DE2010191A1 - Verfahren zur Herstellung von stabilen Cytochrom c enthaltenden Präparaten und Cytochrom c enthaltende Präparate - Google Patents

Description

1 -T-I, Kaialyg-, Kl ta -ku, Tokyo, Ja pan

Verfahren zur Herstellung von stabilen Cytootarora ο enthaltenden Prttparaten und Cytoohrom ο enthaltende Präparate

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von stabilen Cytoohrom ο enthaltenden Pr&paraten sowie Cytoohrom c enthaltende PrHparate·

Cytoohrom ο ist ein Häft-haltlgee Protein* das in fast allen tleriaohen und pflanzlichen Zellen sowie microorganlaaen vorkonmt und als wichtiger Faktor In der Zellatmung wirkt. Ouroh Untersuchungen wurde die biooheniiaohe Punktion dleaer Subotanz im einzelnen bekannt. Alt eine Substanz In der Reihe der Cytoohrorte, nieCytoohrom a und Cytoohrom b, stellt Cytoohron ο einen Vitalfaktor bei der Regulierung der Oxydationagesohwindigkeit in einen •nergieerzeugenden Meohanlsraus dar* Cytoohrom ο findet daher klinisch in den Pillen von erkrankungen Anwendung» von denen angtnonoen wird, dass sit auf Störungen der

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Atmung oder iaangelnder Sauerstoffzufuhr zu den Zellen beruhen, wie beispielsweise Angina pectoris, Herzinfarkt, Gehirnblutung^' Oshimtrombose, Vergiftung durch Drogen, Kohloniaoiiaxydvergif tung und deren Folgeerscheinungen·

Aufgrund seiner pharmakologisohen Wirkung wird Cytoehroia c als eines der wichtigsten Mittel in der klinischen Praxis angesehen. Seine Verabreiohung erfolgte bisher ausßchliesslioh auf parenteralem Wege, d.h. durch intravenous oder intramuskuläre Injektion. Dies 1st der natürliche Schluss aus der üblichen physiologischen Ansicht, die besagt, dass Cytochrom c, da es eine hochmolekulare Verbindung ist, kaum in den Organismus aufgenommen werden kann, wenn es nicht parenteral verabreicht wird·

Cytochrom c, das ein aus tierischen Herzen oder aus Mikroorganismen, wie beispielsweise Hefe, extrahiertes Protein ist, 1st ein Heteroprotein gegenüber dem menschliehen Körper, das gelegentlich aufgrund einer Antigen-Antikörper-tteaktion ein» Anaphylaxie hervorrufen kann. Seine Verwendung erfordert daher grösste Vorsicht. Aueserdem wird das durch Injektion verabreichte Cytochrom ο sehr rasch ausgeschieden. Seine Konzentration in Blut fällt innerhalb von 15 Minuten nach Verabreiohung üb 50 ji ab. Es ist bekannt, dass die wirksam· Konzentration von Cytoohrom c im Blut nur für ein« kurze Zeitspann· vorhanden ist und der grössere Teil des Cytochroma ο unausgenutzt aus dem Körper ausgeschieden wird·

Um diese schweren Nachteile von Cytoohrom ο au·zuschalten. die dessen Brauchbarkeit stark eineohrtinken und vermindern, wurden nun Tierversuch« bezüglich der praktischen Abaorptionerate und der Wirksamkeit von Cytoohrom ο bei oraler Verabreichung, di· sicherer als die Verabreiohung durch Injektion let, durchgeführt. Se wurde Jedoch angenommen, dace der Körper auf diese WelM verabreicht« Cytoohrom· nur schwer absorbieren würd«.

