KR20120063475A - 항-ｔｇｆ-베타 수용체 타입 ⅱ 단일 도메인 항체 - Google Patents

항-ｔｇｆ-베타 수용체 타입 ⅱ 단일 도메인 항체 Download PDF

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KR20120063475A
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스티브 홈즈
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Abstract

본 발명은 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다. 적합하게는, 본 발명에 따른 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인은 10pM 내지 50nM, 바람직하게는 10pM 내지 10nM, 바람직하게는 250pM 내지 10nM 범위의 해리 상수(Kd)로 TGF베타RII에 결합하는 것이다. SEQ ID NO:1 내지 23의 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드가 또한 제공되며, 여기서 상기 분리된 폴리펩티드는 TGF베타RII에 결합한다. 본 발명은 또한 TGF베타 신호전달과 관련된 질병, 및 적합하게는 조직 섬유증, 예를 들어, 폐섬유증, 예를 들어, 특발성 폐섬유증, 간섬유증, 예를 들어, 경화증 및 만성 간염, 류머티스 관절염, 안구 장애, 또는 피부의 섬유증, 예를 들어, 피부의 켈로이드, 및 신장, 예를 들어, 신장염, 신장 섬유증 및 신경화증, 및 혈관 질환, 예를 들어, 재협착의 군으로부터 선택된 질병을 치료하기 위한 폴리펩티드, 리간드 또는 약학적 조성물을 제공한다.

Description

항-ＴＧＦ-베타 수용체 타입 Ⅱ 단일 도메인 항체{ANTI-TGF-BETA RECEPTOR TYPE II SINGLE DOMAIN ANTIBODIES}
발명의 배경
전환 성장 인자-β(TFG베타; TGFβ(TGF-β))는 TGF베타 수용체(TGF베타R; TGFβR(TGF-βR))로의 결합을 통해 세포로의 신호전달을 매개하는 신호전달 분자이다. TGF베타 신호전달 활성은 세포 분화 및 성장을 조절하며, 이의 효과, 즉 다른 세포 기능의 세포 성장-프로모터, 성장-억제인자 또는 유도인자의 특성은 세포 유형에 좌우된다(Roberts, et al, The transforming growth factor-betas, Peptide Growth Factors and Their Receptors, Part I, ed. by Sporn, M.B. & Roberts, A.B., Springer-Verlag, Berlin, 1990, p.419-472 참조).
TGF베타는 광범위한 세포 유형에 의해 생성되고, 이의 동족 수용체는 광범위한 기관 및 세포에서 발현된다(Shi and Massague, Cell, Volume 113, Issue 6, 13 June 2003, Pages 685-700; Biol. Signals., Vol. 5, p.232, 1996 and Pulmonary Fibrosis, Vol. 80 of Lung Biology in Health and Disease Series, ed. by Phan, et al., p.627, Dekker, New York, 1995 참조). TGF베타 수용체는 3개 유형에 해당하는 것으로 확인되었다: TGF베타RI(TGFβRI)(TGF베타 타입 I 수용체(Franzen et al, Cell, Vol. 75, No. 4, p. 681, 1993; GenBank Accession No: Ll 1695)); TGF베타RII(TGFβRII) (TGF베타 타입 II 수용체(Herbert et al, Cell, Vol. 68, No. 4, p. 775, 1992; GenBank Accession No: M85079)) 및 TGF베타RIII(TGF베타 타입 III 수용체(Lopez-Casillas, Cell, Vol. 67, No. 4, p. 785, 1991; GenBank Accession No: L07594)). TGF베타RI 및 TGF베타RII는 TGF-베타의 신호전달에 필수적인 것으로 밝혀진 반면(Laiho et al, J. Biol Chem., Vol. 265, p. 18518, 1990 and Laiho et al, J. Biol Chem., Vol. 266, p. 9108, 1991), TGF베타RIII는 필수적인 것으로 생각되지 않는다.
TGF베타 신호전달은 TGF베타RI 및 RII 둘 모두로의 TGF베타의 결합을 통해 매개된다. 리간드가 세포외 리간드 결합 도메인에 결합되는 경우, 2개의 수용체가 소집되어 RII가 RI을 인산화시키는 것을 가능케 하며, Smad 단백질의 인산화를 통해 신호전달 캐스케이드가 시작된다(상기 언급된 Shi and Massague 참조).
TGF베타의 3개의 이소형(isoform)이 포유동물에서 확인되었다: TGF베타1, TGF베타2, 및 TGF베타3. 각각의 이소형은 다기능성이고, 발달 과정을 위해 생체이용율을 조절하고, 조직 항상성을 유지시키기 위해 자가-조절 피드백 메커니즘으로 작용한다(Dijke and Arthur, Nature Reviews, Molecular Cell Biology, Vol. 8, Nov. 2007, p. 857-869 참조). TFG베타의 수준은 TGF베타 발현 뿐만 아니라 프로테오글리칸, 즉, 세포외기질(ECM)으로의 결합을 통한 조절에 의해 조절된다.
조절이상 TGF베타 신호전달, 예를 들어, 과량의 TGF베타 신호전달 및 높은 수준의 생체이용가능한 TGF베타는 다양한 조직의 섬유증, 예를 들어, 폐섬유증 및 경화증, 만성 간염, 류머티스 관절염, 안구 장애, 혈관 재협착, 피부의 켈로이드, 및 신장경화증의 발생을 포함하는 다수의 병상과 관련이 있다.
따라서, TGF베타 수용체 II로의 결합을 통하는 것과 같은 특정 방식으로 TGF베타 신호전달을 차단하거나 붕괴시키는 화합물을 제공하는 것이 필요하다. 이러한 화합물은 치료제로 사용될 수 있다.
발명의 개요
일 양태에서, 본 발명은 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다. 적합하게는, 첫번째 양태에 따른 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인은 10pM 내지 50nM, 바람직하게는 10pM 내지 10nM, 바람직하게는 250pM 내지 10nM 범위의 해리 상수(Kd)로 TGF베타RII에 결합하는 것이다. 일 구체예에서, 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인은 높은 친화성(높은 역가)으로 TGF베타RII에 결합하고, 10pM 내지 500pM의 해리 상수를 갖는 것이다. 또 다른 구체예에서, 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인은 중간의 친화성(낮은 역가)으로 TGF베타RII에 결합하고, 500pM 내지 50nM, 바람직하게는 500pM 내지 10nM의 해리 상수를 갖는 것이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 분리된 폴리펩티드를 제공한다. 적합하게는, 분리된 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1 내지 23에 기재된 아미노산 서열 중 임의의 서열의 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 70% 이상 동일하고, TGF베타RII에 결합하는 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, 분리된 폴리펩티드는 인간 TGF베타RII에 결합한다. 또 다른 구체예에서, 분리된 폴리펩티드는 또한 마우스, 개, 또는 원숭이, 예를 들어, 시노몰구스(cynomolgus) 원숭이(cyno)와 같은 상이한 종으로부터 유래된 TGF베타RII에 결합한다. 적합하게는, 분리된 폴리펩티드는 마우스 및 인간 TGF베타RII 둘 모두에 결합한다. 이러한 인간 및 다른 종으로부터의 TGF베타RII 사이의 교차반응성은 동일한 항체 작제물이 동물 질병 모델 뿐만 아니라 인간에서 사용되는 것을 가능케 한다.
일 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1 내지 23에 기재된 아미노산 서열의 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드를 제공한다. 일 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:4(DOM23h-271), 8(DOM23h-437) 또는 10(DOM23h-439) 중 임의의 것에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:24 내지 46에 기재된 핵산 서열 중 임의의 서열의 군으로부터 선택된 누클레오티드 서열과 60% 이상 동일하고, TGF베타RII에 결합하는 누클레오티드 서열에 의해 엔코딩되는 분리된 폴리펩티드를 제공한다. 적합하게는, 분리된 폴리펩티드는 인간 TGF베타RII에 결합한다.
또 다른 양태에서, SEQ ID NO:1 내지 23에 기재된 아미노산 서열 중 임의의 서열의 군으로부터 선택된 임의의 하나의 아미노산 서열의 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인이 제공된다. 일 구체예에서, 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인은 SEQ ID NO:1 내지 23에 기재된 아미노산 서열 중 임의의 서열의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인은 SEQ ID NO:4(DOM23h-271), 8(DOM23h-437) 또는 10(DOM23h-439) 중 임의의 것에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인은 SEQ ID NO:1 내지 23에 기재된 아미노산 서열 중 임의의 서열의 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게는, 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인은 TGF베타RII, 바람직하게는 인간 TGF베타RII에 결합한다.
또 다른 양태에서, 25개 이하의 아미노산 위치가 변형된 SEQ ID NO:1 내지 23에 기재된 아미노산 서열 중 임의의 하나의 서열의 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO:1 내지 23 중 어느 하나의 CDR1 서열과 50% 이상 동일한 CRD1 서열을 포함하는 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인이 제공된다.
추가 양태에서, 25개 이하의 아미노산 위치가 변형된 SEQ ID NO:1 내지 23에 기재된 아미노산 서열 중 임의의 하나의 서열의 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO:1 내지 23 중 어느 하나의 CDR2 서열과 50% 이상 동일한 CRD2 서열을 포함하는 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인이 제공된다.
추가 양태에서, 25개 이하의 아미노산 위치가 변형된 SEQ ID NO:1 내지 23에 기재된 아미노산 서열 중 임의의 하나의 서열의 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO:1 내지 23 중 어느 하나의 CDR3 서열과 50% 이상 동일한 CRD3 서열을 포함하는 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인이 제공된다.
추가 양태에서, 25개 이하의 아미노산 위치가 변형된 SEQ ID NO:1 내지 23에 기재된 아미노산 서열 중 임의의 하나의 서열의 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO:1 내지 23 중 어느 하나의 CDR1 서열과 50% 이상 동일한 CRD1 서열을 포함하고, SEQ ID NO:1 내지 23 중 어느 하나의 CDR2 서열과 50% 이상 동일한 CRD2 서열을 포함하는 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인이 제공된다.
또 다른 양태에서, 25개 이하의 아미노산 위치가 변형된 SEQ ID NO:1 내지 23에 기재된 아미노산 서열 중 임의의 하나의 서열의 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO:1 내지 23 중 어느 하나의 CDR1 서열과 50% 이상 동일한 CRD1 서열을 포함하고, SEQ ID NO:1 내지 23 중 어느 하나의 CDR3 서열과 50% 이상 동일한 CRD3 서열을 포함하는 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인이 제공된다.
또 다른 양태에서, 25개 이하의 아미노산 위치가 변형된 SEQ ID NO:1 내지 23에 기재된 아미노산 서열 중 임의의 하나의 서열의 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO:1 내지 23 중 어느 하나의 CDR2 서열과 50% 이상 동일한 CRD2 서열을 포함하고, SEQ ID NO:1 내지 23 중 어느 하나의 CDR3 서열과 50% 이상 동일한 CRD3 서열을 포함하는 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인이 제공된다.
또 다른 양태에서, 25개 이하의 아미노산 위치가 변형된 SEQ ID NO:1 내지 23에 기재된 아미노산 서열 중 임의의 하나의 서열의 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO:1 내지 23 중 어느 하나의 CDR1 서열과 50% 이상 동일한 CRD1 서열을 포함하고, SEQ ID NO:1 내지 23 중 어느 하나의 CDR2 서열과 50% 이상 동일한 CRD2 서열을 포함하고, SEQ ID NO:1 내지 23 중 어느 하나의 CDR3 서열과 50% 이상 동일한 CRD3 서열을 포함하는 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인이 제공된다.
추가 양태에서, SEQ ID NO:1 내지 23 중 어느 하나의 CDR3 서열로 구성된 군으로부터 선택된 CDR3 서열과 50% 이상 동일한 CDR3 서열을 포함하는 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인이 제공된다.
또 다른 양태에서, SEQ ID NO:1 내지 23 중 어느 하나의 CDR3 서열로 구성된 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 포함하는 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인이 제공된다.
또 다른 양태에서, CDR1, CDR2 및 CDR3로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 CDR을 포함하는 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인이 제공되며, 상기 CDR1, CDR2 또는 CDR3은 SEQ ID NO:1 내지 23 중 어느 하나의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 서열과 동일하다.
적합하게는, CDR 서열은 본원에 기재된 케이뱃(Kabat) 방법을 이용하여 결정된다. 일 구체예에서, 각각의 서열의 CDR 서열은 도 7에 기재된 것이다.
일 구체예에서, 다음과 같은 아미노산 중 임의의 아미노산을 포함하는 본 발명의 임의의 양태에 따른 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드가 제공된다: 면역글로불린 단일 가변 도메인의 위치 61에 N, 위치 64에 R, 위치 102에 H, 위치 39에 R, 위치 53에 D 또는 위치 103에 S. 일 구체예에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드는 상기 아미노산의 조합을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드는 위치 61에 N 및 위치 64에 R의 아미노산을 포함한다. 이러한 구체예에서, 아미노산 넘버링은, 예를 들어, SEQ ID NO:1 내지 23에 제공된 서열로 예시되는 바와 같이 면역글로불린 단일 가변 도메인의 아미노산 넘버링이다.
또 다른 양태에서, TGF베타RII에 대해 결합 특이성을 갖고, SEQ ID NO:1 내지 23의 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인의 결합을 억제하는 리간드 또는 결합 모이어티가 제공된다.
본 발명의 추가 양태에서, 본 발명의 임의의 양태에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드를 포함하는 융합 단백질이 제공된다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드, 리간드 또는 융합 단백질은 TGF베타 활성을 중화시키는 것이다. 적합하게는, 본 발명에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드는 TGF베타의 TGF베타RII로의 결합을 억제한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드는 TGF베타RII를 통한 TGF베타 신호전달 활성을 억제한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드는 TGF베타 활성, 특히, TGF베타 세포 성장 활성을 억제한다. 적합하게는, TGF베타RII는 인간 TGF베타RII이다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드, 리간드 또는 융합 단백질은 10 마이크로몰(μM)에서 TGF베타RII 효능제 활성이 결여된다.
또 다른 양태에서, 반감기 연장 모이어티를 추가로 포함하는 본 발명의 임의의 양태에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드, 리간드 또는 융합 단백질이 제공된다. 적합하게는, 반감기 연장 모이어티는 생체내에서 반감기를 향상시키는 폴리펩티드에 대한 결합 부위를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티, 혈청 알부민 또는 이의 단편, 트랜스페린 수용체 또는 이의 트랜스페린-결합 부분, 또는 항체 또는 항체 단편이다. 일 구체예에서, 반감기 연장 모이어티는 혈청 알부민 또는 신생아 Fc 수용체에 대한 결합 부위를 포함하는 항체 또는 항체 단편이다. 또 다른 구체예에서, 반감기 연장 모이어티는 dAb, 항체 또는 항체 단편이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 양태에 따른 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드, 리간드 또는 융합 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩하는 분리된 핵산 또는 재조합 핵산을 제공한다.
일 구체예에서, 분리된 핵산 분자 또는 재조합 핵산 분자는 SEQ ID NO:24 내지 46에 기재된 서열을 갖는 핵산 분자 중 임의의 분자의 군으로부터 선택된 핵산 분자를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 분리된 핵산 또는 재조합 핵산을 제공하며, 상기 핵산은 SEQ ID NO:24 내지 46에 기재된 서열을 갖는 핵산 분자 중 임의의 분자의 누클레오티드 서열과 70% 이상 동일한 누클레오티드 서열을 포함하고, 상기 핵산은 TGF베타RII에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩한다.
또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다.
추가 양태에서, 본 발명에 따른 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드 또는 리간드를 포함하는 폴리펩티드를 생성시키는 방법이 제공되며, 이러한 방법은 상기 핵산 또는 벡터의 발현에 적합한 조건하에서 본 발명에 따른 숙주 세포를 유지시킴으로써 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드, 폴리펩티드 또는 리간드를 생성시키는 단계를 포함한다. 임의로, 상기 방법은 폴리펩티드를 분리시키는 단계, 및 임의로 변이체, 예를 들어, 분리된 폴리펩티드 보다 표준 검정에서 개선된 친화성(Kd) 또는 TGF베타 중화에 대한 EC50을 갖는 돌연변이된 변이체를 생성시키는 단계를 추가로 포함한다. TGF베타 활성에 적합한 검정, 예를 들어, 세포 센서 검정이, 예를 들어, 실시예 섹션에 본원에 기재된다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명에 따른 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드는 약제로서 사용된다. 따라서, 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드를 포함하는 조성물이 제공된다.
적합하게는, 본 발명에 따른 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드 또는 조성물은 TGF베타 신호전달과 관련된 질병의 치료를 위한 것이다. 적합하게는, 상기 질병은 조직 섬유증, 예를 들어, 폐섬유증, 예를 들어, 특발성 폐섬유증, 간섬유증, 예를 들어, 경화증 및 만성 간염, 류머티스 관절염, 안구 장애, 또는 피부의 섬유증, 예를 들어, 피부의 켈로이드, 및 신장의 섬유증, 예를 들어, 신장염, 신장 섬유증 및 신경화증, 또는 혈관 질환, 예를 들어, 재협착이다. TGF베타 신호전달과 관려된 다른 질병은 혈관 질병, 예를 들어, 고혈압, 전자간증, 유전성 출혈성 모세혈관확장증 타입 I(HHT1), HHT2, 폐동맥 고혈압, 대동맥류, 마르팡 증후군(Marfan syndrome), 가족성 뇌동맥류 장애, 로이-디에츠 증후군(Loeys-Dietz syndrome), 동맥 비틀림 증후군(arterial tortuosity syndrome, ATS)을 포함한다. TGF베타 신호전달과 관련된 다른 질병은 근골격계의 질병, 예를 들어, 뒤시엔느 근위축증(Duchenne's muscular dystrophy) 및 근섬유증을 포함한다. TGF베타 신호전달과 관련된 추가 질병은 암, 예를 들어, 결장암, 위암 및 췌장암, 뿐만 아니라 신경교종 및 NSCLC를 포함한다. 또한, 본 발명은 종양 혈관형성에서 TGF베타 신호전달을 조절함으로써 암을 치료하는 방법을 제공한다. 다른 질병 또는 질환은 조직 흉터형성과 관련된 질병 또는 질환을 포함한다. 다른 질병은 폐 질병, 예를 들어, COPD(만성 폐쇄성 폐병)을 포함한다. 일 양태에서, 본 발명은 폐 전달을 위한 항-TGF베타RII 단일 가변 도메인 또는 길항제, 조성물 또는 융합 단백질을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 환자의 폐로의 전달을 위한 항-TGF베타RII 단일 가변 도메인 또는 길항제 또는 융합 단백질을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 폐 전달을 위한 약제의 제조에서의 항-TGF베타RII 단일 가변 도메인 또는 길항제 또는 융합 단백질의 용도를 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 환자의 폐로의 전달을 위한 약제의 제조에서의 본 발명에 따른 항-TGF베타RII 단일 가변 도메인 또는 길항제 또는 융합 단백질의 용도를 제공한다.
일 구체예에서, 가변 도메인 자체, 또는 길항제 또는 융합 단백질의 일부인 경우의 가변 도메인은 류코자임(leucozyme) 및/또는 트립신과 같은 프로테아제에 대해 내성이다.
일 구체예에서, 조성물은 폐 전달을 위한 것이다. 적합하게는, 조성물은 폐 전달을 위한 모노머 dAb를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 폐 전달을 위한 모노머 dAb로 구성된다.
적합하게는, 조성물은 폐 전달을 위한 것이거나, 인간에서 TGF베타-매개 질환의 예방을 위한 것이다.
따라서, 일 구체예에서, 특발성 폐섬유증을 치료하기 위한 항-TGF베타RII dAb가 제공된다. 적합하게는, 항-TGF베타RII dAb는 폐 전달을 위한 모노머 dAb, 바람직하게는 myc 또는 또 다른 정제 태그와 같은 임의의 태그가 결핍된(즉, 태깅되지 않은) 모노머 dAb로 제공된다.
일 양태에서, 조성물은 약학적 조성물이며, 이는 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 인간 환자에서 TGF베타-매개 질환을 치료하고/하거나 예방하는 방법에 제공되고, 이러한 방법은 상기 환자에게 본 발명에 따른 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 함유하는 폐 전달 장치를 제공한다. 적합하게는, 이러한 장치는 흡입기 또는 비내 투여 장치이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 본 발명에 따른 dAb의 아미노산(SEQ ID NO:1-23) 및 핵산(SEQ ID NO:24-46) 서열을 도시한다.
도 2는 DOM23h 나이브(naive) dAb 아미노산 서열의 정렬을 도시한다. 아미노산은 케이뱃에 따라 넘버링된다. CDR 서열은 굵고 밑줄친 글자로 표시된다. 도트는 DOM 23h-251(SEQ ID NO:2)에 대한 서열 동일성을 나타낸다.
도 3은 DOM23h-262(SEQ ID NO:3) 계통 아미노산 서열의 정렬을 도시한다. 아미노산은 케이뱃에 따라 넘버링된다. CDR 서열은 굵고 밑줄친 글자로 표시된다. 도트는 DOM 23h-262(SEQ ID NO:3)에 대한 서열 동일성을 나타낸다.
도 4는 DOM23h-271 계통 아미노산 서열(SEQ ID NO:4)의 정렬을 도시한다. 아미노산은 케이뱃에 따라 넘버링된다. CDR 서열은 굵고 밑줄친 글자로 표시된다. 도트는 DOM23h-271(SEQ ID NO:4)에 대한 서열 동일성을 나타낸다.
도 5는 DOM23h-437 계통 아미노산 서열(SEQ ID NO:4)의 정렬을 도시한다. 아미노산은 케이뱃에 따라 넘버링된다. CDR 서열은 굵고 밑줄친 글자로 표시된다. 도트는 DOM23h-437(SEQ ID NO:8)에 대한 서열 동일성을 나타낸다.
도 6은 DOM23h-439 계통 아미노산 서열(SEQ ID NO:10)의 정렬을 도시한다. 아미노산은 케이뱃에 따라 넘버링된다. CDR 서열은 굵고 밑줄친 글자로 표시된다. 도트는 DOM23h-439(SEQ ID NO:10)에 대한 서열 동일성을 나타낸다.
도 7은 CDR 서열을 상술하는 표를 도시한다.
도 8은 경쟁 비아코어(BIAcore)를 도시한다. DOM23h-437-6(SEQ ID NO:19)을 hTFGβ-RII-Fc 커플링된 칩상에 주입(주입 1)한 직후, DOM23h-437-6(SEQ ID NO:19) 및 DOM23h-271-3(SEQ ID NO:)의 혼합물(A) 또는 DOM23h-437-6(SEQ ID NO:19) 및 DOM23h-439-6(SEQ ID NO:22)의 혼합물(B)로 구성되는 주입 2를 주입하였다. 칩을 10mM 글리신 pH 2.25의 2회 주입(주입 3)을 이용하여 재생시켰다.
도 9는 경쟁 비아코어를 도시한다. DOM23h-437-9(SEQ ID NO:21)를 hTFGβ-RII-Fc 커플링된 칩상에 주입(주입 1)한 직후, DOM23h-437-9(SEQ ID NO:21) 및 DOM23h-262-10(SEQ ID NO:13)의 혼합물(C) 또는 DOM23h-437-9(SEQ ID NO:21) 및 DOM23h-271-12(SEQ ID NO:16)의 혼합물(D)로 구성되는 주입 2를 주입하였다. 칩을 10mM 글리신 pH 2.25의 2회 주입(주입 3)을 이용하여 재생시켰다.
