CN101205302A - 一种聚磷酸酯-聚己内酯三嵌段共聚物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种聚磷酸酯－聚己内酯三嵌段共聚物及其应用。该嵌段共聚物是由聚磷酸酯和疏水性聚己内酯组成的三嵌段共聚物。本发明还提供了由上述的嵌段共聚物制成的纳米颗粒。本发明得到的嵌段共聚物具有良好的生物相容性和可降解性，其物理、化学性能可通过聚己内酯与聚磷酸酯嵌段的分子量及其组成变化而调节，适用于纳米药物载体、基因治疗载体，也可用于再生医学的细胞与组织工程培养的支架材料，大分子前体药物，生物材料表面修饰等领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种聚磷酸酯-聚己内酯三嵌段共聚物及其应用。
背景技术
如何使药物到达病灶部位，并在病灶部位和病灶细胞内释放，是现今药物制剂学的热点和难点。通过药物可控释放和靶向药物输送系统能够减少药物降解与损失，降低副作用，提高生物利用度和疗效。聚合物纳米颗粒载药范围广、结构稳定、具有优良的组织渗透性，体内滞留时间长，能使药物有效地到达靶点，可以提高药物稳定性，延缓释放，提高药效，降低毒副作用。
大量研究证明，纳米尺度的聚合物药物载体可促进药物在肿瘤组织的富集，用纳米药物载体输送药物，在癌症治疗中显示出良好的效果，具有广阔的应用前景。由于肿瘤组织的微环境与正常组织存在显著的差别，不利于小分子药物通过血管输送到肿瘤组织的深部及肿瘤细胞内药物作用的靶位。然而，由于肿瘤新生血管内皮细胞的不连续性，允许粒径小于200nm的粒子通过血管壁进入组织间隙，因此，将药物装载到纳米粒中可通过渗透和滞留增强效应(enhanced permeabilityretention，EPR)在肿瘤组织中富集进而实现被动靶向。研究证实将抗癌药物包载于纳米粒中可5-10倍提高药物在肿瘤部位的富集，如进一步在纳米粒的表面偶联肿瘤细胞特异性亲合配体，可进一步提高药物在肿瘤部位的富集(与游离药物相比)。基于上述研究结果，一些抗癌药物的纳米制剂已被开发并用于临床上治疗各种肿瘤，如美国FDA批准的阿霉素长循环脂质体(DOXIL)、柔红霉素脂质体(DAUNOXOME)和2005年批准的紫杉醇白蛋白纳米粒以及我国批准的紫杉醇脂质体等。临床用药表明，上述纳米药物载体促进了化疗药物在肿瘤组织的富集，明显降低药物的毒副作用，并改善患者的生存质量，治疗效果与游离药物相比明显提高。
利用聚合物纳米颗粒输送药物可以将生物功能化的分子或者配基键合到聚合物纳米颗粒的表面，从而实现对特定细胞的靶向药物输送，典型的实例如在由疏水性聚己内酯和功能化的聚乙二醇嵌段共聚物纳米颗粒表面键合适体(aptamer)分子，识别前列腺细胞膜表面特异性抗原，或键合半乳糖基识别肝癌细胞表面过表达的去唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)。实施生物功能化的分子或者配基到聚合物纳米颗粒的表面键合需要建立简便的方法，对纳米颗粒组成的化学结构具有特殊要求，具体的讲，聚合物亲水链段的末端应具有反应性的官能基团。
生物可降解高分子在药物输运中具有更好的应用前景，原因是生物可降解高分子可以在生物体内降解，其降解产物或被排出体外，或参与生命体代谢，从而可以减少副作用。合成生物可降解高分子包括聚己内酯、聚原酸酯、聚酸酐等在内的大量可降解高分子，这些高分子在药物输运、基因传递、细胞培养和组织工程等生物医用领域获得了广泛的应用。聚磷酸酯是一类由磷酸酯键连接主链结构单元的可降解高分子材料，最早用作阻燃材料；在上个世纪80年代，开始用于核酸和磷壁酸的仿生合成；接着在1980年代开始用于药物传输等生物医用方面的研究；比较成功的用于药物输运的例子是美国Guilford公司开发的Polilactofate微球，它用于肺癌和卵巢癌的治疗的临床试验，使用的是以磷酸酯为扩链剂的聚酯-聚磷酸酯共聚物，通过乳液法制备的微米级颗粒。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种聚磷酸酯-聚己内酯三嵌段共聚物。
