DE2010191B

DE2010191B - Verfahren zur Herstellung eines stabilen Cytochrom c enthaltenden Präparats

Info

Publication number: DE2010191B
Authority: DE
Inventors: Nobuhisa Dr.pharm. Sokashi Saitama Ogawa (Japan)
Original assignee: Mochida Seiyaku K.K., Tokio

Description

Cytochrom c ist ein Häm-haltiges Protein, das in 35 A^^JJ.™^ Methoden wurden bereits zur Stabil.-

fast "allen tierischen und pflanzlichen Zellen sowie J^^TcySrem c enthaltenden Präparaten

Mikroorganismen vorkommt und als wichtiger Faktor sierung von «__yi

in der Zellatmung wirkt. Durch Untersuchungen wurde ausgea^^ ^ _{em Redu}ktionsmittel, wie beidie biochemische Funktion dieser Substanz im emzel- .^^ Natriumsulüt oder Ascorbinsäure zu einer nen bekannt. Als eine Substanz in der Reihe der Cyto- 4<> «Ρ^'^Μ^" _von Cytochromc zuzugeben. Zuchrome, wie Cytochrom a und Cytochrom b stellt ^g" Jj^ _Aminos"_äure, ein Peptid, ein Zucker Cytochromc einen Vitalfaktor bei der Regulierung satzlich tannme a ^ _{Konformationsände}. der Oxydationsgeschwindigkeit in einem energie- u.dgh ™»^ _{Um die} obengenannten Präparate erzeugenden Mechanismus dar. Cytochromc findet rangen,zu^vermn ^ _bringen _m _konnen> daher klinisch in den Fällen von Erkrankungen^An- 45 von^^»J _{solche Lösungen} in Ampullen abwendung, von denen angenommen wird, daß sie auf ist es ^ert0^^e ; _{d L ft durch} stickstoff ersetzt sein Störungen der Atmung oder mange Inder Sauerstoff- ™_o ⁿ:*°^_h Lyophilisation in den Ampullen die zufuhr «i den Zellen beruhen wie beispielsweise ^'^^ksToff^u ersetzen. Diese Verfahrens-Angina pectoris, Herzinfarkt, Gehirnblutung, Gehirn- Luft durch bticj _{für die Stabilis}i_erUng der thromboVe.VergiftungdurchDrogen.Kohlenmonoxyd- 5° ^^aß*™p^W _raparate. Bei der Herstellung von Vergiftung und deren Folgeerscheinungen. fnnS anzuwendenden Arzneimitteln, wie beispiels-Auf Grund seiner pharmakologischen Wirkung ™* J^ⁿ _Oranui_aten oder Suppositorien, ist wird Cytochrom c als eines der wichtigsten Mittel m weise Tabtetten U _{Stabilisatoren}, wie beispielsder klinischen Praxis angesehen Seine Verabreichung selbst das ™'ng^e Reduktionsmitteln, Amino-

Oerbindung istfkaum in den Organismus aufgenom- An^ungm^tffjget ^

men werden kann, wenn es nicht parenteral verab- 6o J£W^*™™\* _denen die obengenannten

^reiCytol^rr^dom c, das ein aus tierischen Herzen oder aus Nacht^u^alt« «nA _von

Mikroorganismen, wie beispielsweise Hefe extrahier EJT^oSrOm «>-Mp«aten gefunden, die sich

tes Protein ist, ist gegenüber dem menschlichen Korper ^f^bl*f".^ Verabreichung eignen. Das erfindungsein Fremdprotein, das gelegentlich auf Grund einer 65 ™' «^X^besteht darin, ein Gemisch von Antigen-Antikörper-Reaktion eine Anaphylaxie_ her- gemäße Verfahren _{hrQm c}