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Es wurde jedoch gefunden, dass in Qegonaetz asu der üblichen physiologischen Regel Cytochrora ο durch die Inteatinalwände langsam absorbiert werden Kann, seine wirksame Konzentration im Blut linger als im Falle einer Injektion vorhanden bleiben kann und . seine Wirksamkeit nicht geringer als im Falle einer Injektion let« Hierauf beruht die vorliegende Erfindung. Ss wurde festgestellt, daas die klinische Brauchbarkeit von Cytoohröm c durch dessen orale Verabreichung erhöht werden kann· Die praktische Durchführung let jedoch schwierig, da Cytochrom ο ausserordentlich Inatabil 1st.

Cytochrom ο verliert insbesondere seine Aktiv!tut rasch bei Einwirkung von Sauerstoff der Luft oder von Licht. Abgesehen von diesen Uusseren Einflüssen let Cytochrom c ein hochmolekulares Protein und unterliegt daher Konforaationsänderungen unter natürlichen Bedingungen, was xu einer Abnahme seiner Aktivität führt«

Verschiedene Methoden wurden bereits zur Stabilisierung von Cytoohrom ο enthaltenden Präparaten ausgearbeitet«

Es lit derzeit Üblich« ein Reduktionsmittel, wie beispielsweise Natriumsulfit oder Ascorbinsäure, zu einer wässrigen Lösung von Cytoohröm ο zuzugeben« Zusätzlich kann ein· Aminosäure, ein Peptid,ein Zucker und dergl. zugesetzt werden» um KonformationeKnderumjtη zu verhüten, lfm die oben genannten Präparate von Cytoohrom ο in den Band·! bringen «u können, ist es erforderlloh, solch« UBsuhgen in Ampullen abzufüllen, wobei die Luft durch Stickstoff ersetzt sein «use, oder naoh Lyophilisation in den Ampullen die Duft durch Slicks toff xu ersetzen. Diese Verfahrenamaesnahiaen sind weeentlioh für die Stablllalorung der tu injizierenden PrHparete. Bei der Herstellung von innerlich anzuwendenden Arznei« mitteln, win beispielsweise Tabletten, Granulaten oder euppoaltorlen, ist IeI₁IMIt da« Einbringen von Stabilisatoren, nif beispielsweise den oben genannten Reduktionsmitteln. Aminosäuren, Peptlden und Zuoker, oioht

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auereichend« um zu verhindern» dass Cytochro« ο seine Aktivität verliert. Solche Produkte sind demzufolge für die klinische Anwendung nioht geeignet.

£e wurde nun ein Verfahren zur Herstellung von Cytoohrora c-Präparaten gefunden» die sieh zur oralen Verabreichung eignen. Daa erflndungsgemässe Verfahren zur Herstellung stabiler Cytochrora c-Präparate besteht darin, eine wässrige Lösung, die Cytochrom ο und Gelatine enthält, zu gelieren und die erhaltene Substanz durch Entfernung des Wassers zu trocknen, während das Cytoohrora c in einem kolloidalen Gelzuatand gehalten wird·

Bs wurde gefunden, dass ein stabiles Cytochrora c enthaltendes Präparat erhalten werden kann, indem ein wässriges kolloidales Gemisch von Cytoohrora ο und Gelatine zunächst abgekUhlt oder langsam entwässert wird, um es in ein Gel Überzuführen, und dieses anschlieeeend durch Entfernung von Wasser getrocknet wird, wobei es in einem kolloidalen Oelzustand gehalten wird* Die Zugabe von Irgendeinen anderen Stabilisator als der Gelatine ist conn unntftig.

