CN114272208A - 胶束辅助解离的多肽纳米级协同多药递送系统及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种胶束辅助解离的多肽纳米级递送系统所述多肽纳米级协同多药递送系统，包括端基氧化为醛基的普朗尼克胶束(AF127)和PG3P，并通过在中性环境下自组装形成；PG3P由以POSS为核，以赖氨酸为分支单元的三代赖氨酸树状大分子(PG3)修饰功能性多肽后形成；由所述端基氧化为醛基的普朗尼克胶束形成第一载体，由所述PG3P形成第二载体。本发明还提供了一种胶束辅助解离的多肽纳米级递送系统所述多肽纳米级协同多药递送系统的制备方法。本发明的多肽纳米级协同多药递送系统具有的树状多肽分子组分树状多肽分子可以实现核酸的稳定递送和高效转染，AF127胶束可以保护多肽组分成功抵达靶向部位，并使体系更容易进入细胞内，且该系统细胞毒性小，可快速排出体外。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，具体而言涉及一种胶束辅助解离的多肽纳米级协同多药递送系统及其制备方法。
背景技术
基因治疗(gene therapy)是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，从而达到治疗目的。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。
近年来，对用于基因治疗的非病毒性递送载体的研究进展迅速，以脂质体，胶束，纳米粒子为递送载体，相较于改良的病毒拥有更低的免疫原性，更大的药物容量，更好的可拓展性。常见的非病毒性基因递送载体主要分为无机类载体和有机类载体，无机类载体常为纳米材料，如水滑石(LDH)，是由二价和三价金属阳离子组成的层状晶体结构的纳米复合材料，LDH作为基因药物载体具有毒性小、生物相容性良好、缓控释、靶向运输、生物成像等特点，但仍然存在着无法精准控制LDH-基因纳米复合物粒度分布、难以开发主动靶向功能效果非常理想的LDH-基因纳米复合物等问题；有机类载体包括聚合物囊泡，聚合物胶束等，聚合物胶束具有显著的生物相容性并能在体内降解从而有利于从机体内排除，但聚合物胶束在体内的稳定性较差，且细胞摄取率低、药物释放缓慢。
Pluronic F127(简称F127)是一种两亲性的PEO-PPO-PEO三嵌段聚合物，具有疏水-亲水-疏水结构，且具备温敏性，F127在水中可以自发的组装成胶束，因此广泛应用于利用两亲性嵌段聚合物组成的胶束载药系统的制备。目前已经出现了，例如Lipofectamine2000等胶束用于基因递送，他们在有血清或无血清条件下都表现出了基因的高表达，但是涉及阳离子聚合物的转染实验中，其形成的复合物具有高度正表面电荷，以及过量的游离阳离子聚合物，过量的游离阳离子聚合物会破坏细胞的质膜，造成较高的细胞毒性。
肽类树状大分子是一类新型的功能性生物医用高分子材料。其结构特殊、性能优异，在分子探针、基因载体等领域已经得到了广泛的应用。肽类树状大分子主要由氨基酸与多肽组合而成，具有良好的生物相容性和亲水性，且具备良好的生物可降解性。肽类材料作为基因递送载体一直是热门的研究方向，多年来衍生了诸如阳离子细胞穿透肽、膜破坏肽、组蛋白肽等多种肽类材料，但是由于肽类材料通常都带有高度的正电荷来压缩核酸，因此它们缺乏在体外和体内有效基因转移的几个基本特征，例如：基因传递载体的隐身特性，向所需细胞/组织的靶向递送，内体破坏，易降解和核靶向功效。
随着研究的深入，越来越多的研究者将肽类材料缀合到其他材料例如PEG、PLGA等材料上，使其他材料对多肽进行笼蔽免于特异性酶的识别从而实现递送系统的隐身特性，这种方法达到了一定的效果，但是过程繁琐，成本高，并且效率较低。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种基于胶束辅助解离的多肽纳米级协同多药递送系统，该系统的树状多肽分子可以实现核酸的稳定递送和高效转染，AF127胶束可以保护多肽组分成功抵达靶向部位，并使体系更容易进入细胞内，且该系统细胞毒性小，可快速排出体外。
本发明的另一目的在于提供一种基于胶束辅助解离的多肽纳米级协同多药递送系统的制备方法。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种基于胶束辅助解离的多肽纳米级协同多药递送系统，所述多肽纳米级协同多药递送系统包括端基氧化为醛基的普朗尼克(AF127)胶束和PG3P，并通过在中性环境下自组装形成；所述PG3P由以POSS为核，以赖氨酸为分支单元的三代赖氨酸树状大分子(PG3)修饰功能性多肽后形成；
其中，由所述端基氧化为醛基的普朗尼克胶束形成第一载体，由所述PG3P形成第二载体。
优选地，所述第一载体搭载药物，药物可以是光敏剂Ce6(二氢卟吩e6)或IR-780(七甲川花菁类小分子)也可以是姜黄素等其他药物。
优选地，所述第二载体搭载核酸，核酸可以是质粒DNA(pDNA)，mRNA，siRNA等。
多药物协同作用可以达到更好的治疗效果，AF127组分对树状多肽组分的正电荷的保护效应极大地提高了系统的递送能力。
优选地，所述第二载体搭载压缩核酸后，第二载体的氨基和核酸的磷酸根的摩尔比为15:1-30:1。
优选地，所述功能性多肽的序列为c(RGDfK)KRRRRRRRR。
本发明的另一目的在于提供一种基于胶束辅助解离的多肽纳米级协同多药递送系统的制备方法，包括以下步骤：