所述聚己内酯为聚ε-己内酯(PCL)；
所述聚磷酸酯(PEEP)由结构式如式(I)的2-乙氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷(2-ethoxy-2-oxo-1，3，2-dioxaphospholane或ethyl ethylene phosphate，EEP)单体聚合而成；
所述三嵌段共聚物中，中间嵌段是所述PCL，两个末端嵌段是所述PEEP；所述两个PEEP嵌段的聚合度均为7-352，对应的数均分子量为1,060-5,3500；所述PCL的聚合度为27-186，对应的数均分子量为3,080-2,1200。
所述三嵌段共聚物表示为PEEP-PCL-PEEP。
上述PEEP-PCL-PEEP共聚物可按照下述方法合成：由异辛酸亚锡催化，大分子聚己内酯引发合成两亲性三嵌段共聚物。
本发明的另一个目的是提供一种纳米颗粒。
本发明所提供的纳米颗粒，由上述PEEP-PCL-PEEP共聚物制成。
所述纳米颗粒的直径可为35-196nm。
本发明的第三个目的是提供一种药物载体。
本发明所提供的药物载体，它的成分是上述纳米颗粒。
本发明的目的还包括提供了用上述PEEP-PCL-PEEP共聚物的纳米颗粒制备的药物输送体系。
本发明得到的PEEP-PCL-PEEP共聚物具有良好的生物相容性和可降解性，其物理、化学性能可通过PEEP与PCL嵌段的分子量及其组成变化而调节。该共聚物主要适用于纳米药物载体、基因治疗载体，也可用于再生医学的细胞与组织工程培养的支架材料，大分子前体药物，生物材料表面修饰等领域。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明
附图说明
图1为PEEP-PCL-PEEP共聚物的合成路线。
图2为PCL大分子引发剂及PEEP-PCL-PEEP共聚物的(A)1H NMR和(B)13C NMR谱。
图3为PCL大分子引发剂及PEEP-PCL-PEEP共聚物的GPC谱。
图4为芘在不同浓度的纳米颗粒溶液中的激发光谱。
图5为共聚物I339.0/I335.5强度比与CMC对数的关系。
图6为共聚物在水溶液中的粒径及粒径分布图。
图7为PEEP49-PCL36-PEEP49不同时间降解产物的GPC谱。
图8为PEEP49-PCL36-PEEP49共聚物的降解产物的1H NMR图谱。
图9为不同浓度PEEP44-PCL27-PEEP44纳米颗粒的细胞毒性。
图10为不同共聚物纳米颗粒的细胞毒性。
图11为PEEP-PCL-PEEP纳米颗粒对负载的紫杉醇的释放
具体实施方式
本发明提供了ABA型三嵌段聚磷酸酯-聚己内酯共聚物及其自组装纳米颗粒，以及纳米颗粒用于负载药物的纳米药物输送体系。该共聚物包括聚磷酸酯(A嵌段)和脂肪族聚己内酯(B嵌段)，所述A嵌段由结构式如式(I)的2-乙氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷(EEP)单体聚合而成，所述B嵌段为聚ε-己内酯(PCL)。所述三嵌段聚磷酸酯-聚己内酯共聚物表示为PEEP-PCL-PEEP。
PEEP-PCL-PEEP共聚物可按照下述方法合成：以端羟基聚ε-己内酯(HO-PCL-OH)为大分子引发剂，以异辛酸亚锡(Sn(Oct)2)为催化剂引发2-乙氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷(EEP)单体开环聚合。通过控制磷酸酯环状单体与脂肪族酯的投料比可以制备不同嵌段长度的ABA型三嵌段共聚物；通过改变单体与引发剂的比例能制备不同分子量的ABA型三嵌段共聚物。聚磷酸酯-聚己内酯共聚物是生物降解的，生物相容的。生物降解是指该聚合物能够利用水解或酶催降解作用在身体内降解。生物相容是指全部的组分在身体内无毒。聚磷酸酯-聚己内酯共聚物具有两亲性，在水溶液中自组装形成纳米尺度的颗粒，颗粒的尺寸与共聚物的组成相关，可以调控。聚磷酸酯-聚己内酯共聚物纳米颗粒具有良好的生物相容性。纳米颗粒可用于包载疏水性药物到其内核(疏水核)，包载的药物如抗癌药物紫杉醇、阿霉素等。颗粒的表面可以方便的进行化学和配体修饰，实施靶向药物输送。
