MX2007004113A - Antagonistas y metodos para usar los mismos. - Google Patents

Abstract

La invencion proporciona metodos para tratar enfermedades inflamatorias (por ejemplo, enfermedades inflamatorias cronicas) comprendiendo administrar un antagonista de Receptor de Factor de Necrosis de Tumor 1. La invencion tambien proporciona ligandos que contienen un monomero de dominio variable unico de inmunoglobulina (anticuerpo de dominio, dAb) que une Receptor de Factor de Necrosis de Tumor 1, y metodos para utilizar los ligandos. Tambien se proporcionan acidos nucleicos codificando los ligandos,celulas huesped recombinantes y metodos para preparar los ligandos.

Description

ANTAGONISTAS Y MÉTODOS PARA USAR LOS MISMOS SOLICITU DES RELACIONADAS Esta solicitud es una continuación en parte de la Solicitud de Patente de EE. U U. No. 10/985,847, presentada el 10 de Noviembre de 2004, que es: 1 ) una continuación en parte de la Solicitud Internacional No. PCT/GB2004/004253, que desi gna los Estados Unidos y se presenta el 8 de Octubre de 2004; y 2) una continuación en parte de la Solicitud Internacional No. PCT/G B2003/005646, que designa los Estados Unidos, se presenta el 24 de Diciembre de 2003, y reivindica la prioridad a la Solicitud del Reino Unido No. GB 0230202.4, presentada el 27 de Diciembre de 2002 y la Solicitud del Reino Unido No. G B 0327706.8, presentada el 28 de Noviembre de 2003, que es una continuación en parte de la Solicitud I nternacional No.

PCT/GB2003/002804, que designa los Estados Unidos, se presenta el 30 de Junio de 2003, y reclama prioridad a la Solicitud del Reino Unido No. GB 0230202.4, presentada el 27 de Diciembre de 2002, que es una continuación en parte de la Solicitud Internacional No. PCT/GB02/03014, que designa los Estados Unidos y se presenta el 28 de J unio de 2002. Las enseñanzas completas de las solicitudes anteriores se incorporan en la presente para referenci a.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El domi nio de unión al antígeno de un anticuerpo comprende dos regiones separadas: un domi nio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (V : que puede ser ya sea VK O V?). El sitio de unión al antígeno por si mismo se forma por seis ciclos de polipéptido: tres de domi nio VH ( H1 , H2 y H3) y tres de domino V (L1 , L2, L3). Un repertorio primario diverso de genes V que codifican los dominios VH y VL se produce por el reordenamiento combinatorio de segmentos de gen. El gen VH se produce por recombi nación de tres segmentos de gen, VH, D y JH. En humanos , existen aproximadamente 51 segmentos VH funcionales (Cook and Tomlinson (1995) Immunol Today, 16:237), 25 segmentos D funcionales (Corbett ef al., ( 1997) J. Mol. Biol. 268: 69) y 6 segmentos JH funcionales (Ravetch et al., ( 1 981 ) Cell, 27: 583), dependiendo del haplotipo. El segmento VH codifica la región de la cadena de polipéptido que forma los ciclos de unión al antígeno, primero y segundo, del domi nio VH (H 1 y H2), mientras los segmentos VH, D y J H se combinan para formar el tercer ci clo de unión al antígeno del dominio VH (H3). El gen V se produce por la recombinación de solamente dos segmentos de gen, VL y JL En humanos, existen aproximadamente 40 segmentos VK funcionales (Scháble and Zachau (1993) Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 374: 1 001 ), 31 segmentos funcionales V? (Williams et al., ( 1996) J. Mol. Biol., 264: 220; Kawasaki et al., (1997) Genome Res., 7:250), 5 segmentos funcionales JK (Hieter et al., (1 982) J. Biol. Chem., 257: 1516) y 4 segmentos J? funcionales (Vasicek and Leder (1990) J. Exp. Med., 172:609), dependiendo del haplotipo. El segmento VL codifica la región de la cadena de polipéptido que forma los ciclos de unión al antígeno, primero y segundo, del dominio VL (L1 y L2), mientras los segmentos VL y JL se combinan para formar el tercer ciclo de unión al antígeno del dominio VL (L3). Los anticuerpos seleccionados del repertorio primario se cree que son suficientemente diversos para unirse a casi todos los antígenos con al menos afinidad moderada. Los anticuerpos de alta afinidad se producen por "maduración de afinidad" de los genes reordenados, en los cuales las mutaciones de punto se generan y seleccionan por el sistema inmune en la base de unión mejorada. Análisis de las estructuras y secuencias de anticuerpos ha mostrado que cinco de los seis ciclos de unión a antígeno (H 1 , H2, L1 , L2, L3) poseen un número limitado de conformaciones de cadena principal o estructuras canónicas (Chothia and Lesk ( 1987) J. Mol. Biol., 196:901 ; Chothia et al., (1989) Nature, 342:877). Las conformaciones de cadena principal se determinan por (i) la longitud del ciclo de unión al antígeno, y (ii) residuos particulares, o tipos de residuo, en cierta posición clave en el ciclo de unión al antígeno y la estructura de anticuerpo. El análisis de las longitudes de ciclo y residuos clave nos ha permitido predecir las conformaciones de cadena principal de H1 , H2, L1 , L2 y L3 codificadas por la mayoría de las secuencias de anticuerpo de humano (Chothia ef al., ( 1992) J. Mol. Biol. 227:799; Tomlinson et al., (1995) EMBO J., 14:4628; Williams et al., (1996) J. Mol. Biol., 264:200). Aunque la región R3 es mucho más diversa en términos de secuencia, longitud y estructura (debido al uso de segmentos D), también forma un número limitado de conformaciones de cadena princi pal para longitudes de ciclo corto que dependen de la longitud y la presencia de residuos particulares, o tipos de residuos, en posiciones clave en el ciclo y la estructura de anticuerpo (Martin et al., ( 1996) J. Mol. Biol., 263: 800; Shirai ef al., (1996) FEBS Letters, 399: 1. Los anticuerpos biespecificos comprendiendo pares complementarios de regiones VH y VL se conocen en la materia. Estos anticuerpos biespecíficos deben comprender dos pares de VH y V s, cada par VH/V uniéndose a un epítopo o antígeno único. Los métodos descritos incluyen hibridomas híbridos (Milstein & Cuello AC, Nature 305:537-40), minicuerpos (Hu et al., (1996) Cáncer Res 56: 3055-3061 ), diacuerpos (Hollinger et al., ( 1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448; WO 94), anticuerpos recombinantes quelantes (CRAbs; Neri et al., (1995) J. Mol. Biol. 246, 367-373); biscFv (por ejemplo, Atwell et al., (1996) Mol. Immunol. 33, 1301 - 1312), anticuerpos estabilizados por "protuberancias en agujeros" (Cárter ef al., (1997) Protein Sci. 6, 781 -788). En cada caso cada especie de anticuerpo comprende dos sitios de unión al antígeno, cada uno proporcionado con un par complementario de dominios VH y VL. Cada anticuerpo así es capaz de unirse a dos diferentes epítopos o antígenos al miso tiempo, con la unión a cada epítopo o antígeno mediado por un VH y su dominio V complementario. Cada una de estas técnicas presenta sus desventajas particulares; por ejemplo en el caso de hibridomas híbridos, los pares VH/VL inactivos pueden reducir grandemente la fracción de IgG biespecífica. Además, la mayoría de los planteamientos biespecíficos se basan en la asociación de diferentes pares VH/VL de la asociación de cadenas VH y VL para recrear dos diferentes sitios de unión VH/VL. Por lo tanto es imposible controlar la proporción de sitios de unión a cada epítopo o antígeno en la molécula entablada y de esta manera muchas de las moléculas ensambladas se unirán a un epítopo o antígeno pero no al otro. En algunos casos ha sido posible formar las cadenas pesadas y ligeras de las interfases de subunidad (Cárter ef al., 1997) para mejorar el número de moléculas que tienen sitios de unión a ambos antígenos o epítopos pero esto nunca resulta en todas las moléculas teniendo unión tanto a antígenos como epítopos. Existe alguna evidencia de que dos diferentes especificidades de unión a anticuerpo deben incorporarse en el mismo sitio de unión, pero esto generalmente representa dos o más especificidades que corresponden a epítopos o antígenos estructuralmente relacionados o a anticuerpos que se reaccionan de manera cruzada ampliamente. Por ejemplo, los anticuerpos reactivos de manera cruzada se han descrito, usualmente donde los dos antígenos se relacionan en secuencia y estructura, tal como una lisozima de pavo y lisozima blanca de huevo de gallina (McCafferty et al., WO 92/01047) o a hapten libre y a hapten conjugado con el portador (Griffiths AD et al., EM BO J 1994 13: 14 34245-60). En un ejemplo adicional, WO 02/02773 (Laboratorios Abbott) describe moléculas de anticuerpo con "especificidad dual". Las moléculas de anticuerpo se refieren a anticuerpos aumentados o seleccionados contra múltiples antígenos, de manera que su especificidad abarca más de un antígeno único. Cada par VH/VL complementario en los anticuerpos de WO 02/02773 especifica una especificidad de unión única para dos o más antígenos estructuralmente relacionados; los dominios VH y VL en tales pares complementarios no poseen cada uno una especificidad separada. Los anticuerpos de esta manera tienen una amplia especificidad única que comprende dos antígenos, que se relacionan estructuralmente. Además, los autoanticuerpos naturales se han descrito, los cuales son polireactivos (Casali & Notkins, Ann. Rev. Immunol. 7, 51 5-531 ) , reaccionando con al menos dos (usualmente más) antígenos diferentes o epítopos que no se relacionan estructuralmente. También se ha mostrado que las selecciones de repertorios de péptido aleatorias utilizando tecnología de despliegue de fago en un anticuerpo monoclonal identificará un rango de secuencias de péptido que se ajustan al sitio de unión al antígeno. Algunas de las secuencias se relacionan altamente, ajustando una secuencia consenso, mientras que otras son muy diferentes y se han denominado mimotopos (Lañe & Stephen, Current Opinión in Immunology, 1993, 5, 268-271 ). Por lo tanto está claro que un anticuerpo de cuatro cadenas, natural, comprendiendo dominios VH y VL complementarios y asociado, tiene el potencial para unirse a muchos diferentes antígenos de un gran universo de antígenos conocidos. Está menos claro como crear un sitio de unión a dos antígenos dados en el mismo anticuerpo, particularmente aquellos que no se relacionan necesariamente de manera estructural. Se han sugerido los métodos de formación de proteína que pueden tener una relación con esto. Por ejemplo, también se ha propuesto que un anticuerpo catalítico podría crearse con una actividad de unión a un ion de metal a través de un dominio variable, y a un hapteno (substrato) a través de contactos con el ion de metal y un dominio variable complementario (Barbas et al., 1993 Proc. Nati. Acad. Sci USA 90, 6385-6389). Sin embargo en este caso, la unión y catálisis del substrato (primer antígeno) se propone para requerir la unión de ion de metal (segundo antígeno). De esta manera, la unión al par VH/VL se refiere a un antígeno único pero de múltiples componentes. Se han descrito métodos para la creación de anticuerpos biespecíficos de dominios únicos de cadena pesada de anticuerpo de camello en los cuales los contactos de unión para un antígeno se crean en un dominio variable, y para un segundo antígeno en un segundo dominio variable. Sin embargo, los dominios variables no son complementarios. De esta manera, un primer dominio variable de cadena pesada se selecciona contra un primer antígeno, y un segundo dominio variable de cadena pesada contra un segundo antígeno, y entonces probablemente ambos dominios se relacionan en la misma cadena para dar un fragmento de anticuerpo biespecífico (Conrath et al., J. Biol. Chem. 270, 27589-27594). Sin embargo, los dominios únicos de cadena pesada de camello son inusuales en que se derivan de anticuerpos de camellos naturales que tienen cadenas no ligeras, y por lo tanto los dominios únicos de cadena pesada son incapaces de asociarse con cadenas ligeras de camello para formar pares VH y V . Los dominios variables de cadena pesada únicos también se han descrito, derivados de anticuerpos naturales que se asocian normalmente con cadenas ligeras (de anticuerpos monoclonales o de repertorios de dominios; ver EP-A-0368684). Se ha mostrado que estos dominios variables de cadena pesada interactúan específicamente con uno o más antígenos relacionados pero no se han combinado con otros dominios variables de cadena pesada o ligera para crear un ligando con una especificidad para dos o más diferentes antígenos. Además, se ha mostrado que estos dominios únicos tienen una vida media in vivo muy corta. Por lo tanto, tales dominios son de valor terapéutico limitado. Se ha sugerido hacer fragmentos de anticuerpo biespecifico al enlazar dominios variables de cadena pesada de diferente especificidad juntos (como se describe arriba). La desventaja con este planteamiento es que los dominios variables de anticuerpo aislado pueden tener una interfase hidrofóbica que normalmente hace interacciones con la cadena liga y se expone a solvente y puede ser "pegajosa" permitiendo que el dominio único se una a superficies hidrofóbicas. Además, en la ausencia de una cadena ligera compañera la combinación de dos o más dominios variables de cadena pesada diferentes y su asociación, posiblemente a través de sus interfases hidrofóbicas, puede prevenir que no se unan a los ligandos a los cuales son capaces de unirse en aislamiento. Además en este caso los domini os variables de cadena pesada no se asociarían con dominios variables de cadena ligera complementarios y de esta manera pueden ser menos estables y fácilmente desdóblales (Worn & Pluckthun, 1 998 Biochemistry 37, 1 3120-7).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a antagonistas del Factor de Necrosis de Tumor 1 (TNFR1 , p55, CD120a, P60, miembro de la superfamilia de receptor TNF 1 , TNFRSF1 A) y métodos para utilizar los antagonistas. Los antagonistas preferidos tienen eficacia para tratar, suprimir o prevenir una enfermedad inflamatoria crónica y no antagonizar substancialmente el Factor de Necrosis de Tumor 2 (TNFR2, P75, CD120b, miembro de superfamilia de receptor TNF 1 B, TNFRSF 1 B). En algunas modalidades, el antagonista es monovalente. En otras modalidades, el antagonista es un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, tal como un fragmento de unión al antígeno monovalente (por ejemplo, scFv, Fab, Fab', dAb) que tiene especificidad de unión para TNFR 1 . Otros antagonistas preferidos son ligandos descritos en l a presente que unen TN FR1 . Los ligandos comprenden un dominio variable único de inmunoglobulina o anticuerpo de dominio (dAb) que tiene especificidad de unión para TNFR1 , o las regiones determinando complementariedad de tal dAb en un formato adecuado. En algunas modalidades, el ligando es un monómero dAb que consiste esencialmente de, o consiste de, un dominio variable único de inmunoglobulina o dAb que tiene especificidad de unión para TNFR1. En otras modalidades, el ligando es un polipéptido que comprende un dAb (o CDRs de un dAb) en un formato adecuado, tal como un formato de anticuerpo. En ciertas modalidades, el ligando es un ligando específico dual que comprende un primer dAb que une TNFR1 y un segundo dAb que tiene una especificidad de unión diferente del primer dAb. En un ligando específico dual comprende un primer dAb que une un primer epítopo en TNFR1 y un segundo dAb que une un epítopo en un objetivo diferente. En otro ejemplo, el segundo dAb une un epítopo en albúmina de suero. En otras modalidades, el ligando es un ligando multiespecífico que comprende un primer dominio de unión a epítopo que tiene especificidad de unión para TNFR1 y al menos otro dominio de unión a epítopo que tiene especificidad de unión diferente del primer dominio de unión a epítopo. Por ejemplo, el primer dominio de unión a epítopo puede ser un dAb que une TNFR1 o puede ser un dominio que comprende CDRs de un dAb que une TNFR1 (por ejemplo, CDRs injertados en un esqueleto o andamio de proteína adecuado, por ejemplo, un afficuerpo, un andamio SpA, un dominio de receptor LDL clase A o un dominio EGF) o puede ser un dominio que une TNFR1 , en donde el dominio se selecciona de un afficuerpo, un dominio SpA, un dominio de receptor LDL clase A o un dominio EGF). En ciertas modalidades, el ligando o monómero dAb se caracteriza por uno o más de las siguientes: 1 ) disocia de TNFR1 de humano con una constante de disociación (Kd) de 50 nM a 20 pM , y una constante de velocidad Kapagada de 5X10"1 a 1x10"7 s*1; 2) inhibe la unión del Factor de Necrosis de Tumor Alfa (TNFa) a TNFR1 con un IC50 de 500 nM a 50 pM ; 3) neutraliza TNFR1 de humano en un ensayo de célula L929 estándar con un ND50 de 500 nM a 50 pM; 4) antagoniza la actividad del TNFR1 en un ensayo de célula estándar con un ND5o de <100 nM , y a una concentración de <10µM el dAb agoniza la actividad del TNFR1 por <5% en el ensayo; 5) inhibe letalidad en el modelo de ataque séptico inducido por galactosamina LPS/D de ratón; 6) resiste agregación; 7) se secreta en una cantidad de al menos aproximadamente 0.5 mg/L cuando se expresa en especies E. coli o Pichia (por ejemplo, P. pastoris); 8) desdobla reversiblemente; 9) tiene eficacia en un modelo de enfermedad inflamatoria crónica seleccionada del grupo que consiste de modelo de artritis inducida por colágeno de ratón, modelo de artritis ?ARE de ratón, modelo de enfermedad del intestino inflamatoria ?ARE de ratón, modelo de enfermedad del intestino inflamatoria inducida por sodio de sulfato de dextran de ratón, modelo de enfermedad pulmonar obstructiva crónica por fumado de tabaco de ratón, y modelos de primate adecuados (por ejemplo, modelo de artritis inducido por colágeno de primate) ; y/o 1 0) tiene eficacia para tratar, suprimir o prevenir una enfermedad inflamatoria crónica. En modalidades particulares, el ligando o monómero dAb se disocia de TNFR1 de humano con una constante de disociación (Kd) de50 nM a 20 pM , y una constante de velocidad Kapagada de 5X1 0" 1 a 1 x10"7 s"1 ; inhibe la unión del Factor de Necrosis de Tumor Alfa (TNFa) a TNFR1 con un IC50 de 500 nM a 50 pM ; y neutraliza TNFR1 de humano en un ensayo de célula L929 estándar con un N D50 de 500 nM a 50 pM . En otras modalidades particulares, el ligando o monómero dAb se disocia de TNFR1 de humano con una constante de disociación (Kd) de 50 nM a 20 Pm, y una constante de velocidad a agada de 5X 10" 1 a 1 x10"7 s" 1 ; i nhibe la unión del Factor de Necrosis de Tumor Alfa (TNFa) a TNFR 1 con un I C50 de 500 nM a 50 pM ; y tiene eficacia en un modelo de enfermedad inflamatoria crónica seleccionada del grupo que consiste de modelo de artritis inducida por colágeno de ratón, modelo de artritis ?ARE de ratón, modelo de enfermedad del intestino inflamatoria ?ARE de ratón, modelo de enfermedad del intestino inflamatoria inducida por sodio de sulfato de dextran de ratón, modelo de enfermedad pulmonar obstructiva crónica por fumado de tabaco de ratón, y modelos de primate adecuados (por ejemplo, modelo de artritis inducido por colágeno de primate). En otras modalidades particulares, el ligando o monómero dAb se disocia de TNFR 1 de humano con una constante de disociación (Kd) de 50 nM a 20 Pm, y una constante de velocidad Kapagada de 5X10" 1 a 1 x10"7 s" 1 ; neutraliza TNFR 1 de humano en un ensayo de célula L929 estándar con un ND50 de 500 nM a 50 pM; y antagoniza la actividad del TNFR1 en un ensayo de célula estándar con un NDS0 de <100 nM, y a una concentración de <10µM el dAb agoniza la actividad del TNFR1 por <5% en el ensayo. En una modalidad más particular, el ligando o monómero dAb comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 90% homologa a una secuencia de aminoácidos de un dAb seleccionado del grupo que consiste de TAR2h-12 (SEQ ID NO:32), TAR2h-13 (SEQ ID NO:33), TAR2h-14 (SEQ ID NO:34), TAR2h-16 (SEQ ID NO:35), TAR2h-17 (SEQ ID NO:36), TAR2h-18 (SEQ ID NO:37), TAR2h-19 (SEQ ID NO:38), TAR2h-20 (SEQ ID NO:39), TAR2h-21 (SEQ ID NO:40), TAR2h-22 (SEQ ID NO:41), TAR2h-23 (SEQ ID NO.42), TAR2h-24 (SEQ ID NO:43), TAR2h-25 (SEQ ID NO:44), TAR2h-26 (SEQ ID NO:45), TAR2h-27 (SEQ ID NO:46), TAR2h-29 (SEQ ID NO:47), TAR2h-30 (SEQ ID NO:48), TAR2h-32 (SEQ ID NO:49), TAR2h-33 (SEQ ID NO:50), TAR2h-10-1 (SEQ ID NO:51), TAR2h-10-2 (SEQ ID NO:52), TAR2h-10-3 (SEQ ID NO:53), TAR2h-10-4 (SEQ ID NO:54), TAR2h-10-5 (SEQ ID NO:55), TAR2h-10-6 (SEQ ID NO:56), TAR2h-10-7 (SEQ ID NO:57), TAR2h-10-8 (SEQ ID NO:58), TAR2h-10-9 (SEQ ID NO:59), TAR2h-10-10 (SEQ ID NO:60), TAR2h-10-11 (SEQ ID NO:61), TAR2h-10-12 (SEQ ID NO:62), TAR2h-10-13 (SEQ ID NO:63), TAR2h-10-14 (SEQ ID NO:64), TAR2h-10-15 (SEQ ID NO:65), TAR2h-10-16 (SEQ ID NO:66), TAR2h-10-17 (SEQ ID NO:67), TAR2h-10-18 (SEQ ID NO:68), TAR2h- 10-19 (SEQ ID NO:69), TAR2h-10-20 (SEQ ID NO:70), TAR2h-10-21 (SEQ ID NO:71), TAR2h-10-22 (SEQ ID NO:72), TAR2h-10-27 (SEQ ID NO:73), TAR2h-10-29 (SEQ ID NO:74), TAR2h-10-31 (SEQ ID NO:75), TAR2h-10-35 (SEQ ID NO:76), TAR2h-10-36 (SEQ ID NO:77), TAR2h-10-37 (SEQ ID NO:78), TAR2h-10-38 (SEQ ID NO:79), TAR2h-10-45 (SEQ ID NO:80), TAR2h-10-47 (SEQ ID NO:81), TAR2h-48 (SEQ ID NO:82), TAR2h-10-57 (SEQ ID NO:83), TAR2h-10-56 (SEQ ID NO:84), TAR2h-10-58 (SEQ ID NO:85), TAR2h-10-66 (SEQ ID NO:86), TAR2h-10-64 (SEQ ID NO:87), TAR2h-10-65 (SEQ ID NO:88), TAR2h-10-68 (SEQ ID NO:89), TAR2h-10-69 (SEQ ID NO:90), TAR2h-10-67 (SEQ ID NO:91), TAR2h-10-61 (SEQ ID NO:92), TAR2h-10-62 (SEQ ID NO:93), TAR2h-10-63 (SEQ ID NO:94), TAR2h-10-60 (SEQ ID NO:95), TAR2h-10-55 (SEQ ID NO:96), TAR2h-10-59 (SEQ ID NO:97), TAR2h-10-70 (SEQ ID NO:98), TAR2h-34 (SEQ ID NO:373), TAR2h-35 (SEQ ID NO:374), TAR2h-36 (SEQ ID NO:375), TAR2h-37 (SEQ ID NO:376), TAR2h-38 (SEQ ID NO:377), TAR2h-39 (SEQ ID NO:378), TAR2h-40 (SEQ ID NO:379), TAR2h-41 (SEQ ID NO:380), TAR2h-42 (SEQ ID NO:381), TAR2h-43 (SEQ ID NO:382), TAR2h-44 (SEQ ID NO:383), TAR2h-45 (SEQ ID NO:384), TAR2h-47 (SEQ ID NO:385), TAR2h-48 (SEQ ID NO:386), TAR2h-50 (SEQ ID NO:387), TAR2h-51 (SEQ ID NO:388), TAR2h-66 (SEQ ID NO:389), TAR2h-67 (SEQ ID NO:390), TAR2h-68 (SEQ ID NO:391), TAR2h-70 (SEQ ID NO:392), TAR2h-71 (SEQ ID NO:393), TAR2h-72 (SEQ ID NO:394), TAR2h-73 (SEQ ID NO:395), TAR2h-74 (SEQ ID NO:396), TAR2h-75 (SEQ ID NO:397), TAR2h-76 (SEQ ID NO:398), TAR2h-77 (SEQ ID NO:399), TAR2h-78 (SEQ ID NO:400), TAR2h-79 (SEQ ID NO:401), y TAR2h-15 (SEQ ID NO.431). En modalidades adicionales, el ligando o monómero dAb comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 90% homologa a una secuencia de aminoácidos de un dAb seleccionado del grupo que consiste de TAR2h-131-8 (SEQ ID NO:433), TAR2h-131-24 (SEQ ID NO:434), TAR2h-15-8 (SEQ ID NO:435), TAR2h-15-8-1 (SEQ ID NO:436), TAR2h-15-8-2 (SEQ ID NO:437), TAR2h-185-23 (SEQ ID NO:438), TAR2h-154-10-5 (SEQ ID NO:439), TAR2h-14-2 (SEQ ID NO:440), TAR2h-151-8 (SEQ ID NO:441), TAR2h-152-7 (SEQ ID NO:442), TAR2h-35-4 (SEQ ID NO:443), TAR2h-154-7 (SEQ ID NO:444), TAR2h-80 (SEQ ID NO:445), TAR2h-81 (SEQ ID NO:446), TAR2h-82 (SEQ ID NO:447), TAR2h-83 (SEQ ID NO:448), TAR2h-84 (SEQ ID NO:449), TAR2h-85 (SEQ ID NO:450), TAR2h-86 (SEQ ID NO:451), TAR2h-87 (SEQ ID NO:452), TAR2h-88 (SEQ ID NO:453), TAR2h-89 (SEQ ID NO:454), TAR2h-90 (SEQ ID NO:455), TAR2h-91 (SEQ ID NO:456), TAR2h-92 (SEQ ID NO:457), TAR2h-93 (SEQ ID NO:458), TAR2h-94 (SEQ ID NO:459), TAR2h-95 (SEQ ID NO:460), TAR2h-96 (SEQ ID NO:461), TAR2h-97 (SEQ ID NO:462), TAR2h-99 (SEQ ID NO:463), TAR2h-100 (SEQ ID NO:464), TAR2h-101 (SEQ ID NO:465), TAR2h-102 (SEQ ID NO:466), TAR2h-103 (SEQ ID NO.467), TAR2h-104 (SEQ ID NO:468), TAR2h-105 (SEQ ID NO:469), TAR2h-106 (SEQ ID NO:470), TAR2h- 107 (SEQ ID NO:471), TAR2h-108 (SEQ ID NO:472), TAR2h-109 (SEQ ID NO:473), TAR2h-110 (SEQ ID NO:474), TAR2h-111 (SEQ ID NO:475), TAR2h-112 (SEQ ID NO:476), TAR2h-113 (SEQ ID NO:477), TAR2h-114 (SEQ ID NO:478), TAR2h-115 (SEQ ID NO:479), TAR2h-116 (SEQ ID NO:480), TAR2h-117 (SEQ ID NO:481), TAR2h-118 (SEQ ID NO:482), TAR2h-119 (SEQ ID NO:483), TAR2h-120 (SEQ ID NO:484), TAR2h-121 (SEQ ID NO:485), TAR2h-122 (SEQ ID NO:486), TAR2h-123 (SEQ ID NO:487), TAR2h-124 (SEQ ID NO:488), TAR2h-125 (SEQ ID NO:489), TAR2h-126 (SEQ ID NO:490), TAR2h-127 (SEQ ID NO:491), TAR2h-128 (SEQ ID NO:492), TAR2h-129 (SEQ ID NO:493), TAR2h-130 (SEQ ID NO:494), TAR2h-131 (SEQ ID NO:495), TAR2h-132 (SEQ ID NO:496), TAR2h-133 (SEQ ID NO:497), TAR2h-151 (SEQ ID NO:498), TAR2h-152 (SEQ ID NO:499), TAR2h-153 (SEQ ID NO:500), TAR2h-154 (SEQ ID NO:501), TAR2h-159 (SEQ ID NO:502), TAR2h-165 (SEQ ID NO:503), TAR2h-166 (SEQ ID NO:504), TAR2h-168 (SEQ ID NO.505), TAR2h-171 (SEQ ID NO:506), TAR2h-172 (SEQ ID NO:507), TAR2h-173 (SEQ ID NO:508), TAR2h-174 (SEQ ID NO:509), TAR2h-176 (SEQ ID NO:510), TAR2h-178 (SEQ ID NO:511), TAR2h-201 (SEQ ID NO:512), TAR2h-202 (SEQ ID NO:513), TAR2h-203 (SEQ ID NO:514), TAR2h-204 (SEQ ID NO:515), TAR2h-185-25 (SEQ ID NO:516), TAR2h-154-10 (SEQ ID NO:517) y TAR2h-205 (SEQ ID NO:627). La invención se refiere a un antagonista de Factor de Necrosis de Tumor I (TNFR1) que une el Factor de Necrosis de Tumor 1 (TNFR1) e inhibe la transducción de señal a través de TNFR1, en donde dicho antagonista no inhibe la unión de TNFa a TNFR1. En algunas modalidades, el antagonista comprende un primer monómero de anticuerpo de dominio (dAb) y un segundo monómero dAb, en donde dicho primer monómero dAb une un dominio de TNFR 1 seleccionado del grupo que consiste de Dominio 1 , Dominio 2, Dominio 3 y Dominio 4, y dicho segundo monómero dAb une un dominio de TNFR1 seleccionado del grupo que consiste de Dominio 1 , Dominio 2, Dominio 3 y Dominio 4, en donde dicho antagonista no agoniza TNFR1 cuando está presente a una concentración de aproximadamente 1 µM en un ensayo de citotoxicidad L929 estándar o un ensayo HeLa IL-8 estándar. En algunas modalidades, la invención es un monómero de anticuerpo de dominio (dAb) o ligando comprendiendo un dAb que une el Factor de Necrosis de Tumor 1 (TNFR1 ) e inhibe transducción de señal a través de TNFR1 , en donde dicho monómero dAb no inhibe la unión de TNFa a TNFR1. En otras modalidades, la invención es un monómero de anticuerpo de dominio (dAb) o ligando comprendiendo un dAb que une el Factor de Necrosis de Tumor I (TNFR 1 ), en donde dicho dAb une el Dominio 1 de TNFR1 y compite con TAR2m-21 -23 para unir a TNFR1 de ratón o compite con TAR2h-205 para unión a TNFR1 de humano. En otras modalidades, la invención es un monómero de anticuerpo de dominio (dAb) o ligando comprendiendo un dAb que une el Factor de Necrosis de Tumor I (TNFR1 ), en donde dicho dAb une el Dominio 3 de TNFR1 y compite con TAR2h-131 -8, TAR2h-15-8, TAR2h-35-4, TAR2h-154-7, TAR2h-154-10 o TAR2h-185-25 para unir a TNFR1 de humano. La invención también se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que tiene especificidad de unión para TNFR1 y tiene eficiencia para tratar, suprimir o prevenir una enfermedad inflamatoria crónica. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno es un fragmento de unión al antígeno monovalente. La invención también proporciona un monómero dAb, y ligandos comprendiendo el monómero dAb, que tiene especificidad de unión a TNFR1 e inhibe señalización mediada por TNFR1 , pero no inhibe substancialmente la unión de TNFa a TNFR1. En algunas modalidades el monómero dAb inhibe la degradación inducida por TNFa o agrupamiento de TNFR1 en la superficie de una célula. La invención también proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas y/o recombinantes que codifican los ligandos de la invención, y vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico recombinantes. También se proporcionan las células huésped comprendiendo las moléculas de ácido nucleico recombinantes o vectores de la invención y métodos para producir los ligandos. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas comprendiendo un antagonista o ligando de la invención y un vehículo farmacológica, fisiológica o farmacéuticamente aceptable. La invención también se refiere a métodos para tratar, suprimir o prevenir una enfermedad o desorden (por ejemplo, una enfermedad inflamatoria crónica, un desorden autoinmune, enfermedad inflamatoria, artritis, esclerosis múltiple, enfermedad del intestino inflamatoria, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, neumonía, ataque séptico), comprendiendo administrar a un mamífero en necesidad de la misma una cantidad terapéuticamente efectiva o dosis de un antagonista o ligando de la invención. La invención también se refiere a un antagonista o ligando de la invención para utilizarse en terapia o diagnóstico, y al uso de un antagonista o ligando de la invención para la fabricación de un medicamento para tratar, suprimir o prevenir una enfermedad o desorden como se describe en la presente (por ejemplo, una enfermedad inflamatoria crónica, un desorden autoinmune, enfermedad inflamatoria, artritis, esclerosis múltiple, enfermedad de intestino inflamatoria, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, neumonía o ataque séptico. En otras modalidades, la enfermedad puede ser fibrosis cística o asma resistente a esteroides severo). La invención se refiere además a una composición farmacéutica para tratar, suprimir o prevenir una enfermedad o desorden descrito en la presente (por ejemplo, una enfermedad inflamatoria crónica, un desorden autoinmune, enfermedad inflamatoria, artritis, esclerosis múltiple, enfermedad de intestino inflamatoria, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, neumonía o ataque séptico. En otras modalidades, la enfermedad puede ser fibrosis cística o asma resistente a esteroides severo) comprendiendo un antagonista o ligando de la invención como un ingrediente activo. Los dominios variables únicos o anticuerpos de dominio (dAb) que tienen especificidad de unión para TNFR1 y ligandos comprendiendo estos dominios variables únicos o dAbs tienen varias ventajas. Por ejemplo, los dominios variables únicos o dAbs que tienen especificidad de unión para TNFR1 descritos en la presente antagonizan TNFR1. De acuerdo con lo anterior los agentes terapéuticos que comprenden un dominio variable único de inmunoglobulina anti-TNFR1 o dAb de la invención pueden administrarse (por ejemplo, para propósitos terapéuticos, de diagnóstico o profilácticos) con riesgo substancialmente reducido de efectos secundarios causados por unión y/o antagonismo de TNFR2 (por ejemplo, inmunosupresión). Los agentes terapéuticos que tienen como objetivo TNF alfa, tal como ENBREL® (entarecept; Immunex Corporation) antagonizan TNFR1 y TNFR2, y la administración de tales agentes puede producir inmunosupresión y efectos secundarios relacionados (por ejemplo, infecciones serias). Estos efectos secundarios pueden limitar el uso de tales agentes, particularmente para enfermedades crónicas donde el agente se administra durante un periodo largo. (Kollias G. and Kontoyiannis D., Cytokine Growth Factor Rev. , Í3(4-5): 315-321 (2002)). En contraste, debido a que los ligandos de la invención específicamente antagonizan TNFR1 , pueden administrarse durante periodos largos, en una base crónica, con riesgo reducido de efectos secundarios y proporcionan ventajas para tratar condiciones inflamatorias y condiciones inflamatorias crónicas (incluyendo enfermedades de larga duración), caracterizadas por periodos de quiescencia y periodos de inflamación activa, tal como enfermedad de intestino inflamatorio y artritis).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1 muestra la diversificación de VH/HSA en posiciones H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98 (DVT o NNK respectivamente codificados) que están en el sitio de unión al antígeno de VH HSA. (SEQ I D NO: 1 , secuencia de nucleótidos; SEQ I D NO:2, secuencia de aminoácidos). La secuencia V« se diversifica en posiciones L50, L53. Figura 2 es un esquema mostrando la estructura del plásmido plTI/plT2 utilizado para preparar bibliotecas de Fv de cadena única (scFv), y muestra la secuencia de nucleótidos del plásmido a través del control de expresión y regiones de clonación (SEQ I D NO:3) y la secuencia de aminoácidos codificada (SEQ I D NO:4). El plásmido se utiliza para preparar Biblioteca 1 : Línea germinal V /DVT VH, Biblioteca 2: Línea germinal VK/NNK VH, Biblioteca 3: Línea germinal VH/DVT V?, y Biblioteca 4: Línea germinal VH/NNK V? en formato de despliegue de fago/ScFv. Estas bibliotecas se pre-seleccionan para unirse a proteína A y proteína L de ligandos genéricos de manera que la mayoría de los clones y bibliotecas seleccionadas son funcionales. Las bibliotecas se seleccionan en HSA (primer vuelta) y ß-gal (segunda vuelta) o selección de HSA ß-gal o en selección de ß-gal (primera vuelta) y HSA (segunda vuelta) ß-gal HSA. scFv soluble de estos clones de PCR se amplifican en la secuencia. Un clon codificando un anticuerpo específico dual K8 se elige para trabajo adicional . Figura 3 muestra una alineación de las cadenas VH (VH de imitación (SEQ ID NO: 5), K8 (SEQ I D NO:6), VH2 (SEQ I D NO:7), VH4 (SEQ I D NO:8), VHC11 (SEQ ID NO:9), VHAI Osd (SEQ I D NO: 10), VHAI sd (SEQ I D NO: 1 1 ), VHAdsd (SEQ I D NO: 12), VHC5sd (SEQ I D NO: 13), VHC1 1 sd (SEQ I D NO: 14), y cadenas V? (Vk de imitación (SEQ I D NO: 16), K8 (SEQ I D NO: 17), E5sc (SEQ I D NO: 18), C3 (SEQ ID NO: 19)). Figura 4 muestra la caracterización de las propiedades de unión del anticuerpo K8, las propiedades de unión del anticuerpo K8 caracterizadas por ELISA de fago monoclonal, el anticuerpo K8 específico dual se encuentra para unir HSA y ß-gal y desplegarse en la superficie del fago con señales absorbentes mayores a 1.0. No se detecta reactividad cruzada con otras proteínas. Figura 5 muestra ELISA scFv soluble realizado utilizando concentraciones conocidas del fragmento de anticuerpo K8. Una placa de 96 cavidades se reviste con 100µg de HSA, BSA y ß-gal a 10µg/ml y 100µg/ml de proteína A a una concentración de 1 µg/ml. 50µg de las diluciones seriales del scFv K8 se aplica y los fragmentos de anticuerpo unidos se detectan con Proteína L-HRP. Los resultados ELISA confirman la naturaleza específica dual del anticuerpo K8. Figura 6 muestra las características de unión del clon K8V?/VH de imitación analizado utilizando ELISA scFV soluble. La producción de los fragmentos scFV solubles se induce por I PTG como se describe por Harrison et al, Methods Enzymol. 1996;267:83-109 y el sobrenadante conteniendo scFv ensayado directamente. ELISA scFV soluble se realiza como se describe en el ejemplo 1 y los scFvs unidos se detectan con Proteína L-HRP. Los resultados de ELISA revelaron que este clon aún es capaz de unir ß-gal , mientras la unión de BSA se elimina. Figura 7 muestra la secuencia (SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3) de vectores de dominio variable 1 y 2. Figura 8 es un mapa del vector CH utilizado para construir un ligando multiespecífico VH1 /VH2. Figura 9 es un mapa del vector C? utilizado para construir un ligando multiespecífico V?1/V?2. Figura 10 muestra un ensayo de receptor TNF comparando el dímero 4 TAR1 -5, dímero 4 TAR1 -5-19 y monómero TAR1 -5-19. Figura 1 1 muestra un ensayo de receptor TNF comparando los dímeros 1 -6 TAR1 -5. Todos los dímeros se han purificado por FPLC y los resultados para las especies diméricas óptimas se muestran. Figura 12 muestra un ensayo de receptor TNF de 19 homodímeros TAR1 -5 en diferentes formatos: formato dAb-enlazador-dAb con enlazador 3U, 5U o 7U, formato Fab y formato de enlazador de articulación de cisteína. Figura 13 muestra la secuencia VH de imitación para l a biblioteca 1. (Secuencia de aminoácidos ((SEQ I D NO:5; secuencias de nucleótidos: filamento de codificación (SEQ ID NO:20), filamento de no codificación (SEQ I D NO:21 ). La secuencia de la estructura VH se basa en la secuencia de línea germinal DP47-J H4b. Posiciones donde la aleatorización NN K (N = nucleótidos A o T o C o G; K.=nucleótidos G o T) se ha incorporado en la biblioteca 1 se indican en el texto subrayado en negritas. Figura 14 muestra La secuencia VH de imitación para la biblioteca 2. (Secuencia de ami noácidos ((SEQ I D NO:22; secuencias de nucleótidos: filamento de codificación (SEQ I D NO:23), filamento de no codificación (SEQ ID NO: 24). La secuencia de la estructura VH se basa en la secuencia de línea germinal DP47-JH4b. Posiciones donde aleatorización NNK (N=Nucleótidos A o T o C o G; K=Nucleótidos G o T) se ha incorporado en la biblioteca 2 se indican en texto subrayado en negritas. Figura 15 muestra la secuencia VK de imitación para la biblioteca 3. (Secuencia de aminoácidos ((SEQ I D NO: 16; secuencias de nucleótidos: filamento de codificación (SEQ I D NO:25), filamento de no codificación (SEQ I D NO: 26). La secuencia de la estructura VK se basa en la secuencia de l ínea germinal DP 9-J?1 . Posiciones donde aleatorización NNK (N=Nucleótidos A o T o C o G; K=Nucleótidos G o T) se ha incorporado en la biblioteca 3 se indican en texto subrayado en negritas. Figura 16 muestra secuencia de aminoácidos y nucleótidos de anti MSA dAbs MSA 16 (secuencia de nucleótidos (SEQ I D NO:27), secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:28) y MSA 26 (secuencia de nucleótidos (SEQ I D NO:29), secuencia de aminoácidos (SEQ I D NO:30).

Figura 17 muestra bianúcleo de inhibición de MSA 16 y 26. dAbs MSA16 and MSA26 purificados se analizan por bianúcleo de inhibición para determinar Kd. Brevemente, los dAbs se prueban para determinar la concentración de dAb requerida para lograr 200RUs de respuesta en un chip CM5 de bianúcleo con una alta densidad de MSA. Una vez que las concentraciones requeridas de dAb se han determinado, el antígeno MSA en un rango de concentraciones alrededor de Kd esperado se premezcla con dAb e incuba durante la noche. La unión a chip de bianúcleo revestido MSA de dAb en cada una de las premezclas se mide entonces a una velocidad de flujo alta de 30 µl/minuto. Figura 18 muestra niveles de suero de MSA16 después de inyección. La vida media del suero de dAb MSA16 se determina en el ratón. MSA16 se dosifica como inyecciones i.v. únicas a aproximadamente 1.5mg/kg en ratones CD1. La modelación con un modelo de 2 compartimentos mostró que MSA16 tuvo un t1 /2a de 0.98hr, un t1 /2ß de 36.5hr y un AUC de 913hr. mg/ml. MSA16 tuvo una vida media considerablemente alargada en comparación con HEL4 (dAb de lisozima blanca de hueco anti-gallina) que tuvo un t1 /2a de 0.06hr y un t1 /2ß de 0.34hr. Figuras 19a-19c muestran un ensayo ELISA (Figura 19a) y de receptor TNF (Figura 19b, 19c) mostrando la inhibición de la unión TNF con un fragmento similar a Fab comprendiendo MSA26Ck y TAR1 -5-19CH. La adición de MSA con el fragmento similar a Fab reduce el nivel de inhibición. Una placa ELISA revestida con 1 µg/ml TNFa se prueba con VK CH específica dual y fragmento similar a Fab VK CK y también con un dAb de unión a TNFa de control a una concentración calculada para dar una señal similar en ELISA. Tanto dAb de control como específico dual se utilizan para probar la placa ELISA en la presencia y en la ausencia de 2mg/ml MSA. La señal en la cavidad específica dual se reduce por más del 50% pero la señal en la cavidad dAb no se reduce del todo (ver Figura 19a). La misma proteína específica dual también se coloca en el ensayo de receptor con y sin MSA y competición por MSA también se muestra (ver Figura 19c). Esto demuestra que la unión de MSA al especifico dual es competitiva con la unión a TNFa. Figura 20 muestra un ensayo de receptor TNF mostrando inhibición de la unión de TNF con un heterodímero unido de disulfuro de TAR1 -5-19 dAb y MSA16 dAb. La adición de MSA con el dímero reduce el nivel de inhibición en una manera dependiente de dosis. El ensayo de receptor TNF (Figura 19 (b)) se conduce en la presencia de una concentración constante de heterodímero ( 18nM) y una serie de dilución de MSA y HSA. La presencia de HSA en un rango de concentraciones (hasta 2 mg/ml) no causo una reducción en la habilidad del dímero para inhibir TNFa. Sin embargo, la adición de MSA causó una reducción dependiente de dosis en la habilidad del dímero para inhibir TNFa (Figura 19a). Esto demuestra que MSA y TNFa compiten por la unión a TAR1 -5-19 unido a cys, dímero MSA16. MSA y HSA solos no tuvieron efecto en el nivel de unión TNF en el ensayo.

Figuras 21 A-21 M muestran las secuencias de aminoácidos (SEQ I D NOS:31 -98 y SEQ I D NOS: 373-401 y 431 ) de varios dominios variables de inmunoglobulina de humano que tienen especificidad de unión para TNFR1 de humano. Las secuencias de aminoácidos presentadas son continuas sin espacios; el símbolo ~ se ha insertado en las secuencias para indicar las ubicaciones de las regiones de determinación complementarias (CDRs). CDR1 se flanquea por ~, CDR2 se flanquea por — , y CDR3 se flanquea por Figuras 22A-22T muestran las secuencias de nucleótidos (SEQ I D NOS: 99-166 y SEQ I D NOS:402-430 y 432) de varios ácidos nucleicos que codifican los dominios variables de inmunoglobulina de humano presentados en la Figura 21 A-21 M . Las secuencias de nucleótidos son continuas sin espacios; el símbolo ~ se ha insertado en las secuencias para indicar la ubicación de las secuencias codificando las CDRs. Las secuencias codificando CDR1 se flanquean por ~, las secuencias codificando CDR2 se flanquean por — , y las secuencias codificando CDR3 se flanquean por — -. Figuras 23A-23B muestran las secuencias de aminoácidos (SEQ I D NOS: 167-179) de varios dominios variables de inmunoglobuli na de humano que tienen especificidad de unión para TNFR1 de ratón. Las secuencias de aminoácidos presentadas son continuas sin espacios. En algunas de las secuencias el símbolo ~ se ha insertado para indicar la ubicación de las regiones de determinación complementarias (CDRs). CDR1 se flanquea por ~, CDR2 se flanquea por — , y CDR3 se flanquea por . Figuras 24A-24C muestran las secuencias de nucleótidos (SEQ I D NOS: 180-192 y 626) de varios ácidos nucleicos que codifican los dominios variables de inmunoglobulina de humano presentados en la Figura 23A-23B. SEQ I D NO: 186 y SEQ I D NO:626 ambas codifican la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 173. Las secuencias de SEQ ID NO:626 codificando CDR1 se flanquean por ~, las secuencias codificando CDR2 se flanquean por — , y las secuencias codificando CDR3 se flanquean por — . Figuras 25A-25L muestran las secuencias de nucleótidos codificando varios dominios variables de inmunoglobulina de humano y las secuencias de aminoácidos de los dominios variables de inmunoglobulina de humano codificados (SEQ I D NOS: 193-198 y 200-295). Figura 26 es una gráfica mostrando que los formatos anti- TNFR1 dAb no agonizan substancialmente TNFR1 en un ensayo L929. Las células. L929 se cultivan en medios que contienen un rango de concentraciones de monómero anti-TNFR1 dAb (TAR2m-21 -23), monómero TAR2m-21 -23 degradado por un anticuerpo anti-myc comercialmente disponible (9E10), anti-TNFR1 dAb/anti-SA dAb específico dual (TAR2m-21 -23 3U TAR7m-16), o monómero anti-TNFR1 dAb pegilado (TAR2m-21 -23 40K PEG). En el caso de monómero TAR2m-21 -23 degradado por el anticuerpo anti-myc, dAb y el anticuerpo se mezclan en una proporción 2: 1 y pre-incuban por una hora a temperatura ambiente para estimular los efectos de degradación i nmune in vivo antes del cultivo. (El monómero TAR2m-21 -23 incluye un epítopo myc.) . Monómero TAR2m-21 -23 se incuba con las células L929 a una concentración de 3,000 nM. Monómero TAR2m-21-23 y anticuerpo anti-Myc se incuban a una concentración de dAb de 3,000 nM . TAR2m-21 -23 3U TAR7m-16 se incuba con las células en concentraciones de 25 nM , 83.3 nM, 250 nM , 833 nM y 2,500 nM . TAR2m-21 -23 40K PEG se incuba con las células en concentraciones de 158.25 nM , 527.5 nM, 1582.5 nM, 5,275 nM y 15, 825 nM . Después de incubación durante la noche, la viabilidad celular se valora. Los resultados revelaron que la incubación de las células L929 con 10 nM, 1 nM o 0.1 nM de un anticuerpo IgG anti-TNFR1 comercialmente disponible que degrada y agoniza TNFR1 (No. de Catálogo AF-425-PB; R&D Systems, Minneapolis, M N) resultó en incremento dependiente de dosis en células no viables, demostrando así la sensibilidad de estas células a combatientes de TNFR1. En contraste, la incubación con varias cantidades de formatos anti-TNFR1 no antagonizan TNFR1 y no resulta en un incremento en el número de células no viables en los cultivos, aún cuando se utiliza más de 1000 veces la concentración del anticuerpo IgG anti-TNFR1 comercialmente disponible. Figuras 27A-27I muestran las secuencias de aminoácidos (SEQ I D NOS:433-517 y 627) de varios dominios variables de inmunoglobulina de humano que tienen especificidad de unión para TNFR1 de humano. Las secuencias de aminoácidos presentadas son continuas sin espacios; el símbolo ~ se ha insertado en las secuencias para indicar las ubicaciones de las regiones de determinación complementarias (CDRs). CDR1 se flanquea por ~, CDR2 se flanquea por — , y CDR3 se flanquea por . Figuras 28A-28O muestran las secuencias de nucleótidos (SEQ I D NOS: 518-602 y 628) de varios ácidos nucleicos que codifican los dominios variables de inmunoglobulina de humano en la Figura 27A-27H. Las secuencias de nucleótidos presentadas son continuas sin espacios; el símbolo - se ha insertado en las secuencias para indicar la ubicación de las secuencias codificando las CDRs. Las secuencias codificando CDR1 se flanquean por ~, las secuencias codificando CDR2 se flanquean por — , y las secuencias codificando CDR3 se flanquean por .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Dentro de esta especificación las modalidades se han descrito en una manera que permite una especificación clara y concisa a escribirse, pero se propone y se apreciará que las modalidades pueden combinarse o separarse de diversas maneras sin partir de la invención. Definiciones "Complementario" Dos dominios de inmunoglobulina son "complementarios" donde pertenecen a familias de estructuras que forman pares o grupos cognados o se derivan de tales familias y mantienen esta característica. Por ejemplo, un dominio VH y un dominio V de un anticuerpo son complementarios, dos dominios VH no son complementarios, y dos dominios VL no son complementarios. Los dominios complementari os pueden encontrarse en otros miembros de la superfamilia de inmunoglobulina, tales como los dominios Va y Vp (o ? y d) del receptor de célula T. En el contexto de la segunda configuración de la presente invención, los dominios no complementarios no se unen a una molécula objetivo de manera cooperativa, pero actúan independientemente en diferentes epítopos objetivo que pueden estar en las mismas o diferentes moléculas. Los dominios que son artificiales, tales dominios en base a andamios de proteína que no unen epítopos al menos que se formen para hacer esto, no son complementarios. Del mismo modo, dos dominios en base a (por ejemplo) un dominio de inmunoglobulina y un dominio de fibronectina no son complementarios. "Inmunoglobulina" Se refiere a una familia de polipéptidos que mantienen la característica de doblez de la inmunoglobulina de moléculas de anticuerpo, que contiene dos hojas ß y, usualmente un enlace de disulfuro conservado. Los miembros de la superfamilia de inmunoglobulina se incluyen en muchos aspectos de las interacciones celulares y no celulares in vivo, incluyendo papeles difundidos en el sistema inmune (por ejemplo, anticuerpo, moléculas receptoras de célula T y lo similar), inclusión en adhesión celular (por ejemplo, las moléculas ICAM) y señalización intracelular (por ejemplo, moléculas receptoras, tal como el receptor PDGF). La presente invención es aplicable a todas las moléculas de la superfamilia de inmunoglobulina que posee dominios de unión.

Preferentemente, la presente invención se refiere a anticuerpos. "Combinación" Dominios variables de acuerdo a la invención se combinan para formar un grupo de dominios; por ejemplo, dominios complementarios pueden combinarse, tales como dominios VL combinándose con dominios VH. Los dominios no complementarios pueden también combinarse. Los dominios pueden combinarse en un número de maneras, incluyendo enlace de los dominios por medios covalentes o no covalentes. "Dominio" Un dominio es una estructura de proteína doblada que mantiene su estructura terciaria independientemente del resto de la proteína. Generalmente, los dominios son responsables de las propiedades funcionales discretas de las proteínas, y en muchos casos pueden agregarse, removerse o transferirse a otras proteínas sin pérdida de función del resto de la proteína y/o del dominio. Por dominio variable de anticuerpo único se entiende un dominio de polipéptido doblado comprendiendo secuencias características de dominios variables de anticuerpo. Por lo tanto incluye dominios variables de anticuerpo completos y dominios variables modificados, por ejemplo, en los cuales uno o más ciclos se han reemplazado por secuencias que no son características de dominios variables de anticuerpo, o dominios variables de anticuerpo que se han truncado o comprometen extensiones de terminal N o C, así como también fragmentos doblados de dominios variables que mantienen al menos en parte la actividad de unión y especificidad del dominio de longitud completa.

"Repertorio" Una colección de diversas variantes, por ejemplo, variantes de polipéptido que difieren en su secuencia primaria. Una biblioteca utilizada en la presente invención comprenderá un repertorio de polipéptidos comprendiendo al menos 1000 miembros. "Biblioteca" El término bi blioteca se refiere a una mezcla de ácidos nucleicos o polipéptidos heterogéneos. La biblioteca se compone de miembros, cada uno de los cuales tiene una secuencia de ácidos nucleicos o polipéptidos única. A este grado, biblioteca es sinónimo de repertorio. Las diferencias de secuencia entre los miembros de la biblioteca son responsables de la diversidad presente en la biblioteca. La biblioteca puede tomar la forma de una mezcla simple de polipéptidos o ácidos nucleicos, o puede estar en la forma de organismos o células, por ejemplo, bacterias, virus, células vegetales o animales y lo similar, transformadas con una biblioteca de ácidos nucleicos. Preferentemente, cada organismo individual o célula contiene solamente uno o un número limitado de miembros de biblioteca. Ventajosamente, los ácidos nucleicos se incorporan en vectores de expresión, para permitir la expresión de los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos. En un aspecto preferido, por lo tanto, una biblioteca puede tomar la forma de una población de organismos huésped, cada organismo conteniendo una o más copias de un vector de expresión conteniendo un miembro único de la biblioteca en forma de ácido nucleico que puede expresarse para producir su miembro de polipéptido correspondiente. De esta manera, la población de organismos huésped tiene el potencial de codificar un gran repertorio de variantes de polipéptido genéticamente diversas. Un "ligando multiespecífico de conformación cerrada" describe un ligando multiespecífico como se define en la presente comprendiendo al menos dos dominios de unión de epítopo como se define en la presente. El término 'conformación cerrada' (ligando multiespecífico) significa que los dominios de unión al epítopo del ligando se ordenan de manera que la unión al epítopo por un dominio de unión al epítopo compite con la unión al epítopo por otro dominio de unión al epítopo. Es decir, los epítopos cognados pueden unirse por cada dominio de unión al epítopo individualmente pero no simultáneamente. La conformación cerrada del ligando puede lograrse utilizando métodos descritos en la presente. "Anticuerpo" Un anticuerpo (por ejemplo IgG , IgM , IgA, IgD o IgE) o fragmento (tal como un Fab , F(ab')2, Fv, Fv enlazado de disulfuro, scFv, anticuerpo multiespecífico de conformación cerrada, scFv enlazado a disulfuro, diacuerpo) si se deriva de cualquier especie que produce de manera natural un anticuerpo, o se crea por tecnología de ADN recombinante; ya sea aislado de suero, células B, hibridomas, transfectomas, levadura o bacteria). "Ligando específico dual" Un ligando comprendiendo un primer dominio variable único de inmunoglobulina y un segundo dominio variable único de inmunoglobulina como se define en la presente, en donde las regiones variables son capaces de unirse a dos antígenos diferentes o dos epítopos en el mismo antígeno que no se unen normalmente por una inmunoglobulina monoespecífica. Por ejemplo, los dos epítopos pueden estar en el mismo hapten, pero no el mismo epítopo o suficientemente adyacente para unirse por un ligando monoespecífico. Los ligandos específicos duales de acuerdo a la invención se componen de dominios variables que tienen diferentes especificidades, y no conti enen pares de dominio variable mutuamente complementarios que tienen la misma especificidad. "Antígeno" Una molécula que se une por un ligando de acuerdo a la presente invención. Típicamente, los antígenos se unen por ligandos de anticuerpo y son capaces de aumentar una respuesta de anticuerpo in vivo. Puede ser un polipéptido, proteína, ácido nucleico u otra molécula. Generalmente, los ligandos específicos duales de acuerdo a la invención se seleccionan para especificidad objetivo contra un antígeno particular. En el caso de anticuerpos convencionales y fragmentos de los mismos, el sitio de unión al anticuerpo definido por los ciclos variables (L1 , L2, L3 y H1 , H2, H3) es capaz de unirse al antígeno. "Epítopo" Una unidad de estructura convencionalmente unida por un par VH/VL de inmunoglobulina. Epitopos definen el sitio de unión mínimo para un anticuerpo, y de esta manera representan el objetivo de especificidad de un anticuerpo. En el caso de un anticuerpo de dominio único, un epítopo representa la unidad de estructura unida por un dominio variable en aislamiento. "Ligando genérico" Un ligando que se une a todos los miembros de un repertorio. Generalmente, no se une a través del sitio de unión al antígeno como se define arriba. Los ejemplos no limitantes incluyen proteína A, proteína L y proteína G. "Selección" Derivado por selección, o derivado por un proceso de selección Darviniano, en el cual las interacciones de unión se hacen entre un dominio y el antígeno o epítopo o entre un anticuerpo y un antígeno o epítopo. De esta manera, un primer dominio variable puede seleccionarse para unirse a un antígeno o epítopo en la presencia o la ausencia de un dominio variable complementario. "Estructura universal" Una secuencia de estructura de anticuerpo única correspondiente a las regiones de un anticuerpo conservado en secuencia como se define por Kabat ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services) o correspondiente a la estructura o repertorio de inmunoglobulina de línea germinal como se define por Chothia and Lesk, (1987) J. Mol . Biol. 196:910-917. La invención proporciona el uso de una estructura única, o un conjunto de tales estructuras, que se ha encontrado que permiten la derivación de virtualmente cualquier especificidad de unión a través de la variación en las regiones hipervariables solas. "Vida media" El tiempo tomado por la concentración de suero del ligando para reducirse al 50%, in vivo, por ejemplo debido a l a degradación del ligando y/o despeje o secuestración del ligando por mecanismos naturales. Los ligandos de la invención se estabilizan in vivo y su vida media se incrementa al unirse a moléculas que resisten la degradación y/o despeje o secuestración. Típicamente, tales moléculas son proteínas que ocurren de manera natural que por ellas mismas tienen una vida media larga in vivo. La vida media de un ligando se incrementa si su actividad funcional persiste, in vivo, por un periodo más largo que un ligando similar que no es específico para la molécula creciente de vida media. De esta manera, un ligando específico para HSA y una molécula objetivo se compara con el mismo ligando en donde la especificidad para HSA no está presente, es decir no une HSA pero une otra molécula. Por ejemplo, puede uni r un segundo epítopo en la molécula objetivo. Típicamente, la vida media se i ncrementa por 10%, 20%, 30%, 40%, 50% o más. Incrementos en el rango de 2x, 3x, 4x, 5x, 10x, 20x, 30x, 40x, 50x o más de la vida media son posibles. Alternativamente, o además, los incrementos en el rango de hasta 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x, 100x, 150x de la vida media son posibles. "Inmunoensayo homogéneo" Un inmunoensayo en el cual el analito se detecta sin necesidad de una etapa de separación de reactivos unidos y no unidos. "Substanciamente idéntica (o "substancialmente homologa")" Una primer secuencia de nucleótidos o aminoácidos que contiene un número suficiente de nucleótidos o residuos de aminoácidos idénticos o equivalentes (por ejemplo, con una cadena lateral similar, por ejemplo, substituciones de aminoácido conservadas) con una segunda secuencia de nucleótidos o aminoácidos de manera que las secuencias de nucleótidos o aminoácidos, primera y segunda, tienen actividades similares. En el caso de anticuerpos, el segundo anticuerpo tiene la misma especificidad de unión y tiene al menos 50% de la afinidad del mismo. Como se utiliza en la presente, los términos "baja severidad" , "severidad media", "alta severidad" o "condiciones de severidad muy alta" describen condiciones para enjuague e hibridización de ácido nucleico. Guía para realizar reacciones de hibridización puede encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. ( 1989), 6.3.1 -6.3.6, que se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. Los métodos acuosos y no acuosos se describen en esa referencia y cualquiera puede utilizarse. Las condiciones de hibridización específicas referidas en la presente son como sigue: ( 1 ) condiciones de hibridización de baja severidad en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproxi madamente 45°C, seguido por dos enjuagues en 0.2X SSC, 0.1 % SDS al menos a 50°C (la temperatura de los enjuagues puede incrementarse a 55°C para condiciones de baja severidad); (2) condiciones de hibridización de severidad media en 6X SSC a aproximadamente 45°C, seguido por uno o más enjuagues en 0.2X SSC, 0.1 % SDS a 60°C; (3) condiciones de hibridización de alta severidad en 6X SSC a aproxi madamente 45°C, seguido por uno o más enjuagues en 0.2X SSC, 0.1 % SDS a 65°C; y preferentemente (4) condiciones de hibridización de severidad muy alta son 0.5M fosfato de sodio, 7% SDS a 65°C, seguido por uno o más enjuagues a 0.2X SSC, 1 % SDS a 65°C. Condiciones de muy alta severidad (4) son las condiciones preferidas y las que deben utilizarse al menos que se especifique otra cosa. Como se utiliza en la presente el término "conformación cerrada" (ligando multiespecífico) significa que los dominios de unión al epítopo del ligando se unen a o asocian entre sí, opcionalmente por medio de una estructura de proteína, de manera que la unión al epítopo por un dominio de unión al epítopo compite con unión al epítopo por otro dominio de unión al epítopo. Es decir, los epítopos cognados pueden unirse por cada dominio de unión al epítopo individual pero no simultáneamente. La conformación cerrada del ligando puede lograrse utilizando métodos descritos en la presente. "Conformación abierta" significa que los dominios de unión al epítopo del ligando se unen a o asocian entre sí, opcionalmente por medio de una Estructura de proteína, de manera que la unión al epítopo por un dominio de unión al epitopo no compite con unión al epítopo por otro dominio de unión al epítopo. Como se refiere en la presente, el término "compite" significa que la unión de un primer epítopo con su dominio de unión al epítopo cognado se inhibe cuando un segundo epítopo se une a su dominio de unión al epítopo cognado. Por ejemplo, la unión puede inhibirse estéricamente, por ejemplo por bloqueo físico de un dominio de unión o por alteración de la estructura o ambiente de un dominio de unión de manera que su afinidad o avidez para un epitopo se reduce.

