CN101337985A - D型氨基酸构成的自组装短肽及在纳米生物医学中的用途 - Google Patents

Abstract

一种D型氨基酸构成的自组装短肽，命名为d－RAD16，具有序列表中SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列。实验表明，本发明所述自组装短肽形成的水凝胶可在制备保湿锁水剂中应用并对创伤有快速止血功能，可以通过添加药学上可接受的载体或者赋形剂制备成适合于临床使用的止血药物。本发明所述自组装短肽形成的纳米纤维支架支持多种细胞的生长，可作为细胞三维培养基质材料；该细胞三维培养基质材料可模拟体内环境，支持细胞在此基质中三维生长，为新药研发提供了一种可模拟体内环境而提高新药成功率的细胞三维培养药物筛选模式。

Description

D型氨基酸构成的自组装短肽及在纳米生物医学中的用途

技术领域

本发明属于自组装短肽领域，特别涉及一种D型氨基酸构成的自组装短肽及在纳米生物医学中的用途。

背景技术

自组装短肽自20世纪90年代问世以来，得到了快速的发展，已合成出多种不同结构的自组装短肽，并已成功应用于生物技术、纳米生物技术领域特别是细胞工程、组织工程、药物控释、再生药物、膜蛋白领域及能源工程(见Zhang，S.，NatureBiotechnology，2003)，但所合成出的自组装短肽多为L型氨基酸构建的自组装短肽体系(Zhang，S.，US Patent，No.5,670,483，1997；No.5,955,343.1999；No.20，020，160，471，2002；No.2004020549；2006)，而L型氨基酸构建的自组装短肽具有较好的生物相容性，在体内被L型酶降解，体内稳定存在的时间较短。

公开号为CN 101054409A的中国专利申请公开了一种两亲型短肽，此种短肽命名为D-EAK，是世界上首次报道的采用D型氨基酸构建的自组装短肽。D型氨基酸的自组装短肽，提供了具有D结构域的蛋白质，它一般不能被常规L型酶降解(见Luo Z，ZhaoX，Zhang S.Self-Organization of a Chiral D-EAK16 Designer Peptide into a 3D Nanofiber Scaffold，Macromol.Biosci.，2008，8(8)，785-791)，体内稳定存在的时间相对较长。实验表明，D-EAK短肽可在制备温控型、酸碱性分子器件或者生物分子探针中应用，可在制备保湿锁水剂中应用，可在细胞培养中应用，可在制备抑菌药物中应用。实验还表明，D-EAK短肽形成的纳米纤维较短，使其的应用范围受到一定的限制。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的D型氨基酸构成的自组装短肽，以增加D型氨基酸构建的自组装短肽的种类，促进自组装短肽在纳米生物医学中的应用。

本发明所述D型氨基酸构成的自组装短肽，命名为d-RAD16，摩尔质量为1712.8g/mol，其氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所述。原理是分子间通过非共价键相互作用自发组合形成一种结构明确、构造稳定、具有某种理化性能的分子聚集体或超分子结构。

实验表明，本发明所述自组装短肽在盐离子、细胞培养基等生理环境下，能自组装形成纳米纤维，且形成的纳米纤维比D-EAK短肽形成的纳米纤维更长。

实验表明，本发明所述自组装短肽能形成非常优良的水凝胶，此种水凝胶是一种高效的锁水性物质，可在制备保湿锁水剂中应用。

实验表明，细胞能在本发明所述自组装短肽形成的纳米纤维上三维黏附、生长，因此，此种短肽可在细胞三维培养中应用，并可作为药物研发的细胞培养基质纳米三维支架材料，通过模拟体内环境而应用于药物的筛选。与传统的二维孔板培养细胞的药物筛选模式相比，可提高新药研发的成功率。

