JP3051650B2 - 血液凝固疾患の治療のための安定な調製物 - Google Patents
血液凝固疾患の治療のための安定な調製物Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ウイルス不活化法に付
された、タンパク質を含む安定な調製物に関する。タン
パク質としては、とりわけ凝固活性タンパク質が適して
おり、そのため該調製物は血液凝固疾患の治療に適して
いる。また、抗原決定基を有するタンパク質および／ま
たはポリペプチドも用いることができる。免疫学的に有
効なタンパク質は、とりわけ免疫剤として重要である。
加えて、種々の酵素および／または酵素阻害剤も、他の
薬理学的に有効なタンパク質と同様にタンパク質として
理解される。
された、タンパク質を含む安定な調製物に関する。タン
パク質としては、とりわけ凝固活性タンパク質が適して
おり、そのため該調製物は血液凝固疾患の治療に適して
いる。また、抗原決定基を有するタンパク質および／ま
たはポリペプチドも用いることができる。免疫学的に有
効なタンパク質は、とりわけ免疫剤として重要である。
加えて、種々の酵素および／または酵素阻害剤も、他の
薬理学的に有効なタンパク質と同様にタンパク質として
理解される。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】血液
の凝固疾患は、たとえば、凝固因子の欠乏により凝固時
間が標準値から外れる場合に起こる。これら疾患は、遺
伝性でもあり、また疾患状態を介して後天的に獲得もさ
れ得る。血友病Ａは、最も頻繁に認められる遺伝性の血
液凝固疾患の一つである。血友病Ａを有する患者は、Ｖ
ＩＩＩ因子の欠乏の結果、頻繁に出血を起こしやすく、
これはＶＩＩＩ因子濃縮製剤で治療することができる。
しかしながら、これら患者の約１５％でＶＩＩＩ因子中
和抗体（いわゆる阻害剤）が存在するため、ＶＩＩＩ因
子濃縮製剤による治療が殆ど不可能となっている。
の凝固疾患は、たとえば、凝固因子の欠乏により凝固時
間が標準値から外れる場合に起こる。これら疾患は、遺
伝性でもあり、また疾患状態を介して後天的に獲得もさ
れ得る。血友病Ａは、最も頻繁に認められる遺伝性の血
液凝固疾患の一つである。血友病Ａを有する患者は、Ｖ
ＩＩＩ因子の欠乏の結果、頻繁に出血を起こしやすく、
これはＶＩＩＩ因子濃縮製剤で治療することができる。
しかしながら、これら患者の約１５％でＶＩＩＩ因子中
和抗体（いわゆる阻害剤）が存在するため、ＶＩＩＩ因
子濃縮製剤による治療が殆ど不可能となっている。
【０００３】血友病Ａ阻害剤患者の治療のため、凝固因
子の複合混合物が試されている。活性化プロトロンビン
複合体ＦＥＩＢＡR（イムノ（Ｉmmuno））は、「８因子
阻害剤バイパス活性（factor eight inhibitor bypassi
ng activity）」を有する。ＶＩＩＩ因子濃縮製剤の代
わりに、Ｘａ凝固因子とリン脂質との混合物を用いて血
友病Ａを治療することも試みられた。米国特許第４,６
１０,８８０号には、Ｘａ因子とリン脂質小胞との混合
物を用いた血友病のイヌの治療が記載されている。この
混合物は安定でなく、そのため、Ｘａ因子含有溶液とリ
ン脂質小胞の懸濁液とを使用直前に新たに混合する必要
があった。混合比は、止血は達成されるが血栓症は起こ
らないような仕方で選択する必要があることが強調され
る。
子の複合混合物が試されている。活性化プロトロンビン
複合体ＦＥＩＢＡR（イムノ（Ｉmmuno））は、「８因子
阻害剤バイパス活性（factor eight inhibitor bypassi
ng activity）」を有する。ＶＩＩＩ因子濃縮製剤の代
わりに、Ｘａ凝固因子とリン脂質との混合物を用いて血
友病Ａを治療することも試みられた。米国特許第４,６
１０,８８０号には、Ｘａ因子とリン脂質小胞との混合
物を用いた血友病のイヌの治療が記載されている。この
混合物は安定でなく、そのため、Ｘａ因子含有溶液とリ
ン脂質小胞の懸濁液とを使用直前に新たに混合する必要
があった。混合比は、止血は達成されるが血栓症は起こ
らないような仕方で選択する必要があることが強調され
る。
【０００４】リン脂質小胞とＸａ因子との組み合わせは
血栓症の危険を増大させることが知られている。ウサギ
を用いたインビボ欝血モデルに基づき（Ｂlood ５９、
４０１〜４０７（１９８２））、Ｘａ因子を合成リン脂
質（ホスファチジルコリン／ホスファチジルセリン脂質
小胞、ＰＣＰＳ小胞）とともに試験した場合に、Ｘａ因
子の凝血形成性が増大することが記載されている。プロ
トロンビン複合体濃縮製剤投与後の血栓症の危険もま
た、凝固活性リン脂質と活性化凝固因子との組み合わせ
によるものである。
血栓症の危険を増大させることが知られている。ウサギ
を用いたインビボ欝血モデルに基づき（Ｂlood ５９、
４０１〜４０７（１９８２））、Ｘａ因子を合成リン脂
質（ホスファチジルコリン／ホスファチジルセリン脂質
小胞、ＰＣＰＳ小胞）とともに試験した場合に、Ｘａ因
子の凝血形成性が増大することが記載されている。プロ
トロンビン複合体濃縮製剤投与後の血栓症の危険もま
た、凝固活性リン脂質と活性化凝固因子との組み合わせ
によるものである。
【０００５】米国特許第４,３４８,３８４号から、ＶＩ
ＩＩ凝固因子およびＩＸ凝固因子をリポソーム中に導入
することが知られている。これにより、血友病Ａまたは
Ｂの治療のために経口または経腸により投与することの
できる調製物が利用可能となる。この場合、リポソーム
のサイズは１μｍであり、ＶＩＩＩ因子およびＩＸ因子
が早期に消化されるのを防ぐ。これら調製物を投与して
も血栓症の危険がないが、それは該調製物が静脈内に存
在しないからである。
ＩＩ凝固因子およびＩＸ凝固因子をリポソーム中に導入
することが知られている。これにより、血友病Ａまたは
Ｂの治療のために経口または経腸により投与することの
できる調製物が利用可能となる。この場合、リポソーム
のサイズは１μｍであり、ＶＩＩＩ因子およびＩＸ因子
が早期に消化されるのを防ぐ。これら調製物を投与して
も血栓症の危険がないが、それは該調製物が静脈内に存
在しないからである。
【０００６】活性化凝固因子の貯蔵中の不安定さは知ら
れている。Ｔhrombosis Ｒesearch２２、２１３〜２２
０（１９８１）から、できるだけ安定なβ−Ｘａ因子調
製物を得ることを可能にする方法が知られている。この
方法によれば、β−Ｘａ因子を、０.０３Ｍイミダゾー
ル緩衝液中のｐＨ７.２の５０％グリセリン中に冷蔵し
て貯蔵する。しかしながら、この方法では、４℃におい
ても不活性な断片への変換が起こる。同様に、貯蔵用グ
リセロール−水混合物中でのＸａ因子の不安定さがＪ.
Ｂiol.Ｃhem.２４８、７７２９〜７７４１（１９７３）
に記載されている。
れている。Ｔhrombosis Ｒesearch２２、２１３〜２２
０（１９８１）から、できるだけ安定なβ−Ｘａ因子調
製物を得ることを可能にする方法が知られている。この
方法によれば、β−Ｘａ因子を、０.０３Ｍイミダゾー
ル緩衝液中のｐＨ７.２の５０％グリセリン中に冷蔵し
て貯蔵する。しかしながら、この方法では、４℃におい
ても不活性な断片への変換が起こる。同様に、貯蔵用グ
リセロール−水混合物中でのＸａ因子の不安定さがＪ.
