RS54950B1

RS54950B1 - Antigen vezujući proteini sposobni za vezivanje timusnog stromalnog limfopoetina

Info

Publication number: RS54950B1
Application number: RS20160490A
Authority: RS
Inventors: Michael R Comeau; James F Smothers; Bo-Rin P Yoon; Christopher Mehlin
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2007-09-10
Filing date: 2008-09-09
Publication date: 2016-11-30
Also published as: PE20140232A1; HUS2200051I1; US7982016B2; NL301207I1; PH12017501025A1; US20090238823A1; CY2022036I2; CR11319A; JP2024161358A; CN101809035B; JP5956716B2; US20120190829A1; PT2205635T; US20160152700A1; DK2205635T3; JP2010538608A; JP2015091820A; AU2008300028B2; CA2698382A1; SG178781A1

Description

OBLAST PRONALASKA

[0001]Oblast ovog pronalaska odnosi se na kompozicije ljudskih antitela sposobnih da vezuju humani timusni stromalni limfopetin, kao i na povezane postupke.

POZADINA PRONALASKA

[0002]Čini se da se prevalenca alergijskih bolesti kao što su astma, alergijski rinitis, atopični đermatitis i alergije na hranu povećava poslednjih godina, naročito u razvijenim zemljama, utičući na sve veći procenat stanovništva (Kay, N Engl. J. Med. 344:30-37 (2001)). Timusni stromalni limfopetin (TSLP) je citokin izveden iz epitelne ćelije proizveden kao odgovor na pro-inflamatorni stimulans. Otkriveno je da TSLP promoviše alergijske inflamatorne odgovore prvenstveno kroz svoju aktivnosti na dendritske i ćelije mastocita (Soumelis et al., Nat Immun 3 (7):673-680 (2002), Allakhverdi et al., J. Ekp. Med. 204 (2):253-258 (2007)). Prijavljeno je da je ekspresija humanog TSLP povećana u astmatičnim disajnim putevima koji su u korelaciji sa ozbiljnosti bolesti (Ying et al., J. Immunol. 174:8183-8190 (2005)). Pored toga, niovi TSLP proteina mogu se detektovati u koncentrovanom fluidu bronhoalveoloarne lavaže (BAL) pacijenata sa astmom, i ostalih pacijenata koji pate od alergijskih poremećaja. Takođe, povećan nivo TSLP proteina i mRNK pronađeni su u kožnim lezijama pacijenata sa atopijskim dermatitisom (AD). Stoga, TSLP antagonisti bili bi korisni u lečenju zapaljenskih poremećaja.

[0003]Pored toga, utvrđeno je TSLP takođe promoviše fibrozu, kako je navedeno u U.S. prijavi redni br. 11/344,379. Fibrotična bolest rezultira tokom procesa obnove tkiva ukoliko se fibrozna faza nastavlja nekontrolisano, dovodeći do ekstenzivnog remodeliranja tkiva i formiranja tkiva trajnog ožiljka (Wynn, Nature Rev. Immunol. 4, 583 (2004)). Procenjeno je da se do 45% smrtnih slučajeva u Sjedinjenim Državama može da pripisati fibroproliferativnim bolestima, škoje mogu uticati na mnoga tkiva i sisteme organa (Wynn, gore navedeno, na 595 (2004)). WO 2007/096149 opisuje TSLP antitela.

[0004]Trenutno, antizapaljenski tretmani koriste se za lečenje fibroznih poremećaja, budući da je fibroza zajednička mnogim upornim zapaljenskim bolestima kao što su idopatska plućna fibroza, progresivne bolesti bubrega, i ciroza jetre. Međutim, mehanizmi uključeni u regulaciju fibroze izgleda đa se razlikuju od onih zapaljenskih, te anti-zapaljenske terapije nisu uvek efikasne u smanjenju ili prevenciji fibroze (Wynn, gore navedeno). Stoga, ostaje potreba za razvijanjem tretmana koji bi smanjili i sprečili

fibrozu.

[0005] Prema tome, oekuje se đa bi antagonisti za TSLP bili korisni za tretiranje ovih zapaljenskih i fibroznih poremećaja. Ovaj pronalazak obezbeđuje takve tretmane i postupke za tretiranje.

SUŠTINA PRONALASKA

[0006] Ovaj pronalazak obezbeđuje izolovani antigen vezujući protein koji obuhvata a. CDR3 sekvencu lakog lanca izabranu između i. CDR3 sekvence lakog lanca koja se razlikuje za ne više od ukupno dva dodatka amino kiseline, supstitucije i/ili delecije iz CDR3 sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od CDR3 sekvence lakog lanca od Al do A27; ii. QQAX8SFPLT (SEQ ID NO: 251); i b. CDR3 sekvencu teškog lanca izabranu između i. CDR3 sekvence teškog lanca koja se razlikuje za ne više od ukupno tri dodataka amino kiseline, supstitucije i/ili delecije iz sekvence CDR3 izabrane iz grupe koja se sastoji od CDR3 sekvence teškog lanca od Al na A27; ii.GGGIX12VADYYXi3YGMDV (SEQ ID NO: 255); iii. DX2iGX22SGWPLFX23Y (SEQ ID NO: 259); gde X8je N ostatak ili D ostatak; Xi2je P ostatak ili A ostatak; X]3je Y ostatak ili F ostatak; X21je G ostatak ili R ostatak; X22je S ostatak ili T ostatak; X23je A ostatak ili D ostatak, i gde se pomenuti antigen vezujući protein specifično vezuje za TSLP.

[0007] Izolovani antigen vezujući protein prema ovom pronalasku dalje obuhvata najmanje jedno od sledećeg: a. CDR1 sekvencu lakog lanca izabranu između i. CDR1 sekvence lakog lanca koja se razlikuje za ne više od tri dodatka amino kiseline, supstitucije i/ili delecije CDR1 sekvence lakog lanca A1-A27; ii. RSSQSLXiYSDGX2TYLN (SEQ ID NO: 246); iii. RASQX4XSSSWLA (SEQ ID NO: 249); b. CDR2 sekvencu lakog lanca izabranu između i. CDR2 sekvence lakog lanca koja se razlikuje za ne više od dva dodatka amino kiseline, supstitucije, i/ili delecije CDR2 sekvence A1-A27; ii. KVSX3(ostaci 1-4 SEQ ID NO: 247); iii. X6X7SSLQS (SEQ ID NO: 250); ili iv. QDX9KRPS (SEQ ID NO: 252); i c. CDR1 sekvencu teškog lanca izabranu između i. CDR1 sekvence teškog lanca koja se razlikuje za ne više od dvdodatka amino kiseline, supstitucije, i/ili delecije CDR1 sekvence A1-A27; ii. Xi0YGMH (SEQ ID NO: 253); i iii. X]5Xi5YMXi7(SEQ ID NO: 257); i d. CDR2 sekvencu teškog lanca izabranu između i. CDR2 sekvence teškog lanca koja se razlikuje za ne više od tri dodatka amino kiseline, supstitucije, i/ili delecije CDR2 sekvence A1-A27; ii. VIWXnDGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO: 254); iii. VISYDGSXMKYYADSVKG (SEQ ID NO: 256); i iv. WINPNSGGTNXiBXi9X2oKFQG (SEQ ID NO: 258); gde Xipredstavlja V ostatak ili I ostatak; X2je N ostatak ili D ostatak; X3 je Y ostatak ili N ostatak; Xa je G ostatak ili S ostatak; X5 je L ostatak ili I ostatak; Xe je N ostatak ili T ostatak; X7 je T ostatak ili A ostatak; Xs je K ostatak ili N ostatak; Xi0 je S ostatak ili N ostatak; Xu je Y ostatak ili F ostatak; XM je Y ostatak ili N ostatak; Xi5je ostatak D ili G ostatak; Xi6je Y ostatak ili D ostatak; Xi7 je Y ostatak ili H ostatak; Xi8 je Y ostatak ili H ostatak; Xi9 je ostatak V ili A ostatak; X20 je Q ostatak ili R ostatak, i gde se pomenuti antigen vezujući protein specifično vezuje za TSLP.

[0008]Humano anti-TSLP-antitelo izolovanog antigen vezujućeg proteina obuhvata ili: a. varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata: i. CDR1 sekvencu lakog lanca izabranu između A1-A27; ii CDR2 sekvencu lakog lanca izabranu između A1-A27; iii. CDR3 sekvencu lakog lanca izabranu između A1-A27; ili b. varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata i. CDR1 sekvencu teškog lanca izabranu između Al-A27; ii. CDR2 sekvencu teškog lanca izabranu između A1-A27, i iii. CDR3 sekvencu teškog lanca izabranu između A1-A27; ili c. varijabilni domen lakog lanca iz (a) i varijabilni domen teškog lanca iz (b).

[0009]Izolovani antigen vezujući protein obuhvata ili a. sekvencu varijabilnog domena lakog lanca izabranu između i. amino kiselina koje imaju sekvencu najmanje 80% identičnu sa sekvencom varijabilnog domena lakog lanca izabranom između L1-L27; ii. sekvence amino kiselina kodirana sekvencom polinukleotida koja je najmanje 80% identična sa sekvencom polinukleotida koja kodira sekvencu varijabilnog domena lakog lanca od L1-L27; iii. sekvenca amino kiselina kodirana sekvencom polinukleotida koja hibridizuje pod umereno strogim uslovima sa komplementom polinukleotida koji se sastoji od sekvence varijabilnog domena lakog :anca iz L1-L27; b. sekvencu varijabilnog domena teškog lanca izabrana između i. sekvence amino kiselina koja je najmanje 80% identična sa sekvencom varijabilnog domena teškog lanca iz H1-H27; ii. sekvence amino kiselina kodirana sekvencom polinukleotida koja je najmanje 80% identična sa sekvencom polinukleotida koja kodira sekvencu varijabilnog domena teškog lanca iz H1-H27; iii. sekvence amino kiselina kodirana sekvencom polinukleotida koja hibridizuje pod umereno strogim uslovima sa komplementom polinukleotida koji se sastoji od sekvence varijabilnog domena teškog lanca iz H1-H27; ili c. varijabilni domen lakog lanca iz (a) i varijabilni domen teškog lanca iz (b), pri čemu se pomenuti antigen vezujući protein specifično vezuje za TSLP.