La frase "dominio variable único de inmunoglobulina" se refiere a una región variable de anticuerpo (VH, VHH , VL) que específicamente une un antígeno o epítopo independientemente de otras regiones V o domi nios, sin embargo, como el término se utiliza en la presente, un dominio variable único de inmunoglobulina puede estar presente en un formato (por ejemplo, homo- o hetero-multímero) con otras regiones variables o dominios variables donde las otras regiones o dominios no se requieren para unión al antígeno por el dominio variable de inmunoglobulina único (es decir, donde el dominio variable único de inmunoglobulina une el antígeno independientemente de los dominios variables adicionales) . "Dominio variable único de inmunoglobulina" comprende no solamente un polipéptido de dominio variable único de anticuerpo aislado, sino que también polipéptidos más largos que comprenden uno o más monómeros de una secuencia de polipéptidos de dominio variable único de anticuerpo. Un "anticuerpo de dominio" o "dAb" es el mismo como un polipéptido de "dominio variable único de inmunoglobulina" como el término se utiliza en la presente. Un polipéptido de dominio variable único de inmunoglobuli na, como se utiliza en la presente se refiere un polipéptido de dominio variable único de inmunoglobulina de mamífero, preferentemente humano, pero también incluye roedor (por ejemplo, como se describe en WO 00/29004, los contenidos de la cual se incorporan en la presente para referencia en su totalidad) o VH H dAbs camélido. Los dAbs camélidos son polipéptidos de dominio variable único de inmunoglobulina que se derivan de especies incluyendo camello, llama, alpaca, dromedario y guanaco, y comprenden anticuerpos de cadena pesada naturalmente desprovistos de cadena ligera; VH H -Moléculas VHH son aproximadamente diez veces más pequeñas que las moléculas IgG y como polipéptidos únicos, son muy estables, resistiendo condiciones de temperatura y pH extremas. Como se utiliza en la presente, el término "antagonista de Receptor de Factor de Necrosis de Tumor 1 (TNFR1 )" se refiere a un agente (por ejemplo, una molécula, un compuesto) que une TNFR1 y puede inhibir (es decir, una o más) una función de TNFR1. Por ejemplo, un antagonista de TNFR1 puede inhibir la unión de TNFa a TNFR 1 y/o inhibir la transducción de señal mediada a través de TNFR1. De acuerdo con lo anterior, respuestas celulares y procesos mediados por TNFR1 (por ejemplo, muerte celular inducida por TNFa en un ensayo de citotoxicidad L929 estándar) pueden inhibirse con un antagonista de TNFR1 . Un antagonista de TNFR1 puede, por ejemplo, ser una molécula orgánica pequeña, producto natural, proteína, péptido o imitación de péptido. Antagonistas de TNFR 1 pueden identificarse, por ejemplo, al seleccionar bibliotecas o colecciones de moléculas, tales como el Recetario Químico del Instituto Nacional de Cáncer, como se describe en la presente o utilizando otros métodos adecuados. Los antagonistas preferidos de TNFR1 son anticuerpo, fragmentos de unión al antígeno de anticuerpo, ligandos y monómeros dAb descritos en la presente. Secuencias similares u homologas (por ejemplo, al menos aproximadamente 70% identidad de secuencia) a las secuencias descritas en la presente también son parte de la invención. En algunas modalidades, la identidad de secuencia en el nivel de aminoácido puede ser aproximadamente 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más alta. En el nivel de ácido nucleico, la identidad de secuencia puede ser aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más alta. Alternativamente, identidad substancial existe cuando los segmentos de ácido nucleico se hibridizarán bajo condiciones de hibridización selectivas (por ejemplo, condiciones de hibri dización de muy alta severidad), al complemento del filamento. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células completas, en un lisato celular, o en una forma substancialmente pura o parcialmente purificada. Cálculos de "homología" o "identidad de secuencia" o "similitud" entre dos secuencias (los términos se utilizan de manera intercambiable en la presente) se realizan como sigue. Las secuencias se alinean para propósitos óptimos de comparación (por ejemplo, espacios pueden introducirse en uno o ambos de una primer secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos y una segunda para alineación óptima y secuencias no homologas pueden ignorarse para propósitos de comparación). En una modalidad preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada para propósitos de comparación es al menos 30%, preferentemente al menos 40%, más preferentemente al menos 50%, aún más preferentemente al menos 60%, y aún más preferentemente al menos 70%, 80%, 90%, 100% de la longitud de la secuencia de referencia. Los residuos de aminoácido o nucleótidos en las posiciones de aminoácido o posiciones de nucleótido correspondientes se comparan entonces. Cuando una posición en la primer secuencia se ocupa por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (como se utiliza en la presente "homología" de ácido nucleico o aminoácido es equivalente a "identidad" de ácido nucleico o aminoácido"). El por ciento de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, tomando en cuenta el número de espacios, y la longitud de cada espacio, que necesita introducirse para alineación óptima de las dos secuencias. Ventajosamente, el algoritmo BLAST (versión 2.0) se emplea para alineación de secuencia, con parámetros establecidos para valores de falla. El algoritmo BLAST se describe en detalle en el sitio web ("www") del Centro Nacional para Información de Biotecnología (". ncbi") de los Institutos Nacionales de Salud ("nih") del gobierno de EE. UU. (". gov"), en el directorio "/Blast/", en el archivo "blast_help.html". Los parámetros de búsqueda se definen como sigue, y se establecen ventajosamente a los parámetros de falla definidos. BLAST (Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica) es el algoritmo de búsqueda heurístico empleado por los programas blastp, blastn, blastx, tblastn, y tblastx; estos programas adscriben significado a sus descubrimientos utilizando los métodos estadísticos de Karli n and Altschul, 1990, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 87(6):2264-8 (ver el archivo "blast_hel p. html", como se descri be arri ba) con unas pocas mejoras. Los programas BLAST se adaptan para búsqueda de similitud de secuencia, por ejemplo, para identificar homólogos con una secuencia de consulta. Los programas generalmente no son útiles para búsqueda de estil o-motivo. Para una discusión de los campos básicos en búsqueda de similitud de bases de datos de secuencias, ver Altschul et al. ( 1 994). Los cinco programas BLAST disponibles en el sitio web del Centro Nacional para I nformación de Biotecnología realizan l as siguientes tareas: "blastp" compara una secuencia de consulta de aminoácidos contra una base de datos de secuencia de proteínas; "blastn" compara una secuencia de consulta de nucl eótidos contra una base de datos de secuencia de nucleótidos; "blastx" compara los seis productos de translación conceptual de estructura de una secuenci a de consulta de nucleótidos (ambos filamentos) contra una base de datos de secuenci a de proteínas; "tblastn" compara una secuencia de consulta de proteína contra una base de datos de secuencia de nucleótidos dinámicamente trasl ada en todas l as seis estructuras de lectura (ambos filamentos) . "tbl astx" compara las seis traducciones de estructura de una secuencia de consulta de nucleótidos contra la seis traducciones de estructura de una base de datos de secuencia de nucleótidos. BLAST utiliza los siguientes parámetros de búsqueda: H ISTOG RAMA Despliega un histograma de puntuaciones para cada búsqueda, falla es si (Ver parámetro H en el M anual BLAST) . DESCRI CPIONES Restringe el número de descripciones cortas de secuencias iguales reportadas al número especificado; l ímite de falla es 1 00 descripciones (Ver parámetro V en la pági na del manual ). Ver también ES PE RAR y CORTE. ALI NEACIONES Restringe las secuencias de bases de datos al número especificado para las cuales se reportan los pares de segmento de alta puntuación (HSPs) ; el límite de falla es 50. Si más secuencias de bases de datos que estas sucede que satisfacen el umbral de significado estadístico para reporte (ver ESPERAR y CORTE abajo), solamente las igualaciones adscritas al mayor significado estadístico se reportan (Ver parámetro B en el M anual BLAST) . ESPERAR El umbral de significado estadístico para reportar igualaciones contra secuencias de bases de datos; el valor de falla es 1 0, de manera que 10 igualaciones se espera que se encuentren meramente por suerte, de acuerdo al modelo estocástico de Karlin and Altschul (1990). Si el significado estadístico adscrito a una igualación es mayor que el umbral ESPERAR, la igualación no se reportará . Umbrales de ESP ERAR más bajos son más severos , conduciendo a que menos igualaciones por suerte se reporten. Los valores fracciónales son aceptables. (Ver parámetro E en el M anual BLAST) . CO RTE La puntuación de corte para reportar pares de segmento de alta puntuación. El valor de falla se calcula del valor ESPERAR (ver arriba). HSPs se reportan para una secuencia de bases de datos solamente si el significado estadístico adscrito a ellos es al menos tan alto como se adscribiría a HSP solo teniendo una puntuación igual al valor CORTE. Valores CORTE más altos son más severos, conduciendo a que menos igualaciones por suerte se reporten. (Ver parámetro S en el Manual BLAST). Típicamente, los umbrales de significado pueden manejarse de manera más intuitiva utilizando ESPERAR. MATRIZ Especificar una matriz de puntuación alterna para BLASTP, BLASTX, TBLASTN y TBLASTX. La matriz de falla es BLOSUM62 (Henikoff & Henikoff, 1992, Proc. Nati. Aacad. Sci. USA 89(22): 10915-9). Las elecciones alternativas válidas incluyen: PAM40, PAM 120, PAM250 e I DENTI DAD. Ninguna matriz de puntuación alterna está disponible para BLASTN; especificando la directiva de MATRIZ en solicitudes BLASTN regresa una respuesta de error. FI LAM ENTO Restringe una búsqueda TBLASTN para solo el filamento superior o inferior de las secuencias de bases de datos; o restringe una búsqueda BLASTN, BLASTX o TBLASTX a solo estructuras de lectura en el filamento superior o i nferior de la secuencia de consulta. FI LTRO Oculta los segmentos de la secuencia de consulta que tienen baja complejidad de composición, como se determina por el programa SEG de Wootton & Federhen (1993) Computers and Chemistry 17: 149-163, o segmentos consistiendo de repeticiones internas de corta periodicidad, según se determina por el programa XNU de Claverie & States, 1993, Computers and Chemistry 17: 191 -201 , o, para BLASTN, por el programa DUST de Tatusov and Lipman (ver el sitio web de NCBI). Filtración puede eliminar estadísticamente de manera significativa pero biológicamente reportes no interesantes de la salida de blast (por ejemplo, golpes contra regiones comunes acidas, básicas o ricas en prolina), dejando las regiones biológicamente más interesantes de la secuencia de consulta disponibles para igualación específica contra secuencias de bases de datos. Secuencia de baja complejidad encontrada por un programa de filtro se substituye utilizando la letra "N" en secuencia de nucleótidos (por ejemplo, "N" repetida 13 veces) y la letra "X" en secuencias de proteína (por ejemplo, "X" repetida 9 veces". Filtración solamente se aplica a la secuencia de consulta (o sus productos de translación), no a secuencias de bases de datos. La filtración de falla es DUST para BLASTN, SEG para otros programas. No es usual ocultarse por SEG, XNU, o ambos, cuando se aplica a secuencias en SWISS-PROT, así la filtración no debe esperarse que siempre produzca un efecto. Además, en algunos casos, las secuencias se ocultan en su totalidad, indicando que el significado estadístico de cualquier igualación reportada contra la secuencia de consulta sin filtrar debe esperarse.

NCBI-gi Causa identificadores NCBI gi a mostrarse en l a salida, además del acceso y/o nombre de lugar. Más preferentemente, las comparaciones de secuencia se conducen utilizando el algoritmo de búsqueda BLAST simple proporcionado en el sitio web NCBI descrito arriba, en el directorio "/BLAST". Al menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por un experto en la materia (por ejemplo, en cultivo celular, genéticas moleculares, química de ácido nucleico, técnicas de hibridización y bioquímica). Las técnicas estándar se utilizan para métodos moleculares, genéticos y bioquímicos (ver generalmente, Sambrook ef al, Molecular Cloning: A Laboratory M anual , 2d ed. ( 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. y Ausubel ef al, Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4lh Ed, John Wiley & Sons, I nc. que se incorporan en la presente para referencia) y métodos químicos. TNFR1 es un receptor de transmembrana conteniendo una región extracelular que une el ligando y un dominio intracelular que carece de actividad de transducción de señal intrínseca pero puede asociarse con moléculas de transducción de señal . El complejo de TNFR1 con TNF unido contiene tres cadenas TNFR1 y tres cadenas TNF. (Banner ef al, Cell, 73(3) 431 -445 (1993)). El ligando TNF está presente como un trímero, que se une por tres cadenas TNFR1 . (Id. ) Las tres cadenas TNFR1 se agrupan de manera cercana en el complejo de receptor-ligando, y este agrupamiento es un prerequisito para transducción de señal mediada por TNFR1. De hecho, los agentes multivalentes que unen TNFR1 , tales como anticuerpos anti-TNFR1 , pueden inducir agrupamiento TNFR1 y transducción de señal en la ausencia de TN F y se utilizan comúnmente como combatientes TNFR1 . (Ver, por ejemplo, Belka et al, EMBO, 14(6): 1 156-1 165 (1995); Mandik-Nayak et al, J. Immunol, 767: 1920-1928 (2001 )). De acuerdo con lo anterior, los agentes multivalentes que unen TN FR1 , son generalmente antagonistas no efectivos de TNFR1 aún si bloquean la unión de TNFa a TNFR1. La región extracelular de TNFR1 comprende un segmento terminal de trece aminoácidos (aminoácidos 1 -13 de SEQ I D NO: 603 (humano); aminoácidos 1 -13 de SEQ I D NO:604 (ratón)), Dominio 1 (aminoácidos 14-53 de SEQ ID NO:603 (humano); aminoácidos 14-53 de SEQ I D NO:604 (ratón)), Dominio 2 (aminoácidos 54-97 de SEQ I D NO: 603 (humano); aminoácidos 54-97 de SEQ I D NO:604 (ratón)), Dominio 3 (aminoácidos 98-138 de SEQ I D NO: 603 (humano); aminoácidos 98-138 de SEQ ED NO:604 (ratón)), y Dominio 4 (aminoácidos 139-167 de SEQ ID NO:603 (humano); aminoácidos 139-167 de SEQ I D NO:604 (ratón)) que se sigue por una región próxima a membrana (aminoácidos 168-182 de SEQ I D NO:603_(humano); aminoácidos 168-183 SEQ ID NO: 604 (ratón)). (Ver, Banner et al, Cell 73(3) 431 -445 (1993) y Loetscher ef al, Cell 61 (2) 351 -359 ( 1990)) . Dominios 2 y 3 hacen contacto con ligando unido (TNFß, TNFa). (Banner et al, Cell, 73(3) 431 -445 ( 1993)). La región extracelular de TNFR1 también contiene una región referida como el dominio de ensamble de unión al pre-ligando o dominio PLAD (aminoácidos 1 -53 de SEQ ID NO:603_(humano); aminoácidos 1 -53 de SEQ I D NO:604 (ratón)) (El Gobierno de EE. U U . , WO 01 /58953; Deng ef al, Nature Medicine, doi : 10.1038/nml304 (2005)). TNFR1 se pierde de la superficie de células in vivo a través de un proceso que incluye proteolísis de TNFR1 en Dominio 4 o en la región próxima a membrana (aminoácidos 168-182 de SEQ I D NO:603; aminoácidos 168-183 de S EQ I D NO:604), para producir una forma soluble de TNFR1. TNFR1 soluble mantiene la capacidad de unir TNFa, y funciona así como un inhibidor endógeno de la actividad de TNFa. La invención se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (por ejemplo, dAb) o ligando que une TNFR 1 pero no compite con TNF para unión a TNFR1. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (por ejemplo, dAb) o ligando puede unir Dominio 1 de TNFR1 o Dominio 4 de TNFR1. Tal anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, dAb) o ligando proporcionan ventajas como agentes de diagnóstico, y puede utilizarse para unir y detectar, cuantificar o medir TNFR1 en una muestra pero no competirá con TNF en la muestra para unión a TNFR1 . De acuerdo con lo anterior, una determinación exacta de si TNFR1 está presente en la muestra o cuanto TNFR1 está en la muestra puede hacerse. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (por ejemplo, dAb) o ligando que une TNFR1 pero no compite con TNF para unión a TNFR1 es un antagonista de TNFR1 como se describe en la presente. La invención también se refiere a un equipo de diagnóstico para determinar si TNFR1 está presente en una muestra o cuanto TNFR1 está presente en una muestra, comprendiendo un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (por ejemplo, dAb) o ligando que une TNFR1 pero no compite con TNF para unión a TNFR1 e instrucciones para utilizarse (por ejemplo, para determinar la presencia y/o cantidad de TNFR1 en la muestra). En algunas modalidades, el equipo comprende además uno o más reactivos ancilares, tales como un regulador adecuado o reactivo de detección adecuado (por ejemplo, un anticuerpo detectablemente marcado o fragmento de unión al antigeno del mismo que une el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (por ejemplo, dAb) o ligando que une TNFR1 pero no compite con TNF para unión a TNFR1 ). La invención también se refiere a un dispositivo comprendiendo una superficie sólida en la cual un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (por ejemplo, dAb) o ligando que une TN FR1 pero no compite con TNF para unión a TNFR1 se inmoviliza de manera que el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo inmovilizado (por ejemplo, dAb) o ligando une TNFR1 . Cualquier superficie sólida adecuada en la cual un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (por ejemplo, dAb) o ligando puede inmovilizarse, puede utilizarse, por ejemplo, vidrio, plásticos, carbohidratos (por ejemplo, perlas de agarosa). Si se desea el soporte puede contener o modificarse para contener grupos funcionales deseados para facilitar la inmovilización del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo (por ejemplo, dAb) o ligando. El dispositivo, y/o soporte, puede tener cualquier forma adecuada, por ejemplo, una hoja, varilla, cinta, placa, portaobjetos, perla, pastilla, disco, gel, tubo, esfera, chip, placa o plato, y lo similar. En algunas modalidades, el dispositivo es un palo de sumergimiento. La invención se refiere a antagonistas de TNFR1 (por ejemplo, ligandos descritos en la presente) que tienen especificidad de unión para Receptor de Factor de Necrosis de Tumor 1 (TNFR1 ; p55; CD 120a). Preferentemente los antagonistas de las invenciones no tienen especificidad de unión para Factor de Necrosis de Tumor 2 (TNFR2) , o no antagoniza substancialmente TNFR2. Un antagonista de TNFR1 no antagoniza substancialmente TNFR2 cuando el antagonista (1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 µM, 10 µM o 100 µM) resulta en no más de aproximadamente 5% inhibición de actividad mediada por TNFR2 por TNFa ( 100 pg/ml) en un ensayo de célula estándar. Particularmente los antagonistas preferidos de TNFR 1 son terapéuticos efectivos para tratar enfermedad inflamatoria crónica (son eficaces, tienen eficacia terapéutica). Por ejemplo, en algunas modalidades, el antagonista de TNFR 1 es eficaz en un modelo de enfermedad inflamatoria crónica, tal como el modelo de artritis inducida por colágeno de ratón , modelo de artritis ?ARE de ratón, modelo de enfermedad de intestino inflamatorio inducido por sodio de sulfato de dextran de ratón, modelo de enfermedad de intestino inflamatorio ?ARE de ratón, modelo de enfermedad pul monar obstructiva crónica por fumada de tabaco de ratón o un modelo de primate adecuado (por ejemplo, artritis inducida por colágeno de primate). Antagonistas de TNFR1 pueden ser monovalentes o multivalentes. En algunas modalidades, el antagonista es monovalente y contiene un sitio de unión que interactúa con TNFR1. Los antagonistas monovalentes unen un TNFR1 y no inducen la degradación o agrupamiento de TNFR1 en la superficie de células que puede conducir a activación del receptor y transducción de señal . En modalidades particulares, el antagonista monovalente de TNFR1 se une al Dominio 1 de TNFR1. En modalidades más particulares, el antagonista monovalente de TNFR1 se une al Dominio 1 de TNFR1 , y compite con TAR2m-21 -23 para unión a TNFR1 de ratón o compite con TAR2h-205 para unión a TNFR1 de humano. En otras modalidades, el antagonista de TNFR 1 es multivalente. Antagonistas multivalentes de TNFR1 pueden contener dos o más copias de un sitio de unión particular para TNFR1 o contienen dos o más diferentes sitios de unión que unen TNFR1. Por ejemplo, como se descpbe en la presente el antagonista de TNFR1 puede ser un dímero, trímero o multímero comprendiendo dos o más copias de un dAb particular que une TNFR1 , o dos o más diferentes dAbs que unen TNFR1. Preferentemente, un antagonista multivalente de TNFR1 no agoniza substancialmente TNFR1 (actúa como un combatiente de TNFR1 ) en un ensayo de célula estándar (es decir, cuando está presente en una concentración de 1 nM , 10 nM, 100 nM , 1 µM , 10 µM , 100 µM , 1000 µM o 5,000 µM , resulta en no más de aproximadamente 5% de la actividad mediada por TNFR1 inducida por TNFa (100 pg/ml) en el ensayo). En ciertas modalidades, el antagonista multivalente de TNFR 1 contiene dos o más sitios de unión para un epítopo deseado o dominio de TNFR1. Por ejemplo, el antagonista multivalente de TNFR1 puede comprender dos o más sitios de unión que unen el mismo epítopo en el Dominio 1 de TNFR1 . En otras modalidades, el antagonista multivalente de TNFR 1 contiene dos o más sitios de unión que se unen a diferentes epítopos o dominios de TNFR1 . En un ejemplo, el antagonista multivalente de TNFR1 comprende un primer sitio de unión que une un primer epítopo en el Dominio 1 de TNFR1 , y un segundo sitio de unión que une un segundo epítopo diferente en el Dominio 1. En otros ejemplos, el antagonista multivalente de TNFR1 puede comprender sitios de unión que unen dos o más epítopos o dominios deseados de TNFR1 . Por ejemplo, los antagonistas multivalentes de TNFR 1 pueden comprender sitios de unión para los Dominios 1 y 2, Dominios 1 y 3, Dominios 1 y 4, Dominios 2 y 3, Dominios 2 y 4, o Dominios 3 y 4 de TNFR1 . Por ejemplo, los antagonistas multivalentes de TNFR 1 pueden comprender sitios de unión para los Dominios 1 , 2, y 3, sitios de unión para los Dominios 1 , 2 y 4, o sitios de unión para los Dominios 1 , 3 y 4 de TNFR1. En ciertas modalidades, el antagonista de TNFR1 es un ligando específico dual comprendiendo un dAb que une el Dominio 1 de TNFR1 , y un dAb que une el Dominio 3 de TNFR1. Preferentemente, tales antagonistas multivalentes no agonizan TNFR1 cando está presente en una concentración de aproximadamente 1 nM , o aproximadamente 10 nM , o aproximadamente 100 nM , o aproximadamente 1 µM, o aproximadamente 10 µM , en un ensayo de citotoxicidad L929 estándar o un ensayo HeLa IL-8 estándar como se describe en la presente. Algunos antagonistas de TNFR1 unen TNFR1 e inhiben la unión de TNFa a TNFR1. En ciertas modalidades, tal antagonista de TNFR1 une el Dominio 2 y/o Dominio 3 de TNFR1. En modalidades particulares, el antagonista compite con TAR2h-10-27, TAR2h-131 -8, TAR2h-15-8, TAR2h-35-4, TAR2h-154-7, TAR2h-154-10 o TAR2h-185-25 para unión a TNFR1. Otros ligandos (que en las modalidades preferidas son antagonistas de TNFR1 ) no inhiben la unión de TNFa a TNFR1 . Tales ligandos (y antagonistas) proporcionan ventajas como agentes de diagnóstico, debido a que pueden utilizarse para unir y detectar, cuantificar o medir TNFR1 en una muestra y no competirá con TNF en la muestra para unión a TNFR1 . De acuerdo con lo anterior, una determinación exacta de si o cuanto TNFR1 está en la muestra puede hacerse. Algo de antagonista de TNFR1 no inhibe la unión de TNFa a TNFR1 , pero inhibe la transducción mediada a través de TNFR1. Por ejemplo, un antagonista de TNFR1 puede inhibir agrupamiento inducido por TNFa de TNFR1 , que precede la transducción de señal a través de TNFR1. Tales antagonistas proporcionan varias ventajas. Por ejemplo, en la presencia de tal un antagonista, TNFa puede unir TNFR1 expresado en la superficie de células y removerse del ambiente celular, pero la transducción de señal mediada por TNFR1 no se activará. De esta manera, producción inducida por señal TNFR1 de TNFa adicional y otros mediadores de inflamación se i nhibirá. De manera similar, los antagonistas de TNFR1 que unen TNFR1 e inhiben la transducción de señal mediada a través de TNFR1 , pero no inhiben la unión de TNFa a TNFR1 , no inhibirán la unión a TNFa e inhibirá la actividad de TNFR1 soluble endógenamente producido. De acuerdo con lo anterior, la administración de tal un antagonista a un mamífero en necesidad del mismo puede complementar las trayectorias reguladoras endógenas que inhiben la actividad de TNFa y la actividad de TNFR1 in vivo. La invención también se refiere a ligandos que (i) unen TNFR 1 (por ejemplo, en el Dominio 1 ), (ii) no antagonizan la activación de Transducción de señal mediada por TNFR1 , y (iii) no inhiben la unión de TNFa a TNFR1. Tal ligando une TNFR1 soluble y no previene que el receptor soluble una TNFa, y de esta manera la administración de tal antagonista a un mamífero en necesidad del mismo puede complementar las trayectorias reguladoras endógenas que inhiben la actividad de TNFa in vivo al incrementar la vida media del receptor soluble en el suero. Estas ventajas son particularmente relevantes para ligandos que se han formateado por tener un tamaño hidrodi námico más grande, por ejemplo, por unión de un grupo PEG, albúmina de suero, transferrina, receptor de transferrina o al menos la porción de unión a transferrina del mismo, una región Fc de anticuerpo, o por conjugación a un dominio de anticuerpo. Por ejemplo, un agente (por ejemplo, polipéptido) que i) une TNFR1 (por ejemplo, en el Dominio 1 ), (ii) no antagoniza la activación de transducción de señal mediada por TNFR1 , y (iii) no inhibe la unión de TNFa a TNFR1 , tal como un monómero dAb, puede formatearse como un fragmento de unión al antígeno más largo de un anticuerpo o como y anticuerpo (por ejemplo, formateado como un Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, IgG, scFv). El tamaño hidrodinámico de un ligando y su vida media de suero también puede incrementarse al conj ugar o enlazar un agente de unión a TNFR1 a un dominio de unión (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de anticuerpo) que une un antígeno o epítopo que incrementa vida media in vivo, como se describe en la presente (ver, Anexo 1 ). Por ejemplo, el agente de unión al TNFR1 (por ejemplo, polipéptido) puede conjugarse o enlazarse a una albúmina anti-suero o anticuerpo de receptor Fc anti-neonatal o fragmento de anticuerpo, por ejemplo un dAb de receptor Fc, Fab, Fab' o scFv anti-SA o anti-neonatal , o a un afficuerpo anti-SA o afficuerpo de receptor Fc anti-neonatal Fc. Ejemplos de albúmina adecuada, fragmentos de albúmina o variantes de albúmina para utilizarse en un ligando de unión al TNFR1 de acuerdo a la invención se describen en WO 2005/077042A2, que se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. En particular, los siguientes albúmina, fragmentos de albúmina o variantes de albúmina pueden utilizarse en la presente invención: • SEQ I D NO: 1 (como se describe en WO 2005/077042A2, esta secuencia incorporándose explícitamente en la presente descripción para referencia); • Fragmento de albúmina o variante comprendiendo o consistiendo de aminoácidos 1 -387 de SEQ I D NO: 1 en WO 2005/077042A2; • Albúmina, o fragmento o variante del mismo, comprendiendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistiendo de: (a) aminoácidos 54 a 61 de SEQ I D NO: 1 en WO 2005/077042A2 (b) aminoácidos 76 a 89 de SEQ I D NO: 1 en WO 2005/077042A2 (c) aminoácidos 92 a 100 de SEQ I D NO: 1 en WO 2005/077042A2 (d) aminoácidos 170 a 176 de SEQ I D NO: 1 en WO 2005/077042A2 (e) aminoácidos 247 a 252 de SEQ I D NO: 1 en WO 2005/077042A2 (f) ami noácidos 266 a 277 de SEQ I D NO: 1 en WO 2005/077042A2 (g) aminoácidos 280 a 288 de SEQ ID NO: 1 en WO 2005/077042A2 (h) aminoácidos 362 a 368 de SEQ ID NO: 1 en WO 2005/077042A2 (i) aminoácidos 439 a 447 de SEQ I D NO: 1 en WO 2005/077042A2 (j) aminoácidos 462 a 475 de SEQ I D NO: 1 en WO 2005/077042A2; (k) aminoácidos 478 a 486 de SEQ I D NO: 1 en WO 2005/077042A2; y (1 ) aminoácidos 560 a 566 de SEQ I D NO: 1 en WO 2005/077042A2. Ejemplos adicionales de albúmina adecuada, fragmentos y análogos para utilizarse en un ligado de unión al TNFR1 de acuerdo a la invención se describen en WO 03/076567 A2, que se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. En particular, la siguiente albúmina, fragmentos o variantes pueden utilizarse en la presente invención: • Albúmina de suero de humano como se describe en WO 03/076567A2, por ejemplo, en la Figura 3 (esta información de secuencia incorporándose explícitamente en la presente descripción para referencia) ; • Albúmina de suero de humano (HA) consistiendo de una cadena de polipéptido no glicosilada única de 585 aminoácidos con un peso molecular de fórmula de 66,500 (Ver, Meloun, ef al, FEBS Letters 58:136 ( 1975); Behrens, et al, Fed. Proc. 34: 591 ( 1975); Lawn, ef al, Nucleic Acids Research 9:6102-61 14 (1981 ); Minghetti , ef al, J. Biol Chem. 261:6747 (1986)); • Una variante polimórfica o análogo o fragmento de albúmi na como se describe en Weitkamp, ef al, Ann. Hum. Genet. 37:219 (1973); • Un fragmento de albúmina o variante como se describe en E P 322094, por ejemplo, HA( 1 -373. , HA( 1 -388), HA( 1 -389) , HA( 1 -369), y HA(1 -419) y fragmentos entre 1 -369 y 1 -419; • Un fragmento de albúmina o variante como se describe en E P 399666, por ejemplo, HA(1 -177) y HA(1 -200) y fragmentos entre HA(1 -X), donde x es cualquier número de 178 a 199. Donde una porción que extiende la vida media (una o más) (por ejemplo, albúmina, transferrina y fragmentos y análogos de los mismos) se utiliza en los ligandos de unión al TNFR1 de la invención, puede conjugarse utilizando cualquier método adecuado, tal como, por fusión directa a la porción de unión al TNFR1 (por ejemplo, anti-TNFR1 dAb o fragmento de anticuerpo), por ejemplo al utilizar una construcción de nucleótido único que codifica una proteína de fusión, en donde la proteína de fusión se codifica como una cadena de polipéptido única con la porción que extiende la vida media ubicada N o C terminalmente a la porción de unión al TNFR 1 . Alternativamente, la conjugación puede lograrse al utilizar un enlazador de péptido entre porciones, por ejemplo, un enlazador de péptido como se describe en WO 03/076567 A2 o WO 2004/003019 (estas descripciones de enlazador incorporándose por referencia en la presente descripción para proporcionar ejemplos para utilizarse en la presente invención). En modalidades más particulares, el antagonista de TNFR1 que une TNFR1 e inhibe la transducción de señal mediada a través de TNFR1 , pero no inhibe la unión de TNFa a TNFR1 , une el Dominio 1 de TNFR1 o Dominio 4 de TNFR1. En ciertas modalidades, tal un antagonista de TNFR1 es un monómero dAb o ligando que une el Dominio 1 de TNFR1 o Dominio 4 de TNFR1 . En una modalidad particular, el antagonista de TNFR1 (por ejemplo, un monómero dAb o ligando) une el Dominio 1 de TNFR1 e inhibe la transducción de señal mediada a través de TNFR1 en la unión de TNFa. Tal un antagonista puede inhibir transducción de señal a través de TNFR1 , pero no inhibir la unión de TNFa a TNFR1 y/o pérdida de TNFR1 para producir TNFR1 soluble. De acuerdo con lo anterior, la administración de tal un antagonista a un mamífero en necesidad del mismo puede complementar las trayectorias reguladoras endógenas que i nhiben la actividad de TN Fa y la actividad de TNFR1 in vivo. Otros antagonistas de TNFR1 unen TNFR1 pero no se unen en el Dominio 4. Tales antagonistas inhiben una función de TNFR 1 pero no inhiben la pérdida de TNFR1 soluble. De acuerdo con lo anterior, la administración de tal un antagonista a un mamífero en necesidad del mismo puede complementar las trayectorias reguladoras endógenas que inhiben la actividad TNFa y la actividad de TN FR1 in vivo. En ciertas modalidades, el antagonista (por ejemplo, compuesto químico, nueva entidad química, monómero dAb, ligando) une el Dominio 1 de TNFR1 y compite con TAR2m-21 -23 para unión a TNFR1 de ratón o compite con TAR2h-205 para unión a TNFR1 de humano. En otras modalidades, el antagonista (por ejemplo, compuesto químico, nueva entidad química, monómero dAb, ligando) une el Dominio 2 o Dominio 4 de TNFR1. En otras modalidades, el antagonista (por ejemplo, compuesto químico, nueva entidad química, monómero dAb, ligando) une el Dominio 3 de TN FR 1 y compite con TAR2h-131 -8, TAR2h-15-8, TAR2h-35-4, TAR2h-1 54-7, TAR2h-154-10, TAR2h-185-25, o TAR2h-27-10 para unión a TNFR 1 (por ejemplo, humano y/o TNFR 1 de ratón). Algunos ligandos (que en modalidades preferidas son antagonistas de TNFR1 ) unen TNFR1 de humano y TNFR1 de ratón. Tales ligandos (por ejemplo, antagonistas, monómeros dAb) proporcionan la ventaja de permitir los estudios precl ínicos y cl ínicos utilizando el mismo ligando y obviar la necesidad de conducir estudios preclínicos con un ligando subrogado adecuado. En otras modalidades, el antagonista o ligando es un anticuerpo que tiene especifi cidad de unión para TNFR 1 o un fragmento de unión al antígeno del mismo, tal como un fragmento Fab, fragmento Fab', fragmento F(ab')2 o fragmento Fv (por ejemplo, scFV). En otras modalidades, el antagonista o ligando es monovalente, tal como un dAb o un fragmento de unión al antígeno monovalente de un anticuerpo, tal como un fragmento Fab, fragmento Fab', o fragmento Fv. En otras modalidades de la invención descritas por esta descripción, en l ugar de utilizar un "dAb" en un antagonista o ligando de la i nvención, se contempla que el experto pueda utilizar un dominio que comprende las CDRs de un dAb que une TNFR 1 (por ejemplo, CDRs injertadas en un andamio de proteína adecuado o estructura, por ejemplo un afficuerpo, un andamio SpA, un domi nio de receptor LDL clase A dominio o un dominio EGF) o puede ser un dominio de proteína comprendiendo un sitio de unión para TNFR 1 , por ejemplo, en donde el dominio se selecciona de un afficuerpo, un dominio SpA, un dominio de receptor LDL clase A dominio o un dominio EGF. La descripción como una totalidad está por construirse de acuerdo con lo anterior para proporcionar descripción de antagonistas, ligandos y métodos utilizando tales dominios en lugar de un dAb. Preferentemente, el antagonista de TNFR1 es un ligando como se describe en la presente. Los ligandos comprenden un dominio variable único de inmunoglobulina o anticuerpo de dominio (dAb) que tiene especificidad de unión para TNFR1 o las regiones de determi nación complementarias de tal un dAb en un formato adecuado. El ligando puede ser un polipéptido que consiste de tal un dAb, o consiste esencialmente de tal un dAb. El ligando también puede ser un polipéptido que comprende un dAb (o las CDRs de un dAb) en un formato adecuado, tal como un formato de anticuerpo (por ejemplo, formato similar a IgG, scFv, Fab, Fab', F(ab')2), un ligando específico dual que comprende un dAb que une TNFR1 y un segundo dAb que une otra proteína objetivo, antígeno o epítopo (por ejemplo, albúmina de suero), o un ligando multiespecífico como se describe en la presente. Antagonistas de TNFR1 , incluyendo ligandos de acuerdo a cualquier aspecto de la presente invención, así como también monómeros dAb útiles para construir tales ligandos, pueden desasociarse ventajosamente de su(s) objetivo(s) cognado(s) con K de 300 nM a 5 pM (es decir, 3x10*7 a 5x10" 2M), preferentemente 50 nM a 20 pM, o 5 nM a 200 pM o 1 nM a 100 pM, 1x10"7M o menos, 1x10"8M o menos, 1x10"9M o menos, 1x10"10M o menos, 1x10"11M o menos; y/o una constante de velocidad Kapagada de 5x10"1 s"1 a 1x10"7 s'\ preferentemente 1x10"2 s"1 a 1x10"6 s~\ o 5x10"3 s"1 a 1x10"5 s"1, o 5x10"1 s" o menos, o 1x10"2 s"1 o menos, o 1x10"3 s"1 o menos, o 1x10"4 s"1 o menos, o 1x10"5 s"1 o menos, o 1x10"6 s"1 o menos como se determina por la resonancia de plasmón de superficie. La constante de velocidad Kd se define como Kapa8ada/KenCßnd¡da. En otras modalidades, el antagonista une TNFR1 e inhibe una (es decir, una o más) función de TNFR1 (por ejemplo, agrupamiento de receptor, señalización de receptor o unión de TNFa a TNFR1), y también se une a otro miembro de la superfamilia de receptor TNF. Preferentemente, este tipo de antagonista también inhibe una función (por ejemplo, agrupamiento de miembro, señalización o unión del miembro a su ligando cognado) del otro miembro de la superfamilia de receptor TNF. La superfamilia de receptor TNF es un grupo reconocido en la materia de proteínas que incluye TNFR1 (p55, CD 120a, p60, superfamilia de receptor TNF miembro 1A, TNFRSF1A), TNFR2 (p75, p80, CD120b, superfamilia de receptor TNF miembro 1B, TNFRSF1B), CD18 (TNFRSF3, LTBR, TNFR2-RP, TNFR-RP, TNFCR, TNF-R-lll), OX40 (TNFRSF4, ACT35, TXGPIL), CD40 (TNFRSF5, p50, Bp50), Fas (CD95, TNFRSF6, APO-I, APTI), DcR3 (TNFRSF6B), CD27 (TNFRSF7, Tp55, S152), CD30 (TNFRSF8, Ki-1, D1S166E), CD137 (TNFRSF9, 4-1BB, ILA), TRAILR-1 (TNFRSF10A, DR4, Apo2), TRAIL-R2 (TNFRSF10B, DR5, KILLER, TRICK2A, TRICKB), TRAILR3 (TNFRSF10C, DcR1, LIT, TRID), TRAILR4 (TNFRSF10D, DcR2, TRUNDD), RANK (TNFRSF11A), OPG (TNFRSF11B, OCIF, TRl), DR3 (TNFRSF12, TRAMP, WSL-1, LARD, WSL-LR, DDR3, TR3, APO-3), DR3L (TNFRSF12L), TACI (TNFRSF13B), BAFFR (TNFRSF13C), HVEM (TNFRSF14, ATAR, TR2, LIGHTR, HVEA), NGFR (TNFRSF16), BCMA (TNFRSF17, BCM), AITR (TNFRSF18, GITR), TNFRSF19, FLJ14993 (TNFRSF19L, RELT), DR6 (TNFRSF21), SOBa (TNFRSF22, Tnfrh2, 2810028K06Rik), mSOB (THFRSF23, Tnfrhl). En algunas modalidades, el antagonista comprende un primer dAb que une TNFR1 e inhibe una función de TNFR1 y un segundo dAb que une otro miembro de la superfamilia de receptor TNF, tal como TNFR2 (CD 120b), OX40, CD40, Fas (CD95), TRAILR-1, TRAILR-2, TAC1, BCMA y lo similar como se enlista arriba. En otra modalidad, el antagonista comprende un monómero dAb que une TNFR1 e inhibe una función (por ejemplo, agrupamiento de receptor, señalización de receptor o unión de TNFa a TNFR1) de TNFR1 y también se une a otro miembro de la superfamilia de receptor TNF, tal como TNFR2 (CD120b), OX40, CD40, Fas (CD95), TRAILR-1, TRAILR-2, TAC1, BCMA y lo similar como se enlista arriba. Ligandos y monómeros dAb que unen TNFR1 La invención proporciona ligandos que comprenden un monómero dAb anti-TNFRI (por ejemplo, ligando específico dual comprendiendo tal dAb) que se une a Receptor TNF I con K de 300 nM a 5 pM (es decir, 3x10"7 a 5x10"12M), preferentemente 50 nM a 20 pM, más preferentemente 5 nM a 200 pM y más preferentemente 1 nM a 100 pM, por ejemplo 1x10"7M o menos, preferentemente 1x10" 8M o menos, más preferentemente 1x10"9M o menos, ventajosamente 1x10'10M ó menos y más preferentemente 1x10"11M o menos; y/o una constante de velocidad Kapagada de 5x1o 1 s"1 a 1x10"7 preferentemente 1x10"2 s"1 a 1x10"6 s"\ más preferentemente 5x10'3 s"1 a 1x10"5 s"1, por ejemplo 5x10"1 s"1 o menos, preferentemente 1x10"2 s"1 o menos, ventajosamente 1x10"3 s"1 o menos, más preferentemente 1x10"4 s"1 o menos, aún más preferentemente 1x10's s"1 o menos, y más preferentemente 1x10"6 s"1 o menos como se determina por resonancia de plasmón de superficie. Preferentemente, el ligando o monómero dAb inhiben la unión de TNF alfa a Receptor TNF alfa I (receptor p55) con una concentración inhibidora 50 (IC50) de 500 nM a 50 pM, preferentemente 100 nM a 50 pM, más preferentemente 10 nM a 100 pM, ventajosamente 1 nM a 100 pM; por ejemplo 50 nM o menos, preferentemente 5 nM o menos, más preferentemente 500 pM o menos, ventajosamente 200 pM o menos, y más preferentemente 100 pM o menos. Preferentemente, el objetivo de Receptor TNF I es TNFa de humano. Preferentemente, el ligando o dAb une TNFR1 de humano e inhibe la unión de TNF alfa de humano a TNFR1 de humano, o inhibe la señalización a través de TNFR1 en respuesta a unión de TNF alfa.

Por ejemplo, en ciertas modalidades, un ligando o monómero dAb puede unir TNFR1 e inhibir la señalización mediada por TNFR1 , pero no inhibe substancialmente la unión de TNFa a TNFR1 . En algunas modalidades, el ligando o monómero dAb inhibe degradación inducida por TNFa o agrupamiento de TNFR1 en la superficie de una célula. Tales ligandos o dAbs (por ejemplo, TAR2m-21 -23 descrito en la presente) son ventajosos debido a que pueden antagonizar TNFR1 de superficie celular pero no reducen substancialmente la actividad inhibidora de TNFR1 soluble endógeno. Por ejemplo, el ligando o dAb pueden unir TNFR1 , pero inhiben la unión de TNFa a TNFR1 en un ensayo de unión al receptor por no más que aproximadamente 10%, no más que aproximadamente 5%, no más que aproximadamente 4%, no más que aproximadamente 3%, no más que aproximadamente 2%, o no más que aproximadamente 1 %. También, en estas modalidades, el ligando o dAb inhibe degradación inducida por TNFa de TNFR1 y/o señalización mediada por TNFR 1 en un ensayo de célula estándar por al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 99%. El ligando puede ser monovalente (por ejemplo, un monómero dAb) o multivalente (por ejemplo, específico dual , multiespecífico) como se describe en la presente. En modalidades particulares, el ligando es un monómero dAb que une el Dominio 1 de TNFR1 . Monómeros de anticuerpo de dominio que unen el Dominio 1 de TNFR1 tienen una marca principal, relativa a otros formatos de unión, tal como un anticuerpo monoclonal, por ejemplo. De esta manera, tal un monómero dAb puede bloquear selectivamente el Dominio 1 , pero no interfiere con la función de otros Dominios de TNFR1. Por ejemplo, un monómero dAb que une el Dominio 1 de TNFR1 puede antagonizar TNFR1 pero no inhibir la unión de TNFa a TNFR1 o pérdida de TNFR1. En modalidades más particulares, el ligando es un monómero dAb que une el Dominio 1 de TNFR1 y compite con TAR2m-21 -23 para unión a TNFR1 de ratón o compite con TAR2h-205 para unión a TNFR1 de humano. En otras modalidades, el ligando es multivalente y comprende dos o más monómeros dAb que unen TNFR1. Ligandos multivalentes pueden contener dos o más copias de un dAb particular que une TNFR1 o contener dos o más dAbs que unen TNFR1. Por ejemplo, como se describe en la presente, el ligando puede ser un dímero, trímero o multímero comprendiendo dos o más copias de un dAb particular que une TNFR1 , o dos o más dAbs diferentes que unen TNFR1 . En algunos ejemplos, el ligando es un homo dímero u homo trímero que comprende dos o tres copias de un dAb particular que une TNFR1 , respectivamente. Preferentemente, un ligando multivalente no agoniza substancialmente TNFR1 (actúa como un combatiente de TNFR1 ) en un ensayo de célula estándar (es decir, cuando está presente en una concentración de 1 nM , 10 nM , 100 nM , 1 µM , 10 µM, 100 µM, 1000 µM o 5,000 µM , resulta en no más que aproximadamente 5% de la actividad mediada por TNFR1 inducida por TNFa (100 pg/ml) en el ensayo). En ciertas modalidades, el ligando multivalente contiene dos o más dAbs que unen epítopo o dominio de TNFR1 deseados. Por ejemplo, el ligando multivalente puede comprender dos o más copias de un dAb que une un epítopo deseado en el Dominio 1 de TNFR1 . En otras modalidades, el ligando multivalente contiene dos o más dAbs que se unen a diferentes epítopos o dominios de TNFR1 . En un ejemplo, el ligando multivalente comprende un primer dAb que une un primer epítopo en el Dominio 1 de TNFR1 , y un segundo dAb que une un segundo epítopo diferente en el Dominio 1 de TNFR1 . En otros ejemplos, el ligando multivalente comprende dAbs que unen dos o más epítopos o dominios deseados de TNFR1. Por ejemplo, el ligando multivalente puede comprender dAbs que unen Dominios 1 y 2, Dominios 1 y 3, Dominios 1 y 4, Dominios 2 y 3, Dominios 2 y 4, o Dominios 3 y 4 de TNFR1. En ciertas modalidades, el ligando multivalente es un ligando específico dual comprendiendo un dAb que une el Dominio 1 de TNFR1 , y un dAb que une el Dominio 3 de TNFR1. Ligandos de este tipo pueden unir TNFR1 con alta avidez, y ser más selectivos para unión a células que sobreexpresan TNFR1 o expresan TNFR1 en su superficie a alta densidad que otros formatos de ligando, tales como monómeros dAb. En otras modalidades particulares, el ligando multivalente comprende dos o más dAbs, o dos o más copias de un dAb particular, que une el Dominio 1 de TNFR1 . Ligandos multivalentes de este tipo pueden unir monómeros TNF R. 1 con baja afinidad, pero uni r multímeros de receptor (por ejemplo, trímeros ver en el complejo de ligando receptor) con alta avidez. De esta manera, ligandos de este formato pueden administrarse para tener como efectivos de manera efectiva receptores que se han agrupado o asociado entre sí y/o ligando (por ejemplo, TN Fa) que se requiere para transducción de señal mediada por TNFR1 . Algunos ligandos o monómeros dAb unen TNFR1 e inhiben la unión de TN Fa a TNFR 1 . En ciertas modalidades, tal un ligando o monómero dAb une el Domi ni o 2 y/o Dominio 3 de TNFR1 . En modalidades particulares, el ligando o monómero dAb une el Dominio 3 de TNFR1 . En modalidades más particulares, el ligando o monómero dAb une el Dominio 3 de TNFR1 y compite con TAR2h- 1 0-27, TAR2h-1 31 -8, TAR2h-1 5-8, TAR2h-35-4, TAR2h- 1 54-7, TAR2h-1 54-1 0 o TAR2h-1 85-25 para unión a TNFR1 . Otros ligandos o monómeros dAb no inhiben la unión de TNFa a TN FR 1 . Tales antagonistas proporcionan ventajas como agentes de diagnóstico, debido a que pueden utilizarse para unir y detectar, cuantificar o medir TNFR 1 en una muestra y no competirán con TNF en la muestra para unión a TNFR1 . De acuerdo con lo anterior, una determi nación exacta de si o cuanto TNFR1 está en la muestra puede hacerse. Algunos ligandos y monómeros dAb no inhiben la unión de TNFa a TNFR1 , pero inhiben la transducción de señal mediada a través de TNFR1. Por ejemplo, un ligando o monómero dAb puede inhibir agrupamiento inducido por TNFa de TNFR 1 , que precede la transducción de señal a través de TNFR1. Tales ligandos o monómeros dAb proporcionan varias ventajas, como se trata en la presente con respecto a antagonistas que tienen estas propiedades. En modalidades particulares, el ligando o monómero dAb de este tipo une el Dominio 1 de TNFR1 o Dominio 4 de TNFR1. En ciertas modalidades, el ligando es un monómero dAb que une el Dominio 1 de TNFR1 o Dominio 4 de TNFR1. En una modalidad particular, el ligando o monómero dAb une el Dominio 1 de TNFR1 e inhibe la transducción de señal mediada a través de TNFR1 en la unión de TNFa. Tal un ligando o monómero dAb puede inhibir la transducción de señal a través de TNFR1 , pero no inhibir la unión de TNFa a TNFR1 y/o pérdida de TNFR1 para producir TNFR1 soluble. De acuerdo con lo anterior, la administración de tal ligando o monómero dAb a un mamífero en necesidad del mismo puede complementar las trayectorias reguladoras endógenas que inhiben la actividad TNFa y la actividad de TNFR1 in vivo. Otros ligandos o monómeros dAb unen TNFR1 pero no se unen en el Dominio 4. Tal ligando o monómeros dAb inhiben una función de TNFR1 pero no inhiben la pérdida of TNFR1 soluble. De acuerdo con lo anterior, la administración de tal un antagonista a un mamífero en necesidad del mismo puede complementar las trayectorias reguladoras endógenas que inhiben la actividad TNFa y la actividad de TNFR1 in vivo. Preferentemente, el ligando o monómero dAb neutraliza (inhibe la actividad de) TNFa o TNFR1 en un ensayo estándar (por ejemplo, los ensayos HeLa IL-8 estándar o L929 estándar descritos en la presente) con una dosis neutralizante 50 (ND50) de 500 nM a 50 pM, preferentemente 100 nM a 50 pM , más preferentemente 10 nM a 100 pM , ventajosamente 1 nM a 100 pM ; por ejemplo 50 nM o menos , preferentemente 5 nM o menos, más preferentemente 500 pM o menos, ventajosamente 200 pM o menos, y más preferentemente 100 pM o menos. En ciertas modalidades, el ligando o monómero dAb específicamente une Receptor de Factor de Necrosis de Tumor 1 de humano (TNFRI ; p55), y se desasocia de TNFR1 de humano con una constante de disociación (Kd) de 50 nM a 20 pM , y una velocidad constante Kapagada de 5X10"1 s"1 a 1 x10"7 s"1 , como se determina por resonancia de plasmón de superficie. En otras modalidades, el ligando o monómero dAb específicamente une TNFR1 con una Kd descrita en la presente e inhibe la letalidad en un modelo de ataque séptico inducido por LPS/D-galactosamina de ratón estándar (es decir, previene la letalidad o reduce la letalidad por al menos aproximadamente 10%, en comparación con un control adecuado). Preferentemente, el monómero dAb inhibe la letalidad por al menos aproximadamente 25%, o por al menos aproximadamente 50%, en comparación con un control adecuado en un modelo de ataque séptico inducido por LPS/D-galactosamina de ratón cuando se administra a aproximadamente 5 mg/kg o más preferentemente aproximadamente 1 mg/kg. En otras modalidades, el ligando o monómero dAb une TNFR 1 y antagoniza la actividad del TNFR1 en un ensayo de célula estándar con ND50 de <100 nM , y en una concentración de <10µM el dAb agoniza la actividad del TNFR1 por <5% en el ensayo. En modalidades particulares, ligando o monómero dAb no agoniza substancialmente TNFR1 (actúa como un combatiente de TNFR1 ) en un ensayo de célula estándar (es decir, cuando está presente en una concentración de 1 nM, 10 nM, 100 nM , 1 µM , 10 µM , 100 µM, 1000 µM o 5,000 µM, resulta en no más que aproximadamente 5% de la actividad mediada por TNFR1 inducida por TNFa ( 100 pg/ml) en el ensayo). En ciertas modalidades, el ligando o monómero dAb es substancialmente resistente a agregación. Por ejemplo, en algunas modalidades, menos que aproximadamente 10%, menos que aproximadamente 9%, menos que aproximadamente 8%, menos que aproximadamente 7%, menos que aproximadamente 6%, menos que aproximadamente 5%, menos que aproximadamente 4%, menos que aproximadamente 3%, menos que aproximadamente 2% o menos que aproximadamente 1 % del ligando o agregados de monómero dAb cuando una solución de 1 -5 mg/ml , 5-10 mg/ml, 10-20 mg/ml, 20-50 mg/ml, 50-100 mg/ml, 100-200 mg/ml o 200-500 mg/ml de ligando o dAb en un solvente que se utiliza de manera rutinaria para formulación de fármaco tal como salina, salina regulada, salina regulada de citrato, agua, una emulsión, y cualquiera de estos solventes con un excipiente aceptable tal como aquel aprobado por FDA, se mantiene a aproximadamente 22°C, 22-25°C, 25-30°C, 30-37°C, 37-40°C, 40-50°C, 50-60°C, 60-70°C, 70-80°C, 15-20°C, 10-15°C, 5-10°C, 2-5°C, 0-2°C, -10°C a 0°C, -20°C a -10°C, -40°C a -20°C, -60°C a -40°C, o -80°C a -60°C, por un periodo de aproximadamente tiempo, por ejemplo, 10 minutos, 1 hora, 8 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 4 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 6 meses, 1 año, o 2 años. Agregación puede valorarse utilizando cualquier método adecuado, tal como, por microscopia, valoración de turbidez de una solución por inspección visual o espectroscopia o cualquier otro método. Preferentemente, la agregación se valora por difusión de luz dinámica. Los ligandos o monómeros dAb que son resistentes a agregación proporcionan varias ventajas. Por ejemplo, tales ligandos o monómeros dAb pueden producirse fácilmente en alta producción como proteínas solubles por expresión utilizando un sistema de producción biológico adecuado, tal como E. coli, y puede formularse y/o almacenarse a concentraciones más altas que polipéptidos convencionales, y con menos agregación y pérdida de actividad.