Ｂiol.Ｃhem.２４８、７７２９〜７７４１（１９７３）
に記載されている。
【０００７】本発明の目的は、凝固活性タンパク質を含
む血液凝固疾患の治療のための安定な調製物を利用でき
るようにすることである。本発明の他の目的は、タンパ
ク質を含み、存在するかもしれないウイルスの不活化処
理に供した安定な調製物を利用できるようにすることで
ある。上記目的は、小胞形態中に適当なタンパク質と脂
質との複合体を含む安定な調製物により本発明によって
解決される。活性化凝固因子の安定性は、Ｘａ因子など
の活性化凝固因子を小胞形態中でリン脂質上に結合させ
ることによって、すなわち脂質小胞中および脂質小胞上
に結合させることによって予期しない仕方で増大するこ
とが示された。溶液中または凍結および／または凍結乾
燥形態での非常に良好な貯蔵安定性が達成される。活性
化凝固因子は、たとえば、凍結乾燥工程やウイルス不活
化を目的とする処理におけるような物理的な不活化から
保護されることさえも示すことができる。活性化凝固因
子のインビボ活性もまた保持され、このことも調製物の
安定性の測定基準である。
む血液凝固疾患の治療のための安定な調製物を利用でき
るようにすることである。本発明の他の目的は、タンパ
ク質を含み、存在するかもしれないウイルスの不活化処
理に供した安定な調製物を利用できるようにすることで
ある。上記目的は、小胞形態中に適当なタンパク質と脂
質との複合体を含む安定な調製物により本発明によって
解決される。活性化凝固因子の安定性は、Ｘａ因子など
の活性化凝固因子を小胞形態中でリン脂質上に結合させ
ることによって、すなわち脂質小胞中および脂質小胞上
に結合させることによって予期しない仕方で増大するこ
とが示された。溶液中または凍結および／または凍結乾
燥形態での非常に良好な貯蔵安定性が達成される。活性
化凝固因子は、たとえば、凍結乾燥工程やウイルス不活
化を目的とする処理におけるような物理的な不活化から
保護されることさえも示すことができる。活性化凝固因
子のインビボ活性もまた保持され、このことも調製物の
安定性の測定基準である。
【０００８】本発明による調製物の予期しない安定性に
より、脂質小胞中または脂質小胞上に結合した形態のタ
ンパク質、たとえば内因性および／または外因性凝固の
それぞれの血液因子および／またはコファクターおよび
／または血液凝固の阻害剤および／または凝固活性リポ
タンパク質（たとえばＬｐ（ａ）など）または抗原、と
りわけウイルス抗原をウイルス不活化処理、好ましくは
化学的および／または物理的処理、とりわけ熱処理に供
することができる。それにより、生物学的活性および／
または抗原性は大部分保持されることになる。
より、脂質小胞中または脂質小胞上に結合した形態のタ
ンパク質、たとえば内因性および／または外因性凝固の
それぞれの血液因子および／またはコファクターおよび
／または血液凝固の阻害剤および／または凝固活性リポ
タンパク質（たとえばＬｐ（ａ）など）または抗原、と
りわけウイルス抗原をウイルス不活化処理、好ましくは
化学的および／または物理的処理、とりわけ熱処理に供
することができる。それにより、生物学的活性および／
または抗原性は大部分保持されることになる。
【０００９】本発明による調製物は、タンパク質の活性
が、非緩衝溶液中、通常の安定化剤の不在下での凍結乾
燥および再構成などの測定基準により４０％以上、好ま
しくは５０％以上保持された場合、および／または活性
タンパク質の活性の４０％以上、好ましくは５０％以
上、最も好ましくは６０％以上が、通常の安定化剤の不
在下、２２℃にて２０時間、調製物の水溶液の貯蔵によ
って保持される場合に、安定であるとされる。「凝固活
性タンパク質」とは、本発明によれば、内因性および／
または外因性凝固の活性化または非活性化血液因子、血
液凝固のコファクターおよび凝固活性リポタンパク質
（たとえば、Ｌｐ（ａ）など）並びにそれらの組み合わ
せを包含する。
が、非緩衝溶液中、通常の安定化剤の不在下での凍結乾
燥および再構成などの測定基準により４０％以上、好ま
しくは５０％以上保持された場合、および／または活性
タンパク質の活性の４０％以上、好ましくは５０％以
上、最も好ましくは６０％以上が、通常の安定化剤の不
在下、２２℃にて２０時間、調製物の水溶液の貯蔵によ
って保持される場合に、安定であるとされる。「凝固活
性タンパク質」とは、本発明によれば、内因性および／
または外因性凝固の活性化または非活性化血液因子、血
液凝固のコファクターおよび凝固活性リポタンパク質
（たとえば、Ｌｐ（ａ）など）並びにそれらの組み合わ
せを包含する。
【００１０】本発明による調製物中の抗原の利点は、と
りわけ、調製物の安定性が増大することと共に脂質成分
がアジュバント効果を有することである。このことによ
り、本発明による調製物はとりわけ免疫剤として適して
いる。抗原は、たとえば、それぞれ組換えにより製造し
た組換えタンパク質および／またはポリペプチドであ
る。そのため、細胞培養のタイプに依存して、感染性因
子による汚染が起こり得る。しかしながら、感染性因子
の伝播に関して安全と考えられる本発明の調製物により
感染は効果的に回避される。非常に高い安定性（本発明
の調製物の注入後にインビボでも確立された）によって
決定されるように、本発明の調製物は患者の治療、とり
わけ血液凝固疾患の治療に非常に適している。
りわけ、調製物の安定性が増大することと共に脂質成分
がアジュバント効果を有することである。このことによ
り、本発明による調製物はとりわけ免疫剤として適して
いる。抗原は、たとえば、それぞれ組換えにより製造し
た組換えタンパク質および／またはポリペプチドであ
る。そのため、細胞培養のタイプに依存して、感染性因
子による汚染が起こり得る。しかしながら、感染性因子
の伝播に関して安全と考えられる本発明の調製物により
感染は効果的に回避される。非常に高い安定性（本発明
の調製物の注入後にインビボでも確立された）によって
決定されるように、本発明の調製物は患者の治療、とり
わけ血液凝固疾患の治療に非常に適している。
【００１１】その構造（タンパク質および脂質成分を特
徴とする）に基づき、血小板凝固活性物質すなわちたと
えば血小板中に天然に存在する血液凝固因子の複合体
が、単独または他の凝固活性物質および脂質小胞と組み
合わせて血小板代用物として用いるのが適しており、そ
れにより、活性化血小板の欠乏に関連する血液凝固疾患
の治療に適している。一方において本発明による複合体
は血小板の形態を代用するものであり、他方においてた
とえばタンパク質溶液中またはカルシウムイオンの存在
下での凝固能またはコラーゲンタイプの構造タンパク質
の吸着などの機能的類似性を確立することができるもの
である。それゆえ、本発明による調製物は血小板の機能
を果たし得る。血友病Ａ阻害剤血漿の凝固時間測定のた
めのインビトロ試験は、血友病Ａ阻害剤患者の治療のた
めの本発明の調製物の有効性を評価することができる。
有効な調製物は、凝固時間を少なくとも５０％、好まし
くは正常血漿の凝固時間まで短縮する。
徴とする）に基づき、血小板凝固活性物質すなわちたと
えば血小板中に天然に存在する血液凝固因子の複合体
が、単独または他の凝固活性物質および脂質小胞と組み
合わせて血小板代用物として用いるのが適しており、そ
れにより、活性化血小板の欠乏に関連する血液凝固疾患
の治療に適している。一方において本発明による複合体
は血小板の形態を代用するものであり、他方においてた
とえばタンパク質溶液中またはカルシウムイオンの存在
下での凝固能またはコラーゲンタイプの構造タンパク質
の吸着などの機能的類似性を確立することができるもの
である。それゆえ、本発明による調製物は血小板の機能
を果たし得る。血友病Ａ阻害剤血漿の凝固時間測定のた
めのインビトロ試験は、血友病Ａ阻害剤患者の治療のた
めの本発明の調製物の有効性を評価することができる。
有効な調製物は、凝固時間を少なくとも５０％、好まし
くは正常血漿の凝固時間まで短縮する。
【００１２】驚くべきことに、Ｘａ凝固因子とリン脂質
小胞とを結合させることにより、良好な貯蔵安定性と長
い半減期とを有する調製物をＶＩＩＩ因子阻害剤血漿に
おいて製造することが可能であることが示された。本発
明による調製物は、凍結乾燥形態で貯蔵するのが好まし
い。凍結乾燥した調製物は、小胞構造中に複合体を含む
溶液に再構成することができる。単糖または二糖などの
炭水化物を約３〜２０％（w/w）の量で添加するのが好
ましい。本発明による複合体の安定性は、少量のカルシ
ウムイオンの存在下でさらに増大する。凝固因子と脂質
小胞との複合体は、凝固疾患の治療のための医薬製剤に
おいて血栓形成性を有しないことも示された。
小胞とを結合させることにより、良好な貯蔵安定性と長
い半減期とを有する調製物をＶＩＩＩ因子阻害剤血漿に
おいて製造することが可能であることが示された。本発
明による調製物は、凍結乾燥形態で貯蔵するのが好まし
い。凍結乾燥した調製物は、小胞構造中に複合体を含む
溶液に再構成することができる。単糖または二糖などの
炭水化物を約３〜２０％（w/w）の量で添加するのが好
ましい。本発明による複合体の安定性は、少量のカルシ
ウムイオンの存在下でさらに増大する。凝固因子と脂質
小胞との複合体は、凝固疾患の治療のための医薬製剤に
おいて血栓形成性を有しないことも示された。
【００１３】活性成分として、本発明による調製物は、
ビタミンＫ依存性タンパク質、たとえばＩＩａ因子、Ｖ
ＩＩａ因子、ＩＸａ因子およびＸａ因子、好ましくはＸ
ａβ因子よりなる群から選ばれた因子を包含する。さら
に、たとえば、ＩＩ因子、ＶＩＩ因子、ＩＸ因子、Ｘ因
子、プロテインＣ、活性化プロテインＣ、プロテインＳ
およびプロテインＺなどの他のタンパク質も含有してよ
い。Ｘａ因子と上記タンパク質の少なくとも一つとの組
み合わせが特に有効であることがわかっている。さらに
ＶＩＩＩ因子、活性化ＶＩＩＩ因子、および／またはｖ
ＷＦ、Ｖ因子および／または活性化Ｖ因子を含有するの
が好ましい。本発明による調製物の他の態様は、活性化
血液凝固因子と脂質小胞との複合体およびさらに「組織
因子」または「組織因子」の断片を包含する。
ビタミンＫ依存性タンパク質、たとえばＩＩａ因子、Ｖ
ＩＩａ因子、ＩＸａ因子およびＸａ因子、好ましくはＸ
ａβ因子よりなる群から選ばれた因子を包含する。さら
に、たとえば、ＩＩ因子、ＶＩＩ因子、ＩＸ因子、Ｘ因
子、プロテインＣ、活性化プロテインＣ、プロテインＳ
およびプロテインＺなどの他のタンパク質も含有してよ
い。Ｘａ因子と上記タンパク質の少なくとも一つとの組
み合わせが特に有効であることがわかっている。さらに
ＶＩＩＩ因子、活性化ＶＩＩＩ因子、および／またはｖ
ＷＦ、Ｖ因子および／または活性化Ｖ因子を含有するの
が好ましい。本発明による調製物の他の態様は、活性化
血液凝固因子と脂質小胞との複合体およびさらに「組織
因子」または「組織因子」の断片を包含する。
【００１４】複合体中に含まれるタンパク質は、ヒトの
ものであって血漿画分から単離したものであるか、また
は組換えにより製造したものであるのが好ましい。感染
の可能性があるため、たとえばウイルスやプリオンなど
の感染性因子の不活化処理をするのがよい。物質または
タンパク質と脂質小胞との複合体の加熱処理を施すのが
推奨できる。かかる処理は、たとえばＥＰ０１５９３１
１号に従って行うことができる。好ましい態様に従い、
高度に精製したＸａ因子（少なくとも１００Ｕ／ｍｇタ
ンパク質）（ウイルス不活化処理により感染性因子を含
まない）とリン脂質小胞との複合体を利用できる。
ものであって血漿画分から単離したものであるか、また
は組換えにより製造したものであるのが好ましい。感染
の可能性があるため、たとえばウイルスやプリオンなど
の感染性因子の不活化処理をするのがよい。物質または
タンパク質と脂質小胞との複合体の加熱処理を施すのが
推奨できる。かかる処理は、たとえばＥＰ０１５９３１
１号に従って行うことができる。好ましい態様に従い、
高度に精製したＸａ因子（少なくとも１００Ｕ／ｍｇタ
ンパク質）（ウイルス不活化処理により感染性因子を含
まない）とリン脂質小胞との複合体を利用できる。
【００１５】その安定性に基づき、何も添加せずに、す
なわち炭水化物（サッカロース）やプロテアーゼインヒ
ビター（アプロチニン）などの通常の安定化剤を添加せ
ずに液体調製物として調製物を利用できる。しかしなが
ら、調製物を液体急速冷凍の形態または凍結乾燥の形態
でも貯蔵することができ、その場合は水分除去のために
多糖を用いるのが好ましい。本発明によれば、小胞形態
のリン脂質は脂質小胞として用いることができる。リン
脂質は合成のものであっても天然のものであってもよ
い。その場合、化学的に純粋なリン脂質の標準混合物が
好ましい。
なわち炭水化物（サッカロース）やプロテアーゼインヒ
ビター（アプロチニン）などの通常の安定化剤を添加せ
ずに液体調製物として調製物を利用できる。しかしなが
ら、調製物を液体急速冷凍の形態または凍結乾燥の形態
でも貯蔵することができ、その場合は水分除去のために
多糖を用いるのが好ましい。本発明によれば、小胞形態
のリン脂質は脂質小胞として用いることができる。リン
脂質は合成のものであっても天然のものであってもよ
い。その場合、化学的に純粋なリン脂質の標準混合物が
好ましい。
【００１６】脂質小胞の調製は、リン脂質分散物の超音
波処理（バレンホルツ（Ｂarenholz）ら、Ｂiochemistr
y １６、２８０６〜２８１０、１９７７）、逆相蒸発法
（スゾカ（Ｆ.Ｓzoka）およびパハドジョプロス（Ｄ.Ｐ
aphadjopoulos）、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ ７
５、４１９４〜４１９８、１９７８）、エタノール注入
法（バツリ（Ｓ.Ｂatzri）およびコーン（Ｅ.Ｄ.Ｋor
n）、Ｂiochem.Ｂiophys.Ａcta ２９８、１０１５〜１
０１９、１９７３）または透析法による混合ミセルから
の界面活性剤の除去（ズンブエール（Ｏ.Ｚumbuehl）お
よびウエーダー（Ｈ.Ｇ.Ｗeder）、Ｂiochem.Ｂiophys.