[0010]Izolovani antigen vezujući protein prem ovom pronalasku obuhvata ili: a. sekvencu varijabilnog domena lakog lanca izabrana između: L1-L27; b. sekvencu varijabilnog domena teškog lanca izabrana između H1-H27; ili c. varijabilni domen lakog lanca iz (a) i varijabilni domen teškog lanca iz (b), pri čemu se antigen vezujući protein specifično vezuje za TSLP. * ;[0011]U daljem aspektu, humano anti-TSLP-antitelo obuhvata sekvencu varijabilnog domena lakog lanca i sekvencu varijabilnog domena teškog lanca izabrane između L5H5, L19.2H19, L20.1H20, L20.2H20, L21H21, L22H22, L23H23, L24H24, L25H25, L26H26, i. ;[0012]U daljem aspektu, humano anti-TSLP-antitelo obuhvata vezujući protein koji se vezuje za TSLP sa suštinski istim Kd kao i referetntno antitelo A5. U još jednom aspektu, izolovani antigen vezujući protein obuhvata vezujući protein koji inhibira TSLP aktivnost u skladu sa primarnim ćelijskim OPG ogledom sa istim IC50 kao i referentno antitelo A5. ;[0013] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na humano anti-TSLP-antitelo koje obuhvata: ;a. varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata: ;i. CDR1 sekvencu lakog lanca koja obuhvata sekvencu amino kiseline SEQ ID NO: 13; ii. CDR2 sekvencu lakog lanca koja obuhvata sekvencu amino kiseline SEQ ID NO: 60; i iii. CDR3 sekvencu lakog lanca koja obuhvata sekvencu amino kiseline SEQ ID NO: 105; i ;b. varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata: ;i. CDR1 sekvencu teškog lanca koja obuhvata sekvencu amino kiseline SEQ ID NO: 145; ii. CDR2 sekvencu teškog lanca koja obuhvata sekvencu amino kiseline SEQ ID NO: 173 i iii. CDR3 sekvencu teškog lanca koja obuhvata sekvencu amino kiseline SEQ ID NO: 212. ;[0014] Preciznije, pronalazak se odnosi na humano anti-TSLP-antitelo koje obuhvata: ;a. sekvencu varijabilnog domena lakog lanca izabrana z grupe koju čine: ;i. amino kiseline koje imaju sekvencu najmanje 80% identičnu sa SEQ ID NO: 363; ii. sekvenca amino kiselina kodirana sekvencom polinukleotida koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID NO: 362; iii. sekvenca amino kiselina kodirana sekvencom polinukleotida koja se hibridizuje pod umereno strogim uslovima sa komplementom polinukleotida koji se sastoji od SEQ ID NO: 362; i ;b sekvencu varijabilnog domena teškog lanca izabrana iz grupe koju čine: ;i. sekvenca amino kiselina koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID NO: 361; ii. sekvenca amino kiselina kodirana sekvencom polinukleotida koja je najmanje 80% identična sa SEQIDNO:360; iii. sekvenca amino kiselina kodirana sekvencom polinukleotida koja se hibridizuje pod umereno strogim uslovima sa komplementom polinukleotida koji se sastoji od SEQ ID NO: 360. ;[0015]U sledećem aspektu, humano anti-TSLP-antitelo unakrsno ulazi u kompeticiji za vezivanje TSLP sa referentnim antitelom. U drugom aspektu, izolovani antigen vezujući protein vezuje za isti epitop kao i referentno antitelo. ;[0016]U jednom aspektu, humano anti-TSLP-antitelo izabrano je između humanog antitela, humanizovanog antitela, himernog antitela, monoklonalnog antitela, poliklonalnog antitela. rekombinovanog antitela, fragmenta antigen-vezujućeg antitela, antitelo pojedinačnog lanca, dijatela, trijatela, tetratela, Fab fragmenta, F (fa')x fragmenta, domenskog antitela, IgD antitela, IgE antitela i IgM antitela, i IgGl antitela, i lgG2 antitela, i lgG3 antitela , i lgG4 antitela, i lgG4 antitela koja imaju najmanje jednu mutaciju u zglobnom regionu koja ublažava sklonost ka intra disulfidnim vezama H-lanca. U jednom aspektu, izolovani antigen vezujući protein je humano antitelo. ;[0017]Takođe je obezbeđen izolovani molekul nukleinske kiseline koji obuhvata sekvencu polinukleotida koja kodira varijabilni domen lakog lanca, varijabilni domen teškog lanca, ili oba, antitela prema ovom pronalasku. U jednom ostvarenju, polinukleotid obuhvata varijabilnu sekvencu lakog lanca L1-L27, i/ili varijabilnu sekvencu teškog lanca H1-H27, ili obe. ;[0018]Takođe su obezbeđeni vektori koji obuhvataju polinukleotide prema ovom pronalasku. U jednom pstvarenju vektor je ekspresioni vektor. Takođe je obezbeđena ćelija domaćin koja obuhvata vektor. Takođe je obezbeđen hibridom sposoban da proizvede antigen vezujući protein prema ovom pronalasku. Takođe je obezbeđen postupak izrade antigen vezujućeg proteina koji obuhvata kultivisanje ćelije domaćina pod uslovima kojim joj omogućavaju da eksprimira antigen vezujući protein. ;[0019]Takođe je obezbeđena farmaceutska kompozicija koja obuhvata antitela prema ovom pronalasku. U jednom ostvarenju, farmaceutska kompozicija obuhvata humano antitelo. Takođe je obezbeđen postupak za tretiranje TSLP-povezanih zapaljenskih stanja kod subjekta kome je potreban takav tretman koji obuhvata davanje terapeutski efikasne količine kompozicije subjektu. U jednom ostvarenju, zapaljensko stanje je alergijska astma, alergijski rinosinusitis, alergijski konjuktivitis ili atopični dermatitis. Takođe je obezbeđen postupak za tretiranje TSLP-povezanih fibroznih poremećaja kod subjekta kome je potreban takav tretman koji obuhvata davanje terapeutski efikasne količine kompozicije subjektu. U jednom ostvarenju, fibrozni poremećaj je skleroderma, intersticijaina bolest pluća, idiopatska plućna fibroza, fibroza koja proizilazi iz hroničnog hepatitisa B ili C, zračenjem indukovana fibroza i fibroza koja nastaje prilikom zarastanja rana. ;KRATAK OPIS CRTEŽA ;[0020]FIG. 1A-FIG. 1F. Ovaj crtež prikazuje sekvencu amino kiseline CDR1, CDR2 i CDR3 regiona lakog lanca iz A1-A27. Dalje je prikazana primerna nukleotidna sekvenca koja kodira svaki CDR. FIG. 2A-FIG. 2F. Ovaj crtež prikazuje sekvencu amino kiseline CDR1, CDR2 i CDR3 regiona teškog lanca iz A1-A27. Dalje je prikazana primerna nukleotidna sekvenca koja kodira svaki CDR. ;DETALJAN OPIS PRONALASKA ;[0021]Ovaj pronalazak se odnosi na humana anti-TSLP-antitela koja se specifično vezuju za citokinski ljudski timusni stromalni limfopetin (TSLP), uključujući antigen vezujuće proteine koji inhibiraju TSLP vezivanje i signalizaciju kao antagonistička TSLP antitela, fragmenti antitela i derivati antitela. Antitela su korisna za inhibiranje ili blokiranje vezivanja TSLP za njegov receptor, i za tretiranje inflamatornih bolesti, fibroznih oboljenja i drugih povezanih stanja. ;[0022]Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje kompozicije, kitove i postupke koji se odnose na humana antitela koja se vezuju za TSLP. Takođe su obezbeđeni molekuli nukleinske kiseline, i njihovi derivati i fragmenti, koji obuhvataju sekvencu polinukleotida koji kodiraju ceo ili deo polipeptida koji se vezuje za TSLP, kao što nukleinska kiselina kodira ceo ili deo anti-TSLP-antitela, fragmenta antitela ili derivata antitela. Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje vektore i plazmide koji obuhvataju takve nukleinske kiseline i ćelije ili ćelijske linije koje obuhvataju takve nukleinske kiseline i/ili vektore i plazmide. Navedeni postupci obuhvataju, na primer, postupke izrade, identifikacije ili izolovanja anti-TSLP-antitela, postupke koji određuju da li se antitelo vezuje za TSLP, postupke dobijanja kompozicija, poput farmaceutskih kompozicija, koje obuhvataju antitelo koje se vezuje za TSLP, t postupke za davanje antitela koje se vezuje za TSLP subjektu, na primer, postupci za tretiranje stanja posredovanih sa TSLP, i za modulaciju biološke aktivnosti povezane sa TSLP signalizacijom in vivo ili in vitro. ;TSLP ;[0023]Timusni stromalni limfopetin (TSLP) odnosi se na citokin četvoro a-heiikoidnog svežnja tipa iKoji je član IL-2 familije ali veoma usko povezan sa IL-7. Citokini su regulatorni proteini niske molekularne težine koji se luče kao odgovor na neke stimuluse, koji deluju na receptore na membrani ciljnih ćelija. Citokini regulišu različite ćelijske odgovore. Citokini su generalno opisani u referencama kao stoje Cvtokines, A. Mire-Sluis and R. Thorne, ed., Academic Press, New York, (1998). ;[0024]TSLP je originalno kloniran iz mišje timusne stromalne ćelijske linije (Sims et al J. Exp. Med. 192 (5), 671-680 (2000)), i nađeno je da podržava rani B i T ćelijski razvoj. Humani TSLP kloniran je kasnije i ustanovljeno je da ima 43 procenata identičnosti u sekvenci amino kiseline sa mišjim homologom ;(Ouentmeier et al. Leukemia 15,1286-1292 (2001), i U.S. Patent No: 6,555,520). Polinukleotid i sekvenca amino kiseline humanog TSLP prikazani su u SEQ ID NO: 1 i 2 respektivno. Utvrđeno je da se TSLP vezuje sa niskim afinitetom za lanac receptora iz familije hematopoietin receptora koji se naziva TSLP-receptor (TSLPR), koji je opisan u US patentnoj prijavi br: 09/895,945 (publikacija br: 2002/0068323) (SEQ ID NO: 3 i 4). Polinukleotidna sekvenca koja kodira humani TSLPR predstavljena je kao SEQ ID NO: 3 ove prijave, i sekvenca amino kiseline predstavljena kao SEQ ID NO: 4 ove prijave, respektivno. Rastvorljivi domen ;TSLPR je približno amino kiseline 25 do 231 iz SEQ ID NO: 4. TSLP se vezuje sa visokim afinitetom za heterodimerni kompleks TSLPR i tnterleukinski 7 receptorski alfa IL-7Rcc (Park et al., J. Exp. Med 192: 5 ;(2000), US Patentna prijava broj 09/895,945, publikacija broj US 2002/0068323). Sekvenca IL-7-receptor a prikazana je na FIG. 2 u U.S. Patentu br. 5,264,416. Sekvenca rastvorljivog domena IL-7 receptora a je amino kiselina 1 do 219 sa FIG. 2 u U.S. patentu br: 5.264.416. ;[0025]Kako se ovde koristi izraz "TSLP polipeptidi" odnosi se na različite oblike TSLP korisni kao imunogeni. Ovo uključuje TSLP izražen u modifikovanom obliku, u kojem je mesto cepanja furina ;uklonjeno kroz modifikacije sekvenci amino kiselina, kako je opisano u objavi PCT patentne prijave WO 03/032898. Modifikovani TSLP zadržava aktivnost, ali sekvenca pune dužine lakše je izražena u ćelijama sisara kao što su CHO ćelije. Primeri TSLP polipeptida obuhvataju SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 373 i SEQ ID NO: 375. ;[0026]Pored toga, TSLP makaki majmuna identifikovan je i prikazan u Primeru 1 ispod i naveden u SEQ ID NO: 380, na primer. ;[0027]TSLP se proizvodi u humanim epitelnim ćelijama, uključujući kožne, bronhijalne, trahealne i epitelne ćelije disajnih puteva, keratinocite, stromalne i mast ćelije, ćelije glatkih mišića, i plućni i kožni fibroblasti, kao što je određeno kvantitativnom analizom mRNK (Soumelis et al., Nature Immunol. 3 (7) 673-680 (2002)). Oba mišji i humani TSLP uključeni su u promovisanju alergijske inflamacije. ;TSLP- aktivnosti ;[0028]TSLP aktivnosti uključuju proliferaciju BAF ćelija koje eksprimiraju humani TSLPR (BAF/HTR), kako je opisano u objavi PCT patentne prijavei WO 03/032898. BAF/HTR Bioogled koristi mišju pro B limfocitnu ćelijsku liniju, koja je transfektovana sa humanim TSLP receptorom. BAF/HTR ćelije su zavisne od huTSLP za rast i razmnožavaju se kao odgovor na aktivni huTSLP dodat u test uzorke. Nakon perioda inkubacije, proliferacija ćelija meri se dodavanjem Alamar Blue boje I ili tricijumovanog timidina. Proiiferacija se takođe može meriti korišćenjem komercijalno dostupnog kita kao Što je CVOJJANT kit za ispitivanje ćelijske proliferacije (Invitrogen). ;[0029] Dodatna ispitivanja za huTSLP aktivnosti uključuju, na primer, ogled merenja indukcije rasta T ćelija iz ljudske koštane srži pomoću TSLP kao što je opisano u U.S. Patentu 6,555,520. Druga TSLP aktivnost je sposobnost da aktivira STAT5 kao što je opisano u referenci u Levin et al., J. Immunol. 162: 677-683 (1999) i PCT patentnoj prijavi WO 03/032898. ;[0030]Dodatna ispitivanja uključuju TSLP indukovanu ccll7/TARC proizvodnju iz primarnih humanih monocitnih i dendritskih ćelija kao što je opisano u objavi US prijave br. 2006/0039910 (redni broj. 11/205,909). ;[0031]Ispitivanja bazirana na ćelijama korisna za merenje TSLP aktivnost, opisana su u donjim primerima. Ona uključuju gore opisano BAF ispitivanje ćelijske proliferacije, kao i primarno ćelijsko isptivanje opisano u nastavku koje meri proizvodnja osteoprotegerina (OPG) indukovanim sa TSLP iz primarnih humanih dendritskih ćelija, kao i ispitivanje mononuklearnih ćelija iz periferne krvi makaki majmuna, takođe opisano u nastavku. ;[0032]TSLP aktivnosti dalje uključuju in vivo aktivnosti. One se mogu meriti u modelima miševa, na primer, kao što su oni opisani u Zhou et al., Nat Immunol 6 (10), 1047-1053 (2005), i Yoo et al., J Exp Med. 202 (4), 541-549 (2005). Na primer, pokazano je da anti-mišje antitelo TSLP smanjuje BALF celularnost i nivoe IL-5 i 11-13 Balf u Ova-astma modelu (Zhou et al). ;Definicije ;[0033]Polinukleotidne i polipeptidne sekvence prikazane su korišćenjem standardne od jedno- ili tro-slovne abrevijacije. Ukoliko nije drugačije naznačeno, polipeptidne sekvence imaju svoje amino krajeve levo, a karboksi krajeve desno, a sekvence jednolančane nukleinske kiseline, i vrh lanca dvolančanih sekvenci nukleinske kiseline, imaju 5' krajeve levo i 3' krajeve desno. Posebana polipeptidna ili polinukleotidna sekvenca može se opisati objašnjavajući kako se razlikuje od referentne sekvence. ;[0034]Polinukleotidne i polipeptidne sekvence određenih varijabilnih domena lakih i teških lanaca, LI ("varijabilni domen lakog lanca 1"), Hl ( "varijabilni domen teškog lanca 1"), itd. Antitela koja obuhvataju laki lanac i teški lanac označena su kombinovanjem naziva varijabilnog domena lakog lanca i teškog lanca. Na primer, "L4H7," označava antitelo koji sadrži varijabilni domen lakog lanca L4 i varijabilni domen teškog lanca H7. ;[0035]Ukoliko nije drugačije definisano, naučni i tehnički izrazi koji su korišćeni u vezi sa ovim pronalaskom imaju značenja koja su uobičajena stručnjacima u ovog oblasti. Dalje, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, izrazi u jednini uključivaće množine, a izrazi u množini ukijučivaće jedninu. Generalno, nomenklature korišćeneuvezi sa, i tehnike, ćelijske i kulture tkiva, molekularne biologije, imunologije, mikrobiologije, genetike i proteinske i hernije nukleinske kiseiine i hibridizacija koji su opisani ovde, poznate su i uobičajeno se koriste u ovoj oblasti. Postupci i tehnike ovog pronalaska uopšteno se izvode prema konvencionalnim postupcima dobro poznatim u ovoj oblasti i kao što je opisano u različitim opštim i specifičnim referencama koje su citirane i opisivane u kroz ovu specifikaciju, ukoliko nije drugačije naznačeno. Videti, npr., Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) i Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), i Harlow and Lane Antybodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990). Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja izvode se prema specifikacijama proizvođača, kao što se obično radi u struci ili kao što je ovde opisano. Terminologija korišćena u vezi sa, i laboratorijski postupci i tehnike analitičke hernije, sintetičke organske hernije i medicinske i farmaceutske hernije ovde opisane, dobro su poznati i uobičajeno se koriste u struci. Standardne tehnike se mogu koristiti za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutske preparate, formulacije i dostavu i tretiranje pacijenata. ;[0036]Sledeći izrazi, ukoliko nije drugačije naznačeno, treba shvatiti da imaju sledeća značenja: Izraz "izolovani molekul" (gde je molekul, na primer, polipeptid, polinukleotid, ili antitelo) je molekul koji zahvaljujući svom poreklu ili izvoru derivacije (1) nije povezan sa prirodno pridruženim komponentama koje ga prate u njegovom nativnom stanju, (2) suštinski je slobodan od drugih molekula iz iste vrste (3) izražen je ćelijom drugačije vrste ili (4) ne javlja se u prirodi. Stoga, molekul koji je hemijski sintetisan ili izražen u ćelijskom sistemu različitom od ćelije iz koje prirodno nastaje, biće "izolovan" od svojih prirodno pridruženih komponenti. Molekul takođe može nastati suštinski bez prirodno pridruženih komponenata izolovanjem, upotrebom tehnika prečišćavanja dobro poznatih u struci. Molekulska čistoća ili homogenost mogu se testirati brojnim sredstvima dobro poznatim u struci. Na primer, čistoća uzorka polipeptida može biti testirana primenom poliakrilamidne gel elektroforeze i bojenjem gela za vizuelizaciju polipeptida tehnikama koje su dobro poznate u tehnici. Za određene svrhe, veća rezolucija može se obezbediti korišćenjem HPLC ili drugih sredstava koja su dobro poznata u stanju tehnike za prečišćavanje. ;[0037]Izrazi "InhibitorTSLP" i "antagonist TSLP" koriste se naizmenično. Svaki je molekul koji detektujuće inhibira TSLP signalizaciju. Inhibicija izazvana inhibitorom TSLP ne mora da bude potpuna sve dok može da se detektuje korišćenjem testa. Na primer, ispitivanje zasnovano na ćelijama opisano u Primeru 4 niže, pokazuje ispitivanje korisno za utvrđivanje TSLP inhibiciju signalizacije. ;[0038]Izrazi "peptid" "polipeptid' i protein" svaki se odnosi na molekul koji sadrži dva ili više aminokiselinska ostatka spojena međusobno peptidnim vezama. Ovi izrazi obuhvataju, npr., nativne i veštačke proteine, proteinske fragmente i polipeptidne analoge (kao što muteine, varijante, i fuzione proteina) sekvence proteina kao post-translatorno ili drukčije kovalentno ili ne-kovalentno, modifikovanih proteina. Peptid, polipeptid ili protein mogu biti monomerni ili polimerni. ;[0039] Izraz "fragment polipeptida" kako se ovde koristi odnosi se na polipeptid koji ima amino-terminalnu i/ili karboksi-terminatnu deleciju u poređenju sa odgovarajućim proteinom pune dužine. Fragmenti mogu biti, na primer, najmanje 5,6, 7, 8,9,10,11, 12,13,14,15, 20, 50, 70, 80, 90,100, 150 ili 200 amino kiselina u dužini. Fragmenti mogu biti, na primer, najviše 1.000, 750, 500,250, 200,175,150, 125,100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20,15,14, 13, 12, 11 ili 10 amino kiselina u dužini. Fragment može dalje obuhvatati, na jednom ili oba njegova kraja, jednu ili više dodatnih amino kiselina, na primer, sekvencu amino kiselina iz različitog prirodno nastalog proteina (npr. Fc ili leucinski domen zatvarača) ili sekvencu veštačke amino kiseline (npr. veštačka vezna sekvenca). ;[0040]Polipeptidi prema ovom pronalasku obuhvataju polipeptide koji su modiftkovani na bilo koji način i iz bilo kog razloga, na primer, da bi: (1) smanjili podložnost proteolizi, (2) smanjili podložnost oksidaciji, (3) izmenili afinitet vezivanja za formiranje proteinskih kompleksa, (4) izmenili afinitete vezivanja, i (4) dodelili ili modifikovali druge fizičko-hemijske ili funkcionalne osobine. Analozi uključuju muteine polipeptida. Na primer, supstitucije jedna ili više supstitucija amino kiseline (npr., konzervativne supstitucije amino kiselina) mogu se javiti u prirodnoj sekvenci (npr., u delu polipeptida van domena(a) koji formiraju intermolekulske kontakte). "Konzervativna supstitucija amino kiseline" je ona koja suštinski ne menja strukturne karakteristike roditeljske sekvence (npr., zamena amino kiseline ne treba da teži lomljenju heliksa koji se javlja u roditeljskoj sekvenci ili da poremeti druge tipove sekundarne strukture koji karakterišu roditeljsku sekvencu ili koji su potrebni za njegovu funkcionalnost). Primeri u struci priznatih polipeptidnih sekundarnih i tercijarnih struktura opisani su u Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Companv, New York (1984).); Introduction to Protein Structure (C. Branden i J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, NY (1991).); i Thornton et al. Nature 354: 105 (1991). ;[0041]"Varijanta" polipeptida obuhvata sekvencu amino kiseline gde su jedan ili više aminokiselinskih ostataka ubačeni u, izbrisane iz i/ili supstituisani u sekvenci amino kiseline u odnosu na drugu sekvencu polipeptida. Varijante pronalaska uključuju fuzione proteine. Varijante antitela opisanih ovde takođe uključuju one koje proizilaze iz prerade. Takve varijante uključuju one sa jednom, dve, tri, Četiri, pet, šest, sedam, osam, devet deset ili više dodatnih amino kiselina na N-terminusu lakog ili teškog lanca, npr., kao rezultat neefikasnog cepanja signalne sekvence. Takve varijante obuhvataju one kojima nedostaje jedna ili više amino kiselina iz N- ili C-terminusa lakog ili teškog lanca. ;[0042]"Derivat" polipeptida je polipeptid (npr., antitelo) koji je hemijski modifikovan, npr., konjugacijom u drugu hemijsku grupu kao što je, na primer, polietilen glikol, albumin (npr., humani serumski albumin), fosforilaciju i glikozilaciju. Ukoliko nije drugačije naznačeno, izraz "antitelo" uključuje, pored antitela koja obuhvataju dva teška lanca pune dužine i dva laka lanca pune dužine, njihove derivate, varijante, fragmente i muteina, koji primeri su opisani u daljem tekstu. ;[0043]"Antigen vezujući protein" prema ovom pronalasku je protein sposoban za vezivanje za antigen i, opciono, deo skele ili okvira koji omogućava antigen vezujućem delu da usvoji konformaciju koja promoviše vezivanje antigen vezujućeg proteina za antigen. U jednom ostvarenju, antigen vezujući protein prema ovom pronalasku obuhvata najmanje jedan CDR. Primeri antigen vezujućih proteina uključuju antitela, fragmente antitela (npr., antigen vezujući deo antitela), derivate antitela, i analoge antitela. Antigen vezujući protein može da obuhvata, na primer, alternativnu skelu proteina ili veštačku skelu sa kalemljenim CDR ili CDR derivatima. Takve skele uključuju, ali nisu ograničene na, skele izvedene iz antitela koje obuhvataju mutacije uvedene da, na primer, stabilizuju trodimenzionalnu strukturu antigen vezujužeg proteina, kao i potpuno sintetičke skele koje obuhvataju, na primer, biokompatibilni polimer. Videti, na primer, Korndorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, Volume 53, Issue 1:121-129; Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20: 639-654. Pored toga, mimetici peptidnih antitela ("PAM") mogu da se koriste, kao i skele bazirane na mimeticima antitela korišćenjem fibronektinskih komponenti kao skela. ;[0044]Antigen vezujući protein može imati, na primer, strukturu prirodnog imunoglobulina. "Imunoglobulin" je tetramerski molekul. Kod prirodnog imunoglobulina, svaki tetramer se sastoji od dva identična para polipeptidnih lanaca, gde svaki par ima jedan "laki" (oko 25 kDa) i jedan "teški" lanac (oko 50-70 kDa). Amino-terminalni deo svakog lanca obuhvata varijabilni region od oko 100 do 110 ili više amino kiselina prvenstveno odgovorne za prepoznavanje antigena. Karboksi-terminalni deo svakog lanca definiše konstantni region prvenstveno odgovoran za efektorsku funkciju. Humani laki lanci se klasifikuju kao ka<p>a i lambda laki lanci. Teški lanci se klasifikuju kao mu, delta, gama, alfa ili epsilon, i definišu izotip antitela kao IgM, IgD, IgG, IgA i IgE, respektivno. Unutar lakih i teških lanaca, varijabilni i konstantni regioni pridruženi "J" regionom od oko 12 ili više amino kiselina, pri čemu teški lanac takođe uključuje "D" region od oko 10 ili više amino kiselina. Videti generalno, Fundamental Immunologv Ch. 7 (Paul, W. ed., 2nd ed. Raven Press,N. Y. (1989)). Varijabilni regioni svakog para lakog/teškog lanca formiraju mesto vezivanja antitela tako da netaknuti imunoglobulin ima dva mesta vezivanja. ;[0045]Prirodni imunoglobulinski lanci pokazuju istu opštu strukturu relativno konzerviranih okvirnih regiona (FR) spojenih sa tri hipervarijabilna regiona, koji se takođe nazivaju regioni koji određuju komplementarnost ili CDR. Od N-terminusa do C-terminusa, i lakih i teški lanci obuhvataju domene FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Dodela amino kiselina svakom domenu je u skladu sa definicijama Kabat et al. Sequences of Protein of Immunological Interest, 5th Ed., US Dept. Of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242, 1991. Netaknuta antitela uključuju ona poliklonska, monoklonska, himerno, humanizovana ili potpuno humana koja imaju teške i lake lance pune dužine. ;[0046]"Antitelo" se odnosi na netaknuti imunoglobulin ili na njegov antigen vezujući deo koji je u kompeticiji sa netaknutim antitelom za specifično vezivanje, osim ako nije drugačije određeno. Antigen vezujući delovi mogu biti proizvedeni tehnikama rekombinantne DNK ili enzimskim ili hemijskim cepanjem netaknutih antitela. Antigen vezujući delovi uključuju Fab, Fab', F (ab') 2, Fd, Fv i domenska antitela (dAbs), i fragmenti regiona koji određuje komplementarnost (CDR), jedno-lančana antitela (scFv), dijatela, trijatela, tetratela, i polipeptidi koji sadrže bar deo imunoglobulina koji je dovoljan da ;prenese specifično vezivanje antigena za polipeptid. ;[0047]Fab fragment je monovalentni fragment koji ima VL, vH, CL i CH1 domene; F(ab')2 fragment je bivalentni fragment koji ima dva Fab fragmenta vezane disulfidnim mostom u zglobnom regionu; Fd fragment ima VHi CH1 domena; Fv fragment ima VL i VHdomene jednokrakog antitela; a dAb fragment ima VHdomen, VLdomen, ili antigen-vezujući fragment VHili V, domena (US Pat. Nor. 6.846.634, 6.696.245, US App. Pub. No. 05/0202512, 04/0202995, 04/0038291, 04/0009507, 03/0039958, Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989). ;[0048]Jednolančano antitelo (scFv) je antitelo u kome su VLi VHudruženi preko povezivača (npr. sintetičkom sekvencom aminokiselinskih ostataka) radi formiranja kontinualnog lanca proteina gde je povezivač dovoljno dugačak da omogući da se lanac proteina savije ka sebi i formira monovalentno antigen vezujuće mesto (videti, npr., Bird et al., 1988, Science 242: 423-26 i Huston et al., 1988, Sci. Proc. Natl. Acad. SAD 85: 5879-83). Dijatela su dvovalentna antitela koja obuhvataju dva polipeptidna lanca, pri čemu svaki polipeptidni lanac sadrži VH i VLdomene pridružiene povezivačom koji je suviše kratak da dozvoli sparivanje između dva domena na istom lancu, omogućavajući da se svaki domen upari sa komplementarnim domenom na drugom polipeptidnom lancu (videti, npr., Hoiliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48 i Poljak et al., 1994, Structure 2:1121-23). Ako su dva polipeptidna lanca dijatela identična, dijatelo koje rezultira iz njihovog uparivanja imaće dva identična antigen vezujuža mesta. Polipeptidni lanci koji imaju različite sekvence mogu se koristiti da bi se dobilo dijatelo sa dva različita antigen vezujuća mesta. Slično, trijatela i tetratela su antitela koja obuhvataju tri i četiri polipeptidnih Ianac3, respektivno, i formiraju tri i četiri antigen vezujuća mesta, resoektivno, koja mogu biti ista ili različita. ;[0049]Regioni koji određuju komplementarnost (CDR) i okvirni regioni (FR) datog antitela mogu da se identifikuju korišćenjem sistema opisanih u Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunologica! Interest, 5th ed., US Department of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242, 1991. Jedan ili više CDR mogu biti ugrađeni u molekul bilo kovalentno ili nekovalentno da bi ga načinili antigen vezujućim proteinom. Antigen vezujući protein može inkorporirati CDR(ove) kao deo većeg polipeptidnog lanca, može kovalentno povezati CDR(ove) sa drugim polipeptidnim lancem, ili može inkorporirati CDR(ove) nekovalentno. CDR-ovi dozvoljavaju antigen vezujućem proteinu da se specifično veže za određeni antigen od interesa. ;[0050]Antigen vezujući protein može imati jedno ili više mesta vezivanja. Ako postoji više od jednog mesta vezivanja, mesta vezivanja mogu biti identična jedno drugom ili mogu biti različita. Na primer, prirodni humani imunoglobulin obično ima dva identična mesta vezivanja, dok "bispecifično" ili "bifunkcionalno" antitelo ima dva različita mesta vezivanja. ;[0051]Izraz "humano antitelo" obuhvata sva antitela koja imaju jedan ili više varijabilnih i konstantnih regiona izvedenih iz humanih imunoglobulinskih sekvenci. U jednom ostvarenju, svi varijabilni i konstantni domeni su izvedeni iz humanih imunoglobulinskih sekvenci (potpuno humano antitelo). Ova antitela se mogu pripremiti na razne načine, Čiji primeri su opisani u daljem tekstu, uključujući i onaj preko imunizacije sa antigenom od interesa miša koji je genetski modifikovan da eksprimira antitela izvedena iz humanih gena koji kodiraju teški i/ili laki lanac. ;[0052]Humanizovano antitelo ima sekvencu koja se razlikuje od sekvence antitela izvedenog iz ne-humanih vrsta sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija, i/ili dodataka, tako da je manje verovatno da će humanizovano antitelo da izazove imuni odgovor, i/ili indukuje blaži imuni odgovor, u poređenju sa antitelom ne-humane vrste, kada se daje humanom subjektu. U jednom ostvarenju, određene amino kiseline u okviru i konstantni domeni teških i/ili lakih lanaca antitela ne-humane vrste su mutirani kako bi proizveli humanizovano antitelo. U drugom ostvarenju, konstantni domen(i) iz humanog antitela fuzionisani su sa varijabilnim domenom(ima) ne-humane vrste. U još jednom ostvarenju, jedan ili više aminokiselinskih ostataka u jednoj ili više CDR sekvenci ne-humanog antitela se menjaju da smanje verovatnoću imunogenosti ne-humanog antitela kada se daje humanom subjektu, pri čemu promenjeni aminokiselinski ostaci ili nisu kritični za imunospecifična vezivanje antitela za svoj antigen, ili se menjaju u sekvenci aminoKiseline koje su napravljene koje su konzervativne promene, tako da vezivanje humanizovanog antitela za antigen nije značajno gore nego vezivanje ne-humanog antitela za antigen. Primeri dobijanja humanizovanih antitela mogu se naći u U.S. Pat. Br. 6.054.297, 5.886.152 i 5.877.293. ;[0053]Izraz "himerno antitelo" odnosi se na antitelo koje sadrži jedan ili više regiona iz jednog antitela i jednan ili više regiona iz jednog ili više drugih antitela. U jednom ostvarenju, jedan ili više CDR su dobijeni iz humanog anti-TSLP-antitela. U još jednom ostvarenju, svi CDR su dobijeni iz humanog anti-TSLP-antitela. U još jednom ostvarenju, CDR iz više od jednog humanog anti-TSLP-antitela rnešaiu se i uparuju u himerno antitelo. Na primer, himerno antitelo može da obuhvata CDR1 iz lakog lanca prvog humanog anti-TSLP-antitela, CDR2 i CDR3 iz lakog lanca drugog humanog anti-TSLP-antitela, i CDR iz teškog lanca iz trećeg anti-TSLP-antitela. Dalje, regioni okvira mogu biti izvedeni iz jednog od istih anti-TSLP-antitela, iz jednog ili više različitih antitela, kao što je humano antitelo, ili iz humanizovanog antitela. U jednom primeru himernog antitela, deo teškog i/ili lakog lanca identičan je sa, homologan je sa ili izveden iz antitela iz određene vrste ili pripada određenoj klasi ili podklasi antitela, dok je ostatak lanca(aca) identičan sa, homologan sa ili izveden iz antttela(a) iz druge vrste ili koja pripadaju drugoj klasi ili potklasi antitela. Takođe su uključeni fragmenti takvih antitela koja ispoljavaju željenu biološku aktivnost (tj. sposobnost da specifično vezuju humani TSLP receptor). ;[0054]Fragmenti ili analozi antitela mogu se lako pripremiti od strane stručnjaka iz ove oblasti prateći uputstva iz ove specifikacije i korišćenjem tehnika koje su poznate u struci. Poželjni amino- i karboksi-terminusi fragmenata ili analoga javljaju se blizu granica funkcionalnih domena. Strukturni i funkcionalni domeni se mogu identifikovati poređenjem podataka sekvence nukleotida i/ili amino kiselina sa javnim ili privatnim bazama podataka sekvenci. Kompjuterizovane metode poređenja mogu se koristiti za identifikaciju motiva sekvence ili predviđene domene proteinske konformacije koji se