ES2912545T3 - Alginatos modificados para la encapsulación de células y terapia celular - Google Patents

Abstract

Alginato modificado de manera singular que comprende uno o más monómeros covalentemente modificados definidos por la fórmula I **(Ver fórmula)** en la que, X es NR, R1 incluye un anillo de 1,2,3-triazol o un grupo alquino; Y1 e Y2 son independientemente hidrógeno o -PO(OR)2, o Y2 está ausente, e Y2 junto con los dos átomos de oxígeno a los que Y1 e Y2 están unidos forman una estructura cíclica tal como se muestra a continuación **(Ver fórmula)** y R2 y R3 son, independientemente, hidrógeno, grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C3-C20, cíclico C3-C20 sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), peptídico o polipeptídico; o R2 y R3, junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un anillo carbocíclico o heterocíclico sustituido o no sustituido de 3 a 8 miembros; y R es, independientemente en cada aparición, hidrógeno, grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C3-C20, cíclico C3-C20 sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), peptídico o polipeptídico.

Description

DESCRIPCIÓN

Alginatos modificados para la encapsulación de células y terapia celular

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de alginatos, químicamente modificados para mejorar su biocompatibilidad y adaptar sus propiedades físicas, para la encapsulación de células, particularmente para la encapsulación de células de islotes pancreáticos, así como a métodos para tratar enfermedades o trastornos, incluyendo la diabetes, mediante la implantación de las células encapsuladas.

Antecedentes de la invención

El trasplante de células secretoras de hormonas o proteínas de miembros genéticamente no idénticos de la misma especie (es decir, alotrasplante) o de especies distintas (es decir, xenotrasplante) es una estrategia prometedora para el tratamiento de muchas enfermedades y trastornos. Usando microcápsulas de alginato para proporcionar inmunoaislamiento, las células secretoras de hormonas o proteínas pueden trasplantarse a un paciente sin la necesidad de un tratamiento exhaustivo con fármacos inmunodepresores. Este principio se ha demostrado con éxito mediante el trasplante de células p pancreáticas encapsuladas con alginato en modelos de rata diabética (Lim, F. y Sun, A. M. Science. 210, 908-910 (1980)). Los métodos para encapsular material biológico en geles de alginato se describen, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 4.352.883 concedida a Lim. En el procedimiento de Lim, se suspende una disolución acuosa que contiene los materiales biológicos que van a encapsularse en una disolución de un polímero soluble en agua. La suspensión forma gotitas que se configuran para dar microcápsulas diferenciadas mediante el contacto con cationes multivalentes tales como Ca2+. Posteriormente se reticula la superficie de las microcápsulas con poliaminoácidos, formando una membrana semipermeable alrededor de los materiales encapsulados.

El método de Lim emplea condiciones que son lo suficientemente suaves como para encapsular las células sin afectar de manera adversa a su supervivencia y función subsiguientes. Las microcápsulas de alginato resultantes son semipermeables, presentando una porosidad suficiente como para permitir que los nutrientes, los desechos y las hormonas y/o proteínas secretados a partir de las células encapsuladas difundan libremente hacia el interior y hacia el exterior de las microcápsulas, y, cuando se implantan en un huésped animal, las microcápsulas de alginato aíslan eficazmente las células encapsuladas del sistema inmunitario del huésped. Véase también la patente estadounidense n.° 7.807.150 concedida a Vacanti, et al.

Se han probado muchos otros materiales sintéticos, incluyendo copolímeros de bloque tales como polímeros de polietilenglicol-diacrilato, poliacrilatos y polímeros termoplásticos, tal como se notifica por la patente estadounidense n.° 6.129.761 concedida a Hubbell y por Aebischer, et al., J Biomech Eng. Mayo de 1991;113(2):178-83. Véase Lesney Modern Drug Discovery 4(3), 45-46, 49, 50 (2001) para una revisión de estos materiales.

Puesto que Lim notificó por primera vez el trasplante de células encapsuladas, muchos otros han intentado crear “biorreactores” para células que pudieran mantener la viabilidad de las células en ausencia de vascularización, mediante la difusión de nutrientes, gases y desechos a través de los materiales encapsulantes, y aun así proteger a las células de las defensas inmunitarias del cuerpo contra células y materiales extraños. Desafortunadamente, los esfuerzos para traducir estas terapias en sujetos humanos han resultado difíciles. Por ejemplo, las células de islotes porcinas encapsuladas con alginato trasplantadas a un sujeto humano que padecía diabetes de tipo 1 demostraron inicialmente una mejora significativa y se requirió una disminución de la dosificación de insulina. Sin embargo, para la semana 49, la dosis de insulina del paciente volvió a los niveles antes del trasplante (Elliot, R. B. et al. Xenotransplantation. 2007; 14(2): 157-161).

En algunos casos, es deseable provocar fibrosis, por ejemplo, cuando las células se implantan como material de relleno, tal como se describe en la patente estadounidense n.° 6.060.053 y según lo aprobado posteriormente por la Administración de Alimentos y Fármacos para el tratamiento de reflujo vesicoureteral.

La eficacia disminuida de las células implantadas a lo largo del tiempo es el resultado del crecimiento fibroblástico excesivo de las cápsulas de alginato. La matriz de gel de alginato provoca una respuesta inflamatoria tras la implantación, lo que da como resultado la encapsulación de la matriz de alginato con tejido fibroso. El tejido fibroso de la superficie de las cápsulas de alginato reduce la difusión de nutrientes y oxígeno hacia las células encapsuladas, provocando su muerte. No se han obtenido mejores resultados con los otros materiales.

Los polímeros de alginato modificados se divulgan por Yang et al., Carbohydrate Polymers 84(2011)33-39, el documento US2008/0242738, el documento GB768309, el documento US 5622 718, el documento US 2881 161 y el documento EP 1614696.

Por tanto, un objeto de la invención es proporcionar polímeros adecuados para la encapsulación e implantación de células en las que los polímeros tengan una mayor biocompatibilidad a largo plazo tras la implantación.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar alginatos químicamente modificados, iónicamente reticulables, con biocompatibilidad mejorada y propiedades fisicoquímicas adaptadas, incluyendo estabilidad en gel, tamaño de poro e hidrofobicidad/hidrofilicidad.

También es un objeto de la invención proporcionar métodos para la encapsulación de células usando polímeros de alginato modificados.

Finalmente, un objeto de la invención es proporcionar métodos de alto rendimiento para la caracterización de los polímeros de alginato modificados.

Sumario de la invención

Se han desarrollado alginatos químicamente modificados para adaptar su biocompatibilidad y sus propiedades físicas. Los alginatos modificados descritos en el presente documento proporcionan propiedades mejoradas en relación con los alginatos no modificados. Además, basándose en el descubrimiento de que los materiales de partida, así como los materiales químicamente modificados y hechos reaccionar, deben purificarse exhaustivamente para eliminar los contaminantes antes de la implantación para evitar la encapsulación, es menos probable que estos materiales provoquen la formación de cápsulas fibrosas tras la implantación.

Los alginatos modificados son polímeros de alginato que contienen uno o más monómeros covalentemente modificados definidos por la fórmula I

Fórmula I

en la que,

X es NR;

R1 incluye un anillo de 1,2,3-triazol o un grupo alquino;

Y1 e Y2 son independientemente hidrógeno o -PO(OR)2; o

Y2 está ausente, e Y1 junto con los dos átomos de oxígeno a los que Y1 e Y2 están unidos forman una estructura cíclica tal como se muestra a continuación

y

R2 y R3 son, independientemente, hidrógeno o una agrupación orgánica que contiene cualquier número de átomos de carbono, preferiblemente 1-30 átomos de carbono, más preferiblemente 1-20 átomos de carbono, más preferiblemente 1-14 átomos de carbono, y que incluye opcionalmente uno o más heteroátomos tales como una agrupación de oxígeno, azufre o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados o cíclicos, siendo las agrupaciones R representativas grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C³-C²⁰, cíclico C³-C²⁰ sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), peptídico o polipeptídico; o

R² y R³ , junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un anillo carbocíclico o heterocíclico sustituido o no sustituido de 3 a 8 miembros; y

R es, independientemente en cada aparición, hidrógeno o una agrupación orgánica que contiene cualquier número de átomos de carbono, preferiblemente 1-30 átomos de carbono, más preferiblemente 1-20 átomos de carbono, más preferiblemente 1-14 átomos de carbono, y que incluye opcionalmente uno o más heteroátomos tales como una agrupación de oxígeno, azufre o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados o cíclicos, siendo las agrupaciones R representativas grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C³-C²⁰, cíclico C³-C²⁰ sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), peptídico o polipeptídico.

Los polímeros de alginato modificados de manera singular son polímeros de alginato que contienen uno o más monómeros covalentemente modificados, en los que sustancialmente todos los monómeros covalentemente modificados presentan la misma modificación covalente (es decir, el polímero contiene un “tipo” o una especie de monómero covalentemente modificado). Los polímeros de alginato modificados pueden contener cualquier razón de monómeros de manuronato, monómeros de guluronato y monómeros covalentemente modificados. En realizaciones preferidas, más del 20%, más preferiblemente más del 25% y lo más preferiblemente más del 30% de los monómeros en el polímero de alginato modificado son monómeros covalentemente modificados.

En realizaciones preferidas, el polímero de alginato modificado puede reticularse iónicamente para formar hidrogeles usando un ion polivalente, tal como Ca²⁺, Sr²⁺ o Ba²⁺. La capacidad de los alginatos modificados para formar hidrogeles estables en condiciones fisiológicas puede cuantificarse usando el ensayo de formación de hidrogel descrito en el presente documento. En realizaciones preferidas, el polímero de alginato modificado forma hidrogeles, de tal manera que la intensidad de fluorescencia medida usando el ensayo de alto rendimiento descrito en el presente documento es de entre 15.000 y 55.000, preferiblemente de entre 20.000 y 55.000, más preferiblemente de entre 25.000 y 55.000.

El alginato modificado es biocompatible, e induce una menor respuesta a cuerpos extraños que el alginato no modificado. La biocompatibilidad de los alginatos modificados puede determinarse cuantitativamente usando ensayos in vitro e in vivo conocidos en el campo, incluyendo el ensayo de biocompatibilidad in vivo descrito en el presente documento. En realizaciones preferidas, el polímero de alginato modificado es biocompatible, de tal manera que la respuesta de fluorescencia normalizada con respecto al alginato no modificado medida usando el ensayo de biocompatibilidad in vivo descrito en el presente documento es de menos del 75%, el 70%, el 65%, el 60%, el 55% o el 50%. También se describen ensayos para la caracterización de polímeros de alginato modificados.

También se describe un ensayo de alto rendimiento útil para caracterizar la capacidad de los polímeros de alginato modificados para formar hidrogeles. En algunas realizaciones, el ensayo de formación de hidrogel descrito en el presente documento se usa para cuantificar la estabilidad de los hidrogeles formados a partir de alginatos o alginatos modificados. En realizaciones preferidas, el ensayo de formación de hidrogel descrito en el presente documento se usa como herramienta de examen para identificar alginatos modificados capaces de formar hidrogeles estables. El ensayo de biocompatibilidad in vivo de alto rendimiento descrito en el presente documento se usa para identificar alginatos modificados que inducen una menor respuesta a cuerpos extraños que el alginato no modificado. También se proporcionan ensayos para cuantificar la biocompatibilidad de los alginatos modificados.

Además, en el presente documento se describen métodos para encapsular materiales biológicos usando polímeros de alginato modificados. En realizaciones particulares, los polímeros de alginato modificados descritos en el presente documento se usan para encapsular células para su uso en métodos para tratar una enfermedad o un trastorno en un paciente humano o animal. En algunas realizaciones, una enfermedad o un trastorno en un paciente humano o animal se trata mediante el trasplante de material biológico exógeno encapsulado en un polímero de alginato modificado. En realizaciones particulares, una enfermedad o un trastorno en un paciente humano o animal se trata mediante el trasplante de células encapsuladas en un polímero de alginato modificado. En una realización más particular, la diabetes se trata mediante el trasplante de células de islotes pancreáticos encapsuladas en un polímero de alginato modificado.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra la estructura general de los alginatos modificados obtenidos usando el enfoque de síntesis combinatorio descrito en el ejemplo 1. El número de alginatos preparados con cada estructura general se indica debajo.

La figura 2 es un gráfico obtenido a partir del ensayo de formación de hidrogel descrito en el ejemplo 2. Se representan gráficamente los valores de intensidad de fluorescencia promedio medidos para los alginatos modificados. Los alginatos modificados que produjeron valores de fluorescencia inferiores a 15.000 se consideraron inutilizables para aplicaciones en las que la formación de hidrogel es crítica (es decir, la encapsulación de células).

La figura 3 es un gráfico que muestra el efecto de alginatos modificados seleccionados sobre la viabilidad de la línea de células HeLa en comparación con el control positivo (sin alginato). El alginato (Alg) tiene una viabilidad del 53%. Se muestra que varios polímeros son más citotóxicos que Alg, sin embargo, la mayoría de la biblioteca funciona igual o mejor que Alg.

