JP2013056890A - 炎症性疾患を治療するための組成物及び方法 - Google Patents

炎症性疾患を治療するための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

【課題】炎症性疾患を治療するための組成物及び方法を提供する。
【解決手段】単一ドメイン抗体リガンド及び二重特異性リガンドを含む抗体ポリペプチド構築物を使用して、関節リウマチを含む疾病を治療する方法、当該リガンドの組成物、並びに当該リガンドの製造及び使用方法。特に、ＴＮＦ−α及びＶＥＧＦを含む炎症性サイトカインを結合する単一ドメイン抗体を調製するための方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、単一ドメイン抗体リガンド及び二重特異性リガンドを含む抗体ポリペプチド構築物を使用して、関節リウマチを含む疾病を治療する方法、当該リガンドの組成物、並びに当該リガンドの製造及び使用方法に関する。特に、本発明は、ＴＮＦ−α及びＶＥＧＦを含む炎症性サイトカインを結合する単一ドメイン抗体を調製するための方法を提供する。第１の抗原又はエピトープに結合する第１の単一免疫グロブリン可変領域と、第２の抗原又はエピトープに結合する第２の単一免疫グロブリン可変領域とを含む二重特異性リガンドをも開示する。より詳細には、本発明は、第１及び第２の抗原又はエピトープの少なくとも一方に結合することにより、インビボでのリガンドの半減期を増加させるように作用する二重特異性リガンドに関する。２つ以上の結合特異性を含む開放及び閉鎖的構造について述べる。例えばＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ及びＨＳＡの任意の組合せを含むことが可能である第１及び第２の抗原を結合する単一ドメイン抗体構築物及び二重特異性リガンドを使用する、関節リウマチを治療するための方法を開示する。
ＴＮＦ−α
名称が暗示するように、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）は、抗腫瘍特性を有する分子として本来記述されていたが、その分子は、炎症及び自己免疫疾患を媒介する上での顕著な役割を含む、他のプロセスにおける主要な役割を果たすことが後に確認された。ＴＮＦ−αは、例えば、関節リウマチ（ＲＡ）、クローン病、潰瘍性結腸炎及び他の腸疾患、乾癬、毒物ショック、移植片対宿主病並びに多発性硬化症を含む炎症状態における主要な炎症誘発性サイトカインである。
ＴＮＦ−αの炎症誘発作用は、血管内皮細胞に対する凝血原活性を誘発すること（Ｐｏｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：１６８０（１９８６））、好中球及びリンパ球の接着を増強させること（Ｐｏｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：３３１９（１９８７））、マクロファージ、好中球及び血管内皮細胞からの血小板活性化因子の放出を刺激すること（Ｃａｍｕｓｓｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３９０（１９８７））等の組織傷害をもたらす。
ＴＮＦ−αは、ＴＮＦ−α変換メタロプロテイナーゼ酵素によって開裂される細胞内尾部により２６ｋＤ膜間前駆タンパク質として合成され、次いで１７ｋＤ可溶性タンパク質として分泌される。活性形態は、２つの異なる細胞表面受容体、すなわちｐ５５ＴＮＦＲ１及びｐ７５ＴＮＦＲ２と相互作用する１７ｋＤ単量体のホモ三量体からなる。ＴＮＦ−αの細胞表面結合前駆体形態は、その因子のいくつかの生物学的効果を媒介しうるという証拠もある。たいていの細胞は、リガンドの異なる生物学的機能を媒介するｐ５５及びｐ７５受容体の双方を発現する。ｐ７５受容体は、リンパ球増殖の誘発に関与し、ｐ５５受容体は、ＴＮＦ媒介細胞毒、アポトーシス、抗ウィルス活性、繊維芽細胞増殖及びＮＦ−κＢ活性化（Ｌｏｃｋｓｌｅｙら、２００１、Ｃｅｌｌ １０４：４８７−５０１参照）。
ＴＮＦ受容体は、ＮＧＦ受容体、Ｆａｓ抗原、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、Ｏｘ４０、及びリンホトキシンα／β六量体を含む一群の膜タンパク質のメンバーである。ホモ三量体による受容体の結合は、ｐ７５又はｐ５５の２つ又は３つの分子の小さい集合体への受容体の凝集を誘発する。ＴＮＦ−αは、主として活性化マクロファージ及びＴリンパ球によって生成されるが、急性炎症反応時の好中球、内皮細胞、ケラチノサイト及び繊維芽細胞によっても生成される。
ＴＮＦ−αは、炎症誘発性サイトカインのカスケードの頂点に存在する（Ｆｅｌｄｍａｎｎ ＆ Ｍａｉｎｉ、２００１、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：１６３に論述されている）。このサイトカインは、さらなる炎症誘発性サイトカイン、特にＩＬ−１及びＩＬ−６の発現又は放出を誘発する（例えば、Ｒｕｔｇｅｅｒｔｓら、２００４、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２６：１５９３−１６１０参照）。ＴＮＦ−αの阻害により、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦを含む炎症性サイトカインの生成が阻害される（Ｂｒｅｎｎａｎら、１９８９、Ｌａｎｃｅｔ ２：２４４）。
ＴＮＦ−αは、炎症において役割を果たすため、炎症性疾患の症状を軽減する取り組みおいて重要な阻害標的にされるようになった。特に可溶性ＴＮＦ−α受容体、及びＴＮＦ−αに特異的な抗体の使用を含む、疾病の臨床治療に対するＴＮＦ−αの阻害の手法が追求されてきた。臨床的使用に対して承認された市販の製品としては、例えば、抗体製品Ｒｅｍｉｃａｄｅ（商標）（インフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ（ペンシルベニア州Ｍａｌｖｅｒｎ））；ヒトＩｇＧ４定常領域マウス可変領域を担持するキメラモノクローナルＩｇＧ抗体）、Ｈｕｍｉｒａ（商標）（米国特許第６，０９０，３８２号に記載されているアダリムマブ又はＤ２Ｅ７（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及び可溶性受容体製品Ｅｎｂｒｅｌ（商標）（エタネルセプト、可溶性ｐ７５ＴＮＦＲ２Ｆｃ融合タンパク質；イムネクス（Ｉｍｍｕｎｅｘ））。
炎症性関節炎におけるＴＮＦ−αの役割は、例えば、Ｌｉ ＆ Ｓｃｈｗａｒｔｚ、２００３、Ｓｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２５：１９−３３に論述されている。ＲＡにおいて、ＴＮＦ−αは、炎症滑膜、特に軟骨−パンヌス関節に多く発現される（ＤｉＧｉｏｖｉｎｅら、１９８８、Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．４７：７６８；Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎら、１９９０、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：３３４７；及びＳａｘｎｅら、１９８８、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．３１：１０４１）。ＴＮＦ−αは、炎症性サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦのレベルを増加させるという証拠に加えて、ＴＮＦ−αは、単独で、関節炎症、及び繊維芽細胞様滑膜細胞の増殖を誘発し（Ｇｉｔｔｅｒら、１９８９、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６６：１９６）、コラゲナーゼを誘発することによって軟骨破壊を誘発し（Ｄａｙｅｒら、１９８５、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６２：２１６３；Ｄａｙｅｒら、１９８６、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７７：６４５）、関節軟骨細胞によるプロテオグリカン合成を阻害し（Ｓａｋｌａｔｖａｌａ、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５４７；Ｓａｋｌａｔｖａｌａら、１９８５、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６２：１２０８）、破骨細胞腫形成及び骨吸収を刺激する（Ａｂｕ−Ａｍｅｒら、２０００、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２７３０７；Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３１９：５１６）することが可能である。ＴＮＦ−αは、骨髄によるＣＤ１４＋単球の放出増加を誘発する。当該単球は、関節を浸透し、ＲＡＮＫ（受容体活性化体又はＮＦ−κＢ）−ＲＡＮＫＬシグナル伝達経路を介して炎症応答を増幅させて、関節炎症時に破骨細胞系性を生じる（Ａｎａｎｄａｒａｊａｈ ＆ Ｒｉｃｈｌｉｎ、２００４、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１６：３３８−３４３に論述されている）。
ＴＮＦ−αは、ＩＬ−８の誘導を通じて血管浸透性を高めることによって、マクロファージ及び好中球を感染部位に導入する急性期タンパク質である。一度存在すると、活性化されたマクロファージは、ＴＮＦ−αを生成し続けることによって、炎症応答を維持し、増幅させる。
可溶性受容体構築物エタネルセプトによるＴＮＦ−αの滴定は、ＲＡの治療に有効であるが、クローン病の治療には有効でない。対照的に、抗体ＴＮＦ−αアンタゴニストインフリキシマブは、ＲＡ及びクローン病の双方の治療に有効である。したがって、可溶性ＴＮＦ−αの単なる中和は、抗ＴＮＦをベースとする治療効果に関与する唯一のメカニズムではない。むしろ、ＴＮＦ−αによって誘発される他の炎症誘発性シグナル又は分子の遮断も役割を果たす（Ｒｕｔｇｅｅｒｔｓら、前出）。例えば、インフリキシマブの投与は、明らかに接着分子の発現を低下させることで、好中球の炎症部位への浸透を低下させる。また、インフリキシマブ治療は、クローン病における既に炎症を起こした腸粘膜から炎症細胞を消失させる。基底膜におけるこのＴ細胞の消失は、Ｆａｓに依存したカスパーゼ８、９そして３の活性化に続く膜結合ＴＮＦ−α担持細胞のアポトーシスによって介在される（Ｌｕｇｅｒｉｎｇら、２００１、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２１：１１４５−１１５７参照）。したがって、膜又は受容体結合ＴＮＦ−αは、抗ＴＮＦ−α治療手法にとって重要な標的である。他には、インフリキシマブは、活性化された末梢血液細胞及び基底膜細胞に結合し、カスパーゼ３の活性化を通じてアポトーシスを誘発することが示された（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒａｎｄｅら、２００３、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２４：１７７４−１７８５）。
細胞内では、三量体ＴＮＦ−αのその受容体に対する結合は、ＳＯＤＤ（死領域のサイレンサ）の如き阻害性分子の置換、及びアダプター因子ＦＡＤＤ、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ２、ｃ−ＩＡＰ、ＲＡＩＤＤ及びＴＲＩＰ＋キナーゼＲＩＰ１及び特定のカスパーゼシグナルを含む伝達事象のカスケードを誘発する（Ｇｏｅｄｄｅｌ、２００２、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：１６３４−１６３５及びＭｕｚｉｏ ＆ Ｓａｃｃａｎｉ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）、Ｃｏｒｔｉ及びＧｈｅｚｚｉ編（Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）、ｐｐ．８１−９９に論述されている）。集合したシグナル伝達複合体は、ＮＦ−κＢ活性化及び後の下流遺伝子活性化を通じて細胞生存経路を活性化することもできるし、カスパーゼ活性化を通じてアポトーシス経路を活性化することもできる。
他の疾病では、同様の細胞外下流サイトカインカスケード及び細胞内シグナル伝達経路が、ＴＮＦ−αによって誘発されうる。したがって、ＴＮＦ−α分子が病状に寄与する他の疾病又は疾患については、ＴＮＦ−αの阻害は、治療の手法を与える。
ＶＥＧＦ
血管形成は、炎症滑膜組織の活発な増殖において重要な役割を果たす。高度に血管化されるＲＡ滑膜組織は、関節周囲軟骨及び骨組織に侵入し、関節破壊をもたらす。
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、知られている最も強力な血管形成サイトカインである。ＶＥＧＦは、その一次転写物が交互にスプライシングされるため、いくつかの交互形態で存在する排出されたヘパリン結合ホモ二量体糖タンパク質である（Ｌｅｕｎｇら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１３０６）。ＶＥＧＦは、炎症において重要なプロセスである血管漏れを誘発する能力を有するため、血管浸透因子（ＶＰＦ）としても知られる。ＲＡ患者の滑膜組織におけるＶＥＧＦの同定は、ＲＡの病理におけるＶＥＧＦの潜在的役割を浮き彫りにした（Ｆａｖａら、１９９４、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：３４１：３４６；Ｎａｇａｓｈｉｍａら、１９９５、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２２：１６２４−１６３０）。ＲＡの病理におけるＶＥＧＦの役割は、抗ＶＥＧＦ抗体をマウスコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）モデルに投与した後の試験を強固なものにした。これらの試験において、疾病を誘発させると、関節におけるＶＥＧＦ発現が増強し、抗ＶＥＧＦ抗血清を投与すると、関節炎疾病の発生が抑止され、設定された疾病が改善された（Ｓｏｎｅら、２００１、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２８１：５６２−５６８；Ｌｕら、２０００、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：５９２２−５９２７）。
抗体ポリペプチド
抗体は、標的の結合が極めて特異的であり、自然の独自の防御メカニズムから誘導されるが、人間の患者における疾病の治療に適用される場合はいくつかの課題に直面する。従来の抗体は、少なくとも４つのポリペプチド鎖を含む大きなマルチサブユニットタンパク質分子である。例えば、ヒトＩｇＧは、ジスルフィド結合して機能的抗体を形成する２つの重鎖及び２つの軽鎖を有する。従来のＩｇＧのサイズは、約１５０ｋＤである。完全抗体（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ等）は、比較的サイズが大きいため、例えば組織浸透における問題により治療有用性が限定される。抗体結合機能及び溶解性を保持するより小さい抗体断片の同定及び生成に多大な労力が向けられてきた。
抗体の重及び軽ポリペプチド鎖は、抗原相互作用に直接関与する可変（Ｖ）領域と、免疫エフェクターとの非抗原特異的相互作用における構造的支援及び機能を提供する定常（Ｃ）領域とを含む。従来の抗体の抗原結合領域は、２つの個別領域、すなわち重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ：Ｖκ又はＶλでありうる）で構成される。抗原結合部位自体は、ＶＨ領域からの３つのポリペプチドループ（Ｈ１、Ｈ２及びＨ３）と、ＶＬ領域からの３つのポリペプチドループ（Ｌ１、Ｌ２及びＬ３）の６つのポリペプチドループで形成される。インビボにおいて、ＶＨ及びＶＬ領域をコードする多様な一次的レパートリーのＶ遺伝子が、遺伝子セグメントの組合せ再構成により生成される。Ｃ領域は、軽鎖Ｃ領域（ＣＬ領域と称する）及び重鎖Ｃ領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域と称する）を含む。
プロテアーゼ消化に続いて、天然抗体のいくつかのより小さい抗原結合断片が同定された。これらは、例えば、「Ｆａｂ断片」（ＶＬ−ＣＬ−ＣＨ１−ＶＨ）、「Ｆａｂ’断片」（重鎖ヒンジ領域を有するＦａｂ）及び「Ｆ（ａｂ’）２断片’’（重鎖ヒンジ領域で接続されたＦａｂ’断片の二量体）を含む。合成ペプチドリンカーで接続されたＶＬ及びＶＨよりなる「単一鎖ＦＶ」（可変断片）又は「ｓｃＦＶ」と称するさらに小さい抗原結合断片を生成するために組換え法が用いられてきた。
単一ドメイン抗体
（例えばヒト及びたいていの他の哺乳類における）天然抗体の抗原結合単位は、一対のＶ領域（ＶＬ／ＶＨ）で構成されていることが一般に知られているが、ラクダ科の生物種は、軽鎖配列を欠いた大量の十分に機能的で極めて特異的な抗体を発現する。ラクダ科の重鎖抗体は、それらの定常領域を介して二量体化された単一重鎖のホモ二量体として見い出される。これらのラクダ科の重鎖抗体の可変領域は、ＶＨＨ領域と称し、ＶＨ鎖の断片として単離された場合に、高い特異性を有する抗原を結合する能力を保持する（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６−４４８；Ｇａｈｒｏｕｄｉら、１９９７、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１４：５２１−５２６）。抗原結合単一ＶＨ領域は、例えば、免疫化マウスの脾臓からのゲノムＤＮＡから増幅され、大腸菌に発現されたマウスＶＨ遺伝子のライブラリーからも同定されている（Ｗａｒｄら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）。Ｗａｒｄらは、「領域抗体」に対して、単離された単一ＶＨ領域を「ｄＡｂ」と命名した。「ｄＡｂ」という用語は、本明細書では、抗原を特異的に結合する単一免疫グロブリン可変領域（ＶＨ、ＶＨＨ又はＶＬ）ポリペプチドと称する。「ｄＡｂ」は、他のＶ領域から独立した抗原を結合するが、その用語が本明細書で用いられるときは、「ｄＡｂ」は、他の領域が、ｄＡｂによる抗原結合に必要とされない場合、すなわちｄＡｂが、さらなるＶＨ、ＶＨＨ又はＶＬ領域から独立した抗原を結合する場合に、他のＶＨ又はＶＬ領域とともにホモ又はヘテロ多量体に存在しうる。
単一免疫グロブリン可変領域、例えばＶＨＨは、知られている最も小さい抗原結合抗体である。治療に使用する場合は、主として、患者に投与されたときに免疫応答を引き起こしそうもないという理由でヒト抗体が好ましい。上述したように、単離された非ラクダ科のＶＨは、比較的不溶性を有する傾向があり、しばしば発現が弱い。ラクダ科のＶＨＨとヒト抗体のＶＨ領域とを比較すると、ヒトＶＨ領域のＶＨ／ＶＬ界面に対応するラクダ科のＶＨＨ領域の骨組み領域にいくつかの重要な差が存在することが明らかになる。抗原結合活性（Ｄａｖｉｅｓ ＆ Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ、１９９４、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３３９：２８５−２９０）を保持しながら、発現及び溶解性が向上した「ラクダ化された」ヒトＶＨ領域を生成するために、これらのヒトＶＨ ３の残基物をＶＨＨ配列（具体的にはＧｌｙ４４ Ｇｌｕ、Ｌｅｕ ４５ Ａｒｇ及びＴｒｐ４７ Ｇｌｙ）へより近づけるための変異が実施された。（本明細書に用いられている可変領域アミノ酸番号付けはＫａｂａｔ番号付け規則（Ｋａｂａｔら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国保健福祉省（ワシントンＤ．Ｃ．）と一致している）。ＷＯ０３／０３５６９４号（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ）には、Ｔｒｐ１０３ Ａｒｇ変異は、非ラクダ科ＶＨ領域の溶解性を向上させることが報告されている。また、Ｄａｖｉｅｓ ＆ Ｒｉｅｃｈｍａｎ（１９９５、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｎ．Ｙ．１３：４７３−４７９）には、ラクダ化されたヒトＶＨ領域のファージディスプレイレパートリーが生成され、１００〜４００ｎＭの親和性でハプテンを結合するクローンが選択されたことが報告されているが、タンパク質抗原に対する結合のために選択されたクローンは、より弱い親和性を有していた。
抗体の抗原領域は、２つの個別領域、すなわち重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ：Ｖκ又はＶλでありうる）を含む。抗原結合部位自体は、ＶＨ領域からの３つのポリペプチドループ（Ｈ１、Ｈ２及びＨ３）と、ＶＬ領域からの３つのポリペプチドループ（Ｌ１、Ｌ２及びＬ３）の６つのポリペプチドループで形成される。ＶＨ及びＶＬ領域をコードする多様な一次的レパートリーのＶ遺伝子が、遺伝子セグメントの組合せ再構成により生成される。ＶＨ遺伝子は、ＶＨ、Ｄ及びＪＨの３つの遺伝子セグメントの組換えによって生成される。ヒトでは、ハプロタイプに応じて、約５１の機能的ＶＨセグメント（Ｃｏｏｋ及びＴｏｍｌｉｎｓｏｎ（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ、１６：２３７）、２５の機能的Ｄセグメント（Ｃｏｒｂｅｔｔら、（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６８：６９）及び６つの機能的ＪＨセグメント（Ｒａｖｅｔｃｈら、（１９８１）Ｃｅｌｌ、２７：５８３）が存在する。ＶＨセグメントは、ＶＨ領域（Ｈ１及びＨ２）の第１及び第２の抗原結合ループを形成するポリペプチド鎖の領域をコードするのに対して、ＶＨ、Ｄ及びＪＨセグメントは、ＶＨ領域（Ｈ３）の第３の抗原結合ループを形成するように結合する。ＶＬ遺伝子は、ＶＬ及びＪＬのわずか２つの遺伝子セグメントの組換えによって生成される。ヒトでは、ハプロタイプに応じて、約４０の機能的Ｖκセグメント（Ｓｃｈａｂｌｅ及びＺａｃｈａｕ（１９９３）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ− Ｓｅｙｌｅｒ、３７４：１００１）、３１の機能的Ｖλセグメント（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．ｓｏ Ｂｉｏｌ．、２６４：２２０；Ｋａｗａｓａｋｉら、（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、７：２５０）、５つの機能的Ｊκ領域（Ｈｉｅｔｅｒら、（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｆ、２５７：１５１６）及び４つの機能的Ｊλセグメント（Ｖａｓｉｃｅｋ及びＬｅｄｅｒ（１９９０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７２：６０９）が存在する。ＶＬセグメントは、ＶＬ領域（Ｌ１及びＬ２）の第１及び第２の抗原結合ループを形成するポリペプチド鎖の領域をコードするのに対して、ＶＬ及びＪＬセグメントは、ＶＬ領域（Ｌ３）の第３の抗原結合ループを形成するように結合する。この一次レパートリーから選択された抗体は、少なくとも中程度の親和性でほぼすべての抗原を結合するのに十分な多様性を有すると考えられる。高親和性抗体は、結合の向上に基づいて免疫系により点変異が生成、選択される、再構成された遺伝子の「親和性成熟」によって生成される。
抗体の構造及び配列の分析により、６つの抗原結合ループ（Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）のうちの５つが、限定された数の主鎖構造又は標準構造を有することが示された（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（１９８７）ｄ：Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１；Ｃｈｏｔｈｉａら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ、３４２：８７７）。主鎖構造は、（ｉ）抗原結合ループの長さ及び（ｉｉ）抗原結合ループ及び抗体骨組内での特定の主要位置における特定の残基物又は残基物の種類によって決定される。ループ長及び主要残基物の分析により、大多数のヒト抗体配列によってコードされるＨ１、Ｈ２，Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の主鎖構造を予測することが可能であった（Ｃｈｏｔｈｉａら、（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：７９９；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．、１４：４６２８；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６４：２２０）。Ｈ３領域は、（Ｄセグメントの使用により）配列、長さ及び構造の観点ではるかに多様であるが、ループ及び抗体骨組内での主要な位置における特定の残基物の長さ及び存在、又は残基物の種類に依存する短いループ長に対する限定された数の主鎖構造をも形成する（Ｍａｒｔｉｎら、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６３：８００；Ｓｈｉｒａｉら、（１９９６）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、３９９：１）。
二重特異性抗体
相補的なＶＨ及びＶＬ領域の対を含む二重特異性抗体は、当該技術分野で知られている。これらの二重特異性抗体は、それぞれのＶＨ／ＶＬ対が単一の抗原又はエピトープに結合する二対のＶＨ及びＶＬを含むはずである。記載の方法は、ハイブリッド雑種細胞（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ＆ Ｃｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７−４０）、ミニボディ（Ｈｕら、（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ３０ ５６：３０５５−３０６１；）、ダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０、６４４４ ６４４８；ＷＯ９４／１３８０４）、キレート化組換え抗体（ＣＲＡｂｓ；（Ｎｅｒｉら、（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４６、３６７−３７３）、ｂｉｓｃＦｖ（例えばＡｔｗｅｌｌら、（１９９６）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３、１３０１ １３１２）、「ノブインホール」安定化抗体（Ｃａｒｔｅｒら、（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．６、７８１ ７８８）。それぞれの場合において、各抗体種は、それぞれが相補的なＶＨ及びＶＬ領域の対によって作られた２つの抗原結合部位を含む。それにより、各抗体は、２つの異なる抗原又はエピトープと同時に結合することが可能となり、ＥＡＣＨ抗原又はエピトープに対する結合は、ＶＨ及びその相補的ＶＬ領域によって媒介される。これらの技術の各々は、それらに特有の欠点を示す。例えばハイブリッド雑種細胞の場合は、不活性ＶＨ／ＶＬ対は、二重特異性ＩｇＧの部分を著しく減少させうる。
また、たいていの二重特異性手法は、２つの異なるＶＨ／ＶＬ結合部位を再現するのに異なるＶＨ／ＶＬ対の会合又はＶＨ及びＶＬ鎖の会合に依存する。したがって、集合分子における各抗原又はエピトープに対する結合部位の比を制御することは不可能であるため、集合分子の多くが１つの抗原又はエピトープに結合し、他の抗原又はエピトープに結合しない。双方の抗原又はエピトープに対する結合部位を有する分子の数を増やすためにサブユニット界面における重又は軽鎖をタンパク質工学により改変することが可能である場合もあった（Ｃａｒｔｅｒら、１９９７）が、これによって、すべての分子が、双方の抗原又はエピトープに対する結合を有することにはならない。
２つの異なる抗体結合特異性が同じ結合部位に組み込まれうるという証拠があるが、これらは、一般には、構造的に関連した抗原又はエピトープ、或いは広い交差反応性の抗体に対応する２つ以上の特異性を表す。例えば、交差反応抗体は、通常は、ニワトリ卵白リゾチーム及びシチメンチョウリゾチームの如き２つの抗原が配列及び構造において関連している場合（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＷＯ９２／０１０４７）又は遊離ハプテン、及び担体に結合しているハプテンに対して関連している場合（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ＡＤら、ＥＭＢＯ Ｊ １９９４ １３：１４ ３２４５−６０）に、そのように記述されてきた。さらなる例において、ＷＯ０２／０２７７３（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）には、「二重特異性」を有する抗体分子が記載されている。言及される抗体分子は、それらの特異性が２つ以上の単一抗原に及ぶように多数の抗原に対して生成又は選択された抗体である。ＷＯ０２／０２７７３の抗体における各相補的ＶＨ／ＶＬ対は、構造的に関連した２つ以上の抗原に対する単一の結合特異性を規定し、そのような相補的な対におけるＶＨ及びＶＬ領域は、それぞれ個別的な特異性を有さない。
したがって、それらの抗体は、構造的に関連した２つの抗原を包含する広い単一の特異性を有する。また、構造的に関連していない少なくとも２つ（通常はそれより多い）異なる抗原又はエピトープと反応する、多反応的な天然自己抗体についても記載されている（Ｃａｓａｌｉ ＆ Ｎｏｔｌｉｎｓ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７、５１５−５３１）。モノクローナル抗体に対するファージディスプレイ技術を用いた無作為ペプチドレパートリー選択により、抗原結合部位に匹敵する一連のペプチド配列が特定されるであろうことも示された。いくつかの配列は高度に関連し、コンセンサス配列に匹敵するのに対して、他の配列は全く異なっており、ミモトープと名付けられた（Ｌａｎｅ ＆ Ｓｔｅｐｈｅｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９３、５、２６８−２７１）。したがって、会合し、且つ相補的なＶＨ及びＶＬ領域を含む天然の四鎖抗体は、知られている多数の抗原から多くの異なる抗原に結合する潜在性を有することは明らかである。同じ抗体における２つの所定の抗原、特に必ずしも構造的に関連していない抗原に対する結合部位をどのように作成するかということはあまり明白ではない。
これに関係しうるタンパク質工学による方法が示唆された。例えば、１つの可変領域を通じての金属イオンに対する結合活性、並びに金属イオンとの接触及び相補的可変領域を通じてのハプテン（基質）に対する結合活性を有する触媒抗体を作成することが可能であることも提案された（Ｂａｒｂａｓら、５ １９９３ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０、６３８５−６３８９）。しかし、この場合は、基質（第１の抗原）の結合及び触媒には、金属イオン（第２の抗体）の結合が必要であることが提案されている。したがって、ＶＨ／ＶＬ対に対する結合は、単一であるが、多成分の抗原と関係がある。
１つの可変領域に１つの抗原に対する結合接触部が作成され、第２の可変領域に第２の抗原に対する結合接触部が作成されるラクダ抗体重鎖単一領域から二重特異性抗体を作成するための方法が記載されている。しかし、可変領域は相補的ではなかった。したがって、第１の重鎖可変領域を第１の抗原に対して選択し、第２の重鎖可変領域を第２の抗原に対して選択し、次いで双方の領域を同一の鎖上で互いに結合させて、二重特異性抗体断片を与える（Ｃｏｎｒａｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０、２７５８９−２７５９４）。しかし、ラクダ重鎖単一領域は、軽鎖を有さない天然のラクダ抗体から誘導されるという点で特異的であり、実際、重鎖単一領域は、ラクダ軽鎖と会合して、相補的なＶＨ及びＶＬ対を形成することができない。
軽鎖を通常伴う天然抗体から誘導される単一重鎖可変領域も記載されている（モノクローナル抗体又は領域のレパートリーから；ＥＰ−Ａ−０３６８６８４参照）。これらの重鎖可変領域は、関連する１つ又は複数の抗原と特異的に相互作用することが示されたが、他の重又は軽鎖可変領域と結合して、２つ以上の異なる抗原に対する特異性を有するリガンドを作成することはなかった。また、これらの単一領域は、インビボ半減期が非常に短いことが示された。したがって、当該領域は、治療価値が限られている。
（上述のように）特異性の異なる重鎖可変領域を互いに結合させることによって二重特異性断片を作ることが示唆された。この手法の短所は、単離された抗体可変領域は、通常は軽鎖と相互作用し、溶媒に接触される疎水性界面を有し、「粘着性」で、単一領域が疎水性表面に結合することを可能にしうるということである。また、パートナーである軽鎖が存在しない状態で、２つ以上の異なる重鎖可変領域の組合せ、及び恐らくはそれらの疎水性界面を介する会合により、それらが分離して結合できるリガンドの一方又は双方に結合することを防止することができる。さらに、この場合は、重鎖可変領域は、相補的軽鎖可変領域に対応づけられないため、安定性が劣り、容易に変性しうる（Ｗｏｒｎ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、１９９８ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７、１３１２０−７）。
本発明人らは、本発明人らの同時係属国際特許出願ＷＯ０３／００２６０９、並びに同時係属未公開英国特許出願第０２３０２０３．２号において、それぞれが異なる特異性を有することができる免疫グロブリン単一可変領域を含む二重特異性免疫グロブリンリガンドについて記載した。それらの領域は、互いに競合して、又は独立して作用して、標的分子上で抗原又はエピトープを結合することができる。
本発明は、ＴＮＦ−α関連炎症性疾患にかかっている個体の当該疾患を治療する方法を記述する。該方法は、治療有効量の単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物、好ましくはヒト単一ドメイン抗体構築物を当該個体に投与することを含み、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物はヒトＴＮＦαを結合し、それによってＴＮＦ−α疾患が治療される。
一態様において、炎症性疾患は関節リウマチであり、該方法は、そのいずれかがヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗する１つ又は複数の単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物の使用を含む。本発明は、ヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗する１つ又は複数の単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物と、リガンドの第１の特異性がＴＮＦαに向けられ、第２の特異性がＶＥＧＦ又はＨＳＡに向けられる二重特異性リガンドとを含む組成物を記述する。本発明は、リガンドの第１の特異性がＶＥＧＦに向けられ、第２の特異性がＨＳＡに向けられる二重特異性リガンドをさらに記述する。
疾病を治療するための医薬の調製、特に関節リウマチを治療するための医薬の調製における、本明細書に記載されているポリペプチド構築物の使用も本明細書に包含される。
一態様において、本発明は、関節リウマチを治療する方法であって、当該治療を必要とする個体に対して、ヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含む治療有効量の組成物を投与することを含み、それによって関節リウマチが治療される方法を包含する。
一実施形態において、該組成物は、関節炎のＴｇ１９７遺伝子組換えマウスモデルのマウスに投与されると、関節炎スコアの増加を防止する。
他の実施形態において、Ｔｇ１９７遺伝子組換えマウスに対する組成物の投与は、ａ）異型接合Ｔｇ１９７遺伝子組換えマウスに対して組成物を腹腔内注射により毎週投与する工程と、ｂ）工程ａ）のマウスの重量を毎週測定する工程と、ｃ）０＝関節炎ではない（正常な外観及び屈曲）、１＝軽度の関節炎（関節の歪み）、２＝中等度の関節炎（腫脹、関節の変形）、３＝重度の関節炎（著しい運動障害）のシステムに従って、関節炎のマクロ表現型徴候についてマウスを毎週採点する工程とを含む。
他の実施形態において、関節炎症状の発症が示される前に組成物が投与される。他の実施形態において、マウスが３週齢のときに組成物が最初に投与される。他の実施形態において、マウスが６週齢のときに組成物が最初に投与される。
他の実施形態において、組成物は、統計的有意の範囲内で、エタネルセプト、インフリキシマブ及びＤ２Ｅ７からなる群から選択される薬剤の（ｍｇ／ｋｇ単位の）同等用量以上である、Ｔｇ１９７遺伝子組換えマウス関節炎試験における効果を有する。
他の実施形態において、組成物は、治療が０から０．５の関節炎スコアをもたらすようなＴｇ１９７遺伝子組換えマウス関節炎試験における効果を有する。他の実施形態において、組成物は、治療が０から１．０の関節炎スコアをもたらすようなＴｇ１９７遺伝子組換えマウス関節炎試験における効果を有する。他の実施形態において、組成物は、治療が０から１．５の関節炎スコアをもたらすようなＴｇ１９７遺伝子組換えマウス関節炎試験における効果を有する。他の実施形態において、組成物は、治療が０から２．０の関節炎スコアをもたらすようなＴｇ１９７遺伝子組換えマウス関節炎試験における効果を有する。
他の実施形態において、治療は、関節リウマチの進行を抑制することを含む。他の実施形態において、治療は、関節リウマチの発症を防止する、又は遅らせることを含む。
他の実施形態において、投与は、ＲＡの１つ又は複数の指標の統計的に有意な変化をもたらす。他の実施形態において、ＲＡの１つ又は複数の指標は、血沈（ＥＳＲ）、リッチ（Ｒｉｔｃｈｉｅ）関節指数及び朝のこわばりの持続時間、関節可動度、関節腫脹、１つ又は複数の関節のＸ線撮像、並びに１つ又は複数の関節の固定部の組織病理学的分析のいずれかを含む。
他の実施形態において、ＲＡの１つ又は複数の指標は、Ｔｇ１９７遺伝子組換えマウスにおける関節炎のマクロ表現型徴候の減少を含み、組成物はＴｇ１９７遺伝子組換えマウスに投与され、Ｔｇ１９７遺伝子組換えマウスは、関節炎のマクロ表現型徴候について採点され、関節炎のマクロ表現型徴候は、０＝関節炎ではない（正常な外観及び屈曲）、１＝軽度の関節炎（関節の歪み）、２＝中等度の関節炎（腫脹、関節の変形）、３＝重度の関節炎（著しい運動障害）のシステムに従って採点される。
他の実施形態において、ＲＡの１つ又は複数の指標は、Ｔｇ１９７遺伝子組換えマウスにおける関節炎の組織病理学的徴候のマクロ表現型徴候の減少を含み、組成物はＴｇ１９７遺伝子組換えマウスに投与され、Ｔｇ１９７遺伝子組換えマウスは、関節炎の組織病理学的徴候について採点され、関節炎の組織病理学的徴候は、関節に実現され、０＝検出可能な病状なし、１＝滑膜の過形成及び多形核浸潤物の存在、２＝パンヌス及び繊維状組織の形成並びに限局性軟骨下骨浸食、３＝関節軟骨破壊及び骨浸食、４＝広範な関節軟骨破壊及び骨浸食のシステムを用いて採点される。
他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、ヒト単一ドメイン抗体ポリペプチドを含む。他の実施形態において、ヒト単一ドメイン抗体ポリペプチドは、ＴＮＦαを結合する。他の実施形態において、単一領域ポリペプチド構築物は、１００ｎＭ未満のＫｄでヒトＴＮＦαを結合する。他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１００ｎＭから５０ｐＭの範囲のＫｄでヒトＴＮＦαを結合する。他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、３０ｎＭから５０ｐＭの範囲のＫｄでヒトＴＮＦαを結合する。他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１０ｎＭから５０ｐＭの範囲のＫｄでヒトＴＮＦαを結合する。他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１ｎＭから５０ｐＭの範囲のＫｄでヒトＴＮＦαを結合する。
他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、標準的なＬ９２９細胞傷害性細胞試験で測定されるヒトＴＮＦαを中和する。
本発明は、関節リウマチを治療する方法であって、当該治療を必要とする個体に対して、ヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチドを含む治療有効量の組成物を投与することを含み、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物はヒトＴＮＦαのＴＮＦα受容体に対する結合を阻害し、それによって関節リウマチが治療される方法をさらに包含する。
一実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、細胞表面受容体に結合されたヒトＴＮＦ−αに対して特異的に結合する。
他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１５分から１２時間の範囲のインビボｔα半減期を有する。他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１から６時間の範囲のインビボｔβ半減期を有する。他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、２から５時間の範囲のインビボｔβ半減期を有する。他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、３から４時間の範囲のインビボｔβ半減期を有する。他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１２から６０時間の範囲のインビボｔβ半減期を有する。他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１２から４８時間の範囲のインビボｔβ半減期を有する。他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１２から２６時間の範囲のインビボｔβ半減期を有する。
他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１５ｍｇ分／ｍｌから１５０ｍｇ分／ｍｌのインビボＡＵＣ半減期値を有する。他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１５ｍｇ分／ｍｌから１００ｍｇ分／ｍｌのインビボＡＵＣ半減期値を有する。他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１５ｍｇ分／ｍｌから７５ｍｇ分／ｍｌのインビボＡＵＣ半減期値を有する。他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１５ｍｇ分／ｍｌから５０ｍｇ分／ｍｌのインビボＡＵＣ半減期値を有する。
他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、ＰＥＧ分子に結合される。他の実施形態において、ＰＥＧ結合単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、少なくとも２４ｋＤａのハイドロダイナミックサイズを有し、全ＰＥＧサイズは２０から６０ｋＤａである。他の実施形態において、ＰＥＧ結合単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、少なくとも２００ｋＤａのハイドロダイナミックサイズを有し、全ＰＥＧサイズは２０から６０ｋＤａである。他の実施形態において、本発明のＰＥＧ化タンパク質を平均で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０又はそれより多いポリエチレングリコール分子に結合することができる。
他の実施形態において、抗体構築物は、ヒトＴＮＦαを結合する２つ以上の単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチドを含む。他の実施形態において、抗体構築物は、ヒトＴＮＦαを結合する単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチドのホモ二量体を含む。他の実施形態において、抗体構築物は、ヒトＴＮＦαを結合する単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチドのホモ三量体を含む。他の実施形態において、抗体構築物は、ヒトＴＮＦαを結合する単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチドのホモ四量体を含む。
他の実施形態において、ＴＮＦα以外の抗原に対して特異的な抗体ポリペプチドをさらに含む。他の実施形態において、ＴＮＦα以外の抗原に対して特異的な抗体ポリペプチドは、単一ドメイン抗体ポリペプチドを含む。他の実施形態において、ＴＮＦα以外の抗原に対して特異的な抗体ポリペプチドによるＴＮＦα以外の抗原の結合は、抗体ポリペプチド構築物のインビボ半減期を増加させる。他の実施形態において、ＴＮＦα以外の抗原は、血清タンパク質を含む。他の実施形態において、血清タンパク質は、フィブリン、α−２マクログロブリン、血清アルブミン、フィブリノゲンＡ、フィブリノゲン、血清アミロイドタンパク質Ａ、ヘプタグロビン、タンパク質、ユビキチン、子宮グロブリン及びβ−２−ミクログロブリンからなる群から選択される。他の実施形態において、ＴＮＦα以外の抗原は、ＨＳＡを含む。
他の実施形態において、治療は、少なくとも１つのさらなる治療薬の投与をさらに含む。
他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
Figure 2013056890
からなる群から選択される抗体ポリペプチドのＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
Figure 2013056890
からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
Figure 2013056890
からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
Figure 2013056890
からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９２％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
Figure 2013056890
からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
Figure 2013056890
からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
Figure 2013056890
からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
Figure 2013056890
からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明は、関節リウマチを治療する方法であって、当該治療を必要とする個体に対して、ヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含む治療有効量の組成物を投与することを含み、組成物は、関節炎のＴｇ１９７遺伝子組換えマウスモデルのマウスに投与されると関節炎スコアの増加を防ぎ、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１００ｎＭ未満のＫｄでヒトＴＮＦαを結合し、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、標準的なＬ９２９細胞試験で測定されるヒトＴＮＦαを中和し、それによって関節リウマチが治療される方法をさらに包含する。
本発明は、ヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含み、関節炎のＴｇ１９７遺伝子組換えマウスモデルのマウスに投与されると関節炎スコアの増加を防ぎ、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、標準的なＬ９２９細胞試験で測定されるヒトＴＮＦαを中和する組成物をさらに包含する。
本発明は、ヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含み、関節炎のＴｇ１９７遺伝子組換えマウスモデルのマウスに投与されると関節炎スコアの増加を防止する組成物であって、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、関節リウマチの進行を抑制する組成物をさらに包含する。
本発明は、ヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含み、関節炎のＴｇ１９７遺伝子組換えマウスモデルのマウスに投与されると関節炎スコアの増加を防止する組成物であって、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１００ｎＭ未満のＫｄでヒトＴＮＦαを結合する組成物をさらに包含する。
本発明は、ヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含み、関節炎のＴｇ１９７遺伝子組換えマウスモデルのマウスに投与されると関節炎スコアの増加を防止する組成物であって、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、標準的なＬ９２９細胞試験で測定されるヒトＴＮＦαを中和し、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、関節リウマチの進行を抑制し、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１００ｎＭ未満のＫｄでヒトＴＮＦαを結合する組成物をさらに包含する。
先述の３つの実施形態のさらなる実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
Figure 2013056890
からなる群から選択される抗体ポリペプチドのＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。
さらなる実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
Figure 2013056890
からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
さらなる実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
Figure 2013056890
からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
さらなる実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
Figure 2013056890
からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９２％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
さらなる実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
Figure 2013056890
からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
さらなる実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
Figure 2013056890
からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
さらなる実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
Figure 2013056890
からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
さらなる実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
Figure 2013056890
からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
さらなる実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
Figure 2013056890
からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明は、関節リウマチを治療する方法であって、当該治療を必要とする個体に対して、ヒトＶＥＧＦの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含む治療有効量の組成物を投与することを含み、それによって関節リウマチが治療される方法をさらに包含する。
一実施形態において、組成物は、コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）マウスモデルのマウスに投与されると、関節炎スコアの増加を防止する。マウス型ＩＩコラーゲンによるＤＢＡ／１マウスの免疫化は、ヒト自己免疫関節炎に対する強力なモデルを提供する慢性再発性多発関節炎を誘発する。そのモデルは、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれているＣｏｕｒｔｅｎａｙら、１９８０、Ｎａｔｕｒｅ ２８２：６６６−６６８；Ｋａｔｏら、１９９６、Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．５５：５３５−５３９；及びＭｙｅｒｓら、１９９７、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６１：１８６１−１８７８に記載されている。
一実施形態において、マウスに対する組成物の投与は、ａ）ＣＩＡマウスに対して組成物を腹腔内注射により毎週投与する工程と、ｂ）工程ａ）のマウスの重量を毎週測定する工程と、ｃ）０＝関節炎ではない（正常な外観及び屈曲）、１＝軽度の関節炎（関節の歪み）、２＝中等度の関節炎（腫脹、関節の変形）、３＝重度の関節炎（著しい運動障害）のシステムに従って、関節炎のマクロ表現型徴候についてマウスを採点する工程とを含む。
一実施形態において、治療は、関節リウマチの進行を抑制することを含む。
一実施形態において、治療は、関節リウマチの発症を防止する、又は遅らせることを含む。
一実施形態において、投与は、ＲＡの１つ又は複数の指標の統計的に有意な変化をもたらす。その変化は、好ましくは少なくとも１０％以上である。
一実施形態において、ＲＡの１つ又は複数の指標は、血沈（ＥＳＲ）、リッチ関節指数（Ｒｉｔｃｈｉｅら、１９６８、Ｑ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７：３９３−４０６）及び朝のこわばりの持続時間、関節可動度、関節腫脹、１つ又は複数の関節のＸ線撮像による分析、並びに１つ又は複数の関節の固定部の組織病理学的指標のいずれかを含む。疾患活動性スコア（ＤＡＳ）及び／又は慢性関節炎体系的指数（ＣＡＳＩ）を用いて、疾患活動性、及び治療によって生じた変化を評価することも可能である（Ｃａｒｏｔｔｉら、２００２、Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．６１：８７７−８８２、及びＳａｌａｆｆｉら、２０００、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ３９：９０−９６参照）。
一実施形態において、ＲＡの１つ又は複数の指標は、コラーゲン誘発関節炎マウスモデルのマウスにおける関節炎のマクロ表現型徴候の減少を含み、組成物は該マウスに投与され、該マウスは、関節炎のマクロ表現型徴候について採点され、関節炎のマクロ表現型徴候は、０＝関節炎ではない（正常な外観及び屈曲）、１＝軽度の関節炎（関節の歪み）、２＝中等度の関節炎（腫脹、関節の変形）、３＝重度の関節炎（著しい運動障害）のシステムに従って採点される。
一実施形態において、ＲＡの１つ又は複数の指標は、コラーゲン誘発関節炎マウスモデルのマウスにおける関節炎の組織病理学的徴候のマクロ表現型徴候の減少を含み、組成物は該マウスに投与され、該マウスは、関節炎の組織病理学的徴候について採点され、関節炎の組織病理学的徴候は、関節に実現され、０＝検出可能な病状なし、１＝滑膜の過形成及び多形核浸潤物の存在、２＝パンヌス及び繊維状組織の形成並びに限局性軟骨下骨浸食、３＝関節軟骨破壊及び骨浸食、４＝広範な関節軟骨破壊及び骨浸食のシステムを用いて採点される。
一実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、ヒト単一ドメイン抗体ポリペプチドを含む。
一実施形態において、ヒト単一ドメイン抗体ポリペプチドは、ＶＥＧＦを結合する。
一実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１００ｎＭ未満のＫｄでヒトＶＥＧＦを結合する。
一実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１００ｎＭから５０ｐＭの範囲のＫｄでヒトＶＥＧＦを結合する。
一実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、３０ｎＭから５０ｐＭの範囲のＫｄでヒトＶＥＧＦを結合する。
一実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１０ｎＭから５０ｐＭの範囲のＫｄでヒトＶＥＧＦを結合する。
一実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１ｎｍから５０ｐＭの範囲のＫｄでヒトＶＥＧＦを結合する。
一実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、ＶＥＧＦ受容体１試験又はＶＥＧＦ受容体２試験で測定されるヒトＶＥＧＦを中和する。
本発明は、関節リウマチを治療する方法であって、当該治療を必要とする個体に対して、ヒトＶＥＧＦの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含む治療有効量の組成物を投与することを含み、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、ヒトＶＥＧＦのＶＥＧＦ受容体に対する結合を抑制し、それによって関節リウマチが治療される方法をさらに包含する。
一実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、細胞表面受容体に結合されたヒトＶＥＧＦに対して特異的に結合する。
一実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、ＰＥＧ分子に結合される。
一実施形態において、ＰＥＧ結合単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、少なくとも２４ｋＤａのハイドロダイナミックサイズを有し、全ＰＥＧサイズは２０から６０ｋＤａである。
一実施形態において、ＰＥＧ結合単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、少なくとも２００ｋＤａのハイドロダイナミックサイズを有し、全ＰＥＧサイズは２０から６０ｋＤａである。
一実施形態において、本発明のＰＥＧ化タンパク質を平均で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０又はそれより多いポリエチレングリコール分子に結合することができる。
一実施形態において、抗体構築物は、ヒトＶＥＧＦを結合する２つ以上の単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチドを含む。
一実施形態において、抗体構築物は、ヒトＶＥＧＦを結合する単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチドのホモ二量体を含む。
一実施形態において、抗体構築物は、ヒトＶＥＧＦを結合する単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチドのホモ三量体を含む。
一実施形態において、抗体構築物は、ヒトＶＥＧＦを結合する単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチドのホモ四量体を含む。
一実施形態において、構築物は、ＶＥＧＦ以外の抗原に対して特異的な抗体ポリペプチドをさらに含む。
一実施形態において、ＶＥＧＦ以外の抗原に対して特異的な抗体ポリペプチドは、単一ドメイン抗体ポリペプチドを含む。
一実施形態において、ＶＥＧＦ以外の抗原に対して特異的な抗体ポリペプチドによるＶＥＧＦ以外の抗原の結合は、抗体ポリペプチド構築物のインビボ半減期を増加させる。
一実施形態において、ＶＥＧＦ以外の抗原は、血清タンパク質を含む。
一実施形態において、血清タンパク質は、フィブリン、α−２マクログロブリン、血清アルブミン、フィブリノゲンＡ、フィブリノゲン、血清アミロイドタンパク質Ａ、ヘプタグロビン、タンパク質、ユビキチン、子宮グロブリン及びβ−２−ミクログロブリンからなる群から選択される。
一実施形態において、ＶＥＧＦ以外の抗原は、ＨＳＡを含む。
一実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１５分から１２時間の範囲のインビボｔα半減期を有する。他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１から６時間の範囲のインビボｔβ半減期を有する。
他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、２から５時間の範囲のインビボｔβ半減期を有する。他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、３から４時間の範囲のインビボｔβ半減期を有する。
他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１２から６０時間の範囲のインビボｔβ半減期を有する。他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１２から４８時間の範囲のインビボｔβ半減期を有する。
他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１２から２６時間の範囲のインビボｔβ半減期を有する。他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１５ｍｇ分／ｍｌから１５０ｍｇ分／ｍｌのインビボＡＵＣ半減期値を有する。他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１５ｍｇ分／ｍｌから１００ｍｇ分／ｍｌのインビボＡＵＣ半減期値を有する。他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１５ｍｇ分／ｍｌから７５ｍｇ分／ｍｌのインビボＡＵＣ半減期値を有する。他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１５ｍｇ分／ｍｌから５０ｍｇ分／ｍｌのインビボＡＵＣ半減期値を有する。
一実施形態において、治療は、少なくとも１つのさらなる治療薬の投与をさらに含む。
一実施形態において、治療薬は、エタネルセプト、インフリキシマブ及びＤ２Ｅ７からなる群から選択される。
一実施形態において、治療薬は、コルチコステロイド、タンパク質分解酵素、非ステロイド抗炎症薬（ＮＴＨＥＳ）、アセチルサリチル酸、ピラゾロン、フェナム酸塩、ジフルニサル、酢酸誘導体、プロピオン酸誘導体、オキシカム、メフェナム酸、ポンステル、メクロフェナム酸塩、メクロメン、フェニルブタゾン、ブタゾリジン、ジフルニサル、ドロビド、ジクロフェナク、ボルタレン、インドメタシン、インドシン、スリンダク、クリノリル、エトドラク、ロジン、ケトロラク、トラドール、ナブメトン、レラフェン、トルメチン、トレクチン、イブプロフェン、モツリン、フェノプロフェン、ナルフォン、フルルビプロフェン、アンテ、カルプロフェン、リマジル、ケトプロフェン、オルジス、ナプロキセン、アナプロクス、ナプロシン、ピロキシカム及びフェルデンからなる群から選択される。
一実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
Figure 2013056890
からなる群から選択される抗体ポリペプチドのＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
Figure 2013056890
からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
Figure 2013056890
からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
Figure 2013056890
からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９２％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
Figure 2013056890
からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
Figure 2013056890
からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
Figure 2013056890
からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
Figure 2013056890
からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明は、ヒトＶＥＧＦの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含み、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、
Figure 2013056890
からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む組成物をさらに包含する。
本発明は、ヒトＶＥＧＦの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含み、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、
Figure 2013056890
からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む組成物をさらに包含する。
本発明は、ヒトＶＥＧＦの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含み、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、
Figure 2013056890
からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む組成物をさらに包含する。
本発明は、ヒトＶＥＧＦの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含み、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、
Figure 2013056890
からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９２％の同一性を有する配列を含む組成物をさらに包含する。
本発明は、ヒトＶＥＧＦの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含み、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、
Figure 2013056890
からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９４％の同一性を有する配列を含む組成物をさらに包含する。
本発明は、ヒトＶＥＧＦの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含み、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、
Figure 2013056890
からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９６％の同一性を有する配列を含む組成物をさらに包含する。
本発明は、ヒトＶＥＧＦの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含み、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、
Figure 2013056890
からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９８％の同一性を有する配列を含む組成物をさらに包含する。
本発明は、ヒトＶＥＧＦの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含み、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、
Figure 2013056890
からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む組成物をさらに包含する。
本発明は、関節リウマチを治療する方法であって、当該治療を必要とする個体に対して、ヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗し、ヒトＶＥＧＦの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含む治療有効量の組成物を投与することを含み、それによって関節リウマチが治療される方法をさらに包含する。
一実施形態において、組成物は、関節炎のＴｇ１９７遺伝子組換えマウスモデルのマウスに投与されると、関節炎スコアの増加を防止する。
他の実施形態において、Ｔｇ１９７遺伝子組換えマウスに対する組成物の投与は、ａ）異型接合Ｔｇ１９７遺伝子組換えマウスに対して組成物を腹腔内注射により毎週投与する工程と、ｂ）工程ａ）のマウスの重量を毎週測定する工程と、ｃ）０＝関節炎ではない（正常な外観及び屈曲）、１＝軽度の関節炎（関節の歪み）、２＝中等度の関節炎（腫脹、関節の変形）、３＝重度の関節炎（著しい運動障害）のシステムに従って、関節炎のマクロ表現型徴候についてマウスを採点する工程とを含む。
他の実施形態において、組成物は、統計的有意の範囲内で、エタネルセプト、インフリキシマブ及びＤ２Ｅ７からなる群から選択される薬剤の効果以上である、Ｔｇ１９７遺伝子組換えマウス関節炎試験における効果を有する。
他の実施形態において、治療は、関節リウマチの進行を抑制することを含む。
他の実施形態において、治療は、関節リウマチの発症を防止する、又は遅らせることを含む。
他の実施形態において、投与は、ＲＡの１つ又は複数の指標の統計的に有意な変化をもたらす。
他の実施形態において、ＲＡの１つ又は複数の指標は、血沈（ＥＳＲ）、リッチ関節指数及び朝のこわばりの持続時間、関節可動度、関節腫脹、１つ又は複数の関節のＸ線撮像、並びに１つ又は複数の関節の固定部の組織病理学的分析のいずれかを含む。
他の実施形態において、ＲＡの１つ又は複数の指標は、Ｔｇ１９７遺伝子組換えマウスにおける関節炎のマクロ表現型徴候の減少を含み、組成物はＴｇ１９７遺伝子組換えマウスに投与され、Ｔｇ１９７遺伝子組換えマウスは、関節炎のマクロ表現型徴候について採点され、関節炎のマクロ表現型徴候は、０＝関節炎ではない（正常な外観及び屈曲）、１＝軽度の関節炎（関節の歪み）、２＝中等度の関節炎（腫脹、関節の変形）、３＝重度の関節炎（著しい運動障害）のシステムに従って採点される。
他の実施形態において、ＲＡの１つ又は複数の指標は、Ｔｇ１９７遺伝子組換えマウスにおける関節炎の組織病理学的徴候のマクロ表現型徴候の減少を含み、組成物はＴｇ１９７遺伝子組換えマウスに投与され、Ｔｇ１９７遺伝子組換えマウスは、関節炎の組織病理学的徴候について採点され、関節炎の組織病理学的徴候は、関節に実現され、０＝検出可能な病状なし、１＝滑膜の過形成及び多形核浸潤物の存在、２＝パンヌス及び繊維状組織の形成並びに限局性軟骨下骨浸食、３＝関節軟骨破壊及び骨浸食、４＝広範な関節軟骨破壊及び骨浸食のシステムを用いて採点される。
他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、ヒト単一ドメイン抗体ポリペプチドを含む。
他の実施形態において、ヒト単一ドメイン抗体ポリペプチドは、ＴＮＦα及びＶＥＧＦを結合する。
他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、標準的なＬ９２９細胞試験で測定されるヒトＴＮＦαを中和する。
他の実施形態において、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、ＰＥＧ分子に結合される。
他の実施形態において、ＰＥＧ結合単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、少なくとも２４ｋＤａのハイドロダイナミックサイズを有し、全ＰＥＧサイズは、２０から６０ｋＤａである。
他の実施形態において、ＰＥＧ結合単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、少なくとも２００ｋＤａのハイドロダイナミックサイズを有し、全ＰＥＧサイズは、２０から６０ｋＤａである。
他の実施形態において、抗体ポリペプチド構築物は、平均で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０又はそれより多いポリエチレングリコール分子に結合される。
他の実施形態において、抗体構築物は、ヒトＴＮＦαを結合する２つ以上の単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチド、及び／又はヒトＶＥＧＦを結合する２つ以上の単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチドを含む。
他の実施形態において、抗体構築物は、ヒトＴＮＦαを結合する単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチドのホモ二量体、及び／又はヒトＶＥＧＦを結合する単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチドのホモ二量体を含む。
他の実施形態において、抗体構築物は、ヒトＴＮＦαを結合する単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチドのホモ三量体、及び／又はヒトＶＥＧＦを結合する単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチドのホモ三量体を含む。
他の実施形態において、抗体構築物は、ヒトＴＮＦαを結合する単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチドのホモ四量体、及び／又はヒトＶＥＧＦを結合する単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチドのホモ四量体を含む。
他の実施形態において、構築物は、ＴＮＦα又はＶＥＧＦ以外の抗原に対して特異的な抗体ポリペプチドをさらに含む。
他の実施形態において、ＴＮＦα又はＶＥＧＦ以外の抗原に対して特異的な抗体ポリペプチドは、単一ドメイン抗体ポリペプチドを含む。
他の実施形態において、ＴＮＦα又はＶＥＧＦ以外の抗原に対して特異的な抗体ポリペプチドによるＴＮＦα又はＶＥＧＦ以外の抗原の結合は、抗体ポリペプチド構築物のインビボ半減期を増加させる。
他の実施形態において、ＴＮＦα又はＶＥＧＦ以外の抗原は、血清タンパク質を含む。
他の実施形態において、血清タンパク質は、フィブリン、α−２マクログロブリン、血清アルブミン、フィブリノゲンＡ、フィブリノゲン、血清アミロイドタンパク質Ａ、ヘプタグロビン、タンパク質、ユビキチン、子宮グロブリン及びβ−２−ミクログロブリンからなる群から選択される。
他の実施形態において、ＴＮＦα以外の抗原は、ＨＳＡを含む。
他の実施形態において、治療は、少なくとも１つのさらなる治療薬の投与をさらに含む。
本発明は、ヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗し、ヒトＶＥＧＦの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含み、関節炎のＴｇ１９７遺伝子組換えマウスモデルのマウスに投与されると関節炎スコアの増加を防止する組成物であって、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、関節リウマチの進行を抑制する組成物をさらに包含する。
本発明は、ヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗し、ヒトＶＥＧＦの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含み、関節炎のＴｇ１９７遺伝子組換えマウスモデルのマウスに投与されると関節炎スコアの増加を防止する組成物であって、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１００ｎＭ未満のＫｄでヒトＴＮＦαを結合する組成物をさらに包含する。
本発明は、ヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗し、ヒトＶＥＧＦの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含み、関節炎のＴｇ１９７遺伝子組換えマウスモデルのマウスに投与されると関節炎スコアの増加を防止する組成物であって、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、標準的なＬ９２９細胞試験で測定されるヒトＴＮＦαを中和し、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、関節リウマチの進行を抑制し、単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１００ｎＭ未満のＫｄでヒトＴＮＦαを結合する組成物をさらに包含する。