Ａcta ６４０、２５２〜２６２、１９８１）などの種々
の方法で行うことができる。さらに、オルソン（Ｏlso
n）らによる押し出し成型法（Ｂiochem.Ｂiophys.Ａcta
５５７、９〜２３、１９７９）を用いることもでき
る。多重ラメラ小胞の分散液は、脂質フィルム（好まし
くは、ロータリーエバポレーターを用いて有機溶媒中の
脂質の溶液を蒸発させることにより得ることができる）
の水和により調製する。ついで、この分散液を、２つの
重ねたポリカーボネートフィルムを窒素圧で通して圧搾
する。
波処理（バレンホルツ（Ｂarenholz）ら、Ｂiochemistr
y １６、２８０６〜２８１０、１９７７）、逆相蒸発法
（スゾカ（Ｆ.Ｓzoka）およびパハドジョプロス（Ｄ.Ｐ
aphadjopoulos）、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ ７
５、４１９４〜４１９８、１９７８）、エタノール注入
法（バツリ（Ｓ.Ｂatzri）およびコーン（Ｅ.Ｄ.Ｋor
n）、Ｂiochem.Ｂiophys.Ａcta ２９８、１０１５〜１
０１９、１９７３）または透析法による混合ミセルから
の界面活性剤の除去（ズンブエール（Ｏ.Ｚumbuehl）お
よびウエーダー（Ｈ.Ｇ.Ｗeder）、Ｂiochem.Ｂiophys.
Ａcta ６４０、２５２〜２６２、１９８１）などの種々
の方法で行うことができる。さらに、オルソン（Ｏlso
n）らによる押し出し成型法（Ｂiochem.Ｂiophys.Ａcta
５５７、９〜２３、１９７９）を用いることもでき
る。多重ラメラ小胞の分散液は、脂質フィルム（好まし
くは、ロータリーエバポレーターを用いて有機溶媒中の
脂質の溶液を蒸発させることにより得ることができる）
の水和により調製する。ついで、この分散液を、２つの
重ねたポリカーボネートフィルムを窒素圧で通して圧搾
する。
【００１７】この方法は、リン脂質が液晶状態となる温
度（相転移温度（ＴM）よりも少なくとも５℃、好まし
くは少なくとも１０℃高い温度）で行う必要がある。場
合により、押し出し成型の前に凍結−融解サイクルの繰
り返しを導入する（ホープ（Ｍ.Ｊ.Ｈope）ら、Ｂioche
m.Ｂiophys.Ａcta ８１２、５５〜６５、１９８５）。
さらに、一つの態様が特に有利であることが確かめられ
た。この場合、多重ラメラ小胞の分散液を上記のように
して製造し、凍結乾燥し、再び水で再構成する。このこ
とにより、その後の押し出し成型を特に容易に行うこと
ができ、また非常に高い脂質濃度（たとえば、１００ｍ
ｇ脂質／ｍｌ）で行うこともできる。
度（相転移温度（ＴM）よりも少なくとも５℃、好まし
くは少なくとも１０℃高い温度）で行う必要がある。場
合により、押し出し成型の前に凍結−融解サイクルの繰
り返しを導入する（ホープ（Ｍ.Ｊ.Ｈope）ら、Ｂioche
m.Ｂiophys.Ａcta ８１２、５５〜６５、１９８５）。
さらに、一つの態様が特に有利であることが確かめられ
た。この場合、多重ラメラ小胞の分散液を上記のように
して製造し、凍結乾燥し、再び水で再構成する。このこ
とにより、その後の押し出し成型を特に容易に行うこと
ができ、また非常に高い脂質濃度（たとえば、１００ｍ
ｇ脂質／ｍｌ）で行うこともできる。
【００１８】本発明による複合体を製造するには、小胞
分散液をタンパク質（この場合、好ましくはＸａ凝固因
子）と混合した後に上記凍結乾燥工程を行うことができ
る。再構成した後、本発明による複合体をさらに押し出
し成型することができる。本発明による複合体を製造す
るための他の可能性は、界面活性剤の存在下で成分を混
合し、ついで界面活性剤をたとえば透析により除去する
ことである。脂質フィルムをタンパク質の溶液で直接水
和することもとりわけ有利であり、この場合は凍結乾燥
および再構成を任意に行うことができ、それにより押し
出し成型を一層容易に行うことができる。場合により、
最後の態様として、この付加的な凍結乾燥工程を省くこ
とができる。好ましくは荷電粒子の存在下または脂質小
胞中および脂質小胞上へのタンパク質の導入を可能とす
る条件下で（濃度、疎水性を有するタンパク質の選択な
ど）、調製した小胞をタンパク質と直接混合することも
考えられる。
分散液をタンパク質（この場合、好ましくはＸａ凝固因
子）と混合した後に上記凍結乾燥工程を行うことができ
る。再構成した後、本発明による複合体をさらに押し出
し成型することができる。本発明による複合体を製造す
るための他の可能性は、界面活性剤の存在下で成分を混
合し、ついで界面活性剤をたとえば透析により除去する
ことである。脂質フィルムをタンパク質の溶液で直接水
和することもとりわけ有利であり、この場合は凍結乾燥
および再構成を任意に行うことができ、それにより押し
出し成型を一層容易に行うことができる。場合により、
最後の態様として、この付加的な凍結乾燥工程を省くこ
とができる。好ましくは荷電粒子の存在下または脂質小
胞中および脂質小胞上へのタンパク質の導入を可能とす
る条件下で（濃度、疎水性を有するタンパク質の選択な
ど）、調製した小胞をタンパク質と直接混合することも
考えられる。
【００１９】押し出し成型法のため、約３０〜１０００
ｎｍの直径を有するフィルターを特に用いることができ
る。脂質小胞の典型的なサイズは（動的光散乱の方法に
より測定される）、ほぼ３０〜９００ｎｍ、好ましくは
１００〜５００ｎｍといったところである。製造した複
合体の安定性は、荷電粒子、たとえばカルシウムイオン
を好ましくは１〜１０ｍＭにて含有する場合に改善され
る。脂質小胞中および脂質小胞上の凝固タンパク質の結
合に基づき、複合体自体の単離精製が可能である。この
ことは、ゲル濾過または超遠心分離により行うことがで
きる。
ｎｍの直径を有するフィルターを特に用いることができ
る。脂質小胞の典型的なサイズは（動的光散乱の方法に
より測定される）、ほぼ３０〜９００ｎｍ、好ましくは
１００〜５００ｎｍといったところである。製造した複
合体の安定性は、荷電粒子、たとえばカルシウムイオン
を好ましくは１〜１０ｍＭにて含有する場合に改善され
る。脂質小胞中および脂質小胞上の凝固タンパク質の結
合に基づき、複合体自体の単離精製が可能である。この
ことは、ゲル濾過または超遠心分離により行うことがで
きる。
【００２０】陰性の荷電を示し得るグリセロリン脂質で
あるホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスフ
ァチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール
（カルジオリピン）およびホスファチジルエタノールア
ミンが適当なリン脂質であり、単独、またはホスファチ
ジルコリンおよびスフィンゴミエリンなどの中性リン脂
質と混合して用いるのが好ましく、その場合、カルシウ
ムイオンを添加することによって結合させるのが好まし
い。アニオン性成分として、他の脂質、たとえばスルフ
ァチドまたはジセチルホスフェート、ホスファチジルメ
タノール、ホスファチジル−β−ラクテートおよびオレ
イン酸を用いることができる。しかしながら、ホスファ
チジルコリンやスフィンゴミエリンなどの中性リン脂質
のみを用いることも考えられる。しかしながら、ポリエ
チレングリコールの脂質誘導体などのような化学的修飾
によって得られる物質またはリゾリン脂質や糖脂質のク
ラスからの物質も用いることができる。たとえばステア
リルアミン、ジメチル−ジオクタデシルアンモニウムブ
ロマイド（ＤＤＡＢ）などの陽性荷電を示し得る脂質、
または１,２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウム
プロパン（ＴＡＰ）や１,２−ジアシル−３−ジメチル
アンモニウムプロパン（ＤＡＰ）のタイプのカチオン性
脂質の使用も考えられる。
あるホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスフ
ァチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール
（カルジオリピン）およびホスファチジルエタノールア
ミンが適当なリン脂質であり、単独、またはホスファチ
ジルコリンおよびスフィンゴミエリンなどの中性リン脂
質と混合して用いるのが好ましく、その場合、カルシウ
ムイオンを添加することによって結合させるのが好まし
い。アニオン性成分として、他の脂質、たとえばスルフ
ァチドまたはジセチルホスフェート、ホスファチジルメ
タノール、ホスファチジル−β−ラクテートおよびオレ
イン酸を用いることができる。しかしながら、ホスファ
チジルコリンやスフィンゴミエリンなどの中性リン脂質
のみを用いることも考えられる。しかしながら、ポリエ
チレングリコールの脂質誘導体などのような化学的修飾
によって得られる物質またはリゾリン脂質や糖脂質のク
ラスからの物質も用いることができる。たとえばステア
リルアミン、ジメチル−ジオクタデシルアンモニウムブ
ロマイド（ＤＤＡＢ）などの陽性荷電を示し得る脂質、
または１,２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウム
プロパン（ＴＡＰ）や１,２−ジアシル−３−ジメチル
アンモニウムプロパン（ＤＡＰ）のタイプのカチオン性
脂質の使用も考えられる。
【００２１】好ましい態様としては、抗ウイルス作用を
有する脂質、たとえばアルキルリン脂質（ＥＰ０５０６
７０４Ｂ１参照）の使用が挙げられる。安定化のため、
リン脂質小胞は、８０モル％までのコレステロールを付
加成分として包含していてよい。すべての特定の脂質は
単独の成分として用いることができるし、場合によりコ
レステロールを添加して用いることもできることを強調
しておく必要がある。複合体の生成のため、脂質小胞を
ゲル状態または液晶状態で用いることができるが、液晶
状態での系の使用が一層好ましい。本発明の一つの態様
において、１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３
−ホスホコリンおよび１−パルミトイル−２−オレオイ
ル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（室温で液晶で
ある）を含む脂質小胞（たとえば、ＰＣ／ＰＳ＝８０／
２０（ｗ／ｗ）、実施例１参照）を用いる。しかしなが
ら、不飽和側鎖を有するリン脂質の使用は、酸化のため
に安定性が低下する結果となり得る。それゆえ、小胞の
化学的安定性のためには、ミリスチン酸、パルミチン酸
（実施例２および３）またはステアリン酸（しかしなが
ら、これらは通常、ゲル状態である）などのような脂肪
酸基を有する脂質を使用するのが好ましい。しかしなが
ら、これら脂質をコレステロールと混合して用いること