S1：将端基氧化为醛基的普朗尼克(AF127)和药物溶解于四氢呋喃中，搅拌后除去溶剂，再加蒸馏水溶解、搅拌、过滤，得到包载药物的醛基化普朗尼克胶束；
S2：将以多面体低聚倍半硅氧烷(POSS)为核的三代赖氨酸树状大分子(PG3)与序列为c(RGDfK)KRRRRRRRR的多功能多肽通过6-马来酰亚胺己酸、N-羟基丁二酰亚胺和三乙胺催化进行接枝，随后将PG3P溶液与核酸共混涡旋后，于室温下静置孵育得到压缩有核酸的PG3P/NA；
S3：利用醛基与氨基形成腙键反应驱动自组装的方法，将步骤S1得到的醛基化普朗尼克胶束与步骤S2得到的压缩有核酸的PG3P/NA，在中性环境下共混孵育，得到多肽纳米级协同多药递送系统AF127@PG3P/NA。
优选地，步骤S3中，所述醛基化普朗尼克胶束与PG3P的自组装体积比为(1-10):(1-10)，醛基化普朗尼克胶束的浓度为0.1-1mg/mL，PG3P的浓度为10-100mg/mL。
优选地，步骤S2中，制备PG3P的具体步骤包括：
A、向搅拌的甲醇中缓慢滴加3-氨基丙基三乙氧基硅烷，随后进行油浴升温至50-60℃，冷凝回流，并逐滴加入浓盐酸，继续升温至90-100℃，搅拌反应，之后将反应好的溶液加入搅拌的四氢呋喃中，离心，真空干燥得到笼聚型半硅氧烷核心POSS；
B、取步骤A得到的POSS，以及BOC-Lys(BOC)-OH、HBTU和HoBt，于氮气保护下溶解与无水DMSO中，冰浴一定时间，再加入DIEA，进行反应，反应完成后加入氯仿进行稀释，并经过饱和食盐水水洗、无水硫酸镁干燥、抽滤、旋蒸后，加入乙腈产生白色沉淀，之后再离心、真空干燥得到一代树状肽类分子PG1；
C、将步骤B的POSS替换成所得的PG1后，重复步骤B，得到二代树状肽类分子PG2；
D、将步骤B的POSS替换成步骤C所得的PG2后，重复步骤B，得到三代树状肽类分子PG3；
E、将步骤D所得到的PG3与6-马来酰亚胺己酸、N-羟基丁二酰亚胺混合于水中，第一次避光搅拌一段时间后透析，冻干得到马来酰亚胺化的树状肽类分子PG3-MHA，再将PG3-MHA与序列为c(RGDfK)KRRRRRRRR的多肽溶解于氯仿中，并加入三乙胺，第二次避光搅拌反应一段时间，旋蒸得到功能化树状肽类分子PG3P。
优选地，步骤A中，甲醇与3-氨基丙基三乙氧基硅烷的体积比为20:1-30:1，加入的浓盐酸与3-氨基丙基三乙氧基硅烷的体积比1:1-3:1；
离心次数为3-5次，每次的速率均为3000-3500rpm，每次离心时间均为5-10min。
优选地，步骤B中，POSS与BOC-Lys(BOC)-OH的摩尔比为1:8-1:10，POSS与HBTU的摩尔比为1:8-1:10，POSS与HoBt摩尔比为1:8-1:10，POSS与DIEA摩尔比为1:30至1:40；
冰浴的时间为15-30min，加入DIEA后的反应时间为24-36h；
使用饱和食盐水水洗3-5次，无水硫酸镁干燥4-6h，离心次数为3-5次，每次的速率均为3000-3500rpm，每次离心时间均为5-10min。
优选地，步骤E中，PG3与6-马来酰亚胺己酸的摩尔比为1:5-1:15，PG3与N-羟基丁二酰亚胺的的摩尔比为1:5-1:15；PG3-MHA与序列为c(RGDfK)KRRRRRRRR的多肽的质量比为1:5；
第一次避光搅拌的时间为24-36h，第二次避光搅拌的时间为24-48h。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明的AF127@PG3P/NA系统中，以POSS为核，以赖氨酸为分支单元的三代赖氨酸树状大分子(PG3)修饰的序列为c(RGDfK)KRRRRRRRR的树状多肽分子，该组分具有较多的氨基单元，导致其具有高的正电性，从而可以有效地压缩负电性的核酸，并且环状RDGfK序列由于是特异性亲和细胞的整合素受体，从而有效靶向纤维细胞和肿瘤细胞等整合素受体高表达的细胞，RRRRRRRR序列由于具有细胞穿膜肽序列和核定位肽序列，从而可以使材料有效穿透细胞膜并且进入细胞核，实现了核酸的稳定递送和高效转染；电中性的AF127胶束组分可以在多肽组分外层形成笼蔽结构，避免了载体因带有很多正电荷而引起的溶血，以及非特异性吸附引起的血栓等不良影响，并且在递送载体的过程中保护多肽组分不被血液中的特异性酶降解，从而成功抵达靶向部位，保证系统具有良好的稳定性；且AF127组分互相组装形成的空腔可以高包封率的包载药物，同时由于载体系统与细胞膜结构的相似性，可以使体系更容易通过胞吞等摄取途径进入到细胞内；另一方面，该AF127@PG3P/NA纳米级基因递送系统利用了氨基酸、精氨酸、天冬氨酸成分，这些成分具有良好生物相容性的材料，因此该系统的细胞毒性低，不会对正常组织细胞产生毒性，副作用小，并且由于氨基酸的可降解性，体系在体内的积累低，可以快速排出。
2、本发明具有特有序列c(RGDfK)KRRRRRRRR的树状多肽分子，含有RDG(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)序列的多肽可以与细胞表面的αvβ3整合素受体特异性结合，是一种靶向肽，本发明具有特殊的环状RDG肽，由于RGD序列成环形，展开面积更大，拥有着与整合素受体更大的结合机会，表现出了比直链状RGD肽更高的结合效率，避免了传统直链状RGD肽的结合效率较低的问题；KRRRR(赖氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸)序列是NLS(核定位)序列，可以介导通过内输蛋白实现的细胞核质转运，从而使体系进入细胞核表达目的基因，RRRR是TAT(细胞穿模)序列，可由4-9个带正电荷的氨基酸组成，用于将细胞不渗透的货物递送到细胞或细胞核中，并改善构建体的内体逃逸能力；因此，序列为c(RGDfK)KRRRRRRRR的多功能肽可以增强体系的靶向能力、细胞穿透能力、核运输能力及内体逃逸，并且含有的多个带正电荷的氨基酸序列进一步增强了构建体对核酸的压缩效果；通过PG3修饰该特有序列的多肽，结合AF127胶束，使本发明的AF127@PG3P/NA系统成为了同时拥有高靶向特异性、细胞穿透能力、核运输能力以及核酸压缩能力。