Vorteilhafte AusfUhrungsformen des erflndungsgemässen Verfahrens sind die folgenden:

a) Gelatine wird zu einer wässrigen Lösung von Cytochrom ο zugegeben. Die erhaltene Lösung wird zur vollständigen Auflösung auf eine Temperatur erhitzt, die nioht so hoch ist, dass sie die Aktivität des Cytochroras ο beeinträchtigen würde, (vorzugsweise auf 40 bis 50*C). Dann wird die Lösung in eine Flüssigkeit gegoasen, die mit Wasser nioht mischbar ist und bei niedrigen Temperaturen nioht hochviskos wird oder gefriert, wie beispielsweise ein pflanzliches öl (z.B. Rioinusöl, CamelUaöi oder flüssiges Paraffin), Mineralöl oder Hexadeoylalkohol, und die Lösung wird dann unter Rühren abgekUhlt. Die LÖeung kann aber auch in

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die oben genannte Flüssigkeit eingetropft werden, ma gelartige Tröpfchen zu bilden. Diese geiartlgen Tropfchen werden abfiltriert, um sie abzutrennen, und unter vermindertem Druck oder trockener; Luft bei einer Temperatur, die die Aufrechterhaltung dee kolloidalen Gelzustands gewährleistet, gehalten» um sie langsam zu trocknen* Ea kann so ein volletändig verfestigtes kugelförmiges Granulat erhalten werden. Die KUhI-temperatur, bei der die KUgeldhen gehalten werden sollen« variiert In Abhängigkeit von der Gelatinekonzentration, muss Jedoch so sein, dass die Beibehaltung des kolloidalen Gelzustands sichergestellt ist. Vorzugsweise liegt die Temperatur unter 20*0.

Die obige Trocknung kann mit Lösungsmitteln für eine Dehydratation, wie beispielsweise Aceton oder Alkohol, vorgenommen werden, dooh muss die anfängliche Trocknung unter Verwendung eines Lösungsmittels vorgenommen werden, das ein Dehydratationsvermögen besitzt, das durch Zugabe von Wasser gesteuert wird. Andernfalls wird nur die Körneroberfläche trocken und fest, was . dazu führt, dass der kolloidale Gelzustand aufgehoben wird. Bs ist daher zweökm&ssig, die Dehydratation in der Weise vorzunehmen, dass mit einein Lösungsmittel mit schwachem Dehydratationsvermögen begonnen wird und dann stetig zu einem Lösungsmittel mit stärkerem Dehydratationsvermögen Übergegangen wird· Die oben genannten kugelförmigen Oranülae können durch geeignete Wahl der Gelatinekonzentration,, der Art des Bewegens, der Art des Eintropfen*, der Art der mit Wasser niohtnlaohbaren PlUeslgktit und der Temperatur auf den gewttnsohten Durchmesser gebrächt werden.

b) Das oben genannte Genleoh von Gelatine und einer wässrigen Lösung von Cytoohrora ο wird dünn verteilt und in ein· Porn gegossen, in der es zu einem OeI abgekühlt wird. Das OeI wird an der Luft bei verhXltnlMKaslg· massig niedriger Temperatur, bsi der es seinen kolloidalen Oelaustand beibehält, vomugaweise bei einer Temperatur unter 20⁹C* trooknen gelassen oder langsam unter trockenem Gas entwässert. DIs erhaltene trockene

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feste Substanz vilrd dann auf die gewünschte Oröase zerkleinert, um ein Granulat zu erhalten.

Öle Ziele der vorliegenden Erfindung können sowohl durch die Arbeitsweise a) als auch die Arbeitsweise b) gut erreicht werden. Die Arbeitsweise a) hat den Vorteil, dass leicht gleichförmige kugelförmige Körner erhalten werden können und dann auf diese Körner leicht ein EnfceralUberzug oder magenrenistentar überzug aufgebracht werden kann.