javljaju u drugim proteinima poznate strukture i/ili funkcije. Postupci za identifikovanje proteinskih sekvenci koje se savijaju u poznatu trodimenzionalnu strukturu su poznati. Videti, npr., Bowie et al., 1991, Science 253: 164. ;[0055]"CDR graftovano antitelo" je antitelo koje sadrži jedan ili više CDR izvedenih iz antitela određene vrste ili izotipa i okvira drugog antitela iste ili različite vrste ili izotipa. ;[0056]"Multi-specifično antitelo" je antitelo koje prepoznaje više od jednog epitopa na jednom ili više antigena. Potklasa ovog tipa antitela je "bi-specifično antitelo" koje prepoznaje dva različita epitopa na istim ili različitim antigenima. ;[0057] Antigen vezujući protein koji uključuje antitelo "specifično se vezuje" za antigen, kao TSLP ako se vezuje za antigen sa visokim afinitetom vezivanja kao što je određeno sa Kd (ili odgovarajućim Kb, kao što je definisano u daljem tekstu) vrednosti od 10'/ M ili manje. ;[0058]"Antigen vezujući domen", "antigen vezujući region" ili "antigen vezujuće mesto" je deo antigen vezujućeg proteina koji sadrži aminokiselinske ostatke (ili druge grupe) koji intereaguju sa antigenom i doprinose specifičnosti antigen vezujućeg proteina i afiniteta ka antigenu. Za antitelo koje se specifično vezuje za svoj antigen, ovo uključuje bar deo najmanje jednog od njegovih CDR domena. ;[0059]"Procenat identiteta" dva polinukleotida ili dve polipeptidne sekvence određuje se poređenjem sekvenci pomoću kompjuterskog programa GAP (deo GCG VVisconsin Package, verzija 10.3 (Accelrvs, San Diego, CA)) koristeći svoje zadane parametre. ;[0060]Izrazi "polinukleotid", "oligonukleotid" i "nukleinska kiselina" koriste se naizmenično i uključuju molekule DNK (npr. cDNK ili genomske DNK), RNK molekule (npr., mRNK}, analoge DNK ili RNK, proizvedene korišćenjem nukleotidnih analoga (npr. peptidne nukleinske kiseline i neprirodne analoge nukleotida) i njihove hibride. Molekul nukleinske kiseline može biti jednolančani ili dvolančani. U jednom ostvarenju, molekuli nukleinske kiseline prema ovom pronalasku obuhvata granični otvoreni okvir čitanja koji kodira antitelo, ili fragment, derivat, mutein ili njihovu varijantu, prema ovom pronalasku. ;[0061]Dva jednolančana polinukleotida su "komplementni" jedan drugome ako njihove sekvence mogu biti poredane u anti-paralelnoj orijentaciji tako da je svaki nukleotid u jednom polinukleotidu suprotan svom komplementarnom nukleotidu u drugom polinukleotidu, bez uvođenja praznina i bez neuparenih nukleotida na 5 'ili 3' kraju bilo koje sekvence. Polinukleotid je "komplementaran" drugom polinukleotidu ako dva polinukleotida mogu da se hibridizuju jedan sa drugim pod umereno strogim uslovima. Stoga, polinukleotid može biti komplementaran drugom polinukleotidu, a da nije njegov komplement. ;[0062]"Vektor" je nukleinska kiselina koja se može koristiti za uvođenje druge nukleinske kiseline vezane na nju u ćeliju. Jedan tip vektora je "plazmid" koji se odnosi na linearni ili kružni dvolančani DNK molekula u kojem se dodatni segmenti nukleinske kiseline mogu vezati. Drugi tip vektora je viralni vektor (npr. replikaciono defektni retrovirusi, adenovirusi i adeno-asocirani virusi), gde se dodatni segmenti DNK mogu uvesti u virusni genom. Određeni vektori su sposobni za autonomnu replikaciju u ćeliji domaćinu u koju su uvedeni (npr., bakterijski vektori koji obuhvataju bakterijsko poreklo replikacije i epizomaini vektori sisara). Drugi vektori (npr., ne-epizomalni vektori sisara) su integrisani u genom ćelije domaćina nakon uvođenja u ćeliju domaćina i tako se repliciraju zajedno sa genomom domaćina. "Ekspresioni vektor" je vrsta vektora koji može da usmerava ekspresiju izabranog polinukleotida. ;[0063]Nukleotidna sekvenca je "operativno povezana" sa regulatornom sekvencom ukoliko regulatorna sekvenca utiče na ekspresiju (npr. nivo, tajming, ili mesto ekspresije) nukleotidne sekvence. "Regulatorna sekvenca" je nukleinska kiselina koja utiče na ekspresiju (npr., nivo, tajming, ili mesto ekspresije) nukleinske kiseline sa kojom je operativno povezan. Regulatorna sekvenca može, na primer, ispoljavati svoje efekte direktno na regulisanu nukleinsku kiselinu ili delovanjem jednog ili više drugih molekula (npr., polipeptidi koji se vezuju za regulatornu sekvencu i/ili nukleinsku kiselinu). Primeri regulatornih sekvenci uključuju promotore, pojačivače i druge elemente kontrole ekspresije (npr. poliadenilacione signale). Dalji primeri regulatornih sekvenci opisani su u, na primer, Goeddel, 1990, Gene Expression Technologv: Methods in Enzvmologv 185, Academic Press, San Diego, CA i Baron et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23: 3605-06. ;[0064]"Ćelija domaćin" je ćelija koji se može koristiti da eksprimira nukleinsku kiselinu, npr., nukleinsku kiselinu prema ovom pronalasku. Ćelija domaćin može biti prokariot, na primer, E. coli, ili može biti eukariot, na primer, jednoćelijski eukariot (npr. kvasca ili drugih gljiva), biljne ćelije (na primer, biljne ćelije duvana ili paradajza), životinjske ćelije (npr. humana ćelija, ćelija majmuna, ćelija hrčka, ćelija pacova, ćelija miša, ili ćelija insekta) ili hibridom. Primeri ćelija domaćina uključuju ćelijske linije jajnika kineskog hrčka (CHO) ili njihove derivate uključujući CHO soj DKSB-11, koji je deficijentan u DHFR (videti Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-20 ), CHO ćelijske linije koje rastu u medijumu bez seruma (videti Rasmussen et al., 1998, Cvtotechnologv 28:31), CS-9 ćelije, derivativne DKSB-11 CHO ćelije i AM-l/D ćelije (opisane u U.S. patentu br. 6,210,924). Druge CHO ćelijske linije uključuju CHO-K1 (ATCC # CCL-61), EM9 (ATCC # CRL-1861), i UV20 (ATCC # CRL-1862). Primeri drugih ćelija domaćina uključuju COS-7 ćelijsku liniju bubrega majmuna (ATCC CRL 1651)(pogledti Gluzman et al., 1981, Cell 23 175), L ćelije, C127 ćelije, 3T3 ćelije (ATCC CCL 163), HeLa ćelije, BHK (ATCC CRL 10) ćelijske linije, ćelijsku liniju CV1/EBNA izvedenu iz ćelijske linije CV1 bubrega afričkog zelenog majmuna (ATCC CCL 70) (videti McMahan et al., 1991, EMBO J. 10:2821), humane embrionske bubrežne ćelije poput 293, 293 EBNA ili MSR 293, humane epidermalne A431 ćelije, humane Colo205 ćelije, ostale transfonr isane ćelijske linije primata, normalne diploidne ćelije, sojeve ćelija izvedenih iz in vitro kulture primarnog tkiva, primarne eksplantate, HL-60, U937, HaK ili Jurkat ćelije. Tipično, ćelija domaćin je uzgajana ćelija koja se može transformisati ili transfektovati sa nukleinskom kiselinom koja kodira polipeptid, koji se zatim može eksprimirati u ćeliji domaćinu. Izraz "rekombinantna ćelija domaćin" može se koristiti da označi ćeliju domaćina koja je transformisana ili transfektovana sa nukleinskom kiselinom koja se eksprimira. Ćelija domaćin takođe može biti ćelija koja obuhvata nukleinsku kiselinu ali je ne eksprimira na željenom nivou ukoliko regulatorna sekvenca nije uvedena u ćeliju domaćina tako postaje operativno povezana sa nukleinskom kiselinom. Podrazumeva se da se izraz ćelija domaćin odnosi ne samo na pojedinu ćeliju koja je predmet ovog pronalaska, već i na potomstvo ili potencijalno potomstvo takve ćelije. Kako se određene modifikacije mogu pojaviti u sledećim generacijama zbog, npr. mutacije ili okolnog uticaja, takvo potomstvo ne može, u stvari, biti identično roditeljskoj ćeliji, ali je ipak uključeno u okvir izraza kako se ovde koristi. ;Antigen vezujući proteini ;[0065]U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje antitela, fragmente antitela, derivate antitela, muteine antitela i varijante antitela koja se vezuju za humani TSLP. Antigen vezujući proteini u skladu sa ovim pronalaskom uključuju antigen vezujuće proteine koji se vezuju za humani TSLP, i time smanjuju TSLP aktivnost. Na primer, antigen vezujući proteini mogu ometati vezivanje TSLP za njegov receptor, i tako smanjiti TSLP aktivnost. ;[0066]Opisan je antigen vezujući protein koji obuhvata jedan ili više CDR sekvenci koje se razlikuju od CDR sekvenci prikazanim na FIG. 1A-1F ili FIG. 2A-2F sa ne više od 5,4, 3, 2, 1 ili 0 aminokiselinskih ostataka. ;[0067]Najmanje jedna CDR3 sekvence antigen vezujućeg proteina je sekvenca sa FIG. 1A-1F ili FIG. 2A-2F. CDR3 sekvenca lakog lanca antigen vezujućeg proteina je sekvenca lakog lanca od Al do A27, a CDR3 sekvenca teškog lanca antigen vezujužeg proteina je CDR3 sekvenca teškog lanca od Al do A27. ;[0068]Antigen vezujuži protein dalje obuhvata 1, 2, 3, 4, ili 5 CDR sekvenci koje se svaka nezavisno razlikuju za 5,4, 3, 2,1, ili 0 pojedinačnih aminokiselinskih dodataka, supstitucije i/ili delecije iz CDR sekvence iz A1-A27. CDR lakog lanca primernog antigen vezujućih proteina A1-A27 i CDR teškog lanca primernih vezujućih proteina A1-A27 prikazani su na FIG. 1A-1F i FIG. 2A-2F, respektivno. Takođe su prikazane polinukleotidne sekvence koje kodiraju sekvence amino kiselina CDR. Pored toga, konsenzus sekvence CDR sekvenci date su u nastavku. ;CDR KONSENZUSSEKVENCE ;VARIJABILNI LAKI LANAC CDR ;Grupa la ;[0069] ;Xi je V (valinski) ostatak ili I (izoleucinski) ostatak, ;X2je N (asparaginski) ostatak ili a D (asparaginski) kiselinski ostatak; Xije Y (tirozinski) ostatak ili N (asparaginski) ostatak; LC CDR3 Konsenzus ;Grupa lb;[0070] ;Xdje G (glicinski) ostatak ili S (serinski) ostatak; ;Xsje L (leucinski) ostatak ili I (izoleucinski) ostatak; LC CDR2 Konsenzus X&je N (asparaginski) ostatak ili T (treoninski) ostatak; X?je T(teoninski) ostatak ili A (alanine) ostatak; ;Xs je N (asparaginski) ostatak ili a D (asparaginski kiseiinski) ostatak; ;Grupa 2;[0071] ;Grupa 3;[0072] ;Grupa 1 ;[0073] ;XioYGMH(SEQIDNO:253) ;Xioje S (serinski) ili N (asparaginski) ostatak; HC CDR2 Konsenzus ; ;Xn je Y (tirozinski) ostatak ili F (fenilalaninski) ostatak. ;HC CDR3 Konsenzus ; ;Xi2 je P (prolinski) ostatak iii A (alaninski) ostatak; Xn je Y (tirozinski) ostatak ili F (fenilalaninski) ostatak. ;Grupa 2;[0074]; SYGIH (SEQ ID NO: 147) HC CDR2 Konsenzus ;VISYDGSXi4KYYADSVKG (SEQ ID NO: 256) ;Xw je Y (tirozinski) ili N (asparaginski) ostatak. ;HCCDR3 Konsenzus ; ;Grupa 3 ;[0075] Xi5 jeD (asparaginski kiselinski) ili G (giicinski) ostatak; Xi6 je Y (tirozinski) ili D (asparaginski kisei<:>rsk<;>} ostatak; Xi7 je Y (tirozinski) ili H (histidinski) ostatak. Xis je Y (tirozinski) ili H (histidinski) ostatak; Xi9 je V (valinski) ili A (alanine) ostatak; ;Xzo je Q (glutamisnki) ili R (argininski) ostatak. ;HCCDR3 Konsenzus ; ;X?ije G (giicinski) ili R ( argininski) ostatak; X« je M (serinski) ili T (treoninski) ostatak; ;Xzj je A (alaninski) ili D (asparaginski kiselinski) ostatak. ;[0076] Tabela 2 ispod obezbeđuje sekvence nukleinske kiseline (DNK) koje kodiraju varijabilne teške domene ( H #) i varijabilne lake domene ( Lff), i sekvence amino kiselina varijabilnih teških i varijabilnih lakih domena za primerne TSLP antigen vezujuće proteine Al - A27, respektivno. CDR 1, 2 i 3 za svaki varijabilni domen su sekvencijalno navedeni od početka do kraja svake sekvence. Regioni okvira (Fr) su podvučeni. Okviri 1, 2 , 3 i 4 svakog varijabilnog domena su sekvencijalno navedeni od početka do kraja svake sekvence (npr., prvi podvučeni deo sekvence je Frl, drugi je Fr2, treći je Fr3 i poslednji je Fr4 u svakoj sekvenci). ; ;[0077] Ovde je opisano jedna ili više sekvenci amino kiselina koje su identične sa sekvencama amino kiselina jednog ili više CDR i mogu dalje obuhvatati jedan ili više FR ilustrovanih gore. Antigen vezujući protein obuhvata CDR1 sekvencu lakog lanca prikazana gore. Antigen vezujući protein obuhvata CDR2 sekvencu lakog lanca prikazana gore. Antigen vezujući protein obuhvata CDR3 sekvencu lakog lanca prikazana gore. Antigen vezujući protein obuhvata CDR1 sekvencu teškog lanca prikazanu u gore. Antigen vezujući protein obuhvata CDR2 sekvencu teškog lanca prikazana gore. Antigen vezujući protein obuhvata CDR3 sekvencu teškog lanca prikazana gore. Antigen vezujući protein dalje obuhvata FR1 sekvencu lakog lanca prikazana gore. Antigen vezujući protein dalje obuhvata FR2 sekvencu lakog lanca prikazana gore. Antigen vezujući protein dalje obuhvata FR3 sekvencu lakog lanca prikazana gore. Antigen vezujući protein dalje obuhvata FR4 sekvencu lakog lanca prikazana gore. Antigen vezujući protein dalje obuhvata FR1 sekvencu teškog lanca prikazana gore. Antigen vezujući protein dalje obuhvata FR2 sekvencu teškog lanca prikazana gore. Antigen vezujući protein dalje obuhvata FR3 sekvencu teškog lanca prikazana gore. Antigen vezujući protein dalje obuhvata FR4 sekvencu teškog lanca prikazana gore. ;[0078] Ovaj pronalazak obezbeđuje antigen vezujući protein koji obuhvata varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata sekvencu amino kiselina koja se razlikuje od sekvence varijabilnog domena lakog lanca izabrane iz grupe koju Čine LI preko L27 samo na 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2,1 ili 0 ostataka, gde je svaka takva razlika sekvence nezavisno ili delecija, umetanje ili supstitucija jednog amino kiselinskog ostatka. U drugom ostvarenju, varijabilni domen lakog lanca obuhvata sekvencu amino kiselina koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, ili 99% identična sa sekvencom varijabilnog domena lakog lanca izabrana iz grupe koju čine L5. U još jednom ostvarenju, varijabilni domen lakog lanca obuhvata sekvencu amino kiselina koja je kodirana nukleotidnom sekvencom koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, ili 99% identična sa nukleotidnom sekvencom koja kodira varijabilni domen lakog lanca izabran iz grupe koju čine L5. U drugom ostvarenju, varijabilni domen lakog lanca obuhvata sekvencu amino kiselina koja je kodirana polinukleotidom koji se hibridizuje pod umereno strogim uslovima sa komplementom polinukleotida koji kodira varijabilni domen lakog lanca izabran iz grupe koju čine L1-L27. U drugom ostvarenju, varijabilni domen lakog lanca obuhvata sekvencu amino kiselina koja je kodirana polinukleotidom koji se hibridizuje pod veoma strogim uslovima sa komplementom 5 polinukleotida lakog lanca iz L5. ;[0079] Otkriveno je da antigen vezujući protein obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata sekvencu amino kiselina koja se razlikuje od sekvence varijabilnog domena teškog lanca odabrane iz grupe koju čine H1-H27 samo na 15,14, 13,12 , 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5,4, 3, 2,1 ili 0 ostatka(aka), gde svaka takva razlika sekvence je nezavisno ili delecija, umetanje ili supstitucija jednog ostatka amino kiseline. U drugom ostvarenju, varijabilni domen teškog lanca obuhvata sekvencu amino kiselina koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ili 99% identična sa sekvencom varijabilnog domena teškog lanca izabrana iz grupe koja se sastoji od H5. U još jednom ostvarenju, varijabilni domen teškog lanca obuhvata sekvencu amino kiselina koja je kodirana nukleotidnom sekvencom koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, ili 99% identična sa nukleotidnom sekvencom koja kodira varijabilni domen teškog lanca odabran iz grupe koju čine H5. U drugom ostvarenju, varijabilni domen teškog lanca obuhvata sekvencu amino kiselina kodirana polinukleotidom koji se hibridizuje pod umereno strogim uslovima sa komplementom polinukleotida koji kodira varijabilni domen teškog lanca odabran iz grupe koju čine H5. U drugom ostvarenju, varijabilni domen teškog lanca obuhvata sekvencu amino kiselina kodirana polinukleotidom koji se hibridizuje pod veoma strogim uslovima sa komplementom polinukleotida koji kodira varijabilni domen teškog lanca odabran iz grupe koju čine H5. ;[0080]U Tabeli 2 iznad, dva laka lanca su povezana sa jednim teškim lancem, identifikovani, na primer kao L-12.1, L-12.2, itd. Ovi alternativni laki lanci svaki su upareni sa jednim teškim lancem. Kombinacija lakog lanca i teškog lanca može biti testirana kao što je opisano u daljem tekstu, a kombinacija lakog lanca i teškog lanca koji obezbeđuje veću TSLP aktivnost neutralisanja može biti izabrana. ;[0081]Dodatna ostvarenja uključuju antigen vezujući proteine koji obuhvataju kombinacije. ;[0082]Antitela, fragmenti antitela i derivati antitela prema ovom pronalasku mogu dalje obuhvatati bilo koji konstantni region poznat u stanju tehnike. Konstantni region lakog lanca može biti, na primer, konstantni region lakog lanca kapa- ili lambda-tipa, npr. konstantni region lakog lanca humanog kapa- ili lambda-tipa. Konstantni region teškog lanca može biti, na primer, konstantni regioni teškog lanca alfa-, delta-, epsilon-, gama ili mu-tipa, na primer, konstantni region teškog lanca humanog alfa-, delta , epsilon-, gama ili mu-tipa. U jednom ostvarenju, konstantni region lakog ili teškog lanca je fragment, derivat, varijanta ili mutein prirodnog konstantnog regiona. ;[0083]U jednom ostvarenju, antitela obuhvataju IgG, kao što je IgGl, lgG2, lgG3 ili lgG4. ;[0084]Poznate su tehnike za dobijanje antitela drugačije potklase iii izotipa iz antitela od interesa, tj. menjanje potklasa. Tako, IgG antitela mogu biti izvedena iz IgM antitela, na primer, i obrnuto. Takve tehnike omogućavaju pripremu novih antitela koja poseduju svojstva antigen-vezivanje datog antitela (roditeljskog antitela), ali takođe pokazuju biološke osobine povezane sa izotipom antitela ili potklasom koje su drugačije od roditeljskog antitela. Tehnike rekombinantne DNK mogu se koristiti. Klonirana DNK koja kodira određene polipeptide antitela mogu se koristiti u takvim postupcima, npr. DNK koja kodira konstantan domen antitela željenog izotipa. Videti takođe Lantto et al., 2002, Methods Mol. Biol. 178: 303-16. ;[0085]U jednom ostvarenju, humano anti-TSLP-antitelo prema ovom pronalasku obuhvata IgGl konstantan domen teškog lanca ili fragment IgGl domena teškog lanca. U jednom ostvarenju, humano anti-TSLP-antitelo prema ovom pronalasku dalje obuhvata kapa ili lambda konstantne domene lakog lanca ili njihov fragment. Konstantni regioni lakog lanca i polinukleotidi koji ih kodiraju dati su u Tabeli 3 u nastavku. U drugom ostvarenju, humano anti-TSLP-antitelo prema ovom pronalasku dalje obuhvata konstantan domen teškog lanca, ili njegov fragment, kao što je lgG2 konstantni region teškog lanca ;prikazan u Tabeli 3. ;[0086] Nukleinska kiselina (DNK) koja kodira konstantne domene teškog i lakog lanca, i sekvence amino kiseline domena teških i lakih lanaca oezbeđene su daljem tekstu. Lambda varijabilni domeni mogu biti fuzionisani sa lambda konstantnim domenima, a kapa varijabilni domeni mogu biti fuzionisani sa kapa konstantnim domenima. ;[0087]Antigen vezujući proteini prema ovom pronalasku uključuju one koje obuhvataju, na primer, kombinacije varijabilnog domena koje imaju željeni izotip (na primer, IgA, IgGl, lgG2, lgG3, lgG4, igM, IgE, i IgD), kao i njihove Fab ili F(ab')2 fragmente. Dalje, ako je poželjan lgG4, takođe može biti poželjno da se uvede tačkasta mutacija u zglobni region kao što je opisano u Bloom et al., 1997, Protein Science 6: 407 kako bi se ublažila tendencija da se formiraju unutrašnje-H lančane disulfidne veze koje mogu da dovedu do heterogenosti u lgG4 antitelima. ;Antitela i fragmenti antitela ;[0088]Kako se ovde koristi, izraz "antitelo" odnosi se na intaktno antitela, ili njegov antigen vezujući fragment, kao što je opisano u odeljku definicije. Antitelo može da obuhvata kompletnni molekul antitela (uključujući poliklonske, monoklonske, himerne, humanizovane ili humane verzije koje imaju teške i/ili lake lance pune dužine) ili da obuhvata njegov antigen vezujući fragment. Fragmenti antitela obuhvataju F(ab')2, Fab, Fab', Fv, Fc, i Fd fragmente, a mogu biti inkorporirani u antitela jednog domena, monovalentna antitela, jednolančana antitela, maksitela, minitela.<;>ntratela. dijatela, trijatela, tetratela, v-NAR i bis-scFv (videti npr. „ Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnologv, 23, 9, 1126-1136). Polipeptidi antitela takođe SU opisani u U. S. Patentu BR. 6,703,199, uključujući fibronektinska polipeptidna monotela. Drugi polipeptidi antitela opisani su u U.S. Patentnoj objavi 2005/0238646, koji su jednolančani polipeptidi. Monovalentni fragmenti antitela opisani su u objavi US patentne prijave 20050227324. ;[0089]Antigen vezujući fragmenti izvedeni iz antitela mou se dobiti, na primer, proteolitičkom hidrolizom antitela, na primer, pepsin ili papain digestijom celih antitela prema konvencionalnim postupcima. Primera radi, fragmenti antitela mogu se proizvesti enzimskim cepanjem antitela sa pepsinom da bi se obezbedio 5S fragment nazvan F(ab')2. Ovaj fragment se može dalje cepati upotrebom tiolskog redukcionog agensa kako bi se proizveo 3.5S Fab' monovalentni fragmenti. Opciono, reakcija cepanja može se izvoditi korišćenjem blokirajuće grupe za sulfhidrilne grupe koje proizilaze iz cepanja disulfidnih veza. Kao alternativa, enzimsko cepanje pomoću papaina proizvodi dva monovalentna Fab fragmenta i Fc fragment direktno. Ovi postupci opisane su, na primer, od strane Goldenberg, U.S. Patent Br. 4,331,647, Nisonoff et al., Arch. Chem. Bvophis. 89: 230,1960; Porter, Biochem. J. 73:119,1959; Edelman et al., u Methods in Enzymology 1: 422 (Academic Press 1967); i Andrews, S.M. and Titus, J.A. u Current Protocols in lmmunology (Coligan J.E., et al., eds.), John Wiley & Sons, New York (2003), strane 2.8.1-2.8.10 i 2.10A.1-2.10A.5. Drugi postupci cepanja antitela, kao što je odvajanje teških lanaca da bi formirali monovalentne fragmente lakog-teškog lanca (FD), dalje cepanje fragmenata ili druge enzimske, hemijske ili genetičke tehnike takođe se mogu koristiti, sve dok se fragmenti vezuju za antigen koji je prepoznat od strane netaknutog antitela. ;[0090]Fragment antitela može takođe biti bilo koji sintetički ili genetski konstrisani protein. Na primer, fragmenti antitela uključuju izolovane fragmente koji se sastoje od varijabilnog regiona lakog lanca, "Fv" fragmenti koji se sastoje od varijabilnih regiona teških i lakih lanaca, rekombinantni jednolančani polipeptidni molekuli u kojima su laki i teški varijabilni regioni povezani peptidnim veznikom (scFv proteinima). ;[0091]Još jedan oblik fragmenta antitela je peptid koji obuhvata jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR) antitela. CDR-ovi (koji se takođe nazivaju "jedinice minimalnog prepoznavanja", ili "hipervarijabilni region") mogu se dobiti konstruisanjem polinukleotida koji kodiraju CDR od interesa. Takvi polinukleotidi se pripremaju, na primer, pomoću lančane reakcije polimeraze kako bi se sintetisao varijabilni region primenom mRNK ćelija koje proizvode antitela kao šablon (videti, na primer, Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzimology 2: 106, 1991, Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies", u Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), page 166 (Cambridge University Press 1995); i Ward et al. "Genetic Manipulation and Exxpresion of antibodies", u Monoclonal Antibodies: (eds.) Principles and Applications, Birch et al., page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)). ;[0092]Prema tome, vezivni agens obuhvata najmanje jedan CDR kao što je ovde opisano. Vezivni agens može obuhvatati najmanje dva, tri, četiri, pet ili šest CDR kao što je ovde opisano. Vezivni agens dalje može obuhvatati najmanje jedan varijabilni regionski domen antitela koje je ovde opisano. Varijabilni regionski domen može biti bilo koje veličine ili aminokiselinske kompozicije i generalno obuhvatati najmanje jednu CDR sekvencu odgovorna za vezivanje za TSLP, na primer CDR 1, CDR2, CDR3 teškog lanca i/ili CDR lakog lanca koji su specifično opisani, a koja je susedna ili u okviru sa jednom ili više sekvenci okvira. Uopšteno, varijabilni (V) regionski domen može biti bilo koji pogodni raspored imunoglobulinskih varijabilnih domena teškog (VH) i/ili lakog (Vi) lanca. Tako, na primer, V regionski domen može biti monomer i biti Vhili VLdomen, koji je sposoban da samostalno veže humani TSLP sa afinitetom najmanje jednakim 1 x 10"<7>M ili manjim kao što je opisano u nastavku. Alternativno, V regionski domen može biti dimerni i sadržati VH-Vh, Vh-AAili VL-VL, dimere. V regionski dimer obuhvata najmanje jedan VH i najmanje jedan VL lanac koji mogu biti nekovalentno povezani (u daljem tekstu Fv). Ako je poželjno, lanci mogu biti kovalentno spojeni bilo direktno, na primer preko disulfidne veze između dva varijabilna domena ili preko povezivača, na primer peptidnim povezivačom, kako bi formirali jednolančani Fv (scFv). ;[0093]Varijabilni regionski domen može biti bilo koji prirodni varijabilni domen ili njegova rekonstruisana verzija. Pod rekonstruisanom verzijom podrazumeva se varijabilni regionski domen koji je kreiran korišćenjem inženjeringa rekombinantne DNK. Takve rekonstruisane verzije uključuju one pripremljene, na primer, od određenog varijabilnog regiona antitrela ubacivanjima, delecijama, ili promenama u ili na sekvenci amino kiselina specifičnog antitela. Posebni primeri obuhvataju rekonstituisane varijabilne regionske domene koji sadrže najmanje jedan CDR i opciono jedan ili više okvira amino kiseline prvog antitela i ostatak varijabilnog regionskog domena drugog antitela. ;[0094]Varijabilni regionski domen može biti kovalentno vezan na C-termina!nu amino kiselinu u najmanje jednom drugom domenu antitela ili njegovog fragmenta. Tako, na primer, VH domen koji je prisutan u varijabilnom regionskom domenu može biti povezan sa imunoglobulinskim CHI domenom ili njegovim fragmentom. Slično tome, V domen može biti povezan sa CKdomenom ili njegovim fragmentom. Na taj način, na primer, antitelo može biti Fab fragment pri Čemu antigen vezujući domen sadrži povezane VHi Vtdomene kovalentno vezane na njihove C-terminuse na CHI i G domenu, respektivno. CHI domen može biti produžen sa dodatnim amino kiselinama, na primer radi obezbeđivanja zglobnog regiona ili dela domena zglobnog regiona kao u npr u Fab' fragmentu, ili kako bi se obezbedili dalji domeni, poput CH2 i CH3 domena antitela. ;Derivati antigen vezujućih proteina ;[0095]Nukleotidne sekvence prikazane na FIG. 1A-1F, FIG. 2A-2F i Tabeli 2 iznad mogu biti izmenjene, na primer, nasumičnom mutagenezom ili usmerenom mutagenezom (npr., oligonukleotid-usmerenom mesto-specifičnom mutagenezom) kako bi se kreirao promenjeni polinukleotid koji obuhvata jedan ili više određenih nukleotidnih supstitucija, delecija, ili insercija u poređenju sa nemutiranim polinukleotidom. Primeri tehnika za izradu takvih pramena opisani su u VValder et al., 1986, Gene 42: 133; Bauer et al., 1985, Gene 37:73; Craik, BioTechniques, Januarv 1985, 12-19; Smith et al., 1981, Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press; i U.S. Patent br. 4.518.584 i 4,737,462. Ovi i drugi postupci mogu biti korišćeni da bi se izradili, na primer, derivati TSLP antigen vezujućih proteina koji imaju željene osobine, na primer, povećan afinitet, težnju ili specifičnost za TSLP, povećanu aktivnost ili stabilnost in vtvo ili in vitro, ili smanjene in vivo sporedne efekte u odnosu na neizvedene antigen vezujuće proteine. ;[0096]Drugi derivati anti-TSLP-antigen vezujućih proteina uključujući antitela u okviru ovog pronalaska, uključuju kovalentne ili agregativne konjugate anti-TSLP-antitela, ili njihove fragmente, sa ostalim proteinima ili polipeptidima, kao stoje ekspresijom rekombinantnih fuzionih proteina koji obuhvata heterologne polipeptide fuzionisani u N-terminusu ili C-terminusu polipeptidnog anti-TSLP-antitela. Na primer, konjugovani peptid može biti heterologni signal (ili lider) polipeptid, npr. lider alfa-faktora kvasca, ili peptid, kao što je epitopna oznaka. Fuzioni proteini koji sadrže antigen vezujuće proteine mogu da obuhvataju peptide dodate da se olakša prečišćavanje ili identifikacija antigen vezujućih proteina (npr., poli-His). Antigen vezujući protein može takođe biti povezan sa FLAG peptidom kao Što je opisano u Hopp et al., Bio/Technology 6: 1204,1988, i U.S. Patentu 5.011.912. FLAG peptid je veoma antigeničan i obezbeđuje epitop reverzibilno vezan posebnim monoklonalnim antitelom (mAb), omogućavajući brzo ispitivanje i lako prečišćavanje eksprimiranog rekombinantnog proteina. Reagensi korisni za dobijanje fuzionih proteina u kojima je FLAG peptid fuzionisan u dati polipeptid komercijalno su dostupni (Sigma, St. Louis, MO). ;[0097]Oligomeri koji sadrže jedan ili više antigen vezujućih proteina mogu biti korišćen kao TSLP antagonisti. Oligomeri mogu biti u obliku kovalentno-povezanih ili ne-kovalentno-povezanih dimera, trimera ili viših oligomera. Oligomeri koji obuhvataju dva ili više antigen vezujuća proteina razmatrana su za upotrebu, pri čemu je jedan primer bio homodimer. Ostali oligomeri uključuju heterodimere, homotrimere, heterotrimere, homotetramere, heterotetramere, itd. ;[0098]Jedno ostvarenje odnosi se na oligomera koji obuhvataju višestruka antitela spojena putem kovalentnih ili nekovalentnih interakcija između peptidnih frupa fuzionisanih na antigen vezujuće proteine. Takvi peptidi mogu biti peptidni veznici (odbojnici), ili peptidi koji imaju svojstvo promovisanja oligomerizacije. Leucinski zatvarač i određeni polipeptidi izvedeni iz antitela su među peptidima koji mogu da promovišu oligomerizaciju antigen vezujućih proteina priključenih na njih, kao što je detaljnije opisano dole. ;[0099]U određenim ostvarenjima, oligomeri obuhvataju od dva do četiri antitela sposobna da se vežu za TSLP. Antitela oligomera mogu biti u bilo kom obliku, kao što bilo koji od gore opisanih oblika, na primer, varijante ili fragmenti. ;[0100]U jednom ostvarenju, oligomer je pripremljen primenom polipeptida izvedenih iz imunoglobulina. Opisana je priprema fuzionih proteina koji obuhvataju određene heterologne polipeptide fuzionisane za različite delove polipeptida izvedenih iz antitela (uključujući Fc domen), na primer kod, Ashkenazi et al., 1991, PNAS USA 88:10535;. Byrn et al., 1990, Nature 344: 677; i Hollenbaugh et al., 1992 "Construction of Immunoglobuiin Proteins", u Current Protocols in Immunologv, Suppl. 