他の態様は、ヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗し、関節炎のＴｇ１９７遺伝子組換えマウスモデルのマウスに投与されると関節炎スコアの増加を防止する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物であって、標準的なＬ９２９細胞試験で測定されるヒトＴＮＦαを中和し、関節リウマチの進行を抑制し、１００ｎＭ未満のＫｄでヒトＴＮＦαを結合する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を選択するための方法であって、（１）各部位においてすべての可能なアミノ置換基が生成されるように、前記単一ドメイン抗体ポリペプチドのいくつかの超可変領域部位をコードする核酸を変異させる工程と、（２）工程（１）で生成された変異超可変領域部位をファージミドディスプレイベクターに導入して、ファージミド表面ディスプレイタンパク質に表示された前記変異超可変領域部位の１つを発現することがそれぞれ可能なディスプレイベクターの大集団を形成する工程と、（３）このようにして生成された変異超可変領域部位が、融合物としての繊維状ファージ粒子から各粒子内に包まれたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ生成物まで一価的に表示されるように、繊維状ファージ粒子の表面に変異超可変領域部位を発現させる工程と、（４）表面発現ファージ粒子をＴＮＦαに結合する能力についてスクリーニングする工程と、（５）ＴＮＦαに結合することが可能な表面発現ファージ粒子を単離する工程と、（６）ＴＮＦαを結合することが可能であり、また、関節炎のＴｇ１９７遺伝子組換えマウスモデルのマウスに投与されると関節炎スコアの増加を防止し、標準的なＬ９２９細胞試験で測定されるヒトＴＮＦαを中和し、関節リウマチの進行を抑制し、１００ｎＭ未満のＫｄでヒトＴＮＦαを結合する工程（５）の表面発現ファージ粒子を選択することによって、ヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含有する表示タンパク質を含有する１つ又は複数のファージミドの種を選択する工程を含む方法である。
他の態様は、関節リウマチを治療する方法であって、当該治療を必要とする個体に対して、ヒトＶＥＧＦの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含む治療有効量の組成物を投与することを含み、それによって前記関節リウマチが治療され、前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１５分から１２時間、１から６時間、２から５時間、又は３から４時間の範囲のインビボｔα半減期を有する方法である。
他の実施形態は、関節リウマチを治療する方法であって、当該治療を必要とする個体に対して、ヒトＶＥＧＦの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含む治療有効量の組成物を投与することを含み、それによって前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１２から６０時間、１２から４８時間、又は１２から２６時間の範囲のインビボｔβ半減期を有する方法である。
他の実施形態は、関節リウマチを治療する方法であって、当該治療を必要とする個体に対して、ヒトＶＥＧＦの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含む治療有効量の組成物を投与することを含み、それによって前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１５ｍｇ分／ｍｌから１５０ｍｇ分／ｍｌ、１５ｍｇ分／ｍｌから１００ｍｇ分／ｍｌ、１５ｍｇ分／ｍｌから７５ｍｇ分／ｍｌ、又は１５ｍｇ分／ｍｌから５０ｍｇ分／ｍｌのインビボＡＵＣ半減期値を有する方法である。
他の実施形態は、関節リウマチを治療する方法であって、当該治療を必要とする個体に対して治療有効量の組成物を投与することを含み、前記組成物は、ヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含み、それによって前記リウマチ関節を治療し、前記組成物は、関節炎のＴｇ１９７遺伝子組換えマウスモデルのマウスに投与されると関節炎スコアの増加を防止し、前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、それぞれ１００ｎＭ未満のＫｄでヒトＴＮＦα及びＶＥＧＦを結合し、前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、それぞれ１００ｎＭから５０ｐＭのＫｄでヒトＴＮＦα及びＶＥＧＦを結合し、前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、それぞれ３０ｎＭから５０ｐＭのＫｄでヒトＴＮＦα及びＶＥＧＦを結合し、前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、それぞれ１０ｎＭから５０ｐＭのＫｄでヒトＴＮＦα及びＶＥＧＦを結合し、又は前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、それぞれ１ｎｍから５０ｐＭの範囲のＫｄでヒトＴＮＦα及びＶＥＧＦを結合する方法である。
他の実施形態は、関節リウマチを治療する方法であって、当該治療を必要とする個体に対して、ヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗し、ヒトＶＥＧＦの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含む治療有効量の組成物を投与することを含み、前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、ヒトＴＮＦαのＴＮＦα受容体に対する結合、及びヒトＶＥＧＦのＶＥＧＦ受容体に対する結合を抑制し、それによって前記関節リウマチが治療される方法である。
他の実施形態は、関節リウマチを治療する方法であって、当該治療を必要とする個体に対して、ヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗し、ヒトＶＥＧＦの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含む治療有効量の組成物を投与することを含み、前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、ヒトＴＮＦαのＴＮＦα受容体に対する結合、及びヒトＶＥＧＦのＶＥＧＦ受容体に対する結合を抑制し、それによって前記関節リウマチを治療し、前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、細胞表面受容体に結合されたヒトＴＮＦαに対して特異的に結合する方法である。
他の実施形態は、関節リウマチを治療する方法であって、当該治療を必要とする個体に対して治療有効量の組成物を投与することを含み、前記組成物は、ヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗し、ヒトＶＥＧＦの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含み、それによって前記関節リウマチを治療し、前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、細胞表面受容体に結合されたヒトＴＮＦαに対して特異的に結合する方法である。
本発明の他の実施形態は、ＴＮＦαに対して特異的な抗体構築物を投与することを含む関節リウマチ治療方法であって、抗体構築物の配列は、本明細書に列記されている抗ＴＮＦ−αクローンのいずれか１つのクローンの配列に対して８５、９０、９５、９６、９７、９８若しくは９９％以上又は１００％の同一性を有する配列を含む、又は当該配列からなる関節リウマチ治療方法である。
本発明の他の実施形態は、ＴＮＦαに対して特異的な抗体構築物を含む組成物であって、抗体構築物の配列は、本明細書に列記されている抗ＴＮＦ−αクローンのいずれか１つのクローンの配列に対して８５、９０、９５、９６、９７、９８若しくは９９％以上又は１００％の同一性を有する配列を含む、又は当該配列からなる組成物である。
本発明の他の実施形態は、ＶＥＧＦに対して特異的な抗体構築物を投与することを含む関節リウマチ治療方法であって、抗体構築物の配列は、本明細書に列記されている抗ＶＥＧＦクローンのいずれか１つのクローンの配列に対して８５、９０、９５、９６、９７、９８若しくは９９％以上又は１００％の同一性を有する配列を含む、又は当該配列からなる関節リウマチ治療方法である。
本発明の他の実施形態は、ＶＥＧＦに対して特異的な抗体構築物を含む組成物であって、抗体構築物の配列は、本明細書に列記されている抗ＶＥＧＦクローンのいずれか１つのクローンの配列に対して８５、９０、９５、９６、９７、９８若しくは９９％以上又は１００％の同一性を有する配列を含む、又は当該配列からなる組成物である。
他の実施形態において、第１の抗原又はエピトープを結合するＶＨ又はＶＬ単一ドメイン抗体の２つの複製物と、第２の抗原又はエピトープを結合するＶＨ又はＶＬ単一ドメイン抗体の２つの複製物とを含む四価二重特異性抗原結合ポリペプチド構築物が提供される。第１及び第２のエピトープは、同一の抗原、或いは異なる抗原に存在することが可能である。第１の抗原又はエピトープを結合する単一ドメイン抗体の２つの複製物の各々は、それぞれのＩｇＧ重鎖定常領域に融合され、第２の抗原又はエピトープを結合する単一ドメイン抗体の２つの複製物の各々は、それぞれの軽鎖定常領域に融合される。これらの四価二重特異性ポリペプチド構築物は、重鎖及び軽鎖定常領域で接続された２つの抗原結合腕を有するという点においてＩｇＧ様である。それらは、各腕に２つの異なる抗原特異性単一ドメイン抗体ポリペプチドが存在することにより、各腕は、２つの異なる抗原又はエピトープを結合して、構築物を四価且つ二重特異性にすることが可能であるという点において、天然のＩｇＧとは異なる。一実施形態において、第１及び第２のエピトープは、ポリペプチド構築物に存在するそのエピトープに対する４つの特異的結合部位が存在するように同一になる。他の実施形態において、第１及び第２のエピトープは、異なっており、同一又は異なる抗原に存在する。
本明細書に記載されている二重特異性四価ポリペプチド構築物は、任意の２つの抗原又はエピトープに対して特異的な単一ドメイン抗体配列、詳細にはヒトＴＮＦ−α及びＶＥＧＦに対して特異的な配列、より詳細には本明細書に記載されている単一ドメイン抗体配列のいずれかを含むことが可能である。他の実施形態において、Ｃκ又はＣλ軽鎖定常領域を使用することが可能であり、ＩｇＧ１以外のＩｇＧ重鎖定常領域を使用することも可能である。
関節炎のＴｇ１９７遺伝子組換えマウスモデルのマウスに単量体として投与されると関節炎スコアの増加を防止する単一領域抗ＴＮＦ−α抗体クローンと、コラーゲン誘発関節炎マウスモデルのマウスに単量体として投与されると関節炎スコアの増加を防止する単一領域抗ＶＥＧＦ抗体クローンとを含むこの種の構築物も包含される。さらなる実施形態において、使用される単一ドメイン抗体ＴＮＦ−α抗体クローンは、単量体として使用されると、本明細書に記載されているＬ９２９細胞傷害性試験におけるＴＮＦ−αを中和し、使用される単一領域抗ＶＥＧＦ抗体クローンは、単量体として使用されると、本明細書に記載されているようにＶＥＧＦ受容体２結合の試験におけるＶＥＧＦ受容体結合に拮抗する。さらなる実施形態において、使用される単一ドメイン抗体クローンは、１００ｎＭ未満のＫｄでそれぞれの抗原又はエピトープを結合する。さらなる実施形態において、二重特異性二価構築物は、１００ｎＭ未満のＫｄでそれぞれの抗原又はエピトープを結合し、本明細書に記載されているＴｇ１９７及びＣＩＡモデルのいずれか又は双方における関節炎スコアの増加を防止する。
当該四価二重特異性構築物を、投与、用量及び効力のモニタリングの観点で、本明細書に記載されている他の構築物と同様にして関節リウマチの治療に使用することが可能である。例えば、ＰＥＧ成分を添加することによって、又は循環半減期を増加させるタンパク質、例えばＨＳＡの如き血清タンパク質に特異的な結合成分（例えばさらなる単一ドメイン抗体）をさらに融合させることによって、上述したように構築物の半減期を変更することが可能である。
次いで、一態様において、ＴＮＦ−αを結合する第１の抗体単一領域ポリペプチドと、ＶＥＧＦを結合する第２の抗体単一領域ポリペプチドとを含む二重特異性抗原結合ポリペプチドが記載される。当該ポリペプチドを、例えば、関節リウマチの治療に使用することが可能である。
次いで、他の態様において、ａ）ＩｇＧ重鎖定常領域に融合した、第１のエピトープを結合する単一ドメイン抗体ポリペプチドを含む第１の融合タンパク質の第１の複製物と、ｂ）前記第１の融合タンパク質の第２の複製物と、ｃ）軽鎖定常領域に融合した、第２のエピトープを結合する単一ドメイン抗体ポリペプチドを含む第２の融合タンパク質の第１の複製物と、ｄ）前記第２の融合タンパク質の第２の複製物とを含み、前記第１の融合タンパク質の前記第１及び前記第２の複製物は、それぞれのＩｇＧ重鎖定常領域を介して互いにジスルフィド結合され、前記第２の融合タンパク質の前記第１の複製物の前記軽鎖定常領域は、前記第１の融合タンパク質の前記第１の複製物のＩｇＧ重鎖定常領域にジスルフィド結合され、前記第２の融合タンパク質の前記第２の複製物の前記軽鎖定常領域は、前記第１の融合タンパク質の前記第２の複製物のＩｇＧ重鎖定常領域にジスルフィド結合され、前記ポリペプチド構築物は、前記第１及び前記第２のエピトープを結合する四価二重特異性抗原結合ポリペプチド構築物が記載される。
当該四価二重特異性抗原結合ポリペプチド構築物の一実施形態において、第１のエピトープを結合する単一ドメイン抗体は、ＶＨ及びＶＬから選択されるＶ領域である。
他の実施形態において、第２のエピトープを結合する単一ドメイン抗体は、ＶＨ及びＶＬから選択されるＶ領域である。
他の実施形態において、ＩｇＧ重鎖定常領域は、ＩｇＧ１重鎖定常領域である。
他の実施形態において、軽鎖定常領域は、Ｃκ又はＣλ軽鎖定常領域である。他の実施形態において、軽鎖定常領域は、Ｃκ軽鎖定常領域である。
他の実施形態において、第１及び第２のエピトープは、同一の抗原に存在する。
他の実施形態において、第１及び第２のエピトープは、異なる第１及び第２の抗原に存在する。
他の実施形態において、第１のエピトープを結合する前記単一ドメイン抗体、及び第２のエピトープを結合する前記単一ドメイン抗体の一方又は双方は、ヒト単一ドメイン抗体である。
他の実施形態において、前記第１のエピトープを結合する単一ドメイン抗体ポリペプチド、及び／又は前記第２のエピトープを結合する単一ドメイン抗体ポリペプチドは、ヒト生殖系列ＶＨ遺伝子配列によってコードされたＦＷ１、ヒト生殖系列ＶＨ遺伝子配列によってコードされたＦＷ２、ヒト生殖系列ＶＨ遺伝子配列によってコードされたＦＷ３、及びヒト生殖系列ＶＨ遺伝子配列によってコードされたＦＷ４のいずれかを含む。
他の実施形態において、第１のエピトープを結合する単一ドメイン抗体ポリペプチドと、第２のエピトープを結合する単一ドメイン抗体の双方がヒト単一ドメイン抗体である。
他の実施形態において、ＩｇＧ重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ重鎖定常領域である。
他の実施形態において、ＩｇＧ重鎖定常領域は、ＣＨ１領域を含む。
他の実施形態において、軽鎖定常領域は、Ｃκ軽鎖定常領域である。
他の実施形態において、構築物は、ＴＮＦ−α及びＶＥＧＦを結合する。他の実施形態において、ＶＥＧＦを結合する単一ドメイン抗体は、ＩｇＧ１重鎖定常領域に融合され、ＴＮＦ−αを結合する単一ドメイン抗体は、Ｃκ軽鎖定常領域に融合される。
他の実施形態において、ＶＥＧＦを結合する単一ドメイン抗体は、コラーゲン誘発関節炎マウスモデルのマウスに投与されると関節炎スコアの増加を防止する。
他の実施形態において、ヒトＶＥＧＦの活性に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド成分は、１００ｎＭ未満のＫｄでヒトＶＥＧＦを結合する。
他の実施形態において、ヒトＶＥＧＦの活性に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド成分は、ＶＥＧＦ受容体１試験又はＶＥＧＦ受容体２試験で測定されるヒトＶＥＧＦを中和する。
他の実施形態において、ヒトＶＥＧＦの活性に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド成分は、細胞表面受容体に結合されたヒトＶＥＧＦに対して特異的に結合する。
本態様の他の実施形態において、ＴＮＦ−αを結合する、又はヒトＴＮＦ−αの活性に拮抗する単一ドメイン抗体は、関節炎のＴｇ１９７遺伝子組換えマウスモデルのマウスに投与されると関節炎スコアの増加を防止する。他の実施形態において、単一ドメイン抗体は、標準的なＬ９２９細胞傷害性試験で測定されるヒトＴＮＦ−αを中和する。他の実施形態において、単一ドメイン抗体は、１００ｎＭ未満のＫｄでヒトＴＮＦ−αを結合する。
本態様の任意の実施形態において、ヒトＴＮＦ−αの活性に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド成分は、例えば、クローン
Figure 2013056890
からなる群から選択される抗体ポリペプチドのＣＤＲ３のアミノ酸配列、又は前記配列に対して例えば少なくとも８５％、或いは少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことが可能である。
本態様の他の実施形態において、ヒトＴＮＦ−αの活性に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド成分は、例えば、クローン
Figure 2013056890
からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又は前記配列に対して例えば少なくとも８５％、或いは少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことが可能である。
本態様の任意の実施形態において、ヒトＶＥＧＦのＶＥＧＦ受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド成分は、例えば、クローン
Figure 2013056890
からなる群から選択される抗体ポリペプチドのＣＤＲ３のアミノ酸配列、又は前記配列に対して例えば少なくとも８５％、或いは少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことが可能である。
本態様の他の実施形態において、ヒトＶＥＧＦのＶＥＧＦに対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド成分は、例えば、クローン
Figure 2013056890
からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又は前記配列に対して例えば少なくとも８５％、或いは少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことが可能である。
定義
特に指定のない限り、本明細書に用いられているすべての科学技術用語は、当業者に広く理解されているものと同じ意味を有する（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術及び生化学）。分子、遺伝子及び生化学的方法（概して、参照により本明細書に組み込まれているＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ、第２版。（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；及びＡｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）、第４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、並びに化学的方法に標準的な技術が用いられている。
本明細書に用いられているように、「領域」という用語は、タンパク質の残りの部分から独立してその三次構造を保持する折りたたみタンパク質を意味する。概して、領域は、タンパク質の個々の機能特性に係わり、多くの場合、タンパク質の残りの部分及び／又は領域の機能を失うことなく、他のタンパク質に対して添加、除去又は転写されうる。
「単一免疫グロブリン可変領域」又は「単一ドメイン抗体ポリペプチド」とは、免疫グロブリン可変領域に特徴的な配列を含み、抗原を特異的に結合する（すなわち解離定数が５００ｎＭ以下である）折りたたみポリペプチド領域を意味する。したがって、「単一ドメイン抗体ポリペプチド」は、完全抗体可変領域、並びに、例えば、１つ又は複数のループが、抗体可変領域に特徴的でない配列、或いは切断されているか、又はＮ−若しくはＣ−末端延長部を含む抗体可変領域で置換された修飾可変領域、並びに５００ｎｍ以下（例えば４５０ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３５０ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、２５０ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１５０ｎＭ以下、１００ｎＭ以下）の解離定数、及び全長領域の標的抗原特異性を保持する可変領域の折りたたみ断片を含む。好ましくは、抗体単一可変領域は、Ｖｋａｐｐａ及びＶｌａｍｂｄａを含むＶＨ及びＶＬからなる群から選択される。
「単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物」という語句は、単離された単一ドメイン抗体ポリペプチドのみならず、単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチド配列の１つ又は複数の単量体を含むより大きいポリペプチド構築物をも包含する。より大きい構築物の一部である単一ドメイン抗体ポリペプチドは、独自に、標的抗原を特異的に結合することが可能であることが強調される。したがって、２つ以上の単一ドメイン抗体ポリペプチドを含む単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、例えば、単一抗原分子を特異的に結合するのに必要な結合部位を形成するのにＶＨ及びＶＬ領域がともに必要とされる構築物を包含しない。単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物における単一ドメイン抗体ポリペプチド環の結合は、ペプチド又はポリペプチド結合、或いは多価ＰＥＧに対するポリペプチド単量体の結合を介する等の他の化学結合でありうる。結合された単一ドメイン抗体ポリペプチドは、同一又は異なっていることが可能であり、構成ポリペプチドの標的特異性も同様に同一又は異なっていることが可能である。
相補的：２つの免疫グロブリン領域は、同族対又はグループを形成する構築物のファミリーに属する、或いは当該ファミリーから誘導され、この特徴を保持する場合は、「相補的」である。例えば、抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域は相補的であり、２つのＶＨ領域は相補的でなく、２つのＶ領域は相補的でない。相補的領域は、Ｔ細胞受容体のＶα及びＶβ（又はＶγ及びＶδ）領域の如き免疫グロブリンスーパーファミリーの他のメンバーに見い出すことができる。本発明の第２の構成の範囲において、被相補的領域は、標的分子を協同的に結合しないが、同一又は異なる分子に存在しうる異なる標的エピトープに対して独立的に作用する。エピトープを結合するように設計されなければエピトープを結合しないタンパク質骨格に基づく領域の如き人工的な領域は、非相補的である。同様に、（例えば）免疫グロブリン領域及びフィブロネクチン領域に基づく２つの領域は相補的でない。
免疫グロブリン：これは、２つのβシート、及び通常は保存ジスルフィド結合を含む、抗体分子の免疫グロブリン折りたたみ特性を保持するポリペプチドのファミリーを意味する。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーは、免疫系における広範な役割（例えば抗体及びＴ細胞受容体分子）、細胞接着への関与（例えばＩＣＡＭ分子）及び細胞内シグナル伝達（例えばＰＤＧＦ受容体の如き受容体分子）を含むインビボの細胞及び非細胞相互作用の多くの態様に関与する。
本発明は、結合領域を保有するすべての免疫グロブリンスーパーファミリー分子に適用可能である。好ましくは、本発明は、抗体に関する。
結合：本発明による可変領域を結合させて、領域のグループを形成する。例えば、ＶＬ領域をＶＨ領域に結合させる等、相補的領域を結合させることができる。非相補的領域を結合させることもできる。共有又は非共有結合手段による領域の結合を含む、いくつかの方法で領域を結合させることができる。
閉鎖構造多重特異性リガンド：この語句は、本明細書において考えられている少なくとも２つのエピトープ結合領域を含む、本明細書に定義されている多重特異性リガンドを記述する。「閉鎖構造」（多重特異性リガンド）という用語は、１つのエピトープ結合領域によるエピトープ結合が、他のエピトープ結合領域によるエピトープ結合と競合するように、リガンドのエピトープ結合領域が構成されることを意味する。すなわち、同族エピトープを各エピトープ結合領域により個別に結合させることができるが、同時に結合させることはできない。リガンドの閉鎖構造は、本明細書に記載されている方法を用いて達成されうる。
抗体：抗体を自然に生成する任意の種から誘導される、又は組換えＤＮＡ技術によって作成される、或いは血清、Ｂ細胞、雑種細胞、トランスフェクト細胞、酵母又は細菌から単離される抗体（例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥ）又は断片（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、閉鎖構造多重特異性抗体、ジスルフィド結合ｓｃＦｖ、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）等）。
二重特異性リガンド：本明細書に定められている第１の免疫グロブリン単一可変領域及び第２の免疫グロブリン単一可変領域を含むリガンドであって、それらの可変領域は、一特異性免疫グロブリンによって通常は結合されない同一抗原上の２つの異なる抗原又は２つのエピトープに結合することが可能であるリガンド。例えば、２つのエピトープは、同一のハプテンに存在しうるが、同一のエピトープに存在せず、また一特異性リガンドによって結合されるほど近接していない。本発明による二重特異性リガンドは、異なる特異性を有する可変領域で構成され、同一の特異性を有する互いに相補的な可変領域対を含まない。
抗原：本発明によるリガンドによって結合される分子。典型的には、抗原は、抗体リガンドによって結合され、インビボで抗体応答を高めることが可能である。それは、ポリペプチド、タンパク質、核酸又は他の分子であってもよい。一般的には、本発明による二重特異性リガンドは、特定の抗原に対する標的特異性について選択される。従来の抗体及びその断片の場合は、可変ループによって定められる抗体結合部位（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＨ１、Ｈ２、Ｈ３）は、抗体に結合することが可能である。
エピトープ：従来免疫グロブリンＶＨ／ＶＬ対によって結合される構造の単位。エピトープは、抗体に対する最小結合部位を定め、抗体の特異性の標的を表す。単一ドメイン抗体の場合は、エピトープは、個別に可変領域によって結合される構造の単位を表す。
汎用リガンド：レパートリーのすべてのメンバーに結合するリガンド。一般には、上記に定めた抗原結合部位を介して結合しない。非限定的な例としては、タンパク質Ａ、タンパク質Ｌ及びタンパク質Ｇが挙げられる。
選択：スクリーニングによって誘導される、或いは結合相互作用が領域と抗原若しくはエピトープ、又は抗体と抗原若しくはエピトープの間で行われるダーウィン選択プロセスによって誘導される。したがって、第１の可変領域は、相補的可変領域の存在下又は不在下での抗原又はエピトープに結合について選択されうる。
ユニバーサルフレームワーク：Ｋａｂａｔ（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、米国保健福祉省」によって定められた配列で保存される抗体の領域に対応する、或いはＣｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９１０−９１７によって定められているヒト生殖系列免疫グロブリンレパートリー又は構造に対応する単一抗体フレームワーク配列。本発明は、高頻度領域のみの変化を通じて実質的に任意の結合特異性の誘導を可能にすることが確認された単一フレームワーク、又は当該フレームワークの集合体の使用を提供する。
均一免疫試験：結合試薬と未結合試薬を分離する工程を必要とせずに検体を検出する免疫試験。
実質的に同一（又は「実質的に相同的」）：第１及び第２のアミノ酸又は核酸配列が類似の活性を有するように、第２のアミノ酸又はヌクレオチド配列に対する十分な数の同一又は同等の（例えば同様の側鎖を、例えば保存アミノ酸置換基を有する）アミノ酸残基又はヌクレオチドを含む第１のアミノ酸又はヌクレオチド配列。抗体の場合は、第２の抗体は、同じ結合特異性を有し、その親和性の少なくとも５０％を有する。
「領域抗体」又は「ｄＡｂ」は、その用語が本明細書に用いられているように、「単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチド」又は「単一ドメイン抗体ポリペプチド」と同等である。
本明細書に用いられているように、「特異的に結合する」という語句は、例えばＢＩＡｃｏｒｅ（商標）表面プラスモン共鳴システム及びＢＩＡｃｏｒｅ（商標）動力学的評価ソフトウェア（例えばバージョン２．１）を用いた表面プラスモン共鳴解析により測定される１μＭ以下の解離定数（Ｋｄ）での免疫グロブリン可変領域による抗原の結合を意味する。特異的結合相互作用に対するＫｄの親和性は、好ましくは約５００ｎＭ以下、より好ましくは約３００ｎＭ以下である。
本明細書に用いられているように、「高親和性結合」という用語は、１００ｎＭ以下のＫｄ以下の結合を意味する。
本明細書に用いられるように、「ヒト単一ドメイン抗体ポリペプチド」という語句は、ヒト生殖系列免疫グロブリンＶ領域から誘導された配列を有するポリペプチドを意味する。配列は、ヒト個体、又はクローン化ヒト抗体遺伝子配列（又はヒト抗体Ｖ領域遺伝子配列）のライブラリーから単離される場合、或いは次に所望の標的抗原に対する結合について選択される１つ又は複数の（無作為又は対象の変異誘発により）１つ又は複数の多様化された配列を精製するのにクローン化ヒト生殖系列Ｖ領域配列が使用された場合に、「ヒト生殖系列Ｖ領域から誘導」される。最小限、ヒト免疫グロブリン可変領域は、天然ヒト免疫グロブリン可変領域配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸類似性（例えば８７％、９０％、９３％、９５％、９７％、又は９９％以上の類似性を含む）を有する。
代替的に、又は加えて、「ヒト免疫グロブリン可変領域」は、４つのヒト免疫グロブリン可変領域フレームワーク領域（Ｗ１−ＦＷ４）（フレームワーク領域はＫａｂａｔら（１９９１、前出）によって記載されている通りである）を含む可変領域である。「ヒト免疫グロブリン可変領域フレームワーク領域」は、ａ）ヒトフレームワーク領域のアミノ酸配列と、ｂ）ヒトフレームワーク領域のアミノ酸配列の少なくとも８つの連続アミノ酸を含むフレームワーク領域とを包含する。ヒト免疫グロブリン可変領域は、ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによってデコードされた対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列と同一であるＦＷ１−ＦＷ４のアミノ酸配列を含むことができ、或いはＦＷ１−ＦＷ４配列が、ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによってデコードされた対応するフレームワーク領域のアミノ酸配列に対して、１０以下のアミノ酸配列差、９以下のアミノ酸配列差、８以下のアミノ酸配列差、７以下のアミノ酸配列差、６以下のアミノ酸配列差、５以下のアミノ酸配列差、４以下のアミノ酸配列差、３以下のアミノ酸配列差、２以下のアミノ酸配列差、又は１以下のアミノ酸配列差を一括して含む可変領域を含むこともできる。
本明細書に定められている「ヒト免疫グロブリン可変領域」は、可変領域が、単一免疫グロブリン可変領域として単独で存在しているか、或いは１つ又は複数のさらなるポリペプチド配列と結合して単一免疫グロブリン可変領域として存在しているかにかかわらず、独自に抗原を特異的に結合する能力を有する。「ヒト免疫グロブリン可変領域」は、その用語が本明細書に用いられているように、「ヒト化」免疫グロブリンポリペプチド、すなわちヒトにおいて免疫原生がより低くなるように定常領域が修飾されたヒト以外の（例えばマウス、ラクダ等の）免疫グロブリンを包含しない。
本明細書に用いられているように、「免疫グロブリン可変領域の配列特性」という語句は、免疫グロブリン可変領域配列に含まれる配列に対して、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、４５以上又は５０以上の連続アミノ酸にわたって相同的であるアミノ酸配列を意味する。
本明細書に用いられているように、「二価」という用語は、抗原結合抗体ポリペプチドが２つの抗原特異性結合部位を有することを意味する。抗原結合部位によって認識されるエピトープは、同一又は異なりうる。抗体ポリペプチドが、それぞれの２つの抗原特異性結合部位を介して（異なる抗原或いは同一の抗原に存在する）２つの異なるエピトープを結合するときは、抗体ポリペプチドは、「二重特異性である」と言われる。
本明細書に用いられているように、「四価」という用語は、抗原結合ポリペプチドが、４つの抗原特異性結合部位を有することを意味する。抗原結合部位によって認識されるエピトープは同一又は異なりうる。「二重特異性」四価抗体ポリペプチドは、１つのエピトープ又は抗原に対して２つの結合部位を有し、異なるエピトープ又は抗原に対して２つの結合部位を有する。
本明細書に用いられているように、「四価二重特異性抗原結合ポリペプチド構築物」は、重鎖及び軽鎖定常領域で結合された２つの抗原結合腕を有するという点において、天然ＩｇＧに類似した構造を有する。しかし、天然ＩｇＧとは異なり、各腕は、第１の抗原に特異的な抗原結合領域と第２の抗原に特異的な抗原結合領域の２つの抗原結合領域を有する。本明細書に記載されている四価二重特異性抗原結合ポリペプチド構築物において、抗原結合領域の各々は、単一ドメイン抗体である。すなわち、抗原結合領域は、互いに対合して、例えばｓｃＦｖｓのように単一結合部位を形成しない。
本明細書に用いられているように、「ＩｇＧ形式」という用語は、構築物が、互いに会合する重鎖及び軽鎖定常領域で結合された２つの抗原結合腕を有するという点において天然ＩｇＧに類似した構造を有する人工の抗原結合ポリペプチドを意味する。本明細書に記載されているように、ＩｇＧ形式における抗原結合ポリペプチドは、ＩｇＧ重鎖定常領域（例えばＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）に融合される、第１の抗原又はエピトープを結合する単一ドメイン抗体ポリペプチドを含む第１の融合タンパク質の２つの複製物と、軽鎖定常領域（例えばＣλ又はＣκ）に融合される、第２の抗原に結合する単一ドメイン抗体ポリペプチドを含む第２の融合タンパク質の２つの複製物との４つのポリペプチド鎖で構成される。この形式において、細胞で共発現されると、重鎖定常領域は互いにジスルフィド結合し、これらの重鎖定常領域の各々も軽鎖定常領域にジスルフィド結合する。ＩｇＧ形式における抗原結合ポリペプチドは、その用語が本明細書に用いられているように四価である。定常領域に融合された単一ドメイン抗体を、異なる抗体を結合する（例えば重鎖定常領域に融合されたｄＡｂ１が１つの抗原を結合し、軽鎖定常領域に融合されたｄＡｂ２が他の抗原を結合する）ように、又は同一の抗原上の異なるエピトープを結合する（例えば重鎖定常領域に融合されたｄＡｂ１が抗原上の１つのエピトープを結合し、軽鎖定常領域に融合されたｄＡｂ２が同一の抗原上の他のエピトープを結合する）ように選択することが可能であり、或いはすべての４つの領域が同一抗原上の同一のエピトープを結合する（ｄＡｂ１及びｄＡｂ２が同一抗原上の同一エピトープを結合する）ことが可能である。
本明細書に記載されているように、「Ｆａｂ形式」とは、１つの単一ドメイン抗体が軽鎖定常領域ＣＬ（例えばＣλ又はＣκ）に融合され、他の単一ドメイン抗体は、ＣＨ１定常領域に融合され、それぞれのＣＨ１及びＣＬ定常領域が互いにジスルフィド結合する二価抗体ポリペプチド構築物を意味する。単一ドメイン抗体を、（二重特異性Ｆａｂ形式を生成する）異なる抗体、（二重特異性の）同一抗原上の異なるエピトープ、又は同一抗原上の同一エピトープを結合するように選択することが可能である。Ｆａｂ形式二重特異性抗体ポリペプチドの例は、例えば、例えばＣλ軽鎖に融合される、本明細書に記載されている抗ＴＮＦ−α単一ドメイン抗体、及び２つの融合タンパク質がそれぞれの定常領域を介して互いにジスルフィド結合される、ヒト重鎖ＣＨ１定常領域に融合される、本明細書に記載されている抗ＶＥＧＦ単一ドメイン抗体を含む。この形式の抗体ポリペプチド構築物において、抗原結合領域は、互いに対合して、例えばｓｃＦｖｓのように単一結合部位を形成せず、各単一ドメイン抗体は、独自に抗原を結合して、構築物を二価にすることが可能である。
「関節リウマチ」（ＲＡ）とは、関節及び／又は他の内臓の内表面の炎症を含む疾病を意味する。ＲＡは、典型的には、多くの異なる関節に影響を与える。それは、典型的には慢性であり、再発の疾病でありうる。ＲＡは、身体全体に影響を与える疾病であり、関節炎の最も一般的な形態の１つである。ＲＡは、疼痛、こわばり、温感、発赤及び腫脹を引き起こす、関節の内面を覆う膜の炎症によって特徴付けられる。炎症を起こした関節内表面、すなわち滑膜は、硬骨及び軟骨を犯し、損傷させうる。炎症性細胞は、硬骨及び軟骨を消化しうる酵素を放出する。影響を受けた関節は、その形及びアラインメントを失い、疼痛及び運動の低下がもたらされる。症状としては、関節の炎症、腫脹、及び運動難及び疼痛が挙げられる。他の症状としては、食欲の低下、発熱、活力喪失、貧血が挙げられる。他の特徴としては、圧力を受ける部分（例えば肘の裏）の皮膚の下の瘤（リウマチ瘤）が挙げられる。関節リウマチは、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，６９８，１９５号に記載されているようないくつかの臨床的に承認された基準に基づいて臨床的に採点される。手短に言えば、臨床応答試験は、以下のパラメータを評価することが可能である。
１．圧痛関節の数及び疼痛／圧痛の評価
以下の採点法が用いられる。
０＝疼痛／圧痛がない
１＝軽度の疼痛。患者は、質問されると圧痛があると言う。
２＝中等度の疼痛。患者は、圧痛があると言い、ひるむ。
３＝重度の疼痛。患者は、圧痛があると言い、ひるみ、引っ込める。
２．腫脹関節の数
圧痛及び腫脹が、関節毎に個別的に評価される。
３．朝のこわばりの持続時間（分）
４．握力
５．目視アナログ疼痛基準（０〜１０ｃｍ）
６．患者、及びブラインドされた評価者は、薬物に対する臨床的応答を評価するように依頼される。臨床的応答は、以下の主観的採点システムを用いて評価される。
５＝優れた応答（見込まれる最良の応答）
４＝良好な応答（見込まれる最良の応答より劣る）
３＝適正な応答（確実に改善されているが、さらに改善されうる）
２＝応答なし（効果なし）
１＝悪化している（疾病の悪化）
関節リウマチの原因はまだ知られていない。しかし、ＲＡは、免疫系が健康な関節組織を攻撃し、炎症及びそれに続く関節損傷を引き起こす自己免疫疾患である。ＲＡを抱える多くの人は、ＨＬＡ−ＤＲ４と呼ばれる一定の遺伝子マーカーを有する。
本明細書に用いられるように、「ＴＮＦ−α関連疾患」という語句は、単独又は他の治療と組み合わせた、ＴＮＦ−αの機能を中和する、又はそれに拮抗する薬剤の投与が、当該疾患を治療するのに有効である疾病又は疾患を意味する（「治療」という用語は本明細書に定められている通りである）。
本明細書に用いられているように、「治療する」又は「治療」という用語は、疾病又は疾病の症状の発症の防止、疾病又は疾病の症状の進行の抑制、或いは疾病又は疾病症状の転換を意味する。
本明細書に記載されているように、「疾病の発症の防止」という語句は、所定の疾病、例えば関節リウマチの１つ又は複数の症状又は測定可能なパラメータが、当該疾病にかかりやすい個体に生じるものではないことを意味する。
本明細書に記載されているように、「疾病の進行の抑制」という語句は、薬剤による治療が、当該治療の存在しない場合の進行に比べて、治療されている個体に既に現れている疾病の症状の重さの増加を停止又は緩めることを意味する。
本明細書に記載されているように、「疾病の転換」という語句は、疾病の１つ又は複数の症状又は測定可能なパラメータが、薬剤の投与後に、当該投与の前の症状又はパラメータに比べて、改善されることを意味する。症状又は測定可能なパラメータの「改善」は、当該測定可能なパラメータの統計的に有意な、好ましくは少なくとも１０％の有意な差によって証明される。
測定可能なパラメータは、直接測定可能なパラメータ、並びに間接的に測定可能なパラメータの双方を含むことができる。直接測定可能なパラメータの非限定的な例としては、関節サイズ、関節可動度、関節炎及び組織病理学的スコア又は指標、及びサイトカインの如き指示体の血清レベルが挙げられる。間接的に測定可能なパラメータとしては、例えば、移動についての不快感又は低下に対する患者の自覚、或いは疾病の重度を評価するための臨床的に承認された基準が挙げられる。
本明細書に用いられているように、パラメータ、例えば関節炎スコア又は他の測定可能なパラメータの「増加」は、そのパラメータの統計的に有意な増加を意味する。或いは、「増加」は、少なくとも１０％の増加を意味する。同様に、当該パラメータの「減少」は、パラメータの統計的に有意な減少、或いは少なくとも１０％の減少を意味する。
本明細書に用いられているように、「拮抗する」という用語は、薬剤が活性に干渉することを意味する。活性が例えばＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ又は他の生物学的に活性を有する分子又はサイトカインである場合には、その用語は、非限定的な例として、受容体に対する結合又は相互作用（インビトロ又は培養における細胞表面、或いはインビボ）、細胞内シグナル伝達、細胞傷害性、マイトジェネシス、或いは分子又はサイトカインに媒介される他の下流効果又はプロセス（例えば遺伝子活性化）を含む分子又はサイトカインの活性の（少なくとも１０％の）抑制を包含する。拮抗することは、因子、例えばＴＮＦ、ＶＥＧＦ等による受容体結合への干渉、並びに因子が細胞表面受容体に結合する場合の因子の活性への干渉を包含する。
本明細書に用いられているように、「以上」という用語は、ある値が他の値に等しいか、又は統計的に有意に（ｐ＜０．１、好ましくはｐ＜０．０５、より好ましくはｐ＜０．０１で）その値より大きいことを意味する。例えば疾病治療、又は受容体結合に対する拮抗においてある組成物の効果を他の組成物の効果と比較する場合には、その比較を等モルで行うべきである。
本明細書に用いられているように、「結合された」とは、ＰＥＧの如きポリマー成分の抗体ポリペプチド、例えば本明細書に記載されている単一ドメイン抗体のアミノ酸残基に対する結合を意味する。単一ドメイン抗体の如き抗体ポリペプチドのアミノ酸残基へのＰＥＧポリマーの結合は、「ＰＥＧ化」と称し、Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）活性エステル、プロピオン酸スクシンイミジル（ＳＰＡ）、マレイミド（ＭＡＬ）、スルホン酸ビニル（ＶＳ）又はチオールを含むが、それらに限定されないいくつかのＰＥＧ結合成分を使用して達成されうる。ＰＥＧポリマー又は他のポリマーを所定の位置で抗体ポリペプチドに結合することができ、或いは抗体分子に無作為に結合することができる。しかし、ＰＥＧポリマーを所定の位置において抗体ポリペプチドに結合させることが好ましい。ＰＥＧポリマーを抗体ポリペプチドにおける任意の残基に結合させることができるが、ポリマーは、抗体ポリペプチドに自然に発生する、又は例えば抗体ポリペプチドにおける天然残基のシステイン又はリジンへの変異誘発により抗体ポリペプチドに組み換えられたリジン又はシステインに結合される。本明細書に用いられているように、「結合される」とは、二量体、三量体、四量体又は他の多量体を形成する２つ以上の抗体単一可変領域単量体の会合を意味することもできる。ｄＡｂ単量体を融合タンパク質として発現させること、単量体間のペプチドリンカーを介して２つ以上の単量体を結合させること、或いは翻訳後の単量体をジスルフィド結合、又はジ、トリ又は多価結合成分（例えばマルチアームＰＥＧ）に対する結合により互いに直接又はリンカーを通じて化学的に結合させることを含むが、それらに限定されない当該技術分野で知られているいくつかの方法によって、ｄＡｂ単量体を結合させて、多量体を形成することが可能である。
本明細書に用いられているように、抗体ポリペプチド、例えば単一可変領域ポリペプチドに対して「直接結合される」ポリマーに関する「直接結合される」という語句は、本来は可変領域の一部である、例えば定常領域、ヒンジ領域又はリンカーペプチドに含まれない残基にポリマーが結合される状況を意味する。逆に、本明細書に用いられているように、抗体ポリペプチドに「直接結合される」という語句は、自然に発生する可変領域の一部である（例えばヒンジ領域に結合されうる）アミノ酸残基にポリマーが結合しない抗体単一可変領域に対するポリマー分子の結合を意味する。ポリマーは、結合ペプチドを介して抗体ポリペプチドに結合する場合は「間接的に結合」される。すなわち、ポリマーは、抗体自体の一部であるアミノ酸残基に結合されない。或いは、ポリマーは、ポリペプチドのＣ末端ヒンジに結合される場合は抗体ポリペプチドに「間接的に結合」され、或いは抗体ポリペプチドの一部として存在しうる定常領域の任意の残基に結合される。
本明細書に用いられているように、「相同性」又は「類似性」という用語は、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列が構造的に互いに類似している度合いを意味する。本明細書に用いられているように、配列「類似性」とは、アミノ酸配列が、配列のアラインメントにおける対応する位置で類似したアミノ酸残基を共有する度合いの尺度である。アミノ酸は、それらの側鎖が類似している場合に互いに類似する。具体的には、「類似性」は、互いに保存的置換体であるアミノ酸を包含する。「保存的」置換は、ｂｌｏｓｕｍ６２置換行列（Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｔｉｋｏｆｆ、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９）において正のスコアを有する任意の置換である。「配列Ａは配列Ｂに対してｎ％の類似性を有する」という表現により、配列ＡとＢの間の最適グローバルアラインメントの位置のｎ％が同一のアミノ酸又は保存的置換からなる。最適グローバルアラインメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアラインメントアルゴリズムにおける以下のパラメータを用いて実現されうる。
ポリペプチドについて：
置換行列：ｂｌｏｓｕｍ６２。
ギャップスコアリング関数：−Ａ −Ｂ＊ＬＧ（ただし、Ａ＝１１（ギャップペナルティ）、Ｂ＝１（ギャップ長ペナルティ）、ＬＧはギャップの長さである）。
ヌクレオチド配列について：
置換行列：一致の場合は１０、不一致の場合は０。
ギャップスコアリング関数：−Ａ −Ｂ＊ＬＧ（ただし、Ａ＝５０（ギャップペナルティ）、Ｂ＝３（ギャップ長ペナルティ）、ＬＧはギャップの長さである）。
典型的な保存的置換は、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びｌｌｅの間；Ｓｅｒ及びＴｈｒの間；残基Ａｓｐ、Ｇｌｕ及びＡｓｎの間；残基Ｇｌｎ、Ｌｙｓ及びＡｒｇの間；又は芳香族残基Ｐｈｅ及びＴｙｒにある。
本明細書に用いられているように、２つの配列は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、又はＴａｔｕｓｏｖａ ＆ Ｍａｄｄｅｎ、１９９９、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０に記載されている「ＢＬＡＳＴ２配列」を用いて配列されたときに互いに少なくとも８５％の同一性を有する場合に互いに「相同」又は類似している。アミノ酸配列が、「ＢＬＡＳＴ２配列アルゴリズム」を用いて配列される場合には、Ｂｌｏｓｕｍ６２行列はデフォルト行列になる。
「同一性」は、当該技術分野で知られているように、配列を比較することによって判断された場合における２つ以上のポリペプチド配列又は２つ以上のポリヌクレオチド配列の関係である。当該技術分野では、「同一性」は、状況に応じて、配列の列の間の一致によって判断された場合におけるポリペプチド又はポリペプチド配列同士の配列関係の度合いをも意味する。同一性百分率は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ、Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ 、Ｐａｒｔ Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１；Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．、４８：１０７３（１９８８）に記載されている方法を含むが、それらに限定されない知られている方法によって容易に計算することが可能である。同一性を求めるための好ましい方法は、試験される配列間の最も高い一致を与えるように設計される。同一性を求めるための方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムで編纂される。２つの配列間の同一性百分率を求めるための好ましいコンピュータプログラム法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）が挙げられるが、それらに限定されない。ＢＬＡＳＴ Ｘプログラムは、ＮＣＢＩ及び他の出典（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、ＮＣＢＩＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））から公的に入手可能である。例示として、「配列番号Ａ」の基準ヌクレオチドに対して少なくとも例えば９５％「同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、そのポリヌクレオチド配列が、「配列番号Ａ」の基準ヌクレオチド配列の１００のヌクレオチド毎に５つまでの点変異を含むことができるという点を除いては、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は基準配列と同一であることを意味する。換言すれば、基準ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、基準配列におけるヌクレオチドの５％までを除去するか、又は他のヌクレオチドで置換することができ、或いは基準配列における全ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドを基準配列に挿入することができる。これらの基準配列の変異は、基準ヌクレオチド配列の５又は３末端位置、或いは基準配列におけるヌクレオチドの間に個々に散在した、又は基準配列内の１つ又は複数の連続的なグループ内に散在したそれらの末端位置の間のどこかで発生しうる。同様に、「配列番号Ｂ」の基準アミノ酸配列に対して少なくとも例えば９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、そのポリペプチド配列が、「配列番号Ｂ」の基準アミノ酸の１００のアミノ酸毎に５つまでのアミノ酸変性物を含むことができるという点を除いては、そのポリペプチドのアミノ酸配列は基準配列と同一であることを意味する。換言すれば、基準アミノ酸配列に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを得るために、基準配列におけるアミノ酸残基の５％までを除去するか、又は他のアミノ酸で置換することができ、或いは基準配列における全アミノ酸残基の５％までの数のアミノ酸を基準配列に挿入することができる。これらの基準配列の変性は、基準アミノ酸配列のアミノ又はカルボキシ末端位置、或いは基準配列における残基の間に個々に散在した、又は基準配列内の１つ又は複数の連続的なグループ内のそれらの末端位置の間のどこかで発生しうる。
本明細書に記載されているように、「低厳密性」、「中厳密性」、「高厳密性」又は「極めて高厳密性条件」という用語は、核酸ハイブリダイゼーション及び洗浄のための条件を示す。ハイブリダイゼーション反応を実施するための指針は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６．３．１−６．３．６に見い出すことができる。水性及び非水性法は、その参考文献に記載されており、いずれも用いることができる。本明細書で参照される具体的なハイブリダイゼーション条件は以下の通りである。（１）約４５℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）に浸した後に、少なくとも５０℃にて０．２×のＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２回洗浄する低厳密性ハイブリダイゼーション条件（低厳密性条件では洗浄の温度を５５℃まで上げることが可能である）。（２）約４５℃で６×のＳＳＣに浸した後に、約６０℃にて０．２×のＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１回又は複数回洗浄する中厳密性ハイブリダイゼーション条件。（３）約４５℃で６×のＳＳＣに浸した後に、６５℃にて０．２×のＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１回又は複数回洗浄する高厳密性ハイブリダイゼーション条件。そして好ましくは（４）極めて高厳密性ハイブリダイゼーション条件は、６５℃で０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳに浸した後に、６５℃にて０．２×のＳＳＣ、１％ＳＤＳで１回又は複数回洗浄するものである。
本明細書に用いられているように、「の濃度で」という語句は、所定のポリペプチドを単位体積当たり記載の質量又はモル量で溶液（好ましくは水溶液）に溶解することを意味する。したがって、「×の濃度で」又は「少なくとも×の濃度で」存在するポリペプチドは、ポリペプチドの乾燥調製物及び結晶化調製物を除く。
本明細書に用いられているように、「レパートリー」という用語は、多様な変異体、例えば、その一次配列が異なるポリペプチド変異体の集合体を意味する。本発明に用いられるライブラリーは、少なくとも１０００のメンバーを含むポリペプチドのレパートリーを包含することになる。
本明細書に用いられているように、「ライブラリー」という用語は、異種のポリペプチド又は核酸の混合物を意味する。ライブラリーは、それぞれが単一ポリペプチド又は核酸配列を有するメンバーからなる。この限りでは、ライブラリーは、レパートリーと同義である。ライブラリーメンバーの間の配列差は、ライブラリーに存在する多様性の原因になっている。ライブラリーは、ポリペプチド又は核酸の単純な混合物の形をとることもできるし、核酸のライブラリーで形質転換された例えば細菌、ウィルス、動物及び植物細胞等の生物又は細胞の形をとることもできる。それぞれの個別的な生物又は細胞は、１つ又は限定された数のライブラリーメンバーを含むのが好ましい。有利には、核酸でコードされたポリペプチドの発現を可能にするために、核酸が発現ベクターに組み込まれる。したがって、好ましい態様において、ライブラリーは、その対応するポリペプチドメンバーを生成するように発現することが可能である核酸形態のライブラリーの単一メンバーを含む発現ベクターの１つ又は複数の複製物をそれぞれ含む宿主生物の集団の形をとることができる。したがって、その宿主生物の集団は、遺伝的に多様なポリペプチド変異体の大きなレパートリーをコードする潜在性を有する。
本明細書に用いられているように、「ポリマー」とは、繰返し単量体単位で構成された巨大分子を意味し、場合によっては置換された直鎖又は枝分れ鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレン若しくはポリオキシアルキレンポリマー、又は枝分れ又は非枝分れ多糖類の如き非合成又は天然ポリマーを意味しうる。本明細書に用いられている「ポリマー」とは、具体的には、場合によっては置換又は枝分れ鎖ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）又はポリ（ビニルアルコール）及びそれらの誘導体を意味する。
本明細書に用いられているように、「ＰＥＧ」又は「ＰＥＧポリマー」は、ポリエチレングリコールを意味し、より具体的には、プロピオン酸スクシンイミジルの如きＰＥＧのＮ−ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）活性エステル、ベンゾトリアゾール活性エステル、マレイミド、ビニルスルホン又はチオール基で誘導体化されたＰＥＧを含むが、それらに限定されないＰＥＧの誘導体化形態を意味しうる。特定のＰＥＧ配合物は、ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳ、ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−ＮＨＳ、ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳ、ＰＥＧ−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨＳ、ＰＥＧ−Ｏ２ＣＮＨ−ＣＨ（Ｒ）−ＣＯ２−ＮＨＳ、ＰＥＧ−ＮＨＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨＳ、及びＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳ（ただし、Ｒは（ＣＨ２）４）ＮＨＣＯ２（ｍＰＥＧ）である）を含むことができる。本発明に有用なＰＥＧポリマーは、線形分子であってもよいし、多数のＰＥＧ成分が単一ポリマー内に存在する枝分れ分子であってもよい。本発明に有用であるいくつかの特に好ましいＰＥＧ構造としては、以下の構造が挙げられるが、それらに限定されない。
Figure 2013056890
本明細書に用いられているように、「スルフヒドリル選択性試薬」は、ＰＥＧポリマーをチオール含有アミノ酸に結合させるのに有用な試薬である。アミノ酸残基システイン上のチオール基は、スルフヒドリル選択性試薬との相互作用に特に有用である。本発明に有用であるスルフヒドリル選択性試薬としては、マレイミド、ビニルスルホン及びチオールが挙げられるが、それらに限定されない。システイン残基に対する結合のためのスルフヒドリル選択性試薬の使用は、当該技術分野で知られており、本発明により必要に応じて改造されうる（例えばＺａｌｉｐｓｋｙ、１９９５、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．６：１５０；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、２０００、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．１７：１０１；Ｈｅｒｍａｎら、１９９４、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１９５：２０３参照）。
本明細書に用いられているように、「抗原」という用語は、抗体又は抗体の結合領域（例えば可変領域）によって結合される分子を意味する。典型的には、抗原は、インビボで抗体応答を引き起こすことが可能である。抗原は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物又は他の分子でありうる。一般に、免疫グロブリン可変領域は、特定の抗原に対する標的特異性について選択される。
本明細書に用いられているように、「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンＶＨ／ＶＬ対によって従来結合される構造の単位を意味する。エピトープは、抗体に対する最小結合部位を定めるため、抗体の特異性の標的を表す。単一ドメイン抗体の場合は、エピトープは、個別に可変領域により結合される構造の単位を表す。
本明細書に用いられているように、「中和する」という用語は、本明細書に記載されている単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチドを基準にして用いられる場合は、ポリペプチドが標的抗原の測定可能な活性又は機能に干渉することを意味する。ポリペプチドは、標的抗原の測定可能な活性又は機能を少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％を含めて９５％以上の抑制（すなわち標的抗原の検出可能な効果又は機能が存在しない）によって標的抗原の測定可能な活性又は機能を低下させる場合は、「中和」ポリペプチドである。標的抗原の測定可能な活性又は機能のこの低下は、当業者が、当該活性又は機能の１つ又は複数の指標を測定する標準的な方法を用いて評価できる。例として、標的がＴＮＦ−αである場合は、標準的なＬ９２９細胞死滅試験を用いて、或いはＴＮＦ−α誘発細胞活性化の測度である、ＨＵＶＥＣ上のＥＬＡＭ−１のＴＮＦ−α誘発発現を抑制する単一免疫グロブリン可変領域の能力を測定することによって、中和活性を評価することが可能である。本明細書に用いられている「中和」と同様に、本明細書に用いられている「細胞毒性を抑制する」とは、細胞毒性が抑制され、細胞死が少なくとも１０％以上低減される、例えば標準的なＬ９２９細胞死滅試験を用いて測定される細胞死の減少を意味する。
本明細書に用いられているように、「標的抗原の測定可能な活性」は、細胞シグナル伝達、酵素活性、結合活性、リガンド依存内在化、細胞死滅、細胞活性化、細胞生存の促進、及び遺伝子発現を含むが、それらに限定されない。当業者は、所定の標的抗原に対する当該活性を測定する試験を実施することが可能である。好ましくは、本明細書に用いられている「活性」は、（１）細胞ベースの試験におけるＮＤ５０、（２）標的リガンドに対する親和性、（３）ＥＬＩＳＡ結合、又は（４）受容体結合試験によって規定される。これらの試験を実施するための方法は、当業者に知られており、それらを以下にさらに詳細に説明する。
本明細書に用いられているように、「活性を保持する」とは、活性が本明細書に記載されているようにして測定される、非ＰＥＧ結合抗体ポリペプチドの活性のレベルの少なくとも１０％、同じ配列の非ＰＥＧ結合抗体ポリペプチドの活性の好ましくは少なくとも２９％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％及び９０％まで、好ましくは９５％、９８％及び１００％までであるＰＥＧ結合抗体ポリペプチド、例えば単一可変領域の活性のレベルを意味する。より具体的には、非ＰＥＧ結合抗体ポリペプチドと比較したＰＥＧ結合抗体ポリペプチドの活性は、抗体モル数を基準に測定されるべきである。すなわち、各試験において、同等のモル数の各々のＰＥＧ結合及び非ＰＥＧ結合抗体ポリペプチドを使用するべきである。特定のＰＥＧ結合抗体ポリペプチドが「活性を保持する」かどうかを判断する際に、ＰＥＧの不在下で、ＰＥＧ結合抗体ポリペプチドの活性を同じ抗体ポリペプチドの活性と比較することが好ましい。
本明細書に用いられているように、「ホモ二量体」、「ホモ三量体」、「ホモ四量体」及び「ホモ多量体」という用語は、それぞれ所定の単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチド配列の２又は３以上（例えば４、５等）の単量体を含む分子を意味する。例えば、ホモ二量体は、同一のＶＨ配列の２つの複製物を含むことになる。単一の免疫グロブリン可変領域ポリペプチドの「単量体」は、特異的に抗原を結合する単一のＶＨ又はＶＬ配列である。ホモ二量体、ホモ三量体、ホモ四量体又はホモ多量体における単量体は、例えば単量体の間にペプチドリンカーを有する融合タンパク質としての発現によって、或いは翻訳後の単量体をジスルフィド結合、又はジ、トリ又は多価結合成分に対する結合により互いに直接又はリンカーを通じて化学的に結合させることによって結合されうる。一実施形態において、ホモ二量体、三量体、四量体又は多量体における単量体をマルチアームＰＥＧポリマーによって結合することが可能であり、二量体、三量体、四量体又は多量体の各単量体は、上述したように、マルチアームＰＥＧのＰＥＧ成分に結合される。
本明細書に用いられているように、「ヘテロ二量体」、「ヘテロ三量体」、「ヘテロ四量体」及び「ヘテロ多量体」という用語は、それぞれ２つ以上の異なる単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチド配列の２又は３以上（例えば４、５、６、７又は８以上）の単量体を含む分子を意味する。例えば、ヘテロ二量体は、ＶＨ１及びＶＨ２の如き２つのＶＨ配列を含むことになり、或いはＶＨ及びＶＬの組合せを含んでいてもよい。ホモ二量体、三量体又は四量体と同様に、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ヘテロ四量体又はヘテロ多量における単量体は、例えば単量体の間にペプチドリンカーを有する融合タンパク質としての発現によって、或いは翻訳後の単量体をジスルフィド結合、又はジ、トリ又は多価結合成分に対する結合により互いに直接又はリンカーを通じて化学的に結合させることによって結合されうる。一実施形態において、ヘテロ二量体、三量体、四量体又は多量体における単量体をマルチアームＰＥＧポリマーによって結合することが可能であり、二量体、三量体、四量体又は多量体の各単量体は、上述したように、マルチアームＰＥＧのＰＥＧ成分に結合される。
本明細書に用いられているように、「半減期」という用語は、リガンド（例えば単一免疫グロブリン可変領域の如き抗体ポリペプチド）の血清濃度が、例えばリガンドの分解、及び／又は自然のメカニズムによるリガンドのクリアランス若しくは隔離によってインビボで５０％減少するのにかかる時間を意味する。抗体ポリペプチドは、インビボで安定化され、それらの半減期は、ＰＥＧの如き分解及び／又はクリアランス若しくは隔離に抵抗する分子に結合することによって増加する。抗体ポリペプチド、例えばｄＡｂ）の半減期は、その機能的活性が、ＰＥＧポリマーに結合しない同様のｄＡｂより長期間にわたってインビボで持続する場合に増加する。典型的には、ＰＥＧ化ｄＡｂの半減期は、非ＰＥＧ化ｄＡｂに比べて１０％、２０％、３０％、４０％又は５０％以上増加する。２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍以上の範囲の半減期の増加が可能である。代替的に、又は加えて、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍の半減期の増加が可能である。本発明によれば、ＰＥＧ結合抗体単一可変領域は、０．２５から１７０時間、好ましくは１から１００時間、より好ましくは３０から１００時間、さらにより好ましくは５０から１００時間、１７０、１８０、１９０及び２００時間までの半減期を有する。
本明細書に用いられているように、ＰＥＧ又は他のポリマー結合ｄＡｂ単量体若しくは多量体に対して用いられるときの「分解に対して抵抗性を有する」又は「分解に抵抗する」とは、ＰＥＧ又は他のポリマー結合ｄＡｂ単量体若しくは多量体が、ｐＨ２でペプシンに３０分間接触したときに１０％以下のレベルで分解する、好ましくは全く分解しないことを意味する。ＰＥＧ又は他のポリマー結合ｄＡｂ多量体（例えばヘテロ又はホモ二量体、三量体、四量体等）を具体的に取り上げると、分解に対して抵抗性を有する分子は、ｐＨ２で３０分間にわたるペプシンの存在下では、５％未満のレベルで分解し、好ましくは全く分解しない。
本明細書に用いられているように、「ハイドロダイナミックサイズ」は、分子の水溶液の拡散に基づく分子（例えばタンパク質分子）の見かけのサイズを意味する。タンパク質の溶液の拡散又は運動を処理して、タンパク質粒子の「ストークス半径」又は「ハイドロダイナミック半径」によって与えられるタンパク質の見かけのサイズを導くことが可能である。タンパク質の「ハイドロダイナミックサイズ」は、同一の分子質量を有する２つのタンパク質がタンパク質の全体構造に基づく異なるハイドロダイナミックサイズを有するように、質量及び形状（構造）の両方に依存する。ＰＥＧ結合抗体ポリペプチド、例えば単一可変領域（本明細書に記載されている抗体可変領域多量体を含む）のハイドロダイナミックサイズは、２４ｋＤａから５００ｋＤａ、３０から５００ｋＤａ、４０から５００ｋＤａ、５０から５００ｋＤａ、１００から５００ｋＤａ、１５０から５００ｋＤａ、２００から５００ｋＤａ、２５０から５００ｋＤａ、３００から５００ｋＤａ、３５０から５００ｋＤａ、４００から５００ｋＤａ及び４５０から５００ｋＤａの範囲でありうる。好ましくは、本発明のＰＥＧ化ｄＡｂのハイドロダイナミックサイズは、３０から４０ｋＤａ、７０から８０ｋＤａ又は２００から３００ｋＤａである。撮像用途に抗体可変領域多量体が望まれる場合は、多量体は、５０から１００ｋＤａのハイドロダイナミックサイズを有するべきである。或いは、治療用途に抗体単一領域多量体が望まれる場合は、多量体は、２００ｋＤａを上回るハイドロダイナミックサイズを有するべきである。
ＶＨ ＨＳＡの抗原結合部位に存在する（それぞれＤＶＴ又はＮＮＫコードされる）Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２ａ、Ｈ５３、Ｈ５５、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８の位置におけるＶＨ／ＨＳＡの多様化を示す図である。ＶＫの配列は、Ｌ５０、Ｌ５３において多様化される。アミノ酸配列、配列番号２１９；抜くレポチド配列、上端鎖、配列番号２２０。 ライブラリー１：生殖系列ＶＫ／ＤＶＴ ＶＨ；ライブラリー２：生殖系列ＶＫ／ＮＮＫ ＶＨ；ライブラリー３：生殖系列ＶＨ／ＤＶＴ ＶＫ；ライブラリー４：生殖系列ＶＨ／ＮＮＫ ＶＫを示す図である。ファージディスプレイ／ＳｃＦｖ形式。これらのライブラリーは、クローンの大多数及び選択されたライブラリーが機能的になるように、遺伝子リガンドタンパク質Ａ及びタンパク質Ｌに対する結合について予め選択された。ライブラリーは、ＨＳＡ（第１ラウンド）及びβ−ｇａｌ（第２ラウンド）又はＨＳＡβ−ｇａｌ選択、或いはβ−ｇａｌ（第１ラウンド）及びＨＳＡ（第２ラウンド）β−ｇａｌ選択で選択された。ＰＣＲのこれらのクローンの可溶性ｓｃＦｖは、その配列で増幅される。二重特異性抗体Ｋ８をコードする１つのクローンをさらなる作業に向けて選択した。ヌクレオチド配列：配列番号２２１；アミノ酸配列：配列番号２２２。 ＶＨ鎖及びＶＫ鎖のアラインメントを示す図である。ＶＨダミー、配列番号１；Ｋ８、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２２３（ＶＨ）及び２３２（ＶＫ）；ＶＨ２、配列番号２２４；ＶＨ４、配列番号２２５；ＶＨＣ１１、配列番号２２６；ＶＨＡ１０ｓｄ、配列番号２２７；ＶＨＡ１ｓｄ、配列番号２２８；ＶＨＡ５ｓｄ、配列番号２２９；ＶＨＣ５ｓｄ、配列番号２３０；ＶＨＣ１１ｓｄ、配列番号２３１；Ｖｋダミー、配列番号３；Ｅ５ｓｄ、配列番号２３３；Ｃ３、配列番号２３４。 Ｋ８抗体の結合特性、モノクローナルファージＥＬＩＳＡによって特徴付けられるＫ８抗体の結合特性の特徴付けを示す図である。二重特異性Ｋ８抗体は、ＨＳＡ及びβ−ｇａｌを結合することが確認され、吸収シグナルが１．０を上回るファージの表面に表示された。他のタンパク質との交差反応は検出されなかった。 知られているＫ８抗体断片の濃度を用いて実現された可溶性ｓｃＦｖ ＥＬＩＳＡを示す図である。９６ウェルプレートに１００μｇのＨＳＡ、ＢＳＡ及びβ−ｇａｌを１０μｇ／ｍｌの濃度で塗布し、１００μｇ／ｍｌのタンパク質Ａを１μｇ／ｍｌの濃度で塗布した。Ｋ８ｓｃＦｖの連続希釈物を５０μｇ塗布し、結合抗体断片をタンパク質Ｌ−ＨＲＰで検出した。ＥＬＩＳＡの結果は、Ｋ８抗体の二重特異性を実証するものである。 可溶性ｓｃＦｖ ＥＬＩＳＡを使用して分析されたクローンＫ８ＶＫ／ダミーＶＨの結合特性を示す図である。Ｈａｒｒｉｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌによって記載されているように、ＩＰＴＧによって可溶性ｓｃＦｖ断片の生成を誘発した。可溶性ｓｃＦｖ ＥＬＩＳＡは、例１に記載されているようにして実現され、タンパク質Ｌ−ＨＲＰで結合ｓｃＦｖｓを検出した。ＥＬＩＳＡ結果により、クローンは依然としてβ−ｇａｌを結合することが可能であるのに対して、結合ＢＳＡは破壊されることが明らかになった。 可変領域ベクター１及び２の配列を示す図である。ヌクレオチド配列：配列番号２２１；アミノ酸配列：配列番号２２２。 ＶＨ１／ＶＨ２多重特異性リガンドを構成するのに使用されるＣＨベクターのマップである。 ＶＫ１／ＶＫ２多重特異性リガンドを構成するのに使用されるＶＫベクターのマップである。 ＴＡＲ１−５二量体４、ＴＡＲ１−５−１９二量体４及びＴＡＲ１−５−１９単量体を比較するＴＮＦ受容体試験。 ＴＡＲ１−５に量体１〜６を比較するＴＮＦ受容体試験。すべての二量体がＥＰＬＣ生成され、最適二量体種についての結果が示される。 異なる形式におけるＴＡＲ１−５ １９ホモ二量体のＴＮＦ受容体試験：３Ｕ、５Ｕ又は７ＵリンカーによるｄＡｂリンカー−ｄＡｂ形式、Ｆａｂ形式及びシステインヒンジリンカー形式。 ライブラリー１に対するダミーＶＨ配列。生殖細胞ＤＰ４７−ＪＨ４ｂに基づくＶＨフレームワークの配列。ＮＮＫ無作為化（Ｎ＝Ａ又はＴ又はＣ又はＧヌクレオチド；Ｋ＝Ｇ又はＴヌクレオチド）がライブラリー１に組み込まれた位置は、太字下線文字列で示されている。アミノ酸配列、配列番号１；ヌクレオチド配列、上端鎖、配列番号２。 ライブラリー２に対するダミーＶＨ配列。生殖系列配列ＤＰ４７−ＪＨ４ｂに基づくＶＨフレームワークの配列。ＮＮＫ無作為化（Ｎ＝Ａ又はＴ又はＣ又はＧヌクレオチド；Ｋ＝Ｇ又はＴヌクレオチド）がライブラリー２に組み込まれた位置は、太字下線文字列で示されている。アミノ酸配列、配列番号２３５；ヌクレオチド配列、上端鎖、配列番号２３６。 ライブラリー３に対するダミーＶＨ配列。生殖系列配列ＤＰＫ９−ＪＫ１に基づくＶＨフレームワーク５の配列。ＮＮＫ無作為化（Ｎ＝Ａ又はＴ又はＣ又はＧヌクレオチド；Ｋ＝Ｇ又はＴヌクレオチド）がライブラリー３に組み込まれた位置は、太字下線文字列で示されている。アミノ酸配列、配列番号３；ヌクレオチド配列、上端鎖、配列番号４。 抗ＭＳＡ ｄＡｂ ＭＳＡ１６及びＭＳＡ２６のヌクレオチド及びアミノ酸配列。アミノ酸配列、配列番号２３７；ヌクレオチド配列、配列番号２３８。ＭＳＡ２６：アミノ酸配列、配列番号２３９；ヌクレオチド配列、配列番号２４０。 ＭＳＡ１６のＢＩＡｃｏｒｅの抑制。精製されたｄＡｂ ＭＳＡ１６を阻害ＢＩＡｃｏｒｅによって分析して、Ｋｄを求めた。手短に述べると、ｄＡｂを試験して、高密度のＭＳＡが塗布されたＢＩＡｃｏｒｅＣＭ５チップ上で２００ＲＵの応答を達成するのに必要とされるｄＡｂの濃度を求めた。必要なｄＡｂの濃度が求められると、期待されるＫｄ付近の濃度の範囲のＭＳＡ抗原をｄＡｂと予備混合し、一晩インキュベートした。次いで、予備混合物の各々におけるｄＡｂのＭＳＡが塗布されたＢＩＡｃｏｒｅチップに対する結合を３０μｌ／分の高流速で測定した。 ＭＳＡ２６のＢＩＡｃｏｒｅの抑制。精製されたｄＡｂ ＭＳＡ２６を阻害ＢＩＡｃｏｒｅによって分析して、Ｋｄを求めた。手短に述べると、ｄＡｂを試験して、高密度のＭＳＡが塗布されたＢＩＡｃｏｒｅＣＭ５チップ上で２００ＲＵの応答を達成するのに必要とされるｄＡｂの濃度を求めた。必要なｄＡｂの濃度が求められると、期待されるＫｄ付近の濃度の範囲のＭＳＡ抗原をｄＡｂと予備混合し、一晩インキュベートした。次いで、予備混合物の各々におけるｄＡｂのＭＳＡが塗布されたＢＩＡｃｏｒｅチップに対する結合を３０μｌ／分の高流速で測定した。 注射後のＭＳＡ１６の血清レベル。マウスにおけるｄＡｂ ＭＳＡ１６の血清半減期を求めた。ＭＳＡ１６を約１．５ｍｇ／ｋｇの濃度で単一のインビボ注射としてＣＤ１マウスに投与した。２区画モデルによるモデリングにより、ＭＳＡ１６は、０．９８時間のｔ１／２β、３６．５時間のｔ１／２β及び９１３時間・ｍｇ／ｍｌのＡＵＣを有することが示された。ＭＳＡ１６は、０．０６時間のｔ１／２β及び０．３４時間のｔ１／２βを有するＨＥＬ４（抗鶏卵白リソザイムｄＡｂ）と比較して、半減期が著しく長かった。 ＭＳＡ２６Ｃｋ及びＴＡＲ１−５−１９ＣＨを含むＦａｂ状断片によるＴＮＦ結合の抑制を示すＥＬＩＳＡ（ａ）及びＴＮＦ受容体試験（ｃ）。Ｆａｂ状断片とともにＭＳＡを添加すると、抑制のレベルが低下する。１ｕｇ／ｍｌのＴＮＦ−αを塗布したＥＬＩＳＡプレートを二重特異性ＶＫ ＣＨ及びＶＫ ＣＫ Ｆａｂ状断片で探査するとともに、ＥＬＩＳＡ状で同様のシグナルを与えるように計算された濃度の対照ＴＮＦ−α結合ｄＡｂで探査した。二重特異性及び対照ｄＡｂの両方を使用して、２ｍｇ／ｍｌのＭＳＡの存在下及び不在下におけるＥＬＩＳＡプレートを探査した。二重特異性ウェルにおけるシグナルは、５０％を上回って低減されたが、ｄＡｂにおけるシグナルは全く低減されなかった（図１９ａ参照）。同じ二重特異性タンパク質を、ＭＳＡを含めて又は含めずに受容体試験に導入し、ＭＳＡによる競合も示した（１９ｃ参照）。これにより、二重特異性に対するＭＳＡの結合は、ＴＮＦ−αに対する結合と競合することが実証される。 ＴＡＲ１−５−１９ｄＡｂ及びＭＳＡ１６ｄＡｂのジスルフィド結合ヘテロ二量体によるＴＮＦ結合の阻害剤を示すＴＮＦ受容体試験。二量体とともにＭＳＡを添加すると、投与量に応じて阻害剤のレベルが低下する。一定濃度のヘテロ二量体（１８ｎＭ）及びＭＳＡ及びＨＳＡの連続的希釈物の存在下で、ＴＮＦ受容体試験を実施した。ある範囲の濃度（２ｍｇ／ｍｌまで）のＨＳＡの存在は、ＴＮＦ−αを抑制する二量体の能力の低下を引き起こさなかった。しかし、ＭＳＡを添加すると、ＴＮＦ−αを抑制する二量体の能力の投与量に応じた低下が生じた。これにより、ＭＳＡとＴＮＦ−αは、システイン結合ＴＡＲ１−５−１９、ＭＳＡ１６二量体に対する結合をめぐって競合することが実証される。ＭＳＡ及びＨＳＡのみでは、試験におけるＴＮＦ結合レベルに対する効果はなかった。 ヒト生殖系列フレームワークセグメントＤＰ４７のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す図である（図１参照）。アミノ酸配列は、配列番号１であり、上端鎖のポリヌクレオチド配列は、配列番号２である。 ヒト生殖系列フレームワークセグメントＤＰＫ９のポリヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す図である（図１参照）。アミノ酸配列は、配列番号３であり、上端鎖のポリヌクレオチド配列は、配列番号４である。 本明細書に記載されているＴＡＲ１クローンに対するアミノ酸配列を示す図である（例えば例１３参照）。ＴＡＲ１−５、配列番号２４１；ＴＡＲ１−２７、配列番号２４２；ＴＡＲ１−２６１、配列番号２４３；ＴＡＲ１−３９８、配列番号２４４；ＴＡＲ１−７０１、配列番号２４５；ＴＡＲ１−５−２、配列番号２４６；ＴＡＲ１−５−３、配列番号２４７；ＴＡＲ１−５−４、配列番号２４８；ＴＡＲ１−５−７、配列番号２４９；ＴＡＲ１−５−８、配列番号２５０；ＴＡＲ１−５−１０、配列番号２５１；ＴＡＲ１−５−１１、配列番号２５２；ＴＡＲ１−５−１２、配列番号２５３；ＴＡＲ１−５−１３、配列番号２５４；ＴＡＲ１−５−１９、配列番号１９１；ＴＡＲ１−５−２０、配列番号２５５；ＴＡＲ１−５−２１、配列番号２５６；ＴＡＲ１−５−２２、配列番号２５７；ＴＡＲ１−５−２３、配列番号２５８；ＴＡＲ１−５−１４、配列番号２５９；ＴＡＲ１−５−２５、配列番号２６０；ＴＡＲ１−５−２６、配列番号２６１；ＴＡＲ１−５−２７、配列番号２６２；ＴＡＲ１−５−２８、配列番号２６３；ＴＡＲ１−５−２９、配列番号２６４；ＴＡＲ１−５−３４、配列番号２６５；ＴＡＲ１−５−３５、配列番号２６６；ＴＡＲ１−５−３６、配列番号２６７；ＴＡＲ１−５−４６４、配列番号２６８；ＴＡＲ１−５−４６３、配列番号２６９；ＴＡＲ１−５−４６０、配列番号２７０；ＴＡＲ１−５−４６１、配列番号２７１；ＴＡＲ１−５−４７９、配列番号２７２；ＴＡＲ１−５−４７７、配列番号２７３；ＴＡＲ１−５−４７８、配列番号２７４；ＴＡＲ１−５−４７６、配列番号２７５；ＴＡＲ１−５−４９０、配列番号２７６；ＴＡＲ１ｈ−１、配列番号２７７；ＴＡＲ１ｈ−２、配列番号２７８；ＴＡＲ１ｈ−３、配列番号２７９。 単一静脈内注射後のｄＡｂ単量体形式又はＦｃ融合形式におけるＴＡＲ１−５−１９の血清半減期の比較を示す図である。 ＴＡＲ１−５−１９を使用した一連のＴｇ１９７モデル試験で投与されたｄＡｂ構築物の投与量及びタイミングの概要を示す図である。 Ｔｇ１９７マウスＲＡモデルにおける調査に使用されたＴＡＲ１−５−１９ｄＡｂ（Ｆｃ融合、ＰＥＧ化、抗ＴＮＦ／抗ＳＡ二重特異性）の異なる形式の毎週投与量の概要を示す図である。 抗ＴＮＦ ｄＡｂ構築物の効果と現行の抗ＴＮＦ製品の効果とを比較するＴｇ１９７マウスＲＡモデル調査で投与された抗ＴＮＦ ｄＡｂ構築物の形式（Ｆｃ融合、ＰＥＧ二量体、ＰＥＧ四量体、抗ＴＮＦ／抗ＳＡ二重特異性）、送達様式及び投与量の概要を示す図である。 Ｔｇ１９７マウスＲＡモデルにおける設定された疾病症状に対する抗ＴＮＦ ｄＡｂの効果を調べる調査のための投与及び採点法を示す図である。 ヒトＩｇＧ１定常領域に融合されたヒトＶＥＧＦに対して特異的なＶκ可変領域と、ヒトＣκ定常領域に融合されたヒトＴＮＦ−αに対して特異的なＶκ可変領域とを含むＩｇＧ状二重特異性抗体に対するＳＤＳ ＰＡＧＥゲル分析を示す図である。レーン１：ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎマルチマークＭＷマーカー。レーン２：１Ｘ非還元添加液における抗ＴＮＦｘ抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体。レーン３：１０ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む１Ｘ添加液における抗ＴＮＦｘ抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体。 ＴＮＦ−α活性及びＶＥＧＦ受容体の試験における抗ＴＮＦｘ抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体の抑制効果を調べる試験の結果を示す図である。Ｌ９２９ＴＮＦ−α細胞毒中和試験の結果。正方形のデータ点（対照抗ＴＮＦ−α抗体）を示す曲線。上向き三角形のデータ点（抗ＴＮＦｘ抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体）を示す曲線。下向き三角形のデータ点（抗ＴＮＦ−α単量体）を示す曲線。 ＴＮＦ−α活性及びＶＥＧＦ受容体の試験における抗ＴＮＦｘ抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体の抑制効果を調べる試験の結果を示す図である。ヒトＶＥＧＦ受容体２結合試験の結果。正方形のデータ点（抗ＴＮＦｘ抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体）を示す曲線。上向き三角形のデータ点（抗ＶＥＧＦ対照）を示す曲線。下向き三角形のデータ点（負の対照）を示す曲線。
