EA039598B1

EA039598B1 - Соединение, нацеленное на ил-23а и фно-альфа, и его применение

Info

Publication number: EA039598B1
Application number: EA201790505A
Authority: EA
Inventors: Рейчел Ребекка Барретт; Лесли С. Джонсон; Санджайа Сингх; Кэтлин Ласт-Барни; До-Цун Син; Патрисия Гиблин; Скотт Бродёр; Неламангала Нагараджа
Original assignee: Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх; Мэкроудженикс, Инк.
Priority date: 2014-09-03
Filing date: 2015-09-03
Publication date: 2022-02-15
Also published as: JP7072600B2; CA2959629A1; CA2959629C; EA202193002A2; US10059763B2; EP3189153B1; ZA201701384B; PH12017500370A1; SG11201701423RA; EA039598B9; CN107109456B; MX2021014663A; AU2015311913A1; US20230382988A1; TWI711629B; US20160060338A1; CL2017000525A1; UA123624C2; US20190016794A1; AR101753A1

Abstract

Изобретение связано с соединениями, специфическими к ИЛ-23А и ФНО-альфа, композициями, содержащими соединения, и способами их применения. Также раскрыты нуклеиновые кислоты, клетки и способы производства, связанные с соединениями и композициями.

Description

Родственные заявки

В данной заявке заявляется приоритет по дате подачи согласно 35 USC. §119 по предварительной заявке США с серийным номером 62/045498, поданной 3 сентября 2014, которая называется Соединение нацеленое на ИЛ-23А и ФНО-АЛЬФА, и его применение, содержание которой в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки.

Уровень техники

Воспаление включает в себя врожденный и адаптивный иммунный ответ, необходимый для борьбы с инфекцией. Однако когда воспаление становится неконтролируемым, могут развиться аутоиммунные и аутовоспалительные заболевания, нейродегенеративные заболевания и даже рак. Установлено, что ингибирование активности провоспалительных цитокинов, таких как ИЛ1, ФНО-альфа, ИЛ6, ИЛ 12, ИЛ17, ИЛ18, или ИЛ23, уменьшает воспаление и подавляет специфические пути, которые активируют иммунные клетки.

Интерлейкин-23 (ИЛ23) представляет собой гетеродимерний цитокин, который состоит из двух субъединиц, р40 и р19. Субъединицу р19 также называют ИЛ-23А. В то время как субъединица р19 является уникальной для ИЛ23, субъединица р40 также является частью цитокина ИЛ12. Было выяснено, что ИЛ23 представляет собой ключевой регулятор патогенных Th17, γδ Т и врожденных лимфоидных клеток (ВЛК), которые запускают продуцирование ИЛ17, ИЛ22 и других цитокинов, что приводит к воспалению местных тканей и их повреждению. ИЛ23 способствует повышенной активности матриксной металлопротеазы ММР9, повышает ангиогенез, снижает инфильтрацию CD8+ Т-клеток и вовлечен в развитие раковых опухолей. Кроме этого, в сочетании с ИЛ6 и ФНО-бета 1 ИЛ23 стимулирует необученные CD4+ Т-клетки к дифференции в клетки Th17. В свою очередь, Th17 клетки производят ИЛ17, провоспалительный цитокин, который усиливает Т-клеточное примирование и стимулирует выработку провоспалительных цитокинов, таких как ИЛ1, ИЛ6, ФНО-альфа, NOS-2, а также индуцирует экспрессию хемокинов, что приводит к воспалению и патогенезу болезни. ИЛ23 проявляет свое влияние через поверхностный клеточный рецептор, который состоит из ИЛ12Р1 субъединицы рецептора ИЛ12, которая работает вместе с уникальной субъединицей ИЛ23R. Экспрессия ИЛ23R происходит только в отдельных популяциях иммунных клеток и обнаружена главным образом в субпопуляциях Т-клеток (αβ и γδ TCR+) и NK-клетках (натуральные киллеры).

У мышей генетическая абляция гена ИЛ23р19 приводит к селективной потери функции ИЛ23, которая сопровождается значительным нарушением Т-зависимых иммунных ответов, в том числе пониженным производством антиген-специфических иммуноглобулинов и ослабленными реакциями задержанной гиперчувствительности (Ghilardi N, et al. (2004) J. Immunol. 172 (5): 2827-33). В нокаутных мышах с недостатком или ИЛ23р40, или ИЛ23р19, или любой субъединицы рецептора ИЛ23 (ИЛ23R и ИЛ12-бета1), развиваются менее тяжелые симптомы в животных моделях рассеянного склероза, артрита и воспалительных заболеваний кишечника. Аналогичные результаты были получены при использовании специфических антител для ИЛ23р19 в ЕАЕ, и опосредованная Т-клеточная модель колита дополнительно подтверждает роль ИЛ23 в этих параметрах заболевания (Chen Y. et al. (2006) J. Clin. Invet. 116 (5): 1317-26; Elson CO. et al. (2007) Gastroenterology 132 (7): 2359-70). Это подчеркивает важность ИЛ23 в хроническом воспалении (Langowski et al. (2006) Nature 442 (7101): 461-5; Kikly K., et al. (2006) Curr. Opin. Immunol. 18 (6): 670-5). Кроме этого, повышенное продуцирование ИЛ23 рассматривается как основной фактор при воспалительных артритах и аутоиммунных воспалительных заболеваниях (Adamopoulos et al. (2011) J. Immunol. 187: 593-594 и Langris et al. (2005) J. Exp. Med. 201:233-240). Сообщается о связи между ИЛ23, его нисходящим цитокином ИЛ22 и формированием костной ткани в мышиной модельной системе, в которой ИЛ23 избыточно экспрессируется (Sherlock et al. (2012) Nat. Med. 18: 106976).

Гомотримерний ФНО-α цитокин экспрессируется преимущественно макрофагами, лимфоцитами, эпителиальными клетками, фибробластами и связывается с двумя разными типами рецепторов: ΦΗΟΡΙ (рецептор 1 ФНО), который экспрессируется на многих типах клеток, и ФНОРП (рецептор 2 ФНО), с более ограниченной экспрессией на иммунных клетках (CD4+ Т-клетки, NK-клетки). Как и многие другие члены суперсимейства ФНО, ФНО-α существует как в мембранной, так и в растворимой форме, растворимые формы возникают при расщеплении мембранной формы металлопротеазой ADAM12 (ТАСЕ, ФНО-α преобразующей фермент). Обе, связанная с мембраной и растворимая формы цитокинов, являются биологически активными.

Фактор некроза опухоли (ФНО-альфа, ФНО-α) представляет собой провоспалительный цитокин, который стимулирует острую фазу воспаления. Фактор некроза опухоли увеличивает коэффициент проницаемости сосудов за счет индукции ИЛ8, тем самым привлекая макрофагов и нейтрофилов к месту инфекции. После этого активированные макрофаги продолжают производить ФНО-альфа, тем самым поддерживая и усиливая воспалительную реакцию. Главная роль ФНО-альфа заключается в регуляции иммунных клеток; однако ФНО-альфа также участвует в регуляции широкого спектра биологических процессов, которые включают клеточную пролиферацию, дифференциацию, апоптоз, метаболизм липидов и свертывания крови. ФНО-альфа может вызвать воспаление, способен индуцировать гибель клеток

- 1 039598 через апоптоз, ингибировать онкогенез, и ингибировать репликацию вирусов.

Нарушение регуляции выработки ФНО-альфа имеет место при множестве человеческих заболеваний, включая аутоиммунные заболевания (например, ревматоидный артрит (РА), болезнь Крона, рассеянный склероз), воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), язвенный колит, псориаз, токсический шок, реакцию трансплантанта против хозяина, инсулинорезистентность, болезнь Альцгеймера, рак и тяжелую депрессию (Swardfager W., et al. (2010) Biol Psychiatry 68 (10): 930-941; (Locksley RM, et al. (2001) Cell 104 (4): 487-501; Dowlati et al., (2010) Biol Psychiatry 67 (5): 446-457; Brynskov J. et al. (2002) Gut 51 (1): 37-43).

Были применены антитела в качестве биологической терапии для ингибирования ФНО-альфа и ИЛ23 при лечении различных воспалительных заболеваний. Infliximab (Centocor, Малверн, Пенсильвания), который описан в патентах США №№ 6277969, 6284471 и 6790444, представляет собой химерное анти-ФНО-альфа моноклональное IgG антитело, которое несет константные области человеческого IgG4 и вариабельные области мыши, и применяется в клинике для лечения ревматоидного артрита, псориатического артрита, анкилозирующего спондилита, болезни Крона, язвенного колита и бляшечного спориаза. Моноклональное антитело адалимумаб (клон D2E7; Abbott Laboratories, Эбботт Парк, Иллинойс), описанное в патенте США № 6090382, представляет собой анти-ФНО-альфа препарат, который применяют в клинике для лечения ревматоидного артрита, болезни Крона, псориаза, псориатического артрита, анкилозирующего спондилоартрита, ювенильного идиопатического артрита. Голимумаб представляет собой блокатор ФНО-альфа, который применяется для лечения ревматоидного артрита, псориатического артрита, анкилозирующего спондилита и неспецифического язвенного колита. Кроме этого, человеческое моноклональное антитело устекинумаб (Centocor, Inc, Малверн, Пенсильвания), описанное в патенте США № 6902734 и патенте США № 7166285, направленное против интерлейкина 12 и интерлейкина 23 (особенно р40 субъединицы), применяется в клинике для лечения тяжелого бляшковидного псориаза и дополнительно изучается для лечения псориатического артрита, рассеянного склероза и саркоидоза. Однако, анти-ФНО-α терапии имеют зарегистрированные побочные эффекты [см., например, Keane J et al. (2001)]. Туберкулез связан с инфликсимабом, нейтрализующим средством фактора некроза опухоли α. N Engl J Med 345 (15): 1098-1104; Scheinfeld N. (2005) Adalimumab: a review of side effects. Expert Opin Drug Saf. 4(4): 637-41; Chovel-Sella A et al. (2012) Clinical efficacy and adverse effects of golimumab in the treatment of rheumatoid arthritis. Isr Med Assoc J. 14 (6): 390-4]. Выявление более эффективных способов лечения позволит вводить меньшие дозы, а также снизит рассходы связанные с лечением.

Сохраняется потребность в композиции с повышенной эффективностью для лечения и предотвращения аутоиммунных или воспалительных заболеваний.

Сущность изобретения

В данном документе предлагаются соединения, специфические к ФНО-альфа и ИЛ23А, композиции, содержащие такие соединения, а также способы их применения и изготовления.

Аспекты раскрытия изобретения связаны с соединением, содержащим первый полипептид и второй полипептид, причем:

(А) указанный первый полипептид содержит:

(i) вариабельный домен легкой цепи первого иммуноглобулина (VL1), специфический к первому целевому белку;

(ii) вариабельный домен тяжелой цепи второго иммуноглобулина (VH2), специфический к второму целевому белку;

(iii) шарнирную область, константную область 2 тяжелой цепи (СН2) и константную область 3 тяжелой цепи (CH3); и (Б) указанный второй полипептид содержит:

(i) вариабельный домен легкой цепи второго иммуноглобулина (VL2), специфический к указанному второму целевому белку; и (ii) вариабельный домен тяжелой цепи первого иммуноглобулина (VH1), специфический к указанному первому целевому белку;

при этом:

(i) указанные VL1 и VH1 объединяются, чтобы сформировать сайт, связывающий указанный первый целевой белок;

(ii) указанные VL2 и VH2 объединяются, чтобы сформировать сайт, связывающий указанный второй целевой белок;

(iii) указанная константная область 2 тяжелой цепи (СН2) содержит тирозин в позиции 252, треонин в позиции 254 и глютаминовую кислоту в позиции 256, пронумерованные в соответствии с индексом EC согласно Kabat для обычного антитела; и (iv) указанный первый целевой белок представляет собой ФНО-альфа и указанный второй целевой белок представляет собой ИЛ-23А или указанный первый целевой белок представляет собой ИЛ-23А и указанный второй целевой белок представляет собой ФНО-альфа, при этом:

(i) указанный VL1 содержит SEQ ID NO: 2, указанный VH1 содержит SEQ ID NO: 1, указанный

- 2 039598

VL2 содержит SEQ ID NO: 8 и указанный VH2 содержит SEQ ID NO: 7; или (ii) указанный VL1 содержит SEQ ID NO: 4 или 6, указанный VH1 содержит SEQ ID NO: 3 или 5, указанный VL2 содержит SEQ ID NO: 8 и указанный VH2 содержит SEQ ID NO: 7; или (iii) указанный VL1 содержит SEQ ID NO: 8, указанный VH1 содержит SEQ ID NO: 7, указанный

VL2 содержит SEQ ID NO: 2 и указанный VH2 содержит SEQ ID NO: 1, или (iv) указанный VL1 содержит SEQ ID NO: 8, указанный VH1 содержит SEQ ID NO: 7, указанный VL2 содержит SEQ ID NO: 4 или 6, и указанный VH2 содержит SEQ ID NO: 3 или 5.

В некоторых вариантах реализации изобретения (ii) указанный VL1 содержит SEQ ID NO: 4, указанный VH1 содержит SEQ ID NO: 3, указанный VL2 содержит SEQ ID NO: 8 и указанный VH2 содержит SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах реализации изобретения (ii) указанный VL1 содержит SEQ ID NO: 6, указанный VH1 содержит SEQ ID NO: 5, указанный VL2 содержит SEQ ID NO: 8 и указанный VH2 содержит SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах реализации изобретения (iv) указанный VL2 содержит SEQ ID NO: 4, указанный VH2 содержит SEQ ID NO: 3, указанный VL1 содержит SEQ ID NO: 8 и указанный VH1 содержит SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах реализации изобретения (iv) указанный VL2 содержит SEQ ID NO: 6, указанный VH2 содержит SEQ ID NO: 5, указанный VL1 содержит SEQ ID NO: 8 и указанный VH1 содержит SEQ ID NO: 7.

В некоторых вариантах реализации изобретения указанный первый полипептид дополнительно содержит первый линкер между указанным VL1 и указанным VH2, а указанный второй полипептид дополнительно содержит второй линкер между указанными VL2 и указанным VH1. В некоторых вариантах реализации изобретения указанный первый линкер или указанный второй линкер содержит аминокислотную последовательность GGGSGGG (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации изобретения указанный первый линкер и указанный второй линкер содержат аминокислотную последовательность GGGSGGG (SEQ ID NO: 9).

В некоторых вариантах реализации изобретения, указанный первый полипептид дополнительно содержит домен константной области 1 тяжелой цепи (СН1) и указанный второй полипептид дополнительно содержит домен константной области легкой цепи (CL), причем указанный CL и указанный СН1 объединяются через дисульфидную связь, чтобы сформировать домен С1.

В некоторых вариантах реализации изобретения указанный первый полипептид дополнительно содержит третий линкер между указанным VH2 и указанным CH1, a указанный второй полипептид дополнительно содержит четвертый линкер между указанными VH1 и указанным CL. В некоторых вариантах реализации изобретения указанный третий линкер содержит аминокислотную последовательность FNRGES (SEQ ID NO: 11). В некоторых вариантах реализации изобретения указанный четвертый линкер содержит аминокислотную последовательность VEPKSS (SEQ ID NO: 12). В некоторых вариантах реализации изобретения указанный третий линкер содержит аминокислотную последовательность FNRGES (SEQ ID NO: 11) и указанный четвертый линкер содержит аминокислотную последовательность VEPKSS (SEQ ID NO: 12). В некоторых вариантах реализации изобретения третий линкер или указанный четвертый линкер содержит аминокислотную последовательность LGGGSG (SEQ ID NO: 10). В некоторых вариантах реализации изобретения указанный третий линкер и указанный четвертый линкер содержат аминокислотную последовательность LGGGSG (SEQ ID NO: 10).

В некоторых вариантах реализации изобретения указанная константная область 2 тяжелой цепи (СН2) содержит аланин в позиции 234 и аланин в позиции 235, пронумерованные в соответствии с индексом EC согласно Kabat для обычного антитела.

В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность указанной шарнирной области, указанной константной области 2 тяжелой цепи (СН2) или указанной константной области 3 тяжелой цепи (CH3), полученна с IgG1 или IgG4. В некоторых вариантах реализации изобретения, указанная шарнирная область содержит аминокислотную последовательность EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 40).

В некоторых вариантах реализации изобретения указанное соединение содержит два указанных первых полипептида и два указанных вторых полипептида, причем два указанных первых полипептида объединены через по меньшей мере одну дисульфидную связь. В некоторых вариантах реализации изобретения указанное соединение содержит два указанных первых полипептида и два указанных вторых полипептида, причем два указанных первых полипептида объединены через по меньшей мере одну дисульфидную связь, и при этом каждый указанный первый полипептид объединен с одним указанным вторым полипептидом через по меньшей мере одну дисульфидную связь. В некоторых вариантах реализации изобретения (i) указанный первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13 и указанный второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14;

(ii) указанный первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15 и указанный второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16;

(iii) указанный первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17 и указанный второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18;

(iv) указанный первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19

- 3 039598 и указанный второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20;

(v) указанный первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21 и указанный второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22;

(vi) указанный первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23 и указанный второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24;

(vii) указанный первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25 и указанный второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26;

(viii) указанный первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27 и указанный второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28;

(ix) указанный первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29 и указанный второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30;

(х) указанный первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31 и указанный второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32;

(xi) указанный первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33 и указанный второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34;

(xi) указанный первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35 и указанный второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36.

В некоторых вариантах реализации изобретения, указанное соединение отличается тем, что содержит два указанных первых полипептида и два указанных вторых полипептида, при этом указанные два первых полипептида объединены через по меньшей мере одну дисульфидную связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения, указанное соединение содержит два указанных первых полипептида и два указанных вторых полипептида, и при этом СН2 и CH3, и СН1, если имеются, одного из первых полипептидов, объединенные с СН2 и CH3, и СН1, если имеются, другого из первых полипептидов, образуя тетравалентную молекулу. В некоторых вариантах реализации изобретения, указанное соединение содержит два указанных первых полипептида и два указанных вторых полипептида, причем каждый из указанных первых полипептидов содержит CH1, CH2 и CH3, и каждый из указанных вторых полипептидов содержит CL, и при этом СН2 и CH3 одного из первых полипептидов объединяется с СН2 и CH3 другого с первых полипептидов, и СН1 каждого из указанных первых полипептидов объединяется с CL одного из указанных вторых полипептидов, образуя тетравалентную молекулу.

Другие аспекты раскрытия изобретения связаны с первым соединением, конкурирующим с другим соединением за связывание с ИЛ-23А и с ФНО-альфа, причем указанное первое соединение содержит третий полипептид и четвертый полипептид, при этом:

(А) указанный третий полипептид содержит:

(ii) вариабельный домен тяжелой цепи второго иммуноглобулина (VH2), специфический ко второму целевому белку; и (iii) шарнирную область, константную область 2 тяжелой цепи (СН2) и константную область 3 тяжелой цепи (CH3); и (Б) указанный четвертый полипептид содержит:

(i) вариабельный домен легкой цепи второго иммуноглобулина (VL2), специфический к указанному второму целевому белку; и (ii) вариабельный домен тяжелой цепи первого иммуноглобулина (VH1), специфический к указанному первому целевому белку; и при этом (i) указанный VL1 и указанный VH1 объединяются для того, чтобы сформировать сайт связывания, связывающий указанный первый целевой белок;

(ii) указанный VL2 и указанный VH2 объединяются для того, чтобы сформировать сайт, связывающий указанный второй целевой белок; и (iii) указанный первый целевой белок представляет собой ФНО-альфа и указанный второй целевой белок представляет собой ИЛ-23А, или указанный первый целевой белок представляет собой ИЛ-23А и указанный второй целевой белок представляет собой ФНО-альфа, и, причем указанное второе соединение содержит первый полипептид и второй полипептид, при этом:

(i) указанный первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13 и указанный второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14;

(iv) указанный первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19 и указанный второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20;

- 4 039598 (vi) указанный первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23 и указанный второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24;

(xii) указанный первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35 и указанный второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36.

Еще другие аспекты изобретения относятся к фармацевтической композиции, содержащей соединение, описанное в данном документе, такое как соединение, описанное выше.

Другие аспекты изобретения связаны со способом лечения аутоиммунного или воспалительного заболевания, включающим стадию, в которой субъекту вводят соединение, описанное в данном документе, такое как соединение, описанное выше, или фармацевтическую композицию, которая содержит указанное соединение.

Еще другие аспекты изобретения связаны с соединением, описанным в данном документе, таким как соединение, описанное выше, для применения в медицине. В некоторых вариантах реализации изобретения указанное применение представляет собой лечение аутоиммунного или воспалительного заболевания.

Еще другие аспекты изобретения относятся к фармацевтической композиции, содержащей соединение, описанное в данном документе, такое как соединение, описанное выше. В некоторых вариантах реализации изобретения указанное применение представляет собой лечение аутоиммунного или воспалительного заболевания.

Еще другие аспекты изобретения связаны с применением соединения, описанного в данном документе, таким как соединение, описанное выше, в производстве лекарственного средства для применения в медицине. В некоторых вариантах реализации изобретения указанное применение представляет собой лечение аутоиммунного или воспалительного заболевания.

Другие аспекты изобретения связаны с применением фармацевтической композиции, описанной в данном документе, такой как фармацевтическая композиция, описанная выше, в производстве лекарственного средства для применения в медицине. В некоторых вариантах реализации изобретения указанное применение представляет собой лечение аутоиммунного или воспалительного заболевания.

Еще другие аспекты изобретения связаны с нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, описанный в этом документе, такой как полипептид, описанный выше. Другие аспекты изобретения связаны с вектором, содержащим указанную нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах реализации изобретения вектор содержит промотор, который функционально связан с указанной нуклеиновой кислотой. Другие аспекты изобретения связаны с клеткой, которая содержит указанную нуклеиновую кислоту или указанный вектор.

Другие аспекты изобретения связаны со способом продуцирования соединения или полипептидов, как описано в данном документе, например, полипептида, описанного выше, включающим стадию, в которой получают клетку, описанную в данном документе, такую клетку, которая описана выше, и стадию, в которой экспрессируют нуклеиновую кислоту, как описано в данном документе, в указанной клетке. В некоторых вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает стадии, в которых изолируют и очищают указанный полипептид или соединение.

Подробности одного или нескольких вариантов раскрытия изобретения изложены в описании ниже. Другие особенности и преимущества изобретения станут очевидными из следующих прилагаемых графических материалов и подробного описания нескольких вариантов реализации изобретения, а также с добавленной формулой изобретения.

Краткое описание графических материалов

Следующие графические материалы являются частью спецификации, и включены для того, чтобы дополнительно продемонстрировать определенные аспекты данного раскрытия изобретения, которые можно лучше понять при помощи ссылки на один или более из этих графических материалов в сочетании с детальным описанием специфических вариантов реализации изобретения, которые представлены в настоящем документе.

На фиг. 1А проиллюстрирована диаграмма иллюстративного соединения, специфического к ФНОальфа и ИЛ23А. Первая полипептидная цепь содержит CH3, CH2, VH₂ (VHn) и VL1 (VLi) домены. Вторая полипептидная цепь содержит VH1 (VHI) и VL₂ (VLII) домены. VL1 и VH1 являются специфическими к первому целевому белку (или ФНО-альфа, или ИЛ23А), a VL2 и VH2 являются специфическими ко вто- 5 039598 рому целевому белку (или ИЛ23А, или ФНО-альфа). Верхняя панель иллюстрирует каждую полипептидную цепь отдельно. Нижняя панель иллюстрирует четырехвалентные соединения, сформированные путем объединения CH2 и CH3 доменов одного первого полипептида с CH2 и CH3 доменами другого первого полипептида. Связывающие домены для первого и второго целевого белка формируются путем объединения VH1 и VL₁, и через объединение VH₂ и VL2 соответственно.