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zu trocknen, bei denen das Cytochrom c in einem Lösungsmittel mit schwachem Dehydratationsver-

kolloidalen Gelzustand verbleibt. Nach diesem Ver- ruögen begonnen wird tind dann stetig zu einem

fahren erhält man ein gelähnliches verfestigtes Pro- Lösungsmittel mit stärkerem Dehydratauonsvermögen

dukt. Beim Trocknen des Lyogels unter Bedingungen übergegangen wird. Die obengenannten kugelförmigen

hoher Temperaturen oder unter Gefrier-Bedingungen 5 Granulate können durch geeignete Wahl der Gelatine^

wird der Gelzuständ spontan zerstört. konzentration, der Art des Bewegens, der Art des Eih-

Mit besonderem Vorteil wird das Gemisch vor dein tfopfens, der Art der mit Wasser nicht mischbaren

Trocknen oadurch in Kügelcheii übergeführt, daß das Flüssigkeit und der Temperatur auf den gewünschten

Gemisch auf eine Temperatür, die über Zimmer- Durchmesser gebracht werden.

temperatur liegt, jedoch nicht so hoch ist, daß sie die io b) Das obengenannte Gemisch von Gelatine und Aktivität des Cytochroms c beeinträchtigt, erwärmt einer wäßrigen Lösung von Cytochrom c wird dünn wird und das hierdurch erhaltene flüssige Gemisch in verteilt in eine Form gegossen, in der es zu einem Gel eine Flüssigkeit, die mit Wasser nicht mischbar ist abgekühlt wird. Das Gel wird an der Luft bei vefhält- und die bei einer Temperatur gehalten wird, die nismäßig niedriger Temperatur, bei der es seinen niedriger als die Temperatur des Gemisches ist, ein- 15 kolloidalen Gelzustand beibehält, vorzugsweise bei gebracht wird. Dabei kann das verflüriigte Gemisch einer Temperatur unter 20⁰C, trocknen gelassen oder in Form von Tröpfchen in diese Flüssigkeit ein- langsam unter trockenem Gas entwässert. Die ergebracht werden. Hierbei ist es weiterhin vorteilhaft, haltene trockene feste Substanz wird dann auf die die Kügelchen mit einem dehydratisierenden Lösungs- gewünschte Größe zerkleinert, um ein Granulat zu mittel zu trocknen. 20 erhalten.

Erfindungsgemäß kann ein stabiles Cytochrom c Sowohl die Arbeitsweise a) als auch die Arbeitsenthaltendes Präparat erhalten werden, indem ein weise b) ist zur Durchführung des erfindungsgemäßen wäßriges kolloidales Gemisch von Cytochrom c und Verfahrens gut geeignet. Die Arbeitsweise a) hat den Gelatine zunächst abgekühlt oder langsam entwässert Vorteil, daß leicht gleichförmige kugelförmige Körner wird, um es in ein Lyogel überzuführen, und dieses 25 erhalten werden können und dann auf diese Körner anschließend durch Entfernung von Wasser getrocknet leicht ein Enteralüberzug oder magenresistenter Überwird, wobei es in einem kolloidalen Gelzustand ge- zug aufgebracht werden kann.

halten wird. Die Zugabe von irgendeinem anderen Zur oralen Verabreichung können die erhaltenen

Stabilisator als der Gelatine ist dann unnötig. Granulate als Granulatpräparate mit einem Enteral-

Vorteilhafte Ausführungsformen des erfindungs- 30 überzug zur Verhinderung einer Zersetzung von

gemäßen Verfahrens sind die folgenden: Cytochrom c durch Magensäure und Pepsin verwendet

