CN103012554B

CN103012554B - 氢化可的松-rgd多肽缀合物，其制备方法及应用

Info

Publication number: CN103012554B
Application number: CN201210539716.XA
Authority: CN
Inventors: 彭师奇; 赵明; 梅升辉; 闫庆连
Original assignee: SHANDONG BAYONN PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHANDONG HUA PLATINUM KASEN BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO., LTD.
Priority date: 2012-12-13
Filing date: 2012-12-13
Publication date: 2014-05-21
Anticipated expiration: 2032-12-13
Also published as: CN103012554A

Abstract

本发明涉及如通式i所示的氢化可的松-RGD多肽缀合物，其制备方法及应用。通式i中，RGDX为四肽Arg-Gly-Asp-X，X=Val，Phe，Ser三种氨基酸中的任意一种。本发明通过实验证明：本发明的化合物具有优秀的免疫抑制作用和抗炎作用，并且骨质疏松副作用降低。临床上可作为低骨质疏松副作用的免疫抑制剂和抗炎剂。同时，本发明的氢化可的松-RGD多肽缀合物在水溶液中均能自组装成粒径稳定在200-700nm的纳米球，因此可以制备成免疫抑制药质体、微乳或脂质体靶向药物。

Description

氢化可的松-RGD多肽缀合物,其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及氢化可的松-RGD多肽缀合物，其制备方法及应用，属于生物医药领域。

背景技术

数千年前，人们就曾设想用正常的器官组织来置换病变的器官组织，但20世纪前的移植除角膜移植外，大部分是失败的。直到20世纪40年代，英国外科医生Mdewaar应用家兔皮肤移植的实验模型，初次论证了器官组织移植中出现的排斥反应本质上是一种免疫应答反应，从而奠定了移植免疫学的基础。80年代以后，有效的免疫抑制剂如环抱素A及FK506等的发现及应用，使移植器官的存活时间进一步延长，但是由于临床用药普遍存在易降解，生物利用度低，脂溶性差，难以透过生物膜等缺点，所以亟待研究药剂纳米包材去改善这些不足之处。

两亲性化合物因其能自组装成明确的纳米纤维结构而受到广泛重视，从纳米技术到组织工程，在许多领域得到应用。而且由于两亲性化合物化学结构的多样性和易于合成，必将成为生物医药和生物材料领域新的研究热点。

氢化可的松作为免疫抑制剂在临床上已经广泛使用，但其具有骨质疏松等一系列副作用，基于甾体和多肽缀合后的缀合激素具有允许效应，可以增强甾体激素的活性，并且这种修饰可能得到活性更好，毒性更低的新化合物，发明人提出本发明。

发明内容

本发明的第一个目的是，提供通式i的3种氢化可的松-RGD多肽缀合物。

其中，RGDX为四肽Arg-Gly-Asp-X，所述X=Val，Ser，Phe三种氨基酸中的任意一种，X=Val时为化合物4a，X=Ser时为化合物4b，X=Phe时为化合物4c。

本发明的第二个目的是，提供通式i的3种氢化可的松-RGD多肽缀合物的制备方法，通式i的氢化可的松-RGD多肽缀合物合成中四肽的合成路线如下所示（以X=Val为例）

上述合成路线中，i)DCC，NMM，HOBt；ii)CH₃OH，2N NaOH；iii)4N HCl/EtOAc；iv)CF₃COOH，TFMSA。

通式i的3种氢化可的松-RGD多肽缀合物的合成路线如下所示：

上述合成路线中，i)丁二酸酐，DMAP；ii)EDC·HCl，HOSu；iii)DMF，H₂O，NMM，RGDV/F/S。

其制备方法，具体包括以下步骤：

(1)在无水THF（四氢呋喃）中，在DCC（N,N-二环己基碳二亚胺）、HOBt（1-羟基苯并三唑）和N-甲基吗啉存在下将N-叔丁氧羰基-硝基精氨酸与甘氨酸苄酯或其盐（优选其对甲苯磺酸盐）缩合，生成N-叔丁氧羰基-硝基精氨酰甘氨酸苄酯；

(2)在冰水浴中，在2N的NaOH存在下将N-叔丁氧羰基-硝基精氨酰甘氨酸苄酯脱除苄酯保护基，生成N-叔丁氧羰基-硝基精氨酰甘氨酸；

(3)在无水THF中，在DCC、HOBt和N-甲基吗啉存在下将N-叔丁氧羰基-苄基天冬氨酸与缬氨酸苄酯或其盐（优选其对甲苯磺酸盐）或苯丙氨酸苄酯或其盐（优选其对甲苯磺酸盐）或丝氨酸-苄醚苄酯或其盐（优选其盐酸盐）缩合，生成N-叔丁氧羰基-苄基天冬氨酰缬氨酸苄酯或N-叔丁氧羰基-苄基天冬氨酰苯丙氨酸苄酯或N-叔丁氧羰基-苄基天冬氨酰丝氨酸苄醚苄酯；

(4)在氯化氢-乙酸乙酯中将N-叔丁氧羰基-苄基天冬氨酰缬氨酸苄酯或N-叔丁氧羰基-苄基天冬氨酰苯丙氨酸苄酯或N-叔丁氧羰基-苄基天冬氨酰丝氨酸苄醚苄酯脱除叔丁氧羰保护基，生成苄基-天冬氨酰缬氨酸苄酯或苄基-天冬氨酰苯丙氨酸苄酯或苄基-天冬氨酰丝氨酸苄醚苄酯的盐酸盐；

