DE3400413A1

DE3400413A1 - Pasteurisierte, therapeutisch aktive faktor-ix-konzentrate und verfahren zu deren herstellung

Info

Publication number: DE3400413A1
Application number: DE19843400413
Authority: DE
Inventors: Gautam Kensington Calif. Mitra; Paul K. Hercules Calif. Ng
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1983-01-13
Filing date: 1984-01-07
Publication date: 1984-07-19
Also published as: DE3400413C2; US4470968A

Description

Pasteurisierte, therapeutisch aktive Faktor-IX-Konzentrate und Verfahren zu deren Herstellung

Die Erfindung betrifft pasteurisierte Zusammensetzungen für therapeutische Anwendungen und Verfahren zu deren Herstellung. Die Erfindung betrifft insbesondere pasteurisierte Zusammensetzungen, die ein Konzentrat von Koagulationsfaktoren II, VII, IX und X enthalten.

Weitere Ziele der Erfindung gehen aus der nachfolgenden Beschreibung hervor, in welcher alle Teile und Prozentsätze auf das Gewicht bezogen sind., sofern nicht anders angegeben. ,

Aus humanem Blutplasma können zahlreiche brauchbare Blutfraktionen und Blutproteine durch Fraktionieren nach .bekannten Techniken erhalten werden, z.B. der Alkoholfraktionierungsmethode von Conn, beschrieben in US-PS 2 390 074 (1945) und in Journal of the American

15 Chemical Society, Band 68, Seite 459 (1947) und der

Rivanol -Ammoniumsulfatmethode.

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Die vorerwähnten Methoden sowie auch andere Variationen und Verfahren, werden in "The Plasma Proteins", 2. Ausgabe, Band III, Seiten 548 bis 550, Academic Press, New York, New York (1977) zusammengefasst. Diese Blutfraktionen enthalten biologisch aktive Proteine, die gewisse therapeutische Qualitäten aufweisen. Beispielsweise ist ein Konzentrat der Faktoren II, VII, IX und X für die- Behandlung von an Hämophilie leidenden Personen geeignet. Man schätzt bis zu 100.000 Fälle an angeborener Hämophilie in den Vereinigten Staaten von Amerika. Von diesen sind annähernd 20.000 Fälle von Hämophilie B, bei denen im Blut solcher Patienten entweder die Plasmathromboplastinkomponente vollständig fehlt oder ein erheblicher Mangel an der Plasmathromboplastinkomponente vorliegt.

Diese Krankheit tritt deshalb in verschiedenen Schweregraden auf und erfordert eine wöchentliche bis zu 1 bis 2 mal jährliche Therapie. Im Falle des vollständigen Fehlens ist eine Austauschtherapie einmal wöchentlieh erforderlich, während in solchen Fällen, bei denen nur ein Teilmangel vorliegt, eine Therapie nur erforderlich wird, wenn Blutungsepisoden eintreten, die in einigen Fällen nur einmal jährlich auftreten. Die Blutungsepisoden bei den angeborenen Teilmangelfällen werden im allgemeinen durch eine vorübergehend erworbene Empfindlichkeit und nicht allein durch eine Verletzung verursacht. Durch intravenöse Injektionen einer ausreichend grossen Menge an Frischplasma oder einer äquivalenten Menge an Frischblut, kann man die Defekte bei einer unter dem Mangel leidenden Person zeitweilig

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.iß-

korrigieren. Die positive Wirkung hält oft für 2 bis 3 Wochen an, obwohl die Koagulationsdefekte, gemessen durch in vitro Versuche in dem Blut des Patienten, nur für 2 oder 3 Tage eine Besserung zeigen. Eine solche Therapie mit Frischplasma oder Frischblut ist zwar wirksam, weist jedoch erhebliche Nachteile auf:

(1) man benötigt schnell zur Verfügung stehende grosse Mengen an Frischplasma;

(2) während der Verabreichung des Plasmas ist ein Krankenhausaufenthalt erforderlich;

(3) zahlreiche Patienten werden gegen wiederholte Blut- oder Plasmainfusionen empfindlich und es können schliesslich lebensgefährliche Transfusionsreaktionen auftreten; .

(4) im besten Fall kann das Plasma nur zum Teil den Mangel beheben;

■ (5) eine Langzeitbehandlung oder ein chirurgischer Eingriff sind nicht möglich, weil die grossen Mengen an benötigtem Blut oder Plasma akute und gefährliche Ödeme hervorrufen.

Wegen der obigen Gründe sind Konzentrate der Koagulationsfaktoren II, Uli, IX und X (Faktor-IX-Konzentrate) für die Verabreichung an Hämophilie B-Patienten entwickelt worden (z.B. die Konzentrate der Faktoren II,

30 VII, IX und X gemäß US-PS 3 717 708).

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Ein Problem/ das sich den Anwendern von Faktor-IX-Konzentraten stellt, ist die Wärmeinstabilität der darin enthaltenen therapeutisch aktiven Proteine. In vielen Fällen stellt man einen erheblichen und in einigen Fällen einen vollständigen Aktivitätsverlust fest, wenn man diese Konzentrate oberhalb der physiologisch verträglichen Temperaturen, d.h. oberhalb etwa 40 bis 45⁰C, erwärmt. Infolgedessen erfordern diese Stoffe eine besondere Vorsicht während der Zubereitung und Lagerung, um eine solche Desaktivierung zu minimieren.

