CN104984403A - 一种荷载药物及脂肪来源间充质干细胞的多肽水凝胶支架及其制备方法 - Google Patents

一种荷载药物及脂肪来源间充质干细胞的多肽水凝胶支架及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种荷载药物及脂肪来源间充质干细胞的多肽水凝胶支架及其制备方法。(1)用超纯水配置浓度为1.836×10-5M~2.651×10-5M的枸橼酸他莫昔芬溶液;(2)在培养板中形成含有1.836×10-5M~2.651×10-5M枸橼酸他莫昔芬的多肽水凝胶;(3)含有1.836×10-5M~2.651×10-5M的枸橼酸他莫昔芬溶液换洗步骤(2)中多肽水凝胶中的溶液至PH为7.0;(4)取人脂肪来源间充质干细胞以1.0×105个/ml每孔加入500μl,培养3d后即得到荷载药物及脂肪来源间充质干细胞的多肽水凝胶支架。本发明的多肽水凝胶支架,既含有抗癌药物枸橼酸他莫昔芬又含有人脂肪来源间充质干细胞,可用于构建活体组织。

Description

一种荷载药物及脂肪来源间充质干细胞的多肽水凝胶支架及其制备方法
技术领域:
本发明涉及一种多肽水凝胶支架,尤其涉及一种荷载药物及脂肪来源间充质干细胞的多肽水凝胶支架及其制备方法。
背景技术:
与2D单层细胞培养相比,3D培养模型能更好地模仿天然组织中细胞的微环境,因此该技术在研究疾病进展及细胞对药物反应中更有价值。在众多材料中,以多肽为基本组成单元,依靠多肽分子天然自组装得到的新颖支架材料具有纳米级纤维组成、简单的氨基酸成分和充分的含水量,更接近天然细胞外基质,可为细胞提供理想的三维环境,同时多肽作为一种生物物质,具有生物利用度高,毒性小和特异靶向等良好的生理功能越来越受到药物创新研究者的青睐。近年来,随着多肽化学的快速发展,多肽作为释药载体的功能应用逐渐成为了新药研制的热点之一。但目前还没有利用多肽水凝胶支架同时荷载脂肪来源间充质干细胞及抗癌药物他莫昔芬的研究。
发明内容:
本发明的目的是提供一种荷载药物及脂肪来源间充质干细胞的多肽水凝胶支架及其制备方法。
本发明的荷载药物及脂肪来源间充质干细胞的多肽水凝胶支架,其制备方法包括以下步骤:
(1)、用超纯水配置浓度为1.836×10-5M~2.651×10-5M的枸橼酸他莫昔芬溶液;
(2)、在培养板中形成含有1.836×10-5M~2.651×10-5M枸橼酸他莫昔芬的1%多肽水凝胶;
(3)、含有1.836×10-5M~2.651×10-5M的枸橼酸他莫昔芬溶液换洗步骤(2)中多肽水凝胶中的溶液至PH为7.0;
(4)、取人脂肪来源间充质干细胞加入培养板中,培养后即得到荷载药物及脂肪来源间充质干细胞的多肽水凝胶支架。
所述的培养板,优选为24孔培养板。
步骤(2)所述的形成含有1.836×10-5M~2.651×10-5M枸橼酸他莫昔芬的多肽水凝胶,优选按照Sigma Aldrich HydroMatrixTM Peptide Cell Culture Scaffold说明书的步骤形成多肽水凝胶。
步骤(4)所述的取人脂肪来源间充质干细胞加入培养板中,优选,1.0×105个/ml每孔加入500μl。
步骤(4)所述的培养,优选在37℃,5%CO2孵箱中培养3d。
本发明的荷载药物及脂肪来源间充质干细胞的多肽水凝胶支架,既含有抗癌药物枸橼酸他莫昔芬又含有人脂肪来源间充质干细胞,能作为种子细胞载体的同时对抗肿瘤药物他莫昔芬起到缓释作用,可用于构建活体组织,填补目前多肽水凝胶培养支架同时荷载药物-细胞的技术空白,构建能具有治疗效果与组织再生功能的3D培养支架。
附图说明:
图1是不同浓度TAM对MCF-7和ADSCs的抑制率趋势图;
图2是水凝胶外观(1%w/v)。
具体实施方式:
以下实施例是对本发明的进一步说明,而不是对本发明的限制。
实施例1:
荷载药物及脂肪来源间充质干细胞的多肽水凝胶支架的制备:
(1)、用超纯水配置浓度为1.836×10-5M~2.651×10-5M的枸橼酸他莫昔芬溶液;
(2)、按照Sigma Aldrich HydroMatrixTM Peptide Cell Culture Scaffold使用说明书在24孔培养板中形成含有1.836×10-5M~2.651×10-5M枸橼酸他莫昔芬的1%多肽水凝胶;
步骤如下:
在水凝胶表面铺展细胞
1、用蒸馏水将浓度为1%(w/v)储备液稀释至所需浓度,所得的工作液在使用前要在冰上放置;
2、将工作液加入到培养孔中,工作液的推荐体积详如表1所示,沿着孔壁加入1-2倍体积的培养基使凝胶开始形成;
表1.工作液的推荐体积
培养板规格 工作液体积
96-well plate 75μl per well
24-well plate 500μl per well
6-well plate 2.4ml per well
3、将加入工作液的培养板置于37℃环境中孵育1小时使凝胶形成,然后1-2小时内小心地换液2次并让其在这段时间内保持37℃孵育,孵育后8小时内需使用;
4、在水凝胶顶部加入所需数量细胞的培养基混悬液。
(3)、含有1.836×10-5M~2.651×10-5M的枸橼酸他莫昔芬溶液换洗步骤(2)中多肽水凝胶中的溶液至PH为7.0;
(4)、取人脂肪来源间充质干细胞以1.0×105个/ml每孔加入500μl,培养3d后即得到荷载药物及脂肪来源间充质干细胞的多肽水凝胶支架。
应用试验数据:
一、筛选药物浓度
1、乳腺癌细胞(MCF-7)与不同浓度他莫昔芬(TAM)溶液平面培养3day
表2.不同浓度TAM溶液对MCF-7活力的影响
2、脂肪干细胞(ADSCs)与不同浓度TAM溶液平面培养3day
表3.不同浓度TAM溶液对ADSC的活力影响
3、不同浓度TAM对MCF-7和ADSCs的抑制率如图1所示。当TAM浓度大于5μmol/L时,其对于MCF-7活力的影响开始有显著性抑制,而当TAM浓度大于25μmol/L时,其对ADSCs的活力影响才有显著性抑制。由此我们推论在TAM浓度为25μmol/L~50μmol/L时,可以控制TAM对ADSC活力影响的同时能有效地抑制MCF-7的活力。
4、计算半数致死量最后确定药物浓度
IC50(MCF-7)=18.36μmol/L
IC50(ADSC)=26.51μmol/L
二、自组装多肽支架基本数据及表征:
1、水凝胶多肽支架的基本数据:
供应商:Sigma Aldrich,外观(颜色):白色
分子量:1526.47g/mol,外观(形态):固体
纯度(HPLC):94%
2、水凝胶支架的表征:
含水率:
WR(%)=(mw-md)/md        mw(干燥前重量)=0.4964g
md(干燥后重量)=0.02476g        WR(%)=95.01%
三、平面培养与载药支架培养条件下对MCF-7活力影响的比较:(培养5day,TAM浓度均为25μmol/L)
表4.载药支架培养条件下对MCF-7的抑制率
抑制率=81.92%
表5.平面培养环境下对MCF-7增殖的影响
抑制率=80.24%
载药支架培养条件下对MCF-7抑制率(81.92%)高于平面培养条件下对MCF-7的抑制率(80.24%),我们可以推论,3D培养环境有利于药物与细胞的相互作用,在此前提下,植入支架所用药量可根据实际情况进行减量,可在不影响正常药效的前提下,减少药量有利于其他正常细胞的生长。
四、平面培养与载药支架培养条件下对ADSCs活力影响的比较:(培养5day,TAM浓度均为25μmol/L)
表6:载药支架对ADSCs的抑制率
抑制率=25.40%
表7:平面培养环境下对ASCs的抑制率
抑制率=44.86%
结论:载药支架培养条件下对ASCs抑制率(25.40%)低于平面培养条件下对ASCs的抑制率(44.86%),推测,ASCs在3D培养条件下,药物对其的不利影响显著少于3D培养环境对其的有利影响。
综上,我们可以推断,3D载药培养支架在有效抑制MCF-7活力的同时,对ADSCs的影响是有限的,可以抑制乳腺癌的增殖速度的同时,维持植入支架中的种子细胞ADSCs的正常增殖,该支架在用于构建治疗性活体组织方面具有可行性。