(5)在无水THF中，在DCC、HOBt和N-甲基吗啉存在下将N-叔丁氧羰基-硝基精氨酰甘氨酸与苄基-天冬氨酰缬氨酸苄酯或苄基-天冬氨酰苯丙氨酸苄酯或苄基-天冬氨酰丝氨酸苄醚苄酯的盐酸盐缩合，生成N-叔丁氧羰基-硝基精氨酰甘氨酰-苄基天冬氨酰缬氨酸苄酯或N-叔丁氧羰基-硝基精氨酰甘氨酰苄基-天冬氨酰苯丙氨酸苄酯或N-叔丁氧羰基-硝基精氨酰甘氨酰-苄基天冬氨酰丝氨酸苄醚苄酯；

(6)在三氟醋酸-三氟甲磺酸存在下将N-叔丁氧羰基-硝基精氨酰甘氨酰-苄基天冬氨酰缬氨酸苄酯或N-叔丁氧羰基-硝基精氨酰甘氨酰苄基-天冬氨酰苯丙氨酸苄酯或N-叔丁氧羰基-硝基精氨酰甘氨酰-苄基天冬氨酰丝氨酸苄醚苄酯脱除叔丁氧羰基、苄基、苄醚和硝基，生成精氨酰甘氨酰天冬氨酰缬氨酸或精氨酰甘氨酰天冬氨酰苯丙氨酸或精氨酰甘氨酰天冬氨酰丝氨酸。

(7)在无水四氢呋喃中，在丁二酸酐和二甲氨基吡啶存在下，将氢化可的松的21位羟基酯化生成氢化可的松-21-丁二酸单酯。

(8)在无水四氢呋喃中，在HCl-EDC[1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐]存在下，将N-羟基琥珀酰亚胺和氢化可的松-21-丁二酸单酯成酯，得到氢化可的松-21-丁二酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯。

(9)在二甲基甲酰胺，N-甲基吗啉和水存在下，将氢化可的松-21-丁二酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯与精氨酰甘氨酰天冬氨酰缬氨酸、精氨酰甘氨酰天冬氨酰苯丙氨酸或精氨酰甘氨酰天冬氨酰丝氨酸避光反应，生成氢化可的松-21-丁二酰-精氨酰甘氨酰天冬氨酰缬氨酸、氢化可的松-21-丁二酰-精氨酰甘氨酰天冬氨酰苯丙氨酸或氢化可的松-21-丁二酰-精氨酰甘氨酰天冬氨酰丝氨酸。

本发明的第三个目的是，评价通式i的3种氢化可的松-RGD多肽缀合物对小鼠脾淋巴细胞丝裂原增殖反应的抑制作用。

本发明的第四个目的是，评价通式i的3种氢化可的松-RGD多肽缀合物对小鼠耳后心肌组织移植的存活时间，并考察化合物对小鼠骨密度，骨矿含量，骨钙含量，骨磷含量的影响。

本发明的第五个目的是，评价通式i的3种氢化可的松-RGD多肽缀合物对二甲苯致炎模型小鼠耳肿胀度的影响。

本发明的第六个目的是，评价通式i的3种氢化可的松-RGD多肽缀合物的自组装性能。

实验结果表明，本发明的3种氢化可的松-RGD多肽缀合物具有优秀的免疫抑制作用和抗炎作用，并且骨质疏松副作用降低，临床上可作为免疫抑制剂和抗炎剂应用。

附图说明

图1为化合物1，4a-c对二甲苯致炎小鼠耳肿胀度的影响。其中n=12，口服给药，1，4a-c的剂量=41.4μmol/kg/day。a)与NS比较，p<0.001，与1比较p<0.01；b)与NS比较p<0.001，与1比较p<0.05；c)与NS比较p<0.05。

图2为化合物4b对二甲苯致炎小鼠耳肿胀度的影响-量效关系实验。其中n=12，口服给药，4b高剂量=41.4μmol/kg/day，4b中剂量=4.14μmol/kg/day，4b低剂量=0.414μmol/kg/day。a)与NS比较，p<0.001，与1比较，p>0.05，与4b高剂量比较，p<0.05；b)与NS比较，p>0.05，与1比较，p<0.05，与4b中剂量比较，p<0.05；c)与NS比较，p<0.05，与1比较，p<0.05，与4b中剂量比较，p<0.05；d)与NS比较，p<0.05。

图3为化合物4a-c在水中自组装的纳米球粒径。

图4为4b在水溶液中形成的纳米球的代表性透射电镜照片。

图5为4a-c在水中自组装的Zeta电位值。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1 制备Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl

800mg（2.5mmol）Boc-Arg(NO₂)-OH溶于适量无水THF，冰浴下加入338mg（2.5mmol）HOBt和619mg（3.0mmol）DCC的无水THF溶液。反应20分钟，得对应的活泼酯，直接用于下面的反应。

775mg（2.3mmol）Tos·Gly-OBzl和230mg（2.3mmol）N-甲基吗啉与适量无水THF混溶，加入上面的反应液，室温反应24小时。TLC（CH₂Cl₂：MeOH＝20：1）显示原料点消失。旋干溶剂，加入150ml乙酸乙酯，用饱和NaHCO₃30ml×3，饱和氯化钠水溶液30ml×3，饱和KHSO₄30ml×3，饱和氯化钠水溶液30ml×3洗涤后，乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥，旋干得标题化合物1.28g（94%），为白色固体，ESI-MS(m/z)：468[M+H]⁺。