实验表明，本发明所述新型自组装短肽对创伤有快速止血功能，可以通过添加药学上可接受的载体或者赋形剂制备成适合于临床使用的止血药物应用。

本发明具有以下有益效果：

1、提供了一种新型结构的自组装短肽，增加了D型氨基酸构成的自组装短肽的类型。

2、提供了一种新型的自组装材料，此种新型材料能广泛应用于细胞及生物工程，纳米生物医学工程等领域，具有明显的社会效益和经济效益。

3、提供一种全新的细胞三维培养体系的筛选新药的细胞纳米支架材料，可广泛应用于医药领域的开发。

4、为止血药物提供了一种新的制备方法和主要原料。

附图说明

图1是本发明所述D型氨基酸构成的自组装短肽d-RAD16的分子结构示意图，图中，碳原子为青色，氧原子为红色，氮原子为蓝色，氢原子为白色。

图2A是本发明所述D型氨基酸构成的自组装短肽d-RAD16的高效液相(HPLC)色谱图，图2B是本发明所述D型氨基酸构成的自组装短肽d-RAD16的质谱(MS)图。

图3是本发明所述D型氨基酸构成的自组装短肽d-RAD16形成的水凝胶的光学图片(×40)，刚果红染色。

图4是本发明所述D型氨基酸构成的自组装短肽d-RAD16的原子力显微图(AFM)，图中，A)pH＝3，纳米纤维和纳米颗粒；B)pH＝7，纳米纤维；C)pH＝10，几乎都是纳米颗粒。

图5是本发明所述D型氨基酸构成的自组装短肽d-RAD16对细胞的生长抑制情况图(二维平板培养)，图中，A)正常肝细胞L02在不同浓度的d-RAD16溶液中的生长率；B)肝癌细胞SMMC7721在不同浓度的d-RAD16溶液中的生长率；C)正常肝细胞L02在不同浓度的紫杉醇溶液中的生长率；D)肝癌细胞SMMC7721在不同浓度的紫杉醇溶液中的生长率；培养时间：48小时，横坐标为lg[浓度]，纵坐标为细胞的生长率。

图6是细胞的生长形态学图，图中，A)正常肝细胞L02二维培养的形态图；B)正常肝细胞L02在本发明所述自组装短肽d-RAD16中三维培养的形态图；C)肝癌细胞SMMC7721二维培养的形态图；D)肝癌细胞SMMC7721在本发明所述自组装短肽d-RAD16中三维培养的形态图。

图7是用本发明所述自组装短肽d-RAD16三维培养细胞，培养基质和细胞在铜网上的形态图及d-RAD16在细胞三维培养中的形态图，图中，A)培养基质和细胞在铜网上的形态图(×20)；B)培养基质和细胞在铜网上的形态图(×40)；C)d-RAD16在细胞三维培养中的形态图(纳米纤维)，放大倍数(×2000)；D)d-RAD16在细胞三维培养中的形态图，细胞周围覆盖大量纳米纤维，放大倍数(×10000)。

图8是肝细胞L02的调亡情况图，图中，A)短肽d-RAD16三维培养肝细胞L02的明场图；B)短肽d-RAD16三维培养肝细胞L02的PI显色图；C)短肽d-RAD16三维培养肝细胞L02的Annexin V-FITC显色图；D)阳性对照的三维培养肝细胞L02的明场图；E)阳性对照的三维培养肝细胞L02的PI显色图；F)阳性对照的三维培养肝细胞L02的AnnexinV-FITC显色图。

图9是肝细胞L02用本发明所述D型氨基酸构成的自组装短肽d-RAD16三维培养7天的形态图，放大倍数(×60)。

图10兔子肝脏止血模型图，图中，A)在兔子肝脏制造的已出血创面；B)使用本发明所述自组装短肽d-RAD16后，肝脏创面的状态(表明已止血)；C)在10只兔子肝脏制造创面的出血量(mg)；D)10只兔子的肝脏出血后，使用本发明所述自组装短肽d-RAD16后的止血时间(秒)。

