos de las tecnicas para realizar tales alteraciones son descritos por Walder et al., 1986, Gene 42: 133; Bauer et al., 1985, Gene 37:73; Craik, BioTechniques, enero de 1985, 12-19; Smith et al., 1981, Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press; y Patentes de Estados Unidos Nums. 4.518.584 y 4.737.462. Estos y otros metodos se pueden utilizar para elaborar, por ejemplo, derivados de proteinas de union a antigeno LPET que tienen una propiedad deseada, por ejemplo, aumento de la afinidad, avidez, o especificidad para LPET, aumento de la actividad o la estabilidad in vivo o in vitro, o reduccion de los efectos secundarios in vivo, en comparacion con las proteinas de union a antigeno no derivatizadas.

Otros derivados de las proteinas de union a antigeno anti-LPET incluyendo anticuerpos dentro del alcance de esta invencion incluyen productos conjugados covalentes o agregados de anticuerpos anti-LPET, o sus fragmentos, con otras proteinas o polipeptidos, por ejemplo mediante la expresion de proteinas de fusion recombinantes que comprenden polipeptidos heterologos fusionados al extremo N o al extremo C de un polipeptido de anticuerpo anti- LPET. Por ejemplo, el peptido conjugado puede ser un polipeptido senal heterologo (o lfder), p. ej., el lfder del factor alfa de levadura, o un peptido tal como una etiqueta epitopica. Las proteinas de fusion que contienen proteinas de union a antigeno pueden comprender peptidos anadidos para facilitar la purificacion o identificacion de la protema de union antigeno (p. ej., poli-His). Una protema de union a antigeno tambien se puede conectar al peptido FLAG como describen. Hoppetal., Bio/Technology 6: 1204, 1988 y la Patente de los Estados Unidos 5.011.912. El peptido FLAG es altamente antigenico y proporciona un epftopo unido reversiblemente por un anticuerpo monoclonal espedfico (mAb), permitiendo un analisis rapido y una purificacion facil de la protema recombinante expresada. Los reactivos utiles para la preparacion de protemas de fusion en donde el peptido FLAG se fusiona a un polipeptido dado estan disponibles comercialmente (Sigma, St. Louis, MO).

Los oligomeros que contienen uno o mas protemas de union de antigeno se pueden emplear como antagonistas de LPET. Los oligomeros pueden estar en forma de dfmeros, trimeros, u oligomeros superiores unidos covalentemente o unidos no covalentemente,. Los oligomeros que comprenden dos o mas protemas de union a antigeno se contemplan para su uso, siendo un ejemplo un homodfmero. Otros oligomeros incluyen heterodfmeros, homotnmeros, heterotrimeros, homotetrameros, heterotetrameros, etc.

Una realizacion esta dirigida a oligomeros que comprenden multiples anticuerpos unidos a traves de interacciones covalentes o no covalentes entre radicales peptidicos fusionados a las protemas de union de antigeno. Tales peptidos pueden ser conectores peptidicos (espaciadores), o peptidos que tienen la propiedad de promover la oligomerizacion. Las cremalleras de leucina y ciertos polipeptidos derivados de anticuerpos estan entre los peptidos que pueden promover la oligomerizacion de las protemas de union a antigeno ancladas a los mismos, como se describe en mas detalle a continuacion.

En realizaciones concretas, los oligomeros comprenden de dos a cuatro anticuerpos capaces de unirse a LPET. Los anticuerpos del oligomero pueden estar en cualquier forma, tal como cualquiera de las formas descritas anteriormente, p. ej., variantes o fragmentos.

En una realizacion, un oligomero se prepara utilizando polipeptidos derivados de inmunoglobulinas. La preparacion de protemas de fusion que comprenden ciertos polipeptidos heterologos fusionados a diversas porciones de polipeptidos derivados de anticuerpos (incluyendo el dominio Fc) ha sido descrita, por ejemplo, por Ashkenazi et al., 1991, PNAS USA 88: 10535; Byrn et al., 1990, Nature 344: 677; y Hollenbaugh et al., 1992 "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", en Current Protocols in Immunology, Supl. 4, paginas 10.19.1 -10.19.11.

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Una realizacion de la presente invencion esta dirigida a un dfmero que comprende dos protemas de fusion creadas fusionando un fragmento de un anticuerpo anti-LPET a la region Fc de un anticuerpo. El dfmero se puede elaborar, por ejemplo, insertando un gen de fusion que codifica la protema de fusion en un vector de expresion apropiado, expresando la fusion de genes en celulas anfitrionas transformadas con el vector de expresion recombinante, y permitiendo que la protema de fusion expresada se ensamble igual que las moleculas de anticuerpo, despues de lo cual se forman enlaces disulfuro intercatenarios entre los radicales Fc para producir el dfmero.

El termino "polipeptido Fc" segun se utiliza en la presente memoria incluye formas nativas y de mutema de los polipeptidos derivados de la region Fc de un anticuerpo. Tambien se incluyen las formas truncadas de tales polipeptidos que contienen la region bisagra que promueve la dimerizacion. Las protemas de fusion que comprenden radicales Fc (y los oligomeros formados a partir de ellas) ofrecen la ventaja de una facil purificacion mediante cromatograffa de afinidad sobre columnas de Protema A o Protema G.

Un polipeptido Fc adecuado, descrito en la solicitud PCT WO 93/10151 (incorporada a la presente como referencia), es un polipeptido de cadena sencilla que se extiende desde la region bisagra N-terminal al extremo C nativo de la region Fc de un anticuerpo IgG1 humano. Otro polipeptido Fc util es la mutema Fc descrita en la Patente de los Estados Unidos 5.457.035 y en Baum et al., 1994, EMBO J. 13: 3.992-4001. La secuencia de aminoacidos de esta mutema es identica a la de la secuencia Fc nativa presentada en el documento WO 93/10151, excepto que el aminoacido 19 se ha cambiado de Leu a Ala, el aminoacido 20 se ha cambiado de Leu a Glu, y el aminoacido 22 se ha cambiado de Gly a Ala. La mutema muestra una afinidad reducida por los receptores de Fc.

En otras realizaciones, la porcion variable de las cadenas pesada y/o ligera de un anticuerpo anti-LPET se puede sustituir por la porcion variable de una cadena pesada y/o ligera de anticuerpo.

Alternativamente, el oligomero es una protema de fusion que comprende multiples protemas de union a antfgeno, con o sin conectores peptfdicos (peptidos espaciadores). Entre los conectores peptfdicos adecuados estan los descritos en las Patentes de los Estados Unidos 4.751.180 y 4.935.233.

Otro metodo para preparar protemas de union a antfgeno oligomericas implica el uso de una cremallera de leucina. Los dominios de cremallera de leucina son peptidos que promueven la oligomerizacion de las protemas en las que se encuentran. Las cremalleras de leucina se identificaron originalmente en varias protemas de union al ADN (Landschulz et al., 1988, Science 240: 1759), y desde entonces han sido encontrados en una variedad de protemas diferentes. Entre las cremalleras de leucina conocidas se encuentran los peptidos de origen natural y sus derivados que dimerizan o trimerizan. Los ejemplos de los dominios de cremallera de leucina adecuados para producir protemas oligomericas solubles se describen en la Solicitud PCT WO 94/10308, y la cremallera de leucina derivada de la protema tensioactiva pulmonar D (SPD) descrita por Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344: 191. El uso de una cremallera de leucina modificada que permite la trimerizacion estable de una protema heterologa fusionada a esta es descrita por Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6: 267-78. En un enfoque, las protemas de fusion recombinantes que comprenden un fragmento de anticuerpo anti-LPET o un derivado fusionado a un peptido de cremallera de leucina se expresan en celulas anfitrionas adecuadas, y los fragmentos de anticuerpos anti-LPET oligomericos solubles o los derivados que forman se recuperan del sobrenadante de cultivo.

Como se describe en la presente memoria, los anticuerpos comprenden al menos una CDR. Por ejemplo, se pueden incorporar una o mas CDR a regiones marco de anticuerpos conocidos (IgG1, IgG2, etc.), o conjugar con un vehmulo adecuado para mejorar la vida media del mismo. Los vehmulos adecuados incluyen, pero no se limitan a Fc, polietilenglicol (PEG), albumina, transferrina, y similares. Estos y otros vehmulos adecuados son conocidos en la tecnica. Tales peptidos de CDR conjugados pueden estar en forma monomerica, dimerica, tetramerica, u otra forma. En una realizacion, se unen uno o mas polfmeros solubles en agua a una posicion mas espedfica, por ejemplo en el extremo amino, de un agente de union.

En ciertas realizaciones preferidas, un anticuerpo comprende uno o mas anclajes para polfmeros solubles en agua, incluyendo, pero no limitados a, polietilenglicol, polioxietilenglicol, o polipropilenglicol. Veanse, p. ej., Las Patentes de los Estados Unidos Nums. 4.640.835. 4.496.689. 4.301.144. 4.670.417. 4.791.192 y 4.179.337. En ciertas realizaciones, un agente de union derivado comprende uno o mas de monometoxi-polietilenglicol, dextrano, celulosa, u otros polfmeros basados en hidratos de carbono, poli-(N-vinil pirrolidona)-polietilenglicol, homopolfmeros de propilenglicol, un copolfmero de oxido de polipropileno/oxido de etileno, polioles polioxietilados (p. ej., glicerol) y poli(alcohol vimlico), asf como mezclas de tales polfmeros. En ciertas realizaciones, se anclan al azar uno o mas polfmeros soluble en agua a una o mas cadenas laterales. En ciertas realizaciones, el PEG puede actuar mejorando la capacidad terapeutica para un agente de union, tal como un anticuerpo. Se discuten algunos de dichos metodos, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos Num. 6.133.426,.

Se apreciara que un anticuerpo de la presente invencion puede tener una sustitucion, delecion, o adicion de al menos un aminoacido siempre que el anticuerpo conserve la especificidad de union. Por lo tanto, las modificaciones de las estructuras de anticuerpos estan incluidas dentro del alcance de la invencion. Estos pueden incluir sustituciones de aminoacidos, que pueden ser conservativas o no conservativas, que no destruyan la capacidad de union a LPET humana de un anticuerpo. Las sustituciones conservativas de aminoacidos pueden abarcar residuos de aminoacidos no naturales, que se incorporan tfpicamente mediante smtesis peptfdica qrnmica en lugar de

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mediante smtesis en sistemas biologicos. Estos incluyen peptidomimeticos y otras formas revertidas o invertidas de radicales de aminoacidos. Una sustitucion conservativa de aminoacidos tambien puede implicar una sustitucion de un residuo de aminoacido nativo por un residuo no nativo de tal manera que haya poco o ningun efecto sobre la polaridad o la carga del residuo de aminoacido en esa posicion.

Las sustituciones no conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de una clase de aminoacidos o mimeticos de aminoacidos por un miembro de otra clase con diferentes propiedades ffsicas (p. ej., tamano, polaridad, caracter hidrofobo, carga). Tales residuos sustituidos pueden introducirse en regiones del anticuerpo humano que son homologas a anticuerpos no humanos, o en las regiones no homologas de la molecula.

Por otra parte, un experto en la tecnica puede generar variantes de ensayo que contienen una unica sustitucion de aminoacido en cada residuo de aminoacido deseado. Las variantes se pueden escrutar a continuacion utilizando analisis de actividad conocidos por los expertos en la tecnica. Tales variantes podnan ser utilizadas para reunir informacion acerca de las variantes adecuadas. Por ejemplo, si se descubre que un cambio en un residuo de aminoacido concreto da como resultado una destruccion de la actividad, una actividad reducida no deseada, o una actividad inadecuada, las variantes con un cambio de este tipo pueden ser evitadas. En otras palabras, basandose en la informacion recopilada a partir de tales experimentos de rutina, un experto en la tecnica puede determinar facilmente los aminoacidos en los que se deben evitar sustittuciones adicionales ya sean solas o combinadas con otras mutaciones.

Un experto en la tecnica sera capaz de determinar las variantes adecuadas del polipeptido que se definen en la presente memoria utilizando mecanismos bien conocidos. En ciertas realizaciones, un experto en la tecnica puede identificar zonas adecuadas de la molecula que se pueden cambiar sin destruir su actividad eligiendo como diana regiones que no se cree que sean importantes para la actividad. En ciertas realizaciones, se pueden identificar residuos y porciones de las moleculas que se conservan entre polipeptidos similares. En ciertas realizaciones, incluso las zonas que pueden ser importantes para la actividad biologica o para la estructura pueden ser objeto de sustituciones conservativas de aminoacidos sin destruir la actividad biologica o sin afectar adversamente la estructura de polipeptido.

Adicionalmente, un experto en la tecnica puede revisar los estudios de estructura-funcion que identifican residuos en polipeptidos similares que son importantes para la actividad o la estructura. A la vista de semejante comparacion, se puede predecir la importancia de los residuos de aminoacido de una protema que corresponden a residuos de aminoacido que son importantes para la actividad o estructura en las protemas similares. Un experto en la tecnica puede optar por sustituciones de aminoacidos qmmicamente similares para tales residuos de aminoacido importantes pronosticados.

Un experto en la tecnica tambien puede analizar la estructura tridimensional y la secuencia de aminoacidos en relacion con esa estructura en polipeptidos similares. A la vista de tal informacion, un experto en la tecnica puede predecir el alineamiento de residuos de aminoacido de un anticuerpo con respecto a su estructura tridimensional. En ciertas realizaciones, un experto en la tecnica puede elegir no hacer cambios radicales en los residuos de aminoacido que se preve que estan sobre la superficie de la protema, ya que tales residuos pueden estar involucrados en importantes interacciones con otras moleculas.

Numerosas publicaciones cientfficas se han dedicado a la prediccion de la estructura secundaria. Vease Moult J., Curr. Op. en Biotech, 7(4):. 422-427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13(2):. 222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113(2):. 211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47: 45-148 (1978); Chou et al., Ann. Rdo. Biochem., 47: 251-276 y Chou et al., Biophys. J., 26: 367-384 (1979). Por otra parte, actualmente se encuentran disponibles programas informaticos para ayudar en la prediccion de la estructura secundaria. Un metodo de prediccion de la estructura secundaria se basa en el modelado por homologfa. Por ejemplo, dos polipeptidos o protemas que tienen una identidad de secuencia de mas de 30%, o una similitud mayor de 40% a menudo tienen topologfas estructurales similares. El reciente crecimiento de las bases de datos estructurales de protemas (PDB) ha proporcionado una mayor previsibilidad de la estructura secundaria, incluyendo el numero potencial de plegamientos dentro de la estructura de un polipeptido o de una protema. Vease Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27(1): 244-247 (1999). Se ha sugerido (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3): 369-376 (1997)) que hay un numero limitado de plegamientos en un polipeptido o protema dados y que una vez que se ha resuelto el numero cntico de estructuras, la prediccion estructural se hara muctusimo mas precisa.

Otros metodos de prediccion de la estructura secundaria incluyen "Diseno por homologfa remota" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3): 377-87 (1997);. Sippl et al., Structure, 4(1): 15-19 (1996)), "analisis del perfil" (Bowie et al., Science, 253: 164-170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzym, 183: 146-159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13): 4355-4358 (1987)), y "vinculacion evolutiva" (Veanse Holm, mas arriba (1999), y Brenner, mas arriba (1997)).

Un experto en la tecnica entendera que algunas protemas, tales como los anticuerpos, pueden someterse a una variedad de modificaciones postraduccionales. El tipo y el alcance de estas modificaciones dependen a menudo de la lmea de celula anfitriona utilizada para expresar las protemas, asf como las condiciones de cultivo. Tales modificaciones pueden incluir variaciones en la glicosilacion, la oxidacion de metionina, la de dicetopiperizina, la

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isomerizacion de aspartato y la desamidacion de asparragina. Una modificacion frecuente es la perdida de un residuo alcalino carboxi-terminal (tal como lisina o arginina), debido a la accion de carboxipeptidasas (como describen Harris, R. J. Journal of Chromatography 705: 129-134, 1995).

En ciertas realizaciones, las variantes de anticuerpos incluyen variantes de glicosilacion en donde el numero y/o tipo de sitio de glicosilacion ha sido alterado en comparacion con las secuencias de aminoacidos de un polipeptido parental. En ciertas realizaciones, las variantes comprenden un mayor o un menor numero de sitios de glicosilacion ligados a N que la protema nativa. Alternativamente, las sustituciones que eliminen esta secuencia eliminaran una cadena de carbohidrato ligada a N existente. Tambien se proporciona un reordenamiento de cadenas de carbohidratos ligadas a N en donde se eliminan uno o mas sitios de glicosilacion ligados a N (normalmente aquellos que son de origen natural) y se crean uno o mas nuevos sitios ligados a N. Otras variantes de anticuerpos preferidos incluyen variantes de cistema, en donde uno o mas residuos de cistema se eliminan de o se sustituyen por otro aminoacido (p. ej., serina) en comparacion con la secuencia de aminoacidos parental. Las variantes de cistema pueden ser utiles cuando los anticuerpos se deben replegar en una conformacion biologicamente activa tal como despues del aislamiento de cuerpos de inclusion insolubles. Las variantes de cistema tienen generalmente menos residuos de cistema que la protema nativa, y tfpicamente tienen un numero par para minimizar las interacciones que resultan de las cistemas no apareadas.

Las sustituciones de aminoacidos deseadas (ya sean conservativas o no conservativas) se pueden determinar por los expertos en la tecnica en el momento en el que se desean dichas sustituciones. En ciertas realizaciones, las sustituciones de aminoacidos se pueden utilizar para identificar residuos importantes de anticuerpos para LPET humana, o para aumentar o disminuir la afinidad de los anticuerpos para LpET humana descrita en la presente memoria.

De acuerdo con ciertas realizaciones, las sustituciones de aminoacidos preferidas son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteolisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidacion, (3) alteran la afinidad de union para formar complejos de protemas, (4) alteran las afinidades de union, y/o (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoqmmicas o funcionales a tales polipeptidos. De acuerdo con ciertas realizaciones, se pueden realizar sustituciones de aminoacidos sencillas o multiples (en determinadas realizaciones, sustituciones de aminoacidos conservativas) en la secuencia de origen natural (en ciertas realizaciones, en la porcion del polipeptido fuera del dominio o los dominios que forman los contactos intermoleculares). En ciertas realizaciones, una sustitucion de aminoacidos conservativa tfpicamente puede no cambiar sustancialmente las caractensticas estructurales de la secuencia parental (p. ej., un reemplazo de un aminoacido no debe tender a romper una helice que existe en la secuencia parental, ni alterar otros tipos de la estructura secundaria que caracteriza la secuencia parental). Los ejemplos de las estructuras secundarias y terciarias de polipeptidos reconocidas en la tecnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, Nueva York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)); y Thornton et al. Nature 354: 105 (1991).

En ciertas realizaciones, los anticuerpos de la invencion pueden estar unidos qmmicamente con polfmeros, lfpidos, u otros radicales.