a) Gelatine wird zu einer wäßrigen Lösung von werden. Sie können aber auch unter Druck zu üblichen Cytochrom c zugegeben. Die erhaltene Lösung wird Tabletten geformt werden, zu denen ein Excipiens zur vollständigen Auflösung auf eine Temperatur zugegeben werden kann, oder sie können zu Suppoerhitzt, die nicht so hoch ist, daß sie die Aktivität des 35 sitorien durch Suspendieren des Granulats ohne Cytochroms c beeinträchtigen würde (vorzugsweise Enteralüberzug in einer Suppositoriengrundmasse, auf 40 bis 5O⁰C). Dann wird die Lösung in eine wie beispielsweise geschmolzenes gehärtetes öl, Kakao-Flüssigkeit gegossen, die mit Was-ser nicht mischbar butter oder Polyäthylenglykol, und Gießen der ist und bei niedrigen Temperaturen nicht hochviskos Suspension in eine Form verarbeitet werden,
wird oder gefriert, wie beispielsweise ein pflanzliches 40 Die so hergestellten Cytochrom c-Präparate werden öl (z. B. Ricinusöl, Camelliaöl oder flüssiges Paraffin), als innerlich einzunehmiende Arzneimittel in Form Mineralöl oder Hexadecylalkohol, und die Lösung von Granulaten oder Tabletten oder als Suppowird dann unter Rühren abgekühlt. Die Lösung kann sitorien verwendet. Im Vergleich mit den Präparaten, aber auch in die obengenannte Flüssigkeit eingetropft die injiziert werden, führen sie nicht so leicht zu einer werden, um gelartige Tröpfchen zu bilden. Diese gel- 45 Anaphylaxie. Die nach dem erfindungsgemäßen Verartigen Tröpfchen werden abfiltriert, um sie abzu- fahren hergestellten stabilen Cytochrom c-Präparate trennen, und unter vermindertem Druck oder trocke- sind sehr viel besser als die üblichen Präparate und ner Luft bei einer Temperatur, die die Aufrecht- sowohl vom medizinischen als auch vom pharmaerhaltung des kolloidalen Gelzustands gewährleistet, zeutischeh Standpunkt aus außerordentlich wertvoll, gehalten, um sie langsam zu trocknen. Es kann so ein 50 Der erfindungsgemäße Stabilisierungsmechanismus vollständig verfestigtes kugelförmiges Granulat er- für Cytochrom c ist nicht völlig geklärt, doch wird der halten werden. Die Kühltemperatur, bei der die Kugel- folgende Mechanismus angenommen: Das gelierte chen gehalten werden sollen, variiert irt Abhängigkeit Gemisch der wäßrigen Lösung von Cytochrom c mit von der Gelatinekonzentration, muß jedoch so sein, Gelatine wird entwässert, während es in kolloidalem daß die Beibehaltung des kolloidalen Gelzustahds 55 Gelzustand gehalten wird. Die Moleküle des Cytosichergestellt ist. Vorzugsweise liegt die Temperatur chroms c werden hierdurch in einem verteilten Zuunter 20⁰C. stand irt dem Gelatinegel gehalten. Sie werden daher

Die obige Trocknung kann Wit bekannten Lösungs- äußeren Einflüssen, wie Sauerstoff odef Licht, nicht

mitteln für eine Dehydration, wie beispielsweise direkt ausgesetzt und sind wirksam vor diesen ge-Aceton oder Alkohol, vorgenommen werden, doch 60 schützt, so daß das Cytöchrörn c-Molekül einen

muß die anfängliche Trocknung unter Verwendung starken Widerstand gegen Aktivitätsverlust aufweist,

eines Lösungsmittels vorgenommen werden, das ein Bei dein erfindungsgemäßen Verfahren ist dl6

Dehydratationsverrnögen besitzt, das durch Zugabe unerläßliche Bedingung für die Stabilisierung vöii

von Wasser gesteuert wird. Andernfalls wird, wie Cytochrom c, das Gemisch Von Gelatine und wäßfiget bekannt, nur die Körneröberfläche trocken und fest, 65 Lösung vört Cytochrom c durch Entfernung des

was dazu führt, daß der kolloidale Gelzuständ auf- Wassers zu trockfieri, während däS GeiriiscH in

gehoben witd. Es ist daher zweckmäßig, die Dehy- kolloidalem Geizusiatid gehalten wird. Daß _^aj. ?

dratation in der Weise vorzunehmen, daß mit einem möglich ist, geht aus dem folgenden Ergebnissen hervor.