La figura 4 es un gráfico obtenido usando el método in vivo descrito en el ejemplo 5, que cuantifica la biocompatibilidad de alginatos modificados seleccionados. La respuesta de fluorescencia obtenida para los alginatos modificados usando el método in vivo descrito en el ejemplo 5 se normalizó con respecto a la respuesta de fluorescencia medida usando alginato no modificado con el fin de cuantificar la biocompatibilidad de los alginatos modificados en cuanto al % de respuesta de fluorescencia.

La figura 5 es un gráfico que detalla la glucemia de ratones trasplantados con islotes de rata encapsulados en alginatos modificados seleccionados así como en dos alginatos no modificados diferentes (CMIT y CJOS). La línea negra discontinua representa la normoglucemia en ratones.

La figura 6 es un gráfico de barras que muestra la respuesta inflamatoria (tal como se mide mediante fluorescencia normalizada con respecto al VLVG) en función del alginato modificado (combinado con alginato no modificado).

Descripción detallada de la invención

Los alginatos son una clase de copolímeros polisacarídicos lineales formados a partir de p-D-manuronato con unidad glicosídica en 1,4 (M) y su epímero C-5 a-L-guluronato (G). Los alginatos son biopolímeros naturales producidos por una variedad de organismos, incluyendo algas pardas marinas y al menos dos géneros de bacterias (Pseudomonas y Azotobacter). Normalmente, los alginatos comerciales se aíslan de algas marinas, incluyendo Macrocystis pyrifera, Ascophyllum nodosum y diversos tipos de Laminaria.

Monómero de a-L-guluronato (G)

Tres tipos de estructura primaria definen la estructura principal polisacarídica de los alginatos: regiones homopoliméricas de monómeros de guluronato consecutivos (bloques G), regiones homopoliméricas de monómeros de manuronato consecutivos (bloques M) y regiones que contienen monómeros de manuronato y guluronato alternos (bloques MG). Los bloques de monómeros presentan diferentes conformaciones en disolución, que van desde una estructura extendida flexible (bloques M) hasta una estructura compacta rígida (bloques G). En el caso de los bloques G, la conformación compacta facilita la quelación de iones multivalentes, en particular iones Ca2+, de tal manera que los bloques G en una cadena de alginato pueden reticularse iónicamente con bloques G en otra cadena de alginato, formando geles estables. Como resultado, la proporción, la longitud y la distribución de los bloques de monómeros influyen en las propiedades fisicoquímicas del polímero de alginato.

En el caso de alginatos comercialmente producidos obtenidos a partir de algas, el peso molecular, la estructura primaria y la razón molar global de monómeros de ácido urónico (razón M/G) en el polímero de alginato dependen de varios factores, incluyendo la especie que produce el alginato, el momento del año en el que se recolecta la especie, y la ubicación y edad del cuerpo de algas. Como resultado, están disponibles comercialmente alginatos que presentan una gama de propiedades fisicoquímicas, tales como peso molecular y viscosidad.

Los alginatos pueden reticularse iónicamente a temperatura ambiente y pH neutro para formar hidrogeles. La capacidad de los alginatos para formar geles estables en condiciones fisiológicamente compatibles hace que los geles de alginato sean útiles en varias aplicaciones biomédicas. Por ejemplo, los geles de alginato se han usado como matriz para la administración de fármacos para modular la farmacocinética de agentes terapéuticos, diagnósticos y profilácticos.

l. Definiciones

“Alginato”, tal como se usa en el presente documento, es un término colectivo usado para referirse a polisacáridos lineales formados a partir de p-D-manuronato y a-L-guluronato en cualquier razón M/G, así como a sales y a derivados de los mismos. El término “alginato”, tal como se usa en el presente documento, abarca cualquier polímero que tenga la estructura mostrada a continuación, así como sales del mismo.

“Biocompatible”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un material que realiza su función deseada cuando se introduce en un organismo sin inducir una respuesta inflamatoria, inmunogenicidad o citotoxicidad significativas a las células, los tejidos o los órganos nativos. La biocompatibilidad, tal como se usa en el presente documento, puede cuantificarse usando el ensayo de biocompatibilidad in vivo descrito en el presente documento en el ejemplo 5.

“Respuesta a cuerpos extraños”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la respuesta inmunológica del tejido biológico a la presencia de cualquier material extraño en el tejido que puede incluir la adsorción de proteínas, macrófagos, células gigantes de cuerpos extraños multinucleados, fibroblastos y angiogénesis.

“Alginato químicamente modificado” o “alginato modificado” se usan en el presente documento de manera intercambiable, y se refieren a polímeros de alginato que contienen uno o más monómeros covalentemente modificados.

“Monómero covalentemente modificado”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un monómero que es un análogo o derivado de un monómero de manuronato y/o guluronato obtenido a partir de un monómero de manuronato y/o guluronato a través de un procedimiento químico.

“Polímero de alginato modificado de manera singular', tal como se usa en el presente documento, se refiere a alginatos modificados que contienen uno o más monómeros covalentemente modificados, en el que sustancialmente todos los monómeros covalentemente modificados presentan la misma modificación covalente (es decir, el polímero contiene un “tipo” o una especie de monómero covalentemente modificado). Los polímeros de alginato modificados de manera singular incluyen, por ejemplo, polímeros de alginato modificados en los que sustancialmente todos los monómeros en el polímero de alginato modificado están representados por monómeros de manuronato, monómeros de guluronato y un monómero covalentemente modificado definido por la fórmula l. No es necesario que todos los monómeros estén covalentemente modificados.

Para la claridad del análisis en el presente documento, los alginatos modificados de manera singular se definen usando fórmulas que ilustran la estructura de los monómeros covalentemente modificados incorporados en la estructura principal y omiten los monómeros de manuronato y guluronato. Por ejemplo, un polímero de alginato modificado de manera singular compuesto por monómeros de manuronato, monómeros de guluronato y un monómero covalentemente modificado definido por la fórmula l, en la que X es NR, R1 es metilo, y R, Y1 e Y2 son hidrógeno, se ilustra en el presente documento mediante la estructura a continuación.

“Análogo” y “derivado” se usan en el presente documento de manera intercambiable, y se refieren a un compuesto que tiene una estructura similar a la de un compuesto original, pero que varía del compuesto original por una diferencia en uno o más componentes determinados. Los análogos o derivados difieren del compuesto original en uno o más átomos, grupos funcionales o subestructuras, que se reemplazan por otros átomos, grupos o subestructuras. Puede imaginarse que un análogo o derivado va a formarse, al menos teóricamente, a partir del compuesto original a través de algún procedimiento químico o físico. Los términos análogo y derivado abarcan compuestos que conservan la misma estructura básica de anillo que el compuesto original, pero presentan uno o más sustituyentes diferentes en el/los anillo(s). Por ejemplo, análogo o derivado de manuronato o guluronato se refiere a compuestos que conservan la parte principal del monómero, por ejemplo, el anillo de piranosa, pero difieren en uno o más sustituyentes en el anillo.

“Manuronato” y “monómero de manuronato”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a monómeros de ácido manurónico así como a sales del mismo.

“Guluronato” y “monómero de guluronato”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a monómeros de ácido gulurónico así como a sales del mismo.

“Sustancialmente”, tal como se usa en el presente documento, especifica una cantidad del 95% o más, del 96% o más, del 97% o más, del 98% o más, o del 99% o más.

“Temperatura de transición vítrea” (T^g), tal como se usa en el presente documento, se refiere a la temperatura a la que se observa una transición reversible en materiales amorfos de un estado duro y relativamente frágil a un estado fundido o similar al caucho. Los valores de T^g para los polímeros de alginato pueden determinarse experimentalmente usando calorimetría diferencial de barrido (DSC, calentados y enfriados a una velocidad de 10 K/min). En todos los casos en el presente documento, los valores de T^g se miden usando muestras de polímero en polvo.

“Química clic”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a reacciones químicas usadas para acoplar dos compuestos juntos, que son de alto rendimiento, de amplio alcance, crean sólo subproductos que pueden retirarse sin cromatografía, son estereoespecíficas, son sencillas de realizar y pueden llevarse a cabo en disolventes que pueden retirarse fácilmente o benignos. Los ejemplos de reacciones que cumplen estos criterios incluyen la apertura nucleófila de anillos de epóxidos y aziridinas, reacciones de carbonilo de tipo no aldólico, incluyendo la formación de hidrazonas y heterociclos, adiciones a enlaces múltiples carbono-carbono, incluyendo adiciones de Michael, y reacciones de cicloadición, tales como una reacción de cicloadición 1,3-dipolar (es decir, una reacción de cicloadición de Huisgen). Véase, por ejemplo, Moses, J.E. y Moorhouse, A.D. Chem Soc. Rev. 2007; 36: 1249-1262; Kolb, H.C. y Sharpless, K.B. Drug Discovery Today. 2003; 8(24): 1128-1137; y Kolb, H.C., et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2001; 40: 2004-2021.

“Catión polivalente”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cationes que tienen una carga positiva mayor de 1. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, Ca²⁺, Ba²⁺ y Sr²⁺.

“Sustituido”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a todos los sustituyentes permisibles de los compuestos o grupos funcionales descritos en el presente documento. En el sentido más amplio, los sustituyentes permisibles incluyen sustituyentes acíclicos y cíclicos, ramificados y no ramificados, carbocíclicos y heterocíclicos, aromáticos y no aromáticos de compuestos orgánicos. Los sustituyentes ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, halógenos, grupos hidroxilo o cualquier otra agrupación orgánica que contiene cualquier número de átomos de carbono, preferiblemente 1-14 átomos de carbono, y opcionalmente incluyen uno o más heteroátomos tales como una agrupación de oxígeno, azufre o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados o cíclicos. Los sustituyentes representativos incluyen grupos alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, halo, hidroxilo, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, ciano, isociano, isociano sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, sulfonilo, sulfonilo sustituido, ácido sulfónico, fosforilo, fosforilo sustituido, fosfonilo, fosfonilo sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C³-C²⁰, cíclico C³-C²⁰ sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, péptido y polipéptido.

Los heteroátomos tales como el nitrógeno pueden tener sustituyentes hidrógeno y/o cualquier sustituyente permisible de compuestos orgánicos descrito en el presente documento que satisfaga las valencias de los heteroátomos. Se entiende que “sustitución” o “sustituido” incluye la condición implícita de que tal sustitución sea según la valencia permitida del átomo sustituido y del sustituyente y que la sustitución dé como resultado un compuesto estable, es decir, un compuesto que no experimente de manera espontánea una transformación tal como mediante transposición, ciclización, eliminación, etc.

“Arilo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a sistemas de anillos C⁵-C¹⁰ aromáticos, heterocíclicos, aromáticos condensados, heterocíclicos condensados, biaromáticos o bihetereocíclicos. Ampliamente definido, “arilo”, tal como se usa en el presente documento, incluye grupos aromáticos de un solo anillo de 5, 6, 7, 8, 9 y 10 miembros que pueden incluir desde cero hasta cuatro heteroátomos, por ejemplo, benceno, pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, triazol, pirazol, piridina, pirazina, piridazina y pirimidina, y similares. Aquellos grupos arilo que tienen heteroátomos en la estructura de anillo también pueden denominarse “heterociclos de arilo” o “compuestos heteroaromáticos”. El anillo aromático puede estar sustituido en una o más posiciones del anillo con uno o más sustituyentes, incluyendo, pero sin limitarse a, halógeno, azida, alquilo, aralquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, hidroxilo, alcoxilo, amino (o amino cuaternizado), nitro, sulfhidrilo, imino, amido, fosfonato, fosfinato, carbonilo, carboxilo, sililo, éter, alquiltio, sulfonilo, sulfonamido, cetona, aldehído, éster, heterociclilo, restos aromáticos o heteroaromáticos, -CF³, -CN; y combinaciones de los mismos.

“Arilo” abarca además sistemas de anillos policíclicos que tienen dos o más anillos cíclicos en los que dos o más carbonos son comunes a dos anillos contiguos (es decir, “anillos condensados”) en los que al menos uno de los anillos es aromático, por ejemplo, el/los otro(s) anillo(s) cíclico(s) puede(n) ser cicloalquilo(s), cicloalquenilo(s), cicloalquinilo(s), arilo(s) y/o heterociclo(s). Los ejemplos de anillos heterocíclicos incluyen, pero no se limitan a, bencimidazolilo, benzofuranilo, benzotiofuranilo, benzotiofenilo, benzoxazolilo, benzoxazolinilo, benzotiazolilo, benzotriazolilo , benzotetrazolilo, bencisoxazolilo, bencisotiazolilo, bencimidazolinilo, carbazolilo, 4aH-carbazolilo, carbolinilo, cromanilo, cromenilo, cinolinilo, decahidroquinolinilo, 2H,6H-1,5,2-ditiazinilo, dihidrofuro[2,3-b]tetrahidrofurano, furanilo, furazanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, imidazolilo, 1H-indazolilo, indolenilo, indolinilo, indolizinilo, indolilo, 3H-indolilo, isatinoílo, isobenzofuranilo, isocromanilo, isoindazolilo, isoindolinilo, isoindolilo, isoquinolinilo, isotiazolilo, isoxazolilo, metilendioxifenilo, morfolinilo, naftiridinilo, octahidroisoquinolinilo, oxadiazolilo, 1,2,3-oxadiazolilo, 1,2,4-oxadiazolilo, 1,2,5-oxadiazolilo, 1,3,4-oxadiazolilo, oxazolidinilo, oxazolilo, oxindolilo, pirimidinilo, fenantridinilo, fenantrolinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, fenoxatinilo, fenoxazinilo, ftalazinilo, piperazinilo, piperidinilo, piperidonilo, 4-piperidonilo, piperonilo, pteridinilo, purinilo, piranilo, pirazinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, pirazolilo, piridazinilo, piridoxazol, piridoimidazol, piridotiazol, piridinilo, piridilo, pirimidinilo, pirrolidinilo, pirrolinilo, 2H-pirrolilo, pirrolilo, quinazolinilo, quinolinilo, 4H-quinolizinilo, quinoxalinilo, quinuclidinilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidroisoquinolinilo, tetrahidroquinolinilo, tetrazolilo, 6H-1,2,5-tiadiazinilo, 1,2,3-tiadiazolilo, 1,2,4-tiadiazolilo, 1,2,5-tiadiazolilo, 1,3,4-tiadiazolilo, tiantrenilo, tiazolilo, tienilo, tienotiazolilo, tienoxazolilo, tienoimidazolilo, tiofenilo y xantenilo. Uno o más de los anillos puede estar sustituido tal como se definió anteriormente para “arilo”.