二重特異性抗体ポリペプチド
本発明人らは、本発明人らの国際特許出願ＷＯ２００４／００３０１９において、リガンドの１つの特異性が、それに結合することによってリガンドの半減期を増加させるように作用することができる生物にインビボで存在するタンパク質又はポリペプチドに向けられる二重特異性リガンドのさらなる改善について記載した。ＷＯ２００４／００３０１９には、第１の抗原又はエピトープに対する結合特異性を有する第１の免疫グロブリン単一可変領域と、第２の抗体又はエピトープに対する結合活性を有する第２の相補的免疫グロブリン単一可変領域とを含む二重特異性リガンドであって、前記抗原又はエピトープの一方又は双方が、インビボでリガンドの半減期を増加させるように作用し、前記に重篤異性リガンドが、抗ＨＳＡ ＶＨ領域及び抗ｐガラクトシダーゼＶＫ領域で構成されなければ、前記第１及び第２の領域は、同一の特異性を共有する互いに相補的な領域を欠く二重特異性リガンドが記載されている。
本明細書に記載されているようにリガンドの半減期を増加させる抗原又はエピトープは、有利には、インビボで生物に見い出されるタンパク質又はポリペプチドに存在する。
例としては、細胞外基質タンパク質、血液タンパク質、及び生物の様々な組織に存在するタンパク質が挙げられる。それらのタンパク質は、血液からのリガンド分泌率を、例えば増量剤として作用することによって、又はリガンドを所望の作用部位に固定することによって低下させるように作用する。インビボの半減期を増加させる抗原／エピトープの例は、以下の付属書１に示されている。
半減期の増加は、免疫グロブリン、特に抗体、最も特別には小サイズの抗体断片のインビボ用途に有益である。当該断片（Ｆｖｓ、ジスルフィド結合Ｆｖｓ、Ｆａｂｓ、ｓｃＦｖｓ及びｄＡｂｓ）は、身体から急速に分泌される。したがって、身体のたいていの部分に急速に到達することができ、迅速に生成され、容易に処理されるが、インビボで短時間しか存続しないことにより、それらのインビボ用途は制限されてきた。本発明は、インビボでのリガンドの半減期を増加させることによってこの問題を解決し、結果として、リガンドの機能的活性の身体における存続時間を長くする。
リガンド半減期の薬動力学的分析及び測定のための方法は、当業者であればよく知っているであろう。詳細は、Ｋｅｎｎｅｔｈ，Ａら、「Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ」及びＰｅｔｅｒｓら、「Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」（１９９６）に見い出すことができる。ｔα及びｔβ半減期並びに曲線下面積（ＡＵＣ）の如き薬動力学的パラメータについて記載している「Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ」、Ｍ Ｇｉｂａｌｄｉ ＆ Ｄ Ｐｅｒｒｏｎ、出版：Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、第２版（１９８２）も参照される。
半減期（Ｔ１／２α及びＴ１／２β）及びＡＵＣを時間に対するリガンドの血清濃度の曲線から求めることが可能である。例えば、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ分析パッケージ（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ．（米国カリフォルニア州Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ所在）から入手可能）を使用して、曲線をモデル化することが可能である。第１の相（α相）において、リガンドは、主として患者のなかで分配され、一部は除去される。第２の相（β相）は、リガンドが分配され、患者から分泌されるのに従って血清濃度が低下するときの末端相である。ｔα半減期は第１の相の半減期であり、ｔβ半減期は第２の相の半減期である。したがって、有利には、本発明は、１５分以上の範囲のｔα半減期を有する本発明によるリガンド、又はリガンドを含む組成物を提供する。一実施形態において、その範囲の下端は３０分、４０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１１時間又は１２時間である。加えて、又は代替的に、本発明によるリガンド又は組成物は、１２時間以内の範囲のｔα半減期を有することになる。一実施形態において、その範囲の上端は、１１、１０、９、８、７、６又は５時間である。好適な範囲の例は、１から６時間、２から５時間又は３から４時間である。有利には、本発明は、２．５時間以上の範囲のｔβ半減期を有する本発明によるリガンド、又はリガンド含む組成物を提供する。
一実施形態において、その範囲の下端は、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１１時間又は１２時間である。加えて、又は代替的に、本発明によるリガンド又は組成物は、２１日間以内の範囲のｔβ半減期を有する。一実施形態において、その範囲の上端は、１２時間、２４時間、２日間、３日間、５日間、１０日間、１５日間又は２０日間である。有利には、本発明によるリガンド又は組成物は、１２から６０時間の範囲のｔβ半減期を有することになる。
さらなる実施形態において、半減期は１２から４８時間の範囲である。さらなる実施形態において、半減期は１２から２６時間の範囲である。
上記の基準に加えて、又はその代わりに、本発明は、１ｍｇ分／ｍｌ以上の範囲のＡＵＣ値（曲線下面積）を有する本発明によるリガンド、又はリガンドを含む組成物を提供する。一実施形態において、その範囲の下端は、５、１０、１５、２０、３０、１００、２００又は３００ｍｇ分／ｍｌである。加えて、又は代替的に、本発明によるリガンド又は組成物は、６００ｍｇ分／ｍｌまでの範囲のＡＵＣを有する。
一実施形態において、その範囲の上端は、５００、４００、３００、２００、１５０、１００、７５又は５０ｍｇ分／ｍｌである。有利には、本発明によるリガンドは、１５から１５０ｍｇ分／ｍｌ、１５から１００ｍｇ分／ｍｌ、１５から７５ｍｇ分／ｍｌ及び１５から５０ｍｇ分／ｍｌからなる群から選択される範囲のＡＵＣを有することになる。
第１の実施形態において、二重特異性リガンドは、２つの相補的可変領域、すなわち、それらの固有の環境において、本発明の範囲でそれらが個別的に同族エピトープに結合する場合であっても同族対又はグループとしてともに機能することが可能である２つの可変領域を含む。例えば、相補的可変領域は、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖可変領域（ＶＨ及びＶＬ）であってもよい。ＶＨ及びＶＬ領域は、有利には、ｓｃＦｖ又はＦａｂ抗体断片によって与えられる。例えば、各Ｖ領域のＣ末端にヒンジ領域を設け、ヒンジ領域においてシステイン同士をジスルフィド結合させること、その領域のＣ末端にそれぞれシステインを有するｄＡｂｓを設け、システインを互いにジスルフィド結合させること、又はＦａｂ形式を生成するためのＶ−ＣＨ＆Ｖ−ＣＬを生成すること、又は二量体、三量体、さらに多量体を生成するためのペプチドリンカー（例えば以下に記載するＧｌｙ４Ｓｅｒリンカー）を使用することによって、多価リガンドを形成するために可変領域を互いに結合させることができる。本発明人らは、相補的可変領域を使用すると、２つの領域表面を互いに被覆させ、溶媒から隔離することが可能であることを見い出した。また、相補的領域は、互いを安定化させることが可能である。加えて、従来技術に使用されたハイブリッド雑種細胞の欠点、又はサブユニット界面における重鎖又は軽鎖をタンパク工学により改変する必要性を伴うことなく、二重特異性ＩｇＧ抗体を作成することが可能である。
本発明の第１の態様の二重特異性リガンドは、少なくとも１つのＶＨ／ＶＬ対を有する。したがって、本発明による二重特異性ＩｇＧは、１つの対がＹ形分子の各腕に存在する２つの当該対を含む。したがって、使用される鎖の比率が調製の成功を左右し、実用的な困難さをもたらす従来の二重特異性抗体又はダイアボディとは異なり、本発明の二重特異性リガンドには鎖の均衡についての問題はない。従来の二重特異性抗体における鎖の不均衡は、ＶＬ鎖１がＶＨ鎖２とともに抗原又はエピトープ１に結合することが可能であり、ＶＨ鎖２がＶＨ鎖２とともに抗原又はエピトープ２に結合することが可能であり、２つの適正な対合が何らかの方法で互いに結合する、２つの異なるＶＬ鎖と２つの異なるＶＨ鎖の会合に起因する。したがって、単一分子において、ＶＬ鎖１がＶＨ鎖１に対合し、ＶＬ鎖２がＶＨ鎖２に対合する場合にのみ、二重特異性がもたらされる。当該二重特異性分子を２つの異なる方法で作ることが可能である。第１に、（例えば二重特異性ＩｇＧにおける）異なる抗原又はエピトープにそれぞれ結合する２つの既存のＶＨ／ＶＬ対合の会合によって作ることが可能である。この場合、ＶＨ／ＶＬ対合は、そのすべてが二重特異性である分子の集団を作るために、１：１の割合ですべて結合しなければならない。このようなことは、（相補的ＣＨ領域が「ノブインツホール」エンジニアリングによって強化されたとしても）生じることはなく、二重特異性分子、及び１つの抗原又はエピトープに結合することが可能であるが、他の抗原又はエピトープに結合することはできない分子の混合物を生じる。二重特異性抗体を作る第２の方法は、（例えば二重特異性ダイアボディにおける）２つの異なるＶＨ鎖と２つの異なるＶＬ鎖の同時会合による。この場合、ＶＬ鎖１がＶＨ鎖１と対合し、ＶＬ鎖２がＶＨ鎖２と対合する傾向（ＶＬ及びＶＨ領域の「ノブインツホール」エンジニアリングによって強化されうる）があるが、この対合はすべての分子で達成されるわけではなく、混合調合物を生じることにより、抗原にもエピトープにも結合することができない不適切な対合が発生する。
本発明の第１の態様による二重特異性リガンド手法に従って構成される二重特異性抗体は、それぞれ抗原又はエピトープ１に対する結合がＶＨ又はＶＬ領域内に存在し、抗原又はエピトープ２に対する結合が相補的ＶＬ又はＶＨ領域内に存在するため、これらのすべての問題を克服する。ＶＨ及びＶＬ領域が１：１で対合するため、すべてのＶＨ／ＶＬ対合は、二重特異性であり、したがってこれらのＶＨ／ＶＬ対合を用いて構成されるすべての形式（Ｆｖ、ｓｃＦｖｓ、Ｆａｂｓ、ミニボディ、ＩｇＧｓ等）は、１００％の二重特異性活性を有することになる。
本発明の範囲において、第１及び第２の「エピトープ」は、同一でなく、単一の一特異性リガンドによって結合されないエピトープであると理解される。本発明の第１の構成において、それらは、有利には、異なる抗原上に存在し、そのうちの１つは、インビボでリガンドの半減期を増加させるように作用する。同様に、第１及び第２の抗原は、有利には、同一でない。
本発明の二重特異性リガンドは、ＷＯ０２／０２７７３に記載されているようなリガンドを含まない。したがって、本発明のリガンドは、任意の１つ又は複数の抗原又はエピトープを共同で結合する相補的ＶＨ／ＶＬ対を含まない。その代わりに、本発明の第１の態様によるリガンドは、Ｖ領域が異なる特異性を有するＶＨ／ＶＬ相補対を含む。
さらに、本発明の第１の態様によるリガンドは、非特異的に関連したエピトープ又は抗原に対する異なる特異性を有するＶＨ／ＶＬ相補対を含む。構造的に関連したエピトープ又は抗原は、抗原又はエピトープを結合するように共同で作用する従来のＶＨ／ＶＬ相補対によって結合されるのに十分な構造的類似性を有するエピトープ又は抗原であり、構造的に関連したエピトープの場合は、エピトープは、構造が十分に類似しているため、ＶＨ／ＶＬに量体の抗原結合部位で形成された同一の結合ポケットに「収まる」。
第２の態様において、本発明は、第１の抗原又はエピトープ結合特異性を有する第１の免疫グロブリン可変領域と、第２の抗原又はエピトープ結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変領域とを含むリガンドであって、前記第１及び第２の可変領域の一方又は両方が、インビボでリガンドの半減期を増加させる抗原に結合し、可変領域は、互いに相補的でないリガンドを提供する。
一実施形態において、１つの可変領域に対する結合により、第２の可変領域に対するリガンドの結合が調節される。
本実施形態において、可変領域は、例えば、ＶＨ領域の対又はＶＬ領域の対であってもよい。第１の結合部位における抗原の結合は、第２の部位における抗原の結合を強化又は抑制するというように調節することができる。例えば、第１の部位における結合は、第２の部位における抗原の結合を少なくとも部分的に抑制する。当該実施形態では、リガンドは、例えば、それが第２の標的抗原に結合され、半減期を増加させるタンパク質から解離する時まで、リガンドの半減期を増加させるタンパク質に対する結合を通じて、インビボで対象生物の体内に維持されうる。
上記脈絡における結合の調節は、互いに相対的な抗原結合部位の構造的近接の結果として達成される。そのような構造的近接は、２つ以上の抗原結合部位を結合させる構造的成分の性質によって、例えば抗原結合部位を近傍に保持する比較的硬い構造を有するリガンドを与えることによって達成されうる。有利には、２つ以上の抗原結合部位は、免疫グロブリン分子内の立体障害及び／又は構造的変化を含むプロセスによって、１つの部位が他の部位における抗原の結合を調節するように、互いに物理的に近接する。
第１及び第２の抗原結合領域を共有結合又は非共有結合で会合させることができる。それらの領域を共有結合で会合させる場合は、その会合を例えばジスルフィド結合によって、又は（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（ｎ＝１から８、例えば２、３、４、５又は７）の如きポリペプチドリンカーで仲介することができる。
本発明の本態様によるリガンドを非免疫グロブリン多重リガンド構造に統合して、同一の抗原の標的分子を結合する多価複合体を形成することによって、優れた結合活性を提供することができる一方、少なくとも１つの可変領域は、抗原を結合して、多量体の半減期を増加させる。例えば、１つ又は複数のエピトープに対して特異的に結合するリガンドを生成するためのＣＤＲの移植のための骨組として、ＳｐＡの如き天然の細菌受容体が使用された。この手順の詳細は、米国特許第５，Ｓ３１，０１２号に記載されている。他の好適な骨組としては、フィブロネクチン及びアフィボディに基づくものが挙げられる。好適な手順の詳細は、ＷＯ９８／５８９６５に記載されている。他の好適な骨組としては、ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｕｋｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００１）３１０、５９１−６０１に記載されているリポカリン及びＣＴＬＡ４、及び例えば細菌ＧｒｏＥＬ又は他のシャペロンポリペプチドの環構造に基づく、ＷＯ００６９９０７（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ）に記載されているような骨組が挙げられる。
タンパク質骨組を結合させ、例えば、ＣＤＲをＣＴＬＡ４骨組に移植し、免疫グロブリンＶＨ又はＶＬ領域とともに使用して、リガンドを形成することができる。
同様に、フィブロネクチン、リポカリン及び他の骨組を結合させることもできる。
可変領域が、例えば本明細書に記載されているファージディスプレイ技術を用いて選択されたＶ遺伝子レパートリーから選択される場合は、これらの可変領域は、本明細書に定められている特定の汎用リガンドによって認識されうるように、包含的フレームワーク領域を含むことが可能である。包含的フレームワーク、汎用リガンド等の使用についてはＷＯ９９／２０７４９に記載されている。本発明において、ファージディスプレイに対する言及は、ファージ及び／又はファージミドを含む。
Ｖ遺伝子レパートリーが用いられる場合は、ポリペプチド配列の変動は、好ましくは、可変領域の構造的ループ内に位置する。いずれの可変領域のポリペプチド配列も、各可変領域のその相補対との相互作用を強化するためにＤＮＡシャフリング又は変異によって変えることができる。
本発明の好ましい実施形態において、「二重特異性リガンド」は、単一鎖Ｆｖ断片である。本発明の代替的な実施形態において、「二重特異性リガンド」は、抗体のＦａｂ領域からなる。「Ｆａｂ領域」という用語は、２つのＶＨ又は２つのＶＬ領域が使用されるＦａｂ状領域を含む。
標的抗原又はエピトープに対して導かれる抗体から可変領域を誘導することができる。或いは、糸状バクテリオファージの表面に発現される領域の如き単一抗体領域のレパートリーから可変領域を誘導することができる。以下及び実施例に記載されるように選択することができる。
ｄＡｂｓの調製
本発明の態様は、二重特異性リガンドのみならず、ＴＮＦ−α単体、ＴＮＦ−α及びＨＳＡ、又は二重特異性形式の他の半減期拡大ポリペプチドを結合するリガンド、並びに二重特異性形式のＴＮＦ−α及びＶＥＧＦを結合するリガンドの様々な構築物にも関する。ＶＥＧＦ及びＨＳＡ又は他の半減期拡大ポリペプチドを結合するリガンドを調製することも可能である。二重特異性ＴＮＦ−α／ＶＥＧＦ構築物は、ＨＳＡ又は他の半減期拡大ヌクレオチドに対するバインダをさらに含むことが可能である。これらの実施形態の各々において、個々のリガンド、すなわちＴＮＦ−α、ＨＳＡ又はＶＥＧＦを結合するリガンドは、好ましくはｄＡｂｓでありうる。当該ｄＡｂｓの生成については以下及び実施例に記載されている。
様々な態様において、本明細書に開示されているｄＡｂｓは、単量体形態、二量体形態、三量体形態、四量体形態、又はさらにより高度な多量体形態で存在しうる。多量体構築物は、二重特異性構築物の如きヘテロ二量体形態に加えて、ホモ多量体、すなわちホモ二量体、ホモ三量体及びホモ四量体等でありうる。ヘテロ三量体、ヘテロ四量体、及びより高次のヘテロ多量体も具体的に検討される。ポリペプチド構築物の血清半減期をさらに長くするために、様々なｄＡｂ構造の各々をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の如きさらなる成分とさらに複合させることが可能である。ＰＥＧ化は、当該技術分野で知られており、本明細書に記載されている。
単一免疫グロブリン可変領域又はｄＡｂｓは、いくつかの方法で調製される。好ましい態様において、ｄＡｂｓは、ヒト単一免疫グロブリン可変領域である。これらの手法の各々については、よく知られている核酸配列の調製（例えば増幅、変異等）及び処理方法が適用可能である。
ｄＡｂｓを調製する一手段は、所望の抗原を結合することが知られているクローン化抗体に対する重鎖及び軽鎖遺伝子のＶＨ又はＶＬ領域を増幅、発現することである。ＶＨ及びＶＬ領域の境界は、Ｋａｂａｔら（１９９１、前出）によって設定されている。重鎖及び軽鎖遺伝子のＶＨ及びＶＬ領域の境界に関する情報は、所定の抗原を結合することが知られている抗体をコードするクローン化重鎖及び軽鎖コード配列からＶ領域を増幅するＰＣＲプライマーを設計するのに用いられる。増幅されたＶ領域は、好適な発現ベクター、例えばｐＨＥＮ−１（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９１、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７）に挿入され、単体、又は他のポリペプチド配列との融合体として発現される。次いで、発現されたＶＨ又はＶＬ領域は、重又は軽鎖ポリペプチドの残りの部分から分離して所望の抗原に結合する高度な親和性についてスクリーニングされる。本発明のすべての態様では、当該技術分野で知られているように、又は以下に記載されているように結合についてのスクリーニングが実施される。
ＶＨ又はＶＬ領域のレパートリーは、例えばファージディスプレイ、所望の抗原に対するパニングによってスクリーニングされる。バクテリオファージディスプレイライブラリー及びラムダファージ発現ライブラリーの構成方法は、当該技術分野でよく知られており、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２；Ｋａｎｇら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８８：４３６３；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４；Ｌｏｗｍａｎら、１９９１、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０８３２；Ｂｕｒｔｏｎら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：１０１３４；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９１、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４１３３；Ｃｈａｎｇら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：３６１０；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら、１９９１、Ｇｅｎｅ、１０４：１４７；Ｍａｒｋｓら、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１；Ｂａｒｂａｓら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４４５７；Ｈａｗｋｉｎｓ及びＷｉｎｔｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２２：８６７；Ｍａｒｋｓら、（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：１６００７；及びＬｅｒｎｅｒら、（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５８：１３１３に教示されている。ｓｃＦｖファージライブラリーは、例えば、Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５８７９−５８８３；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１０６６−１０７０；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０、前出；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１、前出；Ｍａｒｋｓら、１９９１、前出；Ｃｈｉｓｗｅｌｌら、１９９２、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１０：８０；及びＭａｒｋｓら、１９９２、前出に教示されている。バクテリオファージ被覆タンパク質に表示されたｓｃＦｖライブラリーの様々な実施形態が記載されている。例えばＷＯ９６／０６２１３及びＷＯ９２／０１０４７（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ他）並びにＷＯ９７／０８３２０（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ、前出）に記載されているように、ファージディスプレイ手法の改良型も知られている。
ＶＨ又はＶＬ領域のレパートリーは免疫グロブリン配列の天然のレパートリー又は合成レパートリーでありうる。天然のレパートリーは、例えば、１つ又は複数の個体から収穫された免疫グロブリン発現細胞から調製されたものである。当該レパートリーは「原生」、すなわち、例えば、ヒト胎児又は新生免疫グロブリン発現細胞から調製することもできるし、再編成、すなわち、例えば成体ヒトＢ細胞から調製することもできる。天然レパートリーは、例えば、Ｍａｒｋｓら、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１及びＶａｕｇｈａｎら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０９に記載されている。望まれる場合は、標的抗原を結合する、その点について天然レパートリー又は任意のレパートリーから識別されたクローンを変異させ、結合特性が向上した変異体を生成、選択するためにさらにスクリーニングする。
単一免疫グロブリン可変領域の合成レパートリーは、クローン化Ｖ領域に多様性を人工的に導入することによって調製される。合成レパートリーは、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；Ｂａｒｂａｓら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４４５７；Ｎｉｓｓｉｍら、１９９４、ＥＭＢＯ Ｊ．１３：６９２；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、１９９４、ＥＭＢＯ Ｊ．１３：３２４５；ＤｅＫｒｉｕｆら、１９９５、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：９７；及びＷＯ９９／２０７４９に記載されている。
従来の抗体の抗原結合領域は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（Ｖκ又はＶλでありうるＶＬ）の２つの個別的領域を含む。当該抗体の抗原結合部位は、ＶＨ領域からの３つのポリペプチドループ（Ｈ１、Ｈ２及びＨ３）とＶＬ領域からの３つのポリペプチドループ（Ｌ１、Ｌ２及びＬ３）からの３つのポリペプチドループの６つのポリペプチドループによって形成される。これらのループの境界は、例えばＫａｂａｔら（１９９１、前出）に記載されている。ＶＨ及びＶＬ領域をコードするＶ遺伝子の多様な一次レパートリーは、遺伝子セグメントの組合せ再編成によってインビボで生成される。ＶＨ遺伝子は、３つの遺伝子セグメントＶＨ、Ｄ及びＪＨの組換えによって生成される。ヒトには、ハプロタイプに応じて、約５１の機能的ＶＨセグメント（Ｃｏｏｋ及びＴｏｍｌｉｎｓｏｎ（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １６：２３７）、２５の機能的Ｄセグメント（Ｃｏｒｂｅｔｔら、（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６８：６９）、及び６つの機能的ＪＨセグメント（Ｒａｖｅｔｃｈら、（１９８１）Ｃｅｌｌ ２７：５８３）が存在する。ＶＨセグメントは、ＶＨ領域（Ｈ１及びＨ２）の第１及び第２の抗原結合ループを形成するポリペプチド鎖の領域をコードするのに対して、ＶＨ、Ｄ及びＪＨセグメントは結合して、ＶＨ領域（Ｈ３）の第３の抗原結合ループを形成する。
ＶＬ遺伝子は、ＶＬ及びＪＬの２つだけの遺伝子セグメントの組換えによって生成される。ヒトには、ハプロタイプに応じて、約４０の機能的Ｖκセグメント（Ｓｃｈａｂｌｅ及びＺａｃｈａｕ（１９９３）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ ３７４：１００１）、３１の機能的Ｖκセグメント（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６４：２２０；Ｋａｗａｓａｋｉら、（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：２５０）、５つの機能的Ｊκセグメント（Ｈｉｅｔｅｒら、（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１５１６）及び４つの機能的Ｊλセグメント（Ｖａｓｉｃｅｋ及びＬｅｄｅｒ（１９９０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：６０９）が存在する。ＶＬセグメントは、ＶＬ領域（Ｌ１及びＬ２）の第１及び第２の抗原結合ループを形成するポリペプチド鎖の領域をコードするのに対して、ＶＬ及びＪＬセグメントは、結合して、ＶＬ領域（Ｌ３）の第３の抗原結合ループを形成する。この一次レパートリーから選択された抗体は、少なくとも中程度の親和性でほぼすべての抗原を結合するのに十分に多様性を有すると考えられる。高親和性抗体は、点変異が生成され、結合の向上に基づいて免疫系により選択される再構成遺伝子の「親和性成熟」によってインビボで生成される。
抗体の構造及び配列の分析により、６つの抗原結合ループのうちの５つのループ（Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）は、主鎖構造又は標準構造の数が限られていることが示された（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１；Ｃｈｏｔｈｉａら、（１９８９）、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７）。主鎖構造は、（ｉ）抗原結合ループの長さ、及び（ｉｉ）抗原結合ループ及び抗体フレームワークにおける一定の主要位置の特定の残基又は残基の種類によって決定される。ループ長及び主要残基の分析は、大多数のヒト抗体配列によってコードされるＨ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の主鎖構造を予測することを可能にした（Ｃｈｏｔｈｉａら、（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．１４：４６２８；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６４：２２０）。Ｈ３領域は、（Ｄセグメントの使用により）配列、長さ及び構造の観点ではるかに多様性を有するが、ループ及び抗体フレームワークにおける主要位置の特定の残基の長さ及び存在、又は残基の種類に依存する短ループ長に対して限られた数の主鎖構造を形成する（Ｍａｒｔｉｎら、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：８００；Ｓｈｉｒａｉら、（１９９６）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３９９：１）。
本発明の一実施形態によれば、様々な抗原結合ループのＣＤＲにおける任意の部位に合成レパートリーの多様性を付加することが可能であるが、この手法は、適正に重畳しないため、抗原を結合する潜在性を有する分子の割合の低下に寄与するＶ領域の割合を高める。抗原結合ループの主鎖構造に寄与する残基を把握することによって、ＶＨ又はＶＬ領域の合成レパートリーにおいて多様化する特定の残基の識別が可能になる。すなわち、多様性は、主鎖構造を維持するのに不可欠でない残基に最適に導入される。一例として、ループＬ２の多様化について、従来の手法は、Ｋａｂａｔら（１９９１、前出）によって定められた対応するＣＤＲ（ＣＤＲ２）におけるすべての残基、すなわちある７つの残基を多様化することになる。しかし、Ｌ２については、位置５０と５３は、天然抗体では異なっており、抗原に接触することが観察されることが知られている。好ましい手法は、このループにおけるそれら２つの残基のみを多様化することになる。これは、一連の抗原結合特異性を作成するのに必要とされる機能的多様性の点で、有意な向上を示すものである。
一態様において、合成可変領域レパートリーは、人工的に多様化された生殖系列ＶＨ又はＶκに基づいて、ＶＨ又はＶκのバックグラウンドで調製される。例えば、ＶＨ領域レパートリーは、クローン化生殖系列ＶＨ遺伝子セグメントＶ３−２３／ＤＰ４７（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６８）及びＪＨ４ｂに基づく（図１及び２参照）。Ｖκ領域レパートリーは、例えば、生殖細胞Ｖκ遺伝子セグメントＯ２／Ｏ１２／ＤＰＫ９（Ｃｏｘら、１９９４、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７）及びＪκ１に基づく（図３参照）。多様性は、例えば、ＰＣＲ変異誘発によって、これら又は他の遺伝子セグメントに導入される。多様性は、例えば、誤りがちＰＣＲ（Ｈａｗｋｉｎｓら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９）又は化学的変異誘発によって無作為に導入されうる。しかし、上述したように、多様性の導入は、特定の残基に向けられるのが好ましい。所望の残基を、すべてのアミノ酸及びＴＡＧ停止コドンをコードする、変異誘発性プライマーを使用するコドンＮＮＫ（ＩＵＰＡＣ命名法（Ｎ＝Ｇ、Ａ、Ｔ又はＣ、且つＫ＝Ｇ又はＴ）を用いる）の導入の標的にすることが好ましい。ＮＮＮコドン（さらなる停止コドンＴＧＡ及びＴＡＡを生成させる）、ＤＶＴコドン（Ａ／Ｇ／Ｔ）（Ａ／Ｇ／Ｃ）Ｔ）、ＤＶＣコドン（（Ａ／Ｇ／Ｔ）（Ａ／Ｇ／Ｃ）Ｃ）及びＤＶＹコドン（（Ａ／Ｇ／Ｔ）（Ａ／Ｇ／Ｃ）（Ｃ／Ｔ）を含む、同様の目的を達成する他のコドンも使用される。ＤＶＴコドンは、天然のヒト抗体の抗原結合部位に対するアミノ酸残基の分布に最もよく似ている、２２％の血清及び１１％のチロシン、アスパラギン、グリシン、アラニン、アスパラテート、スレオニン及びシステインをコードする。レパートリーは、１つ又は複数の選択された縮重コドンを各部位に有するＰＣＲプライマーを使用して多様化される。ＰＣＲ変異誘発は、当該技術分野でよく知られているが、本発明の方法に有用なプライマー設計及びＰＣＲ変異誘発を以下の「ＰＣＲ変異誘発」の章で検討する。
一態様において、図１に示されるように、ＣＤＲ１、２及び３における多様性に対応する多様性を、部位Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２ａ、Ｈ５３、Ｈ５５、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９７及びＨ９８にＮＮＫコドンを使用して、ヒト生殖系列ＶＨ遺伝子セグメントＶ３−２３／ＤＰ４７（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６８）及びＪＨ４ｂに導入する。
他の態様において、図２に示されるように、ＣＤＲ１、２及び３における多様性に対応する多様性を、例えば、部位Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２ａ、Ｈ５３、Ｈ５５、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ９９、Ｈ１００、Ｈ１００ａ及びＨ１００ｂにＮＮＫコドンを使用して、ヒト生殖系列ＶＨ遺伝子セグメントＶ３−２３／ＤＰ４７及びＪＨ４ｂに導入する。
他の態様において、図３に示されるように、ＣＤＲ１、２及び３における多様性に対応する多様性を、例えば、部位Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５３、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４及びＬ９６にＮＮＫコドンを使用して、ヒト生殖系列Ｖκ遺伝子セグメントＯ２／Ｏ１２／ＤＰＫ９及びＪκ１に導入する。
当該技術分野で知られているように、且つ例えばＷＯ９９／２０７４９に記載されているように、多様化されたレパートリーをファージディスプレイベクターにクローン化する。概して、本発明を実施するのに必要とされる核酸分子及びベクター構築物は、当該技術分野で利用可能であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＵＳＡの如き標準的な実験マニュアルに記載されているように構築及び操作される。
本発明における核酸の操作は、典型的には、組換えベクターで実施される。本明細書に用いられているように、「ベクター」とは、異種ＤＮＡをその発現及び／又は複製のために細胞に導入するのに使用される個別の要素である。当該ベクターを選択又は構築し、次に使用するための方法は、当業者によく知られている。細菌プラスミド、バクテリオファージ、人工染色体及びエピソームベクターを含む多くのベクターが好適に利用可能である。当該ベクターを単純なクローニング及び変異誘発に使用することができる。或いは、本発明のレパートリー（プレレパートリー）メンバーが担持されるベクターの典型として、遺伝子発現ベクターが採用される。本発明に従って使用されるベクターは、所望のサイズ、典型的には０．２５キロベース（ｋｂ）から４０ｋｂの長さのポリペプチドコード化配列に対応するように選択される。インビトロクローニング操作の後に好適な宿主細胞をベクターで形質転換する。各ベクターは、一般にはクローニング（又は「ポリリンカー」）部位、複製起点及び少なくとも１つの選択可能なマーカー遺伝子を含む様々な機能的成分を含む。所定のベクターが発現ベクターである場合は、それは、本発明によるポリペプチドレパートリーメンバーをコードする遺伝子に機能的に結合されるように、それぞれクローニング部位の近傍に位置するエンハンサーエレメント、プロモーター、転写終結因子及びシグナル配列のいずれかをさらに有する。
クローニングベクター及び発現ベクターの双方は、一般には、ベクターが、１つ又は複数の選択された宿主細胞で複製することを可能にする核酸配列を含有する。クローニングベクターにおいて典型的には、この配列は、ベクターが、宿主染色体ＤＮＡと無関係に複製することを可能にし、複製起点、又は自立的に複製する配列を含む。当該配列は、様々な細菌、酵母及びウィルスについてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点は、たいていのグラム陰性細菌に好適であり、２ミクロンプラスミド起源は、酵母に好適であり、様々なウィルス起源（例えばＳＶ４０、アデノウィルス）は、哺乳類細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般には、複製起点は、哺乳類発現ベクターが、ＣＯＳ細胞の如き高レベルのＤＮＡを複製することが可能な哺乳類細胞に使用されなければ、当該ベクターに必要とされない。
有利には、クローニング又は発現ベクターも、やはり選択可能マーカーと称する選択遺伝子を含有する。この遺伝子は、選択培地で成長した形質転換された宿主細胞の生存又は成長に必要なタンパク質をコードする。したがって、選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されていない宿主細胞は、培地で生存しないことになる。典型的な選択遺伝子は、抗生物質及び他の毒素、例えばアンピシリン、ネオミシン、メトトレキセート又はテトラシクリンに対する耐性を与え、栄養要求欠乏を補い、或いは成長培地で得ることができない重要な栄養分を供給するタンパク質をコードする。
本発明によるベクターの複製は大腸菌において最も便利に実施されるため、大腸菌選択可能マーカー、例えば、抗生物質アンピシリンに対する耐性を与えるβ−ラクタマーゼ遺伝子が使用される。これらは、ｐＢＲ３２２、又はｐＵＣ１８若しくはｐＵＣ１９のようなｐＵＣプラスミドの如き大腸菌プラスミドから得ることが可能である。
発現ベクターは、宿主生物に認識され、対象とするコード化配列に機能的に結合されるプロモーターを通常含有する。当該プロモーターは、誘導性又は構成的でありうる。「作動的に結合される」という用語は、記載された成分が、それらが意図したように機能することを可能にする関係にある近位配列を意味する。コード化配列に「作動的に結合された」対照配列は、コード化配列の発現を対照配列に適合する条件下で達成するように結合される。
原核宿主生物に対する使用に好適なプロモーターとしては、例えば、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、及びｔａｃプロモーターの如きハイブリッドプロモーターが挙げられる。細菌系に使用されるプロモーターは、一般には、コード化配列に機能的に結合されたシャインダルガーノ配列をも含有することになる。
本明細書に記載されているライブラリー又はレパートリーにおいて、好ましいベクターは、ポリペプチドライブラリーメンバーに対応するヌクレオチド配列の発現を可能にする発現ベクターである。したがって、選択は、ポリペプチドライブラリーメンバーを発現する単一クローンの個別的な増殖及び発現、又は任意の選択ディスプレイ系の使用によって実施される。上述したように、好ましい選択ディスプレイ系は、バクテリオファージディスプレイを用いる。したがって、ファージ又はファージミドを使用することができる。好ましいベクターは、（二本鎖複製に対して）複製の大腸菌起源を有するとともに、（一本鎖ＤＮＡの生成に対して）複製のファージ起源を有するファージミドベクターである。当該ベクターの操作及び発現は、当該技術分野でよく知られている（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ（１９９２）前出；Ｎｉｓｓｉｍら、（１９９４）前出）。手短に述べると、ベクターは、β−ラクタマーゼ、又はプラスミドに関する選択性を与える選択可能マーカー遺伝子、（ＮからＣ末端が）（発現されたポリペプチドを細胞周辺腔に導く）ｐｅｌＢリーダー配列からなる発現カセットの上流のｌａｃプロモーター、（ライブラリーメンバーのヌクレオチドバージョンをクローン化するための）多重クローニング部位、場合によっては（検出用の）１つ又は複数のペプチドタグ、場合によっては１つ又は複数のＴＡＧ停止コドン、及びファージタンパク質ｐＩＩＩを含有する。大腸菌の様々なサプレッサー及び非サプレッサー株を使用し、グルコース、イソプロピルチオβ−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）、又はＶＣＳ Ｍ１３の如きヘルパーファージを加えると、ベクターは、発現のないプラスミドとして複製し、大量のポリペプチドライブラリーメンバーのみを生成し、又はそのいくつかがそれらの表面にポリペプチド−ｐＩＩＩの少なくとも１つのコピーを含有するファージを生成することが可能になる。
好ましいベクターの例としては、グルコースの存在下で抑制され、ＩＰＴＧにより誘発されるＬａｃＺプロモーターの制御下でｐＩＩＩ融合タンパク質の生成が行われるｐＨＥＮ１ファージミドベクター（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９１、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７；例えばＷＯ０３／０３１６１１における配列番号７のような配列が利用可能である）がある。大腸菌のサプレッサー株、例えばＴＧ１で成長されると、遺伝子ＩＩＩ融合タンパク質が生成され、ファージにおさめられるのに対して、非サプレッサー株、例えばＨＢ２１５１で成長されると、可溶性融合タンパク質の細菌周辺質及び培地への分泌を可能にする。遺伝子ＩＩＩの発現は、ヘルパーファージによる後の感染を防止するため、ファージミドベクターを収容する細菌は、ファージ解放のためのＶＣＳＭ１３ヘルパーファージによる感染前にグルコースの存在下で増殖される。
本発明によるベクターの構成には、従来の結合技術が採用される。単離されたベクター又はＤＮＡ断片は、切断され、調整され、必要なベクターを生成するのに望ましい形態で再結合される。要望に応じて、構成されたベクターに正しい配列が存在することを確認するための配列分析が、標準的な方法を用いて実施される。発現ベクターを構成し、インビトロで転写物を調製し、ＤＮＡを宿主細胞に導入し、発現及び機能を評価するための分析を実施するための好適な方法は、当業者に知られている。試料中の遺伝子配列の存在を検出し、その増幅及び／又は発現をサザン又はノザン解析、ウェスタンブロット法、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質のドットブロット法、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、免疫細胞化学法、又は核酸若しくはタンパク質分子の配列解析の如き従来の方法によって定量化する。要望に応じて、それらの方法をどのように変更できるかを当業者なら容易に認識するであろう。
ＰＣＲ変異誘発
プライマーは、ポリペプチドレパートリーメンバーをコードする核酸レパートリーメンバーの集合体の調製に使用される核酸分子のプールに存在する標的分子の一部に対して相補的である。プライマーは、化学又は酵素的合成方法によって調製されることが最も多い。変異誘発性オリゴヌクレオチドプライマーは、一般には、長さが１５から１００ヌクレオチド、理想的には２０から４０ヌクレオチドであるが、異なる長さのオリゴヌクレオチドも使用される。
典型的には、２つの核酸配列が実質的に相補的である（少なくとも１４から２５のヌクレオチドの範囲にわたって少なくとも約６５％の相補性、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８５％又は９０％の相補性）。参照により本明細書に組み込まれているＫａｎｅｈｉｓａ、１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：２０３を参照されたい。結果として、プライミング部位におけるある程度の不一致は許容されることが期待される。当該不一致は、モノ、ジ又はトリヌクレオチドの如き小さいものでありうる。或いは、それは、不一致が、連続した４以上のヌクレオチドを包含する領域として本明細書に定められているヌクレオチドループを含むことができる。
概して、５つの要因が、第２の核酸分子に対するプライマーのハイブリダイゼーションの効率性及び選択性に影響を与える。これらの要因は、（ｉ）プライマーの長さ、（ｉｉ）ヌクレオチド配列及び／又は組成物、（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーション温度、（ｉｖ）緩衝化学作用及び（ｖ）プライマーをハイブリダイズさせることが必要な領域における立体障害の潜在性であって、非無作為的なプライミング配列が設計される場合は重要な要素である。
プライマーの長さと、プライマーを標的配列にアニールする効率性及び精度との間には正の相関性がある。より長い配列はより短い配列より融解温度（ＴＭ）が高く、所定の標的配列内で繰り返される可能性がより低いことにより、乱交雑ハイブリダイゼーションを最小限にする。二分子ではなく、一分子のハイブリダイゼーション運動は一般には溶液において好適であるため、Ｇ−Ｃ含有率が高い、又は回文配列を含むプライマー配列は、それらの意図する標的部位のように、自己ハイブリダイズする傾向がある。それと同時に、標的配列に緻密に結合するのに十分な数のＧ−Ｃヌクレオチド対を含有するプライマーを設計することは、それぞれの当該対は、Ａ塩基とＴ塩基が対合する時に見られる２つの水素結合ではなく、３つの水素結合によって結合されるため重要である。ハイブリダイゼーション温度は、ハイブリダイゼーション混合物に含まれうる有機溶媒、例えばホルムアミドの濃度のように、プライマーアニーリング効率に逆比例して変化するが、塩濃度の増加は、結合を促進させる。厳密なハイブリダイゼーション条件下では、より長いプローブは、より許容的な条件下では十分であるより短いプローブより効率的にハイブリダイズする。プライマーに対する厳密なハイブリダイゼーション条件は、典型的には、約１Ｍ未満、より一般的には約５００ｍＭ未満、好ましくは約２００ｍＭ未満の塩濃度を含む。ハイブリダイゼーション温度は、０℃から２２℃より高い温度、約３０℃より高い温度、そして（最も多くは）約３７℃を超える温度の範囲にある。より長い断片は、特定のハイブリダイゼーションに対してより高いハイブリダイゼーション温度を必要とすることがある。いくつかの要因がハイブリダイゼーションの厳密性に影響を与えるため、パラメータの組合せの方が、ある単独のパラメータの絶対測定値より重要である。
プライマーは、これらの要素を念頭において設計される。多くの配列の相対的長所を当業者が頭で推定することができるが、これらのいくつかのパラメータの評価及びプライマー配列の最適化を支援するコンピュータプログラムが設計された。当該プログラムの例としては、ＤＮＡＳｔａｒ（商標）ソフトウェアパッケージ（ＤＮＡＳｔａｒ，Ｉｎｃ．（ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ所在）の「ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ」及びＯＬＩＧＯ４．０（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）がある。好適なオリゴヌクレオチドが設計されると、好適な方法、例えばいずれも参照により本明細書に組み込まれているＢｅａｕｃａｇｅ及びＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ、１９８１、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２：１８５９に記載されているホスホラミダイト法、又はＭａｔｔｅｕｃｃｉ及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ、１９８１、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５に記載されているトリエステル法、或いは市販の自動ヌクレオチド合成装置、又は例えばＶＬＳＩＰＳ（商標）技術を用いた他の化学的方法によって調製される。
ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡ（少なくとも１ｆｇ、より実用的には１〜１０００ｎｇ）及び少なくとも２５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して実施される。各配列は、プライマープールの分子のごく小さい部分で表され、後の増幅サイクルにおいて量が限定されるため、プライマープールが極めて不均一である場合はより多量のプライマーを使用するのが有利でありうる。典型的な反応混合物は、２μｌのＤＮＡ、２５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプライマー、２．５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液１（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、０．４μの１．２５μＭ ｄＮＴＰ、０．１５μｌ（又は２．５単位）のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、及び全体積が２５μｌとなる量の脱イオン水を含む。ミネラルオイルを重層し、プログラム式サーマルサイクラーを使用してＰＣＲが実施される。
ＰＣＲサイクルの各工程の長さ及び温度、並びにサイクル数は、実際の厳密性要件に従って調整される。アニーリング温度及びタイミングは、ともに、プライマーを鋳型にアニールする効率性、及び許容される不一致の程度によって決定づけられる。明らかに、核酸分子が同時に増幅及び変異誘発される場合は、合成の少なくとも第１ラウンドにおいて不一致が必要とされる。変異誘発性プライマーの混合プールを使用して分子の集団を増幅する試みにおいて、単に低融解温度に起因する潜在的変異生成物の厳密な（高温）アニーリング条件下での損失を、プライマーの標的部位以外の配列への無差別なアニーリングに対して計量する。プライマーアニーリング条件の厳密性を最適化する能力は、当業者の知識に十分に含められる。３０℃と７２℃の間のアニーリング温度が用いられる。通常は９２℃と９９℃の間の温度で４分間にわたって鋳型分子の最初の変性が生じ、その後に変性（９４〜９９℃、１５秒から１分）、アニーリング（上述のように決定された温度；１〜２分）及び伸長（７２℃、増幅生成物の長さに応じて１から５分）からなる２０〜４０のサイクルが続く。最後の伸長は、一般には、７２℃で４分間にわたって行われ、その後に４℃の無期限の（０〜２４時間の）工程が行われてもよい。
抗原結合についてのｄＡｂｓのスクリーニング
ファージの表面におけるｄＡｂｓのレパートリーの発現に続いて、ファージレパートリーを固定された標的抗原と接触させ、洗浄して未結合ファージを除去し、結合ファージを増殖させることによって選択が行われ、その全プロセスは「パニング」と称する。或いは、ファージは、重畳メンバーによってのみ結合される固定汎用リガンド（例えばタンパク質Ａ又はタンパク質Ｌ）に対するパニングによって、適正に重畳されたメンバー変異体の発現について予備選択される。これには、非機能的メンバーの割合を減少させることによって、標的抗原を結合する可能性の高いメンバーの割合を増加させるという長所がある。汎用リガンドによる予備選択は、ＷＯ９９／２０７４９に教示されている。ファージ抗体ライブラリーのスクリーニングは、例えばＨａｒｒｉｓｏｎら、１９９６、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６７：８３−１０９に広く記載されている。
スクリーニングは、個体支持体、例えばプラスチックチューブ又はウェル、或いはクロマトグラフィマトリックス、例えばＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に固定された生成済み抗原を使用して一般的に実施される。スクリーニング又は選択は、細胞の表面の如き複合抗原上でも実施されうる（Ｍａｒｋｓら、１９９３、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１１４５；ｄｅ Ｋｒｕｉｆら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：３９３８）。別法は、溶液中のビオチン化抗原を結合した後に、ストレプトアビジン被覆ビーズに捕捉することによる選択を含む。
好ましい態様において、パニングは、チューブ又はプレート内のウェル、例えばＮｕｎｃ ＭＡＸＩＳＯＲＰ（商標）免疫チューブ８ウェルストリップに（汎用又は特定）抗原を固定することによって実施される。ウェルを１５０μｌの抗原（ＰＢＳ中１００μｇ／ｍｌ）でコーティングし、一晩インキュベートする。次いで、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、３７℃にて２時間にわたって４００μｌのＰＢＳ−２％スキムミルク（２％ＭＰＢＳ）でブロッキングる。その混合物を室温にて９０分間インキュベートし、未結合ファージを含有する液体を除去する。ウェルをＰＢＳ−０．１％ツイーン２０で１０回濯ぎ、次いでＰＢＳで１０回濯いで、洗剤を除去する。２００μｌの新たに調製した１００ｍＭトリエチルアミンを添加し、十分に混合し、室温にて１０分間インキュベートすることによって、結合ファージを溶出する。溶出されたファージを、１００μｌの１ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）を含むチューブに移し、撹拌して、トリエチルアミンを中和する。指数関数的に増殖する大腸菌宿主細胞（例えばＴＧ１）を３７℃で３０分間のインキュベートによって例えば１５０ｍｌの希釈ファージに感染させる。感染細胞をスピンダウンさせ、新しい培地に再懸濁させ、上層アガロースに播種する。ファージプラークを溶出、又は宿主細胞の新たな培養物に突っ込んで、分析又はさらなる選択ラウンドに向けて増殖させる。必要ならば１つ又は複数のラウンドのプラーク生成を実施して、ナイーブな選択ファージの集団を確保する。他のスクリーニング手法は、Ｈａｒｒｉｓｏｎら、１９９６、前出に記載されている。
ｐＨＥＮ１の如きファージミドベクターが使用された場合に、所望の標的を結合する単一免疫グロブリン可変領域を発現するファージの識別に続いて、細菌の非サプレッサー株、例えば可溶性遺伝子ＩＩＩ融合タンパク質の分泌を可能にするＨＢ２１５１を感染することによって、可変領域融合タンパク質を可溶形態で容易に生成する。或いは、Ｖ領域配列を適切な発現ベクターにサブクローン化して、当該技術分野で知られている方法に従って可溶性タンパク質を生成することが可能である。
ｄＡｂｓの精製及び濃縮
細胞周辺腔又は細菌の培地に分泌されたｄＡｂポリペプチドは、回収され、知られている方法に従って精製される（Ｈａｒｒｉｓｏｎら、１９９６、前出）。Ｓｋｅｒｒａ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８）及びＢｒｅｉｔｌｉｎｇら（１９９１、Ｇｅｎｅ １０４：１４７）には、ペリプラズムからの抗体ポリペプチドの回収が記載されており、Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１）には、培養上澄みからの回収が記載されている。タンパク質Ａ又はタンパク質Ｌの如き汎用リガンドに対する結合によって精製を達成することも可能である。或いは、親和性クロマトグラフィによる精製を容易にするペプチドタグ、例えばＭｙｃ、ＨＡ又は６×−Ｈｉｓタグで可変領域を発現することが可能である。
ポリペプチドは、例えば限外濾過、ダイアフィルトレーション及びタンジェンシャルフローフィルトレーションを含む、当該技術分野でよく知られているいくつかの方法によって濃縮される。限外濾過のプロセスは、半透膜及び圧力を用いて、分子種をサイズ及び形状に基づいて分離する。圧力は、ガス圧又は遠心によって与えられる。例えばＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（マサチューセッツ州Ｂｅｄｆｏｒｄ所在；例としてはＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（商標）及びＭｉｃｒｏｃｏｎ（商標）濃縮器が挙げられる）及びＶｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ（ドイツＨａｎｎｏｖｅｒ所在；例としてはＶｉｖａｓｐｉｎ（商標）濃縮器が挙げられる）による市販の限外濾過製品が広く利用可能である。標的ポリペプチドより小さい分子量カットオフ（１０ｋＤ程度の差を問題なく用いることができるが、通常は標的ポリペプチドの分子量の１／３から１／６）を選択することによって、溶媒及びより小さい溶質が膜を通過する場合もポリペプチドは保持される。したがって、本明細書に記載されているｄＡｂポリペプチドの濃縮には約５ｋＤの分子量カットオフが有用である。
ポリペプチド調製において塩又は緩衝液を除去又は交換するのが望ましい場合には、「洗浄」プロセスに限外濾過膜を使用するダイアフィルトレーションが用いられる。ポリペプチドは、溶媒及び小さい溶質を膜に通すことによって濃縮され、残留する塩又は緩衝液は、保持されたポリペプチドを要望に応じて新たな緩衝液又は塩溶液又は水で希釈しながら限外濾過を続けることによって除去される。連続的ダイアフィルトレーションでは、新たな緩衝液が、濾過液が膜を通過するのと同じ速度で添加される。ダイアフィルトレーション容量は、ダイアフィルトレーションの開始前のポリペプチド溶液の体積であり、連続的なダイアフィルトレーションを用いると、６のダイアフィルトレーション容量を新たな緩衝液で洗浄することによって、９９．５％を上回る量の完全透過性溶質を除去することが可能である。或いは、試料を繰り返し希釈し、次いで濾過して本来の体積に戻して、塩又は緩衝液を除去又は交換し、究極的にポリペプチドを濃縮する不連続的な方法で、そのプロセスを実施することが可能である。ダイアフィルトレーションのための装置、及びその使用のための詳細な手法は、例えば、Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ミシガン州Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ所在）及びＳａｒｔｏｒｉｕｓ ＡＧ／Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ（ドイツＨａｎｎｏｖｅｒ所在）から入手可能である。
「クロスフロー濾過」としても知られているタンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）も限外濾過膜を使用する。標的ポリペプチドを含有する流体が、膜の表面に沿って接線方向に吸引される。圧力によって、流体の一部が、膜を通過する一方、標的ポリペプチドはフィルタ上方に保持される。しかし、標準的な限外濾過とは異なり、保持された分子は、膜の表面に蓄積せず、接線流によって運び去られる。フィルタを通過しない溶液（標的ポリペプチドを含有する）は、膜に繰り返し循環されて、所望の濃度を達成することができる。ＴＦＦのための装置、及びその使用のための詳細な手法は、例えば、Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅ（例えばＰｒｏＦｌｕｘ Ｍ１２（商標）Ｂｅｎｃｈｔｏｐ ＴＦＦシステム及びＰｅｌｌｉｃｏｎ（商標）システム）及びＰａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（例えばＭｉｎｉｍ（商標）タンジェンシャルフローフィルトレーションシステム）から入手可能である。
タンパク質濃度は、当該技術分野でよく知られているいくつかの方法で測定される。これらの方法としては、例えば、アミノ酸分析、２８０ｎｍにおける吸収、「ブラッドフォード」及び「ローリー」法、並びにＳＤＳ−ＰＡＧＥが挙げられる。最も高精度な方法は、全加水分解の後に、ＨＰＬＣによるアミノ酸分析を行うもので、次いで、ｄＡｂポリペプチドの知られている配列との比較により濃度を求める。この方法は最も高精度であるが、高価で時間がかかる。２８０ｎｍのＵＶ吸収の測定によるタンパク質測定は、より高速で、はるかに安価であるが、比較的高精度であり、アミノ酸分析に対する妥協として好まれている。２８０ｎｍの吸収を用いて、本明細書に記載されている実施例に報告されているタンパク質濃度を測定した。
「ブラッドフォード」及び「ローリー」タンパク質試験（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、１９７６、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５４；Ｌｏｗｒｙら、１９５１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３：２６５−２７５）は、試料タンパク質濃度を最も頻繁にはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に基づく標準曲線と比較する。これらの方法は、精度が劣り、単一免疫グロブリン可変領域の濃度を実際より低く見積もる傾向がある。しかし、ＶＨ又はＶκ単一領域ポリペプチドを標準として使用することによってそれらの精度を向上させることが可能である。
さらなるタンパク質試験法は、（参照により本明細書に組み込まれている）米国特許第４，８３９，２９５号に記載され、「ＢＣＡタンパク質試験（ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ）」（例えばピアスカタログ第２３２２７）としてＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ所在）が販売するビシンコニン酸試験である。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法は、知られている標準濃度、例えば単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチドの知られている量と比較するゲル電気泳動及びクーマシーブルー染色を用いる。肉眼又は濃度測定によって定量することが可能である。
第３の態様において、本発明は、第１の結合特異性を有する第１の免疫グロブリン単一可変領域と、第２の（異なる）結合特異性を有する第２の単一免疫グロブリン単一可変領域とを含むリガンドであって、該結合特異性の一方又は両方が、インビボで該リガンドの半減期を増加させる抗原に対して特異的であるリガンドを製造するための方法であって、（ａ）第１の可変領域を第１のエピトープに結合するその能力によって選択する工程と、（ｂ）第２の可変領域を第２のエピトープに結合するその能力によって選択する工程と、（ｃ）可変領域を組み合わせる工程と、（ｄ）リガンドを前記第１のエピトープ及び前記第２のエピトープに結合するその能力によって選択する工程とを含む方法を提供する。
リガンドは、第１及び第２のエピトープに同時に結合することが可能であり、或いは結合領域間にエピトープ結合をめぐる競合が存在する場合は、一方の領域の結合は、その同族のエピトープに対する他の領域の結合を排除することができる。したがって、一実施形態において、上記工程（ｄ）は、第１及び第２の（そして恐らくはさらなる）エピトープに同時に結合することを必要とし、他の実施形態において、第１及び第２のエピトープに対する結合は同時に行われない。
エピトープは、好ましくは個別の抗原上に存在する。
リガンドは、有利には、上述したように、免疫グロブリン可変領域のＶＨ／ＶＬの組合せ、又はＶＨ／ＶＨ若しくはＶＬ／ＶＬの組合せを含む。リガンドは、さらに、インビボでリガンドの半減期を増加させる抗原に対して特異的なＶＨＨ領域が、ニワトリ卵白リソザイム（ＨＥＬ）、ブタ膵臓α−アミラーゼ又はＮｍＣ−Ａを結合しなければ、ラクダＶＨＨ領域を含むことができる。半減期を増加させる抗原に対する特異性を用いて、インビボでリガンドの半減期を増加させることをいずれも記載していないＣｏｎｒａｔｈら、（２００１）ＪＢＣ ２７６：７３４６−７３５０及びＷＯ９９／２３２２１に記載されているように、ブタ、ＢＳＡ結合ＲＲ６アデノシン５染料若しくはＳ．は、ＨＧ９８２細胞を変異させる。
一実施形態において、前記第１の可変領域は、相補的可変領域の不在下で、前記第１のエピトープに対する結合について選択される（すなわち、上述したようにｄＡｂとして選択される）。さらなる実施形態において、前記第１の可変領域は、前記第２の可変領域と異なり、第１の領域に対して相補的である第３の可変領域の存在下で、前記第１のエピトープ／抗原に対する結合について選択される。同様に、第２の領域は、相補的可変領域の不在又は存在下で選択されうる。
半減期を増加させるタンパク質に加えて、本発明のリガンドが標的とする抗原又はエピトープは、任意の抗原又はエピトープであってもよいが、有利には、治療的有益性について標的とされる抗原又はエピトープである。本発明は、任意の当該標的、特には本明細書にさらに特定される標的に対して特異的な開放構造、閉鎖構造及び隔離ｄＡｂ単量体リガンドを含むリガンドを提供する。当該標的は、天然であっても合成であってもよいポリペプチド、タンパク質又は核酸、或いはその一部であってもよい。この点において、本発明のリガンドは、エピトープ又は抗原を結合し、アンタゴニスト又はアゴニスト（例えばＥＰＯ受容体アゴニスト）として作用することができる。選択は、広く多様であることを当業者なら理解するであろう。
それらは、例えば、ヒト又は動物タンパク質、サイトカイン、サイトカイン受容体、酵素、酵素に対する補因子、又はＤＮＡ結合タンパク質であってもよい。本明細書に記載されている一又は二重特異性結合ポリペプチドが標的とすることができる好適なサイトカイン及び成長因子としては、ＡｐｏＥ、Ａｐｏ−ＳＡＡ、ＢＤＮＦ、ＢＬｙＳ、カルジオトロフィン−１、ＥＧＦ、ＥＧＦ受容体、ＥＮＡ−７８、エオタキシン、エオタキシン−２、エキソダス−２、ＥｐｏＲ、酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦ、繊維芽細胞成長因子−１０、ＦＬＴ３リガンド、フラクタルキン（ＣＸ３Ｃ）、ＧＤＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＦ−０１、インシュリン、ＩＦＮ−ｙ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ−、ＩＬ−１ｐ、２０ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８（７２ａ．ａ．）、ＩＬ−８（７７ａ．ａ．）、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８（ＩＧＩＦ）、インヒビンα、インヒビンＢ ＩＰ−１０、ケラチオサイト成長因子−２（ＫＧＦ−２）、ＫＧＦ、レプチン、ＬＩＦ、リンホタクチン、ムレリアン阻害物質、単細胞コロニー阻害因子、単細胞誘引タンパク質、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＤＣ（６７ａ．ａ．）、ＭＤＣ（６９ａ．ａ．）、ＭＣＰ−１（ＭＣＡＦ）、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＩＧ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＭＩＰ３α、ＭＩＰ３β、ＭＩＰ−４、骨髄前駆体阻害因子−１（ＭＰＩＦ−１）、ＮＡＰ−２、ニュールツリン、神経成長因子、β−ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、オンコスタチンＭ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＦ−４、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ１２、ＳＤＦ１β、ＳＣＦ、ＳＣＧＦ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＴＡＲＣ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ受容体Ｉ、ＴＮＦ受容体ＩＩ、ＴＮＩＬ−１、ＴＰＯ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体１、ＶＥＧＦ受容体２、ＶＥＧＦ受容体３、ＧＣＰ−２、ＧＲＯ／ＭＧＳＡ、ＧＲＯ−β、ＧＲＯ−８、ＨＣＣ１、１−３０９、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＴＡＣＥ認識部位、ＴＮＦ ＢＰ−Ｉ及びＴＮＦ ＢＰ−ＩＩ、並びに本明細書の付属書に記載されている組合せ、異なる組合せ、又は個別に存在している付属書２又は付属書３に開示されている任意の標的が挙げられるが、それらに限定されない。
記載したように、好ましいリガンドは、単独で、合わせて、且つ／又は抗ＨＳＡ結合活性とともにＴＮＦ−α及びＶＥＧＦを含む。
サイトカイン受容体は、先述のサイトカインに対する受容体を含む。このリストは網羅的でないことが理解されるであろう。
本発明の一実施形態において、可変領域は、抗原又はエピトープに対して導かれたそれぞれの抗体から誘導される。好ましい実施形態において、可変領域は、単一可変抗体領域のレパートリーから誘導される。
さらなる態様において、本発明は、本明細書に定められている少なくとも１つの二重特異性リガンドをコードする１つ又は複数の核酸分子を提供する。
二重特異性リガンドを単一核酸分子でコードすることができる。或いは、核領域を個別の核酸分子でコードすることができる。リガンドが単一核酸分子でコードされる場合は、領域を、ｓｃＦｖ分子の様式で、融合タンパク質として発現してもよいし、個別に発現し、次に、例えば化学結合剤を使用して互いに結合させてもよい。個別の核酸から発現されたリガンドは、適切な手段により互いに結合されることになる。
核酸は、発現されるとポリペプチドを宿主細胞から搬出するためのシグナル配列をさらにコードすることができ、発現と同時に糸状バクテリオファージ粒子（又は選択表示系の他の成分）の表面成分に融合することができる。
さらなる態様において、本発明は、本発明による二重特異性リガンドをコードする核酸を含むベクターを提供する。
さらなる態様において、本発明は、本発明による二重特異性リガンドをコードするベクターをトランスフェクトした宿主細胞を提供する。
当該ベクターからの発現を、例えばバクテリオファージ粒子の表面に選択のための可変領域を生成するように構成することができる。これにより、表示された可変領域の選択が可能になるため、本発明の方法を用いた「二重特異性リガンド」の選択が可能になる。
本発明は、本発明による少なくとも１つの二重特異性リガンドを含むキットをさらに提供する。
本発明による二重特異性リガンドは、好ましくは、重鎖及び軽鎖領域の組合せを含む。例えば、二重特異性リガンドは、ｓｃＦｖの形態で互いに結合されうるＶＨ領域及びＶＬ領域を含むことができる。加えて、リガンドは、１つ又は複数のＣＨ又はＣＬ領域を含むことができる。例えば、リガンドは、ＣＨ１領域、ＣＨ２又はＣＨ３領域、及び／又はＣＬ領域、Ｃμ、Ｃμ２、Ｃμ３又はＣμ４領域、或いはその組合せを含むことができる。ヒンジ領域を含むこともできる。当該領域の組合せは、例えば、ＩｇＧ又はＩｇＭの如き天然抗体、或いはＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ‘）２分子の如きその断片に類似していてもよい。ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１及びＣＬ領域を含むＩｇＧ分子の単一腕の如き他の構造も考えられる。
本発明の好ましい実施形態において、可変領域は、単一領域Ｖ遺伝子レパートリーから選択される。一般には、単一抗体領域のレパートリーは、糸状バクテリオファージの表面に表示される。好ましい実施形態において、各単一抗体領域は、ファージレパートリーの抗原に対する結合によって選択される。
本発明の好ましい実施形態において、各単一可変領域を相補的可変領域の不在下におけるその標的抗原又はエピトープに対する結合について選択することができる。代替的な実施形態において、単一可変領域を相補的可変領域の存在下におけるその標的抗原又はエピトープに対する結合について選択することができる。したがって、第１の単一可変領域を第３の相補的可変領域について選択することができ、第２の可変領域を第４の相補的可変領域の存在下で選択することができる。相補的な第３又は第４の可変領域は、試験されている単一領域と同じ特異性を有する天然の同族可変領域、又は「ダミー」可変領域の如き非同族相補的領域であってもよい。
好ましくは、本発明の二重特異性リガンドは、２つの可変領域のみを含むが、いくつかの当該リガンドをともに同一のタンパク質に組み込むことができ、例えば２つの当該リガンドをＩｇＧ、又はＩｇＭの如き多量体免疫グロブリンに組み込むことができる。或いは、他の実施形態において、複数の二重特異性リガンドを組み合わせて、多量体を形成する。例えば、２つの異なる二重特異性リガンドを組み合わせて、四重特異性分子を作る。
本発明の方法に従って製造された二重特異性リガンドの軽及び重可変領域は、同一のポリペプチド鎖に存在していてもよいし、或いは異なるポリペプチド鎖に存在していてもよいことを当業者なら理解するであろう。可変領域が異なるポリペプチド鎖に存在する場合は、それらは、リンカー、一般には（ポリペプチド鎖の如き）柔軟性リンカー、化学結合基、又は当該技術分野で知られている任意の他の方法を介して結合されうる。
さらなる態様において、本発明は、本発明の方法によって得られた二重特異性リガンド、及び薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含む組成物を提供する。
さらに、本発明は、本発明による「二重特異性リガンド」又は組成物を使用する疾病の治療及び／又は予防のための方法を提供する。
第２の構成において、本発明は、少なくとも２つの非相補的可変領域を含む多重特異性リガンドを提供する。例えば、一対のＶＨ領域又は一対のＶＬ領域を含むことができる。有利には、それらの領域は、非ラクダ由来の領域である。それらは、好ましくは、ヒト領域である、又はヒトフレームワーク領域（ＦＷ）及び１つ又は複数の非相同的ＣＤＲを含む。ＣＤＲ及びフレームワーク領域は、免疫学に関するタンパク質の配列のＫａｂａｔデータベースにおいて考えられる免疫グロブリン可変領域の領域である。
好ましいヒトフレームワーク領域は、生殖系列遺伝子セグメントＤＰ４７及びＤＰＫ９によってコードされる領域である。有利には、ＶＨ又はＶＬ領域のＦＷ１、ＦＷ２及びＦＷ３は、ＤＰ４７又はＤＰＫ９からのＦＷ１、ＦＷ２又はＦＷ３の配列を有する。ヒトフレームワークは、場合によっては、変異、例えば約５までのアミノ酸変化又は約１０までのアミノ酸変化を本発明のリガンドに使用されるヒトフレームワークに一括して含むことができる。
本発明の第２の構成による多重特異性リガンドにおける可変領域を開放又は閉鎖構造で配置することができる。すなわち、可変領域は、それらの同族リガンドを独立的且つ同時に結合することができるように、或いは可変領域のうちの１つの領域のみが一度にその同族リガンドを結合することができるように、配置することができる。
本発明人らは、一定の構造的条件下において、非相補的可変領域（例えば２つの軽鎖可変領域又は２つの重鎖可変領域）は、当該非相補的領域が同族対としてともに機能しなくても、第１のエピトープの第１の可変領域に対する結合が、第２のエピトープの第２の可変領域に対する結合を抑制するように存在しうることを認識した。
有利には、リガンドは、２対以上の可変領域を含む。すなわち、少なくとも４つの可変領域を含む。有利には、４つの可変領域は、ヒト由来のフレームワークを含む。
