CN104725475B

CN104725475B - 一类自组装短肽及其应用

Info

Publication number: CN104725475B
Application number: CN201510134719.9A
Authority: CN
Inventors: 罗忠礼; 李萌萌; 于华婧; 刘运成; 陈振银; 徐晓帆; 李心远; 谭卯; 谭焜月; 张姗姗; 张宇
Original assignee: Individual
Current assignee: Shenzhen Sainberg Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2015-03-26
Filing date: 2015-03-26
Publication date: 2018-12-18
Anticipated expiration: 2035-03-26
Also published as: CN104725475A

Abstract

本发明公开了一类自组装短肽及其应用，该自组装短肽的氨基酸序列为：XX Ile Ile Ile Ile XX，其中X为Arg或Lys，当X为Arg时命名为R₂I₄R₂，当X为Lys时命名为K₂I₄K₂。本发明提供了一类新型自组装短肽，增加自组装短肽类型。提供了一类新型的自组装材料，这些材料能够形成稳定的纳米纤维，该纳米纤维能够应用于细胞三维培养，模拟体内细胞生存的微环境，黏附细胞生长因子，提供细胞体外生存三维微环境。提供了一类新型的自组装材料，该类材料能够稳定Taq酶的结构，提高PCR的扩增效率，为分子生物学领域提供一种新的研究工具。

Description

一类自组装短肽及其应用

技术领域

本发明属于纳米生物学领域，具体涉及一类自组装短肽及其应用。

背景技术

Taq DNA聚合酶的发现使PCR技术变得简捷、同时也降低了成本，PCR技术得以广泛应用，并逐步应用于临床。但由于Taq酶在高温下的半衰期的限制，使得PCR反应时间有所局限。而现下大部分的改造都集中于运用基因工程技术合成性能优越、更耐热的酶。但此方法耗时长、成本高，而且凡是蛋白酶都容易在高温下失活，因此无法从根本上解决此问题。

自组装短肽自问世以来已有二十多年，近几年更是得到快速发展，尤其是手性自组装短肽体系的提出使得短肽的设计思路更加广泛，现已有多种不同体系的短肽成功应用于细胞工程、组织工程、药物控释、创伤快速修复以及稳定膜蛋白等领域(见Zhongli Luo,Shuguang)。在稳定蛋白质领域中，已经有报道一种类似磷脂结构的自组装短肽A₆D可以显著延长视紫红质在40℃下的半衰期(见Xiaojun Zhao PNAs)。实验表明，这种类似磷脂结构，即一头亲水，一头疏水在水中能够将蛋白质包裹住，从而很好地保护了蛋白质的结构。

发明内容

本发明目的是提供一类自组装短肽，增加自组装短肽体系的多样化以及自组装短肽的种类，以促进自组装短肽在分子生物学中的应用。

本发明的技术方案为：一类自组装短肽，该自组装短肽的氨基酸序列为：XX IleIle Ile Ile XX，其中X为Arg或Lys，当X为Arg时命名为R₂I₄R₂，当X为Lys时命名为K₂I₄K₂。短肽氮端乙酰化。

R₂I₄R₂的氨基酸序列如SEQ ID NO：1：Arg Arg Ile Ile Ile Ile Arg Arg。

K₂I₄K₂的氨基酸序列如SEQ ID NO：2：Lys Lys Ile Ile Ile Ile Lys Lys。

本发明在手性自组装短肽的设计原则下，采用全新理念设计两条结构相似的自组装短肽分别命名为R₂I₄R₂和K₂I₄K₂，摩尔质量为1136.74g/mol和1027.74g/mol，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。短肽的结构特征为拥有亲水的两端和疏水的中心，并能通过分子之间非共价键相互作用，形成结构明确且稳定，并具有某些理化性质的超分子结构或分子聚集体。