“Alquilo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere al radical de grupos alifáticos saturados o insaturados, incluyendo grupos alquilo, alquenilo o alquinilo de cadena lineal, grupos alquilo, alquenilo o alquinilo de cadena ramificada, grupos cicloalquilo, cicloalquenilo o cicloalquinilo (alicíclicos), grupos cicloalquilo, cicloalquenilo o cicloalquinilo sustituido con alquilo, y grupos alquilo, alquenilo o alquinilo sustituidos con cicloalquilo. A menos que se indique lo contrario, un alquilo de cadena lineal o de cadena ramificada tiene 30 átomos de carbono o menos en su estructura principal (por ejemplo, C¹-C³⁰ para cadena lineal, C³-C³⁰ para cadena ramificada), preferiblemente 20 o menos, más preferiblemente 10 o menos, lo más preferiblemente 6 o menos. Si el alquilo es insaturado, la cadena de alquilo generalmente tiene desde 2-30 carbonos en la cadena, preferiblemente desde 2-20 carbonos en la cadena, más preferiblemente desde 2-10 carbonos en la cadena. Del mismo modo, los cicloalquilos preferidos tienen desde 3­ 20 átomos de carbono en su estructura de anillos, preferiblemente desde 3-10 carbonos átomos en su estructura de anillos, lo más preferiblemente 5, 6 ó 7 carbonos en la estructura de anillos.

Los términos “alquenilo” y “alquinilo” se refieren a grupos alifáticos insaturados análogos en cuanto a longitud y posible sustitución a los alquilos descritos anteriormente, pero que contienen al menos un doble o triple enlace, respectivamente.

“Alquilo” incluye una o más sustituciones en uno o más átomos de carbono del radical hidrocarburo así como heteroalquilos. Los sustituyentes adecuados incluyen, pero no se limitan a, halógenos tales como flúor, cloro, bromo o yodo; hidroxilo; -NR¹R² , en el que R¹ y R² son independientemente hidrógeno, alquilo o arilo, y en el que el átomo de nitrógeno está opcionalmente cuaternizado; -SR, en el que R es hidrógeno, alquilo o arilo; -CN; -NO²; -COOH; carboxilato; -COR, -COOR o -CONR², en el que R es hidrógeno, alquilo o arilo; azida, aralquilo, alcoxilo, imino, fosfonato, fosfinato, sililo, éter, sulfonilo, sulfonamido, heterociclilo, restos aromáticos o heteroaromáticos, -CF³; -CN; -NCOCOCH²CH² ; -NCOCOCHCH; -NCS; y combinaciones de los mismos.

“Amino” y “amina”, tal como se usa en el presente documento, son reconocidos en la técnica y se refieren tanto a aminas sustituidas como no sustituidas, por ejemplo, un resto que puede estar representado por la fórmula general:

o

en las que, R, R' y R” representan cada uno independientemente un hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, alquenilo sustituido o no sustituido, alquinilo sustituido o no sustituido, carbonilo sustituido o no sustituido, -(CH2)m-R''', o R y R' junto con el átomo de N al que están unidos completan un heterociclo que tiene desde 3 hasta 14 átomos en la estructura de anillos; R''' representa un grupo hidroxilo, un grupo carbonilo sustituido o no sustituido, un arilo, un anillo de cicloalquilo, un anillo de cicloalquenilo, un heterociclo o un policiclo; y m es cero o un número entero que oscila desde 1 hasta 8. En realizaciones preferidas, sólo uno de R y R' puede ser un carbonilo, por ejemplo, R y R' junto con el nitrógeno no forman una imida. En realizaciones preferidas, R y R' (y opcionalmente R”) representan cada uno independientemente un átomo de hidrógeno, un alquilo sustituido o no sustituido, un alquenilo sustituido o no sustituido, o -(CH2)m-R'''. Por tanto, el término “alquilamina”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo amina, tal como se definió anteriormente, que tiene un alquilo sustituido o no sustituido unido al mismo (es decir, al menos uno de R, R' o R” es un grupo alquilo).

“Carbonilo”, tal como se usa en el presente documento, es reconocido en la técnica e incluye restos que pueden estar representados por la fórmula general:

0

en las que X es un enlace, o representa un oxígeno o un azufre, y R representa un hidrógeno, un alquilo sustituido o no sustituido, un alquenilo sustituido o no sustituido, un alquinilo sustituido o no sustituido, -(CH2)m-R”, o una sal farmacéuticamente aceptable, R' representa un hidrógeno, un alquilo sustituido o no sustituido, un alquenilo sustituido o no sustituido, un alquinilo sustituido o no sustituido, o -(CH2)m-R”; R” representa un grupo hidroxilo, un grupo carbonilo sustituido o no sustituido, un arilo, un anillo de cicloalquilo, un anillo de cicloalquenilo, un heterociclo o un policiclo; y m es cero o un número entero que oscila desde 1 hasta 8. Cuando X es oxígeno y R se define tal como anteriormente, el resto también puede denominarse grupo carboxilo. Cuando X es oxígeno y R es hidrógeno, la fórmula representa un “ácido carboxílico”. Cuando X es oxígeno y R' es hidrógeno, la fórmula representa un “formiato”. En general, cuando el átomo de oxígeno de la fórmula anterior se reemplaza por un azufre, la fórmula representa un grupo “tiocarbonilo”. Cuando X es azufre y R o R' no es hidrógeno, la fórmula representa un “tioéster”. Cuando X es azufre y R es hidrógeno, la fórmula representa un “ácido tiocarboxílico”. Cuando X es azufre y R' es hidrógeno, la fórmula representa un “tioformiato”. Cuando X es un enlace y R no es hidrógeno, la fórmula anterior representa una “cetona”. Cuando X es un enlace y R es hidrógeno, la fórmula anterior representa un “aldehído”.

“Heteroalquilo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a radicales de cadena lineal o ramificada, o radicales que contienen carbonos cíclicos, o combinaciones de los mismos, que contienen al menos un heteroátomo. Los heteroátomos adecuados incluyen, pero no se limitan a, O, N, Si, P y S, en los que los átomos de nitrógeno, fósforo y azufre están opcionalmente oxidados, y el heteroátomo nitrógeno está opcionalmente cuaternizado.

Los ejemplos de radicales de hidrocarburos saturados incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, sec-butilo, ciclohexilo, (ciclohexil)metilo, ciclopropilmetilo, y homólogos e isómeros de, por ejemplo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo. Los ejemplos de grupos alquilo insaturados incluyen, pero no se limitan a, vinilo, 2-propenilo, crotilo, 2-isopentenilo, 2-(butadienilo), 2,4-pentadienilo, 3-(1,4-pentadienilo), etinilo, 1- y 3 propinilo, y 3-butinilo.

“Alcoxilo”, “alquilamino” y “alquiltio” se usan en el presente documento en su sentido convencional, y se refieren a aquellos grupos alquilo unidos a la parte restante de la molécula a través de un átomo de oxígeno, un grupo amino o un átomo de azufre, respectivamente.

“Alquilarilo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo sustituido con un grupo arilo (por ejemplo, un grupo aromático o heteroaromático).

“Heterociclo” o “heterocíclico”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un radical cíclico unido a través de un carbono o nitrógeno de anillo de un anillo monocíclico o bicíclico que contiene 3-10 átomos de anillo, y preferiblemente desde 5-6 átomos de anillo, que consiste en carbono y de uno a cuatro heteroátomos seleccionados cada uno del grupo que consiste en oxígeno distinto de peróxido, azufre y N(Y), en la que Y está ausente o es H, O, alquilo C1-C10, fenilo o bencilo, y que contiene opcionalmente 1-3 dobles enlaces y está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes. Los ejemplos del anillo heterocíclico incluyen, pero no se limitan a, bencimidazolilo, benzofuranilo, benzotiofuranilo, benzotiofenilo, benzoxazolilo, benzoxazolinilo, benzotiazolilo, benzotriazolilo, benzotetrazolilo, bencisoxazolilo, bencisotiazolilo, bencimidazolinilo, carbazolilo, 4aH-carbazolilo, carbolinilo, cromanilo, cromenilo, cinolinilo, decahidroquinolinilo, 2H,6H-1,5,2-ditiazinilo, dihidrofuro[2,3-b]tetrahidrofurano, furanilo, furazanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, imidazolilo, 1H-indazolilo, indolenilo, indolinilo, indolizinilo, indolilo, 3H-indolilo, isatinoílo, isobenzofuranilo, isocromanilo, isoindazolilo, isoindolinilo, isoindolilo, isoquinolinilo, isotiazolilo, isoxazolilo, metilendioxifenilo, morfolinilo, naftiridinilo, octahidroisoquinolinilo, oxadiazolilo, 1,2,3-oxadiazolilo, 1,2,4-oxadiazolilo, 1,2,5-oxadiazolilo, 1,3,4-oxadiazolilo, oxazolidinilo, oxazolilo, oxindolilo, pirimidinilo, fenantridinilo, fenantrolinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, fenoxatinilo, fenoxazinilo, ftalazinilo, piperazinilo, piperidinilo, piperidonilo, 4-piperidonilo, piperonilo, pteridinilo, purinilo, piranilo, pirazinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, pirazolilo, piridazinilo, piridoxazol, piridoimidazol, piridotiazol, piridinilo, piridilo, pirimidinilo, pirrolidinilo, pirrolinilo, 2H-pirrolilo, pirrolilo, quinazolinilo, quinolinilo, 4H-quinolizinilo, quinoxalinilo, quinuclidinilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidroisoquinolinilo, tetrahidroquinolinilo, tetrazolilo, 6H-1,2,5-tiadiazinilo, 1,2,3-tiadiazolilo, 1,2,4-tiadiazolilo, 1,2,5-tiadiazolilo, 1,3,4-tiadiazolilo, tiantrenilo, tiazolilo, tienilo, tienotiazolilo, tienoxazolilo, tienoimidazolilo, tiofenilo y xantenilo. Los grupos heterocíclicos pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes tal como se definió anteriormente para alquilo y arilo.

“Halógeno”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a flúor, cloro, bromo o yodo.

II. Alginatos modificados

En el presente documento se describen polímeros de alginato que se han modificado químicamente para alterar su biocompatibilidad y sus propiedades físicas, así como métodos de preparación de los mismos.

A. Estructura de polímeros de alginato modificados

Los alginatos modificados contienen uno o más monómeros covalentemente modificados definidos por la fórmula I

en la que,

X es NR;

R1 incluye un anillo de 1,2,3-triazol o un grupo alquino;

Y1 e Y2 son independientemente hidrógeno o -PO(OR)2; o

Y2 está ausente, e Y2, junto con los dos átomos de oxígeno a los que Y1 e Y2 están unidos forman una estructura cíclica tal como se muestra a continuación

en la que n es un número entero entre 1 y 4; y

R² y R³ son, independientemente, hidrógeno o una agrupación orgánica que contiene cualquier número de átomos de carbono, preferiblemente 1-30 átomos de carbono, más preferiblemente 1-20 átomos de carbono, más preferiblemente 1-14 átomos de carbono, y que incluye opcionalmente uno o más heteroátomos tales como una agrupación de oxígeno, azufre o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados o cíclicos, siendo las agrupaciones R representativas grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C³-C²⁰, cíclico C³-C²⁰ sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), peptídico o polipeptídico; o

R² y R³ , junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un anillo carbocíclico o heterocíclico sustituido o no sustituido de 3 a 8 miembros; y

R es, independientemente en cada aparición, hidrógeno o una agrupación orgánica que contiene cualquier número de átomos de carbono, preferiblemente 1-30 átomos de carbono, más preferiblemente 1-20 átomos de carbono, más preferiblemente 1-14 átomos de carbono, y que incluye opcionalmente uno o más heteroátomos tales como una agrupación de oxígeno, azufre o nitrógeno en formatos estructurales lineales, ramificados o cíclicos, siendo las agrupaciones R representativas grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, fenilo, fenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, fenoxilo, fenoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, feniltio, feniltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C³-C²⁰, cíclico C³-C²⁰ sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), peptídico o polipeptídico.