4, pages 10.19.1 -10.19.11. ;Jedno ostvarenje ovog pronalaska je usmereno na dimer koji obuhvata dva fuziona proteina stvorenih fuzijom fragmenta anti-TSLP-antitela za Fc region antitela. Ovaj dimer može se pripremiti, na primer, ubacivanjem genske fuzije koja kodira fuzioni protein u odgovarajući ekspresioni vektor, eksprimirajući gensku fuziju u ćelijama domaćina transformisana sa rekombinantnim ekspresionim vektorom, i omogućavajući da se eksprimirani fuzioni protein sastavi slično kao molekuli antitela, nakon čega se interlančana disulfidne veze formiraju između Fc grupa dajući dimer. ;[0101]Izraz "Fc polipeptid" kako se ovde koristi uključuje nativne i mutein oblike polipeptida izvedene iz Fc regiona antitela. Skraćeni oblici takvih polipeptida koji sadrže zglobni region koji promoviše dimerizaciju takođe su uključeni. Fuzioni proteini koji obuhvataju Fc grupe (i oligomere koji su formirane od njih) pružaju prednost lakog prečišćavanja afinitetnom hromatografijom preko kolona sa Proteinom A ili Proteinom G. ;[0102]Jedan pogodan Fc polipeptid, opisan u PCT prijavi WO 93/10151 (ovde uključen kao referenca), je jednolančani polipeptid koji se pruža od N-terminalnog zglobnog regiona do nativnog C-terminusa Fc regiona humanog IgGl antitela. Još jedan koristan Fc polipeptid je Fc mutein opisano u U.S. Patent 5,457,035 i Baum et al., 1994, EMBO J. 13: 3992-4001. Sekvenca amino kiseline ovog muteina je identična onom nativne Fc sekvence predstavljene u WO 93/10151, izuzev što je amino kiselina 19 promenjena iz Leu u Ala, amino kiselina 20 je promenjena iz Leu u Glu, i amino kiselina 22 je promenjena iz Gly u Ala. Mutein pokazuje smanjeni afinitet za Fc receptore. U drugim ostvarenjima, varijabilni deo teških i/ili lakih lanaca anti-TSLP-antitela mogu biti supstituisani za varijabilni deo antitela teškog i/ili lakog lanca. ;[0103] Alternativno, oligomer je fuzioni protein koji obuhvata više antigen vezujućih proteina, sa ili bez peptidnih povezivača ( peptida za razdvajanje). Među pogodnim peptidnim povezivačima su oni opisani u U.S. patentima 4,751,180 i 4,935,233. ;[0104] Još jedanpostupak za dobijanje oligomernih antigen vezujućih proteina uključuje upotrebu leucinskog zatvarača. Domeni leucinskog zatvarača su peptidi koji promovišu oligomerizaciju proteina u kojima se nalaze. Leucinski zatvarači su prvobitno identifikovani u nekoliko DNK-vezujuća proteina ;(Landschulz et al., 1988, Science 240: 1759), a od tada su otkriveni u raznim proteinima. Među poznatim leucinskim zatvaračima nalaze se prirodni peptidi i njihovi derivati koji dimerizuju ili trimerizuju. Primeri domena leucinskog zatvarača pogodnih za proizvodnju rastvornih oligomernih proteina opisani su u PCT prijavi WO 94/10308, a leucinski zatvarač izveden iz plućnog površinskog proteina D (SPD) opisan je u Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191. Upotreba modifikovanog leucinskog zatvarača koji omogućava stabilnu trimerizaciju heterolognog proteina fuzionisanog na osnovu njih, opisan je u Fanslovv et al., 1994, Semin. Immunol. 6: 267-78. U jednom pristupu, rekombinantni fuzioni proteini koji obuhvataju fragment anti-TSLP-antitela ili derivat fuzionisan sa peptidom leucinskog zatvarača eksprimirani su u pogodnim ćelijama domaćinima, a rastvorljivi fragmenti oligomernnih anti-TSLP-antitela ili derivati koji se formiraju dobijaju se iz supernatanta kulture. ;[0105]Kao što je ovde opisano, antitela obuhvataju najmanje jedan CDR. Na primer, jedan ili više CDR mogu biti ugrađeni u poznate regione okvira antitela (IgGl, lgG2, itd.), ili konjugovani u pogodnom vozilu kako bi se poboljšao njihov poluživot. Pogodna vozila uključuju, ali nisu ograničeni na Fc, polietilen glikol (PEG), albumin, transferin, i slično. Ova i druga pogodna vozila poznata su u stanju tehnike. Takvi konjugovani CDR peptidi mogu biti u monomernom, dimernom, tetramernom ili drugom obliku. U jednom ostvarenju, jedan iii više vodorastvornih polimer vezano je na jednom ili više specifičnih položaja, na primer, na amino terminusu, vezujućeg agensa. ;[0106]U nekim poželjnim ostvarenjima, antitelo obuhvata jedan ili više vodorastvornih polimernih priloga, uključujući, a-.\ ne ograničavajući se na, polietilen glikol, polioksietilen glikol iii poiipropilen glikol. Videti, npr., U.S. Pat. Br. 4,640,835, 4,496,689, 4,301,144, 4,670,417, 4,791,192 i 4,179,337. U nekim ostvarenjima, derivativni vezujući agens obuhvata jedan ili više monometoksi-polietilen glikoia, dekstrana, celuloze, ili drugi polimera na bazi ugljenih hidrata, poli- (N-vinil pirolidon) -polietilen glikol, propilen glikol homopolimere, poiipropilen oksid/etilen oksid kopolimere, polioksietilisani polioli (npr. glicerol) i polivinil alkohol, kao i smeše takvih polimera. U nekim ostvarenjima, jedan ili više vodorastvornih polimera nasumično je vezano za jedan ili više bočnih lanaca. U nekim ostvarenjima, PEG može delovati da poboljša terapeutski kapacitet vezujućeg agensa, kao što je antitelo. Određeni takvi postupci opisani su u, na primer, U.S. Pat. 6,133,426. ;[0107]Treba imati na umu da antitelo prema ovom pronalasku može imati najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju, deleciju, ili dodatak, pod uslovom da antitelo zadržava specifičnost vezivanja. Stoga, modifikacije struktura antitela obuhvaćene su unutar obima pronalaska. Ovo može uključiti aminokiselinske supstitucije, koji mogu biti konzervativne ili ne-konzervativne, koji ne uništavajusposobnost humanog TSLP vezivanja antitela. Konzervativne aminokiselinske supstitucije mogu da obuhvate neprirodne aminokiselinske ostatke, koji su tipično inkorporirani hemijskom sintezom peptida, pre nego sintezom u biološkim sistemima. Ovo uključuje peptidomimetski i drugi obrnute ili invertovane oblike aminokiselinskih grupa. Konzervativna aminokiselinska supstitucija može takođe uključivati supstituciju nativnog aminokiselinskog ostatka sa normativnim ostatkom tako ima malo ili nimalo efekta na polarnost ili naelektrisanje aminokiselinskog ostatka na tom položaju. Non-konzervativne supstitucije mogu da obuhvate izmenu člana jedne klase amino kiselina ili aminokiselinskih mimetika sa članom iz druge klase sa različitim fizičkim osobinama (npr. veličina, polaritet, hidrofobnost, naelektrisanje). Takvi supstituisani ostaci se mogu uvesti u regione humanog antitela koji su homologni sa ne-humanim antitelima, ili u nehomologne regione molekula. ;[0108]Štaviše, stručnjak može generisati test varijante koje sadrže jednu aminokiselinsku supstituciju na svakom željenom aminokiselinskom ostatku. Ove varijante se zatim mogu testirati pomoću testova aktivnosti koji su poznati stručnjacima iz ove oblasti. Ovakve varijante mogu da posluže za prikupljanje informacija o pogodnim varijantama. Iva primer, ukoliko se otkrije da pramena određenog aminokiselinskog ostatka dovodi do gubitka, neželjenog smanjenja ili ispoljavanja nepoželjne aktivnosti, varijante sa takvim promenama mogu se izbeći. Drugim rečima, na osnovu informacija prikupljenih tokom ovih rutinskih eksperimenata, stručnjak može lako da odredi amino kiseline u kojima dalje supstitucije treba izbegavati ili same ili u kombinaciji sa drugim mutacijama. ;[0109]Stručnjak će moći da odredi pogodne varijante polipeptida kako je navedeno korišćenjem dobro poznatih tehnika. U nekim ostvarenjima, stručnjak može da identifikuje odgovarajuća područja molekula koja se mogu promeniti bez uništavanja aktivnosti ciljanjem regiona za koje se veruje da nisu važni za aktivnost. U nekim ostvarenjima, moguće je identifikovati ostatke i delove molekula koji su konzervirani među sličnim polipeptidima. U nekim ostvarenjima, čak i područja koja mogu biti značajna za biološku aktivnost ili strukturu mogu biti podvrgnute konzervativnim supstitucijama amino kiselina bez narušavanja biološke aktivnosti ili negativnog uticaja na strukturu polipeptida. ;[0110]Dodatno, stručnjak može ponovo pogledati atrukturno-gunkcionalna identifikujući ostatke u sličnim polipeptidima koji su važni za aktivnost ili strukturu. U pogledu takvog poređenja, moguće je predvideti značaj aminokiselinskih ostataka u proteinu koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima koji su važni za aktivnost ili strukturu u sličnim proteinima. Stručnjak može izabrati hemijski slične aminokiselinske supstitucije za takve predviđene važne amino kiselinske ostatke. ;[0111]Stručnjak može analizirati trodimenzionalnu strukturu i sekvencu amino kiseline u odnosu na strukturu sličnih polipeptida. U pogledu takve informacije, stručnjak može da predvidi redosled aminokiselinskih ostataka antitela u odnosu na njegovu trodimenzionalnu strukturu. U nekim ostvarenjima, stručnjak može odabrati da ne pravi radikalne promene u aminokiselinskim ostacima predviđenih da budu na površini proteina, jer takvi ostaci mogu biti uključeni u važne interakcije sa drugim molekulima. ;[0112] Brojne naučne publikacije su posvećene predviđanju sekundarne strukture. Pogledati Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7 (4): 422-427 (1996), Chou et al., Biochemistrv, 13 (2): 222-245 (1974); Chou et al., Biochemistrv, 113 (2): 211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzvmol. Relat. Areas Mol. Bio!., 47:45-148 ;(1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem, 47: 251-276 i Chou et al., Biophvs. J„ 26: 367-384 (1979). Pored toga, kompjuterski programi su trenutno na raspolaganju da pomognu u predviđanju sekundarne strukture. Jedan postupak za predviđanje sekundarne strukture zasniva se na modelovanju homologije. Na primer, dva polipeptida ili proteina koji imaju identičnost sekvenci veću od 30%, ili sličnost veću od 40% često imaju slične strukturne topologije. Nedavni rast baze podataka strukture proteina (PDB) omogućio je poboljšano predviđanje sekundarne strukture, uključujući potencijalni broj pregiba unutar polipeptidne ili proteinske strukture. Videti Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27 (1): 244-247 (1999). Sugerisano je (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7 (3): 369-376 (1997)) da postoji ograničen broj pregiba u datom polipeptidu ili proteinu i da kada kritični broj struktura dobijen, predviđanje strukture postaje dramatično preciznije. ;[0113] Dodatni postupci predviđanja sekundarne strukture obuhvataju "nizanje" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7 (3): 377-87 (1997); Sippl et al., Structure. 4(1): 15-19 (1996)), "analiza profila" (Bovvie et al., Science, 253: 164-170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzvm., 183: 146-159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84 (13): 4355-4358 (1987)), i "evoluciono povezivanje" (Videti Holm, gore navedeno (1999), i Brenner, gore navedeno (1997)). ;[0114] Stručnjak će razumeti da neki proteini, kao što su antitela, mogu proći kroz različite posttranslacione modifikacija. Vrsta i obim ovih modifikacija često zavisi od linije ćelije domaćina koja se koristi za eksprimiranje proteina kao i za uslove kulture. Takve modifikacije mogu uključiti varijacije u glikozilaciji, metionin oksidaciju, diketopiperizinsko formiranje, aspartatsku izometrizacija i asparaginsku deamidaciju. Čest modifikacija je gubitak karboksi-terminalnog osnovnog ostatka (kao što su lizin ili arginin) usled dejstva karboksipeptidaze (kao što je opisano u Harris, RJ. Journal of Chromatographv 705: 129-134,1995). ;[0115] U nekim ostvarenjima, varijante antitela obuhvataju glikozilirane varijante kod kojih je broj i/ili tip glikozilacionih mesta izmenjen u poređenju sa sekvencama amino kiselina roditeljskog polipeptida. U određenim ostvarenjima, varijante obuhvataju veći ili manji broj N-povezanih mesta glikozilacije u poređenju sa nativnim proteinom. Alternativno, supstitucije koje eliminišu ovu sekvencu će ukloniti postojeći N-vezani ugljenohidratni lanac. Takođe je obezbeđeno preuređivanje N-povezanih ugljovodoničnih lanaca gde su jedno ili više N-povezanih mesta glikozilacije (tipično ona koja se prirodno javljaju) eliminisana, a jedno ili više novih N-povezanih mesta je stvoreno. Dodatne poželjne varijante antitela uključuju cisteinske varijante u kojim su jedan ili više cisteinskih ostataka izbrisani iz ili zamenjeni drugom amino kiselinom (npr., serinom) u poređenju sa roditeljskom sekvencom amino kiseline. Cisteinske varijante mogu biti korisne onda kada antitela moraju ponovo da se saviju u biološki aktivnu konformaciju kao nakon izolacije nerastvornih inkluzionih tela. Cisteinske varijante generalno imaju manje cisteinskih ostataka od nativnog proteina i tipično poseduju paran broj u cilju minimiziranja interakcija nastalih postojanjem neuparenih cisteina. ;[0116] Poželjne supstitucije amino kiselina (konzervativne ili ne-konzervativne) mogu odrediti stručnjaci u trenutku kada su takve supstitucije poželjne. U nekim ostvarenjima, aminokiselinske supstitucije mogu da se koriste za identifikaciju važnih ostataka antitela za humani TSLP, ili za povećanje ili smanjenje afiniteta antitela za humani TSLP ovde opisan. ;[0117] Prema nekim ostvarenjima, poželjne supstitucije amino kiselina su one koje: (1) smanjuju podložnost proteolizi, (2) smanjuju podložnost oksidaciji, (3) menjaju afinitet vezivanja za formiranje proteinsKih kompleksa, (4) menjaju afinitete vezivanja, i/ili (4) daju iii modifikuju druga fiziČkohemijska ili funkcionalna svojstva takvih polipeptida. Prema nekim ostvarenjima, pojedinačne ili višestruke aminokiselinske supstitucije (u određenim ostvarenjima, konzervativne aminokiselinske supstitucije) mogu da se naprave u prirodnoj sekvenci (u određenim ostvarenjima, u delu polipeptida van domena(a) formiranjem intermolekulskih kontakata ). U nekim ostvarenjima, konzervativna aminokiselinska supstitucija tipično ne može značajno da menja strukturne karakteristike roditeljske sekvence (npr., zamena amino kiseline ne treba da narušava heliks koji se javlja u roditeljskoj sekvenci ili poremeti druge tipove sekundarne strukture koji karakterišu roditeljsku sekvencu). Primeri u struci priznatih polipeptidnih sekundarnih i tercijarnih struktura opisani su u Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed, V. H. Freeman and Companv, New York (1984).); Introduction to Protein Structure (C. Branden i J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, NY (1991).); i Thornton et al. Nature 354: 105(1991). ;[0118] U nekim ostvarenjima, antitela prema ovom pronalasku mogu biti hemijski vezana sa polimerima, lipidima ili drugim grupama. ;[0119]Pored toga, antigen vezujući proteini mogu obuhvatati najmanje jedan od CDR opisanih ovde inkorporirani biokompatibilne strukture okvira. U jednom primeru, biokompatibilna struktura okvira obuhvata polipeptid ili njegov deo koji je dovoljan da se formira konformacijski stabilna strukturna podršku, ili okvir ili skela, koja je u stanju da prikaže jednu ili više sekvenci amino kiselina koje se vezuju za antigen (npr., CDR-ovi, varijabilni region, itd.) u regionu lokalizovane površine. Takve strukture mogu biti prirodni polipeptid ili polipeptidno "savijanje" (strukturalni motiv), ili može imati jednu ili više modifikacija, poput dodavanja, delecije ili supstitucije amino kiselina, u odnosu na prirodi polipeptid ili savijanje. Ove skele mogu biti izvedene iz polipeptida bilo koje vrste (ili više od jedne vrste), kao što je čovek, drugi sisar, drugi kičmenjak, beskičmenjak, biljka, bakterija ili virus. ;[0120]Tipične biokompatibilne strukture okvira su na bazi proteinskih skela ili skeleta koji je drugačiji od imunoglobulinskih domena. Na primer, one koje se zasnivaju na fibronektinu, ankirinu, lipokalinu, neokarzinostainu, citohromu b, CP1 cink prstu, PSTI, upredenoj zavojnici, LACI-D1, Z domenu i tendamistat domenu, mogu da se koriste (videti npr. Nvgren i Uhlen, 1997, Current Opinion in Structural Biology, 7, 463-469). ;[0121]Dodatno, stručnjak će prepoznati da antigen vezujući proteini mogu uključivati jedan ili više CDR1, CDR2, CDR3 teškog lanca, i/ili CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca koji imaju jednu aminokiselinsku supstituciju, pod uslovom da antitelo zadržava specifičnost vezivanja ne-supstituisanog CDR. Ne-CDR deo antitela može biti ne-proteinski molekul, pri čemu vezujući agens unakrsno olokira vezivanje antitela opisano ovde sa humanim tsl<p>i/ili inhibira TSLP aktivnost. Ne-CDR deo antitela može biti ne-proteinski molekul u kojem antitelo pokazuje sličan obrazac vezivanja sa humanim TSLP proteinima u ispitivanju kompeticionog vezivanja kao i ono koje ispoljava od strane najmanje jednog od antitela Al A27, i/ili neutrališe aktivnost TSLP. Ne-CDR deo antitela može biti sastavljen od amino kiselina, pri čemu je antitelo rekombinantni vezujući protein ili sintetički peptid, a rekombinantni vezujući protein unakrsno-blokira vezivanje antitela ovde opisanog humanog TSLP i/ili neutrališe TSLP in vitro ili in vivo. Ne-CDR deo antitela može biti sastavljen od amino kiselina, pri čemu je antitelo rekombinantno antitelo, a rekombinantno antitelo pokazuje sličan obrazac vezivanja sa humanim TSLP-polipeptidima u testu kompetitivnog vezivanja, kao što ispoljava najmanje jedno od antitela A1-A27, i/ili neutrališe TSLP aktivnost. ;Postupci pripremanja antigen vezujućih proteina, određenije antitela. ;[0122]Antigen vezujući protein kao što je antitelo koje obuhvata jedan ili više od CDR1, CDR2, CDR3 teškog lanca, i/ili CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca kao Što je opisano gore, mogu se dobiti ekspresijom iz ćelije domaćina koja sadrži DNK kodiranje za ove sekvence. DNK kodiranje za svaku CDR sekvencu može se odrediti na osnovu sekvence amino kiselina CDR-a i sintetisati zajedno sa bilo kojim željenim okvirom varijabilnog region antitela i DNK sekvencama konstantnog regiona korišćenjem tehnika oligonukleotidne sinteze, usmerene mutageneze i tehnika lančane reakcije polimeraze (PCR), po potrebi. DNK kodiranje za okvire varijabilnog regiona i konstantne regione široko je dostupna stručnjacima u bazama podataka za sekvence kao stoje GenBank<®.>;[0123]Dodatna ostvarenja uključuju himerna antitela, npr. humanizovane verzije ne-humanih (npr., mišjih) monoklonalnih antitela. Takva humanizovana antitela mogu biti pripremljena poznatim tehnikama, i obezbeđuju prednost u smanjenu imunogenosti kada se antitela daju ljudima. U jednom ostvarenju, humanizovano monoklonalno antitelo obuhvata varijabilni domen mišjeg antitela (ili ceo ili deo njegovog antigen vezujućeg položaja) i konstantni domen izveden iz humanog antitela. Alternativno, fragment humanizovanog antitela može obuhvatati mesto vezivanja mošjeg monoklonalnog antitela i fragment varijabilnog domena (kome nedostaje anitigen-mesto vezivanja) izvedeno iz humanog antitela. Procedure za proizvodnju himernih i dalje rekonstruisanih monoklonalnih antitela uključuju one opisane u Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323, Liu et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84: 3439, Larrick et al., 1989, Bio/Technologi 7: 934, i Winter et al., 1993, TIPS 14: 139. U jednom ostvarenju, himerno antitelo je CDR graftovano antitelo. Tehnike za humanizaciju antitela opisane su u, npr., U.S. Pat. Br. 5.869.619, 5,225,539, 5,821,337, 5,859,205, 6.881.557, Padlan et al., 1995, FASEB J. 9: 133-39 i Tamura et al., 2000, J. Immunol. 164: 1432-41. Dodatne tehnike za proizvodnju humanizovanih antitela kao što su one opisani su u Zhang, W., et al., Molecular immunologv. 42 (12): 1445-1451, 2005; Hwang W. et al., Methods. 36 (1): 35-42, 2005; Dall'Acqua WF et al., Methods 36 (1): 43-60, 2005; i Clark M., Imunologv Today. 21 (8): 397-402, 2000). ;[0124]Procedure su razvijene za generisanje humanih ili delimično humanih antitela u ne-humanim životinjama. Na primer, pripremljeni su miševi u kojima su jedan ili više endogenih imunoglobulinskih gena inaktivirani različitim sredstvima. Humani imunoglobulinski geni uvedeni su u miševe kako bi zamenili inaktivisane mišje gene. Antitela proizvedena u životinji inkorporiraju humane imunoglobulinske polipeptidne lance kodirane od strane humanog genetskog materijala uvedenog u životinju. U jednom ostvarenju, ne-humana životinja, kao što je transgeni miš, imunizovana je sa TSLP proteinom, na primer, tako da su antitela usmerena protiv različitih TSLP polipeptida generisana u životinji. Primeri pogodnih imunogena dati su u niže Primerima. ;[0125]Primeri tehnika za proizvodnju i korišćenje transgenih životinja za proizvodnju humanih ili delimično humanih antitela opisani su u US patentima 5,814,318, 5,569,825, i 5,545,806, Daviš et al., 2003, Production of human antibodies from transgenic mice in Lo, ed. Antibodv Engineering: Methods and Protocols, Humana Press, NJ: 191-200., Kellermann et al., 2002, Curr Opin Biotechnol. 13: 593-97, Russel et al., 2000, Infect Immun. 68:1820-26, Gallo et al., 2000, Eur J Immun. 30: 534-40, Daviš et al., 1999, Cancer Metastasis Rev. 18: 421-25, Green, 1999, J Immunol Methods. 231:11-23, Jakobovits, 1998, Advanced Drug Deliverv Revievvs 31: 33-42, Green et al., 1998, J Exp Med. 188:483-95, Jakobovits A 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs. 7: 607-14, Tsuda et al., 1997, Genomics. 42: 413-21, Mendez et al., 1997, Nat Genet. 15: 146-56, Jakobovits, 1994, Curr Biol. 4: 761-63, Arbones et al., 1994, Immunitv. 1: 247-60, Green et al., 1994, Nat Genet. 7: 13-21, Jakobovits et al., 1993, Nature. 362: 255-58, Jakobovits et al., 1993, Proc Natl Acad Sci USA. 90: 2551-55. Chen, J., M. Trounstine, F. W. Alt, F. Young, C. Kurahara J. Loring D. Huszar. "Imunoglobulin gene rearrangement in B-cell deficient mice generated by targeted deletion of the JH locus." International lmmunology 5 (1993): 647-656, Choi et al., 1993, Nature Genetics4: 117-23, Fishvvild et al., 1996, Nature Biotechnology 14: 845-51, Harding et al., 1995, Annals of New York Academy of Sciences, Lonberg et al., 1994, Nature 368: 856-59, Lonberg, 1994, Transgenic Approaches to Human Monoclonal Antibodies in Handbook of Experomental Pharmacology 113: 49-101, Lonberg et al., 1995, Internal Review of lmmunology 13: 65-93, Neuberger, 1996, Nature Biotechnology 14: 826, Taylor et al., 1992, Nucleic Acids Research 20: 6287-95, Tailor et al., 1994, International lmmunology 6: 579-91, Tomizuka et al., 1997, Nature Genetics, 16:133-43, Tomizuka et al„ 2000, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 97:722-27, Tuaillon et al., 1993, Proceedings of the National Academy of Sciences. USA 90: 3720-24 i Tuaillon et al., 1994, Journal of lmmunology 152: 2912-20. ;[0126] U sledećem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđu<!>e monoklonalna antitela koja se vezuju za humani TSLP. Monoklonalna antitela mogu biti proizvedena korišćenjem bilo koje tehnike poznate u struci, npr. imortalizovanjem ćelija slezine sakupljenih iz transgene životinje nakon završetka imunizacionog rasporeda. Ćelije slezine mogu biti imortalizovane korišćenjem bilo koje tehnike poznate u struci, npr. njihovim fuzionisanjem sa ćelijama mijeloma radi proizvodnje hibridoma. Ćelije mijeloma za upotrebu u fuzionim procedurama za prouzvodnju hibridoma poželjno ne proizvode antitela, imaju visoku fuzionu efikasnost, i enzimske nedostatke koje čine ih nesposobnim za rast u određenim selektivnim podlogama koje podržavaju rast samo željenih fuzionisanih ćelija (hibridoma). Primeri pogodnih ćelijskih linija za upotrebu u mišjim fuzijama uključuju Sp-20, P3-X63/AG8, P3-X63-Ag8.653, NSl/l.Ag 4 1, SP210-Agl4, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 i S194/5XX0 Bul; primeri ćelijskih linija koje se koriste u pacovskoj fuziju uključuju R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F i 4B210. Druge ćelijske linije korisne za ćelijske fuzije su U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 i UC729-6. ;[0127]U jednom ostvarenju, ćelijska linija hibridoma proizvodi se imunizovanjem životinje (npr. ;transgene životinje koja ima humane imunoglobulinske sekvence) sa TSLP imunogenom; žetvom ćelija slezine iz imunizovane životinje; fuzijom sakupljenih ćelija slezine se ćelijskom linijom mijeloma, čime se stvaraju ćelije hibridoma; uspostavljanjem ćelijskih linija hibridoma iz ćelija hibridoma, i identifikacijom ćelijske linije hibridoma koja proizvodi antitelo koje vezuje TSLP polipeptid. Takve ćelijske linije hibridoma, i TSLP monoklonalna antitela proizvedena od njih, obuhvaćeni su ovim pronalaskom. ;[0128]Monoklonalna antitela izlučena iz ćelijske linije hibridoma može se prečistiti korišćenjem bilo koje tehnike poznate u struci. Hibridomi ili mAb-ovi mogu se dalje proveriti kako bi se identifikovali mAb-ovi sa određenim osobinama, kao stoje blokiranje TSLP aktivnosti kao što je osteoprotegerinska (OPG) proizvodnja iz primarnih humanih dendritiČnih ćelija. Primeri takvih ispitivanja dati su u primerima ispod. ;[0129] Molekularna evolucija regiona koji određuju komplementarnost (CDR) u centru mesta vezivanja antitela takođe je korišćena za izolovanje antitela sa povećanim afinitetom, na primer, kao što je opisano u Schier et al., 1996, J. Mol. Biol. 263: 551. Shodno tome, takve tehnike su korisne u pripremanju antitela za humani TSLP. ;[0130]Antigen vezujući proteini usmereni protiv humanog TSLP mogu da se koriste, na primer, u ispitivanjima za detekciju prisustva TSLP bilo in vitro ili in vivo. ;[0131] lako su humana, delimično humana ili humanizovana antitela pogodna za mnoge primene, ;naročito u slučajevima koji uključuju davanje antitela humanom subjeKtu, i aruge vrste antigen vezujućih proteina biće pogodne za određene primene. Ne-humana antitela mogu se, na primer, dobiti iz bilo koje životinje koja proizvodi antitela, kao što su miš, pacov, zec, koza, magarac, ili ne-humani primat (kao što je majmun (npr. makaki ili rezus majmun) ili čovekoliki majmun (npr., šimpanza)). Ne-humana antitela se mogu koristiti, na primer, u in vitro i primenama zasnovanim na ćelijskoj kulturi, ili bilo kojoj drugoj primeni gde ne dolazi do imunog odgovora na antitelo ovog pronalaska, gde je on zanemarljiv, može se sprečiti, nije bitan ili je požealjn. Ne-humano antitelo daje se ne-humanom subjektu. Ne-humano antitelo ne izaziva imuni odgovor kod ne-humanog subjekta. Ne-humano antitelo je iz iste vrste kao i ne-humani subjekat, npr. mišje antitelo prema ovom pronalasku daje se mišu. Antitelo iz određene vrste može biti pripremljeno, na primer, imunizacijom životinje te vrste sa željenim imunogenom ili koristeći veštački sistem za generisanje antitela te vrste (npr., bakterijski ili fag sistem na bazi prikaza za generisanje antitela određenih vrsta), ili konvertovanjem antitela iz jedne vrste u antitelo iz druge vrste zamenom, npr., konstantnog regiona antitela sa konstantnim regionom iz drugih vrsta, ili zamenom jednog ili više ostataka amino kiseline antitela tako da više podseća na sekvencu antitela iz drugih vrsta. U jednom ostvarenju, antitelo je himerno antitelo koje obuhvata sekvence amino kiselina izvedene iz ;antitela iz dve ili više različitih vrsta. ;[0132]Antigen vezujući proteini mogu se pripremiti bilo kojom od brojnih konvencionalnih tehnika. Na primer, mogu se prečistiti iz ćelija koje ih prirodno izražavaju (npr., antitelo se može prečistiti iz hibridoma koji ga proizvodi), ili su proizvedeni u rekombinantnim ekspresionim sistemima, koristeći bilo koju tehniku poznatu u struci. Videti, na primer, Monoclonal Antibodies, Hvbridomas: A New Dimension in Biological Anaivses, Kennet et al. (eds.). Plenum Press, New York (1980); i Antibodies: A Laboratorv Manual, Harlow and Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988). ;[0133]Bilo koji ekspresioni sistem poznati u struci mogu da se koriste za pripremu rekombinantnih polipeptida prema ovom pronalasku. Uopšteno, ćelije domaćini se transformiŠu sa rekombinantnim ekspresionim vektorom koji obuhvata DNK koja kodira željeni polipeptid. Među ćelijama domaćinima koje se mogu koristiti nalaze se prokarioti, ćelije kvasca ili više eukariotske ćelije. Prokarioti uključuju gram negativne ili gram pozitivne organizme, na primer E. coli ili bacile. Više eukariotske ćelije uključuju ćelije insekata i uspostavljene ćelijske linije sisara. Primeri pogodnih ćelijskih linija domaćina sisara uključuju COS-7 liniju ćelija bubrega majmuna (ATCC CRL 1651)(Gluzman et al., 1981, Cei! 23: 175), L ćelije, 293 ćelije, C127 ćelije, 3T3 ćelije (ATCC CCL 163), ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), HeLa ćelije, BHK (ATCC CRL 10) ćelijske linije i CVI/EBNA ćelijsku liniju izvedenu iz ćelijske linije CVI bubrega afričkog zelenog majmuna (ATCC CCL 70) kao što je opisao McMahan et al., 1991, EMBO J. 10: 2821. Odgovarajuće kloniranje i ekspresioni vektori za upotrebu sa bakterijskim, gljivičnim, kvasca i sisarskim ćelijskim domaćinima opisani su od strane Pouvels et al. (Cloning Vectors: A Laboratorv Manual, Elsevier, New York, 1985). ;[0134]Transformisane ćelije mogu biti kultivisane pod uslovima koji promovišu ekspresiju polipeptida, a polipeptid regenerisan konvencionalnim postupcima prečišćavanja proteina. Jedan takav postupak prečišćavanja opisana je u niže datim Primerima. Polipeptidi ovde razmatrana za upotrebu uključuju polipeptide suštinski homogenih rekombinantnih sisarskih anti-TSLP-antitela suštinski bez kontaminirajućih endogenih materijala. ;[0135]Antigen vezujući proteini mogu se pripremiti, i testirati na željene osobine, bilo kojom od brojnih poznatih tehnika. Neke od tehnika uključuju izolovanje nukleinske kiseline koja kodira lanac polipeptida (ili njegov deo) antigen vezujućeg proteina od interesa (npr, TSLP antitelo) i upravljajući nukleinsku kiselinu putem tehnologije rekombinantne DNK. Nukleinska kiselina može biti fuzionisan sa drugom nukleinskom kiselinom od interesa, ili izmenjena (npr., mutagenezom ili drugim konvencionalnim tehnikama) radi dodavanja, brisanja ili supstitucije jednog ili više aminokiselinskih ostataka, na primer. ;[0136]Jeđnolančana antitela mogu se formirati povezivanjem fragmenata varijabilnog domena teškog i lakog lanca (Fv region) preko mosta amino kiseline (kratkog peptidnog povezivača), rezultirajući kao pojedinačni polipeptidni lanac. Takvi jednolančani Fv (scF) pripremljeni su fuzionisanjem DNK koja kodira peptidni povezivač među DNK koja kodira dva polipeptida varijabilnog domena (VLi VH). Nastali polipeptidi mogu se presaviti na sebe radi formiranja antigen vezujućih monomera ili mogu da formiraju multimere (npr. dimere, trimere ili tetramere), u zavisnosti od dužine fleksibilnog povezivača između dva varijabilna domena (Kortt et al., 1997, Prot. Eng. 10: 423; Kortt et al., 2001, Biomol. Eng. 18: 95-108). Kombinovanjem različitih polipeptida koji obuhvataju VL i VH, mogu se formirati multimerni scFv koji se vezuju za različite epitope (Kriangkum et al., 2001, Biomol. Eng. 18:31-40). Tehnike razvijene za proizvodnju jednolančanih antitela uključuju one opisane u U.S. Patent Br. 4,946,778; Bird, 1988, Science 242: 423; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879; Ward et al., 1989, Nature 334: 544, de Graaf et al., 2002, Methods Mol Biol. 178: 379-87. Jeđnolančana antitela izvedena iz antitela obezbeđenih ovde, uključuju, ali nisu ograničena na, scFv koji obuhvataju kombinacije varijabilnog domena L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L5~^6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10, L11H11, L12H12, L13H13, L14H14, L15H15, L16H16, L17H17, L18H18, L19H19, L20H20, L21H21, L22H22, L23H23, L24H24, L25H25, L26H26 i L27H27 koji su obuhvaćeni ovim pronalaskom. ;[0137]Kada je sintetisana, DNK koja kodira antitelo prema ovom pronalasku ili njegov fragment mogu se propagirati i eksprimirati prema bilo kojem od raznih dobro poznatih postupaka za isecanje, vezivanje, transformaciju i transfekciju nukleinske kiseline korišćenjem bilo kojeg od mnoštva poznatih ekspresionih vektora. Tako, u nekim ostvarenjima ekspresija fragmenta antitela može biti poželjna u prokariotskom domaćinu, kao što je Escherichia coli (videti, npr., Pluckthun et al., 1989 Methods Enzvmo! 