도 10은 경쟁 비아코어를 도시한다. DOM23h-437-9(SEQ ID NO:21)을 hTFGβ-RII-Fc 커플링된 칩상에 주입(주입 1)한 직후, DOM23h-437-9(SEQ ID NO:21) 및 DOM23h-439-8(SEQ ID NO:23)의 혼합물(E)로 구성되는 주입 2를 주입하였다. 칩을 10mM 글리신 pH 2.25의 2회 주입(주입 3)을 이용하여 재생시켰다.
도 11은 서열 식별자 번호(SEQ ID NOs:) 및 이의 해당 확인을 나열하는 표를 도시한다.
발명의 상세한 설명
본 명세서 내에서, 본 발명은 명백하고 간결한 명세서가 기술되는 것을 가능케 하는 방식으로 구체예를 참조로 하여 기재되었다. 구체예는 본 발명을 벗어남이 없이 다양하게 조합되거나 분리되며, 이러한 사항이 인지되어야 한다.
달리 정의되지 않는 경우, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 당업자(예를 들어, 세포 배양, 분자유전학, 핵산 화학, 하이브리드화 기술 및 생화학 분야)에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 분자, 유전학 및 생화학 방법(일반적으로, 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Sambrook, et al ., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. and Ausubel, et al ., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc.] 참조) 및 화학적 방법에 대해 표준 기술이 사용된다.
면역글로불린: 본원에서 사용되는 용어 "면역글로불린"은 2개의 β 시트, 및 보통 보존된 이황화결합을 함유하는 항체 분자의 면역글로불린 폴드 특징을 보유한 폴리펩티드과를 의미한다.
도메인: 본원에서 사용되는 용어 "도메인"은 단백질의 나머지와는 무관한 3차 구조를 보유한 폴딩된 단백질 구조를 의미한다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 별개의 기능적 특성을 책임지며, 많은 경우에 단백질 및/또는 도메인의 나머지의 기능의 손실 없이 첨가되거나, 제거되거나, 다른 단백질로 옮겨질 수 있다. 단일 항체 가변 도메인 또는 면역글로불린 단일 가변 도메인은 항체 가변 도메인의 서열 특징을 포함하는 폴딩된 폴리펩티드 도메인을 의미한다. 따라서, 이는 완전한 항체 가변 도메인, 및 변형된 가변 도메인, 예를 들어, 하나 이상의 루프가 항체 가변 도메인의 특징을 이루지 않는 서열로 대체된 변형된 가변 도메인, 또는 트렁케이션되거나 N-말단 또는 C-말단 신장부를 포함하는 항체 가변 도메인, 뿐만 아니라 전장 도메인의 결합 활성 및 특이성을 적어도 부분적으로 보유하는 가변 도메인의 폴딩된 단편을 포함한다.
면역글로불린 단일 가변 도메인: 구 "면역글로불린 단일 가변 도메인"은 항체 가변 도메인(VH, VHH, VL) 또는 상이한 또는 다른 V 영역 또는 도메인과는 독립적으로 항체 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 의미한다. 면역글로불린 가변 도메인은 다른 가변 영역 또는 가변 도메인을 갖는 포맷(예를 들어, 동종-다합체 또는 이종-다합체)으로 존재할 수 있으며, 여기서 상기 다른 영역 또는 도메인은 단일 면역글로불린 가변 도메인에 의한 항원 결합(즉, 면역글로불린 단일 가변 도메인이 추가 가변 도메인과는 독립적으로 항원에 결합하는 경우)에 필요하지 않다. "도메인 항체" 또는 "dAb"는 "면역글로불린 단일 가변 도메인"이며, 이러한 용어가 본원에서 사용된다. "단일 항체 가변 도메인" 또는 "항체 단일 가변 도메인"은 "면역글로불린 단일 가변 도메인"과 동일하며, 이러한 용어가 본원에서 사용된다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은 한 구체예에서 인간 항체 가변 도메인이나, 이는 또한 설치류(예를 들어, WO 00/29004호에 기재됨, 이의 전체내용은 참조로서 본원에 포함됨), 너스 샤크(nurse shark) 및 카멜리드 VHH dAb와 같은 다른 종으로부터의 단일 항체 가변 도메인을 포함한다. 카멜리드 VHH는 경쇄가 자연적으로 결여된 중쇄 항체를 생성하는 낙타, 라마, 알파카, 단봉 낙타 및 과나코를 포함하는 종으로부터 유래된 면역글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드이다. VHH는 인간화될 수 있다.
본 발명의 모든 양태에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 항체 중쇄 및 경쇄 단일 가변 도메인, 예를 들어, VH, VL 및 VHH로부터 독립적으로 선택된다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 항체를 자연적으로 생성하는 임의의 종으로부터 유래되거나, 재조합 DNA 기술에 의해 생성되는지의 여부, 및, 예를 들어, 혈청, B-세포, 하이브리도마, 트랜스펙토마(transfectoma), 효모 또는 박테리아로부터 분리되는지의 여부와 상관없이 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 또는 이의 단편(예를 들어, Fab, F(ab'), Fv, 이황화 결합된 Fv, scFv, 밀폐 형태 다중특이성 항체, 이황화 결합된 scFv, 디아바디(diabody))을 의미한다.
항체 포맷: 일 구체예에서, 본 발명에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드는 임의의 항체 포맷으로 제공될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "항체 포맷"은 구조 상의 항원에 대한 결합 특이성을 부여하기 위해 하나 이상의 항체 가변 도메인이 통합될 수 있는 임의의 적합한 폴리펩티드 구조를 의미한다. 다양한 적합한 항체 포맷, 예를 들어, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 단쇄 항체, 이특이적 항체, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 동종이합체 및 이종이합체, 상기 중 임의의 것의 항원 결합 단편(예를 들어, Fv 단편(예를 들어, 단쇄 Fv(scFv), 이황화 결합된 Fv), Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편), 단일 항체 가변 도메인(예를 들어, dAb, VH, VHH, VL), 및 상기 중 임의의 것의 변형된 형태(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 적합한 중합체 또는 인간화 VHH의 공유 부착에 의해 변형)가 당 분야에 공지되어 있다. 일 구체예에서, 대안적 항체 포맷은 본 발명에 따른 임의의 분자의 CDR이 적합한 단백질 스캐폴드 또는 골격, 예를 들어, 어피바디, SpA 스캐폴드, LDL 수용체 클래스 A 도메인, 아비머(예를 들어, 미국 출원 공개 번호 2005/0053973호, 2005/0089932호, 2005/0164301호 참조) 또는 EGF 도메인에 이식될 수 있는 대안적 스캐폴드를 포함한다. 추가로, 리간드는 본원에 기재된 바와 같이 2가(이종 2가) 또는 다가(이종 다가)일 수 있다. 다른 구체예에서, "유니버셜 프레임워크(Universal framework)"가 사용될 수 있고, 여기서 "유니버셜 프레임워크"는 케이뱃에 의해 정의("Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services) 된 바에 따라 서열 내에 보존된 항체의 영역, 또는 초티아 및 레스크(Chothia and Lesk)(Chothia and Lesk, (1987) J MoI. Biol. 196:910-917)에 의해 정의된 바에 따라 인간 점라인(germline) 면역글로불린 레퍼토리 또는 구조에 해당하는 단일 항체 프레임워크 서열을 의미한다. 본 발명은 과가변 영역 단독에서의 변이를 통해 사실상 임의의 결합 특이성의 유도를 가능케 하는 것으로 밝혀진 단일 프레임워크 또는 이러한 프레임워크의 세트의 용도를 제공한다.
본 개시를 통해 기재된 본 발명의 구체예에서, 본 발명의 펩티드 또는 리간드에서의 항-TGF베타RII "dAb"의 사용 대신, 당업자가 TGF베타RII에 결합하는 본 발명의 dAb의 CDR(예를 들어, 적합한 단백질 스캐폴드 또는 골격, 예를 들어, 어피바디, SpA 스캐폴드, LDL 수용체 클래스 A 도메인 또는 EGF 도메인에 이식된 CDR) 중 하나 이상 또는 3개 모두를 포함하는 폴리펩티드 또는 도메인을 사용할 수 있는 것이 예측된다. 따라서, 전체로서 상기 개시는 dAb 대신에 상기 도메인을 이용하는 폴리펩티드의 개시를 제공하는 것으로 간주되어야 한다. 이와 관련하여, 개시가 참조로서 본원에 포함되는 WO2008096158호를 참조하라.
일 구체예에서, 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인은 임의의 적합한 면역글로불린 가변 도메인이며, 이는 임의로 인간 가변 도메인, 또는 인간 프레임워크 영역(예를 들어, DP47 또는 DPK9 프레임워크 영역)을 포함하거나, 이로부터 유래되는 가변 도메인이다.
항원: 본원에 기재되는 용어 "항원"은 본 발명에 따른 결합 도메인에 의해 결합되는 분자이다. 통상적으로, 항원은 항체 리간드에 의해 결합되고, 생체내에서 항체 반응을 발생시킬 수 있다. 예를 들어, 이는 폴리펩티드, 단백질, 핵산 또는 다른 분자일 수 있다.
에피토프: "에피토프"는 면역글로불린 VH/VL 쌍에 의해 통상적으로 결합되는 구조의 단위이다. 에피토프는 항체에 대한 최소 결합 부위로 규정되며, 따라서 항체 특이성의 표적이다. 단일 도메인 항체의 경우, 에피토프는 분리시 가변 도메인에 의해 결합되는 구조의 단위이다.
결합: 통상적으로, 특이적 결합은 50 나노몰 이하, 임의로 250 피코몰 이하의 해리 상수(Kd)로 표시된다. 항원 또는 에피토프로의 항원 결합 단백질의 특이적 결합은 적합한 검정, 예를 들어, 스캐차드 분석(Scatchard analysis) 및/또는 경쟁 결합 검정, 예를 들어, 방사선면역측정법(RIA), 효소면역분석법, 예를 들어, ELISA 및 샌드위치 경쟁 검정, 및 이들의 다양한 변형에 의해 결정될 수 있다.
결합 친화성: 결합 친화성은 표면 플라즈몬 공명(SPR), 및 비아코어 시스템(Biacore system)(Uppsala, Sweden)을 이용하는 비아코어(Biacore)(Karlsson et al., 1991)를 이용하여 임의로 결정된다. 비아코어 시스템은 실시간으로 생체분자 상호작용을 모니터하기 위해 표면 플라즈몬 공명(SPR, Welford K. 1991, Opt. Quant. Elect. 23:1; Morton and Myszka, 1998, Methods in Enzymology 295: 268)을 이용하고, 300 nm 이하로 떨어진 표면의 굴절률에서의 변화의 결과로서 유리 지지체 상의 얇은 금 필름의 표면에서의 광의 공명각에서의 변화를 검출할 수 있는 표면 플라즈몬 공명을 이용한다. 비아코어 분석은 편리하게 결합 속도 상수, 해리 속도 상수, 평형 해리 상수, 및 친화 상수를 생성시킨다. 결합 친화성은 비아코어 표면 플라즈몬 공명 시스템을 이용하여 결합 및 해리 속도 상수를 평가함으로써 수득된다(Biacore, Inc.). 바이오센서 칩은 제조업체(Biacore) 설명서에 따라 표적의 공유 커플링에 대해 활성화된다. 이후, 표적은 희석되고, 칩 상에 주입되어, 고정된 물질의 단위에 반응하여 신호가 수득된다. 공명 단위(RU)의 신호는 고정된 물질의 부피(mass)에 비례하므로, 이러한 신호는 매트릭스 상의 고정된 표적 밀도 범위이다. 해리 데이터는 koff +/- s.d.(측정의 표준 편차)를 수득하기 위해 단일-영역 모델(one-site model)로 적합화된다. 각각의 결합 곡선에 대해 유사 일차 속도 상수(Pseudo-first order rate constant)(Kd's)가 계산되고, kon +/- s.e.(적합도의 표준 오차)를 수득하기 위해 단백질 농도의 함수로 플로팅된다. 결합에 대한 평형 해리 상수인 Kd's가 koff/kon로서 SPR 측정으로부터 계산된다.
본 발명의 또 다른 양태는 인간 TGF베타RII에 특이적으로 결합하는 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다. 일 구체예에서, 가변 도메인은 약 50nM, 40nM, 30nM, 20nM, 10nM 이하, 임의로 약 9, 8, 7, 6 또는 5nM 이하, 임의로 약 4 nM 이하, 약 3 nM 이하 또는 약 2 nM 이하 또는 약 1 nM 이하, 임의로 약 500pM 이하의 해리 상수(Kd)로 인간 TGF베타RII에 결합한다. 적합하게는, 가변 도메인이 약 50nM 내지 500pM 범위의 해리 상수를 갖는 경우, 폐와 같은 관심 조직으로의 국소 투여에 특히 적합하다. 이러한 구체예에서, 고농도의 상기 "중간 친화성"의 결합체가 효과적인 치료제로 제공될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 가변 도메인은 약 50OpM 이하, 임의로 약 450pM, 400pM, 350pM, 300pM, 250pM, 200pM, 150pM, 100pM, 50pM 이하, 임의로 약 40pM, 30pM, 20pM, 10pM 이하의 해리 상수(Kd)로 인간 TGF베타RII에 결합한다. 적합하게는, 가변 도메인이 약 500pM 내지 10pM 범위의 해리 상수를 갖는 경우, 임의의 하나의 관심 조직에서의 양이 효과적인 치료를 제공하기에 충분하도록 하는 전신 투여에 특히 적합하다. 이러한 구체예에서, 저농도의 상기 "고친화성" 결합체가 효과적인 치료제로 제공될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 단일 가변 도메인은 인간 TGF베타RII와 또 다른 종으로부터의 TGF베타RII, 예를 들어, 마우스 TGF베타RII 사이의 교차 반응성을 나타낸다. 이러한 구체예에서, 가변 도메인은 인간 및 마우스 TGF베타RII에 특이적으로 결합한다. 이는, 약물 개발이 통상적으로 이러한 약물이 인간에서 시험되기 전에 마우스 시스템에서 선도 약물 후보자의 시험을 필요로 하므로 특히 유용하다. 인간 및 마우스 종에 결합할 수 있는 약물의 공급은 상기 시스템의 결과를 시험하고, 동일한 약물을 이용하여 데이터의 병행(side-by-side) 비교를 가능케 한다. 이는 마우스 TGF베타RII에 대해 작용하는 약물 및 인간 TGF베타RII에 대해 작용하는 별개의 약물을 찾을 필요의 복잡성을 회피하며, 또한 동일하지 않은 약물을 이용한 인간 및 마우스에서의 결과를 비교할 필요성을 회피한다. 개 또는 원숭이, 예를 들어, 시노몰구스 원숭이와 같은 질병 모델에서 이용되는 다른 종 사이의 교차 반응성이 또한 예견된다.
임의로, 적어도 마우스 TGF베타RII에 대한 면역글로불린 단일 가변 도메인의 결합 친화성 및 인간 TGF베타RII에 대한 결합 친화성은 10배, 50배 또는 100배 이하로 상이하다.
CDR: 본원에 기재된 면역글로불린 단일 가변 도메인(dAb)은 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 함유한다. CDR 및 프레임워크(FR) 영역의 위치 및 넘버링 시스템은 케이뱃 등(Kabat et al.)의 문헌[Kabat, E. A. et al ., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)]에 정의되어 있다. 본원에 개시된 VH(CDRH1 등) 및 VL(CDRL1 등)(Vκ) dAb의 CDR(CDR1, CDR2, CDR3)의 아미노산 서열은 널리 공지된 케이뱃 아미노산 넘버링 시스템 및 CDR의 규정을 기초로 하여 당업자에게 용이한 것이 명백할 것이다. 서열 변이성을 기초로 하여 가장 통상적으로 사용되는 방법인 케이뱃 넘버링 시스템에 따르면, 중쇄 CDR-H3는 다양한 길이를 갖고, 삽입부가 K까지의 문자를 이용하여 잔기 H100과 H101 사이에서 넘버링된다(즉, H100, H100A ... H100K, H101). CDR은 대안적으로 다음과 같이 초티아의 시스템(구조적 루프 영역의 위치를 기초로 함)(Chothia et al., (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p877-883)을 이용하거나, AbM(케이뱃과 초티아 사이의 절충)에 따르거나, 접촉(Contact) 방법(결정 구조 및 항원과 접촉하는 잔기의 예측을 기초로 함)에 따라 결정될 수 있다. CDR을 결정하기 위한 적합한 방법에 대해, http://www.bioinf.org.uk/abs/를 참조하라.
각각의 잔기가 넘버링된 후, 하기의 CDR 정의가 적용될 수 있다:
케이뱃:
CDR H1: 31-35/35A/35B
CDR H2: 50-65
CDR H3: 95-102
CDR L1: 24-34
CDR L2: 50-56
CDR L3: 89-97
초티아:
CDR H1: 26-32
CDR H2: 52-56
CDR H3: 95-102
CDR L1: 24-34
CDR L2: 50-56
CDR L3: 89-97
AbM:
(케이뱃 넘버링 이용): (초티아 넘버링 이용):
CDR H1: 26-35/35A/35B 26-35
CDR H2: 50-58 -
CDR H3: 95-102 -
CDR L1: 24-34 -
CDR L1: 50-56 -
CDR L3: 89-97 -
접촉
(케이뱃 넘버링 이용): (초티아 넘버링 이용):
CDR H1: 30-35/35A/35B 30-35
CDR H2: 47-58 -
CDR H3: 93-101 -
CDR Ll: 30-36 -
CDR L2: 46-55 -
CDR L3: 89-96 -
("-"는 케이뱃과 동일한 넘버링을 의미한다.)
TGF 베타 RII: 본원에서 사용되는 용어 "TGF베타RII"(전환 성장 인자 베타 타입 II 수용체; TGFβRII)는 자연 발생 또는 내인성 포유동물 TGF베타RII 단백질, 및 자연 발생 또는 내인성의 상응하는 포유동물 TGF베타RII 단백질과 동일한 아미노산을 갖는 단백질(예를 들어, 재조합 단백질, 합성 단백질(즉, 합성 유기 화학 방법을 이용하여 생성됨))을 의미한다. 따라서, 본원에서 정의되는 바와 같은 상기 용어는 성숙 TGF베타RII 단백질, 다형태 또는 대립유전자 변이체, 및 TGF베타RII의 다른 이소형 또는 상기의 변형되지 않은 형태(예를 들어, 지질화, 당화 형태)를 포함한다. 자연 발생 또는 내인성 TGF베타RII는 야생형 단백질, 예를 들어, 성숙 TGF베타RII, 다형태 또는 대립유전자 변이체 및 다른 이소형 및 포유동물(예를 들어, 인간, 비인간 영장류)에서 자연 발생하는 돌연변이 형태를 포함한다. 이러한 단백질은, 예를 들어, 자연적으로 TGF베타RII를 발현하는 공급원으로부터 회수되거나 분리될 수 있다. 이러한 단백질 및 자연 발생 또는 내인성의 상응하는 TGF베타RII와 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질은 상응하는 포유동물의 명칭으로 언급된다. 예를 들어, 상응하는 포유동물이 인간인 경우, 단백질은 인간 TGF베타RII로 명명된다. 인간 TGF베타RII는, 예를 들어, 문헌[Lin, et al ., Cell 1992, Vol. 68(4), p.775-785] 및 유전자 은행(GenBank) 등록 번호 M85079호에 의해 기재된다.
인간 TGF베타RII는 약 159개의 아미노산의 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 및 신호전달을 위한 단백질 키나제 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 갖는 567개의 아미노산으로 구성되는 막횡단 수용체이다.
본원에서 사용되는 용어 "TGF베타RII"는 또한 TGF베타RII의 부분 또는 단편을 포함한다. 일 구체예에서, 이러한 부분 또는 단편은 TGF베타RII의 세포외 도메인 또는 이의 부분을 포함한다.
면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드, 리간드, 융합 단백질 등과 관련하여 "항-TGF베타RII"는 TGF베타RII를 인지하고 이에 결합하는 모이어티를 의미한다. 일 구체예에서, "항-TGF베타RII"는 단백질 TGF베타RII, 및 적합하게는 인간 TGF베타RII를 특이적으로 인지하고/하거나 이에 특이적으로 결합한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인은 또한 마우스 TGF베타RII에 결합한다(GenBank accession number NM_029575; 예를 들어, Massague et al., Cell 69 (7), 1067-1070 (1992)에 기재됨).
"TGF베타"는 TGF베타1, TGF베타2 및 TGF베타3와 같은 이소형을 포함한다.
TGF베타는 TGF베타RII에 결합하고, TGF베타RI와의 복합체에서 신호전달 경로를 개시한다. 따라서, TGF베타 활성 및 TGF베타 활성의 억제 또는 중화가 TGF베타 신호전달의 산출을 측정하는 임의의 검정을 통해 결정될 수 있다. TGF베타 신호전달은, 예를 들어, 문헌[Itoh , et al ., Eur . J. Biochem 2000, Vol. 267, p.6954; Dennler, et al ., Journal of Leucocyte Biol. 2002, 71(5), p. 731-40]에 개관되어 있다. 따라서, TGF베타 활성은 당업자에게 친숙한 다수의 상이한 검정으로 시험될 수 있다. "억제" 또는 "중화"는 TGF베타의 생물학적 활성이 면역글로불린 단일 가변 도메인의 부재하에서의 TGF베타의 활성에 비해 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인의 존재하에서 전체적 또는 부분적으로 감소되는 것을 의미한다.
일 구체예에서, TGF베타 활성의 억제 또는 중화는 IL-11 방출 검정으로 시험된다. 이러한 구체예에서, 본 발명에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인의 능력이 A549 세포와 같은 세포로부터의 인간 TGF베타1(TGF베타1; TGF-β1) 자극 IL-11 방출을 억제하는 능력에 대해 시험된다. TGF베타1(TGF-β1)은 TGF베타RII(TGF-βRII)에 직접적으로 결합하고, TGF베타RI/RII(TGF-βRI/II) 복합체의 어셈블리를 유도한다. TGF베타RI(TGF-βRI)은 인산화되고, Smad4 경로를 포함하는 여러 경로를 통해 신호전달할 수 있다. Smad4 경로의 활성화는 IL-11의 방출을 발생시킨다. IL-11은 세포 상층액으로 분비된 후, 비색 ELISA에 의해 측정된다. 적합한 IL-11 방출 검정은 본원, 예를 들어, R & D 시스템즈(R & D systems)에 의해 공급되는 인간 IL-11 퀀티카인(Quantikine) ELISA 검정 키트(ref. D1100)에 기재되어 있다.
또 다른 구체예에서, TGF베타 활성은 MC3T3-E1 루시퍼라제 검정에서 MC3T3-E1 세포에서 CAGA-루시퍼라제의 TGF베타-유도 발현을 억제하는 본 발명에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인의 능력에 대해 검정에서 시험된다. CAGA 박스(CAGA box)로 언급되는 TGF베타-반응성 서열 모티프의 3개의 카피가 인간 PAI-I 프로모터에 존재하며, Smad3 및 4 단백질에 특이적으로 결합한다. 루시퍼라제 리포터 작제물로의 다수의 카피의 CAGA 박스의 클로닝은 리포터 시스템으로 트랜스펙션된 세포에 TGF베타 반응성을 부여한다. 하나의 적합한 검정이 본원에 기재되며, 이는 [CAGA]12-루시퍼라제 리포터 작제물로 안정적으로 트랜스펙션된 MC3T3-E1 세포(마우스 골모세포)를 이용한다(Dennler, et ah, (1998) EMBO J. 17, 3091-3100).
다른 적합한 검정은 인간 SBE 베타-락타마제 세포 검정(INVITROGENR, 세포 센서 검정)을 포함한다. 적합한 검정의 예가 본원에 기재된다.