实验表明，本发明所述自组装短肽在盐离子溶液中能自组装形成纳米支架结构，且离子浓度的高低对其结构影响较大，在不同的离子环境下，镁离子对其结构影响较大。

实验表明，温度的变化对本发明所述自组装短肽的结构影响不大，能够在PCR的温度不断变化过程中维持稳定的二级结构。

实验表明，本发明所述自组装短肽形成的支架结构能够在溶液中包裹住Taq酶，稳定酶的空间结构，从而抵抗高温，延长其在高温下的半衰期。

实验表明，本发明所述的自组装短肽能够稳定Taq酶的结构而不影响其功能，从而增加PCR的扩增效率，大大增加PCR的扩增产量。因此，此种短肽可以作为蛋白质或酶的保护材料，应用到分子生物学领域。

实验表明，本发明所述短肽R₂I₄R₂在金属盐离子、细胞培养基等环境下，能进行自组装形成纳米纤维。

实验表明，本发明所述自组装短肽R₂I₄R₂形成的纳米纤维，细胞能在其上进行三维黏附、生长，所以，此自组装短肽可用与动物细胞和植物细胞三维培养中。

本发明具有以下有益效果：

1、提供了一类新型自组装短肽，增加自组装短肽类型。

2、提供了一类新型的自组装材料，这些材料能够形成稳定的纳米纤维，该纳米纤维能够应用于细胞三维培养，模拟体内细胞生存的微环境，黏附细胞生长因子，提供细胞体外生存三维微环境。

3、提供了一类新型的自组装材料，该类材料能够稳定Taq酶的结构，提高PCR的扩增效率，为分子生物学领域提供一种新的研究工具。

附图说明

图1是本发明所述类磷脂结构的自组装短肽R₂I₄R₂和K₂I₄K₂的分子结构示意图(从N端到C端)。

图2是本发明所述类磷脂结构的自组装短肽R₂I₄R₂和K₂I₄K₂高效液相(HPLC)色谱图，

图3是本发明所述类磷脂结构的自组装短肽R₂I₄R₂和K₂I₄K₂的质谱(MS)图。

图4是本发明所述类磷脂结构的自组装短肽R₂I₄R₂和K₂I₄K₂圆二色谱图(CD)。图中A和B显示两条短肽在195nm处有一强负峰，而在216处有一弱的负峰，峰形完好。

图5是本发明所述类自组装短肽R₂I₄R₂和K₂I₄K₂的原子力显微图(AFM),图中，C表示自组装短肽R₂I₄R₂自组装24h后形成短的，交错的纳米纤维；D表示自组装短肽K₂I₄K₂自组装24h后形成的纳米支架结构。

图6是本发明所述类磷脂结构的自组装短肽R₂I₄R₂和K₂I₄K₂的刚果红染色图片，图中，A是R₂I₄R₂在0h,2h,4h,8h,24h,48h的刚果红染色图；B是K₂I₄K₂在0h,2h,4h,8h,24h,48h的刚果红染色图。

图7则是用紫外可见光谱(UV)检测本发明所述类磷脂结构的自组装短肽R₂I₄R₂和K₂I₄K₂延长Taq酶在高温下半衰期的过程图。A是Taq酶在PCR体系缓冲液中的变化图；B和C则是分别加入R₂I₄R₂和K₂I₄K₂后的Taq酶含量变化图。

图8则是Taq酶在高温时，在不同保护材料中的半衰期变化图。

图9是用qPCR验证本发明所述类磷脂结构的自组装短肽R₂I₄R₂和K₂I₄K₂能通过延长Taq酶半衰期来提高PCR的扩增效率。A和B是自组装短肽R₂I₄R₂分别在Taq酶浓度为2.5U/ul和5U/ul时自组装前(0h)和自组装后(24h)对PCR结果的影响；C和D是自组装短肽K₂I₄K₂分别在Taq酶浓度为2.5U/ul和5U/ul时自组装前(0h)和自组装后(24h)对PCR结果的影响。

图10是本发明所述类磷脂结构的自组装短肽R₂I₄R₂和K₂I₄K₂加入PCR反应体系后反应产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图11是本发明所述自组装短肽R₂I₄R₂用于烟草细胞的三维培养图(100×),培养时间为7天。图最后一排为高倍镜(400×)下烟草细胞的分裂相。