Bei der Herstellung des obengenannten lyophilisierten Cytochroms c zur Injektion wurde Gelatine zu der wäßrigen Lösung von Cytochrom c vor der Lyophilisation zugegeben, um eine Verminderung des lyophilisierten Produkts zu verhindern und hierdurch dessen kommerziellen Wert zu verbessern. Es wurde gefunden, daß Gelatine unter den Bedingungen der Lyophilisation nicht zur Stabilisierung von Cytochrom c beiträgt, wie in der nachfolgenden Tabelle I gezeigt ist. Dies kann durch die Tatsache bewiesen werden, daß, wenn die Cytochrom c enthaltende Ampulle unvollständig verschlossen ist, das Eindringen von Luft und Feuchtigkeit das Cytochrom c verfärbt und die Aktivität des Cytochrom c stark herabgesetzt wird. Es ist daher im Falle des üblichen lyophilisierten Produkts mit Gelatine notwendig, daß der obengenannte Stabilisator zugesetzt wird und das Produkt vollständig von äußeren EinSüssen durch sorgfältiges Verschließen in einer Ampulle oder einem anderen Behälter abgeschlossen wird. Es ist auch zweckmäßig, die Luft in der Ampulle durch Inertgas, wie beispielsweise Stickstoff, zu ersetzen.

Es ist besonders bemerkenswert, daß im Gegensatz hierzu die erfindungsgemäß erzielte Stabilisierungswirkung auf Cytochrom c sehr erheblich ist, wobei bei der Verwendung der gleichen Gelatine weder eine Zugabe von anderen Stabilisatoren noch ein Verschließen des Behälters erforderlich ist.
In Tabelle 1 sind die Ergebnisse der Lyophilisation einer Lösung von gereinigtem Cytochrom c aus Pferdeherz angegeben, die die relative Stabilität von Cytochrom c im Falle von Cytochrom c allein, Cytochrom c, zu dem Gelatine zugegeben wurde, und Cyto-

chrom c, zu welchem Natriumbisulfit zugegeben wurde, und von Cytochrom c, zu welchem Natriunibisulfit und Gelatine zugegeben wurde, zeigen. 1 ml der in Tabelle I angegebenen wäßrigen Lösungen wurde in Ampullen gegeben. Nach Lyophilisation wurden

die Ampullen verschlossen und in einer temperaturgeregelten Umgebung bei 45°C aufbewahrt. Anschließend wurde die Änderung der Aktivität geprüft. Die A-ktivität wurde mit Hilfe des Warburg-Manometers gemessen. Proben wurden zu einem System von

Ascorbinsäure und Cytochromoxydase zugegeben, um den Sauerstoffverbrauch zu bestimmen. Die Zahlenwerte bei den Versuchsdaten geben die Restaktivität in Prozent, berechnet aus dem Sauerstoffverbrauch des Cytochroms c, an.

Tabelle I

Proben

Zeitspanne

Luft nicht durch	ersetzt	Stickstoff	30 Wochen	1 Wo
		58	88
1 Woche	10 Wochen	56	88
85	66	60	90
81	67	87	98
88	69	85	97
96	92
96	90

Luft durch Stickstoff ersetzt I 10 Wochen I 30 Wochen

Cytochrom c, 15 mg

Cytochrom c, 15 mg; Gelatine, 5 mg

Cytochrom c, 15 mg; Gelatine, 50 mg

Cytochrom c, 15 mg;
Nairiumbisulfit, 1 mg

Cytochrom c, 15 mg; Natriumbisulfit 1 mg + Gelatine, 5 mg ...

70

72 73

93
92

Die Ergebnisse zeigen, daß die Gelatine in dem lyophilisierten Produkt nicht zur Stabilisierung von Cytochrom c beiträgt.

Diese fehlende Wirkung von Gelatine für die Stabilisierung von Cytochrom c bei der Lyophilisation scheint dadurch bedingt zu sein, daß keine koexistierende Beziehung zwischen Cytochrom c und Gelatine nach der Lyophilisation vorhanden ist.