实施例2 制备Boc-Arg(NO₂)-Gly

1.167g（2.5mmol）Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl溶于适量无水CH₃OH，冰浴下加入2.5ml（5mmol）2NNaOH水溶液。反应30分钟，TLC（CH₂Cl₂：MeOH＝20：1）显示原料点消失，加入饱和KHSO₄调节pH-7，旋干甲醇，加入饱和KHSO₄调节pH-2，用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥，过滤旋干，得到1.075g，收率（90%），直接用于下面的反应。

实施例3 制备Boc-Ser(Bzl)-OBzl

739mg（2.5mmol）Boc-Ser(Bzl)-OH溶于10ml无水乙醇，加入405mg（1.25mmol）Cs₂CO₃的水溶液，室温反应15分钟，TLC（乙酸乙酯：石油醚＝1：1）显示原料点消失。减压浓缩除去溶剂，得对应的铯盐Boc-Ser(Bzl)OCs。将得到的铯盐先溶于2ml无水DMF，再往里加0.3ml（2.5mmol）溴苄。反应混合物于55-60°C搅拌4h，TLC（CHCl₃：MeOH＝30：1）显示Boc-Ser(Bzl)的铯盐消失。反应混合物减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，滤除不溶物。滤液依次用饱和NaHCO₃30ml×3和饱和氯化钠水溶液30ml×3洗涤。乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液37°C减压浓缩，得到873mg（90.6%）标题化合物，为无色油状物。ESI-MS(m/z)386[M+H]⁺。

实施例4 制备HCl·Ser(Bzl)-OBzl

962mg（2.5mmol）Boc-Ser(Bzl)-OBzl溶于6ml乙酸乙酯，加入约10ml4N无水氯化氢-乙酸乙酯溶液（自制），冰浴下搅拌2小时，TLC（CHCl₃：MeOH＝20：1）显示原料点消失。抽干溶剂，残留物用甲醇/无水乙醚结晶，得标题化合物，直接用于下步反应。

实施例5 制备Boc-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl

807mg（2.5mmol）Boc-Asp(OBzl)溶于适量无水THF，冰浴下加入338mg（2.5mmol）HOBt和619mg（3.0mmol）DCC的无水THF溶液。反应20分钟，得对应的活泼酯，直接用于下面的反应。

742mg（2.3mmol）HCl·Ser(Bzl)-OBzl和230mg（2.3mmol）N-甲基吗啉与适量无水THF混溶，加入上面的反应液，室温反应24小时。TLC（CHCl₃：MeOH＝20：1）显示原料点消失。旋干溶剂，加入150ml乙酸乙酯，用饱和NaHCO₃30ml×3，饱和氯化钠水溶液30ml×3，饱和KHSO₄30ml×3，饱和氯化钠水溶液30ml×3洗涤后，乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥，旋干得标题化合物1.28g（94%），为白色固体，ESI-MS(m/z)：592[M+H]⁺。

实施例6 制备HCl·Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl

1.477g（2.5mmol）Boc-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl溶于适量乙酸乙酯，加入约15ml4N无水氯化氢-乙酸乙酯液（自制），室温搅拌2小时，TLC（展开剂CHCl₃：MeOH＝20：1）显示原料点消失。抽干溶剂，残留物用甲醇/无水乙醚析晶，得标题化合物1.277g，收率（97%），ESI-MS(m/z)：492[M+H]⁺

实施例7 制备Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl

1195mg（2.5mmol）Boc-Arg(NO₂)Gly溶于适量无水THF，冰浴下加入338mg（2.5mmol）HOBt和620mg（3.0mmol）DCC的无水THF溶液。反应20分钟，得对应的活泼酯，直接用于下面的反应。

1317mg（2.3mmol）HCl·Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl和230mg（2.3mmol）N-甲基吗啉与适量无水THF混溶，加入上面的反应液，室温反应24小时。TLC（CH₂Cl₂：MeOH＝20：1）显示原料点消失。旋干溶剂，加入150ml乙酸乙酯，用饱和NaHCO₃30ml×3，饱和氯化钠水溶液30ml×3，饱和KHSO₄30ml×3，饱和氯化钠水溶液30ml×3洗涤后，乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥，旋干得标题化合物2.115g（90%），为白色固体，ESI-MS(m/z)：941[M+H]⁺。

实施例8 制备Arg-Gly-Asp-Ser

941mg（1.0mmol）BocArg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-OBzl溶于3ml三氟醋酸，冰浴下加入1ml三氟甲磺酸。反应20分钟，TLC（CH₂Cl₂：MeOH＝10：1）显示原料点消失。加入80ml无水乙醚，析出大量白色粉末，过滤，得到的白色粉末抽干溶剂，溶解在1ml水中，用1/4的浓氨水调节pH-8，过滤，得到的溶液用Sephadex G10脱盐，得到标题化合物350mg，收率（81%），ESI-MS(m/z)：432[M-H]^-。

实施例9 制备Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl

947mg（2.3mmol）Tos·Val-OBzl和230mg（2.3mmol）N-甲基吗啉与适量无水THF混溶，加入上面的反应液，室温反应24小时。TLC（CHCl₃：MeOH＝20：1）显示原料点消失。旋干溶剂，加入150ml乙酸乙酯，用饱和NaHCO₃30ml×3，饱和氯化钠水溶液30ml×3，饱和KHSO₄30ml×3，饱和氯化钠水溶液30ml×3洗涤后，乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥，旋干得标题化合物1.28g（94%），为白色固体，ESI-MS(m/z)：510[M+H]⁺。