が特に有利であることがわかっている。
有する脂質、たとえばアルキルリン脂質（ＥＰ０５０６
７０４Ｂ１参照）の使用が挙げられる。安定化のため、
リン脂質小胞は、８０モル％までのコレステロールを付
加成分として包含していてよい。すべての特定の脂質は
単独の成分として用いることができるし、場合によりコ
レステロールを添加して用いることもできることを強調
しておく必要がある。複合体の生成のため、脂質小胞を
ゲル状態または液晶状態で用いることができるが、液晶
状態での系の使用が一層好ましい。本発明の一つの態様
において、１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３
−ホスホコリンおよび１−パルミトイル−２−オレオイ
ル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（室温で液晶で
ある）を含む脂質小胞（たとえば、ＰＣ／ＰＳ＝８０／
２０（ｗ／ｗ）、実施例１参照）を用いる。しかしなが
ら、不飽和側鎖を有するリン脂質の使用は、酸化のため
に安定性が低下する結果となり得る。それゆえ、小胞の
化学的安定性のためには、ミリスチン酸、パルミチン酸
（実施例２および３）またはステアリン酸（しかしなが
ら、これらは通常、ゲル状態である）などのような脂肪
酸基を有する脂質を使用するのが好ましい。しかしなが
ら、これら脂質をコレステロールと混合して用いること
が特に有利であることがわかっている。
【００２２】
【実施例】つぎに、本発明を実施例によりさらに詳しく
説明するが、本発明はこれらに限られるものではない。リン脂質小胞の製造 実施例１：多重ラメラ小胞の製造 １００ｍｌ容フラスコ中、１,２−ジオレオイル−ｓｎ
−グリセロ−３−ホスホコリン（４０.０ｍｇ）および
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−
３−ホスホセリン（１０.０ｍｇ）（アバンチ・ポラー
・リピッズ（Ａvanti Ｐolar Ｌipids））をクロロホル
ム（５ｍｌ）中に溶解し、減圧条件下、３０℃の温度に
てロータリーエバポレーターを用いて蒸発させた。溶媒
を完全に除去した後、３０ミリバールにてさらに３０分
間真空を保持し、ついで０.１ミリバールの高真空下に
て６時間かけて乾燥させた。ついで、得られたリン脂質
フィルムを緩衝液（２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、ｐＨ７.４；５ｍｌ）を添加して水和させ、室温
にて１時間穏やかに震盪させた。
説明するが、本発明はこれらに限られるものではない。リン脂質小胞の製造 実施例１：多重ラメラ小胞の製造 １００ｍｌ容フラスコ中、１,２−ジオレオイル−ｓｎ
−グリセロ−３−ホスホコリン（４０.０ｍｇ）および
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−
３−ホスホセリン（１０.０ｍｇ）（アバンチ・ポラー
・リピッズ（Ａvanti Ｐolar Ｌipids））をクロロホル
ム（５ｍｌ）中に溶解し、減圧条件下、３０℃の温度に
てロータリーエバポレーターを用いて蒸発させた。溶媒
を完全に除去した後、３０ミリバールにてさらに３０分
間真空を保持し、ついで０.１ミリバールの高真空下に
て６時間かけて乾燥させた。ついで、得られたリン脂質
フィルムを緩衝液（２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、ｐＨ７.４；５ｍｌ）を添加して水和させ、室温
にて１時間穏やかに震盪させた。
【００２３】実施例２ 実施例１により多重ラメラ小胞の分散液を生成させた
後、これを互いに頂部を重ねた２つの１００ｎｍポリカ
ーボネートフィルター（１０ｍｌサーモバレル押し出し
成型機、リペックス・バイオメンブレンズ（Ｌipex Ｂi
omembranes Ｉnc.）、バンクーバー、カナダ）にＮ2圧
で１０回押し出し成型した。このようにして製造した小
胞の粒径を動的光散乱（マルバーン・ズータサイザー
（ＭalvernＺetasizer）４）により測定したところ、平
均直径は約１００ｎｍであった。
後、これを互いに頂部を重ねた２つの１００ｎｍポリカ
ーボネートフィルター（１０ｍｌサーモバレル押し出し
成型機、リペックス・バイオメンブレンズ（Ｌipex Ｂi
omembranes Ｉnc.）、バンクーバー、カナダ）にＮ2圧
で１０回押し出し成型した。このようにして製造した小
胞の粒径を動的光散乱（マルバーン・ズータサイザー
（ＭalvernＺetasizer）４）により測定したところ、平
均直径は約１００ｎｍであった。
【００２４】実施例３ クロロホルム／メタノール混合物（２：１、ｖ／ｖ）
（５ｍｌ）中の１,２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセ
ロ−３−ホスホコリン（ナッターマン・ホスホリピッド
（Ｎattermann Ｐhospholipid ＧｍｂＨ））（３５.０
ｍｇ）および１,２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ
−３−ホスホセリン（アバンチ・ポラー・リピッズ）
（１５.０ｍｇ）から、実施例１の記載と同様にしてリ
ン脂質フィルムを製造した。緩衝液（２０ｍＭトリス、
１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７.４）（５ｍｌ）を添加し
た後、ロータリーエバポレーターを用いて５０℃にてフ
ィルムを水和し、実施例２の記載と同様にして押し出し
成型した。
（５ｍｌ）中の１,２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセ
ロ−３−ホスホコリン（ナッターマン・ホスホリピッド
（Ｎattermann Ｐhospholipid ＧｍｂＨ））（３５.０
ｍｇ）および１,２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ
−３−ホスホセリン（アバンチ・ポラー・リピッズ）
（１５.０ｍｇ）から、実施例１の記載と同様にしてリ
ン脂質フィルムを製造した。緩衝液（２０ｍＭトリス、
１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７.４）（５ｍｌ）を添加し
た後、ロータリーエバポレーターを用いて５０℃にてフ
ィルムを水和し、実施例２の記載と同様にして押し出し
成型した。
【００２５】実施例４ １,２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ
コリン（ナッターマン・ホスホリピッド）（３５.０ｍ
ｇ）および１,２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−
３−ホスホセリン（アバンチ・ポラー・リピッズ）（１
５.０ｍｇ）の混合物から、実施例３の記載に従ってリ
ン脂質小胞を製造した。このフィルムを水和し、５０℃
で押し出し成型も行った。
コリン（ナッターマン・ホスホリピッド）（３５.０ｍ
ｇ）および１,２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−
３−ホスホセリン（アバンチ・ポラー・リピッズ）（１
５.０ｍｇ）の混合物から、実施例３の記載に従ってリ
ン脂質小胞を製造した。このフィルムを水和し、５０℃
で押し出し成型も行った。
【００２６】実施例５ １,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコ
リン（シグマ）（４０.０ｍｇ）および１,２−ジオレオ
イル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（１
０.０ｍｇ）またはウシ心臓からのカルジオリピン（シ
グマ）（１７.５ｍｇ）の混合物から、実施例１および
２の記載と同様にしてリン脂質小胞を製造した。
リン（シグマ）（４０.０ｍｇ）および１,２−ジオレオ
イル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（１
０.０ｍｇ）またはウシ心臓からのカルジオリピン（シ
グマ）（１７.５ｍｇ）の混合物から、実施例１および
２の記載と同様にしてリン脂質小胞を製造した。
【００２７】実施例６ １,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコ
リン（４０.０ｍｇ）および１,２−ジオレオイル−ｓｎ
−グリセロ−３−ホスフェート（シグマ）（１０.０ｍ
ｇ）の混合物から、実施例１および２の記載と同様にし
てリン脂質小胞を製造した。
リン（４０.０ｍｇ）および１,２−ジオレオイル−ｓｎ
−グリセロ−３−ホスフェート（シグマ）（１０.０ｍ
ｇ）の混合物から、実施例１および２の記載と同様にし
てリン脂質小胞を製造した。
【００２８】実施例７ １,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコ
リン（３５.０ｍｇ）、１−パルミトイル−２−オレオ
イル−３−ホスホセリン（アバンチ・ポラー・リピッ
ズ）（１０.０ｍｇ）およびダイズからのホスファチジ
ルイノシトール（シグマ）（５ｍｇ）の混合物から、実
施例１および２の記載と同様にしてリン脂質小胞を製造
した。
リン（３５.０ｍｇ）、１−パルミトイル−２−オレオ
イル−３−ホスホセリン（アバンチ・ポラー・リピッ
ズ）（１０.０ｍｇ）およびダイズからのホスファチジ
ルイノシトール（シグマ）（５ｍｇ）の混合物から、実
施例１および２の記載と同様にしてリン脂質小胞を製造
した。
【００２９】実施例８ 実施例１〜７に記載したホスファチジルコリン、ホスフ
ァチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスフ
ァチジン酸および／またはホスファチジルイノシトール
の混合物に５〜８０モル％のコレステロール（シグマ）
を加え、各実施例に記載するようにして押し出し成型し
た。
ァチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスフ
ァチジン酸および／またはホスファチジルイノシトール
の混合物に５〜８０モル％のコレステロール（シグマ）
を加え、各実施例に記載するようにして押し出し成型し
た。
【００３０】実施例９ リン脂質フィルムを水和した後、実施例１〜８の分散液
をショック凍結し（液体Ｎ2）、３７℃（実施例２、５
〜８）および／または５０℃（実施例３および４）で融
解した。この工程を４回繰り返した。このようにして製
造した多重ラメラ小胞を各実施例に記載するようにして
押し出し成型した。これから得られた小胞調製物は１０