Wie bereits ausgeführt wurde, beruht die vorliegende Erfindung darauf, daß Cytochrom c allmählich absorbiert werden kann, wobei seine wirksame Konzentration im Blut langer andauert als im Falle der Injektion und die Wirksamkeit nicht geringer als bei Injektionen ist Eine genauere Erläuterung soll an Hand des in der Zeichnung gezeigten Diagramms erfolgen.

Die Kurven zeigen den Durchschnitt von fünf Messungen der Änderungen der Konzentration von Cytochrom c im Serum bei Versuchen, bei denen 20 mg einer Lösung von Cytochrom c aus Pferdeherz in die Vene und in das Doudenum einer etwa 200 g wiegenden Ratte eingeführt wurden. Auf der Abszisse ist die Zeit nach der Verabreichung aufgetragen und auf der Ordinate die Menge an Cytochrom c in μg, die in 1 ml Serum festgestellt wurde. Bei intravenöser Verabreichung (gestrichelte Linie) beträgt der Wert nach 1 Stunde nach Verabreichung etwa 2 μ-g/ml und das Cytochrom c verschwindet innerhalb von 6 Stunden vollständig, so daß die Dauer der wirksamen Konzen-

tration im Blut kurz ist. Bei oraler Verabreichung in das Duodenum (ausgezogene Linie) wird die Konzentration über 1 μg/ml etwa 2,5 Stunden gehalten, und es ist noch etwas Cytochrom c im Blutstrom, selbst nach 6 Stunden, vorhanden. Diese experimentellen

Ergebnisse beweisen, daß Cytochrom c durch die Wandungen des Intestinaltrakts durchgehen und in den Blutstrom eintreten kann und daß, da dieser Durchgang verhältnismäßig langsam ist, eine wirksame Konzentration an Cytochrom c im Blut für eine ver-

hältnismäßig lange Zeitspanne aufrechterhalten werden kann.

Die bei dem vorliegenden Versuch angewendete quantitative Analyse der Cytochrom c-Konzentration ist ein neues Verfahren, das zur Messung von Spuren-

mengen an Cytochrom c im Serum ausgearbeitet wurde (N.Ogawa, ETajima, K. Tajima und T. Kinoshita, Journal of Japanese Biochemical Society, Bd. 42 [1970], S. 718). Dieses Verfahren, für das hier keine Rechte beansprucht werden,

zeichnet sich durch eine Empfindlichkeit aus, die 100-bis lOOOmal höher als diejenige der üblichen Messungen der respiratorischen Aktivität oder der Messung des Absorptionsspektrums ist, so daß es möglich ist, eine

Spurenmenge von nut 0,05 μg Cytochrom c pro MiIlU liter nachzuweisen.

Das neue Verfahren ist das folgende: Cytochrom c wird an Schafs-Erythroeyten; die mit Formaldehyd und Gerbsäure zur Bildung von sensibilisierten roten Blutkörperchen behandelt sind, absorbiert. Diese sensibilisierten röten Blutkörperchen können mit dem Antikörper von Cytochrom e reagieren und eine Agglutination einleiten. Wenn jedoch mehr als 0,05 ^g an freiem Cytochrom c in diesem Reaktionssystem vorhanden ist, wird die Hämagglutination inhibiert. Auf diese Weise kann durch gleichzeitige Durchführung von Reaktionen in Verdünnungsreihen der Proben und in den Standardverdünnungsreihen von Cytochrotn c- und Vergleich des Grads der Inhibierung der Agglutination die Menge an Cytochrom c in der Probe bestimmt werden.

In der Praxis wurde eine Chromatographie des geprüften Serums unter Verwendung eines schwach sauren Ionenaustauscherhärzes vom Ammoniumtyp durchgeführt. Das Cytochrom c wurde aus dem Serum abgetrennt, und die niedrigmolekulare Komponente wurde durch Dialyse entfernt. Die quantitative Analyse Würde dann unter Verwendung der obigen Hämagglutinationsinhibierungsreaktion durchgeführt.