具体实施方式

实施例1：D型氨基酸构成的自组装短肽d-RAD16的制备

1、材料

Fmoc-D-Ala-OH(9-芴甲氧羰酰基-D-丙氨酸)、Fmoc-D-Asp(OtBu)-OH(芴甲氧羰酰基D-天冬氨酸-ε-叔丁氧羰酰基)、Fmoc-D-Asp(Boc)-Rink amide Resin(芴甲氧羰酰基-D-天冬氨酸-ε-叔丁氧羰酰基-瑞克酰氨树脂)、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH(9-芴甲氧羰酰基-D-精氨酸-γ-叔丁氧羰酰基)、HBTU(O-苯并三唑-1-基-N、N、N、N-四甲基尿六氟磷酸脂)和HOBT(1-羟基苯并三氮唑)购自四川盛鑫生物药业有限公司；哌啶，乙酸酐，溶剂：DMF(N、N-二甲基甲酰胺)、TFA(三氟乙酸)、DCM(二氯甲烷)、NMM(N-甲基吗啉)购自成都傲飞生物化学品有限公司。

2、制备方法

采用Fmoc(芴甲氧羰基)保护的固相合成法，工艺步骤如下：

称取0.5mmol/gRink amide resin 20g于肽合成器皿中，用200ml DMF溶涨resin 30分钟，抽滤，再用300mlDMF分三次洗涤树脂，每次洗涤时间为2分钟，抽滤干洗涤液，向合成器中加入100ml 20％哌啶/DMF震荡反应30分钟，反应结束后，抽滤出反应液，再用400mlDMF分四次洗涤树脂，洗毕取少许树脂做茚三酮检测，树脂呈阳性，向反应器中加入原料：

Fmoc-D-Ala(Boc)-OH    12.44g

HBTU                  15.16g

HOBT                  5.4g

NMM                   4.4ml

DMF                   160ml

上原料加完后，震荡反应30分钟，反应结束后，用300mlDMF分四次洗涤树脂，每次洗涤时间2分钟，取少许树脂做茚三酮检测，树脂呈阴性；

上述原料加完后，反应40min，抽滤，用30ml DMF洗涤树脂4次，每次洗涤时间2分钟，取少许树脂做茚三酮检测，树脂呈阴性。

(2)向合成器皿中加入5ml 20％哌啶/DMF震荡反应30分钟，反应结束后，抽滤出反应液，再用40mlDMF分四次洗涤树脂，洗毕取少许树脂做茚三酮检测，树脂呈阳性，向反应器皿中加入以下原料：

(a)Fmoc-D-Asp(OtBu)-OH    16.46g

(b)HOBT                   5.4g

(c)NMM                    4.4ml

(d)DMF                    160ml

上述原料加完后，震荡反应40分钟，反应结束后，用30mlDMF分四次洗涤树脂，每次洗涤时间2分钟，取少许树脂做茚三酮检测，树脂呈阴性。

(3)变换步骤(2)中(a)的原料，(b)(c)(d)原料及量不变，重复(2)的步骤：步骤(2)中的(a)原料依次替换为Fmoc-D-Ala(Boc)-OH(12.44g)，Fmoc-D-Arg(pbf)-OH 26.11g；

(4)重复(1)(2)(3)上述步骤的操作，直至合成为序列表中SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列；

最后一个D-Arg合成结束后，脱出Fmoc-保护基，20％哌啶/DMF(哌啶的体积浓度)反应30分钟，洗净树脂，加160ml 50％乙酸酐/DMF(乙酸酐的体积浓度)反应30min，用40ml DMF洗净树脂，再用甲醇洗涤树脂4次，抽滤干，真空干燥8小时。将50ml 90％TFA/DCM(TFA的体积浓度)加入盛有肽树脂的容器中，反应3小时，抽滤，浓缩滤液，向残留液中加乙醚，析出白色固体，抽滤出固体，即得粗肽，通过HPLC(高效液相色谱法)纯化，经冷冻干燥即得本发明所述D型氨基酸构成的自组装短肽d-RAD16，其氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所述。

实施例2：自组装短肽d-RAD16的高效液相色谱和质谱检测与三维分子模型绘制

对实施例1制备的自组装短肽d-RAD16采用普通画图软件(Hyperchem7.5，www.hyper.com)基于能量最小化原理绘制三维分子模型示意图，所绘制的三维分子模型示意图见图1，通过该示意图，可知其氨基酸的空间分布。

将实施例1制备的自组装短肽d-RAD16采用高效液相色谱(HPLC)检测，检测结果见图2A，根据图2A中的谱峰面积确定其纯度达到95％。将实施例1制备的自组装短肽d-RAD16采用质谱(MS)检测，检测结果见图2B，可确定其摩尔质量为1712.8g/mol是正确的。