Ademas, las protemas de union a antfgeno pueden comprender al menos una de las CDR descritas en la presente memoria incorporadas a una estructura de marco biocompatible. En un ejemplo, la estructura de marco biocompatible comprende un polipeptido o porcion del mismo que es suficiente para formar un soporte estructural o marco, o armazon conformacionalmente estable, que es capaz de mostrar una o mas secuencias de aminoacidos que se unen a un antfgeno (p. ej., CDR, una region variable, etc.) en una region de la superficie localizada. Tales estructuras pueden ser un polipeptido o "plegamiento" de polipeptido de origen natural (un motivo estructural), o pueden tener una o mas modificaciones, tales como las adiciones, deleciones o sustituciones de aminoacidos, en relacion con un polipeptido de origen natural o plegamiento. Estos armazones pueden derivar de un polipeptido de cualquier especie (o de mas de una especie), tal como un ser humano, otro mairnfero, otro vertebrado, invertebrado, planta, bacteria o virus.

Tfpicamente, las estructuras de marco biocompatibles se basan en armazones o esqueletos proteicos diferentes de los dominios de inmunoglobulina. Por ejemplo, se pueden utilizar aquellos basados en fibronectina, anquirina, lipocalina, neocarzinostatina, citocromo b, dedo de zinc CP1, ST1, bobina enrollada, LACI-D1, dominio Zy dominios Tendamistat (Vease, p. ej., Nygren y Uhlen, 1997, Current Opinion in Structural Biology, 7, 463-469).

Adicionalmente, un experto en la tecnica reconocera que las protemas de union a antfgeno pueden incluir una o mas de las CDR1, CDR2, CDR3 de la cadena pesada, y/o CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera que tienen una sustitucion de un aminoacido, siempre que el anticuerpo conserve la especificidad de union de la CDR no sustituida. La porcion distinta de CDR del anticuerpo puede ser una molecula no proteica, en donde el agente de union bloquea de manera cruzada la union de un anticuerpo descrito en la presente memoria a LPET humana y/o inhibe la actividad de LPET. La porcion distinta de cDr del anticuerpo puede ser una molecula no proteica en la que el anticuerpo presenta un patron de union similar a las protemas LPET humanas en un analisis de union competitiva como el mostrado por al menos uno de los anticuerpos A1-A27, y/o neutraliza la actividad de LPET. La porcion distinta de CDR del anticuerpo puede estar compuesta por aminoacidos, en donde el anticuerpo es una protema de

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union recombinante o un peptido sintetico, y la protema de union recombinante bloquea de manera cruzada la union de un anticuerpo descrito en la presente memoria a LPET humana y/o neutraliza la LPET in vitro o in vivo. La porcion distinta de CDR del anticuerpo puede estar compuesta por aminoacidos, en donde el anticuerpo es un anticuerpo recombinante, y el anticuerpo recombinante muestra un patron de union similar a los polipeptidos LPET humanos en un analisis de union competitiva como muestra al menos uno de los anticuerpos A1-A27, y/o neutraliza la actividad de LPET.

Metodos de elaboracion de protemas de union a antfgeno, espedficamente anticuerpos.

Una protema de union a antigeno tal como un anticuerpo que comprende una o mas de CDR1, CDR2, CDR3 de la cadena pesada, y/o CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera como se describe anteriormente, se puede obtener por expresion a partir de una celula anfitriona que contiene ADN que codifica estas secuencias. Un ADN que codifica cada secuencia de CDR se puede determinar basandose en la secuencia de aminoacidos de la CDR y se puede sintetizar junto con cualquier marco region variable de un anticuerpo deseado y las secuencias de ADN de la region constante utilizando tecnicas de smtesis de oligonucleotidos, mutagenesis dirigida al sitio y reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), segun proceda. El ADN que codifica los marcos de la region variable y las regiones constantes esta ampliamente disponible para los expertos en la tecnica a partir de bases de datos de secuencias geneticas, tales como GenBank®.

Otras realizaciones incluyen anticuerpos quimericos, p. ej., versiones humanizadas de anticuerpos monoclonales no humanos (p. ej., murinos). Tales anticuerpos humanizados se pueden preparar mediante tecnicas conocidas, y ofrecen la ventaja de una inmunogenicidad reducida cuando los anticuerpos se administran a seres humanos. En una realizacion, un anticuerpo monoclonal humanizado comprende el dominio variable de un anticuerpo murino (o todo o parte del sitio de union a antfgeno del mismo) y un dominio constante derivado de un anticuerpo humano. Alternativamente, un fragmento de anticuerpo humanizado puede comprender el sitio de union a antfgeno de un anticuerpo monoclonal murino y un fragmento del dominio variable (que carece del sitio de union a antfgeno) derivado de un anticuerpo humano. Los procedimientos para la produccion de anticuerpos monoclonales quimericos y adicionalmente manipulados incluyen los descritos por Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323, Liu et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84: 3439, Larrick et al., 1989, Bio/Technology 7: 934 y Winter et al., 1993, TIPS 14: 139. En una realizacion, el anticuerpo quimerico es un anticuerpo injertado con CDR. Las tecnicas para la humanizacion de anticuerpos se discuten en, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Nums. 5.869.619, 5.225.539, 5.821.337, 5.859.205, 6.881.557, Padlan et al., 1995, FASEB J. 9: 133-39 y Tamura et al., 2000, J. Immunol. 164: 1432-41. Otras tecnicas para producir anticuerpos humanizados son las descritas por Zhang, W., et al., Molecular Immunology. 42(12): 1445-1451, 2005; Hwang W. et al., Methods. 36(1): 35-42, 2005; Dall'Acqua WF, et al., Methods 36(1): 43-60, 2005; y Clark, M., Immunology Today. 21(8): 397-402, 2000).

Se han desarrollado procedimientos para la generacion de anticuerpos humanos o parcialmente humanos en animales no humanos. Por ejemplo, se han preparado ratones en los que uno o mas genes de inmunoglobulina endogenos han sido inactivados por diversos medios. Los genes de inmunoglobulina humana se han introducido en los ratones para sustituir a los genes inactivados de raton. Los anticuerpos producidos en el animal incorporan cadenas de polipeptido de inmunoglobulina humana codificados por el material genetico humano introducido en el animal. En una realizacion, un animal no humano, tal como un raton transgenico, se inmuniza con la protema LPET, por ejemplo, de tal manera que se generan en el animal los anticuerpos dirigidos contra diversos polipeptidos LPET. Los ejemplos de los inmunogenos adecuados se proporcionan en los Ejemplos a continuacion.

Los ejemplos de las tecnicas para la produccion y utilizacion de animales transgenicos para la produccion de anticuerpos humanos o parcialmente humanos se describen en las Patentes de los Estados Unidos 5.814.318, 5.569.825 y 5.545.806, Davis et al., 2003, Production of human antibodies from transgenic mice en Lo, ed. Antibody Engineering: Methods and Protocols, Humana Press, NJ: 191-200, Kellermann et al., 2002, CurrOpin Biotechnol. 13: 593-97, Russel et al., 2000, Infect Immun. 68: 1820-26, Gallo et al., 2000, Eur J Immun. 30: 534-40, Davis et al., 1999, Cancer Metastasis Rev. 18: 421-25, Green, 1999, J Immunol Methods. 231: 11-23, Jakobovits de 1998, Advanced Drug Delivery Reviews 31: 33-42, Green et al., 1998, J Exp Med. 188: 483-95, Jakobovits A, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs. 7: 607-14, Tsuda et al., 1997, Genomics. 42: 413-21, Mendez et al., 1997, Nat Genet. 15: 14656, Jakobovits, 1994, Curr Biol. 4: 761-63, Arbones et al., 1994, Immunity. 1: 247-60, Green et al., 1994, Nat Genet. 7: 13-21, Jakobovits et al., 1993, Nature. 362: 255-58, Jakobovits et al., 1993, Proc Natl Acad Sci USA. 90: 255155. Chen, J., M. Trounstine, F. W. Alt, F. Young, C. Kurahara, J. Loring, D. Huszar. "Immunoglobulin gene rearrangement in B-cell deficient mice generated by targeted deletion of the JH locus". International Immunology 5 (1993): 647-656,. Choi et al, 1993, Nature Genetics 4: 117-23, Fishwild et al., 1996, Nature Biotechnology 14: 84551, Harding et al., 1995, Annals of the New York Academy of Sciences, Lonberg et al., 1994, Nature 368: 856-59, Lonberg 1994, Transgenic Approaches to Human Monoclonal Antibodies in Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101, Lonberg et al., 1995, Internal Review of Immunology 13: 65-93, Neuberger, 1996, Nature Biotechnology 14: 826,. Taylor et al., 1992, Nucleic Acids Research 20: 6287-95, Taylor et al., 1994, International Immunology 6: 579-91. Tomizuka et al., 1997, Nature Genetics 16: 133-43, Tomizuka et al., 2000, Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97: 722-27. Tuaillon et al., 1993, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 90: 3720-24, y Tuaillon et al., 1994, Journal of Immunology 152: 2912-20.

En otro aspecto, la presente invencion proporciona anticuerpos monoclonales que se unen a LPET humana. Los

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anticuerpos monoclonales se pueden producir usando cualquier mecanismo conocido en la tecnica, p. ej., inmortalizando las celulas de bazo recogidas del animal transgenico despues de la finalizacion del programa de inmunizacion. Las celulas del bazo se pueden inmortalizar utilizando cualquier mecanismo conocido en la tecnica, p. ej., fusionandolas con celulas de mieloma para producir hibridomas. Las celulas de mieloma para su uso en procedimientos de fusion que producen hibridoma preferiblemente son no productoras de anticuerpos, tienen una alta eficacia de fusion, y deficiencias enzimaticas que las hacen incapaces de crecer en ciertos medios selectivos que soportan el crecimiento solamente de las celulas fusionadas deseadas (hibridomas). Los ejemplos de las lmeas celulares adecuadas para su uso en fusiones de raton incluyen Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, SP210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 y S194/5XX0 Bul; los ejemplos de lmeas celulares utilizadas en fusiones de rata incluyen R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F y 4B210. Otras lmeas celulares utiles para las fusiones celulares son U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 y UC729-6.

En una realizacion, se produce una lmea de celulas de hibridoma mediante la inmunizacion de un animal (p. ej., un animal transgenico que tiene secuencias de inmunoglobulina humana) con un inmunogeno LPET; la recogida de celulas de bazo del animal inmunizado; la fusion de las celulas de bazo recogidas con una lmea celular de mieloma, generando de ese modo celulas de hibridoma; el establecimiento de lmeas celulares de hibridoma de las celulas de hibridoma, y la identificacion de una lmea celular de hibridoma que produce un anticuerpo que se une a un polipeptido LPET. Tales lmeas celulares de hibridoma, y los anticuerpos monoclonales de LPET producidos por ellas, estan incluidos en la presente invencion.

Los anticuerpos monoclonales secretados por una lmea celular de hibridoma se pueden purificar utilizando cualquier mecanismo conocido en la tecnica. Los hibridomas o mAbs pueden ser escrutados ademas para identificar mAbs con propiedades concretas, tales como el bloqueo de una actividad de LPET tal como la produccion de osteoprotegerina (OPG) a partir de celulas dendnticas humanas primarias. Ejemplos de tales analisis se proporcionan en los ejemplos a continuacion.

La evolucion molecular de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) en el centro del sitio de union del anticuerpo tambien se ha utilizado para aislar anticuerpos con una mayor afinidad, por ejemplo, como describe Schier et al., 1996, J. Mol. Biol. 263: 551. Por consiguiente, tales tecnicas son utiles en la preparacion de anticuerpos para LPET humana.

Las protemas de union a antfgenos dirigidas contra LPET humana se pueden utilizar, por ejemplo, en analisis para detectar la presencia de LPET ya sea in vitro o in vivo.

Aunque los anticuerpos humanos, parcialmente humanos o humanizados seran adecuados para muchas aplicaciones, concretamente las que implican la administracion del anticuerpo a un sujeto humano, otros tipos de protemas de union a antfgeno seran adecuadas para ciertas aplicaciones. Los anticuerpos no humanos pueden ser, por ejemplo, derivados de cualquier animal productor de anticuerpos, tal como raton, rata, conejo, cabra, burro, o primate no humano (tal como un mono (p. ej., cinomologo o mono rhesus) o simio (p. ej., chimpance)). Los anticuerpos no humanos se pueden utilizar, por ejemplo, en aplicaciones basadas en el cultivo celular e in vitro, o cualquier otra aplicacion en la que no se produce una respuesta inmunitaria al anticuerpo de la invencion, es insignificante, se puede prevenir, o no es una preocupacion, o no se desea. Un anticuerpo no humano se administra a un sujeto no humano. El anticuerpo no humano no provoca una respuesta inmunitaria en el sujeto no humano. El

anticuerpo no humano es de la misma especie que el sujeto no humano, p. ej., un anticuerpo de raton de la

invencion se administra a un raton. Un anticuerpo de una especie concreta se puede elaborar, por ejemplo, inmunizando un animal de esa especie con el inmunogeno deseado o utilizando un sistema artificial para la generacion de anticuerpos de la especie (p. ej., un sistema basado en la presentacion en bacterias o fagos para la

generacion de anticuerpos de una especie en particular), o mediante la conversion de un anticuerpo de una especie

en un anticuerpo de otra especie mediante el reemplazo, por ejemplo, de la region constante del anticuerpo por una region constante de la otra especie, o mediante el reemplazo de uno o mas residuos de aminoacido del anticuerpo de modo que se asemeje mas a la secuencia de un anticuerpo de la otra especie. En una realizacion, el anticuerpo es un anticuerpo quimerico que comprende las secuencias de aminoacidos derivadas de anticuerpos de dos o mas especies diferentes.

Las protemas de union a antfgeno se pueden preparar mediante cualquiera de una serie de tecnicas convencionales. Por ejemplo, se pueden purificar a partir de celulas que las expresan de forma natural (p. ej., un anticuerpo se puede purificar a partir de un hibridoma que la produce), o se pueden producir en sistemas de expresion recombinantes, utilizando cualquier mecanismo conocido en la tecnica. Vease, por ejemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al., (eds.), Plenum Press, Nueva York (1980); y Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988).

Se puede utilizar cualquier sistema de expresion conocido en la tecnica para elaborar los polipeptidos recombinantes de la invencion. En general, las celulas anfitrionas se transforman con un vector de expresion recombinante que comprende ADN que codifica un polipeptido deseado. Entre las celulas anfitrionas que se pueden emplear se encuentran celulas de procariotas, de levaduras o de eucariotas superiores. Los procariotas incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo E. coli o bacilos. Las celulas eucarioticas superiores incluyen celulas

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de insecto y lmeas celulares establecidas de origen mai^ero. Los ejemplos de las lmeas de celulas anfitrionas de mai^ero adecuadas incluyen la lmea COS-7 de celulas de rinon de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., 1981, Cell 23: 175), celulas L, celulas 293, celulas C127, celulas 3T3 (ATCC CCL 163), celulas de ovario de hamster chino (celulas ChO), celulas HeLa, lmeas celulares BHK (ATCC CRL 10), y la lmea celular CVI/EBNA derivada de la lmea celular de rinon de mono verde africano CVI (ATcC CCL 70) como describen McMahan et al., 1991, EMBO J. 10: 2821. Los vectores de clonacion y expresion apropiados para su uso con anfitriones celulares bacterianos, de hongos, levaduras y de mairnfero son descritos por Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, 1985).

Las celulas transformadas pueden ser cultivadas en condiciones que promueven la expresion del polipeptido, y el polipeptido puede ser recuperado mediante procedimientos de purificacion de protemas convencionales. Uno de tales procedimientos de purificacion se describe en los Ejemplos siguientes. Los polipeptidos contemplados para su uso en la presente memoria incluyen polipeptidos de anticuerpos anti-LPET de mamffero recombinantes sustancialmente homogeneos sustancialmente libres de materiales endogenos contaminantes.

Las protemas de union a antigeno se pueden preparar, y escrutar para determinar las propiedades deseadas, por cualquiera de una serie de tecnicas conocidas. Algunas de las tecnicas implican el aislamiento de un acido nucleico que codifica una cadena de polipeptido (o parte de la misma) de una protema de union a antfgeno de interes (p. ej., un anticuerpo de LPET), y la manipulacion del acido nucleico a traves de la tecnologfa del ADN recombinante. El acido nucleico puede fusionarse con otro acido nucleico de interes, o alterarse (p. ej., por medio de mutagenesis u otras tecnicas convencionales) para anadir, eliminar o sustituir uno o mas residuos de aminoacido, por ejemplo.

Los anticuerpos de cadena sencilla se pueden formar conectando fragmentos del dominio variable de la cadena pesada y ligera (region Fv) a traves de un puente de aminoacidos (conector peptfdico corto), dando como resultando una cadena polipeptfdica sencilla. Tales Fv de cadena sencilla (scFv) se han preparado mediante la fusion de ADN que codifica un conector peptfdico entre los ADN que codifican los dos polipeptidos del dominio variable (Vl y Vh). Los polipeptidos resultantes se pueden plegar sobre sf mismos para formar monomeros de union a antfgeno, o pueden formar multimeros (p. ej., dfmeros, tnmeros, o tetrameros), dependiendo de la longitud de un conector flexible entre los dos dominios variables (Kortt et al., 1997, Prot. Eng. 10: 423; Kortt et al., 2001, Biomol. Eng. 18: 95108). Mediante la combinacion de diferentes polipeptidos que comprenden Vl y Vh diferentes, se puede formar scFv multimericos que se unen a diferentes epftopos (Kriangkum et al., 2001, Biomol. Ing. 18: 31-40). Las tecnicas desarrolladas para la produccion de anticuerpos de cadena sencilla incluyen los descritos en la Patente de Estados Unidos Num. 4.946.778; Bird, 1988, Science 242: 423; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879; Ward et al., 1989, Nature 334: 544, de Graaf et al., 2002, Methods Mol Biol. 178: 379-87. Los anticuerpos de cadena sencilla derivados de anticuerpos proporcionados en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, los scFv que comprenden las combinaciones de dominios variables L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10, L11H11, L12H12, L13H13, L14H14, L15H15, L16H16, L17H17, L18H18, L19H19, L20H20, L21H21, L22H22, L23H23, L24H24, L25H25, L26H26, y L27H27 estan incluidos en la presente invencion.