０ｎｍの平均直径を有していた。
をショック凍結し（液体Ｎ2）、３７℃（実施例２、５
〜８）および／または５０℃（実施例３および４）で融
解した。この工程を４回繰り返した。このようにして製
造した多重ラメラ小胞を各実施例に記載するようにして
押し出し成型した。これから得られた小胞調製物は１０
０ｎｍの平均直径を有していた。
【００３１】実施例１０ 実施例１〜９の記載と同様にして、リン脂質フィルムの
水和により多重ラメラ小胞を製造した。このようにして
得られた分散液を−８０℃で凍結し、凍結乾燥した。凍
結乾燥物を対応容量のＨ2Ｏで再構成した後、各実施例
に記載するようにして押し出し成型を行った。
水和により多重ラメラ小胞を製造した。このようにして
得られた分散液を−８０℃で凍結し、凍結乾燥した。凍
結乾燥物を対応容量のＨ2Ｏで再構成した後、各実施例
に記載するようにして押し出し成型を行った。
【００３２】実施例１１ 実施例１〜１０のリン脂質小胞の製造を、トリス緩衝液
の代わりに１５０ｍＭＮａＣｌ中で行った。これら小胞
のサイズを動的光散乱により測定したところ、緩衝溶液
で製造した小胞と比較してほぼ同一のサイズ分布が得ら
れた。
の代わりに１５０ｍＭＮａＣｌ中で行った。これら小胞
のサイズを動的光散乱により測定したところ、緩衝溶液
で製造した小胞と比較してほぼ同一のサイズ分布が得ら
れた。
【００３３】実施例１２ １,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコ
リン（アバンチ・ポラー・リピッズ）（８.０ｍｇ）、
ダイズからのホスファチジルイノシトール（シグマ）
（２.０ｍｇ）およびコール酸ナトリウム（シグマ）
（１０.０ｍｇ）の混合物を５０ｍｌ容の丸底フラスコ
中に加え、クロロホルム／メタノール混合物（１：１、
ｖ／ｖ）（１０ｍｌ）中に溶解した。ついで、これを減
圧条件下、２０℃の浴温にてロータリーエバポレーター
中で乾燥するまで蒸発させ、無水メタノール（１０ｍ
ｌ）中に取り、再び蒸発させた。このようにして製造し
たフィルムを震盪しながら緩衝液（２０ｍＭトリス、１
５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７.４）（２ｍｌ）中に取っ
た。小胞を製造するため、ついで、この透明な溶液を４
℃の同緩衝液に対して２４時間透析した。動的光散乱に
より粒径を測定したところ、平均直径は２０ｎｍであっ
た。
リン（アバンチ・ポラー・リピッズ）（８.０ｍｇ）、
ダイズからのホスファチジルイノシトール（シグマ）
（２.０ｍｇ）およびコール酸ナトリウム（シグマ）
（１０.０ｍｇ）の混合物を５０ｍｌ容の丸底フラスコ
中に加え、クロロホルム／メタノール混合物（１：１、
ｖ／ｖ）（１０ｍｌ）中に溶解した。ついで、これを減
圧条件下、２０℃の浴温にてロータリーエバポレーター
中で乾燥するまで蒸発させ、無水メタノール（１０ｍ
ｌ）中に取り、再び蒸発させた。このようにして製造し
たフィルムを震盪しながら緩衝液（２０ｍＭトリス、１
５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７.４）（２ｍｌ）中に取っ
た。小胞を製造するため、ついで、この透明な溶液を４
℃の同緩衝液に対して２４時間透析した。動的光散乱に
より粒径を測定したところ、平均直径は２０ｎｍであっ
た。
【００３４】サッカロースの存在下でのリン脂質小胞の
凍結乾燥 実施例１３ 実施例１〜１２で製造した小胞に３〜２０％（ｗ／ｖ）
の濃度のサッカロースを加えた。ついで、これを−８０
℃にて凍結し、凍結乾燥した。凍結乾燥物を再構成した
後、動的光散乱によりサイズを測定したところ、約１０
０ｎｍの平均直径が得られた。この溶液を電子顕微鏡観
察したところ、陰性染色法による視覚化により約８０〜
１３０ｎｍのサイズ分布が得られた。
凍結乾燥 実施例１３ 実施例１〜１２で製造した小胞に３〜２０％（ｗ／ｖ）
の濃度のサッカロースを加えた。ついで、これを−８０
℃にて凍結し、凍結乾燥した。凍結乾燥物を再構成した
後、動的光散乱によりサイズを測定したところ、約１０
０ｎｍの平均直径が得られた。この溶液を電子顕微鏡観
察したところ、陰性染色法による視覚化により約８０〜
１３０ｎｍのサイズ分布が得られた。
【００３５】Ｘａ因子とリン脂質小胞との複合体の製造 実施例１４：共凍結乾燥 Ｘａ因子を以下のようにして製造した。ブルメルヒュイ
ス（Ｂrummelhuis）の方法（Ｍethods of Ｐlasma Ｐro
teinFractionation、カーリング（Ｊ.Ｍ.Ｃurling）
編、１１７頁、アカデミック・プレス、１９８０）に従
って製造しＥＰ０１５９３１１号の方法に従って加熱処
理したプロトロンビン複合体調製物（５０,０００Ｕ Ｘ
因子／ｌに対応）の溶液を、１２％（ｖ／ｖ）トゥイー
ンR８０の存在下、ｐＨ７.０、室温にて１時間処理し
た。ついで、これをクエン酸三ナトリウム二水和物
（７.０ｇ／ｌ）で希釈混合し、１Ｍ塩化バリウム溶液
（４００ｍｌ）を添加するとｐＨ７.０でプロトロンビ
ン複合体のタンパク質が沈殿した。この沈殿を洗浄し、
５０ｍＭベンズアミジンＨＣｌを含有する２５％（ｗ／
ｖ）硫酸アンモニウム溶液中に再懸濁した。非溶解物質
を分離し、タンパク質を再び沈殿させるために硫酸アン
モニウムで溶液を８０％飽和にもっていった。沈殿を緩
衝液中に溶解し、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭベ
ンズアミジンＨＣｌ、ｐＨ６.０を含有する２５ｍＭク
エン酸三ナトリウム緩衝液に対してセファデックス−Ｇ
２５上のクロマトグラフィーにより再緩衝した。
ス（Ｂrummelhuis）の方法（Ｍethods of Ｐlasma Ｐro
teinFractionation、カーリング（Ｊ.Ｍ.Ｃurling）
編、１１７頁、アカデミック・プレス、１９８０）に従
って製造しＥＰ０１５９３１１号の方法に従って加熱処
理したプロトロンビン複合体調製物（５０,０００Ｕ Ｘ
因子／ｌに対応）の溶液を、１２％（ｖ／ｖ）トゥイー
ンR８０の存在下、ｐＨ７.０、室温にて１時間処理し
た。ついで、これをクエン酸三ナトリウム二水和物
（７.０ｇ／ｌ）で希釈混合し、１Ｍ塩化バリウム溶液
（４００ｍｌ）を添加するとｐＨ７.０でプロトロンビ
ン複合体のタンパク質が沈殿した。この沈殿を洗浄し、
５０ｍＭベンズアミジンＨＣｌを含有する２５％（ｗ／
ｖ）硫酸アンモニウム溶液中に再懸濁した。非溶解物質
を分離し、タンパク質を再び沈殿させるために硫酸アン
モニウムで溶液を８０％飽和にもっていった。沈殿を緩
衝液中に溶解し、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭベ
ンズアミジンＨＣｌ、ｐＨ６.０を含有する２５ｍＭク
エン酸三ナトリウム緩衝液に対してセファデックス−Ｇ
２５上のクロマトグラフィーにより再緩衝した。
【００３６】ＤＥＡＥセファロースR速流カラムによ
り、タンパク質含有画分をさらに精製した。クエン酸緩
衝液（２５ｍＭ、ｐＨ６.０）中の塩化ナトリウム濃度
を増加させることにより、Ｘ因子を他のプロトロンビン
複合体タンパク質から溶出分離した。得られた画分を、
１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび２ｍＭ塩化カルシウム
を含有する２０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７.４）
に対して再緩衝させた。ついで、これを１００Ｕ Ｘ因
子当たり０.１４ｍｇのＲＶＶ（ラッセルマムシ毒、ビ
ペラ・ラッセリー（Ｖipera russellii）からのプロテ
アーゼ、ペンタファーム（Ｐentapharm））と混合し、
室温で１時間撹拌した。ついで、生成したＸａ因子をベ
ンズアミジンセファロースRカラムを用いたクロマトグ
ラフィーにより精製し、硫酸アンモニウム沈殿により濃
縮し、ついで塩の除去のためにセファデックスR−Ｇ２
５上でクロマトグラフィーにかけた。生成したＸａ因子
調製物は、少なくとも１００Ｕ Ｘａ因子／ｍｇタンパ
ク質の比活性を有していた。
り、タンパク質含有画分をさらに精製した。クエン酸緩
衝液（２５ｍＭ、ｐＨ６.０）中の塩化ナトリウム濃度
を増加させることにより、Ｘ因子を他のプロトロンビン
複合体タンパク質から溶出分離した。得られた画分を、
１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび２ｍＭ塩化カルシウム
を含有する２０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７.４）
に対して再緩衝させた。ついで、これを１００Ｕ Ｘ因
子当たり０.１４ｍｇのＲＶＶ（ラッセルマムシ毒、ビ
ペラ・ラッセリー（Ｖipera russellii）からのプロテ
アーゼ、ペンタファーム（Ｐentapharm））と混合し、
室温で１時間撹拌した。ついで、生成したＸａ因子をベ
ンズアミジンセファロースRカラムを用いたクロマトグ
ラフィーにより精製し、硫酸アンモニウム沈殿により濃
縮し、ついで塩の除去のためにセファデックスR−Ｇ２
５上でクロマトグラフィーにかけた。生成したＸａ因子
調製物は、少なくとも１００Ｕ Ｘａ因子／ｍｇタンパ
ク質の比活性を有していた。
【００３７】複合体の製造のため、２.５ｍＭ塩化カル
シウムを用いまたは用いることなく、実施例１〜１２に
より製造した小胞調製物をＸａ因子画分に混合した。こ
の溶液を凍結乾燥した。
シウムを用いまたは用いることなく、実施例１〜１２に
より製造した小胞調製物をＸａ因子画分に混合した。こ
の溶液を凍結乾燥した。
【００３８】再構成した後、ＦＥＩＢＡ試験（試験の記
載についてはＡＴ３５０７２６を参照）における調製物
の有効性を試験した。これとの比較のため、複合体を形
成していないＸａ因子のＦＥＩＢ活性を測定した。凍結
乾燥前に、ＦＥＩＢ活性は両方の場合において１７００
Ｕ／ｍｌに達した。凍結乾燥および再構成後、Ｘａ因子
／ＰＣＰＳ複合体の場合には１６５０Ｕ／ｍｌが回復さ
れた。ＦＥＩＢ活性の損失は、複合体を形成していない
Ｘａ因子の場合において遥かに大きかった。１２２０Ｕ
／ｍｌしか回復されなかった。
載についてはＡＴ３５０７２６を参照）における調製物
の有効性を試験した。これとの比較のため、複合体を形
成していないＸａ因子のＦＥＩＢ活性を測定した。凍結
乾燥前に、ＦＥＩＢ活性は両方の場合において１７００
Ｕ／ｍｌに達した。凍結乾燥および再構成後、Ｘａ因子
／ＰＣＰＳ複合体の場合には１６５０Ｕ／ｍｌが回復さ
れた。ＦＥＩＢ活性の損失は、複合体を形成していない
Ｘａ因子の場合において遥かに大きかった。１２２０Ｕ
／ｍｌしか回復されなかった。
