CN104650192B

CN104650192B - 一类能用于修复子宫和保护心肌的自组装短肽及其应用

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Publication number: CN104650192B
Application number: CN201510134840.1A
Authority: CN
Inventors: 罗忠礼; 岳媛媛; 陈振银; 李萌萌; 徐晓帆; 赵天鑫; 孙悦霖; 谭焜月; 张姗姗; 李心远; 谭卯; 张宇
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-03-26
Filing date: 2015-03-26
Publication date: 2017-06-23
Anticipated expiration: 2035-03-26
Also published as: CN104650192A

Abstract

本发明公开了一类能用于修复子宫和保护心肌的自组装短肽，分为三个短肽，其氨基酸序列分别为：GFS‑4：Arg Leu Glu Cys Lys Ala Asp Ala Arg Leu Glu Cys Lys Ala Asp Ala；GFS‑5：Arg Leu Glu Cys Lys Ala Asp Ala Arg Leu Glu Val Lys Ala Asp Ala；GFS‑6：Ala Asp Ala Lys Val Glu Leu Arg Ala Asp Ala Lys Cys Glu Leu Arg；其中GFS‑6中的所有氨基酸均为D型氨基酸，上述短肽碳端为酰胺化。本发明的短肽可以支撑细胞三维培养，其形成的纳米纤维可以体外模拟细胞外基质的三维环境，用于动物细胞和植物细胞的三维培养。此外，它们可以修复子宫和作为心肌的保护材料。

Description

一类能用于修复子宫和保护心肌的自组装短肽及其应用

技术领域

本发明属于纳米生物医学领域，具体是一类能具有生物功能的自组装短肽。

背景技术

分子自组装指的是分子在不受外力介入的情况下，能够进行自我组织，自我聚集形成一种规则的结构，即能够从一个杂乱无序的状态转变成一个有序的状态。在最近的十几年里，分子自组装系统(如氨基酸)已经成为分子生物学、化学以及材料学等学科的交汇点，尤其是手性自组装短肽，已经发展成为了一类新兴的纳米生物材料。由它们构成的纳米纤维已被成功应用于细胞工程、组织工程及生物医学工程等领域。

发明内容

本发明的目的在于提供一类新型的自组装短肽，增加自组装短肽的种类，增加自组装短肽的生物功能，使之可在细胞三维培养、修复子宫、保护心肌中使用，促进自组装短肽在纳米生物医学中的应用。

本发明的技术方案为：一类能用于修复子宫和保护心肌的自组装短肽，其特征在于，分为三个短肽：

GFS-4：Arg Leu Glu Cys Lys Ala Asp Ala Arg Leu Glu Cys Lys Ala AspAla；

GFS-5：Arg Leu Glu Cys Lys Ala Asp Ala Arg Leu Glu Val Lys Ala AspAla；

GFS-6：Ala Asp Ala Lys Val Glu Leu Arg Ala Asp Ala Lys Cys Glu LeuArg；其中GFS-6中的所有氨基酸均为D型氨基酸。

上述短肽碳端为酰胺化，因此其氨基酸序列为：

GFS-4：Arg Leu Glu Cys Lys Ala Asp Ala Arg Leu Glu Cys Lys Ala AspAla-NH₂。

GFS-5：Arg Leu Glu Cys Lys Ala Asp Ala Arg Leu Glu Val Lys Ala AspAla-NH₂。

GFS-6：D-Ala D-Asp D-Ala D-Lys D-Val D-Glu D-Leu D-Arg D-Ala D-Asp D-Ala D-Lys D-Cys D-Glu D-Leu D-Arg-NH₂。

由上面的序列可见，GFS-4和GFS-5仅在12号位上有差别，而GFS-6是GFS-5序列反转后并全部采用D型结构的氨基酸，形成镜像结构。

其氨基酸序列为SEQ ID NO.1、No.2、No.3、，命名编号为GFS-4、GFS-5和GFS-6。其分子量为1791.08g/mol、1787.08g/mol和1787.08g/mol。其自组装原理是通过分子之间非共价键相互作用，形成结构明确且稳定，并具有某些理化性质的超分子结构或分子聚集体。