实施例3：自组装短肽d-RAD16形成水凝胶及锁水性能

1、自组装短肽d-RAD16在不同盐离子作用下形成水凝胶

(1)取储存于4℃的短肽d-RAD16制备成质量浓度为1％的溶液，用18.2KΩ/cm²的水稀释至500mmol/l或者1000mmol/l；

(2)取Na⁺或者K⁺盐(例如NaCl、KCl)配制成不同浓度的盐溶液，盐溶液的浓度范围在0.001～1mol/l皆可；

(3)加入等体积的盐溶液到短肽d-RAD16溶液中，自组装时间24小时。

2、自组装短肽d-RAD16在细胞生长的生理环境下形成水凝胶

(1)取含胎牛血清8～10％的培养基(如DMEM或MEM或RPMI-1640等)100μl滴入96孔板；

(2)在步骤(1)的96孔板溶液中加入质量浓度1％的自组装短肽d-RAD16溶液100μl；

(3)用玻璃吸管或者200μl枪头快速吹打混匀；

(4)置于37℃、体积分数为5％CO₂培养箱中培养24小时。

在上述两种条件下，本发明所述短肽d-RAD16所形成的水凝胶在肉眼下为透明胶体；刚果红染色，在光学显微镜下观察，如图3所示。

3、锁水性能

取自组装短肽d-RAD1610mg溶解于1ml 18.2KΩ/cm²水中，可形成稳定水凝胶，此时短肽d-RAD16与水的质量比可达1∶99，因此是一种高效的锁水性物质，可在制备保湿锁水剂中应用。

实施例4：短肽d-RAD16在不同pH条件下自组装后的原子力显微镜检测

(1)取储存于4℃的短肽d-RAD16制备成质量浓度为0.1％的溶液，用18.2KΩ/cm²的水稀释至500mmol/l或者1000mmol/l；

(2)加适量的盐酸或者氢氧化钠将短肽d-RAD16溶液调节到不同pH值(pH＝3、pH＝7pH＝10)，自组装12小时；

(3)取步骤(2)制备的溶液5～10μl滴于干净云母片上；

(4)水平静置30～60秒；

(5)使用100μl 18.2KΩ/cm²水冲洗至少三次；

(6)放置含检测样品的云母片于超净工作台自然凉干；

(7)采用原子力显微镜(SPM400，Japan)，以敲打模式(Tapping Mode)，观察。

原子力显微镜下的形态图见图4。从图4可以看出，pH值为3时，短肽d-RAD16自组装后呈纳米纤维和纳米颗粒形态(图4A)；pH值为10时，短肽d-RAD16自组装后呈现大量的纳米颗粒(图4C)；pH值为7时，短肽d-RAD16自组装后呈纳米纤维形态(图4B)，纤维直径在10-20nm之间，在视野范围内连续长度可达5000nm左右。

由于生理环境条件下的pH值一般在7左右，因此本发明所述自组装短肽d-RAD16在该环境下的微观形态呈图4B所示的纳米纤维。

实施例5：自组装短肽d-RAD16对细胞的生长抑制情况

本实施例考察短肽d-RAD16对人肝癌细胞SMMC-7721、人正常肝细胞L-02的生长抑制情况。人肝癌细胞SMMC-7721、人正常肝细胞L-02购自中科院上海细胞生物研究所(下同)。

采用SRB(Sulforhodamine B)染色法对细胞的生长情况进行检测。SRB可与生物大分子中的碱性氨基酸结合，其在490nm的光吸收值与细胞数呈良好的线性关系，利用该原理对细胞在短肽d-RAD16中的生长情况作定量检测，阳性对照药物为紫杉醇(0.001、0.01、0.1、1.0和10.0mg/ml)。