Die Wärmeinstabilität der vorerwähnten Proteine macht sie unpasteurisierbar. Aus Plasma isolierte, therapeutsch aktive Proteine können Viren enthalten, z.B. Hepatitis-Viren, die in dem Ausgangsmaterial für die Proteinfraktion, nämlich dem Spenderblut, vorliegen. Es besteht daher die Gefahr einer Hepatitisansteckung bei den Personen, die unpasteurisierte Fraktionen von Blutplasmafraktionen erhalten, weil man die Anwesenheit des Virus mit den bekannten Verfahren nicht mit Sicherheitnachweisen kann; In zahlreichen Situationen muss vom Arzt entschieden werden, ob das Infektionsrisiko für den Patienten durch den Schaden, der dem Patienten entstünde, wenn er keine therapeutische Behandlung mit der Plasmafraktion erhält, wieder wettgemacht wird.

Einige therapeutisch aktive Proteine aus Plasma sind erfolgreich pasteurisiert worden. So ist es bekannt, dass man Albumin durch Erhitzen auf 60⁰C oder 64⁰C während 10 Stunden (Gellis et al, J. Clin. Invest.,

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Bd. 27, Seiten 239 bis 244 (1948)) in Gegenwart von gewissen Stabilisatoren, wie Acetyltryptophan und Natriumcaprylat, pasteurisieren kann. Personen, die dieses pasteurisierte Material erhielten, wurden nicht mit Hepatitis angesteckt und dies ist ein An-.zeichen dafür, dass die Hepatitis-Viren inaktiviert wurden, während die Albuminaktivität unter den vorerwähnten Erwärmungsbedingungen beibehalten wurde. Eine Plasmaproteinfraktion (Human) wurde auch schon 10_:- während der Pasteurisierung nach der oben erwähnten Methode stabilisiert.

Ein Verfahren zum Pasteurisieren von Plasminogen wird von Baumgarten et al in US-PS 3 227 626 beschrieben.· Eine wässrige Zubereitung, enthaltend 0,25 bis 20 mg/ml Plasminogen und weiterhin 0,1 bis 0,5 Mol Lysin mit einem pH von 5,3 bis 7,5, wurde während 10 Stunden bei 6O⁰C erwärmt. Wie in der Patentschrift festgestellt wird, wurden die Hepatitis-Viren zerstört und die Gefahr einer Hepatitisübertragung wurde unter Beibehaltung der Plasminogenaktivität behoben. Versuche, Plasminogen unter den vorerwähnten Bedingungen in Abwesenheit von Lysin zu pasteurisieren, ergaben eine vollständige Zerstörung der Plasminogenaktivität. Interes-

25 sant ist dabei die Feststellung, dass Plasminogen

mit N-Acetyltryptophan und Natriumcaprylat während der Pasteurisierung nicht stabilisiert werden kann, noch dass man Albumin und Plasmaproteinfraktion (human) in Gegenwart von Lysin pasteurisieren kann.

Singher hat ein Verfahren zur Behandlung von Plasminogen

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beschrieben, unter Erhalt eines Materials, das nicht mit Hepatitis-Viren kontaminiert ist (US-PS 2 897 123) In der patentierten Pasteurisierungstechnik werden wässrige Lösungen von Plasminogen während etwa 10 Stunden auf etwa 60⁰C erwärmt. Die Aktivität des Plasminogens wird beibehalten, wenn die Lösungen einen pH im Bereich von nicht weniger als 3 oder mehr als 6,5 und eine Ionenstärke von mehr als 0,2 aufweisen.

Eine weitere Methode zur Entfernung von Hepatitis-Viren aus biologischem Material wird in US-PS 4 168 beschrieben. Das zu behandelnde Material wird mit einer Zubereitung in Berührung gebracht, die Agarosegel oder perlförmiges Polyacrylamid, gekuppelt mit einer

15 Auswahl an hydrophoben Liganden, sein kann. Plasma

und Albumin wurden zur Entfernung von Hepatitis-Viren der obigen Reinigungsmethode unterworfen.

Wässrige Lösungen von Enzymthrombin wurden stabilisiert (Seegers, Arch. Biochem., 1944, Bd. 3, Seiten 363 bis 367), indem man in Gegenwart von Sättigungsmengen von gewissen Glykosiden auf 50⁰G erwärmte. Die stabilisierten Lösungen wurden bei der obigen Temperatur während 48 Stunden oder mehr unter einem minimalen Aktivitätsverlust erwärmt. Andererseits hat Seegers auch offenbart, dass Glykoside und Polyole nur eine minimale Wirkung haben, Enzympröthrombin zu stabilisieren. Die reversible Denaturierung von Lysozym und Ribonuklease wurde von Gerlsma et al, Int. J. Peptide Protein Res., Bd. 4, Seiten 377 bis 383 (1972) untersucht. Die Autoren fanden, dass gewisse mehrwertige

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Alkohole die Temperaturen, bei denen die Enzyme denaturisiert wurden, etwas erhöhten. Schliesslich stellten Simpson et al in J. Am. Chem. Soc., Bd. 75, Nr. 21, Seiten 5139 bis 5152 (1953) und Donovan in J. Sei. Fd. Agric, Bd. 28., Seiten 571 bis 578 (1977) fest, dass die Denaturisierungstemperatur von'Ovalbumin (ein . Eiweissprotein) etwas erhöht wurde in Gegenwart von Saccharose in einer wässrigen Lösung des Proteins. Donovan hat jedoch betont, dass die Denaturisierungstemperatur von Ovalbumin und S-Ovalbumin 84,5⁰C bzw. 92,5⁰C beträgt. Weiterhin haben Ovalbumin und S-Ovalbumin ebenso wie die vorerwähnten Enzyme keine therapeutische Aktivität bei der Behandlung von Krankheiten beim Menschen, während Blutplasmaproteine therapeutisch aktiv sind. Wie unten dargelegt wird, desaktivieren proteolytische Enzyme Blutplasmaproteine.