El polímero de alginato modificado de manera singular contiene uno o más monómeros covalentemente modificados definidos por la fórmula l, en la que R¹ incluye un anillo de 1,2,3-triazol o un grupo alquino.

Los polímeros de alginato modificados pueden tener cualquier peso molecular deseado. El peso molecular promedio en peso de los alginatos es preferiblemente de entre 1.000 y 1.000.000 Dalton, más preferiblemente de entre 10.000 y 500.000 Dalton, tal como se determina mediante cromatografía de permeación en gel.

Los polímeros de alginato modificados pueden contener cualquier razón de monómeros de manuronato, monómeros de guluronato y monómeros covalentemente modificados. En algunas realizaciones, más del 2,5%, del 5%, del 7,5%, del 10%, del 12%, del 14%, del 15%, del 16%, del 18%, del 20%, del 22%, del 24%, del 25%, del 26%, del 28%, del 30%, del 32,5%, del 35%, del 37,5%, del 40%, del 45%, del 50%, del 55% o del 60% de los monómeros en el polímero de alginato modificado son monómeros covalentemente modificados. Preferiblemente más del 20%, más preferiblemente más del 25% y lo más preferiblemente más del 30% de los monómeros en el polímero de alginato modificado son monómeros covalentemente modificados.

Pueden producirse polímeros de alginato modificados mediante la incorporación de monómeros covalentemente modificados que presentan una gama de diferentes potenciales de enlace de hidrógeno, hidrofobicidades/hidrofilicidades y estados de carga. La inclusión de monómeros covalentemente modificados en un polímero de alginato altera las propiedades fisicoquímicas del polímero de alginato. Por consiguiente, las propiedades fisicoquímicas de los alginatos pueden ajustarse para las aplicaciones deseadas mediante la incorporación selectiva de monómeros covalentemente modificados.

Por ejemplo, la temperatura de transición vítrea (T^g) puede variarse mediante la incorporación de monómeros covalentemente modificados. En algunas realizaciones, el polvo de polímero de alginato modificado presenta una Tg, tal como se mide mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC), de más de 50°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C, 80°C, 85°C, 90°C, 95°C, 100°C, 105°C, 110°C, 115°C, 120°C, 125°C, 130°C, 135°C, 140°C, 145°C, 150°C, 160°C, 175°C, 190°C o 200°C.

La hidrofobicidad/hidrofilicidad de los alginatos puede variarse mediante la incorporación de monómeros covalentemente modificados hidrófobos y/o hidrófilos. En realizaciones preferidas, el polímero de alginato modificado contiene uno o más monómeros covalentemente modificados hidrófobos. La hidrofobicidad/hidrofilicidad relativa de los alginatos modificados puede evaluarse cuantitativamente midiendo el ángulo de contacto de una gota de agua sobre una película del polímero de alginato modificado usando un goniómetro. En algunas realizaciones, el alginato modificado tiene un ángulo de contacto de menos de 90°(es decir, es hidrófilo). En realizaciones preferidas, el alginato modificado tiene un ángulo de contacto de más de 90° (es decir, es hidrófobo). En algunas realizaciones, el alginato modificado tiene un ángulo de contacto de más de 95°, 100°, 105°, 110°, 115° o 120°.

En realizaciones usadas para la encapsulación de células, el polímero de alginato modificado puede reticularse iónicamente mediante un catión polivalente, tal como Ca2+, Sr2+ o Ba2+, para formar hidrogeles. La capacidad de los alginatos modificados para formar hidrogeles estables en condiciones fisiológicas puede cuantificarse usando el ensayo de formación de hidrogel descrito en el ejemplo 2.

En algunas realizaciones, el polímero de alginato modificado forma hidrogeles de tal manera que la intensidad de fluorescencia medida usando el ensayo de formación de hidrogel de alto rendimiento descrito en el presente documento es de más de 10.000, 15.000, 20.000, 25.000, 30.000, 35.000, 40.000, 45.000, 50.000 ó 55.000. En realizaciones preferidas, el polímero de alginato modificado forma hidrogeles de tal manera que la intensidad de fluorescencia medida usando el ensayo de formación de hidrogel de alto rendimiento descrito en el presente documento es de más de 15.000. En realizaciones preferidas, el polímero de alginato modificado forma hidrogeles de tal manera que la intensidad de fluorescencia medida usando el ensayo de formación de hidrogel de alto rendimiento descrito en el presente documento es de entre 15.000 y 55.000, preferiblemente de entre 20.000 y 55.000, más preferiblemente de entre 25.000 y 55.000.

En realizaciones usadas para la encapsulación de células, el polímero de alginato modificado forma un hidrogel con suficiente porosidad como para permitir que los nutrientes, los desechos y las hormonas y/o proteínas secretados a partir de las células encapsuladas difundan libremente hacia el interior y hacia el exterior de las microcápsulas, al tiempo que simultáneamente impiden la incursión de células inmunitarias en la matriz del gel. La porosidad y el área de superficie de los hidrogeles de alginato modificado pueden medirse usando análisis BET. Antes del análisis BET, se eliminan el disolvente y las impurezas volátiles mediante calentamiento prolongado del gel de alginato modificado a vacío. Posteriormente, se enfrían las muestras de hidrogel a vacío, por ejemplo, con nitrógeno líquido, y se analizan midiendo el volumen de gas (normalmente gas N2, Kr, CO2 o Ar) adsorbido al hidrogel a presiones específicas. El análisis de la fisisorción del gas a presiones variables se usa para caracterizar el área de superficie total y la porosidad de los geles formados a partir de los polímeros de alginato modificados. El método preferido para determinar la porosidad de hidrogeles es el análisis BET.

En realizaciones preferidas, el alginato modificado forma un hidrogel con suficiente porosidad como para permitir que los nutrientes, los desechos y las hormonas y/o proteínas secretados a partir de las células encapsuladas difundan libremente hacia el interior y hacia el exterior de las microcápsulas, al tiempo que simultáneamente impiden la incursión de células inmunitarias en la matriz del gel. En algunas realizaciones, la porosidad del hidrogel formado a partir del polímero de alginato modificado aumenta en un 5%, un 10%, un 15% o un 20% en relación con la porosidad de un hidrogel formado a partir del polímero de alginato no modificado. En realizaciones alternativas, la porosidad del hidrogel formado a partir del polímero de alginato modificado disminuye en un 5%, un 10%, un 15% o un 20% en relación con la porosidad de un hidrogel formado a partir del polímero de alginato no modificado.

En realizaciones preferidas usadas para la encapsulación de células, el alginato modificado es biocompatible. La biocompatibilidad de los alginatos modificados puede determinarse cuantitativamente usando el ensayo de biocompatibilidad in vivo basado en fluorescencia descrito en el ejemplo 5. En este ensayo, se midió la actividad de catepsina usando un ensayo de fluorescencia in vivo para cuantificar la respuesta a cuerpos extraños al alginato modificado.

En algunas realizaciones, el polímero de alginato modificado es biocompatible, de tal manera que la respuesta de fluorescencia normalizada con respecto al alginato no modificado medida usando el ensayo de biocompatibilidad in vivo descrito en el presente documento es de menos del 100%, del 95%, del 90%, del 85%, del 80%, del 75%, del 70%, del 65%, del 60%, del 55%, del 50%, del 45% o del 40%. En realizaciones preferidas, el polímero de alginato modificado induce una menor respuesta a cuerpos extraños que el alginato no modificado. Esto se indica por una respuesta de fluorescencia normalizada con respecto al alginato no modificado de menos del 100%. En algunas realizaciones, el polímero de alginato modificado es biocompatible, de tal manera que la respuesta de fluorescencia normalizada con respecto al alginato no modificado medida usando el ensayo de biocompatibilidad in vivo descrito en el presente documento es de menos del 75%, más preferiblemente de menos del 65% y lo más preferiblemente de menos del 50%.

B. Morfología de las partículas

Se ha aplicado el creciente reconocimiento de los parámetros que impulsan la fibrosis in vivo al análisis del rendimiento de los alginatos modificados. La implantación intraperitoneal (i.p.) de cápsulas de alginato modificado reveló que los alginatos modificados pueden dar como resultado cápsulas con forma anómala cuando se reticulan usando condiciones definidas para los alginatos no modificados. Estas cápsulas con forma anómala pueden complicar la implementación y la interpretación de las cápsulas de alginato modificado implantadas por vía i.p. En un esfuerzo por mejorar la morfología de las cápsulas, se desarrollaron métodos de formulación para su uso con micropartículas de alginato modificado, en los que se mezclaron alginatos modificados con una pequeña cantidad de alginato de alto peso molecular. Las partículas preparadas a partir de esta mezcla dieron lugar a partículas con morfología y estabilidad mejoradas.

El alginato no modificado tiene normalmente un peso molecular promedio en peso de aproximadamente 50.000 Dalton a aproximadamente 500.000 Dalton; sin embargo, también pueden usarse alginatos no modificados que tienen pesos moleculares. En algunas realizaciones, el peso molecular promedio en peso es de desde aproximadamente 50.000 hasta aproximadamente 250.000 Dalton, más preferiblemente desde aproximadamente 50.000 hasta aproximadamente 150.000 Dalton. En algunas realizaciones, el peso molecular promedio en peso es de aproximadamente 100.000 Dalton.

En otras realizaciones, se usan uno o más polímeros de formación de hidrogel adicionales en combinación con alginato no modificado o en lugar de alginato no modificado. Tales polímeros se conocen en la técnica. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, PEG, quitosano, dextrano, ácido hialurónico, seda, fibrina, poli(alcohol vinílico) y poli(metacrilato de hidroxietilo).

C. Preparación de polímeros de alginato modificados

Los alginatos modificados pueden prepararse a través de modificación covalente de cualquier polímero de alginato disponible. Pueden introducirse monómeros covalentemente modificados en polímeros de alginato usando una variedad de procedimientos de síntesis conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, los monómeros de manuronato y guluronato se modifican covalentemente a través de la amidación de su resto ácido carboxílico. Puede usarse la variación estequiométrica de los reactantes durante la modificación covalente para variar la cantidad de monómero covalentemente modificado incorporado en el alginato modificado.

Además de las reacciones comentadas a continuación, en la técnica se conocen metodologías de síntesis alternativas para la modificación covalente de monómeros de manuronato y guluronato (véase, por ejemplo, March, “Advanced Organic Chemistry,” 5a edición, 2001, Wiley Interscience Publication, Nueva York).

1. Modificación a través del resto carboxilato de los monómeros de manuronato y guluronato

Los monómeros de manuronato y guluronato contienen un resto ácido carboxílico que puede servir como punto de modificación covalente. En realizaciones preferidas, el resto ácido carboxílico presente en uno o más residuos de manuronato y/o guluronato (1) se somete a amidación tal como se muestra en el esquema 1.

Esquema 1. Condiciones de reacción representativas: i. (referencia sólo) HO-R¹, 2-cloro-4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina (CDMT), N-metilmorfolina (NMM); ii. HNR¹R² , CDMT, NMM.

Los residuos de manuronato y guluronato (A) pueden modificarse covalentemente a través de amidación, formando el monómero modificado C. Por ejemplo, los residuos de manuronato y guluronato (A) pueden someterse a amidación mediante reacción con cualquier amina (R¹-NH²) adecuada en presencia de una carbodiimida y DMAP. En un método preferidos, los residuos de manuronato y guluronato (A) se sometieron a amidación mediante reacción con una cantidad estequiométrica de una amina (R1-NH2) adecuada en presencia de CDMT y NMM. Las aminas preferidas para su uso como reactivos en reacciones de amidación incluyen las mostradas a continuación.

2. Modificación de monómeros de manuronato y guluronato a través de química clic

En algunas realizaciones, los monómeros de manuronato y guluronato se modifican covalentemente para introducir un grupo funcional que puede reaccionar adicionalmente a través de química clic.

En realizaciones preferidas, se usa amidación para introducir un grupo funcional que puede reaccionar adicionalmente usando una reacción de cicloadición 1,3-dipolar (es decir, una reacción de cicloadición de Huisgen). En una reacción de cicloadición 1,3-dipolar, se hace reaccionar una primera molécula que contiene un resto azida con una segunda molécula que contiene un alquino terminal o interno. Tal como se muestra a continuación, la azida y los grupos alquino experimentan una reacción de cicloadición 1,3-dipolar intramolecular, acoplando las dos moléculas juntas y formando un anillo de 1,2,3-triazol.

La regioquímica de las reacciones de cicloadición 1,3-dipolar puede controlarse mediante la adición de un catalizador de cobre(l) (formado in situ mediante la reducción de CuSO4 con ascorbato de sodio) o un catalizador de rutenio (tal como Cp*RuCl(PPh3)2, Cp*Ru(COD) o Cp*[RuCU]). Por ejemplo, usando un catalizador de cobre, pueden hacerse reaccionar azidas y alquinos terminales para dar exclusivamente los 1,4-regioisómeros de 1,2,3-triazoles. De manera similar, en presencia de un catalizador de rutenio adecuado, pueden hacerse reaccionar azidas con alquinos internos o terminales para formar exclusivamente los 1,5-regioisómeros de 1,2,3-triazoles.