적합하게는, 본 발명에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드, 리간드 또는 융합 단백질은 자체가 TGF베타RII 수용체 신호전달을 활성화시키지 않는다. 따라서, 일 구체예에서, 본 발명에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드, 리간드 또는 융합 단백질은 10 μM에서 효능제 활성이 결여된다. 효능제 활성은 TGF베타의 부재하에서 본원에 기재된 TGF베타RII 검정에서 관심 화합물을 시험함으로써 결정될 수 있다. TGF베타가 부재인 경우, 관심 화합물의 효능제 활성은 TGF베타RII 신호전달을 검출함으로써 검출된다.
상동성: 본원에 개시된 서열과 유사하거나 상동성(예를 들어, 약 70% 이상의 서열 동일성)인 서열이 또한 본 발명의 일부이다. 일부 구체예에서, 아미노산 수준에서의 서열 동일성은 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 이 이상일 수 있다. 핵산 수준에서, 서열 동일성은 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 이 이상일 수 있다. 대안적으로, 핵산 세그먼트가 선택적 하이브리드화 조건(예를 들어, 매우 높은 엄격성의 하이브리드화 조건)하에서 이의 가닥의 상보체에 하이브리드되는 경우에 충분한 동일성이 존재한다. 핵산은 전체 세포, 세포 용해질, 또는 부분적으로 정제되거나 충분히 순수한 형태로 존재할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "낮은 엄격성", "중간 엄격성", "높은 엄격성" 또는 "매우 높은 엄격성"의 조건은 핵산 하이브리드화 및 세척 조건을 기재한다. 하이브리드화 반응을 수행하기 위한 지침은 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]의 최근의 프로토콜에서 발견될 수 있다. 수성 및 비수성 방법이 상기 참조에 기재되어 있으며, 이용될 수 있다. 본원에서 언급되는 특정 하이브리드화 조건은 다음과 같다: (1) 약 45℃에서 6X 염화나트륨/구연산나트륨(SSC) 중에서의 낮은 엄격성의 하이브리드화 조건 후, 50℃에서의 0.2X SSC, 0.1% SDS 중에서의 2회 세척(세척 온도는 낮은 엄격성 조건에 대해 55℃로 증가될 수 있음); (2) 약 45℃에서의 6X SSC 중에서의 중간 엄격성의 하이브리드화 조건 후, 60℃에서의 0.2X SSC, 0.1% SDS 중에서의 1회 이상의 세척; (3) 약 45℃에서의 6X SSC 중에서의 높은 엄격성의 하이브리드화 조건 후, 65℃에서의 0.2X SSC, 0.1% SDS 중에서의 1회 이상의 세척; 및 임의로 (4) 65℃에서 0.5M 인산나트륨, 7% SDS 중에서의 매우 높은 엄격성의 하이브리드화 조건 후, 65℃에서 0.2X SSC, 1% SDS에서의 1회 이상의 세척. 매우 높은 엄격성의 조건 (4)가 바람직한 조건이며, 달리 특정되지 않는 경우 사용되는 조건이다.
두개의 서열 사이의 "상동성" 또는 "서열 동일성" 또는 "유사성"(이러한 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용됨)의 계산은 다음과 같이 수행된다. 서열은 최적 비교 목적을 위해 정렬된다(예를 들어, 최적 정렬을 위해 첫번째 및 두번째 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘모두에 갭이 도입될 수 있고, 비-상동 서열이 비교 목적을 위해 무시될 수 있다). 일 구체예에서, 비교 목적을 위해 정렬된 참조 서열의 길이는 참조 서열의 약 30% 이상, 임의로 약 40% 이상, 임의로 약 50% 이상, 임의로 약 60% 이상, 및 임의로 약 70%, 80%, 90% 이상, 또는 100%의 길이이다. 상응하는 아미노산 위치 또는 누클레오티드 위치의 아미노산 잔기 또는 누클레오티드가 이후에 비교된다. 첫번째 서열의 위치가 두번째 서열의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 누클레오티드에 의해 차지되는 경우, 분자는 이러한 위치에서 동일하다(본원에서 사용되는 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 "상동성"은 아미노산 또는 핵산 "동일성"과 동등하다). 두개의 서열 사이의 동일석 퍼센트는 두개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입되는 것이 필요한 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려하여, 서열에 의해 공유되는 동일 위치의 수의 함수이다.
본원에 정의된 아미노산 및 누클레오티드 서열 정렬 및 상동성, 유사성 또는 동일성은 디폴트(default) 파라미터를 이용하는 알고리즘 BLAST 2 BLAST 2 시퀀시즈(Sequences)(Tatusova, T. A. et al ., FEMS Microbiol Lett, 174:187-188 (1999))를 이용하여 임의로 제조되고 결정된다. 대안적으로, 디폴트 값에 대한 파라미터 세트를 갖는 BLAST 알고리즘(버전 2.0)이 서열 정렬에 사용된다. BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)는 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx에 의해 이용되는 발견적 검색 알고리즘이며, 이러한 프로그램은 문헌[Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(6):2264-8]의 통계적 방법을 이용한 발견에 의의를 둔다.
리간드: 본원에서 사용되는 용어 "리간드"는 TGF베타RII에 대한 결합 특이성을 갖는 결합 부위를 갖는 하나 이상의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 모이어티를 포함하는 화합물을 의미한다. 리간드는 또한 "결합 모이어티"로 언급될 수 있다.
본 발명에 따른 리간드 또는 결합 모이어티는 임의로 다양한 결합 특이성을 갖는 면역글로불린 가변 도메인을 포함하고, 표적 화합물에 대한 결합 부위를 함께 형성하는 가변 도메인 쌍을 함유하지 않는다(즉, TGF베타RII에 대한 결합 부위를 함께 형성하는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 및 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함하지 않는다). 임의로, 표적에 대한 결합 특이성을 갖는 결합 부위를 갖는 각각의 도메인은 요망되는 표적(예를 들어, TGF베타RII)에 대한 결합 특이성을 갖는 면역글로불린 단일 가변 도메인(예를 들어, 면역글로불린 단일 중쇄 가변 도메인(예를 들어, VH, VHH), 면역글로불린 단일 경쇄 가변 도메인(예를 들어, VL))이다.
따라서, "리간드"는 두개 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 각각의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 상이한 표적에 결합한다. 리간드는 또한 두개 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드 또는 본원에 기재된 바와 같은 적합한 포맷, 예를 들어, 항체 포맷(예를 들어, IgG-유사 포맷, scFv, Fab, Fab', F(ab')2)의 다양한 표적에 결합하는 단일 가변 도메인의 CDR 서열 또는 적합한 단백질 스캐폴드 또는 골격, 예를 들어, 어피바디, SpA 스캐폴드, LDL 수용체 클래스 A 도메인, EGF 도메인, 아비머(avimer) 및 이중특이적 및 다중측이적 리간드를 포함한다.
표적(예를 들어, TGF베타RII)에 대한 결합 특이성을 갖는 결합 부위를 갖는 폴리펩티드 도메인은 또한 요망되는 표적에 대한 결합 부위를 포함하는 단백질 도메인일 수 있고, 예를 들어, 단백질 도메인은 어피바디, SpA 도메인, LDL 수용체 클래스 A 도메인, 아비머로부터 선택된다(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2005/0053973호, 2005/0089932호, 2005/0164301호 참조). 요망시, "리간드"는 각각 독립적으로 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 모이어티 또는 비-펩티드 모이어티(예를 들어, 폴리알킬렌 글리콜, 지질, 탄수화물)일 수 있는 하나 이상의 추가 모이어티를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 리간드는 본원에 기재된 반감기 연장 모이어티(예를 들어, 폴리알킬렌 글리콜 모이어티, 알부민, 알부민 단편 또는 알부민 변이체를 포함하는 모이어티, 트랜스페린, 트랜스페린 단편 또는 트랜스페린 변이체를 포함하는 모이어티, 알부민에 결합하는 모이어티, 신생아 Fc 수용체에 결합하는 모이어티)를 추가로 포함할 수 있다.
경쟁하다: 본원에서 언급되는 용어 "경쟁하다"는 첫번째 표적(예를 들어, TGF베타RII)의 이의 동족 표적 결합 도메인(예를 들어, 면역글로불린 단일 가변 도메인)으로의 결합이 상기 동족 표적에 특이적인 두번째 결합 도메인(예를 들어, 면역글로불린 단일 가변 도메인)의 존재하에서 억제되는 것을 의미한다. 예를 들어, 결합은, 예를 들어, 결합 도메인의 물리적 봉쇄 또는 결합 도메인의 구조 또는 환경의 변경에 의해 입체구조적으로 방해되어, 이의 표적에 대한 친화성 또는 결합성이 감소될 수 있다. 첫번째 및 두번째 결합 도메인 사이의 경쟁을 결정하기 위한 경쟁 ELISA 및 경쟁 비아코어 실험을 수행하는 방법의 세부사항에 대해서는 WO2006038027호를 참조하며, 이의 세부사항은 본 발명에 사용하기 위한 명백한 개시를 제공하기 위해 참조로서 본원에 포함된다.
TGF 베타 신호전달: 적합하게는, 본 발명의 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드는 TGF베타RII를 통해 TGF베타 신호전달을 중화시킬 수 있다. "중화하는"은 TGF베타의 정상적인 신호전달 효과가 봉쇄되어, TGF베타의 존재가 TGF베타RII 신호전달에 대한 중화 효과를 갖는 것을 의미한다. 중화 효과를 측정하는 적합한 방법은 본원에 기재된 바와 같은 TGF베타 신호전달에 대한 검정을 포함한다. 일 구체예에서, 중화는 TGF베타 신호전달 검정에서의 TFG베타 활성의 억제%로 관찰된다. 일 구체예에서, 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드는 TGF베타RII의 세포외 도메인에 결합함으로써, TGF베타의 TGF베타RII의 세포외 도메인으로의 결합을 억제/차단한다. 적합하게는, 과량의 생체이용가능한 TGF베타, 및 TGF베타의 이의 동족 수용체 TGF베타RII로의 결합의 억제를 통해 생체이용가능한 TGF베타의 신호전달 활성을 억제하는데 도움이 되는 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드가 존재하는 경우에 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드가 유용하다.
본원에서 사용되는 용어 "TGF베타RII의 길항제" 또는 "항-TGF베타RII 길항제" 등은 TGF베타RII에 결합하고, TGF베타RII의 기능(즉, 하나 이상의 기능)을 억제할 수 있는 작용제(예를 들어, 분자, 화합물)를 의미한다. 예를 들어, TGF베타RII의 길항제는 TGF베타RII로의 TGF베타의 결합을 억제할 수 있고/있거나, TGF베타RII를 통해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있다. 따라서, TGF베타-매개 과정 및 세포 반응이 TGF베타RII의 길항제로 억제될 수 있다.
일 구체예에서, TGF베타RII에 결합하는 리간드(예를 들어, 면역글로불린 단일 가변 도메인)는 약 10 μM 이하, 약 1 μM 이하, 약 100 nM 이하, 약 50 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 5 nM 이하, 약 1 nM 이하, 약 500 pM 이하, 약 300 pM 이하, 약 100 pM 이하, 또는 약 10 pM 이하의 억제 농도 50(IC50)으로 TGF베타의 TGF베타RII 수용체로의 결합을 억제한다. IC50은 임의로 시험관내 TGF베타 수용체 결합 검정, 또는 세포 검정, 예를 들어, 본원에 기재된 검정을 이용하여 결정된다.
또한, 리간드(예를 들어, 면역글로불린 단일 가변 도메인)가 임의로 약 10 μM 이하, 약 1 μM 이하, 약 100 nM 이하, 약 50 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 5 nM 이하, 약 1 nM 이하, 약 500 pM 이하, 약 300 pM 이하, 약 100 pM 이하, 약 10 pM 이하, 약 1 pM 이하, 약 500 fM 이하, 약 300 fM 이하, 약 100 fM 이하, 약 10 fM 이하의 중화 용량 50(ND50)으로 적합한 시험관내 검정에서 TGF베타RII 유도 기능을 억제하는 것이 예측된다.
"이중 특이적 리간드 ": 일 구체예에서, 본 발명에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드는 첫번째 항원 또는 에피토프 결합 부위(예를 들어, 첫번째 면역글로불린 단일 가변 도메인) 및 두번째 항원 또는 에피토프 결합 부위(예를 들어, 두번째 면역글로불린 단일 가변 도메인)을 포함하는 리간드를 의미하는 "이중 특이적 리간드"의 일부일 수 있고, 여기서 상기 결합 부위 또는 가변 도메인은 단일특이적 면역글로불린에 의해 일반적으로 결합되지 않는 동일 항원 상의 두개의 항원(예를 들어, 상이한 항원 또는 두개 카피의 동일 항원) 또는 두개의 에피토프에 결합할 수 있다. 예를 들어, 두개의 에피토프는 동일한 항원 상에 존재할 수 있으나, 동일한 에피토프는 아니며, 단일특이적 리간드에 의해 결합되기에 충분히 인접되지 않는다. 일 구체예에서, 본 발명에 따른 이중 특이적 리간드는 상이한 특이성을 갖는 결합 부위 또는 가변 도메인으로 구성되며, 이는 동일한 특이성을 갖는(즉, 단일한 결합 부위를 형성하지 않는) 상호 상보적인 가변 도메인 쌍(즉, VH/VL 쌍)을 함유하지 않는다.
일 구체예에서, "이중 특이적 리간드"는 TGF베타RII 및 또 다른 표적 분자에 결합할 수 있다. 예를 들어, 또 다른 표적 분자는 조직 특이적 표적 분자일 수 있어, 본 발명의 이중 특이적 리간드는 본 발명에 따른 항-TGF베타RII 폴리펩티드 또는 면역글로불린 단일 가변 도메인이 관심 조직에 표적화되는 것을 가능케 한다. 이러한 조직은 폐, 간 등을 포함한다.
본 발명의 리간드(예를 들어, 폴리펩티드, dAb 및 길항제)는 두번째 면역글로불린 단일 가변 도메인에 직접 융합된 첫번째 면역글로불린 단일 가변 도메인을 함유하는 융합 단백질로 포맷화될 수 있다. 요망시, 이러한 포맷은 반감기 연장 모이어티를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 리간드는 혈청 알부민에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인에 직접 융합된 두번째 면역글로불린 단일 가변 도메인에 직접 융합된 첫번째 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함할 수 있다.
일반적으로, 표적에 대한 결합 특이성을 갖는 결합 부위를 갖는 폴리펩티드 도메인의 배향은 리간드가 링커를 포함하는지 안하든지 상관없이 디자인 선택의 문제이다. 그러나, 링커를 갖거나 갖지 않는 일부 배향은 다른 배향에 비해 나은 결합 특징을 제공할 수 있다. 모든 배향(예를 들어, dAb1-링커-dAb2; dAb2-링커-dAb1)은 본 발명에 포함되고, 요망되는 결합 특징을 제공하는 배향을 함유하는 리간드는 스크리닝에 의해 용이하게 확인될 수 있다.
dAb 단량체, 이합체 및 삼합체를 포함하는 본 발명에 따른 폴리펩티드 및 dAb는 CH2 및 CH3 도메인 중 하나 또는 둘 모두, 및 임의로 힌지 영역을 포함하는 항체 Fc 영역에 연결될 수 있다. 예를 들어, Fc 영역에 단일한 누클레오티드 서열로서 연결되는 리간드를 엔코딩하는 벡터가 상기 폴리펩티드를 제조하는데 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 언급된 dAb 단량체의 이합체, 삼합체 및 중합체를 제공한다.
표적: 본원에서 사용되는 구 "표적"은 결합 부위를 갖는 폴리펩티드 도메인이 결합할 수 있는 생물학적 분자(예를 들어, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 지질, 탄수화물)를 의미한다. 표적은, 예를 들어, 세포내 표적(예를 들어, 세포내 단백질 표적), 가용성 표적(예를 들어, 분비된 가용성 표적), 또는 세포 표면 표적(예를 들어, 막 단백질, 수용체 단백질)일 수 있다. 일 구체예에서, 표적은 TGF베타RII이다. 또 다른 구체예에서, 표적은 TGF베타RII 세포외 도메인이다.
상보성: 본원에서 사용되는 용어 "상보성"은, 두개의 면역글로불린 도메인이 동족쌍 또는 동족군을 형성하는 구조의 과(family)에 속하거나, 상기 과로부터 유래되고, 이러한 특징을 보유하는 경우를 의미한다. 예를 들어, 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인은 상보적이고, 두개의 VH 도메인은 상보적이지 않고, 두개의 VL 도메인은 상보적이지 않다. 상보적 도메인은 T-세포 수용체의 Vα 및 Vβ(또는 γ 및 δ) 도메인과 같은 면역글로불린 상과의 다른 일원에서 발견될 수 있다. 에피토프에 결합하도록 공학처리되지 않은 경우에 에피토프에 결합하지 않는 단백질 스캐폴드를 기초로 하는 도메인과 같은 인공적인 도메인은 비-상보적이다. 마찬가지로, (예를 들어) 면역글로불린 도메인 및 피브로넥틴 도메인을 기초로 하는 두개의 도메인은 상보적이 아니다.
"친화성" 및 "결합성"은 결합 상호작용의 강도를 기재하는 당 분야의 용어이다. 본 발명의 리간드와 관련하여, 결합성은 세포 상의 표적(예를 들어, 첫번째 표적 및 두번째 표적)과 리간드 사이의 결합의 전체 강도를 의미한다. 결합성은 개별적 표적에 대한 개별적 친화성의 총합을 초과한다.
핵산 분자, 벡터 및 숙주 세포: 본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 리간드(단일 가변 도메인, 융합 단백질, 폴리펩티드, 이중특이적 리간드 및 다중특이적 리간드)를 엔코딩하는 분리된 핵산 분자 및/또는 재조합 핵산 분자를 제공한다.
"분리된" 것으로 본원에서 언급되는 핵산은 유전체 DNA 또는 세포 RNA의 핵산이 이의 기원으로부터 분리된 핵산이며(예를 들어, 이는 세포에 존재하거나, 핵산의 혼합물, 예를 들어, 라이브러리에 존재한다), 이는 본질적으로 순수한 핵산 및 화학적 합성, 또는 생물학적 및 화학적 방법의 조합에 의해 생성되는 핵산을 포함하는 본원에 기재된 방법 또는 다른 적합한 방법에 의해 수득되는 핵산, 및 분리된 재조합 핵산을 포함한다(예를 들어, Daugherty, B.L. et al ., Nucleic Acids Res., 19(9): 2471-2476 (1991); Lewis, A.P. and J.S. Crowe, Gene , 101: 297-302 (1991) 참조).
"재조합"으로 본원에 언급되는 핵산은 중합효소 연쇄 반응(PCR) 및/또는 제한 효소를 이용한 벡터로의 클로닝과 같은 인공 재조합의 방법에 의지하는 절차에 의해 생성되는 핵산을 포함하는 재조합 DNA 방법에 의해 생성되는 핵산이다.
특정 구체예에서, 분리된 핵산 및/또는 재조합 핵산은 본원에 기재된 바와 같은 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 상기 리간드는 본원에 개시된 TGF베타RII에 결합하는 dAb의 아미노산 서열, 예를 들어, SEQ ID NO:1 내지 23 중 임의의 것에 기재된 아미노산 서열과 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 누클레오티드 서열 동일성은 선택된 항-TGF베타RII dAb를 엔코딩하는 누클레오티드 서열의 전장에 걸쳐 결정될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 재조합 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 특정 구체예에서, 벡터는 본 발명의 재조합 핵산에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 발현 조절 요소 또는 서열을 포함하는 발현 벡터이다. 본 발명은 또한 본 발명의 재조합 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 재조합 숙주 세포를 생성시키기에 적합한 벡터(예를 들어, 플라스미드, 파지미드), 발현 조절 요소, 숙주 세포 및 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 예가 본원에 추가로 기재되어 있다.
적합한 발현 벡터는 다수의 요소, 예를 들어, 복제 기점, 선택 마커 유전자, 하나 이상의 발현 조절 요소, 예를 들어, 전사 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 종료자) 및/또는 하나 이상의 번역 신호, 신호 서열 또는 선도 서열 등을 함유할 수 있다. 발현 조절 요소 및 신호 서열은 존재시 벡터 또는 다른 기원에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 항체 사슬을 엔코딩하는 클로닝된 핵산의 전사 및/또는 번역 조절 서열이 직접적인 발현에 사용될 수 있다.
프로모터는 요망되는 숙주 세포에서의 발현을 위해 제공될 수 있다. 프로모터는 항시성 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 항체, 항체 사슬 또는 이의 일부를 엔코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되어, 핵산의 전사를 유도할 수 있다. 원핵생물(예를 들어, E. 콜리(E. coli)에 대해 lac, tac, T3, T7 프로모터) 및 진핵생물(예를 들어, 원숭이 바이러스 40 초기 또는 후기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터) 숙주에 적합한 다양한 프로모터가 이용가능하다.
또한, 발현 벡터는 통상적으로 벡터를 갖는 숙주 세포의 선택을 위한 선택 마커, 및 복제성 발현 벡터의 경우 복제 기점을 포함한다. 항생제 또는 약물 내성을 부여하는 생성물을 엔코딩하는 유전가가 통상적인 선택 마커이며, 이는 원핵생물(예를 들어, 락타마제 유전자(앰피실린 내성), 테트라사이클린 내성을 위한 Tet 유전자) 및 진핵생물 세포(예를 들어, 네오마이신(G418 또는 제네티신), gpt(미코페놀산), 앰피실린, 또는 하이그로마이신 내성 유전자)에서 사용될 수 있다. 디히드로폴레이트 환원효소 마커 유전자는 다양한 숙주에서 메토트렉세이트를 이용한 선택을 가능케 한다. 숙주의 영양요구 마커의 유전자 생성물을 엔코딩하는 유전자(예를 들어, LEU2 , URA3 , HIS3)가 종종 효모에서 선택 마커로 사용된다. 바이러스(예를 들어, 배큘로바이러스) 또는 파지 벡터, 및 숙주 세포의 유전체로 통합가능한 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터의 사용이 또한 고려된다. 포유동물 세포 및 원핵생물 세포(E. 콜리), 곤충 세포(드로소필라 슈니더(Drosophila Schnieder) S2 세포, Sf9) 및 효모(P. 메타놀리카(P. methanolica), P. 파스토리스(P. pastoris), S. 세레비지애(S. cerevisiae))에서의 발현에 적합한 발현 벡터가 당 분야에 널리 공지되어 있다.
적합한 숙주 세포는 원핵생물 숙주 세포, 예를 들어, 박테리아 세포, 예를 들어, E. 콜리, B. 섭틸리스(B. subtilis) 및/또는 다른 적합한 박테리아; 진핵생물 세포, 예를 들어, 진균 또는 효모 세포(예를 들어, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 아스퍼길루스 종(Aspergillus sp .), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 뉴로스포라 크라싸(Neurospora crassa)), 또는 다른 저급 진핵생물 세포, 및 보다 고등한 진핵생물의 세포, 예를 들어, 곤충으로부터의 세포(예를 들어, 드로소필라 슈니더 S2 세포, Sf9 곤충 세포(WO 94/26087(O'Connor)), 포유동물로부터의 세포(예를 들어, COS 세포, 예를 들어, COS-I(ATCC Accession No. CRL-1650) 및 COS-7(ATCC Accession No. CRL-1651), CHO(예를 들어, ATCC Accession No. CRL-9096, CHO DG44(Urlaub, G. and Chasin, LA., Proc. Natl. Acad. ScL USA, 77(7):4216-4220 (1980))), 293(ATCC Accession No. CRL-1573), HeLa(ATCC Accession No. CCL-2), CV1(ATCC Accession No. CCL-70), WOP(Dailey, L., et al, J. Virol, 54:739-749 (1985), 3T3, 293T(Pear, W. S., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:8392-8396 (1993)) NSO 세포, SP2/0, HuT 78 세포 등, 또는 식물(예를 들어, 담배)로부터의 세포일 수 있다(예를 들어, Ausubel, F. M. et al, eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc. (1993). 참조). 일부 구체예에서, 숙주 세포는 분리된 숙주 세포이고, 다세포 유기체(예를 들어, 식물 또는 동물)의 일부가 아니다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 비-인간 숙주 세포이다.