Una vez sintetizado, el ADN que codifica un anticuerpo de la invencion o fragmento del mismo puede ser propagado y expresado de acuerdo con cualquiera de una variedad de procedimientos bien conocidos para la escision, ligacion, transformacion y transfeccion de acido nucleico utilizando cualquiera de los numerosos vectores de expresion conocidos. Por lo tanto, en ciertas realizaciones puede ser preferible la expresion de un fragmento de anticuerpo en un anfitrion procariota, tal como Escherichia coli (vease, p. ej., Pluckthun et al., 1989 Methods Enzymol. 178: 497515). En ciertas otras realizaciones, puede ser preferible la expresion del anticuerpo o un fragmento del mismo en una celula anfitriona eucariota, incluyendo levaduras (p. ej., Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, y Pichia pastoris), celulas animales (incluyendo celulas de mamffero) o celulas vegetales. Los ejemplos de celulas animales adecuadas incluyen, pero no se limitan a, celulas de mieloma (tal como una lmea NSO de raton), COS, CHO o de hibridoma. Los ejemplos de celulas vegetales incluyen celulas de tabaco, mafz, soja, y arroz. Se pueden preparar uno o mas vectores de expresion replicables que contienen ADN que codifica una variable de anticuerpo y/o una region constante y se pueden utilizar para transformar una lmea celular apropiada, por ejemplo, una lmea celular de mieloma no productora, tal como una lmea NSO de raton o una bacteria, tal como E. coli, en donde tendra lugar la produccion del anticuerpo. Con el fin de obtener una transcripcion y una traduccion eficaces, la secuencia de ADN en cada vector debe incluir secuencias reguladoras apropiadas, concretamente una secuencia promotora y lfder operativamente unida a la secuencia de dominio variable. Los metodos concretos para producir anticuerpos de esta manera son generalmente bien conocidos y se utilizan rutinariamente. Por ejemplo, los procedimientos basicos de la biologfa molecular son descritos por Maniatis et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1989; vease tambien Maniatis et al., 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, (2001)). La secuenciacion del ADN se puede realizar como describen Sanger et al. (PNAS 74: 5463, (1977)) y el Amersham International plc sequencing handbook, y la mutagenesis dirigida al sitio puede llevarse a cabo de acuerdo con los metodos conocidos en la tecnica (Kramer et al., Nucleic Acids Res. 12: 9441, (1984); Kunkel Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 488-92 (1985); Kunkel et al., Methods in Enzymol. 154: 367-82 (1987); el Anglian Biotechnology Ltd handbook). Ademas, numerosas publicaciones describen tecnicas adecuadas para la preparacion de anticuerpos por manipulacion de ADN, creacion de vectores de expresion, y transformacion y cultivo de celulas apropiadas (Mountain A y Adair, J R en Biotechnology and Genetic Engineering Reviews (ed. Tombs, M P, 10, Capftulo 1, 1992, Intercept, Andover, Reino Unido); "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed.), Wiley Interscience, Nueva York).

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Cuando se desea mejorar la afinidad de los anticuerpos de acuerdo con la invencion que contienen una o mas de las CDR anteriormente mencionadas, se pueden obtener por una serie de protocolos de maduracion de afinidad incluyendo el mantenimiento de las CDR (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), el barajado de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), la utilizacion de cepas con mutacion de E. coli. (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 350-368, 1996), el barajado de ADN (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), la presentacion en fagos (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 7-88, 1996) y la PCR (Crameri, et al., Nature, 391, 288291, 1998). Todos estos metodos de maduracion de afinidad son analizados por Vaughan et al. (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998).

Otros anticuerpos de acuerdo con la invencion se pueden obtener mediante procedimientos de inmunizacion y fusion celular convencionales como se describe en la presente memoria y conocidos en la tecnica. Los anticuerpos monoclonales de la invencion pueden ser generados utilizando una variedad de tecnicas conocidas. En general, los anticuerpos monoclonales que se unen a antigenos espedficos pueden ser obtenidos por metodos conocidos por los expertos en la tecnica (vease, por ejemplo, Kohler et al., Nature 256: 495, 1975; Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, 1:2.5.12.6.7 (John Wiley & Sons 1991); Patentes de Estados Unidos Nums.. RE 32.011, 4.902614, 4,.543.439 y 4.411.993; Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn, y Bechtol (eds.) (1980); y Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Picksley et al., "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli," en DNA Cloning 2:. Expression Systems, 2a edicion, Glover et al. (eds.), pagina 93 (Oxford University Press 1995)). Los fragmentos de anticuerpos pueden derivar de los mismos usando cualquier tecnica estandar adecuada, tal como la digestion proteolttica u, opcionalmente, mediante digestion proteolttica (por ejemplo, utilizando papama o pepsina), seguido de reduccion suave de los enlaces disulfuro y alquilacion. Alternativamente, dichos fragmentos tambien pueden generarse mediante tecnicas de ingeniena genetica recombinantes como se describe en la presente memoria.

Los anticuerpos monoclonales se pueden obtener mediante inyeccion en un animal, por ejemplo, una rata, un hamster, un conejo, o preferiblemente un raton, incluyendo por ejemplo uno transgenico o uno con un gen desactivado, como se conoce en la tecnica, con un inmunogeno que comprende LPET humana de SEQ ID NO: 2, otras secuencias de polipeptidos de LPET, como se describe en la presente memoria, o un fragmento de las mismas, de acuerdo con metodos conocidos en la tecnica y descritos en la presente memoria. La presencia de produccion de anticuerpos espedficos se puede controlar despues de la inyeccion inicial y/o despues de una inyeccion de refuerzo mediante la obtencion de una muestra de suero y la deteccion de la presencia de un anticuerpo que se une a LPET humana o un fragmento de la misma utilizando cualquiera de varios metodos de inmunodeteccion conocidos en la tecnica y descritos en la presente memoria. De los animales que producen los anticuerpos deseados, se retiran las celulas linfoides, mas comunmente las celulas de los ganglios linfaticos o del bazo, para obtener linfocitos B. Los linfocitos B se fusionan con un companero de fusion de celulas de mieloma sensibilizado a farmacos, preferiblemente uno que sea singenico con el animal inmunizado y que, opcionalmente, tenga otras propiedades deseables (p. ej., incapacidad para expresar productos de genes de Ig endogenos, p. ej., P3X63 - Ag 8.653 (ATCC No. CRL 1580); NSO, SP20) para producir hibridomas, que son lmeas celulares eucariotas inmortales.

Loas celulas linfoides (p. ej., bazo) y las celulas de mieloma se pueden combinar durante unos pocos minutos con un agente promotor de la fusion de membranas, tal como polietilenglicol o un detergente no ionico, y despues se cultivan en placa a baja densidad en un medio selectivo que apoya el crecimiento de celulas de hibridoma, pero no de las celulas de mieloma no fusionadas. Un medio de seleccion preferido es HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Despues de un tiempo suficiente, por lo general alrededor de una a dos semanas se observan las colonias de celulas. Las colonias individuales se aislan, y los anticuerpos producidos por las celulas se pueden someter a ensayo para determinar la actividad de union a LPET humana utilizando uno cualquiera de una variedad de inmunoanalisis conocidos en la tecnica y descritos en la presente memoria. Los hibridomas se clonan (p. ej., mediante clonacion por dilucion limitada o por aislamiento en placa de agar blando) y los clones positivos que producen un anticuerpo espedfico para LPET humana se seleccionan y se cultivan. Los anticuerpos monoclonales de los cultivos de hibridoma se pueden aislar de los sobrenadantes de cultivos de hibridomas.

Un metodo alternativo para la produccion de un anticuerpo monoclonal murino consiste en inyectar las celulas de hibridoma en la cavidad peritoneal de un raton singenico, por ejemplo, un raton que se ha tratado (p. ej., cebado con pristano) para promover la formacion de fluido de ascitis que contiene el anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales pueden ser aislados y purificados mediante una variedad de tecnicas bien establecidas. Tales tecnicas de aislamiento incluyen cromatograffa de afinidad con Protema-A Sepharose, cromatograffa de exclusion por tamano, y cromatograffa de intercambio ionico (vease, por ejemplo, Coligan en las paginas 2.7.1-2.7.12 y las paginas 2.9.1-2.9.3; Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)", en Methods in Molecular Biology, Vol. 10, paginas 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)). Los anticuerpos monoclonales pueden ser purificados por medio de cromatograffa de afinidad utilizando un ligando apropiado seleccionado basandose en las propiedades particulares del anticuerpo (p. ej., isotipo de cadena pesada o ligera, especificidad de union, etc.). Los ejemplos de un ligando adecuado, inmovilizado sobre un soporte solido, incluyen protema A, protema G, un anticuerpo antiregion constante (cadena ligera o cadena pesada), un anticuerpo anti-idiotipo, y LPET, o un fragmento o variante de la misma.

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Un anticuerpo de la presente invencion tambien puede ser un anticuerpo monoclonal completamente humano. Los anticuerpos monoclonales completamente humanos pueden ser generados por cualquiera de las numerosas tecnicas descritas anteriormente. Tales metodos incluyen adicionalmente, pero no se limitan a transformacion con Virus Epstein Barr (EBV) de celulas de sangre periferica humana (p. ej., que contiene linfocitos B), inmunizacion in vitro de celulas B humanas, fusion de celulas de bazo de ratones transgenicos inmunizados que portan genes de inmunoglobulina humana insertados, aislamiento a partir de bibliotecas en fagos de la region V de inmunoglobulina humana, u otros procedimientos como se conocen en la tecnica y basados en la descripcion de la presente memoria. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales completamente humanos se pueden obtener a partir de ratones transgenicos que han sido manipulados para producir anticuerpos humanos espedficos en respuesta a una sensibilizacion antigenica. Se describen metodos para obtener anticuerpos completamente humanos a partir de ratones transgenicos, por ejemplo, en Green et al., Nature Genet. 7: 13, 1994; Lonberg et al., Nature 368: 856, 1994; Taylor et al., Int. Immun. 6: 579, 1994; Patente de Estados Unidos Num. 5.877.397; Bruggemann et al., 1997 Curr. Opin. Biotechnol. 8: 455-58; Jakobovits et al., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764: 525-35. En esta tecnica, los elementos del locus de la cadena pesada y ligera humana se introducen en cepas de ratones derivadas de lmeas de celulas madre embrionarias que contienen interrupciones espedficas de los loci de la cadena pesada y la cadena ligera endogenas (vease tambien Bruggemann et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8: 455-58 (1997)). Por ejemplo, los transgenes de inmunoglobulina humana pueden ser constructos de mini-genes, o transloci en cromosomas artificiales de levadura, que se someten a reordenamiento de ADN espedfico de las celulas B e hipermutacion en el tejido linfoide de raton. Los anticuerpos monoclonales completamente humanos se pueden obtener mediante la inmunizacion de los ratones transgenicos, que pueden producir a continuacion anticuerpos humanos espedficos para LPET humana. Las celulas linfoides de los ratones transgenicos inmunizados se pueden utilizar para producir hibridomas que secretan anticuerpos humanos de acuerdo con los metodos descritos en la presente memoria. Los sueros policlonales que contienen los anticuerpos completamente humanos tambien se puede obtener a partir de la sangre de los animales inmunizados.

Un metodo ilustrativo para la generacion de anticuerpos humanos de la invencion incluye la inmortalizacion de celulas de sangre periferica humana mediante transformacion con EBV, como se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Num. 4.464.456. Dicha lmea de celulas B inmortalizada (o lmea de celulas linfoblastoides) que produce un anticuerpo monoclonal que se une espedficamente a LPET humana se puede identificar por metodos de inmunodeteccion como los proporcionados en la presente memoria, por ejemplo, un ELISA, y despues se puede aislar mediante tecnicas de clonacion convencionales. La estabilidad de la lmea celular linfoblastoide que produce un anticuerpo anti-LPET puede ser mejorada mediante la fusion de la lmea celular transformada con un mieloma murino para producir una lmea celular hubrida de raton-humano de acuerdo con los metodos conocidos en la tecnica (vease, p. ej., Glasky et al, Hybridoma 8: 377-89 (1989)). Otro metodo mas para generar anticuerpos monoclonales humanos es la inmunizacion in vitro, que incluye el cebado de celulas B esplenicas humanas con LPET humana seguido de la fusion de las celulas B cebadas con un companero de fusion heterohubrido. Vease, p. ej., Boerner et al., 1991 J. Immunol. 147: 86-95.

En deltas realizaciones, se selecciona una celula B que esta produciendo un anticuerpo anti-LPET humana y se clonan las regiones variables de la cadena ligera y la cadena pesada a partir de la celula B de acuerdo con los mecanismos de la biologfa molecular conocidos en la tecnica (documento WO 92/02551; Patente de los Estados Unidos 5.627.052; Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 7843-48 (1996)) y descritos en la presente memoria. Las celulas B de un animal inmunizado se pueden aislar del bazo, de ganglio linfatico, o de muestras de sangre periferica mediante la seleccion de una celula que esta produciendo un anticuerpo que se une espedficamente a LPET. Las celulas B tambien se pueden aislar de seres humanos, por ejemplo, de una muestra de sangre periferica. Los metodos para detectar celulas B individuales que estan produciendo un anticuerpo con la especificidad deseada son bien conocidos en la tecnica, por ejemplo, por la formacion de placa, clasificacion de celulas activadas por fluorescencia, estimulacion in vitro seguido por la deteccion de anticuerpos espedficos, y similares. Los metodos para la seleccion de celulas B productoras de anticuerpos espedficos incluyen, por ejemplo, la preparacion de una suspension de celulas individuales de celulas B en agar blando que contiene LPET humana. La union del anticuerpo espedfico producido por la celula B al antfgeno da como resultado la formacion de un complejo, que puede ser visible como un inmunoprecipitado. Despues se seleccionan las celulas B que producen el anticuerpo deseado, los genes de anticuerpos espedficos se pueden clonar mediante el aislamiento y amplificacion de ADN o ARNm de acuerdo con metodos conocidos en la tecnica y descritos en la presente memoria.

Un metodo adicional para la obtencion de anticuerpos de la invencion es mediante presentacion en fagos. Vease, p. ej., Winter et al., 1994 Annu. Rev. Immunol. 12: 433-55; Burton et al., 1994 Adv. Immunol. 57: 191-280. Se pueden crear bibliotecas combinatorias de genes de la region variable de inmunoglobulina humana o murina en vectores de fago que pueden ser escrutados para seleccionar fragmentos de Ig (Fab, Fv, sFv o multimeros de los mismos) que se unen espedficamente a LPET o una variante o fragmento de la misma. Vease, p. ej., la Patente de Estados Unidos Num. 5.223.409;. Huse et al., 1989 Science 246: 1275-1281; Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5728-32 (1989); Alting-Mees et al., Strategys in Molecular Biology 3: 1-9 (1990); Kang et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4363-66; Hoogenboom et al., 1992 J. Molec. Biol. 227: 381-388; Schlebusch et al., 1997 Hybridoma 16: 47-52 y las referencias citadas en el mismo. Por ejemplo, una biblioteca que contiene una pluralidad de secuencias de polinucleotidos que codifican fragmentos de la region variable de Ig se puede insertar en el genoma de un bacteriofago filamentoso, tal como M13 o una variante del mismo, en marco con la secuencia que codifica una

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protema de la cubierta del fago. Una protema de fusion puede ser una fusion de la protema de la cubierta con el dominio de la region variable de cadena ligera y/o con el dominio de la region variable de cadena pesada. De acuerdo con ciertas realizaciones, los fragmentos Fab de inmunoglobulina tambien se pueden presentar en una partmula de fago (vease, p. ej., la Patente de Estados Unidos Num. 5.698.426).

Tambien se pueden preparar bibliotecas de expresion de ADNc de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera en el fago lambda, por ejemplo, utilizando los vectores AlmmunoZap™ (H) y AlmmunoZap™ (L) (Stratagene, La Jolla, California). Brevemente, el ARNm se afsla de una poblacion de celulas B, y se utiliza para crear bibliotecas de expresion de ADNc de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera en los vectores AlmmunoZap (H) y AlmmunoZap (L). Estos vectores se pueden escrutar individualmente o expresar simultaneamente para formar fragmentos Fab o anticuerpos (vease Huse et al, mas arriba; vease tambien Sastry et al., mas arriba). Las placas positivas se pueden convertir posteriormente en un plasmido no lftico que permita un elevado nivel de expresion de fragmentos de anticuerpos monoclonales a partir de E. coli.

En una realizacion, en un hibridoma las regiones variables de un gen que expresa un anticuerpo monoclonal de interes se amplifican utilizando cebadores de nucleotidos. Estos cebadores pueden ser sintetizados por un experto normal en la tecnica, o se pueden comprar de fuentes disponibles comercialmente. (Vease, p. ej., Stratagene (La Jolla, California), que vende cebadores para regiones variables de raton y humanas incluyendo, entre otros, los cebadores para las regiones VHa, VHb, Vhc, VHd, Chi, Vl y Cl) Estos cebadores se pueden utilizar para amplificar

regiones variables de cadena pesada o ligera, que pueden ser insertadas a continuacion en vectores tales como ImmunoZAP™ H o ImmunoZAP™ L (Stratagene), respectivamente. Estos vectores se pueden introducir a continuacion en E. coli, levadura, o sistemas basados en mamferos para su expresion. Se pueden producir grandes cantidades de una protema de cadena sencilla que contienen una fusion de los dominios Vh y Vl utilizando estos metodos (vease Bird et al., Science 242: 423-426, 1988).

Una vez que se han obtenido las celulas productoras de anticuerpos de acuerdo con la invencion utilizando cualquiera de las tecnicas de inmunizacion descritas anteriormente y otras tecnicas, los genes de anticuerpos espedficos se pueden clonar mediante el aislamiento y amplificacion de ADN o ARNm de los mismos de acuerdo con procedimientos convencionales descritos en la presente memoria. Los anticuerpos producidos a partir de los mismos pueden ser secuenciados y las CDR identificadas y el ADN que codifica las cDr puede ser manipulado como se ha descrito anteriormente para generar otros anticuerpos de acuerdo con la invencion.

Los anticuerpos humanos anti-LPET de la presente invencion preferiblemente modulan la actividad de LPET en uno de los analisis basados en celulas descritos en la presente memoria y/o el analisis in vivo descrito en la presente memoria y/o el bloqueo cruzado de la union de uno de los anticuerpos descritos en esta solicitud y/o bloquean de manera cruzada la union de LPET por uno de los anticuerpos descritos en esta solicitud. Son particularmente utiles las protemas de union a antfgeno que compiten de manera cruzada con un anticuerpo ilustrativo descrito en la presente memoria, es decir, bloquean de manera cruzada la union de uno de los anticuerpos ilustrativos descritos en esta solicitud y la union de LPET resulta bloqueada de manera cruzada por uno de los anticuerpos ilustrativos. Por consiguiente se pueden identificar tales agentes de union utilizando los analisis descritos en la presente memoria.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos se generan identificando primero los anticuerpos que se unen a LPET y/o la neutralizan en los analisis basados en celulas descritos en la presente memoria y/o bloquean de manera cruzada los anticuerpos descritos en esta solicitud y/o se bloquean de manera cruzada la union de LPET por uno de los anticuerpos descritos en esta solicitud. Las regiones CDR de estos anticuerpos se utilizan a continuacion para la insercion en marcos biocompatibles apropiados para generar protemas de union a antfgeno. La porcion distinta de CDR del agente de union puede estar compuesta por aminoacidos, o puede ser una molecula no proteica. Los analisis descritos en la presente memoria permiten la caracterizacion de agentes de union. Preferiblemente, los agentes de union de la presente invencion son anticuerpos como los definidos en la presente memoria.

Los anticuerpos humanos anti-LPET de la presente invencion incluyen aquellas que se unen al mismo epftopo que un anticuerpo ilustrativo descrito en la presente memoria. Como se comenta en el Ejemplo 9, los epftopos pueden ser estructurales o funcionales. Los epftopos estructurales pueden ser considerados como el parche de la diana que esta cubierto por el anticuerpo. Los epftopos funcionales son un subconjunto de los epftopos estructurales y comprenden aquellos residuos que contribuyen directamente a la afinidad de la interaccion (p. ej., enlaces de hidrogeno, interacciones ionicas). Un metodo para determinar el epftopo de un anticuerpo consiste en la utilizacion de mutaciones de barrido en la molecula diana y la medicion del efecto de la mutacion sobre la union. Dada la estructura tridimensional de la region de union del anticuerpo, las mutaciones en el epftopo pueden disminuir o aumentar la afinidad de union del anticuerpo por la diana mutada.