Además, los ligandos o monómeros dAb que son resistentes a agregación pueden producirse más económicamente con otros polipéptidos de unión a epítopo o antígeno (por ejemplo, anticuerpos convencionales). Por ejemplo, generalmente, la preparación de polipéptidos de unión a epítopo propuesta para aplicaciones in vivo incluye procesos (por ejemplo, filtración de gel) que remueve los polipéptidos agregados. Falla para remover tales agregados puede resultar en una preparación que no es adecuada para aplicaciones in vivo debido, por ejemplo, a agregados de un polipéptido de unión al antígeno que se propone para actuar como un antagonista puede funcionar como un combatiente al inducir la degradación o agrupamiento del antígeno objetivo. Los agregados de proteína también pueden reducir la eficacia de polipéptido terapéutico al inducir una respuesta inmune en el sujeto al cual se administran. En contraste, los ligandos resistentes a agregación o monómeros dAb de la invención pueden prepararse para aplicaciones in vivo sin la necesidad de incl uir etapas del proceso que remueven agregados, y pueden utilizarse en aplicaciones in vivo sin las desventajas arriba mencionadas causadas por los agregados de polipéptido. En algunas modalidades, el ligando o monómero dAb se desdobla reversiblemente cuando se calienta a una temperatura (Ts) y enfría a una temperatura (Te), en donde Ts es mayor que la temperatura de fusión (Tm) del dAb, y Te es inferior que la temperatura de fusión del dAb. Por ejemplo, el monómero dAb puede desdoblarse de manera reversible cuando se calienta a 80°C y enfría a aproximadamente temperatura ambiente. Un polipéptido que se desdobla de manera reversible pierde función cuando se desdobla pero recupera la función en el redoblado. Tales polipéptidos se distinguen de polipéptidos que se agregan cuando se desdoblan o que se vuelven a doblar de manera inapropiada (polipéptidos mal doblados), es decir, no recuperan la función. El desdoblado y redoblado del polipéptido pueden valorarse, por ejemplo, al detectar directa o indirectamente la estructura del polipéptido utilizando cualquier método adecuado. Por ejemplo, la estructura de polipéptido puede detectarse por dicroísmo circular (CD) (por ejemplo, UV CD cercano, UV CD lejano), fluorescencia (por ejemplo, fluorescencia de cadenas laterales de triptofan), susceptibilidad a proteolísis, resonancia magnética nuclear (NM R), o al detectar o medir una función de polipéptido que es dependiente del doblado apropiado (por ejemplo, unión a ligando objetivo, unión a ligando genérico). En un ejemplo, el desdoblado de polipéptido se valora utilizando un ensayo funcional en el cual la pérdida de la función de unión (por ejemplo, unión a ligando objetivo y/o genérico, unión a substrato) indica que el polipéptido se desdobla. El grado de desdoblado y redoblado de un ligando o monómero dAb puede determinarse utilizando un desdoblado o curva de desnaturalización. Una curva de desdoblado puede producirse al trazar la temperatura como la ordenada y la concentración relativa de polipéptido doblado como la abscisa. La concentración relativa de monómero dAb o ligando doblado puede determinarse directa o indirectamente utilizando cualquier método (por ejemplo, CD, fluorescencia, ensayo de unión). Por ejemplo, una solución de ligando o monómero dAb puede prepararse y elipticidad de la sol ución determinarse por CD. El valor de elipticidad obtenido representa una concentración relativa de monómero dAb o ligando doblado de 100%. El ligando o monómero dAb en la solución se desdobla entonces al elevar incrementalmente la temperatura de la solución y elipticidad se determina en incrementos adecuados (por ejemplo, después de cada incremento de un grado en temperatura). El ligando o monómero dAb en solución se redobla de nuevo al reducir incrementalmente la temperatura de la solución y elipticidad se determina en incrementos adecuados. Los datos pueden trazarse para producir una curva de desdoblado y una curva de redoblado. Las curvas de desdoblado y redoblado tienen una forma sigmoidal característica que incluye una porción en la cual las moléculas de ligando o monómero dAb se desdoblan a varios grados, y una porción en la cual las moléculas de ligando o monómero dAb se desdoblan. La intercepción del eje y de la curva de redoblado es la cantidad relativa de monómero dAb o ligando redoblado recuperado. Una recuperación de al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 60%, o al menos aproximadamente 70%, o al menos aproximadamente 75%, o al menos aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 85%, o al menos aproximadamente 90%, o al menos aproximadamente 95% es indicativa de que el monómero dAb o ligando redoblado se desdobla de manera reversible. En una modalidad preferida, la reversibilidad de desdoblado del monómero dAb o ligando se determina al preparar una solución de monómero dAb o ligando y trazar las curvas de desdoblado y redoblado por calor. La solución de monómero dAb o ligando puede prepararse en cualquier solvente adecuado, tal como un regulador acuoso que tiene un pH adecuado para permitir que el monómero dAb o ligando se disuelva (por ejemplo, pH que es aproximadamente 3 unidades arriba o abajo del punto isoeléctrico (pl)). La solución de monómero dAb o ligando se concentra lo suficiente para permitir que se detecta el desdoblado/redoblado. Por ejemplo, la solución de monómero dAb o ligando puede ser aproximadamente 0.1 µM a aproximadamente 100 µM , o preferentemente aproximadamente 1 µM a aproximadamente 10 µM . Si la temperatura de fusión (Tm) del monómero dAb o ligando se conoce, la solución puede calentarse a aproximadamente diez grados abajo de la Tm (Tm-10) y el doblado se valora por elipticidad o fluorescencia (por ejemplo, exploración de UV CD lejana de 200 nM a 250 nm, CD de longitud de onda fija a 235 nm o 225 nm; espectros de emisión fluorescente de triptofan a 300 a 450 nm con excitación a 298 nm) para proporcionar 100% de monómero dAb o ligando doblado relativo. La solución se calienta entonces a al menos diez grados arriba de Tm (Tm + 10) en incrementos predeterminados (por ejemplo, incrementos de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 1 grado), y la elipticidad o fluorescencia se determina en cada incremento. Entonces, el monómero dAb o ligando se redobla al enfriar a al menos Tm-10 en incrementos predeterminados y la elipticidad o fluorescencia se determina en cada incremento. Si la temperatura de fusión del monómero dAb o ligando no se conoce, la solución puede desdoblarse al calentar de manera incremental de aproximadamente 25°C a aproximadamente 100°C y después redoblarse al enfriar incrementalmente a al menos aproximadamente 25°C, y elipticidad o fluorescencia en cada incremento de calentamiento y enfriamiento se determina. Los datos obtenidos pueden trazarse para producir una curva de desdoblado y una curva de redoblado, en la cual la intercepción de eje y de la curva de redoblado es la cantidad relativa de proteína redoblada recuperada. En ciertas modalidades, los ligandos o monómeros dAb de la invención son eficaces en modelos de enfermedades inflamatorias crónicas cuando una cantidad efectiva se administra. Generalmente una cantidad efectiva es aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg (por ejemplo, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 6 mg/kg, aproximadamente 7 mg/kg, aproximadamente 8 mg/kg, aproximadamente 9 mg/kg, o aproximadamente 10 mg/kg). Los modelos de enfermedad inflamatoria crónica descritos en la presente se reconocen por aquellos expertos en la materia como siendo predictivos de eficacia terapéutico en humanos. La técnica anterior no sugiere utilizar antagonistas de TNFR1 (por ejemplo, antagonista monovalentes, ligandos como se describen en la presente) en estos modelos, o que serían eficaces. En modalidades particulares, el monómero dAb o ligando es eficaz en el modelo de artritis inducida por colágeno de ratón estándar (Ejemplo 15A). Por ejemplo, la administración de una cantidad efectiva del ligando puede reducir la puntuación artrítica promedio de la suma de los cuatro limbos en el modelo de artritis inducida por colágeno de ratón estándar, por ejemplo, por aproximadamente 1 a aproximadamente 16, aproximadamente 3 a aproximadamente 16, aproximadamente 6 a aproximadamente 16, aproxi madamente 9 a aproximadamente 16, o aproximadamente 12 a aproximadamente 16, en comparación con un control adecuado. En otro ejemplo, la administración de una cantidad efectiva del ligando puede retrasar el inicio de los síntomas de artritis en el modelo de artritis inducida por colágeno de ratón estándar, por ejemplo, por aproximadamente 1 día, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 10 días, aproximadamente 14 días, aproximadamente 21 días o aproximadamente 28 días, en comparación con un control adecuado. En otro ejemplo, la administración de una cantidad efectiva del ligando puede resultar en una puntuación artrítica promedio de la suma de los cuatro limbos en el modelo de artritis inducida por colágeno de ratón estándar de 0 a aproximadamente 3, aproximadamente 3 a aproximadamente 5, aproximadamente 5 a aproximadamente 7, aproximadamente 7 a aproximadamente 15, aproximadamente 9 a aproximadamente 15, aproximadamente 10 a aproxi madamente 15, aproximadamente 12 a aproximadamente 15, o aproximadamente 14 a aproximadamente 15. En otras modalidades, el monómero dAb o ligando es eficaz en el modelo de artritis ?ARE de ratón (Ejemplo 15B). Por ejemplo, la administración de una cantidad efectiva del ligando puede reducir la puntación artrítica promedio en el modelo de artritis ?ARE de ratón, por ejemplo, por aproximadamente 0.1 a aproximadamente 2.5, aproximadamente 0.5 a aproximadamente 2.5, aproximadamente 1 a aproximadamente 2.5, aproximadamente 1.5 a aproximadamente 2.5, o aproximadamente 2 a aproximadamente 2.5, en comparación con un control adecuado. En otro ejemplo, la administración de una cantidad efectiva del ligando puede retrasar el inicio de síntomas de artritis en el modelo de artritis ?ARE de ratón por, por ejemplo, aproximadamente 1 día, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 10 días, aproximadamente 14 días, aproximadamente 21 días o aproximadamente 28 días, en comparación con un control adecuado. En otro ejemplo, la administración de una cantidad efectiva del ligando puede resultar en puntuación artrítica promedio en el modelo de artritis ?ARE de ratón de 0 a aproximadamente 0.5, aproximadamente 0.5 a aproximadamente 1 , aproximadamente 1 a aproximadamente 1.5, aproximadamente 1.5 a aproximadamente 2, o aproximadamente 2 a aproximadamente 2.5. En otras modalidades, el monómero dAb o ligando es eficaz en el modelo de enfermedad de i ntestino inflamatorio ?ARE de ratón (I BD) (Ejemplo 15B). Por ejemplo, la administración de una cantidad efectiva del ligando puede reducir la puntuación de inflamación crónica y/o aguda promedio en el modelo de I BD ?ARE de ratón, por ejemplo, por aproximadamente 0.1 a aproximadamente 2.5, aproximadamente 0.5 a aproximadamente 2.5, aproximadamente 1 a aproximadamente 2.5, aproximadamente 1.5 a aproximadamente 2.5, o aproximadamente 2 a aproximadamente 2.5, en comparación con un control adecuado. En otro ejemplo, la administración de una cantidad efectiva del ligando puede retrasar el inicio de síntomas de IBD en el modelo de IBD ?ARE de ratón por, por ejemplo, aproximadamente 1 día, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 10 días, aproximadamente 14 días, aproximadamente 21 días o aproximadamente 28 días, en comparación con un control adecuado. En otro ejemplo, la administración de una cantidad efectiva del ligando puede resultar en una puntuación de infamación crónica y/o aguda promedio en el modelo de BD ?ARE de ratón de 0 a aproximadamente 0.5, aproximadamente 0.5 a aproximadamente 1 , aproximadamente 1 a aproximadamente 1.5, aproximadamente 1.5 a aproxi madamente 2 , o aproxi madamente 2 a aproximadamente 2.5. En otras modalidades, el monómero dAb o ligando es eficaz en el modelo de I BD inducido por sodio de sulfato de dextran (DSS) de ratón ( Ejemplo 15C). Por ejemplo, la administración de una cantidad efectiva del ligando puede reducir la puntuación de severidad promedio en el modelo de I B D DSS de ratón, por ejemplo, por aproximadamente 0.1 a aproximadamente 2.5, aproximadamente 0.5 a aproximadamente 2.5, aproximadamente 1 a aproximadamente 2.5, aproxi madamente 1 .5 a aproximadamente 2.5, o aproximadamente 2 a aproximadamente 2.5, en com paración con un control adecuado. En otro ejemplo, la administración de una cantidad efectiva del ligando puede retrasar el inicio de síntomas de IBD en el modelo de I BD DSS de ratón por, por ejemplo, aproximadamente 1 día, aproxi madamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 10 días, aproxi madamente 14 días, aproximadamente 21 días o aproxi madamente 28 días, en comparación con un control adecuado. En otro ejemplo, la administración de una cantidad efectiva del ligando puede resultar en una puntuación de severidad promedio en el modelo de I BD DSS de ratón de 0 a aproxi madamente 0.5, aproxi madamente 0.5 a aproxi madamente 1 , aproxi madamente 1 a aproxi madamente 1 .5, aproximadamente 1 .5 a aproximadamente 2, o aproximadamente 2 a aproximadamente 2.5. En modalidades particulares , el monómero dAb o li gando es eficaz en el modelo de enfermedad pulmonar obstructiva crónica por fumada de tabaco de ratón (COPD) (Ejemplo 15D). Por ejemplo, la administración de una cantidad efectiva del ligando puede reducir o retrasar el inicio de los síntomas de COPD, en comparación con un control adecuado. En modalidades particul ares, el monómero dAb o ligando específicamente une TNFR1 y comprende la secuencia de aminoácidos de TAR2-10 (SEQ I D NO:31 ) o una secuencia que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% homologa a la misma. En modalidades particulares, el monómero dAb o ligando específicamente une TNFR1 y comprende la secuencia de ami noácidos de TAR2-5 (SEQ I D NO: 195) o una secuencia que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% homologa a la misma. En otras modalidades, el ligando comprende un monómero de anticuerpo de dominio (dAb) que específicamente une el Receptor de Factor de Necrosis de Tumor I (TNFR1 , p55, CD120a) con una Kd de 300 nM a 5 pM , y comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91 %, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% homologa a la secuencia de aminoácidos o un dAb seleccionada del grupo consistiendo de TAR2h-12 (SEQ ID NO:32), TAR2h-13 (SEQ ID NO:33), TAR2h-14 (SEQ ID NO:34), TAR2h-16 (SEQ ID NO:35), TAR2h-17 (SEQ ID NO:36), TAR2h-18 (SEQ ID NO:37), TAR2h-19 (SEQ ID NO:38), TAR2h-20 (SEQ ID NO:39), TAR2h-21 (SEQ ID NO:40), TAR2h-22 (SEQ ID NO:41), TAR2h-23 (SEQ ID NO:42), TAR2h-24 (SEQ ID NO:43), TAR2h-25 (SEQ ID NO:44), TAR2h-26 (SEQ ID NO:45), TAR2h-27 (SEQ ID NO:46), TAR2h-29 (SEQ ID NO:47), TAR2h-30 (SEQ ID NO:48), TAR2h-32 (SEQ ID NO:49), TAR2h-33 (SEQ ID NO:50), TAR2h-10-1 (SEQ ID NO:51), TAR2h-10-2 (SEQ ID NO:52), TAR2h-10-3 (SEQ ID NO:53), TAR2h-10-4 (SEQ ID NO:54), TAR2h-10-5 (SEQ ID NO:55), TAR2h-10-6 (SEQ ID NO:56), TAR2h-10-7 (SEQ ID NO:57), TAR2h-10-8 (SEQ ID NO:58), TAR2h-10-9 (SEQ ID NO:59), TAR2h-10-10 (SEQ ID NO:60), TAR2h-10-11 (SEQ ID NO:61), TAR2h-10-12 (SEQ ID NO:62), TAR2h-10-13 (SEQ ID NO:63), TAR2h-10-14 (SEQ ID NO:64), TAR2h-10-15 (SEQ ID NO:65), TAR2h-10-16 (SEQ ID NO:66), TAR2h-10-17 (SEQ ID NO:67), TAR2h-10-18 (SEQ ID NO:68), TAR2h-10-19 (SEQ ID NO:69), TAR2h-10-20 (SEQ ID NO:70), TAR2h-10-21 (SEQ ID NO:71), TAR2h-10-22 (SEQ ID NO:72), TAR2h-10-27 (SEQ ID NO:73), TAR2h-10-29 (SEQ ID NO:74), TAR2h-10-31 (SEQ ID NO:75), TAR2h-10-35 (SEQ ID NO:76). TAR2h-10-36 (SEQ ID NO:77), TAR2h-10-37 (SEQ ID NO:78), TAR2h-10-38 (SEQ ID NO:79), TAR2h-10-45 (SEQ ID NO:80), TAR2h-10-47 (SEQ ID NO:81), TAR2h-10-48 (SEQ ID NO:82), TAR2h-10-57 (SEQ ID NO:83), TAR2h-10-56 (SEQ ID NO:84), TAR2h-10-58 (SEQ ID NO:85), TAR2h-10-66 (SEQ ID NO:86), TAR2h-10-64 (SEQ ID NO:87), TAR2h-10-65 (SEQ ID NO:88), TAR2h-10-68 (SEQ ID NO:89), TAR2h-10-69 (SEQ ID NO:90), TAR2h-10-67 (SEQ ID NO:91), TAR2h-10-61 (SEQ ID NO:92), TAR2h-10-62 (SEQ ID NO:93), TAR2h-10-63 (SEQ ID NO:94), TAR2h-10-60 (SEQ ID NO:95), TAR2h-10-55 (SEQ ID NO:96), TAR2h-10-59 (SEQ ID NO:97), TAR2h-10-70 (SEQ ID NO:98), TAR2h-34 (SEQ ID NO:373), TAR2h-35 (SEQ ID NO:374), TAR2h-36 (SEQ ID NO:375), TAR2h-37 (SEQ ID NO:376), TAR2h-38 (SEQ ID NO:377), TAR2h-39 (SEQ ID NO:378), TAR2h-40 (SEQ ID NO:379), TAR2h-41 (SEQ ID NO:380), TAR2h-42 (SEQ ID NO:381), TAR2h-43 (SEQ ID NO:382), TAR2h-44 (SEQ ID NO:383), TAR2h-45 (SEQ ID NO:384), TAR2h-47 (SEQ ID NO:385), TAR2h-48 (SEQ ID NO:386), TAR2h-50 (SEQ ID NO:387), TAR2h-51 (SEQ ED NO:388), TAR2h-66 (SEQ ID NO:389), TAR2h-67 (SEQ ID N0:39O), TAR2h-68 (SEQ ID NO:391), TAR2h-70 (SEQ ID NO:392), TAR2h-71 (SEQ ID NO:393), TAR2h-72 (SEQ ID NO:394), TAR2h-73 (SEQ ID NO:395), TAR2h-74 (SEQ ID NO:396), TAR2h-75 (SEQ ID NO:397), TAR2h-76 (SEQ ID NO:398), TAR2h-77 (SEQ ID NO:399), TAR2h-78 (SEQ ID NO:400), TAR2h-79 (SEQ ID NO:401) y TAR2h-15 (SEQ ED NO:431). En modalidades adicionales, el ligando comprende un monómero de anticuerpo de dominio (dAb) que específicamente une el Receptor de Factor de Necrosis de Tumor I (TNFR1, p55, CD120a) con una Kd de 300 nM a 5 pM, y comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% homologa a la secuencia de aminoácidos o un dAb seleccionada del grupo consistiendo de TAR2h-131-8 (SEQ ID NO:433), TAR2h-131-24 (SEQ ID NO:434), TAR2h-15-8 (SEQ ID NO:435), TAR2h-15-8-1 SEQ ID NO:436), TAR2h-15-8-2 (SEQ ID NO:437), TAR2h-185-23 (SEQ ID NO:438), TAR2h-154-10-5 (SEQ ID NO:439), TAR2h-14-2 (SEQ ID NO:440), TAR2h-151-8 (SEQ ID NO:441), TAR2h-152-7 (SEQ ID NO:442), TAR2h-35-4 (SEQ ID NO:443), TAR2h-154-7 (SEQ ID NO:444), TAR2h-80 (SEQ ID NO:445), TAR2h-81 (SEQ ID NO:446), TAR2h-82 (SEQ ID NO:447), TAR2h-83 (SEQ ID NO:448), TAR2h-84 (SEQ ID NO:449), TAR2h-85 (SEQ ID NO:450), TAR2h-86 (SEQ ID NO:451), TAR2h-87 (SEQ ID NO:452), TAR2h-88 (SEQ ID NO:453), TAR2h-89 (SEQ ID NO:454), TAR2h-90 (SEQ ID NO:455), TAR2h-91 (SEQ ID NO:456), TAR2h-92 (SEQ ID NO:457), TAR2h-93 (SEQ ID NO:458), TAR2h-94 (SEQ ID NO:459), TAR2h-95 (SEQ ID NO:460), TAR2h-96 (SEQ ID NO:461), TAR2h-97 (SEQ ID NO:462), TAR2h-99 (SEQ ID NO:463). TAR2h-100 (SEQ ID NO:464), TAR2h-101 (SEQ ID NO:465), TAR2h-102 (SEQ ID NO:466), TAR2h-103 (SEQ ID NO:467) , TAR2h-104 ( SEQ ID NO:468), TAR2h-105 (SEQ ID NO:469) , TAR2h-106 ( SEQ ID NO:470), TAR2h-107 (SEQ ID NO:471) , TAR2h-108 ( SEQ ID NO.472), TAR2h-109 (SEQ ID NO:473) , TAR2h-110 ( SEQ ID NO:474), TAR2h-111 (SEQ ID NO:475) , TAR2h-112 ( SEQ ID NO:476), TAR2h-113 (SEQ ID NO:477) , TAR2h-114 ( SEQ ID NO:478), TAR2h-115 (SEQ ID NO:479) , TAR2h-116 ( SEQ ID NO:480), TAR2h-117 (SEQ ID NO:481) , TAR2h-118 ( SEQ ID NO:482) TAR2h-119 (SEQ ID NO:483) , TAR2h-120 ( SEQ ID NO:484) TAR2h-121 (SEQ ID NO:485) , TAR2h-122 ( SEQ ID NO:486) TAR2h-123 (SEQ ID NO:487) , TAR2h-124 ( SEQ ID NO:488) TAR2h-125 (SEQ ID NO:489) , TAR2h-126 ( SEQ ID NO:490) TAR2h-127 (SEQ ID NO:491) , TAR2h-128 < SEQ ID NO:492) TAR2h-129 (SEQ ID NO:493) , TAR2h-130 ;SEQ ID NO:494) TAR2h-131 (SEQ ID NO:495) , TAR2h-132 (SEQ ID NO:496) TAR2h-133 (SEQ ID NO:497) , TAR2h-151 (SEQ ID NO:498) TAR2h-152 (SEQ ID NO:499) , TAR2h-153 (SEQ ID NO:500) TAR2h-154 (SEQ ID NO:501) , TAR2h-159 (SEQ ID NO:502) , TAR2h-165 (SEQ ID NO:503) , TAR2h-166 (SEQ ID NO:504) , TAR2h-168 (SEQ ID NO:505) , TAR2h-171 (SEQ ID NO:506) , TAR2h-172 (SEQ ID NO:507) , TAR2h-173 (SEQ ID NO:508) , TAR2h-174 (SEQ ID NO:509) , TAR2h-176 (SEQ ID NO:510) , TAR2h-178 (SEQ ID NO:511) , TAR2h-201 (SEQ ID NO:512) , TAR2h-202 (SEQ ID NO:513) , TAR2h-203 (SEQ ID NO:514) , TAR2h-204 (SEQ ID I ^O:515), TAR2h-185-25 (SEQ ID NO:516), TAR2h-154-10 (SEQ I D NO:517) , y TAR2h-205 (SEQ I D NO:627). En modalidades preferidas, los ligandos o dAbs comprenden una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91 %, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% homologa a una secuencia de aminoácidos de un dAb seleccionada del grupo consistiendo de TAR2h-10-27 (SEQ ID NO:73), TAR2h-10-57 (SEQ ID NO:83), TAR2h-10-56 (SEQ I D NO:84), TAR2h-10-58 (SEQ I D NO:85), TAR2h-10-66 (SEQ I D NO:86), TAR2h-10-64 (SEQ I D NO: 87), TAR2h-10-65 (SEQ I D NO:88), TAR2h-10-68 (SEQ I D NO:89) , TAR2h-10-69 (SEQ I D NO:90), TAR2h-10-67 (SEQ ID NO:91 ), TAR2h-10-61 (SEQ ID NO:92), TAR2h-10-62 (SEQ I D NO:93), TAR2h-10-63 (SEQ I D NO:94), TAR2h-10-60 (SEQ I D NO: 95), TAR2h-10-55 (SEQ I D NO:96), TAR2h-10-59 (SEQ I D NO:97), y TAR2h-10-7O (SEQ I D NO:98). Los ligandos o dAbs particularmente preferidos comprenden una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91 %, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% homologa a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73. En otras modalidades, el ligando comprende un monómero de anticuerpo de dominio (dAb) que específicamente une el Receptor de Factor de Necrosis de Tumor I (TNFR1, p55, CD 120a) con una Kd de 300 nM a 5 pM y comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% homologa a la secuencia de aminoácidos o un dAb seleccionada del grupo consistiendo de TAR2m-14 (SEQ ID NO:167), TAR2m-15 (SEQ ID NO:168), TAR2m-19 (SEQ ID NO:169), TAR2m-20 (SEQ ID NO:170), TAR2m-21 (SEQ ID NO:171), TAR2m-24 (SEQ ID NO:172), TAR2m-21-23 (SEQ ID NO: 173), TAR2m-21-07 (SEQ ID NO:174), TAR2m-21-43 (SEQ ID NO:175), TAR2m-21-48 (SEQ ID NO:176), TAR2m-21-10 (SEQ ID NO:177), TAR2m-21-06 (SEQ ID NO:178), TAR2m-21-17 (SEQ ID NO: 179). En algunas modalidades, el ligando comprende un monómero dAb que une TNFR1 y compite con cualquiera de los dAbs descritos en la presente para unión a TNFR1 (por ejemplo, TNFR1 de humano y/o de ratón). Preferentemente, el monómero dAb o ligando se secreta en una cantidad de al menos aproximadamente 0.5 mg/L cuando se expresa en especies E. coli o Pichia (por ejemplo, P. pastoris). En otras modalidades preferidas, el monómero dAb se secreta en una cantidad de al menos aproximadamente 0.75 mg/L, al menos aproxi madamente 1 mg/L, al menos aproximadamente 4 mg/L, al menos aproximadamente 5 mg/L, al menos aproximadamente 10 mg/L, al menos aproximadamente 15 mg/L, al menos aproximadamente 20 mg/L, al menos aproximadamente 25 mg/L, al menos aproximadamente 30 mg/L, al menos aproximadamente 35 mg/L, al menos aproximadamente 40 mg/L, al menos aproximadamente 45 mg/L, o al menos aproximadamente 50 mg/L, o al menos aproximadamente 100 mg/L, o al menos aproximadamente 200 mg/L, o al menos aproximadamente 300 mg/L, o al menos aproximadamente 400 mg/L, o al menos aproximadamente 500 mg/L, o al menos aproximadamente 600 mg/L, o al menos aproximadamente 700 mg/L, o al menos aproximadamente 800 mg/L, al menos aproximadamente 900 mg/L, o al menos aproximadamente 1 g/L cuando se expresa en especies E. coli o Pichia (por ejemplo, P. pastoris). En otras modalidades preferidas, el monómero dAb se secreta en una cantidad de al menos aproximadamente 1 mg/L a al menos aproximadamente 1 g/L, al menos aproximadamente 1 mg/L a al menos aproximadamente 750 mg/L, al menos aproximadamente 100 mg/L a al menos aproximadamente 1 g/L, al menos aproximadamente 200 mg/L a al menos aproximadamente 1 g/L, al menos aproximadamente 300 mg/L a al menos aproximadamente 1 g/L, al menos aproximadamente 400 mg/L a al menos aproximadamente 1 g/L, al menos aproximadamente 500 mg/L a al menos aproximadamente 1 g/L, al menos aproximadamente 600 mg/L a al menos aproximadamente 1 g/L, al menos aproximadamente 700 mg/L a al menos aproximadamente 1 g/L, al menos aproximadamente 800 mg/L a al menos aproxi madamente 1 g/L, o al menos aproximadamente 900 mg/L a al menos aproximadamente 1 g/L cuando se expresa en especies E. coli o Pichia (por ejemplo, P. pastoris). Aunque, los ligandos y monómeros dAb descritos en la presente pueden secretarse cuando se expresan en especies E. coli o Pichia (por ejemplo, P. pastoris), pueden producirse utilizando cualquier método adecuado, tales como métodos sintéticos o métodos de producción biológica que no emplean especies E. coli o Pichia. El monómero dAb puede comprender cualquier dominio variable de inmunoglobulina adecuado, y preferentemente comprende un dominio variable de humano o un dominio variable que comprende regiones de estructura de humano. En ciertas modalidades, el monómero dAb comprende una estructura universal, como se describe en la presente. La estructura universal puede ser una estructura VL (V? o VK) , tal como una estructura que comprende las secuencias de estructura de aminoácidos codificados por el segmento de gen de inmunoglobulina DPK1 , DPK2, DPK3, DPK4, DPK5, DPK6, DPK7, DPK8, DPK9, DPK10, DPK12, DPK13, DPK15, DPK16, DPK18, DPK19, DPK20, DPK21 , DPK22, DPK23, DPK24, DPK25, DPK26 o DPK28 de línea germinal de humano. Si se desea, la estructura V puede comprender además la secuencia de aminoácidos de estructura codificada por el segmento de gen de inmunoglobulina J?1 , J?2, J?3, J?4, o J?5 de línea germinal de humano. En otras modalidades la estructura universal puede ser una estructura VH, tal como una estructura que comprende las secuencias de aminoácidos de estructura codificadas por el segmento de inmunoglobulina de gen DP4, DP7, DP8, DP9, DP 10, DP31 , DP33, DP38, DP45, DP46, DP47, DP49, DP50, DP51 , DP53, DP54, DP65, DP66, DP67, DP68 o DP69 de línea germinal de humano. Si se desea, la estructura VH puede comprender además la secuencia de aminoácidos de estructura codificada por el segmento de gen de inmunoglobulina JH1 , J H2, J H3 , J H4 , JH4b, JH5 y JH6 de línea germinal de humano. En modalidades particulares, el ligando o monómero dAb comprende la estructura VL DPK9, o una estructura VH seleccionada del grupo consistiendo de DP47, DP45 y DP38. El monómero dAb puede comprender un sitio de unión para un ligando genérico, tal como proteína A, proteína L y proteína G. En ciertas modalidades, el monómero dAb comprende una o más regiones de estructura comprendiendo una secuencia de aminoácidos que es la misma que la secuencia de aminoácidos de una región de estructura correspondiente codificada por un segmento de gen de anticuerpo de línea germinal de humano, o las secuencias de aminoácidos de una o más de dichas regiones de estructura comprenden colectivamente hasta 5 diferencias de aminoácido relativas a la secuencia de aminoácidos de dicha región de estructura correspondiente codificada por un segmento de gen de anticuerpo de l ínea germinal de humano. En otras modalidades, las secuencias de aminoácidos de FW1 , FW2, FW3 y FW4 del monómero dAb son las mismas que las secuencias de aminoácidos de regiones de estructura correspondientes codificadas por un segmento de gen de anticuerpo de línea germinal de humano, o las secuencias de aminoácidos de FW1 , FW2, FW3 y FW4 colectivamente contiene hasta 10 diferencias de aminoácido relativas a las secuencias de aminoácidos de regiones de estructura correspondientes codificadas por dicho segmento de gen de anticuerpo de línea germinal de humano. En otras modalidades, el monómero dAb comprende regiones FW1 , FW2 y FW3, y la secuencia de aminoácidos de dichas regiones FW1 , FW2 y FW3 es la misma que la secuencia de aminoácidos de regiones de estructura correspondientes codificadas por los segmentos de gen de anticuerpo de línea germinal de humano. En algunas modalidades, el monómero dAb no comprende un dominio variable de inmunoglobulina Camelid, o uno o más aminoácidos de estructura que son únicos para dominios variable de inmunoglobulina codificados por segmentos de gen de anticuerpo de línea germinal Camelid. Ligandos y monómeros dAb que Unen Albúmina de suero La invención proporciona un monómero dAb o ligando (por ejemplo, ligando específico dual comprendiendo tal un dAb) que se une a albúmina de suero (SA) con una Kd de 1 nM a 500 µM (es decir, x10"9 a 5x10"4), preferentemente 100 nM a 10 µM. Preferentemente, para un ligando específico dual comprendiendo un primer dAb anti-SA y un segundo dAb para otro objetivo, la afinidad (por ejemplo Kd y/o Kapagada como se mide por resonancia de plasmón de superficie, por ejemplo utilizando BiaCore) del segundo dAb para su objetivo es de 1 a 100000 veces (preferentemente 100 a 100000, más preferentemente 1000 a 100000, o 10000 a 100000 veces) la afinidad del primer dAb para SA. Por ejemplo, el primer dAb une SA con una afinidad de aproximadamente 10 µM, mientras el segundo dAb une su objetivo con una afinidad de 100 pM . Preferentemente, la albúmina de suero es albúmina de suero de humano (HSA) . En una modalidad, el primer dAb (o un monómero dAb) une SA (por ejemplo, HSA) con una Kd de aproximadamente 50, preferentemente 70, y más preferentemente 100, 150 o 200 nM . En ciertas modalidades, el monómero dAb específico para SA comprende la secuencia de aminoácidos de MSA-16 (SEQ ID NO:28) o una secuencia que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% homologa a la misma. En otras modalidades, el monómero dAb específico para SA comprende la secuencia de aminoácidos de MSA-26 (SEQ I D NO:30) o una secuencia que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% homologa a la misma. En ciertas modalidades, el monómero dAb que une SA resiste la agregación, se desdobla de manera reversible y/o comprende una región de estructura como se describe arriba para monómeros dAb que unen TNFR1. Moléculas de Ácido Nucleico, Vectores y Células Huésped La invención también proporciona moléculas de ácido nucleico recombinantes y/o aisladas que codifican los ligandos y monómeros dAb descritos en la presente. En ciertas modalidades, el ácido nucleico recombinante y/o aislado comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un monómero de anticuerpo de dominio (dAb) que específicamente une el Receptor de Factor de Necrosis de Tumor I (TNFR1 ) , en donde dicha secuencia de nucleótidos es al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91 %, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% homologa a una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo consistiendo de TAR2h-12 (SEQ ID NO: 32), TAR2h-13 (SEQ I D NO:33), TAR2h-14 (SEQ I D NO: 34), TAR2h-16 (SEQ I D NO:35), TAR2h-17 (SEQ ID NO:36), TAR2h-18 (SEQ ID NO:37), TAR2h-19 (SEQ ID NO:38), TAR2h-20 (SEQ ID NO:39), TAR2h-21 (SEQ ID NO:40), TAR2h-22 (SEQ ID NO:41), TAR2h-23 (SEQ ID NO:42), TAR2h-24 (SEQ ID NO:43), TAR2h-25 (SEQ ID NO:44), TAR2h-26 (SEQ ID NO:45), TAR2h-27 (SEQ ID NO:46), TAR2h-29 (SEQ ID NO:47), TAR2h-30 (SEQ ID NO:48), TAR2h-32 (SEQ ID NO:49), TAR2h-33 (SEQ ID NO:50), TAR2h-10-1 (SEQ ID NO:51), TAR2h-10-2 (SEQ ID NO:52), TAR2h-10-3 (SEQ ID NO:53), TAR2h-10-4 (SEQ ID NO:54), TAR2h-10-5 (SEQ ID NO:55), TAR2h-10-6 (SEQ ID NO:56), TAR2h-10-7 (SEQ ID NO:57), TAR2h-10-8 (SEQ ID NO:58), TAR2h-10-9 (SEQ ID NO:59), TAR2h-10-10 (SEQ ID NO:60), TAR2h-10-11 (SEQ ID NO:61), TAR2h-10-12 (SEQ ID NO:62), TAR2h-10-13 (SEQ ID NO:63), TAR2h-10-14 (SEQ ID NO:64), TAR2h-10-15 (SEQ ID NO:65), TAR2h-10-16 (SEQ ID NO:66), TAR2h-10-17 (SEQ ID NO:67) , TAR2h-10-18 (SEQ ID NO:68 TAR2h-10-19 (SEQ ID NO:69) , TAR2h-10-20 (SEQ ID NO:70 TAR2h-10-21 (SEQ ID NO:71] , TAR2h-10-22 (SEQ ID NO:72 TAR2h-10-27 (SEQ ID NO:73¡ , TAR2h-10-29 (SEQ ID NO:74 TAR2h-10-31 (SEQ ID NO:75¡ I, TAR2h-10-35 (SEQ ID NO:76 TAR2h-10-36 (SEQ ID NO:77, , TAR2h-10-37 (SEQ ID NO:78 TAR2h-10-38 (SEQ ID NO:79 ), TAR2h-10-45 (SEQ ID NO:80 TAR2h-10-47 (SEQ ID NO:81 ), TAR2h-10-48 (SEQ ID NO:82 TAR2h-10-57 (SEQ ID NO:83 ), TAR2h-10-56 (SEQ ID NO:84 TAR2h-10-58 (SEQ ID NO:85 ), TAR2h-10-66 (SEQ ID NO:86 TAR2h-10-64 (SEQ ID NO:87 ), TAR2h-10-65 (SEQ ID NO:88 TAR2h-10-68 (SEQ ID NO:89), TAR2h-10-69 (SEQ ID NO:90), TAR2h-10-67 (SEQ ID NO:91), TAR2h-10-61 (SEQ ID NO:92), TAR2h-10-62 (SEQ ID NO:93), TAR2h-10-63 (SEQ ID NO:94), TAR2h-10-60 (SEQ ID NO:95), TAR2h-10-55 (SEQ ID NO:96), TAR2h-10-59 (SEQ ID NO:97), TAR2h-10-70 (SEQ ID NO:98), TAR2h-34 (SEQ ID NO:402), TAR2h-35 (SEQ ID NO:403), TAR2h-36 (SEQ ID NO:404), TAR2h-37 (SEQ ID NO:405), TAR2h-38 (SEQ ID NO:406), TAR2h-39 (SEQ ID NO:407), TAR2h-40 (SEQ ID NO:408), TAR2h-41 (SEQ ID NO:409), TAR2h-42 (SEQ ID NO:410), TAR2h-43 (SEQ ID NO.411), TAR2h-44 (SEQ ID NO:412), TAR2h-45 (SEQ ID NO:413), TAR2h-47 (SEQ ID NO:414), TAR2h-48 (SEQ ID NO:415), TAR2h-50 (SEQ ID NO:416), TAR2h-51 (SEQ ID NO:417), TAR2h-66 (SEQ ID NO:418), TAR2h-67 (SEQ ID NO:419), TAR2h-68 (SEQ ID NO:420), TAR2h-70 (SEQ ID NO:421), TAR2h-71 (SEQ ID NO:422), TAR2h-72 (SEQ ID NO:423), TAR2h-73 (SEQ ID NO:424), TAR2h-74 (SEQ ID NO:425), TAR2h-75 (SEQ ID NO:426), TAR2h-76 (SEQ ID NO:427), TAR2h-77 (SEQ ID NO:428), TAR2h-78 (SEQ ID NO:429), TAR2h-79 (SEQ ID NO:430), y TAR2h-15 (SEQ ID NO:432). En otras modalidades, el ácido nucleico recombinante y/o aislado comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un monómero de anticuerpo de dominio (dAb) que específicamente une el Receptor de Factor de Necrosis de Tumor I (TNFR1), en donde dicha secuencia de nucleótidos es al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% homologa a una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo consistiendo de TAR2h-131-8 (SEQ ID NO:518), TAR2h-131-24 (SEQ ID NO.519), TAR2h-15-8 (SEQ ID NO:520), TAR2h-15-8-l (SEQ ID NO:521), TAR2h-15-8-2 (SEQ ID NO.522), TAR2h-185-23 (SEQ ID NO:523), TAR2h-154-10-5 (SEQ ID NO.524), TAR2h-14-2 (SEQ ID NO:525), TAR2h-151-8 (SEQ ID NO:526), TAR2h-152-7 (SEQ ID NTO:527), TAR2h-35-4 (SEQ ID NO:528), TAR2h-154-7 (SEQ ID NO:529), TAR2h-80 (SEQ ID NO:530), TAR2h-81 (SEQ ID NO:531), TAR2h-82 (SEQ ID NO:532), TAR2h-83 (SEQ ID NO:533), TAR2h-84 (SEQ ID NO:534), TAR2h-85 (SEQ ID NO:535), TAR2h-86 (SEQ ID NO:536), TAR2h-87 (SEQ ID NO:537), TAR2h-88 (SEQ ID NO.538), TAR2h-89 (SEQ ID NO:539), TAR2h-90 (SEQ ID NO:540), TAR2H-91 (SEQ ID NO:541), TAR2h-92 (SEQ ID NO:542), TAR2h-93 (SEQ ID NO:543), TAR2h-94 (SEQ ID NO:544), TAR2h-95 (SEQ ID NO:545), TAR2h-96 (SEQ ID NO:546), TAR2h-97 (SEQ ID NO:547), TAR2h-99 (SEQ ID NO:548), TAR2h-100 (SEQ ID NO:549), TAR2h-101 (SEQ ID NO:550), TAR2h-102 (SEQ ID NO:551), TAR2h-103 (SEQ ID NO:552), TAR2h-104 (SEQ ID NO:553), TAR2h-105 (SEQ ID NO:554), TAR2h-106 (SEQ ID NO:555), TAR2h-107 (SEQ ID NO:556), TAR2h-108 (SEQ ID NO:557), TAR2h-109 (SEQ ID NO:558), TAR2h-110 (SEQ ID NO:559), TAR2h-111 (SEQ ID NO:560), TAR2h-112 (SEQ ID N0.561), TAR2h-113 (SEQ ID NO:562), TAR2h-114 (SEQ ID NO:563), TAR2h-115 (SEQ ID NO:564), TAR2h-116 (SEQ ID NO:565), TAR2h-117 (SEQ ID NO:566), TAR2h-118 (SEQ ID NO:567), TAR2h-119 (SEQ ID NO:568), TAR2h-120 (SEQ ID NO:569), TAR2h-121 (SEQ ID NO:570), TAR2h-122 (SEQ ID NO:571), TAR2h-123 (SEQ ID NO.572), TAR2h-12 (SEQ ID NO:573), TAR2h-125 (SEQ ID NO:574), TAR2h-126 (SEQ ID NO:575), TAR2h-127 (SEQ ID NO:576), TAR2h-128 (SEQ ID NO:577), TAR2h-129 (SEQ ID NO:578), TAR2h-130 (SEQ ID NO:579), TAR2h-131 (SEQ ID NO:580), TAR2h-132 (SEQ ID NO:581), TAR2h-133 (SEQ ID NO:582), TAR2h-151 (SEQ ID NO:583), TAR2h-152 (SEQ ID NO.584), TAR2h-153 (SEQ ID NO:585), TAR2h-154 (SEQ ID NO:586), TAR2h-159 (SEQ ID NO:587), TAR2h-165 (SEQ ID NO:588), TAR2h-166 (SEQ ID NO:589), TAR2h-168 (SEQ ID NO:590), TAR2h-171 (SEQ ID NO:591), TAR2h-172 (SEQ ID NO:592), TAR2h-173 (SEQ ID NO:593), TAR2h-174 (SEQ ID NO:594), TAR2h-176 (SEQ ID NO:595), TAR2h-178 (SEQ ID NO:596), TAR2h-201 (SEQ ID NO:597), TAR2h-202 (SEQ ID NO:598), TAR2h-203 (SEQ ID NO:599), TAR2h-204 (SEQ ID NO:600), TAR2h-185-25 (SEQ ID NO:601), TAR2h-154-10 (SEQ ID NO:602), y TAR2h-205 (SEQ ID NO:628). En una modalidad preferida, el ácido nucleico recombinante y/o aislado comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% homologa a una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo consistiendo de TAR2h-10-27 (SEQ ID NO:141), TAR2h-10-57 (SEQ ID NO:151), TAR2h-10-56 (SEQ ID NO:152), TAR2h-10-58 (SEQ ID NO: 153), TAR2h-10-66 (SEQ ID NO: 154), TAR2h-10-64 (SEQ ID NO:155), TAR2h-10-65 (SEQ ID NO:156), TAR2h-10-68 (SEQ ID NO:157), TAR2h-10-69 (SEQ ID NO.158), TAR2h-10-67 (SEQ ID NO:159), TAR2h-10-61 (SEQ ID NO: 160), TAR2h-10-62 (SEQ ID NO:161), TAR2h-10-63 (SEQ ID NO:162), TAR2h-10-60 (SEQ ID NO:163), TAR2h-10-55 (SEQ ID NO:164), TAR2h-10-59 (SEQ ID NO:165), y TAR2h-10-70 (SEQ ID NO:166). En otras modalidades, el ácido nucleico recombinante y/o aislado comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un monómero de anticuerpo de dominio (dAb) que específicamente une el Receptor de Factor de Necrosis de Tumor I (TNFR1), en donde dicha secuencia de nucleótidos es al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% homologa a una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo consistiendo de TAR2m-14 (SEQ ID NO: 180), TAR2m-15 (SEQ ID NO:181), TAR2m-19 (SEQ ID NO:182), TAR2m-20 (SEQ ID NOJ183), TAR2m-21 (SEQ ID NO:184), TAR2m-24 (SEQ ID NO:185), TAR2m-21-23 (SEQ ID NO:186), TAR2m-21-07 (SEQ ID NO:187), TAR2m-21-43 (SEQ ID NO:188), TAR2m-21-48 (SEQ ID NO:189), TAR2m-21-10 (SEQ ID NO:190), TAR2m-21-06 (SEQ ID NO:191), TAR2m-21-17 (SEQ ID NO: 192), y TAR2m-21-23a (SEQ ID NO:626). La invención también proporciona un vector comprendiendo una molécula de ácido nucleico recombinante de la invención. En ciertas modalidades, el vector es un vector de expresión comprendiendo uno o más elementos de control o secuencias que se enlazan operativamente al ácido nucleico recombinante de la invención. Los vectores adecuados (por ejemplo, plásmidos, fagmidos) y elementos de control de expresión se describen más abajo. La invención también proporciona una célula huésped recombinante comprendiendo una molécula de ácido nucleico recombinante o vector de la invención. Los métodos y células huésped adecuadas para producir la célula huésped recombinante de la invención se describen abajo. La invención también proporciona un método para producir un ligando (por ejemplo, monómero dAb, ligando específico dual, ligando multiespecifico) de la invención, comprendiendo mantener una célula huésped recombinante comprendiendo un ácido nucleico recombinante de la invención bajo condiciones adecuadas para expresión del ácido nucleico recombinante, mediante el cual el ácido nucleico recombinante se expresa y un ligando se produce. En algunas modalidades, el método comprende además aislar el ligando. Formatos de Ligando Ligandos de acuerdo a la invención pueden formatearse como anticuerpos mono o multiespecíficos o fragmentos de anticuerpo o en estructuras de no inmunoglobulina mono o multiespecíficas. Los formatos adecuados incluyen, cualquier estructura de polipéptido adecuada en la cual un dominio variable de anticuerpo o las CDR del mismo pueden incorporarse para conferir especificidad de unión para antígeno en la estructura. Una variedad de formatos de anticuerpo adecuados se conocen en la materia, tales como formatos similares a IgG , anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos de humano, anticuerpos de cadena única, anticuerpos biespecíficos, cadenas pesadas de anticuerpo, cadenas ligeras de anticuerpo, homodímeros y heterodímeros de cadenas pesadas y/o cadenas ligeras de anticuerpo, fragmentos de unión a antígeno de cualquiera de los anteriores (por ejemplo, un Fragmento Fv (por ejemplo, Fv de cadena única (scFv), un Fv enlazado de disulfuro), un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2), un dominio variable único (por ejemplo, VH, VL), un dAb, y versiones modificadas de cualquiera de los anteriores (por ejemplo, modificado por la unión covalente de glicol de polialquileno (por ejemplo, giicol de polietileno, glicol de polipropileno, glicol de polibutileno) u otro polímero adecuado) . Ver, PCT/GB03/002804, presentada el 30 de Junio de 2003, que designa los Estados Unidos, (WO 2004/081026) considerando PEGilado de varios dominios variables y dAbs, métodos adecuados para preparar los mismos, vida media in vivo incrementada de los dominios variables únicos PEGilados y monómeros dAb y multímeros, PEGs adecuados, tamaños hidrodinámicos preferidos de PEGs, y tamaños hidrodinámicos preferidos de dominios variables únicos PEGilados y monómeros dAb y multímeros. La enseñanza completa de PCT/GB03/002804 (WO 2004/081026), incluyendo las porciones referidas arriba, se incorporan en la presente para referencia. En modalidades particulares, el ligando (por ejemplo, monómero dAb, dímero o multímero, formato específico dual, formato multiespecífico) se PEGila y une el Dominio 1 de TNFR 1 y opcionalmente inhibe una función de TNFR1 . Preferentemente, el ligando PEGilado inhibe la señalización a través de TNFR1. Preferentemente el ligando PEGilado une el Dominio 1 de TNFR1 con substancialmente la misma afinidad que el mismo ligando que no se PEGila. Por ejemplo, en una modalidad, el ligando es un monómero dAb PEGilado que une el Dominio 1 de TNFR1 e inhibe la señalización a través de TNFR1 , en donde el monómero dAb PEGilado une el Dominio 1 de TNFR1 con una afinidad que difiere de la afinidad de dAb en una forma no PEGilada por no más que un factor de aproximadamente 1000, preferentemente no más que un factor de aproximadamente 100, más preferentemente no más que un factor de aproximadamente 10, o con afinidad substancialmente sin cambiar relativa a la forma no PEGilada. Un ligando de acuerdo a la invención que une el Dominio 1 de membrana unida (transmembrana) y formas solubles de TNFR1 , pero no inhibe la unión de TNFa a las formas de receptor, puede ser útil para bloquear el Dominio 1 en el receptor unido de membrana (por ejemplo, para inhibir el agrupamiento de receptor y/o inhibir la señalización) y también para unir a la forma soluble para mejorar la vida media, particularmente cuando se une a PEG o como se describe de otra manera arriba. En una modalidad preferida, el ligando no une el Dominio 2 de membrana unida (transmembrana) y formas solubles de TNFR1. En otra modalidad preferida, el ligando no une el Dominio 3 de membrana unida (transmembrana) y formas solubles de TNFR1 . En otra modalidad preferida, el ligando no une el Dominio 2 o Dominio 3 de membrana unida (transmembrana) y formas solubles de TNFR1. En algunas modalidades, el ligando es un formato similar a IgG. Tales formatos tienen la estructura de cuatro cadenas convencional de una molécula IgG (2 cadenas pesadas y dos cadenas ligeras), en las cuales una o más de las regiones variables (VH y o VL) se han reemplazado con un dAb o dominio variable único de una especificidad deseada. Preferentemente, cada una de las regiones variables (2 regiones VH y 2 regiones V ) se reemplaza con un dAb o dominio variable único. Los dAb(s) o dominio(s) variable(s) único(s) que se incluyen en un formato similar a IgG pueden tener la misma especificidad o diferentes especificidades. En algunas modalidades, el formato similar a IgG es tetravalente y puede tener una, dos, tres o cuatro especificidades. Por ejemplo, el formato similar a IgG puede ser monoespecífico y comprende 4 dAbs que tienen la misma especificidad; biespecífico y comprende 3 dAbs que tienen la misma especificidad y otro dAb que tiene especificidad diferente; biespecifica y comprenden dos dAbs que tienen la misma especificidad y dos dAbs que tienen una especificidad común pero diferente; triespecífico y comprende dAbs, primero y segundo, que tienen la misma especificidad, un tercer dAbs con una especificidad diferente y un cuarto dAb con una especificidad diferente de los primeros, segundos, terceros dAbs; o tetraespecífico y comprende cuatro dAbs cada uno teniendo especificidad diferente. Fragmentos de unión al antígeno de formato similar a IgGs (por ejemplo, Fab, F(ab')2, Fab', Fv, scFv) pueden prepararse. Preferentemente, el formato similar a IgGs o fragmento de unión al antígenos del mismo no degradan TNFR1. Ligandos de acuerdo a la invención, incluyendo monómeros dAb, dímeros y trímeros, pueden enlazarse a una región Fc de anticuerpo, comprendiendo uno o ambos de los dominios CH2 y CH3, y opcionalmente una región de articulación. Por ejemplo, vectores codificando ligandos enlazados como una secuencia de nucleótidos única a una región Fc puede utilizarse para preparar tales polipéptidos. La ¡nvención proporciona además dímeros, trímeros y polímeros de los monómeros dAb arriba mencionados, de acuerdo con los siguientes aspectos de l a presente i nvención. Ligandos de acuerdo a l a invención pueden combinarse y/o formatearse en estructuras de múltiples ligandos de no inmunoglobulina para formar complejos multivalentes, que unen las moléculas objetivo con el mi smo antígeno, proporcionando así avidez superior. En algunas modalidades, al menos un domi nio variable une un antígeno para incrementar la vida media del multímero. Por ejemplo los receptores bacterianos naturales tales como SpA se han utilizado como andamios para el injerto de CDRs para generar ligandos que se unen específicamente a uno o más epítopos. Detalles de este procedimiento se describen en US 5,831 ,012. Otros andamios adecuados incluyen aquellos basados en fibronectin y afficuerpos. Detalles de procedimientos adecuados se describen en WO 98/58965. Otros andami os adecuados incluyen li pocali na y CTLA4, como se describe in van den Beuken ef al, J . M ol . Biol . (2001 ) 310, 591 -601 , y andamios tales como aquellos descritos en WO 00/69907 ( M edical Research Council), que se basan por ejemplo en la estructura de anillo de GroE L bacteriano u otros poli péptidos chaperones. Andamios de proteína pueden combinarse; por ejemplo, CDRs pueden i njertarse en un andamio CTLA4 y utilizarse j untos con domi ni os VH o V de i nmunogl obuli na para formar un ligando. Del mismo modo, fibronectina, lipocalina y otros andamios pueden combinarse. Ligandos duales y multiespecíficos Los inventores han descrito, en su solicitud de patente internacional copendiente WO 03/002609 así como también solicitud de patente UK no publicada copendiente 0230203.2, ligandos de inmunoglobulina específicos duales que comprenden dominios variables únicos de inmunoglobulina que tienen cada uno especificidades diferentes. Los dominios pueden actuar en competición entre sí o independientemente para unir antígenos o epítopos en moléculas objetivo. Ligandos específicos duales de acuerdo a la presente invención preferentemente comprenden combinaciones de dominios de cadena pesada y cadena ligera. Por ejemplo, el ligando específico dual puede comprender un dominio VH y un dominio VL, que pueden relacionarse juntos en la forma de un scFv. Además, los ligandos pueden comprender uno o más dominios CH o CL. Por ejemplo, los ligandos pueden comprender un dominio CH1 , CH2 o CH3, y/o un dominio CL, dominios CD1 , CD2, Cµ3 o Cµ4, o cualquier combinación de los mismos. Un dominio de región de articulación también puede incluirse. Tales combinaciones de dominios pueden, por ejemplo, imitar anticuerpos naturales, tales como IgG o IgM , o fragmentos de los mismos, tales como moléculas Fv, scFv, Fab o F(ab')2. Otras estructuras, tal como un brazo único de una molécula IgG comprendiendo dominios VH, VL, CH1 y CL, se contemplan. En una modalidad preferida de la invención, las regiones variables se seleccionan de los repertorios de gen V de dominio único. Generalmente, el repertorio de dominios de anticuerpo único se despliega en la superficie de bacteriófago filamentoso. En una modalidad preferida cada domi nio de anticuerpo único se sel ecciona por unión de un repertorio de fago a antígeno. En una modalidad preferida de la invención cada domini o variable único puede seleccionarse para unión a su antigeno obj etivo o epítopo en la ausencia de una regi ón variabl e complementaria , en una modalidad alternativa, los dominios variables únicos pueden seleccionarse para unión a su antígeno objetivo o epítopo en la presencia de una región variable complementaria. De esta manera el primer domi nio variable único puede selecci onarse en la presencia de un tercer dominio variable complementario, y el segundo dominio variable puede seleccionarse en la presencia de un cuarto dominio variable complementario. El tercer o cuarto domi nio vari able complementari o puede ser el dominio variable cognado teniendo la misma especificidad que el dominio único que se prueba, o un dominio complementario no cognado, tal como un dominio variable "de i mitación". Preferentemente, el ligando específico dual de la i nvención comprende solamente dos dominios variables aunque varios tales ligandos pueden incorporarse juntos en la misma proteína, por ejempl o, dos de tales ligandos pueden incorporarse en una I gG o una inmunoglobulina multimérica, tal como IgM . Alternativamente, en otro modalidad una pluralidad de ligandos específicos duales se combi nan para crear una molécula tetra-específica. Se apreciará por un experto en la materia que las regiones variables pesadas y ligeras de un ligando específico dual producidas de acuerdo a el método de la presente invención pueden estar en la misma cadena de polipéptido, o alternativamente, en diferentes cadenas de polipéptido. En el caso que las regiones variables están en diferentes cadenas de polipéptido, pueden entonces enlazarse a través de un enlazador, general mente un enlazador flexible (tal como una cadena de polipéptido), un grupo de enlace químico, o cualquier otro método conocido en la materia. En una primer configuración, la presente invención proporciona una mejora adicional en ligandos específicos duales como se desarrolla por los presentes inventores, en los cuales una especificidad del ligando se dirige hacia una proteína o polipéptido presente in vivo en un organismo que puede actuar para incrementar la vida media del ligando por unión a él . De acuerdo con lo anterior, en un primer aspecto, se proporciona un ligando específico dual comprendiendo un primer dominio variable único de inmunoglobulina teniendo una especificidad de unión a un pri mer antígeno o epítopo y un segundo dominio variable único complementario de inmunoglobulina teniendo una actividad de unión a un segundo antígeno o epítopo, en donde uno o ambos de dichos antígenos o epítopos actúa para i ncrementar la vida media del ligando in vivo y en donde dichos dominios , primero y segundo, carecen mutuamente de dominios complementarios que comparten la misma especificidad, siempre que dicho ligando específico dual no consista de un dominio VH anti-HSA y un domino V? anti-ß galactosidasa. Preferentemente, ninguno de los dominios variables, primero y segundo, se une a albúmina de suero de humano (HSA). Antígenos o epítopos que incrementan la vida media de un ligando como se describe en la presente están ventajosamente presentes en proteínas o polipéptidos encontrados en un organismo in vivo. Ejemplos incluyen proteínas de matriz extracelular, proteínas sanguíneas, y proteínas presentes en varios tejidos en el organismo. Las proteínas actúan para reducir la velocidad de despeje de ligando de la sangre, por ejemplo, al actuar como agentes voluminosos, o al sujetar el ligando a un sitio deseado de acción. Ejemplos de antígenos/epítopos que incrementan la vida media in vivo se dan en el Anexo 1 abajo. Vida media incrementada es útil en aplicaciones in vivo de inmunoglobulinas, especialmente anticuerpos y más especialmente fragmentos de anticuerpo de tamaño pequeño. Tales fragmentos (Fvs, Fvs, Fabs, scFvs, dAbs enlazados de disulfuro) sufren de despeje rápido del cuerpo; de esta manera, aunque son capaces de alcanzar la mayoría de las partes del cuerpo rápidamente, y producirse rápidamente y manejarse fácilmente, sus aplicaciones in vivo se han limitado por su persistencia solamente breve in vivo. La invención resuelve este problema al proporcionar vida media incrementada de los ligandos in vivo y consecuentemente tiempos de persistencia más largos en el cuerpo de la actividad funcional del ligando.

Métodos para análisis farmacocinético y determinación de la vida media de ligando serán familiares para aquellos expertos en l a materia. Detalles encontrados en Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists y en Peters ef al, Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach ( 1996). También se hace referencia a " Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, publicado por Marcel Dekker, 2nd Rev. ex edition (1982), que describe los parámetros farmacocinéticos tales como las vidas medias de alfa t y beta t y área bajo la curva (AUC) . Las vidas medias (alta t1/2 y beta t1/2) y AUC pueden determinarse de una curva de concentración de suero de ligando contra tiempo. El paquete de análisis WinNonlin (disponible de Pharsight Corp. , Mountain View, CA94040, USA) puede utilizarse, por ejemplo, para modelar la curva. En una primer fase (la fase alfa) el ligando está experimentando principalmente la distribución en el paciente, con alguna eliminación. Una segunda fase (fase beta) es la fase terminal cuando el ligando se ha distribuido y la concentración de suero está disminuyendo a medida que ei ligando se despeja del paciente. La vida media alfa t es la vida media de la primer fase y la vida media beta t es la vida media de la segunda fase. De esta manera, ventajosamente, la presente invención proporciona un ligando o una composición comprendiendo un ligando de acuerdo a la invención teniendo una vida media ta en el rango de 15 minutos o más. En una modalidad, el extremo inferior del rango es de 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 1 0 horas, 1 1 horas o 12 horas. Además, o alternativamente, un ligando o composición de acuerdo a la invención tendrá una vida media ta en el rango de hasta e incluyendo 12 horas. En una modalidad, el extremo superior del rango es 1 1 , 1 0, 9, 8, 7, 6 o 5 horas. Un ejemplo de un rango adecuado es 1 a 6 horas, 2 a 5 horas o 3 a 4 horas. Ventajosamente, la presente invención proporciona un ligando o una composición comprendiendo un ligando de acuerdo a la invención teniendo una vida media tß en el rango de 2.5 horas o más. En una modalidad, el extremo inferior del rango es 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 10 horas, 1 1 horas, o 12 horas, además, o alternativamente, un ligando o composición de acuerdo a la i nvención tiene una vida media tß en el rango de hasta e incluyendo 21 días. En una modalidad , el extremo superior del rango es 12 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 5 días, 1 0 días, 1 5 días o 20 días. Ventajosamente un ligando o composición de acuerdo a la invención tendrá una vida media tß en el rango de 12 a 60 horas. E n una modalidad adicional, estará en el rango de 12 a 48 horas. E n una modalidad adicional aún, estará en el rango de 12 a 26 horas. Además, o alternativamente al criterio anterior, la presente invención proporciona un ligando o una composición comprendiendo un ligando de acuerdo a la invención teniendo un valor AUC (área bajo la curva) en el rango de 1 mg.min/ml o más. En una modalidad, el extremo inferior del rango es 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 o 300 mg. mi n/ml . Además, o alternativamente, un ligando o composición de acuerdo a la invención tiene una AUC en el rango de hasta 600 mg.min/ml . En una modalidad, el extremo superior del rango es 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 o 50 mg.min/ml. Ventajosamente un ligando de acuerdo a la invención tendrá una AUC en el rango seleccionado del grupo consistiendo de los siguientes: 15 a 150 mg. min/ml , 15 a 100 mg.min/ml , 15 a 75 mg. min/ml , y 15 a 50mg.min/ml. En una primer modalidad, el ligando específico dual comprende dos dominio variables complementarios, es decir dos dominios variables que, en su ambiente natural, son capaces de operar juntos como un par cognado o grupo aún si en el contexto de la presente invención se unen por separado a los epítopos cognados. Por ejemplo, los dominios variables complementarios pueden ser dominios variables de cadena pesada y cadena ligera de inmunoglobulina (VH y VL). Los dominios VH y VL se proporcionan ventajosamente por fragmentos de anticuerpo scFv o Fab Dominios variables pueden enlazarse juntos para formar ligandos multivalentes mediante, por ejemplo: provisión de una región de articulación en el término C de cada dominio V y enlace de disulfuro entre cisteínas en las regiones de articulación; o provisión de dAbs cada uno con una cisteína en el término C del dominio, las cisteínas enlazándose juntas por disulfuro; o producción de V-CH & V-CL para producir un formato Fab; o uso de enlazadores de péptido (por ejemplo enlazadores Gly4Ser tratados en la presente abajo) para producir dímeros, trímeros y multímeros adicionales.

Los inventores han encontrado que el uso de dominios variables complementarios permite que las dos superficies de dominio se empaquen juntas y se secuestren del solvente. Además, los dominios complementarios son capaces de estabilizarse entre sí. Además, permite la creación de anticuerpos IgG específicos duales sin las desventajas de hibridomas híbridos como se utilizan en la técnica anterior, o la necesidad de formar cadenas pesadas o ligeras en las interfases de sub-unidad. Los ligandos específicos duales del primer aspecto de la presente invención tienen al menos un par VH/VL. Una IgG biespecífica de acuerdo a esta invención por lo tanto comprenderá dos tales pares, un par en cada brazo de la molécula en forma de Y. A pesar de diacuerpos o anticuerpos biespecíficos convencionales, por lo tanto, donde la proporción de cadenas utilizadas es determinante del éxito de la preparación de las mismas y conduce a dificultades prácticas, los ligandos específicos duales de la invención están libres de campos de equilibrio de cadena. El desequilibrio de cadena en anticuerpos bi-específicos convencionales resulta de la asociación de dos diferentes cadenas V con dos diferentes cadenas VH, donde la cadena VL 1 junto con la cadena VH 1 es capaz de unirse al antígeno o epítopo 1 y la cadena V 2 junto con la cadena VH 2 es capaz de unirse al antígeno o epítopo 2 y los dos pares correctos están de alguna manera enlazados entre si. De esta manera, solamente cuando la cadena V 1 se empareja con la cadena VH 1 y la cadena V 2 se empareja con la cadena VH 2 en una molécula única se crea bi-especificidad.

Tales moléculas bi-específicas pueden crearse en dos maneras diferentes. Primero, pueden crearse por asociación de dos pares VH/VL existentes que se unen cada uno a diferente antígeno o epítopo (por ejemplo, en una IgG bi-específica). En este caso los pares VH/VL deben venir todos juntos en una proporción 1 : 1 para crear una población de moléculas de las cuales todas son bi-específicas. Esto nunca ocurre (aún cuando el dominio CH complementario se aumenta por formación de "protuberancias en agujeros" conduciendo a una mezcla de moléculas bi-específicas y moléculas que solamente son capaces de unirse a un antígeno o epítopo pero no a la otra. La segunda manera de crear un anticuerpo bi-específico es por la asociación simultánea de dos diferentes cadenas VH con dos diferentes cadenas V (por ejemplo en un diacuerpo bi-específico). En este caso, aunque existen tendencias a ser una preferencia para la cadena VL 1 para emparejarse con la cadena VH 1 y cadena VL 2 para emparejarse con cadena VH 2 (que puede mejorarse por formación de "protuberancias en agujeros" de los dominios V y VH), este emparejamiento nunca se logra en todas las moléculas, conduciendo a una formulación mezclada mediante la cual los pares incorrectos ocurren, que son incapaces de unirse a ya sea antígeno o epítopo. Anticuerpos bi-específicos construidos de acuerdo al planteamiento de ligando específico dual de acuerdo al primer aspecto de la presente invención superan todos estos problemas debido a que la unión a antígeno o epítopo 1 reside entro del dominio VH o VL y la unión a antígeno o epítopo 2 reside con el dominio complementario VL o VH, respectivamente. Ya que los dominios VH y VL se emparejan en una base 1 : 1 todos los pares VH/VL serán bi-específicos y de esta manera todos los formatos construidos utilizando estos pares VH/VL (Fv, scFvs, Fabs, minicuerpos, IgGs etc) tendrán 100% actividad bi-específica. En el contexto de la presente invención, los "epítopos" primero y segundo, se entienden que son epítopos que no son los mismos y no se unen por un ligando monoespecífico único. En la primer configuración de la invención, están ventajosamente en diferentes antígenos, uno de los cuales actúa para incrementar la vida media del ligando in vivo. Del mismo modo, los antígenos, primero y segundo, ventajosamente no son los mismos. Los ligandos específicos duales de la invención no i ncluyen ligandos como se describe en WO 02/02773. De esta manera, los ligandos de la presente invención no comprenden pares VH/V complementarios que unen cualquiera o más antígenos o epítopos co-operativamente. En su lugar, los ligandos de acuerdo al primer aspecto de la invención comprenden un par complementario VH/VL, en donde los V tienen diferentes especificidades. Además, los ligandos de acuerdo al primer aspecto de la invención comprenden pares VH/V complementarios teniendo diferentes especificidades para epítopos o antígenos estructuralmente relacionados. Epitopos o antígenos estructuralmente relacionados son epítopos o antígenos que poseen suficiente similitud estructural a unirse por un par complementario VH/VL convencional que actúa en una manera cooperativa para unir un antígeno o epítopo; en el caso de epítopos estructuralmente relacionados, los epítopos son suficientemente similares en estructura que se "ajustan" en la misma cavidad de unión formada en el sitio de unión al antígeno del dímero VH/VL. En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un ligando comprendiendo un primer dominio variable de inmunoglobulina teniendo una primera especificidad de unión al antígeno o epítopo y un segundo dominio variable de inmunoglobulina teniendo una segunda especificidad de unión al antígeno o epitopo en donde uno o ambos de dichos dominios variables, primero y segundo, se unen a un antígeno que incrementa la vida media del ligando in vivo, y los dominios variables no son complementarios a otros. En una modalidad, unión a través de un dominio variable modula la unión del ligando a través del segundo dominio variable. En esta modalidad, los dominios variables pueden ser, por ejemplo, pares de dominios VH o pares de dominios V . Unión de antígeno al primer sitio puede modular, tal como mejorar o inhibir, la unión de un antígeno en el segundo sitio. Por ejemplo, unión al primer sitio al menos parcialmente inhibe la unión de un antígeno en un segundo sitio. En tal modalidad, el ligando puede por ejemplo mantenerse en el cuerpo de un organismo sujeto in vivo a través de unión a una proteína que incrementa la vida media del ligando hasta el momento que se une al segundo antígeno objetivo y desasocia de la proteína que incrementa la vida media. La modulación de unión en el contexto anterior se logra como una consecuencia de la proximidad estructural de los sitios de unión al antígeno relativos entre sí. Tal proximidad estructural puede lograrse por la naturaleza de los componentes estructurales enlazando los dos o más sitios de unión al antígeno, por ejemplo por la provisión de un ligando con una estructura relativamente rígida que mantiene los sitios de unión al antígeno en proximidad cercana. Ventajosamente, los dos o más sitios de unión al antígeno están en proximidad físicamente cercana entre sí de manera que un sitio modula ia unión de antígeno en otro sitio por un proceso que incluye estorbo estérico y/o cambios conformacionales dentro de la molécula de inmunoglobulina. Los dominios de unión al antígeno, primero y segundo, pueden asociarse ya sea covalentemente o no covalentemente. En el caso que los dominios se asocien covalentemente, entonces la asociación puede mediarse, por ejemplo, mediante enlaces de disulfuro o por un enlazador de polipéptido tal como (Gly4Ser)n, donde n=de 1 a 8, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o 7. En el caso que los dominios variables se seleccionen de repertorios de gen V seleccionados por ejemplo, utilizando tecnología de despliegue de fago como se describe en la presente, entonces estos dominios variables pueden comprender una región de estructura universal, de manera que pueden reconocerse por un ligando genérico específico como se define en la presente. El uso de estructuras universales, li gandos genéricos y lo similar se describe en WO 99/20749. En la presente invención, referencia a despliegue de fago incluye el uso de tanto fago y/o fagemidos. Donde los repertorios de gen V se utilizan la variación en secuencia de polipéptidos se ubica preferentemente dentro de los ciclos estructurales de los dominios variables. Las secuencias de polipéptidos de cualquier dominio variable pueden alterarse por arrastre de ADN o por mutación para mejorar la interacción de cada dominio variable con su par complementario. El arrastre de ADN se conoce en la materia y se enseña, por ejemplo, por Stemmer, Nature 370:389-391 (1994) y Patente de EE. UU. No. 6,297,053, ambas de las cuales se incorporan en la presente para referencia. Otros métodos de mutagénesis se conocen bien por aquellos expertos en la materia. En una modalidad preferida de la invención el 'ligando específico dual' es un fragmento Fv de cadena única. En una modalidad alternativa de la invención, el 'ligando específico dual' consiste de una región Fab de un anticuerpo. El término "región Fab" incluye una región similar a Fab donde los dos dominios VH o dos VL se utilizan. Las regiones variables pueden derivarse de anticuerpos dirigidos contra antígenos o epítopos objetivos. Alternativamente pueden derivarse de un repertorio de dominios de anticuerpo únicos tales como aquellos expresados en la superficie de bacteriófago filamentoso. La selección puede realizarse como se describe abajo.

En un aspecto adicional , la presente invención proporciona una o más moléculas de ácido nucleico codificando al menos un ligando específico dual como se define en la presente. El ligando específico dual puede codificarse en una molécula de ácido nucleico única; alternativamente, cada dominio puede codificarse por una molécula de ácido nucleico separada. Donde el ligando se codifica por una molécula de ácido nucleico única, los dominios pueden expresarse como un polipéptido de fusión, en la manera de una molécula ScFv, o pueden expresarse por separado y enlazarse subsiguientemente juntos, por ejemplo, utilizando agentes de enlace químicos. Los ligandos expresados de ácidos nucleicos separados se enlazarán juntos por medios apropiados. El ácido nucleico puede codificar además una secuencia de señal para exportación de los polipéptidos de una célula huésped en expresión y puede fusionarse con un componente de superficie de una partícula de bacteriófago filamentoso (u otro componente de un sistema de despliegue de selección) en expresión. En un aspecto adicional la presente invención proporciona un vector comprendiendo ácido nucleico codificando un ligando específico dual de acuerdo a la presente invención. En todavía otro aspecto, la presente invención proporciona una célula huésped transfectada con un vector codificando un ligando específico dual de acuerdo a la presente invención. Expresión de tal un vector puede configurarse para producir, por ejemplo en la superficie de una partícula de bacteriófago, domini os variables para selección. Esto permite la selección de regiones variables desplegadas y de esta manera la selección de 'ligandos específicos duales' utilizando el método de la presente invención. La presente invención proporci ona además un equi po comprendiendo al menos un ligando específico dual de acuerdo a la presente i nvención. En un tercer aspecto, la invención proporciona un método para produci r un ligando comprendiendo un primer domi nio variable único de inmunoglobuli na teniendo una pri mer especificidad de unión y un segundo dominio variable único de inmunoglobulina teniendo una segunda (diferente) especificidad de unión, una o ambas de las especifici dades de unión siendo específicas para un antígeno que incrementa la vida media del ligando in vivo, el método comprendiendo las etapas de: a) seleccionar un primer dominio variable por su habilidad para uni rse a un pri mer epítopo, b) seleccionar una segunda región variable por su habilidad para unirse a un segundo epítopo, c) combinar los dominios variables; y d) seleccionar el ligando por su habilidad para unirse a dicho primer epítopo y a dicho segundo epítopo. El ligando puede unirse a los epítopos, primero y segundo, ya sea simultáneamente o, donde existe competencia entre los dominios de unión para unión al epítopo, la unión de un domi nio puede resultar en la unión de otro dominio a su epítopo cognado. En una modalidad, por lo tanto, la etapa (d) anterior requiere unión simultánea a ambos epítopos, primero y segundo (y posiblemente más); en otro modalidad, la unión de los epítopos, primero y segundo, no es simultánea. Los epítopos están preferentemente en antígenos separados. Ligandos ventajosamente comprenden combinaciones VH/V , o combinaciones VH/VH o VL/VL de dominio variable de inmunoglobulinas, como se describe arriba. Los ligandos pueden comprender además dominios VHH camélidos, siempre que el dominio VHH que es específico para un antígeno que incrementa la vida media del ligando in vivo no una la lisozima blanca de huevo de gallina (HEL), alfa-amilasa pancreática porcina o NmC-A; hcg, tinte azo RR6 enlazado a BSA o células S. mutans HG982, como se describe en Conrath ef al, (2001 ) JBC 276:7346-7350 y WO99/23221 , ninguna de las cuales describe el uso de una especificidad para un antigeno que incrementa la vida media para incrementar la vida media del ligando in vivo. En una modalidad, dicho primer dominio variable se selecciona para unión a dicho primer epítopo en ausencia de un dominio variable complementario. En una modalidad adicional , dicho primer dominio variable se selecciona para unión a dicho primer epítopo/antígeno en la presencia de un tercer dominio variable en el cual dicho tercer dominio variable es diferente de dicho segundo dominio variable y es complementario al primer dominio. De manera similar, el segundo dominio puede seleccionarse en la ausencia o presencia de un dominio variable complementario. Los antígenos o epítopos objetivo por los ligandos de la invención, además de la proteína que mejora la vida media, pueden ser cualquier antígeno o epítopo pero ventajosamente es un antígeno o epítopo que se tiene como objetivo con beneficio terapéutico. La invención proporciona ligandos, incluyendo conformación abierta, conformación cerrada y ligandos de monómero dAb aislados, específicos para cualquier objetivo, particularmente aquellos objetivos identificados además en la presente. Tales objetivos pueden ser, o ser parte de, polipéptidos, proteinas o ácido nucleicos, que pueden ocurrir de manera natural o sintéticos. En este aspecto, el ligando de la invención puede unir el epítopo o antígeno y actuar como un antagonista o combatiente (por ejemplo, combatiente receptor EPO). Un experto en la materia apreciara que la elección es grande y variada. Pueden ser, por ejemplo, proteínas de animal o humano, citoquinas, receptores citoquina, co-factores de enzimas para enzimas o proteínas de unión al ADN. Citoquinas y factores de crecimiento adecuados incluyen pero no se limitan a: ApoE, Apo-SAA, BDNF, Cardiotrofin-1 , EGF, receptor EGF, ENA-78, Eotaxin, Eotaxin-2, Exodus-2, EpoR, FGF-ácido, FGF-básico, factor de crecimiento de fibroblasto-10, ligando FLT3, Fractalquina (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-ß1 , insulina, IFN-?, IGF-I , IGF-I I , I L-1 a, I L-1 ß, I L-2, I L-3, I L-4, IL-5, IL-6, I L-7, IL-8 (72 a. a.), I L-8 (77 a. a.) , I L-9, I L-10, I L-1 1 , I L-12, I L-13, I L-15, I L-16, I L-17, I L-18 (I GI F) , Inhibin a, I nhibi n ß, I P-IO, factor de crecimiento de queratinocito-2 (KGF-2), KGF, Leptin, LI F, Linfotactin, substancia inhibidora Muleriana, factor inhibidor de colonia de monocito, proteína atrayente de monocito, M-CSF, M DC (67 a. a.), MDC (69 a. a.), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, M DC (67 a. a.), M DC (69 a. a.), M IG, M I P-1 a, MIP-1 ß, M I P-3a, M I P-3ß, M DP-4, factor inhibidor progenitor mieloide-1 (M PI F-1 ), NAP-2, Neurturina, factor de crecimiento nervioso, ß-NGF, NT-3, NT-4, Oncostatin M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF 1 a, SDF1 ß, SCF, SCGF, factor de célula germinal (SCF), TARC, TGF-a, TGF-ß, TGF-ß2, TGF-ß3, factor de necrosis de tumor (TNF), TNF-a, TNF-ß, receptor TNF I , receptor TNF I I, TNI L-1 , TPO, VEGF, receptor VEGF 1 , receptor VEGF 2, receptor VEGF 3, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-ß, GRO-?, HCC1 , 1 -309, HER 1 , HER 2, HER 3 y HER 4. Receptores de citoquina incluyen receptores para las citoquinas anteriores. Se apreciará que esta lista es por ningún medio exhaustiva. En una modalidad de la invención, los dominios variables se derivan de un anticuerpo respectivo dirigido contra el antígeno o epítopo. En una modalidad preferida los dominios variables se derivan de un repertorio de dominios de anticuerpo variables únicos.