实施例10 制备HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl

1.272g（2.5mmol）Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl溶于适量乙酸乙酯，加入约15ml4N无水氯化氢-乙酸乙酯液（自制），室温搅拌2小时，TLC（展开剂CH₂Cl₂：MeOH＝20：1）显示原料点消失。抽干溶剂，残留物用甲醇/无水乙醚析晶，得标题化合物1.00g，收率（92%），ESI-MS(m/z)：410[M+H]⁺。

实施例11 制备Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl

1087mg（2.3mmol）HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl和230mg（2.3mmol）N-甲基吗啉与适量无水THF混溶，加入上面的反应液，室温反应24小时。TLC（CH₂Cl₂：MeOH＝20：1）显示原料点消失。旋干溶剂，加入150ml乙酸乙酯，用饱和NaHCO₃30ml×3，饱和氯化钠水溶液30ml×3，饱和KHSO₄30ml×3，饱和氯化钠水溶液30ml×3洗涤后，乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥，旋干得标题化合物1.925g（89%），为白色固体，ESI-MS(m/z)：863[M+H]⁺。

实施例12 制备Arg-Gly-Asp-Val

方法与Arg-Gly-Asp-Ser的制备相同，得到301mg(68%)ESI-MS(m/z)：444[M–H]^-。

实施例13 制备Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl

1067mg（2.3mmol）Tos·Phe-OBzl和230mg（2.3mmol）N-甲基吗啉与适量无水THF混溶，加入上面的反应液，室温反应24小时。TLC（CHCl₃：MeOH＝20：1）显示原料点消失。旋干溶剂，加入150ml乙酸乙酯，用饱和NaHCO₃30ml×3，饱和氯化钠水溶液30ml×3，饱和KHSO₄30ml×3，饱和氯化钠水溶液30ml×3洗涤后，乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥，旋干得标题化合物1.28g（92%），为白色固体，ESI-MS(m/z)：558[M+H]⁺。

实施例14 制备HCl·Asp(OBzl)-Phe-OBzl

1.395g（2.5mmol）Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl溶于适量乙酸乙酯，加入约15ml4N无水氯化氢-乙酸乙酯液（自制），室温搅拌2小时，TLC（展开剂CH₂Cl₂：MeOH＝20：1）显示原料点消失。抽干溶剂，残留物用甲醇/无水乙醚析晶，得标题化合物1.171g，收率（95%），ESI-MS(m/z)：458[M+H]⁺

实施例15 制备Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl

1195mg（2.5mmol）Boc-Arg(NO₂)-Gly溶于适量无水THF，冰浴下加入338mg（2.5mmol）HOBt和620mg（3.0mmol）DCC的无水THF溶液。反应20分钟，得对应的活泼酯，直接用于下面的反应。

1232mg（2.3mmol）HCl·Asp(OBzl)-Phe-OBzl和230mg（2.3mmol）N-甲基吗啉与适量无水THF混溶，加入上面的反应液，室温反应24小时。TLC（CH₂Cl₂：MeOH＝20：1）显示原料点消失。旋干溶剂，加入150ml乙酸乙酯，用饱和NaHCO₃30ml×3，饱和氯化钠水溶液30ml×3，饱和KHSO₄30ml×3，饱和氯化钠水溶液30ml×3洗涤后，乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥，旋干得标题化合物2.004g（88%），为白色固体，ESI-MS(m/z)：911[M+H]⁺。

实施例16 制备Arg-Gly-Asp-Phe

合成方法与Arg-Gly-Asp-Ser的制备相同，得320mg(65%)ESI-MS(m/z)：492[M–H]^-。

实施例17 制备氢化可的松丁二酸酯

氢化可的松3.63g(10mmol)，在1.46g(12mmol)DMAP存在下与1.3g(13mmol)丁二酸酐在150ml THF中避光反应，48小时后点板(CH₂Cl₂：CH₃OH=20：1加3滴HOAC)，原料完全消失。加入30ml H₂O后，旋干THF，加入KHSO₄调节pH-2，析出大量白色固体，过滤后用丙酮/石油醚结晶得到白色固体4.41g，收率95.5%.ESI/MS(m/z)461[M-H]^-，¹HNMR(BHSC-300，DMSO-d₆)：δ/ppm=12.20(s，1H)，5.56(s，1H)，5.42(s，1H)，5.10(d，J=17.7Hz，1H)，4.76(d，J=17.7Hz，1H)，4.37(m，1H)，4.27(s，1H)，2.60(s，2H)，2.39(m，3H)，2.16(m，3H)，1.94(m，3H)，1.78(m，1H)，1.67(m，3H)，1.45(m，1H)，1.37(s，3H)，1.28(m，1H)，0.99(m，1H)，0.87(m，1H)，0.76(s，3H).¹³C NMR(BHSC-75，DMSO-d₆)：δ/ppm=205.64，198.66，173.67，172.93，172.10，121.93，89.09，68.05，66.80，55.98，52.04，47.27，34.50，33.91，33.52，33.22，31.84，31.57，29.07，23.74，21.21，17.03。