3、本发明通过醛基与氨基形成腙键反应驱动自组装的方法，将端基氧化为醛基的普朗尼克(AF127)胶束和PG3P在中性环境环境下共混孵育，得到AF127@PG3P/NA系统，该系统由端基氧化为醛基的普朗尼克(AF127)胶束形成第一载体，由PG3P形成第二载体，第一载体可搭载药物，第二载体可搭载核酸，从而实现基因治疗与药物治疗的协同治疗，同时也可以用于光动力治疗的协同治疗；另一方面，醛基与氨基形成腙键反应驱动自组装的过程中，是通过醛基和羧基形成共价键完整组装，避免了通过正负电子的作用，从而使得核酸和药物都具有较好的包封率；同时，本发明的制备方法过程简单，所用材料便宜易得，成本低，效率高，有利于进一步工业化生产。
应当理解，前述构思以及在下面更加详细地描述的额外构思的所有组合只要在这样的构思不相互矛盾的情况下都可以被视为本公开的发明主题的一部分。另外，所要求保护的主题的所有组合都被视为本公开的发明主题的一部分。
结合附图从下面的描述中可以更加全面地理解本发明教导的前述和其他方面、实施例和特征。本发明的其他附加方面例如示例性实施方式的特征和/或有益效果将在下面的描述中显见，或通过根据本发明教导的具体实施方式的实践中得知。
附图说明
附图不意在按比例绘制。在附图中，在各个图中示出的每个相同或近似相同的组成部分可以用相同的标号表示。为了清晰起见，在每个图中，并非每个组成部分均被标记。现在，将通过例子并参考附图来描述本发明的各个方面的实施例，其中：
图1是本发明的多肽纳米级协同多药递送系统的扫描电镜图。
图2是本发明制备的PG3P、AF127以及AF127/PG3P的粒径测试结果图。
图3是本发明制备的PG3P、AF127以及AF127/PG3P的电位测试结果图。
图4是AF127胶束的药物包载能力测试结果图。
图5是PG3P的药物包载能力测试结果图。
图6a是本发明制备的AF127-Ce6的生物相容性实验结果图。
图6b是本发明制备的AF127的生物相容性实验结果图。
图6c是本发明制备的PG3P的生物相容性实验结果图。
图7是本发明制备的AF127/PG3纳米递送系统的基因转染情况图。
具体实施方式
为了更了解本发明的技术内容，特举具体实施例并配合所附图式说明如下。
在本公开中参照附图来描述本发明的各方面，附图中示出了许多说明的实施例。本公开的实施例不必定意在包括本发明的所有方面。应当理解，上面介绍的多种构思和实施例，以及下面更加详细地描述的那些构思和实施方式可以以很多方式中任意一种来实施，这是因为本发明所公开的构思和实施例并不限于任何实施方式。另外，本发明公开的一些方面可以单独使用，或者与本发明公开的其他方面的任何适当组合来使用。
结合图1，本发明提出一种由端基氧化为醛基的普朗尼克(AF127)胶束和以POSS为核，以赖氨酸为分支单元的三代赖氨酸树状大分子(PG3)修饰了功能性多肽后的PG3P，通过在中性环境下自组装形成的协同多药递送体系，并且由端基氧化为醛基的普朗尼克胶束形成第一载体，由PG3P形成第二载体，第一载体搭载药物，第二载体搭载核酸。该多肽纳米级协同多药递送系统为如图1所示的不规则颗粒。
在优选的实施例中，多肽的序列为c(RGDfK)KRRRRRRRR，其中，c代表环状，RGDfK是靶向肽，可以靶向整合素受体高表达的细胞；KRRRR是NLS(核定位)序列，可以有效定位细胞核，使材料把基因递送进入细胞核进行表达；RRRR是穿膜肽，可以促进体系穿透细胞膜。
在具体实施例中，第一载体搭载的药物可以是光敏剂Ce6(二氢卟吩e6)、IR-780(七甲川花菁类小分子)，也可以是姜黄素等其他药物，第二载体搭载的核酸可以是质粒DNA(pDNA)，mRNA，siRNA等，多药物协同作用可以达到更好的治疗效果，AF127组分对树状多肽组分的正电荷的保护效应极大地提高了系统的递送能力。
应当理解为，第一载体搭载的药物和第二载体搭载的核酸包括但不限于上述材料，可根据需求，选择合适的药物和核酸。
更具体的，本发明提供上述的AF127@PG3P/NA的具体制备步骤，先通过薄膜法制备AF127胶束，再将PG3P溶液与核酸共混压缩核酸，最后将两组分在中性环境下共混自组装。
作为本发明的示例性实施，前述具体的实施过程包括：
S1：将端基氧化为醛基的普朗尼克(AF127)和药物溶解于四氢呋喃中，搅拌后除去溶剂，再加蒸馏水溶解、搅拌、过滤，得到包载药物的醛基化普朗尼克胶束。
S2：以多面体低聚倍半硅氧烷(POSS)为核的三代赖氨酸树状大分子(PG3)修饰功能性多肽
A、向搅拌的甲醇中缓慢滴加3-氨基丙基三乙氧基硅烷，随后进行油浴升温至50-60℃，冷凝回流，并逐滴加入浓盐酸，继续升温至90-100℃，搅拌反应，之后将反应好的溶液加入搅拌的四氢呋喃中，离心，真空干燥得到笼聚型半硅氧烷核心POSS。