En una segunda configuración, la presente i nvención proporciona ligandos multiespecíficos. De acuerdo a la presente invención el término "ligando multiespecífico" se refiere a un ligando que posee más de una especificidad de unión al epítopo como se define en la presente. Generalmente, el ligando multiespecífico comprende dos o más dominios de unión al epítopo. Domi nios de unión al epítopo de acuerdo a la presente invención comprenden un andamio de proteina y sitios de i nteracción de epítopo (que están ventajosamente en la superficie del andami o de proteína) . De acuerdo a la presente invención, ventajosamente, cada domi nio de unión al epítopo es de una diferente especificidad de unión al epitopo. En el contexto de la presente invención, "epítopos", primero y segundo, se entiende que son epítopos que no son los mismos y no se unen por un ligando monoespecífico único. Pueden estar en diferentes antígenos o en el mismo antígeno, pero separados por una distancia suficiente que no forman una entidad única que podría uni rse por un par de unión VH/VL monoespecífico único de un anticuerpo convencional . Experimentalmente, si ambos de los dominios variables individuales en forma de anticuerpo de cadena única (anticuerpos de dominio o dAbs) se compiten por separado por un li gando VH/VL monoespecífico contra dos epítopos entonces aquellos dos epítopos no se separan suficientemente para considerarse epítopos separados de acuerdo a la presente invención. De acuerdo a la presente invención, ventajosamente, cada dominio de unión al epítopo comprende un domi nio variable de inmunoglobulina. M ás ventaj osamente, cada domi nio variable de inmunoglobulina será ya sea un dominio de cadena ligera variable (VL) O a dominio de cadena pesada variable VH. En la segunda configuraci ón de la presente invención, los domi nios de inmunoglobulina cuando están presentes en un ligando de acuerdo a la presente i nvención no son complementarios, es decir no se asocian para formar un sitio de unión al antígeno VH/VL. De esta manera, ligando multiespecíficos como se define en la segunda configuración de la invención comprenden dominios de inmunoglobulina del mismo subtipo, es decir ya sea domi nios de cadena ligera variables (VL) o dominios de cadena pesada variables (VH). Además, donde el ligando de acuerdo a la invención está en la conformación cerrada, los dominios de inmunoglobulina pueden ser del tipo VHH camélido. En una modalidad alternativa, el(los) ligando(s) de acuerdo a la invención no comprenden un dominio VHH camélido. Más particularmente, el(los) ligando(s) de la invención no comprenden uno o más residuos de aminoácido que son específicos para dominios VHH camélidos en comparación con dominios VH de humano.

Ventajosamente, los dominios variables únicos se derivan de anticuerpos seleccionados para actividad de unión contra diferentes antígenos o epítopos. Por ejemplo, los dominios variables pueden aislarse al menos en partes por inmunización de humano. Métodos alternativos se conocen en la materia, incluyendo aislamiento de bibliotecas de anticuerpo de humano y síntesis de genes de anticuerpo artificiales. Los dominios variables ventajosamente unen superantígenos, tales como proteína A o proteína L. Unión a superantígenos es una propiedad de dominios variables de anticuerpo correctamente doblado, y permite que tales dominios se aislen de, por ejemplo, bibliotecas de dominios mutantes o recombinantes. Dominios de unión al epítopo pueden también basarse en andamios de proteína o estructuras diferentes a dominios de inmunoglobulina. Por ejemplo los receptores bacterianos naturales tal como SpA se han utilizado como andamios para el injerto de CDRs para generar ligandos que se unen específicamente a uno o más epítopos. Detalles de este procedimiento se describen en US 5,831 ,012. Otros andamios adecuados incluyen aquellos basados en fibronectina y afficuerpos. Detalles de procedimientos adecuados se describen en WO 98/58965. Otros andamios adecuados incluyen lipocalina y CTLA4, como se describe en van den Beuken et al, J. Mol . Biol . (2001 ) 310, 591 -601 , y andamios tales como aquellos descritos en WO0069907 (Medical Research Council), que se basan por ejemplo en la estructura anular de GroEL bacteriano u otros polipéptidos chaperones. Andamios de proteína pueden combinarse; por ejemplo, CDRs pueden injertarse en un andamio CTLA4 y utilizarse junto con dominios VH o VL de inmunoglobulina para formar un ligando multivalente. Del mismo modo, fibronectina, lipocalina y otros andamios pueden combinarse. En una modalidad, el ligando multiespecífico comprende un dominio de unión al epítopo que comprende las CDRs de un dominio de inmunoglobulina único (dAb) que une TNFR1 descrito en la presente injertad en un andamio de proteína adecuado o estructura.

Se apreciará por un experto en la materia que los dominios de unión al epítopo de un ligando multiespecífico de conformación cerrada producido de acuerdo al método de la presente invención puede estar en la misma cadena de polipéptido, o alternativamente, en diferentes cadenas de polipéptido. En el caso que las regiones variables estén en diferentes cadenas de polipéptido, entonces pueden enlazarse a través de un enlazador, ventajosamente un enlazador flexible (tal como una cadena de polipéptido), un grupo de enlace químico, o cualquier método conocido en la materia. Los dominios de unión al epítopo, primero y segundo, pueden asociarse ya sea covalentemente o no covalentemente. En el caso que los dominios se asocien covalentemente, entonces la asociación puede mediarse por ejemplo mediante enlaces de disulfuro. En ciertas modalidades de la segunda configuración de la invención, los epítopos pueden desplazarse entre sí en unión. Por ejemplo, un primer epítopo puede estar presente en un antígeno que, en unión a su primer dominio de unión cognado, causa estorbo estérico de un segundo dominio de unión, o un cambio conformacional en el mismo, que desplaza el epitopo unido al segundo dominio de unión. Ventajosamente, la unión se reduce por 25% o más, ventajosamente 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más, y preferentemente hasta 100% o casi así, de manera la unión se inhibe completamente. Unión de epítopos puede medirse por ensayos de unión al antígeno convencionales, tal como ELISA, por técnicas a base de fluorescencia, incluyendo FRET, o por técnicas tales como resonancia de plasmón de superficie que miden la masa de moléculas. Además, la invención proporciona un ligando multiespecífico de conformación cerrada comprendiendo un primer dominio de unión al epítopo teniendo una primer especificidad de unión al epítopo y un segundo dominio de unión al epítopo no complementario teniendo una segunda especificidad de unión al epítopo, en donde las especificidades de unión, primera y segunda, compiten por unión al epítopo de manera que el ligando multiespecífico de conformación cerrada puede no unir ambos epitopos simultáneamente. Ligandos multiespecíficos de conformación cerrada de la invención no incluyen ligandos como se describe en WO 02/02773. De esta manera, los ligandos de la presente invención no comprenden pares VH/VL complementario que unen cualquiera de uno o más antígenos o epítopos co-operativamente. Sin embargo, los ligandos de acuerdo a la invención preferentemente comprenden pares VH-VH o VL-VL no complementarios. Ventajosamente, cada dominio VH o V en cada par VH-VH o V -VL tiene una especificidad diferente de unión al epítopo, y los sitios de unión al epítopo se ordenan así que la unión de un epítopo en un sitio compite con la unión de un epítopo en otro sitio. Ventajosamente, el ligando multiespecífico de conformación cerrada puede comprender un primer dominio capaz de unión a molécula objetivo, y un segundo dominio capaz de unión a molécula o grupo que extiende la vida media del ligando. Por ejemplo, l a molécula o grupo puede ser un agente volumi noso, tal como HSA o una proteína de matriz celular. Como se utiliza en la presente, la frase "molécula o grupo que extiende la vida media de un ligando" se refiere a una molécula o grupo químico que, cuando se une por un ligando específico dual como se descri be en la presente i ncrementa la vida media in vivo de tal ligando específico dual cuando se administra a un animal, relativo a un ligando que no une esa molécula o grupo. Ejemplos de moléculas o grupos que extienden la vida media de un ligando se descri ben en la presente abajo. En una modalidad preferida, el ligando multiespecífico de conformación cerrada puede ser capaz de unión de la molécula objetivo solamente en desplazamiento de la molécula o grupo que mejora la vida medi a. De esta manera, por ejemplo, un ligando multiespecífi co de conformación cerrada se mantiene en circulación en la corriente sanguínea de un sujeto por una molécula voluminosa tal como HSA. Cuando una molécula objetivo se encuentra, competición entre los domi nios de unión del ligando multiespecífico de conformación cerrada resulta en desplazamiento de HSA y unión del objetivo. En una modalidad preferida de la segunda configuración de la invención, los domini os de unión al epítopo son regiones variables de i nm unoglobulina y se seleccionan de repertorios de gen V de domi nio único. Generalmente el repertorio de dominios de anticuerpo únicos se despliega en la superficie de bacteriófago filamentoso. En una modalidad preferida cada domi nio de anticuerpo único se selecciona por unión de un repertorio de fago a antígeno. En una modalidad preferida de la segunda configuración de la invención, los dominios de unión al epítopo son regiones variables de inmunoglobulina y se seleccionan de repertorios de gen V de dominio único. Generalmente el repertorio de dominios de anticuerpo únicos se despliega en la superficie de bacteriófago filamentoso. En una modalidad preferida cada dominio de anticuerpo único se selecciona por unión de un repertorio de fago a antígeno. En un aspecto, el ligando multiespecífico comprende al menos dos dominios variables no complementarios. Por ejemplo, los ligandos pueden comprender un par de dominios VH o un par de dominios V . Ventajosamente, los dominios son de origen no camélido; preferentemente son dominios de humano o comprenden regiones de estructura de humano (FWs) y una o más CDRs heterólogas. CDRs y regiones de estructura son aquellas regiones de un dominio variable de inmunoglobulina como se define en la base de datos Kabat de Secuencias de Proteínas de I nterés Inmunológico. Las regiones de estructura de humano preferidas son aquellas codificadas por segmentos de gen de línea germinal DP47 y DPK9. Ventajosamente, FW1 , FW2 y FW3 de un dominio VH o V tienen la secuencia de FW1 , FW2 o FW3 de DP47 o DPK9. Las estructuras de humano pueden opcionalmente contener mutaciones, por ejemplo hasta aproximadamente 5 cambios de aminoácido o hasta aproximadamente 10 cambios de aminoácido colectivamente en las estructuras de humano utilizadas en los ligandos de la invención. Los dominios variables en los ligandos multiespecíficos de acuerdo a la segunda configuración de la invención pueden ordenarse en una conformación abierta o una cerrada; es decir, pueden ordenarse de manera que los dominios variables pueden unir sus ligandos cognados independientemente y simultáneamente, o de manera que solamente uno de los dominios variables puede unir su ligando cognado en cualquier momento. Los inventores han realizado que bajo ciertas condiciones estructurales, dominios variables no complementarios (por ejemplo dos dominios variables de cadena ligera o dos variables de dominio de cadena pesada) pueden estar presentes en un ligando de manera que la unión de un primer epítopo a un primer dominio variable inhibe la unión de un segundo epítopo a un segundo dominio variable, aún cuando tales dominios no complementarios no operan juntos como un par cognado. Ventajosamente, el ligando comprende dos o más pares de dominios variables; es decir, comprende al menos cuatro dominios variables. Ventajosamente, los cuatro dominios variables comprenden estructuras de origen humano. En una modalidad preferida, las estructuras de humano son idénticas a aquellas de secuencias de línea germinal de humano. Los presentes inventores consideran que tales anticuerpos serán de uso particular en ensayos de unión al ligando para usos terapéuticos y otros.

En una modalidad de la segunda configuración de la invención, los dominios variables se derivan de un anticuerpo dirigido contra el primer y/o segundo antígeno o epítopo. En una modalidad preferida los dominios variables se derivan de un repertorio de dominios de anticuerpo variables únicos. En un ejemplo, el repertorio es un repertorio que no se crea en un animal o un repertorio sintético. En otro ejemplo, los dominios variables únicos no se aislan (al menos en parte) por inmunización animal. De esta manera, los dominios únicos pueden aislarse de una biblioteca pura. La segunda configuración de la invención, en otro aspecto, proporciona un ligando multi-específico comprendiendo un primer dominio de unión al epítopo teniendo una primer especificidad de unión al epítopo y un segundo dominio de unión al epítopo no complementario teniendo una segunda especificidad de unión al epítopo. Las especificidades de unión, primera y segunda, pueden ser las mismas o diferentes. En un aspecto adicional , la presente invención proporciona un ligando multi-específico de conformación cerrada comprendiendo un primer dominio de unión al epitopo teniendo una primer especificidad de unión al epítopo y un segundo dominio de unión al epítopo no complementario teniendo una segunda especificidad de unión al epítopo en donde las especificidades de unión, primera y segunda, son capaces de competir por unión al epítopo de manera que el ligando multiespecífico de conformación cerrada no puede unir ambos epítopos simultáneamente.

En un aspecto aún adicional , la invención proporciona ligandos de conformación abierta com prendiendo dominios de unión no complementarios, en donde los dominios son específicos para un diferente epítopo en el mismo objetivo. Tales ligandos se unen a objetivos con avidez incrementada. De manera similar, la invención proporciona ligandos multivalentes comprendiendo dominios de unión no complementarios específicos para el mismo epítopo y dirigidos a objetivos que comprenden múltiples copias de dicho epítopo, tal como I L-5 , PDGF-AA, PDGF-BB, TGF beta, TGF beta2, TGF beta3 y TNFa, por ejemplo Receptor TN F 1 de humano y TNFa de humano. En un aspecto similar, ligandos de acuerdo a la invención pueden configurarse para unir epítopos individuales con baja afinidad, de manera que la unión a epítopos individuales no es terapéutica significativa; pero la avidez incrementada resultando de unión a dos epítopos proporciona un beneficio terapéutico. En un ejemplo particular, epítopos pueden tenerse como objetivos, los cuales están presentes individualmente en tipos celulares normales, pero presentes juntos solamente en células enfermas o anormales, tales como células tumorales. En tal situación, solamente las células enfermas o anormales se tienen como objetivo de manera efectiva por los ligandos biespecíficos de acuerdo a la invención. Ligando específico para múltiples copias del mismo epítopo, o epítopos adyacentes, en el mismo objetivo (conocidos como dAbs quelantes) pueden también ser ligandos poliméricos o triméricos (tertraméricos o más) comprendiendo tres, cuatro o más dominios de unión no complementarios. Por ejemplo, ligandos pueden construirse comprendiendo tres o cuatro dominios VH o dominios VL. Además, se proporcionan ligandos que se unen a objetivos de múltiples subunidades, en donde cada dominio de unión es específico para una subunidad de dicho objetivo. El ligando puede ser dimérico, trimérico o polimérico. Preferentemente, los ligandos multiespecíficos de acuerdo a los aspectos anteriores de la invención se obtienen por el método del primer aspecto de la invención. De acuerdo al aspecto anterior de la segunda configuración de la invención, ventajosamente el primer dominio de unión al epítopo y los segundos dominios de unión al epítopo son dominios variables de inmunoglobulina no complementarios, como se define en la presente. Es decir ya sea dominios variables VH-VH o VL-VL. dAbs quelantes en particular pueden prepararse de acuerdo a un aspecto preferido de la invención, principalmente el uso de dAbs de sujeción, en los cuales una biblioteca de dAbs diméricos, triméricos o multiméricos se construye utilizando un vector que comprende un dAb constante aguas arriba o aguas abajo de una secuencia enlazadora, con un repertorio de dAbs segundo, tercero y adicionales insertándose en el otro lado del enlazador. Por ejemplo, dAb guía o de sujeción puede ser TAR1 -5 (VK) , TA R 1 -27(VK) , TAR2h-5(VH) o TAR2h-6(V?). En metodologías alternativas, el uso de enlazadores puede evitarse, por ejemplo por el uso de unión no covalente o afinidad natural entre dominios de unión tales como VH y V?. La invención de acuerdo con lo anterior proporciona un método para preparar un ligando multimérico quelante comprendiendo las etapas de: (a) proporcionar un vector comprendiendo una secuencia de ácidos nucleicos codificando un dominio de unión especifico único para un primer epítopo en un objetivo; (b) proporcionar un vector codificando un repertorio comprendiendo segundos dominios de unión específicos para un segundo epítopo en dicho objetivo, tal epítopo puede ser el mismo o diferente al primer epítopo, dicho segundo epítopo estando adyacente a dicho primer epitopo; y (c) expresar dichos dominios de unión, primero y segundo; y (d) aislar aquellas combinaciones de dominios de unión, primero y segundo, cuando se combinan juntos para producir un dímero de unión al objetivo. Los epítopos, primero y segundo, están adyacentes de manera que un ligando multimérico es capaz de unión a ambos epítopos simultáneamente. Esto proporciona el ligando con las ventajas de avidez incrementada si hay unión. Donde los epítopos son los mismos, la avidez incrementada se obtiene por la presencia de múlti ples copias del epítopo en el objetivo, permitiendo al menos que dos copias se unan simultáneamente para obtener el efecto de avidez incrementada. Los dominios de unión pueden asociarse por varios métodos, así como también el uso de enlazadores. Por ejemplo, los dominios de uni ón pueden comprender residuos cys, avidi na y grupos estreptavidi na u otros medios para post-síntesis de unión no covalente, aquellas combinaciones que se unen al objetivo eficientemente se aislarán. Alternativamente, un enlazador puede estar presente entre los domi ni os de unión, primero y segundo, que se expresan como un poli péptido único de un vector úni co, que comprende el primer dominio de unión, el enlazador y un repertorio de segundos dominios de unión, por ejemplo como se describe arriba . En un aspecto preferido , los dominios de unión, primero y segundo, se asocian naturalmente cuando se unen a antígeno; por ejemplo, dominios VH y V?, cuando se unen a epítopos adyacentes, natural mente se asociarán en una i nteracción de tres vías para formar un dímero estable. Tales proteí nas asociadas pueden aislarse en un ensayo de unión objetivo. Una ventaja de este procedimiento es que solamente los dominios de unión que se unen a epítopos cercanamente adyacentes, en la conformación correcta, se asociarán y de esta manera se aislarán como un resultado de su avidez incrementada para el objetivo. En una modalidad alternativa del aspecto anterior de l a segunda configuración de la invención, al menos un domi nio de uni ón al epítopo comprende un "andamio de proteína" o "estructura de proteína" como se define en la presente. Andamios de proteína de no inmunoglobulina adecuados incluyen pero no se limitan a cualquiera de aquellos seleccionados del grupo consistiendo de: SpA, fibronectina, GroEL y otros chaperones, lipocalina, CCTLA4 y afficuerpos, como se establece arriba. De acuerdo al aspecto anterior de la segunda configuración de la invención, ventajosamente, los dominios de unión al epítopo se unen a una estructura de proteína. Ventajosamente, una estructura de proteína de acuerdo a la invención es una estructura de inmunoglobulina. De acuerdo a la presente invención, el término "estructura de inmunoglobulina" se refiere a una proteína que comprende al menos un doblez de inmunoglobulina y que actúa como un núcleo para uno o más dominios de unión al epítopo, como se define en la presente.

Estructuras de inmunoglobulina preferidas como se define en la presente incluyen cualquiera de una o más de aquellas seleccionadas de las siguientes: una molécula de inmunoglobulina comprendiendo al menos (i) el dominio CL (subclase kappa o lambda) de un anticuerpo; o (ii) el dominio CH1 de una cadena pesada de anticuerpo; una molécula de inmunoglobulina comprendiendo los dominios CH1 y CH2 de una cadena pesada de anticuerpo; una molécula de inmunoglobulina comprendiendo los dominios CH1 , CH2 y CH3 de una cadena pesada de anticuerpo; o cualquiera del subconjunto (ii) en conjunción con el dominio CL (subclase kappa o lambda) de un anticuerpo. Un dominio de región de articulación también puede incluirse. Tales combinaciones de dominios pueden, por ejemplo, imitar los anticuerpos naturales, tales como IgG o IgM , o fragmentos de los mismos, tales como moléculas Fv, scFv, Fab o F(ab')2. Aquellos expertos en la materia están concientes de que esta lista no se propone ser exhaustiva. El enlace de la estructura a los dominios de unión al epítopo, como se define en la presente puede lograrse en el nivel de polipéptido, es decir después de expresión del ácido nucleico codificando la estructura y/o los dominios de unión al epítopo. Alternativamente, la etapa de enlace puede realizarse en el nivel de ácido nucleico. Métodos para enlazar una estructura de proteína de acuerdo a la presente invención, a los dominios de unión al epítopo incluyen el uso de química de proteína y/o técnicas de biología molecular que serán familiares para aquellos expertos en la materia y se describen en la presente. Ventajosamente, el ligando multiespecífíco de conformación cerrada puede comprender un primer dominio capaz de unión a molécula objetivo, y un segundo dominio capaz de unión a molécula o grupo que extiende la vida media del ligando. Por ejemplo, la molécula o grupo puede ser un agente voluminoso, tal como HSA o una proteína de matriz celular. Como se utiliza en la presente, la frase "molécula o grupo que extiende la vida media de un ligando" se refiere a una molécula o grupo químico que, cuando se une por un ligando específico dual como se describe en la presente incrementa la vida media in vivo de tal ligando específico dual cuando se administra a un animal, relativo a un ligando que no une esa molécula o grupo. Ejemplos de moléculas o grupos que extienden la vida media de un ligando se describen en la presente abajo. En una modalidad preferida, el ligando multiespecífico de conformación cerrada puede ser capaz de uni ón de la molécula objetivo solamente en desplazamiento de la molécula o grupo mejorando la vida media. De esta manera, por ejemplo, un ligando multiespecífico de conformación cerrada se mantiene en circulación en la corriente sanguínea de un sujeto por una molécula voluminosa tal como HSA. Cuando una molécula objetivo se encuentra, competición entre los dominios de unión del ligando multiespecífico de conformación cerrada resulta en desplazamiento de HSA y unión del objetivo. En un aspecto adicional de la segunda configuración de la invención, la presente invención proporciona una o más moléculas de ácido nucleico codificando al menos un ligando multiespecífico como se define en la presente. En una modalidad, el ligando es un ligando de conformación cerrada. En otro modalidad, es un ligando de conformación abierta. El ligando multiespecífico puede codificarse por una molécula de ácido nucleico única; alternativamente, cada dominio de unión al epítopo puede codificarse por una molécula de ácido nucleico separada. Donde el ligando se codifica por una single molécula de ácido nucleico única, los dominios pueden expresarse como un polipéptido de fusión, o puede expresarse por separado y enlazarse subsiguientemente juntos, por ejemplo, utilizando agentes de enlace químico. Los ligandos expresados de ácidos nucleicos separados se enlazarán juntos por medios apropiados. El ácido nucleico puede codificar además una secuencia de señal para exportar los polipéptidos de una célula huésped en la expresión y pueden fusi onarse con un componente de superficie de una partícula de bacteriófago fi lamentoso (u otro componente de un sistema de despliegue de selección) en expresión. Las secuencias guía, que pueden utilizarse en expresión bacteriana y/o fago de despliegue de fagemido, i ncluyen pel B, stll , ompA, phoA, bl a y pelA. En un aspecto adicional de la segunda configuración de la invención la presente invención proporciona un vector comprendiendo ácido nucleico de acuerdo a la presente invención. En todavía otro aspecto adicional , la presente i nvención proporciona una célula huésped transfectada con un vector de acuerdo a la presente invención. Expresión de tal un vector puede configurarse para produci r, por ejempl o en la superficie de una partícula de bacteriófago, domi ni os de unión al epítopo para selección. Esto permite l a selección de dominios desplegados y de esta manera la selección de 'ligandos multiespecíficos' utilizando el método de la presente invenci ón. La presente i nvención proporciona además un equipo comprendiendo al menos un ligando multiespecífico de acuerdo a la presente invención, que puede ser un ligando de conformación cerrada o conformación abierta. Equipos de acuerdo a la i nvención pueden ser, por ejemplo, equipos de diagnóstico, equipos terapéuticos, equipos para la detección de especies biológicas o químicas, y lo similar. La presente invención proporciona un método para producir un ligando multiespecífico comprendiendo las etapas de: a) seleccionar un primer dominio de unión al epítopo por su habilidad para unirse a un primer epítopo, b) seleccionar un segundo dominio de unión al epítopo por su habilidad para unirse a un segundo epítopo, c) combinar los dominios de unión al epítopo; y d) seleccionar el ligando multiespecifico de conformación cerrada por su habilidad para unirse a dicho primer segundo epítopo y dicho segundo epítopo. En un aspecto adicional de la segunda configuración, la invención proporciona un método para preparar un ligando multiespecífico de conformación cerrada comprendiendo un primer dominio de unión al epítopo teniendo una primer especificidad de unión al epítopo y un segundo dominio de unión al epítopo no complementario teniendo una segunda especificidad de unión al epítopo, en donde las especificidades de unión, primera y segunda, compiten por unión al epítopo de manera que el ligando multiespecífico de conformación cerrada puede no unir ambos epítopos simultáneamente, dicho método comprendiendo las etapas de: a) seleccionar un primer dominio de unión al epítopo por su habilidad para unirse a un primer epítopo, b) seleccionar un segundo dominio de unión al epítopo por su habilidad para unirse a un segundo epítopo, c) combinar los dominios de unión al epítopo de manera que los dominios están en una conformación cerrada; y d) seleccionar el ligando multiespecífico de conformación cerrada por su habilidad para unirse a dicho primer segundo epítopo y dicho segundo epítopo, pero no a ambos dichos epítopos, primero y segundo, simultáneamente. Una modalidad alternativa del aspecto anterior de la segunda configuración de la invención opcionalmente comprende una etapa adicional (b1 ) comprendiendo seleccionar un tercer dominio de unión al epítopo o adicional. De esta manera el ligando multiespecífico producido, ya sea de conformación cerrada o abierta, comprende más de dos especificidades de unión al epitopo. En un aspecto preferido de la segunda configuración de la invención, donde el ligando multiespecífico comprende más de dos dominios de unión al epítopo, al menos dos de dichos dominios están en una conformación cerrada y compiten por unión; otros dominios pueden competir para unión o pueden estar libres para asociarse independientemente con su(s) epítopo(s) cognado(s). En la segunda configuración de la invención, los epítopos , primero y segundo, son preferentemente diferentes. Pueden ser, o ser parte de, polipéptidos, proteínas o ácido nucleicos, que pueden ocurrir de manera natural o sintéticos. En este aspecto, el ligando de la invención puede unir un epítopo o antígeno y actuar como un antagonista o combatiente (por ejemplo, combatiente de receptor EPO). Los dominios de unión al epítopo del ligando en una modalidad tienen la mismo especificidad de epítopo, y pueden por ejemplo, unir simultáneamente su epítopo cuando múltiples copias del epítopo están presentes en el mismo antígeno. En otra modalidad, estos epítopos se proporcionan en diferente antígenos de manera que el ligando puede unir los epítopos y puentear los antígenos. Un experto en la materia apreciará que la elección de epítopos y antígenos es grande y variada. Pueden ser por ejemplo, proteínas de animal o humano, citoquinas, receptores de citoquina, co-factores de enzima para enzimas o proteínas de unión al ADN. Citoquinas y factores de crecimiento adecuados incluyen pero no se limitan a: ApoE, Apo-SAA, BDNF, Cardiotrofin-1, EGF, receptor EGF, ENA-78, Eotaxin, Eotaxin-2, Exodus-2, EpoR, FGF-ácido, FGF-básico, factor de crecimiento de fibroblasto-10, ligando FLT3, Fractalkine (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-ß1, insulina, IFN-?, IGF-I, IGF-II, IL-1a, IL-1ß, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 a. a.), IL-8 (77 a. a.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IGIF), Inhibin a, Inhibin ß, EP-10, factor de crecimiento de queratinocito-2 (KGF-2), KGF, Leptin, LIF, Linfotactin, substancia inhibidora Muleriana, factor inhibidor de colonia de monocito, proteína atrayente de monocito, M-CSF, MDC (67 a. a.), MDC (69 a. a.), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67 a. a ), MDC (69 a. a ), MIG, MIP-1a, MIP-1ß, MIP-3a, MIP-3ß, MIP-4, factor inhibidor progenitor de mieloide-1 (MPIF-1), NAP-2, Neurturin, factor de crecimiento de nervio, ß-NGF, NT-3, NT-4, Oncostatin M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1a, SDF1ß, SCF, SCGF, factor de célula germinal (SCF), TARC, TGF-a, TGF-ß, TGF- ß2, TGF-ß3, factor de necrosis de tumor (TNF), TNF-a, TNF-ß, receptor TNF I , receptor TNF I I , TNI L-1 , TPO, VEGF, receptor VEGF 1 , receptr VEGF 2, receptor VEGF 3, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-ß, GRO-?, HCC1 , 1 -309, HER 1 , HER 2, HER 3, HER 4, sitio de reconocimiento TACE, TNF BP-I y TNF BP-I I , así como también cualquier objetivo descrito en el Anexo 2 o Anexo 3 a la misma, si en combinación como se establece en los Anexos, en una combinación diferente o individualmente. Los receptores de citoquina i ncluyen receptores para las citoquinas anteriores, por ejemplo, I L-1 R1 ; I L-6R; I L-10R; IL-18R, asi como también receptores para citoquinas establecidos en el Anexo 2 o Anexo 3 y también receptores descritos en el Anexo 2 y 3. Se apreciará que esta lista es por ningún medio exhaustiva. Donde el ligando multiespecífico se une a dos epítopos (en los mismos o diferentes antígenos), el(los) antígeno(s) puede(n) seleccionarse de esta lista. En modalidades particulares, el ligando comprende un dAb que une TN FR1 y un segundo dAb o dominio de unión al epítopo que une cualquiera de estos antígenos. En tales modalidades, el ligando multiespecífico puede comprender cualquier combinación de dominios variables de inmunoglobulinas (por ejemplo, VHVH, VHVL, VLVL). Preparación de I nmunoglobulina En Base a Ligandos M ultiespecíficos Ligandos específicos duales de acuerdo a la invención, ya sea abiertos o cerrados en conformación de acuerdo con la configuración deseada de la invención, pueden prepararse de acuerdo a técnicas previamente establecidas, utilizadas en el campo formación de anticuerpo, para la preparación de scFv, anticuerpos de "fago" y otras moléculas de anticuerpo formadas y otras moléculas de anticuerpo formados. Técnicas para la preparación de anticuerpos, y en anticuerpos biespecíficos particulares, se describen por ejemplo en las siguientes revisiones y las referencias citadas en la presente: Winter & Milstein, ( 1991 ) Nature 349:293-299; Pluckthun (1992) Immunological Reviews 130:151 -188; Wright et al., (1992) Crti. Rev. Immunol. 12: 125-168; Holliger, P. & Winter, G. (1993) Curr. Op. Biotechn. 4, 446-449; Cárter, ef al. (1995) J . Hernatother. 4, 463-470; Chester, K.A. & Hawkins, R. E. (1995) Trends Biotechn. 13, 294-300; Hoogenboom, H. R. (1997) Nature Biotechnol. 15, 125-126; Fearon, D. (1997) Nature Biotechnol. 15, 618-619; Pluckthun, A. & Pack, P. ( 1997) I numunotechnology 3, 83-105; Cárter, P. & Merchant, A. M . ( 1997) Curr. Opin. Biotechnol . 8, 449-454; Holliger, P. & Winter, G. (1997) Cáncer Immunol. Immunother. 45, 128-130. La invención se proporciona para la selección de dominios variables contra dos diferente antígenos o epítopos, y combinación subsiguiente de los dominios variables. Las técnicas empleadas para selección de los dominios variables emplean bibliotecas y procedimientos de selección que se conocen en la materia. Bibliotecas naturales (Marks ef al. ( 1991 ) J. Mol. Biol, 222: 581 ; Vaughan et al. (1996) Nature Biotech. , 14: 309) que utilizan genes V reordenados recolectados de células B de humano se conocen bien por aquellos expertos en la materia. Bibliotecas sintéticas (Hoogenboom & Winter ( 1992) J. Mol. Biol, 227: 381 ; Barbas ef al. (1992) Proc. Nati Acad. Sci USA, 89: 4457; Nissim ef al. (1994) EMBO J. , 13: 692; Griffiths ef al. (1994) EMBO J, 13: 3245; De Kruif ef a/. (1995) J. Mol Biol, 248: 97) se preparan al clonar genes V de inmunoglobuiina, usualmente utilizando PCR. Los errores en el proceso PCR pueden conducir a un alto grado de aleatorización. Las bibliotecas VH y/o VL pueden seleccionarse contra antígenos o epítopos objetivo por separado, en cuyo caso la unión de dominio único se selecciona directamente para, o juntas. Un método preferido para hacer un ligando específico dual de acuerdo a la presente invención comprende utilizando un sistema de selección en el cual un repertorio de dominios variables se selecciona para unión a un primer antígeno o epítopo y un repertorio de dominios variables se selecciona para unión a un segundo antígeno o epítopo. Los dominios variables, primero y segundo, seleccionados se combinan entonces y el ligando específico dual se selecciona para unión tanto a antígeno o epítopo, primero y segundo. Ligandos de conformación cerrada se seleccionan para unión de tanto antígeno o epítopo, primero y segundo en aislamiento pero no simultáneamente. A. Sistemas de vector de biblioteca Una variedad de sistemas de selección se conocen en la materia que son adecuados para utilizarse en la presente invención. Ejemplos de tales sistemas se describen abajo. Sistemas de expresión lambda de bacteriófago pueden seleccionarse directamente como placas de bacteriófago o como colonias de lisogenes, ambos como se describe previamente (Huse et al. ( 1989) Science, 246: 1275; Catón and Koprowski ( 1990) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 87; Mullinax et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. , 87: 8095; Persson et al. (1991 ) Proc. Nati Acad. Sci. U. S.A. , 88: 2432) y son de uso en la invención. Aunque tales sistemas de expresión pueden utilizarse para seleccionar hasta 106 diferentes miembros de una biblioteca, no se adecúan realmente a la selección de números más grandes (mayores a 106 miembros). De particular uso en la construcción de bibliotecas son los sistemas de despliegue de selección, que permiten que un ácido nucleico se enlace al polipéptido que expresa. Como se utiliza en la presente, un sistema de despliegue de selección es un sistema que permite la selección, por medio de despliegues adecuados , de los miembros individuales de la biblioteca al unir los ligandos genéricos y/u objetivo. Procedimientos de selección para aislar miembros deseados de bibliotecas grandes se conocen en la materia, como se ti pifica por técnicas de despliegue de fago. Tales sistemas, en los cuales las secuencias de péptido diversas se despliegan en la superficie de bacteriófago filamentoso (Scott and Smith (1990) Science, 249: 386), han probado ser útiles para crear bibliotecas de fragmentos de anticuerpo (y las secuencias de nucleótidos que los codifican) para la selección in vitro y amplificación de fragmentos de anticuerpo específicos que unen un antígeno objetivo (McCafferty et al. , WO 92/01047) . Las secuencias de nucleótidos codificando las regiones H y VL se enlazan a fragmentos de gen que codifican señales guía que las dirigen al espacio periplásmico de E. coli y como un resultado los fragmentos de anticuerpo resultantes se despliegan en la superficie de bacteriófago, típicamente como fusiones a proteínas de revestimiento de bacteriófago (por ejemplo, pl l l pVII I). Alternativamente, fragmentos de anticuerpo se despliegan externamente en cápsidos de fago lambda (fagocuerpos). Una ventaja de sistemas de despliegue a base de fago es que, debido a que son sistemas biológicos, los miembros de biblioteca seleccionados pueden amplificarse simplemente al desarrollar el fago conteniendo el miembro de biblioteca seleccionado en células bacterianas. Además, ya que la secuencia de nucleótidos que codifican el miembro de biblioteca de polipéptido se contiene en un fago o vector de fagemido, secuenciación, expresión y manipulación genética subsiguiente es relativamente directa. Métodos para la construcción de bibliotecas de despliegue de anticuerpo de bacteriófago y bi bliotecas de expresión de fago lambda se conocen bien en la materia (McCafferty ef al. (1990) Nature, 348: 552; Kang ef al. (1991 ) Proc. Nati. Acad. Sci. U. S.A. , 88: 4363; Clackson et al. (1991 ) Nature, 352: 624; Lowman ef al. (1991 ) Biochemistry, 30: 10832; Burton ef al. (1991 ) Proc. Nati. Acad. Sci U. S.A. , 88: 10134; Hoogenboom et al. (1991 ) Nucleic Acids Res. , 19: 4133; Chang et al. (1991 ) J Immunol., 147: 3610; Breitling ef al. ( 1991 ) Gene, 104: 147; Marks ef al. (1991 ) supra; Barbas ef al. (1992) supra; Hawkins and Winter (1992) J. Immunol, 22: 867; Marks et al. , 1992, J. Biol. Chem. , 267: 16007; Lerner ef al. ( 1992) Science, 258: 1313, i ncorporadas en la presente para referencia) . Un planteamiento particularmente ventajoso ha sido el uso de bibliotecas de fago scFv (Huston et al., 1988, Proc. Nati. Acad. Sci U. S.A. , 85: 5879-5883; Chaudhary et al. ( 1990) Proc. Nati. Acad. Sci U. S.A. , 87: 1066-1070; McCafferty ef al. ( 1990) supra; Clackson ef al. (1991 ) Nature, 352: 624; Marks ef al. (1991 ) J Mol. Biol, 222: 581 ; Chiswell et al. (1992) Trends Biotech., 10: 80; Marks et al. ( 1992) J Biol. Chem. , 267). Varias modalidades de las bibliotecas scFv desplegadas en proteínas de revestimiento de bacteriófago se han descrito. Los refinamientos de planteamientos de despliegue de fago también se conocen, por ejemplo, como se describe en WO96/06213 y WO92/01047 (Medical Research Council et al.) y WO97/08320 (M orphosys), que se incorporan en la presente para referencia. Otros sistemas para generar bibliotecas de polipéptidos incluyen el uso de maquinaria enzimática libre de célula para la síntesis in vitro de los miembros de biblioteca. En un método, las moléculas ARN se seleccionan por vueltas alternas de selección contra un ligando objetivo y amplificación PCR (Tuerk and Gold (1990) Science, 249: 505; Ellington and Szostak (1990) Nature, 346: 818) . Una técnica similar puede utilizarse para identificar secuencias de ADN que unen un factor de transcripción de humano predeterminado (Thiesen and Bach (1990) Nucleic Acids Res., 18: 3203; Beaudry and Joyce (1992) Science, 257: 635; WO92/05258 y WO92/14843). En una manera similar, la translación in vitro puede utilizarse para sintetizar los polipéptidos como un método para generar bibliotecas grandes. Estos métodos que generalmente comprenden complejos de polisoma estabilizados, se describen además en WO88/08453, WO90/05785, WO90/07003, WO91/02076, WO91 /05058, y WO92/02536. Los sistemas de despliegue alternativos que no se basan en fago, tales como aquellos descritos en WO95/22625 y WO95/11922 (Affymax) utilizan los polisomas para desplegar los polipéptidos para selección. Una categoría aún adicional de técnicas incluye la selección de repertorios en compartimientos artificiales, que permiten el enlace de un gen con su producto genético. Por ejemplo, un sistema de selección en el cual los ácidos nucleicos codificando productos genéticos deseables que pueden seleccionarse en microcápsulas formadas por emulsiones de agua en aceite se describe en WO99/02671 , WO00/40712 y Tawfik & Griffiths (1998) Nature Biotechnol 16(7), 652-6. Los elementos genéticos codificando un producto de gen teniendo una actividad deseada se colocan en compartimentos en microcápsulas y después se transcriben y/o trasladan para producir sus productos de gen respectivos (ARN o proteína) dentro de las microcápsulas. Los elementos genéticos que producen producto de gen teniendo actividad deseada se clasifican subsiguientemente. Este planteamiento selecciona productos de gen de interés al detectar la actividad deseada por una variedad de medios. B. Construcción de Biblioteca Bibliotecas propuestas para selección, pueden construirse utilizando técnicas conocidas en la materia, por ejemplo como se establece arriba, o puede comprarse de fuentes comerciales. Las bibliotecas que son útiles en la presente invención se describen, por ejemplo, en WO99/20749. Una vez que un sistema de vector se elige y una o más secuencias de ácido nucleico codificando polipéptidos de interés se clonan en el vector de biblioteca, uno puede generar diversidad dentro de las moléculas clonadas al tomar la mutagénesis antes de la expresión; alternativamente, las proteínas codificadas pueden expresarse y seleccionarse, como se descri be arriba, antes de mutagénesis y vueltas adicionales de selección se realizan. M utagénesis de secuencias de ácidos nucleicos codificando polipéptidos estructuralmente optimizados se lleva a cabo por métodos moleculares estándar. De particular interés es la reacción en cadena de polimerasa, o PCR, (Mullís and Faloona (1987) Methodos Enzymol, 155: 335, en la presente incorporada para referencia) . PCR, que utiliza múltiples ciclos de réplica de ADN catalizada por una polimerasa de ADN dependiente de ADN, termoestable para amplificar la secuencia objetivo de interés, se conoce bien en la materia. La construcción de varias bibliotecas de de anticuerpo se ha tratado en Winter ef al. ( 1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55, y referencias citadas en la misma. PCR se realiza utilizando ADN templado (por al menos 1 fg, más usualmente, 1 -1000 ng) y al menos 25 pmol de cebadores de oligonucleótido; puede ser ventajoso utilizar una cantidad más grande de cebador cuando el grupo cebador es pesadamente heterogéneo, ya que cada secuencia se representa por solamente una fracción pequeña de las moléculas del grupo, y cantidades se vuelven limitantes en los últimos ciclos de amplificación. Una mezcla de reacción típica incluye: 2µl de ADN, 25 pmol de cebador de oligonucleótido, 2.5 µl de 10X regulador PCR 1 (Perkin-Elmer, Foster City, CA), 0.4 µl de 1.25 µM dNTP, 0.15 µl (o 2.5 unidades) de polimerasa de ADN Taq (Perkin Elmer, Foster City, CA) y agua desionizada a un volumen total de 25 µl. Aceite mineral se cubre y el PCR se realiza utilizando un ciclizador térmico programable. La longitud y temperatura de cada etapa de un ciclo PCR, así como también el número de ciclos, se ajusta de acuerdo a los requerimientos de severidad en efecto. La temperatura de templado y temporización se determinan tanto por la eficiencia con la cual se espera que un cebador se temple a un templado y el grado de desacoplamiento está por tolerarse; obviamente, cuando las moléculas de ácido nucleico se amplifican de manera simultánea y mutagenizan, se requiere desacoplamiento, al menos en la primer vuelta de síntesis. La habilidad para optimizar la severidad de las condiciones de templado de cebador se encuentra bien dentro del conocimiento de alguien con experiencia moderada en la materia. Una temperatura de templado de entre 30°C y 72°C se utiliza. La desnaturalización inicial de las moléculas templadas normalmente ocurre a entre 92°C y 99ßC por 4 minutos, seguido por 20-40 ciclos consistiendo de desnaturalización (94-99°C por 15 segundos a 1 minuto), templado (temperatura determinada como se trata arriba; 1 -2 minutos), y extensión (72°C por 1 -5 minutos, dependiendo de la longitud del producto amplificado). La extensión final es generalmente por 4 minutos a 72°C, y puede seguirse por una etapa indefinida (0-24 hora) a 4°C. C. Combinación de Domi nios Variables Únicos Los dominios útiles en la invención, una vez seleccionados, pueden combinarse por una variedad de método conocidos en la materia, ¡ncluyendo métodos covalentes y no covalentes. Los métodos preferidos incluyen el uso de enlazadores de polipéptido, como se describe, por ejemplo, en conexión con moléculas scFv (Bird et al. , (1988) Science 242:423-426). Discusión de enlazadores adecuados se proporciona en Bird ef al. Science 242, 423-426; Hudson ef al. , Journal Immunol Methods 231 ( 1999) 177-189; Hudson et al. , Proc Nat Acad Sci USA 85, 5879-5883. Enlazadores son preferentemente flexibles, permitiendo que los dos domi nios únicos interactúen. Un ejemplo de enlazador es un enlazador (Gly4 Ser)n, donde n= 1 a 8, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o 7. Los enlazadores utilizados en diacuerpos, que son menos flexibles, también pueden emplearse (Holliger et al. , (1993) PNAS (USA) 90:6444-6448). En una modalidad, el enlazador empleado no es una región de articulación de inmunoglobulina. Dominios variables pueden combinarse utilizando métodos diferentes a enlazadores. Por ejemplo, el uso de puentes de disulfuro, proporcionado a través de residuos de cisteína formados o que ocurren de manera natural , puede explotarse para estabilizar los dímeros VH-VH, VL-VL o VH-VL (Reiter ef al. , (1994) Protein Eng. 7:697-704) o al remodelar la interfase entre los dominios variables para mejorar el "ajuste" y de esta manera la estabilidad de interacción (Ridgeway ef al. , (1996) Protein Eng. 7:617-621 ; Zhu et al. , (1997) Protein Science 6:781 -788). Otras técnicas para unir o estabilizar dominios variables de inmunoglobulinas, y en particular dominios VH de anticuerpo, pueden emplearse como apropiadas. De acuerdo con la presente invención, ligandos específicos duales pueden estar en conformaciones "cerradas" en solución. Una configuración "cerrada" es aquella en la cual los dos dominios (por ejemplo, VH y VL) están presentes en forma asociada, tal como aquella de un par VH-V asociado que forma un sitio de unión al anticuerpo. Por ejemplo, scFv puede estar en una conformación cerrada, dependiendo del orden del enlazador utilizado para enlazar los dominios VH y V . Si este es suficientemente flexible para permitir que los dominios se asocien, o se mantengan rígidamente en la posición asociada, es probable que los dominios adopten una conformación cerrada. De manera similar, los pares de dominio V y pares de dominio VL pueden existir en una conformación cerrada. Generalmente, esta será una función de asociación cercana de los dominios, fal como por un enlazador rígido, en la molécula de ligando. Los ligandos en una conformación cerrada serán i ncapaces de uni rse tanto a la molécula que i ncrementa la vi da media del ligando y una segunda molécula objetivo. De esta manera, el ligando típicamente unirá solamente la segunda molécula objetivo en disociación de la molécula que i ncrementa la vida media del ligando. Además, la construcción de los dímeros VH/VH, VL/V o VH/V sin enlazadores proporciona competición entre los dominios. Ligandos de acuerdo a la invención pueden además estar en una conformación abierta. En tal conformación, los ligandos serán capaces de unir simultáneamente tanto la molécula que i ncrementa la vida media del ligando y la segunda molécula objetivo. Típicamente, los dominios variables en una configuración abierta se mantienen (en el caso de pares VH-VL) suficientemente parte en para los domi nios que no interactúan y forman un sitio de unión al anticuerpo y no compiten por unión a sus epítopos respectivos. En el caso de dímeros VH/VH o V /V , los dominios no se forzan j untos por enl azadores rígidos. Naturalmente, tal es pares de domi nio no competi rán por unión a antígeno o formarán un sitio de unión al anticuerpo. Fragmentos Fab y anticuerpos totales existirán principalmente en la conformaci ón cerrada, aunque se apreciará que los l i gandos específicos duales abiertos y cerrados probablemente existen en una variedad de equilibrio bajo diferentes circunstancias. La unión del ligando a un objetivo es probablemente para cambiar el balance del equil ibrio hacia la configuración abierta. De esta manera, ciertos ligandos de acuerdo a la invención pueden existir en dos conformaciones en solución, una de las cuales (la forma abierta) puede unir dos antígenos o ep ítopos independientemente, mientras la conformación alternativa (la forma cerrada) puede unir solamente un antígeno o epítopo; antígenos o epítopos de esta manera compiten para unión al ligando en esta conformación. Aunque la forma abierta del ligando específico dual puede de esta manera existir en equilibrio con la forma cerrada en solución, se contempla que el equilibrio favorecerá la forma cerrada; además, la forma abierta puede secuestrarse por inhibición objetivo en una conformación cerrada. Preferentemente, por lo tanto, ciertos ligandos específicos duales de la invención están presentes en un equilibrio entre dos conformaciones (abierta y cerrada). Ligandos específicos duales de acuerdo a la ¡nvención pueden modificarse para favorecer una conformación abierta o cerrada. Por ejemplo, estabilización de interacciones VH-V con enlaces de disulfuro estabiliza la conformación cerrada. Además, enlazadores utilizados para unir los dominios, incluyendo pares de dominio VH y dominio VL, pueden construirse de manera que la forma abierta se favorece; por ejemplo, los enlazadores pueden ocultar estéricamente la asociación de los dominios, tal como por incorporación de residuos de aminoácido grandes en ubicaciones oportunas, o el diseño de una estructura rígida adecuada que mantendrá los dominios físicamente separados. D. Caracterización en el ligando específico dual La unión del ligando específico dual a sus antígenos o epítopos específicos puede probarse por métodos que serán familiares para aquellos expertos en la materia e incluyen ELISA. En una modalidad preferida de la invención la unión se prueba utilizando ELISA de fago monoclonal . E LI SA de fago puede real izarse de acuerdo a cual qui er procedimiento adecuado: un procedimiento ejemplificativo se establece abajo. Las poblaciones de fago producidas en cada vuelta de selección pueden seleccionarse para unión por E LI SA al antígeno o epítopo seleccionado, para identificar anticuerpos de fago "policlonal". Fago de colonias bacterianas infectadas únicas de estas poblaci ones puede seleccionarse entonces por E LI SA para identificar anticuerpos de fago "monoclonal". También es deseable seleccionar fragmentos de anticuerpo solubles para unión a antígeno o epítopo, y esto también puede subtomarse por ELISA utilizando reactivos, por ejemplo, contra una tag de termi nal C o N (ver por ejemplo Wi nter ef al. ( 1994) Ann. Rev. I m munology 12, 433-55 y referencias citadas en la misma. La diversidad de los anticuerpos monoclonales de fago seleccionados también puede valorarse por electroforesis de gel de productos PCR (M arks ef al. 1 991 , supra; Ni ssi m et al. 1994 supra) , sondeo (Tomlinson ef al. , 1992) J . Mol . Biol. 227, 776) o por secuenciación del ADN de vector. E. Estructura de ligandos específicos duales Como se describe arriba, un anticuerpo se define en la presente como un anticuerpo (por ejemplo IgG, IgM , IgA, IgA, IgE) o fragmento (Fab, Fv, Fv enlazado de disulfuro, scFv, diacuerpo) que comprende al menos un dominio variable de cadena ligera y una pesada, al menos dos variables de dominio de cadena pesada o al menos dos dominios variables de cadena ligera. Puede al menos parcialmente derivarse de cualquier especie que ocurre de manera natural produciendo un anticuerpo, o crearse por tecnología de ADN recombinante; si se aisla de suero, células B, hibridomas, transfectomas, levadura o bacteria). En una modalidad preferida de la invención el ligando específico dual comprende al menos un dominio variable de cadena pesada único de un anticuerpo y un dominio variable de cadena ligera único de un anticuerpo, o dos dominios variables de cadena ligera o pesada únicos. Por ejemplo, el ligando puede comprender un par VH/VL, un par de dominios VH o a par de dominios V . Los dominios variables, primero y segundo, de tal ligando pueden estar en la misma cadena de polipéptido. Alternativamente pueden estar en cadenas de polipéptido separadas. En el caso en que estén en la misma cadena de polipéptido, pueden enlazarse por un enlazador, que es preferentemente una secuencia de péptidos, como se describe arriba. Los dominios variables, primero y segundo, pueden asociarse covalentemente o no covalentemente. En el caso que se asocien covalentemente, los enlaces covalentes pueden ser enlaces de disulfuro. En el caso que l os dominios variables se selecci onan de repertorios de gen V seleccionados, por ejemplo, utilizando tecnología de despliegue de fago como se describe en la presente, entonces estos domi nios variables comprenden una región de estructura universal , de manera que pueden reconocerse por un ligando genérico específico como se define en la presente. El uso de estructuras universales, ligandos genéricos y lo si milar se descri be en WO99/20749. Donde los Repertorios de gen V se utilizan, la variación en secuencia de polipéptido preferentemente se ubica dentro de los ciclos estructurales de los dominios variables. Las secuencias de poli péptido de cualquier domi nio variable pueden alterarse por arrastre de ADN o por mutación para mejorar la i nteracción de cada domi nio variable con su par complementario. El arrastre de ADN se conoce en la materia y enseña, por ejemplo, por Stemmer, 1 994, Nature 370: 389-391 y Patente de EE . UU. No. 6, 297, 053, ambas se incorporan en la presente para referencia. Otros métodos de mutagénesis se conocen bien por aquellos expertos en la materia. En una modalidad preferida de la invención el 'ligando específico dual' es un fragmento Fv de cadena única. En una modali dad alternativa de la invención, el 'ligando específico dual' consiste de un formato Fab. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona ácido nucleico codificando al menos un 'ligando específico dual' como se define en la presente. Un experto en la materia apreciará que, dependiendo del aspecto de la invención, tanto los antígenos como epítopos pueden unirse simultáneamente a la misma molécula de anticuerpo. Alternativamente, pueden competir para unión a la misma molécula de anticuerpo. Por ejemplo, donde ambos epítopos se unen simultáneamente, ambos dominios variables de un ligando específico dual son capaces de unir independientemente sus epítopos objetivo. Donde los dominios compiten, el dominio variable es capaz de unir su objetivo, pero no al mismo tiempo que el otro dominio variable une su objetivo cognado; o el primer dominio variable es capaz de unir su objetivo, pero no al mismo tiempo que el segundo dominio variable une su objetivo cognado. Las regiones variables pueden derivarse de anticuerpos dirigidos contra antígenos o epítopos objetivos. Alternativamente pueden derivarse de un repertorio de dominios de anticuerpo únicos tales como aquellos expresados en la superficie de bacteriófago filamentoso. La selección puede realizarse como se describe abajo.

En general, las moléculas de ácido nucleico y construcciones de vector requeridas para el desempeño de la presente invención pueden construirse y manipularse como se establece en los manuales de laboratorio estándar, tal como Sambrook ef al. ( 1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USA. La manipulación de ácidos nucleicos útiles en la presente invención se lleva a cabo típicamente en vectores recombinantes.