实施例18 制备氢化可的松丁二酸-OSu

氢化可的松丁二酸酯4.62g(10mmol)，在2.50g(13mmol)HCl-EDC存在下与1.50g(13mmol)N-羟基琥珀酰亚胺在100ml THF和10ml DMF的溶剂中避光反应，24小时后点板(CH₂Cl₂：CH₃OH=20：1加3滴HOAC)，原料完全消失。旋干THF，加入乙酸乙酯150ml，用饱和NaHCO₃20ml×3洗涤，然后用NaCl20ml×2洗涤，再用饱和KHSO₄20ml×3洗涤，然后用NaCl20ml×2洗涤，用无水硫酸钠干燥4小时后，过滤，旋干，柱层析（石油醚/丙酮）得到标题化合物4.83g白色固体，收率86.4%.ESI/MS(m/z)582[M+Na]⁺，¹H NMR(BHSC-300，DMSO-d₆)：δ/ppm=5.57(s，1H)，5.44(s，1H)，5.16(d，J=17.7Hz，1H)，4.78(d，J=17.7Hz，1H)，4.38(m，1H)，4.27(s，1H)，2.97(t，J=6.0Hz，2H)，2.81(m，6H)，2.39(m，2H)，2.16(m，2H)，1.93(m，3H)，1.80(m，1H)，1.66(m，3H)，1.48(m，1H)，1.37(s，3H)，1.28(m，1H)，0.99(m，1H)，0.87(m，1H)，0.77(s，3H).¹³C NMR(BHSC-75，DMSO-d₆)：δ/ppm=205.47，198.53，172.79，171.06，170.55，168.68，121.96，89.08，68.31，66.78，65.39，55.98，52.05，47.30，34.51，33.93，33.57，33.24，31.84，31.59，31.15，28.35，26.16，25.90，23.77。

实施例19 氢化可的松-RGD缀合物的合成通法

氢化可的松丁二酸-OSu782mg(1.4mmol)，用20ml DMF溶解后，加入10ml H₂O，然后加入RGDV（Arg-Gly-Asp-Ser、Arg-Gly-Asp-Val或Arg-Gly-Asp-Phe），NMM调节pH-8，避光反应，48小时后点板(CH₃OH加3滴HOAC)，原料基本消失。吹干溶剂，用甲醇20ml×5将化合物溶解出来，旋干后得到白色固体，用乙醚：丙酮=5：120ml×6泡洗固体，然后用大板分离得到。

实施例20 制备氢化可的松-RGDV(4a)

按照实施例19的方法，收率：300mg(34%).Mp159-163°C；ESI/MS(m/z)889[M-H]^-.

IR(KBr)：3363，2938，1661，1405，1273，1114，1047，867，655，612，458cm^-1；¹H NMR(BHSC-300，DMSO-d₆)：δ/ppm=10.22(m，1H)，8.90(d，J=7.5Hz，1H)，8.52(m，1H)，8.15(d，J=6.0Hz，1H)，7.03(m，3H)，5.57(s，1H)，5.41(s，1H)，5.09(d，J=17.7Hz，1H)，4.76(d，J=17.7Hz，1H)，4.35(s，2H)，4.27(s，2H)，4.35(t，J=6.9Hz，1H)，3.93(dd，J=17.1Hz，J=6.0Hz，1H)，3.53(dd，J=16.8Hz，J=4.2Hz，1H)，3.15(m，2H)，2.97(m，1H)，2.58(m，3H)，2.35(m，6H)，2.18(m，2H)，1.95(m，4H)，1.79(t，J=12.0Hz，1H)，1.62(m，7H)，1.37(s，3H)，1.28(m，1H)，0.99(m，1H)，0.82(m，8H)，0.77(s，3H).¹³C NMR(BHSC-75，DMSO-d₆)：δ/ppm=205.70，198.53，173.70，172.81，172.32，171.21，170.84，169.10，157.79，121.96，89.09，67.93，66.82，65.37，58.02，55.99，52.71，52.04，50.45，47.27，42.77，39.42，34.52，33.54，33.25，31.84，31.59，31.04，30.34，29.22，23.75，20.96，19.53，18.27，17.06，15.63.

实施例21 制备氢化可的松-RGDS(4b)

按照实施例19的方法，收率：306mg(35%).Mp184–187°C；ESI/MS(m/z)877[M–H]^-.IR(KBr)：3362，2937，1657，1404，1235，1187，1043，866，649cm^-1；¹H NMR(BHSC-500，DMSO-d₆)：δ/ppm=10.03(m，1H)，8.75(t，J=7.0Hz，1H)，8.53(d，J=8.0Hz，1H)，8.41(d，J=7.5Hz，1H)，7.45(m，2H)，7.19(d，J=5.5Hz，1H)，5.57(s，1H)，5.12(d，J=17.5Hz，1H)，4.76(d，J=17.5Hz，1H)，4.54(s，1H)，4.28(m，3H)，3.93(dd，J=15.0Hz，J=5.0Hz，1H)，3.79(m，3H)，3.57(m，3H)，3.18(m，1H)，2.94(m，2H)，2.66(m，4H)，2.40(m，2H)，2.20(m，3H)，2.11(m，1H)，1.93(m，3H)，1.79(m，1H)，1.71(s，3H)，1.67(m，3H)，1.47(m，3H)，1.38(s，3H)，1.27(m，1H)，1.00(m，1H)，0.87(m，1H)，0.78(s，3H).¹³C NMR(BHSC-125，DMSO-d₆)：δ/ppm=205.80，198.55，172.88，172.34，171.32，168.85，158.14，121.95，89.08，67.98，66.98，66.31，65.37，63.02，56.05，55.78，52.86，47.29，46.83，34.54，33.96，31.89，31.62，30.76，29.33，28.63，24.78，23.83，21.01，20.99，17.42，15.62.