本发明按照短肽的生物学功能将采用全新理念设计的新型自组装短肽GFS-4、GFS-5和GFS-6。可以支撑细胞三维培养，其形成的纳米纤维可以体外模拟细胞外基质的三维环境，用于动物细胞和植物细胞的三维培养。此外，自组装短肽GFS-4、GFS-5和GFS-6，它们可以修复子宫和作为心肌的保护材料。

实验表明，本发明所述短肽GFS-4、GFS-5和GFS-6在金属盐离子、细胞培养基等环境下，能进行自组装形成纳米纤维。

实验表明，本发明所述自组装短肽GFS-4、GFS-5和GFS-6形成的纳米纤维，细胞能在其上进行三维黏附、生长，所以，此自组装短肽可用与动物细胞和植物细胞三维培养中。

实验表明，本发明所述自组装短肽GFS-4、GFS-5和GFS-6对子宫创伤的修复有很好的效果。

实验表明，本发明所述自组装短肽GFS-4、GFS-5和GFS-6能够修复损伤心肌组织，减少炎症反应，增加损伤后心肌干细胞的迁移及新生肉芽组织的生成。

本发明具有以下有益效果：

1、提供了一类新型自组装短肽，增加自组装短肽类型。

2、提供了一类新型的自组装材料，这些材料能够形成稳定的纳米纤维，该纳米纤维能够应用于细胞三维培养，模拟体内细胞生存的微环境，黏附细胞生长因子，提供细胞体外生存三维微环境。

3、提供一类新型生物功能的自组装材料，该类材料能够目的性的修复损伤组织，减少炎症的发生，增加新生肉芽组织的生成，诱导修复干细胞的迁移分化。

4、提供了一类新型的自组装纳米生物医学材料，这些新型生物医学材料能够广泛的应用到纳米生物医学工程、细胞工程及生物工程等领域，并具有明显的经济及其社会效益。

附图说明

图1A、图1B和图1C分别对应本发明所述自组装短肽GFS-4、GFS-5和GFS-6的分子结构示意图。

图2A、图2B和图2C分别对应本发明所述自组装短肽GFS-4、GFS-5和GFS-6的高效液相(HPLC)色谱图。

图3A、图3B和图3C分别对应本发明所述自组装短肽GFS-4、GFS-5和GFS-6的质谱(MS)图。

图4是本发明所述新型自组装短肽GFS-5三维培养细胞图。

图5是本发明所述新型自组装短肽GFS-6三维培养细胞图。

图6是本发明所述自组装短肽GSF-4用于烟草细胞的三维培养图(100×),培养时间为7天。图最后一排为高倍镜(400×)下烟草细胞的分裂相。

图7是本发明所述自组装短肽GSF-4用于烟草细胞的三维培养的吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色图(40×物镜)。

图8为本发明所述自组装短肽GFS-4、GFS-5、GFS-6对大鼠子宫刮伤修复后2天HE染色组织学观察(A-E，40×，A’-E’，100X)。control组(A和A’)：子宫内膜上皮层薄，单层柱状上皮细胞浅染，损伤处内膜间质中细胞数量偏少，缺乏腺体及血管组分。GFS-4组(B和B’)：子宫内膜上皮层较薄，单层柱状上皮细胞着色均匀，损伤处内膜间质中细胞数量与正常组织无明显差别，腺体及血管组分分布均匀。GFS-5组(C和C’)：子宫内膜上皮层较薄，单层柱状上皮细胞着色较均匀，损伤处内膜间质中细胞数量较少，腺体及血管组分分布较少。GFS-6组(D和D’)：子宫内膜上皮层较薄，单层柱状上皮细胞着色较浅，大小规则，损伤处内膜间质中细胞数量偏少，腺体及血管组分分布均匀。