实验以二维孔板的模式培养细胞，加入不同浓度的d-RAD16样品(0.025、0.074、0.22、0.67和2.0mg/ml)，具体实验过程如下：

(1)L-02细胞和SMMC-7721细胞以10％小牛血清的RPMI1640培养基(Gibco公司)培养。实验时接种于96孔板，接种密度为L-02细胞1.2×10⁴个细胞/孔，SMMC-7721细胞1.5×10⁴个细胞/孔，37℃，5％CO₂孵箱培养过夜。

(2)换液后将不同浓度的d-RAD16样品(T)20μl分别加入各孔，同时设立不加样品的空白对照(C)；加药前对照(T0)，以20μl PBS代替样品，总体积200μl/孔。加药前对照(T0)的细胞每孔加入30μl 50％TCA进行固定，4℃放置1小时后，弃去固定液，用蒸馏水洗五次，自然晾干，留置待用。

(3)加入样品(T)和空白对照(C)的细胞继续培养48小时后再固定。所有固定好的细胞以0.4％SRB染液室温下染色20分钟，再用1％醋酸溶液洗去游离的染料，空气干燥后按200μl/孔加入10mM Tris碱，振荡溶解混匀后490nm测定OD值。

(4)根据OD值计算生长率，如果T≥T0，生长率＝(T-T0)/(C-T0)×100；如果T＜T0，(T-T0)/T0×100。如生长率小于50％，则根据生长率应用Xlfit软件中的4Parameter Logistic Model计算半数生长抑制浓度GI50。

实验时，每个数据做2个复孔，重复3次。加入样品后到测值之前不再换液。

半数生长抑制浓度(GI50)和生长抑制率是衡量受试样品抗细胞生长的重要指标之一。实验中，观察了5种不同浓度的样品对人肝癌细胞SMMC-7721、人正常肝细胞L-02的生长抑制情况，能较全面的反应受试样品d-RAD16的抗细胞生长活性。

阳性对照药物为紫杉醇的实验过程同受试样品d-RAD16。

实验结果显示，不同的浓度的d-RAD16(0.025mg/ml，0.074mg/ml，0.22mg/ml，0.67mg/ml和2.0mg/ml)对L-02和SMMC-7721细胞的增殖均无明显影响(见图5A、B)，而不同浓度的阳性药物紫杉醇(0.001、0.01、0.1、1.0和10.0mg/ml)对L-02和SMMC-7721细胞生长有明显的抑制作用(见图5C、D)，证明该模型是成功的。

实验结果表明，短肽d-RAD16不抑制细胞的二维生长，对细胞的生长没有观察到毒性。

实施例6：用短肽d-RAD16对细胞三维培养

细胞三维培养的准备过程与细胞的二维培养相同，其操作如下：

将人肝癌细胞株SMMC-7721和正常肝细胞L02从液氮罐中取出，分别置于37℃水浴中迅速溶解，再加入RPMI-1640(Gibco公司)培养液，悬浮离心沉淀的细胞，然后接种于25cm²培养瓶中；再加入培养液为RPMI-1640的完全培养基，其主要成份为1％双抗溶液(青链霉素)、8-10％(体积浓度)胎牛血清(Gibco公司)。把培养瓶置于37℃、体积分数为5％CO₂培养箱中培养，每2天换液一次。待细胞贴壁生长铺满培养瓶后即可将细胞分瓶传代。传代时在超净台内先将培养瓶内培养液用吸管吸出，培养瓶内加入0.25％的胰酶1ml使贴壁细胞游离，可以适当振荡。显微镜下观察见细胞不再贴壁已经悬浮，加入1～2ml培养液为RPMI-1640的完全培养基终止胰酶作用。将培养瓶中液体移入离心管中，1000转/分，8分钟离心沉淀细胞，弃去上清液，用RPMI-1640的完全培养基培养液悬浮细胞，分瓶接种。当接种细胞生长状态良好后，备用。

细胞三维培养的操作如下：

(1)将实施1制备的自组装短肽d-RAD16用18.2KΩ/cm²的水配制成质量浓度1％的溶液，取适量(如200μl)移入离心管中备用；

(2)将上述准备过程培养好的SMMC-7721和L02细胞分别用0.25％胰酶消化，移入不同的离心管中，1000rmp/min，8min离心沉淀细胞，弃去上清液，加入质量浓度为20％的蔗糖溶液记数到细胞5×10⁵个/ml，各取200μl备用；