178: 497 515). U izvesnim drugim ostvarenjima, ekspresija antitela ili njegovog fragmenta može biti poželjna u eukariotskoj ćeliji domaćinu, uključujući kvasac (npr., Saccharomvces cerevisiae, Schizosaccharomvces pombe i Pichia pastoris), životinjske ćelije (uključujući ćelije sisara) ili biljne ćelije. Primeri pogodnih životinjskih ćelija uključuju, ali nisu ograničeni na, mijelom (kao što je mišja NSO linija), COS, CHO ili ćelije hibridoma. Primeri biljnih ćelija uključuju ćelije duvana, kukuruza, soje i pirinča. Jedan ili više replikabilnih ekspresioni vektora koji sadrže DNK koja kodira varijabilni i/ili konstantni region antitela može da se dobije i koristi za transformaciju odgovarajuće ćelijske linije, na primer, ne-proizvodeće ćelijske linije mijeloma, kao što je mišja NSO linija ili bakterija, kao što je E. coli, u kojem će doći do proizvodnje antitela. U cilju dobijanja efikasne transkripcije i translacije, DNK sekvenca u svakom vektoru treba da uključuje odgovarajuće regulatorne sekvence, posebno promotor i lider sekvencu operativno povezanu sa sekvencom varijabilnog domena. Posebni postupci za proizvodnju antitela na ovaj način, generalno su poznati i rutinski se koriste. Na primer, osnovni molekularni biološki postupci opisani su od strane Maniatis et al. (Molecular Cloning, A Laboratorv Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratorv, New York, 1989;. Videti takođe Maniatis et al., 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (2001)). DNK sekvencionisanje može se izvesti kao što je opisano u Sanger et al. ;(PNAS 74: 5463, (1977)) i Amersham International plc sequenctng handbook, a usmerena mutageneza može se obaviti u skladu sa postupcima koji su poznati u struci (Kramer et al., Nucleic Acids Res. 12: 9441, (1984);Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92 (1985); Kunkel et al., Methods in Enzvmol. 154: 367-82 (1987), The Anglian Biotechnologv Ltd. handbook). Osim toga, brojne publikacije opisuju tehnike pogodne za pripremu antitela putem manipulacije DNK, stvaranja ekspresionih vektora, kao i transformacije i kultivisanja odgovarajućih ćelija (Mountain A i Adair, J R in Biotechnologv and Genetic Engineering Reviews (ed. Tombs, M P, 10 , Chapter 1, 1992, Intercept, Andover, UK); "Current Protocols in Molecular Biologv", 1999, F.M. Ausubel (ed.), Wiley Interscience, New York). ;[0138]Kada se želi da se poboljša afinitet antitela prema ovom pronalasku koja sadrže jedan ili više od gore navedenih CDR može se dobiti brojnim protokolima afinitetnog sazrevanje uključujući održavanje CDR-ova (Yang etal., J. Mol. Biol., 254, 392-403,1995),<p>rešanjem lanca (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783,1992), korišćenjem mutacionih sojeva E. coii. (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 350-368,1996), mešanje DNK (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733,1997), ispoljavanja na fagima (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 7-88, 1996) i PCR (Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998). Svi ovi postupci afinitetnog sazrevanja opisani su od strane Vaughan et al. (Nature Biotechnologv, 16, 535-539, 1998). ;[0139] Druga antitela prema ovom pronalasku mogu se dobiti konvencionalnim postupcima imunizacije i ćelijske fuzije kao što je ovde opisano i poznato u struci. Monoklonalna antitela iz ovog pronalaska mogu da se generišu korišćenjem raznih poznatih tehnika. Uopšteno, monoklonalna antitela koja se vezuju za specifične antigene mogu da se dobiju postupcima poznatim stručnjacima (videti, na primer, Kohleret al., Nature 256: 495,1975; Coligan et al., (eds.), Current Protocols in lmmunology, 1: 2.5.12.6.7 (John Wiley & Sons 1991); U.S. patenti br. RE 32,011, 4.902.614, 4.543.439, i 4.411.993, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn, and Bechtol (eds.) (1980); and Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Picksley et al., "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli," in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), page 93 (Oxford University Press 1995)). Fragmenti antitela mogu biti izvedeni iz njih korišćenjem bilo koje pogodne standardne tehnike poput proteolitičke digestije, ili opciono, proteolitičkom digestijom (na primer, pomoću papaina ili pepsina) praćeno blagim smanjenjem disulfidnih veza i alkilacije. Alternativno, takvi fragmenti mogu se takođe generisati tehnikama rekombinantnog genetskog ;inženjeringa kao što je ovde opisano. ;[0140]Monoklonalna antitela mogu se dobiti tnjektiranjem životinje, na primer, pacova, hrčka, zeca ili poželjno miša, uključujući na primer transgene ili knock-out, kao što je poznato u struci, sa imunogenom koji obuhvata humani TSLP sa SEQ ID NO: 2, drugih TSLP polipeptidnih sekvenci kao što je ovde opisano, ili njegovog fragmenta, u skladu sa postupcima poznatim u struci ili kao što je ovde opisano. Prisustvo proizvodnje specifičnog antitela može se pratiti nakon inicijalnog injektovanja i/ili nakon dopunjenog injektovanja uzimanjem uzorka seruma i detektovanjem prisustva antitela koje se vezuje za humani TSLP ili njegov fragment korišćenjem bilo kog od nekoliko postupaka imunodetekcije poznatih u struci i ovde opisanih. Od životinja koje proizvode željena antitela, limfoidne ćelije, najčešće ćelije iz slezine ili limfnih čvorova, uklonjene su da bi se dobili B-limfociti. B limfociti su zatim fuzionisani sa lek-osetljivim ćelijskim partnerom mijeloma, poželjna onaj koji je singeneričan sa imunizovanom životinjom i koji opciono ima i druge poželjne osobine (npr. nemogućnost da eksprimira proizvode endogenog Ig gena, npr., P3X63 - Ag 8.653 ( ATCC Br. CRL 1580); NSO, SP20) za proizvodnju hibridoma, koji su besmrtne eukariotske ćelijske linije. ;[0141]The limfoidni (npr. iz slezine) ćelije i ćelije mijeloma mogu se kombinovati nekoliko minuta sa agensom promovisanja membranske fuzije, kao što je polietilen glikol ili nejonski deterdžent, a zatim naneti pri niskoj gustini na selektivni medijum koji podržava rast ćelija hibridoma ali ne nefuzionisanih ćelija mijeloma. Poželjan selekcioni medijum je HAT (hipoksantin, aminopterin, timidin). Posle dovoljnog vremena, obično oko jedne do dve nedelje, kolonije ćelija se posmatraju. Pojedinačne kolonije se izoluju, a antitela proizvedena pomoću ćelija mogu se testirati na aktivnost vezivanja za humani TSLP koristeći bilo koji od različitih imunotestova poznatih u struci i ovde opisanih. Hibridomi su klonirani (npr. ograničenim dilucionim kloniranjem ili mekom agar plak izolacijom), a pozitivni klonovi koji proizvode antitelo specifično za humani TSLP biraju se i kultivišu. Monoklonalna antitela iz kultura hibridoma mogu se izolovati iz supernatanta kultura hibridoma. ;[0142]Alternativni postupak za proizvodnju mišjeg monoklonalnog antitela sastoji se u ubrizgavanju ćelija hibridoma u peritonealnu šupljinu singeneričnog miša, na primer, miša koji je tretiran (npr. prajmerisani pristanom) radi promovisanja formiranja ascites tečnosti koja sadrži monoklonalno antitelo. Monoklonalna antitela mogu biti izolovana i prečišćena različitim dobro ustanovljenim tehnikama. Takve tehnike izolacije uključuju afinitetnu hromatografije sa Protein-A Sefarozom, ekskluzionu hromatografiju po veličini i jonoizmenjivačku hromatografiju (videti, na primer, Coligan na stranicama 2.7.1-2.7.12 i stranama 2.9.1-2.9.3; Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," u Methods in Molecular Biologv, Vol. 10, strana 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)). Monoklonalna antitela mogu biti prečišćena afinitetnom hromatografijom koristeći odgovarajuću ligand odabran na osnovu posebnih osobina antitela (npr. izotipa teškog ili lakog lanca, specifičnosti vezivanja, itd). Primeri pogodnog liganda, imobilisani na čvrstoj podlozi, uključuju Protein A, Protein G, antitelo nekonstantnog regiona (laki lanac ili teški lanac), anti-idiotipska antitela, i TSLP ili njihov fragment ili varijanta. ;[0143]Antitelo prema ovom pronalasku može takođe biti potpuno humano monoklonalno antitelo. Potpuno humana monoklonalna antitela mogu biti generisana bilo kojom od brojnih tehnika kao i one prethodno opisane. Takvi postupci dalje obuhvataju, ali nisu ograničeni na, Epstein Barr Virus (EBV) transformaciju humanih perifernih krvnih ćelija (npr. koje sadrže B limfocite), in vitro imunizacija humanih B-ćelija, fuziju ćelija slezine iz imunizovanih transgenih miševa koji nose umetnutne humane imunoglobulinske gene, izolaciju iz fag biblioteka humanog imunoglobulinskog V regiona, ili drugih postupaka koji su poznati u struci i na osnovu opisa ovde. Na primer, potpuno humana monoklonska antitela mogu se dobiti iz transgenih miševa koji su konstruisani da proizvedu specifična humana antitela kao odgovor na antigenski čelendž. Postupci za dobijanje potpuno humanih antitela iz transgenih miševa opisani su, na primer, u Green et al., Nature Genet. 7:13, 1994; Lonberg et al., Nature 368:856, 1994; Tavlor et al., Int. Immun. 6:579, 1994; U.S. Patent No. 5,877,397; Bruggemann et al., 1997 Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58; Jakobovits et al., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:525-35.U ovoj tehnici, elementi ljudskog lokusa teškog i lakog lanca uvode se u sojeve miševa izvedenih iz embrionalnih matičnih ćelijskih linija koje sadrže ciljane poremećaje endogenog lokusa teškog lanca i lakog lanca (videti takođe, Bruggemann et al. Curr. Opin. Biotechnol. 8: 455-58 (1997)). Na primer, humani imunoglobulinski transgeni mogu biti mini-gensKi konstrukti ili transloci na veštačkim hromozomima kvascaKoje se podvrgavaju B-ćelijskom specifičnom DNK rearanžmanu i Hipermutaciji u mišjem limfoidnom tkivu. Potpuno humana monoklonalna antitela mogu se dobiti imunizacijom transgenih miševa, koji zatim mogu proizvesti humana antitela specifična za humani TSLP.Limfoidne ćelije imunizovanih transgenih miševa mogu se koristiti za proizvodnju humanih antitelo-sekretujućeg hibridoma u skladu sa postupcima koji su ovde opisani. Poliklonalni serumi koji sadrži potpuno humana antitela takođe se mogu dobiti iz krvi imunizovanih životinja. ;[0144]Jedan primer postupka za generisanje humanih antitela prema ovom pronalasku uključuje imortalizaciju humanih perifernih krvnih ćelija EBV transformacijom, kao što je opisano, na primer, u U.S. Patent No. 4,464,456. Takav imortalizovana B-ćelijska linija (ili limfoblastoidna ćelijska linija) proizvodi monoklonalno antitelo koje se specifično vezuje za humani TSLP može se identifikovati postupcima imunodetekcije kao što je ovde, na primer, ELISA, a zatim izolovati standardnim tehnikama kloniranja. Stabilnost limfoblastoidne ćelijske linije koja proizvodi anti-TSLP-antitela može se poboljšati fuzijom transformisane ćelijske linije sa mišjim mijelomom kako bi se proizvela mišja-humana hibridna ćelijska linija prema postupcima koji su poznati u struci (videti, npr., Glaskv et al., Hybridoma 8: 377-89 ;(1989)). Još jedan postupak za generisanje humanih monoklonalnih antitela je in vitro imunizacija, koja uključuje prajmerisanje ljudskih B-ćelija slezine sa ljudskim TSLP zatim fuzijom isprajmiranih B-ćelija sa heterohibridnim fuzionim partnerom. Videti, npr., Boerner et al., 1991J. Immunol. 147: 86-95. ;[0145]U određenim ostvarenjima, B-ćelija koja proizvodi anti-humano TSLP antitelo je odabrano, a varijabilni regioni lakog lanca i teškog lanca klonirani su iz B-ćelija u skladu sa tehnikama molekularne biologije poznatim u struci (WO 92 ./02551; U.S. patent 5.627.052; Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7843-48 (1996)) i ovde opisani. B-ćelije iz imunizovane životinje mogu biti izolovane iz slezine, limfnog čvora ili uzorka periferne krvi biranjem ćelije koja proizvodi antitelo koje se specifično vezuje za TSLP. B-ćelije mogu takođe biti izolovane iz ljudi, na primer, iz uzorka periferne krvi. Postupci za detekciju pojedinačnih B-ćelija koje proizvode antitelo sa željenom specifičnošću, dobro su poznati u struci, na primer, plak formiranjem, sortiranjem fluorescencijom-aktiviranih ćelija, in vitro stimulacijom praćenom otkrivanjem specifičnog antitela, i slično. Postupci za odabir specifičnih B-ćelija koje proizvode antitela uključuju, na primer, pripremanje jednoćelijske suspenzije B-ćelija u mekom agaru koji sadrži humani TSLP. Vezivanje specifičnog antitela proizvedenog pomoću B-ćelija za antigen dovodi do formiranja kompleksa, koji može biti vidljiv kao imunotalog. Nakon što su izabrane B-ćelije koje proizvode željeno antitelo, specifični geni antitela mogu da se kloniraju izolovanjem i amplifikacijom DNK ili mRNK prema postupcima poznatim u struci i ovde opisanih. ;[0146]Dodatni postupak za dobijanje antitela prema ovom pronalasku je pomoću ispoljavanja na fagima. Videti, npr., VVinter et al., 1994 Annu. Rev. Immunol. 12: 433-55; Burton et al., 1994 Adv. Immunol. 57: 191-280. Humani ili mišji imunoglobulinski varijabilni regionske genske kombinatorne biblioteke mogu biti napravljena u vektorima faga koji se mogu prikazati radi odabira Ig fragmenata (Fab, Fv, sFv, ili njihovi multimeri) koji se specifično vezuju za TSLP ili njegovu varijantu ili fragment. Videti, na primer, U.S. Patent No. 5,223,409; Huse et al., 1989 Science 246:1275-81; Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5728-32 (1989); Alting-Mees et al., Strategies in Molecular Biology 3:1-9 (1990); Kang et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4363-66; Hoogenboom et al., 1992 J. Molec. Biol. 227:381-388; Schlebusch et al., 1997 Hybridoma 16:47-52 i ovde citirane reference. Na primer, biblioteka koja sadrži mnoštvo polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju fragmente Ig varijabilnog regiona može se umetnuti u genom filamentoznog bakteriofaga, kao što je M 13 ili njegova varijanta, u oviru sa sekvencom koja kodira protein omotača faga. Fuzioni protein može biti fuzioni za protein omotača sa varijabilnim regionskim domena lakog lanca i/ili sa varijabilnim regionskim domenom teškog lanca. Prema nekim ostvarenjima, imunoglobulinski Fab fragmenti mogu takođe biti prikazani na fag čestici (videti, na primer, U.S. Patent No. 5,698,426). ;[0147]Biblioteke imunoglobulinske cDNK ekspresije teškog i lakog lanca mogu takođe biti pripremljene u lambda fagu, na primer, korišćenjem MmmunoZap ™ (H) i XlmmunoZap ,M (L) vektora (Stratagene, La ;Jolla, California). Ukratko, mRNK je izolovana iz B-ćelijske populaciji, i koristiti se za stvaranje biblioteke imunoglobulinske cDNK ekspresije teškog i lakog lanca u AlmmunoZap (H) i MmmunoZap (L) vektorima. Ovi vektori se mogu pregledati pojedinačno ili ko-eksprimirati radi formiranja Fab fragmenta ili antitela (videti Huse et al., gore navedeno; videti takođe Sastri et al., gore navedeno). Pozitivni plakovi mogu naknadno biti konvertovani u ne-litički plazmid koji omogućava ekspresiju visokog nivoa fragmenata monoklonalnih antitela iz E. coli. ;[0148]U jednom ostvarenju, u hibridomu varijabilni regioni gena koji eksprimira monoklonalno antitelo od interesa se pojačavaju upotrebom nukleotidnih prajmera. Ovi prajmeri mogu biti sintetizovani od strane stručnjaka, ili se mogu nabaviti od komercijalno dostupnih izvora, (videti, npr., Stratagene (La Jolla, California), koji prodaje prajmere za mišje i humane varijabilne regione, uključujući, između ostalog, prajmere za Vh3, VHb, Vhc, Vh<j, Chi, Vli CLregione.) Ov<;>prajmeri mogu da se koriste da pojačaju varijabilne regione teškog ili lakog lanca, koji se zatim mogu umetnuti u vektore kao što su ImmunoZAP,<w>H ili ImmunoZAP<IM>L (Stratagene), respektivno. Ovi vektori se zatim mogu uvesti u ekspresione sisteme na bazi E. coli, kvasca ili sisara. Velike količine jednolančanog proteina koji sadrži fuziju VH i VLdomena mogu se proizvesti korišćenjem ovih postupaka (videti Bird et al., Science 242: 423-426., 1988). ;[0149] Kada se obezbede ćelije koje proizvode antitela prema ovom pronalasku bilo kojim gore opisanim imunizacionim i drugim tehnikama, specifični geni antitela mogu da se kloniraju izolovanjem i amplifikacijom DNK ili mRNK iz njih prema standardnim postupcima kao što je ovde opisano. Antitela proizvedena iz njih mnogu se sekvenđonirati, a indetifikovani CDR-ovi i DNK kodiranje za CDR može se manipulisati kao što je prethodno opisano za generisanje drugih antitela prema ovom pronalasku. ;[0150]Humana anti-TSLP-antitela prema ovom pronalasku poželjno moduliraju TSLP aktivnost u jednom od testova baziranih na ćelijama koji su ovde opisani i/ili in vivo testu ovde opisanom i/ili unakrsno blokiraju vezivanje jednog od antitela opisanih u ovoj prijavi i/ili su unakrsno-blokirana od vezivanja sa TSLP jednim od antitela opisanih u ovoj prijavi. Naročito korisni su antigen vezujući proteini koji unakrsno konkurišu sa primernim ovde opisanim antitelom, tj. unakrsno blokiraju vezivanje jednog od primernog antitela opisanog u ovoj prijavi i unakrsno su blokirana od vezivanja sa TSLP jednim od prajmera antitela. Shodno tome, takvi vezujući agensi mogu se identifikovati korišćenjem testova koji su ovde opisani. ;[0151]U nekim ostvarenjima, antitela se generišu prvo identifikacijom antitela koja se vezuju za TSLP i/ili neutralizuju u testovima na bazi ćelija ovde opisanih i/ili umakrsnim blokiranjem antitela opisanih u ovoj prijavi i/ili su unakrsno blokirana od vezivanja sa TSLP jednim od antitela opisanih u ovoj prijavi. CDR regioni iz ovih antitela zatim se koriste za ubacivanje u odgovarajuće biokompatibilne okvire za generisanje antigen vezujućih proteina. Ne-CDR deo vezujućeg agensa može biti sastavljen od amino kiselina, ili može biti ne-proteinski molekul. Ovde opisana ispitivanja omogućavaju karakterizaciju vezujućih agenasa. Poželjno, vezujući agensi prema ovom pronalasku su antitela kao Što je ovde definisano. ;[0152]Humana anti-TSLP-antitela prema ovom pronalasku uključuju one koji se vezuju za isti epitop kao primerno antitelo ovde opisano. Kako je navedeno u Primeru 9, epitopi mogu biti strukturalni ili funkcionalni. Strukturalni epitopi mogu se posmatrati kao flasteri mete koju pokrivaju antitela. Funkcionalni epitopi su podskupovi strukturalnih epitopa i obuhvataju one ostatke koji direktno doprinose afinitetu interakcije (npr. vodonične veze, jonske interakcije). Jedan postupak određivanja epitopa antitela je korišćenjem skenirajućih mutacija u ciljnom molekulu i merenjem efekta mutacije na vezivanje. S obzirom na trodimenzionalnu strukturu antitelo-vezujućeg regiona, mutacije u epitopu mogu smanjiti ili povećati afinitet vezivanja antitela za mutiranu metu. ;[0153]Antigen vezujući proteini mogu biti definisani njihovim epitopima. Kao što se vidi u Tabeli 6, iako se antitela mogu sva vezati za TSLP, ona su različito pogođena mutacijom određenih ostataka u TSLP što je indikacija aa se njihovi epitopi ne preklapaju u potpunosti. Poželjni antigen vezujući proteini uključuju one koji dele bar deo strukturalnog epitopa referentnog antitela ovde opisanog. ;[0154]Na primer, poželjni antigen vezujući protein je onaj koji deli bar deo istog strukturalnog epitopa kao A2. Ovo je dokazano povećanjem u afinitetu vezivanja u poređenju sa divljim tipom TSLP kada TSLP ima mutaciju K67E, K97E, K98E, R100E, K101E, ili K103E. Ovo se takođe može dokazati smanjenjem u afinitetu vezivanja u odnosu na divljim tip TSLP kada TSLP ima mutaciju K21E, T25R, S28R, S64R, ili K73E. lako se na antigen vezujući protein i A2 može uticati na sličan način nekim mutacijama i ne drugih, Što više identiteta postoji između antigen vezujućeg proteina i A2 na efekat mutacija u određenim ostacima TSLP, to više antigen vezujući protein i referentno antitelo dele strukturni epitop. ;[0155]Još jedan poželjan antigen vezujući protein je onaj koji deli bar deo istog struktruralnog epitopa kao A4. Ovo je dokazano povećanjem u vezujućem afinitetu u poređenju sa divljim tipom TSLP kada TSLP ima mutaciju K97E, K98E, R100E, K101E, ili K103E. Ovo takođe može da se dokaže smanjenjem u afinitetu vezivanja u odnosu na divlji tip TSLP kada TSLP ima mutaciju K10E, A14R, K21E, D22R, K73E, ;K75E, ili A76R. ;[0156]Još jedan poželjan antigen vezujući protein je onaj koji deli bar deo istog strukturalnog epitopa kao A5. Ovo je dokazano smanjenjem u afinitetu vezivanja u odnosu na divlji tip TSLP kada TSLP ima mutaciju K12E, D22R, S40R, R122E, N124E, R125E, ili K129E. ;[0157]Još jedan poželjan antigen vezujući protein je onaj koji deli bar deo istog strukturalnog epitopa kao A6. Ovo je dokazano smanjenjem u afinitetu vezivanja u odnosu na divlji tip TSLP kada TSLP ima mutaciju S40R, S42R, H46R, R122E, ili K129E. ;[0158] Još jedan poželjan antigen vezujući protein je onaj koji deli bar deo istog strukturalnog epitopa kao A7. Ovo je dokazano smanjenjem u afinitetu vezivanja u odnosu na divlji tip TSLP kada TSLP ima mutaciju K101E. Ovo takođe može da se dokaže smanjenjem u afinitetu vezivanja u odnosu na divlji tip TSLP kada TSLP ima mutaciju D2R, T4R, D7R, S42R, H46R, T49R, E50R, K112R, R122E, R125E, ili K129E. ;[0159]Još jedan poželjan antigen vezujući protein je onaj koji deli bar deo istog strukturalnog epitopa kao A10. Ovo je dokazano smanjenjem u afinitetu vezivanja u odnosu na divlji tip TSLP kada TSLP ima mutaciju K97E, K98E, R100E, K101E, ili K103E. Ovo takođe može da se dokaže smanjenjem u afinitetu vezivanja u odnosu na divlji tip TSLP kada TSLP ima mutaciju N5R, S17R, T18R, K21E, D22R, T25R, T33R, H46R, A63R, S64R, A66R, E68R, K73E, K75E , A76R, A92R, T93R, K94R, ili A95R. ;[0160]Još jedan poželjan antigen vezujući protein je onaj koji deli bar deo istog strukturalnog epitopa kao A21. Ovo je dokazano smanjenjem u afinitetu vezivanja u odnosu na divlji tip TSLP kada TSLP ima mutaciju K97E, K98E, R100E, K101E, ili K103E. Ovo takođe može da se dokaže smanjenjem u afinitetu vezivanja u odnosu na divlji tip TSLP kada TSLP ima mutaciju K21E, K21R, D22R, T25R, T33R, S64R, K73E, K75E, E111R ili S114R. ;[0161]Još jedan poželjan antigen vezujući protein je onaj koji deli bar deo istog strukturalnog epitopa kao A23. Ovo je dokazano smanjenjem u afinitetu vezivanja u odnosu na divlji tip TSLP kada TSLP ima mutaciju K67E, K97E, K98E, R100E, K101E, ili K103E. Ovo takođe može da se dokaže smanjenjem u afinitetu vezivanja u odnosu na divlji tip TSLP kada TSLP ima mutaciju E9R, K10E, K12E, A13R, S17R, S20R, K21E, K21R, K73E, K75E, N124E, ili R125E. ;[0162]Još jedan poželjan antigen vezujući protein je onaj koji deli bar deo istog strukturalnog epitopa kao A26. Ovo je dokazano smanjenjem u afinitetu vezivanja u odnosu na divlji tip TSLP kada TSLP ima mutaciju K97E, K98E, R100E, K101E, ili K103E. Ovo takođe može da se dokaže smanjenjem u afinitetu vezivanja u odnosu na divlji tip TSLP kada TSLP ima mutaciju A14R, K21E, D22R, A63R, S64R, K67E, K73E, A76R, A92R ili A95R. ;[0163]Upoređivanjem mutacija koje utiču na vezivanje između antitela, sugeriše se da određeni ostaci TSLP teže da budu deo sposobnosti antitela da se vežu za TSLP i blokiraju TSLP aktivnost. Takvi ostaci uključuju K21, D22, K73 i K129. Tako, poželjni antigen vezujući protein uključuju one koji imaju veći afinitet za divlji tip TSLP nego za TSLP koji obuhvata mutaciju K21E, one koje imaju veći afinitet za divlji tip TSLP nego za TSLP koji obuhvata mutaciju D21R, one koji imaju veći afinitet za divlji tip TSLP nego za TSLP koji obuhvta mutaciju K73E, i one koji imaju veći afinitet za divlji tip TSLP nego za TSLP koji obuhvata mutaciju K129E. ;[0164]Dalje, mnogi od primernih antigen vezujućih proteina ovde opisanih deli atribut da se afinitet za TSLP povećava kada se osnovni obrazac amino kiselina na položajima 97-103 menjaju na kiselim amino kiselinama. ;Nukleinske kiseline ;[0165]U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovane molekule nukleinske kiseline. Nukleinske kiseline obuhvataju, na primer, polinukleotide koji kodiraju ceo ili deo antigen vezujućeg proteina, na primer, jedan ili oba lanca antitela ovog pronalaska, ili njegovog fragmenta, derivata, muteina, ili varijante, polinukleotid! dovoljni za upotrebu kao hibridizacione probe, PCR prajmeri ili sekvencioni prajmeri za identifikaciju, analiziranje, mutira nje ili amplifikaciju polinukleotida koji kodira polipeptid, anti-senzitivne nukleinske kiseline za inhibiciju ekspresije polinukleotida, i komplementarne sekvence navedenog. Nukleinske kiseline mogu biti bilo koje dužine. One mogu biti, na primer, 5,10,15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75,100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 , 750,1.000, 1.500, 3.000, 5.000 ili više nukleotida u dužini, i/ili mogu da obuhvataju jednu ili više dodatnih sekvenci, na primer, regulatorne sekvence, i/ili da bude deo veće nukleinske kiseline, na primer, vektora. Nukleinske kiseline mogu biti jednolančane ili dvolančani i mogu obuhvatati RNK i/ili DNK nukleotide i njihove veštačke varijante (npr. peptidne nukleinske kiseline). ;[0166]Nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptide antitela (npr. teškog ili lakog lanca, sam varijabilni domen ili pune dužine) mogu da se izoluju iz B-ćelija miševa koji su imunizovani sa TSLP antigenom. Nukleinska kiselina može da se izoluje konvencionalnim postupcima poput lančane reakcije polimeraze ;(PCR). ;[0167]Sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju varijabilne regione varijabilnih regiona teškog i lakog lanca prikazane su iznad. Stručnjak će ceniti da, zbog degeneracije genetskog koda, svaka od ovde opisanih polipeptidnih sekvenci je kodirana velikim brojem drugih sekvenci nukleinske kiseline. Ovaj pronalazak obezbeđuje svaku degenerisanu nukleotidnu sekvencu koja kodira svaki antigen vezujući protein ovog pronalaska. ;[0168]Pronalazak dalje obezbeđuje nukleinske kiseline koje se hibridizuju sa drugim nukleinskim kiselinama (na primer, nukleinske kiseline koje obuhvataju nukleotidnu sekvencu bilo koju od A1-A27) pod određenim uslovima hibridizacije. Postupci za hibridizaciju nukleinskih kiselina dobro su poznati u struci. Videti, npr., Current Protocols in Molecular Biologv, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Kao što je ovde definisano, umereno strogi uslovi hibridizacije koriste rastvor za predpranje koji sadrži 5X natrijum hlorid/natrijum citrat (SSC), 0,5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8,0), hibridizacioni pufer od oko 50% formamida, 6X SSC i hibridizacionu temperaturu od 55°C (ili druge slične hibridizacione rastvore, poput onog koji sadrži oko 50% formamida, sa temperaturom hibridizacije od 42°C), a uslove pranja od 60°C, u 0.5X SSC, 0.1% SDS. Strogi hibridizacioni uslovi hibrioizuju u 6X SSC na 45°C, nakon Čega sledi jedno ili više ispiranja u 0.1X SSC, 0.2% SDS na 68°C. Dalje, prosečan stručnjak može upravljati hibridizacionim i/ili uslovima ispiranja kako bi povećao ili smanjio strogost hibridizacije tako da nukleinske kiseline koje obuhvataju nukleotidne sekvence koje su najmanje 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 iii 99% identične jedne sa drugima obično ostaju hibridizovane jedna sa drugom. Osnovni parametri koji utiču na izbor uslova hibridizacije i smernice za osmišljavanje odgovarajućih uslova navedeni su, na pnmer, u Sambrook, Fritsch, and Maniatis (1989, Molecular Cloning: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., chapters 9 and 11; and Current Protocols in Molecular Biologv, 1995, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 and 6.3-6.4), a stručnjaci ih mogu lako odrediti na osnovu, na primer, dužine i/ili baze kompozicije DNK. ;[0169]Promene se mogu uvesti mutacijom u nukleinsku kiselinu, što dovodi do promena u sekvenci amino kiseline polipeptida (npr., antigen vezujućem proteinu) koja ga kodira. Mutacije se mogu uvesti korišćenjem bilo koje tehnike poznate u struci. U jednom ostvarenju, jedno ili više posebnih aminokiselinskih ostataka menja se korišćenjem, na primer, usmerenog mutagenezionog protokola. U narednom ostvarenju, jedan ili više nasumično odabranih ostataka menja se korišćenjem, na primer, nasumičnog mutagenezionog protokola. Kako god je pripremljen, mutantni polipeptid može biti eksprimiran i ispitivan na željena svojstva. ;[0170]Mutacije se mogu uvesti u nukleinsku kiselinu bez značajnog menjanja biološke aktivnosti polipeptida koji kodira. Na primer, mogu se izvesti nukleotidne supstitucije koje dovode do supstitucija amino kiselina na ne-esencijalnim ostacima amino kiselina. Nukleotidna sekvenca ovde obezbeđena za A1-A27, ili njen željeni fragment, varijanta, ili derivat, mutirana je tako da kodira sekvencu amino kiseline koja obuhvata jedan ili više delecionih ili supstitucionih ostataka amino kiselina koji su ovde prikazani za A1-A27 da budu ostaci u kojima se dve ili više sekvenci razlikuju. Mutageneza ubacuje amino kiselinu susednu jedom ili više aminokiselinskih ostataka prikazanim ovde za A1-A27 da budu ostaci dve ili više sekvenci koje se razlikuju. Alternativno, jedna ili više mutacija mogu se uvesti u nukleinsku kiselinu koja selektivno menja biološku aktivnost (npr. vezivanje za TSLP) polipeptida kojeg kodira. Na primer, mutacija može kvantitativno ili kvalitativno promeniti biološku aktivnost. Primeri kvantitativnih promena uključuju povećanje, smanjenje ili eliminisanje aktivnosti. Primeri kvalitativnih promena uključuju promenu antigen specifičnosti antigen vezujućeg proteina. ;[0171]U sledećem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji su pogodni za upotrebu kao prajmeri ili hibridizacione probe za detekciju sekvenci nukleinske kiseline ovog pronalaska. Molekul nukleinske kiseline prema ovom pronalasku može da obuhvata samo deo sekvence nukleinske kiseline koja kodira polipeptid pune dužine prema ovom pronalasku, na primer, fragment koji se može koristiti kao proba ili prajmer ili fragment koji kodira aktivni deo (npr., a TSLP vezujući deo) polipeptida prema ovom pronalasku. ;[0172]Probe bazirane na sekvenci nukleinske kiseline prema ovom pronalasku mogu se koristiti za detekciju nukleinske kiseline ili sličnih nukleinskih kiselina, na primer, transkripte koji enkodiraju polipeptid prema ovom pronalasku. Proba može obuhvatati grupu za obeležavanje, npr. radioizotop, fluorescentno jedinjenje, enzim ili enzimski ko-faktor. Takve probe se mogu koristiti za identifikaciju ćelije koja eksprimira polipeptid. ;[0173]U sledećem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje vektore koji obuhvataju nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid prema ovom pronalasku ili njegov deo. Primeri vektora uključuju, ali nisu ograničeni na, plazmide, virusne vektore, ne-epizomalne sisarske vektore i ekspresione vektore, na primer, rekombinantni ekspresioni vektori. ;[0174]Rekombinantni ekspresioni vektori prema ovom pronalasku mogu obuhvatati nukleinsku kiselinu prema ovom pronalasku u obliku pogodnom za ekspresiju nukleinske kiseline u ćeliji domaćinu. Rekombinantni ekspresioni vektori uključuju jednu ili više regulatornih sekvenci, odabrane na osnovu ćelija domaćina koje se koriste za ekspresiju, koja je operativno povezana sa sekvencom nukleinske kiseline koja se izražava. Regulatorne sekvence uključuju one koje usmeravaju konstitutivnu ekspresiju nukleotidne sekvence u mnogim tipovima ćelija domaćina (npr., SV40 rani genski pojačivač, Rous sarkoma virusni promotor i citomegalovirus promotor), one koje usmeravaju ekspresiju nukleotidne sekvence samo u određenim ćelijama domaćinima (npr., tkivno-specifične regulatorne sekvence, pogledati Voss et al., 1986, Trends Biochem. Sci. 11: 28, Maniatis et al., 1987, Science 236: 1237), i one koje usmeravaju inducibilnu ekspresiju nukleotidne sekvence kao odgovor na odrteđeno tretiranje ili stanje (npr. metalotioninski promotor u ćelijama sisara i tet-odgovornog i/ili streptomicin-odgovornog promotora u prokariotskim i u eukariotskim sistemima (videti id.). Stručnjacima će biti jasno da dizajn ekspresionog vektora može zavisiti od faktora kao što je izbor ćelije domaćina koja se transformiše, nivoa ekspresije željenog proteina, itd. Ekspresioni vektori ovog pronalaska mogu se uvesti u ćeliju domaćina kako bi na taj način proizvodili proteine ili peptide, uključujući fuzione proteine ili peptide, kodirani od strane nukleinskih kiselina kao što je ovde opisano. ;[0175]U sledećem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje ćelije domaćina u koju je uveden rekombinantni ekspresioni vektor prema ovom pronalasku. Ćelija domaćin može biti bilo prokariotska ćelija (na primer, E. coli) ili eukariotska ćelija (na primer, ćelije kvasca, insekata ili sisara (npr., CHO ćelije)). Vektor DNK se može uvesti u prokariotske ili eukariotske ćelije konvencionalnim transformacionim ili transfekcionim tehnikama. Za stabilnu transfekciju ćelija sisara, poznato je da, u zavisnosti od ekspresionog vektora i transfekcione tehnike koji se koriste, samo mala frakcija ćelija može da integriše stranu DNK u njihov genom. U cilju identifikacije i odabira ovih integranata, gen koji kodira selektivni marker (npr. za otpornost na antibiotike) obično se uvodi u ćeliju domaćina zajedno sa genom od interesa. Poželjni selektivni markeri uključuju one koji daju rezistenciju na lekove, kao što su G418, higromicin i metotreksat. Ćeiije stabiino transfektovane sa uvedenom nukleinskom kiselinom mogu biti identifikovani izborom leka (npr. ćelije koje su imaju inkorporirani selektivni marker gen će opstati, dok druge ćelije umiru), među ostalim postupcima. ;Indikacije ;[0176]TSLP je uključen u promovisanju raznih inflamatornih poremećaja, posebno alergijskih inflamatornih poremećaja. Kako je ovde korišćen izraz "alergijska inflamacija" odnosi se na manifestacije imunoglobulin E (IgE)-povezane imunološke odgovore. (Manual of Allergv and Immunotogv. Chapter 2, Alvin M. Sanico, Bruce S. Bochner, a Sarbjit S. Saini, Adelman, et al, ed., Lippincott, VVilliams, VVilkins, Philadelphia, PA, (2002)). Alergijska inflamacija kako se ovde koristi generalno se karakteriše infiltracijom u zahvaćenom tkivo tipa 2 pomoćnih T ćelija (TK2 ćelija) (Kay, gore navedeno). Alergijska inflamacija uključuje plućne inflamacione bolesti kao što su alergijski rinosinuzitis, astma, alergijski konjuktivitis, pored kožnih inflamatornih stanja kao što su atopični dermatis ( Manual of Allergv and Immunologv, gore navedeno). Kako je ovde korišćen izraz "TSLP-povezana alergijska inflamacija" odnosi se na stanja alergijske inflamacije u kojima se TSLP prereguliše, ili je pokazano da je drugačije uključen. ;[0177]Alergijska astma je hronični inflamatorni poremećaj disajnih puteva koji je okarakterisan eozinofilijom disajnih puteva, visokim nivoom serumske IgE i aktivacije mastocita, koji doprinose hiperosjetljivosti disajnih puteva, epitelnom oštećenju i hipersekreciji sluzi (Wills-Karp, M, Ann. Rev. Immunol., 17: 255-281 (1999), Manual of Allergv and Immunologv, gore navedeno). Ispitivanja su pokazala da su u disajnim putevima svih astmatičara prisutni različiti stepeni hronične inflamacije, čak i tokom perioda bez simptoma. Kod podložnih osoba, ovo upala uzrokuje ponovljene epizode Šištanje, nemanja daha, teskobe u grudnom košu i kašlja. ( Manual of Allergv and Immunologv, gore navedeno). ;[0178]Atopijski dermatitisje hronično pruritičko oboljenje zapaljenja kože koji je okarakterisan kožnim lezijama, praćeno povišenim ukupnim IgE u serumu, eozinofilijom, povećanim oslobađanjem histamina iz bazofila i mast ćelija. Osobe koje pate od atopijskog dermatitisa pokazuju preterane TH2 odgovore i smatra se da je pokretanje atopijskog dermatitisa posredovano putem rane kožne infiltracije TH2 limfocita koji ispuštaju visoke nivoe IL-4, IL-5 i IL-13 (Leung, J. Allergy Clin. Immunol 105: 860-76 (2000)). Odnos između TSLP i drugih inflamatornih citok'.na opisan je u U.S. prijavi 11/205,904, objava 2006/0039910. ;[0179]Ekspresija humanog TSLP kao što je detektovano in situ hibridizacijom, prijavljena je da je povišena u disajnim putevima asmatičara u korelaciji sa težinom bolesti (Ying et al., J. lmmunology 174: 8183-8190 (2005)). Analiza nivoa TSLP mRNK plićnim uzorcima asmatičara pokazuju povećanu ekspresiju TSLP u poređenju sa kontrolama. Pored toga, TSLP proteinski nivoi mogu se detektovati u koncentrovanoj bronhoalveolarnoj (BAL) tečnosti astmatilčara, pacijenata sa transplantiranim plućima i pacijenata sa cističnom fibrozom. Nedavno je otkriveno da se TSLP oslobađa kao odgovor na mikrobe i traumu, kao i inflamaciju, i da aktivira mastocite (Allakhverdi et al., J. Exp. Med 20492: 253-258 (2007). ;[0180]Pokazano je da humani TSLP protein korelira sa bolešću u bronhijalnoj mukozi i BAL-tečnosti subjekata sa umerenom/teškom astmom i HOBP. (Ying et al., J Immunol 181 (4): 2790-8 (2008). ;[0181]Prekomerna ekspresija TSLP u plućima transgenih miševa dovodi do upale disajnih puteva nalik astmi (Zhou et al., Nat Immunol. 10:1047-1053 (2005). Pored toga, objavljeno je da su TSLPR-deficitarni miševi uspeli da razviju astmu u OVA-astma modelima, pokazujući da je TSLP potreban za razvoj astme u modelima inflamatornih disajnih puteva (Zhou et al., gore navedeno, Carpino etal. Mol Cell Biol 24: 2584-2592 (2004). ;[0182]Pored astme, povećani nivoi TSLP proteina i mRNK nađeni su kod u kožnim lezijama atopičnog dermatitisa (AD) pacijenata i upaljenim tonzilamim epitelnim ćelijama (Soumelis et al., Nature Immunol: 3 (7): 673- 680 (2002). Prekomerna ekspresija TSLP u koži transgenih miševa dovodi do fenotipa nalik AD (Yoo et al., J Exp Med 202: 541-549 (2005)). ;[0183] Prema tome, TSLP antagonisti, specifično TSLP-antigen vezujući proteini i antitela instant aplikacije, korisni su kao terapeutski tretman za alergijske inflamacije, određenije, astmu i atopijski dermatitis. ;[0184]Pored toga, TSLP antagonisti, naročito TSLP-antigen vezujući proteini i antitela prema ovom opisu, takođe su korisni za lečenje fibroznih poremećaja. Pokzano je da je TSLP uključen u promovisanju fibroznih poremećaja, kao što je opisano u objavi ser.br. 11/344,379. Utvrđeno je da TSLP indukuje akumulaciju fibroblasta i deponovanje kolagena kod životinja. Injektovanje mišjeg TSLP, na primer, intradermalno u miševe rezultiralo je u fibrozu u subkutisu miševa, okarakterisana proliferacijom fibroblasta i deponovanjem kolagena. Antagonizujuća TSLP aktivnost rezultiraće u sprečavanju ili smanjenju proliferacije fibroblasta i deponovanja kolagena u tkivu. ;[0185] Kao što se ovde koristi, izraz "fibroproliferativna bolest" ili "fibrozna bolest ili poremećaj" odnosi se na stanja koja uključuju fibrozu u jednom ili više tkiva. Kako je ovde korišćen izraz "fibroza" odnosi se na formiranje fibroznog tkiva kao reparativni ili reaktivni proces, pre nego kao normalan sastojak nekog organa ili tkiva. Fibroza se karakteriše akumulacijom fibroblasta i deponovanjem kolagena u višku normalnog deponovanja u svakom konkretnom tkivu. Kako se ovOekoristi izraz "fibroza" koristi se kao sinonim sa "akumulacija fibroblasta i deponovanje kolagena". F<;>broblasti su ćelije vezivnog tkiva, koje su dispergovane u vezivnom tkivu u ćelom telu. Fibroblasti izlučuju nonrigidnu ekstracelularnu matricu koja sadrži tip I i/ili tip III kolagena. Kao odgovor na povredu tkiva, obližnji fibroblasti migriraju u ranu, razmnožavaju se, i proizvode velike količine kolagena ekstracelularnog matriksa. Kolagen je vlaknasti protein bogat sa glicinom i prolinom koji glavni sastojak ekstracelularne matrice i vezivnog tkiva, hrskavice i kostiju. Kolagen molekuli su tročlano spiralne strukture nazvane a-lanci, koji su namotanio jedan oko drugog u spiralu nalik kanapu. Kolagen postoji u nekoliko oblika ili tipova; od njih, tip l,je najčešći, i nalazi se u koži, tetivama i kostima; i tip III koji se nalazi se u koži, krvnim sudovima i unutrašnjim organima. ;[0186] Fibrozni poremećaji uključuju, ali nisu ograničeni na, sistemsku i lokalnu sklerodermu, keloide i hipertroficne ožiljke, ateroskleroze, restenoze, pulmonarne inflamacije i fibroze, idiopatske pulmonarne fibroze, ciroze jetre, fibrozu kao rezultat hroničnog hepatitisa B ili C infekcije , bolest bubrega, bolest srca koja rezultira iz tkivnog ožiljka, i bolesti očiju poput makularne degeneracije, i retinaine i vitrealne retinopatije. Dodatne fibrozne bolesti uključuju fibrozu koja proizilazi iz hemoterapeutskih lekova, fibroza idukovana zračenjem, i povredama i opekotinama. ;[0187]Skleroderma je fibroznog poremećaja okarakterisan zadebljanjem i induracijom kože izazvani hiperprodukcijom novog kolagena od strane fibroblasta u koži i drugim organima. Skleroderma se može javiti kao lokalno ili sistemsko oboljenje. Sistemska skleroderma može uticati na niz organa. Sistemska skleroza je okarakterisana formiranjem hiajalinizovanog i zgusnutog fibroznog tkiva kolagena, uz zadebljanje kože i adheziju tkiva ispod nje, posebno ruku i lica. Bolest može takođe biti okarakterisana disfagijom zbog gubitka peristaltične i submukozne fibroze ezofagusa, dispneje zbog plućne fibroze, miokardijalne fibroze i renalnih vaskularnih promena. (Stedman's Medical Dictionarv 26th Edition VVilliams and VVilkins, 1995)). Plućna fibroza pogađa 30 do 70% pacijenata sa sklerodermom, često ;rezultirajući u restriktivnom oboljenju pluća (Atamaset al., Cvtokine and Grown Factor Rev 14: 537-550 ;(2003)). Idiopatska plućna fibroza je hroničan, progresivan i obično smrtonosan plućni poremećaj, koji se smatra kao posledica hroničnog zapaljenskog procesa (Ketly et al., Curr Pharma Destgn 9: 39-49 (2003)). ;[0188]Prema tome, TSLP antagonisti, određenije TSLP-antigen vezujući proteini i antitela instant aplikacije, korisni su kao terapeutskoi tretman za fibrozne bolesti, uključujući ali ne ograničavajući se na sklerodermu, intersticijalne bolesti pluća, idiopatsku plućnu fibrozu, fibrozu koja nastaje od hroničnog hepatitisa B ili C, fibrozu indukovanu zračenjem i fibrozu koja nastaje prilikom zarastanja rana. ;[0189]lako su go^e naveden indikacije poželjne, druga bolest, poremećaj ili stanje može biti podložno tretmanu sa ili se mogu preventirati davanjem antigen vezivanja subjektu. Takve bolesti, poremećaji i stanja uključuju, ali nisu ograničeni na, inflamaciju, autoimune bolesti, zapaljenje hrskavice, fibroznu bolest i/ili degradaciju kostiju, artritis, reumatoidni artritis, juvenilni artritis, juvenilni reumatoidni artritis, pauciartikularni juvenilni reumatoidni artritis, poliartikularni ma juvenilni reumatoidni artritis, sistemski početni juvenilni reumatoidni artritis, juvenilni ankilozni spondilitis, juvenilni enteropatski artritis, juvenilni reaktivni artritis, juvenilni Reter-ov sindrom, SEA sindrom (Sindrom Seronegativnosti, Entezopatije, Artropatije), juvenilni dermatomiozitis, juvenilni psorijazni artritis, juvenilna skleroderma, juvenilni sistemski eritemski lupus, juvenilni vaskulitis, pauciartikularni reumatoidni artritis, poliartikularni reumatoidni artritis, sistemski početni reumatoidni artritis, ankilozni spondilitis, enteropatski artritis, reaktivni artritis, Reter-ov sindrom, SEA sindrom (Sindrom Seronegativnosti, Entezopatije, Artropatije), dermatomiozitis, psorijatični artritis, skleroderma, sistemski lupus eritematozus, vaskulitis, miolitis, polimiolitis, dermatomiolitis, osteoartritis, poliarteritis nodoza, Vegenerova granulomatoza, arteritis, ploimijalgija reumatika, sarkoidoza, skleroderma, skleroze, primarna bilijarna skleroza, sklerozirajući holangitis, Sjogren-ov sindrom, psorijazua, plak psorijaza, gutatna psorijaza, inverzna psorijazu, pustular psorijaza, eritrodermična psorijaza, dermatitis, atopijski dermatitis, ateroskleroza, lupus, Still-ova bolest, sistemski lupus eritematozus (SLE), miastenia gravis, inflamatorno oboljenje creva (IBD), Kronova bolest, ulcerativni kolitis, celijakija, multipla skleroza (MS), astma, HOBP, Guillain-Barre-ova bolest, dijabetes melitus tip I, Graves-ova bolest, Addison-ova bolest, Rainaud-ov fenomen, autoimuni hepatitis, GVHD, i slično. U specifičnim ostvarenjima, farmaceutske kompozicije koje obuhvataju terapeutski efikasnu količinu TSP-antigen vezujućeg proteina su obezbeđene. ;[0190] Izraz "tretman" obuhvata ublažavanje ili prevenciju najmanje jednog simptoma ili drugog aspekta poremećaja ili smanjenje težine bolesti, i slično. Antigen vezujući protein ne mora da izvrši potpuno lečenje ili iskoreni svaki simptom ili manifestaciju bolesti, da bi predstavljao održivo terapeutsko sredstvo. Kao što je poznato u odgovarajućem polju, lekovi zaposleni kao terapeutski agensi mogu smanjiti ozbiljnost datog stanja bolesti, ali nije neophodno da ukinu svaku manifestaciju bolesti da bi se smatrali kao korisni terapeutski agensi. Slično, profilaktički primenivan tretman ne mora biti potpuno efikasan u prevenciji početka stanja, kako bi se smatrali održivim profilaktičkim agensima. Jednostavno smanjenje uticaja bolesti (na primer, smanjenjem broja ili ozbiljnost njenih simptoma, ili povećanje efikasnosti drugog tretmana, ili proizvodnja drugog blagotvornog dejstva) ili smanjenje verovatnoće da će se bolest javiti ili pogoršati kod subjekta, je dovoljna. Jedno ostvarenje ovog pronalaska odnosi se na postupak koji obuhvata davanje pacijentu antigen vezujućeg proteina u količini i tokom vremena dovoljnog da indukuje održivo poboljšanje u odnosu na bazalni nivo indikatora koji odražava ozbiljnost određenog poremećaja. ;Farmaceutske kompozicije ;[0191] U nekim ostvarenjima, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koji obuhvataju terapeutski efikasnu količinu jednog ili više antigen vezujućih proteina prema ovom pronalasku zajedno sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačem, nosačem, sredstvom za poboljšanje rastvaranja, emulgatorom, konzervansom i/ili adjuvansom. Pored toga, ovaj pronalazak obezbeđuje postupke za tretiranje pacijenta davanjem takve farmaceutske kompozicije. Izraz "pacijent" obuhvata humane i životinjske subjekte, ;[0192] Farmaceutske kompozicije koje obuhvataju jedan ili više antigen vezujućih proteina mogu se koristiti za smanjenje TSLP-aktivnosti. Farmaceutske kompozicije koje obuhvataju jedan ili više antigen vezujućih proteina mogu se koristiti u tretiranju posledica, simptoma i/ili patologija povezanih sa TSLP-aktivnošću. Farmaceutske kompozicije koje obuhvataju jedan ili više antigen vezujućih proteina mogu se koristiti u postupcima inhibicije vezivanja i/ili signalizacije TSLP za TSLPR koji obuhvataju obezbeđivanje ;antigen vezujućeg proteina prema ovom pronalasku u TSLP. ;[0193]U nekim ostvarenjima, prihvatljivi materijali za formulacije su poželjno netoksični za recipijente u uposlenim dozama i koncentracijama. U izvesnim ostvarenjima, farmaceutska kompozicija može da sadrži formulacione materijale za modifikovanje, održavanje ili očuvanje, na primer, pH, osmolaiiteta, viskoznosti, bistrine, boje, izotoniČnosti, mirisa, sterilnosti, stabilnosti, brzine rastvaranja ili oslobađanja, adsorpcije ili penetracije kompozicije. U takvim ostvarenjima, odgovarajući formulacioni materijali uključuju, ali nisu ograničeni na, amino kiseline (kao što su glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin); antimikrobna sredstva; antioksidante (kao što su askorbinska kiselina, natrijum sulfit ili natrijum hidrogen sulfit); pufere (kao što borat, bikarbonat, Tris-HCI, cifrati, fosfati ili druge organske kiseline); punioce (kao što su manitol ili glicin); helirajuća sredstva (kao što su etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA)); kompleksne agense (kao što su kafein, polivinilpirolidon, beta-ciklodekstrin ili hidroksipropil-beta-ciklodekstrin); punioce; monosaharide; disaharide; i druge ugljene hidrate (kao što su glukoza, saharoza, manoza ili dekstrini); proteine (kao što su serumski albumin, želatin ili imunoglobulini); agense za bojenje, arome i za razblaživanje; agense za err ulgovanje; hidrofilne polimere (kao što je polivinilpirolidon); polipeptide male molekulske težine; kontra-formirajuće soli (kao što je natrijum); konzervanse (kao što je benzalkonijum hlorid, benzojeva kiselina, salicilna kiselina, timerosal, fenetil alkohol, metilparaben, propilparaben, hlorheksidin, sorbinska kiselina ilivodonik peroksid); rastvarače (kao što su glicerin, propilen glikol ili polietilen glikol); šećerne alkohole (kao što su manitol ili sorbitol); agense za suspendovanje; surfaktante ili agense za vlaženje (kao što su pluronici, PEG, sorbitan estri, polisorbati kao što su polisorbat 20, polisorbat, triton, trometamin, lecitin, holesterol, tiloksapal); agense za pospešivanje stabilnosti (kao što su saharoza ili sorbitol); agense za povećanje toniciteta (kao što su halidi alkalnih metala, poželjno natrijum ili kalijum hlorid, manitol, sorbitol); dostavna vozila; razblaživače; eksđpijente i/ili farmaceutske adjuvanse. Videti, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18 " Edition, (A.R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Companv. ;[0194]U određenim ostvarenjima, optimalnu farmaceutsku kompoziciju određuje stručnjak u zavisnosti od, na primer, nameravanog načina primene, formata dostave i željene doze. Videti, na primer, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, gore navedeno. U nekim ostvarenjima, takve kompozicije mogu da utiču na fizičko stanje, stabilnost, brzinu oslobađanja in vivo i stope klirensa in vivo antigen vezujućih proteina prema ovom pronalaskua. U određenim ostvarenjima, primarno vozilo ili nosač u farmaceutskoj kompoziciji može biti po prirodi vodeni ili ne-vodeni. Na primer, pogodno vozilo ili nosač mogu biti voda za injekcije, fiziološki slani rastvor ili veštački likvor, eventualno dopunjen sa drugim materijalima uobičajenim u kompozicijama za parenteralnu primenu. Neutralni puferovani slani rastvor ili slani rastvor pomešan sa serumskim albuminom su dalji primeri vozila. U specifičnim ostvarenjima, farmaceutske kompozicije obuhvataju Tris pufer od oko pH 7.0 8.5, ili acetatni pufer od oko pH 4.0-5.5, i dalje mogu da sadrže sorbitol ili njegovu pogodnu zamenu. U nekim ostvarenjima ovog pronalaska, kompozicije TSLP-antigen vezujućeg proteina mogu biti pripremljene za skladištenje mešanjem izabrane kompozicije koja ima željeni stepen čistoće sa opcionim agensima za formulaciju (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, gore navedeno) u obliku liofilizovanog kolača ili vodenog rastvora. Dalje, u određenim ostvarenjima, Proizvod TSLP-antigen vezujućeg proteina može biti formulisan kao liofilizat korišćenjem pogodnih ekscipijenata kao što je saharoza. ;[0195]Farmaceutske kompozicije prema ovom pronalasku mogu biti izabrane za parenteralnu isporuku. Alternativno, kompozicije mogu biti izabrani za inhalaciju ili za isporuku kroz digestivni trakt, kao što je oralno. Komponente formulacije su prisutne u koncentracijama koje su poželjno prihvatljive za mesto primene. U određenim ostvarenjima, puferi se koriste da održe kompoziciju na fiziološkom pH ili na nešto nižem pH, obično u opsegu pH od oko 5 do oko 8. uključujući oko 5.1, oko 5.2, oko 5.3, oko 5.4, oko 5.5, oko 5.6, oko 5.7, oko 5.8, oko 5.9, oko 6.0, oko 6.1, oko 6.2, oko 6.3, oko 6.4, oko 6.5, oko 6.6, oko 6.7, oko 6.8, oko 6.9, oko 7.0, oko 7.1, oko 7.2 , oko 7.3, oko 7.4, oko 7.5, oko 7.6, oko 7.7, oko 7.8, oko 7.9 i oko 8.0. ;[0196]Kada se razmatra parenteralna primena, terapeutske kompozicije za upotrebu u ovom pronalasku mogu biti obezbeđene u obliku bez pirogena, parenteralno prihvatljivog vodenog rastvora koji obuhvata željeni TSLP-antigen vezujući protein u farmaceutski prihvatljivom vozilu. Posebno pogodno vozilo za parenteralnu injekciju je sterilna destilovana voda u kojoj se TSLP-antigen vezujući protein formuliše kao sterilni, izotonični rastvor, pravilno očuvan, U određenim ostvarenjima, preparat može da obuhvati formulaciju željenog molekula sa agensima kao što su injektabilne mikrosfere, bio-erodibilne čestice, polimerna jedinjenja (kao što su poliaktinska kiselina ili poliglikolna kiselina), perlice ili lipozomi, koji mogu da obezbede kontrolisano ili odloženo oslobađanje proizvoda koji se dobija putem deponovane injekcije. U nekim ostvarenjima, hijaluronska kiselina se takođe može upotrebiti, koja ima efekat promovisanja produženo trajanje u cirkulaciji. U nekim ostvarenjima, implantabilni uređaji za dopremanje leka mogu da se koriste za uvođenje željenog antigen vezujućeg proteina. ;[0197]Farmaceutske kompozicije prema ovom pronalasku mogu biti formulisane za inhalaciju. U ovim ostvarenjima, TSLP-antigen vezujući proteini su poželjno formulisani u obliku suvog, inhalacionog praha. U specifičnim ostvarenjima, TSLP-antigen vezujući proteinski inhalacioni rastvori mogu takođe da se formulišu sa propelantom za dopremanje u obliku aerosola. U nekim ostvarenjima, rastvori mogu biti nebulizovani. Administracija preko pluća i formulacioni postupci stoga su dalje opisani u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCTUS94/001875, koja opisuje plućno dopremanje hemijski modifikovanih proteina. ;[0198]Takođe je razmatrano da se formulacije mogu davati oralno. TSLP-antigen vezujući proteini koji se primenjuju na ovaj način mogu biti formulisani sa ili bez nosača koji se uobičajeno koriste u kompaundiranju čvrstih doznih oblika kao što su tablete i kapsule. U nekim ostvarenjima, kapsula može biti izrađena da oslobodi aktivni deo formulacije na mestu u gastrointestinalnom traktu kada je bioraspoloživost maksimalna, a pred-sistemska degradacija najmanja. Dodatni agensi mogu biti uključeni kako bi se olakšala apsorpcija TSLP-antigen vezujućeg proteina. Razblaživači, arome, voskovi niske tačke topljenja, biljna ulja, lubrikanti, agensi za suspendovanje, agensi za dezintegraciju tableta i veziva se takođe mogu koristiti. ;[0199]Farmaceutska kompozicija prema ovom pronalasku je poželjno obezbeđena da obuhvata efikasnu količinu jednog ili više TSLP-antigen vezujućih proteina u smeši sa ne-toksičnim ekscipijentima koji su pogodni za proizvodnju tableta. Rastvaranjem tableta u sterilnoj vodi, ili drugom odgovarajućem vozilu, rastvori mogu biti pripremljeni u obliku jedinične doze. ;[0200]Pogodni ekscipijenti uključuju, ali nisu ograničeni na, inertne razblaŽivaČe, kao što su kalcijum karbonat, natrijum karbonat ili bikarbonat, laktoza ili kalcijum fosfat; ili vezujuće agense, kao što su škrob, želatin ili akacija; ili lubrikante kao što su magnezijum stearat, stearinska kiselina ili talk. ;[0201]Dodatni farmaceutske kompozicije biće očigledne stručnjacima iz ove oblasti, uključujući formulacije koje uključuju TSLP-antigen vezujući proteine u formulacijama sa odloženom ili kontrolisanom isporukom. Tehnike za formulisanje različitih drugih sredstava za odloženo ili kontrolisano oslobađanje, kao što su lipozomski nosači, bio-erodibilne mikročestice ili porozne perlice i depo injekcije, takođe su poznate stručnjacima iz ove oblasti. Videti, na primer, Međunarodnu patentnu prijavu br. PCT/US93/00829, koja opisuje kontrolisano oslobađanje poroznih polimernih mikročestica za dopremanje farmaceutskih kompozicija. ;[0202]Preparati sa odloženim oslobađanjem mogu uključuju polupropustljive poiimerne matrice u obliku oblikovanih proizvoda, npr., filmova ili mikrokapsula. Matrice sa odloženim oslobađanjem mogu uključivati poliestre, hidrogelove, poliaktide (kao što je opisano u US patentu 3,773,919 i Evropskoj patentnoj prijavi br EP 058481), kopolimere L-glutaminske kiseline i gama etil-L-glutamata (Sidman et al., 1983, Biopolvmers 2: 547-556), poli(2-hidroksietil-inetakrilat) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 i Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105 ), etilen vinil acetat (Langer et al., 1981, gore navedeno) ili poli-D(-)-3-hidroksibuterna kiselina (Evropska patentna prijava objava br EP 133,988). ;[0203]Kompozicije sa odloženim oslobađanjem mogu takođe da uključuju lipozome koji se mogu pripremiti bilo kojim od nekoliko poznatih postupaka u struci. Videti, npr., Eppstein et al., 1985, Proc. Natl Acad. ScL U.S.A. 82.3688-3692; Evropska patentna prijava Objava br EP 036,676.; EP 088.046 i EP 143,949. ;[0204]Farmaceutske kompozicije koje se koriste za in vivo davanje tipično se daju kao sterilni preparati. Sterilizacija se može postići filtracijom kroz sterilne filtracione membrane. Kada je kompozicija liofilizovana, sterilizacija koja koristi ovaj postupak može da se sprovede ili pre ili nakon liofilizacije i rekonstitucije. Kompozicije za parenteralnu primenu mogu se Čuvati u liofilizovanom obliku ili u rastvoru. Parenteralne kompozicije se generalno postavljaju u kontejner koji poseduje sterilni pristupni deo, na primer, kesica za intravenski rastvor ili bočica koja ima poklopac koji se može probušiti iglom za potkožne injekcije. ;[0205]Aspekti ovog pronalaska uključuju samo-puferujuće TSLP-antigen vezujuće proteinske formulacije, koje se mogu koristiti kao farmaceutske kompozicij, kao što je opisano u međunarodnoj patentnoj prijavi WO 0613818 1A2 (PCT/US2006/022599). Jedno ostvarenje obezbeđuje samo-puferujuće TSLP-antigen vezujuće proteinske formulacije koje obuhvataju TSLP-antigen vezujući protein čija je ukupna koncentracija soli manja od 150 mM. ;[0206]Terapeutski efikasna količina farmaceutske kompozicije koja sadrži TSLP-antigen vezujući protein koja će se koristi zavisi od, na primer, terapijskog konteksta i ciljeva. Stručnjaku je jasno da će odgovarajući nivoi doza za tretiranje varirati zavisno od, delimično, molekulu koji se dostavlja, indikacije za koju se koristi TSLP-antigen vezujući protein, načina primene i veličine (telesne mase , površine tela ili veličine organa) i/ili stanja (starosti i opšteg zdravlja) pacijenta. ;[0207]U određenim aspektima, lekar može da podešava dozu i modifikuje put primene za dobijanje optimalnog terapeutskog efekta. Tipična doza može biti u opsegu od oko 0.1 p.g/kg do oko 30 mg/kg ili više, zavisno od gore pomenutih faktora. U specifičnim ostvarenjima, doza se može kretati od 0,1 p.g /kg do oko 30 mg/kg, opciono od 1 u.g /kg do oko 30 mg/kg ili od 10Mg /kg do oko 5 mg/kg. ;[0208]Učestalost doziranja zavisiće od farmakokinetičkih parametara određenog TSLP-antigen vezujućeg proteina u formulaciji koja se koristi. Tipično, lekar primenjuje kompoziciju sve dok se ne dostigne doza koja postiže željeno dejstvo. Kompozicija se stoga može davati kao pojedinačna doza, ili kao dve ili više doza (koje mogu ili ne moraju da sadrže istu količinu željenog molekula) tokom vremena, ili kao kontinuirana infuzija preko implantiranog uređaja ili katetera. Dalja podešavanja odgovarajuće ;doze rutinski se izvodi od strane stručnjaka i u okviru zadataka koje rutinski obavljaju. ;[0209]Odgovarajuće doze mogu se utvrditi upotrebom odgovarajućih podataka doza-odgovor. U nekim ostvarenjima, antigen vezujući protein prema ovom pronalasku može se davati pacijentu tokom dužeg vremenskog perioda. Hronično davanje jednog antigen vezujućeg proteina prema ovom pronalasku minimizuje negativan imuni ili alergijski odgovor uobičajeno povezan sa antigen vezujućim proteinima koji nisu potpuno humani, na primer antitelo stvoreno protiv humanog antigena u ne-humanoj životinji, na primer, ne -kompletno humano antitelo ili ne-humano antitelo proizvedeno u ne-humanoj vrsti. ;[0210]Putanja davanja farmaceutske kompozicije je u skladu sa poznatim postupcima, npr, oralno, injekcijom intravenskim, intraperitonealnim, intracerebralnim (intra-parenhimnim), intracerebroventrikularnim, intramuskularnim, intra-ocularnim, intraarterijskim, imtraportalnim ili intralezionalnim putem; sistemima za odloženo oslobađanje ili implantacionim uređajima. U nekim ostvarenjima, kompozicije se mogu davati bolus injekcijom ili kontinuiranom infuzijom ili implantacionim uređajem. ;[0211]Kompozicija se može takođe davati lokalno preko implantacione membrane, sunđera ili drugog odgovarajućeg materijala na koji je željeni molekul apsorbovan ili inkapsuliran. U nekim ostvarenjima, kada se koristi implantacioni uređaj, uređaj može biti implantiran u bilo koje pogodno tkivo ili organ, a dopremanje željenog molekula može biti putem difuzije, sporim bolus otpuštanjem ili kontinuiranim davanjem. ;Kombinovane terapije ;[0212]U daljim ostvarenjima, antigen vezujući protein se daju u kombinaciji sa drugim agensima korisnim za tretiranje stanja sa kojim je pacijent pogođen. Primeri takvih agenasa uključuju i proteinske i ne-proteinske lekove. Kada se više terapeutika daje zajedno, doze se mogu prilagoditi, kao što je poznato u ovoj oblasti. "Zajedničko davanje" i kombinovana terapija nisu ograničeni na istovremenu primenu, već takođe uključuju režime lečenja u kojima se antigen vezujući protein daje najmanje jednom u toku trajanja tretmana koji uključuje primenu najmanje jednog drugog terapeutskog agensa pacijentu. ;[0213]Ovaj pronalazak je opisan pomoću sledećih primera koji su dati kao ilustracija, a ne kao ograničenje. ;Primer 1:Pobijanje antigena;[0214]Nekoliko oblika rekombirtantnog TSLP korišćeni su kao imunogeni. Humani TSLP eksprimiran je i u E.coli i u ćelijama sisara. E. Coli-proizvedeni humani TSLP bio je neobeleženi protein pune dužine. TSLP protein je proizveden u COS PKB ćelijama koje imaju obrisana mesta furinslog razdvajanja proizvedena brisanjem nukleotide 382-396 (AGAAAAAGGAAAGTC, SEQ ID NO : 370 ) koji odgovara amino kiselinama 128-132 (RKRKV, SEQ ID NO:371). Ovaj protein sadrži C terminal poliHIS-Flag obeležje (nukleotidna ;[0215]Proteinska sekvenca = ;[0216] U drugoj kampanji, TSLP- C terminalni poliHIs-Flag obeležem protein pune dužine je proizveden u COS PKB ćelijama (nukleotida sekvence = RKRKVTTNKCLEQVSQLQGLWRRFNRPLLKQQHHHHHHDYKDDDDK (SEQ ID NO: 375), Imati u vidu da je sekvenca amino kiseline 1-28 (MFPFALLYVLSVSFRKIFILO.LVG L VLT, SEQ ID NO: 376) signalni peptid pocepan iz zrelog proizvoda oba ova proteina. ;[ 0217] Pored toga, makaki TSLP je kloniran i subkloniran/izražen slično bilo sa mestom furinskog cepanja ( nukleotid 358 - 372 (AGAAAAAGGAAAGTC, SEQ ID NO: 370) koje odgovara amino kiselinama 120-124 (RKRKV, SEQ ID NO: 371)) obrisanog (DNA ; ;Primer 2: Mišja artti- humana TSLP- antitela;[0218]hTSLP-Fc korišćen je za imunizaciju 8ALB/c miševa (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine). Nakon nekoliko rundi imunizacije, limfociti su pušteni iz slezine i fuzionisani sa mišjim ćelijama mijeloma, NS1 (ATCC) hemijskom fuzijom sa 50% PEG/DMSO (Sigma). Fuzionisane ćelije su zasejane u plole sa 96-bazenčića na gustini od 2xl0<4>ćelija/bunarČić u 200ul DMEM HAT (O.lmM hipoksantin, 0.16mM timidin, 4mM aminopterin, Sigma) medijum dopunjen sa 10% FBS, 5% Origen faktor za kloniranje (BioVeris "*), 1 x penicilin-streptomicin-glutamin, natrijum piruvat (Invitrogen). Medijum je zamenjen 7 dana posle fuzije sa DMEM HT (O.lmM hipoksantin, 0.16mM timidin) medijumom dopunjenim sa 10% FBS, 5% Origen faktorom kloniranja (BioVeris ™), 1 x penicilin-streptomicin-glutamin, natrijum piruvat (Invitrogen). Kondicionirani mediji su prikupljeni dva dana nakon srednje promene i pripremljeni za primarni skrining.