好ましい実施形態において、ヒトフレームワークは、ヒト生殖系列配列のフレームワークと同一である。
本発明人らは、当該抗体は、治療及び他の用途に対するリガンド結合試験に特定の用途を有するものと考える。
したがって、第２の構成の第１の態様において、本発明は、多重特異性リガンドを製造するための方法であって、ａ）第１のエピトープ結合領域を第１のエピトープに結合するその能力によって選択する工程と、ｂ）第２のエピトープ結合領域を第２のエピトープに結合するその能力によって選択する工程と、ｃ）エピトープ結合領域を組み合わせる工程と、ｄ）閉鎖構造多重特異性リガンドを前記第１の第２のエピトープ及び前記第２のエピトープに結合するその能力によって選択する工程とを含む方法を提供する。
第２の構成のさらなる態様において、本発明は、第１のエピトープ結合特異性を有する第１のエピトープ結合領域と、第２のエピトープ結合特異性を有する非相補的な第２のエピトープ結合領域とを含み、第１及び第２の結合特異性は、閉鎖構造多重特異性リガンドが両方のエピトープを同時に結合することができないように、エピトープ結合をめぐって競合する閉鎖構造多重特異性リガンドを調製するための方法であって、ａ）第１のエピトープ結合領域を第１のエピトープに結合するその能力によって選択する工程と、ｂ）第２のエピトープ結合領域を第２のエピトープに結合するその能力によって選択する工程と、ｃ）エピトープ結合領域を、それらの領域が閉鎖構造になるように組み合わせる工程と、ｄ）閉鎖構造多重特異性リガンドを、前記第１の第２のエピトープ及び前記第２のエピトープに結合するが、前記第１及び第２のエピトープに同時に結合しないその能力によって選択する工程とを含む方法を提供する。
さらに、本発明は、第１のエピトープ結合特異性を有する第１のエピトープ結合領域と、第２のエピトープ結合特異性を有する非相補的な第２のエピトープ結合領域とを含み、第１及び第２の結合特異性は、閉鎖構造多重特異性リガンドが両方のエピトープを同時に結合することができないように、エピトープ結合をめぐって競合する閉鎖構造多重特異性リガンドを提供する。
本発明の第２の構成の上記態様の代替的な実施形態は、場合によっては、第３又はさらなるエピトープ結合領域を選択することを含むさらなる工程（ｂｌ）を含む。このように、製造された多重特異性リガンドは、開放構造であっても閉鎖構造であっても、２つ以上のエピトープ結合特異性を含む。本発明の第２の構成の好ましい態様において、多重特異性リガンドが２つ以上のエピトープ結合領域を含む場合は、前記領域のうちの少なくとも２つは閉鎖構造であり、結合をめぐって競合する。他の領域は、結合をめぐって競合してもよいし、それらの同族エピトープと独立的に会合するように遊離していてもよい。
本発明によれば、「多重特異性リガンド」という用語は、本明細書に定められる２つ以上のエピトープ結合特異性を有するリガンドを意味する。
本明細書に定められるように、「閉鎖構造」（多重特異性リガンド）という用語は、１つのエピトープ結合領域によるエピトープ結合が、他のエピトープ結合領域によるエピトープ結合と競合するように、リガンドのエピトープ結合領域が、場合によってはタンパク質骨組によって、互いに結合又は会合することを意味する。すなわち、同族エピトープは、各エピトープ結合領域によって個々に結合されうるが、同時に結合できない。本明細書に記載されている方法を用いて、リガンドの閉鎖構造を達成することが可能である。
「開放構造」とは、１つのエピトープ結合領域によるエピトープ結合が、他のエピトープ結合領域によるエピトープ結合と競合しないように、リガンドのエピトープ結合領域が、場合によってはタンパク質骨組によって、互いに結合又は会合することを意味する。
本明細書で参照されるように、「競合する」という用語は、第２のエピトープがその同族結合領域に結合される場合に第１のエピトープのその同族エピトープ結合領域に対する結合が阻害されることを意味する。例えば、結合は、例えば結合領域の物理的遮断によって、或いは結合領域の構造又は環境が、エピトープに対するその親和性又は結合活性が低減されるように変化することによって立体的に阻害されうる。
本発明の第２の構成のさらなる態様において、エピトープは、結合すると互いに変位させうる。例えば、第１のエピトープは、その同族の第１の結合領域に結合すると、第２の結合領域に結合されたエピトープを変位させる、第２の結合領域の立体障害又はその構造変化を引き起こす抗原上に存在しうる。
有利には、結合は、２５％以上、有利には４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以上、好ましくは結合が完全に阻害されるように１００％付近まで低減される。ＥＬＩＳＡの如き従来の抗原結合試験、ＦＲＥＴを含む蛍光をベースとした技術、或いは分子の質量を測定する表面プラスモン共鳴の如き技術によって、エピトープの結合を測定することが可能である。
本発明の方法によれば、有利には、各エピトープ結合領域は、エピトープ結合特異性が異なる。
本発明の範囲において、第１及び第２の「エピトープ」は、同一でなく、単一の一特異性リガンドによって結合されないエピトープであると理解される。それらは、異なる抗原又は同一の抗原に存在しうるが、従来の抗体の単一の一特異性ＶＨ／ＶＬ結合対によって結合されうる単一物体を形成しない程度の距離だけ離れていてもよい。実験的に、単一鎖抗体形態（領域抗体又はｄＡｂｓ）の個々の可変領域の双方が、２つのエピトープに対して一特異性ＶＨ／ＶＬリガンドと個別に競合する場合は、それらの２つのエピトープは、本発明による個別のエピトープと見なされるほど十分に離れていない。
本発明の閉鎖構造一特異性リガンドは、ＷＯ０２／０２７７３に記載されているリガンドを含んでいない。したがって、本発明のリガンドは、任意の１つ又は複数の抗原又はエピトープを共同で結合する相補的ＶＨ／ＶＬ対を含まない。その代わりに、本発明によるリガンドは、好ましくは、非相補的なＶＨ又はＶＬ対を含む。有利には、各ＶＨ又はＶＬ対における各ＶＨ又はＶＬは、異なるエピトープ結合特異性を有し、エピトープ結合部位は、１つの部位におけるエピトープの結合が他の部位におけるエピトープの結合と競合するように配置される。
本発明によれば、有利には、各エピトープ結合領域は、免疫グロブリン可変領域を含む。より有利には、各免疫グロブリン可変領域は、可変軽鎖領域（ＶＬ）又は可変重鎖領域ＶＨである。本発明の第２の構成において、本発明によるリガンド上に存在しているときの免疫グロブリン領域は非相補的であり、すなわちＶＨ／ＶＬ抗原結合部位を形成するように会合しない。したがって、本発明の第２の構成において考えられる多重特異性リガンドは、可変軽鎖領域（ＶＬ）又は可変重鎖領域（ＶＨ）である同一のサブタイプの免疫グロブリン領域を含む。さらに、本発明によるリガンドが閉鎖構造である場合は、免疫グロブリン領域はラクダＶＨＨ型であってもよい。
代替的な実施形態において、本発明によるリガンドは、ラクダＶＨＨ領域を含まない。より詳細には、本発明のリガンドは、ヒトＶＨ領域と比較して、ラクダＶＨＨ領域に対して特異的な１つ又は複数のアミノ酸残基を含まない。
有利には、単一可変領域は、異なる抗原又はエピトープに対する結合活性について選択された抗体から誘導される。例えば、少なくとも一部にヒト免疫化によって可変領域を単離することができる。ヒト抗体ライブラリーからの単離及び人工抗体遺伝子の合成を含む代替的な方法が当該技術分野で知られている。
可変領域は、有利には、タンパク質Ａ又はタンパク質Ｌの如き超抗原を結合する。超抗原に対する結合は、適切に重畳した抗体可変領域の特性であり、当該領域を例えば組換え又は変異領域から単離することを可能にする。本発明によるエピトープ結合領域は、タンパク質骨組及びエピトープ相互作用領域（有利には、タンパク質の表面に存在する）を含む。エピトープ結合領域は、免疫グロブリン領域以外のタンパク質骨組又は骨格を基礎としていてもよい。例えば、１つ又は複数のエピトープに対して特異的に結合するリガンドを生成するために、ＳｐＡの如き天然の細菌受容体がＣＤＲの移植のための骨組として使用された。この手順の詳細は、米国特許第５，８３１，０１２号に記載されている。他の好適な骨組としては、フィブロネクチン及びアフィボディを基礎としたものが挙げられる。好適な手順の詳細は、ＷＯ９８／５８９６５に記載されている。他の好適な骨組としては、ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｕｋｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００１）３１０、５９１−６０１に記載されているリポカリン及びＣＴＬＡ４、及び例えば細菌ＧｒｏＥＬ又は他のシャペロンポリペプチドの環構造を基礎とする、Ｗ０００６９９０７（医学研究会議）に記載されているような骨組が挙げられる。タンパク質骨組を組み合わせることができる。例えば、ＣＤＲをＣＴＬＡ４骨組に移植し、免疫グロブリンＶＨ又はＶＬ領域と併用して、多価リガンドを形成することができる。同様に、フィブロネクチン、リポカリン及び他の骨組を組み合わせることもできる。
本発明の方法に従って製造された閉鎖構造多重特異性リガンドのエピトープ結合領域は、同一のポリペプチド鎖、或いは異なるポリペプチド鎖に存在しうることを当業者なら理解するであろう。可変領域が異なるポリペプチド鎖に存在する場合は、リンカー、有利には（ポリペプチド鎖の如き）柔軟リンカー、化学結合基、又は当該技術分野で知られている任意の他の方法を介してそれらを結合することができる。
第１及び第２のエピトープ結合領域を共有結合的又は非共有結合的に会合させることができる。それらの領域が共有結合的に会合される場合は、その会合に例えばジスルフィド結合を仲介させることができる。
本発明の第２の態様において、第１及び第２のエピトープは、異なっていることが好ましい。それらは、天然又は合成物でありうるポリペプチド、タンパク質又は核酸、或いはその一部であってもよい。この点において、本発明のリガンドは、エピトープ又は抗原を結合することができ、アンタゴニスト又はアゴニスト（例えば受容体アゴニスト）として作用することができる。一実施形態におけるリガンドのエピトープ結合領域は、同一のエピトープ特異性を有し、例えば、多数のエピトープの複製物が同一の抗原に存在するときはそれらのエピトープを同時に結合することができる。他の実施形態において、これらのエピトープは、リガンドがエピトープを結合し、抗原を架橋することができるように、異なる抗原に設けられる。エピトープ及び抗原の選択は広く、多様であることを当業者なら理解するであろう。それらは、例えば、ヒト又は動物のタンパク質、サイトカイン、サイトカイン受容体、酵素、酵素に対する補因子、或いはＤＮＡ結合タンパク質であってもよい。
本明細書に記載されている一又は二重特異性結合ポリペプチドが標的とすることができる好適なサイトカイン及び成長因子としては、ＡｐｏＥ、Ａｐｏ−ＳＡＡ、ＢＤＮＦ、ＢＬｙＳ、カルジオトロフィン−１、ＥＧＦ、ＥＧＦ受容体、ＥＮＡ−７８、エオタキシン、エオタキシン−２、エキソダス−２、ＥｐｏＲ、酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦ、繊維芽細胞成長因子−１０、ＦＬＴ３リガンド、フラクタルキン（ＣＸ３Ｃ）、ＧＤＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＦ−０１、インシュリン、ＩＦＮ−ｙ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ−、ＩＬ−１ｐ、２０ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８（７２ａ．ａ．）、ＩＬ−８（７７ａ．ａ．）、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８（ＩＧＩＦ）、インヒビンα、インヒビンＢ ＩＰ−１０、ケラチオサイト成長因子−２（ＫＧＦ−２）、ＫＧＦ、レプチン、ＬＩＦ、リンホタクチン、ムレリアン阻害物質、単細胞コロニー阻害因子、単細胞誘引タンパク質、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＤＣ（６７ａ．ａ．）、ＭＤＣ（６９ａ．ａ．）、ＭＣＰ−１（ＭＣＡＦ）、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＩＧ、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＭＩＰ３α、ＭＩＰ３β、ＭＩＰ−４、骨髄前駆体阻害因子−１（ＭＰＩＦ−１）、ＮＡＰ−２、ニュールツリン、神経成長因子、β−ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、オンコスタチンＭ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＦ−４、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ１２、ＳＤＦ１β、ＳＣＦ、ＳＣＧＦ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＴＡＲＣ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ受容体Ｉ、ＴＮＦ受容体ＩＩ、ＴＮＩＬ−１、ＴＰＯ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体１、ＶＥＧＦ受容体２、ＶＥＧＦ受容体３、ＧＣＰ−２、ＧＲＯ／ＭＧＳＡ、ＧＲＯ−β、ＧＲＯ−８、ＨＣＣ１、１−３０９、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＴＡＣＥ認識部位、ＴＮＦ ＢＰ−Ｉ及びＴＮＦ ＢＰ−ＩＩ、並びに本明細書の付属書に記載されている組合せ、異なる組合せ、又は個別に存在している付属書２又は付属書３に開示されている任意の標的が挙げられるが、それらに限定されない。
サイトカイン受容体は、先述のサイトカイン、例えばＩＬ−１ Ｒ１、ＩＬ−ＧＲ、ＩＬ−１０Ｒ、ＩＬ−１８Ｒに対する受容体、並びに付属書２又は３に記載されているサイトカインに対する受容体、また付属書２及び３に開示されている受容体を含む。
このリストは網羅的でないことが理解されるであろう。多重特異性リガンドが、（同一又は異なる抗原上の）２つのエピトープに結合する場合は、抗原をこのリストから選択できる。
有利には、生物の身体の治療状況において相乗作用的に共同するサイトカイン及び他の分子を標的とする二重特異性リガンドを使用することができる。したがって、本発明は、２つ以上のサイトカインの活性を相乗作用させるための方法であって、前記２つ以上のサイトカインに対して結合することが可能な二重特異性リガンドを投与することを含む方法を提供する。本発明の本態様において、二重特異性リガンドは、相補的及び／又は非相補的領域で構成されるリガンド、開放構造のリガンド、及び閉鎖構造のリガンドを含む任意の二重特異性リガンドであってもよい。例えば、本明細書の本態様は、ＶＨ領域とＶＬ領域の組合せ、ＶＨ領域のみ、及びＶＬ領域のみに関する。
治療の観点での相乗作用をいくつかの方法で達成することができる。例えば、両方の標的がリガンドの標的になる場合は、標的の組合せは治療的に活性でありうるのに対して、１つの標的のみを標的とすることは治療的有効性がない。他の実施形態において、１つの標的だけでは、低い又は最小限の治療効果しかもたらすことができないが、第２の標的と合わせると、その組合せは、治療効果の相乗的上昇をもたらす。
好ましくは、本発明の本態様の二重特異性リガンドによって結合されるサイトカインは、付属書２に示されているリストから選択される。
さらに、１つの特異性は、サイトカイン細胞によって発現されるＣＤ８９を標的とし、他方は腫瘍に特異的である場合は、二重特異性リガンドを腫瘍学分野に使用できる。標的とすることができる腫瘍抗原の例は、付属書３に示されている。
本発明の第２の構成の一実施形態において、可変領域は、第１及び／又は第２の抗原又はエピトープに対して導かれる抗体から誘導される。好ましい実施形態において、可変領域は、単一可変抗体領域のレパートリーから誘導される。一例において、該レパートリーは、動物又は合成レパートリーにおいて作られないレパートリーである。他の例において、単一可変領域は、（少なくとも一部は）動物免疫化によって単離されない。したがって、単一領域を神経ライブラリーから単離することが可能である。
他の態様において、本発明の第２の構成は、第１のエピトープ結合特異性を有する第１のエピトープ結合領域と、第２のエピトープ結合特異性を有する非相補的な第２のエピトープ結合領域とを含む多重特異性リガンドを提供する。第１及び第２の結合特異性は、同一又は異なっていてもよい。
さらなる態様において、本発明は、第１のエピトープ結合特異性を有する第１のエピトープ結合領域と、第２のエピトープ結合特異性を有する非相補的な第２のエピトープ結合領域とを含み、第１及び第２の結合特異性は、閉鎖構造多重特異性リガンドが同時に両方のエピトープを結合できないように、エピトープ結合をめぐって競合することが可能である閉鎖構造多重特異性リガンドを提供する。
さらなる態様において、本発明は、同一の標的上の異なるエピトープに対して特異的である非相補的結合領域を含む開放構造リガンドを提供する。当該リガンドは、高い結合活性で標的に結合する。
同様に、本発明は、同一のエピトープに対して特異的な非相補的結合領域を含み、ＩＬ−５、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＴＧＦβ、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３及びＴＮＦα、例えばヒトＴＮＦα受容体１及びヒトＴＮＦαの如き前記エピトープの多数の複製物を含む標的に導かれる多価リガンドを提供する。
類似の態様において、個々のエピトープに対する結合は治療的有意性がないが、２つのエピトープに対する結合に起因する結合活性の向上が治療的有利性をもたらすように、本発明によるリガンドを低い親和性で個々のエピトープを結合するように構成することが可能である。特定の例において、正常細胞型には個別に存在し、腫瘍細胞の如き異常細胞又は疾病細胞にのみ集まって存在するエピトープを標的とすることができる。当該状況において、本発明による二重特異性リガンドは、異常又は腫瘍疾病細胞のみを効果的に標的とする。同一のエピトープの多数の複製物、又は同一の標的上の隣接するエピトープに対して特異的なリガンド（キレート化ｄＡｂｓとして知られる）は、３又は４以上の非相補的結合領域を含む三量体又は多量体（四量体以上）のリガンドであってもよい。例えば、３又は４のＶＨ領域又はＶＬ領域を含むリガンドを構成することができる。
さらに、各結合領域が標的のサブユニットに対して特異的である多サブユニット標的に結合するリガンドが提供される。リガンドは、二量体、三量体又は多量体であってもよい。好ましくは、本発明の上記態様による多重特異性リガンドは、本発明の第１の態様の方法によって取得可能である。
本発明の第２の構成の上記態様によれば、有利には、第１のエピトープ結合領域及び第２のエピトープ結合領域は、本明細書に定められている非相補的免疫グロブリン可変領域である。それは、ＶＨ−ＶＨ又はＶＬ−ＶＬ可変領域である。
特にキレート化ｄＡｂは、本発明の好ましい態様、すなわちリンカー配列の上流又は下流に構築物ｄＡｂを含むベクターを使用して二量体、三量体又は多量体ｄＡｂのライブラリーを構成し、第２、第３又はさらなるｄＡｂｓをリンカーの他の側に挿入するアンカーｄＡｂｓの使用により調製されうる。例えば、アンカー又は誘導ｄＡｂは、ＴＡＲ１−５（ＶＫ）、ＴＡＲ１−２７（Ｖ）、ＴＡＲ２ｈ−５（ＶＨ）又はＴＡＲ２ｈ−６（ＶＫ）であってもよい。
代替的手法において、例えば、ＶＨとＶＬの如き結合領域間の非共有結合又は自然親和力を用いることによってリンカーの使用を避けることができる。よって、本発明は、キレート化リガンドを調製するための方法であって、
（ａ）標的上の第１のエピトープに対して特異的な単一結合領域をコードする核酸配列を含むベクターを設ける工程と、
（ｂ）第１のエピトープと同一又は異なりうる、前記標的上の第２のエピトープに対して特異的な第２の結合領域を含むレパートリーをコードするベクターを設ける工程であって、前記第２のエピトープは前記第１のエピトープに隣接する工程と、
（ｃ）前記第１及び第２の結合領域を発現する工程と、
（ｄ）結合して、標的結合二量体を形成する第１及び第２の結合領域の組合せを単離する工程とを含む方法を提供する。
第１及び第２のエピトープは、多量体リガンドが両方のエピトープに同時に結合することができるように隣接する。これは、結合の活性の向上という利点をリガンドに付与する。エピトープが同一である場合には、向上した結合活性効果を得るために少なくとも２つの複製物を同時に結合させることを可能にする標的上のエピトープの多数の複製物の存在によって、向上した結合活性が得られる。
いくつかの方法、並びにリンカーの使用によって結合領域を会合させることができる。
例えば、結合領域は、システイン残基、アビジン及びストレプトアビジン基、又は非共有結合後の合成のための他の手段を含むことができる。標的に対して効率的に結合するそれらの組合せが単離されることになる。或いは、リンカーは、例えば上述したように第１の結合領域、リンカー、及び第２の結合領域のレパートリーを含む、単一ベクターからの単一ポリペプチドとして発現される第１の結合領域と第２の結合領域の間に存在していてもよい。
好ましい態様において、第１及び第２の結合領域は、抗原に結合すると自然に会合する。例えば、ＶＨ及びＶＫ領域は、隣接するエピトープに結合すると、三元相互作用で自然に会合して、安定した二量体を形成する。当該会合タンパク質は、標的結合試験で単離されうる。この手順の長所は、正しい構造で近接するエピトープに結合する結合領域のみが会合し、標的に対する結合活性が向上した結果として単離されることである。
本発明の第２の構成の上記の態様の代替的な実施形態において、少なくとも１つのエピトープ結合領域は、本明細書に定められている非免疫グロブリン「タンパク質骨組」又は「タンパク質骨格」を含む。好適な非免疫グロブリンタンパク質骨組は、上述したＳｐＡ、フィブロネクチン、ＧｒｏＥＬ及び他のシャペロン、リポカリン、ＣＣＴＬＡ４及びアフィボディからなる群から選択された骨組のいずれかを含むが、それに限定されない。
本発明の第２の構成の上記態様によれば、有利には、エピトープ結合領域は、「タンパク質骨格」に結合される。
有利には、本発明によるタンパク質骨格は、免疫グロブリン骨格である。本発明によれば、「免疫グロブリン骨格」という用語は、本発明に定められているように、少なくとも１つの免疫グロブリン重畳を含み、１つ又は複数のエピトープ結合領域に対する核として作用するタンパク質を意味する。
本明細書に定められている好ましい「免疫グロブリン骨格」は、少なくとも（ｉ）抗体のＣＬ（カッパ又はラムダサブクラス）又は（ｉｉ）抗体重鎖のＣＨ１領域を含む免疫グロブリン分子；抗体重鎖のＣＨ１及びＣＨ２領域を含む免疫グロブリン分子；抗体重鎖のＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン分子；或いは抗体のＣＬ（カッパ又はラムダサブクラス）と併用される集合体（ｉｉ）のいずれかから選択される骨格のいずれかを含む。ヒンジ領域を含めることもできる。領域の当該組合せは、例えば、ＩｇＧ又はＩｇＭの如き天然抗体、又はＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２分子の如きその断片に類似していてもよい。
このリストは網羅的であるように意図されたものでないことを当業者なら認識するであろう。
本明細書に定められているエピトープ結合領域に対する骨格の結合は、ポリペプチドレベルで、すなわち骨格及び／又はエピトープ結合領域をコードする核酸の発現の後に達成されうる。或いは、結合工程を核酸レベルで実施することができる。本発明によるタンパク質骨格を１つ又は複数のエピトープ結合領域に結合する方法は、当業者によく知られており、本明細書に記載されているタンパク質化学及び／又は分子生物学的技法の使用を含む。
有利には、閉鎖構造多重特異性リガンドは、標的分子を結合することが可能な第１の領域と、リガンドの半減期を延ばす分子又は基を結合することが可能な第２の領域とを含むことができる。例えば、該分子又は基は、ＨＳＡ又は細胞マトリックスタンパク質の如き巨大作用物質であってもよい。本明細書に用いられているように、「リガンドの半減期を延ばす分子又は基」という語句は、本明細書に記載されている二重特異性リガンドに結合されると、その分子又は基を結合しないリガンドと比べて、動物に投与されたときの当該二重特異性リガンドのインビボ半減期を増加させる分子又は化学基を意味する。リガンドの半減期を延ばす分子又は基の例を後に記載する。好ましい実施形態において、閉鎖構造多重特異性リガンドは、半減期を増加させる分子又は基の変位に対してのみ標的分子を結合することが可能でありうる。したがって、例えば、閉鎖構造多重特異性リガンドは、ＨＳＡの如き巨大分子により、被検体の血流における循環が維持される。標的分子に遭遇すると、閉鎖構造多重特異性リガンドの結合領域間の競合により、ＨＳＡの変位及び標的の結合がもたらされる。
本発明の任意の態様によるリガンド、並びに当該リガンドを構成するのに有用なｄＡｂ単量体は、有利には、３００ｎＭから５ｐＭ（すなわち３×１０−７から５×１０−１２Ｍ）、好ましくは５０ｎＭから２０ｐＭ、又は５ｎＭから２００ｐＭ、又は１ｎＭから１００ｐＭ、１×１０−７Ｍ以下、１×１０−８Ｍ以下、１×１０−９Ｍ以下、１×１０−１０Ｍ以下、又は１×１０−１１Ｍ以下のＫｄ、及び／又は表面プラスモン共鳴で測定された５×１０−１から１×１０−７Ｓ−１、好ましくは１×１０−２から１×１０−６Ｓ−１、又は５×１０−３から１×１０−５Ｓ−１、又は５×１０−１Ｓ−１以下、又は１×１０−２Ｓ−１以下、又は１×１０−３Ｓ−１以下、又は１×１０−４Ｓ−１以下、又は１×１０−５Ｓ−１以下、又は１×１０−６Ｓ−１以下のＫｏｆｆ速度定数で、それらの同族２０標的から解離することができる。Ｋｄ速度定数は、Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎと定義づけられる。
特に、本発明は、各ｄＡｂがＴＮＦ−αに結合する抗ＴＮＦ−α ｄＡｂ単量体（又は当該ｄＡｂを含む二重特異性リガンド）、ホモ二量体、ヘテロ二量体又はホモ三量体リガンドを提供する。リガンドは、３００ｎＭから５ｐＭ（すなわち３×１０−７から５×１０−１２Ｍ）、好ましくは５０ｎＭから２０ｐＭ、より好ましくは５ｎＭから２００ｐＭ、最も好ましくは１ｎＭから１００ｐＭのＫｄでＴＮＦ−αに結合する。別法で表現すると、Ｋｄは、１×１０−７Ｍ以下、好ましくは１×１０−８Ｍ以下、より好ましくは１×１０−９Ｍ以下、有利には１×１０−１０Ｍ以下、最も好ましくは１×１０−１１Ｍ以下、及び／又は表面プラスモン共鳴で測定された５×１０−１から１×１０−７Ｓ−１、好ましくは１×１０−２から１×１０−６Ｓ−１、より好ましくは５×１０−３から１×１０−５Ｓ−１、例えば５×１０−１Ｓ−１以下、好ましくは１×１０−２Ｓ−１以下、より好ましくは１×１０−３Ｓ−１以下、有利には１×１０−４Ｓ−１以下、さらに有利には１×１０−５Ｓ−１以下、最も好ましくは１×１０−６Ｓ−１以下のＫｏｆｆ速度定数である。
好ましくは、リガンドは、標準的なＬ９２９試験において、５００ｎＭから５０ｐＭ、好ましくは１００ｎＭから５０ｐＭ、有利には１０ｎＭから１００ｐＭ、より好ましくは１ｎＭから１００ｐＭ、例えば５０ｎＭ以下、好ましくは５ｎＭ以下、有利には５００ｐＭ以下、より好ましくは２００ｐＭ以下、最も好ましくは１００ｐＭ以下のＮＤ５０でＴＮＦ−αを中和する。
好ましくは、リガンドは、５００ｎＭから５０ｐＭ、好ましくは１００ｎＭから５０ｐＭ、より好ましくは５１０ｎＭから１００ｐＭ、有利には１ｎＭから１００ｐＭ、例えば５０ｎＭ以下、好ましくは５ｎＭ以下、より好ましくは５００ｐＭ以下、有利には２００ｐＭ以下、最も好ましくは１００ｐＭ以下のＩＣ５０でＴＮＦ−α受容体Ｉ（ｐ５５受容体）に対するＴＮＦ−αの結合を阻害する。好ましくは、ＴＮＦ−αは、ヒトＴＮＦ−αである。
また、本発明は、３００ｎＭから５ｐＭ（すなわち３×１０−７から５×１０−１２Ｍ）、好ましくは５０ｎＭから２０ｐＭ、より好ましくは５ｎＭから２００ｐＭ、最も好ましくは１ｎＭから１００ｐＭ、例えば１×１０−７Ｍ以下、好ましくは１×１０−８Ｍ以下、より好ましくは１×１０−９Ｍ以下、有利には１×１０−１０Ｍ以下、最も好ましくは１×１０−１１Ｍ以下のＫｄ、及び／又は表面プラスモン共鳴で測定された５×１０−１から１×１０−７Ｓ−１、好ましくは１×１０−２から１×１０−６Ｓ−１、より好ましくは５×１０−３から１×１０−５Ｓ−１、例えば５×１０−１Ｓ−１以下、好ましくは１×１０−２Ｓ−１以下、より好ましくは１×１０−３Ｓ−１以下、有利には１×１０−４Ｓ−１以下、さらに有利には１×１０−５Ｓ−１以下、最も好ましくは１×１０−６Ｓ−１以下のＫｏｆｆ速度定数でＴＮＦ受容体Ｉに結合する抗ＴＮＦ受容体Ｉ ｄＡｂ単量体、又は当該ｄＡｂを含む二重特異性リガンドを提供する。
好ましくは、ｄＡｂ単量体又はリガンドは、標準的な試験（例えば、本明細書に記載されているＬ９２９又はＨｅＬａ試験）において、５００ｎＭから５０ｐＭ、好ましくは１００ｎＭから５０ｐＭ、より好ましくは１０ｎＭから１００ｐＭ、有利には１ｎＭから１００ｐＭ、例えば５０ｎＭ以下、好ましくは５ｎＭ以下、より好ましくは５００ｐＭ以下、有利には２００ｐＭ以下、最も好ましくは１００ｐＭ以下のＮＤ５０でＴＮＦ−αを中和する。
好ましくは、ｄＡｂ単量体又はリガンドは、５００ｎＭから５０ｐＭ、好ましくは１００ｎＭから５０ｐＭ、より好ましくは１０ｎＭから１００ｐＭ、有利には１ｎＭから１００ｐＭ、例えば５０ｎＭ以下、好ましくは５ｎＭ以下、より好ましくは５００ｐＭ以下、有利には２００ｐＭ以下、最も好ましくは１００ｐＭ以下のＩＣ５０でＴＮＦ−α５受容体Ｉ（ｐ５５受容体）に対するＴＮＦ−αの結合を阻害する。好ましくは、ＴＮＦ受容体Ｉ標的は、ヒトＴＮＦ−αである。
また、本発明は、１ｎＭから５００μＭ（例えば１×１０−９から５×１０−４）、好ましくは１００ｎＭから１０ｕＭのＫｄで血清アルブミン（ＳＡ）に結合するｄＡｂ単量体（又は当該ｄＡｂを含む二重特異性リガンド）を提供する。好ましくは、第１の抗ＳＡ ｄＡｂ、及び他の標的に対する第２のｄＡｂを含む二重特異性リガンドについては、第２のｄＡｂのその標的に対する親和性（例えば、Ｋｄ、及び／又は表面プラスモン共鳴により、例えばＢＩＡｃｏｒｅを用いて測定されたＫｏｆｆ）は、第１のｄＡｂのＳＡに対する親和性の１から１０００００倍（好ましくは１００から１０００００倍、より好ましくは１０００から１０００００倍、又は１００００倍から１０００００倍である）。例えば、第１のｄＡｂは、約１０μＭの親和性でＳＡを結合し、第２のｄＡｂは、１００ｐＭの親和性でその標的を結合する。好ましくは、血清アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。
一実施形態において、第１のＡｄｂ（又はｄＡｂ単量体）は、約５０、好ましくは７０、より好ましくは１００、１５０又は２００ｎＭのＫｄでＳＡ（例えばＨＳＡ）を結合する。
本発明は、本発明の先述の態様に従って、上記ｄＡｂ単量体の二量体、三量体及び重合体を提供する。
ｄＡｂ単量体、二量体及び三量体を含む本発明によるリガンドを、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一方又は双方、並びに場合によってはヒンジ領域を含む抗体Ｆｃ領域に結合させることが可能である。例えば、単一ヌクレオチド配列としてＦｃ領域に結合されるリガンドをコードするベクターを使用して、当該ポリペプチドを調製することができる。
本発明の第２の構成のさらなる態様において、本発明は、少なくとも本明細書に定められている多重特異性リガンドをコードする１つ又は複数の核酸分子を提供する。一実施形態において、リガンドは、閉鎖構造リガンドである。他の実施形態において、リガンドは、開放構造リガンドである。多重特異性リガンドは、単一核酸分子上でコードされうる。或いは、各エピトープ結合領域を個別的な核酸分子でコードすることもできる。リガンドが単一核酸分子でコードされる場合は、それらの領域を融合ポリペプチドとして発現してもよいし、個別的に発現し、続いて、例えば化学結合剤を使用して互いに結合させてもよい。個別的な核酸から発現されたリガンドは、適切な手段によって互いに結合されることになる。
核酸は、発現すると同時に宿主細胞からのポリペプチドを移出するために単一配列をコードすることができ、発現すると同時に糸状バクテリオファージ粒子の表面成分（又は選択表示系の他の成分）と融合することができる。細菌発現及び／又はファージ又はファージミド表示に用いることができるリーダー配列は、ｐｅｌＢ、ｓｔＩＩ、ｏｍｐＡ、ｐｈｏＡ、ｂｌａ及びｐｅｌＡを含む。
本発明の第２の構成のさらなる態様において、本発明は、本発明による核酸を含むベクターを提供する。
さらなる態様において、本発明は、本発明によるベクターをトランスフェクトした宿主細胞を提供する。
当該ベクターからの発現を、例えばバクテリオファージ粒子の表面に、選択のためのエピトープ結合領域を生成するように構成することができる。これは、表示領域の選択、そして本発明の方法を用いた「多重特異性リガンド」の選択を可能にする。
本発明の第２の構成の好ましい実施形態において、エピトープ結合領域は、免疫グロブリン可変領域であり、単一領域Ｖ遺伝子レパートリーから選択される。一般には、単一抗体領域のレパートリーは、糸状バクテリオファージの表面に表示される。好ましい実施形態において、各単一抗体領域は、ファージレパートリーを抗原に結合することによって選択される。
本発明は、開放構造又は閉鎖構造リガンドであってもよい、本発明による少なくとも１つの多重特異性リガンドを含むキットをさらに提供する。本発明によるキットは、例えば、診断キット、治療キット、及び化学又は生物種検出用キット等であってもよい。
本発明の第２の構成のさらなる態様において、本発明は、本発明によるリガンドを使用する均一免疫試験を提供する。
本発明の第２の構成のさらなる態様において、本発明は、本発明の方法によって取得可能な閉鎖構造多重特異性リガンド、及び薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含む組成物を提供する。さらに、本発明は、本発明による閉鎖構造多重特異性リガンド又は組成物を使用して疾病を治療するための方法を提供する。本発明の好ましい実施形態において、疾病は、癌又は炎症性疾患、例えば関節リウマチ、喘息又はクローン病である。
本発明の第２の構成のさらなる態様において、本発明は、本発明による閉鎖構造多重特異性リガンド又は組成物を使用する疾病の診断を含む診断方法を提供する。
したがって、概して、閉鎖構造多重特異性リガンドに対する検体の結合を利用して、作用物質を変位させて、変位に関するシグナルを生成させることができる。例えば、検体（第２の抗原）の結合により、酵素（第１の抗原）を、特にその酵素がその活性部位を通じて抗体に保持された場合に抗体に結合させて、免疫試験の基礎を提供することが可能である。
したがって、第２の構成の最後の態様において、本発明は、標的分子の存在を検出するための方法であって、
（ａ）抗原に結合された閉鎖構造多重特異性リガンドを設ける工程であって、前記リガンドは、標的分子及び作用物質に対して特異的であり、リガンドにより結合される作用物質は、リガンドからの変位に関する検出可能なシグナルを生成させる工程と、
（ｂ）閉鎖構造多重特異性リガンドを標的分子に接触させる工程と、
（ｃ）作用物質の変位の結果として生成されたシグナルを検出する工程とを含む方法を提供する。
本発明の第２の構成の上記態様によれば、有利には、作用物質は、閉鎖構造多重特異性リガンドにより結合されると不活性になる酵素である。或いは、作用物質は、酵素に対する基質、及びリガンドにより結合されると不活性になる、又は消失する蛍光、発光又は発色分子からなる群から選択されるいずれかであってもよい。
本明細書に開示されている配列に対して類似又は相同的（例えば少なくとも約７０％の配列同一性を有する）配列も本発明の一部である。いくつかの実施形態において、アミノ酸レベルの配列同一性は、約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上でありうる。核酸レベルでは、配列同一性は、約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上でありうる。或いは、核酸セグメントが、選択的ハイブリダイゼーション条件（例えば極めて高厳密性のハイブリダイゼーション条件）下で鎖の補体に対してハイブリダイゼーションするときに実質的な同一性が存在する。核酸は、全細胞に存在してもよく、細胞可溶化物に存在してもよく、又は部分的に精製された形態又は実質的にナイーブな形態で存在していてもよい。
２つの配列の間の「相同性」又は「配列同一性」又は「類似性」（本明細書では、それらの用語を区別なく用いる）の計算は以下のようにして実施される。最適比較の目的に向けて配列の位置合せを行う（例えば、最適な位置合せのために第１及び第２のアミノ酸又は核酸配列に一方又は双方にギャップを導入し、比較目的について非相同性配列を無視することができる）。
好ましい実施形態において、比較目的で位置合せされた基準配列の長さは、基準配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基又はヌクレオチド残基を比較する。第１の配列における位置は、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドで占められる場合は、それらの分子は、その位置で同一になる（本明細書に用いられるように、アミノ酸又は核酸「相同性」は、アミノ酸又は核酸「同一性」と同等である）。２つのアミノ酸の同一性割合は、２つの配列の最適な位置合せのために導入することが必要なギャップの数及び各ギャップの長さを考慮した、それらの配列が共有する同一位置の数の関数である。
有利には、パラメータをデフォルト値に設定したＢＬＡＳＴアルゴリズム（バージョン２．０）を配列の位置合せに採用する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、「ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ」ファイルの「／Ｂｌａｓｔ！」ディレクトリの米国政府（「．ｇｏｖ」）の国立衛生研究所（「ｎｉｂ」）の全国バイオテクノロジー情報センター（「．ｎｃｂｉ」）のワールドワイドウェブサイト（「ｗｗｗ」）に詳細に記載されている。検索パラメータは、以下のように定められ、有利には規定されたデフォルトパラメータに設定される。
ＢＬＡＳＴ（ベーシックローカルアラインメントサーチツール）は、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘプログラムによって採用される発見的検索アルゴリズムである。これらのプログラムは、いくつかの改善を伴うＫａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ、１９９０、２０ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７（６）：２２６４−８（上述の「ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ」参照の統計的手法を用いたそれらの発見に意義を帰するものである。ＢＬＡＳＴプログラムは、例えば問合せ配列に対する相同性を特定する配列同一性検索に向けて作成された。それらのプログラムは、概してモチーフスタイル検索に有用ではない。配列データベースの類似性検索における基本的問題についての議論については、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９４）を参照されたい。
国立バイオテクノロジー情報センターウェブサイトで入手可能な５つのＢＬＡＳＴプログラムは、以下のタスクを実行する。「ｂｌａｓｔｐ」は、タンパク質配列データベースに対してアミノ酸問合せ配列を比較する。「ｂｌａｓｔｎ」は、ヌクレオチド配列データベースに対してヌクレオチド問合せ配列を比較する。「ｂｌａｓｔｘ」は、タンパク質配列データベースに対してヌクレオチド問合せ配列（両鎖）の６枠概念翻訳プロダクトを比較する。「ｔｂｌａｓｔｎ」は、すべての６つの読み枠（両鎖）において動的に翻訳されたヌクレオチド配列に対してタンパク質問合せ配列を比較する。「ｔｂｌａｓｔｘ」は、ヌクレオチド配列データベースの６枠翻訳に対してヌクレオチド問合せ配列の６枠翻訳を比較する。
ＢＬＡＳＴは、以下の検索パラメータを使用する。
ヒストグラム（ＨＩＳＴＯＧＲＡＭ）：各検索に対するスコアのヒストグラムを表示する。デフォルトはｙｅｓである（ＢＬＡＳＴマニュアルのパラメータＨ参照）。
デスクリプション（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮＳ）：報告された配列を特定された数に対応させる短記述の数を制限する。デフォルト限界は１００記述である（マニュアルのページのパラメータＶ参照）。エクスペクト（ＥＸＰＥＣＴ）及びカットオフ（ＣＵＴＯＦＦ）も参照されたい。
アラインメント（ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ）：高スコアセグメント対（ＨＳＰ）が報告されている、特定された数にデータベース配列を制限する。デフォルト限界は５０である。これより多くのデータベース配列が、報告のための統計的有意閾値を満たす場合は（以下のエクスペクト（ＥＸＰＥＣＴ）及びカットオフ（ＣＵＴＯＦＦ）参照）、最大の統計的有意に帰する対応のみが報告される（ＢＬＡＳＴマニュアルのパラメータＢ参照）。
エクスペクト（ＥＸＰＥＣＴ）：データベース配列に対する対応を報告するための統計的有意閾値。デフォルト値は、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）に従って、１０の対応が単に偶然に見い出されることが期待される１０である。対応に帰する統計的有意がエクスペクト（ＥＸＰＥＣＴ）閾値を上回る場合は、その対応は報告されない。より低いエクスペクト（ＥＸＰＥＣＴ）閾値はより厳密で、報告されるチャンス対応がより少なくなる。分数値も許容される（ＢＬＡＳＴマニュアルのパラメータＥ参照）。
カットオフ（ＣＵＴＯＦＦ）：高スコアセグメント対を報告するためのカットオフスコア。デフォルト値は、エクスペクト（ＥＸＰＥＣＴ）値から計算される（上記参照）。ＨＳＰは、それらに帰する統計的有意が、カットオフ（ＣＵＴＯＦＦ）値に等しいスコアを有する孤立ＨＳＰに帰するものと少なくとも同程度である場合にのみ、データベース配列にについて報告される。より高いカットオフ（ＣＵＴＯＦＦ）値は、より厳密で、報告されるチャンス対応がより少なくなる（ＢＬＡＳＴマニュアルのパラメータＳ参照）。典型的には、有意閾値は、エクスペクト（ＥＸＰＥＣＴ）を用いてより直感的に管理されうる。
マトリックス（ＭＡＴＲＩＸ）：ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ＴＢＬＡＳＴＮ及びＴＢＬＡＳＴＸに対する代用採点マトリックス。デフォルトマトリックスは、ＢＬＯＳＵＭ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．３０ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９（２２）：１０９１５−９）である。有効な代用選択肢は、ＰＡＭ４０、ＰＡＭ１２０、ＰＡＭ：２５０及びＩＤＥＮＴＩＴＹを含む。ＢＬＡＳＴＮに対しては利用可能な代用採点マトリックスはない。ＢＬＡＳＴＮ配列におけるマトリックス（ＭＡＴＲＩＸ）ディレクトリを指定すると、誤り応答が復帰する。
ストランド（ＳＴＲＡＮＤ）：ＴＢＬＡＳＴＮ検索をデータベース配列の上端又は下端鎖に限定する。或いはＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ又はＴＢＬＡＳＴＸ検索を問合せ配列の上端又は下端鎖の読取り枠に限定する。
フィルタ（ＦＩＬＴＥＲ）：Ｗｏｏｔｔｏｎ ＆ Ｆｅｄｅｒｈｅｎ（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７：１４９−１６３のＳＥＧプログラムで測定される組成複雑性が低い問合せ配列のセグメント、或いはＣｌａｖｅｒｉｅ ＆ Ｓｔａｔｅｓ、１９９３、Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７：１９１−２０１のＸＮＵプログラムによって、又はＢＬＡＳＴＮについてはＴａｔｕｓｏｖ ａｎｄ ＬｉｐｍａｎのＤＵＳＴプログラムによって（ＮＣＢＩのワールドワイドウェブサイト参照）測定される短周期内的繰返しから構成されるセグメントをマスクする。フィルタリングは、統計的に有意であるが、生物学的に重要でない報告をブラスト出力（例えば共通の酸性、塩基性又はプロリン豊富領域）から排除して、データベース配列に対する特定の対応付けに利用可能な問合せ配列のより生物学的に重要な領域を残すことが可能である。フィルタプログラムによって見い出される低複雑性配列は、ヌクレオチド配列の文字「Ｎ」（例えば１３回繰り返された「Ｎ」）及びタンパク質配列の文字「Ｘ」（例えば９回繰り返される「Ｘ」）を用いて置換される。
フィルタリングは問合せ配列（又はその翻訳プロダクト）にのみ適用され、データベース配列に適用されない。デフォルトフィルタリングは、ＢＬＡＳＴＮではＤＵＳＴであり、他のプログラムではＳＥＧである。ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴにおける配列に適用される場合は、ＳＥＧ、ＸＮＵ又は双方によって何もマスクされないことが珍しくないため、フィルタリングは常に効果をもたらすものと期待すべきではない。また、配列が全面的にマスクされ、フィルタリングされていない問合せ配列に対して報告されたあらゆる対応の統計的有意が疑わしいことが示される場合もある。
ＮＣＢＩ−ｇｉ：取得及び／又は場所名に加えて、出力中にＮＣＢＩ ｇｉ識別子を示させる。
最も好ましくは、配列比較は、「／ＢＬＡＳＴ」ディレクトリにおける、上記のＮＣＢＩワールドワイドウェブサイトで提供される単純なＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを用いて実施される。
免疫グロブリンをベースとした多重特異性リガンドの調製
本発明による二重特異性リガンドは、本発明の望ましい構成による構造が開放構造であっても閉鎖構造であっても、ｓｃＦｖ、「ファージ」抗体及び他の工作抗体分子を調製するために抗体工学の分野で用いられている既に確立された技術に従って調製されうる。抗体、特に二重特異性抗体を調製するための技術は、例えば、Ｗｉｎｔｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５ １３０：１５１−１８８；Ｗｒｉｇｈｔら、（１９９２）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１２５− １６８；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．＆ Ｗｉｎｔｅｒ、Ｇ．（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．４、４４６−４４９；Ｃａｒｔｅｒら、（１９９５）Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．４、４６３−４７０；Ｃｈｅｓｔｅｒ，Ｋ．Ａ．＆ Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｒ．Ｅ．（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．１３，２９４−３００；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５、１２５−１２６、Ｆｅａｒｏｎ、Ｄ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５、６１８−６１９；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．＆ Ｐａｃｋ，Ｐ．（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３，８３−１０５；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．＆ Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８、４４９−４５４；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｐ．＆ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４５、１２８−１３０の論文、及びそれらに引用されている参考文献に記載されている。
本発明は、２つの異なる抗原又はエピトープに対する可変領域の選択、及びその後の可変領域の組合せを考慮する。可変領域の選択に採用される技術には、当該技術分野で知られているライブラリー及び選択手順が採用される。ヒトＢ細胞から収穫された再編成Ｖ遺伝子を使用する天然ライブラリー（Ｍａｒｋｓら、（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１；Ｖａｕｇｈａｎら、（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１４：３０９）は、当業者によく知られている。合成ライブラリー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１；Ｂａｒｂａｓら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４４５７；Ｎｉｓｓｉｍら、（１９９４）ＥＭＢＯ Ｊ．、１３：６９２；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、（１９９４）ＥＭＢＯ］、１３：３２４５；Ｄｅ Ｋｒｕｉｆら、（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２４８：９７）は、通常ＰＣＲを用いて、クローニング免疫グロブリンＶ遺伝子によって調製される。ＰＣＲプロセスにおける誤差は、高度の無作為化をもたらしうる。ＶＨ及び／又はＶＬライブラリーを標的抗原又はエピトープに対して個別に（この場合は、単一領域結合が直接選択される）又は一緒に選択することができる。
本発明による二重特異性リガンドを製造するための好ましい方法は、可変領域のレパートリーを第１の抗原又はエピトープに対する結合について選択し、可変領域のレパートリーを第２の抗原又はエピトープに対する結合について選択する選択系を使用することを含む。次いで、選択された第１及び第２の可変領域を組み合わせ、二重特異性リガンドを第１及び第２の抗原又はエピトープの両方に対する結合について選択する。閉鎖構造リガンドは、第１及び第２の抗原又はエピトープの両方を同時でなく、個別に結合することについて選択される。
Ａ．ライブラリーベクター系
本発明における使用に好適な様々な選択系が、当該技術分野で知られている。当該系の例を以下に記載する。
バクテリオファージラムダ発現系は、いずれも先述したバクテリオファージプラク又は溶原菌のコロニーとして直接スクリーニングすることができ（Ｍｕｓｅら、（１９８９）２０ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７５；Ｃａｔｏｎ及びＫｏｐｒｏｗｓｉｋｉ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８７；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８７：８０９５；Ｐｅｒｓｓｏｎら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８８：２４３２）、本発明に使用される。当該発現系を使用して、ライブラリーの１０６までの異なるメンバーをスクリーニングすることが可能であるが、それらは、実際には、より多数のメンバー（１０６を超えるメンバー）のスクリーニングに適さない。
ライブラリーの構成に特に使用されるのは、核酸をそれが発現するポリペプチドに結合させることを可能にする選択表示系である。本明細書に用いられているように、選択表示系は、汎用及び／又は標的リガンドを結合することによって、好適な表示手段によるライブラリーの個々のメンバーの選択を可能にする系である。
ファージディスプレイ技術に代表される、大規模ライブラリーの所望のメンバーを単離するための選択プロトコルが当該技術分野で知られている。多様なペプチド配列を糸状バクテリオファージの表面に表示する（Ｓｃｏｔｔ及びＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：３８６）当該系は、標的抗原を結合する特異的抗体断片のインビトロ選択及び増幅のための抗体断片（及びそれらをコードするヌクレオチド配列）のライブラリーを作成するのに有用であることが証明された（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＷＯ９２／０１０４７）。ＶＨ及びＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列は、それらを大腸菌の細胞周辺腔に導くリーダーシグナルをコードする遺伝子断片に結合される。その結果として、得られた抗体断片は、典型的にはバクテリオファージ被覆タンパク質（例えばｐＩＩＩ又はｐＶＩＩＩ）に対する融合物として、バクテリオファージの表面に表示される。
或いは、抗体断片は、ラムダファージカプシド（ファージボディ）に外部から表示される。ファージをベースとした表示系の長所は、生物系であるために、細菌細胞に選択されたライブラリーメンバーを含むファージを単に成長させることによって、選択されたライブラリーメンバーを増幅できることである。また、ポリペプチドライブラリーメンバーをコードするヌクレオチド配列は、ファージ又はファージミドベクターに含まれるため、配列決定、発現及び次の遺伝子操作は比較的簡単である。
バクテリオファージ抗体表示ライブラリー及びラムダファージ発現ライブラリーを構成するための方法は、当該技術分野でよく知られている（参照により本明細書に組み込まれているＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２；Ｋａｎｇら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８８：４３６３；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４；Ｌｏｗｍａｎら、（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：１０８３２；Ｂｕｒｔｏｎら、２０（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．、８８：１０１３４；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９：４１３３；Ｃｈａｎｇら、（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７：３６１０；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら、（１９９１）Ｇｅｎｅ、１０４：１４７；Ｍａｒｋｓら、（１９９１）前出；Ｂａｒｂａｓら、（１９９２）前出；Ｈａｗｋｉｎｓ及びＷｉｎｔｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２２：８６７；Ｍａｒｋｓら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：１６００７；Ｌｅｒｎｅｒら、（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５８：１３１３）。
１つの特に有利な手法は、ｓｃＦｖファージライブラリーを使用することである（Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：５８７９−５８８３；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．、８７：１０６６−１０７０；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、（１９９０）前出；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４；Ｍａｒｋｓら、（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１；Ｃｈｉｓｗｅｌｌら、３０（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１０：８０；Ｍａｒｋｓら、（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７）。バクテリオファージ被覆タンパク質に表示されたｓｃＦｖライブラリーの様々な実施形態が記載されている。例えば、参照により本明細書に組み込まれているＷＯ９６／０６２１３及びＷＯ９２／０１０４７（医学研究会議）並びにＷＯ９７／０８３２０（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）に記載されているファージディスプレイ手法の改良型も知られている。
ポリペプチドのライブラリーを生成するための他の系は、ライブラリーメンバーのインビトロ合成のための無細胞酵素機構の使用を含む。１つの方法において、標的リガンドに対する交替的選択及びＰＣＲ増幅によってＲＮＡを選択する（Ｔｕｅｒｋ及びＧｏｌｄ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：５０５；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ及びＳｚｏｓｔａｋ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ、３４６：８１８）。同様の技術を用いて、所定のヒト転写因子を結合するＤＮＡ配列を識別することができる（Ｔｈｉｅｓｅｎ及びＢａｃｈ（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１８：３２０３；Ｂｅａｕｄｒｙ及びＪｏｙｃｅ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５７：６３５；ＷＯ９２／０５２５８及びＷＯ９２／１４８４３）。同様にして、大きいライブラリーを生成するための方法として、インビトロ翻訳を用いて、ポリペプチドを合成することが可能である。一般には、安定化されたポリソーム複合体を含むこれらの方法は、さらにＷＯ８８／０８４５３、ＷＯ９０／０５７８５、ＷＯ９０／０７００３、ＷＯ９１／０２０７６、ＷＯ９１／０５０５８及びＷＯ９２／０２５３６に記載されている。ＷＯ９５／２２６２５及びＷＯ９５／１１９２２（Ａｆｆｙｍａｘ）に開示されている、ファージをベースとしない代替的な表示系は、選択のためのポリペプチドを表示するのにポリソームを使用する。
さらに他の範疇の技術は、遺伝子のその遺伝子産物との結合を可能にする人工的区画におけるレパートリーの選択を含む。例えば、所望の遺伝子産物をコードする核酸を、油中水エマルジョンで形成されたマイクロカプセルにおいて選択することができる選択系が、ＷＯ９９／０２６７１、ＷＯ００／４０７１２及びＴａｗｆｉｋ ＆ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６（７）、６５２−６に記載されている。所望の活性を有する遺伝子産物をコードする遺伝子要素をマイクロカプセルに区分し、次いで転写且つ／又は翻訳して、マイクロカプセル内にそれぞれの遺伝子産物（ＲＮＡ又はタンパク質）を生成する。続いて、所望の活性を有する遺伝子産物を生成する遺伝子要素を分類する。この手法は、様々な手段によって、所望の活性を検出することにより対象とする遺伝子産物を選択する。
Ｂ．ライブラリー構成
選択を目的としたライブラリーは、例えば上述のように当該技術分野で知られている技術を用いて構成してもよいし、商業的供給源から購入してもよい。本発明に有用なライブラリーは、例えば、ＷＯ９９／２０７４９に記載されている。ベクター系が選択され、対象とするポリペプチドをコードする１つ又は複数の核酸配列がライブラリーベクターにクローン化されると、発現の前に変異誘発を受けることによって、クローン化分子内に多様性を生成することができる。或いは、変異誘発及びさらなる選択が実施される前に、上述したように、コード化タンパク質を発現、選択することができる。構造的に最適化されたポリペプチドをコードする核酸配列の変異誘発が標準的な分子法によって実施される。特に用いられるのは、ポリメラーゼ連鎖反応又はＰＣＲである（参照により本明細書に組み込まれているＭｕｌｌｉｓ及びＦａｌｏｏｎａ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅ’ｎｚｙｍｏｌ．、１５５：３３５）。熱安定性のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって触媒された多数のサイクルのＤＮＡ複製を用いて、対象とする標的配列を増幅させるＰＣＲは、当該技術分野でよく知られている。様々な抗体ライブラリーの構成については、Ｗｉｎｔｅｒら、（１９９４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２、４３３−５５、及びそれに引用された参考文献に論述されている。
ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡ（少なくとも１ｆｇ、より実用的には１〜１０００ｎｇ）及び少なくとも２５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して実施される。各配列は、プライマープールの分子のごく小さい部分で表され、後の増幅サイクルにおいて量が限定されるため、プライマープールが極めて不均一である場合はより多量のプライマーを使用するのが有利でありうる。典型的な反応混合物は、２μｌのＤＮＡ、２５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプライマー、２．５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液１（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ））、０．４μｌの１．２５μＭ ｄＮＴＰ、０．１５μｌ（又は２．５単位）のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ））、及び全体積が２５μｌとなる量の脱イオン水を含む。ミネラルオイルを重層し、プログラム式サーマルサイクラーを使用してＰＣＲが実施される。ＰＣＲサイクルの各工程の長さ及び温度、並びにサイクル数は、実際の厳密性要件に従って調整される。アニーリング温度及びタイミングは、ともに、プライマーを鋳型にアニールする効率性、及び許容される不一致の程度によって決定づけられる。明らかに、核酸分子が同時に増幅及び変異誘発される場合は、合成の少なくとも第１ラウンドにおいて不一致が必要とされる。プライマーアニーリング条件の厳密性を最適化する能力は、当業者の知識に十分に含められる。３０℃と７２℃の間のアニーリング温度が用いられる。通常は９２℃と９９℃の間の温度で４分間にわたって鋳型分子の最初の変性が生じ、その後に変性（９４〜９９℃、１５秒から１分）、アニーリング（上述のように決定された温度；１〜２分）及び伸長（７２℃、増幅産物の長さに応じて１から５分）からなる２０〜４０のサイクルが続く。最後の伸長は、一般には、７２℃で４分間にわたって行われ、その後に４℃の無期限の（０〜２４時間の）工程が行われてもよい。
Ｃ．単一可変領域の組合せ
本発明に有用な領域を選択すると、共有結合法及び非共有結合法を含む、当該技術分野で知られている様々な方法によって組み合わせることができる。
好ましい方法は、記載されているポリペプチドリンカーを例えばｓｃＦｖ分子と併用することを含む（Ｂｉｒｄら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６）。Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２、４２３−４２６；Ｈｕｄｓｏｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１（１９９９）１７７−１８９；Ｈｕｄｓｏｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５、５８７９ ５８８３には好適なリンカーについて論述されている。リンカーは、好ましくは、柔軟で、２つの単一領域が相互作用することを可能にする。１つのリンカーの例は、（Ｇｌｙ４ ｓｅｒ）ｎリンカー（ｎ＝１〜８、例えば２、３、４、５又は７）である。柔軟性が劣る、ダイアボディに使用されるリンカーを採用してもよい（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、（１９９３）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９０：６４４４−６４４８）。
一実施形態において、採用されるリンカーは、免疫グロブリンヒンジ領域ではない。
リンカー以外の方法を用いて様々な領域を組み合わせることができる。例えば、天然又は工作システイン残基を通じて提供されたジスルフィドブリッジの使用を利用して、ＶＨ−ＶＨ、ＶＬ−ＶＬ又はＶＨ−ＶＬ二量体を安定化させる（Ｒｅｉｔｅｒら、（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．７：６９７−７０４）、或いは可変領域間の界面の改造を利用して、総合作用の「適合性」及び安定性を向上させることができる（Ｒｉｄｇｅｗａｙら、（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．７：６１７−６２１；Ｚｈｕら、（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６：７８１−７８８）。
免疫グロブリンの可変領域、特に抗体ＶＨ領域を接合又は安定化するための他の技術を適宜採用することができる。
本発明によれば、二重特異性リガンドを、溶解状態で「閉鎖」構造とすることができる。「閉鎖」構造は、２つの領域（例えばＶＨ及びＶＬ）が、抗体結合部位を形成する会合ＶＬ対の形態の如き会合形態で存在している構造である。例えば、ｓｃＦｖは、ＶＨ及びＶＬ領域を結合するのに使用されるリンカーの配置に応じて、閉鎖構造であってもよい。これが、領域が会合することを可能にするほど柔軟であるか、或いはそれらを会合位置に固定的に保持する場合は、それらの領域は恐らく閉鎖構造を採用することになる。
同様に、ＶＨ領域対及びＶＬ領域対は、閉鎖構造で存在することができる。一般には、これは、リガンド分子における硬質リンカー等による領域の閉鎖構造の機能になる。閉鎖構造のリガンドは、リガンドの半減期を増加させる分子と第２の標的分子の両方を結合できない。したがって、リガンドは、典型的には、リガンドの半減期を増加させる分子からの解離に際して第２の標的分子のみを結合することになる。
さらに、リンカーのないＶＨ／ＶＨ、ＶＬ／ＶＬ又はＶＨ／ＶＬ二量体の構成は、領域間の競合を与える。
本発明によるリガンドは、さらに、開放構造であってもよい。当該構造において、リガンドは、リガンドの半減期を増加させる分子と、第２の標的分子の両方を同時に結合することができる。典型的には、開放構造における可変領域は、それらの領域が相互作用して、抗体結合領域を形成しないとともに、それぞれのエピトープに対する結合をめぐって競合しない程度に離れて保持される（ＶＨ ＶＬ対の場合）。ＶＨ／ＶＨ又はＶＩ／ＶＬ二量体の場合は、それらの領域は、硬質リンカーによって結合されない。本来は、当該領域対は、抗原結合をめぐって競合したり、抗体結合部位を形成したりすることはない。
Ｆａｂ断片及び全抗体は、主として閉鎖構造で存在するが、開放及び閉鎖二重特異性リガンドは、恐らく、異なる雰囲気下において様々な平衡状態で存在する。リガンドの標的に対する結合は、恐らく、平衡のバランスを開放構造へとシフトさせる。したがって、本発明による特定のリガンドは、溶解状態で２つの構造で存在することができ、その１つ（開放形態）は、２つの抗原又はエピトープを独立的に結合することができ、他方の構造（閉鎖形態）は、１つの抗原又はエピトープのみを結合することができる。したがって、抗原又はエピトープは、この構造においてリガンドに対する結合をめぐって競合する。
したがって、二重特異性リガンドの開放形態は、溶解状態で閉鎖形態と平衡に存在することができるが、平衡は閉鎖形態に有利であると想定される。さらに、開放形態は、標的結合によって封鎖されて、閉鎖構造になることが可能である。したがって、好ましくは、本発明の特定の二重特異性リガンドは、２つの構造（開放構造と閉鎖構造）の間で平衡して存在する。
本発明による二重特異性リガンドを、開放及び閉鎖構造に有利になるように改造することができる。例えば、ジスルフィド結合に対するＶＨ−ＶＬ相互作用を安定化すると、閉鎖構造が安定する。さらに、ＶＨ領域及びＶＬ領域対を含む領域を結合するのに使用されるリンカーを、開放形態に有利になるように構成することができる。例えば、リンカーは、大きなアミノ酸残基を反対方向に組み込むこと、又は領域を物理的に離す好適な硬質構築物を設計することによって、領域の会合を立体的に阻害することができる。
Ｄ．二重特異性リガンドの特徴付け
二重特異性リガンドのその特異的抗原又はエピトープに対する結合を、当業者によく知られ、ＥＬＩＳＡを含む方法によって試験することが可能である。本発明の好ましい実施形態において、結合は、モノクローナルファージＥＬＩＳＡを用いて試験される。
ファージＥＬＩＳＡを任意の好適な手順に従って実施することができる。江里時的なプロトコルを以下に記載する。
各選択において生成されたファージの集団を、選択された抗原又はエピトープに対するＥＬＩＳＡによる結合についてスクリーニングして、「ポリクローナル」ファージ抗体を識別することができる。次いで、これらの集団からの単一感染細菌コロニーからのファージをＥＬＩＳＡによってスクリーニングして、「モノクローナル」ファージ抗体を識別することができる。また、可溶性抗体断片を抗原又はエピトープに対する結合についてスクリーニングすることが望ましく、これは、例えばＣ又はＮ末端タグに対する試薬を使用して、ＥＬＩＳＡによって実施することも可能である（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、（１９９４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２、４３３−５５及びそれに引用された参考文献を参照）。
選択されたファージモノクローナル抗体の多様性をＰＣＲ生成物のゲル５電気泳動（Ｍａｒｋｓら、１９９１、前出；Ｎｉｓｓｉｍら、１９９４、前出）、探査（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、１９９２）Ｊ．Ｎｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７、７７６）又はベクターＤＮＡの配列によって評価することもできる。
Ｅ．「二重特異性リガンド」の構造
上述のように、抗体は、本明細書では、少なくとも１つの重鎖及び軽鎖可変領域、少なくとも２つの重鎖可変領域、又は少なくとも２つの軽鎖可変領域を含む抗体（例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）又は断片（Ｆａｂ、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ）と定義づけられる（抗体という用語はｄＡｂをも包含する）。抗体を、自然に抗体を生成する任意の種から少なくとも部分的に誘導するか、又は組換えＤＮＡ技術によって作ることができる（血清、Ｂ細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、酵母又は細菌から単離される）。
本発明の好ましい実施形態において、二重特異性リガンドは、抗体の少なくとも１つの２０単一重鎖可変領域、及び抗体の１つの単一軽鎖可変領域、又は２つの単一重又は軽鎖可変領域を含む。例えば、リガンドは、ＶＨ／ＶＬ対、一対のＶＨ領域又は一対のＶＬ領域を含むことができる。
当該リガンドの第１及び第２の可変領域は、同一のポリペプチド鎖上に存在していてもよい。或いは、それらは、個別のポリペプチド鎖上に存在していてもよい。同一のポリペプチド鎖上に存在する場合は、上述のように、好ましくはペプチド配列であるリンカーによって結合されうる。
第１及び第２の可変領域は、共有結合又は非共有結合的に会合することができる。それらが共有結合的に会合する場合は、共有結合は、ジスルフィド結合であってもよい。
可変領域が、例えば本明細書に記載されているファージディスプレイ技術を用いて選択されたＶ遺伝子レパートリーから選択される場合は、これらの可変領域は、本明細書に記載されている特異的汎用リガンドによって認識されうるように、汎用フレームワーク領域を含む。汎用フレームワーク及び汎用リガンドの使用については、ＷＯ９９／２０７４９に記載されている。
Ｖ遺伝子レパートリーが用いられる場合は、ポリペプチド配列の変動は、好ましくは、可変領域の構造的ループ内に位置する。いずれの可変領域のポリペプチド配列も、各可変領域のその相補対との相互作用を強化するためにＤＮＡシャフリング又は変異によって変えることができる。ＤＮＡシャフリングは、当該技術分野で知られており、いずれも参照により本明細書に組み込まれているＳｔｅｍｍｅｒ、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９−３９１及び米国特許第６，２９７，０５３号に教示されている。
本発明の好ましい実施形態において、「二重特異性リガンド」は、単一鎖Ｆｖ断片である。本発明の代替的な実施形態において、「二重特異性リガンド」は、Ｆａｂ形式からなる。
さらなる態様において、本発明は、本明細書に定められている少なくとも１つの「二重特異性リガンド」をコードする核酸を提供する。
本発明の態様に応じて、抗原及びエピトープの両方が同一の抗体分子に同時に結合できることを当業者なら理解するであろう。或いは、それらは、同一の抗体分子をめぐって競合しうる。例えば、両方のエピトープが同時に結合される場合は、二重特異性リガンドの両方の可変領域が、それらの標的エピトープを独立して結合することが可能である。それらの領域が競合する場合は、１つの可変領域は、その標的を結合することが可能であるが、他の可変領域がその同族標的を結合するのと同時に結合することはできない。或いは、第１の可変領域は、その標的を結合することが可能であるが、第２の可変領域がその同族標的を結合するのと同時に結合することはできない。
可変領域を、標的抗原又はエピトープに対して導かれる抗体から誘導することができる。或いは、糸状バクテリオファージの表面に発現される領域の如き単一の抗体領域のレパートリーから誘導することができる。以下のように選択することができる。
概して、本発明を実施するのに必要とされる核酸分子及びベクター構築物を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＵＳＡの如き標準的な実験マニュアルに記載されているように構築及び操作することができる。
本発明に有用な核酸の操作は、典型的には、組換えベクターで実施される。
したがって、さらなる態様において、本発明は、本明細書に定められている少なくとも１つの「二重特異性リガンド」をコードする核酸を含むベクターを提供する。
本明細書に用いられているように、ベクターは、非相同性ＤＮＡを、その発現及び／又は複製のための細胞に導入するのに使用される個別的な要素を意味する。当該ベクターを選択又は構成し、次に使用する方法は、当業者によく知られている。細菌プラスミド、バクテリオファージ、人工染色体及びエピソームベクターを含む多くのベクターが公的に利用可能である。当該ベクターを単純なクローニング及び遺伝子誘発に使用することができる。或いは、遺伝子発現ベクターが採用される。本発明に従って使用されるベクターは、所望のサイズ、典型的には長さが０．２５キロベース（ｋｂ）から４０ｋｂ以上のポリペプチドコード配列に対応するように選択されうる。好適な宿主細胞は、インビトロのクローニング処理の後にベクターで変換される。各ベクターは、一般には、クローニング（又は「ポリリンカー」）部位、複製起点及び少なくとも１つの選択可能マーカー遺伝子を含む様々な機能的成分を含有する。所定のベクターが発現ベクターである場合は、そのベクターは、本発明によるリガンドをコードする遺伝子に機能的に結合されるようにそれぞれクローニング部位の近傍に位置するエンハンサーエレメント、プロモーター、転写終結及びシグナル配列のいずれかを有する。
一般には、クローニングベクター及び発現ベクターは、いずれも、ベクターが１つ又は複数の選択された宿主細胞に発現することを可能にする核酸配列を含む。典型的には、クローニングベクターにおいて、この配列は、ベクターが宿主染色体ＤＮＡから独立して複製することを可能にし、複製起点、又は自立的に複製する配列を含む。当該配列は、様々な細菌、酵母及びウィルスについてよく知られている。
プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点は、たいていのグラム陰性細菌に好適であり、２ミクロンプラスミド起源は、酵母に好適であり、様々なウィルス起源（例えばＳＶ４０、アデノウィルス）は、哺乳類細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般には、複製起点は、哺乳類発現ベクターがＣＯＳ細胞の如き、高レベルのＤＮＡを複製することが可能な哺乳類細胞に使用されなければ、これらのベクターに必要とされない。
有利には、クローニング又は発現ベクターは、選択可能マーカーとも称する選択遺伝子を含有することができる。この遺伝子は、選択的培地で成長された変換宿主細胞の生存又は成長に必要なタンパク質をコードする。したがって、選択遺伝子を含むベクターで変換されない宿主細胞は、その培地で生存しない。典型的な選択遺伝子は、抗生物質又は他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート又はテトラシクリン、補足栄養要求欠乏に対する抵抗性を与え、栄養要求欠乏を補い、或いは成長培地で得ることができない重要な栄養分を供給するタンパク質をコードする。本発明によるリガンドをコードするベクターの複製は大腸菌において最も便利に実施されるため、大腸菌選択可能マーカー、例えば、抗生アンピシリンに対する抵抗性を与えるβ−ラクタマーゼ遺伝子が使用される。これらは、ｐＢＲ３２２、又はｐＵＣ１８若しくはｐＵＣ１９のようなｐＵＣプラスミドの如き大腸菌プラスミドから得ることが可能である。
発現ベクターは、宿主成体に認識され、対象とするコード化配列に機能的に結合されるプロモーターを通常含有する。当該プロモーターは、誘導性又は構造性でありうる。「機能的に結合される」という用語は、記載された成分が、それらが意図したように機能することを可能にする関係にある近位配列を意味する。コード化配列に「機能的に結合された」対照配列は、コード化配列の発現を対照配列に適合する条件下で達成するように結合される。
