RS52080B - Farmaceutski aktivna supstanca preparata i lekova koji su u stanju da stvaraju trombin i/ili da sadrže trombin - Google Patents

Abstract

Farmaceutski aktivna supstanca za dobijanje lekova koja ima sposobnostgenerisanja trombina ili sadrži trombin, naznačena time, što sadrži:(A) protrombin dobijen iz plazme ili genetskim inžinjeringom (faktor kaogulacije II)(B) faktore koagulacije V, VIII, IX, X dobijene iz plazme ili genetskim inžinjeringom koji mogu biti, u najmanju ruku, delimično prisutni u aktivisanom stanju, i faktor koagulacije Xla dobijen iz plazme ili genetskim inžinjeringom(C) fosfolipide aktivne u koagulaciji koji ne sadrže prione sposobne da izazovu infekciju, pri čemu su fosfolipidi u datom slučaju sadržani u lipozomima.Prijava sadrži još 13 patentnih zahteva.

Description

Opjs

Pronalazak se odnosi na pripremu farmaceutski aktivnih supstanci koji sadrže trombin ili imaju sposobnost generisanja trombina i lekova proizvedenih iz ovih aktivnih supstanci.

Uvod

Ukoliko dođe do povrede krvnih sudova, dolazi do izlaska krvi iz vaskularnog prostora i njenog zgrušavanja. Povređeni krvni sudovi bivaju zatvoreni zgrušanom krvlju, i na taj način organizam biva zaštićen od velikog gubitka krvi. Zgrušavanje krvi je prouzrokovano enzimom trombinom koji se stvara iz svog proenzima protrombina, koji prevodi fibrinogen, sastavni deo krvne plazme, u nerastvorni fibrin. Krv koja ističe iz krvnog suda se zgrušava unutar nekoliko minuta, pri čemu tek oko šestine fibrinogena koji se nalazi u plazmi biva prevedeno u fibrin. U zgrušanoj krvi koja još uvek sadrži još dosta fibrinogena dolazi do daljeg stvaranja trombina, tako da konačno dolazi do kompletnog prevođenja fibrinogena u fibrin. Nastavak stvaranja trombina i zgrušavanja krvi zahteva duže vreme i može biti kompletno završeno tek nakon nekoliko sati.

Pri prevođenju fibrina u fibrinogen trombin deluje tako što prvo iseca, odnosno, delimično iseca fibrinopeptide A i B sa oba kraja molekula fibrina, pri čemu isprva nastaju, još uvek rastvorljivi, fibrinski monomeri. Ovi monomeri zatim bočno međusobno agregiraju, i na taj način grade fibrinsku mrežu. Fibrinska mreža nastala u zgrušanoj krvi lepi se za povređeno tkivo, odnosno korito rane, i dovodi do zaustavljanja oticanja krvi i zatvaranja rane.

Trombin prouzrokuje i prevodjenje faktora koagulacije XIII, koji je proenzim faktora koagulacije XIIla u enzim iz grupe transglutaminaza. Ova transglutaminaza dovodi do umrežavanja proteina kao što su fibrin, fibrin monomer, fibrinogen i drugi proteini koji se nalaze u krvnoj plazmi, stvaranjem kovalentnih veza. Od posebno velikog značaja za stabilnost nastale fibrinske mreže je poprečno umrežavanje fibrina (Siebenlist et al)

Trombin takođe dovodi do stvaranja karboksi peptidaze (TAFla) iz infibitora fibrinolize aktivisanog trombinom (TAFI), koja odseca sa fibrina karboksi terminalne lizinske rezidue, i na taj način, tokom stvaranja kompleksa, aktivator tkivnog plazminogena zajedno sa plazminogenom i fibrinom, povezuje ove molekule, što je neophodno za prevođenje plazminogena u plazmin (Booth).

In vitrodolazi do stvaranja trombina u krvi ili krvnoj plazmi i time se omogućava zgrušavanje uz pomoć tkivnih ekstrakata. Takvi ekstrakti se najbolje dobijaju iz moždanog tkiva uz pomoć vodenih medijuma ili takođe pomoću organskih rastvarača (Moravvitz).

Aktivna supstanca koju je moguće ekstrahovati pogodnim puferovanim rastvorom i koja se naziva Tromboplastin, sastoji se od jednog apoproteina, tkivnog faktora i lipida koji imaju aktivnu ulogu u zgrušavanju kn/i. Kada se dodaju krvi ili plazmi, tek neznatne količine tromboplastina dovode do njihovog brzog zgrušavanja.

Aktivni sastojak koji se dobija ekstrakcijom organskim rastvaračima iz mozga, a koji učestvuje u zgrušavanju, i sastoji se uglavnom od lipida aktivnih u zgrušavanju, naziva se parcijalni tromboplastin. Prilikom njegovog dodavanja krvi ili krvnoj plazmi dolazi do brzog zgrušavanja samo ukoliko se dodaju i aktivirajuće supstance kao što su, na primer, kaolin ili staklo u prahu.

Na taj način otpočinje kaskadna aktivacija enzima koja se kasnije završava nastajanjem enzima trombina koji započinje zgrušavanje krvi (Davie et al.; MacFarlane)

Kaskada događaja u zgrušavanju krvi koje je započeto tromboplastinom se nazivaspoljašnjiput zgrušavanja dok se ono zgrušavanje koje je započeto parcijalnim tromboplastinom nazivaunutrašnjiput. Oba ova puta imaju zajedničko to da, iako na različit način, dolazi do pretvaranja faktora koagulacije X u Xa. Po načinu na koji dolazi do aktivacije faktora X, razlikuju se prvi deo zgrušavanja krviunutrašnjimtenaznim putem, ispoljašnjimputem. U daljem toku, u enzimskom kompleksu protrombinazi koja nastaje kasnije, faktor Xa prevodi protrombin u trombin. Dalji tok događaja naziva sezajedničkiput zgrušavanja krvi. Enzimski sistem koji dovodi do stvaranja faktora koagulacije Xa uz pomoć tromboplastina naziva sespoljašnjitenazni kompleks, nasuprot onom enzimskom kompleksu u kojem ulogu ima parcijalni tromboplastin i koji se nazivaunutrašnji\ enazri\kompleks.

Preovlađujuće shvatanje je da do prekida krvavljenja dovodi tkivni faktor, zajedno sa faktorom koagulacije Vila, koji nakon povrede stupa u sadejstvo sa trombocitima (Rapaport et al). Tkivnog faktora ima u skoro svim tkivima u veoma različitim količinama, zajedno sa lipidima koji aktiviraju zgrušavanje, i te dve supstance, kada dođu u dodir sa krvlju, činespoljašnjikompleks tenaze jer su u krvi stalno prisutne male količine aktiviranog faktora koagulacije VII (Drake et al.). Spoljašnji kompleks tenaze prevodi faktor koagulacije X u Xa kao i faktor koagulacije IX u IXa koji dalje prevodi faktor X u Xa. Aktivacija faktora X i u daljem sledu događaja formiranja trombina veoma se brzo zaustavlja dejstvom inhibitora tkivnog faktora (TFPI). Trenutno nagrađeni spoljašnji kompleks tenaze, kao i faktor koagulacije Xia, dovode, nezavisno jedan od drugoga, do aktivacije unutrašnjeg kompleksa tenaze, koji je po sposobnosti aktivacije faktora koagulacije X oko pedeset puta aktivniji od spoljašnjeg komplaksa tenaze.Unutrašnjikompleks tenaze se sastoji iz aktiviranih faktora koagulacije IXa, Vllla i fosfolipida koji aktiviraju zgrušavanje i ne biva inhibisan pod dejstvom TFPI (von dem Borne et al). Enzim, faktor koagulacije IXa, koji prevodi faktor koagulacije X u Xa je snažniji po svom dejstvu u unutrašnjem kompleksu tenaze oko 100 000 do 1.000 000 puta. Ovo pojačavanje sledi zbog prisustva kofaktora Vllla, koji sam po sebi nije enzim, i određenih fosfolipida pri optimalnoj koncentraciji Ca jona.

Unutrašnji kompleks tenaze veoma brzo prevodi faktor koagulacije X u Xa koji onda sa kofaktorom Va i fosfolipidima aktivnim u koagulaciji aktiviraju protrombin što

dovodi do veoma brzog stvaranja velikih količina trombina (Mann et al).

Pojedinačni faktori koagulacije i trombociti - komponente koje su odgovorne za zgrušavanje krvi - su normalno raspoloživi u velikom višku. Tek kod smanjenja neke od ovih komponenata od oko 90 i više procenata može se zapaziti povećana sklonost ka krvavljenju. Do krvavljenja koje ugrožava život dolazi tek kada je deficijencija takva da se neki od faktora zgrušavanja, na primer trombociti, nalaze u količini koja iznosi nekoliko procenata njihove normalne vrednosti. Centralni značaj tkivnog faktora za započinjanje zgrušavanja i njegovog daljeg širenja u svim organima je nesumnjivo, ali u tkivima sa niskim sadržajem tkivnog faktora dolazi do velikih smetnji u zgrušavanju upravo onda kada je patološki snižen neki od faktoraunutrašnjegkompleksa tenaze ili kompleksa protrombinaze. Najvažniji primer za ovo su pacijenti koji pate od hemofilije A ili hemofilije B. Krv ovih pacijenata se u većini slučajava još uvek zgrušava, ali se zbog nedovoljnog ili neadekvatnog stvaranjaunutrašnjegkompleksa tenaze trombin stvara u nedovoljnim količinama, tako da ne dolazi do dovoljne hemostaze.