Zur oralen Verabreichung können die so erhaltenen Granulate als GranulatPräparate mit einem EnteralUberzug zur Verhinderung einer Zersetzung von Cytoohrom β durch Magensäure und Pepsin verwendet werden* Sie können aber auch unter Druck zu üblichen Tabletten geformt werden« zu denen ein Excipieni zugegeben werden kann« oder sie können zu Suppositorlen durch Suspendieren des Granulats ohne BnteralUberzug in einer Suppositorlengrundmasae, wie beispielsweise geschmolzenes gehärtetes öl, Kakaobutter oder Polyäthylenglykol, und Giessen der Suspension in eine Form verarbeitet werden·

Oio so hergestellten Cytoohrom o-Präparate werden als innerlich einzunehmende Arzneimittel in Form von Granulaten oder Tabletten oder als Buppoaltorlen verwendet. Im Vergleich mit den Präparaten, die injiziert werden« führen sie weniger leicht su einer Anaphylaxie · Die naoh dem erfindungagemässen Verfahren hergestellten stabilen Qytoohrom ο-Präparate sind sehr viel besser als die üblichen Präparate und sowohl vom medizinischen als auoh vom pharmazeutischen Standpunkt aus auaserordentlioh wertvoll.

Der effindungagemässe Stabilisierungsmeohaniamus au* Cytoohrora ο 1st nicht völlig geklärt, de h wird der _ folgende Mechanismus angenomment Das gelierte Oemiaoh der wässrigen Lösung von Cytoohrom ο mit OeIatine wird

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entwKssert,. während es in kolloidalem Gelzustand gehalten wird« Die Moleküle des Cytoohroms c werden hierdurch in einem verteilten Zustand in den Gelatinegel gehalten. Sie werden daher äusseren Einflüssen, wie Sauerstoff oder Licht, nioht direkt ausgesetzt und sind wirksam vor diesen geschützt, so dass das Cytochrom c'Molekül einen starken Wideretand gegen Aktiv!tat8-verlust aufweist.

Bei dem erfindungsgejnässen Verfahren 1st die unerlässliche Bedingung für die Stabilisierung von Cytochrom o, das Gemisch von Gelatine und wässriger Lösung von Cytochrom c durch Entfernung des Wassers zu trocknen, während das Gemisch in kolloidalem Gelzustand gehalten wird· Dass dies ratiglich ist, geht aus den folgenden Ergebnissen hervor.

Bei der Herstellung des oben genannten lyophilisierten Cytochroras ο zur Injektion wurde Gelatine zu der wässrigen Lösung von Cytochrom ο vor der Lyophilisation zugegeben, um eine Verminderung des lyophilisierten Produkts zu verhindern und hierdurch dessen kommerziellen Wert zu verbessern. Es wurde gefunden, dass Gelatine unter den Bedingungen der Lyophilisation nioht zur Stabilisierung von Cytochrom c beiträgt, wie in der nachfolgenden Tabelle I gezeigt 1st. Dies kann durch die Tatsache bewiesen werden, dass, wenn dl· Cytoohrom c enthaltende Ampulle unvollständig verschlossen 1st, das Eindringen von Luft und Feuchtigkeit das Cytoohrom ο verfärbt und dessen Aktivität stark herabgesetzt wird. Es 1st daher im Fall« des Üblichen lyophlIieierten Produkts mit Gelatine notwendig, dass der oben genannte Stabilisator zugesetzt wird und das Produkt vollständig von äusseren Einflüssen durch sorgfältiges Versohlieesen in einer Ampulle oder einem anderen Behälter abgeschlossen wird. Ss 1st auch zweckroäegig, die Luft in der Ampulle durch ein Inertgas, wie beispielsweise Stickstoff zu ersetzen.

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Bs iafc besonders bemerkenswert, dass im Gegensatz hierzu die erfindungsgeraKss erzielte Stabilisierungswirkung auf Cytochrom ο sehr erheblich ist, wobei bsi der Verwendung der gleichen Gelatine weder eine Zugabe von anderen Stabilisatoren noch ein Verschließen des Behälters erforderlich ist.