原核宿主生物に対する使用に好適なプロモーターとしては、例えば、ｐ−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、及びｔａｃプロモーターの如きハイブリッドプロモーターが挙げられる。細菌系に使用されるプロモーターも、一般には、コード化配列に機能的に結合されるシャインダルガーノ配列を含む。好ましいベクターは、ポリペプチドライブラリーメンバーに対応するヌクレオチド配列の発現を可能にする発現ベクターである。したがって、ポリペプチドライブラリーメンバーを発現する単一クローンの個別的増殖及び発現、又は任意の選択表示系の使用によって、第１及び／又は第２の抗原又はエピトープによる選択を行うことが可能である。上述したように、好ましい選択表示系は、バクテリオファージディスプレイである。したがって、ファージ又はファージミドベクター、例えばｐＩＴ１又はｐＩＴ２を使用することができる。本発明に有用なリーダー配列としては、ｐｅｌＢ、ｓｔＩＩ、ｏｍｐＡ、ｐｈｏＡ、ｂｌａ及びｐｅｌＡが挙げられる。一例としては、（二本鎖複製に対して）複製の大腸菌起源を有するとともに、（一本鎖ＤＮＡの生成に対して）複製のファージ起源を有するファージミドベクターがある。当該ベクターの処理及び発現は、当該技術分野でよく知られている（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ（１９９２）前出；Ｎｉｓｓｉｍら、（１９９４）前出）。手短に述べると、ベクターは、β−ラクタマーゼ遺伝子、（ＮからＣ末端が）（発現されたポリペプチドを細胞周辺腔に導く）ｐｅｌＢリーダー配列からなる発現カセットの上流のｌａｃプロモーター、（ライブラリーメンバーのヌクレオチドバージョンをクローン化するための）多重クローニング部位、場合によっては（検出用の）１つ又は複数のペプチドタグ、場合によっては１つ又は複数のＴＡＧ停止コドン、及びファージタンパク質ｐＩＩＩを含有する。したがって、大腸菌の様々なサプレッサー及び非サプレッサー株を使用し、グルコース、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）、又はＶＣＳ Ｍ１３の如きヘルパーファージを加えると、ベクターは、発現のないプラスミドとして複製し、大量のポリペプチドライブラリーメンバーのみを生成し、又はそのいくつかがそれらの表面にポリペプチド−ｐＩＩＩ融合の少なくとも１つのコピーを含有するファージを生成することが可能になる。
本発明によるリガンドをコードするベクターの構成には、従来の結合技術が採用される。単離されたベクター又はＤＮＡ断片は、開裂され、調整され、必要なベクターを生成するのに望ましい形態で再結合される。要望に応じて、構成されたベクターに正しい配列が存在することを確認するための分析を知られている方法で実施することが可能である。発現ベクターを構成し、インビトロで転写物を調製し、ＤＮＡを宿主細胞に導入し、発現及び機能を評価するための分析を実施するための好適な方法は、当業者に知られている。試料中の遺伝子配列の存在を検出し、その増幅及び／又は発現をサザン又はノザン解析、ウェスタンブロット法、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質のドットブロット法、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、免疫細胞化学法、又は核酸若しくはタンパク質分子の配列解析の如き従来の方法によって定量化する。要望に応じて、それらの方法をどのように変更できるかを当業者なら容易に認識するであろう。
閉鎖構造多重特異性リガンドの構造
本発明の第２の構成の態様によれば、２つ以上の非相補的エピトープ結合領域は、本明細書に定められる閉鎖構造になるように結合される。有利には、本明細書に記載されているリンカーの代わりに、又はそれに加えて、エピトープ結合部位の閉鎖構造の形成及び／又は維持を互いに容易にすることができる骨格にそれらの領域をさらに結合させることができる。
（Ｉ）骨格
骨格は、上述した起源において、免疫グロブリン分子に基づいていてもよいし、非免疫グロブリンに基づいていてもよい。本明細書に定められている好ましい「免疫グロブリン骨格」は、少なくとも（ｉ）抗体のＣＬ（カッパ又はラムダサブクラス）領域又は（ｉｉ）抗体重鎖のＣＨ１領域を含む免疫グロブリン分子；抗体重鎖のＣＨ１及びＣＨ２領域を含む免疫グロブリン分子；抗体重鎖のＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン分子；或いは抗体のＣＬ（カッパ又はラムダサブクラス）領域と併用される集合体（ｉｉ）のいずれかから選択される骨格のいずれかを含む。ヒンジ領域を含めることもできる。領域の当該組合せは、例えば、ＩｇＧ又はＩｇＭの如き天然抗体、又はＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２分子の如きその断片に類似していてもよい。このリストは網羅的であるように意図されたものでないことを当業者なら認識するであろう。
（ＩＩ）タンパク質骨組
各エピトープ結合領域は、タンパク質骨組、及びその領域と１つ又は複数のエピトープの特異的相互作用に関与する１つ又は複数のＣＤＲを含む。有利には、本発明によるエピトープ結合領域は、３つのＣＤＲを含む。好適なタンパク質骨組は、免疫グロブリン領域に基づく骨組、フィブロネクチンに基づく骨組、アフィボディに基づく骨組、ＣＴＬＡ４に基づく骨組、ＧｒｏＥＬの如きシャペロンに基づく骨組、リポカリンに基づく骨組、並びに細菌Ｆｃ受容体ＳｐＡ及びＳｐＤに基づく骨組からなる群から選択される骨組のいずれかを含む。このリストは、網羅的であるように意図されたものではないことを当業者なら理解するであろう。
Ｆ：二重特異性リガンドの構成に使用される骨組
主鎖構造の選択
免疫グロブリンスーパーファミリーは、すべてそれらのポリペプチド鎖に対して同様の重畳を共有する。例えば、抗体は、それらの一時的配列の観点で高度に多様化しているが、配列及び結晶構造の比較により、予測に反して、抗体の６つの抗原結合ループのうちの５つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）が、限られた数の主鎖構造、又は標準構造を採用することが明らかになった（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、（１９８７）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１；Ｃｈｏｔｈｉａら、（１９８９）、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：８７７）。したがって、ループ長及び主要残基の分析により、大多数のヒト抗体に見い出されるＨ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の主鎖構造の予測が可能になった（Ｃｈｏｔｈｉａら、（１９９２）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：７９９；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、（１９９５）、ＥＭＢＯ Ｊ．、１４：２０ ４６２８；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、（１９９６）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６４：２２０）。Ｈ３領域は、（Ｄセグメントの使用により）配列、長さ及び構造の観点ではるかに多様であるが、長さ、並びにループ及び抗体フレームワークの主要位置における特定の残基の存在又は残基の種類に依存する短ループ長に対する限られた数の主鎖構造をも形成する（Ｍａｒｔｉｎら、（１９９６）、Ｊ；Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６３：８００；Ｓｈｉｒａｉら、（１９９６）、ＦＥＤＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、３９９：１）。
本発明の二重特異性リガンドは、有利には、ＶＨ領域のライブラリー及び／又はＶＬ領域のライブラリーの如き領域のライブラリーから組み立てられる。さらに、本発明の二重特異性リガンドは、それ自体ライブラリーの形で提供されうる。本発明の一態様において、メンバーの主鎖構造が把握されるように、特定のループ長及び主要残基が選択された二重特異性リガンド及び／又は領域のライブラリーが設計される。有利には、これらは、上述したように、非機能的である確率を最小限にする、自然に見い出される免疫グロブリンスーパーファミリー分子の真の構造である。生殖系列Ｖ遺伝子セグメントは、抗体又はＴ細胞受容体ライブラリーを構成するための１つの好適な基本的フレームワークとして機能する。他の配列も使用される。少数の機能的メンバーが、その機能に影響を与えない変化した主鎖構造を有することができるように、低頻度で変化が生じうる。
標準構造理論は、リガンドにコードされた異なる主鎖構造の数の評価、リガンド配列に基づいた主鎖構造の予測、標準構造に影響を与えない多様化のための残基の選択にも用いられる。ヒトＶＫ領域において、Ｌ１ループは、４つの標準構造の１つを採用することが可能であり、Ｌ２ループは、単一の標準構造を有し、ヒトＶＫ領域の９０％は、Ｌ３ループに対する４又は５の標準構造を採用することが知られている（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、（１９９５）、前出）。したがって、ＶＫ領域単体において、異なる標準構造が組み合わさって、一連の異なる主鎖構造を作ることが可能である。Ｖα領域が、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３ループに対する異なる一連の標準構造をコードし、ＶＫ及びＶα領域が、Ｈ１及びＨ２ループに対するいくつかの標準構造をコードできる任意のＶＨ領域と対合できると仮定すると、これらの５つのループに対して観察される標準構造の組合せの数は極めて大きい。これは、主鎖構造における多様性の生成は、広範な結合特異性の生成に不可欠でありうることを暗示している。しかし、単一の知られている主鎖構造に基づいて抗体ライブラリーを構成することによって、予測に反して、実質的にすべての抗原を標的とするのに十分な多様性を生成するのに主鎖構造における多様性を必要としないことがわかった。さらに驚くべきことは、単一主鎖構造は共通構造である必要がないことである。単一の天然構造をライブラリー全体に対する基礎として使用できる。したがって、好ましい態様において、本発明の二重特異性リガンドは、単一の知られている主鎖構造を有する。
選択される単一主鎖構造は、好ましくは、問題の免疫グロブリンスーパーファミリー型の分子の間で一般化されている。構造は、著しい数の天然分子がそれを採用していると認められる場合に一般化されている。よって、本発明の好ましい態様において、免疫グロブリン領域の各結合ループに対する異なる主鎖構造の自然発生を個別に検討し、次いで、異なるループに対する主鎖構造の所望の組合せを有する天然可変領域を選択する。該当するものがない場合は、最も近いものを選択する。異なるループに対する主鎖構造の所望の組合せは、所望の主鎖構造をコードする生殖系列遺伝子セグメントを選択することによって作られることが好ましい。選択された生殖系列遺伝子セグメントは、自然に高頻度で発現されることがより好ましく、それらは、すべての天然生殖系列遺伝子セグメントで発現されるのが最も好ましい。
二重特異性リガンド又はそのライブラリーを設計するのに際して、６つの抗原結合ループの各々に対する異なる主鎖構造の発生率を個別に検討することができる。Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３については、天然分子の抗原結合ループの２０％から１００％に採用される所定の構造が選択される。
典型的には、観察された発生率は、３５％以上（すなわち３５％から１００％）、理想的には５０％以上、さらには６５％以上である。Ｈ３ループの大多数は、標準構造を有さないため、標準構造を示すそれらのループに共通する主鎖構造を選択するのが好ましい。したがって、それらのループの各々について、天然レパートリーに最も頻繁に観察される構造が選択される。ヒト抗体において、各ループに対する最も慣用的標準構造（ＣＳ）は、Ｈ１−ＣＳ１（発現されたレパートリーの７９％）、Ｈ２−ＣＳ３（４６％）、ＶＫのＬ１−ＣＳ２（３９％）、Ｌ２−ＣＳ１（１００％）、ＶＫのＬ３−ＣＳ１（３６％）である（計算は、αｋ：λ比が７０：３０であることを前提としている。Ｈｏｏｄら、（１９６７）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ、４８：１３３）。標準構造を有するＨ３ループについては、塩架橋が残基９４から残基１０１までの７つの残基のＣＤＲ３長（Ｋａｂａｔら、（１９９１）、免疫学に関するタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、米国保健福祉省）が最も一般的であると思われる。少なくとも１６のヒト抗体配列が、その構造を形成する必要なＨ３長及び主要残基を含むＥＭＢＬデータライブラリーに存在し、少なくとも２つの結晶構造が、抗体モデル化のための基礎として使用できるタンパク質データバンクに存在する（２ｃｇｒ及び１ｔｅｔ）。この標準構造の組合せの最も高頻度に発現される生殖系列遺伝子セグメントは、ＶＨセグメント２−２３（ＤＰ−４７）、ＪＨセグメントＪＨ４ｂ、ＶＫセグメント０２／０１２（ＤＰＫ９）及びＪＫセグメントＪＫ１である。ＶＨセグメントＤＰ４５及びＤＰ３８も好適である。したがって、所望の単一主鎖構造によりライブラリーを形成するための基礎としてこれらのセグメントを併用することが可能である。
或いは、結合ループの各々について、異なる主鎖構造の自然発生率に基づいて単一主鎖構造を個別に選択する代わりに、単一主鎖構造を選択するための基礎として、主鎖構造の組合せの自然発生率を用いる。抗体の場合は、例えば、抗体結合ループの任意の２つ、３つ、４つ、５つ又はすべての６つの抗体に対する標準構造組合せの自然発生率を求めることが可能である。ここで、選択された構造は、天然抗体に共通していることが好ましく、天然レパートリーに最も高頻度に観察されることが最も好ましい。したがって、ヒト抗体において、例えば、５つの抗原結合ループＨ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の自然の組合せを検討する場合は、標準構造の最も高頻度の組合せが求められ、次いで、単一主鎖構造を選択するための基礎として、Ｈ３ループに対する最もポピュラーな構造と組み合わせられる。
ｉｉ．標準配列の多様化
いくつかの選択された主鎖構造、又は好ましくは単一の知られている主鎖構造を選択すると、構造的且つ／又は機能的多様性を有するレパートリーを生成するために、分子の結合部位を変化させることによって本発明による二重特異性リガンド、又は本発明に使用されるライブラリーを構成することが可能である。これは、変異体が、一連の活性を提供できるようにそれらの構造及び／又はそれらの機能に十分な多様性を有するように生成されることを意味する。
所望の多様性は、典型的には、１つ又は複数の位置における選択された分子を変化させることによって、生成される。変化させる位置は、無作為に選ぶことが可能であり、或いは好ましくは選択される。次いで、その間に常在のアミノ酸が天然又は合成の任意のアミノ酸又はその類似体に置換され、非常に多数の変異体が生成される無作為化によって、或いは常在のアミノ酸をアミノ酸の１つ又は複数の規定のサブセットで置換して、より限られた数の変異体を生成することによって、その変化を達成することが可能である。
当該多様性を導入するための様々な方法が報告されている。誤りがちＰＣＲ（Ｈａｗｋｉｎｓら、（１９９２）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２６：８８９）、化学的変異誘発（Ｄｅｎｇら、（１９９４）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９：９５３３）又は細菌変異誘発遺伝子株（Ｌｏｗら、（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ；．Ｂｉｏｌ．、２６０：３５９）を用いて、分子をコードする遺伝子に無作為変異を導入することが可能である。選択された位置を変異させるための方法も当該技術分野でよく知られており、ＰＣＲを使用して、又は使用せずに不適応オリゴヌクレオチド又は変性オリゴヌクレオチドを使用することを含む。例えば、変異を抗原結合ループに向けることによって、いくつかの合成抗体ライブラリーが作られた。ヒト破傷風トキソイド結合ＦａｂのＨ３領域を無作為化して、一連の新しい結合特異性が作られた（Ｂａｒｂａｓら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４４５７）。無作為又は半無作為Ｈ３及びＬ３領域を生殖系列Ｖ遺伝子セグメントに付加して、無変異フレームワーク領域を有する大きなライブラリーが生成された（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ、（１９９２）、Ｊ：Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１；Ｂａｒｂａｓら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４４５７；Ｎｉｓｓｉｍら、（１９９４）、ＥＭＢＯ Ｊ．、１３：６９２；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９４）、ＥＭＢＯ Ｊ．、１３：３２４５；Ｄｅ Ｋｒｕｉｆら、（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２４８：９７）。当該多様化は、他の抗原結合ループのいくつか又はすべてを含むように拡張された（Ｃｒａｍｅｒｉら、（１９９６）、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．、５２：１００；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、（１９９５）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３：４７５；Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ、ＷＯ９７／０８３２０、前出）。ループ無作為化は、Ｈ３のみに対して約１０１５を上回る構造を作り、他の５つのループに対して同様に多数の変異体を作る潜在性を有するため、現行の変換技術を使用して、又は無細胞系を使用しても、すべての可能な組合せを表すライブラリーを生成することは実現可能ではない。例えば、今日までに構成された最も大きいライブラリーの１つでも、この設計のライブラリーに対する潜在的な多様性に対してわずかな割合にすぎない６×１０１０の異なる抗体が生成されただけである（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、（１９９４）、前出）。
好ましい実施形態において、分子の所望の機能の生成又は改造に直接関与するそれらの残基のみが多様化される。多くの分子については、その機能は、標的を結合することであるため、分子の包含的充填、又は選択された主鎖構造の維持にとって重要な残基の変化を回避しながら、多様性を標的結合部位に集中させる必要がある。
抗体領域に適用されたときの標準配列の多様化
抗体二重特異性リガンドの場合は、標的に対する結合は、抗原結合部位であることが最も多い。したがって、極めて好ましい態様において、本発明は、抗原部位における残基のみが変化される抗体二重特異性リガンドのライブラリー又はその組み立てのためのライブラリーを提供する。これらの残基は、ヒト抗体レパートリーにおいて極めて多様であり、高分解能の抗体／抗原複合体において接触することが知られている。例えば、Ｌ２では、位置５０及び５３は天然抗体において多様であり、抗体と接触するのが観察される。対照的に、従来の手法は、Ｋａｂａｔら、（１９９１、前出）によって定められたように、対応する相補的決定領域（ＣＤＲ１）におけるすべての残基を多様化するものであり、７つの残基を、本発明による使用に向けて、ライブラリーで多様化された２つの残基と比較する。これは、一連の抗原結合特異性を生成するのに必要な機能的多様性の観点で、有意な向上を示すものである。
本質的に、抗体多様性は、ナイーブの一次レパートリーを作るための生殖系列Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの体細胞組換え（いわゆる生殖系列及び接合部多様性）と、結果として生じる再編成Ｖ遺伝子の体細胞過剰変異との２つのプロセスの結果である。ヒト抗体配列の分析により、一次レパートリーにおける多様性は、抗原結合部位の中央に集中するのに対して、体細胞過剰変異は、一次レパートリーに高度に保存されている抗原結合部位の周辺の領域に対して多様性を普及させる（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、（１９９６）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５６：８１３参照）。是は、恐らく、配列空間を調べるための効率的な方式として相補的に発達したものであり、明らかに抗体に特有のものであるが、他のポリペプチドレパートリーに容易に適用することが可能である。変化する残基は、標的に対する結合部位を形成する残基のサブセットである。標的結合部位における残基の異なる部分集合（重複するものも含む）は、要望に応じて、選択時に異なる段階で多様化される。
抗体レパートリーの場合は、抗原結合部位における残基のすべてではなく一部が多様化される場合に初期の「ナイーブ」レパートリーが作られる。この脈絡で本明細書に用いられているように、「ナイーブ」という用語は、所定の標的を有さない抗体分子を意味する。これらの分子は、その免疫系が、広範な抗原刺激をまだ受けていない胎児及び新生児個体の場合のように、免疫多様化を受けたことのない個体の免疫グロブリン遺伝子によってコードされる分子である。次いで、このレパートリーは、一連の抗原又はエピトープに対して選択される。次いで、必要に応じて、初期レパートリーにおいて多様化された領域の外側にさらなる多様性を導入することが可能である。この成熟レパートリーを、改造された機能、特異性又は親和性について選択することが可能である。
本発明は、二重特異性リガンドの構成のための結合領域の２つの異なるナイーブレパートリー、又は抗原結合部位における残基の一部又はすべてが変化する二重特異性リガンドのナイーブライブラリーを提供する。「一次」ライブラリーは、生殖系列Ｖ遺伝子セグメントにおいて多様である（生殖系列多様性）又は組換えプロセス中に多様化される（接合部多様性）抗原結合部位の中心の残基に多様性が限定される自然一次レパートリーに似ている。多様化されるそれらの残基としては、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２ａ、Ｈ５３、Ｈ５５、Ｈ５６、ＨＳ８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｌ５０、Ｌ５３、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４及びＬ９６が挙げられるが、それらに限定されない。「体細胞」ライブラリーでは、多様性は、組換え中に多様化される（接合部多様性）、又は高度に体細胞変異する残基に限定される。多様化されるそれらの残基としては、Ｈ３１、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４及びＬ９６が挙げられるが、それらに限定されない。これらのライブラリーにおける多様化に好適なものとして挙げたすべての残基は、１つ又は複数の抗体−抗原複合体で接触することが知られている。両方のライブラリーにおいて、抗原結合部位における残基のすべてが変化するわけではないため、そうすることが望まれる場合は、残留する残基を変化させることによって、選択時にさらなる多様性が導入される。これらの残基（又は抗原結合部位を含むさらなる残基）のいずれかの任意のサブセットを抗原結合部位の初期の且つ／又は後の多様化に使用できることを当業者なら理解するであろう。
本明細書に使用されるライブラリーの構成において、選択位置の多様化は、典型的には、いくつかの可能なアミノ酸（すべての２０のアミノ酸又はそのサブセット）をその位置に導入できるように、ポリペプチドの配列を特定するコード配列を変化させることによって、核酸レベルで達成される。ＩＵＰＡＣ命名法を用いると、尤も汎用的なコドンは、すべてのアミノ酸をコードするＮＮＫコドン、並びにＴＡＧ停止コドンである。ＮＮＫコドンは、好ましくは、必要な多様性を導入するために使用される。さらなる停止コドンＴＧＡ及びＴＡＡの生成をもたらすＮＮＮコドンを含む、同じ目的を達成する他のコドンも使用される。
ヒト抗体の抗原結合部位における側鎖多様性の特徴は、特定のアミノ酸残基に有利である明白な偏りである。ＶＨ、Ｖｋ及びＶλ領域の各々における１０の最も多様な位置のアミノ酸組成物を合計すると、側鎖多様性の７６％超が、わずか７つの異なる残基、すなわちセリン（２４％）、チロシン（１４％）、アスパラギン（１１％）、グリシン（９％）、アラニン（７％）、アスパルテート（６％）及びスレオニン（６％）で占められる。主鎖柔軟性を提供できる親水性残基及び小さい残基へのこの偏りは、恐らく、広範な抗原又はエピトープを結合しやすい表面の発達を反映するものであり、一次レパートリーにおける抗体の乱交雑が必要であることを説明するのに役立つ。
このアミノ酸の分布に似ていることが好ましいため、変化される位置のアミノ酸の分布は、好ましくは、抗体の抗原結合部位に見られる分布に似ている。一連の標的抗原に対する特定のポリペプチド（抗体ポリペプチドだけではない）の選択を可能にするアミノ酸の置換におけるそのような偏りは、任意のポリペプチドレパートリーに容易に適用される。変化させる位置のアミノ酸分布を偏らせるための様々な方法（トリヌクレオチド変異誘発を用いること（ＷＯ９７／０８３２０参照）を含む）があり、そのなかで、合成が容易であるために好ましい方法は、従来の縮退コドンを用いることである。各位置において等しい割合の一重、二重、三重及び四重縮退性を有する）縮退コドンのすべての組合せによってコードされたアミノ酸プロフィルを天然アミノ酸の使用と比較することにより、最も典型的なコドンを計算することが可能である。それぞれＩＵＰＡＣ命名法を用いるコドン（ＡＧＴ）（ＡＧＣ）Ｔ、（ＡＧＴ）（ＡＧＣ）Ｃ及び（ＡＧＴ）（ＡＧＣ）（ＣＴ）、すなわちＤＶＴ、ＤＶＣ及びＤＶＹは、所望のアミノ酸プロフィルに最も近いコドンである。それらは、２２％セリン、１１％チロシン、アスパラギン、グリシン、アラニン、アスパルテート、スレオニン及びシステインをコードする。したがって、好ましくは、ライブラリーは、多様化された位置の各々におけるＤＶＴ、ＤＶＣ又は３０ＤＶＹコドンを用いて構成される。
Ｇ：リガンド半減期を増加させることが可能な抗原
本発明による二重特異性リガンドは、その一構成において、インビボでリガンドの半減期を増加させることができる１つ又は複数の分子に結合することが可能である。典型的には、当該分子は、インビボで自然に発生し、分解、及び生物から不必要な物質を除去する内因性機構により除去に抵抗するポリペプチドである。例えば、生物の半減期を増加させる分子を以下の分子から選択することができる。
細胞外基質からのタンパク質、例えばコラーゲン、ラミニン、インテグリン及びフィブロネクチン。コラーゲンは、細胞外基質の主なタンパク質である。約１５種類のコラーゲン分子が現在知られており、例えば骨、皮膚、腱、靱帯、角膜及び内臓に見られるＩ型コラーゲン（身体コラーゲンの９０％を占める）、又は軟骨、無脊椎盤、脊索、及び目の硝子体に見られるＩＩ型コラーゲンのように、身体の様々な部分に見られる。
フィブリン、α−２マクログロブリン、血清アルブミン、フィブリノゲンＡ、フィブリノゲンＢ、血清アミロイドタンパク質Ａ、ヘプタグロブリン、タンパク質、ユビキチン、子宮グロブリン及びβ−２ミクログロブリンの如き血漿タンパク質、並びにプラスミノゲン、リソザイム、シスタチンＣ、α−１−アンチトリプシン及び膵臓キプシン阻害剤の如き酵素及び阻害剤を含む、血液に見られるタンパク質。プラスミノゲンは、トリプシン状セリンプロテアーゼプラスミンの不活性前駆体である。通常は、血流を循環するのが見られる。プラスミノゲンが活性化され、プラスミンに変換されると、血液細胞を血餅中に巻き込むフィブリノゲン繊維を溶解する強力な酵素領域を開く。これは、フィブリン溶解と呼ばれる。
ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの如き免疫系タンパク質。
レチノール結合タンパク質及びα−１ミクログロブリンの如き輸送タンパク質。
β−デフェンシン１、好中性デフェンシン１、２及び３の如きデフェンシン。
メラノコルチン受容体、ミエリン及びアスコルビン酸塩輸送体の如き血液脳障壁又は神経組織に見られるタンパク質。
トランスフェリン受容体特異性リガンド神経医薬融合タンパク質（ＵＳ５９７７３０７参照）、脳毛細血管内皮細胞受容体、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、インシュリン、インシュリン類似成長因子１（ＩＧＦ１）受容体、インシュリン類似成長因子２（ＩＧＦ２）受容体及びインシュリン受容体。
ポリシスチン、ＩＶ型コラーゲン、有機アニオン輸送体Ｋ１及びヘイマン抗原の如き腎臓に局在化されるタンパク質。
例えばアルコール脱水素酵素、Ｇ２５０等の肝臓に局在化されるタンパク質。
血液凝固因子Ｘ
α−１アンチトリプシン
ＨＮＦ１α
（ＩｇＡを結合する）分泌成分の如き肺に局在化されるタンパク質。
例えばＨＳＰ２７等の心臓に局在化されるタンパク質。これは、拡張心筋症に関連づけられる。
例えばケラチン等の皮膚に局在化されるタンパク質。
造骨活性を示す形質転換成長因子βスーパーファミリーのサブセットである骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）の如き骨特異性タンパク質。
例としては、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、−７（造骨性タンパク質（ＯＰ−１）とも称する）及び−８（ＯＰ−２）が挙げられる。
ヒト栄養膜抗原、ヘルセプチン受容体、エストロゲン受容体、及びカテプシン、例えばカテプシンＢ（肝臓及び脾臓に見られる）を含む腫瘍特異性タンパク質。
ＬＡＧ−３（リンパ球活性化遺伝子）；骨プロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）（Ｎａｔｕｒｅ ４０２、３０４−３０９、１９９９参照）；ＯＸ４０（活性化Ｔ細胞、及びヒトＴ細胞白血病ウィルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）生成細胞において特異的に上方制御されることが知られている唯一の同時刺激Ｔ細胞分子上に発現されるＴＮＦ受容体ファミリーのメンバー−Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００ Ｊｕｌ １；１６５６１）：２６３−７０参照；ＣＧ６５１２ショウジョウバエ、ヒトパラプレギン、ヒトＦｔｓＨ、ヒトＡＦＧ３Ｌ２及びマウスｆｔｓＨを含むメタロプロテアーゼ（関節炎／癌に関連づけられる）；並びに酸性繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−１）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−２）、血管内皮成長因子／血管透過性因子（ＶＥＧＦ／ＶＰＦ）、形質転換成長因子−α（ＴＧＦ−α）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、アンジオゲニン、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、血漿起源の内皮成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）、ミッドカイン血小板起源の成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ）及びフラクタルカインを含む血管形成成長因子を含む、活性化Ｔ細胞にのみ発現される抗原の如き疾病特異性タンパク質。
ストレスタンパク質（熱ショックタンパク質）。
ＨＳＰは、通常細胞内に見られる。それらが、細胞外に見られる場合は、細胞が死んで、その内容物を放出したことを示す指標である。この非プログラム細胞死（壊死）は、外傷、疾病又は損傷の結果として、したがってインビボで、細胞外ＨＳＰが、感染及び疾病に抵抗する免疫系から応答を誘発するときに発生するにすぎない。細胞外ＨＳＰに結合する二重特異性を疾病部位に局在化させることが可能である。
Ｆｃ輸送に関与するタンパク質
ブランベル受容体（ＦｃＲＢとしても知られる）
このＦｃ受容体は、いずれも送達に潜在的に有用である２つの機能を有する。それらの機能は、（１）胎盤を通じて母から子へＩｇＧを輸送すること、（２）ＩｇＧを分解から保護することによって、ＩｇＧのその血清半減期を延ばすことである。受容体は、エンドソームからＩｇＧを再生すると考えられる。Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１９９７、Ｊｕｌ；１５（７）：６３２−６を参照されたい。
インビボでの半減期の増加を必要とせずに、又は増加させることなく、本発明によるリガンドを上記標的に対して特異的に設計することができる。例えば、本発明によるリガンドは、組織特異性であることにより、二重特異性リガンド、或いは半減期の増加をもたらすことができるが、半減期の増加にかかわらず、組織特異性治療関連標的を結合するｄＡｂ単量体の組織特異性標的設定を可能にする先述の標的から選択される標的に対して特異的でありうる。さらに、そのリガンド又はｄＡｂ単量体が腎臓又は肝臓を対象にする場合は、これは、そのリガンド又はｄＡｂ単量体をインビボで代替的なクリアランス経路に転送することができる（例えば、リガンドを肝臓クリアランスから腎臓クリアランスに転送することができる）。
インビボ半減期を増加させる他の手法
特異性の１つが、抗体ポリペプチド構築物の血清半減期を増加させる標的タンパク質に対応する二重特異性リガンドの設計に加えて、血清半減期を増加させる化学成分に対する結合によって、本明細書に記載されている抗体ポリペプチドをさらに安定させることが可能である。抗体分子の薬物動態を向上させるために、本発明は、安定性を高め、半減期を増加させるポリマーに結合される単一領域可変領域ポリペプチドを提供する。ポリマー分子（例えばポリエチレングリコール；ＰＥＧ）のタンパク質に対する結合は、十分に確立され、修飾されたタンパク質の薬物動態特性を調節することが示された。例えば、タンパク質のＰＥＧ修飾は、インビボの循環半減期、抗原性、溶解性、及びタンパク質の分解に対する抵抗性を変えることが示された（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７７、２５２：３５７８；Ｎｕｃｃｉら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１９９１、６：１３３；Ｆｒａｎｃｉｓら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第３版（Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｔ．編）；及び「Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：ｉｎ ｖｉｖｏ Ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ」、１９９１、ｐｐ２３５−２６３（ニューヨーク州Ｐｌｅｎｕｍ所在））。
タンパク質分子の部位特異的及び無作為ＰＥＧ化は、ともに当該技術分野で知られている（例えば、Ｚａｌｉｐｓｋｙ及びＬｅｅ、「Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、１９９２、ｐｐ ３４７−３７０、Ｐｌｅｎｕｍ、ＮＹ；Ｇｏｏｄｓｏｎ及びＫａｔｒｅ、１９９０、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８：３４３；Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄら、１９９１、ＰＮＡＳ、８８：７１８５参照）。より具体的には、リジン残基及びチオール化誘導体における抗体分子の無作為ＰＥＧ化が記載されている（Ｌｉｎｇ及びＭａｔｔｉａｓｓｏｎ、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、５９：３２７；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら、１９８７、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ、１５：１７；Ｋｉｔａｍｕｒａら、１９９１、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５１：４３１０；Ｄｅｌｇａｄｏら、１９９６、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、７３：１７５；Ｐｅｄｌｅｙら、１９９４、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、７０：１１２６）。
ＰＥＧ化の方法は以下に記載されている。抗体ポリペプチド、及び特にｄＡｂｓのＰＥＧ化の例は、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国に指定された２００４年６月３０日に出願された同時係属出願ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００２８２９、及び２００４年１月８日に出願された米国暫定出願第６０／５３５，０７６号に示されている。
親和性／活性の測定
本明細書に記載されている単離された単一ドメイン抗体（例えばｄＡｂ）ポリペプチドは、少なくとも３００ｎＭ以下、好ましくは少なくとも３００ｎＭ〜５０ｐＭ、２００ｎＭ〜５０ｐＭ、より好ましくは少なくとも
Figure 2013056890
又はさらに５０ｐＭ程度の親和性（解離定数、Ｋｄ＝Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ）を有する。
ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ（ニューヨーク州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ所在））を使用する表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）によって、可変領域ポリペプチドの抗原結合親和性を便利に測定することが可能である。この方法では、抗原を、知られている濃度でＢＩＡｃｏｒｅチップに結合させ、可変領域ポリペプチドを導入する。可変領域ポリペプチドと固定抗原との特異的結合は、チップ基質に対するタンパク質濃度の増加、及びＳＰＲシグナルの変化をもたらす。ＳＰＲシグナルの変化は、共鳴単位（ＲＵ）として記録され、センサーグラムのＹ軸に沿って時間に対して表示される。基準シグナルは、チップを通過する溶媒のみ（例えばＰＢＳ）で採取される。基準シグナルと可変領域ポリペプチド注入完了後のシグナルとの正味の差は、所定の試料の結合値を表す。オフ速度（Ｋｏｆｆ）、オン速度（Ｋｏｎ）及び解離速度（Ｋｄ）定数を求めるために、ＢＩＡｃｏｒｅカイネチック評価ソフトウェア（例えばバージョン２．１）が用いられる。
高い親和性は、抗原の表面と抗体又は抗体断片のＣＤＲとの相補性に依存する。相補性は、標的の部分とＣＤＲとの間で可能な分子相互作用の種類及び強度、例えば潜在的イオン相互作用、ファンデルワールス引力、水素結合、又は生じうる他の相互作用によって測定される。ＣＤＲ３は、恐らく一般的にサイズがより大きいために、ＣＤＲ１及び２より抗原結合相互作用により貢献する傾向があり、好ましい表面相互作用のためのより多くの機会を提供する（例えば、Ｐａｄｌａｎら、１９９４、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１６９−２１７；Ｃｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ、１９８７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０４−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８５、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６：６５１−６６３参照）。高い親和性は、高度の相補性を有する単一免疫グロブリン可変領域／抗原対を示すもので、可変領域及び標的の構造に直接関係する。
抗原とポリペプチド構造とのドッキングを可能にする分子モデル化ソフトウェアを用いて、所定の抗原に対する単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチドの高い親和性を付与する構造を強調表示することが可能である。一般には、知られている親和性の単一免疫グロブリン可変領域の構造のコンピュータモデルを、知られている構造のポリペプチド又は他の標的抗原のコンピュータモデルとドッキングさせて、相互作用表面を測定することが可能である。当該知られている相互作用のための相互作用表面の構造が与えられると、相互作用の強さに対する可変領域配列における保守的な、又はより保守的でない置換の正又は負の影響を予測することによって、改善された結合分子の合理的な設計を可能にすることができる。
抗体単一可変領域の多量体形態
一態様において、本明細書に記載されている抗体ポリペプチド構築物（例えばｄＡｂ）は、例えばヘテロ又はホモ二量体、ヘテロ又はホモ三量体、ヘテロ又はホモ四量体、或いはより高次元のヘテロ又はホモ多量体（例えばヘテロ又はホモ五量体から八量体まで）として多量体化される。多量体化は、結合の強度が、多重結合部位の結合親和性の合計に関連づけられる結合活性効果を通じて抗原結合の強度を高めることが可能である。
ヘテロ又はホモ多量体は、例えば、ｄＡｂ−リンカー−ｄＡｂ構成、又はその構成のより高次の多重構造をもたらすペプチドリンカーを通じて融合される単一ドメイン抗体の発現を通じて調製される。多量体をさらなる成分、例えば血清半減期を増加させるポリペプチド配列、又は他のエフェクター成分、例えば毒素若しくは標的成分、例えばＰＥＧに結合させることが可能である。任意のリンカーペプチド配列、例えばｓｃＦｖを生成するために当該技術分野で使用されるリンカー配列を使用して、ヘテロ又はホモ多量体を生成することが可能である。一般的に有用な１つのリンカーは、ｎが１から約１０である（例えばｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０）ペプチド配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号７）の繰返しを含む。例えば、そのリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号８）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５（配列番号９）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）７（配列番号１０）、又は別の多様な（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）（配列番号７）配列でありうる。
ペプチド配列によって結合される単量体としての多量体の発現の代替法は、単量体免疫グロブリン可変領域を、例えばジスルフィド結合又は他の化学結合翻訳後的に通じて結合することである。例えば、遊離システインが、例えば単量体ポリペプチドのＣ末端で作られ、単量体同士のジスルフィド結合が可能になる。本態様、又は遊離システインを必要とする他の態様において、システインは、ｄＡｂ配列（Ｃ末端システインでは、プライマーにおける配列は、下流のＰＣＲプライマーに導入されるため、実際は逆補体、すなわちＡＣＡ又はＧＣＡになる）のコドンに隣接し、且つ１つ又は複数の停止コドンの直前のＰＣＲプライマー二システインコドン（ＴＧＴ、ＴＧＣ）を含めることによって導入される。要望に応じて、リンカーペプチド配列、例えば（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号７）は、ｄＡｂ配列と遊離システインの間に配置される。遊離システイン残基を有する単量体の発現により、単量体形態と二量体形態の約１：１の混合物が得られる。二量体は、ゲルクロマトグラフィ、例えば塩勾配溶離によるイオン交換クロマトグラフィを用いて単量体から分離される。
或いは、作られた遊離システインを使用して、単量体を、三量体マレイミド分子（例えばトリス［２−マレイミドエチル］アミン、ＴＭＥＡ）又は二マレイミドＰＥＧ分子（例えばＮｅｋｔａｒ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ）から入手可能）の如き多価化学リンカーにチオール結合を通じて結合する。
一実施形態において、本発明のホモ二量体又はヘテロ二量体は、Ｃ末端アミノ酸においてそれぞれ免疫グロブリンＣＨ１領域又はＣＫ領域に二重結合されるＶＨ又はＶＬ領域を含む。したがって、ヘテロ又はホモ二量体は、抗原結合領域が、Ｃ末端においてそれぞれＣＨ１及びＣＫ領域に共有結合された関連するＶＨ及び／又はＶＬ領域を含むＦａｂ類似分子であってもよい。加えて、又はその代わりに、本発明のｄＡｂ多量体を、軽鎖配列のない十分に機能的な高度特異性抗体の大部分を発現するラクダ種でモデル化することができる。ラクダ重鎖抗体は、それらの定常領域を介して二量体化される単一重鎖のホモ二量体として見い出される。これらのラクダ重鎖抗体の可変領域は、ＶＨＨ領域と称し、ＶＨ鎖の断片として単離されると、高度な特異性で抗原を結合する能力を保持する（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６−４４８；Ｇａｈｒｏｕｄｉら、１９９７、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１４：５２１−５２６）。したがって、当該技術分野で知られている方法、及び上述の方法を用いて、ラクダ種重鎖抗体ＶＨＨ構造を有する本発明の抗体単一可変領域多量体を構成することができる。
抗体ポリペプチドのＰＥＧ化
本発明は、非ＰＥＧ化抗体ポリペプチドに比べて、活性（例えば結合親和性）の低下を伴わずに半減期を増加させ、分解に対する抵抗性を高めるＰＥＧ化抗体ポリペプチド（例えばｄＡｂ）単量体及び多量体を提供する。
当該技術分野で知られている方法を用いて、本明細書に記載されている抗体ポリペプチド分子を、半減期の増加及び分解抵抗特性の向上を達成するのに有用なポリマー分子（好ましくはＰＥＧ）に結合させることが可能である。本発明に利用できるポリマー成分は、合成又は天然成分であり、直鎖状又は枝分れポリアルキレン、ポリアルケニレン又はポリオキシアルキレンポリマー、或いはホモ又はヘテロ多糖類の如き枝分れ又は非枝分れ多糖類を含むことができるが、それらに限定されない。本発明に使用できる合成ポリマーの好ましい例としては、直鎖状又は枝分れ鎖ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）、又はポリ（ビニルアルコール）及びその誘導体又は置換形態が挙げられる。本明細書に記載されている抗体ポリペプチドに対する結合のための特に好ましい置換ポリマーとしては、メトキシ（ポリエチレングリコール）を含む置換ＰＥＧが挙げられる。ＰＥＧに加えて、又はその代わりに使用できる天然ポリマー成分としては、ラクトース、アミロース、デキストラン又はグリコーゲン、並びに当業者なら認識するであろうその誘導体が挙げられる。ポリマー分子の誘導体形態としては、例えば、本明細書に記載されている抗体ポリペプチドのアミノ酸残基との相互作用を可能にする追加的な成分又は反応基が内部に存在する誘導体が挙げられる。当該誘導体としては、Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）活性エステル、プロピオン酸スクシンイミジルポリマー、マレイミド、ビニルスルホン及びチオールの如きスルフヒドリル選択性反応剤が挙げられる。特に好ましい誘導体化ポリマーとしては、ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳ、ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−ＮＨＳ、ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳ、ＰＥＧ−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨＳ、ＰＥＧ−Ｏ２ＣＮＨ−ＣＨ（Ｒ）−ＣＯ２−ＮＨＳ、ＰＥＧ−ＮＨＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨＳ及びＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳ（ただし、Ｒは（ＣＨ２）４）ＮＨＣＯ２（ｍＰＥＧ）である）の式を有するＰＥＧポリマーが挙げられるが、それらに限定されない。ＰＥＧポリマーは、線状分子でありうるし、又は多重ＰＥＧ成分が単一ポリマーに存在する枝分れ分子でありうる。本発明に有用であるいくつかの特に好ましいＰＥＧ誘導体としては、
Figure 2013056890
が挙げられるが、それらに限定されない。
反応基（例えばＭＡＬ、ＮＨＳ、ＳＰＡ、ＶＳ又はチオール）はＰＥＧポリマーに直接結合されていてもよいし、リンカー分子を介してＰＥＧに結合されていてもよい。
本発明に有用なポリマーのサイズは、５００Ｄａから６０ｋＤａ、例えば１０００Ｄａから６０ｋＤａ、１０ｋＤａから６０ｋＤａ、２０ｋＤａから６０ｋＤａ、３０ｋＤａから６０ｋＤａ、４０ｋＤａから６０ｋＤａ、及び５０ｋＤａから６０ｋＤａまでの範囲でありうる。本発明に使用されるポリマー、特にＰＥＧは、直鎖状ポリマーであるか、又は分枝構造を有していてもよい。分子量と構造の組合せに応じて、ポリマー分子は、抗体構築物（例えばｄＡｂ）単量体又は多量体に結合されると、２４から５００ｋＤａの平均ハイドロダイナミックサイズを有する分子を生成することになる。本明細書に用いられているポリマー分子のハイドロダイナミックサイズとは、分子の水溶液での拡散に基づく分子（例えばタンパク質分子）の見かけのサイズを意味する。タンパク質の溶液での拡散又は運動を処理して、サイズがタンパク質粒子のストークス半径又はハイドロダイナミック半径で与えられるタンパク質の見かけのサイズを導くことが可能である。タンパク質の「ハイドロダイナミックサイズ」は、同一の分子量を有する２つのタンパク質がタンパク質の全体構造に基づく異なるハイドロダイナミックサイズを有することができるように、質量と形状（構造）の両方に依存する。ＰＥＧ結合抗体単一可変領域（本明細書に記載されている単一ドメイン抗体多量体を含む）のハイドロダイナミックサイズは、２４ｋＤａから５００ｋＤａ、３０から５００ｋＤａ、４０から５００ｋＤａ、５０から５００ｋＤａ、１００から５００ｋＤａ、１５０から５００ｋＤａ、２００から５００ｋＤａ、２５０から５００ｋＤａ、３００から５００ｋＤａ、３５０から５００ｋＤａ、４００から５００ｋＤａ、４５０から５００ｋＤａでありうる。好ましくは、ＰＥＧ化ｄＡｂのハイドロダイナミックサイズは、３０から４０ｋＤａ、７０から８０ｋＤａ、又は２００から３００ｋＤａである。したがって、ｄＡｂ又はｄＡｂ多量体の如き抗体ポリペプチドに結合されたポリマー分子のサイズを、所望の用途に応じて変えることが可能である。例えば、ＰＥＧ化ｄＡｂが血中から出て、周辺組織に入るように意図する場合は、血流からの溢出を容易にするために、結合ポリマーのサイズを小さく維持することが望ましい。或いは、ＰＥＧ化ｄＡｂがより長時間にわたって血中にとどまることが望ましい場合は、より高分子量のポリマー（例えば３０から６０ｋＤａポリマー）を使用することが可能である。
当該技術分野でよく知られている方法を用いて、本発明に有用なポリマー（ＰＥＧ）分子を抗体ポリペプチド構築物に結合することが可能である。本発明の抗体ポリペプチド単量体又は多量体に対するＰＥＧ又は他のポリマー成分の結合における第１の工程は、球電子体含有基によるＰＥＧポリマーのヒドロキシル末端基の置換である。特に、ＰＥＧポリマーは、抗体ポリペプチド単量体又は多量体に存在するシステイン又はリジン残基に結合される。システイン及びリジン残基は天然物であるか、又は抗体ポリペプチド分子に作り変えることができる。例えば、システイン残基をｄＡｂポリペプチドのＣ末端で組み換えることができ、或いはｄＡｂ又は他の抗体ポリペプチドにおける特定の溶媒接触可能位置の残基をシステイン又はリジンで置換することができる。好ましい実施形態において、ＰＥＧ成分は、本明細書に記載されているｄＡｂ単量体又は多量体のＣ末端におけるヒンジ領域に存在するシステイン残基に結合される。
一実施形態において、ＰＥＧポリマーは、フレームワーク領域（ＦＷ）に存在する１つ又は複数のシステイン又はリジン残基、及びｄＡｂの１つ又は複数の非相同的ＣＤＲに結合される。ＣＤＲ及びフレームワーク領域は、免疫学に関するタンパク質の配列のＫａｂａｔデータベース（Ｋａｂａｔら、（１９９１）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ、米国保健福祉省）に定められている免疫グロブリン可変領域の領域である。好ましい実施形態において、ＰＥＧポリマーは、ＶＨフレームワークセグメントＤＰ４７又はＶｋフレームワークセグメントＤＰＫ９におけるシスチン又はリジン残基に結合される。ＰＥＧに結合させることができるＤＰ４７のシステイン及び／又はリジン残基は、配列番号１（図２１）の２２又は９６位のシステイン及び４３、６５、７６又は９８位のリジンを含む。本発明によるＰＥＧに結合させることができるＤＰＫ９のシステイン及び／又はリジン残基は、配列番号２（図２２）の２３又は８８位のシステイン残基及び３９、４２、４５、１０３又は１０７位のリジン残基を含む。加えて、特定のシステイン又はリジン残基をＶＨ標準フレームワーク領域ＤＰ３８又はＤＰ４５におけるＰＥＧに結合させることが可能である。
加えて、天然システイン又はリジン残基ではないｄＡｂ分子における特定の溶媒接触可能部位を、ＰＥＧポリマーの結合のためにシステイン又はリジンに変異させることが可能である。所定のｄＡｂの結晶構造の分析の如き当該技術分野で知られている方法を用いて、任意の所定のｄＡｂ単量体又は多量体における溶媒接触可能残基を決定することが可能である。例えば、（鶏卵リソザイムを結合する（以下参照））ＶＨ ｄＡｂ ＨＥＬ４の溶解結晶構造を用いて、残基Ｇｌｎ−１２、Ｐｒｏ−４１、Ａｓｐ−６２、Ｇｌｕ−８９、Ｇｌｎ−１１２、Ｌｅｕ−１１５、Ｔｈｒ−１１７、Ｓｅｒ−１１９及びＳｅｒ−１２０が溶媒接触可能なものとして識別され、ＰＥＧポリマーの結合のためのシステイン又はリジン残基への変異の魅力的な候補となった。
ＨＥＬ４の一次アミノ酸配列（配列番号５）
Figure 2013056890
Ｖｋダミーの一次アミノ酸配列（配列番号６）
Figure 2013056890
加えて、ＶｋダミーｄＡｂ（上記参照）の溶解結晶構造を用いて、残基Ｖａｌ−１５、Ｐｒｏ−４０、Ｇｌｙ−４１、Ｓｅｒ−５６、Ｇｌｙ−５７、Ｓｅｒ−６０、Ｐｒｏ−８０、Ｇｌｙ−７１、Ｇｌｎ−１００、Ｌｙｓ−１０７及びＡｒｇ−１０８が溶媒接触可能なものとして識別され、ＰＥＧポリマーの結合のためのシステイン又はリジン残基への変異の魅力的な候補となった。一実施形態において、ＰＥＧポリマーは、多溶媒接触可能システイン又はリジン残基、或いはシステイン又はリジン残基に変異された溶媒接触可能残基に結合される。或いは、特定の抗体ポリペプチド構築物が１つの溶媒接触可能システイン又はリジン（或いはシステイン又はリジンに修飾された残基）を有するにすぎない場合、或いは特定の溶媒接触可能残基が、ＰＥＧ化のためのいくつかの当該残基から選択される場合には、１つの溶媒接触可能残基のみがＰＥＧに結合される。
本発明に有用であるいくつかの結合スキームがＮｅｋｔａｒ社（カリフォルニア州ＳａｎＣａｒｌｏｓ所在）によって提供される。例えば、ＰＥＧ又は他のポリマーのリジン残基に対する結合が望ましい場合は、プロピオン酸スクシンイミジルの如きＮ−ヒドロキシルスクシンイミドで誘導体化されたＰＥＧポリマーの活性エステルを使用することができる。システイン残基に対する結合が意図される場合は、マレイミド、ビニルスルホン又はチオールの如きスルフヒドリル選択性試薬で誘導化されたＰＥＧポリマーを使用することができる。ＰＥＧ化ｄＡｂを生成するために本発明に従って使用できるＰＥＧ誘導体の具体的な実施形態の例は、Ｎｅｋｔａｒカタログ（ワールドワイドウェブのｎｅｋｔａｒ．ｃｏｍで入手可能）に見い出すことができる。加えて、本発明のｄＡｂ単量体又は多量体に対するＰＥＧポリマーの結合を容易にするために、いくつかの誘導体化形態のＰＥＧを本発明に従って使用することができる。本発明に有用なＰＥＧ誘導体としては、ＰＥＧ−コハク酸スクシンイミジル、ウレタン結合ＰＥＧ、ＰＥＧフェニルカルボネート、ＰＥＧ炭酸スクシンイミジル、ＰＥＧ−カルボキシメチルアジド、無水ジメチルマレイン酸ＰＥＧ、ＰＥＧジチオカルボネート誘導体、ＰＥＧ−トレシレート（２，２，２−トリフルオロエタンスルホネート）、ｍＰＥＧイミドエステル、及びＺａｌｉｐｓｋｙ及びＬｅｅ、（１９９２）（「Ｕｓｅ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｓ ｆｏｒ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、「Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ）に記載されている他の物質が挙げられるが、それらに限定されない。
上記実施形態の各々において、ＰＥＧポリマーを抗体ポリペプチド構築物ペプチドに存在する任意の適用可能な残基に結合することができ、又は好ましくは、その構築物の１つ又は複数の残基をシステイン又はリジン残基に修飾又は変異させ、次いでそれをＰＥＧポリマーのための結合点として使用することができる。好ましくは、このようにして修飾される残基は、溶媒接触可能残基、すなわち、抗体ポリペプチド構築物が本来の重畳構造であるときに水性環境、そして誘導体化ＰＥＧポリマーに接触可能である残基である。これらの残基のいずれかが本発明によるシステイン残基に変異されると、線形又は枝分れＭＡＬ誘導体化ＰＥＧ（ＭＡＬ−ＰＥＧ）を使用したＰＥＧ結合に利用可能となる。
一実施形態において、抗体単一可変領域及びＰＥＧポリマーを含み、ＰＥＧポリマーの抗体単一可変領域に対する割合は少なくとも０．２５：１のモル比である抗体構築物が提供される。さらなる実施形態において、ＰＥＧポリマーの抗体単一可変領域に対するモル比は、０．３３：１以上である。さらなる実施形態において、ＰＥＧポリマーの抗体単一可変領域に対するモル比は０．５：１以上である。
Ｈ：本明細書に記載されているリガンドの使用
１）本発明の第２の構成による多重特異性リガンドの使用
本発明の第２の構成による多重特異性リガンドをインビボ治療及び予防用途、インビトロ及びインビボ診断用途、並びにインビトロ試験及び試薬用途等に採用することができる。例えば、当業者に知られている方法に従って、μＥＬＩＳＡ技術の如き抗体をベースとした試験技術に抗体分子を使用することができる。
上記のように、本発明による多重特異性リガンドは、診断、予防及び治療手順に使用される。本発明による多重特異性抗体は、ウェスタン分析、及び標準的な免疫組織化学手順によるｉｎ ｓｉｔｕタンパク質検出に診断的に使用される。これらの用途に使用される場合は、当該技術分野に知られている技術に従ってリガンドをタグすることができる。加えて、当該抗体ポリペプチドは、樹脂の如きクロマトグラフ支持体に合成される場合は、親和性クロマトグラフィ手順に予備的に使用されうる。すべての当該技術は、当業者によく知られている。
本発明による閉鎖構造多重特異性リガンドの診断的使用は、２つの標的が同時に結合できないように２つの標的を競合的に結合する閉鎖構造多重特異性リガンドの能力（閉鎖構造）、或いは２つの標的を同時に結合する能力（開放構造）を利用する分析のための相同的試験を含む。
真の相同的免疫試験形式は、診断薬、及び薬品の発明及び開発に使用される調査試験システムの製造者によって熱心に求められてきた。主な診断市場としては、病院、医院及びクリニックにおける人体試験、商業的関連研究所、血液銀行、家庭、人体以外の診断薬（例えば食品試験、水試験、環境試験、バイオ防御及び獣医学的試験）、並びに最後に研究（薬物開発、基礎研究及び学術研究）が挙げられる。
現在では、これらのすべての市場は、化学発光、ＥＬＩＳＡ、蛍光、又は希な場合として放射免疫測定技術を中心として構築される免疫測定システムを利用する。これらの試験形式の各々は、分離工程（未結合試薬から結合試薬を分離する工程）を必要とする。場合によっては、いくつかの分離工程が必要とされる。これらのさらなる工程が追加されると、試薬及び自動操作が追加され、時間を要し、試験の究極的な成果に影響を及ぼす。人体の診断では、分離工程を自動化することができ、その問題が隠されるが、排除されることはない。ロボットシステム、さらなる試薬、及びさらなるインキュベート時間等により、多大な費用及び複雑さが加わる。非常に低レベルの試験分子を用いて事実上数百万の試料を一度に試験する高スループットスクリーニングの如き薬物開発では、さらなる分離工程を追加することにより、スクリーニングする能力が失われうる。しかし、分離を回避すると、読取りに過大なノイズが発生する。したがって、現行の試験形式から入手可能な範囲の感度を提供する真の相同的形式が必要とされている。有利には、試験は、感度が高く、ダイナミックレンジが大きい完全に定量的な読取りを有する。感度は、必要とされる試料の量を減少させる重要な要件である。こうした特徴はどちらとも、相同的システムが有する特徴である。これは、管理試験の点で、且つ試料が高価な薬物開発において非常に重要である。当該技術分野で現在利用可能な非相同的システムでは、大量の試料及び高価な試薬が必要とされる。
相同的試験の用途は、最大の試験が、前立腺癌について男性をスクリーニングするのに用いられる前立腺特異性抗原に対する試験である癌試験を含む。他の用途は、妊娠のためのβホグを含めることを試みる女性に対する一連の試験を提供する受精試験を含む。肝炎、ＨＩＶ、風疹、並びに他のウィルス及び微生物及び性的伝染病を含む感染病に対する試験。試験、特にＨＩＶ、Ａ、Ｂ、Ｃ型、非Ａ型、非Ｂ型肝炎に対する試験は血液銀行に用いられる。治療薬監視試験は、効果及び毒性の回避のために患者における処方薬のレベル、例えば不整脈に対するジゴキシン、精神病におけるフェノバルビタルレベル、喘息に対するテオフィリンを監視することを含む。診断試験は、さらに、コカイン及びマリファナ等に対する試験の如き薬物中毒試験に有用である。代謝試験は、甲状腺機能、貧血症並びに他の生理的疾患及び機能を測定するために用いられる。
相同的免疫試験形式は、さらに、標準的な臨床化学試験の製造に有用である。免疫試験及び化学試験を同一の計器上に含めることは診断試験に極めて有利である。好適な化学試験は、グルコース、コレステロール及びカリウム等に対する試験を含む。
相同的免疫試験に対するさらなる主要用途は、薬物発明及び開発である。高スループットスクリーニングは、組合せ化学ライブラリー対超大量標的の試験を含む。シグナルが検出され、次いで陽性グループがより小さいグループに分類され、究極的には細胞、次いで動物において試験される。相同的試験をそれらのすべての種類の試験に用いることができる。薬物開発、特に動物試験及び臨床試験において、免疫試験がよく用いられる。相同的試験は、これらの手順を著しく加速及び簡素化する。他の用途は、食品及び飲料試験（大腸菌及びサルモネラ菌等について肉及び他の食品を試験すること）、大腸菌を含む全ての種類の汚染物質に対する水生植物における試験を含む水試験、及び獣医学的試験を含む。
広範な実施形態において、本発明は、本発明による閉鎖構造多重特異性リガンドに結合され、その検出可能特性が、検体の前記閉鎖構造多重特異性リガンドに対する結合によって変化する検出可能薬剤を含む結合試験を提供する。当該試験を、それぞれが閉鎖構造多重特異性リガンドの上記特性を利用するいくつかの異なる方法で構成することができる。
試験は、薬剤の検出特性の変化をもたらす検体による薬剤の直接又は間接的変位に依存する。例えば、薬剤が、検出可能な終点を有する反応を触媒することが可能である酵素である場合には、前記酵素は、リガンドに結合されて、その活性部位が遮断されることなどによって、酵素が不活性化されうる。やはり閉鎖構造多重特異性リガンドに結合される検体は、酵素を変位させ、活性部位の自由化を通じて活性にする。次いで、酵素は、基質と反応して、検出可能事象を誘発する。代替的な実施形態において、リガンドは、活性部位の外側の酵素を結合して、酵素の構造に影響を与えるとともに、その活性を変化させることができる。例えば、活性部位の構造をリガンドの結合によって制限することができ、或いは活性に必要な共同因子の結合を回避することができる。
試験の物理的実施態様は、当該技術分野で知られている任意の形態をとることができる。例えば、閉鎖構造多重特異性リガンド／酵素複合体を試験片に設けることができ、基質を試験帯の異なる領域、及びリガンド／酵素複合体を通じて移動することが可能な検体を含有する溶液に設け、酵素を変位させ、それを基質領域に運んで、シグナルを生成することができる。或いは、リガンド／酵素複合体を試験棒又は他の固相上に設け、検体／基質溶液に浸漬させ、検体の存在に応じて酵素を溶液中に放出させることができる。
検体の各分子は、潜在的に１つの酵素分子を放出するため、検体は定量的であり、所定時間内に生成されたシグナルの強度は、溶液における検体の濃度に依存する。
閉鎖構造の検体を使用するさらなる構成が可能である。例えば、閉鎖構造多重特異性リガンドを、アロステリック部位で酵素を結合するように構成することによって、酵素を活性化することができる。当該実施形態において、酵素は、検体の不在下で活性である。検体を添加することで、酵素を変位させ、アロステリック活性化を除去し、酵素を不活性化させる。
酵素活性を検体濃度の測度として採用する上記実施形態の脈絡において、酵素の活性化又は不活性化は、シグナル生成反応を触媒する酵素の能力として測定される酵素の活性の増加又は低下を意味する。例えば、酵素は、検出不可能な基質のその検出可能な形態への変換を触媒する。例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼは、商業的に入手可能である色素産性又は化学発光基質とともに当該技術分野で広く使用されている。酵素の活性の増加又は低下のレベルは、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％の如き１０％と１００％の間であってもよい。活性の増加の場合は、その増加は、１００％を上回る、すなわち２００％、３００％又は５００％以上、或いは阻害酵素の基準活性が検出不可能である場合は百分率で測定できない。
さらなる構成において、閉鎖構造多重特異性リガンドは、酵素ではなく、酵素／基質対を結合することができる。したがって、基質は、検体の結合を通じて閉鎖構造多重特異性リガンドから放出されるまで酵素に利用できない。この構成に対する実施態様は、酵素を結合する構成に対する実施態様である。
さらに、蛍光がリガンドに結合すると消滅するような構造において、フルオレセイン又は他の蛍光体の如き蛍光分子を結合するように試験を構成することができる。この場合、検体がリガンドに結合すると、蛍光分子が変位され、シグナルが生成されることになる。本発明に有用な蛍光分子の代用としては、ルシフェリン／ルシフェラーゼの如き発光剤、及びＨＲＰの如き免疫試験に広く使用される薬剤を含む色素産性剤が挙げられる。
本発明に従って調製される多重特異性リガンドの治療及び予防上の使用は、人間等の受容体哺乳類に対する本発明によるリガンドの投与を含む。多重特異性は、抗体が強い結合活性で多量体抗原に結合することを可能にすることができる。多重特異性リガンドは、例えば腫瘍細胞系の死滅を仲介する細胞傷害性Ｔ細胞を採用する際に２つの抗原の架橋を可能にする。
少なくとも９０から９５％の相同性を有する実質的にナイーブなリガンド又はその結合タンパク質、例えばｄＡｂ単量体は、哺乳類に対する投与に好ましく、９８から９９％以上の相同性は、特に哺乳類が人間の場合に、薬学的使用に最も好ましい。部分的又は所望の相同性に純化されると、リガンドは、（体外を含む）診断又は治療に、或いは試験手順及び免疫蛍光染色等の開発及び実施に使用されうる（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｅ及びＰｅｒｎｉｓ、（１９７９及び１９８１）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（ニューヨーク州所在）。
本発明のリガンド又はその結合タンパク質、例えばｄＡｂ単量体は、典型的には、炎症状態、アレルギー性過敏症、癌、細菌又はウィルス感染、及び自己免疫疾患（Ｉ型糖尿病、喘息、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、クローン病及び重症筋無力症を含むが、それらに限定されない）の予防、抑制又は治療に使用されることになる。
関節リウマチに加えて、本明細書に記載されている抗ＴＮＦ−αポリペプチドは、アジソン病（副腎）、耳の自己免疫疾患（耳）、目の自己免疫疾患（目）、自己免疫性肝炎（肝臓）、自己免疫性耳下腺炎（耳下腺）、クローン病及び炎症性腸疾患（腸）、Ｉ型糖尿病（膵臓）、精巣上体炎（精巣上体）、糸球体腎炎（腎臓）、グレーブス病（甲状腺）、ギラン−バレ症候群（神経細胞）、橋本病（甲状腺）、溶血性貧血症（赤血球細胞）、全身性紅斑性狼瘡（多組織）、男性不妊症（精液）、多発性硬化症（神経細胞）、重症筋無力症（神経筋接合部）、天痘瘡（主に皮膚）、乾癬（皮膚）、リウマチ熱（心臓及び接合部）、サルコイド（多組織及び器官）、強皮症（皮膚及び接合組織）、シェーグレン症候群（外分泌腺及び他の組織）、脊椎関節症（体軸骨格及び他の組織）、甲状腺炎（甲状腺）、潰瘍性大腸炎（腸）及び血管炎（血管）（括弧内は影響を受ける器官）を含むが、それらに限定されない自己免疫疾患の治療に適用可能である。
本明細書に記載されている抗ＶＥＧＦポリペプチドは、関節リウマチ及び他の慢性炎症疾患（例えばクローン病及び乾癬等）に加えて、糖尿病、急性ミエロイド性白血病、白血病、並びに黄斑変性及び糖尿病性網膜症を含む眼疾患の治療に使用されうる。
本出願において、「予防」という用語は、疾病の誘発に先立つ保護組成物の投与を含む。「抑制」とは、誘発的事象後で、疾病の臨床的発現前の該組成物の投与を意味する。
疾病から保護する又は疾病を治療する上での抗体又はその結合タンパク質の効果を調べるのに使用できる動物モデルシステムが利用可能である。感受性マウスにおける全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）を試験するための方法は、当該技術分野で知られている（Ｋｎｉｇｈｔら、（１９７８）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１４７：１６５３；Ｒｅｉｎｅｒｓｔｅｎら、（１９７８）、Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、２９９：５１５）。他の生物種からの可溶性ＡｃｈＲタンパク質で疾病を誘発することによって、ＳＪＬ／Ｊ雌マウスにおける重症筋無力症（ＭＧ）が試験されている（Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍら、（１９８８）、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｒｚｏｌ．、４２：２３３）。ＩＩ型コラーゲンを３０回注射することによって、感受性系統のマウスに関節炎が誘発されている（Ｓｔｕａｒｔら、（１９８４）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、４２：２３３）。ミコバクテリア熱ショックタンパク質の注入によって影響を受けやすいラットにアジュバンド関節炎を誘発するモデルが記載されている（Ｖａｎ Ｅｄｅｎら、（１９８８）、Ｎａｔｕｒｅ、３３１：１７１）。記載されているように、チログロブリンの投与によってマウスに甲状腺炎が誘発されている（Ｍａｒｏｎら、（１９８０）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１５２：１１１５）。インシュリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、自然に発生するか、或いはＫａｎａｓａｗａら、（１９８４）、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、２７：１１３に記載されているマウスの如き特定の系統のマウスに誘発されうる。マウス及びラットにおけるＥＡＥは、人間におけるＭＳのモデルとして機能する。このモデルでは、ミエリン塩基性タンパク質を投与することによって脱髄疾患が誘発される（Ｐａｔｅｒｓｏｎ、（１９８６）、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｍｍｕｏｐａｔｈｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｍｉｓｃｈｅｒら編、Ｇｒｕｎｅ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｔｏｎ（ニューヨーク）、ｐｐ．１７９−２１３；ＭｃＦａｒｌｉｎら、（１９７３）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１７９：４７８；及びＳａｔｏｈら、（１９８７）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３８：１７９参照）。
一般に、本リガンドは、薬理学的に適切な担体とともに純化された形態で利用される。典型的には、これらの担体は、水性又はアルコール／水溶液、エマルジョン又は懸濁液を含み、いずれも塩及び／又は緩衝媒体を含む。非経口媒体は、塩化ナトリウム溶液、リンガーブドウ糖及び塩化ナトリウム、及び乳酸加リンガー液を含む。必要に応じてポリペプチド複合体を懸濁液に維持するための好適な生理学的に許容可能なアジュバントは、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン及びアルギン酸塩の如き濃縮剤から選択されうる。
静脈内媒体は、流体及び栄養素補充液、並びにリンガーブドウ糖に基づく液の如き電解質補充液を含む。抗微生物剤、酸化防止剤、キレート化剤及び不活性ガスの如き防腐剤及び他の添加剤が存在していてもよい（Ｍａｃｋ、（１９８２）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版）。
本発明のリガンドを個別に投与する組成物として、又は他の薬剤と併用して使用することができる。これらは、シクロスポリン、メトトレキセート、アドリアマイシン又はシスプラチン及び免疫毒素の如き様々な免疫治療薬を含むことができる。医薬組成物は、本発明のリガンド、或いはさらに、投与前に蓄積されているか否かにかかわらず、異なる標的抗原又はエピトープを使用して選択されたリガンドの如き異なる特異性を有する本発明によるリガンドの組合せとともに様々な細胞毒性又は他の作用物質の「カクテル」を含むことができる。
本発明による医薬組成物の投与の経路は、当業者に広く知られている経路のいずれかであってもよい。免疫治療を含むが、それに限定されない治療では、本発明の選択されたリガンドを標準的な技術に従って任意の患者に投与することが可能である。投与は、非経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、腹膜内投与、経皮投与、肺経路を介する投与を含む任意の適切な方式により、或いはまた適切にカテーテルによる直接的な注入によって可能である。投与の用量及び頻度は、患者の年齢、性別及び状態、他の薬物の同時投与、反対効果、及び臨床医が考慮する他のパラメータに依存することになる。
当業者であれば理解するように、投与の経路及び／又は方式は、所望の結果に応じて変わる。特定の実施形態において、植込錠、経皮パッチ及びマイクロカプセル送達システムを含む徐放製剤形態の如き、化合物を急速な放出から保護する担体を用いて活性化合物を調製することが可能である。単一抗体構築物は、一部にはサイズが小さいために、徐放製剤としての製剤形態によく適している−用量当たりのモル数は、例えばフルサイズの抗体の投与物よりはるかに大きいといえる。エチレン酢酸ビニル、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル及びポリ乳酸の如き生物分解性、生物適合性ポリマーを使用することができる。吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物に含めることによって、注射可能組成物の吸収を長時間化することが可能である。当該製剤形態を調製するための方法の多くは、特許化されており、或いは当業者に広く知られている。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ（ニューヨーク）、１９７８を参照されたい。本明細書に開示されている単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチドの如きポリペプチドの徐放又は長時間放出に適用可能なさらなる方法は、例えば、いずれも参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，３０６，４０６号及び６，３４６，２７４号、並びに例えば米国特許出願第ＵＳ２００２０１８２２５４号及びＵＳ２００２００５１８０８号に記載されている。
本明細書に記載されているリガンドを保存のために凍結乾燥し、使用前に好適な担体中に復元することが可能である。この技術は、従来の免疫グロブリンに有効であることが示されており、当該技術分野で知られている凍結乾燥及び復元技術を採用することが可能である。凍結乾燥及び復元は、様々な度合いの抗体活性損失をもたらしうること（例えば従来の免疫グロブリンでは、ＩｇＭ抗体は、ＩｇＧ抗体より活性ロスが大きい傾向にある）、及び使用レベルを上方調節して補償しなければならないことがあることを当業者なら理解するであろう。
本リガンド又はそのカクテルを含有する組成物を予防及び／又は治療措置のために投与することが可能である。特定の治療用途において、選択された細胞の集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、調節、死滅又はいくつかの他の測定可能パラメータを達成するための十分な量を「治療有効用量」と定義づける。この用量を達成するのに必要な量は、疾病の重症度及び患者自身の免疫系の全体的状態に依存するが、一般には体重１ｋｇ当たりのリガンド、例えば抗体、受容体（例えばＴ細胞受容体）又はその結合タンパク質の量が０．００５から５．０ｍｇの範囲であり、０．０５から２．０ｍｇ／ｋｇ／用量が最も広く用いられている。予防用途でも、本リガンド又はそのカクテルを含有する組成物を同様の用量、又はわずかに少ない用量で投与することができる。
本明細書に記載されている組成物を使用して実施される治療は、１つ又は複数の症状が、治療前の当該症状と比べて、或いは当該組成物で治療されていない個体（人間又はモデル動物）における症状と比べて（例えば少なくとも１０％、又は臨床評価スケールで少なくとも１ポイント）低減される場合に「有効」と見なされる。症状は、明らかに、標的とする疾病又は疾患に応じて異なるが、通常の熟練度の臨床医又は技術者によって測定されうる。当該症状は、例えば、疾病又は疾患の１つ又は複数の生化学的指標のレベル（例えば疾病に相関づけられる酵素又は代謝物質のレベル、影響を受けた細胞数等）を監視することによって、物理的症状（例えば炎症、腫瘍サイズ等）を監視することによって、或いは認められた臨床評価スケール、例えば（多発性硬化症に対する）拡大傷病状態スケール、アーバイン炎症性腸疾患質問調査（３２ポイント評価により腸機能、全身的症状、社会的機能及び情動状態を評価する−スコアは３２から２２４の範囲にあり、スコアが高いほど生活の質が良好であることを示す）、生活の質関節リウマチスケール、又は当該分野で知られている他の認められた臨床評価スケールによって、測定されうる。少なくとも１０％、又は所定のスケールでの１ポイント以上の疾病又は疾患症状の継続的な（例えば１日以上、好ましくはより長期的な）低減は、「有効」治療を示す。同様に、本明細書に記載されている組成物を使用して実施される予防は、１つ又は複数の症状の発症又は重症度が、その組成物で治療されていない同様の個体（人間又は動物モデル）における当該症状に比べて、遅延、低減又は消滅される場合に「有効」である。