(3))将(1)、(2)中的液体在离心管中快速混合，得细胞和短肽d-RAD16的混合溶液；

(4)快速取(3)中的混合溶液50μl滴加入96孔板；

(5)轻微滴加培养液为RPMI-1640的完全培养基10μl，自组装时间5-10min；

(6)轻微滴加培养液为RPMI-1640的完全培养基150μl，放在细胞培养箱培养30-60min；

(7)换液，取出细胞培养孔板液体的1/2，然后加入1/2新鲜的RPMI-1640的完全培养基，换液完成后，放在细胞培养箱继续培养至所需天数(培养2-3天后，观察培养基的颜色变化，若有变化，则换液，换液时取孔板内完全培养基的1/2，然后加1/2，重复二次；通常2-3天换液一次)。

人肝癌细胞SMMC-7721和正常肝细胞L02经上述二维和三维培养后在倒置相差显微镜下的形态见图6，其中，图6A是正常肝细胞L02在二维培养下的形态；图6B是正常肝细胞L02在短肽d-RAD16三维培养下的形态；图6C是肝癌细胞SMMC7721在二维培养下的形态；图6D是肝癌细胞SMMC-7721在短肽d-RAD16三维培养下的形态。

实验结果(图6B和图6D)表明，细胞可以在本发明所述短肽d-RAD16自组装形成纳米纤维支架上黏附、生长，增殖。上述结果提示，本发明所述短肽d-RAD16可以作为细胞三维培养的纳米支架材料，应用于细胞的三维培养。

实施例7：自组装短肽d-RAD16在细胞三维培养中的形态

L02细胞的三维培养方法与实施例6相同，将培养基质(d-RAD16的纳米纤维支架和RPMI-1640的完全培养基)和细胞附着在铜网上，采用相差显微镜可以清楚的观察到L02细胞在铜网的空隙中生长，见图7A、图7B。

取覆盖在铜网上的L02细胞及其培养基质，做电子显微镜检测，检测方法如下：

(1)使用5％(体积比)戊二醛固定上述铜网上的L02细胞及其培养基质，在4℃下30～60分钟；

(2)用体积浓度20％、50％、70％、90％和100％乙醇梯度脱水；

(3)经过CO₂临界干燥2-4小时；

(4)真空干燥后，喷金；

(5)使用扫描电子显微镜(JSM-5900，JEOL，Japan)观察自组装短肽d-RAD16在细胞L02三维培养中的形态。

自组装短肽d-RAD16在细胞L02三维培养中的形态见图7C、图7D，从图中可以看出，L02细胞培养中短肽d-RAD16形成的纤维直径约10～30nm，纤维之间的孔径约10～100nm，细胞的表面上覆盖着大量的纳米纤维，纳米纤维之间形成了纤维支架网，细胞在纳米纤维支架网中生长。

在d-RAD16形成的水凝胶中，通过盐离子引发而形成的纳米纤维的孔径之间保持大量水分，同时这类纳米纤维不能被常规的L型酶溶解(Luo Z，Zhao X，Zhang S.StructuralDynamic of a Self-Assembling Peptide d-EAK16 Made of Only D-Amino Acids，PloS ONE，2008，3(5)：e2364and Luo Z，Zhao X，Zhang S.Self-Organization of a Chiral D-EAK16 DesignerPeptide into a 3D Nanofiber Scaffold，Macromol.Biosci.，2008，8(8)，785-791)，正是这些孔径的存在，使水分子和气体分子以及某些小尺度的生物活性分子或者小的蛋白质分子，能够快速的在这些孔隙中交换，这与充盈大量水性液体的机体组织真正的极其相似，柔软，湿润的表面以及与组织的亲和大大减少了材料对周围组织的刺激性，使得这种水凝胶具有非常良好的生物相容性。

实验结果表明，该短肽在细胞培养中形成了纳米纤维支架网结构，此结果提示，纳米纤维形成的支架网能模拟生物体内的三维基质微环境，可广泛应用于生物、生物技术、纳米生物技术领域特别是细胞工程、组织工程、药物控释、再生药物工程。