본 발명은 또한 재조합 핵산의 발현에 적합한 조건하에서 본 발명의 재조합 핵산을 포함하는 재조합 숙주 세포를 유지시킴으로써, 재조합 핵산을 발현시키고, 리간드를 생성시키는 단계를 포함하는, 본 발명의 리간드(예를 들어, 이중특이적 리간드, 다중특이적 리간드)를 생성시키는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 리간드를 분리시키는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 구체예에 적용되는 개시의 세부사항에 대해서는 WO200708515호의 161페이지의 24항 내지 189페이지의 10행을 참조하라. 이러한 개시는, 본 발명의 개시의 본문에서 명백히 나타나고, 본 발명의 구체예와 관련되며, 하기 청구항에 포함되는 개시에 대해 명백히 뒷받침하므로, 참조로서 본원에 포함된다. 이는 "면역글로불린 기반 리간드", "라이브러리 벡터 시스템", "라이브러리 작제물", "다일 가변 도메인의 조합", "리간드의 특성규명", "리간드의 구조", "골격", "단백질 스캐폴드", "리간드를 작제하는데 사용하기 위한 스캐폴드", "캐노니컬(Canonical) 서열의 다양화" 및 "치료 및 진단 조성물 및 용도"의 세부사항, 뿐만 아니라 "작동가능하게 연결된", "나이브(naive)", "예방", "억제", "치료", "알레르기 질병", "Th2-매개 질병", "치료적 유효량" 및 "유효"의 정의를 제공하는 WO200708515호의 페이지 161의 24행 내지 189페이지의 10행에 제시된 개시를 포함한다.
구 "반감기"는 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드의 혈청 농도가, 예를 들어, 자연 메커니즘에 의한 리간드의 분해 및/또는 리간드의 청소 또는 분리로 인해 생체내에서 50%까지 감소하는데 걸리는 시간을 의미한다. 본 발명의 리간드는 생체내에서 안정화될 수 있고, 이의 반감기는 분해 및/또는 청소 또는 분리에 내성을 갖는 분자로의 결합에 의해 증가된다. 통상적으로, 이러한 분자는 스스로 생체내에서 긴 반감기를 갖는 자연 발생 단백질이다. 리간드의 반감기는 반감기 증가 분자에 특이적이지 않은 유사한 리간드보다 장기간 동안 생체내에서 이의 기능적 활성이 지속되는 경우에 증가된다. 따라서, HSA 및 표적 분자에 대해 특이적인 리간드는 HSA에 대한 특이성이 존재하지 않아, HSA에는 결합하지 않지만 또 다른 분자에는 결합하는 동일 리간드와 비교된다. 통상적으로, 반감기는 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 이 이상 증가된다. 2x, 3x, 4x, 5x, 10x, 20x, 30x, 40x, 50x 또는 이 이상의 범위의 반감기의 증가가 가능하다. 대안적으로, 또는 또한, 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x, 100x, 150x 이하의 범위의 반감기의 증가가 가능하다.
포맷: 증가된 반감기는 면역글로불린, 특히 항체, 가장 특히 작은 크기의 항체 단편의 생체내 적용에 유용할 수 있다. 이러한 단편(Fvs, 이황화결합된 Fvs, Fabs, scFvs, dAbs)은 일반적으로 신체로부터 신속히 청소된다. 본 발명에 따른 dAbs, 폴리펩티드 또는 리간드는 생체내에서 증가된 반감기, 및 이에 따른 신체에서의 리간드의 기능적 활성의 보다 긴 지속 시간을 제공하기 위해 적합화될 수 있다.
약동학 분석 및 리간드 반감기의 결정 방법은 당업자에게 친숙할 것이다. 세부사항은 문헌[Kenneth , A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and in Peters et al, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996)]에서 발견될 수 있다. 또한, 약동학 파라미터, 예를 들어, t 알파 및 t 베타 반감기 및 곡선하영역(AUC)을 기재하는 문헌["Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. ex edition (1982)]을 참조하라.
반감기(t1/2 알파 및 t1/2 베타) 및 AUC는 시간에 대한 리간드의 혈청 농도의 곡선으로부터 결정될 수 있다. 곡선을 모델링하기 위해 WinNonlin 분석 패키지(Pharsight Corp.로부터 이용 가능함, Mountain View, CA94040, USA)가 사용될 수 있다. 첫번째 단계(알파 단계)에서, 리간드는 주로 환자에서 분포되며, 약간의 제거가 발생한다. 두번째 단계(베타 단계)는, 리간드가 분포되고, 리간드가 환자로부터 청소됨에 따라 혈청 농도가 감소하는 말기 단계이다. t 알파 반감기는 첫번째 단계의 반감기이고, t 베타 반감기는 두번째 단계의 반감기이다. 따라서, 일 구체예에서, 본 발명은 15분 이상의 범위의 tα 반감기를 갖는 본 발명에 따른 리간드 또는 리간드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 범위의 하한은 30분, 45분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 10시간, 11시간 또는 12시간이다. 또한, 또는 대안적으로, 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 12시간 이하의 범위의 tα 반감기를 가질 것이다. 일 구체예에서, 상기 범위의 상한은 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5시간이다. 적합한 범위의 예는 1 내지 6시간, 2 내지 5시간 또는 3 내지 4시간이다.
일 구체예에서, 본 발명은 약 2.5시간 이상의 범위의 tβ 반감기를 갖는 본 발명에 따른 리간드(폴리펩티드, dAb 또는 길항제) 또는 리간드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 범위의 하한은 약 3시간, 약 4 시간, 약 5 시간, 약 6 시간, 약 7 시간, 약 10 시간, 약 11 시간, 또는 약 12 시간이다. 또한, 또는 대안적으로, 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 21일 이하의 범위의 tβ 반감기를 갖는다. 일 구체예에서, 상기 범위의 상한은 약 12 시간, 약 24 시간, 약 2일, 약 3일, 약 5일, 약 10일, 약 15일 또는 약 20일이다. 일 구체예에서, 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 약 12 내지 약 60시간 범위의 tβ 반감기를 가질 것이다. 추가 구체예에서, 이는 약 12 내지 약 48시간 범위일 것이다. 추가 구체예에서, 약 12 내지 약 26시간 범위일 것이다.
또한, 또는 상기 기준에 대한 대안으로, 본 발명은 약 1 mg?분/ml 이상의 범위의 AUC 값(곡선하영역)을 갖는 본 발명에 따른 리간드 또는 리간드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 범위의 하한은 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 30, 약 100, 약 200 또는 약 300 mg?분/ml이다. 또한, 또는 대안적으로, 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 약 600 mg?분/ml 이하의 범위의 AUC를 갖는다. 일 구체예에서, 상기 범위의 상한은 약 500, 약 400, 약 300, 약 200, 약 150, 약 100, 약 75 또는 약 50 mg?분/ml이다. 일 구체예에서, 본 발명에 따른 리간드는 하기로 구성되는 군으로부터 선택된 범위의 AUC를 가질 것이다: 약 15 내지 약 150 mg?분/ml, 약 15 내지 약 100 mg?분/ml, 약 15 내지 약 75 mg?분/ml, 및 약 15 내지 약 50mg?분/ml.
본 발명의 폴리펩티드 및 dAb 및 이들을 포함하는 길항제는, 예를 들어, PEG 기, 혈청 알부민, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체 또는 적어도 이의 트랜스페린 결합 부분, 항체 Fc 영역의 부착, 또는 항체 도메인으로의 컨쥬게이션에 의해 큰 유체역학적 크기를 갖도록 포맷화될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 dAb 및 길항제는 항체의 큰 항원 결합 단편 또는 항체로 포맷화된다(예를 들어, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, IgG, scFv로 포맷화된다).
본원에서 사용되는 용어 "유체역학적 크기"는 수용액을 통한 분자의 확산을 기초로 하는 분자(예를 들어, 단백질 분자, 리간드)의 외견상 크기를 의미한다. 용액을 통한 단백질의 확산 또는 이동은 단백질의 외견상 크기를 유도하도록 가공될 수 있으며, 상기 크기는 단백질 입자의 "스톡스 반경(Stokes radius)" 또는 "유체역학적 반경"에 의해 제공된다. 단백질의 "유체역학적 반경"은 질량 및 외형(형태) 둘 모두에 좌우되어, 동일한 분자량을 갖는 단백질이 단백질의 전체 형태를 기초로 하여 상이한 유체역학적 크기를 가질 수 있다.
본 발명의 리간드(예를 들어, dAb 단량체 및 다합체)의 유체역학적 크기는 당 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 리간드의 유체역학적 크기를 결정하기 위해 겔 여과 크로마토그래피가 사용될 수 있다. 리간드의 유체역학적 크기를 결정하기에 적합한 겔 여과 매트릭스, 예를 들어, 가교된 아가로오스 매트릭스가 널리 공지되어 있고, 용이하게 이용가능하다.
리간드 포맷의 크기(예를 들어, dAb 단량체에 부착된 PEG 모이어티의 크기)는 요망되는 응용분야에 따라 다양할 수 있다. 예를 들어, 리간드가 순환계를 떠나 말초 조직으로 진입하는 경우, 혈류로부터의 유출을 촉진하기 위해 리간드의 유체역학적 크기를 낮게 유지시키는 것이 바람직하다. 대안적으로, 리간드를 장기간 동안 체순환에 유지시키는 것이 요망되는 경우, 리간드의 크기가, 예를 들어, Ig 유사 단백질로서 포맷화시킴으로써 증가될 수 있다.
생체내에서 반감기를 증가시키는 항원 또는 에피토프를 표적화시킴에 의한 반감기 연장: 리간드의 유체역학적 크기 및 이의 혈청 반감기는 또한 본 발명의 TGF베타RII 결합 폴리펩티드, dAb 또는 리간드의 본원에 기재된 바와 같은 생체내 반감기를 증가시키는 항원 또는 에피토프에 결합하는 결합 도메인(예를 들어, 항체 또는 항체 단편)으로의 컨쥬게이션 또는 회합에 의해 증가될 수 있다. 예를 들어, TGF베타RII 결합 작용제(예를 들어, 폴리펩티드)는 항혈청 알부민 또는 항-신생아 Fc 수용체 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 항-SA 또는 항-신생아 Fc 수용체 dAb, Fab, Fab' 또는 scFv, 또는 항-SA 어피바디 또는 항-신생아 Fc 수용체 어피바디 또는 항-SA 아비머, 또는 CTLA-4, 리포칼린(lipocallin), SpA, 어피바디, 아비머, GroEl 및 피브로넥틴으로 구성되나 이에 제한되지는 않는 군으로부터 선택된 스캐폴드를 포함하는 항-SA 결합 도메인에 컨쥬게이션되거나 연결될 수 있다(상기 결합 도메인의 개시를 위해서는 WO2008096158호 참조, 상기 도메인 및 이의 서열은 참조로서 본원에 포함되고, 본 발명의 본문의 개시의 일부를 형성한다). 컨쥬게이션은 혈청 알부민에 결합하는 결합 도메인과 같은 결합 도메인에 결합(공유 또는 비공유 결합)되는 본 발명의 폴리펩티드, dAb 또는 길항제를 포함하는 조성물을 의미한다.
통상적으로, 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드는 생체내에서 자연 발생하고, 유기체(예를 들어, 인간)로부터 원치않는 물질을 제거하는 내인성 메커니즘에 의한 분해 또는 제거에 내성인 폴리펩티드이다. 예를 들어, 생체내 혈청 반감기를 향상시키는 폴리펩티드는 세포외 기질로부터의 단백질, 혈액에서 발견되는 단백질, 혈뇌장벽 또는 신경 조직에서 발견되는 단백질, 신장, 간, 폐, 심장, 피부 또는 뼈에 국소화된 단백질, 스트레스 단백질, 질병 특이적 단백질, 또는 Fc 수송과 관련된 단백질로부터 선택될 수 있다. 적합한 폴리펩티드는, 예를 들어, WO2008/096158호에 기재되어 있다.
이러한 방법은 또한 본 발명에 따른 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드의 관심 조직으로의 표적화된 전달에 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명에 따른 고친화성 단일 가변 도메인의 표적화된 전달이 제공된다.
혈청 알부민에 결합하는 dAb: 본 발명은 일 구체예에서 TGF베타RII에 결합하는 폴리펩티드 또는 길항제(예를 들어, 항-TGF베타RII dAb를 포함하는 이중특이적 리간드(첫번째 dAb)) 및 혈청 알부민(SA)에 결합하는 두번째 dAb를 제공하며, 두번째 dAb는 SA에 결합한다. 이중 특이적 리간드의 세부사항은 WO03002609호, WO04003019호, WO2008096158호 및 WO04058821호에서 발견된다.
리간드 및 길항제의 특정 구체예에서, dAb는 인간 혈청 알부민에 결합하고, WO2004003019호에 개시된 dAb 서열 중 임의의 서열(이의 서열 및 핵산 대응부는 참조로서 본원에 포함되고, 본 발명의 본문의 개시의 일부를 형성함), WO2007080392호에 개시된 dAb 서열 중 임의의 서열(이의 서열 및 핵산 대응부는 참조로서 본원에 포함되고, 본 발명의 본문의 개시의 일부를 형성함), WO2008096158호에 개시된 dAb 서열 중 임의의 서열(이의 서열 및 핵산 대응부는 참조로서 본원에 포함되고, 본 발명의 본문의 개시의 일부를 형성함)로 구성된 군으로부터 선택된 dAb와 알부민으로의 결합에 대해 경쟁한다.
특정 구체예에서, dAb는 인간 혈청 알부민에 결합하고, WO2004003019호, WO2007080392호 또는 WO2008096158호 중 임의의 것에 기재된 dAb의 아미노산 서열과 약 80% 이상, 또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 96% 이상, 또는 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 인간 혈청 알부민에 결합하는 dAb는 상기 dAb 중 임의의 dAb의 아미노산 서열과 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 96% 이상, 또는 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, dAb는 인간 혈청 알부민에 결합하고, 상기 dAb 중 임의의 dAb의 아미노산 서열의 아미노산 서열과 약 80% 이상, 또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 96% 이상, 또는 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
더욱 특정한 구체예에서, dAb는 인간 혈청 알부민에 결합하는 Vκ dAb이다. 더욱 특정한 구체예에서, dAb는 인간 혈청 알부민에 결합하는 VH dAb이다.
혈청 알부민에 결합하는 적합한 카멜리드 VHH는 WO2004041862호(Ablynx N.V.) 및 WO2007080392호에 기재된 것을 포함한다(여기서, VHH 서열 및 이의 핵산 대응부는 참조로서 본원에 포함되고, 본 발명의 본문의 개시의 일부를 형성한다). 특정 구체예에서, 카멜리드 VHH는 인간 혈청 알부민에 결합하고, WO2007080392호에 개시된 서열 또는 SEQ ID NO:518-534 중 어느 하나와 약 80% 이상, 또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 96% 이상, 또는 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 서열 번호는 WO2007080392호 또는 WO2004041862호에서 인용되는 서열 번호에 해당한다.
대안적 구체예에서, 길항제 또는 리간드는 TGF베타RII(예를 들어, 인간 TGF베타RII)에 대해 특이적인 결합 모이어티를 포함하며, 여기서 상기 모이어티는 WO2008096158호에 기재된 비-면역글로불린 서열을 포함하며, 상기 결합 모이어티, 이의 생성 및 선택(예를 들어, 다양한 라이브러리로부터의 선택) 방법 및 이들의 서열의 개시는 본 발명의 본문의 개시의 일부로서 참조로서 본원에 포함된다.
반감기 연장 모이어티(예를 들어, 알부민)으로의 컨쥬게이션: 일 구체예에서, (하나 이상의) 반감기 연장 모이어티(예를 들어, 알부민, 트랜스페린 및 이의 단편 및 유사체)는 본 발명의 TGF베타RII-결합 폴리펩티드, dAb 또는 길항제에 컨쥬게이션되거나, 이와 회합된다. TGF베타RII 결합 포맷에 사용하기에 적합한 알부민, 알부민 단편 또는 알부민 변이체의 예는, 개시내용이 참조로서 본원에 포함되고, 본 발명의 본문의 개시의 일부를 형성하는 WO2005077042호에 기재되어 있다.
TGF베타RII-결합 포맷에 사용하기에 적합한 알부민, 단편 및 유사체의 추가 예는, 개시내용이 참조로서 본원에 포함되고, 본 발명의 본문의 개시의 일부를 형성하는 WO03076567호에 기재되어 있다.
(하나 이상의) 반감기 연장 모이어티(예를 들어, 알부민, 트랜스페린 및 이의 단편 및 유사체)가 본 발명의 TGF베타RII-결합 폴리펩티드, dAb 및 길항제를 포맷화하는데 사용되는 경우, 이는 임의의 적합한 방법을 이용하여, 예를 들어, 융합 단백질을 엔코딩하는 단일 누클레오티드 작제물을 이용함으로써 TGF베타RII-결합 모이어티(예를 들어, 항-TGF베타RII dAb)로의 직접적인 융합에 의해 컨쥬게이션될 수 있고, 여기서 상기 융합 단백질은 TGF베타RII 결합 모이어티에 N-말단 또는 C-말단에 위치된 반감기 연장 모이어티를 갖는 단일 폴리펩티드 사슬로 엔코딩된다. 대안적으로, 컨쥬게이션은 모이어티 사이의 펩티드 링커, 예를 들어, WO03076567호 또는 WO2004003019호에 기재된 펩티드 링커를 이용하여 달성될 수 있다(이러한 링커 개시는 본 발명에서 사용하기 위한 예를 제공하기 위해 본 발명의 개시에 참조로서 포함된다).
PEG 로의 컨쥬게이션: 다른 구체예에서, 반감기 연장 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티이다. 일 구체예에서, 길항제는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티(임의로, 이러한 모이어티는 약 20 내지 약 50 kDa, 임의로 약 40 kDa 선형 또는 분지형 PEG를 가짐)에 연결된 본 발명의 단일 가변 도메인을 포함한다(임의로 이로 구성된다). dAb 및 결합 모이어티의 페길화(PEGylation)에 대한 보다 세부의 사항은 WO04081026호를 참조하라. 일 구체예에서, 길항제는 PEG에 연결된 dAb 단량체로 구성되며, 여기서 dAb 단량체는 본 발명에 따른 단일 가변 도메인이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 단일 가변 도메인, 리간드 또는 폴리펩티드는 독소 모이어티 또는 독소에 연결될 수 있다.
프로테아제 내성: 본 발명에 따른 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드는 이의 프로테아제 분해에 대한 내성을 개선시키기 위해 변형될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은, "프로테아제 분해에 대해 내성"인 펩티드 또는 폴리펩티드(예를 들어, 도메인 항체(dAb))는 프로테아제 활성에 적합한 조건하에서 프로테아제와 함께 인큐베이션되는 경우에 프로테아제에 의해 실질적으로 분해되지 않는다. 프로테아제 활성에 적합한 온도, 예를 들어, 37 또는 50℃에서 약 1시간 동안 프로테아제와 인큐베이션된 후에 약 25% 이하, 약 20% 이하, 약 15% 이하, 약 14% 이하, 약 13% 이하, 약 12% 이하, 약 11% 이하, 약 10% 이하, 약 9% 이하, 약 8% 이하, 약 7% 이하, 약 6% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1% 이하의 단백질이 프로테아제에 의해 분해되거나, 실질적으로 단백질이 프로테아제에 의해 분해되지 않는 경우에, 폴리펩티드(예를 들어, dAb)는 실질적으로 분해되지 않는다. 단백질 분해는 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 본원에 기재되는 바와 같은 SDS-PAGE 또는 기능 검정(예를 들어, 리간드 결합)에 의해 평가될 수 있다.
향상된 프로테아제 내성을 갖는 dAb를 생성시키는 방법은, 예를 들어, WO2008149143호에 개시되어 있다. 일 구체예에서, 본 발명에 따른 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드는 류코자임 및/또는 트립신에 의한 분해에 대해 내성이다. 본 발명의 폴리펩티드, 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 리간드는 하기 중 하나 이상에 대해 내성일 수 있다: 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파테이트 프로테아제, 티올 프로테아제, 기질 금속단백분해효소, 카르복시펩티다제(예를 들어, 카르복시펩티다제 A, 카르복시펩티다제 B), 트립신, 키모트립신, 펩신, 파파인, 엘라스타제, 류코자임, 판크레아틴, 트롬빈, 플라스민, 카텝신(예를 들어, 카텝신 G), 프로테이나제(예를 들어, 프로테이나제 1, 프로테이나제 2, 프로테이나제 3), 써몰리신, 키모신, 엔테로펩티다제, 카스파제(예를 들어, 카스파제 1, 카스파제 2, 카스파제 4, 카스파제 5, 카스파제 9, 카스파제 12, 카스파제 13), 칼파인, 피카인, 클로스트리파인, 악티니다인, 브로멜라인, 및 세파라제. 특정 구체예에서, 프로테아제는 트립신, 엘라스타제 또는 류코자임이다. 프로테아제는 또한 생물학적 추출물, 생물학적 균질화물 또는 생물학적 제조물에 의해 제공될 수 있다. 일 구체예에서, 프로테아제는 담, 점액(예를 들어, 위 점액, 비강 점액, 기관지 점액), 기관지폐포 세척액, 폐 균질액, 폐 추출물, 췌장 추출물, 위액, 타액에서 발견되는 프로테아제이다. 일 구체예에서, 프로테아제는 안구 및/또는 눈물에서 발견되는 것이다. 안구에서 발견되는 이러한 프로테아제의 예는 카스파제, 칼파인, 기질 금속단백분해효소, 디스인테그린(disintegrin), 금속단백분해효소(ADAM) 및 트롬보스폰딘 모티프를 갖는 ADAM, 프로테오좀, 조직 플라스미노겐 활성제, 세크레타제(secretase), 카텝신 B 및 D, 시스타틴 C, 세린 프로테아제 PRSS1, 유비퀴틴 프로테오좀 경로(UPP)를 포함한다. 일 구체예에서, 프로테아제는 비-박테리아 프로테아제이다. 일 구체예에서, 프로테아제는 동물, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 인간 프로테아제이다. 일 구체예에서, 프로테아제는 위장관 프로테아제 또는 폐 조직 프로테아제, 예를 들어, 인간에서 발견되는 위장관 프로테아제 또는 폐 조직 프로테아제이다. 본원에 나열된 상기 프로테아제는 또한, 예를 들어, 라이브러리의 레퍼토리의 프로테아제로의 노출을 포함하는 WO2008149143호에 기재된 방법에서 사용될 수 있다.
안정성: 본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 폴리펩티드, 단일 가변 도메인, dAb, 리간드, 조성물 또는 제형은 브리튼 로빈슨(Britton Robinson) 또는 PBS 완충액 중에서 14일 동안 37 내지 50℃에서의 인큐베이션(1 mg/ml의 폴리펩티드 또는 가변 도메인의 농도) 후에 실질적으로 안정적이다. 일 구체예에서, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 이상의 폴리펩티드, 길항제 또는 가변 도메인 등이 37℃에서의 상기 인큐베이션 후에 응집되지 않은 채로 유지된다. 일 구체예에서, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 이상의 폴리펩티드 또는 가변 도메인이 37℃에서의 상기 인큐베이션 후에 단량체로 유지된다.