本発明によるリガンド又はそのカクテルを含有する組成物を予防及び治療環境に利用して、哺乳類における選択標的細胞集団の改変、不活性化、死滅又は除去を支援することができる。加えて、本明細書に記載されているポリペプチドの選択されたレパートリーを体外又はインビトロで選択的に使用して、細胞の非相同的集合体から標的細胞群を死滅、消滅或いは効果的に除去することができる。哺乳類の血液をリガンド、例えば抗体、細胞表面受容体又はその結合タンパク質と体外で組み合わせることにより、望ましくない細胞を死滅させ、或いは血液から除去し、標準的な技術に従って血液を哺乳類に戻すことができる。
２：本発明による半減期向上二重特異性リガンドの使用
本発明の方法による二重特異性リガンドをインビボ治療及び予防用途、及びインビボ診断用途等に採用することができる。
本発明に従って調製された二重特異性リガンドの治療及び予防上の使用は、人間の如き哺乳類に対して本発明によるリガンドを投与することを含む。本発明による二重特異性抗体は、半減期向上分子に対する少なくとも１つの特異性を有する。１つ又は複数のさらなる特異性を標的分子に対して導くことができる。例えば、二重特異性ＩｇＧは、その１つが半減期向上分子上にある４つのエピトープに対して特異的でありうる。二重特異性は、抗体が強い結合活性で多量体抗原に結合することを可能にすることができる。二重特異性抗体は、例えば、腫瘍細胞系の死滅を仲介する細胞傷害性Ｔ細胞を採用する際に、２つの抗原の架橋を可能にすることができる。
少なくとも９０から９５％の相同性を有する、ｄＡｂ単量体の如き、実質的にナイーブなリガンド又はその結合タンパク質は、哺乳類に対する投与に好ましく、９８から９９％以上の相同性は、特に哺乳類が人間の場合に、薬学的使用に最も好ましい。部分的又は所望の相同性に純化されると、リガンドは、（体外を含む）診断又は治療に、或いは試験手順及び免疫蛍光染色の開発及び実施に使用されうる（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｅ及びＰｅｒｎｉｓ、（１９７９及び１９８１）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（ニューヨーク州所在）。
本発明のリガンドは、典型的には、炎症状態、アレルギー性過敏症、癌、細菌又はウィルス感染、及び自己免疫疾患（Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、クローン病及び重症筋無力症を含むが、それらに限定されない）の予防、抑制又は治療に使用されることになる。
疾病から保護する又は疾病を治療する上で二重特異性リガンドの効果を調べるのに使用できる動物モデルシステムが利用可能である。影響を受けやすいマウスにおける全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）を試験するための方法は、当該技術分野で知られている（Ｋｎｉｇｈｔら、（１９７８）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１４７：１６５３；Ｒｅｉｎｅｒｓｔｅｎら、（１９７８）、Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、２９９：ｓ５１５）。他の生物種からの可溶性ＡｃｈＲタンパク質で疾病を誘発することによって、ＳＪＬ／Ｊ雌マウスにおける重症筋無力症（ＭＧ）が試験されている（Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍら、（１９８８）、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４２：２３３）。ＩＩ型コラーゲンの注入によって、影響を受けやすい系統のマウスに関節炎が誘発されている（Ｓｔｕａｒｔら、（１９８４）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、４２：２３３）。ミコバクテリア熱ショックタンパク質の注入によって影響を受けやすいラットにアジュバンド関節炎を誘発するモデルが記載されている（Ｖａｎ Ｅｄｅｎら、（１９８８）、Ｎａｔｕｒｅ、３３１：１７１）。記載されているように、チログロブリンの投与によってマウスに甲状腺炎が誘発されている（Ｍａｒｏｎら、（１９８０）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１５２：１１１５）。インシュリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、自然に発生するか、或いはＫａｎａｓａｗａら、（１９８４）、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、２７：１１３に記載されているマウスの如き特定の系統のマウスに誘発されうる。マウス及びラットにおけるＥＡＥは、人間におけるＭＳのモデルとして機能する。このモデルでは、ミエリン塩基性タンパク質を投与することによって５脱髄疾患が誘発される（Ｐａｔｅｒｓｏｎ、（１９８６）、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｍｉｓｃｈｅｒら編、Ｇｒｕｎｅ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｔｏｎ（ニューヨーク）、ｐｐ．１７９−２１３；ＭｃＦａｒｌｉｎら、（１９７３）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１７９：４７８；及びＳａｔｏｈら、（１９８７）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３８：１７９参照）。
本発明による二重特異性リガンド、及びエンドサイトーシスに関与する細胞外標的（例えばクラスリン）に結合することができるｄＡｂ単量体は、二重特異性リガンドを飲食運動させることを可能に、細胞内標的に結合することができる他の特異性を細胞内環境に送達することを可能にする。この手法は、二重特異性リガンドが細胞内部で機能性を維持することを可能にする物理的特性を有する二重特異性リガンドを必要とする。或いは、最終標的の細胞内区画が酸化性である場合は、十分に重畳したリガンドは、ジスルフィドフリーである必要はない。
一般に、本二重特異性リガンドは、薬理学的に適切な担体とともに純化された形態で利用される。典型的には、これらの担体は、水性又はアルコール／水溶液、エマルジョン又は懸濁液を含み、いずれも塩及び／又は緩衝媒体を含む。非経口媒体は、塩化ナトリウム溶液、リンガーブドウ糖及び塩化ナトリウム、及び乳酸加リンガー液を含む。必要に応じてポリペプチド複合体を懸濁液に維持するための好適な生理学的に許容可能なアジュバントは、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン及びアルギン酸塩の如き濃縮剤から選択されうる。静脈内媒体は、流体及び栄養素補充液、並びにリンガーブドウ糖に基づく液の如き電解質補充液を含む。抗微生物剤、酸化防止剤、キレート化剤及び不活性ガスの如き防腐剤及び他の添加剤が存在していてもよい（Ｍａｃｋ、（１９８２）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版）。
本発明のリガンドを個別に投与する組成物として、又は他の薬剤と併用して使用することができる。これらは、シクロスポリン、メトトレキセート、アドリアマイシン又はシスプラチン及び免疫毒素の如き様々な免疫治療薬を含むことができる。医薬組成物は、本発明のリガンドとともに様々な細胞毒又は他の作用物質の「カクテル」を含むことができる。
本発明による医薬組成物の投与の経路は、当業者に広く知られている経路のいずれかであってもよい。免疫治療を含むが、それに限定されない治療では、本発明のリガンドを標準的な技術に従って任意の患者に投与することが可能である。投与は、非経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、腹膜内投与、経皮投与、肺経路を介する投与を含む任意の適切な方式により、或いはまた適切にカテーテルによる直接的な注入によって可能である。投与の用量及び頻度は、患者の年齢、性別及び状態、他の薬物の同時投与、反対効果、及び臨床医が考慮する他のパラメータに依存することになる。
本発明のリガンドを保存のために凍結乾燥し、使用前に好適な担体中に復元することが可能である。この技術は、従来の免疫グロブリンに有効であることが示されており、当該技術分野で知られている凍結乾燥及び復元技術を採用することが可能である。凍結乾燥及び３０復元は、様々な度合いの抗体活性損失をもたらしうること（例えば従来の免疫グロブリンでは、ＩｇＭ抗体は、ＩｇＧ抗体より活性ロスが大きい傾向にある）、及び使用レベルを上方調節して補償しなければならないことがあることを当業者なら理解するであろう。
本リガンド又はそのカクテルを含有する組成物を予防及び／又は治療処置のために投与することが可能である。特定の治療用途において、選択された細胞の集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、調節、死滅又はいくつかの他の測定可能パラメータを達成するための十分な量を「治療有効用量」と定義づける。この用量を達成するのに必要な量は、疾病の重症度及び患者自身の免疫系の全体的状態に依存するが、一般には体重１ｋｇ当たりのリガンド量が０．００５から５．０ｍｇの範囲であり、０．０５から２．０ｍｇ／ｋｇ用量が最も広く用いられている。予防用途でも、本リガンド又はそのカクテルを含有する組成物を同様の用量、又はわずかに少ない用量で投与することができる。
本発明によるリガンドを含有する組成物を予防及び治療環境に利用して、哺乳類における選択標的細胞集団の改変、不活性化、死滅又は除去を支援することができる。
加えて、本明細書に記載されているポリペプチドの選択されたレパートリーを対外又はインビトロで選択的に使用して、細胞の非相同的集合体から標的細胞群を死滅、消滅或いは効果的に除去することができる。哺乳類の血液をリガンド、例えば抗体、細胞表面受容体又はその結合タンパク質と体外で組み合わせることにより、望ましくない細胞を死滅させ、或いは血液から除去し、標準的な技術に従って血液を哺乳類に戻すことができる。例示のみを目的として、本発明を以下の実施例でさらに説明する。本明細書に用いられているように、ｄＡｂ命名法の目的で、ＴＮＦ−αをＴＡＲ１と呼び、ヒトＴＮＦα受容体１（ｐ５５受容体）をＴＡＲ２と呼ぶ。
３．関節リウマチの治療
好ましい実施形態において、本明細書に記載されているリガンドを使用して、関節リウマチを治療することができる。
一実施形態において、本発明は、関節リウマチを治療する方法であって、そのいずれかがヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗する１つ又は複数の単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を使用することを含む。本発明は、ヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗する１つ又は複数の単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物と、リガンドの１つの特異性が、ＴＮＦαに向けられる単一ドメイン抗体であり、第２の特異性が、ＶＥＧＦ又はＨＳＡに向けられる単一ドメイン抗体である二重特異性リガンドとを含む組成物を包含する。本発明は、リガンドの１つの特異性がＶＥＧＦに向けられ、第２の特異性がＨＳＡに向けられる二重特異性リガンドをさらに包含する。
一実施形態において、本発明は、関節リウマチを治療する方法であって、１つ又は複数の単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含む組成物を投与することを含み、該構築物のいずれかが、ヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗し、且つ／又は関節炎のＴｇ１９７遺伝子組換えマウスモデルのマウスに投与されると関節炎スコアの増加を防止し、且つ／又はＬ９２９細胞傷害性試験におけるＴＮＦ−αを中和する方法を提供する。特に、関節炎を治療する方法は、１つ又は複数の単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含む組成物を投与することを含み、該構築物のいずれかがＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗し、該組成物のＴｇ１９７遺伝子組換えマウスに対する投与は、関節炎スコアの増加を防止する。
ａ）受容体結合試験
関節リウマチを治療するためのリガンドは、ＴＮＦ−αのＴＮＦ−α受容体に対する結合に干渉することが可能である。受容体は、孤立した（通常は膜結合した）受容体であるか、或いはインビトロ又はインビボで細胞上に存在する受容体でありうる。
ＴＮＦ−α受容体結合、及び本明細書に記載されているリガンドによる当該結合に対する干渉を測定するための試験を例６に記載する。これらは、ＥＬＩＳＡ（例６、セクション１．３．１）、ＢＩＡｃｏｒｅ分析（例６、セクション１．３．２）、及び孤立した（又は膜会合した）受容体（例６、セクション１．３．３）と培養細胞の表面に発現した受容体（例６、セクション１．３．３）の両方を使用する生化学的受容体結合試験を含む。
本明細書に用いられているように、受容体の「結合に拮抗する」という用語は、ＴＮＦ−α（又はＶＥＧＦ又は他の因子）の同族受容体に対する結合に干渉する所定の抗体ポリペプチド構築物の能力又は効果を意味する。拮抗性は、本明細書に記載されているインビトロの細胞ベースの試験又はインビボ試験のいずれかを用いて測定される。したがって、受容体は、孤立しているか、膜結合しているか、又は細胞表面に存在しうる。構築物は、構築物の存在下で検出された結合に、構築物が不在のときに比べて統計的に有意な低下がある場合に、同族受容体（例えばＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ）に対する結合に干渉しているか、又はその結合に拮抗している。或いは、構築物は、構築物の存在下における結合測定値が構築物が不在のときに比べて少なくとも１０％低下している場合に、結合に干渉している。
ｂ）Ｌ９２９細胞傷害性試験
関節リウマチの治療のためのリガンドは、Ｌ９２９細胞傷害性試験において、ＴＮＦ−αの細胞傷害性効果に干渉することができる。Ｅｖａｎｓら、２０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５：２４３−２４８に記載されている試験に基づくこの試験を例６、セクション１．３．３に記載する。関節リウマチの治療に有用な抗ＴＮＦ−αリガンドは、この細胞試験において、ＴＮＦ−αの活性を中和することができる。
本明細書に用いられているように、「中和」という用語は、本明細書に記載されている抗体又はｄＡｂポリペプチドに関して用いられるときは、ポリペプチドが標的抗原の測定可能な活性又は機能に干渉することを意味する。ポリペプチドは、標的抗原の測定可能な活性又は機能を少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上、又は１００％の抑制率（すなわち、標的抗原の効果又は機能が検出されない抑制率）で低減する場合に、「中和」ポリペプチドである。したがって、標的がＴＮＦ−αである場合は、本明細書に記載されている標準的なＬ９２９細胞死滅試験を用いて、或いはＴＮＦ−α誘発細胞活性を測定するＨＵＶＥＣでＥＬＡＭ−１のＴＮＦ−α誘発発現を抑制する抗ＴＮＦ−αポリペプチド構築物の能力を測定することによって、中和活性を評価することが可能である。
ＴＮＦ−αの受容体結合活性に対する抗体ポリペプチド干渉についてのさらなる試験は、例６、セクション１．３．３にも記載されているＨｅＬａ ＩＬ−８試験を含む。
ｃ）インビボ試験
Ｔｇ１９７遺伝子組換えマウス関節炎モデルを用いて、本明細書に記載されている抗ＴＮＦ−αリガンドの効果を評価することが可能である。Ｔｇ１９７マウスは、ヒトＴＮＦ−グロビンハイブリッド遺伝子に対する遺伝子組換えマウスで、４〜７週齢におけるヘテロ接合体は、関節リウマチと共通の組織学的特徴を有する慢性の進行性多発関節炎を生じる（Ｋｅｆｆｅｒら、１９９１、ＥＭＢＯ Ｊ．１０：４０２５−４０３１）。関節可動度及び間接腫脹を評価することによって関節炎表現型を採点することが可能である。関節の関節炎表現型を関節のＸ線撮像、並びに膝及び踝／足関節の固定部の組織病理学的分析によって採点することが可能である。
所定の抗体ポリペプチド構築物の効果を評価するための実験的処理を以下のように実施する。
１）抗体ポリペプチド構築物による関節炎の予防を試験するために、動物を以下のように処理する。
ａ）ヘテロ接合性Ｔｇ１９７マウスを、雌と雄が同数の１０の動物のグループに分ける。３週齢から処理を開始し、抗体ポリペプチドをＰＢＳで毎週腹膜内投与し、又は対照動物にはＰＢＳのみを投与する。
ｂ）毎週マウスの体重を測定する。
ｃ）０＝関節炎ではない（正常な外観及び屈曲）、１＝軽度の関節炎（関節の歪み）、２＝中等度の関節炎（腫脹、関節の変形）、３＝重度の関節炎（著しい運動障害）のシステムに従って、関節炎のマクロ表現型徴候についてマウスを採点する。
個々の採点が試験グループに対してブラインドされるように、試験を最適に実施すべきである。この試験の抗体送達の好ましい機構は、ＩＰ注射である。しかし、皮下注射、ＩＶ注射（例えば尾静脈を介する）、筋肉内注射、又は経口、吸入若しくは局所的投与を用いるように試験を構成することが可能である。
処理グループにおける平均関節炎スコアが媒体のみの対照グループより（統計的に有意な量だけ）低い場合に、処理は、Ｔｇ１９７モデルシステムで有効である。平均関節炎スコアが、媒体のみの対照動物と比べて、少なくとも０．５単位、少なくとも１．０単位、少なくとも１．５単位、又は少なくとも２単位低い場合にも処理は有効であると見なされる。或いは、平均関節炎スコアが、治療処置の過程を通じて０から０．２５に維持又は低下される場合に、処理は有効である。
処理グループにおける平均関節炎スコアが、実験の過程を通じて増加しているが、この増加の始まりが、媒体のみの対照と比較した場合に遅れている場合に、処理はＴｇ１９７モデルシステムにおいて有効である。媒体のみの対照と比較した場合の処理グループの平均関節炎スコアの増加の始まりが、少なくとも０．５週間、少なくとも１週間、少なくとも１．５週間、少なくとも２週間、又は３週間を上回る期間だけ遅れている場合も処理は有効であると見なされる。
マクロ表現型の採点の代替として、処理中の様々な間隔で、踝／足及び膝関節を固定し、０＝検出可能な病状なし、１＝滑膜の過形成及び多形核浸潤物の存在、２＝パンヌス及び繊維状組織の形成並びに限局性軟骨下骨浸食、４＝広範な関節軟骨破壊及び骨浸食のシステムを用いて組織病理学的に分析することが可能である。平均組織病理学的スコアが、媒体のみの対照グループより（統計的に有利な量だけ）低い場合に、処理は有効であると見なされる。平均組織病理学的スコアが、媒体のみの対照グループと比べて、少なくとも０．５単位、少なくとも１．０単位、少なくとも１．５単位、少なくとも２．０単位、少なくとも２．５単位、少なくとも２．５単位、少なくとも３．０単位、又は少なくとも３．５単位だけ低い場合にも処理は有効であると見なされる。或いは、平均組織病理学的スコアが、治療処置の過程を通じて０から０．５に維持又は低下される場合に、処理は有効である。
２）確立された関節炎に対する抗体ポリペプチド構築物（抗ＴＮＦ−α、抗ＶＥＧＦ等）の効果を試験するために、動物が有意な関節炎表現型を有する時である６週齢から処理を開始し、Ｔｇ１９７に対して上述のように試験を実施することが可能である。採点及び効果分析も上述のように行う。上述の抗ＴＮＦ−αｄＡｂ構築物は、記載されたモデルシステムのいずれかにおいて、確立された関節炎の進行を停止又は逆転させることが可能である。
いずれの形式においても、処理手法は、単量体、二量体又は他の多量体形態の抗ＴＮＦ−α（例えば本明細書に記載されている）抗ＴＮＦ−αｄＡｂ、単量体、二量体又は他の多量体形態の抗ＶＥＧＦ（例えば、ラクダ抗ＶＥＧＦｄＡｂをも含む、本明細書に記載されている抗ＶＥＧＦｄＡｂｓ）二重特異性形式の抗ＴＮＦ／抗ＶＥＧＦ、及び抗ＨＳＡ、ＰＥＧ又は他の半減期改変成分を担持する個別又は二重特異性構築物を含む。また、本明細書に記載されている抗ＶＥＧＦ組成物を、エタネルセプト（エンブレル）、Ｄ２Ｅ７（フミラ）及びインフリキシマブ（レミケード）の如き他の抗ＴＮＦ組成物と組み合わせて投与することが可能である。当該組合せ治療の効果を、例えば、細胞培養、及び本明細書に記載されているインビボモデルシステムを用いて評価することが可能である。
受け入れられているさらなる関節炎の動物モデルとしては、例えばＨｏｒｓｆａｌｌら、１９９７、Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：５６８７に記載されているコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）、及び例えばＳｔａｓｌｕｋら、１９９７、Ｉｍｍｕｎｏｌ．９０：８１に記載されているプリスタン誘発関節炎が挙げられる。
抗ＶＥＧＦポリペプチド構築物効果に対する試験：
ａ）ＶＥＧＦ受容体２結合試験
この方法は、ＶＥＧＦ受容体２に対するＶＥＧＦ１６５の結合を防止する可溶性領域抗体（ｄＡｂｓ）の能力を測定するためのＶＥＧＦ受容体結合試験を示す。
ＶＥＧＦは、インビトロで内皮細胞に対する特異的ミトゲンであり、インビボで強力な血管形成因子であり、高レベルのタンパク質が様々な種類の腫瘍で発現される。それは、ホモ二量体として活性の４５ｋＤａ糖タンパク質である。これまで、代替的なｍＲＮＡ分裂を通じて発生する５つの異なるイソ型が記載されている。これらのイソ型のうち、ＶＥＧＦ１２１及びＶＥＧＦ１６５が最も多い。
内皮細胞に対するＶＥＧＦの特異的作用は、主に、ＶＥＧＦ Ｒ１（Ｆｌｔ−１）とＶＥＧＦ Ｒ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）の二種類の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）によって調節される。しかし、両受容体が、ＶＥＧＦの結合に際してリン酸化されても、分裂促進性、化学走性、及び形態的変化の誘発の如きＶＥＧＦ活性は、ＶＥＧＦ Ｒ２によって媒介される。
この試験には、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合されるヒトＶＥＧＦ Ｒ２の細胞外領域を含む組換えヒトＶＥＧＦ Ｒ２／Ｆｃキメラを使用する。手短に言えば、受容体をＥＬＩＳＡプレートに捕捉し、次いで非特異性結合を防止するためにプレートを遮断する。次いで、ＶＥＧＦ１６５とｄＡｂタンパク質の混合物を添加し、プレートを洗浄し、ビオチン化抗ＶＥＧＦ抗体及びＨＲＰＨＲＰ共役抗ビオチン抗体を使用して、受容体結合ＶＥＧＦ１６５を検出する。比色基質を使用してプレートを現像し、４５０ｎｍでＯＤを読み取る。ｄＡｂがＶＥＧＦの受容体に対する結合を遮断すれば、色は検出されない。
試験は、以下のように実施される。炭酸塩緩衝液に０．５μｇ／ｍｌの濃度で含められた組換えヒトＶＥＧＦ Ｒ２／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ：３５７−ＫＤ−０５０）をウェル当たり１００μｌの量で９６ウェルのヌンクマキシソープ試験プレートに４℃にて一晩塗布する。ウェルを０．０５％ツイーン／ＰＢＳで３回、ＰＢＳで３回洗浄する。ＰＢＳに含められた２％ＢＳＡをウェル当たり２００μｌ添加して、プレートを遮断し、プレートを室温にて最低１時間インキュベートする。
ウェルを（上記のように）洗浄し、次いで生成したｄＡｂタンパク質を各ウェルに５０μｌずつ添加する。次いで、希釈液に６ｎｇ／ｍｌの濃度（最終濃度を３ｎｇ／ｍｌとする）で含められたＶＥＧＦを各ウェルに５０μｌ添加し、プレートを２時間インキュベートする（上澄みの試験；８０μｌの上澄みを各ウェルに添加し、次いで１５ｎｇ／ｍｌの濃度のＶＥＧＦを２０μｌ添加する）。
以下の対照、すなわち０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ（希釈液のみ）；３ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ：２９３−ＶＥ−０５０）；０．１μｇ／ｍｌの抗ＶＥＧＦ中和抗体を含む３ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｃａｔ＃ＭＡＢ２９３）を含めるべきである。
プレートを（上記のように）洗浄し、次いで希釈液に０．５μｇ／ｍｌの濃度で含められた１００μｌのビオチン化抗ＶＥＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ Ｎｏ：ＢＡＦ２９３）を添加し、室温にて２時間インキュベートする。
ウェルを（上記のように）洗浄し、次いで１００μｌのＨＲＰ共役抗ビオチン抗体（希釈液で１：５０００に希釈；Ｓｔｒａｔｅｃｈ、Ｃａｔ Ｎｏ：２００−０３２−０９６）を添加する。次いで、プレートを室温にて１時間インキュベートする。
プレートを（上記のように）洗浄し、ツイーン２０のあらゆる痕跡を除去して、次のペルオキシダーゼ試験におけるバックグラウンドを制限するとともに、ＯＤ読取りを不正確にする試験プレートウェル内の泡を防止するようにする。
１００μｌのＳｕｒｅＢｌｕｅ１−コンポーネントＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ溶液を各ウェルに添加し、プレートを室温にて最大２０分間放置する。結合したＨＲＰタグ複合体が基質と反応すると、濃青色の可溶性生成物が発生する。１００μｌの１Ｍ塩酸を添加することによって反応を停止させる（青色が黄色に変わる）。プレートの４５０ｎｍにおけるＯＤを、酸を添加してから３０分以内に９６ウェルプレートリーダーで読み取るべきである。４５０ｎｍのＯＤは、結合ストレプトアビジン−ＨＲＰ複合体の量に比例する。
期待される対照からの結果は以下の通りである。０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦは、０．１５ＯＤ未満の低シグナルを与え、３ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦは、０．５ＯＤを上回るシグナルを与え、０．１μｇ／ｍｌの中和抗体で予めインキュベートされた３ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦは、０．２ＯＤ未満のシグナルを与える。
ｂ）ＶＥＧＦ受容体１結合試験
この試験は、ＶＥＧＦ１６５のＶＥＧＦ Ｒ１に対する結合、及びこの相互作用を阻止するｄＡｂｓの能力を測定する。
ここでは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合されたヒトＶＥＧＦ Ｒ１の細胞外領域を含む組換えヒトＶＥＧＦ Ｒ１／Ｆｃキメラを使用する。受容体をＥＬＩＳＡプレートに捕捉し、次いで非特異性結合を防止するためにプレートを遮断する。次いで、ＶＥＧＦ１６５とｄＡｂタンパク質の混合物を添加し、プレートを洗浄し、ビオチン化抗ＶＥＧＦ抗体及びＨＲＰＨＲＰ共役抗ビオチン抗体を使用して、受容体結合ＶＥＧＦ１６５を検出する。比色基質を使用してプレートを現像し、４５０ｎｍでＯＤを読み取る。ｄＡｂがＶＥＧＦの受容体に対する結合を遮断すれば、色は検出されない。
試験は、以下のように実施される。炭酸塩緩衝液に０．１μｇ／ｍｌの濃度で含められた組換えヒトＶＥＧＦ Ｒ１／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ：３２１−ＦＬ−０５０）をウェル当たり１００μｌの量で９６ウェルのヌンクマキシソープ試験プレートに４℃にて一晩塗布する。ウェルを０．０５％ツイーン／ＰＢＳで３回、ＰＢＳで３回洗浄する。
ＰＢＳに含められた２％ＢＳＡをウェル当たり２００μｌ添加して、プレートを遮断し、プレートを室温にて最低１時間インキュベートする。
ウェルを（上記のように）洗浄し、次いで生成したｄＡｂタンパク質を各ウェルに５０μｌずつ添加する。次いで、希釈液に１ｎｇ／ｍｌの濃度（最終濃度を５００ｐｇ／ｍｌとする）で含められたＶＥＧＦを各ウェルに５０μｌ添加し、プレートを１時間インキュベートする（上澄みの試験；８０μｌの上澄みを各ウェルに添加し、次いで２．５ｎｇ／ｍｌの濃度のＶＥＧＦを２０μｌ添加する）。
以下の対照、すなわち０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ（希釈液のみ）；５００ｐｇ／ｍｌのＶＥＧＦ；及び１μｇ／ｍｌの抗ＶＥＧＦ中和抗体を含む５００ｐｇ／ｍｌのＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｃａｔ＃ＭＡＢ２９３）を含めるべきである。
プレートを（上記のように）洗浄し、次いで希釈液に５０ｎｇ／ｍｌの濃度で含められた１００μｌのビオチン化抗ＶＥＧＦ抗体を添加し、室温にて１時間インキュベートする。
ウェルを（上記のように）洗浄し、次いで１００μｌのＨＲＰ共役抗ビオチン抗体（希釈液で１：５０００に希釈）を添加する。次いで、プレートを室温にて１時間インキュベートする。
プレートを（上記のように）洗浄し、ツイーン２０のあらゆる痕跡を除去して、次のペルオキシダーゼ試験におけるバックグラウンドを制限するとともに、ＯＤ読取りを不正確にする試験プレートウェル内の泡を防止するようにする。
１００μｌのＳｕｒｅＢｌｕｅ１−コンポーネントＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ溶液を各ウェルに添加し、プレートを室温にて最大２０分間放置する。結合したＨＲＰタグ複合体が基質と反応すると、濃青色の可溶性生成物が発生する。１００μｌの１Ｍ塩酸を添加することによって反応を停止させる（青色が黄色に変わる）。プレートの４５０ｎｍにおけるＯＤを、酸を添加してから３０分以内に９６ウェルプレートリーダーで読み取るべきである。４５０ｎｍのＯＤは、結合ストレプトアビジン−ＨＲＰ複合体の量に比例する。
期待される対照からの結果は以下の通りである。０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦは、０．１５ＯＤ未満の低シグナルを与え、５００ｐｇ／ｍｌのＶＥＧＦは、０．８ＯＤを上回るシグナルを与え、１μｇ／ｍｌの中和抗体で予めインキュベートされた５００ｐｇ／ｍｌのＶＥＧＦは、０．３ＯＤ未満のシグナルを与える。
ｃ）ＶＥＧＦ活性に対する細胞をベースとした試験
この生物学的試験は、ＨＵＶＥ細胞のＶＥＧＦ誘発増殖を中和する抗体ポリペプチド（例えばｄＡｂｓ）及び他の阻害剤の能力を測定する。９６ウェルプレートに仕込まれたＨＵＶＥ細胞を、予め平衡にされたＶＥＧＦ及びｄＡｂタンパク質とともに７２時間インキュベートする。次いで、細胞生死判別色素を使用して、細胞数を測定する。
試験は、以下のように実施される。ＨＵＶＥ細胞を準合流１７５ｃｍ２フラスコからトリプシン処理する。媒体を吸い出し、細胞を５ｍｌのトリプシンで洗浄し、次いで２ｍｌのトリプシンとともに室温にて５分間インキュベートする。手に打ち付けることによってフラスコの底から細胞を静かに取り除く。次いで、８ｍｌの誘発媒体をフラスコに加え、細胞をピペットで採取して、すべての凝集塊を分散させる。トリパンブルー染料を使用して、生細胞を数える。
細胞をスピンダウンさせ、誘発媒体で２回洗浄し、細胞をスピンダウンさせ、それぞれの洗浄の後に媒体を吸引する。最後の吸引後に、細胞を１０５個／ｍｌ（誘発媒体中）まで希釈し、ウェル当たり１００μｌの量で９６ウェルプレートに仕込む（１００００個／ウェル）。プレートを３７℃にて２時間を上回る時間にわたってインキュベートして、細胞を接着させる。
６０μｌのｄＡｂタンパク質、及び４０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５（最終濃度は１０ｎｇ／ｍｌ）を含有する６０μｌの誘発媒体をｖ底の９６ウェルプレートに加え、フィルムで封止する。次いで、ｄＡｂ／ＶＥＧＦ混合物を３７℃にて０．５〜１時間インキュベートする。
ｄＡｂ／ＶＥＧＦプレートをインキュベータから除去し、１００μｌの溶液をＨＵＶＥＣ含有プレートの各ウェルに加える（最終体積２００μｌ）。次いで、このプレートを、少なくとも７２時間にわたって、３７℃のインキュベータに戻す。
対照ウェルとしては、細胞を含むが、ＶＥＧＦを含まないウェル；細胞、陽性対照中和抗ＶＥＧＦ抗体及びＶＥＧＦを含むウェル；並びに細胞及びＶＥＧＦのみを含む対照ウェルが挙げられる。
細胞タイター９６試薬をウェル当たり２０μｌ添加することによって細胞生死を評価し、プレートを、褐色を帯びるまで３７℃にて２〜４時間インキュベートする。１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳをウェル当たり２０μｌ添加することによって反応を停止させる。次いで、ワラクマイクロプレートリーダーを使用して、４９０ｎｍの吸光度を読み取る。
ＶＥＧＦを含まない対照ウェルの吸光度を他のすべての値から減算する。吸光度は、細胞数に比例する。対照抗ＶＥＧＦ抗体を含む対照ウェルは、最小細胞増殖をも示すはずである。ＶＥＧＦのみを含むウェルは、最小細胞増殖を示すはずである。
ｄ）ＶＥＧＦ活性に対するインビボ試験
抗ＶＥＧＦポリペプチド構築物（単量体、多量体又は二重若しくは多重特異性）の効果を関節炎疾患のＴｇ１９７遺伝子組換えマウスモデルで試験することも可能である。投与法及び採点は、基本的には、抗ＴＮＦ−αポリペプチド構築物について記載したように行われる。
４．クローン病の治療
本明細書に記載されている抗ＴＮＦ−αポリペプチドを使用して、人間のクローン病を治療することが可能である。一実施形態において、本発明は、クローン病、又はＴＮＦ−αが関与する他の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を治療する方法を提供する。該方法は、１つ又は複数の単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含む組成物を投与することを含み、該構築物のいずれかが、ヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗し、且つ／又はＩＢＤのＴｎｆΔＡＲＥ遺伝子組換えマウスモデルのマウスに投与されると急性又は慢性炎症性腸スコアの増加を防止し、且つ／又はＬ９２９細胞傷害性試験におけるＴＮＦ−αを中和する。特に、クローン病又は他の炎症性腸疾患を治療する方法は、１つ又は複数の単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含む組成物を投与することを含み、該構築物は、ヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗し、該組成物のＴｎｆΔＡＲＥ遺伝子組換えマウスに対する投与は、急性又は慢性炎症性腸スコアの増加を防止し、又は減少をもたらす。
クローン病のＴｎｆΔＡＲＥ遺伝子組換えマウスモデルは、最初は、Ｋｏｎｔｏｙｉａｎｎｉｓら、１９９９、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：３８７−３９８に記載された。Ｋｏｎｔｏｙｉａｎｎｉｓら、２００２、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６：１５６３−１５７４も参照されたい。これらのマウスは、ＴＮＦ−α ｍＲＮＡの３’ＡＵリッチ要素（ＡＲＥ）に標的欠失変異を有する。ＡＵリッチ要素は、低いｍＲＮＡ安定性の維持に関与し、それらが崩壊すると、これらの動物にマウスＴＮＦ−αの過剰発現が生じる。それらの動物は、４週齢と８週齢の間に始まるクローン病と極めて類似したＩＢＤ表現型を生じる。基本的な組織病理学的特徴は、不均一の経壁炎症をもたらす、ＰＭＮ／マクロファージ及びリンパ球浸出物が支配的な繊毛鈍化及び粘膜下炎症、並びにリンパ球凝集体及び痕跡的肉芽腫の外観を含む（Ｋｏｎｔｏｙｉａｎｎｉｓら、２００２、前出）。これらの動物は、関節炎表現型をも生じるため、ＲＡにおける抗ＴＮＦ−α治療の効果を個別的に評価するのに使用することも可能である。
処理がＩＢＤを予防するその効果について評価される場合は、所定の抗体ポリペプチド構築物の最初の週間ＩＰ投与により、例えば３週齢から処理を開始する。ある程度、投与頻度は、初期試験の結果に応じて、当業者が選択することが可能である。次いで、Ｋｏｎｔｏｙｉａｎｎｉｓら、２００２、前出に記載されている標準スケールに従って動物を腸疾患について監視することが可能である。回腸のパラフィン埋込み腸組織を、以下のスケールに従ってブラインド的に組織学的に評価する。急性及び慢性炎症を最小限８のハイパワーフィールド（ｈｐｆ）で以下のように評価する。急性炎症スコアでは、０＝ｈｐｆ当たり０〜１の多形核（ＰＭＮ）細胞（ＰＭＮ／ｈｐｆ）；１＝２〜１０ＰＭＮ／ｈｐｆ（粘膜内）；２＝１１〜２０ＰＭＮ／ｈｐｆ（粘膜内）；３＝２１〜３０ＰＭＮ／ｈｐｆ（粘膜内）又は１１〜２０ＰＭＮ／ｈｐｆ（粘膜筋板下の拡がり）；及び４＝＞３０ＰＭＮ／ｈｐｆ（軟膜内）又は＞２０（粘膜筋板下の拡がり）。慢性炎症スコアでは、０＝ｈｐｆ当たり０〜１０の単核白血球（ＭＬ）（ＭＬ／ｈｐｆ）（粘膜内）；１＝１１〜２０ＭＬ／ｈｐｆ（粘膜内）；２＝２１〜３０ＭＬ／ｈｐｆ（粘膜内）又は１１〜２０ＭＬ／ｈｐｆ（粘膜筋板下の拡がり）；３＝３１〜４０ＭＬ／ｈｐｆ（粘膜内）又は２１〜３０ＭＬ／ｈｐｆ（粘膜筋板下の拡がり又は濾胞過形成）；及び４＝＞４０ＭＬ／ｈｐｆ（粘膜内）、又は３０ＭＬ／ｈｐｆ（粘膜筋板下の拡がり又は濾胞過形成）。マウス毎の合計疾病スコアは、各マウスについて急性炎症又は慢性炎症スコアを加算することによって計算される。
確定された疾病に対する処理の効果を評価するために、生後６〜８ヶ月から処理を開始し、同様にして採点を行うことが可能である。
処理された動物において平均組織病理学的疾病スコアが、媒体対照グループより（統計的に有意な量だけ）低い場合に処理は有効であると見なされる。平均組織病理学的スコアが、媒体のみの対照グループと比べて、少なくとも０．５単位、少なくとも１．０単位、少なくとも１．５単位、少なくとも２．０単位、少なくとも２．５単位、少なくとも３．０単位、又は少なくとも３．５単位だけ低い場合にも処理は有効であると見なされる、或いは、平均組織病理学的スコアが、治療処置の過程を通じて０から０．５に維持又は低下される場合に、処理は有効である。
ＩＢＤの他のモデルは、例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける大腸炎のＤＳＳ（デキストラン硫酸ナトリウム）を含む。ＤＳＳモデルは、最初に、Ｏｋａｙａｓｕら、１９９０、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ９８：６９４−７０２に記載され、Ｋｏｊｏｕｈａｒｏｆｆら、１９９７、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：３５３−３５８によって改造された（参照により本明細書に組み込まれている、米国を指定するＷＯ２００４／０４１８６２号も参照されたい）。体重が２１〜２２ｇのＢＡＬＢ／ｃマウスを処理して、７日間の処理とＤＳＳを含まない１２日間の回復間隔のサイクルで、飲み水に５％ｗ／ｖの濃度で含めたＤＳＳを投与することによって慢性大腸炎を誘発する。より短い回復によってモデル化される急性状態ではなく、慢性炎症状態を示すために、４回目の回復期間を１２から２１日に延長することが可能である。最後の回復期間の後に、抗体ポリペプチド、例えば本明細書に記載されているＴＮＦ−αポリペプチドによる処理を行う。最初は週毎の投与が推奨されるが、（特に、半減期改変成分が異なる投与形態を評価するために）必要に応じて当業者が調整することが可能である。処理中に一定の間隔で、動物を殺し、腸を解剖し、本明細書、又はＫｏｊｏｕｈａｒｏｆｆら、１９９７、前出に記載されているようにして組織病理学的スコアを評価する。
炎症性腸疾患の他の動物モデルは、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸の直腸滴下により誘発される慢性腸炎症を含む（ＴＮＢＳ：Ｎｅｕｒａｔｈら、１９９５、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１２８１に記載されている方法；参照により本明細書に組み込まれている米国第６，７６４，８３８号も参照されたい）。上述したのと同じ基準を用いて、組織病理学的採点を実施することが可能である。
他の抗ＴＮＦ−α剤との比較
本明細書に開示されるのは、ＲＡ、クローン病及び他のＴＮＦ−α媒介疾患の治療に有効なＴＮＦ−α ｄＡｂ構築物である。一態様において、抗ＴＮＦ−α ｄＡｂ構築物の効果は、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ）、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ）及びＤ２Ｅ７（ＨＵＭＩＲＡ；参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，０９０，３８２号参照）からなる群から選択される薬剤の効果以上である。
ヒトＩｇＧ１（ｓＴＮＦＲ（ｐ７５）：Ｆｃ、ＥＮＢＲＥＬ、イムネクス）のＦｃ部に結合された可溶性ヒトＴＮＦＲ（ｐ７５）の組換え型の臨床試験により、その投与がＲＡ疾患活性を有意且つ迅速に低減させたことが示されている（Ｍｏｒｅｌａｎｄら、１９９７、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３７：１４１−１４７）。加えて、ＴＮＦＲ（ｐ７５）：Ｆｃに対する小児科臨床試験からの予備安全性データは、この薬物は、一般的に、若年関節リウマチ（ＪＲＡ）の患者に十分に許容されることを示している（Ｇａｒｒｉｓｏｎら、１９９８、Ａｍ．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ｍｅｅｔｉｎｇ、Ｎｏｖ．９，１９９８、ａｂｓｔｒａｃｔ ５８４）。
上述したように、ＥＮＢＲＥＬは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部に結合されたヒト７５キロダルトン（ｐ７５）ＴＮＦＲ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ２０３３３）の細胞外リガンド結合部からなる二量体融合タンパク質である。ＥＮＢＲＥＬのＦｃ成分は、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域及びヒンジ領域を含有するが、ＩｇＧ１のＣＨ１領域を含有しない。ＥＮＢＲＥＬは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）哺乳類細胞発現系で生成される。それは、９３４のアミノ酸からなり、見かけの分子量は約１５０キロダルトンである（Ｓｍｉｔｈら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４８：１０１９−１０２３；Ｍｏｈｌｅｒら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：１５４８−１５６１；参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，３９５，７６０号（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ワシントン州Ｓｅａｔｔｌｅ所在））；参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，６０５，６９０号（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ワシントン州Ｓｅａｔｔｌｅ所在））。
ＴＮＦ−αに対して導かれるモノクローナル抗体（インフリキシマブ、ＲＥＭＩＣＡＤＥ、セントコル）は、メトトレキセートとともに投与されてもメトトレキセートを伴わずに投与されても、ＲＡの治療における臨床効果を実証した（Ｅｌｌｉｏｔｔら、１９９３、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ、３６：１６８１−１６９０；Ｅｌｌｉｏｔｔら、１９９４、Ｌａｎｃｅｔ、３４４：１１０５−１１１０）。これらのデータは、４、１２及び２６週目におけるパウルス（Ｐａｕｌｕｓ）２０％及び５０％基準の有意な低減を実証している。この処理は静脈内投与され、抗ＴＮＦモノクローナル抗体は、２ヶ月間の期間にわたって血中から消える。投与を繰り返すと、効果の持続期間が短くなるものと思われる。患者は、この治療の効果及び持続期間を制限する抗ＴＮＦ抗体に対する抗体を生成することができる（Ｋａｖａｎａｕｇｈら、１９９８、Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．Ｃｌｉｍ．、Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．、２４：５９３−６１４）。メトトレキセートをインフリキシマブと組み合わせて投与すると、抗インフリキシマブ抗体の発生を防止するのに役立つ（Ｍａｉｎｉら、１９９８、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．、４１：１５５２−１５６３）。インフリキシマブも炎症腸疾患クローン病の治療における臨床効果を実証した（Ｂａｅｒｔら、１９９９、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１１６：２２−２８）。
背景のセクションで述べたように、インフリキシマブは、ヒトＩｇＧ４定常領域及びマウス可変領域を有するキメラモノクローナルＩｇＧ抗体である。インフリキシマブポリペプチドは、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，６９８，１９５号及び５，６５６，２７２号に記載されている。
これら又は他の抗ＴＮＦ−α組成物との効果を比較するためには、抗ＴＮＦ−α ｄＡｂ構築物を既存の組成物と併用して、本明細書に記載された受容体結合試験、細胞ベースの試験及びインビボ試験のいずれかを実施すればよい。したがって、この手法は、試験のいずれかにおいて、比較組成物の効果と同等、又は（統計的に有意に）上回るＴＮＦ−αの効果を抑制する効果を示す抗ＴＮＦ−α ｄＡｂ構築物を識別する。同等又はより優れた効果を示す当該構築物及び分析の例を実施例に示す。
（例１）
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及びβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）に対して導かれる二重特異性ｓｃＦｖ抗体（Ｋ８）の選択
本例では、生殖系列（ダミー）ＶＨ領域に結合されたＶＫ可変領域のレパートリーがｐ−ｇａｌに対する結合について選択され、生殖系列（ダミー）ＶＫ領域に結合されたＶＨ可変領域のレパートリーがＨＳＡに対する結合について選択される、β−ｇａｌ及びＨＳＡに対して導かれる二重特異性リガンドの製造方法を説明する。次いで、選択された可変ＶＨ ＨＳＡ及びＶＫβ−ｇａｌ領域を合わせ、抗体をβ−ｇａｌ及びＨＳＡに対する結合について選択する。ＨＳＡは、ヒト血液に見られる半減期増加タンパク質である。
この実験では、４つのヒトファージ抗体ライブラリーを使用した。
ライブラリー１ 生殖系列ＶＫ／ＤＶＴ ＶＨ ８．４６×１０７
ライブラリー２ 生殖系列ＶＫ／ＮＮＫ ＶＨ ９．６４×１０７
ライブラリー３ 生殖系列ＶＨ／ＤＶＴ ＶＫ １．４７×１０８
ライブラリー４ 生殖系列ＶＨ／ＮＮＫ ＶＫ １．４５×１０８
すべてのライブラリーは、側鎖多様性が相補性決定領域（ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）に導入された、ＶＨ（Ｖ３−２３／ＤＰ４７及びＪＨ４ｂ）及びＶＫ（Ｏ１２／Ｏ２／ＤＰＫ９及びＪＫ１）に対する単一ヒトフレームワークに基づいている。
ライブラリー１及びライブラリー２は、ＶＫ配列を含有するのに対して、ＶＨの配列は、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２ａ、Ｈ５３、Ｈ５５、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７及びＨ９８の位置において多様化されている（それぞれＤＶＴ又はＮＮＫコードされる）（図１）。ライブラリー３及びライブラリー４は、ＶＨ配列を含有するのに対して、ＶＫの配列は、Ｌ５０、Ｌ５３、Ｌ９１、Ｈ９２、Ｈ９３、Ｈ９４及びＬ９６の位置において多様化されている（それぞれＤＶＴ又はＮＮＫコードされる）（図１）。それらのライブラリーは、ファージミドｐＩＴ２／ＳｃＦｖ形式であり（図２）、未選択のライブラリーにおけるクローンの大多数が機能的になるように、汎用リガンド、すなわちタンパク質Ａ及びタンパク質Ｌに対する結合について予め選択されている。上記のライブラリーのサイズは、予備選択の後のサイズに対応する。抗原についての選択に先だってライブラリー１とライブラリー２を混合して、単一ＶＨ／ダミーＶＫライブラリーを生成し、ライブラリー３とライブラリー４を混合して、単一ＶＫ／ダミーＶＨライブラリーを形成した。
ＶＫ／ダミーＶＨライブラリーを用いてβ−ｇａｌについて３ラウンドの選択を行い、ＶＨ／ダミーＶＫライブラリーを用いてＨＳＡについて３ラウンドの選択を行った。β−ｇａｌの場合は、ファージ力価が、第１ラウンドの１．１×１０６から第３ラウンドの２．０×１０８に上昇した。ＨＳＡの場合は、ファージ力価が、第１ラウンドの２×１０４から第３ラウンドの１．４×１０９に上昇した。それらの選択は、（Ｄ２領域とＤ３領域の間にプロテアーゼ開裂を有するｐＩＩＩタンパク質を含有する）ＫＭ１３ヘルパーファージを使用し、ＰＢＳに含めた１ｍｇ／ｍｌトリプシンでファージを溶出したことを除いて、Ｇｒｉｆｆｉｔｈら、（１９９３）に記載されているようにして行われた。トリプシンを添加すると、ヘルパーファージから誘導されたｐＩＩＩタンパク質（ファージミドから誘導されたタンパク質ではない）が開裂され、ｃ−ｍｙｃタグ（図２）における開裂により結合ｓｃＦｖファージが溶出することによって、機能的ｓｃＦｖｓを発現するファージがさらに富化し、対応してバックグラウンドが低減される（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ、Ｆｏｌｄｉｎｇ ＆ Ｄｅｓｉｇｎ、３：３２１−３２８、Ｊｕｌ ９、１９９８）。ＨＳＡ又はβ−ｇａｌを１００μｇ／ｍｌの濃度で塗布したイムノチューブを使用して、選択を行った。
結合について調べるために、各選択の第３ラウンドからのコロニーをモノクローナルファージＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。Ｈａｒｒｉｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９９６；２６７：８３−１０９に記載されているようにしてファージ粒子を製造した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに、ＯＢＳに含めた１０μｇ／ｍｌの濃度のＨＳＡ又はβ−ｇａｌ１００μｌを４℃で一晩かけて塗布した。抗Ｍ１３−ＨＲＰ複合体による結合ファージの検出を用いて標準的なＥＬＩＳＡプロトコルを実施した。クローンの選択により、５０μｌの上澄みとともに１．０を上回るＥＬＩＳＡシグナルを与えた。
次に、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＨＳＡについて選択されたＶＨ／ダミーＶＫライブラリー、及びβ−ｇａｌについて選択されたＶＫ／ダミーＶＨライブラリーからＤＮＡプレップを製造した。
多様性の大半を利用するために、ＤＮＡプレップを３ラウンドの選択の各々から製造し、次いで各々の抗原毎にまとめた。次いで、ＤＮＡプレップを３７℃にて一晩ＳａｌＩ／ＮｏｔＩで消化させた。断片のゲル精製に続いて、β−ｇａｌについて選択されたＶＫ／ダミーＶＨライブラリーからのＶＫ鎖を、ＨＳＡについて選択されたＶＨ／ダミーＶＫライブラリーのダミーＶＫ鎖の代わりに結合させて、３．３×１０９のクローンを作った。
次いで、このライブラリーをＨＳＡ（第１ラウンド）及びβ−ｇａｌ（第２ラウンド）について選択し（ＨＳＡ／β−ｇａｌ選択）、又はβ−ｇａｌ（第１ラウンド）及びＨＳＡ（第２のラウンド）について選択した（β−ｇａｌ／ＨＳＡ選択）。選択は、上述のように行われた。第２ラウンドの後のそれぞれの場合において、（上述の）モノクローナルファージＥＬＩＳＡ、及び可溶性ｓｃＦｖ断片のＥＬＩＳＡによってＨＳＡ及びβ−ｇａｌに対する結合について４８のクローンを試験した。Ｈａｒｒｉｓｏｎら、（１９９６）に記載されているようにして可溶性抗体断片を製造し、２％ツイーン／ＰＢＳをブロッキング緩衝液として使用し、タンパク質Ｌ−ＨＲＰで結合ｓｃＦｖｓを検出することを除いて、標準的なＥＬＩＳＡプロトコルを実施した（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、（１９９１）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９：４１３３）。ＨＳＡ／β−ｇａｌ選択による３つのクローン（Ｅ４、Ｅ５及びＥ８）、及びβ−ｇａｌ／ＨＳＡ選択による２つのクローン（Ｋ８及びＫ１０）は、両抗原を結合することが可能であった。これらのクローンからのｓｃＦｖｓをＰＣＲ増幅し、プライマーＬＭＢ３及びｐＨＥＮｓｅｑを使用して、Ｉｇｎａｔｏｖｉｃｈら、（１９９９）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９９ Ｎｏｖ．２６；２９４（２）：４５７−６５に記載されているようにして配列させた。すべてのクローンが同一であることが配列分析により明らかになった。したがって、二重特異性抗体（Ｋ８）をコードする１つのクローンのみを次の試験に向けて選択した（図３）。
（例２）
Ｋ８抗体の結合特性の特徴付け
第１に、Ｋ８抗体の結合特性をモノクローナルファージＥＬＩＳＡによって特徴付けた。９６ウェルプレートに、アルカリリン酸塩（ＡＰＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ピーナッツ凝集素、リソザイム及びシトクロムｃ（交差反応検査用）とともに、ＰＢＳに含めた１０μｇ／ｍｌの濃度の１００μｌのＨＳＡ及びβ−ｇａｌ１０μｇ／ｍｌを４℃にて一晩かけて塗布した。Ｋ８クローンからのファージミドをＨａｒｒｉｓｏｎら、（１９９６）に記載されているようにＫＭ１３で解放し、ファージを含有する上澄み（５０μｌ）を直接試験した。抗Ｍ１３−ＨＲＰ複合体による結合ファージの検出を用いて、標準的なＥＬＩＳＡプロトコルを実施した（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９１）。二重特異性Ｋ８抗体は、１．０を上回る吸収シグナルによりファージの表面に表示されると、ＨＳＡ及びβ−ｇａｌに結合することが確認された（図４）。ＢＳＡに対する強い結合も観察された（図４）。
ＨＳＡとＢＳＡはアミノ酸レベルで７６％の相同性を有するため、Ｋ８抗体が、これらの構造的に関連したタンパク質の両方を認識したことは意外なことではない。他のタンパク質との交差反応は検出されなかった（図４）。
第２に、Ｋ８抗体の結合特性を可溶性ｓｃＦｖ ＥＬＩＳＡで試験した。
Ｈａｒｒｉｓｏｎら、（１９９６）に記載されているように、ＩＰＴＧにより可溶性ｓｃＦｖ断片の生成を誘発した。Ｋ８ｓｃＦｖの発現レベルを測定するために、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（１９８８）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒに記載されているように、タンパク質Ａセファロースカラムを使用して、５０ｍｌ誘導物の上澄みから可溶性抗体断片を精製した。次いで、ＯＤ２８０を測定し、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）に記載されているようにしてタンパク質濃度を計算した。Ｋ８ｓｃＦｖを上澄みに１９ｍｇ／ｌの濃度で生成させた。
次いで、知られている濃度のＫ８抗体断片を使用して、可溶性ｓｃＦｖ ＥＬＩＳＡを実施した。９６ウェルプレートに、１０μｇ／ｍｌの濃度の１００μｌのＨＳＡ、ＢＳＡ及びβ−ｇａｌ、及び１μｇ／ｍｌの濃度のタンパク質Ａを塗布した。Ｋ８ｓｃＦｖの連続希釈液を５０μｌ塗布し、結合抗体断片をタンパク質Ｌ−ＨＲＰで検出した。ＥＬＩＳＡ結果により、Ｋ８抗体の二重特異性が確認された（図５）。
β−ｇａｌに対する結合はＶＫ領域により決定づけられ、ＨＡＳ／ＢＳＡに対する結合はＫ８ｓｃＦｖ抗体のＶＨ領域によって決定づけられることを確認するために、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩ消化によりＶＫ領域をＫ８ｓｃＦｖ ＤＮＡから切り出し、ダミーＶＨ鎖を含有するＳａｌＩ／ＮｏｔＩ消化ｐＩＴ２ベクターに結合させた（図１及び２）。得られたクローンＫ８ＶＫ／ダミーＶＨの結合特性を可溶性ｓｃＦｖ ＥＬＩＳＡによって分析した。Ｈａｒｒｉｓｏｎら、（１９９６）に記載されているように、ＩＰＴＧにより可溶性ｓｃＦｖ断片の生成を誘発し、ｓｃＦｖｓを含有する上澄み（５０μｌ）を直接試験した。例１に記載されているようにして可溶性ｓｃＦｖ ＥＬＩＳＡを実施し、ｓｃＦｖｓをタンパク質Ｌ−ＨＲＰで検出した。ＥＬＩＳＡ結果により、このクローンはβ−ｇａｌを結合することが可能であるのに対して、ＢＳＡに対する結合は消滅した（図６）。
（例３）
単一ＶＨ領域抗体抗原Ａ及びＢ、並びに抗原Ｃ及びＤに対して導かれる単一ＶＫ領域抗体の選択
本例では、抗原Ａ及びＢに対して導かれる単一ＶＨ領域抗体、並びに抗原Ｃ及びＤに対して導かれる単一ＶＫ領域抗体を、相補的可変領域の不在下におけるこれらの抗原に対する結合についてナイーブな単一抗体可変領域のレパートリーを選択することによって製造するための方法を説明する。
結合クローンの選択及び特徴付けを先述のようにして行う（例５、ＰＣＴ／ＧＢ０２／００３０１４参照）。以下の４つのクローンをさらなる試験に向けて選択する。
ＶＨ１−抗ＡＶＨ
ＶＨ２−抗ＢＶＨ
ＶＫ１−抗ＣＶＫ
ＶＫ２−抗ＤＶＫ
例１〜３に記載された手順を同様に実施して、ＶＨ領域（すなわちＶＨリガンド）の組合せと、ＶＬ領域（ＶＬ−ＶＬリガンド）の組合せとを含む二量体分子を生成することができる。
（例４）
二重特異性ＳｃＦｖ抗体（抗原Ａ及びＢに対して導かれるＶＨ１／ＶＨ２、及び抗原Ｃ及びＤに対して導かれるＶＫ１／ＶＫ２の作製及び特徴付け）
本例では、ＳｃＦｖベクターにおけるそれぞれの抗原に対して選択されたＶＫ及びＶＨ単一領域を組み合わせることによって、二重特異性ＳｃＦｖ抗体（抗原Ａ及びＢに対して導かれたＶＨ１／ＶＨ２、及び抗原Ｃ及びＤに対して導かれるＶＫ１／ＶＫ２）を作ることが可能であることを実証する。二重特異性抗体ＶＨ１／ＶＨ２を作るために、ＶＨ１単一領域をＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ消化により可変領域ベクター１（図７）から切除し、ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ消化可変領域ベクター２（図７）に結合させて、ＶＨ１／可変領域ベクター２を作る。プライマーを使用して、ＶＨ２単一領域を可変領域ベクターからＰＣＲ増幅して、ＳａｌＩ制限部位を５’末端に導入し、ＮｏｔＩ制限部位を３’末端に導入する。次いで、ＰＣＲ生成物をＳａｌＩ／ＮｏｔＩで消化し、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩ消化ＶＨ１／可変領域ベクター２に結合させて、ＶＨ１／ＶＨ２／可変領域ベクター２を作る。
同様にして、ＶＫ１／ＶＫ２／可変領域ベクター２を作る。生成されたＶＨ１／ＶＨ２ＳｃＦｖ及びＶＫ１／ＶＫ２ＳｃＦｖの二重特異性を先述したように可溶性ＳｃＦｖ ＥＬＩＳＡで試験する（例６、ＰＣＴ／ＧＢ０２／００３０１４参照）。先述のように競合ＥＬＩＳＡを実施する（例８、ＰＣＴ／ＧＢ０２／００３０１４参照）。
予想される結果
−ＶＨ１／ＶＨ２ ＳｃＦｖは、抗原Ａ及びＢを同時に結合することができる。
−ＶＫ１／ＶＫ２ ＳｃＦｖは、抗原Ｃ及びＤを同時に結合することができる。
−ＶＨ１／ＶＨ２ ＳｃＦｖ結合は競合的である（抗原Ａに結合すると、ＶＨ１／ＶＨ２ ＳｃＦｖは、抗原Ｂを結合することができない）。
−ＶＫ１／ＶＫ２ ＳｃＦｖ結合は競合的である（抗原Ｃに結合すると、ＶＫ１／ＶＫ２ ＳｃＦｖは、抗原Ｄを結合することができない）。
（例５）
二重特異性ＶＨ１／ＶＨ２ Ｆａｂの構成、及びそれらの結合特性の分析
ＶＨ１／ＶＨ２ Ｆａｂを作るために、ＶＨ１単一領域をＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ消化ＣＨベクター（図８）に結合させて、ＶＨ１／ＣＨを作り、ＶＨ２単一領域をＳａｌＩ／ＮｏｔＩ消化ＣＫベクター（図９）に結合させて、ＶＨ２／ＣＫを作る。ＶＨ１／ＣＨ及びＶＨ２／ＣＫからのプラスミドを使用して、先述のように競合大腸菌細胞を同時形質転換する（例８、ＰＣＴ／ＧＢ０２／００３０１４参照）。
次いで、先述のように可溶性ＶＨ１／ＶＨ２ Ｆａｂを生成するように、ＶＨ１／ＣＨ及びＶＨ２／ＣＫプラスミドを含有するクローンをＩＰＴＧにより誘発する（例８、ＰＣＴ／ＧＢ０２／００３０１４参照）。
同様にして、ＶＫ１／ＶＫ２ Ｆａｂを生成する。
先述のように、生成されたＦａｂの結合特性を競合ＥＬＩＳＡによって試験する（例８、ＰＣＴ／ＧＢ０２／００３０１４参照）。
予想される結果
−ＶＨ１／ＶＨ２ Ｆａｂは、抗原Ａ及びＢを同時に結合することができる。
−ＶＫ１／ＶＫ２ Ｆａｂは、抗原Ｃ及びＤを同時に結合することができる。
−ＶＨ１／ＶＨ２ Ｆａｂ結合は競合的である（抗原Ａに結合すると、ＶＨ１／ＶＨ２ Ｆａｂは、抗原Ｂを結合することができない）。
−ＶＫ１／ＶＫ２ Ｆａｂ結合は競合的である（抗原Ｃに結合すると、ＶＫ１／ＶＫ２ Ｆａｂは、抗原Ｄを結合することができない）。
（例６）
キレート化ｄＡｂ二量体
概要
柔軟ポリペプチドリンカーを使用して、ｄＡｂ−リンカー−ｄＡｂ形式のＶＨ及びＶＫホモ二量体を作る。長さの異なるグリシン−セリンリンカー３Ｕ：（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３、５Ｕ：（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５、７Ｕ：（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）７を含有するｄＡｂリンカー−ｄＡｂ形式のベクターを作った。リンカーの上流の案内ｄＡｂｓを使用して二量体ライブラリー、すなわちＴＡＲ１−５（ＶＫ）、５ＴＡＲ１−２７（ＶＫ）、ＴＡＲ２−５（ＶＨ）又はＴＡＲ２−６（ＶＫ）、及びリンカーの後の対応する第２のｄＡｂｓのライブラリーを作った。この方法を用いて、新規の二量体ｄＡｂｓを選択した。抗原結合に対する二量化の効果をＥＬＩＳＡ及びＢＩＡｃｏｒｅ試験、並びに細胞中和及び受容体結合試験で測定した。ＴＡＲ１−５及びＴＡＲ１−２７の両方を二量化することにより、結合親和性及び中和レベルが有意に向上した。
１．０ 方法
１．１ ライブラリー生成
１．１．１ ベクター
ｐＥＤＡ３Ｕ、ｐＥＤＡ５Ｕ及びｐＥＤＡ７Ｕベクターを、ｄＡｂ−リンカー−ｄＡｂ形式に適合する異なるリンカー長を導入するように設計した。ｐＥＤＡ３Ｕについては、センス及びアンチセンス７３塩基対オリゴリンカーを、０．１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリスＨＣｌを含有する緩衝剤（ｐＨ７．４）中で低速アニーリングプログラム（９５℃−５分、８０℃−１０分、７０℃−１５分、５６℃−１５分、使用まで４２℃）を用いてアニールし、ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ制限部位を使用してクローン化した。
リンカーは、３つの（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）（配列番号７）単位、及びＳａｌＩ及びＮｏｔＩクローニング部位の間に収容されたスタッファ領域を包含していた（スキーム１）。単量体ｄＡｂｓがファージディスプレイについて選択される可能性を低減するために、３つの停止コドン、ＳａｃＩ制限部位、及び第２のｄＡｂが存在しないときに領域を枠から除外する枠シフト変異を含むように、スタッファ領域を設計した。ｐＥＤＡ５Ｕ及び７Ｕについては、必要とされるリンカーの長さにより、重複するオリゴ−リンカーをベクター毎に設計し、アニールし、クレノウを用いて伸長した。次いで、断片を精製し、適切な酵素を使用して消化させてから、ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ制限部位を使用してクローニングを行った。
Figure 2013056890
１．１．２ ライブラリー調製
ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩ制限部位を使用して、案内ｄＡｂに対応するＮ末端Ｖ遺伝子をリンカーの上流でクローン化した。ＶＨ遺伝子は既存の適合部位を有するが、ＶＫ遺伝子をクローン化するには、好適な制限部位の導入が必要であった。これは、ＳｕｐｅｒＴａｑ（ＨＴＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ）とｐｆｕターボ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の２：１の混合物を使用する３０サイクルのＰＣＲ増幅で修飾ＰＣＲプライマー（ＶＫ−ＤＬＩＢＦ：５’ｃｇｇｃｃａｔｇｇｃｇｔｃａａｃｇｇａｃａｔ−３’；ＶＫＸｈｏＩＲ：５’ａｔｇｔｇｃｇｃｔｃｇａｇｃｇｔｔｔｇａｔｔｔ−３’）を使用することによって達成される。これによって、５ＮｃｏＩ部位が５’末端に維持される一方、隣接するＳａｌＩ部位が破壊され、ＸｈｏＩ部位が３’末端に導入された。５つの案内ｄＡｂｓを３つの二量体ベクターの各々にクローニングした（ＴＡＲ１−５（ＶＫ）、ＴＡＲ１−２７（ＶＫ）、ＴＡＲ２−５（ＶＨ）、ＴＡＲ２−６（ＶＫ）及びＴＡＲ２−７（ＶＫ））。配列解析によってすべての構築物を検証した。
ベクター（ｐＥＤＡ３Ｕ、５Ｕ及び７Ｕ）の各々におけるリンカーの上流の案内ｄＡｂｓをクローニングすると（ＴＡＲ１−５（ＶＫ）、ＴＡＲ１−２７（ＶＫ）、ＴＡＲ２−５（ＶＨ）又はＴＡＲ２−６（ＶＫ））、対応する第２のｄＡｂｓのライブラリーをリンカーの後にクローニングした。これを達成するために、ＴＡＲ１−５又はＴＡＲ１−２７が案内ｄＡｂｓであるときはヒトＴＮＦ−αに対するＶＫライブラリー（ラウンド１後は約１×１０６の多様性）、或いはＴＡＲ２−５又はＴＡＲ２−６がそれぞれ案内ｄＡｂｓであるときはヒトｐ５５ＴＮＦ受容体に対するＶＨ又はＶＫライブラリー（いずれもラウンド１後は約１×１０５の多様性）のラウンド１の選択から回収されたファージから相補的ｄＡｂライブラリーをＰＣＲ増幅した。ＶＫライブラリーについては、ＳｕｐｅｒＴａｑとｐｆｕターボの２：１の混合物を使用する３０サイクルのＰＣＲ増幅でプライマーを使用してＰＣＲ増幅を実施した。ＳａｌＩ制限部位を遺伝子の５’末端に導入するために、プライマーを使用してＶＨライブラリーをＰＣＲ増幅した。ｄＡｂライブラリーＰＣＲを適切な制限酵素で消化し、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩ制限部位を使用してリンカーの下流の対応するベクターに結合させ、新たに調製した競合ＴＧ１細胞に電気穿孔した。
各ライブラリーに対して達成された力価は、以下の通りである。
Figure 2013056890
１．２ 選択
１．２．１ ＴＮＦ−α
イムノチューブに受動的に塗布されたヒトＴＮＦａを使用して選択を実施した。手短に述べると、１〜４ｍｌの必要な抗原を一晩かけてイムノチューブに塗布した。次いで、イムノチューブをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳに含めた２％ミルク粉末で１〜２時間にわたって遮断し、ＰＢＳでさらに３回洗浄した。ファージ溶液をＰＢＳに含めた２％ミルク粉末で希釈し、室温にて２時間インキュベートする。次いで、チューブをＰＢＳで洗浄し、ファージを１ｍｇ／ｍｌトリプシン−ＰＢＳで溶出させる。ＴＡＲ１−５二量体ライブラリーに対する３つの選択手法を調べた。イムノチューブにおいて、１μｇ／ｍｌ又は２０μｇ／ｍｌの濃度で塗布されたヒトＴＮＦａを使用し、ＰＢＳ０．１％ツイーンで２０回洗浄して、第１ラウンドの選択を行った。ＴＧ１細胞を溶出したファージで感染させ、力価を求める（例えば、Ｍａｒｋｓら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、１９９１、Ｄｅｃ ５；２２２（３）：５８１−９７、Ｒｉｃｈｍａｎｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．、１９９３、Ａｕｇ ３１；３２（３４）：８８４８−５５）。
回収された力価は以下の通りであった。
Figure 2013056890
第２ラウンドの選択を、３つの異なる方法を用いて行った。
１．イムノチューブにおいて、２０回洗浄し、一晩インキュベートした後に、さらに１０回洗浄する。
２．イムノチューブにおいて、２０回洗浄した後に、（１μｇ／ｍｌのＴＮＦ−α）とともに室温にて洗浄緩衝液中で１時間インキュベートし、さらに１０回洗浄する。
３．３３ピコモルのビオチン化ヒトＴＮＦ−αを使用するストレプトアビジンビーズについての選択（Ｈｅｎｄｅｒｉｋｘら、２００２、「ビオチン化抗原に対する抗体の選択。抗体ファージディスプレイ：方法及びプロトコル（Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ａｎｄ Ａｔｋｉｎ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｅｒｓｓ）。ラウンド２の選択からの単一クローンを９６ウェルプレートに集め、２ｍｌ９６ウェルプレート形式で粗上澄みプレップを作製した。
Figure 2013056890
ＴＡＲ１−２７については、以下の変更を加えて、先述したように選択を行った。イムノチューブにおいて、１μｇ／ｍｌ又は２０μｇ／ｍｌの濃度で塗布されたヒトＴＮＦ−αを使用し、ＰＢＳ０．１％ツイーンで２０回洗浄して、第１ラウンドの選択を行った。イムノチューブにおいて、２０回洗浄して、一晩インキュベートした後に、さらに２０回洗浄して、第２ラウンドの選択を行った。ラウンド２の選択による単一クローンを９６ウェルプレートに集め、２ｍｌ９６ウェルプレート形式で粗上澄みプレップを作製した。
ＴＡＲ１−２７力価は以下の通りである。
Figure 2013056890
１．２．２ ＴＮＦ受容体１（ｐ５５受容体；ＴＡＲ２）
ＴＡＲ２ｈ−５ライブラリーのみについて、先述のように選択を実施した。イムノチューブにおいて、１μｇ／ｍｌのヒトｐ５５ＴＮＦ受容体又は１０μｇ／ｍｌのヒトｐ５５ＴＮＦ受容体を使用し、ＰＢＳ０．１％ツイーンで２０回洗浄して、一晩インキュベートした後にさらに２０回洗浄して、第３ラウンドの選択を行った。ラウンド２及び３の選択による単一クローンを９６ウェルプレートに集め、２ｍｌ９６ウェルプレート形式で粗上澄みプレップを作製した。
０ＴＡＲ２ｈ−５力価は以下の通りである。
Figure 2013056890
１．３ スクリーニング
ラウンド２又は３の選択による単一クローンを、適宜異なる選択方法による３Ｕ、５Ｕ及び７Ｕライブラリーの各々から採取した。クローンを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１％グルコースを含む２×ＴＹで３７℃にて一晩成長させた。この培養物の１／１００希釈物を、２ｍｌ９６ウェルプレート形式で、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び０．１％グルコースを含む２ｍｌの２×ＴＹに接種し、ＯＤ６００が約０．９になるまで振とうしながら３７℃で成長させた。次いで、１ｍＭのＩＰＴＧにより３０℃にて一晩培養を促進させた。
Ｓｏｒｖａｌプレート遠心分離機にて、４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することにより上澄みを透明にした。上澄みプレップを最初のスクリーニングに使用した。
１．３．１ ＥＬＩＳＡ
タンパク質Ａ／Ｌ ＥＬＩＳＡ又は抗原ＥＬＩＳＡによって、二量体組換えタンパク質の結合活性を単量体と比較した。手短に述べると、９６ウェルプレートに抗原又はタンパク質Ａ／Ｌを塗布し、４℃にて一晩置いた。プレートを０．０５％ツイーン−ＰＢＳで洗浄し、２時間にわたって２％ツイーン−ＰＢＳで遮断する。試料をプレートに添加し、室温にて１時間インキュベートする。プレートを洗浄し、二次試薬とともに室温にて１時間インキュベートする。プレートを洗浄し、ＴＭＢ基質を展開する。タンパク質Ａ／Ｌ ＨＲＰ又はインディア−ＨＲＰを二次試薬として使用した。抗原ＥＬＩＳＡについては、用いた抗原濃度は、ヒトＴＮＦａ及びヒトＴＮＦ受容体１に対してＰＢＳ中１μｇ／ｍｌであった。案内ｄＡｂの存在により、たいていの場合は、二量体は、ＥＬＩＳＡシグナルを与えたため、オフレート測定をＢＩＡｃｏｒｅによって考察した。
１．３．２ ＢＩＡｃｏｒｅ
ＢＩＡｃｏｒｅ分析をＴＡＲ１−５及びＴＡＲ２ｈ−５クローンに対して実施した。スクリーニングのために、ヒトＴＮＦ−αを高密度（約１００００ＲＵ）でＣＭ５チップに結合した。
５０μｌのヒトＴＮＦａ（５０μｇ／ｍｌ）を、酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）において５μｌ／ｍｉｎでチップに結合した。標準的な方法を用いた分析に続くチップの再生は、ヒトＴＮＦ−αの不安定性により可能ではない。したがって、各試料を分析した後に、チップを緩衝液で１０分間洗浄した。
ＴＡＲ１−５については、ラウンド２の選択によるクローン上澄みをＢＩＡｃｏｒｅによってスクリーニングした。以下の選択方法を用いて、３Ｕ、５Ｕ及び７Ｕライブラリーの各々から４８のクローンをスクリーニングした。
Ｒ１：１μｇ／ｍｌヒトＴＮＦ−αイムノチューブ、Ｒ２ １μｇ／ｍｌヒトＴＮＦ−αイムノチューブ、一晩洗浄。
Ｒ１：２０μｇ／ｍｌヒトＴＮＦ−αイムノチューブ、Ｒ２ ２０μｇ／ｍｌヒトＴＮＦ−αイムノチューブ、一晩洗浄。
Ｒ１：１μｇ／ｍｌヒトＴＮＦ−αイムノチューブ、Ｒ２ ビーズ上の３３ピコモルビオチン化ヒトＴＮＦ−α
Ｒ１：２０μｇ／ｍｌヒトＴＮＦ−αイムノチューブ、Ｒ２ ビーズ上の３３ピコモルビオチン化ヒトＴＮＦ−α
スクリーニングのために、ヒトｐ５５ＴＮＦ受容体をＣＭ５チップに高密度（約４０００ＲＵ）で結合した。１００μｌのヒトｐ５５ＴＮＦ受容体（１０ １０μｇ／ｍｌ）を酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）において５μｌ／ｍｉｎでチップに結合した。標準的な再生条件（グリシンｐＨ２又はｐＨ３）を検討したが、それぞれの場合において、抗原をチップの表面から除去したため、ＴＮＦ−αについては、各試料を分析した後で、チップを緩衝液で１０分間洗浄した。
ＴＡＲ２−５については、ラウンド選択によるクローン上澄みをスクリーニングした。
以下の選択方法を用いて、３Ｕ、５Ｕ及び７Ｕの各々から４８のクローンをスクリーニングした。
Ｒ１：１μｇ／ｍｌヒトｐ５５ＴＮＦ受容体イムノチューブ、Ｒ２ １μｇ／ｍｌヒトｐ５５ＴＮＦ受容体イムノチューブ、一晩洗浄。
Ｒ１：１０μｇ／ｍｌヒトｐ５５ＴＮＦ受容体イムノチューブ、Ｒ２ １０μｇ／ｍｌヒトｐ５５ＴＮＦ受容体イムノチューブ、一晩洗浄。
１．３．３ 受容体及び細胞試験
受容体試験における二量体の中和する能力を以下のように誘導した。
受容体結合
組換えＴＮＦ受容体１（ｐ５５）に対するＴＮＦの結合を抑制する能力について抗ＴＮＦ ｄＡｂを試験した。手短に述べると、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを３０ｍｇ／ｍｌの抗ヒトＦｃマウスモノクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ（米国Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ所在））とともに一晩インキュベートした。ウェルを、０．０５％ツイーン２０を含有するリン酸緩衝塩（ＰＢＳ）で洗浄し、次いでＰＢＳに含めた１％ＢＳＡで遮断してから、１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ受容体１Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（米国Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ所在））とともにインキュベートした。抗ＴＮＦ ｄＡｂをＴＮＦと混合し、洗浄したウェルに最終濃度が１０ｎｇ／ｍｌになるように添加した。ＴＮＦ結合を０．２ｍｇ／ｍｌビオチン化抗ＴＮＦ抗体（ＨｙＣｕｌｔ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（オランダＵｂｅｎ所在））で検出した後に、ホースラディッシュペルオキシダーゼタグストレプトアビジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（英国））で１：５００に希釈し、次いでＴＭＢ基質（ＫＰＬ（米国Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ所在））とともにインキュベートした。ＨＣｌを添加することによって反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を読み取った。抗ＴＮＦ ｄＡｂ活性は、ＴＮＦ結合の低下をもたらしたため、ＴＮＦのみの対照と比較して吸光度が低下していた。
マウスＬ９２９線維芽細胞に対するＴＮＦの細胞傷害性活性を中和する能力についてのＬ９２９細胞傷害性試験抗ＴＮＦ ｄＡｂの試験も行った（Ｅｖａｎｓ、Ｔ．（２０００）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５、２４３−２４８）。手短に述べると、ミクロタイタプレートに仕込まれたＬ９２９細胞を抗ＴＮＦ ｄＡｂ、１００ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ及び１ｍｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤ（Ｓｉｇｍａ（英国Ｐｏｏｌｅ所在））とともに一晩インキュベートした。［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（Ｐｒｏｍｅｇａ（米国Ｍａｄｉｓｏｎ所在））とともにインキュベートした後に、４９０ｎｍの吸光度を読み取ることによって細胞生死判別の測定を行った。抗ＴＮＦ ｄＡｂ活性は、ＴＮＦ細胞傷害性の低下をもたらしたため、ＴＮＦのみの対照と比較して吸光度が増加していた。
初期スクリーニングにおいて、上述のＢＩＡｃｏｒｅ分析のために調製された上澄みも受容体試験に使用した。受容体及び細胞試験において、精製されたタンパク質を使用して、選択された二量体のさらなる分析を実施した。
ＨｅＬａ ＩＬ−８試験
ＨｅＬａ細胞におけるＴＮＦによるＩＬ−８分泌の誘導を中和する能力について、抗ＴＮＦＲ１又は抗ＴＮＦαｄＡｂｓを試験した（ＨＵＶＥＣにおけるＩＬ−１によるＩＬ−８の誘導について記載しているＡｋｅｓｏｎ，Ｌ．ら、（１９９６）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７１、３０５１７−３０５２３の方法から採用した方法；ここでは、ヒトＴＮＦαによる誘導を検討し、ＨＵＶＥＣ細胞系の代わりにＨｅＬａ細胞を使用する）。手短に述べると、マイクロタイタプレートに仕込んだＨｅＬａ細胞をｄＡｂ及び３００ｐｇ／ｍｌのＴＮＦとともに一晩インキュベートした。インキュベート後、上澄みを細胞から吸い出し、サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を介してＩＬ−８濃度を測定した。抗ＴＮＦＲ１ ｄＡｂ活性は、ＴＮＦのみの対照と比較して、上澄みへのＩＬ−８分泌の低下をもたらした。
以下の実験の全体を通してＬ９２９試験を用いる。しかし、抗ＴＮＦ受容体１（ｐ５５）リガンドを測定するには、ＨｅＬａ ＩＬ−８試験を用いるのが好ましい。Ｌ９２９試験におけるマウスｐ５５の存在が、その使用の確定的な制限要因である。
１．４ 配列分析
ＢＩＡｃｏｒｅ及び受容体試験スクリーニングにおいて興味深い特性を有することが証明された二量体を配列させた。配列は、以下の配列表、図面及び実施例に詳述されている。