Primer 3: Generisanje potpuno humanog antitela

[0219]Potpuno humana monoklonska antitela specifična za TSLP generisana su korišćenjem XenoMouse<®>tehnologije prema protokolima koji su opisani, na primer, u U.S. 2005/0118643, United States Patent Nos: 6114598, 6162963, 7049426, 7064244, Green et al., Nature Genetics 7: 13-21 (1994), Medez et al. Nature Genetics, 15:146-156 (1997), Green i Jakobovitis J.Ex. Med. 188:483-495 (1998), i kao što je opisano u nastavku.

[0220]Dve kampanje su sprovedene. U kampanji 1, korišćeni su lgG2 i lgG4 kohorte KsenoMouse<®>. 50% miševa primilo je humani TSLP proizveden u E.coli, a 50% dobijenih sisara proizveli su humani TSlP (opisano gore). Titrt u serumu praćeni su pomoću ELISA (opisano niže), a miševi sa najboljim titrima su fuzionisani za generisanje hibridoma pomoću sledećih protokola.

[0221]Izabrane miševi su žrtvovani i drenažni limfni čvorovi sakupljeni i koncentrovani iz svake kohorte. Limfoidne ćelije su obogaćene za B ćelijama, a B ćelije fuzionisane sa ćelijama mijeloma za stvaranje hibridoma. Fuzionisane hibridoma linije su potom zasejane u hibridoma medijumu i kultivisane tokom 10-14 dana na 37°C. Supernatanti hibridoma su ispitivana na IgG antitela koja se vezuju za TSLP korišćenjem ELISA kao što je opisano u nastavku.

[0222]Druga kampanja je pokrenuta u kojoj su dve kohorte lgG2 KsenoMouse<®>vakcinisane humanim TSLP proizvedenim u sisarima, i jedna kohorta je dopunujena sa makaki TSLP. Nakon nekoliko rundi imunizacije, limfociti iz limfnih čvorova su fuzionisani i kultivisani kao što je opisano gore. Nakon kultivisanja, supernatani hibridoma su pregledani na vezivanje za TSLP korišćenjem ELISA, kao što je opisano u nastavku.

[0223]Poliklonalni supernatanti iz obe kampanje izabrani su za dalje subkloniranje na osnovu dole navedenih testova. Hibridomi koji sadrže antitela koja su potentni inhibitori TSLP aktivnosti su identifikovani, a unakrsna reaktivnost sa cino TSLP je dalje određivana. Rezultati su prikazani u Primeru 5 ispod. Obećavajući supernatanti hibridoma su odabrani na osnovu njihovog učinka u primarnoj DC analizi opisanoj u daljem tekstu. Ti hibridomi su bili klonirana pojedinačna ćelija i proširena za dalje testiranje. Antitela su zatim prečišćena kao što je opisano u nastavku.

[0224]Antitela su prečišćena iz kondicioniranog medija od hibridoma pomoću Mab Select (GE Healthcare) smole. 100 uL 1: 2 suspenzije Mab Select smole uravnotežene u PBS dodato je u između 7 i 10 ml kondicioniranog medija (CM). Epruvete su stavljene na rotatore na 4-8°C preko noći. Epruvete su centrifugirane na 1,000 X g tokom 5 minuta i i nevezana frakcija je odlivena. Smola je isprana sa 5ml PBS, i centrifugirana i dekantovan kao gore. Smola je zatim prebačena u SPIN-X, 0.4Sum, 2ml epruvetu. Smola je dodatna dva puta isprana sa 0,5 ml PBS i centrifugirana. Mabs su eluirani sa 0,2 ml 0.1 M sirćetne kiseline inkubacijom na sobnoj temperaturi uz povremeno mešanje 10 minuta. Epruvete su centrifugirane, i 30ul od IM Tris pufera pH 8.0 dodato je eluatu. Prečišćeni Mab su čuvani 4-8 ° C.

Primer 4: Ispitivanja antitela

A. ELISA za detekciju prisustva anti- TSLP- antitela

[0225]ELISA je izvedena oblaganjem Costar 3368 medijum vezujućih ploča sa 96 bazenčića sa rekombinantno proizvedenim vvtHuTSLP ili pHisFlag pri 2ug/ml 50 ul/bazenčić u 1 x PBS/0.05% azid, i inkubirane preko noći na 4°C. Ploče su oprane i blokirane sa 250uL 1 x PBS/1% mleko (test razblaživač) i inkubirane najmanje 30 minuta na sobnoj temperaturi.

[0226]Dodato je približno 50ul/bunarčić supernatanata hibriodoma, pozitivna kontrola mišjeg antitela M385 ili negativna kontrola i inkubirani na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Ploče su oprane, a sekundarno antitelo, kozji anti-humani IgG Fc HPR (Pierce), ili alternativno kozji anti-mišji IgG HPR (Jackson Labs), naneti su na 400 ng/ml u test razblaživač. Ploče su inkubirane 1 sat na sobnoj temperaturi, oprane, a OD na 450 nm pročitani.

B Izveden je skrining anti- TSLP- hibridoma supernatanta koristeći jedan od sledećih funkcionalnih

testova

[0227]1. Ploče sa 96 bunarčiča obložene su rastvorljivim hulL-7RA -huTSLPR-Fc proteinom, sa kiselim veznikom

8 aa ( SG6APMLS, SEQ ID NO : 382 ) između receptora i humanog Fc, i inkubirane preko noći na 4°C.

2. Ploče su isprane i blokirane tokom 1 sata na sobnoj temperaturi sa PBS +1 % BSA + 5 % saharoza.

3. Ploče su inkubirane sa biotinilovanim huTSLPHFdel (HF se odnosi na poliHis Flag, gde TSLP ima obrisano mesto cepanja furina) (del). Ploče su zatim inkubirane ( +/-) hibridoma supernatanti ili mišje anti-humano TSLP ( M385 ) kao pozitivna kontrola tokom 2h na sobnoj temperaturi. 4. SA-HRP detekcija ( streptavidin-peroksidaza rena ). SA se vezuje snažno sa biotinskim delom biotinilovane huTSLPHFdel, a HRP katalizuje oksidaciju hromogena, TMB ( koji prelazi u plavu boju ), vodonik-peroksidom.

B. Ispitivanja bazirana na ćelijama

[0228]1) Inhibicija TSLP-indukovane proliferacije stabilne BAF ćelijske linije koja eksprimira humani TSLPR-IL7R kompleks supernatantima hibridoma ili prečišćenim antitelima određena je prema sledećem protokolu. 1. BAF: Hu TSLPR stabilne ćelijske linije u medijumu za rast, RPMI 1640 + 10% FBS + 1% L-Glutamin

+ 0.1% Pen/Strep + 0,1% 2-ME isprane su kako bi se uklonio TSLP upotrebljen u medujumu za održavanje, koji je isti kao i medijum za rast, ali sa dodatkom 10 ng/mL huTSLPHwt.

2. HuTSLPwtpHF (+/-) ili makaki TSLPvvtpHF (+/-) inkubirani su sa hibridoma

supernatanti/prečišćena antitela/ili mišji anti-humani TSLP (M385) 30 minuta na sobnoj temperaturi u bazenčićima.

3. 5 x IO<4>BAF ćelije/bazenčić dodato je i inkubirano 3 dana.

4. Ćelije su pulsirane sa tricijumovanim timidinom (luCi/bazenčić) preko noći. Ćelijska proliferacija

BAF ćelija, ili njihova inhibicija, procenjena je količinom inkorporacije (CPM) tricijumovanog timidina od strane ćelija. 2) Primarno ćelijsko ispitivanje. Inhibicija proizvodnje TSLP-indukovanog osteoprotegerina (OPG) (opisan u U.S. Patentu 6,284,728) iz primarnih humanih dendritskih ćelija (DC) od strane hibridoma ili prečišćenih antitela određena je prema sledećem protokolu. 1. Periferne krvne CD11C + mijeloidne DCs obogaćene su iz normalnih vlastitih donatorskih

pakovanja leukafereze pomoću CDlc (BDCA-1) DC izolacionog kita (Miltenvi Biotec).

2. huTSLPvvtpHF (+/-) ili makaki TSLPvvtpHF inkubirani su sa supernatantima ili prečišćenim

antitelom ili mišjim anti-humanim TSLP tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi.

3.1 x 10<5>ćelija/bazenčić dodate su i inkubirane tokom 48 sati. Supernatanti su prikupljeni i

analizirani na proizvodnju ljudskog OPG pomoću ELISA, a određena je inhibicija proizvodnje OPG od strane supernatanta hibridoma iii prečišćenih antitela. OPG ELISA je izvedena korišćenjem DuoSet<®>development kita od R&D svstems. Anti-TSLP-antitela su inhibirala proizvodnju OPG iz ćelija na dozno zavisan način. 3) Ispitivanje makaki perifernih krvnih mononuklearnih ćelija. Inhibicija CvnoTSLP indukovane proizvodnje CCL22/MDC od strane supernatanata hibridoma ili prečišćenih antitela određen je prema sledećem protokolu. 1. Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) iz periferne krvi dobijene od makaki majmuna

(SNBL) dobijene su prekrivanjem 1:1 krv:PBS smeše preko izolimfa.

2. Makaki TSLPvvtpHF (+/-) supernatanti/prečišćeno antitelo ili rastvorljivi hulL-7RA-huTSLPR-Fc

inkubirani su tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi.

3. 4 x IO<5>ćelije/bazenčić dodato je i inkubirano tokom 5 dana. Supernatanti su prikupljeni i analizirani na makaki CCL22/MDC proizvodnju pomoću ELISA.

Primer 5: KDdeterminacije

[0229]Eksperimenti površinske plazmonske rezonance opisani u ovoj patentnoj prijavi izvedeni su na 25°C, koristeći Biacore 3000 instrument (Biacore International AB, Uppsala, Svveden) opremljen sa CM4 senzorskim Čipom. Antitela Anti-FcY specifičnog snimanja kovalentno su imobilisana u dve ćelije protoka na CM4 čipu koristeći standardnu amino-spajajuću herniju sa HBS-EP kao pokretački pufer. Ukratko, svaka ćelija protoka aktivirana je sa 1: 1 (v/v) mešavinom 0,1 M NHS i 0,4 M EDC. AffiniPure koziji anti-humani IgG, FcY Fragment specifično antitelo (Jackson I mm u no Research Inc. West Grove, PA) na 30 ug/ml u 10 mM natrijum acetatu, pH 5.0, imobilisano je sa ciljnim nivoom 3.000 RUs na dve ćelije protoka. Rezidualne reaktivne površine deaktivirane su sa injekcijom 1 M etanolamina. Pokretački pufer je zatim prebačen u HBS-EP + 0,1 mg/ml BSA za sve preostale faze.