De esta manera en un aspecto adicional , la presente invención proporciona un vector comprendiendo ácido nucleico codificando al menos un 'ligando específico dual' como se define en la presente. Como se utiliza en la presente, vector se refiere a un elemento discreto que es utilizado para i ntroducir ADN heterólogo en células para la expresión y/o réplica del mismo. Los métodos mediante los cuales se seleccionan o construyen y, subsiguientemente, utilizan tales vectores se conocen bien por un experto ordinario en la materia. Numerosos vectores están públicamente disponibles, incluyendo plásmidos bacteriales, bacteriófago, cromosomas artificiales y vectores episomales. Tales vectores pueden utilizarse para mutagénesis y clonación simple; alternativamente el vector de expresión genética se emplea. Un vector de uso de acuerdo a la invención puede seleccionarse para acomodar una secuencia de codificación de polipéptido de un tamaño deseado, típicamente de 0.25 kilobase (kb) a 40 kb o más en longitud A, la célula huésped adecuada se transforma con el vector después de manipulaciones de clonación in vitro. Cada vector contiene varios componentes funcionales, que generalmente incluyen un sitio de clonación (o "polienlazador", un origen de réplica y al menos un gen marcador seleccionable. Si el vector dado es un vector de expresión, posee adicionalmente uno o más de los siguientes: elemento mejorador, promotor, terminación de transcripción y secuencias de señal , cada una colocada en la proximidad del sitio de clonación, de manera que se enlazan operativamente al gen codificando un ligando de acuerdo a la invención. Tanto los vectores de expresión como de clonación generalmente contienen secuencias de ácidos nucleicos que permiten que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Típicamente, en vectores de clonación, esta secuencia es una que permite al vector replicarse independientemente del ADN cromosómico huésped e incluye orígenes de réplica o secuencias de réplica autónomas. Tales secuencias se conocen bien por una variedad de bacterias, levadura y virus. El origen de réplica del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias de Gram negativo, el origen de plásmido de 2 micrones es adecuado para levadura, y varios orígenes virales (por ejemplo SV 40, adenovirus) son útiles para vectores de clonación en células de mamífero. Generalmente, el origen de réplica no es necesario para vectores de expresión de mamífero al menos que se utilicen en células de mamífero capaces de replicar altos niveles de ADN, tales como células COS. Ventajosamente, un vector de expresión o clonación puede contener un gen de selección también referido como un marcador seleccionable. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de células huésped transformadas desarrolladas en un medio de cultivo selectivo. Las células huésped no transformadas con el vector conteniendo el gen de selección por lo tanto no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que confieren resistencia a antibióticos y otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, deficiencias auxotróficas de complemento, o suministran nutrientes críticos no disponibles en el medio de crecimiento. Ya que la réplica de los vectores codificando un ligando de acuerdo a la presente invención se realiza más convenientemente en E. coli, un marcador seleccionable de E. coli, por ejemplo, el gen ß-lactamasa que confiere resistencia a la ampicilina antibiótica, es de uso. Estos pueden obtenerse de plásmidos de E. coli, tales como pBR322 o un plásmido pUC tal como pUC18 o pUC19. Los vectores de expresión usualmente contienen un promotor que se reconoce por el organismo huésped y se enlaza operativamente a la secuencia de codificación de interés. Tal un promotor puede ser induci ble o constitutivo. El término "enlazado operativamente" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar en su manera propuesta. Una secuencia de control "enlazada operativamente" a una secuencia de codificación se liga en una manera que la expresión de la secuencia de codificación se logra bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. Los promotores adecuados para utilizarse con huéspedes procarióticos incluyen, por ejemplo, los sistemas de ß-lactamasa y promotor de lactosa, fosfatasa alcalina, el sistema promotor de triptofan (trp) y promotores híbridos tal como el promotor tac. Los promotores para utilizarse en sistemas bacterianos también generalmente contendrán una secuencia Shine-Delgarno operablemente enlazada a la secuencia de codificación. Los vectores preferidos son vectores de expresión que permiten la expresión de una secuencia de nucleótidos correspondiente a un miembro de biblioteca de polipéptido. De esta manera, la selección con el primer y/o segundo antígeno o epítopo puede realizarse por expresión o propagación separada de un clon único expresando el miembro de biblioteca de polipéptidos o por uso de cualquier sistema de despliegue de selección. Como se describe arriba, el sistema de despliegue de selección preferido es despliegue de bacteriófago. De esta manera, vectores de fagemido o fago pueden utilizarse, por ejemplo plT1 o plT2. Secuencias guía útiles en la invención incluyen pelB, stll, ompA, phoA, bla y pelA. Un ejemplo son vectores de fagemido que tienen un origen de réplica de E. coli. (para réplica de doble filamento) y también un origen de réplica de fago (para producción de ADN de filamento único). La manipulación y expresión de tales vectores se conocen bien en la materia (Hoogenboom and Winter (1992) supra; Nissim ef al. (1994) supra). Brevemente, el vector contiene un gen ß-lactamasa para conferir selectividad en el fagemido y un promotor lac aguas arriba de un cassette de expresión que consiste (terminal N a C) de una secuencia guía pelB (que dirige el polipéptido expresado al espacio periplásmico), un sitio de clonación múltiple (para clonación de la versión de nucleótido del miembro de biblioteca), opcionalmente, uno o más péptidos tag (para detección), opcionalmente, uno o más de codón de detención TAG y la proteína de fago pl ll . De esta manera, utilizando varias cepas supresoras y no supresoras de E. coli y con la adición de glucosa, iso-propil tio-ß-D-galactósido (I PTG) o un fago ayudante, tal como VCSM 13, el vector es capaz de replicarse como un plásmido sin expresión, producir grandes cantidades del miembro de biblioteca de polipéptido solamente o producir fago, algunos de los cuales contienen al menos una copia de la fusión polipéptido-pl l l en su superficie. La construcción de vectores codificando ligandos de acuerdo a la invención emplea técnicas de ligación convencionales. Los vectores aislados o fragmentos de ADN se desdoblan, adaptan, y religan en la forma deseada para generar el vector requerido. Si se desea, el análisis para confirmar que las secuencias correctas están presentes en el vector construido puede realizarse en una manera conocida. Los métodos adecuados para construir vectores de expresión, preparar transcripciones in vitro, introducir ADN en células huésped, y realizar análisis para valorar la expresión y función se conocen por aquellos expertos en la materia. La presencia de una secuencia de gen en una muestra se detecta, o su amplificación y/o expresión se cuantifica por métodos convencionales, tales como análisis Southern o Northern, Western blotting, dot blotting de ADN, ANR o proteína, hibridización in situ, inmunohistoquímica o análisis de secuencia de moléculas de proteína y ácido nucleico. Aquellos expertos en la materia fácilmente contemplarán como estos métodos pueden modificarse, si se desea. Estructura de Ligandos Multiespecíficos de Conformación Cerrada De acuerdo a un aspecto de la segunda configuración de la presente invención, los dos o más dominios de unión al epítopo no complementarios se enlazan de manera que están en una conformación cerrada como se define en la presente. Ventajosamente, pueden unirse además a una estructura que puede, como una alternativa, o además de un enlazador descrito en la presente, facilitar la formación y/o mantenimiento de la conformación cerrada de los sitios de unión al epítopo con respecto uno al otro. (I) Estructuras Estructuras pueden basarse en moléculas de inmunoglobulina o puede ser no inmunoglobulina en origen como se establece arriba. Las estructuras de inmunoglobulina preferidas como se definen en la presente incluyen cualquiera de uno o más de aquellos seleccionados de los siguientes: (i) el dominio CL (subclase kappa o lambda) de un anticuerpo; o (ii) el dominio CH 1 de una cadena pesada de anticuerpo; una molécula de inmunoglobulina comprendiendo los dominios CH1 y CH2 de una cadena pesada de anticuerpo; una molécula de inmunoglobulina comprendiendo los dominios CH 1 , CH2 y CH3 de una cadena pesada de anticuerpo; o cualquiera del subconjunto (ii) junto con el dominio CL (subclase kappa o lambda) de un anticuerpo. Un dominio de región de articulación también puede incluirse. Tales combinaciones de dominios pueden, por ejemplo, imitar anticuerpos naturales, tales como IgG o I gM , o fragmentos de los mismos, tales como moléculas Fv, scFv, Fab o F(ab')2. Aquellos expertos en la materia estarán concientes de que esta lista no se propone ser exhaustiva. (I I) Andamios de proteína Cada dominio de unión al epítopo comprende un andamio de proteína y una o más CDRs que se incl uyen en la i nteracción específica del dominio con uno o más epítopos. Ventajosamente, un dominio de unión al epítopo de acuerdo a la presente ¡nvención comprende tres CDRs. Andamios de proteína adecuados i ncl uyen cualquiera de aquellos seleccionados del grupo consistiendo de los siguientes: aquellos basados en dominios de inmunoglobulina, aquellos basados en fibronecti n, aquellos basados en afficuerpos, aquell os basados en CTLA4, aquellos basados en chaperones tal como GroEL, aquellos basados en lipocalina y aquellos basados en los receptores SpA y SpD Fc bacterianos. Aquellos expertos en la materia apreciarán que esta lista no se propone ser exhaustiva. F: Andamios para utilizarse en la construcción de li gandos específicos duales i . Selección de la conformación de cadena principal Los miembros de la superfamilia de inmunoglobulina también comparten un doblez simil ar para su cadena de poli péptido. Por ejemplo, aunque los anticuerpos son altamente diversos en térmi nos de su secuencia primaria, la comparación de secuencias y estructuras cristalográficas ha revelado que, contraria a la expectación, ci nco de los seis ciclos de unión al antígeno de anticuerpos (H 1 , H2, L1 , L2, L3) adoptan un número limitado de conformaciones de cadena principal, o estructuras canónicas (Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol, 196: 901 ; Chothía et al. (1989) Nature, 342: 877). Análisis de longitudes de ciclo y residuos clave por lo tanto ha permitido la predicción de las conformaciones de cadena principal de H 1 , H2, L1 , L2 y L3 encontradas en la mayoría de los anticuerpos de humano (Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol, 227: 799; Tomlinson et al. (1995) EMBOJ. , 14: 4628; Williams et al. ( 1996) J. Mol. Biol, 264: 220). Aunque la región H3 es mucho más diversa en térmi nos de secuencia, longitud y estructura (debido al uso de segmentos D), también forma un número limitado de conformaciones de cadena principal para longitudes de ciclo corto que dependen de la longitud y la presencia de residuos particulares, o tipos de residuo, en posiciones clave en el ciclo y la estructura de anticuerpo (Martin ef al. (1996) J. Mol Biol, 263: 800; Shirai ef al. ( 1996) FEBS Letters, 399: 1 ). Los ligandos específicos duales de ia presente invención se ensamblan ventajosamente de bibliotecas de dominios, tales como bibliotecas de dominios VH y/o bibliotecas de dominios V . Además, los ligandos específicos duales de la invención pueden por si mismo proporcionarse en la forma de bibliotecas. En un aspecto de la presente invención, bibliotecas de ligandos específicos duales y/o dominios se diseñan, en las cuales ciertas longitudes de ciclo y residuos clave se han elegido para asegurar que la conformación de cadena principal de los miembros se conoce. Ventajosamente, estas son conformaciones reales de moléculas de superfamilia de inmunoglobulina encontradas en naturaleza, para minimizar los oportunidades que no son funcionales, como se trata arriba. Los segmentos de gen V de línea germinal sirven como una estructura básica adecuada para construir las bibliotecas de receptor de célula T o anticuerpo; otras secuencias también son de uso. Variaciones pueden ocurrir a una baja frecuencia, de manera que un número pequeño de miembros funcionales puede poseer una conformación de cadena principal alterada, que no afecta su función. La teoría de estructura canónica también es de uso para valorar el número de diferentes conformaciones de cadena principales codificadas por ligando, para predecir la conformación de cadena principal en base a las secuencias de ligando y para elegir residuos para diversificación que no afectan la estructura canónica. Se sabe que, en el dominio V? de humano, el ciclo L1 puede adoptar una de cuatro estructuras canónicas, el ciclo L2 tiene una estructura canónica única y ese 90% de dominios V? de humano adopta una de cuatro o cinco estructuras canónicas para el ciclo L3 (Tomlinson ef al. (1995) supra); de esta manera, en el dominio V? solo, diferentes estructuras canónicas pueden combinarse para crear un rango de diferentes conformaciones de cadena principales. Dado que el dominio V? codifica un rango diferente de estructuras canónicas para los ciclos L1 , L2 y L3 y que los dominios V? y V? pueden emparejarse con cualquier dominio V que puede codificar varias estructuras canónicas para los ciclos H 1 y H2, el número de combinaciones de estructura canónica observadas para estos cinco ciclos es muy grande. Esto implica que l a generación de diversidad en la conformación de cadena principal puede ser esencial para la producción de un amplio rango de especificidades de unión. Sin embargo, al construir una biblioteca de anticuerpos en base a una conformación de cadena princi pal conocida única se ha encontrado, contrario a la expectación, que la diversidad en la conformación de cadena principal no se requiere para generar suficiente diversidad para tener como objetivo substancialmente todos los antígenos. Aún más sorprendentemente, la conformación de cadena principal única no necesita ser una estructura consenso - una conformación que ocurre de manera natural única puede utilizarse como la base para una bi blioteca completa. De esta manera, en un aspecto preferido, los ligandos específicos duales de la invención poseen una conformación de cadena principal conocida única. La conformación de cadena principal única que se elige es preferentemente de lugar común entre moléculas del tipo de superfamilia de inmunoglobulina en cuestión. Una conformación es de lugar común cuando un número significativo de moléculas que ocurren de manera natural se observan para adoptarla. De acuerdo con lo anterior, en un aspecto preferido de la i nvención, la ocurrencia natural de las diferentes conformaciones de cadena principal para cada ciclo de unión de un dominio de inmunoglobulina se consideran por separado y entonces un dominio variable que ocurre de manera natural se elige, que posee la combinación deseada de conformaciones de cadena principal para los diferentes ciclos. Si ninguna está disponible, el equivalente más cercano puede elegirse. Es preferible que la combinación deseada de conformaciones de cadena principal para los diferentes ciclos se crea al seleccionar segmentos de gen de línea germinal que codifican las conformaciones de cadena principal deseadas. Es más preferible, que los segmentos de gen de línea germinal seleccionados se expresan frecuentemente en naturaleza, y más preferible que se expresan más frecuentemente de todos los segmentos de gen de línea germinal natural . Para diseñar ligandos específicos duales o bibliotecas de los mismos la incidencia de las diferentes conformaciones de cadena principal para cada uno de los seis ciclos de unión al antígeno puede considerarse por separado. Para H1 , H2, L1 , L2 y L3, una conformación dada que se adopta por entre 20% y 100% de los ciclos de unión al antígeno de moléculas que ocurren de manera natural se elige. Típicamente, su incidencia observada es arriba de 35% (es decir entre 35% y 100%) e, idealmente, arriba de 50% o aún arriba de 65%. Ya que la mayoría vasta de ciclos H3 no tiene estructuras canónicas, es preferible seleccionar una conformación de cadena principal que es de lugar común entre aquellos ciclos que no despliegan estructuras canónicas. Para cada uno de los ciclos, la conformación que se observa más frecuente en el repertorio natural por lo tanto se selecciona. En anticuerpos de humano, las estructuras canónicas (CS) más populares para cada ciclo son como sigue: H 1 -CS 1 (79% del repertorio expresado), H2-CS 3 (46%), L1 -CS 2 de V? (39%), L2-CS 1 (1 00%), L3-CS 1 de V? (36%) (cálculo asume una proporción ?:? de 70:30, Hood ef al. (1967) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol, 48: 133). Para ciclos H3 que tienen estructuras canónicas, una longitud CDR3 (Kabat ef al. ( 1991 ) Sequences of proteins of immunological interest. Departamento de EE.UU. de Servicios Humanos y de Salud) de siete residuos con un auto-puente de residuo 94 a residuo 101 parece ser más común. Existen al menos 16 secuencias de anticuerpo de humano en la biblioteca de datos EMBL con la longitud H3 requerida y residuos clave para formar esta conformación y al menos dos estructuras cristalográficas en el banco de datos de proteína que pueden utilizarse como una base para modelado de anticuerpo (2cgr y 1 tet). Los segmentos de gen de línea germinal expresados más frecuentemente por esta combinación de estructuras canónicas son los segmentos VH 3-23 (DP-47), el segmento JH J H4b, el segmento V? 02/012 (DPK9) y el segmento J? J?l. Los segmentos VH DP45 y DP38 también son adecuados. Estos segmentos por lo tanto, pueden utilizarse en combinación como una base para construir una biblioteca con la conformación de cadena principal única deseada. Alternativamente, en lugar de elegir la conformación de cadena principal única en base a la ocurrencia natural de las diferentes conformaciones de cadena principal para cada uno de los ciclos de unión en aislamiento, la ocurrencia natural de combinaciones de conformaciones de cadena principal se utiliza como la base para elegir la conformación de cadena principal única. En el caso de anticuerpos, por ejemplo, la ocurrencia natural de combinaciones de estructura canónica para cualquiera dos, tres, cuatro, cinco o todos los seis de los ciclos de unión al antígeno puede determinarse. Aquí, es preferible que la conformación elegida sea de lugar común en anticuerpos que ocurren de manera natural y más preferentemente que se observa más frecuentemente en el repertorio natural. De esta manera, en anticuerpos de humano, por ejemplo, cuando combinaciones naturales de los cinco ciclos de unión al antígeno, H 1 , H2, L1 , L2 y L3, se consideran, la combinación más frecuente de estructuras canónicas se determina y entonces se combina con la conformación más popular para el ciclo H3, como una base para elección de la conformación de cadena principal única, ii. Diversificación de la secuencia canónica Habiendo seleccionado varias conformaciones de cadena principal conocidas o, preferentemente una conformación de cadena principal conocida única, ligandos específicos duales de acuerdo a la invención o bibliotecas para utilizarse en la invención pueden construirse al variar el sitio de unión de la molécula para generar un repertorio con diversidad funcional y/o estructural. Esto significa que variantes se generan de manera que poseen suficiente diversidad en su estructura y/o en su función de manera que son capaces de proporcionar un rango de actividades. La diversidad deseada se genera típicamente al variar la molécula seleccionada en una o más posiciones. Las posiciones a cambiarse pueden elegirse al azar y se seleccionan preferentemente. La variación puede lograrse entonces ya sea al azar, durante lo cual el aminoácido residente se reemplaza por cualquier aminoácido o análogo del mismo, natural o sintético, produciendo un número muy grande de variantes o al reemplazar el aminoácido residente con uno o más de un subconjunto definido de aminoácidos, produciendo un número más limitado de variantes. Varios métodos se han reportado para introducir tal diversidad. PCR propenso a error (Hawkins ef al. (1992) J. Mol. Biol, 226: 889), mutagénesis química (Deng ef al. ( 1994) J. Biol. Chem. , 269: 9533) o cepas de mutador bacteriano (Low ét al. (1996) J. Mol. Biol, 260: 359) pueden utilizarse para introducir mutaciones aleatorias en los genes que codifican la molécula. Los métodos para mutar posiciones seleccionadas también se conocen bien en la materia e incluyen el uso de oligonucieótidos desacoplados o degeneran oligonucleótidos, con o sin el uso de PCR. Por ejemplo, varias bibliotecas de anticuerpos sintéticas se han creado al tener como objetivo mutaciones a los ciclos de unión al antígeno. La región H3 de un Fab de unión al toxoide de tétano de humano se ha aleatorizado para crear un rango de nuevas especificidades de unión (Barbas ef al. ( 1992) Proc. Nati. Acad. Sci USA, 89: 4457). Las regiones H3 y L3 semi-aleatorias o aleatorias se han anexado a los segmentos de gen V de línea germinal para producir grandes bibliotecas con regiones de estructura sin mutar (Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol Biol, 227: 381 ; Barbas et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 4457; Nissim ef al. (1994) EMBO J, 13: 692; Griffiths ef al. ( 1994) EMBO J. , 13:3245; De Kruif ef al. (1995) J. Mol. Biol, 248: 97). Tal diversificación se ha extendido para incluir algunos o todos de los otros ciclos de unión al antígeno (Crameri et al. (1996) Nature Med. , 2: 100; Riechmann et al. (1995) Bio/Technology, 13: 475; Morphosys, WO97/08320, supra). Ya que la aleatorización de ciclo tiene el potencial para crear aproximadamente más de 1015 estructuras para H3 solo y un número similarmente grande de variantes para los otros cinco ciclos, no es factible utilizando tecnología de transformación de corriente o aún al utilizar sistemas libres de célula, producir una biblioteca representando todas las combinaciones posibles. Por ejemplo, en una de las bibliotecas más grandes construidas a la fecha, 6x1010 diferentes anticuerpos, que es solamente una fracción de la diversidad potencial para una biblioteca de este diseño, se generan (Griffiths et al. (1994) supra). En una modalidad preferida, solamente aquellos residuos que se incluyen directamente para crear o modificar la función deseada de la molécula se diversifican. Para muchas moléculas, la función será unir un objetivo y por lo tanto la diversidad debe concentrarse en el sitio de unión al objetivo, mientras se evita el cambio de residuos que son cruciales para el empaquetado total de la molécula o para mantener la conformación de cadena principal elegida. Diversificación de la secuencia canónica a medida que se aplica a los dominios de anticuerpo En el caso de ligandos específicos duales de anticuerpo, el sitio de unión para el objetivo es más frecuentemente el sitio de unión al antígeno. De esta manera, en un aspecto altamente preferido, la ¡nvención proporciona bibliotecas de o para el ensamble de li gandos específicos duales de anticuerpo en que solamente aquellos residuos en el sitio de unión al antígeno se varían. Estos residuos son extremadamente diversos en el repertorio de anticuerpo de humano y se conocen por hacer contactos en complejos de anticuerpo/antígeno de alta resolución. Por ejemplo, en L2 se sabe que las posici ones 50 y 53 son diversas en anticuerpos que ocurren de manera natural y se observan por hacer contacto con el antígeno. En contraste, el planteamiento convencional habría sido diversificar todos los residuos en la Región Determi nante Complementari a (CDR 1 ) correspondiente como se define por Kabat ef al. ( 1 991 , supra), algunos siete residuos en comparación con los dos diversificados en la biblioteca para utilizarse de acuerdo a la invención. Esto representa una mejora significativa en térmi nos de la diversidad funcional requerida para crear un rango de especificidades de unión al antígeno. En naturaleza, la diversidad de anticuerpo es el resultado de dos procesos : recombi nación somática de segmentos de gen V, D, y J de l ínea germi nal para crear un repertorio primario puro (as í llamado diversidad de unión y línea germinal) e hi permutación somática de los genes V reordenados resultantes. El análisis de secuencias de anticuerpo de humano ha mostrado que l a diversidad en el repertorio primario se enfoca en el centro del sitio de unión al antígeno, mientras que la hipermutación somática difunde diversidad a regiones en la periferia del sitio de unión al antígeno que se conservan altamente en el repertorio primario (ver Tomlinson et al ( 1996) J. Mol. Biol, 256: 813). Esta complementariedad se ha incluido probablemente como una estrategia eficiente para espacio de secuencia de búsqueda y, aunque aparentemente única a anticuerpos, puede aplicarse fácilmente a otros repertorios de polipéptidos. Los residuos que se varían son un subconjunto de aquellos que forman el sitio de unión para el objetivo. Diferentes subconjuntos (incluyendo recubrimiento) de residuos en el sitio de unión objetivo se diversifican en diferentes etapas durante la selección, si se desea. En el caso de un repertorio de anticuerpo, un repertorio 'puro' inicial se crea donde algunos, pero no todos, los residuos en el sitio de unión al antígeno se diversifican. Como se utiliza en la presente en este contexto, el término "puro" se refiere a moléculas de anticuerpos que no tienen objetivo pre-determinado. Estas moléculas se parecen a aquellas que se codifican por los genes de inmunoglobulina de un individuo quien no ha experimentado diversificación inmune, como es el caso con individuos recién nacidos y fetales, cuyo sistemas inmunes no se han cambiado aún por una amplia variedad de estímulos antigénicos. Este repertorio se selecciona entonces contra un rango de antígenos o epítopos. Si se requiere, diversidad adicional puede entonces introducirse fuera de la región diversificada en el repertorio inicial . Este repertorio madurado puede seleccionarse para función modificada, especificidad o afinidad. La invención proporciona dos diferentes repertorios puros de domi nios de unión para la construcción de ligandos específicos duales, o una biblioteca pura de ligandos específicos duales, en que algunos o todos los residuos en el sitio de unión al antígeno se varían. La biblioteca "primaria" imita el repertorio primario natural , con diversidad restringida a residuos en el centro del sitio de unión al antígeno que se diversifican en segmentos de gen V de línea germinal (diversidad de línea germinal) o se diversifican durante el proceso de recombinación (diversidad de unión). Aquellos residuos que se diversifican incluyen, pero no se limitan a, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98, L50, L53, L91 , L92, L93, L94 y L96. En la biblioteca "somática", la diversidad se restringe a residuos que se diversifican durante el proceso de recombinación (diversidad de unión) o se mutan altamente de manera somática). Aquellos residuos que se diversifican incluyen, pero no se limitan a: H31 , H33, H35, H95, H96, H97, H98, L30, L31 , L32, L34 y L96. Todos los residuos enlistados arriba como adecuados para diversificación en estas bibliotecas se conocen por hacer contactos en uno o más complejos de anticuerpo-antígeno. Ya que en ambas bibliotecas, no todos los residuos en el sitio de unión al antígeno se varían, diversidad adicional se incorpora durante selección al variar los residuos restantes, si se desea hacer esto. Debe ser aparente para un experto en la materia que cualquier subconjunto de cualquiera de estos residuos (o residuos adicionales que comprenden el sitio de unión al antígeno) puede utilizarse para la diversificación inicial y/o subsiguiente del sitio de unión al antígeno. En la construcción de bibliotecas para utilizarse en la invención, la diversificación de posiciones elegidas se logra típicamente en el nivel de ácido nucleico, al alterar la secuencia de codificación que especifica la secuencia del polipéptido de manera que un número de aminoácidos posibles (todos los 20 o un subconjunto de los mismos) puede incorporarse en esa posición. Utilizando la nomenclatura l UPAC, el codón más versátil es NNK, que codifica todos los aminoácidos así como también el codón de detención TAG. El codón NNK preferentemente se utiliza para introducir la diversidad requerida. Otros codones que logran los mismos finales también son de uso, incluyendo el codón NNN. que conduce a la producción de los codones de detención adicionales TGA y TAA. Una característica de diversidad de cadena lateral en el sitio de unión al antígeno de anticuerpos de humano es una desviación pronunciada que favorece ciertos residuos de aminoácido. Si la composición de aminoácido de las diez posiciones más diversas en cada una de las regiones VH, V? y V? se suma, más del 76% de la diversidad de cadena lateral viene de solamente siete diferentes residuos, estos siendo, serina (24%), tirosina (14%) , asparagina ( 1 1 %), glicina (9%), alanina (7%), aspartato (6%) y treonina (6%) .

Esta desviación hacia residuos hidrofílicos y residuos pequeños que pueden proporcionar flexibilidad de cadena principal probablemente refleja la evolución de superficies que se predisponen a unión de un amplio rango de antígenos o epítopos y puede ayudar a explicar la promiscuidad requerida de anticuerpos en el repertorio primario. Ya que es preferible imitar esta distribución de aminoácidos, la distribución de aminoácidos en las posiciones a variarse preferentemente imita aquella observada en el sitio de unión al antígeno de anticuerpos. Tal desviación en la substitución de aminoácidos que permite la selección de ciertos polipéptidos (no solo polipéptidos de anticuerpo) contra un rango de antígenos objetivo se aplica fácilmente a cualquier repertorio de polipéptido. Existen varios métodos para desviar la distribución de aminoácido en la posición a vararse (incluyendo el uso de mutagénesis de tri-nucleótido, ver WO97/08320), del cual el método preferido, debido á la facilidad de síntesis, es el uso de codones degenerados convencionales. Al comparar el perfil de aminoácido codificado por todas las combinaciones de codones degenerados (con degenerancia única, doble, triple y cuádruple en proporciones iguales en cada posición) con el uso de aminoácido natural es posible calcular el codón más representativo. Los codones (AGT)(AGC)T, (AGT)(AGC)C y (AGT)(AGC)(CT)-es decir, DVT, DVC y DVY, respectivamente utilizando nomenclatura lUPAC- son aquellos más cercanos al perfil de aminoácido deseado: codifican 22% serina y 1 1 % tirosina, asparagina, glicina, alanina, aspartato, treonina y cisteína.

Preferentemente, por lo tanto, bi bliotecas se construyen utilizando ya sea el codón DVT, DVC o DVY en cada una de las posiciones diversificadas. G: Antígenos capaces de incrementar la vida media del ligando Los ligandos específicos duales de acuerdo a la invención, en un configuración de los mismos, son capaces de unirse a una o más moléculas que pueden incrementar la vida media ligando in vivo. Típicamente, tales moléculas son polipéptidos que ocurren de manera natural in vivo y que resisten la degradación o retiro por mecanismos endógenos que remueven material no deseado del organismo. Por ejemplo, la molécula que incrementa la vida media del organismo puede seleccionarse de lo siguiente: Proteínas de la matriz extracelular; por ejemplo colágeno, lamininas, integrinas y fibronectina. Colágenos son las proteínas principales de la matriz extracelular. Aproximadamente 15 tipos de moléculas de colágeno se conocen actualmente, encontrados en diferentes partes del cuerpo, por ejemplo, colágeno tipo I (considerando 90% del colágeno corporal) encontrado en hueso, piel, tendón, ligamentos, córnea, órganos internos o colágeno tipo II encontrado en cartílago, disco invertebrado, notocordio, humor vitreo del ojo. Proteínas encontradas en la sangre, incluyendo: Proteínas de plasma tal como fibrina, macroglobulina a-2, albúmina de suero, fibrinogen A, fibrinogen B, proteína A amiloide de suero, heptaglobin, profilin, ubiquitin, uteroglobulin y ß-2- microglobulin; Enzimas e inhibidores tales como plasminogen, lisozima, cistatina C, alfa-1 -antitripsina e inhibidor de tripsina pancreático.

Plasminogen es el precursor inactivo de plasmin de proteasa de serina similar a tripsin. Se encuentra normalmente circulando a través de la corriente sanguínea. Cuando el plasminogen se activa y se convierte en plasmin, se desdobla un dominio enzimático potente que disuelve ias fibras de fibrinogen que enredan las células sanguíneas en un coágulo sanguíneo. Esto se llama fibronolisis. Proteínas del sistema inmune, tales como IgE, IgG, IgM. Proteínas de transporte tales como proteína de unión al retinol, a-1 microglobulin. Defensinas tales como beta-defensin 1, defensinas de neutrófilo 1,2 y 3. Proteínas encontradas en la barrera cerebral sanguínea o en tejidos neurales, tales como receptor de melanocortin, mielin, transportador de ascorbato. Proteínas de fusión de agente neuorofarmacéutico de ligando específico de receptor de transferrina (ver US5977307); Receptor de célula endotelial capilar de cerebro, transferrina, receptor de transferrina, insulina, receptor del factor de crecimiento similar a insulina 1 (IGF 1), receptor de factor de crecimiento similar a insulina 2 (IGF 2), receptor de insulina. Proteínas localizadas al riñon, tales como policistin, colágeno tipo IV, transportador de anión orgánico K1, antígeno de Heymann.

Proteínas localizadas al hígado, por ejemplo, dehidrogenasa de alcohol G250. Factor de coagulación de sangre x a1 antitripsina HNF 1 a Proteínas localizadas al pulmón, tal como componente secretor (uniones IgA). Proteínas localizadas en el corazón, por ejemplo HSP 27. Esta se asocia con cardiomiopatía dilatada. Proteinas localizadas en la piel, por ejemplo queratina. Proteínas específicas de hueso, tales como proteínas morfogénicas óseas (BM Ps), que son un subconjunto de la superfamilia ß del factor de crecimiento de transformación que demuestran actividad osteogénica. Ejemplos incluyen BMP-2, -4, -5, -6, -7 (también referida como proteína osteogénica (OP-1 ) y -8 (OP-2). Proteínas específicas de tumor, incluyendo antígeno de trofoblasto de humano, receptor de herceptin, receptor de estrógeno, catepsinas por ejemplo, catepsin B (encontradas en hígado y bazo). Proteínas específicas de enfermedad, tales como antígenos expresados solamente en células T activadas incluyendo LAG-3 (gen de activación de linfocíto), ligando de osteoprotegerina (OPGL) ver Nature 402, 304-309; 1999, OX40 (un miembro de la familia de receptor TNF, expresado en células T activadas y la solamente molécula de cél ula T coesti m uladora conocido por específicamente s upraregularse en cél ulas produciendo virus de leucemia de célula T de humano tipo I (HTLV-1 )) Ver J Immunol. 2000 Jul 1 ; 165(l):263-70; Metaloproteasas (asociadas con artritis/cánceres) , i ncl uyendo Drosofila CG6512, parapl egi na de humano, FtsH de humano, AFG3L2 de humano, ftsH de murino, factores de crecimiento angiogénicos, incluyendo factor de crecimiento de fibroblasto ácido (FGF-1 ), factor de crecimiento de fibroblasto básico (FG F-2) , factor de crecimiento endotelial vascular/factor de permeabilidad vascular (VE-G F/VPF) , factor-a de crecimiento de transformación (TGF a), Factor de Necrosis de Tumor-alfa (TNF-a), angiogenin, interleuquina-3 (I L-3), interleuquina-8 ( I L-8) , factor de crecimiento endotelial derivado de plaqueta (PD-ECGF) , factor de crecimiento placental (PIGF) , factor de crecimiento derivado de plaqueta midquina-BB (PDGF). fractalquina. Proteínas de tensión (proteínas de ataque térmico) HSPs se encuentran normalmente intracel ularmente. Cuando se encuentran extracelularmente, es un indicador de que una célula ha muerto y derramado sus contenidos. Esta muerte cel ular no programada (necrosi s) solamente ocurre cuando como un resultado de trauma, enfermedad o lesión y por lo tanto in vivo, HS Ps extracelulares activan una respuesta del sistema inmune que peleará la infección y enfermedad. Un específico dual que se une a HS P extracel ular puede localizarse en un sitio de enfermedad. Proteí nas i ncl uidas en transporte Fc Receptor Brambell (también conocido como FcRB) Este receptor Fc tiene dos funciones, ambas de las cuales son potencialmente útiles para suministro Las funciones son El transporte de IgG de madre a hijo a través de la placenta La protección de IgG de degradación prolongando así su vida de media en suero de IgG. Se piensa que el receptor recicla IgG de endosoma. Ver Holliger ef al. , Nat Biotechnol 1997 Jul; 15(7):632-6. Ligandos de acuerdo a la invención pueden diseñarse para ser específicos para los objetivos anteriores sin requerir ningún incremento en o vida media creciente in vivo. Por ejemplo, ligandos de acuerdo a la invención pueden ser específicos para objetivos seleccionados de los anteriores que son específicos de tejido, permitiendo así el objetivo específico de tejido del ligando específico dual, o un monómero dAb que une un objetivo terapéuticamente relevante específico del tejido, irrespectivo de cualquier incremento en vida media, aunque esto puede resultar. Además, donde el ligando o monómero dAb tiene como objetivo riñon o hígado, esto puede redirigir el ligando o monómero dAb o ligando a una trayectoria de despeje alternativo in vivo (por ejemplo, el ligando puede dirigirse lejos del despeje de hígado a despeje de riñon) . H: Uso de ligandos multiespecíficos de acuerdo a la segunda configuración de la invención Ligandos multiespecíficos de acuerdo al método de la segunda configuración de la presente i nvención pueden emplearse en aplicaciones profilácticas y terapéuticas in vivo, aplicaciones de diagnóstico in vitro e in vivo, ensayo in vitro y aplicaciones de reactivo, y lo similar. Por ejemplo moléculas de anticuerpo pueden utilizarse en técnicas de ensayo a base de anticuerpo, tales como técnicas E LISA, de acuerdo a métodos conocidos por aquellos expertos en la materia. Como se alude arriba, los ligandos multiespecíficos de acuerdo a la i nvención son de uso en procedimientos de diagnóstico, profilácticos y terapéuticos. Los anticuerpos m ultiespecíficos de acuerdo a la invención son de uso a manera de diagnóstico en análisis Western y detección de proteína in situ por procedimientos inmunohi stoquímicos estándar; para utilizarse en estas aplicaciones, los ligandos pueden marcarse de acuerdo con técnicas conocidas en la materia. Además, tales polipéptidos de anticuerpo pueden utilizarse de manera preparada en procedimientos de cromatografía de afi nidad, cuando se componen con un soporte cromatográfico, tal como una resi na. Todas tales técnicas se conocen bien por un experto en la materia. Usos de diagnóstico de los ligandos multiespecíficos de conformación cerrada de acuerdo a la invención i ncl uyen ensayos homogéneos para analitos que explotan la habilidad de ligandos multiespecíficos de conformación cerrada para unir dos objetivos en competición, de manera que los dos objetivos no pueden unir simultáneamente (una formación cerrada), o alternativamente su habilidad para unir dos objetivos (una conformación abierta). En un aspecto adicional de la segunda configuración de la invención, la presente invención proporciona un inmunoensayo homogéneo utilizando un ligando de acuerdo a la presente invención. Un formato de inmunoensayo homogéneo real se ha pensado ávidamente por fabricantes de diagnósticos y sistemas de ensayo de búsqueda utilizados en el desarrollo y descubrimiento de fármaco. Los mercados de diagnóstico principales incluyen prueba de humano en hospitales, oficinas de doctores, y clínicas, laboratorios de referencia comercial, bancos de sangre, y el hogar, diagnósticos no humanos (por ejemplo, prueba de alimento, prueba de agua, prueba ambiental, bio-defensa, y prueba veterinaria) y finalmente búsqueda (incluyendo desarrollo de fármaco; búsqueda básica y búsqueda académica). En el presente todos estos mercados utilizan sistemas de inmunoensayo que se forman alrededor de tecnologías quimiluminescente, ELISA, fluorescencia o en casos raros radioinmunoensayo. Cada uno de estos formatos de ensayo requiere una etapa de separación (separación unida de reactivos no unidos). En algunos casos, varias etapas de separación se requieren. La adición de estas etapas adicionales agrega reactivos y automatización, toma tiempo, y afecta el resultado final de los ensayos. En diagnósticos de humano, la etapa de separación puede ser automática, lo que oculta el problema, pero no lo remueve. Las robóticas, reactivos adicionales, tiempos de incubación adicionales, y lo similar agregan costos considerables y complej idad. En desarrollo de fármaco, tal como selección de alto rendimi ento, donde literalmente millones de muestras se prueban una vez, con niveles muy bajos de molécula de prueba, la adición de etapas de separación adicionales pueden eli minar la habilidad para reali zar una selección. Sin embargo, el evitar la separación crea demasiado ruido en la lectura. De esta manera, existe una necesidad de un formato homogéneo real que proporciona sensibilidades en el rango obtenible de formatos de ensayo presentes. Ventajosamente, un ensayo posee lecturas completamente cuantitativas con alta sensibilidad y un gran rango dinámico. La sensibilidad es un requerimiento importante, a medida que reduce la cantidad de muestra requerida. Ambas de estas características son características que ofrece un sistema homogéneo. Esto es muy importante en el punto de prueba de cuidado, y en desarrollo de fármaco donde las muestras son preciosas. Los sistemas heterogéneos, actualmente disponibles en la materia, requieren grandes cantidades de muestra y reactivos costosos. Las aplicaciones para ensayos homogéneos incluyen prueba de cáncer, donde ei ensayo más grande es aquel para Antígeno Específico de Próstata, utilizado en seleccionar hombres para cáncer de próstata. Otras aplicaciones incluyen prueba de fertilidad, que proporciona una serie de pruebas para mujeres que intentan concebir incluyendo beta-hcg para embarazo. Pruebas para enfermedades infecciosas, incluyendo hepatitis, VI H , rubéola, y otros virus y microorganismos y enfermedades sexualmente transmitidas. Las pruebas se utilizan por bancos de sangre, especialmente para pruebas de VI H, hepatitis A, B, C, no A no B. Las pruebas de monitoreo de fármaco terapéutico incluyen monitorear niveles de fármacos prescritos en pacientes para eficacia y evitar toxicidad, por ejemplo, digoxin para arritmia, y niveles fenobarbitales en casos sicóticos; treofilina para asma. Las pruebas de diagnóstico son además útiles en prueba de abuso de fármaco, tal como prueba para cocaína, marihuana y lo similar. Pruebas metabólicas se utilizan para medir la función de tiroides, anemia y otros desordenes fisiológicos y funciones. El formato de inmunoensayo homogéneo es además útil en la fabricación de ensayos de química clínicos estándar. La inclusión de inmunoensayos y ensayos químicos en el mismo instrumento es altamente ventajosa en prueba de diagnóstico. Los ensayos químicos adecuados incluyen pruebas para glucosa, colesterol , potasio, y lo similar. Una aplicación principal adicional para inmunoensayos homogéneos es descubrimiento y desarrollo de fármaco: selección de alto rendimiento incluye probar bibliotecas de química combinatoria contra objetivos en volumen ultra alto. La señal se detecta, y grupos positivos que se separan en grupos más pequeños, y eventualmente se prueban en células y después animales. Los ensayos homogéneos pueden utilizarse en todos estos tipos de prueba. En desarrollo de fármaco, especialmente estudios en animales y pruebas se hace uso pesado de pruebas clínicas de inmunoensayos. Los ensayos homogéneos aceleran grandemente y simplifican estos procedimientos. Otras aplicaciones incluyen prueba de bebida y alimento: probar carne y otros alimentos para E. coli, salmonela, etc; prueba de agua, incluyendo prueba en plantas de agua para todos los tipos de contaminantes incluyendo E. coli; y prueba veterinaria. En una modalidad amplia, la invención proporciona un ensayo de unión comprendiendo un agente detectable que se une a un ligando multiespecífico de conformación cerrada de acuerdo a la invención, y cuyas propiedades detectables se alteran por la unión de un anaiito a dicho ligando multiespecífico de conformación cerrada. Tal ensayo puede configurarse en varias maneras diferentes, cada una explotando las propiedades anteriores de ligandos multiespecíficos de conformación cerrada. El ensayo se basa en el desplazamiento directo o indirecto de un agente por el analito, resultando en un cambio en las propiedades detectables del agente. Por ejemplo, donde el agente es una enzima que es capaz de catalizar una reacción que tiene un punto final detectable, dicha enzima puede unirse por el ligando para obstruir su sitio activo, inactivando así la enzima. El analito, que también se une por el ligando multiespecífico de conformación cerrada, desplaza la enzima, volviéndola activa a través de liberación del sitio activo. La enzima es entonces capaz de reaccionar con un substrato, para dar origen a un evento detectable. En una modalidad alternativa, el ligando puede unir la enzima fuera del sitio activo, influenciando la conformación de la enzima y de esta manera alterando su actividad. Por ejemplo, la estructura del sitio activo puede limitarse por la unión del ligando, o la unión de cofactores necesarios para actividad puede prevenirse. La implementación física del ensayo puede tomar cualquier forma conocida en la materia. Por ejemplo, el complejo de enzima/ligando multiespecífico de conformación cerrada puede proporcionarse en una cinta de prueba: el substrato puede proporcionarse en una región diferente de la cinta de prueba, y un solvente conteniendo el analizo permite migrar a través del complejo ligando/enzima, desplazando la enzima, y llevándola a la región de substrato para producir una señal . Alternativamente, el complejo ligando/enzima puede proporcionarse en un palo de prueba u otra fase sólida, y sumerge en una solución de analito/substrato, liberando enzima en la solución en respuesta a la presencia de analito. Ya que cada molécula de analito potencialmente libera una molécula de enzima, el ensayo es cuantitativo, con la intensidad de la señal generada en un tiempo dado siendo dependiente en la concentración de analito en la solución. Configuraciones adicionales utilizando el analito en una conformación cerrada son posibles. Por ejemplo, el ligando multiespecífico de conformación cerrada puede configurarse para unir una enzima en un sitio alostérico, activando así la enzima. En tal modalidad, la enzima está activa en la ausencia de analito. Adición del analito desplaza l a enzi ma y remueve la activación alostérica, inactivando así la enzima. En el contexto de las modalidades anteriores que emplean actividad de enzima como una medición de la concentración de analito, activación o i nactivaci ón de la enzima se refiere a un incremento o disminución en la actividad de la enzima, medida como la habilidad de la enzima para catalizar una reacción de generación de señal . Por ejemplo, la enzi ma puede catalizar la conversión de un substrato no detectable a una forma detectable de la misma. Por ejemplo, peroxidasa de rábano picante se utiliza ampliamente en la materia junto con substratos quimiluminescentes o cromogénicos, que están comercialmente disponi bles. El nivel de i ncremento o dismi nución de la actividad de l a enzi ma puede estar entre 1 0% y 1 00%, tal como 20%, 30%. 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90%; en el caso de un incremento en actividad, el incremento puede ser de más de 1 00%, es decir 200%, 300%, 500% o más , o puede no ser medi ble como un porcentaje si la actividad de l ínea base de la enzima inhibida no se detecta. En una configuración adicional, el ligando multiespecífico de conformación cerrada puede uni r el substrato de un par de enzima/substrato, en l ugar de l a enzi ma. El substrato por lo tanto no está disponible a la enzima hasta que se libera del ligando multiespecífico de conformación cerrada a través de unión del analito. Las implementaciones para esta configuración son como para las configuraciones que unen la enzima. Además, el ensayo puede configurarse para unir una molécula fluorescente, tal como una fluoresceína u otro fluoroforo, en una conformación de manera que la fluoresceína se templa en unión al ligando. En este caso, la unión del analito al ligando desplazará la molécula fluorescente, produciendo así una señal. Alternativas para moléculas fluorescentes que son útiles en la presente invención incluyen agentes luminescentes, tales como luciferin/luciferasa, y agentes cromogénicos, incluyendo agentes comúnmente utilizados en inmunoensayos tal como HRP. Usos y composiciones de diagnóstico y terapéuticos La invención proporciona composiciones comprendiendo un antagonista de TNFR1 (por ejemplo ligando) de la invención (por ejemplo, ligando específico dual, ligando multiespecífico, monómero dAb) y vehículo farmacéuticamete aceptable, diluyente o excipiente, y métodos de diagnóstico y terapéuticos que emplean los ligandos o composiciones de la invención. Antagonistas y ligandos (por ejemplo, ligandos específicos duales, ligandos multiespecíficos, monómeros dAb) de acuerdo al método de la presente invención pueden emplearse en aplicaciones profilácticas y terapéuticas in vivo, aplicaciones de diagnóstico in vivo y lo similar. Usos profilácticos y terapéuticos de antagonistas y ligandos (por ejemplo, ligandos multiespecíficos, ligandos específicos duales, monómeros dAb) de la invención incluyen la administración de antagonistas y/o ligandos de acuerdo a la invención a un mamífero receptor, tal como un humano. Ligandos multiespecíficos y específicos duales (por ejempl o, formatos de anticuerpo específico dual) para unirse a antígeno multimérico con mayor avidez. Ligandos duales o multiespecíficos pueden permitir la degradación de dos antígenos, por ejemplo en reclutar células T citotóxicas para mediar la muerte de estirpes de célula de tumor. Ligandos substancialmente puros o proteínas de unión de los mismos, por ejemplo monómeros dAb, de al menos 90 a 95% homogeneidad se prefieren para administración a un mamífero, y 98 a 99% o más homogeneidad se prefiere más para usos farmacéuticos, especialmente cuando el mamífero es un humano. Una vez purificados, parcialmente o a homogeneidad según se desee, los ligandos pueden utilizarse diagnóstica o terapéuticamente (incluyendo extracorporalmente) o para desarrollar y realizar procedimientos de ensayo, coloraciones inmunofluorescentes y lo similar (Lefkovite and Pernis, (1979 y 1981 ) Immunological Methods, Vol umes I y I I , Academic Press, NY). Por ejemplo, los ligandos o proteínas de unión de los mismos, por ejemplo monómeros dAb, de la presente invención típicamente encontrarán uso para prevenir, suprimir o tratar estados inflamatorios incluyendo enfermedades inflamatorias crónicas y agudas. Por ejemplo, los antagonistas y/o ligandos pueden administrarse para tratar, suprimir o prevenir una enfermedad inflamatoria crónica, hipersensibilidad alérgica, cáncer, infección viral o bacteriana, desordenes autoinmunes (que incluyen, pero no se limitan a, diabetes tipo I , asma, esclerosi s múltiple, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil , artritis soriática, espondilartropatia (por ejemplo, espondilitis de anquilosante), lupus sistémico eritematoso, enfermedad del intestino inflamatorio (por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa), miastenia gravis y síndrome de Behcet), soriasis, endometriosis, y adhesiones abdominales (por ejemplo, cirugía post abdominal). Antagonistas (por ejemplo, ligandos) de acuerdo a la invención (por ejemplo, ligandos específicos duales, ligandos multiespecíficos, monómeros dAb) que son capaces de unirse a objetivos extracelulares incluidos en endocitosis (por ejemplo Clatrin) pueden endocitarse, permitiendo acceso a objetivos intracelulares. Además, ligandos multiespecífícos o duales, proporcionan un medio por el cual un dominio de unión (por ejemplo, un monómero dAb) que tiene especificidad capaz de unirse a un objetivo intracelular puede suministrarse a un ambiente intracelular. Esta estrategia requiere, por ejemplo, un ligando específico dual con propiedades físicas que le permiten permanecer funcional dentro de la célula. Alternativamente, si el compartimiento intracelular de destino final se oxida, un ligando de doblez de cavidad puede no necesitarse para estar libre de disulfuro. En la presente solicitud, el término "prevención" incluye administración de la composición protectora antes de la inducción de la enfermedad. "Supresión" se refiere a administración de la composición después de un evento inductivo, pero antes de la aparición cl ínica de la enfermedad. "Tratamiento" incluye administración de la composición protectora después de que los síntomas de enfermedad se manifiestan. Ventajosamente, los ligandos multiespecíficos o duales pueden utilizarse para citoquinas objetivo y otras moléculas que cooperan de manera sinergística en situaciones terapéuticas en el cuerpo de un organismo. La invención por lo tanto proporciona un método para sinergizar la actividad de dos o más dominios de unión (por ejemplo, dAbs) que unen citoquinas u otras moléculas, comprendiendo administrar un ligando multiespecífico o dual capaz de unirse a dichas dos o más moléculas (por ejemplo, citoquinas). En este aspecto de la invención, el ligando multiespecífico o dual puede ser cualquier ligando multiespecífico o dual , incluyendo un ligando compuesto de dominios complementarios y/o no complementarios, un ligando en una conformación abierta, y un ligando en una conformación cerrada. Por ejemplo, este aspecto de la invención se refiere a combinaciones de dominios VH y dominios V , domi nios VH solamente y dominios V solamente. Sinergia en un contexto terapéutico puede lograrse en un número de maneras. Por ejemplo, combinaciones objetivo pueden ser terapéuticamente activas solamente si ambos objetivos se tienen como objetivo por el ligando, mientras que el tener como objetivo uno solo no es terapéuticamente efectivo. En otra modalidad, un objetivo solo puede proporcionar algún efecto terapéutico mínimo o bajo, pero junto con un segundo objetivo la combinación proporciona un incremento sinergístico en efecto terapéutico. Preferentemente, las citoquinas unidas por los ligandos multiespecíficos o duales de este aspecto de la invención se seleccionan de la lista mostrada en el Anexo 2. Además, ligandos multiespecíficos o duales pueden utilizarse en aplicaciones de oncología, donde una especificidad con objetivo CD89, que se expresa por células citotóxicas, y el otro es especifico de tumor. Ejemplos de antígenos de tumor que pueden tenerse como objetivo se dan en Anexo 3. Los sistemas de modelo de animal que pueden utilizarse para seleccionar la efectividad de los antagonistas de TNFR1 (por ejemplo, ligandos, anticuerpos o proteínas de unión de los mismos) para proteger contra o tratar la enfermedad están disponibles. Métodos para la prueba de lupus sistémico eritematoso (SLE) en ratones susceptibles se conocen en la materia (Knight et al. (1978) J. Exp. Med. , 147: 1653; Reinersten et al. (1978) New Eng. J. Med. , 299: 515). Miastenia Gravis (MG) se prueba en ratones hembra SJ L/J al inducir la enfermedad con proteína AchR soluble de otras especies (Lindstrom et al. (1988) Adv. Immunol., 42: 233). Artritis se induce en una cepa susceptible de ratones por inyección de colágeno Tipo I I (Stuart ef al. (1984) Ann. Rev. Immunol, 42: 233). Un modelo mediante el cual la artritis adyuvante se induce en ratas susceptibles por inyección de proteína de ataque térmico microbacteriano se ha descrito (Van Edén et al. (1988) Nature, 331 : 171 ). Tiroidítis se induce en ratones por administración de tiroglobulin como se describe (Marón et al. (1980) J. Exp. Med., 152: 1 1 15). Diabetes mellitus dependiente de insulina (I DDM) ocurre de manera natural o puede inducirse en ciertas cepas de ratones tales como aquellos descritos por Kanasawa et al. ( 1984) Diabetologia, 27: 1 13. EAE en ratón y rata sirve como un modelo para MS en humano. En este modelo, la enfermedad de demielinación se induce por administración de proteína básica de mielin (ver Paterson (1986) Textbook of Immunopathology, Mischer et al. , eds., Gruñe and Stratton, New York, pp. 179-213; McFarlin ef al. (1973) Science, 179: 478: y Satoh et al. (1987) J. Immunol, 138: 179). Generalmente, los presentes antagonistas (por ejemplo, ligandos) se utilizarán en forma purificada junto con vehículos farmacológicamente apropiados. Típicamente, estos vehículos incluyen soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, cualquiera incluyendo salina y/o medio regulado. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio y Ringer lactado. Adyuvantes fisiológicamente aceptables adecuados, si es necesario mantener un complejo de polipéptido en suspensión, pueden elegirse de espesadores tales como carboximetilcelulosa, polivinil pirrolidona, gelatina y alginatos. Vehículos intravenosos incluyen rellenos de nutriente y fluido y rellenos de electrolito, tales como aquellos basados en dextrosa de Ringer. Conservadores y otros aditivos, tales como antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes, también pueden estar presentes (Mack (1982) Remington 's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition). Una variedad de tales formulaciones puede utilizarse, incluyendo formulación de liberación extendida. Los antagonistas (por ejemplo, ligandos) de la presente invención pueden utilizarse como composiciones administradas por separado o junto con otros agentes. Estos pueden incluir varios fármacos inmunoterapéuticos, tales como cilcosporina, metotrexato, adriamicin o cisplatino, e inmunotoxinas. Composiciones farmacéuticas pueden incluir "cócteles" de varios agentes citotóxicos y otros junto con los antagonistas (por ejemplo, ligandos) de la presente invención, o aún combinaciones de iigandos de acuerdo a la presente invención teniendo diferente especificidades, tales como ligandos seleccionados utilizando diferentes antígenos o epítopos objetivos, ya sea agrupados o no antes de administración. La vía de administración de composiciones farmacéuticas de acuerdo a la invención puede ser cualquiera de aquellas comúnmente conocidas por aquellos de experiencia ordinaria en la materia. Para terapia, incluyendo sin limitación inmunoterapia, los ligandos seleccionados de la misma de la invención pueden suministrarse a cualquier paciente de acuerdo con técnicas estándar. La administración puede ser por cualquier modo apropiado, incluyendo parenteralmente, intravenosamente, intramuscularmente, intraperitonealmente, transdérmicamente, a través de la vía pulmonar, o también, de manera apropiada por infusión directa con un catéter. La dosificación y frecuencia de administración dependerá de la edad, sexo y condición del paciente, administración concurrente de otros fármacos, contraindicaciones y otros parámetros tomados en cuenta por el médico. La administración puede ser local (por ejemplo, suministro local al pulmón por administración pulmonar, por ejemplo, administración intranasal) o sistémica como se indica. Los ligandos de esta invención pueden liofilizarse para almacenamiento y reconstituirse en un vehículo adecuado antes de utilizarse. Esta técnica se ha mostrado ser efectiva con inmunoglobulinas convencionales y técnicas de reconstitución y liofilización conocidas en la materia pueden emplearse. Se apreciará por aquellos expertos en la materia que liofilización y reconstitución pueden conducir a grados variables de pérdida de actividad de anticuerpo (por ejemplo, con inmunoglobulinas convencionales, anticuerpos IgM tienden a tener mayor pérdida de actividad que los anticuerpos IgG) y que utilizan niveles pueden haberse ajustado hacia arriba para compensación. Las composiciones conteniendo los presentes antagonistas (por ejemplo, ligandos) o un coctel de los mismos pueden administrarse para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En ciertas aplicaciones terapéuticas, una cantidad adecuada para realizar al menos inhibición parcial , supresión, modulación, muerte, o algún otro parámetro medible, de una población celular seleccionadas se define como una "dosis terapéuticamente efectiva". Las cantidades necesarias para lograr esta dosificación dependerán de la severidad de la enfermedad y el estado general del sistema inmune del paciente, pero generalmente varían de 0.005 a 5.0 mg de ligando, por ejemplo anticuerpo, receptor (por ejemplo un receptor de célula T) o proteína de unión del mismo por kilogramo de peso corporal , con dosis de 0.05 a 2.0 mg/kg/dosis siendo más comúnmente utilizados. Para aplicaciones profilácticas , composiciones conteniendo los presentes ligandos o cócteles de los mismos también pueden administrarse en dosificaciones similares o ligeramente inferiores, para prevenir, inhibir o retrasar el inicio de enfermedad (por ejemplo, para sostener remisión o quiescencia, o para prevenir fase aguda). El médico experto será capaz de determinar el intervalo de dosificación apropiado para tratar, suprimir o prevenir la enfermedad. Cuando un antagonista de TNFR1 (por ejemplo, ligando) se administra para tratar, suprimir o prevenir una enfermedad inflamatoria crónica, puede administrarse hasta cuatro veces por día, dos veces semanalmente, una vez semanalmente, una vez cada dos semanas, una vez al mes, una vez cada dos meses, a una dosificación, por ejemplo, aproximadamente 10 µg/kg a aproximadamente 80 mg/kg, aproximadamente 100 µg/kg a aproximadamente 80 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 80 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 70 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 60 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg , aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 10 µg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 10 µg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 10 µg/kg a aproximadamente 2.5 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 6 mg/kg, aproximadamente 7 mg/kg, aproximadamente 8 mg/kg, aproximadamente 9 mg/kg o aproximadamente 10 mg/kg. En modalidades particulares, el antagonista de TNFR1 (por ejemplo, ligando) se adminisfra para tratar, suprimir o prevenir una enfermedad inflamatoria crónica una vez cada dos semanas o una vez al mes en una dosis de aproximadamente 10 µg/kg a aproximadamente 10 mg/kg (por ejemplo, aproximadamente 10 µg/kg, aproximadamente 100 µg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 6 mg/kg, aproximadamente 7 mg/kg, aproximadamente 8 mg/kg, aproximadamente 9 mg/kg o aproximadamente 10 mg/kg.) Tratamiento o terapia realizada utilizando las composiciones descritas en la presente se considera "efectiva" si uno o más síntomas se reducen (por ejemplo, por al menos 10% o al menos un punto en una escala de valoración clínica), relativa a tales síntomas presentes antes del tratamiento, o relativa a tales síntomas en un individuo (humano o modelo ani mal) no tratado con tal composición u otro control adecuado. Los síntomas variarán obviamente dependiendo de la enfermedad o desorden objetivo, pero pueden medirse por un técnico o médico ordinariamente experto. Tales síntomas pueden medirse, por ejemplo, al monitorear el nivel de uno o más indicadores bioquímicos de la enfermedad o desorden (por ejemplo, niveles de una enzima o metabolito correlacionado con la enfermedad, números de células afectadas, etc. ), al monitorear manifestaciones físicas (por ejemplo, inflamación, tamaño de tumor, etc.) o por una escala de valoración clínica aceptada, por ejemplo, la Escala del Estado de Discapacidad Expandida (para esclerosis múltiple) , Cuestionario de Enfermedad de Intestino I nflamatorio Irvine (valoración de 32 puntos evalúa la calidad de vida con respecto a la función del intestino, síntomas sistémicos, función social y estado emocional-rangos de puntuación de 32 a 224, con puntuaciones más altas indicando una mejor calidad de vida), la Calidad de Vida de Escala de Artritis Reumatoide, y otra escala de valoración clínica aceptada como se conoce en el campo. Una reducción sostenida (por ejemplo, un día o más, preferentemente más tiempo) en síntomas de enfermedad o desorden por al menos 10% o por uno o más puntos en una escala clínica dada es indicativa de tratamiento "efectivo". De manera similar, profilaxis realizada utilizando una composición como se describe en la presente es "efectiva" si el inicio o severidad de uno o más síntomas se retrasa, reduce o elimina relativo a tales síntomas en un individuo similar (modelo de animal o humano) no tratado con la composición. Una composición conteniendo un antagonista (por ejemplo, ligando) o coctel del mismo de acuerdo a la presente invención puede utilizarse en establecimientos terapéuticos o profilácticos para ayudar en la alteración, inactivación, muerte o retiro de una población celular objetivo selecta en un mamífero. Además, los repertorios seleccionados de polipéptidos descritos en la presente pueden utilizarse de manera extracorporal o in vitro selectivamente para matar, eliminar o de otra manera remover de manera efectiva una población celular objetivo de una colección heterogénea de células. La sangre de un mamífero puede combinarse de manera extracorporal con los ligandos, por ejemplo anticuerpos, receptores de superficie de célula o proteínas de unión de los mismos mediante los cuales las células indeseadas se mueren o de otra manera remueven de la sangre para regresar al mamífero de acuerdo con técnicas estándar. Una composición conteniendo un antagonista (por ejemplo, ligando) de acuerdo a la presente invención puede utilizarse en establecimientos profilácticos y terapéuticos para ayudar en la alteración, inactivación, muerte o retiro de una población celular objetivo selecta en un mamífero. Los antagonistas de TNFR1 (por ejemplo, ligandos, monómeros dAb) pueden administrarse y/o formularse juntos con uno o más agentes activos o terapéuticos adicionales.

Cuando un antagonista de TNFR1 (por ejemplo, ligando, monómero dAb) se administra con un agente terapéutico adicional, el antagonista de TNFR1 puede administrarse antes, simultáneamente con o subsiguiente a la administración del agente adicional. Generalmente, el antagonista de TNFR1 (por ejemplo, ligando, monómero dAb) y agente adicional se administran en una manera que proporciona un recubrimiento de efecto terapéutico. En una modalidad, la invención es un método para tratar, suprimir o prevenir una enfermedad inflamatoria crónica, comprendiendo administrar a un mamífero en necesidad del mismo una dosis terapéuticamente efectiva o cantidad de un antagonista de TNFR1 (por ejemplo, un ligando que comprende un monómero dAb que une TNFR1 ). En una modalidad, la invención es un método para tratar, suprimir o prevenir artritis (por ejemplo, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, espondilitis anquilosante, artritis soriática) comprendiendo administrar a un mamífero en necesidad del mismo una dosis terapéuticamente efectiva o cantidad de un antagonista de TNFR1 (por ejemplo, un ligando que comprende un monómero dAb que une TNFR1 ). En otra modalidad, la invención es un método para tratar, suprimir o prevenir soriasis comprendiendo administrar a un mamífero en necesidad del mismo una dosis terapéuticamente efectiva o cantidad de un antagonista de TNFR1 (por ejemplo, un ligando que comprende un monómero dAb que une TNFR1 ).

En otra modalidad, la invención es un método para tratar, suprimir o prevenir enfermedad del intestino inflamatorio (por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa) comprendiendo administrar a un mamífero en necesidad del mismo una dosis terapéuticamente efectiva o cantidad de un antagonista de TNFR1 (por ejemplo, un ligando que comprende un monómero dAb que une TNFR1 ). En otra modalidad, la invención es un método para tratar, suprimir o prevenir enfermedad pulmonar obstructiva crónica (por ejemplo, bronquitis crónica, bronquitis obstructiva crónica, enfisema), comprendiendo administrar a un mamifero en necesidad del mismo una dosis terapéuticamente efectiva o cantidad de un antagonista de TNFR1 (por ejemplo, un ligando que comprende un monómero dAb que une TNFR1 ). En otra modalidad, la invención es un método para tratar, suprimir o prevenir neumonía (por ejemplo, neumonía bacteriana, tal como neumonía Staphylococcal) comprendiendo admi nistrar a un mamífero en necesidad del mismo una dosis terapéuticamente efectiva o cantidad de un antagonista de TNFR1 (por ejemplo, un ligando que comprende un monómero dAb que une TNFR1 ). La invención proporciona un método para tratar, suprimir o prevenir otras enfermedades pulmonares además de enfermedad pulmonar obstructiva crónica, y neumonía. Otras enfermedades pulmonares que pueden tratarse, suprimirse o prevenirse de acuerdo con la invención incluyen, por ejemplo, fibrosis cística y asma (por ejemplo, asma resistente a esteroide) . De esta manera, en otra modalidad, la invención es un método para tratar, suprimir o prevenir una enfermedad pulmonar (por ejemplo, fibrosis cística, asma) comprendiendo administrar a un mamífero en necesidad del mismo una dosis terapéuticamente efectiva o cantidad de un antagonista de TNFR1 (por ejemplo, un ligando que comprende un monómero dAb que une TNFR1 ). En modalidades particulares, un antagonista de TNFR1 se administra a través de suministro pulmonar, tal como por inhalación (por ejemplo, inhalación intrabronquial , intranasal u oral , gotas intranasales) o por suministro sistémico (por ejemplo, parenteral, intravenoso, intramuscular, intraperitoneal, subcutáneo). En otra modalidad, la invención es un método para tratar, suprimir o prevenir ataque séptico comprendiendo administrar a un mamífero en necesidad del mismo una dosis terapéuticamente efectiva o cantidad de un antagonista de TNFR1 (por ejemplo, un ligando que comprende un monómero dAb que une TNFR1 ). En un aspecto adicional aún de la segunda configuración de la invención, la presente invención proporciona una composición comprendiendo un ligando multiespecífico de conformación cerrada, obtenible por un método de la presente invención, y vehículo farmacéuticamete aceptable, diluyente o excipiente. Además, la presente invención proporciona un método para el tratamiento de enfermedad utilizando un "ligando multiespecífico de conformación cerrada" o una composición de acuerdo a la presente invención. En una modalidad preferi da de la invención la enfermedad es cáncer o una enfermedad inflamatoria, por ejemplo artritis reumatoide, asma o enfermedad de Crohn. En un aspecto adicional de la segunda configuración de la invención, la presente invenci ón proporciona un método para el diagnóstico, incluyendo diagnóstico de enfermedad utilizando un ligando multiespecífico de conformación cerrada, o una composición de acuerdo a la presente invención. De esta manera en general la unión de un analito a un ligando multiespecífico de conformación cerrada puede explotarse para desplazar un agente, que conduce a la generación de una señal en desplazamiento. Por ejemplo, unión de analito (segundo antígeno) podría desplazar una enzima (primer antígeno) unido al anticuerpo proporcionando la base para un inmunoensayo, específicamente si la enzima se mantiene en el anticuerpo a través de su sitio activo. De esta manera, la presente invención proporciona un método para detectar la presencia de una molécula objetivo, comprendiendo: (a) proporcionar un ligando multiespecífico de conformación cerrada unido a un agente, dicho ligando siendo específico para la molécula objetivo y el agente, en donde el agente que se une por el ligando conduce a la generación de un señal detectable en desplazamiento del ligando; (b) exponer el ligando multiespecífico de conformación cerrada a la molécula objetivo; y (c) detectar la señal generada como un resultado del desplazamiento del agente. De acuerdo al aspecto anterior de la segunda configuración de la invención, ventajosamente, el agente es una enzima, que es inactivo cuando se une por el ligando multiespecífico de conformación cerrada. Alternativamente, el agente ser cualquiera de uno o más seleccionados del grupo consistiendo de lo siguiente: el substrato para una enzima, y una molécula fluorescente, luminescente o cromogénica que es inactiva o templa cuando se une por el ligando. Además, los repertorios seleccionados de polipéptidos descritos en la presente pueden utilizarse de manera extracorporal o in vitro selectivamente para matar, eliminar o de otra manera remover efectivamente una población celular objetivo de una colección heterogénea de células. La sangre de un mamífero puede combinarse de manera extracorporal con los ligandos, por ejemplo, anticuerpos, receptores de superficie de célula o proteínas de unión de los mismos mediante los cuales las células indesadas se matan o de otra manera se remueven de la sangre de regreso al mamífero de acuerdo con técnicas estándar. EJEMPLOS La invención se describe además, para los propósitos de ilustración solamente, en los siguientes ejemplos. Como se utiliza en la presente, para los propósitos de nomenclatura dAb, TNFa de humano se refiere como TAR1 y receptor de TNFa 1 (receptor p55) se refiere como TAR2.

Eiemplo 1. Selección de un anticuerpo (K8) scFv específico dual dirigido contra albúmina de suero de humano (HSA) y ß-galactosidasa (ß-gal) Este ejemplo explica un método para hacer un anticuerpo específico dual dirigido contra ß-gal y HSA en que un repertorio de dominios variables V? enlazados a un domi nio VH de línea germinal (de imitación) se selecciona para unión a ß-gal y un repertorio de dominios variables VH enlazados a un dominio V? (de imitación) de l ínea germi nal se selecciona para unión a HSA. Los dominios V? ß-gal y VH HSA variables seleccionados se combinan entonces y los anticuerpos se selección para unión a ß-gal y HSA. HSA es una proteína i ncrementando la vida media encontrada en sangre de humano. Cuatro bibliotecas de anticuerpo de fago de humano se utilizan en este experimento. Bi bli oteca 1 Línea germi nal V?/D VT VH 8.46x 1 07 Bi blioteca 2 Línea germi nal VK/NN K VH 9.64x1 07 Biblioteca 3 Línea germinal VH/DVT V, 1 .47x108 Bi blioteca 4 Línea germinal VH/NNK V? 1 .45x1 08 Todas las bi bliotecas se basan en una estructura de humano única para VH (V3-23/DP47 y JH4b) y V? (O12/O2/DPK9 y JJ ) con diversidad de cadena lateral incorporada en regiones de determi nación complementarias (CDR2 y CDR3) . Bi blioteca 1 y Bi blioteca 2 contienen una secuencia V? de imitación, mientras la secuencia VH se diversifica en posiciones H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97 y H98 (DVT o NNK codificada, respectivamente) (Fi gura 1 ). Biblioteca 3 y Biblioteca 4 contienen una secuencia VH de imitación, mientras la secuencia V? se diversifica en posiciones L50, L53, L91 , L92, L93, L94 y L96 (DVT o NNK codificada, respectivamente) (Figura 1 ). Las bibliotecas están en formato plT2/ScFv de fagemido (Figura 2) y se han preseleccionado para unión a ligandos genéricos, Proteína A y Proteína L, de manera que la mayoría de los clones en las bibliotecas no seleccionadas son funcionales. Los tamaños de las bibliotecas mostradas arriba corresponden a los tamaños después de preselección. Biblioteca 1 y Biblioteca 2 se mezclan antes de las selecciones en antígeno para producir una biblioteca VH única/V? de imitación y la biblioteca 3 y biblioteca 4 se mezclan para formar una biblioteca V? única/VH de imitación. Tres vueltas de selecciones se realizan en ß-gal utilizando la biblioteca VK/VH de imitación y tres vueltas de selecciones se realizan en HSA utilizando biblioteca VH/VK de imitación. En el caso de ß-gal las concentraciones de fago van hasta 1 .1 x106 en la primer vuelta a 2.0x108 en la tercer vuelta. En el caso de HSA las concentraciones de fago fueron hasta 2x104 en la primer vuelta a 1 .4x109 en la tercer vuelta. Las selecciones se realizan como se describe por Griffith et al. , (1993), excepto que el fago ayudante KM 13 (que contiene una proteína plll con un sitio de separación de proteasa entre los dominios D2 y D3) se utiliza y el fago se el uye con 1 mg/ml tripsin en PBS. La adición de tripsin separa las proteínas pll l derivadas del fago ayudante (pero no aquellas del fagemido) y eluye fusiones de scFv-fago unidas por separación en c-myc tag (Figura 2), proporcionando así un enriquecimiento adicional para fagos expresando scFvs funcionales y una reducción correspondiente en antecedes (Kristensen & Winter, Folding & Design 3: 321 -328, Jul 9, 1998). Las selecciones se real izan utilizando inmunotubos revestidos con ya sea HSA o ß-gal a concentración de 100µg/ml. Para verificar la unión, 24 colonias de la tercer vuelta de cada selección se seleccionan por ELISA de fago monoclonal . Las partículas de fago se producen como se describe por Harrison ef al. , Methods Enzymol. 1996;267:83-109. Placas ELISA de 96 cavidades se revisten con 100µl de HSA o ß-gal a concentraciones de 10µg/ml en PBS durante la noche a 4°C. Un procedimiento ELISA estándar se sigue (Hoogenboom ef al. , 1991 ) utilizando detección de fago unido con conjugado anti-M 13-HRP. Una selección de clones dio señales ELISA mayores a 1.0 con 50µl sobrenadante. Después preparaciones de ADN se hacen de bi blioteca VH/VK de imitación seleccionada en HSA y de biblioteca VK/VH de imitación seleccionada en ß-gal utilizando el equipo QIAprep Spin Miniprep (Qiagen). Para acceder a la mayoría de la diversidad, las preparaciones de ADN se hacen de cada una de las tres vueltas de selecciones y después se empujan juntas para cada uno de los antígenos. Las preparaciones de ADN se digieren entonces con Sal//Not/ durante la noche a 37°C. Después de la purificación de gel de los fragmentos, las cadenas V? de la biblioteca VK/VH de imitación seleccionada en ß-gal se ligan en lugar de una cadena V? de imitación de la biblioteca VH/VK de imitación seleccionada en HSA creando una biblioteca de 3.3x1 O9 clones. Esta biblioteca se selecciona ya sea en HSA (primer vuelta) y ß-gal (segunda vuelta), selección HSA/ß-gal, o en ß-gal (primer vuelta) y HSA (segunda vuelta), selección ß-gal/I HSA. Las selecciones se realizan como se describe arriba. En cada caso después de la segunda vuelta, 48 clones se prueban para unión a HSA y ß-gal por ELI SA de fago monoclonal (como se describe arriba) y por ELISA de los fragmentos scFv solubles. Los fragmentos de anticuerpo solubles se producen como se describe por Harrison et al. , ( 1996), y procedimiento ELI SA estándar se sigue Hoogenboom ef al. (1991 ) Nucleic Acids Res. , 19: 4133, excepto que 2% Tween/PBS se utiliza como un regulador de bloqueo y scFvs unidos se detectan con Proteína L-HRP. Tres clones (E4, E5 y E8) de la selección HSA/ß-gal y dos clones (K8 y K10) de la selección ß-gal/HSA son capaces de unir ambos antígenos. scFvs de estos clones se amplificaron por PCR y secuenciaron como se describe por I gnatovich et al. , (1999) J Mol Biol 1999 Nov 26;294(2):457-65, utilizando los cebadores LMB3 y pHENseq. Análisis de secuencia reveló que todos los clones fueron idénticos. Por lo tanto, solamente un clon codificando un anticuerpo específico dual (K8) se elige para trabajo adicional (Figura 3). Eiemplo 2. Caracterización de las propiedades de unión del anticuerpo K8.