１．５ 設定
１．５．１ ＴＡＲ１−５−１９二量体
良好な中和特性を有することが示されたＴＡＲ１−５二量体を再設定し、細胞及び受容体試験で分析した。ＴＡＲ１−５案内ｄＡｂを親和性成熟クローンＴＡＲ１−５−１９で置換した。これを達成するために、ＴＡＲ１−５を個々の二量体対からクローンし、ＰＣＲによって増幅されたＴＡＲ１−５−１９で置換した。加えて、ＴＡＲ１−５−１９ホモ二量体も３Ｕ、５Ｕ及び７Ｕベクターで構成した。遺伝子のＮ末端複製物をＰＣＲによって増幅し、上述のようにクローンし、ＳａｌＩ及びＮｏｔＩ制限部位を使用してＣ末端遺伝子断片をクローンした。
１．５．２ 変異誘発
ＴＡＲ１−５二量体対におけるＣ末端ｄＡｂの１つであるｄＡｂ２に存在するアンバー停止コドンを部位誘導変異誘発によってグルタミンに変異させた。
１．５．３ Ｆａｂｓ
ＴＡＲ１−５又はＴＡＲ１−５−１９を含む二量体をＦａｂ発現ベクターに再設定する。ＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ制限部位を使用して、ｄＡｂｓを、ＣＫ又はＣＨ遺伝子を含む発現ベクターにクローンし、配列分析によって検証した。ＣＫベクターをｐＵＣベースのアンピシリン耐性ベクターから誘導し、ＣＨベクターをｐＡＣＹＣクロラムフェニコール耐性ベクターから誘導する。Ｆａｂ発現については、ｄＡｂ−ＣＨ及びｄＡｂ−ＣＫ構築物をＨＢ２１５１細胞に同時形質転換し、０．１％グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び１０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有する２×ＴＹで成長させた。
１．５．３ヒンジ二量体化
シスチン結合形成によるｄＡｂｓの二量化を調べた。アミノ酸の短配列ＥＰＫＳＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号１１）ヒトＩｇＧＣ１ヒンジの改造形態をｄＡｂのＣ末端領域に作った。この配列に対してコードするオリゴリンカーを合成し、先述のようにアニールした。ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ制限部位を使用して、リンカーを、ＴＡＲ１−５−１９を含むｐＥＤＡベクターにクローンした。二量体化は、周辺質のｉｎ ｓｉｔｕで行われる。
１．６ 発現及び精製
１．６．１ 発現
先述のように、最初のスクリーニングのために、２ｍｌ９６ウェルプレート形式に上澄みを調製した。最初のスクリーニングプロセスに続いて、選択された二量体をさらに分析した。上澄みとしてＴＯＰ１０Ｆ’又はＨＢ２１５１細胞に二量体構築物を発現した。手短に述べると、新たに縞づけしたプレートからの個々のコロニーを、１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び１％グルコースを含む２×ＴＹ中で、３７℃にて一晩成長させた。この培養物の１／１００希釈物を、１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び０．１％グルコースを含む２×ＴＹに接種し、ＯＤ６００が約０．９になるまで振とうしながら３７℃で成長させた。次いで、培養物を１ｍＭのＩＰＴＧにより３０℃で一晩誘導した。細胞を遠心分離によって除去し、上澄みをタンパク質Ａ又はＬアガロースで精製した。
Ｆａｂ及びシステインヒンジ二量体をＨＢ２１５２細胞における周辺質タンパク質として発現させた。
一晩培養物の１／１００希釈物を、０．１％グルコース及び適切な抗生物質を含む２×ＴＹに接種し、ＯＤ６００が約０．９になるまで振とうしながら３７℃で成長させた。次いで、培養物を１ｍＭのＩＰＴＧにより３０℃で３〜４時間誘導させた。細胞を遠心分離によって収穫し、ペレットを周辺質調製緩衝液（３０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、２０％スクロース）に再懸濁させた。遠心分離に続いて、上澄みを保持し、ペレットを５ｍＭのＭｇＳＯ４に再懸濁させた。再び遠心分離によって上澄みを収穫し、蓄積し、精製した。
１．６．２ タンパク質Ａ／Ｌ精製
タンパク質Ｌアガロース（Ａｆｆｉｔｅｃｈ（ノルウェー））又はタンパク質Ａアガロース（Ｓｉｇｍａ（英国））からの二量体タンパク質の精製の最適化を調べた。タンパク質を、バッチ、又は蠕動ポンプを使用するカラム溶出によって溶出した。０．１Ｍリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ２．６）、０．２Ｍグリシン（ｐＨ２．５）及び０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．５）の３つの緩衝液を調べた。
最適な条件は、１０カラム容量に対して０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．５）を使用する蠕動ポンプ条件であると決定された。０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．５）を使用する蠕動ポンプ条件でタンパク質Ａによる精製を実施した。
１．６．３ ＦＰＬＣ精製
ＡＫＴＡエクスプローラ１００システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ）におけるＦＰＬＣ分析によってさらなる精製を行った。５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４）における０〜１ＭのＮａＣｌ勾配で溶出される陽イオン交換クロマトグラフィ（１ｍｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｓ−Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ）によってＴＡＲ１−５及びＴＡＲ１−５−１９二量体を分別した。２５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）における０〜１ＭのＮａＣｌ勾配で溶出されるイオン交換（１ｍｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｑ Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ）によってヒンジ二量体を精製した。０．０５％ツイーンを含むＰＢＳにおいて０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で処理されるＳｕｐｅｒｏｓｅ１２（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ）カラムを使用するサイズ排除クロマトグラフィによってＦａｂｓを精製した、精製に続いて、Ｖｉｖａｓｐｉｎ ５Ｋカットオフ濃縮器（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ）を使用して試料を濃縮した。
２．０ 結果
２．１ ＴＡＲ１−５二量体
すべてのライブラリー及び選択条件を包含する第２ラウンドの選択から６×９６のクローンを採取した。上澄みプレップを作り、抗原及びタンパク質Ｌ ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ並びに受容体試験で試験した。ＥＬＩＳＡでは、陽性のクローンを各選択方法から同定し、３Ｕライブラリー、５Ｕライブラリー及び７Ｕライブラリーに分配した。しかし、案内ｄＡｂが常に存在するため、この方法によって高親和性と低親和性を判別するのは不可能であった。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅ分析を実施した。
上澄み２ｍｌを使用してＢＩＡｃｏｒｅ分析を実施した。ＢＩＡｃｏｒｅ分析により、単量体ＴＡＲ１−５と比較して二量体Ｋｏｆｆレートが著しく向上していることが明らかになった。１０−３〜１０−４Ｍの範囲にある二量体Ｋｏｆｆレートと比較して、単量体Ｋｏｆｆレートは１０−１Ｍの範囲にあった。オフレートが非常に遅いと思われる１６のクローンを選択し、これらは３Ｕ、５Ｕ及び７Ｕライブラリーから得られ、配列決定された。加えて、受容体試験においてヒトＴＮＦ−αを中和できるかどうかについて上澄みを分析した。
これらの試験で中和した６つのリードクローン（以下のｄ１〜ｄ６）は配列決定されている。それらの結果は、得られた６つのクローンのうち、異なる第２のｄＡｂは３つ（ｄＡｂ１、ｄＡｂ２及びｄＡｂ３）しか存在しないが、第２のｄＡｂが二度以上認められると、異なる長さのリンカーと結合される。
ＴＡＲ１−５ｄ１：３Ｕリンカー第２のｄＡｂ＝ｄＡｂ１−１μｇ／ｍｌ Ａｇイムノチューブ、一晩洗浄
ＴＡＲ１−５ｄ２：３Ｕリンカー第２のｄＡｂ＝ｄＡｂ２−１μｇ／ｍｌ Ａｇイムノチューブ、一晩洗浄
ＴＡＲ１−５ｄ３：５Ｕリンカー第２のｄＡｂ＝ｄＡｂ２−１μｇ／ｍｌ Ａｇイムノチューブ、一晩洗浄
ＴＡＲ１−５ｄ４：５Ｕリンカー第２のｄＡｂ＝ｄＡｂ３−２０μｇ／ｍｌ Ａｇイムノチューブ、一晩洗浄
ＴＡＲ１−５ｄ５：５Ｕリンカー第２のｄＡｂ＝ｄＡｂ１−２０μｇ／ｍｌ Ａｇイムノチューブ、一晩洗浄
ＴＡＲ１−５ｄ６：７Ｕリンカー第２のｄＡｂ＝ｄＡｂ１−Ｒ１：１μｇ／ｍｌ Ａｇイムノチューブ、一晩洗浄、Ｒ２：ビーズ
６つのリードクローンをさらに調べた。タンパク質を周辺質及び上澄みから生成し、タンパク質Ｌアガロースで精製し、細胞及び受容体試験で調べた。中和のレベルはばらつきがあった（表１）。タンパク質調製のための最適な条件を決定した。上澄みとしてＨＢ２１５１細胞から生成されたタンパク質で最も高い収率（約１０ｍｇｓ／Ｌの培養物）が得られた。上澄みをタンパク質Ｌアガロースとともに室温にて２時間又は４℃で一晩インキュベートした。ビーズをＰＢＳ／ＮａＣｌで洗浄し、蠕動ポンプを使用してＦＰＬＣカラムに充填した。ビーズを１０カラム容量のＰＢＳ／ＮａＣｌで洗浄し、０．１Ｍのグリシン（ｐＨ２．５）で溶出させた。概して、二量体タンパク質は、単量体の後に溶出される。
ＴＡＲ１−５ｄｌ−６二量体をＦＰＬＣによって精製した。３つの化学種をＦＰＬＣ精製によって得て、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより同定した。１つの化学種は単量体に対応し、他の２つの化学種は異なるサイズの二量体に対応する。それらの２つの化学種の大きい方は、恐らく、Ｃ末端タグの存在による。これらのタンパク質を受容体試験で調べた。表１に示されたデータは、２つの二量体化学種（図１１）から得られた最適な結果を表す。二量体対（すなわちｄＡｂ１、ｄＡｂ２及びｄＡｂ３）からの３つの第２のｄＡｂを単量体としてクローニングし、ＥＬＩＳＡ及び細胞及び受容体試験で調べた。すべての３つのｄＡｂは、抗原ＥＬＩＳＡによりＴＮＦに対して特異的に結合し、プラスチック又はＢＳＡと交差反応しない。単量体として、ｄＡｂが細胞又は受容体試験において中和する。
２．１．２ ＴＡＲ−５−１９二量体
６つのリードクローンにおいてＴＡＲ１−５−１９をＴＡＲ１−５に代用した。特に指定のない限り全タンパク質（精製されたタンパク質Ｌのみ）を使用して、細胞及び受容体試験におけるすべてのＴＡＲ１−５−１９二量体の分析を実施した（表２）。ＴＡＲ１−５−１９ｄ４及びＴＡＲ１−５−１９ｄ３は、細胞試験において最良のＮＤ５０（約５ｎＭ）を有し、これは、受容体試験結果と一致しており、ＴＡＲ１−５−１９単量体（ＮＤ５０約３０ｎＭ）に比べて向上している。精製されたＴＡＲ１−５二量体は、受容体及び細胞検体においてばらついた結果を示すが、ＴＡＲ１−５−１９二量体はより一定していた。タンパク質精製中に異なる溶出緩衝液を使用するとばらつきが示された。０．１Ｍリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ２．６）又は０．２Ｍグリシン（ｐＨ２．５）を使用する溶出では、たいていの場合にタンパク質Ｌからすべてのタンパク質が除去されたが、機能性がより低くなった。
ＴＡＲ１−５−１９ｄ４を発酵槽で発現させ、陽イオン交換ＦＰＬＣで精製して、完全にナイーブな二量体を生成した。ＴＡＲ１−５ｄ４については、ＦＰＬＣ生成により、単量体及び２つの二量体化学種に対応する３つの化学種を得た。この二量体のアミノ酸配列を決定した。次いで、ＴＡＲ１−５−１９単量体及びＴＡＲ１−５−１９ｄ４を受容体試験で調べ、単量体に対して得られたＩＣ５０は３０ｎＭであり、二量体に対して得られたＩＣ５０は５ｎＭであった。
ＴＡＲ１−５−１９単量体とＴＡＲ１−５−１９ｄ４とＴＡＲ１−５ｄ４とを比較した受容体試験の結果を図１０に示す。
ＴＡＲ１−５−１９ホモ二量体を３Ｕ、５Ｕ及び７Ｕベクターで作製し、発現させ、タンパク質Ｌで精製した。それらのタンパク質を細胞及び受容体試験で調べ、得られるＩＣ５０（受容体試験に対する）及びＮＤ５０（細胞試験に対する）を求めた（表３、図１２）。
２．２ Ｆａｂ
ＴＡＲ１−５及びＴＡＲ１−５−１９二量体もＦａｂ形式にクローンし、発現し、タンパク質Ｌアガロースで精製した。Ｆａｂを受容体試験で評価した（表４）。それらの結果は、ＴＡＲ１−５−１９及びＴＡＲ１−５二量体の両方について、中和レベルは、それらが誘導された本来のＧｌｙ４Ｓｅｒリンカー二量体と類似していることを示していた。ＴＡＲ１−５−１９をＣＨとＣＫの両方に表示したＴＡＲ１−５−１９Ｆａｂを発現し、タンパク質Ｌ生成し、受容体試験で評価した。得られたＩＣ５０は、約１ｎＭであった。
２．３ ＴＡＲ１−２７二量体
３×９６のクローンを、すべてのライブラリー及び選択条件を包含するラウンド２の選択から採取した。２ｍｌの上澄みプレップをＥＬＩＳＡ及び生物試験での分析のために作製した。抗原ＥＬＩＳＡでは、７１の陽性クローンが得られた。粗上澄みの受容体試験では、阻害特性を有する４２のクローンが生成された（ＴＮＦ結合０〜６０％）。ほとんどの場合において、阻害特性は、強いＥＬＩＳＡシグナルと相関していた。４２のクローンを配列決定し、これらのうちの３９は第２のｄＡｂ配列を有する。最良の阻害特性を与えた１２の二量体をさらに分析した。
１２の中和クローンを２００ｍｌの上澄みプレップとして発現し、タンパク質Ｌで精製した。これらをタンパク質Ｌ及び抗原ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ及び受容体試験で評価した。すべての場合において、強い陽性のＥＬＩＳＡが得られた。ＢＩＡｃｏｒｅ分析により、すべてのクローンが高速のオン及びオフレートを有することが明らかになった。オフレートは、単量体ＴＡＲ１−２７と比較して向上したが、ＴＡＲ１−２７二量体のオフレート（Ｋｏｆｆは約１０−１から１０−２Ｍの範囲にある）は、先に調べたＴＡＲ１−５二量体（Ｋｏｆｆは１０−３〜１０−４Ｍの範囲にある）より速かった。精製された二量体の安定性は疑問があったため、安定性を向上させるために、５％グリコール、０．５％トリトンＸ１００又は０．５％ＮＰ４０（Ｓｉｇｍａ）の添加を２つのＴＡＲ１−２７二量体（ｄ２及びｄｌ６）の精製に含めた。ＮＰ４０又はトリトンＸ１００の添加により、精製生成物の収率が約２倍に向上した。両方の二量体を受容体試験で評価した。ＴＡＲ１−２７ｄ２では、すべての精製条件下で約３０ｎＭのＩＣ５０が得られた。ＴＡＲ１−２７ｄ１６では、安定化剤を使用せずに精製された場合は中和効果を示さなかったが、安定化条件下で精製された場合は約５０ｎＭのＩＣ５０が得られた。さらなる分析を実施しなかった。
２．４ ＴＡＲ１−５二量体
３×９６クローンを、すべてのライブラリー及び選択条件を包含する第２ラウンドの選択から採取した。２ｍｌの上澄みを分析用に作製した。タンパク質Ａ及び抗原ＥＬＩＳＡをプレート毎に実施した。ＢＩＡｃｏｒｅによる良好なオフレート（Ｋｏｆｆは１０−２〜１０−３Ｍの範囲にある）を有するものとして３０の興味深いクローンを同定した。クローンを配列決定し、配列分析により１３のユニークな二量体を同定した。
表１：ＴＡＲ１−５二量体
Figure 2013056890
＊二量体２及び二量体３は、同じ第２のｄＡｂ（ｄＡｂ２と呼ばれる）を有するが、リンカー長が異なる（ｄ２＝（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３、ｄ３＝（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３）ことに留意されたい。ｄＡｂ１は、二量体１、５及び６に対するパートナーｄＡｂである。ｄＡｂ３は、二量体４に対するパートナーｄＡｂである。パートナーｄＡｂのいずれも単独で中和しない。ＦＰＬＣ精製は、特に指定のない限り陽イオン交換によって行われる。ＥＰＬＣによって得られた各二量体に対する最適な二量体化学種がこれらの試験で決定された。
表２：ＴＡＲ１−５−１９二量体
Figure 2013056890
表３：ＴＡＲ１−５−１９ホモ二量体
Figure 2013056890
表４：ＴＡＲ１−５／ＴＡＲ１−５−１９Ｆａｂ
Figure 2013056890
ＴＡＲ１−５−１９ＣＹＳ二量体のＰＣＲ構成
ｄＡｂ三量体について記載している例８を参照されたい。三量体は、単量体と二量体と三量体の混合物を生成する。
ＴＡＲ１−５−１９ＣＹＳ二量体の発現及び精製
例８に概説されているように、タンパク質Ｌアガロース上に捕捉することによって培養物の上澄みから二量体を精製した。
ＴＡＲ１−５−１９ＣＹＳ二量体からのＴＡＲ１−５−１９ＣＹＳ単量体の分離
陽イオン交換分離の前に、製造元のガイドラインに従って、ＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して、単量体／二量体混合試料を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）にバッファー交換した。次いで、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）と予め平衡化された１ｍＬ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｓ陽イオン交換カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に試料を入れた。５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）における以下の塩勾配を用いて、単量体及び二量体を分離した。
１５カラム容量に対する１５０から２００ｍＭの塩化ナトリウム
１０カラム容量に対する２００から４５０ｍＭの塩化ナトリウム
１５カラム容量に対する４５０から１００ｍＭの塩化ナトリウム
二量体のみを含有する成分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して同定し、次いでプールし、１／５容量の１Ｍトリス（ｐＨ８．０）を添加することによってｐＨを８に増加させた。
インビトロ機能的結合試験：ＴＮＦ受容体試験及び細胞試験
ＴＮＦ受容体及び細胞試験を用いて、ヒトＴＮＦｃｚに対する二量体の親和性を測定した。受容体試験におけるＩＣ５０は約０．３〜０．８ｎＭであった。細胞試験におけるＮＤ５０は約３〜８ｎＭであった。
考えられる他のＴＡＲ１−５−１９ＣＹＳ二量体形式
ＰＥＧ二量体及びカスタム合成マレイミド二量体
Ｎｅｋｔａｒ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ）は、小さいリンカーがｄＡｂを分離し、ともにサイズが５から４０ｋＤａの範囲のＰＥＧに結合される二量体として単量体をフォーマットすることを可能にする一連の二マレイミドＰＥＧ［ｍＰＥＧ２−（ＭＡＬ）２又はｍＰＥＧ−（ＭＡＬ）２］を提供している。５ｋＤａのｍＰＥＧ−（ＭＡＬ）２（すなわち、マレイミドが二量体において互いに結合している［ＴＡＲ１−５−１９］−シス−マレイミド−ＰＥＧｘ２）は、ＴＮＦ受容体試験においてオフから１〜３ｎＭの親和性を有することが示された。また、ＴＭＥＡ（トリス［２５マレイミドエチル］アミン）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）又は他の二機能性リンカーを使用して二量体を生成することも可能である。
２，２’−ジチオジピリジン（Ｓｉｇｍａアルドリッチ）及び還元単量体を使用する化学的結合手順を用いて、ジスルフィド二量体を生成することも可能である。
ｄＡｂのＣ末端に対するポリペプチドリンカー又はヒンジの添加
小さいリンカー、すなわち（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（ｎ＝１から１０、例えば１、２、３、４、５、６又は７）或いは免疫グロブリン（例えばＩｇＧヒンジ領域又は無作為ペプチド配列（例えば無作為ペプチド配列のライブラリーから選択される））をｄＡｂと末端システイン残基の間に作ることが可能である。次いで、これを使用して、上述のように二量体を作ることが可能である。
（例８）
ｄＡｂ三量体化
概要
ｄＡｂ三量体化では、タンパク質のＣ末端に遊離システインが必要とされる。次いで、遊離チオールを与えるように還元されたシステイン残基を使用して、三量体マレイミド分子、例えばＴＭＥＡ（トリス［２マレイミドエチル］アミン）にタンパク質を特異的に結合させることが可能である。
ＴＡＲ１−５−１９ＣＹＳのＰＣＲ構成
クローニングのためにＰＣＲ ＴＡＲ１−５−１９をＳａｌＩ及びＢａｍＨＩ部位に特異的に結合させるとともに、Ｃ末端システイン残基を導入するために、以下のオリゴヌクレオチドを使用した。
Figure 2013056890
ＰＣＲ反応（体積５０μＬ）を、２００μＭのｄＮＴＰ、０．４μＭの各プライマー、５μＬの１０×ＰｆｕＴｕｒｂｏ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、１００ｎｇの鋳型プラスミド（ＴＡＲ１−５−１９をコードする）、１μＬのＰｆｕＴｕｒｂｏ酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に設定し、無菌水を使用して体積を５０μＬに調整した。以下のＰＣＲ条件を用いた。：９４℃２分間の初期変性工程、次いで９４℃３０秒間、６４℃３０秒間及び７２℃３０秒間のサイクル。７２℃５分間の最終伸長工程も含めた。ＰＣＲ産物を精製し、ＳａｌＩ及びＢａｍＨＩで消化し、セインレスキクション酵素で切断されたベクターにライゲートした。ＤＮＡシークエンシングによって正確なクローンを検証した。
ＴＡＲ１−５−１９ＣＹＳの発現及び精製
製造元のプロトコルに従って、ＴＡＲ１−５−１９ＣＹＳベクターを化学的にコンピテントな細胞ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。１００μｇ／ｍＬカルベニシリン及び３７μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを使用するために、ｄＡｂプラスミドを担持する細胞を選択した。５００ｍＬの培養液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１００μｇ／ｍＬカルベニシリウム及び３７μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むバッフル付き２Ｌフラスコに培養物を設定した。培養物を３０℃で２００ｒｐｍの条件で１〜１．５のＯ．Ｄ．６００に成長させ、次いで１ｍＭのＩＰＴＧ（Ｍｅｌｆｏｒｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）で誘導した。ｄＡｂの発現を３０℃で１２〜１６時間持続させた。ｄＡｂの大半が培地に存在していることが確認された。したがって、遠心分離（８０００×ｇ、３０分間）によって細胞を培地から分離し、上澄みを使用して、ｄＡｂを精製した。上澄み１リットル当たり、３０ｍＬのタンパク質Ｌアガロース（Ａｆｆｔｅｃｈ）を添加し、２時間撹拌しながらｄＡｂをバッチ結合させた。上澄みが吸い出される前に、さらに１時間にわたって樹脂を重力により沈降させた。次いで、アガロースをＸＫ５０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｍａｃｉａ）に充填し、１０カラム量のＰＢＳで洗浄した。結合したｄＡｂを１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．０）で溶出し、次いで、１．５容量の１Ｍトリス（ｐＨ８．０）を添加することによってタンパク質含有成分を中和した。培養上澄み１リットル当たり、５０対５０の割合の単量体と二量体を含有する２０ｍｇのナイーブなタンパク質を単離した。
ＴＡＲ１−５−１９ＣＹＳの三量体化
２．５ｍｌの１００ＭのＴＡＲ１−５−１９ＣＹＳを５ｍＭジチオスレイトールで還元し、室温で２０分間にわたって放置した。次いで、ＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して試料をバッファー交換した。カラムを５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）と予め平衡させ、試料を入れ、製造元のガイドラインに従って溶出させた。試料を必要になるまで氷上に置いた。ＴＭＥＡ（トリス［２−マレイミドエチル］アミン）をＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。ＴＭＥＡの２０ｍＭの原液を１００％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）で作った。ＴＭＥＡの濃度が３：１（ｄＡｂ：ＴＭＥＡのモル比）より大きいと、タンパク質の急速な沈殿及び架橋が生じることが確認された。また、沈殿及び架橋の速度は、ｐＨが高くなるに従って大きくなった。したがって、１００μＭの還元ＴＡＲ１−５−１９ＣＹＳを使用し、２５μＭのＴＭＥＡを添加して、タンパク質を三量体化し、室温にて２時間反応を進行させた。グリセロール又はエチレングリコールの如き添加剤を２０％（ｖ／ｖ）まで添加すると、カップリング反応が進行するに従って三量体の沈殿が有意に低下することが確認された。カップリングの後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、単量体、二量体及び三量体が溶液中に存在していることが示された。
三量体ＴＡＲ１−５−１９ＣＹＳの精製
ＴＭＥＡ−ＴＡＲ１−５−１９ｃｙｓ反応物１ｍＬ当たり４０μＬの４０％氷酢酸を添加して、ｐＨを４に低下させた。次いで、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）と予め平衡させた１ｍＬのＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｓ陽イオン交換カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｍａｃｉａ）に試料を入れた。３０カラム容量に対して３４０から４５０ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）の塩勾配を用いて、二量体と三量体を部分的に分離させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して三量体のみを含有する成分を同定し、次いで蓄積し、１／５容量の１Ｍトリス（ｐＨ８．０）を添加することによってｐＨを８に上昇させた。（５ＫカットオフＶｉｖａスピン濃縮器（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）を使用する）濃縮工程中の三量体の沈殿を防止するために、１０％グリセロールを試料に添加した。
インビトロ機能的結合試験：ＴＮＦ受容体試験及び細胞試験
ＴＮＦ受容体及び細胞試験を用いて、ヒトＴＮＦ−αに対する三量体の親和性を測定した。受容体試験におけるＩＣ５０は、０．３ｎＭであった。細胞試験におけるＮＤ５０は、３から１０ｎＭの範囲（例えば３ｎＭ）であった。
考えられる他のＴＡＲ１−５−１９ＣＹＳ三量体形式
以下の試薬を使用して、ＴＡＲ１−５−１９ＣＹＳを三量体に設定することもできる。
ＰＥＧ三量体及びカスタム合成マレイミド三量体
Ｎｅｋｔａｒ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ）は、ＰＥＧの末端で化学修飾することが可能である一連のマルチアームＰＥＧを提供している。したがって、各腕の末端におけるマレイミド官能基とともにＰＥＧ三量体を使用すると、ＴＨＥＡを使用する上述の三量体化と同様にしてｄＡｂを三量体化することが可能になる。ＰＥＧは、三量体の溶解度を高めることで、凝集の問題を防止するという点においても有利でありうる。したがって、各ｄＡｂが、マレイミド官能基に結合されたＣ末端システインを有し、マレイミド官能基がＰＥＧ三量体に結合されたｄＡｂを生成することが可能である。
ｄＡｂのＣ末端へのポリペプチドリンカー又はヒンジの添加
小さいリンカー、すなわち（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（ｎ＝１から１０、例えば１、２、３、４、５、６又は７）、免疫グロブリン（例えばＩｇＧヒンジ領域）又は無作為ペプチド配列（例えば無作為ペプチド配列のライブラリーから選択される）をｄＡｂと末端システイン残基の間に作ることが可能である。多量体（例えば二量体又は三量体）を作るのに使用されるときは、これによってもより高度な柔軟性、及びより大きい個別単量体間の距離が導入され、標的、例えばヒトＴＮＦ−αの如きマルチサブユニット標的に対する結合特性が向上しうる。
（例９）
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及びマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）に対して導かれる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）の集合体の選択
この例では、血清アルブミンに対して導かれる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）を製造するための方法を説明する。マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）とヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の両方に対するｄＡｂの選択について説明する。それぞれがＶＨ（図１３：Ｖ３−２３／ＤＰ４７及びＪＨ４ｂに基づくダミーＶＨの配列参照）及びＶＫ（図１５：０１２／０２／ＤＰＫ９及びＪｋ１に基づくダミーＶＫの配列参照）に対する単一ヒトフレームワークに基づいており、ＮＮＫコドンにコードされる側鎖多様性が相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）に組み込まれた３つのヒトファージディスプレイ抗体ライブラリーをこの実験に使用した。
ライブラリー１（ＶＨ）：
位置：Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２ａ、Ｈ５３、Ｈ５５、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９７、Ｈ９８での多様性。
ライブラリーサイズ：６．２×１０９
ライブラリー２（ＶＨ）：
位置：Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２ａ、Ｈ５３、Ｈ５５、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ９９、Ｈ１００、Ｈ１００ａ、Ｈ１００ｂでの多様性。
ライブラリーサイズ：４．３×１０９
ライブラリー３（ＶＫ）：
位置：Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５３、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、Ｌ９６での多様性。
ライブラリーサイズ：２×１０９
未選択のライブラリーにおけるクローンの大多数が機能的になるように、汎用遺伝子リガンドタンパク質Ａ及びタンパク質Ｌに対する結合についてＶＨ及びＶＫライブラリーを予備選択した。上記に示したライブラリーのサイズは、予備選択後のサイズに対応する。ライブラリーの各々を個別的に使用して、２ラウンドの選択を血清アルブミンについて行った。それぞれの選択では、４ｍｌのＰＢＳに１００μｇ／ｍｌの濃度で含めた抗原をイムノチューブ（ｎｕｎｃ）に入れた。第１ラウンドの選択において、３つのライブラリーの各々をＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ）及びＭＳＡ（Ｓｉｇｍａ）に対して個別的にパニングした。第２ラウンドの選択において、６つの第１ラウンドの選択の各々によるファージを（ｉ）再び同じ抗原（例えば第１ラウンドＭＳＡ、第２ラウンドＭＳＡ）に対してパニングし、（ｉｉ）相反的抗原（例えば第１ラウンドＭＳＡ、第２ラウンドＨＳＡ）に対してパニングして、合計１２の第２ラウンドの選択を行った。それぞれの場合において、第２ラウンドの選択後に、ＨＳＡ及びＭＳＡに対する結合について４８のクローンを試験した。可溶性ｄＡｂ断片を、Ｈａｒｒｉｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９９６；２６７：８３−１０９によりｓｃＦｖ断片について記載されているように生成し、２％ツイーンＰＢＳをブロッキング緩衝液として使用し、結合ｄＡｂをタンパク質Ｌ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ）（ＶＫｓ用）及びタンパク質Ａ−ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）（ＶＨｓ用）で検出したことを除いて、標準的なＥＬＩＳＡプロトコルに従った（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、（１９９１）、ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９：４１３３）。
ＭＳＡ、ＨＳＡ又はその両方に対する結合を示すバックグラウンド上のシグナルを与えるｄＡｂをプラスチックのみに対する結合についてＥＬＩＳＡ可溶性形態で試験したが、いずれも血清アルブミンに対して特異的であった。次いで、クローンを配列したところ（以下の表参照）、２１の固有のｄＡｂ配列が同定されていることが明らかになった。選択されたＶＫ ｄＡｂクローン間の（アミノ酸レベルでの）最小類似性は８６．２５％であった（（６９／８０）×１００；多様化された残基のすべてが異なっていた場合の結果（例えばクローン２４及び３４））。選択されたＶＨ ｄＡｂクローン間の最小類似性は９４％であった（（１２７／１３６）×１００）。
次に、ビオチン化抗原を溶液から取り込む能力について、血清アルブミンｄＡｂを試験した。ＥＬＩＳＡプレートに１μｇ／ｍｌタンパク質Ｌ（ＶＫクローン用）及び１μｇ／ｍｌタンパク質Ａ（ＶＨクローン用）を適用したことを除いては、（上述の）ＥＬＩＳＡプロトコルに従った。プロトコル通りに可溶性ｄＡｂを溶液から取り込み、ビオチン化ＭＳＡ又はＨＳＡ及びストレプトアビジンＨＲＰで検出を行った。ビオチン化ＭＳＡ及びＨＳＡは、血清アルブミン分子毎に平均２つのビオチンを達成する目的で、製造元の説明書に従って調製されたものである。ＥＬＩＳＡにおいてビオチン化ＭＳＡを溶液から取り込んだ２４のクローンが同定された。これらのうちの２つ（以下のクローン２及び３８）は、取り込まれたビオチン化ＨＳＡでもあった。次に、ＣＭ５ＢＩＡｃｏｒｅチップに塗布されたＭＳＡを結合する能力について、ｄＡｂを試験した。ＢＩＡｃｏｒｅ上のＭＳＡを結合した８つのクローンが確認された。
Figure 2013056890
Figure 2013056890
いずれの場合も、それらのフレームワークは、ＣＤＲにおける多様性が上の表に示されている通りの対応するダミー配列におけるフレームワークと同一であった。
ＢＩＡｃｏｒｅ上のＭＳＡを結合した８つのクローンのうち、大腸菌に多く発現される２つのクローン（クローンＭＳＡ１６及びＭＳＡ２６）をさらなる試験に向けて選択した（例１０参照）。
ＭＳＡ１６及び２６に対する全ヌクレオチド及びアミノ酸配列を図１６に示す。
（例１０）
ＭＳＡ結合ｄＡｂ ＭＳＡ１６及びＭＳＡ２６のマウスにおける親和性及び血清半減期の測定
ｄαｂｓ ＭＳＡ１６及びＭＳＡ２６を大腸菌の周辺質で発現させ、タンパク質Ｌ−アガロース親和性樹脂（Ａｆｆｉｔｅｃｈ（ノルウェー））に対するバッチ吸着、及び続くｐＨ２．２のグリシンによる溶出を用いて精製した。次いで、精製したｄＡｂを阻害ＢＩＡｃｏｒｅによって分析して、Ｋｄを求めた。手短に述べると、精製されたＭＳＡ１６及びＭＳＡ２６を試験して、高密度のＭＳＡが塗布されたＢＩＡｃｏｒｅＣＭ５チップ上に２００ＲＵの応答を達成するのに必要とされるｄＡｂの濃度を求めた。ｄＡｂの必要な濃度が求められると、期待されるＫｄ付近の一連の濃度のＭＳＡをｄＡｂと混合し、一晩インキュベートした。次いで、それらの混合物の各々におけるｄＡｂのＭＳＡ塗布ＢＩＡｃｏｒｅチップを３０μｌ／分の高い流速で測定した。得られた曲線を用いて、クロッツプロットを作成したところ、推定Ｋｄは、ＭＳＡ１６に対しては２００ｎＭで、ＭＳＡ２６に対しては７０ｎＭであった（図１７Ａ及び図１７Ｂ）。
次に、クローンＭＳＡ１６及びＭＳＡ２６を、ＨＡタグ（核酸配列：ＴＡＴＣＣＴＴＡＴＧＡＴＧＴＴＣＣＴＧＡＴＴＡＴＧＣＡ（配列番号９１）及びアミノ酸配列：ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号９２））を有する発現ベクターにクローニングし、２〜１０ｍｇの量を大腸菌で発現させ、タンパク質Ｌ−アガロース親和性樹脂（Ａｆｆｉｔｅｃｈ（ノルウェー））で上澄みから精製し、ｐＨ２．２のグリシンで溶出した。マウスにおけるｄＡｂの血清半減期を求めた。ＭＳＡ２６ ３０及びＭＳＡ１６を単一静脈内注射として約１．５ｍｇ／ｋｇの濃度でＣＤ１マウスに投与した。
４％Ｍａｒｖｅｌで遮断されたヤギ抗ＨＡ（Ａｂｃａｍ（英国））捕捉及びタンパク質Ｌ−ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）検出ＥＬＩＳＡによって血清レベルの分析を行った。０．０５％ツイーンＰＢＳで洗浄した。試験試料との比較のために、１×マウス血清の存在下でｄＡｂの知られている濃度の検量線を設定した。２区画モデルによるモデル化により、ＭＳＡ−２６は、０．１６時間のｔ１／２α、１４．５時間のｔ１／２β、及び４６５時間・ｍｇ／ｍｌの曲線下面積（ＡＵＣ）（データは不図示）を有し、ＭＳＡ−１６は、０．９８時間のｔ１／２α、３６．５時間のｔ１／２β、及び９１３時間・ｍｇ／ｍｌのＡＵＣ（図１８）を有することが示された。両ＭＳＡクローンは、０．０６時間のｔ１／２α及び０．３４時間のｔ１／２βを有するＨＥＬ４（抗鶏卵白リソザイムｄＡｂ）と比較して、はるかに長い半減期を有していた。
（例１１）
ＶＨ−ＶＨ及びＶＫ−ＶＫ二重特異性Ｆａｂ類似断片の作製
本例では、Ｆａｂ類似断片としてＶＨ及びＶＫ二重特異性を製造するための方法について説明する。記載のＦａｂ類似断片の各々を構成する前に、第１に、対象となる標的に結合するｄＡｂを例９に記載されているライブラリーに類似したｄＡｂライブラリーから選択した。鶏卵リソザイム（Ｓｉｇｍａ）に結合するＶＨ ｄＡｂ、ＨＥＬ４を単離し、ＴＮＦ−α受容体（Ｒ及びＤシステム）に結合する第２のＶＨ ｄＡｂ（ＴＡＲ２ｈ−５）も単離した。これらの配列は配列表に示されている。ＴＮＦ−α（ＴＡＲ１−５−１９）を結合するＶＫ ｄＡｂを選択及び親和性成熟によって単離したが、その配列も配列表に示されている。その配列が図１７Ｂに示されている、例９に記載された第２のＶＫ ｄＡｂ（ＭＳＡ２６）もこれらの実験に使用した。
上記の４つのｄＡｂを含む発現ベクターからのＤＮＡを酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔＩで消化して、ｄＡｂに対してコードするＤＮＡを切除した。消化物をアガロースゲルで泳動させ、そのバンドを切り出した後、Ｑｉａｇｅｎゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ（英国））を使用したゲル精製を行うことによって、想定されるサイズ（３００〜４００ｂｐ）のバンドを精製した。次いで、ｄＡｂをコードするＤＮＡを以下の表に示されるＣＨ又はＣＫベクター（図８及び図９）に挿入した。
Figure 2013056890
ＶＨＣＨ及びＶＨＣκ構築物をＨＢ２１５１細胞に同時形質転換した。それとは別に、ＶκＣＨ及びＶκＣκ構築物をＨＢ２１５１細胞に同時形質転換した。同時形質転換細胞系の各々の培養物を一晩成長させた（５％グルコース、１０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、及びＣＨ及びＣκプラスミドの双方に対する抗生物質選択を維持するための１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＴＹ中）。一晩置いた培養物を使用して、新鮮な培地（２×ＴＹ、１０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール及び１００μｇ／ｍｌアンピシリン）に接種し、ＩＰＴＧの添加によりそれらのＣＨ及びＣκ構築物を発現させる前にＯＤ０．７〜０．９まで成長させた。
次いで、発現されたＦａｂ類似断片を（同時形質転換されたＶＨＣＨ及びＶＨＣκに対する）タンパク質Ａ精製及び（同時形質転換されたＶκＣＨ及びＶκＣκに対する）ＭＳＡ親和性樹脂精製によって周辺質から精製した。
ＶＨ−ＶＨ二重特異性
ゲル上のタンパク質を処理することによって、ＶＨＣＨ及びＶＨＣκ二重特異性の発現を試験した。ゲルをブロットし、Ｆａｂ断片に対する想定サイズのバンドをウェスタンブロットで検出することが可能であり、Ｆａｂ類似断片のＶＨＣＨ及びＶＨＣκ部の両方が存在していることが示された。次に、二重特異性の２つの半体が同一のＦａｂ類似断片に存在しているかどうかを判断するために、重炭酸ナトリウム緩衝液に３ｍｇ／ｍｌの濃度で含めた鶏卵リソザイム（ＨＥＬ）をウェル当たり１００μｌＥＬＩＳＡプレートに塗布し、４℃で一晩置いた。次いで、プレートを（例１に記載されているように）２％ツイーンＰＢＳで遮断した後に、ＶＨＣＨ／ＶＨＣκ二重特異性Ｆａｂ類似断片とともにインキュベートした。二重特異性のＨＥＬに対する結合の検出を、９ｅｌ０（ｍｙｃタグを結合するモノクローナル抗体、Ｒｏｃｈｅ）及び抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、非同族鎖を介して行った。ＶＨＣＨ／ＶＨＣκ二重特異性Ｆａｂ類似断片に対するシグナルは、単独で発現されたＶＨＣκに対する０．０６９のバックグラウンドシグナルと比較して０．１５４であった。これは、Ｆａｂ類似断片が標的抗原に対して結合特異性を有していることを実証している。
ＶＫ−ＶＫ二重特異性
同時形質転換されたＶＫＣＨ及びＶＫＣＫ二重特異性Ｆａｂ類似断片をＭＳＡ親和性樹脂で精製した後に、得られたタンパク質を使用して、１μｇ／ｍｌのＴＮＦ−αが塗布されたＥＬＩＳＡプレート、及び１０μｇ／ｍｌのＭＳＡが塗布されたＥＬＩＳＡプレートを探査した。想定されたように、両方のＥＬＩＳＡプレート上のタンパク質Ｌ−ＨＲＰで検出した場合にバックグラウンドの上にシグナルが存在した（データは不図示）。これは、ＭＳＡに結合することができる（したがってＭＳＡ親和性カラムで精製された）タンパク質の成分も後続のＥＬＩＳＡにおいてＴＮＦ−αに結合することができることを示すもので、抗体断片の二重特異性が確認された。次いで、このタンパク質の成分を後続の２つの実験に使用した。第１に、１μｇ／ｍｌＴＮＦ−αが塗布されたＥＬＩＳＡプレートを二重特異性ＶＫＣＨ及びＶＫＣＫＦａｂ類似断片により探査するとともに、ＥＬＩＳＡで同様のシグナルを与えるように計算された濃度の対照ＴＮＦ−α結合ｄＡｂにより探査した。二重特異性と対照ｄＡｂの両方を使用して、２ｍｇ／ｍｌＭＳＡの存在下及び不在下でＥＬＩＳＡプレートを探査した。二重特異性のウェルにおけるシグナルは、５０％以上低下したが、ｄＡｂウェルにおけるシグナルは全く低下しなかった（図１９ａ参照）。また、ＭＳＡを用いた受容体試験及びＭＳＡを用いない受容体試験に同一のタンパク質を含め、ＭＳＡによる競合も示した（図１９ｃ参照）。これは、ＭＳＡの二重特異性に対する結合がＴＮＦ−αに対する結合と競合することを実証するものである。
（例１２）
マウス血清アルブミン及びＴＮＦαに対する特異性を有するＶＫ−ＶＫ二重特異性ｃｙｓ結合二重特異性の作製
本例では、ジスルフィド結合を介する化学結合によって、マウス血清アルブミン及びＴＮＦ−αの両方に対して特異的な二重特異性抗体断片を製造するための方法について説明する。ＭＳＡ１６（例１による）及びＴＡＲ１−５−１９ｄＡｂの両方を、Ｃ末端システインを有し、タグを有さないｐＥＴベースのベクターに再びクローニングした。２つのｄＡｂを４〜１０ｍｇレベルで発現し、タンパク質Ｌアガロース親和性樹脂（Ａｆｆｉｔｅｃｈ（ノルウェー））を使用して上澄みから精製した。次いで、システインタグｄＡｂをジチオスレイトールで減少させた。次いで、ＴＡＲ１−５−１９ｄＡｂをジチオジピリジンと結合させて、ＰＥＰ１−５−１９ホモ二量体の形成をもたらすジスルフィド結合の再形成を阻止した。次いで、２つの異なるｄＡｂをｐＨ６．５で混合して、ジスルフィド結合形成、及びＴＡＲ１−５−１９、ＭＳＡ１６シス結合ヘテロ二量体の生成を促進させた。２つの非類似タンパク質の複合体を製造するためのこの方法は、本来は、Ｋｉｎｇら（Ｋｉｎｇ ＴＰ、Ｌｉ Ｋｏｃｈｏｕｍｉａｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９７８、第１７巻：１４９９−５０６、「分子間ジスルフィド結合形成によるタンパク質複合体の調製（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｖｉａ ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」）によって記載された。ヘテロ二量体を陽イオン交換により単量体化学種から分離した。期待されたサイズのバンドがＳＤＳゲル上に存在することにより分離を確認した。得られたヘテロ二量体化学種ＴＮＦ受容体試験で試験し、約１８ｎＭのＴＮＦを中和するためのＩＣ５０を有することを確認した。次に、一定の濃度のヘテロ二量体（１８ｎＭ）並びにＭＳＡ及びＨＳＡの一連の希釈物を使用して受容体試験を繰り返した。ある範囲の濃度（２ｍｇ／ｍｌまで）のＨＳＡの存在が、ＴＮＦ−αを抑制する二量体の能力の低下を引き起こすことはなかった。
しかし、ＭＳＡの添加により、ＴＮＦ−αを抑制する二量体の能力が投与量に応じて低下した（図２０）。これは、ＭＳＡとＴＮＦ−αが、シス結合ＴＡＲ１−１９、ＭＳＡ１６二量体に対する結合をめぐって競合することを実証している。
データ概要
先述の実施例に記載した実験で得られたデータの概要が付属書４に記載されている。
（例１３）
抗ＴＮＦ−α ｄＡｂに対する核酸及びポリペプチド配列の概要
本明細書に記載されている抗ＴＮＦ−α ｄＡｂに関する試験の過程全体を通じて、ヒト及び／又はマウスＴＮＦ−αを結合するいくつかの異なるｄＡｂを同定した。配列及びさらなる情報を以下に示す。
マウスＴＮＦ−αを結合するクローン
４つの抗マウスＴＮＦ−α ｄＡｂに対するヌクレオチド及びアミノ酸配列を以下に示す。これらのうちの２つ（ＴＡＲ１−２ｍ−９及びＴＡＲ１−２ｍ−３０）は、マウスＴＮＦ−αの活性を抑制し、２つ（ＴＡＲ１−２ｍ−１及びＴＡＲ１−２ｍ−２）は結合するが、抑制しない。
ＴＡＲ１−２ｍ−９
ＴＡＲ−２ｍ−９は、６μＭのＩＣ５０及び５μＭのＮＤ５０を有するＶｋクローンである。ＩＣ５０及びＮＤ５０は、タンパク質Ｌ架橋により向上しない。このクローンは、ヒトＴＮＦ−αに対する効果はないが（２つの濃度の細胞試験で化学種交差反応性を評価した）、ラットＴＮＦ−αに対して同様の中和活性を有する。
アミノ酸配列（ＣＤＲ３は太字で示される）（配列番号９３）：
Figure 2013056890
ＴＡＲ１−２ｍ−３０：
ＴＡＲ１−２ｍ−３０は、１０μＭのＮＤ５０を有するＶｋクローンである。ＮＤ５０は、タンパク質Ｌ架橋により向上しない。このクローンは、ヒトＴＮＦ−αに対する効果はなく（２つの濃度の細胞試験で化学種交差反応性を評価した）、マウスと比較すると、ラットＴＮＦに対する効果はわずかに小さい。
アミノ酸配列（ＣＤＲ３は太字で示される）（配列番号９５）：
Figure 2013056890
ＴＡＲ１−２ｍ−１：
このクローンは、マウスＴＮＦ−αを結合するが、受容体結合活性を抑制しない。
アミノ酸配列（配列番号９７）：
Figure 2013056890
ＴＡＲ１−２ｍ−２：
このクローンは、マウスＴＮＦ−αを結合するが、受容体結合活性を抑制しない。
アミノ酸配列（配列番号９９）：
Figure 2013056890
ヒトＴＮＦ−αを結合するｄＡｂクローン
ヒトＴＮＦ−αの結合について同定されたｄＡｂのヌクレオチド配列のリストを以下に示す。対応するアミノ酸配列は、図２３に示されている。
Figure 2013056890
Figure 2013056890
Figure 2013056890
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Figure 2013056890
さらなる抗ヒトＴＮＦ−αｄＡｂクローンとしては、以下のものが挙げられる。
いくつかのクローンを親和性成熟させた。クローンＴＡＲ１−１００−４７は、Ｌ９２９細胞試験におけるＮＤ５０が３０〜５０ｎＭで、タンパク質Ｌと架橋させた場合のＮＤ５０が３〜５ｎＭである親和性成熟クローンである。ＴＡＲ１−１００−４７は、アカゲザルＴＮＦと交差反応する。そのアミノ酸配列、及びいくつかの他のクローンのアミノ酸配列を以下に示す。ＴＡＲ１−２−１００及びＴＡＲ１−２−１０９は、ライブラリーの構成に使用される親クローンである。この群における良好なＴＡＲ１クローンは、以下の共通配列を有する。
ＴＡＲ１−１００−４７において太字で示されるＤ／Ｅ３０、Ｗ３２、Ｒ９４及びＦ９６。
Figure 2013056890
Figure 2013056890
Figure 2013056890
Figure 2013056890
Figure 2013056890
これらの実施例における様々な形式に合わせて構成されたＴＡＲ１−５−１９抗ヒトＴＮＦ−αｄＡｂの配列は以下の通りである。
Figure 2013056890
（例１４）
関節炎の予防モデルにおけるＰＥＧ化ＴＡＲ１−５−１９の効果試験
Ｔｇ１９７マウスは、ヒトＴＮＦ−グロビンハイブリッド遺伝子に対する遺伝子組換えマウスであり、４〜７週齢におけるヘテロ接合体は、関節リウマチと共通の組織学的特徴を有する慢性の多発性進行性関節炎を発生させる［Ｋｅｆｆｅｒ，Ｊ．、Ｐｒｏｂｅｒｔ，Ｌ．、Ｃａｚｌａｒｉｓ，Ｈ．、Ｇｅｏｒｇｏｐｏｕｌｏｓ，Ｓ．、Ｋａｓｌａｒｉｓ，Ｅ．、Ｋｉｏｕｓｓｉｓ，Ｄ．、Ｋｏｌｌｉａｓ，Ｇ．（１９９１）、「ヒト腫瘍壊死因子を発現する遺伝子組換えマウス：関節炎の予測的遺伝子モデル（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｔｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ：ａ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．）」、ＥＭＢＯ Ｊ．、第１０巻、４０２５〜４０３１頁］。
Ｔｇ１９７モデルでの関節炎の予防におけるＰＥＧ化ｄＡｂ（ｄＡｂ［すなわち４０Ｋ ｍＰＥＧ２ ＭＡＬ２］の結合のための２つの部位を有し、ｄＡｂがＴＡＲ１−５−１９シスである２ｘ２０ｋ枝分れされるＰＥＧ形式）の効果を試験するために、ヘテロ接合遺伝子組換えマウスを雄と雌が同数の１０匹の群に分けた。３週齢から処理を開始し、試験品目を毎週腹腔内注射した。ＴＡＲ１−５−１９単量体の発現及びＰＥＧ化の概要が、セクション１．３．３、例１に記載されている。すべてのタンパク質調製物をリン酸緩衝食塩水に含め、エンドトキシンの許容レベルについて試験した。
試験をブラインドで行った。毎週、動物の体重を測定し、０＝関節炎ではない（正常な外観及び屈曲）、１＝軽度の関節炎（関節の歪み）、２＝中等度の関節炎（膨れ、関節の変形）、３＝重度の関節炎（著しい運動障害）のシステムに従って、関節炎のマクロ表現型徴候を採点した。
試験の結果は、１０ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ化ＴＡＲ１−５−１９が関節炎の発生を抑制し、食塩水対照と処理群の関節炎スコアに有意な差があることを明確に実証していた。１ｍｇ／ｋｇ用量のＰＥＧ化ＴＡＲ１−５−１９も食塩水対照群に比べて統計的に有意に低い中間関節炎スコアをもたらした（ウィルコクソン試験に対する標準的な近似値を用いた場合はｐ＜０．０５％）。
（例１５）
関節炎の治療モデルにおけるＰＥＧ化ＴＡＲ１−５−１９の効果試験
Ｔｇ１９７マウスモデルにおける関節炎の治療モデルにおけるＰＥＧ化ｄＡｂの効果を試験するために、ヘテロ接合遺伝子組換えマウスを雄と雌が同数の１０匹の群に分けた。マウスが有意な関節炎表現型を有していた６週齢から処理を開始した。試験品目を４．６ｍｇ／ｋｇ腹腔内注射する処理を毎週２回行った。試料調製及び疾病採点は、例１４に記載した通りである。
関節炎採点は、ＰＥＧ化ＴＡＲ１−５−１９は治療モデルにおける関節炎の進行を抑制することを明確に実証した。４．６ｍｇ／ｋｇ用量のＰＥＧ化ＴＡＲ１−５−１９は、９週間目において、食塩水対照群に比べて統計的に有意に低い中間関節炎スコアをもたらした（ウィルコクソン試験に対する標準的な近似値を用いた場合はｐ＜０．０１％）。
（例１６）
低速放出形式におけるｄＡｂ効果
低速放出形式によるｄＡｂの効果を試験するために、小さいＰＥＧ分子を有するｄＡｂ（ＰＥＧは、Ｃ末端シス残基を有するｄＡｂの結合のための４つの部位を有する４ｘ５ｋで、ｄＡｂはＴＡＲ１−５−１９［すなわち２０Ｋ ＰＥＧ４腕ＭＡＬ］である）を０．２ｍｌの蠕動ポンプに充填した。蠕動ポンプは、４週間に０．２ｍｌの放出速度を有し、上述の治療Ｔｇ１９７モデルにおいて６週間目にマウスに皮下移植された。これらの動物の関節炎スコアは、生理食塩水を充填したポンプが移植された動物と比較すると明確に遅い速度で上昇した。これは、ｄＡｂが遅い放出形式により送達された場合に効果があることを実証している。
（例１７）
半減期安定化抗ヒトＴＮＦ−αｄＡｂは、Ｔｇ１９７マウスモデルにおけるＲＡの発症を防止する
本明細書に記載されているｄＡｂ単量体ＴＡＲ１−５−１９は、受動的に塗布されたＴＮＦ−αを使用して初期に選択されたｄＡｂから誘導された親和性成熟ｄＡｂ単量体である。初期のクローンは、Ｌ９２９ＴＮＦ細胞傷害性中和試験におけるＮＤ５０が５μＭより大きい。本明細書に記載されているようにＦｃ融合として設定された場合は、ＴＡＲ１−５−１９クローンは、Ｌ９２９試験におけるＮＤ５０が５ｎＭより小さい。
マウスに注入した後に、ＴＡＲ１−５−１９ｄＡｂ Ｆｃ融合の血清半減期を調べた。結果を図２４に示す。ＴＡＲ１−５−１９ｄＡｂ単量体が約２０分間のｔ１／２βを有していた場合には、同じｄＡｂのＦｃ融合形式バージョンは、２４時間を上回るｔ１／２βを有し、血清半減期の増加が７０倍を上回っていた。
上述のＲＡのＴｇ１９７マウスモデルにおいてＴＡＲ１−５−１９ｄＡｂ Ｆｃ融合構築物を試験した。マウスを、群毎に雌と雄が同数の１０匹を含む５つの群に分けた。ＴＡＲ１−５−１９ｄＡｂ Ｆｃ融合物、ＥＮＢＲＥＬ又は生理食塩水のＩＰ注射を毎週２回行う処理を、ＲＡ症状がまだ示されていない３週齢から開始した。試験を７週間にわたって実施した。図２５に示されるように、２種類の用量、すなわち１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇのＴＡＲ１−５−１９ｄＡｂ Ｆｃ融合物を投与した。陰性の対照動物は、陰性の対照抗β−ｇａｌ Ｆｃ融合物を１０ｍｇ／ｋｇの用量で毎週２回与えられ、１つの群は、生理食塩水注射により毎週２回処理された。比較のために、１つの群に１０ｍｇ／ｋｇのＥＮＢＲＥＬを毎週２回与えた。
動物をブラインド方式で本明細書に記載されているように関節炎スコアについて評価した。７週間の処理過程の最後において、１０ｍｇ／ｋｇの用量のＴＡＲ１−５−１９ｄＡｂ Ｆｃ融合物を毎週２回与えられた動物は、ＥＮＢＲＥＬを１０ｍｇ／ｋｇの用量で与えられた動物より関節炎スコアが低く、未処理の動物、又は陰性の対照ｄＡｂ Ｆｃ融合物を与えられた動物と比べて、関節炎疾患が実質的に完全に予防されていた。
ＴＮＦ−αは悪液質と関連づけられる。抗ＴＮＦ−αｄＡｂ処理の全課程を通じて動物の体重を測定した。ＴＡＲ１−５−１９ｄＡｂ Ｆｃ融合物が与えられた動物の体重は、陰性の対照ｄＡｂ Ｆｃ融合物を与えられた動物、及び処理を受けていない動物より有意に大きく、ＥＮＢＲＥＬ注入を受けた動物の体重と類似していた。
要約すると、１０ｍｇ／ｋｇのＴＡＲ１−５−１９は、Ｔｇ１９７モデルにおいて関節炎の発症を完全に防止した。この応答は、投与量に依存し、一部の効果は１ｍｇ／ｋｇの投与量に起因し、応答は、同様の投与量の既存の抗ＴＮＦ−α役ＥＮＢＲＥＬによって観察された応答より優れていた、この試験は、ヒトの疾患の臨床的に許容されるモデルにおける治療薬としてのｄＡｂの効果を実証している。
動物の関節の固定部の組織病理学的分析は、これらのデータ（不図示）と一致する。
（例１８）
異なる拡大半減期形式に対するインビボ試験
３つの異なる拡大半減期抗ＴＮＦ−αｄＡｂ形式を関節炎スコアに対する効果について調べた。これらの形式は、抗ＴＮＦ−αｄＡｂ Ｆｃ融合物（ヒトＩｇＧ ＣＨ２／ＣＨ３領域に対する融合によってホモ二量体化された２つの抗ヒトＴＮＦ−αｄＡｂ）、２つの異なるＰＥＧ結合抗ＴＮＦ−αｄＡｂ構築物（２ｘ２０Ｋ枝分れＰＥＧに対する２つの同一のｄＡｂのシスマレイミド結合によって形成されたホモ二量体、及び４ｘ１０Ｋ枝分れＰＥＧに対する４つの同一のｄＡｂに対するシスマレイミド結合によって形成されたホモ四量体）、並びに２つの同一の抗ＴＮＦ−αｄＡｂと、それらに続く抗マウス血清アルブミンｄＡｂを含む二重特異性抗ＴＮＦ−α／抗ＳＡ ｄＡｂであった。
個別的な試験において、３週齢から開始し、７週間にわたって継続的に、医薬組成物を図２６に示されるように１０ｍｇ／ｋｇ又は１ｍｇ／ｋｇの投与量で毎週投与し、或いは用量を変えながら毎週２回投与した。
ＰＥＧ化抗ＴＮＦ ｄＡｂホモ二量体は、関節炎スコアに基づく関節炎の完全な予防については、毎週注入プロトコルにおいて１０ｍｇ／ｋｇが有効であった。比較のために使用した現行の抗ＴＮＦ−α薬は、未処理の動物と比べて関節炎スコアが低下したが、ＰＥＧ化ｄＡｂ構築物によって達成されたスコアより統計的に有意に高かった。抗ＴＮＦ−α／抗ＳＡ二重特異性及びＦｃ融合物は、未処理のものと比べて効果を示した。
１ｍｇ／ｋｇを毎週注入する療法において、どの処理も疾患の発症を予防する効果が１００％ではなかったが、ＰＥＧ化抗ＴＮＦ−αｄＡｂ構築物は、無処理のもの及び現行の抗ＴＮＦ−α薬と比べて、疾病症状の進行を予防する効果が高かった。この投与療法において、抗ＴＮＦ−αｄＡｂ Ｆｃ融合物及び二重特異性構築物も現行の薬物より効果的であった。
要約すると、３つの異なる形式の半減期拡大ｄＡｂを使用する毎週投与療法試験では、ヒトの疾病の臨床的に許容されるモデルにおける処理の効果をさらに検証する。
（例１９）
確定された疾病に対する既存の抗ＴＮＦ−α治療薬と比較したＴｇ１９７マウスＲＡモデルにおける抗ヒトＴＮＦ−αｄＡｂの効果
この試験において、確立された疾病に対する様々な形式及び投与療法の抗ＴＮＦ−αｄＡｂ構築物の効果を、Ｔｇ１９７ＲＡモデルにおける同モル用量の現行の抗ＴＮＦ−α治療薬ＥＮＢＲＥＬ、ＨＵＭＩＲＡ及びＲＥＭＩＣＡＤＥと比較した。３週間ではなく、関節炎症状が既に示された６週間から動物への治療薬の投与を開始した。症状を組織学的にモニタリングし（９週間目）、ブラインド的に関節炎採点を行った（毎週）。
毎週２回の投与に対する様々な形式及び投与量が図２７に示されている。形式は、Ｆｃ融合物（ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２／ＣＨ３領域に対する融合によって二量体化されたＴＡＲ１−５−１９ｄＡｂの２つの複製物）、ＴＡＲ１−５−１９ｄＡｂ ＰＥＧ二量体（２ｘ２０Ｋ枝分れＰＥＧに対する２つの同一のｄＡｂのシス−マレイミド結合によって形成されたホモ二量体）、ＴＡＲ１−５−１９ｄＡｂ ＰＥＧ四量体（４ｘ２０Ｋ枝分れＰＥＧに対する４つの同一のｄＡｂのシス−マレイミド結合によって形成されたホモ四量体）及びＴＡＲ１−５−１９ｄＡｂ／抗マウスＳＡ二重特異性（２つの同一の抗ＴＮＦ−αｄＡｂ、及びそれに続く抗マウス血清アルブミンｄＡｂの線形融合物）を含んでいた。投与療法を図２８に概略的に示す。移植蠕動ポンプを介する４ｘ５ｋ ＰＥＧ化ＴＡＲ１−５−１９構築物の連続投与の評価も行った。
試験の結果は、現行の生物製剤はいずれも９週間で関節炎スコアを顕著に逆転させていないことを示していた。ＴＡＲ形式は、いずれも、食塩水対照と比較した場合に関節炎スコアを多かれ少なかれ安定化させ、これは統計的に有意であった。さらに、６週間目のスコアと比較した場合に、疾病の逆転の徴候があった。
また、９週間目における関節炎の関節は、組織病理学的疾病状態について調べると、６週間目の関節と比較した場合に、ＴＡＲ形式で処理した後の疾病重症度が低減されていた。これにより、ＴＡＲ形式は、確立された疾病の関節炎表現型の逆転を誘発できることが確認される。
これらの試験は、試験された抗ＴＮＦ−αｄＡｂ構築物の確立された関節炎疾病の効果を、少なくとも部分的に疾病の過程を逆転させるＴＮＦα−ｄＡｂの能力を含めて実証している。
（例２０）
抗血清アルブミンｄＡｂとの融合物としての抗ＴＮＦ ｄＡｂの効果
関節炎の予防モデルにおけるＴＡＲ１−５−１９／抗血清アルブミンｄＡｂ融合物の効果試験
Ｔｇ１９７マウスは、ヒトＴＮＦ−グロビンハイブリッド遺伝子に対する遺伝子組換えマウスであり、４〜７週齢におけるヘテロ接合体は、関節リウマチと共通の組織学的特徴を有する慢性の多発性進行性関節炎を発生させる［Ｋｅｆｆｅｒ，Ｊ．、Ｐｒｏｂｅｒｔ，Ｌ．、Ｃａｚｌａｒｉｓ，Ｈ．、Ｇｅｏｒｇｏｐｏｕｌｏｓ，Ｓ．、Ｋａｓｌａｒｉｓ，Ｅ．、Ｋｉｏｕｓｓｉｓ，Ｄ．、Ｋｏｌｌｉａｓ，Ｇ．（１９９１）、「ヒト腫瘍壊死因子を発現する遺伝子組換えマウス：関節炎の予測的遺伝子モデル（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｔｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ：ａ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．）」、ＥＭＢＯ Ｊ．、第１０巻、４０２５〜４０３１頁］。
Ｔｇ１９７モデルにおける関節炎の予防におけるＴＡＲ１−５−１９／抗血清アルブミンｄＡｂ融合物（ＴＡＲ１−５−１９、ＴＡＲ１−５−１９及び抗マウス血清アルブミンｄＡｂである３ｄＡｂのインライン三量体）を試験するために、ヘテロ接合遺伝子組換えマウスを雄と雌が同数の１０匹の群に分けた。３週齢から処理を開始し、試験品目を毎週腹腔内注射した。ＴＡＲ１−５−１９／抗血清アルブミンｄＡｂ融合物を、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグで大腸菌に発現させ、Ｎｉ親和性クロマトグラフィ、ＩＥＸ及びゲル濾過によって精製した。すべてのタンパク質調製物をリン酸緩衝食塩水に含め、エンドトキシンの許容レベルについて試験した。
試験をブラインドで行った。毎週、動物の体重を測定し、０＝関節炎ではない（正常な外観及び屈曲）、１＝軽度の関節炎（関節の歪み）、２＝中等度の関節炎（膨れ、関節の変形）、３＝重度の関節炎（著しい運動障害）のシステムに従って、関節炎のマクロ表現型徴候を採点した。
試験の結果は、１０ｍｇ／ｋｇのＴＡＲ１−５−１９／抗血清アルブミンｄＡｂ融合物が関節炎の発生を抑制し、食塩水対照と処理群の関節炎スコアに有意な差があることを明確に実証していた。１ｍｇ／ｋｇ用量のＴＡＲ１−５−１９／抗血清アルブミンｄＡｂ融合物も食塩水対照群に比べて統計的に有意に低い中間関節炎スコアをもたらした（ウィルコクソン試験に対する標準的な近似値を用いた場合はｐ＜２％）。
Ｂ 関節炎の治療モデルにおけるＴＡＲ１−５−１９／抗血清アルブミンｄＡｂ融合物の効果試験
Ｔｇ１９７モデルにおける関節炎の治療モデルにおけるＴＡＲ１−５−１９／抗血清アルブミンｄＡｂ融合物の効果を試験するために、ヘテロ接合遺伝子組換えマウスを雄と雌が同数の１０匹の群に分けた。動物が有意な関節炎表現型を有していた６週齢から処理を開始した。試験品目を２．７ｍｇ／ｋｇ腹腔内注射する処理を毎週２回行った。試料調製及び疾病採点は、上述した通りである。
関節炎採点は、ＴＡＲ１−５−１９／抗血清アルブミンｄＡｂ融合物は治療モデルにおける関節炎の進行を抑制することを明確に実証した。２．７ｍｇ／ｋｇ用量のＴＡＲ１−５−１９／抗血清アルブミンｄＡｂ融合物は、９週間目において、食塩水対照群に比べて統計的に有意に低い中間関節炎スコアをもたらした（ウィルコクソン試験に対する標準的な近似値を用いた場合はｐ＜０．０５％）。
これは、抗ＴＮＦ ｄＡｂは抗ＳＡ ｄＡｂによる形式において有効でありうること、及び抗ＳＡ ｄＡｂは、抗ＴＮＦ ｄＡｂ単体に対して期待される半減期より抗ＴＮＦ ｄＡｂの半減期を延ばしたことを明確に実証している。
（例２１）
ＲＡのＴｇ１９７マウスモデルにおける関節炎及び組織病理学的スコアに対する本明細書に記載されている抗ＴＮＦ−αｄＡｂの効果の調査
ＲＡのＴｇ１９７モデルにおける関節炎及び組織病理学的スコアに対する抗ＴＮＦ−αｄＡｂの効果を調べる２つのさらなる試験を行った。
第１の試験において、ＲＡ症状の発症前の３週齢から、毎週２回１０ｍｇ／ｋｇの用量で上述のＴＡＲ１−５−１９ｄＡｂ Ｆｃ融合物の投与を開始した。同じスケジュールによる食塩水、ＥＮＢＲＥＬ及び対照Ｆｃ融合ｄＡｂ注入物との比較において結果を判断した。
ＴＡＲ１−５−１９ｄＡｂ Ｆｃ融合物は、関節炎スコアによって判断されたように、且つ組織スライドの分析から、ＲＡ症状の発症を防止する上でＥＮＢＲＥＬより効果的であった。
第２の試験において、３週齢から開始した、１０又は１ｍｇ／ｋｇの抗ＴＮＦ−αｄＡｂ Ｆｃ融合物、ＰＥＧ二量体及び二重特異性抗ＴＮＦ／抗ＳＡを毎週投与することの効果を調べる。ＥＮＢＲＥＬ及びＨＵＭＩＲＡと比較する。
１ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの投与量で与えられるすべてのＴＡＲ形式に対する関節炎スコアは、食塩水対照と比較すると減少した。さらに、疾病の発症が遅れるという証拠があった。ＰＥＧ化及び抗ＳＡ二重特異性形式は、ＨＵＭＩＲＡ及びＥＮＢＲＥＬと比較すると、関節炎の重症度の低減により効果的であった。加えて、１０週間目における関節の組織の分析により、ＴＡＲ形式は、食塩水対照と比較するとより効果的で疾病重症度を低減していたことが示された。
要約すると、Ｆｃ融合物におけるＴＡＲ１−５−１９抗ＴＮＦ−ｄＡｂ、ＰＥＧ化及び抗ＳＡ二重特異性形式は、関節炎症状の発症の前に投与されても後に投与されても、Ｔｇ１９７モデルにおけるＲＡ症状に対してすべて効果的である。最も効果的な抗ＴＮＦ ｄＡｂ形式は、ＨＵＭＩＲＡと同等か、又はより効果的であり、最も効果的な抗ＴＮＦ ｄＡｂ形式は、すべての試験においてＥＮＢＲＥＬより有意に効果的である。
（例２２）
抗ヒトＶＥＧＦ ｄＡｂ
ＴＡＲ１５（抗ヒトＶＥＧＦ）
ヒトＶＥＧＦを結合するＶＫ ｄＡｂを以下に記載する。ＲＢＡは、本明細書に記載されている受容体２結合試験を意味する。
Figure 2013056890
ＴＡＲ１５−１クローンは、低密度ＢＩＡｃｏｒｅチップにおいて様々な濃度で試験された場合に５０〜８０ｎＭのＫｄを有する。他のＶＫクローンを、１つの濃度（５０ｎＭ）で低密度チップに接触させた。異なるクローンは、異なる動力学的プロフィルを示す。
アミノ酸配列：
共通配列：Ｗ２８、Ｇ３０、Ｅ３２、Ｓ３４、Ｈ５０及びＹ９３。
さらなるＴＡＲ１５抗ヒトＶＥＧＦ ｄＡｂクローンは、以下のＴＡＲ１５−１０に示されるように、共通配列：Ｗ２８、Ｇ３０、Ｅ３２、Ｓ３４、Ｈ５０及びＹ９３を有する。
Figure 2013056890
Figure 2013056890
ヒトＶＥＧＦを結合するＶＨ ｄＡｂを以下に記載する。これらのクローンは、上澄みＲＢＡ（Ｒ２）の（５０％を上回る）減少をもたらす。
Figure 2013056890
ＶＨクローンを１つの濃度（５０ｎＭ）でＢＩＡｃｏｒｅの低密度ＶＥＧＦチップに接触させた。異なるクローンは、異なる動力学的プロフィルを与える。
アミノ酸配列：
Figure 2013056890
（例２３）
抗ＶＥＧＦ ｄＡｂによるさらなる試験
本明細書に記載されている抗ＶＥＧＦｄＡｂを、例えばＦｃ融合物、Ｆａｂ、ＰＥＧ化形態、二量体、四量体及び抗ＳＡ二重特異性形態を含む、抗ＴＮＦ−αｄＡｂについて上述した様々な形式における効果について試験することが可能である。抗ＶＥＧＦ ｄＡｂを本明細書に記載されている抗ＴＮＦ−αｄＡｂばかりでなく、ＨＵＭＩＲＡ、ＥＮＢＲＥＬ及び／又はＲＥＭＩＣＡＤＥの如き他の抗ＴＮＦ−α調製物で評価することも可能である。
例えば、ＲＡのＴｇ１９７モデルにおける関節炎及び組織病理学的スコアに対する光ＶＥＧＦ ｄＡｂの効果を調べるためにさらなる試験を行うことができる。
例えば、３週齢（ＲＡ症状の発症の前）又は６週齢（症状の発症の後）から毎週１回又は２回、１ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇで、上述したＴＡＲ１−５−１９Ｆｃ融合物に類似したＴＡＲ１５ｄＡｂ Ｆｃ融合物の腹腔内投与を開始し、７週間以上にわたって継続させた。好ましくは等しいモル量の食塩水、対照Ｆｃ融合物（抗β−ｇａｌ）、ＴＡＲ１−５−１９単体、ＥＮＢＲＥＬ、ＲＥＭＩＣＡＤＥ及び／又はＨＵＭＩＲＡとの比較において結果を判断する。
上述したマクロ表現型指標（例えば関節炎スコア）及び組織病理学的スコアについて動物を採点する。効果は、
ｉ）３週齢から動物への投与を開始した場合に（関節炎又は組織病理学的スコアによって明示される）疾病症状を発生させないこと、
ｉｉ）３週齢から投与を開始した場合に、対照動物と比べて、現れる疾病症状の重症度が低いこと、
ｉｉｉ）６週齢から投与を開始した場合に、対照動物と比べて、より重症度の高い疾病に進行することがないか、或いは進行速度が低いこと、
ｉｖ）６週齢から動物に対する投与を開始した場合に、７、８、９、１０、１１、１２又は１４週間目のいずれかにおいて（ここでも関節炎スコア又は組織病理学的スコアによる）症状が逆転することのいずれかによって実証される。
上述の異なる形式、例えばＦａｂ、ＰＥＧ化形態、二量体、四量体及び抗ＳＡ二重特異性形態の各々により同様の試験を行うことが可能である。
ＴＡＲ１５ ｄＡｂの如き抗ＶＥＧＦ ｄＡｂをＨＵＭＩＲＡ、ＥＮＢＲＥＬ及び／又はＲＥＭＩＣＡＤＥと組み合わせてＴｇ１９７マウスモデルに投与することも可能である。当該試験は、ＶＥＧＦ ｄＡｂ単体の試験について上述したのと同様に実施され、効果も同様に測定される。
（例２４）
クローン病モデルにおける抗ＴＮＦ−αｄＡｂの評価
クローン病における抗ＴＮＦ−αｄＡｂ（及び／又は抗ＶＥＧＦ ｄＡｂ）の効果を評価するために、最初にＫｏｎｔｏｙｉａｎｎｉｓら、１９９９、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１０：３８７−３９８に記載されたクローン病のＴｎｆΔＡＲＥ遺伝子組換えマウスモデルを使用する。それらの動物は、４週齢と８週齢の間に始まる、クローン病に対する類似性を有するＩＢＤ表現型を生じる。したがって、抗ＴＮＦ−ａ ｄＡｂ、例えば様々な形式のＴＡＲ１−５−１９（Ｆｃ融合物、Ｆａｂ、ＰＥＧ化（二量体、四量対等）、ＶＥＧＦによる二重特異性、抗ＳＡによる二重特異性等）を（疾病の予防を試験するために）３週齢、又は（疾病症状の安定化、進行の防止又は逆転を試験するために）６週齢に投与し、本明細書に記載されているように体重により、且つ組織学的に動物を採点する。初期試験には１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与を用い、これらの初期試験の結果に応じて調整する。試験組成物を毎週１回又は２回投与するか、或いは例えば蠕動ポンプを使用して連続的に投与することが可能である。或いは、例えばザンタックを用いた胃管栄養法又は腸溶性製剤による経口投与製剤を適用することも可能である。試験は、開始されてから７週間、又はそれ以上継続される。
クローン病のＴｎｆΔＡＲＥモデルにおける効果は、
ｉ）３週齢から動物への投与を開始した場合に疾病症状を発生させないこと、
ｉｉ）３週齢から投与を開始した場合に、対照動物と比べて、現れる疾病症状の重症度が低いこと、
ｉｉｉ）６週齢から投与を開始した場合に、対照動物と比べて、より重症度の高い疾病に進行することがないか、或いは進行速度が低いこと、
ｉｖ）６週齢から動物に対する投与を開始した場合に、７、８、９、１０、１１、１２又は１４週間目のいずれかにおいて症状が逆転することのいずれかによって示される。
特に、処理された動物における平均の組織病理学的疾病スコアが媒体対照群より（統計的に有意な量だけ）低い場合に処理は有効であると見なされる。平均の組織病理学的スコアが、媒体のみの対照群と比べて、少なくとも０．５単位、少なくとも１．０単位、少なくとも１．５単位、少なくとも２．０単位、少なくとも２．５単位、少なくとも３．０単位、又は少なくとも３．５単位だけ低い場合にも処理は有効であると見なされる。或いは、平均の組織病理学的スコアが、治療措置の過程全体を通じて０から０．５又はそれ以下に維持されている場合に処理は有効である。
ＲＡモデルについては、ＶＥＧＦに対して特異的なｄＡｂ又は他の抗ＴＮＦ−ａ組成物（例えばＥＮＢＲＥＬ、ＲＥＭＩＣＡＤＥ及び／又はＨＵＭＩＲＡ）を用いた組合せ治療の効果もこのモデルで評価される。
（例２５）
ヒトＴＮＦ−α及びヒトＶＥＧＦに対して導かれる二重特異性ＩｇＧ
以下に記載する改変ＩｇＧ類似二重特異性形式において、２つの異なる特異性のｄＡｂが、それぞれ重鎖及び軽鎖定常領域に融合される。細胞に同時発現すると、２つの治療標的（例えば、ＴＮＦ−αに対して特異的な標的及びＶＥＧＦに対して特異的な標的）に結合することが可能な２つの可変領域が二重標的ＩｇＧの各腕に存在する二腕ＩｇＧ類似分子が生成される。
ＤＮＡ構築物。使用された哺乳類発現ベクターは、ＣＭＶ最初期プロモーターを介して哺乳類細胞における遺伝子発現を促進するＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐｃＤＮＡ３．１骨格に基づいていた。重鎖発現については、ヒトＣＤ３３シグナルペプチド及びヒトＩｇＧ１重鎖定常領域からなるカセットをベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）のＮｈｅＩ及びＸｂａＩ制限部位に挿入し、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩ制限部位を使用して、ＶＥＧＦに対して特異的で、重鎖ポリペプチドの一部として発現された可変領域をＣＤ３３シグナルペプチドとＩｇＧ１重鎖定常領域の間でこのカセットにクローニングした。軽鎖発現については、ＣＤ３３シグナルペプチド及びヒトＣカッパ定常領域からなるカセットをベクターｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏ（＋）のＮｈｅＩ及びＸｈｏＩ制限部位に挿入し、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩ制限部位を使用して、ＴＮＦ−αに対して特異的で、軽鎖ポリペプチドの一部として発現された可変領域をＣＤ３３シグナルペプチドとＣカッパ定常領域の間でこのカセットにクローニングした。
タンパク質発現及び精製。重鎖及び軽鎖発現ベクターのＤＮＡを、製造元の説明書に従ってＱｉａｇｅｎ ＥｎｄｏＦｒｅｅプラスミドメガキットを使用して調製し、ＨＥＫ２９３（ヨーロッパ細胞培養コレクションから入手）又はＣｏｓ−７細胞（アメリカンタイプカルチャコレクションから入手）にＲｏｃｈｅトランスフェクト試薬Ｆｕｇｅｎｅ６を製造元の説明書に従ってトランスフェクトするのに使用した。５日後、培養上澄みを遠心分離によって収穫し、二工程親和性精製を用いて、スクリーニングされた二重特異性抗体を精製した。第１に、培養上澄みにリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を補給して、最終濃度を１．５×ＰＢＳとし、Ａｍｅｒｓｈａｍストリームラインタンパク質Ａ樹脂上に抗体を取り込んだ。樹脂を２×ＰＢＳで洗浄した後に、１０ｍＭのトリス（ｐＨ８）で洗浄し、０．１Ｍグリシン（ｐＨ２）を使用して、結合抗体を溶出した。２５％容量のＭトリス（ｐＨ８）を添加することによって溶出物を中和し、組換え抗体をＡｆｆｉｔｅｃｈタンパク質Ｌアガロース樹脂上に取り込んだ。樹脂を再び２×ＰＢＳを使用して洗浄した後に、１０ｍＭトリス（ｐＨ８）で洗浄し、０．１Ｍグリシン（ｐＨ２）を使用して、結合した組換え抗体を溶出し、２５％容量の１Ｍトリス（ｐＨ８）を添加することによって溶出物を中和した。
組換え抗体の分析。２８０ｎｍにおける吸光度読取り値を用いて、精製された組換え抗体を分光光度計で定量し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮｕＰＡＧＥ４−１２％ビス−トリスゲル及びＳｉｌｖｅｒＱｕｅｓｔ染色を用いて、製造元の説明書に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。図２９は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域に融合されたヒトＶＥＧＦに対して特異的なカッパ可変領域と、ヒトＣカッパ定常領域に融合されたヒトＴＮＦ−αに対して特異的なカッパ可変領域とを含む二重特異性抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。レーン１にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎマルチマーク分子量マーカーを充填し、レーン２に、１×Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ試料緩衝液に含めた二重特異性抗体を充填し、レーン３に、１０ｍＭβメルカプトエタノールを補充した１×Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ試料緩衝液に含めた二重特異性抗体を充填した。レーン３では、重鎖が５０ｋＤａのバンドとして見られ、軽鎖が２５ｋＤａのバンドとして見られる。
二重特異性の試験。ヒトＴＮＦ細胞試験及びヒトＶＥＧＦ受容体結合試験の双方における各々の精製された抗体のバッチの抗力を測定することによって、発現された抗体の二重特異性を実証した。
用いたヒトＴＮＦ細胞ベースの試験は、Ｅｖａｎｓ（２０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５、２４３−２４８）に記載されたＬ９２９細胞傷害性試験であった。手短に述べると、マイクロタイタプレートに仕込んだＬ９２９細胞を二重特異性抗体、１００ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ及び１ｍｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤ（Ｓｉｇｍａ（英国Ｐｏｏｌｅ所在））とともに一晩インキュベートした。［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（Ｐｒｏｍｅｇａ（米国Ｍａｄｉｓｏｎ所在））とともにインキュベートした後に、４９０ｎｍの吸光度を読み取ることによって細胞生死を測定した。抗ＴＮＦ活性により、ＴＮＦ細胞傷害性が低下したため、ＴＮＦのみの対照と比較して吸光度が高くなった。
基本的には「免疫グロブリンをベースとした多重特異性リガンドの調製」というタイトルのセクションに記載したように、ＶＥＧＦＲ２を使用してＶＥＧＦ活性を測定した。手短に述べると、９６ウェルＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ試験プレートに、炭酸緩衝液に０．５μｇ／ｍｌの濃度で含めた組換えヒトＶＥＧＦ Ｒ２／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ：３５７−ＫＤ−０５０）を一晩かけて塗布した。０．０５％ツイーン／ＰＢＳ、次いでＰＢＳでウェルを繰り返し洗浄した。ＰＢＳに含められた２％ＢＳＡを添加して、プレートを遮断した。ウェルを（上述のように）洗浄し、次いで精製した二重特異性抗体を各ウェルに添加した。次いで、希釈液に６ｎｇ／ｍｌの濃度（最終濃度を３ｎｇ／ｍｌとする）で含められたＶＥＧＦを各ウェルに添加し、プレートを室温にて２時間インキュベートした。プレートを上記のように洗浄し、次いで希釈液に０．５μｇ／ｍｌの濃度で含められたビオチン化抗ＶＥＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ Ｎｏ：ＢＡＦ２９３）を添加し、室温にて２時間インキュベートした。ウェルを上記のように洗浄した後に、ＨＲＰ共役抗ビオチン抗体（希釈液で１：５０００に希釈；Ｓｔｒａｔｅｃｈ、Ｃａｔ Ｎｏ：２００−０３２−０９６）を添加した。次いで、プレートを室温にて１時間インキュベートした。プレートを上記のように洗浄し、ツイーン２０のあらゆる痕跡を除去した。検出のために、１００μｌのＳｕｒｅＢｌｕｅ １−成分ＴＭＢマイクロウェルペロキシダーゼ溶液を各ウェルに添加した。１Ｍ塩酸を添加することによって反応を停止させた後に、プレートリーダーを使用してＯＤ４５０を読み取った。