[0230]Testirana su sledeća antitela. A5 lgG2 je prečišćeno klonsko antitelo, A2 IgGl i lgG2 su rekombinantna prečišćena antitela, a A3 lgG4 i A4 lgG4 su klonalnui supernatanti. Antitela su adekvatno razblažen u pokretačkom puferu tako da je 2-minutno injektovanje na 10u.l/min preko test ćelije protoka rezultiralo kao približno 110-175 jedinica odgovora antitela zarobljenog na površini test ćelije protoka. Ni jedno antitelo nije zarobljeno na površini kontrolne ćelije protoka. Humani, cyno ili mišji TSLP u različitim koncentracijama, zajedno sa puferskim prazninama zatim su propušteni preko dve ćelije protoka. Opsezi koncentracija za humani i cyno TSLP bili su od 0.44-100 nM, dok je i opseg koncentracija za mišji TSLP bio od 8.2-6000 nM. Korišćena je brzina protoka od 50 ul/min, i 2-minutna asocijaciona faza praćena 10-30-minutnom disocijacionom fazom. Posle svakog ciklusa površine su regenerisane sa 30-sekundnim injketovanjem 10 mM glicina pH 1.5. Sveže antitelo je tada zarobljeno na test ćeliji rotoka kako bi se pripremilo za sledeći ciklus.

[0231]Podaci su dvostruko navedeni oduzimanjem odgovora površinske kontrola radi uklanjanja promena grupnog refrakcionog indeksa, a zatim oduzimanjem prosečnog odgovora puferskih praznina radi uklanjanje sistemskih artefakata iz eksperimentalnih ćelija protoka. Podaci TSLP su obrađeni i globalno smešteni u 1:1 model interakcije sa lokalnim Rmax u BIA evaluation Softvare v 4.1. (Biacore International AB, Uppsala, Svveden). Asocijacione (ka) i disocijacione (kd) konstante brzine određene su i upotrebljene za izračunavanje ravnotežne disocijacione konstante (KD). Disocijacione konstante brzina i disocijacione konstante ravnoteže sumirane su u tabeli koja sledi u Primeru 6.

Primer 6: In vitro aktivnost antitela

[0232]Sledeća antitela okarakterisana su korišćenjem gore opisanog Biacore ogleda za kd i KD. Ispitivanje primarnih dendritskih ćelija upotrebljeno je za određivanje IC50 (pM). Podaci za A5 generisani su sa prečišćenim klonskim antitelom, za A2 generisani su sa rekombinantnim prečišćenim antitelom, a podaci za A3 i A4 generisani su korišćenjem klonskog supernatant. Sve verzije TSLP generisane su iz ćelija sisara.

Primer 7: Recombinant Ekspresijai prečišćavanjeantitela

Razvoj stabilnih ćelijskih linija koje eksprimiraju antitela

[0233]Preklapajući oligonukleotidi sintetisani su u skladu sa primarnom sekvencom varijabilnog domena lakog lanca ili teškog lanca za oba osetljivi i anti-osetiljivi lanac. Ovaj oligonukleotidni bazen uključen je u standardnu PCR. Proizvod iz ove prve reakcije korišćen je kao kalup u drugoj PCR amplifikaciji. Amplifikovani fragmenti varijabilnog teškog lanca i varijabilnog lakog lanca sub-klonirani su u intermedijerni vektor i sekvencionisani da identifikuju proizvode bez grešaka. Fragment varijabilnog teškog lanca kloniran je u prolazni ekspresioni vektor koji sadrži signalni peptid i humani lgG2 konstantni region. Fragment varijabilnog lakog lanca kloniran je u prolazni ekspresioni vektor koji sadrži signalni peptid i humani lambda konstantni region. Kompletan gen teškog lanca prebačen je u vektor pDC324. Kompletan gen lakog lanca prebačen je u ekspresioni vektor, pDC323.

[0234] CS 9 ćelije domaćini upotrebljene za transfekciji; eksnresije anti-TSLP-plazmida su CHO ćelijska linija izvedena iz DXB-11 ćelija kroz adaptaciju medijumu bez seruma (Rasmussen et al., Citotechnologv 28: 31-42, 1998 ). Anti-TSLP-ćelijske linije pripremljene su transfekcijom CS-9 ćelija domaćina sa ekspresionim plazmidima pDC323-anti-TSLP-lambda i<p>DC324-anti-TSLP-lgG2 koristeći standardni elektroporacioni ili lipofekcioni postupak. Posle transfekcije ćelijske linije domaćina sa ekspresionim plazmidima, ćelije su gajene u selekcionom medijumu tokom 2-3 nedelje kako bi se omogućila selekcija plazmida i oporavak ćelija. U nekim slučajevima, medijum je obogaćen sa 3% dijaliziranim fetalnim goveđim serumom (DS ili dFBS). Ako je korišćen serum, uklonjen je iz medijuma posle perioda selekcije. Ćelije su gajene u selektivnom medijumu dok nisu postigle> 85% održivosti. Ovaj bazen transfektovanih ćelija zatim je kultivisan u medijumu kulture.

Kloniranje ćelijske linije

[0235]Ćelijska banka pripremljena je od selektovanih klonova u skladu sa sledećom procedurom. Faza kloniranja osigurava da se klonske populacije i ćelijske banke generišu omogućavajući reproduktivno izvođenje u komercijalnoj proizvodnji. Amplifikovani bazen antitelo-eksprimirajučih ćelija zasejan je pod ograničavajućim razblaženjem u 96-bazenčića, a kandidati klonovi procenjeni su za rast i performanse produktivnosti u ispitivanjima male skale

Primer8: Unakrsna kompeticija antitela

[0236] Uobičajeni način da se definišu epitopi je preko kompeticionih eksperimenata. Antitela koja ulaze u kompeticiju jedna sa drugim mogu se posmatrati da vezuju istu lokaciju na meti. Ovaj primer opisuje postupak određivanja kompeticije za vezivanje za TSLP i rezultate postupka kada se primenjuje na brojnim antitela opisanih ovde.

[0237] Eksperimenti vezivanja mogu se izvesti više načina, a postupak koji se koristi može imati uticaj na rezultate testa. Zajedničko ovim postupcima je to što je TSLP obično vezan jednim referentnim antitelom, a ispitan drugim. Ako referentno antitelo sprečava vezivanje probnog antitela onda se smatra da su antitela u istom bunkeru. Redosled u kojem se uposlena antitela je važan. Ako je antitelo A uposleno kao referentno antitelo i blokira vezivanje antitela B, obrnuta situacija nije uvek tačna: antitelo B upotrebljeno kao referentno antitel neće obavezno blokirati antitelo A. Postoji veliki broj faktora u igri: vezivanje antitela može izazvati konformacione promene na meti što sprečava vezivanje drugog antitela ili epitop; koji se preklapaju ali ne zatvaraju u potpunosti jedandrugog može da dozvoli drugom antitelu da i dalje ima dovoljno interakcije visokog afiniteta sa metom kako bi se omogućilo vezivanje. Antitela sa mnogo većim afinitetom mogu da imaju veću sposobnost da izguraju blokiranje antitela sa puta. Generalno, ako se kompeticija posmatra u bilo kom redosledu antitela kaže se da su smeštena u isti bunker, a ako oba antitela mogu da se blokiraju međusobno onda je verovatno da se epitopi kompletnije preklapaju.

[0238] U ovom primeru, upotrebljena je modifikacija postupka multipleksiranog vezivanja opisano je od strane Jia et al (J. Immunological Methods, 288 (2004) 91-98). Kako prisustvo furinskog cepanja unutar TSLP može dovesti do heterogenosti TSLP proteinski preparata, korišćen je TSLP koji ima arginin unutar mesta furinskog cepanja mutiran u alanin. Videti U.S. 7,288,633. Svaki kod perlice streptavidinom obloženih Luminex perlica (Luminex, # L100-L1XX-01, XX precizira kod perlice) je inkubiran u 100 uL 6pg/perlica biotinilovanim monovalentnim mišjim-anti-humanim IgG antitelom (BD Pharmingen, ff 555785) 1 sat na sobnoj temperaturi u mraku, zatim ispran 3 x sa PBSA, fosfatnim slanim puferom (PBS) plus 1% goveđi serumski albumin (BSA). Svaki kod perlice odvojeno je inkubiran sa 100 ul 1:10 anti-TSLP-antitelom za razblaživanje (oblagajuće antitelo) tokom 1 sata, a zatim je ispran. Perlice su spojene, a potom raspoređene u filter ploču sa 96 bazenčića (Millipore, # MSBVN1250). Dodato je 100 uL 2UG/ml roditeljskog TSLP u pola bunarčića, a pufer u drugu polovinu i inkubisani 1 sat, a zatim isprani. 100 ul 1:10 anti-TSLP-antitela za razblaživanje (Detekciono Ab) dodato je u jedan bunarčić sa TSLP i jedan bunarčić bez TSLP, inkubirano 1 sat, a zatim isprana. Irelevantni humani-lgG (Jackson # 009-000-003) kao i uslovi bez antitela (prazno) provedeni su kao negativne kontrole. 20ul PE-konjugovanog monovalentnog mišjeg-anti-humanog IgG (BD Pharmingen,U555787) dodato je u svaki bazenČić i inkubisano 1 sat, a zatim isprano. Perlice su resuspendovane u 75ul PBSA, a najmanje 100 kodova događaji/perlica sakupljeno je na BioPlex instrumentu (BioRađ).

[0239]Srednji fluorescentni intezitet (MFI) u paru antitela bez TSLP oduzet je iz signala odgovarajuće reakcije koja sadrži TSLP. Kako bi se par antitela smatrao vezan istovremeno, i stoga u različitim bunkerima, vrednost reakcije morala je da ispuni dva kriterijuma: 1) vrednosti su morale da budu 2 puta veće od antitela premaza uparenog sa samim sobom, irelevantno ili prazno, koje god bilo najviše, i 2) vrednosti su morale da budu veće od signala za detekciju antitela prisutnog sa irelevantno ili prazno premazanom perlicom.

[0240]Analiza kompeticije između antitela komplikuje se zbog činjenice da postoji nepodudarnost između delovanja antitela kao probe u odnosu na njihovo delovanje kao blokatori. Međutim, ako se uzmu u obzir samo oni bunkeri antitela koji su nedvosmisleni (tj. svako antitelo će blokirati ostala kada se koristi kao referenca) najmanje osam bunkera je pronađeno kao što je prikazano u Tabeli 4 ispod.

[0241 ]Značajno je da se neka antitela, kao što su A23 i A6, mogu se naći u više bunkera. Moguće je utvrditi i ostale odnose bininga, a uključivanje ili isključivanje antitela iz ovih bunkera bazira se prema isključenosti.[ 0242 ]Rezultati testa određuju koje od ostalih antitela unakrsno ulazi u kompeticiju za vezivanje sa referentnim antitelom. Pod " unakrsna kompeticija za vezivanje " podrazumeva se da je referentno antitelo kada se koristi kao blokirajuće antitelo sposobno da blokira vezivanje drugog antitela kada se koristi kao proba i obrnuto. Drugim rečima, ako je referentno antitelo u stanju da blokira drugo antitelo ali drugo antitelo nije u stanju da blokira referentno antitelo, antitela se ne smatraju unakrsno-kompetetivnim. Lista unakrsno-kompetecionih antitela data je u Tabeli 5 .

Primer 9: Mapiranje epitopa

[0243] Dok se epitopi često smatraju linearnim sekvencama, češće je da antitelo prepoznaje lice mete koja se sastoji od diskontinuiranih amino kiselina. Ove amino kiseline mogu biti udaljene na linearnoj sekvenci ali približena kroz savijanje mete, a antitela koja prepoznaju takav epitop poznata su kao konformaciono-osetljiva ili samo konformaciona antitela. Ova vrsta vezivanja se može definisati korišćenjem denaturisanih Vestern blotova, gde se pre obrade na gelu, mete zagrevaju u prisustvu deterdženta i redukcionog agensa kako bi se odvile. Blot iz ovog gela može zatim biti ispitan antitelima, a antitelo koje je u stanju da prepozna metu nakon ovog tretmana najverovatnije prepoznaje linearni epitop. lako epitopi antitela koja vezuju linearne sekvence mogu biti definisani kroz vezivanje za peptide (npr. PepSpot), neće se očekivati da konformaciona antitela vežu standardne peptide sa visokim afinitetom.

[0244]Redukovani, toplotom denaturisani, prečišćeni roditeljski TSLP protein nanet je na 10% Bis-Tris Nupage gei u MES SDS radnom puferu. Protein je prebačen u PVDF membranu, blokiran sa 5% nemasnim suvim mlekom (NFDM) u PBS + 0.05% Tvin (PBST) i inkubisan sa TSLP-antitelima tokom Ih na sobnoj temperaturi. Blotovi su oprani 3 x u PBST, a zatim inkubisani sa kozjim anti-HulgG sekundarnim antitelom tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Blotovi su ponovo isprani i inkubisani sa anti-kozjim IgG: Alexa 680. Nakon ispiranja 3 x u PBST, blotovi su skenirani na LiCor radi vizuelizacije traka.

[0245]Antitela A2, A4, A5, A6, A7, A10, A21, A23, i A26 okarakterisana su primenom ovg postupka. Antitela A2, A4, A5 vezala su se za linearni epitop Što je dokazano jakom trakom Vestern Blotu. Sva ostala antitela su konformacionalna zbog nepostojanja ili izuzetno slabih traka na Vestern Blotu.

[0246]Epitopi se mogu dalje definisati kao strukturalni ili funkcionalni. Funkcionalni epitopi su generalno podskup strukturalnih epitopa i sastoje se od onih ostataka koji direktno doprinose afinitetu interakcije (npr. vodoničnim vezama, jonskim interakcija ra). Strukturalni epitopi mogu se posmatrati kao flasteri mete koja je pokrivena antitelom.

[0247] Skenirajuća mutageneza korišćena je radi dalje definicije epitopa koji su vezani antiteiima. Alanin skenirajuća mutageneza se često koristi za definisanje funkcionalnih epitopa; supstitucija alanina ( bočni lanac metila) u suštini predstavlja amputaciju bočnog lanca divljeg tipa amino kiseline i prilično je suptilna. Interakcije sa kičmom proteina, kao što je vez.vanje vodonika u amidnim vezama, verovatno neće biti pokazane alaninskim skeniranjem. Umesto toga, kor šćena je arginin i glutaminsko kiselinska skenirajuća mutageneza. Ova dva bočna lanca izabrana su zbog njihove velikog sternične gomile i naelektrisanja, što omogućava da mutacije koje nastaju u strukturalnom epitopu imaju veći efekat na vezivanje antitela. Obično se koristi arginin, osim kada je VT ostatakl arginin ili lizin, i u ovim slučajevima ostatak je mutiran u glutaminsku kiselinu zbog menjanja naelektrisanja. U nekoliko slučajeva, VT ostatak je mutiran u oba i arginin i glutaminsku kiselinu.

[0248] Devedeset pet amino kiselina, distribuirane širom TSLP, izabrane su za mutaciju u arginin ili glutaminsku kiselinu. Kako se hidrofobni ostaci uglavnom nalaze unutar savijenog jezgra proteina, selektovanje je bilo bazirano prema naelektrisanim ili polarnim amino kiselinama kako bi se smanjila verovatnoća mutacije koja dovodi do pogrešno savijenih proteina. Kako nije bilo kristalnih struktura, ovi ostaci su suštinski izabran nasumice i distribuirani širom TSLP. Kao što je opisano u Primeru 8, korišćeno je TSLP-sadržavajuće mutirano furinsko mesto cepanja.

[0249]Bioplex ™ test vezivanja koristi se za merenje vezivanja anti-TSLP-antitela za mutante TSLP. Biotinilovani Penta-His Ab (Ojagen, Lot: 130163339) vezan je na 100 kodova perlica streptavidinom-obloženih perlica (Luminex, # L100-L1XX-01, XX specificira kod perle). One se koriste kako bi se zarobio His-obeleženi protein. 100 kodova perlica omogućili su multipleksiranje svih 85 mutanata, 3 roditeljske kontrole, irelevantnog proteina i 12 praznina. Vezivanje antitela sa mutiranim proteinom upoređeno je sa vezivanjem antitela sa roditeljskim antitelom.

[0250]100 uL 1: 5 razblaženje TSLP mutanata i roditeljskog u supernatantu i 1 ug/mL prečišćenog TSLP WT, 1 ug/mL irelevantnog proteina ili bez proteina, vezani su za obložene perlice 1 sat na sobnoj temperaturi uz snažno mućkanje. Perlice su isprane i alikvotirane u filter ploču sa 96-bunarčića (Millipore). lOOul anti-TSLP-antitela u 4-strukom razblaženju dodato je u utrostručene bunarčiće, inkubisano tokom 0.5 sati na sobnoj temperaturi i isprano. U svaki bunarčić dodato je 100 uL 1: 250 razblaženja PE-konjugovanog anti-humanog IgG Fc (Jackson, # 109-116-170), inkubirsano tokom 0.5 sati i oprano. Perle su ponovo suspendovane u 75 ul, mućkane najmanje 3min, i pročitane na Bioplex,<M>.

[0251]Ostatak se smatra deo strukturalnog epitopa (kao "pogodak"), kada je mutiranje u arginin ili glutaminsku kiselinu prekinulo vezivanje antitela. Ovo je viđen kao pomak u EC50 ili smanjenje maksimalnog signala u odnosu na vezivanje sa roditeljskim TSLP antitelom.

[0252]Statističke analize krive vezivanja antitela sa roditeljskim i mutantima korišćene su za identifikaciju statistički značajnog EC50 pomeranja. Analiza je uzela u obzir var ijacije u isptivanju izrađivanju krive.

[0253]EC50 krive mutantnog vezivanja i krive roditeljskog vezivanja su upoređene. Statistički značajne razlike su identifikovane kao pogodci za dalje razmatranje. Krive sa oznakama "nepodudaranja" ili "lošeg podudaranja" isključene su iz ove analize.

[0254]Dva izvora varijacija razmatrana su u odnosu na EC50 procene, varijaciju iz krive podudaranja i perla-perla varijaciju. Roditeljski i mutanti su povezani sa različitim perlama, čime se njihova razlika meša sa razlikom perla-perla. Kriva varijacije podudaranja procenjena je standardnom greškom log EC50 procena. Perla-perla varijacija je eksperimentalno određena pomoću eksperimenta gde su roditeljske kontrole vezane za svaku od perli. Varijacija perli u EC50 procenama krive roditeljskog vezivanja korišćena je da bi se procenila perla-perle varijacija.

[0255]Poređenja dva EC50 (u log skali) izvedena su korišćenjem Studentovog t-testa. T-statistika je izračunata kao odnos između delta (apsolutne razlike između EC50 procena) i standardne devijacije delta. Odstupanje od delta se procenjuje zbirom tri komponente, varijansne procene EC50 za krive mutanata i roditelja nelinearnoj regresiji i dva puta perla-perla varijansi procenjenoj na odvojenom eksperimentu. Višestrukost dve perla-perle varijanse je zbog pretpostavke da obe i mutante i roditeljske perle imaju istu varijaciju.

[0256]Stepen slobode standardne devijacije delta je izračunata korišćenjem Satterthwaite-ove (1946) aproksimacije. Individualne p-vrednosti i intervali poverenja (95% i 99%) izvedeni su na osnovu Studentove t-distribucije za svako poređenje. U slučaju više roditeljskih kontrola, konzervativni pristup je realizovan tako biranjem roditeljske kontrole koja je najsličnija mutantu, to jest, biranjem one sa najvećim p-vrednostima.

[0257]Prilagođavanja multipliciteta su važna za kontrolu lažnih pozitiva zbog izvođenja velikog broja testova istovremeno. Dva oblika prilagođavanja multipliciteta realizovani su za ovu analizu: kontrola porodične pametne greške (FWE) i kontola brzine lažnog otkrivanja (FDR). FVVE pristup kontroliše verovatnoću da jedan ili više pogodaka nisu stvarni; FDR pristup kontroliše očekivani procenat lažno pozitivnih među odabranim pogodcima. Prethodni pristup je konzervativan i manje moćan od ovog. Postoji mnogo dostupnih načina za oba pristupa, za ovu analizu, pri čemu je Hochberg-ov (1988) postupak izabran za FVVE analizu, a ESenjamini-Hochberg-ov (1995) FDR postupak za FDR analizu. Korigovane p-vrednostt za oba pristupa izračunate su ili za svako antitelo ili ceo test.

[0258]Mutacije čija je EC50 bila značajno različita od roditeljski, tj. koja ima FVVE prilagođenu p-vrednost za svako antitelo manje od 0.01, ili maksimalni signal ispod 50% roditeljskog, smatrane su delom strukturalnog epitopa (Tabela 6). Mutacije koje su bile značajne od strane EC50 oplate ili maksimalnog smanjenja signala za sva antitela smatrane su kao pogrešno savijene. Ove mutacije su; Y15R, T55R, T74R i A77R.

[0259]Bilo je nekoliko mutacija koje su omele vezivanje više antitela, posebno K73E, K21E, i D22R. Mutageneza služi za verifikovanje podataka generisanih biningom i za dalje sužavanje prostora epitopa. Čini se da mutacije u TSLP utiču na klastere antitela koja su binovana zajedno.

Primer 10: Toksikologija

[0260]Antitela koja vezuju humani TSLP ali takođe unakrsno reaguju sa TSLP drugih vrsta dozvoljava toksikološko testiranje u tim vrstama. U ovom primeru, antitelo koje unakrsno reaguje sa TSLP makaki majmuna dato je makaki majmunima. Majmuni su zatim posmatrani na toksične efekte.

[0261]Siurnosno farmakološko ispitivanje jedne doze kod makaki majmuna je pokazalo da jedna 300 mg/kg intravenska doza antitela ne pokazuje kardiovaskularne, disanje, temperature tela, ili neurobihevioralne efekte.

[0262]Makaki majmuni (5/pol/grupa) su dobijali 30,100 ili 300 mg/kg doze jednom nedeljno u toku 4 nedelje, subkutanozno. Nijedna nepovoljna toksikologija nije primećena u bilo kojoj dozi. Antitelo nije uticalo na kliničke opservacije, telesnu težinu, oftalmologiju, EKG-ove, kliničku patologiju ili anatomsku patologiju.

[0263] U odvojenom ispitivanju, četiri mužijaka telemeterizovana makaki majmuna dobili su jednu intravensku dozu vozila (dan 1) i 300 mg/kg antitela (dan 3). Tokom četvorodnevnog perioda posmatranja nisu primećeni efekati na kardiovaskularnu, respiratornu ili neurološku funkciju.

[0264] Antitelo je dalje testirano radi određivanja unakrsne reaktivnosti sa normalnom humanim i makaki majmunskim tkivom kao što je preporučeno u FDA vodiču "Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Anitbodv Prducts for Human Use" (FDA Center for Biologics Evaluation and Research, 28 Februarv 1997). Nije primećeno nikakvo obojenje normalnog tkiva pri 1 ili 50 ug/mL

[0265] Gornji rezultati ukazuju da se ne očekuje da antitelo proizvede toksične efekte kod ljudi.

Claims

1. Humano anti-TSLP-antitelo koje obuhvata: a. varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata: i. CDR1 sekvencu lakog lanca koja obuhvata sekvencu amino kiseline SEQ ID NO: 13; ii. CDR2 sekvencu lakog lanca koja obuhvata sekvencu amino kiseline S£Q ID NO: 60; i iii. CDR3 sekvencu lakog lanca koja obuhvata sekvencu amino kiseline SEQ ID NO: 105; i b. varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata: i. CDR1 sekvencu teškog lanca koja obuhvata sekvencu amino kiseline SEQ ID NO: 145; ii. CDR2 sekvencu teškog lanca koja obuhvata sekvencu amino kiseline SEQ ID NO: 173 i iii. CDR3 sekvencu teškog lanca koja obuhvata sekvencu amino kiseline SEQ ID NO: 212.

2. Humano anti-TSLP-antiteto prema zahtevu 1, koje obuhvata: a. sekvencu varijabilnog domena lakog lanca izabranu iz grupe koju čine: i. amino kiseline koje imaju sekvencu najmanje 80% identičnu sa SEQ ID NO: 363; ii. sekvenca amino kiselina kodirana sekvencom polinukleotida koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID NO: 362; iii. sekvenca amino kiselina kodirana sekvencom polinukleotida koja se hibridizuje pod umereno strogim uslovima sa komplementom polinukleotida koji se sastoji oci SEQ ID NO: 362; i b. sekvencu varijabilnog domena teškog lanca izabrana iz grupe koju čine: i. sekvenca amino kiselina koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID NO: 361; ii. sekvenca amino kiselina kodirana sekvencom polinukleotida koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID NO: 360; iii. sekvenca amino kiselina kodirana sekvencom polinukleotida koja se hibridizuje pod umereno strogim uslovima sa komplementom polinukleotida koji se sastoji od SEQID NO: 360.

3. Humano anti-TSLP-antitelo prema zahtevu 1, koje obuhvata: varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata sekvencu SEQ ID NO: 363 i varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata sekvencu SEQ ID NO: 361.

4. Humano anti-TSLP-antitelo prema bilo kom od zahteva 1-2, gde a. Humano anti-TSLP-antitelo vezuje se za TSLP sa suštinski istim Kd kao referentno antitelo, i/ili b. gde humano anti-TSLP-antitelo inhibira TSLP aktivnost u skladu sa primarnim ćelijskim OPG testom sa istim IC50 kao referentno antitelo, pri čemu je pomenuto referentno antitelo antitelo koje obuhvata varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata sekvencu amino kiseline SEQ ID NO: 363 i varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata sekvencu amino kiseline SEQ ID NO: 361.

5. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata humano anti-TSLP-antitelo prema bilo kom od zahteva 1-4.

6. Nukleinska kiselina koja obuhvata sekvencu polinukleotida koja kodira varijabilni domen lakog lanca i varijabilni domen teškog lanca humanog anti-TSLP-antitela prema bilo kom od zahteva 1-4.

7. Rekombinovani ekspresioni vektor koji obuhvata nukleinsku kiselinu prema zahtevu 6.

8. Ćelija domaćin koja obuhvata a) ekspresioni vektor koji obuhvata polinukleotid koji kodira varijabilni domen lakog lanca i varijabilni domen teškog lanca humanog anti-TSLP-antitela prema bilo kom od zahteva 1-4; ili b) ekspresioni vektor koji obuhvata polinukleotid koji kodira varijabilni domen lakog lanca humanog anti-TSLP-antitela premabilo kom od zahteva 1-4 i ekspresioni vektor koji obuhvata polinukleotid koji kodira varijabilni domen teškog lanca humanog anti-TSLP-antitela prema bilo kom od zahteva 1-4.

9. Hibridom sposoban da proizvede humano anti-TSLP-antitelo prema bilo kom od zahteva 1-4.

10. Postupak za proizvodnju humanog anti-TSLP-antitela prema bilo kom od zahteva 1-4, koji obuhvata inkubisanje ćelije domaćina prema zahtevu 8 pod uslovima koji joj omogućavaju da eksprimira antitelo.

11. Kompozicija prema zahtevu 5 za upotrebu u tretiranju a. TSLP-povezanog inflamatornog stanja kod subjekta kome je potreban takav tretman; ili b. TSLP-povezanog fibroznog poremećaja kod subjekta kome je takav tretman potreban.

12. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 11, gde je inflamatorno stanje odabrano iz grupe koju čine alergijska astma, alergijski rinosinuzitis, alergijski konjuktivitis i atopijski dermatitis.

13. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 11, gde je fibrozni poremećaj odabran iz grupe koju čine skleroderma, intersticijalna bolest pluća, idiopatska fibroza pluća, fibroza koja nastaje usled hroničnog hepatitisa B ili C, fibroza indukovana zračenjem i fibroza koja nastaje iz zarastanja rana.

14. Humano anti-TSLP-antitelo prema zahtevu 1, gde je pomenuto humano anti-TSLP-antitelo monoklonalno antitelo.

15. Humano anti-TSLP-antitelo prema zahtevu 1, gde pomenuto humano anti-TSLP-antitelo obuhvata a) laki lanac koji obuhvata varijabilni domen lakog lanca koji obuhvata sekvencu amino kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 363 i lambda konstantni domen lakog lanca koji obuhvata sekvencu amino kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 369; i b) teški lanac koji obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata sekvencu amino kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 361 i lgG2 teški konstantni domen koji obuhvata sekvencu amino kiseline kao što je navedeno u SEQ ID NO: 365.

16. Postupak prema zahtevu 10, u kojem je ćelija domaćin CHO ćelija.

17. Humano anti-TSLP-antitelo koje se može dobiti postupkom prema zahtevu 16.