На фиг. 1Б проиллюстрирована диаграмма иллюстративного соединения, специфического к ФНОальфа и ИЛ23А. Первая полипептидная цепь содержит CH3, CH2, CH1, VH₂ (VHII) и VL1 (VLI) домены. Вторая полипептидная цепь содержит CL, VH₁ (VH_I) и VL₂ (VL_II) домены. VL₁ и VH₁ являются специфическими к первому целевому белку (или ФНО-альфа, или ИЛ23А), a VL2 и VH2 являются специфическими ко второму целевому белку (или ИЛ23А, или ФНО-альфа). Верхняя панель иллюстрирует каждую полипептидную цепь отдельно. Нижняя панель иллюстрирует четырехвалентное соединение, сформированное путем объединения CH2 и CH3 доменов одного первого полипептида с CH2 и CH3 доменами другого первого полипептида. Связывающие домены первого и второго целевого белка формируются путем объединения VH1 и VL1, и через объединение VH2 и VL2 соответственно. Соединение дополнительно объединяется через взаимодействие между CL и СН1 доменами.

На фиг. 2 проиллюстрирован график, демонстрирующий сывороточные концентрации соединения М и его YTE мутанта - соединения А, у самцов яванских обезьян (среднее ± SD (стандартное отклонение), N = 3) после 1 мг/кг ВВ (внутривенной) 10-минутной инфузии.

На фиг. 3 проиллюстрирован график, демонстрирующий сывороточные концентрации соединения О и его YTE мутанта - соединения Е, у самцов яванских обезьян (среднее ± SD (стандартное отклонение), N = 3) после 1 мг/кг ВВ 10-минутной инфузии.

На фиг. 4 проиллюстрирована серия графиков и таблица, которые показывают, что соединение Е поддерживало функциональную эффективность против ИЛ23 in vivo. Мышам вводили эквимолярные дозы или контрольного антитела 3 (ИЛ23А моноклональное антитело), или соединения Е, и стимулировали человеческим ИЛ23 дважды для того, чтобы вызвать воспаление уха. Двадцать четыре часа после последней инъекции уши были собраны и проанализированы по мышиному ИЛ17А и мышиному ИЛ22 в качестве меры функциональной блокады ИЛ23. Соединение E поддерживало функциональную эффективность in vivo по сравнению с контрольным антителом 3 (ИЛ23А моноклональное антитело) в зависимости от конечной экспозиции и уровня эффективности. Контрольное антитело 3: незакрашенные квадраты, треугольники и ромбы. Соединение Е: закрашенные квадраты, треугольники и ромбы. MB: молекулярный вес.

На фиг. 5 проиллюстрирована серия графиков и таблица, которые показывают, что соединение Е поддерживало функциональную эффективность против ФНО in vivo. Мышам вводили эквимолярные дозы или контрольного антитела 2 (ФНОа моноклональное антитело), или соединения Е, и стимулировали человеческим ФНО. Два часа после стимуляции цельная кровь была собрана, и сыворотка была проанализирована по мышиному KC и мышиному ИЛ-6 в качестве меры функциональной блокады ФНО. Соединение Е поддерживало функциональную эффективность in vivo по сравнению с анти-ФНО, в зависимости от конечной экспозиции и уровня эффективности. Контрольное антитело 3: незакрашенные квадраты, треугольники и ромбы. Соединение Е: закрашенные квадраты, треугольники и ромбы. MB: молекулярный вес.

Подробное описание сущности изобретения

В данном изобретении описаны соединения, которые связываются с обоими - ФНО-альфа (в данном документе также называется ФНО-α или ФНОа) и ИЛ23А (также называется ИЛ23р19 или ИЛ-23А). На сегодняшний день нет одобренных соединений, мишенью которых являются ФНО-альфа и ИЛ23А. Существуют ограниченные исследования с одновременной нейтрализацией двух/более ключевых медиаторов воспаления, применяя биотерапевтический подход. Хотя эти исследования не смогли продемонстрировать улучшение в клинических результатах, которое оценивали при лечении ревматоидного артрита (РА), на сегодняшний день не описано бифункциональное терапевтическое средство, нацеленное на одну и ту же комбинацию. Кроме того, подобные комбинации могут увеличить побочные эффекты, такие как риск заражения (см., например, Genovese, MC, Cohen, S., Moreland, L., Lium, D., Robbins, S., et al. (2004). Arth. Rheum. 50, 1412-9; Genovese, M.C., Cohen, S., Moreland, L., Lium, D., Robbins, S., et al. (2004). Arth. Rheum. 50, 1412-9; and Weinblatt, M., Schiff, M., Goldman, A. Kremer, 1, Luggen, M., et al. (2007). Ann. Rheum. Dis. 66, 228-34). Дополнительно, такие биспецифические соединения трудно разрабатывать через проблемные моменты, связанные с растворимостью (например, агрегация) и стабильностью (например, неудовлетворительная фармакокинетика).

Неожиданно было обнаружено, что соединения, описанные в данном документе, связывающие как ФНО-альфа, так и ИЛ23А, имели аналогичные расширенные свойства по сравнению с индивидуальными антителами, которые нацелены на ИЛ23А, или на ФНО-альфа. Также было обнаружено, что эти соединения имеют подходящую фармакокинетику и были растворимыми в подходящих для целей дозирования диапазонах. Дополнительно в некоторых вариантах реализации изобретения существуют преимущества однократного введения над введением нескольких отдельных доз с точки зрения побочных эффектов

- 6 039598 индивидуальных методов лечения и пониженного дозирования. Кроме того, в некоторых вариантах реализации изобретения, CMC свойства соединений показали, что соединения имели низкий уровень агрегации. В одном аспекте, иллюстративные соединения продемонстрировали, в частности, низкую агрегацию. Также было также показано, что линкеры были оптимизированы с целью повышения стабильности и предотвращения расщеплению и, что мутация YTE улучшала аффинность Fc Rn. Считается, что соединения, которые описаны в данном документе, имеют одно или более полезных свойств, например, снижение побочных эффектов, повышение удобства и безопасности введения, увеличенный период полувыведения, увеличенную аффинность связывания, или повышенную ингибирующую активность, по сравнению со стандартными молекулами антител, например, молекулой IgG или молекулой антигенсвязывающего фрагмента (Fab).

Соответственно аспекты раскрытия изобретения связаны с соединениями, которые являются специфическими как к ФНО-альфа, так и к ИЛ23А, а также со способами применения и производства таких соединений.

Соединения

Аспекты раскрытия изобретения связаны с соединением, специфическим как к ФНО-альфа, так и ИЛ23А. Типичная белковая последовательность ФНО-альфа и типичная белковая последовательность ИЛ23А показаны ниже.

>NP_000585.2 - ФНО-альфа [Homo sapiens]

MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFCLLHFGVIGPQREEFPRDLSLI SPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHWANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLWPSEGLYLIYSQVLF KGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSA EINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL (SEQ ID NO: 144) >NP_057668.1 - ИЛ23А [Homo sapiens]

MLGSRAVMLLLLLPWTAQGRAVPGGSSPAWTQCQQLSQKLCTLAWSAHPLVGHMDLREEGDEETTNDVPH IQCGDGCDPQGLRDNSQFCLQRIHQGLIFYEKLLGSDIFTGEPSLLPDSPVGQLHASLLGLSQLLQPEGH HWETQQIPSLSPSQPWQRLLLRFKILRSLQAFVAVAARVFAHGAATLSP (аминокислоты 1-19 является предсказанной сигнальной последовательностью) (SEQ ID NO: 145)

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит первый полипептид и второй полипептид. В некоторых вариантах реализации изобретения, первый полипептид содержит (i) вариабельный домен легкой цепи первого иммуноглобулина (VL1) специфический к первому целевому белку, (ii) вариабельный домен тяжелой цепи второго иммуноглобулина (VH2) специфический ко второму целевому белку; и (iii) шарнирную область, константную область 2 тяжелой цепи (CH2) и константную область 3 тяжелой цепи (CH3). В некоторых вариантах реализации изобретения, первый полипептид дополнительно содержит константную область 1 тяжелой цепи (СН1). В некоторых вариантах реализации изобретения, второй полипептид содержит: (i) вариабельный домен легкой цепи второго иммуноглобулина (VL2), специфический ко второму целевому белку; (ii) вариабельный домен тяжелой цепи первого иммуноглобулина (VH1), специфический к первому целевому белку. В некоторых вариантах реализации изобретения, первый полипептид дополнительно содержит константную область легкой цепи (CL).

Следует понимать, что вариабельные домены и константные домены/области первого полипептида могут располагаться в любом порядке и, что вариабельные домены и константные домены/области (если таковые имеются) второго полипептида могут располагаться в любом порядке. Несколько иллюстративных конфигураций для доменов/областей на первом и втором полипептиде с N-конца к С-концу показаны ниже.

Конфигурация первого полипептида 1: N-VL1-VH2-якорь-CH2-CH3-C

Конфигурация первого полипептида 2: N-VH2-VL1-якорь-CH2-CH3-C

Конфигурация первого полипептида 3: N-VL1-VH2-CH1-якорь-CH2-CH3-C

Конфигурация первого полипептида 4: N-VH2-VL1-CH1-якорь-CH2-CH3-C

Конфигурация второго полипептида 1: N-VL2-VH1-C

Конфигурация второго полипептида 2: N-VH1-VL2-C

Конфигурация второго полипептида 3: N-VL2-VH1-CL-C

Конфигурация второго полипептида 4: N-VH1-VL2-CL-C

Приведенные в качестве примера конфигурации соединения показаны на фиг. 1А и 1Б. В некоторых вариантах реализации изобретения, соединение содержит первый полипептид в Конфигурации 1 и второй полипептид в Конфигурации 1. В некоторых вариантах реализации изобретения, соединение содержит первый полипептид в Конфигурации 3 и второй полипептид в Конфигурации 3.

В некоторых вариантах реализации изобретения, вариабельные области первого полипептида и второго полипептида объединяются друг с другом для того, чтобы сформировать сайт связывания для первого целевого белка и сайт связывания для второго целевого белка. В некоторых вариантах реализации изобретения, VL1 первого полипептида и VH1 второго полипептида объединяются, чтобы сформи

- 7 039598 ровать сайт связывания, который связывается с первым целевым белком, и VL2 второго полипептида и VH2 первого полипептида объединяются, чтобы сформировать сайт связывание, который связывается со вторым целевым белком. В некоторых вариантах реализации изобретения, первый целевой белок представляет собой ФНО-альфа и второй целевой белок представляет собой ИЛ23А. В других вариантах, первый целевой белок представляет собой ИЛ23А, а второй целевой белок представляет собой ФНОальфа. Следует понимать, что под терминами первый и второй не имеется в виду уровень значимости того или иного белка.

Приведенные в качестве примера комбинации последовательностей каждого из VL1, VH1, VL2, и VH2 предлагаются ниже в табл. 1 и также в табл. 2А в примере 1.

Таблица 1. Приведенные в качестве примера комбинации последовательностей VL1, VH1, VL2, и VH2.

Номер комби- нации	Последовательность VL1	Последовательность VH1	Последовательность VL2	Последовательность VH2
1	SEQIDNO2	SEQ ID NO : 1	SEQ ID NO :8	SEQ ID NO :7
2	SEQIDNO:8	SEQ ID NO :7	SEQ ID NO:2	SEQ ID NO: 1
β	SEQ ID NO:8	SEQ ID NO :7	SEQ ID NO:4	SEQ ID NOG
4	SEQ ID NO :8	SEQ ID NO :7	SEQ ID NO: 6	SEQ ID NO :5
5	SEQ ID NO :8	SEQ ID NO :7	SEQ ID NO:4	SEQ ID NO :5
6	SEQ ID NO :8	SEQ ID NO :7	SEQ ID NO :6	SEQ ID NO :3
7	SEQ ID NO :4	SEQ ID NO :3	SEQ ID NO :8	SEQ ID NO :7
8	SEQ ID NO :4	SEQ ID NO :5	SEQ ID NO :8	SEQ ID NO :7
9	SEQ ID NO :6	SEQ ID NO :3	SEQ ID NO :8	SEQ ID NOG
10	SEQ ID NO :6	SEQ ID NO :5	SEQ ID NO :8	SEQ ID NOG

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит последовательность VL1, содержащую CDR1, CDR2, и CDR3 первой легкой цепи и последовательность VH1, содержащую CDR1, CDR2, и CDR3 первой тяжелой цепи, последовательность VL2, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3 второй легкой цепи и последовательность VH2, содержащую CDR1, CDR2, и CDR3 второй тяжелой цепи. В некоторых вариантах реализации изобретения, CDR представляет собой CDR одной или более VL1, VH1, VL2, и VH2 последовательности, которые приведены в табл. 1 или 2А. Типичные последовательности CDR легкой цепи и тяжелой цепи для VL1, VH1, VL2, и VH2 последовательностей, которые предлагаются в табл. 1, показаны ниже:

SEQ ID NO: 1 CDR: DYAMH (SEQ ID NO: 146) (CDR1), AITWNSGHIDYADSVEG (SEQ

ID NO: 147) (CDR2), VSYLSTASSLDY (SEQ ID NO: 148) (CDR3)

SEQ ID NO: 2 CDR: RASQGIRNYLA (SEQ ID NO: 149) (CDR1), AASTLQS (SEQ ID NO:

150) (CDR2), QRYNRAPYT (SEQ ID NO: 151) (CDR3)

SEQ ID NO: 3 i SEQ ID NO: 5 CDR: SYAMH (SEQ ID NO: 152) (CDR1),

FMSYDGSNKKYADSVKG (SEQ ID NO: 153) (CDR2), NYYYYGMDV (SEQ ID NO: 154) (CDR3)

SEQ ID NO: 4 i SEQ ID NO: 6 CDR: RASQSVYSYLA (SEQ ID NO: 155) (CDR1),

DASNRAT (SEQ ID NO: 156) (CDR2), QQRSNWPPFT (SEQ ID NO: 157) (CDR3)

SEQ ID NO: 7 CDR: DQTIH (SEQ ID NO: 158) (CDR1), YIYPRDDSPKYNENFKG (SEQ ID

NO: 159) (CDR2), PDRSGYAWFIY (SEQ ID NO: 160) (CDR3)

SEQ ID NO: 8 CDR: KASRDVAIAVA (SEQ ID NO: 161) (CDR1), WASTRHT (SEQ ID NO:

162) (CDR2), HQYSSYPFT (SEQ ID NO: 163) (CDR3)

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит VH1, VL1, VH2 и/или VL2, содержащие последовательность, которая по меньшей мере на 80% (например, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99%) идентична последовательности, описанной в табл. 1. Процент идентичности двух аминокислотных последовательностей определяется с применением алгоритма Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-68, 1990, измененном как в Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-77, 1993. Такой алгоритм включен в программы NBLAST и XBLAST (версия 2.0) Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215: 403-10, 1990. BLAST белковые поиски могут быть выполнены с помощью программы XBLAST, оценка=50, длина слова=3, для того, чтобы получить аминокислотные последовательности, гомологичные белковым молекулам интереса. Если между двумя последовательностями имеются пробелы, может быть применен Gapped BLAST как описано в Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):33893402, 1997. При использовании программ BLAST и Gapped BLAST, могут быть применены параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST).

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит VH1, VL1, VH2 и/или VL2, содержащие последовательность, которая содержит одну или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10

- 8 039598 или более) мутаций в последовательности, приведенной в табл. 1. Такие мутации могут быть консервативными аминокислотными заменами. Как используется в настоящем документе, консервативная аминокислотная замена относится к аминокислотной замене, не изменяющей относительный заряд или характеристики размера белка, в котором делают аминокислотную замену. Консервативные замены аминокислот включают, например, замены между аминокислотами среди следующих групп: а) М, I, L, V; б) F, Y, W; в) K, R, Н; г) A, G; д) S, T; e) Q, N; и ё) E, D.

Аминокислотные последовательности шарнирной области, CH2 и CH3 соединения (и в качестве варианта СН1 и CL, если соединение содержит такие области) могут быть получены из любого подходящего источника, например, константной области антитела, такого как IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Аминокислотные последовательности константных областей легкой и тяжелой цепей антитела хорошо известны в данной области техники, например, такие последовательности предлагаются в базе данных IMGT (www.imgt.org) или www.vbase2.org/vbstat.php., обе включены в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотные последовательности CH2 и CH3 получены из IgG1 или из IgG4 (например, SEQ ID NO: 39 или 37). В некоторых вариантах реализации изобретения, CL содержит аминокислотную последовательность каппа CL или лямбда CL. В некоторых вариантах реализации изобретения шарнирная область содержит аминокислотную последовательность EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 40). http://www.imgt.Org/http://www.vbase2.org/vbstat.php

В некоторых вариантах реализации изобретения, CH2 и/или CH3 соединения (и в качестве варианта СН1 и CL, если соединение содержит такие области) могут содержать одну или более аминокислотных замен, отличающихся от CH2 или CH3 дикого типа, например одну или более аминокислотных замен в CH2 или CH3 IgG1 дикого типа, или одну или более аминокислотных замен в CH2 или CH3 IgG4 дикого типа (SEQ ID NO: 39 предлагается в качестве примера IgG1 дикого типа). Такие замены известны в данной области техники (см., например, US 7704497, US 7083784, US 6821505, US 8323962, US 6737056 и US 7416727).

В некоторых вариантах реализации изобретения CH2 содержит аминокислотную замену в 234, 235, 252, 254 и/или 256, пронумерованные в соответствии с индексом EC согласно Kabat для обычного антитела (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки). Следует понимать, что все аминокислотные позиции, описанные в данном документе, пронумерованные в соответствии с индексом EC согласно Kabat для обычных антител. В некоторых вариантах реализации изобретения CH2 содержит аминокислотную замену в позиции 252, 254 и/или 256. В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислота в позиции 252 - это тирозин, фенилаланин, серин, триптофан или треонин. В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислота в позиции 254 - это треонин. В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислота в позиции 254 - это серин, аргинин, глутамин, глутаминовая кислота или аспарагиновая кислота. В некоторых вариантах реализации изобретения CH2 содержит тирозин в позиции 252, треонин в позиции 254 и глутаминовую кислоту в позиции 256 (далее упоминается в настоящем документе как мутант YTE). В некоторых вариантах реализации изобретения CH2 содержит аминокислотную замену в позиции 234 и/или 235. В некоторых вариантах реализации изобретения CH2 содержит аланин в позиции 234 и аланин в позиции 235, также дальше упоминается в настоящем документе как мутант КО. В некоторых вариантах реализации изобретения CH2 содержит тирозин в позиции 252, треонин в позиции 254, глутаминовую кислоту в позиции 256, аланин в позиции 234, и аланин в позиции 235, также дальше упоминается в настоящем документе как мутант KO-YTE.

В некоторых вариантах реализации изобретения один или более линкер может быть применен для того, чтобы соединить домены/области вместе на первом и/или втором полипептиде. Например, первый полипептид может содержать линкер между VL1 и VH2. Если первый полипептид содержит СН1, первый полипептид может содержать линкер между VL1 или VH2 (в зависимости от конфигурации, как обсуждалось выше) и СН1 (например, VL1-линкер-CH1 или VH2-линкер-СН1). В другом примере второй полипептид может содержать линкер между VL2 и VH1. Если второй полипептид содержит CL, второй полипептид может дополнительно содержать линкер между VL2 или VH1 (в зависимости от конфигурации, которая обсуждалась выше) и CL (например, VL2-линкер-CL или VH1-линкер-CL). Следует понимать, что любое количество линкеров может быть применено для соединения любого домена или области с любым другим доменом или областью на первом полипептиде, и/или любое количество линкеров может быть применено для соединения любого домена или области с любым другим доменом или областью на втором полипептиде.

Предусмотрено применение любого подходящего линкера, известного в данной области техники, в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации изобретения линкер является пептидным линкером. В некоторых вариантах реализации изобретения пептидный линкер содержит по меньшей мере две аминокислоты, например 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более аминокислот. В некоторых вариантах реализации изобретения пептидный линкер имеет не более 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, или 2 аминокислоты в длину. В некоторых вариантах реализации изобретения пептидный линкер имеет длину в пределах 2 и 50, 2 и 40, 2 и 30, 2 и 20, 2 и 10, 2 и 9, 2 и 8, 2и7 или 2 и 6 аминокислот. В некоторых вариантах реализации изобретения пептидный линкер содержит аминокис- 9 039598 лотную последовательность GGGSGGG (SEQ ID NO: 9), LGGGSG (SEQ ID NO: 10), FNRGES (SEQ ID

NO: 11), VEPKSS (SEQ ID NO: 12), или их комбинацию. В некоторых вариантах реализации изобретения пептидный линкер может содержать несколько копий линкерной последовательности, например несколько копий последовательности GGGSGGG (SEQ ID NO: 9), LGGGSG (SEQ ID NO: 10), FNRGES (SEQ ID NO: 11), VEPKSS (SEQ ID NO: 12), или их комбинацию.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит два первых полипептида и два вторых полипептида. В некоторых вариантах реализации изобретения CH2 и CH3 одного из первых полипептидов объединяются с CH2 и CH3 другого из первых полипептидов, образуя четырехвалентную молекулу (например, два первых полипептиды димеризуются через связи между их соответствующими CH2 и CH3 доменами, чтобы сформировать четырехвалентную молекулу, содержащую два сайта связывания, специфические к первому целевому белка, и два сайта связывания, специфические ко второму целевому белка). Если первый полипептид дополнительно содержит СН1 домен, СН1 домен также может участвовать в образовании тетравалентной молекулы (например, два первых полипептида димеризуются через связи между их соответствующими CH1, CH2 и CH3 доменами, чтобы сформировать тетравалентну молекулу, которая содержит два сайта связывания для первого целевого белка, и два сайта связывания для второго целевого белка). В некоторых вариантах реализации изобретения, первые два полипептида объединены вместе с помощью по меньшей мере одной дисульфидной связи.

Также в этом документе предусмотрены другие соединения, которые конкурируют за связывание с соединением, как описано в данном документе, например, исследуемое соединение, которое конкурирует с соединением, как описано в данном документе, за связывание с ФНО-альфа и ИЛ23А. В некоторых вариантах реализации изобретения, исследуемое соединение может иметь, по меньшей мере 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, или 99% идентичности последовательности с соединением, как описано в данном документе. Конкурентное связывание может быть определено с помощью любого анализа, известного в данной области техники, например, равновесного связывания, ELISA, поверхностного плазмонного резонанса, или спектроскопии.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение, описанное в данном документе, специфически связывается с обеими ФНО-альфа и ИЛ23А. Соединение, которое специфически связывается с антигеном или эпитопом, обозначает термин, хорошо известный в данной области техники, и способы определения такого специфического связывания также хорошо известны в данной области техники. Говорят, что молекула показывает специфическое связывание, если она реагирует или связывается чаще, быстрее, с большей продолжительностью и/или с большей аффинностью с особым целевым антигеном, чем с альтернативными целями. Соединение специфически связывается с целевым антигеном или эпитопом, если оно связывается с большей аффинностью, авидностью, более быстро, и/или с большей продолжительностью, чем оно связывается с другими веществами. Например, соединение, которое специфически (или селективно) связывается с антигеном (например, ФНО-альфа или ИЛ23А) или антигенным эпитопом в этом антигене, предствавляет собой вещество, которое связывается с этим целевым антигеном с большей аффинностью, авидностью, легче и/или с большей продолжительностью, чем оно связывается с другими антигенами или другими эпитопами в этом же антигене. Читая это определение, следует также понимать, что, например, соединение, которое специфически связывается с первым целевым антигеном, может, или не может специфически или селективно связываться со вторым целевым антигеном. Таким образом, специфическое связывание или избирательное связывание не обязательно требует (хотя может включать) исключительное связывание. В целом, как правило, но не обязательно, отсылка к связыванию означает селективное связывание. В некоторых примерах, соединение, которое специфически связывается с целевым антигеном, или эпитопом этого антигена, может не связываться с другими антигенами или другими эпитопами в том же антигеном.