B、取步骤A得到的POSS，以及BOC-Lys(BOC)-OH、HBTU和HoBt，于氮气保护下溶解与无水DMSO中，冰浴15-30min，再加入DIEA，进行反应24-36h，反应完成后加入氯仿进行稀释，并经过饱和食盐水水洗3-5次、无水硫酸镁干燥4-6h、抽滤、旋蒸后，加入乙腈产生白色沉淀，之后以速率3000-3500rpm，时间为5-10min的条件再离心3-5次、真空干燥得到一代树状肽类分子PG1；
其中，PPOSS与BOC-Lys(BOC)-OH的摩尔比为1:8-1:10，POSS与HBTU的摩尔比为1:8-1:10，POSS与HoBt摩尔比为1:8-1:10，POSS与DIEA摩尔比为1:30至1:40。
C、将步骤B的POSS替换成所得的PG1后，重复步骤B，得到二代树状肽类分子PG2。
D、将步骤B的POSS替换成步骤C所得的PG2后，重复步骤B，得到三代树状肽类分子PG3。
E、将步骤D所得到的PG3与6-马来酰亚胺己酸、N-羟基丁二酰亚胺混合于水中，第一次避光搅拌24-36h后透析，冻干得到马来酰亚胺化的树状肽类分子PG3-MHA，再将质量比为1:5的PG3-MHA与序列为c(RGDfK)KRRRRRRRR的多肽溶解于氯仿中，并加入三乙胺，第二次避光搅拌反应24-48h，旋蒸得到功能化树状肽类分子PG3P；
其中，PG3与6-马来酰亚胺己酸的摩尔比为1:5-1:15，PG3与N-羟基丁二酰亚胺的的摩尔比为1:5-1:15。
随后将PG3P溶液与核酸以N/P比15-30进行共混涡旋，再于室温下静置孵育得到压缩有核酸的PG3P。
S3：利用醛基与氨基形成腙键反应驱动自组装的方法，将步骤S1得到的醛基化普朗尼克胶束与步骤S2得到的压缩有核酸的PG3P，以体积比为(1-10):(1-10)，醛基化普朗尼克胶束的浓度为0.1-1mg/mL，PG3P的浓度为10-100mg/mL的条件下，在中性环境下共混孵育，得到多肽纳米级协同多药递送系统AF127@PG3P/NA。
为了便于更好的理解，下面结合几个具体实例对本发明进行进一步说明，但制备工艺不限于此，且本发明内容不限于此。
【实施例1】
1、AF127胶束及包载Ce6的AF127胶束
A、取5g普朗尼克F127溶解于100mL无水二氯甲烷中，再加入2g戴斯马丁氧化剂，搅拌24h后，加入200mL正己烷产生白色沉淀，3000rpm×5min离心三次，弃去液体，于真空干燥箱中干燥得到端基氧化的普朗尼克材料(即醛基化普朗尼克)AF127。
B、取10mg AF127溶解于20mL四氢呋喃中，搅拌30min后，旋蒸溶液至粘稠，加入50mL蒸馏水搅拌30min，并使用0.45微米孔径滤膜过滤溶液，得到AF127胶束。
C、取10mg AF127和1mg Ce6溶解于20mL四氢呋喃中，搅拌30min后，旋蒸溶液至粘稠，加入50mL蒸馏水搅拌30min，并使用0.45微米孔径滤膜过滤溶液，得到包载Ce6的AF127胶束。
2、以多面体低聚倍半硅氧烷(POSS)为核的三代赖氨酸树状大分子(PG3)修饰功能性多肽及PG3P/pDNA
A、取用500mL两口球形烧瓶，向其中加入200mL甲醇，再在搅拌下缓慢滴入15mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，随后油浴升温至50℃后，冷凝回流，使用50mL恒压滴液漏斗逐滴滴入30mL浓盐酸，再升温至90℃，搅拌反应24h后，将反应溶液加入搅拌的四氢呋喃中，3000rpm×5min离心三次，弃去液体，于真空干燥箱中干燥得到笼聚型半硅氧烷核心POSS。
B、称取POSS 1g，BOC-Lys(BOC)-OH 2.83g，HBTU 3.71g，HoBt 1.32g，于氮气保护下使用无水DMSO溶解后，将整个体系冰浴15min后，加入5mL DIEA，反应24h后，加入50mL氯仿稀释，再使用饱和食盐水水洗3-5次，使用无水硫酸镁干燥4h后，抽滤，旋蒸减少溶剂，加入100mL乙腈产生白色沉淀，3000rpm×5min离心三次，弃去液体，于真空干燥箱中干燥得到一代树状肽类分子PG1。
C、按照步骤B中的方法，以PG1代替POSS为核，重复步骤B，得到二代树状肽类分子PG2；再以PG2代替POSS为核，重复步骤B，得到三代树状肽类分子PG3。
D、将PG3 1g，6-马来酰亚胺己酸0.45g，N-羟基丁二酰亚胺0.23g混合于水中，避光搅拌24h后透析，冻干得到马来酰亚胺化的树状肽类分子PG3-MHA，再将PG3-MHA 1g与序列为c(RGDfK)KRRRRRRRR的多肽4g溶解于100mL氯仿中，并加入10mL三乙胺，避光搅拌反应48h后，旋蒸得到功能化树状肽类分子PG3P。
随后取4.2μL 0.1mg/mL的PG3P溶液与2μL 0.1mg/mL的pDNA共混，于室温下静置孵育10-30min得到压缩有核酸的PG3P/pDNA。
3、利用醛基与氨基形成腙键反应驱动自组装的方法，将步骤1得到的AF127胶束与步骤2得到的PG3P/pDNA，以体积比为1:1，醛基化普朗尼克胶束的浓度为0.2mg/mL，PG3P的浓度为50mg/mL的条件下，在中性环境下共混孵育，得到多肽纳米级协同多药递送系统AF127@PG3P/pDNA。
【实施例2】
1、AF127胶束及包载IR-780的AF127胶束
A、取5g普朗尼克F127溶解于100mL无水二氯甲烷中，再加入2g戴斯马丁氧化剂，搅拌24h后，加入200mL正己烷产生白色沉淀，3000rpm×5min离心三次，弃去液体，于真空干燥箱中干燥得到端基氧化的普朗尼克材料(即醛基化普朗尼克)AF127。