Singher zählt in dem vorerwähnten US-Patent einige Methoden ζμΓ Zerstörung von Hepatitis-Viren auf. Die am wenigsten wirksame Methode betrifft die Verwendung von entweder Stickstofflost oder ß-Propiolakton. Eine Hochenergiebestrahlung in geeigneten Dosen ist wirksam, zerstört jedoch bei der Anwendung auf humane Blutprodukte die biologische Aktivität. Wärme wird ebenfalls als wirksam gegen Hepatitis-Viren erkannt, wobei die bevorzugte Behandlung darin besteht, dass man das Material während 10 Stunden auf 60⁰C erwärmt. Höhere Temperaturen oberhalb 70⁰C für kürzere Zeiträume oder niedrigere Temperaturen während längerer Zeiträume sind ebenfalls mit erfolgreichen Ergebnissen

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versucht worden. Dabei ist es jedoch wichtig festzustellen, dass höhere Temperaturen wegen der Denaturierungsgefahr der Proteine unerwünscht sind. Ebenso sind niedrige Temperaturen während längerer Zeiträume zu vermeiden, weil eine Reihe von proteolytischen Enzymen unter diesen Bedingungen aktiviert werden und diese aktivierten Enzyme einen Proteinabbau verursachen. Auch die Anwendung von Temperaturen unterhalb 60⁰C zum Pasteurisieren hat nicht gleichbleibend zu .einem Material, das keine infektiösen Viren enthält, geführt.

Wie vorerwähnt, haben Gellis et al erkannt, dass ein Erhitzen auf 60⁰C bis 64⁰C während 10 Stunden erfolgreich die Hepatitis-Viren in Albumin zerstören. Gellis et al haben experimentell nachgewiesen, dass Albumin, das unter den vorerwähnten Bedingungen erwärmt wurde, keine Hepatitis überträgt, selbst wenn vor dem Pasteurisieren Heptatis-Viren vorhanden waren.

Der Autor hat jedoch festgestellt, dass Hepatitis-Viren ein 1-stündiges Erhitzen auf 56⁰C überlebten, eine Temperatur, die üblicherweise zum Inaktivieren von Viren angewendet wird. Obwohl ein 1-stündiges Erhitzen auf Temperaturen von etwa 56⁰C die meisten

25 Viren deaktiviert, wird der Hepatitis-Virus nicht

inaktiviert und Materialien, die Hepatitis-Viren enthalten und die während 1 Stunde auf 56⁰C erwärmt wurden, verursachen eine Hepatitis-Infektion bei Personen, die diese Materialien erhalten.

In dem japanischen Patent 51-134878 (1976) wird die

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Stabilisierung von Faktor XIII gegen Wärmeinaktivierung (60⁰C während 10 Stunden) unter Verwendung von 10 bis 20 % (w/v) eines Stabilisators, wie einer neutralen Aminosäure/ einem Monosaccharid oder einem Zuckeralkohol gelehrt. Weiterhin wird in US-PS 4 297 344 eine Methode zum Wärmestabilisieren von Koagulationsfaktpren II, VIII, XIII, Antithrombin III

und Plasminogen in Gegenwart von 1 bis 3 molaren Mengen von gewissen Aminosäuren und 20 bis 60 % (w/w) Kohlehydraten offenbart. Haptoglobin wurde in Gegenwart eines Stabilisators, wie einer Aminosäure, einem Mono- oder Disaccharid oder einem Zuckeralkohol pasteurisiert.

In der DE-OS 30 43 857 wird ein Verfahren zur Herstellung einer hepatitisfreien Zubereitung von Koagulationsfaktoren II und/oder VII offenbart. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man die Zubereitung des Faktors II und/oder VII mit einer Aminosäure

20 und/oder einem Saccharid oder einem Zuckeralkohol

und einem Chelatbildner, wie Ethylendiamintetraessigsäure oder Ethylenglykol-bis-(2-aminoethylenether)-tetraacetat vermischt und die Mischung zur Inaktivierung von Hepatitis-Viren erwärmt.

Antithrombin-Zusammensetzungen wurden mit Zitrationen vermischt, um das Antithrombin gegen Wärme zu stabilisieren (Holleman et al, Thromb. Haemostatis, 38, 201 (1977)).

Die vorliegende Erfindung stellt eine Methode zur CUT 79

^: ' ^: 3A00413

Verfügung, um die vorerwähnten Probleme zu lösen. Bei dem erfindungsgemässen Verfahren werden Zusammensetzungen/ die ein Konzentrat der Koagulationsfaktoren II, VII, IX und X enthalten, während der Pasteurisierung unter Erwärmen auf eine Temperatur von etwa 60 bis 100⁰C wärmestabilisiert, indem man sie mit wärmestabilisierenden oder pasteurisierungsstabilisierenden Mengen eines Polyols und einer Quelle für Citrationen vermischt. Als Ergebnis des erfindungsgemässen Verfahrens stehen pasteurisierte Zusammensetzungen, enthaltend ein Konzentrat der Koagulationsfaktoren II, VII, IX und X, wie sie bisher nicht erhältlich waren, zur Verfügung, indem man eine Mischung einer unpasteurisierten Proteinzusammensetzung, eines Polyols und einer Quelle für Zitrationen, suspendiert oder solubilisiert, gewöhnlich in einem wässrigen Medium, bei einer Temperatur und während einer ausreichenden Zeit, um die Proteinzusammensetzung zu pasteurisieren, erwärmt. Im Anschluss an die Pasteurisierungs- oder Wärmebehand-

20 lung werden im gewünschten Masse das Polyol und die

Zitrationen ganz oder zum Teil aus der Proteinzusammensetzung nach üblichen Methoden entfernt und die pasteurisierte Proteinzusammensetzung wird dann in üblicher Weise für die vorgesehene therapeutische Anwendung

25. verarbeitet.