В некоторых вариантах реализации изобретения, соединение, как описано в данном документе, имеет соответствующее сродство к ФНО-альфа и ИЛ23, или их антигенным эпитопам. Как применяется в настоящем документе, аффинность связывания относится к условной константе связывания или K_A. K_A- это величина обратная константе диссоциации (Кд). Соединения, которые описаны в данном документе, могут иметь аффинность связывания (Кд) по меньшей мере 10^-5, 10^-6, 10^-7, 10^-8, 10^-9, 10^-10, W¹¹, 10^-12 М или меньше для одного, или обоих целевых антигенов или антигенных эпитопов. Повышенная аффинность связывания соответствует меньшему Кд. В некоторых вариантах реализации изобретения, соединения, которые описаны в данном документе имеют аффинность связывания (Кд) по меньшей мере 10^-11М или меньше, для одного или обоих целевых антигенов или антигенных эпитопов. Высокая аффинность связывания соединения для первого антигена и второго антигена по отношению к третьему антигену может быть обозначена с помощью более высокой Кд (или меньшего числового значения Кд) для связывания первого и второго антигена, чем Кд (или числового значения Кд) для связывание третьего антигена. В таких случаях, соединение имеет специфичность к первому антигену и второму антигену (например, первому белку в первой конформации или ему подобному, и второму белку в первой конформации или ему подобному) по отношению к третьему антигену (например, тот же первый или второй белок во второй конформации или ему подобный, или третий белок). Отличие в аффинности связывания (например, по специфичности или другими показателями) может составлять по меньшей мере 1,5, 2, 3, 4, 5, 10,

- 10 039598

15, 20, 37,5, 50, 70, 80, 91, 100, 500, 1000, 10000 или 105 раз.

Аффинность связывания (или специфичность связывания) может быть определена различными способами, в том числе, равновесным связыванием, ELISA, поверхностным плазмонным резонансом, или спектроскопией (например, применяя флюоресцентный анализ). Типичными условиями для оценки аффинности связывания является HBS-P буфер (10 мМ HEPES рН 7,4, 150 мМ NaCl, 0,005% (v/v) Surfactant P20). Данные методы могут быть применены для измерения концентрации связанного связывающего белка как функции концентрации целевого белка. Концентрация связанного связывающего белка, ([Bound]) зависит от концентрации свободного целевого белка ([Free]) и концентрации сайтов связывания для связывающего белка на цели, где (N) - число сайтов связывания на одну целевую молекулу, описывается следующим уравнением:

[Bound]=[N][Free]/(Kq + [Free])

Не всегда необходимо точно определять К_а, однако, так как иногда достаточно получить количественную оценку аффинности, например, рассчитанную с помощью такого способа, как ИФА или FACS (сортировка клеток с активированной флуоресценцией) анализа, которая пропорциональна К_а, и, следовательно, может быть применена для сравнений, таких как определение, является ли аффинность выше, например, в 2 раза выше, для получения качественной оценки аффинности, или для того, чтобы предсказать аффинность, например, по активности в функциональном анализе, например, в анализах in vitro или in vivo.

В некоторых вариантах реализации изобретения, соединение содержит первый и второй полипептид, как определено в табл. 2А. В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит:

(i) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14;

(ii) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16;

(iii) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18;

(iv) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20;

(v) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22;

(vi) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24;

(vii) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26;

(viii) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28;

(ix) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30;

(х) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32;

(xi) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34;

(xii) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36;

(xiii) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45;

(xiv) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47;

(xv) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49;

(xvi) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51;

(xvii) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53;

(xviii) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55;

(xix) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57;

(xx) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59;

(xxi) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61;

- 11 039598 (xxii) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63;

(xxiii) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65;

(xxiv) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67;

(xxv) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69;

(xxvi) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71;

(xxvii) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73;

(xxviii) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75;

(xxix) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77;

(xxx) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79;

(xxxi) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81;

(xxxii) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83;

(xxxiii) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 84, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 85;

(xxxiv) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 86, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 87;

(xxxv) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 88, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 89;

(xxxvi) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 90, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 91;

(xxxvii) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 92, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93;

(xxxviii) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 94, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 95;

(xxxix) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 96, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 97;

(x1) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 98, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 99;

(x1i) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 100, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 101;

(x1ii) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 102, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 103;

(x1iii) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 105;

(x1iv) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 107;

(x1v) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 108, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 109;

(x1vi) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 110, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:111;

(x1vii) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 112, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 113;

(x1viii) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 114, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 115;

(x1ix) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 116, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 117;

(1) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 118, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 119;

(1i) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 120, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 121;

(1ii) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 122, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 123;

- 12 039598 (1iii) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 124, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125;

(1iv) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 126, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 127;

(1v) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 128, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129;

(1vi) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 130, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 131;

(1vi i) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 132, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 133;

(1vii i) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 134, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 135;

(1ix) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 136, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 137;

(1х) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 138, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 139;

(1xi) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 140, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 141; или (1xii) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 142, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 143.

В некоторых вариантах реализации изобретения, соединение содержит:

(xi) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; или (xii) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36.

Способы получения соединений, нуклеиновых кислот, векторов и клеток

Аспекты раскрытия изобретения также включают нуклеиновые кислоты, кодирующие соединения, описанные в данном документе, или полипептиды, которые описаны в данном документе (например, первый или второй полипептид, которые описаны в данном документе), которые могут быть закодированы вместе или по отдельности. Полинуклеотиды, кодирующие соединения, описанные в данном документе, или полипептиды, описанные в данном документе, могут быть получены, а нуклеотидные последовательности полинуклеотидов определены, любым способом известным в данной области техники.

В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота содержится в векторе, таком как вектор экспрессии. В некоторых вариантах реализации изобретения вектор содержит промотор, который функционально соединен с нуклеиновой кислотой.

Могут быть применены различные промоторы для экспрессии соединений, описанных в данном документе, или полипептидов, которые описаны в данном документе, которые включают, но не ограничиваются только этими: ранний промежуточный промотор цитомегаловируса (ЦМВ), LTR, такая как LTR, HIV-LTR, HTLV-1 LTR вируса саркомы Рауса, ранний промотор обезьяньего вируса 40 (SV40), лак промотор UV5 E. coli и промотор tk вируса простого герпеса.

Также могут быть использованы регулируемые промоторы. Такие регулируемые промоторы включают те, которые используют lac репрессор с E. coli как модулятор транскрипции для регулирования

- 13 039598 транскрипции с промоторов клеток млекопитающих, которые несут lac оператор [Brown M. et al., Cell, 49: 603-612 (1987)], и те, которые используют тетрациклиновый репрессор (tetR) [Gossen, M., and Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551 (1992); Yao F. et al., Human Gene Therapy, 9: 1939-1950 (1998); Shockelt P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 6522-6526 (1995)]. Другие системы включают димер FK506, VP 16 или р65 с применением астрадиола, RU486, дифенол мурислерона, или рапамицина. Индуцибельные системы можно получить в Invitrogen, Clontech и Ariad.

Могут быть использованы регулируемые промоторы, которые содержат репрессор с опероном. В одном варианте реализации изобретения, лак-репрессор с Escherichia coli может функционировать как транскрипционный модулятор для того, чтобы регулировать транскрипцию через промоторы клеток млекопитающих, которые несут lac оператор [М. Brown et al., Cell, 49: 603-612 (1987)]; Госсен и Буджарт (1992) [М. Gossen et al., Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5547-5551 (1992)] объединили тетрациклиновый репрессор (tetR) с транскрипционным активатором (VP 16) для того, чтобы создать гибридный белок tetRактиватор транскрипции клетки млекопитающего, tTa (tetR-VP 16), с tetO-несущим минимальным промотором, полученным из главного промежуточного-раннего промотора человеческого цитомегаловируса (hCMV) для того, чтобы создать a tetR-tet операторную систему для контроля генной экспрессии в клетках млекопитающих. В одном варианте реализации изобретения, применяется индуцибельный тетрациклиновый переключатель (Yao et al., Human Gene Therapy; Gossen et al., Natl. Acad. Sci. USA, 89: 55475551 (1992); Shockett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 6522-6526 (1995)).

Дополнительно вектор может содержать, например, некоторые или все из следующих: селективный маркерный ген, такой как ген неомицина, для селекции стабильных или временных трансфектантов в клетках млекопитающих; енхансерние/промоторные последовательности с немедленного раннего гена ЦМВ человека для высоких уровней транскрипции; сигналы терминации транскрипции и процессинга РНК с SV40 для стабильности мРНК; точки начала репликации SV40 и ColE1 для правильной еписомальной репликации; внутренние сайты связывания рибосомы (ВССР), полилинкер; и РНК промоторы Т7 и SP6 для in vitro транскрипции смысловой и антисмысловой РНК. Подходящие векторы и способы продуцирования векторов, содержащих трансгены, хорошо известны и доступны в данной области техники.

Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, может быть перенесен в клетку-хозяина с помощью обычных методов (например, электропорации, липосомной трансфекции и преципитации с фосфатом кальция), и трансфицированные клетки затем культивируют с помощью общепринятых методов получения соединений, которые описаны в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения экспрессия соединений, описанных в данном документе, регулируется с помощью конститутивных, индуцибельных или ткань-специфических промоторов.

Клетки-хозяева, применяемые для экспрессии соединений, описанных в данном документе, или полипептидов, описанных в данном документе, могут быть как бактериальными клетками, так и клетками Escherichia coli, или, желательно, эукариотическими клетками. В частности, клетки млекопитающих, такие как клетки яичника китайского хомячка (СНО), в сочетании с вектором, таким как основной промоторный элемент промежуточного раннего гена из человеческого цитомегаловируса, является эффективной системой экспрессии для иммуноглобулинов (Foecking et al. (1986) Powerful And Versatile EnhancerPromoter Unit For Mammalian Expression Vectors, Gene 45: 101-106; Cockett et al. (1990) High Level Expression Of Tissue Inhibitor Of Metalloproteinases In Chinese Hamster Ovary Cells Using Glutamine Synthetase Gene Amplification, Biotechnology 8:662-667).

Для экспрессии соединений, описанных в данном документе, или полипептидов, описанных в данном документе, может быть применено множество хозяин-экспрессирующих векторных систем. Такие хозяин-экспрессирующие системы представляют собой переносчики, с помощью которых кодирующие последовательности соединений, описанные в данном документе, или полипептиды, описанные в данном документе, могут быть продуцированы и впоследствии очищены, но также представляют собой клетки, которые могут, когда трансформированы или трансфицированные с помощью соответствующих кодирующих нуклеотидных последовательностей, экспрессировать соединения, описанные в данном документе, in situ. Они включают, но не ограничиваются только этими: микроорганизмы, такие как бактерии, (например, Е. coli и В. subtilis) трансформированью рекомбинантными бактериофаговыми ДНК, плазмидными ДНК или космидными ДНК векторами экспрессии, содержащие кодирующие последовательности соединений, описанные в данном документе; дрожжи (например, Saccharomyces pichia), трансформированные рекомбинантными дрожжевыми векторами экспрессии, содержащими последовательности, кодирующие соединения, описанные в данном документе; клеточные системы насекомых, инфицированные рекомбинантными вирусными векторами экспрессии (например, baclovirus), содержащими последовательности, кодирующие соединения, описанные в данном документе; клеточные системы растений, инфицированные рекомбинантными вирусными векторами экспрессии (например, вирусом мозаики цветной капусты (CaMV) и вирусом табачной мозаики (ВТМ)) или трансформированные рекомбинантными плазмидными векторами экспрессии (например, Те плазмиды), содержащими последовательности, кодирующие молекулы соединений, описанные в данном документе; или клеточные системы млекопитающих (например, COS, CHO, BHK, 293, 293Т, 3T3 клетки, лимфоцитарные клетки (см. патент США

- 14 039598 №5807715), клетки Per С.6 (человеческие клетки сетчатки, разработанные Crucell) несущие рекомбинантные конструкции экспрессии, содержащие промоторы, полученные из генома клеток млекопитающих (например, промотора металотионеина) или вирусов млекопитающих (например, поздний аденовирусный промотор; промотор 7,5 вируса осповакцины).

В бактериальных системах может быть с большим преимуществом отобран ряд векторов экспрессии, в зависимости от применения, предназначенного для соединения, которое экспрессируется. Например, когда должно быть произведено большое количество такого белка, для получения фармацевтических композиций соединений, описанных в данном документе, могут быть желательными векторы, управляющие экспрессией высоких уровней легко очищаемых гибридных белковых продуктов. Такие векторы включают, но не ограничиваются только этими: вектор экспрессии pUR278 E. coli (Ruther et al. (1983) Easy Identification Of cDNA Clones, EMBO J. 2: 1791-1794), в котором кодирующая последовательность может быть лигирована отдельно в вектор в рамке с lac Z кодирующей областью, таким образом, что продуцируется гибридный белок; векторы pIN (Inouye et al. (1985) Up-Promoter Mutations In The lpp Gene Of Escherichia Coli, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3110; Van Heeke et al. (1989) Expression Of Human Asparagine Synthetase In Escherichia Coli, J. Biol. Chem. 24: 5503-5509) и тому подобное. Могут также быть применены векторы pGEX для того, чтобы экспрессировать полипептиды как гибридные белки с глутатион S-трансферазой (GST). В общем, такие гибридные белки являются растворимыми и могут быть легко очищены с лизированных клеток путем адсорбции и связывания с матриксными глутатионагарозными шариками, с последующим элюированием в присутствии свободного глутатиона. Векторы pGEX предназначенью для включения тромбиновых или Ха протеазных сайтов расщепления, таким образом, клонированный целевой генный продукт может быть освобожден от GST-части.

В системах насекомых, вирус ядерного полиэдроза Autographa califomica (AcNPV) применяется в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов. Вирус размножается в клетках Spodoptera frugiperda. Кодирующая последовательность может быть клонирована отдельно в неважные области (например, ген полиедрина) вируса, и размещена под контролем промотора AcNPV (например, промотором полиедрина).

В клетках-хозяевах млекопитающих может быть применен ряд систем экспрессии на основе вирусов. В тех случаях, когда аденовирус применяется как вектор экспрессии, кодирующая последовательность интереса может быть лигирована с комплексом контроля транскрипции/трансляции, например, поздним промотором и трехсторонней лидерной последовательностью. Этот химерный ген может быть вставлен в геном аденовируса с помощью in vitro или in vivo рекомбинации. Вставка в неважную область вирусного генома (например, область E1 или E3) приведет к образованию рекомбинантного вируса, который является жизнеспособным, и способен экспрессировать молекулу иммуноглобулина в инфицированных хозяевах (см., например, Logan et al. (1984) Adenovirus Tripartite Leader Sequence Enhances Translation Of mRNAs Late After Infection, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655-3659). Также могут потребоваться специфические сигналы инициации, для эффективной трансляции встроенных последовательностей, кодирующих антитело(а). Эти сигналы включают ATG инициирующий кодон и смежные последовательности. Кроме этого, кодон инициации должен быть в фазе с рамкой считывания желаемой кодирующей последовательности для того, чтобы обеспечить трансляцию всей вставки. Эти экзогенные сигналы контроля трансляции и кодоны инициации могут быть различного происхождения, как природного, так и синтетического. Эффективность экспрессии может быть увеличена путем включения соответствующих элементов транскрипции, энхансерних элементов, терминаторов транскрипции и т. д. (см. Bitter et al. (1987) Expression And Secretion Vectors For Yeast, Methods in Enzymol. 153: 516-544).

Кроме этого может быть избран штамм клетки-хозяина, который модулирует экспрессию вставленных последовательностей или модифицирует и обрабатывает генный продукт желаемым специфическим образом. Такие модификации (например, гликозилирование) и обработка (например, расщепление) белковых продуктов, могут быть важны для функции белка. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения соединения, которые описаны в данном документе, могут быть экспрессированные как один генный продукт (например, как единственная полипептидная цепь, то есть, как полибелковий прекурсор), который требует протеолитического расщепления с помощью нативных или рекомбинантных клеточных механизмов для того, чтобы образовать отдельные полипептиды соединений, описанных в данном документе. Таким образом, раскрытие изобретения охватывает проектирование нуклеотидной последовательности для кодирования прекурсорной полибелковой молекулы, содержащей полипептиды соединений, описанных в данном документе, содержащая кодирующие последовательности, способные направлять посттрансляционное расщепления указанного полибелкового прекурсора. Посттрансляционное расщепление полибелкового прекурсора приводит к образованию полипептидов соединений, описанных в данном документе. Посттрансляционное расщепление молекулы прекурсора, содержащей полипептиды соединений, описанных в данном документе, может происходить in vivo (то есть внутри клетки-хозяина с помощью нативных или рекомбинантных клеточных систем/механизмов, например фуринового расщепления в соответствующем сайте) или может происходить in vitro (например, инкубация указанной полипептидной цепи в композиции, содержащей протеазы или пептидазы с известной активностью, и/или в композиции, содержащей условия или реагенты, известные тем, что способст- 15 039598 вуют желаемой протеолитической активности). Очистка и модификация рекомбинантных белков хорошо известны в данной области техники, и таким образом дизайн полибелкового прекурсора может включать в себя ряд вариантов реализации изобретения, которые легко могут быть распознаны квалифицированным специалистом. Любые известные протеазы или пептидазы, которые известны в данной области техники, могут быть применены для описанной модификации молекулы прекурсора, например, тромбин или фактор Xa (Nagai et al. (1985) Oxygen Binding Properties Of Human Mutant Hemoglobins Synthesized In Escherichia Coli, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: 7252-7255, и их обзор выполнен в Jenny et al. (2003) A Critical Review Of The Methods For Cleavage Of Fusion Proteins With Thrombin And Factor Xa, Protein Expr. Purif 31:1-11, каждый из которых включен в данный документ в полном объеме посредством ссылки)), энтерокиназы (Collins-Racie et al. (1995) Production Of Recombinant Bovine Enterokinase Catalytic Subunit In Escherichia Coli Using The Novel Secretory Fusion Partner DsbA, Biotechnology 13: 982-987 этим включен в данный документ в полном объеме посредством ссылки)), фурин, и AcTEV (Parks et al. (1994) Release Of Proteins And Peptides From Fusion Proteins Using A Recombinant Plant Virus Proteinase, Anal. Biochem. 216: 413-417 этим включен в данный документ в полном объеме посредством ссылки)) и протеаза C3 ящура.

Клетки-хозяева имеют характерные и специфические механизмы посттрансляционного процессинга и модификации белков и генных продуктов. Могут быть выбраны соответствующие клеточные линии или хозяйские системы для обеспечения правильной модификации и процессинга чужеродного экспрессирующегося белка. С этой целью могут быть применены эукариотические клетки-хозяева, которые обладают клеточной инженерией для правильного процессинга первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования генного продукта. Такие клетки-хозяева млекопитающих включают, но не ограничиваются только этими: СНО, VERY, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 293Т, 3T3, WI38, ВТ483, Hs578T, HTB2, ВТ20 и T47D, CRL7030 и Hs578Bst.

Стабильная экспрессия является желанной для долгосрочного, плодотворного продуцирования рекомбинантных белков. Например, могут быть разработаны клеточные линии, стабильно экспрессирующие соединения, описанные в данном документе. Вместо того, чтобы применять векторы экспрессии, содержащие вирусные точки начала репликации, клетки-хозяева могут быть трансформированы ДНК, что контролируется соответствующим контролирующими элементами экспрессии (например, промотор, енхансерные последовательности, терминаторы транскрипции, сайты полиаденилирования и т.д.), и маркером селекции. После введения чужеродной ДНК спроектированным клеткам могут позволить расти в течение 1-2 дней в обогащенной среде, а затем их переносят на селективную среду. Маркер селекции в рекомбинантной плазмиде придает устойчивость к веществу, с помощью которого проводят отбор, и позволяет клеткам стабильно интегрировать плазмиду в их хромосомы и расти, образуя очаги, которые, в свою очередь, могут быть клонированы и расширены в клеточные линии. Данный способ может быть с преимуществом использован для разработки клеточных линий, экспрессирующих соединения, описанные в данном документе. Такие сконструированные клеточные линии могут быть особенно полезными для скрининга и оценки соединений, взаимодействующих непосредственно или косвенно с соединениями, которые описаны в данном документе.

Может быть применен ряд систем отбора, включая, но не ограничиваясь только этими: ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (Wigler et al. (1977) Transfer Of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene To Cultured Mouse Cells, Cell 11:223-232), ген гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы (Szybalska et al. (1992) Use Of The HPRT Gene And The HAT Selection Technique In DNA-Mediated Transformation Of Mammalian Cells First Steps Toward Developing Hybridoma Techniques And Gene Therapy, Bioessays 14: 495- 500), и ген аденин фосфорибозилтрансферазы (Lowy et al. (1980) Isolation Of Transforming DNA: Cloning The Hamster aprt Gene, Cell 22: 817-823) могут быть применены в tk-, hgprt- или aprt- клетках, соответственно. Кроме того, антиметаболитная устойчивость может быть использована в качестве основы отбора для следующих генов: dhfr, придающий устойчивость к метотрексату (Wigler et al. (1980) Transformation Of Mammalian Cells With An Amplifiable Dominant-Acting Gene, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567-3570; O'Hare et al. (1981) Transformation Of 5 Mouse Fibroblasts To Methotrexate Resistance By A Recombinant Plasmid Expressing A Prokaryotic Dihydrofolate Reductase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527-1531); gpt, придающий устойчивость к микофеноловой кислоте (Mulligan et al. (1981) Selection For Animal Cells That Express The Escherichia coli Gene Coding For Xanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072-2076); neo, придающий устойчивость к аминогликозиду G-418 (Tolstoshev (1993) Gene Therapy, Concepts, Current Trials And Future Directions, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596; Mulligan (1993), The Basic Science Of Gene Therapy, Science 260: 926932; и Morgan et al. (1993), Human Gene Therapy, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217) и hygro, придающий устойчивость к гигромицину (Santerre et al. (1984) Expression Of Prokaryotic Genes For Hygromycin В And G418 Resistance As Dominant-Selection Markers In Mouse L Cells, Gene 30: 147-156).

Способы, широко известные в данной области рекомбинантной ДНК технологии, и которые могут быть применены, описаны в Ausubel et al. (Eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; and in Chapters 12 and 13 Dracopoli et al. (Eds), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons,

- 16 039598

NY.; Colberre-Garapin et al. (1981) A New Dominant Hybrid Selective Marker for Higher Eukaryotic Cells, J.

Mol. Biol. 150: 1-14.

Уровни экспрессии соединений, описанных в данном документе, или полипептидов, описаных в данном документе, могут быть увеличены с помощью вектора амплификации (для ознакомления см. Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987). Когда маркер в векторной системе, экспрессирующей соединение, описанное в данном документе, может быть амплифицирован, увеличение уровня ингибитора, присутствующего в культуре клетки-хозяина позволит увеличить количество копий маркерного гена. Поскольку область амплификации связана с нуклеотидной последовательностью соединения, описанного в данном документе, или полипептида, описанного в данном документе, производство полипептида также возрастет (Crouse et al. (1983) Expression And Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes, Mol. Cell. Biol. 3: 257-266).

Клетка-хозяин может быть трансфицирована двумя векторами экспрессии, первым вектором, кодирующим первый полипептид соединения, которе описанно в данном документе, и вторым вектором, кодирующим второй полипептид соединения, которое описанно в данном документе. Два вектора могут содержать идентичные маркеры селекции, делающие возможным одинаковую экспрессию обоих полипептидов. В альтернативном варианте может быть применен единственный вектор, кодирующий оба полипептида. Кодирующие последовательности полипептидов соединений, описанных в данном документе, могут содержать кДНК или геномную ДНК.

Как только соединение, описанное в данном документе, или полипептид, описанный в данном документе, была (был) рекомбинантно экспрессирован(о), он(оно) может быть очищен(о) любым способом, известным в данном области техники для очистки полипептидов, полибелков или антител (например, аналогичный схемам очистки антител, основанные на антигенной селективности), например, хроматографией (например, ионообменной, аффинной, особенно аффинной к специфическому антигену (при необходимости после отбора при помощи белка A, где соединение содержит Fc домен (или его часть)), и эксклюзионной хроматографией), центрифугированием, дифференциальной растворимостью, или любым другим стандартным методом для очистки полипептидов или антител.

Другие аспекты изобретения связаны с клеткой, содержащей нуклеиновую кислоту, описанную в данном документе, или вектор, описанный в данном документе. Клетка может быть прокариотической или эукариотической клеткой. В некоторых вариантах реализации изобретения клетка является клеткой млекопитающего. Приведенные в качестве примера типы клеток описаны в данном документе.

Еще другие аспекты изобретения связаны со способом продуцирования соединения, описанного в данном документе, или полипептида, описанного в данном документе (например, первого полипептида или второго полипептида), способом, включающим получение клеток, описанных в данном документе, и экспрессию нуклеиновой кислоты, описанную в данном документе, в указанной клетке. В некоторых вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает выделение и очистку соединения, описанного в данном документе, или полипептида, описанного в данном документе.