In Tabelle I sind die Ergebnisse der Lyophilisation einer Lüsung von gereinigtem Cytochrom c aus Pferdeharz angegeben, die die relative Stabilität von Cytochrom ο im Falle von Cytochrom c allein, Cytochrom c, zu dem Gelatine zugegeben wurde, und Cytochrom c, zu weichem OeIatin© und Natriumsulfit zugegeben wurden, zeigen» 1 ml der in Tabelle I angegebenen wässrigen Lösungen wurde in Ampullen gegeben. Nach lyophilisation wurden die Ampullen verschlossen und in einer temperaturgeregelten Umgebung bei 45*C aufbewahrt. Anschllessend wurde die Änderung der Aktivität geprüft. Die Aktivität wurde mit Hilfe des Warburg-Manometers gemessen. Proben wurden zu einem System von Ascorbinsäure und Cytochromoxydase zugegeben, um den Sauerstoffverbrauch zu bestimmen. Die Zahlenwerte bei den Versuchsdaten geben die Rostaktivität la Prozent» berechnet aus dem Sauerstoffverbrauch des Cytoohroma c, an.

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Tabelle!

Proben	luft nicht Stickstoff	Zeitspanne	58	Luft durch Stiok- stoff ersetzt	10 Wochen	30 Wochen
	1 ioohe	durch ersetzt	56	1 Woohe	70	64
	85	10 30 Wochen Wochen	60	88	72	65
Cytochrom ο 15 mg	81	66	87	88	73	• 68
Cytoohrora c 15 mg Gelatine 5 mg	88	67	. 85	90	93	91
Cytochrom c 15 mg OeIatine 50 mg	96	69		98	92	09
Cytochrom ο 15 mg Natrlumbl- sulfifc 1 rag	96	92
Cytoohrom ο 15 ag Nütriuabi- sulfit 1 rag ♦ Gelatine 5 mg	90

Die Ergebnisse soigen_# dass die Gelatine in dem. lyophilislerten Produkt nicht zur Stabilisierung von Cytoohroo ο beitrügt· Diese fehlende Wirkung von . Gelatin· fUr die Stabilisierung von Cytoahrooa ο bei der lyophilisation scheint daduroh bedingt zu sein, dass keine k ©existierende Besiehung zwischen Oytoohrop ο und Oelatlne im aelzustand bei der lyophilisation vorhanden ist. ·

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Wie bereits ausgeführt wurde, beruht die vorliegende Erfindung darauf, dass Cytochrom c allmählich absorbiert werden kann« wobei seine wirksame Konzentration im Blut länger andauert als im Falle der Injektion und die Wirksamkeit nicht geringer als bei Injektionen Ist* Dies stellt den Schlüssel zum Verständnis der Erfindung dar. Eine genauere Erläuterung soll anhand des In der Zelohnung gezeigten Diagramms erfolgen.

Die Kurven so igen den Durchschnitt von fünf Messungen der Änderung der Konzentration von Cytoohrom ο im Serum bei Versuchen, bei denen 20 mg einer Lösung von Cytoohrom c aus Pferdeherz In die Vene und in das Duodenum einer otwa 200 g wiegenden Hatte eingeführt wurde. Auf der Abszisse 1st die Zeit nach der Verabreichung aufgetragen und auf der Ordinate die Menge an Cytochrom c in /Ug, die in 1 ml Serum festgestellt wurde. Bei Intravenöser Verabreichung (gestrichelte Linie) betragt der Wert nach 1 Stunde nach Verabreichung 1 /Ug/ral und das Cytoohrom c verschwindet innerhalb von 6 Stunden vollständig, so dass die Dauer der wirksamen Konzentration im Blut kurz ist. Bei oraler Verabreichung in das Duodenum (ausgezogene Linie) wird die Konzentration über 1 /Ug/ml j Stunden gehalten« und es ist noch etwas Cytoohrom ο im Blutstrom, selbst nach 6 Stunden, vorhanden. Diese experimentellen Ergebnisse beweisen, dass Cytoohrom ο durch die Wandungen des Intestinaltrakts durchgehen und In den Blutstrom eintreten kann und dass« da dieser Durohgang verhältnlamKsslft angsam 1st« eine wirksame Konzentration an Cytoohron ο la Blut für eine verhKltnlsmtfsslg lange Zeitspanne aufrechterhalten werden kann.