Der Hauptvorteil des erfindungsgemässen Verfahren ist die Verfügbarkeit von wärmestabilen und pasteurisierten Zusammensetzungen, enthaltend ein Konzentrat von Koagulationsfaktoren II, ViI, XI und X, die bisher unbekannt und nicht erhältlich waren. Da die therapeutisch aktiven Proteinzusammensetzungen gemäss der

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Erfindung mit einem minimalen Aktivitätsverlust unter Bedingungen erwärmt werden können, die zur Inaktivierung von Hepatitis-Viren bekannt sind, kann man diese wertvollen Stoffe Patienten verabreichen, welche die vollen therapeutischen Vorteile unter einem wesentlich verminderten Risiko, durch Hepatitis-Viren infiziert zu werden, erhalten.

.Wie schon erwähnt, schliessen die erfindungsgemässen Produkte pasteurisierte oder wärmebehandelte Zusammensetzungen aus einem Konzentrat von Koagulationsfaktoren II, VII, IX und X ein, die einer Pasteurisierung oder Erwärmung bei Temperaturen von etwa 60 bis 100⁰C, vorzugsweise etwa 60 bis 75⁰C, unterworfen wurden, nachdem man sie mit wärmestabilisierenden oder pasteurisierungsstabilisierenden Mengen eines Polyols und einer Quelle für Citrationen vermischt hat, wobei die pasteurisierten Zusammensetzungen Polyole und Citrationen enthalten oder davon frei sind.

20 . .

Das Ausgangsmaterial für das erfindungsgemässe Verfahren ist. einö unpasteurisierte Zusammensetzung aus einem Konzentrat von Koägulationsfaktoren II, VII, IX und X, wobei die Zusammensetzung heptatitsinfektiös sein kann, d.h. infektiöse Mengen an Hepatitis-Viren enthalten kann. Man kann Konzentrate von Faktoren II, VII., IX und X (Faktor IX-Konzentrat-Prothrombin-Komplex) aus Blutplasma auf verschiedene Weisen erhalten. Beispielsweise kann man die Methode gemäß US-PS

30 3 717 708 oder irgendeine andere Methode des CUT 79

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hier beschriebenen Standes der Technik anwenden. Beim Verfahren gemäss US-PS 3 717 708 wird Cohn-Supernatant I, Methode 6, aus unmodifiziertem citriertem Humanplasma auf ein Ionenaustauschharz, auf dem Koagulationsfaktoren II, VII, IX und X adsorbiert sind, aufgebracht. Die vorerwähnten Faktoren werden dann selektiv von dem Ionenaustauschharz eluiert. Ein Beispiel für eine andere Methode zur Herstellung eines Faktor XI-Konzentrates ist das Verfahren, welches in US-PS 4 272 523 beschrieben wird. Im allgemeinen besteht bei Faktor IX-Konzentration aus humanem Blutplasma die Gefahr für eine Hepatitisinfektion.

Die Faktor IX-ZusammenSetzung enthält im allgemeinen etwa 1 bis 20 Gew.% der Koagulationsfaktoren, gewöhnlich mindestens etwa 5 Gew.%. Die Koagulationsaktivitäten sind im allgemeinen normalerweise in den Zusammensetzungen in dem folgenden Verhältnis vorhanden: Faktor II : Faktor IX von etwa 0 bis 10, vorzugsweise etwa 0,1 bis 2,0, Faktor VII : Faktor IX von etwa 0 bis 10, vorzugsweise etwa 0,1 bis 2,0 und Faktor X : Faktor IX von etwa 0 bis 10, vorzugsweise etwa 0,1 bis 2,0.

Beim erfindungsgemässen Verfahren wird die zu pasteurisierende Proteinzusammensetzung in einem wässrigen Medium mit einer Menge an Polyol und einer Quelle für Citrationen, die ausreicht, um die Proteinzusammensetzung während der nachfolgenden Pasteurisierung zu stabilisieren, suspendiert oder gelöst. Die Konzentration an Polyol und Citrationen, die erforderlich ist,

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um die Proteinzusammensetzung^ in Übereinstimmung mit der Erfindung zu stabilisieren, hängt von der Kon- ' zentration an therapeutisch aktivem Protein in der Proteinzusammensetzung und von der Art des Polyols ab. Im allgemeinen soll die wärmestabilisierende Menge oder pasteurisierungsstabilisierende Menge des Polyols im Bereich von etwa 1 bis 1000 Teilen, vorzugsweise 5 bis 100 Teilen an Polyol pro Teil Gesamtprotein in der Proteinzusammensetzung liegen. Im allgemeinen wird etwa 1 Teil der Proteinzusammensetzung mit etwa 1 bis 500 Teilen, vorzugsweise 4 bis 200 Teilen eines wässrigen Mediums, enthaltend.etwa 20 %, vorzugsweise wenigstens etwa.30 %, bis zur Sattigungskonzentration (vorzugsweise bei der Pasteurisierungstemperatur) ,eines Polyols auf einer Gewicht-zu-Volumen-Basis, vermischt. Das therapeutisch aktive Protein wird dann als stabilisiert angesehen/ wenn es einen wesentlichen Teil, d.h. wenigstens 40 % seiner therapeutischen Aktivität während der Pasteurisierung beibehält. Vorzugsweise sollen 50 % oder mehr der therapeutischen Aktivität des Faktor IX-Konzentrats während der Pasteurisierung beibehalten werden. Infolgedessen soll die Menge des zugegebenen Polyols gross genug sein, um die vorerwähnte Menge der therapeutischen Aktivität beizubehalten.