图12是本发明所述自组装短肽R₂I₄R₂用于烟草细胞的三维培养的吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色图(40×物镜)。

具体实施方式

实施例1：类脂状结构的自组装短肽R₂I₄R₂和K₂I₄K₂的制备

1、材料

Fmoc-L-Arg(pbf)-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-精氨酸-γ-叔丁氧羰酰基)、Fmoc-Arg(pbf)-WangResin(9-芴甲氧羰酰基-L-精氨酸-γ-叔丁氧羰酰基-王树脂)、Fmoc-L-Ile(Boc)-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-异亮氨酸-ε-叔丁氧羰酰基)，Fmoc-L-Lys(Boc)-OH(9-芴甲氧羰酰基-L-赖氨酸-ε-叔丁氧羰酰基)、TBTU(O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯)、HBTU(O-苯并三唑-1-基-N、N、N、N-四甲基尿六氟磷酸脂)和HOBT(1-羟基苯并三氮唑)、哌啶、六氢吡啶、醋酸酐、二氯甲烷；溶剂：DMF(N、N-二甲基甲酰胺)、TFA(三氟乙酸)、ACN(乙腈)、冰乙醚。

2、合成方法

采用Fmoc(芴甲氧羰基)保护的固相合成法，具体步骤如下：

(1)第一个Arg的准备：称0.7mmol/g的Fmoc-Arg(pbf)-WangResin 30g，用300ml20％六氢吡啶溶液脱Fmoc 10min。抽滤后再用200ml DMF洗涤2次，每次时间2分钟，甲醇洗涤1次，二氯甲烷洗涤一次，再用200ml DMF洗涤2次，每次2分钟，洗完后取少量树脂做茚三酮检，结果呈阳性。然后向反应器中加入原料：

原料加完后，反应1h。时间结束后，用300ml DMF洗涤3次，每次时间2分钟，甲醇洗涤1次，200ml DMF洗涤1次，时间2分钟。茚检呈阴性

(2)第二个Arg的偶联：用10ml 20％六氢吡啶溶液脱Fmoc 10min；用75ml DMF分四次洗涤，每次2分钟，甲醇洗涤1次，二氯甲烷洗涤一次，茚检呈阳性。再向反应器中加入以下原料：

原料加完后，反应1h。时间结束后，用300ml DMF洗涤3次，每次时间2分钟，甲醇洗涤1次，200ml DMF洗涤1次，时间2分钟。茚检呈阴性。

(3)变换原料，重复步骤2依次偶联Ile,Ile,Ile,Ile,Arg,Arg,最后用醋酸酐封闭。

(4)甲醇收缩5min+5min，抽干树脂。

(5)使用经典裂解液裂解2h，冰乙醚沉降获得氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.1所述的粗肽。

3、纯化步骤

(1)首先将上述得到的粗肽进行样品的10-100％分析，在确定出主峰的保留时间后，线性梯度分析样品；

(2)去离子水和乙腈(4:1)能够较充分的溶解试样品多肽；

(3)200mg多肽置于10ml的溶解瓶中，加入去离子水，经过超声溶解后，用0.45μm的有机相滤头过滤，取上清液；

(4)收峰由线性梯度制备，并确定MS是否正确；

(5)为了符合纯度要求的液体量，要对所收的液体进行纯度的跟踪反馈；

(6)在40℃下，把所收集合格的溶液浓缩至40-50ml；

(7)浓缩好的溶液置于100ml烧杯中，放置于冰柜中冷冻；

(8)干燥；

(9)称量；

(10)反打；

(11)包装。

HPLC纯化后，冷冻干燥，即得本发明所述的自组装短肽R₂I₄R₂，其序列为序列表中SEQ ID NO.1所述。

同理，按照以上步骤更换原材料为Fmoc-L-Lys(Boc)-OH(30.45g)，Fmoc-L-Ile(Boc)-OH，合成本发明所述的自组装短肽K₂I₄K₂,其序列为序列表中SEQ ID NO.2所述。