Primero, las propiedades de unión del anticuerpo K8 se caracterizan por ELISA de fago monoclonal. Una placa de 96 cavidades se reviste con 100µl de HSA y ß-gal junto con fosfatasa alcalina (APS), albúmina de suero de bovino (BSA), aglutinina de maní, lisozima y citocromo c (para verificar la reactividad cruzada) a concentración de 10 µg/ml en PBS durante la noche a 4°C. El fagemido del clon K8 se rescata con KM 13 como se describe por Harrison et al. , (1996) y el sobrenadante (50µl) conteniendo fago ensayado directamente. Un procedimiento ELISA estándar se sigue (Hoogenboom ef al. , 1991 ) utilizando detección de fago unido con conjugado anti-M 13-HRP. El anticuerpo K8 específico dual se encuentra que se une a HSA y ß-gal cuando se despliega en la superficie del fago con señales de absorbencia mayores a 1 .0 (Figura 4) . Unión fuerte a BSA también se observa (Figura 4). Ya que HSA y BSA son 76% homólogos en el nivel de aminoácido, no es sorprendente que el anticuerpo K8 reconoció ambas de estas proteínas estructuralmente relacionadas. No se detecta creatividad cruzada con otras proteínas (Figura 4). Segundo, las propiedades de unión del anticuerpo K8 se prueban en una ELISA scFv soluble. Producción del fragmento scFv soluble se induce por I PTG como se describe por Harrison et al. , ( 1996). Para determinar los niveles de expresión de K8 scFv, los fragmentos de anticuerpo solubles se purifican dei sobrenadante de 50ml de inducciones utilizando columnas de Proteína A-Sepharose como se describe por Harlow and Lañe, Antibodies: a Laboratory Manual , (1988) Cold Spring Harbor. OD28o se mide entonces y la concentración de proteína se calcula como se describe por Sambrook ef al. , (1989). K8 scFv se produce en sobrenadante a 19mg/l. Una ELISA scFv soluble se realiza entonces utilizando concentraciones conocidas del Fragmento de anticuerpo K8. Una placa de 96 cavidades se reviste con 10Oµl de HSA, BSA y ß-gal a 10µg/ml y 100µl de proteina A a concentración de 1 µg/ml. 50µl de las diluciones seriales del K8 scFv se aplica y los fragmentos de anticuerpo unidos se detectan con Proteína L-HRP. Los resultados de ELISA confirmaron la naturaleza específica dual del anticuerpo K8 (Figura 5). Para confirmar que la unión a ß-gal se determina por el dominio V? y unión a HSA/BSA por el dominio VH del anticuerpo K8 scFv, el dominio V? se corta de ADN K8 scFv por digestión Sal //Not/ y liga en un vector plT2 digerido por Sal//Not/ conteniendo cadenas VH de imitación (Figuras 1 y 2). Características de unión del clon resultante K8VK/VH de imitación se analizan por ELISA scFv soluble. Producción de los fragmentos scFv solubles se induce por I PTG como se describe por Harrison ef al. , (1996) y el sobrenadante (50µ) conteniendo scFvs se analiza directamente. ELISA scFv soluble se realiza como se describe en el Ejemplo 1 y scFvs unidos se detectan con Proteína L-HRP. Los resultados de ELISA revelaron que este clon aún es capaz de unir ß-gal, mientras la unión a BSA se elimina (Figura 6). Eiemplo 3. Selección de antígenos de anticuerpos de dominio VH únicos A v B y anticuerpos de dominio V? dirigidos contra antigenos C v D. Este ejemplo describe un método para hacer anticuerpos de dominio VH únicos dirigidos contra antígenos A y B y anticuerpos de dominio V? únicos dirigidos contra antígenos C y D al seleccionar repertorios de dominios variables de anticuerpo únicos vírgenes para unión a estos antígenos en la ausencia de los dominios variables complementarios. Selecciones y caracterización de los clones de unión se realiza como se describe previamente (ver Ejemplo 5, PCT/GB02/003014) .

Cuatro clones se eligen para trabajo adicional: VH 1 -Anti A VH VH2 -Anti B VH VKI - Anti C V? VK2 -Anti D V? Los procedimientos descritos arriba en los Ejemplos 1 -3 pueden utilizarse, en una manera similar como aquella descrita, para producir moléculas de dímero comprendiendo combinaciones de dominios VH (es decir, ligandos VH-VH) y combinaciones de dominios VL (ligandos VL-VL). Eiemplo 4. Creación y caracterización de los anticuerpos ScFv anticuerpos específicos duales (VH1/VH2 dirigidos contra antigenos A y B y VK1/VK2 dirigidos contra antígenos C y D). Este ejemplo demuestra que anticuerpos ScFv específicos duales (VH 1 /VH2 dirigidos contra antígenos A y B y VK1 /VK2 dirigidos contra antígenos C y D) podrían crearse al combinar dominios únicos V? y VH selecci onados contra antígenos respectivos en un vector ScFv. Para crear anticuerpo específico dual VH1/VH2, el dominio único VH 1 se corta del vector de dominio variable 1 (Figura 7) por digestión Ncol/Xho/ y liga en vector de dominio variable 2 digerido por Ncol/Xho/ (Figura 7) para crear VH1/vector de dominio variable 2. Dominio único VH2 se amplifica por PCR del vector de dominio variable 1 utilizando cebadores para introducir el sitio de restricción Sa/I al extremo 5' y sitio de restricción ?/ofl al extremo 3'. El producto PCR se digiere entonces con Sa/l/?/ofl y liga en VH 1/vector de dominio variable 2 digerido por Sa/l/?/ofl para crear VH 1 /VH2/vector de dominio variable 2. VK1 /VK2/vector de dominio variable 2 se crea en una manera similar. La naturaleza específica dual del VH 1/VH2 ScFv producido y K1/VK2 ScFv se prueba en una ELISA scFv soluble como se describe previamente (ver Ejemplo 6, PCT/GB02/003014). Competición ELISA se realiza como se describe previamente (ver Ejemplo 8, PCT/GB 02/003014). Posibles resultados: -VH 1 /VH2 ScFv es capaz de unir antígenos A y B simultáneamente -VK1 /VK2 ScFv es capaz de unir C y D simultáneamente -VH1/VH2 ScFv unión es competitiva (cuando se une al antígeno A, VH1/VH2 ScFv no puede unirse al antígeno B) -VK1 /VK2 ScFv unión es competitiva (cuando se une al antígeno C, VK1 /VK2 ScFv no puede unirse al antígeno D) Eiemplo 5. Construcción de VH1/VH2 Fab específico dual y VK1/VK2 Fab y análisis de sus propiedades de unión Para crear VH1/VH2 Fab, dominio único VH1 se liga en vector CH digerido por Nco\IXho\ (Figura 8) para crear VH 1 /CH y dominio único VH2 se liga en vector CK digerido por Sa/l/?/ofl (Figura 9) para crear VH2/CK. ADN de plásmido de VH 1/CH y VH2/CK se utiliza para co-transformación de células E. coli competentes como se describe previamente (ver Ejemplo 8, PCT/GB02/003014) . El clon conteniendo plásmidos VH 1 /CH y VH2/CK se induce entonces por IPTG para producir VH1 /VH2 Fab soluble como se describe previamente (ver Ejemplo 8, PCT/GB02/003014). VK1 /VK2 Fab se produce en una manera similar. Propiedades de unión de Fabs producidos se prueban por ELISA de competición como se describe previamente (ver Ejemplo 8, PCT/GB 02/003014). Posibles resultados: -VH 1 /VH2 Fab es capaz de unirse a antígenos A y B simultáneamente -VK1 /VK2 Fab es capaz de unirse a antígenos C y D simultáneamente -VH1 /VH2 Fab unión es competitiva (cuando se une al antígeno A, VH1/VH2 Fab no puede unirse al antígeno B) -VK1 /VK2 Fab unión es competitiva (cuando se une al anfígeno C, VK1 /VK2 Fab no puede unirse al antígeno D) Eiemplo ß. Dímeros dAb Quelantes Resumen Homo-dímeros VH y VK se crean en un formato dAb-enlazador-dAb utilizando enlazadores de polipéptido flexibles. Vectores se crean en el formato de dAb enlazador-dAb conteniendo enlazadores de glicina-serina de diferente longitudes 3U:(Gly4Ser)3 (SEQ ID NO: 199), 5U:(Gly4Ser)5 (SEQ ID NO:629), 7U:(Gly4Ser)7 (SEQ ID NO:630). Bibliotecas de dímero se crean utilizando dAbs guía corriente arriba del enlazador: TAR1-5 (VK), TAR1-27(VK), TAR2-5(VH) o TAR2-6(VK) y una biblioteca de segundos dAbs correspondientes después del enlazador. Utilizando este método, nuevos dAbs diméricos se seleccionan. El efecto de dimerización en unión al antígeno se determina por ELISA y estudios BIAcore y en neutralización celular y ensayos de unión al receptor. Dimerización de tanto TAR1-5 como TAR1-27 resultó en una mejora significativa en afinidad de unión y niveles de neutralización. 1.0 Métodos 1.1 Generación de Biblioteca 1.1.1 Vectores Vectores pEDA3U, pEDA5U y pEDA7U se diseñan para introducir diferentes longitudes de enlazador compatibles con el formato dAb-enlazador-dAb. Para enlazadores oligo pEDA3U, de par base 73 sentido y anti-sentido se templan utilizando un programa de templado lento (95°C-5mins, 80°C-10mins, 70°C-15mins, 56°C- 15mins, 42°C hasta uso) en regulador conteniendo O.IMNaCI, 10mM Tris-HCl pH7.4 y clonan utilizando los sitios de restricción Xho\ y ?/ofl . Los enlazadores comprendi eron 3 (Gly4Ser) unidades y una región disecadora alojada entre los sitios de clonación Sa/I y ?/ofl (esquema 1 ). Para reducir la posibilidad de dAbs monoméricos seleccionándose por un despliegue de fago, la región disecadora se diseña para incluir 3 codones de detención, un siti o de restricción Sacl y una mutación de cambio de estructura para poner la región fuera de estructura cuando no está presente segundo dAb. Para pE DA5U y 7U debido a la longi tud de los enlazadores requerida, los oligo-enlazadores de recubrimiento se diseñan para cada vector, templan y alargan utilizando Klenow. El fragmento se purifica entonces y digiere utilizando las enzimas apropiadas antes de clonaci ón utilizando los sitios de restricción Xho? y Not 1 .

Enlazador Ncol Xhol 3U SaM — Notl t 5U t 7U D secador 1 Disecador 2 Esquema 1 1 .1 .2 Preparación de Biblioteca El gen V de termi nal N correspondiente a dAb guía se clona aguas arriba del enlazador utilizando sitios de restricción ?/co1 y Xho? . Los genes VH tienen sitios compatibles existentes, sin embargo la clonación de genes VK requiere la introducci ón de sitios de restricción adecuados. Esto se logra al utilizar cebadores PCR modificados (VK-DLIBF: 5' cggccatggcgtcaacggacat (SEQ I D NO:638); VKXhol R: 5' atgtgcgctcgagcgtttgattt 3" (SEQ I D NO:639)) in 30 ciclos de amplificación PCR utilizando una mezcla 2: 1 de SuperTaq (HTBiotechnology Ltd) y pfu turbo (Stratagene). Esto mantiene el sitio Ncol e el extremo 5' mientras destruye el sitio Salí adyacente e introduce el sitio Xhol en el extremo 3'. 5 dAbs guía se clonan en cada uno de los 3 vectores de dímero: TAR1 -5 (VK), TAR1 -27(VK), TAR2-5(VH), TAR2-6(VK) y TAR2-7(VK). Todas las construcciones se verifican por análisis de secuencia. Habiendo clonado dAbs guía aguas arriba del enlazador en cada uno de los vectores (pEDA3U, 5U y 7U): TAR1 -5 (VK)5 TAR1 -27(VK), TAR2-5(VH) o TAR2-6(VK) una biblioteca de segundos dAbs correspondiente se clona después del enlazador. Para lograr esto, las bibliotecas dAb complementarias se amplifican por PCR de fago recuperado de selecciones de la vuelta 1 de ya sea una biblioteca VK contra TNFa de humano (a aproximadamente 1 x106 diversidad después de la vuelta 1 ) cuando TAR1 -5 o TAR1 -27 son los dAbs guía, o una biblioteca VH o VK contra receptor p55 TNF de humano (ambos aproximadamente 1x105 diversidad después de la vuelta 1 ) cuando TAR2-5 o TAR2-6 respectivamente son los dAbs guía. Para bibliotecas VK se conduce la amplificación PCR utilizando cebadores en 30 ciclos de amplificación PCR utilizando una mezcla 2: 1 de SuperTaq y pfu turbo. Bibliotecas VH se amplifican por PCR utilizando cebadores para introducir el sitio de restricción Salí en el extremo 5' del gen. PCRs de la biblioteca dAb se digieren con las enzimas de restricción apropiadas, ligan en los vectores correspondientes aguas abajo del enlazador, utilizando sitios de restricción Sal1INot1 y electroporan en células TG 1 competentes recientemente preparadas. Las concentraciones logradas para cada biblioteca son como sigue: TAR1 -5: pEDA3U = 4x108, pEDA5U = 8x107, pEDA7U= 1 x108 TAR1 -27: pEDA3U=6.2x108, pEDA5U=1x108, pEDA7U=1x109 TAR2h-5: pEDA3U=4x107, pEDA5U=2x108, pEDA7U=8x107 TAR2h-6: pEDA3U = 7.4x108, pE DA5U= 1 .2x108, pEDA7U = 2.2x108 1 .2 Selecciones 1 .2.1 TNFa Las selecciones se conducen utilizando TNFa de humano pasivamente revestido en inmunotubos. Brevemente, los inmunotubos se revisten durante la noche con 1 -4mls del antígeno requerido. Los inmunotubos se enjuagan entonces 3 veces con PBS y bloquean con 2% leche en polvo en PBS por 1 -2hrs y enjuagan 3 veces más con PBS. La solución de fago se diluye en 2% leche en polvo en PBS e incuba a temperatura ambiente por 2hrs. Los tubos se enjuagan entonces con PBS y el fago se eluye con 1 mg/ml tripsin-PBS. Tres estrategias de selección se investigan para las bibliotecas de dímero TAR1 -5. Las selecciones de la primer vuelta se llevan a cabo en inmunotubos utilizando TNFa de humano revestido a 1 µg/ml o 20µg/ml con 20 enjuagues en PBS 0.1 %Tween. Células TG1 se infectan con el fago eluido y las concentraciones se determinan (por ejemplo, Marks ef al. J Mol Biol . 1991 Di c 5;222(3): 581 -97, Richmann ef al. Biochemistry. 1993 Ago 31 ;32(34):8848-55). Las concentraciones recuperadas fueron: pEDA3U=2.8x107 (1 µg/ml TNF) 1.5x108 (20µg/mlTNF), pEDA5U= 1 .8x107 ( 1 µg/ml TNF), 1.6x108 (20µg/ml TNF) pE DA7U=8x106 ( 1 µg/ml TNF), 7x107 (20µg/ml TNF). Las selecciones de la segunda vuelta se llevan a cabo utilizando 3 diferentes métodos 1 . En inmunotubos, 20 enjuagues con incubación durante la noche seguida por 10 enjuagues más. 2. En inmunotubos, 20 enjuagues seguido por incubación por 1 hr a RT en regulador de enjuague con (1 µg/ml TNFa) y 10 enjuagues más. 3. Selección en perlas de estreptavidin utilizando 33 pmoles teniendo TNFa de humano biotinilado (Henderikx et al, 2002, Selection of antibodies against biotinylated antigens. Antibody Phage Display: Methods and protocols, Ed. O'Brien y Atkin, Humana Press). Los clones únicos de selecciones de la segunda vuelta se toman en placas de 96 cavidades y preparaciones de sobrenadante crudo se hacen en formato de placa de 96 cavidades de 2 ml.

Tabla 1 Para TAR1 -27, selecciones se llevan a cabo como se describe previamente con las siguientes modificaciones. Las selecciones de la pri mer vuelta se llevan a cabo en inmunotubos utilizando TNFa de humano revestido a 1 µg/ml o 2Oµg/ml con 20 enjuagues en PBS 0.1 %Tween. Las selecciones de segunda vuelta se llevan a cabo en inmunotubos utilizando 20 enjuagues con incubación durante la noche seguido por 20 enjuagues más. Los clones únicos de selecciones de la 2 vuelta se toman en placas de 96 cavidades y preparaciones de sobrenadante crudo se hacen en formato de placa de 96 cavidades de 2ml. Concentraciones TAR1 -27 son como sigue: Tabla 2. 1.2.2 RECEPTOR TNF 1 (p55 RECEPTOR;TAR2) Se conducen selecciones como se descri be previamente para las bibliotecas TAR2h-5 solamente. 3 vueltas de selecciones se llevan a cabo en inmunotubos utilizando ya sea 1 µg/ml p55 receptor TNF humano o 1 0µg/ml p55 receptor TNF humano con 20 enjuagues en PBS 0. 1 %Tween con incubación durante la noche segui do por 20 enj uagues más. Los clones únicos de las selecciones de vuelta 2 y 3 se toman en placas de 96 cavidades y preparaciones de sobrenadante crudo se hacen en formato de placa de 96 cavidades de 2ml . Concentraciones TAR2h-5 son como sigue: Tabla 3. 1 .3 Selección Clones únicos de las selecciones de vuelta 2 y 3 se toman de cada una de las bibliotecas 3U , 5U y 7U de los diferentes métodos de selección, donde sea apropiado. Los clones se desarrollan en 2xTY con 1 00µg/ml ampicilina y 1 % glucosa durante la noche a 37°C. Una dil ución 1 /1 00 de este cultivo se inocula en 2 mis de 2xTY con 100µg/ml ampicilina y 0.1 % glucosa en 2ml , formato de placa de 96 cavidades y se desarrollan a 37°C agitación hasta que OD600 fue aproximadamente 0.9. El cultivo se induce entonces con 1 mM I PTG durante la noche a 30°C. Los sobrenadantes se clarifican por centrifugación a 4000 rpm por 15 mins en una placa centrífuga sorval. Las preparaciones de sobrenadante se utilizan para selección inicial . 1 .3.1 ELISA Actividad de unión de proteínas recombinantes diméricas se compara con el monómero por E LISA de Proteína A/L o por ELISA de antígeno. Brevemente, una placa de 96 cavidades se reviste con antígeno o proteína A/L durante la noche a 4°C. La placa se enjuaga con 0.05% Tween-PBS, bloquea por 2hrs con 2% Tween-PBS. La muestra se agrega a la placa incubada por 1 hr a temperatura ambiente. La placa se enjuaga e incuba con el reactivo secundario por 1 hr a temperatura ambiente. La placa se enjuaga y desarrolla con substrato TM B. Proteína A/L-HRP o India-HRP se utiliza como un reactivo secundario. Para ELISAs de antígeno, las concentraciones de antígeno utilizadas fueron 1 µg/ml en PBS para TNFa de humano y receptor THF 1 de humano. Debido a la presencia de dAb guía en la mayoría de los casos, los dímeros dieron una señal ELISA positiva por lo tanto la determinación de fuera de velocidad se examina por BIAnúcleo. 1 .3.2 BIAnúcleo Los análisis BIAnúcleo se conducen para clones TAR1 -5 y TAR2h-5. Para selección, TNFa de humano se acopla a un chip CM5 a alta densidad (aproximadamente 10000 RUs). 50 µl de TNFa de humano (50 µg/ml) se acopla al chip a 5µl/min en regulador de acetato-pH5.5. La regeneración del chip después de análisis durante los métodos estándar no es posible debido a la inestabilidad de TNFa de humano, por lo tanto después de que cada muestra se analiza, el chip se enjuaga por 10 mins con regulador. Para TAR1 -5, los sobrenadantes de clon de la selección de vuelta 2 se seleccionan por BIAnúcleo. 48 clones se seleccionan para cada una de las bibliotecas 3U , 5U y 7U obtenidas utilizando los siguientes métodos de selección: R1 : 1 µg/ml inmunotubo de TNFa de humano, R2 1 µg/ml inmunotubo de TNFa de humano, durante la noche se enjuaga. R1 : 20µg/ml inmunotubo de TNFa de humano, R2 20 µg/ml inmunotubo de TNFa de humano, durante la noche se enjuaga. R1 : 1 µg/ml ¡nmunotubo de TNFa de humano, R2 33 pmoles TNFa de humano biotinilado en perlas. R1 : 20µg/ml inmunotubo de TNFa de humano, R2 33 pmoles perlas de TNFa de humano biotinilado. Para selección, receptor TNF p55 de humano se acopla a un chip CM5 a alta densidad (aproximadamente 4000 RUs). 100 µl de receptor TNF p55 de humano (10 µg/ml) se acopla al chip a 5µl/min en regulador de acetato-pH5.5. Condiciones de regeneración estándar se examinan (glicina pH2 o pH3) pero en cada caso el antígeno se remueve de la superficie del chip, por lo tanto como con TNFa, por lo tanto después de que cada muestra se analiza, el chip se enjuaga por 10 mins con regulador. Para TAR2-5, sobrenadantes de clones de la selección de vuelta 2 se seleccionan. 48 clones se seleccionada de cada una de las bibliotecas 3U, 5U y 7U, utilizando los siguientes métodos de selección: R1 : 1 µg/ml inmunotubo de receptor TNF p55 de humano, R2 1 µg/ml inmunotubo de receptor TNF p55 de humano, durante la noche se enjuaga. R1 : 10µg/ml inmunotubo de receptor TNF p55 de humano, R2 10µg/ml inmunotubo de receptor TNF p55 de humano, durante la noche se enjuaga. 1.3.3 Receptor y Ensayos de Célula La habilidad de los dímeros para neutralizarse en el ensayo de receptor se conduce como sigue: Unión de receptor dAbs anti-TNF se prueban por la habilidad para inhibir la unión de TNF a receptor TNF 1 recombinante (p55). Brevemente, placas Maxisorp se incuban durante la noche con 30mg/ml anticuerpo monoconal de ratón Fc anti-humano (Zymed, San Francisco, USA) . Las cavidades se enjuagan con salina regulada por fosfato (PBS) conteniendo 0.05% Tween-20 y después se bloquean con 1 % BSA en PBS antes de incubarse con 100ng/ml proteína de fusión Fc de receptor TNF 1 (R&D Systems, Minneapolis, USA). dAb anti-TNF se mezcla con TNF que se agrega a las cavidades enjuagadas a una concentración final de 10ng/ml. Unión de TNF se detecta con 0.2mg/ml anticuerpo anti-TNF biotinilado (biotecnología HyCult, Uben, Países Bajos) seguido por 1 en 500 diluciones de estreptavidi n marcada con peroxidasa de rábano picante (Amersham Biosciences, UK) y después la incubación con substrato TMB (KPL, Gaithersburg, USA). La reacción se detiene por la adición de HCl y la asorbencia se lee a 450nm. La actividad de dAb anti-TNF conduce a una disminución en la unión TNF y por lo tanto una disminución en absorbencia en comparación con TNF solamente control. Ensayo de Citotoxicidad L929 dAbs anti-TNF también se prueban para la habilidad de neutralizar la actividad citotóxica de TNF en fibroblastos L929 de ratón (Evans, T. (2000) Molecular Biotechnology 15, 243-248). Brevemente, las células L929 colocadas en placas de microconcentración se incuban durante la noche con dAb anti-TNF, 100pg/ml TNF y 1 mg/ml actinomicin D (Sigma, Poole, UK). La viabilidad celular se mide al leer la absorbencia a 490 nm después de una incubación con [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio (Promega, adison, USA). Actividad de dAb anti-TNF conduce a una disminución en citotoxicidad TNF y por lo tanto un incremento en absorbencia en comparación con el control TNF solamente. En la selección inicial, los sobrenadantes preparados para análisis BIAnúcleo, descritos arriba, también se utilizan en el ensayo receptor. Análisis adicional de dímeros seleccionados también se conduce en el receptor y ensayos de célula utilizando proteínas purificadas. Ensayo HeLa IL-8 dAbs anti-TNF alfa o anti-TNFR1 se prueban para la habilidad de neutralizar la inducción de secreción de I L-8 por TNF en células HeLa (método adaptado de aquel de Akeson, L. ef al. (1996) Journal of Biological Chemistry 271 , 30517-30523, describiendo la inducción de IL-8 por IL-I en HUVEC; observamos en ia inducción por TNF alfa de humano y utilizamos células HeLa en lugar de la estirpe de célula HUVEC). Brevemente, las células HeLa colocadas en placas de microconcentración se incuban durante la noche con dAb y 300pg/ml TNF. Post incubación del sobrenadante se aspira de las células y la concentración IL-8 se mide a través de ELISA intercalada (R&D Systems). Actividad de dAb anti-TNFR1 conduce a una disminución en la secreción de I L-8 en el sobrenadante en comparación con el control TNF solamente. El ensayo L929 se utiliza por todos los siguientes experimentos; sin embargo, el uso del ensayo HeLa I L-8 se prefiere para medir ligandos de receptor anti-TNF 1 (p55); la presencia de ratón p55 en el ensayo L929 posee ciertas limitaciones en su uso. 1.4 Análisis de secuencia Dímeros que probaron tener propiedades interesantes en el BIAnúcleo y las selecciones de ensayo de receptor se secuencia. Las secuencias se detallan en el listado de secuencias. 1.5 Formateo 1.5.1 Dímeros TAR1 -5-19 Los dímeros TAR1 -5 que se muestran por tener buenas propiedades de neutralización se re-formatean y analizan en los ensayos de receptor y célula. Dab guía TAR1 -5 se substituye con el clon madurado por afinidad TAR1 -5-19. Para lograr este TAR1 -5 se clona del par de dímero individual y substituye con TAR1 -5-19 que se ha amplificado por PCR. Además, homodímeros TAR1 -5-19 también se construyen en los vectores 3U, 5U y TU. La copia de terminal N del gen se amplifica por PCR y clona como se describe arriba y el fragmento de gen de terminal C se clona utilizando sitios de restricción Salí y Notl. 1 .5.2 Mutagénesis El codón de detención ámbar presente en dAb2, uno de los dAbs de terminal C en los pares de dímero TAR1 -5 se muta con una glutamina por mutagénesis dirigida por sitio. 1.5.3 Fabs Los dímeros conteniendo TAR1 -5 o TAR1 -5-19 se re-formatean en vectores de expresión Fab. dAbs se clonan en vectores de expresión conteniendo ya sea los genes CK o CH utilizando sitios de restricción SfH y Notl y verificándose por análisis de secuencia. El vector CK se deriva de un vector resistente a ampicilina en base a pUC y el vector CH se deriva de un vector resistente a cloranfenicol pACYC. Para expresión Fab las construcciones dAb-CH y dAb-CK se co-transforman en células HB2151 y desarrollan en 2xTY conteniendo 0.1 % glucosa, 100µg/ml ampicilina y 10µg/ml cloranfenicol. 1 .5.3 Dimerización de articulaci ón Dimerización de dAbs a través de formación de enlace de cisteína se examina. Una secuencia corta de aminoácidos EPKSGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:151 ) una forma modificada de la articulación IgGCI de humano se forma en la región de terminal C en dAb. Un enlazador oligo codificando esta secuencia se sintetiza y templa, como se describe previamente. El enlazador se clona en el vector pEDA conteniendo TAR1 -5-19 utilizando sitios de restricción Xhol y Notl . Dimerización ocurre in situ en el periplasmo. 1 .6 Expresión y purificación 1 .6.1 Expresión Los sobrenadantes se preparan en el formato de placa de 96 cavidades de 2 ml para la selección inicial como se describe previamente. Después del proceso de selección inicial dímeros selectivos se analizan además. Las construcciones de dímero se expresan en células TOP10F' o HB2151 como sobrenadantes. Brevemente, una colonia individual de una placa recientemente rayada se desarrolla durante la noche a 37°C en 2xTY con 100µg/ml ampicilina y 1 % glucosa. Una dilución 1/100 de este cultivo se inocula en 2xTY con 100µg/ml ampicilina y 0.1 % glucosa y desarrolla a 37°C con agitación hasta que OD600 fue aproximadamente 0.9. El cultivo se induce entonces con 1 mM I PTG durante la noche a 30°C. Las células se remueven por centrifugación y el sobrenadante se purifica con agarosa de proteína A o L. Dímeros de articulación de cisteína y Fab se expresan como proteínas periplásmicas en células HB2152. Una dilución 1 /100 de un cultivo durante la noche se inocula en 2xTY con 0.1 % gl ucosa y los antibióticos apropiados y se desarrollan a 30°C con agitación hasta que OD600 fue aproximadamente 0.9. El cultivo se induce entonces con 1 mM I PTG por 3-4 horas a 25°C. Las cél ulas se recolectan por centrifugación y la pastilla se resuspende en regulador de preparación periplásmico (30mM Tris-HCl pHd.O, 1 mM EDTA, 20% sucrosa). Después de la centrifugación el sobrenadante se retiene y la pastilla se resuspende en 5mM MgSO . El sobrenadante se recolecta de nuevo por centrifugación, agrupa y purifica. 1 .6.2 Purificación de proteína A/L Optimización de la purificación de proteínas de dímero de agarosa de Proteína L (Affitech, Noruega) o agarosa de Proteína A (Sigma, UK) se examina. Proteína se eluye por grupo o por elución de columna utilizando una bomba periestáltica. Tres reguladores se examinan 0.1 M Fosfato-regulador de citrato pH2.6, 0.2M Glicina pH2.5 y 0.1 M Glicina pH2.5. La condición óptima se determina para estar bajo condiciones de bomba periestáltica utilizando 0.1 M Glicina pH2.5 sobre 10 volúmenes de columna. La purificación de la proteína A se conduce por condiciones de bomba periestáltica utilizando 0.1 M Glicina pH2.5. 1.6.3 Purificación FPLC Purificación adicional se lleva a cabo por análisis FPLC en el sistema AKTA Explorer 100 (Amersham Biosciences Ltd). Dímeros TAR1 -5 y TAR1 -5-19 se fraccionan por cromatografía de intercambio de catión (1 ml Recurso S -Amersham Biosciences Ltd) eluye con un gradiente 0-1 M NaCI en 5OmM regulador de acetato pH4. Dímeros de articulación se purifican por intercambio de ion (1 ml Recurso Q Amersham Biosciences Ltd) eluido con 0-1 M NaCI gradiente en 25mMTps HCl pH 8.0. Fabs se purifica por cromatografía de exclusión de tamaño utilizando una columna superosa 12 (Amersham Biosciences Ltd ) corrida a una velocidad de flujo de O.dml/min en PBS con 0.05% tween. Después las muestras de purificación se concentran utilizando concentradores de corte 5K de vivaspin (Vivascience Ltd). 2.0 Resultados 2.1 Dímeros TAR1 -5 6x96 clones se toman de la selección de la vuelta 2 comprendiendo todas las bibliotecas y condiciones de selección. Las preparaciones de sobrenadante se hacen y ensayan por antígeno y ELISA de Proteína L, BIAnúcleo y en los ensayos receptores. En ELISAS , clones de unión positivos se identifican de cada método de selección y se distribuyen entre bibliotecas 3U, 5U y 7U. Sin embargo, ya que dAb guía siempre está presente no es posible discriminar entre aglutinantes de alta y baja afinidad por este método, por lo tanto BIAnúcleo se conduce. El análisis BIAnúcleo se conduce utilizando 2ml de sobrenadantes. Análisis BIAnúcleo reveló que las velocidades Kapagadas de dímero se mejoran bastamente en comparación con TAR1 -5 monomérico. La velocidad Kapagada de monómero fue en el rango de 10"1 M en comparación con velocidades Kapagada de dímero que estuvieron en el rango de 1 O"3 -10"4M . 16 clones que parecieron tener velocidades muy lentas se seleccionan, vienen de las bibliotecas 3U, 5U y 7U y se secuencian. Además los sobrenadantes se analizan por la habilidad de neutralizar TNFa de humano en el ensayo de receptor. 6 clones guía (d1 -d6 abajo) que se neutralizan en estos análisis y se han secuenciado. Los resultados muestran que fuera de los 6 clones obtenidos existen solamente 3 segundos dAbs diferentes (dAbl , dAb2 y dAb3) sin embargo donde el segundo dAb se encuentra más de una vez se enlazan con diferentes enlazadores de longitud. TAR1 -5d1 : 3U enlazador 2do dAb=dAb1 -1 µg/ml Ag inmunotubo durante la noche se enjuaga TAR1 -5d2: 3U enlazador 2do dAb=dAb2-1 µg/ml Ag i nmunotubo durante la noche se enjuaga TAR1 -5d3: 5U enlazador 2do dAb=dAb2-1 µg/ml Ag inmunotubo durante la noche se enjuaga TAR1 -5d4: 5U enlazador 2do dAb=dAb3-20µg/ml Ag inmunotubo durante ia noche se enjuaga TAR1 -5d5: 5U enlazador 2do dAb=dAb1 -20µg/ml Ag inmunotubo durante la noche se enjuaga TAR1 -5d6: 7U enlazador 2do dAb=dAb1 -R1 : 1 µg/ml Ag inmunotubo durante la noche se enjuaga, R2: perlas Los 6 clones guía se examinan además. La proteína se produce del periplasmo y sobrenadante, purificada con agarosa de proteína L y examinada en los ensayos de receptor y célula. Los niveles de neutralización estuvieron disponibles (Tabla 1 ). Las condiciones óptimas para preparación de proteína se determinan. La proteína producida de células HB2151 como sobrenadantes dieron la producción más alta (aproximadamente 10mgs/L de cultivo). Los sobrenadantes se incuban con agarosa de proteína L por 2 hrs a temperatura ambiente o durante la noche a 4°C. Las perlas se enjuagan con PBS/NaCI y empacan en una columna FPLC utilizando una bomba periestáltica. Las perlas se enjuagan con 10 volúmenes de columna de PBS/NaCI y eluyen con 0.1 M glicina pH2.5. En general , proteína dimérica se eluye después del monómero. Los dímeros TAR1 -5d1 -6 se purifican por FPLC. Tres especies se obtienen, por purificación FPLC y se identifican por SDS PAGE . Una especie corresponde a monómero y las otras dos especies corresponden a dímeros de diferentes tamaños. La más grande de las dos especies se debe posiblemente a la presencia de tags de terminal C. Estas proteínas se examinan en el ensayo receptor. Los datos presentados en la tabla 1 representan los resultados óptimos obtenidos de las dos especies diméricas (Figura 1 1 ). Tres segundos dAbs de los pares de dímero (es decir, dAbl , dAb2 y dAb3) se clona como monómeros y examinan por ELISA y en el ensayo de receptor y célula. Todos los dAbs se unen específicamente a TNF por ELI SA de antígeno y no reaccionan de manera cruzada con plástico o BSA. Como monómeros, ninguno de los dAbs se neutralizan en los ensayos de receptor o célula. 2.1.2 Dímeros TAR1 -5-19 TAR 1 -5-19 se substituye para TAR1 -5 en los 6 clones guía.

Análisis de todos los dímeros TAR1-5-19 en los ensayos de receptor y célula se conduce utilizando proteína total (proteína L purificada solamente) al menos que se establezca de otra manera (Tabla 2). TAR1 -5-19d4 y TAR1 -5-19d3 tienen la mejor ND50 (~5nM ) en el ensayo de célula, esto es consistente con los resultados del ensayo e receptor y es una mejora sobre el monómero TAR1 -5-19 (ND50~30nM). Aunque dímeros TAR1 -5 purificados dan resultados variables en los ensayos de célula y receptor los dímeros TAR1 -5-19 dímeros fueron más consistentes. La variabilidad se muestra cuando se utilizan diferentes reguladores de elución durante la purificación de proteína. La elución utilizando 0.1 M fosfato-regulador de citrato pH2.6 o 0.2M Glicina pH2.5 aunque se remueve toda la agarosa de proteína L en la mayoría de los casos se vuelve menos funcional . TAR1 -5-19d4 se expresa en el fermentador y purifica en FPLC de intercambio de catión para producir un dímero completamente puro. Como con TAR1 -5d4 tres especies se obtienen, por purificación FPLC correspondiente a monómero y dos especies de dímero. Este dímero se secuencia por aminoácidos. Los monómeros TAR1 -5-19 y TAR1 -5-19d4 se examinan entonces en el ensayo de receptor e IC50 resultante para monómero fue 30nM y para dímero fue 8nM. Los resultados del ensayo de receptor comparando monómero TAR1-5-19, TAR1-5-19d4 y TAR1-5d4 se muestra en la Figura 10. Homodímeros TAR1-5-19 se hacen en los vectores 3U, 5U y 7U, expresaron y purificaron en Proteína L. Las proteínas se examinan en los ensayos de receptor y célula y los IC50s resultantes (para ensayo de receptor) y ND50s (para ensayo de célula) se determinan (Tabla 3, Figura 12). 2.2 Fabs Los dímeros TAR1-5 y TAR1-5-19 también se clonan en formato Fab, expresan y purifican en agarosa de proteína L. Fabs se valoran en los ensayos de receptor (Tabla 4). Estos resultados mostraron que para ambos dímeros TAR1-5-19 y TAR1-5 los niveles de neutralización fueron similares a los dimeros de enlazador Gly Ser originales de los cuales se derivan. Un Fab TAR1-5-19 donde TAR1-5-19 se despliega en ambos CH y CK se expresa, proteína L se purifica y valora en el ensayo de receptor. IC50 resultante fue aproximadamente 1nM. 2.3 Dímeros TAR1-27 3x96 clones se toman de la selección de la vuelta 2 comprendiendo todas las bibliotecas y condiciones de selección. Preparaciones de sobrenadante de 2 ml se hacen para análisis en ELISA y bioensayos. ELISA de antígeno dio 71 clones positivos. El ensayo de receptor de sobrenadantes crudos produjo 42 clones con propiedades inhibidoras (unión TNF 0-60%). En la mayoría de los caos las propiedades inhibidoras correlacionadas con una señal ELISA fuerte. 42 clones se secuencian, 39 de estos tienen segundas secuencias dAb únicas. Los 12 dímeros que dan las mejores propiedades inhibidoras se analizan además. Los 12 clones neutralizantes se expresan como preparaciones de sobrenadante de 200 ml y purifican en proteína L. Estos se valoran por proteína L y ELISA de antígeno, BIAnúcleo y en el ensayo de receptor. Las señales de ELISA positivas fuertes se obtienen en todos los casos. Análisis BIAnúcleo revelaron todos los clones por tener velocidades rápidas de encendida y apagada. Las velocidades apagadas se mejoran en comparación con TAR1 -27 monomérico, sin embargo la velocidad apagada de dímeros TAR1 -27 fueron más rápidas (Kapagada está aproximadamente en el rango de 10~ 1 y 10"2M) que los dímeros TAR1 -5 examinados previamente (Kapagada está aproximadamente en el rango de 10"3 -10"4M). La estabilidad de los dímeros purificados se cuestiona y por lo tanto para mejorar la estabilidad, la adición en 5% glicerol , 0.5% Tritón X100 o 0.5% NP40 (Sigma) se incluye en la purificación de 2 dímeros TAR1 -27 (d2 y d16). La adición de NP40 o Tritón X100™ mejora la producción de producto purificado aproximadamente 2 veces. Ambos dímeros se valoran en el ensayo receptor. TAR1 -27d2 dio I C50 de ~30nM bajo todas las condiciones de purificación. TAR1 -27d16 no mostró efecto de neutralización cuando se purifica sin el uso de agentes de estabilización pero dio un IC50 de ~50nM cuando se purifica bajo condiciones de estabilización. No se conduce análisis adicional. 2.4 Dímeros TAR2-5 3x96 clones se toman de las selecciones de la segunda vuelta comprendiendo todas las bibliotecas y condiciones de selección. Las preparaciones de sobrenadante de 2ml se hacen para análisis. ELISAS de Proteína A y antígeno se conducen para cada placa. 30 clones interesantes se identifican como teniendo buenas velocidades apagadas por BIAnúcleo (Kapagada varía entre 10~2 -10"3M). Los clones se secuencian y 13 dímeros únicos se identifican por análisis de secuencia. Tabla 4: Dímeros TAR1 -5 *nota dímero 2 y dímero 3 tienen el mismo dAb segundo (llamado dAb2), sin embargo tienen diferentes longitudes de enlazador (d2=(Gly Ser)3, d3=(Gly4Ser)3). dAbl es el dAb compañero para dímeros 1 , 5 y 6. dAb3 es el dAb compañero para dímero 4. ninguno de los dAbs compañero se neutralizan solos. La purificación FPLC es por intercambio de catión al menos que se establezca de otra manera. Las especies diméricas óptimas para cada dímero obtenidas por FPLC se determinan en estos ensayos Tabla 5: Dímeros TAR1 -5-19 Tabla 6: Homodímeros TAR1 -5-19 Tabla 7: Fabs TAR1 -5/TAR1 -5-1 9 Fabs Eiemplo 7: Dimerización dAb por enlace de cisteína terminal Resumen Para dimerización dAb, una cisteína libre se ha formado en el término C de la proteína. Cuando se expresa la proteína forma un dímero que puede purificarse por un método de purificación de dos etapas. Construcción PCR de dímero TAR 1 -5-1 9CYS Ver ejemplo 8 describiendo el dímero dAb. El procedimiento de trímero da orign a una mezcla de monómero, dímero y trímero. Expresión y purificación de dímero TAR 1 -5-1 9CYS El dímero se purifica del sobrenadante del cultivo por captura en agarosa de Proteína L como se subraya en el ejemplo 8. Separación de monómero TAR1 -5-1 9CYS del dímero TAR 1 -5- 1 9CYS Antes de l a separación del i ntercambio de catión, la muestra de monómero/dímero mezclada se intercambia por regulador en 50 mM regulador de acetato de sodio pH 4.0 utilizando una columna PD-1 0 (Amersham Pharmacia), siguiendo las indicaciones del fabricante. La muestra se aplica entonces a una columna de intercambio de catión S de Recurso de 1 ml (Amersham Pharmacia), que se ha pre-equilibrado con 50 mM acetato de sodio pH 4.0. El monómero y dímero se separan utilizando el siguiente ingrediente de sal en 50 mM acetato de sodio pH 4.0: 150 a 200 mM cloruro de sodio sobre 15 volúmenes de columna 200 a 450 mM cloruro de sodio sobre 10 volúmenes de columna 450 a 1000 mM cloruro de sodio sobre 15 volúmenes de columna Las fracciones conteniendo dímero solamente se identifican utilizando SDS-PAGE y después se agrupan y el pH se aumenta a 8 por la adición de 1 /5 volumen de 1 M Tris pH 8.0. Ensayo de unión funcional in vitro: ensayo de receptor TNF y ensayo de célula La afinidad del dímero para TNFa de humano se determina utilizando el receptor TNF y ensayo de célula. IC50 en el ensayo de receptor fue aproximadamente 0.3-0.8 nM ; ND50 en el ensayo de célula fue aproximadamente 3-8 nM. Otros formatos de dímero TAR1 -5-19CYS posibles Dímeros PEG y dímeros de maleimida sintéticos comunes Nektar (Shearwater) ofrece un rango de PEGs bi-maleimida [mPEG2-(MAL)2 o mPEG-(MAL)2] que permite que el monómero se formatee como un dímero, con un enlazador pequeño separando los dAbs y ambos enlazándose a un PEG variando en tamaño de 5 a 40 kDa. Se ha mostrado que 5kDa m PEG-(MAL)2 (es decir, [TAR 1 -5-1 9]-Cys-maleimida-PEGx2 , en donde las maleimidas se enlazan juntas en el dímero) tiene una afinidad en el ensayo de receptor TNF de ~ 1 -3 nM . También el dímero puede producirse utilizando TM EA (Tris[2-maleimidoetil]amina) ( Pierce Biotechnology) u otros enlazadores bi-funcionales. También es posible producir el dímero de disulfuro utilizando un procedimiento de acoplamiento químico utilizando 2,2'-ditiodipiridina (Sigma Aldrich) y el monómero reducido. Adición de un enlazador de poli péptido o articulación al término C del dAb Un enlazador pequeño, ya esa (Gly4Ser)n donde n= 1 a 10, por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, 6 o 7, una inmunoglobulina (por ejemplo, región de articulaci ón IgG o secuenci a de pépti do al azar (por ejemplo, seleccionada de una biblioteca de secuencias de péptido ai azar) puede formarse entre dAb y el residuo de cisteína terminal . Este puede utilizarse para hacer dímeros como se subraya arri ba. Ejemplo 8. Trimerización dAb Resumen Para trimización dAb, una cisteína libre se requiere en el térmi no C de la proteína. El residuo de cisteína, una vez reducido para dar el tiol libre, puede entonces utilizarse para acoplar específicamente la proteína a una molécula de maleimida trimérica, por ejemplo, TM EA (Tris[2-maleimidoetil] amina). Construcción PCR de TAR 1 -5-19CYS Los siguientes oligonucleótidos se utilizan para PCR específicamente TAR1 -5-19 con sitios Salí y BamHl para clonación y también para introducir un residuo de cisteina de terminal C: Trp Ser Ala Ser Thr Asp* He Gln Met Thr Gln Ger Pro ßer Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 TOG ASC GOB TCO AOO GAC ATC CAO ATG ACC CAG T T CCA TCC TCT CTG TCT GCA TCT OTA ACC TCG COC AOC TOC CTG TAQ OTC TAC TGG GTC AGA GGT AGG AGA GAC AGA CGT AQA CAT Gly Asp Arg Val TJxr He Thr Cys Arg Ala Ser Gn Ser He Asp Ser Tyr Leu Kie Trp 61 GGA GAC CGT GTC ACC ATC ACT TGC CGG OCA AST CAG AOC ATT SAT AOT TAT TTA CAT TOO CCT CTG GCA CAG TGG TAG TOA ACO GCC CST TCA OTC TCG TAA CTA TCA ATA AAT OTA ACC Tyr Gn Glu LyD Pro Gly Lyß Ala Pro Lys Leu Leu He Tyr Ser Ala Ber Glu Leu Gln 121 TAC CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT AGT GCA TCC GAG TTG CAÁ ATG OTC GTC TTT GOT CCC TTT CGG GGA TTC GAO GAC TAG ATA TCA OGT AGG CTC AAC GTT Ser Gly Val Pro Ser Arg Vhe ser Oly Ser Qly Ser Oly Thr Asp Sfhe Thr Leu thx He 181 AGT GGG GTC CCA TCA CGT TTC AGT GGC AST OOA TCT GGG AC GAT TTC ACT CTC ACC ATC TCA CCC CAO GGT AOT OCA AAC TCA CCG TCA CCT AGA CCC TGT CTA AAß TOA GAO TGG TAG Ser Ser Leu Gln Pro Qlu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Oln ala Val Val Trp Arg Pro 341 AGC AGT CTG CAÁ CCT QA? GAT TTT OCT ACÓ TAC TAC TOT CA CAO GTT OTO TOO COT CCT TCß TCA GAC GTT GGA CTT CTA AAA COA TOC ATO ATG ACÁ CTT CTC CAÁ CAC ACC GCA GOA BamHl Phe Tbr Phe Gly oln Gly Thr Lyß Val Glu He Lys Arg Cyß «* ••* Gly Sßr G?y 301 TTT ACG TTC GGC CAÁ G8 ACC AAS GTQ GAA ATC AAA CGG TCC TAA TAA GGA TCC GGC AAA TGC AAG CCG GTT CCC TGG TTC CAC CTT TAG TTT GCC ACG AIT ATT CCT AGG CCG (* inicio de secuencia TAR1 -5-19CYS; secuencia de aminoácidos TAR1 -5-19CYS (SEQ I D NO.633; secuencias de nucleótidos TAR1 -5- 19CYS (SEQ I D NO:634, filamento de codificación; SEQ I D NO:635, filamento de no codificación)) Cebador delantero 5'-TGGAGCGCGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCA-3' (SEQ I D NO:296) Cebador inverso 5'-TTAGCAGCCGGATCCTTATTA.GCACCGTTTGATTTCCAC-3' (SEQ I D NO:297) La reacción PCR (50µL volumen) se establece como sigue: 200µM dNTPs, 0.4µM de cada cebador, 5 µl de 10x regulador PfuTurbo (Stratagene), 100 ng de plásmido templado (codificando TAR1 -5-19), 1 µl de enzima Pr vTurbo (Stratagene) y el volumen se ajusta a 50µL utilizando agua estéril . Las siguientes condiciones PCR se utilizan: etapa de desnaturalización inicial 94°C por 2 mins, entonces 25 ciclos de 94°C por 30 segs, 64°C por 30 seg y 72°C por 30 seg. Una etapa de extensión final también se incluye de 72°C por 5 mins. El producto PCR se purifica y digiere con Salí y BamHl y liga en el vector que también se ha cortado con las mismas enzimas de restricción. Los clones correctos se verifican por secuenciación de ADN. Expresión y purificación de TAR1 -5-19CYS Vector TAR1 -5-19CYS se transforma en células químicamente competentes BL21 (DE3) pLysS (Novagen) siguiendo el procedimiento del fabricante. Las células llevando el plásmido dAb se seleccionan para utilizar 100µg/mL carbenicilin y 37 µg/mL cloramfenicol . Los cultivos se establecen en matraces turbios de 2L conteniendo 500 mL de caldo terrífico (Sigma-Aldrich), 100µg/mL carbenicilin y 37 µg/mL cloramfenicol. Los cultivos se desarrollan a 30°C a 200rpm a un O. D.600 de 1 -1 .5 y después se induce con 1 mM I PTG (isopropil-beta-D-tiogalactopiranosida, de Melford Laboratories). La expresión del dAb se deja continuar por 12-16 hrs a 30 °C. Se encuentra que la mayoría del dAb está presente en el medio de cultivo. Por lo tanto, las células se separan del medio por centrifugación (8,000xg por 30 mins), y el sobrenadante utilizado para purificar el dAb. Por litro de sobrenadante, 30 mL de agarosa de Proteína L (Affitech) se agrega y dAb se deja unirse por grupo con agitación por 2 horas. La resina se deja entonces establecer bajo gravedad por una hora más antes de que el sobrenadante se sifone. La agarosa se empaqueta entonces en una columna XK 50 (Amersham Phamacia) y se enjuaga con 10 volúmenes de columna de PBS. dAb unido se eluye con 100 mM glicina pH 2.0 y proteína conteniendo fracciones se neutralizan entonces por la adición de 1 /5 volumen de 1 M Tris pH 8.0. Por litro de sobrenadante de cultivo 20 mg de proteína pura se aisla, que contiene una proporción 50:50 de monómero a dímero. Trimerización de TAR1 -5-19CYS 2.5 ml de 100 µM TAR1 -5-19CYS se reduce con 5 m M ditiotreitol y se deja a temperatura ambiente por 20 minutos. La muestra se intercambia entonces por regulador utilizando una columna PD-10 (Amersham Pharmacia). La columna se ha pre-equilibrado con 5 mM EDTA, 50 mM fosfato de sodio pH 6.5, y la muestra se aplica y eluye siguiendo las directrices de fabricantes. La muestra se coloca en hielo hasta que se requiere. TMEA (Tps[2-maleimidoetiljamina) se compra de Pierce Biotechnology. Una solución de reserva de 20 mM de TM EA se hace en 100% DMSO (sulfóxido de dimetilo). Se encuentra que una concentración de TM EA mayor que 3: 1 (proporción molar de dAb:TM EA) causó la rápida precipitación y degradación de la proteína. También, la velocidad de precipitación y degradación fue mayor a medida que el pH se incrementa. Por lo tanto, utilizando 100 µM de TAR1 -5-19CYS reducido, 25 µM TM EA se agrega para trimerizar la proteína y la reacción se deja proceder a temperatura ambiente por dos horas. Se encuentra que la adición de aditivos tales como glicerol o glicol de etileno a 20% (v/v), reduce significativamente la precipitación del trímero a medida que la reacción de acoplamiento procede. Después de acoplamiento, análisis SDS-PAGE mostró la presencia de monómero, dímero y trímero en solución. Purificación de TAR 1 -5-19CYS trimérico 40 µl de 40% ácido acético glacial se agrega ppr mL de la reacción TMEA-TAR1 -5-19cys para reducir el pH a ~4. La muestra se aplica entonces a una columna de intercambio de catión de Recurso S de 1 mL (Amersham Pharmacia), que se ha pre-equilibrado con 50 mM acetato de sodio pH 4.0. El dímero y trímero se separan parcialmente utilizando un gradiente de sal de 340 a 450 mM Cloruro de sodio, 50 mM acetato de sodio pH 4.0 sobre 30 volúmenes de columna. Fracciones conteniendo trímero solamente se identifican utilizando SDS-PAGE y después se agrupan y el pH aumento a 8 por la adición de 1/5 volumen de 1 M Tris pH 8.0. Para prevenir la precipitación del trímero durante etapas de concentración (utilizando 5K corte de concentradores giratorios Viva; Vivascience), 10% glicerol se agrega a la muestra. Ensayo de unión funcional in vitro: ensayo de receptor TNF y ensayo de célula La afi nidad del trímero para TNFa de humano se determina utilizando el ensayo de célula y receptor TNF. I C50 en el ensayo de receptor fue 0.3nM; ND50 en el ensayo de célula estuvo en el rango de 3 a 10nM (por ejemplo, 3nM). Otros formatos de trímero TAR1 -5-19CYS posibles TAR1 -5-19CYS también puede formatearse en un trímero utilizando los siguientes reactivos: Trímeros PEG y trímeros de maleimida sintéticos comunes Nektar (Shearwater) ofrece un rango de PEGs de múltiples brazos que pueden modificarse químicamente en el extremo terminal del PEG. Por lo tanto, utilizando un trímero PEG con un grupo funcional maleimida en el extremo de cada brazo permitiría la trimerización de dAb en una manera similar a esa señalada arriba utilizando TMEA. PEG también puede tener la ventaja para incrementar la solubilidad del trímero previniendo así el problema de agregación. De esta manera, uno podría producir un trímero dAb en el cual cada dAb tiene una cisteína de terminal C que se enlaza a un grupo funcional meleimida, los grupos funcionales maleimida enlazándose a un trímero PEG. Adición de enlazador de polipéptido o articulación al término C del dAb Un enlazador pequeño, ya sea (Gly4Ser)„ donde n= 1 a 10, por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, 6 o 7 , una inmunoglobulina (por ejemplo, región de articulación IgG o secuencia de péptido aleatoria (por ejemplo, seleccionada de una biblioteca de secuencias de péptido al azar) podría formarse entre dAb y el residuo de cisteína terminal . Cuando se utiliza para hacer multímeros (por ejemplo, dímeros o trímeros), de nuevo se introduciría un mayor grado de flexibilidad y distancia entre los monómeros individuales, que pueden mejorar las características de unión al objetivo, por ejemplo, un objetivo de múltiples subunidades tal como TNFa de humano. Eiemplo 9. Selección de una colección de anticuerpos de dominio único (dAbs) dirigidos contra albúmina de suero de humano (HSA) y albúmina de suero de ratón (MSA) Este ejemplo explica un método para hacer un anticuerpo de dominio único (dAb) dirigido contra albúmina de suero. Selección de dAbs contra tanto albúmina de suero de ratón (MSA) como albúmina de suero de humano (HSA) se describe. Tres bibliotecas de anticuerpo de despliegue de fago de humano se utilizan en este experimento, cada una basándose en una estructura de humano única para VH (ver Figura 13: secuencia de VH de imitación en base a V3-23/DP47 y J H4b) o VK (ver Figura 15: secuencia de VK de imitación en base a o12/o2/DPK9 y Jk1 ) con diversidad de cadena lateral codificada por codones NNK incorporados en regiones de determinación complementarias (CDR1 , CDR2 y CDR3). Biblioteca 1 (VH): Diversidad en posiciones: H30, H31 , H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97, H98. Tamaño de biblioteca: 6.2x109 Biblioteca 2 (VH): Diversidad en posiciones: H30, H31 , H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97, H98, H99, H 100, H 100a, H 100b. Tamaño de biblioteca: 4.3x109 Biblioteca 3 (VK) : Diversidad en posiciones: L30, L31 , L32, L34, L50, L53, L91 , L92, L93, L94, L96 Tamaño de biblioteca: 2x109 Las bibliotecas VH y VK se han preseleccionado para unirse a proteína A y proteína L de ligandos genéricos respectivamente de manera que la mayoría de los clones en las bibliotecas no seleccionadas son funcionales. Los tamaños de las bibliotecas mostradas arriba corresponden a los tamaños después de preselección. Dos vueltas de selección se realizan en albúmina de suero utilizando cada una de las bibliotecas por separado. Para cada selección, el antígeno se reviste en inmunotubo (nunc) en 4 ml de PBS a una concentración de 100µg/ml. En la primer vuelta de selección, cada una de las tres bibliotecas se expanden por separado contra HSA (Sigma) y MSA (Sígma). En la segunda vuelta de selección, el fago de cada una de las seis selecciones de primer vuelta se expanden contra (i) el mismo antígeno de nuevo (por ejemplo 1 er vuelta MSA, 2da vuelta MSA) y (ii) contra el antígeno recíproco (por ejemplo 1 er vuelta MSA, 2da vuelta HSA) resultando en un total de doce selecciones de 2da vuelta. En cada caso, después de la segunda vuelta de selección 48 clones se prueban para unión a HSA y MSA. Fragmentos dAb solubles se producen como se describe para fragmentos scFv por Harrison et al. , Methods Enzymol. 1996;267:83-109 y procedimiento ELISA estándar se sigue (Hoogenboom et al. (1991 ) Nucleic Acids Res., 19: 4133) excepto que 2% tween PBS se utiliza como un regulador de bloqueo y dAbs unido se detecta con ya sea proteína L-HRP (Sigma) (para las VKS) y proteína A-HRP (Amersham Pharmacia Biotech) (para las VHs). dAbs que dan una señal arriba de lo anterior indicando la unión a MSA, HSA o ambos se prueba en forma insoluble de E LISA para unión a plástico solo pero fueron específicos para albúmina de suero. Los clones se secuencian entonces (ver tabla abajo) revelando que 21 secuencias dAb únicas se han identificado. La similitud mínima (en el nivel de aminoácido) entre los clones VK dAb fue 86.25% ((69/80)x100; el resultado cuando todos los residuos diversificados son diferentes, por ejemplo, clones 24 y 34). La similitud mínima entre los clones VH dAb seleccionados fue 94% ((127/136)x100). Después, los dAbs de unión a albúmina de suero se prueban por su habilidad para capturar el antígeno biotinilado de la solución. Procedimiento ELISA (como arriba) se sigue excepto que la placa de ELISA se reviste con 1 µg/ml proteína L (para los clones VK) y 1 µg/ml proteina A (para los clones VH). dAb solubles se capturan de solución como en el procedimiento y la detección fue con MSA o HSA biotinilado y HRP de estreptavidin. MSA y HSA biotinilado se han preparado de acuerdo a las instrucciones del fabricante con el objetivo de lograr un promedio de 2 biotinas por molécula de al búmi na de suero . Veinticuatro clones se i dentifican que capturan MSA biotinilado de solución en ELISA. Dos de estos (clones 2 y 38 de abajo) también capturan HSA biotinilado. Después, dAbs se prueban por su habilidad para unir MSA revestido en un chi p de bianúcleo CM5. Ocho clones se encuentran que unen MSA en el bianúcleo. Tabla 8.

En todos los casos las estructuras fueron idénticas a las estructuras en la secuencia de imitación correspondiente, con diversidad en las CDRs según se indica en la Tabla arriba.

De los ocho clones que unieron MSA sobre el bianúcleo, dos clones que se expresan altamente en E. coli (clones MSA16 y MSA26) se eligieron para estudio adicional (ver ejemplo 10). Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos completas para MSA16 y 26 se dan en la Figura 16. Eiemplo 10. Determinación de afinidad y vida media de suero en ratón de MSA que unen dAbs MSA 16 y MSA26. dAbs MSA16 y MSA26 se expresaron en el periplasma de E. coli y se purificaron utilizando absorción en grupo a la resina de afinidad L-agarosa proteínica (Affitech, Norway) seguida por elución con glicina en pH 2.2. Los dAbs purificados se analizaron así por inhibición de bianúcleo para determinar Kd. En resumen, MSA16 y MS A26 purificados se probaron para determinar la concentración de dAb requerido para lograr 200RUs de respuesta sobre un chip de bianúcleo CM5 revestido con una alta densidad de MSA. Una vez que las concentraciones requeridas de dAb se había determinado, el antígeno MSA a un rango de concentraciones alrededor del Kd esperado se premezcló con el dAb y se incubó durante la noche. La unión al chip de bianúcleo revestido MSA de dAb en cada un a de las premezclas se midió así a una velocidad de flujo alta de 30 µl/minuto. Las curvas resultantes se utilizaron para crear diagramas Klotz, que dieron un Kd estimado de 200 nM para M SA16 y 70 nM para MSA 26 (Figura 17 A & B). En seguida, los clones MSA16 y MSA26 se clonaron en un vector de expresión con el tag HA (secuencia de ácido nucleico: TATCCTTATGATGTTCCTGATTATGCA (SEQ I D NO: 631 ) y secuencia de aminoácidos: YPYDVPDYA (SEQ I D NO:632)) y 2-10 mg de cantidades se expresaron en E. coli y se purificación del sobrenadante con resina de afinidad L-agarosa proteínica (Affitech, Norway) y se eluyeron con glici na a pH 2.2. La vida media de suero de los dAbs se determinó en ratón. M S A26 y M S Al 6 se dosificaron como inyecciones i.v. únicas a aprox. 1.5mg/kg en ratones CD1 . El análisis de niveies de suero fue por captura de anti-HA de cabra (Abeam, UK) y ELISA de detección de L-HRP proteínica (invitrogen) que se bloqueó con 4% de Marvel . El lavado fue con 0.05% de PBS tween. Las curvas estándar de concentraciones conocidas de dAb se fijaron en la presencia de suero de Ixratón para asegurar la comparabilidad con las muestras de prueba. El moldeo con un modelo de compartimiento 2 mostró MSA-26 tenía una t1 /2a de 0.16hr, a t1/2ß de 14.5hr y un área bajo la curva (AUC) de 465 hr. mg/ml (datos no mostrados) y MSA-16 tuvo un t1 /2a de 0.98hr, un t1/2/? de 36.5hr y una AUC de 913hr. mg/ml (Figura 18). Ambos clones anti-MSA habían alargado considerablemente la vida media en comparación con HEL4 (un lisozima dAb blanco de huevo anti- gallina) que tuvo un t1/2a de 0.06hr, y un t1 /2 ? de 0.34hr. Eiemplo 11. Creación de fragmentos tipo Fab especifico dual Este ejemplo describe un método para elaborar VH-VH y V?-V? específicos duales como fragmentos tipo Fab. Antes de la construcción de cada uno de los fragmentos tipo Fab descritos, dAbs que se unen a objetivos de elección se seleccionaron primero de bibliotecas dAb similares a aquellas descritas en el ejemplo 9. Un dAb VH, HEL4, que se une a lisozima de huevo de gallina (Sigma) se aisló y un segundo dAb VH (TAR2h-5) que se une a receptor TNFa (sistemas R y D) también se aisló. Las secuencias de estos se dan en el listado de secuencias. Un dAb V? que une TNFa (TAR1 -5-19) se aisló por selección y maduración de afinidad y la secuencia también se establece en el listado de secuencias. Un segundo dAb V? (MSA 26) descrito en el ejemplo 9 cuya secuencia se encuentra en la Figura 17B también se utilizó en estos experimentos. ADN de vectores de expresión conteniendo los cuatro dAbs descritos arriba se ingirió con enzimas Salí y Notl para cortar la codificación de ADN para el dAb. Una banda del tamaño esperado (300-400bp) se purificó al ejecutar ia digestión sobre un gel de agarosa y cortar la banda, seguida por la purificación de gel utilizando el equipo de purificación de gel Qiagen (Qiagen, UK). La codificación de ADN para ios dAbs se insertó así ya sea sen los vectores CH o C? (Figs 8 y 9) según se indica en la Tabla de abajo. Tabla 9.

Las construcciones VH CH y VH C« se cotransformaron en células HB2151. Por separado, las construcciones V? CH y V? C? se contransformaron en células HB2151 . Los cultivos de cada de las estirpes de célula cotransformadas crecieron durante la noche (en 2xTy conteniendo 5% de glucosa, 10 µg/ml de cloramfenicol y 100 .g/ml de ampicilina para mantener la selección antibiótica tanto para plásmidos CH y CK) . Los cultivos durante la noche se utilizaron para inocular medio fresco (2xTy, 10 µg/ml de cloramficol y 100 µg/ml de ampicilina) y crecieron en OD 0.7-0.9 antes de la inducción por la adición de IPTG para expresar sus construcciones CH y C?. El fragmento tipo Fab expresado se purificó así del periplasma por purificación de proteína A (para VH CH y VH CK cotransformadas) y purificación de resina de afinidad MSA (para las V? CH y V? C cotransformadas). VH-VH dual específico La expresión del dual específico VH CH y VH C se probó al ejecutar la proteína en un gel . El gel se manchó y una banda del tamaño esperado para el fragmento Fab podría detectarse sobre un Western blot por medio de la tag myc y ia tag flag, indicando que tanto las partes VH CH como VH C del fragmento tipo Fab se presentaron. Enseguida, a fin de determinar si las dos mitades del dual específico se presentaron en el mismo fragmento tipo Fab, una placa ELISA se reviste durante la noche a 4°C con 100 µl por cavidad de lisozima de huevo de gallina (HEL) a 3 mg/ml en regulador de bicarbonato de sodio. La placa se bloqueó así (como se describe en ejemplo 1 ) con 2% de PBS tween seguido por incubación con el dual específico VH CH/VH C? de fragmento tipo Fab. La detección de la unión del dual específico al HEL fue por medio de la cadena de no cognado utilizando 9e10 (un anticuerpo monoclonal que une la tag myc, Roche) y IgG-HRP de anti ratón (Amersham Pharmacia Biotech). La señal para el dual específico VH CH/VH C? de fragmento tipo FAb fue 0.154 en comparación a una señal anterior de 0.069 para la cadena VH/CK expresada sola. Esto demuestra que el Fragmento tipo Fab tiene especificidad de unión para el antígeno objetivo. V -V? dual específico Después de purificarse el dual específico V? CH y V? C de fragmento tipo Fab sobre una resina de afinidad MSA, la proteina resultante se utilizó para probar una placa ELISA revestida con 1 µg/ml de TNFa y una placa ELISA revestida con 10 µg/ml de MSA. Según se pronostica, hubo señal arriba anterior cuando se detectó con la proteína L-HRP en ambas placas ELISA (datos no mostrados). Esto indicó que la fracción de proteína capaz de unirse a MSA (y por lo tanto purificarse sobre la columna de afinidad MSA) también fue capaz de unir TNFa en una ELISA subsiguiente, confirmando la especificidad dual del fragmento de anticuerpo. Esta fracción de proteína se utilizó así para dos subsiguiente experimentos. En primer lugar, una placa ELISA revestida con 1 µg/ml de TNFa se probó con dual específico V? CH y V? C? de Fragmento tipo Fab y también con un dAb de unión de TNFa de control a una concentración calculada para dar una señal similar sobre la ELISA.