Die bei dem vorliegenden Versuch angewendete quantitative Analyse der Cytoohrom c-Konzentration lat ein

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neues Verfahren, das zur Messung von Spurenmengen an Cytochrom c im Serum ausgearbeitet wurde,, Dieses Verfahren zeichnet sich durch eine Empfindlichkeit aus» die 100 bis lOOOmal höher als diejenige der Üblichen Kessungen der respiratorischen Aktivität oder der Kessung des Absorptionsspektrums ist, so dass es möglich ist , eine Spurenmenge von nur O.,O5pg/tnl an Cytochrom c nachzuweisen.

Das neue Verfahren 1st das folgende: Cytochrom c wird an Schafe»Erythrocyten,die mit Formaldehyd und Gerbsäure zur.Bildung von senslbilisierten roten Blutkörperchen behandelt sind, absorbiert. Diese senslbllisierten roten Blutkörperchen können mit dem Antikörper von Cytochrora c reagieren und eine Agglutination einleiten. Wenn jedoch mehr als 0,05 Mg an freiem Cytochrom c in diesem Reaktionssystem vorhanden ist, wird die Hämagglut!nation inhibiert. Auf diese Welse kann durch gleichzeitige Durchführung von Reaktionen in VerdUnnungsreihen der Proben und in den StandardverdUnmingsreihen von Cytochrom C und Vergleich des Grads der Inhibiarüng der Agglutination die Menge an*Cytochrom c in der Probe bestimmt werden.

in der Praxis wurde eine Chromatographie des geprüften Serums Unter Verwendung von Amberlite IRC»50, Ammonium-Typ, (Handelsname eines von der Firma Rohm ft Haas Co. hergestellten synthetischen Harzes) durchgeführt. Das Cytoohrom ο wurde aus dem Strum abgetrennt, und die niedrigmolekular« Komponente wurde durch Dialyse entfernt. Die quantitative Analyse wurde dann. vttttr -Verwendung der obigen Hämagglutlnatlons£nhikierung&- reaktion durchgeführt.

Immunologisch« Methoden, wi« beispielsweise Blutgruppen«

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bestimmung oder Identifizierung von Virusstämmen, zeichnen sich bekanntlich durch ausserordentlich hohe Spezdfität aus. Es glbfc viele Variationen dieser Methode, unter denen eine geeignete Methode für einen gegebenen Zweck ausgewählt werden kann. Die oben genannte Methode der H&nagglutionationsinhiblerungsreaktion ist unter den verschiedenen Arten dieser immunologischen Methode bemerkenswert empfindlich und eine ausgezeichnete Methode zur quantitativen Analyse von Spuren von Proteinhorraon in Körperflüssigkeiten« beispielsweise Gonadotropin oder Wachstumshormon. Bei der vorliegenden Erfindung wurde bei Anwendung dieser empfindlichen und speziflachen Methode in Anbetracht der Tatsache, dass Cytochrom c ein stark basisches Protein ist, das Verfahren der selektiven Extraktion und Reinigung von Cytochrom c aus dem geprüften Serum durch Chromatographie gewühlt. Öle Ergebnisse dieser quantitativen Analysen sind daher ausserordentlich genau und reproduzierbar und zeigen die Knderuhg der Konzentration des verabreichten Cytochroms c im Blut genau.

Die obigen experimentellen Ergebnisse sind ein Beweis dafür, dass die Wirksamkeit von oral verabreichte« Cytochrom c ebenso gut ist wie diejenige bei Verabreichung durch Injektion.

Dies wird genauer durch den folgenden Versuch der erhöhten Wirkung auf Leukocyten geegigt.