Die Menge an Citrationen beträgt im allgemeinen.0,1 bis 1,0 Mol pro Liter der Lösung und vorzugsweise etwa 0,3 bis 0,5 Mol pro Liter.
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Nachdem man die Proteinzusammensetzung mit dem Polyol

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und den Citrationen vermischt hat, wird die Mischung in einer für die Pasteurisierung ausreichenden Zeit und Temperatur erwärmt. Auf diese Weise wird die Mischung beim Erwärmen unter Bedingungen pasteurisiert, von denen bekannt ist, dass Hepatitis-Viren inaktiviert werden. Eine wirksame Pasteurisierung zur Inaktivierung von Hepatitis-Viren und zur Vermeidung des Risikos einer Hepatitisinfektion erzielt man, wenn man die unpasteurisierte Proteinzusammensetzung 1.0 auf eine Temperatur von etwa 60 bis 100⁰C, vorzugsweise etwa 60 bis 75⁰C während etwa 1 bis 10 Stunden, vorzugsweise 6 bis 10 Stunden, im allgemeinen während etwa 10 Stunden auf 60 bis 65°C, erwärmt.

Die Pasteurisierung wird unter physiologisch annehmbaren pH-Bedingungen durchgeführt. Das heisst, dass der pH der Mischung im allgemeinen im Bereich von etwa 5,5 bis 8,0 und vorzugsweise etwa 6,0 bis 7,5 liegen soll. Im allgemeinen sind physiologische Bedingungen, soweit möglich, während der Pasteurisierung erwünscht, um eine möglichst geringe Störung der therapeutisch aktiven Proteinzusammensetzung sicherzustellen.

Die Menge eines bestimmten Polyols und an Citrationen, die erforderlich sind, um eine bestimmte Proteinzusammensetzung, während der Pasteurisierung zu stabilisieren, und die Bedingungen, die erforderlich sind, um die Zusammensetzung zu pasteurisieren, kann ein Fachmann durch Vorversuche anhand der hier erteilten Lehre leicht bestimmen.

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Im Anschluss an die Pasteurisierung kann man die Mischung aus Polyol, Citrationen und Proteinzusammensetzung zur Entfernung des ganzen oder eines Teils des Polyols und der Citrationen behandeln. Um dies zu erzielen, kann man übliche Methoden anwenden. Man • kann beispielsweise die Mischung unter Verwendung von geeigneten semipermeablen Membranen dialysieren oder diafiltrieren. Dem Fachmann bieten sich weitere Methoden zur Entfernung des Polyols und der Citrationen an.

Die pasteurisierte Mischung kann in bekannter Weise zur Entfernung des Wassers behandelt werden. Beispielsweise kann man die Mischung gefriertrocknen oder ultrafiltrieren und dann gefriertrocknen. Weiterhin kann man die Mischung in üblicher Weise vor der Entfernung des Wassers steril filtrieren. .

Die erfindungsgemässen pasteurisierten Proteinzusammensetzungen können zu pharmazeutischen Zubereitungen für die therapeutische Anwendung formuliert werden. Zur Herstellung von intravenösen Verabreichungen wird die Proteinzusammensetzung gewöhnlich in Wasser, ent-. haltend physiologische Substanzen, wie Natriumchlorid, GIyζin und dergleichen und die auf einen pH, der mit den physiologischen Bedingungen verträglich ist, gepuffert wurde, gelöst. Im allgemeinen sind Richtlinien für intravenös zu verabreichende Proteinzusammensetzungen durch Regierungsverordnungen festgelegt.

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Der Ausdruck "Polyol" bedeutet eine Substanz mit mehr

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als einer Hydroxylgruppe (-0H) und schliesst mehrwertige Alkohole und Kohlenhydrate, wie Zucker, ein. Vorzugsweise soll das Polyol wassermischbar, beim Infusieren physiologisch annehmbar, physikalisch mit dem Protein verträglich und von niedrigem Molekulargewicht sein, d.h. ein Molekulargewicht von weniger als etwa 5.000 haben. Höhermolekulargewichtige Polyole, z.B. Polysaccharide, wie Dextrin, Stärke, Glykogen, Zellulose, Pentosane, Pektin, Hemizellulose und dergleichen, werden bei der vorliegenden Methode nicht bevorzugt, weil sie im allgemeinen wasserunmischbar sind und nur schwer aus den Proteinzusammensetzungen nach Beendigung der Pasteurisierung entfernt werden können.

Typische Beispiele für bei den Verfahren verwendbare Zucker sind Mono-, Di- und Trisaccharide, wie Arabinose, Glukose, Galaktose, Fruktose, Ribose, Mannose, Rhamnose, Saccharose, Maltose, Raffinose, Melezitose und dergleichen. Beispiele für mehrwertige Alkohole oder reduzierte Zucker schliessen Erythrit, Ribit, Sylit, Sorbit, Mannit etc. ein.