本发明中的A嵌段PEEP，为亲水性聚磷酸酯，作为本发明的三嵌段中的末端链段结构，其相对分子量是1,060-5,3500。
本发明中的B嵌段PCL，为疏水性脂肪族聚酯，作为本发明的三嵌段共聚物的中间段结构，其相对分子量为3,080-2,1200。它的优点在于：①相对疏水性，因此在聚合物链之间的疏水-疏水相互作用促进共聚物自组装；②可生物降解；③无毒的和生物相容的；④合成简单且可控。
下述实施例提供了上述PEEP-PCL-PEEP共聚物的合成方法。本发明的三嵌段共聚物可在水环境中自组装形成纳米颗粒并应用于疏水性药物的运输载体。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中的Log特指Log10。
实施例1、PEEP-PCL-PEEP共聚物的合成和表征
一、PEEP-PCL-PEEP共聚物的合成
具有各种分子量的端羟基聚ε-己内酯(HO-PCL-OH)大分子引发剂在本体条件下通过己内酯环状单体在乙二醇(EG)引发、异辛酸亚锡(Sn(Oct)2)催化条件下的开环聚合反应得到。以两端羟基的聚己内酯为大分子引发剂、异辛酸亚锡为催化剂可以合成一系列PEEP-PCL-PEEP共聚物。异辛酸亚锡因其高催化效率及无毒性，是被最广泛应用的内酯及交酯环状单体开环聚合反应的催化剂，已被美国FDA批准作为食品添加剂。
PEEP-PCL-PEEP共聚物的合成路线如图1所示。
1)2-乙氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷(EEP)的制备
首先通过三氯化磷与乙二醇反应合成2-氯-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷(2-chloro-2-oxo-1，3，2-dioxaphospholane，COP)，然后COP与乙醇反应合成EEP，具体的合成方法如下：
在1000mL的三口圆底烧瓶中，将三氯化磷(3.0mol)溶解于无水二氯甲烷(500mL)中，通过恒压滴液漏斗缓慢滴入乙二醇(3.0mol)，待全部滴完后，继续反应0.5小时，减压下蒸去溶剂，连续减压蒸馏两次将产物蒸出(50℃，200Pa)。将产物溶解在苯中，通入O2反应48小时，减压下蒸出溶剂苯，再于减压下连续蒸馏两次将产物蒸出(88-89℃，20Pa)，在N2气氛下于1℃冰箱中封存。
在一个干燥的1000mL三口烧瓶中，用注射器依次加入0.3mol乙醇，0.3mol的三乙胺和500mL的四氢呋喃(THF)，将体系冷却到-5℃后，边搅拌边用恒压滴液漏斗缓慢加入COP的四氢呋喃溶液(0.154mol COP溶于100mL四氢呋喃)，约1小时滴完，体系在-5℃再反应24小时。将白色的三乙胺盐酸盐沉淀物过滤，真空下抽掉溶剂，于减压条件下蒸馏(92-94℃，20Pa)两次纯化。
2)其他组分的制备与预处理
ε-己内酯(CL)于室温条件下用氢化钙干燥48小时减压蒸馏。
乙二醇(EG)使用前减压蒸馏。
异辛酸亚锡(Sn(Oct)2)减压蒸馏后与对二甲苯共沸两次再减压蒸馏。
四氢呋喃(THF)与钠-钾合金处理后在氮气气氛下蒸出。
2、HO-PCL-OH的合成
在手套箱中将ε-己内酯(CL)、乙二醇(EG)及异辛酸亚锡(Sn(Oct)2)按表1的比例分别加入到干燥的圆底烧瓶，在130℃的油浴中加热5小时后溶解于氯仿，不同投料比可得到不同的产物，如此得到了一系列两端羟基的聚己内酯大分子(HO-PCL-OH)，产率(沉淀抽干后得到的聚合物质量/理论得到的聚合物质量×100％)为98％。
表1不同投料比制备的HO-PCL-OH
| 原料配比 | HO-PCL-OH | ||