Las protemas de union a antfgeno se pueden definir por sus epftopos. Como se observa en la Tabla 6, aunque los anticuerpos pueden unirse todos a LPET, se ven afectados de manera diferente por la mutacion de determinados residuos en LPET, una indicacion de que sus respectivos epftopos no se solapan completamente. Las protemas de union a antfgeno preferidas incluyen aquellas que comparten al menos una porcion del epftopo estructural de un anticuerpo de referencia descrito en la presente memoria.

Por ejemplo, una protema de union a antfgeno preferida es una que comparte al menos una porcion del mismo

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epftopo estructural que A2. Esto se evidencia por un aumento de la afinidad de union en comparacion con LPET de tipo salvaje cuando LPET tiene una mutacion K67E, K97E, K98E, R100E, K101E, o K103E. Esto tambien puede ser evidenciado por una disminucion de la afinidad de union en comparacion con LPET de tipo salvaje cuando LPET tiene una mutacion K21E, T25R, S28R, S64R, o K73E. Aunque la protema de union a antfgeno y A2 pueden resultar afectados de manera similar por algunas mutaciones y no por otras, cuanto mayor identidad hay entre la protema de union a antfgeno y A2 sobre el efecto de las mutaciones en ciertos residuos de LPET, mas comparten la protema de union a antfgeno y el anticuerpo de referencia un epftopo estructural.

Otra protema de union a antfgeno preferida es una que comparte al menos una porcion del mismo epftopo estructural que A4. Esto se evidencia por un aumento de la afinidad de union en comparacion con LPET de tipo salvaje cuando LPET tiene la mutacion K97E, K98E, R100E, K101E, o K103E. Esto tambien puede ser evidenciado por una disminucion de la afinidad de union en comparacion con LPET de tipo salvaje cuando LPET tiene la mutacion K10E, A14R, K21 E, D22R, K73E, K75E, o A76R.

Otra protema de union a antfgeno preferido es una que comparte al menos una porcion del mismo epftopo estructural que A5. Esto se evidencia por una disminucion en la afinidad de union en comparacion con LPET de tipo salvaje cuando LPET tiene la mutacion K12E, D22R, S40R, R122E, N124E, R125E, o K129E.

Otra protema de union a antfgeno preferida es una que comparte al menos una porcion del mismo epftopo estructural que A6. Esto se evidencia por una disminucion en la afinidad de union en comparacion con LPET de tipo salvaje cuando LPET tiene la mutacion S40R, S42R, H46R, R122E, o K129E.

Otra protema de union a antfgeno preferida es una que comparte al menos una porcion del mismo epftopo estructural que A7. Esto se evidencia por un aumento de la afinidad de union en comparacion con LPET de tipo salvaje cuando LPET tiene una mutacion K101E. Esto tambien puede ser evidenciado por una disminucion de la afinidad de union en comparacion con LPET de tipo salvaje cuando LPET tiene una mutacion D2R, T4R, D7R, S42R, H46R, T49R, E50R, Q112R, R122E, R125E o K129E.

Otra protema de union a antfgeno preferida es una que comparte al menos una porcion del mismo epftopo estructural que A10. Esto se evidencia por un aumento de la afinidad de union en comparacion con LPET de tipo salvaje cuando LPET tiene una mutacion K97E, K98E, R100E, K101E, o K103E. Esto tambien puede ser evidenciado por una disminucion de la afinidad de union en comparacion con LPET de tipo salvaje LPET cuando LPET tiene la mutacion N5R, S17R, T18R, K21E, D22R, T25R, T33R, H46R, A63R, S64R, A66R, E68R, K73E, K75E , A76R, A92R, T93R, Q94R, o A95R.

Otra protema de union a antfgeno preferida es una que comparte al menos una porcion del mismo epftopo estructural que A21. Esto se evidencia por un aumento de la afinidad de union en comparacion con LPET de tipo salvaje cuando LPET tiene una mutacion K97E, K98E, R100E, K101E, o K103E. Esto tambien puede ser evidenciado por una disminucion de la afinidad de union en comparacion con LPET de tipo salvaje cuando LPET tiene una mutacion K21E, K21R, D22R, T25R, T33R, S64R, K73E, K75E, E111R, o S114R.

Otra protema de union a antfgeno preferida es una que comparte al menos una porcion del mismo epftopo estructural que A23. Esto se evidencia por un aumento de la afinidad de union en comparacion con LPET de tipo salvaje cuando LPET tiene una mutacion K67E, K97E, K98E, R100E, K101E, o K103E. Esto tambien puede ser evidenciado por una disminucion de la afinidad de union en comparacion con LPET de tipo salvaje cuando LPET tiene la mutacion E9R, K10E, K12E, A13R, S17R, S20R, K21E, K21R, K73E, K75E, N124E, o R125E.

Otra protema de union a antfgeno preferida es una que comparte al menos una porcion del mismo epftopo estructural que A26. Esto se evidencia por un aumento de la afinidad de union en comparacion con LPET de tipo salvaje cuando LPET tiene una mutacion K97E, K98E, R100E, K101E, o K103E. Esto tambien puede ser evidenciado por una disminucion de la afinidad de union en comparacion con LPET de tipo salvaje cuando LPET tiene una mutacion A14R, K21E, D22R, A63R, S64R, K67E, K73E, A76R, A92R, o A95R.

La comparacion de las mutaciones que afectan a la union entre el anticuerpo, sugiere que ciertos residuos de LPET tienden a ser parte de la capacidad de los anticuerpos para unirse a LPET y bloquear la actividad de LPET. Tales residuos incluyen K21, D22, K73 y K129. Por lo tanto, la protema de union a antfgeno preferida incluye aquellas que tienen una mayor afinidad por LPET de tipo salvaje que por una LPET que comprende la mutacion K2lE, aquellas que tienen una mayor afinidad por LPET de tipo salvaje LPET que por una LPET que comprende la mutacion D21 R, aquellas que tienen una mayor afinidad por LPET de tipo salvaje que por una LPET que comprende la mutacion K73E, y aquellas que tienen una mayor afinidad por LPET de tipo salvaje que por una LPET que comprende la mutacion K129E.

Ademas, muchas de las protemas de union a antfgeno ilustrativas descritas en la presente memoria comparten el atributo de que la afinidad para LPET aumenta cuando el parche alcalino de aminoacidos en las posiciones 97-103 se cambia a aminoacidos acidos.

Acidos nucleicos

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En un aspecto, la presente invencion proporciona moleculas de acido nucleico aisladas. Los acidos nucleicos comprenden, por ejemplo, los polinucleotidos que codifican toda o parte de una protema de union al antigeno, por ejemplo, una o ambas cadenas de un anticuerpo de la invencion, o un fragmento, derivado, mutema, o variante de las mismas, polinucleotidos suficientes para su uso como sondas de hibridacion, cebadores de PCR o cebadores de secuenciacion para identificar, analizar, mutar o amplificar un polinucleotido que codifica un polipeptido, acidos nucleicos antisentido para inhibir la expresion de un polinucleotido, y secuencias complementarias de los anteriores. Los acidos nucleicos pueden tener cualquier longitud. Pueden tener, por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1.000, 1.500, 3.000, 5.000 o mas nucleotidos de longitud, y/o pueden comprender una o mas secuencias adicionales, por ejemplo, secuencias reguladoras, y/o pueden ser parte de un acido nucleico mas grande, por ejemplo, un vector. Los acidos nucleicos pueden ser de hebra sencilla o de doble hebra y pueden comprender nucleotidos de ARN y/o los nucleotidos del ADN, y variantes artificiales de los mismos (p. ej., acidos peptidonucleicos).

Los acidos nucleicos que codifican polipeptidos de anticuerpo (p. ej., cadena pesada o ligera, dominio variable solamente, o de longitud completa) se pueden aislar de las celulas B de ratones que han sido inmunizados con un antigeno LPET. El acido nucleico puede ser aislado por procedimientos convencionales tales como la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR).

Las secuencias de acido nucleico que codifican las regiones variables de las regiones variables de cadena pesada y ligera se han mostrado anteriormente. El experto en la tecnica apreciara que, debido a la degeneracion del codigo genetico, cada una de las secuencias de polipeptidos descritas en la presente memoria esta codificada por un gran numero de otras secuencias de acidos nucleicos. La presente invencion proporciona cada secuencia de nucleotidos degenerada que codifica cada protema de union a antfgeno de la invencion.

La invencion proporciona adicionalmente acidos nucleicos que hibridan con otros acidos nucleicos (p. ej., acidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleotidos de cualquiera de A1-A27) en condiciones de hibridacion concretas. Los metodos para la hibridacion de acidos nucleicos son bien conocidos en la tecnica. Veanse, p. ej., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Como se define en la presente memoria, una condicion de hibridacion moderadamente rigurosa utiliza una solucion de prelavado que contiene 5X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC), SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0), tampon de hibridacion de formamida a aproximadamente 50%, 6X SSC, y una temperatura de hibridacion de 55°C (u otras soluciones de hibridacion similares, tales como una que contiene formamida a aproximadamente 50%, con una temperatura de hibridacion de 42°C), y unas condiciones de lavado de 60°C, en 0,5X SSC, SDS al 0,1%. Unas condiciones de hibridacion rigurosas son 6X SSC a 45°C, seguido de uno o mas lavados en 0,1X SSC, SDS al 0,2% a 68°C. Ademas, un experto en la tecnica puede manipular las condiciones de hibridacion y/o lavado para aumentar o disminuir el rigor de hibridacion de manera que los acidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleotidos que son identicas entre sf en al menos 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 o 99% permanecen tfpicamente hibridadas entre sf. Los parametros basicos que afectan a la eleccion de las condiciones de hibridacion y la orientacion para idear condiciones adecuadas se exponen, por ejemplo, en Sambrook, Fritsch, y Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., capttulos 9 y 11; y en Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., Eds., John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.10 y 6.3 a 6.4), y pueden ser facilmente determinados por los expertos en la tecnica basandose, por ejemplo, en la longitud y/o composicion de bases del ADN.

Se pueden introducir cambios por medio de mutacion en un acido nucleico, lo que conduce a cambios en la secuencia de aminoacidos del polipeptido (p. ej., una protema de union a antfgeno) que codifica. Las mutaciones pueden introducirse usando cualquier mecanismo conocido en la tecnica. En una realizacion, se cambian uno o mas residuos de aminoacidos concretos utilizando, por ejemplo, un protocolo de mutagenesis dirigida al sitio. En otra realizacion, uno o mas residuos seleccionados aleatoriamente se cambian utilizando, por ejemplo, un protocolo de mutagenesis al azar. Se realice como se realice, un polipeptido mutante puede ser expresado y escrutado para determinar una propiedad deseada.

Se pueden introducir mutaciones en un acido nucleico sin alterar significativamente la actividad biologica del polipeptido que codifica. Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones de nucleotidos que conducen a sustituciones de aminoacidos en residuos de aminoacidos no esenciales. Una secuencia de nucleotidos proporcionada en la presente memoria para A1-A27, o un fragmento, variante, o derivado deseado de la misma, se muta de tal manera que codifica una secuencia de aminoacidos que comprende una o mas deleciones o sustituciones de residuos de aminoacidos que se muestran en la presente memoria para que A1-A27 sean los residuos en los que dos o mas secuencias difieren. La mutagenesis inserta un aminoacido adyacente a uno o mas residuos de aminoacido que se muestran en la presente memoria para que A1-A27 sean los residuos en los que se diferencian dos o mas secuencias. Alternativamente, se pueden introducir una o mas mutaciones en un acido nucleico que cambian selectivamente la actividad biologica (p. ej., la union a LPET) del polipeptido que codifica. Por ejemplo, la mutacion puede cambiar cuantitativamente o cualitativamente la actividad biologica. Los ejemplos de los cambios cuantitativos incluyen el aumento, reduccion o eliminacion de la actividad. Los ejemplos de cambios cualitativos incluyen el cambio de la especificidad por el antfgeno de una protema de union a antfgeno.

En otro aspecto, la presente invencion proporciona moleculas de acido nucleico que son adecuadas para su uso

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como cebadores o sondas de hibridacion para la deteccion de secuencias de acido nucleico de la invencion. Una molecula de acido nucleico de la invencion puede comprender solo una porcion de una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido completo de la invencion, por ejemplo, un fragmento que puede utilizarse como sonda o cebador o un fragmento que codifica una porcion activa (p. ej., una porcion de union a LPET) de un polipeptido de la invencion.

Las sondas basadas en la secuencia de un acido nucleico de la invencion se pueden utilizar para detectar el acido nucleico o acidos nucleicos similares, por ejemplo, transcritos que codifican un polipeptido de la invencion. La sonda puede comprender un grupo marcador, p. ej., un radioisotopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un cofactor enzimatico. Tales sondas se pueden utilizar para identificar una celula que expresa el polipeptido.

En otro aspecto, la presente invencion proporciona vectores que comprenden un acido nucleico que codifica un polipeptido de la invencion o una porcion del mismo. Los ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a, plasmidos, vectores virales, vectores no episomales de mairnfero y vectores de expresion, por ejemplo, vectores de expresion recombinantes.

Los vectores de expresion recombinantes de la invencion pueden comprender un acido nucleico de la invencion en una forma adecuada para la expresion del acido nucleico en una celula anfitriona. Los vectores de expresion recombinantes incluyen una o mas secuencias reguladoras, seleccionadas basandose en las celulas anfitrionas que se van a utilizar para la expresion, que estan unidas operativamente a la secuencia de acido nucleico que se va a expresar. Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresion constitutiva de una secuencia de nucleotidos en muchos tipos de celulas anfitrionas (p. ej. potenciador del gen temprano de SV40, promotor del virus del sarcoma de Rous y promotor de citomegalovirus), aquellas que dirigen la expresion de la secuencia de nucleotidos solo en ciertas celulas anfitrionas (p. ej., secuencias reguladoras espedficas de tejidos, vease Voss et al., 1986, Trends Biochem. Sci. 11: 287, Maniatis et al., 1987, Science 236: 1237, y aquellas que dirigen la expresion inducible de una secuencia de nucleotidos en respuesta a un tratamiento o estado concretos (p. ej., el promotor de metalotioneina en celulas de marnffero y el promotor sensible a tet y/o estreptomicina en sistemas tanto procarioticos como eucarioticos (vease, id.). Los expertos en la tecnica apreciaran que el diseno del vector de expresion puede depender de factores tales como la eleccion de la celula anfitriona a transformar, el nivel de expresion de protema deseado, etc. Los vectores de expresion de la invencion se pueden introducir en celulas anfitrionas para producir de ese modo protemas o peptidos, incluyendo protemas o peptidos de fusion, codificados por acidos nucleicos como los descritos en la presente memoria.

En otro aspecto, la presente invencion proporciona celulas anfitrionas en las cuales se ha introducido un vector de expresion recombinante de la invencion. Una celula anfitriona puede ser cualquier celula procariotica (por ejemplo, E. coli) o celula eucariotica (por ejemplo, celulas de levaduras, insectos, o mamfferos (p. ej., celulas CHO)). El ADN del vector puede introducirse en celulas procarioticas o eucarioticas mediante tecnicas de transformacion o transfeccion convencionales. Para la transfeccion estable de celulas de mamffero, se sabe que, dependiendo del vector de expresion y de la tecnica de transfeccion utilizada, solo una pequena fraccion de las celulas puede integrar el ADN foraneo en su genoma. Con el fin de identificar y seleccionar estos integrantes, se introduce generalmente en las celulas anfitrionas un gen que codifica un marcador seleccionable (p. ej., para la resistencia a antibioticos) junto con el gen de interes. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a farmacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. Las celulas transfectadas de forma estable con el acido nucleico introducido pueden identificarse por medio de seleccion de farmacos (p. ej., las celulas que hayan incorporado el gen marcador seleccionable sobreviviran, mientras que las otras celulas moriran), entre otros metodos.

Indicaciones

La LPET esta involucrada en la promocion de diversos trastornos inflamatorios, en particular trastornos inflamatorios alergicos. Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "inflamacion alergica" se refiere a las manifestaciones de respuestas inmunologicas relacionadas con la inmunoglobulina E (IgE). (Manual of Alergy and Immunology, Capftuio 2, Alvin M. Sanico, Bruce S. Bochner, y Sarbjit S. Saini, Adelman et al., ed., Lippincott, Williams, Wilkins, Filadelfia, PA, (2002)). La inflamacion alergica segun se utiliza en la presente memoria se caracteriza generalmente por la infiltracion en el tejido afectado de las celulas T coadyuvantes de tipo 2 (celulas Th2) (Kay, mas arriba). La inflamacion alergica incluye las enfermedades inflamatorias pulmonares tales como rinosinusitis alergica, asma, conjuntivitis alergica, ademas de las condiciones inflamatorias de la piel tales como la dermatitis atopica (Manual of Alergy and Immunology, mas arriba). Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "inflamacion alergica relacionada con LPET" se refiere a las condiciones de inflamacion alergica en las que la LPET esta regulada al alza, o se demuestra que esta esta implicada de otra manera.

El asma alergica es un trastorno inflamatorio cronico de las vfas respiratorias caracterizado por eosinofilia de las vfas respiratorias, altos niveles de IgE en suero y activacion de los mastocitos, que contribuyen a la hiperreactividad de las vfas respiratorias, el dano epitelial y la hipersecrecion de moco (Wills-Karp, M, Ann. Rev. Immunol. 17: 255-281 (1999), Manual of Alergy and Immunology, mas arriba). Los estudios han demostrado que se encuentran presentes diversos grados de inflamacion cronica en las vfas respiratorias de todos los asmaticos, incluso durante los penodos libres de smtomas. En individuos susceptibles, esta inflamacion causa episodios recurrentes de sibilancias, disnea,

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opresion en el pecho y tos. (Manual of Alergy and Immunology, mas arriba).

La dermatitis atopica es una enfermedad inflamatoria cronica de la piel pruriginosa caracterizada por lesiones de la piel, con una IgE total en suero elevada, eosinofilia, y aumento de la liberacion de histamina de los basofilos y mastocitos. Las personas que padecen dermatitis atopica muestran respuestas Th2 exageradas y se piensa que el inicio de las lesiones de la dermatitis atopica esta mediado por una infiltracion temprana de la piel de linfocitos Th2 que liberan altos niveles de IL-4, IL-5 e lL-13 (Leung, J. Allergy Clin Immunol 105: 860-76 (2000)). La relacion entre la LPET y otras citoquinas inflamatorias se describe en la solicitud de los Estados Unidos 11/205.904, publicacion 2006/0039910.

Se informo de que la expresion de LPET humana detectada mediante hibridacion in situ aumentaba en las vfas respiratorias asmaticas correlacionandose con la gravedad de la enfermedad (Ying et al., J. Immunology 174: 8.1838190 (2005)). Los analisis de los niveles de ARNm de LPET en muestras de pulmon de pacientes asmaticos mostraron una mayor expresion de LPET en comparacion con los controles. Adicionalmente, los niveles de protema LPET son detectables en el fluido de lavado broncoalveolar (LBA) de los pacientes con asma, de los pacientes con trasplante de pulmon, y los pacientes con fibrosis qmstica. Se ha encontrado recientemente que la LPEt es liberada en respuesta a microbios y a traumas asf como a inflamacion, y activa los mastocitos (Allakhverdi et al., J Exp. 20492 Med: 253-258 (2007).