En algunas realizaciones, se usa amidación para formar un monómero covalentemente modificado que contiene un resto alquino. En estas realizaciones, puede hacerse reaccionar adicionalmente el resto alquino presente en el monómero covalentemente modificado con una segunda molécula que contiene un grupo funcional azida. Tras la reacción, la azida y los grupos alquino experimentan una reacción de cicloadición 1,3-dipolar intramolecular formando un anillo de 1,2,3-triazol, acoplando la segunda molécula al monómero covalentemente modificado.

En realizaciones alternativas, se usa amidación para formar un monómero covalentemente modificado que contiene un resto azida. En estas realizaciones, puede hacerse reaccionar adicionalmente resto azida presente en el monómero covalentemente modificado con una segunda molécula que contiene un alquino terminal o interno. Tras la reacción, la azida y los grupos alquino experimentan una reacción de cicloadición 1,3-dipolar intramolecular formando un anillo de 1,2,3-triazol, acoplando la segunda molécula al monómero covalentemente modificado.

En realizaciones preferidas, se usa amidación para formar un monómero covalentemente modificado que contiene un resto azida. Posteriormente, se hace reaccionar el resto azida presente en el monómero covalentemente modificado con una segunda molécula que contiene un alquino terminal o interno, formando un anillo de 1,2,3-triazol y acoplando la segunda molécula al monómero covalentemente modificado.

Tal como se muestra en el esquema 2, pueden emplearse diferentes estrategias para preparar monómeros covalentemente modificados que contienen un resto azida. Por ejemplo, los residuos de manuronato y guluronato (A) pueden experimentar amidación mediante reacción con una amina sustituida con un resto azida (por ejemplo, 11-azido-3,6,9-trioxaundecan-1-amina) en presencia de una carbodiimida y DMAP, formando un monómero modificado funcionalizado con azida F en un sola etapa de síntesis. Alternativamente, los residuos de manuronato y guluronato (A) pueden experimentar amidación mediante reacción con una amina sustituida con cualquier resto que pueda transformarse fácilmente en una azida. Por ejemplo, los residuos de manuronato y guluronato pueden someterse a amidación mediante reacción con 4-yodobencilamina en presencia de una carbodiimida y DMAP, formando el monómero funcionalizado con yodo D. Luego, el resto yodo puede convertirse fácilmente en la azida, por ejemplo, mediante tratamiento con azida de sodio.

Posteriormente, los monómeros funcionalizados con azida pueden hacerse reaccionar con una molécula que contiene una funcionalidad alquino. Por ejemplo, pueden hacerse reaccionar los monómeros funcionalizados con azida F y E con una molécula que contiene una funcionalidad alquino terminal en presencia de un catalizador de cobre(l) (formado in situ mediante la reducción de CuSO4 con ascorbato de sodio), formando los monómeros covalentemente modificados G y H.

Esquema 2.

Los alquinos preferidos para su uso como reactivos en reacciones de cicloadición 1,3-dipolar incluyen los mostrados a continuación.

3. Modificación a través del resto hidroxiio de los monómeros de manuronato y guiuronato

Los monómeros de manuronato y guluronato contienen restos hidroxilo que pueden servir como punto de modificación covalente. En realizaciones preferidas, los restos hidroxilo de los residuos de manuronato y guluronato (1) se hacen reaccionar tal como se muestra en el esquema 3.

Esquema 3.

Condiciones de reacción representativas: i. I-PO(OR)², piridina; ii. R²-CO-R³ , H⁺.

Los residuos de manuronato y guluronato (A) pueden someterse a fosforilación mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, formando el monómero covalentemente modificado I. Por ejemplo, los residuos de manuronato y guluronato pueden someterse a fosforilación mediante reacción con I-PO(OR)² en presencia de piridina (Stowell, J. K. y Widlanski, T. S. Tetrahedron Lett. 1995; 36(11): 1825-1826).

Los residuos de manuronato y guluronato (A) también pueden convertirse en un acetal cíclico usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede formarse un acetal cíclico mediante reacción de los residuos de manuronato y guluronato con cualquier cetona (R²-CO-R³) adecuada en condiciones ácidas.

C. Purificación de los alginatos

Los alginatos comerciales se obtienen generalmente de las algas. Los alginatos en bruto de las algas marinas contienen numerosos contaminantes, incluyendo polifenoles, proteínas y endotoxinas (de Vos, P, et al. Biomaterials 2006; 27: 5603-5617). Se ha demostrado que la presencia de estas impurezas limita la biocompatibilidad de los alginatos implantados.

Para optimizar la biocompatibilidad de los alginatos químicamente modificados descritos en el presente documento, se desarrolló una metodología de purificación rigurosa para eliminar las impurezas potencialmente irritantes. En realizaciones preferidas, se usó alginato de baja viscosidad ultrapuro (UPVLVg , FMC Biopolymers) como sustrato para la modificación covalente. Tras cada modificación covalente, se filtraron los alginatos modificados a través de columnas de sílice modificada, por ejemplo, columnas de sílice modificada con ciano, con el objetivo de capturar las impurezas orgánicas en bruto. Finalmente, después de completar la modificación covalente del polímero de alginato, se someten a diálisis los alginatos modificados para retirar cualquier impureza de bajo peso molecular o de molécula pequeña restante. En un método preferido, los alginatos modificados se someten a diálisis frente a una membrana de valor de corte de peso molecular (MWCO) de 10.000 para retirar cualquier impureza de molécula pequeña restante. La pureza de los alginatos modificados puede determinarse mediante análisis por ¹H-RMN. En un análisis de este tipo, se recopilan espectros de ¹H-RMN del polímero de alginato modificado y se integran los picos correspondientes al polímero de alginato modificado y a cualquier impureza para determinar la cantidad relativa de cada especie en la muestra. En algunas realizaciones, la pureza del polímero de alginato modificado, tal como se determina mediante ¹H-RMN, es de más del 90%, del 91%, del 92%, del 93%, del 94%, del 95%, del 96%, del 97%, del 98% o del 99%. En realizaciones preferidas, la pureza del polímero de alginato modificado, tal como se determina mediante ¹H-RMN, es de más del 90%, más preferiblemente más del 95%.

III. Ensayos para la caracterización de polímeros de alginato modificados

La modificación covalente de polímeros de alginato altera las propiedades fisicoquímicas y la compatibilidad biológica del polímero de alginato.

En algunas realizaciones, se usa un ensayo de formación de hidrogel para cuantificar la estabilidad de los hidrogeles formados a partir de alginatos o alginatos modificados. En realizaciones preferidas, se usa el ensayo de formación de hidrogel como herramienta de examen para identificar alginatos modificados capaces de formar hidrogeles estables. Ensayos in vivo útiles para caracterizar la biocompatibilidad de polímeros de alginato modificados. En algunas realizaciones, se usa el ensayo de biocompatibilidad in vivo de alto rendimiento descrito en el presente documento para identificar alginatos modificados que inducen una menor respuesta a cuerpos extraños que el alginato no modificado.

Además, en el presente documento se describe un método in vivo para cuantificar la biocompatibilidad de los alginatos modificados.

Los ensayos pueden usarse para evaluar la idoneidad y la biocompatibilidad de alginatos tanto modificados como no modificados para determinadas aplicaciones.

A. Ensayo de formación de hidrogel de alto rendimiento

La modificación covalente de los alginatos afecta a las propiedades físicas del alginato, incluyendo la capacidad del alginato para formar hidrogeles adecuados para la encapsulación de células y biomoléculas.

El ensayo de formación de gel aprovecha la capacidad de los hidrogeles para atrapar compuestos fluorescentes y conservar diferencialmente los fluoróforos tras el lavado basándose en la estabilidad del hidrogel. En este ensayo, se forma un hidrogel mediante la reticulación iónica de un alginato modificado candidato en disolución acuosa que contiene un fluoróforo disuelto. Pueden usarse una variedad de fluoro fluoróforos en este ensayo. En realizaciones preferidas, los fluoróforos presentan un máximo de emisión entre 480 y 750 nm. En realizaciones preferidas, el fluoróforo es un colorante de rodamina que presenta un máximo de emisión entre 550 y 600 nm.

Después de la reticulación, el hidrogel se lava repetidamente con agua. Los alginatos modificados candidatos que no se reticulan de manera eficiente se eliminan por lavado junto con cualquier fluoróforo presente. Los alginatos modificados que se reticulan de manera eficiente conservan el fluoróforo durante los lavados. Por consiguiente, midiendo la fluorescencia de los hidrogeles de alginato modificado después del lavado, pueden identificarse fácilmente alginatos modificados capaces de formar hidrogeles estables.

En algunas realizaciones, se comparan los valores de intensidad de fluorescencia relativa medidos para un alginato modificado en relación con los niveles de fluorescencia medidos para el control negativo y el alginato no modificado para determinar si el alginato modificado es capaz de formar hidrogeles. En realizaciones alternativas, se usa el ensayo de formación de hidrogel descrito en el presente documento para cuantificar la estabilidad de los hidrogeles formados a partir de alginatos o alginatos modificados. En estas realizaciones, se usa la intensidad de fluorescencia medida para un alginato modificado para indicar la estabilidad del hidrogel formado a partir del alginato.

En realizaciones preferidas, el polímero de alginato modificado forma hidrogeles de tal manera que la intensidad de fluorescencia medida usando el ensayo de formación de hidrogel de alto rendimiento descrito en el presente documento es de más de 10.000, 15.000, 20.000, 25.000, 30.000, 35.000, 40.000, 45.000, 50.000 ó 55.000. En realizaciones preferidas, el polímero de alginato modificado forma hidrogeles de tal manera que la intensidad de fluorescencia medida usando el ensayo de formación de hidrogel de alto rendimiento descrito en el presente documento es de más de 15.000. En realizaciones preferidas, el polímero de alginato modificado forma hidrogeles de tal manera que la intensidad de fluorescencia medida usando el ensayo de formación de hidrogel de alto rendimiento descrito en el presente documento es de entre 15.000 y 55.000, más preferiblemente de entre 25.000 y 55.000.

B. Ensayo de biocompatibilidad in vivo de alto rendimiento

Los métodos de análisis de la biocompatibilidad actuales son lentos y requieren análisis histológico. En el presente documento se describe un ensayo de biocompatibilidad in vivo de alto rendimiento, útil para evaluar la biocompatibilidad relativa de los polímeros de alginato.

En el ensayo de biocompatibilidad in vivo de alto rendimiento descrito en el presente documento, se inyectan los polímeros de alginato modificados y un control de alginato no modificado en un formato en serie en el lomo de un animal de experimentación para facilitar el examen de alto rendimiento. En realizaciones preferidas, el animal de experimentación es un ratón. Después de la inyección, se comparó la actividad de catepsina en el punto de inyección de los alginatos modificados con la actividad de catepsina en el punto de inyección del alginato no modificado para comparar la respuesta a cuerpos extraños por parte de los alginatos implantados usando obtención de imágenes de fluorescencia in vivo. En realizaciones preferidas, la biocompatibilidad de los materiales se evaluó a los 14 días tras la inyección usando obtención de imágenes de fluorescencia in vivo.

En realizaciones preferidas, se usa el ensayo de biocompatibilidad in vivo de alto rendimiento descrito en el presente documento para identificar alginatos modificados que inducen una respuesta a cuerpos extraños menor que el alginato no modificado. Se comparó la intensidad de fluorescencia medida en el sitio de implantación de los alginatos modificados con la intensidad de fluorescencia medida en el sitio de implantación de un alginato no modificado. En realizaciones preferidas, los alginatos modificados que muestran una intensidad de fluorescencia en el sitio de implantación menor que la intensidad de fluorescencia medida en el sitio de implantación de un alginato no modificado se caracterizaron cualitativamente como biocompatibles. A la inversa, los alginatos modificados que muestran una intensidad de fluorescencia en el sitio de implantación mayor que la intensidad de fluorescencia medida en el sitio de implantación de un alginato no modificado se caracterizaron como no biocompatibles.

También puede usarse el ensayo de biocompatibilidad in vivo de alto rendimiento descrito anteriormente para caracterizar la capacidad de los alginatos modificados para formar hidrogeles mecánicamente estables in vivo. En realizaciones preferidas, la estabilidad in vivo de los geles de alginato se evaluó a los 28 días tras la inyección.

En realizaciones preferidas, los geles de alginato modificado que permanecieron en el sitio de inyección después de 28 días se caracterizaron como capaces de formar hidrogeles mecánicamente estables in vivo. A la inversa, los geles de alginato modificado que no estaban presentes en el sitio de inyección después de 28 días se consideraron como que no eran capaces de formar hidrogeles mecánicamente estables in vivo.

C. Examen in vivo de alginatos modificados para cuantificar la biocompatibilidad

Además, en el presente documento se describe un método in vivo para cuantificar la biocompatibilidad de los alginatos modificados.