图9为本发明所述自组装短肽GFS-4、GFS-5、GFS-6对大鼠子宫刮伤修复后2天Ki67免疫组化染色观察(400×)。

shame组：损伤区见少量增殖细胞；control组：损伤区见少量增殖细胞；GFS-4组：损伤区见数个增殖细胞；GFS-5组：损伤区见数个增殖细胞；GFS-6组：损伤区见数个增殖细胞；

图10为本发明所述自组装短肽GFS-4、GFS-5、GFS-6对大鼠子宫刮伤修复后2天C-Kit免疫组化染色观察(400×)。

shame组：损伤区见少量增殖细胞；control组：损伤区见极少数增殖细胞；GFS-4组：损伤区见数个增殖细胞；GFS-5组：损伤区见数个增殖细胞；GFS-6组：损伤区见数个增殖细胞；

图11A、图11B和图11C是本发明所述新型自组装短肽GFS-4、GFS-5、GFS-6修复损伤心肌组织HE染色图。图11A、11B和11C分别为GFS-4、GFS-5、GFS-6修复损伤心肌组织HE染色图。

具体实施方式

实施例1：本发明所述自组装短肽GFS-4、GFS-5和GFS-6的制备

1.1短肽GFS-4材料

Fmoc-L-Arg(pbf)-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-精氨酸-γ-叔丁氧羰酰基)、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-赖氨酸-ε-叔丁氧羰酰基)、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH(芴甲氧羰酰基-L-天冬氨酸-ε-叔丁氧羰酰基)、Fmoc-L-Cys-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-半胱氨酸)、Fmoc-L-Ala-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-丙氨酸)、Fmoc-L-Leu-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-亮氨酸)、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-谷氨酸-ε-叔丁氧羰酰基)、TBTU(O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯)、HBTU(O-苯并三唑-1-基-N、N、N、N-四甲基尿六氟磷酸脂)和HOBT(1-羟基苯并三氮唑)、哌啶、六氢吡啶、醋酸酐、二氯甲烷；溶剂：DMF(N、N-二甲基甲酰胺)、TFA(三氟乙酸)、ACN(乙腈)、冰乙醚。

1.2短肽GFS-5材料

Fmoc-L-Arg(pbf)-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-精氨酸-γ-叔丁氧羰酰基)、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-赖氨酸-ε-叔丁氧羰酰基)、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH(芴甲氧羰酰基-L-天冬氨酸-ε-叔丁氧羰酰基)、Fmoc-L-Val-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-缬氨酸)、Fmoc-L-Cys-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-半胱氨酸)、Fmoc-L-Ala-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-丙氨酸)、Fmoc-L-Leu-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-亮氨酸)、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-谷氨酸-ε-叔丁氧羰酰基)、TBTU(O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯)、HBTU(O-苯并三唑-1-基-N、N、N、N-四甲基尿六氟磷酸脂)和HOBT(1-羟基苯并三氮唑)、哌啶、六氢吡啶、醋酸酐、二氯甲烷；溶剂：DMF(N、N-二甲基甲酰胺)、TFA(三氟乙酸)、ACN(乙腈)、冰乙醚。