| CLmol | EGmol | Sn(Oct)2mol | |
| 0.100.100.100.10 | 3.332.501.430.50 | 0.250.250.250.25 | HO-PCL27-OHHO-PCL36-OHHO-PCL63-OHHO-PCL186-OH |
3、PEEP-PCL-PEEP的合成
35℃下，将表1中的四种HO-PCL-OH和EEP分别按照表2的配比加入干燥的四氢呋喃溶液中，再分别按照表2中的配比加入异辛酸亚锡，反应3小时后浓缩再沉淀于冷的乙醚中，沉淀物于真空下干燥至恒重，不同投料比可得到不同的产物，如此得到了一系列PEEP-PCL-PEEP共聚物，产率(沉淀抽干后得到的聚合物质量/理论得到的聚合物质量×100％)为85％。
表2不同投料比制备PEEP-PCL-PEEP
| 原料配比 | PEEP-PCL-PEEP | |||
| HO-PCL-OHmmol | EEPmol | Sn(Oct)2mmol | ||
| HO-PCL27-OHHO-PCL36-OHHO-PCL36-OHHO-PCL36-OHHO-PCL63-OHHO-PCL186-OH | 4.020.00.780.254.04.0 | 0.20.20.20.20.20.2 | 4.020.00.780.254.04.0 | PEEP44-PCL27-PEEP44PEEP7-PCL36-PEEP7PEEP120-PCL36-PEEP120PEEP352-PCL36-PEEP352PEEP45-PCL63-PEEP45PEEP49-PCL186-PEEP49 |
二、HO-PCL-OH和PEEP-PCL-PEEP的表征
对上述HO-PCL-OH大分子引发剂及其对应的PEEP-PCL-PEEP共聚物进行核磁共振氢谱(1H NMR)分析，测定其分子结构和数均分子量，1H NMR谱见图2(A)，数均分子量见表3。对上述HO-PCL-OH大分子引发剂及其对应的PEEP-PCL-PEEP共聚物进行核磁共振碳谱(13C NMR)分析，进一步确定其分子结构，13C NMR谱见图2(B)。
图2(A)中，PEEP-PCL-PEEP的1H NMR图谱字母a到i标记了归属于三嵌段聚合物的质子氢。聚ε-己内酯的聚合度通过4.02ppm的三重峰(归属于聚己内酯的-C(O)OCH2)与4.21ppm的单峰(归属于乙二醇的-CH2CH2-)的积分面积比计算得到。对比图2(A)中PCL与PPEP-PCL-PEEP三嵌段共聚物的1H NMR，在嵌段共聚物NMR中新出现的在0.83ppm(j)，4.13ppm(i)，归属于磷酸酯侧链的甲基(-CH2CH3)及亚甲基(-OCH2CH3)。另外，4.29ppm是磷酸酯主链上的亚甲基。在嵌段共聚物的NMR中，对应于聚己内酯的端羟基亚甲基的3.65ppm的三重峰已完全消失，证明PCL大分子引发剂的完全转化。
图2(B)中，三嵌段共聚物的所有碳均能在13C NMR中找到相应的归属。173.8ppm的峰归属于聚己内酯的羰基碳，对化学环境很敏感，对于无规的聚己内酯共聚物，其羰基峰往往显示多重峰，而不是单峰。进一步证实制备得到的共聚物含有PCL和PEEP嵌段。其余共聚物的13C NMR谱与PEEP45-PCL63-PEEP45共聚物的谱类似。
用凝胶渗透色谱(GPC〕法以聚苯乙烯为标准分析HO-PCL-OH大分子引发剂及其对应的PEEP-PCL-PEEP共聚物的数均分子量和分子量分布PDI(分子量分布宽度指数)，GPC谱见图3，数均分子量和分子量分布PDI见表3。
由图3可见，共聚物的GPC谱为单峰，而没有PCL大分子引发剂的峰，表明PCL大分子引发剂已完全消耗且得到了PCL在中间、磷酸酯在两侧的三嵌段共聚物。
表3PCL大分子引发剂及PEEP-PCL-PEEP共聚物的分子量与组成
| 三嵌段共聚物 | 大分子引发剂HO-PCL-OH | 三嵌段共聚物PEEP-PCL-PEEP | ||||