Ebenso sind in die Erfindung Mischungen von Polyolen sowie Substanzen, die in Gegenwart von Wasser oder Wärme Polyole ergeben, wie Hydrate, Actonide und dergleichen, eingeschlossen.

Als Quelle für Citrationen kann man Natriumeitrat, 30 Kaliumeitrat und dergleichen verwenden.

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■ao-

Bei der Durchführung er erfindungsgemässen Pasteurisierung ist es vorteilhaft, wenn die Ionenstärke der Pasteurisierungsmischung physiologisch verträglich ist, d.h. etwa 0,05 bis 0,2 beträgt. Hierzu kann . man ein Salz, wie Natriumchlorid oder dergleichen, aus der Pasteurisierungsmischung zufügen oder entfernen, um die gewünschte Ionenstärke zu erreichen.

Das erfindungsgemässe Verfahren kann auch zusammen mit anderen Methoden zum Inaktivieren von Hepatitis-Viren angewendet werden, z.B. indem man Proteinzusammensetzungen in Gegenwart von anderen Stabilisatoren, wie Aminosäuren, pasteurisiert oder indem man Proteinzusammensetzungen in Gegenwart von Substanzen, von denen bekannt ist, dass sie Hepatitis-Viren töten, erwärmt.

Als Aminosäure kann man Lysin, Arginin, Leucin, Isoleucin, Methionin, Phenylalanin, Threonin, Tryptophan, Valin, Alanin, Asparaginsäure, Cystein, Glutaminsäure, Glyzin, Histidin, Prolin, Serin, Tyrosin und dergleichen verwenden. Substanzen, welche die vorerwähn ten Aminosäuren ergeben, z.B. Aminosäuresalze und dergleichen, können ebenfalls verwendet werden. Dabei ist darauf hinzuweisen, dass Aminosäuren in Abwesenheit eines Polyols keine wirksamen pasteurisierungsstabilisierenden Mittel für Faktor.IX-Konzentrate sind.

Wie vorerwähnt, kann man die pasteurisierten erfindungsgemässen, Faktor IX-Konzentrate enthaltenden

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- yr-

Zusammensetzungen zu pharmazeutischen Zubereitungen, die für therapeutische Anwendungen verwendet werden, verarbeiten. Der Begriff "pharmazeutische Zubereitung" wird hier jedoch in einem breiten Sinn verstanden und schliesst Zubereitungen, die Proteinzusammensetzungen, die nach dem erfindungsgemässen Verfahren pasteurisiert wurden und die nicht nur für therapeutische Zwecke, sondern auch als Reagenzien in bekannter Weise verwendet werden, ein, sowie solche Zubereitungen, die für Gewebekulturen verwendet werden, bei denen Organismen, wie Viren, für die Herstellung von Impfstoffen, Interferon und dergleichen auf Plasma oder Plasmafraktionen, z.B. Conn Effluent II +III, Cohn Fraktion IV, Con Fraktion V und dergleichen gezüchtet werden.

Für alle der obigen Anwendungen ist es vorteilhaft, dass die erfindungsgemäss zur Verfügung gestellten Proteinzusammensetzungen frei von infektiöser Hepatitis sind. Die für therapeutische Verwendungen bestimmten pharmazeutischen Zubereitungen sollen eine therapeutische Menge der pasteurisierten Proteinzusammensetzung enthalten, d.h. eine Menge die ausreicht für eine vorbeugende oder heilende Behandlung. Wird die pharmazeutische Zusammensetzung als Reagenz verwendet, dann soll sie Reagenzmengen der' pasteurisierten Proteinzusammensetzung enthalten. Wendet man sie für Gewebekulturen oder ein Kulturmedium an, dann sollen die pasteurisierten Proteinzusammensetzungen eine Menge der Proteinzusammensetzung enthalten, die aus-

30 reicht, um das gewünschte Wachstum zu erzielen. Es

ist selbstverständlich, dass die in erfindungsgemässer Weise pasteurisierten Proteinzusammensetzungen keine

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infektiösen Mengen an Viren und anderen Organismen, die unter den Pasteurisierungsbedingungen inaktiviert werden, enthalten.

Die Erfindung wird in den nachfolgenden beschreibenden Beispielen weiter erläutert.

BEISPIELE, As saymethoden

Faktor II und VII: Faktor II und Faktor VII wurden nach der Methode von Owren, beschrieben in Scand. J. Clin. and Lab. Investigation, Bd. 1, Seite 81 (1949) untersucht.

Faktor X und Xa; Faktor X und Faktor Xa wurden nach der. Methode von Bachmen et al, beschrieben in Thromb. Diath. Haemorrh., Bd. 2, Seite 24 (1958) untersucht.

Thrombin: Das angewendete Assayverfahren wird von Fenton II et al, in Thrombosis Res., Bd. 4, Seiten 809 bis 817 (1974) beschrieben.

. Faktor IX und VIII: Es wurden Modifizierungen der von Langdell et al (partielle Thromboplastinzeit-. Technik), J. Lab. Clin. Med., Bd. 41, Seiten 637 bis 647 (1953) und von Proctor et al (Kaolingerringszeit-Methode), Amer. J. Clin. Path., Bd. 36, Seite 212 (1961)

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angewendet. Plättchenfaktor 3 wurde mittels einer Cephalinsuspension zur Verfügung gestellt. Maximale Oberflächenkontaktaktivierung wurde mittels Celite ^ pulver erzielt. Alle anderen Gerinnungsfaktoren (ausser Faktor IX und Faktor VIII) wurden aus einem Substrat erhalten, welches Plasma von einem Patienten mit einem erheblichen Mangel an Faktor IX oder Faktor VIII, vermischt mit bariumsulfatabsorbierten Rinderplasma, enthielt. Eine quantitative Bestimmung einer unbekannten Probe wird durchgeführt, indem man deren Gerinnungszeit im Versuch mit einer solchen Verglich, die durch Verdünnung eines normalen Standards erhalten worden war.