Immunologische Methoden, wie beispielsweise Blütgruppenbestitnmung oder Identifizierung von Virusstämmen, zeichnen sich bekanntlich durch außerordentlich hohe Spezifität aus. Es gibt viele Variationen dieser Methode^ unter denen eine geeignete Methode füf einen gegebenen Zweck ausgewählt werden kann.

Die obengenannte Methode der Hämagglutinationsinhibierungsreäktion ist unter den verschiedenen Arten dieser immunologischen Methode bemerkenswert empfindlich und eine ausgezeichnete Methode zur quantitativen Analyse von Spuren von Proteinhormon in Körperflüssigkeiten, beispielsweise Gonadotropin oder Wachstumshormon. Bei der vorliegenden Erfindung Würde bei Anwendung dieser empfindlichen und spezifischen Methode in Anbetracht der Tatsache,

daß Cytochrom c ein stark basisches Pfoteih ist, das Verfahren def selektiven Extraktion ühd Reinigung von Cytochrom e aus dem geprüften Serum durch Chromatographie gewählt. Die Ergebnisse dieser quantitativen Analysen sind daher außerordentlich

iö genau und reproduzierbar Und zeigen die Änderung der Konzentration des verabreichten Cytochrorhs c im Blut genau.

Die obigen expefift^htellen Ergebnisse sind ein Beweis dafür, daß die Wirksamkeit Von oral verabreichten! Cytochfoitt e ebenso gut ist wie diejenige bei Verabreichung durch Injektion.

Dies wird genauer durch den folgenden Versuch der erhöhten Wirkung auf Leuköcyten gezeigt.
Es ist bekannt, daß intravenös injiziertes Cyto-

ab chrom c bei der Heilung von Patienten itt den häufigen Fällen einer durch Verabreichung von Antitumormitteln, wie beispielsweise Triäthylenthiophosphoramid oder Mitomycin G, verursachten Leukopenie wirksam ist In der nachfolgenden Tabelle II sind die

»5 Ergebnisse Von Versuchen zusammengestellt, bei denen 35 mg Cytochrom c je Kilogramm Körper^ gewicht und je Tag an Kaninchen mit Leukopenie verabreicht wurden, nachdem die Leukopenie durch Verabreichung von Triäthylenthiophosphöramid expenmentell erzeugt worden war. Die Wiederherstellung der Anzahl der Leuköcyten bei diesen Tieren würde mit der Anzahl an Leukocytert in einer Kontrollgruppe von Kaninchen verglichen. Bei diesem Versuch wurde ein Cytochrom ^Granulat, das erfindungsgemäß aus Pferdeherzmuskel hergestellt und mit einem Enteralüberzug versehen war, den Kaninchen oral verabreicht.

	0	Tabelle II	3460 2900	12	15
	1590 1760			5460 2860	6400 4690
Aiizahl der Leukdeyten Gruppe* der Granulat mit Ente- ralüberzug verabreicht würde Kontrollgruppe	Verabreichungstage 5 j 8
	2960 2970

Die in der Tabellen angegebenen Werte sind Durchschnittswerte für 6 Tiere in jeder Gruppe.

Die Tiere der Kontrollgruppe erholten sich zwar von Natur aus mit einer feststellbaren Erhöhung der Anzahl der Leuköcyten, doch war die Erholung in der Testgruppe, der das erfindungsgemäß erhaltene Granulat von Cytochrom c mit Enteralüberzug verab-Teicht wurde, schneller, was die Beschleunigung der Leukocytenbildung durch Cytochrom c zeigt Wenn der Erholungsprozeß als zwei Gruppen von dreidimensionalen Probenvektoren in den gleichen Zeitreihen dargestellt und die Hauptpopulationsvektoren statistisch verglichen werden, so kann zwischen beiden eine Signifikanz in einem Grad von weniger als 5% festgestellt werden.