实施例22 制备氢化可的松-RGDF(4c)

按照实施例19的方法，收率：344mg(37%).Mp120-124°C；ESI/MS(m/z)937[M-H]^-.IR(KBr)：3377，2937，1660，1402，1272，1170，1080，867，700，654cm^-1；¹H NMR(BHSC-300，DMSO-d₆)：δ/ppm=10.12(m，1H)，8.99(d，J=6.3Hz，1H)，8.62(m，1H)，8.38(d，J=6.9Hz，1H)，7.48(m，2H)，7.21(m，1H)，7.14(m，5H)，5.57(s，1H)，5.13(d，J=17.7Hz，1H)，4.76(d，J=17.7Hz，1H)，4.40(s，1H)，4.27(m，3H)，3.97(m，2H)，3.48(m，2H)，3.40(m，2H)，3.12(m，1H)，2.95(m，2H)，2.83(m，1H)，2.59(m，2H)，2.37(m，2H)，2.22(m，3H)，1.93(m，4H)，1.80(m，1H)，1.67(m，6H)，1.52(m，3H)，1.38(s，3H)，1.26(m，1H)，0.99(m，1H)，0.81(m，1H)，0.77(s，3H).¹³C NMR(BHSC-125，DMSO-d₆)：δ/ppm=205.84，198.53，176.06，175.18，174.06，173.09，172.34，171.26，170.50，168.92，158.23，139.73，130.01，127.98，125.81，121.94，89.05，72.75，67.96，66.86，65.35，60.74，56.04，52.84，52.05，51.04，47.28，46.82，34.54，33.96，31.88，31.12，30.56，29.32，25.05，24.70，20.95，18.14，16.85.

实施例23 通式i的3种氢化可的松-RGD多肽缀合物对小鼠脾淋巴细胞丝裂原增殖的抑制作用

脱颈处死小鼠，无菌取脾，用200目钢网和注射器芯研磨，用PBS液洗两次，1500转/分条件下离心10分钟，计数后用完全RPMI-1640培养液配成脾细胞5×10⁶/mL的细胞悬液，加100μL细胞悬液于96孔培养板中(每孔含5×10⁵个细胞)。每孔加20μL刀豆蛋白(ConA终浓度为5μg/mL)，该96孔细胞培养板置于体积分数为0.05的CO₂饱和湿度的培养箱内37°C培养4h。4h后按预设的浓度梯度加入待测、经灭菌处理的样品，括号内为终浓度(2×10^-4，1×10^-4，3×10^-5，1×10^-5，3×10^-6，1×10^-6，3×10^-7，1×10^-7)，每个浓度3个复孔，对照组加入等体积的溶解样品的溶媒。同时设不含化合物对照孔和只含同量培养液无ConA的细胞空白孔。各个孔均重复3次(n=3)。培养48h后用MTT法检测化合物对脾淋巴细胞的抑制作用。

按照公式“抑制率=(D对照-D含药)/D对照×100%”计算不同浓度的化合物对脾淋巴细胞增殖的抑制作用，根据细胞相对生存率和化合物的浓度绘制细胞生长曲线，利用该生长曲线求得半数抑制率(^DxIC₅₀)。结果列入表1，结果表明本发明的3种氢化可的松-RGD缀合物在体外对小鼠脾淋巴细胞增殖有明确的抑制作用，其中4a、4b明显优于氢化可的松。

表1氢化可的松-RGD缀合物对小鼠脾淋巴细胞丝裂原增殖的抑制作用

注：n=3，1为氢化可的松

实施例24 3种氢化可的松-RGD缀合物采用小鼠耳后心肌组织移植实验评价化合物的体内免疫抑制活性

本发明采用小鼠耳后心肌组织移植实验评价化合物的体内免疫抑制活性（n=12），结果如表2所示，从表2可以看出：本发明的3种氢化可的松-RGD缀合物在体内能显著延长小鼠耳后心肌组织存活时间，且效果明显优于NS、CsA和氢化可的松；免疫抑制活性明显。

表2在小鼠耳后心肌移植实验中1，4a-c对小鼠心肌存活时间，体重，脾重，脾指数和肝脏指数的影响

注：n=12，Cs为环孢菌素A，NS为生理盐水，下同。除了环孢菌素A(i.p.)，所有化合物口服给药。CsA剂量=2.5μmol/kg/day；1，4a-c的剂量=12.4μmol/kg/day；a)与NS比较，p<0.01，与1比较，p<0.05，与CsA比较，p>0.05；b)与NS比较，p<0.01，与1比较，p<0.01，与CsA比较，p<0.05；c)与NS比较，p>0.05，与CsA比较，p>0.05；d）与NS比较，p<0.05，与CsA比较，p>0.05，与1比较，p<0.05；e）与NS比较，p<0.001，与CsA比较，p<0.001，与1比较，p<0.001；f)与NS比较，p<0.001，与CsA比较，p<0.01，与1比较，p<0.001；g）与NS比较，p>0.05，与1比较，p<0.05；h）与NS比较，p<0.05，与1比较，p>0.05。