Das genaue Assayverfahren ist das gleiche, sowohl für Faktor IX als auch für Faktor VIII, mit der Ausnahme, dass der Aktivator im Faktor IX-Assay ein Platelin ^ Plus-Aktivator ist, anstelle des automatisierten APTT-Reagenz (General Diagnostics, Inc., Morris Plains,

20 New Jersey).

Nicht-aktivierte partielle Thromboplastinzeit {NAPTT): Eine 0,1 ml-Probe von NAPTT-Substratplasma (auf Eis gelagert), eine 0,1 ml-Probe von partiellem Thromboplastin ohne Aktivator (auf Eis gelagert) und 0,1 ml der zu untersuchenden Probe (in verschiedenen Verdünnungen) wurden in ein 10 χ 75 mm-Polystyrol-Reagenzglas gegeben, sorgfältig durch Schütteln vermischt und in ein 37⁰C Wasserbad unter gleichzeitigem Start einer

30 Stoppuhr gegeben. Nach genau 1 Minute wurden 0,1 ml 0,025M CaCl₂ von 37⁰C unter gleichzeitigem Starten

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des Zeitnehmers zugefügt und der Inhalt des Reagenzglases wurde durch sorgfältiges Schütteln vermischt. Anschliessend wurde das Reagenzglas 30 Sekunden bis 1 Minute, je nach der Art der Probe, ungeschüttelt gehalten. Es wurde dann von Zeit zu Zeit schräg gestellt, bis die Gelierung begann oder bis eine Gerinnung festzustellen war, wobei man darauf achtete, das Aussetzen gegenüber Raumtemperatur, die unterhalb 37⁰C lag, zu minimieren. Die Zeit bis zum Auftreten der ersten Gerinnungsbildung wurde aufgezeichnet. Eine Opazität und Gelierung lief dem Auftreten einer eindeutigen Gerinnung voraus.

Wurde die Probe durch einen Trispu.ffer ersetzt, so erhielt man die NAPTT-Zeit für den Nullversuch. Betrug die Nullversuchszeit mehr als 300 Sekunden, so wurde das Assay fortgeführt. Jedes Substratplasma, das eine Nullversuchszeit von weniger als 300 Sekunden ergab, war für diesen Versuch ungeeignet.

Durch Messen der NAPTT-Zeiten in einem grossen Verdünnung sbereich und Auftragen der Zeiten in Sekunden auf der Ordinate und der Konzentrationen auf der Abszisse wurde eine geradlinige Beziehung erhalten. Bei den meisten Prothrombin-Komplex(Faktor IX) Konzentraten wurde eine. Inhibierungswirkung bei niedrigen Verdünnungen festgestellt. Deshalb wurde eine geradlinige Beziehung bei 1:100 oder grösseren Verdünnungen festgestellt. Unter Verwendung eines geeigneten Standards, wie Faktor IX-1 (FN-1) vom Bureau of Biologies und indem man 100 Einheiten/ml für diesen Standard

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einsetzte, war es möglich, eine Standardkurve aufzustellen. Von dieser Standardkurve wurden die NAPTT-Zeiten für eine gegebene Probe abgelesen und als Einheiten ausgedrückt. Längere NAPTT-Zeiten (in der Nähe der Nullversuchszeit), ausgedrückt als niedrige NAPTT-Einheiten/ml, zeigen eine verminderte Thrombogenizität an.

Beispiel 1

Effluent I (3000 1) wurde mit 30 kg DEAE-Sephadex-Gel in Berührung gebracht und während etwa 1 Stunde bei 1 bis 3⁰C vermischt. Die Mischung wurde filtriert, wobei man 30 kg Gel erhielt. 2 kg davon wurden nacheinander mit 10 1 0,2M Ammoniumbikarbonat, 10 1 0,3M Ammoniumbikarbonat und 6 1 0,2M Natriumchloridpuffer gewaschen. Dann wurde mit 4 1 0,55M Natriumchlorid eluiert unter Erhalt einer Proteinlösung mit = 10,12.

Die Ionenstärke des Eluats wurde durch Zugabe von 3 Teilen Wasser für Injektionszwecke um das 4-fache

25 vermindert. Die Lösung wurde auf ein A₂₈₀ von 12

ultrafiltriert und nach Zugabe von Citrat in einer Menge von 0,5M wurde der pH auf 6,5 eingestellt und Saccharose in einer Menge von 1,2 g/ml zugegeben. Die Mischung wurde während 6 oder 10 Stunden auf 6O⁰C

30 erwärmt und nach dem Abkühlen mit einem gleichen

Volumen 0,09M NaCl und 0,01M Natriumeitrat bei pH 7,4

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und 5⁰C vereint. Diese Mischung wurde gegen mindestens 3 Volumina 0,09M NaCl, Ο,ΟΙΜ Natriumeitrat, pH 7,4-Puffer, diafiltriert. Dann wurde die Lösung* auf eine Endstärke von annähernd 25 bis 30 Einheiten· an Faktor IX pro itil ultrafiltriert und der pH wurde auf 6,9 +_ 0,5 eingestellt.