Außerdem hat ein Vergleich praktischer klinischer Versuche zwischen dem erfindungsgemäß erhaltenen Cytochrora c und injiziertem Cytochrom c ergeben, daß das eifindungsgemäß erhaltene Cytochrom c nicht weniger wirksam als das injizierte Cytochrom c ist Außerdem wurde bei zahlreichen klinischen Versuchen von keinem Fall einer Anaphylaxis, wie sie bei Injektionen beobachtet wird, berichtet wenn erfindungsgemäß erhaltenes Cytochrom c verwendet wurde. Erfindungsgemäß kann daher der schwere Nachteil vonlnjektionenvon Cytochrom c ausgeschaltet werden. Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

25 g gereinigtes Cytochrom c aus Pferdeherzmuskel wurden in 370 ml destilliertem Wasser gelöst, und 75 g Gelatine wurden zu der erhaltenen Lösung zugegeben, die anschließend auf etwa 40⁰C unter gelegentlichem Bewegen erwärmt wurde, wobei ein allmähliches Lösen auftrat Ein graduierter Zylinder mit einem Fassungsvermögen von 1500 ml wurde mit 1200 ml Ricinusöl gefüllt. Die obere Schicht des

Ricinusöls in dem Zylinder wurde auf 20 bis 30° C erwärmt, während die untere Schicht bei 5°C oder bei etwa diesem Wert durch Außenkühlung mit Eis oder mit einem anderen Mittel gehalten wurde. Dann wurde das Gemisch von Gelatine und Cytochrom c langsam zu der oberen Schicht des Ricinusöls in dem Zylinder unter Rühren zugesetzt. Das Gemisch von Gelatine und Cytochrom c im oberen Teil des Zylinders wurde in Form von kugelförmigen Teilchen verteilt und während des Absinkens abgekühlt, wobei sich die Teilchen am Boden als gelierte Körnchen absetzten. Der größere Teil des Ricinusöls wurde dann durch Dekantieren abgetrennt, und das Wasser wurde bei einer Temperatur von unter 20° C unter einem Druck von 1 mm Hg unter gelindem Rühren verdampft. Nach Entfernung des größeren Teils des Wassers wurden die Körnchen gesammelt, dreimal mit Aceton zur Entfernung des Ricinusöls gewaschen und in einem mit Phosphorpentoxyd gefüllten Exsikkator vollständig getrocknet.

Beispiel 2

10 g gereinigtes Cytochrom c aus Candida utilis, einem Hefestamm, wurden in 200 ml destilliertem Wasser gelöst 50 g Gelatine wurden zu der erhaltenen Lösung zugegeben, die anschließend auf 4O⁰C unter gelegentlichem Bewegen zur Begünstigung der allmählichen Auflösung erwärmt wurde. Unmittelbar nach der vollständigen Auflösung wurde die Lösung in eine 100 · 300-mm-Form mit einer Tiefe von 10 mm gegossen und abkühlen gelassen.

Nach vollständiger Gelierung wurde das Produkt in einem Niedrigtemperaturtrockner bei etwa 20° C getrocknet Nach Trocknen wurde es auf die gewünschte Korngröße zerkleinert Die folgenden Prüfungsergebnisse zeigen die Stabilität der erfindungsgemäß erhaltenen Cytochrom c-Präparate.

Die in der nachfolgenden Tabelle III angeführte Probe besteht aus kugelförmigen Körnchen, die nach dem Verfahren gemäß Beispiel 1 erhalten war. Die in den nachfolgenden Tabellen IV und V angeführten Proben sind Tabletten aus den Granulaten, die nach den Beispielen 1 bzw. 2 erhalten wurden und dann zu Tabletten mit Lactose als Excipiens in üblicher Weise verarbeitet waren.

Die nachfolgenden Tabellen geben die Restaktivität in Prozent, gemessen in der gleichen Weise wie in Tabelle I, an.