일 구체예에서, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 이상의 폴리펩티드, 길항제 또는 가변 도메인이 50℃에서의 상기 인큐베이션 후에 응집되지 않은 채로 유지된다. 일 구체예에서, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 이상의 폴리펩티드 또는 가변 도메인이 50℃에서의 상기 인큐베이션 후에 단량체로 유지된다. 일 구체예에서, 상기 인큐베이션 중 어느 하나의 인큐베이션 후에 폴리펩티드, 가변 도메인, 길항제의 응집이 관찰되지 않는다. 일 구체예에서, 브리튼-로빈슨 완충액에서 1 mg/ml의 폴리펩티드 또는 가변 도메인의 농도에서 37℃에서의 인큐베이션 후에 폴리펩티드 또는 가변 도메인의 pI는 변경되지 않거나, 실질적으로 변경되지 않은 채로 유지된다. 본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 폴리펩티드, 가변 도메인, 길항제, 조성물 또는 제형은 7 내지 7.5의 pH(예를 들어, pH7 또는 pH7.5)에서 브리튼 로빈슨 완충액 또는 PBS에서 7일 동안 4℃에서의 인큐베이션(100 mg/ml의 폴리펩티드 또는 가변 도메인의 농도) 후에 실질적으로 안정적이다. 일 구체예에서, 95, 95.5, 96, 96.5, 97, 97.5, 98, 98.5, 99 또는 99.5% 이상의 폴리펩티드, 길항제 또는 가변 도메인은 상기 인큐베이션 후에 응집되지 않은 채로 유지된다. 일 구체예에서, 95, 95.5, 96, 96.5, 97, 97.5, 98, 98.5, 99 또는 99.5% 이상의 폴리펩티드 또는 가변 도메인은 상기 인큐베이션 후에 단량체로 유지된다. 일 구체예에서, 상기 인큐베이션 중 어느 하나의 인큐베이션 후에 폴리펩티드, 가변 도메인, 길항제의 응집이 관찰되지 않는다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 폴리펩티드, 가변 도메인, 길항제, 조성물 또는 제형은, 예를 들어, 제트 분무기, 예를 들어, Pari LC+ 컵에서 1시간 동안, 예를 들어, 실온, 20℃ 또는 37℃에서의 분무(예를 들어, 40mg/ml의 폴리펩티드 또는 가변 도메인의 농도) 후에 실질적으로 안정적이다. 일 구체예에서, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95.5, 96, 96.5, 97, 97.5, 98, 98.5, 99 또는 99.5% 이상의 폴리펩티드, 길항제 또는 가변 도메인이 상기 분무 후에 응집되지 않은 채로 유지된다. 일 구체예에서, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95.5, 96, 96.5, 97, 97.5, 98, 98.5, 99 또는 99.5% 이상의 폴리펩티드 또는 가변 도메인이 상기 분무 후에 단량체로 유지된다. 일 구체예에서, 상기 분무 중 어느 하나의 분무 후에 폴리펩티드, 가변 도메인, 길항제의 응집이 관찰되지 않는다.
단량체 형태: 일 구체예에서, 본 발명의 dAb는 단량체 형태로 제공된다. 적합하게는, 본 발명은 (실질적으로) 순수한 단량체를 제공한다. 일 구체예에서, dAb는 98, 99, 99.5% 이상 순수하거나 100% 순수한 단량체이다. dAb가 용액 중에서 단량체이거나 보다 고차의 형태인 과합체인지의 여부를 결정하기 위해, 이는 SEC-MALLS에 의해 분석될 수 있다. SEC MALLS(다각 레이저광 산란을 이용한 크기 배제 크로마토그래피, size exclusion chromatography with multi-angle-LASER-light-scattering)는 용액 중의 고분자의 특성규명을 위한 비-침입성 기술이다. 간단히, 단백질(둘베코 PBS 완충액 중의 1 mg/mL의 농도)이 크기 배제 크로마토그래피(컬럼: TSK3000; S200)에 의해 이의 유체역학적 특성에 따라 분리된다. 분리 후, 광을 산란시키는 단백질의 성향이 다각 레이저광 산란(MALLS) 검출기를 이용하여 측정된다. 단백질이 검출기를 통과하면서 산란된 광의 강도가 각의 함수로 측정된다. 굴절지수(RI) 검출기를 이용하여 검출된 단백질 농도와 함께 수득된 상기 측정은 적절한 방정식(분석 소프트웨어 Astra v.5.3.4.12의 구성요소 부분)을 이용하여 몰질량의 계산을 가능케 한다.
치료 용도: 본 발명은 TGF베타 신호전달과 관련된 질병을 치료하거나, 억제하거나, 예방하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 질병은 이상조절되는 TGF베타 신호전달, TGF베타의 과다발현 또는 고수준의 생체이용가능한 TGF베타에 의해 야기되거나 이에 기인될 수 있다. TGF베타 신호전달과 관련된 질병은 다양한 조직의 섬유증과 관련된 질병, 예를 들어, 폐섬유증, 예를 들어, 특발성 폐섬유증(IPF) 및 다른 간질 폐 질병, 예를 들어, 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS), 간의 섬유증, 예를 들어, 간경화증 및 만성 간염, 류머티스 관절염, 안구 장애, 혈관 질환, 예를 들어, 재협착, 피부의 섬유증, 예를 들어, 피부의 켈로이드 및 상처 치유 후 흉터형성, 및 신장의 섬유증, 예를 들어, 신장염, 신장 섬유증 및 신장경화증 또는 혈관 질환, 예를 들어, 재협착을 포함한다. TGF베타 신호전달과 관련된 다른 질병은 혈관 질병, 예를 들어, 고혈압, 전자간증, 유전성 출혈성 모세혈관확장증 타입 I(HHT1), HHT2, 폐동맥 고혈압, 대동맥류, 마르팡 증후군, 가족성 동맥류 장애, 로이-디에츠(Loeys-Dietz) 증후군, 혈관 비틀림 증후군(ATS)을 포함한다. TGF베타 신호전달과 관련된 다른 질병은 근골격계의 질병, 예를 들어, 뒤시엔느 근위축증(Duchenne's muscular dystrophy) 및 근섬유증을 포함한다. TGF베타 신호전달과 관련된 추가 질병은 암, 예를 들어, 결장암, 위암 및 췌장암 뿐만 아니라 신경교종 및 NSCLC를 포함한다. 또한, 본 발명은, 예를 들어, 종양 혈관형성에서 TGF베타 신호전달을 조정하거나 암 기질의 처리를 통해 암을 표적으로 하는 방법을 제공한다. 다른 질병 또는 질환은 조직 흉터형성과 관련된 것을 포함한다. 다른 질병은 폐 질병, 예를 들어, COPD(만성 폐쇄폐병), 간 질병, 예를 들어, 간부전(예를 들어, 바이러스 간염, 알코올, 비만, 자가면역, 대사성, 폐색성), 신장 질병, 예를 들어, 신부전(예를 들어, 당뇨, 고혈압), 비대심근병증, 이식 거부(폐/간/신장) 및 비대 및 켈로이드 흉터형성을 포함한다.
"섬유증"은 세포외 기질 성분의 과도한 침착, 예를 들어, 콜라겐 야기 과도성장, 흉터형성 및/또는 조직의 경화의 결과이다.
폐 섬유증에서의 TGF베타의 역할이 관찰되었다(Wynn et al., J. Pathology 2008, 214, p.199-210; Sime et al. J. Clinical Immunology 1997, Vol.100, p. 768-776). Th2 사이토카인의 증가된 생성 및 Th1 사이토카인의 감소된 생성으로의 전환이 공지되지 않은 폐 손상의 결과로서 관찰된다. TGF베타의 과발현은 혈관형성, 섬유모세포 활성화, ECM의 침착, 및 섬유발생을 자극한다. 동물 모델(예를 들어, TGF베타 과발현, SMAD3 KO, TGF베타R 신호전달의 억제)은 TGF베타가 폐 섬유증의 발달에 대한 중요한 매개체인 것을 나타낸다.
"특발성 폐 섬유증(IPF)"은 공지된 원인 없이 폐 간질에서 섬유 조직의 비정상적이고 과도한 침작이 발생하는 만성의 진행성 질병이다. 해마다 미국에서 100,000명 당 약 10-20명의 환자의 발병률로 존재한다. 연령에 따라 유병률은 급격히 증가하고, 50세 내지 70세 사이에서 보통 발병하여 75세를 초과하는 연령에서는 100,000명당 175명의 환자에 달한다. 5년 생존률은 20%이며, 평균 2.8년 생존한다. 증상은 마른기침 및 점진적인 호흡곤란, 비정상의 흉부 x-선 또는 HRCT 및 감소된 폐 용적을 포함한다. 현재의 치료법은 코르티코스테로이드(프레드니손), 면역억제제(시클로포스파미드) 또는 이식을 포함하나, 현재 이용가능한 요법 중 어느 것도 효능이 증명되지 않았다. 일 구체예에서, 본 발명의 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드는 IPF에 대한 치료를 제공한다.
적합하게는, 특발성 폐섬유증(IPF)에 대한 성공적인 치료는 폐 섬유모세포 증식의 감소, 폐 섬유모세포 아폽토시스의 증가, 과도한 세포외 기질 합성 및 침착의 감소, 세포외 기질 파괴 및 리모델링의 증가 중 어느 하나를 나타내거나, 진행중인 조직 손상에 대한 일부의 보호 및 정상 조직병리학의 회복을 나타낼 것이다.
적합하게는, 성공적인 치료는 질병 진행을 늦출 것이다.
IPF에 대한 치료의 효능은 블레오마이신 유도 폐 섬유증 모델에서 입증될 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 마우스 TGF베타RII와 교차 반응하므로, 이의 효능이 마우스 모델에서 시험될 수 있다.
TGF베타는 안구 조직에서 세포 거동의 조절에 있어서 중요한 세포 신호전달 분자이다. TGF베타의 과다활성은 상처 치유와 관련될 수 있고, 손상된 시력 및 안구 조직 항상성을 일으킬 수 있는 안구 조직의 섬유성 질병의 발병기전과 관련된다(예를 들어, Saika, Laboratory Investigation (2006), 86, 106-115 참조).
따라서, 일 구체예에서, TGF베타 신호전달과 관련된 질병은 안구 장애, 예를 들어, 안구 조직의 섬유성 질병을 포함한다. 안구의 섬유성 질병은 각막, 결막, 수정체 또는 망막에서 발생할 수 있다. 안구 장애는 증식 유리체망막병증(PVR), 망막 박리 후 장애 및 망막 섬유증, 당뇨 망막병증, 녹내장, 예를 들어, 개방각 녹내장, 폐쇄각 녹내장, 선천성 녹내장 및 수정체 모양의 불균형(pseudo-exfoliation) 증후군, 수정체에서의 상처 치유 반응, 예를 들어, 화학적 또는 열적 화상 후 상처 치유 반응, 또는 스티븐스-존슨 증후군, 및 백내장 수술 후 합병증을 포함한다. TGF베타는 또한 백내장 발달에서 일정한 역할을 한다(Wormstone et al. Exp Eye Res; 83 1238-1245, 2006). 다수의 안구 장애가 수술 후 섬유증의 결과로 발생한다. 또한, TGF베타2(전환 성장 인자 β2)의 과다활성은 녹내장 누공 수술 후에 안구 및 안구 주위에 흉터형성을 야기시키는 것으로 생각된다. TGF베타2는 각막, 망막, 결막 및 잔기둥그물(trabelular meshwork)를 포함하는 안구 조직의 병리적 흉터형성과 관련된 우세한 이소형이다. 잔기둥그물의 흉터형성 또는 섬유증은 상승된 안구내압 및 녹내장 발달 위험을 발생시키는 정상적인 수성 유출 경로의 폐색을 발생시킬 수 있다. TGF베타 2는 녹내장 질병의 임상전 모델에서 병리 작용제인 것으로 밝혀졌다. TGF베타2 수준은 녹내장에 걸린 환자에서 상승되며, TGF베타-2를 이용한 huTM 세포의 시험관내 처리는 표현형 변화 및 ECM 조절 단백질(MMP-2, PAI-I)의 상향조절을 발생시킨다(Lutjen-Drecol (2005), Experimental Eye Research, Vol. 81, Issue 1, pages 1-4; Liton (2005), Biochemical and Biophysical Research Communications Vol. 337, issue 4, p.1229-1236; Fuchshofer et al (2003), Experimental Eye Research, Vol. 77, issue 6, p. 757-765; Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) conference poster #1631 2009). 또한, 안구에서의 TGF베타의 과다발현은 마우스에서 녹내장-유사 병상을 발생시키며(ARVO conference poster #5108 2009), AAV를 이용한 TGF베타-2의 전달은 녹내장의 래트 모델에서 망막 신경절 세포 손실을 억제하는 것으로 밝혀졌다(ARVO conference poster #5510 2009). 더욱 최근에, 배양된 인간 시신경 유두 별아교세포에서의 과도한 산화 스트레스 유도가 TFGbeta2 분비를 증가시키는 것으로 밝혀졌다(Yu et al (2009) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50: 1707-1717). 상기 모두는 TGF베타 2 수준의 감소가 녹내장에서 관찰되는 특징적인 시신경 유두 변화를 최소화시킨다. 그러나, TGF베타는 또한 면역억제 역할을 갖는 것으로 공지되어 있어, 일부 양태에서 보호적일 수 있으며, 따라서 완전한 녹다운이 아닌 TGF베타2의 상승된 수준의 감소가 녹내장 같은 만성 안구 질환의 치료에 바람직할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 dAb 및 조성물 등을 이용하여 치료될 수 있는 질병은 녹내장 누공 수술 후의 흉터형성을 포함한다.
따라서, 일 양태에서, TGF베타 신호전달, 및 특히 조절이상 TGF베타 신호전달과 관련된 질병을 치료하거나, 억제하거나, 예방하는 방법이 제공되며, 이러한 방법은 치료적 유효량 또는 용량의 본 발명에 따른 폴리펩티드, 융합 단백질, 단일 가변 도메인, 길항제 또는 조성물을 상기 질병을 치료하거나, 억제하거나, 예방할 필요가 있는 포유동물에 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드, 리간드 또는 융합 단백질을 제공한다. 적합한 약제는 본원에 기재된 바와 같이 포맷화된 본 발명에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인 등을 포함할 수 있다.
적합하게는, 약제는 약학적 조성물이다. 본 발명의 추가 양태에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드, 단일 가변 도메인, 리간드, 조성물 또는 길항제 및 생리학적 또는 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물(예를 들어, 약학적 조성물)이 제공된다. 일 구체예에서, 조성물은 전달을 위한 비히클을 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리펩티드, 융합 단백질, 단일 가변 도메인, 길항제 또는 조성물은 폐 전달, 예를 들어, 흡입(예를 들어, 기관지내, 비내 또는 경구 흡입, 비내, 예를 들어, 점적액에 의한 비내) 또는 전신 전달(예를 들어, 비경구, 정맥내, 근내, 복막내, 동맥내, 수막강내, 관절내, 피하, 질내 또는 직장 투여)에 의해 투여된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드, 단일 가변 도메인, 리간드 또는 융합 단백질 또는 조성물은, 예를 들어, 국소 투여, 예를 들어, 안구 점적액, 미립자 중합체 시스템, 겔 또는 이식물, 또는 안구내 주사, 예를 들어, 유리체액으로의 주사에 의해 안구로 투여된다. 전달은 안구의 특정 영역, 예를 들어, 안구 표면, 또는 누관 또는 누선 또는 안구의 전방 또는 후방, 예를 들어, 유리체액으로 표적화될 수 있다. 이는 또한 면역글로불린 단일 가변 도메인, 조성물 등이 안구 침투 향상제, 예를 들어, 소듐 카프레이트 또는 점성도 향상제, 예를 들어, 히드록시프로필메틸셀룰로오스(HPMC)와 함께 안구로 전달되는 경우에 유용할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드, 단일 가변 도메인, 조성물, 리간드 또는 길항제를 이용하여 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 질병은 조직 섬유증, 예를 들어, 폐섬유증, 예를 들어, 특발성 폐섬유증이다. 또 다른 구체예에서, 질병은 안구 질병이다.
본 발명의 양태에서, 인간에서의 TGF베타 신호전달과 관련된 질병 또는 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 폴리펩티드, 단일 가변 도메인, 리간드, 조성물 또는 길항제가 제공된다. 또 다른 양태에서, 인간에서의 TGF베타 신호전달과 관련된 질병 또는 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에서의 폴리펩티드, 단일 가변 도메인, 조성물 또는 길항제의 용도가 제공된다. 또 다른 양태에서, 인간 환자에서 TGF베타 신호전달과 관련된 질병 또는 질환을 치료하고/하거나 예방하는 방법이 제공되며, 이러한 방법은 상기 환자에 폴리펩티드, 단일 가변 도메인, 조성물 또는 길항제를 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 치료적 유효량의 본 발명의 리간드(예를 들어, 길항제, 또는 단일 가변 도메인)를 이를 필요로 하는 피검체에 투여하는 것을 포함하는 치료 방법에 관한 것이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 특발성 폐섬유증을 치료할 필요가 있는 피검체에 치료적 유효량의 본 발명의 리간드(예를 들어, 길항제, 또는 단일 가변 도메인)를 투여하는 것을 포함하는, 특발성 폐섬유증을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 조성물(예를 들어, 약학적 조성물)을 포함하는 약물 전달 장치에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 약물 전달 장치는 다수의 치료적 유효 용량의 리간드를 포함한다.
다른 구체예에서, 약물 전달 장치는 비경구 전달 장치, 정맥내 전달 장치, 근내 전달 장치, 복막내 전달 장치, 경피 전달 장치, 폐 전달 장치, 동맥내 전달 장치, 수막강내 전달 장치, 관절내 전달 장치, 피하 전달 장치, 비내 전달 장치, 안구 전달 장치, 질내 전달 장치, 직장 전달 장치, 주사기, 경피 전달 장치, 캡슐, 정제, 분무기, 흡입기, 아토마이저(atomizer), 연무기(aerosolizer), 미스터(mister), 건조 분말 흡입기, 계량 흡입기, 계량 스프레이어, 계량 미스터, 계량 아토마이저, 및 카테터로 구성된 군으로부터 선택된다.
적합하게는, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드, 단일 가변 도메인, 조성물 또는 길항제를 함유하는 폐 전달 장치를 제공한다. 장치는 흡입기 또는 비내 투여 장치일 수 있다. 적합하게는, 폐 전달 장치는 치료적 유효 용량의 본 발명에 따른 리간드 등의 전달을 가능케 한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드, 단일 가변 도메인, 조성물 또는 길항제를 함유하는 안구 전달 장치를 제공한다. 적합하게는, 안구 전달 장치는 치료적 유효 용량의 본 발명에 따른 리간드 등의 전달을 가능케 한다.
본원에서 사용되는 용어 "용량"은 한번에 모두(단위 용량), 또는 소정의 기간에 걸쳐 2회 의상의 투여로 피검체에 투여되는 리간드의 양을 의미한다. 예를 들어, 용량은 하루(24시간)(일일 용량), 2일, 1주, 2주, 3주 또는 1개월 이상(예를 들어, 단일 투여, 또는 2회 이상의 투여에 의함)의 경과에 걸쳐 피검체에 투여되는 리간드(예를 들어, TGF베타RII에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드)의 양을 의미할 수 있다. 투여 사이의 간격은 임의의 요망되는 기간일 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 단일 가변 도메인은, 임의로 폐 질환(예를 들어, 특발성 폐섬유증)을 치료하고/하거나 예방하기 위해, 임의로 흡입(예를 들어, 폐 전달)에 의해 환자에게 전달되는, 임의로 건조 분말 제형으로서, 포맷화되지 않거나(예를 들어, 페길화되지 않거나 반감기 연장되지 않음) PEG에 연결된 dAb 단량체로 제공된다.
본 발명의 리간드는 여러 장점을 제공한다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 리간드는 요망되는 생체내 혈청 반감기를 갖도록 맞춤화될 수 있다. 도메인 항체는 통상적인 항체보다 훨씬 작으며, 통상적인 항체보다 나은 조직 침투를 달성하기 위해 투여될 수 있다. 따라서, dAb 및 dAb를 포함하는 리간드는 질병, 예를 들어, TGF베타-신호전달-매개 질병을 치료하기 위해 투여되는 경우에 통상적인 항체에 비한 장점을 제공한다. 특히, 특발성 폐섬유증을 치료하기 위한 본 발명의 dAb의 폐 전달은 TGF베타 신호전달의 억제제의 특이적 국소 전달을 가능케 한다. 유리하게는, TGF베타RII에 특이적으로 결합하여 이를 억제하는 포맷화되지 않은 dAb 단량체는 폐 전달을 통해 폐로 흡수되기에 충분히 작다.
WO2007085815호의 예는 본 발명의 리간드에 동등하게 적용될 수 있는 관련 검정, 포맷화 및 실험의 세부사항을 제공하는 참조로 본원에 포함된다.
본 발명은 단지 예시의 목적을 위해 하기 실시예에서 추가로 기재된다.
실시예
실시예 1. TGF 베타 RII 에 결합하는 dAb 의 선택
나이브 선택: 4G에 대해 GAS1 선도 서열로부터 발현되고(WO2005093074호 참조), 추가로 6G에 대해 열/냉각 예비선택된(WO04101790호 참조) 항체 단일 가변 도메인을 디스플레이하는 파지 라이브러리인 4G 및 6G 나이브 파지 라이브러리를 이용하였다. DOM23h 선도 서열을 재조합 인간 TGF-β RII/Fc 키메라 단백질(R&D systems, Abingdon, UK, cat no. 341-BR)에 대한 VH 및 VK 라이브러리(4G H11-19 및 6G VH2-4(VH dAb) 및 4G κ1, 4G κ2 및 6G κ(Vκ dAb)로 확인됨)의 풀(pool)을 패닝함으로써 분리하였다. 이러한 키메라 단백질을 마우스 골수종 세포주 NS0에서 인간 IgG1의 Fc 영역에 융합된 인간 TGF-β 수용체 타입 II(Lin, et al ., 1992, Cell 68:775-785)의 159개의 아미노산 잔기의 세포외 도메인을 엔코딩하는 DNA 서열의 발현에 의해 제조하였다.
재조합 인간 TGF-β RII/Fc 키메라 단백질을 첫번째 라운드의 패닝을 위해 4℃에서 밤새 인산염 완충 염수(PBS) 중의 10 μg/ml의 항원으로 튜브를 코팅하여 Maxisorp™[면역시험관(immunotube)(Nunc, Denmark)에 고정시켰다. 면역시험관을 PBS로 3회 세척한 후, 튜브를 파지의 비특이적 결합을 방지하기 위해 PBS 중의 2% 마블(Marvel) 분유(MPBS)로 가장자리까지 충전시킴으로써 블로킹시키고, 실온에서 적어도 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 파지 라이브러리를 4G κ1 및 κ2, 6G κ, 4G H11-13, 4G H14-16, 4G H17-19 및 6G VH2-4의 6개의 그룹으로 풀링시켰다. 파지 당 1x1011개의 파지를 풀링시켰다. 파지를 실온에서 1시간 동안 4 ml의 2% MPBS 중에서 인큐베이션시켰다. 블로킹된 면역시험관을 PBS로 3회 세척하였다. 블로킹된 파지 풀을 면역시험관으로 옮기고, 실온에서 적어도 1시간 동안 회전과 함께 인큐베이션하였다. 면역시험관을 0.1% tween-20을 함유하는 PBS(PBST)로 10회 세척하고, 0.5 ml의 PBS 중 1 mg/ml 트립신으로 결합된 파지를 용리시켰다.