实施例25 采用小鼠耳后心肌组织移植实验评价化合物4a的体内免疫抑制活性中的量效关系实验

为了考察药物的剂量-效应依赖关系，选择活性较好的化合物4a做量效关系研究，分别在上个实验的给药基础上(12.4μmol/kg/day)稀释10倍(1.24μmol/kg/day)和100倍(0.124μmol/kg/day)后给药，结果如表3所示，结果表明：4a高剂量组在体内延长小鼠耳后心肌组织存活时间的效果最好，免疫抑制活性最强。

表34a在小鼠耳后心肌移植-量效关系实验中对小鼠心肌存活时间，体重，脾重，脾指数和肝脏指数的影响

注：n=12，除了CsA(i.p.)，所有化合物口服给药。a)与NS比较，p<0.05，与1比较，p<0.05；b）与NS比较，p>0.05，与1比较，p<0.05；c)与NS比较，p<0.05，与4a12.4μmol/kg/day比较，p<0.05；d)与NS比较，p<0.05，与4a12.4μmol/kg/day比较，p>0.05；e)与NS比较，p>0.05，与4a1.24μmol/kg/day比较，p<0.05；f)与NS比较，p<0.05，与4a1.24μmol/kg/day比较，p<0.05。

实施例26 3种氢化可的松-RGD缀合物在体内免疫抑制活性中对小鼠骨长，骨重，骨密度的影响

由于皮质激素的长期使用可以降低骨密度，导致骨质疏松的发生，故在本实验结束时将骨取出测定化合物对骨长，骨重，骨密度的影响。

骨密度的测量采用X-CT双能骨密度仪来测量，测量部位选取膝盖以下1-2mm的部位进行测量，测量结果如下，结果表明：本发明的3种氢化可的松-RGD缀合物与NS组相比，骨密度的变化不大，但其骨密度显著高于氢化可的松组。

表4化合物1，4a-c对小鼠骨重，骨长和骨密度的影响

注：n=12，所有化合物口服给药，1，4a-c的剂量=12.4μmol/kg/day；a)与NS比较p>0.05，与1比较p<0.01；b)与NS比较p>0.05，与1比较p>0.05；c)与NS比较p>0.05；d)与NS比较p<0.05。

实施例27 3种氢化可的松-RGD缀合物在体内免疫抑制活性中对小鼠骨干重，骨灰重，骨矿含量，骨钙含量的影响

本发明进一步考察了3种氢化可的松-RGD缀合物在体内免疫抑制活性中对小鼠骨干重，骨灰重，骨矿含量，骨钙含量的影响，结果如表5所示，从表5可以看出：本发明的3种氢化可的松-RGD缀合物与NS组相比，各项指标无显著性差异，而与氢化可的松组相比，除骨矿含量外，其他各项指均有显著提高。

表5化合物1，4a-c对小鼠骨干重，骨灰重，骨矿含量，骨磷含量，骨钙含量的影响

注：n=12，所有化合物口服给药。1，4a-c的剂量=12.4μmol/kg/day。a)与NS比较，p<0.05；b)与NS比较，p>0.05，与1比较，p<0.05；c)与NS比较，p>0.05，与1比较，p<0.01；d)与NS比较，p>0.05，与1比较，p<0.05。

实施例28 3种氢化可的松-RGD缀合物对二甲苯致炎小鼠耳肿胀度的影响

本发明考察了3种氢化可的松-RGD缀合物对二甲苯致炎小鼠耳肿胀度的影响，结果如图1所示，从图1可以看出：本发明的3种氢化可的松-RGD缀合物均有明显的抗炎作用，且优于氢化可的松。

实施例29 3种氢化可的松-RGD缀合物对二甲苯致炎小鼠耳肿胀度的影响-量效关系实验

为了考察药物的剂量-效应依赖关系，选择活性较好的化合物4b做对二甲苯致炎小鼠耳肿胀度的影响的量效关系研究，分别在上个实验的给药基础上(41.4μmol/kg/day)稀释10倍(4.14μmol/kg/day)和100倍(0.414μmol/kg/day)后给药，化合物4b对二甲苯致炎小鼠耳肿胀度的影响-量效关系如图2所示，从图2可以看出：高剂量组抗炎作用明显，且优于氢化可的松。

实施例30 3种氢化可的松-RGD多肽缀合物的自组装性能评价

将3种氢化可的松-RGD多肽缀合物配成1μmol/mL的水溶液，在激光纳米粒度仪上25°C测定粒径。连续测定8天，记录其粒径和Zeta电位值。

1)水溶液中3种氢化可的松-RGD多肽缀合物4a-c的纳米球的粒径。结果列入图3，数据表明，本发明的3种氢化可的松-RGD多肽缀合物水溶液中均能自组装成粒经稳定在200-700nm的纳米球。

2)水溶液中3种氢化可的松-RGD多肽缀合物4a-c的纳米球的形态。将水溶液中3种氢化可的松-RGD多肽缀合物4a-c配成浓度为1×10^-10mg/mL的水溶液，然后将此溶液滴在铜网上，挥发干溶剂后在JEM-1230透射电子显微镜下观察纳米球的形态。测定表明，4a-c可形成规则的纳米球。以4b的透射电子显微镜照片作为代表，用图4描述。