Trombin, uglavnom goveđeg porekla, upotrebljava se u lekovima za zaustavljanje krvavljenja nakon površinskih povreda, i ne primenjuje se parenteralno. Njegovo hemostiptično dejstvo može da bude značajno popravljeno kroz kombinovanu primenu sa lekovima koji sadrže fibrinogen (Grey; Young et al). Fibrinogen i trombin se u skladu sa njihovom vrsnom specifičnošću sada pretežno dobijaju iz alogenog materijala. Kroz kombinovanu primenu trombina sa lekovima koji sadrže fibrinogen će se pokušati upotpunjavanje odnosno poboljšavanje fiziološkog zgrušnjavanja krvi i hemostaze koja proizilazi iz toga. To bi omogućilo postizanje hemostaze i kod pacijenata sa teškim poremećajima koagulacije{Matras et al).

Pri kombinovanoj upotrebi koncentrata fibrinogena u kojima je sadržaj fibrinogena 10 do 20 puta veći od onoga koji se nalazi u krvi, i velikih količina trombina (100-1000J/ml) postići će se da se vreme potrebno za zgrušavanje u takvoj fibrinogen-trombin smeši skrati do intervala koji se meri sekundama i time postigne skraćenje za 10 do 100 puta u poređenju sa fiziološkim vremenom krvavljenja. Tako bi se omogućilo, pri optimalnoj primeni ovakvih smeša fibrinogena i trombina, praktično trenutno zaustavljanje krvavljenja, osim ako nije u pitanju povreda nekog većeg, naročito arterijskog krvnog suda (Spaengler).

Fibrinogen koji se pod dejstvom trombina prevodi u fibrin se, kao i zgrušana krv, lepi za korito rane, gde očigledno pod dejstvom transglutaminaza aktiviranih trombinom, dolazi do stvaranja kovalentnih veza između povređenog tkiva i novostvorenog fibrina. Ova snažna adhezija stvorenog fibrina za tkivo se takođe može koristiti za lepljenje tkiva koja ne krvare, jer fibrin u većini slučajeva ne smeta zaceljivanju zalepljenih tkiva i biva uglavnom razgrađen unutar nekoliko dana do nedelja (Matras et al.).

Nasuprot potrebi najbržeg mogućeg početka zgrušavanja kod zaustavljanja krvavljenja pomoću smeše fibrinogena i trombina, kod lepljenja delova tkiva i stvaranja okluzija poželjan je odložen početak zgrušavanja. To daje dovoljno vremena da se delovi tkiva koji se lepe bolje prilagode a slično prilagođavanje je nepohodno i kod okludiranja. Do sada je odlaganje početka zgrušavanja postizano smanjivanjem koncentracije trombina na oko 1% količine koja se uspešno koristi za zaustavljanje krvavljenja. Međutim primena i visokih i niskih koncentracija trombina nosi sa sobom različite nedostatke.

Veoma viskozni rastvori fibrinogena u kojima je koncentracija fibrinogena između 5 i 10% mogu biti zgrušani trombinom unutar nekoliko sekundi kada je trombin prisutan u količini koja iznosi između 100 i 1000 jedinica. Ovo kratko vreme zgrušavanja je neophodno da bi, nakon primene jednog takvog preparata na mestu koje krvari, zgrušavanje nastupilo brzo i dovelo do zaustavljanja krvavljenja. Mana ovakve procedure je to što se rastvor fibrina i rastvor trombina loše mešaju i zbog visokog viskoziteta smeše do kopmletnog mešanja ne može doći za kratko vreme. To dovodi

do nehomogenog zgrušavanja i usled toga, slabijih biomehaničkih osobina.

S druge strane, ukoliko se primena smeše fibrina i trombina ne koristi za zaustavljanje krvavljenja, nego služi za lepljenje delova tkiva, najčešće je neophodno da nastupanje zgrušavanja smeše fibrinogena i trombina bude odloženo, da bi delovi tkiva koje se lepi ili okludira mogli optimalno da se prilagode pre nego što dođe do zgrušavanja. To se sada pokušava redukovanjem količine trombina na deseti do stoti deo količine koja se koristi u hemostazi, doduše sa tim nedostatkom da ne dolazi do potpunog prevođenja raspoloživog fibrinogena u fibrin kao ni faktora XIII u Xllla. Takođe, ovakav postupak ne može da dovede do optimalnog formiranja fibrinskog ugruška jer je niska koncentracija trombina nedovoljna da dovede do prevođenja TaFI u TAFla.

Dalji problem predstavlja korišćenje goveđih sirovina u proizvodnji lekova koji sadrže trombin. Zbog činjenice da se prilikom korišćenja goveđih organa ne može sa sigurnošću isključiti prenošenje priona, danas je upotreba goveđeg trombina jako smanjena.

Goveđi trombin, pored toga, ima i taj nedostatak da je za druge vrste antigen i da može da prouzrokuje alergijske i anafilaktičke reakcije. Ovo se moglo opaziti i kod pacijenata sa poremećajima koagulacije koji su tretirani goveđim trombinom, i kod kojih je trombin izazivao stvaranje antitela koja su unakrsno reagovala sa humanim faktorima koagulacije i na taj način mogla da dovedu do usporavanja zgrušavanja krvi.

U proizvodnji trombina iz protrombina često je za aktivaciju trombina korišćen tromboplastin koji je dobijan iz životinjskih sirovina, najčešće iz goveđeg mozga, usled dobrog prinosa. Zbog postojanja mogućnosti prenosa priona preko tromboplastina dobijenog iz životinjskih sirovina, on se u procesu proizvodnje trombina naširoko isključuje iz upotrebe jer donosi lošije prihode prilikom prodaje. Prema tome, ovaj pronalazak ima za zadatak da učini dostupnim farmaceutski aktivnu supstancu koja ima sposobnost generisanja trombina i koja ne sadrži viruse sposobne da izazovu infekciju i koju je

1. moguće formulisati kao lek koji će imati sposobnost generisanja trombina i moći da se pomeša sa lekom koji sadrži fibrinogen tako da se dobije kompletna i homogena smeša ovih komponenti, ali da pri tome ne dođe do kvarenja prednosti, ovakve, kompletne smeše usled prebrzog zgrušavanja. Pre nego što započne zgrušavanje mora da se obezbedi ne samo potpuno mešanje, već mora da bude omogućeno i prilagođavanje tkiva koje treba lepiti ili okludirati. Stvaranje trombina mora nakon započinjanja zgrušavanja biti nastavljeno dalje, kako bi sav postojeći fibrinogen, faktor XIII, i TAFI u ugrušku bili prevedeni u fibrin, faktor XIIIs i TAFla i na taj način stvorili

dugotrajan pokrov rane sačinjen od fibrina i da u njemu

2. sadržani protrombin po mogućstvu pređe u trombin u potpunosti i da ovaj nakon daljeg prečišćavanja može biti dalje prerađen u lek koji sadrži trombin. Ovaj lek bi se mogao upotrebljavati kao takav ili zajedno sa drugim lekovima koji sadrže fibrinogen.

Lek koji bi se proizveo iz farmaceutski aktivne supstance koja može da generiše trombin trebalo bi nakon primene kod određene vrste da sadrži samo alogeni materijal za tu vrstu, a takođe je potrebno da se prilikom spravljanja koriste samo vrsno specifični proteini. Sve sirovine koje bi se upotrebljavale, kao i pomoćni materijal, moraju da budu takve da isključuju mogućnost prenosa priona. Stvaranje trombina iz protrombinain vivoiin vitrotreba da bude potpuno koliko je god to moguće, tako da bi samo protrombin koji se nalazi na raspolaganju u ugrušku bio upotrebljavan za dalje stvaranje trombina u već zgrušanom fibrinogenu.

Farmaceutski aktivna supstanca, shodno ovom pronalasku, služi za proizvodnju leka koji ima sposobnost stvaranja trombina ili sadrži trombin i koji je naznačen time da sadrži: (A) protrombin dobijen iz plazme ili genetskim inženjeringom (faktor koagulacije II). (B) faktore koagulacije V, VIII, IX i X dobijene iz plazme ili genetskim inžinjeringom koji mogu biti, u najmanju ruku delimično, prisutni u aktivisanom

stanju i faktor koagulacije Xla dobijen iz plazme ili genetskim inžinjeringom

i

(C) fosfolipide aktivne u koagulaciji koji ne sadrže prione sposobne da izazovu infekciju i koji su u datom slučaju sadržani u lipozomima.

Farmaceutski aktivna supstanca shodno ovom pronalasku, sadrži faktor koagulacije VII dobijen iz plazme ili genetskim inžinjeringom ili smešu faktora koagulacije VII i Vila dobijene iz plazme ili genetskim inžinjeringom. Pored toga, sadrži i izdvojeni tkivni faktor, proizveden genetskim inžinjeringom kao takav, ili u relipidiranom obliku.