Se ha demostrado que la protema LPET humana se correlaciona con la enfermedad en la mucosa bronquial y el fluido de LBA de sujetos con asma moderada/grave y EPOC. (Ying et al., J Immunol 181(4):. 2790-8 (2008).

La expresion en exceso de LPET en los pulmones de ratones transgenicos conduce a una inflamacion de las vfas respiratorias similar al asma (Zhou et al., Nat. Immunol 10: 1047-1053 (2005). Adicionalmente, se ha informado de que los ratones con deficiencia de RLPET no desarrollan asma en modelos de asma con OVA, lo que demuestra que se requiere LPET para el desarrollo del asma en modelos de inflamacion de las vfas respiratorias (Zhou et al., mas arriba, Carpino et al., Mol. Cell Biol. 24: 2584-2592 (2004).

Ademas de asma, se ha encontrado un aumento de los niveles de protema LPET y ARNm en la piel lesional de pacientes con dermatitis atopica (DA) y en las celulas epiteliales tonsilares inflamadas (Soumelis et al., Nature Immunol: 3 (7): 673-680 (2002). La expresion en exceso de LPET en la piel de ratones transgenicos conduce a un fenotipo de tipo AD (Yoo et al., J Exp Med 202: 541-549 (2005)).

Por lo tanto, los antagonistas de LPET, espedficamente protemas de union a antfgeno LPET y los anticuerpos de la presente solicitud, son utiles como tratamiento terapeutico para la inflamacion alergica, en particular, el asma y la dermatitis atopica.

Adicionalmente, los antagonistas de LPET, concretamente las protemas de union al antfgeno LPET y los anticuerpos de la presente descripcion tambien son utiles para el tratamiento de los trastornos fibroticos. Se ha demostrado que LPET participa en la promocion de trastornos fibroticos, como se describe en la solicitud num. de serie 11/344.379. Se ha encontrado que LPET induce la acumulacion de fibroblastos y el deposito de colageno en los animales. La inyeccion de LPET murina, por ejemplo, por via intradermica a ratones dio como resultado fibrosis en el tejido subcutaneo de los ratones, que se caracteriza por la proliferacion de fibroblastos y el deposito de colageno. Ejercer un efecto antagonico sobre la actividad de LPET se traducina en la prevencion o la disminucion de la proliferacion de fibroblastos y el deposito de colageno en un tejido.

Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "enfermedad fibroproliferativa" o "enfermedad o trastorno fibroticos" se refiere a afecciones que implican fibrosis en uno o mastejidos. Segun se utiliza en la presente memoria el termino "fibrosis" se refiere a la formacion de tejido fibroso como un proceso de reparacion o reactivo, en lugar de como un constituyente normal de un organo o tejido. La fibrosis se caracteriza por la acumulacion de fibroblastos y el deposito de colageno por encima del deposito normal en cualquier tejido concreto. Segun se utiliza en la presente memoria el termino "fibrosis" se utiliza como sinonimo de "acumulacion de fibroblastos y deposito de colageno". Los fibroblastos son celulas del tejido conectivo, que se dispersan en el tejido conectivo de todo el cuerpo. Los fibroblastos secretan una matriz extracelular no ngida que contiene colageno de tipo I y/o de tipo III. En respuesta a una lesion en un tejido, los fibroblastos cercanos migran a la herida, proliferan, y producen grandes cantidades de matriz extracelular colagenosa. El colageno es una protema fibrosa rica en glicina y prolina que es un componente principal de la matriz extracelular y el tejido conectivo, el cartflago, y el hueso. Las moleculas de colageno son estructuras helicoidales de cadena triple denominadas cadenas alfa, que se enrollan alrededor de la otra en una helice que se asemeja a una soga. El colageno existe en varias formas o tipos; de estos, el tipo I, el mas comun, se encuentra en la piel, los tendones y los huesos; y el tipo III se encuentra en la piel, los vasos sangumeos y los organos internos.

Los trastornos fibroticos incluyen, pero no se limitan a, la esclerodermia sistemica y local, queloides y cicatrices hipertroficas, aterosclerosis, reestenosis, inflamacion pulmonar y fibrosis, fibrosis pulmonar idiopatica, cirrosis hepatica, fibrosis como resultado de infeccion por hepatitis B o C cronica, enfermedad renal , enfermedades del corazon como consecuencia de tejido cicatrizal, y enfermedades oculares tales como la degeneracion macular y la retinopatfa de la retina y el vftreo. Otras enfermedades fibroticas incluyen fibrosis resultante de los farmacos

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quimioterapeuticos, fibrosis inducida por radiacion y lesiones y quemaduras.

La esclerodermia es un trastorno fibrotico que se caracteriza por un engrosamiento y endurecimiento de la piel causados por la produccion en exceso de nuevo colageno por los fibroblastos en la piel y otros organos. La esclerodermia puede ocurrir como una enfermedad local o sistemica. La esclerodermia sistemica puede afectar a numerosos organos. La esclerosis sistemica se caracteriza por la formacion de tejido fibroso de colageno hialinizado y espesado, con engrosamiento de la piel y la adherencia a los tejidos subyacentes, especialmente de las manos y la cara. La enfermedad tambien se puede caracterizar por disfagia debido a la perdida de peristaltismo y fibrosis de la submucosa del esofago, disnea debida a fibrosis pulmonar, fibrosis miocardica, y cambios vasculares renales. (Stedman's Medical Dictionary, 26a edicion, Williams & Wilkins, 1995)). La fibrosis pulmonar afecta a un 30-70% de los pacientes con esclerodermia, produciendo a menudo una enfermedad pulmonar restrictiva (Atamas et al. Citokine and Growth Factor Rev 14: 537-550 (2003)). La fibrosis pulmonar idiopatica es un trastorno pulmonar cronico, progresivo y normalmente letal, que se cree es una consecuencia de un proceso inflamatorio cronico (Kelly et al., Curr Pharma Design 9: 39-49 (2003)).

Por lo tanto, los antagonistas de LPET, espedficamente las protemas de union al antfgeno LPET y anticuerpos de la presente solicitud, son utiles como tratamiento terapeutico para enfermedades fibroticas, incluyendo pero no limitadas a esclerodermia, enfermedad pulmonar intersticial, fibrosis pulmonar idiopatica, fibrosis resultante de hepatitis B o C cronica, fibrosis inducida por radiacion y fibrosis resultante de la cicatrizacion de heridas.

Aunque se prefieren las indicaciones anteriores, otras enfermedades, trastornos o afecciones pueden ser susceptibles de tratamiento con, o se pueden prevenir mediante la administracion de un antfgeno que se une a un sujeto. Tales enfermedades, trastornos y afecciones incluyen, pero no se limitan a, inflamacion, enfermedades autoinmunitarias, inflamacion del cartflago, enfermedad fibrotica y/o degradacion de los huesos, artritis, artritis reumatoide, artritis juvenil, artritis reumatoide juvenil, artritis reumatoide juvenil pauciarticular, artritis reumatoide juvenil poliarticula, artritis reumatoide juvenil de inicio sistemico, espondilitis anquilosante juvenil, artritis enteropatica juvenil, artritis reactiva juvenil smdrome de Reiter juvenil, smdrome de EAS (Smdrome de Entesopatfa y Artropatfa Seronegativa), dermatomiositis juvenil, artritis psoriasica juvenil, esclerodermia juvenil, lupus eritematoso sistemico juvenil, vasculitis juvenil, artritis reumatoide pauciarticular, artritis reumatoide poliarticular, artritis reumatoide de inicio sistemico, espondilitis anquilosante, artritis enteropatica, artritis reactiva, smdrome de Reter, smdrome de EAS (Smdrome de Entesopatfa y Artropatfa Seronegativa), dermatomiositis, artritis psoriasica, esclerodermia, lupus eritematoso sistemico, vasculitis, miolitis, polimiolitis, dermatomiolitis, osteoartritis, poliarteritis nodosa, granulomatosis de Wegener, arteritis, polimialgia reumatica, sarcoidosis, esclerodermia, esclerosis, esclerosis biliar primaria, colangitis esclerosante, smdrome de Sjogren, psoriasis, psoriasis en placas, psoriasis guttata, psoriasis inversa, psoriasis pustulosa, psoriasis eritrodermica, dermatitis, dermatitis atopica, aterosclerosis, lupus, enfermedad de Still, Lupus Eritematoso Sistemico (LES), miastenia grave, enfermedad inflamatoria intestinal (EIl), enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad celfaca, esclerosis multiple (EM), asma, EPOC, enfermedad de Guillain-Barre, diabetes mellitus tipo I, enfermedad de Graves, enfermedad de Addison, fenomeno de Raynaud, hepatitis autoinmunitaria, GVHD, y similares. En realizaciones espedficas, se proporcionan composiciones farmaceuticas que comprenden una cantidad terapeuticamente eficaz de protemas de union a antfgeno LPET.

El termino "tratamiento" incluye el alivio o la prevencion de al menos un smtoma o de otro aspecto de un trastorno, o una reduccion de la gravedad de la enfermedad, y similares. Una protema de union a antfgeno no tiene que efectuar una cura completa, o erradicar cada smtoma o manifestacion de una enfermedad, para constituir un agente terapeutico viable. Como se reconoce en el campo pertinente, los farmacos empleados como agentes terapeuticos pueden reducir la gravedad de un estado de enfermedad dado, pero no es necesario que supriman todas las manifestaciones de la enfermedad para ser considerados como agentes terapeuticos utiles. Del mismo modo, un tratamiento administrado profilacticamente no tiene que ser completamente eficaz en la prevencion de la aparicion de una afeccion con el fin de constituir un agente profilactico viable. Simplemente es suficiente que reduzca el impacto de una enfermedad (por ejemplo, al reducir el numero o la gravedad de sus smtomas, o al aumentar la eficacia de otro tratamiento, o al producir otro efecto beneficioso), o reduzca la probabilidad de que la enfermedad se produzca o empeore en un sujeto. Una realizacion de la invencion se dirige a un metodo que comprende la administracion a un paciente de una protema de union a antfgeno en una cantidad y durante un tiempo suficientes para inducir una mejora sostenida sobre el momento inicial de un indicador que refleja la gravedad del trastorno en particular.

Composiciones farmaceuticas

En algunas realizaciones, la invencion proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden una cantidad terapeuticamente eficaz de una o una pluralidad de las protemas de union a antfgeno de la invencion junto con un diluyente, portador, solubilizante, emulsionante, conservante y/o coadyuvante farmaceuticamente aceptables. Ademas, la invencion proporciona metodos de tratamiento de un paciente mediante la administracion de semejante composicion farmaceutica. El termino "paciente" incluye sujetos humanos y animales.

Las composiciones farmaceuticas que comprenden una o mas protemas de union a antfgeno se pueden utilizar para reducir la actividad de LPET. Las composiciones farmaceuticas que comprenden una o mas protemas de union a antfgeno se pueden utilizar en el tratamiento de las consecuencias, los smtomas, y/o la patologfa asociada con la

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actividad de LPET. Las composiciones farmaceuticas que comprenden una o mas protemas de union de antfgeno se pueden utilizar en metodos de inhibicion de la union y/o la senalizacion de LPET a RLPET que comprenden proporcionar la protema de union a antfgeno de la invencion a LPET.

En ciertas realizaciones, los materiales de formulacion aceptables son preferiblemente no toxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas. En ciertas realizaciones, la composicion farmaceutica puede contener materiales de formulacion para modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, la osmolalidad, la viscosidad, la claridad, el color, la isotonicidad, el olor, la esterilidad, la estabilidad, la velocidad de disolucion o la liberacion, la adsorcion o la penetracion de la composicion. En tales realizaciones, los materiales de formulacion adecuados incluyen, pero no se limitan a, aminoacidos (tales como glicina, glutamina, asparragina, arginina o lisina); antimicrobianos; antioxidantes (tales como acido ascorbico, sulfito de sodio o hidrogeno-sulfito de sodio); tampones (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros acidos organicos); agentes voluminizantes (tales como manitol o glicina); agentes quelantes (tales como acido etilendiamino tetraacetico (EDTA)); agentes complejantes (tales como cafema, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina); cargas; monosacaridos; disacaridos; y otros carbohidratos (tales como glucosa, sacarosa, manosa o dextrinas); protemas (tales como albumina de suero, gelatina o inmunoglobulinas); colorantes, aromatizantes y agentes de dilucion; agentes emulsionantes; polfmeros hidrofilos (tales como polivinilpirrolidona); polipeptidos de bajo peso molecular; contraiones formadores de sales (tales como sodio); conservantes (tales como cloruro de benzalconio, acido benzoico, acido salidlico, timerosal, alcohol fenetflico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, acido sorbico o peroxido de hidrogeno); disolventes (tales como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol); alcoholes de azucares (tales como manitol o sorbitol); agentes de suspension; tensioactivos o agentes humectantes (tales como Pluronics, PEG, esteres de sorbitan, polisorbatos tales como polisorbato 20, polisorbato, Triton, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes potenciadores de la estabilidad (tales como sacarosa o sorbitol); agentes potenciadores de la tonicidad (tales como haluros de metales alcalinos, preferiblemente cloruro de sodio o potasio, manitol sorbitol); vehmulos de suministro; diluyentes; excipientes y/o coadyuvantes farmaceuticos. Vease, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a Edicion, (A. R. Genaro, ed.), 1990, Mack Publishing Company.

En ciertas realizaciones, la composicion farmaceutica optima sera determinada por un experto en la tecnica dependiendo, por ejemplo, de la ruta de administracion pretendida, el formato de suministro y la dosificacion deseada. Vease, por ejemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, mas arriba. En ciertas realizaciones, tales composiciones pueden influir en el estado ffsico, la estabilidad, la velocidad de liberacion in vivo y la velocidad de aclaramiento in vivo de las protemas de union a antfgeno de la invencion. En ciertas realizaciones, el vehmulo primario o el portador en una composicion farmaceutica pueden ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Por ejemplo, un vehmulo o portador adecuado puede ser agua para inyectables, solucion salina fisiologica o lfquido cefalorraqmdeo artificial, posiblemente complementado con otros materiales comunes en composiciones para la administracion parenteral. La solucion salina tamponada neutra o solucion salina mezclada con albumina de suero son otros vehmulos ilustrativos. En realizaciones espedficas, las composiciones farmaceuticas comprenden tampon de Tris de aproximadamente pH 7,0-8,5, o tampon acetato de aproximadamente pH 4,0-5,5, y pueden incluir adicionalmente sorbitol o un sustituto adecuado del mismo. En ciertas realizaciones de la invencion, las composiciones de protema de union a antfgeno LPET se pueden preparar para el almacenamiento mezclando la composicion seleccionada que tiene el grado deseado de pureza con agentes de formulacion opcionales (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, mas arriba) en forma de una torta liofilizada o una solucion acuosa. Adicionalmente, en ciertas realizaciones, el producto de protema de union a antfgeno LPET se puede formular como un producto liofilizado utilizando excipientes apropiados tales como sacarosa.

Las composiciones farmaceuticas de la invencion se pueden seleccionar para el suministro parenteral. Alternativamente, las composiciones se pueden seleccionar para la inhalacion o para el suministro a traves del tracto digestivo, tal como oralmente. Los componentes de la formulacion estan presentes preferiblemente a concentraciones que son aceptables para el sitio de administracion. En ciertas realizaciones, se utilizan tampones para mantener la composicion a pH fisiologico o a un pH ligeramente inferior, tfpicamente dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 8. Incluyendo aproximadamente 5,1, aproximadamente 5,2, aproximadamente 5,3, aproximadamente 5,4, aproximadamente 5,5, aproximadamente 5,6, aproximadamente 5,7,

aproximadamente 5,8, aproximadamente 5,9, aproximadamente 6,0, aproximadamente 6,1, aproximadamente 6,2,

aproximadamente 6,3, aproximadamente 6,4, aproximadamente 6,5, aproximadamente 6,6, aproximadamente 6,7,

aproximadamente 6,8, aproximadamente 6,9, aproximadamente 7,0, aproximadamente 7,1, aproximadamente 7,2,

aproximadamente 7,3, aproximadamente 7,4, aproximadamente 7,5, aproximadamente 7,6, aproximadamente 7,7,

aproximadamente 7,8, aproximadamente 7,9 y aproximadamente 8,0.

Cuando se contempla la administracion parenteral, las composiciones terapeuticas para su uso en esta invencion se pueden proporcionar en forma de una solucion acuosa libre de pirogenos, parenteralmente aceptable que comprende la protema de union a antfgeno LPET deseada en un vehmulo farmaceuticamente aceptable. Un vehmulo particularmente adecuado para la inyeccion parenteral es agua destilada esteril en la que se formula la protema de union a antfgeno LPET como una solucion esteril, isotonica, apropiadamente conservada. En ciertas realizaciones, la preparacion puede implicar la formulacion de la molecula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partmulas bioerosionables, compuestos polimericos (tales como poli(acido lactico) o poli(acido glicolico), cuentas o liposomas, que pueden proporcionar una liberacion controlada o sostenida del producto que puede ser suministrado a traves de una inyeccion de deposito. En ciertas realizaciones, tambien se

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puede utilizar el acido hialuronico, que tiene el efecto de promover una duracion sostenida en la circulacion. En deltas realizaciones, se pueden utilizar dispositivos de suministro de farmacos implantables para introducir la protema de union a antigeno deseada.

Las composiciones farmaceuticas de la invencion se pueden formular para su inhalacion. En estas realizaciones, las protemas de union a antigeno LPET se formulan ventajosamente en forma de un polvo seco, inhalable. En realizaciones espedficas, las soluciones de protema de union de antigeno LPET para inhalacion tambien se pueden formular con un propelente para la administracion en aerosol. En ciertas realizaciones, las soluciones se pueden nebulizar. Los metodos de administracion y formulacion pulmonares, por lo tanto, se describen adicionalmente en la Solicitud de Patente Internacional Num. PCTUS94/001875, que describe el suministro pulmonar de protemas modificadas qmmicamente.

Tambien se contempla que las formulaciones se puedan administrar por via oral. Las protemas de union a antfgeno LPET que se administran de esta manera se pueden formular con o sin portadores utilizados habitualmente en la composicion de formas de dosificacion solidas tales como comprimidos y capsulas. En ciertas realizaciones, se puede disenar una capsula para liberar la porcion activa de la formulacion en un punto del tracto gastrointestinal cuando se maximiza la biodisponibilidad y se reduce al mmimo la degradacion pre-sistemica. Se pueden incluir otros agentes para facilitar la absorcion de la protema de union a antigeno LPET. Tambien se puede emplear diluyentes, aromatizantes, ceras de bajo punto de fusion, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspension, agentes disgregantes de comprimidos, y aglutinantes.

Una composicion farmaceutica de la invencion se proporciona preferiblemente para que comprenda una cantidad eficaz de una o una pluralidad de protemas de union a antigeno LPET en una mezcla con excipientes no toxicos que son adecuados para la fabricacion de comprimidos. Disolviendo los comprimidos en agua esteril, u otro vehmulo apropiado, se pueden preparar soluciones en formas de dosificacion unitaria.

Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato o bicarbonato de sodio, lactosa o fosfato de calcio; o agentes aglutinantes, tales como almidon, gelatina o acacia; o agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, acido estearico, otalco.