3)水溶液中3种氢化可的松-RGD多肽缀合物4a-c的Zeta电位值，如图5所示。

Claims

1.如通式i的氢化可的松-RGD多肽缀合物，

其中，RGDX为四肽Arg-Gly-Asp-X，所述X=Val，Phe，Ser三种氨基酸中的任意一种。

2.一种制备权利要求1所述的氢化可的松-RGD多肽缀合物的方法，其特征是，

（1）在无水四氢呋喃中，在丁二酸酐和二甲氨基吡啶存在下，将氢化可的松的21位羟基酯化生成氢化可的松-21-丁二酸单酯；

（2）在无水四氢呋喃中，在盐酸–1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐存在下，将N-羟基琥珀酰亚胺和氢化可的松-21-丁二酸单酯成酯，得到氢化可的松-21-丁二酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯；

（3）在二甲基甲酰胺，N-甲基吗啉和水存在下，将氢化可的松-21-丁二酰N-羟基琥珀酰亚胺酯与精氨酰甘氨酰天冬氨酰缬氨酸、精氨酰甘氨酰天冬氨酰苯丙氨酸或精氨酰甘氨酰天冬氨酰丝氨酸避光反应，生成氢化可的松-21-丁二酰-精氨酰甘氨酰天冬氨酰缬氨酸、氢化可的松-21-丁二酰-精氨酰甘氨酰天冬氨酰苯丙氨酸或氢化可的松-21-丁二酰-精氨酰甘氨酰天冬氨酰丝氨酸。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征是，所述精氨酰甘氨酰天冬氨酰缬氨酸、精氨酰甘氨酰天冬氨酰苯丙氨酸或精氨酰甘氨酰天冬氨酰丝氨酸的制备方法为：

(1)在无水四氢呋喃中，在N,N-二环己基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑和N-甲基吗啉存在下将N-叔丁氧羰基-硝基精氨酸与甘氨酸苄酯或其盐缩合，生成N-叔丁氧羰基-硝基精氨酰甘氨酸苄酯；

(3)在无水四氢呋喃中，在N,N-二环己基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑和N-甲基吗啉存在下将N-叔丁氧羰基-苄基天冬氨酸与缬氨酸苄酯或其盐、苯丙氨酸苄酯或其盐或丝氨酸-苄醚苄酯或其盐缩合，生成N-叔丁氧羰基-苄基天冬氨酰缬氨酸苄酯、N-叔丁氧羰基-苄基天冬氨酰苯丙氨酸苄酯或N-叔丁氧羰基-苄基天冬氨酰丝氨酸苄醚苄酯；

(4)在氯化氢-乙酸乙酯中将N-叔丁氧羰基-苄基天冬氨酰缬氨酸苄酯、N-叔丁氧羰基-苄基天冬氨酰苯丙氨酸苄酯或N-叔丁氧羰基-苄基天冬氨酰丝氨酸苄醚苄酯脱除叔丁氧羰保护基，生成苄基-天冬氨酰缬氨酸苄酯的盐酸盐、苄基-天冬氨酰苯丙氨酸苄酯的盐酸盐或苄基-天冬氨酰丝氨酸苄醚苄酯的盐酸盐；

(5)在无水四氢呋喃中，在N,N-环己基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑和N-甲基吗啉存在下将N-叔丁氧羰基-硝基精氨酰甘氨酸与苄基-天冬氨酰缬氨酸苄酯的盐酸盐、苄基-天冬氨酰苯丙氨酸苄酯的盐酸盐或苄基-天冬氨酰丝氨酸苄醚苄酯的盐酸盐缩合，生成N-叔丁氧羰基-硝基精氨酰甘氨酰-苄基天冬氨酰缬氨酸苄酯、N-叔丁氧羰基-硝基精氨酰甘氨酰苄基-天冬氨酰苯丙氨酸苄酯或N-叔丁氧羰基-硝基精氨酰甘氨酰-苄基天冬氨酰丝氨酸苄醚苄酯；

(6)在三氟醋酸-三氟甲磺酸存在下将N-叔丁氧羰基-硝基精氨酰甘氨酰-苄基天冬氨酰缬氨酸苄酯、N-叔丁氧羰基-硝基精氨酰甘氨酰苄基-天冬氨酰苯丙氨酸苄酯或N-叔丁氧羰基-硝基精氨酰甘氨酰-苄基天冬氨酰丝氨酸苄醚苄酯脱除叔丁氧羰基、苄基、苄醚和硝基，生成精氨酰甘氨酰天冬氨酰缬氨酸、精氨酰甘氨酰天冬氨酰苯丙氨酸或精氨酰甘氨酰天冬氨酰丝氨酸。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征是，所述步骤（1）的甘氨酸苄酯的盐为甘氨酸苄酯对甲苯磺酸盐；所述步骤（3）的缬氨酸苄酯的盐为缬氨酸苄酯对甲苯磺酸盐；所述苯丙氨酸苄酯的盐为苯丙氨酸苄酯对甲苯磺酸盐；所述丝氨酸-苄醚苄酯的盐为丝氨酸-苄醚苄酯盐酸盐。

5.权利要求1所述的氢化可的松-RGD多肽缀合物在制备具有低骨质疏松副作用的免疫抑制剂中的用途。

6.如权利要求5所述的用途，其特征是，所述免疫抑制剂为免疫抑制剂药质体。

7.如权利要求5所述的用途，其特征是，所述免疫抑制剂为微乳或脂质体靶向药物。

8.权利要求1所述的氢化可的松-RGD多肽缀合物在制备抗炎制剂中的用途。

9.如权利要求8所述的用途，其特征是，所述抗炎制剂为抗炎制剂药质体。

10.如权利要求8所述的用途，其特征是，所述抗炎制剂为微乳或脂质体靶向药物。