【００３９】実施例１５：共凍結乾燥物の押し出し成型 １０００ＵのＸａ因子を含有する実施例１４に従って製
造した共凍結乾燥物および実施例６に従って製造した
１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコ
リン（４０.０ｍｇ）および１,２−ジオレオイル−ｓｎ
−グリセロ−３−ホスフェート（１０.０ｍｇ）のリン
脂質調製物（５０.０ｍｇ）を最初の容量の水に取り、
２つの重ねた４００ｎｍポリカーボネートフィルター
（リペックス・バイオメンブレンズ）を通して２０℃の
温度で２回押し出し成型した。動的光散乱（マルバーン
ジータサイザー４）により粒径を測定したところ、平均
直径は約４５０ｎｍであった。
造した共凍結乾燥物および実施例６に従って製造した
１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコ
リン（４０.０ｍｇ）および１,２−ジオレオイル−ｓｎ
−グリセロ−３−ホスフェート（１０.０ｍｇ）のリン
脂質調製物（５０.０ｍｇ）を最初の容量の水に取り、
２つの重ねた４００ｎｍポリカーボネートフィルター
（リペックス・バイオメンブレンズ）を通して２０℃の
温度で２回押し出し成型した。動的光散乱（マルバーン
ジータサイザー４）により粒径を測定したところ、平均
直径は約４５０ｎｍであった。
【００４０】実施例１６：共押し出し成型 実施例１の記載に従い、リン脂質混合物からフィルムを
製造した。２.５ｍＭ塩化カルシウムを用いまたは用い
ることなく、これを実施例１４のＸａ因子含有溶液で水
和した。フィルムを水和した後、実施例２、９および１
０と同様にして処理し、押し出し成型した。この結果、
Ｘａ因子はリン脂質小胞と複合体を形成した。ついで、
凍結乾燥するため、かくして製造された複合体に３〜２
０％（ｗ／ｖ）の濃度のサッカロースを添加することが
できた。
製造した。２.５ｍＭ塩化カルシウムを用いまたは用い
ることなく、これを実施例１４のＸａ因子含有溶液で水
和した。フィルムを水和した後、実施例２、９および１
０と同様にして処理し、押し出し成型した。この結果、
Ｘａ因子はリン脂質小胞と複合体を形成した。ついで、
凍結乾燥するため、かくして製造された複合体に３〜２
０％（ｗ／ｖ）の濃度のサッカロースを添加することが
できた。
【００４１】活性化プロテインＣ、Ｘａ因子およびリン
脂質小胞の複合体の製造 実施例１７ リン脂質混合物から実施例１の記載と同様にしてフィル
ムを調製した。これを、実施例１４のＸａ因子含有画
分、および１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび５ｍＭ ＣａＣｌ
2を含有する２０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７.４）
中の活性化プロテインＣで水和した。この１０Ｕ Ｘａ
因子／ｍｌ、１０Ｕ活性化プロテインＣ／ｍｌおよび１
０ｍｇリン脂質／ｍｌを含有する混合物を凍結乾燥し
た。
脂質小胞の複合体の製造 実施例１７ リン脂質混合物から実施例１の記載と同様にしてフィル
ムを調製した。これを、実施例１４のＸａ因子含有画
分、および１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび５ｍＭ ＣａＣｌ
2を含有する２０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７.４）
中の活性化プロテインＣで水和した。この１０Ｕ Ｘａ
因子／ｍｌ、１０Ｕ活性化プロテインＣ／ｍｌおよび１
０ｍｇリン脂質／ｍｌを含有する混合物を凍結乾燥し
た。
【００４２】Ｘａ因子およびＰＣＰＳ小胞の複合体の精
製 実施例１８ Ｘａ因子およびＰＣＰＳ小胞を含有する調製物を実施例
１４または１６に記載の方法に従って製造した。その
際、サッカロースを最終濃度５％（ｗ／ｖ）でＸａ因子
リン脂質調製物に添加した。得られた凍結乾燥物を、調
製した溶液が２.４Ｕ Ｘａ因子／ｍｌおよび１ｍｇ／ｍ
ｌ ＰＣＰＳ小胞を含有するような仕方で水中に溶解し
た。Ｓuperose ６ＨＲ１０／３０（ファルマシア）を充
填したカラムを、緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０.１
％アルブミン、０.０１％トゥイーン２０、１ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ2を含有する２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７.４）で
平衡化した。ＰＣＰＳ小胞およびＸａ因子を含有する調
製物（５００μｌ）を上記カラム上、流速０.４ｍｌ／
分でクロマトグラフィーにかけた。溶出流中、２５４ｎ
ｍにおけるＵＶ吸光度を測定した。ＰＣＰＳ小胞および
Ｘａ因子の複合体を含有する排除容積の画分を回収し
た。
製 実施例１８ Ｘａ因子およびＰＣＰＳ小胞を含有する調製物を実施例
１４または１６に記載の方法に従って製造した。その
際、サッカロースを最終濃度５％（ｗ／ｖ）でＸａ因子
リン脂質調製物に添加した。得られた凍結乾燥物を、調
製した溶液が２.４Ｕ Ｘａ因子／ｍｌおよび１ｍｇ／ｍ
ｌ ＰＣＰＳ小胞を含有するような仕方で水中に溶解し
た。Ｓuperose ６ＨＲ１０／３０（ファルマシア）を充
填したカラムを、緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０.１
％アルブミン、０.０１％トゥイーン２０、１ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ2を含有する２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７.４）で
平衡化した。ＰＣＰＳ小胞およびＸａ因子を含有する調
製物（５００μｌ）を上記カラム上、流速０.４ｍｌ／
分でクロマトグラフィーにかけた。溶出流中、２５４ｎ
ｍにおけるＵＶ吸光度を測定した。ＰＣＰＳ小胞および
Ｘａ因子の複合体を含有する排除容積の画分を回収し
た。
【００４３】実施例１９ 実施例１４に従って製造した凍結乾燥物を水で再構成し
て、１ｍｌ当たり５ＵのＸａ因子および５ｍｇのＰＣＰ
Ｓを含有するようにした。この溶液（０.５ｍｌ）を３
０％（ｗ／ｖ）フィコール４００溶液（ファルマシア、
１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液中）（１ｍｌ）と混合し
た。この混合物を超遠心分離管に入れ、１０％フィコー
ル溶液（３ｍｌ）を重層した。最後に、これにＮａＣｌ
溶液（１５０ｍｌ）を重層し、ついでスイングアウトロ
ーラーを用い、１００,０００ｇ、室温にて３０分間遠
心分離にかけた。水溶液に比べて低い密度を有する精製
Ｘａ因子／ＰＣＰＳ複合体を含有する層を上澄み液とし
て分離することができた。
て、１ｍｌ当たり５ＵのＸａ因子および５ｍｇのＰＣＰ
Ｓを含有するようにした。この溶液（０.５ｍｌ）を３
０％（ｗ／ｖ）フィコール４００溶液（ファルマシア、
１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液中）（１ｍｌ）と混合し
た。この混合物を超遠心分離管に入れ、１０％フィコー
ル溶液（３ｍｌ）を重層した。最後に、これにＮａＣｌ
溶液（１５０ｍｌ）を重層し、ついでスイングアウトロ
ーラーを用い、１００,０００ｇ、室温にて３０分間遠
心分離にかけた。水溶液に比べて低い密度を有する精製
Ｘａ因子／ＰＣＰＳ複合体を含有する層を上澄み液とし
て分離することができた。
【００４４】実施例２０ 活性化プロテインＣ、Ｘａ因子およびリン脂質小胞から
なる複合体を実施例１７に従って製造した。凍結乾燥複
合体を水で再構成し、ウルトラフリー−ＭＣフィルター
ユニット、排除限界１００,０００ダルトン（ポリスル
ホンメンブランズ、ミリポア）上、４０００ｒｐｍで３
０分間遠心分離にかけることにより出発容量の３倍に濃
縮した。このようにして得られ保持された物質には、活
性化プロテインＣ、Ｘａ因子およびリン脂質小胞の精製
複合体が含まれていた。
なる複合体を実施例１７に従って製造した。凍結乾燥複
合体を水で再構成し、ウルトラフリー−ＭＣフィルター
ユニット、排除限界１００,０００ダルトン（ポリスル
ホンメンブランズ、ミリポア）上、４０００ｒｐｍで３
０分間遠心分離にかけることにより出発容量の３倍に濃
縮した。このようにして得られ保持された物質には、活
性化プロテインＣ、Ｘａ因子およびリン脂質小胞の精製
複合体が含まれていた。
【００４５】タンパク質とリン脂質との複合体の安定性 実施例２１：Ｘａ因子／ＰＣＰＳ小胞複合体の凍結乾燥
工程での安定性 ＰＣＰＳ小胞を実施例１および２の記載に従って製造し
た。これらをＸａ因子（実施例１４の記載に従って製造
した）と混合し、１５０ｍＭ／ｌ ＮａＣｌおよび５ｍ
Ｍ／ｌ ＣａＣｌ2の水溶液中に１ｍｌ当たり０.５ｍｇ
のリン脂質小胞および４７ＵのＸａ因子を含有するよう
にした。この複合体を凍結乾燥した。これとの比較のた
め、Ｘａ因子を同じ濃度にて凍結乾燥したが、ＰＣＰＳ
小胞は用いなかった。ついで、ドイツ特許出願第Ｐ４３
２５８７２.７に従い、出発容量の蒸留水で再構成した
後に凍結乾燥調製物のＸａ因子活性を測定し、凍結乾燥
前のＸａ因子の量と比較した（表を参照）。
工程での安定性 ＰＣＰＳ小胞を実施例１および２の記載に従って製造し
た。これらをＸａ因子（実施例１４の記載に従って製造
した）と混合し、１５０ｍＭ／ｌ ＮａＣｌおよび５ｍ
Ｍ／ｌ ＣａＣｌ2の水溶液中に１ｍｌ当たり０.５ｍｇ
のリン脂質小胞および４７ＵのＸａ因子を含有するよう
にした。この複合体を凍結乾燥した。これとの比較のた
め、Ｘａ因子を同じ濃度にて凍結乾燥したが、ＰＣＰＳ
小胞は用いなかった。ついで、ドイツ特許出願第Ｐ４３
２５８７２.７に従い、出発容量の蒸留水で再構成した
後に凍結乾燥調製物のＸａ因子活性を測定し、凍結乾燥
前のＸａ因子の量と比較した（表を参照）。
【表１】 この表は、混合調製物中のＸａ因子に対する小胞リン脂
質の安定化効果を示している。
質の安定化効果を示している。
【００４６】実施例２２：溶液中でのＸａ因子／ＰＣＰ
Ｓ小胞複合体の安定性 ＰＣＰＳ小胞とＸａ因子との複合体を実施例２１の記載
と同様にして製造し、凍結乾燥した。再構成後、溶液を
２２℃にて２０時間貯蔵した。ついで、Ｘａ因子の活性
を測定した。以下の表は、複合体を形成していないＸａ
因子と比較したＰＣＰＳ小胞複合体中でのＸａ因子の安
定性を示している。
Ｓ小胞複合体の安定性 ＰＣＰＳ小胞とＸａ因子との複合体を実施例２１の記載
と同様にして製造し、凍結乾燥した。再構成後、溶液を
２２℃にて２０時間貯蔵した。ついで、Ｘａ因子の活性
を測定した。以下の表は、複合体を形成していないＸａ