B、取5mg AF127和1mg IR-780溶解于20mL四氢呋喃中，搅拌60min后，旋蒸溶液至粘稠，加入50mL蒸馏水搅拌30min，并使用0.45微米孔径滤膜过滤溶液，得到包载IR-780的AF127胶束。
2、以多面体低聚倍半硅氧烷(POSS)为核的三代赖氨酸树状大分子(PG3)修饰功能性多肽及PG3P/pDNA
A、取用500mL两口球形烧瓶，向其中加入100mL甲醇，再在搅拌下缓慢滴入5mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，随后油浴升温至50℃后，冷凝回流，使用50mL恒压滴液漏斗逐滴滴入15mL浓盐酸，再升温至90℃，搅拌反应24h后，将反应溶液加入搅拌的四氢呋喃中，3000rpm×10min离心五次，弃去液体，于真空干燥箱中干燥得到笼聚型半硅氧烷核心POSS。
B、称取POSS 1g，BOC-Lys(BOC)-OH 2.43g，HBTU 3.22g，HoBt 1.14g，于氮气保护下使用无水DMSO溶解后，将整个体系冰浴30min后，加入6.7mL DIEA，反应24h后，加入50mL氯仿稀释，再使用饱和食盐水水洗3-5次，使用无水硫酸镁干燥6h后，抽滤，旋蒸减少溶剂，加入100mL乙腈产生白色沉淀，3000rpm×10min离心三次，弃去液体，于真空干燥箱中干燥得到一代树状肽类分子PG1。
C、按照步骤B中的方法，以PG1代替POSS为核，重复步骤B，得到二代树状肽类分子PG2；再以PG2代替POSS为核，重复步骤B，得到三代树状肽类分子PG3。
D、将PG3 1g，6-马来酰亚胺己酸0.15g，N-羟基丁二酰亚胺0.23g混合于水中，避光搅拌36h后透析，冻干得到马来酰亚胺化的树状肽类分子PG3-MHA，再将PG3-MHA 1g与序列为c(RGDfK)KRRRRRRRR的多肽2g溶解于100mL氯仿中，并加入7mL三乙胺，避光搅拌反应24h后，旋蒸得到功能化树状肽类分子PG3P。
随后取5.6μL 0.1mg/mL的PG3P溶液与2μL 0.1mg/mL的mRNA共混，于室温下静置孵育10-30min得到压缩有核酸的PG3P/mRNA。
3、利用醛基与氨基形成腙键反应驱动自组装的方法，将步骤1得到的AF127胶束与步骤2得到的PG3P/mRNA，以体积比为1:10，醛基化普朗尼克胶束的浓度为0.6mg/mL，PG3P的浓度为80mg/mL的条件下，在中性环境下共混孵育，得到多肽纳米级协同多药递送系统AF127@PG3P/mRNA。
【实施例3】
1、AF127胶束及包载姜黄素的AF127胶束
A、取5g普朗尼克F127溶解于100mL无水二氯甲烷中，再加入2g戴斯马丁氧化剂，搅拌24h后，加入200mL正己烷产生白色沉淀，3000rpm×5min离心三次，弃去液体，于真空干燥箱中干燥得到端基氧化的普朗尼克材料(即醛基化普朗尼克)AF127。
B、取1mg AF127和1mg姜黄素溶解于20mL四氢呋喃中，搅拌20min后，旋蒸溶液至粘稠，加入50mL蒸馏水搅拌30min，并使用0.45微米孔径滤膜过滤溶液，得到包载姜黄素的AF127胶束。
2、以多面体低聚倍半硅氧烷(POSS)为核的三代赖氨酸树状大分子(PG3)修饰功能性多肽及PG3P/pDNA
A、取用500mL两口球形烧瓶，向其中加入300mL甲醇，再在搅拌下缓慢滴入10mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，随后油浴升温至50℃后，冷凝回流，使用50mL恒压滴液漏斗逐滴滴入10mL浓盐酸，再升温至90℃，搅拌反应24h后，将反应溶液加入搅拌的四氢呋喃中，3000rpm×5min离心三次，弃去液体，于真空干燥箱中干燥得到笼聚型半硅氧烷核心POSS。
B、称取POSS 1g，BOC-Lys(BOC)-OH 2.83g，HBTU 3.71g，HoBt 1.32g，于氮气保护下使用无水DMSO溶解后，将整个体系冰浴15min后，加入6.7mL DIEA，反应24h后，加入50mL氯仿稀释，再使用饱和食盐水水洗3-5次，使用无水硫酸镁干燥4h后，抽滤，旋蒸减少溶剂，加入100mL乙腈产生白色沉淀，3500rpm×5min离心三次，弃去液体，于真空干燥箱中干燥得到一代树状肽类分子PG1。
C、按照步骤B中的方法，以PG1代替POSS为核，重复步骤B，得到二代树状肽类分子PG2；再以PG2代替POSS为核，重复步骤B，得到三代树状肽类分子PG3。
D、将PG3 1g，6-马来酰亚胺己酸0.45g，N-羟基丁二酰亚胺0.08g混合于水中，避光搅拌24h后透析，冻干得到马来酰亚胺化的树状肽类分子PG3-MHA，再将PG3-MHA 1g与序列为c(RGDfK)KRRRRRRRR的多肽4g溶解于100mL氯仿中，并加入4mL三乙胺，避光搅拌反应36h后，旋蒸得到功能化树状肽类分子PG3P。
随后取8.4μL 0.1mg/mL的PG3P溶液与2μL 0.1mg/mL的siRNA共混，于室温下静置孵育10-30min得到压缩有核酸的PG3P/siRNA。
3、利用醛基与氨基形成腙键反应驱动自组装的方法，将步骤1得到的AF127胶束与步骤2得到的PG3P/siRNA，以体积比为10:1，醛基化普朗尼克胶束的浓度为1mg/mL，PG3P的浓度为30mg/mL的条件下，在中性环境下共混孵育，得到多肽纳米级协同多药递送系统AF127@PG3P/siRNA。
【实施例4】
1、AF127胶束及包载Ce6的AF127胶束