두번째 라운드의 패닝을 10 μg/ml 인간 TGF-β RII/Fc로 코팅된 면역시험관을 이용하여 수행하였다. 투입 파지를 풀 당 1x1010개의 파지로 상기 기재된 바와 같이 풀링시키고, 50 μg/ml의 대조군 Fc 단편이 첨가된 0.5 ml 2% MPBS 중에서 블로킹시켰다. 파지를 실온에서 1시간 동안 블로킹시켰다. 3.5 ml MPBS를 파지에 첨가한 후, 이를 블로킹된 면역시험관으로 옮기고, 실온에서 적어도 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 면역시험관을 PBST로 20회 세척하고, 0.5 ml의 PBS 중 1 mg/ml 트립신으로 결합된 파지를 용리시켰다.
세번째 라운드의 패닝을 1 μg/ml 인간 TGF-β RII/Fc로 코팅된 면역시험관을 이용하여 수행하였다. 투입 파지를, 6G κ 및 4G κ1 및 κ2 투입 파지를 함께 풀링시킨 것을 제외하고는 상기 기재된 바와 같이 풀링시켰다. 파지를 적어도 1시간 동안 100 μg/ml 인간 IgG Fc 단편(인간 골수종 혈장 IgG로부터 유래된 천연 IgG Fc 단편, Calbiochem, California, US, cat. no. 401104)이 첨가된 4 ml 2% MPBS 중에서 블로킹시켰다. 면역시험관을 PBST로 20회 세척하고, 0.5 ml의 PBS 중 1 mg/ml 트립신으로 결합된 파지를 용리시켰다. 두번째 및 세번째 라운드 생산물을 fd-파지 벡터 pDOM4로부터 pDOM10으로 클로닝시켰다. 벡터 pDOM4는, 유전자 III 신호 펩티드 서열이 효모의 당지질 앵커링된 표면 단백질(GAS) 신호 펩티드로 대체된 fd 파지 벡터의 유도체이다. 이는 또한 선도 서열과 유전자 III 사이에 c-myc 태그를 함유하며, 이는 유전자 III 뒤에 인 프레임(in frame)으로 놓여있다. 이러한 선도 서열은 파지 디스플레이 벡터 뿐만 아니라 다른 원핵생물 발현 벡터 모두에서 잘 작용하며, 보편적으로 사용될 수 있다. pDOM10은 dAb의 가용성 발현을 위해 설계된 플라스미드 벡터이다. 이는 LacZ 프로모터의 조절하에서 발현되는 pUC119 벡터를 기초로 한다. N-말단에서 유니버셜 GAS 선도서열 신호 펩티드(WO2005093074호 참조)로의 dAb 유전자의 융합에 의해 상층액으로의 dAb의 발현을 확실하게 하였다. 또한, FLAG-태그를 dAb의 C-말단에 첨부시켰다. 제조업체의 설명서에 따라 QIAprep Spin Miniprep™ 키트(cat. no. 27104, Qiagen)를 이용하여 선택된 dAb-디스플레이 fd-파지에 의해 감염된 세포로부터 pDOM4 DNA를 분리시켜 dAb 유전자의 서브클로닝을 수행하였다. DNA를 SalⅠ 및 NotⅠ 제한 엔도누클레아제로 절단된 비오티닐화된 올리고누클레오티드 DOM57(5'-TTGCAGGCGTGGCAACAGCG-3'(SEQ ID NO:47) 및 D0M6(5'-CACGACGTTGTAAAACGACGGCC-3'(SEQ ID NO:48)을 이용한 PCR에 의해 증폭시키고, SalⅠ 및 NotⅠ로 절단된 pDOM10에 라이게이션시켰다. 라이게이션 생성물을 E. 콜리 HB2151 세포로의 전기천공에 의해 형질전환시키고, 100 μg/ml의 카르베니실린(TYE-carb)이 보충된 TYE 플레이트(트립톤 효모 추출물)에 플레이팅시켰다. 개별적 클론을 채집하여, 100 μg/ml 카르베니실린이 보충된 0.2 ml/웰의 밤새 발현 자가유도 배지(overnight express auto-induction medium)(고수준의 단백질 발현 시스템, Novagen) 중에서 밤새 37℃에서 250 rpm에서 96-웰 플레이트 중에서 발현시켰다. 이후, 이러한 플레이트를 10분 동안 1800g에서 원심분리시켰다.
인간 TGF-β RII/Fc에 결합된 dAb 클론을 ELISA에 의해 확인하였다. 96-웰 Maxisorp™ 이뮤노 플레이트(immuno plate)(Nunc, Denmark)를 4℃에서 밤새 인간 TGF-β RII/Fc로 코팅시켰다. 웰을 PBST로 3회 세척한 후, 실온에서 1시간 동안 PBS 중의 1% Tween(1% TPBS)으로 블로킹시켰다. 블록을 제거하고, 1%TPBS 및 dAb 상층액의 1:1 혼합물을 실온에서 1시간 동안 첨가하였다. 플레이트를 PBST로 3회 세척하고, 검출 항체(모노클로날 항-FLAG M2-퍼옥시다제 항체, Sigma-aldrich, UK)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 비색 기질(SureBlue 1-성분 TMB 마이크로웰 퍼옥시다제 용액, KPL, Maryland, USA)을 이용하여 발달시키고, 흡광도(OD)를 450 nM에서 측정하였고, OD450는 결합된 검출 항체의 양에 비례한다.
양성 결합체를 상기 기재된 바와 같이 수행되는 두번째의 확인 ELISA로 재시험하였다. ELISA에서 확인된 인간 TGF-β RII/Fc-결합 dAb를 48 내지 72시간 동안 30℃ 또는 24시간 동안 37℃에서 밤새 발현 자가유도 배지(OnEx, Novagen)에서 발현시켰다. 배양물을 원심분리(30분 동안 4,600 rpm)시키고, 상층액을 4℃에서 밤새 또는 2시간 동안 실온에서 스트림라인(Streamline)-단백질 A 비드(Amersham Biosciences, GE Healthcare, UK. 결합능: 비드 ml 당 5 mg의 dAb)와 함께 인큐베이션시켰다. 이후, 비드를 유니필터(Unifilter) 96 웰 플레이트(Whatman, GE Healthcare, UK)로 패킹하고, 2 x PBS(웰 당 400 μl)로 세척한 후, 실온에서 2분 동안 1000 rpm에서 원심분리시켰다. 세척 절차를 2 x PBS로 1회 이상 반복한 후, 10 mM 트리스-HCl pH 8.0(Sigma, UK)로 최종 세척하였다. 결합된 dAb를 0.1M 글리신-HCl, pH 2.0(웰 당 210 μl)(Sigma, UK)를 첨가한 후 원심분리에 의해 용리시켰다. 통과액(flow through)을 유니필터 플레이트 아래 위치한 96-웰 둥근 바닥 플레이트(Corning Costar)에 수집하였다. 96 웰 둥근 바닥 플레이트의 웰은 용리된 dAb를 중화시키기 위해 40 μl 1M 트리스 pH 8.0(Sigma, UK)를 함유하였다. 용리 절차를 1회 이상 반복하였다. 대안적으로, 스트림라인-단백질 A 비드를 크로마토그래피 컬럼에 패킹시키고, 2xPBS로 세척한 후, 10 mM 트리스-HCl pH 7.4(Sigma, UK)로 세척하였다. 결합된 dAb를 0.1M 글리신-HCl pH 2.0로 용리시키고, 1M 트리스 pH 8.0로 중화시켰다. dAb의 280 nm에서의 OD를 측정하고, dAb의 아미노산 조성으로부터 계산된 흡광 계수를 이용하여 단백질 농도를 결정하였다.
dAb를 A549 IL-11 방출 검정에서 측정되는 바와 같은 효능, 및 SEC-MALLS 및 DSC(하기 기재됨)에 의해 평가되는 바와 같은 생물리학적 특징에 대해 시험하였다. DOM23h-33 (SEQ ID NO:1), DOM23h-251 (SEQ ID NO:2), DOM23h-262 (SEQ ID NO:3), DOM23h-271 (SEQ ID NO:4), DOM23h-348 (SEQ ID NO:5), DOM23h-435 (SEQ ID NO:6), DOM23h-436 (SEQ ID NO:7), DOM23h-437 (SEQ ID NO:8), DOM23h-438 (SEQ ID NO:9), DOM23h-439 (SEQ ID NO:10), 및 DOM23h-440 (SEQ ID NO:11) 라이브러리를 오류-빈발(error-prone) 친화성 성숙을 위해 선택하였다.
실시예 2. 오류 빈발 친화성 성숙
DOM23h-33 (SEQ ID NO:1), DOM23h-251 (SEQ ID NO:2), DOM23h-262 (SEQ ID NO:3), DOM23h-271 (SEQ ID NO:4), DOM23h-348 (SEQ ID NO:5), DOM23h-435 (SEQ ID NO:6), DOM23h-436 (SEQ ID NO:7), DOM23h-437 (SEQ ID NO:8), DOM23h-438 (SEQ ID NO:9), DOM23h-439 (SEQ ID NO:10), 및 DOM23h-440 (SEQ ID NO:11)의 오류 빈발 돌연변이유발을, 상기 dAb의 친화성을 개선시키기 위해 수행하였다.
파지 라이브러리 작제물: DOM23h-33 (SEQ ID NO:1), DOM23h-251 (SEQ ID NO:2), DOM23h-262 (SEQ ID NO:3), DOM23h-271 (SEQ ID NO:4), DOM23h-348 (SEQ ID NO:5), DOM23h-435 (SEQ ID NO:6), DOM23h-436 (SEQ ID NO:7), DOM23h-437 (SEQ ID NO:8), DOM23h-438 (SEQ ID NO:9), DOM23h-439 (SEQ ID NO:10), 및 DOM23h-440 (SEQ ID NO:11)의 오류 빈발 라이브러리를 GeneMorph® II 무작위 돌연변이유발 키트(Stratagene, Cat No 200550)를 이용하여 제조하였다. 표적 dAb 유전자를 제조업체의 설명서에 따라 Taq DNA 중합효소 및 올리고누클레오티드 DOM008(5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'(SEQ ID NO:49)) 및 DOM009(5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'(SEQ ID NO:50))을 이용하는 PCR에 의해 증폭시킨 후, 희석된 PCR 생성물을 올리고누클레오티드 DOM172(5'-TTGCAGGCGTGGCAACAGCG-3'(SEQ ID NO:51)) 및 DOM173(5'-CACGACGTTGTAAAACGACGGCC-3'(SEQ ID NO:52)), 및 Mutazyme™ II DNA 중합효소를 이용하여 재증폭시켰다. 이러한 PCR 생성물을, DNA 생성물 수율을 증가시키기 위해 Taq DNA 중합효소 및 올리고누클레오티드 DOM172 및 DOM173을 이용하여 추가로 증폭시켰다. PCR 생성물을 SalⅠ 및 NotⅠ 제한 엔도누클레아제로 절단하였다. 절단되지 않은 생성물 및 절단된 말단을 스트렙타비딘 비드(Dynal Biotech, UK)를 이용하여 절단된 생성물로부터 제거하였다. 절단된 생성물을 SalⅠ 및 NotⅠ 제한 엔도누클레아제로 절단된 pDOM4 파지 벡터에 라이게이션시키고, 이를 E. 콜리 TB1 세포를 형질전환시키기 위해 사용하였다. 형질전환된 세포를 15 μg/ml 테트라사이클린이 보충된 2x TY 아가에 플레이팅하여, 1×107개를 초과하는 형질전환주의 라이브러리 크기를 생성시켰다.
오류-빈발 선택: 4라운드의 선택을 100, 5, 0.5 및 0.1 nM 비오티닐화된 인간 TGF-β RII/Fc에 대해 DOM23h-33, DOM23h-251, DOM23h-262, DOM23h-271 및 DOM23h-348 라이브러리 각각을 이용하여 수행하였다. 4라운드의 선택을 100, 10, 1 및 0.1 nM 비오티닐화된 인간 TGF-β RII/Fc에 대해 DOM23h-435, DOM23h-436, DOM23h-437, DOM23h-438, DOM23h-439 및 DOM23h-440 오류-빈발 라이브러리 각각으로 수행하였다. 인간 TGF-β RII/Fc를 5배 몰 과량의 EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin 시약(Pierce, Rockford, USA)(Henderikx, et al ., 2002, Selection of antibodies against biotinylated antigens. Antibody Phage Display: Methods and protocols, Ed. O'Brien and Atkin, Humana Press)을 이용하여 비오티닐화시켰다. 세번째 및 네번째 라운드 선택 결과물을 상기 기재된 바와 같이 pDOM10 벡터로 서브클로닝시켰다. 개별적 클론을 채집하고, 100 μg/ml 카르베니실린이 보충된 0.5 ml/웰의 밤새 발현 자가유도 배지 중에서 24시간 동안 37℃ 및 90% 습도에서 850 rpm으로 96웰 플레이트에서 발현시켰다. 이후, 플레이트를 10분 동안 1800g에서 원심분리시켰다. 상층액을 HBS-EP 완충액 중에 1/5 또는 1/2로 희석시키고, 비오티닐화된 인간 TGF-β RII/Fc로의 결합에 대해 비아코어™(Biacore™)에서 스크리닝하였다(제조업체의 권장사항에 따라 1000 Ru 비오티닐화된 hRII-Fc로 코팅된 SA 칩)(Biacore™, GE Healthcare®). 샘플을 50 μl/분의 유속으로 비아코어에서 이동시켰다. 모(parent) 클론에 비해 높은 수의 공명 단위(RU) 또는 개선된 분리 속도로 결합된 클론을 48 내지 72시간 동안 30℃에서 50ml 밤새 발현 자가유도 배지에서 발현시키고, 30분 동안 4,600 rpm에서 원심분리시켰다. 상층액을 스트림라인-단백질 A 비드와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 이후, 비드를 적하 컬럼으로 패킹시키고, 5 컬럼 부피의 2xPBS로 세척한 후, 1 베드 부피의 10 mM 트리스-HCl pH 7.4로 세척하고, 결합된 dAb를 0.1M 글리신-HCl, pH 2.0로 용리시키고, 1M 트리스-HCl, pH 8.0으로 중화시켰다. dAb의 280 nm에서의 OD를 측정하고, 단백질 농도를 dAb의 아미노산 조성으로부터 계산된 흡광 계수를 이용하여 결정하였다.
실시예 3. dAb 서열로의 K61N D64R 돌연변이의 도입
효능을 개선시키기 위한 시도로 D61N 및 K64R 이중 돌연변이를 DOM23h-271, 437 및 439 계통에 속하는 dAb에 도입시켰다. 이러한 돌연변이를 함유하는 dAb를 DOM23h-262 오류-빈발 파지 라이브러리로 수행된 선택으로부터 분리시켰고, 이들이 A549 IL-11 방출 검정에서 측정시 DOM23h-262(SEQ ID NO:3)보다 효능이 있는 것으로 밝혀졌다. A549 IL-11 방출 검정으로 결정시, DOM23h-262-6(SEQ ID NO:12)에서의 D61N (이뿐만 아니라 Y102H)의 존재는 DOM23h-262(SEQ ID NO:3)에 비해 dAb 효능을 54배 개선시켰고, DOM23h-262-10(SEQ ID NO:13)에서의 D61N 및 K64R (이뿐만 아니라 Q39R, E53D 및 W103S)의 존재는 DOM23h-262(SEQ ID NO:3)에 비해 효능을 540배 개선시켰다(표 1).
중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용한 중첩 신장(Ho, et al ., Gene 1989 77(1))에 의해 DOM23h-271, DOM23h-437 및 DOM23h-439 계통에 속하는 dAb로 돌연변이를 도입시켰고, 중첩 또는 상보적 말단을 갖는 2개의 DNA 단편을 생성시키기 위해 상보적 올리고누클레오티드 프라이머를 사용하였다. 이러한 단편을 중첩 말단이 어닐링되는 이후의 어셈블리 PCR에서 조합시켜, 각각의 가닥의 3' 중첩부가 상보적 가닥의 3' 신장을 위한 프라이머로 작용하도록 하고, 생성된 융합 생성물을 PCR에 의해 추가로 증폭시켰다. 누클레오티드 서열에서의 특정 변화가 중첩 올리고누클레오티드 프라이머로 누클레오티드 변경을 포함시킴으로써 도입될 수 있다. 표적 dAb 유전자 단편을 Taq DNA 중합효소 및 올리고누클레오티드 쌍 DOM008(dAb 유전자의 5' 시작부 플랭크(flank)) 및 CD131(5'-GAACCGGCCCCTCACGGAGTTTGCGTAGTA-3'(SEQ ID NO:53)) 또는 DOM009(dAb 유전자의 3' 말단 플랭크) 및 CD130(5'-TACTACGCAAACTCCGTGAGGGGCCGGTTC-3'(SEQ ID NO:54))(돌연변이된 누클레오티드 잔기는 밑줄로 표시함)을 이용한 2개의 별개의 PCR로 증폭시켰다. 2개의 PCR 단편을 프라이머의 첨가 없이 Taq DNA 중합효소를 이용한 어셈블리 PCR에서 재조합시켰다. 이후, 융합 생성물을 PCR 반응으로의 플랭킹 프라이머 DOM008 및 DOM009의 첨가에 의해 증폭시켰다. PCR 생성물을 SalⅠ 및 NotⅠ 제한 엔도누클레아제로 절단시키고, SalⅠ 및 NotⅠ 제한 엔도누클레아제로 절단된 pDOM10 또는 13 발현 벡터로 라이게이션시키고, 이를 E. 콜리 HB2151 세포를 형질전환시키기 위해 사용하였다. pDOM13 발현 벡터는 FLAG 에피토프 누클레오티드 서열이 2개의 정지 코돈(5'-TAA TAA-3')으로 대체되어, C-말단 FLAG 태그가 없는 가용성 dAb를 발현시키는 것을 제외하고는, pDOM10과 동일한 누클레오티드 서열을 갖는다. D61N 및 K64R 누클레오티드 돌연변이를 DOM23h-271-3 (SEQ ID NO:14), DOM23h-271-7 (SEQ ID NO:15) 및 DOM23h-437-6 (SEQ ID NO:19)에 도입시켜, 각각 DOM23h-271-12 (SEQ ID NO:16), DOM23h-271-13 (SEQ ID NO:17) 및 DOM23h-437-9 (SEQ ID NO:21)를 생성시켰다. DOM23h-437-4 (SEQ ID NO:18) 및 DOM23h 439-6 (SEQ ID NO:22)을, 이미 K64R 돌연변이를 함유하는 오류 빈발 선택 결과물로부터 분리시켰다. D61N 돌연변이를 상기 두 dAb에 도입시켜, 각각 DOM23h-437-8 (SEQ ID NO:20) 및 DM23h-439-8 (SEQ ID NO:23)을 생성시켰다.
실시예 4. TGF -β RII 억제에 대한 검정
dAb를 A549 IL-11 방출 세포 검정 및 SBE-bla HEK 293T 세포 센서 검정에서 시험하였다.
A549 IL -11 방출 검정 : A549 인터루킨-11(IL-11) 방출 검정은 A549 세포로부터의 인간 TGF-β1 자극된 IL-11 방출을 억제하는 dAb의 능력을 측정한다. TGF-β1은 TGF-βRII에 직접 결합하고, TGF-βRI/II 복합체의 어셈블리를 유도한다. TGF-βRI는 인산화되고, Smad4 경로를 포함하는 여러 경로를 통해 신호전달할 수 있다. Smad4 경로의 활성화는 IL-11의 방출을 발생시킨다. The IL-11은 세포 상층액으로 분비된 후, 비색 ELISA에 의해 측정된다.
가용성 dAb를 Smad4 경로를 통한 TGF-β1 신호전달을 차단하는 이의 능력에 대해 시험하였다. 간단히, 검정 배지(DMEM 고 글루코오스 배지(Gibco™, Invitrogen Ltd, Paisley, UK), 10% 가열 비활성화 우태아 혈청(PAA, Austria), 10 mM HEPES(Sigma, UK) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(PAA, Austria)) 중의 웰당 1x105개의 A549 세포를 조직 배양 96 웰 플레이트(Nunc)에 첨가한 후, dAb 및 TGF-β1(최종 농도 3 ng/ml)(R&D Systems, Abingdon, UK)을 첨가하고, 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 인큐베이션시켰다. dAb를 PBS로 투석시키고, 검정하였다. 상층액으로 방출된 IL-11의 농도를 제조업체의 설명서에 따라 Human IL-11 Duoset™(R&D systems, Abingdon, UK)을 이용하여 측정하였다.
결과는 표 1에 요약되어 있다.
SBE - bla HEK 293T 세포 센서 검정 : 신호전달 분자의 Smad 패밀리의 일원은 세포 표면으로부터 핵으로 TGF-β 신호를 전달하는 세포내 경로의 구성요소이다. TGF-β1은 TGF-βRII에 직접 결합하고, TGF-βRI/II 복합체의 어셈블리를 유도한다. 이후, Smad2 및 Smad3은 TGF-βRI에 의해 인산화된 후, co-smad 패밀리 일원 Smad4와 함께 이형화학 복합체(heteromeric complex)를 형성한다. 이러한 복합체는 핵으로 전위되고, 여기서 이들은 DNA에 결합하고, 유전자 전사를 조절한다.
세포 센서 SBE-bla HEK 293T 세포는 HEK 293T 세포(Invitrogen, UK)로 안정적으로 통합된 Smad 결합 요소(SBE)의 조절하에 베타-락타마제 리포터 유전자를 함유한다. 세포는 TGF-β1에 반응하며, Smad2/3 신호전달 경로의 효능제/길항제를 검출하는데 사용될 수 있다.
가용성 dAb를 제조업체의 권장 프로토콜(Invitrogen, UK)에 따라 상기 경로를 통한 TGF-β1 신호전달을 차단하는 능력에 대해 시험하였다. dAb를 PBS로 투석시키고, 검정하였다.
결과는 표 1에 요약되어 있다.
표 1.
Figure pct00001
개별적 A549 IL-11 방출 검정을 이중으로 수행하고, 검정 당 하나의 용량-반응 곡선 및 IC50 값을 결정하였다(n = 1). 검정을 1 내지 6회 사이로 수행하였고, 평균 IC50 값(n = 1 내지 6) ± 표준편차(S.D)가 표 1에 요약되어 있다. 개별적 SBE-bla HEK 293T 세포 센서 검정을 이중으로 수행하였고, 검정 당 2개의 용량-반응 곡선 및 2개의 IC50 값을 결정하였다. 이중 IC50 값의 평균을 계산하여, 검정 당 하나의 IC50 값을 생성시켰다(n = 1). 검정을 1 내지 3회(n = 1 내지 3)로 수행하였고, IC50 값의 평균 ± 표준편차(S.D)를 계산하였고, 이는 표 1에 요약되어 있다.
A549 인( phospho )- Smad MSD 검정 : 본 검정은 인간 폐포 기저 상피세포주인 A549 세포에서의 Smad3의 TGF-β1에 의해 자극된 인산화를 억제하는 dAb의 능력을 측정한다. TGF-β1은 TGF-βRII에 직접 결합하고, TGF-βRI/II 복합체의 어셈블리를 유도한다. TGF-βRI은 인산화되고, 차례로 Smad2 및 Smad3가 인산화된다.
인산화된 Smad2/3의 수준은 항-Smad2/3 포획 항체 및 루테닐화된(ruthenylated)-항-Smad3 검출 항체를 이용하여 세포 용해질에서 측정될 수 있고, 전기화학발광 검정법으로 측정될 수 있다.