Farmaceutski aktivna supstanca shodno ovom pronalasku, takođe može da se sastoji iz dve ili više frakcija plazme i fosfolipida aktivnih u koagulaciji, pri čemu jedna frakcija plazme može sadržati jedan ili više faktora koagulacije, odnosno aktiviranih faktora koagulacije komponenti (A) i (B). Celokupna smeša frakcija plazme, međutim, mora da sadrži sve faktore koagulacije, odnosno aktivirane faktore koagulacije sadržane u komponentama (A) i (B), pri čemu bi prvenstveno bio dodavan još i tkivni faktor.

Faktori koagulacije su proizvedeni posebno i isključivo iz krvne plazme određene vrste sisara ili su dobijeni genetskim inžinjeringom od odgovarajućih faktora koagulacije ili aktiviranih faktora koagulacije, uključujući i tkivni faktor.

U farmaceutski aktivnoj supstanci shodno ovom pronalasku protrombin, faktori kaogulacije V, VIII, IX, X, Xla i u datom slučaju faktori koagulacije VII i Vila kao i tkivni faktor, imaju to preimućstvo da sigurno ne mogu da izazovu virusnu infekciju jer su virusi inaktivirani i/ili je umanjen njihov broj.

Farmaceutski aktivna supstanca, shodno ovom pronalasku, može biti duboko smrznuta ili u se nalaziti u formi liofilizata.

Pored toga, pronalazak se odnosi i na lek koji ima sposobnost generisanja trombina i koji se može dobiti od farmaceutski aktivne supstance, shodno ovom pronalasku.

Lek koji ima sposobnost generisanja trombina, shodno pronalasku, može biti duboko smrznut ili se nalaziti u stanju liofilizata.

Jedan izdvojeni, i zasebno razvijeni oblik leka, koji ima sposobnost generisanja trombina, shodno pronalasku, bi bio naznačen time da u sebi dodatno sadrži i trombin u takvoj količini da nakon odmrzavanja ili rekonstitucije ne sadrži više od jedne jedinice trombina po ml.

Unapređeni i zasebno razvijeni oblik postupka, shodno pronalasku, se sastoji u tome da se spravljena farmaceutski aktivna supstanca, inaktivisanjem virusa bilo pre ili nakon stvaranja trombina, kao i smanjivanjem broja virusnih partikula nakon završetka stvaranja trombina, učini bezbednom od prenosa virusa.

Takođe prikazuje postupak za proizvodnju koncentrata pro-kofaktora koji bi sadržavali faktore koagulacije V i VIII, koji je naznačen time da se krioprecipitat, dobijen iz plazme, rastvara i da se iz rastvora odvaja fibrinogen, pri čemu se dobija rastvor koji sadrži faktore koagulacije V i VIII koji može biti spravljen sa dodatkom kalcijum hlorida.

Takođe prikazuje proizvodnju koncentrata protrombinskog kompleksa koji sadrži faktor koagulacije XI i koji sadrži faktore koagulacije II, VII, Vila, IX, X, i XI, pri čemu na 1.0 ug protrombina sadrži najmanje 0.030 pg faktora koagulacije Xla, a koji bi bio naznačen time da bi supernatant krioprecipitata dobijenog iz plazme bio adsorbovan na anjonskom jonoizmenjivaču, a iz njega bi, nakon ispiranja adsorbovanog materijala i čuvanja na hladnoći, mogao biti eluiran protrombinski kompleks koji sadrži faktor koagulacije Xla.

Pronalazak je zasnovan na saznanju da postoji praktično kompletno, vremenski kontrolisano, stvaranje a-trombina iz protrombina koji ne sadrži viruse sposobne da izazovu infekciju, uz pomoć unutrašnjeg kompleksa tenaze koji ne sadrži viruse sposobne da izazovu infekciju. Unutrašnji kompleks tenaze će se stvoriti aktivisanjem odgovarajućih faktora koagulacije koji ne sadrže viruse sposobne da izazovu infekciju, odnosno, koji su obrađeni tako da ne sadrže viruse sposobne da izazovu infekciju, u prisustvu optimalne koncentracije Ca jona, fosfolipida koji aktivišu zgrušavanje, koji ne sadrže viruse sposobne da izazovu infekciju i aktivišuće supstance, faktora koagulacije Xia, koji ne sadrži viruse sposobne da izazovu infekciju, i/ili aktivišućih supstanci faktora koagulacije Vila i tkivnog faktora koji ne sadrže viruse sposobne da izazovu infekciju.

Postavljeni zadatak će biti da se sa jednom od postojeće tri komponente (komponente A, B i C) farmaceutski aktivne supstance, shodno pronalasku, razvije koji ne bi sadržao viruse sposobne da izazovu infekciju i pri čemu bi farmaceutski aktivna supstanca okarakterisana time da u komponenti A je farmaceutski aktivna supstanca protrombin koji ne sadrži viruse sposobne da izazovu infekciju i koji je dobijen iz plazme ili proizveden genetskim inženjeringom

u komponenti B su farmaceutski aktivne supstance, faktori koagulacije V, VIII, IX, X, Xla koji ne sadrže viruse sposobne da izazovu infekciju, a u slučaju da je osim stvaranja protrombinaze i unutrašnjeg kompleksa tenaze potrebno dodatno započeti i stvaranje spoljašnjeg kompleksa tenaze, farmaceutski aktivne supstance bi bili još i faktor koagulacije VII i/ili Vila kao i tkivni faktor koji ne sadrže viruse sposobne da izazovu infekciju i

komponente C, u potpunosti sintetski proizvedene, koja kao farmaceutki aktivnu supstancu sadrži fosfolipide aktivne u zgrušavanju, koji bi na temperaturi od preko 15° C prelazili iz oblika parakristala u oblik tečnih kristala.

Smeša farmaceutski aktivnih supstanci sadržanih u komponentama A i B, što znači faktori koagulacije, odnosno aktivisani faktori koagulacije, može se dobiti mešanjem dve ili više frakcija plazme u kojima bi bile sadržane sve neophodne farmaceutski aktivne supstance, i u koju bi, kada je potrebno, mogao biti dodat i tkivni faktor.

Nakon mešanja sve tri komponente i dodavanja optimalne količine CaCI2, stvarao bi se trombin na temperaturno zavisan način između 0° i 40° C, pri čemu bi sa porastom temperature rasla brzina stvaranja trombina.

Dobijanje komponente A bi bila omogućeno rastvaranjem liofilizata protrombina, koji ne sadrži viruse sposobne da izazovu infekciju, ili otapanjem zamrznutog rastvora protrombina, koji ne sadrži viruse sposobne da izazovu infekciju, i pripremom koncentrovanog rastvora protrombina koji sadrži 10 do 100 jedinica / ml protrombina, i sadrži 0,1% natrijum citrata i njegov pH je 7.3

Merenje vrednosti ovakvog koncentrovanog rastvora će biti omogućeno određivanjem sadržaja protrombina pomoću plazme deficijentne u faktoru koagulacije II, pravljenjem kalibracione krive pomoću referentne, normalne plazme.

Maksimalne količine meizotrombina i trombina koje se generišu od jedne jedinice protrombina će se određivati pomoću ekarina. Određivanje meizotrombina i trombina vršiće se uz pomoć hromogenog supstrata S-2238. Pored toga, biće određivana količina trombina koja će se generisati od jedne jedinice protrombina nakon dodavanja tromboplastina u NIH jedinicama. Adekvatna standardna kriva za određivanje trombina će se dobiti uz pomoć internacionalnih a-trombin standarda.

Komponenta B će biti dobijena mešanjem koncentrovanih rastvora faktora koagulacije V, VIII, IX, X, Xla kao i faktora koagulacije VII, Vila i tkivnog faktora koji ne sadrže viruse sposobne da izazovu infekciju. Koncentracije pojedinačnih faktora koagulacije u njihovim koncentrovanim rastvorima sadrže 10-100 jedinica po ml; koncentrovani rastvor tkivnog faktora sadrži 25 ug/ml. Sadržaj pojedinačnih faktora koagulacije u koncentrovanom rastvoru će se određivati pomoću odgovarajućih deficijentnih plazmi i za svaki pojedinačni faktor koagulacije će se ustanoviti standardna kriva upotrebom prikupljene (pulovane) normalne plazme.

U cilju određivanja koje su količine pojedinačnih faktora koagulacije potrebne kako bi se dobilo optimalno generisanje trombina bile bi napravljene smeše komponenti A i B koje sadrže po jednu jedinicu faktora koagulacije II, V, VIII, IX, X, Xla i II kao i Xla, VII, Vila sa 2.5 pg tkivnog faktora po reakciji. Nakon dodavanja emulzije lipozoma i sledstvene rekalcifikacije će se odrediti stvaranje trombina na 26° C u adekvatnim vremenskim intervalima. Isto tako će u ovim reakcijama biti utvrđena potrošnja protrombina i stvaranje (3- i v- trombina. Prevođenje protrombina u trombin će biti vršeno u prisustvu 0.1% PEG i biće određivane količine svakog faktora koagulacije i tkivnog faktora po ml koje su neophodne da se dobije optimalno generisanje trombina.