Способы лечения и композиций для применения в медицине

Другие аспекты изобретения связаны со способами лечения и композициями для применения в медицине. Не ограничивающими примерами соединений для применения в способах и композиции являются теми, что содержат:

(iii) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17 и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18;

(xi) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и вто-

- 17 039598 рой полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; или (xii) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36.

В некоторых вариантах реализации изобретения способ лечения или применение является способом лечения аутоиммунного или воспалительного заболевания, или применением в таком способе. В некоторых вариантах реализации изобретения способ включает введение соединения, описанного в данном документе, или фармацевтической композиции, содержащей указанное соединение, субъекту, например субъекту, который имеет или находится под риском приобрести аутоиммунное или воспалительное заболевание.

Субъект, подвергающийся лечению с помощью методов, описанных в данном документе, может быть млекопитающим, более желательно человеком. Млекопитающие включают, но не ограничены только этими: сельскохозяйственных животных, спортивных животных, домашних животных, приматов, лошадей, собак, кошек, мышей и крыс. Человеческий субъект, требующий лечения, может быть человеческим субъектом, имеющим, или находящимся под риском приобрести заболевание, или у него подозревают наличие заболевания. Субъект, имеющий заболевания, может быть обнаружен с помощью обычного медицинского осмотра, например, физического обследования, лабораторного тестирования, функциональной проверки органа, КТ сканирование или УЗИ. Субъект, который подозревается в наличии любого такого заболевания, может демонстрировать один или несколько симптомов заболевания. Признаки и симптомы заболеваний, например, аутоиммунных и воспалительных заболеваний, хорошо известны специалистам в данной области техники. Субъект с риском приобретения заболевания может быть субъектом, имеющим один или более факторов риска данного заболевания.

Не ограничивающие примеры аутоиммунных заболеваний включают: ревматоидный артрит, псориаз, сахарный диабет 1 типа, системную красную волчанку, отторжение трансплантата, аутоиммунные заболевания щитовидной железы (болезнь Хашимото), саркоидоз, склеродермию, гранулематозный васкулит, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, болезнь Шегрена, анкилозирующий спондилоартрит, псориатический артрит, полимиозит дерматомиозит, узелковый периартериит, иммунологическиопосредованное пузырчатое заболевания кожи, синдром Бехчета, рассеянный склероз, системную склеродермию, болезнь Гудпасчера, или иммунологически-опосредованный гломерулонефрит.

Не ограничивающие примеры воспалительных заболеваний включают ревматоидный артрит, системную красную волчанку, очаговую алопецию, анколизирующий спондилит, антифосфолипидный синдром, аутоиммунную болезнь Аддисона, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунный гепатит, аутоиммунное заболевание внутреннего уха, аутоиммунный лимфопролиферативний синдром (АЛПС), аутоиммунную тромбоцитопеническую пурпуру (АТП), болезнь Бехчета, буллезный пемфигоид, кардиомиопатию, брюшной спру дерматит, синдром хронической усталости, иммунодефицит (CFIDS), хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию, рубцовый пемфигус, холодовую лектиновую болезнь, синдром Тибьержа-Вейсенбаха, болезнь Крона, болезнь Дего, дерматомиозит, ювенильный дерматомиозит, дискоидную волчанку, существенную смешанную криоглобулинемию, фибромиалго-фибромиозит, болезнь Грейвса, синдром Гийена-Барре, тиреоидит Хашимото, идиопатический легочный фиброз, болезнь Верльгофа (ИТП), IgA нефропатию, инсулинозависимый сахарный диабет (тип I), ювенильный артрит, болезнь Меньера, смешанное заболевание соединительной ткани, рассеянный склероз, миастению, пузырчатку обычную, пернициозную анемию, узелковый периартериит, полихондрит, плюригландулярные синдромы, ревматическую полимиалгию, полимиозит и дерматомиозит, первичный иммунодефицит, первичный билиарный цирроз печени, псориаз, феномен Рейно, синдром Рейтера, ревматическую лихорадку, саркоидоз, склеродермию, синдром Шегрена, синдром мышечной скованности, артериит Такаясу, височный артериит/гигантоклеточный артериит, неспецифический язвенный колит, увеит, васкулит, витилиго, и гранулематоз Вегенера. В некоторых вариантах реализации изобретения, аутоиммунное или воспалительное заболевание является болезнью Крона, анкилозирующим спондилитом или псориатическим артритом.

Чтобы практиковать способ, описанный в данном документе, эффективное количество соединения или фармацевтической композиции, что описаны в данном документе, может быть введено субъекту (например, человеку), что требует лечения. Известны различные системы доставки, и они могут быть применены для введения соединений по данному изобретению. Способы введения включают, но не ограничиваются только этими: внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, интраназальный, эпидуральный и оральный пути. Соединения по данному изобретению могут быть введены, например, путем инфузии, болюса или инъекции, и могут вводиться вместе с другими биологически активными веществами, такими как противовоспалительные вещества. Введение может быть системным или местным. В желаемых вариантах реализации изобретения, введение выполняют подкожной инъекцией. Лекарственное средство для подобных инъекций может быть приготовлено в, например, предварительно заполненных шприцах, которые можно вводить один раз каждые две недели.

Эффективное количество, как применяется в данном документе, относится к количеству каждого соединения, которое необходимо, чтобы предоставить терапевтический эффект субъекту, либо самостоятельно, либо в комбинации с одним или более другими соединениями. Эффективные количества могут

- 18 039598 быть разными, как определено специалистами в данной области техники, в зависимости от конкретного состояния, подлежащего лечению, тяжести состояния, индивидуальных параметров субъекта, включая возраст, физическое состояние, размер, пол, вес, продолжительность лечения, характер сопутствующей терапии (если таковая имеется), конкретный путь введения и подобные факторы, которые находятся в предел знаний и опыта врача. Эти факторы являются хорошо известными специалистам в данной области техники, и могут быть обнаружены с помощью не более чем рутинных экспериментов. Желательно, в целом, как правило, чтобы применялась максимальная доза отдельных компонентов или их комбинаций, то есть, самая высокая безопасная доза с медицинской точки зрения. Специалистам в данной области техники будет понятно, что субъект может настаивать на более низкой дозе или допустимой дозе по медицинским причинам, психологическим причинам или по любым другим причинам. Эмпирические факторы, такие как период полувыведения, как правило, будут способствовать определению дозировки. Например, соединения, совместимые с иммунной системой человека, такие как соединения, содержащие области с гуманизированных антител или полностью человеческих антител, могут быть применены, чтобы продлить период полувыведения соединения и предотвратить, чтобы соединение было атаковано иммунной системой хозяина. Частота введения может быть определена и скорректирована в ходе лечения, обычно, но не обязательно, основанная на лечении и/или угнетении и/или улучшении и/или замедлении заболевания. В альтернативном варианте могут быть целесообразными лекарственные препараты с непрерывным замедленным высвобождением соединения. В данной области техники известны различные лекарственные формы и устройства для достижения замедленного высвобождения.

В некоторых вариантах реализации изобретения, дозировка происходит ежедневно, каждые два дня, каждые три дня, каждые четыре дня, каждые пять дней, или каждые шесть дней. В некоторых вариантах реализации изобретения, частота дозирования составляет раз в неделю, каждые 2 недели, каждые 4 недели, каждые 5 недель, каждые 6 недель, каждые 7 недель, каждые 8 недель, каждые 9 недель, или 10 недель, или раз в месяц, каждые 2 месяца, или каждые 3 месяца или дольше. Прогресс данной терапии можно легко контролировать с помощью обычных методов и анализов. Режим дозирования (в том числе применяемых соединений) может изменяться с течением времени.

В некоторых вариантах реализации изобретения, взрослому субъекту с нормальным весом могут быть введены дозы, которые варьируют от около 0,01 до 1000 мг/кг. В некоторых вариантах реализации изобретения, доза составляет от 1 до 200 мг. Конкретная схема приема лекарственного средства, то есть доза, время и повторение, будет зависеть от конкретного субъекта и истории болезни этого субъекта, а также от свойств соединения (например, периода полувыведения соединения и других факторов, которые хорошо известны специалистам в данной области техники).

В контексте данного изобретения соответствующая доза соединения, как описано в данном документе, будет зависеть от конкретного вовлеченного соединения (или композиции на его основе), состава и пути введения, типа и тяжести заболевания, от того соединение вводится с профилактическими или лечебными целями, предшествующей терапии, клинической истории субъекта и ответы на антагонист, и по усмотрению лечащего врача. Как правило, врач будет управлять введением соединения до тех пор, пока не будет достигнута установленная доза, позволяющая достичь желаемого результата. Введение одного или более соединений может быть непрерывными или периодическим, в зависимости, например, от физиологического состояния реципиента, в зависимости от того цель введения является терапевтической или профилактической, так и других факторов, известных опытным специалистам. Введение соединения может быть по сути непрерывным в течение заранее выбранного периода времени или может быть разбито на ряд разделенных промежутками времени доз, например, до, во время или после проявления заболевания.

Как применяется в настоящем документе, термин лечение относится к применению или введению соединения, или композиции, содержащей соединение, субъекту, имеющему заболевания, симптомы заболевания или предрасположенность к заболеванию, с целью вылечить, заживить, смягчить, облегчить, изменить, исправить, улучшить, или повлиять на болезнь, симптом заболевания или предрасположенность к заболеванию.

Облегчение заболевания включает в себя замедление развития или прогрессирования заболевания, или снижения тяжести заболевания. Облегчение болезни не обязательно требует лечебных результатов. Как применяется в настоящем документе, замедлить развитие заболевания означает задержать, помешать, замедлить, стабилизировать и/или отсрочить прогрессирование заболевания. Данное замедление может быть различной продолжительности, в зависимости от истории болезни и/или лиц, которых лечат. Способ замедление или облегчения развития заболевания, или задержки начала заболевания - это способ, который снижает вероятность развития одного или более симптомов заболевания в данный конкретный период времени и/или снижает степень симптомов в течение определенного периода времени, по сравнению с ситуацией, когда способ не применяется. Такие сравнения обычно основаны на клинических исследованиях с использованием ряда субъектов, достаточного для получения статистически значимого результата.

Развитие или прогрессирование заболевания означает начальные проявления и/или последующее прогрессирование заболевания. Развитие заболевания может быть обнаружено и оценено с помощью

- 19 039598 стандартных клинических методов, которые хорошо известны в данной области техники. Однако, развитие также относится к прогрессированию, что может быть незаметным. Для целей настоящего раскрытия изобретения, развитие или прогрессирование относится к биологическому течению симптомов. Развитие включает в себя возникновение, рецидив и начало. Как применяется в настоящем документе, начало или возникновения болезни включает первоначальное начало и/или рецидив.

В некоторых вариантах реализации изобретения, соединение, описанное в данном документе, вводят субъекту, который нуждается в лечении, в объеме, достаточном для ингибирования активности одного или обоих ФНО-альфа, или ИЛ23А минимум на 20% (например, 30 40, 50, 60, 70, 80, 90% или более) in vivo или in vitro. Способы определения ингибирующей способности соединения известны в данной области техники. Приведенные в качестве примера анализы ингибирования ФНО-альфа и ИЛ23А приведенные в примерах.

Общепринятые способы, известные специалистам в данной области медицины, могут быть применены для введения соединения или фармацевтической композиции субъекту, в зависимости от типа заболевания, которое будет лечиться, или места заболевания. Данная композиция также может быть введена с помощью других общепринятых путей, например введена перорально, парентерально, путем вдыхания спрея, местно, ректально, назально, трансбуккально, вагинально или через имплантированный резервуар. Термин парентерально, как применяется в данном документе, включает подкожное, внутрикожное, внутривенное, внутримышечное, внутрисуставное, внутриартериальное, внутрисиновиальное введение, введение в полость позвоночного канала, введение в очаг поражения, и внутричерепной впрыск или инфузионные методы. Кроме этого она может быть введена субъекту путем введения вещества медленного всасывания, как применяют 1-, 3- или 6-месячные вещества медленного всасывания или биоразлагаемые материалы и способы.

Фармацевтические композиции

Другие аспекты раскрытия изобретения связаны с фармацевтической композицией, содержащей соединение, описанное в данном документе. Композиция, содержащая соединение настоящего изобретения (например, соединение, которое является специфическим к обоим - ФНО-альфа и ИЛ23А), может быть введена субъекту, имеющему или находящемся под риском приобрести аутоиммунное или воспалительное заболевание. Изобретение относится к применению соединения настоящего изобретения в производстве лекарственного средства для лечения аутоиммунного или воспалительного заболевания. Соединения могут быть введены или по одиночке, или в сочетании с другими композициями для профилактики или лечения аутоиммунного или воспалительного заболевания. Не ограничивающими примерами соединений настоящего изобретения для применения в фармацевтических композициях являются те, которые содержат:

(xi) первый полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; или (xii) первый полипептид,, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, и второй полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36.

Как применяется в настоящем документе, термин фармацевтическая композиция относится в составу соединения, описанного в данном документе, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать дополнительные вещества (например, для специфической доставки, увеличение периода полувыведения, или другие терапевтические соединения).

- 20 039598

Как применяется в настоящем документе, термин фармацевтически приемлемый носитель означает фармацевтически приемлемое вещество, композицию или переносчик, такие как жидкий или твердый наполнитель, растворитель, наполнитель, вспомогательные вещества (например, смазывающее вещество, тальк, стеарат кальция или цинка, или стеариновая кислота), или материал для инкапсулирования растворителя, которые участвуют в переносе или транспортировке соединения с одного участка тела (например, участки введения), в другой участок (например, орган, ткань или часть тела). Фармацевтически приемлемый носитель является приемлемым в смысле совместимости с другими компонентами лекарственного средства и не вредит тканям субъекта (например, является физиологически совместимым, стерильным, имеет физиологический pH и т.д.).

Некоторые примеры веществ, которые могут служить в качестве фармацевтически-приемлемых носителей, включают: 1) сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза; 2) крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; 3) целлюлозу и ее производные, такие как натрий карбоксиметилцеллюлоза, метилцеллюлоза, этилцеллюлоза, микрокристаллическая целлюлоза и ацетат целлюлозы; 4) порошкообразный трагакант; 5) солод; 6) желатин; 7) смазочные вещества, такие как магния стеарат, лаурилсульфат натрия и тальк; 8) наполнители, такие как масло какао и воски суппозиториев; 9) масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, сафлоровое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло; 10) гликоли, такие как пропиленгликоль; 11) полиолы, такие как глицерин, сорбит, манит и полиэтиленгликоль (ПЭГ) 12) сложные эфиры, такие как этил-олеат и этиллауринат; 13) агар; 14) буферные вещества, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; 15) альгиновой кислоты; 16) апирогенную воду; 17) изотонический физиологический раствор 18) раствор Рингера; 19) этиловый спирт 20) растворы с забуференным pH; 21) полиэфиры, поликарбонаты и/или полиангидриды; 22) обьемосоздающие вещества, такие как полипептиды и аминокислоты 23) компонент сыворотки, такой как сывороточный альбумин, ЛПВП и ЛПНП; 22) С2-С12 спирты, такие как этанол; и 23) другие нетоксичные совместимые вещества, применяемые в фармацевтических лекарственных препаратах. Также в состав могут входить: смачивающие вещества, окрашивающие вещества, антиадгезивы, покрывающие вещества, подсластители, вкусовые добавки, ароматизаторы, консерванты и антиоксиданты. Такие термины, как наполнитель, носитель, фармацевтически-приемлемый носитель или подобные применяются как взаимозаменяемые в данном документе.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение настоящего изобретения в композиции вводят путем инъекции, с помощью катетера, с помощью суппозитория или с помощью имплантата, при этом имплантат может быть пористым, непористым, или желеобразным веществом, включая мембрану, такую как резиновая мембрана или волокно. Как правило, при введении композиции применяют материалы, которые не абсорбируют соединение настоящего изобретения.

В других вариантах реализации изобретения соединения настоящего изобретения доставляются системой контролируемого высвобождения. В одном варианте реализации изобретения может быть применен насос (см., например, Langer, 1990, Science 249: 1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88: 507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574). В другом варианте реализации изобретения могут быть применены полимерные материалы. (Смотреть, например, Medical Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., Wiley, New York, 1984); Ranger and Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61. See also Levy et al., 1985, Science 228: 190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25: 351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71: 105.) Другие системы контролируемого высвобождения обсуждаются, например, в Langer, выше.

Соединения настоящего изобретения могут быть введены как фармацевтические композиции, содержащие терапевтически эффективное количество связывающего вещества, и один или более фармацевтически совместимый компонент.

В типичных вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция изготовлена в соответствии с рутинными процедурами в качестве фармацевтической композиции, адаптированной для внутривенного или подкожного введения субъекту, например, человеку. Как правило, композиции для введения путем инъекций представляют собой растворы в стерильном изотоническом водном буфере. В случае необходимости, фармкомпозиция также может содержать вещество, которое повышает растворимость, и местный анестетик, такой как лидокаин, для облегчения боли в месте инъекции. В целом, как правило, компоненты поставляются либо отдельно, либо в смеси в дозированном виде, например, в виде сухого лиофилизированого порошка или безводного концентрата в герметично закрытом контейнере, таком как ампула или сашет, с указанием количества активного вещества. Когда фармкомпозиция должна быть введена вливанием, она может быть приготовлена в виде флакона для вливания, содержащего стерильную фармацевтически-чистую воду или физиологический раствор. Когда фармкомпозицию вводят с помощью инъекции, может быть предоставлена ампула со стерильной водой для инъекций или физиологическим раствором, таким образом, компоненты могут быть смешаны перед введением.

Фармацевтическая композиция для системного введения может быть жидкостью, например стерильным физиологическим раствором, раствором Рингера с лактозой или раствором Хэнка. Кроме этого фармацевтическая композиция может быть в твердой форме и повторно растворена или ресуспендиро

- 21 039598 ванна сразу перед применением. Также рассматриваются лиофилизированные формы.

Фармацевтическая композиция может содержаться внутри липидных частиц или везикул, таких как липосомы или микрокристаллы, которые также подходят для парентерального введения. Частицы могут иметь любую подходящую структуру, например, однослойную или многослойную, если только композиции содержатся в них. Соединения могут быть захваченными в стабилизированные плазмид-липидные частицы (СПЛЧ), которые содержат липид слияния диолейоилфосфатидилетаноламин (ДОФЕ), низкие уровни (5-10 мл%) катионного липида, и которые стабилизированы с помощью полиетиленгликолевого (ПЭГ) покрытие (Zhang Y. P. et al., Gene Ther. 1999, 6: 1438-47). Положительно заряженные липиды, такие как К-[1-(2,3-диолеоилокси)пропил]-К,К,К-триметил-амонийметилсульфат, или ДОТАП, особенно желательны для таких частиц и везикул. Приготовление таких липидных частиц является хорошо известным. Смотреть, например, патенты США № 4880635; 4906477; 4911928; 4917951; 4920016 и 4921757.

Фармацевтические композиции данного изобретения могут быть введены или упакованы, например, в качестве однократной дозы. Термин однократная доза, когда применяется по отношению к фармацевтической композиции данного раскрытия изобретения, относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичного дозирования для субъекта, каждая единица содержит заданное количество активного вещества, рассчитанное для создания желаемого терапевтического эффекта, в сочетании с необходимым растворителем, например носителем или переносчиком.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение, описанное в данном документе, может быть соединено с терапевтической частью, например, противовоспалительным средством. Методы для соединения таких терапевтических частей с полипептидамы, включая, например, Fc домены, хорошо известны; смотреть, например, Amon et al., Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (Eds.), 1985, pp. 243-56, Alan R. Liss, Inc.); Hellstrom et al., Antibodies For Drug Delivery, in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (Eds.), 1987, pp. 623-53, Marcel Dekker, Inc.); Thorpe, Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review, in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (Eds.), 1985, pp. 475-506) Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (Eds.), 1985, pp. 303-16, Academic Press; and Thorpe et al. (1982) The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates, Immunol. Rev., 62: 119-158.

Дополнительно фармацевтическая композиция может быть предложена в качестве фармацевтического набора, который содержит: а) контейнер, содержащий соединение по настоящему изобретению в лиофилизированной форме; и б) второй контейнер, содержащий фармацевтически-приемлемый растворитель (например, стерильную воду) для инъекций. Фармацевтически приемлемый растворитель может быть применен для восстановления или разведения лиофилизированных соединений по настоящему изобретению. При необходимости, к такому контейнеру может быть присоединено сообщение в форме, определенной правительственным агентством, регулирующим производство, применение или продажу фармацевтических или биологических продуктов, для которых сообщение отражает одобрение органом производства, применения или продажи для введения человеку.

В другом аспекте реализации изобретения включено промышленное изделие, содержащее материалы, полезные для лечения описанных выше заболеваний. В некоторых вариантах реализации изобретения промышленное изделие содержит контейнер и этикетку. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы и пробирки. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. В некоторых вариантах реализации изобретения контейнер содержит композицию, которая является эффективной при лечении заболеваний, описанных в данном документе, и может иметь стерильный порт доступа. Например, контейнер может представлять собой пакет для внутривенного раствора или флакон, имеющий пробку, которая пробивается иглой для подкожных инъекций. Активное вещество в композиции является соединением настоящего изобретения. В некоторых вариантах реализации изобретения этикетка на контейнере, или которая присоеденена к контейнеру, указывает, что композиция применяется для лечения заболевания по выбору. Промышленное изделие может дополнительно содержать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как фосфатно-солевой буферный раствор, раствор Рингера или раствор глюкозы. Оно может дополнительно содержать другие материалы, желательные с коммерческой точки зрения пользователя, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши с инструкцией по применению.

Не вдаваясь в подробности, считается, что специалист в данной области техники, опираясь на приведенное выше описание изобретения, использует данное раскрытие изобретения в полном объеме. Вследствие этого, следующие конкретные варианты рассматриваться только как иллюстративные, а не как такие, что ограничивают остальное раскрытие изобретения в любой форме. Все публикации, цитируемые здесь, включены путем ссылки для целей или объекта изобретения, которые упоминаются в данном документе.

- 22 039598

Примеры

Пример 1. Конструирование иллюстративных соединений, нацеленных на ИЛ23А и ФНО-альфа.

В табл. 2А ниже предлагаются соединения, которые связываются с обоими -ИЛ23А и ФНО-альфа, которые были использованы в следующих примерах. Данные соединения были продуцированы с помощью рекомбинантных способов, известных в данной области техники (см., например, публикации PCT WO 2006/113665, WO 2008/157379, и WO 2010/080538, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки). Если коротко, плазмиды, кодирующие первый и второй полипептиды для каждого соединения, были трансфицированные вместе в клетки CHO-S, применяя FreeStyle MAX Reagent (CHO). Клетки культивировали в течение 13-14 дней, и соединения, которые были продуцированы клетками, очищали, используя Белок А хроматографию. Соединения были дополнительно очищены с помощью ексклюзионной хроматографии.