Tanto el dAb de dual específico como control se utilizaron para probar la placa ELISA placa en la presencia y en la ausencia de 2 mg/ml MSA. La señal en la cavidad de dual específico se redujo por más del 50% pero la señal en la cavidad dAb no se redujo del todo (ver Figura 19a). La misma proteína se colocó también en el ensayo de receptor con y sin MSA y la competición por MSA también se mostró (ver Figura 19c). Esto demuestra que la unión de MSA al dual específico es competitiva con unión a TNFa. Ejemplo 12. Creación de un dual específico V?-V? cys unió dual específico con especificidad para albúmina de suero de ratón y TNFa Este ejemplo describe un método para hacer un fragmento de anticuerpo dual específico tanto para albúmina de suero de ratón como TNFa mediante acoplamiento químico por medio de un enlace de disulfuro. Tanto dAbs MSA16 (del ejemplo 1 ) como TAR1 -5-19 se volvieron a clonar en un vector basado en pET con una terminal C de cisteína y no tags. Las dos dAbs se expresaron a niveles de 4-10 mg y se purificaron del sobrenadante utilizado resina de afinidad L-agarosa proteínica (Affitiech, Norway). Los dAbs tagged de cisteína se redujeron así con ditiotreitol . El dAb TAR1 -5-19 se acopló así con ditiodipiridina para bloquear la reformación de enlaces de disulfuro que dan como resultado la formación de homodímeros PEP 1 -5-19. Los dos dAbs diferentes se mezclaron a pH 6.5 para promover la formación de enlace de disulfuro y la generación de heterodímeros unidos cys TAR1 -5-19, MSA16. Este método para producir conjugados de dos proteínas diferentes se describió originalmente por King et al. (King TP, Li Y Kochoumian L Biochemistry. 1978 voM7: 1499-506 Preparation of protein conjugates via intermolecular disulfide bond formation). Los heterodímeros se separaron de especies monoméricas por intercambio de catión. La separación se confirmó por la presencia de una banda del tamaño esperado sobre un gel SDS. La especie heterodimérica resultante se probó en el ensayo de receptor TNF y se encontró que tenía un IC50 para neutralizar TNF de aproximadamente 18 nM. Enseguida, el ensayo de receptor se repitió con una concentración constante de heterodímero (18 nM) y una serie de dilución de MSA y HSA. La presencia de HSA a un rango de concentraciones (hasta 2 mg/ml) no originó una reducción en la habilidad del dímero para inhibir TNFa. Sin embargo, la adición de MSA originó una reducción dependiente de dosis en la habilidad del dímero para inhibir TNFa (figura 20). Esto demuestra que MSA y TNFa compiten para la unión al dímero TAR1 -5-19, MSA16 unido por cys. Resumen de Datos Un resumen de datos obtenidos en los experi mentos establecidos en los siguientes ejemplos se establece en el Anexo 4. Eiemplo 13 Actividad de dAbs TNFR1 de anti-ratón y dAbs TNFR1 anti-humano Tabla 10. Actividad de dAbs TNFR 1 de anti-ratón n/d, no determinado Tabla 1 1 . Actividad de dAbs TNFR1 de anti-humano n/d, no determinado Ensayo de Liberación MRC-S IL-8 Las actividades de ciertos dAbs que unen TNFR1 de humano se valoraron en el siguiente ensayo de célula M RC-5. El ensayo se basa en la inducción de secreción de IL-18 por TNF en células MRC-5 y se adapta del método descrito en Alceson, L. et al. Journal of Biological Chemistry 277: 30517-30523 ( 1996), que describa la inducción de I L-8 por I L-1 en HUVEC. La actividad de los dAbs se ensayó al valorar la inducción de IL-8 por TNFa humano utilizando células MRC-5 en lugar de la estirpe de célula HUVEC. En resumen, Las células M RC-5 se laminaron en placas de microconcentración y las placas se incubaron durante la noche con dAb y TNFa humano (300 pg/ml). Siguiente a la incubación, el sobrenadante de cultivo se aspiró y la concentración de I L-18 en el sobrenadante se midió por medio de un intercalado ELISA (R&D Systems). La actividad de dAb anti-TNFR1 dio como resultado una reducción en la secreción de I L-18 en el sobrenadante en comparación con las cavidades de control que se incubaron con TNFa solamente. Eiemplo 14. Modelo de ataque séptico de ratón La eficacia in vivo de un dAb anti-TNFR1 se valoró en un modelo experimental bien establecido para síndrome de ataque séptico (Rothe et al. , Circulatory Shock 44: 51 -56, ( 1995)). La muerte inducida por LPS en este modelo es dependiente de la activación de TNFR-1 (p55). En este modelo los ratones se sensibilizaron para la toxicidad de LPS utilizando D-galactosamina (D-GaI N). La dosis LPS letal para los animales tipo silvestre en este estudio fue de aproximadamente 10 ng.

LPS (Salmonella enteritidis, Sigma, USA) y D-Galactosamina (D-GaI N, Sigma, USA) se inyectaron intraperitonealmente. Los ratones de control sensibilizados por D-GaIN (10 mg/ratón) murieron dentro de las 18 horas siguientes ai cambio con LPS (10 ng). La mortalidad de los ratones no sensibilizados se registró durante un periodo de 1 día después del cambio. Se les administraron a los ratones un ligando específico dual que une TNFR1 de ratón y albúmina de suero de ratón (TAR2m-21 -23 3U TAR7m-16¡ TAR7m-16 también se refiere en la presente como MSA16) o ENBREL® (entarecept; I mmunex Corporation) por inyecciones intraperitoneales 4 horas antes de la administración de LPS. (Ver, Tabla 12). La supervivencia se monitoreo en intervalos de 4-6 horas durante un período de 48 horas. La eficacia de dAbs de TNFR1 de anti-ratón se demostró por supervivencia. Tabla 12.

TAR2m-21 -23 3U TAR7m-16 es un ligando específico dual que contiene un dAb que une TNFR1 de ratón que se une a través de un enlazador de péptido a un dAb que une albúmina de suero de ratón.

Una secuencia de nucleótidos codificando TAR2m-21 -23 3U TAR7m-16 y la secuencia de aminoácidos del ligando específico dual se presentan abajo como SEQ I D NO: 636 y SEQ I D NO:637, respectivamente.

GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCG TCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAATAGGTATAGTATGGGGTGGCTCC GCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGsGTCTCACGGATTGATTCTTATGGTCGT GGTACATACTACGAAGACCCCGTGAAGGGCCGGTTCAGCATCTCCCGCGACAATTC CAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCCGTAT ATTACTGTGCGAAAATTTCTCAGTTTGGGTCAAATGCGTTTGACTACTGGGGTCAG GGAACCCAGGTCACCGTCTCGAGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGG CGGTGGCGGGJTCGACGGAC^TCC?GATGACCC?GTCTCCATCCTCCCTGTCTGCAT CTGTAGGAGACCGTGTC-ACClATCACrTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTATTAAGCAT TTAAAGTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGC ATCCCGGTTGC7.AAGTGGGGTCCCATC?CGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAG ATTTC?CTC 'C?.CCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGT CAACAGGGGGCTCGGTGGCCTCAGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAA ACGGGCGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAAT (SEQ ID NO: 636) EVQLLESGGG VQPGGSLRLSCAASGFTFNRYSMG LRQAPGKG E VSRIDSYGR GTYYEDPVKGRFSISRDNSK?ITLYLQiylNSIjRAEDTAVYYCAKISQFGSNAFDYWGQ GTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSTDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIIKH LKWYQQKPGKAPKLLIYGASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFT TISSLQPEDFATYYC QQGARWPQTF'GQGTKVEIKRAAAEQKLISEEDLN (SEQIDN?:637) La presencia de sobrevivientes en los grupos de tratamiento TAR2m-21 -23 3U TAR7m-16 demuestra que el dAb de anti-TNFR 1 fue eficaz en la inhibición de la actividad del receptor in vivo, y los resultados demuestran que el efecto fue dependiente de dosis.

Además, la eficacia de tratamiento TAR2m-21 -23 3U TAR7m-16 se comparó favorablemente con la eficacia de ENBREL® (entarecept; Immunex Corporation). La supervivencia de los animales que se trataron con TAR2m-21 -23 3U TAR7m-16 solos (Grupo 5, no cambio LPS) también demuestra que TAR2m-21 -23 3U TAR7m-16 no fue tóxico y no combatieron el receptor in vivo mediante degradación de receptor. Los estudios adicionales confirmaron que los dAbs de anti-TNFR1 no combaten TNFR1 (actúan como combatientes TNFR1 ) en la ausencia de TNFa. Las cél ulas L929 se cultivaron en el medio que contuvo un rango de concentraciones ya sea de monómero TAR2m-21 -23, monómero TAR2m-21 -23 degradado a un anticuerpo anti-myc comercialmente disponible (9E 10), TAR2m-21 -23 3U TAR7m-16 o TAR2m-21 -23 40K PEG. En el caso de monómero TAR2m-21 -23 degradado con el anticuerpo anti-myc, el dAb y anticuerpo se mezclaron en una relación 2: 1 y se pre-incubaron por una hora a temperatura ambiente para simular los efectos de degradación inmune in vivo antes del cultivo. El monómero TAR2m-21 -23 se incubó con las células L929 en una concentración de 3000 nM. El monómero TAR2m-21-23 y anticuerpo anti-Myc se incubaron a una concentración de dAb de 3000 nM . TAR2m-21 -23 3U TAR7m- 16 se incubó con las células a concentraciones de 25 nM , 83.3 nM , 250 nM , 833 nM y 2500 nM . TAEJ2m-21 -23 4OK PEG se incubó con las células a concentraciones 158.25 nM, 527.5 nM, 1582.5 nM , 5275 nM y 15825 nM . Después de la incubación durante la noche, la viabilidad celular se valoró como se describe para el ensayo de citotoxicidad L929. Los resultados revelaron que la incubación con diversas cantidades de dAbs no dieron como resultado un aumento en el número de células no viables en los cultivos. La incubación de cél ulas L929 con 1 0 nM , 1 nM y 0. 1 nM de un anticuerpo I gG anti-TNFR1 comercialmente disponi ble dio como resultado un aumento dependiente de dosis en células no viables demostrando de tal modo la sensibilidad de estas células al agonismo mediado por TNFR 1 . (Figura 26) . Eiemplo 15. Modelos de Enfermedades inflamatorias crónicas. A. Modelo de artritis inducida por colágeno de ratón Los ratones DBA/1 se inyectaron una vez con una emul sión de adyuvante Artrogen-CIA y colágeno Artrogen-CIA ( M D-biosciences) . En ei día 21 , ios animales con altos registros artríticos se removieron del estudio y el resto de los animales se dividieron en grupos de 1 0 con números iguales de animales macho y hembras. En el día 21 los tratamientos comenzaron con i nyecciones interaperitoneales ya sea de salina, ENBREL® (entrarecept; Immunex Corporation) o TAR2m-21 -23 40k PEG y se continuaron por 28 días. Los registros artríticos clínicos en una escala de 0 a 4 se midieron por cada una de las 4 extremidades de los animales, un registro de 0 se valoró por una extremidad normal y un registro de 4 se asignó para una extremidad máximamente inflamada con inclusión de múltiples articulaciones. Una reducción de la suma de los registros artríticos de l as cuatro extremidades del máximo de 16 a (a) 14-15, (b) 12-15, (c) 10-15, (d) 9-15, (e) 7-15, (f) 5-15, (g), 3-15, o (h) 1-15 es un efecto benéfico en este modelo. Un efecto benéfico puede dar como resultado una suma de los registros artríticos de las cuatro extremidades de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1 0, 11, 12, 13, 14 o 15. Un retraso en el inicio de artritis, en comparación con el grupo de control no tratado, también es un efecto benéfico en este modelo. Los registros clínicos claramente demostraron que el tratamiento con TAR2m-21-23 40k PEG tuvo un impacto muy favorable de inhibición del desarrollo de artritis cuando se comparó con el control de salina, y además el tratamiento de TAR2m-21-23 40k PEG se comparó favorablemente con ENBREL® (entarecept; Immunex Corporation). Esta es la primera demostración de inhibición de TNFR1 siendo eficaz en el tratamiento de un modelo de enfermedad inflamatoria crónica. B. Modelo de IBP ?ARE de ratón y artritis Los ratones que llevan una supresión objetivo en los elementos ricos en 3'AU del mARN TNF (referido como ratones Tnf?RE) sobreproducen TFN y desarrollan una enfermedad de intestino inflamado que es histopatológicamente similar a la enfermedad de Crohn. (Kontoyiannis et al., J Exp Med 196:1563-1 '4 (2002).). estos ratones, la enfermedad tipo Crohn se desarrolla entre 4 y 8 semanas de edad, y los animales también desarrollan señales clínicas de artritis reumatoide. Los dAbs que unen TNFR-1 de ratón se valoraron para la eficacia en la inhibición de patología tipo Crohn y artritis en ratones Tnf?ARE. ENBREL® (entarecept; Immunex Corporation) se utiliza como un control positivo. Los agentes se administraron por inyecciones intraperitoneales de acuerdo a la administración y régimen de dosificación presentado en la Tabla 13. Los dAbs que se estudiaron incluyen: 1 ) TAR2m-21 -23 PEGilado con una porción 40 kD PEG; 2) dual específico TAR2m-21 -23 3U TAR7m-16 que une ratón TNFR-1 y albúmina de suero de ratón. Tabla 13.

En la conclusión del período de dosificación, los ratones se sacrificaron y los íleos terminales y colones próximos se removieron para análisis. Para análisis histológico, las muestras de tejido se seccionaron y tintaran con hematoxilina y eosina, y la inflamación crónica y aguda se registrará utilizando un sistema de registro semi-cuantitativo. Los registros se asignaran como sigue: inflamación aguda registro 0=0-1 de célula polimorfonuclear (PM N) por campo de alta energía (PM N/hpf); 1 =2-10 PM N/hpf dentro de la mucosa; 2= 1 1 -20 PM N/hpf dentro de la mucosa; 3=21 -30 PM N/hpf dentro de la mucosa o 11 -20 PM N/hpf con extensión debajo de mucosas muscularis; 4=>30 PM N/hpf dentro de la mucosa o >20 PM N/hpf con extensión debajo de mucosas muscularis; registro de inflamación crónica 0=0-10 de leucocitos mononucleares (M L) por hpf (M L/hpf) dentro de mucosa; 1 = 1 1 -20 ML/hpf dentro de la mucosa; 2=21 -30 ML/hpf dentro de la mucosa o 11 -20 ML/hpf con extensión debajo de mucosas muscularis; 3=31 -40 M L/hpf dentro de la mucosa o hiperplasia folicular; y 4=40 M L/hpf dentro de la mucosa o >30 M L/hpf con extensión debajo de mucosas muscularis o hiperplasi folicular. Las señales macrofenotípicas de artritis se registraron semanalmente de acuerdo al siguiente sistema: 0=no artritis (apariencia y flexión normal); 1 = artritis media (distorsión de la articulación); 2= artritis moderada (absorción, deformación de articulación); 3= artritis pesada (movimiento severamente deteriorado). El TAR2m-21 -23 dAb demostraron buena eficacia in vivo en el modelo de ratón ARE delta de artritis tanto como un monómero 40 kD PEGilado (TAR2m21-23 40 IdD PEG ) como un formato anti- TNFR1/anti-SA dual específico (TAR2m-21 -23 3U TAR7m-16). En la semana 9, los registros artríticos promedio de los grupos tratados tanto de TAR2m-21 -23 como TAR2m-21 -23 3U TAR7m-16 fueron inferiores a 0.4. En contraste, el grupo de control de salina tuvo de artritis moderada a severa con un registro artrítico promedio que fue > 1.0. El grupo tratado con ENBREL® (entarecept; I mmunex Corporation), que se administró 3 veces por semana según se compara con TAR2m-21 -23 y el TAR2m-21 -23 3U TAR7m-16 que se administraron dos veces por semana, tuvieron un registro promedio de 0.5-1 .0. Estos resultados indican que la terapia con formatos dAb que unen TNFR1 es una terapia anti-artritis altamente eficaz, y que tanto los formatos PEGilados como dAb de especificidad dual estudiados son fármacos altamente eficaces para la enfermedad inflamatoria crónica. Además, estos resultados además demuestran que los dAbs que unen TNFR1 abarcan el receptor solamente en una manera antagonística. C. Ratón DSS modelo de EBP. I BD se inducirá en ratones al administrar sodio de sulfato de dextrano (DSS) en el agua para beber. (Ver, por ejemplo, Okayasu I . et al., Gastroenterology 98:694-702 (1990); Podolsky K. , J Gasteroenterol. 38 suppl Xv*:63-66 (2003).). Los ratones BDF1 adultos que son libres de H. pylori se alojaron por 2 semanas para estabilizar su ritmo cardiaco. Todos los ratones se mantendrán en cajas individualmente ventiladas en una unidad de barrera libre de patógeno específico (SPF) en un ciclo de 12 horas de luz:oscuridad. Se les dejo animales comida y agua ad libitum a lo largo de todo.

El estudio se ejecutará por 7 días. El agua para beber contendrá 5% de DSS para la duración del estudio. Todos los animales se trataran en los días 1 -7 en la mañana (0900-1000) y tarde (1600-1700). (Véase Tabla 14). El Día 1 es equivalente a una dosis profiláctica única. Todos los animales se pesaron diariamente y cualquier incidencia de diarrea se notará. Todos los animales se sacrificarán 24 horas siguiente al último tratamiento, y se administrará un pulso de bromodeoxiuridina 40 minutos antes de un sacrificio. Los intestinos delgados distales se removerán de los animales. Una muestra pequeña del intestino delgado distal se colocará en "ARNposterior*', y el resto se fijará en fijador de Carnoy, incorporado en parafina, seccionado (secciones no seriales por pedazo) y se tintaron con hematoxilina y eosina. Las secciones se valorarán visualmente para severidad de I BD y se asignaron un registro de severidad. Los análisis histométricos se realizarán y el área de lesión promedio (área de ulcera), área epitelial promedio, y para i nflamatoria intramural se determinarán. Las secciones transversales H&E del intestino delgado se utilizarán para registrar una serie de dimensiones de tejido utilizando un microscopio Zeiss Axiohome, el cual permite la cuantificación aguda de áreas. Para cada sección transversal , el área de epitelio más propia lumina y el área de tejido conectivo se medirá. El área epitelial se medirá así por separado, la diferencia siendo el área de propria lamina. En el tejido normal, la contribución relativa de este tejido al área es aproximadamente 10%, pero esto aumenta como aumentos de i nflamación. La proporci ón relativa de epitelio: propria lumina por lo tanto cambia. Con el aumento de la severidad de la profundidad de esta área se estrecha (contribuyendo a la ulceración) y la longitud del colon se acorta. J untos estos fenómenos origi nan que el área transversal del lumen aumenta. Este parámetro por lo tanto, también puede ser una medición útil de severidad de enfermedad. Las muestras de tejido se observarán microscópicamente y se asignaron un registro de severidad en donde 0=no inflamación; 1 =inflamación media alrededor de base encri ptada; 2=i nfiltración inflamatoria masiva, y arquitectura mucosal rota; 3=i nfiltración inflamatoria masiva, y arquitectura mucosal rota más ulceración. La efi cacia se indica en este modelo cuando el tratamiento produce una reducción de registro de severidad i nterna , en relación al registro de severidad del grupo de control de salina. Por ejemplo, el registro de severidad del grupo de tratamiento puede reducirse por 0.1 a aproximadamente 1 , 1 a aproximadamente 2, o 2 a aproxi madamente 3. La eficacia podria indicarse por un registro de aproximadamente 2 o menos, 1 a aproximadamente 2, o 1 o menos. 9 grupos de 6 animales se tratarán como sigue: Tabla 14.

DS S en agua para beber + sonda oral + control ve por ejemplo ácido 5'aminosalicilico o similar Animales sin tratar Las sondas orales se darán con ZANTAC® (clorhidrato de ranitidina, GlaxoSmithKIine). D. Modelo de enfermedad pulmonar obstructiva crónica de ratón (COPD) La eficacia de dAbs anti-TNFR1 en avance de la enfermedad en un modelo de humo de tabaco sub-crónico de ratón (TS) se valorará. (Ver, por ejemplo, Wright JL y Churg A. , Chest 722:306S-3O9S (2002).) Los dAbs TNFR 1 de anti-ratón se administrarán por inyecciones interaperitoneales cada 48 horas (comenzando 24 horas antes de la primera exposición a TS) y se darán como formato de vida medio de suero extendido (por ejemplo, PEGilado, ligando específico dual comprendiendo anti-SA dAb). Alternativamente, el dAb anti-TNFR1 se administra por suministro intranasa cada 24 horas (comenzando 4 horas antes de la primera exposición a TS) y se dará como un monómero dAb. ENBRE L® (entarecept; Immunex Corporation) se utilizará como un control positivo. La exposición TTS será diaria y el estudio durará por 1 -2 semanas. (Ver, por ejemplo, Vitalis et al., Eur. Respir. J, 7 */ :664-669 (1 998).). Siguiente a la última exposición TS el lavado bronquioaveolar se analizará por conteos celulares diferenciales y totales para incluir neutrófilos, eosinófilos, macrófagos y subgrupos de T-linfocito. Los lóbulos pulmonares se fijarán en 10% de formalina regulada y las secciones de tejido se analizaron para alargamiento de los alvéolos y ductos alveolares, espesamiento de las pequeñas paredes respiratorias y para que los conteos celulares incluyan neutrófilos, eosinófilos, macrófagos y subgrupos de T-linfocito. La eficacia será evidente por una reducción en el número de neutrófilos, eosinófilos, macrófagos y subgrupos de T-linfocito que se elevaron por exposición de TS y una reducción en el alargamiento inducido por TS de los alvéolos y ductos alveolares y espesamiento de las pequeñas paredes respiratorias. Eiemplo 16. Construcción y Expresión de una Molécula TNFR1 Quimérica Recombinante Este ejemplo explica un método para la generación de una molécula elaborada de diferentes dominios de TNFR1 murino y dominios TNFR1 humano (Banner DW, et al. Cell , 73(3):431 -45 ( 1993).) de manera que la molécula contiene los cuatro dominios extracelulares de TNFR1 pero que estos varían en derivación entre las proteínas de TNFR1 humano y de ratón. Los receptores quiméricos producidos comparten propiedades tanto de TNFR1 humano como TNFR1 de ratón de acuerdo a los diferentes papeles de dominio y funcionalidad. Las moléculas proporcionaron un medio para la valoración de la especificidad de dominio de dAbs, anticuerpos y fragmentos de unión de antígeno de los mismos y otras moléculas (por ejemplo, compuestos químicos orgánicos, NCE's; o dominios de proteína tal como anticuerpos, dominios de receptor LDL o dominios EGF) que unen TNFR1 humano o de ratón. Métodos Las secuencias de TNFR1 de ratón y humano se clonaron previamente en el vector de expresión Pichia pPicZalpha (I nvitrogen) por medio de los sitios de endonucleasa de restricción EcoRI y Notl . El ADN de TNFR1 de ratón templado (y por consecuencia las construcciones de receptor quimérica que terminan con un domi nio murino 4) contuvo una tag 3' 6x Histidina. TNFR1 humano (y por consecuencia las construcciones de receptor quimérica que terminan con un dominio humano 4) contuvo tanto tags Myc como 6x Histidina en secuencia en el extremo 3' . Los PCRs iniciales se realizaron de acuerdo a las condiciones de PCR estándar utilizando RubyTaq polimerasa ADN (USB Corporation, Cleveland, Ohio), 100 ng de ADN templado (comprendiendo el templado minipreparado ADN relevante de ya sea ADN de mTNFRI de longitud completa o hTNFRI ). Las reacciones de PCR típicas que se fijaron fueron como sigue: 25 µl de 10X de regulador RubyTaq PCR conteniendo polimerasa; 2 µl de primer cebador (de 10 µM de cepa); 2 µl de segundo cebador (de 10 µM de cepa); 1 µl (100 ng) de ADN templado de TNFR1 de longitud completa; 20 µl de dH2O (a un volumen final de 50 µl). Las reacciones se fijaron en tubos de pared delgada y se colocaron en un termociclador en donde la reacción se realizó de acuerdo a los siguientes parámetros.

Resumen de las reacciones de PCR iniciales utilizadas en la generación de construcciones quiméricas 'Anotación: H=dominio humano; M=dominio de ratón; por ejemplo, MHHH = Dominio 1 de ratón, dominios humanos 2-4. Los productos PCR que generaron estos PCRs iniciales se cortaron de 1% de gel de agarosa y se purificaron utilizando un equipo de purificación de gel (Qiagen) antes de la elución en 50 µl de dH O. Los cebadores utilizados para la generación de construcción de TNFR1 quimérico.

PCR SOE El ensamble PCR (también conocido como "Gene, 75:77(1):61- 8 ( 1989)) permite a los productos de PCR primarios traerse juntos sin digestión o ligación, haciendo uso de los extremos complementarios de los productos de PCR primarios. Durante este proceso los productos primarios se traen juntos y se desnaturalizan antes de que sus extremos complementarios se les permita amasarse juntos en la presencia de polimerasa de ADN Taq y dNTPs. Varios ciclos de reamasamiento y extensión dan como resultado el relleno de los filamentos complementarios y la producción de un templado de longitud completa. Los cebadores que flanquean el ahora casette de construcción de longitud completa se agregan y un PCR convencional se ejecutó para amplificar el producto instalado. Los PCRs SOE se realizaron a fin de amasar juntos y amplificar los diversos dominios TNFR1 derivados de los PCRs iniciales anteriormente descritos. Los PCRs SOE de ensamble se fijaron como sigue: 40 µl 10 x regulador PCR conteniendo MgCI?; ~2 µl (100 ng) de producto limpio de PCR 1 inicial; ~2 µl (100 ng) de producto limpio de PCR 2 inicial ; 36 µl de dH2O (a volumen final de 80 µl). La mezcla de cebador SOE se agregó después de la etapa de ensamble como sigue: 2 µl de cebador de flanqueo 5' (Cebador 1 ); 2 µi de cebador de flanqueo 3' (Cebador 2); 10 µl de l OxRegulador PCR; 6 µl de dH2O (a volumen final 20 µi). Las reacciones de PCR se realizaron utilizando el programa abajo descrito. Los ciclos de ensamble iniciales requirieron aproximadamente 45 minutos después de lo cual el termociclador se fijo para pausarse a 94° C. 20 µl de mezcla de cebador se agregó a cada reacción y se mezclo. Etapa 1 Ensamble Etapa 2 Amplificación (Pausa a 94°C, mezcla de cebadores se agregan así) Los productos PCR se revisaron al ejecutar 3-5 µl de cada reacción sobre un 1 % de gel de agarosa. 3) Clonación de quimeras TNFR1 ensamblados en el vector de expresión Pichia El vector pPicZalfa (Invitrogen) se ingirió secuencialmente con enzimas EcoRI y Notl antes de la purificación de columna de filtración de gel Cromaspin TE-1000 (Clontech, Mountain View, CA). 4) Transformación de construcciones quiméricas de TNFR1 en E. coli Las construcciones quiméricas ligadas se transformaron en células HB2151 electrocompetente E. coli y se recuperaron por una hora en medios LB de baja sal antes de la laminación en ágar LB de baja sal con 0.25 µg/ml de ZEOCIN, formulación antibiótica conteniendo Phleomicina D (Cayla, Toulouse, Francia), por 24 hrs a 37°C. Las colonias individuales se verificaron así por secuencia y las preparaciones de plásmido Maxiprep a gran escala elaboradas de cada vector de construcción qui mérica. Las secuencias de nucleótido de construcciones quiméricas preparadas se presentan abajo. Las construcciones quiméricas se nombraron de acuerdo al origen de sus dominios (ejecutándose del Dominio 1 en la parte izquierda al Dominio 4 en la parte derecha). Por ejemplo, HMMM contiene el Dominio 1 humano y Dominios 2-4 de ratón. Las proteínas quiméricas que contienen el dominio 4 de ratón tienen solamente tags His y carecen de la región separadora entre la región de transmembrana y Dominio 4.

HMMM AG GTGTGTCCCCAAGGAAAATATATCCACCCTCAAAATAATTCGATTTGCTGTACCAAG GCCAC?AAGGAACCTACTTGTACAATGACTGTCCAGGCCC^G<-«K:AGGATACGGACTGCAG GGAGTGTGAAAAGGGCACC T AOMC?^CCCAGAATTACCTCAGGCAGTGCCTCAGTT^ AAGAC?TGTCGGAAAGAAATGTCCC?GGTGGAGATC CGGTGTGTGGCTGTAAGGAGAACCAGTTCI-^CGCT CGTGGACTGCAGCCCCTGCTTCAACGGT^C^ ACCGTGTGTAACTGCC?TGC-AGGGT CT^^ ACTGCAAGAAAAA?GAGGAGTGTATGAAGTTGTGCCTAAGCGCTCATCATCATO^TCATCA TTAATGA (SEQ DO NO.619) HHHM AGTGTGTGTCCCCAAGGAAAATATATCCACCCTCAAAATAATTCGATTTGCTGTACCAAGT GCCACAAAGG ^CCTAI^TGTAC^?TGACTGTCCAGGCCCGGGGCAGGATACGGACTGCAG GGAGTGTGAGAGCGGCTCCTTCAC8CRIT^GAAAAC CCAAATGCCGAAAGGAAATGGOTC^GGTGGAGATCTCTTCTTGCACAGTGGACCGGGACA C<^TGTGTGGCTGCAGGAAGAACC?G ACCGGC?TTA1TGGAGTGAAAACCTTTTCCAGTG CTT?^TTGC^GCCTCTGCCTCAATGGGACCGTGCACCT ACCGTGTGCACCTGCCATGCAGGGTTCTTTCTGAGAGAAAGTGAGTGCGTCCCTTGCAGCC ACTGCAAGAAAAATGAGGAGTGTATGAAGTTGTGCCTAAGCGCTCATCATCATCATCATCA TTAATGA (SEQ ID NO:620) HHMH AGTGTGTGTCCCCAAGGAAAATATATCCACCCTCT^AAATAATTCGATTTGCTGTACCAAGT GCC?CAAAGGAAC TACTTGTA?^TGACTGTCCAGGCCCGGGGCAGGATACGGACTGCLAG GGAGTGTGAGAGCGGCTCCTTCLACCGCTTCAGAAAACC^^ TCCAAATGCCGAAAGGAAATGGGTCAGGTGGAG?TCTCGGTCTTGCAC?GTXK^ CQ3TGTGTGGCTGTAAGGAGAAC(^GTTC?^CGCTACCTGAGTGAGACACACTTCCAGTG CGTGGACTGCLAGCCCCTG RTCAACGGCACOT^ ACCGTGTGTAACTGCCATGCAGGTTTCTTTCTAAGAGAAAACGAGTGTGTCTCCTGTASTA ACTGTAAGAAAAGCCTGGAGTGCACGAAGTTGTGCCTACCCCAGATTGAGAATGTTAAGGG (^CTGAGGACTCAGGCACCACAG IGCCGC^ GAGGATCTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGA (SEQ ID NO.621) HMHH AGTGTGTGTCCCO?G?AAAATATATCCACCCTC?AAATAATTCGATTTGCTGTACCAAGT GCC?CYÜ^GGAACCTACTTGTAOATGACTGTCC AGGCCCGGGGCAGGATACGGACN'GCAG GGAGTGTGAAAAGGGCACCTTTACGGCTTCCC?GAATT^^ AAGACATGT?-K.Ü .GAAATGTCC<^GGTGG^ CGGTTGTGTGGCTGCAGOA?GAAC?VGTACCX^CATTATTGGAGTGAAAACCTTTTCC?GTG COTCAATTGCAGCCTCTGCCTCAATGGGACCGTGC?C^ ACCGTGTGC?CCTGCCATGCAGGTTTCTTTCT^ ACTOTAAGAAAAGCCTGGAGTGCIACGAAGTTGTGCCTACCCÍ^GATTGAGAATGTTAAGGG C?CTGAGGACTC?GGCACCAC^GCGGCCGCCAGCTTTCTAGAACAAAAACT(^TCTCAGAA GAGGATCTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGA (SEQ ID NO:622) MHHH AGCTTGTGTCCCOVAGGAAAGTATGTCCATTCTAAGAACAATTCC-ATCTGCTGCACCAAGT GCCIAC?AAGGAACCGAC GGGTGAGTGACTGTCCGAGCCC?GGGCGGCSATACAGTCTGCAG GGAGTGTGAGAGCGGCTCCTTCACCGCTTC?GAAAAC^ TCCAAATGCCGAAAGOAAATGGGTC?GGTGG?GATCTCCT CCGTGTGTGGCTGCAGGAAGAACC?GTAC ^CATTATTGGAGTGAAAACCTTTTCCAGTG CTTO -TTGC-AGCCTCTGCCTCAATGGGACCGTGC^CCTCRCSRGCCAGGAGAAACAGAAC ACCGTGTGCACCTGCCATGCAGGTTTCTTTCTAAGAGAAAACGAGTG'TGTCTCCTGTAGTA ACTGTAAGAAAAGCCTC?^GTGCACGAAGTTGTGC<^ACCC(^GATTC3AGAATGTTAAGGG C?CTGAGGACTC?GGCACC?C?GCGGCCGCC?^^ GAGGATCTG7^TAGCGCCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGA (SEQ ID NO:623) 5) Preparación de la construcción quimérica de TNFR1 y transformación en Pichia pastoris. El ADN plásmido generado por cada maxiprep se ingirió con la endonucleasa de restricción de corte infrecuente Pmel a fin de linealizar el ADN antes de la transformación pichia. El ADN alineado se limpió subsecuentemente por extracción de fenol/cloroformo y precipitación de etanol, antes de la resuspensión en 30 µl de dH2O. 10 µl de la solución de ADN linealizado se mezcló con 80 µl de electrocompetente KM7 cél ulas Pichia por 5 minutos antes de la electroporación a 1.5 kV, 200O, 25 µF. Las células se recuperaron inmediatamente con YPDS y se incubaron por 2 horas a 30°C antes de laminarse sobre placas ágar YPDS que contienen 100 µg/ml de ZEOCIN, formulación antibiótica que contiene Pleomicina D (Cayla, Toulouse, Francia), por 2 días. 6) Expresión de construcciones en Pichia Una colonia de transformante individual para cada construcción se tomó en 5 ml de BMGY como un cultivo iniciador y crecieron por 24 hrs a 30°C. Este cultivo se utilizó para inocular 500 ml de medio BMGY que se creció por 24 hrs a 30°C antes de que las células se colectaran por centrifugación a 1500-3000 g por 5 minutos a temperatura ambiente. Las células se volvieron a suspender así en 100 ml de BMMY y crecieron por 4 días con aumentos escalonados en concentración de metanol (0.5% de día 1 , 1 % de día 2, 1.5% de día 3 y 2% de día 4). Después el sobrenadante de expresión se recuperó después de la centrifugación de los cultivos a 3300 g por 15 minutos. 7) Purificación de construcciones quiméricas de TNFR1 utilizando resina Níquel Los sobrenadantes de cultivo se regularon inicialmente a través de la adición de 10 mM de concentración final de imidazol y 2x de PBS. La proteína con etiqueta His se absorbió en grupo por 4 horas (agitación) a temperatura ambiente a través de la adición de resina Níquel-NTA. La mezcla de sobrenadante/resina se fluyó así hacia una columna poli-prep (Biorad). La resina se lavó así con 10 volúmenes de columna de 2xPBS antes de la elución utilizando 250 mM de imidazol 1 x PBS. Después de que el intercambio de regulador la expresión de construcción quimérica se deglicosilató utilizando la deglicosilasa de EndoH antes de la verificación por SDS-PAGE. Secuencias de ADN templado utilizadas durante PCR TNFR1 Humano (Homo sapiens) (región extracelular acceso Genbank 33991418) CTG ?TCCCTCACCTAGGGGACAGGGAGAAGAGAGATAGTGTGTGTCCCCAAGG AAAATATATCCACX^CTCAAAATAATTCGATTTGCTGTACCAAGTGCCACAAAGG AACCT'ACITGTACAATGACrcTCCAGG <XGGGGCAGGATACC jACTGCAGGG AGTGTGAGAGCGGCTCCITCA(XCiCrrcAGAAAACCACCrCAGACACTGC GCTGCTCCAAATGCCGAAAGGAAATGGGTCAGGTGGAGATCTC GCTGGCACAG TGGACXGGGACACCGTGTGTGGCTGCAGGAAGAACCAGTACCGGCATTATTGG AGTGAAAACÍHTI CCAGTGCI CAATTGCAGCO'CTGCC CAATGGGACCGTG CACCTCTCCTGCCAGGAGAAACAGAACACCGTGTGCACCTGCCATGCAGGTTTC TTTCTAAGAsAAAACGAGTGTGTCTCCTGTAGTAACTGTAAGAAAAGCCTGGAG TGCACGAAGTTGTGCCTACCCCAGATTGAGAATGTTAAGGGCACTGAGGACTCA GGCACCACA (SEQ ID NO:624) La región extracelular codificada de TNFR1 humano tiene la siguiente secuencia de aminoácido.

LWHLGDREKRDSV(^GKYIHPQ NSICCIXCHKGTYLYN^ SGSFTASENH RHCI^re aXEMGQV^ QIENVKGTEDSGTT (SEQ ID NO:603) TNFR1 M urino (Mus musculus) (región extracelular acceso GenBank 31560798) CTAGTCT?TCTCITG TGACCGGGAGAAGAGGGATAG ?TGTGTCCCCAAGGA AAGTATGTCCATTCTAAGAACAATTCCATCTGCTGCACCAAGTGCCACAAAGGA ACCTACTTGGTGAGTGACTGTCCGAGCCCAGGGCGGGATACAGTCTGCAGGGA GTGTGAAAAGGGCAC(?TTACGGCITCCCAGAATTACCTCAGGCAGTGTCTCAG T^GCAAGACATGTCGGAAAGAAATGTCCCAGGTGGAGATCGCTCCTTGCCAAGC TGACAAGGACACGGTGTGTGGCTGTAAGGAGAACCAGTTCCAACGCTACCTGA GTGAGACACACTTCCAGTGÍ^TGGACRGCAGCCCCLX??TCAACGGCACCGTGA CAATCCCCTGTAAGGAGAC CAGAACACCGTGTGTAACTGCCATGCAGGGTTCT T C GAGAGAAAGTGAGTGCGTCCC?TGCAGCCACTGCAAGAAAAATGAGGAG TGTATGAAGTTGTGÍXTACCRCCTCCGCTTGCAAATGTCACAAACCCCCAGGAC TCAGGTACTGCG (SEQ ID NO:625) La región extracelular codificada de TNFR1 murino (Mus musculus) tiene la siguiente secuencia de aminoácido.

LWSLGDREKI8SLCTQGKYVHSKL^^ KGTFTASQNYUIQC SCKTCRKEMSQV?ISPCQADKDTVCG :KENQFQRYI^ETHF PPLANVTOPQDSGTA (SEQ ID NO:604) Ejemplo 17. Especificidad de Dominio de dAbs anti-TN FR1 Este ejemplo describe un método que se utilizó para determinar la especificidad de dominio de dAbs que unen TNFR1. El método utilizó resonancia de plasmón de superficie (SPR) ('Detection of immuno-complex formation via resonancia of surface plasmon on gold-coated diffraccíón gratings.' Biosensors. 1987-88;3(4):21 1 -25.) para determinar la habilidad de anticuerpos para unir el TNFR1 biotinilado de ratón o completamente humano que se inmovilizó en una superficie de chip SPR, después de que los anticuerpos se habían incubado y equilibrado con un exceso de las moléculas quiméricas descritas en el Ejemplo 16. En este ensayo, el flujo de un dAb anti-TNFR1 sobre la superficie de TNFR1 genera una señal de SPR indicando esa cantidad de dAb que une TNFR1 inmovilizado sobre el chip SPR. Si el dAb se pre-incuba y se equilibra con una molécula quimérica que comprende el (los) dominio (s) de TNFR1 que el dAb particular se une, así el flujo de esta mezcla sobre la superficie de TNFR1 producirá una señal SPR más pequeña en relación al dAb solo. Sin embargo, si el dAb se pre-incuba y se equilibra con una molécula quimérica que no comprende el (los) dominio (s) de TNFR1 que el dAb particular se une, después el flujo de esta mezcla sobre la superficie de TNFR1 producirá una señal SPR que es aproximadamente la misma como la señal obtenida utilizando dAb solo. Método 1 ) Generación de una superficie TNFR1 de chip SPR. La elección de superficie TNFR1 se determina por la especificidad de especie del dAb anti-TNFR1 a probar. Por lo tanto, los dAbs TNFR1 anti-humano se evaluaron utilizando una superfici e revestida con dAbs TNFR 1 humano y TNFR 1 de anti-ratón se evaluaron utilizando un chip revestido con TNFR1 de ratón. TNFR1 biotinilado se diluyó en el regulador SPR adecuado y se ejecutó a través de un chip sensor de estreptavidin (SA) en un instrumento SPR BIANÚCLEO 3000 (Biacore International AB, Uppsala, Suiza). Se utilizó una velocidad de bajo flujo (5-10 µL/minuto) a fin de maximizar el tiempo de contacto entre el TNFR1 bionitilado y la superficie de estrepatividin. El flujo continuó hasta que la superficie de estrepatividin se saturó con material biofinilado, a fin de generar un chip con superficie de TNFR1 máximo. El chip típicamente unión varias cientos a varias miles de unidades de respuesta SPR del material biotinilado. 2) Concentración de la respuesta anti-TNFR1 en el chip SPR Un experimento de competición exitoso requiere la optimización inicial de la concentración de dAb anti-TNFR1 de tal forma que la mínima cantidad de dAb se fluye sobre la superficie que da una señal de SPR significante. Dentro de un cierto rango de concentración, el dAb unirá la superficie en una manera dependiente de dosis de tal forma que el número de RUs de dAb unido reflejan la concentración de dAb fluido a través de la superficie de chip. A fin de lograr el rango de concentración de esta dependencia de dosis, los dAbs de anti-TNFR1 en una serie de dilución de 10 pliegues de regulador Bianúcleo variando de 1 en 10 de dilución a 1 en 1 , 000,000 de dilución. Las diluciones se inyectaron así individualmente y secuencialmente a través de la superficie de chip TNFR1 , comenzando con la muestra más diluida. El número máximo de RUs logrado en cada dilución se midieron. Después de cada inyección, la superficie de TNFR1 se regeneró para remover el dAb anti-TNFR1 unido en donde es necesario utilizando un regulador de regeneración SPR adecuado. Utilizando este método la concentración mínima de un dAb anti-TNFR1 requerido para generar una señal que represente aproximadamente 100 RU se determinó. 3) Pre-equilibrio de dAbs anti-TNFR1 /quiméricos. Una vez que la concentración de dAb anti-TNFR1 óptimo se determinó, se fijaron las mezclas de dAb anti-TNFR/TNFR1 quimérico. Las mezclas se fijaron de tal forma que la concentración final de dAb anti-TNFR1 fue idéntica a la concentración óptima determinada previamente. Las reacciones se fijaron típicamente en 100 µl de volúmenes que contienen 50 microlitos de un concentrado 2 x de dAb anti-TNFR1 , 40 microlitros de regulador Bianúcleo y 10 microlitros de proteína quimérica neta, purificada. Las concentraciones típicas para la mezcla final fueron aproximadamente 10-100 µM de proteína quimérica y aproximadamente 10-100 nM de dAb anti-TNFR1. Las mezclas se dejaron equilibrar por 30 minutos a temperatura ambiente. 4) Experimento Bianúcleo de Competición Después del equilibrio, cada mezcla de TNFR1 quimérico/dAb anti-TNFR1 se ejecutó secuencialmente sobre la superficie de SPR TNFR1 y el número de unidades de respuesta medidas. Después de que cada mezcla se inyectó, la superficie se regeneró para remover dAb anti-TNFR1 unido antes de que la siguiente mezcla se inyectara. Las diferentes respuestas generadas utilizando los diferentes quiméricos permitieron la determinación de los dominios TNFR1 unidos por dAbs particulares. Estos estudios revelaron que TAR2m-21 -23 une el Dominio 1 de TNFR1 de ratón, TAR2h-205 une el Dominio 1 de TNFR1 humano, y que TAR2h-10-27, TAR2h-131 -8, TAR2h-15-8, TAR2h-35-4, TAR2h-154-7, TAR2h-154-10 y TAR2h-185-25 unen el Dominio 3 de TNFR 1 humano. Eiemplo 18. Métodos de Selección Estas proteínas de receptor quimérico descritas en el Ejemplo 16 pueden utilizarse en ensayos o selecciones para aislar agentes (por ejemplo, anticuerpos, dAbs, compuestos químicos) que se unen a dominios particulares dentro de TNFR1. En resumen, estos métodos describen la adición de las proteínas quiméricas para las preparaciones de anticuerpo crudo antes de su selección para la unión de TNFR 1 ya asea por E LISA o por resonancia de plasmón de superficie. Adicionalmente, describen el uso de proteínas quiméricas revestidas sobre una superficie (por ejemplo, placa ELISA o chip SPR) y la selección de anticuerpos a través de la prueba de su unión a proteínas quiméricas sobre esta superficie. 1 ) Selección de ELISA soluble Este método puede utilizarse para aislar rápidamente anticuerpos o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, dAbs) que unen dominios específicos de TNFR1 de un gran repertorio de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de especificidad desconocida. Una placa de ensayo de 96 cavidades se revestirá durante la noche a 4°C con 100 µl por cavidad de TNFR1 quimérico. Las cavidades bien lavadas 3 veces con 0.1 % de TPBS (salina regulada por fosfato que contiene Tween-20 a una concentración de 0.1 %). 200 µl por cavidad de 1 % de TPBS se agregará para bloquear la placa, y la placa incubada por 1 -2 horas a temperatura ambiente. Las cavidades se lavarán asi 3 veces con PBS antes de la adición de 50 µl de sobrenadante bacteriano o periprep, conteniendo el anticuerpo soluble o fragmento de anticuerpo (que contienen la tag de epítopo c-Myc), en 50 µl de 0.2% de TPBS. La placa se incubará así por 1 hora a temperatura ambiente. Después de esto la placa se lavará 5 veces con 0.1 % de TPBS (0.1 % de Tween-20 en PBS). 100 µl de un monoclonal de ratón anti-c-Myc primario se agregará así en 0.1 % de TPBS a cada cavidad y la placa se incubará por 1 hora a temperatura ambiente. Esta solución de anticuerpo primario se descartará y la placa se lavará así 5 veces con 0.1 % de TPBS. 100 µl de IgG de anti-ratón prediluido (Fc específico) conjugado HRP de cabra se agregará así (Sigma No. de Catálogo A0168) y la placa se incubará por 1 hora a temperatura ambiente. El anticuerpo secundario se descartará así y la placa se lavará 6 veces con 0.1 % de TPBS seguido por 2 lavados con PBS. 50 µl de sol ución de peroxidasa TM B se agregará así a cada cavidad y la placa se dejará a la izquierda a temperatura ambiente por 2-60 minutos. La reacción se detendrá por la adición de 50 µl de 1 M de ácido clorhídrico. La OD a 450 nm de la placa se leerá en un lector de placas de 96 cavidades dentro de 30 minutos de adición acida. Aquellos anticuerpos presentes en el sobrenadante bacteriano crudo o peripreps que unen los dominios de TNFR1 presentes dentro de la proteína quimérica darán una señal ELISA más fuerte que aquellas que no la dan. 2) Selección E LI SA Competitiva. Este método puede utilizarse para seleccionar rápidamente un grupo de diversas preparaciones de anticuerpo crudo o fragmento de anticuerpo que unen TFNR1 a fin de determinar su especificidad de dominio. Una placa de ensayo de 96 cavidades se cubrirán durante la noche a 4°C con 100 µl por cavidad de TNFR1 humano o murino (ya sea humano o de ratón). Las cavidades se lavarán 3 veces con 0.1 % de TPBS (salina regulada de fosfato que contiene Tween-20 a una concentración de 0.1 %). 200 µl por cavidad de 1 % de TPBS (1 % de Tween-20 en PBS) se agregará para bloquear la placa, y la placa se incubará por 1 -2 horas a temperatura ambiente. Las cavidades se levarán así 3 veces con PBS. Al mismo tiempo, los sobrenadantes bacterianos o peripreparaciones se pre-equilibrarán con una concentración pre-óptima de proteína de TNFR1 quimérica en solución. 50 µl de esta mezcla de preparación quimérica/preparación bacteriana cruda, que contiene el anticuerpo soluble o fragmento de anticuerpo se agregará así a la placa ELISA. La placa se incubará por 1 hora a temperatura ambiente. Después, la placa se lavará 5 veces con 0.1 % de TPBSa (0.1 % de Tween-20 en PBS), y 100 µl de un anticuerpo de detección primario (o Proteína-HRP o Proteína L HRP) se agregará en 0.1 % de TPBS, a cada cavidad y la placa se incubará por 1 hora a temperatura ambiente. Esta solución de anticuerpo primario se descartará y la placa se lavará 5 veces con 0.1 % de TPBS. Si se requiere, 100 µl de un anticuerpo secundario/conjugado HRP prediluido de cabra se agregará así, y la placa se incubará por 1 hora a temperatura ambiente. El anticuerpo secundario se descartará así y la placa se lavará 6 veces con 0.1 % de TPBS seguido por 2 lavados con PBS. 50 µl de solución de peroxidasa de TM B se agregará a cada cavidad y la placa se dejará a temperatura ambiente por 2-60 minutos. La reacción se detendrá por la adición de 50 µl de 1 M de ácido clorhídrico. La OD a 450 nm de la placa se leerá en un lector de placa de 96 cavidades dentro de 30 minutos de adición acida. Una reducción en señal ELISA será indicadora de la unión de anticuerpo de los dominios de TNFR 1 quiméricos en lugar del TNFR1 revestido sobre la placa, y por lo tanto, el anticuerpo se une a uno de los dominios dentro de la proteína quimérica. 3) Selección ELISA competitiva para Anticuerpos y Fragmentos de Anticuerpo que compiten con un Anticuerpo de Referencia o Fragmento de Anticuerpo para Unión a TNFR1 . Este método puede utilizarse para seleccionar rápidamente diversos grupos de preparaciones de anticuerpo crudo o fragmento de anticuerpo que unen TN FR1 para aquellos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que compiten con un anticuerpo de referencia o fragmento de anticuerpo (por ejemplo, TAR2m-21 -23) para unión a TNFR1 o unión a un dominio deseado de TNFR1 (por ejemplo, dominio 1 ). El método utiliza un anticuerpo de referencia o fragmento de anticuerpo y el anticuerpo de prueba o fragmento de anticuerpo (por ejemplo, una población de anticuerpos a seleccionar) que contienen diferentes tags detectables (tags epitopo). Una placa de ensayo de 96 cavidades se revestirá durante la noche a 4°C con 100 µl por cavidad de TNFR1 humano o murino. Las cavidades se lavarán 3 veces con 0.1 % de TPBS (Salina regulada por Fosfato que contiene Tween-20 a una concentración de 0.1 %). 200 µl por cavidad de 1 % de TPBS (1 % de Tween-20 en PBS) se agregará para bloquear la placa, y ia placa se incubará por 1 -2 horas a temperatura ambiente. Las cavidades así se lavarán 3 veces con PBS. Al mismo tiempo, las preparaciones de anticuerpo crudo a probar se mezclarán con una concentración pre-óptima de anticuerpo de referencia o fragmento de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo de unión de dominio 1 , TAR2m-21 -23) en solución. Según ya se establece es importante que este anticuerpo no incluya las mismas tags de detección como se presentan en los anticuerpos que se seleccionan para la especificidad de unión de dominio. 50 µl de esta mezcla de anticuerpo crudo/anticuerpo de referencia, se agregará a la placa ELISA. La placa se incubará así por 1 hora a temperatura ambiente. Después, la placa se lavará 5 veces con 0.1 % de TPBS, 100 µl de un anticuerpo de detección primario (que une la tag presente solamente sobre la población de anticuerpo que se selecciona) se agregará en 0.1 % de TPBS a cada cavidad, y la placa se incubará por 1 hora a temperatura ambiente. Esta solución de anticuerpo primario se descartará y la placa se lavará así 5 veces con 0.1 % de TPBS. 100 µl de un anticuerpo secundario prediluido-conjugado HRP que reconoce el anticuerpo de detección primario se agregará así, y la placa se incubará por 1 hora a temperatura ambiente. La solución de anticuerpo secundario se descartará así y la placa se lavará 6 veces con 0.1 % de TPBS seguido por 2 lavados con PBS . 50 µl de solución de peroxidasa de TM B se agregarán así a cada cavidad y la placa se dejará a temperatura ambiente por 2-60 minutos. La reacción se detendrá por la adición de 50 µl de 1 M de ácido clorhídrico. La OD a 450 nm de la placa se leerá en un lector de placas de 96 cavidades dentro de 30 minutos de adición acida. Una ELI SA paralela y separada utilizando este método pero sin la adición del anticuerpo de referencia o fragmento de anticuerpo deberá hacerse en paralelo. Una reducción en señal ELISA en la presencia del anticuerpo de referencia o fragmento de anticuerpo, en comparación a la señal ELI SA para la misma preparación de anticuerpo si n anticuerpo de referencia de competencia o fragmento de anticuerpo, será indicadora de que el anticuerpo particular o fragmento de anticuerpo compite con el anticuerpo de referencia o fragmento de anticuerpo para unión a TNFR1 , y une el mismo dominio de TNFR 1 como el anticuerpo de referencia o fragmento de anticuerpo. 4) Selección de SPR Los métodos ELISA anteriormente descritos pueden adaptarse fácilmente a un formato que utiliza la resonancia de plasmón de superficie, por ejemplo, utilizando un instrumento SPR BIANÚCLEO 3000 (Biacore International AB, Uppsala, Suiza). Generalmente, la proteína quimérica se inmovilizará ya sea sobre el chip SPR, o la proteína quimérica se equilibrará con sobrenadante bacteriano crudo que contiene anticuerpos anti-TNFR1 o fragmentos de anticuerpo, y la mezcla resultante fluirá sobre un chip SPR revestido con TNFR 1 humano de longitud completa o TNFR1 murino. Eiemplo 19. Dímeros de TAR2m21 -23 son antagonistas de TNFR1 de alta avidez Los dímeros TAR2m21 -23 se prepararon al producir una forma de TAR2m21 -23 que contenían un residuo cys en la terminal carbosi utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 8. La proteína (TAR2m21 -23CYS) se expresó en Pichia y se purificó utilizando la Proteína A Streamline. El análisis SDS-PAGE no reductor mostró que -40-50% de la proteína se presentó en solución como un dímero. El dímero además se purificó utilizando cromatografía de filtración de gel . 2 mg de proteína se concentró abajo a aproximadamente 250 µl y se aplicó a una columna de filtración de gel Superdex 75 HR (Amersham Bioscience) que se habían equilibrado previamente con PBS. La columna se ejecutó a una velocidad de flujo de 0.5 ml/min y 0.5 ml de fracciones se colectaron. La elución de la proteína de la columna se monitoreó a 280 nm y las fracciones que contienen el dímero se identificaron por SDS-PAGE no reductor. Las fracciones que contuvieron dímeros pero no TAR2m-21 -23CYS monomérico se combinaron. Las fracciones combinadas se concentraron y la potencia del dAb dimérico se determinó en el ensayo de citotoxicidad de célula L929 TNF (Ejemplo 6). La potencia biológica de dímero TAR2m21 -23 se comparó contra TAR2m-21 -23 monomérico en el ensayo de citotoxicidad L929. En este ensayo, la citotoxicidad inducida por TNF de células L929 de ratón por monómero TAR2m-21 -23 y dímero TAR2m21 -23 se valoró, y los resultados se expresaron como la concentración de monómero de dAb o diméro que inhibieron la citotoxicidad por 50% en el ensayo (dosis neutralizadora 50, ND50). El dAb monomérico tuvo un ND50 de aproximadamente 600 pM en el ensayo. El ND50 del dAb dimerizado (dímero TAR2m21 -23) fue aproximadamente 10 veces inferior (ND50 aproximadamente 60-70 pM) en el ensayo. Estos resultados muestran que el dímero TAR2m21 -23 tuvo una afinidad mejorada de manera importante para el TNFR1 de superficie celular en comparación al monómero de dAb. Los resultados indican que el dímero TAR2m-21 -23 se une a dos moléculas TNFR1 separadas sobre la superficie celular simultáneamente, y el efecto de avidez resultante en la multimerización da como resultado la inhibición mejorada de TNFR1 .