| Mn a | Mn b | PDIc | Mn a | Mn b | PDIc | |
| PEEP44-PCL27-PEEP44PEEP7-PCL36-PEEP7PEEP120-PCL36-PEEP120PEEP352-PCL36-PEEP352PEEP45-PCL63-PEEP45PEEP49-PCL186-PEEP49 | 3080410041004100718021200 | 58307090709070901292040280 | 1.201.181.181.181.161.22 | 6690-3080-66901060-4100-106018250-4100-1825053500-4100-535006840-7180-68407450-21200-7450 | 159001103046700891203538055090 | 1.381.421.501.721.461.49 |
a由1H NMR得到；b由GPC得到；c由GPC得到。
对HO-PCL-OH大分子引发剂及其对应的PEEP-PCL-PEEP共聚物进行FTIR分析，结果显示，三嵌段聚合物均出现1730cm-1与1045cm-1的PCL链段中C＝O与C-O的特征伸缩振动。P＝O的不对称及对称伸缩振动出现在1276cm-1及1166cm-1，而P-O-C伸缩振动在984cm-1。另外，3430cm-1附近出现宽峰，进一步证实了三嵌段共聚物的端羟基结构。
实施例2、PEEP-PCL-PEEP共聚物的纳米颗粒化和药物输送体系
一、纳米颗粒的制备
两亲性嵌段共聚物用于药物传递载体已被广泛研究。当两亲性嵌段共聚物溶于其中一个嵌段的良溶剂而另外一个嵌段的不良溶剂时，共聚物自发组装成聚集体，嵌段之间的共价键阻止了嵌段间的相分离。
通过溶剂挥发法(Solvent evaporation)制备PEEP-PCL-PEEP共聚物的纳米颗粒，具体方法如下：
将100mg PEEP-PCL-PEEP共聚物溶解于5mL四氢呋喃中，边搅拌边滴入100mL超纯水中，于室温下搅拌三小时后，于减压下抽掉有机溶剂，再定容至100mL得到纳米颗粒(1.0g L-1)。分别稀释得到不同浓度(1.0×10-6-0.5g L-1)的溶液。
用上述方法分别制备了表3中6种共聚物的纳米颗粒，以芘为探针通过荧光光谱的方法证实纳米颗粒的形成(λem＝373nm)，6种共聚物的荧光光谱见图4。
由图4可见，随着PEEP-PCL-PEEP共聚物浓度从1.0×10-6增加至0.5g L-1，荧光光谱发生了(0，0)吸收谱带从335.5到339.0nm的红移，该红移是由于芘由水环境转移至疏水核中，意味着核壳结构的纳米颗粒的形成。
二、纳米颗粒的特性
按照步骤1的纳米颗粒的制备方法，分别制备表3中6种共聚物的纳米颗粒。
1、PEEP-PCL-PEEP共聚物的临界聚集浓度
临界聚集浓度(CMC)表明纳米颗粒制剂在静脉注射再被体液稀释后纳米颗粒的稳定性。
通过芘在疏水核与亲水环境中的分配比例，用荧光光谱的方法分别研究表3中6种PEEP-PCL-PEEP纳米颗粒的CMC，具体方法如下：
在25℃下，以溶液339.0nm与335.5nm(I339.0/I335.5)强度比和共聚物浓度作图，聚合物在水溶液中的浓度范围为1.0×10-6-0.5g L-1。图5为不同共聚物I339.0/I335.5强度比与浓度对数的关系。
由图5可见，所有曲线均呈S型，在低浓度下，聚合物的荧光强度基本稳定，当达到一定浓度后，其比值开始迅速增大，表明芘选择性的由水环境进入疏水核中，此时纳米颗粒形成。继续增大聚合物浓度时，荧光强度到达一个平台，不再增大，这表明共聚物在水中已完全自组装形成了以聚己内酯为疏水核的纳米颗粒。CMC值从水平线与斜线切线的交点确定。PEEP-PCL-PEEP的低临界聚集浓度可能归因为PEEP嵌段与聚乙二醇(PEG)相比的轻微疏水性，因此，可以认为PEEP-PCL-PEEP在水中是热力学稳定的，特别是当它用于载药体系时，所以PEEP-PCL-PEEP适合注射给药体系。