Таблица 2А. Приведенные в, качестве примера ИЛ23А и ФНО-альфа связывающие соединения

Идентификатор соединения	Большая цепь vL	Большая цепь vH	Малая цепь vL	Малая цепь vH	Типы линкера	Изотип	SEQ ID NO: (Н-й/2-ой)
Соединение А	ФНОа (D VL (SEQ. ID NO: 2)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	ИЛ23А (D VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (1) VH (SEQ ID NO: 1)	GS	IgGlKO- YTE	13/14
Соединение В	ФНОа (D VL	ИЛ23А (1) VH	ИЛ23А (D VL	ФНОа (1) VH (SEQ ID	VF	IgGlKO- YTE	15/16

- 23 039598

	(SEQ. ID NO: 2)	(SEQ ID NO: 7)	(SEQ ID NO: 8)	NO: 1)
Соединение С	ИЛ23А (1)VL (SEQ. ID NO: 8)	ФНОа (1) VH (SEQ ID NO: 1)	ФНОа (1) VL (SEQ ID NO: 2)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	GS	IgGlKO- YTE	17/18
Соединение D	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (1) VH (SEQ ID NO: 1)	ФНОа (1) VL (SEQ ID NO: 2)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	VF	IgGlKO- YTE	19/20
Соединение Е	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (2) VH (SEQ ID NO: 3)	ФНОа (2) VL (SEQ ID NO: 4)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	GS	IgGlKO- YTE	21/22
Соединение F	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (2) VH (SEQ ID NO: 3)	ФНОа (2) VL (SEQ ID NO: 4)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	VF	IgGlKO- YTE	23/24
Соединение G	ФНОа (2)VL (SEQ ID NO: 4)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (2) VH (SEQ ID NO: 3)	GS	IgGlKO- YTE	25/26
Соединение Н	ФНОа (2)VL (SEQ ID NO: 4)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (2) VH (SEQ ID NO: 3)	VF	IgGlKO- YTE	27/28
Соединение 1	ФНОа (3)VL (SEQ ID NO: 6)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (3) VH (SEQ ID NO: 5)	GS	IgGlKOYTE	29/30
Соединение J	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (3) VH (SEQ ID NO: 5)	ФНОа (3) VL (SEQ ID NO: 6)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	GS	IgGlKO- YTE	31/32
Соединение К	ФНОа (3)VL (SEQ ID NO: 6)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (3) VH (SEQ ID NO: 5)	VF	IgGlKO- YTE	33/34
Соединение L	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (3) VH (SEQ ID NO: 5)	ФНОа (3) VL (SEQ ID NO: 6)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	VF	IgGlKO- YTE	35/36
Соединение М	ФНОа (1)VL (SEQ ID NO: 2)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (1) VH (SEQ ID NO: 1)	GS	IgGlKO	44/45
Соединение N	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (1) VH (SEQ ID NO: 1)	ФНОа (1) VL (SEQ ID NO: 2)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	VF	IgGlKO	46/47
Соединение О	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID	ФНОа (2) VH (SEQ ID NO: 3)	ФНОа (2) VL (SEQ ID NO: 4)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	GS	IgGlKO	48/49

- 24 039598

	NO: 8)
Соединение Р	ИЛ23А (1)VL (SEQ. ID NO: 8)	ФНОа (2) VH (SEQ ID NO: 3)	ФНОа (2) VL (SEQ ID NO: 4)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	VF	IgGlKO	50/51
Соединение Q	ФНОа (2)VL (SEQ ID NO: 4)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (2) VH (SEQ ID NO: 3)	GS	lgG4Pro	52/53
Соединение R	ФНОа (2)VL (SEQ ID NO: 4)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (2) VH (SEQ ID NO: 3)	GS	lgG4Pro- YTE	54/55
Соединение S	ФНОа (2)VL (SEQ ID NO: 4)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (2) VH (SEQ ID NO: 3)	GS	lgG4Pro	56/57
Соединение Т	ФНОа (2)VL (SEQ ID NO: 4)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (2) VH (SEQ ID NO: 3)	GS	lgG4Pro- YTE	58/59
Соединение и	ФНОа (2)VL (SEQ ID NO: 4)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (2) VH (SEQ ID NO: 3)	VF	IgGlKO	60/61
Соединение V	ФНОа (2)VL (SEQ ID NO: 4)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (2) VH (SEQ ID NO: 3)	VF	IgGIWT	62/63
Соединение W	ФНОа (2)VL (SEQ ID NO: 4)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (2) VH (SEQ ID NO: 3)	VF	lgG4Pro	64/65
Соединение X	ФНОа (2)VL (SEQ ID NO: 4)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (2) VH (SEQ ID NO: 3)	VF	lgG4Pro- YTE	66/67
Соединение Y	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (2) VH (SEQ ID NO: 3)	ФНОа (2) VL (SEQ ID NO: 4)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	GS	IgGIWT	68/69
Соединение Z	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (2) VH (SEQ ID NO: 3)	ФНОа (2) VL (SEQ ID NO: 4)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	GS	lgG4Pro	70/71
Соединение АА	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (2) VH (SEQ ID NO: 3)	ФНОа (2) VL (SEQ ID NO: 4)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	GS	lgG4Pro- YTE	72/73
Соединение АВ	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (2) VH (SEQ ID NO: 3)	ФНОа (2) VL (SEQ ID NO: 4)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	VF	IgGIWT	74/75

- 25 039598

Соединение AC	ИЛ23А (1)VL (SEQ. ID NO: 8)	ФНОа (2) VH (SEQ ID NO: 3)	ФНОа (2) VL (SEQ ID NO: 4)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	VF	lgG4Pro	76/77
Соединение AD	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (2) VH (SEQ ID NO: 3)	ФНОа (2) VL (SEQ ID NO: 4)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	VF	lgG4Pro- YTE	78/79
Соединение АЕ	ФНОа (3)VL (SEQ ID NO: 6)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (3) VH (SEQ ID NO: 5)	GS	IgGlKO	80/81
Соединение AF	ФНОа (3)VL (SEQ ID NO: 6)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (3) VH (SEQ ID NO: 5)	GS	IgGIWT	82/83
Соединение AG	ФНОа (3)VL (SEQ ID NO: 6)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (3) VH (SEQ ID NO: 5)	GS	lgG4Pro	84/85
Соединение АН	ФНОа (3)VL (SEQ ID NO: 6)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (3) VH (SEQ ID NO: 5)	GS	lgG4Pro- YTE	86/87
Соединение AI	ФНОа (3)VL (SEQ ID NO: 6)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (3) VH (SEQ ID NO: 5)	VF	IgGlKO	88/89
Соединение AJ	ФНОа (3)VL (SEQ ID NO: 6)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (3) VH (SEQ ID NO: 5)	VF	IgGIWT	90/91
Соединение АК	ФНОа (3)VL (SEQ ID NO: 6)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (3) VH (SEQ ID NO: 5)	VF	lgG4Pro	92/93
Соединение AL	ФНОа (3)VL (SEQ ID NO: 6)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (3) VH (SEQ ID NO: 5)	VF	lgG4Pro- YTE	94/95
Соединение АМ	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (3) VH (SEQ ID NO: 5)	ФНОа (3) VL (SEQ ID NO: 6)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	GS	IgGlKO	96/97
Соединение AN	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (3) VH (SEQ ID NO: 5)	ФНОа (3) VL (SEQ ID NO: 6)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	GS	IgGIWT	98/99
Соединение АО	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (3) VH (SEQ ID NO: 5)	ФНОа (3) VL (SEQ ID NO: 6)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	GS	lgG4Pro	100/101

- 26 039598

Соединение АР	ИЛ23А (1) VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (3) VH (SEQ ID NO: 5)	ФНОа (3) VL (SEQ ID NO: 6)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	GS	lgG4Pro- YTE	102/103
Соединение AQ	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (3) VH (SEQ ID NO: 5)	ФНОа (3) VL (SEQ ID NO: 6)	ИЛ23А(1) VH (SEQ ID NO: 7)	VF	IgGlKO	104/105
Соединение AR	ИЛ23А (1) VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (3) VH (SEQ ID NO: 5)	ФНОа (3) VL(SEQ ID NO: 6)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	VF	IgGIWT	106/107
Соединение AS	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (3) VH (SEQ ID NO: 5)	ФНОа (3) VL (SEQ ID NO: 6)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	VF	lgG4Pro	108/109
Соединение АТ	ИЛ23А (1) VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (3) VH (SEQ ID NO: 5)	ФНОа (3) VL (SEQ ID NO: 6)	ИЛ23А(1) VH (SEQ ID NO: 7)	VF	lgG4Pro- YTE	110/111
Соединение AU	ФНОа (2)VL (SEQ ID NO: 4)	ИЛ23А (1)VH (SEQ ID NO: 7)	ИЛ23А (D VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (2) VH (SEQ ID NO: 3)	GS	IgGlKO	112/113
Соединение AV	ФНОа (1)VL (SEQ ID NO: 2)	ИЛ23А (1)VH (SEQ ID NO: 7)	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (1) VH (SEQ ID NO: 1)	GS	IgGIWT	114/115
Соединение AW	ФНОа (1)VL (SEQ ID NO: 2)	ИЛ23А (1)VH (SEQ ID NO: 7)	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (1) VH (SEQ ID NO: 1)	GS	lgG4Pro	116/117
Соединение АХ	ФНОа (1) VL (SEQ ID NO: 2)	ИЛ23А (1)VH (SEQ ID NO: 7)	ИЛ23А (D VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (1) VH (SEQ ID NO: 1)	GS	lgG4ProYTE	118/119
Соединение AY	ФНОа (1)VL (SEQ ID NO: 2)	ИЛ23А (1)VH (SEQ ID NO: 7)	ИЛ23А (D VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (1) VH (SEQ ID NO: 1)	VF	IgGlKO	120/121
Соединение AZ	ФНОа (1)VL (SEQ ID NO: 2)	ИЛ23А (1)VH (SEQ ID NO: 7)	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (1) VH (SEQ ID NO: 1)	VF	IgGIWT	122/123
Соединение ВА	ФНОа (1)VL (SEQ ID NO: 2)	ИЛ23А (1)VH (SEQ ID NO: 7)	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (1) VH (SEQ ID NO: 1)	VF	lgG4Pro	124/125
Соединение ВВ	ФНОа (1)VL (SEQ ID NO: 2)	ИЛ23А (1)VH (SEQ ID NO: 7)	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (1) VH (SEQ ID NO: 1)	VF	lgG4Pro- YTE	126/127

-27039598

Соединение вс	ИЛ23А (1)VL (SEQ. ID NO: 8)	ФНОа (1) VH (SEQ ID NO: 1)	ФНОа (1) VL (SEQ ID NO: 2)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	GS	IgGlKO	128/129
Соединение BD	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (1) VH (SEQ ID NO: 1)	ФНОа (1) VL (SEQ ID NO: 2)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	GS	IgGIWT	130/131
Соединение BE	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (1) VH (SEQ ID NO: 1)	ФНОа (1) VL (SEQ ID NO: 2)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	GS	lgG4Pro	132/133
Соединение BF	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (1) VH (SEQ ID NO: 1)	ФНОа (1) VL (SEQ ID NO: 2)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	GS	lgG4Pro- YTE	134/135
Соединение BG	ФНОа (2)VL (SEQ ID NO: 4)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (2) VH (SEQ ID NO: 3)	GS	IgGIWT	136/137
Соединение ВН	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (1) VH (SEQ ID NO: 1)	ФНОа (1) VL (SEQ ID NO: 2)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	VF	IgGIWT	138/139
Соединение BI	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (1) VH (SEQ ID NO: 1)	ФНОа (1) VL (SEQ ID NO: 2)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	VF	lgG4Pro	140/141
Соединение BJ	ИЛ23А (1)VL (SEQ ID NO: 8)	ФНОа (1) VH (SEQ ID NO: 1)	ФНОа (1) VL(SEQ ID NO: 2)	ИЛ23А (1) VH (SEQ ID NO: 7)	VF	lgG4Pro- YTE	142/143

ФНОа = ФНО-альфа, VL = вариабельный домен легкой цепи, VH = вариабельный домен тяжелой цепи, GS = GGGSGGGG (SEQ ID NO: 9), LGGGSG (SEQ ID NO: 10), или оба, VF = FNRGES (SEQ ID NO: 11), VEPKSS (SEQ ID NO: 12), или оба, IgG1 WT = IgG1 дикий тип, IgG1KO-YTE = IgG1 с M252Y/S254T/T256E тройной мутацией в Fc области и также содержит L234A/L235A мутации, IgG4ProYTE = IgG4 с M252Y/S254T/T256E тройной мутацией в Fc области и также содержит S241P мутацию, IgG1KO = усеченная Fc область, которая содержит L234A/L235A мутации, IgG4Pro = содержит S241P мутацию. 1-й = первый полипептид, 2-ой = второй полипептид. Нумерация мутаций представляет собой нумерацию согласно Kabat для обычных антител, начиная с принятого для антител СН1.

Ниже приведенные контрольные антитела также были применены для целей сравнения. Контролем служили моноклональные антитела, нацеленные на ФНОа или ИЛ23.

________________________________________________________ Таблица 2Б

Контрольные	Последовательность VH	Последовательность VL
Контрольное антитело 1 (ФНОа моноклональное антитело)	ФНОа (1) VH (SEQID NO: 1)	ФНОа (1) VL (SEQID NO: 2)
Контрольное антитело 2 (ФНОа моноклональное антитело)	ФНОа (2) VH (SEQID NO: 3)	ФНОа (2) VL (SEQID NO: 4)
Контрольное антитело 3 (ИЛ23 моноклональное антитело)	ИЛ23А (1) VH (SEQID NO: 7)	ИЛ23А(1) VL (SEQID NO: 8)

Пример 2. Поверхностный Плазмонный Резонанс (НИР) аффинности иллюстративных соединений Тестируемые соединения были проанализированы с помощью НИР, чтобы определить сродство к ФНО-альфа и ИЛ23 А.

Материалы и способы

НИР эксперименты были выполнены на приборе ProteOn XPR36 (Bio Rad). GLM чип был предварительно обработан с помощью последовательных впрыскиваний 60 с 0,5% SDS, 50 мМ раствора NaOH, и 100 мМ HCl при скорости потока 30 мкл/мин как в вертикальном, так и в горизонтальном направлениях. Предварительно обработанный GLM чип был активирован с помощью впрыскивания смеси EDC (76,7 мг/мл) и сульфо-NHS (21,7 мг/мл) с соотношением 1:1 в 6 горизонтальных каналов. Козьи IgG антитела (GAHA) к Fc гамма человека (Invitrogen) в концентрации 30 мкг/мл в 10 мМ, pH 5,0 натрий-ацетатном буфере был иммобилизирован до 8,000 резонансных единиц на активированном GLM чипе в 6 горизонтальных каналах. Чип был окончательно деактивирован с помощью 1 М этаноламин-HCl в 6 горизон

- 28 039598 тальных каналах. Подготовленный чип GAHA был возвращен в вертикальное положение для захвата исследуемых соединений по 5 вертикальным каналам, и последний канал был использован в качестве референсной колонки. Чип захвата был снова размещен в горизонтальной плоскости для связывания. Связанные человеческие ИЛ-23 (Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc) в пяти концентрациях, 10,0, 5,00, 2,50, 1,25 и 0,625 нМ, были введен горизонтально по поверхности исследуемых соединений в течение 10 мин со скоростью потока 40 мкл/мин в следующем буфере пробега (Bio Rad): фосфатно-солевой буфер (pH 7,4), 0,005% Tween 20. Была разрешена диссоциация в течение 2 ч. Поверхность GAHA была восстановлена с помощью короткого импульсного впрыска (18 с) 0,85% фосфорной кислоты (Bio Rad) при скорости потока 100 мкл/мин в горизонтальном и вертикальном направлениях после 10 мин ассоциации и 2 ч диссоциации. Восстановленный GAHA был готов к еще одному циклу связывания. Связывания соединений с человеческим ФНО-альфа или ФНО-альфа яванского макака было выполнено аналогично.

Результаты

Результаты в табл. 3 показывают, что оба исследуемых соединения были способны связывать ФНОальфа и ИЛ23 с константой диссоциации (Кд) в пикомолярном диапазоне.

Таблица 3

Идентификатор соединения	КД для человеческого ФНО-альфа (пМ)	КД для ФНОальфа яванского макака (пМ)	кд для человеческого ИЛ23 (пМ)
Соединение A	2,14	7,71	4,28 ± 2,03
Соединение E	4,11+0,68	37,1 ± 16,2	7,00 ± 6,92

Пример 3. Оценка связывания с мембран-связанным ФНО-альфа с помощью проточной цитометрии Исследуемые соединения оценивали по их способности дозозависимо связываться с клеточными линиями, трансфицированными для того, чтобы экспрессировать мембран-связанный ФНО-альфа.

Материалы и способы

Все реагенты были подготовлены в красящем буфере для проточной цитометрии (BioLegend). Трансфицированные клеточные линии с мембран-экспрессированным ФНО-альфа (Jurkat и СНО) и родительские клеточные линии были собраны из резервуаров для тканевых культур, промыты, подсчитаны, ресуспендированы к 1X 10⁶ клеток/мл в красящем буфере для проточной цитометрии. Сто микролитров клеточной суспензии добавляли в 96 луночные плашки для микротитрования и помещали на лед. Были подготовлены титры исследуемых соединений и 50 мкл было добавлено к клеткам. После 60 мин инкубации на льду, клетки + исследуемые соединения были промыты и было добавлено 50 мкл вторичного антитела (Jackson ImmunoResearch). Образцы инкубировали в темноте при 4°С, в течение 60 мин, затем промывали. После заключительной промывки клетки ресуспендировали в 60 мкл фиксатора (BD Bioscience). Медиану флуоресценции определяли для каждого образца в проточном цитометре и наносили на график в зависимости от концентрации испытуемого образца. Значение EC₅₀ были рассчитаны с применением 4 Parameter Logistic доступной через в Excel XLfit (Activity Base software, ID Business Solutions, Ltd.). Значение EC50, приведенные ниже, являются геометрическими средними, рассчитанными по нескольким экспериментам для каждого исследуемого образца, и показаны в табл. 4.

Результаты

Результаты, показанные в табл. 4 ниже, демонстрируют, что исследованные соединения связаные с мембраной, связывали ФНО-альфа в зависимости от дозы.

Таблица 4. Значение ЕС₅₀ для мембран-связанного ФНО-альф	) а
Идентификатор соединения	ЕСзо связывания клеток мФНО-Jurkat пМ (геометрическое среднее)	ЕСзо связывания клеток мФНО-СНО пМ (геометрическое среднее)
Соединение М	650	950
Соединение А	910	890
Соединение О	270	770
Соединение Е	200	450
Контрольное антитело 1 (ФНОа)	310	400
Контрольное антитело 2 (ФНОа)	230	310

Пример 4. In vitro L929 анализ цитотоксичности

Соединения были исследованы на их способность ингибировать индуцированную ФНО-альфа ци- 29 039598 тотоксичность.

Способы и материалы

Данный протокол использует PrestoBlue™0 Cell Viability Reagent для определения цитотоксичности рекомбинантного человеческого ФНО-альфа. Более подробный протокол PrestoBlue Cell Viability Protocol может быть загружен с сайта Invitrogen (Invitrogen.com). L929 клетки были выращены и собраны. 1,5х10⁴ клеток переносили в каждую лунку 96-луночного плашки и инкубировали всю ночь при 37°С. Были подготовлены последовательные разведения соединений начиная с 5 нМ в полной среде для анализа, которая содержала 10 мкг/мл актиномицина D и 1000 пг/мл rhФНО-альфа. Положительный контроль содержал 20 нг/мл rhФНО-альфа и 1 мкг/мл актиномицина D. Отрицательный контроль не содержал ФНО-альфа. 10 мкл разведенный добавляли в соответствующие лунки и инкубировали всю ночь при 37°С в 5% СО₂. Реагент PrestoBlue™ был добавлен в лунки, и плашку инкубировали в течение 2 ч при 37°С в 5% СО₂. Относительная единица флуоресценции каждой лунки была измерена, применяя спектрофотометр для считывания планшетов Victor™x2 (возбуждение: 560 нм, излучение: 590 нм). Были нанесены на график флуоресцентные единицы (ось Y) в зависимости от концентрации исследуемого соединения (ось X), и значение IC₅₀ и значение IC₉₀ исследуемых соединений рассчитывали с помощью программного обеспечения Graphpad.

Результаты

Результаты в табл. 5 показывают, что исследуемые соединения были способны ингибировать индуцированную ФНО-альфа цитотоксичность в зависимости от дозы.

____________________________________________ Таблица 5

Идентификатор соединения	1С₅₀ IC90	L929 Цитотоксичность ФНО пМ Г еометрическое среднее
Соединение М	1С₅₀	19
Соединение М	IC90	55
Соединение А	1С₅₀	20
Соединение А	1С₉₀	67
Соединение N	1С₅₀	34
Соединение N	IC90
Соединение D	1С₅₀
Соединение D	IC90
Соединение О	1С₅₀	4,2
Соединение О	IC90	16
Соединение Е	1С₅₀	4,1
Соединение Е	IC90	17
Соединение Р	1С₅₀	3,4
Соединение Р	IC90	14
Соединение F	1С₅₀	2,5
Соединение F	IC90	10
Контрольное антитело 1 (ФНОа)	1С₅₀	62
Контрольное антитело 1 (ФНОа)	IC90	230
Контрольное антитело 2 (ФНОа)	1С₅₀	20
Контрольное антитело 2 (ФНОа)	1С₉₀	95

Пример 5. Ингибирование зависимого от ФНО-альфа высвобождение ИЛ-8 в клетках HeLa.

Анти-ФНО исследуемые образцы были оценены на предмет их способности ингибировать зависящее от ФНО высвобождение ИЛ8 с человеческой клеточной линии HeLa. Образцы были исследованы при высоких и низких концентрациях рекомбинантного человеческого ФНО-альфа и одной (высокой) концентрации рекомбинантного ФНО-альфа яванского макака.

Материалы и способы

Кратко, клетки HeLa (ATCC) собирали, промывали, подсчитывали и ресуспендировали к 4Х 105 клеток/мл в стандартной полной среде (v/v) 10% фетальной бычьей сыворотки с 1% пенициллина и стрептомицина (Полная Среда, ПС). Сто микролитров суспензии клеток HeLa добавляли в 96-луночные плашки для микротитрования. Рекомбинантный человеческий ФНО-альфа (R&D Systems) в двух концентрациях (147 нМ или 4,4 нМ), а также созданные рекомбинантные ФНО-альфа яванского макака (Boe

- 30 039598 hringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc.) (147 Hm) предварительно инкубировали в течение 30 мин при 37°С только с ПС или с титрами исследуемых образцов. После предварительной инкубации исследуемых образцов + ФНО-альфа, 100 мкл смеси(ей) добавляли к клеткам и тестовые плашки инкубировали при 37°С с 5% CO2 увлажненным воздухом в течение 20 ч. Контрольные образцы получали или ПС (нестимулированный контроль), или рекомбинантный ФНО-альфа, разведенный в ПС (стимулированные контроли). После инкубации супернатанты анализировали по ИЛ8 в наборе для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) (MesoScale Discovery) в соответствии с инструкциями производителя. Интерполированные значения ИЛ8 пг/мл были определены для каждого образца и конвертированы в процент от контроля (ПОК). ПОК был нанесен на график в зависимости от концентрации исследуемого образца, и были рассчитаны значения IC₅₀ и IC₉₀, применяя 4 Parameter Logistic Model, которая была доступна через Excel XLfit (Activity Base software, ID Business Solutions, Ltd.).

Исследуемые соединения были проанализированы с учетом IC₅₀/IC₉₀, как описано выше, и средние геометрические были рассчитаны по нескольким экспериментами для каждого исследуемого образца, и приведены в табл. 6.

Результаты

Результаты в табл. 6 показывают, что средние геометрические значения IC50 и IC90 для исследуемых соединений были похожи на средние геометрические значения IC₅₀ и IC₉₀ для Контрольного антитела 1 и для Контрольного антитела 2. Данные показывают, что исследуемые соединения в зависимости от дозы ингибируют индуцированную ФНО-альфа секрецию ИЛ-8, которая была индуцированна или при помощи человеческого ФНО-альфа (при двух исследованных концентрациях), или ФНО-альфа яванского макака.

___________________________________________________________________ Таблица 6

Идентификатор соединения	1С₅₀ IC90	HeLa ИЛ8 НизЧел-ФНО пМ Среднее геометрическое	HeLa ИЛ8 Выс-Чел-ФНО пМ Среднее геометрическое	HeLa ИЛ8 Мак-ФНО пМ Среднее геометрическое
Соединение М	1С₅₀	7,9	260	150
Соединение М	IC90	48	420	270
Соединение А	1С₅₀	8	280	120
Соединение А	IC90	41	460	260
Соединение N	1С₅₀	9,2	350	170
Соединение N	IC90	54	570	330
Соединение D	1С₅₀	И	380	190
Соединение D	IC90	63	590	390
Соединение О	1С₅₀	9,9	430	300
Соединение О	IC90	43	760	970
Соединение Е	1С₅₀	9,2	320	180
Соединение Е	IC90	35	530	600
Соединение Р	1С₅₀	9,2	410	210
Соединение Р	IC90	36	810	810
Соединение F	1С₅₀	7,9	350	190
Соединение F	IC90	39	660	740
Контрольное антитело 1 (ФНОа)	1С₅₀	34	330	170
Контрольное антитело 1 (ФНОа)	IC90	140	490	330
Контрольное антитело 2 (ФНОа)	1С₅₀	И	290	280
Контрольное антитело 2 (ФНОа)	IC90	55	520	1200

Пример 6. Ингибирования зависимого от ФНО-альфа высвобождение ИЛ8 в цельной крови

ФНО является возможным индуктором высвобождение ИЛ8 из человеческих клеток. Соединения исследовали на их способность ингибировать зависящее от ФНО-альфа высвобождение ИЛ-8 в образцах цельной крови.