Smeše komponenti A i B se mogu dobiti iz dve ili više frakcija plazme, sve dok su u njima sadržani svi neophodni faktori koagulacije ili aktivirani faktori koagulacije koji su potrebni za stvaranje unutrašnjeg kompleksa tenaze i kompleksa protrombinaze kao farmaceutski aktivnih supstanci. Do aktivacije unutrašnjeg tenaznog puta dolazi ili preko faktora koagulacije Xla ili preko spoljašnjeg tenaznog puta, naročito u slučaju da nema raspoloživog TFPI. Takođe je moguće aktivisati unutrašnji tenazni put i preko faktora koagulacije Xla i preko spoljašnjeg tenaznog puta istovremneno. U smeši faktora koagulacije koji su neophodni za stvaranje unutrašnjeg kompleksa tenaze bi se mogla dodavanjem, odnosno stavljanjem na raspolaganje faktora koagulacije Xia, odrediti da li najmanje 90% raspoloživog protrombina prelazi u trombin, i ako se to ne dešava, koje su količine faktora Vila i tkivnog faktora potrebne da bi se postiglo praktično potpuno pretvaranje protrombina u trombin. Za generisanje trombina će se koristiti fosfolipidi aktivnih u zgrušavanju, dodati u višku. Aktivacija će se odvijati ili na 26° C ili na 37° C i pri optimalnoj količini Ca jona. Sigurnost da, upotrebljeni faktori koagulacije, odnosno frakcije plazme koje sadrže faktore koagulacije, kao i tkivni faktori dobijeni genetskim inžinjeringom, ne sadrži viruse sposobne da izazovu infekciju će se postići inaktivisanjem virusa, na primer procesovanjem sa rastvaračem i deteržentom i sledstvenim smanjenjem broja virusa metodom nanofiltracije.

Komponenta C će biti dobijena od smeša potpuno sintetičkih holin ili serinfosfolipida ili holin-serin-etanolaminfosfolipida i kao takva biti potpuno sigurna da ne sadrži prione sposobne da izazovu infekciju. Koršćeni će biti samo oni fosfolipidi čija temperatura faznog prelaska iz forme parakristala u formu tečnih kristala leži između 15° i 40° C. Iz takve smeše fosfolipida se mogu proizvesti emulzije koje sadrže lipozome prečnika od 20 nm do 1000 nm, i koji imaju ugrađene polarne delove u spoljašnju membranu. Na temperaturama između 50° i 100° C mogu da se proizvedu lipozomi prečnika 20 nm - 200 nm. Ovakve emulzije se mogu sterilisati filtrima koji zadržavaju bakterije, a zatim sterilno puniti, sušiti, i čuvati u atmosferi azota i skladištiti. Dodatkom vode je moguće rekonstituisati liofilizirane emulzije

Sigurnost da upotrebljavani faktori koagulacije i još uvek nerelipidovani tkivni faktori ne sadrže viruse sposobne da izazovu infekciju će se postići inaktivisanjem virusa procesovanjem najpre sa rastvaračem i deteržentom i sledstvenim daljim odstranjivanjem rastvarača i deterženta. Tragovi upotrebljenog rastvarača, trinitrobutil fosfata, i deterženta, Tween-a 80, koji će moći da se kvantifikuju, ostaće prisutni u rastvoru koji sadrži trombin. Smanjenje broja virusa postići će se metodom nanofiltracije koja će se primeniti nakon prethodnog izbistravanja filtracijom, postepenom filtracijom kroz filtre sa sve manjim i manjim porama počevši sa filtrom sa širinom pore od 5000 nm sve dok se ne dostigne filter pore 35 nm. Bilo bi preporučljivo da se, nakon nanofiltracije kroz filter pore 35 nm, izvrši filtracija i kroz nanofiltre sa veličinom pora od 20 nm i 15 nm.

Generisanja trombina ovakve farmaceutski aktivne supstance je jako zavisno od temperature. Prema tome moguće je mešanjem komponenti A, B i C, čak i pri optimalnoj koncentraciji Ca jona zaustaviti stvaranje trombina iz protrombina, ukoliko se radi pri niskim temperaturama koje su blizu tačke mržnjenja. Za skladištenje je potrebno farmaceutski aktivnu supstancu shodno pronalasku, duboko zamrznuti. U liofiliziranom stanju je moguće skladištiti je na temperaturama između 0° i 25° C. Farmaceutski aktivna supstanca koja ima sposobnost generisanja trombina se može, na niskim temperaturama, formulisati u lek koji ima kapacitet da generiše trombin, preferencijalno 100 do 1000 jedinica trombina po ml, sterilisati filtriranjem, i porcionirati odnosno spakovati u manja pakovanja.

Farmaceutski aktivna supstanca koja ima sposobnost generisanja trombina će se takođe koristiti za proizvodnju leka koji sadrži trombin. Generisanje trombina će se prvenstveno vršiti na temperaturama između 20° i 40° C.

U proizvodnji trombina iz farmaceutski aktivne supstance koja ima sposobnost generisanja trombina, kod koje nisu sve komponente ili nijedna komponenta nije prošla kroz proces inaktivacije virusa, može se izvršiti inaktivacija virusa nakon završetka generisanja trombina. Odstranjivanje supstanci koje inaktivišu viruse se može izvršiti uporedo sa završnim postupkom prečišćavanja generisanog trombina. Moguće je dobiti farmaceutski aktivnu supstancu koja sadrži trombin u količini od 1000 do 10000 jedinica po ml i u njoj smanjiti broj virusnih čestica postupcima izbistravanja filtracijom i sledstvenom nanofiltracijom. Farmaceutski aktivnu supstancu koja ne sadrži viruse sposobne da izazovu infekciju je moguće nakon toga formulisanu i sterilisanu filtriranjem prevesti u lek.

Upotreba leka koji ima sposobnost stvaranja trombina i/ili sadrži trombin zajedno sa lekom koji sadrži fibrinogen bi se mogla koristiti za hemostazu, lepljenje tkiva u kombinaciji sa ušivanjem, ili za okludiranje šupljina i sprovodnih sudova kako bi se sprečio izlaz gasova i tečnosti.

Mešanjem leka ima sposobnost stvaranja trombina sa lekom koji sadrži fibrinogen i eventuelnim malim dodatkom trombina može se podesiti vreme zgrušavanja takve smeše na 30 do 300 sekundi.

Time bi se omogućilo potpuno mešanje lekova čak i pri visokom viskozitetu takve smeše. Isto tako, nakon potpunog mešanja ovih lekova će na raspolaganju ostati još uvek dovoljno vremena za uspešno prilagođavanje delova tkiva koja treba da budu zalepljena ili okludirana. Nakon početka zgrušavanja dolazilo bi, slično kao i kod fiziološkog zgrušavanja, do daljeg stvaranja trombina u delimmično već zgrušanom fibrinogenu, da bi, nakon određenog vremena koje bi moglo da potraje više sati, praktično sav protrombin bio preveden u trombin, dok bi i celokupni fibrinogen bio konvertovan u fibrin. Odvijanje stvaranja trombina na ovaj način omogućava ne samo homogeno stvaranje fibrina u iz fibrinogena, već i uniformnu aktivaciju faktora XIII, a time i unakrsno umrežavanje stvorenih fibrimskih niti, kao i aktivisanje TAFI i kao rezultat toga odsecanje terminalnih lizinskih rezidua fibrina.

Primena smeša koje sadrže fibrinogen u svrhu izazivanja hemostaze zahteva veoma kratko vreme zgrušavanja. Da bi se to postiglo, i uprkos tome zagarantovalo homogeno stvaranje fibrinskog ugruška i aktivacija proenzima kao što su faktor XIII i/ili TAFI, moguće bi bilo kompletno pomešati lek koji sadrži fibrin sa lekom koji ima sposobnost stvaranja trombina, a onda takvu smešu, zajedno sa rastvorom trombina koji sadrži veliku koncentraciju trombina, naneti na mesto koje krvari, lako se započetim zgrušavanjem isprva ne bi stvarao homogeni fibrinski čep, sledstveno stvaranje trombina u fibrinskom čepu, sadržani lek koji ima sposobnost stvaranja trombina dovodio bi do prelaska protrombina u trombin, da bi se na kraju stvorio homogeno zgrušani fibrinski čep sa homogeno raspoređenim faktorom Xllla i homogeno rapoređenim TAFla. Time je i kod brzo zgrušavajućih smeša lekova koji sadrže trombin sa onima koji sadrže fibrin omogućeno stvaranje izvanredne fibrinske strukture i postignuta njena ekstremna otpornost na uticaje koji bi dovodili do fibrinolize.

Pored toga, postoji mogućnost da u smeši koja sadrži faktore koagulacije i ima sposobnost stvaranja trombina, a sastoji se iz protrombinskog kompleksa i faktora VIII, otpočne spontano stvaranje trombina ako joj se dodaju faktori kontaktnog sistema. U ovom slučaju bi se morali dodati faktori koagulacije XI i XII ukoliko već nisu raspoloživi u smeši.