A、取5g普朗尼克F127溶解于100mL无水二氯甲烷中，再加入2g戴斯马丁氧化剂，搅拌24h后，加入200mL正己烷产生白色沉淀，3000rpm×5min离心三次，弃去液体，于真空干燥箱中干燥得到端基氧化的普朗尼克材料(即醛基化普朗尼克)AF127。
B、取10mg AF127和1mg Ce6溶解于20mL四氢呋喃中，搅拌20min后，旋蒸溶液至粘稠，加入50mL蒸馏水搅拌30min，并使用0.45微米孔径滤膜过滤溶液，得到包载Ce 6的AF127胶束。
2、以多面体低聚倍半硅氧烷(POSS)为核的三代赖氨酸树状大分子(PG3)修饰功能性多肽及PG3P/pDNA
A、取用500mL两口球形烧瓶，向其中加入200mL甲醇，再在搅拌下缓慢滴入15mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，随后油浴升温至50℃后，冷凝回流，使用50mL恒压滴液漏斗逐滴滴入30mL浓盐酸，再升温至90℃，搅拌反应24h后，将反应溶液加入搅拌的四氢呋喃中，3000rpm×5min离心三次，弃去液体，于真空干燥箱中干燥得到笼聚型半硅氧烷核心POSS。
B、称取POSS 1g，BOC-Lys(BOC)-OH 2.83g，HBTU 3.71g，HoBt 1.32g，于氮气保护下使用无水DMSO溶解后，将整个体系冰浴15min后，加入5mL DIEA，反应24h后，加入50mL氯仿稀释，再使用饱和食盐水水洗3-5次，使用无水硫酸镁干燥4h后，抽滤，旋蒸减少溶剂，加入100mL乙腈产生白色沉淀，3000rpm×5min离心三次，弃去液体，于真空干燥箱中干燥得到一代树状肽类分子PG1。
C、按照步骤B中的方法，以PG1代替POSS为核，重复步骤B，得到二代树状肽类分子PG2；再以PG2代替POSS为核，重复步骤B，得到三代树状肽类分子PG3。
D、将PG3 1g，6-马来酰亚胺己酸1g，N-羟基丁二酰亚胺0.16g混合于水中，避光搅拌24h后透析，冻干得到马来酰亚胺化的树状肽类分子PG3-MHA，再将PG3-MHA 1g与序列为c(RGDfK)KRRRRRRRR的多肽5g溶解于100mL氯仿中，并加入10mL三乙胺，避光搅拌反应48h后，旋蒸得到功能化树状肽类分子PG3P。
随后取5.6μL 0.1mg/mL的PG3P溶液与2μL 0.1mg/mL的pDNA共混，于室温下静置孵育10-30min得到压缩有核酸的PG3P/pDNA。
3、利用醛基与氨基形成腙键反应驱动自组装的方法，将步骤1得到的AF127胶束与步骤2得到的PG3P/pDNA，以体积比为5:1，醛基化普朗尼克胶束的浓度为0.1mg/mL，PG3P的浓度为100mg/mL的条件下，在中性环境下共混孵育，得到多肽纳米级协同多药递送系统AF127@PG3P/pDNA。
【实施例5】
1、AF127胶束及包载Ce6的AF127胶束
A、取5g普朗尼克F127溶解于100mL无水二氯甲烷中，再加入2g戴斯马丁氧化剂，搅拌24h后，加入200mL正己烷产生白色沉淀，3000rpm×5min离心三次，弃去液体，于真空干燥箱中干燥得到端基氧化的普朗尼克材料(即醛基化普朗尼克)AF127。
B、取10mg AF127和1mg Ce6溶解于20mL四氢呋喃中，搅拌30min后，旋蒸溶液至粘稠，加入50mL蒸馏水搅拌30min，并使用0.45微米孔径滤膜过滤溶液，得到包载Ce6的AF127胶束。
2、以多面体低聚倍半硅氧烷(POSS)为核的三代赖氨酸树状大分子(PG3)修饰功能性多肽及PG3P/pDNA
A、取用500mL两口球形烧瓶，向其中加入200mL甲醇，再在搅拌下缓慢滴入15mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，随后油浴升温至50℃后，冷凝回流，使用50mL恒压滴液漏斗逐滴滴入30mL浓盐酸，再升温至90℃，搅拌反应24h后，将反应溶液加入搅拌的四氢呋喃中，3000rpm×5min离心三次，弃去液体，于真空干燥箱中干燥得到笼聚型半硅氧烷核心POSS。
B、称取POSS 1g，BOC-Lys(BOC)-OH 2.83g，HBTU 3.71g，HoBt 1.32g，于氮气保护下使用无水DMSO溶解后，将整个体系冰浴15min后，加入5mL DIEA，反应24h后，加入50mL氯仿稀释，再使用饱和食盐水水洗3-5次，使用无水硫酸镁干燥4h后，抽滤，旋蒸减少溶剂，加入100mL乙腈产生白色沉淀，3000rpm×5min离心三次，弃去液体，于真空干燥箱中干燥得到一代树状肽类分子PG1。
C、按照步骤B中的方法，以PG1代替POSS为核，重复步骤B，得到二代树状肽类分子PG2；再以PG2代替POSS为核，重复步骤B，得到三代树状肽类分子PG3。
D、将PG3 1g，6-马来酰亚胺己酸0.3g，N-羟基丁二酰亚胺0.16g混合于水中，避光搅拌24h后透析，冻干得到马来酰亚胺化的树状肽类分子PG3-MHA，再将PG3-MHA 1g与序列为c(RGDfK)KRRRRRRRR的多肽4g溶解于100mL氯仿中，并加入10mL三乙胺，避光搅拌反应48h后，旋蒸得到功能化树状肽类分子PG3P。
随后取5.6μL 0.1mg/mL的PG3P溶液与2μL 0.1mg/mL的pDNA共混，于室温下静置孵育10-30min得到压缩有核酸的PG3P/pDNA。
3、利用醛基与氨基形成腙键反应驱动自组装的方法，将步骤1得到的AF127胶束与步骤2得到的PG3P/pDNA，以体积比为1:5，醛基化普朗尼克胶束的浓度为0.8mg/mL，PG3P的浓度为10mg/mL的条件下，在中性环境下共混孵育，得到多肽纳米级协同多药递送系统AF127@PG3P/pDNA。