図３０は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域に融合されたヒトＶＥＧＦに対して特異的なカッパ可変領域と、ヒトＣカッパ定常領域に融合されたヒトＴＮＦ−αに対して特異的なカッパ可変領域とを含む二重特異性抗体に対する結果を示す図である。二重特異性抗体（抗ＴＮＦ−αｘ抗ＶＥＧＦを表す）は、ヒトＴＮＦ−α及びヒトＶＥＧＦの両方を結合した。抗体は、両方の標的に対して二価である。ＴＮＦ−αに対するＮＤ５０は、可変領域として二重特異性分子におけるＣカッパに融合される抗ＴＮＦ−α単量体（２００ｎＭ）に対するＮＤ５０より有意に低い（２４ｎＭ）。ＶＥＧＦに対するＥＣ５０は、可変領域として二重特異性分子における重鎖定常領域に融合される抗ＶＥＧＦ単量体（１２ｎＭ、不図示）に対するＥＣ５０よりはるかに低く（７５ｐＭ）、タンパク質Ｌ架橋によってオリゴマー形成された抗ＶＥＧＦ単量体に対するＥＣ５０よりも低い（平方で示されたデータ点を有する直線、９９０ｐＭ）。
本実施形態の構築物は、第１のエピトープを結合するＶＨ又はＶＬ単一ドメイン抗体の２つの複製物と、第２のエピトープを結合するＶＨ又はＶＬ単一ドメイン抗体の２つの複製物とを含む四価の二重特異性抗原結合ポリペプチド構築物である。第１のエピトープを結合する単一ドメイン抗体の２つの複製物の各々は、ＩｇＧ重鎖定常領域に融合され、第２のエピトープを結合する単一ドメイン抗体の２つの複製物の各々は、軽鎖定常領域に融合される。
当業者は、例えば、他の抗ＴＮＦ−α及び抗ＶＥＧＦ抗体配列、例えば本明細書に記載されている配列のいずれかを使用して、本例に記載されている構築物に類似したさらなる二重特異性四価ポリペプチド構築物を生成することが可能である。他の実施形態において、Ｃκ又はＣλ軽鎖定常領域を使用することができ、ＩｇＧ１以外のＩｇＧ重鎖定常領域を使用することもできる。この種の構築物への展開に使用するのに特に興味深いのは、ｄＡｂ単量体として関節炎のＴｇ１９７遺伝子組換えマウスモデルのマウスに投与されると、関節炎スコアの増加を防止する単一領域抗ＴＮＦ−α抗体クローン、並びにｄＡｂ単量体としてコラーゲン誘発関節炎マウスモデルのマウスに投与されると、関節炎スコアの増加を防止する単一領域抗ＶＥＧＦ抗体クローンである。また、単一領域抗ＴＮＦ−α抗体クローンの単量体は、Ｌ９２９細胞傷害性試験においてヒトＴＮＦ−αを中和すること、及び単一領域抗ＶＥＧＦ抗体クローンの単量体は、本明細書に記載されているＶＥＧＦ受容体２結合の試験においてＶＥＧＦ受容体結合に拮抗することが好ましい。使用される単一ドメイン抗体クローンは、１００ｎＭ未満のＫｄでそれぞれのエピトープを結合することが好ましい。また、当該二重特異性四価構築物は、１００ｎＭ未満のＫｄでそれぞれのエピトープを結合し、本明細書に記載されている関節炎のＴｇ１９７及びＣＩＡモデルのいずれか又は両方において関節炎スコアの増加を防止することが好ましい。
当該構築物を、投与、投与量、及び効果のモニタリングの観点で本明細書に記載されている他の構築物と同様にして、関節リウマチの治療に使用することが可能である。例えば、ＰＥＧ成分の添加、及び／又は循環半減期を増加させるタンパク質、例えばＨＳＡの如き血清タンパク質に対して特異的な結合成分（例えばさらなる単一ドメイン抗体）のさらなる融合によって、上述したように構築物の半減期を改変することが可能である。
本明細書に言及されているすべての出版物、特許及び公開特許出願、並びに前記出版物に引用されている参考文献は、参照により本明細書に組み込まれている。本発明の範囲及び趣旨を逸脱することなく本発明の記載の方法及びシステムに様々な修正及び変更が加えられることを当業者なら理解するであろう。本発明を具体的な好ましい実施形態について説明したが、請求されている発明は当該具体的な実施形態に過度に限定されないことを理解されたい。実際、分子生物学又は関連分野の当業者に自明である、発明を実施するための記載の形態に対する様々な修正が、添付の特許請求の範囲の範囲内に含められるように意図されている。
付属書１：インビボの半減期を向上させるポリペプチド
α−１糖タンパク質（オロソムコイド）（ＡＡＧ）
α−１アンチキロモトリムシン（ＡＣＴ）
α−１アンチトリプシン（ＡＡＴ）
α−１ミクログロブリン（タンパク質ＨＣ）（ＡＩＭ）
α−２マクログロブリン（Ａ２Ｍ）
アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）
アポリポタンパク質Ａ−１（ＡｐｏＡ−１）
アポリタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）
β−２−ミクログロブリン（β２Ｍ）
セルロプラスミン（Ｃｐ）
補体成分（Ｃ３）
補体成分（Ｃ４）
Ｃ１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１ＩＮＨ）
Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）
システインＣ（シスＣ）
フェリチン（ＦＥＲ）
フィブリノゲン（ＦＩＢ）
フィブロネクチン（ＦＮ）
ハプトグロビン（Ｈｐ）
ヘモペクチン（ＨＰＸ）
免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）
免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）
免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）
免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）
免疫グロブリン軽鎖（カッパ／ラムダ）
リポタンパク質（ａ）［Ｌｐ（ａ）］
マンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）
ミオグロビン（Ｍｙｏ）
プラスミノゲン（ＰＳＭ）
プレアルブミン（トランスチレチン）（ＰＡＬ）
レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）
レオマトイド因子（ＲＦ）
血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）
可溶性トランスフェリン受容体（ｓＴｆＲ）
トランスフェリン（Ｔｆ）
付属書２
Figure 2013056890
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付属書３：腫瘍組合せ
Figure 2013056890
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付属書４：
Figure 2013056890
Figure 2013056890
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Claims (202)

  1. 関節リウマチの治療、予防、進行の抑制又は発症の遅延のための医薬品を調製するための、インビトロでのヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含む組成物の使用。
  2. 関節リウマチの１つ又は複数の指標に統計的に有意な変化を誘発するための医薬品を調製するための、インビトロでのヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含む組成物の使用。
  3. 前記組成物は、関節炎のＴｇ１９７遺伝子組換えマウスモデルのマウスに投与されると、関節炎スコアの増加を防止する請求項１又は２に記載の使用。
  4. 前記投与は、ＲＡの１つ又は複数の指標の統計的に有意な変化をもたらす請求項３に記載の使用。
  5. ＲＡの前記１つ又は複数の指標は、血沈（ＥＳＲ）、リッチ関節指数及び朝のこわばりの持続時間、関節可動度、関節腫脹、１つ又は複数の関節のＸ線撮像、並びに１つ又は複数の関節の固定部の組織病理学的分析のいずれかを含む請求項４に記載の使用。
  6. ＲＡの前記１つ又は複数の指標は、Ｔｇ１９７遺伝子組換えマウスにおける関節炎のマクロ表現型徴候の減少を含み、前記組成物はＴｇ１９７遺伝子組換えマウスに投与され、前記Ｔｇ１９７遺伝子組換えマウスは、関節炎の前記マクロ表現型徴候について採点され、関節炎の前記マクロ表現型徴候は、０＝関節炎ではない（正常な外観及び屈曲）、１＝軽度の関節炎（関節の歪み）、２＝中等度の関節炎（腫脹、関節の変形）、３＝重度の関節炎（著しい運動障害）のシステムに従って採点される請求項４に記載の使用。
  7. ＲＡの前記１つ又は複数の指標は、Ｔｇ１９７遺伝子組換えマウスにおける関節炎のマクロ表現型徴候の減少を含み、前記組成物はＴｇ１９７遺伝子組換えマウスに投与され、前記Ｔｇ１９７遺伝子組換えマウスは、関節炎の前記マクロ表現型徴候について採点され、関節炎の前記組織病理学的徴候は、関節に実現され、０＝検出可能な病状なし、１＝滑膜の過形成及び多形核浸潤物の存在、２＝パンヌス及び繊維状組織の形成並びに限局性軟骨下骨浸食、３＝関節軟骨破壊及び骨浸食、４＝広範な関節軟骨破壊及び骨浸食のシステムを用いて採点される請求項４に記載の使用。
  8. Ｔｇ１９７遺伝子組換えマウスに対する前記組成物の投与は、
    ａ）異型接合Ｔｇ１９７遺伝子組換えマウスに対して前記組成物を腹腔内注射により毎週投与する工程と、
    ｂ）工程ａ）のマウスの重量を毎週測定する工程と、
    ｃ）０＝関節炎ではない（正常な外観及び屈曲）、１＝軽度の関節炎（関節の歪み）、２＝中等度の関節炎（腫脹、関節の変形）、３＝重度の関節炎（著しい運動障害）のシステムに従って、関節炎のマクロ表現型徴候について前記マウスを毎週採点する工程とを含む請求項３に記載の使用。
  9. 前記組成物は、関節炎症状の発症が示される前に投与される請求項３に記載の使用。
  10. 前記マウスが３週齢のときに前記組成物が最初に投与される請求項３に記載の使用。
  11. 前記マウスが６週齢のときに前記組成物が最初に投与される請求項３に記載の使用。
  12. 前記組成物は、エタネルセプト、インフリキシマブ及びＤ２Ｅ７からなる群から選択される薬剤以上である、Ｔｇ１９７遺伝子組換えマウス関節炎試験における効果を有する請求項１から１１までのいずれかに記載の使用。
  13. 前記組成物は、治療が０から０．５の関節炎スコアをもたらすようなＴｇ１９７遺伝子組換えマウス関節炎試験における効果を有する請求項１から１２までのいずれかに記載の使用。
  14. 前記組成物は、治療が０から１．０の関節炎スコアをもたらすようなＴｇ１９７遺伝子組換えマウス関節炎試験における効果を有する請求項１から１３までのいずれかに記載の使用。
  15. 前記組成物は、治療が０から１．５の関節炎スコアをもたらすようなＴｇ１９７遺伝子組換えマウス関節炎試験における効果を有する請求項１から１４までのいずれかに記載の使用。
  16. 前記組成物は、治療が０から２．０の関節炎スコアをもたらすようなＴｇ１９７遺伝子組換えマウス関節炎試験における効果を有する請求項１から１５までのいずれかに記載の使用。
  17. 関節リウマチを治療する方法であって、当該治療を必要とする個体に対して、ヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含む治療有効量の組成物を投与することを含み、それによって関節リウマチが治療される方法。
  18. 関節リウマチを治療する方法であって、当該治療を必要とする個体に対して、ヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含む治療有効量の組成物を投与することを含み、前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、ヒトＴＮＦαのＴＮＦα受容体に対する結合を抑制し、それによって前記関節リウマチが治療される方法。
  19. 前記治療は、前記関節リウマチの進行を抑制することを含む請求項１７又は１８に記載の方法。
  20. 前記治療は、関節リウマチの発症を防止する、又は遅らせることを含む請求項１７又は１８に記載の方法。
  21. 前記組成物は、関節炎のＴｇ１９７遺伝子組換えマウスモデルのマウスに投与されると関節炎スコアの増加を防止する請求項１７又は１８に記載の方法、或いは請求項３又は４に記載の使用。
  22. 前記投与は、ＲＡの１つ又は複数の指標の統計的に有意な変化をもたらす請求項２１に記載の方法。
  23. ＲＡの前記１つ又は複数の指標は、血沈（ＥＳＲ）、リッチ関節指数及び朝のこわばりの持続時間、関節可動度、関節腫脹、１つ又は複数の関節のＸ線撮像、並びに１つ又は複数の関節の固定部の組織病理学的分析のいずれかを含む請求項２２に記載の方法。
  24. ＲＡの前記１つ又は複数の指標は、Ｔｇ１９７遺伝子組換えマウスにおける関節炎のマクロ表現型徴候の減少を含み、前記組成物はＴｇ１９７遺伝子組換えマウスに投与され、前記Ｔｇ１９７遺伝子組換えマウスは、関節炎の前記マクロ表現型徴候について採点され、関節炎の前記マクロ表現型徴候は、０＝関節炎ではない（正常な外観及び屈曲）、１＝軽度の関節炎（関節の歪み）、２＝中等度の関節炎（腫脹、関節の変形）、３＝重度の関節炎（著しい運動障害）のシステムに従って採点される請求項２２に記載の方法。
  25. ＲＡの前記１つ又は複数の指標は、Ｔｇ１９７遺伝子組換えマウスにおける関節炎のマクロ表現型徴候の減少を含み、前記組成物はＴｇ１９７遺伝子組換えマウスに投与され、前記Ｔｇ１９７遺伝子組換えマウスは、関節炎の前記マクロ表現型徴候について採点され、関節炎の前記組織病理学的徴候は、関節に実現され、０＝検出可能な病状なし、１＝滑膜の過形成及び多形核浸潤物の存在、２＝パンヌス及び繊維状組織の形成並びに限局性軟骨下骨浸食、３＝関節軟骨破壊及び骨浸食、４＝広範な関節軟骨破壊及び骨浸食のシステムを用いて採点される請求項２２に記載の方法。
  26. Ｔｇ１９７遺伝子組換えマウスに対する前記組成物の投与は、
    ａ）異型接合Ｔｇ１９７遺伝子組換えマウスに対して前記組成物を腹腔内注射により毎週投与する工程と、
    ｂ）工程ａ）のマウスの重量を毎週測定する工程と、
    ｃ）０＝関節炎ではない（正常な外観及び屈曲）、１＝軽度の関節炎（関節の歪み）、２＝中等度の関節炎（腫脹、関節の変形）、３＝重度の関節炎（著しい運動障害）のシステムに従って、関節炎のマクロ表現型徴候について前記マウスを毎週採点する工程とを含む請求項２１に記載の方法。
  27. 前記組成物は、関節炎症状の発症が示される前に投与される請求項２１に記載の方法。
  28. 前記マウスが３週齢のときに前記組成物が最初に投与される請求項２１に記載の方法。
  29. 前記マウスが６週齢のときに前記組成物が最初に投与される請求項２１に記載の方法。
  30. 前記組成物は、エタネルセプト、インフリキシマブ及びＤ２Ｅ７からなる群から選択される薬剤以上である、Ｔｇ１９７遺伝子組換えマウス関節炎試験における効果を有する請求項１から２９までのいずれかに記載の方法又は使用。
  31. 前記組成物は、治療が０から０．５の関節炎スコアをもたらすようなＴｇ１９７遺伝子組換えマウス関節炎試験における効果を有する請求項１から３０までのいずれかに記載の方法又は使用。
  32. 前記組成物は、治療が０から１．０の関節炎スコアをもたらすようなＴｇ１９７遺伝子組換えマウス関節炎試験における効果を有する請求項１から３１までのいずれかに記載の方法又は使用。
  33. 前記組成物は、治療が０から１．５の関節炎スコアをもたらすようなＴｇ１９７遺伝子組換えマウス関節炎試験における効果を有する請求項１から３２までのいずれかに記載の方法又は使用。
  34. 前記組成物は、治療が０から２．０の関節炎スコアをもたらすようなＴｇ１９７遺伝子組換えマウス関節炎試験における効果を有する請求項１から３３までのいずれかに記載の方法又は使用。
  35. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、ヒト単一ドメイン抗体ポリペプチドを含む請求項１から３４までのいずれかに記載の方法又は使用。
  36. 前記ヒト単一ドメイン抗体ポリペプチドはＴＮＦαを結合する請求項１から３５までのいずれかに記載の方法又は使用。
  37. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１００ｎＭ未満のＫｄでヒトＴＮＦαを結合する請求項１から３６までのいずれかに記載の方法又は使用。
  38. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１００ｎＭから５０ｐＭの範囲のＫｄでヒトＴＮＦαを結合する請求項１から３７までのいずれかに記載の方法又は使用。
  39. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、３０ｎＭから５０ｐＭのＫｄでヒトＴＮＦαを結合する請求項１から３８までのいずれかに記載の方法又は使用。
  40. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１０ｎＭから５０ｐＭのＫｄでヒトＴＮＦαを結合する請求項１から３９までのいずれかに記載の方法又は使用。
  41. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１ｎｍから５０ｐＭの範囲のＫｄでヒトＴＮＦαを結合する請求項１から４０までのいずれかに記載の方法又は使用。
  42. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、標準的なＬ９２９細胞試験で測定されるヒトＴＮＦαに拮抗する請求項１から４１までのいずれかに記載の方法又は使用。
  43. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、細胞表面受容体に結合するヒトＴＮＦ−αに特異的に結合する請求項１から４２までのいずれかに記載の方法又は使用。
  44. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１５分から１２時間の範囲のインビボｔα半減期を有する請求項１から４３までのいずれかに記載の方法又は使用。
  45. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１から６時間の範囲のインビボｔα半減期を有する請求項１から４４までのいずれかに記載の方法又は使用。
  46. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、２から５時間の範囲のインビボｔα半減期を有する請求項１から４５までのいずれかに記載の方法又は使用。
  47. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、３から４時間の範囲のインビボｔα半減期を有する請求項１から４６までのいずれかに記載の方法又は使用。
  48. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１２から６０時間の範囲のインビボｔβ半減期を有する請求項１から４７までのいずれかに記載の方法又は使用。
  49. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１２から４８時間の範囲のインビボｔβ半減期を有する請求項１から４８までのいずれかに記載の方法又は使用。
  50. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１２から２６時間の範囲のインビボｔβ半減期を有する請求項１から４９までのいずれかに記載の方法又は使用。
  51. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１５ｍｇ分／ｍｌから１５０ｍｇ分／ｍｌのインビボＡＵＣ半減期を有する請求項１から５０までのいずれかに記載の方法又は使用。
  52. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１５ｍｇ分／ｍｌから１００ｍｇ分／ｍｌのインビボＡＵＣ半減期を有する請求項１から５１までのいずれかに記載の方法又は使用。
  53. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１５ｍｇ分／ｍｌから７５ｍｇ分／ｍｌのインビボＡＵＣ半減期を有する請求項１から５２までのいずれかに記載の方法又は使用。
  54. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１５ｍｇ分／ｍｌから５０ｍｇ分／ｍｌのインビボＡＵＣ半減期を有する請求項１から５３までのいずれかに記載の方法又は使用。
  55. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、ＰＥＧ分子に結合される請求項１から５４までのいずれかに記載の方法又は使用。
  56. ＰＥＧ結合単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、少なくとも２４ｋＤａのハイドロダイナミックサイズを有し、全ＰＥＧサイズは２０から６０ｋＤａである請求項５５に記載の方法又は使用。
  57. ＰＥＧ結合単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、少なくとも２００ｋＤａのハイドロダイナミックサイズを有し、全ＰＥＧサイズは２０から６０ｋＤａである請求項５５に記載の方法又は使用。
  58. ＰＥＧ結合タンパク質は、平均で、１〜２０のポリエチレングリコール分子に結合する請求項５５に記載の方法又は使用。
  59. 前記抗体構築物は、ヒトＴＮＦαを結合する２つ以上の単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチドを含む請求項１から５８までのいずれかに記載の方法又は使用。
  60. 前記抗体構築物は、ヒトＴＮＦαを結合する単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチドのホモ二量体を含む請求項１から５９までのいずれかに記載の方法又は使用。
  61. 前記抗体構築物は、ヒトＴＮＦαを結合する単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチドのホモ三量体を含む請求項１から６０までのいずれかに記載の方法又は使用。
  62. 前記抗体構築物は、ヒトＴＮＦαを結合する単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチドのホモ四量体を含む請求項１から６１までのいずれかに記載の方法又は使用。
  63. 前記抗体構築物は、ＴＮＦα以外の抗原に対して特異的な抗体ポリペプチドをさらに含む請求項１から６２までのいずれかに記載の方法又は使用。
  64. ＴＮＦα以外の抗原に対して特異的な前記抗体ポリペプチドは、単一ドメイン抗体ポリペプチドを含む請求項６３に記載の方法又は使用。
  65. ＴＮＦα以外の抗原に対して特異的な前記抗体ポリペプチドによるＴＮＦα以外の前記抗原の結合は、前記抗体ポリペプチド構築物のインビボ半減期を増加させる請求項６３又は６４に記載の方法又は使用。
  66. ＴＮＦα以外の前記抗原は、血清タンパク質を含む請求項６３から６５までに記載の方法又は使用。
  67. 前記血清タンパク質は、フィブリン、α−２マクログロブリン、血清アルブミン、フィブリノゲンＡ、フィブリノゲン、血清アミロイドタンパク質Ａ、ヘプタグロビン、タンパク質、ユビキチン、子宮グロブリン及びβ−２−ミクログロブリンからなる群から選択される請求項６６に記載の方法又は使用。
  68. ＴＮＦα以外の前記抗原はＨＳＡを含む請求項６３に記載の方法又は使用。
  69. 前記治療は、少なくとも１つのさらなる治療薬の投与をさらに含む請求項１７から６８までのいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
    Figure 2013056890
    からなる群から選択される抗体ポリペプチドのＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む請求項１から６９までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  71. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
    Figure 2013056890
    からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項１から６９までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  72. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
    Figure 2013056890
    からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項１から６９までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  73. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
    Figure 2013056890
    からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９２％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項１から６９までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  74. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
    Figure 2013056890
    からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項１から６９までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  75. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
    Figure 2013056890
    からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項１から６９までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  76. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
    Figure 2013056890
    からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項１から６９までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  77. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
    Figure 2013056890
    からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項１から６９までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  78. 関節リウマチの治療、予防、進行の抑制又は発症の遅延のための医薬品を調製するための、ヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含む組成物であって、
    前記組成物は、関節炎のＴｇ１９７遺伝子組換えマウスモデルのマウスに投与されると、関節炎スコアの増加を防止し、
    前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１００ｎＭ未満のＫｄでヒトＴＮＦαを結合し、
    前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、標準的なＬ９２９細胞試験で測定されるヒトＴＮＦαを中和する組成物の使用。
  79. 関節リウマチを治療する方法であって、当該治療を必要とする個体に対して、ヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含む治療有効量の組成物を投与することを含み、
    前記組成物は、関節炎のＴｇ１９７遺伝子組換えマウスモデルのマウスに投与されると関節炎スコアの増加を防ぎ、
    前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１００ｎＭ未満のＫｄでヒトＴＮＦαを結合し、
    前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、標準的なＬ９２９細胞試験で測定されるヒトＴＮＦαを中和し、
    前記関節リウマチが治療される方法。
  80. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、
    ａ）ＩｇＧ重鎖定常領域に融合した、第１のエピトープを結合する単一ドメイン抗体ポリペプチドを含む第１の融合タンパク質の第１の複製物と、
    ｂ）前記第１の融合タンパク質の第２の複製物と、
    ｃ）軽鎖定常領域に融合した、第２のエピトープを結合する単一ドメイン抗体ポリペプチドを含む第２の融合タンパク質の第１の複製物と、
    ｄ）前記第２の融合タンパク質の第２の複製物とを含み、
    前記第１の融合タンパク質の前記第１及び前記第２の複製物は、それぞれのＩｇＧ重鎖定常領域を介して互いにジスルフィド結合され、
    前記第２の融合タンパク質の前記第１の複製物の前記軽鎖定常領域は、前記第１の融合タンパク質の前記第１の複製物のＩｇＧ重鎖定常領域にジスルフィド結合され、
    前記第２の融合タンパク質の前記第２の複製物の前記軽鎖定常領域は、前記第１の融合タンパク質の前記第２の複製物のＩｇＧ重鎖定常領域にジスルフィド結合され、
    前記ポリペプチド構築物は、前記第１及び前記第２のエピトープを結合する四価二重特異性抗原結合ポリペプチド構築物を含む請求項１から７９までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  81. 前記第１及び／又は前記第２のエピトープは、ＴＮＦ−αエピトープである請求項８０に記載の方法又は使用。
  82. ヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含み、関節炎のＴｇ１９７遺伝子組換えマウスモデルのマウスに投与されると関節炎スコアの増加を防ぎ、前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、標準的なＬ９２９細胞試験で測定されるヒトＴＮＦαを中和する組成物。
  83. ヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含み、関節炎のＴｇ１９７遺伝子組換えマウスモデルのマウスに投与されると関節炎スコアの増加を防ぎ、前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、関節リウマチの進行を抑制する組成物。
  84. ヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含み、関節炎のＴｇ１９７遺伝子組換えマウスモデルのマウスに投与されると関節炎スコアの増加を防ぎ、前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１００ｎＭ未満のＫｄでヒトＴＮＦαを結合する組成物。
  85. ヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含み、関節炎のＴｇ１９７遺伝子組換えマウスモデルのマウスに投与されると関節炎スコアの増加を防止する組成物であって、前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、標準的なＬ９２９細胞試験で測定されるヒトＴＮＦαを中和し、前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、関節リウマチの進行を抑制し、前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１００ｎＭ未満のＫｄでヒトＴＮＦαを結合する組成物。
  86. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、
    ａ）ＩｇＧ重鎖定常領域に融合した、第１のエピトープを結合する単一ドメイン抗体ポリペプチドを含む第１の融合タンパク質の第１の複製物と、
    ｂ）前記第１の融合タンパク質の第２の複製物と、
    ｃ）軽鎖定常領域に融合した、第２のエピトープを結合する単一ドメイン抗体ポリペプチドを含む第２の融合タンパク質の第１の複製物と、
    ｄ）前記第２の融合タンパク質の第２の複製物とを含み、
    前記第１の融合タンパク質の前記第１及び前記第２の複製物は、それぞれのＩｇＧ重鎖定常領域を介して互いにジスルフィド結合され、
    前記第２の融合タンパク質の前記第１の複製物の前記軽鎖定常領域は、前記第１の融合タンパク質の前記第１の複製物のＩｇＧ重鎖定常領域にジスルフィド結合され、
    前記第２の融合タンパク質の前記第２の複製物の前記軽鎖定常領域は、前記第１の融合タンパク質の前記第２の複製物のＩｇＧ重鎖定常領域にジスルフィド結合され、
    前記ポリペプチド構築物は、前記第１及び前記第２のエピトープを結合する四価二重特異性抗原結合ポリペプチド構築物を含む請求項８２から８５までのいずれか一項に記載の組成物。
  87. 前記第１及び／又は前記第２のエピトープは、ＴＮＦ−αエピトープである請求項８６に記載の組成物。
  88. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
    Figure 2013056890
    からなる群から選択される抗体ポリペプチドのＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む請求項８２から８７までのいずれか一項に記載の組成物。
  89. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
    Figure 2013056890
    からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項８２から８７までのいずれか一項に記載の組成物。
  90. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
    Figure 2013056890
    からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項８２から８７までのいずれか一項に記載の組成物。
  91. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
    Figure 2013056890
    からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９２％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項８２から８７までのいずれか一項に記載の組成物。
  92. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
    Figure 2013056890
    からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項８２から８７までのいずれか一項に記載の組成物。
  93. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
    Figure 2013056890
    からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項８２から８７までのいずれか一項に記載の組成物。
  94. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
    Figure 2013056890
    からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項８２から８７までのいずれか一項に記載の組成物。
  95. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
    Figure 2013056890
    からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項８２から８７までのいずれか一項に記載の組成物。
  96. 関節リウマチの治療、予防、進行の抑制又は発症の遅延のための医薬品を調製するための、ヒトＶＥＧＦのＶＥＧＦ受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含む組成物の使用。
  97. 関節リウマチを治療する方法であって、当該治療を必要とする個体に対して、ヒトＶＥＧＦのＶＥＧＦ受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含む治療有効量の組成物を投与することを含み、それによって前記関節リウマチが治療される方法。
  98. 前記組成物は、コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）マウスモデルのマウスに投与されると、関節炎スコアの増加を防止する請求項９６に記載の使用、又は請求項９７に記載の方法。
  99. 前記マウスに対する前記組成物の投与は、
    ａ）ＣＩＡモデルマウスに対して前記組成物を腹腔内注射により毎週投与する工程と、
    ｂ）工程ａ）のマウスの重量を毎週測定する工程と、
    ｃ）０＝関節炎ではない（正常な外観及び屈曲）、１＝軽度の関節炎（関節の歪み）、２＝中等度の関節炎（腫脹、関節の変形）、３＝重度の関節炎（著しい運動障害）のシステムに従って、関節炎のマクロ表現型徴候について前記マウスを採点する工程とを含む請求項９８に記載の方法又は使用。
  100. 前記治療は、前記関節リウマチの進行を抑制することを含む請求項９７から９９までのいずれか一項に記載の方法。
  101. 前記治療は、関節リウマチの発症を防止する、又は遅らせることを含む請求項９７から９９までのいずれか一項に記載の方法。
  102. 前記投与は、ＲＡの１つ又は複数の指標の統計的に有意な変化をもたらす請求項９７から９９までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  103. ＲＡの前記１つ又は複数の指標は、血沈（ＥＳＲ）、リッチ関節指数及び朝のこわばりの持続時間、関節可動度、関節腫脹、１つ又は複数の関節のＸ線撮像、並びに１つ又は複数の関節の固定部の組織病理学的分析のいずれかを含む請求項１０２に記載の方法又は使用。
  104. ＲＡの前記１つ又は複数の指標は、コラーゲン誘発関節炎マウスモデルのマウスにおける関節炎のマクロ表現型徴候の減少を含み、
    前記組成物は前記マウスに投与され、
    前記マウスは、関節炎の前記マクロ表現型徴候について採点され、
    関節炎の前記マクロ表現型徴候は、０＝関節炎ではない（正常な外観及び屈曲）、１＝軽度の関節炎（関節の歪み）、２＝中等度の関節炎（腫脹、関節の変形）、３＝重度の関節炎（著しい運動障害）のシステムに従って採点される請求項１０２に記載の方法又は使用。
  105. ＲＡの前記１つ又は複数の指標は、コラーゲン誘発関節炎マウスモデルのマウスにおける関節炎の組織病理学的徴候のマクロ表現型徴候の減少を含み、
    前記組成物は該マウスに投与され、
    前記マウスは、関節炎の前記組織病理学的徴候について採点され、
    関節炎の前記組織病理学的徴候は、関節に実現され、０＝検出可能な病状なし、１＝滑膜の過形成及び多形核浸潤物の存在、２＝パンヌス及び繊維状組織の形成並びに限局性軟骨下骨浸食、３＝関節軟骨破壊及び骨浸食、４＝広範な関節軟骨破壊及び骨浸食のシステムを用いて採点される請求項１０２に記載の方法又は使用。
  106. 前記二重特異性抗体構築物は、
    ａ）ＩｇＧ重鎖定常領域に融合した、第１のエピトープを結合する単一ドメイン抗体ポリペプチドを含む第１の融合タンパク質の第１の複製物と、
    ｂ）前記第１の融合タンパク質の第２の複製物と、
    ｃ）軽鎖定常領域に融合した、第２のエピトープを結合する単一ドメイン抗体ポリペプチドを含む第２の融合タンパク質の第１の複製物と、
    ｄ）前記第２の融合タンパク質の第２の複製物とを含み、
    前記第１の融合タンパク質の前記第１及び前記第２の複製物は、それぞれのＩｇＧ重鎖定常領域を介して互いにジスルフィド結合され、
    前記第２の融合タンパク質の前記第１の複製物の前記軽鎖定常領域は、前記第１の融合タンパク質の前記第１の複製物のＩｇＧ重鎖定常領域にジスルフィド結合され、
    前記第２の融合タンパク質の前記第２の複製物の前記軽鎖定常領域は、前記第１の融合タンパク質の前記第２の複製物のＩｇＧ重鎖定常領域にジスルフィド結合され、
    前記ポリペプチド構築物は、前記第１及び前記第２のエピトープを結合する四価二重特異性抗原結合ポリペプチド構築物を含む請求項１３４に記載の使用又は方法。
  107. 前記第１及び／又は前記第２のエピトープは、ＶＥＧＦエピトープである請求項１０６に記載の方法又は使用。
  108. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、ヒト単一ドメイン抗体ポリペプチドを含む請求項９６から１０７までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  109. 前記ヒト単一ドメイン抗体ポリペプチドは、ＶＥＧＦを結合する請求項１０８に記載の方法又は使用。
  110. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１００ｎＭ未満のＫｄでヒトＶＥＧＦを結合する請求項９６から１０９までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  111. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１００ｎＭから５０ｐＭの範囲のＫｄでヒトＶＥＧＦを結合する請求項９６から１０９までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  112. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、３０ｎＭから５０ｐＭのＫｄでヒトＶＥＧＦを結合する請求項９６から１０９までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  113. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１０ｎＭから５０ｐＭのＫｄでヒトＶＥＧＦを結合する請求項９６から１０９までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  114. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１ｎｍから５０ｐＭの範囲のＫｄでヒトＶＥＧＦを結合する請求項９６から１０９までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  115. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、ＶＥＧＦ受容体１試験又はＶＥＧＦ受容体２試験で測定されるヒトＶＥＧＦを中和する請求項９６から１１４までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  116. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、細胞表面受容体に結合するヒトＶＥＧＦに特異的に結合する請求項９６から１１５までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  117. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、ＰＥＧ分子に結合される請求項９６から１１６までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  118. ＰＥＧ結合単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、少なくとも２４ｋＤａのハイドロダイナミックサイズを有し、全ＰＥＧサイズは２０から６０ｋＤａである請求項１１７に記載の方法又は使用。
  119. ＰＥＧ結合単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、少なくとも２００ｋＤａのハイドロダイナミックサイズを有し、全ＰＥＧサイズは２０から６０ｋＤａである請求項１１７に記載の方法又は使用。
  120. ＰＥＧ結合単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、平均で、２つ以上のポリエチレングリコール分子に結合される請求項１１７から１１９までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  121. ＰＥＧ結合単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、平均で、２〜２０のＰＥＧ分子に結合される請求項１１７から１１９までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  122. 前記抗体構築物は、ヒトＶＥＧＦを結合する２つ以上の単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチドを含む請求項９６から１２１までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  123. 前記抗体構築物は、ヒトＶＥＧＦを結合する単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチドのホモ二量体を含む請求項９６から１２１までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  124. 前記抗体構築物は、ヒトＶＥＧＦを結合する単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチドのホモ三量体を含む請求項９６から１２１までのいずれかに記載の方法又は使用。
  125. 前記抗体構築物は、ヒトＶＥＧＦを結合する単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチドのホモ四量体を含む請求項９６から１２１までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  126. 前記構築物は、ＶＥＧＦ以外の抗原に対して特異的な抗体ポリペプチドをさらに含む請求項９６から１２５までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  127. ＶＥＧＦ以外の抗原に対して特異的な前記抗体ポリペプチドは、単一ドメイン抗体ポリペプチドを含む請求項１２６に記載の方法又は使用。
  128. ＶＥＧＦ以外の抗原に対して特異的な前記抗体ポリペプチドによるＶＥＧＦ以外の前記抗原の結合は、前記抗体ポリペプチド構築物のインビボ半減期を増加させる請求項１２６又は１２７に記載の方法又は使用。
  129. ＶＥＧＦ以外の前記抗原は、血清タンパク質を含む請求項１２６から１２８までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  130. 前記血清タンパク質は、フィブリン、α−２マクログロブリン、血清アルブミン、フィブリノゲンＡ、フィブリノゲン、血清アミロイドタンパク質Ａ、ヘプタグロビン、タンパク質、ユビキチン、子宮グロブリン及びβ−２−ミクログロブリンからなる群から選択される請求項１２９に記載の方法又は使用。
  131. ＶＥＧＦ以外の前記抗原はＨＳＡを含む請求項１２６から１２９までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  132. 前記治療は、少なくとも１つのさらなる治療薬の投与をさらに含む請求項９７から１３１までのいずれか一項に記載の方法。
  133. 前記治療薬は、エタネルセプト、インフリキシマブ及びＤ２Ｅ７からなる群から選択される請求項１３２に記載の方法。
  134. 前記治療薬は、コルチコステロイド、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）、アセチルサリチル酸、ピラゾロン、フェナム酸塩、ジフルニサル、酢酸誘導体、プロピオン酸誘導体、オキシカム、メフェナム酸、ポンステル、メクロフェナム酸塩、メクロメン、フェニルブタゾン、ブタゾリジン、ジフルニサル、ドロビド、ジクロフェナク、ボルタレン、インドメタシン、インドシン、スリンダク、クリノリル、エトドラク、ロジン、ケトロラク、トラドール、ナブメトン、レラフェン、トルメチン、トレクチン、イブプロフェン、モツリン、フェノプロフェン、ナルフォン、フルルビプロフェン、アンテ、カルプロフェン、リマジル、ケトプロフェン、オルジス、ナプロキセン、アナプロクス、ナプロシン、ピロキシカム及びフェルデンからなる群から選択される請求項１３２に記載の方法。
  135. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
    Figure 2013056890
    からなる群から選択される抗体ポリペプチドのＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む請求項１３４に記載の方法又は使用。
  136. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
    Figure 2013056890
    からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項９６から１３４までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  137. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
    Figure 2013056890
    からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項９６から１３４までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  138. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
    Figure 2013056890
    からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９２％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項９６から１３４までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  139. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
    Figure 2013056890
    からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９４％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項９６から１３４までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  140. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
    Figure 2013056890
    からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項９６から１３４までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  141. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
    Figure 2013056890
    からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項９６から１３４までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  142. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、クローン
    Figure 2013056890
    からなる群から選択される抗体ポリペプチドのアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項９６から１３４までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  143. ヒトＶＥＧＦの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含む組成物であって、前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、
    Figure 2013056890
    からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む組成物。
  144. ヒトＶＥＧＦの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含む組成物であって、前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、
    Figure 2013056890
    からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む組成物。
  145. ヒトＶＥＧＦの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含む組成物であって、前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、
    Figure 2013056890
    からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む組成物。
  146. ヒトＶＥＧＦの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含む組成物であって、前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、
    Figure 2013056890
    からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９２％の同一性を有する配列を含む組成物。
  147. ヒトＶＥＧＦの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含む組成物であって、前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、
    Figure 2013056890
    からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９４％の同一性を有する配列を含む組成物。
  148. ヒトＶＥＧＦの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含む組成物であって、前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、
    Figure 2013056890
    からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９６％の同一性を有する配列を含む組成物。
  149. ヒトＶＥＧＦの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含む組成物であって、前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、
    Figure 2013056890
    からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９８％の同一性を有する配列を含む組成物。
  150. ヒトＶＥＧＦの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含む組成物であって、前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、
    Figure 2013056890
    からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む組成物。
  151. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、
    ａ）ＩｇＧ重鎖定常領域に融合した、第１のエピトープを結合する単一ドメイン抗体ポリペプチドを含む第１の融合タンパク質の第１の複製物と、
    ｂ）前記第１の融合タンパク質の第２の複製物と、
    ｃ）軽鎖定常領域に融合した、第２のエピトープを結合する単一ドメイン抗体ポリペプチドを含む第２の融合タンパク質の第１の複製物と、
    ｄ）前記第２の融合タンパク質の第２の複製物とを含み、
    前記第１の融合タンパク質の前記第１及び前記第２の複製物は、それぞれのＩｇＧ重鎖定常領域を介して互いにジスルフィド結合され、
    前記第２の融合タンパク質の前記第１の複製物の前記軽鎖定常領域は、前記第１の融合タンパク質の前記第１の複製物のＩｇＧ重鎖定常領域にジスルフィド結合され、
    前記第２の融合タンパク質の前記第２の複製物の前記軽鎖定常領域は、前記第１の融合タンパク質の前記第２の複製物のＩｇＧ重鎖定常領域にジスルフィド結合され、
    前記ポリペプチド構築物は、前記第１及び前記第２のエピトープを結合する四価二重特異性抗原結合ポリペプチド構築物を含む請求項１４３から１５０までのいずれか一項に記載の組成物。
  152. 前記第１及び／又は前記第２のエピトープは、ＶＥＧＦエピトープである請求項１５１に記載の組成物。
  153. 関節リウマチの治療、予防、進行の防止又は発症の遅延のための医薬品を調製するための、ヒトＴＮＦαの活性に拮抗し、ヒトＶＥＧＦの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含む組成物の使用。
  154. 関節リウマチの治療、予防、進行の防止又は発症の遅延のための医薬品を調製するための、ヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗し、ヒトＶＥＧＦの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含む組成物の使用。
  155. 関節リウマチを治療する方法であって、その治療を必要とする個体に対して、ヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗し、ヒトＶＥＧＦの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含む治療有効量の組成物を投与することを含み、それによって前記関節リウマチが治療される方法。
  156. 前記ポリペプチド構築物は、二重特異性抗体構築物である請求項１５３又は１５４に記載の使用、或いは請求項１５５に記載の方法。
  157. 前記二重特異性抗体構築物は、
    ａ）ＩｇＧ重鎖定常領域に融合した、第１のエピトープを結合する単一ドメイン抗体ポリペプチドを含む第１の融合タンパク質の第１の複製物と、
    ｂ）前記第１の融合タンパク質の第２の複製物と、
    ｃ）軽鎖定常領域に融合した、第２のエピトープを結合する単一ドメイン抗体ポリペプチドを含む第２の融合タンパク質の第１の複製物と、
    ｄ）前記第２の融合タンパク質の第２の複製物とを含み、
    前記第１の融合タンパク質の前記第１及び前記第２の複製物は、それぞれのＩｇＧ重鎖定常領域を介して互いにジスルフィド結合され、
    前記第２の融合タンパク質の前記第１の複製物の前記軽鎖定常領域は、前記第１の融合タンパク質の前記第１の複製物のＩｇＧ重鎖定常領域にジスルフィド結合され、
    前記第２の融合タンパク質の前記第２の複製物の前記軽鎖定常領域は、前記第１の融合タンパク質の前記第２の複製物のＩｇＧ重鎖定常領域にジスルフィド結合され、
    前記ポリペプチド構築物は、前記第１及び前記第２のエピトープを結合する四価二重特異性抗原結合ポリペプチド構築物を含む請求項１３４に記載の使用又は方法。
  158. 前記組成物は、関節炎のＴｇ１９７遺伝子組換えマウスモデルのマウスに投与されると、関節炎スコアの増加を防止する請求項１５３から１５７までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  159. Ｔｇ１９７遺伝子組換えマウスに対する前記組成物の投与は、
    ａ）異型接合Ｔｇ１９７遺伝子組換えマウスに対して前記組成物を腹腔内注射により毎週投与する工程と、
    ｂ）工程ａ）のマウスの重量を毎週測定する工程と、
    ｃ）０＝関節炎ではない（正常な外観及び屈曲）、１＝軽度の関節炎（関節の歪み）、２＝中等度の関節炎（腫脹、関節の変形）、３＝重度の関節炎（著しい運動障害）のシステムに従って、関節炎のマクロ表現型徴候について前記マウスを毎週採点する工程とを含む請求項１５８に記載の方法又は使用。
  160. 前記組成物は、エタネルセプト、インフリキシマブ及びＤ２Ｅ７からなる群から選択される薬剤以上である、Ｔｇ１９７遺伝子組換えマウス関節炎試験における効果を有する請求項１５８に記載の方法又は使用。
  161. 前記組成物は、コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）マウスモデルのマウスに投与されると、関節炎スコアの増加を防止する請求項１５３から１５７までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  162. 前記マウスに対する前記組成物の投与は、
    ａ）ＣＩＡモデルマウスに対して前記組成物を腹腔内注射により毎週投与する工程と、
    ｂ）工程ａ）のマウスの重量を毎週測定する工程と、
    ｃ）０＝関節炎ではない（正常な外観及び屈曲）、１＝軽度の関節炎（関節の歪み）、２＝中等度の関節炎（腫脹、関節の変形）、３＝重度の関節炎（著しい運動障害）のシステムに従って、関節炎のマクロ表現型徴候について前記マウスを採点する工程とを含む請求項１６１に記載の方法又は使用。
  163. 前記投与は、ＲＡの１つ又は複数の指標の統計的に有意な変化をもたらす請求項１５８に記載の方法又は使用。
  164. 前記治療は、前記関節リウマチの進行を抑制することを含む請求項１３１又は１３４から１３７までのいずれか一項に記載の方法。
  165. 前記治療は、関節リウマチの発症を防止する、又は遅らせることを含む請求項１５５から１６３までのいずれか一項に記載の方法。
  166. ＲＡの前記１つ又は複数の指標は、血沈（ＥＳＲ）、リッチ関節指数及び朝のこわばりの持続時間、関節可動度、関節腫脹、１つ又は複数の関節のＸ線撮像、並びに１つ又は複数の関節の固定部の組織病理学的分析のいずれかを含む請求項１６３に記載の方法又は使用。
  167. ＲＡの前記１つ又は複数の指標は、Ｔｇ１９７遺伝子組換えマウスにおける関節炎のマクロ表現型徴候の減少を含み、
    前記組成物はＴｇ１９７遺伝子組換えマウスに投与され、
    前記Ｔｇ１９７遺伝子組換えマウスは、関節炎の前記マクロ表現型徴候について採点され、
    関節炎の前記マクロ表現型徴候は、０＝関節炎ではない（正常な外観及び屈曲）、１＝軽度の関節炎（関節の歪み）、２＝中等度の関節炎（腫脹、関節の変形）、３＝重度の関節炎（著しい運動障害）のシステムに従って採点される請求項１６３に記載の方法又は使用。
  168. ＲＡの前記１つ又は複数の指標は、Ｔｇ１９７遺伝子組換えマウスにおける関節炎のマクロ表現型徴候の減少を含み、
    前記組成物はＴｇ１９７遺伝子組換えマウスに投与され、
    前記Ｔｇ１９７遺伝子組換えマウスは、関節炎の前記マクロ表現型徴候について採点され、
    関節炎の前記組織病理学的徴候は、関節に実現され、０＝検出可能な病状なし、１＝滑膜の過形成及び多形核浸潤物の存在、２＝パンヌス及び繊維状組織の形成並びに限局性軟骨下骨浸食、３＝関節軟骨破壊及び骨浸食、４＝広範な関節軟骨破壊及び骨浸食のシステムを用いて採点される請求項１４０に記載の方法又は使用。
  169. 前記投与は、ＲＡの１つ又は複数の指標の統計的に有意な変化をもたらす請求項１６１に記載の方法又は使用。
  170. ＲＡの前記１つ又は複数の指標は、コラーゲン誘発関節炎マウスモデルのマウスにおける関節炎のマクロ表現型徴候の減少を含み、
    前記組成物は前記マウスに投与され、
    前記マウスは、関節炎の前記マクロ表現型徴候について採点され、
    関節炎の前記マクロ表現型徴候は、０＝関節炎ではない（正常な外観及び屈曲）、１＝軽度の関節炎（関節の歪み）、２＝中等度の関節炎（腫脹、関節の変形）、３＝重度の関節炎（著しい運動障害）のシステムに従って採点される請求項１６９に記載の方法又は使用。
  171. ＲＡの前記１つ又は複数の指標は、コラーゲン誘発関節炎マウスモデルのマウスにおける関節炎の組織病理学的徴候のマクロ表現型徴候の減少を含み、
    前記組成物は該マウスに投与され、
    前記マウスは、関節炎の前記組織病理学的徴候について採点され、
    関節炎の前記組織病理学的徴候は、関節に実現され、０＝検出可能な病状なし、１＝滑膜の過形成及び多形核浸潤物の存在、２＝パンヌス及び繊維状組織の形成並びに限局性軟骨下骨浸食、３＝関節軟骨破壊及び骨浸食、４＝広範な関節軟骨破壊及び骨浸食のシステムを用いて採点される請求項１６９に記載の方法又は使用。
  172. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、ヒト単一ドメイン抗体ポリペプチドを含む請求項１５３から１７１までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  173. 前記ヒト単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、ＴＮＦα及びＶＥＧＦを結合する請求項１７２に記載の方法又は使用。
  174. ヒトＶＥＧＦの活性に拮抗する前記単一ドメイン抗体ポリペプチド成分は、ＶＥＧＦ受容体１試験又はＶＥＧＦ受容体２試験で測定されるヒトＶＥＧＦを中和する請求項１７２に記載の方法又は使用。
  175. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、標準的なＬ９２９細胞試験で測定されるヒトＴＮＦαを中和する請求項１５３から１７４までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  176. 前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、ＰＥＧ分子に結合される請求項１５３から１７５までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  177. ＰＥＧ結合単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、少なくとも２４ｋＤａのハイドロダイナミックサイズを有し、全ＰＥＧサイズは２０から６０ｋＤａである請求項１７６に記載の方法又は使用。
  178. ＰＥＧ結合単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、少なくとも２００ｋＤａのハイドロダイナミックサイズを有し、全ＰＥＧサイズは２０から６０ｋＤａである請求項１７６に記載の方法又は使用。
  179. 前記抗体ポリペプチド構築物は、平均で、２つ以上のポリエチレングリコール分子に結合される請求項１７６から１７８までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  180. 前記抗体ポリペプチド構築物は、平均で、２〜２０のＰＥＧ分子に結合される請求項１７６から１７８までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  181. 前記抗体構築物は、ヒトＴＮＦαを結合する２つ以上の単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチド、及び／又はヒトＶＥＧＦを結合する２つ以上の単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチド請求項１５３から１８０までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  182. 前記抗体構築物は、ヒトＴＮＦαを結合する単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチドのホモ二量体、及び／又はヒトＶＥＧＦを結合する単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチドのホモ二量体を含む請求項１５３から１８０までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  183. 前記抗体構築物は、ヒトＴＮＦαを結合する単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチドのホモ三量体、及び／又はヒトＶＥＧＦを結合する単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチドのホモ三量体を含む請求項１５３から１８０までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  184. 前記抗体構築物は、ヒトＴＮＦαを結合する単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチドのホモ四量体、及び／又はヒトＶＥＧＦを結合する単一免疫グロブリン可変領域ポリペプチドのホモ四量体を含む請求項１５３から１８０までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  185. 前記構築物は、ＴＮＦα又はＶＥＧＦ以外の抗原に対して特異的な抗体ポリペプチドをさらに含む請求項１５３から１８０までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  186. ＴＮＦα又はＶＥＧＦ以外の抗原に対して特異的な前記抗体ポリペプチドは、単一ドメイン抗体ポリペプチドを含む請求項１８５に記載の方法又は使用。
  187. ＴＮＦα又はＶＥＧＦ以外の抗原に対して特異的な前記抗体ポリペプチドによるＴＮＦα又はＶＥＧＦ以外の前記抗原の結合は、前記抗体ポリペプチド構築物のインビボ半減期を増加させる請求項１８５又は１８６に記載の方法又は使用。
  188. ＴＮＦα又はＶＥＧＦ以外の前記抗原は、血清タンパク質を含む請求項１８５から１８７までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  189. 前記血清タンパク質は、フィブリン、α−２マクログロブリン、血清アルブミン、フィブリノゲンＡ、フィブリノゲン、血清アミロイドタンパク質Ａ、ヘプタグロビン、タンパク質、ユビキチン、子宮グロブリン及びβ−２−ミクログロブリンからなる群から選択される請求項１８８に記載の方法又は使用。
  190. ＴＮＦα以外の前記抗原はＨＳＡを含む請求項１８５から１８９までのいずれか一項に記載の方法又は使用。
  191. 前記治療は、少なくとも１つのさらなる治療薬の投与をさらに含む請求項１５５から１９０までのいずれか一項に記載の方法。
  192. 前記さらなる治療薬は、コルチコステロイド、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）、アセチルサリチル酸、ピラゾロン、フェナム酸塩、ジフルニサル、酢酸誘導体、プロピオン酸誘導体、オキシカム、メフェナム酸、ポンステル、メクロフェナム酸塩、メクロメン、フェニルブタゾン、ブタゾリジン、ジフルニサル、ドロビド、ジクロフェナク、ボルタレン、インドメタシン、インドシン、スリンダク、クリノリル、エトドラク、ロジン、ケトロラク、トラドール、ナブメトン、レラフェン、トルメチン、トレクチン、イブプロフェン、モツリン、フェノプロフェン、ナルフォン、フルルビプロフェン、アンテ、カルプロフェン、リマジル、ケトプロフェン、オルジス、ナプロキセン、アナプロクス、ナプロシン、ピロキシカム及びフェルデンからなる群から選択される請求項１９１に記載の方法。
  193. ＴＮＦ−αを結合する第１の抗体単一領域ポリペプチドと、ＶＥＧＦを結合する第２の抗体単一領域ポリペプチドとを含む二重特異性抗原結合ポリペプチド。
  194. 前記構築物は、
    ａ）ＩｇＧ重鎖定常領域に融合した、第１のエピトープを結合する単一ドメイン抗体ポリペプチドを含む第１の融合タンパク質の第１の複製物と、
    ｂ）前記第１の融合タンパク質の第２の複製物と、
    ｃ）軽鎖定常領域に融合した、第２のエピトープを結合する単一ドメイン抗体ポリペプチドを含む第２の融合タンパク質の第１の複製物と、
    ｄ）前記第２の融合タンパク質の第２の複製物とを含み、
    前記第１の融合タンパク質の前記第１及び前記第２の複製物は、それぞれのＩｇＧ重鎖定常領域を介して互いにジスルフィド結合され、
    前記第２の融合タンパク質の前記第１の複製物の前記軽鎖定常領域は、前記第１の融合タンパク質の前記第１の複製物のＩｇＧ重鎖定常領域にジスルフィド結合され、
    前記第２の融合タンパク質の前記第２の複製物の前記軽鎖定常領域は、前記第１の融合タンパク質の前記第２の複製物のＩｇＧ重鎖定常領域にジスルフィド結合され、
    前記ポリペプチド構築物は、前記第１及び前記第２のエピトープを結合する四価二重特異性抗原結合ポリペプチド構築物を含む請求項１９３に記載の二重特異性抗原結合ポリペプチド。
  195. 前記第１のエピトープはＴＮＦ−αエピトープであり、前記第２のエピトープはＶＥＧＦエピトープである請求項１６５に記載の二重特異性抗原結合ポリペプチド。
  196. 前記第１のエピトープはＶＥＧＦエピトープであり、前記第２のエピトープはＴＮＦ−αエピトープである請求項１６５に記載の二重特異性抗原結合ポリペプチド。
  197. ヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗し、ヒトＶＥＧＦの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含み、関節炎のＴｇ１９７遺伝子組換えマウスモデルのマウスに投与されると関節炎スコアの増加を防止する組成物であって、前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、関節リウマチの進行を抑制する組成物。
  198. ヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗し、ヒトＶＥＧＦの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含む組成物であって、前記組成物は、関節炎のＴｇ１９７遺伝子組換えマウスモデルのマウスに投与されると、関節炎スコアの増加を防止し、前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１００ｎＭ未満のＫｄでヒトＴＮＦαを結合し、前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、関節リウマチの進行を抑制する組成物。
  199. ヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗し、ヒトＶＥＧＦの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含み、関節炎のＴｇ１９７遺伝子組換えマウスモデルのマウスに投与されると関節炎スコアの増加を防止する組成物であって、前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、標準的なＬ９２９細胞試験で測定されるヒトＴＮＦαを中和し、前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、１００ｎＭ未満のＫｄでヒトＴＮＦαを結合し、前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、関節リウマチの進行を抑制する組成物。
  200. ヒトＴＮＦαの受容体に対する結合に拮抗し、ヒトＶＥＧＦの受容体に対する結合に拮抗する単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物を含み、関節炎のコラーゲン誘発関節炎モデルのマウスに投与されると関節炎スコアの増加を防止する組成物であって、前記単一ドメイン抗体ポリペプチド構築物は、関節リウマチの進行を抑制する組成物。
  201. 前記組成物は、少なくとも１つのさらなる治療薬とともに投与される請求項１９３から２００までのいずれか一項に記載の組成物。
  202. 前記さらなる治療薬は、コルチコステロイド、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）、アセチルサリチル酸、ピラゾロン、フェナム酸塩、ジフルニサル、酢酸誘導体、プロピオン酸誘導体、オキシカム、メフェナム酸、ポンステル、メクロフェナム酸塩、メクロメン、フェニルブタゾン、ブタゾリジン、ジフルニサル、ドロビド、ジクロフェナク、ボルタレン、インドメタシン、インドシン、スリンダク、クリノリル、エトドラク、ロジン、ケトロラク、トラドール、ナブメトン、レラフェン、トルメチン、トレクチン、イブプロフェン、モツリン、フェノプロフェン、ナルフォン、フルルビプロフェン、アンテ、カルプロフェン、リマジル、ケトプロフェン、オルジス、ナプロキセン、アナプロクス、ナプロシン、ピロキシカム及びフェルデンからなる群から選択される請求項２０１に記載の組成物。
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