Sve pojedinosti aktivacije faktora koagulacije XIin vivojoš uvek nisu u potpunosti razjašnjene. Potpuno je jasno da ćelije krvi i ćelije endotela tokom ove aktivacije imaju bitnu ulogu. Faktor XI je u krvi vezan nekovalentnim vezama za visoko molekularni kininogen (Kd10"<8>) i protrombin (Kd10"<7>). Ovi kompleksi se mogu nagomilavati na aktivisanim trombocitima, pri čemu u prisustvu trombina i/ili faktora koagulacije XIla dolazi do aktivisanja faktora koagulacije XI.

In vitromože doći do aktivisanja faktora koagulacije XI na negativno naelektrisanim površinama dejstvom faktora koagulacije XIla, pri čemu faktor koagulacije XI la nastaje iz faktora koagulacije XII pod dejstvom kalikreina. Nastanak kalikreina iz prekalikreina raspoloživog u krvi može teći različitim mehanizmima, na primer, preko aktivatora prekalikreina ili solima elagične kiseline.

Moguće je da u smeši koja sadrži faktore koagulacije i ima sposobnost stvaranja trombina, shodno pronalasku, a sastoji se iz protrombinskog kompleksa i faktora VIII, dođe do započinjanja spontanog stvaranja trombina aktivisanjem raspoloživog faktora koagulacije XI, pri čemu bi u svim komponentama ove smeše prethodno bila izvršena inaktivacija virusa. Preferencijalno bi aktivacija bila vršena sa fosfolipidima aktivnim u koagulaciji koji ne sadrže prione sposobne da izazovu infekciju, i sa kalikreinom koji ne sadrži viruse sposobne da izazovu infekciju. Umesto kalikreina, mogao bi se upotrebiti i prekalikrein u kome su inaktivisani virusi zajedno sa prekalikrein aktivatorom koji ne sadrži viruse sposobne da izazovu infekciju ili sa aktivatorima kao što su na primer soli elagične kiseline.

U proizvodnji farmaceutski aktivne supstance koja sadrži trombin, inaktivacija virusa bi mogla da se sprovede tokom ili nakon toga što dođe do stvaranja trombina.

Pronalazak će biti bolje opisan uz pomoć primera koji slede.

Primeri

1. Dobijanje komponente A.

100mg protrombina koji ne sadrži viruse sposobne da izazovu infekciju će biti rastvoreno u 1 L 0.1% rastvora Na-citrata, pH 7.5 i sadržaj protrombina po ml će biti određen uz pomoć protrombin deficijentne plazme. Isto tako će nakon dodavanja ekarina biti određivane količine nagrađenih meizotrombina i trombina konverzijom hromogenog supstrata S-2238. Dalje će biti sprovedeno stvaranje trombina uz pomoć spravljene protrombinaze. Stvoreni trombin će biti određivan uz pomoć rastvora fibrinogena a rezultat će biti izražen kao trombinsko vreme. Prethodno će za taj rastvor fibrinogena biti napravljena standardna kriva uz pomoć

internacionalnog standarda a-trombina. Ovaj koncentrovani rastvor protrombina se može skladištiti smrznut na -20° C najmanje šest meseci.

2. Dobijanje komponente B iz pojedinačnih faktora koagulacije.

Visoko prečišćeni koncentrati faktora koagulacije koji ne sadrže viruse sposobne da izazovu infekciju, a koji su dobijani iz plazme ili genetskim inžinjeringom biće rastvoreni u 0.1% Na-citratu, pH 7.5 i pomešani uz energično mešanje (na magnetnoj mešalici) sa: 3.2 mg faktora V, 0,2 mg faktora VIII, 5,0 mg faktora IX, 11 mg Faktora X i 0.5 mg faktora Xla. Nakon uzimanja uzoraka, rastvor će biti zamrznut i skladišten na -20° C ili nižim temperaturama. Na uzorku koji je ekvivalentan ovom rastvoru će biti određena količina 1 M rastvora CaCI2koja je potrebna da se u rastvoru dobije aktivnost jona kalcijuma ekvivalentna koncentraciji CaCI2u 5 mM - 8 mM rastvoru.

3. Dobijanje smeše komponenti A i B

Zamrznuti rastvori komponente A, dobijen kako je opisano u primeru 1, i komponente B, dobijen kako je opisano u primeru 2, će biti pažljivo odmrznuti pri čemu temperatura ne srne da pređe 4° C. Od dobijenih rastvora će se napraviti smeša jednakih delova komponente A i komponente B, neophodni uzorci će biti uzeti a smeša komponenti će ponovo biti smrznuta i skladištena na -20° C. 4. Dobijanje smeše dobijene iz frakcija plazme koja sadrži faktore koagulacije komponenti A i B.

Iz 10 L duboko smrznute plazme koja će služiti kao početni materijal i koja će biti pažljivo odmrznuta, pri čemu neće biti prekoračena temperatura 4° C, biće odvojen krioprecipitat od supernatanta centrifugiranjem na 6.000 g u toku 15 minuta.

a. Koncentrat protrombinskog kompleksa koji sadrži faktor koagulacije Xla

Supernatant krioprecipitata će biti pomešan sa 16 g slabog anjonskog jonoizmenjivača DEAE Sephadex A-50 čija će pH vrednost biti podešena između 7.8 i 8.8 pomoću 0.1 normalnog natrijum hidroksida, i mešan jedan sat na temperaturi između 3° C i 6° C. Ovakva smeša se može održati najduže 24 sata na toj temperaturi pre nego što se jonoizmenjivač odvoji filtracijom i/ili centrifugiranjem. Tečnost iz koje je izdvojen jonoizmenjivač će biti sačuvana za dobijanje daljih frakcija plazme, a izdvojeni jonoizmenjivač biti dalje prerađivan u cilju dobijanja protrombinskog kompleksa. Tako izdvojeni jonoizmenjivač se može čuvati na temperaturama između 4° C i 6° C do 100 sati. U cilju dalje prerade će se izdvojeni jonoizmenjivač prati dva puta sa po 1 L 0.5% rastvora kuhinjske soli nakon čega će se dobiti protrombinski kompleks koji sadrži faktor koagulacije Xla elucijom sa 1000 ml 0.3 M rastvora NaCI pH 7,5. Jonoizmenjivač će nakon elucije biti još jednom opran sa 500 ml 0.3 M rastvora kuhinjske soli pH 7,5 , nakon čega će se tečnost kojom je ispran jonoizmenjivač sjediniti sa eluatom. U ovom celokupnom eluatu će se uz pomoć ekarina odrediti raspoloživa količina protrombina, nakon čega će se celokupni eluat razrediti tako da se sadržaj protrombina dovede do željene koncentracije koja iznosi između 2 i 5 jedinica protrombina po mililitru. Celokupni eluat, kao koncentrat protrombinskog kompleksa koji sadrži faktor koagulacije Xia, se nakon smrzavanja može skladištiti na -20° C u smrznutom stanju. Sadržaj faktora koagulacije i aktivisanih faktora koagulacije će biti određivan uz pomoć uzoraka koji bi bili uzeti pre zamrzavanja.

b. Dobijanje koncentrata pro-kofaktora

Krioprecipitat istaložen nakon centrifugiranja plazme će biti rastvoren u 750 ml 0.3% citratnog pufera, pH 7,0 i pomešan sa 110 g glicina. Nakon mešanja u trajanju od jednog sata na temperaturi između 0° C i 2° C precipitirani fibrinogen će biti izdvojen centrifugiranjem, a supernatant koji sadrži faktore koagulacije V i VIII će biti zamrznut. U uzorku supematanta koji će biti razblažen vodom u odnosu 1:10 će se odrediti sadržaj faktora VIII kao i količina CaCI2koja je potrebna za rekalcifikaciju kako bi se dobio ekvivalentna jonska aktivnost onoj koju sadrži 5mM rastvor CaCI2. Zamrznuti rastvor se može skladištiti na -20 C.

c. Dobijanje smeše koncentrata protrombina koji sadrži faktor koagulacije Xla i

koncentrata pro-kofaktora.

Rekalcifikovani uzorak koncentrata pro-kofaktora razređenog destilovanom vodom u odnosu 1:10, dobijen kako je opisano u primeru 4 b će biti dodavan. u količinama od 0.1, 0.2, 0.4 i 0.8 ml, količini od 1 ml koncentrata protrombina proizvedenog kako je opisano u primeru 4a. Svakoj od ovih smeša će biti dodavano po 0.1 ml emulzije lipozoma proizvedene kako je opisano u primeru 5. Nakon inkubacije od 8 sati na temperaturi od 26° C će biti određena ona količina koncentrata pro-kofaktora koja je potrebna da se 90 ili više procenata raspoloživog protrombina prevede u trombin.

U cilju proizvodnje smeše koncentrata protrombina koji sadrži faktor koagulacije Xla i koncentrata pro-kofaktora koji su dobijeni iz 10 L duboko smrznute plazme i skladišteni smrznuti, ovi koncentrati će se nakon odmrzavanja pomešati saglasno optimalnom odnosu koji je utvrđen preliminarnim ispitivanjem. Ovakva smeša će se zamrznuti i skladištiti na -20° C.