£β let bekannt, dass intravenös injlslertes Cytoohrom c bei der Heilung von Patienten In den häufigen Fällen einer durch Verabreichung von AntitumormitteIn, wie beispielsweise Tespamin (Handelsname eines von der Firma Sumitomo Chemical Industries Co. hergestellten

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BAD ORiGiNAL

Produkts) oder Mitomycin C, verursachten Leukopenie wirksam ist. In der nachfolgenden Tabelle II sind die Ergebnisse von Versuchen zusammengestellt, bei denen 35 mg Cytochrom c Je kg Körpergewicht und Je Tag an Kaninchen mit Leukopenie verabreicht wurden, wobei die Leukopenie durch Verabreichung von Tetpamln experimentell erzeugt worden war. Öle Wiederherstellung der Anzahl der Leukooyten bei diesen wurde mit der Anzahl an Leukocyten in einer Kontrollgruppe von Kaninchen verglichen. Bei diesem Versuch wurde ein Cytochrom c»Granulat, das erfindungegemüss aus Pferdeherzmuskel hergestellt und mit einem ISnteralUberzug versehen war, den Kaninchen oral verabreicht.

Tabelle XI

	Verabr®lchungs- tage	O	5	8	5*60	15
Anzahl der Leukocyten	Gruppe ,der Gra nulat mit Ente» ralUberzug ver abreicht wurde	1590	2960	3*60	2860	6400
Kontrollgruppe	1760	2970	2900	0690

Öle in der Tabelle IX angegebenen Werte sind Duron» sohnltbewerte für 6 Tiere in jeder Gruppe.

Öle Tiere U^v Xontrol!gruppe erholten sich awar von Natur au· mit einer feststellbaren Erhöhung der Ansahl der Leukooyten» doch war die Srholung in der Testgruppe«

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der das erfindungsgemässe Oramilat von Cytochrom c rait Entaralitfaerzug vorabroicht wurde, schneller, was die Beschleunigung dar Leukocytenblldung durch Cybochrom c zeigt. Wenn der Erholungsprozess als zwei Gruppen von dreidimensionalen Probenvektoren in den gleichen Zeitreihen dargestellt und die Hauptpopulationsvektoren statistisch verglichen werden, so kann zwischen beiden eine Signlfikans in einem Grad von weniger als 5 % festgestellt werden.

Ausserdem hat ein Vergleich praktischer klinischer Versuche zwischen dem erfindungsgemässen Cytochrom c und injiziertem Cytochrom c ergeben, dass das βrfindungsgemäcs© Cytochrom c nicht weniger wirksam als das injizierte Cytochrom c 1st. Ausserdem wurde bei zahlreichen klinischen Versuchen von keinem Fall einer Anaphylaxie, wie sie bei Injektionen beobachtet wird, berichtet, wenn erfinduhgsgemässes Cytochrom c verwendet wurde. ErflndungsgemKss kann daher der schwere Nachteil von Injektionen von Cytoohrom c ausgeschaltet werden.

Öle folgenden Beispiele erIKutern dit Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1

25 β gereinigtes Cytoohrom ο tut Pftrdthtrzmusktl wurden In 570 ml destillierte« V ^ser gelöst, und 75 g Otlatlnt wurden zu dtr erhaltenen Lösung zugegeben, dlt ansohliesaend auf ttwa 4Q*C unttr gtltgtntliohtm Bewegen trwHrmt wurde, wobei tin allmtthllohts Lösen auftrat. Ein graduierter Zylinder mit einem Fassungsvermögen von 1500 ml wurde mit 1200 ml i.-alnueöl gefüllt. DIt ober« Sohioht dta Hicinusöl· in dem Zylinder wurde auf 20 bis J5O*C erwärmt, während die untere Sohioht bei 3"C oder bei etwa diesem Wert durch AussenkUhlung mit Eis odtr mit einem andertn Nitttl gehalten wurde.