Otras composiciones farmaceuticas seran evidentes para los expertos en la tecnica, incluyendo formulaciones que implican protemas de union a antfgeno LPET en formulaciones de suministro sostenido o controlado. Los mecanismos para formular una variedad de medios de suministro sostenido o controlado distintos, tales como portadores de liposomas, micropartmulas bioerosionables o cuentas porosas e inyecciones de deposito, tambien son conocidos por los expertos en la tecnica. Vease, por ejemplo, la Solicitud de Patente Internacional Num. PCT/US93/00829, describe la liberacion controlada de micropartmulas polimericas porosas para el suministro de composiciones farmaceuticas.

Las preparaciones de liberacion sostenida pueden incluir matrices de polfmeros semipermeables en forma de artmulos conformados, p. ej., pelmulas o microcapsulas. Las matrices de liberacion sostenida pueden incluir poliesteres, hidrogeles, polilactidas (como se describe en la Patente de Estados Unidos Num. 3.773.919 y en la Solicitud de Patente Europea Num. EP 058481), copolfmeros de acido L-glutamico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et al., 1983, Biopolymers 2: 547-556), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 y Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105), vinilacetato de etileno (Langer et al., 1981, mas arriba) o acido poli-D(-)-3-hidroxibutmco (Publicacion de la Solicitud de Patente Europea Num. EP 133.988).

Las composiciones de liberacion sostenida tambien pueden incluir liposomas que se pueden preparar por cualquiera de los diversos metodos conocidos en la tecnica. Vease, p. ej., Eppstein et al., 1985, Proc. Natl Acad. Sci U.S.A. 82.3688-3692; Publicaciones de Solicitudes de Patente Europeas Nums. EP 036.676; EP 088.046 y EP 143.949.

Las composiciones farmaceuticas utilizadas para la administracion in vivo tfpicamente se proporcionan en forma de preparaciones esteriles. La esterilizacion se puede lograr mediante filtracion a traves de membranas de filtracion esteriles. Cuando la composicion se liofiliza, la esterilizacion utilizando este metodo se puede llevar a cabo ya sea antes o despues de la liofilizacion y reconstitucion. Las composiciones para la administracion parenteral se pueden almacenar en forma liofilizada o en una solucion. Las composiciones parenterales generalmente se colocan en un recipiente que tiene un puerto de acceso esteril, por ejemplo, una bolsa de solucion intravenosa o un vial que tiene un tapon perforable por una aguja de inyeccion hipodermica.

Los aspectos de la invencion incluyen formulaciones de protema de union a antfgeno LPET auto-tamponadas, que se pueden utilizar como composiciones farmaceuticas, como se describe en la solicitud de patente internacional WO 0613818 1 A2 (PCT/US2006/022599). Una realizacion proporciona formulacion de protema de union a antfgeno LPET auto-tamponadas que comprenden una protema de union a antfgeno LPET en la que la concentracion total de sal es menor de 150 mM.

La cantidad terapeuticamente eficaz de composicion farmaceutica que contiene la protema de union antfgeno LPET que se va a emplear dependera, por ejemplo, del contexto y los objetivos terapeuticos. Un experto en la tecnica apreciara que los niveles de dosificacion apropiados para el tratamiento variaran dependiendo, en parte, de la molecula suministrada, la indicacion para la cual se esta utilizando la protema de union a antfgeno LPET, la via de

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administracion, y el tamano (peso corporal, superficie corporal o tamano del organo) y/o el estado (edad y salud general) del paciente.

En ciertas realizaciones, el medico clmico puede titular la dosificacion y modificar la v^a de admimstracion para obtener el efecto terapeutico optimo. Una dosificacion tipica puede variar de aproximadamente 0,1 pg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg o mas, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En realizaciones espedficas, la dosis puede variar de 0,1 pg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, opcionalmente de 1 pg/kg a aproximadamente 30 mg/kg o de 10 pg/kg a aproximadamente 5 mg/kg.

La frecuencia de dosificacion dependera de los parametros farmacocineticos de la protema de union a antfgeno LPET concreta, de la formulacion utilizada. Tfpicamente, un medico clmico administra la composicion hasta que se alcance una dosis que consiga el efecto deseado. Portanto, la composicion se puede administrar en forma de una dosis unica, o en forma de dos o mas dosis (que pueden o no contener la misma cantidad de la molecula deseada) con el tiempo, o en forma de una infusion continua a traves de un dispositivo de implantacion o un cateter. El perfeccionamiento adicional de la dosificacion apropiada es realizado de manera rutinaria por los expertos normales en la tecnica y esta dentro del ambito de las tareas realizadas rutinariamente por ellos.

Las dosificaciones apropiadas se pueden determinar a traves del uso de datos de dosis-respuesta apropiados. En ciertas realizaciones, las protemas de union a antfgeno de la invencion se pueden administrar a los pacientes a lo largo de un penodo de tiempo prolongado. La administracion cronica de una protema de union a antfgeno de la invencion minimiza la respuesta inmunitaria o alergica adversa comunmente asociada con las protemas de union a antfgenos que no son completamente humanas, por ejemplo un anticuerpo generado contra un antfgeno humano en un animal no humano, por ejemplo, un anticuerpo no completamente humano o un anticuerpo no humano producido en una especie no humana.

La via de administracion de la composicion farmaceutica esta de acuerdo con metodos conocidos, p. ej., por via oral, a traves de inyeccion por via intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimal), intracerebroventricular, intramuscular, intra-ocular, intraarterial, intraportal, o intralesional; por sistemas de liberacion sostenida o por dispositivos de implantacion. En ciertas realizaciones, las composiciones se pueden administrar mediante inyeccion de bolo o continuamente mediante infusion, o mediante un dispositivo de implantacion.

La composicion tambien se puede administrar localmente a traves de implantacion de una membrana, esponja u otro material apropiado sobre el que la molecula deseada se ha absorbido o encapsulado. En ciertas realizaciones, cuando se utiliza un dispositivo de implantacion, el dispositivo puede ser implantado en cualquier tejido u organo adecuado, y el suministro de la molecula deseada puede ser mediante difusion, bolo de liberacion controlada, o una administracion continua.

Terapias combinadas

En realizaciones adicionales, la protema de union al antfgeno se administra combinada con otros agentes utiles para el tratamiento de la afeccion con la que esta afectado el paciente. Los ejemplos de tales agentes incluyen farmacos tanto proteicos como no proteicos. Cuando se administran simultaneamente multiples agentes terapeuticos, las dosis pueden ajustarse en consecuencia, tal como se reconoce en la tecnica pertinente. La "coadministracion" y la terapia combinada no se limitan a la administracion simultanea, tambien incluyen los regfmenes de tratamiento en los que se administra una protema de union a antfgeno al menos una vez durante el transcurso de un tratamiento que implica la administracion de al menos otro agente terapeutico al paciente.

Habiendo descrito la invencion, se ofrecen los siguientes ejemplos a modo de ilustracion, y no de limitacion.

Ejemplo 1: Preparacion del antfgeno

Se utilizaron como inmunogenos varias formas de LPET recombinante. La LPET humana se expreso en celulas tanto de E. coli como de mairnfero. La LPET humana producida por E. coli era una protema de longitud completa sin etiqueta. La protema LPET fue producida en celulas COS PKB que teman un sitio de escision de furina suprimido producido por la supresion de los nucleotidos 382 a 396 (AGAAAAAGGAAAGTC, SEQ ID NO: 370) correspondiente a los aminoacidos 128-132 (RKRKV, SEQ ID NO: 371). Esta protema contiene una etiqueta poliHIS-Flag C terminal (Secuencia de nucleotidos =

ATGTTCCCTTTTGCCTTACTATATGTTCTGTCAGTTTCTTTCAGGAAAATCTTCATCTTACA

ACTTGTAGGGCTGGTGTTAACTTACGACTTCACTAACTGTGACTTTGAGAAGATTAAAGC

AGCCTATCTCAGTACTATTTCTAAAGACCTGATTACATATATGAGTGGGACCAAAAGTAC

CGAGTTCAACAACACCGTCTCTTGTAGCAATCGGCCACATTGCCTTACTGAAATCCAGAG

CCTAACCTTCAATCCCACCGCCGGCTGCGCGTCGCTCGCCAAAGAAATGTTCGCCATGAA

AACTAAGGCTGCCTTAGCTATCTGGTGCCCAGGCTATTCGGAAACTCAGATAAATGCTAC

TCAGGCAATGAAGAAGAGGACAACCAATAAATGTCTGGAACAAGTGTCACAATTACAAG

GATTGTGGCGTCGCTTCAATCGACCTTTACTGAAACAACAGCATCACCATCACCATCACG

ACTACAAAGACGATGACGACAAA (SEQ ID NO: 372);

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Secuencia de protema = MFPFALLYVLSVSFRKIFILQLVGLVLTYDFTNCDFEKIKAAYLSTISKDLITYMSGTKSTEFNN TVSCSNRPHCLTEIQSLTFNPTAGCASLAKEMFAMKTKAALAIWCPGYSETQINATQAMKKR ITNKCLEQVSQLQGLWRRFNRPLLKQQHHHHHHDYKDDDDK (SEQ ID NO: 373).

En otra campana, se produjo una protema LPET completa etiquetada con poliHis-FLAG C terminal en celulas COS PKB (secuencia de nucleotidos =

ATGTTCCCTTTTGCCTTACTATATGTTCTGTCAGTTTCTTTCAGGAAAATCTTCATCTTACA

ACTTGTAGGGCTGGTGTTAACTTACGACTTCACTAACTGTGACTTTGAGAAGATTAAAGC

AGCCTATCTCAGTACTATTTCTAAAGACCTGATTACATATATGAGTGGGACCAAAAGTAC

CGAGTTCAACAACACCGTCTCTTGTAGCAATCGGCCACATTGCCTTACTGAAATCCAGAG

CCTAACCTTCAATCCCACCGCCGGCTGCGCGTCGCTCGCCAAAGAAATGTTCGCCATGAA

AACTAAGGCTGCCTTAGCTATCTGGTGCCCAGGCTATTCGGAAACTCAGATAAATGCTAC

TCAGGCAATGAAGAAGAGGAGAAAAAGGAAAGTCACAACCAATAAATGTCTGGAACAA

GTGTCACAATTACAAGGATTGTGGCGTCGCTTCAATCGACCTTTACTGAAACAACAGCAT

CACCATCACCATCACGACTACAAAGACGATGACGACAAA (SEC ID NO: 374);

Secuencia de protema = MFPFALLYVLSVSFRKIFILQLVGLVLTYDFTNCDFEKIKAAYLSTISKDLITYMSGTKSTEFNN TVSCSNRPHCLTEIQSLTFNPTAGCASLAKEMFAMKTKAALAIWCPGYSETQINATQAMKKR RKRKVTTNKCLEQVSQLQGLWRRFNRPLLKQQHHHHHHDYKDDDDK (SEC ID NO: 375). Observese que la secuencia de aminoacidos 1-28 (MFPFALLYVLSVSFRKIFILQLVGLVLT, SEQ ID NO: 376) es un peptido senal escindido del producto maduro de estas dos protemas.

Ademas, se clono LPET de cinomolgo y se subclono/expreso de manera similar, ya sea con el sitio de escision de furina (nucleotidos 358 -372 (AGAAAAAGGAAAGTC, SEQ ID NO: 370) correspondiente a los aminoacidos 120-124 (RKRKV, SEQ ID NO: 371)) suprimido (ADN =

ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACCGG

TTACGACTTCACTAACTGTGACTTTCAGAAGATTGAAGCAGACTATCTCCGTACTATTTCT

AAAGACCTGATTACATATATGAGTGGGACTAAAAGTACCGACTTCAACAACACCGTCTC

CTGTAGCAATCGGCCACACTGCCTTACTGAAATCCAGAGCCTAACCTTCAATCCCACCCC

CCGCTGCGCGTCGCTCGCCAAGGAAATGTTCGCCAGGAAAACTAAGGCTACCCTCGCTCT

CTGGTGCCCAGGCTATTCGGAAACTCAGATAAATGCTACTCAGGCAATGAAGAAGAGGA

CAACCAATAAATGTCTGGAACAAGTGTCACAATTACTAGGATTGTGGCGTCGCTTCATTC

GAACTTTACTGAAACAACAGCACCACCACCACCACCATGACTATAAAGACGATGACGAC AAAT (SEQ ID NO:

377); Protema = METDTLLLWVLLLWVPGSTGYDFTNCDFQKIEADYLRTISKDLITYMSGTKSTDFNNTVSCS NRPHCLTEIQSLTFNPTPRCASLAKEMFARKTKATLALWCPGYSETQINATQAMKKRTTNKC LEQVSQLLGLWRRFIRTLLKQQHHHHHHDYKDDDDK (SEQ ID NO: 378) o en forma de un producto completo/nativo (Secuencia de nucleotidos =

ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACCGGT

TACGACTTCACTAACTGTGACTTTCAGAAGATTGAAGCAGACTATCTCCGTACTATTTCT

AAAGACCTGATTACATATATGAGTGGGACTAAAAGTACCGACTTCAACAACACCGTCTC

CTGTAGCAATCGGCCACACTGCCTTACTGAAATCCAGAGCCTAACCTTCAATCCCACCCC

CCGCTGCGCGTCGCTCGCCAAGGAAATGTTCGCCAGGAAAACTAAGGCTACCCTCGCTCT

CTGGTGCCCAGGCTATTCGGAAACTCAGATAAATGCTACTCAGGCAATGAAGAAGAGGA

GAAAAAGGAAAGTCACAACCAATAAATGTCTGGAACAAGTGTCACAATTACTAGGATTG

TGGCGTCGCTTCATTCGAACTTTACTGAAACAACAGCACCACCACCACCACCATGACTAT

AAAGACGATGACGACAAA (SEQ ID NO: 379); Protema =

METDTLLLWVLLLWVPGSTGYDFTNCDFQKIEADYLRTISKDLITYMSGTKSTDFNNTVSCS NRPHCLTEIQSLTFNPTPRCASLAKEMFARKTKATLALWCPGYSETQINATQAMKKRRKRKV TTNKCLEQVSQLLGLWRRFIRTLLKQQHHHHHHDYKDDDDK (SEQ ID NO: 380) fusionada a la misma poliHIS-Flag C terminal en celulas COS PKB. Observese que la secuencia de aminoacidos 1-2o (METDTLLLWVLLLWVPGSTG, SEQ ID NO: 381) es un peptido senal escindido del producto maduro de estas dos protemas de cinomolgo.

Ejemplo 2: Anti-anticuerpos anti-LPET humana de raton

Se utilizo hLPET-Fc para la inmunizacion de ratones Balb/c (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine). Despues de varias rondas de inmunizacion, los linfocitos se liberaron a partir del bazo y se fusionaron con celulas de mieloma de raton, NS1 (ATCC) por medio de fusion qmmica con PEG/DMSO al 50% (Sigma). Las celulas fusionadas se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 2x104 celulas/pocillo en 200 pl de medio DMEM HAT (hipoxantina 0,1 mM, timidina 0,16 mM, aminopterina 4 mM, Sigma) con un suplemento de FBS al 10%, Origen Cloning Factor al 5% (BioVeris™), 1x Penicilina-Estreptomicina-Glutamina, piruvato de sodio (Invitrogen). El medio se reemplazo 7 dfas despues de la fusion por medio DMEM HT (hipoxantina 0,1 mM, timidina 0,16 mM) con un suplemento de FBS al 10%, Origen Cloning Factor al 5% (BioVeris™), 1x Penicilina-Estreptomicina-Glutamina, piruvato de sodio (Invitrogen). Se recogieron los medios acondicionados dos dfas despues del cambio de medio y precedido por cribado primario.

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Ejemplo 3: Generacion de anticuerpos completamente humanos

Se generaron anticuerpos monoclonales completamente humanos espedficos para LPET utilizando la tecnologfa XenoMouse® de acuerdo con protocolos descritos, por ejemplo, en el documento U.S. 2005/0118643, las Patentes de Estados Unidos Nums: 6114598, 6162963, 7049426, 7064244, Green et al., Nature Genetics 7: 13-21 (1994), Medez et al. Nature Genetics 15: 146-156 (1997), Green y Jakobovitis J. Ex. Med. 188: 483-495 (1998), y como se describe a continuacion.

Se llevaron a cabo dos campanas. En la campana 1, se utilizaron cohortes de IgG2 e IgG4 de XenoMouse®. Cincuenta por ciento de los ratones recibieron LPET humana producida por E. coli y 50% recibieron LPET humana producida por mairnfero (descrito anteriormente). Los tttulos de suero fueron verificados por medio de ELISA (descrito a continuacion) y los ratones con los mejores tftulos fueron fusionados para generar hibridomas usando los siguientes protocolos.

Los ratones seleccionados fueron sacrificados y los ganglios linfaticos de drenaje se cosecharon y se reunieron a partir de cada cohorte. Las celulas linfoides se enriquecieron para las celulas B y las celulas B se fusionaron con celulas de mieloma para crear hibridomas. Las lmeas de hibridoma fusionadas se cultivaron en placa a continuacion en medio para hibridoma y se cultivaron durante 10-14 dfas a 37°C. Los sobrenadantes de hibridoma se escrutaron para determinar la union de los anticuerpos IgG a LPET por medio de ELISA como se describe a continuacion.

Se inicio una segunda campana en la que dos cohortes de IgG2 XenoMouse® fueron inmunizadas con LPET humana producida por mamnfero, y una cohorte fue reforzada con LPET de cinomolgo. Despues de varias rondas de inmunizacion, los linfocitos de los ganglios linfaticos se fusionaron y se cultivaron como se ha descrito anteriormente. Despues del cultivo, los sobrenadantes de hibridoma se escrutaron para determinar la union a LPET por medio de ELlSA, como se describe a continuacion.

Se seleccionaron los sobrenadantes policlonales de ambas campanas para la subclonacion adicional basandose en los analisis expuestos a continuacion. Se identificaron los hibridomas que conteman los anticuerpos que eran potentes inhibidores de la actividad de LPET, y se determino la reactividad cruzada con LPET de cinomolgo. Los resultados se muestran en el Ejemplo 5 a continuacion. Los sobrenadantes de hibridoma prometedores se seleccionaron basandose en su rendimiento en el analisis de DC primarias descrito a continuacion. Esos hibridomas fueron clonados en una sola celula y se expandieron para someterlos a ensayo posteriormente. Los anticuerpos se purificaron a continuacion, como se describe mas abajo.

Los anticuerpos se purificaron a partir de medio acondicionado de los hibridomas utilizando una resina Mab Select (GE Healthcare). Se anadieron 100 pl de una suspension 1:2 de resina Mab Select equilibrada en PBS a entre 7 y 10 ml de medio acondicionado (CM). Los tubos se colocaron sobre rotadores a 4-8°C durante la noche. Los tubos se centrifugaron a 1.000 x g durante 5 minutos y se decanto la fraccion no unida. La resina se lavo despues con 5 ml de PBS, y se centrifugo y se decanto como anteriormente. Despues, la resina se transfirio a un tubo SPIN-X, 0,45 pm, de 2 ml. La resina se lavo dos veces mas con 0,5 ml de PBS y se centrifugo. Los Mab se hicieron eluir con 0,2 ml de acido acetico 0,1 M mediante incubacion a temperatura ambiente con mezclado ocasional durante 10 minutos. Los tubos se centrifugaron, y se anadieron 30 pl de tampon Tris 1 M de pH 8,0 al producto eluido. Los Mab purificados se almacenaron a 4-8°C.