5. Dobijanje komponente C bez emulgatora.

Biće upotrebljeni potpuno sintetski fosfolipidi, koji, prema tome, neće sadržati viruse i prione sposobne da izazovu infekciju. 200 mg 2Na-1,2-Di-Oleoil-sn-Glicero-3-fosfo-L-Serina, 400 mg 1.2, Di-Oleoil-sn-Glicero-3-fosfoholina i 400 mg Di-Oleoil-etanolamin-fosfolipida će biti rastvoreni u 10 ml hloroforma i potom potpono upareni u staklenom balonu zapremine 250 ml stalnim grejanjem i okretanjem balona. Produvavanjem azota će se u potpunosti odstraniti ostaci hloroforma nakon čega će biti dodato 10 ml rastvora 0.1% citratnog pufera pH 7,3. Fosfolipidni film koji se nalazi na unutrašnjem zidu balona će biti kompletno emulgovan u puferu zagrevanjem na 65° C i emulgovanje će biti ponavljano trešenjem na vorteksu sve dok kompletan lipidni film ne nestane sa unutrašnje površine balona. Emulzija će kao takva ili razblažena u 0.1% citratnom puferu pH 7,0 u odnosu 1:10 biti filtrirana kroz filter sa porama prečnika 0.45 pm, a nakon toga filtrirana kroz filter čija širina pora iznosi 0.22 pm, radi sterilizacije. Ovako pripremljena emulzija se može čuvati u frižideru sterilna i pre upotrebe je treba promućkati na vorteksu u trajanju od 1 minuta. Sterilnost i odsustvo pirogena u emulziji će biti ispitani saglasno evropskoj farmakopeji (Eur. Pharm. 4,<h>Edition 2002 strane 123-126, 2. 6.1. Sterilitv. strane 131 -132, 2.6. 8. Pyrogens).

6. Dobijanje Komponente C sa Natrijum-holatom

250 mg 2Na-1,2-Di-Oleoil-sn-Glicero-3-fosfo-L-Serina, 750 mg 1.2, Di Oleoil-sn-Glicero-3-fosfoholina i 500 mg Natrij u m-holata će biti rastvoreni u 10 ml smeše 1 + 1 hloroforma i metil alkohola nakon čega će oba rastvarača biti uparena pod

vakumom na takav način da na unutrašnjem zidu balona ostane tanak film jednake debljine. Film će se potom skinuti sa zida posude pomoću 10 ml rastvora

0.1% citratnog pufera, pH 7,3 a emulzija dobijena na taj način će se dalje obrađivati i sterilisati kao što je opisano u primeru 1. 7. Aktivišuće supstance za aktivaciju unutrašnjeg puta tenaze koje ne sadrže viruse sposobne da izazovu infekciju.

Kao aktivišuća supstanca će se koristiti ili faktor koagulacije Xla sam, odnosno zajedno sa faktorom koagulacije XI, biće korišćen i faktor koagulacije Vila prvenstveno sa tkivnim faktorom. Faktor koagulacije Xla takođe može biti primenjen zajedno sa faktorom koagulacije Vila i tkivnim faktorom. Aktivisani faktori koagulacije, odnosno tkivni faktori, bi u cilju primene kao farmaceutski aktivne supstance prošli kroz obradu rastvaračem/deterdžentom kojom bi bili inaktivisani virusi a nakon toga bi se rastvarač i deterdžent odstranili i sprovelo smanjivanje broja virusnih partikula procesom nanofiltracije.

Nastale farmaceutski aktivne supstance rastvorene u 0.3% citratnom puferu, pH 7,3 bi bile korišćene kao koncentrovani rastvori aktivirajućih supstanci:

a. 30 pg faktora Xla /ml

b. 30 pg faktora Xla i 50 ng faktora Xl/ml

c. 30 pg faktora Xla i 20 ng faktora Vlla/ml

d. 30 pg faktora Xla i 20 ng faktora Vila i 10 ng tkivnog faktora/ml e. 10 pg/ml tkivnog faktora

U cilju izbora aktivišuće supstance sa najboljim svojstvima bio bi napravljen niz razblaženja pojedinačnih aktivišućih supstanci i po 10 pl svakog razblaženja bi bilo dodavano u 1 ml smeše faktora koagulacije koje su dobijene na način opisan u primerima 3 ili 4 i pomešano sa 10 pl emulzije lipozoma opisane u primeru 5 razblažene u odnosu 1:100. Nakon rekalcifikacije, smeše bi bile držane na 26° odnosno 37° C. U intervalima od 10, 30, 60, i 120 min bi se određivala količina stvorenog faktora Xa pomoću hromogenog supstrata S-2251. Kao aktivišuća supstanca u proizvodnji farmaceutski aktivne supstance sposobne da stvara trombin koristila bi se ona supstanca koja, sa smešama faktora koagulacije dobijenim kao što je opisano u primerima 3 ili 4, daje, nakon rekalcifikacije, najveće količine faktora Xa.

8. Određivanje potrebnih količina komponente C koje u smeši komponenti A i B unutar 8 sati na 26° C odnosno 2 sata na 37° C dovode do prevođenja najmanje 90% raspoloživog protrombina u trombin.

Smešama faktora koagulacije opisanim u primerima 3 ili 4, koje su pomešane u potrebnim količinama sa količinama aktivirajućih supstanci određenih kako je opisano u primeru 7, dodavače se rastuće količine emulzije lipozoma. Na svakih 10 ml smeše faktora koagulacije dodavače se 0,1, 0,2, 0,4, i 0,8 ml emulzije lipozoma proizvedene kao što je opisano u primeru 5, i nakon rekalcifikacije i uzorci će biti inkubirani 8 sati na 26° C ili 2 sata na 37° C. Biće određena najmanja količina emulzije lipozoma koja je potrebna da se najmanje 90% raspoloživog protrombina prevede u trombin. 9. Proizvodnja farmaceutski aktivne supstance koja ima sposobnost generisanja trombina i koja ne sadrži viruse sposobne da izazovu infekciju.

Smeša faktora koagulacije dobijena kao što je opisano u primeru 3, i koja ne sadrži viruse sposobne da izazovu infekciju (komponente A i B), će, nakon odmrzavanja, u slučaju potrebe biti pomešana sa odabranom aktivirajućom supstancom koja ne sadrži viruse sposobne da izazovu infekciju, dobijenom kako je opisano u primeru 7, a ta smeša će biti dalje mešana 15 minuta na temperaturi 0° do 2° C. Ovoj smeši će biti dodata emulzija lipozoma (komponenta C) u količini koja je utvrđena kao što je opisano u primeru 5. Ovoj smeši će se dodati kuhinjska so kao čvrsta supstanca, tako da se dobije finalna koncentracija od 0.9% NaCI i ukoliko je potrebno biće izvršena filtracija, a zatim će smeša biti sterilisana filtriranjem kroz filter sa porama širine 0.22 pm i/ili 0.1 pm. Sve manipulacije uključujući i sterilisanje filtriranjem će se vršiti na temperaturi između 0° i 2° C. Farmaceutski aktivna supstanca koja ima sposobnost generisanja trombina dobijena na ovaj način, će biti nakon uzimanja uzoraka zamrznuta i skladištena na -20° C. Potrebna ispitivanja stabilnosti i odsustva pirogena će biti sprovedeni na način opisan u evropskoj farmakopeji. U kontrolama tokom procesa proizvodnje i u sterilnom filtratu će biti određivan kapacitet za stvaranje trombina nakon rekalcifikacije u toku 2 sata pri temperaturi od 37° C kao i količina još uvek raspoloživovog protrombina koji je moguće aktivirati ekarinom kako bi se osiguralo pretvaranje protrombina u trombin od najmanje 90%.

10. Proizvodnja farmaceutski aktivne supstance koja sadrži trombin i koja ne sadrži

viruse sposobne da izazovu infekciju.

Zamrznuta smeša koncentrata protrombinskog kompleksa koji sadrži faktor Xla i koncentrata pro-kofaktrora proizvedenih kao što je to opisano u primeru 4, biće odmrznuta i pomešana sa potrebnom količinom aktivirajuće supstance odabrane i preračunate kao što je to učinjeno u primeru 7. Smeši faktora koagulacije nakon rekalcifikovanja i dodavanja količine emulzije lipozoma određene kao što je opisano u primeru 6, dodavače se 10 mg Tween-a 80 i 0.3 mg trinitro butil fosfata na 1g proteina, a zatim će smeša biti inkubirana na temperaturi od 26° C u trajanju od osam sati, čime će najveća količina protrombina biti prevedena u trombin i istovremeno će biti sprovedena potrebna inaktivacija virusa.