En este método, se inyecta un polímero de alginato modificado en el lomo de un animal de experimentación. En realizaciones preferidas, el animal de experimentación es un ratón. Después de la inyección, se midió la actividad de catepsina en el punto de inyección de los alginatos modificados usando un ensayo de fluorescencia in vivo. En realizaciones preferidas, el ensayo de fluorescencia se llevó a cabo a los 7 días tras la inyección usando obtención de imágenes de fluorescencia in vivo. En realizaciones preferidas, se midió la intensidad de fluorescencia y se normalizó con respecto a la respuesta de fluorescencia medida usando alginato no modificado con el fin de cuantificar la biocompatibilidad de los alginatos modificados.

En realizaciones preferidas, el polímero de alginato modificado induce una respuesta a cuerpos extraños menor que el alginato no modificado (es decir, la respuesta de fluorescencia normalizada con respecto al alginato no modificado es menor del 100%). En algunas realizaciones, el polímero de alginato modificado es biocompatible de tal manera que la respuesta de fluorescencia normalizada con respecto al alginato no modificado medida usando el ensayo de biocompatibilidad in vivo descrito en el presente documento es de menos del 95%, del 90%, del 85%, del 80%, del 75%, del 70%, del 65%, del 60%, del 55%, del 50%, del 45% o del 40%. En realizaciones preferidas, el polímero de alginato modificado es biocompatible de tal manera que la respuesta de fluorescencia normalizada con respecto al alginato no modificado medida usando el ensayo de biocompatibilidad in vivo descrito en el presente documento es de menos del 75%, más preferiblemente de menos del 65% y lo más preferiblemente de menos del 50%.

IV. Métodos de uso

Los alginatos se usan en una variedad de aplicaciones en las industrias alimentaria, farmacéutica, cosmética, agrícola, gráfica y textil. Los alginatos se emplean ampliamente en la industria alimentaria como agentes espesantes, gelificantes, estabilizantes, de relleno, de suspensión y emulsionantes. Los alginatos pueden usarse como matriz para controlar la administración de agentes terapéuticos, profilácticos y/o diagnósticos. Los alginatos pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas como excipientes, en las que actúan como viscosificantes, agentes de suspensión, emulsionantes, aglutinantes y disgregantes. El alginato también puede usarse como material de impresión dental, como componente de apósitos para heridas y como agente de impresión. Un experto habitual en la técnica reconocerá que los alginatos modificados divulgados en el presente documento pueden usarse en cualquier aplicación para la que se emplean actualmente los alginatos.

Se contempla específicamente que los alginatos modificados descritos en el presente documento pueden usarse en aplicaciones en las que se prefieren biocompatibilidad y propiedades físicas mejoradas en comparación con alginatos disponibles comercialmente.

A. Encapsulación de células

El alginato puede reticularse iónicamente con cationes divalentes, en agua, a temperatura ambiente, para formar una matriz de hidrogel. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 4.352.883 concedida a Lim. En el procedimiento de Lim, se suspende una disolución acuosa que contiene los materiales biológicos que van a encapsularse en una disolución de un polímero soluble en agua, la suspensión forma gotitas que se configuran para dar microcápsulas diferenciadas mediante el contacto con cationes multivalentes, luego se reticula la superficie de las microcápsulas con poliaminoácidos para formar una membrana semipermeable alrededor de los materiales encapsulados.

El polímero soluble en agua con grupos laterales cargados se reticula mediante la reacción del polímero con una disolución acuosa que contiene iones multivalente de carga opuesta, o bien cationes multivalente si el polímero tiene grupos laterales ácidos o bien aniones multivalente si el polímero tiene grupos laterales básicos. Los cationes preferidos para la reticulación de los polímeros con grupos laterales ácidos para formar un hidrogel son cationes divalente y trivalente tales como cobre, calcio, aluminio, magnesio, estroncio, bario y estaño, aunque también pueden usarse cationes orgánicos di-, tri- o tetra-funcionales tales como sales de alquilamonio, por ejemplo, R³N⁺-A /\ /\ /--⁺NR³. Se añaden disoluciones acuosas de las sales de estos cationes a los polímeros para formar membranas e hidrogeles blandos, altamente hinchados. Cuanto más alta es la concentración de catión, o más alta es la valencia, mayor es el grado de reticulación del polímero. Se ha demostrado que concentraciones de tan sólo 0,005 M reticulan el polímero. Las concentraciones más altas están limitadas por la solubilidad de la sal.

Los aniones preferidos para la reticulación de polímeros que contienen cadenas laterales básicas para formar un hidrogel son aniones divalentes y trivalentes tales como ácidos dicarboxílicos de bajo peso molecular, por ejemplo, ácido tereftálico, iones sulfato e iones carbonato. Se añaden disoluciones acuosas de las sales de estos aniones a los polímeros para formar membranas e hidrogeles blandos, altamente hinchados, tal como se describió con respecto a los cationes.

Pueden usarse una variedad de policationes para complejar y estabilizar de ese modo el hidrogel de polímero en una membrana de superficie semipermeable. Los ejemplos de materiales que pueden usarse incluyen polímeros que tienen grupos reactivos básicos tales como grupos amina o imina, que tienen un peso molecular preferido de entre 3.000 y 100.000, tales como polietilenimina y polilisina. Estos están disponibles comercialmente. Un policatión es poli(L-lisina); ejemplos de poliaminas sintéticas son: polietilenimina, poli(vinilamina) y poli(alilamina). También hay policationes naturales, tales como el polisacárido quitosano.

Los polianiones que pueden usarse para formar una membrana semipermeable mediante reacción con grupos de superficie básicos en el hidrogel de polímero incluyen polímeros y copolímeros de ácido acrílico, ácido metacrílico y otros derivados del ácido acrílico, polímeros con grupos SO³H colgantes tales como poliestireno sulfonatado, y poliestireno con grupos ácido carboxílico.

En un método preferido, las células se encapsulan en un polímero de alginato modificado. En una realización preferida, las cápsulas de alginato modificado se fabrican a partir de una disolución de alginato modificado que contiene células suspendidas usando el encapsulador (tal como un encapsulador Inotech). En algunas realizaciones, el alginato modificado se reticula iónicamente con un catión polivalente, tal como Ca²⁺, Ba²⁺ o Sr²⁺. En realizaciones particularmente preferidas, el alginato modificado se reticula usando BaCh. En algunas realizaciones, las cápsulas se purifican adicionalmente después de la formación. En realizaciones preferidas, las cápsulas se lavan con, por ejemplo, disolución HEPES, disolución Krebs y/ o medio RPMl-1640.

Las células pueden obtenerse directamente de un donante, de un cultivo celular de células de un donante o de líneas de cultivo celular establecidas. En las realizaciones preferidas, las células se obtienen directamente de un donante, se lavan y se implantan directamente en combinación con el material polimérico. Las células se cultivan usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica de histocultivo. En la realización preferida, las células son autólogas, es decir, derivan del individuo al que van a trasplantarse las células, pero pueden ser alogénicas o heterólogas.

Pueden evaluarse la unión y la viabilidad celulares usando microscopía electrónica de barrido, histología y evaluación cuantitativa con radioisótopos. La función de las células implantadas puede determinarse usando una combinación de las técnicas anteriores y ensayos funcionales. Por ejemplo, en el caso de hepatocitos, pueden realizarse estudios de función hepática in vivo colocando una cánula en el conducto colédoco del receptor. Luego puede recogerse la bilis en incrementos. Pueden analizarse los pigmentos biliares mediante cromatografía de líquidos de alta presión en busca de tetrapirroles no derivatizados o mediante cromatografía en capa fina después de convertirse en azodipirroles por reacción con azodipirroles diazotizados y etilantranilato, con o sin tratamiento con P-glucuronidasa. También puede determinarse la bilirrubina diconjugada y monoconjugada mediante cromatografía en capa fina después de la metanólisis alcalina de los pigmentos biliares conjugados. En general, a medida que aumenta el número de hepatocitos trasplantados en funcionamiento, aumentarán los niveles de bilirrubina conjugada. También pueden realizarse prueba de función hepática sencillas en muestras de sangre, tales como la producción de albúmina. Pueden llevarse a cabo estudio de función orgánica análogos usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica, según se requiera, para determinar el grado de función celular después de la implantación. Por ejemplo, pueden administrarse células de islotes del páncreas de manera similar a la usada específicamente para implantar hepatocitos, para lograr la regulación de glucosa mediante la secreción apropiada de insulina para curar la diabetes. También pueden implantarse otros tejidos endocrinos. Pueden realizarse estudios que usan glucosa marcada así como estudios que usan ensayos de proteínas para cuantificar la masa celular en los armazones de polímero. Luego pueden correlacionarse estos estudios de masa celular con estudios funcionales celulares para determinar cuál es la masa celular apropiada. En el caso de condrocitos, la función se define como la provisión de un soporte estructural apropiado para los tejidos unidos circundantes.

Esta técnica puede usarse para proporcionar múltiples tipos de células, incluyendo células genéticamente alteradas, dentro de un armazón tridimensional para la transferencia eficiente de un gran número de células y el fomento del injerto del trasplante con el propósito de crear tejido nuevo o equivalente de tejido. También puede usarse para la inmunoprotección de los trasplantes de células mientras crece tejido nuevo o equivalente de tejido excluyendo el sistema inmunitario del huésped.

Los ejemplos de células que pueden implantarse, tal como se describe en el presente documento, incluyen condrocitos y otras células que forman cartílago, osteoblastos y otras células que forman hueso, miocitos, fibroblastos y células de órganos. Tal como se usa en el presente documento, “células de órganos” incluye hepatocitos, células de islotes, células de origen intestinal, células derivadas del riñón y otras células que actúan principalmente para sintetizar y secretar o para metabolizar materiales. Un tipo de célula preferido es una célula de islotes pancreáticos.

La matriz polimérica puede combinarse con factores humorales para fomentar el trasplante y el injerto de células. Por ejemplo, la matriz polimérica puede combinarse con factores angiogénicos, antibióticos, antiinflamatorios, factores de crecimiento, compuestos que inducen diferenciación y otros factores que conocen los expertos en la técnica de cultivo celular.

Por ejemplo, pueden mezclarse factores humorales en una forma de liberación lenta con la suspensión de célulasalginato antes del trasplante o de la formación del implante. Alternativamente, el hidrogel puede modificarse para unir los factores humorales o las secuencias de reconocimiento de señales antes de la combinación con la suspensión de células aisladas.

Las técnicas descritas en el presente documento pueden usarse para la administración de muchos tipos de células diferentes para lograr diferentes estructuras tisulares. En la realización preferida, se mezclan las células con la disolución de hidrogel y se inyectan directamente en un sitio en el que se desea implantar las células, antes de la solidificación del hidrogel. Sin embargo, la matriz también puede moldearse e implantarse en una o más áreas diferentes del cuerpo para adaptarse a una aplicación particular. Esta aplicación es particularmente relevante cuando se desea un diseño estructural específico o cuando el área en la que van a implantarse las células carece de estructura o soporte específico para facilitar el crecimiento y la proliferación de las células.

El sitio, o sitios, en el que van a implantarse las células se determina basándose en la necesidad individual, al igual que el número necesario de células. Para las células que tienen función orgánica, por ejemplo, hepatocitos o células de islotes, puede inyectarse la mezcla en el mesenterio, el tejido subcutáneo, el retroperitoneo, el espacio properitoneal y el espacio intramuscular. Para la formación de cartílago, se inyectan las células en el sitio en el que se desea la formación de cartílago. También puede aplicarse un molde externo para conformar la disolución inyectada. Además, controlando la velocidad de polimerización, es posible moldear el implante inyectado de células-hidrogel como si se moldeara arcilla. Alternativamente, puede inyectarse la mezcla en molde, permitir que solidifique el hidrogel, luego implantar el material.

B. Tratamiento de enfermedades o trastornos

Las células encapsuladas pueden trasplantarse a un paciente que lo necesita para tratar una enfermedad o un trastorno. En algunas realizaciones, las células encapsuladas se obtienen de un miembro genéticamente no idéntico de la misma especie. En realizaciones alternativas, las células encapsuladas se obtienen de una especie distinta del paciente. En realizaciones preferidas, las células secretoras de hormonas o proteínas se encapsulan y trasplantan a un paciente para tratar una enfermedad o un trastorno.

En realizaciones preferidas, la enfermedad o el trastorno está provocado por o implica la disfunción de las células secretoras de hormonas o proteínas en un paciente. En una realización preferida, la enfermedad o el trastorno es diabetes.

La presente invención se entenderá adicionalmente por referencia a los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplos

Ejemplo 1: síntesis combinatoria de alginatos químicamente modificados (referencia sólo)

Los parámetros determinados que rigen la biocompatibilidad del material se entienden escasamente. Por consiguiente, el diseño racional y la síntesis de alginatos modificados que presentan una biocompatibilidad mejorada es un desafío. En un esfuerzo por identificar alginatos modificados con biocompatibilidad y propiedades físicas mejoradas, se usó un enfoque combinatorio para preparar una biblioteca de alginatos modificados que presentan una gama de modificaciones covalentes.