1.3短肽GFS-6材料

Fmoc-D-Arg(pbf)-OH(9-芴甲氧羰酰基-D-精氨酸-γ-叔丁氧羰酰基)、Fmoc-D-Val-OH(9-芴甲氧羰酰基-D-缬氨酸)、Fmoc-D-Asp(OtBu)-OH(芴甲氧羰酰基-D-天冬氨酸-ε-叔丁氧羰酰基)、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH(9-芴甲氧羰酰基-D-赖氨酸-ε-叔丁氧羰酰基)、Fmoc-D-Cys-OH(9-芴甲氧羰酰基-D-半胱氨酸)、Fmoc-D-Ala-OH(9-芴甲氧羰酰基-D-丙氨酸)、Fmoc-D-Glu(OtBu)-OH(9-芴甲氧羰酰基-D-谷氨酸-ε-叔丁氧羰酰基)、Fmoc-D-Leu-OH(9-芴甲氧羰酰基-D-亮氨酸)、TBTU(O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯)、HBTU(O-苯并三唑-1-基-N、N、N、N-四甲基尿六氟磷酸脂)和HOBT(1-羟基苯并三氮唑)、哌啶、六氢吡啶、醋酸酐、二氯甲烷；溶剂：DMF(N、N-二甲基甲酰胺)、TFA(三氟乙酸)、ACN(乙腈)、冰乙醚。

2、制备方法

利用Fmoc(芴甲氧羰基)保护的固相合成法合成：

(1)在肽合成器皿中加20g的0.5mmol/gRink amide resin，加200ml DMF溶涨resin 30分钟，然后抽滤，再分三次洗涤树脂(DMF的量变为300ml)，每次洗涤2min，抽滤，加100ml 20％哌啶/DMF于合成器中，震荡反应30min，抽滤，再洗涤树脂四次(DMF的量变为400ml)，用茚三酮检测树脂，呈阳性，向反应器中加入原料：

上原料加完后，震荡反应30min，用300mlDMF分四次洗涤树脂，每次洗涤时间2min，取少许树脂做茚三酮检测，树脂呈阴性；

上述原料加完后，反应40min，抽滤，用30ml DMF洗涤树脂4次，每次洗涤时间2min，取少许树脂做茚三酮检测，树脂呈阴性。

(2)向合成器皿中加入5ml 20％哌啶/DMF震荡反应30min，抽滤，再用40mlDMF分四次洗涤树脂，洗毕取少许树脂做茚三酮检测，树脂呈阳性，向反应器皿中加入以下原料：

上述原料加完后，震荡反应40min，用30mlDMF分四次洗涤树脂，每次洗涤时间2min，取少许树脂做茚三酮检测，树脂呈阴性。

(3)变换步骤(2)中(a)的原料，(b)(c)(d)原料及量不变，重复(2)的步骤：步骤(2)中的(a)原料依次替换为Fmoc-L-Arg(pbf)-OH(26.11g)，Fmoc-L-Leu-OH(19.60)g，Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH(22.32)g，Fmoc-L-Cys-O,(17.89)g，Fmoc-L-Lys(Boc)-OH(22.15)g；

(4)重复(1)(2)(3)上述步骤的操作，直至合成为序列表中SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列；

最后一个氨基酸合成结束后，脱出Fmoc-，20％哌啶/DMF反应30min，洗净树脂，加160ml50％乙酸酐/DMF，反应30min,用40ml DMF洗净树脂，再用甲醇洗涤树脂4次，抽滤干，真空干燥8h。盛有肽树脂的容器中加入50ml 90％TFA/DCM，反应3h，抽滤，浓缩，加乙醚与残留液中，析出白色固体，抽滤，即得粗肽，通过HPLC(高效液相色谱法)纯化，经冷冻干燥即得本发明所述短肽GFS-4。GFS-5和GFS-6的合成方法与GFS-4的制备方法相同，只是原料替换,GFS-5和GFS-6中Fmoc-L-Val-OH的量为17.21g。

实施例2：本发明所述自组装短肽GFS-4、GFS-5和GFS-6的高效液相色谱和质谱检测与三维分子模型绘制

对实施例1制备的短肽GFS-4、GFS-5和GFS-6采用普通画图软件(Hyperchem7.5,www.hyper.com)绘制得到分子结构示意图，见图1A、图1B、图1C，由图可看出氨基酸的空间分布。