Способы и материалы

Кратко, 120 мкл цельной крови с гепарином добавляли в каждую лунку в 96-луночной плашке для микротитрования. Реагенты для анализа были подготовлены в стандартной Т-клеточной среде (ТКС).

- 31 039598

Титры исследуемых образцов подготавливали в 10-кратных концентрациях и предварительно инкубировали с 10-кратной концентрацией рекомбинантного человеческого ФНО (100 нг/мл, R&D Systems) в течение 1 ч при температуре 37°С. После этой предварительной инкубации 30 мкл смеси цитокин/исследуемое соединение добавляли к цельной крови вместе с 30 мкл соответствующего контроля в ТКС и инкубировали при 37°С с 5% CO2 увлажненным воздухом в течение 48 ч. Контрольные образцы получали или ТКС (не стимулированные контроли), или рекомбинантный человеческий ФНО-альфа, разведенный в ТКС (стимулированные контроли). После инкубации супернатанты анализировали по ИЛ8 в наборе ELISA (MesoScale Discovery) следуя инструкциям производителя. Интерполированные значения ИЛ8 пг/мл были определены для каждого образца и конвертированы в процент от контроля (ПОК). ПОК был нанесен на график в зависимости от концентрации исследуемого образца, и были рассчитаны значения IC₅₀ и IC₉₀ применяя 4 Parameter Logistic Model, которая была доступна через Excel XLfit (Activity Base software, ID Business Solutions, Ltd.).

Исследуемые соединения были проанализированы с учетом IC₅₀/IC₉₀, как описано выше, и средние геометрические были рассчитаны по нескольким экспериментами для каждого исследуемого образца, и приведены в табл. 7.

Результаты

Результаты в табл. 7 показывают, что средние геометрические значения IC₅₀ и IC₉₀ для исследуемых соединений были похожи на средние геометрические значения IC₅₀ и IC₉₀ для Контрольного антитела 1 и для Контрольного антитела 2. Данные показывают, что исследуемые соединения в зависимости от дозы ингибируют идуцированное ФНО-альфа высвобождение ИЛ-8 в цельной крови человека.

Таблица 7

Идентификатор соединения	IC50 IC90	ФНО-ИЛ8 Цельная кровь пМ Г еометрическое среднее
Соединение М	IC50	380
Соединение М	IC90	790
Соединение А	1С₅₀	360
Соединение А	IC90	490
Соединение N	IC50	270
Соединение N	IC90	520
Соединение D	1С₅₀	560
Соединение D	IC90	1100
Соединение О	1С₅₀	320
Соединение О	IC90	470
Соединение Е	1С₅₀	340
Соединение Е	IC90	610
Соединение Р	IC50	290
Соединение Р	IC90	420
Соединение F	1С₅₀	310
Соединение F	IC90	450
Контрольное антитело 1 (ФНОа)	IC50	320
Контрольное антитело 1 (ФНОа)	IC90	490
Контрольное антитело 2 (ФНОа)	1С₅₀	330
Контрольное антитело 2 (ФНОа)	IC90	600

Пример 7. Анализы фосфорилирования NF-kappaB и СТАТ3

Взаимодействие ИЛ23 с его гетеродимерним рецепторным комплексом (ИЛ12Рв1-ИЛ23Р) приводит к нисходящему фосфорилированию сигнального трансдуктора и Активатора Транскрипции 3 (СТАТ3). Взаимодействие ФНО с его рецепторами (ФНОР1/ФНОР2) приводит к нисходящему фосфорилированию ядерного фактора энхансера гена каппа легкого полипептида в В-клетках (NF-kB). Соединения оценивали по их способности ингибировать ФНО-зависимое фосфорилирование NF-kB в клетках Jurkat, и ИЛ23-зависимое фосфорилирование CTAT3 в клетках DB.

Способы и материалы:

Коротко, культуры клеток Jurkat (ATCC) и клеток DB (ATCC), которые доращивали до лог-фазы, собирали, промывали, подсчитывали и ресуспендировали в 2Х 10⁷ клеток/мл в стандартной полной среде (ПС; RPMI1640 с (объем/объем) 10% ФБС и 1X пенициллина и стрептомицина (Invitrogen). Титры исследуемых образцов подготавливали в 4-кратных концентрациях и предварительно инкубировали со смесью 4-кратного рекомбинантного человеческого ИЛ23 (Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc.) и рекомбинантного человеческого ФНО (R&D Systems) в течение 1 ч при температуре 37°С. После предваритель

- 32 039598 ной инкубации исследуемого реагента + смесь цитокинов, 100 мкл смеси добавляли в лунки, которые содержали 100 мкл клеток в двух повторностях. Контроль устанавливали следующим образом: 100 мкл разбавленного ФНО/ИЛ23 + 100 мкл объединенных клеток (стимулированный контроль), или 100 мкл ПС +100 мкл объединенных клеток (нестимулированный контроль). Планшеты для анализа инкубировали ровно 10 мин при 37°С с 5% СО₂ увлажненным воздухом. После инкубации готовили клеточные лизаты и φ-NF-KB и ф-СТАТЗ оценивали в соответствии с инструкцией производителя (MesoScale Discovery). Начальные значения φ-ΝΡ-κΒ и ф-СТАТЗ определяли для каждого образца и конвертировали в процент от контроля (ПОК). ПОК был нанесен на график (ось Υ) в зависимости от концентрации исследуемого вещества (ось X). Значение 1С₅₀ и 1С₉₀ были рассчитаны с применением 4 Parameter Logistic, доступной через в Excel XLfit (Activity Base software, ID Business Solutions, Ltd.).

Исследуемые соединения были проанализированы с учетом IC50/IC90, как описано выше, и средние геометрические были рассчитаны по нескольким экспериментами для каждого исследуемого образца, и приведены в табл. 10. Примечание: данный анализ обеспечивает уверенность в том, что двойная молекула способна нейтрализовать оба нисходящих события передачи сигнала. Момент времени для анализа является оптимальным только для сигнала p-NF-κΒ, и поэтому рассчитанные IC50/IC90 не отражают общую эффективность в количественном выражении.

Результаты

Результаты в табл. 8 показывают, что исследуемые соединения были способны ингибировать оба индуцированное ФНО-альфа фосфорилирования NF-кВ, а также индуцированное ИЛ23 фосфорилирования СТАТЗ в клетках DB.

Таблица 8

Идентификатор соединения	IC50 IC90	Двойные Фосфо Jurkat^Nf-Kb пМ Среднее геометрическое*	Двойные Фосфо DBфСТАТЗ пМ Среднее геометрическое*
Соединение М	1С₅₀	290	190
Соединение М	IC90	680	580
Соединение А	1С₅₀	300	200
Соединение А	IC90	480	500
Соединение N	1С₅₀	300	210
Соединение N	IC90	620	760
Соединение D	1С₅₀	270	170
Соединение D	IC90	810	560
Соединение О	1С₅₀	210	210
Соединение О	IC90	740	580
Соединение Е	1С₅₀	260	230
Соединение Е	IC90	340	770
Соединение Р	1С₅₀	290	340
Соединение Р	IC90	340	630
Соединение F	1С₅₀	280	360
Соединение F	IC90	760	980
Контрольное антитело 1 (ФНОа)	1С₅₀	360	НА
Контрольное антитело 1 (ФНОа)	IC90	660	НА
Контрольное антитело 2 (ФНОа)	1С₅₀	260	НА
Контрольное антитело 2 (ФНОа)	IC90	420	НА
Контрольное антитело 3 (ИЛ23А)	1С₅₀	НА	89
Контрольное антитело 3 (ИЛ23А)	IC90	НА	230

^Результаты являются полуколичественными и оптимизированы для считывания ФНО.

НА; Нет Активности

Пример 8. Ингибирование индуцированного ИЛ23 фосфорилирования СТАТЗ в клетках DB

Взаимодействие ИЛ23 с его гетеродимерним рецепторным комплексом (ИЛ12Рр1-ИЛ23Р) приводит к нисходящему фосфорилированию Сигнального Трансдуктора и Активатора Транскрипции 3 (СТАТЗ). Анти-ИЛ23 исследуемые образцы были оценены на предмет их способности ингибировать зависящее от ИЛ23 фосфорилирования в человеческой клеточной линии DB.

-33 039598

Материалы и способы:

Кратко, 100 мкл человеческой линии клеток DB (ATCC), которые доращивали к лог-фазе, было добавлено в каждую лунку в 96-луночном планшете для микротитрования в концентрации 1X 10⁷ клеток/мл. Реагенты для анализа готовили в полной среде (ПС; RPMI1640 с (объем/объем) 10% фетальной бычьей сывороткой и 1X пенициллином-стрептомицином (Invitrogen)). Титры исследуемых образцов подготавливали в 4-кратных концентрациях и предварительно инкубировали с 4-кратной концентрацией рекомбинантного человеческого ИЛ23 (Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc.) в течение 1 ч при температуре 37°С. После этой предварительной инкубации, 100 мкл смеси цитокин/исследуемое соединение добавляли к 100 мкл клеток DB и инкубировали при 37°С с 5% СО₂ увлажненным воздухом в течение 30 мин. Контрольные образцы получали или ПС (не стимулированные контроли), или рекомбинантный ИЛ23, разведенный в ПС (стимулированные контроли). После инкубации готовили клеточные лизаты и фСТАТ3 был оценен в соответствии с инструкцией производителя (MesoScale Discovery). Начальные значения фСТАТ3 определяли для каждого образца и конвертировали в процент от контроля (ПОК). ПОК был нанесен на график в зависимости от концентрации исследуемого образца, и были рассчитаны значения IC₅₀ и IC₉₀, применяя 4 Parameter Logistic Model, которая была доступна через Excel XLfit (Activity Base software, ID Business Solutions, Ltd.). Исследуемые соединения были проанализированы с учетом IC₅₀/IC₉₀, как описано выше, и средние геометрические были рассчитаны по нескольким экспериментами для каждого исследуемого образца, и продемонстрированы в табл. 9.

Результаты

Результаты в табл. 9 показывают, что средние геометрические значения IC₅₀ и IC₉₀ для исследуемых соединений были похожи на средние геометрические значения IC₅₀ и IC₉₀ для контрольного антитела анти-ИЛ23Ар19. Данные показывают, что исследуемые соединения дозозависимо ингибировали индуцированное ИЛ23 фосфорилирование CTAT3 в клетках DB.

Таблица 9

Идентификатор соединения	1С₅о IC90	челИЛ23 фСТАТЗ DB анализ пМ среднее геометрическое
Соединение М	1С₅₀	190
Соединение М	IC90	530
Соединение А	1С₅₀	210
Соединение А	IC90	420
Соединение N	1С₅₀	240
Соединение N	IC90	510
Соединение D	1С₅₀	280
Соединение D	IC90	560
Соединение О	IC50	300
Соединение О	IC90	720
Соединение Е	1С₅₀	300
Соединение Е	IC90	700
Соединение Р	IC50	300
Соединение Р	IC90	620
Соединение F	IC50	260
Соединение F	IC90	600
Контрольное антитилоЗ (ИЛ23А)	1С₅₀	160
Контрольное антитилоЗ (ИЛ23А)	IC90	310

Пример 9. Анализ спленоцитов мыши зависимий от ИЛ-23 человека (АМС)

Анализ на базе спленоцитов мыши был применен для оценки способности анти-человеческий-ИЛ23 исследуемых образцов ингибировать индукцию мышиного ИЛ17 с помощью рекомбинантного ИЛ23 человека и рекомбинантного ИЛ23 яванского макака в культуре спленоцитов мыши.

Материалы и способы:

Коротко, мононуклеарные клетки с мышиных селезинок (самки мышей C57BL/6 в возрасте менее 13 недель JAX) были изолированы, промыты, подсчитаны и ресуспендированны до 4Х 10⁶ клеток/мл в стандартной Т-клеточной среде (ТКС). Сто микролитров суспензии мИЛ2/спленоцитов добавляли в 96луночные плашки для микротитрования. Рекомбинантный человеческий ИЛ23 (Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc.) или рекомбинантный ИЛ23 яванского макака (Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc.) разводили в ТКС и предварительно инкубировали в течение 2 ч при температуре 37°С только в ТКС, или с титрами исследуемых образцов. После преинкубации исследуемый образец + ИЛ23, 100 мкл смеси добавляли к клеткам и тестовые плашки инкубировали при 37°С с 5% CO₂ увлажненным воздухом в течение 48 ч. Контрольные образцы получали или ТКС (не стимулированные контроли), или рекомбинантный человеческий ИЛ23 разведенный в ТКС (стимулированные контроли). После инкубации уровни

- 34 039598 мышиного ИЛ17 определяли из супернатанта, применяя Quantikine® Mouse ИЛ17 Immunoassay согласно инструкции производителя (R&D Systems). Интерполированные значения мИЛ17 пг/мл были определены для каждого образца и конвертированы в процент от контроля (ПОК). ПОК был нанесен на график в зависимости от концентрации исследуемого образца, и были рассчитаны значения IC50 и IC₉₀, применяя 4 Parameter Logistic Model, которая была доступна через Excel XLfit (Activity Base software, ID Business Solutions, Ltd.). Анти-ИЛ23 исследуемые образцы были проанализированы с учетом IC50/IC90, как описано выше, и средние геометрические были рассчитаны по нескольким экспериментами для каждого исследуемого образца, и продемонстрированы в табл. 10.

Результаты

Результаты в табл. 10 показывают, что исследуемые соединения были способны подавлять высвобождение ИЛ17 с мышиных спленоцитов, которое было индуцированно ИЛ23 человека или яванского макака.

Таблица 10

Идентификатор соединения	1С₅₀ IC90	челИЛ23 АМС пМ среднее геометрическое	макИЛ23 АМС пМ среднее геометрическое
Соединение М	1С₅₀	140	120
Соединение М	IC90	1600	890
Соединение А	1С₅₀	180	120
Соединение А	IC90	1700	730
Соединение N	1С₅₀	230	140
Соединение N	IC90	2000	940
Соединение D	1С₅₀	190	160
Соединение D	IC90	2200	1100
Соединение О	1С₅₀	210	120
Соединение О	IC90	2200	800
Соединение Е	1С₅₀	200	77
Соединение Е	IC90	1700	1200
Соединение Р	1С₅₀	200	97
Соединение Р	IC90	1400	1500
Соединение F	1С₅₀	170	69
Соединение F	IC90	2300	1500
Контрольное антитилоЗ (ИЛ23А)	1С₅₀	53	17
Контрольное антитилоЗ (ИЛ23А)	IC90	350	240

Пример 10. Ингибирование индуцированного ИЛ23 фосфорилирования CTAT3

Взаимодействие ИЛ23 с его гетеродимерним рецепторным комплексом (ИЛ12Рр1-ИЛ23Р) приводит к нисходящему фосфорилированию Сигнального Трансдуктора и Активатора Транскрипции 3 (CTAT3). Соединения были испытаны на способность подавлять индуцированную ИЛ23 активацию CTAT3 в стабильно трансфицированных клетках DB.

Материалы и способы

Клетки были стимулированы конечной концентрацией 15 нг/мл белка ИЛ23. Эта доза была оценена как ЕС₆₀ по данным предыдущих экспериментов, в то же время позволяющая ингибирование исследуемым соединением. Клетки были перенесены на плашки, соединение дозировали, и добавляли ИЛ-23 (в указанном порядке) и инкубировали ночь. Если соединение ингибировало стимуляцию клеток, CTAT3 подавлялся, что приводило к снижению активности люциферазы.

Результаты

Результаты, представленные в табл. 11, показывают, что исследуемые соединения были способны подавлять индуцированное ИЛ23 фосфорилирования CTAT3.

- 35 039598

Таблица 11

Идентификатор соединения	ICso IC90	ИЛ23А фСТАТЗ (MG) пМ среднее геометрическое
Соединение М	IC50	120
Соединение М	IC90	300
Соединение А	IC50	130
Соединение А	IC90	1100
Соединение О	IC50	160
Соединение О	IC90	650
Соединение Е	IC50	140
Соединение Е	IC90	830
Соединение Р	IC50	69
Соединение Р	IC90	480
Соединение F	IC50	90
Соединение F	IC90	650
Контрольное антитело 3 (ИЛ23А)	IC50	35
Контрольное антитело 3 (ИЛ23А)	IC90	140

Пример 11. Дополнительные анализы ИЛ23-А CTAT3

Дополнительные эксперименты проводили подобным примеру 8 образом, для проверки ингибирования индуцированной ИЛ23 активации CTAT3.

Способы и материалы

Суспензионные клетки DB-CTAT3Luc10 Clone 10 выращивали в RPMI1640 + 10%

ФБС. Добавляли 20,000 клеток в каждую лунку 96-луночных планшетов 80 мкл/лунка суспензии клеток. 10 мкл одного из последовательно разведенных соединений добавляли в каждую лунку. 15 нг/мл рекомбинантного человеческого ИЛ-23 добавляли в каждую лунку, при этом определенные лунки содержали только исследуемые соединения и не содержали ИЛ-23, для сравнения. Плашки инкубировали ночь при 37°С/5% СО₂. Активность люцефиразы оценивали, применяя Steady-Glo (Promega and One-Glo), и результаты были считаны на Envision Reader.

Результаты

IC₅₀ и IC₉₀ для исследуемых соединений представлены в табл. 12 и 13. Эти таблицы показывают, что соединения ингибируют ИЛ-23-зависимую активацию CTAT3 в зависимости от дозы.

Таблица 12

Идентификатор соединения	IC50 (пМ)	IC90 (пМ)
Соединение N	235,2	873,7
Контрольное антитело 3 (ИЛ23А)	96,5	192,6
Соединение D	18,6	871,6
Соединение Е	211,9	965,1
Контрольное антитело 3 (ИЛ23А)	104,3	198,8
Соединение G	220,2	1151,0
Соединение С	162,7	620,4
Контрольное антитело 3 (ИЛ23А)	80,3	181,3

Таблица 13

	Первое тестирование	Второе тестирование	Среднее геометрическое
Идентификатор соединения	IC50 (пМ)	IC90 (пМ)	IC50 (пМ)	IC90 (пМ)	IC50 (пМ)	IC90 (пМ)
Контрольное антитело 3 (ИЛ23А)			96,5	192,6	93,1	190,8
			104,3	198,8
			80,3	181,3
Соединение N	178,6	856,4	235,2	873,7	205,0	865,0
Соединение D	178,1	657,2	185,6	871,6	181,8	756,8
Соединение Е	170,2	764,9	211,9	965,1	189,9	859,2
Соединение G	187,1	600,5	220,2	1151,0	203,0	831,4
Соединение С	134,9	352,6	162,7	620,4	148,1	467,7

- 36 039598

Пример 12. Ингибирование индуцированного рекомбинантным ИЛ23 человека высвобождения

ИЛ17А и ИЛ22 мыши

Исследуемые соединения оценивали по их способности ингибировать индуцированное человеческим ИЛ23 цитокиновое высвобождение у мышей С57/В16. Секрецию ИЛ17А и ИЛ22 измеряли после внутрикожной инъекции ИЛ23.

Материалы и способы

Коротко, мышиные самки C57BL/6 (7-10 недель, Charles River) были случайным образом разделены на 8 групп, 8 животных/группа, и им делали внутрибрюшную инъекцию 100 мкл, или цитратного буфера (20мм NaCitrate, 115 мМ хлорида натрия, pH 6,0), или исследуемых соединений в эквивалентной молярной дозе 1,3, 0,4 и 0,13 мг/кг против 1,3 и 0,1 мг/кг соответственно. Через час после приема тестового соединения, мышей обезболивали с помощью изофлурана (Butler Schein) и делали 20 мкл внутрикожную инъекцию, или 0,1% БСА (Sigma) контроля, или 15 мкг/мл (0,3 мкг) rhИЛ23 (собственное производство), разведенного в физиологическом растворе (Invitrogen), в оба уха. Внутрикожные введения антигенных стимулов повторяли ежедневно в течение 2 дней подряд. Через двадцать четыре часа после второго стимулирования мышей забивали с помощью цервикальной дислокации и удаляли каждое ухо. Ткани уха гомогенизировали в 1 мл буфера для гомогенизации (HBSS (Gibco) 0,4% Triton X-100 (Sigma) 1X SigmaFast Protease Inhibitor (Sigma)) применяя MP Biomedicals Fast-Prep 24 гомогенизатор. Гомогенизированные образцы центрифугировали при 4°С в течение 10 мин и собирали супернатант. Супернатанты анализировали на наличие мышиных ИЛ17А и ИЛ22, применяя Quantikine® Mouse ИЛ-17 и мышиные ИЛ-22 Immunoassays в соответствии с инструкциями производителя (R&D Systems). Интерполированные значения цитокина пг/мл определяли для каждого образца. Были определены средние уровни пг/мл для каждой обработанной группы, и была рассчитана статистическая значимость по сравнению с контролем, применяя однофакторный дисперсионный анализ с последующим тестом множественного сравнения Дуннетта. Результаты проиллюстрированы на фиг. 4.

Результаты

Результаты в фиг. 4 показывают, что обработка единственной внутрибрюшной дозой исследуемого соединения была достаточной для значительного ингибирования высвобождения мышиных ИЛ17 и ИЛ22 в коже под действием двухдневных последовательных внутрикожных инъекций рекомбинантного человеческого ИЛ23.

Пример 13. Ингибирования цитокинового высвобождения, зависимого от экзогенного человеческого ФНО-альфа, у мышей С57/В16

Исследуемые соединения оценивали по их способности ингибировать индуцированное с помощью ФНО человека высвобождения цитокинов у мышей С57/В16 после экзогенного влияния человеческим ФНО. Секрецию KC и ИЛ-6 в сыворотке измеряли после внутрибрюшного введения человеческого ФНО.

Материалы и способы

Коротко, мыши-самки C57BL/6 (возраст 8-9 недель, Jackson Labs) были случайным образом разделены на 8 групп, 8 животных/группа, и им делали внутрибрюшную инъекцию 200 мкл, или физиологического раствора с фосфатным буфером (Sigma), или исследуемого соединения в эквивалентной молярной дозе 13,3, 4 и 1,3 мг/кг против 10, 3 и 1 мг/кг соответственно.

Через 2 ч после введения дозы тестового соединения, мышей обезболивали с помощью изофлурана (Butler Schein) и делали 200 мкл внутрикожную инъекцию, или 0,1% БСА контроля, или 15 мкг/мл (3 мкг) rhФНО (R&D Systems), разведенного в солевом растворе (Sigma). Два часа после стимуляции ФНО, мыши были обезболены с помощью изофлурана, цельная кровь была собрана, и тогда мышей забивали с помощью цервикальной дислокации. Цельную кровь центрифугировали при 12,000 об/мин в течение 10 мин и плазму собирали. Плазму анализировали на наличие мышиных KC и ИЛ-6, применяя Multiplex® Mouse KC и мышиный ИЛ-6 Immunoassays в соответствии с инструкциями производителя (MSD). Интерполированные значения цитокина пг/мл определяли для каждого образца. Были определены средние уровни для каждой обработанной группы, и рассчитывали статистическую значимость по сравнению с контролем, применяя однофакторный дисперсионный анализ с последующим тестом множественного сравнения Дуннетта. Результаты показаны на фиг. X.

Результаты

Результаты на фиг. 5 показывают, что обработкой единственной внутрибрюшной дозой исследуемого соединения удалось значительно ингибировать высвобождение мышиных KC и ИЛ-6 в сыворотке крови, при этом высвобождение индуцировали с помощью внутрибрюшинного введения рекомбинантного человеческого ФНО.