实施例8：肝细胞L02在自组装短肽d-RAD16中三维培养的调亡情况

本实施例中，细胞三维培养同实施例6，从蛋白的水平考察细胞的调亡情况。三维培养体系阳性对照为浓度10mg/ml的顺铂，阴性对照为本三维培养体系。

具体步骤如下：

(1)三维培养的肝细胞L02置于96孔板生长3天；

(2)用PBS洗涤细胞两次；

(3)在500μl的缓冲溶液(Binding Buffer)中加入2μl Annexin V-FITC，5μlPropidium Iodide，混匀；

(4)将上述体系避光、室温反应5min。

(5)放置该96孔板于荧光显微镜下，双色滤光片(FITC和罗丹明)观察AnnexinV-FITC荧光信号呈绿色，PI荧光信号呈红色。

阳性对照的操作同上。

在显微镜的观察视野范围内，与阳性对照(见图8D、8E、8F)相比，肝细胞L02在d-RAD16中生长状态良好，很少有细胞调亡(见图8A、8B、8C)。

再继续培养4天，可以在培养体系中清楚的观察到细胞增殖非常快，可形成细胞团或者细胞片分布(见图9)。

实验表明，使用本发明所述自组装短肽d-RAD16构建细胞三维培养模型，模拟体内基质环境和三维空间环境，很少有细胞调亡。此结果提示，若结合细胞因子与各种信号通路特点，可研究细胞在近似于体内微环境的条件下增殖与分化，这为研究细胞在体外的扩增和定向分化搭建了一个新型平台，提供了有别于传统二维筛药模式的三维筛药模式。

实施例9：自组装短肽d-RAD16在制备止血药物中的应用

本实施例中，实验用动物为重量在1～3Kg之间的新西兰大白兔，雌雄随机分布，12只，由四川大学华西医院动物实验中心提供。

实验大白兔分为以下两组：

(1)实验组(n＝10)

兔子被水合氯醛麻醉后，绑在手术台上，剃去腹部兔毛，开腹腔暴露肝部，在兔子的肝脏的中部，划一道创伤(长度为1.5cm，宽度为0.1-0.2cm，深度为0.2-0.4cm，见图10A)，用纱布擦血后在每只兔子的伤口创面使用枪头滴加浓度10mg/ml的短肽d-RAD16溶液0.2ml；肉眼观察止血情况(见图10B)，按秒表统计各只兔子的止血时间，称量纱布擦血前后的重量，统计加短肽d-RAD16溶液前各只兔子的失血重量。

实验结果见图10，从图10C可以看出，10只新西兰大白兔创伤的平均出血量约为488mg，从图10D可以看出，10只新西兰大白兔创伤的平均止血时间约为18秒。

(2)空白组(n＝2)

与实验组采用相同的方式麻醉并在肝脏上制造相同的创伤，不涂敷任何药物，让其自然止血，止血时间约为90-120秒。实验完毕后，按照动物实验的相关法律法规，对动物快速实施安乐死。

上述实验表明，本发明所述自组装短肽d-RAD16具有快速止血功能，可在制备止血药物中应用。

SEQUENCE LISTING

<110>成都瑞恩生物技术有限公司

<120>D型氨基酸构成的自组装短肽及在纳米生物医学中的用途

<160>1

<170>PatentIn Version 3.3

<210>1

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<222>(1)……(16)

<223>端基保护

<400>1

AC-D-Arg  D-Ala  D-Asp  D-Ala  D-Arg  D-Ala  D-Asp  D-Ala  D-Arg

       1                           5

D-Ala  D-Asp  D-Ala  D-Arg  D-Ala  D-Asp  D-Ala-NH2

 10                                15

Claims (5)

1、一种D型氨基酸构成的自组装短肽，其特征在于它的氨基酸序列为序列表中SEQID NO：1所述。

2、权利要求1所述自组装短肽在制备保湿锁水剂中的应用。

3、权利要求1所述自组装短肽在细胞三维培养中的应用。

4、权利要求1所述自组装短肽在药物筛选中的应用。

5、权利要求1所述自组装短肽在制备止血药物中的应用。

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