Ejemplo 4: analisis de Anticuerpos

A. ELISA para detectar la presencia de anticuerpo anti-LPET

Se llevo a cabo un ELISA mediante el recubrimiento de placas de 96 pocillos de union a medio 3368 Costar con wtHuLPET producida de forma recombinante o pHisFlag a 2 pg/ml 50 pl/pocillo en 1 x PBS/azida al 0,05%, y se incubaron durante la noche a 4°C. Las placas se lavaron y se bloquearon con 250 pl de 1X PBS/leche al 1% (el diluyente del analisis), y se incubaron al menos 30 minutos a la temperatura ambiente.

Se anadieron aproximadamente 50 pl/pocillo de sobrenadantes de hibridoma, anticuerpo de control positivo de raton M385, o un control negativo, y se incubaron a la temperatura ambiente durante 2 horas. Las placas se lavaron, y se aplico un anticuerpo secundario, anti-Fc IgG HPR humano de cabra (Pierce), o, alternativamente, un anti-IgG HPR de raton de cabra (Jackson Labs), a 400 ng/ml en diluyente de analisis. Las placas se incubaron 1 hora a temperatura ambiente, se lavaron, y se leyo la DO a 450 nm.

B. El escrutinio de sobrenadantes de hibridoma anti-LPET se realizo utilizando uno de los siguientes analisis funcionales

1. Se recubrieron placas de 96 pocillos con la protema huIL-7Ra-huRLPET-Fc soluble, con un conector acido de 8 aa (SGGAPMLS, SEQ ID NO: 382) entre el receptor y un Fc humano, y se incubaron durante la noche a 4°C. 2

2. Las placas se lavaron y se bloquearon durante 1 hora a RT con PBS + BSA al 1% + sacarosa al 5%.

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3. Las placas se incubaron con huLPETHFdel biotinilada (HF significa poliHis Flag, donde la LPET tiene el sitio de escision de furina suprimido) (del). Las placas se incubaron a continuacion (+/-) sobrenadantes de hibridoma de o anti-LPET humana de raton (M385) como control positivo durante 2ha RT.

4. Deteccion de SA-HRP (estreptavidina-peroxidasa de rabano picante). SA se une fuertemente a la porcion de biotina de huLPETHFdel biotinilada y HRP cataliza la oxidacion del cromogeno, TMB (que se vuelve azul), por el peroxido de hidrogeno.

B. Analisis basados en celulas

1) La inhibicion de la proliferacion inducida por LPET de la lmea celular BAF estable que expresa el complejo de RLPET-IL7R humano por sobrenadantes de hibridoma o anticuerpos purificados se determino de acuerdo con el siguiente protocolo.

1. BAF: Se lavaron lmeas celulares estables Hu RLPET en medio de cultivo, RPMI 1640 + FBS al 10% + L- glutamina al 1% + Pen/Strep al 0,1% + 2-ME al 0,1% para eliminar la LPET utilizada en el mantenimiento de los medios, que es la misma que la de los medios de crecimiento, pero con la adicion de 10 ng/mL de huLPETHFwt.

2. Se incubaron HuLPETwtpHF (+/-) o LPETwtpHF (+/-) de cinomolgo con sobrenadantes de hibridoma/anticuerpo purificado/o anti-LPET humana (M385) de raton durante 30 minutos a la temperatura ambiente en pocillos.

3. Se anadieron 5 x103 4 celulas BAF/pocillo y se incubaron durante 3 dfas.

4. Las celulas se pulsaron con timidina tritiada (1 pCi/pocillo) durante la noche. La proliferacion celular de las celulas BAF, o la inhibicion de la misma, se evaluaron mediante la cantidad de incorporacion de timidina tritiada (CPM) por las celulas.

2) Analisis de celulas primarias. Se determino la inhibicion de la produccion de osteoprotegerina (OPG) inducida por LPET (descrita en la Patente de los Estados Unidos 6.284.728) de celulas humanas primarias dendnticas (DC) por los hibridomas o anticuerpos purificados de acuerdo con el siguiente protocolo.

1. Se enriquecieron CD11c de sangre periferica + DC mieloides a partir de envases de leucoferesis de donantes en las instalaciones normales utilizando el kit de aislamiento de DC CD1c (BDCA-1) (Miltenyi Biotec).

2. Se incubaron huLPETwtpHF (+/-) o LPETwtpHF de cinomolgo con sobrenadantes o anticuerpo purificado o anti-LPET humana de raton durante 30 minutos a la temperatura ambiente.

3. Se anadieron 1 x 105 celulas/pocillo y se incubaron durante 48 horas. Los sobrenadantes se recogieron y se analizaron para determinar la produccion de OPG humana por medio de ELISA, y se determino la inhibicion de la produccion de OPG por los sobrenadantes de hibridoma o anticuerpos purificados. El ELISA para OPG se realizo utilizando un kit de desarrollo DuoSet® de R&D Systems. Los anticuerpos anti-LPET inhibieron la produccion de OPG a partir de las celulas de una manera dependiente de la dosis.

3) Analisis de Celulas Mononucleares de Sangre Periferica de cinomolgo. Se determino la inhibicion de la produccion de CCL22/MDC inducida por CynoLPET por sobrenadantes de hibridoma o anticuerpos purificados de acuerdo con el siguiente protocolo.

1. Se obtuvieron celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) de sangre periferica obtenida a partir de monos cinomolgos (SNBL) mediante la superposicion de una mezcla 1:1 de sangre: PBS sobre isolinfa.

2. Se incubaron sobrenadante de LPETwtpHF (+/-) de cinomolgo/anticuerpo purificado o huIL-7RA- huRLPET-Fc soluble durante 30 minutos a la temperatura ambiente.

3. Se anadieron 4x105 celulas/pocillo y se incubaron durante 5 dfas. Los sobrenadantes se recogieron y se analizaron para determinar la produccion de CCL22/MDC de cinomolgo por medio de ELISA.

Ejemplo 5: Determinaciones de Kd

Los experimentos de resonancia de plasmon superficial descritos en esta solicitud de patente se realizaron a 25°C utilizando un aparato Biacore 3000 (Biacore International AB, Uppsala, Suecia) equipado con un chip sensor CM4. Los anticuerpos de captura espedficos anti-Fc gamma se inmovilizaron covalentemente a dos celdas de flujo en el chip CM4 utilizando la qrnmica de acoplamiento de aminas convencional con HBS-EP como tampon de migracion. En pocas palabras, cada celda de flujo se activo con una mezcla 1:1 (v/v) de NHS 0,1 M y EDC 0,4 M. Se inmovilizo anti-IgG humana de cabra AffiniPure, anticuerpo espedfico del fragmento Fcy (Jackson ImmunoResearch Inc. West Grove, PA) a 30 pg/ml en acetato de sodio 10 mM, pH 5,0 con un nivel diana de 3000 UR en dos celulas de flujo. Las superficies reactivas residuales se desactivaron con una inyeccion de etanolamina 1 M. El tampon de migracion se cambio a continuacion a HBS-EP + 0,1 mg/ml de BSA para todas las etapas restantes.

Se sometieron a ensayo los siguientes anticuerpos. A5 IgG2 era un anticuerpo monoclonal purificado, A2 IgG1 e IgG2 eran anticuerpos purificados recombinantes, y A3 IgG4 y A4 IgG4 fueron sobrenadantes clonales. Los anticuerpos se diluyeron apropiadamente en tampon de migracion, de modo que una inyeccion de 2 minutos a 10 pl/min sobre la celda de flujo de ensayo dio lugar a aproximadamente 110 a 175 unidades de respuesta de 5 anticuerpo capturado sobre la superficie de la celda de flujo de ensayo. Ningun anticuerpo fue capturado sobre la superficie de la celda de flujo de control. Despues se hicieron fluir LPEt humana, de cinomolgo o murina a diversas concentraciones, junto con blancos de tampon en las dos celdas de flujo. Los intervalos de concentracion para LPET humana y de cinomolgo fueron de 0,44 a 100 nM, mientras que el intervalo de concentracion para la LPET murina fue de 8,2 a 6000 nM. Se utilizo una velocidad de flujo de 50 pl/min y una fase de asociacion 2 minutos seguida de 10 una fase de disociacion de 10 a 30 minutos. Despues de cada ciclo de las superficies se regeneraron con una inyeccion de 30 segundos de glicina 10 mM a pH 1,5. A continuacion, se capturo el anticuerpo de nueva aportacion en la celda de flujo de ensayo para prepararlo para el siguiente ciclo.

Se hizo referencia a los datos dos veces restando las respuestas de la superficie de control para eliminar los cambios de mdice de refraccion en masa, y luego restando la respuesta del blanco de tampon promediada para 15 eliminar artefactos sistematicos de las celdas de flujo experimentales. Los datos de LPET se procesaron y se ajustaron globalmente a un modelo de interaccion 1:1 con un Rmax local en el soporte logico de evaluacion BIA v 4.1. (Biacore International AB, Uppsala, Suecia). Las constantes de la velocidad de asociacion (ka) y de disociacion (kd) se determinaron y se utilizaron para calcular la constante de equilibrio de disociacion (Kd). Las constantes de la velocidad de disociacion y las constantes de equilibrio de disociacion se resumen en la tabla que se encuentra en el 20 Ejemplo 6.

Ejemplo 6: Actividad in vitro de anticuerpos

Los siguientes anticuerpos se caracterizaron utilizando el analisis Biacore descrito anteriormente para determinar kd y KD. El analisis de celulas dendnticas primarias se utilizo para determinar la CI50 (pM). Los datos para A5 se generaron con anticuerpo clonal purificado, para A2 se generaron con anticuerpo purificado recombinante, y los 25 datos para A3 y A4 se generaron utilizando el sobrenadante clonal. Todas las versiones de LPET se generaron a partir de celulas de mairnfero.

Anticuerpo: LPET Tasa de disociacion kd (1/x) KD (pM) CI50 (pM)

A5 IgG2: LPET Hu 70,36 x 10'b 29,2 100-220

: LPET Cyno 80,64 x 10'b 51,2 680-970

: LPET Mu 80,81 x 10-4 377,000 Nd

A2 IgG1: LPET Hu 30,49 x 10-4 203 600-1700

: LPET Cyno 10,04 x 10-4 46,8 250-860

: LPET Mu -- -- --

A2 IgG2: LPET Hu 20,85 x 10-4 157 6-24

: LPET Cyno 90,42 x 10-5 37,6 Nd

: LPET mu sin union sin union n/a

A3 IgG4: LPET Hu 20,7 x 10-4 170 6-24

: LPET Cyno Nd nd Nd

: LPET Mu Nd nd Nd

A4 IgG4: LPET Hu 30,30 x 10-4 340 30-59

: LPET Cyno Nd nd Nd

: LPET Mu Nd nd Nd

Ejemplo 7: Expresion recombinante y purificacion de anticuerpos Desarrollo de la lmea celular estable que expresa anticuerpos

30 Se sintetizaron oligonucleotidos solapantes correspondientes a la secuencia primaria del dominio variable de la cadena ligera o la cadena pesada para la hebra tanto efectora como antisentido. Esta reserva de oligonucleotidos se empleo en una PCR convencional. El producto de esta primera reaccion se utilizo como molde en una segunda amplificacion por PCR. Los fragmentos de la cadena pesada variable y de la cadena ligera variable amplificados se subclonaron en un vector intermedio y se secuenciaron para identificar los productos libres de errores. El fragmento 35 de la cadena pesada variable se clono en un vector de expresion transitoria que contema un peptido senal y una

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

region constante de IgG2 humana. El fragmento de la cadena ligera variable se clono en un vector de expresion transitoria que contema un peptido senal y una region constante lambda humana. El gen completo de la cadena pesada se transfirio al vector pDC324. El gen completo de la cadena ligera se transfirio al vector de expresion, pDC323.

Los celulas anfitrionas CS-9 utilizadas para la transfeccion de los plasmidos de expresion anti-LPET son una lmea celular CHO derivada de celulas DXB-11 a traves de la adaptacion a un medio libre de suero (Rasmussen et al, Cytotechnology 28: 31-42, 1998). Las lmeas celulares anti-LPET se crearon mediante la transfeccion de las celulas anfitrionas CS-9 con los plasmidos de expresion pDC323-anti-LPET-lambda y pDC324-anti-LPET-IgG2 utilizando procedimientos de electroporacion o de lipofeccion convencionales. Despues de la transfeccion de la lmea de celulas anfitrionas con los plasmidos de expresion, las celulas se cultivaron en medio de seleccion durante 2-3 semanas para permitir la seleccion de los plasmidos y la recuperacion de las celulas. En algunos casos, el medio fue complementado con suero bovino fetal dializado al 3% (ds o DFBS). Si se utilizaba el suero, este se retiraba del medio despues del penodo de seleccion. Las celulas se cultivaron en medio selectivo hasta que alcanzaron > 85% de viabilidad. Esta reserva de celulas transfectadas se cultivo a continuacion en medio de cultivo.

Clonacion de la lmea celular

Se elaboro un banco de celulas de clones seleccionados de acuerdo con el siguiente procedimiento. La etapa de clonacion asegura que las poblaciones clonales y los bancos de celulas se generaron permitiendo un funcionamiento reproducible en la fabricacion comercial. Se sembro una reserva amplificada de las celulas que expresaban los anticuerpos bajo dilucion limitante en placas de 96 pocillos, y se evaluaron los clones candidato para determinar el crecimiento y la productividad en estudios a pequena escala.

Ejemplo 8: Competencia cruzada de anticuerpos

Una manera comun de definir epftopos es a traves de experimentos de competicion. Se puede considerar que los anticuerpos que compiten entre sf se unen al mismo sitio sobre la diana. Este ejemplo describe un metodo de determinacion de la competencia por la union a LPET y los resultados del metodo cuando se aplica a numerosos anticuerpos descritos en la presente memoria.

Los experimentos de agrupamiento de pfxeles ("binning") se pueden llevar a cabo de numerosas maneras, y el metodo empleado puede tener un efecto sobre los resultados del analisis. Es comun a estos metodos que la LpET sea unida tipicamente por un anticuerpo de referencia y sondeada por otro. Si el anticuerpo de referencia evita a continuacion la union del anticuerpo sonda, se dice que los anticuerpos estan en el mismo grupo ("bin"). El orden en el que se emplean los anticuerpos es importante. Si el anticuerpo A se emplea como anticuerpo de referencia y bloquea la union del anticuerpo B, lo contrario no siempre es cierto: el uso del anticuerpo B como anticuerpo de referencia no necesariamente va a bloquear el anticuerpo A. Hay una serie de factores en juego aquft la union de un anticuerpo puede causar cambios conformacionales en la diana que impiden la union del segundo anticuerpo, o epftopos que se superponen pero no se ocluyen por completo entre sf pueden permitir que el segundo anticuerpo tenga todavfa suficientes interacciones de alta afinidad con la diana como para permitir la union. Los anticuerpos con una afinidad mucho mas alta pueden tener una mayor capacidad para lanzar un anticuerpo de bloqueo fuera del camino. En general, si se observa competencia en cualquier orden se dice que los anticuerpos se agrupan juntos, y si los dos anticuerpos pueden bloquearse entre sf, entonces es probable que los epftopos se solapen de forma mas completa.

Para este ejemplo, se utilizo una modificacion del metodo Multiplexed Binning descrito por Jia, et al. (J. Immunological Methods, 288 (2004) 91-98). Debido a la presencia de un sitio de escision de furina dentro de LPET, que puede conducir a la heterogeneidad de las preparaciones de protema LPET, se utilizo una LPET que tema la arginina del sitio de escision de furina mutado a alanina. Vease el documento U.S. 7.288.633. Cada Codigo de Cuenta (Bead Code) de las cuentas de Luminex recubiertas con estreptavidina (Luminex, Num. L100-L1XX-01, XX especifica el codigo de cuenta) se incubo en 100 pl de 6 pg/cuenta de anticuerpo de captura anti-IgG humana de raton monovalente biotinilado (BD Pharmingen, Num. 555785) durante 1 hora a la temperatura ambiente en la oscuridad, despues se lavaron 3 veces con PBSA, solucion salina tamponada con fosfato (PBS) mas albumina de suero bovino al 1% (BSA). Cada codigo de cuenta se incubo por separado con 100 pl de una dilucion 1:10 de anticuerpo anti-LPET (Anticuerpo de Recubrimiento) durante 1 hora, luego se lavo. Las cuentas se reunieron, a continuacion se dispensaron a una placa de filtro de 96 pocillos (Millipore, Num. MSBVN1250). Se anadieron 100 pl de LPET 2 pg/ml de LPET parental a la mitad de los pocillos y tampon a la otra mitad y se incubaron durante 1 hora, despues se lavaron. Se anadieron 100 pl de una dilucion 1:10 de anticuerpo anti-LPET (Deteccion de Ab) a un pocillo con LPET y un pocillo sin LPET, se incubaron durante 1 hora, despues se lavaron. Se ejecutaron una IgG humana irrelevante (Jackson, Num. 009-000-003), asf como un estado sin anticuerpo (blanco) como controles negativos. Se anadieron 20 pl de anticuerpo anti-IgG humana de raton monovalente conjugado con PE (BD Pharmingen, Num. 555787) a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora, despues se lavaron. Las cuentas se volvieron a suspender en 75 pl de PBSA y se recogieron al menos 100 eventos/codigo de cuenta en el aparato BioPlex (BioRad).

Se resto la Mediana de la Intensidad de Fluorescencia (MFI) del par de anticuerpos sin LPET de la senal de la

reaccion correspondiente que contema LPET. Para considerar que el par de anticuerpos esta unido simultaneamente, y por lo tanto en diferentes grupos, el valor de la reaccion tema que cumplir dos criterios: 1) los valores teman que ser de 2 veces mayores que el anticuerpo de recubrimiento emparejado consigo mismo, el irrelevante o el blanco, lo que fuera mas alto, y 2) los valores teman que ser mayores que la senal del anticuerpo de 5 deteccion presente con las cuentas recubiertas con el irrelevante o con el blanco.

El analisis de la competencia entre los anticuerpos se complica por el hecho de que habfa una incongruencia entre el rendimiento de los anticuerpos como sondas frente a su rendimiento como bloqueadores. Sin embargo, si se teman en cuenta solo los grupos de anticuerpos que eran inequvocos (es decir, cada anticuerpo bloqueara los otros cuando se utilice como una referencia) se encontraba un mmimo de ocho grupos como se muestra en la Tabla 4 a 10 continuacion.

Tabla 4

Grupo 1: 2 3 4 5 6 7 8

A5: A6 A27 A24 A10 A4 A2 A23

A17: A7 A11 A12 A26 A23 A21 A6

A6: A11 A24 A10 A4



: A26

Es notable que algunos anticuerpos, tales como A23 y A6, se encuentran en multiples grupos. Es posible determinar otras relaciones de agrupacion, y la inclusion o exclusion de anticuerpos a partir de estos grupos era sesgada hacia 15 la exclusion.