1. Estrategia combinatoria general

Se seleccionaron como reactivos un conjunto de doce alcoholes, nueve aminas, dos aminas usadas para introducir un resto azida (una amina que contiene un resto azida y una amina que contiene un resto yoduro que va a convertirse en un resto azida tras la amidación) y diecinueve alquinos con una gama de diferentes estructuras químicas, hidrofobicidades/hidrofilicidades, potenciales de enlace de hidrógeno y estados de carga para la síntesis combinatoria de alginatos modificados. Con el conocimiento de que se ha demostrado que las impurezas presentes en los polímeros de alginato limitan la biocompatibilidad de los alginatos implantados, se seleccionó alginato de baja viscosidad ultrapuro (UPLVG, FMC Biopolymers) como material de partida para los experimentos de modificación.

Alcoholes usados como reactivos para la esterificación

Aminas usadas como reactivos para la amidación

Aminas usadas como reactivos para introducir restos azida

Alquinos usados como reactivos para la cidoadición 1,3-dipoIar

Se modificó covalentemente el polímero de alginato no modificado mediante reacción con uno, dos, o tres los ésteres, las aminas y/o los alquinos mostrados anteriormente de manera combinatoria. La figura 1 muestra la estructura general de los alginatos modificados obtenidos usando este método.

2. Condiciones de reacción representativas

Debido a la naturaleza paralela y combinatoria del procedimiento de modificación, se realizaron reacciones de síntesis usando un módulo de núcleo robótico. Se seleccionó el alginato UPLVG como material de partida para los experimentos de modificación. En la primera reacción combinatoria, se hizo reaccionar el alginato no modificado con uno de los alcoholes, las aminas y las aminas usadas para introducir un resto azida en presencia de 2-cloro-4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina (CDMT) y N-metilmorfolina (NMM). En una segunda etapa combinatoria, se hizo reaccionar cada uno de los polímeros de alginato modificados formados anteriormente con otro de los alcoholes, las aminas o las aminas usadas para introducir un resto azida en presencia de 2-cloro-4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina (CDMT) y N-metilmorfolina (NMM). En una etapa combinatoria final, se funcionalizaron adicionalmente todos los miembros de la biblioteca que se hicieron reaccionar con una amina usada para introducir un resto azida usando una reacción de cicloadición 1,3-dipolar. En primer lugar, se hicieron reaccionar con azida de sodio esos miembros de la biblioteca que se habían hecho reaccionar con 4-yodobencilamina para convertir los restos yoduro en restos azida. Posteriormente, se hicieron reaccionar todos los miembros de la biblioteca que se habían hecho reaccionar con una amina usada para introducir un resto azida con uno de los alquinos usados como reactivos para la cicloadición 1,3-dipolar en presencia de CuSO4/ascorbato de sodio.

Para optimizar la biocompatibilidad de los alginatos químicamente modificados, se desarrolló una metodología de purificación rigurosa para eliminar las impurezas potencialmente irritantes. Tras cada modificación covalente, se filtraron los alginatos modificados a través de una columna de sílice modificada con ciano con el objetivo de capturar las impurezas orgánicas en bruto. Finalmente, después de completar todas las etapas de modificación covalente, se sometieron a diálisis los alginatos modificados frente a una membrana de MWCO de 10.000 para retirar cualquier impureza de bajo peso molecular o de molécula pequeña restante.

Se determinó la pureza de los alginatos modificados mediante análisis por 1H-RMN. Se recopilaron los espectros de 1H-RMN de cada polímero de alginato modificado y se integraron los picos correspondientes al polímero de alginato modificado y a cualquier impureza para determinar la cantidad relativa de cada especie en la muestra.

Ejemplo 2: examen de alto rendimiento de alginatos modificados usando un ensayo de formación de hidrogel (referencia sólo)

La modificación covalente de los alginatos afecta a las propiedades físicas del alginato, incluyendo la capacidad del alginato para formar hidrogeles adecuados para la encapsulación de células y biomoléculas. Para eliminar los alginatos modificados que han perdido su capacidad para formar hidrogeles y centrar adicionalmente los esfuerzos de examen en los candidatos más fuertes, se usó un ensayo de reticulación basado en fluorescencia para cuantificar la capacidad de los alginatos modificados para formar hidrogeles.

El ensayo de formación de hidrogel descrito en el presente documento aprovecha la capacidad de los hidrogeles para atrapar compuestos fluorescentes y conservar diferencialmente los fluoróforos tras el lavado basándose en la estabilidad del hidrogel. Se disolvió en agua cada uno de los alginatos modificados preparados usando el enfoque combinatorio descrito en el ejemplo 1. Se añadió a cada muestra un colorante de rodamina que fluoresce a 580 nm. Luego se reticuló la muestra de alginato modificado mediante la adición de una sal de bario o calcio, por ejemplo, BaCl2, para inducir la formación de un hidrogel. Después de la incubación durante 10 minutos, se lavó repetidamente cada muestra con agua. Se midió la intensidad de fluorescencia de cada muestra usando un fluorímetro.

Se examinó cada alginato modificado tres veces y se promediaron los resultados obtenidos en los tres ensayos. Se compararon los valores de intensidad de fluorescencia promedio para cada alginato modificado con los niveles de fluorescencia del control negativo (agua) y alginato no modificado (UPLVG). Los alginatos modificados que dieron lugar a valores de fluorescencia inferiores al control negativo se consideraron inutilizables para aplicaciones en las que la formación de hidrogel es crítica (es decir, la encapsulación de células).

Ejemplo 3: examen in vitro de alginatos modificados para detectar la biocompatibilidad (referencia sólo)

Se evaluó la citotoxicidad de los polímeros de alginato modificados en células HeLa para examinar la biocompatibilidad in vitro. Se cargaron los alginatos modificados identificados en el ejemplo 2 como capaces de formar hidrogeles en pocillos de placas de 96 pocillos que se recubrieron con poli-L-lisina. También se cargaron como controles alginato no modificado y solución salina en los pocillos de placas de 96 pocillos que se recubrieron con poli-L-lisina. Se dispensó una disolución de reticulación de BaCh 100 mM en todos los pocillos de la placa de 96 pocillos. Luego se aspiró el exceso de agente reticulante. Se sembraron células HeLa en los pocillos y se incubaron durante 3 días a 37°C en una cámara humidificada.

Se realizó un ensayo de viabilidad celular usando bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT), en el que se aspiraron los medios de todos los pocillos y se añadieron 100 |il de medio DMEM sin rojo de fenol y 10 |il de MTT (5 mg/ml) a todos los pocillos de la placa de 96 pocillos. Se incubó la placa durante 4 horas a 37°C en una cámara humidificada. Después de la incubación, se aspiraron 85 |il de disolución y se añadieron 100 |il de DMSO. Se forman cristales de formazano de color violeta durante el ensayo en proporción al número de células HeLa viables presentes en cada pocillo. Se pipeteó hacia arriba y hacia abajo el contenido de cada pocillo para solubilizar los cristales de formazano antes de la medición. Se incubó la placa a 37°C durante 10 minutos, después de lo cual se eliminaron las burbujas de la agitación. Se leyó la placa usando un lector de placas UV/Vis a 540 nm con una referencia a 700 nm. Se normalizó la viabilidad a las células sembradas en pocillos sin alginato.

En la figura 3 se muestran los resultados de la viabilidad celular, que representa gráficamente el efecto de alginatos modificados seleccionados sobre la viabilidad de la línea de células HeLa en comparación con el control positivo (sin alginato). El alginato (Alg) tiene una viabilidad del 53%. El ensayo identificó polímeros de alginato modificados que mostraban una citotoxicidad disminuida en relación con el alginato no modificado. Estos se seleccionaron para su posterior análisis.

Ejemplo 4: examen in vivo de alto rendimiento de alginatos modificados para evaluar la biocompatibilidad

Los métodos de análisis de la biocompatibilidad actuales son lentos y requieren análisis histológico. Con el fin de examinar un gran número de alginatos modificados preparados usando los métodos de síntesis combinatoria descritos en el presente documento, se usó un ensayo de biocompatibilidad in vivo de alto rendimiento para evaluar la biocompatibilidad relativa de los polímeros de alginato.

1. Protocolo de examen in vivo de alto rendimiento

Se obtuvieron ratones SKH1 macho de 8-12 semanas de edad de Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Se mantuvieron los ratones en los animalarios del Instituto de Tecnología de Massachusetts, acreditado por la Asociación americana del bienestar de animales de laboratorio, y se alojaron en condiciones convencionales con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Se proporcionaron tanto agua como alimento a voluntad.

Se realizaron inyecciones según la norma ISO 10993-6: 2001. Antes de la inyección se esterilizaron todos los materiales mediante filtración de 0,22 |im. Se anestesiaron los ratones mediante inhalación de isoflurano a una concentración del 1-4% de isoflurano/parte restante O2 para minimizar el movimiento. Se realizó el lavado quirúrgico de sus lomos con alcohol isopropílico al 70% y se les inyectaron a los animales alginatos modificados en un formato en serie en el lomo del ratón para el examen de alto rendimiento. Se realizaron seis inyecciones en cada ratón, siendo una de las inyecciones un control de alginato no modificado. Los volúmenes de inyección eran de 100 |il.

Los días 1, 3, 7, 14, 21 y 28 tras la inyección, se obtuvieron imágenes cinéticas de la actividad de células huésped en respuesta a la implantación de alginatos modificados usando obtención de imágenes de fluorescencia de todo el animal. 24 horas antes de la obtención de imágenes de fluorescencia in vivo, se inyectaron 2 nmol de ProSense-680 (VisEn Medical, Woburn, MA, longitud de onda de excitación 680 ± 10 nm, emisión 700 ± 10 nm) disuelto en 150 |il de PBS estéril en la vena de la cola de cada ratón para obtener imágenes de la actividad de catepsina.

Se realizó obtención de imágenes de fluorescencia in vivo con un sistema de medición IVIS-Spectrum (Xenogen, Hopkinton, MA). Se mantuvieron los animales bajo anestesia inhalada usando el 1-4% de isoflurano en el 100% de oxígeno a una velocidad de flujo de 2,5 l/min. Se usaron un compartimento de 8 x 8 y un campo de visión de 13,1 cm para la obtención de imágenes. Se optimizaron el tiempo de exposición y el paso de luz (el tamaño relativo del orificio de la apertura) para cada imagen adquirida. Se adquirieron los datos y se analizaron usando el software Living Image 3.1 patentado del fabricante. Todas las imágenes se presentan en eficiencia de fluorescencia, que se define como la razón de la intensidad de fluorescencia recogida con respecto a un patrón interno de intensidad incidente en la configuración de obtención de imágenes seleccionada. Se designaron las regiones de interés (ROI) alrededor del sitio de cada inyección.

Se examinó la biocompatibilidad de los materiales a los 14 días tras la inyección. Se comparó la intensidad de fluorescencia medida en el sitio de implantación de alginatos modificados con la intensidad de fluorescencia medida en el sitio de implantación de un alginato no modificado. Los alginatos modificados que mostraron una intensidad de fluorescencia en el sitio de implantación menor que la intensidad de fluorescencia medida en el sitio de implantación de un alginato no modificado se caracterizaron como biocompatibles. Los alginatos modificados que mostraron una intensidad de fluorescencia en el sitio de implantación mayor que la intensidad de fluorescencia medida en el sitio de implantación de un alginato no modificado se caracterizaron como no biocompatibles.

Se evaluó la estabilidad in vivo de los geles de alginato a los 28 días tras la inyección. Los alginatos modificados que permanecieron en el sitio de inyección después de 28 días se caracterizaron como capaces de formar hidrogeles mecánicamente estables in vivo. Los alginatos modificados que no estaban presentes en el sitio de inyección después de 28 días se caracterizaron como incapaces de formar hidrogeles mecánicamente estables in vivo y se clasificaron como “fallos”.

Los alginatos modificados caracterizados como biocompatibles y capaces de formar hidrogeles mecánicamente estables in vivo se identificaron como “aciertos” y se seleccionaron para un estudio posterior.

2. Validación del protocolo de examen in vivo de alto rendimiento

Con el fin de validar el ensayo de examen in vivo de alto rendimiento descrito anteriormente, se inyectaron por vía subcutánea los alginatos modificados a ratones en un formato en serie y se reticularon in situ tal como se describió anteriormente. Se obtuvieron imágenes de los ratones los días 1, 3, 7, 14, 21 y 28 tras la inyección usando obtención de imágenes de fluorescencia de todo el animal, y se recogieron muestras de tejido después de la obtención de imágenes para su análisis histológico. Para obtener muestras de tejido para su análisis histológico, se sacrificaron los ratones mediante asfixia con CO2 y se extirparon el biomaterial inyectado y el tejido circundante. Luego se fijaron los tejidos en formalina al 10%, se incrustaron en parafina, se realizaron cortes de 5 |im y se tiñeron usando hematoxilina y eosina (H&E) para el análisis histológico por un patólogo certificado.