Claims (5)

1.一种荷载药物及脂肪来源间充质干细胞的多肽水凝胶支架,其特征在于,是通过以下方法制备的:
(1)、用超纯水配置浓度为1.836×10-5M~2.651×10-5M的枸橼酸他莫昔芬溶液;
(2)、在培养板中形成含有1.836×10-5M~2.651×10-5M枸橼酸他莫昔芬的1%多肽水凝胶;
(3)、含有1.836×10-5M~2.651×10-5M的枸橼酸他莫昔芬溶液换洗步骤(2)中多肽水凝胶中的溶液至PH为7.0;
(4)、取人脂肪来源间充质干细胞加入培养板,培养后即得到荷载药物及脂肪来源间充质干细胞的多肽水凝胶支架。
2.根据权利要求1所述的荷载药物及脂肪来源间充质干细胞的多肽水凝胶支架,其特征在于,所述的培养板为24孔培养板。
3.根据权利要求1所述的荷载药物及脂肪来源间充质干细胞的多肽水凝胶支架,其特征在于,步骤(2)所述的形成含有1.836×10-5M~2.651×10-5M枸橼酸他莫昔芬的多肽水凝胶,按照Sigma Aldrich HydroMatrixTMPeptide Cell Culture Scaffold说明书的步骤形成多肽水凝胶。
4.根据权利要求1所述的荷载药物及脂肪来源间充质干细胞的多肽水凝胶支架,其特征在于,步骤(4)所述的取人脂肪来源间充质干细胞加入培养板中,具体为:1.0×105个/ml每孔加入500μl。
5.根据权利要求1所述的荷载药物及脂肪来源间充质干细胞的多肽水凝胶支架,其特征在于,步骤(4)所述的培养,具体为:在37℃,5%CO2孵箱中培养3d。
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