Los resultados del analisis determinaron cual de los otros anticuerpos competfa de manera cruzada por la union con el anticuerpo de referencia. Por "compite de manera cruzada por la union" se entiende que el anticuerpo de referencia, cuando se utiliza como anticuerpo de bloqueo, es capaz de bloquear la union del otro anticuerpo cuando se utiliza como una sonda y viceversa. En otras palabras, si el anticuerpo de referencia era capaz de bloquear el otro 20 anticuerpo, pero el otro anticuerpo no era capaz de bloquear el anticuerpo de referencia, no se diria que los anticuerpos presentan competencia cruzada. Una lista de los anticuerpos que presentan competencia cruzada se proporciona en la Tabla 5.

Tabla 5

Anticuerpo de referencia: Anticuerpos que presentan competencia cruzada ilustrativos

A2: A21, A23

A4: A10, A23, A26

A5: A6, A8, A11, A17

A6: A5, A7, A8, A11, A17, A23

A7: A6, A8, A11, A17

A8: A5, A6, A7, A17, A23

A10: A4, A12, A24, A26

A11: A5, A6, A7, A17, A24, A27

A12: A10, A24, A26

5

10

15

20

25

30

35

40

A17: A5, A6, A7, A8, A11

A21: A2, A23, A27

A23: A2, A4, A6, A8, A21

A24: A10, A11, A12, A26, A27

A26: A4, A 10, A 12, A24

A27: A11, A21, A24

Ejemplo 9: Mapeo epitopico

Mientras que a menudo se consideran que los epftopos son secuencias lineales, es mas frecuente el caso en el que un anticuerpo reconoce una cara de la diana que se compone de aminoacidos discontinuos. Estos aminoacidos pueden estar muy separados sobre la secuencia lineal pero aproximarse por medio del plegamiento de la diana, y los anticuerpos que reconocen semejante epftopo se conocen como anticuerpos sensibles a la conformacion o simplemente conformacionales. Este tipo de union se puede definir mediante el uso de transferencias Western desnaturalizadas, en donde antes de circular sobre un gel la diana se calienta en presencia de detergente y un agente reductor para desplegarla. La transferencia de este gel puede ser sondeada a continuacion por anticuerpos, y un anticuerpo que sea capaz de reconocer la diana despues de este tratamiento probablemente reconozca un epftopo lineal. Aunque los epftopos de anticuerpos que unen secuencias lineales pueden ser definidos mediante la union a peptidos (p. ej., PepSpot), no se esperana que los anticuerpos conformacionales se unieran a peptidos convencionales con alta afinidad.

Se cargo protema LPET parental purificada, desnaturalizada por calor, reducida sobre gel Bis-Tris NuPAGE al 10% en Tampon de Migracion MES SDS. La protema se transfirio a una membrana PVDF, se bloqueo con leche en polvo desnatada al 5% (NFDM) en PBS + Tween al 0,05% (PBST), y se incubo con anticuerpos para LPET durante 1 hora a RT. Las transferencias se lavaron 3 veces en PBST, despues se incubaron con un anticuerpo secundario anti- hulgG de cabra durante 1 hora a la RT. Las transferencias se lavaron de nuevo y se incubaron con anti-IgG de cabra:Alexa 680. Despues de lavar 3 veces en PBST, las transferencias se escanearon en el LiCor para visualizar las bandas.

Los anticuerpos A2, A4, A5, A6, A7, A10, A21, A23, y A26 se caracterizaron utilizando este metodo. Los anticuerpos A2, A4, y A5 se unieron al epftopo lineal como se evidencia por una banda fuerte en la Transferencia Western. Todos los otros anticuerpos fueron conformacionales debido a las bandas nulas o muy debiles en la Transferencia Western.

Los epftopos se pueden definir adicionalmente como estructurales o funcionales. Los epftopos funcionales son generalmente un subconjunto de los epftopos estructurales y consisten en aquellos residuos que contribuyen directamente a la afinidad de la interaccion (p. ej., enlaces de hidrogeno, interacciones ionicas). Los epftopos estructurales pueden ser considerados como el parche de la diana que esta cubierta por el anticuerpo.

Se empleo la mutagenesis de barrido para definir aun mas los epftopos unidos por los anticuerpos. Se utiliza una mutagenesis de barrido con alanina con frecuencia para definir los epftopos funcionales; la sustitucion de alanina (cadena lateral de metilo) es esencialmente una amputacion de la cadena lateral de tipo salvaje de los aminoacidos y es bastante sutil. Las interacciones con el esqueleto de la protema, tales como la union de hidrogeno a los enlaces amida, probablemente no se revelanan con el barrido de alanina. En su lugar, se utilizo mutagenesis de barrido con arginina y acido glutamico. Estas dos cadenas laterales se eligieron debido a su gran volumen esterico y su carga, que permiten que las mutaciones que se producen en el epftopo estructural tengan un mayor efecto sobre la union del anticuerpo. La arginina se empleaba generalmente excepto cuando el residuo WT era arginina o lisina, y en estos casos el residuo se mutaba a acido glutamico para cambiar la carga. En algunos casos, el residuo WT se mutaba tanto a arginina como a acido glutamico.

Se seleccionaron noventa y cinco aminoacidos, distribuidos a lo largo de LPET, para la mutacion a arginina o acido glutamico. Puesto que los residuos hidrofobos se encuentran generalmente en el interior del nucleo plegado de una protema, la seleccion se sesgada hacia aminoacidos cargados o polares para reducir la probabilidad de que la mutacion diera como resultado una protema mal plegada. Como no habfa estructura cristalina, estos residuos se eligieron esencialmente al azar y se distribuyeron en toda la LPET. Como se describe en el Ejemplo 8, se utilizo una

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

LPET que contema un sitio de escision de furina mutado.

Se utilizo un analisis de union BioPlex™ para medir la union de los anticuerpos anti-LPET a LPET mutante. Se unio un Ab Penta-His biotinilado (Qiagen, Lote Num: 130163339) sobre 100 codigos de cuentas de cuentas recubiertas de estreptavidina (Luminex, Num L100-L1XX-01, XX especifica el codigo de cuenta). Estos se utilizaron para capturar la protema etiquetada con His. Los 100 codigos de cuenta permitieron la multiplexacion de los 85 mutantes, 3 controles parentales, una protema irrelevante y 12 blancos. La union del anticuerpo a la protema mutante se comparo con la union del anticuerpo al parental.

Se unieron 100 pl de una dilucion 1:5 de los mutantes de LPET y los parentales en sobrenadante y 1 pg/ml de LPET WT purificada, 1 pg/ml de protema irrelevante o ninguna protema a las cuentas recubiertas durante 1 hora a la RT con agitacion vigorosa. Las cuentas se lavaron y se dividieron en almuotas en una placa de filtro de 96 pocillos (Millipore). Se anadieron 100 pl de anticuerpos anti-LPET en diluciones a la cuarta a pocillos por triplicado, se incubaron durante 0,5 horas a la temperatura ambiente y se lavaron. Se anadieron 100 pl de una dilucion 1:250 de anti-Fc de IgG humana conjugada con PE (Jackson, Num. 109-116-170) a cada pocillo, se incubaron durante 0,5 horas y se lavaron. Las cuentas se volvieron a suspender en 75 pL, se agitaron durante al menos 3 min, y se leyeron en el BioPlex™.

Un residuo se consideraba parte del epttopo estructural (un "exito") cuando al mutarlo a arginina o acido glutamico interrumpfa la union del anticuerpo. Esto se observo como un desplazamiento en la CE50 o una reduccion de la senal maxima en comparacion con la union del anticuerpo a LPET parental.

Se utilizaron analisis estadfsticos de curvas de union de anticuerpos a parentales y mutantes para identificar los desplazamientos de EC50 estadfsticamente significativos. El analisis tuvo en cuenta la variacion en el analisis y el ajuste de curvas.

Se compararon las CE50 de las curvas de union a los mutantes y de las curvas de union a los parentales. Se identificaron las diferencias estadfsticamente significativas como exitos para una consideracion adicional. Las curvas con etiquetas "sin ajuste" o "mal ajuste" fueron excluidas de este analisis.

Se consideraron dos fuentes de variaciones en la comparacion de las estimaciones de la CE50, la variacion del ajuste de la curva y la variacion de cuenta a cuenta. Los parentales y los mutantes estaban ligados a diferentes cuentas, por lo tanto, su diferencia se confundfa con la diferencia de cuenta a cuenta. La variacion del ajuste de la curva se estimo por medio del error tfpico de las estimaciones de la CE50 de registro. La variacion de cuenta a cuenta se determino experimentalmente usando un experimento donde los controles parentales estaban ligados a cada una de las cuentas. La variacion de las cuentas en las estimaciones de la CE50 de la curva de union parental se utilizo para estimar la variacion de cuenta a cuenta.

Las comparaciones de dos CE50 (en escala logantmica) se llevaron a cabo utilizando la prueba t de Student. Un estadfstico t se calcula como la razon entre delta (las diferencias absolutas entre las estimaciones de CE50) y la desviacion tfpica de delta. La varianza de delta se calcula por la suma de los tres componentes, la estimacion de la varianza de CE50 para las curvas mutantes y parentales en la regresion no lineal y dos veces la varianza de cuenta a cuenta estimada a partir de un experimento separado. El multiplo de dos para la varianza de cuenta a cuenta se debe a la suposicion de que tanto las cuentas mutantes como parentales tienen la misma varianza.

El grado de libertad de la desviacion tfpica de delta se calculo utilizando la aproximacion de Satterthwaite (1946). Los valores de p individuales y los intervalos de confianza (95% y 99%) se obtuvieron basandose en la distribucion de la t de Student para cada comparacion. En el caso de multiples controles parentales, se implemento un enfoque conservativo escogiendo el control parental que era mas similar al mutante, es decir, escogiendo aquellos con los valores de p mayores.

Los ajustes de multiplicidad fueron importantes para controlar los falsos positivos a la vez que se llevo a cabo un gran numero de ensayos de forma simultanea. Se llevaron a cabo dos formas de ajuste de la multiplicidad para este analisis: el control del error global (FWE por sus siglas en ingles) y el control de la tasa de falso descubrimiento (FDR por sus siglas en ingles). El enfoque FWE controla la probabilidad de que uno o mas exitos no sean reales; el enfoque FDR controla la proporcion esperada de falsos positivos entre los exitos seleccionados. El primer enfoque es mas conservativo y menos potente que el ultimo. Hay muchos metodos disponibles para ambos enfoques, para este analisis, se eligio el metodo de Hochberg (1988) para el analisis de FWE y el metodo de FDR de Benjamini- Hochberg (1995) para el analisis de FDR. Los valores de p ajustados para ambos enfoques se calcularon para cada anticuerpo o para todo el analisis.

Las mutaciones cuya CE50 fue significativamente diferente de la parental, es decir, que teman un valor de p ajustado a FWE para cada anticuerpo de menos de 0,01, o una senal maxima por debajo de 50% de la parental fueron consideradas parte del epttopo estructural (Tabla 6). Las mutaciones que fueron significativas por un desplazamiento de la CE50 o una reduccion de la senal maxima para todos los anticuerpos se consideraron mal plegadas. Estas mutaciones fueron; Y15R, T55R, T74R y A77R.

Tabla 6. Resumen de mutaciones que afectan a la union del anticuerpo en BioPlex y son parte del epttopo

5

10

15

20

25

estructural.

Anticuerpo: Lineal Aumento de la afinidad de union Disminucion de la afinidad de union

A2: Si K67E, K97E, K98E, R100E, K101E, K103E K21E, T25R, S28R, S64R, K73E

A4: Si K97E, K98E, R100E, K101E, K103E K10E, A14R, K21E, D22R, K73E, K75E, A76R

A5: Si K12E, D22R, S40R, R122E, N124E, R125E, K129E

A6: No S40R, S42R, H46R, R122E, K129E

A7: No K101E D2R, T4R, D7R, S42R, H46R, T49R, E50R, Q112R, R122E, R125E, K129E

A10: No K97E, K98E, R100E, K101E, K103E N5R, S17R, T18R, K21E, D22R, T25R, T33R, H46R, A63R, S64R, A66R, E68R, K73E, K75E, A76R, A92R, T93R, Q94R, A95R

A21: No K97E, K98E, R100E, K101E, K103E K21E, K21R, D22R, T25R, T33R, S64R, K73E, K75E, E111R, S114R

A23: No K67E, K97E, K98E, R100E, K101E, K103E E9R, K10E, K12E, A13R, S17R, S20R, K21E, K21R, K73E, K75E, N124E, R125E

A26: No K97E, K98E, R100E, K101E, K103E A14R, K21E, D22R, A63R, S64R, K67E, K73E, A76R, A92R, A95R

Habfa varias mutaciones que interruirpan la union de multiples anticuerpos, en particular K73E, K21E, y D22R. La mutagenesis sirve para verificar los datos generados por el agrupamiento y para estrechar aun mas en el espacio del epftopo. Las mutaciones en LPET parecen afectara agrupaciones de anticuerpos que se agrupan juntos.

Ejemplo 10: Toxicologfa

Los anticuerpos que se unen a LPET humana pero tambien presentan reaccion cruzada con LPET de otras especies permiten ensayos de toxicologfa en esas especies. En este ejemplo, se administro un anticuerpo que reaccionaba de forma cruzada con LPET de mono cinomolgo a monos cinomolgos. Los monos se observaron a continuacion para determinar los efectos toxicos.

Un estudio de farmacologfa de seguridad de dosis unica en monos cinomolgos indica que una sola dosis intravenosa de 300 mg/kg del anticuerpo no tema efectos cardiovasculares, respiratorios, sobre la temperatura corporal, o neuroconductuales.

A los monos cinomolgos (5/sexo/grupo) se les administraron dosis de 30, 100 o 300 mg/kg una vez por semana durante 4 semanas, por via subcutanea. No se observo toxicologfa adversa a ninguna dosis. El anticuerpo no afecto a las observaciones clmicas, al peso corporal, a la oftalmologfa, a los ECG, a la patologfa clinica o a la patologfa anatomica.

En un estudio separado, a cuatro monos cinomolgos sometidos a telemetna se les administro una sola dosis intravenosa de vehfculo (dfa 1) y 300 mg/kg de anticuerpo (dfa 3). Durante un periodo de observacion de cuatro dfas no se observaron efectos sobre las enfermedades cardiovasculares, respiratorias, o sobre la funcion neurologica.

El anticuerpo se sometio a ensayo adicionalmente para determinar la reactividad cruzada con tejido humano normal y de mono cinomolgo como se recomienda en la grna de la FDA "Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Atibody Products for Human Use" (FDA Center for Biologics Evaluation and Research, 28 de Febrero de 1997). No se observo tincion del tejido normal a 1 o 50 pg/ml.

Los resultados anteriores sugieren que no se espera que el anticuerpo produzca efectos toxicos en los seres humanos.

Claims

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1. Un anticuerpo humano anti-LPET que comprende:

a. un dominio variable de cadena ligera que comprende:

i. una secuencia CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos del SEQ ID NO: 13;

ii. una secuencia CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos del SEQ ID NO: 60; y

iii. una secuencia CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos del SEQ ID NO: 105; y

b. un dominio variable de cadena pesada que comprende:

i. una secuencia CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos del SEQ

ID NO: 145;

ii. una secuencia CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos del SEQ ID NO:173; y

iii. una secuencia CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos del SEQ ID NO: 212; y
2. El anticuerpo humano anti-LPET de la reivindicacion 1, que comprende:

a. una secuencia del dominio variable de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste en:

i. aminoacidos que tienen una secuencia identica en al menos 80% al SEQ ID NO: 363;

ii. una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de polinucleotidos que es identica

en al menos 80% al SEQ ID NO: 362;

iii. una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de polinucleotido que hibrida en condiciones moderadamente rigurosas con el complemento de un polinucleotido que consiste en el SEQ ID NO: 362;

y

b. una secuencia del dominio variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en:

i. una secuencia de aminoacidos que es identica en al menos 80% al SEQ ID NO: 361;

ii. una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de polinucleotido que es identica en el menos 80% al SEC ID NO: 360;

iii. una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de polinucleotido que hibrida en condiciones moderadamente rigurosas con el complemento de un polinucleotido que consiste en el SEQ ID NO: 360;
3. El anticuerpo humano anti-LPET de la reivindicacion 1, que comprende:

un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 363 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia del SEQ ID NO: 361.
4. El anticuerpo humano anti-LPET de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde

a. el anticuerpo humano anti-LPET se une a LPET sustancialmente con la misma Kd que un anticuerpo de referencia, y/o

b. en donde el anticuerpo humano anti-LPET inhibe la actividad de LPET de acuerdo con el analisis de OPG de celulas primarias con la misma CI50 que un anticuerpo de referencia,

en donde dicho anticuerpo de referencia es un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos del SEQ ID NO: 363 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos del SEQ ID NO: 361.
5. Una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo humano anti-LPET de una cualquiera de las

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reivindicaciones 1-4.
6. Un acido nucleico que comprende una secuencia de polinucleotido que codifica el dominio variable de cadena ligera y el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo humano anti-LPET de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
7. Un vector de expresion recombinante que comprende el acido nucleico de la reivindicacion 6.
8. Una celula anfitriona que comprende

a) un vector de expresion que comprende un polinucleotido que codifica el dominio variable de cadena ligera y el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo humano anti-LPET de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4; o

b) un vector de expresion que comprende un polinucleotido que codifica el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo humano anti-LPET de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y un vector de expresion que comprende un polinucleotido que codifica el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo humano anti-LPET de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
9. Un hibridoma capaz de producir el anticuerpo humano anti-LPET de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
10. Un metodo de produccion del anticuerpo humano anti-LPET de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende incubar la celula anfitriona de la reivindicacion 8, en condiciones que permiten expresar el anticuerpo.
11. Una composicion de acuerdo con la reivindicacion 5, para su uso en el tratamiento de

a. una afeccion inflamatoria relacionada con LPET en un sujeto que necesita semejante tratamiento; o b un trastorno fibrotico relacionado con LPET en un sujeto que necesite semejante tratamiento.
12. La composicion para su uso de la reivindicacion 11, en donde la afeccion inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en asma alergica, rinosinusitis alergica, conjuntivitis alergica, y dermatitis atopica.
13. La composicion para su uso de la reivindicacion 11, en donde el trastorno fibrotico se selecciona del grupo que consiste en esclerodermia, enfermedad pulmonar intersticial, fibrosis pulmonar idiopatica, fibrosis que se produce a partir de hepatitis B o C cronica, fibrosis inducida por radiacion, y fibrosis que se produce a partir de la curacion de heridas.
14. El anticuerpo humano anti-LPET de la reivindicacion 1, en donde dicho anticuerpo humano anti-LPET es un anticuerpo monoclonal.
15. El anticuerpo humano anti-LPET de la reivindicacion 1, en donde dicho anticuerpo humano anti-LPET comprende a) una cadena ligera que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en el SEQ ID NO: 363 y un dominio constante de cadena ligera lambda que comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en el SEQ ID NO: 369; y b) una cadena pesada que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en el SEQ ID NO: 361 y un dominio constante pesado de IgG2 que comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en el SEQ ID NO: 365.
16. El metodo de la reivindicacion 10, en donde la celula anfitriona es una celula CHO.
17. Un anticuerpo humano anti-LPET obtenible mediante el metodo de la reivindicacion 16.