2、纳米颗粒的体积与体积分布
通过动态光散射测量由表4的六种共聚物形成的纳米颗粒的粒径与粒径分布，其中，该六种共聚物在水溶液中浓度均为0.2g L-1。结果见表4和图6，表明当三嵌段共聚物在水溶液中浓度为0.2g L-1时，所形成的纳米颗粒粒径均小于200nm。
表4纳米颗粒的直径
| 形成纳米颗粒的共聚物 | 纳米颗粒的直径(nm) | 粒径分布指数 |
| PEEP44-PCL27-PEEP44PEEP7-PCL36-PEEP7PEEP120-PCL36-PEEP120PEEP352-PCL36-PEEP352PEEP45-PCL63-PEEP45PEEP49-PCL186-PEEP49 | 35±1.258±6.538±1.480±3.2118±7.1196±10.8 | 0.12±0.010.25±0.040.09±0.010.16±0.020.20±0.020.25±0.03 |
3、纳米颗粒的电势测定
通过Zeta电势测量纳米颗粒表面的电势。将聚合物纳米颗粒(0.2gL-1)用0.45μm的微孔滤膜过滤，通过Malvern Zetasizer Nano ZS90测量得到其电势。通过Zeta电势的测量发现纳米颗粒表面的电势在-20mV左右，表明纳米颗粒表面带较强的负电荷，而负电荷之间的静电排斥力可以减少纳米颗粒之间的聚集。
三、纳米颗粒的体外降解
对PEEP49-PCL36-PEEP49共聚物形成的纳米颗粒进行酶促降解，由于其他三嵌段共聚物与PEEP49-PCL36-PEEP49具有相同的结构而仅是三嵌段的分子量不同，酶促降解的结果对于其它PEEP-PCL-PEEP共聚物同样适用。
1、用脂肪酶进行降解
在37℃，中性条件下用假单胞菌脂肪酶(Pseudomonas lipase，购于Sigma-Aldrich公司，产品号：62309)催化PEEP49-PCL36-PEEP49纳米颗粒的体外降解，具体方法如下：
将PEEP49-PCL36-PEEP49纳米颗粒重悬于磷酸盐缓冲溶液中(0.05mol L-1，pH7.0)，降解于37℃下进行，假单胞菌脂肪酶浓度为(0.2g L-1)，纳米颗粒浓度为1.0g L-1。在不同的时间间隔(0、2、4、18和48小时)，取出定体积的聚合物纳米颗粒，冻干后通过凝胶渗透色谱分析降解产物的分子量，结果见图7。在降解48小时的降解产物透析后冻干，溶于CDCl3进行核磁共振氢谱分析，结果见图8(A)。
图7为脂肪酶降解PEEP49-PCL36-PEEP49产物的GPC谱。从图中可见，2小时后聚合物分子量明显的减少，出现了低分子量的降解产物峰，并且低分子量峰峰强随着降解时间而增强。在保留时间分别为35.41，33.43，32.28分钟的峰分别对应峰值分子量为110，310，530，分别为6-羟基己酸，二聚体，三聚体。值得注意的是保留时间对应于27.20分钟的峰峰值分子量为5070，且其分子量在降解过程中保持不变。该峰对应于PEEP嵌段，表明PEEP无法被脂肪酶所降解。
在图8(A)中，可以看到PCL的峰(化学位移为1.36ppm，1.62ppm，2.30ppm及4.10ppm)已基本消失，而PEEP的峰((化学位移为0.83ppm，4.13ppm及4.29ppm)仍可见，表明在酯肪酶的催化下PCL被降解而PEEP无法被脂肪酶降解。
2、用磷酸二酯酶I型进行降解
聚磷酸酯相对于聚氧化乙烯(PEO)一个显著优点是聚磷酸酯是生物可降解的且其降解速率可以通过聚合物主链与侧链的结构改变而调节。通过合适的设计，其降解产物无毒且生物相容性好。磷酸二酯酶存在于人细胞的胞质体及亚细胞器中。本发明研究了聚合物纳米颗粒在磷酸二酯酶I型催化下的降解。
在37℃，中性条件下用磷酸二酯酶I型(Phosphodiesterase I from Crotalus atrox，购于Sigma-Aldrich公司，产品号：P4506)催化PEEP49-PCL36-PEEP49纳米颗粒的体外降解，具体方法如下：