将实施例1制备的短肽GFS-4、GFS-5和GFS-6利用高效液相色谱(HPLC)检测，参见图2A、图2B、图2C，由图中的谱峰面积可计算GFS-4、GFS-5和GFS-6的纯度分别为96.55％、96.18％和97.03％。将实施例1制备的短肽采用质谱(MS)检测，参见图3A、图3B、图3C，说明其分子量分别为1791.08g/mol、1787.08g/mol和1787.08g/mol是正确的。

实施例3：用短肽GFS-5对细胞三维培养

细胞三维培养的准备过程与细胞的二维培养相同，其操作如下：

将人肝癌细胞株SMMC-7721和正常肝细胞L02从液氮罐中取出，分别置于37℃水浴中迅速溶解，再加入RPMI-1640(Gibco公司)培养液，悬浮离心沉淀的细胞，然后接种于25cm²培养瓶中；再加入培养液为RPMI-1640的完全培养基，其主要成份为1％双抗溶液(青链霉素)、8－10﹪(体积浓度)胎牛血清(Gibco公司)。把培养瓶置于37℃、体积分数为5﹪CO₂培养箱中培养，每2天换液一次。待细胞贴壁生长铺满培养瓶后即可将细胞分瓶传代。传代时在超净台内先将培养瓶内培养液用吸管吸出，培养瓶内加入0.25﹪的胰酶1ml使贴壁细胞游离,可以适当振荡。显微镜下观察见细胞不再贴壁已经悬浮，加入1～2ml培养液为RPMI-1640的完全培养基终止胰酶作用。将培养瓶中液体移入离心管中，1000转/分,8分钟离心沉淀细胞，弃去上清液，用RPMI-1640的完全培养基培养液悬浮细胞，分瓶接种。当接种细胞生长状态良好后，备用。

细胞三维培养的操作如下：

(1)将新型自组装短肽GFS-5用18.2KΩ/cm²的水配制成质量浓度1％的溶液，取适量(如200μl)移入离心管中备用；

(2)将上述准备过程培养好的SMMC-7721和L02细胞分别用0.25％胰酶消化，移入不同的离心管中，1000rmp/min,8min离心沉淀细胞，弃去上清液，加入质量浓度为20％的蔗糖溶液记数到细胞5×10⁵个/ml，各取200μl备用；

(3))将(1)、(2)中的液体在离心管中快速混合，得细胞和短肽GFS-5的混合溶液；

(4)快速取(3)中的混合溶液50μl滴加入96孔板；

(5)轻微滴加培养液为RPMI-1640的完全培养基10μl，自组装时间5～10min；

(6)轻微滴加培养液为RPMI-1640的完全培养基150μl，放在细胞培养箱培养30～60min；

(7)换液，取出细胞培养孔板液体的1/2,然后加入1/2新鲜的RPMI-1640的完全培养基，换液完成后，放在细胞培养箱继续培养至所需天数(培养2－3天后，观察培养基的颜色变化，若有变化，则换液，换液时取孔板内完全培养基的1/2,然后加1/2，重复二次；通常2-3天换液一次)。

人肝癌细胞SMMC-7721和正常肝细胞L02经上述三维培养后在倒置相差显微镜下的形态见图4，实验结果表明，细胞可以在本发明所述短肽GFS-5自组装形成纳米纤维支架上黏附、生长，增殖。上述结果提示，本发明所述新型自组装短肽GFS-5可以作为细胞三维培养的纳米支架材料，应用于细胞的三维培养。

实施例4：用短肽GFS-6对细胞三维培养

分别配制所需浓度的肽溶液与A549细胞(重庆医科大学分子与肿瘤医学实验室赠送)悬液，取相等容量的的短肽GFS-6溶液和细胞悬液均匀混合，在96孔板中每孔滴加50μl的短肽，静置10min，再加入培养基培养。