Rastvor koji sadrži trombin može da bude zamrznut i skladišten ili će odmah, odnosno nakon odmrzavanja, biti dalje prerađivan. Dodavanjem odgovarajuće količine rastvora natrijum citrata doteraće se pH vrednost od 6.5 i koncentracija od 25 milimola, a onda će se, uz dalje mešanje, dodati onoliko polietilen glikola molekularne mase između 6.000 i 8.000, koliko je potrebno da se dostigne njegova koncentracija od 0.1%. Nakon toga će se uz mešanje dodati 20% suspenzija CM Sepharosa-e koja je prethodno oprana 0.025 M natrijum citratom pH 6.5, sve dok najmanje 95% raspoloživog trombina ne bude adsorbovano na CM Sepharosa-u. Potrebna količina CM-Sepharosa-e će biti utvrđena preliminarnim ispitivanjem, u kome će se odrediti najmanja količina 20% emulzije koja adsorbuje najmanje 95% raspoloživog trombina. CM-Sepharose-a će biti zatim centrifugirana 30 minuta na 3.000 do 5.000 g, sediment će biti resuspendovan u 25 mM citratnom puferu pH 6.5 i njime će biti napunjena odgovarajuća kolona. Kolona će biti isprana sa 1% citratnim puferom pH 6.5 koji sadrži i 0.1% PEG, a zatim će biti urađena elucija gradijentom kuhinjske soli koji u sebi sadrži 0.1% citrat i 0.1% PEG pH 6,5. Gradijent kuhinjske soli će biti napravljen tako da se koncentracije kreću između 10 i 200 mM. Frakcije koje sadrže najveće količine trombina će biti sakupljene, dijalizirane i filtrirane pri čemu će se dobiti koncentracija trombina od oko 500 J po ml. Takav rastvor se može skladištiti zamrznut nakon liofiliziranja, ili odmah dalje prerađivati. Nakon prethodnog izbistravanja filtracijom kroz filtere sa porama različitih veličina između 5.000 i 75 nm, rastvor koji sadrži trombin će biti filtriran kroz nanofilter sa porama veličine 35 nm i preferencijalno, kroz filtre sa prečnikom pora od 20 i 15 nm. Rastvor trombina u kome je smanjen broj virusnih čestica, dobijen na taj način, će biti koncentrisan ultrafiltracijom uz pomoć 30 KD filtra tako da sadrži

5.000 J trombina po ml i skladišten zamrznut ili liofilizovan.

11. Proizvodnja leka koji ima sposobnost generisanja trombina i koji ne sadrži viruse sposobne da izazovu infekciju.

Uzorak ekvivalentan zamrznutoj ili liofilizovanoj farmaceutski aktivnoj supstanci koja je dobijena kao što je opisano u primeru 9, biće razblažen rastvorom 0.9% NaCI tako, da uzorak nakon rekalcifikacije generiše 500 ± 50 jedinica trombina po ml unutar dva sata na temperaturi od 37° C.

Takav razblaženi uzorak će biti pomešan sa jednakom količinom leka koji sadrži 5 -10% fibrinogena, za koji se računa da će biti sastavni deo kompleta fibrinskog

leka, i biće određivano vreme zgrušavanja ove smeše nakon rekalcifikovanja. Ukoliko vreme zgrušavanja na 37° C bude duže od 150 sekundi, farmaceutski aktivnoj supstanci proizvedenoj kao što je opisano u primeru 7, će biti dodato još onoliko trombina proizvedenog kao što je opisano u primeru 8 koliko je potrebno da se vreme zgrušavanja skrati na 100 do 150 sekundi.

Tako određene količine trombina će biti uz mešanje dodavane aktivnoj supstanci dobijenoj kao što je opisano u primeru 9 na temperaturi između 0° C i 2° C i ova smeša će nakon izbistravanja filtracijom, biti sterilisana filtracijom. Sav dobijeni sterilni rastvor će biti preferencijalno na jednako niskoj temperaturi raspodeljen, napunjen u bočice za krajnju upotrebu i liofilizovan. Rastvaranje liofilizovanog praha će se vršiti sterilnim 5 mM rastvorom CaCI2. 12. Dobijanje leka koji sadrži trombin i ne sadrži viruse sposobne da izazovu infekciju.

U farmaceutski aktivnoj supstanci spravljenoj kao što je opisano u primeru 10 će se, nakon otapanja ili rastvaranja, koncentracija NaCI doterati na 0.9% pomoću kuhinjske soli, i nakon toga će se podesiti željena koncentracija trombina na 500 do 5.000 jedinica po ml dodavanjem izotoničnog rastvora kuhinjske soli. Dodaće se i onoliko PEG-a koliko je potrebno da se njegova finalna koncentracija dovede na 0.1%, a rastvor će biti doterati na 5mM koncetraciju CaCI2pomoću dodavanja 10% rastvora CaCI2. Ovaj rastvor će se sterilisati filtriranjem, porcionirati i sterilno puniti u bočice za krajnju upotrebu, nakon čega se može skladištiti zamrznut ili liofilizovan. Rekonstituisanje liofilizovanog rastvora će se

vršiti aqua pro injectione.

13. Primena leka koji ima sposobnost stvaranja trombina zajedno sa lekom koji sadrži trombin. 1 ml leka koji sadrži fibrinogen sa sadržajem od 50 - 100 mg fibrinogena po ml,

će biti pomešan sa 1 ml leka koji ima sposobnost stvaranja trombina opisanom u primeru 11. Smeša ova dva leka će biti snažno mešana dvadesetak sekundi pod sterilnim uslovima i homogena smeša dobijena na taj način će se nanositi na mesta koja trebaju da se lepe ili okludiraju, nakon toga, tako što će delovi tkiva koji treba da se zalepe ili okludiraju biti prilagođeni jedan drugom. Delovi tkiva će se držati u takvoj, prilagođenoj poziciji, dok ne dođe do zgrušavanja smeše lekova. Ukoliko je potrebno, delovi tkiva se mogu držati fiksirani u takvoj poziciji i duže, a to može potrajati i više sati.

14. Primena leka koji sadrži trombin

Količini od 2 ml smeše lekova opisane u primeru 13, shodno pronalasku, biće dodato 0.2 ml leka koji sadrži trombin opisanog u primeru 12, sa 2.000 jedinica trombina po ml, nakon čega će se lekovi brzo pomešati. Ova smeša će, nakon nanošenja na mesto koje krvari, dovesti do brzog zaustavljanja krvavljenja, po mogućstvu nakon uklanjanja nagomilane krvi usisavanjem odnosno upijanjem ili izduvavanjem krvi. 15. Određivanje faktora koagulacije XI i faktora koagulacije XII u eluatu sa jonoizmenjivačem, opisanom u primeru 4a, koji nije nakon zasićenja skladišten nego se odmah nakon pranja zasićenog jonoizmenjivača pristupilo eluiranju. Određivanje će se vršiti pomoću pogodnih plazmi deficijentnih u faktorima koagulacije poreklom od American Diagnostics. 16. Određivanje kalikreina i prekalikreina u eluatima sa jonoizmenjivača koji su zasićeni protrombinskim kompleksom i koji su eluirani odmah nakon pranja ili nakon skladištenja u trajanju do 100 sati na temperaturi koju obezbeđuje frižider. Aktivnost kalikreina će biti određivana pomoću hromogenog supstrata S-2403 pri čemu će se za određivanje koristiti 4 mM rastvor hromogenog supstrata a čija će finalna koncentracija u reakciji iznositi 0.4 mM. Koncentracija prekalikreina će se isto tako određivati hromogenim supstratom S-2403 pri čemu će eluat u razblaženju 1:10 biti pomešan sa jednakom količinom 0.5% suspenzije kaolina i biti inkubiran 5 minuta na 37° C uz mućkanje. Od izmerene ekstinkcije će biti oduzeta vrednost ekstinkcije koja je dobijena bez aktivacije suspenzijom kaolina, i pomoću standardne krive će biti određena količina odnosno broj jedinica prekalikreina . 17. Određivanje aktivatora prekalikreina. Određivanje će se vršiti na isti način kao i određivanje prekalikreina, osim što će umesto suspenzije kaolina biti napravljen niz razblaženja aktivatora prekalikreina. Kada se budu koristile bakarne soli elagične kiseline, biće korišćen niz razblaženja od 10 ng do 10000 ng koji iz date količine prekalikreina unutar 5 minuta na 37° C stvara maksimalne količine kalikreina. 18. Proizvodnja biljnih i/ili potpuno sintetičkih emulzija fosfolipida od L-alfa-fosfatidil holina, L-alfa-fosfatidil-L-serina i L-alfa-fosfatidil-etanolamina će se vršiti na isti način kao što je to opisano u primeru 5. 19. Određivanje TAFla. Određivanje TAFla će se vršiti pomoću hromogenog TAFI activitv kit-a poreklom od American Diagnostica bez dodavanja aktivatora (trombin). Sadržaj TAFla će se izračunati sa standardne krive, koja će biti određena uz pomoć razblaženja plazme i njegove naknadne aktivacije pomoću trombina, pri čemu će se TAFla aktivnost meriti pomoću hromogenog supstrata. 20. Određivanje faktora koagulacije Xllla. Određivanje aktiviranog faktora XII će se vršiti prema evropskoj farmakopeji SUPPL. 4.5. 07/2003. str. 3687 bez upotrebe aktivatora faktora XIII (trombina). 21. Tretiranje emulzija fosfolipida ultrazvukom. Iz smeše fosfolipida će se napraviti 1% suspenzija razblaživanjem sa izotonim rastvorom kuhinjske soli, i 2 ml će biti podvrgnuto ultrazvučnom tretmanu. Tretiranje ultrazvukom će se vršiti ultrazvučnim dezintegratorom Sonifire II VV-250. Izlazna snaga će iznositi maksimalno 200 vati pri radnoj frekvenci od 20 kHz. Biće korišćen konvertor 102 C sa standardnim rezonatorom od 1/2" i mikrovrhom 101-148-062. Ultrazvučni tretman će biti sprovedeno u trajanju 10 do 100 sekundi na stepenu 1 pri 10%nom pulsnom intervalu, bez hlađenja emulzije koja se tretira. Određivanje aktivnosti fosfolipidne emulzije tretirane ultrazvukom, će biti sprovedeno uz pomoć referentne plazme i suspenzije kaolina, merenjem parcijelnog tromboplastinskog vremena. 100 pl plazme će biti inkubirano na 37° C sa 50 pl emulzije lipozoma i 50 pl 0.5%-ne suspenzije kaolina u trajanju od 5 minuta, rekacifikovano i biće određeno vreme zgrušavanja na 37° C. Biće određena potrebna količina emulzije lipozoma koja prouzrokuje najkraće vreme zgrušavanja. Delotvornost lipozomskih emulzija opisanih u primerima 5 i 6 kao i emulzije fosfolipida opisane u primeru 18 se takođe može određivati i ovom metodom. 22. Određivanje pogodnih koncentracija jona kalcijuma za podešavanje željene dužine vremena zgrušavanja farmaceutski aktivne supstance koja ima sposobnost generisanja trombina. Farmaceutski aktivne supstance koje imaju sposobnost generisanja trombina će biti proizvedene i ispitivanoj farmaceutski aktivnoj supstanci će biti dodavan kalcijum u geometrijskom nizu razblaženja jona kalcijuma u kome će najveća koncentarcija Ca-jona biti 1 mM. Niz razblaženja će biti napravljen tako da je najmanja koncentracija 125 pm a najveća 1000 pm. Na isti način će se napraviti niz razblaženja jona kalcijuma od 10 mM do 640 mM i odrediti će se vreme zgrušavanja. Potrebne koncentracije jona kalcijuma će biti određene pomoću standardne krive.