实施例2：类脂状结构的自组装短肽R₂I₄R₂和K₂I₄K₂的高效液相色谱和质谱检测与三维分子模型绘制

对实施例1制备的自组装短肽R₂I₄R₂和K₂I₄K₂采用普通画图软件(Hyperchem 7.5,www.hyper.com)基于能量最小化原理绘制三维分子模型示意图，所绘制的三维分子模型示意图见图1，通过该示意图，可知其氨基酸的空间分布。

将实施例1制备的自组装短肽R₂I₄R₂和K₂I₄K₂采用高效液相色谱(HPLC)检测，检测结果见图2，根据图2中的谱峰面积确定其纯度分别达到95.71％和95.92％。将实施例1制备的自组装短肽d-RAD16采用质谱(MS)检测，检测结果见图3，可确定其摩尔质量分别为1136.74g/mol和1027.74g/mol是正确的。

实施例3：本发明所述自组装短肽R₂I₄R₂和K₂I₄K₂的圆二色性检测和原子力显微镜(AFM)检测

用去离子水分别配制100μM的R₂I₄R₂和K₂I₄K₂短肽溶液，圆二色谱仪(AVIV400CDspectrometer)对短肽进行CD检测，参数设置：扫描波长为190-260nm，光径为2mm。本发明所述自组装短肽R₂I₄R₂和K₂I₄K₂有相同的类磷脂结构，在常温下的二级结构特征是在195nm处有一强负峰，而在216处有一弱的负峰，峰形完好(见图4A和4B)。这一结果表明，新型的类磷脂结构的R₂I₄R₂和K₂I₄K₂具有处于α-螺旋和无规卷曲之间的二级结构，但在特定条件下仍能发生自组装，形成纳米纤维。

用生理盐水配制500μM的R₂I₄R₂短肽溶液，在室温下让短肽自组装48小时，分别在0和24h时制作样本。在新撕开的云母片上滴加10μl短肽溶液，静置60s，再用1ml去离子水冲洗3次，吸干云母片上的水分，将含有检测样品的云母片置于超净的工作台上，自然晾干后，用原子力显微镜观察，扫描模式为敲打模式。同理，K₂I₄K₂按照同样的方式检测。自组装24h后短肽R₂I₄R₂和K₂I₄K₂都自组装形成纳米纤维，但纤维交错在一起，长度不长，且结构不是很致密(见图5)。

实施例4：本发明所述自组装短肽R₂I₄R₂和K₂I₄K₂的刚果红染色实验及自组装形态和效果

用生理盐水配制5mg/ml的R₂I₄R₂和K₂I₄K₂短肽溶液，在25℃下孵育24到72小时。取10μl水凝胶涂抹在载玻片上，用刚果红液染色30s，在光镜下观察(结果见图6)。

5mg/ml的短肽R₂I₄R₂和K₂I₄K₂在盐离子溶液中0h时就有支架结构，但结构很松散；4～8h后形成的膜状结构较为严密，但空隙仍然较大；24h后膜状结构明显，48h后结构更加凝实。

实施例5：UV-可见光谱检测自组装短肽R₂I₄R₂和K₂I₄K₂延长Taq酶高温下的半衰期

对照组和实验组分别为500U Taq酶+1ml PCR buffer和500U Taq酶+1ml0.1mM短肽。取10ul 10mM母液，加入990ul PCR buffer配制成0.1mM短肽溶液。将短肽溶液加入比色皿后再加入500U Taq酶，置于4℃下组装24h，组装后置于可控温的紫外可见光谱仪中。温度升高至95℃后扫描波长220nm～500nm,然后维持温度不变，每隔5min扫描一次，直至测试60min。最后根据一级动力学方程计算Taq酶半衰期。

图7和图8分别为高温下60min内Taq酶的UV变化图和半衰期变化图。图7显示Taq酶在PCR缓冲液中，即对照组的半衰期≈25min；而加入了R₂I₄R₂和K₂I₄K₂后的半衰期分别为≈36min，≈42min。