Tabelle III

Probe

Erfindungsgemäß erhaltenes Granulat

Lagerungsdauer bei 45° C 1 Woche j 10 Wochen | 30 Wochen

92

91

Tabelle IV

Probe

Erfindungsgemäß erhaltene Tabletten

Lagerun(!sdauer bei 45° C 1 Woche j 10Wochen | 30Wochen

93

89

Tabelle V

Probe

Erfindungsgemäß
erhaltene Tabletten! 96

Lagerungsdauer bei 45° C

4 Wochen

7 Wochen

12 Wochen

96

24Wo-I chen

|41 Wochen

94

Wie aus den Tabelle III bis V ersichtlich ist, behalten die erfindungsgemäß erhaltenen Cytochrom c-Präparate trotz der Tatsache, daß ein Stabilisator, wie er für übliche Cytochrom c-Präparate unerläßlich ist, nicht verwendet wird, ihre Aktivität über eine sehr lange Zeitspanne bei Lagerung bei 45° C bei. Bei einem Vergleich der Stabilität gegenüber derjenigen von üblichen lyophilisierten Präparaten, die sich zur Injektion eignen, wie sie in Tabelle I angegeben sind, ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäß erhaltenen Präparate den üblichen Präparaten zur Injektion, zu denen Stabilisatoren zugegeben wurden und die in Ampullen, in denen die Luft durch Stickstoff ersetzt wurde, enthalten sind, äquivalent sind. Wie die Kurven in dem Diagramm der Zeichnung zeigen, können die erfindungsgemäß erhaltenen Cytochrom c-Präparate ihre Konzentration im Blut für viele Stunden auf einem erheblichen Spiegel beibehalten.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

cyto^omc g. ς*

1. Verfahren zur Herstellung eines stabilen ^b^ⁿ> .^"Ιί J J^ _Κγ eine kurze Zeitspanne vor-Cytochromc enthaltenden Präparats, dadurch 5 ^^^^^„ößere Teil des Cytochromsc gekennzeichnet, daß ein Gemisch von ^hMden "J ™* X^Körper ausgeschieden wird. Gelatine und einer wäßrigen Lösung von Cyto- ^U^XJ ^we"n Nachteile von Cytochromc chrom c geliert und das erhaltene Gel unter Bedin- Um djese scnw _Brauchbarkeit stark eingungen getrocknet wird, bei denen das Cyto- auszuschalten ^e ^^ _{nun Tierver}s_Uc_he chrom c in einem kolloidalen Gelzustand verbleibt io schrieen und vermm, _{A üonsrate und der}

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- ^.f^f^^ochrom c bei oraler Verabreizeichnet, daß das Gemisch vor dem Trocknen da- ^ [ksamkeit von yx Verabreichung durch durch in Kügelchen übergeführt wird, daß das chung die ⁸Jj^ ^ _{Es wurd}e angenommen, Gemisch auf eine Temperatur, die über Zimmer- Injektion £^™f ^.^ _{verabreichte Cyt0}. temperatur Hegt, jedoch nicht so hoch ist, daß sie x₅ daß te ^ ™ _{bieren wünlc}.

die Aktivität des Cytochromsc beeinträchtigt, chrome »™^r *^ _{d daß im} Gegensatz zu erwärmt wird und das hierdurch erhaltene flüssige Es .^J^^schen Regel Cytochrom c

Gemisch in eine Flüssigkeit, die mit Wasser nicht der «^«jj^g langsam absorbiert werden mischbar ist und die bei einer Temperatur gehalten durch ^^^Konzentration im Blut langer wird, die niedriger al* die Temperatur des Ge- ao kann, ^ ^S^_{ü vorha}nden bleibt und seine misches ist, eingebracht wird. ate im ™1ε einer "g _d j _{Falle einer} Injekt.on

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekenn- W>rksamke.t mc* gennge* Erfindung. Es

zeichnet, daß das verflüssigte Gemisch in Form von ^ »«fj™¹^ _die klinische Brauchbarkeit Tröpfchen in diese Flüssigkeit eingebracht wird. wurde estgestellt, daL Verabreichung

4 Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekenn- *₅ von C>toch mc dun» α _{che Durchführung}

zeichnet, daß die Kügelchen mit einem dehydrati- erhöht werden kann ^_n _{ς außero}rdentlich

sierenden Lösungsmittel getrocknet werden. ist jedoch schwierig, αϊ y

ⁱⁿS^S verliert insbesondere seine Aktivität