细胞三维培养的操作如下：

(1)将实施1制备的自组装短肽GFS-6配制成50mg/ml的溶液，取适量溶液(100-300μl)移入离心管中备用；

(2)培养好的A549细胞用0.25％胰酶消化，移入离心管中，1000rmp/min离心沉淀细胞10min，弃上清液，加入蔗糖溶液(质量浓度为20％)；

(3)在离心管中快速混合(1)和(2)中的溶液，得短肽和细胞的混合液；

(4)取(3)中的混合液50μl滴加到96孔板中；

(5)滴加RPMI-1640完全培养基20μl，自组装5－10min；

(6)滴加RPMI-1640完全培养基150μl，放在细胞培养箱培养30－60min；

(7)取出一半的细胞培养孔板液体,加入等体积的新鲜的RPMI-1640的完全培养基，换液完毕后，置于细胞培养箱继续培养.

运用GFS-6自组装形成的纳米纤维作为三维支架材料培养细胞，发现A549细胞可以在该三维体系中生长，细胞圆球形，边界清楚(图5)。

实施例5：本发明所述自组装短肽GSF-4用于烟草细胞三维培养

烟草细胞的制备

1.1将2g烟草愈伤组织研磨，放入培养基中，摇床恒温恒速摇动，制备烟草细胞悬浮体系。

1.2从悬浮的烟草细胞培养基中提取烟草细胞-培养基混合体系，准备进行三维培养。

三维体系的建立

2.1将制备好的短肽用去离子水配制成所需浓度的短肽溶液待用。

2.2将提前准备的烟草细胞-培养基混合液离心去上清液，用6％的蔗糖溶液稀释细胞沉淀物，配制成烟草细胞-蔗糖混合液待用。

2.3将短肽溶液和烟草细胞-蔗糖混合液等体积混匀，构建三维体系。

2.4将三维体系转移到96孔板中，并加入一定体积的培养基，进行三维培养。

数据采集

3.1白光观察烟草细胞生长情况，并采集7天周期内的图片，记录其细胞在三维环境下分裂的过程。

图6为烟草细胞在GSF-4中第一天、第三天和第七天的生长情况。实验表明，GSF-4能很好地支撑植物细胞生长。

3.2荧光染色在7周期内，用AO/EB双染法对植物细胞的生长状态以及活性进行测定。

3.2.1吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色

1)PBS缓冲液配置：8.5g氯化钠，0.68g磷酸二氢钾，0.15g氢氧化钠，100ml蒸馏水混匀，使用时稀释10倍。

2)AO/EB染料:精确称取AO(吖啶橙)、EB(溴化乙锭)各1mg，分别溶于10ml BS中使之配成100μg/ml的储备液，滤过，4℃保存，用前等量混合，备用。

3)AO/EB染色及观察结果：加入AO/EB染料2-4μl/100μl细胞悬液混匀，室温避光染色30s，荧光显微镜下观察结果并计数200个细胞。

由于细胞坏死时，细胞膜的完整性早期即被破坏，线粒体明显肿胀，细胞体积明显增大，所以AO/EB染色就会呈不均匀的橙红色荧光。而图7显示烟草细胞大小均匀，橙红色细胞少，表明烟草细胞生长情况良好，短肽GSF-4可以很好地支撑植物细胞生长。

实施例6：3种新型自组装短肽GFS-4、GFS-5和GFS-6对损伤子宫的修复情况

本实施例中，实验用动物为重量在200～250g之间的雌性SD大鼠，随机分布，12只，由重庆医科大学动物实验中心提供。

实验大鼠分为5组，进行下述实验：

(1)取实验鼠腹腔注射1.0～1.5mL水合氯醛麻醉。

(2)麻醉后，大鼠取仰卧位，四肢妥善固定于手术板，在无菌手术条件下，下腹部备皮，碘伏棉球消毒，铺消毒洞巾。

(3)取下腹部正中纵形切口，距耻骨联合上约2cm，长约2.5-3cm，依次切开皮肤、腹壁各层进入腹腔。

(4)探测子宫并暴露，缓慢挑出“Y”型子宫一侧。

(5)距子宫交汇处1cm，水平剪开一长约0.5cm切口，放入特制刮宫针，在子宫系膜对侧宫腔区域行走2cm后退出。

(6)在各组中，用微量注射器分别注入5种不同溶液。分别为：A组：生理盐水；B组：5ug/uL GSF-3；C组：5ug/uL GSF-4；D组：5ug/uL GSF-5；E组：5ug/uL GSF-6。