Se evaluó la fibrosis en una escala en la que un cero implicaba la ausencia de fibrosis, un uno indicaba cobertura parcial con de una a dos capas de fibrosis, un dos designaba una capa fibrótica más gruesa que casi cubría el implante y un tres indicaba una cobertura fibrótica concéntrica del polímero. Tanto las células polimorfonucleares (PMN) como los macrófagos se evaluaron en una escala en la que la ausencia de observación de células se indicaba con un cero, las células dispersadas se puntuaban con un uno, numerosas agrupaciones de células en los lados del polímero se puntuaban con un dos y numerosas células alrededor del material dieron como resultado un tres. Se examinaron tanto la puntuación histológica como la respuesta de fluorescencia normalizada con respecto al alginato para toda la biblioteca, y los materiales que superaron al alginato no modificado se consideraron biocompatibles. Esto corresponde a una señal de fluorescencia normalizada de <100% y a una puntuación de fibrosis <3.

Se demostró que los datos capturados usando obtención de imágenes de todo el animal presentaban tendencias temporales similares en el reclutamiento celular de fagocitos para los biomateriales en comparación con el análisis histológico. Por consiguiente, se validó el método de examen in vivo de alto rendimiento descrito anteriormente.

Ejemplo 5: examen in vivo de alginatos modificados para cuantificar la biocompatibilidad

Se obtuvieron ratones SKH1 macho de 8-12 semanas de edad de Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Se mantuvieron los ratones en los animalarios del Instituto de Tecnología de Massachusetts, acreditado por la Asociación americana del bienestar de animales de laboratorio, y se alojaron en condiciones convencionales con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Se proporcionaron tanto agua como alimento a voluntad.

Se realizaron inyecciones según la norma ISO 10993-6: 2001. Antes de la inyección se esterilizaron todos los materiales mediante filtración de 0,22 |im. Se anestesiaron los ratones mediante inhalación de isoflurano a una concentración del 1-4% de isoflurano/parte restante O2 para minimizar el movimiento. Se realizó el lavado quirúrgico de sus lomos con alcohol isopropílico al 70% y se les inyectó a los animales un alginato modificado. El volumen de inyección era de 100 |il.

Se midió la actividad de catepsina a los 7 días tras la inyección usando un ensayo de fluorescencia in vivo para cuantificar la respuesta a cuerpos extraños por parte del alginato modificado. 24 horas antes de la obtención de imágenes de fluorescencia in vivo, se inyectaron 2 nmol de ProSense-680 (VisEn Medical, Woburn, MA, longitud de onda de excitación 680 ± 10 nm, emisión 700 ± 10 nm) disuelto en 150 |il de PBS estéril en la vena de la cola de cada ratón para obtener imágenes de la actividad de catepsina.

Se realizó obtención de imágenes de fluorescencia in vivo con un sistema de medición IVIS-Spectrum (Xenogen, Hopkinton, MA). Se mantuvieron los animales bajo anestesia inhalada usando el 1-4% de isoflurano en el 100% de oxígeno a una velocidad de flujo de 2,5 l/min. Se usaron un agrupamiento de 8 x 8 y un campo de visión de 13,1 cm para la obtención de imágenes. Se optimizaron el tiempo de exposición y el paso de luz (el tamaño relativo del orificio de la apertura) para cada imagen adquirida. Se adquirieron los datos y se analizaron usando el software Living Image 3.1 comercial del fabricante. Todas las imágenes se presentan en eficiencia de fluorescencia, que se define como la razón de la intensidad de fluorescencia recogida con respecto a un patrón interno de intensidad incidente en la configuración de obtención de imágenes seleccionada. Se designaron las regiones de interés (ROI) alrededor del sitio de cada inyección.

Se capturaron imágenes de fluorescencia a los 7 días tras la inyección que ilustran la actividad de catepsina relativa en el punto de inyección de los alginatos modificados seleccionados. Se midió la intensidad de fluorescencia y se normalizó con respecto a la respuesta de fluorescencia medida usando alginato no modificado con el fin de cuantificar la biocompatibilidad de los alginatos modificados. En la figura 4 se incluyen los resultados obtenidos para los alginatos modificados seleccionados.

Ejemplo 6: tratamiento de diabetes en ratones con diabetes inducida por STZ (referencia sólo)

El trasplante de células beta encapsuladas con alginato biocompatible ofrece potencial como tratamiento para la diabetes. Se encapsularon células de islotes pancreáticos de rata usando catorce polímeros de alginato modificados biocompatibles identificados usando los ensayos detallados anteriormente (incluyendo PF_N287_B_B4, PF_N287_F2, PF_N287_G3, PF_N287_B3, PF_N287_B_B8, PF_N287_A4, PF_N287_B1, PF_N287_E3, PF_N263_C12, PF_N63_A12, PF_N287_E1, PF_N287_D3, PF_N263_A7 y PF_N263_C6). Se fabricaron cápsulas de islotes encapsulados con alginato a partir de 750 |il de una disolución al 4% (p/v) de cada alginato modificado en agua desionizada que contenía 1.000 islotes suspendidos usando el encapsulador Inotech (Inotech) ajustado a una tensión de 1,05 kV, una vibración de 1225 Hz y una velocidad de flujo de 10-25 ml/min con una boquilla de 300 |im. Se reticuló el alginato en una disolución de BaCh 20 mM. Después de la encapsulación, se lavaron las cápsulas dos veces con disolución HEPES, cuatro veces con disolución Krebs y dos veces con medio RPMl-1640.

Se trasplantaron las células de islotes de rata encapsuladas a ratones con diabetes inducida por STZ. Antes del trasplante, se anestesiaron los ratones bajo un flujo continuo del 1-4% de isoflurano con oxígeno a 0,5 l/min. Se usará una afeitadora con una cuchilla de corte de tamaño n.° 40 para retirar el pelo y revelar un área de aproximadamente 2 cm x 2 cm en la línea central ventral del abdomen del animal. Se preparó de manera aséptica toda el área afeitada con un mínimo de 3 ciclos de lavado quirúrgico con Povidine, seguido de aclarado con alcohol al 70%. También se aplicó una pintura cutánea final con Povidine. Se cubrió el sitio quirúrgico con papel desechable estéril para evitar que el pelo circundante tocara el sitio quirúrgico. Se usó un bisturí afilado para realizar una incisión en la línea central de 0,5-0,75 cm a través de la piel y la línea alba en el abdomen. Se usó una pipeta de plástico estéril para transferir las microcápsulas de alginato a la cavidad peritoneal. Se cerró el músculo abdominal mediante sutura con seda negra 5­ 0 Ethicon o hilo absorbible monofilamentoso PDS 5,0-6,0. Se cerró la capa externa de la piel usando grapas para heridas. Se retiraron estas grapas para heridas a los 7-10 d tras la cirugía después de que se confirmara la cicatrización completa.

Se monitorizaron diariamente las glucemias en los ratones con diabetes inducida por STZ durante entre 20 y 30 días tras el trasplante usando una gota de sangre obtenide mediante el lavado quirúrgico de la cola con alcohol isopropílico al 70% y realizando un corte superficial en la piel de la cola para producir una gota de sangre. Se sujetaron los ratones durante la toma de muestras en un inyector de cola giratorio.

En la figura 5 se muestran las glucemias en los ratones con diabetes inducida por STZ tras el trasplante de islotes. La línea negra discontinua representa normoglucemia en los ratones. Las células de islotes pancreáticos de rata que se encapsularon en alginatos modificados fueron capaces de reducir las glucemias en todos los casos y, en algunos casos, fueron capaces incluso de inducir normoglucemia.

Ejemplo 7: partículas preparadas a partir de la mezcla de alginato(s) modificado(s) y alginato no modificado (referencia sólo)

Se ha aplicado el creciente reconocimiento de los parámetros que impulsan la fibrosis in vivo al análisis del rendimiento de los alginatos modificados. La implantación intraperitoneal (i.p.) de cápsulas de alginato modificado reveló que los alginatos modificados pueden dar como resultado cápsulas con forma anómala cuando se reticulan usando condiciones definidas para los alginatos no modificados. Estas cápsulas con forma anómala pueden complicar la implementación y la interpretación de las cápsulas de alginato modificado implantadas por vía i.p. En un esfuerzo por mejorar la morfología de las cápsulas, se desarrollaron métodos de formulación para su uso con micropartículas de alginato modificado, en los que se mezclaron alginatos modificados con una pequeña cantidad de alginato de alto peso molecular. Las partículas preparadas a partir de esta mezcla dieron lugar a partículas con morfología y estabilidad mejoradas.

Se combinó 1:1 en volumen una disolución al 6% de alginato modificado (p/p) con una disolución al 1,15% de alginato no modificado (p/p). Después del mezclado, se forman cápsulas haciendo pasar esta disolución a través de un generador electrostático de gotas, seguido de la reticulación del polímero en una disolución acuosa de cloruro de bario 20 mM.

Se compararon las partículas preparadas a partir de micropartículas de alginato modificado 263_A12 formuladas con bario y manitol con las partículas preparadas a partir de 263_A12 mezclado con una pequeña cantidad de alginato SLG100 no modificado (16% en peso). Las partículas preparadas a partir de una mezcla de alginato modificado y alginato no modificado produjeron poblaciones de micropartículas más homogéneas. Se realizó un análisis de fluorescencia cuantitativo con Prosense en varios puntos de tiempo con alginatos modificados mezclados con SLG100. En la figura 6 se muestran los resultados. Varios alginatos modificados reformulados mostraron una menor respuesta inflamatoria el día 7 en comparación con el alginato de control. Los experimentos iniciales con cápsulas grandes (1,5 mm de diámetro) muestran cápsulas comparablemente limpias después de 2 semanas en el espacio i.p. de ratones C57BL6 inmunocompetentes.

Los datos recopilados hasta la fecha con estas cápsulas controladas indican que la reformulación y la morfología de las cápsulas pueden tener un efecto significativo sobre la inflamación, tal como se mide mediante Prosense. Se observa una respuesta inflamatoria mejorada en algunos polímeros (figura 6), mientras que otros se ven afectados negativamente.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   Alginato modificado de manera singular que comprende uno o más monómeros covalentemente modificados definidos por la fórmula I

   

   en la que,

   X es NR,

   R¹ incluye un anillo de 1,2,3-triazol o un grupo alquino;

   Y¹ e Y² son independientemente hidrógeno o -PO(OR)² , o

   Y² está ausente, e Y² junto con los dos átomos de oxígeno a los que Y¹ e Y² están unidos forman una estructura cíclica tal como se muestra a continuación

   

   y

   R² y R³ son, independientemente, hidrógeno, grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, carbonilo, carbonilo sustituido, carboxilo, carboxilo sustituido, amino, amino sustituido, amido, amido sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C³-C²⁰, cíclico C³-C²⁰ sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), peptídico o polipeptídico;

   o

   R² y R³ , junto con el átomo de carbono al que están unidos, forman un anillo carbocíclico o heterocíclico sustituido o no sustituido de 3 a 8 miembros; y

   R es, independientemente en cada aparición, hidrógeno, grupo alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, alcoxilo, alcoxilo sustituido, aroxilo, aroxilo sustituido, alquiltio, alquiltio sustituido, ariltio, ariltio sustituido, poliarilo, poliarilo sustituido, cíclico C³-C²⁰, cíclico C³-C²⁰ sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, aminoácido, poli(etilenglicol), peptídico o polipeptídico.

   Alginato modificado según la reivindicación 1, en el que Y¹ e Y² son cada uno hidrógeno y X es NH.

   Alginato modificado según la reivindicación 1 ó 2, en el que R¹ comprende un anillo de 1,2,3-triazol obtenido mediante una reacción de cicloadición 1,3-dipolar en la que una primera molécula que contiene un resto azida se hace reaccionar con una segunda molécula que contiene un alquino terminal o interno.

   Alginato modificado según la reivindicación 3, en el que el alquino en la cicloadición 1,3-dipolar se selecciona de:

   

   Alginato modificado según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 4, en el que

   R1 es

   

   R4 es

   

   o

   y en el que Y1 e Y2 son cada uno hidrógeno y X es NH.

   Alginato modificado según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que

   R1 es

   

   y R4 es

   

   o

   y en el que Yi e Y2 son cada uno hidrógeno y X es NH.

   7. Alginato modificado según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en el que dicho monómero está definido por la fórmula E

   o

   

   en las que X1 se deriva de un alquino seleccionado de:

   

   8. Alginato modificado según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en el que más del 20% de los monómeros en el alginato modificado comprenden monómeros covalentemente modificados.

   9. Alginato modificado según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, en el que el alginato modificado tiene un peso molecular promedio en peso entre aproximadamente 10.000 Da y 500.000 Da.

   10. Hidrogel que comprende un alginato modificado según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9, en el que el alginato modificado puede reticularse iónicamente usando Ca2+, Ba2+ o Sr2+.

   11. Hidrogel según la reivindicación 10, que comprende además un polímero seleccionado del grupo que consiste en poli(etilenglicol), quitosano, dextrano, ácido hialurónico, seda, fibrina, poli(alcohol vinílico) y poli(metacrilato de hidroxietilo).

   12. Material biológico encapsulado con un hidrogel según la reivindicación 10 u 11, mediante el cual el material encapsulado es para su implantación o trasplante a un paciente humano o animal para tratar una enfermedad o un trastorno en el paciente humano o animal.

   13. Material biológico según la reivindicación 12, en el que el hidrogel comprende una microcápsula.

   14. Material biológico según la reivindicación 12 ó 13, en el que el hidrogel comprende una mezcla del alginato modificado y un alginato no modificado.

   15. Material biológico según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que el material biológico son células.