가용성 dAb를 상기 경로를 통한 TGF-β1 신호전달을 차단하는 능력에 대해 시험하였다. 간단히, 성장 배지(25mM HEPES(Invitrogen, UK) 및 1% GlutaMAX™(Invitrogen, UK)이 보충된, 10% 가열 비활성화 우태아 혈청(Invitrogen, UK)을 갖는 DMEM F12) 중의 웰당 2 x 104개의 A549 세포를 흑색의 투명 바닥 조직 배양 384 웰 플레이트(Greiner Bio-one, UK)에 첨가하고, 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. dAb를 트리스-완충 염수 pH 8.0(TBS)(Sigma, UK)로 완충액 교환하고, 검정하였다. 이후, dAb를 성장 배지로 희석시키고, 세포에 첨가하고, 37℃(5% CO2)에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, TGF-β1(25 mM HEPES 및 1% GlutaMAX™가 보충된 DMEM 배지(Invitrogen, UK)에 희석됨)을 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 사용된 TGF-β1의 농도는 A549 세포 성장의 TGF-β1 자극에 대한 EC80 값(최대의 80% 반응을 발생시키는 농도)과 동등하였다. 통상적으로 사용된 TGF-β1의 농도는 2.2 ng/ml이었다. 세포를 4℃에서 20분 동안 포스파타제 억제제(Sigma, Poole, UK) 및 프로테아제 억제제(Roche)가 보충된 용해 완충액(Cell Signaling Technology, MA, U.S.A) 중에서 용해시켰다. 세포 용해질을 384 웰 고 결합 MSD 플레이트(Meso Scale Discovery, MD, U.S.A)로 옮기고, 실온에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. MSD 플레이트를 이전에 60 μg/ml 비오티닐화된 Smad2/3(BD Biosciences, Oxford, UK)로 스포팅(spotting)시켰고, 4℃에서 밤새 5% 마블 건조 분유 및 0.1% Tween 20(Sigma, UK)을 함유하는 TBS(MTTBS)로 블로킹시키고, 0.1% Tween 20을 함유하는 TBS(TTBS)로 1회 세척하였다. 세포 용해질을 제거하고, 플레이트를 TTBS로 3회 세척한 후, 루테닐화된 항-인 Smad3 항체(Cell Signaling Technology MA, USA)를 첨가하였다. 항-인 Smad3 항체를 제조업체의 설명서에 따라 MSD TAG-NHS-Ester(루테늄(II) 트리스-비피리딘)(Meso Scale Discovery, MD, USA))로 라벨링하였다. 플레이트를 실온에서 18시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 TTBS로 1회 세척하고, 계면활성제(Meso Scale Discovery, MD, USA)가 보충된 판독(Read) 완충액 T(Meso Scale Discovery, MD, USA)를 첨가하였다. 플레이트를 MSD Sector 이미지 6000(Meso Scale Discovery, MD, USA)을 이용하여 판독하였다. 다른 관련 세포주, 예를 들어, 일차 폐 섬유모세포로 본 검정을 수행하는 것이 가능하다.
DOM23h dAb의 수득된 검정 데이터의 결과가 표 2에 요약되어 있다.
RAW 264. 7 인 - Smad 검정 : 본 검정은 마우스 대식세포 세포주인 RAW264.7 세포에서 Smad3의 TGF-β1에 의해 자극된 인산화를 억제하는 dAb의 능력을 측정한다. TGF-β1은 TGF-βRII에 직접 결합하고, TGF-βRI/II 복합체의 어셈블리를 유도한다. TGF-βRI은 인산화되고, 차례로 Smad2 및 Smad3이 인산화된다. 인산화된 Smad2/3의 수준은 항-Smad2/3 포획 항체 및 루테닐화된-항-Smad3 검출 항체를 이용하여 세포 용해질에서 측정될 수 있고, 전기화학발광 검정법으로 측정될 수 있다.
가용성 dAb를 상기 경로를 통한 TGF-β1 신호전달을 차단하는 능력에 대해 시험하였다. 간단히, 성장 배지(10% 가열 비활성화 우태아 혈청(Invitrogen, UK) 및 0.01% 플루론산(Sigma, UK)이 보충된 고 글루코오스 DMEM(Invitrogen, UK)) 중의 웰 당 3.45 x 105개의 RAW 264.7 세포를 조직 배양 96 웰 플레이트(Corning Costar)에 첨가하고, 37℃ 및 5% CO2에서 2일 동안 인큐베이션하였다. dAb를 TBS로 완충액 교환하였고, 검정하였다. 이후, dAb를 성장 배지 중에서 희석시키고, 세포에 첨가하고, 37℃(5% CO2)에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, 25mM Hepes(Invitrogen, UK)가 보충된 TGF-β1(DMEM(Invitrogen, UK)에 희석됨)을 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 사용된 TGF-β1의 농도는 RAW 264.7 세포 성장의 TGF-β1 자극의 EC80 값(최대의 80% 반응을 발생시키는 농도)과 동등하였다. 통상적으로 사용된 TGF-β1의 농도는 1.1 ng/ml이었다. 세포를 4℃에서 20분 동안 포스파타제 및 프로테아제 억제제가 보충된 용해 완충액 중에서 용해시켰다. 세포 용해질을 384 웰 고 결합 MSD 플레이트(Meso Scale Discovery, MD, U.S.A)로 옮기고, 실온에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. MSD 플레이트를 이전에 60 μg/ml 비오티닐화된 Smad2/3으로 스포팅시켰고, 4℃에서 밤새 MTTBS로 블로킹시키고, TTBS로 1회 세척하였다. 세포 용해질을 제거하고, 플레이트를 TTBS로 3회 세척하고, 루테닐화된 항-인 Smad3 항체를 플레이트에 첨가하고, 실온에서 18시간 동안 인큐베이션시켰다. 항-인 Smad3 항체를 제조업체의 설명서에 따라 MSD TAG-NHS-Ester(루테늄(II) 트리스-비피리딘)(Scale Discovery, MD, USA))로 라벨링하였다. 플레이트를 TTBS로 2회 세척하고, 계면활성제가 보충된 판독 완충액 T를 첨가하였다. 플레이트를 MSD Sector 이미지 6000을 이용하여 판독하였다.
DOM23h dAb의 수득된 검정 데이터의 결과가 표 2에 요약되어 있다.
Figure pct00002
개별적 A549 인-Smad MSD 검정을 단일(singlet), 이중(duplicate) 또는 삼중(triplicate)으로 수행하였고, 검정 당 1개, 2개 또는 3개의 용량-반응 곡선 및 IC50 값을 각각 결정하였다(n = 1, 2 또는 3). DOM23h-271-12(SEQ ID NO:16)를 7회의 검정으로 시험하였고, 이중 4회를 이중으로 시험하고, 3회를 삼중으로 시험하였다(n = 17). DOM23h-437-9(SEQ ID NO:21)를 3회의 검정으로 시험하였고, 이중 1회를 이중으로 시험하고, 2회를 삼중으로 시험하였다(n = 8). DOM23h-439-8(SEQ ID NO:23)을 3회의 검정으로 시험하였고, 이중 2회를 삼중으로 시험하고, 1회를 단일로 시험하였다(n = 7). IC50 값의 평균 ± 표준오차(S.E)를 계산하였고, 이는 표 2에 요약되어 있다.
개별적 RAW 264.7 인-Smad 검정을 단일, 이중 또는 삼중으로 수행하였고, 검정 당 1개, 2개 또는 3개의 용량-반응 곡선 및 IC50 값을 결정하였다(n = 1, 2 또는 3). DOM23h-271-12(SEQ ID NO:16)를 7회의 검정으로 시험하였고, 이중 1회를 단일로 시험하고, 6회를 이중으로 시험하고, 2회를 삼중으로 시험하였다(n = 19). 수득된 IC50 값의 범위가 표 2에 요약되어 있다. DOM23h-437-9(SEQ ID NO:21) 및 DOM23h-439-8(SEQ ID NO:23) 둘 모두를 삼중으로 5회 시험하였다(n = 10).
MC3T3 - E1 루시퍼라제 검정 : MC3T3-E1 루시퍼라제 검정은 MC3T3-E1 세포에서 TGFβ에 의해 유도된 CAGA-루시퍼라제의 발현을 억제하는 dAb의 능력을 측정한다. CAGA 박스로 언급되는 3 카피의 TGFβ-반응성 서열 모티프가 인간 PAI-1 프로모터에 존재하고, 이는 Smad3 및 4 단백질에 특이적으로 결합한다. 다수의 카피의 CAGA 박스의 루시퍼라제 리포터 작제물로의 클로닝은 리포터 시스템으로 트랜스펙션된 세포에 대한 TGFβ 반응성을 부여한다. 이러한 검정은 [CAGA]12-루시퍼라제 리포터 작제물로 안정적으로 트랜스펙션된 MC3T3-E1 세포(마우스 골모세포)를 이용한다(Dennler, et al . (1998) EMBO J. 17, 3091-3100).
가용성 dAb를 Smad3/4 경로를 통한 TGF-β1 신호전달을 차단하는 능력에 대해 시험하였다. 간단히, 검정 배지(RPMI 배지(Gibco, Invitrogen Ltd, Paisley, UK), 10% 가열 비활성화 우태아 혈청, 및 1% 페니실린/스트렙토마이신) 중의 웰 당 2.5 x 104개의 MC3T3-E1 세포를 조직 배양 96 웰 플레이트(Nunc)에 첨가한 후, dAb 및 TGF-β1(최종 농도 1 ng/ml)을 첨가하고, 37℃ 및 5% CO2에서 6시간 동안 인큐베이션시켰다. dAb를 PBS로 투석시키고, 본 검정에서 시험하였다. Brightglow 루시퍼라제 시약(Promega, UK)을 웰에 첨가하고, 2분 동안 실온에서 인큐베이션시켜, 세포를 용해시키고, 발생된 발광을 루미노미터(luminometer)에서 측정하였다.
DOM23h-271-12 (SEQ ID NO:16), DOM23h-437-9 (SEQ ID NO:21) 및 DOM23h-439-8 (SEQ ID NO:23)을 MC3T3-E1 루시퍼라제 검정에서 시험하였다. 결과가 표 3에 제시되어 있다.
표 3.
Figure pct00003
개별적 MC3T3-E1 루시퍼라제 검정을 이중으로 수행하였고, IC50 값을 결정하였다(n=1). 검정을 2회 내지 4회(n = 2 내지 4)로 수행하였고, IC50 값의 범위가 표 3에 요약되어 있다. DOM23h-271-12 (SEQ ID NO:16)에 대해 수득된 결과는 시험된 dAb 배치 수에 따라 다양하였다. 따라서, IC50 값의 범위 및 평균 IC50 값 ± 표준편차(S.D)를 각각의 배치 수에 대해 계산하였고, 이는 표 3에 요약되어 있다.
실시예 5. DSC ( 시차 주사 열량계 )
dAb의 열 안정성을 시차 주사 열량계(DSC)를 이용하여 결정하였다. dAb를 PBS 완충액 중에서 1 mg/ml로 시험하였다. 단백질을 PBS 완충액으로 밤새 투석하였다. PBS 완충액을 모든 샘플에 대한 참조로 사용하였다. DSC를 180℃/시간의 가열 속도로 모세관 세포 미세열량계 VP-DSC(Microcal, MA, USA)를 이용하여 수행하였다. 통상적인 스캔은 참조 완충액 및 단백질 샘플 둘 모두에 대해 25-90℃였다. 각각의 참조 완충액 및 샘플 쌍 이후, 모세관 세포를 수중 1% Decon(Fisher-Scientific) 용액으로 세정한 후, PBS로 세정하였다. 발생된 데이터 결과를 Origin 7 Microcal 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 참조 완충액으로부터 수득된 DSC 결과를 샘플 결과로부터 공제하였다. 샘플의 정확한 몰농도를 융해 온도(Tm), 엔탈피(ΔH) 및 반트 호프 엔탈피(ΔHv) 값에 대한 값을 통상적으로 발생시키는 데이터 분석에 포함시켰다. 데이터를 1 및 2 전이 사건(또는 피크) 둘 모두를 갖는 비-2-상태 모델(non-2-state model)로 적합화시켰다.
표 4에 요약된 최적의 적합화 모델로부터의 겉보기 융해 온도(app Tm)와 함께 둘 모두의 모델에 대해 app Tm을 수득하였다. dAb의 융해 온도(Tm)는 48.3℃ 내지 62.9℃의 범위였다. DOM23h-271-12 (SEQ ID NO:16) 및 DOM23h-271-13 (SEQ ID NO:17)에 존재하는 추가 D61N 및 K64R 돌연변이는 DOM23h-271-3 (SEQ ID NO:14) 및 DOM23h-271-7 각각에 비해 단백질의 열 안정성을 감소시켰다; DOM23h-271-3 (SEQ ID NO:14) 및 DOM23h-271-12 (SEQ ID NO:16) 쌍에 대해 4℃ 및 DOM23h-271-7 (SEQ ID NO:15) 및 DOM23h-271-13 (SEQ ID NO:17) 쌍에 대해 2℃의 차이로 열 안정성을 감소시켰다. DOM437-9에 존재하는 추가 D61N 및 K64R 돌연변이는 또한 상기 돌연변이가 없는 동일 서열(DOM23h-437-6(SEQ ID NO:19))에 비해 단백질의 열 안정성을 적어도 4℃까지 감소시켰다. DOM23h-439-7을 생성시키는 DOM23h-439로의 D61N 및 K64R 돌연변이의 추가는 약 2℃의 열 안정성의 감소를 발생시켰다. 유사하게, K64R 돌연변이를 함유하는 dAb인 DOM23h-439-6(SEQ ID NO:22)으로의 D61N 돌연변이의 추가는 약 2℃의 열 안정성의 감소를 발생시켰다. 표 4에 기재되는 이러한 데이터는 D61N K64R 돌연변이가 DOM23h dAb의 열 안정성에 대해 부정적인 효과를 갖는 것을 암시한다.
표 4.
Figure pct00004
실시예 6: dAb 발현:
DOM23h-271, 437, 및 439 계통에 속하는 dAb를 상기 기재된 바와 같이 발현시켰다. DOM23h-271(SEQ ID NO:4)은 잘 발현되었고, 발현 수준은 72 mg/l이었다(표 5). 오류 빈발 돌여변이 선택 결과물로부터 분리된 DOM23h-271-3(SEQ ID NO:14) 및 DOM23h-271-7(SEQ ID NO:15)이 또한 잘 발현되었고, 발현 수준은 모 DOM23h-271 dAb와 동등하였다(DOM23h-271-3(SEQ ID NO:14)에 대해 63 mg/l, 및 DOM23h-271(SEQ ID NO:4)에 대해 71 mg/l(표 5)). DOM23h-271-12(SEQ ID NO:16)를 생성시키는 DOM23h-271-3(SEQ ID NO:14)으로의 D61N 및 K64R 돌연변이의 도입은 발현 수준을 7배 감소시켰다(표 5). DOM23h-271-13(SEQ ID NO:17)을 생성시키는 DOM23h-271-7로의 동일 돌연변이의 도입은 dAb 발현 수준을 2.5배까지 감소시켰다(표 5).
DOM23h-437 계통으로부터의 dAb로의 D61N 및 K64R 돌연변이의 도입은 상기 기재된 바와 유사한 효과를 가졌다. DOM23h-437(SEQ ID NO:8), DOM23h-437-4(SEQ ID NO:18) 및 DOM23h-437-6(SEQ ID NO:19)은 모두 잘 발현되었고, 발현 수준은 각각 89, 66 및 98 mg/l였다(표 5). 그러나, 상기 dAb로의 D61N 및 K64R 돌연변이의 도입은 발현 수준을 1.7 내지 2.5배 감소시켰다(표 5). DOM23h-439(SEQ ID NO:10) 및 DOM23h-439-8(SEQ ID NO:23)로의 D61N 및 K64R 돌연변이의 도입은 유사한 효과를 가졌고, 이들 dAb의 발현 수준은 각각 1.8 및 4.6배 감소되었다(표 5).
표 5.
Figure pct00005
HB2151 세포로 형질전환된 pDOM10 또는 pDOM13 발현 벡터의 dAb를 48 내지 72시간 동안 30℃에서 밤새 발현 자가유도 배지에서 발현시켰다. 스트림라인 단백질 A 비드를 배양 상층액에 첨가하여, 가용성 VH dAb를 결합시켰다. 비드를 2 x PBS로 세척하고, 결합된 dAb를 0.1M 글리신 pH 2.0로 용리시키고, 1M 트리스 pH 8.0으로 중화시켰다. dAb의 280 nm에서의 OD를 측정하고, 단백질 농도를 dAb의 아미노산 조성으로부터 계산된 흡광계수를 이용하여 결정하였다.
실시예 7: 경쟁 비아코어 :
DOM23h-271, 437 및 439 계통으로부터의 dAb가 hTGFβ-RII 상의 동일하거나 상이한 결합 부위에 대해 서로 경쟁하는지 아닌지의 여부를 연구하기 위해 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 이용하여 실험을 수행하였다. 비아코어™(BIAcore™) 3000 기계(BIAcore, GE healthcare, Sweden)에서 SPR 실험을 수행하였다. 제조업체의 설명서에 따라 10 mM 아세트산나트륨 완충액 pH 4(BIAcore, GE Healthcare, Sweden) 중의 50 ug/ml의 hTGFb-RII/Fc 항원을 CM5 센서 칩(BIAcore, GE Healthcare, Sweden)에 커플링시켰다. 약 5500 RU의 항원을 커플링시켰다. 블랭크(blank) 유동 세포를 참조로 사용하였다. 정제된 dAb를 HBS-EP 완충액(BIAcore, GE Healthcare, Sweden)에서 희석시키고, 공동-주입 지시(co-inject command)를 이용하여 30 μl/분의 속도로 항원 코팅된 유동 세포 및 블랭크 유동 세포 상에 유동시켰다. 공동주입 지시는 첫번째 샘플 직후의 두번째 샘플의 주입을 가능케 한다. 첫번째 주입은 단일한 dAb로 구성되며, 두번째 주입은 첫번째 dAb와 두번째 dAb의 혼합물로 구성되었다. 모든 dAb를 최대 최대능으로 항원 표면에 결합하기에 충분히 높은 농도로 사용하였다. 첫번째 dAb에 의한 항원 표면의 최대 결합능이 두개의 dAb의 혼합물을 주입함으로써 초과될 수 있는 경우, 두번째 dAb는 항원 상의 상이한 결합 부위 또는 에피토프에 대해 경쟁할 가능성이 크다. 두번째 주입 후에 추가 결합이 관찰되지 않는 경우, 두개의 dAb는 동일 항원 결합 부위에 대해 경쟁할 가능성이 크다. 결과는, 가장 효능 있는 또는 가장 높은 친화성의 dAb가 먼저 주입되는 경우에 해석되기 용이하다. CM5 센서 칩의 표면을 10 mM 글리신 pH 2.25(2회의 10 μl 주입)를 이용하여 공동주입 주기 후에 5분 대기 기간에 따라 재생시켰다.
DOM23h-437-6(SEQ ID NO:19), DOM23h-271-3(SEQ ID NO:14) 및 DOM23h-439-6(SEQ ID NO:22)을 개별적으로 및 서로 조합하여 공동-주입함으로써 경쟁 비아코어 실험을 수행하였다. 이러한 클론을 오류 빈발 성숙 라이브러리를 이용한 선택에 따라 분리시켰다. 이들은 D61N K64R 이중 돌연변이를 함유하지 않으나, DOM23h-439-6(SEQ ID NO:22)는 K64R 단일 돌연변이를 함유한다. DOM23h-437-6(SEQ ID NO:19)이 세개의 dAb 중 가장 효능이 있었고, 이에 따라 100 nM로 먼저 주입한 후, DOM23h-437-6(SEQ ID NO:19)(100 nM) 및 DOM23h-271-3(SEQ ID NO:14)(500 nM)의 혼합물(도 8A) 또는 DOM23h-437-6(SEQ ID NO:19)(100 nM) 및 DOM23h-439-6(SEQ ID NO:22)(500 nM)의 혼합물(도 8B)을 주입하였다. 두번째 주입 동안 결합된 dAb의 보다 많은 RU는 DOM23h-437-6(SEQ ID NO:19)이 DOM23h-271-3(SEQ ID NO:14) 및 DOM23h-439-6(SEQ ID NO:22)에 비해 상이한 항원 결합 부위에 대해 경쟁하는 것을 암시한다.
DOM23h-262-10(SEQ ID NO:13), DOM23h-271-12(SEQ ID NO:16) 및 DOM23h-439-8(SEQ ID NO:23)과 조합된 DOM23h-437-9(SEQ ID NO:21)를 공동 주입함으로써 경쟁 비아코어 실험을 수행하였다. 이러한 클론은 모두 D61N K64R 돌연변이를 함유한다. DOM23h-262-10(SEQ ID NO:13)은 오류 빈발 라이브러리 선택 결과물로부터 직접 분리시킨 반면, DOM23h-437-9(SEQ ID NO:), DOM23h-271-12(SEQ ID NO:) 및 DOM23h-439-8(SEQ ID NO:)은 부위 특이적 돌연변이유발에 의해 DOM23h-437-6(SEQ ID NO:19), DOM23h-271-3(SEQ ID NO:14) 및 DOM23h-439-6(SEQ ID NO:22)에 각각 D61N K64R 돌연변이를 도입시킴으로써 생성시켰다. DOM23h-437-9(SEQ ID NO:21)는 4개의 dAb 중 가장 효능이 있었고, 이에 따라 먼저 주입한 후, 다른 3개의 dAb 중 하나와 조합하여 주입하였다. 모든 dAb를 100 nM로 시험하였다. 두번째 주입 동안 결합된 dAb의 추가 RU가 없는 것은 모든 4개의 dAb가 동일 항원 결합 부위에 대해 경쟁하는 반면, D61N K64R 이중 돌연변이가 dAb 누클레오티드 서열에 존재하지 않는 경우 3개의 계통은 동일 항원 결합 부위에 대해 경쟁하지 않는 것을 암시한다. 데이터는 도 9 및 10에 요약되어 있다.
NR 돌연변이의 요약: DOM23h-271, DOM23h-437 및 DOM23h-439 계통으로의 D61N 및 K64R 돌연변이의 추가는 효능을 개선시키며, 이러한 돌연변이를 갖는 dAb는 A549 IL-11 방출 검정 및 SBE-bla Hek293T 세포 센서 검정으로 측정시 hTGFβ-RII-매개 신호전달을 중화시킨다(표 1). 또한, D61N 및 K64R 돌연변이를 함유하는 DOM23h-271-12(SEQ ID NO:16)는 mTGFβRII와 교차 반응하는데, 이는 MC3T3-E1 루시퍼라제 검정 및 RAW 264.7 인-Smad 검정에서 mTGFβ-RII-매개 신호전달을 중화하는 능력을 나타내기 때문이다. DOM23h-437-9(SEQ ID NO:21)는 MC3T3-E1 루시퍼라제 검정에서 mTGFβ-RII 매개 신호전달을 억제할 수 있었으나, RAW 264.7 인-Smad 검정에서는 그렇지 않았다. 그러나, D61N K64R 돌연변이의 존재는 DSC에 의해 결정시 열 안정성을 감소시켰다(표 4). 발현 수준에서의 감소가 또한 관찰되었다(표 5).