因子と比較したＰＣＰＳ小胞複合体中でのＸａ因子の安
定性を示している。
【表２】
【００４７】実施例２３：プロテインＣ／Ｘａ因子／Ｐ
ＣＰＳ小胞複合体の凍結乾燥での安定性 プロテインＣ、Ｘａ因子およびＰＣＰＳ小胞からなる複
合体を実施例１７と同様にして製造し、凍結乾燥した。
この調製物は、１５０ｍＭ ＮａＣｌの水溶液中に０.５
ｍｇのリン脂質小胞／ｍｌ、１０ＵのプロテインＣ／ｍ
ｌおよび４７ＵのＸａ因子／ｍｌを含有していた。これ
との比較のため、プロテインＣおよびＸａ因子を同濃度
にて凍結乾燥したが、ＰＣＰＳ小胞は用いなかった。つ
いで、Ｘａ因子活性を実施例２１と同様にして測定し、
プロテインＣ活性は出発容量の蒸留水で再構成した後の
凍結乾燥調製物における発色試験（イムノクロムＰＣ、
イムノ）を用いて測定し、凍結乾燥前のＸａ因子および
プロテインＣのそれぞれの量と比較した。
ＣＰＳ小胞複合体の凍結乾燥での安定性 プロテインＣ、Ｘａ因子およびＰＣＰＳ小胞からなる複
合体を実施例１７と同様にして製造し、凍結乾燥した。
この調製物は、１５０ｍＭ ＮａＣｌの水溶液中に０.５
ｍｇのリン脂質小胞／ｍｌ、１０ＵのプロテインＣ／ｍ
ｌおよび４７ＵのＸａ因子／ｍｌを含有していた。これ
との比較のため、プロテインＣおよびＸａ因子を同濃度
にて凍結乾燥したが、ＰＣＰＳ小胞は用いなかった。つ
いで、Ｘａ因子活性を実施例２１と同様にして測定し、
プロテインＣ活性は出発容量の蒸留水で再構成した後の
凍結乾燥調製物における発色試験（イムノクロムＰＣ、
イムノ）を用いて測定し、凍結乾燥前のＸａ因子および
プロテインＣのそれぞれの量と比較した。
【表３】 この表は、複合体中のプロテインＣおよびＸａ因子に対
するリン脂質小胞の安定化効果を示している。
するリン脂質小胞の安定化効果を示している。
【００４８】実施例２４：プロテインＣ／Ｘａ因子／Ｐ
ＣＰＳ小胞複合体の溶液中での安定性 プロテインＣ、Ｘａ因子およびＰＣＰＳ小胞の複合体を
実施例２３と同様にして製造し、凍結乾燥した。再構成
した後、溶液を２２℃にて２０時間貯蔵した。ついで、
プロテインＣおよびＸａ因子の活性を測定した。以下の
表は、複合体を形成していない因子と比較してＰＣＰＳ
小胞複合体においてプロテインＣおよびＸａ因子の安定
性が増大することを示している。
ＣＰＳ小胞複合体の溶液中での安定性 プロテインＣ、Ｘａ因子およびＰＣＰＳ小胞の複合体を
実施例２３と同様にして製造し、凍結乾燥した。再構成
した後、溶液を２２℃にて２０時間貯蔵した。ついで、
プロテインＣおよびＸａ因子の活性を測定した。以下の
表は、複合体を形成していない因子と比較してＰＣＰＳ
小胞複合体においてプロテインＣおよびＸａ因子の安定
性が増大することを示している。
【表４】
【００４９】タンパク質／リン脂質複合体のインビトロ
特徴付け 実施例２５ 本発明による調製物の有効性を試験するため、以下の試
験系を用いた。ＶＩＩＩ因子阻害剤血漿（４５ベセスダ
ユニット／ｍｌ）（１００μｌ）を凝固測定管中で１５
０ｍＭ ＮａＣｌを含有する２０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝
液（ｐＨ７.４；ＴＢＳ）（１００μｌ）と混合し、さ
らに１００μｌの０.０２５Ｍ塩化カルシウム溶液で再
度カルシウム添加した。分析すべき試料（１００μｌ）
を添加したらすぐに、凝固測定計（シュニットガー／グ
ロス（Ｓchnitger／Ｇross））を用いて３７℃にて混合
物の凝固時間を測定した。表示した被験物質の試料とし
て純粋なＴＢＳ緩衝液を用いた場合には、凝固時間は８
２０秒であった。これに対し、この試験系における正常
血漿の凝固時間は約３５０秒であった。
特徴付け 実施例２５ 本発明による調製物の有効性を試験するため、以下の試
験系を用いた。ＶＩＩＩ因子阻害剤血漿（４５ベセスダ
ユニット／ｍｌ）（１００μｌ）を凝固測定管中で１５
０ｍＭ ＮａＣｌを含有する２０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝
液（ｐＨ７.４；ＴＢＳ）（１００μｌ）と混合し、さ
らに１００μｌの０.０２５Ｍ塩化カルシウム溶液で再
度カルシウム添加した。分析すべき試料（１００μｌ）
を添加したらすぐに、凝固測定計（シュニットガー／グ
ロス（Ｓchnitger／Ｇross））を用いて３７℃にて混合
物の凝固時間を測定した。表示した被験物質の試料とし
て純粋なＴＢＳ緩衝液を用いた場合には、凝固時間は８
２０秒であった。これに対し、この試験系における正常
血漿の凝固時間は約３５０秒であった。
【００５０】実施例１６に従って製造した調製物を、
０.８８ｍＵのＸａ因子および０.３μｇのリン脂質／ｍ
ｌの濃度で試験した。添加物として、ＡＴ３６８８８３
の方法に従って製造したＦＥＩＢＡ（０.１Ｕ）かまた
は組換えＶＩＩａ因子（ノボ・ノルディスク（Ｎovo Ｎ
ordisk））（０.１Ｕ）のいずれかを試験した。また、
実施例１および２の方法に従って製造したリン脂質小胞
（０.３μｇ／ｍｌ）を用いて実施例１４の方法に従っ
て製造したＦＥＩＢＡ調製物（０.０１；０.１；１.０
Ｕ／ｍｌ）の混合物またはＸ因子（０.０１；０.１；
１.０Ｕ／ｍｌ）の混合物を試験した。試験した物質が
凝固時間に及ぼす効果を以下の表に示す。凝固タンパク
質とリン脂質小胞との複合体を含有する調製物による凝
固時間の短縮
０.８８ｍＵのＸａ因子および０.３μｇのリン脂質／ｍ
ｌの濃度で試験した。添加物として、ＡＴ３６８８８３
の方法に従って製造したＦＥＩＢＡ（０.１Ｕ）かまた
は組換えＶＩＩａ因子（ノボ・ノルディスク（Ｎovo Ｎ
ordisk））（０.１Ｕ）のいずれかを試験した。また、
実施例１および２の方法に従って製造したリン脂質小胞
（０.３μｇ／ｍｌ）を用いて実施例１４の方法に従っ
て製造したＦＥＩＢＡ調製物（０.０１；０.１；１.０
Ｕ／ｍｌ）の混合物またはＸ因子（０.０１；０.１；
１.０Ｕ／ｍｌ）の混合物を試験した。試験した物質が
凝固時間に及ぼす効果を以下の表に示す。凝固タンパク
質とリン脂質小胞との複合体を含有する調製物による凝
固時間の短縮
【表５】
【００５１】種々のリン脂質小胞型の生物学的インビト
ロ活性 実施例２６ 種々のリン脂質の混合物を種々の組成で含むリン脂質小
胞を上記実施例の記載に従って製造し、Ｘａ因子との混
合調製物とした。かくして得られたＸａ因子−リン脂質
小胞複合体を、実施例２５と同様にしてＶＩＩＩ因子阻
害剤血漿に対する凝固時間短縮の効果を調べた。その結
果（凝固時間）を以下の表に示す。
ロ活性 実施例２６ 種々のリン脂質の混合物を種々の組成で含むリン脂質小
胞を上記実施例の記載に従って製造し、Ｘａ因子との混
合調製物とした。かくして得られたＸａ因子−リン脂質
小胞複合体を、実施例２５と同様にしてＶＩＩＩ因子阻
害剤血漿に対する凝固時間短縮の効果を調べた。その結
果（凝固時間）を以下の表に示す。
【表６】
【表７】
【００５２】凡例： ＤＯＰＣ：１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３
−ホスホコリン ＰＯＰＳ：１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−
グリセロ−３−ホスホセリン ＣＨＯＬ：コレステロール ＣＬＰ：ジホスファチジルグリセリン（カルジオリピ
ン） ＰＩ：ホスファチジルイノシトール ＤＭＰＣ：１,２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−
３−ホスホコリン ＤＭＰＳ：１,２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−
３−ホスホセリン ＤＰＰＣ：１,２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−
３−ホスホコリン ＤＯＰＧ：１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３
−ホスホグリセリン ＤＯＰＡ：１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３
−リン酸
−ホスホコリン ＰＯＰＳ：１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−
グリセロ−３−ホスホセリン ＣＨＯＬ：コレステロール ＣＬＰ：ジホスファチジルグリセリン（カルジオリピ
ン） ＰＩ：ホスファチジルイノシトール ＤＭＰＣ：１,２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−
３−ホスホコリン ＤＭＰＳ：１,２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−
３−ホスホセリン ＤＰＰＣ：１,２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−
３−ホスホコリン ＤＯＰＧ：１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３
−ホスホグリセリン ＤＯＰＡ：１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３
−リン酸
【００５３】実施例２７ Ｘａ因子（２０ｍＵ）およびＰＣＰＳ（４.９６μｇ／
ｍｌ）を用いて実施例１４に従って製造した複合体およ
びその種々の希釈液のＶＩＩＩ因子阻害剤血漿中での有
効性を、混合後すぐ、および３７℃にて１時間インキュ
ベートした後に以下の凝固試験で測定した。試料（２０
０μｌ）を凝固測定管中で１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有
する２０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７.４；ＴＢ
Ｓ）（１００μｌ）と混合し、さらに１００μｌの０.
０２５Ｍ塩化カルシウム溶液で再度カルシウム添加し
た。この溶液の添加後すぐ、混合物の凝固時間を凝固測
定計（シュニットガー／グロス）を用いて３７℃にて測
定した。
ｍｌ）を用いて実施例１４に従って製造した複合体およ
びその種々の希釈液のＶＩＩＩ因子阻害剤血漿中での有
効性を、混合後すぐ、および３７℃にて１時間インキュ
ベートした後に以下の凝固試験で測定した。試料（２０
０μｌ）を凝固測定管中で１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有
する２０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７.４；ＴＢ
Ｓ）（１００μｌ）と混合し、さらに１００μｌの０.