【表征和检测】
以下测试所用的多肽纳米级协同多药递送系统及其中间体均为实施例1中所得的样品。
1、粒径和电位测试
分别取AF127胶束和PG3P，并按照实施例1中步骤3的方法将AF127胶束和PG3P组装得到AF127/PG3P，分别检测上述AF127胶束、PG3P以及AF127/PG3P的粒径和电位，其结果如图2和图3所示，PG3P的粒径为80.59±5.39nm，电位为+46.65±3.86mV，AF127胶束的粒径为165.93±10.63nm，电位为-10.53±0.96mV，而AF127/PG3P的粒径为205.42±15.33nm，电位为+5.66±0.43mV，结果表明，AF127与PG3P结合后，体系电位降低，较低的电位保证材料不会被血液中的特异性识别酶识别降解，并且粒径处于100-300nm区间可以保证体系不会在血液中聚集形成血栓。
2、包载能力测试
为了检测AF127胶束和PG3P对药物和基因的包载能力，使用Ce6为目的物，绿色荧光蛋白质粒为目的基因来进行实验。
取包载Ce6的AF127，使用紫外分光光度计检测其于660nm处的吸光度，并与事先检测好的Ce6吸光度/浓度标准曲线对应，得到AF127对Ce6的包封率。
将PG3P树状肽类分子和绿色荧光蛋白质粒按照5，8，10，15，20，25，30的N/P溶解于HEPES缓冲液中，检测粒径与电位的变化情况，观察PG3P树枝状肽类分子对质粒的压缩能力。
如图4所示，胶束在660nm出表现出较强的吸光度，通过计算得到AF127胶束的包封率为85.85％。
如图5所示，PG3P在N/P大于15时粒径与电位稳定，在20以上达到最佳效果，电位为+22.35mV，+20至+25mV的电位保证了PG3P与质粒的结合体结合稳定不会分离，从而使载体将质粒递送进入细胞并表达，粒径为160.94nm，不会在血液中过度堆积，形成大体积的栓塞。
3、生物相容性测试
(1)将-80℃取出的3T3细胞复苏接种到25mm3的培养瓶中，加入5mL配好的DMEM完全培养基(含90％DMEM培养基，10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素双抗)，在37℃，5％CO2的条件下于培养箱中培养24h使细胞贴壁繁殖。
(2)在二次传代后，将一瓶3T3细胞消化后计数，以4000每孔的密度接种到96孔板中，在37℃，5％CO 2的条件下于培养箱中培养24h使细胞贴壁。
(3)弃去培养液，设置组别：空白组(无细胞，培养基，不加药)；对照组(有细胞，培养基，不加药)；AF127-Ce6胶束组(有细胞，培养基，加药)；PG3P组(有细胞，培养基，加药)；每组设置5个复孔。
(4)分别孵育12h，24h，48h，72h弃去上清，加入灭菌PBS清洗三次。最后，每孔加入10μL CCK-8试剂溶液和100μL的DMEM培养基，在37℃、5％CO2的培养箱中温育1小时，最后用酶标仪测定450nm处的吸光度。
(5)数据处理。细胞存活率＝(OD实验组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)*100％。
(6)结果如图6所示，三种材料在不同时间段的细胞存活率均在80％以上，表明了材料对细胞的毒性很低，不会由于材料自身毒性引起正常细胞死亡，从而影响机体活性，良好的细胞毒性说明了材料的良好生物相容性。
4、质粒转染效果测试
(1)将-80℃取出的3T3细胞复苏接种到25mm3的培养瓶中，加入5mL配好的DMEM完全培养基(含90％DMEM培养基，10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素双抗)，在37℃，5％CO2的条件下于培养箱中培养24h使细胞贴壁繁殖。
(2)在二次传代后，将一瓶3T3细胞消化后计数，以10000每孔的密度接种到96孔板中，在37℃，5％CO2的条件下于培养箱中培养24h使细胞贴壁。
(3)24h后，将孔中的培养基更换为无血清的DMEM培养基和10％血清的DMEM培养基量大组，每个大组按照pDNA量为200ng每孔的定量将N/P为20的AF127/PG3P-pDNA材料加入不同孔中，每个N/P设置5个复孔，并以200ng pDNA为阴性对照组，PEI为阳性对照，无细胞组为空白组，37℃，5％CO2孵育4h后，将所有孔的培养基更换为10％血清的DMEM培养基，继续培养44h后，于倒置荧光显微镜下观察绿色荧光情况观察质粒转染效果。
如图7所示，在无血清和有血清情况下，AF127/PG3P组均表现出了高于市售的PEI的转染效率，说明该材料可以高效地转染细胞，并促进质粒的表达。
虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明。本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。因此，本发明的保护范围当视权利要求书所界定者为准。
Claims (11)
1.一种基于胶束辅助解离的多肽纳米级协同多药递送系统，其特征在于：所述多肽纳米级协同多药递送系统包括端基氧化为醛基的普朗尼克(AF127)胶束和PG3P，并通过在中性环境下自组装形成；所述PG3P由以笼状倍半硅氧烷(POSS)为核，以赖氨酸为分支单元的三代赖氨酸树状大分子(PG3)修饰功能性多肽后形成；