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Dann wurde das Oemlsch von Gelatine und Cytochrom ο langsam zu'der oberen Schicht des RicifiUsÖls in dem Zylinder untsr Rühren zugesetzt. Das Qemlsch von Gelatin· und Cytoohrom c im oberen Teil des Zylinders wurde in Form von kugelförmigen Teilchen verteilt und wtlhrend des Abainkene abgekühlt, wobei sich die Teilchen am Boden ale gelierte Körnchen absetzten.Der grössere Teil des Rlcinusöls wurde dann durch Dekantieren ab- . getrennt, und das Wasser wurde bei einer Temperatur von unter 20⁰C unter einem Druck von 1mm Hg unter gelindem Rühren verdampft* Nach Entfernung des grösseren Teils des Wassers wurden die Körnchen gesammelt» dreimal mit Aceton zur Entfernung des Rioinusöls gewaschen und in einem mit Phosphorpehtoxyd gefüllten Exsiccator vollständig getrocknet _β

B;lspiel 2

TO g gereinigtes Cytochrom c aus Candida utilis,· einem Hefestamm« wurden in 200 ml destilliertem Wasser gelöst. 50 g Oelatine wurden zu der erhaltenen Lösung zugegeben, die anschlieesend auf 40*C unter gelegentlichem Bewegen zur Begünstigung der allmKhlichen Auflösung erwärmt wurde. Unmittelbar nach der vollständigen Auflösung wurde die Lösung in eine 100 mm χ 300 mm Form mit einer Tief« von 10 mm gegossen und abkehlen gelassen.

Mach vollständiger Gelierung wurde das Produkt in ein@D NlQdrigtemporaturtrpokner bei etwa 20®C getrooknot Trocknen wurde es auf die gewünschte Komgröss© klelnert, Die folgenden Prüfungsergebnlsse zeigen die Stabllltttt der erfindiangegemKssen Cytoohrom c-Präparat«.

Die in der nachfolgenden Tabelle IXI «angeführte Prcb« besteht aus kugelförmigen Körnchen _f dl® siacsh «lern \ferfahren g€$m&8s Beispiel 1 ©rh&ltesi war. Die ir» den

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Claims (7)

1. Patentansprüche

   U Verfahren zur Herstellung eines stabilen, Cytochrom e enthaltenden Präparate, dadurch gekennzeichnet, dass ein Gemisch von Gelatine und einer wässrigen Lösung von Cytochrom c geliert wird und das erhaltene OeI getrocknet wird, während das Cytochrom c in einem kolloidalen Oelzustand gehalten wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, daduroh gekennzeichnet, dass das Oemisch vor dem Trocknen in KUgelohen übergeführt wird, indem das Oeulech auf tine Temperatur, die über Zimmertemperatur liegt, jedoch nicht so hoch 1st, dass sie die Aktivität des Cytoohroms c beeinträchtigen würde, erwHrmt wird und das Oemisch in eine Flüssigkeit, die mit Waaeer nicht mischbar ist, eingebracht wird«
3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, daduroh gekennzeichnet, dass die mit Wasser nicht nischbare Flüssigkeit bei einer Temperatur gehalten wird, dl· niedriger als die Temperatur des Oemieoha ist, und das Genisch In Form von Tröpfchen in diese Flüssigkeit eingebracht wird.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 2, daduroh gekennzeichnet, dass dl· mit Wasser nicht mlsohbar· Flüssigkeit nach Einbringen des Oemisohs abgeküh*» wird.
5. 5. Verfahren nach Anspruoh 2, daduroh gekennzeichnet, dass dl· KUgtlohen aus der mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit abgetrennt und ansohliesser ^Λ in eine« dehydratisierenden Lösungsmittel getrocknet werden.

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6. 6. Zusammensetzungen sur Einführung von Cytochro» c In der! Körper, dadurch gekennzeichnet, das« βIe Cytoehrom ο in einem kolloidalen OeIzustand enthalten,
7. 7. Zusammensetzung nach Anspruoh 6in Form von Tabletten zur oralen Verabreichung.

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