０２５Ｍ塩化カルシウム溶液で再度カルシウム添加し
た。この溶液の添加後すぐ、混合物の凝固時間を凝固測
定計（シュニットガー／グロス）を用いて３７℃にて測
定した。
【００５４】表示した被験物質中の試料としてＶＩＩＩ
因子阻害剤血漿（４５ベセスダユニット／ｍｌ）とＴＢ
Ｓ緩衝液との１＋１混合物を用いた場合には、凝固時間
は５００秒以上であった。比較として、実施例１４の方
法に従って製造した純粋なＸａ因子を試験した。その結
果を以下の表にまとめて示す。ＶＩＩＩ因子阻害剤血漿
とともにインキュベートする前およびインキュベートし
た後におけるＸａ因子／ＰＣＰＳおよびＸａ因子の凝固
時間
因子阻害剤血漿（４５ベセスダユニット／ｍｌ）とＴＢ
Ｓ緩衝液との１＋１混合物を用いた場合には、凝固時間
は５００秒以上であった。比較として、実施例１４の方
法に従って製造した純粋なＸａ因子を試験した。その結
果を以下の表にまとめて示す。ＶＩＩＩ因子阻害剤血漿
とともにインキュベートする前およびインキュベートし
た後におけるＸａ因子／ＰＣＰＳおよびＸａ因子の凝固
時間
【表８】 本発明によるＸａ因子／ＰＣＰＳの複合体は複合体を形
成していないＸａ因子よりも高い安定性を有する。低濃
度においては、Ｘａ因子／ＰＣＰＳはまたＶＩＩＩ因子
阻害剤血漿中で１時間インキュベートした後に凝固時間
の短縮をもたらすが、複合体を形成していないＸａ因子
ではその凝固時間短縮活性を失ってしまっている。
成していないＸａ因子よりも高い安定性を有する。低濃
度においては、Ｘａ因子／ＰＣＰＳはまたＶＩＩＩ因子
阻害剤血漿中で１時間インキュベートした後に凝固時間
の短縮をもたらすが、複合体を形成していないＸａ因子
ではその凝固時間短縮活性を失ってしまっている。
【００５５】タンパク質／リン脂質複合体のインビボ特
徴付け 実施例２８：血栓形成性に関する試験 ＡＴ３６８８８３の方法に従って製造したＦＥＩＢＡ調
製物を、ベスラー−スタシス（Ｗessler−Ｓtasis）モ
デルにおいてＰＣＰＳ小胞との複合体としておよび複合
体を形成しない形態にて血栓形成性について試験した。
ＰＣＰＳ小胞を実施例１および２の方法に従って製造し
たが、その際、適当なフィルターの選択により１００ｎ
ｍおよび／または５０ｎｍの平均サイズの小胞が得られ
た。ウサギ１ｋｇ当たり４ＵのＦＥＩＢＡおよび６０μ
ｇのＰＣＰＳを用いた。ＦＥＩＢＡ調製物の血栓形成性
は、ＰＣＰＳ小胞との複合体形成により増大しなかっ
た。すべての場合において、上記欝血モデルにおいて血
栓形成は示されなかった（スコア＝０〜１）。
徴付け 実施例２８：血栓形成性に関する試験 ＡＴ３６８８８３の方法に従って製造したＦＥＩＢＡ調
製物を、ベスラー−スタシス（Ｗessler−Ｓtasis）モ
デルにおいてＰＣＰＳ小胞との複合体としておよび複合
体を形成しない形態にて血栓形成性について試験した。
ＰＣＰＳ小胞を実施例１および２の方法に従って製造し
たが、その際、適当なフィルターの選択により１００ｎ
ｍおよび／または５０ｎｍの平均サイズの小胞が得られ
た。ウサギ１ｋｇ当たり４ＵのＦＥＩＢＡおよび６０μ
ｇのＰＣＰＳを用いた。ＦＥＩＢＡ調製物の血栓形成性
は、ＰＣＰＳ小胞との複合体形成により増大しなかっ
た。すべての場合において、上記欝血モデルにおいて血
栓形成は示されなかった（スコア＝０〜１）。
【００５６】タンパク質／リン脂質小胞複合体の加熱処
理 実施例２９：Ｘａ因子とＰＣＰＳ小胞との複合体の加熱
処理 実施例１４または１６に従って製造したＸａ因子および
ＰＣＰＳの凍結乾燥物を、ＥＰ１５９３１１の方法に従
い、６０℃で１０時間および８０℃で１時間処理した。
再構成した溶液のＸａ因子活性は、加熱処理前の活性の
９０％以上あった。動的光散乱の方法により（マルバー
ンジータサイザー４）、小胞構造の保存を検出すること
ができた。
理 実施例２９：Ｘａ因子とＰＣＰＳ小胞との複合体の加熱
処理 実施例１４または１６に従って製造したＸａ因子および
ＰＣＰＳの凍結乾燥物を、ＥＰ１５９３１１の方法に従
い、６０℃で１０時間および８０℃で１時間処理した。
再構成した溶液のＸａ因子活性は、加熱処理前の活性の
９０％以上あった。動的光散乱の方法により（マルバー
ンジータサイザー４）、小胞構造の保存を検出すること
ができた。
【００５７】実施例３０：ＦＥＩＢＡとＰＣＰＳ小胞と
の複合体の加熱処理 実施例１４と同様にしてリン脂質小胞とＦＥＩＢＡとの
複合体を製造し、凍結乾燥した。再構成後、凍結乾燥物
は４ｇ Ｎａ3クエン酸２Ｈ2Ｏ／ｌおよび８ｇＮａＣｌ
／ｌの緩衝液（ｐＨ７.０）中に３０ＵのＦＥＩＢＡ／
ｍｌおよび３.４ｍｇのＰＣＰＳ／ｍｌを含有してい
た。この組成に対応する凍結乾燥物をＥＰ１５９３１１
の方法に従い、６０℃で１０時間および８０℃で１時間
処理した。加熱処理後の再構成溶液中のＦＥＩＢＡ活性
は、加熱処理前の活性の９０％以上であった。動的光散
乱の方法により（マルバーンジータサイザー４）、小胞
構造の保存を検出することができた。
の複合体の加熱処理 実施例１４と同様にしてリン脂質小胞とＦＥＩＢＡとの
複合体を製造し、凍結乾燥した。再構成後、凍結乾燥物
は４ｇ Ｎａ3クエン酸２Ｈ2Ｏ／ｌおよび８ｇＮａＣｌ
／ｌの緩衝液（ｐＨ７.０）中に３０ＵのＦＥＩＢＡ／
ｍｌおよび３.４ｍｇのＰＣＰＳ／ｍｌを含有してい
た。この組成に対応する凍結乾燥物をＥＰ１５９３１１
の方法に従い、６０℃で１０時間および８０℃で１時間
処理した。加熱処理後の再構成溶液中のＦＥＩＢＡ活性
は、加熱処理前の活性の９０％以上であった。動的光散
乱の方法により（マルバーンジータサイザー４）、小胞
構造の保存を検出することができた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ユルゲン・ジークマン オーストリア、アー−1210ヴィーン、ゲ ラスドルファー・シュトラーセ153／209 番 (72)発明者 ペーター・トゥレチェック オーストリア、アー−1190ヴィーン、フ ートヴァイデンガッセ41番 (56)参考文献 特開 昭56−127307（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−70814（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−46921（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−179122（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−206314（ＪＰ，Ａ) 特表 平４−501429（ＪＰ，Ａ) 特表 昭58−500548（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 9/127 A61K 9/19
Claims (24)
- 【請求項１】 脂質小胞中および／または脂質小胞上に
結合したタンパク質を含む安定でウイルス安全性の調製
物であって、静脈内注射に適したものであり、存在して
いるかもしれないウイルスの不活化処理を施したことを
特徴とする調製物。 - 【請求項２】 該タンパク質が凝固活性である請求項１
に記載の調製物。 - 【請求項３】 化学的手段および／または物理的手段に
よる処理を施した請求項１に記載の調製物。 - 【請求項４】 加熱処理した請求項３に記載の調製物。
- 【請求項５】 内因系または外因系血液凝固の血液凝固
因子を含む請求項１〜４のいずれかに記載の調製物。 - 【請求項６】 活性型の血液凝固因子またはコファクタ
ーを含む請求項５に記載の調製物。 - 【請求項７】 該活性化凝固因子がビタミンＫ依存性タ
ンパク質である請求項６に記載の調製物。 - 【請求項８】 該活性化凝固因子がＩＩａ因子、ＶＩＩ
ａ因子、ＩＸａ因子およびＸａ因子よりなる群から選ば
れたものである請求項７に記載の調製物。 - 【請求項９】 Ｘａβ因子を含む請求項８に記載の調製
物。 - 【請求項１０】 ＩＩ因子、ＶＩＩ因子、ＩＸ因子、Ｘ
因子、プロテインＣ、活性化プロテインＣ、プロテイン
ＳおよびプロテインＺよりなる群から選ばれたタンパク
質をさらに含む請求項６〜９のいずれかに記載の調製
物。 - 【請求項１１】 組織因子または組織因子の断片をさら
に含む請求項６〜１０のいずれかに記載の調製物。 - 【請求項１２】 ＶＩＩＩ因子、活性化ＶＩＩＩ因子お
よび／またはフォンビルブラント因子をさらに含む請求
項６〜１１のいずれかに記載の調製物。 - 【請求項１３】 Ｖ因子および／または活性化Ｖ因子を
さらに含む請求項５〜１１のいずれかに記載の調製物。 - 【請求項１４】 該タンパク質が酵素および／または阻
害剤である請求項１〜４のいずれかに記載の調製物。 - 【請求項１５】 該タンパク質が凝固活性リポタンパク
質である請求項１〜４のいずれかに記載の調製物。 - 【請求項１６】 該リポタンパク質がＬｐ（ａ）である
請求項１５に記載の調製物。 - 【請求項１７】 該タンパク質が抗原である請求項１〜
４のいずれかに記載の調製物。 - 【請求項１８】 該脂質小胞が、動的光散乱法に従って
測定された、３０〜９００ｎｍ、好ましくは１００〜５
００ｎｍの範囲のサイズを有する請求項１〜１７のいず
れかに記載の調製物。 - 【請求項１９】 炭水化物やプロテアーゼ阻害剤のよう
な通常の安定化剤を含まない請求項１〜１８のいずれか
に記載の調製物。 - 【請求項２０】 液体−凍結形態または凍結乾燥形態で
存在する請求項１〜１９のいずれかに記載の調製物。 - 【請求項２１】 不活化処理前の生物学的活性に関して
少なくとも９０％の活性を有するタンパク質を含む請求
項１〜２０のいずれかに記載の調製物。 - 【請求項２２】 小胞分散物をタンパク質と混合した後
に凍結乾燥工程を行い、脂質小胞中および／または脂質
小胞上に結合したタンパク質をウイルス不活化処理に供
する工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の調
製物の製造法。 - 【請求項２３】 脂質フィルムの直接水和がタンパク質
の溶液で起こり、脂質小胞中および／または脂質小胞上
に結合したタンパク質をウイルス不活化処理に供する工
程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の調製物の
製造法。 - 【請求項２４】 脂質小胞中および脂質小胞上にタンパ
ク質を導入するために調製した脂質小胞をタンパク質と
直接混合し、脂質小胞中および／または脂質小胞上に結
合したタンパク質をウイルス不活化処理に供する工程を
含むことを特徴とする、請求項１に記載の調製物の製造
法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4416166A DE4416166C2 (de) | 1994-05-06 | 1994-05-06 | Stabiles Präparat zur Behandlung von Blutgerinnungsstörungen |
| DE4416166-2 | 1994-05-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07304658A JPH07304658A (ja) | 1995-11-21 |
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Family
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7109458A Expired - Fee Related JP3051650B2 (ja) | 1994-05-06 | 1995-05-08 | 血液凝固疾患の治療のための安定な調製物 |
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|---|---|
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| EP (1) | EP0680764A3 (ja) |
| JP (1) | JP3051650B2 (ja) |
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| DE4430205A1 (de) * | 1994-08-26 | 1996-02-29 | Behringwerke Ag | Zusammensetzungen, die als Gegenmittel für Blut-Antikoagulanzien geeignet sind und deren Verwendung |
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