Literatura

Blomback B. Fibrinogen: Evolution of the Structure-Function Concept: Kevnote Address at Fibrinogen 2000 Congress. Annals N. Y. Acad. Sci. 2001; 936:1-10

Booth N.A. TAFI Meets the Sticky Ends. Thromb. Haemost. 2001;85:1-2

Davie E.W., Ratnoff O. D. VVaterfall sequence for intrinsic blood clotting. Science 1964;145:1310-12

Drake T.A., Morrissey J.H., Edgington T.S. Selective cellular expression of tissue factor in human tissue. Implication for disorders of hemostasis and thrombosis. Am.

J. Path. 1989;134:1087-97

Grey E.G. Fibrin as a haemostatic in cerebral surgerv. Surg. Gyn. Obst.

1915;21:452-454

MacFarlane R.G. An enzyme cascade in the blood clotting mechanism and its function as an biochemical amplifier. Nature 1964;202:498-9

Mann K.G., Jenny R.J., Krishnaswamy. Cofactor proteins in the assembly and expression of blood clotting enzvme complexes. Ann. Rev. Biochem. 1988;57:915-56

Matras H. et al. Zur Klebung von Nervenanastomosen mit Gerinnungssubstanzen. Fortschr. Kiefer-Gesichts-Chir. 1976;112-114.

Moravvitz P. Die Chemie der Blutgerinnung. Ergebn. d. Physio. 1905 ; 4 : 307

Rapaport S. I., Rao L. V. M. The Tissue Factor Pathway : How it has become aTrima Ballerina". Thromb. Haemost. 1995;74:7-17

Siebenlist K.R., Meh D.A., Mosesson M. W. PROTRANSGLUTAMINASE (F-XIII) mediated cross-linking of fibrinogen and fibrin. Thromb. Haemost. 2001;86:1221-8

Spangler H.P. Gevvebeklebung und lokale Blutstillung mit Fibrinogen, Thrombin und Blutgerinnungsfaktor XIII (EXPERIMENTELLE Untersuchungen und klinische Erfahrungen). Wien. KLIN. VVschr. 1976;88(4):3-18

von dem Borne P.A.K., Koppelman S.J., Bouma B.N. et al. Surface independent factor XI activation by thrombin in the presence of high molecular vveight kininogen.

Thromb. Haemost. 1994;72:397-402

Young F. et al."Suture"of VVounds by Plasma-Thrombin Adhesion. War Med. 1944;6:80-85

Claims (14)

1. Farmaceutski aktivna supstanca za dobijanje lekova koja ima sposobnost generisanja trombina ili sadrži trombin, naznačena time, što sadrži: (A) protrombin dobijen iz plazme ili genetskim inžinjeringom (faktor kaogulacije II) (B) faktore koagulacije V, VIII, IX, X dobijene iz plazme ili genetskim inžinjeringom koji mogu biti, u najmanju ruku, delimično prisutni u aktivisanom stanju, i faktor koagulacije Xla dobijen iz plazme ili genetskim inžinjeringom (C) fosfolipide aktivne u koagulaciji koji ne sadrže prione sposobne da izazovu infekciju, pri čemu su fosfolipidi u datom slučaju sadržani u lipozomima.

2. Farmaceutski aktivna supstanca prema zahtevu 1, naznačena time, što sadrži faktor koagulacije VII dobijen iz plazme ili genetskim inžinjeringom ili smešu faktora koagulacije VII i Vila dobijenih iz plazme ili genetskim inžinjeringom.

3. Farmaceutski aktivna supstanca prema bilo kojem od zahteva 1 ili 2, naznačena time, što sadrži tkivni faktor, proizveden genetskim inžinjeringom kao takav, ili u relipidiranom obliku.

4. Farmaceutski aktivna supstanca prema bilo kojem od zahteva 1 do 3, naznačena time, što sadrži faktore koagulacije proizvedene isključivo iz krvne plazme određene vrste sisara ili dobijene genetskim inžinjeringom od odgovarajućih faktora koagulacije ili aktiviranih faktora koagulacije, uključujući i tkivni faktor.

5. Farmaceutski aktivna supstanca prema bilo kojem od zahteva 1 do 4, naznačena time, što protrombin, faktori kaogulacije V, VIII, IX, X, Xla i u datom slučaju faktori koagulacije VII i Vila, kao i tkivni faktor ne sadrže viruse sposobne da izazovu infekciju jer su virusi inaktivirani i/ili je u njoj smanjen broj virusnih čestica.

6. Farmaceutski aktivna supstanca prema bilo kojem od zahteva 1 do 5, naznačena time, što je duboko smrznuta ili u formi liofilizata.

7. Lek koji ima sposobnost generisanja trombina, koji se dobija iz farmaceutski aktivne supstance prema bilo kojem od zahteva 1 do 5.

8. Lek koji ima sposobnost generisanja trombina prema zahtevu 7, naznačen time, što je duboko smrznut ili u formi liofilizata.

9. Lek koji ima sposobnost generisanja trombina prema zahtevu 7, naznačen time, što u sebi dodatno sadrži i trombin u takvoj količini da, nakon odmrzavanja ili rekonstitucije, ne sadrži više od jedne jedinice trombina po ml.

10. Farmaceutski aktivne supstance prema zahtevima 1 do 6 sačinjena od protrombinskih kompleksa, koji imaju sposobnost generisanja trombina i sadrže faktor koagulacije XI i faktor koagulacije XII u kojima su inaktivisani virusi, koje su aktivirane, prvenstveno u prisustvu fosfolipida aktivnih u koagulaciji, dodavanjem kalikreina u kome su inaktivisani virusi, odnosno koji ne sadrži viruse sposobne da izazovu infekciju, ili prekalikreina u kome su inaktivisani virusi odnosno koji ne sadrži viruse sposobne da izazovu infekciju.

11. Farmaceutski aktivne supstance prema zahtevima 1 do 6 i 10, koje, osim protrombinskog kompleksa, sadrže još i TAFI ili TAFla i faktor koagulacije XIII i nakon aktivacije protrombina iskazuje sadržaj od najmanje 3 J (50 pg) TAFla odnosno 3 J TAFla i 5 J faktora koagulacije Xllla na 1000 J trombina.

12. Farmaceutski aktivne supstance prema zahtevima 1 do 6, 10 i 11, i smeše lekova prema zahtevima 7 do 9, naznačene time, što su u njima upotrebljeni fosfolipidi aktivni u zgrušavanju biljnog porekla ili biljnog i sintetičkog porekla koji ne sadrže prione sposobne da izazovu infekciju, prvenstveno u odnosu fosfatidil holina i fosfatidil serina od 3 +1 ili fosfatidil holina, fosfatidil serina i fosfaetanolamina od 2 + 2 + 1.

13. Dobijanje farmaceutski aktivnih supstanci prema zahtevima 1 do 6, 10, 11 i 12 kao i lekova prema zahtevima 7 do 9, naznačeno time, što upotrebljena emulzija fosfolipida je takođe tretirana ultrazvukom i nakon toga obavezno sterilisana filtriranjem.

14. Dobijanje lekova koji imaju sposobnost generisanja trombina i koji ne sadrže viruse sposobne da izazovu infekciju prema zahtevu 9 i farmaceutski aktivnih supstanci prema zahtevima 10 i 11, pri čemu je kao komponenta C upotrebljena emulzija fosfolipida proizvedena prema zahtevu 13.