El formato dimérico (dímero TAR2m21-23) se probó así para ver si mostraba cualquiera de las señales de agonismo TNFR, es decir, la habilidad de originar la degradación de TNFR1 e iniciar la señalización intracelular y muerte celular. Esto se logró utilizando un ensayo de citotoxicidad de célula L929 modificada en el cual no se agregó TNF-a, pero los anticuerpos de anti-TNFR1 o los formatos dAb se probaron para ver si combaten el TNFR1 e inducen la muerte celular. El anticuerpo anti-TNFR1 AF-425-PB (R&D Systems) que es un combatiente conocido de TNFR1, y un anticuerpo anti-TNFR1 MAB430 (R&D Systems), un antagonista reportado de TNFR1, TAR2m-21-23 y dímero TAR2m21-23 se probaron en el ensayo. El anticuerpo AF-425-PB activó TNFR1 e indujo la citotoxicidad en el ensayo con un ND50 de aproximadamente 100 pM. Aún el anticuerpo de antagonista reportado MAB430 originó la degradación de receptor y la muerte celular en el ensayo con un ND50 de aproximadamente 10 nM. En contraste, el dímero TAR2m-21-23 no originó ninguna muerte celular en el ensayo, aún cuando se presentó en concentraciones muy altas (>1 µM). Estos resultados muestran que el dímero TAR2m21-23 no es un combatiente TNFR1. Los resultados indican que los dímeros, trímeros u otros multímeros de dAbs que unen TNFR1 tienen avidez alta para TNFR1 expresada en ia superficie de las células y son antagonistas TNFR1 eficaces. Además, los resultados de este estudio muestran que los multímeros de dAbs que unen el Dominio 1 de TNFR1, tal como dímero TAR2m21-23, pueden unir dos moléculas TNFR1 (a medida que pueden los anticuerpos que actuaron como combatientes en el ensayo) y que la unión del dominio o epítopo objetivo en TNFR 1 (Dominio 1 ) previnieron la asociación de clase de cadenas receptoras que se requiere para el inicio de señalización TNFR1. Esta propiedad es única para una molécula bivalente en la que es capaz de degradar el TNFR1 sobre la superficie celular y todavía no origina la señalización TNFR1 y muerte celular. Eiemplo 20. Aislamiento de dAbs que unen TNFR1 humano y TNFR1 de ratón Los dAbs de secuencia conocida se expresaron en E. coli y se purificaron con resina de línea germinal Proteína A. Después de la elución con Tris-Glicina, dAbs se fluyeron sobre un chip SPR al cual se había inmovilizado TNFR1 humano biotinilado (célula de flujo 2) y TNFR 1 murino biotinilado se había inmovilizado (célula de fl ujo 4) . (El chip SPR se revistió con TNFR1 humano y TNFR1 murino en densidades similares). Las células de flujo 1 y 3 se dejaron en blanco y actuaron como superficies de referencia de no antígeno para la detección y substracción de unión no específica. El dAb se fluyó sobre las 4 células de flujo en serie (es decir, célula de flujo 1 , después 2, 3, y finalmente 4) con las diferencias de respuesta entre las células de flujo 2 y 1 medidas y las diferencias de respuesta entre las cél ulas de flujo 4 y 3 también midiéndose. El formador siendo una medición de unión a TNFR1 humano y la última unión a TNFR1 murino. Las curvas de unión específica se notaron para la unión tanto a TNFR1 humano como TNFR1 muri no, la naturaleza de las curvas siendo de tal forma que una velocidad encendida más rápida para el T NFR1 humano que el TNFR1 murino, se notó. Las velocidades apagadas fueron ampliamente similares. Una valoración de la reactividad cruzada se da por el número de unidades de respuesta (RU) máximamente logradas por cada caso de unión. En este ejemplo, la superficie de TNFR1 biotinilado humano comprendió aproximadamente 900RU de TNFR1 en célula de flujo 2, mientras que la célula de flujo 4 comprendió aproximadamente 1400RU de TNFR1 murino. Como un control , TAR2h-154-7, un dAb específico humano a una concentración de 2 micromolares se unió a la superficie humana con una respuesta máxima de 385RU, dando una respuesta en la superficie de ratón de solamente 4.5RU. 2 micromolares de TAR2h-205 dieron una respuesta en la superficie humana de 435RU, y una respuesta en la superficie de ratón de 266RU. Todas las publicaciones mencionadas en la presente especificación, y las referencias citadas en dichas publicaciones, se incorporan en la presente para referencia. Varias modificaciones y variaciones de los métodos descritos y sistema de la invención serán aparentes para aquellos expertos en la materia sin alejarse del alcance y espíritu de la invención. A pesar de que la invención se ha descrito en relación con las modalidades preferidas específicas, deberá entenderse que la invención según se reivindica no deberá limitarse indebidamente a tales modalidades específicas. A su vez, varias modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención que son obvias para aquellos expertos en la biología molecular o campos relacionados se pretende que se encuentren dentro del alcance de ias siguientes reivindicaciones. Anexo 1 ; polipéptidos que mejoran la vida media in vivo. Glicoproteína Alfa-1 (Orosomucoid) (AAG) Antiquiromotripsina Alfa-1 (ACT) Antitripsina Alfa-1 (AAT) Microglobulina Alfa-1 (proteína HC) (AI M) Macroglobulina Alfa-2 (A2M) Antitrombina l ll (AT lll) Apolipoproteína A-l (Apo A-l) Apoliproteína B (Apo B) Beta-2-microglobulina (B2M) Ceruloplasmina (Cp) Complemento Complementario (C3) Complemento Complementario (C4) Inhibidor de Esterasa Cl (Cl DSfH) Proteína Reactiva-C (CRP) Cistatina C (Cys C) Ferritina (FE R) Fibrinogen (FI B) Fibronectina (FN) Haptoglobina (Hp) Hemopexina (HPX) Inmunoglobulina A (IgA) Inmunoglobulina D (IgD) Inmunoglobulina E (IgE) Inmunoglobuli na G (IgG) Inmunoglobulina M (IgM) Cadenas Ligeras de Inmunoglobulina (kapa/lambda) Lipoproteína (a) [Lp(a)] Proteína de unión de Mannosa (M BP) Mioglobina (Myo) Plasminogen (PSM) Prealbúmina (Transtiretina) (PAL) Proteína de unión de Retinol (RBP) Factor de reumatoide (RF) Amiloide de Suero A (SAA) Receptor de Tranferrina Soluble (sTfR) Transferrina (Tf) Anexo 2 Anexo 3 Combinaciones de oncología Anexo 4 RESUMEN DE DATOS

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Un ligando de monómero dAb específico para Receptor de Factor de Necrosis de Tumor 1 (TNFR1; p55), que se disocia de TNFR1 de humano con una constante de disociación (Kd) de 50 nM a 20 pM, y una constante de velocidad Kapagada de 5x10'1 a 1x10"7 s"1, como se determina por resonancia de plasmón de superficie. 2. El ligando de monómero dAb de la reivindicación 1, en donde dicho monómero dAb inhibe la unión de Factor de Necrosis de Tumor Alfa (TNFa) a TNFR1 con IC50 de 500 nM a 50 pM. 3. El ligando de monómero dAb de acuerdo a la reivindicación 1 o 2, en donde el monómero neutraliza TNFR1 de humano en un ensayo de célula L929 estándar con ND50 de 500 nM a 50 pM. 4. El ligando de monómero dAb de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el dAb antagoniza la actividad del TNFR1 en un ensayo de célula estándar con ND50 de <100 nM, y en una concentración de <10µM el dAb agoniza la actividad del TNFR1 por <5% en el ensayo. 5. El ligando de monómero dAb de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende una estructura universal. 6. El ligando de monómero dAb de acuerdo a la reivindicación 5, en donde la estructura universal comprende la estructura DPK9 V , o una estructura VH seleccionada del grupo consistiendo de DP47, DP45 y DP38. 7. El ligando de monómero dAb de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 -7, que comprende un sitio de unión para un ligando genérico. 8. El ligando de monómero dAb de la reivindicación 7, en donde el ligando genérico se selecciona del grupo consistiendo de proteína A, proteína L y proteína G. 9. El ligando de monómero dAb de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el ligando de monómero dAb comprende un dominio variable de anticuerpo teniendo una o más regiones de estructura comprendiendo una secuencia de aminoácidos que es la misma que la secuencia de aminoácidos de una región de estructura correspondiente codificada por un segmento de gen de anticuerpo de línea germinal de humano, o las secuencias de aminoácidos de una o más de dichas regiones de estructura colectivamente comprende hasta 5 diferencias de aminoácido relativas a la secuencia de aminoácidos de dicha región de estructura correspondiente codificada por un segmento de gen de anticuerpo de línea germinal de humano. 10. El ligando de monómero dAb de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 -8, en donde el ligando de monómero dAb comprende un dominio variable de anticuerpo, en donde las secuencias de aminoácidos de FW1 , FW2, FW3 y FW4 son las mismas que las secuencias de aminoácidos de regiones de estructura correspondientes codificadas por un segmento de gen de anticuerpo de línea germinal de humano, o las secuencias de aminoácidos de FW1 , FW2, FW3 y FW4 colectivamente contienen hasta 10 diferencias de aminoácido relativas a las secuencias de aminoácidos de regiones de estructura correspondientes codificadas por dicho segmento de gen de anticuerpo de línea germinal de humano. 1 1 . El ligando de monómero dAb de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 -8, en donde el ligando de monómero dAb comprende un dominio variable de anticuerpo comprendiendo regiones FW1 , FW2 y FW3, y la secuencia de aminoácidos de dichas FW1 , FW2 y FW3 son las mismas que las secuencias de aminoácidos de regiones de estructura correspondientes codificadas por los segmentos de gen de anticuerpo de línea germinal de humano. 12. El ligando de monómero dAb de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 1 1 , en donde dicho segmento de gen de anticuerpo de línea germinal de humano se selecciona del grupo consistiendo de DP47, DP45, DP48 y DPK9. 13. El ligando de monómero dAb de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 -8, comprendiendo un dominio VH que no es un dominio variable de inmunoglobulina Camelid. 14. El ligando de monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 1 -8, comprendiendo un dominio VH que no contiene uno o más aminoácidos que son específicos a dominios variables de inmunoglobulina Camelid en comparación con dominios VH de humano. 15. El ligando de monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 1 -14, en donde dicho ligando de monómero dAb comprende un residuo Cys termi nal . 16. Un ligando específico dual comprendiendo al menos un ligando de monómero dAb de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 -15. 17. El ligando específico dual de la reivindicación 16, en donde dicho ligando específico dual es un dímero. 18. Un ligando de monómero dAb específico para Receptor de Factor de Necrosis de Tumor 1 (TNFR1 ; p55), en donde el dAb comprende la secuencia de aminoácidos de TAR2-10 o una secuencia que es al menos 80% homologa a la misma. 19. El ligando de monómero dAb de la reivindicación 18, en donde el dAb comprende la secuencia de aminoácidos de TAR2-10 o una secuencia que es al menos 90% homologa a la misma. 20. Un ligando de monómero dAb específico para Receptor de Factor de Necrosis de Tumor 1 (TNFR1 ; p55), en donde el dAb comprende la secuencia de aminoácidos de TAR2-5 o una secuencia que es al menos 80% homologa a la misma. 21 . El ligando de monómero dAb de la reivi ndicación 20, en donde el dAb comprende la secuencia de aminoácidos de TAR2-5 o una secuencia que es al menos 90% homologa a la misma. 22. Un ácido nucleico aislado codificando un ligando de monómero dAb específico para Receptor de Factor de Necrosis de Tumor 1 (TNFR1 ; p55), que se disocia de TNFR1 de humano con una constante de disociación (Kd) de 50 nM a 20 pM, y una constante de velocidad Kapagada de 5X10" 1 a 1x10"7 s'1 , como se determina por resonancia de plasmón de superficie. 23. El ácido nucleico aislado de acuerdo a la reivindicación 22, en donde dicho dAb del ligando de monómero dAb comprende la secuencia de aminoácidos de TAR2-10 o una secuencia que es al menos 80% homologa a la misma. 24. El ácido nucleico aislado de acuerdo a la reivindicación 22, en donde dicho dAb del ligando de monómero dAb comprende la secuencia de aminoácidos de TAR2-5 o una secuencia que es al menos 80% homologa a la misma. 25. Un ácido nucleico aislado codificando el ligando específico dual de la reivindicación 16. 26. Un ácido nucleico recombinante codificando un ligando de monómero dAb específico para Receptor de Factor de Necrosis de Tumor 1 (TNFR1 ; p55), que se disocia de TNFR1 de humano con una constante de disociación (Kd) de 50 nM a 20 pM , y una constante de velocidad Kapagada de 5X10"1 a 1x10"7 s"1 , como se determina por resonancia de plasmón de superficie. 27. El ácido nucleico recombinante de acuerdo a la reivindicación 26, en donde dicho dAb del ligando de monómero dAb comprende la secuencia de aminoácidos de TAR2-10 o una secuencia que es al menos 80% homologa a la misma. 28. El ácido nucleico recombinante de acuerdo a la reivindicación 26, en donde dicho dAb del ligando de monómero dAb comprende la secuencia de aminoácidos de TAR2-5 o una secuencia que es al menos 80% homologa a la misma. 29. Un ácido nucleico recombinante codificando el ligando específico dual de la reivindicación 16. 30. Un vector comprendiendo el ácido nucleico recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 26-28. 31 . El vector de acuerdo a la reivindicación 30 comprendiendo además una secuencia de control de expresión operablemente enlazada a dicho ácido nucleico recombinante. 32. Una célula huésped comprendiendo un vector de acuerdo a la reivindicación 30. 33. Un método para producir un ligando de monómero dAb comprendiendo mantener una célula huésped de la reivindicación 32 bajo condiciones adecuadas para expresión del ácido nucleico recombinante, mediante lo cual un ligando de monómero dAb se produce. 34. El método de la reivindicación 33, comprendiendo además aislar el ligando de monómero dAb. 35. Un vector comprendiendo el ácido nucleico recombinante de la reivindicación 29. 36. El vector de acuerdo a la reivindicación 35 comprendiendo además una secuencia de control de expresión operablemente enlazada a dicho ácido nucleico recombinante. 37. Una cél ula huésped comprendiendo un vector de acuerdo a la reivindicación 36. 38. Un método para producir un ligando específico dual comprendiendo mantener una célula huésped de la reivindicación 37 bajo condiciones adecuadas para expresión del ácido nucleico recombinante, mediante lo cual un ligando específico dual se produce. 39. El método de la reivindicación 33, comprendiendo además aislar el ligando específico dual. 40. Un método para tratar un desorden autoinmune, comprendiendo administrar a un mamífero en necesidad del mismo una dosis terapéuticamente efectiva de ligando de monómero dAb específico para Receptor de Factor de Necrosis de Tumor 1 (TNFR1 ; p55), que se disocia de TNFR1 de humano con una constante de disociación (Kd) de 50 nM a 20 pM , y una constante de velocidad Kapagada de 5X10 1 a 1 x10"7 s"1 , como se determina por resonancia de plasmón de superficie. 41 . Un método para tratar un desorden autoinmune, comprendiendo administrar a un mamífero en necesidad del mismo una dosis terapéuticamente efectiva de ligando específico dual comprendiendo un ligando de monómero dAb específico para Receptor de Factor de Necrosis de Tumor 1 (TNFR1 ; p55) , que se disocia de TNFR1 de humano con una constante de disociación (Kd) de 50 nM a 20 pM, y una constante de velocidad Kapagada de 5x10"1 a 1 x10"7 s'\ como se determina por resonancia de plasmón de superficie. 42. El método de la reivindicación 35 o reivindicación 36, en donde dicho desorden autoinmune se selecciona del grupo consistiendo de diabetes tipo I , asma, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, l upus sistémico eritematoso, enfermedad de Crohn y miastenia gravis. 43. Una composición comprendiendo un ligando de monómero dAb de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 -15 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 44. Una composición comprendiendo un ligando específico dual de acuerdo a la reivindicación 16 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 45. Un antagonista de Factor de Necrosis de Tumor 1 (TNFR1 ) que no antagoniza substancialmente el Factor de Necrosis de Tumor 2 (TNFR2) y es efectivo para tratar una enfermedad inflamatoria crónica en un sujeto. 46. El antagonista de la reivindicación 45, en donde dicho antagonista es efectivo en un modelo de enfermedad inflamatoria crónica seleccionado del grupo consistiendo de modelo de artritis inducida por colágeno de ratón, modelo de artritis ?ARE de ratón, modelo de enfermedad de intestino inflamatorio ?ARE de ratón, modelo de enfermedad del intestino inflamatorio inducida por sodio de sulfato dextran de ratón, y modelo de enfermedad pulmonar obstructiva crónica por fumada de tabaco de ratón. 47. El antagonista de la reivindicación 45 o 46, en donde dicho antagonista es monovalente. 48. El antagonista de cualquiera de las reivindicaciones 45-47, en donde dicho antagonista es un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo. 49. El antagonista de la reivindicación 48, en donde dicho antagonista es un fragmento de unión al antígeno monovalente de un anticuerpo. 50. El antagonista de cualquiera de las reivindicaciones 45-47, en donde dicho antagonista es un monómero de anticuerpo de dominio. 51. El antagonista de cualquiera de las reivindicaciones 45-50, en donde dicho antagonista une TNFR1 Kd de 300 nM a 5 pM. 52. Un monómero de anticuerpo de dominio (dAb) que específicamente une el Receptor de Factor de Necrosis de Tumor I (TNFR1 ), en donde dicho monómero dAb une TNFR1 con una Kd de 300 nM a 5 pM y es efectivo para tratar una enfermedad inflamatoria crónica en un sujeto. 53. El monómero dAb de la reivindicación 52, en donde dicho dAb es efectivo en un modelo de enfermedad inflamatoria crónica seleccionado del grupo consistiendo de modelo de artritis inducida por colágeno de ratón, modelo de artritis ?ARE de ratón, modelo de enfermedad de intesti no inflamatorio ?ARE de ratón, modelo de enfermedad del intestino inflamatorio inducida por sodio de sulfato dextran de ratón, y modelo de enfermedad pulmonar obstructiva crónica por fumada de tabaco de ratón. 54. El monómero dAb de la reivi ndicación 52 o 53, en donde dicho monómero dAb no antagoniza substancialmente el Factor de Necrosis de Tumor 2 (TNFR2). 55. El monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 52-54, en donde dicho monómero dAb no agoniza substanci almente TN FR 1 en un ensayo de célula L929 estándar cuando está presente en una concentración de hasta 1 0 µM . 56. El monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 52-55, en donde dicho monómero dAb inhibe la unión de Factor de Necrosis de Tumor Alfa (TNFa) a TN FR 1 con IC50 de 500 nM a 50 pM. 57. El monómero dAb de cualquiera de las reivi ndicaciones 52-56, en donde dicho monómero dAb se secreta en una cantidad de al menos aproximadamente 0.5 mg/L cuando se expresa en E. coli. 58. El monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 52-57, en donde dicho monómero dAb se desdobla de manera reversible cuando se calienta a una temperatura (Ts) y enfría a una temperatura (Te), en donde Ts es mayor que la temperatura de fusión (Tm) del monómero dAb, y Te es ¡nferior a la temperatura de fusión del monómero dAb. 59. El monómero dAb de la reivindicación 58, en donde Ts es aproximadamente 80°C y Te es aproximadamente temperatura ambiente. 60. El monómero dAb de cualquiera de las reivi ndicaciones 52-59, en donde dicho TNFR1 es TN FR1 de humano. 61 . El monómero dAb de la reivindicación 56, en donde dicho TNFa es TN Fa de humano y dicho TNFR1 es TNFR1 de humano. 62. El monómero dAb de cualquiera de las reivi ndi caci ones 52-61 , en donde dicho monómero dAb comprende un VH de humano o un VL de humano. 63. El monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 52-62, en donde las secuencias de aminoácidos de una o más de las regiones de estructura FW1 , FW2, FW3 y FW4 de dicho monómero dAb son las mismas que la secuencia de aminoácidos de una región de estructura correspondiente codificada por un segmento de gen de anticuerpo de línea germinal de humano, o las secuencias de aminoácidos de una o más de dichas regiones de estructura colectivamente comprenden hasta 5 diferencias de aminoácido relativas a la secuencia de aminoácidos de dicha región de estructura correspondiente codificada por un segmento de gen de anticuerpo de línea germinal de humano. 64. El monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 52-62, en donde las secuencias de aminoácidos de FW1 , FW2, FW3 y FW4 en dicho monómero dAb son las mismas que las secuencias de aminoácidos de regiones de estructura correspondientes codificadas por un segmento de gen de anticuerpo de l ínea germinal de humano, o las secuencias de aminoácidos de FW1 , FW2, FW3 y FW4 colectivamente contienen hasta 10 diferencias de aminoácido relativas a las secuencias de aminoácidos de regiones de estructura correspondientes codificadas por dicho segmento de gen de anticuerpo de l ínea germinal de humano. 65. El monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 52-62, en donde dicho monómero dAb comprende regiones FW1 , FW2 y FW3, y la secuencia de aminoácidos de dichas regiones FW1 , FW2 y FW3 son l as mismas que las secuencias de ami noácidos de regiones de estructura correspondientes codificadas por los segmentos de gen de anticuerpo de línea germinal de humano. 66. El monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 63-65, en donde dicho segmento de gen de anticuerpo de l ínea germi nal de humano se selecci ona del grupo consistiendo de DP47, DP45, DP48 y DPK9. 67. El monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 52-61 , en donde dicho monómero dAb no comprende un domi nio variable de i nmunoglobulina Camelid. 68. El monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 52-61 , en donde dicho monómero dAb no contiene uno o más ami noácidos de estructura que son únicos para l os domi nios variables de i nmunoglobuli na codificados por segmentos de gen de anticuerpo de línea germinal Camelid. 69. El monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 52-68, en donde dicho monómero dAb comprende un residuo de Ci steína termi nal . 70. El monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 52-69, en donde dicho monómero dAb comprende además una porción de glicol de polialquileno. 71 . El monómero dAb de la reivi ndicación 70, en donde dicha porción de glicol de polialquileno es una porción de glicol de polietileno. 72. Un ligando multiespecífico comprendiendo al menos un monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 52-71. 73. El ligando multiespecífico de la reivindicación 72, en donde dicho ligando multiespecífico comprende al menos un monómero dAb que no une TNFR1. 74. El ligando multiespecífico de la reivindicación 72, en donde dicho ligando multiespecífico comprende al menos un monómero dAb que específicamente une albúmina de suero. 75. Un formato de anticuerpo comprendiendo al menos un monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 52-71 . 76. Un ácido nucleico aislado codificando un monómero de anticuerpo de dominio (dAb) que específicamente une el Receptor de Factor de Necrosis de Tumor I (TNFR1 ), en donde dicho monómero dAb une TNFR1 con una Kd de 300 nM a 5 pM y es efectivo para tratar una enfermedad inflamatoria crónica en un sujeto. 77. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 76, en donde dicho monómero dAb es efectivo en un modelo de enfermedad inflamatoria crónica seleccionado del grupo consistiendo de modelo de artritis inducida por colágeno de ratón, modelo de artritis ?ARE de ratón, modelo de enfermedad de intestino inflamatorio ?ARE de ratón, modelo de enfermedad de intestino inflamatorio inducido por sodio de sulfato de dextran de ratón, y modelo de enfermedad pulmonar obstructiva crónica por fumada de tabaco de ratón. 78. Un ácido nucleico aislado codificando el ligando multiespecífico de la reivindicación 72. 79. Un ácido nucleico aislado codificando el formato de anticuerpo de la reivindicación 75. 80. Un ácido nucleico recombinante codificando un monómero de anticuerpo de dominio (dAb) que específicamente une el Receptor de Factor de Necrosis de Tumor I (TNFR1 ), en donde dicho monómero dAb une TNFR 1 con una Kd de 300 nM a 5 pM y es efectivo para tratar una enfermedad inflamatoria crónica en un sujeto. 81. El ácido nucleico recombinante de la reivindicación 80, en donde dicho monómero dAb es efectivo en un modelo de enfermedad inflamatoria crónica seleccionado del grupo consistiendo de modelo de artritis inducida por colágeno de ratón, modelo de artritis ?ARE de ratón, modelo de enfermedad de intestino inflamatorio ?ARE de ratón, modelo de enfermedad de i ntestino inflamatorio inducido por sodio de sulfato de dextran de ratón, y modelo de enfermedad pulmonar obstructiva crónica por fumada de tabaco de ratón. 82. Un ácido nucleico recombinante codificando el ligando multiespecífico de la reivindicación 72. 83. Un ácido nucleico recombinante codificando el formato de anticuerpo de la reivindicación 75. 84. Un vector comprendiendo el ácido nucleico recombinante de la reivindicación 80. 85. El vector de acuerdo a la reivindicación 84 comprendiendo además una secuencia de control de expresión operablemente enlazada a dicho ácido nucleico recombinante. 86. U na célula huésped comprendiendo un vector de la reivi ndicación 85 o un áci do nucleico recombi nante de la reivindicación 80. 87. Un método para producir un monómero dAb comprendiendo mantener una cél ula huésped de la reivi ndicación 86 baj o condici ones adecuadas para expresión del ácido nucleico recombinante, mediante lo cual un monómero dAb se produce. 88. El método de la reivindicación 87, comprendiendo además aislar el ligando de monómero dAb. 89. Un vector comprendi endo el ácido nucleico recombi nante de la reivi ndicación 82. 90. El vector de la reivindicación 89 comprendiendo además una secuencia de control de expresi ón operabl emente enlazada a dicho ácido nucleico recombi nante. 91 . Una célula huésped comprendiendo un vector de la reivindicación 90 o un ácido nucleico recombinante de la reivi ndicación 82. 92. Un método para producir un ligando multiespecífico comprendiendo mantener una célula huésped de la reivi ndicación 91 bajo condiciones adecuadas para expresión del ácido nucleico recombi nante, mediante lo cual un ligando multiespecífico se produce. 93. El método de la reivindicación 92, comprendiendo además aislar el ligando multiespecífico. 94. Un vector comprendiendo el ácido nucleico recombinante de la reivindicación 83. 95. El vector de la reivi ndicación 94 comprendiendo además una secuencia de control de expresión operablemente enlazada a dicho ácido nucleico recombinante. 96. Una célula huésped comprendiendo un vector de la reivindicación 95 o ácido nucleico recombinante de la reivindicación 83. 97. Un método para producir un formato de anticuerpo comprendiendo mantener una célula huésped de la reivindicación 96 bajo condiciones adecuadas para expresión del ácido nucleico recombinante, mediante lo cual un formato de anticuerpo se produce. 98. El método de la reivindicación 97, comprendiendo además aislar el formato de anticuerpo. 99. Una composición comprendiendo un monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 52-71 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 100. Una composición comprendiendo un ligando multiespecífico de acuerdo a la reivindicación 72 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 101. Una composición comprendiendo un formato de anticuerpo de acuerdo a la reivindicación 75 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 102. Un monómero de anticuerpo de dominio (dAb) que específicamente une el Receptor de Factor de Necrosis de Tumor I (TNFR1 ), en donde dicho monómero dAb une TNFRI con una Kd de 300 nM a 5 pM y comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 90% homologa a una secuencia de aminoácidos de un dAb seleccionada del grupo consistiendo de TAR2h-12 (SEQ ID NO:32), TAR2h-13 (SEQ ID NO:33), TAR2h-14 (SEQ ID NO:34), TAR2h-16 (SEQ ID NO:35), TAR2h-17 (SEQ ID NO:36), TAR2h-18 (SEQ ID NO:37), TAR2h-19 (SEQ ID NO:38), TAR2h-20 (SEQ ID NO:39), TAR2h-21 (SEQ ID NO:40), TAR2h-22 (SEQ ID NO:41), TAR2h-23 (SEQ ID NO:42), TAR2h-24 (SEQ ID NO:43), TAR2h-25 (SEQ ID NO:44), TAR2h-26 (SEQ ID NO:45), TAR2h-27 (SEQ ID NO:46), TAR2h-29 (SEQ ID NO:47), TAR2h-30 (SEQ ID NO:48), TAR2h-32 (SEQ ID NO:49), TAR2h-33 (SEQ ID NO:50), TAR2h-10-1 (SEQ ID NO:51), TAR2h-10-2 (SEQ ID NO:52), TAR2h-10-3 (SEQ ID NO:53), TAR2h-10-4 (SEQ ID NO:54), TAR2h-10-5 (SEQ ID NO:55), TAR2h-10-6 (SEQ ID NO:56), TAR2h-10-7 (SEQ ID NO.57), TAR2h-10-8 (SEQ ID NO:58), TAR2h-10-9 (SEQ ID NO:59), TAR2h-10-10 (SEQ ID NO:60 TAR2h-10-11 (SEQ ID NO:61), TAR2h-10-12 (SEQ ID NO:62 TAR2h-10-13 (SEQ ID NO:63), TAR2h-10-14 (SEQ ID NO:64 TAR2h-10-15 (SEQ ID NO:65). TAR2h-10-16 (SEQ ID NO:66 TAR2h-10-17 (SEQ ID NO:67), TAR2h-10-18 (SEQ ID NO:68 TAR2h-10-19 (SEQ ID NO:69), TAR2h-10-20 (SEQ ID NO:70 TAR2h-10-21 (SEQ ID NO:71), TAR2h-10-22 (SEQ ID NO:72 TAR2h-10-27 (SEQ ID NO:73), TAR2h-10-29 (SEQ ID NO:74 TAR2h-10-31 (SEQ ID NO:75), TAR2h-10-35 (SEQ ID NO:76 TAR2h-10-36 (SEQ ID NO:77), TAR2h-10-37 (SEQ ID NO:78 TAR2h-10-38 (SEQ ID NO:79), TAR2h-10-45 (SEQ ID NO:80), TAR2h-10-47 (SEQ ID NO:81), TAR2h-10-48 (SEQ ID NO:82), TAR2h-10-57 (SEQ ID NO:83), TAR2h-10-56 (SEQ ID NO.84), TAR2h-10-58 (SEQ ID NO:85), TAR2h-10-66 (SEQ ID NO:86), TAR2h-10-64 (SEQ ID NO:87), TAR2h-10-65 (SEQ ID NO:88), TAR2h-10-68 (SEQ ID NO:89), TAR2h-10-69 (SEQ ID NO:90), TAR2h-10-67 (SEQ ID NO:91), TAR2h-10-61 (SEQ ID NO:92), TAR2h-10-62 (SEQ ID NO:93), TAR2h-10-63 (SEQ ID NO:94), TAR2h-10-60 (SEQ ID NO:95), TAR2h-10-55 (SEQ ID NO:96), TAR2h-10-59 (SEQ ID NO:97), TAR2h-10-70 (SEQ ID NO:98), TAR2h-34 (SEQ ID NO:373), TAR2h-35 (SEQ ID NO:374), TAR2h-36 (SEQ ID NO:375), TAR2h-37 (SEQ ID NO:376), TAR2h-38 (SEQ ID NO:377). TAR2h-39 (SEQ ID NO:378), TAR2h-40 (SEQ ID NO:379), TAR2h-41 (SEQ ID NO:380), TAR2h-42 (SEQ ID NO:381), TAR2h-43 (SEQ ID NO:382), TAR2h-44 (SEQ ID NO:383), TAR2h-45 (SEQ ID NO:384), TAR2h-47 (SEQ ID NO:385), TAR2h-48 (SEQ ID NO:386), TAR2h-50 (SEQ ID NO:387), TAR2h-51 (SEQ ID NO:388), TAR2h-66 (SEQ ID NO:389), TAR2h-67 (SEQ ID NO:390), TAR2h-68 (SEQ ID NO:391), TAR2h-70 (SEQ ID NO:392), TAR2h-71 (SEQ ID NO:393), TAR2h-72 (SEQ ID NO:394), TAR2h-73 (SEQ ID NO:395), TAR2h-74 (SEQ ID NO:396), TAR2h-75 (SEQ ID NO:397), TAR2h-76 (SEQ ID NO:398), TAR2h-77 (SEQ ID NO:399), TAR2h-78 (SEQ ID NO:400), TAR2h-79 (SEQ ID NO:401) y TAR2h-15 (SEQ ID NO.431). 103. Un monómero de anticuerpo de dominio (dAb) que específicamente une el Receptor de Factor de Necrosis de Tumor I (TNFR1, p55, CD120a), comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 90% homologa a una secuencia de aminoácidos de un dAb seleccionada del grupo consistiendo de TAR2m-14 (SEQ ID NO: 167), TAR2M-15 (SEQ ID NO: 168), TAR2m-19 (SEQ ID NO:169), TAR2m-20 (SEQ ID NO: 170), TAR2m-21 (SEQ ID NO:171), TAR2m-24 (SEQ ID NO:172), TAR2m-21-23 (SEQ ID NO:173), TAR2m-21-07 (SEQ ID NO:174), TAR2m-21-43 (SEQ ID NO:175), TAR2m-21-48 (SEQ ID NO:176), TAR2m-21-10 (SEQ ID NO: 177), TAR2m-21-06 (SEQ ID NO: 178), TAR2m-21-17 (SEQ ID NO:179). 104. El monómero dAb de la reivindicación 102, en donde dicho ligando comprende además una porción de glicol de polialquileno. 105. El monómero dAb de la reivindicación 104, en donde dicha porción de glicol de polialquileno es una porción de glicol de polietileno. 106. Un ligando multiespecífico comprendiendo al menos un monómero dAb de la reivindicación 102. 107. El ligando multiespecífico de la reivindicación 106, en donde dicho ligando multiespecífíco comprende al menos un monómero dAb que no une TNFR1. 108. El ligando multiespecífico de la reivindicación 106, en donde dicho ligando multiespecífico comprende al menos un monómero dAb que específicamente une albúmina de suero. 109. Un formato de anticuerpo comprendiendo al menos un monómero dAb de la reivindicación 102. 110. Un ácido nucleico recombinante comprendiendo una secuencia de nucleótidos que codifica un monómero de anticuerpo de dominio (dAb) que específicamente une el Receptor de Factor de Necrosis de Tumor I (TNFR1), en donde dicha secuencia de nucleótidos es al menos aproximadamente 90% homologa a una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo consistiendo de TAR2h-12 (SEQ ID NO:32), TAR2h-13 (SEQ ID NO:33), TAR2h-14 (SEQ ID NO:34), TAR2h-16 (SEQ ID NO:35), TAR2h-17 (SEQ ID NO:36), TAR2h-18 (SEQ ID NO:37), TAR2h-19 (SEQ ID NO:38), TAR2h-20 (SEQ ID NO:39), TAR2h-21 (SEQ ID NO:40), TAR2h-22 (SEQ ID NO:41), TAR2h-23 (SEQ ID NO:42), TAR2h-24 (SEQ ID NO:43), TAR2h-25 (SEQ ID NO:44), TAR2h-26 (SEQ ID NO:45), TAR2h-27 (SEQ ID NO:46), TAR2h-29 (SEQ ID NO:47), TAR2h-30 (SEQ ID NO:48), TAR2h-32 (SEQ ID NO:49), TAR2h-33 (SEQ ID NO:50), TAR2h-10-1 (SEQ ID NO:51), TAR2h-10-2 (SEQ ID NO:52), TAR2h-10-3 (SEQ ID NO:53), TAR2h-10-4 (SEQ ID NO:54), TAR2h-10-5 (SEQ ID NO:55), TAR2h-10-6 (SEQ ID NO:56), TAR2h-10-7 (SEQ ID NO:57), TAR2h-10-8 (SEQ ID NO:58), TAR2h-10-9 (SEQ ID NO:59), TAR2h-10-10 (SEQ ID NO:60), TAR2h-10-11 (SEQ ID NO:61), TAR2h-10-12 (SEQ ID NO:62), TAR2h-10-13 (SEQ ID NO:63), TAR2h-10-14 (SEQ ID NO:64), TAR2h-10-15 (SEQ ID NO:65), TAR2h-10-16 (SEQ ID NO:66), TAR2h-10-17 (SEQ ID NO:67), TAR2h-10-18 (SEQ ID NO:68), TAR2h-10-19 (SEQ ID NO:69), TAR2h-10-20 (SEQ ID NO:70), TAR2h-10-21 (SEQ ID NO:71 TAR2h-10-22 (SEQ ID NO:72 TAR2h-10-27 (SEQ ID NO:73 TAR2h-10-29 (SEQ ID NO:74 TAR2h-10-31 (SEQ ID NO:75 TAR2h-10-35 (SEQ ID NO:76 TAR2h-10-36 (SEQ ID NO:77 TAR2h-10-37 (SEQ ID NO:78 TAR2h-10-38 (SEQ ID NO:79 TAR2h-10-45 (SEQ ID NO:80 TAR2h-10-47 (SEQ ID NO:81 TAR2h-10-48 (SEQ ID NO:82 TAR2h-10-57 (SEQ ID NO:83 TAR2h-10-56 (SEQ ID NO:84 TAR2h-10-58 (SEQ ID NO:85 TAR2h-10-66 (SEQ ID NO:86 TAR2h-10-64 (SEQ ID NO:87 TAR2h-10-65 (SEQ ID NO:88 TAR2h-10-68 (SEQ ID NO:89 TAR2h-10-69 (SEQ ID NO:90 TAR2h-10-67 (SEQ ID NO:91 TAR2h-10-61 (SEQ ID NO:92 TAR2h-10-62 (SEQ ID NO:93 TAR2h-10-63 (SEQ ID NO:94 TAR2h-10-60 (SEQ ID NO:95 TAR2h-10-55 (SEQ ID NO:96) TAR2h-10-59 (SEQ ID NO:97 TAR2h-10-70 (SEQ ID NO:98), TAR2h-34 (SEQ ID NO:402), TAR2h-35 (SEQ ID NO:403), TAR2h-36 (SEQ ID NO.404), TAR2h-37 (SEQ ID NO:405), TAR2h-38 (SEQ ID NO:406), TAR2h-39 (SEQ ID NO:407), TAR2h-40 (SEQ ID NO:408), TAR2h-41 (SEQ ID NO:409), TAR2h-42 (SEQ ID NO:410), TAR2h-43 (SEQ ID NO:411), TAR2h-44 (SEQ ID NO:412), TAR2h-45 (SEQ ID NO:413), TAR2h-47 (SEQ ID NO:414), TAR2h-48 (SEQ ID NO:415), TAR2h-50 (SEQ ID NO:416), TAR2h-51 (SEQ ID NO:417), TAR2h-66 (SEQ ID NO:418), TAR2h-67 (SEQ ID NO:419), TAR2h-68 (SEQ ID NO:420), TAR2h-70 (SEQ ID NO:421), TAR2h-71 (SEQ ID NO:422), TAR2h-72 (SEQ ID NO:423), TAR2h-73 (SEQ ID NO:424), TAR2h-74 (SEQ ID NO:425), TAR2h-75 (SEQ ID NO:426), TAR2h-76 (SEQ ID NO:427), TAR2h-77 (SEQ ID NO:428), TAR2h-78 (SEQ ID NO:429), TAR2h-79 (SEQ ID NO:430) y TAR2h-15 (SEQ ID NO.432). 111. Un ácido nucleico recombinante comprendiendo una secuencia de nucleótidos que codifica un monómero de anticuerpo de dominio (dAb) que específicamente une el Receptor de Factor de Necrosis de Tumor I (TNFR1), en donde dicha secuencia de nucleótidos es al menos aproximadamente 90% homologa a una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo consistiendo de TAR2m-14 (SEQ ID NO:180), TAR2m-15 (SEQ ID NO:181), TAR2m-19 (SEQ ID NO:182), TAR2m-20 (SEQ ID NO:183), TAR2m-21 (SEQ ID NO:184), TAR2m-24 (SEQ ID NO:185), TAR2m-21-23 (SEQ ID NO: 186), TAR2m-21-07 (SEQ ID NO: 187), TAR2m-21-43 (SEQ ID NO:188), TAR2m-21-48 (SEQ ID NO:189), TAR2m-21-10 (SEQ ID NO:190), TAR2m-21-06 (SEQ ID NO.191), y TAR2m-21-17 (SEQ ID NO: 192). 112. Un vector comprendiendo el ácido nucleico recombinante de la reivindicación 110. 113. El vector de la reivindicación 112 comprendiendo además una secuencia de control de expresión operablemente enlazada a dicho ácido nucleico recombinante. 114. Una célula huésped comprendiendo un vector de la reivindicación 113 o ácido nucleico recombinante de la reivindicación 110. 115. Un método para producir un monómero dAb comprendiendo mantener una célula huésped de la reivindicación 114 bajo condiciones adecuadas para expresión del ácido nucleico recombinante, mediante lo cual un monómero dAb se produce. 116. Un método para tratar, suprimir o prevenir una enfermedad inflamatoria crónica, comprendiendo administrar a un sujeto en necesidad del mismo una dosis terapéuticamente efectiva de un antagonista de Factor de Necrosis de Tumor 1 (TNFR1) que no antagoniza substancialmente el Factor de Necrosis de Tumor 2 (TNFR2). 117. El método de la reivindicación 116, en donde dicho antagonista es monovalente. 118. El método de la reivindicación 116 o 117, en donde dicho antagonista es un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo. 119. El método de la reivindicación 118, en donde dicho antagonista es un fragmento de unión al antígeno monovalente de un anticuerpo. 120. El método de cualquiera de las reivindicaciones 116-119, en donde dicho antagonista es un monómero de anticuerpo de dominio. 121. El método de cualquiera de las reivindicaciones 116-120, en donde dicho antagonista une TNFR1 Kd de 300 nM a 5 pM. 122. El método de cualquiera de las reivindicaciones 116-121, en donde dicha enfermedad inflamatoria crónica se selecciona del grupo consistiendo de artritis, esclerosis múltiple, enfermedad del intestino inflamatorio y enfermedad pulmonar obstructiva crónica. 123. Un método para tratar una enfermedad inflamatoria, comprendiendo administrar a un sujeto en necesidad del mismo una dosis terapéuticamente efectiva de un ligando comprendiendo un monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, 18-21, 52-71 y 102-105. 124. Un método para tratar artritis, comprendiendo administrar a un sujeto en necesidad del mismo una dosis terapéuticamente efectiva de un ligando comprendiendo un monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, 18-21, 52-71 y 102-105. 125. El método de la reivindicación 124, en donde dicha artritis es artritis reumatoide o artritis reumatoide juvenil. 126. Un método para tratar esclerosis múltiple, comprendiendo administrar a un sujeto en necesidad del mismo una dosis terapéuticamente efectiva de un ligando comprendiendo un monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, 18-21, 52-71 y 102-105. 127. Un método para tratar enfermedad del intestino inflamatorio, comprendiendo administrar a un sujeto en necesidad del mismo una dosis terapéuticamente efectiva de un ligando comprendiendo un monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, 18-21, 52-71 y 102-105. 128. El método de la reivindicación 127, en donde dicha enfermedad del intestino inflamatorio se selecciona del grupo consistiendo de enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa. 129. Un método para tratar enfermedad pulmonar obstructiva crónica, comprendiendo administrar a un sujeto en necesidad del mismo una dosis terapéuticamente efectiva de un ligando comprendiendo un monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 1 -15, 18-21 , 52-71 y 102-105. 130. El método de la reivindicación 129, en donde dicha enfermedad pulmonar obstructiva crónica se selecciona del grupo consistiendo de bronquitis crónica, bronquitis obstructiva crónica y enfisema. 131 . Un método para tratar neumonía, comprendiendo administrar a un sujeto en necesidad del mismo una dosis terapéuticamente efectiva de un ligando comprendiendo un monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 1 -15, 18-21 , 52-71 y 102-105. 132. El método de la reivindicación 131 , en donde dicha neumonía es neumonía bacteriana. 133. El método de la reivindicación 132, en donde dicha neumonía bacteriana es neumonía Staphylococcal . 134. Un método para tratar ataque séptico, comprendiendo administrar a un sujeto en necesidad dei mismo una dosis terapéuticamente efectiva de un ligando comprendiendo un monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 1 -15, 18-21 , 52-71 y 102-105. 135. Un polipéptido comprendiendo un monómero de anticuerpo de dominio (dAb) que específicamente une el Receptor de Factor de Necrosis de Tumor I (TNFR1 ), en donde dicho polipéptido une TNFR1 con una Kd de 300 nM a 5 pM y es efectivo para tratar una enfermedad inflamatoria crónica en un sujeto. 136. El polipéptido de la reivindicación 135, en donde dicho polipéptido es efectivo en un modelo de enfermedad inflamatoria crónica seleccionado del grupo consistiendo de modelo de artritis inducida por colágeno de ratón, modelo de artritis ?ARE de ratón, modelo de enfermedad de intestino inflamatorio ?ARE de ratón, modelo de enfermedad de intestino inflamatorio inducido por sodio de sulfato de dextran de ratón, y modelo de enfermedad pulmonar obstructiva crónica por fumada de tabaco de ratón. 137. Un monómero de anticuerpo de dominio (dAb) que específicamente une el Receptor de Factor de Necrosis de Tumor I (TNFR1 ), en donde dicho monómero dAb une TNFR1 con una Kd de 300 nM a 5 pM e inhibe la letalidad en el modelo de ataque séptico inducido por LPS/D-galactosamina de ratón. 138. Un ácido nucleico aislado codificando un monómero de anticuerpo de dominio (dAb) que específicamente une el Receptor de Factor de Necrosis de Tumor I (TNFR1 ), en donde dicho monómero dAb une TNFR1 con una Kd de 300 nM a 5 pM e inhibe la letalidad en el modelo de ataque séptico inducido por LPS/D-galactosamina de ratón. 139. Un ácido nucleico recombinante codificando un monómero de anticuerpo de dominio (dAb) que específicamente une el Receptor de Factor de Necrosis de Tumor I (TNFR1 ), en donde dicho monómero dAb une TNFR1 con una K de 300 nM a 5 pM e inhibe la letalidad en el modelo de ataque séptico inducido por LPS/D-galactosamina de ratón. 140. Un vector comprendiendo el ácido nucleico recombinante de la reivindicación 139. 141 . El vector de acuerdo a la reivindicación 140 comprendiendo además una secuencia de control de expresión operablemente enlazada a dicho ácido nucleico recombinante. 142. Una célula huésped comprendiendo un vector de la reivindicación 141 o un ácido nucleico recombinante de la reivindicación 139. 143. Un método para producir un monómero dAb comprendiendo mantener una célula huésped de la reivindicación 142 bajo condiciones adecuadas para expresión del ácido nucleico recombinante, mediante lo cual un monómero dAb se produce. 144. El método de la reivindicación 143, comprendiendo además aislar el monómero dAb. 145. Un monómero de anticuerpo de dominio (dAb) que específicamente une el Receptor de Factor de Necrosis de Tumor I (TNFR1 ), en donde dicho monómero dAb une TNFR1 con una Kd de 300 nM a 5 pM e inhibe transducción de señal mediada por TNFR1 , en donde dicho monómero dAb no inhibe substancialmente l a unión de TNFa a TNFR1 . 146. El monómero dAb de la reivindicación 145, en donde dicho monómero dAb inhibe la degradación inducida por TNFa de TNFR1 . 147. Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que específicamente une el Receptor de Factor de Necrosis de Tumor I (TNFR1 ), en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo une TNFR1 con una Kd de 300 nM a 5 pM y es efectivo para tratar una enfermedad i nflamatoria crónica en un sujeto. 148. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de la reivindicación 147, en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno es un fragmento de unión al antígeno monovalente. 149. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la reivindicación 148, en donde dicho fragmento de unión al antígeno monovalente es un monómero dAb. 150. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de la reivi ndicación 147, en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno es efectivo en un modelo de enfermedad inflamatoria crónica seleccionada del grupo consistiendo de modelo de artritis inducida por colágeno de ratón y modelo de artriti s ?ARE de ratón. 151 . El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de la reivindicación 147, en donde dicha enfermedad inflamatoria crónica se selecciona del grupo consistiendo de artritis reumatoide, enfermedad del i ntesti no i nflamatorio, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, espondilitis anquilosante, soriasis y artritis soriática. 1 52. Un antagonista de Factor de Necrosis de Tumor I (TNFR1 ) que une el Factor de Necrosis de Tumor 1 (TNFR 1 ) e inhibe transducción de señal a través de TNFR1 , en donde dicho antagonista no inhibe la unión de TNFa a TNFR1. 153. El antagonista de TNFR1 de la reivindicación 152, en donde dicho antagonista de TNFR1 inhibe muerte celular inducida por TNFa en un ensayo de citotoxicidad L929 estándar o secreción inducida por TNFa de IL-8 en un ensayo HeLa IL-8 estándar. 154. El antagonista de T NFR1 de la reivindicación 152 o 153, en donde dicho antagonista de TNFR1 une el Dominio 1 de TNFR1. 155. El antagonista de TNFR1 de la reivindicación 154, en donde dicho antagonista de TNFR1 compite con TAR2m-21 -23 para unión a TNFR1 de ratón 156. El antagonista de TNFR1 de la reivindicación 154, en donde dicho antagonista de TNFR1 compite con TAR2h-205 para unión a TNFR1 de humano. 157. El antagonista de TNFR1 de la reivindicación 152 o 153, en donde dicho antagonista de TNFR1 une el Dominio 2 o 3 de TNFR1. 158. El antagonista de TNFR1 de la reivindicación 152 o 153, en donde dicho antagonista de TNFR1 une el Dominio 4 de TNFR 1. 159. Un antagonista de Factor de Necrosis de Tumor 1 (TNFR1 ) comprendiendo un primer monómero de anticuerpo de dominio (dAb) y un segundo monómero dAb, en donde dicho primer monómero dAb une un dominio de TNFR1 seleccionado del grupo consistiendo de Dominio 1 , Dominio 2, Dominio 3 y Dominio 4, y dicho segundo monómero dAb une un dominio de TNFR1 seleccionado del grupo consistiendo de Dominio 1, Dominio 2, Dominio 3 y Dominio 4, en donde dicho antagonista no agoniza TNFR1 cuando está presente en una concentración de aproximadamente 1 µM en un ensayo de citotoxicidad L929 estándar o un ensayo HeLa IL-8 estándar. 160. El antagonista de TNFR1 de la reivindicación 159, en donde dicho primer dAb une el Dominio 1 de TNFR1 y dicho segundo dAb une el Dominio 1 de TNFR1; dicho primer dAb une el Dominio 1 de TNFR1 y dicho segundo dAb une el Dominio 2 de TNFR1 ; dicho primer dAb une el Dominio 1 de TNFR1 y dicho segundo dAb une el Dominio 3 de TNFR1; dicho primer dAb une el Dominio 1 de TNFR1 y dicho segundo dAb une el Dominio 4 de TNFR1; dicho primer dAb une el Dominio 2 de TNFR1 y dicho segundo dAb une el Dominio 2 de TNFR1; dicho primer dAb une el Dominio 2 de TNFR1 y dicho segundo dAb une el Dominio 3 de TNFR1; dicho primer dAb une el Dominio 2 de TNFR1 y dicho segundo dAb une el Dominio 4 de TNFR1; dicho primer dAb une el Dominio 3 de TNFR1 y dicho segundo dAb une el Dominio 3 de TNFR1; dicho primer dAb une el Dominio 3 de TNFR1 y dicho segundo dAb une el Dominio 4 de TNFR1, o dicho primer dAb une el Dominio 4 de TNFR1 y dicho segundo dAb une el Dominio 4 de TNFR1. 161. El antagonista de la reivindicación 159 o 160, en donde el antagonista es un dímero comprendiendo dicho primer dAb y dicho segundo dAb. 162. Un monómero de anticuerpo de dominio (dAb) que une el Factor de Necrosis de Tumor 1 (TNFR1) e inhibe transducción de señal a través de TNFR1, en donde dicho monómero dAb no inhibe la unión de TNFa a TNFR1. 163. El monómero dAb de la reivindicación 162, en donde dicho monómero dAb inhibe muerte celular inducida por TNFa en un ensayo de citotoxicidad L929 estándar o secreción inducida por TNFa de IL-8 en un ensayo HeLa IL-8 estándar. 164. El monómero dAb de la reivindicación 162 o 163, en donde dicho monómero dAb une el Dominio 1 de TNFR1. 165. El monómero dAb de la reivindicación 164, en donde dicho monómero dAb compite con TAR2m21-23 para unión a TNFR1 de ratón. 166. El monómero dAb de la reivindicación 164, en donde dicho monómero dAb compite con TAR2h-205 para unión a TNFR1 de humano. 167. El monómero dAb de la reivindicación 162 o 163, en donde dicho monómero dAb une el Dominio 2 o 3 de TNFR1. 168. El monómero dAb de la reivindicación 162 y 163, en donde dicho monómero dAb une el Dominio 4 de TNFR1 . 169. El monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 162-168, en donde dicho monómero dAb comprende un residuo Cys terminal. 170. Un ligando comprendiendo al menos un monómero dAb de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 162-169. 171. El ligando de la reivindicación 170, en donde dicho ligando es a homodímero comprendiendo dos monómeros dAb, en donde cada uno de dichos dos monómeros dAb es un monómero dAb de acuerdo a la reivindicación 162. 172. El ligando de la reivindicación 170, en donde dicho ligando es un heterodímero comprendiendo dos diferente monómeros dAb. 173. El ligando de cualquiera de las reivindicaciones 170-172, en donde dicho ligando no agoniza TNFR1 cuando está presente en una concentración de aproximadamente 1 µM en un ensayo de citotoxicidad L929 estándar o un ensayo HeLa IL-8 estándar. 174. Un monómero de anticuerpo de dominio (dAb) que une el Factor de Necrosis de Tumor I (TNFR1 ), en donde dicho dAb une el Dominio 1 de TNFR1 y compite con TAR2m-21 -23 para unión a TNFR1 de ratón. 175. Un monómero de anticuerpo de dominio (dAb) que une el Factor de Necrosis de Tumor I (TNFR1 ), en donde dicho monómero dAb une el Dominio 1 de TNFR1 y compite con TAR2h-205 para unión a TNFR1 de humano. 176. El monómero dAb de la reivindicación 174 o reivindicación 175, en donde dicho dAb une el Dominio 1 de TNFR1 de humano. 177. El monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 174-176, en donde dicho monómero dAb inhibe la muerte celular inducida por TNFa en un ensayo de citotoxicidad L929 estándar o secreción inducida por TNFa de IL-8 en un ensayo HeLa I L-8 estándar. 178. El monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 174-177, en donde dicho monómero dAb comprende un residuo Cys terminal. 179. El monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 174-178, en donde dicho monómero dAb no inhibe la unión de TNFa a TNFR1. 180. Un ligando comprendiendo un monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 174-179. 181 . El ligando de la reivindicación 180, en donde dicho ligando comprende dos o más de dichos monómeros dAb. 182. El ligando de la reivindicación 180 o 181 , en donde dicho ligando es un homodímero comprendiendo dos de dicho monómeros dAb, en donde cada uno de dicho monómeros dAb es un monómero dAb de acuerdo a la reivindicación 174. 183. Un ligando específico dual comprendiendo al menos un monómero dAb de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 174- 1 79. 184. El ligando específico dual de la reivindicación 183, comprendiendo un primer monómero dAb de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 174-179 y un segundo monómero dAb, en donde dicho segundo monómero dAb une el Dominio 1 , Dominio 2, Dominio 3 o Dominio 4 de TNFR1. 185. El ligando específico dual de la reivindicación 184, en donde dicho ligando específico dual es un heterodímero comprendiendo dicho primer dAb y dicho segundo dAb. 186. El ligando específico dual de la reivindicación 184 o 185, en donde dicho segundo dAb une el Dominio 1 de TNFR 1 . 187. El ligando específico dual de la reivindicación 184 o 185, en donde dicho segundo dAb une el Dominio 3 de TNFR1. 188. El ligando específico dual de la reivindicación 187, en donde dicho segundo dAb compite con TAR2h-10-27, TAR2h-131 -8, TAR2h-15-8, TAR2h-35-4, TAR2h-154-7, TAR2h-154-10 o TAR2h-185-25 para unión a TNFR1 de humano. 189. El ligando o ligando especifico dual de cualquiera de las reivindicaciones 181 -188, en donde dicho ligando o ligando específico dual no agoniza TNFR1 cuando está presente en una concentración de aproximadamente 1 µM en un ensayo de citotoxicidad L929 estándar o un ensayo HeLa I L-8 estándar. 190. Un monómero de anticuerpo de dominio (dAb) que une el Factor de Necrosis de Tumor I (TNFR1 ), en donde dicho dAb une el Dominio 3 de TNFR1 y compite con TAR2h-131 -8, TAR2h-15-8, TAR2h-35-4, TAR2h-154-7, TAR2h-154-10 o TAR2h-185-25 para unión a TNFR1 de humano. 191 . El monómero dAb de la reivindicación 190, en donde dicho dAb une el Dominio 3 de TNFR1 de humano. 192. El monómero dAb de la reivindicación 190 o 191 , en donde dicho monómero dAb inhibe la muerte cel ular inducida por TNFa en un ensayo de citotoxicidad L929 estándar o secreción inducida por TNFa de IL-8 en un ensayo HeLa IL-8 estándar. 193. El monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 190-192, en donde dicho monómero dAb comprende un residuo Cys terminal . 194. Un ligando comprendiendo un monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 190-193. 195. El ligando de la reivindicación 194, en donde dicho ligando comprende dos o más de dichos monómeros dAb. 196. El ligando de la reivindicación 194 o 195, en donde dicho ligando es un homodímero comprendiendo dos de dichos monómeros dAb, en donde cada uno de dichos monómeros dAb es un monómero dAb de acuerdo a la reivindicación 190. 197. Un ligando específico dual comprendiendo al menos un monómero dAb de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 190- 1 93. 198. El ligando específico dual de la reivindicación 197, comprendiendo un primer monómero dAb de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 190-193 y un segundo monómero dAb, en donde dicho segundo monómero dAb une el Dominio 1 , Dominio 2, Dominio 3 o Dominio 4 de TNFR1 . 199. El ligando específico dual de la reivindicación 198, en donde dicho ligando específico dual es un heterodímero comprendiendo dicho primer dAb y dicho segundo dAb. 200. El ligando específico dual de la reivindicación 198 o 199, en donde dicho segundo dAb une el Dominio 1 de TNFR 1. 201. El ligando específico dual de la reivindicación 198 o 199, en donde dicho segundo dAb une el Dominio 3 de TNFR1. 202. El ligando o ligando específico dual de cualquiera de las reivindicaciones 194-201 , en donde dicho ligando o ligando específico dual no agoniza TNFR1 cuando está presente en una concentración de aproximadamente 1 µM en un ensayo de citotoxicidad L929 estándar o un ensayo HeLa I L-8 estándar. 203. Un monómero de anticuerpo de dominio (dAb) que específicamente une el Receptor de Factor de Necrosis de Tumor I (TNFR1 ), en donde dicho monómero dAb une TNFR1 con una Kd de 300 nM a 5 pM y comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 90% homologa a una secuencia de aminoácidos de un dAb seleccionada del grupo consistiendo de TAR2h-131 -8 (SEQ I D NO:433), TAR2h-131 -24 (SEQ I D NO:434), TAR2h-15-8 (SEQ I D NO:435), TAR2h-15-8-1 SEQ I D NO:436) , TAR2h-15-8-2 (SEQ I D NO:437), TAR2h-185-23 (SEQ I D NO:438) , TAR2h-154-10-5 (SEQ I D NO:439), TAR2h-14-2 (SEQ I D NO:440), TAR2h-151 -8 (SEQ I D NO:441 ), TAR2h-152-7 (SEQ ID NO:442) , TAR2h-35-4 (SEQ I D NO:443), TAR2h-154-7 (SEQ I D NO:444) , IO (O _. __. cn o cn o cn NO:497 TAR2h-151 (SEQ I D NO:498), TAR2h-152 (SEQ I D NO:499 TAR2h-153 (SEQ I D NO:500), TAR2h-154 (SEQ I D NO:501 TAR2h-159 (SEQ I D NO:502), TAR2h-165 (SEQ I D NO:503 TAR2h-166 (SEQ I D NO:504), TAR2h-168 (SEQ I D NO:505 TAR2h-171 (SEQ I D NO:506), TAR2h-172 (SEQ I D NO: 507 TAR2h-173 (SEQ I D NO: 508), TAR2h-174 (SEQ I D NO:509 TAR2h-176 (SEQ I D NO:510), TAR2h-178 (SEQ I D NO:51 1 TAR2h-201 (SEQ I D NO:512), TAR2h-202 (SEQ I D NO.513 TAR2h-203 (SEQ I D NO:514), TAR2h-204 (SEQ I D NO:515 TAR2h-185-25 (SEQ I D NO: 516) , TAR2h-154-10 (S EQ I D NO:517 y TAR2h-205 (SEQ I D NO:627). 204. El monómero dAb de la reivindicación 203, comprendiendo además una porción de glicol de polialquileno. 205. El monómero dAb de la reivindicación 204, en donde dicha porción de glicol de polialquileno es una porción de glicol de polietileno. 206. Un ligando comprendiendo al menos un monómero dAb de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 203-205. 207. El ligando de acuerdo a la reivindicación 206, en donde dicho ligando es un ligando específico dual o ligando multiespecífico. 208. Un formato de anticuerpo comprendiendo al menos un monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 203-205. 209. Un ácido nucleico recombinante comprendiendo una secuencia de nucleótidos que codifica un monómero de anticuerpo de dominio (dAb) que específicamente une el Receptor de Factor de Necrosis de Tumor I (TNFR1), en donde dicha secuencia de nucleótidos es al menos aproximadamente 90% homologa a una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo consistiendo de TAR2h-131-8 (SEQ ID NO:518), TAR2h-131-24 (SEQ ID NO:519), TAR2h-15-8 (SEQ ID NO:520), TAR2h-15-8-1 (SEQ ID NO:521), TAR2h-15-8-2 (SEQ ID NO:522), TAR2h-185-23 (SEQ ID NO:523), TAR2h-154-10-5 (SEQ ID NO:524), TAR2h-14-2 (SEQ ID NO:525), TAR2h-151-8 (SEQ ID NO: 526), TAR2h-152-7 (SEQ ID NO:527), TAR2h-35-4 (SEQ ID NO:528), TAR2h-154-7 (SEQ ID NO:529), TAR2h-80 (SEQ ID NO:530), TAR2h-81 (SEQ ID NO:531), TAR2h-82 (SEQ ID NO:532), TAR2h-83 (SEQ ID NO:533), TAR2h-84 (SEQ ID NO:534), TAR2h-85 (SEQ ID NO:535), TAR2h-86 (SEQ ID NO:536), TAR2h-87 (SEQ ID NO:537), TAR2h-88 (SEQ ID NO:538), TAR2h-89 (SEQ ID NO:539), TAR2h-90 (SEQ ID NO:540), TAR2h-91 (SEQ ID NO:541), TAR2h-92 (SEQ ID NO:542), TAR2h-93 (SEQ ID NO.543), TAR2h-94 (SEQ ID NO:544), TAR2h-95 (SEQ ID NO:545), TAR2h-96 (SEQ ID NO: 546), TAR2h-97 (SEQ ID NO: 547), TAR2h-99 (SEQ ID NO:548), TAR2h-100 (SEQ ID NO:549), TAR2h-101 (SEQ ID NO:550), TAR2h-102 (SEQ ID NO:551), TAR2h-103 (SEQ ID NO:552), TAR2h-104 (SEQ ID NO:553), TAR2h-105 (SEQ ID NO:554), TAR2h-106 (SEQ ID NO:555), TAR2h-107 (SEQ ID NO:556), TAR2h-108 (SEQ BD NO:557), TAR2h-109 (SEQ ID NO:558), TAR2h-110 (SEQ ID NO:559), TAR2h-111 (SEQ ID NO:560), TAR2h-112 (SEQ ID NO:561), TAR2h-113 (SEQ ID NO:562), TAR2h-114 (SEQ ID NO:563), TAR2h-115 (SEQ ID NO:564), TAR2h-116 (SEQ ID NO:565), TAR2h-117 (SEQ ID NO:566), TAR2h-118 (SEQ ID NO:567), TAR2h-119 (SEQ ID NO:568), TAR2h-120 (SEQ ID NO:569), TAR2h-121 (SEQ ID NO:570), TAR2h-122 (SEQ ID NO:571), TAR2h-123 (SEQ ID NO:572), TAR2h-12 (SEQ ID NO:573), TAR2h-125 (SEQ ID NO:574), TAR2h-126 (SEQ ID NO:575), TAR2h-127 (SEQ ID NO:576), TAR2h-128 (SEQ ID NO:577), TAR2h-129 (SEQ ID NO:578), TAR2h-130 (SEQ ID NO:579), TAR2h-131 (SEQ ID NO:580), TAR2h-132 (SEQ ID NO:581), TAR2h-133 (SEQ ID NO:582), TAR2h-151 (SEQ ID NO:583), TAR2h-152 (SEQ ID NO.584), TAR2h-153 (SEQ ID NO.585), TAR2h-154 (SEQ ID NO:586), TAR2h-159 (SEQ ID NO:587), TAR2h-165 (SEQ ID NO:588), TAR2h-166 (SEQ ID NO.589), TAR2h-168 (SEQ ID NO:590), TAR2h-171 (SEQ ID NO:591), TAR2h-172 (SEQ ID NO:592), TAR2h-173 (SEQ ID NO:593), TAR2h-174 (SEQ ID NO:594), TAR2h-176 (SEQ ID NO:595), TAR2h-178 (SEQ ID NO:596), TAR2h-201 (SEQ ID NO:597), TAR2h-202 (SEQ ID NO:598), TAR2h-203 (SEQ ID NO:599), TAR2h-204 (SEQ ID NO:600), TAR2h-185-25 (SEQ ID NO:601), TAR2h-154-10 (SEQ ID NO.602), y TAR2h-205 (SEQ ID NO:628). 210. Un vector comprendiendo el ácido nucleico recombinante de la reivindicación 209. 211. El vector de la reivindicación 210 comprendiendo además una secuencia de control de expresión operablemente enlazada a dicho ácido nucleico recombinante. 212. Una célula huésped comprendiendo un vector de la reivindicación 211 o ácido nucleico recombinante de la reivindicación 209. 213. Un método para producir un monómero dAb comprendiendo mantener una célula huésped de la reivindicación 212 bajo condiciones adecuadas para expresión del ácido nucleico recombinante, mediante lo cual un monómero dAb se produce. 214. Un ligando que une el Dominio 1 de TNFR1 soluble y transmembrana TNFR1, pero no inhibe la unión de TNFa a TNFR1 soluble o transmembrana TNFR1. 215. El ligando de la reivindicación 214, en donde dicho ligando es un antagonista de TNFR1. 216. El ligando de la reivindicación 214 o 215, en donde dicho ligando compite con TAR2m-21-23 para unión a TNFR1 de ratón. 217. El ligando de la reivindicación 214 o 215, en donde dicho ligando compite con TAR2h-205 para unión a TNFR1 de humano. 218. El ligando de cualquiera de las reivindicaciones 214-217 en donde el ligando comprende una porción de unión a TNFR1 y una porción que extiende la vida media. 219. El ligando de la reivindicación 218 en donde la porción que extiende la vida media es una porción de glicol de polietileno, albúmina de suero o un fragmento del mismo, receptor de transferrina o una porción de unión a transferrina del mismo, o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprendiendo un sitio de unión para un polipéptido que mejora la vida media in vivo. 220. El ligando de la rei vi ndicación 21 9, en donde la porción que exti ende la vida media es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprendiendo un sitio de unión para albúmina de suero o receptor Fc neonatal. 221 . El ligando de la reivi ndicación 220, en donde l a porción que extiende la vida media es un dAb. 222. Un ligando que une TNFR1 de humano y TNFR1 de ratón. 223. El ligando de la reivindicación 222, en donde dicho ligando comprende una porción de unión a TN FR 1 que une el Domi nio 1 de TNFR 1 de humano y TN FR 1 de ratón . 224. El ligando de la reivindicación 223, en donde dicha porción de unión es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. 225. El ligando de la reivi ndicación 224, en donde di cha porci ón de unión es un dAb. 226. Un método para tratar, suprimir o prevenir una enfermedad inflamatoria comprendiendo administrar a un sujeto en necesidad del mismo una dosis terapéuticamente efectiva de un antagonista de cualquiera de las reivi ndicaciones 1 52-1 61 , un monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 162-169, 174-179, 190-1 93, y 203-205, un ligando o ligando específico dual de cual quiera de las reivindicaciones 170-173, 180-189, 1 94-202 , 206, 207, y 214-225 o un formato de anticuerpo de la reivi ndicación 208. 227. El método de la reivindicación 226, en donde dicha enfermedad inflamatoria es una enfermedad inflamatoria crónica. 228. Un método para tratar artritis, comprendiendo admi nistrar a un sujeto en necesidad del mismo una dosi s terapéuticamente efectiva de un antagonista de cualquiera de las reivindicaciones 152-161 , un monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 162-169, 174-179, 190-193, y 203-205, un ligando o ligando específico dual de cualquiera de las reivi ndicaciones 170-173, 180-189, 194-202, 206, 207, y 214-225 o un formato de anticuerpo de la reivindicación 208. 229. El método de la reivindicación 228, en donde dicha artritis es artritis reumatoide o artritis reumatoide juvenil. 230. Un método para tratar esclerosis múltiple, comprendiendo administrar a un sujeto en necesidad del mismo una dosis terapéuticamente efectiva de un antagonista de cualquiera de las reivindicaciones 152-161 , un monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 162-169, 174-179, 190-193, y 203-205, un ligando o ligando específico dual de cualquiera de las reivindicaciones 170-173, 180-189, 194-202, 206, 207, y 214-225 o un formato de anticuerpo de la reivindicación 208. 231. Un método para tratar enfermedad del intestino inflamatorio, comprendiendo administrar a un sujeto en necesidad del mismo una dosis terapéuticamente efectiva de un antagonista de cualquiera de las reivindicaciones 152-161 , un monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 162-169, 174-179, 190-193, y 203-205, un ligando o ligando específico dual de cualquiera de las reivindicaciones 170-173, 180-189, 194-202, 206, 207, y 214-225 o un formato de anticuerpo de la reivindicación 208. 232. El método de la reivi ndicación 231 , en donde dicha enfermedad del i ntesti no i nfl amatorio se selecciona del grupo consistiendo de enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa. 233. Un método para tratar enfermedad pulmonar obstructiva cróni ca, comprendiendo admi nistrar a un sujeto en necesidad del mismo una dosis terapéuticam ente efectiva de un antagonista de cualquiera de las reivindicaciones 152-161 , un monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 162-169, 174-179, 190-193, y 203-205, un ligando o ligando dual específico de cual quiera de l as reivi ndicaciones 170-1 73, 1 80- 1 89, 1 94-202, 206, 207, y 214-225 o un formato de anticuerpo de la reivindicación 208. 234. Un método para tratar neumonía, comprendiendo admi nistrar a un sujeto en necesidad del mismo una dosis terapéuticamente efectiva de un antagonista de cualquiera de l as reivindicaciones 1 52-161 , un monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 162-169, 174-1 79, 190-193, y 203-205, un ligando o ligando específico dual de cualquiera de las reivindicaciones 170-1 73, 1 80-1 89, 194-202, 206, 207, y 214-225 o un formato de anticuerpo de la reivindicación 208. 235. El método de la reivindicación 234, en donde dicha neumonía es neumonía bacteriana. 236. El método de la reivindicaci ón 235, en donde dicha neumonía bacteriana es neumonía Staphylococcal . 237. Un método para tratar ataque séptico, comprendiendo admi nistrar a un sujeto en necesidad del mi smo una dosis terapéuticamente efectiva de un antagonista de cualquiera de las reivindicaciones 152-161, un monómero dAb de cualquiera de las reivindicaciones 162-169, 174-179, 190-193, y 203-205, un ligando o ligando específico dual de cualquiera de las reivindicaciones 170-173, 180-189, 194-202, 206, 207, y 214-225 o un formato de anticuerpo de la reivindicación 208. 238. Uso de un antagonista que une el Dominio 3 de TNFR1 en la fabricación de un medicamento para bloquear la unión a TNFa a TNFR1, en donde dicho antagonista compite con un monómero dAb seleccionado del grupo consistiendo de TAR2h-10-27, TAR2h-131-8, TAR2h-15-8, TAR2h-35-4, TAR2h-154-7, TAR2h-154-10 y TAR2h-185-25 para unión a TNFR1 de humano. 239. Un método para tratar y/o prevenir en un paciente una enfermedad mediada por la unión de TNFa a TNFR1, el método comprendiendo administrar al paciente un antagonista que une el Dominio 3 de TNFR1, en donde dicho antagonista compite in vitro con un monómero dAb seleccionado del grupo consistiendo de TAR2h-10-27, TAR2h-131-8, TAR2h-15-8, TAR2h-35-4, TAR2h-154-7, TAR2h-154-10 y TAR2h-185-25 para unión a TNFR1 de humano. 240. El método de cualquiera de las reivindicaciones 40-42, 116-134, 226-237 y 239, en donde el antagonista, dAb, ligando o ligando específico dual, o un formato de anticuerpo se administra a través de administración pulmonar. 241. El método de cualquiera de las reivindicaciones 40-42, 116-134, 226-237 y 239, en donde el antagonista, dAb, ligando o ligando específico dual, o un formato de anticuerpo se admi nistra a través de administración sistémi ca.