实施例6：短肽R₂I₄R₂和K₂I₄K₂增加qPCR扩增效率

1、从新鲜猪肾中提取胆绿素还原酶的RNA，通过逆转录合成下一步qPCR所需模板cDNA；

2、qPCR反应体系为25ul体系，是用SYBR Green I作为荧光染料，操作方便，反应灵敏。

3、qPCR过程对照组与实验组设置：对照组为普通PCR体系，即所有试剂加完后用DEPC水定容至25ul体系；而实验组则是用不同浓度的短肽溶液定容至25ul体系。

4、上样完毕后置于荧光定量PCR仪中，设置反应条件(40循环)：

5、PCR过程完成后样品保留，用于琼脂糖凝胶电泳，与DNA marker对比，确定其为目的扩增片段。

qPCR和凝胶电泳结果见图9和图10。由图9可以看出，加入短肽并经过组装24h后与0h相比，R₂I₄R₂使PCR的循环阈值由24增加到30；K₂I₄K₂使PCR的循环阈值由30缩短到22左右。而图10是qPCR完成后样品的琼脂糖凝胶电泳图，更显示加入短肽后的扩增产量都明显比未加入短肽组大，并且组装24h后的短肽组要比0h的大。这都说明自组装短肽R₂I₄R₂和K₂I₄K₂都大大增加了PCR的扩增效率。

实施例7：本发明所述自组装短肽R₂I₄R₂用于烟草细胞三维培养

1.烟草细胞的制备

1.1将2g烟草愈伤组织研磨，放入培养基中，摇床恒温恒速摇动，制备烟草细胞悬浮体系。

1.2从悬浮的烟草细胞培养基中提取烟草细胞-培养基混合体系，准备进行三维培养。

2.三维体系的建立

2.1将制备好的短肽用去离子水配制成所需浓度的短肽溶液待用。

2.2将提前准备的烟草细胞-培养基混合液离心去上清液，用6％的蔗糖溶液稀释细胞沉淀物，配制成烟草细胞-蔗糖混合液待用。

2.3将短肽溶液和烟草细胞-蔗糖混合液等体积混匀，构建三维体系。

2.4将三维体系转移到96孔板中，并加入一定体积的培养基，进行三维培养。

3.数据采集

3.1白光观察烟草细胞生长情况，并采集7天周期内的图片，记录其细胞在三维环境下分裂的过程。

图11为烟草细胞在R₂I₄R₂中第一天、第三天和第七天的生长情况。实验表明，R₂I₄R₂能很好地支撑植物细胞生长。

3.2荧光染色在7周期内，用AO/EB双染法对植物细胞的生长状态以及活性进行测定。

3.2.1吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色

1)PBS缓冲液配置：8.5g氯化钠，0.68g磷酸二氢钾，0.15g氢氧化钠，100ml蒸馏水混匀，使用时稀释10倍。

2)AO/EB染料:精确称取AO(吖啶橙)、EB(溴化乙锭)各1mg，分别溶于10ml BS中使之配成100μg/ml的储备液，滤过，4℃保存，用前等量混合，备用。

3)AO/EB染色及观察结果：加入AO/EB染料2-4μl/100μl细胞悬液混匀，室温避光染色30s，荧光显微镜下观察结果并计数200个细胞。

由于细胞坏死时，细胞膜的完整性早期即被破坏，线粒体明显肿胀，细胞体积明显增大，所以AO/EB染色就会呈不均匀的橙红色荧光。而图12显示烟草细胞大小均匀，橙红色细胞少，表明烟草细胞生长情况良好，短肽R₂I₄R₂可以很好地支撑植物细胞生长。

以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。

Claims

1.一类自组装短肽，其特征在于，该自组装短肽的氨基酸序列为Arg Arg Ile Ile IleIle Arg Arg或Lys Lys Ile Ile Ile Ile Lys Lys，两条短肽分别命名为R₂I₄R₂和K₂I₄K₂，且两条短肽氮端乙酰化。

2.根据权利要求1 所述的一类自组装短肽在稳定Taq 酶中的应用。

3.根据权利要求1 所述的一类自组装短肽在增加PCR 的扩增效率中的应用。

4.根据权利要求1 所述的一类自组装短肽中的R₂I₄R₂在动物细胞和植物细胞三维培养中的应用。