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Tabelle 1

Probe	Koagulationsfaktorer (U/ml) II VII IX X	6	7,1	21 ,5	49,	L	spezifische Aktivität (UZA₂₈₀)*	NAPT sek**	T sek***
pasteurisiert 6 h gemäss der Erfin dung	'27,	3	6,2	20,9	59,	6	0,67	265	293
pasteurisiert 10 h gemäss der Erfin dung	30,	2	4,0	13,6	24,	1	0,52	242	286
Ausgangsraaterial	12,	8	1,13	289	331

* Einheiten IX pro A-on
** 1:100-Verdünnung

* * * 1:200-Verdünnung

- 2-r -

Beispiel 2

Effluent I (150O₁D wurde mit 15 kg DEAE-Sephadex-Gel in Berühr.ung gebracht und während 1 Stunde bei 1 bis 3°C vermischt. Die Mischung wurde filtriert, wobei man 50 kg eines Gels erhielt, das hintereinander mit ■ 50 1 0,2M Ammoniumbikarbonat, und 50 1 0,3M Ammoniumbikarbonat gewaschen wurde. Der Faktor IX-Komplex wurde mit 0,75M Ammoniumbikarbonat eluiert, bis der A__R0 des Eluats allmählich auf 3,5 abfiel. Ammoniumbikarbonat in dem Eluatiwurde durch Diafiltration gegen NLT 5 Volumina von 0,09M NaCl, 0,01M Na-Citrat, pH 7,4, entfernt. Zu der,Lösung (Α_ΟΟΛ - 13) würde Natrium-

j /Ou

citrat bis zu einer Menge von 0,5M, pH eingestellt auf 6,5, und Saccharose bis zu einer Menge von 1,2 g/ml gegeben. Die Lösung wurde dann weiter wie in Beispiel 1 verarbeitet und die Ergebnisse werden nachfolgend gezeigt. . ■

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Tabelle

Probe

pasteurisiert 10 h gemäss der Erfindung

Ausgangsmaterial

Koagulationsfaktor

(U/ml) II VII IX X

25,6 12,2 17,8 37,6

13,0 5,0 14,8 22,3

spezifische
Aktivität

0,49

1,14

* Einheiten IX pro ** 1:100-Verdünnung

* * * 1:200-Verdünnung

NAPTT sek** sek***

250

266

294

288

30-

Beispiel 3

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde bis zur Stufe der Pasteurisierung bei 60⁰C während -10 Stunden wiederholt. Nach dem.Pasteurisieren wurde die Lösung mit 2 Teilen Wasser.für Injektionszwecke verdünnt und der pH wurde auf 7,1 eingestellt. .Die Mischung wurde auf eine zuvor mit 0,14M NaCl und· 0',005Fl Phosphatpuffer, pH 7*1, ins Gleichgewicht gebrachte DEAE-Sepharosesäule aufgebracht. Der adsorbierte Faktor IX-Komplex wurde mit einem NaCl-Gtadienten, 0,14M bis 0,44M, eluiert. Die Faktor IX-Aktivität enthaltenden Fraktionen wurden zusammengegeben. Die spezifischen Aktivitäten der Faktoren II, VII, IX und X betrugen 2,5, <0,1, 1,3 bzw.

15 2,5.

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Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Pasteurisieren einer Koagulationsfaktoren II, VII, IX und X enthaltenden Zusammensetzung durch Erhifzen, dadurch gekennzeichnet, daß
man die Zusammensetzung mit einem Polyol und einer

5 Quelle für Citrationen vermischt, um das Protein während der Pasteurisierung zu stabilisieren.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man 1 bis 1000 Teile an Polyol, bezogen auf

1 Teil Gesamtprotein, zusetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man 0,1 bis 1,0 Mol an Citrationen pro Liter der Zusammensetzung zusetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zusammensetzung mit einer wäßrigen

Lösung vermischt, in welcher 20 % bis zur Sättigungskonzentration des Polyols enthalten sind.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyol ein Kohlehydrat oder ein Zuckeralkohol ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zusammensetzung etwa 1 bis 10 Stunden auf eine Temperatur von etwa 60 bis 100⁰C erwärmt,

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der Pasteurisierung das Polyol und die Citrationen aus der Mischung entfernt.

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8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man das Polyol und die Citrationen entfernt, indem man die Mischung einer Diafiltration unterwirft.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet,

daß man das Polyol und die Citrationen entfernt, indem man die Mischung einer Dialyse oder einer Iorienaustauschchro.matogra.fie unterwirft.

10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man weiterhin eine Sterilfiltration vornimmt.

11. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem weiteren Schritt das Wasser aus der Zusammensetzung entfernt.

12. Pasteurisierte Zusammensetzung, enthaltend Koagulationsfaktoren II, VII, IX und X.

13. Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, .dadurch gekenn-. zeichnet, daß die Koagulationsfaktoren etwa Ibis 20 Gew.?o der Zusammensetzung ausmachen.

14. Zusammensetzung gemäß Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Faktoren in der Zusämmensetzung im Verhältnis Faktor II : Faktor IX von etwa 0 bis 10; Faktor VII : Faktor IX von etwa 0 bis 10; und Faktor X : Faktor IX von etwa 0 bis 10 vorliegen.

15. Gefriergetrocknete Zusammensetzung gemäß Anspruch bis 14.

16. Zusammensetzung gemäß Anspruch 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß sie im wesentlichen'frei von infektiöser Hepatitis ist.

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17. Pharmazeutisches Mittel, enthaltend eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 12 bis 16.

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