Пример 14. Фармакокинетика соединений в яванского макака

Материалы и способы

Исследования с единственной внутривенной дозой (ВВ) для двух пар соединений (Соединение М и Соединение А; Соединение О и Соединение Е) проводились на самцах яванских обезьян (N = 3 в каждой группе), которым не вводили биопрепараты, и в соответствии с правилами Институционального комитета по уходу за животными и их использованием. ВВ дозы вводили в количестве 1 мг/кг в виде 10 мин ВВ

- 37 039598 инфузии. Образцы сыворотки крови собирали перед введением дозы, 1, 4, 8 ч, в день введения дозы, и 1,

2, 3, 4, 5, 7, 10, 14, 21, 28, 35, и 42 (1008 ч) дней после введения дозы для соединения М и соединения А;

и только до 14-го дня для соединения О и соединения Е. Сывороточные концентрации введенных в качестве дозы молекул были измерены с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).

Образцы для стандартной калибровочной кривой и контроля качества (КК) готовили в 100% сыворотке для каждого исследуемого вещества. Каждая стандартная кривая состояла из семи ненулевых точек, начиная с 10240 нг/мл, которые затем последовательно разбавляли в 3 раза. Также был включен пустой образец (матрица без исследуемого образца). Были подготовлены четыре образца КК в низком, среднем и высоком диапазонах начиная с 2560 нг/ мл, которые затем последовательно разбавляли в четыре раза. Образцы для стандартной кривой и КК хранились в замороженном виде до проведения анализа проб, при котором их разводили в 20 раз, чтобы имитировать образцы исследования. Образцы для стандартной кривой и КК были включены в двух повторах при каждой аналитической серии. Нижние и верхние пределы количественного определения были определены как самая низкая и самая высокая точки стандартной кривой для того, чтобы иметь возвратно-рассчитанную концентрацию, которую можно воспроизвести, что не превышает 25 процентов (%) от номинальной концентрации. Критерий принятия для стандартных точек кривой и образцов КК был 25 процентов (%) от номинальной концентрации.

Плашки Nunc-ELISA покрывали 1 мкл обезьяно-адсорбированного козьего антитела к IgG человека (Southern Biotech), в качестве реагента захвата, и инкубировали ночь при 2-8°С. После промывки и блокировки плашек промывочным буфером (0,05% (объем/объем) Tween 20 в фосфатно-солевом буфере (ФСБ)) и блокирующим буфером (5% бычий сывороточный альбумин (БСА) в ФСБ), стандарт, КК, и неизвестные образцы, разведенные 1:20, 1:400, 1:8000 с 5% сывороткой обезьяны (обезьянья сыворотка от Innovative Research) были добавлены в лунки плашки и инкубированы в течение 1 ч при комнатной температуре. Лунки плашки промывали промывочным буфером и добавляли обезьянийадсорбированный биотинилированный козье антитело к IgG человека (Southern Biotech) как вторичный реагент, и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Плашки промывали 3 раза и добавляли 100 мкл 1 мкг/мл пероксидаз-конъюгированного стрептавидина на 15 мин при комнатной температуре, после чего следовали дополнительные 3 промывки и добавления 100 мкл 3,3', 5,5'Тетраметилбензидинового (ТМВ, BioFX) субстрата на 3-4 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливали путем добавления 100 мкл стоп-раствора (BioFX) и абсорбцию измеряли устройством считывания плашек Molecular Devices с программным обеспечением SoftmaxPro, версия 5.4.1.

Результаты

Исследования фармакокинетики (ФК) с единственной внутривенной дозой (ВВ) для двух пар соединений (Соединение М и Соединение А; Соединение О и Соединение Е) проводились на самцах яванского макака (N = 3 на группу), которым до этого ни разу не вводили биопрепараты. Тестовые соединения вводили в количестве 1 мг/кг, в виде 10 мин ВВ инфузии. Образцы сыворотки крови собирали перед введением дозы, 1, 4, 8 ч, в день введения дозы, и 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 14, 21, 28, 35 и 42 (1008 ч) дней после введения дозы для соединения М и соединения А; и только до 14-го дня для соединения О и соединения Е. Концентрации введенных в качестве доз молекул были измерены с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).

Концентрации в сыворотке крови (среднее и стандартное отклонение) для каждой из молекул представлены в табл. 14.

Таблица 14. Концентрации в сыворотке крови (среднее ± SD (стандартное отклонение), N = 3) исследуемых соединений в яванских обезьян______________________________________

Время (сутки)	Соединение М	Соединение А	Соединение О	Соединение Е
Среднее (нМ)	SD (нМ)	Среднее (нМ)	SD (нМ)	Среднее (нМ)	SD (нМ)	Среднее (нМ)	SD (нМ)
0	0	0	0	0	0	0	0	0
0,042	89,62	26,41	115,60	15,44	96,69	23,15	107,57	10,43
0,167	75,30	17,97	108,03	22,92	92,29	19,75	102,36	4,81
0,333	69,71	9,19	89,15	16,32	65,27	11,53	86,45	10,65
1	54,49	13,94	63,68	6,69	30,10	12,41	52,87	8,85
2	35,17	8,93	49,95	6,04	7,44	3,22	32,51	6,30
3	18,58	6,66	43,51	6,64	4,14	0,70	24,65	6,49
4	13,86	5,61	40,02	8,50	2,76	0,25	19,02	4,84
5	9,55	3,40	43,69	19,63	1,96	0,09	13,98	3,84
7	3,76	1,31	27,84	3,29	1,08	0,21	8,49	3,38
10	нпко	НПКО	НПКО	НПКО	НПКО	НПКО	0,3797	НВ
14	нпко	НПКО	нпко	НПКО	НПКО	нпко	НПКО	НПКО
21	нпко	НПКО	нпко	нпко
28	нпко	НПКО	нпко	нпко
35	нпко	НПКО	нпко	нпко
42	нпко	нпко	нпко	нпко

НПКО: ниже предела количественного определения НВ: не вычислено, N = 1

Фармакокинетические (ФК) параметры исследуемых соединений были рассчитаны с применением

- 38 039598 программного обеспечения WinNonlin Phoenix 6.1 (Certara, Мэриленд, США), с применением модельнезависимого подхода для ВВ инфузионной дозы. Образцы сыворотки, которые показали резкий спад концентрации в любой момент времени после дозировки, и все последующие образцы в том конкретном животном, были исключены из оценки параметров ФК. Дополнительный анализ показал, что причиной этого внезапного падения концентрации после первых нескольких дней было появление антител к соединению для гуманизированных биологических молекул в обезьяне. В ФК анализ были включены данные только первых семи дней, которые были получены от отдельных животных. Графики концентрациявремя проиллюстрированы на фиг. 2 и 3 для двух пар исследуемых соединений. Ключевые ФК параметры (среднее ± SD) для двух пар тестируемых соединений представлены в табл. 15.

Таблица 15б Ключевые ФК параметры (среднее ± SD, N = 3) двух пар исследуемых соединений яванской обезьяны после 1 мг/кг ВВ вливания в течение 10 мин

Идентификатор соединения	АУЦ (нМ/сутки)	КЛ (мл/сутки/ кг)	Vss (мл/кг)	Т1/2 (сутки)	MRT (сутки)
Соединение М	186 ±48,3	28,2 ± 7,8	62,4 ± 13,7	1,6 ±0,04	2,2 ±0,1
Соединение А	592 ± 68,3	8,5 ± 1,1	71,5 ± 8,9	6,2 ± 0,5	8,4 ± 1,0
Соединение О	98,0 ± 14,7	51,8 ±7,8	76,1 ± 30,3	2,3 ± 0,8	1,4 ±0,4
Соединение Е	244 ± 54,6	21,2 ±4,5	65,0 ±3,9	2,5 ± 0,3	3,1 ±0,5

Соединение А, исследуемое соединение с мутацией YTE, продемонстрировало 3,3-кратное снижение клиренса (КЛ) и 3,9-кратное увеличение времени полувыведения (Т1/2) по сравнению с соответствующими исследуемыми соединениями, которые не содержат мутации YTE (Соединение М). Соединение Е, исследуемое соединение с мутацией YTE, продемонстрировало 2,4-кратное снижение КЛ по сравнению с соответствующими исследуемыми соединениями, которые не содержат мутации YTE (Соединение О).

Пример 15. Предсказания ФК и дозы иллюстративного соединения для человека Предсказания человеческой ФК

Предсказания человеческой ФК Соединения Е было сделано с помощью аллометрического масштабирования от ФК параметров, полученных в яванской обезьяны, применяя фактор 2-кратного снижения клиренса у человека по сравнению с обезьяной при сохранении одинакового объема распределения. Таким образом, прогнозируемый клиренс в организме человека составляет 12,1 мл/сутки/кг с конечным полураспадом в 7,4 суток.

Прогнозирование дозы для человека:

Прогнозирование дозы для человека было сделано на основе обширных данных эффективности экспозиции, полученных из клинических исследований препарата голимумаб в различных популяциях пациентов. Голимумаб (Simponi®) одобрен для лечения ревматоидного артрита (РА), анкилозирующего спондилита (АС) и псориатического артрита (ПА) у пациентов с помощью 50 мг ежемесячных подкожных (ПЖ) доз, и язвенного колита (ЯК) у пациентов с помощью 100 мг ежемесячных ПЖ доз. Simponi® достигает минимального уровня около 3,2 нМ у пациентов с РА (50 мг ежемесячные ПЖ дозы) и 9,7 нМ (100 мг ежемесячные ПЖ дозы) у пациентов с ЯК (Simponi® BLA 2009; Sandborn 2013). Эти данные применяют в качестве ориентиров для терапевтических минимальных уровней для АС и CD соответственно. Минимальные уровни при клинически одобренных дозах Stelara составляют около 6 нМ. На основании наблюдений в три раза выше эффективности соединения Е по сравнению с устекинумаб (Stelara®), для того, чтобы Соединение Е покрыло ИЛ23, значение низких уровней соединения должны составлять -2 нМ. Так как концентрация минимального уровня соединения для покрытия ФНО является большей, чем для покрытия ИЛ23, минимальный уровень соединения равный 9,7 нМ для Simponi® был применен для предсказаний дозы.

Компартментное моделирование данных ФК в яванской обезьяны (2-компартментная модель) с последующим моделированием Монте-Карло с применением 2-кратного снижения масштабирования КЛ, 73% биодоступность и одновременные изменения клиренса и распределения констант скорости с номинальным КЛ, равным 30%, и логарифмическое нормальное распределение показывают, что 54 мг (90% доверительные интервалы 31 -90 мг) ПЖ дозы, которые вводили каждые 2 недели, будут поддерживать минимальный уровень соединения на уровне 9,7 нМ.

Пример 16. Очистка соединений

Способы

Соединения очищали с помощью Mab Select SuRe, в качестве стадии аффинной очистки. Промывки с высокой концентрацией соли избегали для того, чтобы предотвратить агрегацию. Элюцию выполняли с применением ацетат-натриевого буфера, pH 3,5. После очистки с помощью Mab Select SuRE, образцы были нейтрализованы, и были применены в отношении гидроксиапатитной смолы первого типа, и элюированы, применяя различные концентрации фосфатного буфера. Пик вымывания для мономеров был при -140 мМ NaPhosphate 100 мМ NaCl pH 7,0, и пик вымывание для агрегатов был при -200 мМ NaPhos

- 39 039598 phate 100 мМ NaCl pH 7,0. После гидроксиапатита образец был постоянно >95% мономером.

Исследования с применением скоростной седиментации (СС) с помощью Аналитического Ультра Центрифугирования (АУЦ) применяли для получения информации о чистоте образца и его агрегатных состояниях. Образцы центрифугировали в оптимальных условиях в XL-I (Beckman Coulter, Фуллертон, Калифорния) 20°С с помощью An60Ti ротора с четырьмя отверстиями, на скорости 40000 об./мин. Процесс осаждения контролировали с помощью ультрафиолетового поглощения при 280 нм, применяя соответствующий буфер для разведения как референсный буфер. Изменения в распределении концентраций в ячейке ультрацентрифуги регистрировали с ходом времени, используя операционное программное обеспечение XL-I, и анализировали с применением c(S) модели непрерывного распределения в программном обеспечении SEDFIT (версия 14.1), чтобы получить распределение коэффициента седиментации. Процент мономера был рассчитан на основе интегрированной площади пика.

Результаты

Результаты очистки соединений приведены в табл. 16. Данные показывают, что соединения имеют высокую чистоту и однородность, которые указывают на хорошую стабильность.

Таблица 16

Параметр	Соединение А	Соединение Е
Процент мономера (скоростная седиментация)	99,4	99,0

Пример 17. Масс-спектрофотометрический профиль соединений

Способы Нашивные образцы

Эта процедура предоставляет данные относительно интактной массы соединения или белка. 2 мкл образца вводили в колонку Agilent PoroShell 300SB-C8, 5 мкм, (75x1,0мм). Температура колонки составляла 80°С и скорость потока составляла 50 мкл/мин. Соединение или белок элюировали с колонки с градиентом от 20% В на 0 мин к 85% В на 10 мин. Подвижная фаза А представляла собой смесь Вода/Ацетонитрил/Муравьиная кислота (99/1/0,1), и подвижная фаза В представляла собой смесь Ацетонитрил/Вода/Муравьиная кислота (95/5/0,1). Сток был направлен в Agilent 6210 TOF масс-спектрометр, который (сток) был просканирован от массы 600 до массы 3200. Сырые данные были восстановлены с помощью программы MassHunter.

Образец с удаленными дисулъфидными связями

Эта процедура предоставляет данные относительно массы белка, или легкой цепи и массы тяжелой цепи. 2 мкл 50 мМ ТСЕР (Tris 2-карбоксиетил фосфин) добавляли к 10 мкл образца и 10 мкл 8М гуанидина, и инкубировали 15 мин при 37°С. 2 мкл этого образца вводили, как указано выше, но с такими отличиями: температура колонки составляла 60°С, а диапазон масс составлял 600-2000.

Дегликозилированный образец

Эта процедура предоставляет данные относительно дегликозильованой массы белка, или легкой цепи и тяжелой цепи. 10 мкл образца, 10 мкл 200 мМ NH4HCO3, 2 мкл 50 мМ ТСЕР, и 1 мкл (1:10) PNGase F (или 1 мкл QA дегликозилирующей смеси, если имелось O-связанное гликозилирование) инкубировали в течение 3 ч при 37°С. Инкубацию удлиняли к одной ночи для сильно гликозилированных образцов. Затем добавляли 25 мкл 8М гуанидина и 4 мкл 50 мМ ТСЕР и инкубировали 15 мин при 37°С. Этот образец был введен тем же путем, что и образец с удаленными дисульфидными связями, указанный выше.

Картирование белкового пептида с помощью масс-спектрометрии 25 мкл образца добавляли к 25 мкл 8 М мочевины в 400 мМ бикарбоната аммония. 5 мкл 50 мМ ТСЕР затем добавляли и образец инкубировали втечение 15 мин при 60°С. После охлаждения образца до комнатной температуры добавляли 5 мкл 150 мМ йодоцетамида и образец инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин. После добавления 40 мкл воды добавляли 5 мкл трипсина в 1 мМ HCl, чтобы получить конечное соотношение фермент:субстрат 1:50. Пробы инкубировали при 37°С в течение ночи. Тогда 5 мкл вводили в колонку Thermo Hypurity С18, 100x1,0 мм. Скорость потока составляла 80 мкл/мин. Белок элюировали с колонки с помощью градиента от 0%В на 0 мин до 40%В на 33 мин. Подвижная фаза А представляла собой смесь Вода/Ацетонитрил/Муравьиная кислота (99/1/0,1), и подвижная фаза В представляла собой смесь Ацетонитрил/Вода/Муравьиная кислота (95/5/0,1). Сток был направлен в Thermo Orbitrap Velos массспектрометр. Первое событие сканирования было в FT (Fourier Transform), и сканирование проводили от массы 300 до массы 2000 с разрешением от 30000. Со второго по седьмое событие сканирования были в IT (ion trap, ионная ловушка), и фрагментировали 6 наиболее интенсивных ионов с первого события сканирования. Пептиды, содержащие гликозилирование, были профилированны ручным выделением, и проценты рассчитывали на основе высоты пиков.

Результаты

Результаты продемонстрированы в табл. 17. Данные, которые обозначают предсказанную аминокислотную последовательность и структуру, были отражены и восстановлены без неожиданной разнородности. Шаблон гликозилирования является типичным для обычных антител, экспрессированных в клетках СНО, и не демонстрирует каких-либо атипичных структур.

- 40 039598

Параметр	Соединение А	Соединение Е
Масс-спектрометрия: Профиль молекулярного веса интактной молекулы	Интактная/Совпадает с последовательностью	Интактная/Совпадает с последовательностью
Масс-спектрометрия: Профиль гликозилирования	Не определено	Аналогичный СНОэкспрессированному IgG

Таблица 17

Пример 18. Термическая стабильность соединений

Способы

Отслеживали термическое развертывания и агрегацию 2 мг/мл растворов соединений в фосфатном буфере от 20 до 110°С при темпе сканирования 60°С/ч с помощью автоматического капиллярного дифференциального сканирующего калориметра (ДСК) (MicroCai, LLC, Бостон). Было выполнено два сканирования с соответствующим буфером для того, чтобы настроить термическую историю прибора и получить базовую линию для каждого образца, при этом среднее этих сканирований вычитается из следующей белковой термограммы для получения настоящей теплоемкости. Нормированные результаты сканирования впоследствии анализировали с помощью Origin 7.0. Базовые линии до начала перехода отнимали для каждой результирующей термограммы теплоемкости для того, чтобы получить результирующую избыточную теплоемкость (Ср, ех) как функцию от температуры. Указанные значения температур перехода (Тм) представляют позиции пиковых максимумов, определенных при визуальном осмотре экспериментальных термограмм. Результаты

Результаты представлены в табл. 18. Данные показывают, что соединения являются стабильными, и предполагают, что соединения могут сохраняться длительное время.

_______________________________________________________________________________Таблица 18

Параметр	Соединение А	Соединение Е
Термостабильность (°C)	57,9, 72,1, 82,9	67,6, 83,1

Пример 19. Растворимость соединений

Способы

Образцы соединений постепенно концентрировали к наиболее возможной высокой концентрации, не наблюдая при этом преципитации, применяя фильтр центрифугирования Amicon Ultra с молекулярной массой отсечения 50000 Дальтон (Millipore, Биллерике). Затем концентрированные растворы белка анализировали в эксперименте скорости седиментации (СС) с помощью аналитического ультрацентрифугирования (АУЦ) для получения информации по чистоте образца и агрегатным состояниям (см. пример 16 по очистке, для деталей способа).

Результаты

Результаты продемонстрированы в табл. 19. Данные показывают, что соединения являются растворимыми и стабильно сохраняют высокий процент мономера без подбора состава или добавления вспомогательных веществ.

Таблица 19

Параметр	Соединение А	Соединение Е
Растворимость (концентрация)	48 мг/мл	51 мг/мл
Процент мономера	98,6	97,0

Пример 20. Валентность соединений

Способы

Измерение валентности для образцов соединений в 50 мМ КС1 и 10 мМ натрий-ацетатном буфере при pH 5,0 выполняли на инструменте ProteomeLab РА800™ Beckman Coulter (Фуллертон, Калифорния), который оснащен детектором поглощения ультрафиолета (УФ), с рабочей длиной волны равной 214 нм. Систему поддерживали при 20°С и применяли eCap аминокапилляр с внутренним диаметром 50 мкм (Beckman Coulter, номер партии # 477431). Капилляр промывали 100 мМ NaOH, раствором восстановления амина (Beckman Coulter, номер партии # 477433) и рабочим буфером перед впрыском каждого образца. Промежутки времени прохождения образцов измеряли при напряжениях 10 кВ, 14 кВ и 18 кВ. Был применен диметилформамид (ДМФА) (0,005%) (Pierce) как маркер электроосмотического потока (ЭОП). Были получены данные применяя программное обеспечение 32 Karat™ (v7.0). Коэффициент диффузии определяли из эксперимента СС с помощью АУЦ.

Результаты

Данные валентности (см. табл. 20) указывают на коллоидную стабильность соединений в растворе, то есть сетевое взаимодействие белок-белок в растворе. Соединения с валентностью больше чем 15 имеют сильную сеть взаимодействие отталкивания и высокий потенциал для того, чтобы быть приготовленными в высоких концентрациях.

-41 039598

Параметр	Соединение А	Соединение Е
Валентность, pH 5,0	20,9	24,4

Таблица 20

Пример 21. Предсказанная in silico иммуногенности

Способы

Иммуногенность белковых лекарственных средств была предсказана in silico, применяя вычислительный инструмент EpiMatrix, который был разработан EpiVax, Инк. (Провиденс, Род-Айленд). EpiMatrix включает предсказания Т-хелперного эпитопа, а также эпитопа регуляторных Т-клеток, из которых первый вызывает иммунный ответ, в то время как второй является ингибирующим. Коротко, последовательность белка была сначала разбита на белковые рамки длиной 9 аминокислот, которые, как было доказано, являються ядром связывания белков генов HLA класса II. Потенциал связывания пептидов длиной 9 аминокислот с каждым из восьми распространенных аллелей HLA класса II оценивается на основе экспериментальных данных или вычислительного прогнозирования. Начисляются баллы для отображения потенциала связывания пептидов длиной 9 аминокислот с каждым алеллем HLA, и выполняется нормирование для того, чтобы сделать возможным сравнение связывания любого 9-аминокислотного полипептида с любым из многих аллелей HLA, и прогнозирование иммуногенности в глобальном масштабе. В итоге, программа генерирует общий бал иммуногенности, tReg Adjusted Ерх Score, который вместе с другими детерминантами иммуногенности помогает принять обоснованное решение о вероятности того, что соединения будут вызывать иммунный ответ in vivo.

Результаты

Результаты приведены в табл. 21. Общие баллы иммуногенности для этих соединений являются низкими, и предполагают, что эти соединения скорее всего не вызывают сильного иммунного ответа in vivo.

Таблица 21

Параметр	Соединение А	Соединение Е
EpiVax	-37,7, -35,6	-31,1,-46,8

Нормирование аллель-специфичных баллов

Пример 22: Стабильность соединений в цельной крови

Способы

Анализ интерференции цельной крови был выполнен на Octet RED96, для того чтобы выявить эффекты неспецифического связывания или нецелевого связывания соединений в присутствии цельной крови (ЦК). Растворы соединений в цельной крови и 1х кинетическом рабочем буфере (Ixkb) инкубировали при температуре 37°С в течение 48 ч. Кинетические измерения для инкубированных образцов соединений были выполнены на Octet RED96, оборудованном стрептавидиновим (SA) биосенсорным датчиком (ForteBio, Менло-Парк, Калифорния) при 27°С. Были описаны соотношение скорость ассоциации/сигналы связывания в буфере и цельной крови. Соотношение <2 рассматривалось как такое, что указывает на отсутствие интерференции.

Результаты

Результаты приведены в табл. 22.

Таблица 22

Параметр	Соединение А	Соединение Е
Соотношение сигнала связывания в цельной крови/кинетическом буфере к челФНОа	1,5	1,4
Соотношение сигнала связывания в цельной крови/кинетическом буфере	1,8	1,3

Пример 23. Краткое изложение исследуемых параметров

Сводные данные параметров для определенных соединений приведены в табл. 23 ниже.