(7)用7-0丝线缝合子宫切口，复位子宫，术后用温生理盐水冲洗腹腔2次后4-0丝线逐层关闭切口(间断缝合法)，碘伏消毒。

(8)做好记号，待其麻醉醒后，移回动物房。

(9)手术两天后，处死实验老鼠，取出子宫，做石蜡包埋、切片，通过HE染色和Ki67抗体、C-kit抗体免疫组化，进行组织学分析。

图8为子宫组织的HE染色。与空白对照组比较：

1)四种短肽能促进大鼠受损子宫内膜中腺体的再生、成熟及血管的生成，其中GFS-3、GFS-4、GFS-6的作用最为明显，GFS-5的促进作用稍差。

2)GFS-3、GFS-4还能有效促进损伤处内膜间质细胞的增殖。

图9为免疫组化-Ki67，表明四种短肽均能有效促进子宫内膜损伤区域的细胞增殖。

图10为免疫组化-C-Kit，表明四种短肽均能增强子宫内膜损伤区域中干细胞的表达。

实施例7：新型自组装短肽GFS-4，GFS-5和GFS-6对损伤后心肌组织的修复作用

实验用动物为重量在200-250g之间的SD大鼠，雌雄随机分布，12只，由重庆医科大学动物实验中心提供。

(1)实验组(n＝6)

术前准备：SD大鼠称重后水合氯醛腹腔麻醉、备皮；

气管插管：剥离颈部气管，插管，调节呼吸机，频率：80，潮气量：10，呼吸比：1:2；

左前降支结扎术：开胸后根据心耳位置确定血管走形，行结扎手术；

用药：用微量注射器在结扎部位心肌层推注20μlGFS-5溶液(5mg/ml)。

(2)空白组(n＝6)与实验组采用相同的手术方式，推注生理盐水。

心脏标本采集：术后3D，7D，12D，20D分别采集实验动物损伤后的心肌组织，福尔马林固定48h后石蜡包埋，连续切片并常规HE染色。

新型自组装短肽GFS-4，GFS-5和GFS-6对损伤后心肌组织的修复作用如图11，实验结果表明，本发明所述新型自组装短肽GFS-4(图11A)，GFS-5(图11B)和GFS-6(图11C)具有修复损伤后心肌组织的作用，能够降低炎症反应，增加新生血管数量，减少胶原沉积，可在开发新型心肌损伤药物中应用。

以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。

Claims

1.一类能用于修复子宫和保护心肌的自组装短肽，其特征在于，分为三个短肽，其氨基

酸序列分别为：

GFS-4：Arg Leu Glu Cys Lys Ala Asp Ala Arg Leu Glu Cys Lys Ala Asp Ala；

GFS-5：Arg Leu Glu Cys Lys Ala Asp Ala Arg Leu Glu Val Lys Ala Asp Ala；

GFS-6：Ala Asp Ala Lys Val Glu Leu Arg Ala Asp Ala Lys Cys Glu Leu Arg；其中GFS-6中

的所有氨基酸均为D型氨基酸；

上述短肽碳端为酰胺化。

2.根据权利要求1所述的一类能用于修复子宫和保护心肌的自组装短肽在制备细胞三维培养纳米支架材料中的应用。

3.根据权利要求1所述的一类能用于修复子宫和保护心肌的自组装短肽在用于制备修复子宫药物中的应用。

4.根据权利要求1所述的一类能用于修复子宫和保护心肌的自组装短肽在用于制备心肌保护药物中的应用。