其中，由所述端基氧化为醛基的普朗尼克胶束形成第一载体，由所述PG3P形成第二载体。
2.根据权利要求1所述的基于胶束辅助解离的多肽纳米级协同多药递送系统，其特征在于：所述第一载体搭载药物，包括：光敏剂Ce6(二氢卟吩e6)、IR-780(七甲川花菁类小分子)或者姜黄素。
3.根据权利要求1所述的基于胶束辅助解离的多肽纳米级协同多药递送系统，其特征在于：所述第二载体搭载核酸(NA)，包括：质粒DNA(pDNA)、mRNA或者siRNA。
4.根据权利要求1所述的基于胶束辅助解离的多肽纳米级协同多药递送系统，其特征在于：所述第二载体搭载压缩核酸后，第二载体的氨基和核酸的磷酸根的摩尔比为15:1-30:1。
5.根据权利要求1所述的基于胶束辅助解离的多肽纳米级协同多药递送系统，其特征在于：所述功能性多肽的序列为c(RGDfK)KRRRRRRRR。
6.一种根据权利要求1-5中任意一项所述的基于胶束辅助解离的多肽纳米级协同多药递送系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将端基氧化为醛基的普朗尼克(AF127)和药物溶解于四氢呋喃中，搅拌后除去溶剂，再加蒸馏水溶解、搅拌、过滤，得到包载药物的醛基化普朗尼克胶束；
S2：将以多面体低聚倍半硅氧烷(POSS)为核的三代赖氨酸树状大分子(PG3)与序列为c(RGDfK)KRRRRRRRR的多功能多肽通过6-马来酰亚胺己酸、N-羟基丁二酰亚胺和三乙胺催化进行接枝得到PG3P，随后将PG3P溶液与核酸共混涡旋后，于室温下静置孵育得到压缩有核酸的PG3P；
S3：利用醛基与氨基形成腙键反应驱动自组装的方法，将步骤S1得到的醛基化普朗尼克胶束与步骤S2得到的压缩有核酸的PG3P，在中性环境下共混孵育，得到多肽纳米级协同多药递送系统AF127@PG3P/NA。
7.根据权利要求6所述的基于胶束辅助解离的多肽纳米级协同多药递送系统的制备方法，其特征在于：步骤S3中，所述醛基化普朗尼克胶束与PG3P的自组装体积比为(1-10):(1-10)，醛基化普朗尼克胶束的浓度为0.1-1mg/mL，PG3P的浓度为10-100mg/mL。
8.根据权利要求6所述的基于胶束辅助解离的多肽纳米级协同多药递送系统的制备方法，其特征在于，步骤S2中，制备PG3P的具体步骤包括：
A、向搅拌的甲醇中缓慢滴加3-氨基丙基三乙氧基硅烷，随后进行油浴升温至50-60℃，冷凝回流，并逐滴加入浓盐酸，继续升温至90-100℃，搅拌反应，之后将反应好的溶液加入搅拌的四氢呋喃中，离心，真空干燥得到笼聚型半硅氧烷核心POSS；
B、取步骤A得到的POSS，以及BOC-Lys(BOC)-OH、HBTU和HoBt，于氮气保护下溶解与无水DMSO中，冰浴一定时间，再加入DIEA，进行反应，反应完成后加入氯仿进行稀释，并经过饱和食盐水水洗、无水硫酸镁干燥、抽滤、旋蒸后，加入乙腈产生白色沉淀，之后再离心、真空干燥得到一代树状肽类分子PG1；
C、将步骤B的POSS替换成所得的PG1后，重复步骤B，得到二代树状肽类分子PG2；
D、将步骤B的POSS替换成步骤C所得的PG2后，重复步骤B，得到三代树状肽类分子PG3；
E、将步骤D所得到的PG3与6-马来酰亚胺己酸、N-羟基丁二酰亚胺混合于水中，第一次避光搅拌一段时间后透析，冻干得到马来酰亚胺化的树状肽类分子PG3-MHA，再将PG3-MHA与序列为c(RGDfK)KRRRRRRRR的多肽溶解于氯仿中，并加入三乙胺，第二次避光搅拌反应一段时间，旋蒸得到功能化树状肽类分子PG3P。
9.根据权利要求8所述的基于胶束辅助解离的多肽纳米级协同多药递送系统的制备方法，其特征在于：步骤A中，甲醇与3-氨基丙基三乙氧基硅烷的体积比为20:1-30:1，加入的浓盐酸与3-氨基丙基三乙氧基硅烷的体积比1:1-3:1；离心次数为3-5次，每次的速率均为3000-3500rpm，每次离心时间均为5-10min。
10.根据权利要求8所述的基于胶束辅助解离的多肽纳米级协同多药递送系统的制备方法，其特征在于：步骤B中，POSS与BOC-Lys(BOC)-OH的摩尔比为1:8-1:10，POSS与HBTU的摩尔比为1:8-1:10，POSS与HoBt摩尔比为1:8-1:10，POSS与DIEA摩尔比为1:30至1:40；冰浴的时间为15-30min，加入DIEA后的反应时间为24-36h；使用饱和食盐水水洗3-5次，无水硫酸镁干燥4-6h，离心次数为3-5次，每次的速率均为3000-3500rpm，每次离心时间均为5-10min。
11.根据权利要求8所述的基于胶束辅助解离的多肽纳米级协同多药递送系统的制备方法，其特征在于：步骤E中，PG3与6-马来酰亚胺己酸的摩尔比为1:5-1:15，PG3与N-羟基丁二酰亚胺的摩尔比为1:5-1:15；PG3-MHA与序列为c(RGDfK)KRRRRRRRR的多肽的质量比为1:5；第一次避光搅拌的时间为24-36h，第二次避光搅拌的时间为24-48h。
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| 杨扬等: "基于聚合物的环境敏感型纳米抗肿瘤药物传输系统的研究", 《生物化学与生物物理进展》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114272208B (zh) | 2022-10-14 |
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