-42039598

Таблица 23

Параметр	Соединение А	Соединение Е
Процент мономера после двух этапов очистки	99,4%	99%
Масс-Спектрометрический Профиль	Интактный	Интактный
р! как определено с помощью IEF (гетерогенность)	~ 8,8	~ 8,8
Термическая стабильность (дифференциальная сканирующая калориметрия)	57,9, 72,1, 82,9	67,6, 83,1
Растворимость	48 мг/мл	51 мг/мл
Валентность при pH 5,0	20,9	24,4
Предсказанная иммуногенность (EpiVax Бал)	-37,69, -35,57	-31,1, -46,8
Стабильность в цельной крови (человеческая ЦК, 48 ч при 37 °C); поддержание связывания с ИЛ23 и ФНОа	Поддерживается	Поддерживается

Последовательности

SEQ ID NO	Последовательность
1	EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAIT WNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTA SSLDYWGQGTLVTVSS
2	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQ SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIK
3	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGNGLEWVAFMSY DGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGIAAGG NYYYYGMD VWGQGTTVTVS S
4	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIK
5	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGDGLEWVAFMSY DGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGIAAGG

-43039598

	NYYYYGMD VWGQGTTVTVS S
6	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIK
7	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWIGYIYP RDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSGYAWFI YWGQGTLVTVSS
8	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIK
9	GGGSGGG
10	LGGGSG
11	FNRGES
12	VEPKSS
13	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQ SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSLGGGSGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S WTVPS S SLGTQIYICNVN HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
14	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEW VSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSY LSTASSLDYWGQGTLVTVSSLGGGSGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSIYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
15	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQ SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVAIYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSFNRGESASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S WTVPS S SLGTQIYICNVN HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH

- 44 039598

	QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
16	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEW VSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSY LSTASSLDYWGQGTLVTVSSVEPKSSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
17	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEW VSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSY LSTASSLDYWGQGTLVTVSSLGGGSGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S VVTVPS S SLGTQIYICN VNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITRE PEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
18	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQ SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVAIYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSLGGGSGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSIYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
19	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEW VSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSY LSTASSLDYWGQGTLVTVSSFNRGESASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S VVTVPS S SLGTQIYICN VNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITRE PEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW

- 45 039598

	QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
20	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQ SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSVEPKSSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
21	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGNGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSLGGGSGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S VVTVPS S SLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKD TLYITREPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
22	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSLGGGSGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSIYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
23	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGNGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSFNRGESASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S VVTVPS S SLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDT LYITREPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
24	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA

- 46 039598

	TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSVEPKSSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKW ACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
25	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSLGGGSGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S WTVPS S SLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
26	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGNGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSLGGGSGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSIYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
27	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSFNRGESASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S WTVPS S SLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQWTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
28	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGNGLEWV

- 47 039598

	AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSVEPKSSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
29	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSLGGGSGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S WTVPS S SLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
30	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGDGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSLGGGSGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
31	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGDGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSLGGGSGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S WTVPS S SLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKD TLYITREPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
32	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSLGGGSGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN

- 48 039598

	FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
33	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSFNRGESASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S WTVPS S SLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
34	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGDGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSVEPKSSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKWACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
35	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGDGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSFNRGESASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S WTVPS S SLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDT LYITREPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQWTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
36	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSWSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSVEPKSSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC

- 49 039598

37	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP APEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
38	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKIYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCP APEFLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
39	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQIYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSIYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPG
40	EPKSCDKTHTCPPCP
41	RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE SVTEQDSKDSIYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
42	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQIYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCP PCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSIYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK
43	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQIYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCP PCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSIYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPG
44	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQ SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVAIYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKGGG

- 50 039598

	SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSLGGGSGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S VVTVPS S SLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
45	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEW VSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSY LSTASSLDYWGQGTLVTVSSLGGGSGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
46	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEW VSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSY LSTASSLDYWGQGTLVTVSSFNRGESASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S VVTVPS S SLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
47	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQ SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSVEPKSSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
48	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGNGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG

-51 039598

	IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSLGGGSGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S VVTVPS S SLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
49	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSLGGGSGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
50	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGNGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSFNRGESASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS SWTVPS S SLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
51	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSVEPKSSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
52	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSLGGGSGASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS SWTVPS S SLGTKTYTCNVD

- 52 039598

	HKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
53	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGNGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSLGGGSGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKWACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
54	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSLGGGSGASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S WTVPS S SLGTKTYTCNVD HKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCV WDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
55	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGNGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSLGGGSGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
56	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSLGGGSGASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S WTVPS S SLGTKTYTCNVD HKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWL

- 53 039598

	NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQWTLPPSQEEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
57	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGNGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSLGGGSGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
58	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSLGGGSGASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S WTVPS S SLGTKTYTCNVD HKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCV VVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
59	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGNGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSLGGGSGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
60	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSFNRGESASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S WTVPS S SLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQWTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ

- 54 039598

	QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
61	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGNGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSVEPKSSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKWACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
62	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSFNRGESASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S WTVPS S SLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
63	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGNGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSVEPKSSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSIYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
64	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSFNRGESASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S WTVPS S SLGTKTYTCNVD HKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQWTLPPSQEEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
65	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR

- 55 039598

	HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGNGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSVEPKSSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
66	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSFNRGESASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S WTVPS S SLGTKTYTCNVD HKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCV VVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
67	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGNGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSVEPKSSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSIYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
68	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGNGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSLGGGSGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S WTVPS S SLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
69	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI

-56039598

	GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSLGGGSGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
70	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGNGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSLGGGSGASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S WTVPS S SLGT KTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS RWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
71	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSLGGGSGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
72	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGNGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSLGGGSGASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S WTVPS S SLGT KTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLYI TREPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQWTLPPSQEEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS RWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
73	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSLGGGSGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN

- 57 039598

	FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
74	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGNGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSFNRGESASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
75	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSVEPKSSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
76	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGNGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSFNRGESASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGT KTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS RWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
77	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSVEPKSSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC

- 58 039598

78	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGNGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSFNRGESASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTA ALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S WTVPS S SLGT KTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLYI TREPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQWTLPPSQEEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS RWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
79	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSWSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSVEPKSSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKW ACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
80	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSWSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSLGGGSGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQWTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
81	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGDGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSLGGGSGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
82	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSWSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG

- 59 039598

	SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSLGGGSGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S WTVPS S SLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
83	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGDGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSLGGGSGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKWACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
84	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSWSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSLGGGSGASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S WTVPS S SLGTKTYTCNVD HKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQWTLPPSQEEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
85	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGDGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSLGGGSGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKWACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
86	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSWSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG

- 60 039598

	YAWFIYWGQGTLVTVSSLGGGSGASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S VVTVPS S SLGTKTYTCNVD HKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCV VVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
87	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGDGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSLGGGSGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
88	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSFNRGESASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S VVTVPS S SLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
89	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGDGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSVEPKSSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
90	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSFNRGESASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVN

- 61 039598

	HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
91	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGDGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSVEPKSSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
92	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSFNRGESASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S VVTVPS S SLGTKTYTCNVD HKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
93	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGDGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSVEPKSSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
94	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSFNRGESASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S VVTVPS S SLGTKTYTCNVD HKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCV VVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWL

-62039598

	NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
95	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGDGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSVEPKSSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
96	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGDGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSLGGGSGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S VVTVPS S SLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
97	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSLGGGSGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
98	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGDGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSLGGGSGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRE EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL

- 63 039598

	TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
99	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSLGGGSGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
100	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGDGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSLGGGSGASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGT KTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS RWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
101	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSLGGGSGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSIYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
102	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGDGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSLGGGSGASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGT KTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLYI TREPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS RWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
103	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA

- 64 039598

	TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSLGGGSGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
104	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGDGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSFNRGESASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
105	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSVEPKSSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
106	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGDGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSFNRGESASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
107	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI

- 65 039598

	GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSVEPKSSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKW ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
108	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGDGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSFNRGESASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGT KTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS RWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
109	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSVEPKSSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKW ACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
ПО	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGDGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSFNRGESASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTA ALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S WTVPS S SLGT KTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLYI TREPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQWTLPPSQEEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS RWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
111	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSWSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSVEPKSSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNF

- 66 039598

	YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKW ACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
112	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSLGGGSGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S WTVPS S SLGTQIYICNVN HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQWTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
113	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGNGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSLGGGSGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKWACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
114	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQ SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSLGGGSGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S WTVPS S SLGTQIYICNVN HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQWTLPPSREEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
115	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEW VSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSY LSTASSLDYWGQGTLVTVSSLGGGSGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KWACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC

- 67 039598

116	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQ SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSLGGGSGASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S WTVPS S SLGTKTYTCNVD HKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQWTLPPSQEEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
117	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEW VSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSY LSTASSLDYWGQGTLVTVSSLGGGSGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KWACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
118	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQ SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSLGGGSGASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S WTVPS S SLGTKTYTCNVD HKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCV VVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQWTLPPSQEEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
119	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEW VSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSY LSTASSLDYWGQGTLVTVSSLGGGSGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KWACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
120	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQ SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKGGG

- 68 039598

	SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSFNRGESASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S WTVPS S SLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
121	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEW VSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSY LSTASSLDYWGQGTLVTVSSVEPKSSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KWACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
122	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQ SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSFNRGESASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S WTVPS S SLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQWTLPPSREEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
123	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEW VSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSY LSTASSLDYWGQGTLVTVSSVEPKSSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KWACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
124	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQ SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG

- 69 039598

	YAWFIYWGQGTLVTVSSFNRGESASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS SWTVPS S SLGTKTYTCNVD HKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQWTLPPSQEEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
125	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEW VSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSY LSTASSLDYWGQGTLVTVSSVEPKSSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KWACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
126	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQ SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSFNRGESASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS SWTVPS S SLGTKTYTCNVD HKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCV VVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQWTLPPSQEEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
127	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEW VSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSY LSTASSLDYWGQGTLVTVSSVEPKSSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KWACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
128	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEW VSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSY LSTASSLDYWGQGTLVTVSSLGGGSGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS SWTVPS S SLGTQTYICN

- 70 039598

	VNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
129	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQ SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSLGGGSGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
130	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEW VSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSY LSTASSLDYWGQGTLVTVSSLGGGSGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S WTVPS S SLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQWTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
131	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQ SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSLGGGSGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
132	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEW VSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSY LSTASSLDYWGQGTLVTVSSLGGGSGASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S WTVPS S SLGTKTYTCN VDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQD

- 71 039598

	WLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQWTLPPSQEEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
133	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQ SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSLGGGSGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
134	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEW VSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSY LSTASSLDYWGQGTLVTVSSLGGGSGASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S WTVPS S SLGTKTYTCN VDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVT CVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQWTLPPSQEEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
135	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQ SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSLGGGSGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
136	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSWSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSLGGGSGASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S WTVPS S SLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQWTLPPSREEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ

-72039598

	GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
137	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGNGLEWV AFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRG IAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSSLGGGSGRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
138	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEW VSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSY LSTASSLDYWGQGTLVTVSSFNRGESASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S WTVPS S SLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQWTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
139	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQ SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSVEPKSSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKW ACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
140	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEW VSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSY LSTASSLDYWGQGTLVTVSSFNRGESASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S WTVPS S SLGTKTYTCN VDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQWTLPPSQEEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
141	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQ

- 73 039598

	SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSVEPKSSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
142	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASRDVAIAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTR HTGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVADYFCHQYSSYPFTFGSGTKLEIKGGG SGGGGEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEW VSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSY LSTASSLDYWGQGTLVTVSSFNRGESASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLS S VVTVPS S SLGTKTYTCN VDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVT CVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
143	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQ SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKGGG SGGGGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDQTIHWMRQAPGQGLEWI GYIYPRDDSPKYNENFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIPDRSG YAWFIYWGQGTLVTVSSVEPKSSRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
144	MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFCLL HFGVIGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQL QWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVL LTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQL EKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
145	MLGSRAVMLLLLLPWTAQGRAVPGGSSPAWTQCQQLSQKLCTLAWSAH PLVGHMDLREEGDEETTNDVPHIQCGDGCDPQGLRDNSQFCLQRIHQGLI FYEKLLGSDIFTGEPSLLPDSPVGQLHASLLGLSQLLQPEGHHWETQQIPS LSPSQPWQRLLLRFKILRSLQAFVAVAARVFAHGAATLSP
146	DYAMH
147	AITWNSGHIDYADSVEG
148	VSYLSTASSLDY

- 74 039598

149	RASQGIRNYLA
150	AASTLQS
151	QRYNRAPYT
152	SYAMH
153	FMSYDGSNKKYADSVKG
154	NYYYYGMDV
155	RASQSVYSYLA
156	DASNRAT
157	QQRSNWPPFT
158	DQTIH
159	YIYPRDDSPKYNENFKG
160	PDRSGYAWFIY
161	KASRDVAIAVA
162	WASTRHT
163	HQYSSYPFT

Другие варианты реализации изобретения

Все описанные свойства, раскрытые в данной спецификации, могут быть объединены в любой комбинации. Каждое свойство, раскрытое в данной спецификации, может быть заменено на альтернативное свойство, которое служит той самой, эквивалентной или аналогичной цели. Таким образом, если не ука зано иначе, каждое свойство раскрывается в данном изобретении только для примера общего ряда экви валентных или аналогичных свойств.

Из приведенного выше описания, специалист в данной области может легко определить существенные характеристики данного раскрытия изобретения, и без отхода от сущности и объема этого изобретения, может выполнить различные изменения и модификации изобретения для того, чтобы адаптировать его к различных применениям и условиям. Таким образом, другие варианты реализации изобретения также находятся в пределах формулы изобретения.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Соединение, которое специфически связывается с фактором некроза опухоли альфа (ФНО-альфа) и интерлейкином-23-А (ИЛ-23А) и противодействует активности, опосредованной ФНО-альфа и ИЛ23А, содержащее первый полипептид и второй полипептид, причем:

(A) указанный первый полипептид содержит:

(i) вариабельный домен легкой цепи первого иммуноглобулина (VL1), специфический к первому целевому белку;

(ii) вариабельный домен тяжелой цепи второго иммуноглобулина (VH2), специфический ко второму целевому белку; и (iii) шарнирную область, константную область 2 тяжелой цепи (CH2) и константную область 3 тяжелой цепи (CH3); и (B) указанный второй полипептид содержит:

(i) вариабельный домен легкой цепи второго иммуноглобулина (VL2), специфический к указанному второму целевому белку;

(ii) вариабельный домен тяжелой цепи первого иммуноглобулина (VH1), специфический к указанному первому целевому белку;

(C) при этом:

(i) указанные VL1 и VH1 объединяются, чтобы сформировать сайт связывания, связывающий указанный первый целевой белок;

(ii) указанные VL2 и VH2 объединяются, чтобы сформировать сайт связывания, связывающий указанный второй целевой белок;

(iii) указанная константная область 2 тяжелой цепи (CH2) содержит тирозин в позиции 252, треонин в позиции 254 и глутаминовую кислоту в позиции 256, пронумерованные в соответствии с индексом EC согласно Kabat; и (iv) указанный первый целевой белок представляет собой ФНО-альфа и указанный второй целевой белок представляет собой ИЛ-23А или указанный первый целевой белок представляет собой ИЛ-23А и указанный второй целевой белок представляет собой ФНО-альфа, (D) при этом:

(i) указанный VL1 содержит SEQ ID NO: 2, указанный VH1 содержит SEQ ID NO: 1, указанный VL2 содержит SEQ ID NO: 8 и указанный VH2 содержит SEQ ID NO: 7; или

- 75 039598 (ii) указанный VL1 содержит SEQ ID NO: 8, указанный VH1 содержит SEQ ID NO: 7, указанный

VL2 содержит SEQ ID NO: 2 и указанный VH2 содержит SEQ ID NO: 1.
2. Соединение, которое специфически связывается с фактором некроза опухоли альфа (ФНО-альфа) и интерлейкином-23-А (ИЛ-23А) и противодействует активности, опосредованной ФНО-альфа и ИЛ23А, содержащее первый полипептид и второй полипептид, причем:

(A) указанный первый полипептид содержит:

(i) вариабельный домен легкой цепи первого иммуноглобулина (VL1), специфический к первому целевому белку;

(ii) вариабельный домен тяжелой цепи второго иммуноглобулина (VH2), специфический ко второму целевому белку; и (iii) шарнирную область, константную область 2 тяжелой цепи (CH2) и константную область 3 тяжелой цепи (CH3); и (B) указанный второй полипептид содержит:

(i) вариабельный домен легкой цепи второго иммуноглобулина (VL2), специфический к указанному второму целевому белку;

(ii) вариабельный домен тяжелой цепи первого иммуноглобулина (VH1), специфический к указанному первому целевому белку;

(C) при этом:

(i) указанные VL1 и VH1 объединяются, чтобы сформировать сайт связывания, связывающий указанный первый целевой белок;

(ii) указанные VL2 и VH2 объединяются, чтобы сформировать сайт связывания, связывающий указанный второй целевой белок;

(iii) указанная константная область 2 тяжелой цепи (CH2) содержит тирозин в позиции 252, треонин в позиции 254 и глутаминовую кислоту в позиции 256, пронумерованные в соответствии с индексом EC согласно Kabat; и (iv) указанный первый целевой белок представляет собой ФНО-альфа и указанный второй целевой белок представляет собой ИЛ-23А или указанный первый целевой белок представляет собой ИЛ-23А и указанный второй целевой белок представляет собой ФНО-альфа, (D) при этом:

(i ) указанный VL1 содержит SEQ ID NO: 4, указанный VH1 содержит SEQ ID NO: 3, указанный VL2 содержит SEQ ID NO: 8 и указанный VH2 содержит SEQ ID NO: 7; или (ii ) указанный VL1 содержит SEQ ID NO: 8, указанный VH1 содержит SEQ ID NO: 7, указанный VL2 содержит SEQ ID NO: 4 и указанный VH2 содержит SEQ ID NO: 3.
3. Соединение по п.1, в котором указанный VL1 содержит SEQ ID NO: 2, указанный VH1 содержит SEQ ID NO: 1, указанный VL2 содержит SEQ ID NO: 8 и указанный VH2 содержит SEQ ID NO: 7.
4. Соединение по п.1, в котором указанный VL1 содержит SEQ ID NO: 8, указанный VH1 содержит SEQ ID NO: 7, указанный VL2 содержит SEQ ID NO: 2 и указанный VH2 содержит SEQ ID NO: 1.
5. Соединение по п.2, где в (D)(i) указанный VL1 содержит SEQ ID NO: 4, указанный VH1 содержит SEQ ID NO: 3, указанный VL2 содержит SEQ ID NO: 8 и указанный VH2 содержит SEQ ID NO: 7.
6. Соединение по п.2, где в (D)(ii) указанный VL2 содержит SEQ ID NO: 4, указанный VH2 содержит SEQ ID NO: 3, указанный VL1 содержит SEQ ID NO: 8 и указанный VH1 содержит SEQ ID NO: 7.
7. Соединение по п.1 или 2, где указанный первый полипептид дополнительно содержит первый линкер между указанным VL1 и указанным VH2, а указанный второй полипептид дополнительно содержит второй линкер между указанными VL2 и указанным VH1.
8. Соединение по п.7, где указанный первый линкер или указанный второй линкер содержит аминокислотную последовательность GGGSGGG (SEQ ID NO: 9).
9. Соединение по п.7, где указанный первый линкер и указанный второй линкер содержат аминокислотную последовательность GGGSGGG (SEQ ID NO: 9).
10. Соединение по п.1 или 2, где указанный первый полипептид дополнительно содержит домен константной области 1 тяжелой цепи (СН1), а указанный второй полипептид дополнительно содержит домен константной области легкой цепи (CL), причем указанный CL и указанный СН1 объединены через дисульфидную связь для того, чтобы сформировать С1 домен.
11. Соединение по п.10, где указанный первый полипептид дополнительно содержит третий линкер между указанным VH2 и указанным СН1, а указанный второй полипептид дополнительно содержит четвертый линкер между указанным VH1 и указанным CL.
12. Соединение по п.11, где указанный третий линкер содержит аминокислотную последовательность FNRGES (SEQ ID NO: 11).
13. Соединение по п.11, где указанный четвертый линкер содержит аминокислотную последовательность VEPKSS (SEQ ID NO: 12).
14. Соединение по п.11, где указанный третий линкер содержит аминокислотную последовательность FNRGES (SEQ ID NO: 11) и указанный четвертый линкер содержит аминокислотную последовательность VEPKSS (SEQ ID NO: 12).

- 76 039598
15. Соединение по п.11, где указанный третий линкер или указанный четвертый линкер содержат аминокислотную последовательность LGGGSG (SEQ ID NO: 10).
16. Соединение по п.11, где указанный третий линкер и указанный четвертый линкер содержат аминокислотную последовательность LGGGSG (SEQ ID NO: 10).
17. Соединение по любому из предшествующих пунктов, где указанная константная область 2 тяжелой цепи (CH2) содержит аланин в позиции 234 и аланин в позиции 235, пронумерованные в соответствии с индексом EC согласно Kabat.
18. Соединение по любому из предшествующих пунктов, где аминокислотную последовательность указанной шарнирной области, указанной константной области 2 тяжелой цепи (CH2) или указанной константной области 3 тяжелой цепи (CH3) получают из IgG1 или из IgG4.
19. Соединение по любому из предшествующих пунктов, где указанная шарнирная область содержит аминокислотную последовательность EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 40).
20. Соединение по любому из предшествующих пунктов, где указанное соединение содержит два указанных первых полипептида и два указанных вторых полипептида, при этом два первых полипептида объединены вместе через по меньшей мере одну дисульфидную связь.
21. Соединение по п.1 или 2, где:

(i) указанный первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13 и указанный второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14;

(ii) указанный первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15 и указанный второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16;

(iii) указанный первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17 и указанный второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18;

(iv) указанный первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19 и указанный второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20;

(v) указанный первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21 и указанный второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22;

(vi) указанный первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23 и указанный второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24;

(vii) указанный первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25 и указанный второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26 и (viii) указанный первый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27 и указанный второй полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.
22. Соединение по п.21, где указанное соединение содержит два указанных первых полипептида и два указанных вторых полипептида, при этом указанные два первых полипептида объединены вместе через по меньшей мере одну дисульфидную связь и при этом каждый указанный первый полипептид объединен с одним указанным вторым полипептидом через по меньшей мере одну дисульфидную связь.
23. Соединение по п.21 или 22, где указанное соединение содержит два указанных первых полипептида и два указанных вторых полипептида, при этом каждый из указанных первых полипептидов содержит CH1, CH2 и CH3 и каждый из указанных вторых полипептидов содержит CL, и при этом CH2 и CH3 одного из первых полипептидов объединяется с CH2 и CH3 другого из первых полипептидов, и СН1 каждого из указанных первых полипептидов объединяется с CL одного из указанных вторых полипептидов для того, чтобы сформировать тетравалентную молекулу.
24. Композиция для ингибирования активности ФНО-альфа и ИЛ23А, содержащая соединение по любому из пп.1-23, которое специфически связывается с фактором некроза опухоли альфа (ФНО-альфа) и интерлейкином-23-А (ИЛ-23А), противодействует активности, опосредованной ФНО-альфа и ИЛ-23А, и фармацевтически приемлемый носитель.
25. Применение соединения по любому из пп.1-23, которое специфически связывается с фактором некроза опухоли альфа (ФНО-альфа) и интерлейкином-23-А (ИЛ-23 А) и противодействует активности, опосредованной ФНО-альфа и ИЛ-23 А, при лечении аутоиммунного заболевания.
26. Применение соединения по любому из пп.1-23, которое специфически связывается с фактором некроза опухоли альфа (ФНО-альфа) и интерлейкином-23-А (ИЛ-23А) и противодействует активности, опосредованной ФНО-альфа и ИЛ-23А, при лечении воспалительного заболевания.
27. Фармацевтическая композиция для лечения аутоиммунного заболевания, содержащая терапевтически эффективное количество соединения по любому из пп.1-23, которое специфически связывается с фактором некроза опухоли альфа (ФНО-альфа) и интерлейкином-23-А (ИЛ-23А) и противодействует активности, опосредованной ФНО-альфа и ИЛ-23 А.
28. Фармацевтическая композиция для лечения воспалительного заболевания, содержащая терапевтически эффективное количество соединения по любому из пп.1-23, которое специфически связывается с фактором некроза опухоли альфа (ФНО-альфа) и интерлейкином-23-А (ИЛ-23А) и противодействует активности, опосредованной ФНО-альфа и ИЛ-23.
29. Нуклеиновая кислота, кодирующая соединение по любому из пп.1-23, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность соединения по любому

- 77 039598 из пп.1-23.
30. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.29.
31. Вектор по п.30, дополнительно содержащий промотор, функционально соединенный с указанной нуклеиновой кислотой.
32. Клетка для продуцирования соединения по любому из пп.1-23, содержащая нуклеиновую кислоту по п.29 или вектор по п.30 или 31.
33. Способ продуцирования соединения по любому из пп.1-23, которое специфически связывается с фактором некроза опухоли альфа (ФНО-альфа) и интерлейкином-23-А (ИЛ-23А) и противодействует активности, опосредованной ФНО-альфа и ИЛ-23, включающий стадию, на которой получают клетку по п.32, которая продуцирует соединение, кодируемое указанной нуклеиновой кислотой в указанной клетке.
34. Способ по п.33, дополнительно включающий стадию, на которой выделяют и очищают указанное соединение.