将聚合物纳米颗粒重悬于Tris缓冲溶液中(0.05mol L-1，pH 8.8)，降解于37℃下进行，磷酸二酯酶I型浓度为(0.2g L-1)，纳米颗粒浓度为1.0g L-1。在降解48小时的降解产物透析后冻干，溶于CDCl3进行核磁共振氢谱分析，结果见图8(B)。
在37℃及pH＝8的条件下，在磷酸二酯酶浓度为0.2g L-1时，聚合物纳米颗粒溶液变浑浊。降解产物主要是非水溶性的PCL嵌段，而不再是在水中热力学稳定的纳米颗粒水溶液。在图8(B)中，可以看到PEEP的峰(化学位移为：0.83ppm，4.13ppm及4.29ppm)强度相对于PCL(化学位移为1.36ppm，1.62ppm，2.30ppm及4.10ppm)明显降低，表明在磷酸二酯酶催化下的降解。
四、PEEP-PCL-PEEP共聚物纳米颗粒的体外毒性
通过MTT方法测定共聚物纳米颗粒的细胞毒性。
1、不同浓度PEEP44-PCL27-PEEP44纳米颗粒的细胞毒性
分别将浓度为1/512、1/256、1/128、1/64、1/32、1/16、1/8、1/4、1/2、1g L-1的PEEP44-PCL27-PEEP44纳米颗粒与HEK293细胞共培养24小时后测细胞活力，用同样浓度的SDS作为对照，结果见图9。
图9为不同浓度PEEP44-PCL27-PEEP44纳米颗粒的细胞毒性。由图可见，当纳米颗粒浓度为125μg mL-1时，细胞活力才轻微下降，当纳米颗粒浓度超过1mg mL-1时，90％的细胞仍存活。
2、不同共聚物的纳米颗粒的细胞毒性
将浓度为1mg mL-1的表3所述6种共聚物的纳米颗粒与细胞共培养24小时后测细胞活力，用同样浓度的SDS作为对照，结果见图10。
图10为浓度为1mg mL-1的各种共聚物纳米颗粒的细胞毒性。由图可见，各种共聚物纳米颗粒均对细胞无明显的毒性，表明PEEP-PCL-PEEP共聚物对于HEK293细胞有良好的生物相容性和低毒性。
五、纳米颗粒作为紫杉醇药物载体的载药及体外释放
1、聚合物纳米颗粒包载紫杉醇的载药效率和载药量
紫杉醇作为一种化疗抗癌药物，临床上用于治疗各种癌症，如卵巢癌，乳腺癌，肺癌等。由于紫杉醇的疏水性，聚乙氧基蓖麻油(Cremopho EL)被作为紫杉醇的增溶及传递载体，但聚乙氧基蓖麻油可能导致严重的毒副作用如肾脏毒性或神经毒性，所以需要发展新的用于紫杉醇及其他疏水性药物的载体，来增加紫杉醇的溶解度及减少制剂的毒性。
通过透析法将疏水性药物紫杉醇包载于PEEP-PCL-PEEP纳米颗粒，具体方法如下：
分别将表5中的6种PEEP-PCL-PEEP(100mg)溶解于1.0mL四氢呋喃中，加入紫杉醇的二甲亚砜溶液中(10mg于0.5mL二甲亚砜)。边搅拌边将超纯水滴入上述混合溶液中，继续在室温下搅拌3小时后用超纯水透析24小时(透析袋：Spectra/Por，截留分子量15,000)。溶液用0.45μm的微孔滤膜过滤后冻干，得到六种包载紫杉醇的纳米颗粒。
通过动态光散射测量由表4的六种共聚物载药后形成的上述包载紫杉醇的纳米颗粒的粒径与粒径分布，结果见表5。
将包载紫杉醇的纳米颗粒溶于乙腈/水(50∶50)以破坏纳米颗粒，纳米颗粒的载药量通过高效液相色谱(HPLC，High performance liquid chromatography)测定。HPLC由Waters 1525双向泵、Waters 2487双通道紫外-可见检测器、1500柱温箱及SymmetryC18分离柱组成，流动相为乙腈/水(50∶50，v/v)，温度30℃，流速为1.0mL min-1，紫外-可见检测波长为227nm，通过Breeze软件对结果进行分析，各组成纳米颗粒的载药率与载药效率见表5。
表5包载紫杉醇的纳米颗粒的直径、载药量和载药效量
| 三嵌段共聚物 | 载药后纳米颗粒 | 载药率％ | 载药效率％ | |
| 直径(nm) | PDI | |||