실시예 8 - 블레오마이신 -유도 폐 섬유증의 마우스 모델
블레오마이신(BLM)-유도 염증 및 섬유증은 특발성 폐 섬유증에 대한 실험 모델이다. 상기 방법은 이전에 기재되었다(Anon, et al ., AmJ Respir . Crit . Care Med. 2005 vol. 171, p 1279-1285. Piguet et al ., Int. J. Exp. Path. 1997, vol. 78,p. 43-48. Gasse, et al ., J. Clin . Invest ., (2007) vol 117, p 3786-3799).
BLM은 폐포 대식세포 및 상피세포의 산화 스트레스, DNA 손상 및 아폽토시스를 유도하여, 케모카인 및 전염증성 사이토카인 분비, 염증 세포 점증, 리모델링 및 폐 섬유증을 발생시킨다.
블레오마이신으로 처리된 마우스에 TGFβ-RII에 결합하는 dAb가 비내 투여되고, 폐 염증 및 섬유증 예방에서의 이의 효과가 결정된다.
본 발명은 이의 구체예를 참조로 하여 특별히 제시되고 기재되었으나, 하기 첨부되는 청구항에 의해 포함되는 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 형태 및 세부사항에서의 다양한 변화가 이루어질 수 있음을 당업자는 이해할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Glaxo Group Limited Caroline J DIMECH Adriaan Allart STOOP Rudolf Maria DE WILDT Steve HOLMES <120> LIGANDS THAT BIND TGF-BETA RECEPTOR RII <130> DB63509 WO <150> 61/229334 <151> 2009-07-29 <160> 123 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-33 <400> 1 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gln Tyr 20 25 30 Arg Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ala Pro Ser Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys His Arg Thr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-251 <400> 2 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Asp Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Lys Ile Thr Gln Lys Gly Asp Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Ala Thr His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-262 <400> 3 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Phe Asn Tyr 20 25 30 Glu Met Ala Trp Ala Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Leu Ile Ser Ala Glu Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Arg Arg Asp Ala Ser Met Gly His Thr Thr Arg Arg Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 4 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-271 <400> 4 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Arg Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Glu Pro Ile Gly Asn Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gln Ile Pro Gly His Lys Trp Thr Ala Asn Ser Arg Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-348 <400> 5 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Asp Met Ala Trp Ala Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Ser His Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Arg Ser Trp Asp Gly Val His Ala Gln Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-435 <400> 6 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Asp 20 25 30 Arg Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asp Pro Gln Gly Gln His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys His Asn Ser Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 7 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-436 <400> 7 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Lys Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Trp Pro Asn Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp His Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-437 <400> 8 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Arg Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asp Ser Gln Gly His Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Gly Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-438 <400> 9 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Gln Gly 20 25 30 Asp Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Gly Met Asp Gly Asp Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Pro Ser Ser Thr Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-439 <400> 10 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Thr Glu 20 25 30 Gln Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Asp Ser Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Arg His Ala Ala Gly Val Ser Gly Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 11 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-440 <400> 11 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Asp 20 25 30 Arg Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asp Pro Gln Gly Gln His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Leu Leu Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-262-6 <400> 12 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Phe Asn Tyr 20 25 30 Glu Met Ala Trp Ala Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Leu Ile Ser Ala Glu Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Arg Arg Asp Ala Ser Met Gly His Thr Thr Arg Arg Phe Asp 100 105 110 His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 13 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gln Ile Pro Gly His Met Trp Thr Ala Asn Pro Arg Ser Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 15 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-271-7 <400> 15 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Arg Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Glu Pro Ile Gly Asn Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gln Ile Pro Gly Arg Lys Trp Thr Ala Asn Ser Arg Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaatatggg 300 ggttattttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagcg 349 <210> 32 <211> 358 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-438 <400> 32 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg cagggggata tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctggagtg ggtctcacgt attggtatgg atggtgataa gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaggtcct 300 tcgagtacta gtccgtttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcg 358 <210> 33 <211> 367 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-439 <400> 33 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttggg acggagcaga tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacgt attgattcgc ctggtgggag gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacggcat 300 gcggctgggg tttcgggtac ttattttgac tactggggtc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcgagcg 367 <210> 34 <211> 349 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-440 <400> 34 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttacg gatgatagga tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagct attgatcctc agggtcagca tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagagctg 300 cttagttttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagcg 349 <210> 35 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-262-6 <400> 35 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttttt aattatgaga tggcgtgggc ccgccaggct 120 ccagggaagg gcctagagtg ggtctcattg attagtgctg agggtacgag gacatactac 180 gcaaactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 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gattatcgta tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagcg attgattctc agggtcatac gacatactac 180 gcagactccg tgaggggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaatatggg 300 ggttattttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 42 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-437-6 <400> 42 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcaa cctccggatt caccttttct gattatcgta tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagcg attgattctc agggtcatac gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg cgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaatatggg 300 ggttattttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 43 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-437-8 <400> 43 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccatttct gattatcgta tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagcg attgattctc agggtcatac gacatactac 180 gcaaactccg tgaggggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaatatggg 300 ggttattttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 44 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-437-9 <400> 44 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcaa cctccggatt caccttttct gattatcgta tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagcg attgattctc agggtcatac gacatactac 180 gcaaactccg tgaggggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg cgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaatatggg 300 ggttattttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 45 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-439-6 <400> 45 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacggc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttggg acggagcaga tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacga attgattcac ctggtgggag gacatactac 180 gcagactccg tgaggggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacggcat 300 gcggctgggg tttcgggtac ttattttgac tactggggtc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcgagc 366 <210> 46 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-439-8 <400> 46 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacggc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttggg acggagcaga tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacga attgattcac ctggtgggag gacatactac 180 gcaaactccg tgaggggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacggcat 300 gcggctgggg tttcgggtac ttattttgac tactggggtc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcgagc 366 <210> 47 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 Thr Thr Gly Cys Ala Gly Gly Cys Gly Thr Gly Gly Cys Ala Ala Cys 1 5 10 15 Ala Gly Cys Gly 20 <210> 48 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 Cys Ala Cys Gly Ala Cys Gly Thr Thr Gly Thr Ala Ala Ala Ala Cys 1 5 10 15 Gly Ala Cys Gly Gly Cys Cys 20 <210> 49 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 Ala Gly Cys Gly Gly Ala Thr Ala Ala Cys Ala Ala Thr Thr Thr Cys 1 5 10 15 Ala Cys Ala Cys Ala Gly Gly Ala 20 <210> 50 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 Cys Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Thr Thr Thr Thr Cys Cys Cys Ala 1 5 10 15 Gly Thr Cys Ala Cys Gly Ala Cys 20 <210> 51 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 Thr Thr Gly Cys Ala Gly Gly Cys Gly Thr Gly Gly Cys Ala Ala Cys 1 5 10 15 Ala Gly Cys Gly 20 <210> 52 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 Cys Ala Cys Gly Ala Cys Gly Thr Thr Gly Thr Ala Ala Ala Ala Cys 1 5 10 15 Gly Ala Cys Gly Gly Cys Cys 20 <210> 53 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 Gly Ala Ala Cys Cys Gly Gly Cys Cys Cys Cys Thr Cys Ala Cys Gly 1 5 10 15 Gly Ala Gly Thr Thr Thr Gly Cys Gly Thr Ala Gly Thr Ala 20 25 30 <210> 54 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 Thr Ala Cys Thr Ala Cys Gly Cys Ala Ala Ala Cys Thr Cys Cys Gly 1 5 10 15 Thr Gly Ala Gly Gly Gly Gly Cys Cys Gly Gly Thr Thr Cys 20 25 30 <210> 55 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-33 CDR1 <400> 55 Gln Tyr Arg Met Trp 1 5 <210> 56 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-33 CDR2 <400> 56 Ala Ile Ala Pro Ser Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 57 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-33 CDR3 <400> 57 His Arg Thr Ser Phe Asp Tyr 1 5 <210> 58 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-251 CDR1 <400> 58 Asp Tyr Asp Met Trp 1 5 <210> 59 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-251 CDR2 <400> 59 Lys Ile Thr Gln Lys Gly Asp Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 60 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-251 CDR3 <400> 60 Asp Ala Thr His Phe Asp Tyr 1 5 <210> 61 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-262 CDR1 <400> 61 Asn Tyr Glu Met Ala 1 5 <210> 62 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-262 CDR2 <400> 62 Leu Ile Ser Ala Glu Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 63 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-262 CDR3 <400> 63 Arg Arg Asp Ala Ser Met Gly His Thr Thr Arg Arg Phe Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 64 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-271 CDR1 <400> 64 Glu Tyr Arg Met Trp 1 5 <210> 65 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-271 CDR2 <400> 65 Ser Ile Glu Pro Ile Gly Asn Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 66 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-271 CDR3 <400> 66 Gln Ile Pro Gly His Lys Trp Thr Ala Asn Ser Arg Phe Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 67 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-348 CDR1 <400> 67 Asp Tyr Asp Met Ala 1 5 <210> 68 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-348 CDR2 <400> 68 Arg Ile Ser His Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 69 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-348 CDR3 <400> 69 Arg Ser Trp Asp Gly Val His Ala Gln Phe Asp Tyr Trp 1 5 10 <210> 70 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-435 CDR1 <400> 70 Asp Asp Arg Met Trp 1 5 <210> 71 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-435 CDR2 <400> 71 Ala Ile Asp Pro Gln Gly Gln His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 72 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-435 CDR3 <400> 72 His Asn Ser Ser Phe Asp Tyr Trp 1 5 <210> 73 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-436 CDR1 <400> 73 Asp Tyr Lys Met Gly 1 5 <210> 74 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-436 CDR2 <400> 74 Ser Ile Trp Pro Asn Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 75 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-436 CDR3 <400> 75 Asp His Met Gly Phe Asp Tyr Trp 1 5 <210> 76 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-437 CDR1 <400> 76 Asp Tyr Arg Met Trp 1 5 <210> 77 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-437 CDR2 <400> 77 Ala Ile Asp Ser Gln Gly His Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 78 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-437 CDR3 <400> 78 Tyr Gly Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp 1 5 <210> 79 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-438 CDR1 <400> 79 Gln Gly Asp Met Trp 1 5 <210> 80 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-438 CDR2 <400> 80 Arg Ile Gly Met Asp Gly Asp Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 81 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-438 CDR3 <400> 81 Gly Pro Ser Ser Thr Ser Pro Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 82 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-439 CDR1 <400> 82 Thr Glu Gln Met Trp 1 5 <210> 83 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-439 CDR2 <400> 83 Arg Ile Asp Ser Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 84 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-439 CDR3 <400> 84 Arg His Ala Ala Gly Val Ser Gly Thr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 85 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-440 CDR1 <400> 85 Asp Asp Arg Met Trp 1 5 <210> 86 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-440 CDR2 <400> 86 Ala Ile Asp Pro Gln Gly Gln His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 87 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-440 CDR3 <400> 87 Glu Leu Leu Ser Phe Asp Tyr Trp 1 5 <210> 88 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-262-6 CDR1 <400> 88 Asn Tyr Glu Met Ala Trp 1 5 <210> 89 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-262-6 CDR2 <400> 89 Leu Ile Ser Ala Glu Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 90 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-262-6 CDR3 <400> 90 Arg Arg Asp Ala Ser Met Gly His Thr Thr Arg Arg Phe Asp His 1 5 10 15 <210> 91 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-262-10 CDR1 <400> 91 Phe Asn Tyr Glu Met Ala 1 5 <210> 92 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-262-10 CDR2 <400> 92 Leu Ile Ser Ala Asp Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val Arg 1 5 10 15 Gly <210> 93 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-262-10 CDR3 <400> 93 Arg Arg Asp Ala Ser Met Gly His Thr Thr Arg Arg Phe Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 94 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-271-3 CDR1 <400> 94 Glu Tyr Arg Met Trp 1 5 <210> 95 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-271-3 CDR2 <400> 95 Leu Ile Glu Pro Ile Gly Asn Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 96 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-271-3 CDR3 <400> 96 Gln Ile Pro Gly His Met Trp Thr Ala Asn Pro Arg Ser Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 97 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-271-7 CDR1 <400> 97 Glu Tyr Arg Met Trp 1 5 <210> 98 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-271-7 CDR2 <400> 98 Ala Ile Glu Pro Ile Gly Asn Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 99 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-271-7 CDR3 <400> 99 Gln Ile Pro Gly Arg Lys Trp Thr Ala Asn Ser Arg Phe Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 100 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-271-12 CDR1 <400> 100 Glu Tyr Arg Met Trp 1 5 <210> 101 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-271-12 CDR2 <400> 101 Leu Ile Glu Pro Ile Gly Asn Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val Arg 1 5 10 15 Gly <210> 102 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-271-12 CDR3 <400> 102 Gln Ile Pro Gly His Met Trp Thr Ala Asn Pro Arg Ser Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 103 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-271-13 CDR1 <400> 103 Glu Tyr Arg Met Trp 1 5 <210> 104 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-271-13 CDR2 <400> 104 Ala Ile Glu Pro Ile Gly Asn Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val Arg 1 5 10 15 Gly <210> 105 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-271-13 CDR3 <400> 105 Gln Ile Pro Gly Arg Lys Trp Thr Ala Asn Ser Arg Phe Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 106 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-437-4 CDR1 <400> 106 Asp Tyr Arg Met Trp 1 5 <210> 107 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-437-4 CDR2 <400> 107 Ala Ile Asp Ser Gln Gly His Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Arg 1 5 10 15 Gly <210> 108 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-437-4 CDR3 <400> 108 Tyr Gly Gly Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 109 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-437-6 CDR1 <400> 109 Asp Tyr Arg Met Trp 1 5 <210> 110 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-437-6 CDR2 <400> 110 Ala Ile Asp Ser Gln Gly His Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 111 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-437-6 CDR3 <400> 111 Tyr Gly Gly Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 112 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-437-8 CDR1 <400> 112 Asp Tyr Arg Met Trp 1 5 <210> 113 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-437-8 CDR2 <400> 113 Ala Ile Asp Ser Gln Gly His Thr Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val Arg 1 5 10 15 Gly <210> 114 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-437-8 CDR3 <400> 114 Tyr Gly Gly Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 115 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-437-9 CDR1 <400> 115 Ser Asp Tyr Arg Met 1 5 <210> 116 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-437-9 CDR2 <400> 116 Ala Ile Asp Ser Gln Gly His Thr Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val Arg 1 5 10 15 Gly <210> 117 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-437-9 CDR3 <400> 117 Tyr Gly Gly Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 118 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-439-6 CDR1 <400> 118 Thr Glu Gln Met Trp 1 5 <210> 119 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-439-6 CDR2 <400> 119 Arg Ile Asp Ser Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Arg 1 5 10 15 Gly <210> 120 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-439-6 CDR3 <400> 120 Arg His Ala Ala Gly Val Ser Gly Thr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 121 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-439-8 CDR1 <400> 121 Thr Glu Gln Met Trp 1 5 <210> 122 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-439-8 CDR2 <400> 122 Arg Ile Asp Ser Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val Arg 1 5 10 15 Gly <210> 123 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM23h-439-8 CDR3 <400> 123 Arg His Ala Ala Gly Val Ser Gly Thr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10

Claims (42)

  1. 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  2. 제 1항에 있어서, 10pM 내지 50nM 범위의 해리 상수(Kd)로 TGF베타RII에 결합하는 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  3. 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
  4. 제 3항에 있어서, SEQ ID NO:1 내지 23의 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하며, TGF베타RII에 결합하는, 분리된 폴리펩티드.
  5. SEQ ID NO:1 내지 23의 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
  6. SEQ ID NO:24 내지 46의 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열과 60% 이상 동일한 누클레오티드 서열에 의해 엔코딩되며, TGF베타RII에 결합하는, 분리된 폴리펩티드.
  7. 제 1항에 있어서, SEQ ID NO:1 내지 23의 군의 하나 이상의 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  8. 제 1항에 있어서, SEQ ID NO:1 내지 23의 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  9. 제 1항에 있어서, SEQ ID NO:1 내지 23의 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 하나 이상의 아미노산 서열이 25개 이하의 아미노산 위치에서 변형되며, SEQ ID NO:1 내지 23의 군으로부터 선택된 CDR1 서열과 50% 이상 동일한 CDR1 서열을 포함하는, 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  10. 제 1항에 있어서, SEQ ID NO:1 내지 23의 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 하나 이상의 아미노산 서열이 25개 이하의 아미노산 위치에서 변형되며, SEQ ID NO:1 내지 23의 군으로부터 선택된 CDR2 서열과 50% 이상 동일한 CDR2 서열을 포함하는, 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  11. 제 1항에 있어서, SEQ ID NO:1 내지 23의 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 하나 이상의 아미노산 서열이 25개 이하의 아미노산 위치에서 변형되며, SEQ ID NO:1 내지 23의 군으로부터 선택된 CDR3 서열과 50% 이상 동일한 CDR3 서열을 포함하는, 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  12. 제 1항에 있어서, SEQ ID NO:1 내지 23의 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 하나 이상의 아미노산 서열이 25개 이하의 아미노산 위치에서 변형되며, SEQ ID NO:1 내지 23의 군으로부터 선택된 CDR1 서열과 50% 이상 동일한 CDR1 서열을 포함하고, SEQ ID NO:1 내지 23의 군으로부터 선택된 CDR2 서열과 50% 이상 동일한 CDR2 서열을 추가로 포함하는, 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  13. 제 1항에 있어서, SEQ ID NO:1 내지 23의 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 하나 이상의 아미노산 서열이 25개 이하의 아미노산 위치에서 변형되며, SEQ ID NO:1 내지 23의 군으로부터 선택된 CDR1 서열과 50% 이상 동일한 CDR1 서열을 포함하고, SEQ ID NO:1 내지 23의 군으로부터 선택된 CDR3 서열과 50% 이상 동일한 CDR3 서열을 추가로 포함하는, 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  14. 제 1항에 있어서, SEQ ID NO:1 내지 23의 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 하나 이상의 아미노산 서열이 25개 이하의 아미노산 위치에서 변형되며, SEQ ID NO:1 내지 23의 군으로부터 선택된 CDR2 서열과 50% 이상 동일한 CDR2 서열을 포함하고, SEQ ID NO:1 내지 23의 군으로부터 선택된 CDR3 서열과 50% 이상 동일한 CDR3 서열을 추가로 포함하는, 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  15. 제 1항에 있어서, SEQ ID NO:1 내지 23의 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 하나 이상의 아미노산 서열이 25개 이하의 아미노산 위치에서 변형되며, SEQ ID NO:1 내지 23의 군으로부터 선택된 CDR1 서열과 50% 이상 동일한 CDR1 서열을 포함하고, SEQ ID NO:1 내지 23의 군으로부터 선택된 CDR2 서열과 50% 이상 동일한 CDR2 서열 및 SEQ ID NO:1 내지 23의 군으로부터 선택된 CDR3 서열과 50% 이상 동일한 CDR3 서열을 추가로 포함하는, 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  16. 제 1항에 있어서, SEQ ID NO:1 내지 23의 군으로부터 선택된 CDR3 서열과 50% 이상 동일한 CDR3 서열을 포함하는 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  17. 제 1항에 있어서, SEQ ID NO:1 내지 23의 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 포함하는 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  18. 제 1항에 있어서, CDR1, CDR2, 및 CDR3의 군으로부터 선택된 하나 이상의 CDR을 포함하고, 상기 CDR1, CDR2, 또는 CDR3가 SEQ ID NO:1 내지 23의 군으로부터 선택된 CDR1, CDR2, 또는 CDR3 서열과 동일한, 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  19. 면역글로불린 단일 가변 도메인의 위치 61에 N, 위치 64에 R, 위치 102에 H, 위치 39에 R, 위치 53에 D 또는 위치 103에 S의 군으로부터 선택된 아미노산 중 하나 이상을 포함하는, 제 1항, 제 2항 또는 제 7항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 청구된 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 제 3항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 청구된 폴리펩티드.
  20. SEQ ID NO:1 내지 23의 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, TGF베타RII에 대한 결합 특이성을 갖고, 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인의 결합을 억제하는 리간드.
  21. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드가 인간 TGF베타RII에 결합하는 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드가 마우스 TGF베타RII에 결합하는 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드.
  23. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 청구된 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드를 포함하는 융합 단백질.
  24. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드가 TGF베타 활성을 중화시키는 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드, 리간드 또는 융합 단백질.
  25. 제 1항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드가 TGF베타RII로의 TGF베타의 결합을 억제하는 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드, 리간드 또는 융합 단백질.
  26. 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 청구된 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드, 리간드 또는 융합 단백질을 엔코딩하는 분리된 핵산.
  27. 제 26항에 있어서, 상기 핵산이 SEQ ID NO:24 내지 46의 군으로부터 선택된 하나 이상의 누클레오티드 서열과 70% 이상 동일한 하나 이상의 누클레오티드 서열을 포함하고, 상기 하나 이상의 핵산이 TGF베타RII에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩하는, 분리된 핵산 분자.
  28. 제 26항 또는 제 27항에 있어서, SEQ ID NO:24 내지 46의 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 분리된 핵산 분자.
  29. 제 26항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 청구된 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  30. 제 26항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 청구된 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  31. 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 청구된 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드 또는 리간드를 포함하는 폴리펩티드를 생성시키는 방법으로서, 상기 핵산 또는 벡터의 발현에 적합한 조건하에서 제 30항에 청구된 숙주 세포를 유지시킴으로써 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드를 포함하는 폴리펩티드를 생성시키는 것을 포함하는, 방법.
  32. 약제로서 사용하기 위한, 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 청구된 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드.
  33. 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 청구된 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드를 포함하는 약학적 조성물.
  34. TGF베타 신호전달과 관련된 질병을 치료하기 위한, 제 32항 또는 제 33항에 청구된 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드 또는 약학적 조성물.
  35. 제 34항에 있어서, TGF베타 신호전달과 관련된 상기 질병이 조직 섬유증, 예를 들어, 폐섬유증, 예를 들어, 특발성 폐섬유증, 간섬유증, 예를 들어, 경화증 및 만성 간염, 류머티스 관절염, 안구 장애, 또는 피부의 섬유증, 예를 들어, 피부의 켈로이드, 및 신장의 섬유증, 예를 들어, 신장염, 신장 섬유증 및 신경화증, 및 혈관 질환, 예를 들어, 재협착의 군으로부터 선택되는, 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드 또는 약학적 조성물.
  36. 제 35항에 있어서, 상기 안구 장애가 안구 조직의 섬유성 질병, 증식 유리체망막병증(PVR), 당뇨 망막병증, 녹내장, 예를 들어, 개방각 녹내장, 폐쇄각 녹내장, 선천성 녹내장 및 수정체 모양의 불균형(pseudo-exfoliation) 증후군, 수정체에서의 상처 치유 반응, 예를 들어, 화학적 또는 열적 화상 후 상처 치유 반응, 또는 스티븐스-존슨 증후군, 백내장 수술 후 합병증, 및 녹내장 누공 수술 후 흉터형성의 군으로부터 선택되는, 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드 또는 약학적 조성물.
  37. 제 1항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드 또는 약학적 조성물이 폐 전달용으로 제형화되는 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드 또는 약학적 조성물.
  38. 제 1항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드 또는 약학적 조성물이 안구 전달용으로 제형화되는 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드 또는 약학적 조성물.
  39. 폐 전달을 위한 약제의 제조에서의 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 청구된 항-TGF베타RII 단일 가변 도메인 또는 길항제 또는 융합 단백질의 용도.
  40. 환자의 폐로의 전달을 위한 약제의 제조에서의 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 청구된 항-TGF베타RII 단일 가변 도메인 또는 길항제 또는 융합 단백질의 용도.
  41. 인간 환자에 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 청구된 항-TGF베타RII 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리펩티드 또는 리간드를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 인간 환자의 TGF베타-매개 질환을 치료하고/하거나 예방하는 방법.
  42. 제 33항에 청구된 바와 같은 조성물을 함유하는 폐 전달 장치.
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