| PEEP44-PCL27-PEEP44PEEP7-PCL36-PEEP7PEEP120-PCL36-PEEP120PEEP352-PCL36-PEEP352PEEP45-PCL63-PEEP45PEEP49-PCL186-PEEP49 | 36±2.588±9.965±3.2104±5.7126±6.3224±22.5 | 0.15±0.010.33±0.030.17±0.020.12±0.010.23±0.020.39±0.07 | 0.56±0.030.92±0.121.56±0.042.46±0.643.16±0.331.81±0.15 | 5.6±0.39.2±1.2215.6±0.4224.6±6.431.6±3.3418.1±1.47 |
由表5可见，随着疏水段分子量的增大，载药效率增大，表明随着疏水链段的增长，增强了疏水嵌段与紫杉醇的相互作用，使载药量增加。PEEP49-PCL186-PEEP49的载药效率却比较低，可能是由于聚合物与紫杉醇之间很强的相互作用，使得聚合物在制备过程中沉淀。值得注意的是，将表5与上面的表4比较，聚合物形成的纳米颗粒的体积在载药前后仅发生较小的变化，而随着PCL嵌段的增长体积变化更明显。
2、聚合物纳米颗粒的体外释放
聚合物纳米颗粒的体外释放在37℃于PBS(0.02M，pH＝7.4)中进行。将1.5mL载药聚合物纳米颗粒(1.0mg mL-1)置于透析管中，(Spectra/Por，Float-A-Lyzer，载留分子量25,000)，37℃下置于25mL磷酸盐缓冲溶液中搅拌。在不同的时间间隔，将磷酸盐缓冲溶液取出，并补充以同体积的磷酸盐缓冲溶液。将取出的缓冲冻干后通过HPLC测量紫杉醇的积累释放量，结果见图11。
由图11可见，在起始时，紫杉醇有一个较快的释放，这可能是归因于位于聚合物壳较近的紫杉醇扩散，在之后一周内，紫杉醇的释放较慢而平缓，大约有45-60％的紫杉醇被释放。实验发现，聚合的结构与药物释放的动力学有关系，例如，PEEP49-PCL36-PEEP49释放最快，而PEEP49-PCL186-PEEP49释放则最慢，这可能归因于长疏水链段与紫杉醇之间的强相互作用，长的疏水链段可能使聚合物纳米颗粒的聚集数变大，减少其表面积，从而使释放较慢。大约有25％-55％的纳米颗粒不被释放，这可能是归因于聚合物疏水核与紫杉醇的疏水相互作用。
Claims (10)
1.一种嵌段共聚物，是由聚磷酸酯和疏水性聚己内酯组成的三嵌段共聚物；
所述聚己内酯为聚ε-己内酯；
所述聚磷酸酯由结构式如式(I)的2-乙氧基-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷单体聚合而成；
所述三嵌段共聚物中，中间嵌段是所述聚己内酯，两个末端嵌段是所述聚磷酸酯；所述两个聚磷酸酯嵌段的聚合度均为7-352，对应的数均分子量为1,060-5,3500；所述疏水性聚己内酯为聚ε-己内酯，其聚合度为27-186，对应的数均分子量为3,080-2,1200。
2.如权利要求1所述的三嵌段共聚物，其特征在于：所述共聚物为PEEP44-PCL27-PEEP44。
3.如权利要求1所述的三嵌段共聚物，其特征在于：所述共聚物为PEEP7-PCL36-PEEP7。
4.如权利要求1所述的三嵌段共聚物，其特征在于：所述共聚物为PEEP120-PCL36-PEEP120。
5.如权利要求1所述的三嵌段共聚物，其特征在于：所述共聚物为PEEP352-PCL36-PEEP352。
6.如权利要求1所述的三嵌段共聚物，其特征在于：所述共聚物为PEEP45-PCL63-PEEP45。
7.如权利要求1所述的三嵌段共聚物，其特征在于：所述共聚物为PEEP49-PCL186-PEEP49。
8.一种纳米颗粒，它由权利要求1-7中任一所述的嵌段共聚物制成，它的直径为35-196nm。
9.如权利要求8所述的纳米颗粒，其特征在于：所述纳米颗粒进行了化学修饰或配体修饰。
10.一种药物载体，它的成分是权利要求8或9所述的纳米颗粒。
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